RS59910B1

RS59910B1 - Derivati holana za upotrebu u lečenju i/ili prevenciji fxr i tgr5/gpbar1 posredovanih bolesti

Info

Publication number: RS59910B1
Application number: RS20200163A
Authority: RS
Inventors: Angela Zampella; Stefano Fiorucci
Original assignee: Bar Pharmaceuticals S R L
Priority date: 2014-05-29
Filing date: 2015-05-28
Publication date: 2020-03-31
Also published as: WO2015181275A1; ES2768718T3; MX2020004024A; PT3149019T; ES2938874T3; US10407462B2; SI3149019T1; SMT202300057T1; KR20170008767A; CN106661079A; EA201692316A1; LT3626725T; PL3626725T3; EP3626725B1; HUE061506T2; EP3149019B1; HRP20200225T1; MX388957B; CY1122631T1; PH12016502327A1

Description

Opis

OBLAST TEHNIKE

Ovaj pronalazak se odnosi na jedinjenja koja imaju u osnovi strukturu holana, a navedena jedinjenja se koriste u lečenju i/ili prevenciji FXR i TGR5/GPBAR1 posredovanih bolesti.

STANJE TEHNIKE

Žučne kiseline (BAs) su molekuli signalizacije, koji reaguju sa dve vrste određenih ćelijskih receptora, intraćelijskim jedarnim receptorima i receptorima koji su na površini ćelije. Jedarni receptori obuhvataju farnezoid X receptor (FXR), identifikovan kao endogeni senzor žučne kiseline (Makishima et al Science 1999, 284, 1362; Parks et al. Science 1999, 284, 1365).

FXR, koji se intenzivno ekspresuje u entero-hepatičnim tkivima (jetra i crevo), reguliše homeostazu žučnih kiselina, metaboličke puteve, koji takođe, obuhvataju homeostazu lipida i glukoze (Zhang et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2006, 103, 1006). Sem toga, FXR agonisti obezbeđuju anti-inflamatorne i anti-fibrotske i antikancerske efekte (Renga et al. FASEB J.2012, 26, 3021-3031).

Receptor žučnih kiselina na ćelijskoj površini (GPBAR1, M-BAR1, GP-BAR1, TGR5) pripada rodopsinu-sličnoj superfamiliji G protein kuplovanih receptora (Takeda et al. FEBS Lett.2002, 520, 97; Kawamata et al. J. Biol. Chem.2003, 278, 9435).

Ligand koji se veže za TGR5/GPBAR1 dovodi do povećanja nivoa intracelularnog cAMP uz posledičnu aktivaciju kaskade signaliziranja. GPBAR1 se intenzivno ekspresuje u jetri i crevima, ali takođe i u mišićima, mozgu, adipoznom tkivu, makrofagima i endotelijalnim ćelijama. U mišićima i smeđem adipoznom tkivu, TGR5/GPBAR1 povećavaju potrošnju energije i potrošnju kiseonika (Watanabe et al. Nature 2006, 439, 484) u entero-endokrinim L ćelijama, aktivacija TGR5/GPBAR1 stimuliše sekreciju glukagonu sličnog peptida (GLP)-1, inkretin koji poboljšava oslobađanje insulina iz pankreasa, na koji način se regulišu nivoi glukoze u krvi, gastrointestinalna pokretljivost i apetit (Thomas, et al. Cell. Metab. 2009, 10, 167).

Hemijski, BAs su derivati skraćenog holesterolskog bočnog lanca. Njihov molekulski repertoar se stvara prvo u jetri sa produkcijom primarnih žučnih kiselina, holne kiseline (CA) i henodeoksiholne kiseline (CDCA). Mikrobiotransformacija u crevima generiše sekundarne žučne kiseline, deoksiholnu kiselinu (DCA) i litoholnu kiselinu (LCA). U organizmu čoveka, žučne kiseline su konjugovane sa glicinom i taurinom. Aktivnost prema dva receptora BA je strukturno zavisna od CDCA, najmoćnijeg endogenog FXR aktivatora i, LCA i TLCA, najsnažnijih prirodnih agonista TGR5/GPBAR1.

Holestatski pruritus je označen kao težak nuspojava povezan sa primenom FXR agonista kod PBC i, nedavno ispitivanje ukazuje na TGR5/GPBAR1 kao molekulski target, koji je uključen u razvoj ovog neželjenog efekta (Alemi et al. J. Clin. Invest.2013, 123, 1513-1530).

WO2013192097 opisuje 6-alfa-etil-henodeoksiholnu kiselinu (6-ECDCA), potentan i selektivan FXR agonist, koji pruža antiholestatski efekat. WO2008002573 opisuje derivate žučne kiseline kao FXR ligande u prevenciji ili lečenju FXR-posredovanih bolesti ili stanja.

WO2010014836 i Sato H. (J Med Chem. 2008, 51, 4849) opisuju TGR5 modulatore. D’Amore C. et al. (J. Med. Chem. 2014, 57, 937) opisuje dizajn, sintezu i biološko ispitivanje GPBAR1/FXR dualnih agonista. D’Amore et al. opisuje jedinjenja BAR502 i BAR504 kao intermedijere sinteze.

Iguchi Y. et al. (J Lipid Res. 2010, 51, 1432) opisuje žučne alkoholne funkcionalne grupe kao ligande za TGR5.

Jedinjenja BAR107 je izloženo kao sintetski intermedijer kod Kihira K. et al. (Steroids 1992, 57(4), 193-198).

Swaan P. W.et al. (J. Comp.-Aid. Mol. Des.1997, 11, 581-588) su iz grupe konjugata žučnih kiselina testirali ursoholat (tamo jedinjenje 15, ovde BARn406) u molekularnom modeliranju nosača žučnih kiselina u crevima. BARn406 nije ispoljio detektabilnu sposobnost inhibicije transporta tauroholne kiseline u CaCo-2 ćelijama.

Burns et al. (Steroids 2011, 76(3), 291-300) opisuje sintezu i olfaktornu aktivnost neprirodnih, sulfatnih derivata 5-žučnih kiselina kod morske zmijuljice (Petromyzon marinus). Tamo izloženo jedinjenje 9e (ovde jedinjenje BAR407) nije podstaklo olfaktorni odgovor.

Festa et al. (J. Med. Chem. 2014, 57, 8477) opisuje sintezu selektivnih FXR ili GPBAR1 modulatora.

Cilj ovog pronalaska je otkrivanje novih jedinjenja koja sadrže holansko hemijsko jezgro i, koja moduliraju FXR i/ili TGR5/GPBAR1.

SUŠTINA PRONALASKA

Predmet ovog pronalaska je jedinjenje koje ima formulu

Nađeno je da su jedinjenja kako su gore opisana, modulatori FXR ili/i TGR5/GPBAR1 i, zbog toga su korisna u lečenju bolesti koje FXR i TGR5/GPBAR1 posreduju.

Prema tome, aspekt ovog pronalaska se odnosi na jedinjenje za upotrebu kao lek, navedeno jedinjenje ima formulu:

U sledećem aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na jedinjenja koja imaju formule:

za upotrebu u prevenciji i/ili lečenju gastrointestinalnih poremećaja, bolesti jetre, kardiovaskularnih bolesti, ateroskleroze, metaboličkih bolesti, infektivnih bolesti, kancera, bubrežnih poremećaja, upalnih poremećaja i neuroloških poremećaja (kao što je šlog).

Ovaj pronalazak se, takođe, odnosi na postupak za dobijanje jedinjenja kao što je prethodno opisano.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

Nađeno je da su jedinjenja prema pronalasku visoko selektivni FXR ili TGR5/GPBAR1 modulatori ili dualni FXR i TGR5/GPBAR1 modulatori i, zbog toga, korisna su kao lekovi, posebno za primenu u prevenciji i/ili lečenju gastrointestinalnih poremećaja, bolesti jetre, kardiovaskularnih bolesti, ateroskleroze, metaboličkih bolesti, metaboličkih poremećaja, infektivnih bolesti, kancera, bubrežnih poremećaja, inflamatornih poremećaja i neuroloških poremećaja, kao što je šlog.

U izvesnim realizacijama oboljenje jetre je izabrano u grupi koja se sastoji od hroničnih bolesti jetre, uključujući primarnu bilijarnu cirozu (PBC), cerebrotendinoznu ksantomatozu (CTX), primarni sklerozirajući holangitis (PSC), holestazu izazvanu lekovima, intrahepatičnu holestazu u trudnoći, holestazu povezanu sa parenteralnom ishranom, prekomerni rast bakterija i holestazu povezanu sa sepsom, autoimuni hepatitis, hronični virusni hepatitis, alkoholnu bolest jetre, nealkoholnu bolest masne jetre (NAFLD), nealkoholni steatohepatitis (NASH), transplantaciju jetre udruženu sa bolešću domaćin protiv kalema, transplantaciju sa živog donora, regeneraciju jetre, kongenitalnu fibrozu jetre, granulomatoznu bolest jetre, intraili ekstrahepatični malignitet, Wilson-ovu bolest, hemohromatozu i nedostatak alfa 1-antitripsina.

U izvesnim realizacijama, gastrointestinalna bolest je izabrana iz grupe u kojoj su: inflamatorna bolest creva (IBD) (uključujući Crohn-ovu bolest, ulcerozni kolitis i neodređeni kolitis), sindrom iritabilnog creva (IBS), prekomerni rast bakterija, akutni i hronični pankreatitis, malapsorpcija, postradijacioni kolitis i mikroskopski kolitis.

U izvesnim realizacijama, bubrežna bolest je izabrana iz grupe u kojoj su: dijabetična nefropatija, hipertenzivna nefropatija, hronična bolest glomerula, uključujući hronični glomerulonefritis i hroničnu transplantacionu glomerulopatiju, hronične tubulointersticijalne bolesti i vaskularni poremećaji bubrega.

U izvesnim realizacijama, kardiovaskularna bolest je izabrana iz grupe u kojoj su: ateroskleroza, dislipidemija, hiperholesterolemija, hipertrigliceridemija, hipertenzija, takođe poznata kao arterijalna hipertenzija, inflamatorna srčana bolest, uključujući miokarditis i endokarditis, ishemijska bolest srca, stabilna angina, nestabilna angina, infarkt miokarda, cerebrovaskularna bolest uključujući ishemijski šlog, plućna srčana bolest uključujući plućnu hipertenziju, bolest perifernih arterija (PAD), takođe poznata kao periferna vaskularna bolest (PVD), bolest okluzije perifernih arterija i periferna obliterativna arteriopatija.

U izvesnim realizacijama, metabolička bolest je izabrana iz grupe u kojoj su: insulinska rezistencija, metabolički sindrom, Tip I i Tip II dijabetes, hipoglikemija, poremećaji adrenalnog korteksa, uključujući insuficijenciju adrenalnog korteksa.

U izvesnim realizacijama, metabolički poremećaj je izabran u grupi koja se sastoji od gojaznosti i stanja povezanih sa barijatrijskom hirurgijom.

U izvesnim realizacijama, kancer je izabran iz grupe u kojoj su: kancer jetre, kanceri žučnih puteva, kancer pankreasa, kancer želuca, kancer debelog creva i rektuma, kancer dojke, kancer jajnika i stanja povezana sa rezistencijom na hemoterapiju.

U izvesnim realizacijama, infektivni poremećaji su izabrani iz grupe u kojoj su bolest povezana sa humanom imunodeficijencijom (AIDS) i srodni poremećaji, infekcije virusom B i virusom C.

U izvesnim realizacijama, upalni poremećaj je izabran iz grupe u kojoj su: reumatoidni artritis, fibromijalgija, Syogren-ov sindrom, skleroderm, Behcet-ov sindrom, vaskulitis i sistemski lupus eritematozus.

Podaci o aktivnosti izvesnih jedinjenja pronalaska na FXR i TGR5/GPBAR1 su opisani u sledećoj tabeli. U ovoj tabeli, aktivnosti za jedinjenja pronalaska na FXR i GPBAR1 su upoređene sa onima za referentno jedinjenje, tj. CDCA za FXR i TLCA za TGR5/GPBAR1. Svako jedinjenje je ispitano u koncentraciji od 10 mikroM i, transaktivaciona aktivnost CDCA na FXR i TLCA na CRE (tj. TGR5/GPBAR1) se smatra jednakom 100%.

Tabela 1

U jednom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na gore-pomenuta jedinjenja, pri čemu su jedinjenja FXR i TGR5/GPBAR1 dualni agonisti. Odabrani primer iz ove grupe je BAR502. Iznenađujuće, BAR502 ne izaziva svrab kada se daje životinjama, koje su holestatične primenom ANIT ili Estrogena. Kod holestatskih sindroma, smatra se da nakupljanje žučnih kiselina u organizmu izaziva svrab. Nedavno se pokazalo da TGR5/GPBAR1 posreduje svrab uzrokovanu intradermalnom administracijom DCA i LCA (Alemi et al. J. Clin. Invest. 2013, 123, 1513-1530). U kliničkim studijama, primenjivanje obetiholne kiseline pacijentima koji boluju od primarne bilijarne ciroze (PBC) dovelo je do jakog svraba kod otprilike 80% pacijenata. Jedna specifičnost i iznenađujuća prednost BAR502 je ta što ovaj agens ne izaziva svrab kada se daje životinjama koje su holestatične administracijom α-naftil-izotiocijanata (ANIT) ili 17αetinilestradiola (dva potvrđena modela holestaze). U ovim eksperimentalnim okolnostima, primena BAR502 povećava preživljavanje, umanjuje serumske nivoe alkalne fosfataze i snažno modulira ekspresiju kanonskih FXR targetnih gena, uključujući OSTa, BSEP, SHP i MDR1 u jetri, bez izazivanja svraba. U modelu 17α-etinilestradiola, BAR502 ublažava holestazu i ponovo oblikuje bazen žučnih kiselina bez izazivanja svraba, pokazujući da u modelima neobstruktivne holestaze, BAR502 ublažava oštećenje jetre bez izazivanja svraba.

U jednom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na jedinjenja koja su visoko selektivni FXR agonisti bez efekata na GPBAR1 kada se sama primenjuju, ali su efektivna u inhibiciji aktivacije GPBAR1 prouzrokovane sa TLCA (10 µM), te se tako ponašaju kao GPBAR1 antagonisti. U jednom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na jedinjenja formule (I) pri čemu su jedinjenja visoko selektivni GPBAR1 agonisti bez efekta na FXR. U jednom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na jedinjenja formule (I) pri čemu su jedinjenja visoko selektivni GPBAR1 antagonisti bez efekta na FXR.

Ovaj pronalazak se, takođe, odnosi na postupak za dobijanje jedinjenja kakvo je gore opisano.

U aspektu, ovo izlaganje se odnosi na postupak za dobijanje jedinjenja formule (I) kao što je gore opisano, u kom n=0, navedeni postupak obuhvata dovođenje u kontakt jedinjenja formule (XII)

sa HCOOH i HClO4i naknadno, dovođenje u kontakt nastalog jedinjenja sa TFA, trifluorosirćetnim anhidridom i NaNO2za dobijanje jedinjenje formule (VII)

Jednostavne i dobro poznate hemijske transformacije zatim mogu prevesti jedinjenje formule (VII) u jedinjenje formule (I) kao što je prethodno opisano, tako da se -CN grupa može hidrolizovati u COOH, kao što se i OCHO grupa može hidrolizovati u hidroksil grupu ili =O grupa redukovati u hidroksil grupu.

U aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na postupak za dobijanje prethodno opisanih jedinjenja, navedeni postupak obuhvata podvrgavanje jedinjenja formule (VIII) aldolnoj kondenzaciji, pa se tako dovodi u kontakt jedinjenje formule (VIII)

u kojoj n = 0,1, P je zaštita alkoholne funkcionalne grupe, poželjno OAc, sa alkil litijumom, kao što je nBuLi, a zatim sa acetaldehidom, poželjno takođe u prisustvu BF3(OEt)2, za dobijanje jedinjenja formule (IX)

gde su n i P, kao što su prethodno opisani.

Aldolna kondenzacija je reakcija dodavanja aldola, koja može uključuti nukleofilnu adiciju keton enolata na aldehid, pri čemu kada se formira, aldol dovodi do gubitaka molekula vode da se formira α,β-nezasićeno karbonilno jedinjenje.

Podvrgavanjem jedinjenja formule (IX) katalitičkoj hidrogenaciji, poželjno sa H2u prisustvu Pd(OH)2/C, može se dobiti jedinjenje formule (X)

U aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na postupak za dobijanje jedinjenja formule

navedeni postupak obuhvata dovođenje u kontakt jedinjenja formule (XIV)

u kojoj n je 0, R8je OAc;

sa MeONa/MeOH radi epimerizacije na C6 stereocentru, kako se dobija jedinjenje formule (XI)

u kom: n je 0, R8je kao što je prethodno opisano. U slučaju da je R8OAc, tretman sa MeONa/MeOH istovremeno postiže hidrolizu C3 acetoksi grupe, kako se dobija jedinjenje formule (XI) u kojoj R8je OH.

Redukcija karbonila na C7 se može postići dovođenjem u kontakt jedinjenja formule (X) sa NaBH4ili Ca(BH4)2kako se dobija smeša beta-OH (do 70% u slučaju jedinjenja BAR501) i alfa-OH na C7. Dalji tretman sa LiBH4redukuje, ukoliko ga ima, funkcionalnu grupu metil estra u bočnom lancu u -CH2OH i OAc zaštitnu grupu na C3 u OH.

Redukcija karbonila na C7 se može postići dovođenjem u kontakt jedinjenja formule (XI) ili odgovarajućeg jedinjenja, koje ima COOH na bočnom lancu, sa LiBH4dobijajući skoro isključivo alfa-OH na C7. Istovremeno, tretman sa LiBH4redukuje, ukoliko ga ima, funkcionalnu grupu metil estra u bočnom lancu u -CH2OH i OAc zaštitnu grupu na C3 u OH. Podvrgavanje jedinjenja formule (IX) redukciji sa NaBH4prati tretman sa LiBH4, proizvodeći redukciju na C7 i na bočnom lancu uz istovremeno uklanjanje zaštite, naročito deacetilaciju, na C3, kako se dobija jedinjenje u kome je R1alfa-OH, R2je =CH-CH3, R3je beta-OH, n=0,1 i R je CH2OH.

Podvrgavanjem gornjeg jedinjenja, u kome je R1alfa-OH, R2je =CH-CH3, R3je beta-OH, n=0,1 i R je CH2OH, kataltičkoj hidrogenaciji, poželjno sa H2i Pd(OH)2/C, može se dobiti jedinjenje formule (I), u kome je R1alfa-OH, R2je alfa-Et, R3je beta-OH, n=0,1 i R je CH2OH.

Ovaj pronalazak će se bolje razumeti kroz primere i eksperimentalni deo u nastavku.

EKSPERIMENTALNI DEO

Hemija

PRIMER 1. Izrada jedinjenja koja imaju formulu (I) u kojoj R2=H (nije deo pronalaska)

PRIMER 1A. Sinteza bis-homoursodeoksiholanskih derivata

Niz reakcija u četiri koraka sa jedinjenjem 1, uključujući zaštitu funkcionalnih alkoholnih grupa na C3 i C7, redukciju metil estra u bočnom lancu i zatim, Swern oksidacija/ Wittig C2 homologacija u jednom sudu, proizvodi zaštićeni metil estar Δ<24,25>-bis-homoUDCA. Hidrogenacijom dvostruke veze bočnog lanca i uklanjanjem zaštite sa alkoholne funkcije, dobija se bishomoUDCA metil estar 4, koji je korišćen kao polazni materijal u izradi BAR305 i njegovog odgovarajućeg alkohola, BAR304, putem obrade sa LiOH odnosno, LiBH4.

a) 2,6-lutidin, t-butildimetilsilil trifluorometansulfonat, CH2Cl2, 0<O>C; b) LiBH4, MeOH suv, THF, 0<O>C, kvantitativan prinos kroz dva koraka; c) DMSO, oksalil hlorid, suv TEA, CH2Cl2, -78<O>C zatim, metil(trifenilfosforaniliden)acetat 76%; d) H2, Pd(OH)2/C Degussa tip, THF/MeOH 1:1, kvantitativan prinos; e) HCl 37%, MeOH, kvantitativan prinos; f)

NaOH 5% u MeOH/H2O 1:1 v/v, 60%; g) LiBH4, MeOH suv, THF, 0<O>C, 77%.

Koraci a,b) Izrada 3α,7β-di(terc-butildimetilsililoksi)-5β-holan-24-ola (2)

Jedinjenje 1 (1.2 g, 3 mmol) se zaštiti na dve alkoholne funkcionalne grupe, sledeći isti postupak sinteze opisan u J. Med. Chem. 2014, 57, 937 kako se dobija 1.9 g metil 3α,7βdi(terc-butildimetilsililoksi)-5β-holan-24-oata (kvantitativni prinos) u formi bezbojnih iglica, koje se podvrgnu sledećem koraku bez prethodnog prečišćavanja.

Metanol (850 µL, 21 mmol) i LiBH4(10.5 mL, 2M in THF, 21 mmol) se dodaju u rastvor metil estra (1.9 g, 3 mmol) u suvom THF-u (30 mL) na 0° tačno sledeći isti postupak sinteze opisan u J. Med. Chem. 2014, 57, 937. Prečišćavanjem na silika gelu (heksan/etil acetat 99:1 i 0.5% TEA) se dobija jedinjenje 2 u vidu bele čvrste materije (1.8 g, kvantitativni prinos).

Korak c) Izrada metil 3α,7β-di(terc-butildimetilsililoksi)-25,26-bishomo-5β-hol-24-en-26-oata (3) u jednom sudu

DMSO (2.1 mL, 30 mmol) se tokom 15 min u vidu kapi doda u rastvor oksalil hlorida (7.5 mL, 15 mmol) u suvom dihlorometanu (30 mL) na -78 °C u atmosferi argona. Posle 30 min, putem kanile se doda rastvor jedinjenja 2 (1.8 g, 3 mmol) u suvom CH2Cl2i, mešavina se meša na -78°C u toku 30 min. Kap po kap se doda Et3N (2.5 mL, 18 mmol). Posle 1h, dodaje se metil(trifenilfosforaniliden)acetat (2.0 g, 6 mmol) i, mešavina se ostavlja da se zagreje do sobne temperature. Doda se zasićeni NaCl rastvor i, vodena faza se ekstrahuje sa dietil etrom (3x100 mL). Spojene organske faze se isperu sa vodom, osuše (Na2SO4) i ukoncentrišu. Prečišćavanjem na silika gelu (heksan-etil acetat 95:5 i 0.5% TEA) se dobija jedinjenje 3 u vidu bezbojnog ulja (1.5 g, 76%).

Korak d) Izrada metil 3α,7β-di(terc-butildimetilsililoksi)-25,26-bishomo-5β-holan-26-oata

Rastvor jedinjenja 3 (1.5 g, 2.3 mmol) u suvom THF/suvom MeOH (25 mL/25 mL, v/v) se hidrogenizuje u prisustvu Pd(OH)25 mas.% na aktiviranom uglju Degussa tipa (20 mg) sledeći isti postupak sinteze opisan u J. Med. Chem. 2014, 57, 937 kako se dobija metil 3α,7βdi(terc-butildimetilsililoksi)-25,26-bishomo-5β-holan-26-oat (1.5 g, kvantitativni prinos), koji se podvrgne koraku e) bez prethodnog prečišćavanja.

Korak e) Izrada metil 3α,7β-dihidroksi-25,26-bishomo-5β-holan-26-oata (4)

Metil 3α,7β-di(terc-butildimetilsililoksi)-25,26-bishomo-5β-holan-26-oat (1.5 g) se rastvori u metanolu (70 mL). U rastvor se doda HCl (2 mL, 37% v/v) sledeći isti postupak sinteze opisan u J. Med. Chem. 2014, 57, 937 kako se dobija jedinjenje 4 u vidu bezbojne amorfne čvrste materije (1.0 g, kvantitativni prinos).

Korak f) Izrada 3α,7β-dihidroksi-25, 26-bishomo-5β-holan-26-oinske kiseline (BAR305)

Deo jedinjenja 4 (430 mg, 1 mmol) je hidrolizovan sa NaOH (400 mg, 10 mmol) u rastvoru MeOH:H2O 1:1 v/v (20 mL) u toku 4 h na refluksu. Analitički uzorak je prečišćen pomoću HPLC na Nucleodur 100-5 C18 (5 µm ; 4.6 mm i.d. x 250 mm) uz MeOH/H2O (95:5) kao eluent (brzina protoka 1 mL/min) (tR=5 min).

BAR305: C26H44O4

<1>H NMR je zabeležen na Varian Inova 400 MHz, primenom CD3OD kao rastvarača: δ 3.47 (2H, m, H-3 and H-7), 2.27 (2H, t, J = 7.2 Hz, H2-25), 0.96 (3H, s, H3-19), 0.94 (3H, d, J = 6.5 Hz, H3-21), 0.70 (3H, s, H3-18).

<13>C NMR je zabeležen na Varian Inova 100 MHz, primenom CD3OD kao rastvarača: δ 178.2, 72.1, 71.9, 57.6, 56.7, 44.8, 44.5, 44.0, 41.6, 40.7, 38.6, 38.0, 36.9, 36.8, 36.1, 35.3, 35.2, 30.9, 29.8, 27.9, 26.7, 26.6, 23.9, 22.4, 19.3, 12.7.

Korak g) 25, 26-bishomo-5β-holan-3α,7β, 26-triol (BAR304)

Jedinjenje 4 (500 mg, 1.2 mmol) je redukovano pod istim uslovima izvođenja, kakvi su opisani u koraku b). Prečišćavanjem na silika gelu (CH2Cl2/metanol 9:1) se dobija BAR304 u vidu bezbojnog ulja (375 mg, 77%). Analitički uzorak je prečišćen pomoću HPLC na Nucleodur 100-5 C18 (5 µm; 4.6 mm i.d. x 250 mm) uz MeOH/H2O (85:15) kao eluent (brzina protoka 1 mL/min) (tR=9 min).

BAR 304: C26H46O3

<1>H NMR je zabeležen na Varian Inova 400 MHz, primenom CD3OD kao rastvarača: δ 3.53 (2H, t, J = 6.5 Hz, H2-26), 3.48 (2H, m, H-3 and H-7), 0.95 (3H, s, H3-19), 0.93 (3H, d, J = 6.5 Hz, H3-21), 0.70 (3H, s, H3-18).

<13>C NMR je zabeležen na Varian Inova 100 MHz, primenom CD3OD kao rastvarača: δ 72.1, 71.9, 63.0, 57.5, 56.7, 44.7, 44.4, 44.0, 41.6, 40.7, 38.5, 37.9, 37.2, 37.0, 36.1, 35.2, 33.7, 30.9, 29.8, 27.9, 27.4, 27.1, 23.9, 22.4, 19.4, 12.7.

PRIMER 1B. Sinteza 3α,7β-dihidroksi-24-nor-5β-holan-23-il-23-natrijum sulfata (BAR106) i 3α,7β-dihidroksi-24-nor-5β-holan-23-ola (BAR107)

BAR106 je proizveden od UDCA, nizom reakcija, koje obuhvataju performilaciju na hidroksilnim grupama, Beckmann-ovu degradaciju jednog ugljenika na C24 i transformaciju karboksilne grupe na C23 u odgovarajući metil estarski intermedijer. Izvodi se zaštita na hidroksilnim grupama na C-3 i C-7 u vidu silil etara, redukcija metil estra na C23, sulfatacija na C23 primarne alkoholne funkcionalne grupe i konačno, uklanjanje zaštite, na koji način se dobija sirovi BAR106 u vidu amonijum soli. Prečišćavanjem na Amberlitu i zatim, pomoću HPLC, dobija se naslovljeni BAR106 u vidu natrijumove soli.

a) HCOOH, HClO496%; b) TFA, trifluorosirćetni anhidrid, NaNO2, 96%; c) KOH 30% u MeOH/H2O 1:1 v/v, 97%; d) p-TsOH, MeOH suv, 98%; e) 2,6-lutidin, t-butildimetilsilil trifluorometansulfonat, CH2Cl2, 0<O>C, 88%; f) LiBH4, MeOH suv, THF, 0<O>C, kvantitativan prinos; g) Et3N.SO3, DMF, 95<O>C; h) HCl 37%, MeOH, onda amberlit CG-120, MeOH,

86% kroz dva koraka; i) LiBH4, MeOH suv, THF, 0<O>C, kvantitativan prinos.

Koraci a,d) Izrada metil 3α,7β-dihidroksi-24-nor-5β-holan-23-oata (6)

Ursodeoksiholna kiselina (2.0 g, 5.1 mmol) je transformisana u metil 3α,7βdihidroksi-24-nor-5β-holan-23-oat (6, 1.6 g, 87%) sledeći isti postupak sinteze opisan u: J. Med. Chem. 2014, 57, 937.

Korak e) Izrada metil 3α,7β-di(terc-butildimetilsililoksi)-5β-holan-24-oata

Jedinjenje 6 (1.2 g, 3.0 mmol) se zaštiti na hidroksilnim grupama pod istim uslovima izvođenja, kakvi su opisani u Primeru 1A korak a). Prečišćavanjem fleš hromatografijom na silika gelu, uz primenu heksan/etil acetata 9:1 i 0.5% trietilamina kao eluenata, dobija se zaštićeni metil estar (1.6 g, 88%).

Korak f) Izrada 3α,7β-di(terc-butildimetilsililoksi)-5β-holan-24-ola (7)

Metil estar bočnog lanca (818 mg, 1.3 mmol) je redukovan pod istim uslovima izvođenja, kakvi su opisani u Primeru 1A korak b). Prečišćavanjem fleš hromatografijom na silika gelu, uz primenu heksan/etil acetata 98:2 i 0.5% trietilamina kao eluenata, dobija se jedinjenje 7 (770 mg, kvantitativni prinos).

Koraci g, h) Izrada 3α,7β-dihidroksi-24-nor-5β-holan-23-il-23-natrijum sulfata (BAR106)

Trietilamin-sumpor trioksidni kompleks (2.0 g, 11 mmol) se doda rastvoru jedinjenja 7 (660 mg, 1.1 mmol) u suvom DMF-u (25 mL) sledeći isti postupak sinteze opisan u: J. Med. Chem. 2014, 57, 937. HPLC na Nucleodur 100-5 C18 (5 µm; 10 mm i.d. x 250 mm) sa MeOH/H2O (65:35) kao eluentom (brzina protoka 3 mL/min), obezbeđuje 442 mg (86% kroz dva koraka) BAR106 (tR=8.4 min).

BAR 106: C23H39NaO6S

<1>H NMR je zabeležen na Varian Inova 400 MHz, primenom CD3OD kao rastvarača: δ 4.04 (2H, m, H2-23), 3.48 (2H, m, H-3 and H-7), 1.00 (3H, d, J= 6.5 Hz, H3-21), 0.97 (3H, s, H3-19), 0.72 (3H, s, H3-18).

Korak i) Izrada 3α,7β-dihidroksi-24-nor-5β-holan-23-ola (BAR107)

Jedinjenje 6 se transformiše u BAR107 pod istim uslovima izvođenja, kakvi su opisani u koraku f.

BAR107: C23H40O3

<1>H NMR je zabeležen na Varian Inova 400 MHz, primenom CD3OD kao rastvarača: δ 3.60 (1H, m, H-7), 3.51 (1H, m, H-3), 3.50 (2H, m, H2-23), 0.97 (3H, d, ovl, H3-21), 0.96 (3H, s, H3-19), 0.72 (3H, s, H3-18).

<13>C NMR je zabeležen na Varian Inova 100 MHz, primenom CD3OD kao rastvarača: δ 72.1, 71.9, 60.8, 57.5, 57.1, 44.8, 44.5, 44.0, 41.6, 40.7, 39.9, 38.6, 38.0, 36.1, 35.2, 34.1, 31.0, 29.8, 27.9, 23.9, 22.4, 19.5, 12.6;

Primer 1C. Sinteza 7α-hidroksi-5β-holan-24-il-24-natrijum sulfata (BAR402)

Tozilacijom i eliminacijom na C-3 hidroksilnoj grupi u metil estru 8 a zatim, redukcijom dvostruke veze, potom tretmanom sa LiBH4i regio-selektivnom sulfatacijom na C-24 primarne hidroksilne grupe, dobija se BAR402.

a) p-TsOH, piridin, kvantitativan prinos; b) LiBr, Li2CO3, DMF, refluks; c) H2, Pd(OH)2, THF/MeOH 1:1, sobna temperatura, kvantitativan prinos; d) LiBH4, MeOH suv, THF, 0<O>C, 79%; e) Et3N.SO3, DMF, 95<O>C.

Koraci a-c) Izrada metil 7-keto-5β-holan-24-oata (9)

U rastvor jedinjenja 8 (965 mg, 2.5 mmol) u suvom piridinu (100 mL), doda se tozil hlorid (4.7 g, 25.0 mmol) i, mešavina se meša na sobnoj temperaturi u toku 4 h. Smeša se izruči u hladnu vodu (150 mL) i ekstrahuje sa CH2Cl2(3 x 150 mL). Spojeni organski slojevi se isperu sa zasićenim NaHCO3rastvorom (150 mL) i vodom (150 mL), a zatim, osuše preko anhidrovanog MgSO4i upare u vakuumu, kako se dobija 1.4 g metil 3α-toziloksi-7-keto-5βholan-24-oata (kvantitativni prinos). Dodaju se litijum bromid (434 mg, 5.0 mmol) i litijum karbonat (370 mg, 5.0 mmol) rastvoru 3α-toziloksi-7-keto-5β-holan-24-oata (1.4 g, 2.5 mmol) u suvom DMF-u (30 mL) i, mešavina se u toku 2 h podvrgne refluksu. Posle hlađenja do sobne temperature, mešavina se polako izruči u 10% HCl rastvor (20 mL) i ekstrahuje sa CH2Cl2(3 x 50 mL). Spojeni organski slojevi se uzastopno isperu sa vodom, zasićenim NaHCO3rastvorom i vodom, a zatim osuše preko anhidrovanog MgSO4i upare do suvog, kako se dobija 965 mg uljastog ostatka (kvantitativni prinos), koji se podvrgava sledećem koraku bez prethodnog prečišćavanja. Hidrogenacijom na Pd(OH)2pod istim uslovima izvođenja, kakvi su opisani u Primeru 1A, korak d, dobija se 975 mg jedinjenja 9 (kvantitativni prinos), koje se podvrgava sledećem koraku bez prethodnog prečišćavanja.

Korak d) Izrada 5β-holan-7α,24-diola

Tretiranjem jedinjenja 9 sa LiBH4pod istim uslovima izvođenja, kako su opisani u Primeru 1A korak b i prečišćavanjem na silika gelu (etil acetat-heksan, 85:15), dobija se 5βholan-7α,24-diol u vidu čvrste materije bele boje (714 mg, 79%).

Korak e) Izrada 7α-hidroksi-5β-holan-24-il-24-natrijum sulfata (BAR402)

Sulfatacija na C24 je izvedena u istim uslovima izvođenja, koji su opisani u Primeru 1B korak g), kako se dobija sirovi BAR402 u vidu amonijumske soli. RP18/HPLC na Nucleodur 100-5 C18 (5 µm; 10 mm i.d. x 250 mm) sa MeOH/H2O (90:10) kao eluentom (brzina protoka 3 mL/min) obezbeđuje BAR402 (tR= 6.6 min) u vidu natrijumove soli.

BAR402: C24H41NaO5S

<1>H NMR je zabeležen na Varian Inova 400 MHz, primenom CD3OD kao rastvarača: δ 3.96 (2H, t, J = 6.6 Hz, H2-24), 3.78 (1H, br s, H-7), 0.96 (3H, d, J = 6.5 Hz, H3-21), 0.92 (3H, s, H3-19), 0.69 (3H, s, H3-18);

<13>C NMR je zabeležen na Varian Inova 100 MHz, primenom CD3OD kao rastvarača: δ 69.7, 69.4, 57.7, 51.6, 45.0, 43.8, 41.2, 41.0, 39.0, 37.1, 37.0 36.3, 34.2, 33.3, 31.7, 29.5, 29.0, 27.3, 24.8, 24.3, 22.7, 21.9, 19.2, 12.3.

PRIMER 2. Izrada jedinjenja formule (I) u kojoj R2=Et ili =CH-CH3

PRIMER 2A. Sinteza 6β-etil-3α,7β-dihidroksi-5β-holan-24-ola (BAR501)

Formiranje metil estra i acetilacija na C-3 hidroksil grupi u 7-KLCA obrazuje intermedijer 10 u prinosu od 84% kroz dva koraka. Aldolna adicija na silil enol etarski intermedijer generiše jedinjenje 11 koje se hidrogenizuje na egzocikličnoj dvostrukoj vezi (H2na Pd(OH)2) kako se dobija jedinjenje 12 u 80% prinosu kroz tri koraka. Tretman sa NaBH4u metanolu, a zatim redukcija sirovog proizvoda reakcije sa LiBH4obezbeđuje smešu, čijim se HPLC prečišćavanjem (88% MeOH:H2O) dobija čist BAR501 u 79% prinosu u odnosu na njegov C7 epimer, BAR504-6b.

a) p-TsOH, MeOH suv; b) sirćetni anhidrid, piridin, 84% kroz dva koraka; c) DIPA, n-BuLi, TMSCl, suv TEA, suv THF, -78<O>C; d) acetaldehid, BF3(OEt)2, CH2Cl2, -60<O>C, 80% kroz dva koraka; e) H2, Pd(OH)2, THF/MeOH 1:1, kvantitativan prinos; f) NaBH4, MeOH; l) LiBH4, MeOH suv, THF, 0<O>C, 79% kroz dva koraka.

Koraci a-d). Izrada metil 3α-acetoksi-6-etiliden-7-keto-5β-holan-24-oata (11)

U rastvor 7-ketolitoholne kiseline (5 g, 12.8 mmol), rastvorene u 100 mL suvog metanola se doda p-toluensulfonska kiselina (11 g, 64.1 mmol). Rastvor se ostavi da stoji na sobnoj temperaturi 2 h. Smeša se ugasi dodatkom zasićenog NaHCO3rastvora. Nakon uparavanja metanola, ostatak se ekstrahuje sa EtOAc (3x150 mL). Spojeni ekstrakti se isperu sa slanim rastvorom, osuše sa Na2SO4i upare, kako se dobija metil estar u vidu amorfne čvrste materije (5.13 g, kvantitativni prinos).

U rastvor metil estra (5.13 g, 12.7 mmol) u suvom piridinu (100 mL), doda se višak sirćetnog anhidrida (8.4 mL, 89 mmol). Kada je reakcija završena, piridin se ukoncentruje pod vakuumom. Ostatak se izruči u hladnu vodu (100 mL) i ekstrahuje sa AcOEt (3x150 mL). Spojene organske faze se osuše (Na2SO4) i ukoncentrišu kako se dobija ostatak, koji se dalje prečišćava fleš hromatografijom na silika gelu uz primenu heksan/etil acetata 8:2 i 0.5% trietilamina kao eluenta (4.8 g jedinjenja 10 u vidu bele čvrste materije, 84% prinos kroz dva koraka).

U rastvor diizopropilamina (23 mL, 0.16 mol) u suvom THF-u (50 mL) se, kap po kap, doda rastvor n-butillitijuma (60 mL, 2.5 M u heksanu, 0.15 mol) na -78°C. Posle 30 min, doda se trimetilhlorosilan (27.1 mL, 0.21 mol). Posle još 30 min, doda se rastvor jedinjenja 10 (4.8 g, 10.7 mmol) u suvom THF-u (70 mL). Reakciona smeša se meša na -78°C još 45 min i zatim, doda se trietilamin (54 mL, 0.38 mol). Posle 1 h, reakciona smeša se ostavi da se zagreje do -20°C, obradi se zasićenim vodenim NaHCO3rastvorom (100 mL) i u toku 2 h dovede na sobnu temperaturu. Vodena faza se ekstrahuje sa etil acetatom (3x50 mL). Spojene organske faze se onda isperu sa zasićenim rastvorom NaHCO3vodom i slanim rastvorom. Posle sušenja preko anhidrovanog Na2SO4, ostatak se upari pod vakuumom kako se dobija 6 g ostatka žute boje, koji se razblaži u suvom CH2Cl2(50 mL) i, ohladi na -78°C. U ovo, kap po kap se doda mešani rastvor acetaldehida (3 mL, 53 mmol) i BF3·OEt2(13.5 mL, 0.107 mol). Reakciona smeša se meša u toku 2 h na -60°C i ostavi da se zagreje do sobne temperature. Smeša se ugasi sa zasićenim vodenim NaHCO3rastvorom i ekstrahuje se sa CH2Cl2. Spojene organske faze se isperu sa slanim rastvorom, osuše preko anhidrovanog Na2SO4i ukoncentrišu pod vakuumom.

Prečišćavanje na silika gelu (heksan-etil acetat 9:1 i 0.5% TEA) obezbeđuje jedinjenje 11 (4.1 g, 80%). NMR analiza pokazuje dijasteromerni odnos E/Z >95%. E konfiguracija na dvostrukoj vezi izvan prstena je utvrđena pomoću dipolarnog kuplovanja H3-26 (δ 1.67)/H-5 (δ 2.62) u Noesy spektru (400 MHz, vreme mešanja 400 ms).

(E)-3α-acetoksi-6-etiliden-7-keto-5β-holan-24-oat (11): C29H44O5

<1>H NMR je zabeležen na Varian Inova 400 MHz, primenom CDCl3kao rastvarača: δ 6.16 (1H, q, J = 7.0 Hz, H-25), 4.74 (1H, m, H-3), 3.64 (3H, s, COOCH3), 2.62 (1H, dd, J = 13.0, 3.6 Hz, H-5), 1.98 (3H, s, COCH3), 1.67 (3H, d, J = 7.0 Hz, H3-26), 1.00 (3H, s, H3-19), 0.92 (3H, d, J = 6.0 Hz, H3-21), 0.67 (3H, s, H3-18).

<13>C NMR je zabeležen na Varian Inova 100 MHz, primenom CDCl3kao rastvarača: δ 204.5, 174.6, 170.7, 143.1, 130.2, 72.5, 54.5, 51.4, 50.7, 48.6, 45.2, 43.5, 39.1, 38.9, 35.1, 34.9, 34.1, 33.4, 31.0, 30.9, 28.4, 25.9 (2C), 22.8, 21.4, 21.2, 18.4, 12.7, 12.2.

Korak e) Izrada metil 3α-acetoksi-6β-etil-7-keto-5β-holan-24-oata (12)

Rastvor jedinjenja 11 (4.0 g, 8.5 mmol) u suvom THF/suvom MeOH (100 mL, 1:1 v/v) je hidrogenizovan u prisustvu Pd(OH)220 mas.% na aktiviranom uglju (100 mg), Degussa tipa. Smeša je preneta u standardni PARR aparat i propušten je azot, a zatim i vodonik nekoliko puta. Aparat je mućkan pod 344,738 Pa (50 psi) H2. Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi u toku 8 h.

Katalizator je filtriran kroz Celit i, povraćeni filtrat je ukoncentrisan pod vakuumom kako se dobilo jedinjenje 12 (4.0 g, kvantitativni prinos).

Metil 3α-acetoksi-6β-etil-7-keto-5β-holan-24-oat (12): C29H46O5

<1>H NMR je zabeležen na Varian Inova 400 MHz, primenom CD3OD kao rastvarača: δ 4.65 (1H, m, H-3), 3.66 (3H, s, COOCH3), 2.56 (1H, t, J = 11.5 Hz, H-8), 2.35 (1H, m, H-23a), 2.22 (1H, m, H-23b), 1.99 (3H, s, COCH3), 1.22 (3H, s, H3-19), 0.92 (3H, d, J = 6.3 Hz, H3-21), 0.83 (3H, t, J = 7.2 Hz, H3-26), 0.67 (3H, s, H3-18).

<13>C NMR je zabeležen na Varian Inova 100 MHz, primenom CD3OD kao rastvarača: δ 214.7, 174.3, 170.2, 72.6, 61.7, 54.8, 51.3, 49.0, 48.5, 45.3, 42.7, 42.3 (2C), 38.6, 35.4, 35.1, 35.0, 31.0, 30.8, 28.0 (2C), 26.4, 25.7, 24.7, 21.3, 21.1, 18.2, 12.9, 11.9. β konfiguracija etil grupe na C-6 je određena dipolarnim kuplovanjem H3-26 (δ 0.83)/ H3-19 (δ 1.22) i H-8 (δ 2.56)/H-25 (δ 1.83) u Noesy spektru (400 MHz, vreme mešanja 400 ms).

Koraci f,g) Izrada 6β-etil-3α,7β-dihidroksi-5β-holan-24-ola (BAR501)

U metanolni rastvor jedinjenja 12 (1.18 g, 2.5 mmol), doda se veliki višak NaBH4na 0°C. Smeša se ostavlja na sobnoj temperaturi u toku 2 h i zatim, kap po kap se dodaju voda i MeOH tokom perioda od 15 min, na 0°C, uz razvijanje efervescencije. Posle uparavanja rastvarača, ostatak se razblaži sa vodom i ekstrahuje sa AcOEt (3x50 mL). Spojeni ekstrakti se isperu sa slanim rastvorom, osuše sa Na2SO4i upare, kako se dobija 1.3 g sirovog ostatka, koji se podvrgne sledećem koraku bez prethodnog prečišćavanja. Sirovi ostatak se obradi sa LiBH4(2 M u THF) u istom operativnom stanju opisanom u Primeru 1A korak b). HPLC prečišćavanje na Nucleodur 100-5 C18 (5 µm; 10 mm i.d. x 250 mm) sa MeOH/H2O (88:12) kao eluentom (brzina protoka 3 mL/min), obezbeđuje 802 mg BAR501 (79%, tR= 11 min).

Alternativno, korak f se izvodi sa Ca(BH4)2, proizvedenim in situ.

U rastvor jedinjenja 12 (500 mg, 1.05 mmol) i apsolutnog etanola (4 mL), na 0°C, doda se CaCl2(466 mg, 4.2 mmol). U isti rastvor se doda rastvor NaBH4(159 mg, 4.2 mmol) u apsolutnom etanolu (4 mL). Posle 4h na -5°C, u vidu kapi se doda MeOH. Potom, nakon uparavanja rastvarača, ostatak se razblaži sa vodom i ekstrahuje sa AcOEt (3x50 mL). Spojeni ekstrakti se isperu sa slanim rastvorom, osuše sa Na2SO4i upare, kako se dobija 500 mg sirovog ostatka, koji se podvrgne koraku g bez prethodnog prečišćavanja.

BAR501: C26H46O3

<1>H NMR je zabeležen na Varian Inova 700 MHz, primenom CD3OD kao rastvarača: δ 3.74 (1H, dd, J= 10.3, 6.0 Hz, H-7), 3.51 (1H, ovl, H-3), 3.49 (2H, ovl, H2-24), 1.00 (3H, s, H3-19), 0.97 (3H, d, J = 6.5 Hz, H3-21), 0.96 (3H, t, J = 7.6 Hz, H3-26), 0.72 (3H, s, H3-18).

<13>C NMR je zabeležen na Varian Inova 175 MHz, primenom CD3OD kao rastvarača: δ 75.371.9, 63.6, 57.5, 56.5, 51.6, 45.7, 44.9, 42.1, 41.5, 40.4, 40.3, 37.1, 35.8, 32.4, 30.7, 30.3, 29.7, 29.6, 28.3, 26.2, 23.4, 22.1, 19.4, 14.8, 12.7.

Primer 2B. Izrada 6β-etil-3α,7α-dihidroksi-5β-holan-24-ola (BAR504-6b)

BAR504-6b je proizveden, kako je opisano u Primeru 2A (tR= 20.4 min). BAR504-6b: C26H46O3

<1>H NMR je zabeležen na Varian Inova 700 MHz, primenom CD3OD kao rastvarača: δ 3.60 (1H, s, H-7), 3.51 (2H, m, H2-24), 3.35 (1H, ovl, H-3), 2.30 (1H, q, J = 13.5 Hz, H-4a), 0.97 (3H, d, J = 6.8 Hz, H3-21), 0.95 (3H, t, J = 7.3 Hz, H3-26), 0.94 (3H, s, H3-19), 0.70 (3H, s, H3-18).

<13>C NMR je zabeležen na Varian Inova 175 MHz, primenom CD3OD kao rastvarača: δ 71.9, 71.8, 62.7, 56.8, 51.7, 50.5, 46.7, 42.5, 41.4, 40.1, 36.6, 36.4, 36.2, 36.0, 33.2, 32.4, 30.1, 29.5, 28.8, 28.5, 25.3, 23.9, 20.7, 18.4, 13.7, 11.4.

PRIMER 2C. Sinteza 6α-etil-3α, 7α-dihidroksi-24-nor-5β-holan-23-ola (BAR502), 6β-etil-3α, 7β-dihidroksi-24-nor-5β-holan-23-ola (BARn501- nije deo pronalaska) i 6p-etil-3a, 7αdihidroksi-24-nor-5β-holan-23-ola (BARn504-6b)

7-KLCA (1g, 2.56 mmol) se podvrgne Beckmann-ovoj degradaciji na C24 i metilaciji na C-23 kako se dobija jedinjenje 13 sa 66% prinosom. Acetilacija na C-3 i alkilacija daje jedinjenje 14 koje se hidrogenizuje dajući jedinjenje 15. Tretmanom sa MeONa/MeOH omogućava se uzastopna hidroliza na C-3 i epimerizacija na C-6. Istovremena redukcija metil estarske funkcionalne grupe na C-23 i karbonil grupe na C-7 obezbeđuje BAR502 sa 89% prinosom. Intermedijer 15 (250 mg, 0.54 mmol) se takođe koristio kao polazni materijal u izradi BARn501 i BARn504-6b.

a) HCOOH, HClO4; b) TFA, trifluorosirćetni anhidrid, NaNO2; c) KOH 30% u MeOH/H2O 1:1 v/v, 88% kroz tri koraka; d) p-TsOH, MeOH suv; e) sirćetni anhidrid, piridin; f) DIPA, n-BuLi, TMSCl, suv TEA, suv THF, -78<O>C; g) acetaldehid, BF3(OEt)2, CH2Cl2, -60<O>C, 60% kroz četiri koraka; h) H2, Pd(OH)2, THF/MeOH 1:1, kvantitativan prinos; i) MeONa, MeOH; j) LiBH4, MeOH, suv THF, 0<O>C, 70% kroz dva koraka; k) NaBH4, MeOH suv, 0<O>C; l) LiBH4, MeOH, suv THF,

0<O>C, 77% kroz dva koraka.

Koraci a-d) Izrada metil 7-keto-24-nor-LCA (13)

Jedinjenje 13 (660 mg, 1.69 mmol, 66% kroz četiri koraka) proizvedeno je od 7-KLCA pod istim uslovima izvođenja, koji su opisani u Primeru 1B, koraci a-d).

Koraci e-h) Izrada metil 3α-acetoksi-6β-etil-7-keto-24-nor-5β-holan-23-oata (15)

Jedinjenje 13 (660 mg, 1.69 mmol) je podvrgnuto istim uslovima izvođenja, koji su opisani u Primeru 2A koraci b-d kako se dobija 603 mg jedinjenja 14 (78% kroz tri koraka). NMR analiza demonstrira dijasteromerni odnos E/Z >95%. E konfiguracija na egzocikličnoj dvostrukoj vezi je utvrđena putem dipolarnog kuplovanja H3-25 (δ 1.67)/H-5 (δ 2.61) na Noesy spektru (400 MHz, vreme mešanja 400 ms).

(E)-3α-acetoksi-6-etiliden-7-keto-24-nor-5β-holan-23-oat (14): C28H42O5

<1>H NMR je zabeležen na Varian Inova 400 MHz, primenom CDCl3kao rastvarača: δ 6.17 (1H, q, J = 7.2 Hz, H-24), 4.75 (1H, m, H-3), 3.64 (3H, s, COOCH3), 2.61 (1H, dd, J = 13.1, 4.0 Hz, H-5), 1.98 (3H, s, COCH3), 1.67 (3H, d, J = 7.2 Hz, H3-25), 1.00 (3H, s, H3-19), 0.97 (3H, d, J = 6.8 Hz, H3-21), 0.67 (3H, s, H3-18).

<13>C NMR je zabeležen na Varian Inova 100 MHz, primenom CDCl3kao rastvarača: δ 204.5, 174.2, 170.5, 143.0, 130.6, 72.5, 54.7, 51.4, 50.7, 48.6, 45.3, 43.7, 41.5, 39.1, 38.8, 34.6, 34.2, 33.6, 33.4, 28.5, 25.9 (2C), 22.8, 21.3 (2C), 19.7, 12.7, 12.1. Hidrogenacija na Pd(OH)2pod istim uslovima izvođenja, koji su opisani u Primeru 2A, korak e, proizvodi 600 mg jedinjenja 15 (kvantitativni prinos).

β konfiguracija etil grupe na C-6 je određena putem dipolarnog kuplovanja H3-25 (δ 0.83)/ H3-19 (δ 1.22) u Noesy spektru (400 MHz, vreme mešanja 400 ms).

3α-acetoksi-6β-etil-7-keto-24-nor-5β-holan-23-oat (15): C28H44O5

<1>H NMR je zabeležen na Varian Inova 400 MHz, primenom CDCl3kao rastvarača: δ 4.65 (1H, m, H-3), 3.67 (3H, s, COOCH3), 2.60 (1H, t, J = 11.2 Hz, H-8), 2.43 (1H, dd, J = 14.2, 2.6 Hz, H-22a), 1.98 (3H, s, COCH3), 1.88 (1H, m ovl, H-6), 1.22 (3H, s, H3-19), 0.98 (3H, d, J = 6.4 Hz, H3-21), 0.83 (3H, t, J = 7.0 Hz, H3-25), 0.70 (3H, s, H3-18).

<13>C NMR je zabeležen na Varian Inova 100 MHz, primenom CDCl3kao rastvarača: δ 215.3, 174.0, 170.5, 72.8, 61.9, 55.0, 51.4, 49.2, 48.7, 45.5, 42.9, 42.6, 41.4, 38.7 (2C), 35.6, 35.3, 34.9, 28.3 (2C), 26.5, 25.9, 24.8, 21.4, 21.3, 19.6, 13.0, 12.1.

Koraci i,j) Izrada 6α-etil-3α,7α-dihidroksi-24-nor-5β-holan-23-ola (BAR502)

U rastvor jedinjenja 15 (450 mg, 1.0 mmol) i suvog metanola (4 mL), doda se MeONa (20 mL, 0.5 M in MeOH, 10 mmol). Posle 24 h, u vidu kapi se doda H2O. Onda, posle uparavanja rastvarača, ostatak se razblaži sa vodom i ekstrahuje sa AcOEt (3x50 mL). Spojeni ekstrakti se isperu sa vodom, osuše sa Na2SO4, potom upare, kako se dobija jedinjenje 16 koje se dalje podvrgava koraku g, bez prethodnog prečišćavanja.

Metil 6α-etil-3α-hidroksi-7-keto-24-nor-5β-holan-23-oat (16): C26H42O4

<1>H NMR je zabeležen na Varian Inova 400 MHz, primenom CDCl3kao rastvarača: δ 3.64 (3H, s, COOCH3), 3.45 (1H, m, H-3), 2.83 (1H, q, J = 7.3 Hz, H-6), 2.51 (1H, t, J = 11.2 Hz, H-8), 2.45 (1H, dd, J = 14.5, 3.2 Hz, H-22a), 1.26 (3H, s, H3-19), 0.98 (3H, d, J = 6.6 Hz, H3-21), 0.81 (3H, t, J = 7.0 Hz, H3-25), 0.73 (3H, s, H3-18).

<13>C NMR je zabeležen na Varian Inova 100 MHz, primenom CDCl3kao rastvarača: δ 214.9, 175.4, 71.6, 56.2, 53.2, 52.0, 51.9, 51.0, 50.5, 45.2, 43.8, 42.2, 40.2, 36.7, 35.3, 34.8, 32.5, 30.5, 29.4, 25.6, 24.0, 22.9, 20.1, 20.0, 12.6, 12.4.

Jedinjenje 16 se podvrgne redukciji sa NaBH4pod istim uslovima izvođenja, koji su opisani u Primeru 1A, korak g. Silika gel hromatografijom uz eluaciju sa heksan/EtOAc 6:4, dobija se BAR502 (274 mg, 70% kroz dva koraka). Analitički uzorak se dobija pomoću HPLC na Nucleodur 100-5 C18 (5 µm; 4.6 mm i.d. x 250 mm) sa MeOH/H2O (88:12) kao eluentom (brzina protoka 1 mL/min, tR=10.8 min).

BAR502: C25H44O3

<1>H NMR je zabeležen na Varian Inova 400 MHz, primenom CD3OD kao rastvarača: δ 3.65 (1H, s, H-7), 3.61 (1H, m, H-23a), 3.53 (1H, m, H-23b) 3.31 (1H, m, H-3), 0.97 (3H, d, J = 6.6 Hz, H3-21), 0.92 (3H, s, H3-19), 0.91 (3H, t, J = 7.0 Hz, H3-25), 0.71 (3H, s, H3-18).

<13>C NMR je zabeležen na Varian Inova 100 MHz, primenom CD3OD kao rastvarača: δ 73.2, 71.1, 60.7, 57.7, 51.4, 46.9, 43.8, 42.9, 41.3, 40.9, 39.8, 36.7, 36.5, 34.6, 34.5, 34.2, 31.2, 29.4, 24.5, 23.7, 23.4, 21.8, 19.3, 12.1, 11.9.

Koraci k,l). Izrada 6β-etil-3α,7β-dihidroksi-24-nor-5β-holan-23-ola (BARn501) i 6β-etil-3α,7α-dihidroksi-24-nor-5β-holan-23-ola (BARn504-6b)

Jedinjenje 15 (100 mg, 0.22 mmol) je podvrgnuto istim uslovima izvođenja, koji su opisani u Primeru 2A koraci f-g. HPLC prečišćavanjem na Nucleodur 100-5 C18 (5 µm; 10 mm i.d. x 250 mm) sa MeOH/H2O (86:14) kao eluentom (brzina protoka 3 mL/min), dobija se 47 mg BARn501 (54%, tR= 11 min) i 20 mg BARn504-6b (23%, tR= 15 min).

BARn501: C25H44O3

<1>H NMR je zabeležen na Varian Inova 400 MHz, primenom CD3OD kao rastvarača: δ 3.73 (1H, dd, J = 10.5, 5.5 Hz, H-7), 3.61 (1H, m, H-23a), 3.51 (1H, m, ovl, H-23b), 3.51 (1H, m, ovl, H-3), 0.98 (3H, d, ovl, H3-21), 0.97 (3H, s, H3-19), 0.96 (3H, t, ovl, H3-25), 0.70 (3H, s, H3-18).

<13>C NMR je zabeležen na Varian Inova 100 MHz, primenom CD3OD kao rastvarača: δ 75.2, 71.8, 60.8, 57.5, 56.6, 51.5, 45.5, 44.8, 42.0, 41.4, 40.7, 40.3, 39.9, 36.9, 36.0, 34.2, 30.5, 29.6, 28.3, 26.2, 23.4, 22.0, 19.4, 14.7, 12.9.

BARn504-6b: C25H44O3

<1>H NMR je zabeležen na Varian Inova 400 MHz, primenom CD3OD kao rastvarača: δ 3.63 (1H, m, H-23a), 3.60 (1H, m, H-7), 3.55 (1H, m, H-23b), 3.37 (1H, m, H-3), 2.30 (1H, q, J = 12.5 Hz, H-4a), 0.97 (3H, d, J = 6.6 Hz, H3-21), 0.95 (3H, s, H3-19), 0.95 (3H, t, J = 7.0 Hz, H3-25), 0.72 (3H, s, H3-18).

<13>C NMR je zabeležen na Varian Inova 100 MHz, primenom CD3OD kao rastvarača: δ 72.8, 72.7, 60.8, 57.9, 52.7,51.4, 47.5, 43.7, 42.3, 41.0, 39.9, 37.5, 37.3, 36.7, 34.2, 33.3, 31.0, 29.6, 29.4, 26.2, 24.8, 21.6, 19.3, 14.5, 12.1.

PRIMER 2D. Sinteza 6-etiliden-3α,7β-dihidroksi-5β-holan-24-ola (BAR503), 6α-etil-3α,7βdihidroksi-5β-holan-24-ola (BAR501-6a - nije deo pronalaska), 6-etiliden-3α,7β-dihidroksi-24-nor-5β-holan-23-ola (BARn503 - nije deo pronalaska) i 6α-etil-3α,7β-dihidroksi-24-nor-5β-holan-23-ola (BARn501-6a - nije deo pronalaska)

Intermedijer 11 se podvrgne redukciji sa NaBH4a zatim tretmanu sa LiBH4. Alternativno, izvodi se tretman sa LiAlH4na ni malo komplikovan način, dovodeći do uzastopne redukcije na C-24 i C-7. BAR503 se, takođe, koristi kao polazni materijal za BAR501-6a, uz hidrogenaciju na Pd(OH)2katalizatoru. Isti sintetski postupak je izveden na intermedijeru 14, na koji način se dobijaju odgovarajući 23-derivati, BARn503 i BARn501-6a.

a) NaBH4, MeOH; b) LiBH4, MeOH suv, THF, 0<O>C TFA, 85% kroz dva koraka; c) H2, Pd(OH)2, THF:MeOH 1:1 v /v.

Koraci a,b). Izrada 6-etiliden-3α,7β-dihidroksi-5β-holan-24-ola (BAR503) i 6-etiliden-3α,7β-dihidroksi-24-nor-5β-holan-23-ola (BARn503)

Jedinjenje 11 (1 g, 2.11 mmol) je podvrgnuto istim uslovima izvođenja, koji su opisani u Primeru 2A koraci f, g. HPLC prečišćavanjem na Nucleodur 100-5 C18 (5 µm; 10 mm i.d. x 250 mm) sa MeOH/H2O (88:12) kao eluentom (brzina protoka 3 mL/min), dobija se 727 mg BAR503 (85% kroz dva koraka, tR= 9.2 min). Alternativno, LiAIH4tretman jedinjenja 11 proizvodi BAR503.

BAR503: C26H44O3

<1>H NMR je zabeležen na Varian Inova 400 MHz, primenom CD3OD kao rastvarača: δ 5.66 (1H, q, J = 6.9 Hz, H-25), 3.90 (1H, d, J = 9.8 Hz, H-7), 3.55 (1H, m, H-3), 3.50 (2H, m, H2-24), 2.50 (1H, dd, J = 4.0, 13.1 Hz, H-5), 1.62 (3H, d, J = 6.9 Hz, H3-26), 0.97 (3H, d, J = 6.8 Hz, H3-21), 0.81 (3H, s, H3-19), 0.70 (3H, s, H3-18).

<13>C NMR je zabeležen na Varian Inova 100 MHz, primenom CD3OD kao rastvarača: δ 142.7, 114.5, 73.4, 71.1, 63.6, 57.1, 56.1, 45.2, 44.9, 44.2, 40.7, 40.2, 36.3, 36.2, 35.9, 34.7, 32.4, 30.2, 29.5, 28.8, 27.4, 22.6, 21.5, 18.5, 11.8, 11.7.

Isti sintetski postupak je izveden sa intermedijerom 14. HPLC prečišćavanjem na Nucleodur 100-5 C18 (5 µm; 10 mm i.d. x 250 mm) sa MeOH/H2O (86:14) kao eluentom (brzina protoka 3 mL/min), dobija se BARn503 (tR= 8 min).

BARn503: C25H42O3

<1>H NMR je zabeležen na Varian Inova 400 MHz, primenom CD3OD kao rastvarača: δ 5.66 (1H, q, J = 6.8 Hz, H-24), 3.92 (1H, d, J = 9.9 Hz, H-7), 3.60 (1H, m, H-23a), 3.56 (1H, m, H-3), 3.55 (1H, m, H-23b), 2.52 (1H, dd, J = 3.7, 13.2 Hz, H-5), 1.63 (3H, d, J = 6.8 Hz, H3-25), 0.98 (3H, d, J = 6.5 Hz, H3-21), 0.95 (3H, s, H3-19), 0.71 (3H, s, H3-18).

<13>C NMR je zabeležen na Varian Inova 100 MHz, primenom CD3OD kao rastvarača: δ 143.7, 115.4, 74.1, 71.860.8, 58.0, 57.1, 46.1, 45.9, 45.1, 41.6, 41.1, 39.9, 37.0, 36.4, 35.8, 34.1, 30.9, 29.8, 28.1, 23.5, 22.5, 19.5, 12.7, 12.6.

Korak c). Izrada 6α-etil-3α,7β-dihidroksi-5β-holan-24-ola (BAR501-6a) and and 6α-etil-3α,7β-dihidroksi-24-nor-5β-holan-23-ola (BARn501-6a)

BAR503 (350 mg, 0.86 mmol) je podvrgnut istim uslovima izvođenja, koji su opisani u Primeru 2A korak e, dobijajući BAR501-6a u kvantitativnom prinosu.

BAR501-6a: C26H46O3

<1>H NMR je zabeležen na Varian Inova 400 MHz, primenom CD3OD kao rastvarača: δ δ 3.50 (2H, t, J = 6.8 Hz, H3-24), 3.44 (1H, m, H-3), 3.07 (1H, t, J = 9.8 Hz, H-7), 0.96 (3H, d, J = 6.8 Hz, H3-21), 0.95 (3H, s, H3-19), 0.86 (3H, t, J = 7.4 Hz, H3-26), 0.71 (3H, s, H3-18).

<13>C NMR je zabeležen na Varian Inova 100 MHz, primenom CD3OD kao rastvarača: δ 76.5, 72.3, 63.6, 57.9, 57.3, 46.3, 45.0, 44.8, 41.8, 41.0, 39.9, 37.0, 36.4, 35.5, 33.3, 31.3, 31.0, 30.3, 29.8, 27.8, 24.3, 22.5, 22.0, 19.3, 12.8, 11.8.

BARn503 je podvrgnut istim uslovima izvođenja, koji su opisani u Primeru 2A korak e, dobijajući BARn501-6a u kvantitativnom prinosu.

BARn501-6a: C25H44O3

<1>H NMR je zabeležen na Varian Inova 400 MHz, primenom CD3OD kao rastvarača: δ 3.62 (1H, m, H-23a), 3.54 (1H, m, H-23b), 3.45 (1H, m, H-3), 3.08 (1H, t, J = 9.8 Hz, H-7), 0.97 (3H, d, J = 6.5 Hz, H3-21), 0.95 (3H, s, H3-19), 0.86 (3H, t, J = 7.4 Hz, H3-25), 0.73 (3H, s, H3-18).

<13>C NMR je zabeležen na Varian Inova 100 MHz, primenom CD3OD kao rastvarača: δ 76.4, 72.5, 60.8, 57.9, 57.2, 46.2, 45.1, 44.7, 41.8, 41.2, 40.0, 39.8, 36.5, 35.6, 34.2, 31.2, 30.9, 29.9, 27.9, 24.1, 22.7, 22.0, 19.5, 12.7, 11.7.

PRIMER 2E Sinteza 6α-etil-3α,7a-dihidroksi-24-nor-5β-holan-23-nitrila (BAR506 - nije deo pronalaska)

7-KLCA se transformiše u nitril 17 primenjivanjem iste sintetske procedure, koja je opisana u Primeru 1B koraci a-b. Alkilacijom koju prati redukcija dvostruke veze i epimerizacija na C-6 pod istim uslovima izvođenja kakvi su opisani u Primeru 2A koraci c-d odnosno, Primeru 2C korak i, dobija se jedinjenje 18. Tretman sa LiBH4kao u Primeru 2C korak j obezbeđuje željenu 7α hidroksil grupu u BAR506.

a) HCOOH, HClO4; b) TFA, trifluorosirćetni anhidrid, NaNO2; c) DIPA, n-BuLi, TMSCl, suv TEA, suv THF, -78<O>C; d) acetaldehid, BF3(OEt)2, CH2Cl2, -60<O>C; e) H2, Pd(OH)2, THF/MeOH 1:1; f) MeONa, MeOH; g) LiBH4, MeOH, suv

THF, 0<O>C

BAR506: C25H41NO2

<1>H NMR je zabeležen na Varian Inova 700 MHz, primenom CD3OD kao rastvarača: δ 3.66 (1H, br s, H-7), 3.31 (1H, ovl, H-3), 2.46 (1H, dd, J = 3.8, 16.9 Hz, H-22a), 2.34 (1H, dd, J = 7.4, 16.9 Hz, H-22b), 1.16 (3H, d, J = 6.5 Hz, H3-21), 0.91 (3H, t, J = 7.5 Hz, H3-25), 0.92 (3H, s, H3-19), 0.73 (3H, s, H3-18).

<13>C NMR je zabeležen na Varian Inova 175 MHz, primenom CD3OD kao rastvarača: δ 120.3, 72.9, 70.9, 56.1, 51.5, 46.7, 43.4, 42.9, 41.4, 40.2, 36.5, 36.2, 34.3 (2C), 34.2, 30.7, 29.2, 24.9, 24.4, 23.4, 23.3, 21.9, 18.5, 12.1, 11.6.

Biološke aktivnosti. Aktivnost odabranih jedinjenja je ispitana in vitro korišćenjem modela cele ćelije transfektovane sa reporter genima, da bi se utvrdila selektivnost jedinjenja, što je prikazano u Tabeli 1, prema FXR i TGR5/GPBAR1 u poređenju sa henodeoksiholnom kiselinom (CDCA) i TLCA. CDCA je primarna žučna kiselina, koja funkcioniše kao endogeni ligand za FXR, dok je TLCA fiziološki ligand za TGR5/GPBAR1. U ovom testu, HepG2 ćelije (ćelijska linija poreklom iz jetre) se uzgajaju na 37°C u minimumu esencijalnog medijuma sa Earl-ovim solima koji sadrži 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS), 1% L-glutamina i 1% penicilin/streptomicina. HEK-293T ćelije se uzgajaju na 37°C u D-MEM koji sadrži 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS), 1% L-glutamina i 1% penicilin/streptomicina. Eksperimenti transfekcije su izvedeni korišćenjem Fugene HD prema navodima proizvođača. Ćelije se postave u ploču sa 24 pozicije u količini 5 x 10<4>ćelija/poziciji. Za FXR posredovanu transaktivaciju, HepG2 ćelije se transfektuju sa 100 ng pSG5-FXR, 100 ng pSG5-RXR, 100 ng pGL4.70 vektor koji kodira humani Renilla gen i 250 ng reporter vektor p(hsp27)-TK-LUC koji sadrži element IR1odgovora na FXR, koji je kloniran od promotera toplotnog šok proteina 27 (hsp27).

Za GPBAR1 posredovanu transaktivaciju, HEK-293T ćelije se transfektuju sa 200 ng pGL4.29, reporter vektor koji sadrži element (CRE) IR1odgovora na cAMP koji vodi transkripciju luciferaza reporter gena luc2P, sa 100 ng pCMVSPORT6-humanog GPBAR1 i sa 100 ng pGL4.70 vektor koji kodira humani Renilla gen. U kontrolnim eksperimentima HEK-293T ćelije se transfektuju samo sa vektorima pGL4.29 i pGL4.70 da bi se isključila bilo kakva mogućnost da bi jedinjenja mogla aktivirati CRE na GPBAR1 nezavisan način. U 24 h nakon transfekcije, ćelije se stimulišu 18 h sa 10 µM TLCA kao kontrolnim agensom ili pretpostavljenim GPBAR1 agonistima pri istoj koncentraciji. Posle treatmana, ćelije se liziraju u 100 µL pufera za liziranje (25 mM Tris-fosfat, pH 7.8; 2 mM DTT; 10% glicerol; 1% Triton X-100) i, 20 µL ćelijskog lizata se testira na aktivnost luciferaze korišćenjem test sistema luciferaze. Luminescencija se meri korišćenjem Glomax 20/20 luminometra. Aktivnosti luciferaze se normalizuju prema Renilla aktivnostima. Antagonizam GPBAR1/TGR5 prema FXR se meri kao procenat aktivnosti u testu transaktivacije tražene aktivnosti TLCA kao primer agonizma.

Životinje i protokoli. GPBAR1 nulti miševi (GPBAR1-B6=GPBAR12/2 miševi, generisani direktno u C57BL/6NCrl osnovu), kao i urođena legla na C57BL/6NCrl su čuvani pod kontrolisanim temperaturama (22°C) i fotoperiodima (12:12-časovni svetlo/mrak ciklus), uz dozvoljen neograničeni pristup standardnoj mišijoj hrani i vodi iz česme i, dozvoljena je aklimatizacija na ove uslove bar 5 dana pre uključivanja u eksperiment.

Test grebanja. Za ova ispitivanja su korišćeni mužjaci GPBAR1<-/->miševa i njihova urođena legla (8-12 nedelja starosti). Na bazi vrata se obrije krzno i, miševi stave u pojedinačne cilindre na staklenoj polici. Na vratu se povuče krug od otprilike 0.5 cm u dijametru i, u ovu oblast se injektuju test agensi. Miševi se aklimatizuju na sobu za eksperimente, uređaje za zadržavanje i istraživače tokom 2 h perioda u 2 uzastopna dana pre eksperimenata. Ponašanje grebanja su određivala 2 posmatrača, koji nisu bili upoznati sa ispitivanim agensima ili genotipovima. Grebanje je definisano kao podizanje zadnje šape ka injekcionom položaju i zatim, stavljanje šape na pod, nezavisno od broja zamaha. Ukoliko se broj razlikovao više od 5 grebanja u 30-minutnom periodu, oba posmatrača su ponovo ispitivala zabeleženo. Rezultati su izraženi kao broj dešavanja grebanja u toku 30 ili 60 min posmatranja. Testirani agensi su bili: DCA (25 µg), TLCA (25 µg), UDCA (25 µg) i BAR502 (25 µg), ili sa betulinskom kiselinom (50 µg), oleanolnom kiselinom (50 µg). LCA i DCA su bili rastvoreni u DMSO, dok drugi agensi u 0.9% NaCl (10 µL). U drugoj eksperimentalnoj postavci, GPBAR1<-/->miševima i njihovim urođenim leglima je primenjen alfa-naftilizotiocijanat (ANIT) (25 mg/kg, per os) rastvoren u maslinovom ulju ili samo maslinovo ulje (kontrolni miševi) ili sa kombinacijom ANIT plus BAR502 (15 mg/Kg jednom na dan, per os) u toku 10 dana. Na dan 5, ispitivano je spontano grebanje u toku 60 min i nakon subkutane injekcije sa 25 µg DCA. Serumski nivoi ukupnog bilirubina, aspartat aminotransferaze (AST) i alkalne fosfataze su mereni rutinskim kliničko-hemijskim testiranjem, koje je izvedeno na Hitachi 717 automatskom analizatoru. Za estrogenski model, primeni se divlji tip C57BL6 u 10 mg/Kg i.p. sa 17α-etinilestradiolom (17αE2) rastvorenim u PEG ili samo sa PEG (kontrolni miševi) ili sa kombinacijom 17αE2i BAR502 (15 mg/Kg dnevno, per os) u toku 8 dana. Na kraju ispitivanja, zabeleženo je spontano grebanje i grebanje indukovano s.c. injekcijom od 25 µg DCA. Izmeri se žučna kesa i, takođe se izmere serumski nivoi bilirubina i alkalne fosfataze. Tokom ispitivanja, istraživači i visoko trenirani personal i veterinar koji brinu o životinjama su životinje vizualno ispitivali barem dva puta na dan, od ponedeljka do petka i, jednom dnevno tokom vikenda. Životinje su merene svakog dana i žrtvovane u indikovanim vremenskim tačkama ili kada je njihovo kliničko stanje postajalo kritično, prema ispitanom smanjenju telesne težine koje bi iznosilo 25% od početme telesne težine za 7 dana. Sem toga, životinje su žrtvovane kada pri dnevnom ispitivanju nisu mogle da ustanu ili da se kreću. Miševi su eutanazirani prekomernom dozom natrijum pentobarbitala (>100 mg/kg i.p.).

Claims

Patentni zahtevi 1. Jedinjenje odabrano iz grupe, koju čine:
2. Jedinjenje prema zahtevu 1, pri čemu je navedeno jedinjenje 6β-etil-3α,7β-dihidroksi-5βholan-24-ol.
3. Jedinjenje za upotrebu kao lek, pri čemu je navedeno jedinjenje odabrano iz grupe, koju čine:
4. Jedinjenje za upotrebu kao lek, prema zahtevu 3, pri čemu je navedeno jedinjenje odabrano u grupi koja se sastoji od 6β-etil-3α,7β-dihidroksi-5β-holan-24-ol i 6α-etil-3α,7α-dihidroksi-24-nor-5β-holan-23-ol.
5. Jedinjenje za upotrebu kao FXR i/ili TGR5/GPBAR1 modulator, u prevenciji i/ili lečenju gastrointestinalnih poremećaja, bolesti jetre, kardiovaskularnih bolesti, ateroskleroze, metaboličkih bolesti, infektivnih bolesti, kancera, bubrežnih poremećaja, upalnih poremećaja i neuroloških poremećaja, pri čemu je navedeno jedinjenje odabrano iz grupe, koja se sastoji od:
6. Farmaceutska kompozicija, koja sadrži jedinjenje odabrano iz grupe koju čine BAR501, BAR503 i BAR504-6b kako su definisana u zahtevu 1 i, bar još jedan farmaceutski sastojak.
7. Postupak za dobijanje jedinjenja, odabranog iz grupe, koju čine:

navedeni postupak obuhvata podvrgavanje jedinjenja formule (VIII) aldolnoj kondenzaciji, dovodeći u kontakt jedinjenje formule (VIII)

u kome n je 0 ili 1, a P je hidroksilna zaštitna grupa, sa alkil litijumom, kao što je nBuLi, a zatim sa acetaldehidom, poželjno takođe u prisustvu BF3(OEt)2, za dobijanje jedinjenja formule (IX)

gde su n i P kao što su gore opisani i zatim, podvrgavanje jedinjenja formule (IX) katalitičkoj hidrogenaciji, radi dobijanja jedinjenja formule (X)
8. Postupak prema zahtevu 7 za dobijanje jedinjenja, odabranog iz grupe, koju čine:

u kome se jedinjenje formule (X) podvrgava redukciji karbonila na C7 dovođenjem u kontakt jedinjenja formule (X) sa NaBH4ili Ca(BH4)2za dobijanje smeše alfa-OH i beta-OH na C7; a zatim se podvrgava tretmanu sa LiBH4kojim se u potpunosti redukuje metil estarska funkcionalna grupa u bočnom lancu do -CH2OH.
9. Postupak za dobijanje jedinjenja formule

navedeni postupak obuhvata dovođenje u kontakt sa MeONa/MeOH jedinjenja formule (XIV)

u kojoj n je 0, R8je OAc za dobijanje epimerizacije C6 stereocentra, čime se dobija jedinjenje formule (XI)

pri čemu tretman sa MeONa/MeOH istovremeno omogućava hidrolizu C3 acetoksi grupe.
10. Postupak prema zahtevu 9, naznačen time što se redukcija karbonila na C7 dobija dovođenjem u kontakt jedinjenja formule (XI) ili odgovarajućeg jedinjenja koje ima COOH u bočnom lancu, sa LiBH4dobijanjem gotovo isključivo alfa-OH na C7; pri čemu tretman sa LiBH4istovremeno redukuje, ukoliko je prisutan, metil estarsku funkcionalnu grupu u bočnom lancu do - CH2OH i uklanja zaštitu OAc ukoliko je prisutna na C3. Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5