RS59859B1 - Homogen vodeni rastvor injektabilnog hitozana ph vrednosti približne fiziološkoj ph - Google Patents

Description

Opis

[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na oblast punilaca ili biomaterijala, injektabilnih kod ljudi ili životinja. Određenije, ovaj pronalazak se odnosi na homogeni vodeni rastvor injektabilnog hitozana pH vrednosti što je bliže moguće fiziološkoj pH (pH = 7). Ovaj pronalazak se takođe odnosi na kompozicije koje sadrže homogeni vodeni rastvor hitozana. Predmet pronalaska su kompozicije koje se upotrebljavaju kao dermatološke, kozmetičke kompozicije ili čak kao medicinsko sredstvo, poželjno kao implantat koji može da se bioresorbuje.

[0002] Različiti injektabilni punioci naročito kod ljudi su već poznati.

[0003] Kolagen je dugo bio proizvod izbora kao punilac za lice, određenije za popunjavanje bora i finih linija ili čak za osvežavanje ivica usana. Međutim, od kad su se našle na tržištu, hijaluronske kiseline se najviše koriste. Zapravo, pored biorazgradivosti kolagena za koju se smatra da je prebrza, postoje i problemi bezbednosti vezano za njegovo životinjsko poreklo (goveđe ili svinjsko).

[0004] Direktno ubrizgavanje hijaluronske kiseline ima dve prednosti: neposredni mehanički efekat punjenja i odsustvo upalnih pojava, usled njene biokompatibilnosti. Međutim ova biokompatibilnost ide ruku pod ruku sa brzom razgradnjom koja daje nezadovoljavajući proizvod, čak i ako bi se vek ubrizgavanja proizvoda mogao produžiti zahvaljujući upotrebi umrežene hijaluronske kiseline.

[0005] Međutim, proizvodi koji se danas najviše koriste u medicini i estetskoj hirurgiji su resorbujući proizvodi čiji je rok trajanja generalno manji od 12 meseci.

[0006] Na tržištu i dalje postoje punioci koji su opisani kao "trajni", u smislu što za njihovu bioresorpciju može biti neophodno nekoliko godina. Ovi proizvodi između ostalog sadrže sintetičke ili biosintetičke polimere, kao što su akrilni derivati, poliakrilamidi, koji izazivaju značajnu fibroznu enkapsulaciju na samom početku veka punjenja. Međutim, trajnost proizvoda ubrizganog u tkiva predstavlja rizik od dugoročnih komplikacije ili odloženih upalnih pojava, na primer stvaranja upalnih granuloma, cista … nekoliko meseci, čak i nekoliko godina, nakon njegove injekcije. Drugi proizvodi danas predstavljaju zanimljivu alternativu: to je PLA (polimlečna kiselina), polimer čija je biodegradacija sporija u odnosu na druge prirodne polimere, kao što su kolagen ili hijaluronska kiselina. Procenjuje se da punjenje traje do dve godine nakon injekcije. Ovi proizvodi su prisutni na tržištu naročito pod nazivom New-Fill (ili Sculptra). Glavni nedostatak ove tehnologije je što je efekat punjenja vidljiv tek nakon osam nedelja, što ne čini pacijenta u potpunosti zadovoljnim.

[0007] Pored toga, fibroza koja je primećena tokom upotrebe nerazgradivih proizvoda se ispostavila da je od velikog značaja u pogledu dugoročnog estetskog efekta, i tako su razvijeni punioci kvalifikovani kao "polutrajni" koji, po njihovoj heterogenoj kompoziciji « vektor - čestice » imaju profibrotički efekat pri tom ostaju biorazgradive. Kao primer se navodi proizvod Atlean koji obezbeđuje disperziju čestica TCP (trikalcijumfosfata) u hijaluronskoj kiselini i proizvod Radiesse koji obezbeđuje disperziju čestica kalcijumhidroksiapatita u gelu karboksimetilceluloze. U svakom slučaju, gel nosač obezbeđuje estetski efekat neposrednog punjenja, dok čestice postepeno stvaraju fibrozu što garantuje dugoročan efekat. Prednost ovih proizvodi, pored ovog dvostrukog mehanizma delovanja (mehaničkog i tkivnog induktora), je ta što su oni na kraju u potpunosti apsorbovani.

[0008] Na naročito povoljan način, hitozan se, zahvaljujući svojoj jedinstvenoj hemijskoj strukturi, prema organizmu ponaša kao "mamac" iz biološkog okruženja (A. Montembault, K. Tahiri, C. Korwin-Zmijowska, X, Chevalier, M. Corvol, A.Domard, Biochimie, 88 (2006), 551-64): sa jedne strane, dovoljno je "prepoznat" da ne izaziva opasnu upalnu reakciju, a sa druge strane dovoljno je "neprepoznat" da se ne razgrađuje brzo. Molekul se u stvari sastoji od niza fragmenata N-acetil-D-glukozamina i D-glukozamina, pri čemu prvi predstavlja sastojak molekula ekstracelularne matrice (ovaj ostatak pronalazimo u hijaluronskoj kiselini, na primer), a drugi je potpuno odsutan iz nje, i stoga se sa biološkog stanovišta hitozan teže razgrađuje.

[0009] Koncept upotrebe "mamca" iz biološkog okruženja je u potpunosti nov u oblasti injektabilnih lekova, naročito u estetskoj medicini, a do danas na tržište nije plasiran nijedan punilac koji sadrži hitozan.

[0010] Pored toga, u literaturi je poznato da hitozan stimuliše određene ćelije imuniteta, kao što su makrofagovi, koji u njegovom prisustvu proizvode povećanu količinu faktora rasta. Ovi faktori rasta su biološki posrednici koji promovišu proizvodnju ekstracelularne matrice i proliferaciju fibroblasta, ćelija koje proizvode vlakna kolagena. Na taj način hitozan podstiče sintezu fibroznog tkiva, koja omogućava dugoročno „biološko“ punjenje i bez neželjenih dejstava, konstituisanje ili supstituisanje bioloških tkiva ili punjenje bioloških tkiva, na primer punjenje depresije kože, ubrizgavanje u hrskavicu ili zglobove).

[0011] Međunarodna prijava WO 2013/079646, koju je prijavilac podneo, posebno predlaže homogeni vodeni rastvor injektabilnog hitozana koji sadrži hitozan sa stepenom acetilacije manjim od 20%, pri čemu pomenuti vodeni rastvor ima pH manju od 6.2. Ove formulacije imaju veoma dobre rezultate i dobra injektabilna svojstva na ovoj pH ispod 6.2. Međutim, kako je objašnjeno u ovoj prijavi, neophodne je da se pH održava ispod 6.2 kako bi se izbeglo želatiranje ovih rastvora. Zapravo, hitozan sa stepenom acetilacije manjim od 20% kao što je onaj koji se koristi u ovim injektabilnim formulacijama je osetljiv na pH, i ima svojstvo da se rastvara u tečnom obliku u vodenom rastvoru pri pH manjoj od 6.2, ali i da se želatinira iznad pH od 6.2.

[0012] Međutim, kada je poželjno da se rastvor hitozana ubrizga direktno u tkiva čija je fiziološka pH (između 6.8 i 7.4), bilo bi poželjno da se koristi rastvor pH vrednosti koja je što je bliže moguće fiziološkoj pH kako bi se izbegla nekroza tkiva usled kiselosti ubrizgane formule.

[0013] Dokument WO 2009/150651 predlaže da se kompozicije formulišu na bazi hitozana čija je pH približna fiziološka pH kombinovanjem, visoko acetilisanog rastvora hitozana rastvorljivog pri fiziološkoj pH, sa visoko deacetilisanim hitozanom koji se taloži na pH približnoj 6.5 u injektabilnom hidrogelu, kako bi se dobila mešavina hitozana različitih stepena acetilacije, pri čemu se pomenuta mešavina ne taloži na pH većoj od 6.5. Međutim, ovi hidrogelovi želatinirane teksture imaju, zbog svog visokog viskoziteta, slaba injektabilna svojstva (ili mogućnost ubrizgavanja, tj. lakog ubrizgavanja zbog većeg ili manjeg zadovoljavajućeg protoka kroz iglu na špricu) u poređenju sa kompozicijama u neželatiniranom tečnom obliku. Pored toga, mešavina dva hitozana različitih stepena acetilacije nije jednostavna da se primeni i može da zadaje probleme u smislu homogenosti dobijenih hidrogelova.

[0014] Prijava WO03/042250 predlaže da se njen deo hemijski modifikuje umrežavanjem hitozana u rastvoru pH vrednosti od oko 6.8, pri čemu se pomenuti rastvori pripremaju i održavaju u tečnom stanju na veoma niskim temperaturama (4°C), da bi se omogućilo njihovo želatiranje na 37°C. Stoga kontrolisanje želatiniranja rastvora na 37°C je sa jedne strane omogućeno hemijskom modifikacijom hitozana, a sa druge, povećanjem temperature. Međutim, u okviru ove prijave, neutralni rastvori hitozana mogu samo da se dobiju održavanjem rastvora na veoma niskoj temperaturi (reda od 4 do 5°C.), i upotrebom pufera tipa glicerofosfata , koji je poznat po tome da povećava rastvorljivost hitozana u vodi i daje rastvor hitozana termoželatinirajućih svojstava. Glicerofosfat međutim može da uzrokuje probleme sa netolerancijom, posebno kada se ubrizgava u biološka tkiva. Pored toga, neutralni tečni rastvori dobijeni prema zahtevu WO03/042250 se ne mogu ni pripremati ni čuvati na sobnoj temperaturi, što dovodi do značajnih industrijskih ograničenja i dodatnih troškova.

[0015] Stoga bi bilo poželjno da formulacije na bazi hitozana imaju pH približnu fiziološkoj pH, i koje ostaju u tečnom stanju na sobnoj temperaturi, određenije između 20 i 25°C, kako bi se lako ubrizgavali.

[0016] Predmet ovog pronalaska, prema prvom aspektu, je homogeni vodeni rastvor injektabilnog hitozana koji sadrži, u fiziološki prihvatljivom okruženju, između 0.1 i 4.5 mas.% hitozana sa stepenom acetilacije manjim od 20% i prosečne molekulske mase između 100,000 i 1,500,000 g/mol, pri čemu je pomenuti rastvor pH vrednosti veće ili jednake 6.2, poželjno između 6.2 i 7.2, pri čemu pomenuti rastvor ne sadrži hitozan sa stepenom acetilacije većim od 20%, pri čemu je pomenuti rastvor tečan i homogen na sobnoj temperaturi.

[0017] Predmet pronalaska, prema drugom aspektu, je vodeni rastvor kako je ovde opisano, koga karakteriše sposobnost da može da se pripremi postupkom koji obuhvata najmanje sledeće faze:

- rastvaranje hitozana u vodi dodavanjem kiseline kao što je slaba kiselina, da bi se dobio homogeni vodeni rastvor hitozana koji sadrži, u fiziološki prihvatljivom okruženju, između 0.1 i 4.5 mas.% hitozana sa stepenom acetilacije manjim od 20% i prosečnom molekulskom masom između 100,000 i 1,500,000 g/mol, pri čemu pomenuti rastvor ima pH manju od 6.2, pri čemu je pomenuta slaba kiselina poželjno izabrana iz grupe koju čine sirćetna kiselina, glikolna kiselina, mlečna kiselina, glutaminska kiselina, i njihove mešavine, i

- podešavanje pH dijalizom, poželjno na sobnoj temperaturi, da bi se dobio vodeni rastvor čija je pH veća ili jednaka 6.2, poželjno između 6.2 i 7.2, poželjno između 6.25 i 7.1.

[0018] Pronalazak se stoga takođe odnosi na postupak dobijanja vodenog rastvora kako je prethodno opisano, koji obuhvata najmanje sledeće faze:

- rastvaranje hitozana u vodi dodavanjem kiseline kao što je slaba kiselina, da bi se dobio homogeni vodeni rastvor hitozana koji sadrži, u fiziološki prihvatljivom okruženju, između 0.1 i 4.5 mas.% hitozana sa stepenom acetilacije manjim od 20% i prosečno molekulskom masom između 100,000 i 1,500,000 g/mol, pri čemu pomenuti rastvor ima pH manju od 6.2, pri čemu je pomenuta slaba kiselina poželjno izabrana iz grupe koju čine sirćetna kiselina, glikolna kiselina, mlečna kiselina, glutaminska kiselina, i njihove mešavine, i

- podešavanje pH dijalizom, poželjno na sobnoj temperaturi, da bi se dobio vodeni rastvor čija je pH veća ili jednaka 6.2, poželjno između 6.2 i 7.2, poželjno između 6.25 i 7.1.

[0019] Homogeni vodeni rastvori hitozana prema ovom pronalasku su stabilni na temperaturi, naročito do 40°C, naročito između 20 i 30°C, i stoga nisu termoželatinirajući već se želatiniraju samo pri povećanju pH. Stoga se, prema ovom aspektu, one i dalje razlikuju od formulacija opisanih u patentnoj prijavi WO03/042250. Dobijanje temperaturno stabilnih rastvora je naročito poželjno za industrijsku primenu rastvora prema ovom pronalasku, i njihovo čuvanje.

Hitozan

[0020] Vodeni rastvori prema pronalasku obuhvataju najmanje jedan hitozan.

[0021] Hitozan je amino-polisaharid koji se generalno dobija N-deacetilacijom hitina, polisaharida koji je u širokoj upotrebi u biomasi. Hitin je posebno prisutan u kutikulama zglavkara, endoskeletu glavonožaca, ćelijskim zidovima ili ekstracelularnoj matrici gljiva, kvasaca ili algi.

[0022] Poželjno prema ovom pronalasku, hitozan predstavlja prirodan proizvod koji se dobija iz životinjskih izvora, na primer iz ljuski tipa rakova, škampa ili lignji, ili iz biljnih izvora, kao što su gljive ili alge. Hitozan i hitin su ravni kopolimeri, redom, 2-acetamido-2-deoksi-D-glukopiranoze i 2-amino-2-deoksi-D-glukopiranoze. Češće govorimo o N-acetil-D-glukozamin (GlcNAc) i D-Glukozamin (GlcN)) jedinicama, povezanim β- (1 → 4) glikozidnim vezama. Hitin i hitozan se razlikuju po molarnoj frakciji (izraženoj u %) GlcNAc jedinicama prisutnim u kopolimeru, koja se takođe naziva stepen acetilacije (DA).

[0023] U nastavku su šematski prikazane hemijske strukture hitozana i hitina prema stepenu acetilacije

gde je nGlcNAc = broj acetilisanih jedinica, a nGlcN = broj deacetilisanih jedinica.

[0025] Prema ovom pronalasku, hitozan ima nivo acetilacije (DA) manji od 20%, poželjno manji od 19%, poželjnije manji od 17%, još poželjnije manji ili jednak 15%, na primer manji od 10 %.

[0026] Uglavnom hitozan prema ovom pronalasku ima nivo acetilacije (DA) između 0.5 i 20%, poželjnije između 1 i 19%, poželjnije između 1 i 17%, poželjnije između 2 i 15 % i još poželjnije između 2 i 10%.

[0027] Stepen acetilacije je poželjno izmeren prema postupku opisanom u publikaciji. " Physicochemical studies of the gelation of chitosan in a hidroalcoholic médium " A. MONTEMBAULT, C. VITON, A. DOMARD Biomaterials, 26 (8), 933-943, 2005).

[0028] Hitozan koji se koristi u rastvorima prema pronalasku ima prosečnu molekulsku masu (određenu pre sterilizacije prema postupku opisanom u "Physico-chemical studies of the gelation of chitosan in a hidroalcoholic médium" A. MONTEMBAULT, C. VITON, A. DOMARD Biomaterials, 26 (8), 933-943, 2005) između 100,000 i 1,500,000 g/mol, poželjno između 200,000 i 1,000,000 g/mol, poželjnije između 250,000 i 800,000 g/mol, i još poželjnije između 300,000 i 600,000 g/mol .

[0029] Konvencionalno hitozan molekulske mase između 100,000 i 1,000,000 g.mol<-1>takođe može biti okarakterisan svojim viskozitetom (konvencionalno pri koncentraciji od 1% u 1% vodenom rastvoru sirćetne kiseline na 25°C). Imajući ovo u vidu, molekulska masa hitozana takođe može biti definisana viskozitetom između 5 Pa.s i 20 Pa.s.

[0030] Viskozitet kompozicije je izmeren na 25°C upotrebom DHR1 reometra (TA industrie) i geometrijom ravni od 40mm prema dinamičnom režimu rada sa brzinom smicanja 0.01 do 1 s<-1>.

[0031] Prema poželjnom načinu ostvarivanja, hitozan koji se koristi u rastvorima prema pronalasku nije hemijski modifikovan, a naročito nije presađen da bi promovisao svoju rastvorljivost u vodenom rastvoru pri pH vrednostima koje se su blizu neutralnosti (između 6.2 i 7.2). U ovom smislu se razlikuje od hitozana koji se koriste u prijavi WO03/042250 ili zahtevu JP-H02-69502, u publikaciji " Synthesis and characterization of sugar-bearing chitosan derivatives : aqueous solubility and biodegradability ", Jae Hyung Park et al. , Biomacromolecules 2003, 4, 1087-1091, i u publikaciji " Water solubility of partially N-acetylated chitosans as a function of pH : effect of chemical composition and depolymerization " Varum K. M. et al., Carbohydrate polimeri 25 (1994), 65-70.

[0032] Prema određenoj karakteristici, drugi hitozan niže molekulske mase, poželjno manje od 20,000 g/mol, može da se doda hitozanu kako je prethodno definisano, pod uslovom da homogenost tako dobijenog rastvora nije promenjena.

[0033] U ovom načinu ostvarivanja, ovaj drugi hitozan može da se dodaje u obliku čestica umreženog hitozana.

Rastvor

[0034] Homogeni vodeni rastvor injektabilnog hitozana prema pronalasku sadrži, u fiziološki prihvatljivom okruženju, hitozan sa stepenom acetilacije manjim od 20% i prosečnom molekulskom masom između 100,000 i 1,500,000 g/mol, kako je prethodno opisano.

[0035] Pod “fiziološki prihvatljivim okruženjem” se, u smislu ove prijave, misli na okruženje koje ne predstavlja rizik od netolerancije ili toksičnosti tokom ubrizgavanja rastvora za injekcije u biološka tkiva prema pronalasku. Prema tome, fiziološki prihvatljivo okruženje naročito mora biti inertan i biokompatibilan u smislu bioloških tkiva kao što su mišići, zglobovi, očne jabučice, i generalno u mekim ili tvrdim tkivima tela, na primer organima (digestivnim ili urogenitalnim) ili masnim tkivima, sluznicama, desnima, hrskavici, kostima...

[0036] pH vodenog rastvora prema ovom pronalasku je veća ili jednaka 6.2, a poželjno između 6.2 i 7.2, poželjno između 6.25 i 7.1, i poželjnije između 6.3 i 7.0.

[0037] U kontekstu pronalaska, hitozan je rastvorljiv u vodenom rastvoru, kao što je voda, u gore pomenutim rasponima pH vrednosti, poželjno protonacijom aminskih grupa hitozana. Poželjno, vodeni rastvor prema pronalasku je stabilan, naročito stabilan (konzervisanje njegovih reoloških karakteristika, boje, transparentnosti i/ili bistrine na 25°C.) tokom skladištenja na temperaturama koje se kreću od 4 do 25°C u toku najmanje 1 meseca poželjno najmanje 6 meseci, i poželjnije najmanje 24 meseca. Drugim rečima, čak i nakon čuvanja tokom produženog perioda na temperaturama između 4 i 25°C, njegove karakteristike vodenog rastvora prema pronalasku (reološke, boja, transparentnost i/ili bistrina) su sačuvane na 25°C.

[0038] Pod injektabilnim "rastvorom" se, u smislu ove prijave, misli na kompoziciju u tečnom obliku, nasuprot želatinirane kompozicije. Tako se razlikuje od kompozicija u obliku injektabilnih hidrogelova na bazi rastvorenog hitozana poput onih opisanih u patentnoj prijavi WO 2009/150651. Ove hidrogelovi želatinirane teksture imaju, zbog svog višeg viskoziteta, manje dobra injektabilna svojstva (ili sposobnost ubrizgavanja, koja olakšava ubrizgavanje usled više ili manje zadovoljavajućeg protoka kroz iglu u špricu) u odnosu na tečne rastvore prema pronalasku.

[0039] Pojam “tečni” rastvor u smislu ovog pronalaska označava kompoziciju koja teče po sopstvenoj masi, naročito nakon najviše 24 sata, poželjno najviše 10 sati, za razliku od gela, a naročito hidrogela.

[0040] Tečni rastvori prema pronalasku poželjno imaju viskozitet manji od 1000 Pa.s na 25°C, poželjno između 20 i 800 Pa.s, poželjnije između 50 i 600 Pa.s. Poređenja radi, formulacije u obliku hidrogelova generalno imaju viskozitet reda od 4000 do 10000 Pa.s.

[0041] Viskozitet kompozicije je izmeren na 25°C upotrebom DHR1 reometra (TA industrie) i geometrijom ravni od 40mm prema dinamičnom režimu rada sa brzinom smicanja od 0.01 do 1 s<-1>.

[0042] Razlika između rastvora prema ovom pronalasku i formulacija u obliku gelova može naročito biti demonstrirana merenjem reoloških svojstava ovih kompozicija.

[0043] Razlikovanje gel/rastvor se vrši tokom reološkog ispitivanja pri oscilaciji od 0.1 do 100 rad.s<-1>pri konstantnoj frekvenciji od 1Hz na 25°C kako bi se odredio viskozni modul G "i elastični modul G '.

[0044] Zapravo, tečni rastvor u smislu ovog pronalaska naročito karakteriše činjenica da je njegov viskozni modul G " veći od njegovog elastičnog modula G '. U slučaju gela, naprotiv, elastični modul G' je viši od viskoznog modula G ". Merenja se izvode na DHR2 reometru (TA industries) i 40 mm geometriji ravni prema dinamičnom režimu rada (ugaona frekvencija: 100 do 1 rad/s, 1% deformacija, 37°C). Uzorci napravljeni od 2.5 ml rastvora hitozana koji se ispituju su stavljeni u čaše, stavljene u medijum za kulturu na 37°C u toku 24 sata.

[0045] Pod “homogenim” rastvorom hitozana se, u smislu ove prijave, misli da je sav polimer hitozana rastvoren, pri čemu je to rastvor koji ne sadrži čvrste čestice u suspenziji u tečnoj fazi. Rastvor prema pronalasku je takođe uobičajeno transparentan. Homogenost rastvora hitozana može naročito biti okarakterisana merenjem propustljivosti svetlosti kroz uzorak rastvora. Prema tome, prema poželjnom načinu ostvarivanja, rastvor hitozana prema ovom pronalasku ima vrednost propustljivosti svetlosti, na talasnoj dužini jednakoj 500 nm, kroz uzorak debljine od 1 cm, veći od 60%, poželjno veći od 70%, poželjnije veći) od 80%, i još poželjnije veći) od 90%. Određenije, homogeni vodeni rastvor prema pronalasku ima propustljivost između 60 i 100%, poželjno između 70 i 99%, poželjnije između 80 i 98%, i još poželjnije između 90 i 97%.

[0046] Homogeni tečni rastvori hitozana koji su predmet ovog pronalaska su poželjno tečni i homogeni na sobnoj temperaturi, odnosno između 20 i 25°C, poželjno na 25°C. Razlikuju se po ovom pitanju od intermedijernih rastvora opisanih u primerima zahteva WO03/042250, koji su tečni na niskim temperaturama (4°C) ali se želatiniraju i postaju zamućeni kada temperatura poraste.

[0047] Homogeni tečni rastvori hitozana koji su predmet ovog pronalaska su poželjno stabilni pri skladištenju na 25°C tokom vremena. Određenije, njihov viskozitet na 25°C i njihova propustljivost ostaju stabilni najmanje 1 sat i do više od 3 godine kako bi se omogućilo čuvanje rastvora. Prema tome, rastvori prema pronalasku poželjno imaju stabilnost čuvanja na 25°C u periodu između 1h i 3 godine poželjnije između 10h i 2 godine, još poželjnije između 1 dana i 1 godine, i poželjnije čak između 1 meseca i 9 meseci.

[0048] Prema određenoj karakteristici ovog pronalaska, homogeni vodeni rastvor hitozana sadrži između 0.1 i 4.5 %, poželjno između 1 i 3.5 %, određenije između 2 i 3.5 mas.% hitozana, u odnosu na ukupnu masu vodenog rastvora.

[0049] Na posebno poželjan način, vodeni rastvor prema pronalasku je formulisan da se daje ili koristi ubrizgavanjem intradermalnim ili supkutanim, intramuskularnim, intraartikularnim, intraokularnim putem, i opširnije u meka ili tvrda tkiva tela na primer organe (digestivni ili urogenitalni sistem) ili masna tkiva, sluznice, desni, hrskavicu, kosti, itd. Budući da mu je pH približna fiziološkoj pH, rastvor prema pronalasku može biti ubrizgan direktno u tkiva bez rizika od njihove nekroze. Rastvor može da se pakuje u špric kao što je sterilni špric.

[0050] U određenom načinu ostvarivanja, vodeni rastvor prema pronalasku je sterilisan pre ubrizgavanja, na primer u autoklavu.

[0051] Nakon sterilizacije, hitozan obično ima prosečnu molekulsku masu između 50,000 i 1,200,000 g/mol, poželjno između 100,000 i 1,000,000 g/mol.

[0052] Nakon sterilizacije, tečni rastvori prema pronalasku poželjno imaju viskozitet manji od 800 Pa.s, poželjno između 5 i 800 Pa.s. Viskozitet rastvora nakon sterilizacije je izmeren prema postupku opisanom za merenje viskoziteta rastvora pre sterilizacije.

[0053] Na posebno poželjan način, vodeni rastvor prema ovom pronalasku pre injekcije ne sadrži hitozan sa stepenom acetilacije većim od 20%. Prema tome, hitozan prema pronalasku nije pomešan sa hitozanom sa stepenom acetilacije između 30 i 60%, kako je opisano u patentnim prijavama WO 2008/072230 i WO 2009/150651.

[0054] U određenom načinu ostvarivanja prema ovom pronalasku, vodeni rastvor sadrži nekoliko hitozana, ali sa jednim stepenom acetilacije (DA), pri čemu je pomenuti stepen acetilacije manji od 20%, poželjno manji od 10%.

[0055] U drugom određenom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, vodeni rastvor sadrži hitozan kao što je prethodno definisano u mešavini sa drugim hitozanom, kao što je oligosaharid hitozana koji se takođe naziva hito-oligosaharid, sa stepenom acetilacije manjim od 20%, poželjno manjim od 10%, još poželjnije sa stepenom acetilacije koji je identičan kao kod hitozana kao što je prethodno definisano, i koji obično ima veoma malu prosečnu molekulsku masu, na primer manju od 20,000 g/mol, poželjno manju od 17,000 g/mol.

[0056] U drugom određenom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, vodeni rastvor sadrži, kao polimer, jedan hitozan sa stepenom acetilacije kao što je prethodno definisano, poželjno sa prosečnom molekulskom masom kao što je prethodno definisano, poželjno u sadržaju između 0.1 i 4.5%, poželjno između 1 i 3.5%, određenije između 2 i 3.5 mas.% hitozana, u odnosu na ukupnu masu vodenog rastvora.

Sredstvo za umrežavanje

[0057] U određenom načinu ostvarivanja, hitozan može biti delimično umrežen jonskim interakcijama izazvanim na primer dodavanjem sulfata, citrata, metalnih anjona ili čak anjonskih molekula, određenije formiranjem kompleksa polielektrolita sa polisaharidima koji imaju karboksilnu grupu COO<->(alginati, pektin, ksantan, hijaluronska kiselina), sa polisaharidima sa sulfatnom grupom, ili sa polimlečnom kiselinom (PLA), ili takođe interakcijom sa proteinima (kolagen), nukleinskom kiselinom (DNK, l 'RNK, Si RNK, mRNK ...) ili oksidovanim polisaharidima.

[0058] U drugom određenom načinu ostvarivanja, hitozan može biti delimično umrežen upotrebom kovalentnih sredstava za umrežavanje (pr: genipin), uz isključenje sredstava poznatih po svojoj toksičnosti, kao što su sredstva iz epoksi grupe (na primer etar 1,4-butanedioldiglicidila - BDDE) ili bi ili poli funkcionalni estri (na primer etilen diamin tetra sirćetna kiselina - EDTA), divinil sulfon, karbodiimidi, i dialdehidi.

[0059] U određenom načinu ostvarivanja, vodeni rastvor prema pronalasku se sastoji od kombinacije vodenog rastvora neumreženog hitozana sa vodenim rastvorom umreženog hitozana.

Postupak dobijanja rastvora

[0060] Prema određenoj karakteristici, vodeni rastvor prema pronalasku može da se pripremi prema sledećim fazama

- rastvaranje hitozana u vodi dodavanjem kiseline kao što je slaba kiselina da bi se dobio homogeni vodeni rastvor hitozana koji sadrži, u fiziološki prihvatljivom okruženju, između 0.1 i 4.5 mas.% hitozana sa stepenom acetilacije manjim od 20% i a prosečnu molekulsku masu između 100,000 i 1,500,000 g/mol, pri čemu pomenuti rastvor ima pH manju od 6.2,

pri čemu je pomenuta kiselina poželjno izabrana iz grupe koju čine sirćetna kiselina, glikolna kiselina, mlečna kiselina, glutaminska kiselina, i njihove mešavine, i

- podešavanje pH dijalizom, poželjno na sobnoj temperaturi, da bi se dobio vodeni rastvor čija je pH veća ili jednaka 6.2, poželjno između 6.2 i 7.2, poželjno između 6.25 i 7.1.

[0061] Pre rastvaranja, hitozan je obično u obliku praška ili pahuljice. Nakon rastvaranja, hitozan je u protonisanom obliku. Predstavlja katjonski polielektrolit, čija suprotnost dolazi iz kiseline u kojoj se rastvara. Na primer, ako se u vodu dodaje sirćetna kiselina da bi se rastvorio hitozan, nailazimo na hitozan u obliku acetata hitozana tj. NH protonisan oblik3<+>amino funkcija u elektrostatičkoj interakciji sa jonima acetata.

[0062] Hitozan je rastvoren u vodi upotrebom jake kiseline ili slabe kiseline. Međutim, hitozan je poželjno rastvoren u vodi upotrebom slabe kiseline da bi se izbegla razgradnja hidrolizom u kiselom rastvoru (pri pH vrednostima reda od 3 ili manje dobijenim tokom rastvaranja jakom kiselinom ). Jake

1

kiseline se, iako efikasnije omogućavaju rastvaranje u vodi, teže primenjuju i zahtevaju precizan rad na stehiometriji.

[0063] Jaka kiselina može na primer da bude hlorovodonična kiselina ili fosforna kiselina.

[0064] Slaba kiselina može biti izabrana između sirćetne kiseline, glikolne kiseline, mlečne kiseline, glutaminske kiseline, i njihovih mešavina.

[0065] U određenom načinu ostvarivanja prema pronalasku, tokom faze rastvaranja, kiselina se dodaje u količini strogo neophodnoj za rastvaranje hitozana. Stoga se višak kiseline može koristiti za određene hitozane, na primer hitozane koji se teško rastvaraju strogo potrebnom količinom kiseline, zatim se hitozan ponovo taloži, na primer upotrebom amonijaka. Nakon serija ispiranja koje za cilj imaju da uklone višak amonijaka i soli, hitozan zatim može da se liofilizuje kako bi se obnovila suva materija. To će zatim biti lakše za rastvaranje.

[0066] U drugom određenom načinu ostvarivanja prema pronalasku, tokom faze rastvaranja, kiselina se dodaje u količini strogo neophodnoj za rastvaranje hitozana, kao što je stehiometrijska količina strogo neophodna za protonaciju NH2mesta.

[0067] Broj mesta koja će se protonisati se obično izračunava na sledeći način:

gde je m = masa unesene sirovine, % vode = sadržaj vode sirovine, DA = stepen acetilacije, nNH2= broj mesta koja će biti protonisana u mol. Mmonomer= prosečna molekulska masa ostatak u g.mol-1

[0068] Kontrolisanje pH rastvora je veoma važno kako bi se izbegla kisela nekroza tkiva nakon ubrizgavanja, i takođe kako bi se zaštitili rastvor od hidrolize i razgradnje hitozana ukoliko je sterilizacija sprovedena (na primer u autoklavu na 121°C u trajanju od 15 minuta).

[0069] U kontekstu ovog pronalaska, pH se podešava veoma postepeno dijalizom.

[0070] Bez želje za vezivanjem za bilo koju teoriju, čini se da je postepenim podešavanjem pH (naročito dijalizom), za razliku od naglog podešavanja dodavanjem puferisanog rastvora, moguće održavanje rastvora u tečnom obliku bez želatiniranja, a da se pri tom postignu pH vrednosti koje su približne fiziološkoj pH. Čini se da postupci iz prethodnog stanja tehnike kod kojih je pH podešavana dodavanjem jedinjenja kao što je natrijumbikarbonat ili PBS pufer (“fosfatom puferisan slani rastvor”), daju previše nagao porast pH, što dovodi do želatiranja rastvora pH vrednosti od 6.2. Nasuprot svim očekivanjima, pronalazači su u poređenju sa ovom prijavom istakli da se kontrolisanjem porasta pH radi kontinuiranog, progresivnog održavanja vodenog rastvora hitozana u tečnom obliku postiže pH veća od 6.2, i da se pri tom sve više približava fiziološkoj pH.

[0071] pH vrednost je poželjno kontrolisana upotrebom pH metra tokom porasta pH da bi se dostigla pH veća ili jednaka 6.2 i poželjno između 6.2 i 7.2, poželjno između 6.25 i 7, 1, i poželjnije 6.3 i 7.0.

[0072] Dijaliza predstavlja postupak odvajanja membrane od molekula ili jona u rastvoru. Prema tome, u kontekstu ove prijave, vodeni rastvor hitozana prema pronalasku može biti dijalizovan prema puferisanom rastvoru koji ima pH jednaku finalnoj pH željenoj za rastvor hitozana (ciljana pH), odnosno najmanje veću od 6.2, poželjno između 6.2 i 7.2, poželjno između 6.25 i 7.1. Kada puferisani rastvor ima pH veću od pH želatiniranja rastvora (ne primer 7.5), u tom slučaju bi trebalo pratiti dijalizu kako bi se izbeglo želatiniranje rastovra.

[0073] Puferisani rastvor može, na primer, da bude fosfatom puferisan slani rastvor (PBS, TBS, PBS-mlečna kiselina), tris (tris(hidroksimetil)metilamin), 4-2-hidroksietil-1-piperazintan sulfonska kiselina (HEPES), 2-{[tris(hidroksimetil)metil]amino}etan sulfonska kiselina (TES), 3- (N-morfolino)propan sulfonska kiselina (MOPS), piperazin-N, N'-bis (2-etan sulfonska kiselina)), MES (2 - (N-morfolino)etan sulfonska kiselina (PIPES), natrijum hlorid (NaCl).

[0074] Prema poželjnom načinu ostvarivanja, puferisan rastvor je puferisani rastvor fosfata PBS ("fosfatom puferisan slani rastvor" – slani puferisani rastvor fosfata) koga čini "kisela" so NaH2PO4, "bazna" so Na2HPO4i NaCl.

[0075] Prema određenom načinu ostvarivanja, pufer je fiziološki prihvatljiv, odnosno ne predstavlja rizik od netolerancije ili toksičnosti tokom ubrizgavanja rastvora za injekciju prema pronalasku u tkiva. Kao takav, pufer je poželjno različit od glicerofosfata, i određenije od β-glicerofosfata koji, iako veoma iritirajući za kožu, stvara probleme kalcifikacije kada je ubrizgan u tkiva.

[0076] Prema određenom načinu ostvarivanja pronalaska, dijaliza može da se sprovede statistički u jednoj kupki prema puferisanom rastvoru kako je prethodno opisano.

[0077] U ovom načinu ostvarivanja, puferisan rastvor može da ima pH veću od željene pH za rastvor hitozana, na primer između 7.0 i 7.5. Dijaliza zatim mora biti praćena u stvarnom vremenu kako pH ne bi porasla iznad pH želatiranja. Međutim, upotreba puferisanog rastvora čija je pH previsoka može da ima nedostatak u smislu stvaranja gradijenta pH unutar vrećice za dijalizu koja obuhvata vodeni rastvor hitozana, određenije između periferije vrećice i njenog centra, koji može da promeni homogenost rastvora hitozana. Pored toga, ukoliko ovaj pH gradijent uzrokuje želatiranje vodenog rastvora hitozana na periferiji membrane, to bi moglo smanjiti efikasnost i kvalitet dijalize ograničavanjem razmene protona, soli i rastvarača između rastvora hitozana i puferisanog rastvora.

[0078] Prema tome, kada se dijaliza sprovodi statistički u jednoj kupki prema puferisanom rastvoru, poželjno je da pomenuti puferisani rastvor ima pH jednaku željenoj finalnoj pH za rastvor hitozana (ciljana pH), na primer između 6.5 i 6.9.

[0079] Prema poželjnijem načinu ostvarivanja, dijaliza može da se sprovede statistički u nekoliko uzastopnih kupki prema puferisanim rastvorima i sa različitom pH koja sve više raste do konačne željene pH za rastvor hitozana (ciljana pH). Na taj način je moguće da se pH postepenije povećava kao funkcija broja korišćenih puferisanih kupki, tako da se što više teži želatiranju pH rastvora hitozana a da se pri tom nikada ne dostigne. Međutim, svaka promena kupke je praćena naglom promenom pH, mada male amplitude, koja može da destabilizuje rastvor hitozana i uzrokuje želatiranje na pH nivoima od oko 6.3-6 4. Ove pH vrednosti su sigurno više od onih koje su dobijene za kompozicije iz prethodnog stanja tehnike, koje primenjuju dodavanje pufera direktno u vodeni rastvor hitozana, ali mogu više da pristupe fiziološkoj pH kako bi rizici od nekroze tkiva tokom ubrizgavanja vodenog rastvora hitozana se sveli na minimum.

[0080] Prema tome, prema posebno poželjnom načinu ostvarivanja, dijaliza se sprovodi dinamički, odnosno kontinuirano cirkulisanjem najmanje jednog rastvora koji omogućava postepen porast pH kroz jednu ili više vrećica za dijalizu koje se sastoje od dijalizne membrane koja sadrži vodeni rastvor hitozana.

[0081] Ovaj postupak dinamične dijalize uglavnom koristi prvi rezervoar A koji sadrži zapreminu VATrastvora slabe kiseline. Rastvor slabe kiseline sadržan u rezervoaru A cirkuliše kroz seriju vrećica za dijalizu međusobno povezanih u nizu ili paralelno. Izlaz zadnjeg džepa je povezan sa drugim rezervoarom B koji sadrži zapreminu VBbaze, pri čemu pomenuta baza moguće predstavlja konjugovanu bazu slabe kiseline koja se koristi u prvom rezervoaru A, ili jaču bazu od ove druge. Sadržaj drugog rezervoara B se zatim sipa u rezervoar A, pri tom modifikujući njegovu kompoziciju. Sistem funkcioniše u zatvorenom kolu dok se ne postigne kiselo-bazna ravnoteža u rezervoarima A i B, pri čemu se u svakom rezervoaru formira puferisan rastvor određene pH. Na ovaj način, pH rastvora hitozana koji se nalazi u vrećicama za dijalizu postepeno raste dok ne dosegne pH izabranog puferisanog rastvora. Takav uređaj je određenije ilustrovan na FIG.1.

[0082] Prema tome, u postupku dinamične dijalize prema pronalasku naročito se primenjuju sledeće faze:

i. priprema, u prvom rezervoaru A, prvog rastvora koji obuhvata slabu kiselinu, nazvanog “rastvor slabe kiseline”,

ii. priprema, u drugom rezervoaru B, drugog rastvora koji obuhvata konjugovanu bazu ili bazu jaču od konjugovane baze slabe kiseline koja se koristi u “rastvoru slabe kiseline”,

iii. cirkulacija “rastvora slabe kiseline” kroz jednu ili više vrećica za dijalizu koje se sastoje od dijalizne membrane koja sadrži vodeni rastvor hitozana koji sadrži, u fiziološki prihvatljivom okruženju, između 0.1 i 4.5 mas.% hitozana sa stepenom acetilacije manjim od 20% i prosečnom molekulskom masom između 100,000 i 1,500,000 g/mol, pri čemu pomenuti rastvor ima pH manju od 6.2,

iv. uvođenje pomenutug “rastvora slabe kiseline” dobijenog na kraju dijalize iz faze iii) u drugom rezervoaru B, pri čemu je kompozicija pomenutog drugog rezervoara B modifikovana u mešavinu "baza ε slaba kiselina", pri čemu ε predstavlja veoma malu količinu,

1

v. uvođenje mešavina“baza ε slaba kiselina” iz rezervoara B u rezervoar A da bi se dobila mešavina "slaba kiselina ε baza" u pomenutom rezervoaru A,

vi. ponavljanje faze iii, iv, i v dok se u rezervoarima A i B ne postigne kiselo-bazna ravnoteža, formirajući tako u svakom rezervoaru puferisan rastvor određene pH.

[0083] Rastvor slabe kiseline sadržan u rezervoaru A može naročito da obuhvati bilo koju slabu kiselinu, poželjno slabiju od kiseline koja se koristi za rastvaranje hitozana.

[0084] Poželjno, slaba kiselina koja se koristi u rastvoru iz rezervoara A je izabrana između dihidrogenfosfata (H2PO4-), 4-(2-hidroksietil)-1-piperazin etansulfonske kiseline, 2-[[1,3-dihidroksi-2-(hidroksimetil)propan-2-il]amino] etansulfonske kiseline, 3-(N-morfolino)propanesulfonske kiseline, piperazin-N, N'-bis(2-etansulfonske) 2- (N-morfolino)etansulfonske kiseline, karboksilnih kiselina kao što je sirćetna kiselina, glikolna kiselina. Poželjnije, slaba kiselina koja se koristi u rezervoaru A predstavlja mešavinu dihidrogenfosfata (H2PO4-) i NaCl.

[0085] Radi simultanog kontrolisanja osmolariteta rastvora hitozana, slaba kiselina koja se koristi u rastvoru iz rezervoara A može da se kombinuje sa takozvanom neutralnom solju, odnosno sa onom koja ne stupa u interakciju sa parom bazne kiseline koji se nalazi u rezervoarima A i B, određenije jedna so natrijuma (NaCl) ili so kalijuma (KCl).

[0086] Bazni rastvor koji se nalazi u rezervoaru B uključuje konjugovanu bazu ili jaču bazu od konjugovane baze slabe kiseline koja se koristi u rastvoru slabe kiseline koja se koristi u rastvoru iz rezervoara A. Prema tome, kada je dihidrogenfosfat (H2PO4-) slaba kiselina koja se koristi u rezervoaru A, hidrogenfosfat (HPO4<2->) može da se koristi u rezervoaru B. Par kiselina-baza je izabran tako da je njegov pKa blizu željene pH za puferisan rastvor (+/- 1). Određenije, pKa para kiselina-baza poželjno može da bude između 5.3 i 8.2, poželjno između 5.5 i 7.5.

[0087] Vrećice za dijalizu se sastoje od dijalizne membrane koji sadrži vodeni rastvor hitozana.

Membrana na primer može da se sastoji od polimera regenerisane celuloze (prirodna celuloza transformisana, serijom hemijskih i fizičkih operacija) ili estra celuloze (na primer celuloza acetata) sa pragom isključenja između 5kDa i 30KDa.

[0088] Sistem pumpi može određenije da omogući obezbeđivanje kontinuirane cirkulacije rastvora slabe kiseline koja se nalazi u rezervoaru A i baznog konjugata koji se nalazi u rezervoaru B.

[0089] Sistem mešanja može da se primeni u oba rezervoara A i B. U rezervoaru A, moguće je homogenizovati rastvor i izbeći varijacije pH koje su povezane sa uvođenjem dela (ε) rastvora koji se nalazi u rezervoaru B. U rezervoaru B, mešanje je naročito korisno kada se baza koristi u obliku soli. Mešanje stoga omogućava postepeno rastvaranje bazne soli. Prema tome upotreba baza u obliku soli može da omogući dalje usporavanje rasta pH i samim tim da obezbedi čak veću postepenu dijalizu.

[0090] Na kraju postupka dinamične dijalize, ravnoteža kiselina-baza se postiže u rezervoarima A i B, na taj način formirajući, u svakom rezervoaru, puferisani rastvor AB određene pH.

[0091] Sadržaj slabe kiseline koji se koristi u rezervoaru A i sadržaj konjugovane baze koja se koristi u rezervoaru B se izračunava postupcima poznatim u tehnici da bi se dobio, nakon obnavljanja ravnoteže kiselina-bazna, AB puferisani rastvor željene pH.

[0092] Ukupna zapremina AB puferisanog rastvora (VABV =AT+ VB) poželjno predstavlja najmanje 5 puta veću zapreminu vodenog rastvora hitozana kojeg bi trebalo dijalizovati, poželjno najmanje 10 puta.

[0093] Zapremina VArastvora slabe kiseline poželjno predstavlja 100 puta veću zapreminu

VBkonjugovane baze ili jače baze od konjugovane baze slabe kiseline koja se koristi u prvom rezervoaru. Zapravo, što se koncentrovanija ili jača baza koristi u rezervoaru B, to je dijaliza brža. Da bi se dijaliza usporila, poželjno je u okvirima ovog pronalaska, da se poveća zapremina VBrezervoara B na konstantu zapreminu Va rezervoara A.

[0094] Kontinuirana cirkulacija rastvora A i B, prekursori puferisanog rastvora AB, omogućavaju postepen porast pH (i osmolaritet kada se koriste soli) rastvora hitozana čime se omogućava pristup fiziološkim vrednostima. Kinetika pH podešavanja se može kontrolisati modifikovanjem brzine cirkulacije rastvora A i B.

[0095] Postupak dinamične dijalize ima najmanje jednu od sledećih prednosti:

● izbegava se stvaranje filma želatiranog hitozana na dijalizovanoj membrani

● ne uzrokuje fizičko-hemijsku rupturu u rastvoru hitozana što bi moglo da ugrozi njegovu stabilnost ● više su skloni pH vrednosti želatiranja pri tome ne uzrokujući ovo drugo; i približavaju se što je više moguće ovoj oblasti

● povećanje reproduktivnosti ispitivanja

● oslobađanje od trajne pH kontrole tokom dijalize

● povećanje homogenosti rastvora hitozana a samim tim i đpriceva nakon raspodele, čime se olakšava sterilizacija (identičan sastav u svakom špricu).

● ograničavanje rukovanja dijaliznim membranama i samim tim ograničavanje rizika od kontaminacije ● ograničavanje humane intervencije i samim tim troškova oko dijalize.

[0096] Posle ubrizgavanja, određenije u tkiva, homogeni vodeni rastvor prema ovom pronalasku će pogodno formirati polukristalni sistem, naročito usled promene pH koja je povezana sa uticajem puferisanog okruženja organizma.

[0097] Pod "polukristalnim sistemom" se obično misli na sistem koji se sastoji od kristalne faze i nekristalne (amorfne) faze.

[0098] Obično, dobijeni kristali hitozana odgovaraju hidriranom alomorfu hitozana.

[0099] Na posebno poželjan način prema ovom pronalasku, vodeni rastvor ima dobru biokompatibilnost i bioresorbujući je. Određenije, prema pronalasku proizvod ima trajanje bioresorpcije koje je dovoljno, za produženi efekat, kao što je produženi efekat punjenja.

[0100] Pod “bioresorbujući” ili “bioresorpcija” se misli na biodegradaciju koja dovodi do potpune ili suštinski potpune razgradnje ubrizganog proizvoda.

1

[0101] Prema određenoj karakteristici ovog pronalaska, rastvor hitozana predstavlja tečnost pre ubrizgavanja, koja se brzo želatinira (za nekoliko minuta do nekoliko sati) in situ, i njeno vreme apsorbovanja je dugo od trenutka ubrizgavanja, obično od par nedelja do nekoliko meseci, na primer reda od 3 do 4 nedelje do 12 do 18 meseci. Proizvod ili biomaterijal koji se sastoji od ili koji sadrži vodeni rastvor prema pronalasku ima koristi od bakteriološke i gljivične prirode hitozana, dobro poznate u svetu prehrambene industrije i flastera. Ova svojstva olakšavaju konzervisanje proizvoda i pomažu da se ograniče rizici od infekcije povezane sa ubrizgavanjem ili odložene upalne pojave za druge proizvode kako je prethodno pomenuto. Suočen sa prirodnim molekulima koji su se do sada koristili za popunjavanje bora (kolagen, hijaluronska kiselina), hitozan je jedini koji ima takva svojstva. Dalje, proizvod ili biomaterijal koji se sastoji od ili koji sadrži vodeni rastvor prema pronalasku obezbeđuje efektivno biološko punjenje koje je trenutno poželjno: hitozan, zapravo promoviše sintezu kolagena, omogućava punjenje nepravilnosti na koži, kao što su bore, stimulacijom prirodnih mehanizama.

[0102] Ovaj pronalazak se takođe odnosi na homogeni vodeni rastvor injektabilnog hitozana koji sadrži, u fiziološki prihvatljivom okruženju, između 0.1 i 4.5 mas.% hitozana sa stepenom acetilacije manjim od 20% i prosečne molekulske mase između 100,000 i 1,500,000 g/mol, pri čemu pomenuti rastvor ima pH veću ili jednaku 6.2, poželjno između 6.2 i 7.2, pri čemu pomenuti rastvor ne sadrži hitozan sa stepenom acetilacije većim od 20%, pri čemu je pomenuti rastvor tečan i homogen na sobnoj temperaturi, radi upotrebe u konstituciji ili supstituisanju bioloških tkiva, na primer kao implantat, ili punjenju bioloških tkiva, na primer punjenju depresija kože, ubrizgavanju u hrskavicu ili zglobove).

[0103] Poželjno, rastvor i hitozan su onakvi kao što je prethodno definisano.

[0104] Određenije, hitozan ima prosečnu molekulsku masu između 100,000 i 1,500,000 g/mol, poželjno između 200,000 i 1,000,000 g/mol, poželjnije između 250,000 i 800,000 g/mol, i ponovo poželjnije između 300,000 i 600,000 g/mol.

[0105] Obično, pomenuti vodeni rastvor ne sadrži hitozan sa stepenom acetilacije većim od 20%.

[0106] Poželjno, pomenuti vodeni rastvor može biti pripremljen prema fazama prethodno pomenutog postupka.

[0107] Ovaj pronalazak se takođe odnosi na kompoziciju koja obuhvata vodeni rastvor prema pronalasku, i opciono prihvatljivo jedinjenje ili ekscipijens.

[0108] U određenom načinu ostvarivanja, vodeni rastvor hitozana prema pronalasku obuhvata so kao što je natrijumhlorid, ili bilo koji drugi ekscipijens koji je poželjno prihvatljiv za podešavanje osmolariteta kompozicija. Dodavanje soli kao što je natrijumhlorid može biti poželjno za dobijanje izotoničnog rastvora.

[0109] Prema određenoj karakteristici ovog pronalaska, kompozicija takođe obuhvata najmanje jedno jedinjenje čija je terapeutska aktivnost prepoznata. Primera radi može se navesti analgetik, lokalno anestetsko jedinjenje kao što je lidokain, mepivakain, bupivakain ili ropivakain, angiogeno jedinjenje, vakcina, hormon, ili čak aktivno jedinjenje faktora rasta ili bioaktivni oligosaharid, na primer,

1

oligosaharid hijaluronske kiseline ili oligosaharid hitozana sa stepenom polimerizacije manjim od 20, ili čak nukleinska kiselina, protein ili antikancersko sredstvo.

[0110] Predmet ovog pronalaska je takođe kompozicija ili vodeni rastvor prema ovom pronalasku koji se upotrebljava kao dermatološka, kozmetička kompozicija, ili čak kao medicinsko sredstvo, poželjno kao implantat koji može da se bioresorbuje.

[0111] Ovaj pronalazak se takođe odnosi na kozmetičku upotrebu ili postupak kozmetičkog ili estetskog tretiranja ljudskog tela ili lica koji obuhvata ubrizgavanje kompozicije ili vodenog rastvora prema pronalasku.

[0112] Predmet ovog pronalaska je takođe upotreba tog vodenog rastvora kao vektora aktivnih sastojaka, na primer kao nosača za vakcine, antikancerske lekove ili hormone.

[0113] U određenom načinu ostvarivanja, kompozicija ili vodeni rastvor prema ovom pronalasku je namenjen za upotrebu u popravci ili rekonstrukciji tkiva.

[0114] Određenije, kompozicija ili vodeni rastvor prema ovom pronalasku mogu da se koriste za konstituciju ili supstituisanje bioloških tkiva, na primer kao implantat, ili punjenje bioloških tkiva, na primer ubrizgavanje u hrskavice ili zglobove ili za punjenje šupljina tela ili lica, kao što su bore ili fine linije, ili za stvaranja ili povećanje zapremine lica ili čovečjeg tela, ili takođe za ožiljke na koži.

[0115] Prema drugim određenim načinima ostvarivanja, kompozicija ili vodeni rastvor prema ovom pronalasku može da se koristi:

- u hirurgiji, posebno u popravci organa, ili u medicini ili estetskoj hirurgiji,

- u urologiji, posebno za lečenje nekontrolisanog mokrenja,

- u infektologiji, određenije kao tečni nosač za vakcine,

- u oftalmologiji, određenije za lečenje rožnjače,

- u stomatologiji, određenije za ugradnju zubnih implantata ili za popravku kostiju,

- u ortopediji, posebno u pokosnici za stvaranje volumena ili čak u angiologiji.

[0116] Kompozicija ili vodeni rastvor prema ovom pronalasku takođe mogu da se koriste u reumatologiji.

[0117] Poželjno, kompozicija ili vodeni rastvor prema ovom pronalasku takođe mogu da se koriste kao vektor aktivnog sastojka određenije terapeutskog, kao što je vakcina ili hormon tipa insulina ili estrogena, i uopštenije za sve aktivne sastojke čija kontrolisana i/ili produžena isporuka ili otpuštanje imaju prednost.

[0118] Ovaj pronalazak se takođe odnosi na kozmetičku upotrebu vodenog rastvora ili kompozicije prema pronalasku za lečenje ili borbu protiv starenja kože.

[0119] Na kraju, ovaj pronalazak se takođe odnosi na postupak za povećavanje rastvorljivosti hitozana u vodi sa stepenom acetilacije manjim od 20% i prosečne molekulske mase između 100,000 i 1,500,000 g/mol kao što je prethodno opisano, koji obuhvata najmanje sledeće faze:

1

- rastvaranje hitozana u vodi dodavanjem kiseline kao što je slaba kiselina da bi se dobio homogeni vodeni rastvor hitozana koji sadrži, u fiziološki prihvatljivom okruženju, hitozan sa stepenom acetilacije manjim od 20% i prosečne molekulske mase između 100,000 i 1,500,000 g/mol, pri čemu pomenuti rastvor sadrži između 0.1 i 4.5 mas.% hitozana, pri čemu pomenuti rastvor ima pH manju od 6.2,

pri čemu je pomenuta kiselina poželjno izabrana iz grupe koju čine sirćetna kiselina, glikolna kiselina, mlečna kiselina, glutaminska kiselina, i njihove mešavine, i

- podešavanje pH dijalizom, poželjno na sobnoj temperaturi, da bi se dobio vodeni rastvor pH vrednosti veće ili jednake 6.2, poželjno između 6.2 i 7.2, poželjno između 6.25 i 7.1.

[0120] Faze ovog postupka su detaljno opisane u prethodnom delu teksta.

[0121] Sledeći primeri imaju za cilj da ilustruju pronalazak pri tom ne ograničavajući njegov obim na bilo koji način.

Primer 1: Priprema vodenog rastvora hitozana

Kiseli rastvor hitozana:

[0122] Vodeni rastvor hitozana je pripremljen rastvaranjem čvrstog hitozana u vodi koja je zakiseljena sirćetnom kiselinom.

[0123] Korišćeni hitozan predstavlja hitozan molekulske mase MM od između 400,000 i 1,500,000 g.mol<-1>i stepena acetilacije = 5%.

[0124] Njegov viskozitet, izmeren pri koncentraciji od 1% u vodenom rastvoru , sa 1% u sirćetnoj kiselini na 25°C, iznosi 9.578 Pa.s

pri čemu je 1 ,5 g hitozana rastvoreno u 500 μL glacijalne sirćetne kiseline i 49.5 ml PBS pufera ("fosfatom puferisan slani rastvor" - pH = 6.5) koji obuhvata NaCl, "kiselu" so NaH2PO4i "baznu" so Na2HPO4.

[0125] pH rastvora je 5.45.

Oprema za dijalizu:

[0126] Dijaliza je sprovedena upotrebom SpectraPor 4 membrana u regenerisanoj celulozi sa pragom segregacije od 12-14000 Da.

[0127] pH vrednosti su izmerene upotrebom prenosivog FiveGo FG2 (Mettler Toledo) pH metra.

[0128] Korišćen je pufer fosfata PBS ("fosfatom puferisan slani rastvor" - pH = 6.5).

[0129] Dijaliza je sprovedena prema 3L pufera koji je redovno obnovljen. Dijaliza je zaustavljena pri prvim znacima želatiranja.

[0130] pH rastvora hitozana je regularno izmerena i njeno razvijanje je prikazano na FIG.2.

1

[0131] pH rastvora hitozana bi stoga mogla biti povećana do vrednosti od 6.46 bez bilo kog znaka želatiranja rastvora.

Primer 2: Poređenje

[0132] Prijavilac je pokušao da reprodukuje homogeni rastvor hitozana opisan u primeru 1 patentne prijave WO03/042250.

[0133] Zbog ovoga, korišćen je hitozan sa stepenom deacetilacije od 84%.

[0134] 2,34 g hitozana (84% deacetilisan) je rastvoreno umešavanjem u 100 ml rastvora HCl (0.1 M). Posle 30 minuta mešanja, dobijen je homogeni rastvor hitozana.

[0135] Rastvor hitozana je ohlađen u frižideru do 4°C i čuvan je u ledenom kupatilu.

[0136] pH mu je podešena na 6.8 dodavanjem, čak na 4°C, soli dinatrijum αβ-glicero-fosfata.1.0g soli dinatrijum αβ-glicero-fosfata je dovoljan da se postigne željena pH od 6.8.

[0137] Međutim, soli αβ-glicero-fosfata su veoma slabo rastvorene u rastvorima hitozana bez obzira na ručno i mehaničko mešanje. Inkluzije gela su se pojavile veoma brzo oko manje rastvorljivih kristala glicerofosfata.

[0138] Prema tome, homogeni vodeni rastvori hitozana pH vrednosti od 6.8 ne mogu biti dobijeni reprodukovanjem primera 1 dokumenta WO03/042250.

[0139] Kako bi se rešio ovaj problem, prijavilac je reprodukovao ovo ispitivanje tako što je zamenio soli dinatrijumαβ-glicero-fosfata sa solima dinatrijumβ-glicero-fosfata, čija su svojstva za poboljšavanje hitozana dobro poznata.

[0140] Zbog ovog novog ispitivanja, korišćen je isti hitozan sa stepenom deacetilacije od 84%.

[0141] 2,34 g hitozana (84% deacetilisan) je rastvoreno uz mešanje u 100 ml HCl rastvora (0.1 M).

[0142] Rastvor hitozana je ohlađen u frižideru do 4°C i čuvan je u ledenom kupatilu.

[0143] pH mu je podešena na 6.8 progresivnim dodavanjem, čak na 4°C, 2.84 g soli dinatrijum β-glicerofosfata dispergovanog ručnim mešanjem.

[0144] Homogeni rastvor hitozana na 3.4°C, pH vrednosti od 6.8, je dobijen na taj način. Propustljivost rastvora pre i posle dodavanja β-glicero-fosfata je takođe izmerena rasipanjem svetlosti, na talasnoj dužini jednakoj 500 nm, kroz uzorak debljine od 1 cm.

[0145] Rastvor je zatim zagrejan u vodenom kupatilu do postizanja temperature od 25°C (sobne temperature), i čuvan je na ovoj temperaturi tokom 17h. Dobijena kompozicija je želatirana i izraženog je beličastog izgleda. Propustljivost više ne može da se izmeri imajući u vidu kompaktnu prirodu dobijenog gela.

[0146] Rezultati su dati u tabeli u nastavku:

1

Claims (19)

1. [0147] Prema tome, rastvor dobijen iz primera 1 dokumenta WO03/042250, modifikovan upotrebom soli dinatrijuma β-glicero-fosfata umesto soli dinatrijum αβ-glicero-fosfata, je veoma tečan i prilično homogen (propustljivost 77%) na niskoj (4°C) . [0148] Međutim, porast temperature do 25°C (sobna temperatura) uzrokuje želatiranje kompozicije. U dokumentu WO03/042250, hemijsko kalemljenje hitozana zapravo omogućava dobijanje injektabilnog rastvora na 25°C. Bez ovog kalemljenja, kompozicije opisane u dokumentu WO03/042250 su u obliku gela od 25°C i mogu se ubrizgati samo na 4°C. [0149] Suprotno tome, homogeni vodeni rastvori prema ovom pronalasku su u obliku injektabilnog tečnog rastvora čak i na sobnoj temperaturi (20-25 ° C), i gela samo kada pH raste in situ. Patentni zahtevi 1. Homogeni vodeni rastvor injektabilnog hitozana koji sadrži, u fiziološki prihvatljivom okruženju, između 0.1 i 4.5 mas.% hitozana sa stepenom acetilacije manjim od 20% i prosečne molekulske mase između 100,000 i 1,500,000 g/mol, pri čemu je pH pomenutog rastvora veća ili jednaka 6.2, poželjno između 6.2 i 7.2, pri čemu pomenuti rastvor ne sadrži hitozan sa stepenom acetilacije većim od 20%, pri čemu je pomenuti rastvor tečan i homogen na sobnoj temperaturi.
2. 2. Vodeni rastvor prema prethodnom zahtevu, naznačen time, što hitozan ima nivo acetilacije manji od 19%, poželjno manji od 17%, poželjnije manji ili jednak 15%, i najpoželjnije manji od 10%. 2
3. 3. Vodeni rastvor prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačen time, što sadrži između 1 i 3.5 mas.% hitozana, određenije između 2 i 3.5 mas.% hitozana, u odnosu na ukupnu masu vodenog rastvora.
4. 4. Vodeni rastvor prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačen time, što hitozan ima prosečnu molekulsku masu između 200,000 i 1,000,000 g/mol, poželjnije između 250,000 i 800,000 g/mol, a još poželjnije između 300,000 i 600,000 g/mol.
5. 5. Vodeni rastvor prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačen time, što ima pH između 6.25 i 7.1, poželjno između 6.3 i 7.0.
6. 6. Vodeni rastvor prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačen time, što ga je moguće pripremiti postupkom koji obuhvata najmanje sledeće faze: - rastvaranje hitozana u vodi dodavanjem kiseline, kao što je slaba kiselina, da bi se dobio homogeni vodeni rastvor hitozana koji sadrži, u fiziološki prihvatljivom okruženju, između 0.1 i 4.5 mas.% hitozana sa stepenom acetilacije manjim od 20% i prosečne molekulske mase između 100,000 i 1,500,000 g/mol, pri čemu pomenuti rastvor ima pH manju od 6.2, pri čemu je pomenuta kiselina poželjno izabrana iz grupe koju čine sirćetna kiselina, glikolna kiselina, mlečna kiselina, glutaminska kiselina, i njihove mešavine, i - podešavanje pH dijalizom, poželjno na sobnoj temperaturi, da bi se dobio vodeni rastvor čija je pH veća ili jednaka 6.2, poželjno između 6.2 i 7.2, i poželjno između 6.25 i 7.1.
7. 7. Vodeni rastvor prema zahtevu 3, naznačen time, što se tokom faze rastvaranja, kiselina dodaje u količini strogo neophodnoj za rastvaranje hitozana.
8. 8. Vodeni rastvor prema jednom od zahteva 3 ili 4, naznačen time, što je dijalizovan prema puferisanom rastvoru koji ima pH veću od 6.2, poželjno između 6.2 i 7.2, poželjno između 6.25 i 7.1.
9. 9. Vodeni rastvor prema jednom od zahteva 3 do 5, naznačen time, što puferisan rastvor predstavlja fosfatom puferisan slani rastvor koji obuhvata "kiselu" so NaH2PO4, "baznu" so Na2HPO4i NaCl.
10. 10. Vodeni rastvor prema jednom od zahteva 3 do 6, naznačen time, što je dijaliza dinamična, pri čemu se sprovode naročito sledeće faze: i. dobijanje, u prvom rezervoaru A, prvog rastvora koji obuhvata slabu kiselinu, označenog kao "rastvor slabe kiseline", ii. dobijanje, u drugom rezervoaru B, drugog rastvora koji obuhvata konjugovanu bazu ili bazu jaču od konjugovane baze slabe kiseline koja se koristi u "rastvoru slabe kiseline", iii. cirkulisanje "rastvora slabe kiseline" kroz jedan ili više dijaliznih džepova koji se sastoje od dijalizne membrane koja sadrži vodeni rastvor hitozana koji sadrži, u fiziološki prihvatljivom okruženju, između 0.1 i 4.5 mas.% hitozana sa stepenom acetilacije manjim od 20% i prosečnom molekulskom masom između 100,000 i 1,500,000 g/mol, pri čemu pomenuti rastvor ima pH manju od 6.2, iv. uvođenje pomenutog "rastvora slabe kiseline" dobijenog na kraju dijalize iz faze iii) u drugi rezervoar B, pri čemu je kompozicija pomenutog drugog rezervoara B modifikovana u mešavinu "baza ε slaba kiselina", pri čemu ε predstavlja veoma malu količinu, v. uvođenje mešavine "baza ε slaba kiselina" iz rezervoara B u rezervoar A da bi se dobila mešavina "slaba kiselina ε baza" u pomenutom rezervoaru A, vi. ponavljanje faze iii, iv, i v dok se u rezervoarima A i B ne postigne kiselo-bazna ravnoteža, formirajući tako u svakom rezervoaru puferisan rastvor određene pH.
11. 11. Vodeni rastvor prema zahtevu 7, naznačen time, što slaba kiselina koja se koristi u rezervoaru A predstavlja mešavinu dihidrogenfosfata (H2PO4-) i NaCl, a baza koja se koristi u rezervoaru B je hidrogenfosfat (HPO4<2->).
12. 12. Vodeni rastvor prema jednom od zahteva 3 do 8, naznačen time, što se dijalizna membrana sastoji od polimera regenerisane celuloze (prirodne celuloze transformisane serijom hemijskih i fizičkih operacija) ili estra celuloze (na primer acetata celuloze) sa pragom isključenja između 5kDa i 30kDa.
13. 13. Kompozicija koja obuhvata vodeni rastvor prema bilo kom od prethodnih zahteva i, opciono, neko prihvatljivo jedinjenje ili prihvatljiv ekscipijens.
14. 14. Kompozicija prema zahtevu 13, koja obuhvata najmanje jedno aktivno jedinjenje kao što je analgetik, lokalni anestetik, kao što je lidokain, mepivakain, bupivakain ili ropivakain, angiogeno jedinjenje, vakcina, hormon, ili čak aktivno jedinjenje kao što je faktor rasta ili bioaktivni oligosaharid, na primer oligosaharid hijaluronske kiseline ili oligosaharid hitozana sa stepenom polimerizacije manjim od 20, ili čak nukleinska kiselina, protein ili antikancersko sredstvo.
15. 15. Kompozicija prema zahtevu 13 ili 14, naznačena time, što je formulisana da se daje ili koristi kao intradermalna ili supkutana, intramuskularna, intraartikularna ili intraokularna injekcija, i uopšte u meko ili tvrdo tkivo tela, na primer organe (digestivni ili urogenitalni sistem) ili masna tkiva, sluznice, desni, hrskavicu, kosti.
16. 16. Kompozicija prema bilo kom od zahteva 13 do 15, za upotrebu u popravci ili rekonstrukciji tkiva, određenije u konstituisanju ili supstituisanju bioloških tkiva, na primer kao implant, ili za popunjavanje bioloških tkiva, na primer popunjavanje depresija kože, ubrizgavanje u koštanu hrskavicu ili u zglobove.
17. 17. Kompozicija prema bilo kom od zahteva 13 do 15, za upotrebu kao dermatološka ili kozmetička kompozicija, ili čak za upotrebu kao medicinsko sredstvo, poželjno kao implant koji može da se bioresorbuje.
18. 18. Kompozicija prema zahtevu 17, za upotrebu u hirurgiji, medicini ili estetskoj hirurgiji, u urologiji, reumatologiji, oftalmologiji, odontologiji, ortopediji, ili čak u angiologiji.
19. 19. Kompozicija prema zahtevu 17, za upotrebu kao vektor aktivnih sastojaka, na primer kao nosač vakcina, antikancerskih lekova ili hormona. 2