RS59898B1 - Intraćelijsko davanje - Google Patents

Description

Opis

POVEZANE PRIJAVE

[0001] Ova prijava ima prioritet američke privremene prijave br.61/548,013, podnete 17. oktobra 2011. i američke privremene prijave br.61/684,301, podnete 17. avgusta 2012.

IZJAVA KOJA SE ODNOSI NA FEDERALNO SPONZORISANO ISTRAŽIVANJE

[0002] Ovaj pronalazak je napravljen najmanje delom uz podršku Vlade prema Odobrenju 5 RC1 EB011187-02, koje je dodelio Nacionalni zdravstveni institut. Vlada poseduje određena prava u ovom pronalasku.

POZADINA

[0003] Mnoga farmaceutska sredstva se uglavnom fokusiraju na razvoj lekova malih molekula. Ovi lekovi se tako nazivaju zbog relativno male veličine koja im omogućava da se slobodno difunduju u telu kako bi stigli do svog cilja. Ovi molekuli takođe mogu da preskaču preko inače nepropusne ćelijske membrane uglavnom bez smetnji. Sledeća generacija terapija na bazi proteina, DNK ili RNK, međutim, ne može odmah da pređe ćelijsku membranu i stoga je neophodna ćelijska modifikacija radi olakšanog davanja. Ustanovljeni postupci koriste hemikalije ili električne pulseve za probijanje membrane i davanje materijala u citoplazmu. Pravilno intraćelijsko davanje je ključna faza u istraživanju, razvoju i primeni sledeće generacije terapijskih sredstava.

[0004] Postojeći postupci su često teški za razvoj i izrazito specifični za njihovu naročitu primenu. Dalje, postojeći postupci nisu pravilno usmereni na mnoge klinički važne tipove ćelija, poput matičnih ćelija i imunih ćelija. Stoga je prisutna potreba za robusnijom i preciznijom tehnikom koja može da se pozabavi potrebama savremenih bioloških/medicinskih istraživanja.

[0005] Kao primer već poznatih postupaka i respektivnih sistema, US 2009/280518 A1 opisuje sistem za merenje mehaničke karakteristike ćelije, u kojem se elastičnost ćelije meri posmatranjem kako ćelija reaguje na kompresiju i deformisanje pomoću senzora, i, detaljnije, u kojem se specifična električna otpornost ćelije prvo meri pomoću para elektroda, zatim prolazi kroz karakteristiku deformisanja ćelije, a onda se specifična električna otpornost ćelije ponovo meri pomoću drugog para elektroda. Kao dalji primer, članak "Shear-Induced Intracellular Loading of Cells With Molecules by Controlled Microfluidics" koji su napisali Daniel M. Hallow et. al., BIOTECHNOLOGY and BIOENGINEERING, WILEY & SONS, HOBOKEN, NJ, US, 2008, 99 (4), str.846-854, opisuje ispitivanje radi testiranja hipoteze da kontrolisani protok kroz mikrokanale može prouzrokovati smicanjem indukovano intraćelijsko punjenje ćelija molekulima, pri čemu su, određenije, DU145 ćelije kancera prostate izložene opterećenju smicanja fluida u prisustvu fluorescentnih molekula koji probijaju ćeliju pomoću uređaja za smicanje na bazi konusa i ploče ili protokom velike brzine kroz mikrokanal, u kojem su pomoću špric pumpe suspenzije ćelije protekle kroz mikrokanale prečnika 50-300 mikrometara. Međutim, i dalje je prisutna potreba za robusnijom i preciznijom tehnikom koja može da zadovolji potrebe savremenih bioloških/medicinskih istraživanja.

SAŽETAK

[0006] Ovaj pronalazak je zasnovan na iznenađujućem otkriću da kontrolisana povreda, npr. podvrgavanje ćelije suženju, rapidnom istezanju, rapidnoj kompresiji ili pulsu velike brzine smicanja dovodi do apsorpcije molekula u citoplazmu ćelije iz okružujućeg medijuma ćelije. Cilj ovog pronalaska je ostvaren pomoću mikrofluidnog sistema za prouzrokovanje perturbacija u ćelijskoj membrani ćelije za intraćelijsko davanje korisnog sadržaja prema patentnom zahtevu 1, postupka za davanje korisnog sadržaja u ćeliju prema bilo kom od patentnih zahteva 10, 20 ili 26, i mikrofluidnog sistema za upotrebu sa ćelijom suspendovanom u rastvoru i za prouzrokovanje perturbacija u ćelijskoj membrani prema patentnom zahtevu 30. Stoga, ovaj pronalazak poseduje mikrofluidnu platformu bez vektora za intraćelijsko davanje materijala direktno u citozol, npr. jedinjenja ili kompozicije, u eukariotsku ćeliju. Ovaj uređaj je koristan kao višestruko upotrebljiv i široko primenljiv laboratorijski alat za davanje željenih molekula u ciljne ćelije. Davanje molekula u ćeliju pomoću ovde opisanih postupaka je proporcionalno, npr. linearno ili monotoničko sa brzinom ćelije kroz suženje i/ili pritisak. Na primer, 50 µl suspenzije ćelije prolazi kroz uređaj za nekoliko sekundi. Opseg propusnog kapaciteta je između 1 ćelije/sekunda po kanalu (ili čak manje) do preko 1.000 ćelija/sekunda po kanalu. Uobičajene brzine ćelije kroz suženje uključuju 10 mm/sekunda do 500 mm/sekunda, iako brzine ćelije mogu dostići do 10 m/s (ili čak više). Dodatni kanali se mogu paralelno postaviti radi povećanja ukupnog propusnog kapaciteta sistema.

[0007] Apsorpcija molekula je na bazi difuzije, a ne endocitoze, tj. korisni sadržaj (jedinjenje(a) koje(a) se daje(u) u ćeliju) je prisutan u citoplazmi, a ne u endozomima nakon prolaska kroz uređaj. Malo ili nimalo korisnog sadržaja se pojavljuje u endozomima nakon obrade ćelija. Na primer, veliki molekuli se apsorbuju sporije od manjih molekula. Kontrolisano istezanje ćelije i brzina kretanja ćelija kroz suženje dovodi do boljeg davanja ciljnih molekula, uz istovremeno očuvanje vijabilnosti i celovitosti ćelija. Nakon obrade, vijabilnost ćelija iznosi između 70-100%, npr. uobičajena vijabilnost iznosi 90% nakon obrade. Poređenja radi, za prethodne postupke davanja koji su koristili velike brzine smicanja od samo nekoliko sekundi ili milisekundi utvrđeno je da dovode do loše vijabilnosti ćelija nakon obrade. Za razliku od prethodnih tehnika, postupci ovog pronalaska podvrgavaju ćelije pulsaciji smicanja u opsegu od 100-1000 Pa za veoma kratak vremenski period (otprilike 100 mikrosekundi) dok ćelija prolazi kroz suženje. Trenutne tehnike, međutim, se fundamentalno razlikuju od prethodnih tehnika. U ovim tehnikama, poželjno je prisutno potpuno mehaničko deformisanje ćelije dok prolazi kroz suženje, što može zahtevati sile smicanja drugačije od prethodnih tehnika. U poželjnim načinima ostvarivanja, ćelije se ne podvrgavaju električnoj struji. U drugim načinima ostvarivanja, koristi se kombinovana obrada, npr. mehaničko deformisanje pomoću ovde opisanog uređaja pre ili nakon elektroporacije (tip osmotske transfekcije kod kojeg se električna struja koristi za stvaranje privremenih rupa u membranama ćelije, što omogućava ulazak nukleinskih kiselina ili makromolekula).

[0008] Korisni sadržaj je jedinjenje ili kompozicija koja se daje u ćeliju. Na primer, korisni sadržaj može uključivati proteine, fluorescentne boje, kvantne tačke, ugljenične nanocevi, RNK molekule, DNK molekule, antigene i druge makromolekule, nanočestice i kompozicije materije.

[0009] Širina suženja uređaja, dužina suženog dela, geometrija ulaznog regiona i dubina kanala uređaja utiču na davanje molekula u ćeliju. Poželjno, širina suženog dela zaštitne cevi nije manja od 4 µm u prečniku, a dužina suženog dela zaštitne cevi je poželjno između 40-50 µm. Dužina suženog dela generalno ne prelazi 90 µm. Prečnik suženog dela je povezan sa tipom ćelije koja se obrađuje. Kao što je opisano u nastavku, prečnik je manji od prečnika ćelije (npr.20-99% prečnika ćelije). Mnoge ćelije su između 5-15 µm u prečniku, npr. dendritske ćelije su 7-8 µm u prečniku. Na primer, prečnik suženog dela je 4,5, 5, 5,5, 6, ili 6,5 µm za obradu jedne ćelije. U drugom primeru, veličina/prečnik suženog dela za obradu ljudskog jajašceta je između 6,2 µm i 8,4 µm, iako su moguća veća i manja suženja (prečnik ljudske jajne ćelije je otprilike 12 µm). U drugom primeru, embrioni (npr. grozdovi 2-3 ćelije) se obrađuju pomoću prečnika suženja od između 12 µm i 17 µm.

[0010] Uređaj i postupci se koriste u razvoju i proizvodnji vakcina pomoću profesionalnih ćelija koje prezentuju antigen, poput dendritskih ćelija. Na primer, postupak stimulisanja prezentacije antigena se sprovodi podvrgavanjem dendritske ćelije kontrolisanoj povredi poput tranzitornog suženja ili pulsacije visokog smicanja i dovođenja dendritske ćelije u kontakt sa rastvorom koji obuhvata ciljni antigen. Postupak prinosi visoko aktivne ćelije koje prezentuju antigen u poređenju sa prethodnim postupcima stimulisanja. Proizvodnja vakcina se sprovodi pokretanjem dendritskih ćelija ili drugih ćelija koje prezentuju antigen kroz uređaj koji sadrži suženje (čime se ćelije podvrgavaju rapidnom istezanju), a zatim inkubiranjem ćelija u rastvoru koji sadrži korisni sadržaj, npr. antigen. Ćelije se potapaju u medijum ćelijske kulture koji sadrži jedan ili više antigena nakon rapidnog deformisanja ćelija, ali ćelije mogu doći u kontakt sa antigenom pre, tokom i/ili nakon događaja/postupka rapidnog deformisanja.

[0011] Surfaktanti (npr.0,1 – 10 mas.%) se opciono koriste (npr. poloksamer, serum izveden od životinja, albumin protein) u protočnom puferu. Prisustvo surfaktanata ne utiče na davanje molekula u ćelije; međutim, surfaktanti se opciono koriste za smanjenje zapušenja uređaja tokom rada.

[0012] Uređaj je napravljen od silicijuma, metala (npr. nerđajućeg čelika), plastike (npr. polistirena), keramike, ili bilo kog drugog materijala pogodnog za karakteristike nagrizanja u mikronskim razmerama i uključuje jedan ili više kanala ili zaštitnih cevi kroz koje ćelije prolaze. Silicijum je naročito pogodan, jer postupci minijaturisanja uzoraka su utvrđeni u ovom materijalu, stoga je jednostavnije proizvoditi nove uređaje, menjati projekte, itd. Pored toga, tvrdoća silicijuma može obezbediti prednosti u odnosu na fleksibilnije supstrate poput polidimetilsiloksana (PDMS), npr. veće brzine davanja. Na primer, uređaj uključuje 2, 10, 20, 25, 45, 5075, 100 ili više kanala. Uređaj je mikrofabrikovan nagrizanjem silicijuma. Ćelije su pomerene, npr. gurnute, kroz kanale ili zaštitne cevi primenom pritiska. Pokretač ćelije može primeniti pritisak. Pokretač ćelije može uključivati, na primer, pumpu pod pritiskom, gasni cilindar, kompresor, vakuum pumpu, špric, špric pumpu, peristaltičku pumpu, ručni špric, pipetu, klip, kapilarni efektor i gravitaciju. Kao alternativa kanalima, ćelije mogu proći kroz suženje u obliku mrežastih ili blisko postavljenih ploča. U svakom slučaju, širina suženja kroz koje ćelije prolaze je 20-99% širine ili prečnika ćelije koja se obrađuje u svom prirodnom stanju, tj. stanju bez pritiska. Temperatura može uticati na apsorpciju kompozicija i vijabilnost. Postupci su sprovedeni na sobnoj temperaturi (npr.20 °C), fiziološkoj temperaturi (npr.39 °C), temperaturi višoj od fiziološke, ili smanjenoj temperaturi (npr.4 °C), ili na temperaturama između ovih primernih temperatura.

[0013] Nakon kontrolisane povrede ćelije suženjem, istezanjem, i/ili pulsacijom velike brzine smicanja, ćelije su inkubirane u rastvoru davanja koji sadrži jedinjenje ili molekul koji se želi uvesti u ćeliju.

Kontrolisana povreda može se karakterisati kao mali, npr.200 nm u prečniku, defekt u ćelijskoj membrani. Period oporavka za ćelije iznosi nekoliko minuta za zatvaranje povrede prouzrokovane prolaskom kroz suženje. Period davanja obuhvata 1-10 minuta ili duže, npr.15, 20, 30, 60 minuta ili više, pri čemu je 2-5 minuta optimalno prilikom rada na sobnoj temperaturi. Duži vremenski periodi inkubacije u rastvoru davanja ne moraju nužno prinositi povećanu apsorpciju. Na primer, podaci su pokazali da je nakon 5 minuta malo ili nimalo dodatnog materijala apsorbovano od strane ćelija.

[0014] Stoga, ovaj pronalazak obezbeđuje rešenje dugotrajnih problema u području davanja leka u ćelije i nedostataka povezanih sa ranijim postupcima.

[0015] U pogledu davanja materijala u eukariotsku ćeliju, ćelije se mogu klasifikovati u dve velike kategorije:

1) Ćelije jednostavne za davanje (ETD): Najdostupniji hemijski i virusni postupci spadaju u ovu kategoriju. Ćelije jednostavne za davanje često nemaju direktan klinički značaj.

2) Ćelije teške za davanje (DTD): Veliki klinički značaj. Napredak u tehnologiji davanja može značajno omogućiti/ubrzati razvoj novih terapija. Ova kategorija uključuje matične ćelije, primarne ćelije i imune ćelije. Očekuje se drastičan porast tržišta za davanje DTD ćelija, pošto će nova terapijska sredstva na bazi RNK, matičnih ćelija i proteina dobiti na značaju u narednim godinama.

[0016] Ovde opisane tehnike su se dokazale posebno korisnim za područja istraživanja DTD ćelija, iako se iste tehnike mogu koristiti sa ETD ćelijama. Pored toga, olakšano je davanje materijala (poput kvantnih tačaka, ugljeničnih nanocevi i antitela) koji se ne mogu efektivno davati bilo kojim drugim postupkom ni ETD ni DTD ćelijama.

[0017] Generalno, u jednom aspektu ovaj pronalazak obezbeđuje mikrofluidni sistem sa karakteristikama prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 30.

[0018] Primene ovog pronalaska mogu takođe obezbediti jednu ili više sledećih karakteristika. Poprečni presek kanala je odabran iz grupe koju čine kružni, eliptični, oblik izduženog proreza, kvadratni, šestougaoni i trougaoni. Suženje uključuje ulazni deo, centralnu tačku i izlazni deo. Ulazni deo definiše ugao suženja, pri čemu je ugao suženja optimizovan radi smanjenja zapušenja kanala. Mikrofluidni sistem dalje uključuje više paralelno raspoređenih mikrofluidnih kanala, npr.2, 5, 10, 20, 40, 45, 50, 75, 100, 500, 1.000 ili više.

[0019] Generalno, u drugom aspektu ovaj pronalazak takođe obezbeđuje postupak koji ima karakteristike prema patentnom zahtevu 10.

[0020] Primene ovog pronalaska mogu takođe obezbediti jednu ili više sledećih karakteristika. Poprečni presek mikrofluidnog kanala je odabran iz grupe koju čine kružni, eliptični, oblik izduženog proreza, kvadratni, šestougaoni i trougaoni. Prolazak rastvora uključuje prolazak rastvora kroz ulazni deo, centralnu tačku i izlazni deo suženja. Postupak može dalje uključivati smanjenje zapušenja mikrofluidnog kanala podešavanjem ugla suženja ulaznog dela. Rešenje uključuje prolazak rastvora kroz više paralelno raspoređenih mikrofluidnih kanala.

[0021] Generalno, u još jednom aspektu ovaj pronalazak takođe obezbeđuje postupak sa karakteristikama prema patentnom zahtevu 20.

[0022] Primene ovog pronalaska mogu takođe obezbeđivati jednu ili više sledećih karakteristika.

Poprečni presek mikrofluidnog kanala je odabran iz grupe koju čine kružni, eliptični, oblik izduženog proreza, kvadratni, šestougaoni i trougaoni. Prolazak rastvora uključuje prolazak rastvora kroz ulazni deo, centralnu tačku i izlazni deo suženja. Postupak dalje uključuje smanjenje zapušenja mikrofluidnog kanala podešavanjem ugla suženja ulaznog dela. Prolazak rastvora uključuje prolazak rastvora kroz više mikrofluidnih kanala raspoređenih u jednom od nizova i paralelno. Inkubiranje uključuje inkubiranje ćelije tokom 0,0001 sekunde do 20 minuta (ili čak i duže). Pritisak je pritisak smicanja i kompresije.

[0023] Generalno, u još jednom aspektu, ovaj pronalazak takođe obezbeđuje postupak sa karakteristikama prema patentnom zahtevu 26.

[0024] Primene ovog pronalaska mogu takođe obezbediti jednu ili više sledećih karakteristika.

Deformisanje ćelije uključuje deformisanje ćelije tokom 1 µs do 10 ms, npr.10 µs, 50 µs, 100 µs, 500 µs i 750 µs. Inkubiranje se odvija tokom 0,0001 sekunde do 20 minuta, npr.1 sekunda, 30 sekundi, 90 sekundi, 270 sekundi i 900 sekundi.

[0025] Različite primene pronalaska mogu obezbediti jednu ili više sledećih mogućnosti. Može se ostvariti veća preciznost i skalabilnost davanja u poređenju sa prethodnim tehnikama. Davanje materijala u ćeliju može se automatizovati. Materijal poput proteina, RNK, siRNK, peptida, DNK i nepropustljive boje može se implantirati u ćeliju, poput embrionskih matičnih ćelija ili indukovanih pluripotentnih matičnih ćelija (iPSC-ovi), primarnih ćelija ili imortalizovanih ćelijskih linija. Uređaj i postupci su prijemčivi za bilo koji tip ćelija, a veličina suženog dela je prilagođena ćeliji koja će biti obrađena. Uređaji i postupci mogu obezbediti značajne prednosti. Na primer, eksperimentalna buka u trenutnim sistemima može biti smanjena u poređenju sa prethodnim tehnikama. Količine davanja materijala mogu biti konzistentne u populaciji ćelija. Ćelijama se može rukovati pojedinačno, a ne u seriji. Pronalazak je takođe demonstrirao prilično jedinstvenu mogućnost za davanje različitih nanočestica i proteina u citozol. Postojeći postupci su prilično nepouzdani ili neefikasni u izvođenju takvih funkcija.

[0026] U pogledu davanja senzitivnih korisnih sadržaja, npr. proteina (naročito velikih proteina, npr. većih od 30, 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500 kDa ili više), kvantnih tačaka, ili drugih korisnih sadržaja koji su senzitivni na na ili oštećeni usled izloženosti struji, oni se pouzdano daju u ćelije, uz istovremeno očuvanje celovitosti i aktivnosti senzitivnog korisnog sadržaja. Stoga, uređaj i postupci poseduju značajne prednosti u odnosu na postojeće tehnike poput elektroporacije, koja podvrgava kompozicije korisnog sadržaja struji (čime se oštećuje korisni sadržaj) i dovodi do niske vijabilnosti ćelija (npr.505 ili više ćelija obično umre nakon elektroporacije). Još jedna prednost postupka rapidnog istezanja/deformisanja jeste što se matične ili ćelije prekursori smatraju prijemčivim za apsorpciju korisnog sadržaja bez izmene stanja diferencijacije ili aktivnosti obrađene ćelije. Pored davanja kompozicija u citoplazmu ćelije u terapijske svrhe, npr. za proizvodnju vakcina, postupak se koristi za uvođenje molekula, npr. velikih molekula koji obuhvataju detektabilni marker, za obeležavanje intraćelijskih struktura poput organela ili za obeležavanje intraćelijskih konstituenata u svrhu dijagnostikovanja ili snimanja.

[0027] Različite primene pronalaska mogu takođe obezbediti jednu ili više sledećih mogućnosti. DNK se može davati u ćelije sa dozom za davanje poput matičnih, primarnih, imunih ćelija. Može se sprovesti davanje veoma velikih plazmida (čak i celih hromozoma). Kvantitativno davanje u ćelije poznatih količina konstrukta gena za ispitivanje nivoa ekspresije gena od interesa i njegova senzitivnost na koncentraciju se takođe mogu sprovesti. Davanje poznatih količina DNK sekvenci zajedno sa poznatom količinom enzima koji pojačavaju DNK rekombinaciju kako bi se ostvarilo jednostavnije/efikasnije stabilno davanje, homologna rekombinacija i mutageneza specifična za mesto se može sprovesti. Ovde opisani postupci i uređaji mogu se takođe koristiti za kvantitativno davanje RNK za efikasnija/konkluzivnija ispitivanja RNK. Takođe se sprovodi davanje male interferirajuće RNK (siRNK) u citoplazmu ćelije.

[0028] Različite primene pronalaska mogu takođe obezbediti jednu ili više sledećih mogućnosti. RNK se može davati u ćeliju za prigušivanje RNK bez potrebe za lipozomima. Poznate količine RNK molekula zajedno sa poznatim količinama dajser molekula mogu se davati radi dostizanja standardizovane, efikasne RNK preko više ćelijskih linija u različitim uslovima. mRNK se može davati u ćelije za ispitivanje aspekata pravila ekspresije gena na posttranskripcionom nivou. Poznate količine obeležene RNK za ispitivanje vremena poluraspada RNK-ova i ćelija može biti moguće. Može se sprovesti univerzalno davanje proteina. Poznate količine obeleženih proteina se mogu davati za ispitivanje njihovog vremena poluraspada u ćelijama. Davanje obeleženih proteina za ispitivanje lokalizacije proteina se može ostvariti. Poznate količine tagovanih proteina mogu se davati za ispitivanje interakcija protein-protein u ćelijskom okruženju. Može se sprovesti davanje obeleženih antitela u žive ćelije za imuno bojenje i Western blot na bazi fluorescentnosti.

[0029] Različite primene pronalaska mogu takođe obezbediti jednu ili više sledećih kliničkih i istraživačkih mogućnosti. Kvantitativno davanje lekova u ćelijske modele za poboljšani skrining i ispitivanja doze se može sprovesti. Postupak se može koristiti kao postupak visokog propusnog kapaciteta za skrining aktivnosti proteina u citozolu radi identifikacije proteinskih terapijskih sredstava ili razumevanja mehanizama bolesti. Takve primene su trenutno ozbiljno ograničene aktuelnim postupcima davanja proteina zbog njihove neefikasnosti. Uređaji i tehnike se koriste za intraćelijsko davanje lekova konkretnom podskupu cirkulišućih krvnih zrnaca (npr. limfocita), postupak visokog propusnog kapaciteta davanja šećera u ćelije radi poboljšanja kriokonzervacije ćelija, naročito oocita, diferencijaciju ciljnih ćelija uvođenjem proteina, mRNK, DNK i/ili faktora rasta, davanje genetskog ili proteinskog materijala za indukovanje reprogramiranja ćelije u cilju proizvodnje iPS ćelija, davanje DNK i/ili rekombinacionih enzima u embrionske matične ćelije za razvoj linija transgenih matičnih ćelija, davanje DNK i/ili rekombinacionih enzima u zigote za razvoj transgenih organizama, aktivaciju DC ćelija, generisanje iPSC, i diferencijaciju matičnih ćelija, davanje nanočestica za dijagnostička i/ili mehanička ispitivanja, kao i uvođenje kvantnih tačaka. Ćelije kože upotrebljene u vezi sa plastičnom hirurgijom su takođe modifikovane pomoću ovde opisanih uređaja i postupka.

[0030] Postupak stimulisanja prezentacije antigena pomoću postupka za davanje antigena i/ili imunih stimulatornih molekula prinosi ćelije za prezentaciju antigena, npr. dendritske ćelije, sa poboljšanim nivoima aktivnosti u poređenju sa konvencionalnim postupcima stimulacije, što dovodi do povećanih nivoa imuniteta posredstvom T i B-ćelije na ciljni antigen. Takav postupak može se stoga koristiti kao sredstvo za aktivaciju imunog sistema kao odgovor na kancer ili infekcije.

[0031] U svrhu skrininga, snimanja ili dijagnostike, uređaj se može koristiti u postupku obeležavanja ćelija. Postupak obeležavanja ćelija se sprovodi podvrgavanjem ćelija kontrolisanoj povredi i dovođenjem ćelije u kontakt sa rastvorom koji obuhvata detektabilni marker, pri čemu navedena povreda obuhvata tranzitorno suženje ili puls visokog smicanja. Detektabilni marker obuhvata fluorescentni molekul, radionuklid, kvantne tačke, zlatne nanočestice ili magnetne perle.

[0032] Pre ovog pronalaska, manipulacija matičnim ćelijama u svrhu uvođenja egzogenih kompozicija je bila otežana. Ovde opisani uređaj i postupci, npr. prolazak matičnih ćelija ili progenitornih ćelija poput indukovanih pluripotentnih matičnih ćelija (iPSC-ovi) kroz kanal suženja ne indukuju diferencijaciju, već pouzdano indukuju apsorpciju kompozicija u ćeliju. Na primer, faktori diferencijacije se uvode u takve ćelije. Nakon apsorpcije uvedenih faktora, ćelije nastavljaju kretanje na putanji diferencijacije koju diktira uvedeni faktor bez komplikacija povezanih sa postupkom kojim je (su) faktor(i) uveden(i) u ćeliju.

[0033] Pored jedne ćelije, čak i veoma velike ćelije, npr. jajašca; otprilike 200 µm u prečniku, grozdovi ćelija, npr. grozdovi od 2-5 ćelija poput embriona koji obuhvata 2-3 ćelije se obrađuju radi apsorpcije ciljnih kompozicija. Veličina otvora je odgovarajuće podešena, tj. tako da širina suženja bude tek malo manja od veličine grozda. Na primer, širina kanala je 20-99% širine ćelijskog grozda.

[0034] Ćelije ili ćelijski grozdovi su prečišćeni/izolovani ili obogaćeni za željeni tip ćelije. Dendritske ćelije ili druge ćelije, npr. imune ćelije poput makrofaga, B ćelija, T ćelija ili matične ćelije poput embrionskih matičnih ćelija ili iPS upotrebljene u postupcima su prečišćene ili obogaćene. Na primer, ćelije su izolovane ili obogaćene sopstvenom ekspresijom površinskih markera ćelije ili drugim karakteristikama identifikacije. Dendritske ćelije su identifikovane i izolovane sopstvenom ekspresijom 0-integrina, CD11c ili drugih površinskih markera identifikacije ćelije. U pogledu ćelija, pojam „izolovane“ označava da je ćelija suštinski oslobođena drugih tipova ćelija ili ćelijskog materijala sa kojim se obično javlja. Na primer, uzorak ćelija određenog tipa tkiva ili fenotipa je „suštinski čist“ kada iznosi najmanje 60% populacije ćelija. Poželjno, priprema iznosi najmanje 75%, poželjnije iznosi najmanje 90%, a najpoželjnije iznosi najmanje 99% ili 100% populacije ćelija. Čistoća se meri bilo kojim odgovarajućim standardnim postupkom, na primer, fluorescentno aktiviranim ćelijskim sortiranjem (FACS).

[0035] Kompozicije korisnog sadržaja poput polinukleotida, polipeptida, ili drugih agenasa su prečišćene i/ili izolovane. Konkretno, kako se ovde koristi, „izolovani“ ili „prečišćeni“ molekul nukleinske kiseline, polinukleotid, polipeptid ili protein je suštinski oslobođen drugih ćelijskih materijala, ili podloge za kulturu kada se proizvodi rekombinantnim tehnikama, ili hemijskih prekursora ili drugih hemikalija kada se hemijski sintetizuje. Prečišćena jedinjenja su najmanje 60% po masi (suva masa) jedinjenja od interesa. Poželjno, priprema iznosi najmanje 75%, poželjnije najmanje 90%, a najpoželjnije najmanje 99%, po masi jedinjenja od interesa. Na primer, prečišćeno jedinjenje je ono koje iznosi najmanje 90, 91, 92, 93, 94, 95, 98, 99, ili 100 (mas.%) željenog jedinjenja po masi. Čistoća se meri bilo kojim odgovarajućim standardnim postupkom, na primer, analizom hromatografije na koloni, hromatografije na tankoj koloni, ili tečne hromatografije visokih performansi (HPLC). Prečišćeni ili izolovani polinukleotid (ribonukleinska kiselina (RNK) ili dezoksiribonukleinska kiselina (DNK)) je oslobođen od gena ili sekvenci koje ga flankiraju u prirodnom stanju. Primeri izolovanog ili prečišćenog molekula nukleinske kiseline uključuju: (a) DNK koji je deo prirodnog genomskog DNK molekula, ali nije flankiran sa obe sekvence nukleinske kiseline koje flankiraju taj deo molekula u genomu organizma u kojem se prirodno javlja; (b) nukleinsku kiselinu inkorporiranu u vektor ili u genomsku DNK prokariota ili eukariota na takav način da rezultujući molekul nije identičan sa bilo kojim prirodnim vektorom ili genomskom DNK; (c) zasebni molekul poput cDNK, genomskog fragmenta, fragmenta proizvedenog lančanom reakcijom polimeraze (PCR), ili restrikcionog fragmenta; i (d) rekombinantnu nukleotidnu sekvencu koja je deo hibridnog gena, tj. gena koji šifruje fuzioni protein. Izolovani molekuli nukleinske kiseline u skladu sa ovim pronalaskom dalje uključuju sintetički proizvedene molekule, kao i bilo koje nukleinske kiseline koje su izmenjene hemijski i/ili sa modifikovanom kičmom.

[0036] Rastvor suspenzije je bilo koji fiziološki ili ćelijski kompatibilni pufer ili rastvor. Na primer, rastvor suspenzije je podloga za kulturu ćelije ili fosfat-puferovani fiziološki rastvor. Korisni sadržaj je isti ili različiti rastvor suspenzije koji takođe sadrži kompoziciju predviđenu za davanje unutar ćelije.

[0037] Prednosti ovog uređaja uključuju izbegavanje modifikacije željenog korisnog sadržaja, i ne nužno izlaganje korisnog sadržaja bilo kakvim elektromagnetnim poljima ili drugim oblicima naprezanja. U pogledu elektroporacije, pokazalo se da ovaj postupak oštećuje proteine i nije efikasan u davanju. Ovaj značajan nedostatak ne predstavlja problem sa ovde opisanim postupkom; ovaj postupak je naročito pogodan za davanje senzitivnih korisnih sadržaja, npr. proteina, naročito velikih proteina (npr.40 kDa -70 kDa, i do 120, 130, 150, 200 kDa ili više), velikih konstrukata nukleinske kiseline (npr. plazmida i drugih konstrukata koji sadrže 1 kb, 2 kb, 5 kb ili više polimera nukleinske kiseline i do celokupnih hromozoma), velikih jedinjenja, kao i kvantnih tačaka (npr.12 nm u prečniku) i drugih materijala za koje se zna da su osetljivi i da se lako oštećuju nakon izloženosti struji. Na primer, površinski ligandi na nanočestici ili kvantnoj tački mogu biti oštećeni ili se napuniti kao odgovor na električno polje koje time rezultuje agregacijom čestica, čime se ograničava/eliminiše njihova funkcionalnost. Još jedna prednost postupka kontrolisane povrede je vreme dovođenja ćelija u kontakt sa kompozicijom davanja. Naročito važne za proteine, koji su osetljivi na proteaze, temperaturu, kao i struju, ćelije dolaze u kontakt sa rastvorom korisnog sadržaja nakon obrade u relativno kratkom vremenskom periodu u poređenju sa prethodnim postupcima. Mikrofluidna priroda uređaja takođe zahteva daleko manje radne zapremine, čime se konzerviraju dragocene sirovine i/ili ćelije. Uređaj se takođe može spojiti sa postupcima davanja poput elektroporacije ili lipozomima za proizvodnju značajno pojačanog davanja u odnosu na svaki pojedinačni postupak.

[0038] Funkcionalna aktivnost datog korisnog sadržaja inverzno korelira sa tečnim opterećenjem smicanja, tj. fizičko naprezanje ćelijske membrane poput istezanja ćelijske membrane posreduje u apsorpciji korisnog sadržaja umesto smicanja. Konvencionalni postupci davanja nanočestice mogu rezultirati time da veće količine materijala dobiju pristup intraćelijskom okruženju ćelije; međutim, ovi postupci dovode do manje aktivnosti datog materijala u poređenju sa ovde opisanim postupcima zbog činjenice da prethodni postupci rezultiraju sekvestracijom datog materijala u endozome. Ovde opisani postupci dovode do davanja jedinjenja/kompozicija direktno u citozol tako da manja količina korisnog sadržaja datog u ćeliju dovodi do veće količine funkcionalne aktivnosti datih molekula zbog njihovog pristupa drugim citozolnim komponentama. Na primer, prethodni postupci za davanje nanočestica za posledicu su imali 2-10 puta veću količinu materijala datog u ćeliju, ali uz malo ili nimalo funkcionalne aktivnosti datog materijala zbog sekvestracije u endozome. Uređaji i postupci ovog pronalaska

1

prevazilaze ovaj nedostatak prethodnih postupaka intraćelijskog davanja izbegavanjem endozomnog odeljka.

[0039] Dodatne prednosti i karakteristike uključuju vremensku skalu obrade i brzine ćelije koje su mnogo veće nego u prethodnim pristupima. Dalje, u drugim postupcima ćelije se ne stiskaju čvrsto kao u ovim postupcima, npr. kako je utvrđeno veličinom (prečnikom) ćelije u odnosu na veličinu (prečnik) suženja (kao % prečnika ćelije). Ovo brzo, snažno, ali potkožno stiskanje ili deformisanje dovodi do boljih rezultata apsorpcije korisnog sadržaja direktno u citozol od strane ćelija. Deformisanje ćelije je iznenadno, tj. nastupa suštinski tokom 1 µs do 1 ms. Generalno, preveliko opterećenje ćelije indukovano deformisanjem može biti smrtonosno za ćeliju, dok u isto vreme premalo opterećenje ne indukuje perturbacije ćelije. Stoga predmet ovog pronalaska obezbeđuje postupke i sisteme koji prouzrokuju dovoljno opterećenja za indukovanje privremenih perturbacija, ali bez previše perturbacija koje bi bile trajne i smrtonosne za ćeliju.

[0040] Bilo koji od gore opisanih postupaka je sproveden in vitro, ex vivo ili in vivo. Za in vivo primene, uređaj može biti implantiran u vaskularnom lumenu, npr. rednom stentu. Ova i druge mogućnosti pronalaska, zajedno sa samim pronalaskom, biće potpunije shvaćene nakon pregleda crteža, detaljnog opisa i patentnih zahteva u nastavku.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0041]

FIG.1A je šematski dijagram mikrofluidnog sistema. Ćelije su izložene materijalu davanja (korisni sadržaj) nakon prolaska kroz suženje.

FIG.1B je šematski dijagram mikrofluidnog sistema. Ćelije su izložene materijalu davanja (korisni sadržaj) kroz postupak suspenzije ćelija u rastvoru koji uključuje materijal davanja (korisni sadržaj) (npr. ćelije su izložene materijalu davanja pre i nakon prolaska kroz suženje).

FIG.2A je šematski dijagram načina ostvarivanja mikrofluidnog sistema.

FIG.2B je ilustrativni dijagram mikrofluidnog sistema koji prikazuje dubinu, širinu i dužinu.

FIG.3 je šematski dijagram mikrofluidnog sistema.

FIG.4 is šematski dijagram koji prikazuje perturbacije u ćelijskom zidu.

FIG.5 je fotografija mikrofluidnog sistema.

FIG.6 je fotografija mikrofluidnog sistema.

FIG.7 je fotografija mikrofluidnog sistema.

FIG.8A-8B su grafikoni koji prikazuju primerne rezultate dobijene iz mikrofluidnog sistema.

FIG.9 je grafikon koji prikazuje primerne rezultate dobijene iz ćelija koje su obrađene pomoću mikrofluidnog sistema.

FIG.10 je grafikon koji prikazuje primerne rezultate dobijene iz ćelija koje su obrađene pomoću mikrofluidnog sistema.

FIG.11 je grafikon koji prikazuje primerne rezultate dobijene iz ćelija koje su obrađene pomoću mikrofluidnog sistema.

FIG.12 je šematski dijagram mikrofluidnog sistema.

FIG.13 je grafikon koji prikazuje primerne rezultate dobijene iz ćelija koje su obrađene pomoću mikrofluidnog sistema.

FIG.14 je grafikon koji prikazuje primerne rezultate dobijene iz ćelija koje su obrađene pomoću mikrofluidnog sistema.

FIG.15 je grafikon koji prikazuje primerne rezultate dobijene iz ćelija koje su obrađene pomoću mikrofluidnog sistema.

FIGS.16A-16F su primerni šematski dijagrami mikrofluidnih sistema.

FIG.17 je dijagram toka koji se odnosi na postupak upotrebe mikrofluidnog sistema.

FIGS.18A-18B su grafikoni koji prikazuju primerne rezultate dobijene iz ćelija koje su obrađene pomoću mikrofluidnog sistema.

FIG.19 je prikaz prenosa i konfokalnih fluorescentnih slika, nakon čega sledi z-profil konfokalnih fluorescentnih slika obrađenih ćelija koje se daju sa kvantnim tačkama (QD-ovi) pomoću predmeta ovog pronalaska.

FIG.20A ilustruje efikasnost davanja u citozol HeLa ćelije nakon obrade pomoću predmeta ovog pronalaska sa QD-ovima obloženim ligandom poli-imidazola (PIL). Vijabilnost ćelije je iznosila >80% kako je izmereno protočnom citometrijom.

FIG.20B ilustruje vijabilnost HeLa ćelija nakon davanja čistog QD535 pomoću predmeta ovog pronalaska, kako je izmereno bojenjem propidijum jodida i protočnom citometrijom.

FIG.21 ilustruje projekat, apsorpciju i stabilnost konstrukta na različitim podlogama.

FIG.22A ilustruje žive snimke ćelijske konfokalne mikroskopije obrađenih i kontrolnih ćelija.

FIG.22B ilustruje promenu intenziteta obrađenih ćelija u funkciji vremena u zelenim i crvenim kanalima. FIG.23 ilustruje merenja protočnom citometrijom prosečne fluorescentnosti i vijabilnosti ćelije.

FIG.24 ilustruje epifluorescentno snimanje neagregiranih kvantnih tačaka u citozolu ćelije nakon obrade pomoću uređaja sa 10 nM rastvora kvantne tačke, i trepćuće tragove tri kvantne tačke pomoću autofluorescentnosti.

FIG.25 ilustruje eksperimentalne rezultate koji pokazuju da učinak davanja zavisi od brzine ćelije i projekta suženja.

FIG.26 ilustruje skeniranja različitih horizontalnih ravni HeLa ćelije nakon davanja pacifik plavog konjugovanog 3 kDa dekstrana, prema merenju konfokalnom mikroskopijom.

FIG.27 ilustruje pojednostavljeni, 2D difuzni model koji simulira pasivnu difuziju materijala u ćeliju preko porisane membrane.

FIG.28 ilustruje rezultate dvostepenog davanja materijala.

FIG.29 ilustruje podatke koji se odnose na davanje SiRNK, proteina i nanočestice.

FIG.30 ilustruje primenljivost predmeta ovog pronalaska na tipove ćelija.

FIG.31 ilustruje podatke od davanja nanomaterijala i antitela.

FIG.32 ilustruje primene davanja proteina.

FIG.33 je tabela primernih tipova ćelija, kojima je uspešno dat korisni sadržaj.

FIG.34 je ilustracija koja opisuje sistem u kojem je krv pacijenta obrađena pomoću mikrofluidnog uređaja za davanje korisnog sadržaja poput makromolekula.

FIG.35 ilustruje efikasnost davanja i vijabilnost ljudskih embrionskih matičnih ćelija obrađenih pomoću 10 µm-6 µm uređaja za davanje korisnog sadržaja.

FIG.36 prikazuje generisanje i karakterizaciju mišjih i ljudskih iPSC linija direktnim davanjem fuzionisanih proteina za reprogramiranje pomoću predmeta ovog pronalaska.

FIG.37 prikazuje preliminarne rezultate reprogramiranja proteina i opisuje ekspresiju markera ljudske embrionske matične ćelije Oct4, SSEA-4, Tra-60, Tra-80, alkalnu fosfatazu (AP) u iPSC kolonijama.

FIG.38 prikazuje mikrografe koji ilustruju uređaj modifikovan pomoću inkorporiranih elektroda na bilo kojoj strani suženja putem fotolitografskog uzorkovanja i Au odlaganja za uvođenje lokalizovanog električnog polja u kanal, čime se kombinuje deformisanje ćelije sa elektroporacijom.

FIG.39 prikazuje drugi način ostvarivanja mikrofluidnog sistema, u kojem ulazni deo ima ugao suženja od 90 stepeni.

FIG.40 prikazuje grafike koji prikazuju poređenje vijabilnosti i efikasnosti davanja između uređaja u skladu sa primernim načinom ostvarivanja opisanim u FIG.2A i uređaja u skladu sa primernim načinom ostvarivanja opisanim u FIG.39.

FIG.41 prikazuje histograme CD45 ekspresije aktivnih T ćelija kako je izmereno pomoću Alexa 488 antitela do CD45. Ćelije koje su obrađene pomoću uređaja u prisustvu CD45 koji prigušuje RNK iskazuju niži vrh intenziteta fluorescentnosti, čime se iskazuje nokdaun ekspresije CD45 gena.

FIG.42 je ilustracija koja prikazuje više primernih polja primene poput regenerativne medicine; imunologije; snimanja i opažanja; i vakcina protiv kancera i ispitivanja kancera.

FIG.43A i 43B su histogrami intenziteta od protočne citometrije kontrolne populacije koja je izložena kaskadno plavom konjugovanom 3 kDa dekstranu i populacije ćelija koje su podvrgnute 30 µm-6 µm uređaju, a zatim izložene 3 kDa dekstranu.

FIG.44 je trakasti grafikon koji ilustruje GFP nokdaun u ljudskim embrionskim matičnim ćelijama nakon obrade pomoću mikrofluidnog uređaja i povezanih postupaka.

FIG.45A i 45B su dva grafika koja ilustruju intenzitet boje i vijabilnost ljudskih embrionskih matičnih ćelija nakon davanja 3 kDa plave boje.

DETALJAN OPIS

1

[0042] Načini ostvarivanja ovog pronalaska obezbeđuju tehnike za primenu kontrolisanog deformisanja na ćeliju tokom unapred utvrđenog vremenskog perioda kako bi se prouzrokovale perturbacije u ćelijskoj membrani tako da se materijali mogu davati u unutrašnjost ćelije. Deformisanje može biti prouzrokovano, na primer, pritiskom indukovanim mehaničkim naprezanjem ili silom smicanja. U jednom primeru, mikrofluidni sistem uključuje strukturu koja kontroliše i/ili manipuliše tečnostima geometrijskim zadržavanjem tečnosti u maloj razmeri (npr. submililitarske zapremine poput mikrolitara, nanolitara ili pikolitara). Mikrofluidni sistem može intraćelijski da daje bukvalno svaki korisni sadržaj u ćeliju. Sistem se sastoji od jednog ili više mikrofluidnih kanala sa suženjem kroz koje prolaze ćelije. Poželjno, ćelije protiču kroz mikrofluidni kanal suspendovan u tečnom medijumu koji se pokreće pritiskom kroz sistem. Kada ćelija prolazi kroz suženje, njena membrana se perturbira, što prouzrokuje privremene pukotine u membrani i dovodi do apsorpcije korisnog sadržaja koji je prisutan na okolnim podlogama. Suženje je funkcija veličine ciljne ćelije, ali poželjno istog reda ili manjeg od prečnika ćelije. Više suženja može se postaviti paralelno i/ili u nizovima. Perturbacija u ćeliji je prekid u ćeliji koji omogućava materijalu sa spoljašnjosti ćelije da se kreće u ćeliji (npr. rupa, pucanje, šupljina, otvor, pora, prelom, procep, perforacija). Perturbacije (npr. pore ili rupe) koje kreiraju ovde opisani postupci ne formiraju se zbog sklopa podjedinica proteina radi formiranja multimerne strukture pore poput one kreirane dopunjavanjem ili bakterijskim hemolizinima. Drugi načini ostvarivanja su u opsegu patentnih zahteva ovog pronalaska.

[0043] U pozivanju na FIG.1-3, mikrofluidni sistem 5 uključuje kanal 10 koji definiše cevasti lumen. Mikrofluidni kanal 10 uključuje suženje 15 koje je poželjno konfigurisano tako da samo jedna ciljna ćelija 20 može proći kroz suženje 15 u jednom trenutku. Poželjno, ćelije 20 prolaze kroz kanal 10 suspendovan u puferskom rastvoru 25 koji takođe uključuje materijale 30 davanja, iako se materijali davanja mogu dodati puferskom rastvoru 25 nakon što ćelije 20 prođu kroz suženje 15. Dok ćelija 20 prilazi i prolazi kroz suženje 15, suženje 15 primenjuje pritisak (npr. mehanička kompresija) na ćeliju 20, stiskajući ćeliju 20 (npr. prikazano kao ćelija 201). Pritisak primenjen na ćeliju pomoću suženja 15 prouzrokuje perturbacije (npr. rupe prikazane na FIG.4) u ćelijskoj membrani (npr. ćelija 202). Kada ćelija prođe kroz suženje 15, ćelija 20 počinje da apsorbuje materijal u puferskom rastvoru 25 kroz rupe, uključujući materijal 30 davanja (npr. ćelija 203). Ćelijska membrana se otkriva tokom vremena, a najmanje deo materijala 30 davanja poželjno ostaje zarobljen unutar ćelije.

[0044] Konfiguracija suženja 15 može se prilagoditi za kontrolu suženja ćelije 20, čime se kontroliše pritisak koji se primenjuje na ćeliju 20. Poželjno, suženje 15 uključuje ulazni deo 35, centralnu tačku 40 i izlazni deo 45. Na primer, prečnik(ci) suženja 15 može (mogu) se menjati radi podešavanja pritiska koji se primenjuje na ćeliju (i brzine primene/oslobađanja tog pritiska), a dužina suženja 15 može se razlikovati za podešavanje količine vremena tokom kojeg se pritisak primenjuje na ćeliju. U određenim konfiguracijama, fizičko suženje ćelije nije neophodno, ali zato veoma kratko podvrgavanje ćelije neobično velikoj brzini smicanja i/ili brzini kompresije može prouzrokovati željene perturbacije.

Generalno, ne postoje zahtevi koji se odnose na spoljašnji prečnik mikrofluidnog sistema, a odnos unutrašnjeg prečnika i spoljašnjeg prečnika se može menjati (npr. veći od 5).

[0045] Prečnik centralne tačke 40 može biti funkcija prečnika ćelije 20. Poželjno, centralna tačka 40 je istog reda kao ili manja od prečnika ćelije 20 (npr.20-99% prečnika ćelije). Poželjno, prečnik centralne tačke 40 je između 60% i 70% prečnika ćelije, iako se optimalni prečnik centralne tačke može razlikovati na osnovu primene i/ili tipa ćelije. Primerni prečnici centralne tačke 40 koji su upotrebljeni u prethodnim eksperimentima su 5-6 µm i 7-8 µm. Centralna tačka 40 takođe može biti veća od prečnika ćelije 20, ali može biti konfigurisana kako bi prouzrokovala puls pritiska (npr. smicanje) koji se primenjuje na ćeliju 20. Takav pritisak se može primeniti na ćeliju 20, a da pritom ne dodiruje zidove kanala 10. Smicanje se može izmeriti poznatim tehnikama (npr. Journal of Applied Physics 27, 1097 (1956); Murphey et al.).

[0046] Ugao suženja (npr. α na FIG.2A) ulaznog dela 35 se može razlikovati (npr. koliko brzo se prečnik smanjuje). Ugao suženja je poželjno ugao koji smanjuje zapušenje sistema 5 dok ćelije prolaze kroz njega. Ugao izlaznog dela 45 se takođe može razlikovati. Na primer, ugao izlaznog dela 45 se konfiguriše radi smanjenja verovatnoće turbulencije/vrtloga koja može rezultirati nelaminarnim protokom (npr. opseg od 1-80 stepeni). Zidovi ulaznog dela 35 i/ili izlaznog dela 45 su poželjno linearni, iako su moguće i druge konfiguracije (npr. zidovi mogu biti zakrivljeni).

[0047] Poprečni presek kanala 10, ulaznog dela 35, centralne tačke 40 i izlaznog dela 45 može se razlikovati. Na primer, različiti poprečni preseci mogu biti kružni, eliptični, u obliku izduženog proreza, kvadratni, šestougaoni, trougaoni itd. Dužina centralne tačke 40 se takođe može razlikovati, i može se podesiti da menja vremenski period u kojem se pritisak primenjuje na ćeliju 20 dok prolazi kroz suženje 15. Pri datoj brzini protoka, duže suženje 15 (npr. duža centralna tačka 40) će primeniti pritisak na ćeliju 20 tokom dužeg vremenskog perioda. Dužina kanala 10, ulaznog dela 35, centralne tačke 40 i izlaznog dela 45 može se razlikovati. Na primer, dubina se može podesiti za obezbeđivanje manjeg suženja i time se poboljšava davanje na način sličan promenama širine suženja. Širina i dužina se razlikuju između projekata uređaja i mogu se utvrditi tokom proizvodnje uređaja, na primer hromiranom maskom koja se koristi u fazi litografije (kada je uređaj na bazi silicijuma). Dubina može biti uniformna u celom kanalu i može se utvrditi tokom proizvodnje uređaja, na primer u fazi dubokog nagrizanja reaktivnim jonima. Dubina može biti, na primer, 15 µm-20 µm. Kako se ovde koristi, dimenzije uređaja se označavaju nizom brojeva koji označavaju dužinu, širinu i broj suženja (npr.30 µm - 6 µm x 5 označava uređaj sa dužinom od 30 µm, širinom od 6 µm i 5 suženja).

[0048] Brzina kojom ćelije 20 prolaze kroz kanal 10 takođe se može razlikovati radi kontrole davanja materijala 30 davanja u ćelije 20. Na primer, podešavanje brzine ćelija 20 kroz kanal 10 može promeniti vremenski period u kojem se pritisak primenjuje na ćelije, i može promeniti brzinu kojom se pritisak primenjuje na ćeliju (npr. polako ili iznenadno). Ćelije 20 prolaze kroz sistem 5 brzinom od najmanje 0,1

1

mm/s poput 0,1 mm/s do 5 m/s, a poželjno između 10 mm/s do 500 mm/s, iako su moguće druge brzine. U nekim načinima ostvarivanja, ćelije 20 mogu prolaziti kroz sistem 5 brzinom većom od 5 m/s.

[0049] Kanal 10 se može proizvesti od različitih materijala poput silicijuma, stakla, keramike, kristalnih supstrata, amorfnih supstrata i polimera (npr. polimetil metakrilat (PMMA), PDMS, ciklični olefinski kopolimer (COC), itd.). Proizvodnja se poželjno sprovodi u čistoj prostoriji, i može koristiti, na primer, suvo nagrizanje, vlažno nagrizanje, fotolitografiju, injekciono presovanje, lasersku ablaciju, SU-8 maske, itd. Jedan primerni kanal 10 je dugačak otprilike 40-50 µm, sa prečnikom ne-suženja od otprilike 50 µm, sa prečnikom suženja od otprilike 4-8 µm. Poželjno, dužina kanala 10 se održava što kraćom kako bi se izbeglo zapušenje. Moguće su druge dimenzije.

[0050] FIG.39 prikazuje drugi način ostvarivanja mikrofluidnog sistema. U ovom načinu ostvarivanja, kanal 10 uključuje preliminarni ulazni deo 50 koji ne sužava ćeliju 20. Prošireni deo 55 kanala obezbeđuje da ulazni deo 35 ima ugao suženja od 90 stepeni (npr. alfa na FIG.2A).

[0051] FIG.40 prikazuje dva grafika koji prikazuju upoređivanje vijabilnosti i efikasnosti davanja između dva primerna načina ostvarivanja. Oznaka 4000 predstavlja merenja sprovedena tokom upotrebe načina ostvarivanja u skladu sa FIG.2A, dok 4010 predstavlja merenja sprovedena tokom upotrebe načina ostvarivanja u skladu sa FIG.39. Za istu brzinu ćelije i radni pritisak, pokazalo se da način ostvarivanja na FIG.39 poseduje visoku efikasnost davanja i vijabilnost. Ovo je postignuto uprkos sličnosti brzine smicanja, brzine ćelije i vremena provedenog pod kompresijom sa načinom ostvarivanja na FIG.2A.

[0052] Više parametara može uticati na davanje materijala 30 davanja u ćeliju 20. Na primer, dimenzije suženja 15, brzine radnog protoka (npr. tranzitno vreme do suženja 15), koncentracija materijala 30 davanja u puferskom rastvoru 25, i vremenski period u kojem se ćelija 20 dobija/inkubira u puferskom rastvoru 25 nakon suženja mogu uticati na apsorpciju materijala 30 davanja u ćeliju 20. Dodatni parametri koji utiču na davanje materijala 30 u ćeliju 20 mogu uključivati brzinu ćelije 20 u suženju 15, brzinu smicanja u suženju 20, komponentu brzine koja je upravna na brzinu protoka, brzinu kompresije ćelije i vreme u suženju. Takvi parametri mogu biti projektovani za kontrolu davanja materijala 30 davanja. Kompozicija puferskog rastvora 25 (npr. koncentracija soli, sadržaj seruma, itd.) može takođe uticati na davanje materijala 30 davanja. Dok ćelija 20 prolazi kroz suženje 15, deformisanje/opterećenje indukovano suženjem 15 privremeno prouzrokuje povredu ćelije koja prouzrokuje pasivnu difuziju materijala kroz perturbaciju. U nekim načinima ostvarivanja, ćelija 20 se deformiše samo tokom kratkog vremenskog perioda, tokom 100 µs kako bi se minimizirala šansa za aktivaciju apoptotskih puteva kroz signalne mehanizme ćelije, iako su mogući drugi periodi trajanja (npr. u opsegu od nanosekundi do sati). Početna zapažanja su pokazala da apsorpcija materijala 30 davanja od strane ćelije 20 nastupa nekoliko minuta nakon što ćelija 20 prođe kroz suženje 15.

[0053] Ćelije 20 se mogu pokretati kroz kanal 10 različitim postupcima. Na primer, pritisak se može primeniti pomoću pumpe sa ulazne strane (npr. gasni cilindar ili kompresor), vakuum se može primeniti pomoću vakuum pumpe sa izlazne strane, kapilarna akcija kroz cev i/ili sistem 5 se može napajati

1

gravitacijom. Protočni sistemi na bazi razmaka se takođe mogu koristiti (npr. špric pumpa, peristaltička pumpa, ručni špric ili pipeta, klipovi, itd.). Primerne brzine protoka kroz jedan kanal 10 su reda veličine od 1 µl za nekoliko sekundi. Pored toga, puferski rastvor 25 može uključivati jedan ili više lubrikanata (pluronics ili drugi surfaktanti) koji mogu biti projektovani da smanjuju ili eliminišu zapušenje kanala 10 i poboljšaju vijabilnost.

[0054] Sistem 5 se može kontrolisati kako bi se obezbedilo da količine davanja materijala 30 davanja budu konzistentne u celokupnoj populaciji ćelija. Na primer, sistem 5 može uključivati upotrebu konvektivnog mehanizma davanja nakon suženja koji dodiruje materijal 30 davanja na propustljivoj membrani ćelije 20. Kontrolom brzine protoka sekundarnog toka, količina materijala 30 davanja obezbeđena ćeliji može se poželjno kontrolisati. Pored toga, kontrola koncentracije materijala 30 davanja u puferskom rastvoru 25 tokom dobijanja membrane može takođe poboljšati konzistentnost davanja materijala 30 davanja populaciji ćelija. Poželjno, sistem 5 radi kao čisto mehanički sistem bez primene bilo kakvih električnih polja i/ili hemijskih agenasa, iako su moguće druge konfiguracije (npr. električni i/ili optički senzori se mogu koristiti za merenje karakteristike ćelije poput fluorescentnosti). Pored toga, sistem 5 poželjno radi nezavisno od tipa materijala koji se daje. Na primer, proteini, RNK i DNK mogu se davati kroz isti sistem bez ikakvih dodatnih modifikacija.

[0055] U nekim konfiguracijama sa određenim tipovima ćelija 20, ćelije 20 mogu biti inkubirane u jednom ili više rastvora koji pomažu apsorpciju materijala davanja u unutrašnjost ćelije. Na primer, ćelije 20 mogu biti inkubirane u rastvoru depolimerizacije poput lantrunkulina A (0,1 µg/ml) tokom 1 sata pre davanja radi depolimerizacije citoskeletona aktina. Kao dodatni primer, ćelije mogu biti inkubirane u 10 µM kolhicina (Sigma) tokom 2 sata pre davanja radi depolimerizacije mikrocevaste mreže. Ovi postupci mogu pomoći u dobijanju ekspresije gena prilikom davanja DNK.

[0056] Takođe u pozivanju na FIG.5, prikazana je fotografija paralelne konfiguracije sistema 5. Sistem 5 može uključivati bilo koji broj paralelnih kanala. Poželjno, dodatni paralelni kanali se dodaju sistemu 5, a ukupni propusni kapacitet sistema 5 se može povećati. FIG.6 prikazuje fotografiju paralelne konfiguracije sistema 5 koja uključuje filtere na ulazu svakog od kanala 10. Pored toga, FIG.6 takođe prikazuje konfiguraciju suženja 15 koja uključuje ulazni deo 35 koji uključuje više faza. Takođe u pozivanju na FIG.7, prikazana je dodatna fotografija prototipa sistema 5. Kako je očigledno na FIG.7, prototip, koji uključuje inkubacioni bazenčić, ima dimenzije od otprilike 2,54 cm x 0,635 cm x 0,635 cm (1 inč x 1⁄4 inča x 1⁄4 inča). Druge konfiguracije sistema 5 takođe mogu uključivati sortere, module pre obrade/posle obrade, i/ili module senzora (npr. optičke, električne i magnetne).

[0057] Kako je detaljnije opisano u nastavku u pogledu primera, mikrofluidni sistem i povezani postupci imaju širok opseg primena. FIG.42 je ilustracija koja prikazuje više primernih područja primene. Na primer, predmet ovog pronalaska može se primeniti na regenerativnu medicinu tako da se omogući reprogramiranje ćelija i diferencijacija matičnih ćelija. Predmet ovog pronalaska može se primeniti na imunologiju, na primer za prezentaciju antigena i pojačanje/supresiju imune aktivnosti kroz davanje

1

dendritskim ćelijama, monocitima, T ćelijama, B ćelijama i drugim limfocitima. Dalje, snimanje i opažanje može imati koristi od poboljšanog davanja ciljnim ćelijama kvantnih tačaka, ugljeničnih nanocevi i antitela. Pored toga, predmet ovog pronalaska ima primenu u vakcinama protiv kancera i istraživanjima, na primer za izolaciju cirkulišućih ćelija tumora (CTC) i lečenje limfoma. Postupak takođe obezbeđuje robusnu platformu za skrining aktivne siRNK i jedinjenja malih molekula koja mogu da leče bolest ili upravljaju ponašanjem ćelija.

[0058] Ovaj koncept je uspešno demonstriran u prototipu u kojem su ćelije 20 indukovane da apsorbuju boju koja inače ne probija membranu (npr. fluorescentne boje od 3 kDA do 2 MDA molekularne mase, DNK, protein, RNK, nanocevi ili nanočestice prisutne u puferskom rastvoru 25. Za ćelije 20 se pokazalo da se dobijaju i proliferuju nakon ovog postupka, zadržavajući pritom dati materijal tokom više od 72 sata. Jedanaest različitih tipova ćelije je testirano pomoću ovog sistema, uključujući one navedene na FIG.33, čime se demonstrira da sistem obezbeđuje robusne performanse kod različitih tipova ćelija. FIG.

33 je tabela koja uključuje tipove ćelija koje predmet ovog pronalaska uspešno primenjuje. Prosečni propusni kapacitet ćelije je izmeren na redu veličine od 5.000-20.000 ćelija/sekunda, prosečna efikasnost davanja je izmerena na 96%, a vijabilnost ćelije je izmerena na 95% pomoću jednog kanala 10. Svi testovi su sprovedeni na sobnoj temperaturi. Temperatura se, međutim, može razlikovati kod nekih tehnika. Na primer, postupci se mogu sprovoditi na sobnoj temperaturi (npr.20 °C), fiziološkoj temperaturi (npr.39 °C), temperaturi višoj od fiziološke ili na smanjenoj temperaturi (npr.4 °C), ili na temperaturama između ovih primernih temperatura. Sprovođenje postupaka na smanjenoj temperaturi (tj. suštinski blizu 4 °C što se može dostići, na primer, pomoću hlađenja, ledene kade, ili drugih poznatih tehnika) dovelo je do iznenađujućeg poboljšanja efikasnosti davanja i vijabilnosti ćelije. Stoga, temperatura se može podesiti kako bi uticala na davanje kompozicije i vijabilnost ćelije.

[0059] Kako je prikazano na FIG.8A-B, povećanje brzine ćelije kroz suženje 15 može povećati procenat davanja i efikasnost davanja materijala 30 davanja. Utvrđeno je da se efikasnost davanja linearno razlikuje sa brzinom ćelije, i da je prisutan dozno zavisni odgovor.

[0060] Kako je prikazano na FIG.9, vreme inkubiranja ćelije u puferskom rastvoru 25 nakon što ćelija prođe kroz suženje 15 može imati uticaj na ukupan procenat davanja materijala 30 davanja u ćeliju 20. Primećeno je, međutim, da se nakon određenog perioda vremena inkubiranja (otprilike 2-3 minuta) procenat davanja suštinski ne menja. Na osnovu ovih podataka, smatra se da su perturbacije prouzrokovane u ćeliji 20 nakon što ona prođe kroz suženje 15 ispravljene u roku od otprilike pet minuta nakon što ćelija 20 prođe kroz suženje 15. Pored toga, i za referencu, -1 minut odgovara kontrolnoj grupi.

[0061] Kako je prikazano na FIG.10, primećeno je da prolazak ćelija 20 kroz suženje 15 više puta može imati dejstvo na ukupan procenat davanja, ali da negativno utiče na ukupnu vijabilnost ćelija 20. Za generisanje ovih podataka, ćelije su sprovedene kroz suženje 15, sakupljene i ponovo sprovedene kroz uređaj u roku od otprilike 1 minuta.

1

[0062] Primećeno je da se tokom vremenskog perioda kada su ćelije 20 perturbirane (npr. nakon prolaska kroz suženje 15) materijal iz ćelije može ekstrahovati kroz perturbacije. Stoga, utvrđeno je da, kada su ćelije 20 perturbirane, taj materijal može proticati u i iz ćelije 20. Ova karakteristika znači da se sistem 5 može koristiti kao postupak uzorkovanja intraćelijskog materijala bez liziranja ćelije.

Perturbacije u ćelijskoj membrani će poželjno rezultirati isticanjem makromolekula iz citoplazme i, stoga, mogu se koristiti za sondiranje kompozicije citoplazme.

[0063] Kako je prikazano na FIG.11, stabilne HeLa ćelije koje ekspresuju zeleni fluorescentni protein (GFP) su obrađene u prisustvu siRNK koja prigušuje GFP (Ambion, SAD) i analizirane pomoću FACS (FACS Canto II, BD Biosciences, SAD) tokom 48 sati za nokdaun fluorescentnosti. Rezultati na FIG.11 pokazuju > 40% nokdaun ekspresije gena – što je rezultat uporediv sa rezultatom komercijalnih reagenasa poput Lipofektamina 2000 (Invitrogen, SAD). Kontrole šifrovane siRNK, takođe na FIG.11, pokazuju da ovaj nokdaun nije prouzrokovan samim procesom deformisanja.

[0064] Kako je prikazano na FIG.13-14, dimenzije stiskanja mogu imati dejstvo na ukupnu efikasnost davanja materijala 30 davanja. Na primer, FIG.13-14 pokazuju da, pošto se radni pritisak razlikuje (npr. promenom dužine i/ili širine suženja 15), ukupna efikasnost davanja se donekle razlikuje (FIG.14 se odnosi na davanje kvantnih tačaka (nanočestica) u različitim uslovima). Dalje, kako je prikazano na FIG.

18A-18B, procenjene brzine ćelije mogu imati dejstvo na ukupnu vijabilnost i efikasnost davanja materijala 30 davanja. Na primer, FIG.18A pokazuje da, pošto se radna brzina razlikuje, ukupna efikasnost davanja se donekle razlikuje. Pored toga, FIG.18B pokazuje da, pošto se radna brzina razlikuje, vijabilnost ćelija se donekle može razlikovati. Ovi crteži pokazuju da promena dužine suženja može pojačati davanje, uz minimalan uticaj na vijabilnost. Pored toga, veći molekuli ulaze u ćeliju pri manjoj brzini nakon suženja u odnosu na manje molekule. Ovaj postupak intraćelijskog davanja ovde opisan je „univerzalan“ po tome što funkcioniše za mnoge različite tipove materijala i ćelija. Dalje, pukotine membrane indukovane ovim uređajem mogu obično biti najmanje -100 nm veličine, iako su moguće pukotine drugih veličina.

[0065] Kada je reč o FIG.12, u jednoj primeni, gradijent koncentracije između puferskog rastvora 25 i citozola može se kontrolisati radi predvidljive kontrole količine datog materijala. Mogu se koristiti lokalizovani postupci davanja koji izlažu ćelije 20 koncentrovanom oblaku makromolekula nakon što su ćelije 20 porisane od suženja. Bilo koji takav lokalizovani postupak davanja, međutim, treba da uzme u obzir procenjeno vreme naknadnog zaptivanja perturbacije kako bi se obezbedio pravilan rad. Ovo se može primeniti inkorporiranjem „mikrobrizgaljke“ upravne na kanal koja daje veliku koncentraciju korisnog sadržaja u blizinu ćelijske membrane (ilustrovano na Fig.6A). Poželjno, mikrobrizgaljka se može nalaziti u i/ili blizu suženja 15. Takav pristup može omogućiti suplementaciju mehanizma difuznog davanja konvektivnom komponentom, čime se omogućava preciznije punjenje ćelije većim koncentracijama. Poželjno, ubrizgavanje se odvija dok je ćelija 20 u području velike koncentracije

1

suženja 15. Lokalizovana tehnika ima dodatnu prednost konzervacije vrednih materijala davanja, pošto nije neophodno održavati veliku koncentraciju u puferu.

[0066] Kada je reč o FIG.16A, nizovi mikrostubova 100 mogu se koristiti za primenu pritiska na ćelije 20 tako da se prouzrokuje perturbacija. U ovoj primeni, ćelije 20 se sprovode kroz niz sužavajućih stubova tako da se pritisak primenjuje na ćelije 20.

[0067] Kada je reč o FIG 16B, kompresione ploče 105 se mogu koristiti za primenu pritiska na ćelije 20 tako da se prouzrokuje perturbacija. U ovoj primeni, kompresione ploče 105 se mogu kontrolisati tako da se pritisak primenjuje na ćelije 20 u unapred definisanom vremenskom periodu. Kompresione ploče 105 mogu se konfigurisati tako da se jedna ili obe ploče kreću radi primene pritiska na ćelije 20. Dodatni skupovi kompresionih ploča 105 se takođe mogu obezbediti tako da ćelije 20 u značajnoj meri budu okružene.

[0068] Kada je reč o FIG.16C, puferski aditivi 115 (ili materijali za povećanje zapremine vezani za površinu ćelije) mogu se koristiti za simulaciju stiskanja dok ćelija 20 prolazi kroz suženje 15 koje je veće od prečnika ćelije 20. Na primer, moguće je simulirano suženje zbog interferencije puferskih aditiva 115. Primeri puferskih aditiva 115 uključuju mikro ili nanočestice (npr. na bazi polimera, na bazi lipida, na bazi keramike, metalne, itd.). Ove čestice su obeležene ligandom za vezivanje ćelije poput antitela, DNK sekvence, peptida ili malog molekula, iako ovo nije obavezno.

[0069] Kada je reč o FIG.16D, perle 120 se mogu koristiti za kompresiju ćelije 20. Na primer, magnetna i/ili elektrostatička sila može se koristiti za primenu pritiska na ćeliju 20, ili u slučaju FIG.16E, za povlačenje ćelije 20. Poželjno, sila primenjena na ćeliju 20 je dovoljna da prouzrokuje perturbaciju.

[0070] Kada je reč o FIG.16F, višestruki protoci 125 fluida mogu se usmeravati tako da se prouzrokuje kompresija (ili rapidno tranzitorno smicanje) ćelije 20. Na primer, višestruki protoci 125 fluida mogu se izbaciti tako da prilaze ili dodiruju jedan drugog. Dok ćelije 20 prolaze kroz višestruke protoke 125 fluida, sila se može primeniti na ćelije 20 tako da se prouzrokuje perturbacija u membrani ćelije 20.

Alternativno, ćelije se mogu izbaciti kroz usku mlaznicu koja podseća na prorez radi olakšanog davanja.

[0071] Sistem 5 može biti samostalni sistem, poput onog prikazanog na FIG.7, iako su moguće i druge konfiguracije. Na primer, sistem 5 može biti implantiran in vivo u pacijenta za lokalno intraćelijsko davanje, i/ili može biti inkorporiran ex vivo u mašinu za obradu ćelija pre vraćanja ćelija u pacijenta.

[0072] Pored ovde opisanih prednosti davanja, mikrofluidna priroda sistema omogućava preciznu kontrolu nad uslovima davanja, predobradom i kasnijom karakterizacijom ćelija. Na primer, sistem se može primenjivati u nizovima pomoću modula fluorescentno aktiviranog ćelijskog sortiranja (FACS). Ovo može omogućiti davanje i sortiranje željenih ćelija u istom sistemu, u realnom vremenu. Različite tehnike predobrade i analize nakon sortiranja se takođe mogu upotrebiti, čime se omogućava razvoj kontinuiranih analiza visokog propusnog kapaciteta za skrining leka i dijagnostiku.

[0073] Efikasnost davanja korisnog sadržaja koji se daje ciljnim ćelijama se utvrđuje podvrgavanjem kontrolne populacije ciljnih ćelija korisnom sadržaju, kao i populacije podvrgnute obradi mikrofluidnom

2

uređaju. Kontrolni uzorak je izložen istom rastvoru davanja, u istoj koncentraciji, u najmanje istom vremenskom periodu kao ćelije koje uređaj obrađuje. Radi nadoknade za površinsko vezivanje, endocitozu i druga dejstva poput autofluorescentnosti, dati region je definisan tako da samo gornjih 1-5% živih kontrolnih ćelija spada u ovaj region. Efikasnost davanja uzorka stoga odgovara procentu živih ćelija koje se nalaze u datom regionu. Na primer, FIG.43A je histogram intenziteta iz protočne citometrije populacije kontrolnih ćelija koja je izložena kaskadno plavom konjugovanom 3 kDa dekstranu. FIG.43B je histogram intenziteta iz protočne citometrije ćelija koje su podvrgnute uređaju od 30 µm-6 µm. Definisani dati region je neosenčeni region na 43A i 43B.

[0074] Tokom rada, kada je reč o FIG.17, uz dalje pozivanje na FIG.1-3, u postupku 1000 za sprovođenje intraćelijskog davanja sistem 5 uključuje prikazane faze. Postupak 1000, međutim, je samo primeran i nije ograničavajući. Postupak 1000 se može izmeniti, npr. dodavanjem, uklanjanjem, izmenom ili reorganizacijom faza.

[0075] U fazi 1005, ćelije 20 su suspendovane u puferskom rastvoru 25 zajedno sa materijalima 30 davanja. Uobičajene koncentracije ćelije mogu biti u opsegu od 10<4>do 10<9>ćelija/ml. Koncentracija materijala davanja može biti u opsegu od 10 mg/ml do 0,1 µg/ml. Materijal davanja može se dodati u ćelijski pufer pre ili odmah nakon davanja, u zavisnosti od željene konfiguracije, budući da povrede/pore ostaju otvorene tokom 1-5 minuta. Puferovani rastvori mogu biti sačinjeni od više soli, šećera, faktora rasta, proizvoda izvedenih od životinja ili bilo koje druge komponente neophodne za pravilnu ćelijsku proliferaciju, održavanje zdravlja ćelije ili indukovanje ćelijskih signalnih puteva. Dodatni materijali se takođe mogu dodati u puferski rastvor 25. Na primer, surfaktanti (npr. pluronics) i/ili materijali za povećanje zapremine mogu se dodati u puferski rastvor 25.

[0076] U fazi 1010, puferski rastvor 25 koji uključuje ćelije 20 i materijale 30 davanja se sprovodi kroz kanal 10 sistema 5. Puferski rastvor 25 može prolaziti kroz kanal 10 pomoću gravitacije, ili mu se mogu dodati drugi postupci. Na primer, pritisak se može primeniti na puferski rastvor 25 na ulaznoj strani kanala 10 (npr. upotrebom gasnog cilindra i/ili kompresora), i/ili vakuum se može primeniti pomoću vakuumske pumpe na izlaznoj strani. Pored toga, sistemi protoka na bazi razmaka se takođe mogu koristiti.

[0077] Pošto pojedinačne ćelije 20 prolaze kroz suženje 15, pritisak se trenutno primenjuje na ćeliju 20 pomoću čvrste konstrukcije suženja 15, što prouzrokuje perturbacije poput rupa radi razvoja u ćelijskoj membrani tako da se materijali 30 davanja mogu davati u unutrašnjost ćelije 20. Količina i/ili trajanje pritiska primenjenog na ćeliju 20 može se razlikovati podešavanjem dimenzija suženja 15, brzine kojom ćelija 20 prolazi kroz suženje 15, i/ili podešavanjem oblika suženja 15. U jednoj konfiguraciji, otprilike 5.000-20.000 ćelija/sekunda prolazi kroz suženje 15, a svaka ćelija se skuplja tokom otprilike 100 µs.

[0078] Sistem 5 može uključivati jedan ili više kanala 10. Na primer, sistem 5 može uključivati 50-100 kanala 10 koji su raspoređeni u paralelnoj konfiguraciji. Upotreba paralelne konfiguracije može smanjiti posledice zapušenja koje se razvija u jednom ili više kanala 10, i može povećati ukupan propusni kapacitet sistema 5. Pored toga, sistem 5 može uključivati jedan ili više kanala u međusobnim nizovima.

[0079] U fazi 1015, nakon što ćelije 20 prolaze kroz suženje 15, ćelije mogu da se inkubiraju/dobiju sedenjem u puferskom rastvoru 25. Tokom ovog vremena, ćelije 20 će apsorbovati neke od materijala 30 davanja prisutnih u puferskom rastvoru 25 kroz perturbacije u ćelijskoj membrani. Jedan mehanizam apsorpcije je na bazi difuzije, pošto izgleda da se veći molekuli apsorbuju sporije od manjih molekula. Poželjno, ćelije 20 se ostavljaju da se inkubiraju/dobiju u puferskom rastvoru 25 tokom 2-5 minuta, iako su moguća i druga trajanja. Tokom perioda u kojem se ćelije 20 inkubiraju/dobijaju u puferskom rastvoru 25, materijal iz unutrašnjosti ćelije 20 može takođe biti oslobođen iz ćelije u puferski rastvor 25. Tokom perioda inkubacije/dobijanja, određeni uslovi se mogu kontrolisati kako bi se obezbedilo da količine davanja materijala 30 davanja budu konzistentne u populaciji ćelija. Na primer, mogu se koristiti konvektivni mehanizmi nakon suženja koji dodiruju materijal davanja na ćeliji koja se inkubira/dobija.

[0080] Opciono, u fazi 1020, nakon što su ćelije inkubirane/dobijene, ćelije se mogu isprati radi uklanjanja puferskog rastvora. Poželjno, do ispiranja dolazi nakon vremenskog perioda neophodnog za obnavljanje perturbacija, iako do ispiranja može doći u drugim vremenskim periodima kako bi se kontrolisala količina materijala 30 davanja apsorbovanih od ćelija.

Primer 1 - Davanje funkcionalnih projektovanih nanočestica

[0081] Projektovani nanomaterijali imaju ogroman potencijal kao alati za snimanje živih ćelija, terapijski molekularni agensi davanja, ili čak kao sredstva za manipulisanje živim ćelijama sa spoljašnjim sredstvima poput svetlosnih ili magnetnih polja. (Howarth, M., et al. Monovalent, reduced-size quantum dots for imaging receptors on living cells. Nature Methods 5, 397-399 (2008)). Međutim, većina ovih potencijalnih primena zahteva da se nanomaterijali daju u citozol ćelije. Većina nanočestica, poput QD-ova, treba da bude pasivizovana pomoću polimera koji čini nanočestice rastvorljivim u vodenom medijumu, a ovo ih generalno sprečava da se pasivno difunduju kroz ćelijsku membranu.

Mikroubrizgavanje nanočestica se smatra nepraktičnim zbog zahteva za specijalnom opremom i niskog propusnog kapaciteta, dok elektroporacija prouzrokuje agregaciju QD unutar ćelije. Stoga, većina pokušaja davanja QD-ova u citoplazmu ćelije se oslanja na endocitozu QD-ova od strane ćelije i izlazak iz endozoma. Pre pojave predmeta ovog pronalaska, nije bilo moguće davati QD-ove u citoplazmu ćelije na zadovoljavajući i skalabilan način. Sistem obezbeđuje rešenje za ovaj problem davanja iz prethodnih pristupa.

[0082] Mikrofluidni uređaj se kombinuje sa novom generacijom nedavno opisanih biološki kompatibilnih QD-ova. (Liu, W., et al. Compact biocompatible quantum dots via RAFT-mediated synthesis of imidazole-based random copolymer ligand. JACS 132, 472-483 (2010)). QD-ovi koji se koriste u primeru 1 su obloženi sa ligandom poliimidazola koji obuhvata više grupa imidazola za helaciju metala i više poli(etilen) glikola (PEG) za rastvaranje vode i pasivizaciju.

[0083] Za citozolno davanje QD-ova, ćelije su odmerene u PBS rastvoru koji sadrži QD. Rastvor ćelije i QD je pipetovan u mikrofluidni uređaj, a rastvor je pokrenut kroz kanale pri konstantnom pritisku, nakon čega sledi period inkubiranja od 5 min. Nakon ovog perioda inkubiranja, višak QD-ova je razdvojen centrifugiranjem. Za kontrolnu populaciju, rastvor ćelije i QD je postavljen u mikrofluidni uređaj, a ćelije su izložene QD rastvoru tokom vremenskog perioda ekvivalentnom protokolu citozolnog davanja.

[0084] FIG.19 je prikaz transmisije i konfokalnih fluorescentnih slika, nakon čega slede snimci z-profila konfokalnih fluorescentnih slika obrađenih ćelija koje se daju sa QD-ovima pomoću predmeta ovog pronalaska. FIG.19 ilustruje (gore) odmah nakon obrade (tj. davanja) i (dole) nakon inkubiranja od 48 h na 37 °C i 5% CO2. Obrazac difuznog bojenja je ograničen na citoplazmu i čini se da nanočestice ne ulaze u jezgro (tamni region unutar ćelije). Skala je 10 µm. Određeni slobodni ligand poliimidazola koji je oblagao QD-ove snimljene na FIG.19 nije iskazao nikakvu funkcionalnost osim obezbeđivanja biokompatibilnosti kroz PEG grupe. Konfokalni mikroskopski snimci pokazuju da HeLa ćelije, odvojene i zaokružene nakon protoka kroz mikrofluidni uređaj, imaju difuzno citoplazmatično QD bojenje kroz različite z-profile ćelije (FIG 19, gore). Difuzno bojenje se zadržava čak i nakon 48 sati, nakon inkubiranja i zadržavanja ćelija na 37 °C u 5% CO2(FIG.19, dole). Difuzna QD fluorescentnost je slabija na 48 sati, verovatno zbog ćelijske deobe (Fig 19). Uređaj je dao QD-ove (∼13 nm hidrodinamičkog prečnika) u ∼40% populacije živih ćelija pri propusnom kapacitetu od ∼10.000 ćelija/s. FIG.20A ilustruje efikasnost davanja u citozol HeLa ćelija po obradi od strane predmeta ovog pronalaska pomoću QD-ova obloženih sa PIL. Vijabilnost ćelija je iznosila >80% prema merenju protočnom citometrijom. FIG.20B ilustruje vijabilnost HeLa ćelija nakon davanja čistog QD535 od strane predmeta ovog pronalaska, kako je izmereno bojenjem propidijum jodidom i merenjem protočnom citometrijom. Vijabilnost obrađenih ćelija izmerena protočnom citometrijom, difuzno bojenje na konfokalnim slikama i sposobnost ćelije da se zadržava su konzistentni sa davanjem QD-ova u citoplazmu živih ćelija.

[0085] Radi potvrde da fluorescentnost zaista proističe od QD-ova koji se daju u citozol naspram QD-ova sekvestriranih u endozomima, nanočestica je projektovana da menja svoj emisioni profil nakon interakcije sa redukujućim okruženjem citozola. Potencijal redukcije unutar ćelijske citoplazme je -260 do -220 mV i prvenstveno je uslovljen održavanjem visokih koncentracija (5-10 mM) tripeptid glutationa. Stoga, merenjem fluorescentnosti QD-boja konstrukta čija emisija se menja prilikom izloženosti okruženju citozola, može se utvrditi lokalizacija i hemijska pristupačnost datih nanočestica. QD-boja je napravljena tako da se sastoji od QD-a koji emituje zeleno (λemisija = 541 nm) koji deluje kao donor energije karboksi-X-rodamin (Rox) boji (λemisija = 610 nm), konjugovano kroz reducibilnu disulfidnu vezu.

[0086] FIG.21 ilustruje projekat, apsorpciju i stabilnost konstrukta u različitim medijumima. U 2100 nalazi se šematski prikaz PIL pre konjugovanja sa bojom i oblaganja QD-ova (levo), i rezultujućeg

2

konstrukta QD-disulfid-Rox (desno) (slika nije u razmeri). U 2110 je prikazan spektar apsorpcije konstrukta QD-disulfid-boja. Ekscitacija na 488 nm i na 405 nm su obezbedile isključivu apsorpciju od strane QD-ova u eksperimentu. U 2120 je prikazana stabilnost fluorescentnog prenosa energije od QD do Rox za konstrukt na punoj podlozi za kulturu na 37 °C i 5% CO2, čime je demonstrirano da disulfidna veza nije razložena u ekstraćelijskom okruženju. Grafik 2130 ilustruje razlaganje disulfidne veze pomoću citozolnog redukujućeg agensa glutationa, kako je prikazano dobijanjem QD fluorescentnosti. U 2140, prikazano je dobijanje QD fluorescentnosti nakon obrade pomoću ne-tiolnog redukujućeg agensa tris(2-karboksietil) fosfina, uz dalju podršku razlaganja disulfidne veze.

[0087] Tiolne grupe koje su inkorporirane u PIL su formirale disulfidne veze sa tiolizovanim Rox bojama. Spektar apsorpcije prečišćenog konstrukta poseduje karakteristike apsorpcije i QD i Rox (2120) u proseku od 13 Rox boja po QD, čime se efektivno gasi QD fluorescentnost (2130). Ovaj konstrukt služi kao ireverzibilni senzor specifičnog redukujućeg okruženja u citozolu. Kada je QD selektivno ekscitovana pomoću lasera na 488 nm (mikroskopija) ili 405 nm (protočna citometrija) dok su disulfidni mostovi netaknuti, konstrukt se podvrgava fluorescentno rezonantnom energetskom transferu (FRET) tako da je dominantna Rox emisija u crvenom. U analizi rastvora, ćelijski redukujući agens glutation razlaže disulfidne mostove, oslobađajući Rox boje i omogućavajući dobijanje QD fluorescentnosti (2140).

Redukujući agens tris-(2karboksietil) fosfin na ne-tiolnoj bazi takođe omogućava dobijanje QD fluorescentnosti, što označava da se oslobađanje Rox sa QD površine ne odvija preko PIL pomeranja pomoću glutationa (2140). Rox fluorescentnost ne može u potpunosti nestati zbog toga što su neki od disulfidnih mostova sterično ometeni dugačkim PEG grupama na PIL, i zbog određene manje količine nespecifične interakcije između boje i QD površine.

[0088] Promene fluorescentnog profila konstrukta, izmerene protočnom citometrijom i konfokalnom mikroskopijom, potvrđuju davanje QD-disulfid-Rox konstrukata ćelijskoj citoplazmi. Prilikom izloženosti redukujućem citozolnom okruženju, razlaganje disulfidnih veza ometa FRET postupak od QD do boje. Stoga, nakon isključive ekscitacije QD-a, fluorescentnost QD kanala se povećava, dok se fluorescentnost Rox kanala smanjuje sa vremenom. Žive HeLa ćelije su obrađene pomoću mikrofluidnog uređaja u rastvoru sa visokom koncentracijom QD-disulfid-Rox, inkubiranom tokom 5 minuta, i isprane radi uklanjanja viška QD-ova pre dodavanja podloge za ćelijsku kulturu (tj. obrađene ćelije). Kontrolne ćelije su inkubirane sa QD-disulfid-Rox tokom 5 minuta umesto obrade mikrofluidnim uređajem i isprane pre postavljanja u podlogu za ćelijsku kulturu. Fluorescentnost Rox i QD kanala ovih obrađenih i kontrolnih ćelija su primećene konfokalnom mikroskopijom i protočnom citometrijom.

[0089] FIG.22A i 22B ilustruju konfokalne mikroskopske slike živih ćelija i analizu intenziteta fluorescentnosti, čime se demonstrira citoplazmatično bojenje i hemijska pristupačnost QD površine. FIG.22A ilustruje slike obrađenih ćelija (gore) i kontrolnih ćelija (dole). Izgled difuzne zelene fluorescentnosti je prisutan samo u obrađenim ćelijama. Skala je 10 µm. FIG.22B ilustruje promenu intenziteta u funkciji vremena u zelenim i crvenim kanalima. Zbog toga što je n < 20 u svakoj vremenskoj tački, fluktuacije ukupne prosečne fluorescentnosti su ispravljene normalizacijom na vremensku tačku od 0 h.

[0090] Pod konfokalnim mikroskopom, difuzna fluorecentnost koja se pojavljuje u citoplazmi obrađenih ćelija napreduje od izrazito crvene do izrazito zelene (kako je prikazano na FIG.22A). Slike kontrolnih ćelija prikazuju određeno nespecifično vezivanje na spoljašnjoj membrani kako je demonstrirano fluorescentnošću u obliku prstena, i nije prisutno povećanje u signalima zelenih kanala. Ova dejstva su konzistentna sa očekivanim razlaganjem citozolnih disulfidnih veza koje smanjuju dejstvo FRET. Na FIG.

22B, linijski grafik prikazuje prosečni intenzitet QD i Rox kanala po ćeliji nakon ispravljanja razlika u datom fluorescentnom materijalu od ćelije do ćelije normalizacijom za ukupnu fluorescentnost, za obrađene i kontrolne ćelije i autofluorescentnost. Za obrađene ćelije, grafik prikazuje prelaz između 2-4 sata inkubiranja gde QD fluorescentnost nadmašuje Rox fluorescentnost. Interesantno je da je utvrđeno da se Rox signal obrađenih ćelija stabilizuje iznad nivoa autofluorescentnosti nakon 9 sati. Ovo je konzistentno sa rezultatima iz analiza rastvora, gde su neki FRET ostali nakon smanjenja. Primećeno difuzno bojenje i povećanje QD signala i smanjenje Rox signala izrazito podržavaju citozolno davanje i kasnije razlaganje disulfidne veze. Čini se da se QD fluorescentnost u kontrolnim ćelijama, ugašena od strane FRET do Rox, ne razlikuje od autofluorescentnosti. Kontrolne ćelije prikazuju određenu Rox fluorescentnost iznad autofluorescentnosti u ranijim vremenskim tačkama, koja se zatim stabilno smanjuje. Ovo se može pripisati nespecifičnim interakcijama između QD-S-S-Rox i površine ćelije, nakon čega sledi ponovna solvatacija konstrukata u medijumu.

[0091] FIG.23 ilustruje merenja protočne citometrije prosečne fluorescentnosti i vijabilnosti ćelije. U 2300 prikazana je prosečna fluorescentnost QD-a (levo) i Rox (desno) po ćeliji, što pokazuje povećanje QD fluorescentnosti samo u obrađenim ćelijama. Rox fluorescentnost u obrađenim i kontrolnim ćelijama je na nivoima autofluorescentnosti do vremenske tačke od 24 h. U 2310 prikazan je histogram distribucije intenziteta fluorescentnosti među obrađenim i kontrolnim ćelijama u odabranim vremenskim tačkama, u QD kanalu (levo) i Rox kanalu (desno). Procenjeno je da je do davanja QD-a došlo u najmanje 35% populacije ćelija. Siva područja su predviđena da usmeravaju oko prilikom kretanja vrhova histograma intenziteta fluorescentnosti. U 2320 ilustrovana je vijabilnost kontrolnih i obrađenih ćelija izmerena propidijum jodidom.

[0092] Merenja protočnom citometrijom ilustrovana na FIG.23 potvrđuju da QD-disulfid-Rox konstrukti mogu biti u interakciji sa citozolnim okruženjem. Merenja protočnom citometrijom su zabeležena na svim živim ćelijama, što obuhvata i date ćelije (∼35% populacije obrađenih ćelija) i ćelije koje nisu date. U 2100 ilustrovana je prosečna fluorescentnost po ćeliji obrađenih i kontrolnih populacija. Prosečna QD fluorescentnost je u početku veća za obrađene ćelije, uz dostizanje vrha na ∼9 sati i postepeno opadanje nakon toga, za razliku od QD fluorescentnosti populacije kontrolnih ćelija, koja ostaje uporediva sa nivoima autofluorescentnosti. Ovo je konzistentno sa citozolnim smanjenjem disulfidnih mostova između QD-a i boje unutar obrađenih ćelija, nakon čega sledi razblaživanje fluorescentnih

2

konstrukata ćelijskom deobom. Rox fluorescentnost za obrađene i kontrolne ćelije počinje visoko i opada tokom prva 2 sata. Ovo opadanje se pripisuje ponovnoj solvataciji u medijum čestica koje su postale vezane za površinu ćelije tokom inkubiranja. Prosečna Rox fluorescentnost u populaciji obrađenih ćelija izgleda slično kontrolnim ćelijama zbog prisustva ćelija koje nisu date u populaciji obrađenih ćelija. Prisustvo datih ćelija i ćelija koje nisu date u populaciji obrađenih ćelija može se razlikovati u histogramima QD i Rox intenziteta prikazanim u 2310. Sa povećanim vremenom, histogrami fluorescentnosti postaju bimodalni za obrađene ćelije, ali ostaju unimodalni za kontrolne ćelije. QD fluorescentnost raste sa vremenom u podskupu populacije obrađenih ćelija (2100), čime se dalje podržava pukotina FRET procesa u citozolu obrađenih i datih ćelija. Rox fluorescentnost se generalno smanjuje pošto se konstrukti vezani za membranu ponovo solvatuju u medijumu, ali podskup populacije obrađenih ćelija zadržava Rox fluorescentnost. Ovo je konzistentno sa nepotpunim smanjenjem QD-S-S-Rox veza primećenih u konfokalnoj mikroskopiji. Vijabilnost populacije obrađenih ćelija, izmerena bojenjem propidijum jodidom, je u okviru 10% kontrolne populacije u svim vremenskim tačkama (2130). Vijabilnost ćelija od > 90% u odnosu na kontrolnu grupu je povoljna u odnosu na alternativne postupke poput elektroporacije i postupaka na bazi polimera, koji su prineli niske vijabilnosti nakon obrade niske u opsegu od 40 - 60%.

[0093] FIG.24 ilustruje epifluorescentno snimanje neagregiranih QD-ova u citozolu ćelije nakon obrade uređajem pomoću 10 nM QD rastvora (gore), i trepćuće tragove tri QD obeležene sa 2400, 2410 i 2420 pomoću autofluorescentnosti. Izgleda da su trepćući tragovi QD nebinarni zbog dugačkog vremena akvizicije (500 ms). Skale su 10 µm.

[0094] Platforma za davanje QD je takođe omogućila snimanje jednog molekula davanjem neagregiranih QD-disulfid-Rox konstrukata, pošto je primećena naizmeničnost emisije konzistentna sa QD-ovima. Za ovaj eksperiment, QD-disulfid-Rox konstrukti su dati u citozol, nakon čega je usledilo inkubiranje od 10 sati i snimanje na epifluorescentnom mikroskopu. Inkubacija od 10 sati je obezbedila da je QD fluorescentnost iz unutrašnjosti citozola dobijena preko redukcije disulfidne veze; epifluorescentna mikroskopija je upotrebljena kako bi se obezbedilo da je sakupljeno dovoljno fotona. Nekoliko trepćućih QD-ova je primećeno kada su ćelije obrađene pomoću predmeta ovog pronalaska na niskim QD koncentracijama (FIG.24). Izgleda da su tragovi intenziteta trepćućih QD-ova u citozolu, prikazani u 2400, 2410 i 2420, nebinarni usled dugačkog vremena akvizicije (500 ms). Translaciona kretanja ćelije su smatrana minimalnim tokom vremenskog okvira akvizicije (∼1 min). Ovi podaci demonstriraju mogućnost primećivanja događaja u vezi sa jednim molekulom unutar citozola ćelije davanjem QD-ova kao fluorescentnih oznaka pomoću predmeta ovog pronalaska.

[0095] Primer 1 demonstrira davanje nanočestice u citozol ćelije prema načinu ostvarivanja predmeta ovog pronalaska. Posmatranjem razlaganja QD-disulfid-Rox citozolnih reduktanata pokazalo se da površina nanočestice stupa u interakciju sa citozolnim komponentama. Načini ostvarivanja predmeta ovog pronalaska omogućavaju davanje QD-ova u citoplazmu ćelije visokog propusnog kapaciteta bez

2

prodiranja bilo koje ćelije ili izlaženja endozoma iz liganda, uz istovremenu konzervaciju vijabilnosti ćelije i celovitosti QD. Efikasnost davanja od 35% može se dalje povećavati povećanjem broja mikrofluidnih suženja, izmenom dimenzija suženja ili povećanjem broja ciklusa obrade. Za razliku od većine trenutnih postupaka prodiranja ćelije u peptid ili davanja pomoću pozitivnog naelektrisanja, predmet ovog pronalaska ne zahteva dualno konjugovanje sredstva intraćelijskog davanja i sredstva citozolnog ciljanja proteina na istoj nanočestici. Odbacivanjem potrebe za prvopomenutim, ublažavanje zabrinutosti zbog unakrsne reaktivnosti, nejednake efikasnosti reaktivnosti konjugacionih strategija i konjugaciona stehiometrija se mogu ostvariti. Stoga, postiže se značajna fleksibilnost projekta QD konstrukta, čime se utire put za intraćelijsko obeležavanje i praćenje proteina. Postupci su korisni za davanje mnogih fluorescentnih nanomaterijala sa kompleksnim projektima koji ciljaju intraćelijske proteine i organele dokazanim strategijama ciljanja proteina poput, ali bez ograničavanja na tagovanje streptavidin-biotina, HaloTag-hloroalkana i sortaze.

[0096] U primeru 1, sve hemikalije su dobijene od Sigma Aldrich i upotrebljene kako su primljene, osim ako je drugačije naznačeno. Materijali osetljivi na vazduh sačuvani su u Omni-Lab VAC boksu za rukavice u atmosferi suvog azota sa nivoima kiseonika < 0,2 ppm. Svi rastvori su bili spektroskopski ili reagensi. Aromatična jedinjenja nosioci prstena su vizualizovana na TLC pomoću ručne UV lampe i KMnO4.

Jedinjenja nosioci amina su vizualizovana na TLC pomoću Ninhydrin boje. Hromatografija na koloni je sprovedena na Teledyne Isco Combi Flash Companion. HeLa ćelije su nabavljene od ATCC, a svi materijali ćelijskog medijuma su nabavljeni od Mediatech, osim ako je drugačije naznačeno.

[0097] U primeru 1, 1H NMR spektri su zabeleženi na Bruker DRX 401 NMR spektrometru. MS-ESI je sprovedeno na Bruker Daltonics APEXIV 4.7 FT-ICR-MS mašini. Spektri UV-Vis apsorpcije su uzeti pomoću HP 8453 spektrofotometra analize rada diode. Spektri fotoluminescentnosti i apsorpcije su zabeleženi pomoću BioTek Synergy 4 čitača mikroploče. Molekularne mase polimera su utvrđene u DMF rastvoru na Agilent 1100 nizovima HPLC/GPC sistema sa tri PLgel kolone (103, 104, 105 Å) u nizovima nasuprot uskih polistirenskih standarda. Derivati boje su prečišćeni upotrebom Varian ProStar Prep HPLC sistema. Modifikovani polimer je prečišćen pomoću GE Healthcare PD-10 kolona popunjenih SephadexTM G-25M. Ligandom razmenjeni QD-ovi su prečišćeni dijalizom centrifugiranja pomoću Millipore Amicon Ultra 30K prekidnih centrifugalnih filtera i pomoću GFC na AKTAprime Plus hromatografskom sistemu (Amersham Biosciences) opremljenom samostalno upakovanom Superdex 20010/100 staklenom kolonom. Merenja protočne citometrije su sprovedena na LSR Fortessa (BD Biosciences).

[0098] U primeru 1, CdSe jezgra sa prvim vrhom apsorpcije od 478 nm su sintetizovana pomoću prethodno navedenog postupka (1). Ukratko, 0,4 mmol (54,1 mg) od CdO, 0,8 mmol (0,2232 g) od TDPA, 9,6 mmol (3,72 g) od TOPO je stavljeno u flask sa okruglim dnom od 25 mL. Rastvor je degaziran tokom 1 sata na 160 °C i zagrejan na 300 °C u argonu dok se CdO nije rastvorio i formirao čist homogen rastvor. Nakon ovoga usledilo je postavljanje rastvora pod vakuum na 160 °C radi uklanjanja oslobođene vode.

2

Rastvor je ponovo zagrejan na 360 °C u argonu, a TOP-Se rastvor (1,5 mL od 1,5 M TOP-Se u 1,5 mL od TOP) je rapidno dodat kako bi se dobila CdSe jezgra sa prvom karakteristikom apsorpcije na 478 nm.

[0099] CdS omotači su odloženi na CdSe jezgrima modifikacijom prethodno navedenih postupaka (2). Jezgra izolovana ponovljenim precipitacijama od heksana sa acetonom su dovedena do 180 °C u kompoziciji rastvarača oleilamina (3 mL) i oktadecena (6 mL). Prekursorski rastvori Cd i S su zatim uvedeni kontinuirano brzinom od 4 mL/hr. Cd prekursor se sastojao od 0,33 mmol Cd-oleata i 0,66 mmol oleilamina u kompoziciji rastvarača oktadecena (1,5 mL) i TOP (3 mL). S prekursor se sastojao od 0,3 mmol heksametildisilatiana [(TMS)2S] u 6 mL TOP. Dodavanje ukupno 3 monosloja od Cd i S je prinelo QD-ove sa emisijom na 541 nm i kvantnim prinosom od 60% prilikom razblaživanja u oktanu. Koeficijent ekstinkcije CdSe(CdS) je izračunat upotrebom koeficijenta ekstinkcije CdSe jezgara iz literature (3) i uz pretpostavku da je 95% od CdSe jezgara zadržano tokom faze oblaganja.

[0100] U primeru 1, silicijumski čip je proizveden pomoću tehnike fotolitografije i dubokog nagrizanja reaktivnim jonima. Rezultujuća nagrizena silicijumska ploča je očišćena (sa H2O2 i H2SO4) radi uklanjanja ostataka, oksidizovana radi proizvodnje staklene površine i povezana sa Pyrex pločom pre postavljanja u pojedinačno zapakovanim uređajima. Svaki uređaj je zatim pojedinačno pregledan radi provere nedostataka pre upotrebe.

Primer 2 - Davanje makromolekula

[0101] Intraćelijsko davanje makromolekula je ključna faza u terapijskim i istraživačkim primenama. Davanje RNK i DNK posredstvom nanočestice, na primer, je korisno za gensku terapiju, dok se davanje proteina koristi za uticaj na ćelijsku funkciju u kliničkom i laboratorijskom okruženju. Drugi materijali, poput malih molekula, kvantnih tačaka ili zlatnih nanočestica se daju u citozol u različite svrhe od terapije kancera do intraćelijskog obeležavanja i praćenja jednog molekula.

[0102] Za demonstraciju univerzalnosti tehnike, modeli molekula dekstrana su dati u više tipova ćelija: DC2.4 dendritske ćelije, fibroblastovi prepucijuma novorođene bebe (NuFF) i mišje embrionske matične ćelije (mESC) su ostvarile efikasnost davanja do 55%, 65% i 30% respektivno. Početni eksperimenti su takođe pokazali uspešno davanje u primarne limfocite, makrofage i dendritske ćelije izvedene od miševa. Dalje, tehnika nije prouzrokovala ekscesivnu citotoksičnost ili indukovala diferencijaciju matičnih ćelija. Zaista, svi tipovi ćelija su iskazali vijabilnost od preko 60% čak i pri najvećim testiranim brzinama. Projekat i uslovi rada uređaja nisu prethodno optimizovani za bilo koji od prethodnih tipova ćelija.

[0103] FIG.25 ilustruje eksperimentalne rezultate koji pokazuju da učinak davanja zavisi od brzine ćelije i projekta suženja. Dimenzije suženja su označene brojevima (npr.10 µm -6 µm x 5) tako da prvi broj odgovara dužini suženja, drugi širini suženja, a treći (ako ga ima) broju suženja u nizu po kanalu. U 2500, prikazana je efikasnost davanja, a u 2510 vijabilnost ćelije 18 sati nakon obrade (izmereno protočnom

2

citometrijom) je prikazana u funkciji brzine ćelije za projekte uređaja 40 µm - 6 µm (○), 20 µm - 6 µm (□) i 10 µm - 6 µm x 5 (Δ). U 2520, prikazana je efikasnost davanja, a u 2530 vijabilnost ćelije (izmereno protočnom citometrijom) je prikazana u funkciji brzine u primarnim ljudskim fibroblastovima (□), DC2.4 dendritskim ćelijama (○) i mišjim embrionskim matičnim ćelijama (mESC) (△) obrađenim pomoću uređaja 30 µm - 6 µm. Ljudski fibroblast i dendritske ćelije su analizirane 18 sati nakon davanja. MESC-ovi su analizirani 1 sat nakon davanja. Sve tačke podataka su sprovedene u triplikatima, a trake sa greškama predstavljaju dve standardne devijacije.

[0104] FIG.26 ilustruje skenove 2600 različitih horizontalnih ravni HeLa ćelije nakon davanja pacifik plavog konjugovanog 3 kDa dekstrana, izmereno konfokalnom mikroskopijom. Skenovi očitavaju podatke odozgo na dole, zatim sleva na desno gde je gornje levo na z = 6,98 µm, a donje desno na z = -6,7 µm. Skala je na 6 µm. U 2610, prikazana je efikasnost davanja živih ćelija uređaja 10 µm - 6 µm (□), 20 µm - 6 µm (○), 30 µm - 6 µm (△) i 40 µm - 6 µm (◇). Vremenska osa označava količinu vremena proteklog od početne obrade ćelija pre nego što su izložene ciljnom rastvoru davanja. Svi rezultati su izmereni protočnom citometrijom 18 sati nakon obrade. U 2620, prikazan je prosečan intenzitet populacije datih ćelija normalizovanih od strane neobrađenih ćelija radi kontrole za autofluorescentnost. Fluoresceinom konjugovani 70 kDa dekstran (horizontalne linije) i pacifik plavim konjugovani 3 kDa dekstran (dijagonalne linije) se daju u ćeliju (ciklusi 1 i 3) i uklanjaju iz ćelije (ciklus 2) u uzastopnim ciklusima obrade. Kontrolne ćelije predstavljaju ćelije koje su izložene samo rastvoru davanja, a nisu obrađene od strane uređaja. Sve tačke podataka su sprovedene u triplikatima, a trake sa greškama predstavljaju dve standardne devijacije.

[0105] Pošto prethodne tehnike davanja na bazi nanočestice i peptida koji prodire u ćeliju (CPP) koriste endocitotske puteve, izloženi su dokazi koji isključuju uticaj endocitoze u mehanizmu davanja pomoću predmeta ovog pronalaska. FIG.26 ilustruje u 2600 konfokalnu mikroskopiju ćelija obrađenih sa pacifik plavim konjugovanim 3 kDa dekstranom koja demonstrira difuzno citozolno bojenje nasuprot karakteristici punktata koja bi se očekivala od endocitotskih postupaka. Dalje, kada se eksperimenti davanja sprovode na 4 °C, temperaturi na kojoj je endocitoza minimizirana, na efikasnost davanja temperatura minimalno utiče za oba test materijala korisnog sadržaja, 3 kDa i 70 kDa dekstran. Ovi podaci pokazuju da endocitoza verovatno neće biti zaslužna za davanje u ovom sistemu.

[0106] Karakterisana je kinetika davanja tokom vremena. Ćelije su obrađene pomoću predmeta ovog pronalaska u odsustvu materijala davanja i kasnije su izložene pacifik plavim obeleženom 3 kDa dekstranu u definisanom vremenskom intervalu nakon obrade. U ovom pristupu, dok ćelije prolaze kroz suženje, njihova membrana je pokidana; međutim, ne javlja se nikakvo merljivo davanje dok se ne izlože obeleženom dekstranu. Stoga, efikasnost davanja u svakoj vremenskoj tački će odražavati udeo ćelija koje su ostale porozne u tom vremenskom periodu nakon obrade. Ovaj postupak obuhvata kinetiku formiranja/zatvaranja pora. Rezultati pokazuju da se gotovo 90% davanja odvija tokom prvog minuta nakon obrade bez obzira na projekat uređaja (2610). Primećena vremenska skala podržava hipotezu o

2

formiranju pora, pošto su prethodni radovi o kinetici obnove membrane naveli da je do zaptivanja membrane došlo oko 30 sekundi nakon indukovanja povrede. Nasuprot tome, preporučena vremenska skala za endocitotske postupke poput mehanizama davanja posredstvom nanočestice i CPP je u opsegu od nekoliko sati.

[0107] Pošto je davanje materijala kroz pore membrane difuzivno, materijal se može izmenjivati unutar i izvan ćelije tokom životnog veka pore. Endocitotski ili konvektivni mehanizmi, sa druge strane, moraju biti jednosmerni, tj. samo olakšavaju transport materijala u ćeliju. Za demonstraciju dvosmernog transporta materijala u ćelijsku membranu sproveden je eksperiment koji se sastoji od 3 ciklusa davanja. U prvom ciklusu, ćelije su obrađene u prisustvu 3 kDa i 70 kDa dekstrana, inkubirane tokom 5 min u rastvoru dekstrana i isprane dvaput pomoću PBS. Jedna trećina uzorka je zadržana i zasejana za naknadnu analizu. U drugom ciklusu, preostale isprane ćelije su ponovo obrađene od strane uređaja, ali u odsustvu bilo kog materijala davanja i inkubirane tokom još 5 min. Polovina ovog uzorka je zasejana za naknadnu analizu. U trećem ciklusu, preostale ćelije iz drugog ciklusa su provučene kroz uređaj pod istim uslovima kao u prvom ciklusu (tj. u prisustvu dekstrana), inkubirane tokom 5 minuta i isprane dvaput u PBS. Ćelije su analizirane protočnom citometrijom 18 sati nakon eksperimenta. Izmene u intenzitetu normalizovane fluorescentnosti demonstriraju neto difuziju dekstrana unutar ćelija tokom prvog ciklusa, izvan ćelija drugog ciklusa, i ponovo unutar ćelija tokom trećeg ciklusa (2620). Ovi rezultati su stoga konzistentni sa difuzivnim mehanizmom davanja.

[0108] FIG.27 ilustruje pojednostavljen, 2D difuzni model razvijen u softverskom paketu poznatom kao COMSOL Multiphysics koji simulira pasivnu difuziju materijala u ćeliju u porisanoj membrani. COMSOL Multiphysics je softver / FEA softverski paket za analizu konačnih elemenata, rešavanje problema i simulaciju razvijen od strane COMSOL za različite primene u oblasti fizike i inženjeringa, naročito za spojene fenomene, ili multifiziku. U 2700, prikazano je davanje/gubitak materijala u funkciji difuzivnosti membrane. Rezultati simulacije pokazuju procenat materijala koji je dat/izgubljen iz ćelije u funkciji difuzivnosti membrane kada je materijal od interesa u puferu (□) ili u ćeliji (○) u trenutku poracije. U 2710 prikazan je grafički prikaz simuliranog sistema i gradijent koncentracije koji se formira u membrani ako se materijal daje iz pufera u ćeliju.

[0109] Upotrebom vrednosti iz literature za difuzivnosti čestice unutar i izvan citoplazme ćelije, eksperimentalni rezultati iz FIG.26 su kvalitativno rekreirani sa difuzijom kao jedinim načinom masenog prenosa. Dalje, prilagođavanjem eksperimentalnih podataka ovom modelu, ova tehnika daje 10-40% materijala davanja u puferu u citozol ćelije. Poređenja radi, procenjuje se da postupci za davanje proteina na bazi CPP daju samo 0,1% puferskog materijala u citozol.

[0110] Veličina čestice (ili hidrodinamički poluprečnik) utiče na njenu difuzivnost i njenu sposobnost da ulazi u pore membrane određene veličine. Stoga, ovaj parametar utiče na efikasnost davanja u mehanizmu formiranja/difuzije pora. U nizu eksperimenata, dati su test korisni sadržaji od 3 kDa, 10 kDa, 70 kDa, 500 kDa i 2 MDa fluoresceinom ili pacifik plavim konjugovanog dekstrana. Fluoresceinom obeleženi plazmidi procenjeni na 3,1 MDa su takođe dati. Ovi model molekuli su odabrani na osnovu njihove sličnosti u pogledu molekularne mase sa materijalima davanja od interesa.3 kDa - 10 kDa dekstran, na primer, su slične veličine kao i neki kratki peptidi ili siRNK, dok je opseg 70 kDa - 2 MDa iste veličine kao većina proteina i neke male nanočestice.

[0111] FIG.28 ilustruje rezultate dvostepenog davanja materijala. U 2800, prikazana je efikasnost davanja živih ćelija, u funkciji vremena, za HeLa ćelije obrađene sa pacifik plavim konjugovanim 3 kDa (□), fluoresceinom konjugovanim 70 kDa (○) i 2 MDa (A) dekstranom. Ovaj eksperiment je sproveden pomoću 10 µm - 6 µm x 5 čipa. Sve tačke podataka su sprovedene u triplikatima, a trake sa greškama predstavljaju dve standardne devijacije.2810 i 2820 ilustruju histogramske prikaze podataka protočne citometrije za HeLa ćelije koje su neobrađene (crveno), obrađene na 700 mm/s (zeleno), obrađene na 500 mm/s (narandžasto), obrađene na 300 mm/s (svetlo plavo) ili samo izložene materijalu davanja (kontrolno, tamno plavo). Materijal davanja se sastojao od pacifik plavim konjugovanog 3 kDa dekstrana (2810) i fluoresceinom konjugovanog 70 kDa dekstrana (2820).

[0112] Eksperimenti su pokazali da molekuli veći od 70 kDa imaju drugačiji profil davanja u odnosu na 3 kDa dekstran (2800). Uređaj je proizveo dvostepeno davanje kada je 10 µm - 6 µm x 5 uređaj radio na 500 mm/s, što, na primer, omogućava da preko 90% živih ćelija prima 3 kDa molekule, dok oko 50% prima veće 70 kDa i 2 MDa molekule.

[0113] Histogrami koji odgovaraju ovim podacima protočne citometrije označavaju da davanje 3kDa dekstrana proizvodi dva istaknuta vrha (2810). U prvoj podpopulaciji, ćelije iskazuju blage nivoe davanja kako je primećeno promenom vrha u odnosu na kontrolne ćelije (kontrolne ćelije predstavljaju endocitozu i površinsko vezivanje kako je ranije opisano za tačke podataka na 0 mm/s) sa povećanjem prosečnog intenziteta fluorescentnosti od 2-6x. U drugoj populaciji, ćelije iskazuju poboljšane nivoe davanja koji odgovaraju povećanju prosečnog intenziteta fluorescentnosti od 20-100x u odnosu na kontrolne ćelije. Ovo dejstvo može označavati da je potonja podpopulacija ćelija ozbiljnije porisana od prethodno pomenute, čime je omogućeno povećanje influksa materijala od gotovo 10x. Zaista, kao što je ilustrovano krivama od 300 mm/s, 500 mm/s i 700 mm/s, čini se da povećanje ozbiljnosti obrade povećanjem radnih brzina povećava proporciju ćelija sa pojačanim davanjem. Slična karakteristika se primećuje za davanje većih molekula 70 kDa dekstrana (2820). Ovo dejstvo je manje izraženo, međutim, pošto dejstva difuzivnosti donje čestice i mogućeg isključenja veličine smanjuju ukupnu datu količinu. Populacija blagog davanja (prvi vrh) pokazuje povećanje od samo 1,5-2x prosečnog intenziteta fluorescentnosti u poređenju sa povećanjem od 2-6x puta primećenim u slučaju 3 kDa. Ovo dejstvo može se pripisati neskladu u podacima davanja u 2800, pošto u slučaju većih molekula populaciju blagog davanja može biti teško razlikovati od kontrolnih ćelija na osnovu trenutne definicije davanja. Kao rezultat toga, za veće molekule, poput 70 kDa i 2 MDa dekstrana, uglavnom se meri druga populacija pojačanog davanja.

1

[0114] Radi provere da li je materijal dat rapidnim mehaničkim deformisanjem aktivan i biološki dostupan u citozolu ćelije, sproveden je niz eksperimenata sa davanjem test korisnog sadržaja GFP koji prigušava siRNK (Ambion, SAD) HeLa ćelijama koje ekspresuju destabilizovan GFP. Primećen je dozno zavisni i sekventno specifični GFP nokdaun (do 80%) na 18 sati nakon obrade. Odgovor nokdauna gena na brzinu ćelije i projekat uređaja je bio konzistentan sa eksperimentima davanja dekstrana tako da su veće brzine i višestruki projekti suženja prineli veći nokdaun gena. Lipofektamin 2000 je upotrebljen kao pozitivna kontrola u ovim eksperimentima. Projekat uređaja i radni parametri nisu optimizovani za davanje siRNK pre sprovođenja ovih eksperimenata.

[0115] FIG.29 ilustruje podatke koji se odnose na davanje SiRNK, proteina i nanočestice. U 2900, nokdaun gena je ilustrovan u funkciji tipa uređaja i brzine ćelije, u destabilizovanom GFP koji ekspresuje HeLa ćelije 18 sati nakon davanja anti-eGFP siRNK pomoću 10 µm - 6 µm x 5 čipa u koncentraciji davanja od 5 µM. Lipofektamin 2000 je upotrebljen kao pozitivna kontrola. U 2910, prikazana je efikasnost davanja fluoresceinom obeleženog 70 kDa i pacifik plavim obeleženog 3 kDa dekstrana rapidnim mehaničkim deformisanjem i elektroporacijom. Svaki tip dekstrana je bio u koncentraciji od 0,1 mg/ml u rastvoru davanja. U 2920, prikazana je efikasnost davanja fluoresceinom obeleženog albumina goveđeg seruma (○), efikasnost davanja pacifik plavim konjugovanog 3 kDa dekstrana (□) i vijabilnost ćelije (Δ) u funkciji brzine, pomoću 30 µm - 6 µm uređaja. U 2930, prikazani su fluorescentni mikrografi HeLa ćelija odmah nakon davanja antitela u tubulin pomoću taga Alexa Fluor 488. Skale su na 5 µm. U 2940 i 2950 prikazane su slike skenirajuće tunelske mikroskopije (TEM) zlatnih nanočestica (neke su označene strelicama) u ćelijama fiksiranim ∼1s nakon obrade pomoću 10 µm - 6 µm x 5 uređaja. Skale su na 500 nm. Sve tačke podataka su sprovedene u triplikatima, a trake sa greškama predstavljaju dve standardne devijacije.

[0116] U daljim eksperimentima, potencijal citozolnog davanja je istražen za prethodno izazovne primene, poput davanja proteina i nanočestice. Radi poređenja učinka predmeta ovog pronalaska sa komercijalno dostupnim postupcima, 3 kDa i 70 kDa dekstran su dati, kao model proteina, u ljudske fibroblastove pomoću predmeta ovog pronalaska i Neon sistema za elektroporaciju (Invitrogen).

Rezultati pokazuju da rapidno mehaničko deformisanje obezbeđuje 7-struko ili veće povećanje efikasnosti davanja za takve makromolekule (2910). Za translaciju postupka u davanje proteina, uređaj prečnika kanala 30 µm - 6 µm je upotrebljen za davanje fluoresceinom obeleženog albumina goveđeg seruma (BSA) HeLa ćelijama sa efikasnošću do 44%, uz održavanje vijabilnosti iznad 90% (2920). Alexa Fluor 488 obeležena antitela u tubulin (BioLegend) su takođe data HeLa ćelijama nakon obrade pomoću 30µm-6µm uređaja upotrebom koncentracije antitela od 0,25 mg/ml (2930). Difuzno bojenje pokazuje da materijal nije zarobljen u endozomima i stoga je takođe uspešno dat upotrebom ove tehnike.

[0117] Za davanje nanočestice, TEM slike ćelija fiksiranih ∼1 s nakon deformisanja (2940 i 2950) pokazuju davanje PEG1000 obloženih zlatnih nanočestica od 15 nm. Izgleda da su zlatne nanočestice uglavnom neagregirane i nisu vidljivo sekvestrirane u endozome. Na ovim slikama, primećeni su dokazi

2

za različite nedostatke u citoplazmi ćelije zaslužni za davanje. Demonstriran je visoki propusni kapacitet, ne-citotoksično davanje kvantnih tačaka direktno u citozol ćelije – cilj koji su prethodne tehnike želele da ostvare. U ovim eksperimentima, kvantne tačke sa Rox bojom vezane za njihovu površinu su date rapidnim mehaničkim deformisanjem i posmatrane tokom vremena. Ovi podaci su prineli minimalnu procenjenu efikasnost davanja od 35% i potvrdili da su date kvantne tačke u citozolu i hemijski pristupačne intraćelijskom okruženju.

[0118] Prolazne pore se formiraju rapidnim mehaničkim deformisanjem ćelije dok prolazi kroz mikrofluidno suženje. Podaci podržavaju ovaj mehanizam demonstriranjem difuznog citozolnog bojenja (FIG 26 u 2600), funkcionalnošću siRNK (FIG.29 u 2900) i dvosmernim kretanjem materijala kroz porisanu membranu (FIG.26 u 2920). Više parametara je identifikovano, poput dimenzija suženja, broja suženja u nizu i brzine ćelije koji utiču na efikasnost davanja i vijabilnost (FIG.25). Ovi parametri se stoga mogu koristiti za optimizaciju projekta uređaja za pojedinačne primene na osnovu tipa ćelije i veličine materijala davanja.

[0119] U primeru 2, ova tehnika je zasnovana na mikrofluidnom sistemu, koji se može inkorporirati u veći integrisani sistem koji se sastoji od više faza predobrade pre davanja i faza analize ili sortiranja nakon obrade. Pri prosečnoj brzini propusnog kapaciteta od 10.000 ćelija/s, uređaj za davanje može, na primer, biti postavljen u liniji sa mašinom protočne citometrije za sortiranje ćelija ili sprovođenje drugih analitičkih zadataka odmah nakon davanja.

[0120] Ovde opisani uređaji, sistemi i postupci obezbeđuju 30 potencijalnih prednosti u odnosu na postojeće postupke. Slično elektroporaciji i mikroubrizgavanju, u pitanju je mehanizam na bazi poracije i stoga se ne oslanja na egzogene materijale, hemijsku modifikaciju korisnih sadržaja ili endocitotske puteve. Za razliku od elektroporacije, međutim, ne oslanja se na električna polja koja su pokazala ograničen uspeh u davanju proteina, mogu oštetiti neki korisni sadržaj, ili prouzrokovati citotoksičnost. Zaista, trenutni rezultati su demonstrirali relativno visoku vijabilnost u većini primena, a čini se da senzitivni korisni sadržaji, poput kvantnih tačaka, nisu oštećeni. Predmet ovog pronalaska stoga obezbeđuje značajne prednosti u područjima poput obeležavanja i praćenja citozolnog materijala gde oštećenje kvantne tačke zbog elektroporacije može biti problem, a upotreba postupaka hemijskog davanja može ograničiti opseg dostupnih površinskih hemija.

[0121] Primer 2 je takođe demonstrirao sposobnost uređaja da daje proteine u citozol ćelije. Procene podataka i modela pokazuju da predmet ovog pronalaska može da daje 10-100x više materijala po ćeliji u odnosu na prethodne prakse, poput upotrebe ćelije koja prodire u peptide ili elektroporacije. Ovo poboljšanje brzine davanja obezbeđuje moćan postupak za upotrebu u reprogramiranju ćelije na bazi proteina, na primer, kada davanje transkripcionog faktora u citozol ćelije predstavlja veliku prepreku za razvoj pouzdanih postupaka generisanja iPSC. Takođe se može koristiti predmet ovog pronalaska za ispitivanje mehanizma bolesti davanjem različitih proteina/peptida od interesa. Zaista, predmet ovog pronalaska se može koristiti za skrining visokog propusnog kapaciteta biblioteka peptida pošto, za razliku od većine tehnika na bazi CPP ili nanočestice, predmet ovog pronalaska nije senzitivan na strukturu i hemiju proteina, ne oslanja se na endocitotske puteve i ne utiče na funkcionalnost proteina.

[0122] Pošto je predmet ovog pronalaska demonstrirao potencijal za davanje u primarne ćelije, citozolno davanje rapidnim mehaničkim deformisanjem može se primeniti kao ex-vivo mehanizam obrade. U ovom pristupu, ciljne ćelije pacijenta, izolovane iz krvi ili drugog tkiva, obrađuje uređaj izvan tela pacijenta, a zatim se one ponovo uvode u telo. Takav pristup koristi povećanu efikasnost davanja terapijskih sredstava na bazi proteina ili nanočestice i bezbedniji je od postojećih tehnika pošto uklanja potrebu za potencijalno toksičnim česticama vektora i ublažava bilo kakva potencijalna neželjena dejstva povezana sa retikuloendotelijalnim klirensom i davanjem izvan cilja.

[0123] U primeru 2, uređaji na bazi silicijuma su proizvedeni u pogonu za mikroproizvodnju upotrebom tehnike fotolitografije i dubokog nagrizanja reaktivnim jonima. U ovom postupku, silicijumske ploče od 6" debljine 450 µm se obrađuju sa heksametildisilazanom (HMDS), obloženim fotootpornim materijalom (OCG934, FujiFilm) tokom 60s na 3000 obrtaja u minutu (rpm), izloženim UV svetlosti (EV1- EVG) kroz hromiranu masku sa projektom kanala suženja i razvijenim u AZ405 (AZ Electronic Materials) rastvoru tokom 100s. Nakon 20min pečenja na 90 °C, ploča je nagrizena dubokim nagrizanjem reaktivnim jonima (SPTS Technologies) do željene dubine (obično, u ovom primeru, 15 µm). Piranha obrada (H2O2 i H2SO4) je upotrebljena za uklanjanje bilo kakvog preostalog fotootpornog materijala nakon završetka postupka nagrizanja. Za nagrizanje pristupnih rupa (tj. ulaznih i izlaznih) postupak je ponovljen na suprotnoj strani ploče (tj. onoj koja ne sadrži nagrizene kanale) upotrebom drugačije maske, koja sadrži obrasce pristupne rupe, i debljeg fotootpornog materijala AZ9260 (AZ Electronic Materials).

[0124] Čišćenje kiseonik plazme i RCA su upotrebljeni za uklanjanje bilo kakvih preostalih nečistoća. Vlažna oksidacija je upotrebljena za uzgajanje 100-200 nm silicijum oksida pre nego što je ploča anodično vezana za Pyrex ploču i postavljena u pojedinačne uređaje. Svaki uređaj je pojedinačno pregledan radi provere nedostataka pre upotrebe.

[0125] Pre svakog eksperimenta, uređaji su postavljeni na držač sa ulaznim i izlaznim rezervoarima (svi su prilagođeni i proizvedeni od Firstcut). Ovi rezervoari stupaju u interakciju sa uređajem upotrebom Buna-N O-prstenova (McMaster-Carr) kako bi se obezbedilo pravilno zaptivanje. Ulazni rezervoar je povezan sa sistemom regulisanja pritiska pomoću Teflon cevi radi obezbeđivanja neophodne pokretačke sile za prolazak materijala kroz uređaj. Primer 2 može prihvatiti pritiske do 4.826 bara (70 psi).

[0126] U primeru 2 ćelijska kultura je uključivala HeLa (ATCC), GFP ekspresovane HeLa, a DC2.4 (ATCC) ćelije su kultivisane u visokoj koncentraciji glukoze Dubelko modifikovanog esencijalnog medijuma (DMEM, Mediatech) dopunjenog sa 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS) (Atlanta Biologics) i 1% penicilin streptomicina (Mediatech). Primarne ćelije ljudskog fibroblasta (NuFF) (Globalstem) su kultivisane u visokoj koncentraciji glukoze DMEM dopunjene sa 15% FBS. Ćelije su sačuvane u inkubatoru na 37 °C i 5% CO2. Kada je to primenljivo, adherentne ćelije su suspendovane obradom pomoću 0,05% Trypsin/EDTA (Mediatech) tokom 5-10 min.

4

[0127] Mišje embrionske matične ćelije (mESC) su uzgajane na mišjim embrionskim fibroblastovima (Chemicon) u medijumima koji se sastoje od 85% nokaut DMEM, 15% fetalnog goveđeg seruma, 1 mM glutamina, 0,1 mM beta merkaptoetanola i 1% neesencijalnih amino kiselina zamenjenih sa 1000 jedinica/mL LIF (Millipore, SAD). Ćelije su sprovođene svaka 2-3 dana pomoću 0,25% Trypsin/EDTA. Kada su obrađene pomoću uređaja, mESC su mogle da ponovo formiraju kolonije i zadržale su uobičajenu morfologiju čak i 2 nedelje nakon obrade.

[0128] Radi sprovođenja eksperimenta za primer 2, ćelije su prvo suspendovane u željenom puferu davanja (medijum rasta, slani fosfatni puferski rastvor (PBS), ili PBS dopunjen sa 3% FBS i 1% F-68 Pluronics (Sigma)), pomešane sa željenim materijalom davanja i postavljene u unutrašnji rezervoar uređaja. Ovaj rezervoar je povezan sa linijom komprimovanog vazduha koju kontroliše regulator, a odabrani pritisak (0-4.826 bara (0-70 psi)) je upotrebljen za pokretanje fluida kroz uređaj. Obrađene ćelije se zatim sakupljaju iz izlaznog rezervoara. Ćelije su inkubirane na sobnoj temperaturi u rastvoru davanja tokom 5-20 min nakon obrade kako bi se obezbedilo zatvaranje pora pre podvrgavanja bilo kakvoj daljoj obradi.

[0129] U primeru 2 sa eksperimentima koji porede davanje dekstrana različite veličine ili davanje proteina sa davanjem dekstrana, molekuli od interesa su zajedno dati, tj. upotrebljeni su u istom eksperimentu sa istom populacijom ćelija, na istom uređaju i diferencirani su na osnovu njihovih fluorescentnih oznaka. Svi eksperimentalni uslovi su sprovedeni u triplikatu, a trake sa greškama predstavljaju dve standardne devijacije.

[0130] Za davanje fluorescentno obeleženih molekula dekstrana (Invitrogen) ili Apolioproteina E (Invitrogen), eksperimenti iz primera 2 su sprovedeni kako je gore opisano tako da pufer davanja sadrži 0,1-0,3 mg/ml dekstrana ili 1 mg/ml Apolioproteina E respektivno.

[0131] Za davanje fluoresceinom konjugovanog BSA (Invitrogen), ćelije su prvo inkubirane na podlozi za kulturu koja sadrži 5 mg/ml neobeleženog BSA (Sigma) tokom 2 sata na 37 °C, a zatim obrađene pomoću uređaja iz primera 2 upotrebom pufera davanja koji sadrži 1mg/ml fluoresceinom konjugovanog BSA. Faza predinkubacije je bila predviđena da minimizira nespecifično vezivanje fluorescentno obeleženog BSA za površinu ćelije.

[0132] GFP nokdaun za primer 2 je izmeren kao smanjenje procenta prosečnog intenziteta fluorescentnosti populacije ćelija u odnosu na neobrađene kontrolne ćelije. Lipofektamin 2000 siRNK čestice su pripremljene kombinovanjem 1 µg od siRNK sa 1 µl od Lipofektamin 2000 reagensa u 100 µl od PBS. Nakon 20 min od inkubiranja na sobnoj temperaturi, 20 µl ove kompozicije je dodato u svaki eksperimentalni bazenčić koji sadrži ∼20.000 ćelija i 100 µl medijuma. Ćelije su ostavljene da se inkubiraju sa česticama tokom 18 sati pre analize.

[0133] U primeru 2, zlatne nanočestice su pripremljene konjugovanjem terminovanog tiola, 1000 MW polietilen glikola (PEG) sa površinom nanočestice, višak PEG-a je zatim ispran četiri puta centrifugiranjem (10.000 rcf za 30 min), a rezultujući materijal je suspendovan u PBS do krajnje koncentracije od 100 nM. Za snimanje davanja GNP HeLa ćelijama, ćelije su suspendovane u PBS dopunjenom sa 3% FBS, 1% F-68 Pluronics i 47 nM od GNP; obrađene pomoću 10 µm - 6 µm x 5 uređaja i fiksirane u 2,5 mas.% glutaraldehida, 3 mas.% paraformaldehida i 5,0 mas.% saharoze u 0,1 M pufera natrijum kakodilata (pH 7,4). Nakon fiksacije tokom noći, ćelije su naknadno fiksirane u 1 mas.% OsO4 u puferu veronal-acetata tokom 1 h. Zatim su obojene kao celina tokom noći sa 0,5% uranil acetata u puferu veronal-acetata (pH 6,0), dehidrirane i ukalupljene u Spurr smoli. Delovi su zarezani na Reichert Ultracut E (Leica) u debljini od 70 nm pomoću dijamantskog noža. Delovi su ispitani pomoću EM410 elektronskog mikroskopa (Phillips).

[0134] U primeru 2, Neon sistem za elektroporaciju (Invitrogen) je upotrebljen za transfektovanje NuFF ćelija sa fluoresceinom obeleženim 70 kDa i pacifik plavim obeleženim 3 kDa dekstranima. Postupak proizvođača je praćen u ispiranju ćelija i njihovoj suspenziji u odgovarajućim puferima. Ćelije su obrađene pomoću nastavka od 10 µl u gustini od 10<7>ćelija/ml sa koncentracijom dekstrana od 0,1 mg/ml. Tri upotrebljena uslova su bili sledeći: 1) Jedan puls u trajanju od 20 ms od 1700 V 2) Tri pulsa u trajanju od 10 ms od 1600 V 3) Dva pulsa u trajanju od 20 ms od 1400 V. Uslove 1 i 3 je preporučio proizvođač kao optimalne uslove za transfekciju ćelija ljudskog fibroblasta sa efikasnošću davanja eGFP plazmida od 84% i 82% respektivno.

[0135] U primeru 2 konfokalnih slika, uzorci su centrifugirani na 800rcf tokom 4min i isprani 2-3 puta pomoću PBS pre snimanja. Konfokalne slike su snimljene na živim ćelijama pomoću C1 konfokalne pomoćne jedinice na Nikon TE2000-U invertnom mikroskopu sa 60x sočivom za potapanje u vodu. Fluorescentni uzorci su ekscitovani pomoću lasera od 405 nm i detektovani pomoću standardnog DAPI filtera (Nikon).

[0136] U primeru 2 fluorescentne mikroskopije, uzorci su centrifugirani na 800 rcf tokom 4min i isprani 2-3 puta pomoću PBS pre snimanja. Slike su dobijene pomoću Axiovert 200 (Zeiss) invertnog mikroskopa opremljenog Neofluar sočivima (Zeiss). Ekscitacija fluorescentnosti je obezbeđena pomoću X-cite 120Q živine lampe (Lumen Dynamics). Mikroskop je opremljen Hamamatsu C4742-95 kamerom (Hamamatsu), a slike su analizirane pomoću ImageJ (NIH).

[0137] U primeru 2 protočne citometrije, za analizu ćelija nakon eksperimenta davanja, ćelije su isprane 2-3 puta pomoću PBS (>100 µl po bazenčiću u ploči od 96 bazenčića). Zatim su resuspendovane u PBS dopunjenom sa 3% FBS, 1% F-68 Pluronics i 10 µg/ml propidijum jodida (Sigma). Ćelije su analizirane na LSR Fortessa (BD Biosciences) ili FACSCanto (BD Biosciences) opremljen robotom za uzorkovanje visokog propusnog kapaciteta. Laseri od 405 nm i 488 nm su upotrebljeni za ekscitaciju željenih fluorofora. Signali propidijum jodida (bojenje živih/mrtvih ćelija), fluoresceina i pacifik plavog su detektovani pomoću 695 nm dugačkog prolaska, 530/30 i 450/50 filtera respektivno. Analiza podataka je sprovedena pomoću FACS Diva (BD Biosciences) i FlowJo (FlowJo) softvera.

Primer 3 – Matične ćelije i imune ćelije

[0138] Proteini, nanočestice, siRNK, DNK i ugljenične nanocevi su uspešno dati u jedanaest različitih tipova ćelija, uključujući embrionske matične ćelije i imune ćelije. Zaista, mogućnost davanja strukturno različitih materijala i njegova primenljivost za primarne ćelije koje se teško transfektuju pokazuju da ovaj uređaj i postupci imaju široku primenljivost u istraživačkim i kliničkim primenama.

[0139] U primeru 3, svaki uređaj se sastoji od 45 identičnih paralelnih mikrofluidnih kanala, koji sadrže jedno ili više suženja, nagrizenih na silicijumskom čipu i zaptivenih pomoću Pyrex sloja. Širina i dužina svakog suženja (detaljnije opisano u nastavku) su u opsegu od 4-8 µm i 10-40 µm respektivno. Uređaj iz primera 3 je obično radio pri brzini propusnog kapaciteta od 20.000 ćelija/s, prinoseći blizu milion obrađenih ćelija po uređaju pre kvara, usled zapušenja. Paralelni projekat kanala je odabran radi povećanja propusnog kapaciteta, dok je istovremeno obezbeđena uniformna obrada ćelija, pošto bilo kakva zapušenja ili neispravnosti u jednom kanalu ne mogu uticati na brzinu protoka u susednim kanalima (uređaj može raditi pri konstantnom pritisku). Pre upotrebe, uređaj se može prvo povezati sa čeličnom površinom koja povezuje ulazne i izlazne rezervoare sa silicijumskim uređajem. Kompozicija ćelija i željenog materijala davanja se zatim može postaviti u ulazni rezervoar, a Teflon cev se pričvršćuje na ulazu. Regulator pritiska se zatim može koristiti za podešavanje pritiska u ulaznom rezervoaru i pokretanje ćelija kroz uređaj. Obrađene ćelije se mogu sakupiti iz izlaznog rezervoara.

[0140] Parametri koji utiču na efikasnost davanja koji su identifikovani (pogledati, npr. primer 2 iznad) mogu uključivati brzinu ćelije, dimenzije suženja i broj suženja (čime se menjaju brzine smicanja i kompresije koje imaju ćelije). Na primer, efikasnost davanja živim HeLa ćelijama pacifik plavim obeleženih molekula 3kDa dekstrana koji ne mogu da probiju membranu monotonički se povećava sa brzinom ćelije u različitim projektima suženja (npr. FIG.25 u 2500). Dimenzije suženja takođe utiču na davanje; povećanje dužine suženja sa 20 µm na 40 µm je gotovo udvostručilo efikasnost davanja pri svim radnim brzinama (npr. FIG.25 u 2500), uz minimalno dejstvo na vijabilnost (npr. FIG.25 u 2510). Smanjenje širine suženja je imalo slično dejstvo. Povećanje broja suženja u nizu takođe je povećalo efikasnost davanja tako da je uređaj sa pet dužina suženja od 10 µm u nizu bio bolji od jednog projekta dužine od 10 µm, 20 µm ili 40 µm za sve brzine ćelije (npr. FIG.25 u 2500 i 2510). U ovim podacima, tačke podataka za 0 mm/s odgovaraju kontrolnom slučaju, pri čemu se ćelije podvrgavaju istoj obradi kao i drugi uzorci, ali ne prolaze kroz uređaj, čime se odražavaju bilo kakva endocitotska ili dejstva površinskog vezivanja.

[0141] Za ispitivanje višestruke upotrebljivosti ove tehnike procenjena je njena sposobnost davanja modela molekula dekstrana u više tipova ćelija koje su tradicionalno teške za transfektovanje, naročito imunih ćelija i matičnih ćelija. Fluorescentno obeleženi 70 kDa i 3 kDa dekstran su upotrebljeni za ove eksperimente pošto su slične veličine kao i mnogi molekuli proteina i siRNK respektivno, jednostavno ih je detektovati protočnom citometrijom i imaju minimalna dejstva površinskog vezivanja pošto imaju negativni naboj.

[0142] FIG.30 ilustruje primenljivost predmeta ovog pronalaska u tipovima ćelija. U 3000 prikazana je efikasnost davanja i vijabilnost NuFF ćelija obrađenih pomoću 30 µm - 6 µm uređaja za davanje 3 kDa i 70 kDa dekstrana. U 3010 prikazana je efikasnost davanja i vijabilnost mišjih dendritskih ćelija izolovanih iz slezine i obrađenih pomoću 10 µm - 4 µm uređaja za davanje 3 kDa i 70 kDa dekstrana. U 3020 prikazana je efikasnost davanja i vijabilnost mišjih embrionskih matičnih ćelija obrađenih pomoću 10 µm - 6 µm uređaja za davanje 3 kDa i 70 kDa dekstrana. U 3030 prikazana je efikasnost davanja 3 kDa, a u 3040 prikazan je 70 kDa dekstran koji se daje B-ćelijama (CD 19<+>), T-ćelijama (TCR-β<+>) i makrofagima (CD11b) izolovanim iz celokupne mišje krvi centrifugiranjem i obrađenim pomoću 30 µm - 5 µm i 30 µm - 5 µm x 5 uređaja na 1000 mm/s.3 kDa i 70 kDa dekstran su obeleženi pacifik plavim i fluoresceinom respektivno. Sve tačke podataka su sprovedene u triplikatu, a trake sa greškama predstavljaju dve standardne devijacije.

[0143] Upotrebom različitih projekata uređaja, molekuli dekstrana su dati fibroblastovima prepucijuma novorođene bebe (NuFF) (3000), primarnim mišjim dendritskim ćelijama (3010) i embrionskim matičnim ćelijama (3020). Ovi eksperimenti su prineli minimalan gubitak (<25%) vijabilnosti ćelija (3000, 3010, i 3020), a rezultati u mišjim embrionskim matičnim ćelijama pokazuju da postupak ne indukuje diferencijaciju. U daljim ispitivanjima, bela krvna zrnca (sloj leukocita i trombocita) izolovana su iz mišje krvi centrifugiranjem i obrađena pomoću uređaja. B ćelije, T ćelije i makrofagi, kako su diferencirani bojenjem antitela, iskazali su uspešno davanje i 3 kDa i 70 kDa dekstrana (3030 i 3040).

[0144] Radi ilustracije potencijala predmeta ovog pronalaska u prevazilaženju trenutnih izazova davanja, više eksperimenata je sprovedeno u mogućim primenama od reprogramiranja ćelija do opažanja na bazi ugljeničnih cevi. Pored dole opisanih materijala specifičnih za primenu, predmet ovog pronalaska je demonstrirao uspešno davanje različitih test korisnih sadržaja poput Apolioproteina E, albumina goveđeg seruma i GFP-plazmida.

[0145] FIG.31 ilustruje podatke iz davanja nanomaterijala i antitela. U 3100 prikazana je efikasnost davanja i vijabilnost HeLa ćelija obrađenih pomoću 10 µm - 6 µm x 5 uređaja za davanje pacifik plavim obeleženog 3kDa dekstrana i Cy5 obeleženih, DNK umotanih ugljeničnih nanocevi. U 3110 su prikazane slike ćelije svetlog polja pokrivene Raman rasejavanjem u G-traci (crveno) kako bi se pokazalo davanje ugljeničnih nanocevi u obrađenim ćelijama (levo) naspram endocitoze (desno). Skale su na 2 µm. U 3120 prikazan je fluorescentni mikrograf HeLa ćelije 18 sati nakon davanja pacifik plavim obeleženog 3kDa dekstrana (srednji panel) i antitela u tubulin pomoću Alexa Fluor 488 taga (desni panel). Skale su na 3 µm. U 3130 je prikazana efikasnost davanja i vijabilnost HeLa ćelija obrađenih pomoću 10 µm - 6 µm x 5 uređaja, na 500 mm/s, za davanje Alexa Fluor 488 obeleženih anti-tubulin antitela. Efikasnost davanja u različitim koncentracijama antitela je upoređena sa kontrolom endocitoze na 100 µg/ml i neobrađenih ćelija.

[0146] Provera uspešnosti davanja ugljeničnih nanocevi (inkapsuliranih pomoću DNK oligonukleotida) protočnom citometrijom (3100) i Raman spektroskopijom (3110). Antitela su takođe data tubulinu (3120 i 3130) pomoću ove tehnike, uz prinos difuzne distribucije kroz ćeliju koja će biti konzistentna sa citozolnim davanjem. Gore navedeni materijali su trenutno teški za davanje u citozol ćelije, a svaki materijal često zahteva specijalizovanu modifikaciju radi olakšanog davanja. U primeru 3, sva četiri materijala su data HeLa ćelijama pomoću istog skupa uslova na 10 µm - 6 µm x 5 uređaju.

[0147] Efikasno davanje proteina primarnim ćelijama može omogućiti više terapijskih primena. Izazov u reprogramiranju ćelija, na primer, je neefikasnost prethodnih postupaka davanja proteina na bazi CPP. FIG.32 ilustruje primene davanja proteina. U 3200 prikazana je western blot analiza davanja c-Myc, Klf-4, Oct-4 i Sox-2 od strane peptida koji prodiru u ćeliju naspram 10 µm - 6 µm uređaja u NuFF ćelije. Svaki od četiri proteina ima dodatne grupe 9 arginina (9R) za olakšanu apsorpciju. Kolone lizata (Ly) odgovaraju proteinskom sadržaju ćelija koje su isprane i lizirane, dok kolone bujona odgovaraju proteinskom sadržaju okruženja medijuma. U 3210 prikazana je efikasnost davanja i vijabilnost dendritskih ćelija izolovanih iz slezine i obrađenih pomoću 10 µm - 4 µm uređaja za davanje pacifik plavim obeleženog 3 kDa dekstrana i Alexa Fluor 488 obeleženog ovalbumina. Sve tačke podataka su sprovedene u triplikatima, a trake sa greškama predstavljaju dve standardne devijacije.

[0148] Sposobnost davanja četiri primerna faktora transkripcije (Oct4, Sox2, c-Myc i Klf-4) ćelijama ljudskih fibroblastova je ispitana i upoređena sa postupkom na bazi CPP (3200). Rezultati pokazuju da, pored toga što se ne oslanja na endocitozu, koja veliki deo materijala može ostaviti zarobljenim u endozomima, davanje rapidnim mehaničkim deformisanjem prinosi značajno veću efikasnost davanja za sva 4 proteina. Ovaj rezultat je u skladu sa gore navedenom simulacijom koja je pokazala da predmet ovog pronalaska može imati poboljšanje od 10-100x u davanju proteina u odnosu na CPP-ove.

[0149] Prezentacija antigena u dendritskim ćelijama (DC-ovi) je još jedno područje u kojem predmet ovog pronalaska nudi prednost. Istraživači ispituju postupke za ekspresiju antigena u MHC klasa I receptorima DC-ova radi indukovanja potentnog citotoksičnog odgovora T ćelije. Predmet ovog pronalaska, koji ima direktne kliničke implikacije u pripremi vakcine protiv kancera, na primer, oslanja se na citozolno davanje antigenskih proteina, pošto je prezentacija MHC klasa I gotovo isključiva za citozolne proteine. Olakšavanjem direktnog citozolnog davanja materijala, predmet ovog pronalaska služi kao platforma za generisanje in vivo citotoksičnog odgovora T ćelije na specifični antigen. Radi ilustracije ove mogućnosti, Alexa 488 obeleženi ovalbumin, model antigenskog proteina, uspešno je dat mišjim dendritskim ćelijama izvedenim iz slezine (3210). Uprkos većoj brzini endocitoze u ovom tipu ćelije, uređaj je proizveo značajno povećanje brzina davanja u odnosu na endocitozu u kontrolnim ćelijama (0mm/s). Dalje, dati materijal je prisutan u citoplazmi zahvaljujući mehanizmu deformisanja ćelije. Ova karakteristika je naročito važna za davanje antigena, pošto je citoplazmatični pritisak ključni zahtev za prezentaciju antigena MHC klasa I.

[0150] Sistem iz primera 3 je pogodan istraživački alat koji ima mogućnost da daje ugljenične nanocevi, zlatne nanočestice i antitela (FIG.31) – tri materijala koja je teško davati trenutnim tehnikama. Predmet ovog pronalaska značajno proširuje mogućnost sondiranja intraćelijskih procesa olakšavanjem bojenja antitela i kvantnih tačaka struktura/proteina živih ćelija i omogućavanjem upotrebe ugljeničnih nanocevi kao citozolne molekularne sonde ili hemijskog senzora. Kao robusni postupak davanja proteina, može se koristiti za skrining biblioteka peptida/proteina visokog propusnog kapaciteta pošto, nasuprot većini postupaka na bazi CPP ili nanočestica, ovaj postupak nije senzitivan na strukturu i hemiju proteina, ne oslanja se na endocitotske puteve i ne utiče na funkcionalnost proteina.

[0151] Pored toga, predmet ovog pronalaska je koristan za terapiju (FIG.32). Na primer, ciljne ćelije pacijenta su izolovane iz krvi ili drugog tkiva, obrađene pomoću uređaja za davanje željenog terapijskog sredstva i ponovo uvedene u telo. Takav pristup koristi povećanu efikasnost davanja terapijskih makromolekula i bezbedniji je od postojećih tehnika, pošto uklanja potrebu za potencijalno toksičnim česticama vektora i ublažava bilo kakva potencijalna neželjena dejstva povezana sa retikuloendotelijalnim klirensom i davanjem van cilja.

Primer 4 – Personalizovane vakcinacije protiv kancera

[0152] Trenutni izazovi u intraćelijskom davanju makromolekula su značajna prepreka boljem razumevanju mehanizama bolesti i primeni novih terapijskih pristupa. Uprkos nedavnim napredovanjima u tehnologiji davanja, obrada ćelija izvedenih od pacijenata ostaje izazov, a trenutni postupci se često oslanjaju na toksična električna polja ili egzogene materijale. Mikrofluidna platforma i povezani sistemi i postupci oslanjaju se na mehaničko deformisanje ćelija radi olakšanog davanja. Ovaj kontrolisani fizički pristup je doneo rezultate u prethodno izazovnim područjima, poput reprogramiranja ćelija na bazi proteina i davanja kvantnih tačaka.

[0153] Najefektivniji i najdirektniji način uticaja na ponašanje ćelije je davanje aktivnih agenasa u citoplazmu ćelije. Intraćelijsko davanje makromolekula stoga ima ključnu ulogu u istraživanju i razvoju (R&D), uz primene od otkrića leka do ispitivanja biohemijskih procesa i terapijskih primena. Trenutni postupci, međutim, imaju ograničenja. Često iskazuju nisku efikasnost u ćelijama izvedenim od pacijenata (primarnim), oslanjaju se na toksična električna polja ili egzogeni materijal i nisu pogodni za davanje strukturno različitih materijala, poput proteina.

[0154] Robusna platforma za davanje koja može da reši ove probleme omogućava značajan napredak u biološkim istraživanjima i služi kao osnov za novu generaciju terapija poput personalizovane vakcinacije protiv kancera. Efektivan postupak davanja proteina za imune ćelije, na primer, može poslužiti kao platforma za vakcinaciju protiv kancera.

[0155] Kako je gore opisano, ovde opisani mikrofluidni uređaji, povezani sistemi i postupci olakšavaju intraćelijsko davanje materijala rapidnim deformisanjem ćelije dok prolazi kroz suženje. Postupak deformisanja prouzrokuje prolaznu pukotinu ćelijske membrane i time omogućava pasivnu difuziju materijala iz okružujućeg pufera u citozol ćelije. Uklanjanjem potrebe za egzogenim materijalima i električnim poljima na koje se oslanjaju trenutni postupci ovaj pristup obezbeđuje pojednostavljen i

4

robustan pristup davanju sa smanjenom toksičnošću. Stoga, ovaj postupak može poslužiti kao široka platforma za intraćelijsko davanje makromolekula sa prednostima u nekim istraživačkim i kliničkim primenama, poput vakcinacije protiv kancera.

[0156] FIG.34 je ilustracija koja prikazuje sistem u kojem se krv pacijenta obrađuje pomoću mikrofluidnog uređaja radi davanja makromolekula. Jedan način ostvarivanja predmeta ovog pronalaska uključuje sistem u kojem se dendritske ćelije (DC-ovi), izolovane iz krvi pacijenta, obrađuju pomoću uređaja, ex vivo, kako bi se aktivirale protiv određenog antigena kancera, a zatim ponovo uvele u krvotok pacijenta. Na primer, dati antigen je uobičajeno ekspresovani protein za koji se zna da je povezan sa određenom bolešću ili specifičan za pacijenta dobijen biopsijom. Davanjem antigena kancera direktno u DC citoplazmu može se iskoristiti put prezentacije MHC-I antigena i indukovati snažan odgovor citotoksičnog T limfocita(CTL) kod pacijenta. Ove aktivirane T-ćelije zatim traže i uništavaju bilo kakve kancerogene ćelije koje ekspresuju ciljni antigen. Fleksibilnost platforme u upotrebi utvrđenih antigena specifičnih za bolest ili onih koji su direktno izvedeni iz tumora pacijenta omogućava lečenje pacijenata koji su otporni na druge terapije. Zaista, ovo obezbeđuje personalizovani i ciljani odgovor na bolest uz minimalna neželjena dejstva. Ovaj način ostvarivanja može se primeniti u uobičajenoj bolničkoj laboratoriji (<1 sat po obradi) uz pomoć obučenog tehničara. Zbog male veličine i relativne jednostavnosti, sistem obrade kojim upravlja pacijent se takođe može koristiti.

[0157] Postupak vakcinisanja protiv kancera je demonstriran u mišjem modelu. Ovaj sistem se koristi za uspešno davanje i obradu ovalbumina, modela antigena, u mišje dendritske ćelije i kako je naznačeno povećanom prezentacijom antigena, SIINFEKL peptida, na receptorima MHC klasa I. Ove obrađene dendritske ćelije pospešuju proliferativni odgovor citotoksičnog T limfocita (CTL) in vitro. Obrađeni DC-ovi se ponovo uvode u životinju radi generisanja in vivo CTL odgovora. Uređaji su korisni za davanje antigena u DC-ove izolovane iz ljudske krvi.

[0158] Podaci pokazuju da uređaj može da daje materijal senzitivnim primarnim ćelijama (uključujući DC-ove) bez prouzrokovanja prekomerne smrti ćelija. Stoga, oštećenje ćelije ne predstavlja ozbiljan problem. Imuni odgovor može biti poboljšan povećanjem broja obrađenih ćelija, povećanjem količine i diverziteta datog antigena, i/ili pomoću faktora aktivacije zajedničkog davanja, poput lipopolisaharida. Primećena je mala ili nikakva toksičnost kod ćelija obrađenih pomoću ovog uređaja, što ove postupke čini ne samo izvodljivim, već i poželjnim za terapijske primene na ljudima i životinjama.

Primer 5 – Lečenje kancera krvi

[0159] Kako je opisano u primeru 4, rapidno mehaničko deformisanje ćelija može obezbediti robusna sredstva za davanje antigena dendritskim ćelijama (DC-ovi) i stoga može biti platforma za ćelijske terapije. Ovaj sistem je zasnovan na otkriću da rapidno mehaničko deformisanje ćelija može prouzrokovati formiranje tranzitornih pora membrane koje omogućavaju difuzivno davanje materijala iz okružujućeg medijuma. Za razliku od prethodno spomenutih postojećih terapija, ovaj postupak se ne oslanja na prilagođene fuzione proteine, unakrsnu prezentaciju antigena, virusne vektore, nanočestice ili mehanizme endocitoze; stoga, obezbeđuje značajna poboljšanja efikasnosti in vivo, uz istovremeno smanjenje terapijskih troškova. Fleksibilnost i jednostavnost ovog fundamentalno drugačijeg pristupa omogućava široku platformu za aktivaciju dendritskih ćelija koje mogu indukovati CD8 odgovor na različite antigene kancera. Ovaj sistem može ciljati kancere krvi, poput limfoma B ćelije, koji su prijemčiviji za imune terapije, kao i više dodatnih tipova kancera (npr. melanom, kancer pankreasa, itd.) i obezbeđuje vitalni i personalizovani novi pristup borbi protiv bolesti.

[0160] Ćelijska terapija protiv kancera je atraktivna opcija zbog njene sposobnosti da aktivira imuni sistem pacijenta i pokrene dugotrajni odgovor T ćelije specifičan za antigen CD8 na bolest. Ove terapije, poput nedavno odobrenog Provenge® za kancer prostate, imaju minimalna neželjena dejstva u odnosu na hemoterapije i lečenje zračenjem. Međutim, jedna od najvećih prepreka razvoju ćelijskih terapija jeste ostvarivanje pravilne prezentacije antigena davanjem antigena u citoplazmu ćelije. Tradicionalno, aktivacija odgovora CD8 efektora se razlikuje od CD4 odgovora po lokaciji stranog proteina koji ulazi u ćeliju koja prezentuje antigen (npr. dendritska ćelija). Proteini koji se mogu pronaći u citoplazmi indukuju CD8 odgovor, dok ekstraćelijski proteini zarobljeni endocitozom indukuju CD4 odgovor. Pošto mehanizam unakrsne prezentacije unutar ćelija koje prezentuju antigen ostaje nedostižan, mora se razviti pouzdan postupak davanja željenog antigena direktno u citoplazmu ćelije radi unapređenja terapija koje koriste potentni odgovor citotoksičnog efektora CD8. Robustan i efektivan postupak citoplazmatičnog davanja u dendritske ćelije se koristi kao platforma za indukovanje imunih odgovora na različite tipove kancera.

[0161] Eksperimenti na HeLa ćelijama, ilustrovani na FIG.8A i FIG.11, pokazali su da rapidno mehaničko deformisanje ćelije rezultuje formiranjem tranzitornih povreda/pora u ćelijskoj membrani, koje omogućavaju pasivnu difuziju materijala iz okružujućeg pufera u citoplazmu ćelije. Ovaj prethodno nezapaženi fenomen proizvodi ćelije koje su vijabilne i iskazuju uobičajenu proliferaciju nakon obrade. Eksperimenti su pokazali da veći molekuli iskazuju manje brzine davanja od manjih molekula, što je pokazatelj difuzivnog mehanizma. Uspešno davanje siRNK i difuzno bojenje citozola, kako je izmereno konfokalnom mikroskopijom, takođe pokazuju da su dati materijali u citozolu i u aktivnom/pristupačnom stanju. Tradicionalno, postupci davanja antigena često pokazuju obećavajuće rezultate ćelijskih linija, ali ne uspevaju da se translatuju do primarnih imunih ćelija. Ovde opisan postupak davanja, međutim, ne zavisi od endocitotskih puteva ili ćelijskog odgovora na egzogene materijale, koji se značajno mogu razlikovati u tipovima ćelija, i prvenstveno se oslanja na dvoslojne karakteristike membrane. Stoga, zbog svoje jednostavnosti i novog puta, ova tehnologija je prijemčivija za prelaz sa ćelijske linije na davanje u primarnu imunu ćeliju i stoga obezbeđuje značajno poboljšanje u prezentaciji antigena.

[0162] MHC klasa I prezentacija antigena i sazrevanje dendritske ćelije mogu se analizirati bojenjem antitela kao odgovor na davanje ovalbumin proteina. T ćelije sakupljene od OT-I i OT-II TCR transgenih miševa takođe se mogu koristiti za merenje CD8 i CD4 proliferacije kao odgovor na punjenje ovalbumina i/ili SIINFEKL antigena. Ovaj sistem može biti optimizovan za povećanu CD8 proliferaciju u poređenju sa dendritskim ćelijama prajmovanim samo endocitozom.

[0163] Primarne mišje dendritske ćelije su prečišćene MACS CD11c+ razdvajanjem (Miltenyi Biotec, Nemačka) iz slezina B6 miševa. Uređaj koji sadrži suženja sa širinom kanala od 6 µm koji može da poriše membranu HeLa ćelije od 13 µm se može koristiti. Zbog manje veličine ovih dendritskih ćelija, uređaji za mikroproizvodnju i testiranje sa širinama kanala od 3-5 µm mogu se koristiti za proveru učinka. Postojeći protokoli za fotolitografiju i duboko nagrizanje reaktivnim jonima mogu se modifikovati kako bi se omogućila efikasna proizvodnja ovih uređaja. Fluorescentno obeleženi molekuli dekstrana mogu se koristiti kao model molekuli za procenu efikasnosti davanja pomoću FACS. Kasnije, ovalbumin protein se može davati ćelijama i analizirati pomoću western blot za potvrdu apsorpcije proteina u primarnim ćelijama.

[0164] Sazrevanje dendritske ćelije može se ispitivati pomoću bojenja CD80 i CD86 antitela kako bi se pokazalo da postupak rapidnog deformisanja indukuje sazrevanje ćelije. Upotreba ekstraćelijskih TLR agonista, poput lipopolisaharida (LPS), može se razmotriti ako se smatra neophodnom za ručno indukovanje sazrevanja DC-ova nakon davanja. Ovalbumin protein se može davati dendritskim ćelijama, a prezentacija antigena može se kvantifikovati pomoću MHC-I SIINFEKL antitela. Pored toga, efikasnost prezentacije antigena u odgovoru na davanje TCR specifičnih peptida može se proceniti kako bi se pokazala sposobnost sistema da daje/prezentuje antigenske proteine naspram peptida. Kasnije, CD8 i CD4 T ćelije se mogu sakupljati od TCR transgenih OT-I i OT-II miševa respektivno, obojiti pomoću CFSE i ko-kultivisati pomoću dendritskih ćelija obrađenih ovalbuminom tokom 5 dana. Proliferacija T ćelije u oba podskupa može se izmeriti pomoću FACS. Projekat uređaja može se optimizovati za proizvodnju povećanih nivoa populacija funkcionalne CD8 T ćelije u poređenju sa konvencionalnim in vitro postupcima (npr. endocitoza).

[0165] Višestruka sposobnost indukovanja odgovora specifičnih za antigen CD8 predstavlja cilj ćelijskih terapija kancera koji se do sada pokazao nedostižnim zbog neefikasne prezentacije antigena ili neadekvatne fleksibilnosti postupka davanja. Postojeći postupci imaju više nedostataka, uključujući njihovo oslanjanje na štetna električna polja, upotrebu egzogenih materijala, modifikaciju sekvence proteina i/ili endocitotskih puteva radi olakšanog davanja antigena. Predmet ovog pronalaska, međutim, obezbeđuje fundamentalno drugačiji pristup citozolnom davanju koje nema nijedan od gore navedenih problema. Dalje, po prirodi svog mehanizma poracije i difuzije, ovaj postupak je široko primenljiv za više tipova antigena i stoga može da leči više ciljnih kancera. Isti mehanizam se čak može koristiti za uvođenje dodatnih signalnih molekula radi poboljšanog sazrevanja/aktivacije DC-ova u cilju proizvodnje

4

potentnijeg odgovora T ćelije. Takva platforma na širokoj osnovi je sveobuhvatnija i robusnija od bilo kog postojećeg mehanizma davanja/prezentacije antigena koji se ispituje za vakcinaciju protiv kancera.

[0166] Primer 5 može imati širok uticaj. S obzirom na ogromno društveno opterećenje koje kancer predstavlja u celoj zemlji (procenjenih 570.000 smrti u SAD u 2011. godini); kancer će verovatno pogoditi značajan udeo stanovništva. Pogođeno stanovništvo ima koristi od razvoja novih ćelijskih terapija koje koriste snagu imunog sistema pacijenta za borbu protiv bolesti. Predmet ovog pronalaska je efikasnija personalizovana platforma lečenja za više tipova kancera, poput kancera krvi, npr. leukemija, limfoma i multiplih mijeloma, kao i mijeloproliferativnih neoplazmi i mijelodisplastičkih sindroma. Postupci su takođe naročito korisni za lečenje metastatičkih kancera, npr. zbog svoje sklonosti širenju preko cirkulacije krvi. Kanceri sa nepoznatim epitopom antigena, na primer, mogu se lečiti digestijom uzorka biopsije tumora, davanjem lizata u DC-ove pacijenta i ponovnim uvođenjem DC-ova u telo. Ovo bi omogućilo aktivaciju T ćelija domaćina protiv širokog opsega antigena kancera, čime se obezbeđuje efektivni tretman sa višestrukim ciljem. Ovaj personalizovani aspekt može biti od naročitog interesa za ljude koji mogu razviti različite oblike kancera, često neadekvatno lečene trenutnim tretmanima, zbog izloženosti u neprijateljskom okruženju. Prilagođavanjem lečenja bolesti pojedinca, ovaj postupak može obezbediti blagovremenu, efektivnu negu čak i u najagresivnijim slučajevima, poput kancera otpornih na više lekova. Ova imuna terapija može takođe biti naročito efektivna u sprečavanju metastaze (odgovorna za ∼90% smrti povezanih sa kancerom) pošto CD8 T ćelije mogu jednostavno locirati i uništiti metastatičke ćelije, dok imunološka memorija obezbeđena preko ovih tretmana može da spreči budući recidiv. Pored toga, kao istraživački alat, ovaj postupak može obezbediti mehanistička ispitivanja obrade antigena bez presedana radi boljeg razumevanja procesa unakrsne prezentacije antigena, a samim tim radi poboljšanja efikasnosti postojećih/alternativnih postupaka imune aktivacije.

Primer 6 – Reprogramiranje ćelija

[0167] Matične ćelije imaju ključnu ulogu u trenutnim istraživanjima u regenerativnoj medicini, naročito u području inženjeringa tkiva koje se rapidno širi. iPSC-ovi su od naročitog interesa zbog njihovog kapaciteta za samostalnu obnovu, demonstrirane sposobnosti diferencijacije u bilo koji tip ćelije i autolognih (specifičnih za pacijenta) karakteristika. Stoga, iPSC-ovi obezbeđuju priliku za izvođenje progenitornih ćelija više loza iz zajedničkog pluripotentnog izvora, koje se mogu kombinovati u prepoznatljive, a ipak interaktivne pregrade tkiva. Dalje, ove ćelije mogu na kraju ukloniti potrebu za ljudskim embrionskim matičnim ćelijama (hESC-ovi) u kliničkim primenama, čime se izbegavaju mnoge moralne i etičke debate vezane za ove tipove ćelija. Dalje, iPSC-ovi izvedeni od pacijenta izbegavaju ili minimizuju probleme imunog odbijanja ćelija izvedenih od hESC. Stoga, trenutna istraživanja su uglavnom fokusirana na osmišljavanje efikasnih protokola oslobođenih od virusa za proizvodnju velikog broja iPSC-ova.

[0168] iPSC-ovi su prvobitno generisani reprogramiranjem fibroblastova odraslih miševa i ljudi (HF-ovi) u pluripotentno stanje na osnovu retro-virusne preterane ekspresije 4 transkripciona faktora Oct 3/4, Sox2, c-Myc i Klf4. Ovi iPSC-ovi nisu samo u velikoj meri identični ES ćelijama u globalnoj ekspresiji gena, DNK metilaciji i modifikaciji histona, već takođe mogu da se diferenciraju u tipove ćelija koji predstavljaju sva 3 sloja klice. Dok iPSC tehnologija poseduje ogroman potencijal za biomedicinska istraživanja i terapiju na bazi ćelija, moraju se prevazići ozbiljne prepreke kako bi se uvideo njen puni potencijal. Na primer, većina linija iPSC je izvedena iz različitih somatskih ćelija retrovirusnim ili lentivirusnim uvođenjem gena za reprogramiranje sa šifrovanjem faktora, što rezultira višestrukim hromozomskim pukotinama pomoću integracije virusnog vektora, a bilo šta od toga može prouzrokovati genetsku disfunkciju i/ili tumor. Pored toga, transgeni za reprogramiranje (određenije, c-Myc i Klf4) su blisko povezani sa onkogenezom, što povećava mogućnost da njena rezidualna ekspresija i/ili reaktivacija može prouzrokovati formiranje tumora. Stoga, mnoge laboratorije su nedavno istraživale različite neintegrativne pristupe genomu poput adenovirusa, epizomalnih vektora, mRNK-ova i mikroRNK-ova. Napominjemo da se pokazalo da se iPSC-ovi mogu generisati direktnim davanjem četiri faktora reprogramiranja (Oct 3/4, Sox2, c-Myc i Klf4) fuzionisana sa peptidima koji prodiru u ćeliju (CPP). Dok je navedeno da generisanje mišjih iPSC-ova može nastupiti davanjem četiri faktora fuzionisana pomoću CPP ekspresovana u E. coli, može se pokazati da ljudski iPSC-ovi mogu biti generisani pomoću četiri faktora fuzionisana pomoću CPP ekspresovana u sisarskim ćelijama. Međutim, oba ispitivanja su navela da je efikasnost reprogramiranja na bazi proteina veoma niska (<0,01%). Pošto reprogramiranje na bazi proteina ne uključuje nijedan tip genetskog materijala (DNK ili RNK) i vektorski nosač (virus ili plazmid), direktno davanje proteina obezbeđuje jedan od najbezbednijih postupaka reprogramiranja. Pokazalo se da ljudski iPSC-ovi na bazi proteina efikasno generišu funkcionalne neurone dopamina bez abnormalnih karakteristika povezanih sa integracijom virusnog genoma. Pošto se efikasnost reprogramiranja na bazi proteina može poboljšati pomoću predmeta ovog pronalaska upotrebom tehnologije platforme za davanje, time se širom otvara mogućnost generisanja klinički vijabilnih iPS ćelija. Dalje, ovaj pristup omogućava precizniji nivo kontrole nad ćelijskom funkcijom zaobilaženjem stohastičnih procesa koji regulišu translaciju i/ili transkripciju u reprogramiranju mRNK, plazmida i virusnom reprogramiranju. Direktno davanje proteina stoga obezbeđuje dve fundamentalne prednosti u odnosu na alternativne postupke odbacivanjem rizika od mutagenskog umetanja i omogućavanjem preciznije kontrole visoko senzitivnog postupka reprogramiranja. Ovde opisana tehnologija davanja je demonstrirala svoju sposobnost da daje proteine u visokoj efikasnosti HF-ovima i matičnim ćelijama. Eksperimenti koji upoređuju mogućnosti davanja ove tehnike sa postojećim metodologijama peptida koji prodire u ćeliju pokazali su značajno povećanje u davanju upotrebom ovog pristupa (potencijalno 100x više na osnovu simulacija). Dalje, njen mehanizam fizičke poracije uklanja potrebu za hemijskom modifikacijom ili upotrebom egzogenih jedinjenja koja su uključena u alternativne postupke davanja proteina. Mali molekuli, siRNK i drugi faktori se takođe mogu zajednički davati tokom reprogramiranja,

4

pošto je postupak agnostičan u odnosu na tip materijala koji se daje. Ovaj sistem stoga obezbeđuje jedinstveni alat za indukovanje reprogramiranja ćelija direktnim davanjem proteina. Ovaj jednostavan mehanizam delovanja (tj. difuzija kroz pore) takođe omogućava potencijalno predviđanje i kontrolu količina davanja sa velikom preciznošću, čime se olakšavaju ispitivanja optimizacije radi boljeg razumevanja dinamike reprogramiranja i značajnog povećanja efikasnosti. Na kraju, ova mikrofluidna tehnika se može koristiti kao medicinski uređaj za generisanje iPSC-ova za primene u inženjeringu kliničkog tkiva i ćelijskoj terapiji.

[0169] Dalje, primene ovog sistema nisu ograničene na davanje proteina. Ova tehnika može uključivati univerzalni postupak davanja koji može da daje niz makromolekula (DNK, RNK, proteini, šećeri i peptidi) u gotovo bilo koji tip ćelija. Ovo omogućava mnoštvo primena koje trenutne tehnologije nedovoljno koriste. Trenutni postupci na bazi lipozoma, nanočestica i elektroporacije, na primer, često sa teškoćom transfektuju određene primarne ćelije (poput imunih ćelija ili matičnih ćelija) i mogu biti neefektivni prilikom davanja proteina i nanočestica (poput kvantnih tačaka). Davanje peptida za primene terapijskog skrininga i mehanizma bolesti mogu takođe biti predmet ovog novog postupka, dok savremene prakse često zahtevaju hemijsku modifikaciju ili inkapsulaciju. Takođe se ovaj postupak može koristiti za primene opažanja na bazi nanočestica radi davanja modifikovanih kvantnih tačaka za obeležavanje organela i mehanistička ispitivanja bolesti.

[0170] Intraćelijsko davanje je kamen temeljac mnogih primena u biološkim istraživanjima od fundamentalnih ispitivanja ekspresije gena do mehanizama bolesti i, kako je navedeno u ovoj prijavi, generisanja iPSC-ova. Utvrđeni postupci davanja, poput onih na bazi lipozoma, polimernih nanočestica i elektroporacije često uključuju upotrebu egzogenih jedinjenja kao nosača za davanje (ili električnih polja u slučaju elektroporacije) i specifični su za materijal i/ili ćeliju. Na primer, lipofektamin (Invitrogen) može davati DNK i RNK molekule (podskupovima ćelijskih linija ili primarnih ćelija), ali ne može formirati pravilan kompleks za davanje proteina ili drugih makromolekula. Elektroporacija, sa druge strane, iako je obećavajuća u svojoj sposobnosti da cilja različite tipove ćelija, prouzrokuje oštećenje ćelije zbog visokih električnih polja i ima ograničenu uspešnost u davanju proteina. Ovo je čini naročito nepogodnom za višestruke transfekcije neophodne u generisanju iPSC, na primer. Peptidi koji prodiru u membranu predstavljaju još jednu tehniku davanja koja je uglavnom specifična za proteine. Ovi postupci na bazi peptida, međutim, imaju nepredvidljiva dejstva na funkcionalnost proteina i dovode do značajne degradacije proteina u endozomu. Stoga, predmet ovog pronalaska koji opisuje univerzalni postupak koji može da daje niz makromolekula (DNK, RNK, proteini, peptidi, mali molekuli) uz minimalnu ćelijsku smrt omogućava kontrolu nad ćelijskom funkcijom bez presedana u jednoj tehnološkoj platformi, čime se obezbeđuju ispitivanja mehanizma bolesti, identifikacija makromolekularnih terapijskih kandidata, usmerena diferencijacija ili reprogramiranje matičnih ćelija i razvoj dijagnostičkih tehnika pomoću reporterskih ćelijskih linija.

4

[0171] Ovde opisani mikrofluidni uređaj može poslužiti kao univerzalna platforma davanja na širokoj osnovi. Kao mikrofluidni uređaj, uživa pogodnosti precizne kontrole nad uslovima obrade na nivou jedne ćelije. Jedinstvena kombinacija kontrole na nivou jedne ćelije i propusnog kapaciteta na makro-skali postavlja ovaj uređaj u jedinstveni položaj u odnosu na postojeće postupke davanja. Dosadašnji podaci su pokazali sposobnost sistema da daje materijal u preko 11 različitih tipova ćelija, uključujući linije ćelija kancera, embrionske matične ćelije, primarne fibroblastove i primarne limfocite. Njen mehanizam mehaničke poracije je takođe omogućio davanje prethodno izazovnih materijala poput ugljeničnih nanocevi i kvantnih tačaka.

[0172] Prethodni radovi koji su koristili rekombinantne proteine za proizvodnju iPSC-ova su demonstrirali nedopustivo niske efikasnosti (<0,01%) i stoga su nepogodni za široku kliničku primenu. Ovde pomenuti uređaj, sistemi i postupci, međutim, su demonstrirali sposobnost davanja proteina direktno u citoplazmu sa visokom efikasnošću i uz minimalnu ćelijsku smrt, čime se obezbeđuje atraktivna mogućnost stvaranja značajnih prednosti u efikasnosti reprogramiranja putem efektivnijeg davanja. Direktnim utvrđivanjem količina dostupnog proteina može se sprovoditi precizna kontrola nad intraćelijskom kinetikom. Drugi postupci reprogramiranja (npr. virusna, ekspresija plazmida i mRNK ekspresija), sa druge strane, oslanjaju se na stohastična dejstva za utvrđivanje nivoa dostupnosti proteina i stoga su nepogodni za kinetička ispitivanja. Niska efikasnost trenutnih metodologija reprogramiranja pokazuje da je proces izrazito senzitivan na stohastične varijacije, a tek će uzak opseg nivoa ekspresije transkripcionog faktora rezultirati reprogramiranjem. Direktnim davanjem proteina u citoplazmu može se sprovoditi kontrola nad dostupnošću proteina bez presedana, a time se mogu konzistentnije nametnuti precizni uslovi neophodni za reprogramiranje. Ovi uslovi, kada se identifikuju i optimizuju, mogu se precizno reprodukovati za svaku ćeliju koja se podvrgava obradi i stoga mogu drastično poboljšati efikasnost reprogramiranja.

[0173] Ova tehnika omogućava/poboljšava različite primene intraćelijskog davanja. Pored toga, striktno mehanička priroda tehnike eliminiše bilo kakve potencijalne komplikacije koje proističu iz upotrebe hemijskih agenasa ili električnih polja. Podaci nisu otkrili nikakve značajne promene u ponašanju ćelije usled ove obrade. Stoga, ovaj sistem je robustan, visokog propusnog kapaciteta, visoke efikasnosti i univerzalan mehanizam intraćelijskog davanja sa naročitom upotrebljivošću u primenama reprogramiranja.

[0174] Dokazi pokazuju da rapidno deformisanje koje nastupa dok ćelija prolazi kroz suženje indukuje formiranje tranzitornih pora u ćelijskoj membrani, što omogućava difuziju makromolekula iz okružujućeg pufera u citozol. Ova tehnika je demonstrirana u 11 različitih tipova ćelija, uključujući linije ćelija kancera, primarne fibroblastove, primarne limfocite i embrionske matične ćelije (bez prouzrokovanja diferencijacije). Jedan prototip može da obradi ∼ 20.000 ćelija/s i radi u opsegu koncentracija ćelija (104-108 ćelija/ml). Problemi koji se odnose na zapušenje su takođe uglavnom ublaženi poboljšanjem eksperimentalnih protokola i projektom čipa tako da svaki uređaj može da

4

obrađuje ∼ 1 milion ćelija pre zapušenja, uz mogućnost čišćenja i reciklaže. Pored toga, višekanalni projekat obezbeđuje značajne viškove, tako da zapušenje jednog kanala ne utiče na učinak drugih. Protok pokrenut pritiskom (pri kontrolisanom konstantnom pritisku) i paralelni projekat kanala obezbeđuju konzistentan profil protoka po kanalu, bez obzira na procenat zapušenih kanala u čipu.

[0175] Demonstrirana je sposobnost uređaja da daje molekule dekstrana u ljudske fibroblastove i embrionske matične ćelije. FIG.35 ilustruje potencijalne prednosti reprogramiranja ćelija. U 3500, prikazana je efikasnost davanja i vijabilnost ljudskih embrionskih matičnih ćelija obrađenih pomoću 10 µm-6 µm uređaja za davanje 3 kDa dekstrana. U 3510, prikazana je western blot analiza davanja c-Myc, Klf-4, Oct-4 i Sox-2 od strane peptida koji prodiru u ćeliju naspram 10 µm-6 µm uređaja u NuFF ćelije. Kolone lizata (Ly) odgovaraju sadržaju proteina ćelija koje su isprane i lizirane, dok kolone bujona odgovaraju sadržaju proteina okruženja medijuma. U 3520 ilustrovani su snimci konfokalne mikroskopije NuFF ćelija fiksirani nakon davanja faktora reprogramiranja. Proteini su tagovani pomoću Alexa 488 konjugovanog anti-FLAG antitela, a jezgro je obojeno pomoću DAPI.

[0176] Dalje, efikasnost davanja uređaja je upoređena sa efikasnošću postupka davanja 9 arginina (CPP) koji se trenutno koristi za reprogramiranje na bazi proteina. Rezultati (3510) su demonstrirali značajan porast količine c-Myc, Klf4, Oct4 i Sox2 datih prema merenju pomoću tehnike western blot. Konfokalna mikroskopija je zatim potvrdila uspešnu lokalizaciju ovih transkripcionih faktora u jezgro ćelije (3520). Jednostavan 2-D model difuzije je razvijen u COMSOL za simulaciju mehanizma davanja na osnovu vrednosti iz literature za difuzivnosti čestice unutar i izvan citoplazme ćelije. Prilagođavanjem ovog modela eksperimentalnim podacima može se proceniti da ova tehnika daje 10-40% materijala davanja prisutnog u puferu u citozol ćelije. Poređenja radi, procenjuje se da CPP postupci za davanje proteina daju samo 0,1% puferskog materijala u citozol. Ovaj pristup stoga obezbeđuje robusni porast količine datog materijala reprogramiranja (10-100 puta). Dalje, to obezbeđuje veću biodostupnost datih transkripcionih faktora.

[0177] FIG.36 opisuje generisanje i karakterizaciju mišjih i ljudskih iPSC linija direktnim davanjem fuzionisanih proteina reprogramiranja. U 3600, prikazana je početna kultura mišjeg hepatocita (prva slika); morfologija nakon 6 ciklusa obrade proteina (druga slika); utvrđene iPS kolonije (treća slika); i AP bojenje utvrđenih iPS kolonija (četvrta slika). U 3610 prikazano je imunobojenje ESC markera (Nanog, Oct4 i SSEA1) u p-miPSC. Jezgra su obojena pomoću DAPI (plavo). U 3620 analiza sekvenciranja bisulfita Oct4 promotora otkriva gotovo kompletno epigenetsko reprogramiranje u p-miPSC-1 i p-miPSC-2 linijama. Otvoreni i zatvoreni krugovi označavaju nemetilisane i metilisane CpG, respektivno. U 3630, potencijal in vivo diferencijacije je analiziran ubrizgavanjem p-miPSC-ova u imunodeficijentne miševe i H&E bojenjem teratoma. Rezultujući teratomi sadržali su tkiva koja predstavljaju sva tri sloja klice; ćelije loze ektoderma (neuralna cev ili epidermis), mezoderma (hrskavica ili mišić) i endoderma (respiratorni epitel ili epitel poput creva). U 3640 himere izvedene iz p-miPSC-1 (levi panel) i p-miPSC-2 (desni panel) u E13.5 fetusima prikazuju visok nivo GFP iz injektovanih p-miPSC-ova. U 3650 do 3670, ljudske iPSC

4

linije, p-hiPSC-01 (3660) i p-hiPSC-02 (3670) se generišu direktnim davanjem četiri faktora reprogramiranja fuzionisana pomoću CPP iz bioptiranih odraslih ljudskih fibroblastova (3650).

[0178] FIG.37 prikazuje preliminarne rezultate reprogramiranja proteina. U 3700, prikazana je progresija morfoloških izmena iz fibroblastova u kolonije. Bele strelice označavaju potencijalne reprogramirane ćelije. Crvene strelice ukazuju na koalescentne iPSC-ove koji formiraju koloniju. U 3710 do 3760, prikazana je ekspresija markera ljudske embrionske matične ćelije Oct4, SSEA-4, Tra-60, Tra-80, alkalne fosfataze (AP) u iPSC kolonijama. Tamo gde je to prikladno, malo polje predstavlja DAPI bojenje nakon obezbojavanja. Skale su na 100 µm.

[0179] Pošto su ljudski iPSC-ovi na bazi proteina generisani i karakterisani, dalje potpuno reprogramirani mišji i ljudski iPSC-ovi su generisani prethodnim postupkom davanja faktora reprogramiranja fuzionisanih pomoću CPP, kako je ispitano svim kriterijumima uključujući epigenetske analize, in vivo pluripotentnost i formiranje himere (FIG.36). Međutim, i pored upotrebe delimično prečišćenih proteina, efikasnost reprogramiranja je i dalje bila niska (<0,1 %) i trajala je duže od postupaka virusnog reprogramiranja. Stoga, pokušalo se sa upotrebom uređaja za davanje 4 proteina za reprogramiranje Oct4, Sox2, Klf4 i c-Myc ljudskim fibroblastovima u koncentraciji pufera od 80 µg/ml. Ćelije su obrađene 4 puta u intervalu od 48 sati između svakog davanja. Sledećih 14-20 dana u kulturi pojavile su se prve reprogramirane kolonije poput hiPSC. Tokom ovog perioda, primećena je tranzicija u morfologiji fibroblastova, pošto su formirali iPSC kolonije i ekspresuju više hESC markera (FIG.37).

[0180] Klatrin, kaveole i makropinocitoza su tri najčešće predlagana mehanizma za endocitotsku internalizaciju. Kako bi se ispitalo da li je endocitoza uključena u makromolekularno davanje nakon rapidnog deformisanja ćelije, mogu se koristiti poznate hemikalije za blokiranje ovih mehanizama. Konkretno, hlorpromazin se može koristiti za inhibiranje endocitoze posredovane klatrinom; genisten za inhibiranje endocitoze posredovane kaveolama; i 5-(N-etil-N-izopropil) amirolid (EIPA,) za inhibiranje makropinocitoze (svi se mogu nabaviti od Sigma Aldrich). HeLa ćelije se mogu inkubirati sa hlorpromazinom (10 µg/ml), genistenom (200 µM) i EIPA (25 µM) tokom 2 sata pre obrade. Dekstran, dsRED i dsRED-9R proteini se zatim mogu davati rapidnim deformisanjem obrađenih ćelija. Respektivne efikasnosti davanja, kako je izmereno pomoću FACS, mogu ilustrovati uticaj inhibicije endocitoze na mehanizme davanja na bazi CPP i uređaja. Eksperimenti ko-lokalizacije sa markerima endozoma (Invitrogen) pomoću konfokalne mikroskopije takođe mogu utvrditi procenat materijala koji je sekvestriran u endozome.

[0181] Moguće je spojiti sistem rapidnog deformisanja ćelije sa drugim utvrđenim postupcima davanja, poput elektroporacije, za ublažavanje endocitotskih mehanizama. Inkorporiranje elektroda blizu suženja može spojiti deformisanje i elektroporaciju kako bi se omogućila dejstva davanja za prinos poboljšanog učinka sistema u odnosu na bilo koji pojedinačni postupak. Pored toga, zajedničko davanje hemijskih agenasa poput hlorokvina (Sigma), različitih polimera ili peptida endozomalnog izlaza, može se koristiti za pomoć prilikom endozomalnog izlaza datih materijala u sistemu rapidnog deformisanja ćelije.

4

[0182] Dok ćelija prolazi kroz suženje, doživljava kratko (∼10-100 µs), ali rapidno smicanje i kompresiju. Prethodno se pokazalo da tangencijalno smicanje indukuje formiranje pora. Međutim, sistem takođe indukuje mehaničku kompresiju. Za procenu ovih parametara, HeLa i HF ćelije se mogu inkubirati u 0,1 µg/ml lantrunkulina A (Invitrogen) tokom 1 sata pre davanja radi depolimerizacije citoskeletona aktina. Fluorescentno obeleženi dekstran (Invitrogen) se zatim može davati populaciji obrađenih ćelija upotrebom uređaja za rapidno deformisanje. Ovi eksperimenti se takođe mogu ponavljati sa ćelijama koje su inkubirane u 10 µM kolhicina (Sigma) tokom 2 sata pre davanja radi depolimerizacije mikrocevaste mreže. FACS analiza se može upotrebiti za merenje efikasnosti davanja toksinom obrađenih ćelija u odnosu na neobrađene kontrolne ćelije. Veruje se da formiranje pora korelira sa brzinom deformisanja ćelije kao odgovor na datu geometriju. Uloga citoskeletona u otporu deformisanju je prethodno ispitana upotrebom uređaja koji sondira deformabilnost ćelije kako bi se obezbedila kvantitativna merenja brzina deformisanja. U ovom postupku, elektrode se postavljaju na bilo kojoj strani suženja, a izmena električnog kapaciteta između dve elektrode se meri dok ćelija prolazi kroz suženje. Izmene električnog kapaciteta u suženju zatim koreliraju sa prolaznim vremenom ćelije, tj. njenim vremenom deformisanja. Učinak davanja uređaja, u gore navedenim eksperimentima, može korelirati sa ovim prethodnim ispitivanjima deformisanja kako bi se proizveo kvantitativni odnos između brzine deformisanja i efikasnosti poracije.

[0183] Slično objavljenim ispitivanjima kojima se karakteriše sonoporacija, tehnike skenirajuće elektronske mikroskopije (SEM) i transmisione elektronske mikroskopije (TEM) mogu se koristiti na uzorcima fiksiranim u definisanim vremenskim intervalima nakon obrade radi direktnog merenja veličine i distribucije predloženih pora tokom vremena. Fiksacija ćelija može se sprovesti na sobnoj temperaturi pomoću rastvora 25% glutaraldehida (Sigma). Uzorci ćelije se zatim mogu dehidrirati sukcesivnim ispiranjima etanola pre snimanja. Okolne SEM (ESEM) tehnike se mogu koristiti za direktno snimanje fiksiranih uzoraka. Zbog njene relativno niske rezolucije (∼200 nm), međutim, ova tehnika je pogodna za detektovanje morfoloških izmena ili povreda skale 1-0,5 µm. Ukoliko ESEM ne uspe da detektuje bilo kakve morfološke izmene, ćelije mogu biti obložene slojem zlata od 1-10 nm pomoću vakuumskog isparivača radi poboljšanja rezolucije do nanometarske skale neophodne za direktno posmatranje finijih struktura pore pomoću SEM. TEM se takođe može koristiti kao alternativna tehnika snimanja ukoliko SEM ne uspe da proizvede željene rezultate. Ove tehnike omogućavaju razlikovanje lokalne povrede i mehanizma uniformne poracije davanja i merenja prosečne veličine i distribucije pore. Veličina i distribucija pore u ćelijama koje su se podvrgle rapidnom deformisanju ćelija mogu se uporediti sa neobrađenim ćelijama. Lokalizovana distribucija pora na površini membrane označava model povrede, dok uniformnija distribucija podržava model uniformne poracije.

[0184] COMSOL softver za multifiziku može se koristiti za konstrukciju 3D modela porisane ćelije.

Upotrebom objavljenih podataka o difuzivitetima citoplazme i pufera, u kombinaciji sa odgovarajućim modelima pora iz mehanističkih ispitivanja moguće je proizvesti predvidljiv model davanja. Ovaj model podražava poroznu membranu koja razdvaja citoplazmu niske difuzivnosti od regiona pufera visoke difuzivnosti. Pod pretpostavkama modela, pore imaju fiksnu veličinu u fiksnom vremenskom periodu pre neposrednog ponovnog zaptivanja. Dinamično ponašanje pora, poput izmena oblika i prečnika, mogu biti inkorporirane u kompleksne modele spajanjem sa MatLab ili drugim softverom. Simulirana predviđanja kvaliteta davanja mogu biti proverena pomoću eksperimentalnih podataka na bazi FACS i elektroforeze gela (npr. western blots). Ova poređenja mogu se koristiti za fino podešavanje modela i time omogućavaju predviđanje količine datog materijala. Mogućnosti predviđanja ovog modela mogu simulirati dejstva različitih veličina pora, vreme otvaranja pora i koncentracije pufera i stoga se mogu koristiti kao smernice za buduća ispitivanja.

[0185] Multifizičke simulacije (npr. COMSOL ili CFD-ACE) takođe se mogu koristiti za modelovanje protoka fluida kroz uređaj. Ovi modeli se mogu koristiti za preciznije predviđanje brzina protoka i opterećenja smicanja u ulaznom, izlaznom i regionima suženja. Ovi podaci se mogu koristiti za pojašnjenje veza između opterećenja smicanja i brzine protoka radi efikasnosti davanja u projektima suženja. Dalje, izgradnjom širokog modela uređaja moguće je ispitivati konzistentnost padova pritiska između različitih kanala i podešavati ulazne i izlazne projekte kako bi se obezbedilo da svi kanali rade u gotovo identičnim uslovima kako bi se poboljšala uniformnost obrade u populaciji ćelija.

[0186] Fenomen davanja može se optimizovati prvenstveno za povećanje efikasnosti davanja i vijabilnosti ćelija. Uniformnost populacije (tj. davanje slične količine materijala svakoj ćeliji) može se koristiti kao sekundarni parametar optimizacije. Početni rezultati su identifikovali brzinu ćelije, dužinu suženja, širinu suženja i oblik ulaznog regiona kao senzitivne parametre. Kompozicija medijuma, sa druge strane, izgleda da nije važan faktor. Moguće je konstruisati niz uređaja, koji sistematski menja dužinu i širinu suženja između 5-50 µm i 4-8 µm respektivno. Mogući su različiti uglovi suženja dok se glavni kanal sužava kako bi formirao suženje. Eksperimentalni podaci o efikasnosti i vijabilnosti ovih uređaja, kako je izmereno pomoću FACS, mogu korelirati sa gore navedenim podacima o modelovanju radi boljeg razumevanja dejstava opterećenja smicanja i dimenzija suženja. Ovaj proces se može ponavljati za različite linije ćelija, koje mogu drugačije odgovarati na obradu. Ovi podaci se mogu koristiti za razvoj uređaja sa optimizovanim geometrijama i radnim parametrima za konkretne (ili njihove konkretne podskupove) tipove ćelija.

[0187] FIG.38 prikazuje mikrografe koji ilustruju naizmenične strukture uređaja. Mikrograf svetlog polja preliminarnog rada kombinuje suženje i elektrode (skala 30 µm). Kako je ilustrovano na FIG.38, uređaj se može modifikovati spajanjem fenomena rapidnog deformisanja sa elektroporacijom. Zlatne elektrode mogu biti inkorporirane na bilo kojoj strani suženja fotolitografskim obrascem i Au odlaganjem radi uvođenja lokalizovanog električnog polja u kanal. Kasniji eksperimenti mogu identifikovati vrednosti radnih parametara (snaga električnog polja, frekvencija i radna brzina) koje demonstriraju poboljšani učinak u odnosu na trenutne postupke. Spajanjem dva nezavisna mehanizma poracije može se izvršiti preciznija kontrola nad sistemom i manipulacija više parametara radi optimizacije učinka sistema za

1

svaki tip ćelija. Pored toga, električna polja se mogu koristiti kao pokretačka snaga za davanje većih naelektrisanih molekula, poput DNK, koji imaju male brzine difuzije.

[0188] Moguća je pojednostavljena verzija sistema za jednokratnu upotrebu pogodna za upotrebu od strane potencijalnih saradnika. Injekciono presovanje ili utiskivanje toplotom PMMA i polikarbonata može se koristiti za primenu verzije uređaja na bazi polimera. Naknadno smanjenje će omogućiti ovim uređajima da se koriste kao alat za jednokratnu upotrebu, čime se poboljšava sterilnost i jednostavnost upotrebe. Pored toga, pojednostavljenjem cevastih veza, montažnog sistema i konfiguracije regulatora pritiska izvodljivo je dostaviti sistem jednostavan za upotrebu.

[0189] Moguće je reprogramiranje fibroblastova na bazi proteina u iPS ćelijama i ispitivanja optimizacije prostora parametara reprogramiranja. Prethodna ispitivanja su pokazala da se iPSC-ovi mogu generisati direktnim davanjem faktora reprogramiranja fuzionisanih pomoću CPP iz ljudskih i mišjih tkiva (FIG.36) i da se ovi iPSC-ovi na bazi proteina mogu diferencirati u funkcionalne ćelije (npr. neuroni dopamina) bez abnormalnih fenotipova povezanih sa virusnim iPSC-ovima. Međutim, zbog mnogih faktora koji uključuju degradaciju proteina u kulturi, neefikasnosti davanja i degradaciju u endozomima ćelija, efikasnosti reprogramiranja direktnim davanjem proteina su previše niske (<0,01%) za bilo kakvu praktičnu upotrebu. Ovde opisani mikrofluidni uređaji mogu značajno povećati efikasnost reprogramiranja na bazi proteina omogućavanjem efikasnog davanja proteina direktno u citoplazmu, čime se izbegava grubo endozomalno okruženje i komplikovan postupak endozomalnog izlaza koji se obično javlja u postupcima davanja slobodnog ili inkapsuliranog proteina.

[0190] Generisanje ljudskih iPSC-ova je olakšano davanjem na bazi mikrofluida. Uređaj se koristi za davanje jednog ili više, npr.4 proteina reprogramiranja (c-Myc (protein, Genbank Accession NP_002458.2; DNK, Genbank Accession NM_002467.4), Klf4 (protein, Genbank Accession AAH30811.1; DNK, Genbank Accession NM_004235.4), Oct4 (protein, Genbank Accession ADW77326.1; DNK, Genbank Accession HQ122675.1) i Sox2 (protein, Genbank Accession NP_003097.1; DNK, Genbank Accession NM_003106.3);) u embrionske ljudske fibroblastove (HF-ovi). Pored Yamanaka četiri faktora (MKOS koji je c-Myc-Klf4-Oct4-Sox2), identifikovano je da nekoliko dodatnih faktora (npr. Lin28 (protein, Genbank Accession AAH28566.1; DNK, Genbank Accession NM_024674.4) i Nanog (protein, Genbank Accession AAP49529.1; DNK, Genbank Accession NM_024865.2), Esrrb (protein, Genbank Accession AAI31518.1; DNK, Genbank Accession NM_004452.3), Glis1 (protein, Genbank Accession NP_671726.2; DNK, Genbank Accession NM_147193.2) i PRDM14 (protein, Genbank Accession NP_078780.1; DNK, Genbank Accession NM_024504.3)) pojačavaju efikasnost reprogramiranja. U celosti je utvrđeno da su sisarska ekspresija i prečišćavanje 6 faktora (MKOS Lin28 i Nanog; MKOSLN) ustanovili bioaktivnost svakog faktora pomoću analize reportera. Ovi faktori mogu biti ekspresovani u E.coli ili u sisarskim ćelijama. Pošto E.coli-ekspresovani proteini nemaju post-translacione modifikacije poput fosforilacije, acetilacije i ubikvitinacije, prečišćeni proteini mogu se koristiti nakon ekspresije u sisarskim ćelijama (HEK293 i CHO). E.coli-ekspresovani proteini (komercijalno dostupni od Stemgent, Cambridge, MA)

2

mogu se koristiti za poređenje. Prvo, FLAG-tagovani faktori reprogramiranja ekspresovani u HEK293 ćelijama pomoću transfekcije mogu biti resuspendovani u NP40 puferu lize ćelije koji sadrži 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% NP-40 i inhibitore proteaze. Nakon centrifugiranja, sakupljena rastvorljiva frakcija može se dodati sa ekvilibrisanim anti-FLAG M2 gelom afiniteta agaroze. Nakon dvostrukog ispiranja pomoću PBS, zadržani FLAG-tagovani proteini mogu biti razblaženi dodavanjem 0,1 mg/ml FLAG peptida (Sigma). Suspendovani rastvor ljudskih fibroblastova i 4 ili 6 prečišćenih proteina mogu se primeniti na uređaj, a obrađene ćelije se mogu postaviti na pločice obložene sa 0,1% želatina sa kondicioniranim hESC medijumima tokom 1, 2, ili 3 dana pre sledećeg ciklusa davanja. Nakon ponavljanja ciklusa davanja proteina (6-16) pomoću mikrofluidnih uređaja, obrađene ćelije biće postavljene na mitomicin C obrađeni mišji embrionski fibroblast (MEF) i uzgajane tokom 3-4 nedelje sa regularnim hESC medijumima. IPSC kolonije mogu postati vidljive u roku od 3 nedelje nakon zasejavanja na MEF. Efikasnost generisanja iPSC-a može se uporediti sa efikasnošću davanja proteina pomoću naših originalnih rekombinantnih proteina fuzionisanih pomoću CPP. Ovi iPSC kandidati mogu biti temeljno ispitani za sve kriterijume autentičnih iPSC-ova, uključujući molekularne i ćelijske karakteristike, kao i in vitro i in vivo pluripotentnost, kako je prethodno opisano. Upotreba 4 ili 6 faktora generisaće iPSC linije sa izrazito poboljšanom efikasnošću. Takođe je moguća dalja ekspresija dodatnih faktora poput Esrrb, Glisl i PRDM14 i upotreba ovih faktora u eksperimentima reprogramiranja.

[0191] Proteini reprogramiranja i mRNK-ovi i/ili mikroRNK-ovi se mogu kombinovano davati.

Mikrofluidni uređaj se može koristiti za davanje ne samo proteina, već i bilo kojih drugih makromolekula. Kako bi se iskoristila ova jedinstvena karakteristika za optimalno integrativno negenomsko reprogramiranje, moguće je kombinovati upotrebu faktora reprogramiranja i mRNK-ova i/ili mikroRNK-ova. Određenije, od izuzetnog je interesa da iPSC linije mogu biti uspešno generisane upotrebom samo mikroRNK-ova. Zaista, transfekcija mikroRNK-ova na bazi lipofektamina može generisati kolonije poput iPSC. Pošto je verovatno da mikroRNK-ovi indukuju reprogramiranje po drugačijem mehanizmu od faktora reprogramiranja, odgovarajuća kombinacija proteina reprogramiranja i mikroRNK-ova preko mikrofluidnog uređaja može dalje pojačati efikasnost reprogramiranja. Kombinovano davanje proteina i mRNK-ova može značajno olakšati efikasnosti reprogramiranja. Stoga, optimalna kombinovana obrada proteina, mRNK-ova i/ili mikroRNK-ova može se postići upotrebom mikrofluidnog uređaja. Iako mikroRNK/mRNK ne može ponuditi jednak nivo kontrole kao proteini, kapacitet uređaja za ispitivanja optimizacije visokog propusnog kapaciteta i dalje obezbeđuje značajne prednosti u pogledu efikasnosti u odnosu na prethodne pristupe.

[0192] Jedinstvene karakteristike mikrofluidnog uređaja mogu omogućiti davanje različitih kvantifikovanih količina svakog faktora, na kontrolisan i ponovljiv način. Optimizacija predmeta ovog pronalaska olakšava razvoj pouzdanog visoko efikasnog alata za davanje proteina u HF-ove. Moguće je pojasniti optimalne količine davanja i frekvencije svakog faktora reprogramiranja. Za razliku od postupaka na bazi mRNK, plazmida ili virusnih postupaka, sistem se ne oslanja na stohastičnu prirodu ekspresije i/ili translacije gena radi utvrđivanja efektivne intraćelijske koncentracije transkripcionih faktora. Stoga, sposobnost uređaja da daje protein direktno u citozol postavlja ga u jedinstven položaj da sprovodi preciznu kontrolu nad intraćelijskim okruženjem. Moguć je niz rasporeda davanja koji menja učestalost obrade (svakih 1, 2 ili 3 dana) i koncentraciju proteina svakog od četiri faktora zasebno. Određenije, na osnovu više izveštaja koji navode da su viši nivoi Oct4 ključni za efikasno reprogramiranje, moguće je testirati dejstvo upotrebe različitih koncentracija Oct4, pri čemu se koncentracije ostalih faktora održavaju na istom nivou. Različite koncentracije c-Myc mogu biti procenjene za dati tip ćelije, pošto je utvrđeno da njegovi visoki nivoi generišu uglavnom transformisane kolonije umesto iPSC-ova u nekim situacijama. Dalje, moguće je testirati dejstvo češće obrade c-Myc zbog izuzetno kratkog vremena poluraspada (∼30 min) uz odgovarajuću koncentraciju.

[0193] Optimizacija temporalne obrade faktora reprogramiranja je olakšana pomoću opisanih postupaka. Svaki faktor ima funkcionalnu ulogu i učestvuje u postupku reprogramiranja. Najmanje jedan, a u nekim slučajevima kombinacija faktora je neophodna za dostizanje željenog rezultata reprogramiranja. Na primer, poznato je da c-Myc potiskuje ekspresiju gena diferencijacije. Pored toga, poznato je da Klf4 ograničava mikroRNK let-7, koji je povezan sa putevima diferencijacije i inhibicijom pluripotentnosti. Stoga, temporalno regulisano reprogramiranje može biti moguće obradom c-Myc i/ili Klf4 za početni period, na osnovu suboptimalnog stanja. Pored toga, iako Nanog nije neophodan za generisanje iPSC, poznato je da je on ključan za krajnje uspostavljanje i održavanje pluripotentnosti. Stoga, dejstvo dodavanja Nanog u kasnijoj fazi postupka reprogramiranja se može testirati. Dalje, sekvencijalna obrada mikroRNK-ova i proteina može se testirati i upoređivati, a efikasnost reprogramiranja se može upoređivati sa onima iz zasebnih obrada ili istovremenih obrada. Ovo temporalno regulisano reprogramiranje je izvodljivo zbog jedinstvene karakteristike mikrofluidnog uređaja i može biti važno za dalju optimizaciju reprogramiranja proteina. Efikasnost reprogramiranja može se izračunati deljenjem broja kolonija na dan 28 sa brojem obrađenih HF ćelija. Kada se završi, analiza regresije se može upotrebiti za dedukovanje relativne važnosti svakog faktora reprogramiranja, njegove optimalne koncentracije, optimalne učestalosti/vremena davanja i, posledično, optimalnog protokola za generisanje iPSC-ova. Sposobnost kontrole količine i vremena proteina koji se daje u svaku ćeliju može istaći funkcionalni značaj svakog faktora u postupku reprogramiranja, čime se dalje poboljšava razumevanje postupka reprogramiranja ćelija i uspostavljanja pluripotentnosti. Pored toga, rezultati ovog rada mogu se koristiti za dalje poboljšanje projekta uređaja kako bi se ispunili zahtevi reprogramiranja i kako bi se omogućio krajnji razvoj klinički primenljivih verzija.

[0194] Upotrebom optimizovanog postupka reprogramiranja proteina kako je gore opisano, protokol se generalno može primeniti na ćelije odraslih ljudskih fibroblastova specifične za pacijente. Pošto su ispitivane efikasna diferencijacija ESC-ova i iPSC-ova u funkcionalnim neuronima dopamina i dejstva transplantacije, moguće je generisati iPSC-ove ili iPSC linije iz ljudskih fibroblastova izvedenih od

4

pacijenata obolelih od Parkinsonove bolesti. Kada se iPSC linije generišu i karakterišu, indukuju se radi diferencijacije u neurone dopamina i karakterizacije njihovih ćelijskih, molekularnih, fizioloških i elektrofizioloških karakteristika. Neuroni dopamina se testiraju za in vivo funkcionalnost nakon transplantacije u životinjskim modelima Parkinsonove bolesti poput genetskog PD modela, miševa obolelih od afakije.

[0195] Davanje proteina na bazi mikrofluida može se koristiti za direktnu konverziju ćelije, npr. za direktnu konverziju fibroblastova u druge tipove ćelija poput funkcionalnih neurona, hepatocita i krvnih zrnaca. U prošlosti, manipulacije su koristile virusnu ekspresiju ključnih transkripcionih faktora, što prouzrokuje značajne hromozomske pukotine i mutacije gena, čime se naglašava potreba za razvojem nevirusnih postupaka konverzije koji ne integrišu genom poput direktnog davanja proteina pomoću ovde opisanih postupaka. Stoga, ovaj uređaj se može koristiti za davanje proteina na bazi mikrofluida za direktnu konverziju ćelija. Pošto je sisarska ekspresija određenih transkripcionih faktora ponekad izazovna, može biti izvodljivije testirati konverziju pomoću jednog ili dva faktora proteina. Međutim, moguće je konvertovati fibroblastove u drugu sudbinu ćelije pomoću jednog faktora, npr. Oct4 ili Sox2 za generisanje krvnih ili neuralnih prekursora respektivno. Ovi proteini su odmah dostupni u prečišćenom obliku, za konverzije ćelije pomoću davanja proteina na bazi mikrofluida.

[0196] FIG.44 je trakasti grafikon koji ilustruje GFP nokdaun u HESC-ovima merenjem GFP intenziteta 48 sati nakon obrade pomoću aktivnih siRNK sekvenci i šifrovanih kontrola upotrebom mikrofluidnog uređaja i povezanih postupaka. FIG.45A i 45B su dva grafika koji ilustruju intenzitet boje i vijabilnost ljudskih embrionskih matičnih ćelija nakon davanja 3 kDa plave boje.

[0197] Drugi načini ostvarivanja su u području ovog pronalaska kako je definisano u priloženim patentnim zahtevima. Na primer, zbog prirode softvera, gore opisane funkcije mogu se primeniti pomoću softvera, hardvera, firmvera, direktne veze ili kombinacije bilo čega od navedenog.

Karakteristike koje primenjuju funkcije takođe mogu biti fizički locirane na različitim položajima, uključujući distribuciju tako da se delovi funkcija primenjuju na različitim fizičkim lokacijama.

Claims (34)

Patentni zahtevi

1. Mikrofluidni sistem za prouzrokovanje perturbacija u ćelijskoj membrani ćelije za intraćelijsko davanje korisnog sadržaja, pri čemu sistem obuhvata:

mikrofluidni kanal koji definiše lumen koji omogućava ćeliji suspendovanoj u puferu da prolazi kroz njega, pri čemu mikrofluidni kanal uključuje suženje koje deformiše ćeliju i koje prouzrokuje navedene perturbacije, pri čemu prečnik suženja iznosi 20-99% prečnika ćelije, i pri čemu prečnik suženja u ćelijskoj membrani indukuje dovoljno velike perturbacije da korisni sadržaj prođe kroz nju.

2. Mikrofluidni sistem prema zahtevu 1, u kojem prečnik suženja takođe smanjuje verovatnoću da će ćelija umreti usled deformisanja.

3. Mikrofluidni sistem prema zahtevu 1 ili 2, u kojem prečnik suženja iznosi 20% do 60% prečnika ćelije.

4. Mikrofluidni sistem prema bilo kom od zahteva 1 do 3, u kojem suženje uključuje ulazni deo, centralnu tačku, i izlazni deo.

5. Mikrofluidni sistem prema zahtevu 4, u kojem

ulazni deo definiše ugao suženja, a ugao suženja je optimizovan radi smanjenog zapušenja kanala ili radi poboljšanog davanja i vijabilnosti ćelije; ili

ulazni deo definiše ugao suženja od 90 stepeni.

6. Mikrofluidni sistem prema bilo kom od zahteva 1 do 5, koji dalje obuhvata više mikrofluidnih kanala raspoređenih u nizovima i/ili paralelno.

7. Mikrofluidni sistem prema bilo kom od zahteva 1 do 6, koji dalje obuhvata pokretač ćelije.

8. Mikrofluidni sistem prema zahtevu 7, u kojem je pokretač ćelije odabran iz grupe koju čine: pumpa pod pritiskom, gasni cilindar, kompresor, vakuum pumpa, špric, špric pumpa, peristaltička pumpa, ručni špric, pipeta, klip, kapilarni efektor, ljudsko srce, ljudski mišić, i gravitacija.

9. Mikrofluidni sistem prema bilo kom od zahteva 1 do 8, u kojem je poprečni presek mikrofluidnog kanala odabran iz grupe koju čine kružni, eliptični, oblik izduženog proreza, kvadratni, šestougaoni, i trougaoni.

10. Postupak za davanje korisnog sadržaja u ćeliju, pri čemu postupak obuhvata

obezbeđivanje ćelije u rastvoru suspenzije;

prolazak rastvora kroz mikrofluidni kanal koji uključuje suženje koje deformiše ćeliju, pri čemu prečnik suženja iznosi 20-99% prečnika ćelije, pri čemu, dok ćelija prolazi kroz suženje, sila deformisanja se primenjuje na ćeliju, što prouzrokuje perturbacije ćelije dovoljno velike za prolazak korisnog sadržaja; i

inkubiranje ćelije u rastvoru koji sadrži korisni sadržaj tokom unapred utvrđenog vremena nakon prolaska kroz suženje.

11. Postupak prema zahtevu 10, pri čemu rastvor suspenzije obuhvata ćeliju i korisni sadržaj pre, tokom i/ili nakon prolaska kroz suženje.

12. Postupak prema zahtevu 10 ili 11, pri čemu prečnik suženja iznosi 20% do 60% prečnika ćelije.

13. Postupak prema bilo kom od zahteva 10 do 12, pri čemu je poprečni presek mikrofluidnog kanala odabran iz grupe koju čine kružni, eliptični, oblik izduženog proreza, kvadratni, šestougaoni, i trougaoni.

14. Postupak prema bilo kom od zahteva 10 do 13, pri čemu prolazak rastvora uključuje prolazak rastvora kroz ulazni deo, centralnu tačku i izlazni deo suženja, u kojem ulazni deo definiše ugao suženja.

15. Postupak prema zahtevu 14, koji dalje obuhvata smanjeno zapušenje mikrofluidnog kanala ili poboljšano davanje i vijabilnost ćelije podešavanjem ugla suženja ulaznog dela.

16. Postupak prema zahtevu 15, pri čemu ulazni deo definiše ugao suženja od 90 stepeni.

17. Postupak prema bilo kom od zahteva 10 do 16, pri čemu prolazak rastvora uključuje prolazak rastvora kroz više mikrofluidnih kanala raspoređenih u nizovima i/ili paralelno.

18. Postupak prema bilo kom od zahteva 10 do 17, pri čemu inkubiranje ćelije u rastvoru koji sadrži korisni sadržaj uključuje inkubiranje ćelije duže od 0,0001 sekunde, poput 0,0001 sekunde do 60 minuta.

19. Postupak prema bilo kom od zahteva 10 do 18, pri čemu sila deformisanja obuhvata kompresiju, ili kompresiju i smicanje.

20. Postupak za davanje korisnog sadržaja u ćeliju, pri čemu postupak obuhvata:

obezbeđivanje ćelije u rastvoru suspenzije;

prolazak ćelije kroz suženje koje deformiše ćeliju, pri čemu prečnik suženja iznosi 20-99% prečnika ćelije tako da se sila deformisanja primenjuje na ćeliju dok prolazi kroz suženje, čime se prouzrokuju perturbacije u ćelijskoj membrani dovoljno velike da kroz nju prođe korisni sadržaj; i

inkubiranje ćelije u rastvoru sa korisnim sadržajem nakon što se ćelija deformiše.

21. Postupak prema zahtevu 20, pri čemu rastvor suspenzije obuhvata ćeliju i korisni sadržaj pre, tokom i/ili nakon prolaska kroz suženje.

22. Postupak prema zahtevu 20 ili 21, pri čemu suženje iznosi 20% do 60% prečnika ćelije.

23. Postupak prema bilo kom od zahteva 20 do 22, pri čemu prolazak rastvora uključuje prolazak rastvora kroz više suženja raspoređenih u nizovima i/ili paralelno.

24. Postupak prema bilo kom od zahteva 20 do 23, pri čemu deformisanje ćelije uključuje deformisanje ćelije tokom 1 µs do 1 ms i/ili pri čemu se inkubiranje javlja tokom 0,0001 sekunde do 20 minuta.

25. Postupak prema bilo kom od zahteva 20 do 24, pri čemu sila deformisanja obuhvata kompresiju, ili kompresiju i smicanje.

26. Postupak za davanje korisnog sadržaja u ćeliju, pri čemu postupak obuhvata:

obezbeđivanje suspenzije ćelije i korisnog sadržaja;

protok suspenzije kroz suženje koje deformiše ćeliju, pri čemu prečnik suženja iznosi 20-99% prečnika ćelije, za iznenadno i privremeno deformisanje ćelije; i

inkubiranje ćelije u suspenziji tokom unapred utvrđenog vremena nakon iznenadnog i privremenog deformisanja.

27. Postupak prema zahtevu 26, pri čemu se suženje nalazi u mikrofluidnom kanalu.

28. Postupak prema zahtevu 26 ili 27, pri čemu prečnik suženja iznosi 20% do 60% prečnika ćelije.

29. Postupak prema bilo kom od zahteva 26 do 28, pri čemu protok suspenzije kroz suženje u mikrofluidnom kanalu deformiše ćeliju suštinski tokom 1 µs do 1 ms.

30. Mikrofluidni sistem za upotrebu sa ćelijom suspendovanom u rastvoru i za prouzrokovanje perturbacija u ćelijskoj membrani, pri čemu sistem obuhvata:

suženje koje deformiše ćeliju, pri čemu prečnik suženja iznosi 20-99% prečnika ćelije za iznenadno i privremeno deformisanje ćelije, pri čemu suženje prouzrokuje perturbacije u ćelijskoj membrani, u kojoj su perturbacije dovoljno velike za prolazak korisnog sadržaja.

31. Mikrofluidni sistem prema zahtevu 30, u kojem suženje iznosi 20% do 60% prečnika ćelije.

32. Mikrofluidni sistem prema zahtevu 30 ili 31, pri čemu je sistem konfigurisan da prouzrokuje iznenadno i privremeno deformisanje ćelije, upotrebom:

(i) mikrofluidnog kanala;

(ii) više mikrostubova konfigurisanih u nizu;

(iii) jedne ili više pokretnih ploča; ili

(iv) materijala za povećanje zapremine.

33. Mikrofluidni sistem prema bilo kom od zahteva 30 do 32, u kojem se ćelija deformiše tokom 1 µs do 1 ms.

34. Postupci kako su opisani u bilo kom od zahteva 10 do 29, pri čemu se postupak koristi za davanje:

(i) DNK, RNK, siRNK, proteina ili obeleženih makromolekula primarnim fibroblastovima i matičnim ćelijama za reprogramiranje ćelija;

(ii) antigena, obeleženih makromolekula, peptida ili RNK primarnim imunim ćelijama;

(iii) najmanje jednog od kvantnih tačaka, fluorescentnih jedinjenja i ugljeničnih nanocevi ciljnoj ćeliji radi pomoći tokom snimanja ciljne ćelije; ili

(iv) lekova ćeliji tumora.