RS59847B1 - Protein koji vezuje rgma i njegova upotreba - Google Patents

Protein koji vezuje rgma i njegova upotreba

Info

Publication number
RS59847B1
RS59847B1 RS20191502A RSP20191502A RS59847B1 RS 59847 B1 RS59847 B1 RS 59847B1 RS 20191502 A RS20191502 A RS 20191502A RS P20191502 A RSP20191502 A RS P20191502A RS 59847 B1 RS59847 B1 RS 59847B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
rgma
antibody
seq
sequence listing
amino acid
Prior art date
Application number
RS20191502A
Other languages
English (en)
Inventor
Motonori Hashimoto
Toshihide Yamashita
Original Assignee
Mitsubishi Tanabe Pharma Corp
Univ Osaka
Univ Chiba Nat Univ Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Mitsubishi Tanabe Pharma Corp, Univ Osaka, Univ Chiba Nat Univ Corp filed Critical Mitsubishi Tanabe Pharma Corp
Publication of RS59847B1 publication Critical patent/RS59847B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/06—Antiglaucoma agents or miotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)

Description

Opis
OBLAST TEHNIKE
[0001] Ovaj se pronalazak odnosi na protein koji vezuje RGMa (odbijajući molekul A usmeravanja) i njegovu upotrebu.
OBLAST PRONALASKA
[0002] RGM (odbijajući molekul usmeravanja), koji je protein membrane privezane na GPI sa molekularnom težinom od oko 33 kDa, je prvobitno identifikovan kao molekul usmeravanja aksona u sistemu za vida (videti nepatentni dokment 1). Familija RGM obuhvata tri člana koji se zovu RGMa, RGMb i RGMc. Od njih, RGMa je ponovo izražen posle povrede centralnog nervnog sistema kod odraslih ljudi i pacova kao i u stadijumu razvoja, i inhibicija RGMa kod pacova ubrzava izrastanje (ponovno oslobađanje) neurita posle povrede kičmenog stuba i unapređuje funkcionalni oporavak (videti nepatentni dokument 2). Dakle, RGMa se smatra inhibitorom neurita posle povrede centralnog nervnog sistema.
[0003] RGMa je takođe prijavljen da ima dejstva na imuni sistem. RGMa je izražen na dendritskim ćelijama i deluje na T ćelije, čime se pospešuje prianjanje T ćelija na ICAM-1 i fibronektin i uvođenje proizvodnje citokina (patentni dokument 4). Na modelu miša sa multipla sklerozom, isporuka anti-RGMa antitela potiskuje simptome usled encefalomijelitisa i takođe pokazuje dejstva potiskivanja pojave i relapsa (povratka/pogoršanja) bolesti. Smatra se da se anti-RGMa antitelo vezuje na RGMa izražen na dendritskim ćelijama da bi inhibirao aktivaciju T ćelija, čime deluje na multipla sklerozu.
[0004] Mehanizam prenosa (transdukcije) signala RGMa se takođe objašnjava, i protein neogenin je opisan kao receptor RGMa (patentni dokument 3). Neogenin je pojedinačni protein transmembrane izražen na neuronima i T ćelijama.
[0005] RGMa se vezuje na neogenin na membranu ćelije da bi se indukovala unutarćelijska RhoA aktivacija i Ras inaktivacija, čime se obezbeđuje inhibitorno dejstvo izrastanja neurita. U međuvremenu, poznato je da neogenin prouzrokuje apoptozu u odsustvu RGMa vezivanja u mozgu pileta u razvoju (Matsunaga et al., Dev.Growth Differ.46, 481, 2004). Dakle, RG- Ma/neogenin putanja se smatra da ima dva konfliktna dejstva pospešenja neuronskog opstanka, koji je poželjno dejstvo za oporavljanje nerva, i za inhibiranje izrastanja neurita, negativno dejstvo.
[0006] Kako Farmaceutski agens koji cilja RGM, patentni dokument 1 opisuje agens koji unapređuje regeneraciju aksona koji sadrži anti-RGM neutrališuće antitelo kao aktivni sastojak. Patentna dokumenta 2 i 3 opisuju terapijski agens za mehaničko oštećenje na mozgu i kičmenom stubu, i anti-RGM antitelo koje reguliše vezivanje RGM na njegov receptor neogenin. Patentni dokument 4 opisuje medicinske upotrebe anti-RGM antitela kao što je za multipla sklerozu. Patentni dokument 5 opisuje terapijske upotrebe anti-RGM antitela za bolesti koje obuhvataju multipla sklerozu, povredu mozga kod sisara, povredu kičmenog stuba, apopleksiju, neurodegenerativnu bolest i šizofreniju. Pored toga, patentni dokument 6 opisuje terapijske upotrebe RGM modulatora kao što je anti-RGM antitelo za povredu kičmenog stuba i multipla sklerozu, i nepatentni dokument 3 opisuje terapijsku upotrebu za progresivnu multipla sklerozu.
PATENTNA DOKUMENTA IZ PRETHODNOG STANJA TEHNIKE
[0007]
Patentni dokument 1: WO2005/087268
Patentni dokument 2: Nerešena PCT prijava patenta prevedena sa japanskog br.2010-537655
Patentni dokument 3: Nerešena PCT prijava patenta prevedena sa japanskog br.2009-510002
Dokument 4:WO2011/071059
Patentni dokument 5: Nerešena PCT prijava patenta prevedena sa japanskog br.
2011-512806
Patentni dokument 6: Nerešena PCT prijava patenta prevedena sa japanskog br.
2004-525875
Dokument 7: WO 2011/070045
NEPATENTNA DOKUMENTA
Nepatentni dokument 1: Neuron 5, 735-743 (1990)
Non-Patent Document 2: J. Cell Biol. 173, 47-58 (2006)
Nepatentni dokument 3: Cell Reports 10, 1-12 (2015)
KRATAK OPIS PRONALASKA
TEHNIČKI PROBLEM
[0009] Terapijske upotrebe anti-RGMa antitela protiv neuroloških i imunoloških bolesti su opisane kao što je opisano gore u tekstu, ali uobičajena antitela imaju probleme kao što je nedovoljna aktivnost, mogućnost oštećenja urođenih funkcija RGMa, i neželjena dejstva. Specifično, uobičajena antitela mogu suzbiti vezivanje između RGMa i neogenina, čime se takođe inhibiraju poželjna dejstva kao što je potiskivanje apoptoze koju ispoljava neogenin vezan na RGMa.
[0010] Dakle, cilj ovog pronalaska je da se obezbedi protein koji vezuje RGMa koji ne inhibira interakciju RGMa/neogenina već neutrališe RGMa aktivnost na inhibiranje izrastanja neurita.
REŠENJE PROBLEMA
[0011] Pronalazači ovog pronalaska su intenzivno proučavali da bi rešili gore navedene probleme. Kao rezultat, ovi pronazači su uspeli da dobiju protein koji vezuje RGMa koji ne inhibira vezivanje između RGMa i neogenina već neutrališe aktivnost RGMa inhibiranja izrastanja neurita, i utvrdili su da je moguće koristiti protein koji vezuje RGM kao lek za neurološke ili imunološke bolesti.
[0012] Ovaj pronalazak je kao što je opisan u nastavku.
[1] Izolovano anti-RGMa antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, pri čemu sekvenca amino kiseline svakog od regiona 1 određivanja komplementarnosti lakog lanca (LCDR1), regiona 2 određivanja komplementarnosti lakog lanca (LCDR2), regiona 3 određivanja komplementarnosti lakog lanca (LCDR3), regiona 1 određivanja komplementarnosti teškog lanca (HCDR1), regiona 2 određivanja komplementarnosti teškog lanca (HCDR2) i regiona 3 određivanja komplementarnosti teškog lanca (HCDR3) obuhvata sledeće:
LCDR1:RASQDISSYLN (SEK ID BR: 30 u spisku sekvenci) LCDR2:YTSRLHS (SEK ID BR: 31 u spisku sekvenci)
LCDR3:QQLNTLP (SEK ID BR: 32 u spisku sekvenci)
HCDR1:DAWMD (SEK ID BR: 33 u spisku sekvenci) HCDR2:EIRSKANNHATYYAESVKG (SEK ID BR: 34 u spisku sekvenci) i HCDR3:RDGAY (SEK ID BR: 35 u spisku sekvenci);
ili
LCDR1:RSSQSLVHSNGNTYLH (SEK ID BR: 36 u spisku sekvenci) LCDR2:KVSNRFS (SEK ID BR: 37 u spisku sekvenci)
LCDR3:SQSTHVP (SEK ID BR: 38 u spisku sekvenci)
HCDR1:TSYYWN (SEK ID BR: 39 u spisku sekvenci) HCDR2:YISYDGTNNYNPSLKN (SEK ID BR: 40 u spisku sekvenci) i HCDR3:SFG, i
pri čemu je u svaku od jedne ili više amino kiselina sekvenci CDR moguće supstituisati, obrisati, i/ili dodati.
[2] Anti-RGMa antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen je opisan u [1], pri čemu promenljivi region teškog lanca (VH) obuhvata sledeće:
VH:EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFSDAWMDWVRQAPGKGLEWVAEI RSKANNHATYYAESVKGRFTISRDDSKSIVYLQMNSLRTEDTALYYCTRRDGAYW-GKGTTVTVSS (SEK ID BR: 41 u spisku sekvenci) ili sekvenca amino kiseline koja ima identičnost od barem 90% sa pomenutom sekvencom amino kiseline; i
pri čemu promenljivi region lakog lanca (VL) obuhvata sledeće: VL:DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRL HSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFASYFCQQLNTLPWTFGGGTKVEME
(SEK ID BR: 42 u spisku sekvenci) ili sekvencu amino kiseline koja ima identinost od barem 90% sa pomenutom sekvencom amino kiseline.
[3] Anti-RGMa antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen je opisano u [1] ili [2], pri čemu je anti-RGMa antitelo humanizovano antitelo.
[4] Anti-RGMa antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen su opisani u jednom od
[1] do [3], pri čemu to anti-RGMa antitelo obuhvata konstantni region humanog IgG.
[5] Molekul nukleinske kiseline koji kodira deo proteina od tog anti-RGMa antitela ili njegov fragment koji vezuje antigen su opisani u bilo kom od [1] do [4].
[6] Molekul nukleinske kiseline je opisan u [5], pri čemu sekvence nukleotida kodiraju svaku od sekvenci amino kiseline VH i VL je sekvenca nukleotida koja obuhvata:
VH:
VL:
(SEK ID BR: 44 u spisku sekvenci).
[7] Rekombinantni vektor koji obuhvata molekul nukleinske kiseline opisan u [5] ili [6].
[8] Ćelija domaćin koja obuhvata rekombinantni vektor opisan u [7].
[9] Postupak za proizvodnju anti-RGMa antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen je opisan u bilo kom od [1] do [4], taj postupak obuhvata kultivisanje ćelije domaćina opisane u [8].
[10] Farmaceutska supstanca koja obuhvata anti-RGMa antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen su opisani u bilo kom od [1] do [4].
[11] Farmaceutska supstanca opisana u [10] za upotrebu u sprečavanju, lečenju, ili spečavanju povratka neuroloških ili imunoloških bolesti.
[12] Farmaceutska supstanca opisana u [11], pri čemu su neurološke bolesti izabrane iz grupe koja obuhvata amiotropnu lateralnu sklerozu, povredu brahijalnog pleksusa, oštećenje mozga (uključujući traumatsku povredu mozga), cerebralnu paralizu, Gilen-Barov (Guillain-Barre) sindrom, cerebralnu leukodistrofiju, multipla sklerozu (uključujući relapsno remitentnu multipla sklerozu, primarnu progresivnu multipla sklerozu, sekondarnu progresivnu multipla sklerozu), optički neuromijelitis (Devicova bolest), post-polio sindrom, spina bifidu, povredu kičmenog stuba, spinalnu mišićnu atrofiju, spinalni neoplazam, transverzalni mijelitis, demenciju (uključujući senilnu demenciju, srednje kognitivno oštećenje, Alchajmerovu bolest, demenciju povezanu sa Alchajmerovom bolešću), Hantingtonovu bolest, tardivnu diskineziju, maniju, Parkinsonovu bolest, Stil-Ričardsonov (Steele-Richardson) sindrom, Daunov (Down) sindrom, mijasteniju gravis, neurotraumu (uključujući traumu optičkog nerva), vaskularnu amiloidozu, krvarenje na mozgu povezano sa amiloidozom, infarkt mozga, cerebritis, akutno konfuzno stanje, glaukom, šizofreniju i degeneracija sloja vlakna nerva mrežnjače (uključujući dijabetesnu retinopatiju, ishemijsku optičku neuropatiju, X-povezano raslojavanje mrežnjače, lekom indukovanu optičku neuropatiju, distrofiju mrežnjače, degeneraciju makule povezanu sa starošću, bolesti očiju koje karakterišu limfni čvorovi optičkog diska (optic disc drusen), bolesti očiju koje karakteriše genetička determinanta za degeneraciju fotoreceptora, autosomalnu recesivnu distrofiju konusnih štapova (rožnjače) mrežnjače, mitohondrijalni poremećaj povezan sa optičkom neuropatijom).
[13] Farmaceutska supstanca opisana u [11], pri čemu se imunološke bolesti biraju iz grupe koja obuhvata multipla sklerozu (uključujući i relapsno-remitentnu multipla sklerozu, primarnu progresivnu multipla sklerozu, sekundarnu progresivnu multipla sklerozu), optički neuromijelitis, psorijazu, artritis (uključujući reumatoidni artritis, osteoartritis, psorijazni artritis), Glen-Barov (Guillain-Barre) sindrom, neuro-Behčetovu (neuro-Behcet) bolest, pernicioznu anemiju, tip I (od insulina zavisan) dijabetes melitus, sistemski lupus eritematozus (SLE), upalna bolest creva (IBD), Sjogrenov (Sjogren) sindrom, Gudpasterov (Goodpasture) sindrom, Grejvsovu (Graves) bolest, automimunu hemolitičku anemiju, autoimunu trombocitopenu purpuru, astmu, polinozu, atopijskii dermatitis, glomerulonefritis, mijastenija gravis, Hašimotova (Hashimoto) bolest, i sarkoidoza.
[14] Farmaceutska supstanca opisana u [11], pri čemu se neurološke ili imunološke bolesti biraju iz grupe koja obuhvata povredu kičmenog stuba, neurotraumu (uključujući traumu optičkog nerva) i multipla sklerozu (uključujući relapsnu-remitentnu multipla sklerozu, primarnu progresivnu multipla sklerozu, sekundarnu progresivnu multipla sklerozu).
POVOLJAN UČINAK OVOG PRONALASKA
[0013] Protein koji vezuje RGMa iz ovog pronalaska ne inhibira interakciju između RGMa i neogenina, čime se omogućava da se održe dejstva kao što je inhibicija apoptoze na neurone i slično što je ispoljeno pomoću neogenina vezanog na RGMa, čime se dobija jako zaštitno dejstvo na neurone i zanemarljivi problemi zbog pratećih dejstava povezanih sa osiromašenjem neurona. Pored toga, humanizovano anti-RGMa antitelo iz ovog pronalaska je superiorno uobičajenim antitelima zbog svojstava kao što je vezivanje na humani RGMa i termičke stabilnosti. Samim tim, antitelo je moguće koristiti kao lek za neurološke ili imunobiološke bolesti koje imaju odličnu efikasnost i skoro da nema neželjenih dejstava.
KRATAK OPIS SLIKA NACRTA
[0014]
Sl. 1 pokazuje rezultat ogleda inhibicije vezivanja RGMa na neogenin upotrebom poliklonalnog anti-RGMa antitela (AF2459), antitelo iz uporedivog primera (r5F9), i antitela iz ovog pronalaska (r70E4 i 116A3).
Sl. 2 pokazuje rezultat ogleda inhibicije vezivanja RGMa na BMP2 upotrebom kontrolnog mišjeg IgG i antitela iz ovog pronalaska (B5.70E4 i B5.116A3).
Sl. 3 pokazuje rezultat testa stabilnosti na toplotu za antitela upotrebom antitela iz uporedivog primera (rH5F9), himernog antitela iz ovog pronalaska (r116A3C) i humanizovanih antitela iz ovog pronalaska (HE/KA i HA/KC).
Sl. 4 pokazuje rezultat ogleda izrastanja neurita upotrebom antitela iz ovog pronalaska (B5.70E4 (levo) i B5.116A3 (desno)).
Sl. 5 pokazuje rezultat testa efikasnosti upotrebom kontrolnog mišjeg IgG (mo-IgG2bk), i antitela iz ovog pronalaska (r70E4 i r116A3) i upotrebom mišjeg modela povrede kičmenog stuba. Rezultati testova efikasnosti na modelu (A) preloma kičmenog stuba i na modelu (B) hemisekcije kičmenog stuba.
Sl. 6 pokazuje rezultat testa efikasnosti za antitelo iz ovog pronalaska (B5.116A3) upotrebom mišjeg modela multipla skleroze indukovane pomoću PLP139-151peptida. Leva strana pokazuje EAE ocene, desna strana pokazuje promene u telesnoj težini, i gornji i donji delovi pokazuju rezultate kada su testirana antitela bila isporučena posle 7 i 10 dana i posle 18 i 21 dana, prema opisanom redosledu.
OPIS IZVOĐENJA PRONALASKA
[0015] Da bi se olakšalo razumevanje ovog pronalaska, pojmovi korišćeni u ovom pronalasku će biti objašnjeni dole u tekstu.
RGMa
[0016] RGMa je inhibitorni protein izrastanja neurita u centralnom nervnom sistemu i humani RGMa protein je biosintetisan kao protein preteča koji obuhvata 450 aminokiselina kao što je prikazano u SEK ID BR: 1 u spisku sekvenci. Uklanja se signalni peptid Met 1 do Pro 47 predstavlja na N terminusu (koji se odnosi na taj Peptid iz prvog ostatka metionina na 47. ostatak prolina sa strane N-terminusa, slično je objašnjeno ovde dole u tekstu), peptidna veza između Asp 168 i Pro 169 se cepa, i peptid C terminusa Arg 423 na Cys 450 se uklanja i istovremeno GPI sidro se dodaje na karboksilnu grupu na C terminusu od Gly 422 koja je postala C terminus. Humani RGMa protein je izražen na membrani ćelije preko GPI sidra kao zrelog proteina u kom su domen N terminusa (Cys 48 do Asp 168) i domen Cterminusa (Pro 169 do Ala 424) međusobno spojeni disulfidnom vezom. Protein prekursor mišjeg RGMa obuhvata sekvencu aminokiseline prikazanu u SEK ID BR: 2 u spisku sekvenci i protein prekursor pacovskog RGMa obuhvata sekvencu aminokiseline prikazanu u SEK ID BR: 3 u spisku sekvenci. Kako se njihovi peptidi C terminusa uklone, zreli protein odatle imaju iste sekvence amino kiseline. U ovom pronalasku, RGMa može da se odnosi bilo na protein prekursor, zreli protein ili njegov aktivni fragment, ili može da bude derivat ili njegova varijanta, dokle god deluje preko vezivanja na neogenin kao što je opisano kasnije u tekstu. RGMa može biti humani RGMa ili RGMa izveden iz drugih organizama, ali prednost se daje humanom RGMa.
Neogenin
[0017] Neogenin je izražen u, na primer, neuronima centralnih nerava i funkcionišu kao jedan od RGMa receptora. Kao što je prikazano u SEK ID BR: 10 u spisku sekvenci, humani protein neogenin obuhvata 1461 aminokiseline i izražen je kao zreli protein membrane posle uklanjanja signalnog peptida Met 1 do Ala 33. U ovom pronalasku, neogenin može da se odnosi na bilo protein prekursor, zreli protein ili fragment koji vezuje RGMa, ili može da bude njegov derivat ili varijanta, dokle god se vezuje na RGMa. Neogenin može da bude humani neogenin ili neogenin izveden iz drugih organizama, ali se prednost daje humanom neogeninu.
Neutralizacija
[0018] Pojam "neutralizacija" kako je ovde korišćen se odnosi na aktivnost putem koje može da se pojavi vezivanje na cilj koji je predmet interesovanja i inhibicija bilo koje funkcije cilja. Drugim rečima, fraza "neutralisanje inhibitorne aktivnosti izrastanja neurita RGMa" znači da se protein vezivanja RGMa veže na RGMa, čime se inhibira inhibitorna aktivnost izrastanja neurita od RGMa. Inhibitornu aktivnost izrastanja neurita je moguće proceniti putem jednog ili više od nekoliko in vitro ili in vivo ogleda poznatih u ovoj oblasti, i moguće ga je proceniti, na primer, ogledom inhibicije izrastanja neurita koji je opisan ovde.
Izolovan
[0019] Pojam "izolovan" kao što je izolovan protein koji vezuje RGMa znači da je identifikovan, i odvojen i/ili oporavljen iz komponenata u njegovom prirodnom stanju. Nečistoće u prirodnom stanju i supstance koje mogu da ometaju dijagnostičku i terapijsku upotrebu antitela, obuhvataju enzime, hormone i druge proteinaste ili neproteinaste rastvorljive komponente. Generalno, izolacija proteina koji vezuje RGMa ili sličnog može da se dobije pomoću barem jednog koraka prečišćavanja. Za protein vezivanja RGMa prečišćen barem jednim korakom prečišćavanja moguće je koristiti "izolovani protein koji vezuje RGMa".
Protein koji vezuje RGMa
[0020] Kako je ovde korišćeno, pojam "protein koji vezuje RGMa" se odnosi na molekul koji obuhvata protein koji se veže na RGMa. Primeri proteina koji vezuju RGMa obuhvataju anti-RGMa antitela i njihove fragmente koji vezuju antigen; skafold proteini koji su poput skele vezuju RGMa; rastvorljivi proteini receptora RGMa kao što je vanćelijski domen Neogenin; i njegovi proteini fuzije. Pojam "skafold protein koji vezuje RGMa" se odnosi na protein koji ostvaruje funkciju vezivanja na RGMa uvođenjem
1
mutacija u Kunitz domen inhibitora proteaze serina, vanćelijski domen humanog fibronektina, ankirina, lipokalina ili sličnog. Pojam "protein fuzije" se odnosi na proteine koji vezuju RGMa vezane hemijski ili genetički na molekule funkcije koji nisu protein koji vezuje RGMa iz ove prijave kao što su nepeptidni polimeri kao što je polietilen glikol (PEG), radioaktivne supstance, toksini, jedinjenja male molekularne težine, citokini, faktori rasta (npr., TGF- β, NGF, neurotrofin), albumin, enzimi, i druga antitela.
Humano antitelo
[0021] Pojam "humano antitelo" se odnosi na antitelo kod koga su i laki i teški lanci izvedeni iz humanog imunoglobulina. Zavisno od razlike u konstantnim regionima teških lanaca, humana antitela obuhvataju IgG koji imaju γ-teške lance (uključujući IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4), IgM sa m-mikro teškim lancima, IgA sa α-teškim lancima (uključujući IgA1i IgA2), IgD sa δ-teškim lancima, ili IgE sa ε-teškim lancima. Laki lanci, u principu, obuhvataju bilo κ lance ili λ lance.
Humanizovano antitelo
[0022] Pojam "humanizovano antitelo" se odnosi na antitelo koje obuhvata promenljive regione koji obuhvataju regione određivanja komplementarnosti antitela izvedene iz nehumane životinje i okvirne regione izvedene iz humanog antitela, i konstantne regione izvedene iz humanog antitela.
Himerno antitelo
[0023] Pojam "himerno antitelo" se odnosi na antitelo kod kog laki lanac, teški lanac, ili oba obuhvataju nehumani izvedeni promenljivi region i humani izvedeni konstantni region.
Anti-RGMa antitelo
[0024] Kako je ovde korišćeno, pojam "anti-RGMa antitelo" se odnosi na molekule imunoglobulina koji se vezuju na RGMa, ili njihove modifikovane molekule. Modifikovani molekuli obuhvataju multispecifična antitela, himerna antitela, humanizovana antitela, funkcionalno modifikovana antitela, i konjugovana antitela.
Multispecifična antitela
[0025] Pojam "multispecifično antitelo" se odnosi na asimetrično antitelo koje obuhvata dva ili više nezavisna mesta prepoznavanja antigena sa dve ili više različite specifičnosti antigena, uključujući bispecifično antitelo koje ima dve specifičnosti antigena i trispecifično antitelo koje ima tri specifičnosti antigena.
Functionalno modifikovano antitelo
[0026] Kako je ovde korišćeno, pojam "funkcionalno modifikovano antitelo" se odnosi na antitelo u kom funkcije koje nisu funkcija vezivanja antigena tog antitela, uključujući funkciju ubijanja ćelije, funkciju aktiviranja komplementa i funkciju produženja poluživota u serumu, su modifikovane uglavnom modifikovanjem aminokiseline ili lanca šećera od Fc reGiona tog antitela.
Konjugovano antitelo
[0027] Kako je ovde korišćeno, pojam "konjugovano antitelo" se odnosi na antitelo vezano hemijski ili genetički na molekule funkcije koji nisu antitelo kao što su nepeptidni polimeri kao što je polietilen glikol (PEG), radioaktivne supstance, toksini, jedinjenja male molekularne težine, citokini, faktori rasta (npr., TGF- β, NGF, neurotrofin), albumin, i enzimi.
Fragment koji vezuje antigen
[0028] Kako je ovde korišćeno, pojam "fragment koji vezuje antigen" se odnosi na protein koji obuhvata deo antitela i može da se veže na antigen. Primeri fragmenta koji vezuje antigen obuhvataju F(ab’)2, Fab’, Fab, Fv (promenljivi fragment antitela), disulfidom povezan Fv, jednolančano antitelo (scFv), i njegovi polimeri. Pored toga, fragment koji vezuje antigen obuhvata konjugovane fragmente koji vezuju antigen vezane hemijski i genetički na molekule funkcije koji nisu anti-RGMa antitelo u ovoj prijavi kao što su nepeptidni polimeri kao što je polietilen glikol (PEG), radioaktivne supstance, toksini, jedinjenja male molekularne težine, citokini, faktori rasta (npr., TGF- β, NGF, neurotrofin), albumin, enzimi, i druga antitela.
Region određivanja komplementarnosti
[0029] Pojam "region određivanja komplementarnosti (CDR)" se odnosi na region koji formira mesto vezivanja antigena u promenljivom regionu molekula imunoglobulina, koji se takođe zove hiperpromenljivi region, i posebno se odnosi na deo u kom se sekvenca aminokiseline menja u velikoj meri za svaki molekul imunoglobulina. Kako CDR, svaki laki i teški lanac ima tri CDR (LCDR1, LCDR2, LCDR3, i HCDR1, HCDR2, HCDR3). U ovoj prijavi, CDR molekula imunoglobulina se određuju prema Kabat sistemu numeracije (Kabat et al., 1987, Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA).
Procenat (%) identičnost sekvence amino kiseline
[0030] "Procenat (%) identičnosti" kada je reč o identifikovanoj sekvenci referentnog polipeptida, kao što je promenljivi region, je definisan kao procenat ostataka aminokiseline u sekvenci kandidata koje su identične na ostatke amino kiseline specifične sekvence referentnog polipeptida, posle raspoređivanja sekvenci i uvođenja praznina kao što je neophodno da bi se dobio maksimalni % identičnosti i podrazumeva da se ni jedna konzervativna zamena ne smatra delom identičnosti sekvence. Poravnanje za potrebe određivanja % identičnosti može biti odstvareno posle upotrebe razlčitih postupaka u okviru znanja u toj oblasti nauke i tehnike, na primer, da se izvede korišćenjem javno dostupnog računarskog softvera kao što je BLAST, BLAST-2, ALIGN, ili Megalign (DNASTAR) softver. Stručnjaci u ovoj oblasti mogu da odrede odgovarajuće parametre za poravnanje sekvenci, uključujući sve algoritme neophodne da se postigne maksimalno poravnanje celom dužinom sekvenci koje se porede. Međutim, za ovde navedene potrebe, vrednosti % identitčnosti se dobijaju upotrebom računarskog programa za poređenje sekvenci BLAST u poravnavanjima u obliku parova.
[0031] U situacijama gde je BLAST korišćen za poređenja sekvence aminokiseline, % identičnosti date sekvence A aminokiseline prema datoj sekvenci B aminokiseline se izračunava kao u nastavku:
100 puta frakcija (razlomak) X/Y
pri čemu je X broj ostataka amino kiseline dobijen kao identična poklapanja programom za poklapanja sekvence Blast u tom programskom poklapanju A i B, i pri čemu je Y ukupan broj ostataka aminokiseline u B. Biće jasno da ako je dužina sekvence A
1
aminokiseline drugačija od družine sekvence B aminokiseline, % identičnosti A prema B će biti drugačiji od % identičnosti B prema A. Osim ako nije drugačije navedeno, sve vrednosti % identičnosti ovde navedene su dobijene korišćenjem kompjuterskog programa BLAST kao što je prikazano u neposredno prethodnom odeljku.
Takmičenje
[0032] Kako je ovde korišćeno, pojam "takmičenje" sa anti-RGMa antitelom iz ovog pronalaska znači da, kako je izmereno ovde opisanom rezonancom površinskog plazmona (SPR), vezivanje između anti-RGMa antitela iz ovog pronalaska i RGMa je smanjeno sa značajnom razlikom usled prisustva pomenutog anti-RGMa antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen.
Protein koji vezuje RGMa
[0033] Ovde opisan protein koji vezuje RGMa je izolovan protein koji vezuje RGMa, što ne inhibira vezivanje između RGMa i neogenina već neutrališe inhibitornu aktivnost RGMa u pogledu izrastanja neurita.
[0034] Preporučljivo, RGMa proteini su RGMa proteini izvedeni iz sisara. Na primer, humani RGMa proteini obuhvataju protein koji ima sekvencu aminokiseline od SEK ID BR: 1 u spisku sekvenci, mišji RGMa proteini obuhvataju protein koji ima sekvencu aminokiseline SEK ID BR: 2 u spisku sekvenci, i pacovski RGMa proteini obuhvataju protein koji ima sekvencu aminokiseline SEK ID BR: 3 u spisku sekvenci. Polipeptid koji obuhvata sekvencu aminokiseline pri čemu jedna ili više (preporučljivo 1 do 20, preporučljivije 1 do 10, još preporučljivije 1 do 5) aminokiselina u ovim sekvencama jesu supstituisane, obrisane, umetnute i/ili dodate i imaju pretežno istu aktivnost kao RGMa protein; ili može biti poželjniji polipeptid koji obuhvata sekvencu aminokiseline koja ima 90% ili veću (preporučljivo 95% ili više) identičnost sa sekvencom aminokiseline.
[0035] Kako je ovde korišćeno, polipeptid "sa pretežno istom aktivnošću kao RGMa protein" obuhvata bilo koji polipeptid dokle god taj polipeptid ima inhibitornu aktivnost u pogledu izrastanja neurita.
[0036] Supstitucija amino kiseline je poželjno konzervativna supstitucija. Kako je ovde korišćeno, "konzervativna supstitucija" znači zamenu ostatka aminokisleine sa drugim hemijski sličnim ostatkom aminokiseline tako da se ne menja u značajnoj meri aktivnost tog peptida. Na primer, supstitucija jednog hidrofobnog ostatka drugim hidrofobnim ostatkom, supstitucija jednog polarnog ostatka drugim polarnim ostatkom koji ima isto naelektrisanje, i slično su obuhvaćene. Primeri funkcionalno sličnih aminokiselina sa kojima je takva supstitucija moguća obuhvataju kao nepolarne (hidrofobne) aminokiseline, alanin, valin, izoleucin, leucin, prolin, triptofan, fenilalanin i metionin. Primeri polarnih (neutralnih) aminokiselina obuhvataju glicin, serin, treonin, tirozin, glutamin, asparagin, i cistein. Primeri pozitivno naelektrisanih (baznih) aminokiselina obuhvataju arginin, histidin i lizin. Primeri negativno naelektrisanih (kiselih) aminokiselina obuhvataju asparaginsku kiselinu i glutaminsku kiselinu.
[0037] Vezivanje ovde opisanog proteina koji vezuje RGMa na RGMa znači vezivanje specifično za RGMa. Preporučeniji je protein koji vezuje RGMa koji ima nisku konstantu disocijacije (Kd) za humani RGMa, na primer, od 10<-8>M ili manje, poželjnije 10<-9>M ili manje, i još poželjnije 10<-10>M ili manje kao gornju graničnu vrednost, i na primer bez ograničenja, od 10<-14>M ili više, još poželjnije 10<-13>ili više kao donju graničnu vrednost.
[0038] RGMa protein obuhvata domen N terminusa i domen C terminusa kao zreli protein, ali ima inhibitornu aktivnost izrastanja neurita sa samo domenom C terminusa. Ovde opisan protein koji vezuje RGMa iz ovog pronalaska se poželjno vezuje samo na domen C terminusa od RGMa da bi se neutralisala inhibitorna aktivnost izrastanja neurita. Preporučeniji je protein koji vezuje RGMa koji ima nisku konstantu disocijacije (Kd) za domen C terminusa humanog RGMa, na primer, od 10<-8>M ili manje, poželjnije 10<-9>M ili manje, i još poželjnije 10<-10>M ili manje kao gornju graničnu vrednost, i na primer bez ograničenja, od 10<-14>M ili više, još poželjnije 10<-13>ili više kao donju graničnu vrednost.
[0039] Protein koji vezuje RGMa ne inhibira vezivanje između RGMa i neogenina. Ovde, fraza "ne inhibira vezivanje između RGMa i neogenina" znači da su, u sistemu vezivanja RGMa i neogenin pokazanom u odeljku Primeri u daljem opisu, čak i kada je koncentracija proteina koji vezuje RGMa povećana, vezivanje između RGMa i neogenina nije pretežno smanjeno. Na primer, u slučaju gde je protein koji vezuje RGMa dodat na sistem vezivanja koji se odnosi na RGMa i neogenin, i njegova koncentracija je povećana, ako koncentracija proteina koji vezuje RGMa pokazuje IC50nije manja od 10 µg/mL, još poželjnije ne manje od 50 µg/mL, najpoželjnije ne manje od 100 µg/mL, može se reći da protein koji vezuje RGMa ne inhibira vezivanje između RGMa i neogenina.
[0040] Neogenin korišćen za ogled vezivanja sa RGMa je poželjno neogenin istog tipa kao RGMa. Drugim rečima, poželjno je da je mišji i humani neorginin korišćen za mišji ili humani RGMa, prema opisanom redosledu. Primera radi, humani neogenin obuhvata
1
protein koji ima sekvencu aminokiseline iz SEK ID BR: 10 u spisku sekvenci. Međutim, dokle god je sposoban za vezivanje na RGMa, protein koji ima sekvencu aminokiseline sa 90% ili više (poželjno 95% ili veću) identičnost sa SEK ID BR: 10 u spisku sekvenci može biti poželjniji.
[0041] Protein koji vezuje RGMa neutrališe aktivnost inhibiranja izrastanja neurita od strane RGMa. Inhibitorna aktivnost izrastanja neurita može biti procenjena pomoću ogleda izrastanja neurita prikazanog u Primerima u daljem tekstu opisa. Dodavanje RGMa inhibira izrastanje neurita, ali dodavanje proteina koji vezuje RGMa sprečava inhibiciju izrastanja neurita pomoću RGMa. Protein koji vezuje RGMa iz ovog pronalaska može da neutrališe inhibiciju izrastanja neurita dodavanjem RGMa za 50% ili više, poželjnije za 80% ili više, i najpoželjnije za 90% ili više.
[0042] Kako sekvence aminokiseline RGMa proteina budu različite zavisno od vrsta životinje, postoje i razlike u sekvenci amino kiseline između humanog RGMa koji predstavlja SEK ID BR: 1 u spisku sekvenci, mišjeg RGMa koji predstavlja SEK ID BR: 2 u spisku sekvenci, i pacovskog RGMa koji predstavlja SEK ID BR: 3 u spisku sekvenci. Kako se glodari kao što su miševi i pacovi generalno koriste kao eksperimentalni materijali u farmakološkim i bezbednosnim testovima proteinskih preparata kao što su preparati antitela, protein koji vezuje RGMa iz ovog pronalaska se poželjno vezuje na mišji i/ili pacovski RGMa, i poželjniji su oni koji imaju nizak Kd za mišji i/ili pacovski RGMa. Proteini koji vezuju RGMa čiji Kd ima gornju granicu od, na primer, 5 x 10<-7>M ili manju, poželjnije 10<-8>M ili manju, i još poželjnije 10<-9>M ili manje, i donju graničnu vrednost od, na primer, bez ograničavanja, 10<-12>M ili više, poželjnije 10<-11>ili veću su uključeni.
[0043] Protein koji vezuje RGMa je poželjno odlično stabilan na toplotu. Stabilnost na toplotu je moguće proceniti smanjenjem vezivanja sa RGMa toplotnom obradom, i protein koji vezuje RGMa iz ovog pronalaska je poželjno stabilan čak i pomoću obrade toplotom na 60°C ili više, još poželjnije čak i obradom toplotom na 65°C ili višom, i još poželjnije čak i obradom toplotom na 70°C ili više.
[0044] Mesto vezivanja kada se protein koji vezuje RGMa iz ovog pronalaska veže na RGMa nije posebno ograničeno. Na primer, kod humanog RGMa, vezivanje na jedan ili više sledećih peptida je poželjnije:EEVVNAVEDWDSQG (SEK ID BR: 26 u spisku sekvenci) (brojevi aminokiseline 298-311 SEK ID BR: 1 u spisku sekvenci) NQQID-FQAFHTNAE (SEK ID BR: 27 u spisku sekvenci) (brojevi aminokiseline 322-335 SEK ID BR: 1 u spisku sekvenci), PTAPETFPYET (SEK ID BR: 28 u spisku sekvenci) (brojevi aminokiseline 349-359 SEK ID BR: 1 u spisku sekvenci) KLPVEDLYYQA (SEK ID BR: 29
1
u spisku sekvenci) (brojevi aminokiseline 367-377 SEK ID BR: 1 u spisku sekvenci). Protein koji vezuje RGMa iz ovog pronalaska vezuje se poželjnije na SEK ID BR: 26 i 27 iz spiska sekvenci, još poželjnije na SEK ID BR: 26 i 27 iz spiska sekvenci i na SEK ID BR: 28 ili 29 iz spiska sekvenci.
[0045] Specifični primeri proteina koji vezuje RGMa obuhvataju anti-RGMa antitelo, skafold protein koji vezuje RGMa, i njihove proteine fuzije.
Anti-RGMa antitelo
[0046] Anti-RGMa antitelo iz ovog pronalaska obuhvata poliklonska ili monoklonska antitela dobijena upotrebom RGMa proteina ili njegovog delimičnog fragmenta (na primer, fragmenta koji obuhvata jednu ili više od SEK ID BR: 26 do 29 u gornjem spisku sekvenci) kao antigen i vakcinaciju sisara kao što su miševi sa tim antigenima; himerna antitela i humanizovana antitela proizvedena korišćenjem tehnologije rekombinovanja gena; humana antitela proizvedena upotrebom, na primer, transgenskih životinja koje proizvode humano antitelo; i slično. Kada je antitelo iz ovog pronalaska isporučeno kao lek ljudima, humanizovano antitelo ili humano antitelo je poželjnije sa gledišta pratećih efekata.
[0047] Antigene je moguće koristiti direktno za vakcinaciju ili mogu biti korišćeni kao kompleks sa proteinom nosačem. Za dobijanje kompleksa antigena i proteina nosača, agensi kondenzacije kao što je glutaraldehid, karbodiimid i aktivni estar maleimid. Primeri proteina nosača obuhvataju albumin serum govečeta, tiroglobulin, hemocijanin, i KLH.
[0048] Primeri sisara koje treba imunizovati obuhvataju miševe, pacove, hrčke, morsku prasad, zečeve, mačke, pse, svinje, koze, konje i stoku, i metode vakcinacije obuhvataju potkožnu, intramuskularnu ili intraperitonealnu isporuku. Posle isporuke, antigene je moguće isporučiti u mešavini sa kompletnim Frojndovim adjuvansom ili nekompletnim Frojndovim adjuvansom, i isporuka se obično izvodi jednom svake 2 do 5 nedelja. Ćelije koje proizvode antitelo su dobijene iz slezine ili limfnih čvorova vakcinisanih životinja su spojene fuzijom sa ćelijama mijeloma i izolovane kao hibridomi. Kao mijeloma ćelije, koriste se one izvedene iz sisara kao što je miš, pacov, ili čovek.
Poliklonalno antitelo
[0049] Poliklonalna antitela moguće je dobiti postojanjem zajedničkih proizvodnih metoda. To znači, poliklonalna antitela moguće je dobiti iz seruma dobijenog od životinja
1
podvrgnutih vakcinaciji, na primer, vakcinacijom sisara kao što je gore opisano sa antigenom kao što je opisano gore zajedno sa Frojndovim adjuvansom ako je potrebno.
Monoklonalno antitelo
[0050] Specifično, monoklonalna antitela je moguće dobiti kao u nastavku. To znači, antigen kao što je gore opisano se koristi kao imunognen, i imunogen se ubrizgava ili transplantira jednom ili više puta u kombinaciji sa Frojndovim adjuvansom, ako je ptorebno, sisaru kao što je gore opisano potkožno, intramuskularno, intravenozno, u stopalo ili intraperitonealno za vakcinaciju. Generalno, vakcinacija a se izvodi 1 do 4 puta na svakih 1 do 14 dana od početne vakcinacije, i ćelije koje proizvode antitelo se dobiju iz sisara vakcinisanih od oko 1 do 5 dana posle finalne vakcinacije.
[0051] Monoklonalna antitela moguće je dobiti korišćenjem postupaka dobro poznatim stručnjacima u ovoj oblasti (na primer, "Current Protocols in Molecular Biology" (John Wiley & Sons (1987)), Antibodies: A Laboratory Manual, Ed.Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988))).
[0052] Dobijanje "hibridoma" koji izlučuju monoklonalna antitela moguće je izvesti u skladu sa metodom koju su opisali Köhler and Milstein et al. (Nature, 256, 495, 1975) i metodama koje su joj slične. To znači, da se hibridomi dobijaju spajanjem fuzijom ćelije koja proizvodi antitelo koje je sadržano u slezini ili slične dobijene iz vakcinisanog sisara sa ćelijom mijeloma koja nema sposobnost proizvodnje autoantitela izvedenih iz sisara, poželjno miša, pacova ili čoveka.
[0053] Primeri ćelija mijeloma koje je moguće koristiti za fuziju ćelije obuhvataju mijelom izveden iz miša P3/X63-AG8.653 (653), P3/NSI/1-Ag4-1 (NS-1), P3/X63-Ag8.U1 (P3U1), SP2/0-Ag14 (Sp2/O, Sp2), PAI, F0 i BW5147, mijelom izveden iz pacova 210RCY3-Ag.2.3., i mijelom izveden iz čoveka U-266AR1, GM1500-6TG-A1-2, UC729-6, CEM-AGR,D1R11 i CEM-T15.
[0054] Primeri akceleratora fuzije obuhvataju polietilen glikol i slične. Generalno, ćelije koje proizvode antitelo i ćelije mijeloma u brojčanom odnosu od obično oko 1: 1 do 10: 1 su ostavljene da reaguju, korišćenjem polietilen glikola (prosečna molekularna težina: 1000 do 4000) u koncentraciji od oko 20 do 50%, na temperaturi od 20 do 40°C, poželjno 30 do 37°C tokom oko 1 do 10 minuta, pri čemu je moguće izvesti fuziju ćelije.
[0055] Analiziranje klonova hibridoma koji proizvode monoklonalna antitela moguće je izvesti kultivisanjem hibridoma, na primer, u mikrotitarskim pločama i merenje reaktivnosti supernatanata kulture u pregradama na imunogenu imunohemijskim metodama kao što
1
je ELISA.
[0056] Pri analiziranju hibridoma koji proizvode antitelo, takođe se procenjuje pored ogleda vezivanja sa RGMa proteinom, da li to antitelo ne inhibira vezivanje između RGMa proteina i neogenina i da li to antitelo neutrališe funkciju RGMa proteina (inhibitorna aktivnost izrastanja neurita). Ove metode analize omogućavaju odabir anti-RGMa antitela iz ovog pronalaska.
[0057] Klonove je još moguće dobiti iz pregrada koje sadrže hibridome koji proizvode željena antitela kloniranjem upotrebom ograničavajućeg razblaženja. Odabir i uzgoj hibridoma se obično izvodi na podlozi kulture ćelije životinja koja sadrži 10 do 20% seruma goveđeg fetusa suplementiranog sa HAT (hipoksantinom, aminopterinom i timidinom).
[0058] Monoklonalna antitela iz hibridoma moguće je proizvesti kultivisanjem hibridoma in vitro ili uzgajanjem in vivo, na primer, u ascitnoj tečnosti sisara kao što su miševi i pacovi i izolovanjem monoklonalnih antitela iz tako dobijenog supernatanta kulture ili ascitne tečnosti sisara.
[0059] Kada su kultivisani in vitro, hibridomi se uzgajaju, održavaju, i čuvaju u skladu sa različitim uslovima kao što su karakteristike i postupak kultivisanja za vrste ćelija koje treba kultivisati, i moguće je koristiti hranljivu podlogu pogodnu za proizvodnju monoklonalnih antitela u kulturi supernatanta.
[0060] Primeri baznih podloga obuhvataju podlogu sa malim sadržajem kalcijuma kao što je Hamova F12 podloga, MCDB 153 podloga ili MEM podloga sa malim sadržajem kalcijuma i podloga sa visokim sadržajem kalcijuma kao što je MCDB 104 podloga, MEM podloga, D-MEM podloga, RPMI 1640 podloga, ASF 104 podloga ili RD podloga. Bazna podloga može obuhvatiti, na primer, serum, hormone, citokine i/ili različite neorganske ili organske supstance u skladu sa namenom.
[0061] Monoklonalna antitela je moguće izolovati i prečistiti, na primer, podvrgavanjem gore pomenute kulture supernatanta ili ascitne tečnosti zasićenom amonijum sulfatu, metodi taloženja euglobulina, metodi kaproinske kiseline, metodi kaprilne kiseline, hromatografiji sa jonskom izmenom (kao što je DEAE ili DE52) afinitetnoj hromatografiji na koloni kao što je hromatografija na anti-imunoglobulinskoj koloni ili hromatografija na koloni proteina A. Specifično, prečišćavanje monoklonalnog antitela može da se izvede bilo kojim postupcima poznatim kao imunoglobulinski postupci prečišćavanja, i moguće ih je lako izvesti putem takvog frakcionisanja amonijum sulfata, PEG frakcionisanja, frakcionisanja etanolom, i afinitetne hromatografije koja koristi anjonski izmenjivač i dalje korišćenje RGMa proteina.
1
[0062] Monoklonalna antitela moguće je takođe dobiti postupkom prikaza faga. Kod postupka prikaza faga, fagovi izabrani iz opcione biblioteke antitela faga se analiziraju korišćenjem željenog imunogena i biraju se fagovi koji imaju željeni kapacitet vezivanja na immunogen. Dalje, sekvenca koja odgovara antitelu sadržana u tom fagu se izoluje ili sekvencira i vektor ekspresije koji obuhvata molekul nukleinske kiseline koji kodira antitelo ili domen koji vezuje antigen se konstrušie na osnovu izolovane sekvence ili određene sekvence. Najzad, monoklonalna antitela je moguće proizvesti kultivisanjem linija ćelije transfektovane sa takvim vektorima ekspresije. Humana biblioteka antitela može da se koristi kao biblioteka antitela faga da bi se generisala humana antitela koja imaju željena svojstva vezivanja.
[0063] Kao skafold protein koriste se, na primer, Kunic-ov (Kunitz) domen iz humanog inhibitora proteaze serina i vanćelijskog domena humanog fibrinonektina, i sekvencu ciljnog mesta vezivanja na skafold moguće je modifikovati da bi se generisala protein skele koji se vezuje na RGMa (Clifford Mintz et.al BioProcess International, 2013, Vol.11(2), pp40-48).
[0064] Proteini fuzije obuhvataju proteine koji vezuju RGMa vezane hemijski ili genetički na molekule funkcije koji nisu protein koji vezuje RGMa iz ove prijave kao što su nepeptidni polimeri kao što je polietilen glikol (PEG), radioaktivne supstance, toksini, jedinjenja male molekularne težine, citokini, faktori rasta (npr., TGF- β, NGF, neurotrofin), albumin, enzimi, i druga antitela.
[0065] Kada je PEG vezan kao funkcionalni molekul, PEG je moguće koristiti sa molekularnom težinom od, bez ograničenja, 2.000 do 100.000 Da, još poželjnije 10.000 do 50.000 Da, koji može biti linearni ili razgranat. Upotrebom, na primer, NHS aktivne grupe, PEG je moguće vezati, na primer na amino grupe N terminusa aminokiselina proteina koji vezuje RGMa.
[0066] U slučaju upotrebe radioaktivnih supstanci kao funkcionalnog molekula koriste se, na primer,<131>I,<125>I,<90>Y,<64>Cu,<99>Tc,<77>Lu ili<211>At. Radioaktivne supstance je moguće direktno vezati na protein koji vezuje RGMa, na primer, postupak sa T hloraminom T.
[0067] Kada se koristi toksin kao funkcionalni molekul koriste se, na primer, bakterijski toksini (npr., toksin difterije), fitotoksini (npr., ricin), mali toksini (npr., geldanamicin), maitansinoidi i kaliheamicin.
[0068] Kada se koristi jedinjenje male molekularne težine kao funkcionalni molekul koriste se, na primer, daunomicin, doksorubicin, metotreksat, mitomicin, neokarcinostatin, vindesin i fluorescentne boje kao što je FITC.
2
[0069] Kada se koristi enzim kao funkcionalni molekul koriste se, na primer, luciferaze (npr., luciferaze svitaca i bakterijske luciferaze; US Pat. br. 4,737,456), malat dehidrogenaze, ureaze, peroksidaze (npr., peroksidaze rena (HRPO)), alkalne fosfataze, β-galaktozidaze, glukoamilaze, lizozima, oksidaze saharida (npr., oksidaze glukoze, oksidaze galaktoze i glukoze-6-fosfat dehidrogenaze), heterociklične oksidaze (npr., urikaze i ksantin oksidaze), laktoper-oksidaza, i mikroperoksidaza.
[0070] Primeri linkera korišćenih za hemijsko vezivanje toksina, jedinjenje male molekularne težine ili enzim obuhvataju dvovalentne redikale (npr., alkilen, arilen, heteroarilen), jedinicu linkera koja se ponavlja ili alkoksi predstavljen pomoću -(CR2)nO(CR2)n-(pri čemu je R opcioni supstituent, i n je pozitivni celi broj) (npr., polietilenoksi, PEG i polimetilenoksi) i alkilamino (npr., polietilenamino, Jeffamine™) i diacid estar i amid (npr., sukcinat, sukcinamid, diglikolat, malonat, i kaproamid). Postupci hemijske modifikacije za vezivanje funkcionalnih molekula su već uspostavljeni u ovoj oblasti (D.J.King., Applications and Engineering of Monoclonal antibodies., 1998 T.J. International Ltd, Monoclonal Antibody-Based Therapy of Cancer., 1998, Marcel Dekker Inc; Chari et al., Cancer Res., 1992 Vol 152:127; Liu et al., Proc Natl Acad Sci USA., 1996 Vol 93:8681).
[0071] Preporučeno izvođenje ovog pronalaska je himerno antitelo. Kao "himerno antitelo", himerno antitelo kod kog promenljivi region jeste promenjivi region izveden iz imunoglobulina nehumane životinje (kao što je miš, pacov, hrčak ili pile) i konstantni region je konstantni region humanog imunoglobulina uzet kao primer. Himerno antitelo je moguće pripremiti, na primer, vakcinisanjem miša antigenom, odsecanjem promenljivog regiona koji se vezuje na antigen iz gena koji kodira mišje monoklonalno antitelo, i kombinovanje promenljivog regiona sa konstantnim regionom antitela izvedenog iz humane koštane srži. Konstanti region izveden iz humanog imunoglobulina ima jedinstvenu sekvencu aminokiseline zavisno od izotipa kao što je IgG (IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4), IgM, IgA (IgA1 i IgA2), IgD i IgE, ali konstantni region rekombinantnog himernog antitela u skladu sa ovim pronalaskom može da bude konstantni region humanog imunoglobulina koji pripada bilo kom izotipu. Konstantni region je poželjno konstantni region humanog IgG. Vektor ekspresije može da bude pripremljen korišćenjem gena himernog antitela tako pripremljen. Ćelije domaćini se transformišu sa vektorom ekspresije da bi se dobile himerne transformantne ćelije koje proizvode antitelo, i zatim su transformisane ćelije kultivisane da bi se dobilo željeno himerno antitelo iz supernatanta kulture.
[0072] Još jedno preporučeno izvođenje ovog pronalaska je humanizovano antitelo.
"Humanizovano antitelo" u ovom pronalasku je antitelo dobijeno kalemljenjem samo DNK sekvence mesta koje vezuje antigen (CDR; region određivanja komplementarnosti) antitelo nehumane životinje kao što je miš na humani gen antitela (CDR kalemljenje). Humanizovana antitela moguće je pripremiti po ugledu na postupke opisane u, na primer nerešenoj PCT prijavi patenta prevedenoj sa japanskog br. Hei 4-506458 and Japanese Patent No. 2912618. Specifično, razmatra se humanizovano antitelo koje karakteriše to što deo ili svi CDR jesu CDR izvedeni iz monoklonalnih antitela nehumanih sisara (kao što je miš, pacov i hrčak), ti okvirni regioni promenljivog region su okvirni regioni promenljivih regiona izvedenih iz humanog imunoglobulina, i što su konstantni regioni konstantni regioni izvedeni iz humanog imunoglobulina.
[0073] Humanizovano antitelo iz ovog pronalaska moguće je proizvesti, na primer, kao u nastavku, ali se podrazumeva da postupak proizvodnje nije tako ograničen.
[0074] Na primer, rekombinantno humanizovano antitelo izvedeno iz mišjeg monoklonalnog antitela moguće je proizvesti genetskim inženjeringom sa pozivom na nerešenu PCT prijavu patenta prevedenu sa japanskog br. Hei 4-506458 i Sho 62-296890. To znači da su, kodiranje DNK za mišji deo CDR teškog lanca i kodiranje DNK za mišji deo CDR lakog lanca izolovani iz hibridoma koji proizvode mišje monoklonalno antitelo, i kodiranje gena humanog teškog lanca za celi region koji nije CDR kodiranje gena humanog teškog lanca i humanog lakog lanca za ceo region koji nije CDR humanog lakog lanca su izolovani iz humanog gena imunoglobulina.
[0075] Humani gen teškog lanca na koji se kalemi izolovana kodirana DNK za mišji deo CDR teškog lanca se uvodi u odgovarajući vektor ekspresije tako da je moguća njegova ekspresija. Slično, humani gen lakog laca na koji se kalemi kodiranje DNK za mišji deo CDR lakog lanca se uvodi u drugi odgovarajući vektor ekspresije tako da je njegova ekspresija moguća. Alternativno, humani geni teškog i lakog lanca na koji se kalemi mišji CDR mogu biti uvedeni u isti vektor ekspresije tako da je moguća njegova ekspresija. Ćelije domaćina se transformišu sa vektorom ekspresije tako pripremljenim da bi se dobile humanizovane transformantne ćelije koje proizvode antitelo, i zatim su transformisane ćelije kultivisane da bi se dobilo željeno humanizovano antitelo iz supernatanta kulture.
[0076] Još jedno preporučeno izvođenje ovog pronalaska je humano antitelo. Humano antitelo se odnosi na antitelo u kom su svi regioni uključujući promenljive regione teškog lanca i konstante regione teškog lanca i promenljive regione lakog lanca i konstante regione lakog lanca koji čine imunoglobulin izvedeni iz gena koji kodiraju humani imunoglobulin. Humana antitela moguće je pripremiti uvođenjem humanig gena antitela u miševe. Humana antitela moguće je proizvesti na isti način kao gore pomenutim postupkom za pripremu poliklonalnih antitela ili monoklonalnih antitela, specifično, na primer, imunizovanjem tansgenske životinje pripremljene integrisanjem barem humanih gena imunoglobulina u lokus gena sisara, koji nije čovek, nego sisara kao što je miš.
[0077] Na primer, transgenske miševe koji proizvode humana antitela moguće je pripremiti prema postupcima opisanim, na primer, u Nature Genetics, Vol.7, p.13-21, 1994; Nature Genetics, Vol.15, p.146-156, 1997; nerešenoj PCT prijavi patenta prevedenoj sa japanskog br. Hei 4-504365 i br. Hei 7-509137; WO 94/25585; Nature, Vol.368, p.856-859, 1994; nerešenoj PCT prijavi patenta prevedenoj sa japanskog br. Hei 6-500233. Specifični primeri transgenskih miševa obuhvataju HuMab™ miša (Medarex, Princeton NJ), KMTM miša (Kirin Pharma Company, Japan), i KM (FCyRIIb-KO) miša.
[0078] Specifični primeri monoklonalnog antitela iz ovog pronalaska obuhvataju one kod kojih CDR u promenljivom regionu teškog lanca obuhvataju sekvence aminokiseline SEK ID BR: 33 (HCDR 1), 34 (HCDR 2) i 35 (HCDR 3) u spisku sekvenci i u čijim CDR u promenljivom regionu lakog lanca obuhvataju sekvence aminokiseline iz SEK ID BR: 30 (LCDR 1), 31 (LCDR 2) i 32 (LCDR 3) u spisku sekvenci. Jedna do nekoliko amino kiselina u jednom ili više od CDR mogu biti supstituisane dokle god se zadržavaju svojstva antitela iz ovog pronalaska o tome da imaju sposobnost da se vežu na RGMa, ne inhibiraju vezivanje između RGMa i neogenina, i neutrališu inhibitornu aktivnost RGMa u pogledu izrastanja neurita. Jedan do nekoliko znači, na primer, jedan ili dva. Supstitucija amino kiseline je poželjno konzervativna supstitucija da bi se zadržala svojstva iz ovog pronalaska. Zadržavanje svojstava antitela znači da se ova svojstva zadržavaju do istog nivoa, na primer, 80% ili više, preporučljivo 90% ili više, još preporučljivije 95% ili više u poređenju sa svojstvima pre modifikacija sekvence amino kiseline CDR. Zadržavanje takođe obuhvata poboljšanje.
[0079] Region koji nije CDR nije posebno ograničen dokle god je to sekvenca koja može da zadrži strukturu kao antitelo i ispolji njegovu funkciju, i može da bude bilo koja od sekvenci izvedenih iz miša, čoveka, i drugih sisara, njenih himernih sekvenci, i veštačkih sekvenci. U slučaju da obuhvataju konstantni region, sekvence aminokiseline konstantnih regiona u teškom lancu i lakom lancu su pokazane na primerima onih koje su opisane u istraživanju nukleinskih kiselina (Nucleic Acids Research vol.14, p1779, 1986, The Journal of Biological Chemistry vol.257, p1516, 1982 and Cell vol.22, p197, 1980).
[0080] Primeri mišjih antitela koji imaju ove CDR obuhvataju antitela kod kojih laki lanac
2
ima sekvencu aminokiseline sa SEK ID BR: 4 u spisku sekvenci i kod koje teški lanac ima sekvencu amino kiseline SEK ID BR: 5 u spisku sekvenci. Kod ovih sekvenci aminokiseline, može postojati supstitucija, delecija, dodavanje ili umetanje jedne ili više (1 do 20, 1 do 10 ili 1 do 5) aminokiselina dokle god se zadržavaju svojstva antitela koje ima sposobnost da se veže na RGMa, ne inhibiraju vezivanje između RGMa i neogenina, i neutralisanje inhibitorne aktivnosti RGMa u pogledu izrastanja neurita. Takva supstitucija, delecija ili dodavanje može biti uvedena u CDR, ali je poželjno uvedena u region koji nije CDR. Supstitucija amino kiseline je poželjno konzervativna supstitucija da bi se zadržala svojstva iz ovog pronalaska.
[0081] Mišja/humana himerna antitela kod kojih su konstantni regioni u gore pomenutom mišjem antitelu izvedeni iz čoveka su takođe uključena. Primer takvih mišjih/humanih himernih antitela je antitelo kod koga laki lanac ima sekvencu aminokiseline SEK ID BR: 8 u spisku sekvenci (promenljivi region se nastavlja od 1 do 107) i kod kog teški lanac ima sekvencu amino kiseline SEK ID BR: 9 u spisku sekvenci (promenljivi region se prostire od 1 do 116). Kod ovih sekvenci aminokiseline, može postojati supstitucija, delecija, dodavanje ili umetanje jedne ili više (1 do 20, 1 do 10 ili 1 do 5) aminokiselina dokle god se zadržavaju svojstva antitela koje ima sposobnost da se veže na RGMa, ne inhibiraju vezivanje između RGMa i neogenina, i neutralisanje inhibitorne aktivnosti RGMa u pogledu izrastanja neurita. Takva supstitucija, delecija ili dodavanje može biti uvedena u CDR, ali je poželjno uvedena u region koji nije CDR. Supstitucija amino kiseline je poželjno konzervativna supstitucija da bi se zadržala svojstva iz ovog pronalaska.
[0082] Pored toga, kao primer se uzimaju humanizovana antitela u čijem regionu koji nije CDR je izveden iz čoveka. Primer takvih humanizovanih antitela je antitelo kod kog teški lanac ima sekvencu amino kiseline iz bilo koje od SEK ID BR: 11 do 18 (promenljivi region je sve do 116. ostatka na strani N terminusa) i kod kog laki lanac ima sekvencu aminokiseline iz bilo koje od SEK ID BR: 19-25 u spisku sekvenci (promenljivi region se pruža od 1. do 107. ostatka na strani N terminusa).
[0083] Kod sekvenci aminokiseline humanizovanog antitela (teški lanac: SEK ID BR: 11-18 u spisku sekvenci, laki lanac: SEK ID BR: 19 do 25 u spisku sekvenci), može postojati supstitucija, delecija, dodavanje ili umetanje jedne ili više (1 do 20, 1 do 10 ili 1 do 5) aminokiselina dokle god se zadržavaju svojstva antitela koje ima sposobnost da se veže na RGMa, ne inhibiraju vezivanje između RGMa i neogenina, i neutralisanje inhibitorne aktivnosti RGMa u pogledu izrastanja neurita. Takva supstitucija, delecija ili dodavanje može biti uvedena u CDR, ali je poželjno uvedena u region koji nije CDR. Supstitucija aminokiseline je poželjno konzervativna supstitucija da bi se zadržala svojstva iz ovog pronalaska.
[0084] Sekvenca aminokiseline teškog lanca i sekvenca aminokiseline lakog lanca može da bude bilo koja njihova kombinacija, ali posebno se preporučuje da antitelo koje ima teške lance obuhvata sekvencu aminokiseline SEK ID BR: 15 u spisku sekvenci i da laki lanci obuhvataju sekvencu aminokiseline SEK ID BR: 19 u spisku sekvenci. U sekvenci aminokiseline SEK ID BR: 15 u spisku sekvenci, sekvenca aminokiseline koja odgovara promenljivom regionu teškog lanca je prikazana u SEK ID BR: 41 u spisku sekvenci i sekvenca aminokiseline koja odgovara promenljivom regionu lakog lanca je prikazana u SEK ID BR: 42 u spisku sekvenci. Dakle, posebno poželjno antitelo iz ovog pronalaska je antitelo kod kog promenljivi region teškog lanca ima sekvencu aminokiseline iz SEK ID BR: 41 u spisku sekvenci i kod koje promenljivi region lakog lanca ima sekvencu amino kiseline SEK ID BR: 42 u spisku sekvenci.
[0085] Kod ovih sekvenci aminokiseline, može postojati supstitucija, delecija, dodavanje ili umetanje jedne ili više (1 do 20, 1 do 10 ili 1 do 5) aminokiselina dokle god se zadržavaju svojstva antitela koje ima sposobnost da se veže na RGMa, ne inhibiraju vezivanje između RGMa i neogenina, i neutralisanje inhibitorne aktivnosti RGMa u pogledu izrastanja neurita. Takva supstitucija, delecija ili dodavanje može biti uvedeno u CDR, ali je poželjno uvedeno u region koji nije CDR. Supstitucija amino kiseline je poželjno konzervativna supstitucija da bi se zadržala svojstva iz ovog pronalaska.
[0086] Kod sekvence amino kiseline antitela iz ovog pronalaska koja obuhvata supstituciju, deleciju ili slično u sekvenci amino kiseline iz SEK ID BR: 41 i/ili 42 u spisku sekvenci kao što je opisano gore, promenljivi region teškog lanca je sekvenca aminokiseline koja ima 90% ili veću (još preporučljivije 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili veću) identičnost sa SEK ID BR: 41 u spisku sekvenci, i promenljivi region lakog lanca je sekvenca aminokiseline koja ima 90% ili veću (još preporučljivije 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili veću) identičnost sa SEK ID BR: 42 u spisku sekvenci.
[0087] Drugi specifični primeri monoklonalnog antitela iz ovog pronalaska obuhvataju one kod kojih CDR u promenljivom regionu teškog lanca obuhvataju sekvence aminokiseline SEK ID BR: 39 (HCDR 1), 40 (HCDR 2) i SFG (HCDR 3) u spisku sekvenci i u čijim CDR u promenljivom regionu lakog lanca obuhvataju sekvence aminokiseline iz SEK ID BR: 36 (LCDR 1), 37 (LCDR 2) i 38 (LCDR 3) u spisku sekvenci. Jedna do nekoliko amino kiselina u jednom ili više od CDR mogu biti supstituisane dokle god se zadržavaju svojstva antitela iz ovog pronalaska o tome da imaju sposobnost da se vežu na RGMa, ne
2
inhibiraju vezivanje između RGMa i neogenina, i neutrališu inhibitornu aktivnost RGMa u pogledu izrastanja neurita.
[0088] Jedan do nekoliko znači, na primer, jedan ili dva. Supstitucija amino kiseline je poželjno konzervativna supstitucija da bi se zadržala svojstva iz ovog pronalaska.
[0089] Region koji nije CDR nije posebno ograničen dokle god je to sekvenca koja može da zadrži strukturu kao antitelo i ispolji njegovu funkciju, i može da bude bilo koja od sekvenci izvedenih iz miša, čoveka, i drugih sisara, njenih himernih sekvenci, i veštačkih sekvenci. U slučaju da obuhvataju konstantni region, sekvence aminokiseline konstantnih regiona u teškom lancu i lakom lancu su pokazane na primerima onih koje su opisane u istraživanju nukleinskih kiselina (Nucleic Acids Research vol.14, p1779, 1986, The Journal of Biological Chemistry vol.257, p1516, 1982 and Cell vol.22, p197, 1980).
[0090] Primeri mišjih antitela koji imaju ove CDR obuhvataju antitela kod kojih laki lanac ima sekvencu aminokiseline sa SEK ID BR: 6 u spisku sekvenci i kod koje teški lanac ima sekvencu amino kiseline SEK ID BR: 7 u spisku sekvenci. Kod ovih sekvenci aminokiseline, može postojati supstitucija, delecija, dodavanje ili umetanje jedne ili više (1 do 20, 1 do 10 ili 1 do 5) aminokiselina dokle god se zadržavaju svojstva antitela koje ima sposobnost da se veže na RGMa, ne inhibiraju vezivanje između RGMa i neogenina, i neutralisanje inhibitorne aktivnosti RGMa u pogledu izrastanja neurita. Takva supstitucija, delecija ili dodavanje može biti uvedena u CDR, ali je poželjno uvedena u region koji nije CDR. Supstitucija amino kiseline je poželjno konzervativna supstitucija da bi se zadržala svojstva iz ovog pronalaska.
[0091] Takođe su uključena kao gore pomenuto mišje antitelo, himerna antitela čiji su konstantni regioni izvedeni iz čoveka. Još su uključena i humanizovana antitela u čijem regionu koji nije CDR je izveden iz čoveka.
[0092] Anti-RGMa antitelo iz ovog pronalaska obuhvata multispecifična antitela, funkcionalno modifikovana antitela, i konjugovana antitela koja imaju CDR koji obuhvataju specifične sekvence aminokiseline (na primer, sekvence aminokiseline SEK ID BR: 30 u spisku sekvenci za LCDR1, SEK ID BR: 31 u spisku sekvenci za LCDR2, SEK ID BR: 32 u spisku sekvenci za LCDR3, SEK ID BR: 33 u spisku sekvenci za HCDR1, SEK ID BR: 34 u spisku sekvenci za HCDR2, i SEK ID BR: 35 u spisku sekvenci za HCDR3), ili imaju promenljive regione koji obuhvataju specifične sekvence aminokiseline (na primer, sekvene aminokiseline SEK ID BR: 41 u spisku sekvenci za promenljivi region teškog lanca, i SEK ID BR: 42 za promenljivi region lakog lanca).
[0093] Anti-RGMa antitelo iz ovog pronalaska samo može da bude vezano na antitelo koje
2
ima drugu specifičnost vezivanja antigena koja nije anti-RGMa specifičnost putem tehnika genetskog inženjeringa da se pripreme multispecifična antitela kao bispecifična antitela. Tehnike genetskog inženjeringa su već uspostavljene u ovoj oblasti. Na primer, korišćenjem tehnike za DVD-Ig kod kog su promenljivi regioni povezani u nizu (Wu et al., Nature Biotechnology 25(11), 1290 (2007)) ili tehnike za ART-Ig kod koje su teški lanci dva tipa antitela koja se vezuju na različite antigene kombinovani modifikovanjem Fc regiona nekog antitela (Kitazawa et al., Nature Medicine 18(10), 1570(2012), moguće je dobiti željena bispecifična antitela. Drugi antigeni, koji nisu RGMa obuhvataju, ali se ne ograničavaju na, faktore koji inhibiraju izrastanje neurita kao što je Nogo, MAG, Omgp, CSPG, Sema 3A i Lingo-1, i molekuli povezani sa imunim sistemom kao što je TNF- α, IL-6 receptor, CD3, CD20, α4 integrin, BLys, stromalni limfopoietin timusa, IgE, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-13, IL- 17, IL-23 i IL-25.
[0094] Funkcionalno modifikovana antitela se uzimaju kao primer kao modifikovani molekuli anti-RGMa antitela iz ovog pronalaska. Funkcionalno modifikovano antitelo znači antitelo kod kog funkcije kao što je funkcija ubijanja ćelije, dopunjavaju funkciju aktivacije i funkciju da se produži poluvek trajanja krvi se modifikuju uglavnom modifikovanjem Fc regiona ili sličnog (Shitara, Journal of the Pharmaceutical Society of Japan, 2009, Vol. 129(1), p3; Ishii et al., Nippon Yakubutsugaku Zasshi (Folia Pharmacologica Japonica), 2010, Vol.136(5), p280; Hashiguchi et al., The Journal of Japanese Biochemical Society, 2010, Vol.82(8),p710).
[0095] Funkcionalno modifikovana antitela anti-RGMa antitela se dobijaju sledećim postupkom. Na primer, kada se anti-RGMa antitelo iz ove prijave proizvede korišćenjem, kao ćelija domaćina, CHO ćelije, čiji je gen α1,6- fukoziltransferaze (FUT 8) prekinut, dobiju se antitela sa smanjenim sadržajem fukoze šećernog lanca i povećanom funkcijom ubijanja ćelije, i kada se anti-RGMa antitelo iz ove prijave proizvede korišćenjem, kao ćelije domaćina, CHO ćelija u koje je uveden FUT8 gene, dobiju se antitela sa slabom funkcijom ubijanja ćelije (WO 2005/035586, WO 2002/31140 i WO 00/61739). Funkciju aktivacije komplementa je moguće regulisati modifikovanjem ostataka aminokiseline u Fc regionu (U.S. Patent Nos: 6737056, 7297775 i 7317091). Produžetak poluveka trajanja krvi moguće je postići upotrebom varijanti Fc regiona sa povećanim vezivanjem na FcRn koji je jedan od Fc receptora (Hashiguchi et al., The Journal of Japanese Biochemical Society, 2010, Vol.82 (8), p710). Ova funkcionalno modifikovana antitela moguće je proizvesti tehnikama genetskog inženjeringa.
[0096] Konjugovana antitela se izuzimaju kao modifikovani molekuli anti-RGMa antitela
2
iz ovog pronalaska. Primeri konjugovanog antitela obuhvataju konjugovana antitela kod kojih su anti-RGMa antitela vezana hemijski ili genetički na molekule funkcije koji nisu anti-RGMa antitelo u ovoj prijavi kao što su nepeptidni polimeri kao što je polietilen glikol (PEG), radioaktivne supstance, toksini, jedinjenja male molekularne težine, citokini, faktori rasta (npr., TGF- β, NGF, neurotrofin), albumin, enzimi, i druga antitela.
[0097] Kada je PEG vezan kao funkcionalni molekul, PEG je moguće koristiti sa molekularnom težinom od, bez ograničenja, 2.000 do 100.000 Da, još poželjnije 10.000 do 50.000 Da, koji može biti linearni ili razgranat. Upotrebom, na primer, NHS aktivne grupe, PEG je moguće vezati, na primer na amino grupe N terminusa aminokiselina antitela.
[0098] U slučaju korišćenja radioaktivne supstance kao funkcionalnog molekula koriste se, na primer,<131>I,<125>I,<90>Y,<64>Cu,<99>Tc,<77>Lu ili<211>At. Radioaktivne supstance je moguće direktno vezati na antitela, na primer, postupkom hloramina T.
[0099] Kada se koristi toksin kao funkcionalni molekul koriste se, na primer, bakterijski toksini (npr., toksin difterije), fitotoksini (npr., ricin), mali toksini (npr., geldanamicin), maitansinoidi i kaliheamicin.
[0100] Kada se koristi jedinjenje male molekularne težine kao funkcionalni molekul koriste se, na primer, daunomicin, doksorubicin, metotreksat, mitomicin, neokarcinostatin, vindesin i fluorescentne boje kao što je FITC.
[0101] Kada se koristi enzim kao funkcionalni molekul koriste se, na primer, luciferaze (npr., luciferaze svitaca i bakterijske luciferaze; US Pat. br. 4,737,456), malat dehidrogenaze, ureaze, peroksidaze (npr., peroksidaze rena (HRPO)), alkalne fosfataze, β-galaktozidaze, glukoamilaze, lizozima, oksidaze saharida (npr., oksidaze glukoze, oksidaze galaktoze i glukoze-6-fosfat dehidrogenaze), heterociklične oksidaze (npr., urikaze i ksantin oksidaze), laktoper-oksidaza, i mikroperoksidaza.
[0102] Primeri linkera korišćenih za hemijsko vezivanje toksina, jedinjenje male molekularne težine ili enzim obuhvataju dvovalentne radikale (npr., alkilen, arilen, heteroarilen), jedinica linkera koja se ponavlja ili alkoksi je predstavljena pomoću-(CR2)nO(CR2)n-(pri čemu je R opcioni supstituent, i n je pozitivni celi broj) (npr., polietilenoksi, PEG i polimetilenoksi) i alkilamino (npr., polietilenamino, Jeffamine™) i diacid estar i amid (npr., sukcinat, sukcinamid, diglikolat, malonat, i kaproamid). Postupci hemijske modifikacije za vezivanje funkcionalnih molekula su već uspostavljeni u ovoj oblasti (D.J.King., Applications and Engineering of Monoclonal antibodies., 1998 T.J. International Ltd, Monoclonal Antibody-Based Therapy of Cancer., 1998 Marcel Dekker
2
Inc; Chari et al., Cancer Res., 1992 Vol152:127; Liu et al., Proc Natl Acad Sci USA., 1996 Vol 93:8681).
[0103] "Fragmenti koji vezuju antigen" od antitela u ovom pronalasku znači delimični region koji ima svojstvo vezivanja antigena, od gore opisanih antitela, uključujući, posebno, F(ab’)2, Fab’, Fab, Fv (promenljivi fragment antitela), disulfidom povezan Fv, jednolančanog antitela (scFv), i njegovih polimera. Fragmenti vezivanja antigena još obuhvataju konjugovane fragmente koji vezuju antigen vezane hemijski ili genetički na molekule funkcije koji nisu anti-RGMa antitelo u ovoj prijavi kao što su nepeptidni polimeri kao što je polietilen glikol (PEG), radioaktivne supstance, toksini, jedinjenja male molekularne težine, citokini, faktori rasta (npr., TGF- β, NGF, neurotrofin), albumin, enzimi, i druga antitela.
[0104] Kako je ovde korišćeno, "F (ab’)2" i "Fab" znači fragmente antitela koji su proizvedeni tretiranjem imunoglobulina sa pepsinskom proteazom ili papajinom proteazom i proizvedene su razlaganjem uzvodno i nizvodno od disulfidne veze koja postoji između dva teška lanca u regionu zgloba. Na primer, tretiranje papainaom IgG može prouzrokovati cepanje uzvodno od disulfidne veze koja postoji između dva teška lanca u regionu zgloba da bi se proizvela dva homologna fragmenta antitela od kojih svaki obuhvata laki lanac koji obuhvata VL (promenljivi region lakog lanca) i CL (konstantni region lakog lanca) i fragment teškog lanca koji obuhvata VH (promenljivi region teškog lanca) i CH γ1 ( γ1 region unutar konstantnog regiona teškog lanca) kod kog su fragment lakog lanca i fragment teškog lanca povezani međusobno preko disulfidne veze na domenu C terminusa. Svaki od dva homologna fragmenta antitela se pominje kao Fab. Tretiranje pepsinom IgG može da prouzrokuje cepanje nizvodno od disulfidne veze koja postoji između dva teška lanca u regionu zgloba da bi se proizveo fragment antitela nešto malo veći od onog u kom su dva Fabs međusobno povezana na regionu zgloba. Ovaj fragment antitela se pominje kao F(ab’)2.
[0105] Konjugovani fragmenti koji vezuju antigen se uzimaju kao primer kao modifikovani molekuli fragmenta koji vezuje antigen od anti-RGMa antitela iz ovog pronalaska. Primeri konjugovanog fragmenta koji vezuje antigen obuhvataju one kod kojih delimični region koji ima svojstvo vezivanja antigena od anti-RGMa antitela se veže hemijski ili genetički na molekul funkcije koji nije anti-RGMa antitelo u ovoj prijavi kao što su nepeptidni polimeri kao što je polietilen glikol (PEG), radioaktivne supstance, toksini, jedinjenja male molekularne težine, citokini, faktori rasta, (npr., TGF- β, NGF, neurotrofin), albumin, enzimi, i druga antitela.
2
[0106] Kada je PEG vezan kao funkcionalni molekul, PEG je moguće koristiti sa molekularnom težinom od, a bez ograničenja, 2.000 do 100.000 Da, još poželjnije 10.000 do 50.000 Da, koji može biti linearni ili razgranat. PEG je moguće naći, na primer, na amino grupi N terminusa delimičnog regiona koji ima svojstvo vezivanja antigena anti-RGMa antitela korišćenjem, na primer, NHS aktivne grupe.
[0107] U slučaju korišćenja radioaktivne supstance kao funkcionalnog molekula koriste se, na primer,<131>I,<125>I,<90>Y,<64>Cu,<99>Tc,<77>Lu ili<211>At. Radioaktivne supstance mogu biti direktno vezane na delimični region koji ima svojstvo koje vezuje antigen od tog anti-RGMa antitela pomoću, na primer, postupka sa hloraminom T.
[0108] Kada se koristi toksin kao funkcionalni molekul koriste se, na primer, bakterijski toksini (npr., toksin difterije), fitotoksini (npr., ricin), mali toksini (npr., geldanamicin), maitansinoidi i kaliheamicin.
[0109] Kada se koristi jedinjenje male molekularne težine kao funkcionalni molekul koriste se, na primer, daunomicin, doksorubicin, metotreksat, mitomicin, neokarcinostatin, vindesin i fluorescentne boje kao što je FITC.
[0110] Kada se koristi enzim kao funkcionalni molekul koriste se, na primer, luciferaze (npr., luciferaze svitaca i bakterijske luciferaze; US Pat. br. 4,737,456), malat dehidrogenaze, ureaze, peroksidaze (npr., peroksidaze rena (HRPO)), alkalne fosfataze, β-galaktozidaze, glukoamilaze, lizozima, oksidaze saharida (npr., oksidaze glukoze, oksidaze galaktoze i glukoze-6-fosfat dehidrogenaze), heterociklične oksidaze (npr., urikaze i ksantin oksidaze), laktoper-oksidaza, i mikroperoksidaza.
[0111] Primeri linkera korišćenih za hemijsko vezivanje toksina, jedinjenje male molekularne težine ili enzim obuhvataju dvovalentne radikale (npr., alkilen, arilen, heteroarilen), jedinicu linkera koja se ponavlja ili alkoksi predstavljen pomoću -(CR2)nO(CR2)n-(pri čemu je R opcioni supstituent, i n je pozitivni celi broj) (npr., polietilenoksi, PEG i polimetilenoksi) i alkilamino (npr., polietilenamino, Jeffamine™) i diacid estar i amid (npr., sukcinat, sukcinamid, diglikolat, malonat, i kaproamid). Postupci hemijske modifikacije za vezivanje funkcionalnih molekula su već uspostavljeni u ovoj oblasti (D.J.King., Applications and Engineering of Monoclonal antibodies., 1998 T.J. International Ltd, Monoclonal Antibody-Based Therapy of Cancer., 1998 Marcel Dekker Inc; Chari et al., Cancer Res., 1992 Vol152:127; Liu et al., Proc Natl Acad Sci USA., 1996 Vol 93:8681).
[0112] Kod anti-RGMa antitela koje obuhvata CDRs ili promenljive regione koji imaju specifične sekvence aminokiseline iz ovog pronalaska, konstantni region je poželjno konstantni region humanog IgG (IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4) za održavanje sa dugim poluvekom trajanja u krvi.
[0113] Ovaj pronalazak takođe obuhvata anti-RGMa antitelo koje se takmiči sa antitelom koje ima sekvence aminokiseline iz specifičnih CDR kao što je opisano gore za vezivanje na RGMa proteine, i njegove fragmente koji vezuju antigen. Antitelo koje se takmiči sa antitelom koje ima sekvence aminokiseline iz specifičnih CDR kao što je opisano gore u tekstu za vezivanje na RGMa proteine obuhvataju epitope u regionima izabranim iz Glu 298 do Gly 311, Asn 322 do Glu 335, Lys 367 do Ala 377, i Pro 349 do Thr 359.
[0114] Antitelo je moguće dobiti (analiziratI) ili proceniti omogućavanjem antitelu da koegzistira u sistemu vezivanja tog antitela koje ima CDR sekvence kao što je opisano gore u tekstu i RGMa proteine. Na primer, antitelo je moguće dobiti pretragom korišćenjem sledećeg postupka rezonance površinskog plazmona (SPR).
[0115] Biotinilisani humani RGMa protein (4 µg/mL) kao ligand se učitava na avidinom imobilisan senzorski čip da bi se imobilisali humani RGMa proteini ekvivalentni sa 1300 do 1600 RU. Dalje, opciono anti-RGMa antitelo (15 µg/mL) se puni kao analit i vezuje na humani RGMa protein imobilisan na senzorskom čipu. Ponavljanjem toga više puta, stvara se stanje u kom se opciono anti-RGMa antitelo veže na sve humane molekule RGMa proteina na senzorskom čipu (zasićeno stanje) i određuje se količina vezivanja u zasićenom stanju (zasićena količina 1 vezivanja).
[0116] Slični eksperiment se izvodi sa anti-RGMa antitelom koje obuhvata sekvence aminokiseline specifičnih CDR iz ovog pronalaska da bi se odredila količina vezivanja u zasićenom stanju (zasićena količina 2 vezivanja).
[0117] Dalje, humani RGMa proteini na senzorskom čipu se zasićuju sa anti-RGMa antitelom koje obuhvata sekvence aminokiseline specifičnih CDR iz ovog pronalaska, i zatim se opciono anti-RGMa antitelo (15 µg/mL) učitava kao analit da bi se ispitalo da li se opciono anti-RGMa antitelo vezuje dodatno na humani RGMa protein zasićen sa anti-RGMa antitelom koje obuhvata sekvence aminokiseline specifičnih CDR iz ovog pronalaska.
[0118] Ako opciono anti-RGMa antitelo može da se veže dodatno na humani RGMa protein zasićen sa anti-RGMa antitelom koje obuhvata sekvence amino kiseline specifičnih CDR iz ovog pronalaska pri čemu pokazuje zasićenu količinu 1 vezivanja opcionog anti-RGMa antitela izračunatu gore, onda se za to antitelo donosi sud da se "ne takmiči". Sa druge strane, ako opciono anti-RGMa antitelo ne može da se veže dodatno na humani RGMa protein zasićen sa anti-RGMa antitelom koje obuhvata sekvence
1
aminokiseline specifičnih CDR iz ovog pronalaska, onda se za to antitelo donosi sud da se "takmiči". Čak i ako opciono anti-RGMa antitelo može da se veže dodatno na humani RGMa protein zasićen sa anti-RGMa antitelom koje obuhvata sekvence aminokiseline iz specifičnih CDR iz ovog pronalaska, kada dodata količina vezivanja ne dostigne zasićenu količinu 1 vezivanja sa značajnom razlikom, onda se za to antitelo donosi sud da se "takmiči". Značajne razlike se ispituju opštim statističkim postupcima (na primer, Studentskim t testom), i nivo značaja se postavlja na 5% ili manje.
[0119] Anti-RGMa antitelo koje se takmiči sa anti-RGMa antitelom koje obuhvata specifične CDR sekvence aminokiseline kao što je opisano gore za vezivanje sa RGMa može da bude antitelo izvedeno iz bilo koje životinje kao što je antitelo miša, čoveka, pacova, zeca, koze, ili kamile, ili može da bude himerno ili humanizovano antitelo koje je kombinacija ovih antitela, humanizovano, ili humano antitelo.
Molekuli nukleinske kiseline iz ovog pronalaska
[0120] Primeri molekula nukleinske kiseline iz ovog pronalaska obuhvataju polinukleotide kod kojih region koji kodira promenljivi region teškog lanca obuhvata sekvencu baze koja kodira sekvencu aminokiseline SEK ID BR: 33, 34, i 35 u spisku sekvenci, prema opisanom redosledu (u kom jedna ili više sekvenci aminokiseline može biti supstituisana, brisana, umetnuta ili dodata) i region koji kodira promenljivi region lakog lanca obuhvata sekvencu baze koja kodira sekvencu amino kiseline SEK ID BR: 30, 31, i 32 u spisku sekvenci, prema opisanom redosledu (u kom jedna ili više sekvenci aminokiseline može biti supstituisana, brisana, umetnuta ili dodata) i polinukleotide kod kojih region koji kodira promenljivi region teškog lanca obuhvata sekvencu baze koja kodira sekvencu amino kiseline SEK ID BR: 39, 40, i SFG u spisku sekvenci, prema opisanom redosledu (u kom jedna ili više sekvenci aminokiseline može biti supstituisana, brisana, umetnuta ili dodata) i region koji kodira promenljivi region lakog lanca obuhvata sekvencu baze koja kodira sekvencu amino kiseline SEK ID BR: 36, 37, i 38 u spisku sekvenci, prema opisanom redosledu (u kom jedna ili više aminokiselina može da bude supstituisana, brisana, umetnuta ili dodata).
[0121] Drugi primeri molekula nukleinske kiseline iz ovog rponalaska obuhvataju polinukleotide kod kojih region koji kodira teški lanac obuhvata sekvencu baze koja kodira sekvencu aminokiseline SEK ID BR: 5 u spisku sekvenci i taj region koji kodira laki lanac obuhvata sekvencu baze koja kodira sekvencu amino kiseline iz SEK ID BR: 4 u spisku sekvenci; i polinukleotide kod kojih taj region koji kodira teški lanac obuhvata sekvencu
2
baze koja kodira sekvencu amino kiseline iz SEK ID BR: 7 u spisku sekvenci i taj region koji kodira laki lanac obuhvata sekvencu baze koja kodira sekvencu amino kiseline iz SEK ID BR: 6 u spisku sekvenci.
[0122] Drugi primeri molekula nukleinske kiseline iz ovog pronalaska obuhvataju polinukleotide kod kojih region koji kodira teški lanac obuhvata sekvencu baze koja kodira sekvencu aminokiseline SEK ID BR: 9 u spisku sekvenci i taj region koji kodira laki lanac obuhvata sekvencu baze koja kodira sekvencu amino kiseline iz SEK ID BR: 8 u spisku sekvenci.
[0123] Drugi primeri molekula nukleinske kiseline iz ovog pronalaska obuhvataju polinukleotide kod kojih region koji kodira teški lanac obuhvata sekvencu baze koja kodira sekvencu aminokiseline bilo koje od SEK ID BR: 11 do 18 u spisku sekvenci i taj region koji kodira laki lanac obuhvata sekvencu baze koja kodira sekvencu amino kiseline bilo koje od SEK ID BR: 19 do 25 u spisku sekvenci.
[0124] Posebno je poželjno da primeri molekula nukleinske kiseline iz ovog rponalaska obuhvataju polinukleotide kod kojih region koji kodira teški lanac obuhvata sekvencu baze koja kodira sekvencu aminokiseline SEK ID BR: 15 u spisku sekvenci i taj region koji kodira laki lanac obuhvata sekvencu baze koja kodira sekvencu amino kiseline iz SEK ID BR: 19 u spisku sekvenci.
[0125] Drugi primeri molekula nukleinske kiseline iz ovog pronalaska obuhvataju polinukleotide kod kojih region koji kodira promenljivi region teškog lanca obuhvata sekvencu baze koja kodira sekvencu aminokiseline SEK ID BR: 41 u spisku sekvenci i taj region koji kodira promenljivi region lakog lanca obuhvata sekvencu baze koja kodira sekvencu amino kiseline iz SEK ID BR: 42 u spisku sekvenci.
[0126] Specifični primeri molekula nukleinske kiseline iz ovog pronalaska obuhvataju polinukleotide kod kojih region koji kodira promenljivi region teškog lanca obuhvata sekvencu baze SEK ID BR: 43 u spisku sekvenci i region koji kodira promenljivi region lakog lanca obuhvata sekvencu baze SEK ID BR: 44 u spisku sekvenci.
[0127] Molekul nukleinske kiseline iz ovog pronalaska mogu biti polinukleotidi koji hibridizuje pod strogim uslovima na komplementarni lanac DNK koji ima sekvencu baze iz SEK ID BR: 43 u spisku sekvenci i polinukleotidi koji hibridizuje pod strogim uslovima na komplementarni lanac DNK koji ima sekvencu baze iz SEK ID BR: 44 u spisku sekvenci dokle god molekul nukleinske kiseline iz ovog pronalaska kodira monoklonalno antitelo koje ima sposobnost da se veže na RGMa, ne inhibira vezivanje između RGMa i neogenina, i neutrališe inhibitornu aktivnost RGMa u pogledu izrastanja neurita. Primeri strogih uslova obuhvataju uslove izvođenja southern hibridizacije i pranje pri kocentraciji soli koja odgovara 0,1 x SSC, 0,1% SDS na 68°C.
[0128] Molekul nukleinske kiseline iz ovog pronalaska može kodirati sve konstantne regione i promenljive regione teških i lakih lanaca, i može kodirati samo promenljive regione teških i lakih lanaca. Sekvenca baze konstantnog regiona teškog lanca i lakog lanca u slučaju kodiranje svega od konstantnog regiona i promenljiv region poželjno su one koje su opisane u (Nucleic Acids Research vol.14, p1779, 1986, The Journal of Biological Chemistry vol.257, p1516, 1982 and Cell vol.22, p197, 1980).
[0129] Molekul nukleinske kiseline iz ovog pronalaska je moguće dobiti, na primer, sledećim postupkom. Prvo, ukupna RNK se priprema iz ćelija kao što su hibridomi korišćenjem komercijalnog pribora za ekstrakciju RNK, i cDNK se sintetiše sa reverznom transkriptazom korišćenjem nasumičnih početnica ili sličnog. Dalje, cDNK koje kodiraju antitelo se pojačavaju PCR postupkom upotrebom, za početnice, oligonukleotida koji imaju sekvence očuvane u promenljivim regionima poznatih gena teškog i lakog lanca humanog antitela, prema opisanom redosledu. Sekvencu koja kodira konstantni region, moguće je dobiti pojačavanjem poznate sekvence PCR postupkom. Sekvencu baze od DNK moguće je odrediti uobičajenim postupkom, na primer ugradnjom u plazmid za sekvenciranje.
[0130] Alternativno, DNK koja kodira monoklonalno antitelo iz ovog pronalaska moguće je takođe dobiti hemijskim sintetisanjem sekvence promenljivog regiona ili njenim delom i njenim vezivanjem na sekvencu koja obuhvata konstantni region.
[0131] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje rekombinantni vektor koji obuhvata molekul nukleinske kiseline iz ovog pronalaska i transformant (ćeliju domaćina) koja obuhvata rekombinantni vektor. Rekombinantni vektor mogu biti vektori koji mogu biti izraženi u prokariotskim ćelijama kao što je E. coli (Escherichia coli) (npr., pBR322, pUC119 ili njihov derivat), i poželjno su vektori koji mogu biti izraženi u eukariotskim ćelijama, i još poželjnije su vektori koji mogu biti izraženi u ćelijama izvedenim iz sisara. Primeri vektora koje je moguće izraziti u ćelijama izvedenim iz sisara obuhvataju vektore plazmida kao što je pcDNK 3.1 (Invitrogen), pConPlus, pcDM8, pcDNK I/Amp, pcDNK 3.1, pREP4; i virusni vektori kao što je pDON-AI DNK (Takara Bio). Vektor može da bude vektor koji obuhvata sekvencu koja kodira teški lanac i sekvencu koja kodira laki lanac ili mogu biti dva vektora od nekog vektora koji obuhvata sekvencu koja kodira teški lanac i od nekog vektora koji obuhvata sekvencu koja kodira laki lanac.
[0132] Transformant u koji se uvodi rekombinantni vektor iz ovog pronalaska može biti
4
prokariotska ćelija kao što je Escherichia coli ili Bacillus subtilis, poželjno eukariotska ćelija, još poželjnije ćelija sisara. Primeri ćelije sisara obuhvataju ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO ćelije), COS, mijelom, BHK, HeLa, Vero, 293, NS0, Namalwa i YB2/0.
[0133] Dobijeno anti-RGMa antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen je moguće prečišćavati do homogenosti. Postupke odvajanja i prečišćavanja korišćene za uobičajene proteine moguće je koristii za odvajanje i prečišćavanje antitela i sličnog. Odvajanje i prečišćavanje antitela je moguće postići odgovarajućim odabirom i kombinovanjem, na primer, ali ne i ograničeno na, hromatografske kolone, kao što je afintietna hromatografija, filteri, ultrafiltracija, isoljavanje, dijaliza, SDS (natrijum-dodecilsulfat) elektroforeza na poliakrilamidnom gelu ili izoelektrično fokusiranje (Antibodies: A Laboratory Manual. (Antitela:Laboratorijski priručnik)). Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Primeri kolona korišćenih za afinitetnu hromatografiju obuhvataju kolonu na proteinu A, kolonu na proteinu G, anti-imunoglobulinsku antitelom konjugovanu kolonu i antigenom konjugovanu kolonu. Primeri kolone na proteinu A obuhvataju Hyper D, POROS and Sepharose F. F. (Amersham Biosciences).
Agensi za sprečavanje ili tretiranje imunoloških i neuroloških bolesti
[0134] Anti-RGMa antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen iz ovog pronalaska neutališe inhibotornu aktivnost RGMa u pogledu izrastanja neurita da bi se pospešila popravka neuronske funkcije i tako može biti korišćena kao agens za sprečavanje, lečenje, ili spečavanje povratka neuroloških bolesti.
[0135] Takođe, anti-RGMa antiteloili njegov fragment koji vezuje antigen iz ovog pronalaska neutrališe aktivaciju T ćelije pomoću RGMa i zato može da se koristi kao agens za sprečavanje, tretiranje, ili sprečavanje relapsa imunoloških bolesti.
[0136] Primeri neurološke bolesti obuhvataju amiotropnu lateralnu sklerozu, povredu brahijalnog pleksusa, oštećenje mozga (uključujući traumatsku povredu mozga), cerebralnu paralizu, Gilen-Barov (Guillain-Barre) sindrom, cerebralnu leukodistrofiju, multipla sklerozu (uključujući relapsno remitentnu multipla sklerozu, primarnu progresivnu multipla sklerozu, sekondarnu progresivnu multipla sklerozu), optički neuromijelitis (Devicova bolest), post-polio sindrom, spina bifida, povreda kičmenog stuba, spinalna mišićna atrofija, spinalni neoplazam, transverzalni mijelitis, demencija (uključujući senilnu demenciju, umereno kognitivno oštećenje, Alchajmerovu bolest, demenciju povezanu sa Alchajmerovom bolešću), Hantingtonovu bolest, tardivnu diskineziju, maniju, Parkinsonovu bolest, Stil-Ričardsonov (Steele-Richardson) sindrom, Daunov (Down) sindrom, mijastenija gravis, neurotrauma (uključujući traumu optičkog nerva), vaskularnu amiloidozu, krvarenje na mozgu povezano sa amiloidozom, infarkt mozga, cerebritis, akutno konfuzno stanje, glaukom, šizofrenija i degeneracija sloja vlakna nerva mrežnjače (uključujući dijabetesnu retinopatiju, ishemijsku optičku neuropatiju, X-povezano raslojavajje mrežnjače, lekom indukovana optička neuropatija, distrofija mrežnjače, degeneracija makule povezana sa starošću, bolesti očiju koje karakterišu limfni čvorovi optičkog diska (optic disc drusen), bolesti očiju koje karakteriše genetička determinanta za degeneraciju fotoreceptora, autosomalna recesivna distrofija konusnih štapova (rožnjače) mrežnjače, mitohondrijalni poremećaj povezan sa optičkom neuropatijom). Povreda kičmenog stuba i neurotrauma (uključujući traumu nerva) imaju prednost.
[0137] Primeri imunološke bolesti obuhvataju multipla sklerozu (uključujući i relapsnoremitentnu multipla sklerozu, primarnu progresivnu multipla sklerozu, sekundarnu progresivnu multipla sklerozu), optički neuromijelitis, psorijazu, artritis (uključujući reumatoidni artritis, osteoartritis, psorijazni artritis), Glen-Barov (Guillain-Barre) sindrom, neuro-Behčetovu (neuro-Behcet) bolest, pernicioznu anemiju, tip I (od insulina zavisan)dijabetes melitus, sistemski lupus eritematozus (SLE), upalnu bolest creva (IBD), Sjogrenov (Sjogren) sindrom, Gudpasterov (Goodpasture) sindrom, Grejvsovu (Graves) bolest, automimunu hemolitičku anemiju, autoimunu trombocitopenu purpuru, astmu, polinozu, atopijskii dermatitis, glomerulonefritis, mijasteniju gravis, Hašimotovu (Hashimoto) bolest, i sarkoidozu. Prednost se daje multipla sklerozi.
[0138] Anti-RGMa antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen iz ovog pronalaska moguće je koristiti kao agens za sprečavanje, lečenje, ili sprečavanje relapsa neurološke/imunološke bolesti, koje preporučljivo obuhvataju povredu kičmenog stuba, neurotraumu (uključujući traumu optičkog nerva) i multipla sklerozu (uključujući relapsnuremitentnu multipla sklerozu, primarnu progresivnu multipla sklerozu, sekundarnu progresivnu multipla sklerozu).
[0139] Kako je ovde korišćen, pojam "lečenje" obuhvata bilo kakvo lečenje bolesti kod sisara, posebno čoveka, i obuhvata inhibiranje simptoma bolesti, to znači, inhibiranje progresije ili eliminisanje bolesti ili simptoma, i ublažavanje simptoma bolesti, to znači, prouzrokovanje regresije bolesti ili simptoma ili odlaganje razvoja simptoma.
[0140] "Sprečavanje" obuhvata sprečavanje pojave gore opisanih bolesti kod sisara, posebno čoveka.
[0141] "Sprečavanje relapsa" obuhvata sprečavanje relapsa ponovne remisije gore opisanih bolesti i relaps kod sisara, posebno čoveka.
[0142] Anti-RGMa antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen iz ovog pronalaska moguće je koristiti kao farmaceutsku supstancu za upotrebu za sprečavanje ili lečenje neuroloških ili imunoloških bolesti.
[0143] Oblik isporuke anti-RGMa antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen iz ovog pronalaska nije posebno ograničen i moguće ga je isporučiti sisarima uključujući humane bilo kojom rutom oralne ili parenteralne isporuke (npr., intravenoznom, intramuskularnom, potkožnom, rektalnom, transkutanom, intracerebralnom, intraspinalnom ili drugom topikalnom isporukom).
[0144] Oblici doziranja za oralnu i parenteralnu isporuku i oblici dobijanja su dobro poznati stručnjacima u ovoj oblasti, i farmaceutska supstanca može da se dobije kombinovanjem antitela prema ovom pronalasku sa farmaceutski prihvatljivim nosačem ili sličnim.
[0145] Oblici doziranja za parenteralnu isporuku obuhvataju preparate koji se mogu ubrizgati (npr., injekcije kap po kap, intravenozne injekcije, intramuskularne injekcije, potkožne injekcije, intradermalne injekcije, preparate za intracerebralnu isporuku, i preparate za intraspinalnu isporuku), spoljne preparate (npr., masti, tople obloge, i losione), supozitorne inhalante, kapi za oči, oftalmičke masti, nazalne kapi, kapi za uši, i lipozome. Specifično, kada antitelo prema ovom pronalasku treba da direktno deluje na centralno nervno tkivo, može da bude infuzionirano kontinualno korišćenjem medicinske mikropumpe, koja je osmotska pumpa, ili pomešano sa fibrinskim lepkom ili sličnim da bi se dobio preparat sa zadržanim otpuštanjem i zatim postavio u obolelo tkivo.
[0146] Na primer, preparati koje je moguće ubrizgati se obično pripremaju rastvaranjem antitela u destilovanu vodu koju je moguće ubrizgati i, ako je neophodno, moguće je dodati agens rastvaranja, pufer, agens podešavanja pH vrednosti, agens izotonizacije, umirujući agens, konzervans, i agens stabilizacije. Preparati koje je moguće ubrizgati mogu takođe biti liofilisani preparati napravljeni pre upotrebe.
[0147] Oblici doziranja za oralnu isporuku obuhvataju čvrste ili tečne oblike doze, posebno, tablete, obložene tablete, pilule, fine granule, granule, prahove, kapsule, sirupe, emulzije, suspenzije, injekcije i tablete.
[0148] Farmaceutska supstanca iz ovog pronalaska može još da sadrži druge terapijski delotvorne lekove, i ako je neophodno, komponente kao što su mikrobiocidi, antiflogistici, vitamini i aminokiseline mogu biti pomešani.
[0149] Farmakološki prihvatljivi nosači obuhvataju, na primer, ekscipijente, lubrikanse, vezivna sredstva i dezintegranse za čvrste preparate; i rastvarače, agense rastvaranja, suspendujuće agense, agense izotonizacije, puferska sredstva i umirujuće agense za tečne preparate. Ako je neophodno, aditivi kao što su obično antiseptici, antioksidansi, sredstva za bojenje, zaslađivači, apsorbensi, i sredstva za ovlaživanje mogu biti odgovarajuće korišćeni u odgovarajućim količinama.
[0150] Doza antitela prema ovom pronalasku može da bude određena na osnovu različitih činilaca kao što je ruta isporuke, tip bolesti, stepen simptoma, starost, pol, telesna težina, ozbiljnost bolesti pacijenta, farmakološki nalazi kao što su farmakokinetičke i toksikološke karakteristike, da li se koristi sistem isporuke leka, ili ne, i da li se isporučuje kao deo kombinacije sa drugim lekovima. Obično, 1 do 5.000 µg/dan, poželjno 10 do 2.000 µg/dan, poželjnije 50 do 2.000 µg/dan za oralnu isporuku ili 1 do 5.000 µg/dan, poželjno 5 do 2.000 µg/dan, još poželjnije 50 do 2.000 µg/dan za injekciju moguće je ubrizgati po odrasloj osobi (60 kg telesne težine) u jednoj ili više doza. Za parenteralnu isporuku u celo telo, 10 do 100.000 µg/kg, još 100 do 50.000 µg/kg, i još preporučljivije 500 do 20.000 µg/kg po kilogramu telesne težine može biti isporučeno u intervalu od jednom dnevno, jednom nedeljno, jednom mesečno, ili 1 do 7 puta godišnje. Za topikalnu isporuku moguća je upotreba osmotske pumpe ili sličnog, obično, kontinualnom infuzijom u količini od 10 do 100.000 µg/dan, preporučljivije 100 do 10.000 µg/dan, i još preporučljivije 500 do 5.000 µg/dan po odrasloj osobi (60 kg telesne težine).
PRIMERI
[0151] Ovaj pronalazak će biti opisan detaljnije u nastavku ovog teksta sa pozivom na Primer, ali ovaj pronalazak nije ograničen na varijantna rešenja u primerima koji slede.
Primer 1: Dobijanje humanog RGMa proteina (domen C terminusa)
[0152] CHO ćelija koja eksprimuje rekombinantni humani RGMa protein kod kog se oznaka histidina fuzijom spaja na C terminus od Pro 169 do Gly 422 (koji se odnosi na ostatak prolina na poziciji 169 na ostatak glicina na poziciji 422 od strane N terminusa, ovde u daljem tekstu slično opisano) humanog RGMa proteina (SEK ID BR: 1 u spisku sekvenci) je ustanovljeno.
[0153] Domen C terminusa humanog RGMa proteina sadržanog u kulturi supernatanta CHO ćelija je apsorbovan na koloni nikla (GE Healthcare, 17-5247-01), i eluiran sa 100 mM rastvora imidazola. Dijalizom, imidazol frakcija eluacije je zamenjena natrijum fosfatnim puferskim rastvorom (PBS) i korišćena kao imunogen.
Primer 2: Dobijanje mišjeg anti-humanog RGMa monoklonalnog antitela
[0154] Deset mikrograma rekombinantnog humanog RGMa proteina dobijenog u Primeru 1 je pomešano sa kompletnim Frojndovim adjuvansom (Sigma) da bi se pripremila emulzija, i BALB/c miš (Charles River Japan) je vakcinisan time na nekoliko potkožnih mesta na pozadini. Posle toga, vakcinacija je izvedena slično u intervalima od 1 do 2 nedelje sa 10 µg rekombinantnog humanog RGMa proteina pripremljenog u emulziji sa nekompletnim Frojndovim adjuvansom (Sigma), i krv je prikupljena posle nekoliko vakcinacija. Titar antitela je izmeren ELISA opisano dole u kom su imobilisani humani ili mišji RGMa proteini. Kod pojedinaca koji su pokazali povećani titar antitela, 10 µg humanog RGMa proteina je intravenozno isporučeno radi pospešenja, i splenociti su oporavljeni posle 2 ili 3 dana.
[0155] Za fuziju ćelije, ćelije slezine i mišje ćelije mijeloma (SP2/0, Dainippon Sumitomo Pharma) sa pola broja ćelija slezine su pomešane i centrifugirane, i polietilen glikol (Roche Diagnostics) je dodat u frakciju taloga dobijenog kao rezultat da bi se dobile fuzije ćelije. Ćelije su zatim centrifugirane i oprane dvaput sa D-MEM (Invitrogen). Ćelije su vraćene u suspenziju u GIT podlogu (Nippon Pharmaceutical) koja sadrži 10% seruma goveđeg fetusa (Invitrogen), 1% BM condimed (Roche Diagnostics) i HAT (Sigma-Aldrich) i zasejan u svakoj pregradi ploče sa 96 pregrada na 5 X 10<4>mijeloma ćelija/pregradi. Kultura supernatanta je oporavljena i analiziranaa za ćelije koje proizvode antitelo pomoću humanog RGMa proteinom imobilisane ELISA tehnike iz Primera 3.
[0156] Ćelije koje proizvode antitelo su dobijene analiziranjem su klonirane postupkom ograničenog razblaženja, i ćelija hibridoma koje proizvode dve vrste monoklonalnih antitela (B5.116A3 i B5.70E4) su odabrane.
[0157] Izotipi oba monoklonalna antitela određena upotrebom pribora za izotipovanje (Mouse MonoAB ID/SP KIT, ZYMED, 93-6550) su bili mišji IgG2b za teški lanac i kapa za laki lanac.
[0158] Kultura supernatanata hibridoma su podvrgnute afinitetnoj hromatografiji korišćenjem agaroze na čijim su anti-mišjim IgG antitelima imobilisani (Anti-Mouse IgG-Agarose proizvod kompanije Sigma) da bi se prečistila monoklonalna antitela. Pošto je antitelo vezano na kolonu, kolona je oprana sa PBS. Zatim je antitelo eluirano sa 10 mM glicin hidrohlorida (pH 2,7) i eluat je neutralisan odmah posle toga. Posle toga, neutralisani eluat je zamenjen sa PBS kroz ultrafilter.
Primer 3: ELISA na kojoj su imobilisani humani i mišji RGMa proteini
[0159] Humani RGMa protein (R&D systems, 2459-RM) ili mišji RGMa protein (R&D systems, 2458-RG) su pripremljeni na 2 µg/mL sa PBS su svaki raspršeni na ploču sa 96 pregrada sa 50 µL/pregradi, i ploča je ostavljena da stoji na sobnoj temperaturi tokom 1 sat. Posle uklanjanja rastvora, ApplieBlock (Seikagaku Bio-Business, 200150) razblažen 5-struko sa PBS je raspršen sa 200 µL/pregradi i ploča je ostavljena da stoji na sobnoj temperaturi tokom 1 sat da bi se blokiralo nespecifično vezivanje. Posle pranja tri puta sa PBST (PBS koji sadrži 0,05% Tween 20), uzorke (npr., mišji serum, supernatant kulture hibridoma, rekombinantni supernatant kulture izražene antitelom je opisan kasnije, ili prečišćeno antitelo) serijski razblaženo sa PBS su svaki dodati u 50 µL/pregradi, i ploča je ostavljena da stoji na sobnoj temperaturi tokom 1 sat. Posle toga, ploča je oprana tri puta sa PBST, i zatim je peroksidazom označeno ovčje anti-mouse IgG antitelo (GE Healthcare, NA9310V) razblaženo sa PBS raspršeno svako sa 50 µL/pregradi, i ploča je ostavljena da stoji na sobnoj temperaturi tokom 1 sat. Posle pranja tri puta, pribor za bojenje peroksidazom (Sumitomo Bakelite, ML- 1130O) je dodat i ostavljen da razvije boju tokom izvesnog perioda vremena, i apsorpcija na 492 nm je izmerena sa čitačem ploče.
Primer 4: Analiza epitopa antitela
[0160] Epitopi na koje se antitela vezuju su određeni postupkom pretrage peptida.
Ukupno 83 vrste peptida je sintetisano spajanjem fuzijom na strani N terminusa sekvenci amino kiseline koje obuhvataju 11 konsekutivnih ostataka prenetih pomoću 3 ostatka sadržana u Arg 172 do Ala 424 humanog RGMa proteina (SEK ID BR: 1 u spisku sekvenci) sa sekvencom razmaka (SGSG) sa biotinilisanim N terminusom (SEK ID BR: 46 u spisku sekvenci). Posle imobilizacije peptida na pločama obloženim avidinom, antitela koja se testiraju (B5.116A3 i B5.70E4) su ostavljena da reaguju.
Naknadno, peroksidazom označeno zečje anti-mišje Ig antitelo (Dako, P026002) je ostavljeno da reaguje. Pošto je dodat rastvor supstrata i boja razvijena posle izvesnog vremena, izmerena je apsorpcija sa čitačem ploče.
[0161] Kao rezultat, B5.116A3 vezani na peptide izvedene iz humanog RGMa od Glu 298 do Gly 311 (dva tipa peptida: Glu 298 do Asp 308 i Val 301 do Gly 311), Asn 322 do Glu 335 (dva tipa peptida: Asn 322 do Thr 332 i Ile 325 do Glu 335), i Lys 367 do Ala 377; i B5.70E4 vezani na peptide izvedene iz humanog RGMa od Glu 298 do Gly 311 (dva tipa peptida: Glu 298 do Asp 308 i Val 301 do Gly 311), Asn 322 do Glu 335 (dva tipa peptida: Asn 322 do Thr 332 i Ile 325 do Glu 335), i Pro 349 do Thr 359.
Primer 5: Analiza sekvence i kloniranje gena mišjeg antitela
4
[0162] Ukupna RNK je ekstahovana iz ćelija hibridoma koje su proizvodile mišje monoklonalno antitelo (B5.116A3 ili B5.70E4). Korišćenjem ukupne RNK kao uzorka, cDNK je sintetisana reakcijom reverzne transkripcije. Upotreba cDNK kao uzorka, geni promenljivih i konstantnih regiona lakog lanca, i promenljivi i konstantni regioni teškog lanca su pojačani pomoću PCR i određene su DNK sekvence. Dalje, na osnovu određenih sekvenci promenljivih i konstantnih regiona, geni antitela pune dužine su pojačani pomoću PCR i klonirani. Sekvence amino kiseline kodirane ovim genima antitela su bile kao u nastavku.
(1) B5.116A3 sekvenca aminokiseline lakog lanca (SEK ID BR: 4 u spisku sekvenci)
(2) B5.116A3 sekvenca aminokiseline teškog lanca (SEK ID BR: 5 u spisku sekvenci)
(3) B5.70E4 sekvenca aminokiseline lakog lanca (SEK ID BR: 6 u spisku sekvenci)
(4) B5.70E4 sekvenca aminokiseline teškog lanca (SEK ID BR: 7 u spisku sekvenci)
Primer 6: Dobijanje rekombinantnog mišjeg antitela i rekombinantnog pacovskog mišjeg himernog antitela
[0163] Dobijena su rekombinantna mišja antitela dva tipa anti-RGMa antitela B5.116A3 i B5.70E4 izvedena iz hibridoma (ovde u daljem tekstu se pominju kao "r116A3" i "r70E4", prema opisanom redosledu).
[0164] Pored toga, kao uporedni primer, rekombinantno pacovsko mišje himerno antitelo (ovde u daljem tekstu se pominje kao "r5F9") je pripremljeno fuzionim spajanjem promenljivih regiona pacovskog antitela 5F9 sa konstantnim regionima mišjeg antitela (IgG2b κ) (konstantni region lakog lanca je Arg 108 do Cys 214 od SEK ID BR: 4 u spisku sekvenci, i konstantni region teškog lanca je Ala 117 do Lys 452 SEK ID BR: 5 u spisku sekvenci) prema patentnom dokumentu 1 (WO2009/106356).
[0165] DNK koja kodira lake i teške lance svakog od antitela je umetnuta u pcDNK 3.3 (Life Technologies) da bi se pripremio vektor ekspresije. Vektor ekspresije je uveden u HEK293F ćelije (Life Technologies) korišćenjem Neofection 293 (ASTEC). Ćelije su odgajane na 37°C pod 8% atmosferom gasa ugljen-dioksida tokom 6 dana, i zatim je oporavljen supernatant kulture. Za prečišćavanje rekombinantnog antitela, supernatant kulture je nanet na afinitetnu kolonu na kojoj je imobilisan protein A ili protein G (GE Healthcare), i antitela vezana na kolonu su eluirana sa 10 mM glicin hidrohlorida (pH2.8). Eluat je neutralisan neposredno, i zatim je zamenjen sa PBS.
[0166] U slučaju gde rafinisana čistoća treba da bude povećana u skladu sa svrhom upotrebe, antitela prečišćena sa kolonom na proteinu A su prečišćena sa keramičkim hidroksiapatitom tipa 1 (CHT) kolona (BIORAD). Antitela vezana na CHT kolonu su oprana sa 10 mM KH2PO4(pH6.5) i zatim su eluirana sa 20 mM KH2PO4(pH6.5), 0,5 M NaCl. Eluirane frakcije su prikupljene i zatim zamenjene sa PBS.
Primer 7: Ogled vezivanja na ćelijama koje eksprimuju RGMa protein
[0167] Vektor ekspresije pune dužine humanog RGMa proteina (Met 1 do Cys 450 od SEK ID BR: 1 u spisku sekvenci), humani RGMa protein domena C terminusa (Pro 169 do Cys 450 od SEK ID BR: 1 u spisku sekvenci), mišjeg RGMa proteina pune dužine (Met 1 do Trp 454 of SEK ID BR: 2 u spisku sekvenci), pacovskii RGMa protein domena C terminusa (Pro 170 do Trp 449 SEK ID BR: 3 u spisku sekvenci) je uveden u CHO ili HEK 293 ćelije da bi se pripremile ćelije koje izražavaju antigen.
[0168] Kod RGMa proteina, peptid C terminusa se prerađuje tokom GPI reakcije dodavanja sidra. Mišji i pacovski RGMa proteini se oba cepaju na Ala 427 i uklanja se peptid C terminusa. Samim tim, sekvence amino kiseline proteina pune dužine i domen C terminusa izraženi na ćeliji preko GPI sidra su isti kod miša i pacova.
[0169] Testirana antitela (r116A3 i r70E4) i r5F9 (uporedni primer) sa finalnom koncentracijom od 10 µg/mL su reagovala sa gore opisanim ćelijama koje eksprimuju antigen i zatim su ćelije oprane sa PBS koji sadrži 0,1% albumina goveđeg seruma i 0,05% NaN3. FITC-označeno anti-mišje antitelo imunoglobulina (DAKO) su ostavljeni da reaguju i ćelije su oprane. Fluorescencija je izmerena protočnom citometrijom (FACSCalibur koji je proizvela kompanija Beckton Dickinson), i procenjena su svojstva vezivanja testiranih antitela na ćelije koje eksprimuju antigen (Tabela 1).
[0170] Kao rezultat, utvrđeno je da su r116A3 i r70E4 vezani na domen C terminusa humanih i pacovskih RGMa proteina, za razliku od r5F9. RGMa protein ima inhibitorno dejstvo izrastanja neurita čak i u samo domenu C terminusa, i r116A3 i r70E4 inhibiraju i RGMa protein pune dužine i domen C terminusa.
4
Tabela 1: Procena vezivanja različitih rekombinantnih anti-RGMa antitela na ćelije * koje eksprimuju antigen
000000000000
Primer 8: Određivanje konstante disocijacije za RGMa protein
[0171] Afinitet testiranih antitela (r116A3 i r70E4) i r5F9 (uporedni primer) za RGMa protein su izmereni postupkom rezonance površinskog plazmona (SPR) korišćenjem Proteon XPR36 (Bio-Rad).
[0172] Humani RGMa protein (R&D Systems, 2459-RM), domen C terminusa humanog RGMa proteina (dobijen u Primeru 1) ili mišji RGMa protein (R&D Systems, 2458-RG) razblažen do 10 µg/mL sa 10 mM acetatnim puferom (pH 4,5) je imobilisan na GLC senzorskokm čipu postupkom spajanja aminom. Serijski razblažena testirana antitela su naneta kao analiti pri brzini protoka od 100 µL/min tokom 60 sekundi da bi se odredila konstanta disocijacije (Kd vrednost).
[0173] Kao što je prikazano u Tabeli 2, r116A3 i r70E4 su takođe vezani na domen C terminusa humanog RGMa proteina, ali r5F9 nije. R116A3 vezan na humani RGMa protein 32 puta jače nego r5F9 i na mišji RGMa protein 44 puta jače nego r5F9.
Tabela 2: Afinitet anti-RGMa monoklonalnog antitela
Primer 9: Ogled inhibicije vezivanja RGMa-neogenin
[0174] Vanćelijski domen (Ala 34 do Leu 1105) rekombinantnog humanog proteina neogenina (SEK ID BR: 10 u spisku sekvenci) je prečišćen. Uspostavljena je CHO linija ćelije koja eksprimuje humani domen vanćelijskog proteina Neogenina. Oznaka histidina je spojena fuzijom na C terminus. Iz kulture supernatanta CHO ćelija, vanćelijski domen je apsorbovan na koloni nikla (GE Healthcare, 17-5247-01), i zatim je eluiran sa 100 mM rastvorom imidazola. Dijalizom, frakcija rastvora imidazola je zamenjena sa PBS.
[0175] Humani RGMa protein (R&D systems, 2459-RM) je označen sa biotinom korišćenjem kompleta za oznaku biotina ChromaLink Biotin Labeling Kit (Solulink). Jednake količine biotinom označenog humanog RGMa proteina podešena na 2 µg/mL i testirana antitela (r116A3 i r70E4) podvrgnuta 2-strukom serijskom razblaženju su pomešana i ostavljena da reaguju na sobnoj temperaturi tokom 2 sata da bi se pripremio mešoviti rastvor.
[0176] U isto vreme, 50 µL/pregradi humanog vanćelijskog domena neogenin proteina je podešen na 2 µg/mL sa PBS je dodat u ploču sa 96 pregrada, i ploča je ostavljena da stoji na sobnoj temperaturi tokom 1 sat da bi se pripremila ploča imobilisana neogeninom. Posle uklanjanja rastvora, 2,5% rastvora albumina goveđeg seruma je dodato i ploča je ostavljena da stoji tokom 1 sat da bi se blokiralo nespecifično vezivanje. Na ploču imobilisanu neogeninom, gore opisani pomešani rastvor je dodat u 50 µL/pregradu, i ploča je ostavljena da stoji na sobnoj temperaturi tokom 1 sat. Zatim je izvedena operacija pranja, i dodat je peridoksidazom označen Avidin (VECTASTAIN ABC system, koji su proizvele Vector Laboratories), i ploča je ostavljena da stoji na sobnoj temperaturi tokom 1 sat. Operacija pranja je zatim izvedena, dodat je rastvor supstrata, razvoj boje je izveden tokom izvesnog perioda vremena, i apsorpcija je izmerena sa čitačem ploče. Odnos apsorpcije u odsustvu antitela je grafički prikazan kao 1, i procenjena je inhibicija vezivanja zavisna od koncentracije RGMa-neogenina pomoću antitela (Sl.1).
[0177] Kao rezultat, za razliku od anti-humanog RGMa poliklonalnog antitela (R&D Systems, AF2459) i r5F9, r116A3 i r70E4 nisu inhibirali vezivanje RGMa-neogenina.
Primer 10: Ogled inhibicije vezivanja RGMa-BMP2
[0178] Humani RGMa protein (R&D systems, 2459-RM) je podešen na 2 µg/mL sa PBS je dodat na ploču sa 96-pregrada sa 50 µL/pregradi, i ploča je ostavljena da stoji na sobnoj temperaturi tokom 1 sat.2,5%-ni rastvor albumina goveđeg seruma je dodat i mešavina je ostavljena da stoji tokom 1 sat da bi se blokiralo nespecifično vezivanje, čime je pripremljena ploča imobilisana RGMa proteinom. Testirana antitela (B5.116A3 i B5.70E4) su serijski razblažena do 0,01 do 10 µg/mL su dodata u ploču imobilisanu RGMa proteinom i ploča je ostavljena da stoji na sobnoj temperaturi tokom 1 sat. Zatim je izvedena, operacija pranja, i humani BMP2 protein (R&D systems, 355-BM) je razblažen
4
do 0,5 µg/mL je dodat i ploča je ostavljena da stoji na sobnoj temperaturi tokom 1 sat.
[0179] Biotin označeno anti-BMP2 antitelo je ostavljeno da reaguje, i još je dodat peroksidazom označen Avidin (VECTASTAIN ABC system, proizvod kompanije Vector Laboratories) i dodat je rastvor supstrata, razvoj boje je izveden tokom izvesnog perioda vremena, i apsorpcija je izmerena sa čitačem ploče (Sl.2).
[0180] Kao rezultat, posebno, anti-RGMa antitelo (B5.116A3) je slabo inhibiralo vezivanje RGMa-BMP2 na način zavisan od koncentracije (Apsorpcija: 0,45 sa 0,01 µg/mL, 0,4 sa 0,1 µg/mL, 0,32 sa 1 µg/mL, i 0,1 sa 10 µg/mL).
Primer 11: Projektovanje humanizovanog antitela
[0181] Humanizacija mišjeg monoklonalnog antitela B5.116A3 je izvedena kalemljenjem regiona određivanja komplementarnosti (CDR) prema postupku koji su opisali Winter et al. opisanom u patentu br. 2912618.
[0182] Prvo, pripremljeni su modeli 3D homologije promenljivih regiona lakog i teškog lanca mišjeg monoklonalnog antitela B5.116A3 i identifikovani su ostaci aminokiseline unutar okvirnog (FW) regiona,smešteni blizu CDR. Odabrani su okvirni (FW) regioni humanih antitela kod kojih se ove aminokisleine zadržavaju što je moguće više, CDR mišjeg antitela su nakalemljeni na njih, i time je projektovano humanizovano antitelo. U projektovanoj sekvenci humanizovanog antitela, teški lanac je opisan kao HA (SEK ID BR: 11 u spisku sekvenci) i laki lanac je opisan kao KA (SEK ID BR: 19 u spisku sekvenci). Pored toga, više sekvenci humanizovanog antitela je projektovano uvođenjem dodatnih mutacija u amino kiseline unutar okvirnih regiona uključenih u strukturnu stabilnost promenljivog regiona (ukupno 8 teških lanaca u opsegu od HB do HH uključujući HA i ukupno 7 lakih lanaca u opsegu od KB do KG uključujući KA).
4
Tabela 3: Projektovane sekvence humanizovanog antitela
Primer 12: Dobijanje rekombinantnog mišjeg humanog himernog antitela i rekombinantnog humanizovanog antitela
[0183]
(1) Rekombinantno mišje humano himerno anti-RGMa antitelo 116A3 (r116A3C) koje ima seledeće sekvence aminokiseline pripremljene prema Primera 6.
Laki lanac (SEK ID BR: 8 u spisku sekvenci)
4
Teški lanac (SEK ID BR: 9 u spisku sekvenci)
(2) Ukupno 20 humanizovanih anti-RGMa antitela koja obuhvataju sledeće kombinacije teškog i lakog lanca su pripremljene prema Primeru 6.
Kombinacije teškog lanca/lakog lanca;
HA/KA, HA/KB, HA/KC, HA/KG, HB/KC, HC/KA, HC/KB, HD/KA, HD/KB, HD/KC,
HD/KD, HE/KA, HF/KA, HF/KF, HF/KG, HG/KD, HG/KH, HH/KA, HH/KD, HH/KF
(3) Rekombinantno humanizovano anti-RGMa antitelo (ovde u daljem tekstu se pominje kao rH5F9) je pripremljeno prema Primeru 6 (Uporedni primer).
[0184] Promenljivi region humanizovanog anti-RGMa monoklonalnog antitela h5F9 opisan u patentnom dokumentu 1 (WO2009/106356) (laki lanac je seq ID_53 patentnog dokumenta 1, i teški lanac je ID_50 patentnog dokumenta 1) je ligovan sa konstantnim regionom humanog antitela je Arg 108 do Cys 214 od SEK ID BR: 26 u spisku sekvenci, i teški lanac je Ala 117 do Lys 446 SEK ID BR: 27 u spisku sekvenci).
4
Primer 13: Test stabilnosti antitela na toplotu
[0185] Dvadeset µL alikvota supernatanta kulture kod kog je rekombinantno antitelo opisano u Primeru 12 je izraženo je prikupljeno i tretirano toplotom tokom 10 minuta u 8 tačaka temperature od 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 i 75°C, prema opisanom redosledu, korišćenjem termičkog ciklera (Takara bio, TP 600). Supernatant kulture je razblažen sa PBS tako da je finalna koncentracija antitela bila 125 ng/mL. Posle toga, supernatant kulture je podvrgnut ELISA tehnici analize gde su imobilisani humani RGMa proteini opisani u Primeru 3 da bi se procenilo svojstvo vezivanja antigena tog antitela (Sl.3).
[0186] Kao rezultat, humanizovano antitelo obuhvata kombinaciju teškog lanca HE i lakog lanca KA (ovde u daljem tekstu se pominje kao "rH116A3"), i mišje humano himerno antitelo (r116A3C) je pokazalo bolju toplotnu stabilnost od humanizovanog antitela (rH5F9). Ovde u daljem tekstu, humanizovano antitelo obuhvata ovu kombinaciju HE/KA je opisano kao rH116A3.
[0187] Kada nije izvedena obrada toplotom, mišje humano himerno antitelo (r116A3C) i humanizovano antitelo (rH116A3) su pokazali ekvivalentna svojstva vezivanja antigena, i da nije bilo smanjena u svojstvu vezivanja antigena povezanog sa humanizacijom.
Primer 14: Uspostavljanje CHO stabilne linije ćelija koja proizvodi humanizovano anti-RGMa antitelo (rH116A3)
[0188] CHO stabilna linija ćelije koja proizvodi humanizovano anti-RGMa antitelo (rH116A3) je uspostavljeno korišćenjem Lonza GS Xceed system (Lonza). Vektor pXC dvostrukog gena koji obuhvata sekvencu koja kodira laki lanac (SEK ID BR: 44 u spisku sekvenci) i sekvenca koja kodira teški lanac (SEK ID BR: 43 u spisku sekvenci) humanizovanog anti-RGMa antitela (rH116A3) je uvedeno u CHOK1 SV GS laboratorijske roditeljske linije ćelije, i zaliha transformisanih ćelija je dobijena pod selekcijom metionina sulfoksimina (MSX). Posle odvajanja u pojedinačne ćelije protočnom citometrijom, procenjeni su količina proizvodnje antitela u kulturi supernatanta, proliferacija ćelije i slično, i dobijena je CHO stabilna linija ćelije.
Primer 15: Ogled izrastanja neurita
[0189] Mali mozak je izrezan ekscizijom iz neonatalnog pacova (P7), suspendovan u rastvoru tripsina (0,25% rastvora tripsina u PBS koji obuvhata 0,2% DNase) i razgrađen na 37 °C tokom 10 do 15 minuta. Dalje, DMEM podloga koja sadrži 10% seruma goveđeg fetusa je dodato i mešavina je centrifugirana. Ćelije su držane u suspenziji u istoj podlozi
4
i centrifugirane i isti postupak je ponovljen dvaput da bi se oprale ćelije. Dalje, ova suspenzija ćelije je filtrirana kroz 70 µm cediljke za ćelije i centrifugirana, i nataložena frakcija je vraćena u suspenziju u istoj podlozi. B27 suplement (GIBCO) je dodat u suspenziju ćelije da bi se pripremile neonatalne pacovske granule ćelija malog mozga.
[0190] Dalje, neonatalne pacovske granule ćelija malog mozga su zasejane na ploču kulture ćelije i kultivisane na 37 °C tokom 1 dana.
[0191] Rekombinantni RGMa protein (R&D systems, 2459-RM) sa finalnom koncentracijom od 2 µg/mL je dodat i ćelije su kultivisane na 37 °C tokom 2 dana. Dužina neurita je izmerena mikroskopom. Kao što je prikazano na Sl.4, dodavanje RGMa je dalo kao rezultat promene u dužini neurita od 37 µm do 26 µm u eksperimentu na slici levo i od 38 µm do 27 µm na slici desno, čime inhibira izrastanje neurita. Iako dodavanje samo testiranog antitela (B5.116A3 ili B5.70E4) u finalnoj koncentraciji od 10 µg/mL nije promenilo dužinu neurita, istovremeno dodavanje rekombinantnog RGMa proteina i antitela koje se testira je indukovalo izrastanje neurita do istog nivoa kao kontrolu (nije RGMa dodat), što ukazuje na neutralizujuće dejstvo antitela protiv RGMa proteina.
Primer 16: Test efikasnosti upotrebom modela povrede kičmenog stuba pacova.
[0192] Wistar pacov (ženka, 8 nedelja stara, teška oko 200 g) anestezirani aspiraciojm halotana (Takeda Pharmaceutical) je podvrgnuto laminektomiji prednjeg i zadnjeg pršljena oko kičme u nivou T9 (T8 do T10), i izložen je kičmeni stub. U slučaju procene korišćenjem modela preloma kičmenog stuba, pritisak 200 kdyn je primenjen na izložen kičmeni stub upotrebom pribora IH impactor (Precision System).
[0193] Neposredno posle oštećenja kičmenog stuba kao što je opisano gore, osmotska minipumpa je napunjena sa 400 µg/mL antitela koje se testira (r116A3 ili r70E4) ili kontrolno mišje antitelo (mo-IgG2b κ) (200 µL zapremine, 0,5 µL/sat, 14 dana isporuka) (Alzet, model 2002) je postavljen pod kožu leđa pacova. Vrh silikonske cevčice priključen na izlazni okvir osmotske mini pumpe je postavljen ispod dura na mesto povrede kičmenog stuba. Cevčica je spojena i pričvršćena na vrtložne procese na strani desnog donjeg uda laminoektomiziranog mesta, mišić i slojevi kože su prišiveni hirurški i pacov je odgajan.
[0194] Motorička funkcija pacovskog modela povrede kičmenog stuba je procenjena korišćenjem Baso-Beti-Bresnan (Basso-Beattie-Bresnahan) (BBB) ocene (Basso, D.M., Beattie, M.S., & Bresnahan, J.C., A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. J Neurotrauma 12, 1-21 (1995)) i to 0, 1, 3 i 7 dana posle povrede, i svake nedelje posle toga tokom najduže 8 nedelja. Kao rezultat, kako je prikazano na Sl.
5(A), r116A3 ili r70E4 je značajno poboljšalo BBB ocenu 4 ili 3 nedelje posle isporuke, prema opisanom redosledu u poređenju sa kontrolnim antitelom (mo-IgG2b κ) (p<0,05, Studentski test).
[0195] U slučaju procene upotrebom hemisekcionog modela kičmenog stuba, leđna strana izloženog kičmenog stuba je odsečena do dubine od 1,8 mm do 2,0 mm. Na isti način kao gore, testirano antitelo (B5.116A3) ili kontrolno mišje antitelo (mo-IgG2b κ) je isporučeno korišćenjem osmotske minipumpe i procenjeo BBB ocenom i to 0, 1, 3. i 7. dana posle povrede, i svake nedelje posle toga tokom najduže 10 nedelja. Kao što je prikazano na Sl. 5(B), B5.116A3 značajno je poboljšana BBB ocena 4 nedelja posle isporuke u poređenju sa kontrolnim antitelom (mo-IgG2b κ) (p<0,01, Studentski t-test).
Primer 17: Test efikasnoti korišćenjem modela miša sa multipla sklerozom
[0196] PLP139-151 peptid (HSLGKWLGHPDKF: SEK ID BR: 45 u spisku sekvenci, Peptide Institute) je rastvoreno u fiziološkog slanom rastvoru (Otsuka Pharmaceutical Factory) i pomešano sa nepotpunim Frojndovim adjuvansom (Sigma) na koji je dodat mrtvi bacil tuberkle H37 Ra (Difco Laboratories) da bi se pripremila emulzija. SJL/JorllcoCrj (SJL/J) miš (Charles River Japan) je vakcinisan potkožno u leđa sa PLP139-151 peptidom na 50 µg/glava, i EAE ocena i ocenjene su promene telesne težine (H. Kataoka, K Sugahara, K. Shimano, K. Teshima, M. Koyama, A. Fukunari and K. Chiba. FTY720, sfingozin 1-fosfatni receptor modulator, poboljšava eksperimentalni autoimuni encefalomijelitis inhibiranjem upale T ćelije. Cellular & Molecular Immunology 6, 439-448, 2005.) (Sl.6).
[0197] Testirano antitelo (B5.116A3) razblaženo u fiziološkom slanom rastvoru je isporučeno intraperitonealno sa 20 mg/kg svakog 7. i 10. dana ili 18. i 21. dan posle fanckinacije sa PLP139-151peptidom.
[0198] Kao rezultat, kako je prikazano na Sl.6, u poređenju sa kontrolnim antitelom (mo-IgG2b κ), anti-RGMa mišje monoklonalno antitelo (B5.116A3) je inhibiralo pogoršanje EAE ocene isporukom pre pojave (gornji deo Sl.6) i pokazalo je dejstvo sprečavanja relapsa isporukom posle pojave (donji deo Sl.6).
Primer 18: Test imunogenosti antitela
[0199] Nediferencirane dendritske ćelije su sadržane u peifernoj krvi izvedenoj iz 51 zdravog donora su sazrele stimulacijama faktorom granulocitno-monocitnog stimulisanja kolonije (GM-CSF) i Interleukina 4. Antitelo koje se testira (rH116A3) u finalnoj
1
koncentraciji od 50 µg/mL je dodato na zrele dendritske ćelije i ćelije su odgajane tokom 4, 5 dana da bi se omogućilo da dendritske ćelije apsorbuju antitelo. CD4+ T ćelije (T ćelije pomoćnice) iz periferne krvi izvedene iz istog davaoca su pomešane sa dendritskim ćelijama, i zajedno kultivisane još nedelju dana, i zatim je izmerena proliferacija T ćelija protočnom citometrijom. Upotrebom aktivnosti proliferacije T ćelije testiranog antitela kao indeksa, proenjen je rizik imunogenosti kod ljudi. Kao rezultat, proliferacija T ćelije je primećena kod 4 (7,8%) od 51 donora, i zato je rizik od imunogenosti bio nizak.
2
4
1
2
�
1
2
4
1
2
4

Claims (1)

  1. Patentni zahtevi 1. Izolovano anti-RGMa antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, pri čemu sekvenca amino kiseline svakog od regiona 1 određivanja komplementarnosti lakog lanca (LCDR1), regiona 2 određivanja komplementarnosti lakog lanca (LCDR2), regiona 3 određivanja komplementarnosti lakog lanca (LCDR3), regiona 1 određivanja komplementarnosti teškog lanca (HCDR1), regiona 2 određivanja komplementarnosti teškog lanca (HCDR2) i regiona 3 određivanja komplementarnosti teškog lanca (HCDR3) obuhvata sledeće: LCDR1: RASQDISSYLN (SEK ID BR: 30 u spisku sekvenci), LCDR2: YTSRLHS (SEK ID BR: 31 u spisku sekvenci), LCDR3: QQLNTLP (SEK ID BR: 32 u spisku sekvenci), HCDR1: DAWMD (SEK ID BR: 33 u spisku sekvenci), HCDR2: EIRSKANNHATYYAESVKG (SEK ID BR: 34 u spisku sekvenci) i HCDR3: RDGAY (SEK ID BR: 35 u spisku sekvenci); ili LCDR1: RSSQSLVHSNGNTYLH (SEK ID BR: 36 u spisku sekvenci) LCDR2: KVSNRFS (SEK ID BR: 37 u spisku sekvenci) LCDR3:SQSTHVP (SEK ID BR: 38 u spisku sekvenci) HCDR1: TSYYWN (SEK ID BR: 39 u spisku sekvenci) HCDR2: YISYDGTNNYNPSLKN (SEK ID BR: 40 u spisku sekveci) i HCDR3: SFG 2. Anti-RGMa antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen prema patentnom zahtevu 1, pri čemu taj promenljivi region teškog lanca (VH) obuhvata sledeće: VH:EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFSDAWMDWVRQAPGKGLEWVAEIR SKANNHATYYAESVKGRFTISRDDSKSIVYLQMNSLRTEDTALYYCTRRDGAYWGK-GTTVTVSS (SEK ID BR: 41 u spisku sekvenci) ili sekvencu aminokiseline koja ima identičnost od barem 90% sa pomenutom sekvencom aminokiseline; i pri čemu promenljivi region lakog lanca (VL) obuhvata sledeće: VL:DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLH SGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFASYFCQQLNTLPWTFGGGTKVEME (SEK ID BR: 42 u spisku sekvenci) ili sekvencu amino kiseline koja ima identinost od barem 90% sa pomenutom sekvencom amino kiseline. 3. Anti-RGMa antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen prema patentnom zahtevu 1 ili 2, pri čemu je to anti-RGMa antitelo humanizovano antitelo. 4. Anti-RGMa antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, pri čemu to anti-RGMa antitelo obuhvata konstantne regione humanog IgG. 5. Molekul nukleinske kiseline koji kodira deo proteina od tog anti-RGMa antitela ili njegov fragment koji vezuje antigen prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4. 6. Molekul nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 5, pri čemu kodiranje sekvence nukleotida za svaku od VH i VL sekvenci aminokiseline je sekvenca nukleotida koja obuhvata: VH:
    (SEK ID BR: 44 u spisku sekvenci). 7. Rekombinantni vektor koji obuhvata molekul nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 5 ili 6. 8. Ćelija domaćin koja obuhvata rekombinantni vektor prema patentnom zahtevu 7. 9. Postupak za proizvodnju anti-RGMa antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, taj postupak obuhvata korak odgajanja ćelije domaćina prema patentnom zahtevu 8. 10. Farmaceutska supstanca koja obuhvata anti-RGMa antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigenprema prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4. 11. Farmaceutska supstanca prema patentnom zahtevu 10 za upotrebu u sprečavanju, lečenju, ili spečavanju povratka neuroloških ili imunoloških bolesti. 12. Farmaceutska supstanca za upotrebu prema patentnom zahtevu 11, pri čemu su neurološke bolesti izabrane iz grupe koja obuhvata amiotropnu lateralnu sklerozu, povredu brahijalnog pleksusa, oštećenje mozga (uključujući traumatsku povredu mozga), cerebralnu paralizu, Gilen-Barov (Guillain-Barre) sindrom, cerebralnu leukodistrofiju, multipla sklerozu (uključujući relapsno remitentnu multipla sklerozu, primarnu progreisvnu multipla sklerozu, sekondarnu progresivnu multipla sklerozu), optički neuromijelitis (Devicova bolest), post-polio sindrom, spina bifidu, povredu kičmenog stuba, spinalnu mišićnu atrofiju, spinalni neoplazam, transverzalni mijelitis, demencija (uključujući senilnu demenciju, srednje kognitivno oštećenje, Alchajmerovu bolest, demenciju povezanu sa Alchajmerovom bolešću), Hantingtonovu bolest, tardivnu diskineziju, maniju, Parkinsonovu bolest, Stil-Ričardsonov (Steele-Richardson) sindrom, Daunov (Down) sindrom, mijastenija gravis, neurotrauma (uključujući traumu optičkog nerva), vaskularnu amiloidozu, krvarenje na mozgu povezano sa amiloidozom, infarkt mozga, cerebritis, akutno konfuzno stanje, glaukom, šizofreniju i degeneraciju sloja vlakna nerva mrežnjače (uključujući dijabetesnu retinopatiju, ishemijsku optičku neuropatiju, X-povezano raslojavanje mrežnjače, lekom indukovanu optičku neuropatiju, distrofiju mrežnjače, degeneraciju makule povezana sa starošću, bolesti očiju naznačena time što su limfni čvorovi optičkog diska (optic disc drusen), bolesti očiju naznačena time što su genetička determinanta za degeneraciju fotoreceptora, autosomalnu recesivnu distrofiju konusnih štapova (rožnjače) mrežnjače, mitohondrijalni poremećaj povezuju sa optičkom neuropatijom). 13. Farmaceutska supstanca za upotrebu prema patentnom zahtevu 11, pri čemu se imunološke bolesti biraju iz grupe koja obuhvata multipla sklerozu (uključujući i relapsno-remitentnu multipla sklerozu, primarnu progresivnu multipla sklerozu, sekundarnu progresivnu multipla sklerozu), optički neuromijelitis, psorijazu, artritis (uključujući reumatoidni artritis, osteoartritis, psorijazni artritis), Glen-Barov (Guillain-Barre) sindrom, neuro-Behčetovu (neuro-Behcet) bolest, pernicioznu anemiju, tip I (od insulina zavisan) dijabetes melitus, sistemski lupus eritematozus (SLE), upalna bolest creva (IBD), Sjogrenov (Sjogren) sindrom, Gudpasterov (Goodpasture) sindrom, Grejvsova (Graves) bolest, automimunu hemolitičku anemiju, autoimunu trombocitopenu purpuru, astmu, polinozu, atopijskii dermatitis, glomerulonefritis, mijasteniju gravis, Hašimotovu (Hashimoto) bolest, i sarkoidozu. 14. Farmaceutska supstanca za upotrebu prema patentnom zahtevu 11, pri čemu se neurološke ili imunološke bolesti biraju iz grupe koja obuhvata povredu kičmenog stuba, neurotraumu (uključujući traumu optičkog nerva), multipla sklerozu (uključujući relapsnu-remitentnu multipla sklerozu, primarnu progresivnu multipla sklerozu, sekundarnu progresivnu multipla sklerozu). 1
RS20191502A 2015-04-28 2016-04-27 Protein koji vezuje rgma i njegova upotreba RS59847B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2015091095 2015-04-28
PCT/JP2016/063166 WO2016175236A1 (ja) 2015-04-28 2016-04-27 ＲＧＭａ結合タンパク質及びその使用
EP16786512.0A EP3290441B1 (en) 2015-04-28 2016-04-27 Rgma binding protein and use thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS59847B1 true RS59847B1 (sr) 2020-02-28

Family

ID=57198582

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20191502A RS59847B1 (sr) 2015-04-28 2016-04-27 Protein koji vezuje rgma i njegova upotreba

Country Status (33)

Country Link
US (3) US10287346B2 (sr)
EP (2) EP3290441B1 (sr)
JP (8) JP6497760B2 (sr)
KR (4) KR102040235B1 (sr)
CN (2) CN113801225A (sr)
AU (2) AU2016253886B2 (sr)
CA (1) CA2983898A1 (sr)
CL (1) CL2017002729A1 (sr)
CO (1) CO2017011975A2 (sr)
CR (2) CR20200517A (sr)
CY (1) CY1122569T1 (sr)
DK (1) DK3290441T3 (sr)
DO (1) DOP2017000248A (sr)
ES (1) ES2758480T3 (sr)
GT (1) GT201700224A (sr)
HR (1) HRP20192099T1 (sr)
HU (1) HUE047146T2 (sr)
IL (2) IL287291B (sr)
LT (1) LT3290441T (sr)
MX (2) MX392169B (sr)
NZ (2) NZ775372A (sr)
PE (2) PE20180251A1 (sr)
PH (1) PH12017501941A1 (sr)
PL (1) PL3290441T3 (sr)
PT (1) PT3290441T (sr)
RS (1) RS59847B1 (sr)
RU (1) RU2705304C2 (sr)
SA (1) SA517390230B1 (sr)
SG (1) SG11201708848TA (sr)
SI (1) SI3290441T1 (sr)
TW (4) TWI732757B (sr)
WO (1) WO2016175236A1 (sr)
ZA (2) ZA201708047B (sr)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10287346B2 (en) * 2015-04-28 2019-05-14 Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation RGMa binding protein and use thereof
WO2018119142A1 (en) 2016-12-21 2018-06-28 Amgen Inc. Anti-tnf alpha antibody formulations
WO2018215345A1 (en) * 2017-05-25 2018-11-29 Philips Lighting Holding B.V. Luminaire
AU2019301336B2 (en) 2018-07-10 2022-11-24 Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation Prevention or treatment method for peripheral neuropathy or pain accompanying disease in which peripheral neuropathy or astrocyte disorder is recognized
CN116785439A (zh) * 2018-07-19 2023-09-22 国立大学法人东京大学 Htlv-1相关性脊髓病（ham）治疗或预防剂、及ham的治疗方法
AR120898A1 (es) * 2019-12-26 2022-03-30 Univ Osaka Agente para tratar o prevenir neuromielitis óptica en fase aguda
AU2021207010A1 (en) * 2020-01-15 2022-08-25 Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation Prophylactic or therapeutic agent for dementia
EP4091632A4 (en) * 2020-01-15 2024-07-10 Osaka University AGENTS FOR THE PREVENTION OR TREATMENT OF DIABETIC AUTONOMOUS NEUROPATHY
CN112138146B (zh) * 2020-09-25 2022-08-09 安徽医科大学 Manf蛋白的应用
AR124914A1 (es) 2021-02-18 2023-05-17 Mitsubishi Tanabe Pharma Corp Nuevo anticuerpo anti-pad4
TW202434285A (zh) 2022-11-07 2024-09-01 國立大學法人大阪大學 與異常蛋白質之聚集體形成相關之疾病的預防或治療劑
WO2025070749A1 (ja) * 2023-09-29 2025-04-03 田辺三菱製薬株式会社 脊髄又は脳の障害により引き起こされる疾患に伴う随伴症状の予防又は治療剤

Family Cites Families (54)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
DE69120146T2 (de) 1990-01-12 1996-12-12 Cell Genesys Inc Erzeugung xenogener antikörper
ATE158021T1 (de) 1990-08-29 1997-09-15 Genpharm Int Produktion und nützung nicht-menschliche transgentiere zur produktion heterologe antikörper
ES2301158T3 (es) 1992-07-24 2008-06-16 Amgen Fremont Inc. Produccion de anticuerpos xenogenicos.
JPH08509612A (ja) 1993-04-26 1996-10-15 ジェンファーム インターナショナル インコーポレイテッド 異種抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物
US5565331A (en) 1993-11-12 1996-10-15 The Regents Of The University Of California Nucleic acids encoding neural axon outgrowth modulators
US5747262A (en) 1995-10-16 1998-05-05 The Regents Of The University Of California Neurological drug screens
US5824775A (en) 1996-04-19 1998-10-20 The Regents Of The University Of California Human netrin-1
US5939271A (en) 1997-02-19 1999-08-17 The Regents Of The University Of California Netrin receptor
AU735607B2 (en) 1997-08-13 2001-07-12 Yale University Central nervous system axon regeneration
US6528624B1 (en) 1998-04-02 2003-03-04 Genentech, Inc. Polypeptide variants
WO2000032746A2 (en) 1998-11-30 2000-06-08 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Netrin-like and ependymin-like nucleic acids and polypeptides and uses thereof
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
CA2704600C (en) 1999-04-09 2016-10-25 Kyowa Kirin Co., Ltd. A method for producing antibodies with increased adcc activity
US7166573B1 (en) 1999-05-28 2007-01-23 Ludwig Institute For Cancer Research Breast, gastric and prostate cancer associated antigens and uses therefor
CA2953239A1 (en) 2000-10-06 2002-04-18 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Antibody composition-producing cell
US7981420B2 (en) 2000-12-22 2011-07-19 Max-Planck-Gesellschaft Zur Foederung Der Wissenschaften E.V. Therapeutic use of antibodies directed against repulsive guidance molecule (RGM)
WO2002063959A1 (en) 2001-02-09 2002-08-22 The Schepens Eye Research Institute Methods and compositions for stimulating axon regeneration and prventing neuronal cell degeneration
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
WO2003089608A2 (en) 2002-04-18 2003-10-30 The General Hospital Corporation Drg11-responsive (dragon) gene family
WO2004003150A2 (en) * 2002-06-26 2004-01-08 Yale University Modulators and modulation of the interacton between rgm and neogenin
US20040199186A1 (en) 2003-04-04 2004-10-07 Kuffler Suzanne Elizabeth Implant to promote axon regeneration across spinal cord and peripheral nerve gaps
JPWO2005035586A1 (ja) 2003-10-08 2007-11-22 協和醗酵工業株式会社 融合蛋白質組成物
WO2005087268A1 (ja) 2004-03-11 2005-09-22 Bioclues, Inc 軸索再生促進剤
CN1950108A (zh) * 2004-03-11 2007-04-18 生物线索株式会社 轴突再生促进剂
EP1773375A1 (en) 2004-07-14 2007-04-18 University of Utah Research Foundation Netrin-related compositions and uses
US20060063208A1 (en) 2004-08-02 2006-03-23 Woolf Clifford J DRG11-responsive (DRAGON) gene and uses thereof
US7449442B2 (en) 2005-07-12 2008-11-11 Children's Medical Center Corporation EGFR inhibitors promote axon regeneration
EP1928905B1 (de) 2005-09-30 2015-04-15 AbbVie Deutschland GmbH & Co KG Bindungsdomänen von proteinen der repulsive guidance molecule (rgm) proteinfamilie und funktionale fragmente davon sowie deren verwendung
US20080051319A1 (en) 2006-08-22 2008-02-28 Children's Medical Center Corporation Inhibiting JNK Signaling Promotes CNS Axon Regeneration
JPWO2008038599A1 (ja) 2006-09-25 2010-01-28 国立大学法人 千葉大学 軸索再生促進剤
EP1906185A1 (en) 2006-09-26 2008-04-02 ProteoSys AG Use of at least one isoform of progesterone receptor membrane component 1 (PGRMC1)
EP2033971A1 (de) 2007-09-06 2009-03-11 Abbott GmbH & Co. KG Bone Morphogenetic Protein (BMP)-bindende Domänen von Proteinen der Repulsive Guidance Molecule (RGM) Proteinfamilie und funktionale Fragmente davon sowie deren Verwendung
US8962803B2 (en) * 2008-02-29 2015-02-24 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Antibodies against the RGM A protein and uses thereof
DE102008014880A1 (de) 2008-03-12 2009-09-17 Eberhard-Karls-Universität Tübingen Antientzündliches Polypeptid
US8470977B2 (en) * 2008-03-14 2013-06-25 Transgene S.A. Antibody against the CSF-1R
CN101306193A (zh) 2008-05-15 2008-11-19 复旦大学 人神经突起生长素在制备创伤愈合药物中的应用
US8367352B2 (en) 2008-06-06 2013-02-05 Children's Medical Center Corporation Promoting axon regeneration in the adult CNS through control of protein translation
JP2010146801A (ja) 2008-12-17 2010-07-01 Kurita Water Ind Ltd 微生物発電方法及び微生物発電装置
MX2012006560A (es) 2009-12-08 2012-10-05 Abbott Gmbh & Co Kg Anticuerpos monoclonales contra la proteina rgm a para utilizarse en el tratamiento de degeneracion de capa de fibra de nervio retinal.
ES2555060T3 (es) 2009-12-09 2015-12-28 Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation Inhibidor de la activación de linfocitos T, composición farmacéutica que lo contiene y método de cribado de sustancias inhibidoras de la activación de linfocitos T
CA3204283A1 (en) * 2011-12-14 2013-06-20 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Composition and method for the diagnosis and treatment of iron-related disorders
EP3369746A1 (en) 2012-01-27 2018-09-05 AbbVie Deutschland GmbH & Co KG Composition and method for diagnosis and treatment of diseases associated with neurite degeneration
WO2013113107A1 (en) 2012-02-03 2013-08-08 University Health Network Methods for promoting neuron survival, axonal growth and/or regeneration
GB201203180D0 (en) * 2012-02-24 2012-04-11 Okapi Sciences Nv Compounds for treating parvovirus infection
US20140242043A1 (en) 2013-02-23 2014-08-28 Stemnion, Inc. Methods for preventing or treating optic neuritis
SG10201708048XA (en) * 2013-03-18 2017-10-30 Biocerox Prod Bv Humanized anti-cd134 (ox40) antibodies and uses thereof
CA2923772A1 (en) 2013-09-17 2015-03-26 University Health Network (Uhn): Technology Development And Commercialization Agents directed against a cis rgma/neogenin interaction or lipid rafts and use of the same in methods of treatment
US11485787B2 (en) 2014-02-05 2022-11-01 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Agents that modulate RGMb-neogenin-BMP signaling and methods of use thereof
US10287346B2 (en) 2015-04-28 2019-05-14 Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation RGMa binding protein and use thereof
CN105925578A (zh) 2016-05-30 2016-09-07 东北师范大学 靶向沉默Neogenin的shRNA
US20220089737A1 (en) * 2020-09-11 2022-03-24 Janssen Biotech, Inc. Multi-specific immune targeting molecules and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
RU2019134410A (ru) 2020-03-03
HUE047146T2 (hu) 2020-04-28
BR112017022994A2 (pt) 2019-11-19
SA517390230B1 (ar) 2021-06-09
US20180100012A1 (en) 2018-04-12
TW202521584A (zh) 2025-06-01
JP7307446B2 (ja) 2023-07-12
JP7606196B2 (ja) 2024-12-25
AU2016253886A1 (en) 2017-12-14
KR20220140023A (ko) 2022-10-17
RU2017135353A3 (sr) 2019-04-08
JP6497760B2 (ja) 2019-04-10
KR20190124350A (ko) 2019-11-04
TW201710296A (zh) 2017-03-16
MX2017013894A (es) 2018-03-01
IL255293B (en) 2021-10-31
NZ737770A (en) 2024-09-27
MX2022005565A (es) 2022-06-09
KR102613528B1 (ko) 2023-12-12
JP7780158B2 (ja) 2025-12-04
ES2758480T3 (es) 2020-05-05
LT3290441T (lt) 2020-02-10
CN107531791A (zh) 2018-01-02
EP3290441B1 (en) 2019-10-30
HK1245808A1 (en) 2018-08-31
CA2983898A1 (en) 2016-11-03
KR102854388B1 (ko) 2025-09-02
US20210277098A1 (en) 2021-09-09
IL287291A (en) 2021-12-01
DK3290441T3 (da) 2020-01-02
KR20170138565A (ko) 2017-12-15
RU2017135353A (ru) 2019-04-08
CR20200517A (es) 2021-01-12
EP3584260A1 (en) 2019-12-25
JP2019141048A (ja) 2019-08-29
SI3290441T1 (sl) 2020-03-31
JP2026032030A (ja) 2026-02-25
IL255293A0 (en) 2017-12-31
JP6955721B2 (ja) 2021-10-27
CL2017002729A1 (es) 2018-06-08
AU2016253886B2 (en) 2019-05-16
TWI873350B (zh) 2025-02-21
PE20230381A1 (es) 2023-03-06
CN113801225A (zh) 2021-12-17
TW202138389A (zh) 2021-10-16
JP2021106587A (ja) 2021-07-29
JP2025029166A (ja) 2025-03-05
US10287346B2 (en) 2019-05-14
TWI732757B (zh) 2021-07-11
HRP20192099T1 (hr) 2020-03-06
KR102451786B1 (ko) 2022-10-05
JPWO2016175236A1 (ja) 2018-04-19
CR20170539A (es) 2018-04-20
WO2016175236A1 (ja) 2016-11-03
IL287291B (en) 2022-09-01
GT201700224A (es) 2019-07-26
US11008388B2 (en) 2021-05-18
NZ775372A (en) 2024-12-20
KR102040235B1 (ko) 2019-11-05
JP2023030057A (ja) 2023-03-07
PL3290441T3 (pl) 2020-05-18
US20190270799A1 (en) 2019-09-05
DOP2017000248A (es) 2018-01-31
CO2017011975A2 (es) 2018-02-20
AU2019210655A1 (en) 2019-08-22
CN107531791B (zh) 2021-09-07
PH12017501941A1 (en) 2018-03-19
EP3290441A4 (en) 2018-10-17
ZA201708047B (en) 2020-01-29
CY1122569T1 (el) 2021-01-27
EP3290441A1 (en) 2018-03-07
ZA201907773B (en) 2021-05-26
MX392169B (es) 2025-03-21
NZ775384A (en) 2024-12-20
JP7306660B2 (ja) 2023-07-11
TWI873576B (zh) 2025-02-21
SG11201708848TA (en) 2017-11-29
JP2023025285A (ja) 2023-02-21
PT3290441T (pt) 2019-12-02
KR20230173734A (ko) 2023-12-27
TW202328205A (zh) 2023-07-16
RU2705304C2 (ru) 2019-11-06
PE20180251A1 (es) 2018-02-02
JP2023120374A (ja) 2023-08-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7307446B2 (ja) ＲＧＭａ結合タンパク質及びその使用
RU2809500C2 (ru) СВЯЗЫВАЮЩИЙ RGMa БЕЛОК И ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЕ
HK40013857A (en) Rgma binding protein and use thereof
HK1245808B (en) Rgma binding protein and use thereof
BR122024027449A2 (pt) Anticorpo anti-rgma isolado e composição farmacêutica compreendendo o mesmo
BR112017022994B1 (pt) Anticorpo anti-RGMa isolado, molécula de ácido nucleico, vetor recombinante e composição farmacéutica compreendendo o mesmo