RS59977B1 - Polipeptidi - Google Patents

Polipeptidi

Info

Publication number
RS59977B1
RS59977B1 RS20200191A RSP20200191A RS59977B1 RS 59977 B1 RS59977 B1 RS 59977B1 RS 20200191 A RS20200191 A RS 20200191A RS P20200191 A RSP20200191 A RS P20200191A RS 59977 B1 RS59977 B1 RS 59977B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
polypeptide
pramlintide
pro37
alpha
glu14
Prior art date
Application number
RS20200191A
Other languages
English (en)
Inventor
Lauge Schäffer
Thomas Kruse
Henning Thøgersen
Original Assignee
Novo Nordisk As
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novo Nordisk As filed Critical Novo Nordisk As
Publication of RS59977B1 publication Critical patent/RS59977B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/57527—Calcitonin gene related peptide
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/225—Calcitonin gene related peptide
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/542—Carboxylic acids, e.g. a fatty acid or an amino acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/643—Albumins, e.g. HSA, BSA, ovalbumin or a Keyhole Limpet Hemocyanin [KHL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/14—Prodigestives, e.g. acids, enzymes, appetite stimulants, antidyspeptics, tonics, antiflatulents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/12—Drugs for disorders of the metabolism for electrolyte homeostasis
    • A61P3/14—Drugs for disorders of the metabolism for electrolyte homeostasis for calcium homeostasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)

Description

OBLAST PRONALASKA
Pronalazak se odnosi na polipeptide koji sadrže amino-kiselinsku sekvencu koja je analogna SEQ ID No: 2 (pramlintid), farmaceutske kompozicije koje sadrže ove polipeptide i ove polipeptide za upotrebu kao lekova.
STANJE TEHNIKE
Veliki i rastući broj ljudi pati od dijabetesa melitusa i gojaznosti. Dijabetes melitus je metabolički poremećaj u kojem je sposobnost korišćenja glukoze delimično ili potpuno izgubljena.
Brojni režimi lečenja ciljaju prekomernu glukozu u krvi dok su drugi usmereni pre svega na smanjenje telesne težine. Najefikasnija sredstva protiv dijabetesa koja se koriste za snižavanje glukoze u krvi su insulin i njegovi analozi. Već duže vreme je poznato da se, kada se tradicionalni insulin koristi za lečenje dijabetesa, on povezuje sa povećanjem telesne težine. Insulin se mora ubrizgati potkožno do nekoliko puta dnevno.
Dijabetes tipa 2 uglavnom se leči dijetom i vežbanjem u ranim fazama. Kako stanje napreduje, dodaju se različita oralna antidijabetička sredstva. Ubrizgana sredstva poput GLP-1 analoga takođe se mogu koristiti u ovoj fazi. Generalno, ova sredstva su najefikasnija kod pacijenata sa funkcionisanjem beta-ćelija sposobnih da oslobađaju insulin i amilin.
Humani aminlin (SEQ ID No: 1) je polipeptid dugačak 37 aminokiselina koji ima fizičkohemijska svojstva koja njegovu upotrebu kao lek čine problematičnom. Konkretno, on ima tendenciju ka fibrilogenezi, tj. formiranju fibrila, in vitro i/ili ex vivo i postaje neefikasan zbog taloženja. Pored toga, aminlin je teško formulisati jer je hemijski nestabilan i taloži se pri fiziološkom pH. Stoga se formuliše u kiselom rastvoru.
Humani amin se vezuje za dva različita receptorska kompleksa. Ova dva kompleksa sadrže kalcitonin receptor plus protein koji modifikuje aktivnost receptora, RAMP1 ili RAMP3. Iz bliskog odnosa između kalcitoninskog receptora i amilinskog receptora, može se očekivati neka unakrsna reaktivnost na kalcitoninskog receptora od agonista amilinskog receptora. Kao primer, pramlintid ima neki afinitet prema kalcitoninskom receptoru, ali je 14 puta jači na amilinski receptor.
Kalcitoninski receptor se nalazi u mnogim tkivima po telu i veruje se da učestvuje u regulaciji koštanog metabolizma. Kalcitonin lososa trenutno se prodaje pod trgovačkim imenom Miacalcic®. Proizvod se koristi protiv hiperkalcemije, osteoporoze (uključujući postmenopauzalnu osteoporozu i osteoporozu koja je povezana sa glukokortikoidima), ostitis derformans (Pagetova bolest) i daje se jednom dnevno injekcijom ili nazalno. Kalcitonin se vezuje za specifične receptore u membrani skeleta, bubrega i u centralnom nervnom sistemu (CNS). Poluživot u plazmi kalcitonina lososa je oko 45 minuta.
Polipeptidi sa aktivnostima na kalcitoninskom receptoru mogu biti korisni u lečenju hiperkalcemije, osteoporoze, Pagetove bolesti, gojaznosti ili gojaznosti povezanih sa gojaznošću, kao i u prevenciji bolesti povezanih sa gojaznošću. Nedostatak lečenja trenutno korišćenim preparatima kalcitonina je taj da se, zbog kratkog poluživota kalcitonina lososa, lek mora primenjivati nekoliko puta dnevno i mora se davati neposredno pre obroka.
Polipeptidi sa dvostrukom aktivnošću i za kalcitoninski receptor i za amilinski receptor mogu biti povoljni.
Pramlintid (SEQ ID No: 2) je lek koji tržište plasira kompanija Amylin Pharmaceuticals plasiraju kao Symlin<®>za lečenje dijabetesa kao dodatak insulinu. Pramlintid je agonist receptora amilina. Otprilike 14 puta manje je aktivan na kalcitoninskom receptoru.
Hemijska struktura pramlintida je prikazana ispod i takođe na slici 1.
Pramlintid je hemijski nestabilan pri neutralnom pH i zato se obezbeđuje u kiselom rastvoru. U poređenju sa ljudskim amilinom, amino-kiseline na pozicijama 25, 28 i 29 u pramlintidu su supstituisane prolinom. Ova modifikacija smanjuje tendenciju proteina ka fibrilogenezi. Pramlintid ima vrlo kratak poluživot u plazmi i zbog toga se mora ubrizgati dva do tri puta dnevno.
WO2010046357 i WO2009034119 otkrivaju polipeptide koji sadrže analoge amilina koji imaju ostatak koji veže albumin (koji se u njemu nazivaju derivati amina). Iako ovi polipeptidi sa ostacima koji vezuju albumine pokazuju poboljšana farmakokinetička (PK) ili farmakodinamička (PD) svojstva u poređenju sa pramlintidom, oni i dalje mogu da pokažu slabu fizičku stabilnost pod određenim uslovima.
WO2011064282 se odnosi na postupak za proizvodnju polipeptida u genetski modifikovanom soju kvasca, posebno otkrivajući prekursor za stvaranje pramlintidskog jedinjenja sa C-terminalnim amidom.
KRATAK OPIS PRONALASKA
Predmetni pronalazak se odnosi na polipeptid prema Formuli (I):
Xaa1-Cys- Xaa3-Thr-Ala-Thr-Cys-Ala-Thr-Gln-Arg-Leu-Ala-Xaa14-Phe-Leu- Xaa17-Xaa18-Ser-Ser- Xaa21- Xaa22- Phe- Gly- Pro- Xaa26-Leu-Pro-Pro-Thr- Xaa31-Val-Gly-Ser- Xaa35-Thr-Pro
pri čemu
Xaa1je izbrisan ili nezavisno izabran iz Ala, Cys, Glu, Gly, His, Arg, Ser i Lys;
Xaa3je nezavisno izabran iz Gly, His, Arg, Ser i Asn;
Xaa14je nezavisno izabran iz Glu;
Xaa17je nezavisno izabran iz His, Arg, Lys i Val;
Xaa18je nezavisno izabran iz Arg, Lys i His;
Xaa21je nezavisno izabran iz Ala, Lys, Gln, Ser i Asn;
Xaa22je nezavisno izabran iz Glu, Gln, Ser, Thr i Asn;
Xaa26je nezavisno izabran iz Pro, Arg i Ile;
Xaa31je nezavisno izabran iz Ser, Glu, Asp i Asn;
Xaa35je nezavisno izabran iz His, Arg, Lys, Asp, Gln i Glu;
gde je C-terminalni kraj polipeptida amid;
i gde C-terminalni kraj može, po izboru, da se derivatiše;
i gde je polipeptid agonist receptora amilina.
Po izboru, polipeptid ima EC50u testu potencije humanog amilinskog receptora, kakav je ovde otkriven, od oko 1800pM ili manji. Po izboru, polipeptid ima EC50u testu potencije humanog kalcitoninskog receptora, kakav je ovde stavljeno na uvid, od oko 1800pM ili manji. Po izboru, polipeptid ima rastvorljivost pri pH 4 od oko 100 µM ili više u testu rastvorljivosti, kao što je ovde stavljeno na uvid. Po izboru, polipeptid ima rastvorljivost pri pH 7 od oko 100 µM ili više u testu rastvorljivosti, kao što je ovde stavljeno na uvid. Po izboru, polipeptid ima fizičku stabilnost od oko 25 sati ili veću u testu fibrilogeneze (koji se, takođe, naziva test fibrilacije), kao što je ovde stavljeno na uvid. Po izboru, polipeptid ima bar jedan supstituent vezan za najmanje jedan od njegovih aminokiselinskih ostataka.
Barem u nekim realizacijama, polipeptidi ovog pronalaska imaju povećanu rastvorljivost.
Barem u nekim realizacijama, polipeptidi ovog pronalaska imaju povećanu fizičku stabilnost.
Barem u nekim realizacijama, polipeptidi ovog pronalaska imaju povećanu rastvorljivost i fizičku stabilnost.
Barem u nekim realizacijama, polipeptidi ovog pronalaska pokazuju povoljan farmakokinetički profil i/ili povoljan farmakološki profil. Primer povoljnog farmakokinetičkog profila je profil dugog dejstva.
Predmetni pronalazak se, takođe, odnosi na farmaceutske formulacije koje sadrže iste. Predmetni pronalazak se, takođe, odnosi na farmaceutsku upotrebu istih. Predmetni pronalazak se, takođe, odnosi na isporuku istog (kao što je primena) pacijentima kojima je potrebno lečenje istim.
U drugom aspektu, pronalazak dalje sadrži farmaceutski preparat koji sadrži gore pomenuti polipeptid.
U drugom aspektu, pronalazak dalje obuhvata postupak za proizvodnju farmaceutske kompozicije koja sadrži gorenavedeni polipeptid.
U drugom aspektu, pronalazak dalje sadrži gorenavedeni polipeptid za upotrebu kao lek.
Polipeptidi ovog pronalaska su povoljni jer poseduju poboljšanu rastvorljivost i/ili fizičku stabilnost.
Ovde su opisani pogodni testovi koji se koriste za određivanje potencijala amilinskih i kalcitoninskih receptora, kao i za određivanje rastvorljivosti i fizičke stabilnosti polipeptida. Na primer, pogledajte Analize (II), (IV) i (III), respektivno.
Slika 1 predstavlja strukturu.
Slika 2 predstavlja strukturu.
Slika 3 predstavlja strukturu.
Slika 4 predstavlja strukturu.
DEFINICIJE
Izraz „humani amin“, kako je ovde upotrebljen, odnosi se na polipeptidni humani aminlin koji ima sekvencu kao što je prikazano u SEQ ID No: 1. Izraz uključuje, ali nije ograničen na, humani polipeptidni hormon od 37 amino-kiselina koje se nazivaju amilin, koji se u prirodi kosekretuje sa insulinom iz β -ćelija pankreasa. Humani amilin ima sledeću primarnu sekvencu amino-kiselina:
Lys-Cys-Asn-Thr-Ala-Thr-Cys-Ala-Thr-Gln-Arg-Leu-Ala-Asn-Phe-Leu-Val-His-Ser-Ser-Asn-Asn-Phe-Gly-Ala-Ile-Leu-Ser-Ser-Thr-Asn-Val-Gly-Ser-Asn-Thr-Tyr(SEQ ID NO: 1)
Ljudski amilin ima disulfidni most između dva Cys ostatka i C-terminalnu amidnu grupu. Ova struktura je prikazana u daljem tekstu i, takođe, na slici 4.
Ovde se SEQ ID No: 1 i humani amilin mogu koristiti naizmenično.
Izraz „pramlintid“, kako je ovde upotrebljen, odnosi se na sintetički polipeptid koji ima sekvencu kao što je prikazano u SEQ ID No 2. Pramlintid ima sledeću primarnu sekvencu amino-kiselina:
Lys-Cys-Asn-Thr-Ala-Thr-Cys-Ala-Thr-Gln-Arg-Leu-Ala-Asn-Phe-Leu-Val-His-Ser-Ser-Asn-Asn-Phe-Gly-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-Thr-Asn-Val-Gly-Ser-Asn-Thr-Tyr (SEQ ID NO: 2)
Pramlintid ima disulfidni most između dva Cys ostatka i C-terminalnu amidnu grupu. Ova struktura je prikazana u daljem tekstu i, takođe, na slici 1.
Ovde se SEQ ID No: 2 i pramlintid mogu koristiti naizmenično.
Izraz „kalcitonin“ znači kalcitonin lososa ili humani kalcitonin.
Izraz „kalcitonin lososa“ ili „sCT” označava nativnu proteinsku sekvencu kalcitonina lososa, kao što je otkriveno u Niall i dr. (1969), Biochemistry vol 64, slika 2. Kalcitonin lososa je polipeptid koji se sastoji od 32 amino-kiseline. Ima disulfidni most između prve i sedme amino-kiseline na amino-terminalnom kraju polipeptidnog lanca, disulfidni most je neophodan za njegovu biološku aktivnost, i prolinamidnu grupu na karboksilnoj terminalnoj aminokiselini.
Izraz „humani kalcitonin“ označava nativnu sekvencu proteina humanog kalcitonina kao što je otkriveno u Niall i dr. (1969), Biochemistry vol 64, slika 2.Humani kalcitonin je polipeptid koji se sastoji od 32 amino-kiseline. Ima disulfidni most između prve i sedme amino-kiseline na amino-terminalnom kraju polipeptidnog lanca, disulfidni most je neophodan za njegovu biološku aktivnost, i prolinamidnu grupu na karboksilnoj terminalnoj aminokiselini.
Izraz „analog amilina“ ili „amilinski analog“, kako je ovde upotrebljen, odnosi se na varijantu SEQ ID No: 1.
Izraz „analog pramlintida“ ili „pramlintidni analog“, kako je ovde upotrebljen, odnosi se na varijantu SEQ ID No: 2.
Na primer, pomenute varijante uključuju, ali nisu ograničene na, jednu ili više supstitucija i/ili jednu ili više delecija i/ili jedan ili više dodataka bilo kojeg od amino-kiselinskih ostataka za bilo koju prirodnu ili neprirodnu amino-kiselinu, sintetičku amino-kiselinu ili peptidomimetik i/ili vezivanje supstituenta na bilo koju od prirodnih ili neprirodnih amino-kiselina, sintetičkih amino-kiselina ili peptidomimetik na bilo kojoj dostupnoj poziciji.
Varijanta može imati isti broj amino-kiselinskih ostataka kao pramlintid (tj. 37). Alternativno, varijanta može sadržati manje amino-kiselinskih ostataka od pramlintida. Alternativno, varijanta može da sadrži više amino-kiselinskih ostataka od pramlintida. U nekim rešenjima, varijanta ima isti broj amino-kiselinskih ostataka kao pramlintid (tj. 37). U nekim realizacijama, varijanta uključuje supstituciju bilo kojeg od amino-kiselinskih ostataka bilo koje prirodne ili neprirodne amino-kiseline, sintetičke amino-kiseline ili peptidomimetika i/ili vezivanje supstituenta na bilo koju od prirodnih ili neprirodnih amino-kiselina, sintetičku amino-kiselinu ili peptidomimetik na bilo kojoj dostupnoj poziciji.
Polipeptid može da sadrži jednu ili više supstitucija amino-kiselina. Prema tome, za neke realizacije, broj supstitucija amino-kiselina u analogu amilina može biti najmanje jedan. Poželjno, broj amino supstitucija je između jedan i petnaest, poželjnije između jedan i dvanaest, poželjnije između jedan i deset, poželjnije između jedan i pet, poželjnije između jedan i tri.
Broj insercija, dodataka, delecija ili supstitucija amino-kiselina može biti najmanje 1, ali do 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 insercija, dodataka, delecija ili zamena može biti prisutno. Supstitucija ili dodatak može biti bilo kojom prirodnom ili neprirodnom amino-kiselinom, sintetičkim aminokiselinom, peptidomimeticima ili drugim hemijskim jedinjenjima. Dodavanje ili delecija aminokiselinskih ostataka može da bude na N-terminalu peptida i/ili na C-terminalu peptida.
Kada se ovde koristi, izraz „prirodna amino-kiselina“ je amino-kiselina (sa uobičajenim oznakama od tri slova i jednog slova u zagradama) izabrana iz grupe koja se sastoji od: Glicina (Gly & G), prolina (Pro & P), alanina (Ala & A), valina (Val & V), leucina (Leu & L), izoleucina (Ile & I), metionina (Met & M), cisteina (Cys & C), fenilalanina (Phe & F), tirozina (Tyr & Y ), triptofana (Trp & W), histidina (His & H), lizina (Lys & K), arginina (Arg & R), glutamina (Gln & Q), asparagina (Asn & N), glutaminske kiseline (Glu & E), aspartanska kiselina (Asp & D), serina (Ser & S) and treonina (Thr & T). Ako zbog grešaka pri kucanju postoje odstupanja od najčešće korištenih oznaka, primenjuju se najčešće korišćene oznake. Amino-kiseline prisutne u polipeptidima ovog pronalaska su, poželjno, amino-kiseline koje mogu da se kodiraju nukleinskom kiselinom.
Ako analog sadrži ili više od 37 amino-kiselinskih ostataka ili manje od 37 amino-kiselinskih ostataka, onda stručnjak još uvek može da uskladi tu sekvencu sa sekvencom pramlintida (SEQ ID No. 2) da odredi broj smeštaja odgovarajućeg ostatka amino-kiseline. Pogodan program poravnanja je „igla“, što je poravnanje Needleman-Wunsch. Algoritam za ovaj program poravnanja je opisan u Needleman, S.B. and Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48: 443-453.
U numeričkom nizu SEQ ID No: 2, i prema ustaljenoj praksi u tehnici, ostatku amino-kiseline na N-kraju (Lys) je dodeljen br. 1 i sledeći amino-kiselinski ostaci se broje uzastopno, završavajući na C-kraju sa tirozinom sa dodeljenim br. 37. Stoga, uopšteno, svako upućivanje ovde na pozicionirani broj amino-kiselinskog ostatka obezbeđuje njegovu lokaciju u sekvenci od 37 amino-kiselina; data sekvenca od 37 amino-kiselina je analog pramlintida. Na primer, upućivanje na analog koji je modifikovan na poziciji 14 može se odnositi na analog u kome je 14. amino ostatak od 37 amino-kiselina u analogu modifikovan.
Drugim rečima, numerisanje analognog niza amino-kiselina obezbeđuje položaj svakog analoga u odnosu na sekvencu od 37 amino-kiselina, pri čemu je numerisanje uzastopno i uzlazno u smeru od N-kraja do C-kraja.
Analozi se mogu opisati upućivanjem na broj amino-kiselinskog ostatka pramlintida ili humanog amilina koji je modifikovan, tj. njegovom pozicijom i prirodom modifikacije. Slede neograničavajući primeri odgovarajuće analogne nomenklature.
Na primer:
[Pro37]-pramlintid označava analog SEQ ID No: 2 (pramlintid) pri čemu promena u odnosu na pramlintid predstavlja supstituciju Tyr-a na poziciji 37 sa Pro.
[Glu14,Arg17,Pro37]-pramlintid označava analog SEQ ID No: 2 (pramlintid), u kome je Asn na poziciji 14 supstituisana sa Glu, Val na poziciji 17 je supstituisana sa Arg, a Tyr na poziciji 37 je supstituisana sa Pro.
Kao još jedan primer, des1 (ili Des<1>) u odnosu na analog pramlintida odnosi se na analog u kome je N-terminalna amino-kiselina, lizin, izbrisana. Analog pramlintida, gde je izbrisana N-terminalna aminokiselina takođe se može označiti kao 1 pramlintid.
[Pro25,Pro28,Pro29]-humani amilin označava analog SEQ ID No: 1 (humani amilin) gde su modifikacije humanog amilina to što su Ala na poziciji 25 i Cys na pozicijama 28 i 29 supstituisane sa Pro. Ovaj polipeptid je pramlintid. Prema tome, razumeće se da je pramlintid analog humanog amilina. Stoga se „analozi pramlintida“ i „analozi amilina“ mogu koristiti naizmenično.
Očigledno je iz gornjih primera da amino-kiselinski ostaci mogu biti identifikovani njihovim punim imenom, njihovim jednoslovnim kodom i/ili njihovim troslovnim kodom. Ova tri načina su potpuno ekvivalentna.
Izrazi „odgovara“, „odgovarajući je“, „pozicija/položaj ekvivalentan“ ili „odgovarajući položaj/pozicija“, kao što se ovde koristi, mogu se koristiti za karakterizaciju mesta modifikacije u analogu pramlintida upućivanjem na SEQ ID No: 2. Ekvivalentne ili odgovarajuće pozicije lako se zaključuju, npr. jednostavnim rukopisom i vizuelnim pregledom; i/ili se može koristiti standardni program poravnanja proteina ili polipeptida, kao što je „poravnanje“ koje se zasniva na Needleman-Wunsch poravnanju. Ovaj algoritam je opisan u Needleman, S.B. and Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48: 443-453, i program poravnanja koje su napravili Myers and W. Miller u „Optimal Alignments in Linear Space" CABIOS (računarske aplikacije u biološkim naukama) (1988) 4 : 11-17. Za poravnanje se može koristiti podrazumevana matrica bodovanja BLOSUM62 i podrazumevana matrica identiteta, a razlika za prvi ostatak u prekidu može se postaviti na -10, a razlike za dodatne ostatke u prekidu na -0.5.
Polipeptid može da sadrži jedan ili više supstituenata na jednom ili više amino-kiselinskih ostataka. Takvi polipeptidi se, takođe, mogu nazvati derivatima pramlintida ili amilinskim derivatima.
Izraz „supstituent“, kako je ovde upotrebljen, označava bilo koji pogodni deo vezan, posebno kovalentno vezan, na amino-kiselinski ostatak, naročito na bilo koju raspoloživu poziciju na amino-kiselinskom ostatku. Obično je pogodna grupa hemijski grupa.
U nekim realizacijama supstituent sadrži linker.
U nekim realizacijama, polipeptid ima supstituent na jednom amino-kiselinskom ostatku, čiji je amino-kiselinski ostatak ili amino-kiselinski ostatak u N-terminalnom ostatku ili je aminokiselinski ostatak lizin.
U nekim realizacijama, polipeptid ima supstituent na N-terminalnom amino-kiselinskom ostatku vezan preko α(alfa)-amino grupe N-terminalnog amino-kiselinskog ostatka.
U nekim realizacijama, N-terminalni amino-kiselinski ostatak je lizin i polipeptid ima supstituent na N-terminalnom amino-kiselinskom ostatku vezan preko ε(epsilon)-amino grupe lizinskog amino ostatka.
U nekim realizacijama, polipeptid se produžava dodavanjem ostatka lizina na N-kraju i polipeptid ima supstituent na N-terminalnom ostatku amino-kiseline vezan preko ε-amino grupe lizinskog amino ostatka.
U nekim rešenjima, polipeptid se produžava dodavanjem aminokiselinskog ostatka na N-kraju i polipeptid ima supstituent na N-terminalnom ostatku amino-kiseline vezanom preko αamino grupe ostatka N-terminalnog ostatka amino-kiseline.
Kako je ovde upotrebljen, termin „hidrokarbil” odnosi se na grupu koja sadrži najmanje ugljenik i vodonik koji mogu opciono da sadrže jedan ili više drugih odgovarajućih supstituenata. Primeri takvih supstituenata mogu da uključuju hidroksi, alkil, halo, alkoksi, haloalkil, haloalkoksi, amino, aminoalkil ili cikličnu grupu. Osim mogućnosti da su supstituenti ciklična grupa, kombinacija supstituenata može formirati cikličnu grupu. Ako hidrokarbilna grupa sadrži više od jednog atoma ugljenika, onda ti atomi ugljenika ne moraju nužno biti povezani jedan sa drugim. Na primer, najmanje dva atoma ugljenika mogu biti povezani preko pogodnog atoma ili grupe. Prema tome, hidrokarbilna grupa može sadržavati heteroatome. Prikladni heteroatomi biće jasni stručnjacima u tehnici i uključuju, na primer, sumpor, azot, kiseonik, fosfor i silicijum. U jednom aspektu, hidrokarbilna grupa izabrana je iz grupe koju čine alkilna grupa, alkenilna grupa, alkinilna grupa, arilna grupa, heteroarilna grupa ili cikloalkilna grupa, od kojih svaka može biti opciono supstituisana. Primeri takvih supstituenata mogu da uključuju hidroksi, alkil, halo, alkoksi, haloalkil, haloalkoksi, amino, aminoalkil ili cikloalkil grupu.
Kako je ovde upotrebljen, izraz „alkil” uključuje i zasićene ravne lance i razgranate alkil grupe koje mogu biti supstituisane (mono- ili poli-) ili nesupstituisane. Poželjno, alkil grupa je C1-20alkil grupa, poželjnije C1-15, poželjnije C1-10alkil grupa, poželjnije C1-8alkil grupa, poželjnije C1-6alkil grupa. Posebno poželjne alkil grupe uključuju, na primer, metil, etil, npropil, izo-propil, n-butil, sec-butil, izo-butil, terc-butil, n-pentil, n-heksil, n-heptil i n-oktil. Pogodni supstituenti uključuju, na primer, hidroksi, alkil, halo, alkoksi, haloalkil, haloalkoksi, amino, aminoalkil ili cikloalkil grupu.
Kao se ovde koristi, izraz „cikloalkil” odnosi se na cikličnu alkil grupu koja može biti supstituisana (mono- ili poli-) ili nesupstituisana. Pogodni supstituenti uključuju, na primer, hidroksi, alkil, halo, alkoksi, haloalkil, haloalkoksi, amino, aminoalkil ili cikloalkil grupu.
Kako je ovde upotrebljen, izraz „alkenil” odnosi se na lanac ugljenika koji sadrži jednu ili više dvostrukih veza ugljenik-ugljenik, koje mogu biti razgranate ili nerazgranate, i supstituisane (mono- ili poli-) ili nesupstituisane. Poželjno, alkenil grupa je C2-20alkenil grupa, još poželjnije C2-15alkenil grupa, poželjnije C2-10alkenil grupa, poželjnije C2-8alkenil grupa, ili još poželjnije C2-6alkenil grupa. Pogodni supstituenti uključuju, na primer, hidroksi, alkil, halo, alkoksi, haloalkil, haloalkoksi, amino, aminoalkil ili cikloalkil grupu.
Kako je ovde upotrebljen, izraz „alkinil” odnosi se na lanac ugljenika koji sadrži jednu ili više trostrukih veza ugljenik-ugljenik, koje mogu biti razgranate ili nerazgranate i supstituisane (mono- ili poli-) ili nesupstituisane. Poželjno alkinilna grupa je C2-20alkinilna grupa, poželjnije C2-15alkinilna grupa, poželjnije C2-10alkinil grupa, poželjnije C2-8alkinil grupa, ili još poželjnije C2-6alkinil grupa. Pogodni supstituenti uključuju, na primer, hidroksi, alkil, halo, alkoksi, haloalkil, haloalkoksi, amino, aminoalkil ili cikloalkil grupu.
Kako je ovde upotrebljen, izraz „aril” odnosi se na C6-10aromatičnu grupu koja može biti supstituisana (mono- ili poli-) ili nesupstituisana. Uobičajeni primeri uključuju fenil i naftil, itd. Pogodni supstituenti uključuju, na primer, hidroksi, alkil, halo, alkoksi, haloalkil, haloalkoksi, amino, aminoalkil ili cikloalkil grupu.
Kako je ovde upotrebljen, izraz „heteroaril” odnosi se na arilnu grupu kao što je definisano gore koja sadrži jedan ili više heteroatoma. Pogodni heteroatomi će biti očigledni stručnjacima u tehnici i uključuju, na primer, sumpor, azot, kiseonik, fosfor i silicijum. Pogodni supstituenti uključuju, na primer, hidroksi, alkil, halo, alkoksi, haloalkil, haloalkoksi, amino, aminoalkil ili cikloalkil grupu.
Izraz „linker” kako je ovde upotrebljen uključuje pogodne supstituente koji mogu pridružiti grupu (deo), kao što je hemijska grupa, polipeptidu, kao što je polipeptidna kičma. Tako, linker i hemijska grupa zajedno postaju supstituent. Grupa spojena na linker može biti bilo koja odgovarajuća grupa (deo). Primeri uključuju grupu koja vezuje albumin.
U jednoj realizaciji, deo koji vezuje albumin ima od 6 do 40 atoma ugljenika, od 8 do 26 atoma ugljenika ili od 14 do 22 atoma ugljenika, na primer 16, 17, 18, 19, 20 atoma ugljenika.
U drugoj realizaciji, deo koji vezuje albumin je acilna grupa izabrana iz grupe koja sadrži CH3(CH2)rCO-, gde je r ceo broj od 4 do 38, poželjno ceo broj od 4 do 24, poželjnije izabran iz grupe koja sadrži CH3(CH2)6CO-, CH3(CH2)8CO-, CH3(CH2)10CO-, CH3(CH2)12CO-, CH3(CH2)14CO-, CH3(CH2)16CO-, CH3(CH2)18CO-, CH3(CH2)20CO- i CH3(CH2)22CO-.
U jednoj realizaciji, deo koji vezuje albumin sadrži grupu koja može biti nabijena naelektrisana na pH 7.4.
U jednoj realizaciji, deo koji vezuje albumin sadrži grupu karboksilne kiseline, kao što je HOOC(CH2)sCO-, pri čemu je s ceo broj od 12 do 22. Poželjno, s je 16 ili 18.
U jednoj realizaciji, deo vezan za linker je deo koji vezuje albumin.
Na primer, linker može da sadrži jednu ili dve amino-kiseline koje se na jednom kraju vezuju za grupu - kao što je deo koji vezuje albumin - a na drugom kraju se vezuju za bilo koju raspoloživu poziciju na polipeptidnoj kičmi.
U nekim realizacijama, linker obezbeđuje most ili vezu između amino grupe na polipeptidnoj kičmi i acilne grupe na grupi - kao što je deo koji vezuje albumin. Linker može biti vezan za, ili blizu, N-terminalni ostatak amino-kiseline. Poželjno, linker je vezan na amino-kiselinu na poziciji 1 analoga pramlintida.
Sledeći primer linkera je kombinacija najmanje jedne amino-kiseline i amina.
U jednoj realizaciji, poželjno je da je amin grupa OEG, pri čemu je formula OEG prikazana dole:
U nekim realizacijama, poželjno je da je linker izabran iz grupe koja se sastoji od γGlu, γGluγGlu, γGlu- γGlu- γGlu, γGlu- γGlu- γGlu- γGlu, Glu, Glu-Glu, Glu- γGlu, Glu-Arg, Glu-Glu-Arg, His, His-His, His- γGlu, His-His- γGlu, Gly, Gly- γGlu, Ser, Ser- γGlu, D-Arg-D-Arg, Arg, Arg-Arg, Arg-Arg- γGlu, Ser-Ser,-Gly-Ser-Ser, Ser-Ser,-Gly-Ser-Ser- γGlu, Ser-Ser-Gly-Ser-Ser-Gly and Ser-Ser-Gly-Ser-Ser-Gly- γGlu, γGlu-OEG, γGlu-2xOEG i OEG, poželjno da je linker izabran iz γGlu, γGlu- γGlu, γGlu-OEG, γGlu-2xOEG i OEG, poželjnije, linker je γGlu- γGlu.
Linker može doprineti i/ili pojačati efekat vezivanja grupe (na primer, deka koji vezuje albumin), npr. linker koji sadrži γGlu može pojačati efekat vezivanja albumina kod polipeptida.
Upotrebom izraza „ γGlu” ili „gGlu” ili gamaGlu ili gama-L-Glu označava se amino-kiselina sa
sledećom strukturom (takođe prikazana na slici 2):
alfa-azot i gama-karboksi grupa iz amidnih veza na dva
susedna ostatka
Upotrebom izraza „ γGlu- γGlu” označava se deo sa sledećom strukturom:
Upotrebom izraza „ γGlu-OEG”] označava se deo sa sledećom strukturom:
Upotrebom izraza „ γGlu-OEG-OEG” označava se deo sa sledećom strukturom:
Izraz „epilson amino grupa” ili „ε-amino grupa” ovde upotrebljen u odnosu na lizin, odnosi se na amino grupu na 6. poziciji, koristeći IUPAC standardnu konvenciju o numerisanju.
Izraz „alfa amino grupa” ili „α-amino grupa” odnosi se na amino grupu na 2. poziciji, koristeći IUPAC standardnu konvenciju o numerisanju. Pozivamo se na sledeću strukturu (takođe, prikazanu na Slici 3).
epsilon amino grupa
alfa amino grupa
O
Izraz „deo koji vezuje albumin”, kako se ovde koristi, odnosi se na bilo koju hemijsku grupu koja se može vezati za albumin, tj. ima afinitet vezanja albumina. U jednom aspektu, deo koji vezuje albumin je acilna grupa.
U nekim realizacijama, po mogućnosti, deo koji vezuje albumin je acilna grupa izabrana iz:
(a) CH3(CH2)rCO-, pri čemu je r ceo broj od 4 do 24;
(b) HOOC(CH2)sCO-, pri čemu je s ceo broj od 14 do 20, na primer 16 ili 18.
„Afinitet vezivanja albumina” može se odrediti pomoću nekoliko postupaka poznatih u struci. U jednoj metodi, jedinjenje koje se meri se radioaktivno obeležava sa npr.<125>I ili<3>H i inkubiraju se imobilisanim albuminom (Kurtzhals et.al., Biochem.J., 312, 725-731 (1995)). Izračunava se vezivanje jedinjenja u odnosu na standard. U drugom postupku, srodno jedinjenje je radioaktivno obeleženo i njegovo vezivanje za albumin imobilizovano na npr. zrnicima SPA je upoređeno sa serijom razblaživanja jedinjenja koje se meri. Vrednost EC50za upoređivanje je merilo afiniteta jedinjenja. U trećem postupku, afinitet receptora ili potentnost jedinjenja se meri u različitim koncentracijama albumina, a pomak u relativnom afinitetu ili potentnosti jedinjenja u funkciji koncentracije albumina odražava njegov afinitet prema albuminu.
Polipeptidi ovog pronalaska pokazuju dobru potentnost. Izraz „potentnost“ koristi se za opisivanje efekta datog jedinjenja u ispitivanjima gde je uspostavljena sigmoidna veza između log koncentracije i efekta jedinjenja. Štaviše, odgovor treba da varira od 0 do 100%. EC(efektivna koncentracija)50može se koristiti za opisivanje koncentracije datog jedinjenja dajući odgovor od 50% u testu, kao što je funkcionalni test.
Polipeptidi ovog pronalaska pokazuju dobru aktivnost. Izraz „aktivnost" odnosi se na sposobnost smanjenja apetita i/ili povećanja sitosti. Aktivnost se može meriti sposobnošću da se smanji apetit, npr. opisano u ovom tekstu u Ispitivanju (I).
Polipeptidi predmetnog pronalaska pokazuju dobru fizičku stabilnost. Izraz „fizička stabilnost“ polipeptida prema pronalasku ili njegove formulacije odnosi se na tendenciju polipeptida da ne formira biološki neaktivne i/ili nerastvorljive agregate kao rezultat izlaganja termomehaničkom naprezanju i/ili interakciji sa destabilizujućim interfejsima i površinama, kao što su hidrofobne površine i interfejsi. Fizička stabilnost vodenih polipeptidnih formulacija može se proceniti vizuelnim pregledom, testom fibrilacije ThT (koji se ponekad naziva i ThT test fibrilologeneze) i/ili merenjima zamućenosti kao što je ovde opisano na drugom mestu. Vizuelna inspekcija formulacije vrši se na oštrom usmerenom svetlu sa tamnom pozadinom. Zamućenost formulacije je okarakterisana vizuelnim rezultatom koji određuje stepen zamućenosti, na primer na skali od 0 do 3 (formulacija koja ne pokazuje zamućenost odgovara vizuelnoj oceni 0, a formulacija koja pokazuje vizuelnu zamućenost na dnevnoj svetlosti odgovara vizuelnom rezultatu 3). Formulacija je klasifikovana kao fizički nestabilna u pogledu agregacije proteina, kada pokazuje vizuelnu zamućenost na dnevnom svetlu. Alternativno, zamućenost formulacije može se proceniti jednostavnim merenjem zamućenosti koje je dobro poznato stručnjaku.
Polipeptidi predmetnog pronalaska pokazuju dobru hemijsku stabilnost. Izraz „hemijska stabilnost" polipeptida prema pronalasku ili njegove formulacije odnosi se na nema hemijskih kovalentnih promena u strukturi polipeptida, čime se izbegava stvaranje hemijskih produkata razgradnje sa potencijalno manjom potencijom i/ili potencijalno povećana imunogena svojstva u poređenju sa roditeljskom (nativnom) strukturom polipeptida. Različiti proizvodi hemijske degradacije mogu da se formiraju u zavisnosti od tipa i prirode roditeljskog polipeptida i sredine kojoj je polipeptid izložen. Eliminacija hemijske razgradnje najverovatnije se ne može u potpunosti izbeći, a sve veće količine proizvoda hemijske razgradnje često se vide tokom skladištenja i upotrebe polipeptidnih formulacija, kao što je dobro poznato stručnjaku u tehnici. Većina polipeptida je podložna deamidaciji, procesu u kome se amidna grupa bočnog lanca u glutaminilnim ili asparaginilnim ostacima hidrolizuje da bi se formirala slobodna karboksilna kiselina. Drugi putevi degradacije uključuju stvaranje transformacionih proizvoda visoke molekulske mase gde su dva ili više polipeptidnih molekula kovalentno vezani jedan za drugi preko transamidacije i/ili interakcije disulfida što dovodi do stvaranja kovalentno vezanih dimera, oligomera i polimerskih proizvoda degradacije (Stability of Protein Pharmaceuticals, Ahern. T.J. & Manning M.C., Plenum Press, New York 1992). Oksidacija (npr. metioninskih ostataka) može se pomenuti kao druga varijanta hemijske degradacije. Hemijska stabilnost polipeptidne formulacije može se proceniti merenjem količine proizvoda hemijske degradacije u različitim vremenskim tačkama nakon izlaganja različitim uslovima okoline (formiranje proizvoda degradacije se često može ubrzati, na primer, povećanjem temperature). Količina svakog pojedinačnog proizvoda degradacije se često određuje razdvajanjem proizvoda degradacije u zavisnosti od veličine i/ili naelektrisanja molekula korišćenjem različitih tehnika hromatografije (e.g. SEC-HPLC i/ili RP-HPLC).
Izraz „stabilizovana kompozicija“ se odnosi na formulaciju sa povećanom fizičkom stabilnošću, povećanom hemijskom stabilnošću ili povećanom fizičkom i hemijskom stabilnošću u poređenju sa vodenim rastvorom polipeptida.
OPIS PRONALASKA
Sledeći opis pronalaska uključuje stavljanje na uvid realizacija i aspekata koji se ne smeju tumačiti kao opis zahtevanog pronalaska, per se, ali koji može poslužiti kao dodatna pomoć za razumevanje pronalaska čija se zaštita traži i njegove modifikacije.
Opšti aspekti
Ovde su otkriveni polipeptidi koji sadrže sekvencu amino-kiselina koja je analogna SEQ ID No: 2, pri čemu:
(a) dati analog sadrži ostatak prolina na poziciji 37;
(b) dati analog sadrži ostatak glutaminske kiseline na poziciji 14;
(c) dati analog sadrži ostatak histidina ili arginina na poziciji 17;
pri čemu numerisanje analognih sekvenci amino-kiselina odgovara numerisanju sekvence amino-kiseline u SEQ ID No: 2; i
opciono, polipeptid ima najmanje jedan supstituent vezan za najmanje jedan od njegovih amino-kiselinskih ostataka.
Predmetni pronalazak se odnosi na polipeptide prema Formuli (I):
Xaa1-Cys-Xaa3-Thr-Ala-Thr-Cys-Ala-Thr-Gln-Arg-Leu-Ala-Xaa14-Phe-Leu-Xaa17-Xaa18-Ser-Ser-Xaa21-Xaa22-Phe-Gly-Pro-Xaa26-Leu-Pro-Pro-Thr- Xaa31-Val-Gly-Ser-Xaa35-Thr-Pro;
Formula (I) (SEQ ID No:3)
pri čemu
Xaa1je izbrisan ili nezavisno izabran iz Ala, Cys, Glu, Gly, His, Arg, Ser i Lys;
Xaa3je nezavisno izabran iz Gly, His, Arg, Ser i Asn;
Xaa14je nezavisno izabran iz Glu i Asn;
Xaa17je nezavisno izabran iz His, Arg, Lys i Val;
Xaa18je nezavisno izabran iz Arg, Lys i His;
Xaa21je nezavisno izabran iz Ala, Lys, Gln, Ser i Asn;
Xaa22je nezavisno izabran iz Glu, Gln, Ser, Thr i Asn;
Xaa26je nezavisno izabran iz Pro, Arg i Ile;
Xaa31je nezavisno izabran iz Ser, Glu, Asp i Asn;
Xaa35je nezavisno izabran iz His, Arg, Lys, Asp, Gln i Glu;
pri čemu je C-kraj polipeptida amid;
pri čemu C-kraj može po izboru biti derivatizovan; i
pri čemu je polipeptid agonist receptora amilina.
Polipeptid ovog pronalaska može da sadrži ostatak na poziciji 17 koji je histidin ili arginin, poželjno arginin.
Polipeptid ovog pronalaska može da sadrži ostatak na poziciji 35 koji je nezavisno izabran od bilo kog od histidina, asparagina, glutamina i glutaminske kiseline; poželjno histidina, glutamina i asparagina; poželjnije asparagin.
Polipeptid ovog pronalaska može da sadrži amino-kiselinski ostatak na poziciji 14 koji je glutaminska kiselina i ostatak na poziciji 17 koji je arginin.
Polipeptid ovog pronalaska može da sadrži najmanje jedan supstituent vezan na najmanje jedan amino-kiselinski ostatak datog polipeptida. Ova supstituentna grupa može biti izabrana iz bilo koje od grupa supstituenata predstavljenih u tabeli 1. Supstituentna grupa može biti vezana za α-amino grupu N-terminalnih ostataka amino-kiselina ili za Lys ostatak.
Derivat polipeptida prema ovom pronalasku može sadržavati γGlu linker vezan na N-kraj datog polipeptida i HOOC(CH2)18CO- ili HOOC(CH2)16CO- kao ostatak koji vezuje albumin, i može imati polipeptidnu sekvencu koja sadrži:
a. Glu na poziciji 14,
b. His ili Arg na poziciji 17 i
c. Pro na poziciji 37.
Polipeptid ovog pronalaska može biti bilo koji od polipeptida predstavljenih u Tabeli 9. Polipeptid može biti N-alfa-[(S)-4-karboksi-4-(19-karboksinonadekanoilamino)butiril]- [Glu14, Arg17, Pro37]-pramlintid. Polipeptid može biti N-alfa-[(S)-4-karboksi-4-(19-karboksinonadekanoilamino)butiril]-[Glu14, His17, Pro37]- pramlintid.
Neke prednosti
Polipeptidi ovog pronalaska mogu da ispoljavaju poboljšanu fizičku stabilnost.
Polipeptidi ovog pronalaska mogu da ispoljavaju poboljšanu rastvorljivost.
Polipeptidi ovog pronalaska mogu da ispoljavaju i poboljšanu fizičku stabilnost i rastvorljivost.
Neki poželjni aspekti
Ovde su prikazani pogodni testovi za merenje vezivanja i potencijala humanog receptora amilina (rastvorljivost i fizička stabilnost) (Na primer, pogledajte Ispitivanja (II), (IV) i (III) tim redosledom).
Poželjno, Xaa14je Glu.
Poželjno, Xaa17je His ili Arg; poželjnije Arg.
Poželjno Xaa35je Asn ili Gln; poželjnije Asn
Poželjno Xaa14je Glu i Xaa17je Arg.
Poželjno Xaa14je Glu i Xaa17je His.
U jednoj poželjnoj realizaciji, polipeptid koji sadrži sekvencu amino-kiseline koja je analogna SEQ ID No: 2 je Formule (I) gde:
Xaa1je Lys;
Xaa3je Asn;
Xaa14je Glu
Xaa17je His or Arg;
Xaa18je His;
Xaa21je Asn;
Xaa22je Asn;
Xaa26je Ile;
Xaa31je Asn;
Xaa35je Asn.
U jednoj poželjnoj realizaciji, polipeptid koji sadrži sekvencu amino-kiseline koja je analogna SEQ ID No: 2 je Formule (I) gde:
Xaa1je izbrisan ili nezavisno izabran iz His, Arg i Lys;
Xaa3je nezavisno izabran iz Gly, His i Asn;
Xaa14je nezavisno izabran iz Glu i Asn;
Xaa17je nezavisno izabran iz His, Arg i Val;
Xaa18je nezavisno izabran iz Arg i His;
Xaa21je nezavisno izabran iz Ser i Asn;
Xaa22je Asn;
Xaa26je Ile;
Xaa31je nezavisno izabran iz Glu i Asn;
Xaa35je nezavisno izabran iz His, Arg, Lys, Asp, Gln i Glu.
U jednoj poželjnoj realizaciji, polipeptid koji sadrži sekvencu amino-kiseline koja je analog SEQ ID No: 2 je Formule (I) gde:
Xaa1je izbrisan ili nezavisno izabran iz Gly, His, Arg, Ser i Lys;
Xaa3je nezavisno izabran iz His i Asn;
Xaa14je nezavisno izabran iz Glu i Asn;
Xaa17je nezavisno izabran iz His, Arg i Val;
Xaa18je nezavisno izabran iz Arg i His;
Xaa21je nezavisno izabran iz Gln, Ser i Asn;
Xaa22je Asn;
Xaa26je nezavisno izabran iz Pro i Ile;
Xaa31je Asn;
Xaa35je Asn.
U jednoj realizaciji, C-kraj se može derivatizovati.
U jednoj realizaciji, C-kraj polipeptida može biti završen ili kao kiselina ili kao amid. U jednom aspektu, C-kraj polipeptida je amid.
U jednoj realizaciji, C-kraj je derivatizovan sa amidom Formule (II):
(II) C(O)NR<1>R<2>
gde su R<1>i R<2>nezavisno izabrani iz H i alkila. Poželjno je da su i R<1>i R<2>H.
U jednoj realizaciji, polipeptidi ovog pronalaska mogu imati supstituent vezan na bilo kojoj raspoloživoj poziciji na jednom ili više ostataka amino-kiselina. Primeri supstituenata uključuju hemijske grupe (delove) direktno vezane za jedan ili više amino-kiselinskih ostataka, ili hemijske grupe indirektno vezane za jedan ili više amino-kiselinskih ostataka pomoću linkera. Dostupne tačke vezivanja biće poznate stručnjaku. Primeri dostupnih tačaka vezivanja uključuju N-kraj polipeptida, C-kraj polipeptida, epsilon-amino grupu ostatka lizina, hidroksilnu grupu ostatka serina, tirozina ili treonina, amidnu grupu ostatka asparagina ili glutamina, karboksilnu grupu asparaginske kiseline ili ostatak glutaminske kiseline, tiolnu grupu ostatka cisteina. Poželjno, supstituent je vezan za N-kraj polipeptida, ili epsilon amino grupu ostatka lizina.
U drugoj realizaciji, supstituent je vezan za N-terminalnu amino grupu polipeptida pri čemu ostatak N-terminalne amino-kiseline odgovara pozicijia 1 analoga SEQ ID No: 2.
U sledećoj realizaciji, supstituent je vezan na epsilon amino grupu ostatka lizina na poziciji 1 analoga SEQ ID No: 2.
U jednoj realizaciji, supstituent je izabran iz grupe koja sadrži hidrokarbilnu supstituentnu grupu, hidroksilnu grupu i atom halogena. Primeri pogodnih atoma halogena uključuju F, Cl, Br i I. Poželjno, supstituent je hidrokarbilna supstituentna grupa.
U drugoj realizaciji, hidrokarbilna supstituentna grupa je alkil grupa, ili grupa Formule (III):
(III) Ln-Y
pri čemu
L je linker;
n = 0 or 1
I je hemijska grupa - kao što je deo koji vezuje albumin.
U jednoj realizaciji, linker sadrži 1 do 10 amino-kiselina. Linker može dalje da sadrži amine.
Primeri pogodnih amina uključuju:
–C(O)–(CH2)l–O–[CH2CH2-O]m–(CH2)p–[NHC(O)–(CH2)l–O–[(CH2)n–O]m–(CH2)p]q–NH–
Pri čemu l, m, n i p su nezavisno 1-7, a q je 0-5.
Na primer, linker može da sadrži amin izabran iz:
–C(O)–CH2–O– CH2– CH2–O–CH2–CH2–NH– ; i
–C(O)–CH2–O–CH2–CH2–O–CH2– CH2–[NHC(O)–CH2–O–CH2–CH2–O–CH2–CH2–]1-NH–; i – C(O)–(CH2)2–O–[CH2CH2-O]7–(CH2)2–NH–.
U drugoj realizaciji, linker je kombinacija ostataka amino-kiselina i gore pomenutih amina, na primer:
γGlu-C(O)–CH2–O–CH2–CH2–O–CH2–CH2–[NHC(O)–CH2–O–CH2–CH2–O– CH2– CH2–]1-NH-; ili
Arg-Arg- γGlu-C(O)–CH2–O–CH2–CH2–O–CH2– CH2–[NHC(O)–CH2–O–CH2–CH2–O– CH2– CH2–]1-NH-.
U nekim realizacijama, n = 1, a L je izabrano iz grupe koja se sastoji od γGlu, γGlu- γGlu, γGluγGlu- γGlu, γGlu- γGlu- γGlu- γGlu, Glu, Glu-Glu, Glu- γGlu, Glu-Arg, Glu-Glu-Arg, His, His-His, HisγGlu, His-His- γGlu, Gly, Gly- γGlu, Ser, Ser- γGlu, D-Arg-D-Arg, Arg, Arg-Arg, Arg-Arg- γGlu, Ser-Ser,-Gly-Ser-Ser, Ser-Ser,-Gly-Ser-Ser- γGlu, Ser-Ser-Gly-Ser-Ser-Gly and Ser-Ser-Gly-Ser-Ser-Gly- γGlu, γGlu-OEG, γGlu-OEG-OEG i OEG.
U nekim realizacijama, n = 1, a L je izabrano iz γGlu, γGlu- γGlu, γGlu-OEG, γGlu-OEG-OEG i OEG, poželjnije, linker je γGlu- γGlu.
U drugoj realizaciji, n = 0; prema tome, ne postoji linker između amino-kiselinskih ostataka polipeptidne kičme i hemijske grupe, Y, tj. Y je vezano na dostupnu poziciju na polipeptidnoj kičmi.
U jednom aspektu, Y je deo koji vezuje albumin.
U jednom aspektu, deo koji vezuje albumin je acilna grupa.
Poželjno, deo koji vezuje albumin je HOOC(CH2)sCO-, pri čemu je s ceo broj od 12 do 22. Poželjnije, s je ceo broj od 14 do 20, na primer 14, 15, 16, 17, 18, 19 ili 20. Poželjnije, s je 16 do 18. Poželjnije, s je 18.
U jednoj realizaciji, polipeptid sadrži γGlu linker vezan za N-kraj analoga amilina i HOOC(CH2)18CO ili HOOC(CH2)16CO- kao ostatak koji vezuje albumin i gde sekvenca analoga amila sadrži Glu na poziciji 14, His ili Arg na poziciji 17, His na poziciji 35 ili Pro na poziciji 37 u poređenju sa SEQ ID NO: 2.
U drugoj realizaciji, supstituentna grupa i/ili grupa formule (III) je izabrana iz sledećih grupa predstavljenih u Tabeli 1.
Tabela 1
Poželjno, polipeptidi ovog pronalaska sadrže jedan supstituent.
Poželjno, polipeptidi ovog pronalaska imaju jedan supstituent vezan za N-terminalnu amino grupu polipeptida, pri čemu N-terminalni ostatak amino-kiseline odgovara poziciji 1 analoga SEQ ID No: 2.
Poželjno, supstituent je:
O
je vezan za N-terminalnu amino grupu polipep Otida.
Za realizacije koje sadrže deo koji vezuje albumin, polipeptidi ovog pronalaska mogu da pokazuju produženi farmakokinetički profil i dobra farmakodinamička svojstva. Zbog toga se polipeptidi prema ovom pronalasku ne moraju ubrizgavati toliko često koliko poznati amilinski proizvodi.
Dalje, polipeptidi ovog pronalaska smanjuju unos hrane. Smanjenje unosa hrane superiorno je u odnosu na poznate amilinske proizvode.
U jednoj realizaciji, deo koji vezuje albumin vezuje se nekovalentno na albumin. Poželjno, deo koji vezuje albumin ima afinitet vezivanja albumina prema albuminu humanog seruma koji je ispod oko 10 µM ili ispod oko 1 µM.
Tabela 2 prikazuje listu jedinjenja koja imaju rastvorljivost veću od 100 µM pri pH 4.
TABELA 2
Kao što je pokazano u odeljku Primeri ovde, gore predstavljeni polipeptidi imaju rastvorljivost veću ili jednaku 100 µM (mikromola) pri pH 4.
U jednoj realizaciji, ovde otkriveni polipeptidi imaju rastvorljivost veću ili jednaku 125 µM (mikromola) pri pH 4.
U jednoj realizaciji, ovde otkriveni polipeptidi imaju rastvorljivost veću ili jednaku 150 µM (mikromola) pri pH 4.
U jednoj realizaciji, ovde otkriveni polipeptidi imaju rastvorljivost veću ili jednaku 175 µM (mikromola) pri pH 4.
U jednoj realizaciji, ovde otkriveni polipeptidi imaju rastvorljivost veću ili jednaku 200 µM (mikromola) pri pH 4.
U jednoj realizaciji, rastvorljivost se meri testom rastvorljivosti, kao što je ovde predstavljeno.
Tabela 3 predstavlja listu jedinjenja koja imaju rastvorljivost veću od 100 µM pri pH 7.
TABELA 3
Kao što je pokazano u odeljku Primeri ovde, gore predstavljeni polipeptidi imaju rastvorljivost veću ili jednaku 100 µM (mikromola) pri pH 7.
U jednoj realizaciji, ovde otkriveni polipeptidi imaju rastvorljivost veću ili jednaku 125 µM (mikromola) pri pH 7.
U jednoj realizaciji, ovde otkriveni polipeptidi imaju rastvorljivost veću ili jednaku 150 µM (mikromola) pri pH 7.
U jednoj realizaciji, ovde otkriveni polipeptidi imaju rastvorljivost veću ili jednaku 175 µM (mikromola) pri pH 7.
U jednoj realizaciji, ovde otkriveni polipeptidi imaju rastvorljivost veću ili jednaku 200 µM (mikromola) pri pH 7.
U jednoj realizaciji, rastvorljivost se meri testom rastvorljivosti, kao što je ovde predstavljeno.
Tabela 4 prikazuje spisak jedinjenja koja imaju rastvorljivost veću od 100 µM, i pri pH 4 i pH 7.
TABELA 4
Kao što je pokazano u odeljku Primeri ovde, gore predstavljeni polipeptidi imaju rastvorljivost veću ili jednaku 100 µM (mikromola) i pri pH 4 i pH 7.
U jednoj realizaciji, ovde otkriveni polipeptidi imaju rastvorljivost veću ili jednaku 125 µM (mikromola) i pri pH 4 i pH 7.
U jednoj realizaciji, ovde otkriveni polipeptidi imaju rastvorljivost veću ili jednaku 150 µM (mikromola) i pri pH 4 i pH 7.
U jednoj realizaciji, ovde otkriveni polipeptidi imaju rastvorljivost veću ili jednaku 175 µM (mikromola) i pri pH 4 i pH 7.
U jednoj realizaciji, ovde otkriveni polipeptidi imaju rastvorljivost veću ili jednaku 200 µM (mikromola) i pri pH 4 i pH 7.
U jednoj realizaciji, rastvorljivost se meri testom rastvorljivosti, kao što je ovde predstavljeno.
Tabela 5 prikazuje spisak jedinjenja koja imaju fizičku stabilnost veću ili jednaku 25 sati u testu fibrilologeneze.
TABELA 5
Kao što je pokazano u odeljku Primeri ovde, gore navedeni polipeptidi imaju fizičku stabilnost veću ili jednaku 25 sati u testu fibrilogeneze.
U jednoj realizaciji, ovde otkriveni polipeptidi imaju fizičku stabilnost veću ili jednaku 30 sati.
U jednoj realizaciji, ovde otkriveni polipeptidi imaju fizičku stabilnost veću ili jednaku 35 sati.
U jednoj realizaciji, ovde otkriveni polipeptidi imaju fizičku stabilnost veću ili jednaku 40 sati.
U jednoj realizaciji, ovde otkriveni polipeptidi imaju fizičku stabilnost veću ili jednaku 45 sati.
U jednoj realizaciji, fizička stabilnost se meri testom fibrilogeneze, kao što je ovde predstavljeno.
Tabela 6 predstavlja spisak jedinjenja koja imaju vrednost EC50humanog receptora amilina od 1800pM (pikomomola) ili manju.
TABELA 6
Kao što je pokazano u odeljku Primeri ovde, gore predstavljeni polipeptidi imaju vrednost humanog amilina EC50od 1800 pM (pikomola) ili manju.
U jednoj realizaciji, ovde otkriveni polipeptidi imaju vrednost humanog amilina EC50od 1500 pM (pikomola) ili manju.
U jednoj realizaciji, ovde otkriveni polipeptidi imaju vrednost humanog amilina EC50od 1200 pM (pikomola) ili manju.
U jednoj realizaciji, ovde otkriveni polipeptidi imaju vrednost humanog amilina EC50od 1000 pM (pikomola) ili manju.
U jednoj realizaciji, ovde otkriveni polipeptidi imaju vrednost humanog amilina EC50od 800 pM (pikomola) ili manju.
U jednoj realizaciji, ovde otkriveni polipeptidi imaju vrednost humanog amilina EC50od 600 pM (pikomola) ili manju.
U jednoj realizaciji, ovde otkriveni polipeptidi imaju vrednost humanog amilina EC50od 400 pM (pikomola) ili manju.
U jednoj realizaciji, ovde otkriveni polipeptidi imaju vrednost humanog amilina EC50od 200 pM (pikomola) ili manju.
U jednoj realizaciji, ovde otkriveni polipeptidi imaju vrednost humanog amilina EC50od 100 pM (pikomola) ili manju.
U jednoj realizaciji, ovde otkriveni polipeptidi imaju vrednost humanog amilina EC50od 75 pM (pikomola) ili manju.
U jednoj realizaciji, ovde otkriveni polipeptidi imaju vrednost humanog amilina EC50od 60 pM (pikomola) ili manju.
U jednoj realizaciji, humani amilin EC50meri se u testu koji je ovde predstavljen.
Tabela 7 predstavlja listu jedinjenja koja imaju receptor humanog amilina EC50od 1800 pM (pikomola) ili manje.
TABELA 7
Kao što je pokazano u odeljku Primeri ovde, gore predstavljeni polipeptidi imaju vrednost humanog kalcitonina EC50od 1800 pM (pikomola) ili manju.
U jednoj realizaciji, ovde otkriveni polipeptid ima vrednost humanog kalcitonina EC50od 1500 pM (pikomola) ili manju.
U jednoj realizaciji, ovde otkriveni polipeptid ima vrednost humanog kalcitonina EC50od 1200 pM (pikomola) ili manju.
U jednoj realizaciji, ovde otkriveni polipeptid ima vrednost humanog kalcitonina EC50od 1000 pM (pikomola) ili manju.
U jednoj realizaciji, ovde otkriveni polipeptid ima vrednost humanog kalcitonina EC50od 800 pM (pikomola) ili manju.
U jednoj realizaciji, ovde otkriveni polipeptid ima vrednost humanog kalcitonina EC50od 600 pM (pikomola) ili manju.
U jednoj realizaciji, ovde otkriveni polipeptid ima vrednost humanog kalcitonina EC50od 400 pM (pikomola) ili manju.
U jednoj realizaciji, ovde otkriveni polipeptid ima vrednost humanog kalcitonina EC50od 200 pM (pikomola) ili manju.
U jednoj realizaciji, ovde otkriveni polipeptid ima vrednost humanog kalcitonina EC50od 100 pM (pikomola) ili manju.
U jednoj realizaciji, ovde otkriveni polipeptid ima vrednost humanog kalcitonina EC50od 80 pM (pikomola) ili manju.
U jednoj realizaciji, humani kalcitonin EC50se meri u testu kao što je ovde predstavljeno.
Tabela 8 predstavlja spisak jedinjenja koja imaju vrednost receptora humanog amilina EC501800pM (pikomomola) ili manju, rastvorljivost od 150 µM ili više pri pH 7 i fizičku stabilnost od 25 sati ili više u testu fibrilogeneze.
TABELA 8
U jednoj realizaciji, ovde otkriveni polipeptidi imaju vrednost humanog amilina EC50od 1800 pM (pikomola) ili manju, i rastvorljivost veća od 150 µM, pri pH 7, i fizičku stabilnost veću od ili jednaku 25 sati u testu fibrilologeneze.
U jednoj realizaciji, humani aminlin EC50, rastvorljivost pri pH 7 i fizička stabilnost mere se ispitivanjem kao što je ovde predstavljeno.
Tabela 9 predstavlja spisak jedinjenja koja imaju vrednost EC50humanog receptora za aminlin od 1800 pM (pikomola) ili manju, rastvorljivost 200 µM ili više pri pH 7 i fizičku stabilnost od 45 sati ili veću u testu fibrilogeneze.
TABELA 9
U jednoj realizaciji, ovde otkriveni polipeptidi imaju vrednost humanog amilina EC50od 1800 pM (pikomola) ili manju, i rastvorljivost veću od 200 µM, pri pH 7, i fizičku stabilnost veću od ili jednaku 45 sati u testu fibrilologeneze.
U jednoj realizaciji, humani amilin EC50, rastvorljivost pri pH 7 i fizička stabilnost se mere testovima kako je ovde predstavljeno.
Za neke realizacije, ovde otkriveni polipeptid ima produženi farmakokinetički profil u poređenju sa pramlintidom, merenim u ispitivanju (IX), kao što je opisano u odeljku Ispitivanja.
Za neke realizacije, ovde otkriveni polipeptid ima T1⁄2 plazme od najmanje 30 sati.
Za neke realizacije, ovde otkriveni polipeptid ima T1⁄2 plazme od najmanje 40 sati.
Za neke realizacije, ovde otkriveni polipeptid ima T1⁄2 plazme od najmanje 50 sati.
Za neke realizacije, ovde otkriveni polipeptid ima T1⁄2 plazme od najmanje 60 sati.
Za neke realizacije, ovde otkriveni polipeptid ima T1⁄2 plazme od najmanje 70 sati.
Za neke realizacije, ovde otkriveni polipeptid ima T1⁄2 plazme od najmanje 75 sati.
Za neke realizacije, ovde otkriveni polipeptid ima T1⁄2 plazme od najmanje 80 sati.
Za neke realizacije, ovde otkriveni polipeptid ima T1⁄2 plazme od najmanje 85 sati.
Za neke realizacije, ovde otkriveni polipeptid ima T1⁄2 plazme od najmanje 90 sati.
Za neke realizacije, ovde otkriveni polipeptid ima T1⁄2 plazme od najmanje 95 sati.
Za neke realizacije, ovde otkriveni polipeptid ima T1⁄2 plazme od najmanje 100 sati.
POSTUPAK
Proizvodnja polipeptida poput amilina ili njegovih analoga je dobro poznato u stanju tehnike. Polipeptidi ovog pronalaska se mogu proizvesti klasičnom sintezom polipeptida, npr. sinteza polipeptida u čvrstoj fazi koristeći t-Boc ili Fmoc hemije ili druge dobro utvrđene tehnike, videti npr. Greene and Wuts, “Protective Groups in Organic Synthesis”, John Wiley & Sons, 1999. Polipeptidi se mogu takođe proizvesti postupkom koji obuhvata kultivaciju ćelije domaćina koja sadrži DNK sekvencu koja kodira polipeptid i koja je sposobna da eksprimuje polipeptid u odgovarajućem hranljivom medijumu pod uslovima koji dozvoljavaju eksprimovanje polipeptida. Za polipeptide koji sadrže neprirodne amino-kiselinske ostatke, rekombinantnu ćeliju treba modifikovati tako da se neprirodne amino-kiseline ugrade u polipeptid, na primer, korišćenjem mutanata tRNK.
FARMACEUTSKE KOMPOZICIJE
U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži polipeptid prema pronalasku i farmaceutski prihvatljiv ekscipijens. Kompozicije su pogodne za parenteralnu primenu.
U jednoj realizaciji, polipeptid je prisutan u formulaciji u koncentraciji od oko 0,1 mg/ml do oko 25 mg/ml. U drugoj realizaciji, polipeptid je prisutan u formulaciji u koncentraciji od oko 1 mg/ml do oko 10 mg/ml.
U još jednoj realizaciji, formulacija ima pH od 2.0 do 10.0. U još jednoj realizaciji, formulacija ima pH od 2.0 do 7.0. U još jednoj realizaciji, formulacija ima pH od 2.5 do 4.5. U još jednoj realizaciji, formulacija ima pH od 3.5 do 4.5.
Farmaceutske kompozicije koje sadrže polipeptid iz predmetnog pronalaska mogu se dobiti konvencionalnim tehnikama, npr. kao što je opisano u Remingtonovim Pharmaceutical Sciences, 1985 ili u Remingtonovim: The Science and Practice of Pharmacy, 19<th>edition, 1995.
Formulacija može dalje da sadrži sistem pufera, konzervanse, sredstva za izotoničnost, sredstva za heliranje, stabilizatore i/ili surfaktante. Upotreba takvih ekscipijenasa u farmaceutskim kompozicijama dobro je poznata stručnjaku u tehnici. Radi praktičnosti pogledajte Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19<th>edition, 1995.
U jednoj realizaciji, farmaceutska formulacija je vodena formulacija, tj. formulacija koja sadrži vodu. Takva formulacija je uobičajeno rastvor ili suspenzija. U sledećoj realizaciji pronalaska, farmaceutska formulacija je vodeni rastvor.
Izraz „vodena formulacija” definisan je kao formulacija koja sadrži najmanje 50 %w/w vode.
Slično tome, izraz „vodeni rastvor“ je definisan kao rastvor koji sadrži najmanje 50% w/w vode, a izraz „vodena suspenzija“ je definisan kao suspenzija koja sadrži najmanje 50% w/w vode.
U sledećoj realizaciji, farmaceutska formulacija je zamrzavanjem sušena formulacija u koju lekar ili pacijent dodaje pre upotrebe rastvarače i/ili razblaživače. U sledećoj realizaciji farmaceutska formulacija je osušena formulacija (na primer npr. sušena smrzavanjem ili osušena raspršivanjem) spremna za upotrebu bez prethodnog rastvaranja.
Pod „osušenim oblikom“ podrazumeva se tečna farmaceutska kompozicija ili formulacija osušena zamrzavanjem (tj., liofilizacijom; videti, na primer, Williams and Polli(1984) J. Parenteral Sci. Technol. 38:48-59), osušena raspršivanjem (videti Masters (1991) in Spray-Drying Handbook (5th ed; Longman Scientific and Technical, Essez, U.K.), pp. 491-676; Broadhead et al. (1992) Drug Devel. Ind. Pharm.18:1169-1206; i Mumenthaler et al. (1994) Pharm. Res. 11:12-20, ili osušena vazduhom (Carpenter and Crowe (1988) Cryobiology 25:459-470, i Roser (1991) Biopharm.4:47-53).
U sledećoj realizaciji, pufer je izabran iz grupe koja se sastoji od acetata, karbonata, citrata, glicilglicina, histidina, glicina, lizina, arginina, dihidrogen fosfata, hidrogen fosfata, fosfata i tris(hidroksimetil)-aminometana, bicina, tricina, jabučne kiseline, mlečne kiseline, sukcinata, maleinske kiseline, fumarne kiseline, vinske kiseline, asparaginske kiseline ili njihovih smeša. Svaki od ovih specifičnih pufera predstavlja alternativnu realizaciju.
U još jednoj realizaciji, formulacija dalje sadrži farmaceutski prihvatljivi konzervans. U sledećoj realizaciji, formulacija dalje sadrži izotonično sredstvo, npr. propilen glikol, manitol ili glicerol. U sledećoj realizaciji, formulacija dalje sadrži helatno sredstvo.
U još jednoj realizaciji, formulacija dalje sadrži stabilizator. Upotreba stabilizatora u farmaceutskim kompozicijama dobro je poznata poznata stručnjaku u tehnici. Radi praktičnosti, referenca je Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19<th>edition, 1995.
Formiranje agregata pomoću polipeptida tokom skladištenja tečne farmaceutske kompozicije može negativno uticati na biološku aktivnost tog polipeptida, što ima za rezultat gubitak terapijske efikasnosti farmaceutske kompozicije. Pored toga, formiranje agregata može izazvati druge probleme, kao što su začepljenje cevi, membrana ili pumpi kada se farmaceutska kompozicija koja sadrži polipeptid daje putem infuzionog sistema.
Kompozicije predmetnog pronalaska su stabilizovane tečne farmaceutske kompozicije čije terapeutski aktivne komponente uključuju polipeptid koji eventualno pokazuje stvaranje agregata tokom skladištenja u tečnim farmaceutskim formulacijama.
Pod „stvaranjem agregata“ podrazumeva se fizička interakcija između molekula polipeptida koja rezultira stvaranjem oligomera, koji mogu ostati rastvorljivi, ili velikih vidljivih agregata koji se talože iz rastvora.
Pod „tokom skladištenja“ podrazumeva se tečna farmaceutska kompozicija ili formulacija koja kada je jednom pripremljena nije odmah data subjektu. Umesto toga se, nakon pripreme, pakuje za čuvanje, bilo u tečnom obliku, u zamrznutom stanju, ili u osušenom obliku radi kasnije rekonstitucije u tečni oblik ili drugi oblik pogodan za davanje subjektu.
Farmaceutske kompozicije mogu dalje da sadrže količinu baze amino-kiselina dovoljnu da smanji stvaranje agregata pomoću polipeptida tokom skladištenja kompozicije.
Pod „bazom amino-kiselina“ podrazumeva se amino-kiselina ili kombinacija amino-kiselina, pri čemu je bilo koja data amino-kiselina prisutna ili u svom slobodnom baznom obliku ili u obliku soli. Kada se koristi kombinacija amino-kiselina, sve amino-kiseline mogu biti prisutne u svojim slobodnim baznim oblicima, sve mogu biti u obliku soli, ili neke mogu biti prisutne u slobodnim baznim oblicima, dok su druge prisutne u njihovim oblicima soli . U jednoj realizaciji, amino-kiseline koje se koriste u pripremi kompozicija su one koje nose naelektrisani bočni lanac, kao što su arginin, lizin, asparaginska kiselina i glutaminska kiselina. Bilo koji stereoizomer (tj. L ili D, izomer ili njihove smeše) određene amino-kiseline npr. metionin, histidin, imidazol, arginin, lizin, izoleucin, asparaginska kiselina, triptofan, treonin i njihove smeše) ili kombinacije ovih stereoizomera, mogu biti prisutni u farmaceutskim kompozicijama pronalaska sve dok je određena amino-kiselina prisutna ili u obliku slobodne baze ili u obliku soli. U jednoj realizaciji se koristi L-stereoizomer. Kompozicije mogu, takođe, biti formulisane sa derivatima ovih amino-kiselina. Pogodni derivati arginina uključuju, na primer, aminoguanidin, ornitin i N-monoetil L-arginin, pogodni derivati metionina uključuju etionin i butionin, a pogodni derivati cisteina uključuju S-metil-L cistein. Kao i kod drugih amino-kiselina, derivati amino-kiselina su ugrađeni u kompozicije bilo u njihovom slobodnom baznom obliku, bilo u obliku soli. U daljoj realizaciji amino-kiseline ili njihovi derivati amino-kiselina se koriste u koncentraciji, koja je dovoljna da spreči ili odloži agregaciju proteina.
U još jednoj realizaciji, formulacija dalje sadrži sufrakant.
Moguće je da drugi sastojci mogu biti prisutni u farmaceutskoj formulaciji polipeptida. Takvi dodatni sastojci mogu da uključuju sredstva za vlaženje, emulgatore, antioksidante, sredstva za povećanje volumena, modifikatore toničnosti, helatna sredstva, metalne jone, uljane nosače, proteine (npr. albumin iz humanog seruma, želatin ili proteine) i cviterjon (npr. amino-kiselina kao što je betain, taurin, arginin, glicin, lizin i histidin). Takvi dodatni sastojci, naravno, ne bi trebalo da negativno utiču na ukupnu stabilnost farmaceutske formulacije.
Farmaceutske kompozicije koje sadrže polipeptid prema ovom pronalasku mogu se dati pacijentu kome je potreban takav tretman na više mesta, na primer, na lokalnim mestima, na primer, na koži i sluzokoži, na mestima koja zaobilaze apsorpciju, na primer , davanje u arteriju, venu, srce i na mestima koja uključuju apsorpciju, na primer, unošenje u kožu, ispod kože, u mišiće ili abdomen.
Davanje farmaceutskih kompozicija prema pronalasku može biti preko nekoliko načina primene, na primer, jezično, podjezično, bukalno, u ustima, oralno, u stomaku i crevima, nazalno, plućno, na primer, kroz bronhiole i alveole ili njihova kombinacija, epidermalno, dermalno, transdermalno, vaginalno, rektalno, preko očiju, na primer kroz konjuktivu, uretalno i parenteralno za pacijente kojima je potreban takav tretman.
Kompozicije predmetnog pronalaska mogu se primeniti u više doznih oblika, na primer, u obliku rastvora, suspenzija, emulzija, mikroemulzija, višestruke emulzije, pene, melema, paste, gipsa, masti, tableta, obloženih tableta, ispiranja, kapsula, na primer, tvrde želatinske kapsule i meke želatinske kapsule, čepića, rektalnih kapsula, kapi, gelova, sprejeva, praška, aerosola, inhalatora, kapi za oči, masti za oči, ispiranja za oči, vaginalnih pesara, vaginalnih prstenova, vaginalne masti, rastvora za injekcije, in situ transformišućih rastvora, na primer in situ geliranje, in situ podešavanje, in situ taloženje, in situ kristalizacija, rastvora za infuziju i implantata.
Kompozicije predmetnog pronalaska mogu se dalje kombinovati ili vezivati, na primer, kroz kovalentne, hidrofobne i elektrostatičke interakcije, nosač lekova, sistem za isporuku lekova i napredni sistem za davanje lekova da bi se dodatno poboljšala stabilnost njihovog derivata analoga amilina, povećala bioraspoloživost, povećavala rastvorljivost, smanjili štetni efekti, postigla hronoterapija dobro poznata stručnjacima u tehnici i povećao odgovor pacijenta ili bilo koja kombinacija istih.
Kompozicije predmetnog pronalaska su korisne u formulacijama čvrstih supstanci, polučvrstih, praška i rastvora za plućnu primenu derivata analoga amilina, korišćenjem, na primer, inhalatora za odmerenu dozu, inhalatora za suvi prah i nebulizatora, a sve su to uređaji dobro poznati stručnjacima u tehnici.
Kompozicije predmetnog pronalaska su korisne u formulacijama kontrolisanih, zadržanih, produženih, retardiranih sistema i sistema za sporo otpuštanje lekova.
Parenteralno davanje može biti izvedeno supkutanom, intramuskularnom, intraperitonealnom ili intravenskom injekcijom pomoću šprica, opciono šprica nalik olovci. Alternativno, parenteralna primena može biti izvedena pomoću infuzione pumpe. Sledeća opcija je kompozicija koja može biti rastvor ili suspenzija za primenu derivata analoga amilina u obliku nazalnog ili plućnog spreja. Kao još dodatna opcija, farmaceutske kompozicije koji sadrže polipeptid iz pronalaska mogu se, takođe, prilagoditi transdermalnoj primeni, npr.primeni injekcijom bez igle ili iz flastera, opcionalno jontoforeznog flastera, ili transmukoznog, npr. bukalno.
Polipeptid ovog pronalaska može se primeniti plućnim putem u nosaču, kao rastvor, suspenzija ili suvi prah upotrebom bilo koje poznate vrste uređaja pogodnih za plućno davanje leka. Primeri za njih sadrže, ali nisu ograničeni na, tri opšta tipa dobijanja aerosola za plućno davanje lekova, i mogu uključivati mlazne ili ultrazvučne nebulizatore, inhalatore sa merenom dozom ili inhalatore suvog praha (prim. Yu J, Chien YW. Pulmonary drug delivery: Physiologic and mechanistic aspects. Crit Rev Ther Drug Carr Sys 14(4) (1997) 395-453).
U jednoj realizaciji farmaceutska formulacija koja sadrži polipeptid je stabilna više od 6 nedelja tokom upotrebe i više od 3 godine skladištenja.
U drugoj realizaciji farmaceutska kompozicija koja sadrži polipeptid je stabilna više od 4 nedelje tokom upotrebe i više od 3 godine skladištenja.
U drugoj realizaciji, farmaceutska formulacija koja sadrži derivat analoga amilina je stabilna više od 4 nedelje korišćenja i više od dve godine skladištenja.
U drugoj realizaciji, farmaceutska formulacija koja sadrži derivat analoga amilina je stabilna više od 2 nedelje korišćenja i više od dve godine skladištenja.
U jednom aspektu, postupak za proizvodnju farmaceutske kompozicije koja sadrži derivat prema pronalasku obuhvata mešanje derivata prema pronalasku sa najmanje jednim farmaceutski prihvatljivim ekscipijensom.
TERAPIJSKE INDIKACIJE
U jednom aspektu, polipeptid prema pronalasku može se koristiti kao lek.
U jednom aspektu, polipeptid prema pronalasku može se koristiti kao lek za lečenje ili prevenciju hiperglikemije, dijabetesa tipa 2, oslabljene tolerancije na glukozu, dijabetesa tipa 1, gojaznosti, hipertenzije, sindroma X, dislipidemije, kognitivnih poremećaja, ateroskleroze, infarkta miokarda, koronarne bolesti srca i drugih kardiovaskularnih poremećaja, moždanog udara, sindrom zapaljenja creva, dispepsije i čira na želucu.
U jednom aspektu, polipeptid se koristi za odlaganje ili sprečavanje napredovanja bolesti kod dijabetesa tipa 2.
U jednom aspektu, polipeptid prema pronalasku može se koristiti kao lek za lečenje ili prevenciju gojaznosti.
U jednom aspektu, polipeptid prema pronalasku može se upotrebiti kao lek za lečenje ili prevenciju hiperkalcemije, osteoporoze ili Padžetove bolesti. U jednom aspektu, polipeptid se može koristiti kao lek za smanjenje telesne težine. U jednom aspektu, polipeptid se može koristiti kao lek za lečenje ili prevenciju gojaznosti, ili kao lek za prevenciju povećanja telesne težine. U jednom aspektu, polipeptid modifikuje unos hrane, poput smanjenja unosa hrane.
U jednom aspektu, lek smanjuje unos hrane, smanjuje apoptozu β-ćelija, povećava funkciju β -ćelija i β -ćelijsku masu, i/ili obnavlja osetljivost na glukozu β-ćelija.
U jednom aspektu, polipeptid prema pronalasku može se koristiti za pripremu leka.
U jednom aspektu polipeptid se može koristiti za pripremu leka za lečenje ili prevenciju hiperglikemije, dijabetesa tipa 2, oslabljene tolerancije na glukozu, dijabetesa tipa 1, gojaznosti, hipertenzije, sindroma X, dislipidemije, kognitivnih poremećaja, ateroskleroze, infarkta miokarda, koronarne bolesti srca i drugih kardiovaskularnih poremećaja, moždanog udara, sindroma zapaljenja creva, dispepsije i čira na želucu.
U jednom aspektu, polipeptid se može koristiti za dobijanje leka za odlaganje ili prevenciju napredovanja bolesti kod dijabetesa tipa 2.
U jednom aspektu, polipeptid smanjuje unos hrane, smanjuje apoptozu β-ćelija, povećava funkciju β-ćelija i β-ćelijsku masu, i/ili obnavlja osetljivost na glukozu u β-ćelijama.
Tretman sa polipeptidom u skladu sa ovim pronalaskom može se, takođe, kombinovati sa drugom ili više farmakološki aktivnih supstanci, npr. odabranih iz antidijabetičkih sredstava, sredstava protiv gojaznosti, sredstava za regulaciju apetita, antihipertenzivnih agenasa, sredstava za lečenje i/ili prevenciju komplikacija koje su rezultat ili su povezane sa dijabetesom i sredstava za lečenje i/ili prevenciju komplikacija i poremećaja koji su rezultat ili su povezani sa gojaznošću. Primeri ovih farmakološki aktivnih supstanci su: Insulin, derivat insulina, analozi insulina, GLP-1, derivati GLP-1, GLP-1 analozi, derivati oksintomodulina, sulfonilureje, bigvanidi, meglitinidi, inhibitori glukozidaze, antagonisti glukagona, inhibitori DPP-IV (dipeptidil peptidaza-IV), inhibitori enzima jetre uključeni u stimulaciju glukoneogeneze i/ili glikogenolize, modulatori unosa glukoze, jedinjenja koja modifikuju metabolizam lipida kao što su antihiperlipidemična sredstva kao HMG CoA inhibitori (statini), jedinjenja koja smanjuju unos hrane, RXR agonisti i sredstva koja deluju na kalijumskom kanalu zavisnom od ATP-a β-ćelija; Holestiramin, kolestipol, klofibrat, gemfibrozil, lovastatin, pravastatin, simvastatin, probukol, dekstrotiroksin, neteglinid, repaglinid; β-blokatori kao što su alprenolol, atenolol, timolol, pindolol, propranolol i metoprolol, inhibitori ACE (angiotenzin konvertujućeg enzima), kao što su benazepril, kaptopril, enalapril, fosinopril, lizinopril, alatriopril, kvinapripil i ramipril, blokatori kalcijumskih kanala kao štp su nifedipin, felodipin, nikardipin, izradipin, nimodipin, diltiazem i verapamil, i α-blokatori poput doksazosina, urapidila, prazosina i terazosina; agonisti CART-a (kokainom i amfetaminom regulisani transkript), agonisti NPI-a (neuropeptida Y), antagonisti MC4 (melanokortin 4), antagonisti oreksina, agonisti TNF-a (faktor nekroze tumora), agonisti CRF-a (faktor oslobađanja kortikotropina), agonisti CRF BP-a (faktor oslobađanja kortikotropina koji vezuje protein), agonisti urokortidina, β3 agonisti, agonisti MSH (melanocit stimulišući hormon), antagonisti MCH (melanin koncentracioni hormon), agonisti CCK (holecitokinin), inhibitori ponovnog unosa serotonina, inhibitori ponovnog unosa serotonina i noradrenalina, mešana serotoninska i noradrenergička jedinjenja, 5HT (serotoninski) agonisti, agonisti bombezina, antagonisti galanina, hormon rasta, jedinjenja koja oslobađaju hormon rasta, agonisti TRH (tirotropin oslobađajući hormon), modulatori UCP 2 ili 3 (odvajajući protein 2 ili 3), agonisti leptina, agonisti DA (bromokriptin, dopreksin), inhibitori lipaze/amilaze, modulatori RXR (retinoidni X receptor), TR β agonisti; antagonisti histamina H3, gastrina i analozi gastrina.
Podrazumeva se da bilo koja pogodna kombinacija polipeptida prema pronalasku sa jednim ili više gore pomenutih jedinjenja i opciono jednom ili više daljih farmakološki aktivnih supstanci se smatra da spada u obuhvat predmetnog pronalaska.
Predmetni pronalazak će sada biti opisan putem primera.
PRIMERI
Pripremljeni polipeptidi su prikazani u Tabeli 10.
Tabela 10
Potentnost in vitro polipeptida naspram receptora amilina i receptora kalcitonina kod pacova i ljudi (kako je opisano u Ispitivanju (II)) prikazana je u Tabeli 11.
Tabela 11
Rastvorljivost polipeptida je testirana kao što je opisano u Ispitivanju (IV), a rezultati prikazani u tabeli 12.
Tabela 12
Derivati amilina testirani su na fizičku stabilnost u ThT testu (Ispitivanje (III)) i podaci dati u tabeli 13.
Tabela 13
Derivati amilina testirani su u odnosu na njihov efekat u testu unosa hrane (Ispitivanje (I)) i rezultati prikazani u Tabeli 14
Tabela 14
Poluživot derivata amilina iz ovog pronalaska testiran je na patuljastim svinjama kao što je opisano u Ispitivanju (IX), a podaci su dati u Tabeli 15.
Tabela 15
SKRAĆENICE
Neke od skraćenica korišćene u Primerima su:
Acm: acetamidometil
HATU: (O-(7-azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronium heksafluorofosfat) HBTU: 2-(1H-Benzotriazol-1-il-)-1,1,3,3-tetrametiluronium heksafluorofosfat Fmoc: 9H-fluoren-9-ilmetoksikarbonil
Boc: terc-butiloksikarbonil
Mtt: 4-metiltritil
DCM: dihlorometan
TIPS: triizopropilsilan
TFA: trifluoroacetatna kiselina
NMP: 1-metil-pirolidin-2-on
HOAt: 1-Hidroksi-7-azabenzotriazol
DIC: Diizopropilkarbodiimid
Trt: trifenilmetil
ISPITIVANJA
U sledećim primerima upućuje se na sledeća ispitivanja:
Ispitivanje (I) - Eksperimentalni protokol za testiranje efikasnosti apetita korišćenjem ad libitum modela hranjenog pacova
ISPITIVANJE (II)a - Funkcionalna analiza - Ispitivanje receptora humanog kalcitonina i amilina
ISPITIVANJE (II)b - Funkcionalna analiza- Ispitivanje receptora kalcitonina i amilina kod pacova
ISPITIVANJE (III) - ThT fibrilacioni testovi za procenu fizičke stabilnosti proteinskih formulacija
ISPITIVANJE (IV) – Određivanje rastvorljivosti
ISPITIVANJE (V) – Određivanje vezivanja za humani receptor aminlina
ISPITIVANJE (VI) – Određivanje vezivanja za receptor amilina pacova
ISPITIVANJE (VII) – Određivanje vezivanja za humani receptor kalcitonina
ISPITIVANJE (VIII) – Određivanje vezivanja za receptor kalcitona pacova
ISPITIVANJE (IX) - pK - Određivanje T1⁄2 kod patuljaste svinje
ISPITIVANJE (X) - pK - Određivanje T1⁄2 kod pacova
ISPITIVANJE (I) - Eksperimentalni protokol za ispitivanje efikasnosti na apetit pomoću ad libitum hranjenog modela pacova
Za eksperimente se koriste pacovi Sprague Dawley (SD) iz Taconic Europe, Danska. Pacovi su imali telesnu težinu 200-250 g na početku eksperimenta. Pacovi dolaze najmanje 10-14 dana pre početka eksperimenta kako bi se omogućila aklimatizacija na eksperimentalno okruženje. Tokom ovog perioda životinje se tretiraju najmanje 2 puta. Nakon dolaska, pacovi su smešteni pojedinačno u trajanju od jedne nedelje u obrnutoj svetlosno/mračnoj fazi (što znači da se svetla isključuju tokom dana, a pale tokom noći tokom dve nedelje). Pošto su pacovi normalno aktivni i jedu najveći deo svog dnevnog unosa hrane tokom mračnog perioda, pacovi se doziraju ujutru pre nego što se ugasi svetlo. Ova postavka rezultira najmanjom varijacijom podataka i najvišom osetljivošću ispitivanja. Eksperiment se sprovodi u kućnim kavezima pacova, a pacovi imaju slobodan pristup hrani i vodi tokom perioda aklimatizacije i perioda eksperimenta. Svaka doza derivata testirana je u grupi od 5-8 pacova. Grupa od 6-8 pacova uključena je u svaki skup testiranja. Pacovi se doziraju jednom prema telesnoj težini sa 0,01-3 mg/kg rastvora koji se daje intraperitonealno (ip), oralno (po) ili potkožno (supkutano) (sc). Za svaku grupu se beleži vreme doziranja. Nakon doziranja, pacovi se vraćaju u svoje kućne kaveze, gde im je omogućen pristup hrani i vodi. Potrošnja hrane beleži se pojedinačno kontinuirano, on-line registrovanjem ili ručno svakih sat vremena tokom 7 sati, a zatim nakon 24 sata, a ponekad i 48 sati. Na kraju eksperimentalne sesije, životinje su eutanazirane.
Pojedinačni podaci se beleže u Microsoft Excel-u. Vrednosti izvan opsega se isključuju nakon primene Grabsovog testa statističke procene za identifikaciju ekstremnih vrednosti, a rezultat je grafički prikazan pomoću programa GraphPad Prism.
ISPITIVANJE (II) - Funkcionalni testovi
ISPITIVANJE (II) a - Ispitivanje receptora humanog kalcitonina i amilina
1. Okvir testa luciferaze
Aktivacija receptora kalcitonina i amilina (koekspresija receptora kalcitonina i proteina koji modifikuju aktivnosti receptora (RAMP)) dovodi do povećanih unutarćelijskih koncentracija cAMP. Shodno tome, transkribovanje se aktivira od strane promotora koji sadrže više kopija elementa cAMP odgovora (CRE). Stoga je moguće izmeriti aktivnost amilina upotrebom CRE reporter gena luciferaraze koji se uvodi u BHK ćelije takođe eksprimujući receptore kalcitonina ili amilina.
2. Konstrukcija kalcitonina (a) - i amilina 3(a) - ćelijska linija receptora / CRE-luc.
Ćelijska linija BHK570 je stabilno transfektovana humanim receptorem kalcitonina i CRE-reaktivnim reporter genom luciferaze. Ćelijska linija je dalje transfektovana RAMP-3, koristeći standardne postupke. Ovo pretvara receptor kalcitonina u 3 (a) receptor amilina. Metotreksat, neomicin i higromicin su selekcioni markeri za luciferazu, receptor kalcitonina i RAMP-3, respektivno.
3. Ispitivanje luciferaze
Da bi se obavila ispitivanja aktivnosti, BHK kalcitonin (a) receptor ili amilin 3 (a) -receptor / CRE-luc ćelije posejane su u bele ploče sa kulturom od 96 ležišta, sa gustinom od oko 20.000 ćelija / ležište. Ćelije su bile u 100 μl medijuma za rast (DMEM sa 10% FBS, 1% Pen/Strep, 1 mM Na-piruvatom, 250 nM Metotreksata, 500 µg/ml Neomicina i 400 µg/ml Higromicina). Posle inkubacije preko noći na 37°C i 5% CO2, medijum za rast je zamenjen sredstvom za ispitivanje od 50 μl/ležištu (DMEM (bez fenol crvenog), Glutamax<TM>, 10% FBS i 10 mM Hepes, pH 7.4). Pored toga, dodato je 50 μl / ležištu standardnog ili uzorka u puferu za ispitivanje. Posle 3 sata inkubacije na 37°C i 5% CO2, medijum za analizu sa standardnim uzorkom je uklonjen i zamenjen sa 100 µl / ležištu PBS. Dalje je dodato 100 μl / ležištu LucLite<TM>. Ploče su zapečaćene i inkubirane na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta. Konačno, merenje luminescence je izvršeno na TopCounter (Packard) u režimu SPC (pojedinačno brojanje fotona).
Ispitivanje (II) b - Analiza receptora kalcitonina i amilina kod pacova
Okvir cAMP testa
Aktivacija receptora kalcitonina i amilina (koekspresija receptora kalcitonina i proteina koji modifikuju aktivnosti receptora (RAMP)) dovodi do povećanih unutarćelijskih koncentracija cAMP. Da bi se kvantifikovao nivo cAMP u prelazno transfektovanim ćelijama korišćen je FlashPlate<®>test aktivacije adenilil ciklaze Perkin Elmer-a. Osnovni princip testa FlashPlate<®>je upoređivanje između radioaktivnog i neradioaktivnog cAMP-a generisanog od ćelija na fiksni broj mesta vezivanja.
Konstrukcija kalcitonina(a) pacova i ćelija receptora amilina 3(a) pacova.
BHK tk ́ts 13 ćelije su prolazno transfektovane ili receptorom kalcitonina (a) pacova ili receptorom amilina 3 (a) (receptor kalcitonin (a) pacova RAMP3 pacova) koristeći FuGENE<®>6 (Roche), prema preporukama proizvođača.
cAMP ispitivanje
24 sata nakon prolaznog transfektovanja, ćelije (ćelije receptora kalcitonina (a) pacova ili receptora amilina 3 (a)) dodate su (100.000 ćelija / ležištu) u FlashPlates<®>sa 96 ležišta sa uzorcima ili standardnim u FlashPlate stimulacionom puferu sa IBMX-om i inkubirane 30 min. Detekciona smeša je napravljena prema protokolu proizvođača i scintilacija izmerena nakon 3 sata inkubacije na TopCounter<TM>(Packard).
ISPITIVANJE (III) - ThT fibrilacioni testovi za procenu fizičke stabilnosti proteinskih formulacija
Niska fizička stabilnost polipeptida može dovesti do stvaranja amiloidne fibrile, koja se primećuje kao dobro uređena, makromolekularna struktura nalik na konac u uzorku, što na kraju može dovesti do stvaranja gela. Ovo se tradicionalno meri vizuelnom inspekcijom uzorka. Međutim, ta vrsta merenja je veoma subjektivna i zavisi od posmatrača. Zbog toga je primena indikatorske probe malog molekula mnogo povoljnija. Tioflavin T (ThT) je takva proba i ima jasan potpis fluorescencije kada se veže za fibrile [Naiki et al. (1989) Anal. Biochem.177, 244-249; LeVine; (1999) Methods. Enzymol.09, 274-284].
Vremenski tok za formiranje fibrila može se opisati sigmoidnom krivom sa sledećim izrazom [Nielsen et al. (2001) Biochemistry 40, 6036-6046]:
Ekv. (1)
Ovde, F je ThT fluorescencija u vremenu t. Konstanta t0je vreme potrebno da se dostigne 50% maksimalne fluorescencije. Dva važna parametra koji opisuju formiranje fibrila su vreme kašnjenja izračunato pomoću t0– 2 τ i prividna konstantna brzina kapp= 1/ τ.
Formiranje delimično presavijenog intermedijera polipeptida je predloženo kao opšti mehanizam inicijacije fibrilacije. Nekoliko tih intermedijera se nukleiraju da bi formirali šablon na kojem mogu da se sklapaju novi intermedijeri i fibrilacija se nastavlja. Vreme kašnjenja odgovara intervalu u kome je izgrađena kritična masa nukleusa i prividna konstanta brzine je brzina kojom se formira sam fibril.
Priprema uzorka
Uzorci su pripremljeni sveže pre svakog ispitivanja. Svaki sastav uzorka opisan je u svakom primeru. PH uzorka je podešen na željenu vrednost pomoću odgovarajućih količina koncentrovanog NaOH i HClO4ili HCl. Tioflavin T je dodat u uzorke iz matičnog rastvora u H2O do konačne koncentracije 1 μM.
Uzorci alikvota od 200 μl stavljeni su na mikrotitarsku ploču sa 96 ležišta (Packard OptiPlate ™-96, beli polistiren). Obično, četiri ili osam replika svakog uzorka (koje odgovaraju jednom uslovu testa) su postavljene u jednu kolonu ležišta. Ploča je zapečaćena sa Scotch Pad-om (Qiagen).
Inkubacija i merenje fluorescencije
Inkubacija na datoj temperaturi, mućkanje i merenje ThT fluorescentne emisije je urađeno u Fluoroskan Ascent FL fluorescentnom čitaču ploča ili Varioskan čitaču ploča (Thermo Labsystems). Temperatura je podešena na 37°C. Orbitalno mućkanje je podešeno na 960 rpm sa amplitudom od 1 mm u svim predstavljenim podacima. Merenje fluorescencije je izvršeno korišćenjem ekscitacije kroz 444 nm filter i merenje emisije kroz 485 nm filter.
Svako izvođenje je započeto inkubacijom ploče na temperaturi testa tokom 10 min. Ploča je merena svakih 20 minuta tokom željenog vremenskog perioda. Između svakog merenja, ploča se mućka i zagreva kako je opisano.
Rukovanje podacima
Tačke merenja su sačuvane u Majkrosoft Excel formatu za dalju obradu, a crtanje krive i postavljanje je izvršeno pomoću GraphPad Prism-a. Pozadinska emisija iz ThT u odsustvu fibrila bila je zanemarljiva. Tačke podataka su obično srednja vrednost od četiri ili osam uzoraka i prikazane su sa stubićima grešaka sa standardnim odstupanjima. U istom grafikonu prikazani su samo podaci dobijeni istim eksperimentom (tj. uzorci na istoj ploči) koji osiguravaju relativnu meru fibrilacije između eksperimenata.
Skup podataka se može postaviti na Eq. (1). Međutim, budući da se pune sigmodijalne krivulje u ovom slučaju ne postižu uvek tokom merenja, stepen fibrilacije se izražava kao ThT fluorescencija tabulirana kao srednja vrednost uzoraka i prikazana sa standardnom devijacijom u različitim vremenskim tačkama.
Merenje početnih i krajnjih koncentracija
Koncentracija polipeptida u svakoj od testiranih formulacija merena je i pre primene u ThT fibrilacijskom testu („Početno“), i nakon završetka ThT fibrilacije („Posle ThT testa“). Koncentracije su određene reverznim HPLC postupcima korišćenjem pramlintidnog standarda kao reference. Pre merenja po završetku, prikupljeno je 150 µl iz svake replike i preneto je u Eppendorf epruvetu. Oni su centrifugirani na 30000 G tokom 40 min. Supernatanti su filtrirani kroz 0,22 µm filter pre nanošenja na HPLC sistem.
ISPITIVANJE (IV) – Određivanje rastvorljivosti
Polipeptid je rastvoren u vodi brzinom od ~ 500 nmol/ml i pomešan 1:1 sa nizom pufera (100 mM glikolglicina pH 3.0, 100 mM glikolglicina pH 4.0, 100 mM glikolglicina pH 5.0, 100 mM bistrispropana pH 6.0, 100 mM bistrispropana pH 6.5, 100 mM bistrispropana pH 7.0, 100 mM bistrispropana pH 7.5, 100 mM bistrispropana pH 8.0). Nakon 18 sati na sobnoj temperaturi uzorci su centrifugirani i koncentracija polipeptida određena putem UPLC.
ISPITIVANJE (V) – Određivanje vezivanja za receptor humanog amilina
Ispitivanje vezivanja izvršeno je upotrebom zrnaca (RPNQ0001) za scintilacioni test blizine (SPA) iz PerkinElmer-a i korišćene su ćelijske membrane iz Amilin 3(a)/CRE-luc ćelije (kao što je opisano u Ispitivanju (II)). Membrane su pripremljene na sledeći način; ćelije su isprane PBS-om i inkubirane Versene-om otprilike 5 min pre sakupljanja. Ćelije su isprane PBS-om i ćelijska suspenzija je centrifugirana 5 min pri 1000 rpm. Ćelije su homogenizovane (ultraturaks) u puferu koji sadrži 20 mM Na-HEPES i 10 mM EDTA (pH 7.4) i centrifugirane na 20.000 rpm tokom 15min. Dobijen pelet je ponovo suspendovan, homogenizovan i centrifugiran (20.000rpm, 15min) u puferu koji sadrži 20mM Na-HEPES i 0.1 mM EDTA (pH 7.4, pufer 2). Dobijen pelet je ponovo suspendovan u puferu 2 i izmerena je koncentracija proteina (BCA protein Assay, Pierce). Homogenat se održavao hladnim tokom celog postupka. Membrane su do upotrebe držane na -80°C. Test je izveden u Optiplate od 384 ležišta (PerkinElmer) u ukupnoj zapremini od 40 µl. Membrane su pomešane sa zrncima SPA. Konačna koncentracija membrana od 35 ng/µL i zrnaca SPA je bila 0,05 mg / ležištu. Ispitna jedinjenja su rastvorena u DMSO i dalje razblažena u puferu za ispitivanje (50 mM Hepes, pH 7.4, 1 mM CaCl2, 5 mM MgCl2, 0,1% OA i 0,02% Tween20). Radioligand<125>I-amilin pacova (NEX448 PerkinElmer) je rastvoren u puferu za ispitivanje i dodat u Optiplate u krajnjoj koncentraciji od 50 pM / ležištu (približno 20.000cpm/10µl). Konačna smeša je inkubirana mućkanjem pri 400 rpm tokom 120 min na 25°C pre centrifugiranja (1500 rpm, 10 min). Uzorci su analizirani na TopCounter™ (Packard). IC50je izračunat korišćenjem (analiza poređenja na jednom mestu vezanja) GraphPad Prism5 kao mere afiniteta receptora.
ISPITIVANJE (VI) - Određivanje vezivanja za receptor amilina pacova
Ispitivanje je izvedeno kao što je prethodno opisano (Ispitivanje (V) - Određivanje vezivanja za receptor humanog aminlina), s izuzetkom što smo koristili membrane pripremljene iz BHK tk'ts 13 ćelija koje su prolazno transfektovane sa receptorom kalcitonina pacova RAMP 3 u ekvimolarnom odnosu (1:2). BHK tk ́ts 13 ćelije su prolazno transfektovane sa receptorima kalcitonina pacova koristeći FuGENE® 6 (Roche), prema preporukama proizvođača. Ćelije su uzgajane u DMEM sa 10% FBS i 1% Pen/Strep. Otprilike 48 sati nakon transfektovanja, ćelije su sakupljene i pripremljene su membrane.
ISPITIVANJE (VII) - Određivanje vezivanja za humani receptor kalcitonina
Ispitivanje vezivanja izvršeno je korišćenjem zrnaca (RPNQ0001) scintilacionog testa blizine (SPA) iz PerkinElmer-a i ćelijskih membrana pripremljenih iz BHK tk'ts 13 ćelijske linije koja je stabilno transfektovana humanim receptorem kalcitonina i CRE- odgovornog reporterskog gena luciferaze. Membrane su pripremljene na sledeći način; ćelije su isprane PBS-om i inkubirane Versene-om otprilike 5 min pre sakupljanja. Ćelije su isprane PBS-om i ćelijska suspenzija je centrifugirana 5 min pri 1000 rpm. Ćelije su homogenizovane (Ultraturaks) u puferu koji sadrži 20 mM Na-HEPES i 10 mM EDTA (pH 7.4) i centrifugirane na 20.000 rpm tokom 15 min. Dobijen pelet je ponovo suspendovan, homogenizovan i centrifugiran (20.000 rpm, 15 min) u puferu koji sadrži 20mM Na-HEPES i 0,1mM EDTA (pH 7.4, pufer 2). Dobijen pelet je ponovo suspendovan u puferu 2 i izmerena je koncentracija proteina (BCA protein Assay, Pierce). Homogenat se održavao hladnim tokom celog postupka. Membrane su do upotrebe držane na -80°C. Analiza je izvedena u Optiplate od 384 ležišta (PerkinElmer) u ukupnoj zapremini od 40 µl. Membrane su pomešane sa zrncima SPA. Konačna koncentracija membrana od 35 ng/µL, a krajnja koncentracija zrnaca SPA bila je 0,05 mg / ležištu. Ispitivana jedinjenja su rastvorena u DMSO i dalje razblažena u puferu za ispitivanje (50 mM Hepes, pH 7.4, 1 mM CaCl2, 5 mM MgCl2, 0,1% OA i 0,02% Tween20). Radioligand
<125>I-kalcitonin (NEX422 PerkinElmer) je rastvoren u puferu za ispitivanje i dodat u Optiplate u krajnjoj koncentraciji od 75 pM / ležištu (približno 30.000 cpm/ 10µl). Konačna smeša se inkubira 120 minuta uz mućkanje na 400 rpm na 25°C pre centrifugiranja (1500 rpm, 10 min). Uzorci su analizirani na TopCounter™ (Packard). IC50je izračunat korišćenjem (analiza poređenja na jednom mestu vezanja) GraphPad Prism5 kao mera afiniteta receptora.
ISPITIVANJE (VIII) - Određivanje vezivanja za receptor kalcitonina pacova
Ispitivanje je izvedeno kao što je opisano gore (Ispitivanje (VII) - Određivanje vezivanja za humani receptor kalcitonina), osim što smo koristili membrane pripremljene izBHK tk'ts 13 ćelija koje su prolazno transfektovane sa receptorom kalcitonina pacova. BHK tk ́ts 13 ćelije su prolazno transfektovane sa receptorima kalcitonina pacova korišćenjem FuGENE® 6 (Roche), prema preporukama proizvođača. Ćelije su uzgajane u DMEM sa 10% FBS i 1% Pen/Strep. Otprilike 48 sati nakon transfektovanja, ćelije su sakupljene i pripremljene su membrane.
ISPITIVANJE (IX) - pK - Određivanje T1⁄2 kod patuljastih svinja
T1⁄2 je terminalni poluživot = ln2/λzjedinjenja u plazmi. λzje konstanta brzine prvog reda povezana sa krajnjim (log-linearnim) delom krive koncentracije u plazmi-vreme i procenjuje se linearnom regresijom vremena u odnosu na log koncentraciju.
Vrednosti T1⁄2 analoga amilina ovog pronalaska su određene farmakokinetičkim istraživanjima kod muških Gottingen patuljastih svinja iz Ellegaard Göttingen Minipigs ApS i poštovani su principi laboratorijske brige o životinjama.
Dozvoljeno je razdoblje aklimatizacije od oko 6-10 dana pre nego što su životinje uključene u studiju. Na početku perioda aklimatizacije patuljaste svinje su bile stare oko 5 do 12 meseci, a težine su bile od 7 do 35 kg. Patuljaste svinje su imale dva centralna venska katetera koja su korišćena za uzorkovanje krvi.
Studije su sprovedene u sobi za životinje koja je osvetljena tako da daje ciklus od oko 12 sati svetlosti i 12 sati tame. Životinje su smeštene pojedinačno.
Životinje su imale slobodan pristup pitkoj vodi za domaćinstvo tokom studije, ali su obično gladovale od noći pre doziranja do otprilike 6-12 sati nakon doziranja. Životinje su vagane po dolasku i u danima doziranja.
U ovom istraživanju su ispitivane supstance davane supkutano u dozi od oko 2 nmol/kg. Životinje su primile jednu potkožnu injekciju. Potkožna injekcije je data sa desne strane vrata, otprilike 5-7 cm od uha i 7-9 cm od sredine vrata. Injekcije su davane sa graničnikom na igli, omogućavajući uvođenje oko 0,5 cm igle. Svaka ispitna supstanca je davana obično trima, ali u nekim slučajevima dvema ili četirima životinjama.
Iz svake životinje dobijen je potpuni profil koncentracije u plazmi - vreme, koji koristi 12-16 tačaka uzorkovanja. Na primer, uzorci krvi su uzeti po sledećem rasporedu:
Posle supkutane primene:
Pre doze, (0), 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 48, 72, 96, 120, 168 i 240 sati posle injekcije.
U nekim slučajevima su uzeti i dodatni uzorci krvi do 288 sati nakon injekcije.
U svako vreme uzorkovanja, iz svake životinje je uzeto 0,5 do 2 ml krvi. Uzorci krvi uzeti su preko centralnog venskog katetera.
Uzorci krvi su sakupljeni u EDTA epruvete (tj. Sarstedt Mikro epruveta 1,3 mL K3E). Uzorci krvi držani su na ledu najviše 20 min. pre centrifugiranja. Plazma je odvojena centrifugiranjem (tj. na 4°C, 10 min, 1500 G) i odmah je preneta u Micronic epruvete. Otprilike 200 μl plazme preneseno je u svaku Micronic epruvetu. Plazma je čuvana na -20°C do ispitivanja. Uzorci plazme testirani su na sadržaj amilina korišćenjem ELISA testa.
Profili plazma koncentracije-vremena analizirani su nekompartmentalnom farmakokinetičkom analizom (NCA) koristeći WinNonlin Professional 5.0 (Pharsight Inc., Mountain View, CA, USA). NCA je rađen korišćenjem pojedinačnih profila koncentracije u plazmi - vremena svake životinje. T1⁄2 je terminalni poluživot = ln2/λzi određen je iz λz,konstante brzine prvog reda povezane sa terminalnim (log-linearnim) delom krive, procenjen linearnom regresijom vremena u odnosu na log koncentraciju.
ELISA test u plazmi za kvantifikaciju amina
Humani aminlin ELISA je sendvič imuno-test na osnovu monoklonskog antitela za određivanje nivoa amilina u humanoj plazmi. Antitelo za hvatanje prepoznaje humani amilin, amilinsku kiselinu (deamidirani aminlin), 1-20 fragmenta amilina, ali ne redukovani aminin. Antitelo za otkrivanje vezuje se za redukovani ili neredukovani humani amilin, ali ne i amilinsku kiselinu i usloženjeno je sa streptavidin-alkalnom fosfatazom. Supstrat, 4-metilumbeliferil fosfat, nanosi se na kompletirani sendvič i fluorescentni signal, praćen na 355 nm / 460 nm, proporcionalan je količini amilina prisutnog u uzorku.
MS-postupak za kvantifikaciju amilina
40 µl plazme je razblaženo sa 120 µl 66,67% EtOH 1% HCOOH i mešano. Centrifugirano 20 min. pri 13000 rpm, 4°C. Supernatant se analizira pomoću LC-MS metode na Sciex API 3000 i kvantitativno određuje u odnosu na standard sastavljen u plazmi
ISPITIVANJE (X) - pK - Određivanje T1⁄2 kod pacova
T1⁄2 je terminalni poluživot = ln2/λzjedinjenja u plazmi. λzje konstanta brzine prvog reda povezana sa krajnjim (log-linearnim) delom krive koncentracija u plazmi-vreme i procenjuje se linearnom regresijom vremena u odnosu na log koncentraciju.
Vrednosti T1⁄2 analoga amilina ovog pronalaska su određene farmakokinetičkim istraživanjima na mužjacima pacova Sprague Dawley iz Taconic Europe i poštovani su principi laboratorijske brige o životinjama.
Dozvoljeno je razdoblje aklimatizacije od oko 7 dana pre nego što su životinje uključene u studiju. Na početku perioda aklimatizacije, pacovi su bili u rasponu težine od 300-400g. Pacovi su imali stalne katetere u a. carotis koji su korišćeni za uzorkovanje krvi.
Studije su sprovedene u sobi za životinje koja je osvetljena tako da daje ciklus od oko 12 sati svetlosti i 12 sati tame. Životinje su bile smeštene pojedinačno zbog katetera i imale su neograničen pristup hrani i vodi. Životinje su merene u danima doziranja.
U ovom istraživanju su ispitivane supstance davane supkutano u dozi od oko 20 nmol/kg. Životinje su primile jednu potkožnu injekciju u vrat pomoću igle od 25 G sa špricem. Svaka ispitivana supstanca davana je obično trima, ali u nekim slučajevima dvema ili četirima životinjama.
Iz svake životinje dobijen je potpuni profil koncentracija u plazmi - vreme koji koristi 8-10 tačaka uzorkovanja. Na primer, uzorci krvi su uzeti po sledećem rasporedu:
Nakon supkutanog davanja:
Pre doze (0), 0,5, 1, 1,5, 2, 4, 6, 12, 24, 48 i 72 sata posle injekcije.
U svakom vremenu uzorkovanja, 0,08 do 0,10 ml krvi je uzeto iz svake životinje. Uzorci krvi uzimani su putem katetera.
Uzorci krvi su sakupljeni u EDTA epruvete za ispitivanje. Uzorci krvi držani su na ledu najviše 20 min. pre centrifugiranja. Plazma je odvojena pomoću centrifugiranja (tj. na 4°C, 10 min, 1500 G) i odmah je preneta u Micronic epruvete ili PCR ploče. Preneto je oko 40 μl plazme i čuvana je na -20°C do ispitivanja. Uzorci plazme testirani su na sadržaj amilina korišćenjem ELISA testa.
Profili plazma koncentracije-vremena analizirani su nekompartmentalnom farmakokinetičkom analizom (NCA) koristeći WinNonlin Professional 5.0 (Pharsight Inc., Mountain View, CA, USA). NCA je rađen korišćenjem pojedinačnih profila koncentracija u plazmi – vreme svake životinje. T1⁄2 je terminalni poluživot = ln2/λzi određen je iz λz,konstante brzine prvog reda povezane sa terminalnim (log-linearnim) delom krive, procenjen linearnom regresijom vremena u odnosu na log koncentraciju.
PRIPREME
Polipeptidne sekvence su pripremljene prema dole pomenutoj sintezi polipeptida i jedinjenja kao što su predstavljena u Tabelama (npr. Tabela 10) su pripremljena prema dole navedenoj sintezi.
Jedan postupak sinteze polipeptida bila je Fmoc hemija na mikrotalasnom sintetizatoru polipeptida Liberty polypeptide synthesizer (CEM Corp., Severna Karolina). Smola je bila Tentagel S RAM sa punjenjem od oko 0,25 mmol/g ili PAL-ChemMatrix sa punjenjem od oko 0,43 mmol/g. Hemija spajanja bila je DIC/HOAt u NMP korišćenjem rastvora amino-kiselina od 0,3 M u NMP i molarnim viškom od 6-8 puta. Uslovi spajanja su bili 5 minuta na temperaturi do 70°C. Deprotekcija je bila sa 5% piperidina u NMP na do 70°C. Korišćene zaštićene amino-kiseline su standardne Fmoc-amino-kiseline (obezbeđene od npr. Anaspeca ili Novabiochem-a) rastvorene na 0,3 M u NMP koji sadrži 0,3 M HOAt.
Drugi postupak sinteze polipeptida bio je Fmoc hemijom na Prelude polipeptidnom sintetizatoru (Protein Technologies, Arizona). Smola je bila Tentagel S RAM sa opterećenjem od oko 0,25 mmol/g ili PAL-ChemMatrix sa opterećenjem od oko 0,43 mmol/g. Hemija spajanja bila je DIC/HOAt u NMP korišćenjem rastvora amino-kiselina od 0,3 M u NMP i molarnim viškom od 6-8 puta. Uslovi spajanja su bili jednostruki ili dvostruki spojevi tokom 1 ili 2 sata na sobnoj temperaturi. Deprotekcija je bila sa 20% piperidina u NMP. Korišćene zaštićene amino-kiseline su standardne Fmoc-amino-kiseline (obezbeđene od npr. Anaspeca ili Novabiochem-a) rastvorene na 0,3 M u NMP koji sadrži 0,3 M HOAt.
Drugi postupak sinteze polipeptida bio je na Applied Biosystems 433 polipeptidnom sintetizatoru u skali od 0,25 mmol ili 1,0 mmol korišćenjem proizvođača koji su isporučili FastMoc UV protokole koji koriste HBTU ili HATU posredovane spojeve u NMP i UV praćenje uklanjanja zaštite Fmoc zaštitne grupe. Početna smola korišćena za sintezu polipeptidnih amida bila je Rink-Amidna smola. Upotrebljeni derivati zaštićenih amino-kiselina su standardne Fmoc-amino-kiseline (obezbeđene od npr. Anaspec-a ili Novabiochem-a) koje se isporučuju u prethodno podešenim kertridžima pogodnim za ABI433A sintetizator.
Kada je poželjna hemijska modifikacija bočnog lanca lizina, lizin je ugrađen kao Lys(Mtt), a N-terminalna amino-kiselina je ili uključena u sekvencu kao Boc-aminokiselina ili, ako je N-terminalna amino-kiselina bila ugrađena kao Fmoc-amino-kiselina, Fmoc grupa je uklonjena i N-kraj je zaštićen tretmanom sa 6 ekvivalenta Boc-karbonata i 6 ekvivalenta DIPEA u NMP u trajanju od 30 minuta. Smola je isprana NMP i DCM, a Mtt grupa je uklonjena suspendovanjem smole u urednom heksafluoroizopropanolu tokom 20 minuta, a zatim ispiranjem sa DCM i NMP. Hemijska modifikacija lizina izvedena je dodavanjem jednog ili više građevinskih blokova navedenih dole istim postupcima kao i za sintezu polipeptida, tj. jednim ili više automatizovanih koraka na Liberty-ju ili ABI 433 ili jednom ili više ručnih koraka spajanja na sobnoj temperaturi. Posle sinteze, smola je isprana sa DCM i osušena, a polipeptid je otcepljen sa smole tretmanom u trajanju od 2 sata sa TFA/TIPS/vodom (92,5/5/2,5/ ili 95/2,5/2,5) nakon čega je sledilo taloženje sa 4 zapremine dietiletrom, dalje ispiranjem sa dietiletrom i sušenje. Ako je polipeptid sadržavao cisteine zaštićene Acm grupama, polipeptid je ponovo rastvoren u vodi sa 2-5 mg/ml, pH podešen na ispod 4, a disulfidni most formiran tretmanom sa 4 ekv. joda (2% w/v u metanolu) tokom 15 minuta. Alternativno, disulfidni most je formiran na smoli korišćenjem Trt kao zaštitne grupe za cistein i tretiranjem sa 10 ekvivalenata joda u NMP tokom 1 sata. U ovom slučaju, sirovi polipeptid je prečišćen direktno posle cepanja i precipitacije dietiletera.
Prečišćavanje: Sirovi polipeptid je prečišćen semipreparativnom HPLC na koloni 20 mm x 250 mm sa čak 5 µ ili 7 µ C-18 silicijum-dioksidom. Polipeptidni rastvori su pumpani na kolonu HPLC i istaloženi polipeptidi su rastvoreni u 5 ml 50% sirćetne kiseline H2O i razređeni do 20 ml sa H2O i ubrizgani u kolonu koja je zatim eluirana gradijentom od 40-60% CH3CN u 0,1% TFA 10 ml/min tokom 50 min na 40<o>C. Sakupljene su frakcije koje sadrže polipeptid. Prečišćeni polipeptid je liofilizovan nakon razblaživanja eluata vodom.
Za analizu HPLC-frakcija i konačnog proizvoda RP-HPLC analiza izvedena je korišćenjem UV detekcije na 214 nm i npr. Vydac 218TP544,6 mm xk 250 mm 5 µ C-18 silika koloni (The Separations Group, Hesperia, SAD) i eluira se na pr.1 ml/min pri 42<o>C. Najčešće se koristio jedan od četiri različita uslova elucije:
A1: Ekvilibracija kolone sa puferom koji se sastoji od 0,1M (NH4)2SO4, koji je podešen na pH 2.5 sa koncentrovanom H2SO4i eluiran gradijentom od 0% do 60% CH3CN u istom puferu tokom 50 minuta.
B1: Ekvilibracija kolone sa 0,1% TFA / H2O i eluiranje gradijentom od 0% CH3CN / 0,1% TFA / H2O do 60% CH3CN / 0,1% TFA / H2O tokom 50 min.
B6: Ekvilibracija kolone sa 0.1% TFA / H2O i eluiranje gradijentom od 0% CH3CN / 0,1% TFA / H2O do 90% CH3CN / 0,1% TFA / H2O tokom 50 min.
Alternativno, RP-HPLC analiza je izvedena korišćenjem UV detekcije na 214 nm i Symmetry300, 3,6 mm x 150 mm, 3,5 µ C-18 silika kolone (Waters) koja je eluirana sa 1 ml/min na 42<o>C.
B4: Ekvilibracija kolone sa 0,05% TFA / H2O i eluiranje gradijentom od 5% CH3CN / 0,05% TFA / H2O do 95% CH3CN / 0,05% TFA / H2O tokom 15 min.
Identitet polipeptida je potvrđen od strane MALDI-MS na Bruker Microflex-u.
Pripremljeni polipeptidi prikazani su u Tabeli 10 (predstavljenoj ranije):
Zapažanja
Svi naslovi i podnaslovi su ovde dati radi pogodnosti i ne treba smatrati da na bilo koji način ograničavaju pronalazak.
Upotreba bilo kog i svih primera ili odgovarajućeg jezika (npr. „kao što je“) koji su ovde dati, ima za cilj samo da bolje osvetli pronalazak i ne ograničava obim pronalaska, osim ako nije drugačije navedeno. Nijedan jezik u specifikaciji ne bi trebalo tumačiti kao pokazatelj bilo kojeg elementa koji nije tražen kao bitnog za praksu pronalaska.
LISTING SEKVENCI
SEQ ID NO: 1
SEQ ID NO: 2
SEQ ID NO: 3

Claims (15)

  1. PATENTNI ZAHTEVI 1. Polipeptid prema Formuli (I): Xaa1-Cys-Xaa3-Thr-Ala-Thr-Cys-Ala-Thr-Gln-Arg-Leu-Ala-Xaa14-Phe-Leu- Xaa17-Xaa18-Ser-Ser- Xaa21-Xaa22- Phe-Gly-Pro-Xaa26-Leu-Pro-Pro-Thr- Xaa31-Val-Gly-Ser-Xaa35-Thr-Pro; pri čemu Xaa1 je izbrisan ili nezavisno izabran iz Ala, Cys, Glu, Gly, His, Arg, Ser i Lys; Xaa3 je nezavisno izabran iz Gly, His, Arg, Ser i Asn; Xaa14 je Glu; Xaa17 je nezavisno izabran iz His, Arg, Lys i Val; Xaa18 je nezavisno izabran iz Arg, Lys i His; Xaa21 je nezavisno izabran iz Ala, Lys, Gln, Ser i Asn; Xaa22 je nezavisno izabran iz Glu, Gln, Ser, Thr i Asn; Xaa26 je nezavisno izabran iz Pro, Arg i Ile; Xaa31 je nezavisno izabran iz Ser, Glu, Asp i Asn; Xaa35 je nezavisno izabran iz His, Arg, Lys, Asp, Gln i Glu; gde numerisanje sekvenci amino-kiselina odgovara numerisanju sekvenci amino-kiselina u SEQ ID No: 2; naznačen time što je C-kraj polipeptida amid; naznačen time što C-kraj može, opciono, biti derivatizovan; i naznačen time što je polipeptid agonist receptora amilina.
  2. 2. Polipeptid prema zahtevu 1, koji sadrži ostatak na poziciji 17 koji je histidin ili arginin, poželjno arginin.
  3. 3. Polipeptid prema bilo kojem od zahteva 1-2, naznačen time što sadrži ostatak na poziciji 35, koji je nezavisno izabran od bilo kog od histidina, asparagina, glutamina i glutaminske kiseline; poželjno histidin, glutamin i asparagin; poželjnije asparagin.
  4. 4. Polipeptid prema bilo kojem od zahteva 1-3, koji sadrži amino-kiselinski ostatak na poziciji 14 koji je glutaminska kiselina i ostatak na poziciji 17 koji je arginin.
  5. 5. Polipeptid prema bilo kom od zahteva 1-4, naznačen time što je najmanje jedan supstituent vezan za barem jedan amino-kiselinski ostatak datog polipeptida.
  6. 6. Polipeptid prema zahtevu 5, naznačen time što je supstituentna grupa izabrana iz bilo koje od supstituentnih grupa predstavljenih u donjoj tabeli:
  7. 7. Polipeptid prema bilo kom od zahteva 1-6, naznačen time što je supstituent vezan za α-amino grupu N-terminalnih ostataka amino-kiselina ili za Lys ostatak.
  8. 8. Polipeptid prema bilo kom od zahteva 1-7, izabran iz grupe koja se sastoji od bilo kog od polipeptida navedenog ispod: N-alfa-[(S)-4-Karboksi-4-(19-karboksinonadekanoilamino)butiril]-Gly-[His1,Glu14,Arg17,Pro37]-pramlintid; N-alfa-[(S)-4-Karboksi-4-(19-karboksinonadekanoilamino)butiril]-[His1,Glu14,Arg17,Pro37]-pramlintid; N-alfa-[(S)-4-Karboksi-4-(19-karboksinonadekanoilamino)butiril]-[Gly1,Glu14,Arg17,Pro37]-pramlintid; N-alfa-[(S)-4-Karboksi-4-(19-karboksinonadekanoilamino)butiril]-[Arg1,Glu14,His17,Pro37]-pramlintid; N-alfa-[(S)-4-Karboksi-4-(19-karboksinonadekanoilamino)butiril]-Gly-[Arg1,Glu14,His17,Pro37]-pramlintid; N-alfa-[(S)-4-Karboksi-4-(19-karboksinonadekanoilamino)butiril]-[Glu14,Arg17,Pro37]-pramlintid; N-alfa-[(S)-4-Karboksi-4-(19-karboksinonadekanoilamino)butiril]-[Glu14,His17,Gln21,Pro37]-pramlintid; N-alfa-[(S)-4-Karboksi-4-(19-karboksinonadekanoilamino)butiril]-[Glu14,His17,Pro37]-pramlintid; N-alfa-[(S)-4-Karboksi-4-(19-karboksinonadekanoilamino)butiril]-[Lys11,Glu14,His17,Pro37]-pramlintid; N-alfa-[(S)-4-Karboksi-4-(19-karboksinonadekanoilamino)butiril]-Glu-Arg-[Glu1,Glu14,Arg17,Pro37]-pramlintid; N-alfa-[(S)-4-Karboksi-4-(19-karboksinonadekanoilamino)butiril]-[Glu14,Arg18,Ser21,Ser22,Ser28,Ser29,Asp31,Asp35,Pro37]-pramlintid; N-alfa-[(S)-4-Karboksi-4-(19-karboksinonadekanoilamino)butiril]-[Glu14,His17,Gln21,Gln35,Pro37]-pramlintid; N-alfa-[(S)-4-Karboksi-4-(19-karboksinonadekanoilamino)butiril]-[Glu14,His17,Thr21,Pro37]-pramlintid; N-alfa-[(S)-4-Karboksi-4-(19-karboksinonadekanoilamino)butiril]-[Glu14,His17,Gln35,Pro37]-pramlintid; N-alfa-[(S)-4-Karboksi-4-(19-karboksinonadekanoilamino)butiril]-Glu-Arg-[Glu1,Glu14,Arg17,Gln21,Pro37]-pramlintid; N-alfa-[(S)-4-Karboksi-4-(19-karboksinonadekanoilamino)butiril]-Glu-Arg-[Glu1,Glu14,Arg17,Gln21,Gln35,Pro37]-pramlintid; N-alfa-[(S)-4-Karboksi-4-(19-karboksinonadekanoilamino)butiril]-Glu-Arg-[Glu1,Glu14,Arg17,Gln21,Gln31,Gln35,Pro37]-pramlintid; N-alfa-[(S)-4-Karboksi-4-(19-karboksinonadekanoilamino)butiril]-Glu-Arg-[Glu1,Glu14,Arg17,Gln21,Gln22,Gln31,Gln35,Pro37]-pramlintid. 99 1
  9. 9. Derivat polipeptida prema bilo kom od zahteva 1-8, naznačen time što dati derivat sadrži γGlu linker vezan na N-kraj datog polipeptida i HOOC(CH2)18CO- ili HOOC(CH2)16CO-kao ostatak koji vezuje albumin i time što sekvenca polipeptida sadrži: a. Glu na poziciji 14, b. His ili Arg na poziciji 17 i c. Pro na poziciji 37.
  10. 10. Polipeptid prema bilo kom od zahteva 1-9, naznačen time što je polipeptid: N-alfa-[(S)-4-Karboksi-4-(19-karboksinonadekanoilamino)butiril]-[Glu14, Arg17, Pro37]-pramlintid.
  11. 11. Polipeptid prema bilo kom od zahteva 1-10, naznačen time što je polipeptid:: N-alfa-[(S)-4-Karboksi-4-(19-karboksinonadekanoilamino)butiril]-[Glu14,His17,Pro37]-pramlintid.
  12. 12. Polipeptid prema bilo kom od zahteva 1-11, za upotrebu kao lek.
  13. 13. Polipeptid prema bilo kom od zahteva 1-12, za upotrebu u lečenju ili prevenciji hiperglikemije, dijabetesa tipa 2, oslabljene tolerancije na glukozu, dijabetesa tipa 1, gojaznosti, hipertenzije, sindroma X, dislipidemije, kognitivnih poremećaja, ateroskleroze, infarkta miokarda, koronarne bolesti srca i drugih kardiovaskularnih poremećaja, moždanonog udara, sindrom zapaljenja creva, dispepsije i čira na želucu, hiperkalcemije, osteoporoze i Padžetove bolesti.
  14. 14. Farmaceutska kompozicija koja sadrži polipeptid prema bilo kom od zahteva 1-11, i farmaceutski prihvatljiv ekscipijent.
  15. 15. Postupak za pripremu farmaceutske kompozicije prema zahtevu 14 koji obuhvata mešanje polipeptida prema bilo kom od zahteva 1-11 sa najmanje jednim farmaceutski prihvatljivim ekscipijentom. 100 1 1
RS20200191A 2011-06-10 2012-06-08 Polipeptidi RS59977B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP11169405 2011-06-10
US201161496113P 2011-06-13 2011-06-13
EP12729418.9A EP2718316B1 (en) 2011-06-10 2012-06-08 Polypeptides
PCT/EP2012/060900 WO2012168432A1 (en) 2011-06-10 2012-06-08 Polypeptides

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS59977B1 true RS59977B1 (sr) 2020-03-31

Family

ID=47295518

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20200191A RS59977B1 (sr) 2011-06-10 2012-06-08 Polipeptidi

Country Status (18)

Country Link
US (4) US8722849B2 (sr)
EP (3) EP2718316B1 (sr)
JP (3) JP6121992B2 (sr)
KR (1) KR102066987B1 (sr)
CN (3) CN103596973A (sr)
AU (1) AU2012266269B2 (sr)
BR (1) BR112013031268B1 (sr)
CA (1) CA2838884C (sr)
ES (1) ES2664509T3 (sr)
IL (1) IL229258B (sr)
MX (1) MX341324B (sr)
MY (1) MY161773A (sr)
PL (1) PL2718316T3 (sr)
RS (1) RS59977B1 (sr)
RU (1) RU2669999C2 (sr)
SI (1) SI2718316T1 (sr)
WO (3) WO2012168430A2 (sr)
ZA (1) ZA201309174B (sr)

Families Citing this family (54)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102066987B1 (ko) 2011-06-10 2020-01-16 노보 노르디스크 에이/에스 폴리펩티드
ES2640285T3 (es) * 2012-04-19 2017-11-02 Novo Nordisk A/S Análogos de amilina humana
AR096440A1 (es) 2013-05-28 2015-12-30 Takeda Pharmaceuticals Co Compuesto peptídico agonista del receptor del péptido similar al glucagón tipo i (glp-1) y del péptido insulinotrópico dependiente de glucosa (gip)
AR097701A1 (es) * 2013-09-19 2016-04-13 Zealand Pharma As Análogos de amilina
WO2016034604A1 (en) * 2014-09-04 2016-03-10 Novo Nordisk A/S Novel amylin and calcitonin receptor agonist
JP2018012644A (ja) * 2014-11-26 2018-01-25 武田薬品工業株式会社 ペプチド化合物
CA2971721A1 (en) 2014-12-23 2016-06-30 Colgate-Palmolive Company Oral care composition
CN105985995A (zh) * 2015-01-29 2016-10-05 暨南大学 一种利用家蚕生物反应器生产普兰林肽(pa)的方法
EA035791B1 (ru) * 2015-03-18 2020-08-11 Зилэнд Фарма А/С Аналоги амилина
CN106554405B (zh) * 2015-09-30 2020-04-24 深圳翰宇药业股份有限公司 一种多肽及其用途、制备方法
CN106928086B (zh) 2015-12-31 2019-05-31 深圳翰宇药业股份有限公司 一种长链化合物的制备方法
EP3467106B1 (en) 2016-05-24 2025-07-09 Takeda Pharmaceutical Company Limited Peptide compound
AR109514A1 (es) 2016-09-09 2018-12-19 Zealand Pharma As Análogos de amilina
MA46780A (fr) 2016-11-07 2019-09-11 Novo Nordisk As Esters à dchbs actif de composés peg et leur utilisation
HUE066356T2 (hu) 2017-08-24 2024-07-28 Novo Nordisk As GLP-1 készítmények és alkalmazásaik
KR102911883B1 (ko) 2018-10-11 2026-01-13 인타르시아 세라퓨틱스 인코포레이티드 인간 아밀린 유사체 폴리펩타이드 및 사용 방법
CN119455003A (zh) 2019-02-12 2025-02-18 Ambrx公司 包含抗体-tlr激动剂缀合物的组合物、方法和用途
CN113614101B (zh) 2019-02-22 2024-07-16 洛约拉马利蒙特大学 淀粉样肽的变体
EP3930757A1 (en) 2019-03-01 2022-01-05 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for protein delivery
MX2022005661A (es) 2019-11-11 2022-09-07 Boehringer Ingelheim Int Agonistas del receptor npy2.
PE20221575A1 (es) * 2020-02-18 2022-10-06 Novo Nordisk As Formulaciones farmaceuticas
UA130066C2 (uk) 2020-08-07 2025-10-29 Бьорінгер Інгельхайм Інтернаціональ Гмбх Розчинні агоністи рецепторів npy2
AU2021327396A1 (en) 2020-08-20 2023-03-23 Ambrx, Inc. Antibody-TLR agonist conjugates, methods and uses thereof
IL300620B2 (en) 2020-09-24 2025-12-01 Gubra As Ham15-52 analogues with improved amylin receptor (hamy3r) potency
TWI850611B (zh) 2020-12-18 2024-08-01 丹麥商諾佛 儂迪克股份有限公司 Glp-1及澱粉素受體之共促效劑
TW202400632A (zh) 2021-03-03 2024-01-01 美商美國禮來大藥廠 長效澱粉素受體促效劑及其用途
MX2023011480A (es) 2021-04-03 2023-12-06 Ambrx Inc Conjugados anticuerpo anti-her2-fármaco y usos de estos.
WO2022248419A2 (en) 2021-05-22 2022-12-01 Adocia Compositions comprising short-acting hormones for treating or preventing obesity and pumps comprising said composition
EP4144362A1 (en) 2021-09-06 2023-03-08 Adocia Compositions comprising short-acting hormones for treating or preventing obesity and pumps comprising said composition
EP4129324A1 (en) 2021-08-02 2023-02-08 Adocia Compositions comprising at least an amylin receptor agonist and a glp-1 receptor agonist
CA3237751A1 (en) 2021-11-10 2023-05-19 Tyler Brown Ionic liquid compositions
TWI876242B (zh) 2021-12-13 2025-03-11 丹麥商諾佛 儂迪克股份有限公司 包括環糊精的醫藥調配物
CN118973602A (zh) 2022-03-30 2024-11-15 诺和诺德股份有限公司 配制方法
EP4534553A1 (en) * 2022-05-27 2025-04-09 Hangzhou Sciwind Biosciences Co., Ltd. Human amylin analog, and derivative and use thereof
MX2024005969A (es) 2022-05-30 2024-06-11 Zealand Pharma As Formulaciones liquidas de analogos de amilina.
IL319599A (en) 2022-09-19 2025-05-01 Zealand Pharma As Combination therapy
KR20250127104A (ko) * 2022-12-22 2025-08-26 노보 노르디스크 에이/에스 아밀린 수용체 작용제
US12116388B2 (en) 2022-12-22 2024-10-15 Novo Nordisk A/S Amylin receptor agonists
WO2024164776A1 (zh) * 2023-02-10 2024-08-15 杭州先为达生物科技股份有限公司 多肽及其衍生物、组合物及其应用
TW202500183A (zh) 2023-06-15 2025-01-01 丹麥商諾佛 儂迪克股份有限公司 包括環糊精的醫藥調配物
TW202504913A (zh) 2023-06-21 2025-02-01 丹麥商西蘭製藥公司 減重
EP4731239A1 (en) 2023-06-21 2026-04-29 Zealand Pharma A/S Analogues with improved properties
KR20260032481A (ko) 2023-06-30 2026-03-09 질랜드 파마 에이/에스 병용 요법
WO2025114501A1 (en) 2023-11-30 2025-06-05 Novo Nordisk A/S Tri-agonists of the glp-1, gip, and amylin receptors
WO2025160082A1 (en) * 2024-01-23 2025-07-31 Viking Therapeutics, Inc. Amylin analogs
TW202545982A (zh) * 2024-02-07 2025-12-01 大陸商江蘇恆瑞醫藥股份有限公司 胰島澱粉樣多肽類似物及其醫藥用途
WO2025172606A1 (en) 2024-02-16 2025-08-21 Adocia Composition comprising semaglutide, cagrilintide and a co-polyamino acid bearing carboxylate charges and hydrophobic radicals
EP4721760A1 (en) 2024-10-07 2026-04-08 Adocia Composition comprising a peptide having an isoelectric point of less than 6.5 and a co-polyamino acid bearing carboxylate charges and hydrophobic radicals
EP4603079A1 (en) 2024-02-16 2025-08-20 Adocia Composition comprising a peptide having an isoelectric point of less than 6.5 and a co-polyamino acid bearing carboxylate charges and hydrophobic radicals
EP4603080A1 (en) 2024-02-16 2025-08-20 Adocia Composition comprising semaglutide, cagrilintide and a co-polyamino acid bearing carboxylate charges and hydrophobic radicals
EP4684802A1 (en) 2024-07-23 2026-01-28 Adocia Composition comprising a peptide having an isoelectric point of less than 6.5 and a co-polyamino acid bearing carboxylate charges and hydrophobic radicals
WO2025172605A1 (en) 2024-02-16 2025-08-21 Adocia Composition comprising a peptide having an isoelectric point of less than 6.5 and a co-polyamino acid bearing carboxylate charges and hydrophobic radicals
EP4684801A1 (en) 2024-07-23 2026-01-28 Adocia Composition comprising semaglutide, cagrilintide and a co-polyamino acid bearing carboxylate charges and hydrophobic radicals
EP4721761A1 (en) 2024-10-07 2026-04-08 Adocia Composition comprising semaglutide, cagrilintide and a co-polyamino acid bearing carboxylate charges and hydrophobic radicals

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ZA936811B (en) * 1992-10-28 1995-03-15 Upjohn Co Somatotropin modifications
US6410511B2 (en) 1997-01-08 2002-06-25 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Formulations for amylin agonist peptides
EP1053001B1 (en) 1998-02-13 2010-12-15 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Novel mixed amylin activity compounds
WO1999057147A1 (fr) * 1998-04-30 1999-11-11 Kirin Brewery Company, Limited Mutants de la thrombopoietine humaine
AU4930299A (en) * 1998-07-31 2000-02-21 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Remedies for neuropathy containing as the active ingredient galectin-1 or its derivatives
US7772188B2 (en) * 2003-01-28 2010-08-10 Ironwood Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the treatment of gastrointestinal disorders
WO2005097825A2 (en) * 2004-03-31 2005-10-20 Xencor, Inc. Bmp-7 variants with improved properties
JP5252435B2 (ja) * 2006-03-15 2013-07-31 ノボ・ノルデイスク・エー／エス アミリン誘導体
CN101578102B (zh) * 2007-01-05 2013-07-17 印第安纳大学研究及科技有限公司 在生理性pH缓冲液中显示增强的溶解性的胰高血糖素类似物
EP2036923A1 (en) * 2007-09-11 2009-03-18 Novo Nordisk A/S Improved derivates of amylin
CN102076353A (zh) 2008-06-25 2011-05-25 诺沃-诺迪斯克有限公司 胰岛淀粉样多肽和鲑鱼降钙素的衍生杂合肽
WO2010046357A1 (en) 2008-10-21 2010-04-29 Novo Nordisk A/S Amylin derivatives
EP2504355B1 (en) 2009-11-25 2015-07-22 Novo Nordisk A/S Method for making polypeptides
KR102066987B1 (ko) 2011-06-10 2020-01-16 노보 노르디스크 에이/에스 폴리펩티드

Also Published As

Publication number Publication date
ZA201309174B (en) 2022-08-31
CA2838884C (en) 2022-11-29
CN103596972A (zh) 2014-02-19
KR102066987B1 (ko) 2020-01-16
EP2718316B1 (en) 2019-12-04
EP2718315B1 (en) 2017-12-27
US9029325B2 (en) 2015-05-12
RU2013156937A (ru) 2015-07-20
US20130059770A1 (en) 2013-03-07
WO2012168431A3 (en) 2013-01-31
JP2014519510A (ja) 2014-08-14
JP6121992B2 (ja) 2017-04-26
EP2718316A1 (en) 2014-04-16
EP2718314A2 (en) 2014-04-16
RU2669999C2 (ru) 2018-10-17
US8575090B2 (en) 2013-11-05
MX2013013913A (es) 2013-12-16
BR112013031268B1 (pt) 2020-05-12
WO2012168430A3 (en) 2013-01-31
BR112013031268A8 (pt) 2018-01-16
KR20140043764A (ko) 2014-04-10
CN103596972B (zh) 2018-03-20
US20140018286A1 (en) 2014-01-16
CA2838884A1 (en) 2012-12-13
MX341324B (es) 2016-08-16
AU2012266269B2 (en) 2017-04-06
JP2014519511A (ja) 2014-08-14
AU2012266269A1 (en) 2013-11-21
EP2718315A2 (en) 2014-04-16
IL229258B (en) 2019-11-28
ES2664509T3 (es) 2018-04-19
WO2012168432A1 (en) 2012-12-13
US20130005646A1 (en) 2013-01-03
CN103649115B (zh) 2016-01-20
CN103649115A (zh) 2014-03-19
US8722849B2 (en) 2014-05-13
PL2718316T3 (pl) 2020-06-29
US20130012427A1 (en) 2013-01-10
WO2012168430A2 (en) 2012-12-13
IL229258A0 (en) 2014-01-30
SI2718316T1 (sl) 2020-03-31
CN103596973A (zh) 2014-02-19
JP6247205B2 (ja) 2017-12-13
US8741836B2 (en) 2014-06-03
JP2014519509A (ja) 2014-08-14
MY161773A (en) 2017-05-15
BR112013031268A2 (pt) 2016-11-22
WO2012168431A2 (en) 2012-12-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102066987B1 (ko) 폴리펩티드
JP5703226B2 (ja) アミリン誘導体
JP6227629B2 (ja) ヒトアミリン類似体
TW201315477A (zh) 多胜肽