RS59664B1 - Anti-tim3 antitela i postupci upotrebe - Google Patents

Anti-tim3 antitela i postupci upotrebe

Info

Publication number
RS59664B1
RS59664B1 RS20191618A RSP20191618A RS59664B1 RS 59664 B1 RS59664 B1 RS 59664B1 RS 20191618 A RS20191618 A RS 20191618A RS P20191618 A RSP20191618 A RS P20191618A RS 59664 B1 RS59664 B1 RS 59664B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
tim3
hvr
amino acid
antibody
acid sequence
Prior art date
Application number
RS20191618A
Other languages
English (en)
Inventor
Valeria Lifke
Guy Georges
Victor Levitsky
Oliver Ploettner
Stefan Seeber
Barbara Weiser
Ildiko Wuensche
Adrian Zwick
Original Assignee
Hoffmann La Roche
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hoffmann La Roche filed Critical Hoffmann La Roche
Publication of RS59664B1 publication Critical patent/RS59664B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A61K47/6829—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxins or Pseudomonas exotoxin A
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A61K47/6831—Fungal toxins, e.g. alpha sarcine, mitogillin, zinniol or restrictocin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Description

OPIS
OBLAST PRONALASKA
Predmetni pronalazak se odnosi na anti-TIM3 antitela i postupke za primenu istih. OSNOVA TIM3 je humani protein koji pripada imunoglobulinskoj superfamiliji, a TIM familiji proteina. Kod ljudi, slično miševima, TIM-3 se eksprimira na T ćelijama, kao i na fagocitnim ćelijama, poput makrofaga i dendritskih ćelija. Vezivanje TIM-3 za proteinski ligand (npr. galektin-9) može da inhibira Th1 odgovor mehanizmom indukcije apoptoze, i zbog toga da dovede do indukcije periferne tolerancije. Smanjenje ekspresije humanog TIM-3 sa siRNA ili inhibicija humanog TIM-3 blokirajućim antitelom povećava izlučivanje interferona alfa iz CD4 pozitivnih T ćelija, podržavajući inhibitorsku ulogu TIM-3 u humanim T ćelijama. U fagocitima, TIM-3 funkcioniše i kao receptor za prepoznavanje ćelija apoptoze. Analiza kliničkih uzoraka pacijenata sa autoimunom bolešću nije pokazala ekspresiju TIM-3 u CD4 pozitivnim ćelijama. Konkretno, u klonovima T ćelija dobijenim iz cerebrospinalne tečnosti bolesnika sa multiplom sklerozom, nivo ekspresije TIM-3 je bio niži, a nivo sekrecije IFN-gama viši od one kod klonova dobijenih od normalnih zdravih osoba (Koguchi K i sar., J Exp Med. 203 (2006) 1413-1418).
Postoje izveštaji o povezanosti TIM-3 sa alergijskim bolestima ili astmom (WO96/27603 i WO2003/063792).
Prema analizi pomoću mikročipova hematopoetskih matičnih ćelija pacijenata sa akutnom mijeloidnom leukemijom (u daljem tekstu „AML“) i normalnih hematopoetskih matičnih ćelija, TIM-3 se eksprimira na matičnim ćelijama AML, i zbog toga analiza sugeriše uključenost TIM-3 u hematološke malignosti (Majeti R i sar., PNAS, 106 (2009) 3396-3401 i WO2009/091547).
Primeri anti-TIM-3 monoklonskih antitela uključuju antihumano monoklonsko antitelo pacova TIM-3 (klon 344823, proizvođača R&D Systems) i antihumano mišje monoklonsko antitelo TIM-3 (klon F38-2E2, proizvođača R&D Systems). WO2013/06490 se odnosi na anti-TIM-3 antitela koja pokazuju brzu internalizaciju i njihove imunokonjugate za lečenje kancera i smanjenje upale. US2012/189617 se odnosi na anti-TIM-3 antitela koja pokazuju veću efektorsku aktivnost, poput ćelijske citotoksičnosti zavisne od antitela (ADCC aktivnost) za bolesti koje se odnose na humanu ćeliju koja eksprimira TIM-3.
REZIME
Pronalazak je definisan u priloženim patentnim zahtevima, i svi drugi aspekti koji su ovde izloženi, a ne spadaju u opseg patentnih zahteva, su samo informativni.
Pronalazak obezbeđuje anti-TIM3 antitela i postupke za njihovu primenu.
Pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo koje se vezuje za humani TIM3, pri čemu antitelo sadrži (a) VH domen koji sadrži (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu ID BR. SEKV.: 37; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu ID BR. SEKV.: 38 i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od ID BR. SEKV.: 39; i (b) VL domena koji sadrži (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu ID BR. SEKV.: 40; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu ID BR. SEKV.: 41 i (iii) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu ID BR. SEKV.: 42.
Pronalazak dalje omogućava izolovano antitelo koje se vezuje za humani TIM3, pri čemu antitelo sadrži
i) VH sekvencu SQ ID NO: 83 i VL sekvencu SQ ID NO:84, ili
ii) VH sekvencu SQ ID NO: 85 i VL sekvencu SQ ID NO: 86.
U jednom otelotvorenju, anti-TIM3 antitelo prema pronalasku je antitelo pune dužine IgG1.
U jednom otelotvorenju, anti-TIM3 antitelo prema pronalasku je antitelo pune dužine IgG1 sa mutacijama L234A, L235A i P329G (numerisanje prema Kabatovom EU indeksu).
Još jedan aspekt ovog pronalaska je izolovana nukleinska kiselina koja kodira antitelo prema pronalasku.
Još jedan aspekt ovog pronalaska je imunokonjugat koji sadrži antitelo prema pronalasku i citotoksično sredstvo.
U jednom poželjnom otelotvorenju ovog pronalaska je takav imunokonjugat, pri čemu je citotoksično sredstvo pseudomonas egzotoksin A ili amatoksin.
Još jedan aspekt ovog pronalaska je farmaceutska formulacija koja sadrži antitelo prema pronalasku ili imunokonjugat prema pronalasku i farmaceutski prihvatljiv nosač.
Još jedan aspekt ovog pronalaska je antitelo prema pronalasku ili imunokonjugat prema pronalasku za upotrebu kao lek.
Još jedan aspekt ovog pronalaska je antitelo prema pronalasku ili imunokonjugat prema pronalasku za upotrebu u lečenju kancera.
Još jedan aspekt ovog pronalaska je upotreba antitela prema pronalasku ili imunokonjugata prema pronalasku za upotrebu u proizvodnji leka.
Još jedan aspekt ovog pronalaska je upotreba antitela prema pronalasku ili imunokonjugata prema pronalasku za upotrebu u proizvodnji leka za lečenje kancera.
Još jedan aspekt ovog pronalaska je postupak lečenja pojedinca koji ima kancer, koji obuhvata davanje pojedincu efikasne količine antitela prema pronalasku ili imunokonjugata prema pronalasku.
Anti-TIM3 antitela iz predmetnog pronalaska pokazuju veoma dragocena svojstva, kao što su brza i snažna internalizacija na ćelijama kancera koje eksprimiraju TIM3, snažna citotoksična aktivnost kao imunokonjugat (npr. kada se konjuguju sa pseudomonas egzotoksinima ili amatoksinima). Zbog toga su korisni terapeutici za lečenje različitih kancera, posebno tumora krvi, poput leukemija i limfoma. Nadalje, pokazuju snažno oslobađanje imunostimulišućeg citokina u mešanoj limfocitnoj reakciji (MLR) i zbog toga su korisni kao imunostimulatorna terapija za kancer. Pored toga, humanizovane verzije antitela imaju poboljšano vezivanje i specifičnost vezivanja za CD4 T ćelije u poređenju sa roditeljskim antitelima.
KRATAK OPIS SLIKA SL. 1A: Vremenski zavisna internalizacija na bazi FACS anti-TIM3 antitela Tim3_0022 (skraćeno <TIM-3> Ab (022)) internalizovanog u rec CHOC1 ćelije koje eksprimiraju huTIM-3 nakon inkubacije na 37 °C.
SL. 1B: Rezultati ispitivanja internalizacije na bazi FACS pokazuju da je Fab fragment anti-TIM3 antitela Tim3_0022 (skraćeno <TIM-3> Ab(022)) internalizovan u rec CHOC1 ćelije koje eksprimiraju huTIM-3 nakon inkubacije na 37 °C sa sličnom kinetikom kao puni IgG format.
SL. 2A: Vezivanje anti-TIM3 antitela za RPMI-8226 ćelije (oznaka antitela klon 0016 se odnosi na antitelo Tim3_0016, klon 0016 se odnosi na varijantu antitela Tim3_0016 (antitelo Tim3_0018), klon 0022 se odnosi na antitelo Tim3_00122, itd.).
SL. 2B: Vezivanje anti-TIM3 antitela za Fajferove ćelije (oznaka antitela klon 0016 se odnosi na antitelo Tim3_0016, klon 0016 se odnosi na varijantu antitela Tim3_0016 (antitelo Tim3_0018), klon 0022 se odnosi na antitelo Tim3_00122, itd.).
SL. 3: nivo ekspresije TIM-3 na različitim uzorcima AML ćelija pacijenata pomoću FACS koristeći anti-TIM-3 mAb.
SL. 4: Direktno poređenje vezivanja TIM3 antitela za različite mononuklearne ćelije periferne krvi (monociti, NK ćelije, T ćelije, CD4 T ćelije):
4A: % pozitivnih ćelija za koje se vezuje varijanta Tim3_0016 (antitelo Tim3_0018) i humanizovane verzije.
4B: Srednji intezitet fluorescencije-vezivanje varijante Tim3_0016 (antitelo Tim3_0018) i humanizovane verzije za različite mononuklearne ćelije periferne krvi.
4C: % pozitivnih ćelija za koje se vezuju Tim3_0028 i himerne i humanizovane verzije.
4D: Srednji intezitet fluorescencije-vezivanje Tim3_0028 i himerne i humanizovane verzije za različite mononuklearne ćelije periferne krvi.
DETALJAN OPIS OTELOTVORENJA PRONALASKA
I. DEFINICIJE
„Akceptorski humani okvir“ je za ove svrhe okvir koji sadrži aminokiselinsku sekvencu okvira varijabilnog domena lakog lanca (VL) ili varijabilnog domena teškog lanca (VH) dobijenog od okvira humanog imunoglobulina ili okvira humanog konsenzusa, kao što je definisan dole. Humani akceptorski okvir „dobijen od” okvira humanog imunoglobulina ili okvira humanog konsenzusa može da sadrži iste aminokiselinske sekvence kao što su njihove, ili može da sadrži izmene u sekvenci aminokiselina. U nekim otelotvorenjima, broj izmena aminokiselina je 10 ili manje, 9 ili manje, 8 ili manje, 7 ili manje, 6 ili manje, 5 ili manje, 4 ili manje, 3 ili manje, ili 2 ili manje. U nekim otelotvorenjima, VL akceptorski humani okvir je po sekvenci identičan sa sekvencom okvira VL humanog imunoglobulina ili sekvencom okvira humanog konsenzusa. (po potrebi definisati germinativne linije)
Izraz „anti-TIM3 antitelo” i „antitelo koje se vezuje za TIM3” se odnosi na antitelo koje je sposobno da veže TIM3 sa dovoljnim afinitetom, na takav način da antitelo bude korisno kao dijagnostički i/ili terapeutski agens za ciljanje TIM3. U jednom otelotvorenju, obim vezivanja anti-TIM3 antitela za nepovezan protein koji nije TIM3 je manji od oko 10% od vezivanja antitela za TIM3 kao što je izmereno, npr. analizom površinske plazmonske rezonance (npr. BIACORE). U nekim otelotvorenjima, antigen-vezujući protein koji se vezuje za humani TIM3 ima KD vrednost afiniteta vezivanja za vezivanje za humani TIM3 od ≤ 1 µM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0,1 nM, ≤ 0,01 nM, ili ≤ 0,001 nM (npr.10<-8>M ili manje, npr. od 10<-8>M do 10<-13>M, npr., od 10<-9>M do 10<-13>M). U jednom poželjnom otelotvorenju, odgovarajuća KD vrednost afiniteta vezivanja je određena u testu površinske plazmonske rezonance korišćenjem ekstracelularnog domena (ECD) humanog TIM3 (TIM3 - ECD) za afinitet vezivanja TIM3.
Termin „antitelo” ovde je upotrebljen u najširem smislu i obuhvata različite strukture antitela uključujući, bez ograničenja, monoklonska antitela, poliklonska antitela, multispecifična antitela (npr. bispecifična antitela) i fragmente antitela, dokle god oni pokazuju željenu aktivnost vezivanja za antigen.
„Fragment antitela” ukazuje na molekul koji nije netaknuto antitelo, a koji sadrži deo netaknutog antitela koje vezuje antigen za koji se vezuje netaknuto antitelo. Primeri za fragmente antitela uključuju, ali se ne ograničavaju na Fv, Fab, Fab', Fab’-SH,F(ab')2; dijatela, linearna antitela, molekule antitela sa jednim lancem (npr. scFv) i multispecifična antitela nastala od fragmenata antitela.
„Antitelo koje se vezuje za isti epitop“ kao referentno antitelo odnosi se na antitelo koje blokira vezivanje referentnog antitela za njegov antigen u kompetitivnom testu za 50% ili više, i obrnuto, referentno antitelo blokira vezivanje antitela za njegov antigen u kompetitivnom testu za 50% ili više. Ovde je dat primer kompetitivnog testa.
Termin „himerno“ antitelo ukazuje na antitelo kod koga je deo teškog i/ili lakog lanca dobijen od posebnog izvora ili vrste, dok je ostatak teškog i/ili lakog lanca dobijen od različitog izvora ili vrste.
„Klasa” antitela ukazuje na vrstu konstantnog domena ili konstantnog regiona koju ima njegov teški lanac. Postoji pet glavnih klasa antitela: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, a neke od njih mogu dalje da se dele na potklase (izotipove), npr. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, i IgA2. Konstantni domeni teškog lanca koji odgovaraju različitim klasama imunoglobulina zovu se α, δ, ε, γ, odnosno µ.
Izraz „citotoksični agens”, u smislu ovog dokumenta, odnosi se na supstancu koja inhibira ili sprečava ćelijsku funkciju i/ili izaziva smrt ili uništenje ćelije. Citotoksični agensi uključuju, ali se ne ograničavaju na, radioaktivne izotope (npr. At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 i radioaktivni izotopi Lu); hemoterapeutske agense ili lekove (npr. metotreksat, adriamicin, vinka alkaloide (vinkristin, vinblastin, etopozid), doksorubicin, melfalan, mitomicin C, hlorambucil, daunorubicin ili druge interkalirajuće agense); agense za inhibiciju rasta; enzime i njihove fragmente, kao što su nukleolitički enzimi; antibiotike; toksine, kao što su toksini malog molekula ili enzimski aktivni toksini bakterijskog, fungalnog, biljnog ili životinjskog porekla, uključujući njihove fragmente i/ili varijante; i razna antitumorska ili antikancerogena sredstva otkrivena ispod.
U jednom poželjnom otelotvorenju, „citotoksični agens” je pseudomonas egzotoksin A (ili njegove varijante) WO2005052006, WO2007016150, WO2007014743, WO2007031741, WO200932954, WO201132022, WO2012/154530, i WO 2012/170617, Liu W, i sar., PNAS 109 (2012) 11782-11787, Mazor R, i sar. PNAS 111 (2014) 8571-8576 i Alewine C, i sar., Mol Cancer Ther. (2014) 2653-61. U jednom poželjnom otelotvorenju, „pseudomonas egzotoksin A” sadrži aminokiselinske sekvence ID BR. SEKV.: 69 ili sadrži aminokiselinske sekvence ID BR. SEKV.: 70 (njihova priprema je takođe opisana u Mazor R, i sar.. PNAS 111 (2014) 8571-8576 i Alewine C, i sar., Mol Cancer Ther. (2014) 2653-61).
U još jednom poželjnom otelotvorenju, „citotoksični agens” je amatoksin (ili njegova varijanta) kako opisuju, npr. WO2010/115630, WO2010/115629, WO2012/119787, WO2012/041504, i WO2014135282 sa poželjnim varijantama opisanim u WO2012/041504 (npr. konjugovan preko 6’ C-atoma amatoksinske aminokiseline 4, posebno preko atoma kiseonika vezanog za 6' C-atom amatoksinske aminokiseline, i pri čemu je TIM3 antitelo povezano linkerom preko ostatka uree) i WO2014135282.
„Efikasna količina“ agensa, npr. farmaceutske formulacije, odnosi se na količinu koja je u potrebnim dozama i vremenskim periodima efikasna za postizanje željenog terapeutskog ili profilaktičkog rezultata.
Izraz „Fc region” u ovom dokumentu se koristi da definiše C-terminalni region imunoglobulinskog teškog lanca koji sadrži najmanje deo konstantnog regiona. Izraz uključuje nativne sekvence Fc regiona i varijante Fc regiona. U jednom otelotvorenju, Fc region teškog lanca humanog IgG pruža se od Cys226, ili od Pro230, do karboksilnog terminusa teškog lanca. Međutim, na C kraju Fc regiona lizin (Lys447) može, ali ne mora da bude prisutan. Ako ovde nije drugačije naznačeno, numeracija aminokiselinskih ostataka u Fc regionu ili konstantnom regionu je prema EU sistemu numeracije, koji se zove i EU indeks, kao što su opisali Kabat, E.A. i sar., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242.
„Okvir” ili „FR” se odnosi na ostatke varijabilnog domena koji nisu ostaci hipervarijabilnog regiona (HVR). FR varijabilnog domena generalno se sastoji od četiri FR domena: FR1, FR2, FR3 i FR4. Prema tome, HVR i FR sekvence generalno se pojavljuju u sledećoj sekvenci u VH (ili VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
Izrazi „antitelo pune dužine”, „netaknuto antitelo” i „kompletno antitelo” u ovom dokumentu se koriste kao sinonimi za ukazivanje na antitelo koje ima suštinski sličnu strukturu strukturi nativnog antitela, ili koje ima teške lance koji sadrže Fc region, kao što je u ovom dokumentu definisano.
Izrazi „ćelija domaćin”, „ćelijska linija domaćina” i „kultura ćelije domaćina” koriste se kao sinonimi i ukazuju na ćelije u koje je uvedena egzogena nukleinska kiselina, uključujući potomstvo takvih ćelija. Ćelije domaćini uključuju „transformante” i „transformisane ćelije”, koje uključuju primarne transformisane ćelije i potomstvo dobijeno od njih, bez obzira na broj presejavanja. Potomstvo ne mora biti po sadržaju nukleinskih kiselina sasvim istovetno matičnoj ćeliji, već može da sadrži mutacije. Ovde se uključuje mutantno potomstvo koje ima istu funkciju ili biološku aktivnost kao što je ispitano ili odabrano u originalno transformisanoj ćeliji.
„Humano antitelo” je ono koje ima aminokiselinsku sekvencu koja odgovara aminokiselinskoj sekvenci koju proizvodi čovek ili humana ćelija ili ono dobijeno iz nehumanog izvora koji koristi humani repertoar antitela ili druge sekvence za kodiranje humanog antitela. Ova definicija humanog antitela specifično isključuje humanizovano antitelo koje sadrži ne-humane antigen-vezujuće ostatke.
„Okvir humanog konsenzusa“ je okvir koji predstavlja najčešće ostatke aminokiselina u izboru okvirnih sekvenci VL ili VH humanog imunoglobulina. Generalno, izbor VL ili VH sekvenci humanog imunoglobulina je iz podgrupe sekvenci varijabilnog domena. Generalno, podgrupa sekvenci je podgrupa kao u Kabat, E.A. i sar. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd. Bethesda MD (1991), NIH Publication 91-3242, tomovi 1-3. U jednom otelotvorenju, za VL, podgrupa je podgrupa kapa I, kao u Kabat i sar, gore navedeno. U jednom otelotvorenju, za VH, podgrupa je podgrupa III, kao u Kabat i sar, gore navedeno.
„Humanizovano” antitelo ukazuje na himerno antitelo koje obuhvata aminokiselinske ostatke od ne-humanih HVR i aminokiselinske ostatke od humanih FR. U određenim otelotvorenjima, humanizovano antitelo će sadržati u suštini sve, ili barem jedan, a tipično dva, varijabilna domena, u kojima svi, ili suštinski svi HVR (npr. CDR), odgovaraju onima iz nehumanog antitela, a svi, ili suštinski svi FR, odgovaraju onima iz humanog antitela. Humanizovano antitelo opciono može da sadrži barem deo konstantnog regiona antitela dobijenog od humanog antitela. „Humanizovani oblik” antitela, npr. ne-humanog antitela, ukazuje na antitelo koje je pretrpelo humanizaciju.
Izraz „hipervarijabilni region” ili „HVR”, u smislu ovog dokumenta, ukazuje na svaki od regiona varijabilnog domena antitela koji su hipervarijabilni u sekvenci („regioni koji određuju komplementarnost” ili „CDR”) i/ili formiraju strukturno definisane petlje („hipervarijabilne petlje”) i/ili sadrže ostatke u kontaktu sa antigenom („antigen kontakti”). U suštini, antitela sadrže šest HVR: tri u VH (H1, H2, H3) i tri u VL (L1, L2, L3). U ovom dokumentu, primeri za HVR uključuju:
(a) hipervarijabilne petlje koje se pojavljuju na aminokiselinskim ostacima 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) i 96-101 (H3); (Chothia i Lesk, J. Mol. Biol.
196:901-917 (1987));
(b) CDR koji se pojavljuju na aminokiselinskim ostacima 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2) i 95-102 (H3) (Kabat i sar., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991));
(c) antigen kontakte koji se pojavljuju na aminokiselinskim ostacima 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2) i 93-101 (H3); (MacCallum i sar. J. Mol. Biol.
262:732-745 (1996)); i
(d) kombinacije (a), (b) i/ili (c), uključujući aminokiselinske ostatke HVR 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (H3) i 94-102 (H3).
Ako nije drugačije naznačeno, HVR ostaci i drugi ostaci u varijabilnom domenu (npr. FR ostaci) ovde su nabrojani prema radu Kabat i sar, gore navedeno.
„Imunokonjugat” je antitelo konjugovano sa jednim heterologim molekulom ili sa više heterologih molekula, uključujući, bez ograničenja, citotoksični agens. U jednoj poželjnom otelotvorenju, imunokonjugat je anti-TIM3 antitelo kako je ovde opisano konjugovano sa jednim ili više citotoksičnih agenasa (poželjno pseudomonas egzotoksin A ili amatoksin).
„Pojedinac” ili „ispitanik” je sisar. Sisari uključuju, bez ograničenja, domaće životinje (npr. krave, ovce, mačke, pse i konje), primate (npr. ljude i nehumane primate, kao što su majmuni), zečeve i glodare (npr. miševe i pacove). U određenim primerima izvođenja, pojedinac ili ispitanik je čovek.
„Izolovano” antitelo je ono koje je izdvojeno iz svog prirodnog okruženja. U nekim primerima izvođenja, antitelo je prečišćeno do čistoće veće od 95% ili 99% kao što je određeno, na primer, elektroforetski (npr. SDS-PAGE, izoelektrično fokusiranje (IEF), kapilarna elektroforeza) ili hromatografski (npr. jonskom izmenom ili reverzno-faznim HPLC postupkom). Za pregled postupaka za procenu čistoće antitela, pogledajte npr. Flatman i sar., J. Chromatogr. B 848 (2007) 79-87.
„Izolovana“ nukleinska kiselina ukazuje na molekul nukleinske kiseline koji je odvojen od komponenata svog prirodnog okruženja. Izolovana nukleinska kiselina uključuje molekul nukleinske kiseline koji se nalazi u ćelijama koje uobičajeno sadrže molekul nukleinske kiseline, ali je molekul nukleinske kiseline prisutan ekstrahromozomski, ili na hromozomskoj lokaciji koja se razlikuje od njegove prirodne hromozomske lokacije.
„Izolovana nukleinska kiselina koja kodira anti-TIM3 antitelo” ukazuje na jedan molekul ili više molekula nukleinske kiseline koji kodiraju teške i lake lance antitela (ili njihove fragmente), uključujući takve molekule nukleinske kiseline u jednom vektoru ili odvojenim vektorima, i takve molekule nukleinske kiseline prisutne na jednoj lokaciji ili više lokacija u ćeliji domaćinu.
Termin „monoklonsko antitelo”, u smislu ovog dokumenta, odnosi se na antitelo dobijeno iz populacije suštinski homogenih antitela, tj. pojedinačnih antitela koja sadržana u populaciji su identična i/ili se vezuju za isti epitop, sa izuzetkom mogućih varijanti antitela, npr. koje sadrže mutacije koje postoje u prirodi ili se mogu razviti tokom proizvodnje preparata monoklonskog antitela, a takve su varijante uopšteno prisutne u neznatnim količinama.
Nasuprot preparatima poliklonskih antitela, koji tipično uključuju različita antitela, usmerena prema različitim determinantama (epitopima), svako monoklonsko antitelo iz preparata monoklonskog antitela je usmereno na pojedinačnu determinantu na antigenu. Tako, reč „monoklonsko” ukazuje na karakter antitela, da je dobijeno iz suštinski homogene populacije antitela, i ne bi je trebalo tumačiti kao zahtev za proizvodnju antitela bilo kojim posebnim postupkom. Na primer, monoklonska antitela koja će se koristiti u skladu sa predmetnim pronalaskom mogu se dobiti različitim tehnikama, uključujući, ali se ne ograničavajući na postupak hibridoma, postupke rekombinantne DNK, postupke displeja faga i postupke koje koriste transgene životinje koje sadrže kompletne lokuse humanog imunoglobulina ili njihove delove, i ovde su opisani takvi postupci i primeri drugih postupaka za dobijanje monoklonskih antitela.
„Golo antitelo“ ukazuje na antitelo koje nije konjugovano sa heterologim delom (npr. citotoksičnim delom) ili radiološkom oznakom. Golo antitelo može biti prisutno u farmaceutskoj formulaciji. (Uključiti ako prethodno stanje tehnike ima imunokonjugate).
„Nativna antitela“ ukazuju na molekule imunoglobulina koji se sreću u prirodi, sa različitim strukturama. Na primer, nativna IgG antitela su heterotetramerni glikoproteini od oko 150.000 daltona, sastavljeni od dva identična laka lanca i dva identična teška lanca koji su povezani disulfidnim vezama. Od N− do C-kraja, svaki teški lanac ima varijabilni region (VH), koji se takođe zove varijabilni teški domen ili varijabilni domen teškog lanca, za kojim slede tri konstantna domena (CH1, CH2 i CH3). Slično tome, od N− do C-kraja, svaki laki lanac ima varijabilni region (VL), koji se takođe zove varijabilni laki domen ili varijabilni domen lakog lanca, za kojim sledi konstantni laki (CL) domen. Laki lanac antitela može se svrstati u jedan od dva tipa, koji se zovu kapa (κ) i lambda (λ), na osnovu aminokiselinske sekvence njihovog konstantnog domena.
Termin „uputstvo za upotrebu” koristi se da se ukaže na uputstvo koje se uobičajeno nalazi u komercijalnim pakovanjima terapeutskih proizvoda, koje sadrži informacije o indikacijama, upotrebi, doziranju, primeni, kombinovanoj terapiji, kontraindikacijama i/ili upozorenjima u vezi sa upotrebom takvog terapeutskog proizvoda.
„Procenat (%) identičnosti aminokiselinske sekvence” u poređenju sa sekvencom referentnog polipeptida definisan je kao procenat onih aminokiselinskih ostataka u sekvencikandidatu koji su identični aminokiselinskim ostacima u sekvenci referentnog polipeptida, nakon poravnavanja sekvenci i uvođenja praznina, ako je potrebno, da bi se postigao maksimalni procenat identičnosti sekvence, pri tom ne uzimajući u obzir bilo koje konzervativne supstitucije kao deo identiteta sekvence. Poravnavanje radi određivanja procenta
1
identičnosti aminokiselinske sekvence može se postići na različite načine koji su poznati u okviru struke, na primer, pomoću javno dostupnog kompjuterskog softvera, kao što je BLAST, BLAST-2, ALIGN ili Megalign (DNASTAR) softver. Stručnjaci za ovu oblast mogu da odrede odgovarajuće parametre za poravnavanje sekvenci, uključujući sve potrebne algoritme za postizanje maksimalnog poravnavanja u kompletnoj dužini sekvenci koje se porede. Međutim, ovde su u tu svrhu vrednosti za % identičnosti sekvence aminokiselina dobijene pomoću kompjuterskog programa za poređenje sekvenci ALIGN-2. Kompjuterski program za poređenje sekvenci ALIGN-2 delo je kompanije Genentech, Inc., a izvorni kod je podnet sa korisničkom dokumentacijom u U.S. Copyright Office (Patentni zavod SAD), Washington D.C., 20559, gde je registrovan pod patentnim brojem U.S. Copyright Registration No. TXU510087. Program ALIGN-2 je javno dostupan od Genentech, Inc., South San Francisco, California ili može biti kompiliran iz izvornog koda. Program ALIGN-2 treba da se kompilira za primenu na operativnom sistemu UNIX, uključujući digitalni UNIX V4.0D. Sve parametre poređenja sekvenci je postavio program ALIGN-2 i nisu se menjali.
U slučajevima kada je ALIGN-2 korišćen za poređenja sekvenci aminokiselina, % identičnosti aminokiselinske sekvence date aminokiselinske sekvence A sa datom aminokiselinskom sekvencom B, ili u odnosu na nju (što drugačije može da se izrazi kao data aminokiselinska sekvenca A koja ima ili sadrži određeni % identičnosti aminokiselinske sekvence prema, sa ili u odnosu na datu aminokiselinsku sekvencu B) izračunava se na sledeći način:
100 puta količnik X/Y
gde je X broj aminokiselinskih ostataka za koje je dobijen rezultat da su identični putem programa za poređenje sekvenci ALIGN-2 pri poravnavanju A i B u tom programu, i gde je Y ukupan broj aminokiselinskih ostataka u B. Treba shvatiti da, u slučaju da dužina aminokiselinske sekvence A nije jednaka dužini aminokiselinske sekvence B, % identičnosti sekvence aminokiseline A u odnosu na B neće biti isti kao % identičnosti sekvence aminokiseline B u odnosu na A. Osim ako nije drugačije navedeno, sve ovde upotrebljene vrednosti % identičnosti sekvence aminokiseline dobijene su kako je opisano u prethodnom paragrafu pomoću ALIGN-2 kompjuterskog programa.
Termin „farmaceutska formulacija” odnosi se na preparat koji je u takvom obliku da omogućava efikasnu biološku aktivnost aktivnog sastojka koji se u njoj nalazi i koji ne sadrži dodatne komponente koje su neprihvatljivo toksične za ispitanika na kome će formulacija biti primenjena.
„Farmaceutski prihvatljiv nosač” upućuje na sastojak farmaceutske formulacije koji nije aktivni sastojak, i koji je netoksičan za ispitanika. Farmaceutski prihvatljiv nosač uključuje, ali nije ograničen na pufer, ekscipijens, stabilizator ili konzervans.
Izraz „TIM3”, kako se ovde koristi, odnosi se na bilo koji nativni protein imunoglobulina mucina 3 (TIM3) T ćelija (poznat i kao ćelijski receptor 2 virusa hepatitisa A (HAVcr-2), molekul oštećenja bubrega-3 (KIM-3), TIM-3, Tim3 ili Tim-3) iz bilo kog izvora kičmenjaka, uključujući sisare poput primata (npr. ljudi) i glodara (npr. miševa i pacova), osim ako nije drugačije naznačeno. Termin obuhvata neobrađen, „kompletne dužine“ TIM3, kao i svaki oblik TIM3 koji je rezultat obrade u ćeliji. Termin takođe obuhvata prirodno postojeće varijante TIM3, npr. splajsovane ili alelne varijante. Aminokiselinska sekvenca primera humanog TIM3 je prikazana u SQ ID NO:77. Aminokiselinska sekvenca ekstracelularnog domena (ECD) TIM3 je prikazana u SQ ID NO:78.
TIM3 je humani protein koji pripada imunoglobulinskoj superfamiliji, a TIM familiji proteina. Kod ljudi, slično miševima, TIM-3 se eksprimira na T ćelijama, kao i na fagocitnim ćelijama, poput makrofaga i dendritskih ćelija. Vezivanje TIM-3 za proteinski ligand (npr. galektin-9) može da inhibira Th1 odgovor mehanizmom indukcije apoptoze, i zbog toga da dovede do indukcije periferne tolerancije. Smanjenje ekspresije humanog TIM-3 sa siRNA ili inhibicija humanog TIM-3 blokirajućim antitelom povećava izlučivanje interferona alfa iz CD4 pozitivnih T ćelija, podržavajući inhibitorsku ulogu TIM-3 u humanim T ćelijama. U fagocitima, TIM-3 funkcioniše i kao receptor za prepoznavanje ćelija apoptoze. Analiza kliničkih uzoraka pacijenata sa autoimunom bolešću nije pokazala ekspresiju TIM-3 u CD4 pozitivnim ćelijama. Konkretno, u klonovima T ćelija dobijenim iz cerebrospinalne tečnosti pacijenata sa multiplom sklerozom, nivo ekspresije TIM-3 je bio niži, a nivo sekrecije IFN-□ □ viši od one kod klonova dobijenih od normalnih zdravih osoba (Koguchi K i sar., J Exp Med.
203 (2006) 1413-1418).
Postoje izveštaji o povezanosti TIM-3 sa alergijskim bolestima ili astmom (WO96/27603 i WO2003/063792).
Prema analizi pomoću mikročipova hematopoetskih matičnih ćelija pacijenata sa akutnom mijeloidnom leukemijom (u daljem tekstu „AML“) i normalnih hematopoetskih matičnih ćelija, TIM-3 se eksprimira na matičnim ćelijama AML, i zbog toga analiza sugeriše uključenost TIM-3 u hematološke malignosti (Majeti R i sar., PNAS, 106 (2009) 3396-3401 i WO2009/091547).
Primeri anti-TIM-3 monoklonskih antitela uključuju antihumano monoklonsko antitelo pacova TIM − 3 (klon 344823, proizvođača R&D Systems) i antihumano mišje monoklonsko antitelo TIM-3 (klon F38-2E2, proizvođača R&D Systems).
U smislu ovog dokumenta, „lečenje” (i njegovi gramatički oblici, kao što je „lečiti”) odnosi se na kliničku intervenciju u pokušaju da se izmeni prirodni tok bolesti kod pojedinca koji se leči, a može se primenjivati radi profilakse ili tokom kliničke patologije. Poželjni efekti lečenja uključuju, bez ograničenja, sprečavanje pojave ili recidiva bolesti, ublažavanje simptoma, smanjenje svih direktnih ili indirektnih patoloških posledica bolesti, sprečavanje metastaze, usporavanje napredovanja bolesti, poboljšavanje ili ublažavanje stanja bolesti i remisiju ili poboljšanu prognozu. U nekim otelotvorenjima, antitela iz ovog pronalaska se koriste da odlože razvoj bolesti ili da uspore napredovanje bolesti.
Izraz „varijabilni region” ili „varijabilni domen” ukazuje na domen teškog ili lakog lanca antitela, koji je uključen u vezivanje antitela za antigen. Varijabilni domeni teškog lanca i lakog lanca (VH i VL, datim redosledom) nativnog antitela u suštini imaju slične strukture, pri čemu svaki domen sadrži četiri očuvana okvirna regiona (FR) i tri hipervarijabilna regiona (HVR). (Vidi, npr. Kindt, T.J. i sar. Kuby Immunology, 6. izd., W.H. Freeman i Co., N.Y. (2007), strana 91) Jedan VH ili VL domen može biti dovoljan za dodeljivanje antigen-vezujuće specifičnosti. Nadalje, antitela koja vezuju određeni antigen mogu se izolovati pomoću VH ili VL domena iz antitela koje vezuje antigen, za pregledanje biblioteke komplementarnih VH, odnosno VL domena. Vidi, npr. Portolano, S. i sar. J. Immunol.150 (1993) 880-887; Clackson, T. i sar. Nature 352 (1991) 624-628).
Izraz „vektor”, u smislu ovog dokumenta, ukazuje na molekul nukleinske kiseline koji ima sposobnost propagacije druge nukleinske kiseline za koju je vezan. Termin uključuje vektor kao samoumnožavajuću strukturu nukleinske kiseline, kao i vektor ugrađen u genom ćelije domaćina u koju je uveden. Pojedini vektori mogu da upravljaju ekspresijom nukleinskih kiselina za koje su operativno vezani. Takvi vektori se ovde pominju kao „ekspresioni vektori”.
II. KOMPOZICIJE I POSTUPCI
U jednom aspektu, pronalazak se delom zasniva na otkriću da se izabrana anti-TIM3 antitela iz pronalaska vezuju za određene epitope TIM3, pokazujući snažnu i brzu internalizaciju i/ili visoku citotoksičnu aktivnost prema ćelijama kancera kao imunokonjugat i/ili pokazuju snažno oslobađanje imunostimulišućeg citokina (npr. interferon gama). U nekim otelotvorenjima, obezbeđena su antitela koja se vezuju za TIM3. Antitela iz pronalaska su korisna npr. za dijagnostikovanje ili lečenje kancera.
A. Primeri anti-TIM3 antitela
Pronalazak je definisan u priloženim patentnim zahtevima, i svi drugi aspekti koji su ovde izloženi, a ne spadaju u opseg patentnih zahteva, su samo informativni.
U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje izolovana antitela koja se vezuju za TIM3.
1
U nekim otelotvorenjima, obezbeđen je anti-TIM3 pri čemu antitelo:
• indukuje internalizaciju TIM3 (u FACS testu na TIM3 eksprimirajućim RPMI8226 ćelijama (ATCC<®>CCL-155™)) od najmanje 45% nakon 120 minuta na 37 °C (vidi primer 6) • U jednom otelotvorenju, antitelo indukuje internalizaciju TIM3 (u FACS testu na TIM3 eksprimirajućim RPMI8226 ćelijama (ATCC<®>CCL-155™)) od najmanje 50% nakon 120 minuta na 37 °C (vidi primer 6)
• U jednom otelotvorenju, antitelo indukuje internalizaciju TIM3 (u FACS testu na TIM3 eksprimirajućim RPMI8226 ćelijama (ATCC<®>CCL-155™)) od najmanje 55% nakon 120 minuta na 37 °C (vidi primer 6)
• U jednom otelotvorenju, antitelo indukuje internalizaciju TIM3 (u FACS testu na TIM3 eksprimirajućim RPMI8226 ćelijama (ATCC<®>CCL-155™)) od najmanje 60% nakon 240 minuta na 37 °C (vidi primer 6)
• U jednom otelotvorenju, antitelo indukuje internalizaciju TIM3 (u FACS testu na TIM3 eksprimirajućim RPMI8226 ćelijama (ATCC<®>CCL-155™)) od najmanje 65% nakon 240 minuta na 37 °C (vidi primer 6)
U nekim otelotvorenjima, obezbeđen je anti-TIM3, pri čemu antitelo:
• nadmeće se za vezivanje za TIM3 sa anti-Tim3 antitelom koji sadrži VH i VL Tim3_0016
• vezuje se za TIM3 ljudi i cinomolgusa
• kao imunokonjugat pokazuje citotoksičnu aktivnost na TIM3 eksprimirajućim ćelijama (u jednom otelotvorenju, imunokonjugati imaju relativnu IC50 vrednost citotoksične aktivnosti kao pseudomonas egzotoksin A konjugat na ćelijama RPMI-8226 od 0,1 ili manju (kao što je mereno u primeru 11)
• indukuje oslobađanje interferona-gama (u MLR testu − vidi primer 5).
U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje anti-TIM3 antitelo koje sadrži najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest HVR izabranih od (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu ID BR. SEKV.:1; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu ID BR. SEKV.:2; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu ID BR. SEKV.: 3; (d) HVR-L1 sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:4; ili HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:11; HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:12; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:5; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:6.
U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje anti-TIM3 antitelo koje sadrži (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:1; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:2; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO: 3; (d) HVR-L1 sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:4; ili HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:11; HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:12; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:5; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:6.
U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje anti-TIM3 antitelo koje sadrži (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO: 1; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO: 2; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO: 3; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO: 4; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO: 5; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO: 6.
U jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje anti-TIM3 antitelo koje sadrži (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO: 1; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO: 2; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO: 3; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO: 11; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO: 5; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO: 6.
U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje anti-TIM3 antitelo koje sadrži (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu ID BR. SEKV.: 1; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO: 2; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO: 3; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO: 12; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO: 5; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO: 6.
U drugom aspektu, antitelo iz pronalaska sadrži (a) VH domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve, ili sve tri sekvence VH HVR izabrane od (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:1; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:2, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SQ ID NO:3, i (b) VL domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve, ili sve tri sekvence VL HVR izabrane od (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:4; ili HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:11; ili HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:12; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:5 i (c) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:6.
U drugom aspektu, antitelo iz pronalaska sadrži (a) VH domen koji sadrži (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:1; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku
1
sekvencu SQ ID NO:2, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SQ ID NO:3, i (b) VL domen koji sadrži (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:4; ili HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:11; ili HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:12; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:5 i (iii) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:6.
U drugom aspektu, antitelo iz pronalaska sadrži (a) VH domen koji sadrži (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:1; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:2, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SQ ID NO:3, i (b) VL domen koji sadrži (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:4; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:5, i (iii) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:6.
U drugom aspektu, antitelo iz pronalaska sadrži (a) VH domen koji sadrži (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:1; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:2, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SQ ID NO:3, i (b) VL domen koji sadrži (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:11; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:5, i (iii) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:6.
U drugom aspektu, antitelo iz pronalaska sadrži (a) VH domen koji sadrži (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:1; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:2, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SQ ID NO:3, i (b) VL domen koji sadrži (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:12; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:5, i (iii) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:6.
U jednom otelotvorenju, takvo anti-TIM3 antitelo sadrži
i) VH sekvencu SQ ID NO:7 i VL sekvencu SQ ID NO:8;
ii) VH sekvencu SQ ID NO:9 i VL sekvencu SQ ID NO:10;
iii) ili humanizovanu varijantu VH i VL antitela pod i) ili ii).
U jednom poželjnom otelotvorenju, takvo anti-TIM3 antitelo sadrži
i) VH sekvencu SQ ID NO: 79 i VL sekvencu SQ ID NO:80, ili
ii) VH sekvencu SQ ID NO: 81 i VL sekvencu SQ ID NO:82.
Jedno poželjno otelotvorenje je antitelo koje se vezuje za humano TIM3 antitelo, pri čemu antitelo sadrži VH sekvencu SQ ID NO:79 i VL sekvencu SQ ID NO:80.
Jedno poželjno otelotvorenje je antitelo koje se vezuje za humano TIM3 antitelo, pri čemu antitelo sadrži VH sekvencu SQ ID NO:81 i VL sekvencu SQ ID NO:82.
1
U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje anti-TIM3 antitelo koje sadrži najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest HVR-ova izabranih od (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:13; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:14; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:15; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:16; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:17; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:18.
U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje anti-TIM3 antitelo koji sadrži (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO: 13; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO: 14; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO: 15; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO: 16; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO: 17; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od SQ ID NO: 18.
U drugom aspektu, antitelo iz pronalaska sadrži (a) VH domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve, ili sve tri sekvence VH HVR izabrane od (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NOSQ ID NO:13; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NOSQ ID NO:14, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SQ ID NOSQ ID NO:15, i (b) VL domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve, ili sve tri sekvence VL HVR izabrane od (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NOSQ ID NO:16; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NOSQ ID NO:17, i (c) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NOSQ ID NO:18.
U drugom aspektu, antitelo iz pronalaska sadrži (a) VH domen koji sadrži (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:13; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:14, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SQ ID NO:15, i (b) VL domen koji sadrži (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:16; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:17, i (iii) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:18.
U jednom otelotvorenju, takvo anti-TIM3 antitelo sadrži
i) VH sekvencu SQ ID NO:19 i VL sekvencu SQ ID NO:20;
ii) ili humanizovanu varijantu VH i VL antitela pod i).
U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje anti-TIM3 antitelo koje sadrži najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest HVR-ova izabranih od (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:21; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:22; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:23; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:24; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku
1
sekvencu SQ ID NO:25; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:26. U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje anti-TIM3 antitelo koji sadrži (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO: 21; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO: 22; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO: 23; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO: 24; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO: 25; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO: 26.
U drugom aspektu, antitelo iz pronalaska sadrži (a) VH domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve, ili sve tri sekvence VH HVR izabrane od (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NOSQ ID NO:21; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NOSQ ID NO:22, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SQ ID NOSQ ID NO:23, i (b) VL domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve, ili sve tri sekvence VL HVR izabrane od (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NOSQ ID NO:24; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NOSQ ID NO:25, i (c) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NOSQ ID NO:26.
U drugom aspektu, antitelo iz pronalaska sadrži (a) VH domen koji sadrži (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:21; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:22, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SQ ID NO:23, i (b) VL domen koji sadrži (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:24; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:25, i (iii) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:26.
U jednom otelotvorenju, takvo anti-TIM3 antitelo sadrži
i) VH sekvencu SQ ID NO:27 i VL sekvencu SQ ID NO:28;
ii) ili humanizovanu varijantu VH i VL antitela pod i).
U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje anti-TIM3 antitelo koje sadrži najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest HVR-ova izabranih od (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:29; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:30; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:31; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:32; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:33; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:34.
U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje anti-TIM3 antitelo koji sadrži (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO: 29; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO: 30; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO: 31; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO: 32; (e) HVR-L2 koji sadrži
1
aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO: 33; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO: 34.
U drugom aspektu, antitelo iz pronalaska sadrži (a) VH domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve, ili sve tri sekvence VH HVR izabrane od (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NOSQ ID NO:29; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NOSQ ID NO:30, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SQ ID NOSQ ID NO:31, i (b) VL domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve, ili sve tri sekvence VL HVR izabrane od (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NOSQ ID NO:32; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NOSQ ID NO:33, i (c) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NOSQ ID NO:34.
U drugom aspektu, antitelo iz pronalaska sadrži (a) VH domen koji sadrži (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:29; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:30, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SQ ID NO:31, i (b) VL domen koji sadrži (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:32; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:33, i (iii) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:34.
U jednom otelotvorenju, takvo anti-TIM3 antitelo sadrži
i) VH sekvencu SQ ID NO:35 i VL sekvencu SQ ID NO:36;
ii) ili humanizovanu varijantu VH i VL antitela pod i).
U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje anti-TIM3 antitelo koje sadrži najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest HVR-ova izabranih od (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:37; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:38; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:39; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:40; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:41; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:42.
U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje anti-TIM3 antitelo koji sadrži (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO: 37; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO: 38; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO: 39; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO: 40; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO: 41; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO: 42.
U drugom aspektu, antitelo iz pronalaska sadrži (a) VH domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve, ili sve tri sekvence VH HVR izabrane od (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NOSQ ID NO:37; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku
1
sekvencu SQ ID NOSQ ID NO:38, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SQ ID NOSQ ID NO:39, i (b) VL domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve, ili sve tri sekvence VL HVR izabrane od (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NOSQ ID NO:40; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NOSQ ID NO:41, i (c) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NOSQ ID NO:42.
U drugom aspektu, antitelo iz pronalaska sadrži (a) VH domen koji sadrži (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:37; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:38, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SQ ID NO:39, i (b) VL domen koji sadrži (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:40; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:41, i (iii) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:42.
U jednom otelotvorenju, takvo anti-TIM3 antitelo sadrži
i) VH sekvencu SQ ID NO:43 i VL sekvencu SQ ID NO:44;
ii) ili humanizovanu varijantu VH i VL antitela pod i).
U jednom poželjnom otelotvorenju, takvo anti-TIM3 antitelo sadrži
i) VH sekvencu SQ ID NO: 83 i VL sekvencu SQ ID NO:84, ili
ii) VH sekvencu SQ ID NO: 85 i VL sekvencu SQ ID NO: 86.
Jedno poželjno otelotvorenje je antitelo koje se vezuje za humano TIM3 antitelo, pri čemu antitelo sadrži VH sekvencu SQ ID NO:83 i VL sekvencu SQ ID NO:84.
Jedno poželjno otelotvorenje je antitelo koje se vezuje za humano TIM3 antitelo, pri čemu antitelo sadrži VH sekvencu SQ ID NO:85 i VL sekvencu SQ ID NO:86.
U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje anti-TIM3 antitelo koje sadrži najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest HVR-ova izabranih od (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:45; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:46; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:47; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:48; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:49; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:50.
U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje anti-TIM3 antitelo koji sadrži (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO: 45; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO: 46; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO: 47; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO: 48; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO: 49; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO: 50.
U drugom aspektu, antitelo iz pronalaska sadrži (a) VH domen koji sadrži najmanje
2
jednu, najmanje dve, ili sve tri sekvence VH HVR izabrane od (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NOSQ ID NO:45; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NOSQ ID NO:46, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SQ ID NOSQ ID NO:47, i (b) VL domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve, ili sve tri sekvence VL HVR izabrane od (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NOSQ ID NO:48; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NOSQ ID NO:49, i (c) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NOSQ ID NO:50.
U drugom aspektu, antitelo iz pronalaska sadrži (a) VH domen koji sadrži (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:45; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:46, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SQ ID NO:47, i (b) VL domen koji sadrži (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:48; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:49, i (iii) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:50.
U jednom otelotvorenju, takvo anti-TIM3 antitelo sadrži
i) VH sekvencu SQ ID NO:51 i VL sekvencu SQ ID NO:52;
ii) ili humanizovanu varijantu VH i VL antitela pod i).
U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje anti-TIM3 antitelo koje sadrži najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest HVR-ova izabranih od (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:53; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:54; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:55; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:56; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:57; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:58.
U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje anti-TIM3 antitelo koji sadrži (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO: 53; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO: 54; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO: 55; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO: 56; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO: 57; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO: 58.
U drugom aspektu, antitelo iz pronalaska sadrži (a) VH domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve, ili sve tri sekvence VH HVR izabrane od (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NOSQ ID NO:53; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NOSQ ID NO:54, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SQ ID NOSQ ID NO:55, i (b) VL domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve, ili sve tri sekvence VL HVR izabrane od (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NOSQ ID NO:56; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NOSQ ID NO:57, i (c) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NOSQ ID NO:58.
U drugom aspektu, antitelo iz pronalaska sadrži (a) VH domen koji sadrži (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:53; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:54, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SQ ID NO:55, i (b) VL domen koji sadrži (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:56; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:57, i (iii) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:58.
U jednom otelotvorenju, takvo anti-TIM3 antitelo sadrži
i) VH sekvencu SQ ID NO:59 i VL sekvencu SQ ID NO:60;
ii) ili humanizovanu varijantu VH i VL antitela pod i).
U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje anti-TIM3 antitelo koje sadrži najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest HVR-ova izabranih od (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:61; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:62; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:63; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:64; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:65; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:66.
U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje anti-TIM3 antitelo koji sadrži (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO: 61; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO: 62; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO: 63; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO: 64; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO: 65; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO: 66.
U drugom aspektu, antitelo iz pronalaska sadrži (a) VH domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve, ili sve tri sekvence VH HVR izabrane od (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NOSQ ID NO:61; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NOSQ ID NO:62, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SQ ID NOSQ ID NO:63, i (b) VL domen koji sadrži najmanje jednu, najmanje dve, ili sve tri sekvence VL HVR izabrane od (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NOSQ ID NO:64; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NOSQ ID NO:65, i (c) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NOSQ ID NO:66.
U drugom aspektu, antitelo iz pronalaska sadrži (a) VH domen koji sadrži (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:61; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:62, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SQ ID NO:63, i (b) VL domen koji sadrži (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:64; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:65, i (iii) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:66.
U jednom otelotvorenju, takvo anti-TIM3 antitelo sadrži
i) VH sekvencu SQ ID NO:67 i VL sekvencu SQ ID NO:68;
ii) ili humanizovanu varijantu VH i VL antitela pod i).
U svim gorepomenutim otelotvorenjima, anti-TIM3 antitelo je humanizovano. U jednom otelotvorenju, anti-TIM3 antitelo sadrži HVR-ove kao u svakom od prethodnih otelotvorenja, i dalje sadrži akceptorski humani okvir, npr. okvir humanog imunoglobulina ili okvir humanog konsenzusa. U drugom otelotvorenju, anti-TIM3 antitelo sadrži HVR-ove kao u bilo kom od gornjih otelotvorenja, i dalje sadrži VH i VL koji sadrže takve HVR-ove.
U sledećem aspektu, pronalazak obezbeđuje antitelo koje se vezuje za isti epitop kao anti-TIM3 antitelo iz ovog dokumenta. Na primer, u određenim otelotvorenjima, obezbeđeno je antitelo koje se vezuje za isti epitop kao anti-TIM3 antitelo koje sadrži VH sekvencu SQ ID NOSQ ID NO:7 i VL sekvencu SQ ID NOSQ ID NO:8, ili je obezbeđeno antitelo koje se vezuje za isti epitop kao anti-TIM3 antitelo koje sadrži VH sekvencu SQ ID NOSQ ID NO:9 i VL sekvencu SQ ID NOSQ ID NO:10, ili je obezbeđeno antitelo koje se vezuje za isti epitop kao anti-TIM3 antitelo koje sadrži VH sekvencu SQ ID NOSQ ID NO:19 i VL sekvencu SQ ID NOSQ ID NO:20, ili je obezbeđeno antitelo koje se vezuje za isti epitop kao anti-TIM3 antitelo koje sadrži VH sekvencu SQ ID NOSQ ID NO:27 i VL sekvencu SQ ID NOSQ ID NO:28, ili je obezbeđeno antitelo koje se vezuje za isti epitop kao anti-TIM3 antitelo koje sadrži VH sekvencu SQ ID NOSQ ID NO:35 i VL sekvencu SQ ID NOSQ ID NO:36, ili je obezbeđeno antitelo koje se vezuje za isti epitop kao anti-TIM3 antitelo koji sadrži VH sekvencu SQ ID NOSQ ID NO:43 i VL sekvencu SQ ID NOSQ ID NO:44, ili je obezbeđeno antitelo koje se vezuje za isti epitop kao anti-TIM3 antitelo koje sadrži VH sekvencu SQ ID NOSQ ID NO:51 i VL sekvencu SQ ID NOSQ ID NO:52, ili je obezbeđeno antitelo koje se vezuje za isti epitop kao anti-TIM3 antitelo koje sadrži VH sekvencu SQ ID NOSQ ID NO:59 i VL sekvencu SQ ID NOSQ ID NO:60, ili je obezbeđeno antitelo koje se vezuje za isti epitop kao anti-TIM3 antitelo koje sadrži VH sekvencu SQ ID NOSQ ID NO:67 i VL sekvencu SQ ID NOSQ ID NO:68.
U jednom poželjnom otelotvorenju, obezbeđeno je antitelo koje se vezuje za isti epitop kao anti-TIM3 antitelo koje sadrži VH sekvencu SQ ID NO:7 i VL sekvencu SQ ID NO:8.
U jednom poželjnom otelotvorenju, obezbeđeno je antitelo koje se takmiči u vezivanju za humani TIM3 sa anti-TIM3 antitelom koje sadrži VH sekvencu SQ ID NOSQ ID NO:7 i
2
VL sekvencu SQ ID NOSQ ID NO:8 (kao što je određeno u kompetitivnom testu opisanom u Primeru 4 na RPMI-8226 ćelijama (ATCC<®>CCL-155™).
U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje anti-TIM3 antitelo (npr. antitelo koje se vezuje za humani TIM3) koje sadrži
A) (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:1; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:2; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:3; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:4; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:5; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:6; ili
B) (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:1; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:2; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:3; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:11; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:5; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:6; ili
C) (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:1; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:2; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:3; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:12; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:5; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:6; ili
D) (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:13; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:14; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:15; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:16; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:17; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:18; ili
E) (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:21; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:22; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:23; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:24; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:25; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:26; ili
F) (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:29; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:30; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:31; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:32; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:33; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:34; ili
G) (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:37; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:38; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO.:39; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:40; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:41; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:42; ili
H) (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:45; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:46; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:47; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:48; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:49; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:50; ili.
I) (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:53; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:54; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:55; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:56; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:57; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:58; ili
J) (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:61; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:62; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:63; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:64; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:65; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:66.
U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje anti-TIM3 antitelo (npr. antitelo koje se vezuje za humani TIM3) koje sadrži
A) (a) VH domen koji sadrži (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:1; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:2, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SQ ID NO:3, i (b) VL domen koji sadrži (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:4; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:5, i (iii) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:6; ili
B) (a) VH domen koji sadrži (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:1; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:2, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SQ ID NO:3, i (b) VL domen koji sadrži (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:11; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:5, i (iii) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:6; ili
2
C) (a) VH domen koji sadrži (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:1; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:2, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SQ ID NO:3, i (b) VL domen koji sadrži (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:12; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:5, i (iii) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:6; ili
D) (a) VH domen koji sadrži (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:13; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:14, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SQ ID NO:15, i (b) VL domen koji sadrži (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:16; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:17, i (iii) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:18; ili
E) (a) VH domen koji sadrži (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:21; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:22, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SQ ID NO:23, i (b) VL domen koji sadrži (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:24; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:25, i (iii) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:26; ili.
F) (a) VH domen koji sadrži (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:29; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:30, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SQ ID NO:31, i (b) VL domen koji sadrži (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:32; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:33, i (iii) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:34; ili
G) (a) VH domen koji sadrži (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:37; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:38, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SQ ID NO:39, i (b) VL domen koji sadrži (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:40; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:41, i (iii) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:42; ili
H) (a) VH domen koji sadrži (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:45; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:46, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SQ ID NO:47, i (b) VL domen koji sadrži (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:48; (ii) HVR-L2 koji sadrži
2
aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:49, i (iii) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:50; ili
I) (a) VH domen koji sadrži (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:53; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:54, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SQ ID NO:55, i (b) VL domen koji sadrži (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:56; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:57, i (iii) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:58; ili
J) (a) VH domen koji sadrži (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:61; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:62, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SQ ID NO:63, i (b) VL domen koji sadrži (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:64; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:65, i (iii) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:66.
U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje anti-TIM3 antitelo (npr. antitelo koje se vezuje za humani TIM3) koje
A1)
i) sadrži VH sekvencu SQ ID NOSQ ID NO:7 i VL sekvencu SQ ID NOSQ ID NO:8; ii) sadrži VH sekvencu SQ ID NOSQ ID NO:9 i VL sekvencu SQ ID NOSQ ID NO:10; iii) ili humanizovanu varijantu VH i VL antitela pod i) ili ii);
ili A2)
i) sadrži VH sekvencu SQ ID NOSQ ID NO:79 i VL sekvencu SQ ID NOSQ ID NO:80, ili
ii) sadrži VH sekvencu SQ ID NOSQ ID NO:81 i VL sekvencu SQ ID NOSQ ID NO:82.
ili B)
i) sadrži VH sekvencu SQ ID NOSQ ID NO:19 i VL sekvencu SQ ID NOSQ ID NO:20; ii) ili humanizovanu varijantu VH i VL antitela pod i);
ili C)
i) sadrži VH sekvencu SQ ID NOSQ ID NO:27 i VL sekvencu SQ ID NOSQ ID NO:28; ii) ili humanizovanu varijantu VH i VL antitela pod i);
ili D)
i) sadrži VH sekvencu SQ ID NOSQ ID NO:35 i VL sekvencu SQ ID NOSQ ID NO:36; ii) ili humanizovanu varijantu VH i VL antitela pod i);
2
ili E)
i) sadrži VH sekvencu SQ ID NOSQ ID NO:43 i VL sekvencu SQ ID NOSQ ID NO:44; ii) ili humanizovanu varijantu VH i VL antitela pod i);
ili F)
i) sadrži VH sekvencu SQ ID NOSQ ID NO:51 i VL sekvencu SQ ID NOSQ ID NO:52; ii) ili humanizovanu varijantu VH i VL antitela pod i);
ili G1)
i) sadrži VH sekvencu SQ ID NOSQ ID NO:59 i VL sekvencu SQ ID NOSQ ID NO:60; ii) ili humanizovanu varijantu VH i VL antitela pod i);
ili G2)
i) sadrži VH sekvencu SQ ID NOSQ ID NO:83 i VL sekvencu SQ ID NOSQ ID NO:84, ili
ii) sadrži VH sekvencu SQ ID NOSQ ID NO:85 i VL sekvencu SQ ID NOSQ ID NO:86.
ili H)
i) sadrži VH sekvencu SQ ID NOSQ ID NO:67 i VL sekvencu SQ ID NOSQ ID NO:68; ii) ili humanizovanu varijantu VH i VL antitela pod i).
U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje anti-TIM3 antitelo (npr. antitelo koje se vezuje za humani TIM3) koje sadrži
A) (a) VH domen koji sadrži (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:1; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:2, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SQ ID NO:3, i (b) VL domen koji sadrži (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:4; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:5, i (iii) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:6; ili
B) (a) VH domen koji sadrži (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:1; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:2, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SQ ID NO:3, i (b) VL domen koji sadrži (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:11; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:5, i (iii) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:6; ili
C) (a) VH domen koji sadrži (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:1; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:2, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SQ ID NO:3, i (b) VL domen koji sadrži (i) HVR-
2
L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:12; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:5, i (iii) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:6; ili
D) (a) VH domen koji sadrži (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:13; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:14, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SQ ID NO:15, i (b) VL domen koji sadrži (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:16; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:17, i (iii) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:18; ili
E) (a) VH domen koji sadrži (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:21; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:22, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SQ ID NO:23, i (b) VL domen koji sadrži (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:24; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:25, i (iii) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:26; ili.
F) (a) VH domen koji sadrži (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:29; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:30, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SQ ID NO:31, i (b) VL domen koji sadrži (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:32; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:33, i (iii) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:34; ili
G) (a) VH domen koji sadrži (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:37; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:38, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SQ ID NO:39, i (b) VL domen koji sadrži (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:40; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:41, i (iii) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:42; ili
H) (a) VH domen koji sadrži (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:45; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:46, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SQ ID NO:47, i (b) VL domen koji sadrži (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:48; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:49, i (iii) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:50; ili
I) (a) VH domen koji sadrži (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID
2
NO:53; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:54, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SQ ID NO:55, i (b) VL domen koji sadrži (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:56; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:57, i (iii) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:58; ili
J) (a) VH domen koji sadrži (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:61; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:62, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SQ ID NO:63, i (b) VL domen koji sadrži (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:64; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:65, i (iii) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:66;
pri čemu je antitelo nezavisno okarakterisano sa jednim ili više sledećih svojstava: anti-TIM3 antitelo
• indukuje internalizaciju TIM3 (u FACS testu na TIM3 eksprimirajućim RPMI8226 ćelijama) od najmanje 45% nakon 120 minuta na 37 °C (vidi primer 6)
• U jednom otelotvorenju, antitelo indukuje internalizaciju TIM3 (u FACS testu na TIM3 eksprimirajućim RPMI8226 ćelijama) od najmanje 50% nakon 120 minuta na 37 °C (vidi primer 6)
• U jednom otelotvorenju, antitelo indukuje internalizaciju TIM3 (u FACS testu na TIM3 eksprimirajućim RPMI8226 ćelijama) od najmanje 55% nakon 120 minuta na 37 °C (vidi primer 6)
• U jednom otelotvorenju, antitelo indukuje internalizaciju TIM3 (u FACS testu na TIM3 eksprimirajućim RPMI8226 ćelijama) od najmanje 60% nakon 240 minuta na 37 °C (vidi primer 6)
• U jednom otelotvorenju, antitelo indukuje internalizaciju TIM3 (u FACS testu na TIM3 eksprimirajućim RPMI8226 ćelijama) od najmanje 65% nakon 240 minuta na 37 °C (vidi primer 6)
U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje anti-TIM3 antitelo (npr. antitelo koje se vezuje za humani TIM3) koje sadrži
A) (a) VH domen koji sadrži (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:1; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:2, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SQ ID NO:3, i (b) VL domen koji sadrži (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:4; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:5, i (iii) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:6; ili
B) (a) VH domen koji sadrži (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:1; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:2, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SQ ID NO:3, i (b) VL domen koji sadrži (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:11; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:5, i (iii) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:6; ili
C) (a) VH domen koji sadrži (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:1; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:2, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SQ ID NO:3, i (b) VL domen koji sadrži (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:12; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:5, i (iii) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:6; ili
D) (a) VH domen koji sadrži (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:13; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:14, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SQ ID NO:15, i (b) VL domen koji sadrži (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:16; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:17, i (iii) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:18; ili
E) (a) VH domen koji sadrži (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:21; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:22, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SQ ID NO:23, i (b) VL domen koji sadrži (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:24; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:25, i (iii) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:26; ili.
F) (a) VH domen koji sadrži (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:29; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:30, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SQ ID NO:31, i (b) VL domen koji sadrži (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:32; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:33, i (iii) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:34; ili
G) (a) VH domen koji sadrži (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:37; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:38, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SQ ID NO:39, i (b) VL domen koji sadrži (i)
1
HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:40; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:41, i (iii) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:42; ili
H) (a) VH domen koji sadrži (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:45; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:46, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SQ ID NO:47, i (b) VL domen koji sadrži (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:48; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:49, i (iii) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:50; ili
I) (a) VH domen koji sadrži (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:53; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:54, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SQ ID NO:55, i (b) VL domen koji sadrži (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:56; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:57, i (iii) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:58; ili
J) (a) VH domen koji sadrži (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:61; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:62, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SQ ID NO:63, i (b) VL domen koji sadrži (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:64; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:65, i (iii) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SQ ID NO:66;
pri čemu je antitelo nezavisno okarakterisano sa jednim ili više sledećih svojstava: anti-TIM3 antitelo
• indukuje internalizaciju TIM3 (u FACS testu na TIM3 eksprimirajućim RPMI8226 ćelijama) od najmanje 45% nakon 120 minuta na 37 °C (vidi primer 6)
• U jednom otelotvorenju, antitelo indukuje internalizaciju TIM3 (u FACS testu na TIM3 eksprimirajućim RPMI8226 ćelijama) od najmanje 50% nakon 120 minuta na 37 °C (vidi primer 6)
• U jednom otelotvorenju, antitelo indukuje internalizaciju TIM3 (u FACS testu na TIM3 eksprimirajućim RPMI8226 ćelijama) od najmanje 55% nakon 120 minuta na 37 °C (vidi primer 6)
• U jednom otelotvorenju, antitelo indukuje internalizaciju TIM3 (u FACS testu na TIM3 eksprimirajućim RPMI8226 ćelijama) od najmanje 60% nakon 240 minuta na 37 °C (vidi primer 6)
2
• U jednom otelotvorenju, antitelo indukuje internalizaciju TIM3 (u FACS testu na TIM3 eksprimirajućim RPMI8226 ćelijama) od najmanje 65% nakon 240 minuta na 37 °C (vidi primer 6)
• takmiči se u vezivanju za TIM3 sa anti-Tim3 antitelom koje sadrži VH SQ ID NO:7 i VL SQ ID NO:8.
• vezuje se za TIM3 ljudi i cinomolgusa
• kao imunokonjugat pokazuje citotoksičnu aktivnost na TIM3 eksprimirajućim ćelijama (u jednom otelotvorenju, imunokonjugati imaju relativnu IC50 vrednost citotoksične aktivnosti kao pseudomonas egzotoksin A konjugat na ćelijama RPMI-8226 od 0,1 ili manju (kao što je mereno u primeru 11)
• indukuje oslobađanje interferona-gama (u testu mešane limfocitne reakcije (MLR) kao što je opisano u primeru 5.
U daljem aspektu pronalaska, anti-TIM3 antitelo prema bilo kom od gornjih otelotvorenja je monoklonsko antitelo, uključujući himerno, humanizovano ili humano antitelo. U jednom otelotvorenju, anti-TIM3 antitelo je fragment antitela, npr. Fv, Fab, Fab’, scFv, dijatelo, ili F(ab’)2fragment. U drugom otelotvorenju, antitelo je antitelo kompletne dužine, npr. netaknuto IgG1 ili IgG4 antitelo ili druga klasa ili izotip antitela kao što je ovde definisano.
U daljem aspektu, anti-TIM3 antitelo prema bilo kom od gornjih otelotvorenja može da uključi bilo koju karakteristiku, samu ili u kombinaciji, kao što je opisano u poglavljima 1-7 u nastavku:
1. Afinitet antitela
U nekim otelotvorenjima, ovde dato antitelo ima konstantu disocijacije Kd od ≤1 μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0,1 nM, ≤ 0,01 nM, ili ≤ 0,001 nM (npr.10<-8>M ili manje, npr. od 10<-8>M do 10<-13>M, npr. od 10<-9>M do 10<-13>M).
U jednom poželjnom otelotvorenju, KD se meri korišćenjem testa površinske plazmonske rezonance pomoću BIACORE<®)>) na 25 °C sa imobilizovanim čipovima antigena CM5 na ~10 jedinica odgovora (RU). Ukratko, biosenzorski čipovi sa karboksimetilovanim dekstranom (CM5, BIACORE, Inc.) aktivirani su pomoću N-etil-N’-(3-dimetilaminopropil)-karbodiimid hidrohlorida (EDC) i N-hidroksisukcinimida (NHS) prema uputstvu dobavljača. Antigen je razblažen pomoću 10 mM natrijum acetata, pH 4,8, do 5 μg/ml (~ 0,2 μM) pre injektovanja pri protoku od 5 μl/min da bi se dobilo oko 10 jedinica odgovora (RU) kuplovanog proteina. Nakon injektovanja antigena, injektovan je 1 M etanolamin da blokira neproreagovale grupe. Za merenja kinetike, injektovane su dvostruke serije razblaženja Fab (0,78 nM do 500 nM) u PBS-u sa 0,05% polisorbata 20 (TWEEN-20™) surfaktanta (PBST) na 25°C pri protoku od oko 25 μl/min. Brzine asocijacije (konili ka) i brzine disocijacije (koffili kd) izračunate su pomoću jednostavnog jedan-na-jedan Lengmirovog modela vezivanja (BIACORE<®>softver za procenu. verzija 3.2) simultanim podešavanjem senzorgrama asocijacije i disocijacije. Ravnotežna konstanta disocijacije KD je izračunata kao odnos kd/ka (koff/kon.) Vidi, npr. Chen, Y. i sar. J. Mol. Biol.293 (1999) 865-881. Ako brzina asocijacije pređe 10<6>M<-1>s<-1>prema gore opisanom testu površinske plazmonske rezonance, onda brzina asocijacije može da se odredi primenom tehnike fluorescentnog prigušivanja, koja meri porast ili opadanje intenziteta fluorescentne emisije (ekscitacija = 295 nm; emisija = 340 nm, 16 nm širina trake) na 25°C kod 20 nM anti-antigen antitela (Fab oblik) u PBS-u, pH 7,2, u prisustvu rastućih koncentracija antigena, određeno spektrometrom, kao što je spektrofotometar sa mogućnošću zaustavljanja toka (Aviv Instruments) ili spektrofotometar serije 8000 SLM-AMINCO™ (ThermoSpectronic) sa kivetom sa mešanjem.
2. Fragmenti antitela
U određenim otelotvorenjima, antitelo iz ovog dokumenta je fragment antitela. Fragmenti antitela uključuju, ali nisu ograničeni na, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv i scFv fragmente i druge fragmente opisane u nastavku. Pregled određenih fragmenata antitela vidi u Hudson, P.J. i sar., Nat. Med. 9 (2003) 129-134. Za pregled scFv fragmenata, vidi npr. Plueckthun, A., u; The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol.113, Rosenburg i Moore (izd.), Springer-Verlag, New York, str. 269-315 (1994); vidi takođe WO 93/16185; i U.S. Patent br.5,571,894 i 5,587,458. Raspravu o Fab i F(ab')2fragmentima koji sadrže regenerisane ostatke receptorski vezujućih epitopa i koji imaju produžen poluživot in vivo pogledajte u U.S. Patentu br.5,869,046.
Dijatela su fragmenti antitela sa dva mesta za vezivanje antigena koja mogu biti dvovalentna ili bispecifična. Vidi, npr., EP 0404 097; WO 1993/01161; Hudson, P.J. i sar., Nat. Med.9 (2003) 129-134; i Holliger, P. i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448. Trijatela i tetratela su takođe opisana u radu Hudson, P.J. i sar., Nat. Med.9 (20039129-134).
Antitela sa jednim domenom su fragmenti antitela koji sadrže kompletan varijabilni domen teškog lanca antitela ili njegov deo, ili kompletan varijabilni domen lakog lanca antitela ili njegov deo. U pojedinim otelotvorenjima, antitelo sa jednim domenom je humano antitelo sa jednim domenom (Domantis, Inc., Waltham, MA; vidi, npr. U.S. Patent br.6,248,516 B1).
Fragmenti antitela mogu se dobiti različitim tehnikama, uključujući, ali se ne ograničavajući na proteolitičku digestiju netaknutog antitela, kao i proizvodnju pomoću
4
rekombinantnih ćelija domaćina (npr. E. coli ili faga), kao što je ovde opisano.
3. Himerna i humanizovana antitela
U pojedinim otelotvorenjima, ovde dato antitelo je himerno antitelo. Pojedina himerna antitela opisuje, npr. U.S. Patent br. 4,816,567; kao i Morrison, S.L. i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855). U jednom primeru, himerno antitelo sadrži ne-humani varijabilni region (npr. varijabilni region dobijen od miša, pacova, hrčka, zeca ili ne-humanog primata, kao što je majmun) i humani konstantni region. U daljem primeru, himerno antitelo je antitelo „sa zamenjenom klasom”, kod koga je klasa ili potklasa zamenjena klasom ili potklasom matičnog antitela. Himerna antitela uključuju njihove antigen-vezujuće fragmente.
U određenim otelotvorenjima, himerno antitelo je humanizovano antitelo. Tipično, nehumano antitelo je humanizovano da bi se smanjila imunogenost za ljude, pri čemu zadržava specifičnost i afinitet matičnog ne-humanog antitela. Generalno, humanizovano antitelo sadrži jedan ili više varijabilnih domena kod kojih su HVR-ovi, npr. CDR-ovi (ili njihovi delovi) dobijeni od ne-humanog antitela, a FR-ovi (ili njihovi delovi) su dobijeni od sekvenci humanog antitela. Humanizovano antitelo opciono takođe sadrži najmanje deo humanog konstantnog regiona. U nekim primerima izvođenja, neki FR ostaci u humanizovanom antitelu su supstituisani odgovarajućim ostacima ne-humanog antitela (npr. antitela sa koga su dobijeni HVR ostaci), npr. da bi se povratila ili poboljšala specifičnost antitela ili njegov afinitet.
Pregled humanizovanih antitela i postupaka za njihovu pripremu daju, npr. Almagro, J.C. i Fransson, J., Front. Biosci.13 (2008) 1619-1633, a dalje ih opisuju, npr. Riechmann, I. i sar. Nature 332 (1988) 323-329; Queen, C. i sar. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033; US Patent br. 5, 821,337, 7,527,791, 6,982,321, i 7,087,409; Kashmiri, S.V. i sar., Methods 36 (2005) 25-34 (opisujući SDR (a-CDR) grafting); Padlan, E.A., Mol. Immunol.28 (1991) 489-498 (opisuje „preuređivanje površine”); Dall’Acqua, W.F. i sar. Methods 36 (2005) 43-60 (opisuje „mešanje FR”); i Osbourn, J. i sar. Methods 36 (2005) 61-68; i Klimka, A. i sar Br. J. Cancer 83 (2000) 252-260 (opisuje pristup „vođene selekcije” kod mešanja FR).
Humani regioni okvira koji se mogu upotrebiti za humanizaciju uključuju, bez ograničenja: regione okvira izabrane pomoću postupka „najboljeg slaganja” (vidi, npr. Sims, M.J. i sar. J. Immunol.151 (1993) 2296-2308; regione okvira dobijene iz sekvence konsenzusa humanih antitela konkretne podgrupe varijabilnih regiona lakog ili teškog lanca (vidi, npr. Carter, P. i sar. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; i Presta, L.G. i sar. J. Immunol. 151 (1993) 2623-2632); humane zrele (somatski mutirane) regione okvira ili regione okvira humane germinativne linije (vidi, npr. Almagro, J.C. i Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633); i regione okvira dobijene skriningom biblioteka FR (vidi, npr. Baca, M. i sar. J. Biol. Chem. 272 (1997) 10678-10684 i Rosok, M.J. i sar. J. Biol. Chem. 271 (19969 22611-22618).
4. Humana antitela
U pojedinim otelotvorenjima, ovde dato antitelo je humano antitelo. Humana antitela mogu se dobiti primenom različitih tehnika poznatih u struci. Humana antitela su generalno opisali van Dijk, M.A. i van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-374 i Lonberg, N., Curr. Opin. Immunol.20 (2008) 450-459.
Humana antitela se mogu dobiti primenom imunogena na transgenu životinju koja je modifikovana da proizvodi netaknuta humana antitela ili netaknuta antitela sa humanim varijabilnim regionima kao odgovor na antigenski izazov. Takve životinje tipično sadrže kompletne lokuse humanog imunoglobulina ili njihov deo, koji zamenjuju lokuse endogenog imunoglobulina, ili koji su prisutni ekstrahromozomski ili nasumično integrisani u životinjske hromozome. U takvim transgenim miševima, lokusi endogenog imunoglobulina su generalno inaktivirani. Pogledajte pregled postupaka za dobijanje humanih antitela od transgenih životinja u: Lonberg, N., Nat. Biotech. 23 (2005) 1117-1125. Pogledajte takođe, npr. U.S. Patent br. 6,075,181 i 6,150,584 koji opisuju tehnologiju XENOMOUSE™; U.S. Patent br.
5,770,429 koji opisuje tehnologiju HUMAB®; U.S. Patent br. 7,041,870 koji opisuje tehnologiju K-M MOUSE®, i U.S. Patent Application Publication br. US 2007/0061900, koja opisuje tehnologiju VELOCIMOUSE®). Humani varijabilni regioni netaknutih antitela koja stvaraju takve životinje mogu se dalje modifikovati, npr. kombinovanjem sa različitim humanim konstantnim regionom.
Humana antitela mogu se takođe dobiti postupcima na bazi hibridoma. Opisane su ćelijske linije humanog mijeloma i mišje-humanog heteromijeloma za proizvodnju humanih monoklonskih antitela. (Vidi, npr., Kozbor, D., J. Immunol. 133 (1984) 3001-3005; Brodeur, B.R. i sar., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York (1987), str.51-63; i Boerner, P. i sar., J. Immunol. 147 (1991) 86-95) Humana antitela koja su generisana tehnologijom humanog B-ćelijskog hibridoma, takođe su opisana u Li, J. i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 (2006) 3557-3562. Dodatni postupci uključuju one opisane, na primer, u U.S. Patentu br.7,189,826 (opisuje proizvodnju monoklonskih humanih IgM antitela iz ćelijskih linija hibridoma) i Ni, J., Xiandai Mianyixue 26 (2006) 265-268 (opisuje humano-humane hibridome). Tehnologija humanih hibridoma (tehnologija trioma) je takođe opisana u Vollmers, H.P. i Brandlein, S., Histology and Histopathology 20 (2005) 927-937 i Vollmers, H.P. i Brandlein, S., Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27 (2005) 185-191.
Humana antitela takođe mogu da se proizvedu izolovanjem sekvenci varijabilnog domena Fv klona izabranih iz biblioteka displeja faga humanog porekla. Takve sekvence varijabilnog domena mogu onda da se kombinuju sa željenim humanim konstantnim domenom. Tehnike za izbor humanih antitela iz biblioteka antitela su opisane u nastavku.
5. Antitela dobijena iz biblioteke
Antitela iz predmetnog pronalaska mogu da se izoluju pretraživanjem kombinatornih biblioteka u potrazi za antitelima sa željenom aktivnošću ili aktivnostima. Na primer, veliki broj postupaka je poznat u struci za stvaranje biblioteka displeja faga i pretraživanje takvih biblioteka za antitela koja imaju željene karakteristike vezivanja. Pregled takvih metoda dat je, npr. u Hoogenboom, H.R. i sar. Methods in Molecular Biology 178 (2001) 1-37 i dalje su opisane, npr. u McCafferty, J. i sar. Nature 348 (1990) 552-554; Clackson, T. i sar. Nature 352 (1991) 624-628; Marks, J.D. i sar. J. Mol. Biol.222 (1992) 581-597; Marks, J.D. i Bradbury, A., Methods in Molecular Biology 248 (2003) 161-175; Sidhu, S.S. i sar. J. Mol. Biol. 338 (2004) 299-310; Lee, C.V. i sar. J. Mol. Biol. 340 (2004) 1073-1093; Fellouse, F.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (2004) 12467-12472; i Lee, C.V. i sar. J. Immunol. Methods 284 (2004) 119-132.
Kod pojedinih postupaka displeja faga, repertoari VH i VL gena su odvojeno klonirani putem lančane reakcije polimeraze (PCR), i nasumično rekombinovani u biblioteke faga, koje zatim mogu da se pretražuju za antigen-vezujuće fage, kao što opisuju Winter G. i sar, Ann. Rev. Immunol., 12 (1994) 433-455. Fagi tipično vrše displej fragmenata antitela, bilo kao Fv (scFv) fragmenti s jednim lancem ili kao Fab fragmenti. Biblioteke iz imunizovanih izvora daju antitela velikog afiniteta prema imunogenu, ne zahtevajući konstruisanje hibridoma. Alternativno, naivni repertoar može biti kloniran (npr. od ljudi) da bi se obezbedio jedan izvor antitela za širok opseg nesvojstvenih, kao i svojstvenih antigena bez ikakve imunizacije, kao što opisuju Griffiths, A.D. i sar. EMBO J.12 (1993) 725-734. Najzad, naivne biblioteke mogu takođe da se naprave sintetički, kloniranjem nepreuređenih segmenata V-gena iz matičnih ćelija, i upotrebom PCR prajmera koji sadrže nasumične sekvence za kodiranje veoma varijabilnih CDR3 regiona, i za postizanje premeštanja in vitro, kao što opisuju Hoogenboom, H.R. i Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388. Patentne publikacije koje opisuju biblioteke faga humanih antitela uključuju, na primer: US Patent br. 5,750,373, i US Patent Publication br. 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 i 2009/0002360.
Antitela ili fragmenti antitela izolovani iz biblioteka humanih antitela se ovde smatraju humanim antitelima ili fragmentima humanih antitela.
6. Multispecifična antitela
U pojedinim otelotvorenjima, ovde dato antitelo je multispecifično antitelo, npr. bispecifično antitelo. Multispecifična antitela su monoklonska antitela koja imaju sposobnost specifičnog vezivanja za najmanje dva različita mesta. U određenim otelotvorenjima, jedna od specifičnosti vezivanja je za TIM3 i druga je za bilo koji drugi antigen. U određenim otelotvorenjima, bispecifična antitela mogu da se vežu za dva različita epitopa TIM3. Bispecifična antitela mogu takođe da se upotrebe za lokalizaciju citotoksičnih agenasa na ćelije koje eksprimiraju TIM3. Bispecifična antitela mogu da se dobiju kao antitela kompletne dužine ili kao fragmenti antitela.
Tehnike za dobijanje multispecifičnih antitela uključuju, ali nisu ograničene na, rekombinantnu koekspresiju dva imunoglobulinska para teški lanac-laki lanac sa različitim specifičnostima (vidi Milstein, C. i Cuello, A.C., Nature 305 (1983) 537-540, WO 93/08829, i Traunecker, A. i sar. EMBO J. 10 (1991) 3655-3659), i inženjerstvo „dugme u rupici“ (vidi, npr. U.S. Patent br.5,731,168). Multispecifična antitela se takođe mogu dobiti dizajniranjem pomoću efekata elektrostatičkog upravljanja, za dobijanje Fc-heterodimernih molekula antitela (WO 2009/089004); biokonjugacijom dva ili više antitela ili fragmenata (vidi, npr. U.S. Patent br. 4,676,980, i Brennan, M. i sar. Science 229 (1985) 81-83); primenom leucinskih zatvarača za proizvodnju bispecifičnih antitela (vidi, npr. Kostelny, S.A. i sar. J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553; primenom tehnologije „dijatela“ za dobijanje fragmenata bispecifičnih antitela (vidi, npr. Holliger, P. i sar. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448); i primenom jednolančanih Fv (scFv) dimera (vidi, npr. Gruber, M i sar. J. Immunol. 152 (1994) 5368-5374); i pripremom trispecifičnih antitela kao što opisuju, npr., Tutt, A. i sar. J. Immunol. 147 (1991) 60-69).
Ovde su takođe obuhvaćena dizajnirana antitela sa tri ili više funkcionalnih mesta vezivanja antigena, uključujući „antitela hobotnice“ (vidi, npr. US 2006/0025576).
Ovde antitelo ili fragment takođe uključuje „dvojno delujuće Fab” ili „DAF”, koje sadrži mesto vezivanja antigena koji se vezuje za TIM3as, kao i drugi, različit antigen (pogledajte, na primer US 2008/0069820).
Ovde dato antitelo ili njegov fragment takođe obuhvata multispecifična antitela opisana u WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080253, WO 2009/080254, WO 2010/112193, WO 2010/115589, WO 2010/136172, WO 2010/145792, and WO 2010/145793, WO2011/117330, WO2012/025525, WO2012/025530, WO2013/026835, WO2013/026831, WO2013/164325, ili WO 2013/174873.
7. Varijante antitela
U pojedinim otelotvorenjima, razmatrane su varijante aminokiselinskih sekvenci antitela koja su ovde data. Na primer, može biti poželjno da se poboljša afinitet vezivanja i/ili druga biološka svojstva antitela. Varijante aminokiselinskih sekvenci antitela se mogu dobiti uvođenjem odgovarajućih modifikacija u sekvencu nukleotida koja kodira antitelo ili putem sinteze peptida. Takve modifikacije uključuju, na primer, uklanjanja, i/ili umetanja, i/ili supstitucije ostataka u aminokiselinskim sekvencama antitela. Svaka kombinacija izbacivanja, ubacivanja i supstitucije može se načiniti da se dođe do finalnog konstrukta, pod uslovom da finalni konstrukt ima željene karakteristike, npr. antigen-vezujuće.
a) Varijante supstitucije, ubacivanja i izbacivanja
U pojedinim otelotvorenjima, date su varijante antitela koja imaju jednu ili više supstitucija aminokiselina. Mesta od interesa za supstitucionu mutagenezu uključuju HVR-ove i FR-ove. Primeri za promene su dati u Tabeli 1 pod naslovom „primeri supstitucija”, i kako je opisano u nastavku, prema klasama bočnih nizova aminokiselina. Konzervativne supstitucije su prikazane u Tabeli 1 pod naslovom „poželjne supstitucije”. Supstitucije aminokiselina mogu biti uvedene u željeno antitelo i proizvodi ispitani na željenu aktivnost, npr. zadržano/poboljšano vezivanje antigena, smanjena imunogenost, ili poboljšan ADCC ili CDC.
TABELA 1
Aminokiseline mogu da se grupišu prema zajedničkim osobinama bočnog niza: (1) hidrofobne: Norleucin, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) neutralne hidrofilne: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) kisele: Asp, Glu;
(4) bazne: His, Lys, Arg;
(5) ostaci koji utiču na orijentaciju niza: Gly, Pro;
(6) aromatične: Trp, Tyr, Phe.
4
Nekonzervativne supstitucije zahtevaju izmenu člana jedne od ovih klasa drugom klasom.
Jedna vrsta supstitucionih varijanti uključuje supstituciju jednog ili više ostataka hipervarijabilnog regiona matičnog antitela (npr. humanizovanog ili humanog antitela). Generalno, rezultujuće varijante izabrane za dalje ispitivanje će imati modifikacije (npr. poboljšanja) izvesnih bioloških osobina (npr. povećan afinitet, smanjenu imunogenost) u odnosu na matično antitelo i/ili će imati suštinski zadržane izvesne biološke osobine matičnog antitela. Primer supstitucione varijante je afinitetno zrelo antitelo, koje može biti stvoreno na pogodan način, npr. korišćenjem tehnika afinitetnog sazrevanja na osnovu displeja faga, kao što su one ovde opisane. Ukratko, jedan ili više HVR ostataka je mutiran, i varijantna antitela su izložena na fagu i ispitana u pogledu određene biološke aktivnosti (npr. afiniteta vezivanja).
Izmene (npr. supstitucije) mogu se napraviti u HVR-ima, npr. radi poboljšanja afiniteta antitela. Takve izmene mogu se napraviti na "žarištima" HVR, tj. ostacima kodiranim kodonima koji trpe mutaciju sa visokom učestalošću tokom procesa somatskog sazrevanja (vidi, npr. Chowdhury, P.S., Methods Mol. Biol.207 (2008) 179-196), i/ili SDR-ima (a-CDR-ovi), pri čemu se dobijene varijante VH ili VL ispituju na afinitet vezivanja. Afinitetno sazrevanje putem konstruisanja i ponovnog izbora iz sekundarnih biblioteka su opisali, npr. Hoogenboom, H.R. i sar. u Methods in Molecular Biology 178 (2002) 1-37. U nekim otelotvorenjima afinitetnog sazrevanja, raznovrsnost se uvodi u varijabilne gene izabrane za sazrevanje putem bilo kojeg od raznovrsnih postupaka (npr. PCR koji favorizuje greške, mešanje lanaca ili mutageneza kontrolisana oligonukleotidima). Zatim se kreira sekundarna biblioteka. Biblioteka se zatim pretražuje radi identifikovanja varijanti antitela sa željenim afinitetom. Drugi postupak za uvođenje raznovrsnosti uključuje pristup usmeren na HVR, gde je nekoliko HVR ostataka randomizovano (npr. 4-6 ostataka istovremeno). HVR ostaci uključeni u vezivanje antigena mogu biti specifično identifikovani, npr. primenom skenirajuće mutageneze alaninom ili modelovanja. Posebno su često cilj CDR-H3 i CDR-L3.
U pojedinim otelotvorenjima, supstitucije, ubacivanja ili izbacivanja mogu se desiti u jednom ili više HVR-ova, dokle god takve izmene znatno ne smanje sposobnost antitela da vezuje antigen. Na primer, konzervativne izmene (npr. konzervativne supstitucije kao što su ovde date) koje ne smanjuju znatno afinitet vezivanja mogu se načiniti u HVR-ima. Takve izmene mogu biti izvan HVR „vrućih tačaka“ ili SDR-ova. U pojedinim otelotvorenjima varijanti VH i VL sekvenci datih iznad, svaki HVR je ili neizmenjen, ili sadrži najviše jednu, dve ili tri supstitucije aminokiselina.
Korisni postupak za identifikovanje ostataka ili regiona antitela koji mogu biti ciljani za mutagenezu se zove „skenirajuća mutageneza sa alaninom”, i opisali su je Cunningham, B.C. i Wells, J.A., Science 244 (1989) 1081-1085. U tom postupku, ostatak ili grupa ciljanih ostataka (npr. naelektrisani ostaci, kao što su arg, asp, his, lys i glu) se identifikuju i zamene neutralnom ili negativno naelektrisanom aminokiselinom (npr. alaninom ili polialaninom) da bi se odredilo da li to utiče na interakciju antitela sa antigenom. Dalje supstitucije mogu biti uvedene na lokacijama aminokiselina koje pokazuju funkcionalnu osetljivost na inicijalne supstitucije. Umesto toga, ili pored toga, kristalna struktura kompleksa antigen-antitelo služi za identifikovanje tačaka kontakta antitela sa antigenom. Takvi kontaktni ostaci i susedni ostaci mogu biti ciljani, ili eliminisani kao kandidati za supstituciju. Mogu se pregledati varijante da bi se odredilo da li imaju željena svojstva.
Ubacivanja aminokiselinskih sekvenci uključuju fuzije amino- i/ili karboksi-kraja, pri čemu se dužina kreće od jednog ostatka do polipeptida koji sadrže stotine ostataka ili više, kao i ubacivanja u sekvencu jednog ostatka aminokiselina, ili većeg broja. Primeri terminalnih umetanja uključuju antitelo sa N-terminalnim metionil ostatkom. Druge varijante ubacivanja kod molekula antitela uključuju fuziju sa N− ili C− krajem antitela sa enzimom (npr. za ADEPT) ili polipeptidom, što povećava poluživot antitela u serumu.
b) Varijante Fc regiona
U određenim otelotvorenjima, jedna ili više modifikacija aminokiselina može biti uvedena u Fc region antitela iz ovog dokumenta, time stvarajući varijantu Fc regiona. Varijanta Fc regiona može da sadrži sekvencu humanog Fc regiona (npr. Fc region humanog IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4) koji sadrži modifikaciju aminokiseline (npr. supstituciju) na jednom ili više aminokiselinskih mesta.
Antitela sa redukovanom efektorskom funkcijom uključuju ona sa supstitucijom jednog ili više ostataka Fc regiona 238, 265, 269, 270, 297, 327 i 329 (U.S. Patent br. 6,737,056). Takvi Fc mutanti uključuju Fc mutante sa supstitucijama na dva ili više položaja aminokiselina 265, 269, 270, 297 i 327, uključujući takozvani „DANA” Fc mutant sa supstitucijom ostataka 265 i 297 alaninom (US Patent br.7,332,581).
Opisane su pojedine varijante antitela sa poboljšanim ili smanjenim vezivanjem za FcR. (Vidi, npr. U.S. Patent br. 6,737,056; WO 2004/056312 i Shields, R.L. i sar., J. Biol. Chem.
276(2001): 6591-6604).
U jednom otelotvorenju pronalaska, takvo antitelo je IgG1 sa mutacijama L234A i L235A ili sa mutacijama L234A, L235A i P329G. U drugom otelotvorenju, ili IgG4 sa mutacijama S228P i L235E ili S228P, L235E ili i P329G (numerisanje prema EU indeksu Kabata i sar., Kabat i sar., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd. ublic Health Service, National Institutes of Health (Javna zdravstvena služba, Nacionalni institut za zdravlje), Bethesda, MD, 1991).
Antitela sa produženim poluživotom i poboljšanim vezivanjem za neonatalni Fc receptor (FcRn), koji je odgovoran za transfer IgG majke na fetus (Guyer, R.L. i sar. J. Immunol. 117 (1976) 587-593, i Kim, J.K. i sar. J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434), opisana su u US 2005/0014934. Ta antitela sadrže Fc region sa jednom supstitucijom ili više supstitucija koje poboljšavaju vezivanje Fc regiona za FcRn. Takve Fc varijante uključuju one sa supstitucijom na jednom ostatku ili više ostataka Fc regiona: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 ili 434, npr. supstitucija ostatka Fc regiona 434 (US Patent br.7,371,826).
Vidi i Duncan, A.R. i Winter, G., Nature 322 (1988) 738-740; US 5,648,260; US 5,624,821; i WO 94/29351 za druge primere varijanti Fc-regiona.
c) Varijante antitela projektovane sa cisteinom
U pojedinim otelotvorenjima, može biti poželjno da se naprave antitela projektovana sa cisteinom, npr. „tioMAb“, kod kojih je jedan ili više ostataka antitela zamenjeno ostacima cisteina. U naročitim otelotvorenjima, supstituisani ostaci se nalaze na pristupačnim mestima na antitelu. Supstitucijom tih ostataka cisteinom, reaktivne tiolske grupe se time postavljaju na pristupačna mesta na antitelu, i mogu se koristiti za konjugovanje antitela sa drugim funkcionalnim ostacima, kao što su funkcionalni ostaci lekova ili funkcionalni ostaci linkerlek, da bi se dobio imunokonjugat, kao što je u nastavku opisano. U pojedinim otelotvorenjima, bilo koji, ili više ostataka navedenih u nastavku mogu biti supstituisani cisteinom: V205 (Kabatova numeracija) lakog lanca; A118 (EU numeracija) teškog lanca; i S400 (EU numeracija) teškog lanca Fc regiona. Antitela projektovana sa cisteinom mogu se dobiti kao što je opisano, npr. u U.S. Patentu br.7,521,541.
d) Derivati antitela
U pojedinim otelotvorenjima, ovde dato antitelo može se dalje modifikovati da sadrži dodatne neproteinske funkcionalne ostatke koji su poznati u struci i koji su dostupni. Funkcionalni ostaci pogodni za derivatizaciju antitela uključuju, bez ograničenja, hidrosolubilne polimere. Neograničavajući primeri hidrosolubilnih polimera uključuju, ali nisu ograničeni na polietilen glikol (PEG), kopolimere etilen glikol/propilen glikol, karboksimetilcelulozu, dekstran, polivinil alkohol, polivinil pirolidon, poli-1,3-dioksolan, poli-1,3,6-trioksan, kopolimer etilen/anhidrid maleinske kiseline, poliaminokiseline (homopolimere ili nasumične kopolimere), i dekstran ili poli(n-vinil pirolidon)polietilen glikol, homopolimere propropilen glikola, kopolimere polipropilen oksid/etilen oksid,
4
polioksietilovane poliole (npr. glicerol), polivinil alkohol, i njihove smeše. Polietilen glikol propionaldehid može imati prednosti u proizvodnji zbog svoje stabilnosti u vodi. Polimer može imati bilo koju molekulsku masu, a može biti razgranat ili sa ravnim nizom. Broj polimera vezanih za antitelo može da varira i, ako je više od jednog polimera vezano, to mogu biti isti ili različiti molekuli. U suštini, broj i/ili vrsta polimera korišćenih za derivatizaciju može se odrediti na osnovu razmatranja, uključujući, bez ograničenja, naročite osobine ili funkcije antitela koje treba poboljšati i da li će derivat antitela biti korišćen u terapiji pod definisanim uslovima, itd.
U drugom otelotvorenju, dati su konjugati antitela i neproteinskog ostatka koji mogu selektivno da se zagrevaju izlaganjem radijaciji. U jednom otelotvorenju, neproteinski deo je ugljenična nanocevčica (Kam, N.W. i sar. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605). Radijacija može biti na bilo kojoj talasnoj dužini, i uključuje, ali nije ograničena na talasne dužine koje ne oštećuju obične ćelije, ali koje zagrevaju neproteinski ostatak na temperaturu na kojoj ćelije u blizini neproteinskog ostatka antitela bivaju ubijene.
B. Rekombinantni postupci i smeše
Antitela se mogu proizvesti korišćenjem rekombinantnih postupaka i smeša, npr., kako je opisano u U.S. Patentu br. 4,816,567. U jednom otelotvorenju, obezbeđena je izolovana nukleinska kiselina koja kodira anti-TIM3 antitelo iz ovog dokumenta. Takva nukleinska kiselina može kodirati aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VL i/ili aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VH antitela (npr. lake i/ili teške lance antitela). U sledećem otelotvorenju obezbeđen je jedan ili više vektora (npr., ekspresionih vektora) koji sadrže takvu nukleinsku kiselinu. U daljem otelotvorenju, obezbeđena je ćelija domaćin koja sadrži takvu nukleinsku kiselinu. U jednom takvom otelotvorenju, ćelija domaćin sadrži (npr., transformisana je sa): (1) vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VL antitela, i aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VH antitela, ili (2) prvi vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VL antitela, i drugi vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VH antitela. U jednom otelotvorenju, ćelija domaćin je eukariotska, npr. ćelija jajnika kineskog hrčka (CHO) ili limfoidna ćelija (npr., Y0, NS0, Sp20 ćelija). U jednom otelotvorenju, obezbeđen je postupak za proizvodnju anti-TIM3 antitela, pri čemu postupak obuhvata uzgajanje ćelije domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira antitelo, kako je dato gore, u uslovima koji su pogodni za ekspresiju antitela i, eventualno, izolovanje antitela iz ćelije domaćina (ili medijuma za uzgajanje ćelija domaćina).
Za rekombinantnu proizvodnju anti-TIM3 antitela, nukleinska kiselina koja kodira antitelo, npr. kako je gore opisano, izoluje se i ubacuje u jedan ili više vektora radi daljeg kloniranja i/ili ekspresije u ćeliji domaćina. Takva nukleinska kiselina može biti lako izolovana i sekvencirana korišćenjem klasičnih postupaka (npr. korišćenjem oligonukleotidnih sondi koje mogu selektivno da se vežu za gene koji kodiraju teške i lake lance antitela).
Pogodne ćelije domaćini za kloniranje ili ekspresiju vektora koji kodiraju antitelo uključuju prokariotske ili eukariotske ćelije, ovde opisane. Na primer, antitela se mogu proizvesti u bakteriji, naročito kada nije neophodna glikozilacija niti Fc efektorska funkcija. Za ekspresiju fragmenata antitela i polipeptida u bakterijama, vidi npr. US 5,648,237, US 5,789,199 i US 5,840,523. (Vidi takođe Charlton, KA, u: Methods in Molecular Biology, Vol.
248, Lo, B.K.C. (izd.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), str.245-254, koji opisuje ekspresiju fragmenata antitela u E. coli.) Nakon ekspresije, antitelo može da se izoluje iz paste bakterijskih ćelija u rastvorljivoj frakciji, i može dalje da se prečišćava.
Osim prokariota, eukariotski mikrobi, kao što su filamentozne gljivice ili kvasci, pogodni su domaćini za kloniranje ili ekspresiju vektora koji kodiraju antitelo, uključujući sojeve gljivica i kvasaca čiji su putevi glikozilacije „humanizovani”, što dovodi do proizvodnje antitela sa delimično ili potpuno humanim obrascem glikozilacije. Vidi Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414; i Li, H. i sar. Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215.
Pogodne ćelije domaćini za ekspresiju glikozilovanog antitela, isto tako, izvedene su od višećelijskih organizama (beskičmenjaka i kičmenjaka). Primeri ćelija beskičmenjaka uključuju ćelije biljaka i insekata. Identifikovani su brojni sojevi bakulovirusa koji mogu da se koriste zajedno sa ćelijama insekata, naročito za transfekciju ćelija Spodoptera frugiperda.
Kulture biljnih ćelija se, takođe, mogu koristiti kao domaćini. Pogledajte, npr. US Patente br. 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978, i 6,417,429 (opisuju PLANTIBODIES™ tehnologiju za proizvodnju antitela u transgenim biljkama).
Ćelije kičmenjaka se, isto tako, mogu upotrebiti kao domaćini. Na primer, mogu se koristiti ćelijske linije sisara koje su adaptirane za rast u suspenziji. Drugi primeri korisnih ćelijskih linija domaćina sisara su CV1 linije bubrega majmuna transformisane pomoću SV40 (COS-7); humane embrionske linije bubrega (ćelije 293 ili 293, kao što je opisano u npr. Graham, F.L. i sar. J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74), ćelije bubrega mladunca hrčka (BHK), Sertolijeve ćelije miša (TM4 ćelije kao što je opisano u npr. Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252), ćelije bubrega majmuna (CV1), ćelije burega afričkog zelenog majmuna (VERO-76), humane ćelije cervikalnog karcinoma (HELA), ćelije bubrega psa (MDCK, ćelije jetre pacova (BRL 3A), humane ćelije pluća (W138), humane ćelije jetre (Hep G2), tumorske ćelije mlečne žlezde miša (MMT 060562), TRI ćelije, kao što je opisano u npr. Mather, J.P. i
4
sar. Annals N.Y. Acad. Sci.383 (1982) 44-68; MRC 5 ćelije i FS4 ćelije. Ostale korisne ćelijske linije domaćina sisara uključuju ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO), uključujući DHFR<->CHO ćelije (Urlaub, G. i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220); i ćelijske linije mijeloma, kao što su Y0, NS0 i Sp2/0. Radi pregleda izvesnih ćelijskih linija domaćina sisara, pogodnih za proizvodnju antitela, vidi, npr. Yazaki, P. i Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol.248, Lo, B.K.C. (izd.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), str.255-268.
C. Testovi
Anti-TIM3 antitela iz ovog dokumenta mogu se identifikovati, pretražiti ili okarakterisati prema svojim fizičkim/hemijskim svojstvima i/ili biološkoj aktivnosti, putem različitih testova poznatih u struci.
1. Testovi vezivanja i drugi testovi
U jednom aspektu, antitelo iz pronalaska ispitano je da se odredi njegova antigen vezujuća aktivnost, npr. poznatim postupcima kao što je ELISA, vestern blot, itd.
U drugom aspektu, kompetitivni testovi se mogu koristiti za identifikovanje antitela koje se takmiči sa Tim3_0016 (koji sadrži VH sekvencu SQ ID NOSQ ID NO: 7 i VL sekvencu SQ ID NOSQ ID NO: 8) u vezivanju za TIM3 (ili alternativno sa varijantom Tim3_0016 antitela Tim3_0018 sa 6 identičnih HVR-ova). Stoga, jedno otelotvorenje pronalaska je antitelo koje se takmiči u vezanju za humani TIM3 sa anti-TIM3 antitelom koje sadrži sve 3 HVR VH sekvence SQ ID NOSQ ID NO:7 i sve 3 HVR VL sekvence SQ ID NOSQ ID NO:8). U određenim otelotvorenjima, takvo konkurentsko antitelo se vezuje za isti epitop (npr. linearni ili konformacioni epitop) za koji se vezalo anti-TIM3 antitelo Tim3_0016. Detaljni primeri postupaka za mapiranje epitopa na koje se antitelo vezuje su dati u Morris, G.E. (izd.), Protokoli za mapiranje epitopa, u: Methods in Molecular Biology, Vol.66, Humana Press, Totowa, NJ (1996).
U primeru za kompetitivni test, imobilisani TIM3(-ECD) je inkubiran u rastvoru koji sadrži prvo, obeleženo antitelo, koje se vezuje za TIM3 (npr. anti-TIM3 antitelo aTim3_0016) i drugo, neobeleženo antitelo, čija se sposobnost takmičenja sa prvim antitelom ispituje u pogledu vezivanja za TIM3. Drugo antitelo može da se nalazi u supernatantu hibridoma. Kao kontrola, imobilisani TIM3 je inkubiran u rastvoru koji sadrži prvo, obeleženo antitelo, ali ne i drugo, neobeleženo antitelo. Nakon inkubacije, u uslovima koji dopuštaju vezivanje prvog antitela za TIM3, višak nevezanog antitela se uklanja i meri se količina obeleživača vezanog za imobilisano TIM3. Ako je količina obeleživača vezanog za imobilisani TIM3 u ispitivanom uzorku značajno smanjena u odnosu na kontrolni uzorak, to ukazuje da se drugo antitelo takmiči sa prvim antitelom u pogledu vezivanja za TIM3. Vidi Harlow, E. i Lane, D.,
4
Antibodies: A Laboratory Manual, Poglavlje 14, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1988). Za drugi primer kompetitivnog testa pogledajte Primer 4.
2. Testovi za merenje aktivnosti
U jednom aspektu, dati su testovi za identifikaciju ovih anti-TIM3 antitela koja imaju biološku aktivnost. Biološka aktivnost može obuhvatati, na primer, internalizaciju receptora TIM3, ili oslobađanje citokina, ili citotoksičnu aktivnost (kao imunokonjugati konjugovani sa toksinom) ili unakrsnu reaktivnost vezivanja kod cinomolgusa, kao i vezivanje za različite tipove ćelija. Antitela koja imaju takvu biološku aktivnost in vivo i/ili in vitro takođe su obezbeđena.
U pojedinim otelotvorenjima, antitelo iz pronalaska je ispitano na takvu biološku aktivnost kao što je opisano npr. u primerima od 5 do 15.
D. Imunokonjugati (samo kancer ili modifikacija za cilj)
Pronalazak takođe daje imunokonjugate, uključujući anti-TIM3 antitelo ovde konjugovano sa jednim ili više citotoksičnih agenasa, kao što su hemoterapeutski agensi ili lekovi, agensi za inhibiciju rasta, toksini (npr. proteinski toksini, enzimski aktivni toksini bakterijskog, fungalnog, biljnog ili životinjskog porekla, ili njihovi fragmenti), ili radioaktivni izotopi.
U jednom otelotvorenju, imunokonjugat je konjugat antitelo-lek (ADC) u kome je antitelo konjugovano sa jednim ili više lekova, uključujući, ali se ne ograničavajući na, majtanzinoid (vidi US 5,208,020, US 5,416,064 i EP 0 425 235 B1); auristatin, kao što su funkcionalni ostaci leka monometil auristatina DE i DF (MMAE i MMAF) (vidi US 5,635,483, US 5,780,588 i US 7,498,298); dolastatin; kaliheamicin ili njegov derivat (vidi US 5,712,374, US 5,714,586, US 5,739,116, US 5,767,285, US 5,770,701, US 5,770,710, US 5,773,001 i US 5,877,296; Hinman, L.M. i sar., Cancer Res.53 (1993) 3336-3342; i Lode, H.N. i sar., Cancer Res. 58 (1998) 2925-2928); antraciklin kao što je daunomicin ili doksorubicin (vidi Kratz, F. i sar., Curr. Med. Chem. 13 (2006) 477-523; Jeffrey, S.C. i sar., Bioorg. Med. Chem. Lett. 16 (2006) 358-362; Torgov, M.Y. i sar. Bioconjug. Chem. 16 (2005) 717-721; Nagy, A. i sar. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000) 829-834; Dubowchik, G.M. i sar., Bioorg.& Med. Chem. Letters 12 (2002) 1529-1532; King, H.D. i sar., J. Med. Chem. 45 (2002) 4336-4343; i U.S. Patent br. 6,630,579); metotreksat; vindesin; taksan kao što je docetaksel, paklitaksel, larotaksel, tesetaksel i ortataksel; trihotecen; i CC1065.
U drugom otelotvorenju, imunokonjugat uključuje antitelo kao što je ovde opisano, konjugovano za enzimski aktivan toksin ili njegov fragment, uključujući, ali se ne ograničavajući na A lanac difterije, nevezujuće aktivne fragmente toksina difterije, A lanac
4
egzotoksina (iz Pseudomonas aeruginosa), A lanac ricina, A lanac abrina, A lanac modecina, alfa-sarcin, proteine Aleurites fordii, proteine diantina, proteine vinobojke (Phytolaca americana) (PAPI, PAPII i PAP-S), inhibitor iz gorke dinje (momordica charantia), kursin, krotin, inhibitor iz sapunjače (sapaonaria officinalis), gelonin, mitogelin, restriktocin, fenomicin, enomicin i trikotecene.
U drugom otelotvorenju, imunokonjugat uključuje antitelo kao što je ovde opisano, konjugovano sa pseudomonas egzotoksinom A (ili njegovim varijantama). Pseudomonas egzotoksin A (PE) je bakterijski toksin sa citotoksičnom aktivnošću koji može biti efikasan u uništavanju ili inhibiranju rasta nepoželjnih ćelija, npr. ćelija kancera. Prema tome, PE može biti koristan za lečenje ili sprečavanje bolesti poput npr. kancera. Nekoliko deimunizovanih pseudomonas egzotoksina (PE) je poznato u struci. Izbrisane verzije domena II (na primer, PE24) mogu biti manje imunogene i mogu izazvati manje nuspojave (poput, na primer, sindroma curenja kapilara i hepatotoksičnosti) u poređenju sa PE38, koji sadrži domen II. U PE24 varijantama se mogu koristiti različiti linkeri za furin koji mogu da se cepaju. Takvi deimunizovani pseudomonas egzotoksini (PE) su opisani na primer, u Međunarodnim publikacijama za prijavu patenata WO2005052006, WO2007016150, WO2007014743, WO2007031741, WO200932954, WO201132022, WO2012/154530, i WO 2012/170617. Izraz „pseudomonas egzotoksin A” kako se ovde koristi obuhvata divlji tip i deimunizovane pseudomonas egzotoksine (PE). U jednom poželjnom otelotvorenju, „pseudomonas egzotoksin A” se odnosi na deimunizovanu PE24 varijantu kao što je npr. opisano, bez ograničenja, u WO2009/32954, WO2011/32022, WO2012/154530, WO 2012/170617, Liu W i sar., PNAS 109(2012) 11782-11787, Mazor R i sar. PNAS 111 (2014) 8571-8576 i Alewine C, i sar., Mol Cancer Ther. (2014) 2653-61. U jednom poželjnom otelotvorenju, „pseudomonas egzotoksin A” sadrži aminokiselinske sekvence SQ ID NOSQ ID NO:69 ili sadrži aminokiselinske sekvence SQ ID NOSQ ID NO:70 (njihova priprema je takođe opisana u Mazor R, i sar. PNAS 111 (2014) 8571-8576 i Alewine C, i sar., Mol Cancer Ther. (2014) 2653-61).
U drugom otelotvorenju, imunokonjugat sadrži antitelo kao što je ovde opisano, konjugovano sa amatoksinom, ili njegove varijante. Amatoksini (α-amanitin, β-amanitin, amanin) su ciklični peptidi sastavljeni od 8 aminokiselina. Mogu se izolovati iz pečuraka Amanita phalloides ili pripremiti sintezom iz gradivnih blokova. Amatoksini inhibiraju specifičnu DNK zavisnu RNK polimerazu II ćelija sisara, a ovom transkripcijom i biosintezom proteina pogođenih ćelija. Inhibicija transkripcije u ćeliji izaziva zaustavljanje rasta i proliferacije. Iako nije kovalentno vezan, kompleks između amanitina i RNK-polimeraze II je vrlo čvrst (KD = 3nM). Disocijacija amanitina od enzima je veoma spor proces koji čini
4
oporavak pogođene ćelije malo verovatnim. Kada u ćeliji inhibicija transkripcije traje predugo, ćelija prolazi programiranu ćelijsku smrt (apoptozu), kao što je prikazano u kulturama Jurkatovih ćelija inkubiranih sa α-amanitinom ili, sa mnogo većom efikasnošću, u Jurkatovim ćelijama inkubiranim sa membranski propustljivim O-metil-α-amanitin oleatom. U jednom poželjnom otelotvorenju, termin „Amatoksin”, kako se ovde koristi, odnosi se na alfa-amanitin ili njegovu varijantu, kako je opisano npr. u WO2010/115630, WO2010/115629, WO2012/119787, WO2012/041504, i WO2014135282 sa poželjnim varijantama opisanim u WO2012/041504 ((npr. konjugovano putem 6’ C-atoma amatoksinske aminokiseline 4, posebno preko atoma kiseonika vezanog za 6' C-atom amatoksinske aminokiseline, i pri čemu je TIM3 antitelo povezano linkerom preko ostatka uree) i WO2014135282.
U drugom otelotvorenju, imunokonjugat uključuje antitelo kao što je ovde opisano, konjugovano za radioaktivni atom, dajući radiokonjugat. Dostupni su raznovrsni radioizotopi za proizvodnju radiokonjugata. Primeri uključuju At<211>, I<131>, I<125>, Y<90>, Re<186>, Re<188>, Sm<153>, Bi<212>, P<32>, Pb<212>i radioaktivne izotope Lu. Kada se radiokonjugat koristi za detekciju, on može da sadrži radioaktivni atom za scintigrafske studije, na primer TC<99m>ili I<123>, ili spin oznaku za snimanje nuklearnom magnetnom rezonancom (NMR) (takođe poznato kao snimanje magnetnom rezonancom, MR), kao što je ponovo jod-123, jod-131, indijum-111, fluor-19, ugljenik-13, azot-15, kiseonik-17, gadolinijum, mangan ili gvožđe.
Konjugati antitela i citotoksičnog agensa mogu se napraviti pomoću različitih agenasa za vezivanje bifunkcionalnih proteina, kao što je N-sukcinimidil-3-(2-piridilditio) propionat (SPDP), sukcinimidil-4-(N-maleimidometil) cikloheksan-1-karboksilat (SMCC), iminotiolan (IT), bifunkcionalni derivati imidoestara (kao što je dimetil adipimidat HCl), aktivni estri (kao što je disukcinimidil suberat), aldehidi (kao što je glutaraldehid), bis-azido jedinjenja (kao što je bis (p-azidobenzoil) heksandiamin), bis-diazonijum derivati (kao što je bis-(pdiazonijumbenzoil)-etilendiamin), diizocijanati (kao što je toluen 2,6-diizocijanat), i bisaktivna jedinjenja fluora (kao što je 1,5-difluor-2,4-dinitrobenzen). Na primer, imunotoksin ricina se može dobiti kao što opisuju Vitetta, E.S. i sar. Science 238 (1987) 1098-1104. Ugljenikom 14 obeležena 1-izotiocijanatobenzil-3-metildietilen triaminpentasirćetna kiselina (MX-DTPA) je primer helatnog agensa za konjugaciju radionukleotida za antitelo. Pogledajte WO 94/11026. Linker može biti „raskidivi linker“ koji olakšava oslobađanje citotoksičnog leka u ćeliji. Na primer, može se koristiti kiselo labilni linker, linker osetljiv na peptidazu, fotolabilni linker, dimetil linker ili linker koji sadrži disulfid (Chari R.V. i dr., Cancer Res.52 (1992) 127-131; U.S. Patent br.5,208,020).
Imunokonjugati ili ADC koji su ovde izričito razmatrani, ali nisu ograničeni na takve
4
konjugate pripremljene sa reagensima za unakrsne linkere koji uključuju, ali nisu ograničeni na BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC i sulfo-SMPB i SVSB (sukcinimidil-(4-vinilsulfon)benzoat) koji su komercijalno dostupni (npr. Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL.,SAD).
E. Postupci i kompozicije za dijagnostiku i detektovanje
U pojedinim otelotvorenjima, svako od anti-TIM3 antitela koja su ovde data korisno je za detektovanje TIM3 u biološkim uzorcima. Termin „detekcija“ kako se ovde koristi obuhvata kvantitativnu ili kvalitativnu detekciju. U pojedinim otelotvorenjima, biološki uzorak uključuje ćeliju ili tkivo, kao što su matične ćelije kancera AML.
U jednom otelotvorenju, dato je anti-TIM3 antitelo za upotrebu u postupcima za dijagnozu ili detekciju. U sledećem aspektu, obezbeđen je postupak za detekciju prisustva TIM3 u biološkom uzorku. U pojedinim otelotvorenjima, postupak obuhvata kontakt biološkog uzorka sa anti-TIM3 antitelom kao što je ovde opisano, pod uslovima koji dopuštaju vezivanje anti-TIM3 antitela sa TIM3, i detektovanje nastajanja kompleksa između anti-TIM3 antitela i TIM3. Takav postupak može biti in vitro ili in vivo postupak. U jednom otelotvorenju, anti-TIM3 antitelo je upotrebljeno da se izabere ispitanik podoban za terapiju anti-TIM3 antitelom, npr. kada je TIM3 biomarker za izbor pacijenata.
Primeri poremećaja koji se mogu dijagnostikovati korišćenjem antitela iz ovog pronalaska uključuju kancer, uključujući različite oblike hematoloških kancera kao što su AML ili multipli mijelomi (MM).
U pojedinim otelotvorenjima, data su obeležena anti-TIM3 antitela. Oznake uključuju, ali nisu ograničene na, oznake ili ostatke koji se detektuju direktno (kao što su fluorescentne, hromoforne, elektronski nepropusne, hemiluminescentne i radioaktivne oznake), kao i ostatke, kao što su enzimi ili ligandi, koji se detektuju indirektno, npr. putem enzimske reakcije ili molekulske interakcije. Primeri oznaka uključuju, ali se ne ograničavaju na radioizotope<32>P,<14>C,<125>I,<3>H, i<131>I, fluorofore, kao što su helati retkih zemalja ili fluorescein i njegovi derivati, rodamin i njegovi derivati, dansil, umbeliferon, luceriferaze, npr. luciferaza svica i bakterijska luciferaza (U.S. Patent br. 4,737,456), luciferin, 2,3-dihidroftalazindioni, peroksidaza rena (HRP), alkalna fosfataza, β-galaktozidaza, glukoamilaza, lizozim, saharid oksidaze, npr. glukoza oksidaza, galaktoza oksidaza i glukoza-6-fosfat dehidrogenaza, heterociklične oksidaze, kao što je urikaza i ksantin oksidaza, vezane sa enzimom koji koristi vodonik peroksid za oksidaciju prekursora boje, kao što je HRP, laktoperoksidaza ili mikroperoksidaza, biotin/avidin, spin oznake, oznake bakteriofagi, stabilni slobodni radikali, i slično.
F. Farmaceutske formulacije
Farmaceutske formulacije anti-TIM3 antitela, prema opisu iz ovog dokumenta, pripremaju se mešanjem takvog antitela koje ima željeni stepen čistoće sa jednim farmaceutski prihvatljivim nosačem ili više takvih opcionih nosača. (Remington's Pharmaceutical Sciences 16. izdanje, Osol, A. (izd.) (1980)), u obliku liofilizovanih formulacija ili vodenih rastvora. Farmaceutski prihvatljivi nosači su uglavnom netoksični za primaoca u primenjenim dozama i koncentracijama i uključuju, bez ograničenja: pufere, kao što je fosfatni, citratni, i puferi drugih organskih kiselina; antioksidanse, uključujući askorbinsku kiselinu i metionin; konzervanse (kao što je oktadecil dimetilbenzil amonijum hlorid; heksametonijum hlorid; benzalkonijum hlorid, benzetonijum hlorid; fenol, butil ili benzil alkohol; alkil parabene, kao što je metil ili propil paraben; katehol; rezorcinol; cikloheksanol; 3-pentanol; i m-krezol); polipeptide male molekulske mase (manje od oko 10 ostataka); proteine, kao što je albumin iz seruma, želatin ili imunoglobulini; hidrofilne polimere, kao što je poli(vinilpirolidon); aminokiseline, kao što je glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin ili lizin; monosaharide, disaharide i druge ugljene hidrate, uključujući glukozu, manozu ili dekstrine; helatne agense, kao što je EDTA; šećere, kao što je saharoza, manitol, trehaloza ili sorbitol; kontrajone koji grade soli, kao što je natrijum; metalne komplekse (npr. kompleksi Zn-protein); i/ili nejonske surfaktante, kao što je polietilen glikol (PEG). Primeri farmaceutski prihvatljivih nosača ovde dalje uključuju sredstva za intersticijalnu disperziju lekova, kao što su rastvorni neutralno aktivni glikoproteini hijaluronidaze (sHASEGP), na primer, humani rastvorljivi PH-20 glikoproteini hijaluronidaze, kao što je rhuPH20 (HYLENEX<®>, Baxter International, Inc.). Pojedini primeri za sHASEGP i postupci primene, uključujući rhuPH20, opisani su u US Patent Publication br.2005/0260186 i 2006/0104968. U jednom aspektu, sHASEGP se kombinuje sa jednom ili više dodatnih glikozaminoglikanaza, kao što je hondroitinaza.
Primeri liofilizovanih formulacija antitela opisani su u US Patentu br. 6,267,958. Vodene formulacije antitela uključuju one opisane u US Patentu br. 6,171,586 i WO 2006/044908, pri čemu ove druge formulacije uključuju histidin-acetatni pufer.
Formulacija ovde može takođe da sadrži više od jednog aktivnog sastojka, kao što je neophodno za naročitu indikaciju koja se leči, poželjno one sa komplementarnim aktivnostima koje ne utiču negativno jedna na drugu. Na primer, može biti poželjno da se dalje obezbede [[navesti lekove koji se mogu kombinovati sa anti-TIM3 antitelom]]. Takvi aktivni sastojci su pogodno prisutni u kombinaciji u količinama koje su efikasne za nameravane svrhe.
Aktivni sastojci mogu biti zarobljeni u pripremljenim mikrokapsulama, na primer,
1
tehnikom koacervacije ili interfacijalne polimerizacije, na primer, hidroksimetilceluloze, odnosno želatinskih mikrokapsula, odnosno mikrokapsula poli(metilmetakrilata), u koloidnim sistemima za isporuku lekova (na primer, lipozomi, albuminske mikrosfere, mikroemulzije, nanočestice i nanokapsule) ili u makroemulzijama. Takve tehnike su objavljene u Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. izdanje, Osol A. (izd.) (1980).
Mogu se pripremiti preparati sa produženim oslobađanjem. Pogodni primeri preparata sa produženim oslobađanjem uključuju polupropustljive matrice čvrstih hidrofobnih polimera koje sadrže antitelo, a te matrice su u određenom obliku, npr. film ili mikrokapsule.
Formulacije za primenu in vivo generalno su sterilne. Sterilnost se može lako postići, npr. filtracijom kroz sterilne filtracione membrane.
G. Postupci lečenja i kompozicije
Bilo koja anti-TIM3 antitela (ili proteini koji vezuju antigen) ili imunokonjugati anti-TIM3 antitela (ili proteini koji vezuju antigen) konjugovanih sa citotoksičnim agensom, obezbeđenim ovde, mogu se koristiti u terapijskim postupcima.
U jednom aspektu, obezbeđeno je anti-TIM3 antitelo ili imunokonjugat anti-TIM3 antitela konjugovanog sa citotoksičnim agensom za upotrebu kao lek. U daljnjim aspektima, obezbeđeno je anti-TIM3 antitelo ili imunokonjugat anti-TIM3 antitela konjugovanog sa citotoksičnim agensom za upotrebu u lečenju kancera. U nekim otelotvorenjima, obezbeđeno je anti-TIM3 antitelo ili imunokonjugati anti-TIM3 antitela konjugovanih sa citotoksičnim agensom za upotrebu u postupku lečenja. U nekim otelotvorenjima, pronalazak obezbeđuje anti-TIM3 antitelo ili imunokonjugat anti-TIM3 antitela konjugovanog sa citotoksičnim agensom zapostupak lečenja osobe koja ima kancer, koji uključuje davanje osobi efikasne količine anti-TIM3 antitela ili imunokonjugata anti-TIM3 antitela konjugovanog sa citotoksičnim agensom.
U daljim otelotvorenjima, pronalazak obezbeđuje anti-TIM3 antitelo ili imunokonjugat anti-TIM3 antitela konjugovanog sa citotoksičnim agensom za upotrebu u indukovanju apoptoze u ćeliji kancera / ili inhibiranju proliferacije ćelije kancera. U nekim otelotvorenjima, pronalazak obezbeđuje anti-TIM3 antitelo ili imunokonjugat anti-TIM3 antitela konjugovanog sa citotoksičnim agensom za postupak indukcije apoptoze u ćeliji kancera / ili inhibiranju proliferacije ćelija kancera kod pojedinca koji obuhvata davanje pojedincu efikasnog anti-TIM3 antitela ili imunokonjugata anti-TIM3 antitela konjugovanog sa citotoksičnim agensom da indukuje apoptozu u ćeliji kancera / ili da inhibira proliferaciju ćelije kancera.
U sledećim otelotvorenjima, pronalazak obezbeđuje anti-TIM3 antitelo za upotrebu kao imunostimulišućeg agensa / ili agensa za stimulisanje lučenja IFN gama. U pojedinim
2
otelotvorenjima, pronalazak daje anti-TIM3 antitelo za upotrebu u postupku za upotrebu kod imunostimulacije / ili stimulisanja sekrecije IFN gama kod pojedinca, uključujući davanje pojedincu efikasnog anti-TIM3 antitela za imunostimulaciju / ili stimulaciju izlučivanja IFN gama.
„Pojedinac” prema svakom od gornjih otelotvorenja je poželjno čovek. U sledećem aspektu, pronalazak obezbeđuje upotrebu anti-TIM3 antitela ili imunokonjugata anti-TIM3 antitela konjugovanog sa citotoksičnim agensom u proizvodnji ili pripremi leka. U jednom otelotvorenju, lek je za terapiju kancera. U daljem otelotvorenju, lek je za upotrebu u metodi za lečenje kancera, koja obuhvata davanje efikasne količine leka pojedincu koji ima kancer. U sledećem otelotvorenju, lek je za indukciju apoptoze u ćeliji kancera/ ili inhibiranje proliferacije ćelija kancera. U sledećem otelotvorenju, lek je za upotrebu u postupku indukcije apoptoze u ćeliji kancera / ili inhibiranju proliferacije ćelija kancera kod pojedinca koji boluje od kancera, što obuhvata davanje pojedincu efikasne količine medikamenta za indukciju apoptoze u ćeliji kancera / ili za inhibiciju proliferacije ćelija kancera. „Pojedinac“ prema bilo kom od gornjih otelotvorenja može biti čovek.
U daljem aspektu, pronalazak daje postupak za lečenje kancera. U jednom otelotvorenju, postupak uključuje davanje pojedincu koji ima kancer efikasne količine anti-TIM3 antitela. „Pojedinac“ prema bilo kom od gornjih otelotvorenja može biti čovek.
U daljem aspektu, pronalazak pruža metodu za indukciju apoptoze u ćeliji kancera/ ili inhibiranje proliferacije ćelija kancera kod pojedinca koji boluje od kancera. U jednom otelotvorenju, postupak uključuje davanje pojedincu efektivne količine anti-TIM3 antitela ili imunokonjugata anti-TIM3 antitela konjugovanog sa citotoksičnim jedinjenjem da indukuje apoptozu u ćeliji kancera / ili da inhibira proliferaciju ćelija kancera kod pojedinca koji boluje od kancera. U jednom otelotvorenju, „pojedinac“ je čovek.
U daljem aspektu, pronalazak daje farmaceutske formulacije koje sadrže bilo koje od ovde datih anti-TIM3 antitela, npr. za upotrebu u bilo kojoj od gornjih terapeutskih postupaka. U jednom otelotvorenju, farmaceutska formulacija uključuje bilo koje od ovde datih anti-TIM3 antitela i farmaceutski prihvatljiv nosač.
Antitelo iz pronalaska (i svaki dodatni terapeutski agens) može biti primenjeno bilo kojim pogodnim postupkom, uključujući parenteralnu, intrapulmonarnu i intranazalnu, i, ako se želi za lokalno lečenje, intralezionu primenu. Parenteralne infuzije uključuju intramuskularnu, intravensku, intraarterijsku, intraperitonealnu ili supkutanu primenu. Doziranje može biti bilo kojim prikladnim načinom, npr. putem injekcija, kao što su intravenske ili supkutane injekcije, što delimično zavisi od toga da li je primena kratkotrajna ili hronična. Ovde su razmatrani različiti rasporedi doziranja uključujući, bez ograničenja, pojedinačnu ili višestruku primenu u različitim terminima, bolusnu primenu i pulsnu infuziju.
Antitela iz predmetnog pronalaska biće formulisana, dozirana i primenjena u skladu sa dobrom lekarskom praksom. Faktori za razmatranje u ovom kontekstu uključuju konkretni poremećaj koji se leči, konkretnog sisara koji se leči, kliničko stanje pojedinačnog pacijenta, uzrok poremećaja, mesto isporuke agensa, postupak primene, raspored primene i ostale faktore poznate lekarima. Antitelo ne mora da bude, ali je opciono formulisano sa jednim ili više agenasa koji se trenutno primenjuju za sprečavanje ili lečenje poremećaja o kome se radi. Efikasna količina takvih drugih agenasa zavisi od količine antitela prisutnog u formulaciji, vrste poremećaja ili lečenja, kao i drugih faktora koji su razmatrani u gornjem tekstu. Oni se generalno koriste u istim dozama i sa istim načinom primene kao što je gore opisano, ili od oko 1 do 99% doza koje su ovde opisane, ili u bilo kojoj dozi i sa bilo kojim načinom primene za koje je empirijski/klinički dokazano da su odgovarajući.
Za prevenciju ili lečenje bolesti, odgovarajuća doza antitela iz pronalaska (kada se koristi samo ili u kombinaciji sa jednim ili više drugih dodatnih terapeutskih agenasa) zavisiće od vrste bolesti koja se leči, vrste antitela, težine i toka bolesti, bilo da se antitelo primenjuje u preventivne ili terapeutske svrhe, kao i od prethodne terapije, kliničke istorije pacijenta i njegovog odgovora na antitelo, kao i odluke nadležnog lekara. Antitelo se pogodno primenjuje na pacijentu jednokratno, ili kao serija terapija. U zavisnosti od vrste i težine bolesti, oko 1 µg/kg do 15 mg/kg (npr.0,5 mg/kg − 10 mg/kg) antitela je kandidat za početnu dozu za primenu na pacijentu, ili, na primer, putem jedne ili više primena, ili kontinualnom infuzijom. Jedna tipična dnevna doza može biti u opsegu od oko 1 µg/kg do 100 mg/kg ili više, u zavisnosti od gorenavedenih faktora. Kod ponovljene primene tokom nekoliko dana ili duže, u zavisnosti od stanja, lečenje će generalno biti nastavljeno sve do željenog suzbijanja simptoma bolesti. Doza antitela navedena kao primer bila bi u opsegu od oko 0,05 mg/kg do oko 10 mg/kg. Tako, jedna ili više doza od oko 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg ili 10 mg/kg (ili bilo koja njihova kombinacija) može se dati pacijentu. Takve doze mogu se primenjivati povremeno, npr, svake nedelje ili svake tri nedelje (npr. tako da pacijent primi od oko dve do oko dvadeset, ili npr. oko šest doza antitela). Može se primeniti veća početna doza, a nakon toga jedna ili više manjih doza. Primer za dozni režim uključuje primenu inicijalne početne doze od oko 4 mg/kg, nakon čega sledi nedeljna doza održavanja od oko 2 mg/kg antitela. Međutim, mogu biti korisni i drugi dozni režimi. Napredak ove terapije jednostavno se prati klasičnim tehnikama i testovima.
Podrazumeva se da bilo koja od gorenavedenih formulacija ili terapeutskih postupaka
4
može biti izvedena uz upotrebu imunokonjugata iz pronalaska umesto anti-TIM3 antitela ili kao njegovog dodatka.
Podrazumeva se da bilo koja od gorenavedenih formulacija ili terapeutskih postupaka može biti izvedena uz upotrebu imunokonjugata iz pronalaska umesto anti-TIM3 antitela ili kao njegovog dodatka.
III. Proizvodi
U drugom aspektu pronalaska, obezbeđen je proizvod koji sadrži materijale korisne za lečenje, prevenciju i/ili dijagnostikovanje prethodno opisanih poremećaja. Proizvod sadrži ambalažu i etiketu ili uputstvo u pakovanju, na ambalaži ili povezano sa njom. Pogodna ambalaža uključuje, na primer, boce, bočice, špriceve, kese za IV rastvor, itd. Ambalaža može biti izrađena od različitih materijala, kao što je staklo ili plastika. Ambalaža sadrži smešu koja je sama po sebi ili u kombinaciji sa drugom smešom efikasna za lečenje, prevenciju i/ili dijagnostikovanje stanja, i može imati priključak za sterilni pristup (na primer, ambalaža može biti kesa za intravenski rastvor ili bočica sa zapušačem koji može da se probuši iglom za potkožnu injekciju). Najmanje jedan aktivni agens u kompoziciji je antitelo iz pronalaska. Oznaka ili uputstvo za upotrebu ukazuje na to da se kompozicija koristi za lečenje stanja po izboru. Pored toga, proizvod može da sadrži (a) prvo pakovanje sa kompozicijom koja se u njemu nalazi, pri čemu kompozicija sadrži antitelo iz pronalaska; i (b) drugo pakovanje sa kompozicijom koja se u njemu nalazi, pri čemu kompozicija sadrži dodatni citotoksični ili drugi terapeutski agens. Proizvod u ovoj realizaciji pronalaska može dalje da sadrži uložak za pakovanje koji ukazuje da kompozicija može da se koristi za lečenje specifičnog stanja. Umesto toga, ili pored toga, proizvod može dalje da sadrži drugu (ili treću) ambalažu koja sadrži farmaceutski prihvatljiv pufer, kao što je bakteriostatska voda za injekcije (BWFI), fiziološki rastvor sa fosfatnim puferom, Ringerov rastvor i rastvor dekstroze. Može dalje da obuhvati druge materijale poželjne sa komercijalnog i aspekta upotrebe, uključujući druge pufere, razblaživače, filtere, igle i špriceve.
Podrazumeva se da svaki od gorepomenutih proizvoda može da sadrži imunokonjugat iz pronalaska umesto ili pored anti-TIM3 antitela.
Opis sekvenci aminokiselina
SQ ID NOSQ ID HVR-H1 teškog lanca, Tim3_0016
NO: 1
SQ ID NOSQ ID HVR-H2 teškog lanca, Tim3_0016
NO: 2
SQ ID NOSQ ID HVR-H3 teškog lanca, Tim3_0016
NO: 3
SQ ID NO: 4 HVR-L1 lakog lanca, Tim3_0016
SQ ID NO: 5 HVR-L2 lakog lanca, Tim3_0016
SQ ID NO: 6 HVR-L3 lakog lanca, Tim3_0016
SQ ID NO: 7 varijabilni domen teškog lanca VH, Tim3_0016
SQ ID NO: 8 varijabilni domen lakog lanca VL, Tim3_0016
SQ ID NO: 9 varijabilni domen teškog lanca VH, varijanta Tim3_0016 (0018) SQ ID NO: 10 varijabilni domen lakog lanca VL, varijanta Tim3_0016 (0018) SQ ID NO: 11 HVR-L1 lakog lanca , Tim3_0016 HVR-L1 varijanta 1_NQ (uklanjanje mesta glikozilacije mutacijom N u Q)
SQ ID NO: 12 HVR-L1 lakog lanca, Tim3_0016_HVR L1 varijanta 2_NS (uklanjanje mesta glikozilacije mutacijom N u S)
SQ ID NO: 13 HVR-H1 teškog lanca, Tim3_0021
SQ ID NO: 14 HVR-H2 teškog lanca, Tim3_0021
SQ ID NO: 15 HVR-H3 teškog lanca, Tim3_0021
SQ ID NO: 16 HVR-L1 lakog lanca, Tim3_0021
SQ ID NO: 17 HVR-L2 lakog lanca, Tim3_0021
SQ ID NO: 18 HVR-L3 lakog lanca, Tim3_0021
SQ ID NO: 19 varijabilni domen teškog lanca VH, Tim3_0021
SQ ID NO: 20 varijabilni domen lakog lanca VL, Tim3_0021
SQ ID NO: 21 HVR-H1 teškog lanca, Tim3_0022
SQ ID NO: 22 HVR-H2 teškog lanca, Tim3_0022
SQ ID NO: 23 HVR-H3 teškog lanca, Tim3_0022
SQ ID NO: 24 HVR-L1 lakog lanca, Tim3_0022
SQ ID NO: 25 HVR-L2 lakog lanca, Tim3_0022
SQ ID NO: 26 HVR-L3 lakog lanca, Tim3_0022
SQ ID NO: 27 varijabilni domen teškog lanca VH, Tim3_0022
SQ ID NO: 28 varijabilni domen lakog lanca VL, Tim3_0022
SQ ID NO: 29 HVR-H1 teškog lanca, Tim3_0026
ca, Tim3_0026
ca, Tim3_0026
a, Tim3_0026
a, Tim3_0026
a, Tim3_0026
škog lanca VH, Tim3_0026 kog lanca VL, Tim3_0026 ca, Tim3_0028
ca, Tim3_0028
ca, Tim3_0028
a, Tim3_0028
a, Tim3_0028
a, Tim3_0028
škog lanca VH, Tim3_0028 kog lanca VL, Tim3_0028 ca, Tim3_0030
ca, Tim3_0030
ca, Tim3_0030
a, Tim3_0030
a, Tim3_0030
a, Tim3_0030
škog lanca VH, Tim3_0030 kog lanca VL, Tim3_0030 ca, Tim3_0033
ca, Tim3_0033
ca, Tim3_0033
a, Tim3_0033
a, Tim3_0033
a, Tim3_0033 varijabilni domen teškog lanca VH, Tim3_0033
varijabilni domen lakog lanca VL, Tim3_0033
HVR-H1 teškog lanca, Tim3_0038
HVR-H2 teškog lanca, Tim3_0038
HVR-H3 teškog lanca, Tim3_0038
HVR-L1 lakog lanca, Tim3_0038
HVR-L2 lakog lanca, Tim3_0038
HVR-L3 lakog lanca, Tim3_0038
varijabilni domen teškog lanca VH, Tim3_0038
varijabilni domen lakog lanca VL, Tim3_0038
primer egzotoksina pseudomonas A varijanta 1 (primer deimunizovanog PE24)
primer egzotoksina pseudomonas A varijanta 2 (primer deimunizovanog PE24)
humani konstantni region kapa lakog lanca
humani konstantni region lambda lakog lanca
humani konstantni region teškog lanca dobijen od IgG1
humani konstantni region teškog lanca dobijen od IgG1 sa mutacijama L234A i L235A
humani konstantni region teškog lanca dobijen od IgG1 sa mutacijama L234A, L235A i P329G
humani konstantni region teškog lanca dobijen od IgG4
primer za humane TIM3 sekvence
humani ekstracelularni domen TIM3 (ECD)
VH humanizovana verzija varijante Tim3_0016 (0018) (= Tim3-0433) VL humanizovana verzija varijante Tim3_0016 (0018) (= Tim3-0433) VH humanizovana verzija varijante Tim3_0016 (0018) (= Tim3-0434) VL humanizovana verzija varijante Tim3_0016 (0018) (= Tim3-0434) VH humanizovana verzija Tim3-0028 (= Tim3-0438)
SQ ID NO: 84 VL humanizovana verzija Tim3-0028 (= Tim3-0438)
SQ ID NO: 85 VH humanizovana verzija Tim3-0028 (= Tim3-0443)
SQ ID NO: 86 VL humanizovana verzija Tim3-0028 (= Tim3-0443)
U sledećim aminokiselinskim sekvencama VH i VL domena, uključujući označene HVR (HVR-ovi podebljanim, podvučenim slovima) anti-TIM3 antitela Tim3-0016, varijanta Tim3-0016 (0018) i njegove humanizovane verzije Tim3-0433 i Tim3-0434, Tim3-0021, Tim3-0022, Tim3-0026, Tim3-0028 i njegove humanizovane verzije Tim3-0438 i Tim3-0443, Tim3-0030, i Tim3-0033, Tim3-0038 su navedene:
VH Tim3_0016:
VH Tim3_0018 (= VL varijanta Tim3_0016):
VH humanizovana verzija varijante Tim3_0016 (0018) (= Tim3-0433)
VL humanizovana verzija varijante Tim3_0016 (0018) (= Tim3-0433)
VH humanizovana verzija varijante Tim3_0016 (0018) (= Tim3-0434)
VL humanizovana verzija varijante Tim3_0016 (0018) (= Tim3-0434)
VH Tim3_0021:
VH Tim3_0022:
VH Tim3_0026:
VL Tim3_0026:
1
VL Tim3_0028:
VH humanizovana verzija Tim3-0028 (= Tim3-0438)
VL humanizovana verzija Tim3-0028 (= Tim3-0438)
VH humanizovana verzija Tim3-0028 (= Tim3-0443)
2
VL humanizovana verzija Tim3-0028 (= Tim3-0443)
VL aTim3_0030:
VL aTim3_0033:
VH aTim3_0038:
V. PRIMERI
U nastavku su dati primeri postupaka i kompozicija iz pronalaska.
Iako je pronalazak koji prethodi opisan prilično detaljno pomoću ilustracija i primera za lakše razumevanje, opise i primere ne treba tumačiti kao ograničenja za opseg primene pronalaska.
Primer 1a: Generisanje anti-TIM3 antitela
Imunizacija miševa
NMRI miševi su imunizovani genetski, koristeći plazmidni ekspresioni vektor koji kodira humani Tim-3 kompletne dužine, intradermalnom primenom 100 ug vektorske DNK (plazmid 15304_hTIM3-fl), a zatim elektroporacijom (2 kvadratna impulsa od 1000 V/cm, trajanja 0,1 ms, interval 0,125 s; a zatim 4 kvadratna impulsa od 287,5 V/cm, trajanja 10 ms, interval 0,125 s. Miševi su primili 6 uzastopnih imunizacija 0, 14, 28, 42, 56, 70. i 84. dana. Krv je uzeta 36, 78. i 92. dana i pripremljen je serum koji je korišćen za određivanje titra pomoću ELISA tehnike (vidi dole). Životinje sa najvišim titrima su odabrane za pojačavanje 96. dana, intravenskom injekcijom 50 ug humane himere rekombinantnog humanog Tim-3 Fc, i monoklonska antitela su izolovana tehnologijom hibridoma, fuzijom splenocita u ćelijsku liniju mijeloma 3 dana nakon pojačanja.
Određivanje titra u serumu (ELISA)
Humana himera rekombinantnog humanog Tim-3 Fc je imobilisana na Maxisorp ploči sa 96 bunarčića, sa 0,3 ug/ml, 100 μl / bunarčiću, u PBS-u, nakon čega je sledila blokada ploče
4
2% kroteinom C u PBS-u, 200 μl / bunarčiću; primena serijski razblaženja antiseruma, u duplikatu, u 0,5% kroteinu C u PBS-u, 100 μl / bunarčiću; detekcija sa kozjim anti-mišjim antitelom konjugovanim sa HRP-om (Jackson Immunoresearch/Dianova 115-036-071; 1/16000). Za sve korake, ploče su inkubirane 1 sat na 37 °C. Između svih koraka, ploče su isprane 3 puta sa 0,05% Tween 20 u PBS-u. Signal je razvijen dodavanjem rastvorljivog supstrata BM Blue POD (Roche), 100 ul/bunarčiću; i zaustavljen dodavanjem 1 M HCl, 100 ul/bunarčiću. Apsorbanca je očitana na 450 nm, nasuprot 690 nm kao referenci. Titar je definisan kao razblaženje antiseruma što rezultuje polu-maksimalnim signalom.
Primer 1b: Karakterizacija anti-Tim3 antitela
ELISA za Tim3
Nunc-Maxi SORP streptavidinske ploče (MicroCoat kat. br. 11974998/MC1099) su obloženae sa 25 μl/bunarčiću Tim3-ECD-His-biotinom (biotinilovan BirA ligazom) i inkubirane na RT tokom 1 h uz mućkanje pri rotaciji od 400 obrtaja u minuti. Posle ispiranja (3x90 μl/bunarčiću PBST pufera), 25 μl uzoraka aTim3 ili razblaženog (koraci 1:2) referentnog antitela aTim3 F38-2E2 (Biolegend) je dodato i inkubirano 1h na sobnoj temperaturi. Posle ispiranja (3x90 µl/bunarčiću PBST pufera), dodato je 25µl/bunarčiću ovčje antimišje POD (GE NA9310V) u razblaženju 1:9000 i inkubirano na sobnoj temperaturi tokom 1 h uz mućkanje pri rotaciji od 400 obrtaja u minuti. Posle ispiranja (4x90 μl/bunarčiću PBST pufera) dodato je 25 μl/bunarčiću i TMB supstrata (Calbiochem, kat. br. CL07) i inkubirano do OD 1,5 - 2,5. Tada je reakcija zaustavljena dodavanjem 25 µl/bunarčiću rastvora 1N HCl. Merenje je izvršeno na 370/492 nm.
Rezultati ELISA testa navedeni su kao vrednosti EC50 [ng/ml] u zbirnoj tabeli 2 u nastavku.
Primer: Ćelijska ELISA za Tim3
Adherentna CHO-K1 ćelijska linija stabilno transficirana plazmidom 15312_hTIM3-fl_pUC_Neo kodiranjem za humani Tim3 pune dužine i selekcijom sa G418 (marker otpornosti na neomicin na plazmidu) je zasejana u koncentraciji od 1,2x10E6 ćelija/ml na ploče sa ravnim dnom sa 384 bunarčića i uzgajana preko noći.
Sledećeg dana je dodato u 25 μl/bunarčiću uzorka Tim3 ili referentnog antitela za aTim3 F38-2E2 bez azida (Biolegend, 354004) i inkubirano 2h na 4 °C (kako bi se izbegla internalizacija). Posle ispiranja (3x90 μl/bunarčiću PBST (BIOTEK perač: Prog.29, 1 x 90), ćelije su fiksirane izbacivanjem zaostalog pufera i dodavanjem 50µl/bunarćiću 0,05% glutaraldehida: Razblaživanje 1:500 25% glutaraldehida (Sigma kat. br.: G5882) u 1xPBS puferu, i inkubirne 1 h na sobnoj temperaturi. Posle ispiranja (3x90 μl/bunarčiću PBST (BIOTEK perač: Prog.21, 3x90 GreinLysin) 25 μl/bunarćiću, dodato je sekundarno antitelo za detekciju (ovčija-antimišja POD; F(ab')2fragment povezan sa POD rena; GE NA9310), a zatim inkubirano 2h na sobnoj temperaturi uz mućkanje pri rotaciji od 400 obrtaja u minuti. Posle ispiranja (3x90 μl/bunarčiću PBST (BIOTEK perač: Prog. 21, 3x90 GreinLysin) 25 μl/bunarćiću, dodat je TMB rastvor supstrata (Roche 11835033001) i inkubiran do OD 1,5 -2,5. Tada je reakcija zaustavljena dodavanjem 25 µl/bunarčiću rastvora 1N HCl. Merenje je izvršeno na 370/492 nm.
Rezultati ELISA za ćelije su navedeni kao vrednosti „EC50 CHO-Tim3“ [ng/ml] u zbirnoj tabeli 2 u nastavku.
Tabela 2: Afinitet vezivanja primera antitela (ELISA i BIACORE)
BIAcore karakterizacija Tim3 AB
Testovi zasnovani na površinskoj plazmonskoj rezonanci (SPR) korišćeni su za određivanje kinetičkih parametara vezivanja između nekoliko mišjih vezivača Tim3 kao i komercijalnih referenci za vezivanje humanog Tim3. Zbog toga je anti-mišji IgG imobilisan vezivanjem amina za površinu (BIAcore) CM5 senzorskog čipa. Zatim su uzeti uzorci, a za njih je vezan monomerni hu/cy Tim3-ECD kao i Fc-označeni humani Tim3-ECD dimer. Površina senzorskog čipa je regenerisana nakon svakog ciklusa analize. Konstanta ravnoteže KDkonačno je dobijena prilagođavanjem podataka modelu 1:1 Lengmirove interakcije.
Oko 12000 jedinica odgovora (RU) od 30 µg/ml antimišjeg IgG (GE Healthcare kat. br. BR-1008-38) je vezano za tačke 1,2,4 i 5 protočnih ćelija 1-4 (tačke 1,5 su aktivne, a tačke 2,4 su referentne tačke) CM5 senzorskog čipa u BIAcore B4000 na pH 5,0 pomoću kompleta za kuplovanje amina koji isporučuje GE Healthcare.
Pufer za uzorak i radni pufer je HBS-EP+ (0,01 M HEPES, 0,15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0,05% v/v surfaktant P20, pH 7,4). Temperatura protočne ćelije je podešena na 25 °C, a temperatura odeljka sa uzorkom na 12 °C. Sistem je prajmovan radnim puferom.
Uzorci su injektovani 30 sekundi sa koncentracijom od 200 µg/ml i vezani za tačke 1 i 5 svake protočne ćelije, omogućavajući merenje osam uzoraka paralelno. Zatim je kompletan skup različitih (monomernih cino, monomernih humanih i huFc fuzionisanih dimernih humanih Tim3-ECD) koncentracija (v. Tabelu X) injektovan u svaki uzorak u trajanju od 240 s, praćen vremenom disocijacije od 30/1800 s (v. Tabelu 1). Svaki ciklus analize (uzimanje uzoraka, tačka 1 i 5 − injektovanje Tim3 ECD) je zatim regenerisan injektovanjem glicin-HCl pH 1,7 tokom 30 sekundi. Protok je postavljen na 30µl/min tokom celog perioda.
Konačno, dvostruki referentni podaci su uklopljeni u model Lengmirove interakcije1:1 pomoću BIAcore B4000 softvera za procenu. Rezultujući afiniteti prema monomernom humanom, cino Tim3 i HuFc fuzionisanom dimernom humanom Tim3 prikazani su u tabelama 2 i 3. Na afinitet prema Hu Tim3 dimeru najverovatnije utiče avidnost, i zato je naizgled jači od afiniteta prema monomernom huTim3.
Tabela 3a: Afiniteti vezivanja određeni BIAcore-KD vrednostima dobijenim kinetičkim SPR merenjima. -n.f. znači da nije moguće postavljanje, najverovatnije zbog nevezivanja ili slabog vezivanja.
Određivanje afiniteta prema Tim3 pomoću SPR (himerna varijanta TIM3-0016 (0018) i humanizovane verzije)
Protein A je imobilisan vezivanjem amina za površinu (Biacore) CM5 senzorskog čipa. Uzorci su tada uhvaćeni i hu Tim3-ECD je vezan za njih. Površina senzorskog čipa je regenerisana nakon svakog ciklusa analize. Konstanta ravnoteže i kinetičke konstante brzine konačno su dobijene prilagođavanjem podataka Lengmirovom modelu interakcije 1:1.
Oko 2000 jedinica odgovora (RU) od 20 µg/ml proteina A je vezano za tačke 1, 2, 4 i 5 svih protočnih ćelija CM5 senzorskog čipa na instrumentu Biacore B4000 pomoću kompleta za kuplovanje amina koji isporučuje GE Healthcare.
Pufer za uzorak i radni pufer je HBS-EP+ (0,01 M HEPES, 0,15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0,05 % v/v surfaktant P20, pH 7,4). Temperatura protočne ćelije je podešena na 25 °C, a temperatura odeljka sa uzorkom na 12 °C. Sistem je prajmovan radnim puferom.
Različiti uzorci su injektovani u trajanju od 30 sekundi sa koncentracijom od 10 nM i vezani uzastopno za tačke 1 i 5 u svim protočnim ćelijama. Zatim je kompletan skup razblaženja monomernih humanih Tim3-ECD (600 nM, 200 nM, 66,7 nM, 2 × 22,2 nM, 7,4 nM, 2,5 nM i 2 × 0 nM) uzastopno injektovan u svaki uzorak u trajanju od 300 s. Nakon svakog injektovanja antigena usledilo je vreme disocijacije 12 s/1000 s i dva koraka regeneracije od 30 s rastvorom glicin-HCl pH 1,5, od kojih je poslednji obuhvatao period stabilizacije nakon injektovanja od 20 sekundi.
Konačno, dvostruki referentni podaci su uklopljeni u Lengmirov model interakcije 1: 1 koristeći Biacore B4000 softver za procenu. Rezultujuće vrednosti KDsu prikazane u Tabeli 3b.
Određivanje afiniteta prema Tim3 putem SPR ((himerni TIM3-0028 i humanizovane verzije))
Anti-humani Fc IgG je imobilisan vezivanjem amina za površinu (Biacore) CM5 senzorskog čipa. Uzorci su tada uhvaćeni i hu Tim3-ECD je vezan za njih. Površina senzorskog čipa je regenerisana nakon svakog ciklusa analize. Konstanta ravnoteže i kinetičke konstante brzine konačno su dobijene prilagođavanjem podataka Lengmirovom modelu interakcije 1:1.
Oko 2500 jedinica odgovora (RU) od 10 µg/ml anti-humanog Fc IgG (GE Healthcare kat. br. BR-1008-39) vezano je za tačke 1, 2, 4 i 5 svih protočnih ćelija CM5 senzorskog čipa u Biacore B4000 instrumentu pomoću kompleta za kuplovanje amina koji isporučuje GE Healthcare.
Pufer za uzorak i radni pufer je HBS-EP+ (0,01 M HEPES, 0,15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0,05 % v/v surfaktant P20, pH 7,4). Temperatura protočne ćelije je podešena na 25 °C, a temperatura odeljka sa uzorkom na 12 °C. Sistem je prajmovan radnim puferom.
Različiti uzorci su injektovani u trajanju od 30 sekundi sa koncentracijom od 10 nM i vezani uzastopno za tačke 1 i 5 u svim protočnim ćelijama. Zatim je kompletan skup razblaženja monomernih humanih Tim3-ECD (600 nM, 200 nM, 66,7 nM, 2 × 22,2 nM, 7,4 nM, 2,5 nM i 2 × 0 nM) uzastopno injektovan u svaki uzorak u trajanju od 300 s. Nakon svakog injektovanja antigena usledilo je vreme disocijacije od 12 s/700 s i dva koraka regeneracije od 30 s sa 3 M rastvorom MgCl2, od kojih poslednji sadrži „dodatno ispiranje posle injektovanja“ radnim puferom.
Konačno, dvostruki referentni podaci su uklopljeni u Lengmirov model interakcije 1:1 koristeći Biacore B4000 softver za procenu. Rezultujuće vrednosti KDsu prikazane u Tabeli 3b.
Tabela 3b: Afiniteti vezivanja određeni BIAcore-KD vrednostima dobijenim kinetičkim SPR merenjima
Primer 2: Stvaranje derivata anti-Tim3 antitela
Derivati himernih antitela
Himerna Tim3 antitela su generisana amplifikacijom varijabilnih regiona teškog i lakog lanca mišjih antitela anti-TIM3 Tim3-0016, varijante Tim3-0016 (0018), Tim3-0021, Tim3-0022, Tim3-0026, Tim3-0028, Tim3-0030, i Tim3-0033, Tim3-0038 putem PCR-a i njihovim kloniranjem u ekspresionke vektore teških lanaca kao fuzione proteine sa humanim IgG1 skeletom / humanim CH1-šarka-CH2-CH3 sa LALA i PG mutacijama (leucin 234 u alanin, leucin 235 u alanin, prolin 329 u glicin) ukidajući efektorske funkcije i ekspresione vektore lakog lanca kao fuzione proteine u humani C-kappa. LC i HC plazmidi su zatim kotransficirani u HEK293 i prečišćeni nakon 7 dana iz supernatanta standardnim postupcima za prečišćavanje antitela.
Uklanjanje mesta glikozilacije NYT: Izmena 1 HVR-L1 položaja u Tim3-0016, varijanti Tim3_0016 (nazvana 0018 ili Tim3_0018) supstitucijom N sa Q ili S Mutacije u varijabilnom regionu lakog lanca u Tim3_0016 i varijanti Tim3_0016 (0018) generisane su in vitro mutagenezom koristeći „Quick Change Lightning komplet za mutagenezu dirigovanu mestom“ kompanije Agilent prema uputstvu proizvođača. Ovom metodom, asparagin (N) motiva mesta glikozilacije NYT u lakom lancu HVR-L1 (SQ ID NO: 4) je zamenjen glutaminom (Q) (što daje SQ ID NO: 11 = Tim3_0016_HVR-L1 varijanta 1_NQ) ili, alternativno, asparagin (N) je zamenjen serinom (S) (što daje SQ ID NO: 12 = Tim3_0016_HVR-L1 varijanta 2_NS). U oba je uspešno modifikovan motiv mesta glikozilacije NYT. LC i HC plazmidi, koji kodiraju varijante, su zatim kotransficirani u HEK293 i prečišćeni nakon 7 dana iz supernatanta standardnim postupcima za prečišćavanje antitela.
Generisani mutanti su testirani ELISA testom na humanom Tim3, ELISA testom na Tim3 cinomolgusa i ćelijskim ELISA testom na adhezivnim ćelijama CHO-K1 koje eksprimiraju humani Tim3 kompletne dužine.
TABELA 4:
Otkriveno je da svi generisani mutanti pokazuju čak funkcionalnije vezivanje za humani TIM3 (human), cino TIM3 (cyno) ili humani TIMR na CHO ćelijama nego roditeljska antitela Tim3_0016 ili varijanta Tim3_0016 antitela Tim3_0018.
Humanizovani derivati antitela
Humanizacija VH i VL domena mišje anti-Tim3-0016 varijante (0018) i anti-Tim3_0028
Na osnovu aminokiselinske sekvence VH i VL domena a) anti-Tim3 antitela varijante Tim3_0016 (0018) (sa aminokiselinskim sekvencama 6 HVR-a, pri čemu su u lakom lancu HVR-L1 varijanta 2_NS (uklanjanje mesta glikozilacije pomoću mutacije N u S) korišćena (SQ ID NO: 1, 2, 3, 12, 5 i 6) humanizovana anti-Tim3 antitela varijante Tim3-0433 i Tim3-0434 generisana i zasnovana na aminokiselinskom nizu VH i VL domena b) anti-Tim3 antitela Tim3_0028 (sa aminokiselinskim sekvencama 6 HVR-ova (SQ ID NO: 37, 38, 39, 40, 41 i 42) generisane su humanizovane varijante anti-Tim3 antitela Tim3-0438 i Tim3-0443.
1
Humanizovane sekvence aminokiselina za varijabilne regione teškog i lakog lanca su prevedene natrag u DNK, i rezultujuće cDNK su sintetisane (GenArt) i zatim klonirane u ekspresione vektore teških lanaca kao fuzioni proteini sa humanim IgG1 skeletom / humanim CH1-šarka-CH2-CH3 sa LALA i PG mutacijama (leucin 234 u alanin, leucin 235 u alanin, prolin 329 u glicin) ukidajući efektorske funkcije ili u ekspresione vektore lakog lanca kao fuzione proteine u humani C-kappa. LC i HC plazmidi su zatim kotransficirani u HEK293 i prečišćeni nakon 7 dana iz supernatanta standardnim postupcima za prečišćavanje antitela. Dobijena humanizovana Tim3-antitela su imenovana kao što sledi:
Tabela: VH i VL sekvence humanizovanih antitela
Tabela: HVR sekvence humanizovanih antitela
Primer 3: Fluorescentno označavanje prečišćenog monoklonskog antitela Fluorescentno označavanje monoklonskog antitela dobijenog od hibridoma je izvršeno upotrebom kompleta za označavanje monoklonskog antitela Alexa Fluor 488 (proizvođača
2
Invitrogen) prema upustvu proizvođača. Nakon obeležavanja, za svako antitelo je potvrđeno da je pozitivno obeleženo pomoću Alexa Fluor 488 (u daljem tekstu „Alexa-488”)putem analize uređajem FACSCalibur (proizvođača BD Biosciences) za TIM-3 koji eksprimira RPMI-8226 i Fajferove ćelije.
Primer 4: Klasifikacija epitopskih vezujućih grupa pomoću kompetivnog testa na bazi FACS
Odnos epitopa između generisanih anti-TIM3 antitela i šest anti-TIM3 referentnih antitela je analiziran kompetitivnim testom vezivanja na bazi FACS. Referentna antitela za TIM3 su sledeća: antitela 4177 i 8213 kako je opisano u US2012/189617, antitela 1.7E10 i 27.12E12 kako je opisano u WO2013/06490; antitelo 344823 (klon 344823, proizvođač R&D Systems) i antitelo F38-2E2 (klon F38-2E2, proizvođači BioLegend i R&D Systems). Ukratko, testiranom antitelu je dozvoljeno da interaguje i vezuje se za RPMI-8226 ćelije koje eksprimiraju TIM-3 (ATCC ® CCL-155™), a zatim je procenjeno metodom protočne citometrije da li se još jedno anti-TIM-3 antitelo takođe može vezati za ćelija koje eksprimiraju TIM-3.
Ukratko, humane TIM3 eksprimirajuće RPMI-8226 ćelije inkubirane su sa BD humanim Fc blokom 10 min na sobnoj temperaturi i obojene su u dva različita eksperimentalna podešavanja da se isključi uticaj razlike u afinitetu testiranih antitela na vezivanje:
1) sa otkrivenim prečišćenim anti-TIM3 (10 µ/ml u BD puferu za bojenje u trajanju od 0,5 h na 4 °C), konjugovane sa Alexa*488 prema uputstvu proizvođača (molekularne sonde A-20181) sa prosekom od 2,7 fluorofora po antitelu. Pored toga, a) dodata su neoznačena (1-4) referentna rekombinantna anti-TIM3 antitela ili kontrola izotipa (10 µg/ml) tokom 0,5 h na 4 °C u BD SB-u i posle ispiranja BD SB-om obojena pomoću PE obeleženih anti-huFcγ Ab (JIR, 109-116-098, 1:200, 0,5h na 4 °C u BD SB-u) ili b) PE obeležena (5-6) raspoloživa referentna anti-TIM3 antitela ili odgovarajuće izotipske kontrole dodavani su (10 µg/ml) u trajanju od 0,5 h na 4 °C u BD SB-u. Nakon ispiranja i centrifugiranja, MFI signali obojenih ćelija RPMI-8226 analizirani su BD Biosciences FACSCanto protočnim citometrom.
Tabela 5: Sažetak karakterizacije epitopa − kompetitivnost Tim3-antitela za vezivanje za Tim3
Rezultati mapiranja grupa epitopa na bazi FACS pokazuju da Tim3_0016 i Tim3_0016 varijanta Tim3_0018 ne pokazuju takmičenje u vezivanju za bilo koje testirano anti-TIM-3 referentno antitelo, i sugerisano je da ova Ab prepoznaju novi epitop različit od epitopa koji su prepoznala sva prethodno opisana TIM3 referentna antitela dok se Tim3_0022, Tim3_0026, Tim3_0028 i Tim3_0038 takmiče u različitom obimu u vezivanju za površinski eksprimiran TIM3 na JRPMI-8226 ćelijama sa različitim konkurentima.
Primer 5: Uticaj humanih anti-TIM-3 antitela na proizvodnju citokina u mešanoj limfocitnoj reakciji (MLR)
Mešana limfocitna reakcija je korišćena da se pokaže efekat blokiranja TIM-3 puta do efektorskih ćelija limfocita. T ćelije u ispitivanju su testirane na aktiviranje i lučenje IFN-gama u prisustvu ili odsustvu anti-TIM-3 mAb.
Humani limfociti su izolovani iz periferne krvi zdravog donora centrifugiranjem sa gradijentom gustine pomoću leukosepa (Greiner Bio One, 227288). Ukratko, heparinizovana krv je razblažena trostrukom zapreminom PBS-a, i 25 ml alikvota razblažene krvi je raslojeno u leukosep epruvetama od 50 ml. Posle centrifugiranja na 800 x g tokom 15 minuta na sobnoj temperaturi (bez prekida), frakcije koje sadrže limfocite su sakupljene, isprane PBS-om i direktno korišćene u funkcionalnom testu ili resuspendovane u medijumu za smrzavanje (10%
4
DMSO, 90% FCS) sa 1,0E 07 ćelija/ml i skladištene u tečnom azotu. Odnos ciljne ćelije / ćelije ispitanika 1:1 korišćen je u testu MLR (tj. svaka MLR kultura je sadržala − 2,0E+05 PBMC svakog donora u ukupnoj zapremini od 200 µl. Anti-TIM3 monoklonska antitela Tim3_0016, varijanta Tim3_0016 (Tim3_0018), Tim3_0021, Tim3_0022, Tim3_0026, Tim3_0028, Tim3_0030, Tim3_0033, Tim3_0038 i L38-2E2 (BioLegend) dodanta su svakoj kulturi u različitim koncentracijama antitela. Nijedno antitelo ili antitelo za kontrolu izotipa nije korišćeno kao negativna kontrola, i rec IL-2 (20 EU/ml) je korišćen kao pozitivna kontrola. Ćelije su kultivisane 6 dana na 37 °C. Nakon 6. dana, uzeto je 100 µl medijuma iz svake kulture za merenje citokina. Nivo IFN-gama je izmeren korišćenjem kompleta OptEIA ELISA (BD Biosciences).
Rezultati su prikazani u Tabeli 6 (izlučivanje / oslobađanje IFN-g). Anti-TIM-3 monoklonska antitela podstiču aktivaciju T ćelija i lučenje IFN-gama na način zavisan od koncentracije. Anti-TIM3 antitela Tim3_0021, Tim3_0022, Tim3_0028 i Tim3_0038 smanjuju oslobađanje inflamatornog citokina IFN-gama više nego F38-2E2 antitelo. Tim3_0016, varijanta Tim3_0016 (Tim3_0018), Tim3_0033 i Tim3_0038 su pokazali slično oslobađanje u poređenju sa antitelom F38-2E2. Suprotno tome, kulture koje sadrže antitelo za kontrolu izotipa nisu pokazale povećanje sekrecije IFN-gama.
Tabela 6a: Procenat oslobađanja IFNgamma antitela izazvanog Tim3 antitelom u odnosu na rec IL-2 (20 EU/ml) (= 100%) kao pozitivnu kontrolu i bez antitela kao negativne kontrole
U daljim eksperimentima izmerene su EC50 vrednosti sledećih himernih i humanizovanih antitela (generisanih kako je gore opisano) u kombinaciji sa 0,1µg/ml anti-PD1 mAb: himerno antitelo chi_Tim3_018 i njegove humanizovane verzije Tim3-433 i Tim3-434, himerno chi_Tim3_028 antitelo i njegove humanizovane verzije Tim3-438 i Tim3-443 su izmereni sa različitim smešama limfocita donora (D2 i D3, odnosno D1 i D5) Rezultati su prikazani u tabeli 6b.
Tabela 6b: EC50 indukovanih anti-Tim3 antitela (izlučivanje / oslobađanje IFN-g)
Primer 6: Internalizacija anti-TIM-3 antitela u ćelije koje eksprimiraju TIM-3 Ovde opisana specifična TIM-3 antitela se mogu internalizovati u ćelije koje eksprimiraju TIM-3, uključujući limfom koji eksprimira TIM-3, multipli mijelom i AML ćelije. Na primer, otkrivena TIM-3 specifična antitela i njihovi fragmenti su prikazani kao internalizovani u rec TIM3 CHO ćelije stabilne da eksprimiraju humani TIM-3 kako je procenjeno pomoću ćelijskog ELISA, protočne citometrije (FACS) i konfokalne mikroskopije.
Npr. stabilne Tim3-transficirane CHO-K1 ćelije (klon 8) (4x10<4>ćelija / bunarčiću / 100µl) zasejane su u MTP sa 98 bunarčića koristeći sveži medijum za uzgajanje. Posle vezivanja ćelija preko noći, medijum za uzgajanje ćelija je uklonjen, i testirana antitela su dodata ćelijama (10 µg/ml u medijumu za uzgajanje ćelija) i inkubirana 0,5 sati na 4 °C. Za referencu je upotrebljeno komercijalno mišje antihumano antitelo (TIM3 MAB 11E365 (US Biological, T5469-92P). Posle ispiranja (2x medijumom za uzgajanje ćelija) i centrifugiranja ćelije su inkubirane tokom 3 sata na a) 4 °C ili b) 37 °C u 200 µl medijuma za uzgajanje ćelija. Internalizacija se tipično odvija na 37 °C, ali ne na 4 °C, što pruža drugu kontrolu reakcije. Zatim su ćelije fiksirane sa 100 µl/bunarčiću 0,05% glutaraldehida (Sigma kat.br.: G5882) u 1xPBS tokom 10 minuta na sobnoj temperaturi (RT). Nakon toga su usledila tri koraka ispiranja sa 200 µl PBS-T, i sekundarno antitelo ovčje-antimišje POD (F(ab')2fragment povezan sa POD rena; GE NA9310)) je dodavano tokom 1 sata na RT. Nakon završnih koraka ispiranja (3xPBS-T), dodat je TMB supstrat (Roche br. za naručivanje 11835033001) tokom 15 min, i razvoj boje je zaustavljen upotrebom 1N HCl. Konačni OD su određeni merenjem na 450/620 nm u ELISA čitaču. Ovaj postupak za ćelijsku ELISA tehniku je korišćen za procenu srednje propusnosti internalizujućeg kapaciteta ispitivanih antitela koja su prečišćena iz supernatanta hibridoma.
Procenat internalizacije je izračunat na sledeći način:
Internalizacija [%] = (1- ODuzorak_37 C/ ODuzorak_4 C)*100
Rezultati su prikazani na Sl.1A i B za (Internalizaciju). Skoro sva testirana anti-TIM-3 monoklonska antitela su bila slično dobro internalizovana u stabilne Tim3 transficirane CHO-K1 ćelije nakon 3 h inkubacije na 37 °C (nisu prikazani svi podaci).
Određivanje EC50 vrednosti internalizacije (vremenska zavisnost) kao i poređenje kinetike internalizacije u zavisnosti od jednovalentnosti u odnosu na dvovalentnost procenjivano je putem FACS za odabrane kandidate.
Ukratko, humane TIM3 stabilne eksprimirajuće CHO-K1 ćelije su zasejane (4x10<5>ćelija / bunarčiću / 50 µl) u MTP sa 98 bunarčića sa dnom u obliku slova V, koristeći sveži medijum za uzgajanje, i inkubirane su 10 minuta na RT Redimune® NF Liquid, da se blokira nespecifično vezivanje. Dodato je više od 50 µl/bunarčiću odabranog prečišćenog anti-TIM3 (10 µg/ml u medijumu za uzgajanje) i inkubirano tokom 1 sata na 4 °C. Posle ispiranja (sa medijumom za uzgajanje) i centrifugiranja, ćelije su inkubirane 0,25, 0,5, 1, 2, 3, 4, 6 i 24 sata na a) 4 °C ili b) 37 °C u 200 µl medijuma za uzgajanje ćelija. Zatim su ćelije isprane sa PBS/1% BSA i sekundarnim antitelom Alexa Fluor 488 kozji-antimišji IgG, F(ab)2 su dodavani tokom 1 sata na 4 °C. Nakon ispiranja i centrifugiranja, dodato je 125 µl CellFix (BD Bioscience, 1:1000) i MFI signali obojenih ćelija su analizirani protočnim citometrom BD Biosciences FACSCanto.
Procenat internalizacije je izračunat na sledeći način:
Internalizacija [%] = (1- MFIuzorak_37 C/ MFIuzorak_4 C)*100
Primer za procenu vremenski zavisne internalizacije anti-TIM3 antitela Tim3_0016, varijanta Tim3_0016 (Tim3_0018), Tim3_0021, Tim3_0028, Tim3_0030, Tim3_0033, Tim3_0038 na RPMI-8226 ćelijama (ATCC ® CCL-155™):
Predmetna otkrivena anti-TIM3 antitela se brzo internalizuju u TIM3 eksprimirajuće RPMI-8226 ćelije (ATCC ® CCL-155™) na visokom nivou. Eksperimenti su izvedeni kao što je gore opisano sa TIM3 eksprimirajućim RPMI-8226 ćelijama (ATCC ® CCL-155™) umesto rec CHOK1 ćelija koje eksprimiraju huTIM-3. Rezultati su prikazani u Tabeli 7. Kao referentna antitela za TIM3 korišćena su sledeća antitela: antitelo 8213 kako je opisano u US2012/189617, antitelo 27.12E12 kako je opisano u WO2013/06490. Tim3_0016, varijanta Tim3_0016 (Tim3_0018), Tim3_0038 korišćena su kao himerne verzije humanog IgG1.
Tabela 7: Procenat internalizacije u naznačenom terminu (0 min postavljeno kao 0 procenata)
Iz rezultata, antitela pronalaska se brzo internalizuju u visokom procentu u poređenju sa referentnim antitelima na RPMI-8226 ćelijama (ATCC ® CCL-155™)
Primer 7: Vezivanje anti-TIM-3 antitela za izolovane humane monocite koji eksprimiraju TIM-3
CD14+ monociti su izolovani iz antikoagulisane periferne krvi zdravih donora centrifugiranjem sa gradijentom gustine pomoću fikol-paka (GE Healthcare) (vidite Opšte protokole u uputstvu za upotrebu ili posetite www.miltenyibiotec.com/protocols) i zatim pozitivnom selekcijom putem CD14 MicroBeads (CD14 mikroperlica). Prvo su ćelije CD14+ magnetno obeležene pomoću CD14 mikroperlica. Zatim je ćelijska suspenzija naneta na MACS® kolonu koja je smeštena u magnetno polje MACS separatora. Magnetno obeležene CD14+ ćelije se zadržavaju u koloni. Neobeležene ćelije prolaze, ova ćelijska frakcija je osiromašena u CD14+ ćelijama. Nakon uklanjanja kolone iz magnetnog polja, magnetno zadržane CD14+ ćelije mogu se eluirati kao pozitivno odabrana ćelijska frakcija. Posle centrifugiranja na 200 x g tokom 10 minuta na sobnoj temperaturi, monociti su sakupljeni i korišćeni direktno u testu vezivanja ili su resuspendovani u medijumu za smrzavanje (10% DMSO, 90% FCS) pri 1,0E+07 ćelija/ml i uskladišteni u tečnom azotu.
Kao što je prikazano u literaturi, monociti eksprimiraju konstitutivno TIM3 na svojoj površini. 1x105 CD14+ izolovanih humanih monocita (50 µl / bunarčiću) je stavljeno u MTP sa 98 bunarčića sa dnom u obliku slova V u sveži medijum za uzgajanje, i inkubirani su 15 minuta na RT uz Redimune® NF tečnost da se blokira nespecifično vezivanje. Dodato je 50 µl / bunarčiću otkrivenih anti-TIM3 mAb ili referentnih anti-TIM-3 mAb 344823 (R&D) i F38-2E2 (BioLegend) (10 µg/ml u medijumu za uzgajanje) i inkubirano tokom 1 sata na 4 °C. Zatim su ćelije isprane sa PBS/1%BSA i PE-obeleženi kozji-antimišji F(ab')2 sekundarnog antitela (Jackson Lab 115-006-072) su dodati tokom 1 sata na 4 °C. Nakon ispiranja i centrifugiranja, MFI signali obojenih ćelija su analizirani protočnim citometrom BD Biosciences FACSCanto.
Specifično vezivanje je izračunato na sledeći način:
Specifično vezivanje [MFI] = Geom. Srednji MFIuzorak- Geom. Srednja MFIkontrola izotipaRezultati su prikazani u Tabeli 8: (Vezivanje za humane monocite). TIM3 klonovi Tim3_0016, Tim3_0018, Tim3_0020, Tim3_0028 i Tim3_0038 vezuju se za humane monocite različitih donora čak i bolje od referentnih anti-TIM-3 Ab.
Tabela 8: Vezivanje za humane monocite
Primer 8: Vezivanje anti-TIM-3 antitela za izolovane cino monocite koji eksprimiraju TIM-3
CD14+ monociti su izolovani iz antikoagulisane periferne krvi majmuna cinomolgus (Covance) centrifugiranjem sa gradijentom gustine pomoću fikol-paka (GE Healthcare) (vidite Opšte protokole uputstvu za upotrebu ili posetite www.miltenyibiotec.com/protocols) i zatim pozitivnom selekcijom putem NHP CD14 MicroBeads (mikroperlica). Prvo su ćelije CD14+ magnetno obeležene pomoću CD14 mikroperlica. Zatim je ćelijska suspenzija naneta na MACS® kolonu koja je smeštena u magnetno polje MACS separatora. Magnetno obeležene CD14+ ćelije se zadržavaju u koloni. Neobeležene ćelije prolaze, ova ćelijska frakcija je osiromašena u CD14+ ćelijama. Nakon uklanjanja kolone iz magnetnog polja, magnetno zadržane CD14+ ćelije mogu se eluirati kao pozitivno odabrana ćelijska frakcija. Posle centrifugiranja na 200 x g tokom 10 minuta na sobnoj temperaturi, monociti su sakupljeni i korišćeni direktno u testu vezivanja ili su resuspendovani u medijumu za smrzavanje (10% DMSO, 90% FCS) pri 1,0E+07 ćelija/ml i uskladišteni u tečnom azotu.
Kao što je prikazano u literaturi, monociti eksprimiraju konstitutivno TIM3 na svojoj površini. 1x105 CD14+ izolovanih cino monocita (50 µl / bunarčiću) su stavljeni u MTP sa 98 bunarčića sa dnom u obliku slova V u svežem medijumu za uzgajanje, i inkubirani su 15 minuta na RT uz Redimune® NF tečnost da se blokira nespecifično vezivanje. Dodato je 50 µl/bunarčiću Alexa488 obeleženog anti-TIM3 (10 µg/ml u medijumu za uzgajanje ćelija) i inkubirano tokom 1 sata na 4 °C. Nakon ispiranja i centrifugiranja, MFI signali obojenih ćelija su analizirani protočnim citometrom BD Biosciences FACSCanto..
Specifično vezivanje je izračunato na sledeći način:
Specifično vezivanje [MFI] = Geom. Srednji MFIuzorak- Geom. Srednja MFIkontrola izotipaRezultati su prikazani u Tabeli 9 (Vezivanje na cino monocite). TIM3 klonovi Tim3_0016, Tim3_0018, Tim3_0026, Tim3_0028 i, Tim3_0030 se vezuju za cino monocite različitih donora majmuna cino.
Tabela 9: Vezivanje za cino monocite
Primer 9: Vezivanje anti-TIM-3 antitela za NHL i MM ćelijske linije koje eksprimiraju TIM-3
Kapacitet vezivanja otkrivenih anti-TIM3 antitela i dva klona referentnih TIM3 antitela (1) 4177 i (2) 8213 (Kyowa) je analiziran pomoću FACS. Ukratko, humane ćelije B ćelijskog limfoma koje eksprimiraju TIM3 (prikazane kao Fajferove ćelije) i ćelije multiplog mijeloma (prikazane kao RPMI-8226 ćelije) inkubirane su sa BD humanim Fc blokom 10 min na RT da se blokira nespecifično vezivanje. Zatim je 2x105 ćelija (50 µl / bunarčiću) stavljeno u MTP sa 98 bunarčića sa dnom u obliku slova V, i dodato je 50 µl / bunarčiću Alexa488 obeleženog anti-TIM3 (10 µg/ml u BD puferu za bojenje) i inkubirano tokom 1 sata na 4 °C. Nakon ispiranja i centrifugiranja, MFI signali obojenih ćelija su analizirani protočnim citometrom BD Biosciences FACSCanto.
1
Specifično vezivanje je izračunato na sledeći način:
Specifično vezivanje [MFI] = Geom. Srednji MFIuzorak- Geom. Srednja MFIkontrola izotipaRezultati su prikazani na Sl.2A i 2B (vezivanje za RPMI-8226 i Fajferove ćelije). Primer 10: Citotoksična aktivnost anti-TIM-3 antitela na TIM-3 eksprimirajućim NHL i MM ćelijama
TIM3-specifična antitela konjugovana sa pseudomonas egzotoksinom (PE 24) efikasno ubijaju ćelije koje eksprimiraju TIM3.
Citotoksična aktivnost otkrivenih anti-TIM3 antitela i jedan komercijalno dostupan anti-TIM3 referentni klon antitela 11E365 (proizvođača US Biological) analizirani su Promega CellTiter-Glo luminescentnim testom vijabilnosti ćelija. Ukratko, do 5 x10<3>(50µl/bunarčiću na ploči sa 98 bunarčića, u tri primerka) rekombinantnih CHO K1 ćelija sa stabilnom ekspresijom humanog TIM-3 ili 2 x10<4>ćelija (50 µl / bunarčiću na ploči sa 98 bunarčića, u tri primerka) ćelija humanog B ćelijskog limfoma koje eksprimiraju TIM3 (na primer, kao Fajferove ćelije) ili ćelija multiplog mijeloma (prikazane kao RPMI-8226 ćelije) dodato je 25µl/bunarčiću serijskog razblaženja 1:5 otkrivenih TIM-3 antitela sa najvišom koncentracijom od 10 µg/ml ili odgovarajućeg medijuma unetretirane ćelije ili kontrola izotipa u neciljane tretirane ćelije. Tretman se kreće od 10 µg/ml do 1 ng/ml u tri primerka. Sva antitela su korišćena kao mišje verzije Fcγ kompletne dužine. Za konjugaciju konjugacije pseudomonas egzotoksina 10 µg/ml mišjeg Fcγ fragmenta, specifični Fab konjugovani sa PE 24 su dodati i inkubirani 3 dana na 37 °C. Cikloheksimid kao poznati inhibitor sinteze proteina u eukariotama je korišćen kao pozitivna kontrola. Vijabilnost tretiranih ćelija je merena testom vijabilnosti Promega CellTiter-Glo luminescentne ćelije.
Citotoksična aktivnost je izračunata na sledeći način:
Rel. Inhibicija [%] = (1-(Euzorak- Enegativna kontrola)/(Epozitivna kontrola- Enegativna kontrola))*100 Rezultati su prikazani u Tab. 10 (Citotoksična aktivnost anti-TIM3 mAb na TIM-3 eksprimirajućim rekombinantnim, NHL i MM ćelijskim linijama u sendvič formatu).
2
Tabela 10:
Svi testirani TIM3 klonovi su vrlo potentni (IC50 u opsegu 0,01-0,2 nM) na rekombinantnim CHO K1 ćelijama koje stabilno ekspreimiraju humani TIM-3 i Fajferovim ćelijama koje eksprimiraju visoke i umerene nivoe TIM-3, i još potentnije u svojoj citotoksičnoj aktivnosti nego potentni internalizujući referentni anti-TIM-3 Ab klon 11E365, US Biological. TIM3 klonovi 0016, 0018, 0021, 0022, 0033 i 0038 su takođe potentni na RPMI-8226 ćelijama koje eksprimiraju 5 puta niži nivo TIM-3 u poređenju sa rekombinantnim CHO TIM-3 ćelijama.
Primer 11: Poređenje citotoksične aktivnosti otkrivenih anti-TIM3 antitela u odnosu na dva anti-TIM3 referentna antitela 1.7.E10 i 27-12E12 (kao što je opisano u WO2013/06490).
Citotoksična aktivnost otkrivenih anti-TIM3 antitela i dva anti-TIM3 referentna antitela, TIM3 referentna antitela 1.7E10 i 27.12E12, kao što je opisano u WO2013/06490, analizirana je pomoću Promega CellTiter-Glo testa vijabilnosti luminescentne ćelije kao što je gore opisano. Sva antitela korišćena su kao humani IgG1 format pune dužine, uključujući deo humanog Fcgama. U ovom eksperimentu, konjugacija pseudomonas egzotoksina je ostvarena pomoću specifičnih Fab humanog Fcγ fragmenta konjugovanog sa PE 24 (10 µg/ml), koji su dodavani i inkubirani tokom 5 dana na 37 °C.
Rezultati su prikazani u Tab.11. - Poređenje citotoksične aktivnosti anti-TIM3 mAb na TIM-3 eksprimirajućim NHL i MM ćelijskim linijama
Tabela 11: Poređenje citotoksične aktivnosti anti-TIM3 mAb na TIM-3 eksprimirajućim NHL i MM ćelijskim linijama
Svi otkriveni TIM3 klonovi su vrlo aktivni (IC50 u opsegu 0,02-0,08 nM) na Fajferovim i RPMI-8226 ćelijama koje eksprimiraju TIM-3, i još i potentnije u svojoj citotoksičnoj aktivnosti nego snažni internalizujući referentni anti-TIM-3 Ab klon 27-12E12. Sva antitela su upoređena sa konjugatima pseudomonas egzotoksina (PE24) koristeći isti pseudomonas egzotoksin pod istim uslovima
4
Primer 12: Citotoksična aktivnost Fab-PE24 konstrukata otkrivenih anti-TIM3 antitela na MM, NHL i AML ćelijskim linijama (koje eksprimiraju TIM3, ali ne i PSMA).
Citotoksična aktivnost je analizirana pomoću Promega CellTiter-Glo luminescentne analize vijabilnosti ćelija kao što je gore opisano. Inkubirana su serijska razblaženja 1:5 Fab fragmenata otkrivenih anti-TIM3 antitela direktno konjugovanih sa PE24 sa najvišom koncentracijom od 50 µg/ml ili odgovarajućim medijumom za netretirane ćelije ili nevezujuće anti-PSMA Fab-PE24 kontrole za neciljane tretirane ćelije, inkubirane sa 7,5x10<3>Fajferovih ćelija ili 2x10<3>RPMI-8226 ćelija (50 μl / bunarčiću na ploči sa 98 bunarčića) 4 dana na 37 °C. Tretman se kreće od 50 µg/ml do 8 ng/ml u tri primerka. Za pozitivnu kontrolu je korišćen cikloheksimid.
Rezultati su prikazani u Tab. 12. (Citotoksična aktivnost Fab-PE24 konstrukata otkrivenih anti-TIM3 antitela na MM, NHL i AML ćelijskim linijama).
Tabela 12: Citotoksična aktivnost Fab-PE24 konstrukata otkrivenih anti-TIM3 antitela na različitim MM, NHL i AML ćelijskim linijama (RPMI-8226, Karpas-299, CMK, TF-1, MOLM-13)
Svi testirani Lab-PE24 konstrukti otkrivenih anti-TIM3 antitela su vrlo potentni (IC50 u opsegu 1-10 nM) na MM (RPMI-8226) i NHL (Karpas-299) ćelijama koje eksprimiraju umeren nivo TIM-3 i pokazuju značajnu citotoksičnu aktivnost na ćelijskim linijama AML (CMK, TL-1, MOLM-13) koje eksprimiraju vrlo niske nivoe TIM-3.
Primer 13: Citotoksična aktivnost imunokonjugata (konjugati pseudomonas egzotoksina A (Fab-PE24 konstrukti)) otkrivenog anti-TIM3 na primarnim matičnim ćelijama leukemije / progenitorskim AML ćelijama kod relapsnih / refraktornih pacijenata
CD34+ ćelije iz periferne krvi relapsnih / refraktornih pacijenata dobijene su od AllCells, LLC, Alameda, CA.
Tabela 13: Kliničke karakteristike pacijenata sa AML-om
Nakon potvrđivanja čistoće i vijabilnosti svih uzoraka (opseg čistoće 84-94% i opseg vijabilnosti 95-99%), nivo ekspresije TIM-3 je procenjen putem FACS kao što je opisano u primeru 7 upotrebom anti-TIM-3 mAb 344823 (R&D). (vidi sliku 3)
Svi testirani (4/4) uzorci primarnih leukemijskih matičnih / progenitorskih (CD34+) ćelija AML relapsnih / refraktornih pacijenata pokazuju homogenu ekspresiju TIM-3 na različitim nivoima.
Za procenu citotoksične aktivnosti Fab-PE24 konstrukata otkrivenih anti-TIM3 klonova 0016 i 0022 na primarnim ćelijama CD34+ AML, 1 x10<4>ćelija (50 µl / bunarčiću na ploči sa 98 bunarčića u tri primerka) inkubirano je sa serijskim razblaženjima 1:5 Fab fragmenata sa najvećom koncentracijom od 50 µg/ml ili odgovarajućim medijumom za netretirane ćelije ili nevezujućom anti-PSMA Fab-PE24 kontrolom za neciljane tretirane ćelije 3 dana na 37 °C. Za pozitivnu kontrolu upotrebljen je cikloheksimid. Citotoksična aktivnost je analizirana pomoću Promega CellTiter-Glo testa vijabilnosti luminescentnih ćelija kao što je opisano gore u primeru 12.
Rezultati su prikazani u Tab. 14. (Citotoksična aktivnost Fab-PE24 konstrukata otkrivenih anti-TIM3 antitela na primarnim ćelijama CD34 AML).
Tabela 14: Citotoksična aktivnost Fab-PE24 konstrukata otkrivenih anti-TIM3 antitela na primarnim ćelijama CD34 AML
Fab-PE24 konstrukti anti-TIM3 antitela Tim3_0016 i Tim3_0022 su veoma potentni na primarnm uzorcima (2/4) AML (PB0142 i PB0135) (IC50 u rasponu od 30-116 nM) i pokazuju značajnu citotoksičnu aktivnost na svim (4/4) primarnim leukemijskim matičnim / progenitorskim (CD34+) ćelijama AML koje eksprimiraju različite nivoe TIM-3.
Primer 14: Poređenje potentnosti Fab-PE24 konstrukata izabranih anti-TIM3 antitela na NHL i MM ćelijskim linijama
Procena citotoksične aktivnosti sortaze vezane za Fab-PE24 konstrukte odabranih otkrivenih anti-TIM3 antitela analizirana je pomoću Promega CellTiter-Glo testa vijabilnosti luminescentnih ćelija, kao što je gore opisano u primeru 12.
Rezultati su prikazani u Tab. 15. (Citotoksična aktivnost Fab-PE24 konstrukata odabranih anti-TIM3 antitela na NHL i MM ćelijama).
Tabela 15: Citotoksična aktivnost Fab-PE24 konstrukata odabranih anti-TIM3 antitela na NHL i MM ćelijama
Visoka citotoksična potentnost je demonstrirana sa Fab-PE24 konstruktima svih odabranih otkrivenih anti-TIM3 antitela (IC50 u opsegu od 0,3-5 nM) na NHL (Fajferovim) i MM (RPMI-8226) ćelijama koje eksprimiraju umeren nivo TIM-3.
Najveća citotoksična aktivnost je primećena kod Fab-PE24 konstrukata otkrivenih antitela TIM3 Tim3_0016 i Tim3_0038.
Primer 15: Poređenje citotoksične aktivnosti konstrukta Fab-PE24 i ukupnog konjugata IgG-amatoksin istog klona otkrivenog antitela TIM-3 na Fajferovim ćelijama Procena citotoksičnih aktivnosti konjugovanog Fab-PE24 konstrukta otkrivenog anti-TIM3 klona 0016 u odnosu na ukupni IgG istog klona konjugovanog sa amatoksinom (prema postupcima opisanim u WO2012/041.504 (konjugovanim putem 6’ C-atoma aminokiseline 4 amatoksina, posebno putem atoma kiseonika vezanog za 6’ C-atom aminokiseline amatoksina, i pri čemu je TIM3 antitelo povezano linkerom preko ostatka uree) analizirana je pomoću Promega CellTiter-Glo testa vijabilnosti luminescentnih ćelija kao što je opisano gore u primeru 12.
Rezultati su prikazani u Tab.16. (Citotoksična aktivnost konstrukta Fab-PE24 u odnosu na ukupni konjugat IgG-amatoksin anti-TIM3 klona 0016 na NHL ćelijama).
Tabela 16: Citotoksična aktivnost konstrukta Fab-PE24 u odnosu na konjugat ukupni IgG-amatoksin anti-TIM3 klona 0016 na NHL ćelijama
Citotoksična aktivnost anti-TIM-3 klona konjugovanog sa amanitinom (IC500,8 nM) je uporediva sa citotoksičnom aktivnošću konstrukta Fab-PE24 istog klona (IC500,3 nM) na NHL (Fajferovim) ćelijama koje eksprimiraju umereni nivo TIM-3.
Primer 15: Direktno poređenje vezivanja TIM3 antitela za različite mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC)
Test vezivanja
Sveže izolovani PBMC ili 3 dana poliklonski aktiviranih (anti-CD3 vezana na ploče i rastvorna anti-CD28 antitela, po 1 ug/ml, oba od BD Pharmingen) CD4 T ćelija su bojeni pomoću Alexa 647 direktno konjugovanim anti-TIM antitelima Tim3-0018, Tim3-0028 ili njihovim himerizovanim ili humanizovanim verzijama tokom 1 sata na 4 °C. Ćelije su zatim isprane da bi se eliminisala nevezana antitela i bojene površinskim markerima 30 minuta na 4 C stepena da bi se razlikovali monociti (CD14<+>(BD Pharmingen)), NK ćelije (CD16<+>(eBioscience), CD56<+>(BioLegend) i CD3-) i T ćelije (CD3<+>(eBioscience)) pre fiksiranja pomoću sredstva za fiksiranje BD Cell Fix. Ćelije su nabavljene od LSRFortessa, BD Biosciences.
Rezultati su prikazani na slikama od 4A do 4 D (na slikama su korišćene sledeće oznake: za Tim3-0018: 0018 (aTIM-3), za humanizovanu verziju Tim3-0018 Tim3-0434: 0434 (h0018), za Tim3-0028 : 0028 (aTIM-3), za himernu Tim3-0028: chi0028, za humanizovanu verziju Tim3-0028 Tim3-0438: 0438 (h0028)). Podaci pokazuju da su humanizovana antitela imala poboljšano vezivanje i specifičnost vezivanja za CD4 T-ćelije u odnosu na roditeljska antitela.
1
2
4
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
11
11
11
11
11
11
11
12
12
12
��
��
12
12
1
11
12
1
14
1
1
1
1
�

Claims (13)

PATENTNI ZAHTEVI
1. Izolovano antitelo koje se vezuje za TIM3, pri čemu antitelo sadrži
i) VH sekvencu SQ ID NO:83 i VL sekvencu SQ ID NO:84; ili
ii) VH sekvencu SQ ID NO: 85 i VL sekvencu SQ ID NO: 86.
2. Antitelo prema zahtevu 1, pri čemu antitelo sadrži
VH sekvencu SQ ID NO: 83 i VL sekvencu SQ ID NO: 84.
3. Antitelo prema zahtevu 1, pri čemu antitelo sadrži
VH sekvencu SQ ID NO: 85 i VL sekvencu SQ ID NO: 86.
4. Antitelo prema bilo kom od prethodnih zahteva, koje je IgG1 antitelo pune dužine.
5. Antitelo prema bilo kom od prethodnih zahteva, koje je IgG1 antitelo pune dužine sa mutacijama L234A, L235A i P329G (numerisanje prema Kabatovom EU indeksu).
6. Izolovana nukleinska kiselina koja kodira antitelo prema bilo kom od prethodnih zahteva.
7. Ćelija domaćin koja sadrži nukleinsku kiselinu iz otelotvorenja 6.
8. Postupak za proizvodnju antitela, uključujući uzgajanje ćelije domaćina iz otelotvorenja 7, tako da se proizvodi antitelo.
9. Postupak iz zahteva 8, koja dalje uključuje izolovanje antitela iz ćelije domaćina.
10. Imunokonjugat koji sadrži antitelo iz bilo kog od zahteva od 1 do 5 i citotoksični agens.
11. Farmaceutska formulacija koja sadrži antitelo prema bilo kom od zahteva od 1 do 5 ili imunokonjugat prema zahtevu 10 i farmaceutski prihvatljiv nosač.
12. Antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 5, ili imunokonjugat iz zahteva 10, koji se primenjuje kao lek.
13. Antitelo prema bilo kojem od zahteva 1 do 5, ili imunokonjugat iz zahteva 10, za primenu u lečenju kancera.
RS20191618A 2014-11-06 2015-11-05 Anti-tim3 antitela i postupci upotrebe RS59664B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP14192175 2014-11-06
EP15188056 2015-10-02
PCT/EP2015/075820 WO2016071448A1 (en) 2014-11-06 2015-11-05 Anti-tim3 antibodies and methods of use
EP15790559.7A EP3215532B1 (en) 2014-11-06 2015-11-05 Anti-tim3 antibodies and methods of use

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS59664B1 true RS59664B1 (sr) 2020-01-31

Family

ID=54427759

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20191618A RS59664B1 (sr) 2014-11-06 2015-11-05 Anti-tim3 antitela i postupci upotrebe

Country Status (24)

Country Link
US (6) US20160257749A1 (sr)
EP (2) EP3215532B1 (sr)
JP (1) JP6517357B2 (sr)
KR (1) KR102011205B1 (sr)
CN (1) CN107001475B (sr)
AU (1) AU2015341801B2 (sr)
CA (1) CA2964830C (sr)
DK (1) DK3215532T3 (sr)
ES (1) ES2763548T3 (sr)
HU (1) HUE047784T2 (sr)
IL (1) IL251868B (sr)
LT (1) LT3215532T (sr)
MX (1) MX374788B (sr)
MY (1) MY193661A (sr)
NZ (1) NZ731467A (sr)
PL (1) PL3215532T3 (sr)
PT (1) PT3215532T (sr)
RS (1) RS59664B1 (sr)
RU (1) RU2723708C2 (sr)
SG (1) SG11201703561QA (sr)
SI (1) SI3215532T1 (sr)
TW (1) TWI618717B (sr)
WO (1) WO2016071448A1 (sr)
ZA (1) ZA201702789B (sr)

Families Citing this family (135)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL3409278T3 (pl) 2011-07-21 2021-02-22 Sumitomo Pharma Oncology, Inc. Heterocykliczne inhibitory kinazy białkowej
JP2018510151A (ja) * 2015-03-06 2018-04-12 ソレント・セラピューティクス・インコーポレイテッド Ｔｉｍ３に結合する抗体医薬
CN107847589B (zh) 2015-04-01 2022-03-29 安奈普泰斯生物有限公司 针对t细胞免疫球蛋白和粘蛋白蛋白3(tim-3)的抗体
CN111349118B (zh) 2015-05-18 2023-08-22 住友制药肿瘤公司 具有增加的生物利用度的阿伏西地前药
SMT202100506T1 (it) 2015-10-02 2021-11-12 Hoffmann La Roche Anticorpi bispecifici specifici per pd1 e tim3
EP3458485B1 (en) 2016-05-19 2021-12-29 The General Hospital Corporation Tethered interleukin-2 to its receptor il-2rbeta, a platform to enhance natural killer and regulatory t cell activity
TWI781934B (zh) 2016-05-27 2022-11-01 美商艾吉納斯公司 抗-tim-3抗體及其使用方法
EP3468581A1 (en) 2016-06-13 2019-04-17 Torque Therapeutics, Inc. Methods and compositions for promoting immune cell function
TWI640536B (zh) 2016-06-20 2018-11-11 克馬伯有限公司 抗體
JP7027401B2 (ja) 2016-07-14 2022-03-01 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー Ｔｉｍ３に対する抗体およびその使用
JOP20190013A1 (ar) * 2016-08-25 2019-01-31 Lilly Co Eli أجسام مضادة لـ (تي آي ام -3)
BR112019003976A2 (pt) * 2016-08-26 2019-05-28 Beigene, Ltd. anticorpos anti-tim-3 e seu uso
US10738338B2 (en) 2016-10-18 2020-08-11 The Research Foundation for the State University Method and composition for biocatalytic protein-oligonucleotide conjugation and protein-oligonucleotide conjugate
BR112019008861A2 (pt) 2016-11-01 2019-07-09 Tesaro, Inc. anticorpos direcionados contra imunoglobulina de células t e proteína de mucina 3 (tim-3)
CA3042698A1 (en) 2016-11-04 2018-05-11 Aximmune, Inc. Beta-alethine, immune modulators, and uses thereof
US11279694B2 (en) 2016-11-18 2022-03-22 Sumitomo Dainippon Pharma Oncology, Inc. Alvocidib prodrugs and their use as protein kinase inhibitors
EP3551659A1 (en) * 2016-12-08 2019-10-16 Eli Lilly and Company Anti-tim-3 antibodies for combination with anti-pd-l1 antibodies
SG10201913083SA (en) 2017-01-09 2020-03-30 Tesaro Inc Methods of treating cancer with anti-tim-3 antibodies
EP3606947B1 (en) * 2017-04-03 2022-12-21 F. Hoffmann-La Roche AG Immunoconjugates of il-2 with an anti-pd-1 and tim-3 bispecific antibody
KR20190121816A (ko) 2017-04-03 2019-10-28 에프. 호프만-라 로슈 아게 항-pd-1 항체와 돌연변이 il-2 또는 il-15의 면역접합체
PL3606955T3 (pl) 2017-04-05 2025-02-24 F. Hoffmann-La Roche Ag Przeciwciała dwuswoiste swoiście wiążące się z PD1 i LAG3
AR111651A1 (es) 2017-04-28 2019-08-07 Novartis Ag Conjugados de anticuerpos que comprenden agonistas del receptor de tipo toll y terapias de combinación
WO2018229715A1 (en) 2017-06-16 2018-12-20 Novartis Ag Compositions comprising anti-cd32b antibodies and methods of use thereof
WO2018235056A1 (en) 2017-06-22 2018-12-27 Novartis Ag Il-1beta binding antibodies for use in treating cancer
KR20200019865A (ko) 2017-06-22 2020-02-25 노파르티스 아게 암 치료에 사용하기 위한 il-1베타 결합 항체
CN110785187B (zh) 2017-06-22 2024-04-05 诺华股份有限公司 针对cd73的抗体分子及其用途
WO2018237173A1 (en) 2017-06-22 2018-12-27 Novartis Ag Antibody molecules to cd73 and uses thereof
US20200223924A1 (en) 2017-06-27 2020-07-16 Novartis Ag Dosage regimens for anti-tim-3 antibodies and uses thereof
CN111163798A (zh) 2017-07-20 2020-05-15 诺华股份有限公司 用于抗lag-3抗体的给药方案及其用途
EP3658185A4 (en) 2017-07-28 2021-07-14 Phanes Therapeutics, Inc. ANTI-TIM-3 ANTIBODIES AND USES THEREOF
BR112020003362A2 (pt) 2017-08-28 2020-08-18 Bristol-Myers Squibb Company antagonistas de tim-3 para o tratamento e diagnóstico de cânceres
WO2019055579A1 (en) 2017-09-12 2019-03-21 Tolero Pharmaceuticals, Inc. TREATMENT REGIME FOR CANCERS THAT ARE INSENSITIVE TO BCL-2 INHIBITORS USING THE MCL-1 ALVOCIDIB INHIBITOR
WO2019081983A1 (en) 2017-10-25 2019-05-02 Novartis Ag CD32B TARGETING ANTIBODIES AND METHODS OF USE
US20200353050A1 (en) 2017-11-10 2020-11-12 Armo Biosciences, Inc. Compositions and methods of use of interleukin-10 in combination with immune check-point pathway inhibitors
MX2020004756A (es) 2017-11-16 2020-08-20 Novartis Ag Terapias de combinacion.
CA3083949A1 (en) 2017-11-30 2020-06-06 Novartis Ag Bcma-targeting chimeric antigen receptor, and uses thereof
TWI784063B (zh) * 2017-12-27 2022-11-21 財團法人生物技術開發中心 具有增進蛋白質表現功效的宿主細胞及其用途
CN112218651A (zh) 2018-01-08 2021-01-12 诺华公司 用于与嵌合抗原受体疗法组合的免疫增强rna
KR20250078626A (ko) 2018-01-12 2025-06-02 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 Tim3에 대한 항체 및 그의 용도
US20210363242A1 (en) 2018-01-16 2021-11-25 Bristol-Myers Squibb Company Methods of treating cancer with antibodies against tim3
US20210038659A1 (en) 2018-01-31 2021-02-11 Novartis Ag Combination therapy using a chimeric antigen receptor
EP3752203A1 (en) 2018-02-13 2020-12-23 Novartis AG Chimeric antigen receptor therapy in combination with il-15r and il15
CN110144011B (zh) * 2018-02-14 2020-06-23 上海洛启生物医药技术有限公司 针对t淋巴细胞免疫球蛋白黏蛋白3的单域抗体
US12202894B2 (en) 2018-03-20 2025-01-21 WuXi Biologics Ireland Limited Anti-TIM-3 antibodies
BR112020018539A2 (pt) 2018-03-23 2020-12-29 Bristol-Myers Squibb Company Anticorpos contra mica e/ou micb e usos dos mesmos
US20210147547A1 (en) 2018-04-13 2021-05-20 Novartis Ag Dosage Regimens For Anti-Pd-L1 Antibodies And Uses Thereof
EP3781597A1 (en) 2018-04-18 2021-02-24 Xencor, Inc. Lag-3 targeted heterodimeric fusion proteins containing il-15/il-15ra fc-fusion proteins and lag-3 antigen binding domains
KR20210003814A (ko) * 2018-04-18 2021-01-12 젠코어 인코포레이티드 IL-15/IL-15Rα Fc-융합 단백질 및 TIM-3 항원 결합 도메인을 함유하는 TIM-3 표적화 이종이량체 융합 단백질
AU2019258468B2 (en) * 2018-04-24 2023-06-29 Ampsource Biopharma Shanghai Inc. Antibody against TIM-3 and application thereof
TWI869346B (zh) 2018-05-30 2025-01-11 瑞士商諾華公司 Ｅｎｔｐｄ２抗體、組合療法、及使用該等抗體和組合療法之方法
WO2019232244A2 (en) 2018-05-31 2019-12-05 Novartis Ag Antibody molecules to cd73 and uses thereof
KR20250151605A (ko) 2018-06-01 2025-10-21 노파르티스 아게 Bcma에 대한 결합 분자 및 이의 용도
KR20210035805A (ko) 2018-06-15 2021-04-01 플래그쉽 파이어니어링 이노베이션스 브이, 인크. 세포후 신호전달 인자의 조절을 통한 면역 활성의 증가
JP7097465B2 (ja) 2018-06-19 2022-07-07 アルモ・バイオサイエンシーズ・インコーポレイテッド キメラ抗原受容体細胞療法と併用するｉｌ－１０剤の組成およびその使用方法
WO2020007240A1 (zh) * 2018-07-03 2020-01-09 上海健信生物医药科技有限公司 一种双特异性抗体及其用途
BR122022012697B1 (pt) 2018-07-10 2023-04-04 Novartis Ag Usos de derivados de 3-(5-hidróxi-1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6- diona, e kit
AR116109A1 (es) 2018-07-10 2021-03-31 Novartis Ag Derivados de 3-(5-amino-1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona y usos de los mismos
WO2020021465A1 (en) 2018-07-25 2020-01-30 Advanced Accelerator Applications (Italy) S.R.L. Method of treatment of neuroendocrine tumors
CN112566936B (zh) * 2018-08-21 2024-07-12 阿尔伯特爱因斯坦医学院 针对人tim-3的单克隆抗体
WO2020043095A1 (zh) * 2018-08-28 2020-03-05 江苏恒瑞医药股份有限公司 一种tim3抗体药物组合物及其用途
MX2021006544A (es) 2018-12-04 2021-07-07 Sumitomo Pharma Oncology Inc Inhibidores de cinasa dependiente de ciclina 9 (cdk9) y polimorfos de los mismos para uso como agentes para el tratamiento de cancer.
JP7196311B2 (ja) * 2018-12-12 2022-12-26 ウーシー バイオロジクス アイルランド リミテッド 抗ｔｉｍ－３抗体とその利用
MX2021007392A (es) 2018-12-20 2021-08-24 Novartis Ag Regimen de dosificacion y combinacion farmaceutica que comprende derivados de 3-(1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona.
CN113438961A (zh) 2018-12-20 2021-09-24 Xencor股份有限公司 含有IL-15/IL-15Rα和NKG2D抗原结合结构域的靶向异二聚体Fc融合蛋白
CA3123356A1 (en) 2018-12-20 2020-06-25 Novartis Ag Combinations of a hdm2-p53 interaction inhibitor and a bcl2 inhibitor and their use for treating cancer
AU2019406840A1 (en) 2018-12-21 2021-06-03 Novartis Ag Use of IL-1 beta antibodies in the treatment or prevention of myelodysplastic syndrome
WO2020128637A1 (en) 2018-12-21 2020-06-25 Novartis Ag Use of il-1 binding antibodies in the treatment of a msi-h cancer
US20220056123A1 (en) 2018-12-21 2022-02-24 Novartis Ag Use of il-1beta binding antibodies
MX2021007271A (es) 2018-12-21 2021-07-15 Onxeo Nuevas moleculas de acido nucleico conjugado y sus usos.
EP3897613A1 (en) 2018-12-21 2021-10-27 Novartis AG Use of il-1beta binding antibodies
CA3128368A1 (en) * 2019-02-01 2020-08-06 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Senolytic car-t cells targeting upar, a cell surface and secreted senescence biomarker
NZ778055A (en) 2019-02-12 2025-11-28 Sumitomo Pharma America Inc Formulations comprising heterocyclic protein kinase inhibitors
BR112021015783A2 (pt) 2019-02-15 2021-10-05 Novartis Ag Derivados de 3-(1-oxo-5-(piperidin-4-il)isoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona e usos dos mesmos
WO2020165834A1 (en) 2019-02-15 2020-08-20 Novartis Ag Substituted 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives and uses thereof
JP2022525149A (ja) 2019-03-20 2022-05-11 スミトモ ダイニッポン ファーマ オンコロジー， インコーポレイテッド ベネトクラクスが失敗した急性骨髄性白血病（ａｍｌ）の処置
WO2020198077A1 (en) 2019-03-22 2020-10-01 Sumitomo Dainippon Pharma Oncology, Inc. Compositions comprising pkm2 modulators and methods of treatment using the same
US20200318200A1 (en) 2019-04-02 2020-10-08 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Methods for Identifying Progression of a Primary Melanoma
EP3962493A2 (en) 2019-05-03 2022-03-09 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Methods of modulating immune activity/level of irf or sting or of treating cancer, comprising the administration of a sting modulator and/or purinergic receptor modulator or postcellular signaling factor
WO2020243568A1 (en) 2019-05-30 2020-12-03 Bristol-Myers Squibb Company Methods of identifying a subject suitable for an immuno-oncology (i-o) therapy
WO2020243563A1 (en) 2019-05-30 2020-12-03 Bristol-Myers Squibb Company Multi-tumor gene signatures for suitability to immuno-oncology therapy
CN114174537A (zh) 2019-05-30 2022-03-11 百时美施贵宝公司 细胞定位特征和组合疗法
CN114302878A (zh) 2019-07-03 2022-04-08 大日本住友制药肿瘤公司 酪氨酸激酶非受体1(tnk1)抑制剂及其用途
US20220306737A1 (en) * 2019-09-16 2022-09-29 Novartis Ag Use of high-affinity, ligand-blocking, humanized anti-t-cell immunoglobulin domain and mucin domain-3 (tim-3) igg4 antibody for the treatment of myelofibrosis
WO2021053559A1 (en) 2019-09-18 2021-03-25 Novartis Ag Entpd2 antibodies, combination therapies, and methods of using the antibodies and combination therapies
WO2021051351A1 (zh) * 2019-09-19 2021-03-25 上药生物治疗（香港）有限公司 一种分离的抗原结合蛋白及其用途
AU2020370832A1 (en) 2019-10-21 2022-05-19 Novartis Ag TIM-3 inhibitors and uses thereof
BR112022007376A2 (pt) 2019-10-21 2022-07-05 Novartis Ag Terapias de combinação com venetoclax e inibidores de tim-3
KR102330387B1 (ko) * 2019-12-03 2021-11-24 한국과학기술원 호메오단백질의 세포외 분비능 조절방법 및 이를 이용하여 세포외 분비능이 조절된 호메오단백질 변이체
EP4076434A1 (en) 2019-12-17 2022-10-26 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Combination anti-cancer therapies with inducers of iron-dependent cellular disassembly
TW202135859A (zh) 2019-12-20 2021-10-01 瑞士商諾華公司 組合療法
CA3166509A1 (en) 2020-01-14 2021-07-22 Synthekine, Inc. Biased il2 muteins methods and compositions
MX2022008763A (es) 2020-01-17 2022-07-27 Novartis Ag Combinacion que comprende un inhibidor de tim-3 y un agente hipometilante para usarse en el tratamiento del sindrome mielodisplasico o leucemia mielomonocitica cronica.
KR102572804B1 (ko) * 2020-02-25 2023-08-31 국립암센터 CD11b+ 세포에서 TIM-3의 발현 수준을 측정하는 암 진단 또는 예후 예측을 위한 정보제공 방법
WO2021175191A1 (zh) * 2020-03-02 2021-09-10 信达生物制药(苏州)有限公司 抗tim-3抗体及其用途
EP4138998A4 (en) * 2020-04-24 2024-05-22 The Administrators of The Tulane Educational Fund Compositions and methods for preventing or reducing the effects of infections by coronaviruses that bind the ace2 receptor
TW202214857A (zh) 2020-06-19 2022-04-16 法商昂席歐公司 新型結合核酸分子及其用途
WO2021260528A1 (en) 2020-06-23 2021-12-30 Novartis Ag Dosing regimen comprising 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives
US20230355804A1 (en) 2020-06-29 2023-11-09 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Viruses engineered to promote thanotransmission and their use in treating cancer
WO2022020745A1 (en) * 2020-07-23 2022-01-27 Emory University Galectin-9 specific binding agents for use in treating cancer
JP7819176B2 (ja) 2020-08-03 2026-02-24 ノバルティス アーゲー ヘテロアリール置換３－（１－オキソイソインドリン－２－イル）ピペリジン－２，６－ジオン誘導体及びその使用
IL300916A (en) 2020-08-31 2023-04-01 Bristol Myers Squibb Co Cell localization signature and immunotherapy
WO2022043557A1 (en) 2020-08-31 2022-03-03 Advanced Accelerator Applications International Sa Method of treating psma-expressing cancers
US20230338587A1 (en) 2020-08-31 2023-10-26 Advanced Accelerator Applications International Sa Method of treating psma-expressing cancers
US12577621B2 (en) 2020-09-08 2026-03-17 Duke University LRRK2 mutations as biomarkers for the prediction of immune checkpoint response in cancer
IL302569A (en) 2020-11-06 2023-07-01 Novartis Ag Cd19 binding molecules and uses thereof
WO2022120179A1 (en) 2020-12-03 2022-06-09 Bristol-Myers Squibb Company Multi-tumor gene signatures and uses thereof
TW202237119A (zh) 2020-12-10 2022-10-01 美商住友製藥腫瘤公司 Ａｌｋ﹘５抑制劑和彼之用途
WO2022146947A1 (en) 2020-12-28 2022-07-07 Bristol-Myers Squibb Company Antibody compositions and methods of use thereof
MX2023007650A (es) 2020-12-28 2023-09-11 Bristol Myers Squibb Co Metodos de tratamiento de tumores.
WO2022150788A2 (en) 2021-01-11 2022-07-14 Synthekine, Inc. Compositions and methods related to receptor pairing
AU2022218137A1 (en) 2021-02-03 2023-08-24 Mozart Therapeutics, Inc. Binding agents and methods of using the same
CA3214085A1 (en) 2021-03-31 2022-10-06 Darby Rye Schmidt Thanotransmission polypeptides and their use in treating cancer
JP2024514530A (ja) 2021-04-02 2024-04-02 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 切断型ｃｄｃｐ１に対する抗体およびその使用
TW202304979A (zh) 2021-04-07 2023-02-01 瑞士商諾華公司 抗ＴＧＦβ抗體及其他治療劑用於治療增殖性疾病之用途
US12037346B2 (en) 2021-04-13 2024-07-16 Nuvalent, Inc. Amino-substituted heteroaryls for treating cancers with EGFR mutations
CN117377692A (zh) 2021-04-23 2024-01-09 苏州逻晟生物医药有限公司 Tim-3-靶向抗体及其用途
AR125874A1 (es) 2021-05-18 2023-08-23 Novartis Ag Terapias de combinación
EP4363059A1 (en) 2021-06-29 2024-05-08 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Immune cells engineered to promote thanotransmission and uses thereof
JP2024529340A (ja) 2021-07-14 2024-08-06 シンセカイン インコーポレイテッド 新生物疾患の細胞療法に使用するための方法および組成物
JPWO2023286854A1 (sr) * 2021-07-16 2023-01-19
WO2023076876A1 (en) 2021-10-26 2023-05-04 Mozart Therapeutics, Inc. Modulation of immune responses to viral vectors
US20240294926A1 (en) 2021-12-16 2024-09-05 Valerio Therapeutics New conjugated nucleic acid molecules and their uses
US20250230242A1 (en) * 2022-03-14 2025-07-17 Nanjing Shunxin Pharmaceuticals Co., Ltd. Of Chiatai Tianqing Pharm. Group Pharmaceutical composition of anti-tim-3 antibody and hypomethylating agent
JP2025509749A (ja) 2022-03-18 2025-04-11 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー ポリペプチドの単離方法
WO2023214325A1 (en) 2022-05-05 2023-11-09 Novartis Ag Pyrazolopyrimidine derivatives and uses thereof as tet2 inhibitors
EP4531916A1 (en) 2022-06-02 2025-04-09 Bristol-Myers Squibb Company Antibody compositions and methods of use thereof
EP4598946A1 (en) 2022-10-05 2025-08-13 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Nucleic acid molecules encoding trif and additionalpolypeptides and their use in treating cancer
WO2024151687A1 (en) 2023-01-09 2024-07-18 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Genetic switches and their use in treating cancer
EP4658687A1 (en) 2023-01-31 2025-12-10 University of Rochester Immune checkpoint blockade therapy for treating staphylococcus aureus infections
CN121712571A (zh) 2023-08-15 2026-03-20 百时美施贵宝公司 陶瓷羟基磷灰石色谱流通法
WO2025068461A1 (en) 2023-09-29 2025-04-03 Negio Therapeutics Guanfacine derivatives and their use in treating cancer
WO2025068452A1 (en) 2023-09-29 2025-04-03 Negio Therapeutics Guanfacine derivatives and their use in treating cancer
WO2025132831A1 (en) 2023-12-19 2025-06-26 Universite D'aix-Marseille N-heteroaryl derivatives and uses thereof for treating cancer
US20250215087A1 (en) 2023-12-29 2025-07-03 Bristol-Myers Squibb Company Combination therapy of kras inhibitor and treg depleting agent
WO2025262250A1 (en) 2024-06-20 2025-12-26 Negio Therapeutics Guanfacine derivatives and their uses

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3020413A1 (en) * 2002-01-30 2016-05-18 The Brigham and Women's Hospital, Inc. Compositions and methods related to TIM-3, a TH1-specific cell surface molecule
MXPA06003686A (es) * 2003-10-03 2007-03-01 Brigham & Womens Hospital Ligandos tim-3 y sus metodos.
JP5569946B2 (ja) * 2009-01-26 2014-08-13 国立大学法人 岡山大学 免疫抑制剤および自己免疫疾患の予防および治療剤
ES2682078T3 (es) * 2010-06-11 2018-09-18 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Anticuerpo anti-TIM-3
WO2013006490A2 (en) * 2011-07-01 2013-01-10 Cellerant Therapeutics, Inc. Antibodies that specifically bind to tim3

Also Published As

Publication number Publication date
IL251868B (en) 2021-09-30
US20230279109A1 (en) 2023-09-07
JP6517357B2 (ja) 2019-05-22
EP3215532A1 (en) 2017-09-13
ZA201702789B (en) 2019-09-25
RU2017119543A3 (sr) 2019-06-06
RU2017119543A (ru) 2018-12-06
CA2964830C (en) 2024-01-02
AU2015341801A1 (en) 2017-04-27
BR112017008986A2 (pt) 2018-01-30
AU2015341801B2 (en) 2021-05-06
CA2964830A1 (en) 2016-05-12
CN107001475B (zh) 2021-01-29
EP3632935A1 (en) 2020-04-08
TWI618717B (zh) 2018-03-21
US20180072804A1 (en) 2018-03-15
NZ731467A (en) 2021-12-24
US20240270844A1 (en) 2024-08-15
MY193661A (en) 2022-10-24
HUE047784T2 (hu) 2020-05-28
SI3215532T1 (sl) 2020-02-28
KR102011205B1 (ko) 2019-08-14
US20190382480A1 (en) 2019-12-19
LT3215532T (lt) 2020-01-10
PT3215532T (pt) 2019-12-18
TW201629101A (zh) 2016-08-16
CN107001475A (zh) 2017-08-01
MX2017005920A (es) 2017-06-27
PL3215532T3 (pl) 2020-03-31
ES2763548T3 (es) 2020-05-29
US20220363755A1 (en) 2022-11-17
KR20170080662A (ko) 2017-07-10
MX374788B (es) 2025-03-06
WO2016071448A1 (en) 2016-05-12
JP2018503396A (ja) 2018-02-08
EP3215532B1 (en) 2019-10-23
DK3215532T3 (da) 2020-01-02
IL251868A0 (en) 2017-06-29
US20160257749A1 (en) 2016-09-08
RU2723708C2 (ru) 2020-06-17
SG11201703561QA (en) 2017-05-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240270844A1 (en) Anti-tim3 antibodies and methods of use
US20240294642A1 (en) Anti-pd1 antibodies and methods of use
US11981737B2 (en) Anti-HLA-G antibodies and use thereof
JP2017536102A (ja) 抗アルファ−シヌクレイン抗体及び使用方法
JP2019507584A (ja) 抗ミオスタチン抗体および使用方法
KR20150063565A (ko) Her3의 베타-헤어핀 및 her4의 베타-헤어핀에 결합하는 항-her3/her4 항원 결합 단백질
JP6433511B2 (ja) Ｈｅｒ３のベータヘアピンに結合する抗ｈｅｒ３抗体
JP2019518012A (ja) 修飾された抗テネイシン抗体及び使用方法
HK1241906B (zh) 抗tim3抗体及使用方法
HK1241906A1 (en) Anti-tim3 antibodies and methods of use
BR112017008986B1 (pt) Anticorpo isolado, imunoconjugado, formulação farmacêutica, e uso do anticorpo
HK1259019B (zh) 抗pd1抗体及使用方法
HK1208235A1 (en) Anti-biotin antibodies and methods of use