RS59818B1 - Novo anti-netrin-1 antitelo - Google Patents

Description

Opis

[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na netrin-1 vezujući polipeptid ili antitelo koje je korisno u izazivanju ćelijske smrti ili apoptoze tumorskih ćelija koje nose netrin-1 receptor kao što je UNC5 receptor u prisustvu netrina-1, naročito tumora koji eksprimira netrin-1, i njegovu upotrebu u lečenju kancera.

[0002] Netrin-1 je član porodice netrina i predstavlja navigacioni pokazatelj aksona, u oba, i u privlačnom i u odbojnom kontekstu i igra glavnu ulogu u razvoju nervnog sistema. Glavni receptori za netrin-1 su DCC (Deleted in Colorectal Cancer) i UNC5 (UNC5A, UNC5B, UNC5C, UNC5D kod ljudi, UNC5H1, UNC5H2, UNC5H3, UNC5H4 kod miševa), pri čemu svi oni pripadaju porodici receptora zavisnosti (Keino-Masu, 1996, Cell 87: 175-185 ; Ackermann, 1997, Nature 386: 838-842; Hong, 1999, Cell 97: 927-941; Mehlen, 1998, Nature 395: 801-804). Receptorima zavisnosti je zajednička mogućnost da izazovu apoptozu u odsustvu njihovih odgovarajućih liganda, pri čemu je ova mogućnost blokirana po vezivanju odgovarajućeg liganda (Mehlen, 2004, Cell Mol Life Sci 61: 1854-1866; Bredesen, 2005, Cell Death Differ 12: 1031-1043).

[0003] Kod raznih humanih kancera, primećeno je smanjenje ili gubitak ekspresije DCC, samim tim, i smanjenje ili gubitak apoptoze uzrokovane DCC-om (Kinzler, 1996, Proc Natl Acad Sci 100: 4173-4178). Dalje, primećeno je da su i UNC5 geni takođe nizvodno regulisani kod većine kolorektalnih tumora, što ukazuje da gubitak receptora zavisnosti UNC5 predstavlja selektivnu prednost za tumorske ćelije (Bernet, 2007, Gastroenterology 133: 180-1848; Shin, 2007, Gastroenterology 133: 1849-1857).

Međutim, ne samo da nizvodna regulacija receptora zavisnosti DCC i UNC5 pojačava preživljavanje raznih tumorskih ćelija, već je primećena i ekspresija njihovog netrin- 1 liganda. Određenije, pokazano je da većina tumora dojke, ispoljava povećanu ekspresiju netrina-1 (Fitamant, 2008, Proc Natl Acad Sci 105: 4850-4855). Do sada, pokazano je da su dva pod-domena imunoglobulina (Ig) ekstracelularnog dela UNC5 odgovorna za vezivanje netrina-1, ali nejasno je da li su oba domena neophodna za potpuno vezivanje netrina-1 (Geisbrecht, 2003, J .Biol. Chem.278 : 32561-32568 ; Kruger, 2004, J. Neur.24 : 10826-10834).

[0004] Kako je prethodno pokazano, neutralizacija netrina-1 ektodomenom DDC ili delom ovog ektodomena (koji deluje kao netrin-1 mamac protein) može da uzrokuje apoptozu u tumorskim ćelijama koje eksprimiraju receptore zavisnosti DCC i/ili UNC5 (EP-A1-1989546). Ovaj ektodomen ili deo ektodomena može da smanji metastazu ćelija kancera dojke u plućima (Fitamant et al.2008). Dalje, ovaj ektodomen ili deo ovog ektodomena se takođe pokazao da povećava procenat ćelijske smrti ćelija kancera ne-malih ćelija pluća i ćelija neuroblastoma koje eksprimiraju visoke nivoe netrina-1 (DelloyeBourgeois, 2009, J Natl Cancer Inst 101 : 237-247 ; Delloye-Bourgeois, 2009, JEM 206 : 833-847). WO2012025618 opisuje DCC-fuzione proteine koje imaju poboljšan DCC mamac.

[0005] EP 1989546 (WO2007099133) opisuje monoklonalna ili poliklonalna antitela usmerena specifično protiv netrina-1 ili netrin-1 receptora, naročito usmerenih na ekstracelularni domen netrin-1 receptora ili na netrin-1 fragment koji može da stupi u interakciju sa ekstracelularnim domenom pomenutih receptora netrina-1, kao lek. FR2878165 opisuje sekvencu (SEQ ID NO 164) koja odgovara ostacima 341-396 (56aa) netrina-1.

[0006] Podnosilac prijave je sada odredio linearni ili suštinski linearni epitop na netrinu-1 koji verovatno odgovara specifičnom regionu vezivanja netrina-1 za receptore, određenije klase UNC5, posebno UNC5B i UNC5A, ili alternativno odgovara regionu blizu specifičnog regiona vezivanja netrina-1 za receptor koji kada se veže za antitelo sprečava interakciju netrin-1/receptor. Ovo određivanje linearnog epitopa omogućava podnosiocu prijave da proizvede antitela koja se vezuju za netrin-1 i koja se mešaju sa interakcijom netrin-1/receptori, samim tim izazivajući apoptozu ili ćelijsku smrt tumorskih ćelija koje eksprimiraju ili koje prekomerno eksprimiraju netrin-1 i najmanje jedan receptor netrina-1, zahvaljujući činjenici da ova interakcija inhibira netrin-1 koji se vezuje za receptor i multimerizaciju receptora. Podnosilac prijave je takođe proizveo mišje monoklonalno antitelo usmereno protiv ovog epitopa i njegove razne humanizovane oblike.

[0007] Aminokiselinska sekvenca pune dužine netrina-1 je data kao SEQ ID NO: 1, a cDNK koja kodira je stoga data na SEQ ID NO: 2. Linearni epitop je okarakterisan u drugom domenu netrina-1 koji je poput EGF a prikazan je na SEQ ID NO: 3 i određenije na SEQ ID NO:35. cDNK koja kodira ovaj epitop je prikazana na SEQ ID NO: 4, redom 36.

[0008] Stoga je prvi cilj ovog pronalaska polipeptid kako je definisano u zahtevima. Polipeptid predstavlja linearni epitop netrina-1 ili fragment ili varijantu pomenutog linearnog epitopa. Određenije, pronalazak se odnosi na ili opisuje:

- izolovani ili prečišćeni polipeptid sekvence SEQ ID NO: 3,

- varijantu polipeptida sa najmanje 85, 90, 95, 96, 97, 98 ili 99 % identiteta SEQ ID NO: 3, - varijantu polipeptida od najviše 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50 aminokiselina i koja obuhvata SEQ ID NO: 3 ili varijantu sekvence kako je prethodno opisano, kao što je varijanta polipeptida koja se sastoji od 22 uzastopne aminokiseline SEQ ID NO: 3 od pozicije 9 (A) do pozicije 30 (C), uključujući one aminokiseline, čija je varijanta predstavljena kao SEQ ID NO: 35,

- varijanta polipeptida koju čini najmanje 20, 25 ili 30 uzastopnih aminokiselina SEQ ID NO: 3 kao što je varijanta polipeptida sekvence SEQ ID NO: 35, ili varijanta sekvence kako je prethodno opisano,

- polipeptid sekvence SEQ ID NO: 35, ili varijanta sekvence kako je prethodno opisano,

- izolovani ili prečišćeni polipeptid koga kodira cDNK sekvenci SEQ ID NO: 4 ili 36.

[0009] Drugi predmet ovog pronalaska je cDNK kako se tvrdi u zahtevima. cDNK kodira za pomenuti polipeptid koji predstavlja linearni epitop netrina-1 ili fragment ili varijantu pomenutog linearnog epitopa. Određenije, pronalazak se odnosi na ili opisuje:

- cDNK sekvencu SEQ ID NO: 4,

- varijantu cDNK koja kodira polipeptid sekvence SEQ ID NO: 3 ili njegovu varijantu, pomoću degeneracije genetičkog koda,

- varijantu cDNK koja kodira varijantu polipeptida kako je ranije definisano, naročito cDNK koja kodira varijantu polipeptida SEQ ID NO: 35, kao što je cDNK SEQ ID NO: 36,

- varijantu cDNK koja ima najmanje 85, 90, 95, 96, 97, 98 ili 99 % identiteta od SEQ ID NO: 4 ili 36.

[0010] Prema ovom pronalasku, varijanta polipeptida može da generiše antitelo koje i dalje zadržava mogućnost da se specifično vezuje za linearni epitop na netrinu-1 i da inhibira interakciju netrina-1 za njegov receptor, naročito UNC5 ili DCC, posebno UNC5B i UNC5A, i da uzrokuje apoptozu ili ćelijsku smrt tumorske ćelije koja eksprimira ili koja prekomerno eksprimira netrin-1 i receptor netrina-1. Varijanta cDNK kodira za polipeptid SEQ ID NO: 3 ili SEQ ID NO: 35 ili za varijantu polipeptida.

[0011] Drugi cilj pronalaska je upotreba polipeptida SEQ ID NO: 3 ili 35 ili njegove varijante, da bi se proizvelo monoklonalno antitelo, a tako proizvedena monoklonalna antitela takođe predstavljaju cilj ovog pronalaska. Stručnjak je svestan postupaka koji omogućavaju proizvodnju monoklonalnih antitela, upotrebom tehnike plazmocita i hibridoma. Pronalazak obuhvata upotrebu ovih postupaka da bi se proizvela antitela specifično usmerena na polipeptid SEQ ID NO: 3 ili 35 ili njegovu varijantu. U područje ovog pronalaska se ubraja i proizvodnja polipeptida ili monoklonalnih antitela putem genetskog inženjeringa na osnovu sekvenci nukleinske kiseline koje kodiraju za specifični polipeptid ili antitelo, zahvaljujući određivanju i opisu CDR-a VH i VL. U područje ovog pronalaska se takođe ubraja obezbeđivanje fragmenata antitela i/ili humanizovanih antitela ili fragmenata antitela sa varijabilnim regionom specifičnim za linearni epitop pronalaska, fragment ili njegovu varijantu. Pojam "vezujući polipeptid" se ovde upotrebljava da obuhvati antitela i varijante antitela, fragmente i kombinaciju koji održavaju funkciju vezivanja antitela.

[0012] Ovaj pronalazak se takođe odnosi na netrin-1 vezujuće monoklonalno antitelo koje se specifično vezuje za polipeptid sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 3 ili 35 ili njegovu varijantu kako je definisano u zahtevu 8. Vezujuće monoklonalno antitelo ima svojstvo vezivanja za netrin-1 i uzrokuje ćelijsku smrt ili apoptozu tumorske ćelije preko UNC5 ili DCC receptora. Činjenica je da slobodni ili aktivni netrin-1 ne postoji više ili je na nedovoljnom nivou, tako da se aktivira signaliziranje apoptoze receptora netrina-1.

[0013] Ovaj pronalazak se takođe odnosi na netrin-1 vezujuće monoklonalno antitelo koje je definisano svojim regionom(ima) za određivanje komplementarnosti (CDR(ovi)), pri čemu vezujuće monoklonalno antitelo ima svojstvo vezivanja za netrin-1 i izazivanja ćelijske smrti ili apoptoze tumorske ćelije preko UNC5 ili DCC receptora.

[0014] Ovaj pronalazak se bavi antitelom ili njegovim epitop-vezujućim fragmentom.

[0015] Upotrebom IMGT definicije, ovaj pronalazak opisuje netrin-1 vezujući polipeptid koji obuhvata jedan ili više regiona za određivanje komplementarnosti (CDR) sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 7 (CDR3-H), SEQ ID NO: 9 (CDR3-L), i poželjno obe.

[0016] Određenije, polipeptid dalje može biti definisan dodatnim prisustvom CDR1, CDR2 ili CDR1 i CDR2 VH i/ili VL. Stoga, polipeptid može da obuhvati jedan ili više CDR(ova) sa aminokiselinskim sekvencama SEQ ID NO: 7 i SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7 i SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 9 i sekvencu YAS; i/ili SEQ ID NO: 9 i SEQ ID NO: 8.

[0017] Pronalazak opisuje polipeptid koji obuhvata CDR1-H sekvence SEQ ID NO: 5, CDR2-H sekvence SEQ ID NO: 6, CDR3-H sekvence SEQ ID NO: 7.

[0018] Pronalazak opisuje polipeptid koji obuhvata CDR1-L sekvence SEQ ID NO: 8, CDR2-L sekvence YAS i CDR3-L sekvence SEQ ID NO: 9.

[0019] Monoklonalno antitelo prema pronalasku obuhvata CDR1-H sekvence SEQ ID NO: 5, CDR2-H sekvence SEQ ID NO: 6, CDR3-H sekvence SEQ ID NO: 7, CDR1-L sekvence SEQ ID NO: 8, CDR2-L sekvence YAS i CDR3-L sekvence SEQ ID NO: 9.

[0020] Upotrebom Kabat definicije ovaj pronalazak samim tim opisuje netrin-1 vezujući polipeptid koji obuhvata jedan ili više regiona za određivanje komplementarnosti (CDR) sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 30 (CDR3-H), SEQ ID NO: 9 (CDR3-L), i poželjno obe.

[0021] Određenije, polipeptid dalje može biti definisan dodatnim prisustvom CDR1, CDR2 ili CDR1 i CDR2 VH i/ili VL. Stoga, polipeptid može da obuhvati jedan ili više CDR(ova) sa aminokiselinskim sekvencama SEQ ID NO: 30 i SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 30 i SEQ ID NO: 29; SEQ ID NO: 9 i SEQ ID NO: 32; i/ili SEQ ID NO: 9 i SEQ ID NO: 31.

[0022] Pronalazak opisuje polipeptid koji obuhvata CDR1-H sekvence SEQ ID NO: 28, CDR2-H sekvence SEQ ID NO: 29, CDR3-H sekvence SEQ ID NO: 30.

[0023] Pronalazak opisuje polipeptid koji obuhvata CDR1-L sekvence SEQ ID NO: 31, CDR2-L sekvence SEQ ID NO: 32 i CDR3-L sekvence SEQ ID NO: 9.

[0024] Monoklonalno antitelo prema pronalasku obuhvata CDR1-H sekvence SEQ ID NO: 28, CDR2-H sekvence SEQ ID NO: 29, CDR3-H sekvence SEQ ID NO: 30, CDR1-L sekvence SEQ ID NO: 31, CDR2-L sekvence SEQ ID NO: 32 i CDR3-L sekvence SEQ ID NO: 9.

[0025] Ovi polipeptidi predstavljaju netrin-1 vezujuće polipeptide, pri čemu vezujući polipeptid ima svojstvo vezivanja za netrin-1 i izaziva ćelijsku smrt ili apoptozu tumorske ćelije putem UNC5 ili DCC receptora. Ovi polipeptidi su poželjno antitela, naročito monoklonalna antitela. Razni oblici vezujućih polipeptida ili antitela (uključujući njihove fragmente i kombinacije) će biti opisani kasnije u nastavku.

[0026] U prvoj seriji načina ostvarivanja, polipeptid ili antitelo prema pronalasku obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 10, 11, 12 ili 13. Obično, obuhvata obe sekvence SEQ ID NO: 10 i 11, ili SEQ ID NO: 12 i 13.

[0027] U drugoj seriji načina ostvarivanja, polipeptid ili antitelo je humanizovano i obuhvata aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe SEQ ID NO: 14 do 19 i/ili iz grupe SEQ ID NO: 20 do 27. Obično, polipeptid ili antitelo je humanizovano i obuhvata aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe SEQ ID NO: 14 do 19 i aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe SEQ ID NO: 20 do 27.

[0028] Specifični načini ostvarivanja predstavljaju sledeća humanizovana antitela. Prvi navedeni u ovoj tabeli odgovara kalemljenju mišjih CDR-ova u humani IgG1. Ostala koja se nazivaju HUM predstavljaju monoklonalna antitela koja imaju varijabilne regione humanog okvira. Tabela takođe daje referencu za CH i CL humanog IgG1. Drugi alotipovi mogu takođe da se koriste.

[0029] Drugi cilj pronalaska je farmaceutska kompozicija koja obuhvata najmanje jedan netrin-1 vezujući polipeptid ili antitelo prema pronalasku i farmaceutski prihvatljiv nosač ili ekscipijens. U jednom načinu ostvarivanja, polipeptid ili antitelo je humanizovano.

[0030] Pronalazak opisuje postupak lečenja kancera pri čemu je subjektu, kom je to potrebno, data terapeutski efektivna količina farmaceutske kompozicije koja obuhvata najmanje jedan netrin-1 vezujući polipeptid ili antitelo prema pronalasku i farmaceutski prihvatljiv nosač ili ekscipijens. U jednom načinu ostvarivanja, polipeptid ili antitelo je humanizovano.

[0031] Stoga kompozicija i postupak mogu da obuhvate bilo koju od karakteristika ili kombinaciju karakteristika kako je opisano u pogledu polipeptida ili antitela kako je ovde opisano.

[0032] Prema karakteristici, kancer predstavlja onaj kancer gde tumorske ćelije eksprimiraju ili prekomerno eksprimiraju receprot netrina-1, naročito klase UNC5, naročito UNC5B i/ili UNC5A, i/ili DCC. Obično tumorske ćelije izbegavaju receptor netrina-1 koji je povezan sa apoptozom zahvaljujući vezivanju netrina-1 za pomenuti receptor, određenije klase UNC5, naročito UNC5B i/ili UNC5A, i/ili DCC, u prisustvu netrina-1. Prema karakteristici, kancer je onaj gde tumorske ćelije ili ćelije strome eksprimiraju ili prekomerno eksprimiraju netrin-1.

[0033] Neki načini ostvarivanja kancera uključuju kancer dojke sa metastazom, kancer ne-malih ćelija pluća, agresivni neuroblastom, adenokarcinom pankreasa, primarni melanom, metastazu melanoma, kancere jajnika, glioblastom, akutnu mijeloidnu leukemiju, hroničnu limfocitnu leukemiju, agresivni limfom B-ćelija, sarkom, adenokarcinom bubrega, kancere glave i vrata, kancere testisa (npr. embrionalni karcinom, teratom, tumori žumančane kese), kancere bubrega, kancere želuca, kancere uterusa.

[0034] Postupci određivanja, bilo da data ćelija eksprimira receptore zavisnosti DCC i/ili UNC5 netrina-1 na površini ili pokazuje značajnu uzvodnu regulaciju ekspresije gena netrina-1, su dobro poznati u tehnici i obuhvataju, ali bez ograničenja na, IHC (imunohistohemija) FACS-a (sortiranje ćelija aktivirano fluorescencijom), kvantitativni PCR (npr. sa cDNK premazanom heksamerom) ili alternativno Vestern Blot metodu sparenu sa hromogenskim tehnikama za detektovanje proteina na osnovu boje (kao što su coomassie bojenje srebrnom ili plavom) ili postupci za detektovanje proteina u rastvorima i na gelovima, blotovima i mikropločicama na osnovu fluorescencije i luminescencije, kao što su imunološko bojenje, kao i imunoprecipitacija, ELISA, mikropločice, i masena spektrometrija. U kontekstu ovog pronalaska, primeri za kancere koje bi trebalo lečiti su ovde navedeni uključujući refraktorne verzije bilo kog od pomenutih kancera. Prekomerno eksprimiranje netrina-1 može stoga da se izmeri putem RT-PCR upotrebom prikladnih primera kao što su oni opisani i obezbeđeni ovde, u pogledu normalnog tkiva ili sličnog kancera koji ne eksprimira prekomerno netrin-1.

[0035] U jednom načinu ostvarivanja pronalaska, kompozicije i upotrebe su za lečenje kancera koji eksprimiraju ili prekomerno eksprimiraju netrin-1, pri čemu je ovo eksprimiranje ili prekomerno eksprimiranje povezano sa samim kancerom, ili je uzrokovano samim lečenjem hemoterapeutskim lekom, ili sa oboje.

[0036] Pronalazak opisuje postupak kombinovanog antikancerskog lečenja koje obuhvata davanje pacijentu, kom je to potrebno, hemoterapeutskog leka i polipeptida ili antitela kako je ovde opisano. Hemoterapeutski lek i polipeptid ili antitelo su u efektivnoj količini.

[0037] Drugi cilj pronalaska je kompozicija koja obuhvata polipeptid ili antitelo kako je ovde opisano za upotrebu u obliku antikancerskog leka koji bi trebalo da se koristi u kombinaciji sa hemoterapeutskim lekom kod pacijenta. Pronalazak se takođe odnosi na kompoziciju koja obuhvata polipeptid ili antitelo kako je ovde opisano za upotrebu u funkciji antikancerskog leka kod pacijenta koji se leči hemoterapeutskim lekom.

[0038] Drugi predmet pronalaska je kompozicija koja obuhvata hemoterapeutski lek za upotrebu u funkciji antikancerskog leka koji bi trebalo upotrebljavati kod pacijenta u kombinaciji sa polipeptidom ili antitelom kako je ovde opisano. Pronalazak se takođe odnosi na kompoziciju koja obuhvata hemoterapeutski lek za upotrebu antikancerskog leka kod pacijenta koji je lečen polipeptidom ili antitelom kako je ovde opisano.

[0039] Drugi cilj pronalaska je kompozicija ili komplet delova koji obuhvata hemoterapeutski lek i polipeptid ili antitelo kako je ovde opisano, za simultanu, odvojenu ili sekvencijalnu primenu kod pacijenta.

[0040] Drugi predmet pronalaska je kompozicija ili komplet delova koji obuhvata hemoterapeutski lek i polipeptid ili antitelo kako je ovde opisano, za simultanu, odvojenu ili sekvencijalnu primenu kod pacijenta, za upotrebu u funkciji antikancerskog leka ili antikancerskog lečenja.

[0041] Drugi predmet pronalaska je kompozicija koja obuhvata hemoterapeutski lek i polipeptid ili antitelo kako je ovde opisano, u farmaceutski prihvatljivom nosiocu ili nosaču.

[0042] Drugi predmet pronalaska je kompozicija koja obuhvata hemoterapeutski lek i polipeptid ili antitelo kako je ovde opisano, u farmaceutski prihvatljivom nosiocu ili nosaču, za upotrebu u funkciji antikancerskog leka.

[0043] Opet drugi predmet je upotreba polipeptida ili antitela kako je ovde opisano za pripremu antikancerskog leka čija je namena kombinovano lečenje pacijenta sa hemoterapeutskim lekom.

[0044] Opet drugi predmet je upotreba hemoterapeutskog leka za pripremu antikancerskog leka čija je namena kombinovano lečenje pacijenta polipeptidom ili antitelom kako je ovde opisano.

[0045] Opet drugi predmet je upotreba polipeptida ili antitela kako je ovde opisano i hemoterapeutskog leka za pripremu kombinovanog antikancerskog leka.

[0046] Opet drugi predmet je upotreba polipeptida ili antitela kako je ovde opisano i hemoterapeutskog leka za pripremu kombinovane kompozicije antikancerskog leka ili kompleta delova, za simultanu, odvojenu ili sekvencijalnu primenu kod pacijenta.

[0047] U skladu sa karakteristikom pronalaska i kako je dalje objašnjeno u nastavku, hemoterapeutski lek je lek koji izaziva prekomerno eksprimiranje netrina-1 u ćelijama kancera a polipeptid ili antitelo kako je ovde opisano promoviše apoptozu izazvanu receptorima netrina-1 ili ćelijsku smrt uprkos prekomernom eksprimiranju.

[0048] Hemoterapeutski lek određenije predstavlja lek koji izaziva prekomerno eksprimiranje netrina-1 u ćelijama kancera. Određivanje da lek može da izazove prekomerno eksprimiranje netrina-1 može lako da se sprovede na bilo kojoj ćeliji kancera, kao što je ćelijska linija ili ćelije iz biopsije. U jednom načinu ostvarivanja, ispitivanje se izvodi na ćelijama iz kancera koji bi trebalo da se leči, na primer iz biopsije. U drugom načinu ostvarivanja, ispitivanje se izvodi na ćeliji, kao što je ćelijska linija, koja je predstavnik kancera koji bi trebalo da se leči. U drugom načinu ostvarivanja, ispitivanje se radi na A549 ili H460 ćelijskoj liniji. Ispitivanje može da obuhvati poređenje ekspresije gena netrina-1 između ćelija lečenih hemoterapeutskim lekom i nelečenih ćelija. Eksprimiranje može da se izmeri pomoću PCR, naročito kvantitativnog RT-PCR, na primer upotrebom prajmera opisanih i datih u ovom opisu (SEQ ID NO: 33 i 34) kako je opisano u celokupnom sadržaju WO2014041088 na koji stručnjak može da se pozove.

Klasifikacija leka u porodici onih koji izazivaju ovo prekomerno eksprimiranje može jednostavno da se izvede u skladu sa metodom opisanom u sledećem materijalu i metodi na A549 ili H460 ćelijskoj liniji, kako WO2014041088 opisuje .

[0049] Hemoterapeutski lek je naročito citotoksičan lek. U nekim poželjnim načinima ostvarivanja, taj lek je doksorubicin, 5-fluorouracil (5FU), paclitaksel (npr. Taxol), ili cisplatin.

[0050] U jednom načinu ostvarivanja, lek je citotoksični antibiotik. Citotoksični antibiotik može da bude aktinomicin, antraciklin, bleomicin, plicamicin ili mitomicin. Antraciklin može da bude doksorubicin, daunorubicin, valrubicin, idarubicin ili epirubicin.

[0051] U jednom načinu ostvarivanja, lek je alkilišuće sredstvo. Alkilišuće sredstvo može biti derivat platine, kao što je cisplatin, karboplatin, oksaliplatin ili druga alkilišuća sredstva kao što su ciklofosfamid, ifosfamid, melfalan, tiotep. Druge klase uključuju-epipodofilotoksine, npr. etopozid, inhibitore topoizomeraze (kamptotekini), npr. irinotekan, topotekan, alkilišuća sredstva za manju brazdu DNK, npr. Trabectedin (YONDELIS), metotreksat, pemtreksed, raltitreksed.

[0052] U jednom načinu ostvarivanja, lek je taksan ili druga ciljna sredstva tubulina. Taksan može biti paclitaksel ili docetaksel, ili eribulin (skoro odobren za kancer dojke).

[0053] U jednom načinu ostvarivanja, lek je antineoplastično sredstvo kao što su :

- sredstva za hormonsku terapiju kancera dojke: npr. tamoksifen, letrozol, anastrozol, eksemestan, fazlodeks;

- sredstva za hormonsku terapiju kancera prostate:npr. LHRH agonisti, bicalutamid, abirateron;

- monoklonalna antitela : npr. cetuksimab, panitumumab, bevacizumab;

- inhibitori kinaze : npr. imatinib, nilotinib, dasatinib, erlotinib, gefitinib, afatinib, sunitinib, sorafenib, pazopanib, crizotinib, aksitinib.

[0054] Definicije i dalji načini ostvarivanja, varijante i alternative pronalaska:

Kako se ovde upotrebljava, sekvenca "najmanje 85% identična referentnoj sekvenci" predstavlja sekvencu koja je, celom svojom dužinom, 85%, ili više, određenije 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% ili 100% identična celoj dužini referentne sekvence.

[0055] Procenat "identičnosti sekvence" može da se odredi poređenjem dve sekvence, koje su optimalno poravnane iznad prozora za poređenje, pri čemu deo polipeptidne sekvence u prozoru za poređenje može da obuhvati dodavanja ili brisanja (tj. praznine) u poređenju sa referentnom sekvencom (koja ne obuhvata dodavanja ili brisanja) za optimalno poravnanje dve sekvence. Procenat se računa određivanjem broja pozicija na kojima se javlja identičan aminokiselinski ostatak da bi se dobio broj sparenih pozicija, deleći broj sparenih pozicija sa ukupnim brojem pozicija u prozoru za poređenje i množenjem rezultata sa 100 da bi se dobio procenat identičnosti sekvenci. Optimalno poravnanje sekvenci radi poređenja se izvodi globalnim poravnanjem po parovima, npr. upotrebom Nidlmen-Vanšovog algoritma (1970) J. Mol. Biol.48: 443. Procenat identičnosti sekvence može odmah da se odredi na primer upotrebom programa Needle, sa BLOSUM62 matricom, i sledećim parametrima praznina-otvorena=10, praznina-produžetak=0.5.

[0056] U kontekstu pronalaska, "konzervativna supstitucija aminokiseline" je ona u kojoj je aminokiselinski ostatak supstituisan drugim aminokiselinskim ostatkom koji ima grupu bočnog lanca sa sličnim hemijskim svojstvima (npr., punjenje ili hidrofobičnost). Generalno, konzervativna supstitucija aminokiseline suštinski neće promeniti funkcionalna svojstva proteina. Primeri aminokiselinskih grupa koje imaju bočne lance sličnih hemijskih svojstava uključuju 1) alifatične bočne lance: glicin, alanin, valin, leucin, i izoleucin; 2) alifatične-hidroksil bočne lance: serin i treonin; 3) bočne lance koji sadrže amid: asparagin i glutamin; 4) aromatične bočne lance: fenilalanin, tirozin, i triptofan; 5) bazne bočne lance: lizin, arginin, i histidin; 6) kisele bočne lance: aspartsku kiselinu i glutaminsku kiselinu; i 7) bočne lance koji sadrže sumpor: cistein i metionin. Grupe konzervativnih supstitucija aminokiselina su: valin-leucinizoleucin, fenilalanin-tirozin-triptofan, lizin-arginin, alanin-valin, glutamat-aspartat, i asparagin-glutamin.

[0057] Kroz ovu prijavu, pojam "obuhvata" bi trebalo tumačiti kao da obuhvata sve specifično pomenute karakteristike kao i one opcione, dodatne, nenaznačene. Kako se ovde upotrebljava, korišćenje pojma "obuhvata" takođe opisuje način ostvarivanja pri čemu nije prisutna ni jedna druga karakteristika osim onih specifično pomenutih (tj. "sastoji se od").

[0058] "Antitelo" može biti prirodno ili konvencionalno antitelo u kome su dva teška lanca međusobno povezana drugim disulfidnim vezama a svaki teški lanac je povezan sa lakim lancem disulfidnom vezom. Postoje dva tipa lakog lanca, lambda (λ) i kapa (κ). Postoji pet glavnih klasa teških lanaca (ili izotipova) koji određuju funkcionalnu aktivnost molekula antitela: IgM, IgD, IgG, IgA i IgE. Svaki lanac sadrži različite domene sekvence. Laki lanac uključuje dva domena ili regiona, varijabilni domen (VL) i konstantni domen (CL). Teški lanac uključuje četiri domena, varijabilni domen (VH) i tri konstantna

1

domena (CH1, CH2 i CH3, zajednički označeni kao CH). Varijabilni regioni i lakih (VL) i teških (VH) lanaca određuju prepoznavanje vezivanja i specifičnost za antigen. Domeni konstantnog regiona lakih (CL) i teških (CH) lanaca dodeljuju Fc receptorima (FcR) važna biološka svojstva kao što je udruživanje lanaca antitela, sekrecija, transplacentna mobilnost, komplementno vezivanje, i vezivanje za Fc receptore (FcR). Fv fragment je deo N-kraja Fab fragmenta imunoglobulina i čine ga varijabilni delovi jednog lakog lanca i jednog teškog lanca. Specifičnost antitela leži u strukturnoj komplementarnosti između mesta koje kombinuje antitelo i antigenske determinante. Mesta koja kombinuju antitelo su napravljena od ostataka koji su prevashodno od hipervarijabilnih ili regiona određivanja komplementarnosti (CDR-ova). Povremeno, ostaci iz regiona koji nisu hipervarijabilni ili iz okvirnih regiona (FR) utiču na celokupnu strukturu domena i samim tim i na mesto kombinovanja.

[0059] "Regioni određivanja komplementarnosti" ili "CDR-ovi" se odnose na aminokiselinske sekvence koje zajedno definišu afinitet vezivanja i specifičnost prirodnog Fv regiona nativnog mesta vezivanja imunoglobulina. Svaki i laki i teški lanac imunoglobulina ima tri CDR-ova, označena sa CDR1-L, CDR2-L, CDR3-L i CDR1-H, CDR2-H, CDR3-H, redom. Konvencionalno antitelo antigen-vezujuće mesto, stoga, uključuje šest CDR-ova, koji obuhvataju CDR set od svakog V regiona i teškog i lakog lanca.

[0060] "Okvirni regioni" (FR-ovi) se odnose na aminokiselinske sekvence umetnute između CDR-ova, tj. na one delove varijabilnih regiona lakog i teškog lanca imunoglobulina koji su relativno konzervirani među različitim imunoglobulinima u jednoj vrsti. Svaki, i laki i teški lanac imunoglobulina ima četiri FR-ova, označenih sa FR1-L, FR2-L, FR3-L, FR4-L, i FR1-H, FR2-H, FR3-H, FR4-H, redom.

[0061] Kako se ovde upotrebljava, "humani okvirni region" predstavlja okvirni region koji je suštinski identičan (oko 85%, ili više, određenije 90%, 95%, 97%, 99% ili 100%) sa okvirnim regionom humanog antitela koje se prirodno javlja.

[0062] U kontekstu pronalaska, CDR/FR definicija u lakom ili teškom lancu imunoglobulina se određuje na osnovu IMGT definicije (Lefranc et al. (2003) Dev Comp Immunol.27(1):55-77; www.imgt.org).

[0063] Kako se ovde upotrebljava, pojam "antitelo" označava konvencionalna antitela i njihove fragmente, kao i antitela jednog domena i njihove fragmente, određenije varijabilni teški lanac antitela jednog domena, i himerna, humanizovana, bispecifična ili multispecifična antitela.

[0064] Kako se ovde upotrebljava, antitelo ili imunoglobulin takođe uključuje "antitela jednog domena" koja su opisana u novije vreme i koja predstavljaju antitela čiji regioni određivanja komplementarnosti predstavljaju deo polipeptida jednog domena. Primeri antitela jednog domena uključuju teški lanac antitela, antitela koja prirodno nemaju lake lance, antitela jednog domena dobijena iz konvencionalnih antitela od četiri lanca, konstruisana antitela jednog domena. Antitela jednog domena mogu da se dobiju od bilo koje vrste uključujući, ali bez ograničenja na miša, čoveka, kamilu, lamu, kozu, zeca i govedo. Antitela jednog domena mogu biti antitela jednog domena koja se prirodno javljaju poznata kao antitelo teškog lanca koje nema lake lance. Određenije, vrsta Camelidae, na primer kamila, dromedar, lama, alpaka i gvanako, proizvode teški lanac antitela koja prirodno nemaju laki lanac. Antitelima teškog lanca kamilaida takođe nedostaje CH1 domen.

[0065] Varijabilni teški lanac ovih antitela jednog domena koja nemaju lake lance su poznati u tehnici kao "VHH" ili "nanotelo". Slično konvencionalnim VH domenima, VHH-ovi sadrže četiri FR-ova i tri CDR-ova. Nanotela imaju prednost u odnosu na konvencionalna antitela: ona su oko deset puta manja od IgG molekula, i kao posledica toga funkcionalna nanotela savijena na pravi način mogu da nastanu in vitro ekspresijom pri tom postižući visok prinos. Dalje, nanotela su veoma stabilna, i otporna na delovanje proteaza. Svojstva i proizvodnju nanotela su pregledali Harmsen i De Haard (Harmsen and De Haard (2007) Appl. Microbiol. Biotechnol.77:13-22).

[0066] Pojam "monoklonalno antitelo" ili "mAb" kako se ovde upotrebljava se odnosi na molekul antitela jedne aminokiselinske kompozicije koja je usmerena protiv specifičnog antigena, i ne treba je tumačiti kao traženu proizvodnju antitela bilo kojom posebnom metodom. Monoklonalno antitelo može da se proizvede jednim klonom B ćelija ili hibridomom, ali takođe može da bude i

rekombinantno, tj. proizvedeno konstruisanjem proteina.

[0067] "Fragmenti" (konvencionalnih) antitela obuhvataju deo intaktnog antitela, određenije antigen vezujući region ili varijabilni region intaktnog antitela. Primeri fragmenata antitela uključuju Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, (dsFv)2, scFv, sc(Fv)2, dijatela, bispecifična i multispecifična antitela formirana od fragmenata antitela. Fragment konvencionalnog antitela takođe može da bude i antitelo jednog domena, kao što je antitelo teškog lanca ili VHH.

[0068] Pojam "Fab" označava fragment antitela molekulske mase od oko 50,000 Da i antigen vezujuću aktivnost, u kojoj oko pola strane N-kraja H lanca i ceo L lanac, među fragmentima dobijenim tretiranjem IgG proteazom, papainom, su povezani zajedno disulfidnom vezom.

[0069] Pojam "F(ab')2" se odnosi na fragment antitela molekulske mase od oko 100,000 Da i antigen vezujuću aktivnost, koja je blago veća od Fab-a koji je disulfidnom vezom vezan za zglobni region, među fragmentima dobijenim tretiranjem IgG proteazom, pepsinom.

[0070] Polipeptid jednog lanca Fv ("scFv") je kovalentno povezan sa VH::VL heterodimerom koji je obično eksprimiran iz fuzije gena uključujući VH i VL koji kodiraju gene povezane veznikom koji kodira peptid. Humani scFv fragment pronalaska uključuje CDR-ove koji se drže u odgovarajućoj konformaciji, određenije upotrebom tehnika rekombinacije gena. Dvovalentni i multivalentni fragmenti antitela mogu da formiraju ili spontano združivanjem jednovalentnih scFv-ova, ili mogu da budu generisani kuplovanjem jednovalentnih scFv-ova peptidnim veznikom, kao što je dvovalentni sc(Fv)2.

[0071] "dsFv" predstavlja VH::VL heterodimer stabilizovan disulfidnom vezom.

[0072] "(dsFv)2" označava dva dsFv kuplovana peptidnim veznikom.

[0073] Pojam "bispecifično antitelo" ili "BsAb" označava antitelo koje kombinuje antigen-vezujuća mesta dva antitela unutar jednog molekula. Stoga, BsAb-ovi istovremeno mogu da vežu dva različita antigena.

Genetski inženjering je sve češće korišćen da bi se dizajnirala, modifikovala, i proizvodila antitela ili derivati antitela sa željenim setom svojstava vezivanja i funkcija efektora kako je na primer opisano u EP 2 050764 A1.

[0074] Pojam "multispecifično antitelo" označava antitelo koje kombinuje antigen-vezujuća mesta dva ili više antitela unutar jednog molekula.

[0075] Pojam "dijatela" se odnosi na male fragmente antitela sa dva antigen-vezujuća mesta, pri čemu fragmenti obuhvataju varijabilni domen teškog lanca (VH) povezan sa varijabilnim domenom lakog lanca (VL) u istom polipeptidnom lancu (VH-VL). Upotrebom veznika koji je prekratak da omogući sparivanje između dva domena na istom lancu, pri čemu su ti domeni prinuđeni da se sparuju sa komplmentarnim domenima drugog lanca i da kreiraju dva antigen-vezujuća mesta.

[0076] U određenom načinu ostvarivanja, epitop-vezujući fragment je izabran iz grupe koju čine Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, (dsFv)2, scFv, sc(Fv)2, dijatela i VHH.

[0077] "Himerno antitelo", kako se ovde upotrebljava, je antitelo u kojem je konstantni region, ili njegov deo izmenjen, zamenjen, ili razmenjen, tako da je varijabilni region povezan sa konstantnim regionom različite vrste, ili pripada drugoj klasi ili podklasi antitela. "Himerno antitelo" se takođe odnosi na antitelo u kojem je varijabilni region, ili njegov deo, izmenjen, zamenjen, ili razmenjen, tako da je konstantni region povezan sa varijabilnim regionom različite vrste, ili pripada drugoj klasi ili podklasi antitela.

[0078] Pojam "humanizovano antitelo" se odnosi na antitelo koje je inicijalno, u celosti ili delimično nehumanog porekla i koje je modifikovano da zameni određene aminokiseline, određenije u okvirnim regionima teških i lakih lanaca, kako bi se izbegao ili sveo na minimum imuni odgovor kod ljudi.

Konstantni domeni humanizovanog antitela su većinom vremena humani CH i CL domeni. U jednom načinu ostvarivanja, humanizovano antitelo ima konstantne domene humanog porekla. Kako se ovde upotrebljava, pojam "humanizovano antitelo" se odnosi na himerno antitelo koje sadrži minimalnu sekvencu dobijenu iz nehumanog imunoglobulina, npr. CDR-ove.

[0079] Pojam "polipeptid" ili "netrin-1 vezujući polipeptid" se koristi da obuhvati sve ove vrste antitela, fragmente ili njihovu kombinaciju.

[0080] Cilj humanizacije je smanjenje kod imunogenosti kod ksenogenskog antitela, kao što je mišje antitelo, za uvođenje kod čoveka, pri tom održavajući puni antigen vezujući afinitet i specifičnost antitela. Humanizovana antitela, ili antitela podešena tako da ih ne odbacuju drugi sisari, mogu biti proizvedena upotrebom nekoliko tehnologija kao što je ponovno javljanje na površini ili kalemljenje CDR. Kako se ovde upotrebljava, tehnologija ponovnog javljanja na površini koristi kombinaciju molekulskog modelovanja, statističku analizu i mutagenezu da bi promenila površine koje nisu CDR varijabilnih regiona antitela da bi ličile na površine poznatih antitela ciljnog domaćina.

[0081] Antitela mogu biti humanizovana upotrebom raznih drugih tehnika uključujući CDR-kalemljenje

1

(EP0239400; WO91/09967; Br. patenata u SAD.5,530,101 i 5,585,089), premazivanje ili ponovno javljanje na površini (EP0592106; EP0519596; Padlan (1991) Molecular Immunology 28(4/5):489-498; Studnicka et al. (1994) Protein Engineering 7(6):805-814; Roguska et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A.91:969-973), i mešanje lanaca (br. patenta u SAD 5,565,332). Humana antitela mogu biti napravljena raznim postupcima koji su poznati u tehnici uključujući postupke prikaza faga. Videti takođe br. patenata u SAD.4,444,887, 4,716,111, 5,545,806, i 5,814,318; i međunarodnu patentnu

privaju WO98/46645, WO98/50433, WO98/24893, WO98/16654, WO96/34096, WO96/33735, i WO91/10741.

[0082] U kontekstu pronalaska, pojam "lečiti" ili "lečenje", kako se ovde upotrebljava, označava promenu toka, olakšavanje, inhibiranje napretka, ili sprečavanje poremećaja ili stanja na koji se taj pojam odnosi, ili jedan ili više simptoma takvog poremećaja ili stanja.

[0083] Pod pojmom "lečenje kancera" kako se ovde upotrebljava podrazumeva se inhibicija rasta malignih ćelija tumora i/ili progresije metastaza pomenutog tumora. Takvo lečenje takođe može da dovede do regresije rasta tumora, tj., smanjenja veličine tumora koji može da se izmeri. U određenom načinu ostvarivanja, takvo lečenje vodi do delimične regresije tumora ili metastaze. U drugom određenom načinu ostvarivanja, takvo lečenje dovodi do potpune regresije tumora ili metastaze.

[0084] Prema pronalasku, pojam "pacijent" ili "pacijent kome je potrebno" se odnosi na čoveka ili drugog sisara koji ima ili kod koga postoji verovatnoća da će dobiti maligni tumor.

[0085] U određenom načinu ostvarivanja, pacijent koji bi trebalo da se leči je možda već lečen drugim anikancerskim terapijama. Određenije, pacijent koji bi trebalo da se leči je možda prethodno bio lečen režimom baziranim na oksaliplatinu-, cisplatinu-, karboplatinu-, i/ili paclitaksel-docetakselu.

[0086] Pod "terapeutski efektivnom količinom" polipeptida ili antitela prema ovom pronalasku se misli na dovoljnu količinu istog da bi se lečila pomenuta kancerska bolest, u razumnom odnosu koristi/rizika koji može da se primeni na bilo koje medicinsko lečenje. Smatra se, međutim, da o ukupnoj dnevnoj upotrebi polipeptida ili antitela ovog pronalaska odlučuje nadležni doktor u vidu zdravog medicinskog rasuđivanja. Nivo specifične terapeutski efektivne doze za bilo kog određenog pacijenta će zavisiti od raznih faktora uključujući poremećaj koji se leči i njegovu ozbiljnost; aktivnost specifičnog uposlenog polipeptida ili antitela; specifičnu uposlenu kompoziciju, uzrast, telesnu masu, opšte zdravstveno stanje, pol i ishranu pacijenta; vreme primene, način primene, i stopu izlučivanja specifičnog uposlenog polipeptida ili antitela; trajanje lečenja; lekovi koji se koriste u kombinaciji ili slučajno sa specifičnim uposlenim polipeptidom ili antitelom; i slične faktore koji su dobro poznati u medicinskoj tehnici. U određenom načinu ostvarivanja, pomenuta terapeutski efektivna količina polipeptida ili antitela koja se daje pacijentu je doza koja je u opsegu od 5 mg/m<2>do 500 mg/m<2>, određenije u opsegu od 150 mg/m<2>do 450 mg/m<2>površine tela.

[0087] U daljem načinu ostvarivanja, polipeptid ili antitelo prema pronalasku se u više navrata daju prema protokolu koji zavisi od pacijenta koji se leči (starost, masa, istorija lečenja, itd.), što može da odredi iskusan doktor.

[0088] "Farmaceutski" ili "farmaceutski prihvatljiv" se odnosi na molekulske entitete i kompozicije koje ne stvaraju neželjenu, alergijsku ili drugu nepovoljnu reakciju kada se daju sisaru, posebno čoveku, kako je prikladno. Farmaceutski prihvatljiv nosač ili ekscipijens se odnosi na netoksični čvrsti, polučvrsti ili tečni punilac, razblaživač, materijal za kapsuliranje ili pomoćnu formulaciju bilo koje vrste.

[0089] Oblik farmaceutskih kompozicija uključujući polipeptid ili antitelo prema pronalasku i način primene prirodno zavise od stanja koje se leči, ozbiljnosti bolesti, uzrasta, mase, i pola pacijenta, itd.

[0090] Polipeptid ili antitelo prema pronalasku mogu biti formulisani za topikalnu, oralnu, parenteralnu, intranazalnu, intravensku, intramuskularnu, supkutanu ili intraokularnu primenu i njima slične. U određenom načinu ostvarivanja, polipeptid ili antitelo prema pronalasku se daje intravenski [0091] Određenije, farmaceutske kompozicije uključujući polipeptid ili antitelo prema pronalasku mogu da sadrže nosače koji su farmaceutski prihvatljivi za formulaciju koja može da se ubrizga. Ovi određenije mogu biti izotonični, sterilni, slani rastvori (mononatrijum ili dinatrijumfosfat, natrijum, kalijum, kalcijum ili magnezijumhlorid i njima slični ili kompozicije takvih soli), ili suve, naročito kompozicije osušene zamrzavanjem koje po dodavanju sterilisane vode ili fiziološkog slanog rastvora, u zavisnosti od slučaja, omogućavaju konstisuisanje rastvora koji mogu da se ubrizgaju.

[0092] Da bi se pripremile farmaceutske kompozicije, efektivna količina polipeptida ili antitela prema pronalasku može biti rastvorena ili dispergovana u farmaceutski prihvatljivom nosaču ili vodenom medijumu.

[0093] Farmaceutski oblici koji su prikladni za injekcionu upotrebu uključuju sterilne vodene rastvore ili disperzije i sterilne praškove za improvizovani preparat sterilnih rastvora ili disperzije koje mogu da se ubrizgaju. U svim slučajevima, oblik mora da bude sterilan i mora da bude u tečnom stanju u meri da lako može lako da se uvuče u špric. Mora da bude stabilan u uslovima proizvodnje i čuvanja i mora da se čuva od kontaminiranog uticaja mikroorganizama, kao što su bakterije i gljivice.

[0094] Nosač može da bude medijum rastvarača ili disperzije koji sadrži, na primer, vodu, etanol, poliol (na primer, glicerol, propilenglikol i tečni polietilenglikol, i njima slične) i njihove odgovarajuće kompozicije. Može da se održava prava fluidnost, na primer, upotrebom omotača, kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzije i upotrebom surfaktanata, sredstava za stabilizovanje, krijoprotektanata ili antioksidanata. Do sprečavanja delovanja mikroorganizama dolazi upotrebom antibakterijskih i antifungalnih sredstava. U mnogim slučajevima, biće poželjno da se uključe izotonična sredstva, na primer, šećeri ili natrijumhlorid.

[0095] Sterilni rastvori koji mogu da se ubrizgaju su pripremljeni inkorporisanjem aktivnih jedinjenja u potrebnoj količini u odgovarajući rastvarač sa nekoliko drugih gore nabrojanih sastojaka, po potrebi, nakon čega sledi filtrirana sterilizacija. Generalno, disperzije su pripremljene inkorporisanjem raznih

1

sterilisanih aktivnih sastojaka u sterilni nosač koji sadrži bazni medijum disperzije i druge potrebne sastojke od gore navedenih. U slučaju sterilnih praškova za pripremu sterilnih rastvora koji mogu da se ubrizgaju, poželjni postupci pripreme su tehnike sušenja vakuumom i sušenja zamrzavanjem koje daju prašak aktivnog sastojka plus dodatni željeni sastojak iz njegovog prethodno sterilno-filtriranog rastvora.

[0096] Po formulisanju, rastvori će se primenjivati na način koji je kompatibilan sa doznom formulacijom i u takvoj količini kao što je ona terapeutski efektivna. Formulacije se lako primenjuju u raznim doznim oblicima, kao što je prethodno opisana vrsta rastvora koji mogu da se ubrizgaju, ali se mogu uposliti i kapsule sa otpuštanjem leka i njima slične.

[0097] Za parenteralnu primenu u vodenom rastvoru, na primer, rastvor bi trebalo da bude puferovan na odgovarajući način ukoliko je neophodno, a tečni razblaživač prvo obezbeđen u izotoničnom obliku sa dovoljno soli ili glukoze. Ovi određeni vodeni rastvori su posebno prikladni za intravensku, intramuskularnu, supkutanu i intraperitonealnu primenu. S tim u vezi, sterilni vodeni medijumi koji mogu biti uposleni će biti poznati stručnjacima u smislu ovog pronalaska. Na primer, jedna doza bi mogla biti rastvorena u 1 mL izotoničnog NaCl rastvora i ili dodata u 1000 mL hipodermaklizne tečnosti ili ubrizgana na predloženo mesto za infuziju, (videti na primer, "Remington's Farmaceutske Sciences" 15th Edition, strane 1035-1038 i 1570-1580). Neka varijacija u dozi će se neophodno desiti u zavisnosti od stanja subjekta koji se leči. Osoba koja je odgovorna za primenu, će, u bilo kom slučaju, odrediti odgovarajuću dozu za pojedinačnog subjekta.

Tabela 1: Opis sekvenci:

1

1

1

1

2

[0098] CDR-ovi pod IMGT su istaknuti masnim slovima u tabeli 1, tamo gde je potrebno.

[0099] Ovaj pronalazak će sada biti opisan detaljnije upotrebom primera koje ne bi trebalo smatrati ograničavajućim načinima ostvarivanja.

Kratak opis crteža:

[0100]

FIG.1 : ELISA ispitivanje vezivanja mišjeg 4C11 za humani netrin-1. Razne koncentracije 4C11 su inkubirane na mikrotitracionoj ploči sa 96 bunarčića obloženoj sa FLAG-označenim netrinom-1 (APOTECH). Vezani 4C11 je detektovan upotrebom konjugovanog sa peroksidazom rena kozjeg anti-mišjeg IgG (Jackson Immunoresearch) i hemiluminescentnog supstrata (PIERCE ECL supstrat vestern blot metode). Luminescentant je očitan na Tecan Infinite F-500 luminometeru.

FIG.2 : Inhibicija vezivanja netrina-1 na UNC5B-Fc pomoću 4C11. FLAG-označeni netrin-1 (APOTECH) u prisustvu raznih koncentracija 4C11 su inkubirane na mikrotitracionoj ploči sa 96

2

bunarčića obloženoj sa UNC5B-Fc (Netris). Vezani netrin-1 je detektovan upotrebom anti-FLAG antitela konjugovanog sa preoksidazom rena (Sigma) i hemiluminescentnim supstratom (PIERCE ECL supstrat vestern blot metode). Luminescencija je očitana na Tecan Infinite F-500 luminometeru.

FIG.3 : Mapiranje linearnog epitopa 4C11 je izvedeno upotrebom niza 59015-aminokiselinskih linearnih peptida koji pokrivaju celu sekvencu humanog netrina-1 sa peptid-peptid preklapanjem 14 aminokiselina. Vezivanje 4C11 na peptid je otkriveno upotrebom peroksidaze (POD)-obeleženog anti-mišjeg IgG i hemoluminescentnog supstrata.

FIG.4 : Šema koja prikazuje aminokiselinsku sekvencu epitopa netrina-1 (smeštenog u drugom domenu laminina poput EGF-a) koju prepoznaje mišje 4C11 antitelo.

FIG.5 : Izazivanje kaspaze 3 u A549 adenokarcinomskim humanim alveolarnim bazalnim epitelijalnim ćelijama u prisustvu mišjeg 4C11 antitela.

FIG.6 : Inhibicija rasta humanih ksenograftova kod golih miševa tretiranih mišjim 4C11 antitelom. Humane A549 epitelijalne ćelije adenokarcinoma pluća su ubrizgane supkutano atimičnim (tj. imunodeficijentnim) golim miševima. Kada tumor dosegne približno 100 mm<3>, miševi (n=10 po grupi) su tretirani intraperitonealno sa 5mg/kg jednom nedeljno sa 4C11 ili kontrolom izotipa (MOPC21),.

FIG.7 : Inhibicija rasta humanih ksenograftova kod golih miševa tretiranih mišjim 4C11 antitelom. GRANTA-519 ćelije humanog mantle ćelijskog limfoma su ubrizgane supkutano atimičnim (tj. imunodeficijentnim) golim miševima. Kada tumor dosegne približno 100 mm<3>, miševi (n=10 po grupi) su tretirani intraperitonealno sa 2mg/kg jednom nedeljno ili dva puta nedeljno sa 4C11 ili sa nosačem (PBS).

FIG.8 : In vivo efekat humanizovanog 4C11 antitela (hum03) u rastu osteosarkoma kod pacova koji može da bude presađen. Tumori osteosarkoma pacova su presađeni u paratibijalni položaj nakon denudacije periosteuma (n=7). Pacovi su tretirani dva puta nedeljno slabom intraperitonealnom injekcijom od 4.4mg/kg humanizovanog 4C11 hum03 ili kontrolom izotipa sa ili bez doksorubicina (2mg/kg) ili sa PBS-om. Ovaj crtež prikazuje koliko se puta tumor uvećao 17. dana.

FIG.9: Pepscan analiza NET1 vezujućeg domena anti-netrin 1 humanizovanog 4C11 monoklonalnog antitela (NET1-H-mAb) HUM03. Sirovi Pepscan podaci dobijeni skriningom humanizovanog 4C11 mAb protiv preklapanja biblioteke peptida 590 linearnih peptida (x-osa). Jačina signala interakcije se vizualizuje na y-osi. Pik odgovara sledećoj aminokiselinskoj sekvenci:

ARRCRFNMELYKLSGRKSGGVC (SEQ ID NO: 35).

Primer 1: Generisanje, skrining i humanizacija antitela

[0101] HTP™ miševi su primili 8 injekcija (svakodnevno dva dana; prva injekcija u prisustvu potpunog Freundovog adjuvansa, ostale sa nepotpunim adjuvansom) od 100µg netrina 1-Fc (Adipogen). Fuzija hibridoma je izvedena 2 nedelje nakon prve imunizacije (Abpro, Lexington, MA). Supernatanti hibridoma su pregledani skriningom radi specifičnih monoklonalnih anti-netrin 1 antitela upotrebom ELISA ispitivanja dvostrukog-antigena (netrin 1-Fc i nerelevantni Fc himerni protein). Sekundarno ELISA ispitivanje je upotrebljeno da bi se izabrala monoklonalna antitela koja mogu da blokiraju interakciju netrina 1 sa DCC ili UNC5h2. Mišje monoklonalno antitelo (mišji 4C11 ili NET1-M-mAb je zatim izabrano. Ovo antitelo je napravljeno od sekvenci SEQ ID NO: 12 i 13.

[0102] Humanizacija je izvedena na sledeći način: dvostruko razgranati DNK fragmenti koji kodiraju za CDR sekvence lakog lanaca i teškog lanca mišjeg 4C11 su kombinovani sa bazenima humanih okvira. Varijabilni domeni pune dužine su zatim klonirani u ekspresione vektore sisara. Varijabilni domeni lakog lanca su klonirani u okvir sa signalom sekrecije i humanim kapa konstantnim domenom. Varijabilni domeni teškog lanca su klonirani u okvir sa vodećom sekvencom i humanim IgG1 konstantnim domenom. Raznolikost biblioteke i integriteta LC i HC okvira za očitavanje je proverena sekvencioniranjem. Pojedinačni klonovi su stavljeni u niz u formi 96 bunarčića a DNK plazmida je pripremljena za transfekciju u CHO ćelije. Humanizovana biblioteka je transfektovana u CHO ćelije u formatu 96 bunarčića. Supernatanti iz transfektovanih CHO ćelija su sakupljeni u roku od 48 sati nakon transfekcije i pregledani skriningom putem ispitivanja vezivanja netrina-1 i ELISA kompeticije. Varijabilni domeni lakog lanca i teškog lanca najboljih 10 pogodaka su sekvencionirani, poravnani, i analizirani. Humanizovana antitela HUM01-10 su generisana kako je prethodno opisano.

PRIMER 2: proizvodnja MAb i prečišćavanje proteina A

[0103] Postupci za proizvodnju monoklonalnih antitela zasnovanih na sekvencama nukleinske kiseline koje kodiraju za teške i lake lance su poznata od stručnjaka. Na osnovu ovde opisanih sekvenci, stručnjak može da proizvede razna mišja, humanizovana i potpuno humanizovana antitela usmerena protiv linearnog epitopa SEQ ID NO: 3 ili 35 ili bilo koje njegove varijante, kao što je mišje 4C11, i humanizovana HUM1-10 i HUM1'-10' antitela.

[0104] Ćelije sisara su poželjne kao domaćini za proizvodnju terapeutskih glikoproteina, usled njihove sposobnosti da glikoziluju proteine u obliku koji je najkompatibilniji za primene kod ljudi (Jenkins et al., Nat Biotech.1996; 14:975-81). Ćelije domaćini sisara koje mogu da se upotrebljavaju uključuju, humane Hela, 283, H9 i Jurkat ćelije, mišje NIH3T3 i C127 ćelije, Cos 1, Cos 7 i CV1 ćelije afričkog zelenog majmuna, quail QC1-3 ćelije, mišje L ćelije i ćelije jajnika kineskog hrčka. Bakterije glikoziluju proteine veoma retko, i kao druga vrsta uobičajenih domaćina, kao što su kvasci, filamentne gljive, ćelije insekata i biljaka daju modele povezane sa brzim čišćenjem iz krvotoka.

[0105] Ćelije jajnika kineskog sisara (CHO) dopuštaju konzistentno generisanje genetički stabilnih, visoko

2

produktivnih klonalnih ćelijskih linija. One mogu biti kultivisane do visokih gustina u jednostavnim biorekatorima pomoću medijuma koji ne sadrže serum, i one dozvoljavaju razvoj bezbednih i bioloških procesa koji se mogu reprodukovati. Druge životinjske ćelije uključuju ćelije bubrega bebe hrčka (BHK), NSO- i SP2/0- ćelije mijeloma miša. Proizvodnja od transgenih životinja je takođe bila ispitana (Jenkins et al., Nat Biotech.1996; 14:975-81).

[0106] Tipičan ekspresioni vektor sisara sadrži promoterski element (rani i kasni promoteri od SV40, ponavljanja dugih terminala (LTR-ovi) od retrovirusa npr. RSV, HTLV1, HIV1 i rani promoter citomegalovirusa (mCMV, hCMV), koji posreduje početak transkripcije mRNK, proteina koji kodira sekvencu, i signala koji su potrebni za završetak transkripcije i poliadenilacije transkripta (BGH polyA, gen kinaze timidina herpesa virusa Herpes simplex polyA (TKpa), kasni SV40 polyA i 3' UTR_Beta_Globin_polyA). Dodatni elementi uključuju pojačivače (Eµ, hIE1), Kozak sekvence, signalni peptid i introne praćene mestima za deljenje RNK davaoca i primaoca. Prikladni ekspresioni vektori za upotrebu u praksi prilikom realizovanja ovog pronalaska uključuju, primera radi, vektore kao što su pcDNK3.1, pcDNK3.3, pOptiVEC, pRSV, pEµMCMV, pMCMVHE-UTR-BG, pHCMVHE-UTR-BG, pMCMV-UTR-BG, pHCMV-UTR-BG, pMCMVHE-SV40, pHCMVHE-SV40, pMCMV-SV40, pHCMV-SV40, pMCMVHE-TK, pHCMVHE-TK, pMCMV-TK, pHCMV-TK, pMCMVHE-BGH, pHCMVHE-BGH, pMCMV-BGH, pHCMV-UTR-BGH).

[0107] Prazne CHO lake C ćelije su zajedno transfektovane sa MAb ekspresionim vektorom za lake i teške lance nakon uobičajenog postupka prolazne ili stabilne transfekcije. Sekrecija H i L lanaca je omogućena odgovarajućom humanom IgH vodećom sekvencom. Regioni koji kodiraju za lake i teške lance su uvedeni u MAb ekspresioni vektor u mestu za višestruko kloniranje. Transformanti su analizirani radi ispravne orijentacije i okvira očitavanja, pri čemu ekspresioni vektor može biti transfektovan u CHO ćelijsku liniju.

[0108] Tečnost sakupljene ćelijske kulture iz CHO ćelija se prebacuje u Hi Trap rProtein A kolonu (GE Healthcare, Saint Cyr au Mont d'Or, France) koja je ekvilibrisana fosfatom puferisanim slanim rastvorom, pH vrednosti od 7.2. Nevezujući proteini prolaze kroz i uklanjaju se sa nekoliko pranja sa PBS puferom koji sledi. MAb je eluirano iz kolone proteina A pomoću faze eluiranja 0.1 M limunske kiselina na pH 3.0. Eluent kolone je praćen pomoću A280. Pik MAb-a je sakupljen.

Primer 3 : ELISA ispitivanje vezivanja 4C11 antitela za netrin-1 (FIG.1)

[0109] Bela mikrotitraciona ploča sa 96 bunarčića (Costar 3912 Corning) je inkubirana tokom noći na 4°C sa 100ng His-označenog netrina-1 (R&D 6419-N1) u 100µL fosfatom puferisanog slanog rastvora (PBS). Nakon tri ispiranja sa 300µL PBS-0.05% Tween-20 (PBS-T), ploča je blokirana dodavanjem 100µL PBS-3% BSA i inkubirana 1 sat na sobnoj temperaturi. Nakon tri pranja sa 300µL PBS-T, ploča je inkubirana sa raznim količinama (10 ng do 1200ng) anti-netrin-1 antitela. Nakon tri pranja sa 300µL PBS-T, 100µL

2

relevantnog sekundarnog antitela konjugovanog u peroksidazu rena (npr. kozjeg anti-humano IgG (Fc) Sigma A0170 ili kozjeg anti-mišjeg IgG lakog lanca specifičnog (kapa) Jackson Immunoresearch 115-035-174) razblaženog 1/10,000 u PBST-3% BSA je dodato i ploča je inkubirana 1 sat na sobnoj temperaturi. Nakon tri pranja sa 300µL PBS-T, dodato je 100µL luminescentnog supstrata HRP (ECL supstrat vestern blot metode, PIERCE). Nakon 5 do 10 minuta, luminescencija je očitana na Tecan Infinite F-500 luminometru.

[0110] FIG.1 prikazuje uobičajenu dozno-zavisnu interakciju 4C11 mišjeg antitela za adsorbovani netrin-1 u ELISA ispitivanju.

[0111] Koncentracija antitela koja omogućava 50% vezivanja (EC50) se računa iz sigmoidalnih kriva vezivanja kako je prikazano na FIG.1. Tabela 1 prikazuje EC50vrednosti (u µg/mL i u nM) različitih mišjih (4C11 celo antitelo kao i Fab i Fab'2 fragmenti) i humanizovanih 4C11 antitela.

Tabela 1: Potencija raznih 4C11 varijanti za vezivanje za netrin-1 (primer 3) ili za narušavanje vezivanja netrina-1 na UNC5B (Primer 5):

2

Primer 4 : Ispitivanje vezivanja antitela rezonancijom površinskog plazmona

[0112] Svojstva vezivanja antitela su analizirana upotrebom Biacore T I 00 (GE Healthcare) sa povezanim softverom Biacore T100 Control Biacore TI 00 Evaluation, i čipom:CM5-Chip u formi ispitivanja.

[0113] Mišje 4C11 (lgG1) antitelo (SEQ ID NO: 12 i 13) je uhvaćeno preko aminskih kuplovanih molekula za hvatanje. Ubrizgana je serija rastućih koncentracija netrina-1. Površina čipa sa samim aminski kuplovanim molekulom za hvatanje je korišćena kao referentna kontrolna površina za korelaciju mogućih efekata pufera ili nespecifičnog vezivanja netrina-I.

[0114] Molekuli za hvatanje: anti-mišjeg IgG antitela (od koze, Jackson Immuno Research).

[0115] Aminsko kuplovanje molekula za hvatanje. Standardno aminsko kuplovanje u skladu sa uputstvima proizvođača: tekući pufer: HBS- N pufer, aktivacija kompozicijom EDC/NHS, cilj gustine liganda od 10000 RU; antitela za hvatanje su razblažena u kuplujućem puferu 10mM NaAc, pH 4.5, c = 30 µg/mL; konačno preostale aktivirane karboksilne grupe su blokirane injekcijom 1 M etanolamina.

[0116] Hvatanje 4C11 antitela : hvatanje 4C11 antitela na ćelijama protoka 2 do 4: protok 5 µL/min, vreme kontakta 72 sekunde, c(anti-mišja IgG antitela) = 5nM. Pufer za hvatanje: PBS (pH7.4), 0.005% Tween 20

Uzorak analita: serije klasičnih koncentracija su izmerena pri brzini protoka od 50 µL/min uzastopnim ubrizgavanjem analita u 5 ili 6 rastućih koncentracija (c = 2-164 nM). Tekući pufer: 20mM Hepes pH7.4, 600mM NaCl, 0.005% Tween 20. Analit je ubrizgavan 3 minuta nakon čega je usledila faza disocijacije 90s.

[0117] Analiza polukvantitativne rezonancija površinskog plazmona (SPR) vezujuće kinetike netrina- 1 za uhvaćeno 4C11 je izvedena upotrebom BIAcore analize vezivanja 4C11 mišjeg antitela kako je obezbeđeno i opisano u ovom pronalasku za humani netrin-1.4C11 antitelo je uhvaćeno na površini čipa preko aminski kuplovanih anti-humanih IgG(Fc) molekula. Serija sa rastućim koncentracijama A humanog netrina-1 je ubrizgana a ponašanje kinetičkog vezivanja je praćeno SPR promenama. Promene kao relativne jedinice nasuprot kontrolnog čipa su tokom vremena snimane na y-osi (x-osa). Praćena je reprezentativna kriva asocijacije i disocijacije uhvaćenog analita 4C11 pri različitim koncentracijama ubrizganog humanog netrina-1.

[0118] Kinetički parameteri su izračunati upotrebom dvostruke reference (kontrolna referenca:

2

vezivanje analita za molekul za hvatanje; ćelija protoka: netrin-1 koncentracija"0" kao slepa proba) i izračunavanja sa modelom' vezivanja 1: 1 kinetike titracije.

Tabela 2 daje podatke o afinitetu izmerenom sa SPR (BIACORE® T100) na 25 °C u PBS:

Primer 5: 4C11 inhibira vezivanje netrina-1 za UNC5B (FIG.2)

[0119] Bela mikrotitraciona ploča sa 96 bunarčića (Costar 3912 Corning) je inkubirana tokom noći na 4°C ili sa 100ng UNC5B-Fc (R&D 1006-UN-050) ili DCC-Fc (R&D 844-DC-050) u 100µL fosfatom puferisanog slanog rastvora (PBS). Nakon tri pranja sa 300µL PBS-0.05% Tween-20 (PBS-T), ploča je blokirana dodavanjem 100µL PBS-2% BSA i inkubirana 1 sat na sobnoj temperaturi. Nakon tri pranja sa 300µL PBS-T, ploča je inkubirana 1 sat na sobnoj temperaturi, sa 100µL PBS-1% BSA koji sadrži 50ng/mL FLAG-označenog netrina-1 (Adipogen) i raznim količinama (0,2 ng do 3000ng) 4C11 antitela. Nakon tri pranja sa 300µL PBS-T, 100µL anti-FLAG M2 monoklonalnog antitela konjugovanog u peroksidazu rena (HRP) (Sigma A8592) razblaženog 1/5,000 u PBST-1% BSA je dodato a ploča je inkubirana 1 sat na sobnoj temperaturi. Nakon tri pranja sa 300µL PBS-T, dodato je 100µL luminescentnog supstrata HRP (ECL supstrat vestern blot metode, PIERCE). Nakon 5 do 10 minuta, luminescencija je očitana na Tecan Infinite F-500 luminometru.

[0120] FIG.2 prikazuje uobičajenu dozno-zavisnu inhibiciju vezivanja netrina-1 za UNC5B povećavanjem količine mišjeg 4C11 mišjeg antitela u ELISA ispitivanju.

[0121] Koncentracija antitela koja omogućava 50% inhibicije (IC50) su izračunate iz sigmoidalnih kriva vezivanja kako je prikazano na FIG.5. Tabela 1 daje IC50vrednosti (u µg/mL i u nM) različitih mišjih (4C11 celo antitelo kao i Fab i Fab'2 fragmenti) i humanizovanih 4C11 antitela.

Primer 6 : Mapiranje netrin-1 epitopa mišjeg 4C11 (FIG.3 i 4)

[0122] Mapiranje epitopa je izvedeno upotrebom niza 59015-aminokiselinskih linearnih peptida koji pokrivaju celu sekvencu humanog netrina-1 (bez signalnog peptida) sa preklapanjem peptid-peptid 14 aminokiselina. Linearni peptidi su sintetizovani upotrebom standardne Fmoc-hemije i deprotektovani upotrebom trifluorne kiseline. Polipropilenske kartice formata kreditne kartice sa 455 bunarčića koje sadrže kovalentno povezane peptide su inkubirane 30min na 25°C u PBST (PBS-1% Tween 80) sa 5% SQ (SQ, Super-Q, 4% konjskog seruma (v/v), 5% ovalbumina (mas.%) u PBST. Nakon pranja, peptidi su inkubirani sa 4C11 (1 µg/mL) PBST-0.1% SQ. Nakon pranja, peptidi su inkubirani sa 1/1000 razblaženja

2

konjugata peroksidaze anti-mišjeg antitela (SouthernBiotech) jedan sat na 25° C. Nakon pranja, dodati su supstrat peroksidaze 2,2'-azino-di-3-etilbenztiazolin sulfonat (ABTS) i 2 mikrolitra 3-procentnog H2O2. Nakon jednog sata, razvoj boje je kvantifikovan uređajem sa prenosom naboja (CCD) - kamera i sistem obrate slike.

[0123] FIG.3 prikazuje da mišje 4C11 stupa u interakciju sa peptidima uključenim u SEQ ID NO: 3:

VACNCNLHARRCRFNMELYKLSGRKSGGVCLNCRHNTAGRHCH.

[0124] FIG.4 predstavlja skicu položaja epitopa koga prepoznaje mišje 4C11 antitelo. Ovaj epitop je sproveden pomoću drugog domena poput EGF-a netrina-1.

[0125] Mapiranje Pepscan epitopa upotrebom tačkastog niza od 59015-aminokiselinskih linearnih peptida koji pokrivaju celu sekvencu humanog NET1. Kako je prikazano na FIG.9, antitelo HUM03 vezuje 8 preklapajućih peptida koji odgovaraju aminokiselinskoj sekvenci "ARRCRFNMELYKLSGRKSGGVC" (SEQ ID NO: 35) koja je prisutna unutar V-2 domena NET1. Vezujući epitop antitela se samim tim preklapa sa NET1 domenom koji je uključen u interakciju sa UNC5B. Da bi se potvrdilo da je V-2 domen NET1 zaista odgovoran za interakciju sa HUM03, generisali smo zbir mutanata i izveli in vitro ispitivanje vezivanja ovih mutanata sa antitelom kao i sa UNC5B. Tačka mutacije K358L je bila dovoljna da se smanji interakcija sa HUM03. Trostruka mutacija R348A-R349A-R351 A je smanjila interakciju.

Primer 7 : kaspaza-3 izazvana 4C11 u humanim A549 epitelijalnim ćelijama adenokarcinoma pluća (FIG.5)

[0126] Prvog dana ćelije su zasejane u medijumu koji ne sadrži serum (1.8 x 10<5>ćelija po bunarčiću u pločama sa šest bunarčića sa 1 mL po bunarčiću). Drugog dana, medijum je zamenjen sa 1 mL svežeg medijuma koji ne sadrži serum a koji sadrži ili nosač (Ctrl), mišje 4C11 antitelo, ili mišje IgG1,k nerelevantno antitelo (Ab) (10µg/mL). Tretiranja se izvode u duplikatu. Trećeg dana, ćelije iz 2 identično tretirana bunarčića su sakupljene i kombinovane kao jedan bazen. Nakon centrifugiranja, ćelijski peleti su ponovo suspendovani u 55µL pufera lize obezbeđenog u kompletu za fluorometrijsko ispitivanje Caspase 3/CPP32 (Gentaur Biovision, Brisel, Belgija). Apoptoza je zatim praćena merenjem aktivnosti kaspaze-3 upotrebom prethodno pomenutog kompleta. Sve vrednosti su bile normalizovane do kontrole.

[0127] FIG.5 prikazuje da mišje 4C11 antitelo izaziva aktivnost kaspaze 3 u humanim A549 epitelijalnim ćelijama adenokarcinoma pluća.

Primer 8 : in vivo 4C11-uzrokovana inhibicija rasta ksenograftova A549 ćelija (humane epitelijalne ćelije adenokarcinoma pluća) (FIG.6) i GRANTA (humani mantle ćelijski limfom) (FIG.7).

[0128] Ženke atimičnih nu/nu miševa starosti sedam nedelja (20-22 g telesne mase) su dobijene iz objekta za držanje životinja Charles River. Miševi su držani u sterilisanim kavezima sa filterima na vrhu i održavani su u objektu za držanje životinja u kom nema patogena. Svi tumori su implantirani s.c. injekcijama tumorskih ćelija (10<7>A549 ćelije ili 10<6>GRANTA ćelije) u 200µL PBS u desni bok miševa. Lečenje 4C11 antitelom je započeto kada su tumori utvrđeni (V≈100mm<3>, približno 15-20 dana nakon injekcija). Miševi su primili intraperitonealnu injekciju 4C11 antitela (različite doze i rasporedi), nosilac (PBS), ili kontrolu izotipa (MOPC21) (n=10 miševi). Veličine tumora su izmerene kaliperom. Zapremine tumora su izračunate sa formulom v = 0.5<∗>(dužina<∗>širina<2>).

[0129] Miševi sa A549 ksenograftima su tretirani sa 5mg/kg 4C11 jednom nedeljno, dok su miševi sa GRANTA ksenograftima primili nižu dozu 4C11 (2mg/kg) jednom ili dva puta nedeljno.

[0130] FIG.6 i 7 pokazuju značajnu supresiju rasta tumora humanih A549 epitelijalnih ćelija adenokarcinoma pluća (A) i humanog GRANTA humanog mantle ćelijskog limfoma (B) ksenograftovanih kod imunodeficijentnih miševa.

[0131] 4C11 antitelo pokazuje inhibiciju A549 i GRANTA rasta tumora.

Primer 9 : Sinergija između humanizovanog 4C11 (hum03) i doksorubicina kod osteosarkoma pacova (FIG.8).

[0132] Osteosarkom kod pacova izazvan zračenjem je transformisan u model koji može da se presadi koji je nakalemljen u paratibijalni položaj nakon denudacije periosteuma (ref. Allouche M.et al. , 1980, Int. J. Cancer 26, 777-782). Kako netrin-1 nije bio eksprimiran u ovom tumoru, stimulisali smo netrin-1 i ekspresiju njegovih receptora upotrebom sredstva za hemoterapiju (Doks, Dorubicin) kako je u novije vreme objavljeno (cf Paradisi et al.2013 EMBO Mol Med (2013) 5, 1821-1834). Pacovi kod kojih je osteosarkom nakalemljen su primili dva puta nedeljno, intra-peritonealnu injekciju humanizovanog 4C11 hum03 (4.4mg/kg) ili nosača (ctr). Neke životinje su dodatno primile intraperitonealnu injekciju doksorubicina (2mg/kg). Veličine tumora su izmerene kaliperom. Zapremine tumora su izračunate upotrebom formule v = 0.5<∗>(dužina<∗>širina<2>). Naporedo sa tim, koristi se MRI kako bi se pratio model rasta.

[0133] FIG.8 pokazuje da se inhibicija rasta osteosarkoma postiže kod životinja koje su istovremeno tretirane i sa 4C11 i sa doksorubicinom.

Primer 10 : Efekat mišjeg 4C11 kod zapaljenskog modela spontanog kancera debelog creva generisanog zapaljenjem. (model mišje IBD (zapaljenska bolest creva) udružene sa kolorektalnim kancerom)

(cf Ref Proc Natl Acad Sci U S A.2009 Oct 6;106(40):17146-51).

[0134] Miševi su tretirani sa AOM DSS i tretirani sa PBS ili 4C11 intraperitonealno 2mg/kg dva puta nedeljno (n=7) kako je prethodno opisano (Ref : Neufert C et al (2007) Nat Protoc 2: 1998-2004).

1

Ukratko, divljim ženkama Balb/C miševa starosti 8 nedelja koje ne sadrže patogene je intraperitonealno ubrizgano 10 mg/kg telesne mase AOM rastvorenog u PBS. Dan posle, 2.5% DSS je davano u pijaćoj vodi tokom jedne nedelje, a nakon toga 2 nedelje u regularnoj vodi . Miševi su tretirani sa DSS 1 nedelju svake 2 nedelje do desete nedelje eksperimenta i tri puta nedeljno im je ubrizgavano 4C11 ili PBS. Životinje su žrtvovane na početku desete nedelje i debelo crevo je uklonjeno sa histološke analize. Tabela 3 jasno pokazuje da lečenje miševa 4C11 antitelom sprečava ili usporava razvoj adenokarcinoma debelog creva do kog dolazi usled zapaljenja.

[0135] Tabela 3 : Efekat anti-netrina mAb 4C11 na tumore debelog creva in vivo do kojih dolazi usled zapaljenja. Mišji model IBD (zapaljensk bolest creva)-udružene sa kolorektalnim kancerom je generisan kako je već opisano (Proc Natl Acad Sci U S A.2009 Oct 6;106(40):17146-51). Miševi su prvo tretirani sa azoksimetanom (AOM) i dekstran sulfat natrijumom (DSS) da bi se izazvao kolorektalni kancer. Miševi su tretirani sa PBS ili 4C11 intraperitonealno 2mg/kg dva puta nedeljno (n=7). Miševi su žrtvovani.

Uklonjeno debelo crevo je fiksirano u formaldehidu radi histološke analize. Tabela 3 predstavlja procenat miševa koji pokazuju razne kancerogene i predkancerogene lezije na debelom crevu.

Primer 11: Kvantifikacija netrin-1 proteina u humanim kancerskim ćelijama:

[0136] Za imunoblot analizu, ćelije su lizirane sonikacijom u modifikovanom RIPA puferu (50mM Tris-HCI, pH7.5, 150mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% natrijumdeoksiholat, 0.1% SDS, 1 mM EDTA, koktel inhibitora proteaze i 5mM DTT) i inkubirana 1h na 4°C. Celularni ostaci su peletirani centrifugiranjem (10.000g 15' na 4°C), a ekstrakti proteina (200 po traci) se prebace u 10% SDS-poliakrilamidne gelove i blotuju na PVDF listovima (Millipore Corporation, Billerica, MA, U.S.A.). Filteri su blokirani sa 10% nemasnog osušenog mleka i 5% BSA u PBS/0.1% Tween 20 (PBS-T) tokom noći a zatim su inkubirani 2h sa zečjim poliklonalnim α-netrinom-1 (razblaženje 1:500, klon H104, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) i mišjim β-aktinom monoklonalnih antitela (Santa Cruz Biotechnologies). Nakon tri pranja sa PBS-T, filteri su inkubirani sa odgovarajućim HRP-konjugovanim sekundarnim antitelom (1:10000, Jackson ImmunoResearch, Suffolk, UK) 1h. Detekcija je izvedena upotrebom West Dura Chemiluminescence

2

System (Pierce, Rockford, IL, U.S.A.).

[0137] Za ispitivanje imunofluorescencije, ćelije su odvojene, centrifugirane na pokrovnim stakalcima sa citospinerom (Shandon Cytospin 3, Thermo Scientific) i fiksirane 30 minuta sa 4% (v/v) paraformaldehidom. Ćelije su zatim permeabilizovane 30 minuta u 0.2% Triton X-100/PBS i blokirane u PBS koji sadrži 2% BSA i 2% normalnog magarećeg seruma. Endogeni netrin-1 je obojen upotrebom monoklonalnog α-netrin-1 antitela pacova (R&D systems) i Alexa-488 magarećeg anti-pacovskog IgG (molekulske probe). Jezgra su kontrabojena upotrebom Hoescht bojenja (Sigma).

Primer 12: Primer kancera koji prekomerno eksprimiraju netrin-1 i koji eksprimiraju DCC i/ili UNC5A i/ili B i/ili C i/ili D za kandidata za lečenje sa UNC5-TRAP ili humanizovanim 4C11 antitelom.

[0138] Procenat slučajeva prekomerno eksprimirajućeg netrina-1 je dat za svaku vrstu kancera za koju je ekspresija netrina-1 i njegovih receptora kvantifikovana.

● 60 % metastatičkog kancera dojke (Fitamant et al., PNAS 2008),

● 47 % kancera pluća ne-malih ćelija (Delloye-Bourgeois et al., JNCI 2009),

● 38 % agresivnog neuroblastoma (Delloye-Bourgeois et al., J. Exp. Med.2009),

● 61 % adenokarcinoma pankreasa (Link et al., Annals of Chir. Onco.2007; Dumartin et al., Gastro 2010),

● 100 % primarnog melanoma (n=7), metastaze melanoma (n=6) (Kaufmann et al., Cellular Oncology 2009),

● 76 % kancera jajnika (Panastasiou et al0., Oncotarget 2011),

● 65% glioblastoma,

● 60 % akutne mijeloidne leukemije i hronične limfocitne leukemije

● 50 % agresivnog limfoma β-ćelija,

● 30 % sarkoma,

● 40 % adenokarcinoma bubrega,

● 22 % kancera glave i vrata,

● kanceri testisa (36 % embrionskog karcinoma, 50 % teratoma, 100 % tumora zametnih ćelija) ● 50 % kancera bubrega,

● 26 % kancera želuca,

● 19 % kancera uterusa.

Primer 13. Kvantitativni RT-PCR koji dopušta procenu ekspresije netrina-1 ili prekomerne ekspresije u skladu sa PCT/EP2013/068937:

[0139] Ukupna RNK je ekstrahovana upotrebom NucleoSpin® RNA II Kit-a (Macherey Nagel, Düren, Germany) u skladu sa protokolom proizvođača. Reakcije RT-PCR se izvode sa iScript® cDNK Synthesis Kit (Biorad). Jedan ukupne RNK je obrnuto transkribovan upotrebom sledećeg programa: 25°C za 5 min, 42°C za 30 min i 85°C za 5 min. Za ispitivanja ekspresije, ciljani transkripti su amplifikovani u LakiCycler® 2.0 aparatu (Roche Applied Science), upotrebom LakiCycler FastStart DNA Master SYBR Green I Kit (Roche Applied Science). Ekspresija ciljanih gena je normalizovana do gena glicerilaldehid 3-fosfat dehidrogenaze (GAPDH) i fosfoglicerat kinaze (PGK), koji se koriste kao geni za održavanje. Količina ciljanih transkripata, normalizovanih do gena za održavanje, je izračunata upotrebom komparativne CTmetode. Validacioni eksperiment je izveden kako bi se pokazalo da su efikasnosti ciljanih i gena za održavanje domaćinstva. Sekvence prajmera su sledeće:

Prednji prajmer: aaaagtactgcaagaaggactatgc SEQ ID NO:33.

Reverzni prajmer: ccctgcttatacacggagatg SEQ ID NO:34.

Primer 14. Kvantifikacija netrin-1 proteina u humanim kancerskim ćelijama u skladu sa PCT/EP2013/068937:

[0140] Za imunoblot analizu, ćelije su lizirane sonikacijom u modifikovanom RIPA puferu (50mM Tris-HCI, pH7.5, 150mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% natrijumdeoksiholatu, 0.1% SDS, 1 mM EDTA, koktelu inhibitora proteaze i 5mM DTT) i inkubirana 1h na 4°C. Celularni ostaci su peletirani centrifugiranjem (10.000g 15' na 4°C) a ekstrakti proteina (200 po traci) su preneseni na 10% SDS-poliakrilamidne gelove i blotovani na PVDF listovima (Millipore Corporation, Billerica, MA, U.S.A.). Filteri su blokirani sa 10% nemasnog osušenog mleka i 5% BSA u PBS/0.1% Tween 20 (PBS-T) tokom noći a zatim inkubirani 2h sa zečjim poliklonalnim α-netrin-1 antitelima (razblaženje 1:500, klon H104, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) i mišjim monoklonalnim antitelima β-aktina (Santa Cruz Biotechnologies). Nakon tri pranja saPBS-T, filteri su inkubirani sa odgovarajućim HRP-konjugovanim sekundarnim antitelom (1:10000, Jackson ImmunoResearch, Suffolk, UK) 1h. Detekcija se izvodi upotrebom West Dura Chemiluminescence System (Pierce, Rockford, IL, U.S.A.).

[0141] Za ispitivanje imunofluorescencije, ćelije su odvojene, centrifugirane na pokrovnim stakalcima sa citospinerom (Shandon Cytospin 3, Thermo Scientific) i fiksirane 30 minuta sa 4% (v/v) paraformaldehidom. Ćelije su zatim permeabilizovane 30 minuta u 0.2% Triton X-100/PBS i blokirane u PBS-u koji sadrži 2% BSA i 2% normalni magareći serum. Endogeni netrin-1 je obojen upotrebom monoklonalnog α-netrin-1 antitela pacova (R&D sistemi) i Alexa-488 magarećeg anti-pacovskog IgG (molekulske probe). Jezgra su kontraobojena upotrebom Hoescht bojenja (Sigma).

Primer 15: In vivo modeli ksenotgrafta.

[0142] Različite humane ćelijske linije (H358 i A549 epitelijalne ćelijske linije plućnog adenokarcinoma, i ćelijske linije GRANTA-519 mantle ćelijskog limfoma i difuzne velike B-ćelije limfoma oci-li3) u eksponencijalnom rastu su sakupljene iz kulture, oprane dva puta sterilnim PBS-om, prebrojane i

4

5.10<6>ćelija je ponovo suspendovano u PBS-u pre s.c. implantacije u desni bok ženki Swiss/golih miševa starih 5 nedelja. Zapremine tumora (V) su određene formulom V= 0.5 (dužina x širina<2>) sa kaliperom. Utvrđeni su tumori od 100+/- 20mm<3>pre randomizacije u grupe (10 miševa u svakoj). Anti-netrin 1 antitelo ili kontrola izotipa su i.v. (H358, A549, oci-li3) ili i.p. (GRANTA-519) ubrizgani u miševe u dozi od 10mg/kg dva puta nedeljno. Procenat inhibicije rasta tumora (%TGI) je određen za svaku ćelijsku liniju nakalemljenu dana (d) označenog u tabeli koja sledi i izračunatog formulom TGI (%)=(1-T/C)x100 gde T označava srednju gustinu tumora ispitivane grupe (tretirane anti-netrin 1 antitelom) dana d, a C označava srednju gustinu grupe tretirane kontrolom izotipa. Inhibicija rasta tumora <50% se smatra značajnom.

[0143] Mišja i humanizovana antitela ovog pronalaska su imala efekte inhibiranja efikasnog rasta tumora.

4

4

�

4

4

4

4

1

2

4

1

2

Claims (20)

1. Patentni zahtevi 1. Izolovani ili prečišćeni polipeptid: - koji se sastoji od sekvence SEQ ID NO: 3, ili varijante polipeptida koja je najmanje 85% identična celoj dužini SEQ ID NO: 3, ili varijante koja se sastoji od fragmenta od najmanje 20 uzastopnih aminokiselina SEQ ID NO: 3, ili - kodiran pomoću cDNK sekvence SEQ ID NO: 4, ili njene varijante zbog degeneracije genetičkog koda, ili varijante cDNK koja je najmanje 85% identična celoj dužini SEQ ID NO: 4.
2. 2. Polipeptid prema zahtevu 1, čija sekvenca je prikazana na SEQ ID NO: 35, ili varijanta polipeptida koja je najmanje 85% identična celoj dužini SEQ ID NO: 35.
3. 3. Polipeptid prema zahtevu 1, kodiran pomoću cDNK sekvence SEQ ID NO: 36 ili njene varijante zbog degeneracije genetičkog koda, ili varijante cDNK koja je najmanje 85% identična celoj dužini SEQ ID NO: 36.
4. 4. Polipeptid prema zahtevu 1, koji se sastoji od polipeptida koji je najmanje 90, 95, 96, 97, 98 ili 99 % identičan celoj dužini SEQ ID NO: 3, ili polipeptida koji se sastoji od fragmenta od najmanje 25 ili 30 uzastopnih aminokiselina SEQ ID NO: 3.
5. 5. cDNK sekvence SEQ ID NO: 4 ili 36, ili njene varijante zbog degeneracije genetičkog koda, ili varijanta cDNK koja je najmanje 85% identična celoj dužini SEQ ID NO: 4 ili 36.
6. 6. cDNK prema zahtevu 5, koja je najmanje 90, 95, 96, 97, 98 ili 99 % identična celoj dužini SEQ ID NO: 4 ili 36.
7. 7. Upotreba polipeptida prema bilo kom od zahteva 1 do 4 za pripremu monoklonalnog antitela.
8. 8. Netrin-1 vezujuće monoklonalno antitelo koje: (i) specifično se vezuje za polipeptid sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 3 ili 35 ili varijantu polipeptida koja je najmanje 85 % identična SEQ ID NO: 3 ili 35, ili varijantu polipeptida koja se sastoji od fragmenta od najmanje 20 uzastopnih aminokiselina SEQ ID NO: 3 ; ili (2i) obuhvata CDR1-H sekvence SEQ ID NO: 5, CDR2-H sekvence SEQ ID NO: 6, CDR3-H sekvence SEQ ID NO: 7, i CDR1-L sekvence SEQ ID NO: 8, CDR2-L sekvence YAS i CDR3-L sekvence SEQ ID NO: 9; ili (3i) obuhvata CDR1-H sekvence SEQ ID NO: 28, CDR2-H sekvence SEQ ID NO: 29, CDR3-H sekvence SEQ ID NO: 30, i CDR1-L sekvence SEQ ID NO: 31, CDR2-L sekvence SEQ ID NO: 32 i CDR3-L sekvence SEQ ID NO: 9, pri čemu to antitelo poseduje svojstvo vezivanja za netrin-1 i izazivanja ćelijske smrti ili apoptoze tumorske ćelije preko UNC5 receptora ili DCC receptora.
9. 9. Netrin-1 vezujuće monoklonalno antitelo prema zahtevu 8, koje antitelo definisano pod (i) specifično vezuje za polipeptid koji je najmanje 90, 95, 96, 97, 98 ili 99 % identičan SEQ ID NO: 3.
10. 10. Netrin-1 vezujuće monoklonalno antitelo prema bilo kom od zahteva 8 do 9, koje predstavlja njegov fragment za vezivanje epitopa.
11. 11. Netrin-1 vezujuće monoklonalno antitelo prema bilo kom od zahteva 8 do 10, koje obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 10, 11, 12 ili 13, poželjno obe sekvence SEQ ID NO: 10 i 11, ili SEQ ID NO: 12 i 13.
12. 12. Netrin-1 vezujuće monoklonalno antitelo prema bilo kom od zahteva 8 do 11, koje obuhvata aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe SEQ ID NO: 14 do 19 i/ili iz grupe SEQ ID NO: 20 do 27, poželjno obuhvata aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe SEQ ID NO: 14 do 19 i aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe SEQ ID NO: 20 do 27.
13. 13. Netrin-1 vezujuće monoklonalno antitelo prema zahtevu 12, koje obuhvata par aminokiselinskih sekvenci odabranih između parova SEQ ID NO: 14 i 20; 15 i 21; 16 i 22; 17 i 23; 17 i 24; 16 i 25; 17 i 26; 4 17 i 22; 18 i 25; i 16 i 21.
14. 14. Netrin-1 vezujuće monoklonalno antitelo prema zahtevu 13, koje dalje obuhvata humani kapa konstantni domen u lakom lancu, i humani IgG1 konstantni domen u teškom lancu.
15. 15. Farmaceutska kompozicija koja obuhvata antitelo prema bilo kom od zahteva 8 do 14, i farmaceutski prihvatljiv nosač, nosilac ili razblaživač.
16. 16. Kompozicija prema zahtevu 15, za upotrebu u lečenju subjekta od kancera, pri čemu taj kancer ima tumorske ćelije koje eksprimiraju netrin-1 receptor.
17. 17. Kompozicija prema zahtevu 15, za upotrebu u lečenju subjekta od kancera, pri čemu taj kancer ima tumorske ćelije koje eksprimiraju netrin-1 receptor i netrin-1 ili tumorske ćelije koje eksprimiraju netrin-1 receptor unutar ćelija strome koje eksprimiraju netrin-1.
18. 18. Kompozicija za upotrebu prema zahtevu 16 ili 17, pri čemu je kancer onaj gde tumorske ćelije eksprimiraju ili prekomerno eksprimiraju netrin-1 receptor, određenije klase UNC5, posebno UNC5B i/ili UNC5A, i/ili DCC.
19. 19. Kompozicija za upotrebu prema zahtevu 16, pri čemu se kompozicija koja obuhvata monoklonalno antitelo koristi u kombinaciji sa hemoterapeutskim lekom kod pacijenta.
20. 20. Kompozicija za upotrebu prema zahtevu 19, pri čemu je taj hemoterapeutski lek doksorubicin, 5-fluorouracil (5FU), paclitaksel, ili cisplatin.