RS60075B1 - Postupak za kvantifikaciju pd-l1 - Google Patents

Description

Opis

OBLAST TEHNIKE

[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na visoko senzitivno, specifično i reprodukujuće RT-qPCR ispitivanje u stvarnom vremenu za kvantifikaciju PD-L1 ekspresije u RNK uzorku, kao što je izolovani RNK uzorak iz cirkulišućih ćelija tumora (CTC) u perifernoj krvi pacijenata sa čvrstim kancerima.

POZADINA PRONALASKA

[0002] Otkriće ključnih molekulskih puteva koji promovišu rast tumora i održavanje zajedno sa razvojem lekova koji specifično inhibiraju ove puteve se dosta promenilo tokom višegodišnjeg ograničenog broja opcija za lečenje mnogih tipova kancera. Obećanje oblasti u nastajanju personalizovane medicine, će se sve više upotrebljavati za izradu terapeutskih preparata za definisane podpopulacije, i vremenom, pojedinačne pacijente kako bi se pojačala efikasnost i na minimum svela neželjena dejstva. Međutim, uspeh personalizovane medicine zavisi od tačnih, reprodukujućih i klinički korisnih pratećih dijagnostičkih ispitivanja kako bi se identifikovali pacijenti koji mogu da imaju koristi od ciljnih terapija. Prema ovom konceptu, najnoviji plan je uspešan zajednički razvoj selektivnog inhibitora prve klase onkogenske BRAF kinaze, vemurafeniba (ZELBORAF), koji cilja samo mutantni BRAF protein, koji je detektovan kao V600E pozitivan putem odobrenog pratećeg dijagnostičkog testa, Cobas 4800 BRAF V600 mutacioni test (Roche Molecular Diagnostics).

[0003] Uprkos novom razvoju ciljnih terapija kod mnogih tipova kancera, mnogi pacijenti nemaju koristi od ovih terapija. Ova činjenica je dovela do poboljšanog razumevanja mehanizama zaštitnog antitumorskog imuniteta i razvoja efikasnijih imunoterapija koje povećavaju preživljavanje pacijenata čime se potvrđuje dugogodišnja ideja da imunitet igra važnu ulogu u patogenezi kancera. Imunoterpaija je tip lečenja kancera koji je osmišljen da ojača prirodne odbrambene sposobnosti organizma radi borbe sa kancerom. Koristi materijale koje pravi ili telo ili se prave u laboratoriji kako bi se poboljšala, ciljala ili povratila funkcija imunog sistema. Sada je kroz intenzivne istraživačke napore očigledno da ćelije kancera mogu da razviju specifične mehanizme kako bi se izbegao imunološki nadzor. Jedan od ovih mehanizama je da se imunom sistemu predstavi tako da on ne uspe da ga prepozna kao nešto što bi trebalo da bude ubijeno. Drugi mehanizam je mešanje sa mogućnostima T-ćelija, čija je dužnost da izvode takva ubijanja i koje, budući da su u telu prisutne decenijama, obezbeđuju trajan imunitet na datu bolest. Poslednje, postoji mnogo načina u kojima imuni sistem kao celina može biti suzbijen.

[0004] Humane kancere karakterišu visoke učestalosti genetskih i epigenetskih izmena, koje stvaraju neo-antigene koje imuni sistem potencijalno prepoznaje. Mogućnost imunog sistema da razlikuje svoje normalne ćelije od tumorskih i da napadne strane napadače kao što su virusi obezbeđuje osnovu za brzo i specifično čišćenje većine infekcija. Imuni sistem može da detektuje i eliminiše većinu tumora, koji su u ranom stadijumu i ne mogu klinički da se detektuju pomoću koncepta imunološkog uređivanja kancera. Međutim, ćelije kancera koriste "ćelijsku kamuflažu" kako bi zavarale imuni sistem da misli da su one normalne ćelije; kao rezultat neki tumori nisu u potpunosti uništeni i beže iz imunološkog nadzora. Osnovna prepreka imunoterapeutskim pristupima je ta što je većina mehanizama aktivna na mestu tumora, koji dejstvuju zajedno da bi se efikasno balansirao anti-tumorski imunitet.

[0005] Uprkos činjenici da je endogeni imuni odgovor na kancer primećen kod pacijenata, čini se da ovaj odgovor nije efikasan, a utvrđene kancere toleriše imuni sistem. U prilog ovom stanju tolerancije, tumori mogu da iskorišćavaju nekoliko različitih mehanizama kako bi se aktivno suzbio imuni odgovor domaćina. Među ovim mehanizmima, endogene „imune kontrolne tačke“ koje normalno prekidaju imune odgovore radi ublažavanja oštećenja kolateralnog tkiva mogu biti izabrane od strane tumora da bi se izbeglo uništavanje imunog sistema. U novije vreme, razvijeni su mnogi specifični inhibitori puta imunih kontrolnih tačaka i odobreni od strane FDA da bi se obezbedili novi imunoterapeutski pristupi za lečenje kancera, uključujući razvoj anti-CTLA-4 antitela (Ab), ipilimumaba (Yervoy), za lečenje pacijenata sa uznapredovalim melanomom i anti-PD-L1 antitelo, nivolumab (Opdivo), za lečenje pacijenata sa uznapredovalim kancerom pluća nemalih pločastih ćelija (NSCLC) koji je uznapredovao ili nakon hemoterapije na bazi platine.

[0006] Programirana smrt 1 (PD-1) predstavlja imuni inhibitorni receptor eksprimiran na nekoliko imunih ćelija, određenije citotoksičnih T ćelija. Ovaj receptor stupa u interakciju sa dva liganda, ligandom programirane smrti 1 (PD-L1) (B7-H1, CD274) i PD-L2 (B7-DC). PD-1 ima veći afinitet za PD-L1, koji je u velikoj meri eksprimiran na ćelijama tumora, kao i drugim imunim ćelijama, dok je PD-L2 primarno eksprimiran na makrofagovima i dendritičnim ćelijama [Keir M, Butte M, Freeman G, Sharpe A. PD-1 and its ligands in tolerance and immunity. Annu Rev Immunol 2008;26: 677-704]. Kada se PD-1 vezuje za ćelije tumora koje eksprimiraju PD-L1, aktivnost T-ćelija i proizvodnja citokina su suzbijene, što dovodi do iscrpljenja T-ćelija. PD-L1 ligacija sa PD-1 tokom infekcije ili zapaljenja kod normalnih tkiva je kritički važna u održavanju homeostaze imunog odgovora da bi se sprečio autoimunitet. PD-1/PD-L1 interakcija u tumorskom mikro-okruženju, međutim, obezbeđuje imuni beg za tumorske ćelije gašenjem citotoksičnih T ćelija. Stoga blokiranjem ove interakcije, očekuje se da će tumorske ćelije da napadnu citotoksične T ćelije. Aktivacija PD-1/PD-L1 puta štiti tumorske ćelije od imunoloških odgovora posredovanih T-ćelijama. Inhibicija PD-1/PD-L1 puta poništava imuno izbegavanje nadopunjavanjem mnoštva aktiviranih neiscrpljenih T-ćelija. Razvoj i kliničko ispitivanje antitela koja blokiraju imuni sistem su, do sada, doveli do kliničke aktivnosti kod različitih maligniteta uključujući melanom i kancer pluća [Callahan MK, Wolchok JD. At the bedside: CTLA-4 and PD-1-blocking antibodies in cancer immunotherapy. J Leukoc Biol.2013;94:41-53].

[0007] Nedavno su, Larkin et al., predstavili randomiziranu, dvostruko slepu, 3. fazu studije, u kojoj su nivolumab (anti-PD-1 antitelo) kao monoterapija ili u kombinaciji sa nivolumabom plus ipilimumabom (anti-CTLA-4 antitelo) poređeni sa samim ipilmumabom kod pacijenata sa metastatskim melanomom. Srednja vrednost preživljavanja bez napretka je duža sa nivolumabom plus ipilimumabom, u poređenju sa ipilimumabom ili nivolumabom kao monoterapijom. Međutim, kod pacijenata sa PD-L1-pozitivnim tumorima, srednja vrednost preživljavanja bez napredovanja (PFS) je 14.0 meseci u grupi nivolumabplus-ipilimumab i u nivolumab grupi, ali kod pacijenata sa PD-L1-negativnim tumorima, PFS je bila duža sa kombinovanom terapijom nego kod samog nivolumaba. Iz ovih rezultata je postalo jasno da ekspresija PD-L1 predstavlja značajan predvidljiv biološki marker u anti-PD-Ll lečenjima. Stoga je potreba za razvijanjem novog pratećeg dijagnostičkog testa za detektovanje PD-L1 pozitivnih ili negativnih tumora, u porastu [Larkin J, Chiarion-Sileni V, Gonzalez R, Grob JJ, Cowey CL, Lao CD, et al. Combined Nivolumab and Ipilimumab or Monotherapy in Untreated Melanom. N Engl J Med.2015;373: 23-34].

[0008] US2007/0231264 A1 obezbeđuje kompozicije, postupke i komplete povezane sa proteinima koji funkcionišu u kontrolisanju biologije i fiziologije ćelija sisara, uključujući ćelije imunog sistema sisara. WO2014/151006 A2 otkriva biološke markere za izbor pacijenata i prognozu kod kancera, kao i postupke korišćenja upotrebe antagonista PD-L1/PD-1 puta. Geng H et al., International Journal of Cancer, vol. 118, no.11, 1 June 2006, pages 2657-2664 opisuje umešanost B7-H1 u izbegavanje tumora u postupku imunoterpaije sa HSP70 vakcinom, čime se ukazuje na obećavajuću strategiju lečenja kancera. Wu Y et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, vol.392, no.4, 19 February 2010, pages 510-515 otkrivaju da bi prekomerna ekspresija Dlk (humani DAPk poput kinaze) mogla da sintetiše ćelije u apoptozu dok je prekomerna ekspresija neaktivnog mutanta kinaze mogla da spase smrt apoptotičnih ćelija, što ide u prilog tome da rekonstitucija ekspresije Dlk može da dovede do potencijalnog terapeutskog pristupa karcinomu grlića materice.

[0009] U poslednje vreme, pristup "tečne biopsije" ima visoki potencijal da značajno promeni terapeutsku strategiju kod pacijenata koji pate od mnogih tipova kancera. Detekcija, brojanje i molekulska karakterizacija cirkulišućih ćelija tumora (CTCs), cirkulišuće tumorske DNK bez ćelija (ctDNK) i cirkulišućih mikroRNK (miRNK) obezbeđuju izuzetno moćan i neinvazivan izvor bioloških markera baziranih na krvi za individualno molekulsko profilisanje svakog pacijenta u stvarnom vremenu, i posebno pre i posle lečenja. Primene tečne biopsije su bazirane na identifikaciji molekulskih meta, proceni prognoze, dijagnozi ponovnog javljanja/napredovanja, praćenju odgovora na terapiju i praćenju tumorskih genomskih profila u stvarnom vremenu. Najvažnije, čini se da ova ispitivanja bazirana na krvi predstavljaju priličan izazov i da su izuzetno važna u slučaju da biopsije tumora nisu pristupačne (kao što je u slučaju NSCLC). Štaviše ona mogu da ponude pomno praćenje bioloških markera u periodu nakon bolesti čime se omogućava efikasnost lečenja i potencijalno da poboljšaju opcije izbora lečenja.

[0010] U novije vreme, Mazel et al., upotrebom CellSearchTM sistema (Veridex, J&J), FDA-očišćene platforme za brojanje CTC-a, upotrebom anti-PD-Ll specifičnog antitela i četvrtog kanala za slikanje u CellSearch, su otkrili PD-L1 pozitivne CTC kod 11 od 16 (68.8%) pacijenata sa metastatskim kancerom dojke. Specifičnije, u njihovoj studiji, koristili su anti-humano B7-H1/PD-L1PE-konjugovano monoklonalno antitelo za PD-L1 ekspresiju, time ukazujući da bi ovo ispitivanje moglo da se koristi za tečnu biopsiju za praćenje i slojevitost pacijenata sa kancerom koji su blokirane imune kontrolne tačke [Mazel M, Jacot W, Klaus P, Bartkowiak K, Topart D, Cayrefourcq L et al. Frequent expression of PD-L1 on circulating breast cancer cells. Mol Oncol.2015, Article in press]. Štaviše, Oliveira-Costa et al., su otkrili jaku citoplazmatičnu ekspresiju PD-L1 u CTC-a kod karcinoma oralnih pločastih ćelija upotrebom imunofluorescencije i Nanostring-a [Oliveira-Costa JP, Fiorini de Carvalho A, Gobbi da Silveira G, Amaya P, Wu Y et al., Gene expression patterns through oral squamous cell carcinoma development: PD-L1 expression in primary tumor and circulating tumor cells. Oncotarget.2015;6: 20902-20].

[0011] Detekcija PD-L1 ekspresije u CTC-a kvantitativnim putem bi se mogla koristiti za praćenje efikasnosti kontrolnih tačaka imunih inihibitora kao pristup "tečne biopsije" i mogao bi da ponudi mnoge napretke u kliničkoj praksi. Stoga, iz ovog razloga, ultrasenzitivan i visoko specifičan postupak baziran na RT-qPCR za kvantifikaciju PD-L1 ekspresije u CTC-a je razvijen i validiran, pogodan za praćenje efikasnosti inhibitora kontrolnih tačaka u perifernoj krvi pacijenata sa kancerom. Ovo ispitivanje ima veoma visoku analitičku senzitivnost i specifičnost u cilju kvantifikovanja ekspresije PD-L1 u CTC-a, i visoko je senzitivno u poređenju sa drugim postupcima koji se koriste u tumorskim tkivima kao što je imunohistohemija. Štaviše, razvijeni postupak predstavlja molekulski dijagnostički test u zatvorenoj epruveti koji obuhvata jednostavan klinički alat visoke propusnosti, koji lako može da se automatizuje i da se koristi u većini molekulskih dijagnostičkih kliničkih laboratorija budući da ne zahteva skupe instrumenta, i lak je za upotrebu. Štaviše, razvijeni postupak je kvantitativan, i time omogućava ne samo prepoznavanje razlika u ekspresiji PD-L1 kod kliničkih uzoraka, već i podvrgavanje dnevnim ispitivanjima učinkovitosti kontrole kvaliteta (robusnost, reproduktivnost, preciznost u seriji i preciznost između serija) koja su veoma važna zbog akreditacije.

[0012] Prvi put je osmišljen novi postupak baziran na RT-qPCR sa novim specifično dizajniranim prajmerima i proba hidrolize za kvantifikaciju PD-L1 mRNK transkripata u humanom kliničkom uzorku posebno perifernoj krvi (CTC-e). Posebno za molekulsku karakterizaciju CTC-a, potrebne su visoko senzitivne, robusne i specifične metodologije. Ovde je obezbeđen dokaz da je ovo ispitivanje pogodno za selekciju pacijenata za imunoterapiju baziranu na primeni inhibitora kontrolne tačke, kao i za praćenje efikasnosti inhibitora kontrolne tačke u perifernoj krvi pacijenata sa kancerom.

KRATAK SADRŽAJ PRONALASKA

[0013] Predmet ovog pronalaska je da obezbedi poboljšan postupak za kvantifikovanje PD-L1 mRNK ekspresije u RNK uzorku kao što je izolovani RNK uzorak CTC-a u perifernoj krvi pacijenata sa čvrstim tumorima. Ovaj predmet se u potpunosti ili delimično postiže postupkom prema patentnom zahtevu 1. Načini ostvarivanja i dodatni detalji ovog pronalaska su dati u zavisnim zahtevima u prilogu, u crtežima i u listi sekvenci. Određenije, ovaj pronalazak se odnosi na in vitro postupak za kvantitativno određivanje ekspresije liganda programirane smrti 1 (PD-L1) u uzorku tečne biopsije cirkulišućih ćelija tumora (CTC), pri čemu pomenuti postupak obuhvata faze:

i. podvrgavanje uzorka reverznoj transkripciji upotrebom RNK prisutne u uzorku kao templat da bi se sintetisala odgovarajuća cDNK sekvenca,

ii. stvaranje reakcione mešavine koja obuhvata uzorak, reagense za amplifikaciju nukleinske kiseline, par ciljnih prajmera, ciljnu probu hidrolize, pri čemu su pomenuti par prajmera i ciljna proba hidrolize sposobni da hibridizuju sa PD-L1 mRNK, i pri čemu se pomenuti ciljni par sastoji od prednjeg ciljnog prajmera koji obuhvata sekvencu 5'-GCTGAATTGGTCATCCCAGAA-3' (SEQ ID NO: 4) i reverznog ciljnog prajmera koji obuhvata sekvencu 5'-TTTCACATCCATCATTCTCCCTT-3' (SEQ ID NO: 6)

iii. podvrgavanje reakcione mešavine uslovima amplifikacije optimizovanim tako da se stvori najmanje jedna kopija sekvence nukleinske kiseline komplementarna ciljnoj sekvenci, pri čemu ciljna sekvenca predstavlja mRNK transkript PD-L1 mRNK sekvence (SEQ ID NO: 1), i

iv. određivanje količine PD-L1 mRNK u pomenutom uzorku,

v. normalizovanje ekspresije PD-L1 u odnosu na ekspresiju referentnog gena, čiji nivoi ekspresije ostaju konstantni između različitih tipova ćelija i

vi. poređenje količine PD-L1 mRNK eksprimirane u pomenutom uzorku sa pozitivnom kontrolom koja predstavlja uzorak koji obuhvata PD-L1 mRNK i negativnom kontrolom koja predstavlja uzorak bez obuhvatanja PD-L1 mRNK da bi se procenila prekomerna ekspresija PD-L1 mRNK sekvence.

[0014] Postupak je baziran na kvantitativnom određivanju PD-L1 mRNK ekspresije u uzorku. Ovo ispitivanje može da obuhvati nizvodnu analizu PD-L1 mRNK ekspresije u RNK uzorku, kao što je izolovani RNK uzorak CTC-a u perifernoj krvi pacijenata sa čvrstim kancerima.

[0015] Faza izolacije CTC-a bi mogla da se izvede primenom postupaka poznatih stručnjaku, kao što je npr. različita mikrofluidizacija i filtracija uređajima za veličinu, centrifugiranje gradijenta gustine, pozitivna i negativna imunomagnetna selekcija, CellSearchTM uređaj, sistemi za analizu jedne ćelije, ili in-vivo CTC sistemi za izolaciju kao što je sistem za sakupljanje ćelija (Gilupi, GmbH) ili sistemi leukafereze. Trebalo bi imati u vidu da CTC izolacija nije ograničena na navedene postupke.

[0016] Određenije, ciljna sekvenca u ovde opisanom postupku predstavlja mRNK-transkript PD-L1 gena, koji je deriviran nakon reverzne transkripcije RNK prisutne u uzorku upotrebom komercijalno dostupnog cDNK kompleta.

[0017] Kvantifikacija PD-L1 mRNK ekspresije može biti korišćena kod mnogih tipova kancera kao što je kancer dojke, urotelijalni, kolorektalni, oezofagealni, gastrični, hepatocelularni karcinom, kancer pluća, melanom, orofaringealni karcinom pločastih ćelija, nazofaringealni, multipli mijelom, karcinom bubrežnih ćelija, kancer grlića materice, glioblastom, maligni mezoteliomi, limfomi, kancer jajnika i pankreasa. Poželjno, kvantifikacija PD-L1 mRNK ekspresije može da se koristi kod bilo kog tipa maligne neoplastične bolesti da bi se kvantifikovala ekspresija PD-L1 mRNK.

[0018] Postupak prema ovom pronalasku amplifikuje specifično samo PD-L1 mRNK sekvencu, pri čemu se izbegava amplifikacija genomske DNK. Postupak obuhvata RT-qPCR, upotrebom para ciljnih prajmera, koji obuhvata najmanje jedno mesto koje zauzima intron, i ciljnu proba hidrolize. Poželjno mesto koje zauzima intron može da obuhvati samo jednu bazu ili na bilo kom mestu introna što dovodi do toga da se ciljni prajmeri vezuju samo za sekvencu bez introna u zadatim uslovima. Postupak koristi par ciljnih prajmera koji se samo vezuje za sekvencu u kojoj su introni izrezani, npr. mRNK, cDNK. Štaviše, ciljna proba hidrolize je deo amplifikacione reakcione mešavine i hibridizuje sa novo sintetisanom ciljnom sekvencom u odabranim uslovima, pod uslovom da je ciljna sekvenca prisutna u ispitivanom uzorku.

[0019] Prema ovom pronalasku glavna karakteristika para ciljnih prajmera je ta što obuhvata najmanje jedno mesto koje zauzima intron. Ovo obezbeđuje par ciljnih prajmera koji se samo vezuje za sekvencu u kojoj su introni izrezani, npr. mRNK, cDNK. Trebalo bi razumeti da pomenuto "rezanje" može da se javi prirodno tj. da obezbedi za detekciju mRNK u biološkom uzorku. Međutim, ovaj izraz takođe obuhvata konstruisanu sekvencu sa intronima "izrezanim" iz sekvence, npr. cDNK. Mesto koje zauzima intron može da obuhvata jednu bazu na bilo kom mestu introna pod uslovom da se ciljni prajmer vezuje jedino za sekvencu bez introna u datim uslovima. Jedan ili oba, prednji i reverzni ciljni prajmeri mogu da obuhvate jedno ili više mesta koje zauzima intron(i). U poželjnom načinu ostvarivanja oba ciljna prajmera obuhvataju mesto koje zauzima intron.

[0020] Određenije, prednji ciljni prajmer predstavlja prajmer koji je produžen u istom smeru kao kodirajući lanac ciljne nukleinske kiseline. Prednji ciljni prajmer je osmišljen tako da hibridizuje između eksona 4 i 5 PD-L1 mRNK sekvence kako bi se pojačala samo mRNK ciljna sekvenca pri čemu se izbegava DNK genomska amplifikacija. Prednji ciljni prajmer je komplementaran sa 3'-krajem. Nasuprot tome, reverzni ciljni prajmer predstavlja prajmer koji je produžen u istom smeru kao nekodirajući lanac ciljne nukleinske kiseline. Reverzni ciljni prajmer je dizajniran tako da hibridizuje između eksona 5 i 6 PD-L1 mRNK sekvence radi amplifikacije samo ciljne sekvence pri tom izbegavajući nespecifične proizvode. Posledično, ciljni prajmeri su u ravni sa njihovim 3'-krajevima koji su jedan naspram drugog.

[0021] Određenije, "par ciljnih prajmera", koji se koristi u postupku, može da se hibridizuje sa sekvencom PD-L1 mRNK.

[0022] Određenije ciljna sekvenca predstavlja mRNK-transkript PD-L1 mRNK sekvence (SEQ ID NO: 1). Trebalo bi imati u vidu da DNK sekvenca za PD-L1 (SEQ ID NO: 1) navedena u priloženoj listi sekvenci odgovara transkribovanoj mRNK sekvenci pomenutog proteina. Prednji ciljni prajmer uključuje sekvencu 5'-GCTGAATTGGTCATCCCAGAA-3' (SEQ ID NO: 4). Reverzni ciljni prajmer uključuje sekvencu 5'-TTTCACATCCATCATTCTCCCTT-3' (SEQ ID NO: 6). Pronalazak dalje otkriva sekvence specifičnih proba, kao što su ciljne probe hibridizacije, probe hidrolize (TaqMan) ili molekulske Beacon, ili SCORPION tip probe, za detekciju/kvantifikaciju amplifikacije PCR proizvoda. Dalje, proba može da se koristi kako bi se osigurala specifičnost. Pomenuta proba predstavlja cljnu probu hidrolize. Poželjno ciljna proba hidrolize bi trebalo da uključuje najmanje sekvencu 5'-GCACATCCTCCA-3' (SEQ ID NO: 7), poželjnije ciljna proba hidrolize uključuje sekvencu 5'-6FAM-ACCTCTGGCACATCCTCCAAATGAAAG-BBQ-3' (SEQ ID NO: 8) i dve fluorescentne čestice. Probe su poželjno označene. Oznaka može ili da se detektuje zbog fluorofora prajmera, hemilimunifora, florescentnih čestica i njima sličnih ili da se indirektno detektuje specifično vezujućim partnerima i nukleinskim kiselinama. Poželjne oznake se direktno detektuju, a naročito poželjne oznake su fluoresncente boje, kao što je SYBR Zelena I, FAM, HEX, VIC, fluorescein LC Crvena 610, LC Crvena640, LC Crvena670, LC Crvena 705, i druge fluorescentne boje poznate u tehnici.

[0023] Određenije, ciljna proba hidrolize je dizajnirana da hibridizuje sa unutrašnjim regionom sa amplikonom. Posebno, ciljna proba hidrolize koja se koristi u ovom postupku je dizajnirana da hibridizuje sa unutrašnjim regionom eksona 5 PD-L1 mRNK sekvence. Obično je 20-30 bp oligonukleotid sa fluorescentnom reporterskom bojom (tj.6-fluorescein, FAM) kovalentno pričvršćen za 5' kraj i fluorescentna boja za gašenje (tj. BlackBerry Sredstvo za gašenje, BBQ). Boja za gašenje koja se nalazi u blizini smanjuje intenzitet emisije reporterske boje. Proba hidrolize je dodata direktno u PCR mešavinu, a uslovi su bukvalno identični onima koji su ustanovljeni za standardnu PCR. Tokom faze proširivanja PCR ciklusa, Taq DNK polimeraza cepa probu hidrolize samo kada se hibridizuje sa metom, razdvajajući reportersku boju od boje za gašenje. Povećanje intenziteta fluorescencije na 518 nm (kada je FAM reporterska boja) (usled otpuštanja efekta gašenja na reporter) je rezultat probe hidrolize i kvantitativno je za početnu količinu templata. Intenzitet fluorescencije specifično reporterske boje raste zbog nedostatka bliskosti sa bojom za gašenje. Ponovljeni ciklusi denaturacije, kaljenja i proširivanja dovode do eksponencijalne amplifikacije PCR proizvoda i intenziteta fluorescencije.

[0024] U drugom aspektu, faza (v) postupka može dalje da obuhvati par referentnih prajmera koji hibridizuje sa referentnom mRNK sekvencom referentnog gena kako bi se obezbedilo da je materijal koji može da se amplifikuje, prisutan u uzorcima za ispitivanje kako bi se izbegli lažni negativni rezultati.

[0025] Referentni gen idealno bi trebalo da bude stabilan, da se eksprimira u ćelijama i tkivima od značaja koji ne ispoljavaju promene u eksperimentalnim uslovima ili stanju bolesti. Ovi geni se koriste da normalizuju mRNK nivoe gena od značaja pre poređenja između različitih uzoraka primenom RT-qPCR. Ovi referentni geni su odgovorni za merenje i smanjenje grešaka iz varijacija među uzorcima, ekstrakciju i kvalitet RNK i efikasnost u sintezi cDNK, unutrašnje kontrole i različite eksperimentalne uzorke kao kod normalnih ćelija ili tumorskog tkiva. U RT-qPCR postupku, odgovarajući referentni gen bi trebalo da se smatra tačnom kvantifikacijom mRNK ekspresije zato što je ciklus kvantifikacije (CQ) ciljnih gena poređen sa CQreferentnog gena. Nivoi ekspresije referentnog gena bi trebalo da ostanu konstanti između različitih tipova ćelija; drugačije normalizacija do različite unutrašnje reference može da dovede do povećanja grešaka. Nekoliko gena je korišćeno kao referentni geni, uključujući hipoksantin fosforibozil transferazu (HPRT), β2-mikroglobulin (B2M), gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenazu (GAPDH) i β-aktin (ACTB), 18S ribozomalnu RNK (18S rRNK), 28S ribozomalnu RNK (28S rRNK), α-tubulin (TUBA), albumin (ALB), ribozomalni protein L32 (RPL32), vezujući protein TATA sekvence (TBP), ciklofilin C (CYCC), Efaktor izduživanja 1α (EF1A), RNK polimerazu II (RPII) [Suzuki T, Higgins PJ, Crawford DR. Control selection for RNA quantitation. Biotechniques, 2000; 29:332-7].

[0026] U poželjnom načinu ostvarivanja, B2M koji se koristi kao referentni gen u ovom pronalasku, i poželjno pomenuti par referentnih prajmera je dizajniran tako da hibridizuje sa B2M (Beta-2-Mikroglobulin) mRNK sekvencom (SEQ ID NO: 2).

[0027] Stoga, u drugom aspektu ovog pronalaska obezbeđen je par referentnih prajmera B2M mRNK sekvence (SEQ ID NO: 2). Trebalo bi imati u vidu da DNK sekvenca B2M (SEQ ID NO: 2) navedena u priloženoj listi sekvenci odgovara transkribovanoj mRNK sekvenci pomenutog proteina. U poželjnom načinu ostvarivanja prednji referentni prajmer bi trebalo da uključuje najmanje sekvencu 5'-GCCGTGTGAAC-3' (SEQ ID NO: 9), poželjnije prednji referentni prajmer uključuje sekvenca 5'-GCCTGCCGTGTGAACCATGT-3' (SEQ ID NO: 10). U poželjnom načinu ostvarivanja reverzni referentni prajmer bi trebalo da uključuje najmanje sekvencu 5'-CTTCAAACCTC-3' (SEQ ID NO: 11), poželjnije reverzni referentni prajmer uključuje sekvencu 5'-AAATGCGGCATCTTCAAACCTC-3' (SEQ ID NO: 12).

[0028] U kontekstu ovog pronalaska "referentni par prajmera" i "par ciljnih prajmera" nisu isti. U kontekstu ovog pronalaska predviđeno je da izraz "referentni par prajmera" označava par prajmera, koji je sposoban da hibridizuje sa genskom sekvencom, koja je sveprisutna u datoj ćeliji. Određenije, "referentni par prajmera", koji se koristi u postupku, je sposoban da hibridizuje sa sekvencom

B2M mRNK sekvence. Drugim rečima, "referentni par prajmera" može da se koristi kao unutrašnja kontrola u postupku ili kompletu prema ovom pronalasku.

[0029] Kod RT-qPCR u stvarnom vremenu, proba hibridizacija za kvantifikaciju B2M ekspresije može da se koristi kako je prethodno opisano u odnosu na PD-L1 par prajmera. U poželjnom načinu ostvarivanja referentna proba hidrolize bi trebalo da uključuje najmanje sekvencu 5'-CTCGATCCCAC-3' (SEQ ID NO: 13), poželjnije ciljna proba hidrolize uključuje sekvencu 5'-6FAM-CATGATGCTGCTTACATGTCTCGATCCCAC-BBQ-3' (SEQ ID NO: 14) i dve fluorescentne čestice.

[0030] U daljem aspektu, ovaj dokument se takođe odnosi na postupak za:

i. dijagnostikovanje i/ili prognoziranje maligne neoplastične bolesti kod subjekta pre imunoterapije inhibitorima kontrolne tačke, i/ili

ii. predviđanje efikasnosti lečenja maligne neoplastične bolesti kod subjekta pre imunoterapije inhibitorima kontrolne tačke, i/ili

iii. ocenjivanje ishoda lečenja maligne neoplastične bolesti kod subjekta tokom i posle imunoterapije inhibitorima kontrolne tačke, i/ili

iv. ocenjivanje ponovnog javljanja maligne neoplastične bolesti kod subjekta tokom i posle imunoterapije inhibitorima kontrolne tačke,

pri čemu pomenuti postupak obuhvata kvantifikaciju PD-L1 mRNK u uzorku prema fazama za in vitro postupak kako je ovde opisano,

pri čemu je subjekat ljudsko biće, koje ima malignu neoplastičnu bolest,

pri čemu inhibitori kontrolnih tačaka mogu da obuhvate inhibitore blokade imunih kontrolnih tačaka, kao što su anti-PD-Ll inhibitori.

[0031] In vitro postupak kako je ovde opisano poželjno može da se koristi za određivanje količine PD-L1 mRNK u uzorku za:

i. dijagnostikovanje i/ili prognoziranje maligne neoplastične bolesti kod subjekta pre imunoterapije inhibitorima kontrolne tačke, i/ili

ii. predviđanje efikasnosti lečenja maligne neoplastične bolesti kod subjekta pre imunoterapije inhibitorima kontrolne tačke, i/ili

iii. ocenjivanje ishoda lečenja maligne neoplastične bolesti kod subjekta tokom i posle imunoterapije inhibitorima kontrolne tačke, i/ili

iv. ocenjivanje ponovnog javljanja maligne neoplastične bolesti kod subjekta tokom i posle imunoterapije inhibitorima kontrolne tačke,

pri čemu analizirani uzorak može biti biološki uzorak, a pomenuti biološki uzorak može biti dobijen od subjekta. Poželjno, subjekat je sisar kao što je ljudsko biće, koje ima malignu neoplastičnu bolest.

[0032] Maligna neoplastična bolest može biti izabrana iz grupe koju čine kancer dojke, urotelijalni, kolorektalni, oezofagealni, gastrični, hepatocelularni karcinom, kancer pluća, nazofaringealni, multipli mijelom, karcinom bubrežnih ćelija, limfomi, melanom, orofaringealni karcinom pločastih ćelija, kancer grlića materice, glioblastom, maligni mezoteliomi, kancer jajnika i pankreasa.

[0033] In vitro postupak kako je ovde opisano se poželjno koristi kada subjekat ima kancer dojke i kancer pluća ne-malih ćelija.

[0034] Prilikom dijagnostikovanja i/ili prognoziranja maligne neoplastične bolesti kod subjekta pre imunoterapije inhibitorima kontrolne tačke, postupak obuhvata faze:

a) izvođenje in vitro postupka za kvantifikaciju PD-L1 mRNK u uzorku kako je ovde opisano, b) određivanje količine PD-L1 mRNK u pomenutom uzorku,

c) normalizovanje ekspresije PD-L1 u odnosu na B2M ekspresiju, koji se koristi kao referentni gen, d) poređenje količine PD-L1 mRNK detektovane u pomenutom uzorku sa pozitivnom kontrolom i negativnom kontrolom da bi se procenila prekomerna ekspresija PD-L1, čime se dobijaju prognostičke informacije.

[0035] Uzorak je poželjno dobijen od subjekta koji ima malignu neoplastičnu bolest kome nije prepisana imunoterapija inhibitorima kontrolne tačke. U daljim načinima ostvarivanja, pozitivna kontrola obuhvata mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) od zdravih kontrolnih uzoraka budući da se PBMC eksprimiraju kao i PD-L1 na veoma niskim nivoima.

[0036] Stoga, indikacija prognostičkih informacija je relativna promena u količini mRNK PD-L1 u pomenutom uzorku koja se identifikuje pre imunoterapije inhibitorima kontrolnih tačaka i može da proceni rizik budućih ishoda kod pojedinca na osnovu kliničkih i nekliničkih karakteristika. Određenije, postupak određivanja prognoze kako se ovde upotrebljava se odnosi na predviđanje ishoda ili budućnosti subjekta, naravno. Prognoza uključuje predviđanje preživljavanja pacijenta. Štaviše, prognoza može biti korišćena da se predvidi vreme preživljavanja pojedinca bez bolesti, vreme preživljavanja bez napretka, specifično vreme preživljavanja bolesti, stopu preživljavanja, ili vreme preživljavanja. Prognostičko ispitivanje može biti preduzeto sa (npr. u isto vreme kad i) dijagnozom prethodno nedijagnostikovanog stanja kancera, ili može biti povezano sa postojećim (prethodno dijagnostikovanim) stanjem.

[0037] Prilikom predviđanje efikasnosti lečenja maligne neoplastične bolesti kod subjekta pre imunoterapije inhibitorima kontrolne tačke, postupak obuhvata faze:

a) izvođenje in vitro postupka za kvantifikaciju PD-L1 mRNK u uzorku kako je ovde opisano, b) određivanje količine PD-L1 mRNK u pomenutom uzorku,

c) normalizovanje ekspresije PD-L1 u odnosu na B2M ekspresiju, koji se koristi kao referentni gen, d) poređenje količine PD-L1 mRNK detektovane u pomenutom uzorku sa pozitivnom i negativnom kontrolom da bi se procenila prekomerna ekspresija PD-L1, čime se predviđa efikasnost lečenja maligne neoplastične bolesti kod subjekta.

[0038] Uzorak je poželjno dobijen od subjekta koji ima malignu neoplastičnu bolest i kome kao imunoterpaija nisu davani inhibitori kontrolne tačke. Stoga, predviđanje je povezano sa količinama prekomerne ekspresije PD-L1 mRNK u pomenutom uzorku koje su identifikovane pre primanja imunoterapije inhibitorima kontrolne tačke, kao što su anti-PD-Ll inhibitori i mogu da ukažu ukoliko je verovatno da će subjekat povoljno odgovoriti na režim lečenja, i samim tim se može klinički koristiti za donošenje odluka o lečenju biranjem najpogodnijeg modela lečenja za bilo koji određeni subjekat.

[0039] Prilikom ocenjivanja ishoda lečenja maligne neoplastične bolesti kod subjekta tokom i posle imunoterapije inhibitorima kontrolne tačke, postupak obuhvata faze:

a) izvođenje in vitro postupka za kvantifikaciju PD-L1 mRNK u uzorku kako je ovde opisano, b) određivanje količine PD-L1 mRNK u pomenutom uzorku,

c) normalizovanje ekspresije PD-L1 u odnosu na B2M ekspresiju, koji se koristi kao referentni gen, d) poređenje količine PD-L1 mRNK detektovane u pomenutom uzorku sa pozitivnom kontrolom kako bi se procenila prekomerna ekspresija PD-L1,

e) ponavljanje faza a) do d) u jednoj ili više vremenskih tački tokom i posle imunoterapije inhibitorima kontrolne tačke pomenutog subjekta, i pri čemu promena u relativnoj količini od PD-L1 mRNK u pomenutim uzorcima tokom vremena ukazuje na efikasnost lečenja.

[0040] Uzorak je poželjno dobijen od subjekta koji ima malignu neoplastičnu bolest pre i nakon što je subjekat primio inhibitore kontrolne tačke kao imunoterpaiju. Stoga, ukazivanje na efikasno lečenje predstavlja relativnu promenu u smanjenju količine PD-L1 mRNK u pomenutom uzorku u odnosu na prethodno analiziran uzorak u fazama ponovljenog postupka.

[0041] Prilikom ocenjivanja vraćanja maligne neoplastične bolesti kod subjekta tokom i posle imunoterapije inhibitorima kontrolne tačke, postupak obuhvata faze:

a) izvođenje in vitro postupka za kvantifikaciju PD-L1 mRNK u uzorku kako je ovde opisano, b) određivanje količine PD-L1 mRNK u pomenutom uzorku,

c) normalizovanje ekspresije PD-L1 u odnosu na B2M ekspresiju, koji se koristi kao referentni gen, d) poređenje količine PD-L1 mRNK detektovane u pomenutom uzorku sa pozitivnom i negativnom kontrolom da bi se procenila prekomerna ekspresija PD-L1,

e) ponavljanje faza a) do d) u jednoj ili više tačaka tokom i posle imunoterapije inhibitorima kontrolne tačke pomenutog subjekta, i pri čemu promena u relativnoj količini PD-L1 mRNK u pomenutim uzorcima tokom vremena ukazuje na rizik od vraćanja.

[0042] Stoga, ukazivanje na vraćanje je relativna promena u rastućoj količini PD-L1 mRNK u pomenutim uzorcima koji identifikuju malignu neoplastičnu bolest tokom imunoterpaije anti-PD-Ll inhibitorima, tj. porast količine PD-L1 mRNK tokom vremena u uzorku u odnosu na prethodno analiziran uzorak u fazama ponovljenog postupka.

[0043] Pronalazak se takođe odnosi na komplet za određivanje količine PD-L1 mRNK u uzorku, pri čemu komplet za kvantifikaciju PD-L1 u uzorku takođe može da se koristi za:

i. određivanje ekspresije PD-L1 mRNK u uzorku, i/ili

ii. dijagnostikovanje i/ili prognoziranje maligne neoplastične bolesti kod subjekta pre imunoterapije inhibitorima kontrolne tačke, i/ili

iii. predviđanje efikasnosti lečenja maligne neoplastične bolesti kod subjekta pre imunoterapije inhibitorima kontrolne tačke, i/ili

iv. ocenjivanje ishoda lečenja maligne neoplastične bolesti kod subjekta tokom i posle imunoterapije inhibitorima kontrolne tačke, i/ili

v. ocenjivanje ponovnog javljanje maligne neoplastične bolesti kod subjekta tokom i posle imunoterapije inhibitorima kontrolne tačke.

[0044] Komplet obuhvata

a) reagensi za amplifikaciju nukleinske kiseline,

b) par ciljnih prajmera sposobnih da hibridizuju sa PD-L1 mRNK i koji se sastoje od prednjeg ciljnog prajmera koji obuhvata sekvencu 5'-GCTGAATTGGTCATCCCAGAA-3' (SEQ ID NO: 4) i reverznog ciljnog prajmera koji obuhvata sekvencu 5'-TTTCACATCCATCATTCTCCCTT-3' (SEQ ID NO: 6), c) par referentnih prajmera sposoban da hibridizuje sa mRNK referentnog gena,

d) ciljna proba hidrolize sposobna da hibridizuje sa PD-L1 mRNK

e) referentna proba hidrolize sposobna da hibridizuje sa mRNK referentnog gena,

f) opciono uputstva za izvođenje in vitro postupka prema ovom pronalasku.

[0045] Komplet može da obuhvati

- prednji ciljni prajmer za određivanje količine PD-L1 u uzorku, pri čemu pomenuti prednji ciljni prajmer obuhvata sekvencu 5'-GCTGAATTGGTCATCCCAGAA-3'(SEQ ID NO: 4), i

- reverzni ciljni prajmer za određivanje kvantifikacije PD-L1 u uzorku, pri čemu pomenuti reverzni ciljni prajmer obuhvata sekvencu 5'-TTTCACATCCATCATTCTCCCTT -3' (SEQ ID NO: 6), i - ciljnu probu hidrolize za određivanje količine PD-L1 u uzorku, pri čemu ciljna proba hidrolize obuhvata ili se sastoji od najmanje sekvence 5'-6FAM-GCACATCCTCCA-BBQ-3' (SEQ ID NO: 7), poželjnije ciljna proba hidrolize uključuje sekvencu 5'-6FAM-ACCTCTGGCACATCCTCCAAATGAAAG-BBQ-3' (SEQ ID NO: 8) i dve fluorescentne čestice (FAM, BBQ), i

- prednji referentni prajmer za normalizovanje podataka za kvantifikaciju PD-L1 u odnosu na ekspresiju B2M kao referentnog gena, pri čemu prednji referentni prajmer obuhvata ili se sastoji od najmanje sekvence 5'-GCCGTGTGAAC-3' (SEQ ID NO: 9), poželjnije prednji referentni prajmer uključuje sekvencu 5'-GCCTGCCGTGTGAACCATGT-3' (SEQ ID NO: 10), i

- reverzni referentni prajmer za normalizaciju podataka za kvantifikaciju PD-L1 u odnosu na ekspresiju B2M kao referentnog gena, pri čemu pomenuti reverzni referentni prajmer obuhvata ili se sastoji od najmanje sekvence 5'-CTTCAAACCTC-3' (SEQ ID NO: 11), poželjnije reverzni referentni prajmer uključuje sekvencu 5'-AAATGCGGCATCTTCAAACCTC-3' (SEQ ID NO: 12), i - referentna proba hidrolize za normalizovanje podataka za kvantifikaciju PD-L1 u odnosu na ekspresiju B2M kao referentnog gena, pri čemu referentna proba hidrolize obuhvata ili se sastoji od najmanje sekvence 5'-6FAM-CTCGATCCCAC-BBQ-3' (SEQ ID NO: 13), poželjnije ciljna proba hidrolize uključuje sekvencu 5'-6FAM-CATGATGCTGCTTACATGTCTCGATCCCAC-BBQ-3' (SEQ ID NO: 14) i dve fluorescentne čestice (FAM, BBQ).

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0046]

Fig.1: ilustruje postupak za izolaciju CTC-a iz periferne krvi i nizvodnu RT-qPCR za PD-L1 i B2M. Fig.2: prikazuje mesta hibridizacije za prajmere i probu hidrolize za amplifikaciju PD-L1 mRNK sekvence. Prajmeri-prednji, reverzni- i proba hidrolize su prikazani masnim slovima, a veza eksonekson je prikazana prednjom kosom crtom.

Fig.3: prikazuje mesta hibridizacije za prajmere i probu hidrolize za amplifikaciju B2M mRNK sekvence. Prajmeri -prednji, reverzni- i proba hidrolize su prikazani masnim slovima, a veza eksonekson je prikazana prednjom kosom crtom.

Fig.4: RT-qPCR ispitivanje za PD-L1: eksperimentalni dijagram toka za PD-L1 mRNK ekspresiju u kliničkim uzorcima.

Fig.5: predstavlja RT-qPCR kalibracione krive za PD-L1 i B2M (kopije/µL, sve merene trostruko). Fig.6: prikazuje kvantitativnu ekspresiju PD-L1 kod svežih smrznutih NSCLC primarnih tumora (2-

<ΔΔCq>vrednosti).

Fig.7: prikazuje ΔCq vrednosti između primarnih tkiva NSCLC i njihovih susednih normalnih tkiva. Fig.8: prikazuje kvantitativnu ekspresiju PD-L1 u CTC-a (2<-ΔΔCq>vrednosti).

Fig.9: prikazuje ΔCq vrednosti između kontrolne grupe i CTC-a izolovanih iz uzoraka metastatskog kancera dojke.

DEFINICIJE

[0047] Očekuje se da izrazi koji se koriste u ovom pronalasku, uopšteno, slede standardne definicije koje su uopšteno prihvaćene od strane stručnjaka iz oblasti molekularne biologije. Nekoliko izuzetaka, kao što je navedeno u nastavku, dalje su definisani u obimu ovog pronalaska.

[0048] "Najmanje jedan" kako se ovde upotrebljava označava jedan ili više, tj.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 itd.

[0049] Kako se ovde upotrebljava "ciljna sekvenca" označava sekvencu koja je detektovana, amplifikovana, i amplifikovana i detektovana ili je komplementarna sa sekvencom obezbeđenom ovde ili na neki drugi način ima najmanje jedan intron u svom nativnom stanju tj. kao genomsku DNK ili dodatnu hromozomalnu DNK. Dok se izraz ciljna sekvenca ponekad odnosi na jednolančanu sekvencu, stručnjaci će shvatiti da ciljna sekvenca može biti dvolančana. Određenije, prema ovom tekstu "ciljna sekvenca" se odnosi na deo PD-L1 sekvence, koji je amplifikovan, kada se par prajmera vezuje za željenu sekvencu.

[0050] Kako se ovde upotrebljava, izraz "prajmer" se odnosi na oligonukleotid koji je, proizveden sintetički, sposoban da dejstvuje kao tačka inicijacije sinteze nukleinske kiseline kada se stavi u uslove u kojima je sinteza proizvoda proširenja prajmera komplementarna sa lancem nukleinske kiseline indukovana, tj., u prisustvu nukleotida i sredstva za polimerizaciju kao što je DNK polimeraza, reverzna transkriptaza ili njima slični, i na odgovarajućoj temperaturi i pH. Prajmer je poželjno jednolančani za maksimalnu efikasnost, ali alternativno može biti i dvolančani. Ukoliko je dvolančani, prajmer se prvo tretira da bi se razdvojili lanci pre nego što se koristi za pripremu proizvoda proširivanja. Prajmer mora biti dovoljno dugačak da se omogući sinteza proizvoda proširivanja u prisustvu sredstava za polimerizaciju. Tačne dužine polimera će zavisiti od mnogo faktora. Uključujući temperaturu i izvor prajmera. Na primer, u zavisnosti od kompleksnosti ciljne sekvence, prajmer obično sadrži 15 do 25 ili više nukleotida, iako može da sadrži i manje nukleotida. Molekuli kratkih prajmera generalno zahtevaju hladnije temperature kako bi se formirali dovoljno stabilni hibridni kompleksi sa templatom. Određenije, prajmeri, koji se ovde upotrebljavaju, su poželjno dizajnirani tako da se izbegne amplifikacija genomske DNK ili cDNK da bi se sprečila nespecifična amplifikacija kontaminiranja genomske DNK u uzorku.

[0051] Faza opcione reverzne transkripcije u postupku ovog pronalaska je uključena kad god je to neophodno da bi se amplifikovala ciljna sekvenca, tj. kada je priroda ciljne sekvence RNK. Ovaj postupak, označen kao reverzna transkripcija, se javlja pod upravljanjem RNK-zavisnog DNK enzima polimeraze koji se naziva reverzna transkriptaza. Postupak dalje zahteva pufere i reagense, kao što su dNTP-i, za reverznu transkripciju. Kompleti za reverznu transkripciju su komercijalno dostupni, a stručnjak je dužan da izvede postupak. Reagensi za amplifikaciju nukleinske kiseline koji se upotrebljavaju u ovom pronalasku uključuju reagense koji su dobro poznati i mogu da uključe, ali bez ograničenja na, enzim sa aktivnošću polimeraze npr. polimeraze koje su stabilne na toploti kao što je Taq-polimeraza (i, po potrebi, aktivnost reverzne transkriptaze npr. prilikom praćenja mRNK), zajednički faktori enzima kao što su magnezijum ili magnan; soli i deoksinukleotidni trifosfati (dNTP-i).

[0052] Izraz " uslovi amplifikacije " je generalno definisan kao uslovi koji promovišu hibridizovanje ili kaljenje sekvence prajmera do ciljne sekvence i naknadno proširivanje sekvence prajmera. U tehnici je dobro poznato da takvo kaljenje zavisi od nekoliko parametara, uključujući temperaturu, jonsku snagu, dužinu sekvence. Komplementarnost i G:C sadržaj sekvence. Na primer, snižavanje temperature u okruženju komplementarne sekvence nukleinskih kiselina promoviše kaljenje. Za bilo koji set sekvenci, temperatura topljenja, ili Tm, može biti procenjena putem nekoliko poznatih postupaka. Obično, dijagnostička primena koristi temperature hibridizacije, koje su blizu (tj. u okviru 10°C) temperature topljenja. Jonska snaga ili koncentracija "soli" takođe utiče na temperaturu topljenja, budući da mali katjoni teže da stabilizuju stvaranje dupleksa zanemarivanjem negativnog naboja na kičmi fosfodiestra. Uobičajene koncetracije soli zavise od prirode i valentnosti katjona ali ih stručnjaci lako razumeju. Slično tome, takođe je poznato da visok G:C sadržaj i povećana dužina sekvence stabilizuju formiranje dupleksa jer G:C parovi uključuju 3 veze vodonika gde A:T parovi imaju samo dve, i zato što duže sekvence imaju više veza vodonika koji drže te sekvence zajedno. Stoga, visok sadržaj G:C i lanci većih dužina utiču na uslove hibridizacije podizanjem temperature topljenja. Kada su sekvence za datu dijagnostičku primenu izabrane, sadržaj G:C i dužina će biti poznati i mogu se uzeti u obzir za precizno određivanje toga šta potpada pod uslove hibridizacije. Budući da je jonska snaga uobičajeno optimizovana radi enzimske aktivnosti, jedini preostao parametar koji može da varira je temperatura. Generalno se temperatura hibridizacije bira tako da bude približna ili na Tmprajmera ili probe. Stoga, dobijanje prikladnih uslova hibridizacije za određeni prajmer, probu, ili set prajmera i proba je dobro poznato u praksi stručnjaka. Proizvod amplifikacije proizveden kako je gore opisano može biti detektovan tokom ili nakon amplifikacije ciljne sekvence upotrebom bilo kog prigodnog postupka i neke probe koja je detaljnije opisana u nastavku.

[0053] Kako se ovde upotrebljava, izraz "temperatura topljenja " (Tm) u vezi sa oligonukleotidom je definisana kao temperatura na kojoj 50% DNK formira stabilnu dvostruku spiralu, a drugih 50% je odvojeno u jednolančane molekule. Kako je stručnjacima poznato, temperatura kaljenja PCR je obično nekoliko stepeni niža od Tm, pri čemu je ova docnija izračunata na osnovu koncentracija oligo i soli u reakciji.

[0054] Izrazi "polinukleotid" i "oligonukleotid" se upotrebljavaju naizmenično. "Oligonukleotid" je izraz koji se ponekad koristi za opis kraćeg polinukleotida.

[0055] Izrazi "hibridizovan" i "hibridizacija" se odnose na interakcije sparivanja baza između dve nukleinske kiseline koje dovode do stvaranja dupleksa. Ne postoji zahtev da dve nukleinske kiseline imaju komplementarnost 100% u celoj dužini da bi se postigla hibridizacija.

[0056] Izraz "spoljašnji standard" kako se ovde upotrebljava označava sintetički DNK ili RNK transkript u poznatoj količini(ama) ili koncentraciji(ama) koji je odvojeno ispitan od uzorka za ispitivanje, tj. putem interpolacije ili ekstrapolacije na standardnoj krivi.

[0057] Kako se ovde upotrebljava, "prag ciklusa" (Ct) se odnosi na kvantifikaciju vrednosti ciklusa izračunatu iz snimljenih mera fluorescencije kvantitativne PCR u stvarnom vremenu. "Cq" se odnosi na broj ciklusa potrebnih da bi PCR signal stigao do značajnog praga. Izračunata Cq vrednost je proporcionalna logu broja ciljnih kopija prisutnih u uzorku. Cq kvantifikacija je izvedena bilo kojim postupkom za amplifikaciju kvantitativne PCR u stvarnom vremenu koja je opisana u tehnici [Bustin SA. Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays. J Mol Endocrinol 2000;25: 169-193].

[0058] "Preciznost" je mera stepena ponovljivosti nekog analitičkog postupka pri normalnom funkcionisanju i normalno je izražen kao procenat relativne standardne devijacije za statistički značajan broj uzoraka. Dve najuobičajenije mere preciznosti su "ponovljivost" i "reproduktivnost". Ovo su izražavanja dve ekstremne mere preciznosti koje se mogu dobiti. Ponovljivost (najmanja očekivana preciznost) će dati ideju o vrsti varijabilnosti koja može da se očekuje kada postupak izvodi jedan analitičar na jednom delu opreme na u kratkom vremenskom razmaku. Ukoliko uzorak analizira određeni broj laboratorija u cilju upoređivanja, onda se koristi reproduktivnost (koja je najveća mera preciznosti) kao značajnija mera preciznosti.

[0059] "Limit detekcije" (LoD) predstavlja najnižu koncentraciju analita koja se verovatno pouzdano može razlikovati od slepe probe i na kojoj je detekcija izvodljiva. LoD se određuje korišćenjem i izmerenog LoB i ispitivanih replikata uzorka za koji je poznato da sadrži nizak nivo koncentracije analita.

[0060] "Limit kvantifikacije" (LoQ) se odnosi na najnižu koncentraciju na kojoj analit ne može samo biti pouzdano detektovan već na kojoj su zadovoljeni neki prethodno definisani ciljevi za odstupanje i preciznost. LoQ je definisan kao tri puta veći od LOD.

[0061] "Linearnost" je sposobnost postupka da se dobiju rezultati ispitivanja koji su direktno proporcionalni koncentraciji analita u okviru datog opsega. Linearnost je generalno prijavljena kao varijanta nagiba na regresionoj liniji. Tradicionalno, linearnost se smatra poželjnim svojstvom postupaka budući da samo linearne krive mogu lako da se tumače. Sa lako dostupnim računarom, to sada više nije toliko važno i nelinearne kalibracije mogu lako da se reše.

[0062] "Lažno negativan" se odnosi na rezultat ispitivanja koji ukazuje da subjekat nema malignu neoplastičnu bolest kada je subjekat zapravo ima. U kontekstu ove prijave "lažno negativan" se odnosi na rezultat koji je netačan zato što postupkom nije određena prekomerna ekspresija PD-L1 u uzorku od subjekta.

[0063] "Lažno pozitivan" se odnosi na rezultat ispitivanja koji ukazuje da subjekat koji ima malignu neoplastičnu bolest kada je zapravo nema. U kontekstu ove prijave "lažno pozitivan" se odnosi na rezultat ispitivanja koji je netačan zato što postupak ukazuje da se odredi prekomerna ekspresija PD-L1 u uzorku, koja ne postoji.

[0064] "Zdrav" se odnosi na subjekat koji je dobrog zdravlja. Takav subjekat pokazuje odsustvo bilo kakve maligne ili nemaligne bolesti. U kontekstu ove prijave, "zdrav pojedinac" je zdrav samo u smislu da nema nikakvu malignu ili nemalignu bolest; "zdrav pojedinac" može da ima druge bolesti ili stanja koja se u normalnim okolnostima ne smatraju "zdravim".

[0065] "Prognoza" kako se ovde upotrebljava se odnosi na predviđanje verovatnoće napretka, uključujući ponovno javljanje, metastatsko širenje, i otpornost leka, maligne neoplastične bolesti. Na primer, pacijent koji ima profil ekspresije, koji je međusobno povezan sa invazivnim fenotipom, može da ispolji visoko proliferativnu aktivnost, i stoga može biti pokazatelj povoljnog odgovora na terapiju, budući da invazivni fenotip može biti histološka karakteristika koja se koristi da ukazuje na neoplastičnu bolest koja je osetljiva na terapiju.

[0066] "Maligna" neoplazma se generalno slabo razlikuje (anaplazija), ima karakteristično brz rast praćen progresivnom infiltracijom, invazijom, i destrukcijom okolnog tkiva. Dalje, maligna neoplazma ima kapacitet da metastazira do udaljenih mesta. Izraz "metastaza" se odnosi na širenje ili migraciju kancerskih ćelija od primarnog (originalnog) tumora do drugog organa ili tkiva, i obično može da se identifikuje prisustvom „sekundarnog tumora“ ili „sekundarne ćelijske mase“ tipa tkiva primarnog (originalnog) tumora, a ne od organa ili tkiva u kojem je sekundarni (metastatski) tumor lociran. Na primer karcinom kancera pluća koji je migrirao na kosti se smatra da je metastazirani kancer pluća, i sastoji se od kancerskih ćelija koje potiču od epitelijalnih ćelija pluća koje rastu u tkivima kostiju.

[0067] Kako se ovde upotrebljava, izraz "klinički ishod" ili "ishod" se tumači u smislu različitih krajnjih tačaka kao što su preživljavanja bez bolesti (DFS), preživljavanje bez relapsa (RFS), vreme do pojave relapsa (TR), preživljavanje specifično za kancer (CSS) ili sveukupno preživljavanje (OS), u skladu sa preporukama Punt CJ, Buyse M, Köhne C-H, Hohenberger P, Labianca R, Schmoll HJ, et al. Endpoints in Adjuvant Treatment Trials: A Systematic Review of the Literature in Colon Cancer and Proposed Definitions for Future Trials. J. Natl. Cancer Inst.2007;13: 998-1003.

[0068] Kako se ovde upotrebljava, izraz "preživljavanje bez relapsa" ili "preživljavanje bez vraćanja bolesti" (RFS) je definisan kao vreme do bilo kog događaja, nevezano za uzrok tog događaja, sa izuzetkom bilo kog drugog primarnog kancera. Vraćanje bolesti ili smrt od istog kancera i sve smrti koje su povezane sa lečenjem ili smrti iz drugih razloga predstavljaju događaje. Drugi primarni od istih kancera i drugi primarni kanceri se zanemaruju, a gubitak do perioda praćenja nakon bolesti je cenzurisan.

[0069] Kako se ovde upotrebljava, izraz "preživljavanje bez bolesti" (DFS) je definisan kao vreme do bilo kog događaja, nevezano za uzrok ovog događaja. Svi događaji su uključeni, osim gubitka do perioda praćenja posle bolesti koji je cenzurisan. Kako se ovde upotrebljava, “ukupno preživljavanje" (OS) je definisano kao vreme do smrti, nevezano za uzrok, da li je ili nije smrt nastupila zbog kancera. Loko regionalni recidiv, udaljene metastaze, drugi primarni kanceri, i drugi ostali primarni kanceri su zanemareni. Gubitak do perioda praćenja nakon bolesti je cenzurisan.

[0070] "Subjekat" kako se ovde upotrebljava uključuje ljude, nehumane primate kao što su šimpanze i drugi majmuni i majmunske vrste, domaće životinje kao što je stoka, ovce, svinje, koze i konji, domaći sisari kao što su psi i mačke, laboratorijske životinje uključujući glodare kao što su miševi, pacovi i zamorci, i njima slični. Izraz se ne odnosi na određeni uzrast ili pol. Stoga je namera da odrasli i novorođeni subjekti, kao i fetusi, bilo muški ili ženski, budu pokriveni. U poželjnim načinima ostvarivanja, subjekat je sisar, uključujući ljude i nehumane sisare. U najpoželjnijem načinu ostvarivanja, subjekat je čovek.

[0071] Kako se ovde upotrebljava "biološki uzorak" obuhvata različite tipove uzoraka dobijene od bilo kog subjekta koji ima ili nema malignu neoplazmu. Subjekat je obično čovek. Na primer, biološki uzorci uključuju uzorke dobijene iz tkiva ili krvi sakupljene od pojedinaca za koje se sumnja da imaju malignu neoplazmu.

[0072] "Imunoterpaija" predstavlja lečenje koje koristi određene delove imunog sistema pacijenta da se bori sa bolestima kao što je kancer. Ovo može da se uradi ili stimulisanjem imunog sistema da radi teže ili pametnije da bi se napale kancerske ćelije ili davanjem komponenti imunog sistema, kao što su proteini imunog sistema koje pravi čovek. Neke vrste imunoterapija se ponekad nazivaju biološka terapija ili bioterapija. U poslednjih nekoliko decenija imunoterapija je postala važan deo lečenja nekih kancera. Imunoterapija uključuje lečenja koja rade na različite načine. Neki jačaju imuni sistem organizma na veoma uobičajen način. Drugi pomažu da istreniraju imuni sistem da napada kancerske ćelije specifično.

[0073] "Inhibitori kontrolne tačke" (takođe poznati kao modulatori imunih kontrolnih tačaka) su dizajnirani da smanje efektivnost proteina kontrolnih tačaka. Mogli su da imaju različite mehanizme delovanja, ali ukoliko su efikasni, pustili bi imuni sistem da vidi druge molekule na površini kancerskih ćelija. Postoji mnogo vrsta imunih inhibitora kontrolne tačke, kao što su anti-PD-Ll inhibitori, anti-CTLA4 inhibitori itd.

[0074] Kako se ovde upotrebljava izraz cirkulišuće ćelije tumora (CTC) predstavljaju ćelije koje su iscurile u vaskulaturu iz primarnog tumora i koje cirkulišu u krvotoku. CTC-e stoga čine seme za naknadni rast dodatnih tumora (metastaza) u vitalnim udaljenim organima, čime se aktivira mehanizam koji je odgovoran za veliku većinu smrti povezanih sa kancerom.

[0075] Kako se ovde upotrebljava, izraz PD-L1 se odnosi na zvanični naziv gena " ligand 1 programirane smrti " (PD-L1; takođe nazvan B7-H1 ili CD274). Gen "liganda 1 programirane smrti" je eksprimiran na mnogim kancerskim i imunim ćelijama i igra važnu ulogu u blokiranju "ciklusu imuniteta protiv kancera" vezivanjem programirane smrti-1 (PD-1) i B7.1 (CD80), od kojih oba predstavljaju negativne regulatore aktivacije T-limfocita. Vezivanje PD-L1 za njegove receptore suprimira migraciju T-ćelija, proliferaciju i sekreciju citotoksičnih medijatora, i ograničava ubijanje tumorskih ćelija. PD-L1-PD-1 osa štiti domaćina od prekomerno reaktivnih ćelija T-efektora ne samo kod kancera već takođe i tokom mikrobioloških infekcija. Blokiranje PD-L1 bi stoga pojačalo antikancerski imunitet, ali se malo zna o faktorima predviđanja efikasnosti. Uobičajenije je da se izraz "ciljna sekvenca", kako se ovde upotrebljava odnosi na PD-L1 mRNK sekvencu.

[0076] Kako se ovde upotrebljava, izraz B2M se odnosi na zvaničan naziv gena "beta-2-mikroglobulin", koji kodira protein u serumu pronađen u vezi sa teškim lancem glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC) klase I na površini gotovo svih nukleisanih ćelija. Protein ima pretežno strukturu beta-nabranog lista koji može da formira amiloidne fibrile u nekim patološkim uslovima. Kodirani antimikrobiološki protein ispoljava antibakterijsku aktivnost u amniotičkoj tečnosti. Uobičajenije je da se, izraz "referentna sekvenca", kako se ovde upotrebljava odnosi na B2M mRNK sekvencu.

[0077] Kako se ovde upotrebljava, izraz "referentni gen" se odnosi na bilo koju određenu poznatu genomsku sekvencu, bilo delimičnu ili potpunu, bilo kog organizma ili virusa koji može da se koristi za pozivanje na identifikovane sekvence od subjekta. Na primer, za referentni genom koji se koristi za humane subjekte kao i mnoge druge organizme je pronađen na sajtu www.ncbi.nlm.nih.gov Nacionalnog centra za biotehnološke informacije. "Genom" se odnosi na potpune genetske informacije o organizmu ili virusu, eksprimiran u sekvenci nukleinske kiseline. Izraz "referentni gen", kako se ovde upotrebljava, se uobičajenije odnosi na B2M gen.

DETALJAN OPIS

[0078] Ovaj pronalazak se odnosi na visoko senzitivno, specifično i reprodukujuće RT-qPCR ispitivanje u stvarnom vremenu za kvantifikaciju PD-L1 ekspresije u biološkom uzorku, kao što je izolovani RNK uzorak iz CTC u perifernoj krvi pacijenata sa čvrstim kancerima. Klinička važnost PD-L1 mRNK ekspresije je povezana sa odgovorom na ciljne imunoterapije kod mnogih tipova kancera.

MATERIJALI I POSTUPCI

Pacijenti

[0079] Kao prva grupa, analizirano je ukupno 31 primarnih NSCLC karcinoma i njihovih odgovarajućih 31 susednih ne-neoplastičnih tkiva. Kao druga grupa, ukupno 32 uzorka periferne krvi su uzeta od 22 pacijenta sa metastatskim kancerom dojke i 10 od zdravih ženskih davalaca, koji su korišćeni kao kontrolna grupa radi definisanja specifičnosti ovog ispitivanja. Uzorci tkiva su sakupljeni u vreme hirurške intervencije i odmah su zamrznuti u tečnom azotu i čuvani su na -80 °C. Svi uzorci su histološki analizirani da bi se pristupilo broju tumorskih komponenti (najmanje 70% tumorskih ćelija) i kvalitetu materijala (tj.,odsustvu nekroze).

CTC izolacija iz periferne krvi sa pozitivnom imunomagnetnom selekcijom

[0080] CTC su izolovane iz 20 mL periferne krvi kako je prethodno opisano [Strati A, et al. Gene expression profile of circulating tumor cells in breast cancer by RT-qPCR. BMC Cancer 2011;11: 422]. Ovaj postupak je prikazan na Fig.1. Štaviše, razvijeno RT-qPCR ispitivanje za PD-L1 takođe može biti primenjeno i na uzorcima CTC izolovanih različitim metodologijama. Da bi se smanjila kontaminacija krvi epitelijalnim ćelijama iz kože, prvih 5 ml krvi se odbacuje, a epruveta za sakupljanje je na jednom kraju odvojena pre povlačenja igle. Nakon sakupljanja, periferna krv je razblažena sa 20 mL fosfatom puferisanog slanog rastvora (PBS, pH 7.3) i mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC-e) su izolovane centrifugiranjem gustine gradijenta pomoću Ficol-Paque TM PLUS (GE Healthcare, Bio-Sciences AB) na 670 g, 30 min na sobnoj temperaturi. Ćelije interfejsa su uklonjene, oprane dva puta sa 40 mL sterilnog PBS-a (pH 7.3, 4°C), na 530 g, 10 min, i ponovo suspendovane u 1 mL PBS-a. CTC su obogaćene upotrebom imunomagnetnih perli za hvatanje obloženih Ber-EP4 (Dynabeads® Epithelial Enrich, Invitrogen), prema uputstvima proizvođača. Dve frakcije su izolovane za svaki uzorak: EpCAM-pozitivna CTC frakcija (CTC frakcija) i odgovarajuća EpCAM-negativna frakcija koja sadrži PBMC (PBMC frakcija).

RNK izolacija iz tumorskih tkiva i cDNK sinteza

[0081] Ukupna ćelijska RNK je izolovana sa Qiagen RNeasy Mini Reagent Set-om (Qiagen), prema uputstvima proizvođača. Sve faze pripreme i rukovanja RNK su se odvijale u haubi sa laminarnim protokom u uslovima bez RNKaze. Izolovana RNK je rastvorena u RNK puferu za čuvanje (Ambion) i čuvana na -70°C do upotrebe. RNK koncentracija je određena u NanoDrop® ND-1000 spektrofotometru (NanoDrop Technologies). Količina od 1µg ukupne RNK je korišćena da bi se izvela reverzna transkripcija RNK sa High-Capacity RNA-to-cDNA™ Kompletom (Applied Biosystems, USA) u ukupnoj zapremini od 20µL, prema uputstvima proizvođača.

RNK izolacija iz CTC-a i cDNK sinteza

[0082] Ukupna RNK izolacija je izvedena pomoću TRIZOL-LS reagensa (Invitrogen, USA). Sve faze pripreme i rukovanja RNK se odvijaju u haubi sa laminarnim protokom, u uslovima bez RNKze. Izolovana RNK je rastvorena u 20µL pufera za čuvanje RNK (Ambion, USA) i čuvana je na -70°C do upotrebe. RNK koncentracija je određena očitavanjima apsorbance na 260 nm pomoću Nanodrop-1000 spektrofotometra (NanoDrop, Technologies, USA). mRNK je izolovana u ukupnoj RNK, upotrebom Dynabeads kompleta za prečišćavanje mRNK (Invitrogen, USA) prema uputstvima proizvođača. cDNK sinteza je izvedena upotrebom High-Capacity RNA-to-cDNA™ Kompleta (Applied Biosystems, USA) u ukupnoj zapremini od 20µL prema uputstvima proizvođača.

Modeli prajmera i proba

[0083] Prajmeri i probe hidrolize za PD-L1 i B2M koji se koristi kao referentni gen su bili de novo insilico dizajnirani (tabela 1). In-silico dizajn je izveden upotrebom Primer Premier 5.0 softvera (Premier Biosoft, CA, USA) da bi se izbeglo formiranje prajmer-dajmer, lažnih mesta prajmera i formiranje struktura poput ukosnica. Hibridizacija sa genomskom DNK je u potpunosti izbegnuta. Štaviše, prajmeri i probe su dizajnirani, tako da amplifikuju specifične PD-L1 ili B2M ciljne gene prema istraživanju u BLAST Sequence Similarity Search tool (NCBI, NIH). Probe hidrolize su uključivale 5'-fluorescein (FAM) kao fluorofor kovalentno pričvršćen za 5'-kraj oligonukleotidne probe i BlackBerry® Sredstvo za gašenje (BBQ) kao sredstvo za gašenje na 3'-kraju. Položaj prajmera i proba hidrolize za svaki ciljni gen su prikazani na Fig.2 i 3.

Tabela 1. RT-qPCR ispitivanje za PD-L1 i B2M ekspresije; sekvence prajmera i probe hidrolize Veličina Gen (Pristupni br.) Sekvenca (5'-3') Tm(°C) amplikona

[0084] Za svaki gen, dizajnirani su par prajmera i proba hidrolize. Za PD-L1, set prajmera S1 je dizajniran da bi se amplifikovao region (147 bp) koji obuhvata najmanje jedno mesto koje zauzima intron. Ovo obezbeđuje par prajmera koji će se samo vezati za sekvencu u kojoj su interoni izrezani, npr. mRNK, cDNK. Određenije, prednji prajmer je dizajniran između eksona 4 i 5 (veza intron ekson), a reverzni prajmer je dizajniran između eksona 5 i 6 (veza intron ekson) PD-L1 mRNK sekvence da bi se pojačala samo mRNK ciljna sekvenca pri čemu se izbegava DNK genomska amplifikacija i ne-specifični proizvodi. Proba hidrolize je dizajnirana da hibridizuje sa unutrašnjim regionom u okviru amplikona. Za B2M, dizajnirani su par prajmera i proba hidrolize. Za B2M, set prajmera S2 je dizajniran da bi se amplifikovao region (99 bp) koji obuhvata najmanje jedno mesto koje zauzima intron. Ovo obezbeđuje par prajmera koji će se samo vezati za sekvencu u kojoj su interoni izrezani, npr. mRNK, cDNK.

Određenije, prednji prajmer je dizajniran u unutrašnjem regionu eksona 9 B2M mRNK sekvence, a reverzni prajmer je dizajniran između eksona 2 i 3 B2M mRNK sekvence radi amplifikacije samo ciljne sekvence pri čemu se izbegavaju ne-specifični proizvodi. U ovom slučaju, proba hidrolize je dizajnirana da bi bila hibridizovana između eksona 3 i 4 (veza intron ekson). Svi prajmeri i probe sekvenci su prikazani u tabeli 1.

RT-qPCR ispitivanje

[0085] RT-qPCR reakcija je izvedena u LightCycler 2.0 (IVD instrument, Roche, Germany) upotrebom staklenih kapilarnih epruveta (Roche Applied Science, Germany). Kao pozitivna kontrola koja je koristila PBMC od zdravih kontrolnih uzoraka jer PBMC takođe eksprimira PD-L1. Protokol ciklusa je bio identičan za oba i PD-L1 i B2M i sastojao se od početne 2-min faze denaturacije na 95 °C, nakon čega je usledilo 45 ciklusa denaturacije na 95 °C za 10 s, kaljenjem na 58 °C za 20 s, i proširivanjem na 72 °C za 20 s. PCR u stvarnom vremenu je izvedena u ukupnoj zapremini od 10 µL po reakciji. Mešavina PCR reakcija za PD-L1 i B2M je detaljno opisana u tabeli 2.

Tabela 2. Komponente reakcije za PD-L1 i B2M RT-qPCR

PRIMER 1

Razvoj i analitička validacija ispitivanja

[0086] Eksperimentalni dijagram toka ispitivanja je prikazan na Fig.4.

[0087] Optimizacija protokola. Postupci za kvantifikaciju PD-L1 i B2M ekspresije bazirani na RT-qPCR su optimizovani u brojnim eksperimentima, upotrebom pozitivne kontrole cDNK uzoraka iz periferne krvi mononuklearnih ćelija (PBMC) zdravih kontrolnih uzoraka i negativne kontrole PCR reakcione mešavine, u odnosu na: temperaturu kaljenja PCR, parametre ciklusa, prajmera i koncentracija probe, Mg<+2>i koncentracija dNTP-a.

[0088] Jedna RT-qPCR je izvedena za ekspresiju PD-L1 i B2M . Kvantifikacija je bazirana na praćenju u stvarnom vremenu tokom PCR označene specifične probe hidrolize za PD-L1. Ciklus gde signal fluorescencije raste iznad pozadinske buke (ciklus kvantifikacije, Cq) je najbolje kvantifikovan putem LightCycler softvera kao maksimum drugog derivata krive. RT-PCR za PD-L1 mRNK u stvarnom vremenu je izvedena upotrebom LightCycler sistema (Roche Diagnostics). Za razvijeni protokol, prajmeri i probe hidrolize su korišćeni kako je prethodno opisano.

[0089] RT-PCR u stvarnom vremenu je izvedena u ukupnoj zapremini od 10 µL u LightCycler staklenim kapilarima. Za PCR, 1 µL od cDNK je stavljen u 9 µL reakcione zapremine koja sadrži PCR reakcionu mešavinu, koja je opisana u Tabeli 3. Štaviše, protokol PCR uslova je korišćen kako je prethodno opisano.

[0090] Postupak takođe može biti primenjen na bilo koji instrument za PCR u stvarnom vremenu, kao što je LightCycler 1.5 instrument, LightCycler 2.0 instrument, LightCycler 480 (Roche Diagnostics) i Applied Biosystems Real-Time PCR Instrument.

PRIMER 2

RT-qPCR kvantifikacija upotrebom eksternih kalibratora

[0091] Kao prvo, pojedinačni PCR amplikoni specifično za PD-L1 i B2M su generisani kako bi se iskoristili kao kalibratori eksterne kvantifikacije. U ovu svrhu, ukupna RNK je ekstrahovana iz PBMC pula od normalnih uzoraka budući da PBMC eksprimira i PD-L1. cDNK je sintetisana i služila je kao templat za amplifikaciju PD-L1 i B2M gore pomenutom opisanom RT-qPCR. PCR proizvodi su prečišćeni upotrebom MinElute PCR Kompleta za prečišćavanje (Qiagen, Germany), i amplikoni su kvantifikovani u Nanodrop-1000 spektrofotometru (NanoDrop, Technologies, USA).

[0092] DNK koncentracija je prevedena u kopije/µL upotrebom Avogadro broja i molekulske mase amplikonskog broja baza PCR proizvoda pomnoženog sa srednjom vrednosti molekulske mase para nukleinskih kiselina koji iznosi 660. Pripremljen je standardni osnovni rastvor koji odgovara

10<10>kopija/µL za svaki transkript gena. Serijska razblaženja ovog osnovnog rastvora amplikona u vodi bez DNkze/RNkze u opsegu od 10<5>kopija/µL do 10 kopija/µL su služila kao kalibratori kvantifikacije tokom ispitivanja. Za kvantifikacije PD-L1 i B2M transkripata gena, eksterna kalibraciona kriva je dobijena grafičkim prikazom koncentracije svakog kalibratora izraženog kao kopije/µL naspram odgovarajućeg ciklusa kvantifikacije (Cq).

PRIMER 3

Limit detekcije i linearnost ispitivanja

[0093] Procenjen je limit detekcije (LOD) razvijenog RT-qPCR ispitivanja za oba PD-L1 i B2M kao kopije/µL u reakciji. Da bi se LOD procenio, pripremljeni su kalibratori kvantifikacije koji sadrže poznat broj kopija/µL kako je u nastavku detaljno opisano: Za svaki gen generisana je ciljna kalibraciona kriva upotrebom serija trostrukih razblaženja standarda za svaku koncentraciju, u opsegu od 10<5>kopija/µL do 10 kopija/µL. Kalibracione krive su pokazale linearnost od 10 kopija/µL do 10<5>kopija/µL, sa koeficijentima korelacije većim od 0.99 u oba slučaja, što ukazuje na precizan odnos između loga i linearnosti (Fig.5). Nijedan od prajmera i proba hidrolize nije dao nikakav signal za bilo koji od ciljnih transkripata gena kada je analizirano 50 ng/µL od 10 različitih genomskih DNK.

[0094] LOD za oba ova ispitivanja je iznosio 3 kopije/µL, a limit kvantifikacije (LOQ) je bio 9 kopija/µL, (procenjeno prema MIQE Guidelines, S. Bustin et.al. Clin Chem.2009). Karakteristike kalibracione krive su date u tabeli 3 u nastavku.

Tabela 3. Karakteristike kalibracione krive za PD-L1 i B2M RT-qPCR

PRIMER 4

Procena preciznosti unutrašnjeg i međuispitivanja

[0095] Ponovljivost ili unutrašnje ispitivanje varijance (preciznost u seriji) PD-L1 RT-qPCR, je procenjena ponovnim analiziranjem 3 uzorka cDNK koja odgovaraju niskoj, srednjoj ili visokoj mRNK ekspresiji, dok je B2M procenjen ponovnim analiziranjem 4 cDNK uzoraka koji odgovaraju 1, 10, 100 i 1000 ekvivalenata ćelija po µL cDNK u istom ispitivanju, u 3 paralelna određivanja.

[0096] Varijanca unutrašnjeg ispitivanja izražena kao CV-i (%) Cq varijance za PD-L1, u opsegu od 0.84 do 1.2, dok je za B2M u opsegu od 0.21 do 0.72 (tabela 4). Varijanca unutrašnjeg ispitivanja izražena kao unutar rada CV-i kopija/µL u opsegu za PD-L1, od 16% do 20% i za B2M od 3.7% do 14% (tabela 4). Reproduktivnost ili varijanca međuispitivanja (preciznost između rada) RT-qPCR ispitivanja, je procenjena analiziranjem istog cDNK uzorka, predstavljajući 100 SKBR-3 ćelija za B2M i PBMC-e za PDL1 i čuvana je zamrznuta u alikvotima na -20°C, tokom perioda jednog meseca na 4 odvojena ispitivanja izvedena u 4 različita dana. CV-i u seriji su bili 17% za B2M, i 15% za PD-L1 (tabela 4).

Tabela 4. RT-qPCR za PD-L1 i B2M: Procena preciznosti unutrašnjeg i međuispitivanja

PRIMER 5

Normalizacija podataka za kvantifikaciju PD-L1 ekspresije u primarnim tumorima i CTC-a

[0097] Normalizacija podataka za kvantifikaciju PD-L1 ekspresije je izvedena u odnosu na ekspresiju B2M kao referentnog gena, i upotrebom 2<-ΔΔCt>postupka (Livak and Schmittgen, Methods 2001).

[0098] U primarnim tumorima dva uzorka su bila dostupna za svakog pacijenta: a) primarni tumor i odgovarajuće nekancersko tkivo. U ovom slučaju za svaki uzorak, ekspresija PD-L1 je procenjena kao relativni odnos sa B2M koji se koristi kao referentni gen i u primarnom tumoru i njegovom susednom nekancerskom tkivu, koje se koristi kao kalibrator. Zatim upotrebom 2<-ΔΔCt>pristupa, normalizacija analitičkog signala (Cq) PD-L1 u svakom uzorku primarnog tumora sa odgovarajućim analitičkim signalom (Cq) PD-L1 u susednom nekancerskom uzorku.

[0099] U slučaju CTC-a za svaki uzorak, ekspresija PD-L1 se procenjuje kao relativni odnos sa B2M koji se koristi kao referentni gen i kod EpCAM-pozitivne CTC frakcije i kod odgovarajuće EpCAM-pozitivne CTC frakcije u grupi zdravih davalaca krvi koja se koristi kao kalibrator. Zatim upotrebom 2<-ΔΔCt>pristupa, procenjena je prekomerna ekspresija PD-L1 u EpCAM-pozitivnoj CTC frakciji uzoraka periferne krvi.

[0100] U EpCAM-pozitivnoj CTC frakciji, jedan uzorak je definisan kao PD-L1 prekomerno eksprimiran na osnovu jednostruke promene PD-L1 ekspresije u odnosu na grupu od deset zdravih pojedinaca koji se koriste kao kontrolna grupa. Specifičnije, vrednost isečka je procenjena prema ekspresiji PD-L1 u EpCAM-pozitivnoj frakciji deset zdravih pojedinaca analiziranih na tačno isti način kao uzorci periferne krvi pacijenta. Za ovih deset kontrolnih uzoraka, izmerena je razlika Cq vrednosti (ΔCqkontrola) za PD-L1 od odgovarajuće Cq vrednosti za B2M (CqPD-L1-CqB2M). Srednja vrednost ovih 10 ΔCq vrednosti je bila 15.78 ± 0.83 (Tabela 5).

Tabela 5. Ekspresija PD-L1 u PBMC (kontrolna grupa). (ΔCq vrednosti: CqPD-L1-CqB2M)

Primer 6

Ekspresija PD-L1 u primarnim tumorima (NSCLC)

[0101] U ovoj grupi, kvantifikacija PD-L1 ekspresije je izvedena kod 31 para NSCLC tkiva i njihovih susednih ne-neoplastičnih tkiva pomoću RT-qPCR. PD-L1 je eksprimiran u svim tkivima, i njegova ekspresija je normalizovana u odnosu na ekspresiju B2M gena i upotrebom pristupa relativne kvantifikacije opisanog od strane Livak i Schmittgen kako je prethodno opisano. U ovom ispitivanju je pokazano da je PD-L1 prekomerno eksprimiran u 14/31 (45.2%) NSCLC tkiva (Fig.6). ΔCq vrednosti između primarnih tkiva NSCLC i njihovih susednih normalnih uzoraka su prikazane na Fig.7.

PRIMER 7

Ekspresija PD-L1 ekspresije u CTC-a

[0102] U ovoj grupi, izvedena je kvantifikacija PD-L1 u EpCAM-pozitivnoj CTC frakciji (izolovanih iz periferne krvi pacijenata sa metastatskim kancerom dojke). Za uzorak svakog pacijenta, izračunata je odgovarajuća CqPD-L1-CqB2Mvrednost (ΔCquzorak). Zatim je svaka pojedinačna ΔCquzorakvrednost procenjena traženjem razlike u odnosu na srednju vrednost ΔCqkontrola(ΔΔCq=ΔCquzorak- ΔCqkontrola) (tabela 6). Srednja vrednost 2<-ΔΔCq>za analiziranu grupu pacijenata je iznosila 2.20. Uzorci sa 2-

<ΔΔCq>vrednošću iznad 2.20 ili ΔCq vrednošću ispod 14.7 su definisani kao pozitivni za prekomernu ekspresiju PD-L1 mRNK (tabela 6). Štaviše, ΔCq vrednosti kod svih uzoraka od zdravih pojedinaca su bile iznad 14.7 (Fig.8).

[0103] Prema rezultatima, utvrđeno je da je PD-L1 prekomerno eksprimiran kod 8/22 (36.4%) pacijenata sa potvrđenom metastazom (Fig.8). ΔCq vrednosti između kontrolne grupe i CTC izolovanih iz uzoraka metastatskog kancera dojke su prikazani na Fig.9.

Tabela 6. Ekspresija PD-L1 u EpCAM-pozitivnoj CTC frakciji (2<-ΔΔCq>vrednosti)

Claims (11)

1. Patentni zahtevi 1. In vitro postupak za kvantitativno određivanje ekspresije liganda programirane smrti 1 (PD-L1) u uzorku tečne biopsije cirkulišućih ćelija tumora (CTC), pri čemu pomenuti postupak obuhvata faze: i. podvrgavanje uzorka tečne biopsije reverznoj transkripciji upotrebom RNK prisutne u uzorku kao templat da bi se sintetisala odgovarajuća cDNK sekvenca, ii. stvaranje reakcione mešavine koja obuhvata uzorak, reagense za amplifikaciju nukleinske kiseline, par ciljnih prajmera, ciljnu probu hidrolize, pri čemu su pomenuti par ciljnih prajmera i ciljna proba hidrolize sposobni da hibridizuju sa PD-L1 mRNK, i pri čemu se pomenuti par ciljnih prajmera sastoji od prednjeg ciljnog prajmera koji obuhvata sekvencu 5'-GCTGAATTGGTCATCCCAGAA-3' (SEQ ID NO: 4) i reverznog ciljnog prajmera koji obuhvata sekvencu 5'-TTTCACATCCATCATTCTCCCTT-3' (SEQ ID NO: 6) iii. podvrgavanje reakcione mešavine uslovima amplifikacije optimizovanim tako da se stvori najmanje jedna kopija sekvence nukleinske kiseline komplementarna sa ciljnom sekvencom, pri čemu ciljna sekvenca predstavlja mRNK transkript PD-L1 mRNK sekvence (SEQ ID NO: 1), i iv. određivanje količine PD-L1 mRNK u uzorku tečne biopsije, v. normalizovanje ekspresije PD-L1 u odnosu na ekspresiju referentnog gena čiji nivoi ekspresije ostaju konstantni između različitih tipova ćelija, vi. poređenje količine PD-L1 mRNK eksprimirane u pomenutom uzorku sa pozitivnom kontrolom koja predstavlja uzorak koji obuhvata PD-L1 mRNK i sa negativnom kontrolom koja predstavlja uzorak bez obuhvatanja PD-L1 mRNK da bi se procenila prekomerna ekspresija PD-L1 mRNK sekvence.
2. 2. Postupak prema zahtevu 1, za i. dijagnostikovanje i/ili prognoziranje maligne neoplastične bolesti kod subjekta pre imunoterapije inhibitorima kontrolne tačke, i/ili ii. predviđanje efikasnosti lečenja maligne neoplastične bolesti kod subjekta pre imunoterapije inhibitorima kontrolne tačke, i/ili iii. procenjivanje ishoda lečenja maligne neoplastične bolesti kod subjekta tokom i posle imunoterapije inhibitorima kontrolne tačke, i/ili iv. ocenjivanje ponovnog javljanja maligne neoplastične bolesti kod subjekta tokom i posle imunoterapije inhibitorima kontrolne tačke, u kojem je subjekt sisar, koji ima ili za koga se sumnja da ima malignu neoplastičnu bolest.
3. 3. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 do 2, u kojem ciljna PD-L1 proba hidrolize obuhvata najmanje sekvencu 5'-6FAM-GCACATCCTCCA-BBQ-3' (SEQ ID NO: 7), poželjno ciljna PD-L1 proba hidrolize obuhvata sekvencu 5'-6FAM-ACCTCTGGCACATCCTCCAAATGAAAG-BBQ-3' (SEQ ID NO: 8) i dve fluorescentne čestice.
4. 4. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 do 3, u kojem je referentni gen izabran iz grupe koju čine hipoksantin fosforibozil transferaza (HPRT), β2-mikroglobulin (B2M), gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenaza (GAPDH) i β-aktin (ACTB), 18S ribozomalna RNK (18S rRNK), 28S ribozomalna RNK (28S rRNK), α-tubulin (TUBA), albumin (ALB), ribozomalni protein L32 (RPL32), vezujući protein TATA sekvence (TBP), ciklofilin C (CYCC), Efaktor izduživanja 1α (EF1A), RNK polimeraza II (RPII).
5. 5. Postupak prema zahtevu 4, u kojem referentni gen predstavlja mRNK sekvencu (SEQ ID NO: 2) β2-mikroglobulina (B2M), a prednji B2M referentni prajmer obuhvata najmanje sekvencu 5'-GCCGTGTGAAC-3' (SEQ ID NO: 9) ili prednji B2M referentni prajmer obuhvata sekvencu 5'-GCCTGCCGTGTGAACCATGT-3' (SEQ ID NO: 10) i u kojem reverzni B2M referentni prajmer obuhvata najmanje sekvencu 5'-CTTCAAACCTC-3' (SEQ ID NO: 11) ili reverzni B2M referentni prajmer obuhvata sekvencu 5'-AAATGCGGCATCTTCAAACCTC -3' (SEQ ID NO: 12).
6. 6. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 do 5, u kojem ciljna ili referentna proba hidrolize obuhvata fluorescentne čestice.
7. 7. Postupak prema zahtevu 6, u kojem fluorescentne čestice ciljne ili referentne probe hidrolize predstavljaju fluorescentni reporter kovalentno pričvršćen za 5' kraj ciljne ili referentne probe hidrolize i fluorecentnu boju za gašenje pričvršćenu za 3' kraj.
8. 8. Postupak prema zahtevu 7, u kojem fluorescentnu reportersku boju predstavlja 6-fluorescein (FAM), a fluorescentnu boju za gašenje predstavlja BlackBerry Sredstvo za gašenje (BBQ).
9. 9. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 do 8, u kojem referentna B2M proba hidrolize obuhvata najmanje sekvencu 5'-6FAM-CTCGATCCCAC-BBQ-3' (SEQ ID NO: 13), poželjno referentna B2M proba hidrolize obuhvata sekvencu 5'-6FAM-CATGATGCTGCTTACATGTCTCGATCCCAC -BBQ-3' (SEQ ID NO: 14) i dve fluorescentne čestice.
10. 10. Postupak prema bilo kom od zahteva 2 do 9, u kojem je maligna neoplastična bolest izabrana iz grupe koju čine kancer dojke, urotelijalni, kolorektalni, ezofagealni, gastrični, hepatocelularni karcinom, kancer pluća, melanom, nazofaringealni kancer, multipli mijelom, karcinom bubrežnih ćelija, limfomi, orofaringealni karcinom pločastih ćelija, kancer grlića materice, glioblastom, maligni mezoteliomi, kancer jajnika i pankreasa.
11. 11. Komplet za amplifikovanje PD-L1 ciljne sekvence i određivanje ekspresije PD-L1 mRNK u uzorku koji obuhvata; a) reagensi za amplifikaciju nukleinske kiseline, b) par ciljnih prajmera sposoban da hibridizuje sa PD-L1 mRNK i koji se sastoji od prednjeg ciljnog prajmera koji obuhvata sekvencu 5'-GCTGAATTGGTCATCCCAGAA-3' (SEQ ID NO: 4) i reverznog ciljnog prajmera koji obuhvata sekvencu 5'-TTTCACATCCATCATTCTCCCTT-3' (SEQ ID NO: 6), c) par referentnog prajmera sposoban da hibridizuje sa mRNK referentnog gena, d) ciljna proba hidrolize sposobna da hibridizuju sa PD-L1 mRNK e) referentna proba hidrolize sposobna da hibridizuje sa mRNK referentnog gena, f) opciono uputstva za izvođenje in vitro postupka kako je definisano u zahtevima 1 do 10.