RS60222B1 - Anti-cd166 antitela koja mogu da se aktiviraju i postupci za njihovu upotrebu - Google Patents

Anti-cd166 antitela koja mogu da se aktiviraju i postupci za njihovu upotrebu

Info

Publication number
RS60222B1
RS60222B1 RS20200511A RSP20200511A RS60222B1 RS 60222 B1 RS60222 B1 RS 60222B1 RS 20200511 A RS20200511 A RS 20200511A RS P20200511 A RSP20200511 A RS P20200511A RS 60222 B1 RS60222 B1 RS 60222B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
activatable
seq
amino acid
cancer
Prior art date
Application number
RS20200511A
Other languages
English (en)
Inventor
James William West
Jason Gary Sagert
Jonathan Alexander Terrett
Annie Yang Weaver
Luc Roland Desnoyers
Shweta Singh
Original Assignee
Cytomx Therapeutics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Cytomx Therapeutics Inc filed Critical Cytomx Therapeutics Inc
Publication of RS60222B1 publication Critical patent/RS60222B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
    • A61K31/537—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines spiro-condensed or forming part of bridged ring systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68033—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a maytansine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6873—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting an immunoglobulin; the antibody being an anti-idiotypic antibody
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6891—Pre-targeting systems involving an antibody for targeting specific cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

Opis
Oblast pronalaska
[0001] Pronalazak se uopšteno odnosi na antitela koja mogu da se aktiviraju koja se specifično vezuju za CD166 i postupke za pravljenje i upotrebu ovih anti-CD166 antitela, i anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju u raznim terapijskim, dijagnostičkim i profilaktičkim indikacijama.
Osnov pronalaska
[0002] Terapije zasnovane na antitelima pokazale su se kao efikasni tretmani za nekoliko bolesti, ali u nekim slučajevima, njihovu terapijsku efikasnost ograničila je toksičnost usled široke rasprostranjenosti ekspresije ciljnih molekula. Pored toga, terapeutici na bazi antitela ispoljili su i druga ograničenja, kao što je brzi klirens iz cirkulacije nakon primene. Komercijalno dostupna anti-CD166 antitela koja prepoznaju CD166 kako čoveka, tako i cinomolgousa, opisana su kod KE et al. (DIFFERENTIATION, 2009, 77(3), p.256-262), a terapijska efikasnost jednolančanog anti-CD166 Fv poznata je iz WIIGER et al. (CANCER IMMUNOLOGY, 2010, 59(11), p.1665-1674).
[0003] U oblasti niskomolekulskih terapeutika, razvijene su strategije za obezbeđivanje prolekova aktivnog hemijskog entiteta. Takvi prolekovi se primenjuju u relativno neaktivnom (ili značajno manje aktivnom) obliku. Kada se primeni, prolek se metaboliše in vivo u aktivno jedinjenje. Takve strategije prolekova mogu da obezbede povećanje selektivnosti leka za njegov predviđeni cilj i smanjenje neželjenih dejstava. Antitela koja mogu da se aktiviraju koja sadrže maskirajući fragment i fragment koji može da se otcepi, konjugovana sa lekom, poznata su iz WO2010/081173 i WO2014/197612.
[0004] Postoji kontinuirana potreba u oblasti terapeutika na bazi antitela za antitelima koja imitiraju željena svojstva niskomolekulskog proleka.
Kratak opis pronalaska
[0005] Pronalazak je definisan priloženim patentnim zahtevima.
[0006] U jednom aspektu, obezbeđeno je antitelo koje može da se aktivira koje, u aktiviranom stanju, vezuje CD166 koje sadrži: antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB) koji se specifično vezuje za sisarski CD166, pri čemu AB specifično vezuje CD166 čoveka i CD166 cinomolgus majmuna, gde AB sadrži CDR1 VH aminokiselinske sekvence GFSLSTYGMGVG (SEQ ID NO: 127), CDR2 VH aminokiselinske sekvence NIWWSEDKH (SEQ ID NO: 128), CDR3 VH aminokiselinske sekvence IDYGNDYAFTY (SEQ ID NO: 129), CDR1 VL aminokiselinske sekvence RSSKSLLHSNGITYLY (SEQ ID NO: 130) ili RSSQSLLHSNGITYLY (SEQ ID NO: 131), CDR2 VL aminokiselinske sekvence QMSNLAS (SEQ ID NO: 132) ili QMSNRAS (SEQ ID NO: 133), i CDR3 VL aminokiselinske sekvence AQNLELPYT (SEQ ID NO: 134); maskirajući fragment (MM) koji inhibira vezivanje AB za CD166 kada je antitelo koje može da se aktivira u neotcepljenom stanju, i gde je MM polipeptid dužine ne veće od 40 aminokiselina; fragment koji može da se otcepi (CM) kuplovan sa AB, pri čemu je CM polipeptid koji je supstrat za proteazu; i prvi povezujući peptid (LP1) i drugi povezujući peptid (LP2), pri čemu antitelo koje može da se aktivira u neotcepljenom stanju ima strukturni raspored od N-terminalnog kraja ka C-terminalnom kraju kao što sledi: MM-LP1-CM-LP2-AB i pri čemu je svaki od LP1 i LP2 peptid dužine od oko 1 do 20 aminokiselina.
[0007] U nekim primerima izvođenja, MM antitela koje može da se aktivira prema pronalasku: (i) ima konstantu disocijacije za vezivanje za AB koja je veća od konstante disocijacije AB sa CD166; i/ili (ii) ne interferira ili ne kompetira sa AB u vezivanju sa CD166 kada je antitelo koje može da se aktivira u otcepljenom stanju; i/ili (iii) polipeptidna sekvenca je drugačija od one kod CD166 čoveka; i/ili (iv) polipeptidna sekvenca nije više od 50% identična sa bilo kojim prirodnim vezujućim partnerom AB.
[0008] U nekim primerima izvođenja, njegov antigen-vezujući fragment odabran je iz grupe koja se sastoji od Fab fragmenta, F(ab')2 fragmenta, scFv, scAb i dAb.
[0009] U nekim primerima izvođenja, AB specifično vezuje CD166 čoveka. U nekim primerima izvođenja AB sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 121 ili SEQ ID NO: 122, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 123-126.
[0010] U nekim primerima izvođenja, dva vezujuća peptida ne moraju da budu međusobno identični.
[0011] U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira prema pronalasku sadrži: teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NOS: 121, 122 ili 239; i sekvencu lakog lanca koja sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOS: 123-126, 242, 244, 246, 248, 303, 310, 312, 314, 316, i 363-474.
[0012] U još jednom aspektu prema pronalasku, obezbeđeno je konjugovano antitelo koje može da se aktivira tako da, u aktiviranom stanju, vezuje CD166 koje sadrži: antitelo koje može da se aktivira prema pronalasku; i agens konjugovan sa AB.
[0013] U nekim primerima izvođenja antitela koje može da se aktivira ili konjugovanog antitela koje može da se aktivira prema pronalasku, MM sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 135-238.
[0014] U nekim primerima izvođenja antitela koje može da se aktivira ili konjugovanog antitela koje može da se aktivira prema pronalasku, CM sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 18-87 i 318-358.
[0015] U nekim primerima izvođenja antitela koje može da se aktivira ili konjugovanog antitela koje može da se aktivira prema pronalasku, MM sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 219-238.
[0016] U nekim primerima izvođenja antitela koje može da se aktivira ili konjugovanog antitela koje može da se aktivira prema pronalasku, CM sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 70-87 i 336-358.
[0017] U nekim primerima izvođenja antitela koje može da se aktivira ili konjugovanog antitela koje može da se aktivira prema pronalasku, agens je toksin ili njegov fragment.
[0018] Opciono, agens je inhibitor mikrotubula; ili agens koji oštećuje nukleinsku kiselinu; ili je odabran iz grupe koja se sastoji od dolastatina ili njegovog derivata, auristatina ili njegovog derivata, majtanzinoida ili njegovog derivata, duokarmicina ili njegovog derivata, kaliheamicina ili njegovog derivata, i pirolobenzodiazepina ili njegovog derivata; ili je agens auristatin E ili njegov derivat, monometil auristatin E (MMAE), monometil auristatin F (MMAF), monometil auristatin D (MMAD), majtanzinoid izabran iz grupe koja se sastoji od DM1 i DM4, majtanzinoid DM4, majtanzinoid DM1, duokarmicin, pirolobenzodiazepin, ili dimer pirolobenzodiazepina; i/ili je agens detektabilni fragment; gde je opciono detektabilni fragment dijagnostički agens.
[0019] U nekim primerima izvođenja antitela koje može da se aktivira ili konjugovanog antitela koje može da se aktivira prema pronalasku, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB) sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 121 i 122, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 123-126, 363-370, 373, 374, 377, 378, 381, 382, 385, 386, 389, 390, 393, 394, 397, 398, 401, 402, 405, 406, 409, 410, 413, 414, 417, 418, 421, 422, 425, 426, 429, 430, 433, 434, 437, 438, 441, 442, 445, 446, 449, 450, 453, 454, 457, 458, 461, 462, 465, 466, 469, 470, 473, i 474.
[0020] U nekim primerima izvođenja antitela koje može da se aktivira ili konjugovanog antitela koje može da se aktivira prema pronalasku:
(i) antitelo koje može da se aktivira sadrži kombinaciju aminokiselinskih sekvenci, gde je kombinacija aminokiselinskih sekvenci izabrana iz jednog reda u tabeli A, pri čemu za datu kombinaciju, (a) teški lanac AB sadrži aminokiselinske sekvence CDR VH sekvenci koje odgovaraju datoj kombinaciji u jednom redu navedenom u tabeli A, (b) laki lanac AB sadrži aminokiselinske sekvence CDR VL sekvenci koje odgovaraju datoj kombinaciji u jednom redu navedenom u tabeli A, (c) MM sadrži aminokiselinsku sekvencu maskirajuće sekvence (MM) koja odgovara datoj kombinaciji u jednom redu navedenom u tabeli A, i (d) CM sadrži aminokiselinsku sekvencu sekvence supstrata (CM) koja odgovara datoj kombinaciji u jednom redu navedenom u tabeli A; i/ili
(ii) antitelo koje može da se aktivira sadrži kombinaciju aminokiselinskih sekvenci, gde za datu kombinaciju aminokiselinskih sekvenci, (a) teški lanac AB sadrži aminokiselinske sekvence VH sekvence ili CDR VH sekvenci izabrane iz grupe koja se sastoji od: VH sekvence ili CDR VH sekvenci navedenih u odgovarajućoj koloni tabele B, (b) laki lanac AB sadrži aminokiselinske sekvence VL sekvence ili VL CDR sekvenci izabrane iz grupe koja se sastoji od: VL sekvence ili VL CDR sekvenci navedenih u odgovarajućoj koloni tabele B, (c) MM sadrži aminokiselinsku sekvencu maskirajuće sekvence (MM) izabranu iz grupe koja se sastoji od: MM sekvenci navedenih u odgovarajućoj koloni tabele B, i (d) CM sadrži aminokiselinsku sekvencu sekvence supstrata (CM) izabranu iz grupe koja se sastoji od: CM sekvenci navedenih u odgovarajućoj koloni tabele B; i/ili
(iii) antitelo koje može da se aktivira sadrži: teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 121, 122 ili 239; i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOS: 123-126, 242, 244, 246, 248, 303, 310, 312, 314, 316, i 363-474.
[0021] U nekim primerima izvođenja konjugovanog antitela koje može da se aktivira prema pronalasku agens je konjugovan sa AB preko linkera. Opciono linker kojim je agens konjugovan sa AB sadrži fragment SPDB, fragment vc, ili fragment PEG2-vc, i/ili linker i toksin konjugovan sa AB sadrži fragment SPDB-DM4, fragment vc-MMAD, fragment vc-MMAE, fragment vcduokarmicin, ili fragment PEG2-vc-MMAD; ili je linker takav, da može da se otcepi, ili da ne može da se otcepi.
[0022] U nekim primerima izvođenja, konjugovano antitelo koje može da se aktivira sadrži aminokiselinske sekvence, linker, i toksin izabran iz jednog reda u tabeli C, pri čemu za datu kombinaciju: (a) AB sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sekvence teškog lanca ili sekvence varijabilnog domena teškog lanca koja odgovara datoj kombinaciji u jednom redu navedenom u tabeli C, (b) AB sadrži laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sekvence lakog lanca ili sekvence varijabilnog domena lakog lanca koja odgovara datoj kombinaciji u jednom redu navedenom u tabeli C, i (c) linker i toksin sadrže linker i toksin koji odgovaraju datoj kombinaciji u jednom redu navedenom u tabeli C.
[0023] U još jednom aspektu prema pronalasku, obezbeđena je farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo koje može da se aktivira prema pronalasku, ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira prema pronalasku, i nosač.
[0024] U nekim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija sadrži dodatni agens, pri čemu je dodatni agens opciono terapijski agens.
[0025] U sledećem aspektu prema pronalasku, obezbeđen je molekul izolovane nukleinske kiseline kojai kodira antitelo koje može da se aktivira prema pronalasku.
[0026] U sledećem aspektu prema pronalasku, obezbeđen je vektor koji sadrži molekul izolovane nukleinske kiseline prema pronalasku.
[0027] U još jednom aspektu prema pronalasku, obezbeđen je postupak za proizvodnju antitela koje može da se aktivira kultivacijom ćelije pod uslovima koji vode ekspresiji antitela ili antitela koje može da se aktivira, pri čemu ćelija sadrži molekul nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu pronalaska ili vektor prema patentnom zahtevu pronalaska.
[0028] U sledećem aspektu prema pronalasku, obezbeđen je postupak za proizvodnju antitela koje može da se aktivira koje, u aktiviranom stanju, vezuje CD166, pri čemu postupak obuhvata: (a) kultivaciju ćelije koja sadrži konstrukt nukleinske kiseline koja kodira antitelo koje može da se aktivira pod uslovima koji vode ekspresiji antitela koje može da se aktivira, pri čemu antitelo koje može da se aktivira sadrži antitelo koje može da se aktivira prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4, 6, 7, 9, i 10; i (b) izdvajanje antitela koje može da se aktivira; i/ili opciono (c) konjugaciju agensa prema patentnom zahtevu 8 sa izdvojenim antitelom koje može da se aktivira.
[0029] U još jednom aspektu prema pronalasku, obezbeđeno je antitelo koje može da se aktivira prema pronalasku, konjugovano antitelo koje može da se aktivira prema pronalasku, ili farmaceutska kompozicija prema pronalasku, za upotrebu kao lek.
[0030] U sledećem aspektu prema pronalasku, obezbeđeno je antitelo koje može da se aktivira prema pronalasku, konjugovano antitelo koje može da se aktivira prema pronalasku, ili farmaceutska kompozicija prema pronalasku, za upotrebu u postupku za lečenje, ublažavanje simptoma, ili odlaganje progresije poremećaja ili bolesti udružene sa ćelijama koje eksprimiraju CD166, pri čemu je poremećaj ili bolest kancer.
[0031] U nekim primerima izvođenja, kancer je adenokarcinom, kancer žučnog kanala (bilijarnog trakta), kancer bešike, kancer kostiju, kancer dojke, Her2-negativni kancer dojke, trostruko-negativni kancer dojke, kancer endometrijuma, kancer dojke pozitivan na estrogenski receptor, karcinoid, kancer grlića materice, holangiokarcinom, kolorektalni kancer, kancer debelog creva, kancer endometrijuma, gliom, kancer glave i vrata, kancer skvamoznih ćelija glave i vrata, leukemija, kancer jetre, kancer pluća, nesitnoćelijski kancer pluća, sitnoćelijski kancer pluća, limfom, melanom, orofaringealni kancer, kancer jajnika, kancer pankreasa, kancer prostate, metastatski karcinom prostate otporan na kastraciju, bubrežni kancer, sarkom, kancer kože, kancer skvamoznih ćelija, kancer želuca, kancer testisa, tiroidni kancer, urogenitalni kancer, ili urotelijalni kancer.
[0032] U nekim primerima izvođenja kancer je odabran iz grupe koja se sastoji od holangiokarcinoma, kancera endometrijuma, trostruko negativnog kancera dojke (TNBC), kancera dojke pozitivnog na estrogenski receptor, nesitnoćelijskog kancera pluća (NSCLC), karcinoma prostate, sitnoćelijskog kancera pluća (SCLC), orofaringealnog kancera, kancera grlića materice, kancera jajnika, karcinoma skvamoznih ćelija glave i vrata (HNSCC) i kancera prostate.
[0033] U nekim primerima izvođenja, dva povezujuća peptida (L1 i L2) ne moraju da budu međusobno identična.
[0034] U nekim primerima izvođenja, najmanje jedan od LP1 ili LP2 sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od (GS)n, (GGS)n, (GSGGS)n(SEQ ID NO: 1) i (GGGS)n(SEQ ID NO: 2), gde je n ceo broj od najmanje jedan.
[0035] U nekim primerima izvođenja, najmanje jedan od LP1 ili LP2 sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od GGSG (SEQ ID NO: 3), GGSGG (SEQ ID NO: 4), GSGSG (SEQ ID NO: 5), GSGGG (SEQ ID NO: 6), GGGSG (SEQ ID NO: 7), i GSSSG (SEQ ID NO: 8).
[0036] U nekim primerima izvođenja, LP1 sadrži aminokiselinsku sekvencu GSSGGSGGSGGSG (SEQ ID NO: 9), GSSGGSGGSGG (SEQ ID NO: 10), GSSGGSGGSGGS (SEQ ID NO: 11), GSSGGSGGSGGSGGGS (SEQ ID NO: 12), GSSGGSGGSG (SEQ ID NO: 13), ili GSSGGSGGSGS (SEQ ID NO: 14).
[0037] U nekim primerima izvođenja, LP2 sadrži aminokiselinsku sekvencu GSS, GGS, GGGS (SEQ ID NO: 15), GSSGT (SEQ ID NO: 16) ili GSSG (SEQ ID NO: 17).
[0038] U nekim primerima izvođenja, AB ima konstantu disocijacije od oko 100 nM ili manje za vezivanje sa CD166.
[0039] U nekim primerima izvođenja, AB ima konstantu disocijacije od oko 100 nM ili manje za vezivanje sa sisarskim CD166. U nekim primerima izvođenja, AB ima konstantu disocijacije od oko 10 nM ili manje za vezivanje sa sisarskim CD166. U nekim primerima izvođenja, AB ima konstantu disocijacije od oko 5 nM ili manje za vezivanje sa CD166. U nekim primerima izvođenja, AB ima konstantu disocijacije od oko 1 nM ili manje za vezivanje sa CD166. U nekim primerima izvođenja, AB ima konstantu disocijacije od oko 0.5 nM ili manje za vezivanje sa CD166. U nekim primerima izvođenja, AB ima konstantu disocijacije od oko 0.1 nM ili manje za vezivanje sa CD166. U nekim primerima izvođenja, AB ima konstantu disocijacije od 0.01 nM do 100 nM, 0.01 nM do 10 nM, 0.01 nM do 5 nM, 0.01 nM do 1 nM, 0.01 do 0.5 nM, 0.01 nm do 0.1 nM, 0.01 nm do 0.05 nM, 0.05 nM do 100 nM, 0.05 nM do 10 nM, 0.05 nM do 5 nM, 0.05 nM do 1 nM, 0.05 do 0.5 nM, 0.05 nm do 0.1 nM, 0.1 nM do 100 nM, 0.1 nM do 10 nM, 0.1 nM do 5 nM, 0.1 nM do 1 nM, 0.1 do 0.5 nM, 0.5 nM do 100 nM, 0.5 nM do 10 nM, 0.5 nM do 5 nM, 0.5 nM do 1 nM, 1 nM do 100 nM, 1 nM do 10 nM, 1 nM do 5 nM, 5 nM do 100 nM, 5 nM do 10 nM, ili 10 nM do 100 nM, za vezivanje sa sisarskim CD166.
[0040] U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira u neotcepljenom stanju specifično vezuje sisarski CD166 sa konstantom disocijacije manjom od, ili jednakom 1 nM, manjom od, ili jednakom 5 nM, manjom od, ili jednakom 10 nM, manjom od, ili jednakom 15 nM, manjom od, ili jednakom 20 nM, manjom od, ili jednakom 25 nM, manjom od, ili jednakom 50 nM, manjom od, ili jednakom 100 nM, manjom od, ili jednakom 150 nM, manjom od, ili jednakom 250 nM, manjom od, ili jednakom 500 nM, manjom od, ili jednakom 750 nM, manjom od, ili jednakom 1000 nM, i 122. /ili manjom od, ili jednakom 2000 nM.
[0041] U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira u neotcepljenom stanju specifično vezuje sisarski CD166 sa konstantom disocijacije većom od, ili jednakom 1 nM, većom od, ili jednakom 5 nM, većom od, ili jednakom 10 nM, većom od, ili jednakom 15 nM, većom od, ili jednakom 20 nM, većom od, ili jednakom 25 nM, većom od, ili jednakom 50 nM, većom od, ili jednakom 100 nM, većom od, ili jednakom 150 nM, većom od, ili jednakom 250 nM, većom od, ili jednakom 500 nM, većom od, ili jednakom 750 nM, većom od, ili jednakom 1000 nM, i 122. /ili većom od, ili jednakom 2000 nM.
[0042] U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira u neotcepljenom stanju specifično vezuje sisarski CD166 sa konstantom disocijacije u opsegu od 1 nM do 2000 nM, 1 nM do 1000 nM, 1 nM do 750 nM, 1 nM do 500 nM, 1 nM do 250 nM, 1 nM do 150 nM, 1 nM do 100 nM, 1 nM do 50 nM, 1 nM do 25 nM, 1 nM do 15 nM, 1 nM do 10 nM, 1 nM do 5 nM, 5 nM do 2000 nM, 5 nM do 1000 nM, 5 nM do 750 nM, 5 nM do 500 nM, 5 nM do 250 nM, 5 nM do 150 nM, 5 nM do 100 nM, 5 nM do 50 nM, 5 nM do 25 nM, 5 nM do 15 nM, 5 nM do 10 nM, 10 nM do 2000 nM, 10 nM do 1000 nM, 10 nM do 750 nM, 10 nM do 500 nM, 10 nM do 250 nM, 10 nM do 150 nM, 10 nM do 100 nM, 10 nM do 50 nM, 10 nM do 25 nM, 10 nM do 15 nM, 15 nM do 2000 nM, 15 nM do 1000 nM, 15 nM do 750 nM, 15 nM do 500 nM, 15 nM do 250 nM, 15 nM do 150 nM, 15 nM do 100 nM, 15 nM do 50 nM, 15 nM do 25 nM, 25 nM do 2000 nM, 25 nM do 1000 nM, 25 nM do 750 nM, 25 nM do 500 nM, 25 nM do 250 nM, 25 nM do 150 nM, 25 nM do 100 nM, 25 nM do 50 nM, 50 nM do 2000 nM, 50 nM do 1000 nM, 50 nM do 750 nM, 50 nM do 500 nM, 50 nM do 250 nM, 50 nM do 150 nM, 50 nM do 100 nM, 100 nM do 2000 nM, 100 nM do 1000 nM, 100 nM do 750 nM, 100 nM do 500 nM, 100 nM do 250 nM, 100 nM do 150 nM, 150 nM do 2000 nM, 150 nM do 1000 nM, 150 nM do 750 nM, 150 nM do 500 nM, 150 nM do 250 nM, 250 nM do 2000 nM, 250 nM do 1000 nM, 250 nM do 750 nM, 250 nM do 500 nM, 500 nM do 2000 nM, 500 nM do 1000 nM, 500 nM do 750 nM, 500 nM do 500 nM, 500 nM do 250 nM, 500 nM do 150 nM, 500 nM do 100 nM, 500 nM do 50 nM, 750 nM do 2000 nM, 750 nM do 1000 nM, ili 1000 nM do 2000 nM.
[0043] U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira u aktiviranom stanju specifično vezuje sisarski CD166 sa konstantom disocijacije manjom od, ili jednakom 0.01 nM, 0.05 nM, 0.1 nM, 0.5 nM, 1 nM, 5 nM, ili 10 nM.
[0044] U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira u aktiviranom stanju specifično vezuje sisarski CD166 sa konstantom disocijacije većom od, ili jednakom 0.01 nM, 0.05 nM, 0.1 nM, 0.5 nM, 1 nM, 5 nM, ili 10 nM.
[0045] U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira u aktiviranom stanju specifično vezuje sisarski CD166 sa konstantom disocijacije u opsegu od 0.01 nM do 100 nM, 0.01 nM do 10 nM, 0.01 nM do 5 nM, 0.01 nM do 1 nM, 0.01 do 0.5 nM, 0.01 nM do 0.1 nM, 0.01 nM do 0.05 nM, 0.05 nM do 100 nM, 0.05 nM do 10 nM, 0.05 nM do 5 nM, 0.05 nM do 1 nM, 0.05 do 0.5 nM, 0.05 nm do 0.1 nM, 0.1 nM do 100 nM, 0.1 nM do 10 nM, 0.1 nM do 5 nM, 0.1 nM do 1 nM, 0.1 to 0.5 nM, 0.5 nM do 100 nM, 0.5 nM do 10 nM, 0.5 nM do 5 nM, 0.5 nM do 1 nM, 1 nM do 100 nM, 1 nM do 10 nM, 1 nM do 5 nM, 5 nM do 100 nM, 5 nM do 10 nM, ili 10 nM do 100 nM.
[0046] U nekim primerima izvođenja, sisarski CD166 odabran je iz grupe koja se sastoji od CD166 čoveka i CD166 cinomolgus majmuna. U nekim primerima izvođenja, AB specifično vezuje CD166 čoveka ili CD166 cinomolgus majmuna sa konstantom disocijacije manjom od 1 nM. U nekim primerima izvođenja, sisarski CD166 je CD166 čoveka. U nekim primerima izvođenja, sisarski CD166 je CD166 cinomolgusa.
[0047] U nekim primerima izvođenja, AB ima jedno ili više od sledećih svojstava: (a) AB specifično vezuje CD166 čoveka; i (b) AB specifično vezuje CD166 čoveka i CD166 cinomolgus majmuna.
[0048] U nekim primerima izvođenja, AB ima jedno ili više od sledećih svojstava: (a) AB specifično vezuje CD166 čoveka i CD166 cinomolgus majmuna; (b) AB inhibira vezivanje sisarskog CD6 za sisarski CD166; (c) AB inhibira vezivanje CD6 čoveka za CD166 čoveka; i (d) AB inhibira vezivanje CD6 cinomolgus majmuna za CD166 cinomolgus majmuna.
[0049] U nekim primerima izvođenja, AB blokira sposobnost prirodnog liganda ili receptora da veže sisarski CD166 sa EC50 manjom od, ili jednakom 5 nM, manjom od, ili jednakom 10 nM, manjom od, ili jednakom 50 nM, manjom od, ili jednakom 100 nM, manjom od, ili jednakom 500 nM, i/ili manjom od, ili jednakom 1000 nM. U nekim primerima izvođenja, AB blokira sposobnost sisarskog CD6 da veže sisarski CD166 sa EC50 manjom od, ili jednakom 5 nM, manjom od, ili jednakom 10 nM, manjom od, ili jednakom 50 nM, manjom od, ili jednakom 100 nM, manjom od, ili jednakom 500 nM, i/ili manjom od, ili jednakom 1000 nM. U nekim primerima izvođenja, prirodni ligand ili receptor CD166 je CD6.
[0050] U nekim primerima izvođenja, AB blokira sposobnost prirodnog liganda da veže sisarski CD166 sa EC50 od 5 nM do 1000 nM, 5 nM do 500 nM, 5 nM do 100 nM 5 nM do 50 nM, 5 nM do 10 nM, 10 nM do 1000 nM, 10 nM do 500 nM, 10 nM do 100 nM 10 nM do 50 nM, 50 nM do 1000 nM, 50 nM do 500 nM, 50 nM do 100 nM, 100 nM do 1000 nM, 100 nM do 500 nM, 500 nM do 1000 nM. U nekim primerima izvođenja, AB blokira sposobnost sisarskog CD6 da veže sisarski CD166 sa EC50 od 5 nM do 1000 nM, 5 nM do 500 nM, 5 nM do 100 nM 5 nM do 50 nM, 5 nM do 10 nM, 10 nM do 1000 nM, 10 nM do 500 nM, 10 nM do 100 nM 10 nM do 50 nM, 50 nM do 1000 nM, 50 nM do 500 nM, 50 nM do 100 nM, 100 nM do 1000 nM, 100 nM do 500 nM, 500 nM do 1000 nM. U nekim primerima izvođenja, prirodni ligand ili receptor CD166 je CD6.
[0051] U nekim primerima izvođenja, AB predmetnog otkrića inhibira ili redukuje rast, proliferaciju, i/ili metastazu ćelija koje eksprimiraju sisarski CD166. Bez želje za vezivanjem za neku određenu teoriju, AB predmetnog otkrića može da inhibira ili redukuje rast, proliferaciju, i/ili metastazu ćelija koje eksprimiraju sisarski CD166 specifičnim vezivanjem CD166 i inhibiranjem, blokiranjem, i/ili sprečavanjem vezivanja prirodnog liganda ili receptora za sisarski CD166. U nekim primerima izvođenja, prirodni ligand ili receptor sisarskog CD166 je sisarski CD6.
[0052] U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira uključuje jedan ili više polipeptida koji uključuju kombinaciju sekvenci u datom redu tabele A ili bilo koju kombinaciju maskirajuće sekvence (MM), sekvence supstrata (CM), sekvence varijabilnog domena lakog lanca ili CDR sekvenci varijabilnog domena lakog lanca, i sekvence varijabilnog domena teškog lanca ili CDR sekvenci varijabilnog domena teškog lanca iz tabele B.
[0053] U nekim primerima izvođenja, konjugati antitela i leka (ADC) i konjugati antitela koje može da se aktivira i leka (AADC) mogu da uključuju jedan ili više polipeptida koji uključuju kombinaciju sekvence lakog lanca ili sekvenci varijabilnog domena lakog lanca, i sekvence teškog lanca ili sekvenci varijabilnog domena teškog lanca, linker, i toksin u datom redu tabele C ili bilo koju kombinaciju sekvence lakog lanca ili sekvence varijabilnog domena lakog lanca, i sekvence teškog lanca ili sekvence varijabilnog domena teškog lanca, linker, i toksin iz tabele C.
[0054] U nekim primerima izvođenja, MM ima konstantu disocijacije za vezivanje sa AB koja je veća od konstante disocijacije AB sa CD166.
1
[0055] U nekim primerima izvođenja, MM ima konstantu disocijacije za vezivanje sa AB koja nije veća od konstante disocijacije AB sa CD166.
[0056] U nekim primerima izvođenja, MM ima konstantu disocijacije za vezivanje sa AB koja je manja od konstante disocijacije AB sa CD166.
[0057] U nekim primerima izvođenja, konstanta disocijacije (Kd) MM prema AB nije više od 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1 000, 2500, 5000, 10 000, 50000, 100000, 500 000, 1000 000, 5000 000, 10000 000, 50 000 000 puta ili više veća, ili je između 1-5, 5-10, 10-100, 10-1 000, 10-10000, 10-100000, 10-1000 000, 10-10000 000, 100-1000, 100-10000, 100-100000, 100-1 000 000, 100-10 000 000, 1 000-10 000, 1 000-100 000, 1 000-1 000 000, 1000-10000 000, 10000-100 000, 10000-1 000 000, 10 000-10 000 000, 100000-1 000 000, ili 100000-10 000 000 puta ili više veća od konstante disocijacije AB prema ciljnom molekulu.
[0058] U nekim primerima izvođenja, MM ne interferira ili kompetira sa AB za vezivanje sa CD166 kada je antitelo koje može da se aktivira u otcepljenom stanju.
[0059] U nekim primerima izvođenja, MM je polipeptid dužine od oko 2 do 40 aminokiselina. U nekim primerima izvođenja, MM je polipeptid dužine od sve do oko 40 aminokiselina.
[0060] U nekim primerima izvođenja, polipeptidna sekvenca MM je drugačija od one kod CD166. U nekim primerima izvođenja, polipeptidna sekvenca MM nije više od 50% identična sa bilo kojim prirodnim vezujućim partnerom AB. U nekim primerima izvođenja, polipeptidna sekvenca MM je drugačija od one kod CD166 i nije više od 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, ili 10% identična sa bilo kojim prirodnim vezujućim partnerom AB.
[0061] U nekim primerima izvođenja, kuplovanje MM sa AB redukuje sposobnost AB da veže CD166 tako da je konstanta disocijacije (Kd) AB prema CD166 kada je kuplovan sa MM najmanje dva puta veća od KdAB prema CD166 kada nije kuplovan sa MM.
[0062] U nekim primerima izvođenja, kuplovanje MM sa AB redukuje sposobnost AB da veže CD166 tako da je konstanta disocijacije (Kd) AB prema CD166 kada je kuplovan sa MM najmanje pet puta veća od KdAB prema CD166 kada nije kuplovan sa MM.
[0063] U nekim primerima izvođenja, kuplovanje MM sa AB redukuje sposobnost AB da veže CD166 tako da je konstanta disocijacije (Kd) AB prema CD166 kada je kuplovan sa MM najmanje 10 puta veća od KdAB prema CD166 kada nije kuplovan sa MM.
[0064] U nekim primerima izvođenja, kuplovanje MM sa AB redukuje sposobnost AB da veže CD166 tako da je konstanta disocijacije (Kd) AB prema CD166 kada je kuplovan sa MM najmanje 20 puta veća od KdAB prema CD166 kada nije kuplovan sa MM.
[0065] U nekim primerima izvođenja, kuplovanje MM sa AB redukuje sposobnost AB da veže CD166 tako da je konstanta disocijacije (Kd) AB prema CD166 kada je kuplovan sa MM najmanje 40 puta veća od KdAB prema CD166 kada nije kuplovan sa MM.
[0066] U nekim primerima izvođenja, kuplovanje MM sa AB redukuje sposobnost AB da veže CD166 tako da je konstanta disocijacije (Kd) AB prema CD166 kada je kuplovan sa MM najmanje 100 puta veća od KdAB prema CD166 kada nije kuplovan sa MM.
[0067] U nekim primerima izvođenja, kuplovanje MM sa AB redukuje sposobnost AB da veže CD166 tako da je konstanta disocijacije (Kd) AB prema CD166 kada je kuplovano sa MM najmanje 1000 puta veća od KdAB prema CD166 kada nije kuplovano sa MM.
[0068] U nekim primerima izvođenja, kuplovanje MM sa AB redukuje sposobnost AB da veže CD166 tako da je konstanta disocijacije (Kd) AB prema CD166 kada je kuplovan sa MM najmanje 10 000 puta veća od KdAB prema CD166 kada nije kuplovan sa MM.
[0069] U nekim primerima izvođenja, u prisustvu CD166, MM redukuje sposobnost AB da veže CD166 za najmanje 90% kada je CM neotcepljen, u poređenju sa time kada je CM otcepljen, kada se ispituje in vitro upotrebom testa zamene ciljnog molekula kao što je, na primer, test opisan u PCT objavi br. WO 2010/081173.
[0070] U nekim primerima izvođenja, MM sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 135-238.
[0071] U nekim primerima izvođenja, proteaza koja cepa CM je aktivna, npr., ushodno regulisana ili drugačije neregulisana, u obolelom tkivu, i proteaza cepa CM u antitelu koje može da se aktivira kada je antitelo koje može da se aktivira izloženo proteazi.
[0072] U nekim primerima izvođenja, proteaza je ko-lokalizovana sa CD166 u tkivu, i proteaza cepa CM u antitelu koje može da se aktivira kada je antitelo koje može da se aktivira izloženo proteazi.
[0073] U nekim primerima izvođenja, CM je postavljena u antitelu koje može da se aktivira na taj način da je, kada je antitelo koje može da se aktivira u neotcepljenom stanju, vezivanje antitela koje može da se aktivira za CD166 redukovano, tako da se odvija sa konstantom disocijacije koja je najmanje dvaput veća od konstante disocijacije kojom se nemodifikovano AB vezuje za CD166, dok u otcepljenom stanju (tj., kada je antitelo koje može da se aktivira u otcepljenom stanju), AB vezuje CD166.
[0074] U nekim primerima izvođenja, CM je postavljena u antitelu koje može da se aktivira na taj način da je, kada je antitelo koje može da se aktivira u neotcepljenom stanju, vezivanje antitela koje može da se aktivira za CD166 redukovano tako da se odvija sa konstantom disocijacije koja je najmanje pet puta veća od konstante disocijacije kojom se nemodifikovano AB vezuje za CD166, dok u otcepljenom stanju (tj., kada je antitelo koje može da se aktivira u otcepljenom stanju), AB vezuje CD166.
[0075] U nekim primerima izvođenja, CM je postavljena u antitelu koje može da se aktivira na taj način da je, kada je antitelo koje može da se aktivira u neotcepljenom stanju, vezivanje antitela koje može da se aktivira za CD166 redukovano tako da se odvija sa konstantom disocijacije koja je najmanje 10 puta veća od konstante disocijacije kojom se nemodifikovano AB vezuje za CD166, dok u otcepljenom stanju (tj., kada je antitelo koje može da se aktivira u otcepljenom stanju), AB vezuje CD166.
[0076] U nekim primerima izvođenja, CM je postavljena u antitelu koje može da se aktivira na taj način da je, kada je antitelo koje može da se aktivira u neotcepljenom stanju, vezivanje antitela koje može da se aktivira za CD166 redukovano tako da se odvija sa konstantom disocijacije koja je najmanje 20 puta veća od konstante disocijacije kojom se nemodifikovano AB vezuje za CD166, dok u otcepljenom stanju (tj., kada je antitelo koje može da se aktivira u otcepljenom stanju), AB vezuje CD166.
[0077] U nekim primerima izvođenja, CM je postavljena u antitelu koje može da se aktivira na taj način da je, kada je antitelo koje može da se aktivira u neotcepljenom stanju, vezivanje antitela koje može da se aktivira za CD166 redukovano tako da se odvija sa konstantom disocijacije koja je najmanje 40 puta veća od konstante disocijacije kojom se nemodifikovano AB vezuje za CD166, dok u otcepljenom stanju, AB vezuje CD166.
[0078] U nekim primerima izvođenja, CM je postavljena u antitelu koje može da se aktivira na taj način da je, kada je antitelo koje može da se aktivira u neotcepljenom stanju, vezivanje antitela koje može da se aktivira za CD166 redukovano tako da se odvija sa konstantom disocijacije koja je najmanje 50 veća od konstante disocijacije kojom se nemodifikovano AB vezuje za CD166, dok u otcepljenom stanju, AB vezuje CD166.
[0079] U nekim primerima izvođenja, CM je postavljena u antitelu koje može da se aktivira na taj način da je, kada je antitelo koje može da se aktivira u neotcepljenom stanju, vezivanje antitela koje može da se aktivira za CD166 redukovano tako da se odvija sa konstantom disocijacije koja je najmanje 100 veća odkonstante disocijacije kojom se nemodifikovano AB vezuje za CD166, dok u otcepljenom stanju, AB vezuje CD166.
[0080] U nekim primerima izvođenja, CM je postavljena u antitelu koje može da se aktivira na taj način da je, kada je antitelo koje može da se aktivira u neotcepljenom stanju, vezivanje antitela koje može da se aktivira za CD166 redukovano tako da se odvija sa konstantom disocijacije koja je najmanje 200 puta veća od konstante disocijacije kojom se nemodifikovano AB vezuje za CD166, dok u otcepljenom stanju, AB vezuje CD166.
[0081] U nekim primerima izvođenja, CM je polipeptid dužine do 15 aminokiselina.
[0082] U nekim primerima izvođenja, CM je polipeptid koji uključuje prvi fragment koji može da se otcepi (CM1), koji predstavlja supstrat za najmanje jednu matriksnu metaloproteazu (MMP) i drugi fragment koji može da se otcepi (CM2), koji predstavlja supstrat za najmanje jednu serin
1
proteazu (SP). U nekim primerima izvođenja, svaka od CM1 sekvence supstrata i CM2 sekvence supstrata CM1-CM2 supstrata je nezavisno polipeptid dužine do 15 aminokiselina.
[0083] U nekim primerima izvođenja, CM je supstrat za najmanje jednu proteazu koja je, ili se smatra da je, ushodno regulisana ili drugačije neregulisana kod kancera. U nekim primerima izvođenja, CM je supstrat za najmanje jednu proteazu koja je, ili se smatra da je, ushodno regulisana kod zapaljenja. U nekim primerima izvođenja, CM je supstrat za najmanje jednu proteazu koja je, ili se smatra da je, ushodno regulisana ili drugačije neregulusana kod autoimuniteta.
[0084] U nekim primerima izvođenja, CM je supstrat za najmanje jednu proteazu izabranu iz grupe koja se sastoji od matriksne metaloproteaze (MMP), trombina, neutrofilne elastaze, cistein proteaze, legumaina, i serin proteaze, kao što je matriptaza (MT-SP1) i urokinaza (uPA). Bez vezivanja za teoriju, smatra se da su ove proteaze ushodno regulisane ili drugačije neregulisane kod najmanje jednog od kancera, zapaljenja, i/ili autoimuniteta.
[0085] Primeri supstrata uključuju, ali nisu ograničeni na supstrate koje mogu da se cepaju pomoću jednog ili više od sledećih enzima ili proteaza navedenih u tabeli 4.
[0086] U nekim primerima izvođenja, CM je odabran za upotrebu sa određenom proteazom, na primer, sa proteazom za koju se zna da je ko-lokalizovana sa ciljnim molekulima za antitela koja mogu da se aktiviraju.
[0087] U nekim primerima izvođenja, CM je supstrat za najmanje jednu MMP. Primeri MMP uključuju MMP navedene u tabeli 4. U nekim primerima izvođenja, CM je supstrat za proteazu izabran iz grupe koja se sastoji od MMP 9, MMP14, MMP1, MMP3, MMP13, MMP17, MMP11, i MMP19. U nekim primerima izvođenja CM je supstrat za MMP9. U nekim primerima izvođenja, CM je supstrat za MMP14.
[0088] U nekim primerima izvođenja, CM je supstrat koji uključuje sekvencu TGRGPSWV (SEQ ID NO: 18); SARGPSRW (SEQ ID NO: 19); TARGPSFK (SEQ ID NO: 20); LSGRSDNH (SEQ ID NO: 21); GGWHTGRN (SEQ ID NO: 22); HTGRSGAL (SEQ ID NO: 23); PLTGRSGG (SEQ ID NO: 24); AARGPAIH (SEQ ID NO: 25); RGPAFNPM (SEQ ID NO: 26); SSRGPAYL (SEQ ID NO: 27); RGPATPIM (SEQ ID NO: 28); RGPA (SEQ ID NO: 29); GGQPSGMWGW (SEQ ID NO: 30); FPRPLGITGL (SEQ ID NO: 31); VHMPLGFLGP (SEQ ID NO: 32); SPLTGRSG (SEQ ID NO: 33); SAGFSLPA (SEQ ID NO: 34); LAPLGLQRR (SEQ ID NO: 35); SGGPLGVR (SEQ ID NO: 36); PLGL (SEQ ID NO: 37); LSGRSGNH (SEQ ID NO: 318); SGRSANPRG (SEQ ID NO: 319); LSGRSDDH (SEQ ID NO: 320); LSGRSDIH (SEQ ID NO: 321); LSGRSDQH (SEQ ID NO: 322); LSGRSDTH (SEQ ID NO: 323); LSGRSDYH (SEQ ID NO: 324); LSGRSDNP (SEQ ID NO: 325); LSGRSANP (SEQ ID NO: 326); LSGRSANI (SEQ ID NO: 327); LSGRSDNI (SEQ ID NO: 328); MIAPVAYR (SEQ ID NO: 329); RPSPMWAY (SEQ ID NO: 330); WATPRPMR (SEQ ID NO: 331); FRLLDWQW (SEQ ID NO: 332); ISSGL (SEQ ID NO: 333); ISSGLLS (SEQ ID NO: 334); i/ili ISSGLL (SEQ ID NO: 335).
[0089] U nekim primerima izvođenja, CM sadrži aminokiselinsku sekvencu LSGRSDNH (SEQ ID NO: 21). U nekim primerima izvođenja, CM sadrži aminokiselinsku sekvencu TGRGPSWV (SEQ ID NO: 18). U nekim primerima izvođenja, CM sadrži aminokiselinsku sekvencu PLTGRSGG (SEQ ID NO: 24). U nekim primerima izvođenja, CM sadrži aminokiselinsku sekvencu GGQPSGMWGW (SEQ ID NO: 30). U nekim primerima izvođenja, CM sadrži aminokiselinsku sekvencu FPRPLGITGL (SEQ ID NO: 31). U nekim primerima izvođenja, CM sadrži aminokiselinsku sekvencu VHMPLGFLGP (SEQ ID NO: 32). U nekim primerima izvođenja, CM sadrži aminokiselinsku sekvencu PLGL (SEQ ID NO: 37). U nekim primerima izvođenja, CM sadrži aminokiselinsku sekvencu SARGPSRW (SEQ ID NO: 19). U nekim primerima izvođenja, CM sadrži aminokiselinsku sekvencu TARGPSFK (SEQ ID NO: 20). U nekim primerima izvođenja, CM sadrži aminokiselinsku sekvencu GGWHTGRN (SEQ ID NO: 22). U nekim primerima izvođenja, CM sadrži aminokiselinsku sekvencu HTGRSGAL (SEQ ID NO: 23). U nekim primerima izvođenja, CM sadrži aminokiselinsku sekvencu AARGPAIH (SEQ ID NO: 25). U nekim primerima izvođenja, CM sadrži aminokiselinsku sekvencu RGPAFNPM (SEQ ID NO: 26). U nekim primerima izvođenja, CM sadrži aminokiselinsku sekvencu SSRGPAYL (SEQ ID NO: 27). U nekim primerima izvođenja, CM sadrži aminokiselinsku sekvencu RGPATPIM (SEQ ID NO: 28). U nekim primerima izvođenja, CM sadrži aminokiselinsku sekvencu RGPA (SEQ ID NO: 29). U nekim primerima izvođenja, CM sadrži aminokiselinsku sekvencu LSGRSGNH (SEQ ID NO: 318). U nekim primerima izvođenja, CM sadrži aminokiselinsku sekvencu SGRSANPRG (SEQ ID NO: 319). U nekim primerima izvođenja, CM sadrži aminokiselinsku sekvencu LSGRSDDH (SEQ ID NO: 320). U nekim primerima izvođenja, CM sadrži aminokiselinsku sekvencu LSGRSDIH (SEQ ID NO: 321). U nekim primerima izvođenja, CM sadrži aminokiselinsku sekvencu LSGRSDQH (SEQ ID NO: 322). U nekim primerima izvođenja, CM sadrži aminokiselinsku sekvencu LSGRSDTH (SEQ ID NO: 323). U nekim primerima izvođenja, CM sadrži aminokiselinsku sekvencu LSGRSDYH (SEQ ID NO: 324). U nekim primerima izvođenja, CM sadrži aminokiselinsku sekvencu LSGRSDNP (SEQ ID NO: 325). U nekim primerima izvođenja, CM sadrži aminokiselinsku sekvencu LSGRSANP (SEQ ID NO: 326). U nekim primerima izvođenja, CM sadrži aminokiselinsku sekvencu LSGRSANI (SEQ ID NO: 327). U nekim primerima izvođenja, CM sadrži aminokiselinsku sekvencu LSGRSDNI (SEQ ID NO: 328). U nekim primerima izvođenja, CM sadrži aminokiselinsku sekvencu MIAPVAYR (SEQ ID NO: 329). U nekim primerima izvođenja, CM sadrži aminokiselinsku sekvencu RPSPMWAY (SEQ ID NO: 330). U
1
nekim primerima izvođenja, CM sadrži aminokiselinsku sekvencu WATPRPMR (SEQ ID NO: 331). U nekim primerima izvođenja, CM sadrži aminokiselinsku sekvencu FRLLDWQW (SEQ ID NO: 332). U nekim primerima izvođenja, CM sadrži aminokiselinsku sekvencu ISSGL (SEQ ID NO: 333). U nekim primerima izvođenja, CM sadrži aminokiselinsku sekvencu ISSGLLS (SEQ ID NO: 334). U nekim primerima izvođenja, CM sadrži aminokiselinsku sekvencu i/ili ISSGLL (SEQ ID NO: 335).
[0090] U nekim primerima izvođenja, CM je supstrat za MMP i uključuje sekvencu ISSGLSS (SEQ ID NO: 38); QNQALRMA (SEQ ID NO: 39); AQNLLGMV (SEQ ID NO: 40); STFPFGMF (SEQ ID NO: 41); PVGYTSSL (SEQ ID NO: 42); DWLYWPGI (SEQ ID NO: 43), ISSGLLSS (SEQ ID NO: 44), LKAAPRWA (SEQ ID NO: 45); GPSHLVLT (SEQ ID NO: 46); LPGGLSPW (SEQ ID NO: 47); MGLFSEAG (SEQ ID NO: 48); SPLPLRVP (SEQ ID NO: 49); RMHLRSLG (SEQ ID NO: 50); LAAPLGLL (SEQ ID NO: 51); AVGLLAPP (SEQ ID NO: 52); LLAPSHRA (SEQ ID NO: 53); i/ili PAGLWLDP (SEQ ID NO: 54).
[0091] U nekim primerima izvođenja, CM sadrži aminokiselinsku sekvencu ISSGLSS (SEQ ID NO: 38). U nekim primerima izvođenja, CM sadrži aminokiselinsku sekvencu QNQALRMA (SEQ ID NO: 39). U nekim primerima izvođenja, CM sadrži aminokiselinsku sekvencu AQNLLGMV (SEQ ID NO: 40). U nekim primerima izvođenja, CM sadrži aminokiselinsku sekvencu STFPFGMF (SEQ ID NO: 41). U nekim primerima izvođenja, CM sadrži aminokiselinsku sekvencu PVGYTSSL (SEQ ID NO: 42). U nekim primerima izvođenja, CM sadrži aminokiselinsku sekvencu DWLYWPGI (SEQ ID NO: 43). U nekim primerima izvođenja, CM sadrži aminokiselinsku sekvencu ISSGLLSS (SEQ ID NO: 44). U nekim primerima izvođenja, CM sadrži aminokiselinsku sekvencu LKAAPRWA (SEQ ID NO: 45). U nekim primerima izvođenja, CM sadrži aminokiselinsku sekvencu GPSHLVLT (SEQ ID NO: 46). U nekim primerima izvođenja, CM sadrži aminokiselinsku sekvencu LPGGLSPW (SEQ ID NO: 47). U nekim primerima izvođenja, CM sadrži aminokiselinsku sekvencu MGLFSEAG (SEQ ID NO: 48). U nekim primerima izvođenja, CM sadrži aminokiselinsku sekvencu SPLPLRVP (SEQ ID NO: 49). U nekim primerima izvođenja, CM sadrži aminokiselinsku sekvencu RMHLRSLG (SEQ ID NO: 50). U nekim primerima izvođenja, CM sadrži aminokiselinsku sekvencu LAAPLGLL (SEQ ID NO: 51). U nekim primerima izvođenja, CM sadrži aminokiselinsku sekvencu AVGLLAPP (SEQ ID NO: 52). U nekim primerima izvođenja, CM sadrži aminokiselinsku sekvencu LLAPSHRA (SEQ ID NO: 53). U nekim primerima izvođenja, CM sadrži aminokiselinsku sekvencu PAGLWLDP (SEQ ID NO: 54).
[0092] U nekim primerima izvođenja, CM je supstrat za trombin. U nekim primerima izvođenja, CM je supstrat za trombin i uključuje sekvencu GPRSFGL (SEQ ID NO: 55) ili GPRSFG (SEQ ID NO: 56). U nekim primerima izvođenja, CM sadrži aminokiselinsku sekvencu GPRSFGL
1
(SEQ ID NO: 57). U nekim primerima izvođenja, CM sadrži aminokiselinsku sekvencu GPRSFG (SEQ ID NO: 58).
[0093] U nekim primerima izvođenja, CM sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od NTLSGRSENHSG (SEQ ID NO: 59); NTLSGRSGNHGS (SEQ ID NO: 60); TSTSGRSANPRG (SEQ ID NO: 61); TSGRSANP (SEQ ID NO: 62); VAGRSMRP (SEQ ID NO: 63); VVPEGRRS (SEQ ID NO: 64); ILPRSPAF (SEQ ID NO: 65); MVLGRSLL (SEQ ID NO: 66); QGRAITFI (SEQ ID NO: 67); SPRSIMLA (SEQ ID NO: 68); i SMLRSMPL (SEQ ID NO: 69).
[0094] U nekim primerima izvođenja, CM sadrži aminokiselinsku sekvencu NTLSGRSENHSG (SEQ ID NO: 59). U nekim primerima izvođenja, CM sadrži aminokiselinsku sekvencu NTLSGRSGNHGS (SEQ ID NO: 60). U nekim primerima izvođenja, CM sadrži aminokiselinsku sekvencu TSTSGRSANPRG (SEQ ID NO: 61). U nekim primerima izvođenja, CM sadrži aminokiselinsku sekvencu TSGRSANP (SEQ ID NO: 62). U nekim primerima izvođenja, CM sadrži aminokiselinsku sekvencu VAGRSMRP (SEQ ID NO: 63). U nekim primerima izvođenja, CM sadrži aminokiselinsku sekvencu VVPEGRRS (SEQ ID NO: 64). U nekim primerima izvođenja, CM sadrži aminokiselinsku sekvencu ILPRSPAF (SEQ ID NO: 65). U nekim primerima izvođenja, CM sadrži aminokiselinsku sekvencu MVLGRSLL (SEQ ID NO: 66). U nekim primerima izvođenja, CM sadrži aminokiselinsku sekvencu QGRAITFI (SEQ ID NO: 67). U nekim primerima izvođenja, CM sadrži aminokiselinsku sekvencu SPRSIMLA (SEQ ID NO: 68). U nekim primerima izvođenja, CM sadrži aminokiselinsku sekvencu SMLRSMPL (SEQ ID NO: 69).
[0095] U nekim primerima izvođenja, CM je supstrat za neutrofilnu elastazu. U nekim primerima izvođenja, CM je supstrat za serin proteazu. U nekim primerima izvođenja, CM je supstrat za uPA. U nekim primerima izvođenja, CM je supstrat za legumain. U nekim primerima izvođenja, CM je supstrat za matriptazu. U nekim primerima izvođenja, CM je supstrat za cistein proteazu. U nekim primerima izvođenja, CM je supstrat za cistein proteazu, kao što je katepsin.
[0096] U nekim primerima izvođenja, CM je CM1-CM2 supstrat i uključuje sekvencu ISSGLLSGRSDNH (SEQ ID NO: 70), koji je u ovom dokumentu označen i kao supstrat 2001; ISSGLLSSGGSGGSLSGRSDNH (SEQ ID NO: 71); AVGLLAPPGGTSTSGRSANPRG (SEQ ID NO: 72); TSTSGRSANPRGGGAVGLLAPP (SEQ ID NO: 73); VHMPLGFLGPGGTSTSGRSANPRG (SEQ ID NO: 74); TSTSGRSANPRGGGVHMPLGFLGP (SEQ ID NO: 75); AVGLLAPPGGLSGRSDNH (SEQ ID NO: 76), koji je u ovom dokumentu označen i kao supstrat 3001; LSGRSDNHGGAVGLLAPP (SEQ ID NO: 77); VHMPLGFLGPGGLSGRSDNH (SEQ ID NO: 78); LSGRSDNHGGVHMPLGFLGP (SEQ ID NO: 79); LSGRSDNHGGSGGSISSGLLSS
1
(SEQ ID NO: 80); LSGRSGNHGGSGGSISSGLLSS (SEQ ID NO: 81); ISSGLLSSGGSGGSLSGRSGNH (SEQ ID NO: 82); LSGRSDNHGGSGGSQNQALRMA (SEQ ID NO: 83); QNQALRMAGGSGGSLSGRSDNH (SEQ ID NO: 84); LSGRSGNHGGSGGSQNQALRMA (SEQ ID NO: 85); QNQALRMAGGSGGSLSGRSGNH (SEQ ID NO: 86); ISSGLLSGRSGNH (SEQ ID NO: 87); GLSGRSDNHGGAVGLLAPP (SEQ ID NO: 336); GLSGRSDNHGGVHMPLGFLGP (SEQ ID NO: 337); ISSGLLSGRSANPRG (SEQ ID NO: 338), koji je u ovom dokumentu označen i kao supstrat 2003; AVGLLAPPTSGRSANPRG (SEQ ID NO: 339), koji je u ovom dokumentu označen i kao supstrat 2004; AVGLLAPPSGRSANPRG (SEQ ID NO: 340), koji je u ovom dokumentu označen i kao supstrat 2005; ISSGLLSGRSDDH (SEQ ID NO: 341), koji je u ovom dokumentu označen i kao supstrat 2006; ISSGLLSGRSDIH (SEQ ID NO: 342), koji je u ovom dokumentu označen i kao supstrat 2007; ISSGLLSGRSDQH (SEQ ID NO: 343), koji je u ovom dokumentu označen i kao supstrat 2008; ISSGLLSGRSDTH (SEQ ID NO: 344), koji je u ovom dokumentu označen i kao supstrat 2009; ISSGLLSGRSDYH (SEQ ID NO: 345), koji je u ovom dokumentu označen i kao supstrat 2010; ISSGLLSGRSDNP (SEQ ID NO: 346), koji je u ovom dokumentu označen i kao supstrat 2011; ISSGLLSGRSANP (SEQ ID NO: 347), koji je u ovom dokumentu označen i kao supstrat 2012; ISSGLLSGRSANI (SEQ ID NO: 348), koji je u ovom dokumentu označen i kao supstrat 2013; AVGLLAPPGGLSGRSDDH (SEQ ID NO: 349), koji je u ovom dokumentu označen i kao supstrat 3006; AVGLLAPPGGLSGRSDIH (SEQ ID NO: 350), koji je u ovom dokumentu označen i kao supstrat 3007; AVGLLAPPGGLSGRSDQH (SEQ ID NO: 351), koji je u ovom dokumentu označen i kao supstrat 3008; AVGLLAPPGGLSGRSDTH (SEQ ID NO: 352), koji je u ovom dokumentu označen i kao supstrat 3009; AVGLLAPPGGLSGRSDYH (SEQ ID NO: 353), koji je u ovom dokumentu označen i kao supstrat 3010; AVGLLAPPGGLSGRSDNP (SEQ ID NO: 354), koji je u ovom dokumentu označen i kao supstrat 3011; AVGLLAPPGGLSGRSANP (SEQ ID NO: 355), koji je u ovom dokumentu označen i kao supstrat 3012; AVGLLAPPGGLSGRSANI (SEQ ID NO: 356), koji je u ovom dokumentu označen i kao supstrat 3013; ISSGLLSGRSDNI (SEQ ID NO: 357), koji je u ovom dokumentu označen i kao supstrat 2014; i/ili AVGLLAPPGGLSGRSDNI (SEQ ID NO: 358), koji je u ovom dokumentu označen i kao supstrat 3014.
[0097] U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat uključuje sekvencu ISSGLLSGRSDNH (SEQ ID NO: 70). U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat uključuje sekvencu ISSGLLSSGGSGGSLSGRSDNH (SEQ ID NO: 71). U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat uključuje sekvencu AVGLLAPPGGTSTSGRSANPRG (SEQ ID NO: 72). U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat uključuje sekvencu TSTSGRSANPRGGGAVGLLAPP (SEQ ID NO: 73). U nekim primerima izvođenja, CM1-
1
CM2 supstrat uključuje sekvencu VHMPLGFLGPGGTSTSGRSANPRG (SEQ ID NO: 74). U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat uključuje sekvencu TSTSGRSANPRGGGVHMPLGFLGP (SEQ ID NO: 75). U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat uključuje sekvencu AVGLLAPPGGLSGRSDNH (SEQ ID NO: 76). U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat uključuje sekvencu LSGRSDNHGGAVGLLAPP (SEQ ID NO: 77). U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat uključuje sekvencu VHMPLGFLGPGGLSGRSDNH (SEQ ID NO: 78). U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat uključuje sekvencu LSGRSDNHGGVHMPLGFLGP (SEQ ID NO: 79). U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat uključuje sekvencu LSGRSDNHGGSGGSISSGLLSS (SEQ ID NO: 80). U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat uključuje sekvencu LSGRSGNHGGSGGSISSGLLSS (SEQ ID NO: 81). U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat uključuje sekvencu ISSGLLSSGGSGGSLSGRSGNH (SEQ ID NO: 82). U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat uključuje sekvencu LSGRSDNHGGSGGSQNQALRMA (SEQ ID NO: 83). U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat uključuje sekvencu QNQALRMAGGSGGSLSGRSDNH (SEQ ID NO: 84). U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat uključuje sekvencu LSGRSGNHGGSGGSQNQALRMA (SEQ ID NO: 85). U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat uključuje sekvencu QNQALRMAGGSGGSLSGRSGNH (SEQ ID NO: 86). U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat uključuje sekvencu ISSGLLSGRSGNH (SEQ ID NO: 87). U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat uključuje sekvencu GLSGRSDNHGGAVGLLAPP (SEQ ID NO: 336). U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat uključuje sekvencu i/ili GLSGRSDNHGGVHMPLGFLGP (SEQ ID NO: 337). U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat uključuje sekvencu ISSGLLSGRSANPRG (SEQ ID NO: 338). U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat uključuje sekvencu AVGLLAPPTSGRSANPRG (SEQ ID NO: 339). U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat uključuje sekvencu AVGLLAPPSGRSANPRG (SEQ ID NO: 340). U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat uključuje sekvencu ISSGLLSGRSDDH (SEQ ID NO: 341). U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat uključuje sekvencu ISSGLLSGRSDIH (SEQ ID NO: 342). U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat uključuje sekvencu ISSGLLSGRSDQH (SEQ ID NO: 343). U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat uključuje sekvencu ISSGLLSGRSDTH (SEQ ID NO: 344). U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat uključuje sekvencu ISSGLLSGRSDYH (SEQ ID NO: 345). U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat uključuje sekvencu ISSGLLSGRSDNP (SEQ ID NO: 346). U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat uključuje sekvencu ISSGLLSGRSANP (SEQ ID NO: 347). U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat uključuje sekvencu
1
ISSGLLSGRSANI (SEQ ID NO: 348). U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat uključuje sekvencu AVGLLAPPGGLSGRSDDH (SEQ ID NO: 349). U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat uključuje sekvencu AVGLLAPPGGLSGRSDIH (SEQ ID NO: 350). U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat uključuje sekvencu AVGLLAPPGGLSGRSDQH (SEQ ID NO: 351). U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat uključuje sekvencu AVGLLAPPGGLSGRSDTH (SEQ ID NO: 352). U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat uključuje sekvencu AVGLLAPPGGLSGRSDYH (SEQ ID NO: 353). U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat uključuje sekvencu AVGLLAPPGGLSGRSDNP (SEQ ID NO: 354). U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat uključuje sekvencu AVGLLAPPGGLSGRSANP (SEQ ID NO: 355). U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat uključuje sekvencu AVGLLAPPGGLSGRSANI (SEQ ID NO: 356), ISSGLLSGRSDNI (SEQ ID NO: 357). U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat uključuje sekvencu AVGLLAPPGGLSGRSDNI (SEQ ID NO: 358).
[0098] U nekim primerima izvođenja, CM je supstrat za najmanje dve proteaze. U nekim primerima izvođenja, svaka proteaza odabrana je iz grupe koja se sastoji od onih prikazanih u tabeli 4. U nekim primerima izvođenja, CM je supstrat za najmanje dve proteaze, pri čemu je jedna od proteaza odabrana iz grupe koja se sastoji od MMP, trombina, neutrofilne elastaze, cistein proteaze, uPA, legumaina i matriptaze i druge proteaze odabrane iz grupe koja se sastoji od onih prikazanih u tabeli 4. U nekim primerima izvođenja, CM je supstrat za najmanje dve proteaze izabrane iz grupe koja se sastoji od MMP, trombina, neutrofilne elastaze, cistein proteaze, uPA, legumaina i matriptaze.
[0099] U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira uključuje najmanje prvi CM i drugi CM. U nekim primerima izvođenja, prvi CM i drugi CM su svaki polipeptidi dužine ne veće od 15 aminokiselina. U nekim primerima izvođenja, prvi CM i drugi CM u antitelu koje može da se aktivira u neotcepljenom stanju imaju strukturni raspored od N-terminalnog kraja ka C-terminalnom kraju kao što sledi: MM-CM1-CM2-AB ili AB-CM2-CM1-MM. U nekim primerima izvođenja, najmanje jedan od prvog CM i drugog CM je polipeptid koji funkcioniše kao supstrat za proteazu izabranu iz grupe koja se sastoji od MMP, trombina, neutrofilne elastaze, cistein proteaze, uPA, legumaina, i matriptaze. U nekim primerima izvođenja, prvi CM se otcepljuje pomoću prvog agensa za cepanje izabranog iz grupe koja se sastoji od MMP, trombina, neutrofilne elastaze, cistein proteaze, uPA, legumaina, i matriptaze u ciljnom tkivu, a drugi CM se otcepljuje pomoću drugog agensa za cepanje u ciljnom tkivu. U nekim primerima izvođenja, druge proteaze odabrane iz grupe koja se sastoji onih prikazanih u tabeli 4. U nekim primerima izvođenja, prvi agens za cepanje i drugi agens za cepanje su ista proteaza izabrana iz grupe koja se sastoji od MMP, trombina, neutrofilne elastaze, cistein proteaze, uPA, legumaina, i matriptaze,
2
i prvi CM i drugi CM su različiti enzimski supstrati. U nekim primerima izvođenja, prvi agens za cepanje i drugi agens za cepanje su ista proteaza izabrana iz grupe koja se sastoji od onih prikazanih u tabeli 4. U nekim primerima izvođenja, prvi agens za cepanje i drugi agens za cepanje su različite proteaze. U nekim primerima izvođenja, prvi agens za cepanje i drugi agens za cepanje su ko-lokalizovani u ciljnom tkivu. U nekim primerima izvođenja, prvi CM i drugi CM se otcepljuju pomoću najmanje jednog agensa za cepanje u ciljnom tkivu.
[0100] U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira se izlaže i cepa pomoću proteaze tako da, u aktiviranom ili otcepljenom stanju, aktivirano antitelo uključuje aminokiselinsku sekvencu lakog lanca koja uključuje najmanje deo LP2 i/ili CM sekvence nakon što proteaza otcepi CM.
[0101] U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira takođe uključuje agens konjugovan sa AB. U nekim primerima izvođenja, agens konjugovan sa AB ili AB antitela koje može da se aktivira je terapijski agens. U nekim primerima izvođenja, agens je antineoplastični agens. U nekim primerima izvođenja, agens je toksin ili njegov fragment. Kako se ovde koristi, fragment toksina je fragment koji zadržava toksičnu aktivnost. U nekim primerima izvođenja, agens je konjugovan sa AB preko linkera koji može da se otcepi. U nekim primerima izvođenja, agens je konjugovan sa AB preko linkera koji uključuje najmanje jednu sekvencu supstrata CM1-CM2. U nekim primerima izvođenja, agens je konjugovan sa AB preko linkera koji ne može da se otcepi. U nekim primerima izvođenja, agens je konjugovan sa AB preko linkera koji može da se otcepi u intracelularnom ili lizozomalnom okruženju. U nekim primerima izvođenja, agens je inhibitor mikrotubula. U nekim primerima izvođenja, agens je agens koji oštećuje nukleinsku kiselinu, kao alkilator DNK, agens za cepanje DNK, unakrsni linker DNK, interkalirajući agens za DNK, ili drugi agens koji oštećuje DNK. U nekim primerima izvođenja, agens je agens odabran iz grupe navedene u tabeli 5. U nekim primerima izvođenja, agens je dolastatin. U nekim primerima izvođenja, agens je auristatin ili njegov derivat. U nekim primerima izvođenja, agens je auristatin E ili njegov derivat. U nekim primerima izvođenja, agens je monometil auristatin E (MMAE). U nekim primerima izvođenja, agens je monometil auristatin D (MMAD). U nekim primerima izvođenja, agens je majtanzinoid ili derivat majtanzinoida. U nekim primerima izvođenja, agens je DM1 ili DM4. U nekim primerima izvođenja, agens je duokarmicin ili njegov derivat. U nekim primerima izvođenja, agens je kaliheamicin ili njegov derivat. U nekim primerima izvođenja, agens je pirolobenzodiazepin. U nekim primerima izvođenja, agens je dimer pirolobenzodiazepina.
[0102] U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira je konjugovano sa jednim ili više ekvivalenata agensa. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira je konjugovano sa jednim ekvivalentom agensa. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira je konjugovano sa dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset, ili više od deset ekvivalenata agensa. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira je deo smeše antitela koja mogu da se aktiviraju koja imaju homogeni broj ekvivalenata konjugovanih agenasa. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira je deo smeše antitela koja mogu da se aktiviraju koja imaju heterogeni broj ekvivalenata konjugovanih agenasa. U nekim primerima izvođenja, smeša antitela koja mogu da se aktiviraju je takva da je prosečan broj agenasa konjugovanih sa svakim antitelom koje može da se aktivira između nula i jedan, između jedan i dva, između dva i tri, između tri i četiri, između četiri i pet, između pet i šest, između šest i sedam, između sedam i osam, između osam i devet, između devet i deset, i deset i više. U nekim primerima izvođenja, smeša antitela koja mogu da se aktiviraju je takva da je prosečan broj agenasa konjugovanih sa svakim antitelom koje može da se aktivira jedan, dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset, ili više. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira sadrži jednu ili više mesto-specifičnih modifikacija aminokiselinske sekvence tako da je broj lizinskih i/ili cisteinskih rezidua povećan ili smanjen u odnosu na originalnu aminokiselinsku sekvencu antitela koje može da se aktivira, čime se, u nekim primerima izvođenja, odgovarajuće povećava ili smanjuje broj agenasa koji mogu da budu konjugovani sa antitelom koje može da se aktivira, ili u nekim primerima izvođenja ograničava konjugacija agenasa sa antitelom koje može da se aktivira na mesto-specifičan način. U nekim primerima izvođenja, modifikovano antitelo koje može da se aktivira modifikovano je pomoću jedne ili više neprirodnih aminokiselina na mesto-specifičan način, čime se, u nekim primerima izvođenja, ograničava konjugacija agenasa samo na mesta na kojima su neprirodne aminokiseline.
[0103] U nekim primerima izvođenja, agens je antizapaljenski agens.
[0104] U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira takođe uključuje detektabilni fragment. U nekim primerima izvođenja, detektabilni fragment je dijagnostički agens.
[0105] U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira takođe uključuje signalni peptid. U nekim primerima izvođenja, signalni peptid je konjugovan sa antitelom koje može da se aktivira putem spejsera. U nekim primerima izvođenja, spejser je konjugovan sa antitelom koje može da se aktivira u odsustvu signalnog peptida. U nekim primerima izvođenja, spejser je spojen direktno sa MM antitela koje može da se aktivira. U nekim primerima izvođenja, spejser je spojen direktno sa MM antitela koje može da se aktivira u strukturnom rasporedu od N-terminalnog kraja ka C-terminalnom kraju spejser-MM-CM-AB. Primer spejsera spojenog direktno za N-terminalni kraj MM antitela koje može da se aktivira je QGQSGQ (SEQ ID NO: 88). Drugi primeri spejsera spojenog direktno za N-terminalni kraj MM antitela koje može da se aktivira uključuju QGQSGQG (SEQ ID NO: 305), QGQSG (SEQ ID NO: 306), QGQS (SEQ ID NO: 307), QGQ (SEQ ID NO: 308), QG (SEQ ID NO: 309), i Q. Drugi primeri spejsera spojenog direktno za N-terminalni kraj MM antitela koje može da se aktivira uključuju GQSGQG (SEQ ID NO: 359), QSGQG (SEQ ID NO: 360), SGQG (SEQ ID NO: 361), GQG (SEQ ID NO: 362), i G. U nekim primerima izvođenja, spejser nije spojen za N-terminalni kraj MM. U nekim primerima izvođenja, spejser uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu QGQSGQ (SEQ ID NO: 88). U nekim primerima izvođenja, spejser uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu QGQSGQG (SEQ ID NO: 305). U nekim primerima izvođenja, spejser uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu QGQSG (SEQ ID NO: 306). U nekim primerima izvođenja, spejser uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu QGQS (SEQ ID NO: 307). U nekim primerima izvođenja, spejser uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu QGQ (SEQ ID NO: 308). U nekim primerima izvođenja, spejser uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu QG (SEQ ID NO: 309). U nekim primerima izvođenja, spejser uključuje najmanje aminokiselinsku reziduu Q. U nekim primerima izvođenja, spejser uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu GQSGQG (SEQ ID NO: 359). U nekim primerima izvođenja, spejser uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu QSGQG (SEQ ID NO: 360). U nekim primerima izvođenja, spejser uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu SGQG (SEQ ID NO: 361). U nekim primerima izvođenja, spejser uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu GQG (SEQ ID NO: 362). U nekim primerima izvođenja, spejser uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu G. U nekim primerima izvođenja, spejser je odsutan.
[0106] U nekim primerima izvođenja, AB antitela koje može da se aktivira prirodno sadrži jednu ili više disulfidnih veza. U nekim primerima izvođenja, AB može da se konstruiše tako da uključuje jednu ili više disulfidnih veza.
[0107] U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira kodirno je sekvencom nukleinske kiseline koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca koja sadrži SEQ ID NO: 122.
[0108] U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira kodirano je sekvencom nukleinske kiseline koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 123-126.
[0109] U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira kodirano je sekvencom nukleinske kiseline koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 122, i sekvencu nukleinske kiseline koja kodira aminokiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 123-126.
2
[0110] U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira uključuje jedan ili više polipeptida koji uključuju kombinaciju sekvenci u datom redu tabele A ili bilo koju kombinaciju maskirajuće sekvence (MM), sekvence supstrata (CM), sekvence varijabilnog domena lakog lanca ili CDR sekvenci varijabilnog domena lakog lanca, i sekvence varijabilnog domena teškog lanca ili CDR sekvenci varijabilnog domena teškog lanca iz tabele B.
Tabela A: Kombinacije anti-CD166 antitela koje može da se aktivira
2
2
2
2
2
1
103 LEGWCLHPLCLWGAG QNQALRMA (SEQ ID NO: 39) 130, 127,
2
130, 127,
LEGWCLHPLCLWGAG ISSGLLSGRSDNP (SEQ ID NO:
114 132, 128,
(SEQ ID NO: 230) 346)
134 129
LEGWCLHPLCLWGAG AVGLLAPPGGLSGRSANI (SEQ 130, 127, 126
(SEQ ID NO: 230) ID NO: 356) 132, 128,
4
[0111] U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira predmetnog otkrića uključuje jedan ili više polipeptida koji uključuju kombinaciju sekvenci izabranih iz tabele A ili tabele B, gde polipeptid uključuje kombinaciju maskirajuće sekvence izabrane iz kolone označene kao "Maskirajuća sekvenca (MM)" u tabeli A ili tabeli B, sekvence supstrata iz kolone označene kao "Sekvenca supstrata (CM)" u tabeli A ili tabeli B, varijabilni domen lakog lanca ili CDR regione lakog lanca iz kolone označene kao "VL ili CDR VL" ili "CDR VL SEQ ID NOs" u tabeli A ili tabeli B, i varijabilni domen teškog lanca ili CDR regione teškog lanca iz kolone označene kao "VH ili CDR VH" ili "CDR VH SEQ ID Nos" u tabeli A ili tabeli B. Na primer, antitelo koje može da se aktivira predmetnog otkrića uključuje aminokiselinske sekvence kombinacije br. 54, koja uključuje maskirajuću sekvencu SEQ ID NO: 222, sekvencu supstrata SEQ ID NO: 76, varijabilni domen lakog lanca koji uključuje CDR VL sekvence SEQ ID NOS: 130, 132, i 134, i varijabilni domen teškog lanca koji uključuje CDR VH sekvence 127, 128, i 129. Prema tome, antitelo koje može da se aktivira koje uključuje najmanje kombinaciju sekvenci u bilo kom datom redu tabele A opisano je u ovom dokumentu. Slično, bilo koja kombinacija maskirajuće sekvence (MM), sekvence supstrata (CM), sekvence varijabilnog domena lakog lanca ili CDR sekvenci varijabilnog domena lakog lanca, i sekvence varijabilnog domena teškog lanca ili CDR sekvenci varijabilnog domena teškog lanca iz tabele B opisana je u ovom dokumentu. Antitelo koje može da se aktivira koje uključuje najmanje bilo koju kombinaciju maskirajuće sekvence, sekvence supstrata, varijabilnog teškog lanca ili CDR regiona varijabilnog teškog lanca, i varijabilnog lakog lanca ili CDR regiona varijabilnog lakog lanca odabrane iz odgovarajućih kolona tabele A ili tabele B takođe je opisano u ovom dokumentu. U nekim ilustrativnim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira koje uključuje najmanje kombinaciju sekvenci u bilo kom datom redu tabele A ili bilo koju kombinaciju maskirajuće sekvence (MM), sekvence supstrata (CM), sekvence varijabilnog domena lakog lanca ili CDR sekvenci varijabilnog domena lakog lanca, i sekvence varijabilnog domena teškog lanca ili CDR sekvenci varijabilnog domena teškog lanca iz tabele B može da se kombinuje sa jednim ili više toksina, uključujući dolastatin ili njegov derivat, auristatin ili njegov derivat, majtanzinoid ili njegov derivat, duokarmicin ili njegov derivat, kaliheamicin ili njegov derivat, ili pirolobenzodiazepin ili njegov derivat. U nekim ilustrativnim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira koje uključuje najmanje kombinaciju sekvenci u bilo kom datom redu iz tabele A ili bilo koju kombinaciju maskirajuće sekvence (MM), sekvence supstrata (CM), sekvence varijabilnog domena lakog lanca ili CDR sekvenci varijabilnog domena lakog lanca, i sekvence varijabilnog domena teškog lanca ili CDR sekvenci varijabilnog domena teškog lanca iz tabele B može da se kombinuje sa jednim ili više toksina, uključujući auristatin E, monometil auristatin F (MMAF), monometil auristatin E (MMAE), monometil auristatin D (MMAD), majtanzinoid DM4, majtanzinoid DM1, pirolobenzodiazepin, dimer pirolobenzodiazepina, i/ili duokarmicin.
[0112] Bilo koja od kombinacija u tabeli A ili tabeli B kao što je gore opisano može da se kombinuje sa konstantnim regionima humanog imunoglobulina da bi rezultovala potpuno humanim IgG uključujući IgG1, IgG2, IgG4 ili sa mutiranim konstantnim regionima da bi rezultovala humanim IgG sa izmenjenim funkcijama kao što su IgG1 N297A, IgG1 N297Q, ili IgG4 S228P. Kombinacije opisane u tabeli A ili tabeli B nisu ograničene određenim kombinacijama prikazanim u bilo kom datom redu, i stoga mogu da uključuju bilo koju maskirajuću sekvencu iz kolone 2 u tabeli A (ili koloni 1 u tabeli B) kombinovanu sa bilo kojom sekvencom supstrata iz kolone 3 u tabeli A (ili kolone 2 u tabeli B) kombinovanu sa bilo kojom VL sekvencom ili setom CDR VL sekvenci iz kolone 4 u tabeli A (ili kolone 3 u tabeli B) kombinovanu sa bilo kojom VH sekvencom ili setom CDR VH sekvenci iz kolone 5 u tabeli A (ili kolone 4 u tabeli B). Pored maskirajućih sekvenci opisanih u koloni 2 u tabeli A ili koloni 1 u tabeli B, bilo koja maskirajuća sekvenca koja je ovde opisana može da se koristi u kombinaciji. Pored sekvence supstrata opisane u koloni 3 u tabeli A ili koloni 2 u tabeli B, bilo koja ovde opisana CM može da se koristi u kombinaciji. Pored sekvence varijabilnog regiona lakog lanca ili CDR sekvenci lakog lanca opisanih u koloni 4 u tabeli A ili koloni 3 u tabeli B, bilo koja sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca ili CDR sekvence lakog lanca opisane u ovom dokumentu mogu da se koriste u kombinaciji. Pored sekvence varijabilnog regiona teškog lanca ili CDR sekvenci teškog lanca opisanih u koloni 5 u tabeli A ili koloni 4 u tabeli B, bilo koja sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca ili CDR sekvence teškog lanca opisane u ovom dokumentu mogu da se koriste u kombinaciji.
[0113] U nekim primerima izvođenja, konjugati antitela sa lekom (ADC) i konjugati antitela koje može da se aktivira sa lekom (AADC) mogu da uključuju jedan ili više polipeptida koji uključuju kombinaciju sekvence lakog lanca ili sekvenci varijabilnog domena lakog lanca, i sekvence teškog lanca ili sekvenci varijabilnog domena teškog lanca, linker, i toksin u datom redu tabele C ili bilo koju kombinaciju sekvence lakog lanca ili sekvenci varijabilnog domena lakog lanca, i sekvence teškog lanca ili sekvenci varijabilnog domena teškog lanca, linker, i toksin u tabeli C.
Tabela C: Kombinacije ADC anti-CD166 i ADC anti-CD166 koje može da se aktivira
4
4
4
4
4
4
4
1
[0114] Konjugat antitela sa lekom (ADC) predmetnog otkrića ili konjugat antitela koje može da se aktivira sa lekom (AADC) predmetnog otkrića mogu da uključuju jedan ili više polipeptida
2
koji uključuju kombinaciju aminokiselinskih sekvenci, linkera, i toksina navedenih u datom redu tabele C. Prema tome, u ovom dokumentu opisan je konjugat antitela koje može da se aktivira sa lekom (ADC) predmetnog otkrića ili konjugat antitela koje može da se aktivira sa lekom (AADC) predmetnog otkrića koji uključuje kombinaciju aminokiselinskih sekvenci, linkera, i toksina navedenih u datom redu ili obezbeđenih kao specifična kombinacija. Na primer, konjugat antitela koje može da se aktivira sa lekom predmetnog otkrića može da uključuje aminokiselinske sekvence kombinacije br. 55, koja uključuje teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 239, laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 246, i spdb-DM4 linker-toksin. U drugom primeru AADC otkrivenom i opisanom u ovom dokumentu, konjugat antitela koje može da se aktivira sa lekom predmetnog otkrića može da uključuje aminokiselinske sekvence kombinacije br. 33, koja uključuje teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 239, laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 244, i vc-MMAE linker-toksin.
[0115] Bilo koja od kombinacija u tabeli C koja navodi varijabilni region teškog lanca i lakog lanca može da se kombinuje sa konstantnim regionima humanog imunoglobulina da bi se dobili potpuno humani IgG uključujući IgG1, IgG2, IgG4 ili sa mutiranim konstantnim regionima da bi se dobili IgG sa izmenjenim funkcijama kao što su IgG1 N297A, IgG1 N297Q, ili IgG4 S228P. Kombinacije opisane u tabeli C nisu ograničene određenim kombinacijama prikazanim u bilo kom datom redu, i prema tome mogu da uključuju bilo koju sekvencu teškog lanca ili sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca iz kolone 2 u tabeli C kombinovanu sa bilo kojom sekvencom lakog lanca ili sekvencom varijabilnog regiona lakog lanca iz kolone 3 u tabeli C kombinovanu sa bilo kojim linkerom iz kolone 4 kombinovanu sa bilo kojim toksinom iz kolone 5. Pored sekvenci teškog lanca ili sekvenci varijabilnog regiona teškog lanca navedenih u koloni 2, bilo koja sekvenca teškog lanca ili sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca koja je ovde opisana može da se koristi u kombinaciji. Pored sekvenci lakog lanca ili sekvenci varijabilnog regiona lakog lanca navedenih u koloni 3, bilo koja sekvenca lakog lanca ili sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca koja je ovde opisana može da se koristi u kombinaciji. Pored linkera navedenih u koloni 4, bilo koji linker koji je ovde opisan može da se koristi u kombinaciji. Pored toksina navedenih u koloni 5, bilo koji toksin koji je ovde opisan može da se koristi u kombinaciji.
[0116] U nekim primerima izvođenja, serumski poluživot antitela koje može da se aktivira je duži od onog kod odgovarajućeg antitela; npr., pK antitela koje može da se aktivira je duže nego kod odgovarajućeg antitela. U nekim primerima izvođenja, serumski poluživot antitela koje može da se aktivira je sličan onom kod odgovarajućeg antitela. U nekim primerima izvođenja, serumski poluživot antitela koje može da se aktivira je najmanje 15 dana kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, serumski poluživot antitela koje može da se aktivira je najmanje 12 dana kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, serumski poluživot antitela koje može da se aktivira je najmanje 11 dana kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, serumski poluživot antitela koje može da se aktivira je najmanje 10 dana kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, serumski poluživot antitela koje može da se aktivira je najmanje 9 dana kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, serumski poluživot antitela koje može da se aktivira je najmanje 8 dana kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, serumski poluživot antitela koje može da se aktivira je najmanje 7 dana kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, serumski poluživot antitela koje može da se aktivira je najmanje 6 dana kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, serumski poluživot antitela koje može da se aktivira je najmanje 5 dana kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, serumski poluživot antitela koje može da se aktivira je najmanje 4 dana kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, serumski poluživot antitela koje može da se aktivira je najmanje 3 dana kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, serumski poluživot antitela koje može da se aktivira je najmanje 2 dana kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, serumski poluživot antitela koje može da se aktivira je najmanje 24 časova kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, serumski poluživot antitela koje može da se aktivira je najmanje 20 časova kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, serumski poluživot antitela koje može da se aktivira je najmanje 18 časova kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, serumski poluživot antitela koje može da se aktivira je najmanje 16 časova kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, serumski poluživot antitela koje može da se aktivira je najmanje 14 časova kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, serumski poluživot antitela koje može da se aktivira je najmanje 12 časova kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, serumski poluživot antitela koje može da se aktivira je najmanje 10 časova kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, serumski poluživot antitela koje može da se aktivira je najmanje 8 časova kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, serumski poluživot antitela koje može da se aktivira je najmanje 6 časova kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, serumski poluživot antitela koje može da se aktivira je najmanje 4 časa kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, serumski poluživot antitela koje može da se aktivira je najmanje 3 časa kada se primeni u organizmu.
[0117] U nekim primerima izvođenja, anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira je monospecifično. U nekim primerima izvođenja, anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano anti-CD166
4
antitelo koje može da se aktivira je multispecifično, npr., u smislu neograničavajućeg primera, bispecifično ili trifunkcionalno. U nekim primerima izvođenja, anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira je formulisano kao deo molekula bispecifičnog pro-aktivatora T ćelija (BITE). U nekim primerima izvođenja, anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira formulisano je kao deo pro-himernog antigenog receptora (CAR) modifikovanih T ćelija, ili drugog konstruisanog receptora.
[0118] U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira ili njegov antigenvezujući fragment ugrađen je u multispecifično antitelo koje može da se aktivira ili njegov antigen-vezujući fragment, pri čemu najmanje jedna ručica multispecifičnog antitela koje može da se aktivira specifično vezuje CD166. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira ili njegov antigen-vezujući fragment ugrađen je u bispecifično antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, pri čemu najmanje jedna ručica bispecifičnog antitela koje može da se aktivira specifično vezuje CD166.
[0119] U nekim primerima izvođenja, anti-CD166 antitela, konjugovana anti-CD166 antitela, anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju i/ili konjugovana anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju opisana u ovom dokumentu koriste se zajedno sa jednim ili više dodatnih agenasa ili kombinacijom dodatnih agenasa. Pogodni dodatni agensi uključuju aktuelne farmaceutske i/ili hirurške terapije za predviđenu primenu, kao što je, na primer, kancer. Na primer, anti-CD166 antitela, konjugovana anti-CD166 antitela, anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju i/ili konjugovana anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju mogu da se koriste zajedno sa dodatnim hemoterapijskim ili antineoplastičnim agensom.
[0120] U nekim primerima izvođenja, dodatni agens (agensi) je hemoterapijski agens, kao što je hemoterapijski agens izabran iz grupe koja se sastoji od docetaksela, paklitaksela, abraksana (tj., albumin-konjugovanog paklitaksela), doksorubicina, oksaliplatina, karboplatina, cisplatina, irinotekana i gemcitabina.
[0121] U nekim primerima izvođenja, dodatni agens (agensi) je inhibitor kontrolne tačke, inhibitor kinaze, agens koji ciljno deluje na inhibitore u tumorskom mikrookruženju, i/ili agonist T ćelija ili NK. U nekim primerima izvođenja, dodatni agens (agensi) je radijaciona terapija, sama ili u kombinaciji sa drugim dodatnim agensom (agensima) kao što je hemoterapijski ili antineoplastični agens. U nekim primerima izvođenja, dodatni agens (agensi) je vakcina, onkovirus, i/ili DC-aktivirajući agens kao što je, u smislu neograničavajućeg primera, agonist tollu-sličnog receptora (TLR) i/ili α-CD40. U nekim primerima izvođenja, dodatni agens (agensi) je antitelo usmereno na tumor konstruisano da ubije tumor putem ADCC ili putem direktne konjugacije sa toksinom (npr., konjugat antitela sa lekom (ADC)).
[0122] U nekim primerima izvođenja, inhibitor kontrolne tačke je inhibitor ciljnog molekula izabranog iz grupe koja se sastoji od CTLA-4, LAG-3, PD-1, CD166, TIGIT, TIM-3, B7H4, i Vista. U nekim primerima izvođenja, inhibitor kinaze je odabran iz grupe koja se sastoji od B-RAFi, MEKi, i Btk inhibitora, kao što je ibrutinib. U nekim primerima izvođenja, inhibitor kinaze je krizotinib. U nekim primerima izvođenja, inhibitor tumorskog mikrookruženja odabran je iz grupe koja se sastoji od inhibitora IDO, inhibitora α-CSF1R, inhibitora α-CCR4, TGF-beta, supresorske ćelije mijeloidnog porekla, ili T-regulatorne ćelije. U nekim primerima izvođenja, agonist je odabran iz grupe koja se sastoji od Ox40, GITR, CD137, ICOS, CD27, i HVEM.
[0123] U nekim primerima izvođenja, inhibitor je inhibitor CTLA-4. U nekim primerima izvođenja, inhibitor je inhibitor LAG-3. U nekim primerima izvođenja, inhibitor je inhibitor PD-1. U nekim primerima izvođenja, inhibitor je inhibitor CD166. U nekim primerima izvođenja, inhibitor je inhibitor TIGIT. U nekim primerima izvođenja, inhibitor je inhibitor TIM-3. U nekim primerima izvođenja, inhibitor je inhibitor B7H4. U nekim primerima izvođenja, inhibitor je inhibitor Vista. U nekim primerima izvođenja, inhibitor je inhibitor B-RAFi. U nekim primerima izvođenja, inhibitor je inhibitor MEKi. U nekim primerima izvođenja, inhibitor je inhibitor Btk. U nekim primerima izvođenja, inhibitor je ibrutinib. U nekim primerima izvođenja, inhibitor je krizotinib. U nekim primerima izvođenja, inhibitor je inhibitor IDO. U nekim primerima izvođenja, inhibitor je inhibitor α-CSF1R. U nekim primerima izvođenja, inhibitor je inhibitor α-CCR4. U nekim primerima izvođenja, inhibitor je TGF-beta. U nekim primerima izvođenja, inhibitor je supresorske ćelije mijeloidnog porekla. U nekim primerima izvođenja, inhibitor je T-regulatorna ćelija.
[0124] U nekim primerima izvođenja, agonist je Ox40. U nekim primerima izvođenja, agonist je GITR. U nekim primerima izvođenja, agonist je CD137. U nekim primerima izvođenja, agonist je ICOS. U nekim primerima izvođenja, agonist je CD27. U nekim primerima izvođenja, agonist je HVEM.
[0125] U nekim primerima izvođenja, anti-CD166 antitelo, konjugovano antitelo, antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira primenjuje se tokom i/ili posle tretmana u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih agenasa kao što su, na primer, hemoterapijski agens, antizapaljenski agens, i/ili imunosupresivni agens. U nekim primerima izvođenja, anti-CD166 antitelo, konjugovano anti-CD166 antitelo, anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira i dodatni agens formulisani su u jednu terapijsku kompoziciju, i anti-CD166 antitelo, konjugovano anti-CD166 antitelo, anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira i dodatni agens primenjuju se istovremeno. Alternativno, anti-CD166 antitelo, konjugovano anti-CD166 antitelo, anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira i dodatni agens su odvojeni jedno od drugog, npr., svaki je formulisan u posebnu terapijsku kompoziciju, i anti-CD166 antitelo, konjugovano anti-CD166 antitelo, anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira i dodatni agens se primenjuju istovremeno, ili se anti-CD166 antitelo, konjugovano anti-CD166 antitelo, anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira i dodatni agens primenjuju u različito vreme tokom režima lečenja. Na primer, anti-CD166 antitelo, konjugovano anti-CD166 antitelo, anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira primenjuje se pre dodatnog agensa, anti-CD166 antitelo, konjugovano anti-CD166 antitelo, anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira primenjuje se nakon primene dodatnog agensa, ili se anti-CD166 antitelo, konjugovano anti-CD166 antitelo, anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira i dodatni agens primenjuju naizmenično. Kao što je ovde opisano, anti-CD166 antitelo, konjugovano anti-CD166 antitelo, anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira i dodatni agens primenjuju se u pojedinačnim dozama ili višestrukim dozama.
[0126] U nekim primerima izvođenja, anti-CD166 antitelo, konjugovano anti-CD166 antitelo, anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira i dodatni agens (agensi) primenjuju se istovremeno. Na primer, anti-CD166 antitelo, konjugovano anti-CD166 antitelo, anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira i dodatni agens (agensi) mogu da budu formulisani u jednu kompoziciju ili primenjeni kao dve ili više odvojenih kompozicija. U nekim primerima izvođenja, anti-CD166 antitelo, konjugovano anti-CD166 antitelo, anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira i dodatni agens (agensi) primenjuju se uzastopno, ili se anti-CD166 antitelo, konjugovano anti-CD166 antitelo, anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira i dodatni agens primenjuju u različita vremena tokom režima lečenja.
[0127] U nekim primerima izvođenja, anti-CD166 antitelo, konjugovano anti-CD166 antitelo, anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira primenjuje se tokom i/ili posle lečenja u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih agenasa kao što je, u smislu neograničavajućeg primera, hemoterapijski agens, antizapaljenski agens, i/ili imunosupresivni agens, kao što je alkilirajući agens, antimetabolit, antimikrotubularni agens, inhibitor topoizomeraze, citotoksični antibiotik, i/ili bilo koji drugi agens koji oštećuje nukleinsku kiselinu. U nekim primerima izvođenja, dodatni agens je taksan, kao što je paklitaksel (npr., Abraxane®). U nekim primerima izvođenja, dodatni agens je antimetabolit, kao što je gemcitabin. U nekim primerima izvođenja, dodatni agens je alkilirajući agens, kao što je hemoterapija na bazi platine, kao što je karboplatin ili cisplatin. U nekim primerima izvođenja, dodatni agens je ciljani agens, kao što je inhibitor kinaze, npr., sorafenib ili erlotinib. U nekim primerima izvođenja, dodatni agens je ciljani agens, kao što je drugo antitelo, npr., monoklonsko antitelo (npr., bevacizumab), bispecifično antitelo, ili multispecifično antitelo. U nekim primerima izvođenja, dodatni agens je inhibitor proteozoma, kao što je bortezomib ili karfilzomib. U nekim primerima izvođenja, dodatni agens je imunomodulatorni agens, kao što je lenolidomind ili IL-2. U nekim primerima izvođenja, dodatni agens je zračenje. U nekim primerima izvođenja, dodatni agens je agens koji stručnjaci u ovoj oblasti smatraju standardom nege. U nekim primerima izvođenja, dodatni agens je hemoterapijski agens dobro poznat stručnjacima u ovoj oblasti.
[0128] U nekim primerima izvođenja, dodatni agens je drugo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, drugo konjugovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, drugo antitelo koje može da se aktivira ili njegov antigen-vezujući fragment i/ili drugo konjugovano antitelo koje može da se aktivira ili njegov antigen-vezujući fragment. U nekim primerima izvođenja dodatni agens je drugo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, drugo konjugovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, drugo antitelo koje može da se aktivira ili njegov antigenvezujući fragment i/ili drugo konjugovano antitelo koje može da se aktivira ili njegov antigenvezujući fragment usmeren na isti cilj kao prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, prvo konjugovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, antitelo koje može da se aktivira ili njegov antigen-vezujući fragment i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira ili njegov antigen-vezujući fragment, npr., protiv CD166. U nekim primerima izvođenja dodatni agens je drugo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, drugo konjugovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, drugo antitelo koje može da se aktivira ili njegov antigen-vezujući fragment i/ili drugo konjugovano antitelo koje može da se aktivira ili njegov antigen-vezujući fragment usmeren na ciljni molekul drugačiji od ciljnog molekula na koji deluje prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, prvo konjugovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, antitelo koje može da se aktivira ili njegov antigen-vezujući fragment i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira ili njegov antigen-vezujući fragment.
[0129] Kao neograničavajući primer, antitelo ili antigen-vezujući fragment i/ili AB antitela koje može da se aktivira je vezujući partner za bilo koji ciljni molekul naveden u tabeli 1.
Tabela 1: Primeri ciljnih molekula
[0130] Kao neograničavajući primer, antitelo ili antigen-vezujući fragment i/ili AB antitela koje može da se aktivira je, ili potiče od antitela navedenog u tabeli 2.
Tabela 2: Primeri izvora Ab
1
2
[0131] U nekim primerima izvođenja, dodatno antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, konjugovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, antitelo koje može da se aktivira ili njegov antigen-vezujući fragment, i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira ili njegov antigen-vezujući fragment je monoklonsko antitelo, domensko antitelo, jednolančano, Fab fragment, F(ab')2fragment, scFv, scAb, dAb, antitelo sa jednim domenom teškog lanca, ili antitelo sa jednim domenom lakog lanca. U nekim primerima izvođenja, dodatno antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, konjugovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, antitelo koje može da se aktivira ili njegov antigen-vezujući fragment, i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira ili njegov antigen-vezujući fragment je mišje, drugog glodara, himerno, humanizovano ili potpuno humano monoklonsko antitelo.
[0132] Otkriće takođe obezbeđuje postupke za proizvodnju polipeptida anti-CD166 antitela i/ili anti-CD166 antitela koje može da se aktivira kultivacijom ćelije pod uslovima koji vode ekspresiji polipeptida, pri čemu ćelija sadrži molekul izolovane nukleinske kiseline koja kodira antitelo i/ili antitelo koje može da se aktivira koje je ovde opisano, i/ili vektore koji uključuju ove sekvence izolovane nukleinske kiseline. Otkriće obezbeđuje postupke za proizvodnju antitela i/ili antitela koje može da se aktivira kultivacijom ćelije pod uslovima koji vode ekspresiji antitela i/ili antitela koje može da se aktivira, pri čemu ćelija sadrži molekul izolovane nukleinske kiseline koja kodira antitelo i/ili antitelo koje može da se aktivira koje je ovde opisano, i/ili vektore koji uključuju ove sekvence izolovane nukleinske kiseline.
[0133] Pronalazak takođe obezbeđuje postupak za proizvodnju antitela koja mogu da se aktiviraju koja u aktiviranom stanju vezuju CD166 kao što je definisano u patentnim zahtevima, (a) kultivacijom ćelije koja sadrži konstrukt nukleinske kiseline koja kodira antitelo koje može da se aktivira pod uslovima koji vode ekspresiji antitela koje može da se aktivira, pri čemu antitelo koje može da se aktivira sadrži maskirajući fragment (MM), fragment koji može da se otcepi (CM), i antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB) koje specifično vezuje CD166, (i) pri čemu je CM polipeptid koji funkcioniše kao supstrat za proteazu; i (ii) pri čemu je CM pozicioniran u antitelu koje može da se aktivira tako da, kada je antitelo koje može da se aktivira u neotcepljenom stanju, MM interferira sa specifičnim vezivanjem AB za CD166, a u neotcepljenom stanju MM ne interferira ili kompetira sa specifičnim vezivanjem AB za CD166; i (b) izdvajanjem antitela koje može da se aktivira. Pogodni AB, MM, i/ili CM uključuju bilo koji od ovde opisanih AB, MM, i/ili CM.
[0134] U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira u neotcepljenom stanju ima strukturni raspored od N-terminalnog kraja ka C-terminalnom kraju kao što sledi: MM-CM-AB ili AB-CM-MM. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira sadrži a povezujući peptid između MM i CM. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira sadrži povezujući peptid između CM i AB. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira sadrži prvi povezujući peptid (LP1) i drugi povezujući peptid (LP2), i gde antitelo koje može da se aktivira u neotcepljenom stanju ima sledeći strukturni raspored od N-terminalnog kraja ka C-terminalnom kraju: MM-LP1-CM-LP2-AB ili AB-LP2-CM-LP1-MM. U nekim primerima izvođenja, dva povezujuća peptida ne moraju da budu međusobno identični. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira u neotcepljenom stanju ima sledeći strukturni raspored od N-terminalnog kraja ka C-terminalnom kraju: spejser-MM-LP1-CM-LP2-AB ili AB-LP2-CM-LP1-MM-spejser.
[0135] U nekim primerima izvođenja, najmanje jedan od LP1 ili LP2 sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od (GS)n, (GGS)n, (GSGGS)n(SEQ ID NO: 1) i (GGGS)n(SEQ ID NO: 2), gde je n ceo broj od najmanje jedan.
[0136] U nekim primerima izvođenja, najmanje jedan od LP1 ili LP2 sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od GGSG (SEQ ID NO: 3), GGSGG (SEQ ID NO: 4), GSGSG (SEQ ID NO: 5), GSGGG (SEQ ID NO: 6), GGGSG (SEQ ID NO: 7), i GSSSG (SEQ ID NO: 8).
[0137] U nekim primerima izvođenja, LP1 sadrži aminokiselinsku sekvencu GSSGGSGGSGGSG (SEQ ID NO: 9), GSSGGSGGSGG (SEQ ID NO: 10), GSSGGSGGSGGS (SEQ ID NO: 11), GSSGGSGGSGGSGGGS (SEQ ID NO: 12), GSSGGSGGSG (SEQ ID NO: 13), ili GSSGGSGGSGS (SEQ ID NO: 14).
[0138] U nekim primerima izvođenja, LP2 sadrži aminokiselinsku sekvencu GSS, GGS, GGGS (SEQ ID NO: 15), GSSGT (SEQ ID NO: 16) ili GSSG (SEQ ID NO: 17).
[0139] Otkriće obezbeđuje postupke za prevenciju, odlaganje progresije, lečenje, ublažavanje simptoma, ili olakšavanja na drugi način bolesti posredovane CD166 kod subjekta primenom terapijski efikasne količine ovde opisanog anti-CD166 antitela, konjugovanog anti-CD166 antitela, anti-CD166 antitela koje može da se aktivira i/ili konjugovanog anti-CD166 antitela koje može da se aktivira kod subjekta kome je to potrebno.
[0140] Otkriće takođe obezbeđuje postupke za prevenciju, odlaganje progresije, lečenje, ublažavanje simptoma, ili olakšavanja na drugi način kancera kod subjekta primenom terapijski efikasne količine ovde opisanog anti-CD166 antitela, konjugovanog anti-CD166 antitela, anti-CD166 antitela koje može da se aktivira i/ili konjugovanog anti-CD166 antitela koje može da se aktivira kod subjekta kome je to potrebno. Poznato je da se CD166 eksprimira kod više različitih kancera, kao što je, u smislu neograničavajućeg primera, bilo koji epitelni ili kancer skvamoznih ćelija, bilo koji karcinoid, i/ili neuroendokrini kancer. Primeri kancera uključuju, ali nisu ograničeni na adenokarcinom, kancer žučnih kanala (bilijarnog trakta), kancer bešike, kancer dojke, npr., trostruko-negativni kancer dojke, Her2-negativni kancer dojke, kancer dojke
4
pozitivan na estrogenski receptor; karcinoidni kancer; kancer grlića materice; holangiokarcinom; kolorektalni kancer; endometrijalni kancer; gliom; kancer glave i vrata, npr., kancer skvamoznih ćelija glave i vrata; leukemija; kancer jetre; kancer pluća, npr., NSCLC, SCLC; limfom; melanom; orofaringealni kancer; kancer jajnika; kancer pankreasa; kancer prostate, npr., metastatski karcinom prostate otporan na kastraciju; bubrežni kancer; kancer kože; kancer skvamoznih ćelija; kancer želuca; kancer testisa; tiroidni kancer; i urotelijalni kancer.
[0141] U nekim primerima izvođenja, kancer je bilo koji epitelni ili skvamozni kancer. U nekim primerima izvođenja, kancer je kancer prostate, kancer dojke, kancer pluća, kancer grlića materice, orofaringealni kancer, i/ili kancer glave i vrata.
[0142] U nekim primerima izvođenja, kancer je kancer bešike, kancer kostiju, kancer dojke, karcinoid, kancer grlića materice, kolorektalni kancer, kancer debelog creva, kancer endometrijuma, epitelni kancer, gliom, kancer glave i vrata, kancer jetre, kancer pluća, melanom, orofaringealni kancer, kancer jajnika, kancer pankreasa, kancer prostate, bubrežni kancer, sarkom, kancer kože, kancer želuca, kancer testisa, tiroidni kancer, urogenitalni kancer, i/ili urotelijalni kancer.
[0143] U nekim primerima izvođenja, kancer je odabran iz grupe koja se sastoji od trostruko negativnog kancera dojke (TNBC), nesitnoćelijskog kancera pluća (NSCLC), sitnoćelijskog kancera pluća (SCLC), kolorektalnog karcinoma sa Ras mutacijom, retkog epitelnog kancera, orofaringealnog kancera, kancera grlića materice, karcinoma skvamoznih ćelija glave i vrata (HNSCC), i/ili kancera prostate. U nekim primerima izvođenja, kancer je udružen sa tumorom koji eksprimira CD166. U nekim primerima izvođenja, kancer je posledica tumora koji eksprimira CD166.
[0144] Anti-CD166 antitelo, konjugovano anti-CD166 antitelo, anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira korišćeno u bilo kom primeru izvođenja ovih postupaka i upotreba, može da se primeni u bilo kom stadijumu bolesti. Na primer, takvo anti-CD166 antitelo, konjugovano anti-CD166 antitelo, anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira može da se primeni kod pacijenta koji pati od kancera bilo kog stadijuma, od ranog do metastatskog. Pojmovi subjekat i pacijent se ovde koriste kao sinonimi.
[0145] U nekim primerima izvođenja, subjekat je sisar, kao što je čovek, nehumani primat, domaća životinja (npr., mačka, pas, konj), životinja gajena na farmi, radna životinja, ili životinja iz zoološkog vrta. U nekim primerima izvođenja, subjekat je čovek. U nekim primerima izvođenja, subjekat je domaća životinja. U nekim primerima izvođenja, subjekat je životinja za koju se brine veterinar.
[0146] Anti-CD166 antitelo, konjugovano anti-CD166 antitelo, anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira i njihove terapijske formulacije primenjuju se kod subjekta koji pati od, ili je osetljiv na bolest ili poremećaj udružen sa aberantnom ekspresijom i/ili aktivnošću CD166. Subjekat koji pati od, ili je osetljiv na bolest ili poremećaj udružen sa aberantnom ekspresijom i/ili aktivnošću CD166 identifikovan je upotrebom bilo kog od raznih postupaka poznatih u struci. Na primer, subjekti koji pate od kancera ili drugog neoplastičnog stanja identifikuju se upotrebom bilo kog od različitih kliničkih i/ili laboratorijskih testova kao što je, medicinski pregled i analiza krvi, urina i/ili stolice za procenu zdravstvenog stanja. Na primer, subjekti koji pate od zapaljenja i/ili zapaljenskog poremećaja identifikuju se upotrebom bilo kog od različitih kliničkih i/ili laboratorijskih testova kao što je, medicinski pregled i/ili analiza telesnih tečnosti, npr., analiza krvi, urina i/ili stolice za procenu zdravstvenog stanja.
[0147] Primena anti-CD166 antitela, konjugovanog anti-CD166 antitela, anti-CD166 antitela koje može da se aktivira i/ili konjugovanog anti-CD166 antitela koje može da se aktivira kod pacijenta koji pati od bolesti ili poremećaja udruženog sa aberantnom ekspresijom i/ili aktivnošću CD166 smatra se uspešnom ako se postigne bilo koji od različitih laboratorijskih ili kliničkih ciljeva. Na primer, primena anti-CD166 antitela, konjugovanog anti-CD166 antitela, anti-CD166 antitela koje može da se aktivira i/ili konjugovanog anti-CD166 antitela koje može da se aktivira kod pacijenta koji pati od bolesti ili poremećaja udruženog sa aberantnom ekspresijom i/ili aktivnošću CD166 smatra se uspešnom ako se jedan ili više og simptoma udruženih sa bolešću ili poremećajem ublaži, redukuje, inhibira ili ne napreduje u sledeći, tj., teži stadijum. Primena anti-CD166 antitela, konjugovanog anti-CD166 antitela, anti-CD166 antitela koje može da se aktivira i/ili konjugovanog anti-CD166 antitela koje može da se aktivira kod pacijenta koji pati od bolesti ili poremećaja udruženog sa aberantnom ekspresijom i/ili aktivnošću CD166 smatra se uspešnom ako bolest ili poremećaj uđe u remisiju ili ne napreduje u sledeći, tj., teži stadijum.
[0148] U nekim primerima izvođenja, anti-CD166 antitelo, konjugovano anti-CD166 antitelo, anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira i njegove terapijske formulacije primenjuju se kod subjekta koji pati od, ili je osetljiv na bolest ili poremećaj, kao što su subjekti koji pate od kancera ili drugog neoplastičnog stanja, pri čemu obolele ćelije subjekta eksprimiraju CD166. U nekim primerima izvođenja, obolele ćelije su povezane sa aberantnom ekspresijom i/ili aktivnošću CD166. U nekim primerima izvođenja, obolele ćelije su povezane sa normalnom ekspresijom i/ili aktivnošću CD166. Subjekat koji pati od, ili je osetljiv na bolest ili poremećaj pri čemu obolele ćelije subjekta eksprimiraju CD166 identifikuje se upotrebom bilo kog od različitih postupaka poznatih u struci.
Na primer, subjekti koji pate od kancera ili drugog neoplastičnog stanja identifikuju se upotrebom bilo kog od različitih kliničkih i/ili laboratorijskih testova kao što je, medicinski pregled i analiza krvi, urina i/ili stolice za procenu zdravstvenog stanja. Na primer, subjekti koji pate od zapaljenja i/ili zapaljenskog poremećaja identifikuju se upotrebom bilo kog od različitih kliničkih i/ili laboratorijskih testova kao što je, medicinski pregled i/ili analiza telesnih tečnosti, npr., analiza krvi, urina i/ili stolice za procenu zdravstvenog stanja.
[0149] U nekim primerima izvođenja, anti-CD166 antitelo, konjugovano anti-CD166 antitelo, anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira i njihove terapijske formulacije primenjuju se kod subjekta koji pati od, ili je osetljiv na bolest ili poremećaj povezan sa ćelijama koje eksprimiraju CD166 ili sa prisustvom, rastom, proliferacijom, metastazama, i/ili aktivnošću takvih ćelija, kao što su subjekti koji pate od kancera ili drugih neoplastičnih stanja. U nekim primerima izvođenja, ćelije su povezane sa aberantnom ekspresijom i/ili aktivnošću CD166. U nekim primerima izvođenja, ćelije su povezane sa normalnom ekspresijom i/ili aktivnošću CD166. Subjekat koji pati od, ili je osetljiv na bolest ili poremećaj povezan sa ćelijama koje eksprimiraju CD166 identifikuje se upotrebom bilo kog od različitih postupaka poznatih u struci. Na primer, subjekti koji pate od kancera ili drugog neoplastičnog stanja identifikuju se upotrebom bilo kog od različitih kliničkih i/ili laboratorijskih testova kao što je, medicinski pregled i analiza krvi, urina i/ili stolice za procenu zdravstvenog stanja. Na primer, subjekti koji pate od zapaljenja i/ili zapaljenskog poremećaja identifikuju se upotrebom bilo kog od različitih kliničkih i/ili laboratorijskih testova kao što je, medicinski pregled i/ili analiza telesnih tečnosti, npr., analiza krvi, urina i/ili stolice za procenu zdravstvenog stanja.
[0150] Primena anti-CD166 antitela, konjugovanog anti-CD166 antitela, anti-CD166 antitela koje može da se aktivira i/ili konjugovanog anti-CD166 antitela koje može da se aktivira kod pacijenta koji pati od bolesti ili poremećaja udruženog sa ćelijama koje eksprimiraju CD166 smatra se uspešnom ako se postigne bilo koji od različitih laboratorijskih ili kliničkih ciljeva. Na primer, primena anti-CD166 antitela, konjugovanog anti-CD166 antitela, anti-CD166 antitela koje može da se aktivira i/ili konjugovanog anti-CD166 antitela koje može da se aktivira kod pacijenta koji pati od bolesti ili poremećaja udruženog sa ćelijama koje eksprimiraju CD166 smatra se uspešnom ako se jedan ili više og simptoma udruženih sa bolešću ili poremećajem ublaži, redukuje, inhibira ili ne napreduje u sledeći, tj., teži stadijum. Primena anti-CD166 antitela, konjugovanog anti-CD166 antitela, anti-CD166 antitela koje može da se aktivira i/ili konjugovanog anti-CD166 antitela koje može da se aktivira kod pacijenta koji pati od bolesti ili poremećaja udruženog sa ćelijama koje eksprimiraju CD166 smatra se uspešnom ako bolest ili poremećaj uđe u remisiju ili ne napreduje u sledeći, tj., teži stadijum.
[0151] U nekim primerima izvođenja, anti-CD166 antitelo, konjugovano anti-CD166 antitelo, anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira primenjuje se tokom i/ili posle lečenja u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih agenasa kao što je, na primer, hemoterapijski agens, antizapaljenski agens, i/ili imunosupresivni agens. U nekim primerima izvođenja, anti-CD166 antitelo, konjugovano anti-CD166 antitelo, anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira i dodatni agens (agensi) primenjuju se istovremeno. Na primer, anti-CD166 antitelo, konjugovano anti-CD166 antitelo, anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira i dodatni agens (agensi) mogu da budu formulisani u jednoj kompoziciji ili primenjeni kao dve ili više odvojenih kompozicija. U nekim primerima izvođenja, anti-CD166 antitelo, konjugovano anti-CD166 antitelo, anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira i dodatni agens (agensi) primenjuju se uzastopno.
[0152] Otkriće takođe obezbeđuje postupke i komplete za upotrebu anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju i/ili konjugovanih anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju u različitim dijagnostičkim i/ili profilaktičkim indikacijama. Na primer, otkriće obezbeđuje postupke i komplete za detekciju prisustva ili odsustva agensa za cepanje i ciljnog molekula od interesa kod subjekata ili u uzorku pomoću (i) dovođenja u kontakt subjekata ili uzorka sa anti-CD166 antitelom koje može da se aktivira, pri čemu anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira sadrži maskirajući fragment (MM), fragment koji može da se otcepi (CM) koji se cepa pomoću agensa za cepanje, i antigen-vezujući domen ili njegov fragment (AB) koji specifično vezuje ciljni molekul od interesa, pri čemu anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira u neotcepljenom, neaktiviranom stanju sadrži sledeći strukturni raspored od N-terminalnog kraja ka C-terminalnom kraju: MM-CM-AB ili AB-CM-MM; (a) gde je MM peptid koji inhibira vezivanje AB za CD166, i gde MM nema aminokiselinsku sekvencu prirodnog vezujućeg partnera AB i nije modifikovana forma prirodnog vezujućeg partnera AB; i (b) pri čemu, kada je AB u neotcepljenom, neaktiviranom stanju, MM interferira sa specifičnim vezivanjem AB za CD166, i kada je AB u otcepljenom, aktiviranom stanju MM ne interferira ili kompetira sa specifičnim vezivanjem AB za CD166; i (ii) merenja nivoa aktiviranog anti-CD166 antitela koje može da se aktivira kod subjekta ili u uzorku, pri čemu detektabilni nivo aktiviranog anti-CD166 antitela koje može da se aktivira kod subjekta ili u uzorku ukazuje na to da su agens za cepanje i CD166 prisutni kod subjekta ili u uzorku, i pri čemu izostanak detektabilnog nivoa aktiviranog anti-CD166 antitela koje može da se aktivira kod subjekta ili u uzorku ukazuje na to da su agens za cepanje, CD166, ili oba, i agens za cepanje i CD166, odsutni kod subjekta ili u uzorku.
[0153] U nekim primerima izvođenja, anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira je anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira sa kojim je konjugovan terapijski agens. U nekim primerima izvođenja, anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira nije konjugovano sa agensom. U nekim primerima izvođenja, anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira sadrži detektabilnu oznaku. U nekim primerima izvođenja, detektabilna oznaka je postavljena na AB. U nekim primerima izvođenja, merenje nivoa anti-CD166 antitela koje može da se aktivira kod subjekta ili u uzorku postiže se upotrebom sekundarnog reagensa koji se specifično vezuje za aktivirano antitelo, pri čemu reagens sadrži detektabilnu oznaku. U nekim primerima izvođenja, sekundarni reagens je antitelo koji sadrži detektabilnu oznaku.
[0154] U nekim primerima izvođenja ovih postupaka i kompleta, anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira uključuje detektabilnu oznaku. U nekim primerima izvođenja ovih postupaka i kompleta, detektabilna oznaka uključuje agens za snimanje, kontrastni agens, enzim, fluorescentnu oznaku, hromofor, boju, jedan ili više jona metala, ili oznaku na bazi liganda. U nekim primerima izvođenja ovih postupaka i kompleta, agens za snimanje sadrži radioizotop. U nekim primerima izvođenja ovih postupaka i kompleta, radioizotop je indijum ili tehnecijum. U nekim primerima izvođenja ovih postupaka i kompleta, kontrastni agens sadrži jod, gadolinijum ili gvožđe oksid. U nekim primerima izvođenja ovih postupaka i kompleta, enzim sadrži peroksidazu rena, alkalnu fosfatazu, ili β-galaktozidazu. U nekim primerima izvođenja ovih postupaka i kompleta, fluorescentna oznaka sadrži žuti fluorescentni protein (YFP), cijan fluorescentni protein (CFP), zeleni fluorescentni protein (GFP), modifikovani crveni fluorescentni protein (mRFP), crveni fluorescentni protein tdimer2 (RFP tdimer2), HCRED, ili derivat europijuma. U nekim primerima izvođenja ovih postupaka i kompleta, luminescentna oznaka sadrži derivat N-metilakridijuma. U nekim primerima izvođenja ovih postupaka, oznaka sadrži oznaku Alexa Fluor<®>, kao što je Alex Fluor<®>680 ili Alexa Fluor<®>750. U nekim primerima izvođenja ovih postupaka i kompleta, oznaka na bazi liganda sadrži biotin, avidin, streptavidin ili jedan ili više haptena.
[0155] U nekim primerima izvođenja ovih postupaka i kompleta, subjekat je sisar. U nekim primerima izvođenja ovih postupaka, subjekat je čovek. U nekim primerima izvođenja, subjekat je nehumani sisar, kao što je nehumani primat, domaća životinja (npr., mačka, pas, konj), životinja gajena na farmi, radna životinja, ili životinja iz zoološkog vrta. U nekim primerima izvođenja, subjekat je glodar.
[0156] U nekim primerima izvođenja ovih postupaka i kompleta, postupak je postupak in vivo. U nekim primerima izvođenja ovih postupaka, postupak je in situ postupak. U nekim primerima izvođenja ovih postupaka, postupak je ex vivo postupak. U nekim primerima izvođenja ovih postupaka, postupak je in vitro postupak.
[0157] U nekim primerima izvođenja postupaka i kompleta, postupak se koristi za identifikovanje ili na drugi način bliže određivanje populacije pacijenata pogodne za lečenje anti-CD166 antitelom koje može da se aktivira prema otkriću, praćeno lečenjem primenom tog anti-CD166 antitela koje može da se aktivira i/ili konjugovanog anti-CD166 antitela koje može da se aktivira kod subjekta kome je to potrebno. Na primer, pacijenti čiji je rezultat testa pozitivan za oba, ciljni molekul (npr., CD166) i proteazu koja cepa supstrat u fragmentu koji može da se otcepi (CM) anti-CD166 antitela koje može da se aktivira ispitivani u ovim postupcima, identifikovani su kao pogodni kandidati za lečenje takvim anti-CD166 antitelom koje može da se aktivira koje sadrži takav CM, i pacijentu se tada daju terapijski efikasne količine ispitivanog anti-CD166 antitela koje može da se aktivira i/ili konjugovanog anti-CD166 antitela koje može da se aktivira. Slično tome, pacijenti čiji je rezultat negativan za bilo koji, ili oba ciljna molekula (npr., CD166) i proteazu koja cepa supstrat u CM u antitelu koje može da se aktivira ispitivani upotrebom ovih postupaka mogu da budu identifikovani kao pogodni kandidati za drugi oblik terapije. U nekim primerima izvođenja, takvi pacijenti mogu da budu ispitani sa drugim anti-CD166 antitelima koja mogu da se aktiviraju dok se anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira pogodno za lečenje ne identifikuje (npr., anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira koje sadrži CM koji se cepa u telu pacijenta na mestu bolesti). U nekim primerima izvođenja, kod pacijenta se tada primenjuju terapijski efikasne količine konjugovanog i/ili anti-CD166 antitela koje može da se aktivira za koje je pacijent imao pozitivan rezultat testa. Pogodni AB, MM, i/ili CM uključuju bilo koji od ovde opisanih AB, MM, i/ili CM.
[0158] Farmaceutske kompozicije prema pronalasku mogu da uključuju antitelo prema pronalasku i nosač. Ove farmaceutske kompozicije mogu da budu uključene u komplete, kao što su, na primer, dijagnostički kompleti.
Kratak opis crteža
[0159]
Slika 1 je grafikon koji prikazuje vezivanje različitih anti-CD166 antitela predmetnog otkrića za protein CD166 čoveka.
Slika 2 je šematski prikaz selekcione šeme za anti-CD166 maskirajuće peptide predmetnog otkrića. Kućice označavaju populacije sa parametrima sortiranja označenim između kućica. Sva FACS sortiranja su sprovedena u 0.5% BSA sa viškom mišjeg izotipa za blokiranje nespecifičnog vezivanja za Alexa Fluor 488 obeleženo M9 Mab (VH sekvence SEQ ID NO: 119, VL sekvence SEQ ID NO: 120).
Slike 3A i 3B su serija grafikona koji prikazuju sposobnost anti-CD166 antitela CD166 M9 vK1/HcB (VH sekvence SEQ ID NO: 121, VL sekvence SEQ ID NO: 123) predmetnog otkrića i različitih anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju predmetnog otkrića da vežu CD166 čoveka.
Slika 4 je grafikon koji prikazuje sposobnost različitih anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju prema otkriću da vežu CD166 čoveka kada su proteolitički aktivirana.
Slika 5 je grafikon koji prikazuje sposobnost različitih konjugovanih anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju prema otkriću da vežu CD166 čoveka kada su proteolitički aktivirana.
Slike 6A-6D su serije snimaka koje pokazuju da je anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira prema otkriću aktivirano (tj., podvrgnuto cepanju) u uzorcima tkiva kancera debelog creva, i da anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira nije aktivirano u uzorcima zdravog tkiva. Slike 6A i 6C prikazuju rezultate IHC analize na uzorcima tumora i zdravog tkiva, a slike 6B i 6D prikazuju rezultate in situ vizualizacije na uzorcima tumora i zdravog tkiva.
Slike 7A-7D su serije snimaka koje pokazuju da je anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira prema otkriću aktivirano (tj., podvrgnuto cepanju) u uzorcima tkiva kancera pluća, i da anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira nije aktivirano u uzorcima zdravog tkiva. Slike 7A i 7C prikazuju rezultate IHC analize na uzorcima tumora i zdravog tkiva, a slike 7B i 7D prikazuju rezultate in situ vizualizacije na uzorcima tumora i zdravog tkiva.
Slike 8A-8D su serije snimaka koji pokazuju da anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira prema otkriću nije aktivirano u uzorcima zdravog tkiva. Slike 8A i 8C prikazuju rezultate IHC analize na uzorcima zdravog tkiva, a slike 8B i 8D prikazuju rezultate in situ vizualizacije na uzorcima zdravog tkiva.
Slika 9 je serija grafikona koji prikazuju potencu konjugovanog anti-CD166 antitela prema otkriću protiv ćelijske linije kancera dojke, ćelijske linije kancera prostate, ćelijske linije kancera pankreasa, ćelijske linije kancera skvamoznih ćelija glave i vrata, i ćelijske linije CD166 kao negativne kontrole.
Slika 10 je grafikon koji prikazuje efikasnost konjugovanog anti-CD166 antitela koje može da se aktivira (AADC, kompleks antitela koje može da se aktivira i leka, eng.-Activatable Antibody Drug Complex) prema otkriću u modelu kancera dojke.
Slika 11 je grafikon koji prikazuje efikasnost konjugata CD166 AADC DM4 prema predmetnom otkriću (tj., anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira prema otkriću konjugovano sa DM4) u modelu nesitnoćelijskog kancera pluća (NSCLC) H292.
Slika 12 je grafikon koji prikazuje efikasnost konjugata CD166 AADC DM4 prema predmetnom otkriću u modelu nesitnoćelijskog kancera pluća (NSCLC) H1975.
1
Slika 13 je grafikon koji prikazuje sposobnost anti-CD166 antitela prema otkriću da veže CD166 čoveka i cinomolgus majmuna sa jednakim afinitetom.
Slika 14 je grafikon koji prikazuje rezultate studije tolerabilnosti kod cinomolgus majmuna upotrebom anti-CD166 antitela koje može da se aktivira prema otkriću.
Slika 15 je grafikon koji prikazuje da se konjugovano anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira prema predmetnom otkriću dobro toleriše pri projektovanoj terapijskoj dozi. Slike 16A, 16B, i 16C su serije grafikona koje prikazuju sposobnost različitih konjugovanih anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju prema otkriću da vežu CD166 čoveka kada se takva konjugovana antitela koja mogu da se aktiviraju proteolitički aktiviraju.
Slika 17 je grafikon koji prikazuje sposobnost anti-CD166 antitela prema predmetnom otkriću da se veže za humane H292 ćelije i primarne epitelne ćelije bubrega cinomolgus majmuna sa uporedivim afinitetom.
Slika 18 je grafikon koji prikazuje sposobnost anti-CD166 antitela prema predmetnom otkriću da inhibiraju humane HuT-78 ćelije u vezivanju za CD6 receptor.
Slike 19A-19C su grafikoni koji prikazuju sposobnost konjugata anti-CD166 antitela koje može da se aktivira sa lekom prema predmetnom otkriću da se vežu za CD166 i humane ćelije u oblicima aktiviranim proteazom (podvrgnutim cepanju) i neaktiviranim (podvrgnutim cepanju) oblicima.
Slike 20A i 20B su grafikoni koji prikazuju primer testa citotoksičnosti konjugata anti-CD166 antitela koje može da se aktivira sa lekom prema predmetnom otkriću za humane ćelije H292 i HCC1806.
Slike 21A-21D su grafikoni koji prikazuju sposobnost konjugata anti-CD166 antitela koje može da se aktivira sa lekom prema predmetnom otkriću da indukuju imunološki odgovor u ćelijama.
Slika 22 je grafikon koji prikazuje sposobnost konjugata anti-CD166 antitela koje može da se aktivira sa lekom prema predmetnom otkriću da u ćelijama indukuje ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela.
Slika 23 su grafikoni koji prikazuju efikasnost konjugata anti-CD166 antitela koje može da se aktivira sa lekom prema predmetnom otkriću protiv višestrukih ksenograftskih modela tumora, poreklom od ćelija i poreklom od pacijenta.
Slike 24A do 24D su grafikoni koji prikazuju citotoksičnost konjugata anti-CD166 antitela koje može da se aktivira sa lekom prema predmetnom otkriću protiv višestrukih ćelijskih linija poreklom od kancera endometrijuma, i test koji prikazuje nivoe ekspresije CD166 na ćelijama poreklom od kancera endometrijuma.
2
Slike 25A i 25B prikazuju primere studija in situ vezivanja anti-CD166 antitela prema predmetnom otkriću u modelu ksenografta kancera pluća.
Slika 26 je grafikon koji prikazuje efikasnost konjugata anti-CD166 antitela koje može da se aktivira sa lekom prema predmetnom otkriću protiv kancera pluća u mišjem ksenograftskom modelu.
Detaljan opis pronalaska
[0160] Pronalazak je definisan priloženim patentnim zahtevima.
[0161] Otkriće obezbeđuje monoklonska antitela (mAb) i monoklonska antitela koja mogu da se aktiviraju koja specifično vezuju CD166, poznat i kao klaster diferencijacije 166, ćelijski adhezioni molekul aktiviranih leukocita (ALCAM), i/ili MEMD. U nekim primerima izvođenja, ćelije koje sadrže CD166 internalizuju monoklonska antitela i monoklonska antitela koja mogu da se aktiviraju. CD166 je ćelijski adhezioni molekul koji se vezuje za CD6, receptor ćelijske površine koji pripada superfamiliji proteina (SRCRSF) receptora čistača bogatih cisteinom (SRCR). Poznato je da je CD166 povezan sa interakcijama ćelija-ćelija i ćelija-matriks, ćelijskom adhezijom, ćelijskom migracijom, i aktivacijom i proliferacijom T-ćelija. Aberantna ekspresija i/ili aktivnost CD166 i signalizacije povezane sa CD166 uključena je u patogenezu mnogih bolesti i poremećaja, kao što je kancer, inflamacija i autoimunitet. Na primer, CD166 je visoko eksprimiran u različitim vrstama kancera kao što je, na primer, kancer prostate, kancer dojke, kancer pluća kao što je NSCLC i/ili SCLC, orofaringealni kancer, kancer grlića materice, i kancer glave i vrata kao što je HNSCC.
[0162] Otkriće obezbeđuje anti-CD166 antitela, konjugovana anti-CD166 antitela, anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju, i/ili konjugovana anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju koja su korisna u postupcima za lečenje, prevenciju, odlaganje progresije, poboljšanje i/ili ublažavanje simptoma bolesti ili poremećaja udruženog sa aberantnom ekspresijom i/ili aktivnošću CD166. Na primer, anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju koriste se u postupcima za lečenje, prevenciju, odlaganje progresije, poboljšanje i/ili ublažavanje simptoma kancera ili drugog neoplastičnog stanja.
[0163] Otkriće obezbeđuje anti-CD166 antitela, konjugovana anti-CD166 antitela, anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju, i/ili konjugovana anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju koja su korisna u postupcima za lečenje, prevenciju, odlaganje progresije, poboljšavanje i/ili ublažavanje simptoma bolesti ili poremećaja udruženog sa ćelijama koje eksprimiraju CD166. U nekim primerima izvođenja, ćelije su povezane sa aberantnom ekspresijom i/ili aktivnošću CD166. U nekim primerima izvođenja, ćelije su povezane sa normalnom ekspresijom i/ili aktivnošću CD166. Na primer, anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju koriste se u postupcima za lečenje, prevenciju, odlaganje progresije, poboljšanje i/ili ublažavanje simptoma kancera ili drugog neoplastičnog stanja.
[0164] Otkriće obezbeđuje anti-CD166 antitela, konjugovana anti-CD166 antitela, anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju, i/ili konjugovana anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju koja su korisna u postupcima za lečenje, prevenciju, odlaganje progresije, poboljšanje i/ili ublažavanje simptoma bolesti ili poremećaja kod koga obolele ćelije eksprimiraju CD166. U nekim primerima izvođenja, obolele ćelije su povezane sa aberantnom ekspresijom i/ili aktivnošću CD166. U nekim primerima izvođenja, obolele ćelije su povezane sa normalnom ekspresijom i/ili aktivnošću CD166. Na primer, anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju koriste se u postupcima za lečenje, prevenciju, odlaganje progresije, poboljšanje i/ili ublažavanje simptoma kancera ili drugog neoplastičnog stanja.
[0165] Anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju i/ili konjugovana anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju uključuju antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji specifično vezuje CD166 kuplovan sa maskirajućim fragmentom (MM), tako da kuplovanje MM redukuje sposobnost antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta da veže CD166. U nekim primerima izvođenja, MM je kuplovan preko sekvence koja uključuje supstrat za proteazu, na primer, proteazu koja je ko-lokalizovana sa CD166 na mestu lečenja kod subjekta.
[0166] Primeri anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju uključuju, na primer, antitela koja mogu da se aktiviraju koja uključuju teški lanac i laki lanac koji su, ili potiču od, varijabilnih sekvenci teškog lanca i varijabilnih sekvenci lakog lanca prikazanih ispod (CDR sekvence, koje su definisane prema AbM definiciji datoj na veb stranici Dr. Andrew C. R. Martin, dostupnoj na www_bioinf_org_uk/abs/) prikazane su podebljano i podvučeno):
muM9 VH:
muM9 VL:
huM9c VH:
4
hM9vK-1 VL:
[0167] Primeri anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju uključuju, na primer, antitela koja mogu da se aktiviraju koja uključuju teški lanac i laki lanac koji su, ili potiču od, varijabilnog teškog lanca i lakog lanca prikazanih ispod:
HuCD166_HcC
Aminokiselinska sekvenca
[0168] Primeri anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju uključuju, na primer, antitela koja mogu da se aktiviraju koja uključuju kombinaciju sekvence regiona koji određuje komplementarnost 1 varijabilnog teškog lanca (CDR1 VH, ovde označen i kao CDRH1), sekvence regiona koji određuje komplementarnost 2 varijabilnog teškog lanca (CDR2 VH, ovde označen i kao CDRH2), sekvence regiona koji određuje komplementarnost 3 varijabilnog teškog lanca (CDR3 VH, ovde označen i kao CDRH3), sekvence regiona koji određuje komplementarnost 1 varijabilnog lakog lanca (CDR1 VL, ovde označen i kao CDRL1), sekvence regiona koji određuje komplementarnost 2 varijabilnog lakog lanca (CDR2 VL, ovde označen i kao CDRL2), i sekvence regiona koji određuje komplementarnost 3 varijabilnog lakog lanca (CDR3 VL, ovde označen i kao CDRL3), pri čemu je najmanje jedna CDR sekvenca odabrana iz grupe koja se sastoji od CDR1 VH sekvence koji sadrži aminokiselinsku sekvencu GFSLSTYGMGVG (SEQ ID NO: 127); CDR2 VH sekvence koja sadrži aminokiselinsku sekvencu NIWWSEDKH (SEQ ID NO: 128); CDR3 VH sekvence koja sadrži aminokiselinsku sekvencu IDYGNDYAFTY (SEQ ID NO: 129); CDR1 VL sekvence koja sadrži aminokiselinsku sekvencu RSSKSLLHSNGITYLY (SEQ ID NO: 130) ili RSSQSLLHSNGITYLY (SEQ ID NO: 131); CDR2 VL sekvence koja sadrži aminokiselinsku sekvencu QMSNLAS (SEQ ID NO: 132) ili QMSNRAS (SEQ ID NO: 133); i CDR3 VL sekvence koja sadrži aminokiselinsku sekvencu AQNLELPYT (SEQ ID NO: 134).
[0169] U nekim primerima izvođenja, anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira uključuje teški lanac koji sadrži ili potiče od aminokiselinske sekvence teškog lanca prikazane u objavama SAD patentnih prijava br.20150071937, 20090070890, i/ili 20090203538.
[0170] U nekim primerima izvođenja, anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira uključuje teški lanac koji sadrži CDR1 VH, CDR2 VH, CDR3 VH, CDR1 VL, CDR2 VL, i/ili CDR3 VL sekvencu koja sadrži ili potiče od CDR kiselinske sekvence prikazane u objavama SAD patentnih prijava br.20150071937, 20090070890, i/ili 20090203538.
[0171] U nekim primerima izvođenja, anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira uključuje teški lanac koji sadrži ili potiče od aminokiselinske sekvence teškog lanca prikazane u tabeli 12. U nekim primerima izvođenja, anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira uključuje laki lanac koji sadrži ili potiče od aminokiselinske sekvence teškog lanca prikazane u tabeli 12. U nekim primerima izvođenja, anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira uključuje teški lanac koji sadrži ili potiče od aminokiselinske sekvence teškog lanca prikazane u tabeli 12, i laki lanac koji sadrži ili potiče od aminokiselinske sekvence lakog lanca prikazane u tabeli 12. U nekim primerima izvođenja, anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira uključuje kombinaciju sekvenci varijabilnog regiona teškog lanca i varijabilnog regiona lakog lanca iz kombinacije prikazane u grupi A u tabeli 12. U nekim primerima izvođenja, anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira uključuje kombinaciju sekvenci varijabilnog regiona teškog lanca i varijabilnog regiona lakog lanca prikazanu u grupu B u tabeli 12. U nekim primerima izvođenja, anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira uključuje kombinaciju sekvenci varijabilnog regiona teškog lanca i varijabilnog regiona lakog lanca prikazanu u grupi C u tabeli 12. U nekim primerima izvođenja, anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira uključuje kombinaciju sekvenci varijabilnog regiona teškog lanca i varijabilnog regiona lakog lanca prikazanu u grupi D u tabeli 12.
[0172] U nekim primerima izvođenja, anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira uključuje kombinaciju sekvenci regiona koji određuje komplementarnost (CDR) sekvence teškog lanca od sekvenci teškog lanca prikazanih u grupi A tabele 12. U nekim primerima izvođenja, anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira uključuje kombinaciju CDR sekvenci lakog lanca od sekvenci lakog lanca prikazanih u grupi A tabele 12. U nekim primerima izvođenja, anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira uključuje kombinaciju CDR sekvenci teškog lanca od sekvenci teškog lanca prikazanih u grupi A tabele 12 i CDR sekvenci lakog lanca od sekvenci teškog lanca prikazanih u grupi A tabele 12.
[0173] U nekim primerima izvođenja, anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira uključuje kombinaciju CDR sekvenci teškog lanca od sekvenci teškog lanca prikazanih u grupi B tabele 12. U nekim primerima izvođenja, anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira uključuje kombinaciju CDR sekvenci lakog lanca od sekvenci lakog lanca prikazanih u grupi B tabele 12. U nekim primerima izvođenja, anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira uključuje kombinaciju CDR sekvenci teškog lanca od sekvenci teškog lanca prikazanih u grupi B tabele 12 i CDR sekvenci lakog lanca od sekvenci teškog lanca prikazanih u grupi B tabele 12.
[0174] U nekim primerima izvođenja, anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira uključuje kombinaciju CDR sekvenci teškog lanca od sekvenci teškog lanca prikazanih u grupi C tabele 12. U nekim primerima izvođenja, anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira uključuje kombinaciju CDR sekvenci lakog lanca od sekvenci lakog lanca prikazanih u grupi C tabele 12. U nekim primerima izvođenja, anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira uključuje kombinaciju CDR sekvenci teškog lanca od sekvenci teškog lanca prikazanih u grupi C tabele 12 i CDR sekvenci lakog lanca od sekvenci teškog lanca prikazanih u grupi C tabele 12.
[0175] U nekim primerima izvođenja, anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira uključuje kombinaciju CDR sekvenci teškog lanca od sekvenci teškog lanca prikazanih u grupi D tabele 12. U nekim primerima izvođenja, anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira uključuje kombinaciju CDR sekvence lakog lanca od sekvenci lakog lanca prikazanih u grupi D tabele 12. U nekim primerima izvođenja, anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira uključuje kombinaciju CDR sekvenci teškog lanca od sekvenci teškog lanca prikazanih u grupi D tabele 12 i CDR sekvenci lakog lanca od sekvenci teškog lanca prikazanih u grupi D tabele 12.
Tabela 12. Sekvence varijabilnog regiona teškog lanca (VH) i varijabilnog regiona lakog lanca (VL) za antitela koja mogu da se aktiviraju koja vezuju CD166
[0176] U nekim primerima izvođenja, anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira uključuje CDR sekvencu prikazanu u tabeli 13, kombinaciju CDR VL sekvenci (CDR1 VL, CDR2 VL, CDR3 VL) izabranu iz grupe koja se sastoji od kombinacija prikazanih u jednom redu tabele 13, kombinaciju CDR VH sekvenci (CDR1 VH, CDR2 VH, CDR3 VH) izabranu iz grupe koja se sastoji od kombinacija prikazanih u tabeli 13, ili kombinaciju CDR VL i CDR VH sekvenci (CDR1 VL, CDR2 VL, CDR3 VL, CDR1 VH, CDR2 VH, CDR3 VH) izabranih iz grupe koja se sastoji od kombinacija prikazanih u tabeli 13.
Tabela 13. CDR sekvence za antitela i antitela koja mogu da se aktiviraju koja vezuju CD166
[0177] U nekim primerima izvođenja, anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira sadrži ili potiče od antitela koje je proizvedeno, izlučeno ili na drugi način proizvedeno iz hibridoma, kao što je, na primer, hibridom/hibridomi opisani u objavi SAD patentne prijave br. 20040048319 i deponovano u Američkoj kolekciji kultura (ATCC) pod depozitnim brojem PTA-4478. U nekim primerima izvođenja, anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira sadrži ili potiče od antitela koje je proizvedeno, izlučeno ili na drugi način proizvedeno iz hibridoma, kao što je, na primer, hibridom/hibridomi opisani u SAD patentu br. 6,022,540 i deponovani u ATCC pod depozitnim brojem HB 11789.
[0178] U nekim primerima izvođenja, anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira sadrži ili potiče od antitela koje je proizvedeno, izlučeno ili na drugi način proizvedeno iz hibridoma, kao što je, na primer, hibridom/hibridomi opisani u SAD patentu br.5,998,172 i deponovani u ATCC pod depozitnim brojem HB 12136, HB 12137, HB 12138, HB12139, HB 12140, i/ili HB 12141.
[0179] Anti-CD166 antitela i AB u antitelima koja mogu da se aktiviraju prema otkriću specifično vezuju ciljni molekul CD166, kao što je, na primer, sisarski CD166, i/ili CD166 čoveka. U otkriće su uključena i anti-CD166 antitela i AB koja se vezuju za isti CD166 epitop kao antitelo prema otkriću i/ili aktivirano antitelo koje može da se aktivira kao što je ovde opisano. U otkriće su uključena i anti-CD166 antitela i AB koja kompetiraju sa ovde opisanim anti-CD166 antitelom i/ili aktiviranim anti-CD166 antitelom koje može da se aktivira za vezivanje sa ciljnim molekulom CD166, npr., CD166 čoveka. U otkriće su uključena i anti-CD166 antitela i AB koja unakrsno kompetiraju sa ovde opisanim anti-CD166 antitelom i/ili aktiviranim anti-CD166 antitelom koje može da se aktivira za vezivanje sa ciljnim molekulom CD166, npr., CD166 čoveka.
[0180] Ovde obezbeđena anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju uključuju maskirajući fragment. U nekim primerima izvođenja, maskirajući fragment je aminokiselinska sekvenca koja je kuplovana ili drugačije spojena sa anti-CD166 antitelom i smeštena je unutar konstrukta anti-CD166 antitela koje može da se aktivira tako da maskirajući fragment redukuje sposobnost anti-CD166 antitela da specifično veže CD166. Pogodni maskirajući fragmenti identifikuju se upotrebom bilo koje od raznih poznatih tehnika. Na primer, peptidni maskirajući fragmenti identifikuju se upotrebom postupaka opisanih u PCT objavi br. WO 2009/025846 autora Daugherty et al.
[0181] Ovde obezbeđena anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju uključuju fragment koji može da se otcepi. U nekim primerima izvođenja, fragment koji može da se otcepi uključuje aminokiselinsku sekvencu koja je supstrat za proteazu, obično vanćelijsku proteazu. Pogodni supstrati identifikuju se upotrebom bilo koje od raznih poznatih tehnika. Na primer, peptidni substrati identifikuju se upotrebom postupaka opisanih u SAD patentu br. 7,666,817 autora Daugherty et al.; u SAD patentu br. 8,563,269 autora Stagliano et al.; i u PCT objavi br. WO 2014/026136 autora La Porte et al. (Videti takođe Boulware et al. "Evolutionary optimization of peptide substrates for proteases that exhibit rapid hydrolysis kinetics." Biotechnol Bioeng. 106.3 (2010): 339-46).
[0182] Primeri supstrata uključuju, ali nisu ograničeni na supstrate koje mogu da cepaju jedan ili više od sledećih enzima ili proteaza navedenih u tabeli 4.
1
Tabela 4: Primeri proteaza i/ili enzima
2
[0183] Ovde opisana anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju prevazilaze ograničenje terapijskih antitela, posebno terapijskih antitela za koja se zna da su in vivo toksična bar u izvesnom stepenu. Ciljno-posredovana toksičnost predstavlja veliko ograničenje za razvoj terapijskih antitela. Ovde obezbeđena anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju konstruisana su za rešavanje problema toksičnosti povezane sa inhibicijom cilja u normalnim tkivima tradicionalnim terapijskim antitelima. Ova anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju ostaju maskirana sve do proteolitičke aktivacije na obolelom mestu. Polazeći od anti-CD166 antitela kao parentalnog terapijskog antitela, anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju konstruisana su kuplovanjem antitela sa inhibitornom maskom preko linkera koji uključuje proteazni supstrat.
[0184] Kada je AB modifikovan sa MM i nađe se u prisustvu ciljnog molekula, specifično vezivanje AB za njegov ciljni molekul je redukovano ili inhibirano, u poređenju sa specifičnim vezivanjem AB koji nije modifikovan sa MM ili specifičnim vezivanjem parentalnog AB za ciljni molekul.
[0185] KdAB modifikovanog sa MM prema ciljnom molekulu je najmanje 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1000, 2 500, 5000, 10 000, 50000, 100000, 500 000, 1000 000, 5000 000, 10000 000, 50000 000 ili više, ili između 5-10, 10-100, 10-1000, 10-10000, 10-100000, 10-1000 000, 10-10 000 000, 100-1 000, 100-10000, 100-100 000, 100-1000 000, 100-10 000 000, 1000-10 000, 1000-100 000, 1000-1 000 000, 1000-10 000 000, 10 000-100 000, 10000-1 000 000, 10 000-10 000 000, 100 000-1 000 000, ili 100 000-10 000 000 puta veća od KdAB koji nije modifikovan sa MM ili parentalnog AB prema ciljnom molekulu. Nasuprot tome, afinitet vezivanja AB modifikovanog sa MM prema ciljnom molekulu je najmanje 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1000, 2 500, 5000, 10000, 50 000, 100000, 500000, 1000 000, 5 000 000, 10 000 000, 50000 000 ili više, ili između 5-10, 10-100, 10-1000, 10-10000, 10-100000, 10-1000 000, 10-10 000 000, 100-1 000, 100-10 000, 100-100 000, 100-1 000 000, 100-10 000 000, 1 000-10 000, 1 000-100 000, 1 000-1 000 000, 1000-10 000 000, 10000-100 000, 10000-1 000 000, 10 000-10 000 000, 100 000-1 000 000, ili 100 000-10 000 000 puta niži od afiniteta vezivanja AB koji nije modifikovan sa MM ili parentalnog AB prema ciljnom molekulu.
[0186] Konstanta disocijacije (Kd) MM prema AB je uopšteno veća od KdAB prema ciljnom molekulu. KdMM prema AB može da bude najmanje 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1000, 2 500, 5 000, 10 000, 100 000, 1 000 000 ili čak 10 000 000 puta veća od KdAB prema ciljnom molekulu. Nasuprot tome, afinitet vezivanja MM prema AB je uopšteno niži od afiniteta vezivanja AB prema ciljnom molekulu. Afinitet vezivanja MM prema AB može da bude najmanje 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1000, 2500, 5000, 10000, 100000, 1 000 000 ili čak 10 000 000 puta niži od afiniteta vezivanja AB prema ciljnom molekulu.
[0187] U nekim primerima izvođenja, konstanta disocijacije (Kd) MM prema AB je približno jednaka Kd AB prema ciljnom molekulu. U nekim primerima izvođenja, konstanta disocijacije (Kd) MM prema AB nije veća od konstante disocijacije AB prema ciljnom molekulu.
[0188] U nekim primerima izvođenja, konstanta disocijacije (Kd) MM prema AB je manja od konstante disocijacije AB prema ciljnom molekulu.
[0189] U nekim primerima izvođenja, konstanta disocijacije (Kd) MM prema AB je veća od konstante disocijacije AB prema ciljnom molekulu.
[0190] U nekim primerima izvođenja, MM ima Kd za vezivanje sa AB koja nije veća od Kd za vezivanje AB za ciljni molekul.
[0191] U nekim primerima izvođenja, MM ima Kd za vezivanje sa AB koja nije manja od Kd za vezivanje AB za ciljni molekul.
[0192] U nekim primerima izvođenja, MM ima Kd za vezivanje sa AB koja je približno jednaka Kd za vezivanje AB za ciljni molekul.
[0193] U nekim primerima izvođenja, MM ima Kd za vezivanje sa AB koja je manja od Kd za vezivanje AB za ciljni molekul.
[0194] U nekim primerima izvođenja, MM ima Kd za vezivanje sa AB koja je veća od Kd za vezivanje AB za ciljni molekul.
[0195] U nekim primerima izvođenja, MM ima Kd za vezivanje sa AB koja nije više od 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, ili 1000 puta veća od Kd za vezivanje AB za ciljni molekul. U nekim
4
primerima izvođenja, MM ima Kd za vezivanje sa AB koja je između 1-5, 2-5, 2-10, 5-10, 5-20, 5-50, 5-100, 10-100, 10-1000, 20-100, 20-1000, ili 100-1 000 puta veća od Kd za vezivanje AB za ciljni molekul.
[0196] U nekim primerima izvođenja, MM ima afinitet vezivanja sa AB koji je manji od afiniteta vezivanja AB za ciljni molekul.
[0197] U nekim primerima izvođenja, MM ima afinitet vezivanja sa AB koji nije veći od afiniteta vezivanja AB za ciljni molekul.
[0198] U nekim primerima izvođenja, MM ima afinitet vezivanja sa AB koji je približno jednak afinitetu vezivanja AB za ciljni molekul.
[0199] U nekim primerima izvođenja, MM ima afinitet vezivanja sa AB koja nije manji od afiniteta vezivanja AB za ciljni molekul.
[0200] U nekim primerima izvođenja, MM ima afinitet vezivanja sa AB koji je veći od afiniteta vezivanja AB za ciljni molekul.
[0201] U nekim primerima izvođenja, MM ima afinitet vezivanja sa AB koji je 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, ili 1 000 manji od afiniteta vezivanja AB za ciljni molekul. U nekim primerima izvođenja, MM ima afinitet vezivanja sa AB koji je između 1-5, 2-5, 2-10, 5-10, 5-20, 5-50, 5-100, 10-100, 10-1000, 20-100, 20-1000, ili 100-1000 puta manji od afiniteta vezivanja AB za ciljni molekul. U nekim primerima izvođenja, MM ima afinitet vezivanja sa AB koji je 2 do 20 puta manji od afiniteta vezivanja AB za ciljni molekul. U nekim primerima izvođenja, MM nije kovalentno vezan za AB i u ekvimolarnoj koncentraciji sa AB ne inhibira vezivanje AB za ciljni molekul.
[0202] Kada je AB modifikovan sa MM i nalazi se u prisustvu ciljnog molekula, specifično vezivanje AB za njegov ciljni molekul je redukovano ili inhibirano, u poređenju sa specifičnim vezivanjem AB koji nije modifikovan sa MM ili specifično vezivanje parentalnog AB za ciljni molekul. U poređenju sa vezivanjem AB koji nije modifikovan sa MM ili vezivanjem parentalnog AB za ciljni molekul, sposobnost AB da veže ciljni molekul kada je modifikovan sa MM može da bude smanjena za najmanje 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% i čak 100% tokom najmanje 2, 4, 6, 8, 12, 28, 24, 30, 36, 48, 60, 72, 84, ili 96 časova, ili 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, ili 180 dana, ili 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ili 12 meseci ili više kada se meri in vivo ili u in vitro testu.
[0203] MM inhibira vezivanje AB za ciljni molekul. MM vezuje antigen-vezujući domen AB i inhibira vezivanje AB za ciljni molekul. MM može sterički da inhibira vezivanje AB za ciljni molekul. MM može alosterički da inhibira vezivanje AB za njegov ciljni molekul. U ovim primerima izvođenja kada je AB modifikovan ili kuplovan sa MM i u prisustvu ciljnog molekula nema vezivanja ili suštinski nema vezivanja AB za ciljni molekul, ili nema više od 0.001%, 0.01%, 0.1%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, ili 50% vezivanja AB za ciljni molekul, u poređenju sa vezivanjem AB koji nije modifikovan sa MM, parentalnim AB, ili AB koji nije kuplovan sa MM za ciljni molekul, tokom najmanje 2, 4, 6, 8, 12, 28, 24, 30, 36, 48, 60, 72, 84, ili 96 časova, ili 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, ili 180 dana, ili 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ili 12 meseci ili duže, mereno in vivo ili u in vitro testu.
[0204] Kada je AB kuplovan sa ili modifikovan sa MM, MM 'maskira' ili redukuje ili drugačije inhibira specifično vezivanje AB za ciljni molekul. Kada je AB kuplovan sa, ili modifikovan sa MM, takvo kuplovanje ili modifikacija može da utiče na strukturnu promenu koja redukuje ili inhibira sposobnost AB da specifično veže ciljni molekul.
[0205] AB kuplovan sa, ili modifikovan sa MM može da bude predstavljen sledećim formulama (redosledom od amino (N) terminalnog regiona ka karboksilnom (C) terminalnom regionu:
(MM)-(AB)
(AB)-(MM)
(MM)-L-(AB)
(AB)-L-(MM)
gde je MM maskirajući fragment, AB je antitelo ili njegov fragment, a L je linker. U mnogim primerima izvođenja, može da bude poželjno ubacivanje jednog ili više linkera, npr., fleksibilnih linkera, u kompoziciju tako da se obezbedi fleksibilnost.
[0206] U određenim primerima izvođenja, MM nije prirodni vezujući partner AB. U nekim primerima izvođenja, MM ne sadrži ili suštinski ne sadrži homologiju sa bilo kojim prirodnim vezujućim partnerom AB. U nekim primerima izvođenja, MM nije više od 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, ili 80% sličan sa bilo kojim prirodnim vezujućim partnerom AB. U nekim primerima izvođenja, MM nije više od 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, ili 80% identičan sa bilo kojim prirodnim vezujućim partnerom AB. U nekim primerima izvođenja, MM nije više od 25% identičan sa bilo kojim prirodnim vezujućim partnerom AB. U nekim primerima izvođenja, MM nije više od 50% identičan sa bilo kojim prirodnim vezujućim partnerom AB. U nekim primerima izvođenja, MM nije više od 20% identičan sa bilo kojim prirodnim vezujućim partnerom AB. U nekim primerima izvođenja, MM nije više od 10% identičan sa bilo kojim prirodnim vezujućim partnerom AB.
[0207] U nekim primerima izvođenja, antitela koja mogu da se aktiviraju uključuju AB koji je modifikovan sa MM i takođe uključuje jedan ili više fragmenata koji mogu da se otcepe (CM). Takva antitela koja mogu da se aktiviraju ispoljavaju vezivanje koje može da se aktivira/promenljivo vezivanje, za ciljni molekul AB. Antitela koja mogu da se aktiviraju uopšteno uključuju antitelo ili fragment antitela (AB), modifikovan ili kuplovan sa maskirajućim fragmentom (MM) i fragmentom koji može da se modifikuje ili otcepi (CM). U nekim primerima izvođenja, CM sadrži aminokiselinsku sekvencu koja služi kao supstrat za najmanje jednu proteazu.
[0208] Elementi antitela koja mogu da se aktiviraju su raspoređeni tako da su MM i CM raspoređeni na taj način da u otcepljenom (ili relativno aktivnom) stanju i u prisustvu ciljnog molekula, AB vezuje ciljni molekul, dok kada je antitelo koje može da se aktivira u neotcepljenom (ili relativno neaktivnom) stanju u prisustvu ciljnog molekula, specifično vezivanje AB za njegov ciljni molekul je redukovano ili inhibirano. Specifično vezivanje AB za njegov ciljni molekul može da bude redukovano zahvaljujući inhibiciji ili maskiranju sposobnosti AB da specifično veže svoj ciljni molekul pomoću MM.
[0209] KdAB modifikovanog sa MM i CM prema ciljnom molekulu je najmanje 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1000, 2 500, 5000, 10000, 50 000, 100000, 500000, 1000 000, 5 000 000, 10 000 000, 50000 000 ili više, ili između 5-10, 10-100, 10-1000, 10-10000, 10-100000, 10-1000 000, 10-10 000 000, 100-1 000, 100-10 000, 100-100 000, 100-1 000 000, 100-10 000 000, 1 000-10 000, 1 000-100 000, 1 000-1 000 000, 1000-10 000 000, 10000-100 000, 10000-1 000 000, 10 000-10 000 000, 100000-1 000 000, ili 100000-10 000 000 puta veća od KdAB koji nije modifikovan sa MM i CM ili parentalnog AB prema ciljnom molekulu. Nasuprot tome, afinitet vezivanja AB modifikovanog sa MM i CM prema ciljnom molekulu je najmanje 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1000, 2500, 5 000, 10000, 50000, 100 000, 500000, 1000 000, 5000 000, 10000 000, 50 000 000 ili više, ili između 5-10, 10-100, 10-1 000, 10-10000, 10-100000, 10-1 000 000, 10-10 000 000, 100-1000, 100-10 000, 100-100000, 100-1 000 000, 100-10000 000, 1000-10 000, 1 000-100 000, 1000-1 000 000, 1000-10 000 000, 10000-100 000, 10000-1 000 000, 10 000-10 000 000, 100000-1 000 000, ili 100000-10 000 000 puta niži od afiniteta vezivanja AB koji nije modifikovan sa MM i CM ili parentalnog AB prema ciljnom molekulu.
[0210] Kada je AB modifikovan sa MM i CM i nalazi se u prisustvu ciljnog molekula, ali ne i u prisustvu modifikujućeg agensa (na primer najmanje jedne proteaze), specifično vezivanje AB za njegov ciljni molekul je redukovano ili inhibirano, u poređenju sa specifičnim vezivanjem AB koji nije modifikovan sa MM i CM ili parentalnog AB za ciljni molekul. Kada se poredi sa vezivanjem parentalnog AB ili vezivanjem AB koji nije modifikovan sa MM i CM za njegov ciljni molekul, sposobnost AB da veže ciljni molekul kada je modifikovan sa MM i CM može da bude redukovana za najmanje 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% i čak 100% tokom najmanje 2, 4, 6, 8, 12, 28, 24, 30, 36, 48, 60, 72, 84, ili 96 časova ili 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, ili 180 dana, ili 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ili 12 meseci ili duže, mereno in vivo ili u in vitro testu.
[0211] Kako se ovde koristi, pojam otcepljeno stanje odnosi se na stanje antitela koja mogu da se aktiviraju nakon modifikacije CM sa najmanje jednom proteazom. Pojam neotcepljeno stanje, kako se ovde koristi, odnosi se na stanje antitela koja mogu da se aktiviraju u odsustvu otcepljivanja CM pomoću proteaze. Kao što je gore diskutovano, termin "antitela koja mogu da se aktiviraju" ovde se koristi da označi antitelo koje može da se aktivira u oba njegova stanja, neotcepljenom (nativnom) stanju, kao i u otcepljenom stanju. Stručnjaku u oblasti biće jasno da u nekim primerima izvođenja otcepljenom antitelu koje može da se aktivira može da nedostaje MM zbog otcepljivanja CM proteazom, što rezultuje oslobađanjem najmanje MM (npr., kada MM nije spojen sa antitelima koja mogu da se aktiviraju kovalentnom vezom (npr., disulfidnim vezom između cisteinskih rezidua).
[0212] Pod pojmom koje može da se aktivira ili promenljivo, podrazumeva se da antitelo koje može da se aktivira ispoljava prvi nivo vezivanja za ciljni molekul kada je antitelo koje može da se aktivira u inhibiranom, maskiranom ili neotcepljenom stanju (tj., prvoj konformaciji), i drugi nivo vezivanja za ciljni molekul u neinhibiranom, nemaskiranom i/ili otcepljenom stanju (tj., drugoj konformaciji), pri čemu je drugi nivo vezivanja ciljnog molekula veći od prvog nivoa vezivanja. Uopšteno, pristup ciljnog molekula do AB antitela koje može da se aktivira veći je u prisustvu agensa za cepanje sposobnog da otcepi CM, tj., proteaze, nego u odsustvu takvog agensa za cepanje. Prema tome, kada je antitelo koje može da se aktivira u neotcepljenom stanju, AB je inhibiran za vezivanje ciljnog molekula i može da bude maskiran za vezivanje ciljnog molekula (tj., prva konformacija je takva da AB ne može da veže ciljni molekul), a u otcepljenom stanju AB nije inhibiran ili je demaskiran za vezivanje ciljnog molekula.
[0213] CM i AB antitela koja mogu da se aktiviraju odabrani su tako da AB predstavlja vezujući fragment za dati ciljni molekul, a CM predstavlja supstrat za proteazu. U nekim primerima izvođenja, proteaza je ko-lokalizovana sa ciljnim molekulom na mestu lečenja ili dijagnostičkom mestu u telu subjekta. Kako se ovde koristi, ko-lokalizovan znači da se nalazi na istom mestu ili u relativnoj blizini. U nekim primerima izvođenja, proteaza cepa CM dajući aktivirano antitelo koje se vezuje za ciljni molekul smešten blizu mesta cepanja. Ovde opisana antitela koja mogu da se aktiviraju nalaze konkretnu primenu kada je, na primer, proteaza sposobna da cepa mesto u CM, tj., proteaza, prisutna na relativno višim nivoima u tkivu koje sadrži ciljni molekul na mestu lečenja ili dijagnostičkom mestu, nego u tkivu na mestu koje nije mesto lečenja (na primer u zdravom tkivu). U nekim primerima izvođenja, CM prema otkriću takođe cepa jedna ili više drugačijih proteaza. U nekim primerima izvođenja, jedna ili više drugačijih proteaza je kolokalizovana sa ciljnim molekulom i odgovorna za cepanje CM in vivo.
[0214] U nekim primerima izvođenja antitela koja mogu da se aktiviraju obezbeđuju redukovanu toksičnost i/ili sporedna neželjena dejstva koja bi inače mogla da rezultuju iz vezivanja AB na mestima koja nisu mesta lečenja kada AB ne bi bio maskiran ili drugačije inhibiran za vezivanje za ciljni molekul.
[0215] Uopšteno, antitelo koje može da se aktivira može da bude konstruisano selektovanjem AB od interesa i konstruisanjem preostalog antitela koje može da se aktivira tako da, kad je konformaciono ograničeno, MM obezbeđuje maskiranje AB ili redukciju vezivanja AB za njegov ciljni molekul. Kriterijumi strukturnog dizajna mogu da budu uzeti u obzir da bi se obezbedilo ovo funkcionalno svojstvo.
[0216] Obezbeđena su antitela koja mogu da se aktiviraju koja ispoljavaju promenljivi fenotip željenog dinamičkog opsega za vezivanje ciljnog molekula u inhibiranoj naspram neinhibirane konformacije. Dinamički opseg uopšteno se odnosi na odnos (a) maksimalnog detektovanog nivoa parametra pod prvim setom uslova prema (b) minimalnoj detektovanoj vrednosti tog parametra pod drugim setom uslova. Na primer, u kontekstu antitela koje može da se aktivira, dinamički opseg odnosi se na odnos (a) maksimalnog detektovanog nivoa vezivanja ciljnog proteina za antitelo koje može da se aktivira u prisustvu najmanje jedne proteaze sposobne za cepanje CM antitela koja mogu da se aktiviraju prema (b) minimalnom detektovanom nivou vezivanja ciljnog proteina za antitelo koje može da se aktivira u odsustvu proteaze. Dinamički opseg antitela koje može da se aktivira može da se izračuna kao odnos konstante disocijacije pri obradi antitela koje može da se aktivira agensom za cepanje (npr., enzimom) prema konstanti disocijacije pri obradi antitela koja mogu da se aktiviraju agensom za cepanje. Što je veći dinamički opseg antitela koje može da se aktivira, bolji je promenljivi fenotip antitela koje može da se aktivira. Antitela koja mogu da se aktiviraju koja imaju relativno više vrednosti dinamičkog opsega (npr., veće od 1) ispoljavaju poželjnije promenljive fenotipe tako da se vezivanje ciljnog proteina antitelima koja mogu da se aktiviraju javlja u većem stepenu (npr., pretežno se javlja) u prisustvu agensa za cepanje (npr., enzima) sposobnog za cepanje CM antitela koja mogu da se aktiviraju nego u odsustvu agensa za cepanje.
[0217] Antitela koja mogu da se aktiviraju mogu da budu obezbeđena u raznim strukturnim konfiguracijama. Primeri formula za antitela koja mogu da se aktiviraju dati su ispod. Posebno je predviđeno da redosled od N- ka C-terminalnom kraju AB, MM i CM može da bude obrnut u antitelu koje može da se aktivira. Takođe je specifično predviđeno da aminokiselinske sekvence CM i MM mogu da se preklapaju, npr., tako da je CM sadržan unutar MM.
[0218] Na primer, antitela koja mogu da se aktiviraju mogu da budu predstavljena sledećom formulom (redosledom od amino (N) terminalnog regiona ka karboksilnom (C) terminalnom regionu:
(MM)-(CM)-(AB)
(AB)-(CM)-(MM)
gde je MM maskirajući fragment, CM je fragment koji može da se otcepi, i AB je antitelo ili njegov fragment. Treba napomenuti da iako su MM i CM predstavljene kao odvojene komponente u formulama iznad, u svim primerima izvođenja (uključujući formule) koji su ovde opisani, predviđeno je da aminokiselinske sekvence MM i CM mogu da se preklapaju, npr., tako da je CM potpuno ili delimično sadržan u MM. Pored toga, formule iznad obezbeđuju dodatne aminokiselinske sekvence koje mogu da budu smeštene N-terminalno ili C-terminalno u odnosu na elemente antitela koja mogu da se aktiviraju.
[0219] U određenim primerima izvođenja, MM nije prirodni vezujući partner AB. U nekim primerima izvođenja, MM ne sasdrži ili suštinski ne sadrži homologiju sa bilo kojim prirodnim vezujućim partnerom AB. U nekim primerima izvođenja, MM nije više od 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, ili 80% sličan sa bilo kojim prirodnim vezujućim partnerom AB. U nekim primerima izvođenja, MM nije više od 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, ili 80% identičan sa bilo kojim prirodnim vezujućim partnerom AB. U nekim primerima izvođenja, MM nije više od 50% identičan sa bilo kojim prirodnim vezujućim partnerom AB. U nekim primerima izvođenja, MM nije više od 25% identičan sa bilo kojim prirodnim vezujućim partnerom AB. U nekim primerima izvođenja, MM nije više od 20% identičan sa bilo kojim prirodnim vezujućim partnerom AB. U nekim primerima izvođenja, MM nije više od 10% identičan sa bilo kojim prirodnim vezujućim partnerom AB.
[0220] U mnogim primerima izvođenja može da bude poželjno ubacivanje jednog ili više linkera, npr., fleksibilnih linkera, u konstrukt antitela koje može da se aktivira tako da se obezbedi fleksibilnost na jednom ili više od MM-CM spojeva, CM-AB spojeva, ili oba. Na primer, AB, MM, i/ili CM mogu da ne sadrže dovoljan broj rezidua (npr., Gly, Ser, Asp, Asn, posebno Gly i Ser, naročito Gly) da obezbede željenu fleksibilnost. U tom slučaju, promenljivi fentoip takvih konstrukata antitela koje može da se aktivira može da ima koristi od uvođenja jedne ili više aminokiselina da bi se obezbedio fleksibilni linker. Pored toga, kao što je opisano ispod, kada je antitelo koje može da se aktivira obezbeđeno kao konformacijski ograničen konstrukt, fleksibilni linker može da bude funkcionalno ubačen da olakša formiranje i održavanje ciklične strukture u neotcepljenom antitelu koje može da se aktivira.
[0221] Na primer, u određenim primerima izvođenja antitelo koje može da se aktivira sadrži jednu od sledećih formula (gde formula ispod predstavlja aminokiselinsku sekvencu u N- ka C-terminalnom smeru ili C- ka N-terminalnom smeru):
(MM)-L1-(CM)-(AB)
(MM)-(CM)-L2-(AB)
(MM)-L1-(CM)-L2-(AB)
pri čemu su MM, CM, i AB kao što je gore definisano; gde su L1 i L2 svaki nezavisno i opciono prisutni ili odsutni, isti ili različiti fleksibilni linkeri koji uključuju najmanje 1 fleksibilnu aminokiselinu (npr., Gly). Pored toga, formule iznad obezbeđuju dodatne aminokiselinske sekvence koje mogu da budu smeštene N-terminalno ili C-terminalno u odnosu na elemente antitela koja mogu da se aktiviraju. Primeri uključuju, ali nisu ograničeni na, fragmente koji ciljno deluju (npr., ligand za receptor ćelije prisutan u ciljnom tkivu) i fragmente koji produžuju serumski poluživot (npr., polipeptide koji vezuju serumske proteine, kao što je imunoglobulin (npr., IgG) ili serumski albumin (npr., humani serumski albumin (HAS)).
[0222] CM se specifično cepa najmanje jednom proteazom brzinom od oko 0.001-1500 x 10<4>M-1S-1 ili najmanje 0.001, 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 2.5, 5, 7.5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 200, 250, 500, 750, 1000, 1250, ili 1500 x 104 M-1S-1. U nekim primerima izvođenja, CM se specifično cepa brzinom od oko 100 000 M<-1>S<-1>. U nekim primerima izvođenja, CM se specifično cepa brzinom od oko 1x10E2 do oko 1x10E6 M<-1>S<-1>(tj., od oko 1x10<2>do oko 1x106 M-1S-1).
[0223] Za specifično cepanje enzimom, ostvaruje se kontakt između enzima i CM. Kada se antitelo koje može da se aktivira koje sadrži AB kuplovan sa MM i CM nalazi u prisustvu ciljnog molekula i dovoljne aktivnosti enzima, CM može da bude otcepljen. Dovoljna aktivnost enzima može da se odnosi na sposobnost enzima da ostvari kontakt sa CM i ostvari cepanje. Lako može da se zamisli da enzim može da bude u blizini CM, ali ne može da obavi cepanje zbog drugih ćelijskih faktora ili modifikacije proteina enzima.
[0224] Linkeri pogodni za upotrebu u kompozicijama koje su ovde opisane uopšteno su oni koji obezbeđuju fleksibilnost modifikovanih AB ili antitela koja mogu da se aktiviraju da bi se olakšala inhibicija vezivanja AB za ciljni molekul. Takvi linkeri se uopšteno označavaju kao fleksibilni linkeri. Pogodni linkeri mogu lako da se odaberu i mogu da budu bilo koje od različitih pogodnih dužina, kao što je od 1 aminokiseline (npr., Gly) do 20 aminokiselina, od 2 aminokiseline do 15 aminokiselina, od 3 aminokiseline do 12 aminokiselina, uključujući 4 aminokiseline do 10 aminokiselina, 5 aminokiselina do 9 aminokiselina, 6 aminokiselina do 8 aminokiselina, ili 7 aminokiselina do 8 aminokiselina, i mogu da budu dužine 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ili 20 aminokiselina.
[0225] Primeri fleksibilnih linkera uključuju polimere glicina (G)n, polimere glicin-serin (uključujući, na primer, (GS)n, (GSGGS)n (SEQ ID NO: 1) i (GGGS)n (SEQ ID NO: 2), gde je n ceo broj od najmanje jedan), polimere glicin-alanin, polimere alanin-serin, i druge fleksibilne
1
linkere poznate u stanju tehnike. Polimeri glicina i glicin-serin su relativno nestrukturirani, i mogu da služe kao neutralni spoj između komponenata. Glicin pokriva značajno veći prostor fipsi čak i od alanina, i znatno je manje ograničen od rezidua sa dužim bočnim lancima (videti Scheraga, Rev. Computational Chem. 11173-142 (1992)). Primeri fleksibilnih linkera uključuju, ali nisu ograničeni na Gly-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO: 3), Gly-Gly-Ser-Gly-Gly (SEQ ID NO: 4), Gly-Ser-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO: 5), Gly-Ser-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 6), Gly-Gly-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO: 7), Gly-Ser-Ser-Ser-Gly (SEQ ID NO: 8), i slično. Stručnjak uobičajenog znanja će prepoznati da konstrukcija antitela koja mogu da se aktiviraju može da uključuje linkere koji su potpuno ili delimično fleksibilni, tako da linker može da uključuje fleksibilni linker, kao i jedan ili više delova koji daju manje fleksibilnu strukturu, da bi se dobila željena struktura antitela koja mogu da se aktiviraju.
[0226] Otkriće obezbeđuje i kompozicije i postupke koji uključuju anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira koje uključuje antitelo ili fragment antitela (AB) koji specifično vezuje CD166, pri čemu je AB kuplovan sa maskirajućim fragmentom (MM) koji smanjuje sposobnost AB da veže svoj ciljni molekul. U nekim primerima izvođenja, anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira dodatno uključuje fragment koji može da se otcepi (CM) koji je supstrat za proteazu. Kompozicije i postupci koji su ovde obezbeđeni omogućavaju vezivanje jednog ili više agenasa sa jednom ili više cisteinskih rezidua u AB bez ugrožavanja aktivnosti (npr., maskiranja, aktiviranja ili aktivnosti vezivanja) anti-CD166 antitela koje može da se aktivira. U nekim primerima izvođenja, kompozicije i postupci koji su ovde obezbeđeni omogućavaju vezivanje jednog ili više agenasa sa jednom ili više cisteinskih rezidua u AB bez redukovaanja ili drugačijeg narušavanja jedne ili više disulfidnih veza u MM. Kompozicije i postupci koji su ovde obezbeđeni proizvode anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira koje je konjugovano sa jednim ili više agenasa, npr., bilo kog od mnogih terapijskih, dijagnostičkih i/ili profilaktičkih agenasa, na primer, u nekim primerima izvođenja, bez bilo kog/kojih od agenasa konjugovanih sa MM u anti-CD166 antitelu koje može da se aktivira. Kompozicije i postupci koji su ovde obezbeđeni proizvode konjugovana anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju u kojima MM zadržava sposobnost da efektivno i efikasno maskira AB antitela koje može da se aktivira u neotcepljenom stanju. Kompozicije i postupci koji su ovde obezbeđeni proizvode konjugovana anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju u kojima je antitelo koje može da se aktivira još uvek aktivirano, tj., otcepljeno, u prisustvu proteaze koja može da cepa CM.
[0227] Anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju imaju najmanje imaju najmanje jdnu tačku konjugacije za agens, ali u ovde obezbeđenim postupcima i kompozicijama za konjugaciju sa agensom je dostupno manje od svih mogućih tačaka konjugacije. U nekim primerima izvođenja, jedna ili više tačaka konjugacije su atomi sumpora uključeni u disulfidne veze. U
2
nekim primerima izvođenja, jedna ili više tačaka konjugacije su atomi sumpora uključeni u međulančane disulfidne veze. U nekim primerima izvođenja, jedna ili više tačaka konjugacije su atomi sumpora uključeni u međulančane sulfidne veze, ali ne i atomi sumpora uključeni u unutarlančane disulfidne veze. U nekim primerima izvođenja, jedna ili više tačaka konjugacije su atomi sumpora cisteina ili drugih aminokiselinskih rezidua koje sadrže atom sumpora. Takve rezidue mogu da se jave prirodno u strukturi antitela ili mogu da budu ugrađene u antitelo mestospecifičnom mutagenezom, hemijskom konverzijom, ili nepodudarnom ugradnjom neprirodnih aminokiselina.
[0228] Obezbeđeni su i postupci za pripremu konjugata anti-CD166 antitela koje može da se aktivira koji imaju jednu ili više međulančanih disulfidnih veza u AB i jednu ili više unutarlančanih disulfidnih veza u MM, i obezbeđen je lek koji reaguje sa slobodnim tiolima. Postupak uopšteno uključuje delimičnu redukciju međulančanih disulfidnih veza u antitelu koje može da se aktivira pomoću redukcionog agensa, kao što je, na primer, TCEP; i konjugaciju leka koji reaguje sa slobodnim tiolima sa delimično redukovanim antitelom koje može da se aktivira. Kako se ovde koristi, termin delimična redukcija odnosi se na situacije u kojima se anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira dovodi u kontakt sa redukcionim agensom, i redukuju se manje od svih disulfidnih veza, npr., manje od svih mogućih mesta konjugacije. U nekim primerima izvođenja, manje od 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% ili manje od 5% svih mogućih mesta konjugacije se redukuje.
[0229] U drugim primerima izuvođenja, obezbeđen je postupak za redukciju i konjugaciju agensa, npr., leka, sa anti-CD166 antitelom koje može da se aktivira koji rezultuje selektivnošću u razmeštanju agensa. Postupak uopšteno uključuje delimičnu redukciju anti-CD166 antitela koje može da se aktivira redukcionim agensom, tako da nijedno od konjugacionih mesta u maskirajućem fragmentu ili drugom delu antitela koje može da se aktivira, koja nisu AB, nije redukovano, i konjugaciju agensa sa međulančanim tiolima u AB. Konjugaciono mesto/mesta su odabrana tako da omoguće željeno razmeštanje agensa, kako bi se omogućilo da se konjugacija odvija na željenom mestu. Redukcioni agens je, na primer, TCEP. Uslovi redukcione reakcije kao što su, na primer, odnos redukcionog agensa prema antitelu koje može da se aktivira, dužina inkubacije, temperatura tokom inkubacije, pH rastvora redukcione reakcije, itd., određuju se identifikovanjem uslova koji proizvode konjugovano antitelo koje može da se aktivira u kome MM zadržava sposobnost da efektivno i efikasno maskira AB antitela koje može da se aktivira u neotcepljenom stanju. Odnos redukcionog agensa prema anti-CD166 antitelu koje može da se aktivira variraće u zavisnosti od antitela koje može da se aktivira. U nekim primerima izvođenja, odnos redukcionog agensa prema anti-CD166 antitelu koje može da se aktivira biće u opsegu od oko 20:1 do 1:1, od oko 10:1 do 1:1, od oko 9:1 do 1:1, od oko 8:1 do 1:1, od oko 7:1 do 1:1, od oko 6:1 do 1:1, od oko 5:1 do 1:1, od oko 4:1 do 1:1, od oko 3:1 do 1:1, od oko 2:1 do 1:1, od oko 20:1 do 1:1.5, od oko 10:1 do 1:1.5, od oko 9:1 do 1:1.5, od oko 8:1 do 1:1.5, od oko 7:1 do 1:1.5, od oko 6:1 do 1:1.5, od oko 5:1 do 1:1.5, od oko 4:1 do 1:1.5, od oko 3:1 do 1:1.5, od oko 2:1 do 1:1.5, od oko 1.5:1 do 1:1.5, ili od oko 1:1 do 1:1.5. U nekim primerima izvođenja, odnos je u opsegu od oko 5:1 do 1:1. U nekim primerima izvođenja, odnos je u opsegu od oko 5:1 do 1.5:1. U nekim primerima izvođenja, odnos je u opsegu od oko 4:1 do 1:1. U nekim primerima izvođenja, odnos je u opsegu od oko 4:1 do 1.5:1. U nekim primerima izvođenja, odnos je u opsegu od oko 8:1 do oko 1:1. U nekim primerima izvođenja, odnos je u opsegu od oko 2.5:1 do 1:1.
[0230] U nekim primerima izvođenja, obezbeđen je postupak za redukciju međulančanih disulfidnih veza u AB anti-CD166 antitela koje može da se aktivira i konjugaciju agensa, npr., agensa koji sadrži tiol kao što je lek, sa rezultujućim međulančanim tiolima za selektivno smeštanje agensa/agenasa u AB. Postupak uopšteno uključuje delimičnu redukciju AB redukcionim agensom, da bi se formirala najmanje dva međulančana tiola bez formiranja svih mogućih međulančanih tiola u antitelu koje može da se aktivira; i konjugaciju agensa sa međulančanim tiolima delimično redukovanog AB. Na primer, AB antitela koje može da se aktivira se delimično redukuje oko 1 čas na oko 37°C pri željenom odnosu redukcioni agens: antitelo koje može da se aktivira. U nekim primerima izvođenja, odnos redukcionog agensa prema antitelu koje može da se aktivira biće u opsegu od oko 20:1 do 1:1, od oko 10:1 do 1:1, od oko 9:1 do 1:1, od oko 8:1 do 1:1, od oko 7:1 do 1:1, od oko 6:1 do 1:1, od oko 5:1 do 1:1, od oko 4:1 do 1:1, od oko 3:1 do 1:1, od oko 2:1 do 1:1, od oko 20:1 do 1:1.5, od oko 10:1 do 1:1.5, od oko 9:1 do 1:1.5, od oko 8:1 do 1:1.5, od oko 7:1 do 1:1.5, od oko 6:1 do 1:1.5, od oko 5:1 do 1:1.5, od oko 4:1 do 1:1.5, od oko 3:1 do 1:1.5, od oko 2:1 do 1:1.5, od oko 1.5:1 do 1:1.5, ili od oko 1:1 do 1:1.5. U nekim primerima izvođenja, odnos je u opsegu od oko 5:1 do 1:1. U nekim primerima izvođenja, odnos je u opsegu od oko 5:1 do 1.5:1. U nekim primerima izvođenja, odnos je u opsegu od oko 4:1 do 1:1. U nekim primerima izvođenja, odnos je u opsegu od oko 4:1 do 1.5:1. U nekim primerima izvođenja, odnos je u opsegu od oko 8:1 do oko 1:1. U nekim primerima izvođenja, odnos je u opsegu od oko 2.5:1 do 1:1.
[0231] Reagens koji sadrži tiol može da bude, na primer, cistein ili N-acetil cistein. Redukcioni agens može da bude, na primer, TCEP. U nekim primerima izvođenja, redukovano antitelo koje može da se aktivira može da bude prečišćeno pre konjugacije, upotrebom na primer, hromatografije na koloni, dijalize, ili dijafiltracije. Alternativno, redukovano antitelo se ne prečišćava posle delimične redukcije i pre konjugacije.
4
[0232] Otkriće obezbeđuje i delimično redukovana anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju u kojima je najmanje jedna međulančana disulfidna veza u antitelu koje može da se aktivira redukovana redukcionim agensom bez narušavanja bilo kojih unutarlančanih disulfidnih veza u antitelu koje može da se aktivira, pri čemu antitelo koje može da se aktivira uključuje antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB) koji se specifično vezuje za CD166, maskirajući fragment (MM) koji inhibira vezivanje AB antitela koje može da se aktivira u neotcepljenom stanju za ciljni molekul CD166, i fragment koji može da se otcepi (CM) kuplovan sa AB, gde je CM polipeptid koji funkcioniše kao supstrat za proteazu. U nekim primerima izvođenja MM je kuplovan sa AB preko CM. U nekim primerima izvođenja, jedna ili više unutarlančanih disulfidnih veza antitela koje može da se aktivira nije poremećena redukcionim agensom. U nekim primerima izvođenja, jedna ili više unutarlančanih disulfidnih veza MM u antitelu koje može da se aktivira nije poremećena redukcionim agensom. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira u neotcepljenom stanju ima sledeći strukturni raspored od N-terminalnog kraja ka C-terminalnom kraju: MM-CM-AB ili AB-CM-MM. U nekim primerima izvođenja, redukcioni agens je TCEP.
[0233] Otkriće obezbeđuje i delimično redukovana antitela koja mogu da se aktiviraju u kojima je najmanje jedna međulančana disulfidna veza u antitelu koje može da se aktivira redukovana redukcionim agensom bez narušavanja bilo kojih unutarlančanih disulfidnih veza u antitelu koje može da se aktivira, pri čemu antitelo koje može da se aktivira uključuje antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB) koji se specifično vezuje za ciljni molekul, npr., CD166, maskirajući fragment (MM) koji inhibira vezivanje AB antitela koje može da se aktivira u neotcepljenom stanju za ciljni molekul, i fragment koji može da se otcepi (CM) kuplovan sa AB, gde je CM polipeptid koji funkcioniše kao supstrat za najmanje jednu proteazu. U nekim primerima izvođenja, MM je kuplovan sa AB preko CM. U nekim primerima izvođenja, jedna ili više unutarlančanih disulfidnih veza antitela koje može da se aktivira nije narušena redukcionim agensom. U nekim primerima izvođenja, jedna ili više unutarlančanih disulfidnih veza MM u antitelu koje može da se aktivira nije narušena redukcionim agensom. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira u neotcepljenom stanju ima sledeći strukturni raspored od N-terminalnog kraja ka C-terminalnom kraju: MM-CM-AB ili AB-CM-MM. U nekim primerima izvođenja, redukcioni agens je TCEP.
[0234] U sledećim primerima izvođenja, postupak za redukciju i konjugaciju agensa, npr., leka, sa anti-CD166 antitelom koje može da se aktivira rezultuje selektivnošću u razmeštaju agensa obezbeđivanjem anti-CD166 antitela koje može da se aktivira sa definisanim brojem i pozicijama lizinskih i/ili cisteinskih rezidua. U nekim primerima izvođenja, definisani broj lizinskih i/ili cisteinskih rezidua je viši ili niži od broja odgovarajućih rezidua u aminokiselinskoj sekvenci parentalnog antitela ili antitela koje može da se aktivira. U nekim primerima izvođenja, definisani broj lizinskih i/ili cisteinskih rezidua može da rezultuje definisanim brojem ekvivalenata agensa koji mogu da budu konjugovani sa anti-CD166 antitelom ili anti-CD166 antitelom koje može da se aktivira. U nekim primerima izvođenja, definisani broj lizinskih i/ili cisteinskih rezidua može da rezultuje definisanim brojem ekvivalenata agensa koji mogu da budu konjugovani sa anti-CD166 antitelom ili anti-CD166 antitelom koje može da se aktivira na mesto-specifičan način. U nekim primerima izvođenja, modifikovano antitelo koje može da se aktivira je modifikovano pomoću jedne ili više neprirodnih aminokiselina na mesto-specifičan način, ograničavajući tako, u nekim primerima izvođenja, konjugaciju agensa samo na mesta na kojima su neprirodne aminokiseline. U nekim primerima izvođenja, anti-CD166 antitelo ili anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira sa definisanim brojem i pozicijama lizinskih i/ili cisteinskih rezidua može da bude delimično redukovano redukcionim agensom kao što je ovde diskutovano, tako da nijedno konjugaciono mesto u maskirajućem fragmentu ili drugom delu antitela koje može da se aktivira koji nije AB nije redukovano, i agens konjugovan sa međulančanim tiolima u AB.
[0235] U nekim primerima izvođenja, ovde opisana antitela koja mogu da se aktiviraju takođe uključuju agens konjugovan sa antitelom koje može da se aktivira. U nekim primerima izvođenja, konjugovani agens je terapijski agens, kao što je antizapaljenski i/ili antineoplastični agens. U takvim primerima izvođenja, agens je konjugovan sa ugljenohidratnim fragmentom antitela koje može da se aktivira, na primer, u nekim primerima izvođenja, pri čemu je ugljenohidratni fragment smešten van antigen-vezujućeg regiona antitela ili antigen-vezujućeg fragmenta u antitelu koje može da se aktivira. U nekim primerima izvođenja, agens je konjugovan sa sulfhidrilnom grupom antitela ili antigen-vezujućeg fragmenta u antitelu koje može da se aktivira.
[0236] U nekim primerima izvođenja, agens je citotoksični agens kao što je toksin (npr., enzimski aktivan toksin bakterijskog, gljivičnog, biljnog, ili životinjskog porekla, ili njegovi fragmenti), ili radioaktivni izotop (tj., radiokonjugat).
[0237] U nekim primerima izvođenja, agens je detektabilni fragment kao što je, na primer, oznaka ili drugi marker. Na primer, agens je, ili uključuje, radioaktivno obeleženu aminokiselinu, jedan ili više biotinilskih fragmenata koji mogu da budu detektovani obeleženim avidinom (npr., streptavidinom koji sadrži fluorescentni marker ili enzimsku aktivnost koja može da bude detektovana optičkim ili kalorimetrijskim postupcima), jedan ili više radioizotopa ili radionuklida, jednu ili više fluorescentnih oznaka, jednu ili više enzimskih oznaka, i/ili jedan ili više hemiluminescentnih agenasa. U nekim primerima izvođenja, detektabilni fragmenti su spojeni pomoću molekula spejsera.
[0238] Otkriće se takođe odnosi na imunokonjugate koji sadrže antitelo konjugovano sa citotoksičnim agensom kao što je toksin (npr., enzimski aktivan toksin bakterijskog, gljivičnog, biljnog, ili životinjskog porekla, ili njegovi fragmenti), ili radioaktivni izotop (tj., radiokonjugat). Pogodni citotoksični agensi uključuju, na primer, dolastatine i njihove derivate (npr. auristatin E, AFP, MMAF, MMAE, MMAD, DMAF, DMAE). Na primer, agens je monometil auristatin E (MMAE) ili monometil auristatin D (MMAD). U nekim primerima izvođenja, agens je agens odabran iz grupe navedene u tabeli 5. U nekim primerima izvođenja, agens je dolastatin. U nekim primerima izvođenja, agens je auristatin ili njegov derivat. U nekim primerima izvođenja, agens je auristatin E ili njegov derivat. U nekim primerima izvođenja, agens je monometil auristatin E (MMAE). U nekim primerima izvođenja, agens je monometil auristatin D (MMAD). U nekim primerima izvođenja, agens je majtanzinoid ili derivat majtanzinoida. U nekim primerima izvođenja, agens je DM1 ili DM4. U nekim primerima izvođenja, agens je duokarmicin ili njegov derivat. U nekim primerima izvođenja, agens je kaliheamicin ili njegov derivat. U nekim primerima izvođenja, agens je pirolobenzodiazepin.
[0239] U nekim primerima izvođenja, agens je vezan za AB upotrebom maleimid kaproil-valincitrulinskog linkera ili maleimid PEG-valin-citrulinskog linkera. U nekim primerima izvođenja, agens je vezan za AB upotrebom maleimid kaproil-valin-citrulinskog linkera. U nekim primerima izvođenja, agens je vezan za AB upotrebom maleimid PEG-valin-citrulinskog linkera. U nekim primerima izvođenja, agens je monometil auristatin D (MMAD) vezan za AB upotrebom maleimid PEG-valin-citrulin-para-aminobenziloksikarbonil linkera, i ova konstrukcija korisnog opterećenja linkera ovde se naziva "vc-MMAD." U nekim primerima izvođenja, agens je monometil auristatin E (MMAE) vezan za AB upotrebom maleimid PEG-valin-citrulin-para-aminobenziloksikarbonil linkera, i ova konstrukcija korisnog opterećenja linkera ovde se naziva "vc-MMAE." U nekim primerima izvođenja, agens je vezan za AB upotrebom maleimid PEG-valin-citrulin linkera. U nekim primerima izvođenja, agens je monometil auristatin D (MMAD) vezan za AB upotrebom maleimid bis-PEG-valin-citrulin-paraaminobenziloksikarbonil linkera, i ova konstrukcija korisnog opterećenja linkera ovde se naziva "PEG2-vc-MMAD." Strukture vc-MMAD, vc-MMAE, i PEG2-vc-MMAD prikazane su ispod:
vc-MMAD:
vc-MMAE:
PEG2-vc-MMAD:
[0240] Otkriće obezbeđuje i konjugovana antitela koja mogu da se aktiviraju koja uključuju antitelo koje može da se aktivira vezano za korisno opterećenje monometil auristatin D (MMAD), pri čemu antitelo koje može da se aktivira uključuje antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB) koji se specifično vezuje za ciljni molekul, maskirajući fragment (MM) koji inhibira vezivanje AB antitela koje može da se aktivira u neotcepljenom stanju za ciljni molekul, i fragment koji može da se otcepi (CM) kuplovan sa AB, i CM je polipeptid koji funkcioniše kao supstrat za najmanje jednu MMP proteazu.
[0241] U nekim primerima izvođenja, MMAD-konjugovano antitelo koje može da se aktivira može da bude konjugovano upotrebom bilo kog od nekoliko postupaka za vezivanje agenasa za AB: (a) vezivanjem za ugljenohidratne fragmente AB, ili (b) vezivanjem za sulfhidrilne grupe AB, ili (c) vezivanjem za amino grupe AB, ili (d) vezivanjem za karboksilatne grupe AB.
[0242] U nekim primerima izvođenja, korisno opterećenje MMAD je konjugovano sa AB preko linkera. U nekim primerima izvođenja, korisno opterećenje MMAD je konjugovano sa cisteinom u AB preko linkera. U nekim primerima izvođenja, korisno opterećenje MMAD je konjugovano sa lizinom u AB preko linkera. U nekim primerima izvođenja, korisno opterećenje MMAD je konjugovano sa nekom drugom reziduom u AB preko linkera, kao što su ovde opisane rezidue. U nekim primerima izvođenja, linker je linker koji sadrži tiol. U nekim primerima izvođenja, linker je linker koji može da se otcepi. U nekim primerima izvođenja, linker je linker koji ne može da se otcepi. U nekim primerima izvođenja, linker je odabran iz grupe koja se sastoji od linkera prikazanih u tabelama 6 i 7. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira i korisno opterećenje MMAD su vezani preko maleimid kaproil-valin-citrulinskog linkera. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira i korisno opterećenje MMAD su vezani preko maleimid PEG-valin-citrulinskog linkera. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira i korisno opterećenje MMAD su vezani preko maleimid kaproil-valin-citrulin-para-aminobenziloksikarbonil linkera. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira i korisno opterećenje MMAD su vezani preko maleimid PEG-valin-citrulin-para-aminobenziloksikarbonil linkera. U nekim primerima izvođenja, korisno opterećenje MMAD je konjugovano sa AB upotrebom tehnologije delimične redukcije i konjugacije koja je ovde opisana.
[0243] U nekim primerima izvođenja, komponenta polietilen glikola (PEG) linkera predmetnog otkrića formirana je od 2 etilen glikolna monomera, 3 etilen glikolna monomera, 4 etilen glikolna monomera, 5 etilen glikolnih monomera, 6 etilen glikolnih monomera, 7 etilen glikolnih monomera, 8 etilen glikolnih monomera, 9 etilen glikolnih monomera, ili najmanje 10 etilen glikolnih monomera. U nekim primerima izvođenja predmetnog otkrića, PEG komponenta je granati polimer. U nekim primerima izvođenja predmetnog otkrića, PEG komponenta je polimer koji nije granat. U nekim primerima izvođenja, komponenta PEG polimera je funkcionalizovana pomoću amino grupe ili njenog derivata, karboksilne grupe ili njenog derivata, ili, i amino grupe ili njenog derivata i karboksilne grupe ili njenog derivata.
[0244] U nekim primerima izvođenja, PEG komponenta linkera predmetnog otkrića je aminotetra-etilen glikol-karboksilna grupa ili njen derivat. U nekim primerima izvođenja, PEG komponenta linkera predmetnog otkrića je amino-trietilen glikol-karboksilna grupa ili njen derivat. U nekim primerima izvođenja, PEG komponenta linkera predmetnog otkrića je aminodi-etilen glikol-karboksilna grupa ili njen derivat. U nekim primerima izvođenja, amino derivat je formacija amidne veze između amino grupe i karboksilne grupe sa kojom je konjugovana. U nekim primerima izvođenja, karboksilni derivat je formacija amidne veze između karboksilne grupe i amino grupe sa kojom je konjugovana. U nekim primerima izvođenja, karboksilni derivat je formacija estarske veze između karboksilne grupe i hidroksilne grupe sa kojom je konjugovana.
[0245] Enzimski aktivni toksini i njihovi fragmenti koji mogu da se upotrebe uključuju A lanac difterije, nevezujuće aktivne fragmente toksina difterije, A lanac egzotoksina (iz Pseudomonas aeruginosa), A lanac ricina, A lanac abrina, A lanac modecina, alfa-sarcin, proteine Aleurites fordii, diantin proteine, proteine Phytolaca americana (PAPI, PAPII, i PAP-S), inhibitor Momordica charantia, kurcin, krotin, inhibitor Sapaonaria officinalis, gelonin, mitogelin, restriktocin, fenomicin, enomicin, i trikotecene. Razni radionuklidi su dostupni za proizvodnju radiokonjugovanih antitela. Primeri uključuju<212>Bi,<131>I,<131>In,<90>Y, i<186>Re.
[0246] Konjugati antitela i citotoksičnog agensa prave se upotrebom raznih bifunkcionalnih protein-kuplujućih agenasa kao što su N-sukcinimidil-3-(2-piridilditiol) propionat (SPDP), iminotiolan (IT), bifunkcionalni derivati imidoestara (kao što je dimetil adipimidat HCL), aktivni estri (kao što je disukcinimidil suberat), aldehidi (kao što je glutareldehid), bis-azido jedinjenja (kao što je bis (p-azidobenzoil) heksandiamin), derivati bis-diazonijuma (kao što je bis-(pdiazonijumbenzoil)-etilendiamin), diizocijanati (kao što je tolien 2,6-diizocijanat), i bis-aktivna jedinjenja fluora (kao što je 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzen). Na primer, ricinski imunotoksin može da se pripremi kao što je opisano u Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987). 1-Izotiocijanatobenzil-3-metildietilen triaminpentasirćetna kiselina (MX-DTPA) obeležena ugljenikom 14 je primer helirajućeg agensa za konjugaciju radionukleotida sa antitelom. (Videti WO94/11026).
[0247] Tabela 5 navodi neke od primera farmaceutskih agenasa koji mogu da se koriste u ovde opisanom otkriću, ali to ni u kom slučaju nije isključiva lista.
Tabela 5: Primeri farmaceutskih agenasa za konjugaciju
1
11
[0248] Stručnjaci sa uobičajenim znanjem u ovoj oblasti prepoznaće da širok opseg mogućih fragmenata može da bude kuplovan sa rezultujućim antitelima prema otkriću. (Videti, na primer, "Conjugate Vaccines", Contributions to Microbiology and Immunology, J. M. Cruse and R. E. Lewis, Jr (eds), Carger Press, New York, (1989)).
[0249] Kuplovanje može da se postigne bilo kojom hemijskom reakcijom koja će vezati dva molekula, sve dok antitelo i drugi fragment zadržavaju svoje odgovarajuće aktivnosti. Ovo povezivanje može da uključuje mnoge hemijske mehanizme, na primer kovalentno vezivanje, afinitetno vezivanje, interkalaciju, koordinatno vezivanje i kompleksiranje. U nekim primerima izvođenja, vezivanje je, međutim, kovalentno vezivanje. Kovalentno vezivanje može da se
1 2
postigne ili direktnom kondenzacijom postojećih bočnih lanaca ili ugradnjom spoljašnjih premošćujućih molekula. Mnogi bivalentni ili polivalentni vezujući agensi su korisni u kuplovanju proteinskih molekula, kao što su antitela predmetnog otkrića, sa drugim molekulima. Na primer, reprezentativni agensi za kuplovanje mogu da uključuju organska jedinjenja kao što su tioestri, karbodiimidi, sukcinimid estri, diizocijanati, glutaraldehid, diazobenzeni i heksametilen diamini. Ovaj spisak nije namenjen da bude kompletan za različite klase agenasa za kuplovanje poznate u stanju tehnike, već pre, predstavlja primere uobičajenih agenasa za kuplovanje. (Videti Killen and Lindstrom, Jour. Immun. 133:1335-2549 (1984); Jansen et al., Immunological Reviews 62:185-216 (1982); i Vitetta et al., Science 238:1098 (1987).
[0250] U nekim primerima izvođenja, pored kompozicija i postupaka koji su ovde obezbeđeni, konjugovano antitelo koje može da se aktivira može takođe da bude modifikovano za mestospecifičnu konjugaciju putem modifikovanih aminokiselinskih sekvenci ubačenih ili drugačije uključenih u sekvencu antitela koje može da se aktivira. Ove modifikovane aminokiselinske sekvence su konstruisane da omoguće kontrolisano postavljanje i/ili doziranje konjugovanog agensa u konjugovanom antitelu koje može da se aktivira. Na primer, antitelo koje može da se aktivira može da bude konstruisano tako da uključuje cisteinske supstitucije na pozicijama na lakim i teškim lancima koje obezbeđuju reaktivne tiolske grupe i ne utiču negativno na savijanje i sklapanje proteina, niti menjaju vezivanje antigena. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira može da bude konstruisano tako da se jedna ili više neprirodnih aminokiselinskih rezidua uključuju ili drugačije uvode u antitelo koje može da se aktivira da bi se obezbedila pogodna mesta za konjugaciju. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira može da bude konstruisano tako da se peptidne sekvence koje mogu da se aktiviraju putem enzima uključuju ili drugačije uvode u sekvencu antitela koje može da se aktivira.
[0251] Pogodni linkeri su opisani u literaturi. (Videti, na primer, Ramakrishnan, S. et al., Cancer Res. 44:201-208 (1984) gde je opisana upotreba MBS (M-maleimidobenzoil-N-hidroksisukcinimid estra). Videti takođe, SAD patent br. 5,030,719, koji opisuje upotrebu halogenovanog derivata acetil hidrazida kuplovanog sa antitelom pomoću oligopeptidnog linkera. U nekim primerima izvođenja, pogodni linkeri uključuju: (i) EDC (1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) karbodiimid hidrohlorid; (ii) SMPT (4-sukcinimidiloksikarbonil-alfa-metil-alfa-(2-pridilditio)-toluen (Pierce Chem. Co., kat. (21558G); (iii) SPDP (sukcinimidil-6 [3-(2-piridilditio) propionamido]heksanoat (Pierce Chem. Co., kat br. 21651G); (iv) Sulfo-LC-SPDP (sulfosukcinimidil 6 [3-(2-piridilditio)-propianamid] heksanoat (Pierce Chem. Co. kat. br.2165-G); i (v) sulfo-NHS (N-hidroksisulfo-sukcinimid: Pierce Chem. Co., kat. br.24510) konjugovan sa EDC. Dodatni linkeri uključuju, ali nisu ograničeni na, SMCC ((sukcinimidil 4-(N-
1
maleimidometil)cikloheksan-1-karboksilat), sulfo-SMCC (sulfosukcinimidil 4-(N-maleimidometil)cikloheksan-1-karboksilat), SPDB (N-sukcinimidil-4-(2-piridilditio) butanoat), ili sulfo-SPDB (N-sukcinimidil-4-(2-piridilditio)-2-sulfo butanoat).
[0252] Gore opisani linkeri sadrže komponente koje imaju različite osobine, što dovodi do konjugata sa različitim fizikohemijskim svojstvima. Na primer, sulfo-NHS estri alkil karboksilata su stabilniji od sulfo-NHS estara aromatičnih karboksilata. Linkeri koji sadrže NHS-estar su manje rastvorljivi od sulfo-NHS estara. Dalje, linker SMPT sadrži sterički ometenu disulfidnu vezu, i može da formira konjugate povećane stabilnosti. Disulfidne veze, su uopšteno, manje stabilne od drugih veza jer se disulfidna veza cepa in vitro, rezultujući u manje dostupnih konjugata. Sulfo-NHS, konkretno, može da poboljša stabilnost karbodimidnih spojnica. Karbodimidne spojnice (kao što je EDC) kada se koriste zajedno sa sulfo-NHS, formiraju estre koji su otporniji na hidrolizu od same reakcije karbodimidnog kuplovanja.
[0253] U nekim primerima izvođenja, linkeri mogu da se cepaju. U nekim primerima izvođenja, linkeri ne mogu da se cepaju. U nekim primerima izvođenja, prisutna su dva ili više linkera. Dva ili više linkera su svi isti, tj., mogu da se otcepe ili ne mogu da se otcepe, ili su dva ili više linkera različiti, tj., najmanje jedan koji može da se otcepi i najmanje jedan koji ne može da se otcepi.
[0254] Predmetno otkriće koristi nekoliko postupaka za vezivanje agenasa za AB: (a) vezivanje za karbohidratne fragmente AB, ili (b) vezivanje za sulfhidrilne grupe AB, ili (c) vezivanje za amino grupe AB, ili (d) vezivanje za karboksilatne grupe AB. Prema otkriću, AB mogu da budu kovalentno vezani za agens preko posrednog linkera koji ima najmanje dve reaktivne grupe, jednu za reakciju sa AB i jednu za reakciju sa agensom. Linker, koji može da uključuje bilo koje kompatibilno organsko jedinjenje, može da bude odabran tako da reakcija sa AB (ili agensom) ne utiče negativno na reaktivnost i selektivnost AB. Osim toga, vezivanje linkera za agens može da ne uništi aktivnost agensa. Pogodni linkeri za reakciju sa oksidovanim antitelima ili oksidovanim fragmentima antitela uključuju one koji sadrže amin izabran iz grupe koja se sastoji od primarne amino, sekundarne amino, hidrazinske, hidrazidne, hidrokailamino, fenilhidrazinske, semikarbazidne i tiosemikarbazidne grupe. Takve reaktivne funkcionalne grupe mogu da postoje kao deo strukture linkera, ili mogu da se uvedu pogodnom hemijskom modifikacijom linkera koji ne sadrže takve grupe.
[0255] Prema predmetnom otkriću, pogodni linkeri za vezivanje sa redukovanim AB uključuju one koji imaju određene reaktivne grupe sposobne da reaguju sa sulfhidril grupom redukovanog antitela ili fragmenta. Takve reaktivne grupe uključuju, ali nisu ograničene na: reaktivne haloalkil grupe (uključujući, na primer, haloacetil grupe), p-merkuribenzoat grupe i grupe
1 4
sposobne za reakcije tipa Majklove adicije (uključujući, na primer, maleimide i grupe tipa, opisanog kod Mitra and Lawton, 1979, J. Amer. Chem. Soc.101: 3097-3110).
[0256] Prema predmetnom otkriću, pogodni linkeri za vezivanje sa Ab koja nisu ni oksidovana ni redukovana uključuju one koji imaju određene funkcionalne grupe sposobne za reakciju sa primarnim amino grupama prisutne u nemodifikovanim lizinskim reziduama u Ab. Takve reaktivne grupe uključuju, ali nisu ograničene na, NHS estre karboksilne ili ugljene kiseline, sulfo-NHS estre karboksilne ili ugljene kiseline, 4-nitrofenil estre karboksilne ili ugljene kiseline, pentafluorofenil estre karboksilne ili ugljene kiseline, acil imidazole, izocijanate i izotiocijanate.
[0257] Prema predmetnom otkriću, pogodni linkeri za vezivanje sa Ab koja nisu ni oksidovana ni redukovana uključuju one koji imaju određene funkcionalne grupe sposobne za reakciju sa grupama karboksilne kiseline prisutnim u reziduama aspartata ili glutamata u Ab, koje su aktivirane odgovarajućim reagensima. Pogodni aktivirajući reagensi uključuju EDC, sa ili bez dodatog NHS ili sulfo-NHS, i druge dehidratacione agense koji se upotrebljavaju za formiranje karboksamida. U ovim slučajevima, funkcionalne grupe prisutne u pogodnim linkerima uključivale bi primarne i sekundarne amino, hidrazinske, hidroksilaminske i hidrazidne grupe.
[0258] Agens može da bude vezan za linker pre ili posle vezivanja linkera za AB. U određenim primenama može da bude poželjno da se prvo proizvede intermedijer AB-linker u kome je linker bez pridruženog agensa. U zavisnosti od konkretne primene, specifični agens može zatim da se kovalentno veže za linker. U nekim primerima izvođenja, AB se prvo veže za MM, CM i udružene linkere, a zatim se veže za linker u svrhu konjugacije.
[0259] Granati linkeri: U specifičnim primerima izvođenja, upotrebljavaju se granati linkeri koji imaju višestruke pozicije za vezivanje agenasa. Kod linkera sa višestrukim pozicijama, pojedinačno kovalentno vezivanje za AB rezultovalo bi intermedijerom AB-linker sposobnim za vezivanje agensa na većem broju pozicija. Pozicije mogu da budu aldehidne ili sulfhidrilne grupe ili bilo koja hemijska pozicija za koju agens može da se veže.
[0260] U nekim primerima izvođenja, veća specifična aktivnost (ili veći odnos agenasa prema AB) može da se ostvari vezivanjem linkera sa jednom pozicijom na više pozicija u AB. Ovo mnoštvo pozicija može da bude uvedeno u AB bilo kojim od dva postupka. Prvo, mogu da se generišu višestruke aldehidne grupe i/ili sulfhidrilne grupe u istom AB. Drugo, za aldehid ili sulfhidril u AB može da se veže "granati linker" koji ima višestruke funkcionalne pozicije za naknadno vezivanje za linkere. Funkcionalne pozicije granatog linkera ili linker sa višestrukim pozicijama mogu da budu aldehidne ili sulfhidrilne grupe, ili može da bude bilo koja hemijska pozicija za koju linkeri mogu da budu vezani. Još veće specifične aktivnosti mogu se dobiti kombinovanjem ova dva pristupa, odnosno vezivanjem linkera sa višestrukim pozicijama na nekoliko pozicija u AB.
1
[0261] Linkeri koji mogu da se otcepe: Peptidni linkeri koji su podložni cepanju enzimima sistema komplementa kao što je, ali bez ograničenja u-aktivator plazminogena tkivni aktivator plazminogena, tripsin, plazmin, ili drugi enzim koji ima proteolitičku aktivnost mogu da se koriste u jednom primeru izvođenja predmetnog otkrića. Prema jednom postupku predmetnog otkrića, agens se vezuje preko linkera podložnog cepanju pomoću komplementa. Antitelo se bira iz klase koja može da aktivira komplement. Konjugat antitelo-agens, prema tome, aktivira kaskadu komplementa i oslobađa agens na ciljnoj poziciji. Prema sledećem postupku predmetnog otkrića, agens se vezuje preko linkera podložnog cepanju enzimima koji imaju proteolitičku aktivnost kao što je u-aktivator plazminogena tkivni aktivator plazminogena, plazmin ili tripsin. Ovi otcepljivi linkeri su korisni u konjugovanim antitelima koja mogu da se aktiviraju koja uključuju vanćelijski toksin, npr., u smislu neograničavajućeg primera, bilo koji od vanćelijskih toksina prikazanih u tabeli 5.
[0262] Neograničavajući primeri sekvence linkera koji može da se otcepi dati su u tabeli 6.
Tabela 6: Primeri sekvenci linkera za konjugaciju
1
[0263] Pored toga, agensi mogu da budu vezani putem disulfidnih veza (na primer, disulfidnih veza na molekulu cisteina) za AB. Budući da mnogi tumori prirodno oslobađaju visoke nivoe glutationa (redukcioni agens), to može da redukuje disulfidne veze uz naknadno oslobađanje agensa na mestu isporuke. U nekim primerima izvođenja, redukcioni agens koji bi modifikovao CM takođe bi modifikovao linker konjugovanog antitela koje može da se aktivira.
[0264] Spejseri i elementi koji mogu da se otcepe: U nekim primerima izvođenja, može da bude neophodno konstruisanje linkera na taj način da se optimizuje razmak između agensa i AB antitela koje može da se aktivira. Ovo može da se ostvari upotrebom linkera opšte strukture:
W - (CH2)n - Q
gde
W je ili --NH--CH2-- ili --CH2--;
Q je aminokiselina, peptid; i
n je ceo broj od 0 do 20.
[0265] U nekim primerima izvođenja, linker može da sadrži spejserski element i element koji može da se otcepi. Spejserski element služi da pozicionira element koji može da se otcepi dalje od jezgra AB, tako da je element koji može da se otcepi pristupačniji za enzim odgovoran za cepanje. Određeni granati linkeri koji su opisani iznad mogu da služe kao spejserski elementi.
[0266] Kroz ovu diskusiju treba razumeti da vezivanje linkera za agens (ili spejserskog elementa za element koji može da se otcepi, ili elementa koji može da se otcepi za agens) ne mora da
1
predstavlja poseban način vezivanja ili reakciju. Prihvatljiva je svaka reakcija koja daje proizvod odgovarajuće stabilnosti i biološke kompatibilnosti.
[0267] Serumski komplement i izbor linkera: Prema jednom postupku predmetnog otkrića, kada je poželjno oslobađanje agensa, upotrebljava se AB koji predstavlja antitelo klase koja može da aktivira komplement. Rezultujući konjugat zadržava i sposobnost da veže antigen i da aktivira kaskadu komplementa. Prema tome, prema ovom primeru izvođenja predmetnog otkrića, agens je spojen za jedan kraj linkera koji može da se otcepi ili elementa koji može da se otcepi, a drugi kraj linkerske grupe vezan je za specifičnu poziciju u AB. Na primer, ako agens ima hidroksi grupu ili amino grupu, može da bude vezan za karboksi terminalni kraj peptida, aminokiselinu ili drugi pogodno odabran linker preko estrske, odnosno amidne veze. Na primer, takvi agensi mogu da budu vezani za peptidni linker preko karbodimidne reakcije. Ako agens sadrži funkcionalne grupe koje bi interferirale sa vezivanjem za linker, ove interferirajuće funkcionalne grupe mogu da budu blokirane pre vezivanja i deblokirane kada proizvod, konjugat ili intermedijer, bude napravljen. Suprotni ili amino-terminalni kraj linkera se tada koristi ili direktno, ili posle dalje modifikacije za vezivanje sa AB koje može da aktivira komplement.
[0268] Linkeri (ili spejserski elementi linkera) mogu da budu bilo koje željene dužine, jedan nijhov kraj može da bude kovalentno vezan za specifične pozicije na AB antitela koje može da se aktivira. Drugi kraj linkera ili spejserskog elementa može da bude vezan za aminokiselinu ili peptidni linker.
[0269] Prema tome, kada se ovi konjugati vežu za antigen u prisustvu komplementa, amidna ili estarska veza koja povezuje agens sa linkerom će biti razdvojena, što rezultuje oslobađanjem agensa u njegovom aktivnom obliku. Ovi konjugati, kada se primene kod subjekta, izvršiće isporuku i oslobađanje agensa na ciljnom mestu, i posebno su efikasni za in vivo isporuku farmaceutskih agenasa, antibiotika, antimetabolita, antiproliferativnih agenasa i slično, kao što je predstavljeno, ali bez ograničenja, u tabeli 5.
[0270] Linkeri za oslobađanje bez aktivacije komplementa: U još jednoj primeni ciljne isporuke, poželjno je oslobađanje agensa bez aktivacije komplementa, budući da će aktivacija kaskade komplementa na kraju lizirati ciljnu ćeliju. Stoga, ovaj pristup je koristan kada isporuka i oslobađanje agensa treba da se obave bez ubiljanja ciljne ćelije. Takav cilj postoji kada je poželjna isporuka ćelijskih medijatora kao što su hormoni, enzimi, kortikosteroidi, neurotransmiteri, geni ili enzimi u ciljne ćelije. Ovi konjugati mogu da se pripreme vezivanjem agensa za AB koji nije sposoban za aktivaciju komplementa preko linkera koji je blago podložan cepanju serumskim proteazama. Kada se ovaj konjugat primeni kod osobe, kompleksi antigenantitelo će se brzo formirati, dok će se cepanje agensa odvijati sporo, dovodeći, na taj način, do oslobađanja jedinjenja na ciljnom mestu.
1
[0271] Biohemijski unakrsni linkeri: U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira može da bude konjugovano sa jednim ili više terapijskih agenasa upotrebom određenih biohemijskih unakrsnih linkera. Umrežavajući reagens obrazuje molekulske mostove koji povezuju funkcionalne grupe dva različita molekula. Da bi se dva različita proteina postepeno spojila, mogu da se koriste hetero-bifunkcionalni unakrsni linkeri koji eliminišu nepoželjno obrazovanje homopolimera.
[0272] Peptidil linkeri koji mogu da se otcepe pomoću lizozomalnih proteaza su takođe korisni, na primer, Val-Cit, Val-Ala ili drugi dipeptidi. Pored toga, mogu da se upotrebe linkeri nepostojani u prisustvu kiselina koji mogu da se otcepe u lizozomskom okruženju sa niskim pH, na primer: bis-sialil etar. Drugi pogodni linkeri uključuju supstrate nepostojane u prisustvu katepsina, posebno one koji pokazuju optimalnu funkciju na kiselom pH.
[0273] Primeri hetero-bifunkcionalnih unakrsnih linkera navedeni su u tabeli 7.
Tabela 7: Primeri hetero-bifunkcionalnih unakrsnih linkera
1
HETERO-BIFUNKCIONALNI UNAKRSNI LINKERI
Linker Reaktivan prema Prednosti i primene Dužina ručice spejsera
[0274] Linkeri koji ne mogu da se otcepe ili direktno vezivanje: U nekim primerima izvođenja prema otkriću, konjugat može da bude konstruisan tako da se agens isporuči na cilj, ali bez oslobađanja. Ovo može da se obavi vezivanjem agensa za AB bilo direktno ili preko linkera koji ne može da se otcepi.
[0275] Ovi linkeri koji ne mogu da se otcepe mogu da uključuju aminokiseline, peptide, D-aminokiseline ili druga organska jedinjenja koja mogu da budu modifikovana tako da uključuju funkcionalne grupe koje mogu naknadno da se upotrebe u vezivanju za AB ovde opisanim postupcima. Opšta formula za takav organski linker mogla bi da bude
W - (CH2)n - Q
gde
W je ili --NH--CH2-- ili --CH2--;
Q je aminokiselina, peptid; i
n je ceo broj od 0 do 20.
[0276] Konjugati koji ne mogu da se otcepe: U nekim primerima izvođenja, jedinjenje može da bude vezano za AB koji ne aktiviraju komplement. Kada se upotrebljavaju AB koji nisu
11
sposobni da aktiviraju komplement, ovo povezivanje može da se ostvari upotrebom linkera koji su podložni cepanju aktiviranim komplementom ili upotrebom linkera koji nisu podložni cepanju aktiviranim komplementom.
[0277] Ovde opisana antitela mogu takođe da budu formulisana kao imunolipozomi. Lipozomi koji sadrže antitelo pripremaju se postupcima poznatim u stanju tehnike, kao što je opisano kod Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); i SAD pat. br. 4,485,045 i 4,544,545. Lipozomi sa poboljšanim vremenom cirkulacije opisani su u SAD patentu br.5,013,556.
[0278] Posebno korisni lipozomi mogu da budu napravljeni postupkom reverzno-fazne evaporacije sa lipidnom kompozicijom koja sadrži fosfatidilholin, holesterol, i PEG-derivatizovani fosfatidiletanolamin (PEG-PE). Lipozomi se protiskuju kroz filtere definisane veličine pora da bi se dobili lipozomi željenog prečnika. Fab' fragmenti antitela predmetnog otkrića mogu da budu konjugovani sa lipozomima kao što je opisano kod Martin et al., J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982) preko reakcije izmene disulfida.
Definicije:
[0279] Osim ako nije drugačije definisano, naučni i tehnički pojmovi korišćeni u vezi sa predmetnim otkrićem imaće značenja koja uobičajeno podrazumevaju stručnjaci u ovoj oblasti. Pojam entitet odnosi se na jedan ili više tih entiteta. Na primer, jedinjenje se odnosi na jedno ili više jedinjenja. Kao takvi, termini "jedan", "jedan ili više" i "najmanje jedan" mogu da se koriste kao sinonimi. Dalje, osim ako kontekst ne zahteva drugačije, termini u jednini će uključivati množinu i termini u množini će uključivati jedninu. Uopšteno, nomenklatura upotrebljena u vezi sa, i tehnike, ćelijske i tkivne kulture, molekularne biologije i proteinske i oligo- ili polinukleotidne hemije i hibridizacije, koje su ovde opisane, su one koje su dobro poznate i uobičajeno korišćene u ovoj oblasti. Standardne tehnike se koriste za rekombinantnu DNK, oligonukleotidnu sintezu, i kulturu tkiva i transformaciju (npr., elektroporacija, lipofekcija). Enzimske reakcije i tehnike prečišćavanja sprovode se prema specifikacijama proizvođača ili kao što se uobičajeno radi u ovoj oblasti ili kao što je opisano u ovom dokumentu. Gore pomenute tehnike i procedure se uopšteno sprovode prema uobičajenim postupcima dobro poznatim u stanju tehnike i kao što je opisano u različitim opštim i specifičnijim referencama koje su navedene i o kojima je diskutovano u predmetnoj specifikaciji. Videti npr., Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)). Nomenklatura upotrebljena u vezi sa, i laboratorijske procedure i tehnike, analitičke hemije, sintetske organske hemije, i medicinske i farmaceutske hemije koje su ovde opisane su one koje su dobro poznate i uobičajeno korišćene u ovoj oblasti. Standardne tehnike se koriste za hemijske sinteze, hemijske analize, farmaceutsku preparaciju, formulaciju, i isoruku, i lečenje pacijenata.
[0280] Ako se koriste u skladu sa ovim otkrićem, podrazumevaće se da sledeći izrazi, osim ako nije drugačije naznačeno, imaju sledeća značenja:
[0281] Kako se ovde koristi, pojam "antitelo" odnosi se na imunoglobulinske molekule i imunološki aktivne, npr., antigen-vezujuće, delove molekula imunoglobulina (Ig), tj., molekula koji sadrže antigen-vezujuće mesto koje specifično vezuje (imunološki reaguje sa) antigenom. Pod "specifično vezuje" ili "imunološki reaguje sa" ili "imunospecifično vezuje" podrazumeva se da antitelo reaguje sa jednom ili više antigenih determinanti željenog antigena i ne reaguje sa drugim polipeptidima ili se vezuje sa mnogo nižim afinitetom (Kd> 10-6). Antitela uključuju, ali nisu ograničena na, poliklonsko, monoklonsko, himerno, domensko antitelo, jednolančano antitelo, Fab i F(ab')2fragmente, scFv, i biblioteku koja eksprimira Fab.
[0282] Poznato je da osnovna strukturna jedinica antitela sadrži tetramer. Svaki tetramer je sačinjen od dva identična para polipeptidnih lanaca, gde svaki par ima jedan "laki" (oko 25 kDa) i jedan "teški" lanac (oko 50-70 kDa). Amino-terminalni deo svakog lanca uključuje varijabilni region od oko 100 do 110 ili više aminokiselina primarno odgovornih za prepoznavanje antigena. Karboksi-terminalni deo svakog lanca definiše konstantni region primarno odgovoran za efektorsku funkciju. Uopšteno, molekuli antitela koji potiču od čoveka odnose se na bilo koju klasu IgG, IgM, IgA, IgE i IgD, koje se međusobno razlikuju po prirodi teškog lanca koji je prisutan u molekulu. Određene klase imaju i podklase, kao što su IgG1, IgG2, i druge. Osim toga, kod ljudi, laki lanac može da bude kapa lanac ili lambda lanac.
[0283] Pojam "monoklonsko antitelo" (mAb) ili "kompozicija monoklonskog antitela", kako se ovde koristi, odnosi se na populaciju molekula antitela koja sadrži samo jednu molekulsku vrstu molekula antitela koja se sastoji od jedinstvenog proizvoda gena za laki lanac i jedinstvenog proizvoda gena za teški lanac. Konkretno, regioni koji određuju komplementarnost (CDR) monoklonskog antitela identični su u svim molekulima populacije. MAb sadrže antigenvezujuće mesto sposobno da imunološki reaguje sa određenim epitopom antigena koje se odlikuje jedinstvenim afinitetom vezivanja za njega.
[0284] Pojam "antigen-vezujuće mesto" ili "vezujući deo" odnosi se na deo imunoglobulinskog molekula koji učestvuje u vezivanju antigena. Antigen-vezujuće mesto obrazuju aminokiselinske rezidue N-terminalnih varijabilnih ("V") regiona teškog ("H") i lakog ("L") lanca. Ovi visoko divergentni nizovi u V regionima teškog i lakog lanca, označeni kao "hipervarijabilni regioni", umetnuti su između konzervativnijih bočnih nizova poznatih kao "okvirni regioni" ili "FR". Prema tome, pojam "FR" odnosi se na aminokiselinske sekvence koje se prirodno nalaze između, i odmah do, hipervarijabilnih regiona u imunoglobulinima. U molekulu antitela, tri hipervarijabilna regiona lakog lanca i tri hipervarijabilna regiona teškog lanca postavljena su jedan prema drugom u trodimenzionalnom prostoru tako da formiraji antigen-vezujuću površinu. Antigen-vezujuća površina je komplementarna sa trodimenzionalnom površinom vezanog antigena, i tri hipervarijabilna regiona svakog teškog i lakog lanca označena su kao "regioni koji određuju komplementarnost" ili "CDR". Pripisivanje aminokiselina svakom domenu je u skladu sa definicijama Kabatovih sekvenci proteina od imunološkog interesa (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 i 1991)), ili Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987), Chothia et al. Nature 342:878-883 (1989).
[0285] Kako se ovde koristi, pojam "epitop" uključuje bilo koju proteinsku determinantu sposobnu da se specifično veže za imunoglobulin, scFv, ili T-ćelijski receptor. Pojam "epitop" uključuje bilo koju proteinsku determinantu sposobnu da se specifično veže za imunoglobulin ili T-ćelijski receptor. Epitopske determinante obično se sastoje od hemijski aktivnih površinskih grupacija molekula kao što su aminokiseline ili bočni lanci šećera i obično imaju specifične odlike trodimenzionalne strukture, kao i specifične odlike naelektrisanja. Na primer, antitela mogu da se razviju protiv N-terminalnih ili C-terminalnih peptida u polipeptidu. Kaže se da antitelo specifično vezuje antigen kada je konstanta disocijacije ≤ 1 µM; u nekim primerima izvođenja, ≤ 100 nM i u nekim primerima izvođenja, ≤ 10 nM.
[0286] Kako se ovde koriste, izrazi "specifično vezivanje", "immunološko vezivanje" i "svojstva imunološkog vezivanja" odnose se na nekovalentne interakcije tipa koji se javlja između molekula imunoglobulina i antigena za koji je imunoglobulin specifičan. Jačina, ili afinitet interakcija imunološkog vezivanja može da se izrazi kao konstanta disocijacije (Kd) interakcije, pri čemu manja Kdpredstavlja veći afinitet. Svojstva imunološkog vezivanja odabranih polipeptida mogu da se kvantifikuju upotrebom postupaka dobro poznatih u ovoj oblasti. Jedan takav postupak uključuje merenje brzina obrazovanja i disocijacije kompleksa antigen-vezujuće mesto/antigen, pri čemu te brzine zavise od koncentracija partnera kompleksa, afiniteta interakcije, i geometrijskih parametara koji jednako utiču na brzinu u oba smera. Prema tome, i "konstanta brzine vezivanja" (Kon) i "konstanta brzine disocijacije" (Koff) mogu da se odrede izračunavanjem koncentracija i stvarnih brzina asocijacije i disocijacije. (Videti Nature 361:186-87 (1993)). Odnos Koff/Konomogućava ukidanje svih parametara koji nisu povezani sa afinitetom, i jednak je konstanti disocijacije Kd. (Videti, uopšteno Davies et al. (1990) Annual Rev Biochem 59:439-473). Kaže se da se antitelo predmetnog otkrića specifično vezuje za ciljni molekul, kada je konstanta vezivanja (Kd) ≤1 µM, u nekim primerima izvođenja ≤ 100 nM, u nekim primerima izvođenja ≤ 10 nM, i u nekim primerima izvođenja ≤ 100 pM do oko 1 pM, mereno testovima kao što su testovi vezivanja radioliganda ili slični testovi poznati stručnjacima u ovoj oblasti.
11
[0287] Pojam "izolovani polinukleotid", kako se ovde koristi, značiće polinukleotid genomskog, cDNK, ili sintetskog porekla ili neku njihovu kombinaciju, koji zbog svog porekla, "izolovani polinukleotid", (1) nije povezan sa celim ili delom polinukleotida u kome se "izolovani polinukleotid" nalazi u prirodi, (2) funkcionalno je vezan za polinukleotid za koji nije vezan u prirodi, ili (3) ne javlja se u prirodi kao deo veće sekvence. Polinukleotidi u skladu sa otkrićem uključuju molekule nukleinske kiseline koja kodira ovde prikazane teške lance molekula imunoglobulina, i molekule nukleinske kiseline koja kodira ovde prikazane lake lance molekula imunoglobulina.
[0288] Pojam "izolovani protein", na koji se ovde poziva označava protein poreklom od cDNK, rekombinantne RNK, ili sintetskog porekla ili neku njihovu kombinaciju, koji zbog svog porekla ili izvora, "izolovani protein" (1) nije povezan sa proteinima koji se nalaze u prirodi, (2) lišen je drugih proteina iz istog izvora, npr., mišjih proteina, (3) eksprimiran je u ćeliji poreklom od druge vrste, ili (4) se ne javlja u prirodi.
[0289] Pojam "polipeptid" se ovde koristi kao generički pojam da označi nativni protein, fragmente, ili analoge polipeptidne sekvence. Stoga, fragmenti nativnog proteina i analozi su vrste polipeptidnog roda. Polipeptidi u skladu sa otkrićem sadrže teški lanac molekula imunoglobulina koji je ovde prikazan, i laki lanac molekula imunoglobulina koji je ovde prikazan, kao i molekule antitela formirane od kombinacija koje sadrže teški lanac molekula imunoglobulina i laki lanac molekula imunoglobulina, kao što je kapa laki lanac molekula imunoglobulina, i obrnuto, kao i njihovi fragmenti i analozi.
[0290] Pojam "prirodni", kako se ovde koristi, primenjen na objekat odnosi se na činjenicu da objekat može da se nađe u prirodi. Na primer, polipeptidna ili polinukleotidna sekvenca koja je prisutna u organizmu (uključujući viruse) koja može da bude izolovana iz izvora u prirodi i koju čovek nije namerno modifikovao u laboratoriji ili drugačije, je prirodna.
[0291] Pojam "funkcionalno vezan", kako se ovde koristi, odnosi se na to da su pozicije tako opisanih komponenata u odnosu koji im dozvoljava da funkcionišu na predviđeni način. Kontrolna sekvenca "funkcionalno vezana" za kodirajuću sekvencu je povezana na takav način da se ekspresija kodirajuće sekvence postiže pod uslovima koji su kompatibilni sa kontrolnom sekvencom.
[0292] Pojam "kontrolna sekvenca", kako se ovde koristi, odnosi se na polinukleotidne sekvence koje su neophodne za ostvarivanje ekspresije i obradu kodirajućih sekvenci za koje su vezane. Priroda takvih kontrolnih sekvenci razlikuje se u zavisnosti od organizma domaćina, kod prokariota, takve kontrolne sekvence uopšteno uključuju promotor, mesto vezivanja ribozoma, i sekvencu za završetak transkripcije, kod eukariota, uopšteno, takve kontrolne sekvence uključuju promotore i sekvencu za završetak transkripcije. Pojam "kontrolne sekvence" namenjen je da uključuje, najmanje, sve komponente čije prisustvo je od suštinskog značaja za ekspresiju i obradu, i može takođe da uključuje dodatne komponente čije prisustvo predstavlja prednost, na primer, liderske sekvence i sekvence fuzionog partnera. Pojam "polinukleotid", kako je ovde navedeno označava nukleotide dužine od najmanje 10 baza, bilo ribonukleotide ili deoksinukleotide ili modifikovani oblik bilo kog od ta dva tipa nukleotida. Pojam uključuje jednolančane i dvolančane oblike DNK.
[0293] Pojam oligonukleotid kako je ovde navedeno uključuje prirodne, i modifikovane nukleotide međusobno vezane prirodnim, i neprirodnim oligonukleotidnim vezama. Oligonukleotidi su podset polinukleotida koji uopšteno ima dužinu od 200 baza ili manje. U nekim primerima izvođenja, oligonukleotidi su dugi 10 do 60 baza i u nekim primerima izvođenja, dugi su 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ili 20 do 40 baza. Oligonukleotidi su obično jednolančani, npr., za probe, mada oligonukleotidi mogu da budu dvolančani, npr., za upotrebu u konstruisanju genskog mutanta. Oligonukleotidi prema otkriću su ili "sens" ili "antisens" oligonukleotidi.
[0294] Pojam "prirodni nukleotidi", kako je ovde navedeno, uključuje deoksiribonukleotide i ribonukleotide. Pojam "modifikovani nukleotidi" kako je ovde navedeno uključuje nukleotide sa modifikovanim ili supstituisanim grupama šećera i slično. Pojam "oligonukleotidne veze" kako je ovde navedeno uključuje oligonukleotidne veze kao što je fosforotioat, fosforoditioat, fosforoselerloat, fosforodiselenoat, fosforoanilotioat, fosforaniladat, fosforonmidat, i slično. Videti npr., LaPlanche et al. Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986); Stec et al. J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984), Stein et al. Nucl. Acids Res.16:3209 (1988), Zon et al. Anti Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon et al. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)); Stec et al. SAD patent br. 5,151,510; Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990). Oligonukleotid može, po želji, da uključuje oznaku za detekciju.
[0295] Kako se ovde koristi, dvadeset konvencionalnih aminokiselina i njihove skraćenice prate uobičajenu upotrebu. Videti Immunology - A Synthesis (2nd Edition, E.S. Golub and D.R. Green, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)). Stereoizomeri (npr., D-aminokiseline) dvadeset konvencionalnih aminokiselina, neprirodne aminokiseline kao što su α-, αdisupstituisane aminokiseline, N-alkil aminokiseline, mlečna kiselina, i druge nekonvencionalne aminokiseline mogu takođe da budu pogodne komponenete za polipeptide predmetnog otkrića. Primeri nekonvencionalnih aminokiselina uključuju: 4 hidroksiprolin, γ-karboksiglutamat, ε-N,N,N-trimetillizin, ε -N-acetilizin, O-fosfoserin, N-acetilserin, N-formilmetionin, 3-metilhistidin, 5-hidroksilizin, σ-N-metilarginin, i druge slične aminokiseline i imino kiseline (npr., 4-hidroksiprolin). Pri zapisivanju polipeptida koje se ovde koristi, smer nalevo je smer ka
11
amino-terminalnom kraju, a smer nadesno je smer ka karboksi-terminalnom kraju, u skladu sa standardnom upotrebom i konvencijom.
[0296] Slično, ako nije navedeno drugačije, levi kraj jednolančanih polinukleotidnih sekvenci je 5' kraj, smer nalevo dvolančanih polinukleotidnih sekvenci označen je kao 5' smer. Smer dodavanja od 5' ka 3' nascentnih RNK transkripata označen je kao transkripcioni smer, regioni sekvence na DNK lancu koji imaju istu sekvencu kao RNK i koji su 5' u odnosu na 5' kraj RNK transkripta označeni su kao "ushodne sekvence", regioni sekvence na DNK lancu koji imaju istu sekvencu kao RNK i koji su 3' u odnosu na 3' kraj RNK transkripta označeni su kao "nishodne sekvence".
[0297] Kada se primenjuje na polipeptide, pojam "suštinska identičnost" znači da dve peptidne sekvence, kada su optimalno poravnate, kao što je pomoću programa GAP ili BESTFIT upotrebom zadatih težina za praznine, dele najmanje 80 procenata identičnosti sekvence, u nekim primerima izvođenja, najmanje 90 procenata identičnosti sekvence, u nekim primerima izvođenja, najmanje 95 procenata identičnosti sekvence, i u nekim primerima izvođenja, najmanje 99 procenata identičnosti sekvence.
[0298] U nekim primerima izvođenja, pozicije rezidua koje nisu identične razlikuju se po konzervativnim aminokiselinskim supstitucijama.
[0299] Kao što je ovde diskutovano, smatra se da su minorne varijacije u aminokiselinskim sekvencama antitela ili molekula imunoglobulina obuhvaćene ovim otkrićem, pod uslovom da varijacije u aminokiselinskoj sekvenci očuvaju najmanje 75%, u nekim primerima izvođenja, najmanje 80%, 90%, 95%, i u nekim primerima izvođenja, 99% sekvence. Konkretno, obuhvaćene su konzervativne aminokiselinske zamene. Konzervativne zamene su one koje se odvijaju unutar familije aminokiselina koje su srodne po svojim bočnim lancima. Genetski kodirane aminokiseline su uopšteno podeljene u familije: (1) kisele aminokiseline su aspartat, glutamat; (2) bazne aminokiseline su lizin, arginin, histidin; (3) nepolarne aminokiseline su alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofan, i (4) nenaelektrisane polarne aminokiseline su glicin, asparagin, glutamin, cistein, serin, treonin, tirozin. hidrofilne aminokiseline uključuju arginin, asparagin, aspartat, glutamin, glutamat, histidin, lizin, serin, i treonin. Hidrofobne aminokiseline uključuju alanin, cistein, izoleucin, leucin, metionin, fenilalanin, prolin, triptofan, tirozin i valin. Druge familije aminokiselina uključuju (i) serin i treonin, koje su alifatična-hidroksi familija; (ii) asparagin i glutamin, koje su familija koja sadrži amid; (iii) alanin, valin, leucin i izoleucin, koje su alifatična familija; i (iv) fenilalanin, triptofan, i tirozin, koje su aromatična familija. Na primer, razumno je očekivati da izolovana zamena leucina izoleucinom ili valinom, aspartata glutamatom, treonina serinom, ili slična zamena aminokiseline strukturno srodnom aminokiselinom neće imati veliko dejstvo na vezivanje ili
11
svojstva rezultujućeg molekula, posebno ako zamena ne uključuje aminokiselinu u okvirnom regionu. To da li aminokiselinska izmena rezultuje funkcionalnim peptidom može lako da se odredi ispitivanjem specifične aktivnosti derivata polipeptida. Testovi su ovde detaljno opisani. Stručnjaci u ovoj oblasti mogu lako da pripreme fragmente ili analoge antitela ili molekula imunoglobulina. Pogodni amino- i karboksi-terminalni krajevi fragmenata ili analoga javljaju se blizu granica funkcionalnih domena. Strukturni i funkcionalni domeni mogu da se identifikuju poređenjem podataka o nukleotidnoj i/ili aminokiselinskoj sekvenci sa javnim ili vlasničkim bazama podataka o sekvencama. U nekim primerima izvođenja, postupci za kompjutersko poređenje koriste se za identifikaciju motiva sekvence ili predviđene konformacije proteinskih domena koji se javljaju u drugim proteinima poznate strukture i/ili funkcije. Postupci za identifikaciju proteinskih sekvenci koji se savijaju u poznatu trodimenzionalnu strukturu su poznati. Bowie et al. Science 253:164 (1991). Prema tome, gore navedeni primeri pokazuju da stručnjaci u ovoj oblasti mogu da prepoznaju mootive sekvence i strukturne konformacije koje mogu da se koriste za definisanje strukturnih i funkcionalnih domena prema otkriću.
[0300] Pogodne aminokiselinske supstitucije su one koje: (1) smanjuju osetljivost na proteolizu, (2) smanjuju osetljivost na oksidaciju, (3) menjaju afinitet vezivanja za obrazovanje proteinskih kompleksa, (4) menjaju afinitete vezivanja, i (5) doprinose ili modifikuju druga fizikohemijska ili funkcionalna svojstva takvih analoga. Analozi mogu da uključuju razne muteine sekvence drugačije od prirodne peptidne sekvence. Na primer, pojedinačne ili višestruke aminokiselinske supstitucije (na primer, konzervativne aminokiselinske supstitucije) mogu da se uvedu u prirodnu sekvencu (na primer, u delu polipeptida izvan domena koji formira/formiraju međumolekulske kontakte. Konzervativna aminokiselinska supstitucija ne bi trebalo suštinski da promeni strukturne karakteristike parentalne sekvence (npr., zamenska aminokiselina ne bi trebalo da teži da naruši spiralu koja se javlja u parentalnoj sekvenci, ili da naruši druge vrste sekundarnih struktura koje odlikuju parentalnu sekvencu). Primeri u struci poznatih polipeptidnih sekundarnih i tercijarnih struktura opisani su u Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)); i Thornton et at. Nature 354:105 (1991).
[0301] Pojam "polipeptidni fragment", kako se ovde koristi, odnosi se na polipeptid koji ima amino-terminalnu i/ili karboksi-terminalnu deleciju i/ili jednu ili više unutrašnjih delecija, ali u kome je preostala aminokiselinska sekvenca identična odgovarajućim pozicijama u prirodnoj sekvenci izvedena, na primer, iz cele dužine cDNK sekvence. Fragmenti su tipično najmanje 5, 6, 8 ili 10 aminokiselina dugi, u nekim primerima izvođenja, najmanje 14 aminokiselina dugi, u nekim primerima izvođenja, najmanje 20 aminokiselina dugi, obično najmanje 50 aminokiselina
11
dugi, i u nekim primerima izvođenja, najmanje 70 aminokiselina dugi. Pojam "analog", kako se ovde koristi, odnosi se na polipeptide koji su sačinjeni od segmenta od najmanje 25 aminokiselina koji ima suštinsku identičnost sa delom izvedene aminokiselinske sekvence i koji se specifično vezuje za ciljni molekul, pod pogodnim uslovima vezivanja. Tipično, polipeptidni analozi sadrže konzervativnu aminokiselinsku supstituciju (ili adiciju ili deleciju) u odnosu na prirodnu sekvencu. Analozi su tipično najmanje 20 aminokiselina dugi, u nekim primerima izvođenja, najmanje 50 aminokiselina dugi ili duži, i mogu često da budu dugi kao prirodni polipeptid cele dužine.
[0302] Pojam "agens" se ovde koristi da označi hemijsko jedinjenje, smešu hemijskih jedinjenja, biološki makromolekul, ili ekstrakt napravljen od bioloških materijala.
[0303] Kako se ovde koriste, pojmovi "oznaka" ili "obeležen" odnose se na ugradnju detektabilnog markera, npr., ugradnjom radioaktivno obeležene aminokiseline ili vezivanjem za polipeptid biotinilovanih fragmenata koji mogu da budu detektovani obeleženim avidinom (npr., streptavidin koji sadrži fluorescentni marker ili enzimsku aktivnost koja može da bude detektovana optičkim ili kalorimetrijskim metodama). U određenim situacijama, oznaka ili marker mogu takođe da budu terapijski. Različiti postupci za obeležavanje polipeptida i glikoproteina su poznati u stanju tehnike i mogu da se koriste. Primeri oznaka za polipeptide uključuju, ali nisu ograničeni na, sledeće: radioizotope ili radionuklide (npr., 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), fluorescentne oznake (npr., FITC, rodamin, lantanid fosfore), enzimske oznake (npr., peroksidaza rena, p-galaktozidaza, luciferaza, alkalna fosfataza), hemiluminescentne agense, biotinil grupe, unapred određene polipeptidne epitope koje prepoznaje sekundarni reporter (npr., sekvence leucinskog zatvarača, mesta vezivanja za sekundarna antitela, domeni vezivanja metala, epitopske oznake). U nekim primerima izvođenja, oznake su vezane pomoću ručica spejsera različitih dužina da bi se smanjila potencijalna sterna ometanja. Pojam "farmaceutski agens ili lek", kako se ovde koristi, odnosi se na hemijsko jedinjenje ili kompoziciju sposobnu da indukuje željeno terapijsko dejstvo kada se pravilno primeni kod pacijenta.
[0304] Ostali hemijski pojmovi ovde se koriste u skladu sa konvencionalnom upotrebom u ovoj oblasti, kao što je ilustrovano u McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985)).
[0305] Kako se ovde koristi, "suštinski čist" znači da je vrsta datog objekta pretežno prisutna vrsta (tj., na molarnoj osnovi je zastupljenija od bilo koje druge pojedinačne vrste u kompoziciji), i u nekim primerima izvođenja, suštinski prečišćena frakcija je kompozicija u kojoj vrsta objekta čini najmanje oko 50 procenata (na molarnoj bazi) od svih prisutnih makromolekulskih vrsta.
11
[0306] Uopšteno, suštinski čista kompozicija će sadržati više od oko 80 procenata svih makromolekulskih vrsta prisutnih u kompoziciji, u nekim primerima izvođenja, više od oko 85%, 90%, 95%, i 99%. U nekim primerima izvođenja, vrsta datog objekta je prečišćena do suštinske homogenosti (vrste kontaminanta ne mogu da budu detektovane u kompoziciji konvencionalnim metodama detekcije) pri čemu se kompozicija suštinski sastoji od jedne makromolekulske vrste.
[0307] Pojam pacijent uključuje humane i veterinarske subjekte.
[0308] Antitela i/ili antitela koja mogu da se aktiviraju prema otkriću specifično vezuju dati ciljni molekul, npr., humani ciljni protein kao što je CD166 čoveka. U otkriće su uključena i antitela i/ili antitela koja mogu da se aktiviraju koja se vezuju ta isti epitop kao ovde opisana antitela i/ili antitela koja mogu da se aktiviraju. U otkriće su uključena i antitela i/ili antitela antitela koja mogu da se aktiviraju koja kompetiraju sa ovde opisanim anti-CD166 antitelom i/ili anti-CD166 antitelom koje može da se aktivira za vezivanje sa CD166, npr., CD166 čoveka. U otkriće su uključena i antitela i/ili antitela antitela koja mogu da se aktiviraju koja unakrsno kompetiraju sa ovde opisanim anti-CD166 antitelom i/ili an anti-CD166 antitelom koje može da se aktivira za vezivanje sa CD166, npr., CD166 čoveka.
[0309] Stručnjaci u ovoj oblasti će prepoznati da je moguće odrediti, bez nepotrebnog eksperimentisanja, da li monoklonsko antitelo (npr., mišje monoklonsko ili humanizovano antitelo) ima istu specifičnost kao monoklonsko antitelo upotrebljeno u postupcima koji su ovde opisani utvrđivanjem da li prvo sprečava drugo da se veže za ciljni molekul. Ako monoklonsko antitelo koje se ispituje kompetira sa monoklonskim antitelom prema otkriću, što se ispoljava smanjenjem vezivanja monoklonskim antitelom prema otkriću, tada se dva monoklonska antitela vezuju za isti, ili blisko povezani, epitop. Alternativni postupak za određivanje da li monoklonsko antitelo ima specifičnost monoklonskog antitela prema otkriću je da se monoklonsko antitelo prema otkriću pre-inkubira sa ciljnim molekulom, a zatim doda monoklonsko antitelo koje se ispituje da bi se odredilo da li je sposobnost monoklonskog antitela koje se ispituje da veže ciljni molekul inhibirana. Ako je monoklonsko antitelo koje se ispituje inhibirano, tada, po svemu sudeći, ono ima istu, ili funkcionalno ekvivalentnu, epitopsku specifičnost kao monoklonsko antitelo prema otkriću.
Multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju
[0310] Otkriće obezbeđuje i multispecifična anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju. Multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju koja su ovde obezbeđena su multispecifična antitela koja prepoznaju CD166 i najmanje jedan ili više različitih antigena ili epitopa i koja uključuju najmanje jedan maskirajući fragment (MM) vezan za najmanje jedan antigen- ili epitop-vezujući domen multispecifičnog antitela tako da kuplovanje MM redukuje sposobnost
11
antigen- ili epitop-vezujućeg domena da veže svoj ciljni molekul. U nekim primerima izvođenja, MM je kuplovan sa antigen- ili epitop-vezujućim domenom multispecifičnog antitela preko fragmenta koji može da se otcepi (CM) koji funkcioniše kao supstrat za najmanje jednu proteazu. Multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju koja su ovde obezbeđena su stabilna u cirkulaciji, aktivirana na predviđenim mestima za terapiju i/ili dijagnozu, ali ne i u normalnom, tj., zdravom tkivu, i, kada se aktiviraju, ispoljavaju vezivanje za ciljni molekul koje je najmanje uporedivo sa odgovarajućim, nemodifikovanim multispecifičnim antitelom.
[0311] U nekim primerima izvođenja, multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju su konstruisana da privlače imuno-efektorske ćelije, ovde označena i kao multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju koja privlače imuno-efektorske ćelije. U nekim primerima izvođenja, multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju su namenjena da privlače leukocite, ovde označena i kao multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju koja privlače leukocite. U nekim primerima izvođenja, multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju su namenjena da privlače T ćelije, ovde označena i kao multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju koja privlače T ćelije. U nekim primerima izvođenja, multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju privlače površinski antigen na leukocitu, kao što je na T ćeliji, na ćeliji prirodnom ubici (NK), na mijeloidnoj mononuklearnoj ćeliji, na makrofagu, i/ili na drugoj imunoefektorskoj ćeliji. U nekim primerima izvođenja, imuno-efektorska ćelija je leukocit. U nekim primerima izvođenja, imuno-efektorska ćelija je T ćelija. U nekim primerima izvođenja, imunoefektorska ćelija je NK ćelija. U nekim primerima izvođenja, imuno-efektorska ćelija je mononuklearna ćelija, kao što je mijeloidna mononuklearna ćelija. U nekim primerima izvođenja, multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju namenjena su da vežu ili drugačije interaguju sa više od jednog ciljnog molekula i/ili više od jednog epitopa, ovde označena i kao antitela koja mogu da se aktiviraju usmerena na više antigena. Kako se ovde koriste, pojmovi "ciljni molekul" i "antigen" koriste se kao sinonimi.
[0312] U nekim primerima izvođenja, multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju prema otkriću koja privlače imuno-efektorske ćelije uključuju ciljno antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji vezuje CD166 i antitelo ili njegov antigen-vezujući deo koji privlači imunoefektorske ćelije, gde je najmanje jedno od ciljnog antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta i/ili antitela ili njegovog antigen-vezujućeg dela koji privlači imuno-efektorske ćelije maskiran. U nekim primerima izvođenja, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji privlači imuno-efektorske ćelije uključuje prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB1) koji vezuje prvi, ciljni molekul koji privlači imuno-efektorske ćelije, gde je AB1 vezan za maskirajući fragment (MM1) tako da kuplovanje MM1 redukuje sposobnost AB1 da veže prvi ciljni molekul. U nekim primerima izvođenja, usmereno antitelo ili njegov antigen-vezujući
12
fragment uključuje drugo antitelo ili njegov fragment koji uključuje drugo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB2) koji vezuje CD166, gde je AB2 vezan za maskirajući fragment (MM2) tako da kuplovanje MM2 redukuje sposobnost AB2 da veže CD166. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje privlači imuno-efektorsku ćeliju ili njegov antigen-vezujući fragment uključuje prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB1) koji vezuje prvi, ciljni molekul koji privlači imuno-efektorske ćelije, gde je AB1 vezan za maskirajući fragment (MM1) tako da kuplovanje MM1 redukuje sposobnost AB1 da veže prvi ciljni molekul, i usmereno antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment uključuje drugo antitelo ili njegov fragment koji uključuje drugo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB2) koji vezuje CD166, gde je AB2 vezan za maskirajući fragment (MM2) tako da kuplovanje MM2 redukuje sposobnost AB2 da veže CD166. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje ne privlači imuno-efektorske ćelije je antitelo usmereno na kancer. U nekim primerima izvođenja antitelo koje ne privlači imunoefektorske ćelije je IgG. U nekim primerima izvođenja antitelo koje privlači imuno-efektorske ćelije je scFv. U nekim primerima izvođenja antitelo usmereno na CD166 (npr., antitelo koje ne privlači imuno-efektorske ćelije) je IgG i antitelo koje privlači imuno-efektorske ćelije je scFv. U nekim primerima izvođenja, imuno-efektorska ćelija je leukocit. U nekim primerima izvođenja, imuno-efektorska ćelija je T ćelija. U nekim primerima izvođenja, imuno-efektorska ćelija je NK ćelija. U nekim primerima izvođenja, imuno-efektorska ćelija je mijeloidna mononuklearna ćelija.
[0313] U nekim primerima izvođenja, multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju prema otkriću koja privlače T ćelije uključuju antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment usmeren na CD166 i antitelo ili njegov antigen-vezujući deo koji privlači T ćelije, gde je najmanje jedno od antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta usmerenog na CD166 i/ili antitela ili njegovog antigen-vezujućeg dela koji privlači T ćelije maskiran. U nekim primerima izvođenja, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji privlači T ćelije uključuje prvo antitelo ili njegov antigenvezujući fragment (AB1) koji vezuje prvi, ciljni molekul koji privlači T ćelije, gde je AB1 vezan za maskirajući fragment (MM1) tako da kuplovanje MM1 redukuje sposobnost AB1 da veže prvi ciljni molekul. U nekim primerima izvođenja, usmereno antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment uključuje drugo antitelo ili njegov fragment koji uključuje drugo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB2) koji vezuje CD166, gde je AB2 vezan za maskirajući fragment (MM2) tako da kuplovanje MM2 redukuje sposobnost AB2 da veže CD166. U nekim primerima izvođenja, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji privlači T ćelije uključuje prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB1) koji vezuje prvi, ciljni molekul koji privlači T ćelije, gde je AB1 vezan za maskirajući fragment (MM1) tako da kuplovanje MM1 redukuje sposobnost AB1 da veže prvi ciljni molekul, i usmereno antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment uključuje drugo antitelo ili njegov fragment koji uključuje drugo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB2) koji vezuje CD166, gde je AB2 vezan za maskirajući fragment (MM2) tako da kuplovanje MM2 redukuje sposobnost AB2 da veže CD166.
[0314] U nekim primerima izvođenja multispecifičnog antitela koje može da se aktivira koje privlači imuno-efektorske ćelije, jedan antigen je CD166, a drugi antigen je tipično stimulatorni ili inhibitorni receptor prisutan na površini T ćelije, ćelije prirodnog ubice (NK), mijeloidne mononuklearne ćelije, makrofaga, i/ili druge imuno-efektorske ćelije, kao što je, ali bez ograničenja, B7-H4, BTLA, CD3, CD4, CD8, CD16a, CD25, CD27, CD28, CD32, CD56, CD137, CTLA-4, GITR, HVEM, ICOS, LAG3, NKG2D, OX40, PD-1, TIGIT, TIM3, ili VISTA. U nekim primerima izvođenja, antigen je stimulatorni receptor prisutan na površini T ćelije ili NK ćelije; primeri takvih stimulatornih receptora uključuju, ali nisu ograničeni na, CD3, CD27, CD28, CD137 (označene i kao 4-1BB), GITR, HVEM, ICOS, NKG2D, i OX40. U nekim primerima izvođenja, antigen je inhibitorni receptor prisutan na površini T-ćelije; primeri takvih inhibitornih receptora uključuju, ali nisu ograničeni na, BTLA, CTLA-4, LAG3, PD-1, TIGIT, TIM3, i NK-eksprimirane KIR. Domen antitela koji daje specifičnost T-ćelijskom površinskom antigenu može takođe da bude supstituisan ligandom ili domenom liganda koji se vezuje za T-ćelijski receptor, NK-ćelijski receptor, makrofagni receptor, i/ili drugi receptor imunoefektorskih ćelija, kao što su, ali bez ograničenja, B7-1, B7-2, B7H3, PDL1, PDL2, ili TNFSF9.
[0315] U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira koje privlači T ćelije uključuje anti-CD3 epsilon (CD3ε, ovde označeno i kao CD3e i CD3) scFv i usmereno antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, gde je najmanje jedno od anti-CD3ε scFv i/ili usmerenog antitela ili njegovog antigen-vezujućeg dela maskirano. U nekim primerima izvođenja, CD3ε scFv uključuje prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB1) koje vezuje CD3ε, gde je AB1 vezan za maskirajući fragment (MM1) tako da kuplovanje MM1 redukuje sposobnost AB1 da veže CD3ε. U nekim primerima izvođenja, usmereno antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment uključuje drugo antitelo ili njegov fragment koji uključuje drugo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB2) koji vezuje CD166, gde je AB2 vezan za maskirajući fragment (MM2) tako da kuplovanje MM2 redukuje sposobnost AB2 da veže CD166. U nekim primerima izvođenja, CD3ε scFv uključuje prvo antitelo ili njegov antigenvezujući fragment (AB1) koji vezuje CD3ε, gde je AB1 vezan za maskirajući fragment (MM1) tako da kuplovanje MM1 redukuje sposobnost AB1 da veže CD3ε, i usmereno antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment uključuje drugo antitelo ili njegov fragment koji uključuje drugo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB2) koje vezuje CD166, gde je AB2 vezan za maskirajući fragment (MM2) tako da kuplovanje MM2 redukuje sposobnost AB2 da veže CD166.
[0316] U nekim primerima izvođenja, antitela usmerena na više antigena i/ili antitela koja mogu da se aktiviraju usmerena na više antigena uključuju najmanje prvo antitelo ili njegov antigenvezujući fragment koji vezuje prvi ciljni molekul i/ili prvi epitop i drugo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji vezuje drugi ciljni molekul i/ili drugi epitop. U nekim primerima izvođenja, antitela usmerena na više antigena i/ili antitela koja mogu da se aktiviraju usmerena na više antigena vezuju dva ili više različitih ciljnih molekula. U nekim primerima izvođenja, antitela usmerena na više antigena i/ili antitela koja mogu da se aktiviraju usmerena na više antigena vezuju dva ili više različitih epitopa na istom ciljnom molekulu. U nekim primerima izvođenja, antitela usmerena na više antigena i/ili antitela koja mogu da se aktiviraju usmerena na više antigena vezuju kombinaciju dva ili više različitih ciljnih molekula i dva ili više različitih epitopa na istom ciljnom molekulu.
[0317] U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira koje sadrži IgG ima maskirane IgG varijabilne domene. U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira koje sadrži scFv ima maskirane scFv domene. U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira ima i IgG varijabilne domene i scFv domene, gde je najmanje jedan od IgG varijabilnih domena kuplovan sa maskirajućim fragmentom. U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira ima i IgG varijabilne domene i scFv domene, gde je najmanje jedan od scFv domena kuplovan sa maskirajućim fragmentom. U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira ima i IgG varijabilne domene i scFv domene, gde je najmanje jedan od IgG varijabilnih domena kuplovan sa maskirajućim fragmentom i najmanje jedan od scFv domena je kuplovan sa maskirajućim fragmentom. U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira ima i IgG varijabilne domene i scFv domene, gde je svaki od IgG varijabilnih domena i scFv domena kuplovan sa svojim sopstvenim maskirajućim fragmentom. U nekim primerima izvođenja, jedan domen antitela multispecifičnog antitela koje može da se aktivira ima specifičnost za ciljni antigen, a drugi domen antitela ima specifičnost za T-ćelijski površinski antigen. U nekim primerima izvođenja, jedan domen antitela multispecifičnog antitela koje može da se aktivira ima specifičnost za ciljni antigen, a drugi domen antitela ima specifičnost za drugi ciljni antigen. U nekim primerima izvođenja, jedan domen antitela multispecifičnog antitela koje može da se aktivira ima specifičnost za epitop ciljnog antigena, a drugi domen antitela ima specifičnost za drugi epitop ciljnog antigena.
[0318] U multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira, scFv može da bude fuzionisano sa karboksilnim terminalnim krajem teškog lanca IgG antitela koje može da se aktivira, sa karboksilnim terminalnim krajem lakog lanca IgG antitela koje može da se aktivira, ili sa karboksilnim terminalnim krajem i teškog i lakog lanca IgG antitela koje može da se aktivira. U
12
multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira, scFv može da bude fuzionisan sa amino terminalnim krajem teškog lanca IgG antitela koje može da se aktivira, sa amino terminalnim krajem lakog lanca IgG antitela koje može da se aktivira, ili sa amino terminalnim krajem i teškog i lakog lanca IgG antitela koje može da se aktivira. U multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira, scFv može da bude fuzionisan sa bilo kojom kombinacijom jednog ili više karboksilnih terminalnih krajeva i jednim ili više amino-terminalnih krajeva IgG antitela koje može da se aktivira. U nekim primerima izvođenja, maskirajući fragment (MM) vezan za fragment koji može da se otcepi (CM) vezan je za, i maskira, antigen-vezujući domen IgG. U nekim primerima izvođenja, maskirajući fragment (MM) vezan za fragment koji može da se otcepi (CM) vezan je za, i maskira, antigen-vezujući domen najmanje jednog scFv. U nekim primerima izvođenja, maskirajući fragment (MM) vezan za fragment koji može da se otcepi (CM), vezan je za, i maskira, antigen-vezujući domen IgG i maskirajući fragment (MM) vezan za fragment koji može da se otcepi (CM), vezan je za, i maskira, antigen-vezujući domen najmanje jednog scFv.
[0319] Otkriće obezbeđuje primere struktura multispecifičnog antitela koje može da se aktivira koje uključuju, ali nisu ograničene na, sledeće: (VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2; (VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2; (MM-L1-CM-L2-VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3-L4-VH*-L3-VL*)2; (MM-L1-CM-L2-VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3-L4-VL*-L3-VH*)2; (VL-CL)2: (MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL)2:(MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (MM-L1-CM-L2-VL-CL)2:(VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (MM-L1-CM-L2-VL-CL)2:(VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2; (MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2; (MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2: (MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2: (MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2: (MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2: (MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*)2: (MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*)2: (MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*)2: (MM-L1-CM-L2-VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*)2: (MM-L1-CM-L2-VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2: (VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH*-L3-VL*-L2-CM-L1-MM)2: (VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2CM-L1-MM)2: (VL*-L3-VH*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; ili (VL-CL-L4-VL*-L3-VH*-L2-CM-L1-MM)2: (VH*-L3-VL*-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2, gde: VL i VH predstavljaju lake i teške varijabilne domene prve specifičnosti, sadržane u IgG; VL* i VH* predstavljaju varijabilne domene druge specifičnosti, sadržane u scFv; L1 je linkerski peptid koji povezuje maskirajući fragment (MM) i fragment koji može da se otcepi (CM); L2 je linkerski peptid koji povezuje fragment koji može da se otcepi (CM), i antitelo; L3 je linkerski peptid koji povezuje varijabilne domene scFv; L4 je linkerski peptid koji povezuje antitelo prve specifičnosti sa antitelom druge specifičnosti; CL je konstantni domen lakog lanca; i CH1, CH2, CH3 su konstantni domeni teškog lanca. Prva i druga specifičnost mogu da budu usmerene prema bilo kom antigenu ili epitopu.
[0320] U nekim primerima izvođenja multispecifičnog antitela koje može da se aktivira koje privlači T ćelije, jedan antigen je CD166, a drugi antigen je tipično stimulatorni (ovde označen i kao aktivirajući) ili inhibitorni receptor prisutan na površini T-ćelije, ćelije prirodnog ubice (NK), mijeloidne mononuklearne ćelije, makrofaga, i/ili druge imuno-efektorske ćelije, kao što je, ali bez ograničenja, B7-H4, BTLA, CD3, CD4, CD8, CD16a, CD25, CD27, CD28, CD32, CD56, CD137 (označena i kao TNFRSF9), CTLA-4, GITR, HVEM, ICOS, LAG3, NKG2D, OX40, PD-1, TIGIT, TIM3, ili VISTA. Domen antitela koji daje specifičnost T-ćelijskom površinskom antigenu može takođe da bude supstituisan ligandom ili domenom liganda koji se vezuje za T-ćelijski receptor, NK-ćelijski receptor, makrofagni receptor, i/ili receptor druge imunoefektorske ćelije.
[0321] U nekim primerima izvođenja, usmereno antitelo je anti-CD166 antitelo koje je ovde opisano. U nekim primerima izvođenja, usmereno antitelo može da bude u obliku antitela koje može da se aktivira. U nekim primerima izvođenja, jedan ili više scFv može da bude u obliku Pro-scFv (videti, npr., WO 2009/025846, WO 2010/081173).
[0322] U nekim primerima izvođenja, scFv je specifičan za vezivanje CD3ε, i sadrži ili potiče od antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje CD3ε, npr., CH2527, FN18, H2C, OKT3, 2C11, UCHT1, ili V9. U nekim primerima izvođenja, scFv je specifičan za vezivanje CTLA-4 (ovde označen i kao CTLA i CTLA4).
[0323] U nekim primerima izvođenja, anti-CTLA-4 scFv uključuje aminokiselinsku sekvencu:
12
[0324] U nekim primerima izvođenja, anti-CTLA-4 scFv uključuje aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 117.
[0325] U nekim primerima izvođenja, anti-CD3ε scFv uključuje aminokiselinsku sekvencu:
[0326] U nekim primerima izvođenja, anti-CD3ε scFv uključuje aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 118.
[0327] U nekim primerima izvođenja, scFv je specifičan za vezivanje jedne ili više T-ćelija, jedne ili više NK-ćelija i/ili jednog ili više makrofaga. U nekim primerima izvođenja, scFv je specifičan za vezivanje ciljnog molekula izabranog iz grupe koja se sastoji od B7-H4, BTLA, CD3, CD4, CD8, CD16a, CD25, CD27, CD28, CD32, CD56, CD137, CTLA-4, GITR, HVEM, ICOS, LAG3, NKG2D, OX40, PD-1, TIGIT, TIM3, ili VISTA.
[0328] U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira takođe uključuje agens konjugovan sa AB. U nekim primerima izvođenja, agens je terapijski agens. U nekim primerima izvođenja, agens je antineoplastični agens. U nekim primerima izvođenja, agens je toksin ili njegov fragment. U nekim primerima izvođenja, agens je konjugovan sa multispecifičnim antitelom koje može da se aktivira preko linkera. U nekim primerima izvođenja, agens je konjugovan sa AB preko linkera koji može da se otcepi. U nekim primerima izvođenja, linker je linker koji ne može da se otcepi. U nekim primerima izvođenja, agens je inhibitor mikrotubula. U nekim primerima izvođenja, agens je agens koji oštećuje nukleinsku kiselinu, kao što je agens koji alkiluje DNK ili agens koji interkalira DNK, ili drugi agens koji oštećuje DNK. U nekim primerima izvođenja, linker je linker koji može da se otcepi. U nekim primerima izvođenja, agens je agens odabran iz grupe navedene u tabeli 5. U nekim primerima izvođenja, agens je dolastatin. U nekim primerima izvođenja, agens je auristatin ili njegov derivat. U nekim primerima izvođenja, agens je auristatin E ili njegov derivat. U nekim primerima izvođenja, agens je monometil auristatin E (MMAE). U nekim primerima izvođenja, agens je monometil auristatin D (MMAD). U nekim primerima izvođenja, agens je majtanzinoid ili derivat majtanzinoida. U nekim primerima izvođenja, agens je DM1 ili DM4. U nekim primerima izvođenja, agens je duokarmicin ili njegov derivat. U nekim primerima izvođenja, agens je
12
kaliheamicin ili njegov derivat. U nekim primerima izvođenja, agens je pirolobenzodiazepin. U nekim primerima izvođenja, agens je dimer pirolobenzodiazepina.
[0329] U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira takođe uključuje detektabilni fragment. U nekim primerima izvođenja, detektabilni fragment je dijagnostički agens.
[0330] U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira prirodno sadrži jednu ili više disulfidnih veza. U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira može da bude konstruisano tako da uključuje jednu ili više disulfidnih veza.
[0331] Otkriće obezbeđuje i molekul izolovane nukleinske kiseline koja kodira ovde opisano multispecifično antitelo koje može da se aktivira, kao i vektore koji uključuju ove sekvence izolovane nukleinske kiseline. Otkriće obezbeđuje postupke za proizvodnju multispecifičnog antitela koje može da se aktivira kultivacijom ćelija pod uslovima koji vode ekspresiji antitela koje može da se aktivira, pri čemu ćelija sadrži takav molekul nukleinske kiseline. U nekim primerima izvođenja, ćelija sadrži takav vektor.
[0332] Otkriće obezbeđuje i postupak za proizvodnju multispecifičnih antitela koja mogu da se aktiviraju prema otkriću (a) kultivacijom ćelija koje sadrže konstrukt nukleinske kiseline koja kodira multispecifično antitelo koje može da se aktivira pod uslovima koji vode ekspresiji multispecifičnog antitela koje može da se aktivira, i (b) izdvajanjem multispecifičnog antitela koje može da se aktivira. Pogodni AB, MM, i/ili CM uključuju bilo koji od ovde opisanih AB, MM, i/ili CM.
[0333] Otkriće obezbeđuje i multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju i/ili kompozicije multispecifičnog antitela koje može da se aktivira koje uključuju najmanje prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB1) koji specifično vezuje prvi ciljni molekul ili prvi epitop i drugo antitelo ili antigen-biding njegov fragment (AB2) koji vezuje drugi ciljni molekul ili drugi epitop, gde je najmanje AB1 kuplovan ili drugačije vezan za maskirajući fragment (MM1), tako da kuplovanje MM1 redukuje sposobnost AB1 da veže svoj ciljni molekul. U nekim primerima izvođenja, MM1 je kuplovan sa AB1 preko sekvence prvog fragmenta koji može da se otcepi (CM1) koja uključuje supstrat za proteazu, na primer, proteazu koja je ko-lokalizovana sa ciljnim molekulom AB1 na mestu lečenja ili dijagnostičkom mestu kod subjekta. Multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju koja su ovde obezbeđena su stabilna u cirkulaciji, aktiviraju se na predviđenim mestima terapije i/ili dijagnoze, ali ne i u normalnom, tj., zdravom tkivu, i, kada se aktiviraju, ispoljavaju vezivanje za ciljni molekul AB1 koje je najmanje upoedivo sa odgovarajućim, nemodifikovanim multispecifičnim antitelom. Pogodni AB, MM, i/ili CM uključuju bilo koji od ovde opisanih AB, MM, i/ili CM.
12
[0334] Otkriće obezbeđuje i kompozicije i postupke koji uključuju multispecifično antitelo koje može da se aktivira koje uključuje najmanje prvo antitelo ili fragment antitela (AB1) koji specifično vezuje ciljni molekul i drugo antitelo ili fragment antitela (AB2), gde je najmanje prvi AB u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira kuplovan sa maskirajućim fragmentom (MM1) koji smanjuje sposobnost AB1 da veže svoj ciljni molekul. U nekim primerima izvođenja, svaki AB je kuplovan sa MM koji smanjuje sposobnost svog odgovarajućeg AB da veže svaki ciljni molekul. Na primer, u primerima izvođenja bispecifičnog antitela koje može da se aktivira, AB1 je kuplovan sa prvim maskirajućim fragmentom (MM1) koji smanjuje sposobnost AB1 da veže svoj ciljni molekul, i AB2 je kuplovan sa drugim maskirajućim fragmentom (MM2) koji smanjuje sposobnost AB2 da veže svoj ciljni molekul. U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira sadrži više od dva AB regiona; u takvim primerima izvođenja, AB1 je kuplovan sa prvim maskirajućim fragmentom (MM1) koji smanjuje sposobnost AB1 da veže svoj ciljni molekul, AB2 je kuplovan sa drugim maskirajućim fragmentom (MM2) koji smanjuje sposobnost AB2 da veže svoj ciljni molekul, AB3 je kuplovan sa trećim maskirajućim fragmentom (MM3) koji smanjuje sposobnost AB3 da veže svoj ciljni molekul, i tako za svaki AB u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira. Pogodni AB, MM, i/ili CM uključuju bilo koji od ovde opisanih AB, MM, i/ili CM.
[0335] U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira dalje uključuje najmanje jedan fragment koji može da se otcepi (CM) koji je supstrat za proteazu, gde CM povezuje MM za AB. Na primer, u nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira uključuje najmanje prvo antitelo ili fragment antitela (AB1) koji specifično vezuje ciljni molekul i drugo antitelo ili fragment antitela (AB2), gde je najmanje prvi AB u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira kuplovan preko prvog fragmenta koji može da se otcepi (CM1) za maskirajući fragment (MM1) koji smanjuje sposobnost AB1 da veže svoj ciljni molekul. U nekim primerima izvođenja bispecifičnog antitela koje može da se aktivira, AB1 je kuplovan preko CM1 sa MM1, i AB2 je kuplovan preko drugog fragmenta koji može da se otcepi (CM2) sa drugim maskirajućim fragmentom (MM2) koji smanjuje sposobnost AB2 da veže svoj ciljni molekul. U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira sadrži više od dva AB regiona; u nekim od ovih primera izvođenja, AB1 je kuplovan preko CM1 sa MM1, AB2 je kuplovan preko CM2 sa MM2, i AB3 je kuplovan preko trećeg fragmenta koji može da se otcepi (CM3) sa trećim maskirajućim fragmentom (MM3) koji smanjuje sposobnost AB3 da veže svoj ciljni molekul, i tako za svaki AB u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira. Pogodni AB, MM, i/ili CM uključuju bilo koji od ovde opisanih AB, MM, i/ili CM.
12
Antitela koja mogu da se aktiviraju koja imaju nevezujuće sterne fragmente ili vezujuće partnere za nevezujuće sterne fragmente
[0336] Otkriće obezbeđuje i antitela koja mogu da se aktiviraju koja uključuju nevezujuće sterne fragmente (NB) ili vezujuće partnere (BP) za nevezujuće sterne fragmente, gde BP regrutuje ili na drugi način privlači NB ka antitelu koje može da se aktivira. Ovde obezbeđena antitela koja mogu da se aktiviraju uključuju, na primer, antitelo koje može da se aktivira koje uključuje nevezujući sterni fragment (NB), linker koji može da se otcepi (CL) i antitelo ili fragment antitela (AB) koji vezuje ciljni molekul; antitelo koje može da se aktivira koje uključuje vezujućeg partnera za nevezujući sterni fragment (BP), CL i AB; i antitelo koje može da se aktivira koje uključuje BP za koji je NB regrutovan, CL i AB koji vezuje ciljni molekul. Antitela koja mogu da se aktiviraju u kojima je NB kovalentno vezan za CL i AB antitela koje može da se aktivira ili je udružen interakcijom sa BP koji je kovalentnovezan za CL i AB antitela koje može da se aktivira su, kako je ovde navedeno, "antitela koja mogu da se aktiviraju koja sadrže NB". Pod izrazom koje može da se aktivira ili promenljivo, misli se da antitelo koje može da se aktivira ispoljava prvi nivo vezivanja za ciljni molekul kada je antitelo koje može da se aktivira u inhibiranom, maskiranom ili stanju u kome nije podvrgnuto cepanju (tj., prvoj konformaciji), i drugi nivo vezivanja za ciljni molekul kada je antitelo koje može da se aktivira u neinhibiranom, nemaskiranom i/ili stanju u kome je podvrgnuto cepanju (tj., drugoj konformaciji, tj., aktivirano antitelo), gde je drugi nivo vezivanja ciljnog molekula veći od prvog nivoa vezivanja ciljnog molekula. Kompozicije antitela koje može da se aktivira mogu da ispolje povećanu biološku raspoloživost i povoljniju biološku raspodelu u poređenju sa konvencionalnim terapeuticima na bazi antitela.
[0337] U nekim primerima izvođenja, antitela koja mogu da se aktiviraju obezbeđuju smanjenu toksičnost i/ili neželjena sporedna dejstva koja bi inače mogla da rezultuju iz vezivanja na mestima koja nisu mesta lečenja i/ili dijagnostike da AB nisu bila maskirana ili drugačije inhibirana za vezivanje na takvom mestu.
[0338] Anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju koja uključuju nevezujući sterni fragment (NB) mogu da se naprave upotrebom postupaka prikazanih u PCT objavi br. WO 2013/192546.
Upotreba antitela, konjugovanih antitela, antitela koja mogu da se aktiviraju i konjugovanih antitela koja mogu da se aktiviraju
[0339] Treba imati u vidu da će se primena terapijskih entiteta u skladu sa otkrićem odvijati sa odgovarajućim nosačima, ekscipijensima, i drugim agensima koji su uključeni u formulacije da obezbede poboljšani prenos, isporuku, toleranciju, i slično. Mnoštvo odgovarajućih formulacija
12
može se naći u formulama poznatim svim farmaceutskim hemičarima: Remington's Pharmaceutical Sciences (15th ed, Mack Publishing Company, Easton, PA (1975)), posebno poglavlje 87 autora Blaug, Seymour, u njemu. Ove formulacije uključuju, na primer, prahove, paste, masti, želee, voskove, ulja, lipide, vezikule koje sadrže lipide (katjonske ili anjonske) (kao što je Lipofectin™), DNK konjugate, anhidrovane apsorpcione paste, emulzije ulje-u-vodi i voda-u-ulju, emulzije karbovaks (polietilen glikoli različitih molekulskih težina), polučvrste gelove, i polučvrste smeše koje sadrže karbovaks. Bilo koja od gore pomenutih smeša može da bude pogodna u lečenjima i terapijama u skladu sa predmetnim otkrićem, pod uslovom da aktivni sastojak u formulaciji nije inaktiviran formulacijom i da je formulacija fiziološki kompatibilna i tolerabilna sa putem primene. Videti takođe Baldrick P. "Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance." Regul. Toxicol Pharmacol. 32(2):210-8 (2000), Wang W. "Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals." Int. J. Pharm. 203(1-2): 1-60 (2000), Charman WN "Lipids, lipophilic drugs, and oral drug deliverysome emerging concepts." J Pharm Sci.89(8):967-78 (2000), Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA J Pharm Sci Technol. 52:238-311 (1998) i citate u njima za dodatne informacije u vezi sa formulacijama, ekscipijensima i nosačima dobro poznatim farmaceutskim hemičarima.
[0340] Terapijske formulacije prema otkriću, koje uključuju anti-CD166 antitelo i/ili anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira, kao što je u vidu neograničavajućeg primera, antitelo, konjugovano antitelo, antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira, koriste se za prevenciju, lečenje ili drugačije ublažavanje bolesti ili poremećaja povezanog sa aberantnom ekspresijom i/ili aktivnošću ciljnog molekula. Na primer, terapijske formulacije prema otkriću, koje uključuju antitelo, konjugovano antitelo, antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira, koriste se za lečenje ili drugačije ublažavanje kancera ili drugih neoplastičnih stanja, zapaljenja, zapaljenskog poremećaja, i/ili autoimunske bolesti. U nekim primerima izvođenja, kancer je solidni tumor ili hematološki malignitet kod koga se ciljni molekul eksprimira. U nekim primerima izvođenja, kancer je solidni tumor kod koga se ciljni molekul eksprimira. U nekim primerima izvođenja, kancer je hematološki malignitet kod koga se ciljni molekul eksprimira. U nekim primerima izvođenja, ciljni molekul se eksprimira na parenhimu (npr., kod kancera, deo organa ili tkiva koji je često nosilac funkcije/funkcija organa ili tkiva). U nekim primerima izvođenja, ciljni molekul eksprimira se na ćeliji, tkivu, ili organu. U nekim primerima izvođenja, ciljni molekul se eksprimira na stromi (tj., vezivni potporni okvir ćelije, tkiva, ili organa). U nekim primerima izvođenja, ciljni molekul eksprimira se na osteoblastu. U nekim primerima izvođenja, ciljni molekul eksprimira se na endotelu (vaskulatura). U nekim primerima izvođenja, ciljni molekul
1
eksprimira se na kancerskoj matičnoj ćeliji. U nekim primerima izvođenja, agens sa kojim je antitelo i/ili antitelo koje može da se aktivira konjugovano je inhibitor mikrotubula. U nekim primerima izvođenja, agens sa kojim je antitelo i/ili antitelo koje može da se aktivira konjugovano je agens koji oštećuje nukleinsku kiselinu.
[0341] Efikasnost prevencije, ublažavanja ili lečenja određuje se u skladu sa bilo kojim poznatim postupkom za dijagnostikovanje ili lečenje bolesti ili poremećaja povezanog sa ekspresijom i/ili aktivnošću ciljnog molekula, kao što je, na primer, aberantna ekspresija i/ili aktivnost ciljnog molekula. Produženje preživljavanja subjekta ili drugačije odlaganje progresije bolesti ili poremećaja povezanog sa ekspresijom i/ili aktivnošću ciljnog molekula, npr., aberantnom ekspresijom i/ili aktivnošću ciljnog molekula, kod subjekta ukazuje na to da antitelo, konjugovano antitelo, antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira daje kliničku korist.
[0342] Antitelo, konjugovano antitelo, antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira može da se primeni u obliku farmaceutskih kompozicija. Načela i razmatranja uključena u pripremu takvih kompozicija, kao i uputstva za izbor komponenti data su, na primer, u Remington: The Science And Practice Of Pharmacy 19th ed. (Alfonso R. Gennaro, et al., editors) Mack Pub. Co., Easton, Pa.: 1995; Drug Absorption Enhancement: Concepts, Possibilities, Limitations, And Trends, Harwood Academic Publishers, Langhorne, Pa., 1994; i Peptide And Protein Drug Delivery (Advances In Parenteral Sciences, Vol.4), 1991, M. Dekker, New York.
[0343] U nekim primerima izvođenja u kojima se koriste fragmenti antitela, odabran je najmanji fragment koji se specifično vezuje za vezujući domen ciljnog proteina. Na primer, na bazi sekvenci varijabilnog regiona antitela, peptidni molekuli mogu da budu konstruisani tako da vezuju ciljnu proteinsku sekvencu. Takvi peptidi mogu da budu sintetisani hemijski i/ili proizvedeni tehnologijom rekombinantne DNK. (Videti, npr., Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993)). Formulacija može takođe da sadrži više od jednog aktivnog jedinjenja prema potrebi za određenu indikaciju koja se leči, na primer, u nekim primerima izvođenja, ona sa komplementarnim aktivnostima koje ne utiču negativno jedna na drugu. U nekim primerima izvođenja, ili dodatno, kompozicija može da sadrži agens koji pojačava njegovu funkciju, kao što je, na primer, citotoksični agens, citokin, hemoterapijski agens, ili agens koji inhibira rast. Takvi molekuli su pogodno prisutni u kombinaciji u količinama koje su efikasne za namenjenu svrhu.
[0344] Aktivni sastojci mogu takođe da budu obuhvaćeni u pripremljenim mikrokapsulama, na primer, tehnikama koacervacije ili međupovršinske polimerizacije, na primer, u hidroksimetilceluloznim ili želatinskim mikrokapsulama i poli-(metilmetakrilat)
1 1
mikrokapsulama, redom, u koloidnim sistemima za isporuku leka (na primer, lipozomi, albumin mikrosfere, mikroemulzije, nano-čestice, i nanokapsule) ili u makroemulzijama.
[0345] Formulacije za upotrebu za in vivo primenu moraju da budu sterilne. Ovo se lako postiže filtracijom kroz membrane za sterilnu filtraciju.
[0346] Mogu da se pripreme preparati sa produženim oslobađanjem. Pogodni primeri preparata sa produženim oslobađanjem uključuju polupropustljive matrice čvrstih hidrofobnih polimera koje sadrže antitelo, gde su matrice u obliku uobličenih artikala, npr., filmova, ili mikrokapsula. Primeri matrica sa produženim oslobađanjem uključuju poliestre, hidrogelove (na primer, poli(2-hidroksietil-metakrilat), ili poli(vinilalkohol)), polilaktide (SAD pat. br. 3,773,919), kopolimere L-glutaminske kiseline i γ etil-L-glutamat, nedegradabilni etilen-vinil acetat, degradabilne kopolimere mlečne kiseline i glikolne kiseline kao što je LUPRON DEPOT ™ (injektabilne mikrosfere sačinjene od kopolimera mlečne kiseline i glikolne kiseline i leuprolid acetata), i poli-D-(-)-3-hidroksibuterne kiseline. Dok polimeri kao što je etilen-vinil acetat i mlečna kiselinaglikolna kiselina omogućavaju oslobađanje molekula preko 100 dana, određeni hidrogelovi oslobađaju proteine tokom kraćih vremenskih perioda.
[0347] U nekim primerima izvođenja, antitelo, konjugovano antitelo, antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira sadrži detektabilnu oznaku. Koristi se intaktno antitelo, ili njegov fragment (npr., Fab, scFv, ili F(ab)2). Pojam "obeležen", u smislu probe ili antitela, namenjen je da obuhvati direktno obeležavanje probe ili antitela kuplovanjem (tj., fizičkim spajanjem) detektabilne supstance za probu ili antitelo, kao i indirektno obeležavanje probe ili antitela reaktivnošću sa drugim reagensom koji je direktno obeležen. Primeri indirektnog obeležavanja uključuju detekciju primarnog antitela upotrebom fluorescentno-obeleženog sekundarnog antitela i obeležavanje krajeva DNK probe biotinom tako da može da se detektuje fluorescentno-obeleženim streptavidinom. Pojam "biološki uzorak" namenjen je da uključuje tkiva, ćelije i biološke fluide izolovane iz subjekta, kao i tkiva, ćelije i fluide prisutne u telu subjekta. Prema tome, upotreba pojma "biološki uzorak", uključuje krv i frakciju ili komponentu krvi uključujući krvni serum, krvnu plazmu, ili limfu. To znači da postupak za detekciju prema otkriću može da se koristi za detekciju analita iRNK, proteina, ili genomske DNK u biološkom uzorku in vitro kao i in vivo. Na primer, in vitro tehnike za detekciju analita iRNK uključuju Northern hibridizaciju i in situ hibridizacije. In vitro tehnike za detekciju proteinskog analita uključuju enzimski vezane imunosorbentne testove (ELISA), Western blot-ove, imunoprecipitacije, imunohemijsko bojenje, i imunofluorescenciju. In vitro tehnike za detekciju analita genomske DNK uključuju Southern hibridizacije. Procedure za sprovođenje imunoloških testova opisane su, na primer u "ELISA: Theory and Practice: Methods in Molecular Biology", Vol. 42, J. R. Crowther (Ed.) Human Press, Totowa, NJ, 1995;
1 2
"Immunoassay", E. Diamandis and T. Christopoulus, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1996; i "Practice and Theory of Enzyme Immunoassays", P. Tijssen, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1985. Osim toga, in vivo tehnike za detekciju proteinskog analita uključuju uvođenje u telo subjekta obeleženog antitela protiv proteinskog analita. Na primer, antitelo može da bude obeleženo radioaktivnim markerom čije prisustvo i lokacija u telu subjekta mogu da se detektuju standardnim tehnikama vizualizacije.
[0348] Antitela, konjugovana antitela, antitela koja mogu da se aktiviraju i/ili konjugovana antitela koja mogu da se aktiviraju prema otkriću su takođe korisna u različitim dijagnostičkim i profilaktičkim formulacijama. U jednom primeru izvođenja, antitelo, konjugovano antitelo, antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira primenjuje se kod pacijenata koji nose rizik od razvoja jednog ili više od gore pomenutih poremećaja. Predispozicija pacijenta ili organa za jedan ili više od gore pomenutih poremećaja može da se odredi upotrebom genotipskih, seroloških ili biohemijskih markera.
[0349] U nekim primerima izvođenja prema otkriću, antitelo, konjugovano antitelo, antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira primenjuje se kod osoba kojima je dijagnostikovana klinička indikacija povezana sa jednim ili više od gore pomenutih poremećaja. Nakon dijagnoze, antitelo, konjugovano antitelo, antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira primenjuje se za ublažavanje ili reverziju dejstava kliničke indikacije.
[0350] Antitelo, konjugovano antitelo, antitelo koje može da se aktivira, i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira prema otkriću takođe je korisno u detekciji ciljnog molekula u uzorcima uzetim od pacijenta i prema tome je takođe korisno kao dijagnostičko sredstvo. Na primer, antitela i/ili antitela koja mogu da se aktiviraju, i njihove konjugovane verzije, prema otkriću koriste se u in vitro testovima, npr., ELISA, za detekciju nivoa ciljnog molekula u uzorku uzetom od pacijenta.
[0351] U jednom primeru izvođenja, antitelo, konjugovano antitelo, antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira prema otkriću je imobilisano na čvrstoj podlozi (npr., bunarčić/bunarčići mikrotitarske ploče). Imobilisano antitelo, konjugovano antitelo, antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira služi kao antitelo koje hvata bilo koji ciljni molekul koji može da bude prisutan u ispitivanom uzorku. Pre dovođenja u kontakt imobilisanog antitela i/ili antitela koje može da se aktivira, i/ili njihovih konjugovanih verzija, sa uzorkom uzetim od pacijenta, čvrsta podloga se ispira i tretira agensom za blokiranje kao što je protein mleka ili albumin da bi se sprečila nespecifična adsorpcija analita.
[0352] Zatim se bunarčići tretiraju ispitivanim uzorkom za koji se sumnja da sadrži antigen, ili rastvorom koji sadrži standardnu količinu antigena. Takav uzorak je, npr., uzorak seruma
1
subjekta za koga se sumnja da ima nivo cirkulišućeg antigena koji se smatra dijagnostičkim za patologiju. Posle ispiranja ispitivanog uzorka ili standarda, čvrsta podloga se tretira drugim antitelom koje je detektabilno obeleženo. Obeleženo drugo antitelo služi kao antitelo za detekciju. Nivo detektabilne oznake se meri, i koncentracija ciljnog antigena u ispitivanom uzorku određuje se poređenjem sa standardnom krivom razvijenom iz standardnih uzoraka.
[0353] Jasno je da je na osnovu rezultata dobijenih upotrebom antitela i antitela koja mogu da se aktiviraju prema otkriću, i njihovih konjugovanih verzija, u in vitro dijagnostičkom testu, moguće odrediti stadijum bolesti kod subjekta na osnovu nivoa ekspresije ciljnog antigena. Za datu bolest, uzorci krvi se uzimaju od subjekata kod kojih su dijagnostikovani različiti stadijumi bolesti, i/ili se uzimaju na različitim tačkama terapijskog lečenja bolesti. Upotrebom populacije uzoraka koji pružaju statistički značajne rezultate za svaki stadijum progresije ili terapije, određuje se opseg koncentracija antigena koji se može smatrati karakterističnim za svaki stadijum.
[0354] Antitelo, konjugovano antitelo, antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira može takođe da se koristi u dijagnostičkim postupcima i/ili postupcima za vizualizaciju. U nekim primerima izvođenja, takvi postupci su in vitro postupci. U nekim primerima izvođenja, takvi postupci su in vivo postupci. U nekim primerima izvođenja, takvi postupci su in situ postupci. U nekim primerima izvođenja, takvi postupci su ex vivo postupci. Na primer, antitela koja mogu da se aktiviraju koja imaju CM koji može da se enzimski otcepi mogu da se koriste za detekciju prisustva ili odsustva enzima koji može da otcepi CM. Takva antitela koja mogu da se aktiviraju mogu da se koriste u dijagnostici, koja može da uključuje in vivo detekciju (npr., kvalitativnu ili kvantitativnu) enzimske aktivnosti (ili, u nekim primerima izvođenja, okruženja sa povećanim redukcionim potencijalom kao što je ono koje može da obezbedi redukciju disulfidne veze) putem izmerenog nakupljanja aktiviranih antitela (tj., antitela koja rezultuju iz cepanja antitela koje može da se aktivira) u datoj ćeliji ili tkivu datog organizma-domaćina. Takvo nakupljanje aktiviranih antitela ukazuje ne samo na to da tkivo eksprimira enzimsku aktivnost (ili povećani redukcioni potencijal u zavisnosti od prirode CM) već i da tkivo eksprimira ciljni molekul za koji se aktivirano antitelo vezuje.
[0355] Na primer, CM može da bude odabran tako da bude supstrat za najmanje jednu proteazu nađenu na mestu tumora, na mestu virusne ili bakterijske infekcije na biološki ograničenom mestu (npr., kao što je u apscesu, u organu, i slično), i slično. AB može da bude ono koje vezuje ciljni antigen. Upotrebom postupaka koji su ovde opisani, ili kada je pogodno, postupaka poznatih stručnjaku u ovoj oblasti, detektabilna oznaka (npr., fluorescentna oznaka ili radioaktivna oznaka ili radioaktivni obeleživač) može da bude konjugovana sa AB ili drugim regionom antitela i/ili antitela koje može da se aktivira. Pogodne detektabilne oznake razmatraju
1 4
se u kontekstu gornjih metoda skrininga i dodatni specifični primeri su dati u tekstu ispod. Upotrebom AB specifičnog za protein ili peptid obolelog stanja, zajedno sa najmanje jednom proteazom čija aktivnost je povišena u obolelom tkivu od interesa, antitela koja mogu da se aktiviraju će ispoljiti povećanu stopu vezivanja za obolelo tkivo u odnosu na tkiva gde enzim specifičan za CM nije prisutan na detektabilnom nivou ili je prisutan na nižem nivou nego u obolelom tkivu ili je neaktivan (npr., u obliku zimogena ili u kompleksu sa inhibitorom). Budući da se mali proteini i peptidi brzo uklanjaju iz krvi pomoću sistema bubrežne filtracije, i budući da enzim specifičan za CM nije prisutan na detektabilnom nivou (ili je prisutan na nižim nivoima u neobolelim tkivima ili je prisutan u neaktivnoj konformaciji), nakupljanje aktiviranih antitela u obolelom tkivu je pojačano u odnosu na neobolela tkiva.
[0356] U drugom primeru, antitela koja mogu da se aktiviraju mogu da se koriste za detekciju prisustva ili odsustva agensa za cepanje u uzorku. Na primer, kada antitela koja mogu da se aktiviraju sadrže CM podložan cepanju pomoću enzima, antitela koja mogu da se aktiviraju mogu da se koriste za detekciju (bilo kvalitativnu ili kvantitativnu) prisustva enzima u uzorku. U drugom primeru, kada antitela koja mogu da se aktiviraju sadrže CM podložan cepanju pomoću redukcionog agensa, antitela koja mogu da se aktiviraju mogu da se koriste za detekciju (bilo kvalitativnu ili kvantitativnu) prisustva redukujućih uslova u uzorku. Da bi se olakšala analiza u ovim postupcima, antitela koja mogu da se aktiviraju mogu da budu detektabilno obeležena, i mogu da budu vezana za podlogu (npr., čvrstu podlogu, kao što je pločica ili perla). Detektabilna oznaka može da bude smeštena na delu antitela koje može da se aktivira koji nije oslobođen nakon cepanja, na primer, detektabilna oznaka može da bude kvenčovana fluorescentna oznaka ili druga oznaka koja nije detektabilna dok se ne dogodi cepanje. Test može da bude izveden, na primer, dovođenjem u kontakt imobilisanih, detektabilno obeleženih antitela koja mogu da se aktiviraju sa uzorkom za koji se smatra da sadrži enzim i/ili redukcioni agens tokom vremena dovoljnog da dođe do cepanja, zatim pranjem da bi se uklonio višak uzorka i kontaminanti. Prisustvo ili odsustvo agensa za cepanje (npr., enzima ili redukcionog agensa) u uzorku se zatim procenjuje promenom u detektabilnom signalu antitela koja mogu da se aktiviraju pre dovođenja u kontakt sa uzorkom npr., prisustvo i/ili porast detektabilnog signala zahvaljujući cepanju antitela koje može da se aktivira pomoću agensa za cepanje u uzorku.
[0357] Takvi postupci za detekciju mogu da se prilagode tako da omogućavaju i detekciju prisustva ili odsustva ciljnog molekula koji može da veže AB antitela koja mogu da se aktiviraju kada je otcepljen. Tako, testovi mogu da se prilagode za procenu prisustva ili odsustva agensa za cepanje i prisustva ili odsustva ciljnog molekula od interesa. Prisustvo ili odsustvo agensa za cepanje može da bude detektovano pomoću prisustva i/ili porasta detektabilne oznake antitela koja mogu da se aktiviraju kao što je gore opisano, i prisustvo ili odsustvo ciljnog molekula
1
može da bude detektovano detekcijom kompleksa ciljni molekul-AB npr., upotrebom detektabilno obeleženog antitela protiv ciljnog molekula.
[0358] Antitela koja mogu da se aktiviraju takođe su korisna u in situ vizualizaciji za validaciju aktivacije antitela koje može da se aktivira, npr., cepanjem proteazom, i vezivanja za određeni ciljni molekul. In situ vizualizacija je tehnika koja omogućava lokalizaciju proteolitičke aktivnosti i ciljnog molekula u biološkim uzorcima kao što su ćelijske kulture ili isečci tkiva. Upotrebom ove tehnike, moguće je potvrditi i vezivanje za dati ciljni molekul i proteolitičku aktivnost na osnovu prisustva detektabilne oznake (npr., fluorescentna oznaka).
[0359] Ove tehnike su korisne sa bilo kojim zamrznutim ćelijama ili tkivom koje potiče sa obolelog mesta (npr. tumorsko tkivo) ili od zdravih tkiva. Ove tehnike su takođe korisne sa svežim uzorcima ćelija ili tkiva.
[0360] U ovim tehnikama, antitelo koje može da se aktivira obeleženo je detektabilnom oznakom. Detektabilna oznaka može da bude fluorescentna boja, (npr. fluorofor, fluorescein izotiocijanat (FITC), rodamin izotiocijanat (TRITC), Alexa Fluor® oznaka), boja u blizini infracrvenog spektra (NIR) (npr., Qdot® nanokristali), koloidni metal, hapten, radioaktivni marker, biotin i amplifikacioni reagens kao što je streptavidin, ili enzim (npr. peroksidaza rena ili alkalna fosfataza).
[0361] Detekcija oznake u uzorku koji je bio inkubiran sa obeleženim antitelom koje može da se aktivira ukazuje na to da uzorak sadrži ciljni molekul i sadrži proteazu koja je specifična za CM antitela koje može da se aktivira. U nekim primerima izvođenja, prisustvo proteaze može da se potvrdi upotrebom širokog spektra inhibitora proteaze kao što su oni koji su ovde opisani, i/ili upotrebom agensa koji je specifičan za proteazu, na primer, antitelo kao što je A11, koje je specifično za proteazu matriptazu i inhibira proteolitičku aktivnost matriptaze; Videti npr., međunarodnu objavu broj WO 2010/129609, objavljenu 11 novembra 2010. Isti pristup upotrebe širokog spektra inhibitora proteaze kao što su oni koji su ovde opisani, i/ili upotreba selektivnijeg inhibitornog agensa može da se koristi za identifikaciju proteaze koja je specifična za CM antitela koje može da se aktivira. U nekim primerima izvođenja, prisustvo ciljnog molekula može da se potvrdi upotrebom agensa koji je specifičan za ciljni molekul, npr., drugo antitelo, ili detektabilna oznaka može da se stavi u kompeticiju sa neobeleženim ciljnim molekulom. U nekim primerima izvođenja, neobeleženo antitelo koje može da se aktivira može da se koristi, sa detekcijom obeleženim sekundarnim antitelom ili kompleksnijim detekcionim sistemom.
[0362] Slične tehnike su korisne i za in vivo vizualizaciju kod koje detekcija fluorescentnog signala kod subjekta, npr., sisara, uključujući čoveka, ukazuje na to da obolelo mesto sadrži ciljni molekul i sadrži proteazu koja je specifična za CM antitela koje može da se aktivira.
1
[0363] Ove tehnike su korisne i u kompletima i/ili kao reagensi za detekciju, identifikaciju ili karakterizaciju aktivnosti proteaze u raznim ćelijama, tkivima, i organizmima na osnovu proteaza-specifičnog CM u antitelu koje može da se aktivira.
[0364] Otkriće obezbeđuje postupke za upotrebu antitela i/ili antitela koja mogu da se aktiviraju u različitim dijagnostičkim i/ili profilaktičkim indikacijama. Na primer, otkriće obezbeđuje postupke za detekciju prisustva ili odsustva agensa za cepanje i ciljnog molekula od interesa kod subjekta ili u uzorku pomoću (i) dovođenja u kontakt subjekta ili uzorka sa antitelom koje može da se aktivira, pri čemu antitelo koje može da se aktivira sadrži maskirajući fragment (MM), fragment koji može da se otcepi (CM) koji je odvojen agensom za cepanje, npr., proteazom, i antigen-vezujući domen ili njegov fragment (AB) koji specifično vezuje ciljni molekul od interesa, gde antitelo koje može da se aktivira u stanju kada nije podvrgnuto cepanju, neaktiviranom stanju, sadrži sledeći strukturni raspored od N-terminalnog kraja ka C-terminalnom kraju: MM-CM-AB ili AB-CM-MM; (a) gde je MM peptid koji inhibira vezivanje AB za ciljni molekul, i gde MM nema aminokiselinsku sekvencu prirodnog vezujućeg partnera AB i nije modifikovani oblik prirodnog vezujućeg partnera AB; i (b) gde, u stanju kada nije podvrgnuto cepanju, neaktiviraom stanju, MM interferira sa specifičnim vezivanjem AB za ciljni molekul, a u stanju kada je podvrgnuto cepanju, aktiviranom stanju, MM ne interferira ili kompetira sa specifičnim vezivanjem AB za ciljni molekul; i (ii) merenja nivoa aktiviranog antitela koje može da se aktivira kod subjekta ili u uzorku, pri čemu detektabilni nivo aktiviranog antitela koje može da se aktivira kod subjekta ili u uzorku ukazuje na to da je agens za cepanje i ciljni molekul prisutan kod subjekta ili u uzorku, i gde izostanak detektabilnog nivoa aktiviranog antitela koje može da se aktivira kod subjekta ili u uzorku ukazuje na to da su agens za cepanje, ciljni molekul ili oba, i agens za cepanje i ciljni molekul, odsutni i/ili nisu u dovoljnoj meri prisutni kod subjekta ili u uzorku. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira je antitelo koje može da se aktivira sa kojim je terapijski agens konjugovan. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira nije konjugovano sa agensom. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira sadrži detektabilnu oznaku. U nekim primerima izvođenja, detektabilna oznaka je smeštena na AB. U nekim primerima izvođenja, merenje nivoa antitela koje može da se aktivira kod subjekta ili u uzorku postiže se upotrebom sekundarnog reagensa koji se specifično vezuje za aktivirano antitelo, pri čemu reagens sadrži detektabilnu oznaku. U nekim primerima izvođenja, sekundarni reagens je antitelo koje sadrži detektabilnu oznaku.
[0365] Otkriće obezbeđuje i postupke za detekciju prisustva ili odsustva agensa za cepanje kod subjekta ili u uzorku pomoću (i) dovođenja u kontakt subjekta ili uzorka sa antitelom koje može da se aktivira u prisustvu ciljnog molekula od interesa, npr., ciljnog molekula, pri čemu antitelo
1
koje može da se aktivira sadrži maskirajući fragment (MM), fragment koji može da se otcepi (CM) koji se otcepljuje agensom za cepanje, npr., proteazom, i antigen-vezujući domen ili njegov fragment (AB) koji specifično vezuje ciljni molekul od interesa, pri čemu antitelo koje može da se aktivira u neotcepljenom, neaktiviranom stanju, sadrži sledeći strukturni raspored od N-terminalnog kraja ka C-terminalnom kraju: MM-CM-AB ili AB-CM-MM; (a) gde je MM peptid koji inhibira vezivanje AB za ciljni molekul, i gde MM nema aminokiselinsku sekvencu prirodnog vezujućeg partnera AB i nije modifikovani oblik prirodnog vezujućeg partnera AB; i (b) gde u neotcepljenom, neaktiviranom stanju, MM interferira sa specifičnim vezivanjem AB za ciljni molekul, a u otcepljenom, aktiviranom stanju, MM ne interferira ili kompetira sa specifičnim vezivanjem AB za ciljni molekul; i (ii) merenja nivoa aktiviranog antitela koje može da se aktivira kod subjekta ili u uzorku, pri čemu detektabilni nivo aktiviranog antitela koje može da se aktivira kod subjekta ili u uzorku ukazuje na to da je agens za cepanje prisutan kod subjekta ili u uzorku, i gde odsustvo detektabilnog nivoa aktiviranog antitela koje može da se aktivira kod subjekta ili u uzorku ukazuje na to da je agens za cepanje odsutan i/ili nije u dovoljnoj meri prisutan kod subjekta ili u uzorku. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira je antitelo koje može da se aktivira sa kojim je terapijski agens konjugovan. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira nije konjugovano sa agensom. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira sadrži detektabilnu oznaku. U nekim primerima izvođenja, detektabilna oznaka je smeštena na AB. U nekim primerima izvođenja, merenje nivoa antitela koje može da se aktivira kod subjekta ili u uzorku postiže se upotrebom sekundarnog reagensa koji se specifično vezuje za aktivirano antitelo, pri čemu reagens sadrži detektabilnu oznaku. U nekim primerima izvođenja, sekundarni reagens je antitelo koje sadrži detektabilnu oznaku.
[0366] Otkriće obezbeđuje i komplete za upotrebu u postupcima za detekciju prisustva ili odsustva agensa za cepanje i ciljnog molekula kod subjekta ili u uzorku, pri čemu kompleti uključuju najmanje antitelo koje može da se aktivira koje sadrži maskirajući fragment (MM), fragment koji može da se otcepi (CM) koji se otcepljuje agensom za cepanje, npr., proteazom, i antigen-vezujući domen ili njegov fragment (AB) koji specifično vezuje ciljni molekul od interesa, pri čemu antitelo koje može da se aktivira u neotcepljenom, neaktiviranom stanju, sadrži sledeći strukturni raspored od N-terminalnog kraja ka C-terminalnom kraju: MM-CM-AB ili AB-CM-MM; (a) gde je MM peptid koji inhibira vezivanje AB za ciljni molekul, i gde MM nema aminokiselinsku sekvencu prirodnog vezujućeg partnera AB i nije modifikovani oblik prirodnog vezujućeg partnera AB; i (b) gde u neotcepljenom, neaktiviranom stanju, MM interferira sa specifičnim vezivanjem AB za ciljni molekul, a u otcepljenom, aktiviranom stanju, MM ne interferira ili kompetira sa specifičnim vezivanjem AB za ciljni molekul; i (ii) merenja
1
nivoa aktiviranog antitela koje može da se aktivira kod subjekta ili u uzorku, pri čemu detektabilni nivo aktiviranog antitela koje može da se aktivira kod subjekta ili u uzorku ukazuje na to da je agens za cepanje prisutan kod subjekta ili u uzorku, i gde odsustvo detektabilnog nivoa aktiviranog antitela koje može da se aktivira kod subjekta ili u uzorku ukazuje na to da je agens za cepanje odsutan i/ili nije u dovoljnoj meri prisutan kod subjekta ili u uzorku. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira je antitelo koje može da se aktivira sa kojim je terapijski agens konjugovan. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira nije konjugovano sa agensom. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira sadrži detektabilnu oznaku. U nekim primerima izvođenja, detektabilna oznaka je smeštena na AB. U nekim primerima izvođenja, merenje nivoa antitela koje može da se aktivira kod subjekta ili u uzorku postiže se upotrebom sekundarnog reagensa koji se specifično vezuje za aktivirano antitelo, pri čemu reagens sadrži detektabilnu oznaku. U nekim primerima izvođenja, sekundarni reagens je antitelo koje sadrži detektabilnu oznaku.
[0367] Otkriće obezbeđuje i postupke za detekciju prisustva ili odsustva agensa za cepanje kod subjekta ili u uzorku pomoću (i) dovođenja u kontakt subjekta ili uzorka sa antitelom koje može da se aktivira, pri čemu antitelo koje može da se aktivira sadrži maskirajući fragment (MM), fragment koji može da se otcepi (CM) koji se otcepljuje agensom za cepanje, npr., proteazom, antigen-vezujući domen (AB) koji specifično vezuje ciljni molekul, i detektabilnu oznaku, pri čemu antitelo koje može da se aktivira u neotcepljenom, neaktiviranom stanju, sadrži sledeći strukturni raspored od N-terminalnog kraja ka C-terminalnom kraju: MM-CM-AB ili AB-CM-MM; gde je MM peptid koji inhibira vezivanje AB za ciljni molekul, i gde MM nema aminokiselinsku sekvencu prirodnog vezujućeg partnera AB i nije modifikovani oblik prirodnog vezujućeg partnera AB; pri čemu, u neotcepljenom, neaktiviranom stanju, MM interferira sa specifičnim vezivanjem AB za ciljni molekul, a u otcepljenom, aktiviranom stanju, MM ne interferira ili kompetira sa specifičnim vezivanjem AB za ciljni molekul; i pri čemu je detektabilna oznaka smeštena na delu antitela koje može da se aktivira koji se oslobađa nakon otcepljivanja CM; i (ii) merenja nivoa detektabilne oznake kod subjekta ili u uzorku, pri čemu detektabilni nivo detektabilne oznake kod subjekta ili u uzorku ukazuje na to da je agens za cepanje odsutan i/ili nije u dovoljnoj meri prisutan kod subjekta ili u uzorku i pri čemu odsustvo detektabilnog nivoa detektabilne oznake kod subjekta ili u uzorku ukazuje na to da je agens za cepanje prisutan kod subjekta ili u uzorku. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira je antitelo koje može da se aktivira sa kojim je terapijski agens konjugovan. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira nije konjugovano sa agensom. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira sadrži detektabilnu oznaku. U nekim primerima izvođenja, detektabilna oznaka je smeštena na AB. U nekim primerima izvođenja,
1
merenje nivoa antitela koje može da se aktivira kod subjekta ili u uzorku postiže se upotrebom sekundarnog reagensa koji se specifično vezuje za aktivirano antitelo, pri čemu reagens sadrži detektabilnu oznaku. U nekim primerima izvođenja, sekundarni reagens je antitelo koje sadrži detektabilnu oznaku.
[0368] Otkriće obezbeđuje i komplete za upotrebu u postupcima za detekciju prisustva ili odsustva agensa za cepanje i ciljnog molekula kod subjekta ili u uzorku, pri čemu kompleti uključuju najmanje antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira (npr., antitelo koje može da se aktivira sa kojim je konjugovan terapijski agens) koje je ovde opisano za upotrebu u dovođenju u kontakt subjekta ili biološkog uzorka i sredstva za detekciju nivoa aktiviranog antitela koje može da se aktivira i/ili konjugovanog antitela koje može da se aktivira kod subjekta ili u biološkom uzorku, pri čemu detektabilni nivo aktiviranog antitela koje može da se aktivira kod subjekta ili u biološkom uzorku ukazuje na to da su agens za cepanje i ciljni molekul prisutni kod subjekta ili u biološkom uzorku, i gde odsustvo detektabilnog nivoa aktiviranog antitela koje može da se aktivira kod subjekta ili u biološkom uzorku ukazuje na to da su agens za cepanje, ciljni molekul, ili oba, i agens za cepanje i ciljni molekul odsutni i/ili nisu u dovoljnoj meri prisutni kod subjekta ili u biološkom uzorku, tako da vezivanje ciljnog molekula i/ili cepanje antitela koje može da se aktivira pomoću proteaze ne može da se detektuje kod subjekta ili u biološkom uzorku.
[0369] Otkriće obezbeđuje i postupke za detekciju prisustva ili odsustva agensa za cepanje kod subjekta ili u uzorku pomoću (i) dovođenja u kontakt subjekta ili biološkog uzorka sa antitelom koje može da se aktivira u prisustvu ciljnog molekula, i (ii) merenja nivoa aktiviranog antitela koje može da se aktivira kod subjekta ili biološkom uzorku, pri čemu detektabilni nivo aktiviranog antitela koje može da se aktivira kod subjekta ili biološkom uzorku ukazuje na to da je agens za cepanje prisutan kod subjekta ili biološkom uzorku i pri čemu odsustvo detektabilnog nivoa aktiviranog antitela koje može da se aktivira kod subjekta ili biološkom uzorku ukazuje na to da je agens za cepanje odsutan i/ili nije prisutan kod subjekta ili u biološkom uzorku na detektabilnom nivou, tako da cepanje pomoću proteaze antitela koje može da se aktivira ne može da bude detektovano kod subjekta ili u biološkom uzorku. Takvo antitelo koje može da se aktivira uključuje maskirajući fragment (MM), fragment koji može da se otcepi (CM) koji se otcepljuje agensom za cepanje, npr., proteazom, i antigen-vezujući domen ili njegov fragment (AB) koji se specifično vezuje za ciljni molekul, pri čemu antitelo koje može da se aktivira u neotcepljenom (tj., neaktiviranom) stanju sadrži sledeći strukturni raspored od N-terminalnog kraja ka C-terminalnom kraju: MM-CM-AB ili AB-CM-MM; (a) pri čemu je MM peptid koji inhibira vezivanje AB za ciljni molekul, i pri čemu MM nema aminokiselinsku sekvencu prirodnog vezujueg partnera AB; i (b) pri čemu MM antitela koje može da se aktivira u
14
neotcepljenom stanju interferira sa specifičnim vezivanjem AB za ciljni molekul, i gde MM antitela koje može da se aktivira u otcepljenom (tj., aktiviranom) stanju ne interferira ili kompetira sa specifičnim vezivanjem AB za ciljni molekul. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira je antitelo koje može da se aktivira sa kojim je terapijski agens konjugovan. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira nije konjugovano sa agensom. U nekim primerima izvođenja, detektabilna oznaka je vezana za maskirajući fragment. U nekim primerima izvođenja, detektabilna oznaka je vezana za fragment koji može da se otcepi N-terminalno u odnosu na mesto cepanja proteazom. U nekim primerima izvođenja, jedino antigen-vezujuće mesto u AB je maskirano. U nekim primerima izvođenja gde antitelo prema otkriću ima najmanje dva antigen-vezujuća mesta, najmanje jedno antigen-vezujuće mesto je maskirano i najmanje jedno antigen-vezujuće mesto nije maskirano. U nekim primerima izvođenja sva antigen-vezujuća mesta su maskirana. U nekim primerima izvođenja, korak merenja uključuje upotrebu sekundarnog reagensa koji sadrži detektabilnu oznaku.
[0370] Otkriće obezbeđuje i komplete za upotrebu u postupcima za detekciju prisustva ili odsustva agensa za cepanje i ciljnog molekula kod subjekta ili u uzorku, pri čemu kompleti uključuju najmanje antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira kako je ovde opisano za upotrebu u dovođenju u kontakt subjekta ili biološkog uzorka sa antitelom koje može da se aktivira u prisustvu ciljnog molekula, i merenja nivoa aktiviranog antitela koje može da se aktivira kod subjekta ili u biološkom uzorku, pri čemu detektabilni nivo aktiviranog antitela koje može da se aktivira kod subjekta ili u biološkom uzorku ukazuje na to da je agens za cepanje prisutan kod subjekta ili u biološkom uzorku, i pri čemu odsustvo detektabilnog nivoa aktiviranog antitela koje može da se aktivira kod subjekta ili u biološkom uzorku ukazuje na to da je agens za cepanje odsutan i/ili nije prisutan kod subjekta ili u biološkom uzorku na detektabilnom nivou, tako da cepanje proteazom antitela koje može da se aktivira ne može da bude detektovano kod subjekta ili u biološkom uzorku. Takvo antitelo koje može da se aktivira uključuje maskirajući fragment (MM), fragment koji može da se otcepi (CM) koji se otcepljuje agensom za cepanje, npr., proteazom, i antigen-vezujući domen ili njegov fragment (AB) koji specifično vezuje ciljni molekul, pri čemu antitelo koje može da se aktivira u neotcepljenom (tj., neaktiviranom) stanju sadrži sledeći strukturni raspored od N-terminalnog kraja ka C-terminalnom kraju: MM-CM-AB ili AB-CM-MM; (a) pri čemu je MM peptid koji inhibira vezivanje AB za ciljni molekul, i pri čemu MM nema aminokiselinsku sekvencu prirodnog vezujućeg partnera AB; i (b) pri čemu MM antitela koje može da se aktivira u neotcepljenom stanju interferira sa specifičnim vezivanjem AB za ciljni molekul, i gde MM antitela koje može da se aktivira u otcepljenom (tj., aktiviranom) stanju ne interferira ili kompetira sa specifičnim vezivanjem AB za ciljni molekul. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira je antitelo koje može da se aktivira sa kojim je konjugovano terapijski agens. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira nije konjugovano sa agensom. U nekim primerima izvođenja, detektabilna oznaka je vezana za maskirajući fragment. U nekim primerima izvođenja, detektabilna oznaka je vezana za fragment koji može da se otcepi N-terminalno u odnosu na mesto cepanja proteazom. U nekim primerima izvođenja, jedino antigen-vezujuće mesto u AB je maskirano. U nekim primerima izvođenja gde antitelo prema otkriću ima najmanje dva antigen-vezujuća mesta, najmanje jedno antigenvezujuće mesto je maskirano i najmanje jedno antigen-vezujuće mesto nije maskirano. U nekim primerima izvođenja sva antigen-vezujuća mesta su maskirana. U nekim primerima izvođenja, korak merenja uključuje upotrebu sekundarnog reagensa koji sadrži detektabilnu oznaku.
[0371] Otkriće obezbeđuje i komplete za upotrebu u postupcima za detekciju prisustva ili odsustva agensa za cepanje kod subjekta ili u uzorku, pri čemu kompleti uključuju najmanje antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira kako je ovde opisano za upotrebu u dovođenju u kontakt subjekta ili biološkog uzorka i sredstva za detekciju nivoa aktiviranog antitela koje može da se aktivira i/ili konjugovang antitela koje može da se aktivira kod subjekta ili u biološkom uzorku, pri čemu antitelo koje može da se aktivira uključuje detektabilnu oznaku koja je smeštena na delu antitela koje može da se aktivira koji se oslobađa nakon otcepljivanja CM, pri čemu detektabilni nivo aktiviranog antitela koje može da se aktivira kod subjekta ili u biološkom uzorku ukazuje na to da je agens za cepanje odsutan i/ili nije u dovoljnoj meri prisutan kod subjekta ili biološkom uzorku tako da vezivanje ciljnog molekula i/ili cepanje proteazom antitela koje može da se aktivira ne može da bude detektovano kod subjekta ili u biološkom uzorku, i pri čemu odsustvo detektabilnog nivoa aktiviranog antitela koje može da se aktivira kod subjekta ili u biološkom uzorku ukazuje na to da je agens za cepanje prisutan kod subjekta ili u biološkom uzorku na detektabilnom nivou.
[0372] Otkriće obezbeđuje postupke za detekciju prisustva ili odsustva agensa za cepanje i ciljnog molekula kod subjekta ili u uzorku pomoću (i) dovođenja u kontakt subjekta ili biološkog uzorka sa antitelom koje može da se aktivira, pri čemu antitelo koje može da se aktivira uključuje detektabilnu oznaku koja je smeštena na delu antitela koje može da se aktivira koji se oslobađa nakon otcepljivanja CM i (ii) merenja nivoa aktiviranog antitela koje može da se aktivira kod subjekta ili u biološkom uzorku, pri čemu detektabilni nivo aktiviranog antitela koje može da se aktivira kod subjekta ili u biološkom uzorku ukazuje na to da su agens za cepanje, ciljni molekul ili oba, agens za cepanje i ciljni molekul, odsutni i/ili nisu u dovoljnoj meri prisutni kod subjekta ili u biološkom uzorku, tako da vezivanje ciljnog molekula i/ili cepanje antitela koje može da se aktivira proteazom ne može da bude detektovano kod subjekta ili u biološkom uzorku, i pri čemu sniženi detektabilni nivo aktiviranog antitela koje može da se aktivira kod subjekta ili u biološkom uzorku ukazuje na to da su agens za cepanje i ciljni molekul prisutni kod subjekta ili u biološkom uzorku. Sniženi nivo detektabilne oznake je, na primer, snižavanje od oko 5%, oko 10%, oko 15%, oko 20%, oko 25%, oko 30%, oko 35%, oko 40%, oko 45%, oko 50%, oko 55%, oko 60%, oko 65%, oko 70%, oko 75%, oko 80%, oko 85%, oko 90%, oko 95% i/ili oko 100%. Takvo antitelo koje može da se aktivira uključuje maskirajući fragment (MM), fragment koji može da se otcepi (CM) koji se otcepljuje agensom za cepanje, i antigen-vezujući domen ili njegov fragment (AB) koji specifično vezuje ciljni molekul, pri čemu antitelo koje može da se aktivira u neotcepljenom (tj., neaktiviranom) stanju sadrži sledeći strukturni raspored od N-terminalnog kraja ka C-terminalnom kraju: MM-CM-AB ili AB-CM-MM; (a) gde je MM peptid koji inhibira vezivanje AB za ciljni molekul, i gde MM nema aminokiselinsku sekvencu prirodnog vezujućeg partnera AB; i (b) gde MM antitela koje može da se aktivira u neotcepljenom stanju interferira sa specifičnim vezivanjem AB za ciljni molekul, i gde MM antitela koje može da se aktivira u otcepljenom (tj., aktiviranom) stanju ne interferira ili kompetira sa specifičnim vezivanjem AB za ciljni molekul. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira je antitelo koje može da se aktivira sa kojim je konjugovan terapijski agens. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira nije konjugovano sa agensom. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira sadrži detektabilnu oznaku. U nekim primerima izvođenja, detektabilna oznaka je smeštena na AB. U nekim primerima izvođenja, merenje nivoa antitela koje može da se aktivira kod subjekta ili u uzorku postiže se upotrebom sekudarnog reagensa koji se specifično vezuje za aktivirano antitelo, pri čemu reagens sadrži detektabilnu oznaku. U nekim primerima izvođenja, sekundarni reagens je antitelo koje sadrži detektabilnu oznaku.
[0373] Otkriće obezbeđuje i komplete za upotrebu u postupcima za detekciju prisustva ili odsustva agensa za cepanje i ciljnog molekula kod subjekta ili u uzorku, pri čemu kompleti uključuju najmanje antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira kako je ovde opisano za upotrebu u dovođenju u kontakt subjekta ili biološkog uzorka i sredstva za detekciju nivoa aktiviranog antitela koje može da se aktivira i/ili konjugovanog antitela koje može da se aktivira kod subjekta ili u biološkom uzorku, pri čemu detektabilni nivo aktiviranog antitela koje može da se aktivira kod subjekta ili u biološkom uzorku ukazuje na to da su agens za cepanje, ciljni molekul ili oba, agens za cepanje i ciljni molekul odsutni i/ili nisu u dovoljnoj meri prisutni kod subjekta ili u biološkom uzorku, tako da vezivanje ciljnog molekula i/ili cepanje antitela koje može da se aktivira proteazom ne može da bude detektovano kod subjekta ili u biološkom uzorku, i pri čemu sniženi detektabilni nivo aktiviranog antitela koje može da se aktivira kod subjekta ili biološkom uzorku ukazuje na to da su agens za cepanje i ciljni molekul prisutni kod subjekta ili u biološkom uzorku. Sniženi nivo detektabilne oznake je,
14
na primer, sniženje od oko 5%, oko 10%, oko 15%, oko 20%, oko 25%, oko 30%, oko 35%, oko 40%, oko 45%, oko 50%, oko 55%, oko 60%, oko 65%, oko 70%, oko 75%, oko 80%, oko 85%, oko 90%, oko 95% i/ili oko 100%.
[0374] Otkriće obezbeđuje i postupke za detekciju prisustva ili odsustva agensa za cepanje kod subjekta ili u uzorku pomoću (i) dovođenja u kontakt subjekta ili biološkog uzorka sa antitelom koje može da se aktivira, pri čemu antitelo koje može da se aktivira uključuje detektabilnu oznaku koja je smeštena na delu antitela koje može da se aktivira koji se oslobađa nakon otcepljivanja CM; i (ii) merenja nivoa detektabilne oznake kod subjekta ili u biološkom uzorku, pri čemu detektabilni nivo detektabilne oznake kod subjekta ili u biološkom uzorku ukazuje na to da je agens za cepanje odsutan i/ili nije prisutan kod subjekta ili u biološkom uzorku na detektabilnom nivou, tako da cepanje antitela koje može da se aktivira proteazom ne može da bude detektovano kod subjekta ili u biološkom uzorku, i pri čemu sniženi detektabilni nivo detektabilne oznake kod subjekta ili u biološkom uzorku ukazuje na to da je agens za cepanje prisutan kod subjekta ili u biološkom uzorku. Sniženi nivo detektabilne oznake je, na primer, sniženje od oko 5%, oko 10%, oko 15%, oko 20%, oko 25%, oko 30%, oko 35%, oko 40%, oko 45%, oko 50%, oko 55%, oko 60%, oko 65%, oko 70%, oko 75%, oko 80%, oko 85%, oko 90%, oko 95% i/ili oko 100%. Takvo antitelo koje može da se aktivira uključuje maskirajući fragment (MM), fragment koji može da se otcepi (CM) koji se otcepljuje agensom za cepanje, i antigenvezujući domen ili njegov fragment (AB) koji specifično vezuje ciljni molekul, pri čemu antitelo koje može da se aktivira u neotcepljenom (tj., neaktiviranom) stanju sadrži sledeći strukturni raspored od N-terminalnog kraja ka C-terminalnom kraju: MM-CM-AB ili AB-CM-MM; (a) gde je MM peptid koji inhibira vezivanje AB za ciljni molekul, i gde MM nema aminokiselinsku sekvencu prirodnog vezujućeg partnera AB; i (b) gde MM antitela koje može da se aktivira u neotcepljenom stanju interferira sa specifičnim vezivanjem AB za ciljni molekul, i gde MM antitela koje može da se aktivira u otcepljenom (tj., aktiviranom) stanju ne interferira ili kompetira sa specifičnim vezivanjem AB za ciljni molekul. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira je antitelo koje može da se aktivira sa kojim je konjugovan terapijski agens. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira nije konjugovano sa agensom. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira sadrži detektabilnu oznaku. U nekim primerima izvođenja, detektabilna oznaka je smeštena na AB. U nekim primerima izvođenja, merenje nivoa antitela koje može da se aktivira kod subjekta ili u uzorku postiže se upotrebom sekundarnog reagensa koji se specifično vezuje za aktivirano antitelo, pri čemu reagens sadrži detektabilnu oznaku. U nekim primerima izvođenja, sekundarni reagens je antitelo koje sadrži detektabilnu oznaku.
[0375] Otkriće obezbeđuje i komplete za upotrebu u postupcima za detekciju prisustva ili odsustva agensa za cepanje od interesa kod subjekta ili u uzorku, pri čemu kompleti uključuju najmanje antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira kao što je ovde opisano za upotrebu u dovođenju u kontakt subjekta ili biološkog uzorka i sredstva za detekciju nivoa aktiviranog antitela koje može da se aktivira i/ili konjugovanog antitela koje može da se aktivira kod subjekta ili u biološkom uzorku, pri čemu antitelo koje može da se aktivira uključuje detektabilnu oznaku koja je smeštena na delu antitela koje može da se aktivira koji se oslobađa nakon otcepljivanja CM, pri čemu detektabilni nivo detektabilne oznake kod subjekta ili u biološkom uzorku ukazuje na to da su agens za cepanje, ciljni molekul, ili oba, agens za cepanje i ciljni molekul odsutni i/ili nisu u dovoljnoj meri prisutni kod subjekta ili u biološkom uzorku, tako da vezivanje ciljnog molekula i/ili cepanje antitela koje može da se aktivira proteazom ne može da bude detektovano kod subjekta ili u biološkom uzorku, i pri čemu sniženi detektabilni nivo detektabilne oznake kod subjekta ili u biološkom uzorku ukazuje na to da su agens za cepanje i ciljni molekul prisutni kod subjekta ili u biološkom uzorku. Sniženi nivo detektabilne oznake je, na primer, sniženje od oko 5%, oko 10%, oko 15%, oko 20%, oko 25%, oko 30%, oko 35%, oko 40%, oko 45%, oko 50%, oko 55%, oko 60%, oko 65%, oko 70%, oko 75%, oko 80%, oko 85%, oko 90%, oko 95% i/ili oko 100%.
[0376] U nekim primerima izvođenja ovih postupaka i kompleta, antitelo koje može da se aktivira uključuje detektabilnu oznaku. U nekim primerima izvođenja ovih postupaka i kompleta, detektabilna oznaka uključuje agens za vizualizaciju, kontrastni agens, enzim, fluorescentnu oznaku, hromofor, boju, jedan ili više metalnih jona, ili oznaku na bazi liganda. U nekim primerima izvođenja ovih postupaka i kompleta, agens za vizualizaciju sadrži radioizotop. U nekim primerima izvođenja ovih postupaka i kompleta, radioizotop je indijum ili tehnecijum. U nekim primerima izvođenja ovih postupaka i kompleta, kontrastni agens sadrži jod, gadolinijum ili gvožđe oksid. U nekim primerima izvođenja ovih postupaka i kompleta, enzim sadrži peroksidazu rena, alkalnu fosfatazu, ili β-galaktozidazu. U nekim primerima izvođenja ovih postupaka i kompleta, fluorescentna oznaka sadrži žuti fluorescentni protein (YFP), cijan fluorescentni protein (CFP), zeleni fluorescentni protein (GFP), modifikovani crveni fluorescentni protein (mRFP), crveni fluorescentni protein tdimer2 (RFP tdimer2), HCRED, ili derivat europijuma. U nekim primerima izvođenja ovih postupaka i kompleta, luminescentna oznaka sadrži derivat N-metilakridijuma. U nekim primerima izvođenja ovih postupaka, oznaka sadrži Alexa Fluor® oznaku, kao što je Alex Fluor® 680 ili Alexa Fluor® 750. U nekim primerima izvođenja ovih postupaka i kompleta, oznaka na bazi liganda sadrži biotin, avidin, streptavidin ili jedan ili više haptena.
14
[0377] U nekim primerima izvođenja ovih postupaka i kompleta, subjekat je sisar. U nekim primerima izvođenja ovih postupaka i kompleta, subjekat je čovek. U nekim primerima izvođenja, subjekat je nehumani sisar, kao što je nehumani primat, domaća životinja (npr., mačka, pas, konj), životinja gajena na farmi, radna životinja, ili životinja iz zoološkog vrta. U nekim primerima izvođenja, subjekat je glodar.
[0378] U nekim primerima izvođenja ovih postupaka, postupak je in vivo postupak. U nekim primerima izvođenja ovih postupaka, postupak je in situ postupak. U nekim primerima izvođenja ovih postupaka, postupak je ex vivo postupak. U nekim primerima izvođenja ovih postupaka, postupak je in vitro postupak.
[0379] U nekim primerima izvođenja, in situ vizualizacija i/ili in vivo vizualizacija su korisne u postupcima za identifikaciju pacijenata koje treba lečiti. Na primer, kod in situ vizualizacije, antitela koja mogu da se aktiviraju koriste se za skrining uzoraka pacijenata za identifikovanje onih pacijenata koji imaju odgovarajuću proteazu/proteaze i ciljni molekul/molekule na odgovarajućoj lokaciji, npr., na mestu tumora.
[0380] U nekim primerima izvođenja in situ vizualizacija se koristi za identifikovanje ili drugačije izdvajanje populacije pacijenata pogodne za lečenje antitelom koje može da se aktivira prema otkriću. Na primer, pacijenti sa pozitivnim rezultatom testa na oba, ciljni molekul (npr., ciljni molekul) i proteazu koja cepa supstrat na fragment koji može da se otcepi (CM) ispitivanog antitela koje može da se aktivira (npr., akumulacija aktiviranog antitela na obolelom mestu) identifikuju se kao pogodni kandidati za lečenje takvim antitelom koje može da se aktivira koje sadrži takav CM. Slično, pacijenti sa negativnim rezultatom testa na bilo koji ili oba od ciljnog molekula (npr., ciljnog molekula) i proteaze koja cepa supstrat u CM u antitelu koje može da se aktivira koje se ispituje upotrebom ovih postupaka, mogu da budu identifikovani kao pogodni kandidati za drugi oblik terapije. U nekim primerima izvođenja, takvi pacijenti sa negativnim rezultatom testa u odnosu na prvo antitelo koje može da se aktivira mogu da budu ispitani sa drugim antitelima koja mogu da se aktiviraju koja sadrže drugačije CM dok se ne identifikuje pogodno antitelo koje može da se aktivira za lečenje (npr., antitelo koje može da se aktivira koje sadrži CM koji se otcepljuje u telu pacijenta na obolelom mestu). U nekim primerima izvođenja, kod pacijenta se zatim primenjuju terapijski efikasne količine antitela koje može da se aktivira za koje je pacijent imao pozitivan rezultat testa.
[0381] U nekim primerima izvođenja in vivo vizualizacija se koristi za idetifikaciju ili drugačije izdvajanje populacije pacijenata pogodnih za lečenje antitelom koje može da se aktivira prema otkriću. Na primer, pacijenti koji imaju pozitivan rezultat testa za oba, ciljni molekul (npr., ciljni molekul) i proteazu koja cepa supstrat na fragment koji može da se otcepi (CM) ispitivanog antitela koje može da se aktivira (npr., akumulacija aktiviranog antitela na obolelom mestu)
14
identifikuju se kao pogodni kandidati za lečenje takvim antitelom koje može da se aktivira koje sadrži takav CM. Slično, pacijenti koji imaju negativan rezultat testa mogu da budu identifikovani kao pogodni kandidati za drugi oblik terapije. U nekim primerima izvođenja, takvi pacijenti koji imaju negativan rezultat testa u pogledu prvog antitela koje može da se aktivira mogu da budu ispitani na druga antitela koja mogu da se aktiviraju koja sadrže drugačije CM dok se ne identifikuje pogodno antitelo koje može da se aktivira za lečenje (npr., antitelo koje može da se aktivira koje sadrži CM koji se otcepljuje u telu pacijenta na obolelom mestu). U nekim primerima izvođenja, kod pacijenta se tada primenjuju terapijski efikasne količine antitela koje može da se aktivira za koje je pacijent imao pozitivan rezultat testa.
[0382] U nekim primerima izvođenja postupaka i kompleta, postupak ili komplet se koristi za identifikaciju ili drugačije izdvajanje populacije pacijenata pogodnih za lečenje antitelom koje može da se aktivira prema otkriću. Na primer, pacijenti koji imaju pozitivan rezultat testa za oba, ciljni molekul (npr., ciljni molekul) i proteazu koja cepa supstrat na fragment koji može da se otcepi (CM) antitela koje može da se aktivira ispitivanog ovim postupcima identifikuju se kao pogodni kandidati za lečenje takvim antitelom koje može da se aktivira koje sadrži takav CM. Slično, pacijenti koji imaju negativan rezultat testa za oba, ciljne molekule (npr., ciljni molekul) i proteazu koja cepa supstrat u CM u antitelu koje može da se aktivira ispitivanom upotrebom ovih postupaka mogu da se identifikuju kao pogodni kandidati za drugi oblik terapije. U nekim primerima izvođenja, takvi pacijenti mogu da se ispitaju na druga antitela koja mogu da se aktiviraju dok se ne identifikuje antitelo koje može da se aktivira pogodno za lečenje (npr., antitelo koje može da se aktivira koje sadrži CM koji se otcepljuje u telu pacijenta na obolelom mestu). U nekim primerima izvođenja, pacijenti koji imaju negativan rezultat testa za bilo koji od ciljnih molekula (npr., ciljni molekul) identifikuju se kao pogodni kandidati za lečenje takvim antitelom koje može da se aktivira koje sadrži takav CM. U nekim primerima izvođenja, pacijenti koji imaju negativan rezultat testa bilo koji od ciljnih molekula (npr., ciljni molekul) identifikuju se kao kandidati koji nisu pogodni za lečenje takvim antitelom koje može da se aktivira koji sadrži takav CM. U nekim primerima izvođenja, takvi pacijenti mogu da se ispitaju na druga antitela koja mogu da se aktiviraju dok se ne identifikuje antitelo koje može da se aktivira pogodno za lečenje (npr., antitelo koje može da se aktivira koje sadrži CM koji se otcepljuje u telu pacijenta na obolelom mestu). U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira je antitelo koje može da se aktivira sa kojim je konjugovan terapijski agens. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira nije konjugovano sa agensom. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira sadrži detektabilnu oznaku. U nekim primerima izvođenja, detektabilna oznaka je smeštena na AB. U nekim primerima izvođenja, merenje nivoa antitela koje može da se aktivira kod subjekta ili u uzorku postiže se
14
upotrebom sekundarnog reagensa koji se specifično vezuje za aktivirano antitelo, pri čemu reagens sadrži detektabilnu oznaku. U nekim primerima izvođenja, sekundarni reagens je antitelo koje sadrži detektabilnu oznaku.
[0383] U nekim primerima izvođenja, postupak ili komplet se koristi za identifikaciju ili drugačije izdvajanje populacije pacijenata pogodnih za lečenje antitelom koje može da se aktivira i/ili konjugovanim antitelom koje može da se aktivira (npr., antitelo koje može da se aktivira konjugovano sa terapijskim agensom) usmerenim protiv ciljnog molekula, prema otkriću, praćenu lečenjem primenom tog antitela koje može da se aktivira i/ili konjugovanog antitela koje može da se aktivira kod subjekta kome je to potrebno. Na primer, pacijenti koji imaju pozitivan rezultat testa za oba, ciljne molekule (npr., ciljni molekul) i proteazu koja cepa supstrat na fragment koji može da se otcepi (CM) antitela koje može da se aktivira i/ili konjugovanog antitela koje može da se aktivira ispitivanog u ovim postupcima identifikuju se kao pogodni kandidati za lečenje takvim antitelom i/ili takvim konjugovanim antitelom koje može da se aktivira koje sadrži takav CM, i kod pacijenta se tada primenjuju terapijski efikasne količine ispitivanog antitela koje može da se aktivira i/ili konjugovanog antitela koje može da se aktivira. Slično, pacijenti koji imaju negativan rezultat testa za bilo koji, ili oba, od ciljnog molekula (npr., ciljni molekul) i proteaze koja cepa supstrat u CM u antitelu koje može da se aktivira ispitivanog upotrebom ovih postupaka mogu da budu identifikovani kao pogodni kandidati za drugi oblik terapije. U nekim primerima izvođenja, takvi pacijenti mogu da budu ispitani na drugo antitelo i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira dok se ne identifikuje pogodno antitelo i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira za lečenje (npr., antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira koje sadrži CM koji se otcepljuje u telu pacijenta na obolelom mestu). U nekim primerima izvođenja, kod pacijenta se zatim primenjuju terapijski efikasne količine antitela koje može da se aktivira i/ili konjugovanog antitela koje može da se aktivira za koje je pacijent imao pozitivan rezultat testa.
[0384] U nekim primerima izvođenja ovih postupaka i kompleta, MM je peptid koji ima dužinu od oko 4 do 40 aminokiselina. U nekim primerima izvođenja ovih postupaka i kompleta, antitelo koje može da se aktivira sadrži linkerski peptid, pri čemu je linkerski peptid smešten između MM i CM. U nekim primerima izvođenja ovih postupaka i kompleta, antitelo koje može da se aktivira sadrži linkerski peptid, pri čemu je linkerski peptid smešten između AB i CM. U nekim primerima izvođenja ovih postupaka i kompleta, antitelo koje može da se aktivira sadrži prvi linkerski peptid (L1) i drugi linkerski peptid (L2), pri čemu je prvi linkerski peptid smešten između MM i CM, a drugi linkerski peptid je smešten između AB i CM. U nekim primerima izvođenja ovih postupaka i kompleta, svaki od L1 i L2 je peptid dužine od oko 1 do 20 aminokiselina, i pri čemu svaki od L1 i L2 ne mora da bude isti linker. U nekim primerima
14
izvođenja ovih postupaka i kompleta, jedan ili oba od L1 i L2 sadrže glicin-serinski polimer. U nekim primerima izvođenja ovih postupaka i kompleta, najmanje jedan od L1 i L2 sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od (GS)n, (GSGGS)n (SEQ ID NO: 1) i (GGGS)n (SEQ ID NO: 2), gde je n ceo broj od najmanje jedan. U nekim primerima izvođenja ovih postupaka i kompleta, najmanje jedan od L1 i L2 sadrži aminokiselinsku sekvencu formule (GGS)n, gde je n ceo broj od najmanje jedan. U nekim primerima izvođenja ovih postupaka i kompleta, najmanje jedan od L1 i L2 sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od Gly-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO: 3), Gly-Gly-Ser-Gly-Gly (SEQ ID NO: 4), Gly-Ser-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO: 5), Gly-Ser-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 6), Gly-Gly-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO: 7), i Gly-Ser-Ser-Ser-Gly (SEQ ID NO: 8).
[0385] U nekim primerima izvođenja ovih postupaka i kompleta, AB sadrži sekvencu antitela ili fragmenta antitela odabranu od unakrsno reaktivnih sekvenci antitela prikazanih u ovom dokumentu. U nekim primerima izvođenja ovih postupaka i kompleta, AB sadrži Fab fragment, scFv ili jednolančano antitelo (scAb).
[0386] U nekim primerima izvođenja ovih postupaka i kompleta, agens za cepanje je proteaza koja je ko-lokalizovana kod subjekta ili u uzorku sa ciljnim molekulom i CM je polipeptid koji funkcioniše kao supstrat za proteazu, gde proteaza cepa CM u antitelu koje može da se aktivira kada je antitelo koje može da se aktivira izloženo proteazi. U nekim primerima izvođenja ovih postupaka i kompleta, CM je polipeptid dužine do 15 aminokiselina. U nekim primerima izvođenja ovih postupaka i kompleta, CM je kuplovan sa N-terminalnim krajem AB. U nekim primerima izvođenja ovih postupaka i kompleta, CM je kuplovan sa C-terminalnim krajem AB. U nekim primerima izvođenja ovih postupaka i kompleta, CM je kuplovan sa N-terminalnim krajem VL lanca AB.
[0387] Antitela, konjugovana antitela, antitela koja mogu da se aktiviraju i/ili konjugovana antitela koja mogu da se aktiviraju prema otkriću koriste se u dijagnostičkim i profilaktičkim formulacijama. U jednom primeru izvođenja, antitelo koje može da se aktivira primenjuje se kod pacijenata koji imaju rizik od razvoja jednog ili više od gore navedenog zapaljenja, zapaljenskih poremećaja, kancera ili drugih poremećaja.
[0388] Predispozicija pacijenta ili organa za jedan ili više od gore navedenih poremećaja može da se odredi upotrebom genotipskih, seroloških ili biohemijskih markera.
[0389] U nekim primerima izvođenja prema otkriću, antitelo, konjugovano antitelo, antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira primenjuje se kod osoba kod kojih je dijagnostikovana klinička indikacija povezana sa jednim ili više od gore pomenutih poremećaja. Nakon dijagnoze, antitelo, konjugovano antitelo, antitelo koje može da se aktivira
14
i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira primenjuje sw da ublažiti ili preokrene dejstva kliničke indikacije.
[0390] Antitela, konjugovana antitela, antitela koja mogu da se aktiviraju i/ili konjugovana antitela koja mogu da se aktiviraju prema otkriću takođe su korisna u detekciji ciljnog molekula u uzorcima uzetim od pacijenta i prema tome su korisna kao dijagnostici. Na primer, antitela, konjugovana antitela, antitela koja mogu da se aktiviraju i/ili konjugovana antitela koja mogu da se aktiviraju prema otkriću koriste se u in vitro testovima, npr., ELISA, za dtekciju nivoa ciljnih molekula u uzorku uzetom od pacijenta.
[0391] U jednom primeru izvođenja, antitelo i/ili antitelo koje može da se aktivira prema otkriću imobilisano je na čvrstoj podlozi (npr., bunarčić/bunarčići mikrotitarske ploče). Imobilisano antitelo i/ili antitelo koje može da se aktivira služi kao antitelo za hvatanje za bilo koji ciljni molekul koji može da bude prisutan u ispitivanom uzorku. Pre dovođenja u kontakt imobilisanog antitela i/ili antitela koje može da se aktivira sa uzorkom uzetim od pacijenta, čvrsta podloga se ispira i tretira blokirajućim agensom kao što je protein mleka ili albumin za prevenciju nespecifične adsorpcije analita.
[0392] Zatim se bunarčići tretiraju ispitivanim uzorkom za koji se sumnja da sadrži antigen, ili rastvorom koji sadrži standardnu količinu antigena. Takav uzorak je, npr., uzorak seruma subjekta za koga se sumnja da ima nivo cirkulišućeg antigena koji se smatra dijagnostičkim za patologiju. Posle ispiranja ispitivanog uzorka ili standarda, čvrsta podloga se tretira drugim antitelom koje je detektabilno obeleženo. Obeleženo drugo antitelo služi kao antitelo za detekciju. Nivo detektabilne oznake se meri, i koncentracija ciljnog antigena u ispitivanom uzorku određuje se poređenjem sa standardnom krivom razvijenom iz standardnih uzoraka.
[0393] Jasno je da je na osnovu rezultata dobijenih upotrebom antitela i/ili antitela koja mogu da se aktiviraju prema otkriću u in vitro dijagnostičkom testu, moguće odrediti stadijum bolesti kod subjekta na osnovu nivoa ekspresije ciljnog antigena. Za datu bolest, uzorci krvi se uzimaju od subjekata kod kojih su dijagnostikovani različiti stadijumi bolesti, i/ili se uzimaju na različitim tačkama terapijskog lečenja bolesti. Upotrebom populacije uzoraka koji pružaju statistički značajne rezultate za svaki stadijum progresije ili terapije, određuje se opseg koncentracija antigena koji se može smatrati karakterističnim za svaki stadijum.
[0394] Antitela, konjugovana antitela, antitela koje mogu da se aktiviraju i/ili konjugovana antitela koje mogu da se aktiviraju mogu takođe da se koriste u dijagnostičkim postupcima i/ili postupcima za vizualizaciju. U nekim primerima izvođenja, takvi postupci su in vitro postupci. U nekim primerima izvođenja, takvi postupci su in vivo postupci. U nekim primerima izvođenja, takvi postupci su in situ postupci. U nekim primerima izvođenja, takvi postupci su ex vivo postupci. Na primer, antitela koja mogu da se aktiviraju koja imaju CM koji može da se otcepi
1
enzimski mogu da se koriste za detekciju prisustva ili odsustva enzima koji može da otcepi CM. Takva antitela koja mogu da se aktiviraju mogu da se koriste u dijagnostici, koja može da uključuje in vivo detekciju (npr., kvalitativnu ili kvantitativnu) enzimske aktivnosti (ili, u nekim primerima izvođenja, okruženja sa povećanim redukcionim potencijalom kao što je ono koje može da obezbedi redukciju disulfidne veze) putem izmerenog nakupljanja aktiviranih antitela (tj., antitela koja rezultuju iz cepanja antitela koje može da se aktivira) u datoj ćeliji ili tkivu datog organizma-domaćina. Takvo nakupljanje aktiviranih antitela ukazuje ne samo na to da tkivo eksprimira enzimsku aktivnost (ili povećani redukcioni potencijal u zavisnosti od prirode CM), već i da tkivo eksprimira ciljni molekul za koji se aktivirano antitelo vezuje.
[0395] Na primer, CM može da bude odabran tako da bude proteazni supstrat za proteazu nađenu na mestu tumora, na mestu virusne ili bakterijske infekcije na biološki ograničenom mestu (npr., kao što je u apscesu, u organu, i slično), i slično. AB može da bude ono koje vezuje ciljni antigen. Upotrebom postupaka koji su ovde opisani, ili kada je pogodno, postupaka poznatih stručnjaku u ovoj oblasti, detektabilna oznaka (npr., fluorescentna oznaka ili radioaktivna oznaka ili radioaktivni obeleživač) može da bude konjugovana sa AB ili drugim regionom antitela i/ili antitela koje može da se aktivira. Pogodne detektabilne oznake razmatraju se u kontekstu gornjih metoda skrininga i dodatni specifični primeri su dati u tekstu ispod. Upotrebom AB specifičnog za protein ili peptid stanja bolesti, zajedno sa proteazom čija aktivnost je povišena u obolelom tkivu od interesa, antitela koja mogu da se aktiviraju će ispoljiti povećanu stopu vezivanja za obolelo tkivo u odnosu na tkiva gde enzim specifičan za CM nije prisutan na detektabilnom nivou, ili je prisutan na nižem nivou nego u obolelom tkivu, ili je neaktivan (npr., u obliku zimogena ili u kompleksu sa inhibitorom). Budući da se mali proteini i peptidi brzo uklanjaju iz krvi pomoću sistema bubrežne filtracije, i budući da enzim specifičan za CM nije prisutan na detektabilnom nivou (ili je prisutan na nižim nivoima u neobolelim tkivima ili je prisutan u neaktivnoj konformaciji), nakupljanje aktiviranih antitela u obolelom tkivu je pojačano u odnosu na neobolela tkiva.
[0396] U drugom primeru, antitela koja mogu da se aktiviraju mogu da se koriste za detekciju prisustva ili odsustva agensa za cepanje u uzorku. Na primer, kada antitela koja mogu da se aktiviraju sadrže CM podložan cepanju pomoću enzima, antitela koja mogu da se aktiviraju mogu da se koriste za detekciju (bilo kvalitativnu ili kvantitativnu) prisustva enzima u uzorku. U drugom primeru, kada antitela koja mogu da se aktiviraju sadrže CM podložan cepanju pomoću redukcionog agensa, antitela koja mogu da se aktiviraju mogu da se koriste za detekciju (bilo kvalitativnu ili kvantitativnu) prisustva redukujućih uslova u uzorku. Da bi se olakšala analiza u ovim postupcima, antitela koja mogu da se aktiviraju mogu da budu detektabilno obeležena, i mogu da budu vezana za podlogu (npr., čvrstu podlogu, kao što je pločica ili perla). Detektabilna
1 1
oznaka može da bude smeštena na delu antitela koje može da se aktivira koji nije oslobođen nakon cepanja, na primer, detektabilna oznaka može da bude kvenčovana fluorescentna oznaka ili druga oznaka koja nije detektabilna dok se ne dogodi cepanje. Test može da bude izveden, na primer, dovođenjem u kontakt imobilisanih, detektabilno obeleženih antitela koja mogu da se aktiviraju sa uzorkom za koji se smatra da sadrži enzim i/ili redukcioni agens tokom vremena dovoljnog da dođe do cepanja, zatim pranjem da bi se uklonio višak uzorka i kontaminanti. Prisustvo ili odsustvo agensa za cepanje (npr., enzima ili redukcionog agensa) u uzorku se zatim procenjuje promenom u detektabilnom signalu antitela koja mogu da se aktiviraju pre dovođenja u kontakt sa uzorkom npr., prisustvo i/ili porast detektabilnog signala zahvaljujući cepanju antitela koje može da se aktivira pomoću agensa za cepanje u uzorku.
[0397] Takvi postupci za detekciju mogu da se prilagode tako da omogućavaju i detekciju prisustva ili odsustva ciljnog molekula koji može da veže AB antitela koja mogu da se aktiviraju kada je otcepljen. Tako, testovi mogu da se prilagode za procenu prisustva ili odsustva agensa za cepanje i prisustva ili odsustva ciljnog molekula od interesa. Prisustvo ili odsustvo agensa za cepanje može da bude detektovano pomoću prisustva i/ili porasta detektabilne oznake antitela koja mogu da se aktiviraju kao što je gore opisano, i prisustvo ili odsustvo ciljnog molekula može da bude detektovano detekcijom kompleksa ciljni molekul-AB npr., upotrebom detektabilno obeleženog antitela protiv ciljnog molekula.
[0398] Antitela koja mogu da se aktiviraju takođe su korisna u in situ vizualizaciji za validaciju aktivacije antitela koje može da se aktivira, npr., cepanjem proteazom, i vezivanja za određeni ciljni molekul. In situ vizualizacija je tehnika koja omogućava lokalizaciju proteolitičke aktivnosti i ciljnog molekula u biološkim uzorcima kao što su ćelijske kulture ili isečci tkiva. Upotrebom ove tehnike, moguće je potvrditi i vezivanje za dati ciljni molekul i proteolitičku aktivnost na osnovu prisustva detektabilne oznake (npr., fluorescentna oznaka).
[0399] Ove tehnike su korisne sa bilo kojim zamrznutim ćelijama ili tkivom koje potiče sa obolelog mesta (npr. tumorsko tkivo) ili od zdravih tkiva. Ove tehnike su takođe korisne sa svežim uzorcima ćelija ili tkiva.
[0400] U ovim tehnikama, antitelo koje može da se aktivira obeleženo je detektabilnom oznakom. Detektabilna oznaka može da bude fluorescentna boja, (npr. fluorescein izotiocijanat (FITC), rodamin izotiocijanat (TRITC), boja u blizini infracrvenog spektra (NIR) (npr., Qdot® nanokristali), koloidni metal, hapten, radioaktivni marker, biotin i amplifikacioni reagens kao što je streptavidin, ili enzim (npr. peroksidaza rena ili alkalna fosfataza).
[0401] Detekcija oznake u uzorku koji je bio inkubiran sa obeleženim antitelom koje može da se aktivira ukazuje na to da uzorak sadrži ciljni molekul i sadrži proteazu koja je specifična za CM antitela koje može da se aktivira. U nekim primerima izvođenja, prisustvo proteaze može da se
1 2
potvrdi upotrebom širokog spektra inhibitora proteaze kao što su oni koji su ovde opisani, i/ili upotrebom agensa koji je specifičan za proteazu, na primer, antitelo kao što je A11, koje je specifično za proteazu matriptazu i inhibira proteolitičku aktivnost matriptaze; videti npr., međunarodnu objavu broj WO 2010/129609, objavljenu 11 novembra 2010. Isti pristup upotrebe širokog spektra inhibitora proteaze kao što su oni koji su ovde opisani, i/ili upotreba selektivnijeg inhibitornog agensa može da se koristi za identifikaciju proteaze koja je specifična za CM antitela koje može da se aktivira. U nekim primerima izvođenja, prisustvo ciljnog molekula može da se potvrdi upotrebom agensa koji je specifičan za ciljni molekul, npr., drugo antitelo, ili detektabilna oznaka može da se stavi u kompeticiju sa neobeleženim ciljnim molekulom. U nekim primerima izvođenja, neobeleženo antitelo koje može da se aktivira može da se koristi, sa detekcijom obeleženim sekundarnim antitelom ili kompleksnijim detekcionim sistemom.
[0402] Slične tehnike su korisne i za in vivo vizualizaciju kod koje detekcija fluorescentnog signala kod subjekta, npr., sisara, uključujući čoveka, ukazuje na to da obolelo mesto sadrži ciljni molekul i sadrži proteazu koja je specifična za CM antitela koje može da se aktivira.
[0403] Ove tehnike su korisne i u kompletima i/ili kao reagensi za detekciju, identifikaciju ili karakterizaciju aktivnosti proteaze u raznim ćelijama, tkivima, i organizmima na osnovu proteaza-specifičnog CM u antitelu koje može da se aktivira.
[0404] U nekim primerima izvođenja, in situ vizualizacija i/ili in vivo vizualizacija su korisne u postupcima za identifikaciju pacijenata koje treba lečiti. Na primer, kod in situ vizualizacije, antitela koja mogu da se aktiviraju koriste se za skeniranje uzoraka pacijenata za identifikovanje onih pacijenata koji imaju odgovarajuću proteazu/proteaze i ciljni molekul/molekule na odgovarajućoj lokaciji, npr., na mestu tumora.
[0405] U nekim primerima izvođenja in situ vizualizacija se koristi za identifikaciju ili drugačije izdvajanje populacije pacijenata pogodnih za lečenje antitelom koje može da se aktivira prema otkriću. Na primer, pacijenti koji imaju pozitivan rezultat testa i za ciljni molekul i za proteazu koja cepa supstrat u fragmentu koji može da se otcepi (CM) ispitivanog antitela koje može da se aktivira (npr., nakupljanje aktiviranog antitela na obolelom mestu) identifikuju se kao pogodni kandidati za lečenje takvim antitelom koje može da se aktivira koje sadrži takav CM. Slično, pacijenti koji imaju negativan rezultat testa za bilo koji, ili oba od ciljnog molekula i proteaze koja cepa supstrat u CM u antitelu koje može da se aktivira koje se ispituje ovim postupcima identifikuju se kao pogodni kandidati za drugi oblik terapije (tj., nisu pogodni za lečenje ispitivanim antitelom koje može da se aktivira). U nekim primerima izvođenja, takvi pacijenti koji imaju negativan rezultat testa u pogledu prvog antitela koje može da se aktivira mogu da budu ispitani na druga antitela koja mogu da se aktiviraju koja sadrže drugačije CM dok se ne
1
identifikuje antitelo koje može da se aktivira pogodno za lečenje (npr., antitelo koje može da se aktivira koje sadrži CM koji se otcepljuje u telu pacijenta na obolelom mestu).
[0406] U nekim primerima izvođenja in vivo vizualizacija se koristi za identifikaciju ili drugačije izdvajanje populacije pacijenata pogodnih za lečenje antitelom koje može da se aktivira prema otkriću. Na primer, pacijenti koji imaju pozitivan rezultat testa i za ciljni molekul i za proteazu koja cepa supstrat u fragmentu koji može da se otcepi (CM) ispitivanog antitela koje može da se aktivira (npr., nakupljanje aktiviranog antitela na obolelom mestu) identifikuju se kao pogodni kandidati za lečenje takvim antitelom koje može da se aktivira koje sadrži takav CM. Slično, pacijenti koji imaju negativan rezultat testa identifikuju se kao pogodni kandidati za drugi oblik terapije (tj., nisu pogodni za lečenje ispitivanim antitelom koje može da se aktivira). U nekim primerima izvođenja, takvi pacijenti koji imaju negativan rezultat testa u pogledu prvog antitela koje može da se aktivira mogu da budu ispitani na druga antitela koja mogu da se aktiviraju koja sadrže drugačije CM dok se ne identifikuje antitelo koje može da se aktivira pogodno za lečenje (npr., antitelo koje može da se aktivira koje sadrži CM koji se otcepljuje u telu pacijenta na obolelom mestu).
Farmaceutske kompozicije
[0407] Antitela, konjugovana antitela, antitela koja mogu da se aktiviraju i/ili konjugovana antitela koja mogu da se aktiviraju prema otkriću (ovde označena i kao "aktivna jedinjenja"), i njihovi derivati, fragmenti, analozi i homolozi, mogu da budu ugrađeni u farmaceutske kompozicije pogodne za primenu. Takve kompozicije tipično sadrže antitelo, konjugovano antitelo, antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira i farmaceutski prihvatljiv nosač. Kako se ovde koristi, pojam "farmaceutski prihvatljiv nosač" namenjen je da uključuje bilo koji i sve rastvarače, disperzione medijume, premaze, antibakterijske i antigljivične agense, izotonične agense i agense koji odlažu apsorpciju, i slično, kompatibilne sa farmaceutskom primenom. Pogodni nosači su opisani u najnovijem izdanju Remington's Pharmaceutical Sciences, standardnog referentnog teksta u ovoj oblasti. Pogodni primeri takvih nosača ili razblaživača uključuju, ali nisu ograničeni na, vodu, fiziološki rastvor, Ringerove rastvore, dekstrozni rastvor, i 5% humani serumski albumin. Mogu da se koriste i lipozomi i nevodeni vehikulumi kao što su fiksna ulja. Upotreba takvih medijuma i agenasa za farmaceutski aktivne supstance dobro je poznata u ovoj oblasti. Osim ako je bilo koji konvencionalni medijum ili agens nespojiv sa aktivnim jedinjenjem, njegova upotreba u kompozicijama je predviđena. Dodatna aktivna jedinjenja mogu takođe da budu uključena u kompozicije.
1 4
[0408] Farmaceutska kompozicija prema otkriću je formulisana da bude kompatibilna sa predviđenim putem njene primene. Primeri puteva primene uključuju parenteralnu, npr., intravensku, intradermalnu, subkutanu, oralnu (npr., inhalaciju), transdermalnu (tj., topikalnu), transmukoznu, i rektalnu primenu. Rastvori ili suspenzije koje se koriste za parenteralnu, intradermalnu, ili subkutanu primenu mogu da uključuju sledeće komponente: sterilni razblaživač kao što je voda za injekcije, fiziološki rastvor, fiksna ulja, polietilen glikoli, glicerin, propilen glikol ili drugi sintetski rastvarači; antibakterijske agense kao što je benzil alkohol ili metil parabeni; antioksidanse kao što je askorbinska kiselina ili natrijum bisulfit; helirajuće agense kao što je etilendiamintetrasirćetna kiselina (EDTA); pufere kao što su acetati, citrati ili fosfati, i agense za podešavanje toničnosti kao što je natrijum hlorid ili dekstroza. pH može da se podesi kiselinama ili bazama, kao što je hlorovodonična kiselina ili natrijum hidroksid. Parenteralni preparat može da bude obuhvaćen u ampoulama, špricevima za jednokratnu upotrebu ili multidoznim bočicama od stakla ili plastike.
[0409] Farmaceutske kompozicije pogodne za injektabilnu upotrebu uključuju sterilne vodene rastvore (kada su rastvorljive u vodi) ili disperzije i sterilne prahove za magistralnu pripremu sterilnih injektabilnih rastvora ili disperzija. Za intravensku primenu, pogodni nosači uključuju fiziološki rastvor, bakteriostatsku vodu, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, N.J.) ili fosfatno puferisani fiziološki rastvor (PBS). U svim slučajevima, kompozicija mora da bude sterilna i treba da bude fluidna u stepenu koji omogućava laku primenu špricem. Mora da bude stabilna pod uslovima proizvodnje i skladištenja i mora da bude konzervirana protiv kontaminirajućeg dejstva mikroorganizama kao što su bakterije i gljive. Nosač može da bude rastvarač ili medijum za dispergovanje koji sadrži, na primer, vodu, etanol, poliol (na primer, glicerol, propilen glikol, i tečni polietilen glikol, i slično), i njihove pogodne smeše. Ispravna fluidnost može da se održava, na primer, upotrebom premaza kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzije i upotrebom surfaktanata. Sprečavanje dejstva mikroorganizama može da se postigne različitim antibakterijskim i antigljivičnim agensima, na primer, parabenima, hlorobutanolom, fenolom, askorbinskom kiselinom, timerosalom, i slično. U nekim primerima izvođenja, biće poželjno uključiti izotonične agense, na primer, šećere, polialkohole kao što je manitol, sorbitol, natrijum hlorid u kompoziciju. Produžena apsorpcija injektabilnih kompozicija može da se postigne uključivanjem u kompoziciju agensa koji odlaže apsorpciju, na primer, aluminijum monostearata i želatina.
[0410] Sterilni injektabilni rastvori mogu da se pripreme uključivanjem aktivnog jedinjenja u potrebnoj količni u odgovarajući rastvarač sa jednim ili kombinacijom sastojaka nabrojanih u tekstu iznad, po potrebi, praćenim sterilnom filtracijom. Uopšteno, disperzije se pripremaju uključivanjem aktivnog jedinjenja u sterilni vehikulum koji sadrži bazni disperzioni medijum i
1
potrebne druge sastojke od gore nabrojanih. U slučaju sterilnih prahova za pripremu sterilnih injektabilnih rastvora, postupci za pripremu su sušenje vakuumom i sušenje zamrzavanjem koje daje prah aktivnog sastojka i bilo kog dodatnog željenog sastojka iz njihovog prethodno sterilno filtrovanog rastvora.
[0411] Oralne kompozicije uopšteno uključuju inertni razblaživač ili jestivi nosač. One mogu da budu zatvorene u želatinskim kapsulama ili komprimovane u tablete. U svrhu oralne terapijske primene, aktivno jedinjenje može da bude ugrađeno sa ekscipijentima i upotrebljeno u obliku tableta, troha, ili kapsula. Oralne kompozicije mogu da budu pripremljene i upotrebom fluidnog nosača za upotrebu kao tečnost za ispiranje usta, gde se jedinjenje u fluidnom nosaču primenjuje oralno i promućka i ispljune ili proguta. Farmaceutski kompatibilni vezivni agensi, i/ili adjuvansi mogu da budu uključeni kao deo kompozicije. Tablete, pilule, kapsule, trohe i slično mogu da sadrže bilo koji od sledećih sastojaka, ili jedinjenja slične prirode: vezivo kao što je mikrokristalna celuloza, guma tragakant ili želatin; ekscipijent kao što je skrob ili laktoza, gens za raspadanje kao što je alginska kiselina, Primogel, ili kukuruzni skrob; lubrikans kao što je magnezijum stearat ili Sterotes; sredstvo za klizanje kao što je koloidni silicijum dioksid; zaslađivač kao što je saharoza ili saharin; ili aroma kao što je pepermint, metil salicilat, ili aroma pomorandže.
[0412] Za primenu inhalacijom, jedinjenja se isporučuju u obliku aerosolnog spreja iz posude pod pritiskom ili raspršivača koji sadrži pogodan propelant, npr., gas kao što je ugljen dioksid, ili nebulizera.
[0413] Sistemska primena može takođe da bude transmukozna ili transdermalna. Kod transmukozne ili transdermalne primene, u formulaciji se koriste penetranti koji odgovaraju barijeri kroz koju treba da se prodre. Takvi penetranti su uopšteno poznati u ovoj oblasti, i uključuju, na primer, za transmukoznu primenu, deterdžente, žučne soli, i derivate fuzidinske kiseline. Transmukozna primena može da se postigne upotrebom nazalnih sprejeva ili supozitorija. Za transdermalnu primenu, aktivna jedinjenja su formulisana u masti, meleme, gelove, ili kreme kao što je opšte poznato u ovoj oblasti.
[0414] Jedinjenja mogu da se pripreme i u obliku supozitorija (npr., sa uobičajenim bazama za supozitorije kao što su kakao buter i drugi gliceridi) ili retencione klizme za rektalnu isporuku.
[0415] U jednom primeru izvođenja, aktivna jedinjenja su pripremljena sa nosačima koji će zaštititi jedinjenje od brze eliminacije iz tela, kao što je formulacija sa kontrolisanim oslobađanjem, uključujući implante i mikroinkapsulirane sisteme za isporuku. Mogu da se koriste biorazgradivi, biokompatibilni polimeri, kao što je etilen vinil acetat, polianhidridi, poliglikolna kiselina, kolagen, poliortoestri i polilaktična kiselina. Postupci za pripremu takvih formulacija biće očigledni stručnjacima u ovoj oblasti. Materijali mogu da se dobiju i
1
komercijalno od Alza Corporation and Nova Pharmaceuticals, Inc. Lipozomske suspenzije (uključujući lipozome usmerene na inficirane ćelije sa monoklonskim antitelima na virusne antigene) mogu da se koriste i kao farmaceutski prihvatljivi nosači. One mogu da se pripreme prema postupcima poznatim stručnjacima u ovoj oblasti, na primer, kao što je opisano u SAD patentu br.4,522,811.
[0416] Posebno je pogodno formulisati oralne ili parenteralne kompozicije u jediničnim doznim oblicima za jednostavnost primene i ujednačenost doze. Jedinični dozni oblik, kako se ovde koristi, odnosi se na fizički odvojene jedinice pogodne kao jedinstvene doze za lečenje subjekta; pri čemu svaka jedinica sadrži unapred određenu količinu aktivnog jedinjenja za koju je izračunato da proizvodi željeno terapijsko dejstvo zajedno sa potrebnim famaceutskim nosačem. Specifikacija za jedinične dozne oblike prema otkriću je uslovljena i direktno zavisi od jedinstvenih karakteristika aktivnog jedinjenja i određenog terapijskog dejstva koje treba da se postigne, i ograničenja svojstvenih oblasti dobijanja jedinjenja, takvih kao aktivno jedinjenje za lečenje subjekata.
[0417] Farmaceutske kompozicije mogu se staviti u kontejner, pakovanje ili dozator zajedno sa uputstvima za primenu.
[0418] Pronalazak će dalje biti opisan u sledećim primerima.
Primeri
PRIMER 1. Karakterizacija anti-CD166 antitela
[0419] Ovde prikazane studije su razvijene za procenu vezivanja anti-CD166 antitela prema otkriću.
[0420] Vezivanje različitih anti-CD166 antitela prema otkriću potvrđeno je ELISA testom (slika 1). Ispitivana su antitela protiv CD166 čoveka koja sadrže sledeće VH i VL sekvence:
1
[0421] M9 mAb je dobijeno upotrebom tehnologije mišjeg hibridoma, a preostale sekvence su generisane humanizovanjem sekvence M9 mAb. Stručnjaci sa uobičajenim znanjem u ovoj oblasti će znati da je sposobnost razvijanja anti-CD166 antitela dugo bila otežana, jer istraživači nisu mogli da stvore hibridome i/ili antitela u miševima u koje je uvođen CD166 čoveka. Nasuprot tome, anti-CD166 antitela prikazana u ovom dokumentu generisana su protiv CD166 čoveka u miševima.
[0422] Antitelo protiv CD166-M9 antitelo koje sadrži VH sekvence SEQ ID NO: 119, VL sekvence SEQ ID NO: 120 korišćeno je kao pozitivna kontrola, a antitelo za kontrolu izotipa korišćeno je kao negativna kontrola.
[0423] Kao što je prikazano na slici 1, sva humanizovana anti-CD166 antitela pokazala su vezivanje za CD166 uporedivo sa M9. Upotrebom standardnog protokola za ELISA test, protein CD166 čoveka je apsorbovan na ploče za ELISA test i zatim inkubiran sa naznačenom koncentracijom antitela. Vezano antitelo je detektovano upotrebom sekundarnog antitela protiv FAB čoveka sa peroksidazom.
PRIMER 2. Pronalazak maskirajućih fragmenata
[0424] Studije obezbeđene u ovom dokumentu razvijene su za identifikovanje i karakterizaciju maskirajućih fragmenata za upotrebu u anti-CD166 antitelima koja mogu da se aktiviraju prema otkriću.
[0425] Antitelo miša Mab M9 protiv CD166 (VH sekvence SEQ ID NO: 119, VL sekvence SEQ ID NO: 120) upotrebljeno je za skrining biblioteke peptida X15sa ograničenjem količine cisteina sa ukupnim diverzitetom od 3x1011 , u kojoj je X bilo koja aminokiselina, upotrebom postupka sličnog onom opisanom u PCT međunarodnoj objavi broj WO 2010/081173, objavljenoj 15. jula 2010. Skrining se sastojao od dva ciklusa MACS i četiri ciklusa FACS sortiranja. Postupak sortiranja prikazan je na slici 2.
[0426] Pojedinačni klonovi iz populacija M2F1.1, M2F2.1, M2F3.1, i M2F4.1 su sekvencirani i rezultati su prikazani u tabeli 9.
Tabela 9. Sekvence maskirajućih peptida:
1
1
1
[0427] Maskirajući fragmenti su podvrgnuti skraćivanju i skeniranju alanina da bi se generisale familije antitela koja mogu da se aktiviraju sa različitim efikasnostima maskiranja. Sekvence su prikazane ispod u tabeli 10. Slovo "a" označava položaj alanina koji je ugrađen kao deo skeniranja. Ekvivalentan je sa "A".
Tabela 10. Skraćivanje i skeniranje alanina maskirajućih peptida
1 1
[0428] Ovi maskirajući peptidi su korišćeni za generisanje anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju prema otkriću. Sekvence za određena od ovih anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju prikazane su ispod u tabeli 11. U nekim primerima izvođenja, ova anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju uključuju fragment koji može da se otcepi 2001 (ISSGLLSGRSDNH; SEQ ID NO: 70), fragment koji može da se otcepi 3001 (AVGLLAPPGGLSGRSDNH; SEQ ID NO: 76), fragment koji može da se otcepi 2007 (ISSGLLSGRSDIH; SEQ ID NO: 342), fragment koji može da se otcepi 2008 (ISSGLLSGRSDQH; SEQ ID NO: 343), fragment koji može da se otcepi 2011 (ISSGLLSGRSDNP; SEQ ID NO: 346), fragment koji može da se otcepi 2012 (ISSGLLSGRSANP; SEQ ID NO: 347), fragment koji može da se otcepi 2013 (ISSGLLSGRSANI; SEQ ID NO: 348), fragment koji može da se otcepi 3007 (AVGLLAPPGGLSGRSDIH; SEQ ID NO: 350), fragment koji može da se otcepi 3008 (AVGLLAPPGGLSGRSDQH; SEQ ID NO: 351), fragment koji može da se otcepi 3011 (AVGLLAPPGGLSGRSDNP; SEQ ID NO: 354), fragment koji može da se otcepi 3012
1 2
(AVGLLAPPGGLSGRSANP; SEQ ID NO: 355), ili fragment koji može da se otcepi 3013 (AVGLLAPPGGLSGRSANI; SEQ ID NO: 356), kao što je naznačeno.
[0429] Dok određene ispod prikazane sekvence uključuju spejsersku sekvencu SEQ ID NO: 305, stručnjaci u ovoj oblasti će znati da anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju prema otkriću mogu da uključuju bilo koju pogodnu spejsersku sekvencu, kao što je, na primer, spejserska sekvenca izabrana iz grupe koja se sastoji od QGQSGQG (SEQ ID NO: 305), QGQSGQ (SEQ ID NO: 88), QGQSG (SEQ ID NO: 306), QGQS (SEQ ID NO: 307), QGQ (SEQ ID NO: 308), QG (SEQ ID NO: 309), GQSGQG (SEQ ID NO: 359), QSGQG (SEQ ID NO: 360), SGQG (SEQ ID NO: 361), GQG (SEQ ID NO: 362), G ili Q. U nekim primerima izvođenja, anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju prema otkriću mogu da nemaju spejsersku sekvencu spojenu sa svojim N-terminalnim krajem.
Tabela 11. Sekvence anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju
1
14
1 [spejser (SEQ ID NO: 481)] [huCD166Lc1_7614.6_3001 (SEQ ID NO: 315)] Nukleotidna sekvenca
1
1 [spejser (SEQ ID NO: 305)] [huCD166Lc1_7614.6_3001 VL domen (SEQ ID NO: 368)] Aminokiselinska sekvenca
[spejser (SEQ ID NO: 305)] [huCD166Lc1_7614.6_3007 VL domen (SEQ ID NO: 378)] Aminokiselinska sekvenca
1
1
[spejser (SEQ ID NO: 305)] [HuCD166Lc1_7614.6_2012 VL domen (SEQ ID NO: 398)] Aminokiselinska sekvenca
1
11
[spejser (SEQ ID NO: 305)] [huCD166Lc1_7614.8_3007 VL domen (SEQ ID NO: 418)] Aminokiselinska sekvenca
1 2
1
[spejser (SEQ ID NO: 305)] [HuCD166Lc1_7614.8_2012 VL domen (SEQ ID NO: 438)] Aminokiselinska sekvenca
1 4
[spejser (SEQ ID NO: 305)] [huCD166Lc1_7614.8_3013 (SEQ ID NO: 448)] Aminokiselinska sekvenca
1
[spejser (SEQ ID NO: 305)] [huCD166Lc1_7614_3001 VL domen (SEQ ID NO: 458)] Aminokiselinska sekvenca
1
1
PRIMER 3. Generisanje anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju
[0430] Studije koje su ovde date razvijene su za generisanje anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju prema otkriću.
[0431] Generisana su anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju sa različitim efikasnostima maskiranja (tj., merom sposobnosti MM antitela koje može da se aktivira da blokira vezivanje AB antitela koje može da se aktivira za njegov ciljni molekul). Peptidi 16522 i 7614 su mutirani podvrgavanjem skraćivanju i skeniranju alanina kao što je opisano u primeru 2, i ove varijante maskirajućih peptida korišćene su za generisanje familija anti-CD166 antitela koja mogu da se
1
aktiviraju u opsegu umnoška sposobnosti maskiranja. Sposobnost anti-CD166 antitela CD166 M9 vK1/HcB (VH sekvence SEQ ID NO: 121, VL sekvence SEQ ID NO: 123) i različitih anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju da vežu CD166 čoveka procenjivana je upotrebom ELISA testa za vezivanje CD166 (slika 3A, 3B). Ispitivana anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju uključivala su sekvence varijabilnog teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 121, sekvenca varijabilnog lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 123, fragment koji može da se otcepi (CM) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu ISSGLLSGRSDNH (SEQ ID NO: 70) ovde označenu kao supstrat 2001, i jedan od maskirajućih fragmenata prikazanih u tabeli 10. Cele sekvence su prikazane iznad u tabeli 11.
[0432] Upotrebom standardnog protokola ELISA testa, protein CD166 čoveka je apsorbovan na ploče za ELISA test i zatim inkubiran sa naznačenom koncentracijom antitela ili antitela koje može da se aktivira. Vezano antitelo ili antitelo koje može da se aktivira detektovano je sekundarnim antitelom protiv FAB čoveka sa peroksidazom. Kratak prikaz ilustrativnih prividnih in vitro konstanti disocijacije (Kd) antitela koja mogu da se aktiviraju predmetnog pronalaska za CD166 polipeptid određenih ELISA testom prikazan je ispod u tabeli 17, kao i odgovarajući porast Kd u odnosu na parentalno anti-CD166 M9 antitelo (vk-1/HcB). Osim za parentalalno anti-CD166 M9 antitelo, maskirajući fragment za svako antitelo koje može da se aktivira je takav, kao što je navedeno, kako je ovde opisano, a sekvenca supstrata bila je 2001 (ISSGLLSGRSDNH (SEQ ID NO: 70)).
Tabela 17: Prividne konstante disocijacije anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju prema ELISA testu
1
PRIMER 4. Aktivacija anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju
[0433] Studije koje su ovde date razvijene su za procenu aktivacije anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju.
[0434] Slika 4 je grafikon koji prikazuje sposobnost različitih anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju prema otkriću da vežu CD166 čoveka kada se proteolitički aktiviraju. Kao što je prikazano na slici 4, anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju ponovo uspostavljaju vezivanje antitela kada se proteolitički aktiviraju. Vezivanje anti-CD166 antitela (huM9 HcC/vk-1; VH sekvence SEQ ID NO: 122, VL sekvence SEQ ID NO: 123), različitih anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju prema otkriću, i uPA aktiviranih anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju procenjivana je upotrebom vezivanje CD166 pomoću ELISA testa. Ispitivana anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju uključivala su sekvence varijabilnog teškog lanca SEQ ID NO: 122, sekvence varijabilnog lakog lanca SEQ ID NO: 123, bilo fragment koji može da se otcepi (CM1, supstrat 2001) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu ISSGLLSGRSDNH (SEQ ID NO: 70) ili fragment koji može da se otcepi (CM2, supstrat 3001) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu AVGLLAPPGGLSGRSDNH (SEQ ID NO: 76), i jedan od maskirajućih fragmenata prikazanih u tabeli 10. Cele sekvence prikazane su iznad u tabeli 11.
[0435] Upotrebom standardnog protokola za ELISA test, protein CD166 čoveka je apsorbovan na ploče za ELISA test i zatim inkubiran sa naznačenom koncentracijom antitela ili antitela koje može da se aktivira. Vezano antitelo ili antitelo koje može da se aktivira detektovano je sekundarnim antitelom protiv FAB čoveka sa peroksidazom.
[0436] U ilustrativnoj studiji, određen je afinitet vezivanja anti-CD166 antitela (anti-CD166 HcC/vk-1 predmetnog otkrića i anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju (anti-CD166-7614.6-3001) predmetnog otkrića za ćelije čoveka (HCC1806 ćelije humanog kancera dojke) i
1
CD166 čoveka. Pod ovim uslovima, ilustrativni prividni afiniteti vezivanja (Kd) pomoću ELISA testa su 96.2 nM i 1.3 nM za anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira i anti-CD166 antitelo predmetnog otkrića, redom. U ilustrativnom testu vezivanja HCC1806 ćelija mereno protočnom citometrijom, prividni afiniteti vezivanja (Kd) su 372 nM i 3.2 nM za anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira i anti-CD166 antitelo predmetnog otkrića, redom. Ovi ilustrativni rezultati su pokazali da anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira, u stanju kada nije podvrgnuto cepanju, pokazuje niži afinitet vezivanja za izolovani CD166 polipeptid i CD166 na ćelijama, u poređenju sa anti-CD166 antitelom predmetnog otkrića.
[0437] Slika 5 je grafikon koji prikazuje sposobnost različitih konjugovanih anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju prema otkriću da ostvare ubijanje ćelija HCC1806 kada se proteolitički aktiviraju sa uPA. Ova konjugovana anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju su ovde označena i kao "CD166 AADC" ili konjugati antitela protiv CD166 koje može da se aktivira sa lekom (Activatable Antibody Drug Conjugates). Ispitivana konjugovana anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju uključuju sekvence varijabilnog teškog lanca SEQ ID NO: 122, sekvence varijabilnog lakog lanca SEQ ID NO: 123, fragment koji može da se otcepi (CM1, supstrat 2001) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu ISSGLLSGRSDNH (SEQ ID NO: 70), jedan od maskirajućih fragmenata prikazanih u tabeli 10, i majtanzinoid DM4 konjugovan sa antitelom koje može da se aktivira preko SPDB linkera. Cele sekvence antitela koja mogu da se aktiviraju prikazane su iznad u tabeli 11. Sva ovde opisana konjugovana antitela koja mogu da se aktiviraju proizvedena su u TCRS (The Chemistry Research Solution).
[0438] Kao što je prikazano na slici 5, različta konjugovana anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju prema otkriću ponašaju se kao izotip-DM4 kada su maskirana, ali kada su proteolitički aktivirana sa uPA, ova konjugovana anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju pokazuju slično ubijanje ćelija kao kod huCD166 ADC. Sposobnost konjugata leka da ubije HCC1806 ćelije procenjena je dodavanjem naznačene koncentracije ADC ili AADC i inkubiranjem ćelija tokom 3 dana. Ćelijska vijabilnost je merena upotrebom testa CellTiter Glo. Slični rezultati zapaženi su kada je antitelo koje može da se aktivira konjugovano sa agensom koji oštećuje nukleinsku kiselinu ispitivano u takvim testovima za ubijanje ćelija.
[0439] Sledeće studije su razvijene za procenu aktivacije i vezivanja anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju u uzorcima tumora nakon izlaganja jednoj ili više proteaza.
[0440] Uzorci ksenotransplantata tumora i uzoraka zdravog tkiva analizirani su upotrebom imunohistohemijske (IHC) analize i testa in situ vizualizacije koji je opisan u PCT objavi br. WO 2014/107599. Ukratko, ovaj in situ test koristi anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira prema otkriću, odgovarajuće parentalno antitelo, i modifikovanu verziju anti-CD166 antitela koje može da se aktivira u kojoj je CM zamenjen linkerom koji ne može da se otcepi, ovde
1 1
uopšteno označenim kao anti-CD166 NSUB modifikovano antitelo. Parentalno antitelo se koristi kao pozitivna kontrola, dok se verzija anti-CD166 antitela koje može da se aktivira koja ne može da se otcepi koristi kao negativna kontrola. Isečci zamrznutog tkiva ksenotransplantata se zatim stavljaju na predmetno staklo, ispiraju dva puta rastvorom PBS-T praćenim PBS-om, a zatim podvrgavaju tokom 30 minuta prethodnom tretmanu tkiva koktelom širokog spektra inhibitora proteaze ili samo puferom. Detektabilna oznaka kao što je Alexa Fluor-680® se zatim konjuguje za svako od anti-CD166 antitela koje može da se aktivira i anti-CD166 NSUB modifikovano antitelo. Detektabilno obeleženo anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira i anti-CD166 NSUB modifikovano antitelo se zatim primenjuju na tkivo i inkubiraju jedan čas u mraku (da bi se sprečilo obezbojenje fluorescencije). Posle inkubacije sa 1 µg/ml inkubirani tumorski isečci su isprani tri puta rastvorom PBS-T, zatim PBS-om i kontrastno obojeni jedarnim markerom DAPI tokom 1 minuta. Za detekciju pozitivnog bojenja korišćena je zatim analiza fluorescentne mikroskopije. Pozitivno bojenje anti-CD166 antitela koje može da se aktivira koje izostaje pri prethodnom tretmanu isečaka tkiva inhibitorima proteaze ukazuje na to da je vezivanje anti-CD166 antitela koje može da se aktivira za uzorak tkiva rezultat proteolitičkog događaja. Pozitivno bojenje anti-CD166 antitela koje može da se aktivira trebalo bi takođe da izostane kada je tkivo prethodno tretirano viškom neobeleženog ("hladnog") parentalnog antitela. Osim toga, inkubacija tumorskog tkiva trebalo bi da pokaže pozitivno bojenje sa parentalnim antitelom, na koje nije delovao prethodni tretman tkiva inhibitorima proteaze, ali ono izostaje kada je tkivo prethodno tretirano neobeleženim parentalnim antitelom. Signal ne bi trebalo da bude detektovan za anti-CD166 NSUB modifikovano antitelo pri detekciji na prethodno tretiranom tkivu, na tkivu koje nije prethodno tretirano inhibitorima proteaze, ili na tkivu prethodno tretiranom neobeleženim parentalnim antitelom.
[0441] Slike 6A-6D su serija snimaka koji pokazuju da je anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira aktivirano (tj., otcepljeno) u uzorcima tkiva kancera debelog creva, a da anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira nije aktivirano u uzorcima zdravog tkiva. Slike 6A i 6C prikazuju rezultate IHC analize na uzorcima tumora i zdravog tkiva, a slike 6B i 6D prikazuju rezultate in situ testa vizualizacije na uzorcima tumora i zdravog tkiva.
[0442] Slike 7A-7D su serija snimaka koji pokazuju da je anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira aktivirano (tj., otcepljeno) u uzorcima tkiva kancera pluća, a da anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira nije aktivirano u uzorcima zdravog tkiva. Slike 7A i 7C prikazuju rezultate IHC analize na uzorcima tumora i zdravog tkiva, a slike 7B i 7D prikazuju rezultate in situ testa vizualizacije na uzorcima tumora i zdravog tkiva.
[0443] Slike 8A-8D su serija snimaka koji pokazuju da anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira nije aktivirano u uzorcima zdravog tkiva. Slike 8A i 8C prikazuju rezultate IHC analize
1 2
na uzorcima zdravog tkiva, a slike 8B i 8D prikazuju rezultate in situ testa vizualizacije na uzorcima zdravog tkiva.
PRIMER 5. Aktivnost konjugovanih anti-CD166 antitela
[0444] Ovaj primer pokazuje da konjugovano anti-CD166 antitelo prema otkriću ("CD166 ADC") ispoljava in vitro aktivnost ubijanja ćelija u poređenju sa konjugatom kontrolnog antitela ("kontrolni ADC").
[0445] Slika 9 je serija grafikona koji pokazuju aktivnost konjugovanog anti-CD166 antitela prema otkriću prema ćelijskoj liniji kancera dojke, ćelijskoj liniji kancera prostate, ćelijskoj liniji kancera pankreasa, ćelijskoj liniji kancera skvamoznih ćelija glave i vrata, i CD166 ćelijskoj liniji kao negativnoj kontroli.
PRIMER 6. Efikasnost konjugovanih anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju u modelima tumora
[0446] Ovaj primer pokazuje efikasnost konjugovanog anti-CD166 antitela koje može da se aktivira prema otkriću ("CD166 AADC" ili konjugat antitela protiv CD166 koje može da se aktivira sa lekom - Activatable Antibody Drug Conjugate) u različitim modelima kancera.
[0447] Slika 10 je grafikon koji prikazuje efikasnost AADC koji uključuje anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira prema otkriću konjugovano sa majtanzinoidom DM4, u poređenju sa izotipskom DM4-konjugovanom kontrolom, i ADC koji uključuje DM4-konjugovanu verziju parentalnog antitela za anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira. Efikasnost se meri kao srednja zapremina tumora merena u različitim vremenskim tačkama posle primene (5 mg/kg IV, 1. i 8. dana) u modelu kancera dojke.
[0448] Kao što je prikazano na slici 10, efikasnost AADC ekvivalentna je efikasnosti koja se javlja kod ADC.
[0449] Slika 11 je grafikon koji prikazuje efikasnost CD166 anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju prema otkriću, u poređenju sa izotipskom DM4-konjugovanom kontrolom, i CD166 ADC, DM4-konjugovanim parentalim anti-CD166 antitelom. Efikasnost se meri kao srednja zapremina tumora merena u različitim vremenskim tačkama posle primene (5 mg/kg IV, 1. i 8. dana) u modelu H292 nesitnoćelijskog kancera pluća (NSCLC).
[0450] Ksenotransplantati tumora H292 su tretirani izotipskom-DM4 kontrolom, huCD166-DM4 ADC, huCD166_7614.6_CM2-DM4 AADC, ili huCD166_7614.6_CM1-DM4 ADDC, gde su CM1 i CM2 ovde opisani supstrati 2001 i 3001, redom. Tumori su rasli do prosečno 150 mm<3>, a zatim su miševi nasumično raspoređeni u grupe od po osam miševa, i 1. i 8. dana su im date doze naznačenih ispitivanih supstanci. Grafički je prikazana srednja zapremina tumora ± SEM.
1
[0451] Kao što je prikazano na slici 11, efikasnost oba ispitivana AADC ekvivalentna je efikasnosti koja se javlja kod ADC.
[0452] Slika 12 je grafikon koji prikazuje efikasnost CD166 AADC DM4-konjugovanog anti-CD166 antitela koje može da se aktivira, ovde označenog i kao huCD166_7614.6_CM2-DM4 AADC (gde je CM2 supstrat 3001), u poređenju sa izotipskom DM4-konjugovanom kontrolom, i CD166 ADC DM4-konjugovanim parentalnim anti-CD166 antitelom. Efikasnost se meri kao srednja zapremina tumora merena u različitim vremenskim tačkama posle primene (5 mg/kg IV, 1. i 8. dana) u modelu H1975 nesitnoćelijskog kancera pluća (NSCLC).
[0453] Kao što je prikazano na slici 12, efikasnost AADC ekvivalentna je efikasnosti koja se javlja kod ADC.
PRIMER 7. Analiza tolerabilnosti anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju
[0454] Anti-CD166 antitela prema otkriću su okarakterisana prema svojoj specifičnosti za vrste pri vezivanju za CD166 čoveka i druge blisko povezane proteine.
[0455] Kao što je prikazano na slici 13, anti-CD166 antitela prema otkriću vezuju CD166 čoveka i cinomolgus majmuna sa jednakim afinitetom. Nijedno od ispitivanih anti-CD166 antitela prema otkriću ne vezuje CD166 pacova ili miša. Kdvezivanja anti-CD166 antitela za CD166 čoveka i CD166 cinomolgusa u ovim ilustrativnim studijama vezivanja iznosi 1.3 nM za oba.
[0456] Zatim, nivoi ekspresije CD166 su analizirani u različitim tipovima normalnih tkiva čoveka i cinomolgus majmuna. Kao što je prikazano u tabeli 3 ispod, nivoi ekspresije CD166 bili su gotovo identični u ispitivanim uzorcima tkiva čiveka i cinomolgus majmuna:
Tabela 3. Nivoi ekspresije CD166 u uzorcima normalnog tkiva čoveka i cinomolgusa
1 4
[0457] Značajna ekspresija CD166 detektovana je uzorcima tkiva jetre i kod čoveka i kod cinomolgusa.
[0458] U početnim farmakokinetičkim studijama, nađeno je da konjugovana anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju prema otkriću izbegavaju eliminaciju zavisnu od antigena (tj., brzi klirens antitela zbog velike zastupljenosti prirodno eksprimiranog antigena CD166 u celom telu).
[0459] Slika 14 prikazuje rezultate studije tolerabilnosti kod cinomolgus majmuna pri primeni 5 mg/kg konjugovanog anti-CD166 antitela koje može da se aktivira prema otkriću. Ove studije su sprovedene upotrebom huCD166_7614.6_CM2-DM4 AADC (gde je CM2 supstrat 3001). Doza od 5 mg/kg je odabrana jer je to terapijska doza upotrebljena kod drugih konjugata DM4 i antitela koji uključuju vezu SPDB.
[0460] Farmakokinetika konjugata sa lekom huCD166-7614.6-CM1 DM4 (gde je CM1 supstrat 2001) i nekonjugovanog huCD166 antitela procenjivana je kod cinomolgus majmuna posle pojedinačne doze od 5 mg/kg ili 3 mg/kg, redom. Ukupni serumski nivoi IgG čoveka mereni su upotrebom sendvič ELISA testa protiv IgG čoveka. U skladu sa izbegavanjem eliminacije na ciljnom mestu delovanja, CD166 AADC je pokazao značajno veću izloženost nego antitelo. Kod majmuna tretiranih konjugatom sa lekom huCD166-7614.6-CM1 DM4 ne javlja se uočljiva toksičnost. Posle 21 dana, nije bilo kliničkih zapažanja, nije bilo znakova toksičnosti na ciljnom mestu delovanja, i nije bilo znakova toksičnosti za jetru. Kao što je prikazano na slici 14, klirens konjugata anti-CD166 antitela sa DM4 upoređen je sa parentalnim antitelom. Vezivanje antigena bilo je ispod nivoa kvantifikacije.
1
[0461] Slika 15 je grafikon koji pokazuje da se konjugovano anti-CD166 antitelo koje može da se aktivira dobro toleriše u projektovanim terapijskim dozama. Ove studije su sprovedene upotrebom huCD166_7614.6_CM2-DM4 AADC (gde je CM2 supstrat 3001).
[0462] Prema tome, za razliku od tradicionalne ADC terapije, nema dokaza o oštećenju jetre kod cinomolgus majmuna posle primene konjugovanog anti-CD166 antitela koje može da se aktivira prema otkriću.
PRIMER 8. Aktivacija zavisna od proteaze anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju
[0463] Ilustrativne studije koje su ovde prikazane, razvijene su za procenu aktivacije zavisne od proteaze antitela koja mogu da se aktiviraju i konjugovanih antitela koja mogu da se aktiviraju protiv CD166 prema otkriću.
[0464] Slike 16A, 16B, i 16C su grafikoni koji pokazuju sposobnost različitih anti-CD166 konjugovanih anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju prema otkriću da vežu CD166 čoveka na ćelijama HCC1806 u prisustvu ili odsustvu aktivacije zavisne od proteaze. Ova konjugovana anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju su ovde označena i kao "CD166 AADC" ili "konjugat antitela protiv CD166 koje može da se aktivira sa lekom - Activatable Antibody Drug Conjugate". Kao što je prikazano na slici 16A, konjugovana anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju su sprečena da se vežu za CD166 na ćelijama HCC1806. Nasuprot tome, kao što je prikazano na slikama 16B i 16C, konjugovana anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju ponovo stiču aktivnost vezivanja antitela koja je slična aktivnosti vezivanja nemaskiranog konjugovanog anti-CD166 antitela i nemaskiranog anti-CD166 antitela kada su AADC proteolitički aktivirani matriptazom (MT-SP1) ili matriksnom metaloproteazom 14 (MMP-14).
[0465] Vezivanje anti-CD166 antitela (VH sekvence SEQ ID NO: 122, VL sekvence SEQ ID NO: 123), različitih konjugovanih i nekonjugovanih anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju prema otkriću, i proteazom-aktiviranih konjugovanih anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju prema otkriću procenjivana je upotrebom testa vezivanja na bazi protočne citometrije. Ispitivana konjugovana i nekonjugovana anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju uključivala su sekvence varijabilnog teškog lanca SEQ ID NO: 122, sekvence varijabilnog lakog lanca SEQ ID NO: 123, fragment koji može da se otcepi (CM1, supstrat 2001) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu ISSGLLSGRSDNH (SEQ ID NO: 70) ili fragment koji može da se otcepi (CM2, supstrat 3001) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu AVGLLAPPGGLSGRSDNH (SEQ ID NO: 76), i jedan od maskirajućih fragmenata prikazanih u tabeli 10. Cele sekvence su prikazane iznad u tabeli 11. Konjugovana anti-CD166 antitela i konjugovana anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju uključivala su majtanzinoid DM4
1
konjugovan sa antitelom koje može da se aktivira preko linkera SPDB. U tipičnom testu, HCC1806 ćelije su inkubirane sa naznačenim koncentracijama anti-CD166 antitela, antitela koje može da se aktivira, konjugovanog antitela, ili antitela koje može da se aktivira u PBS+2%FBS tokom 1 časa na ledu. Posle pranja 2X rastvorom PBS 2% FBS, ćelije su inkubirane sa sekundarnim kozjim antitelom protiv IgG čoveka, konjugovanim sa AlexaFluor 647 (Jackson ImmunoResearch), tokom 30-45 minuta na ledu. Ćelije su zatim oprane 2X rastvorom PBS 2% FBS i fiksirane 1% formaldehidom. Vezano antitelo je detektovano upotrebom citometra Guava EasyCyte i izmerena je medijana intenziteta fluorescencije (MFI) populacije ćelija.
[0466] Kao što je prikazano na slici 16A, konjugovana anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju su sprečena da se vežu za CD166 na ćelijama HCC1806. Kao što je prikazano na slikama 16B i 16C, različita konjugovana i nekonjugovana anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju prema otkriću ponašaju se slično jedna drugima kada su maskirana, ali kada su konjugovana anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju bila proteolitički aktivirana proteazom, ispoljila su slično vezivanje kao u slučaju nemaskiranog huCD166 parentalnog antitela i nemaskiranog huCD166 ADC.
PRIMER 9. Vezivanje anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju i konjugata antitela sa lekom za tkiva čoveka
[0467] Ilustrativne studije u ovom primeru pokazuju svojstva vezivanja konjugata anti-CD166 antitela sa lekom (ADC) i konjugata anti-CD166 antitela koje može da se aktivira sa lekom (AADC) predmetnog otkrića za tkiva čoveka.
[0468] U ovoj studiji, pripremljeni su isečci smrznutog tkiva poreklom od normalne prostate, jajnika, dojke, pankreasa, i desne pretkomore čoveka (kat. br. T1234201, T1234086, T1234183, T1234188, i T1234127, redom; BioChain, Newark, CA) i blokirani upotrebom standardnih protokola, a zatim inkubirani sa 0.4 µg/mL anti-CD166 ADC predmetnog otkrića (anti-CD166-spdb-DM4), anti-CD166 AADC predmetnog otkrića (anti-CD166-7614.6-3001-spdb-DM4), aktiviranog anti-CD166 AADC predmetnog otkrića (anti-CD166-7614.6-3001-spdb-DM4 inkubiranim sa prečišćenim uPA tokom 16 časova na 37°C), ili izotipske kontrole ADC (chKTI-spdb-DM4, himerno humano IgG1 antitelo protiv inhibitora tripsina soje, konjugovano sa spdb-DM4). Posle inkubacije sa ispitivanim supstancama, isečci su tretirani sa 2.5 µg/mL mišjeg anti-DM4 monoklonskog antitela (Immunogen). Detekcija korisnog opterećenja DM4 postignuta je inkubacijom sa anti-mišjim antitelom konjugovanim sa HRP polimerom (EnvisionTM+ System-HRP Labeled polymer anti-mouse, Dako, K4006) što je praćeno dodavanjem supstrata 3,3'-diaminobenzidina (DAB Plus, Dako, K3467). Tkiva su kontrastno obojena hematoksilinom i slike su dobijene pomoću virtualnog skenera slajdova Olympus VS120.
1
[0469] Ilustrativni rezultati ove studije pokazali su da anti-CD166 AADC predmetnog otkrića (anti-CD166-7614.6-3001-spdb-DM4) ispoljava nedostatak imunološkog bojenja na svakom od pet isečaka tkiva čoveka, što je u skladu sa njegovim maskiranim stanjem, i slično onome što je zapaženo kod izotipske kontrole ADC. Aktivacija anti-CD166 AADC predmetnog otkrića pomoću uPA povratila je vezivanje aktiviranog anti-CD166 AADC kod dva od tkiva sa najvišom ekspresijom, prostate i dojke. Intenzitet bojenja i raspodela uPA-aktiviranog anti-CD166 AADC predmetnog otkrića bile su slične onima kod konjugata parentalnog anti-CD166 antitela sa lekom (anti-CD166-spdb-DM4).
PRIMER 10. Vezivanje anti-CD166 antitela za kancere čoveka
[0470] Ovaj primer pokazuje da se CD166 eksprimira u različitim tumorima poreklom od pacijenata imunohistohemijskim (IHC) bojenjem upotrebom anti-CD166 antitela.
[0471] U ovoj studiji, pripremljeni su uzorci tumora fiksirani formalinom i uronjeni u parafin (FFPE) u mikro-nizovima tkiva (US Biomax) i blokirani upotrebom standardnih protokola, a zatim inkubirani sa 5 µg/mL anti-CD166 zečjeg monoklonskog antitela EPR2759[2] (Abcam, ab109215). Detekcija anti-CD166 antitela sprovedena je inkubacijom sa 5 µg/mL biotinilisanogkonjugovanog magarećeg anti-zečjeg IgG antitela (Jackson Immunoresearch, 711-065-152), što je praćeno dodavanjem ABC-HRP Elite Standard (Vector Laboratories, PK-6100) da bi se obrazovao kompleks avidin-biotin-HRP, a nakon toga je dodat supstrat 3,3'-diaminobenzidin (DAB Plus, Dako, K3467). Tkiva su kontrastno obojena hematoksilinom i slike su dobijene pomoću virtualnog skenera slajdova Olympus VS120.
[0472] Svakom jezgru tkiva dodeljen je IHC skor "negativno" (nema bojenja), "slabo" (intenzitet 1+ u ≤ 70% tumorskih ćelija ili 2+ u ≤ 30% tumorskih ćelija), "umereno" (intenzitet 1+ u > 70% tumorskih ćelija ili 2+ u >30% do ≤ 70% tumorskih ćelija ili 3+ u ≤ 30% tumorskih ćelija), ili "jako" (intenzitet 2+ u > 70% tumorskih ćelija ili 3+ u >30% tumorskih ćelija), i procenat ispitivanih uzoraka koji pokazuju "umereno" ili "jako" IHC bojenje za anti-CD166 prikazan je u tabeli 4 ispod.
Tabela 4: IHC test ekspresije CD166 kod kancera poreklom od pacijenata
1
PRIMER 11. Vezivanje anti-CD166 antitela za ćelije čoveka i cinomolgusa
[0473] Ilustrativne studije koje su ovde prikazane, razvijene su za procenu vezivanja anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju prema otkriću za ćelije čoveka i cinomolgusa u testu protočne citometrije.
[0474] Slika 17 je grafikon koji pokazuje sposobnost anti-CD166 antitela (anti-huCD166) prema otkriću da veže humane H292 ćelije ili primarne epitelne ćelije bubrega cinomolgusa, mereno protočnom citometrijom. Kao što je prikazano na slici 17, anti-CD166 antitela predmetnog otkrića pokazala su uporedive afinitete vezivanja za CD166 na površini ćelija i kod ćelija čoveka i kod ćelija cinomolgusa.
[0475] Vezivanje anti-CD166 antitela (huM9 vk-1/HcC; VH sekvence SEQ ID NO: 122, VL sekvence SEQ ID NO: 123) predmetnog otkrića za humane H292 ćelije i primarne epitelne ćelije bubrega cinomolgusa procenjena je upotrebom testa vezivanja na bazi protočne citometrije. U tipičnom testu, H292 ćelije ili primarne epitelne ćelije bubrega cinomolgusa inkubirane su sa naznačenim koncentracijama anti-CD166 antitela u rastvoru PBS+2%FBS tokom 1 časa na ledu. Posle pranja 2X sa PBS 2% FBS, ćelije su inkubirane sa sekundarnim kozjim anti-humanim IgG antitelom, konjugovanim sa AlexaFluor 647 (Jackson ImmunoResearch), tokom 30-45 minuta na ledu. Ćelije su zatim oprane 2X rastvorom PBS 2% FBS i fiksirane 1% formaldehidom. Vezano antitelo je detektovano upotrebom citometra Guava EasyCyte i izmerena je srednja vrednost intenziteta fluorescencije (MFI) populacije ćelija.
[0476] Kao što je prikazano na slici 17, anti-CD166 antitelo predmetnog otkrića vezuje se za ćelije čoveka i cinomolgusa sa uporedivim afinitetom (EC50od 3.1 nM za humane ćelije, i EC50od 1.7 nM za ćelije cinomolgusa).
PRIMER 12. Inhibicija vezivanja ćelija za CD6 anti-CD166 antitelima
[0477] U ovoj ilustrativnoj studiji, anti-CD166 antitela predmetnog otkrića pokazuju sposobnost da blokiraju adheziju ćelija humanog limfoma za imobilisani CD6, receptor za koji je CD166 ligand.
1
[0478] Slika 18 je grafikon koji pokazuje sposobnost anti-CD166 antitela (anti-huCD166; vk-1/HcC) predmetnog otkrića da blokira adheziju HuT-78 ćelija humanog limfoma za imobilisani CD166 čoveka. U ovom testu, HuT-78 ćelije koje eksprimiraju CD166 su fluorescentno obeležene i inkubirane sa rekombinantnim CD6 proteinom imobilisanim na plastičnim pločama. Posle nekoliko pranja, vezane HuT-78 ćelije detektuju se merenjem fluorescencije i izražavaju kao procenat od ukupne fluorescencije (pre pranja). MAB656 je anti-CD166 mišje monoklonsko antitelo za koje je objavljeno da inhibira ćelijsku adheziju u ovom testu (R&D Systems), verovatno narušavanjem interakcije CD166 sa njegovim receptorom, CD6. U ovom ilustrativnom testu, anti-CD166 antitelo predmetnog otkrića i MAB656 su pokazali slične nivoe inhibicije ćelijske adhezije za CD6. Oba antitela su pokazala EC50 od približno 3.7 nM. Izotipsko kontrolno antitelo nije ispoljilo inhibiciju ćelijske adhezije.
PRIMER 13. Aktivacija anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju zavisna od proteaze
[0479] Ilustrativne studije koje su ovde prikazane, razvijene su za procenu aktivacije anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju i konjugovanih antitela koja mogu da se aktiviraju prema otkriću zavisnu od proteaze.
[0480] Slika 19A je grafikon koji prikazuje in vitro vezivanje za CD166 u ELISA testu anti-CD166 antitela (anti-huCD166 HcC/vk-1, "CD166 Ab"), konjugata anti-CD166 antitela sa lekom (anti-CD166-spdb-DM4, "CD166-ADC"), anti-CD166 antitela koje može da se aktivira (anti-CD166-7614.6-3001, "CD166 Pb"), konjugata antitela koje može da se aktivira sa lekom (anti-CD166-7614.6-3001-spdb-DM4, "CD166-AADC"). Kao što je naznačeno, testovi su sprovedeni i sa proteazom-aktiviranim konjugatima anti-CD166 antitela koje može da se aktivira sa lekom, upotrebom urokinaze (uPA), matriptaze (MT-SP1), ili matriksne metaloproteaze 14 (MMP14) kao što je naznačeno. Upotrebom standardnog protokola za ELISA test, protein CD166 čoveka je apsorbovan na ELISA ploče i zatim inkubiran sa naznačenom koncentracijom antitela. Vezano antitelo je detektovano pomoću sekundarnog anti-humanog IgG antitela konjugovanog sa peroksidazom rena.
[0481] Slike 19B i 19C su grafikoni koji prikazuju vezivanje za humane HCC1806 ili H292 ćelije u testu protočne citometrije anti-CD166 antitela (anti-huCD166 HcC/vk-1, "CD166 Ab"), konjugata anti-CD166 antitela sa lekom (anti-CD166-spdb-DM4, "CD166-ADC"), anti-CD166 antitela koje može da se aktivira (anti-CD166-7614.6-3001, "CD166 Pb"), konjugata antitela koje može da se aktivira sa lekom (anti-CD166-7614.6-3001-spdb-DM4, "CD166-AADC"). Kao što je naznačeno, testovi su sprovedeni i sa proteazom-aktiviranim konjugatima anti-CD166 antitela koje može da se aktivira sa lekom, upotrebom urokinaze (uPA), matriptaze (MT-SP1), ili
1
matriksne metaloproteaze 14 (MMP14), kao što je naznačeno. Kao kontrola, ispitivano je i izotipsko IgG1 antitelo konjugovano sa spdb-DM4 ("IgG1 izotipski-ADC"). U tipičnom testu, H292 ćelije ili HCC1806 ćelije su inkubirane sa naznačenim koncentracijama anti-CD166 antitela u rastvoru PBS+2%FBS tokom 1 časa na ledu. Posle pranja 2X rastvorom PBS 2% FBS, ćelije su inkubirane sa sekundarnim kozjim anti-humanim IgG antitelom, konjugovanim sa AlexaFluor 647 (Jackson ImmunoResearch), tokom 30-45 minuta na ledu. Ćelije su zatim oprane 2X rastvorom PBS 2% FBS i fiksirane 1% formaldehidom. Vezano antitelo je detektovano upotrebom citometra Guava EasyCyte i izmerena je medijana intenziteta fluorescencije (MFI) populacije ćelija.
Tabela 14: Vezivanje konstrukata anti-CD166 antitela za CD166 i ćelije čoveka
[0482] Kao što je prikazano ilustrativnim rezultatima u tabeli 14, CD166-AADC koji nije podvrgnut cepanju pokazao je povećanu prividnu Kd u poređenju sa nemaskiranim CD166-ADC u ELISA testu i protočnoj citometriji. Izgleda da je aktivacija CD166-AADC pomoću sve tri proteaze obnovila afinitet vezivanja konjugata anti-CD166 antitela koje može da se aktivira sa lekom do nivoa uporedivog sa onim kod nemaskiranog CD166-ADC.
[0483] Slike 20A i 20B su grafikoni koji pokazuju in vitro citotoksičnost za humane HCC1806 ili H292 ćelije anti-CD166 antitela (anti-huCD166 HcC/vk-1, "CD166 Ab"), konjugata anti-CD166 antitela sa lekom (anti-CD166-spdb-DM4, "CD166-ADC"), anti-CD166 antitela koje može da se aktivira (anti-CD166-7614.6-3001, "CD166 Pb"), konjugata antitela koje može da se aktivira sa lekom (anti-CD166-7614.6-3001-spdb-DM4, "CD166-AADC"). Kao što je naznačeno, testovi su sprovedeni i sa proteazom-aktiviranim konjugatom anti-CD166 antitela
1 1
koje može da se aktivira sa lekom, upotrebom urokinaze (uPA), matriptaze (MT-SP1), ili matriksne metaloproteaze 14 (MMP14), kao što je naznačeno. Kao kontrola, ispitivano je i izotipsko IgG1 antitelo konjugovano sa spdb-DM4 ("IgG1 izotipski-ADC"). U tipičnom testu, H292 ćelije ili HCC1806 ćelije su inkubirane sa naznačenim koncentracijama antitela, antitela koje može da se aktivira, konjugovanog antitela koje može da se aktivira sa lekom, ili konjugata antitela koje može da se aktivira sa lekom, tretiranim proteazom, i inkubacijom ćelija 3 do 5 dana. Vijabilnost ćelija merena je upotrebom testa CellTiter Glo. Rezultati ovih testova citotoksičnosti ukratko su prikazani ispod u tabeli 15.
Tabela 15: In vitro citotoksičnost konstrukata anti-CD166 antitela za ćelije čoveka
[0484] Ovi ilustrativni rezultati u tabeli 15 i na slikama 20A i 20B pokazuju da konjugati anti-CD166 antitela koje može da se aktivira sa lekom (CD166-AADC) predmetnog otkrića koji su proteolitički aktivirani proteazom koja prepoznaje sekvencu supstrata (CM) pokazuju višestruko povećanje citotoksičnosti za humane ćelije u poređenju sa odgovarajućim anti-CD166 AADC koji nije podvrgnut cepanju. Osim toga, aktivirani anti-CD166 AADC pokazuje citotoksičnost koja je uporediva sa nemaskiranim anti-CD166 ADC.
PRIMER 14. Test imunološkog rizika za anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju
[0485] Ilustrativne studije koje su ovde prikazane, razvijene su za procenu sposobnosti konjugata anti-CD166 antitela koje može da se aktivira sa lekom (CD166-AADC) predmetnog otkrića da pokrenu imunološki odgovor u in vitro testu.
[0486] U ovim ilustrativnim studijama, u in vitro testovima ispitivano je oslobađanje citokina i proliferacija mononuklearnih ćelija periferne krvi čoveka (PBMC), kao odgovor na tretman konjugatima anti-CD166 antitela koje može da se aktivira sa lekom (anti-CD166-7614.6-3001-spdb-DM4, "CD166-AADC"), konjugata anti-CD166 antitela sa lekom (anti-CD166 (vk-1/HcC)-spdb-DM4, "CD166-ADC"), anti-CD3 pozitivne kontrole (OKT3 antitelo), i konjugata izotipske kontrole antitela sa lekom ("Izotip") u sledećim koncentracijama:
1 2
[0487] U ovoj ilustrativnoj studiji, pet normalnih, zdravih donora procenjivano je u dva odvojena formata, metodom vlažnog oblaganja i solubilne ispitivane supstance. Standardni panel Th1 i Th2 citokina uključujući IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNFα, i IFNγ meren je na 24 časa posle tretmana. Kao što je prikazano na slici 21A-21D, titracija doze CD166-AADC ili odgovarajućeg CD166-ADC nije pokazala značajno oslobađanje citokina iz humanih PBMC, u poređenju sa pozitivnom kontrolom (anti-CD3, OKT3) i negativnom (izotipski ADC) kontrolom antitela. Dodatno, za razliku od pozitivne kontrole OKT3 antitela, ni CD166-AADC ni CD166-ADC nisu indukovali proliferaciju PBMC, prema proceni 8. dana posle tretmana.
PRIMER 16. Ćelijska citotoksičnost zavisna od antitela konjugovanih anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju
[0488] Ilustrativne studije koje su ovde prikazane, razvijene su za procenu in vitro ćelijske citotoksičnosti zavisne od antitela (ADCC) za humane ćelije konjugata anti-CD166 antitela koje može da se aktivira sa lekom prema predmetnom otkriću.
[0489] Slika 22 je grafikon koji prikazuje in vitro test ADCC na humanim ćelijama adenokarcinoma jajnika (SKOV3) upotrebom konjugata anti-CD166 antitela koje može da se aktivira sa lekom predmetnog otkrića (anti-huCD166 (HcC/vk-1)-7614.6-3001-spdb-DM4, "CD166-AADC"), konjugata anti-CD166 antitela sa lekom (anti-CD166-spdb-DM4, "CD166-ADC"), anti-EGFR pozitivne kontrole, i IgG1 izotipske kontrole-spdb-DM4 ("IgG1 izotipski-ADC")
[0490] Aktivnosti ADCC u ovim ilustrativnim testovima procenjivane su upotrebom biološkog reporterskog ADCC testa (Promega). U ovom testu, Jurkat T ćelije stabilno transficirane sa FcRγIIIa i NF-AT-inducibilnim luciferaznim reporterom inkubirane su sa SKOV3 ćelijama koje
1
eksprimiraju CD166 u prisustvu CD166-AADC ili kontrolnog antitela. Aktivnost luciferaze je stimulisana u funkciji vezivanja antitela za ciljne ćelije, angažovanja FcRγIIIa receptora i nishodnog prenosa signala u efektorskim ćelijama. U ćelijama SKOV3, koje eksprimiraju visoke nivoe CD166 i EGFR, inkubacija sa CD166-AADC ili CD166-ADC pokazala je sličnu aktivnost sa IgG1 izotipskom kontrolom ADC, i nižu od one zapažene sa pozitivnom kontrolom anti-EGFR antitela. Doza CD166-AADC ili CD166-ADC je titrirana u testu. Ovi podaci sugerišu da CD166-AADC, kao i CD166-ADC, ima ograničen potencijal za ADCC.
PRIMER 17. Efikasnost konjugovanih anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju protiv modela ksenotransplantata tumora poreklom od ćelija i pacijenata
[0491] Ilustrativne studije koje su ovde prikazane, razvijene su za procenu in vivo efikasnosti konjugata anti-CD166 antitela koje može da se aktivira sa lekom predmetnog otkrića protiv ksenotransplantata poreklom od ćelija i pacijenata u mišjem modelu tumora.
[0492] U ovim ilustrativnim studijama, ispitivano je više modela ksenotransplantata (PDX) poreklom od humanih ćelijskih linija i poreklom od pacijenata koji predstavljaju različite tipove kancera. Dva modela ksenotransplantata poreklom od ćelijske linije (H292 ćelija nesitnoćelijskog karcinoma pluća (NSCLC) i HCC1806 ćelija trostruko negativnog karcinoma dojke), i dva modela ksenotransplantata (PDX) poreklom od pacijenata za karcinom jajnika (CTG-0791) i holangiokarcinom (CTG-0941). Kod svakog modela, miševi koji nose tumor nasumično su raspoređeni u grupe i tretman je započeo sa konjugatom anti-CD166 antitela koje može da se aktivira sa lekom predmetnog otkrića (anti-huCD166 (HcC/vk-1)-7614.6-3001-spdb-DM4, "CD166-AADC"), konjugatom izotipske kontrole SPDB-DM4, ili kontrolom vehikuluma kao što je naznačeno. Ispitivane supstance su primenjene intravenski 0. i 7. dana studije, u dozi od 3 ili 5 mg/kg kao što je naznačeno.
[0493] Kao što je prikazano na slici 23, tretman sa CD166-AADC, pri, ili ispod očekivanih terapijskih doza kod ljudi, vodio je regresijama tumora i trajnim odgovorima kod većine miševa. Druge slične ilustrativne studije sumirane su u tabeli 16 ispod.
Tabela 16: Efikasnost konjugata anti-CD166 antitela koje može da se aktivira sa lekom
1 4
PRIMER 18. In vitro citotoksičnost konjugovanih anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju protiv ćelijskih linija poreklom od kancera endometrijuma
[0494] Ilustrativne studije koje su ovde prikazane, razvijene su za procenu in vitro efikasnosti konjugata anti-CD166 antitela koje može da se aktivira sa lekom predmetnog otkrića protiv ćelijskih linija poreklom od kancera endometrijuma.
[0495] Kao što je prikazano na slikama 24A-24C, ove ilustrativne studije in vitro citotoksičnosti prema ćelijskim linijama poreklom od humanog kancera endometrijuma materice (HEC-1-A, AN3-CA, i KLE ćelijske linije) konjugata anti-CD166 antitela sa lekom (anti-CD166-spdb-DM4, "CD166-ADC"), i konjugata antitela koje može da se aktivira sa lekom (anti-CD166-7614.6-3001-spdb-DM4, "CD166-7614.6-AADC"; i anti-CD166-7614.8-3001-spdb-DM4, "CD166-7614.8-AADC"). Izotipski kontrolni-ADC (chKTI-spdb-DM4) korišćen je kao kontrola. U tipičnom testu, ćelije su inkubirane sa naznačenim koncentracijama konjugata antitela sa lekom, ili konjugata antitela koje može da se aktivira sa lekom, tokom 3 do 5 dana. Vijabilnost ćelija merena je upotrebom testa CellTiter Glo. Ovi ilustrativni rezultati pokazali su da anti-CD166-AADC i anti-CD166-ADC predmetnog otkrića ispoljavaju citotoksičnost protiv svih ćelijskih linija u poređenju sa negativnom kontrolom. Ovi ilustrativni rezultati takođe su pokazali da anti-CD166-AADC koji nisu podvrgnuti cepanju ispoljavaju nižu citotoksičnost od anti-CD166-ADC predmetnog otkrića zahvaljujući svom nižem afinitetu za ciljni molekul zbog maskiranog supstrata. Izgleda da je relativna osetljivost ćelijskih linija na anti-CD166 predmetnog otkrića u korelaciji sa nivoom ekspresije CD166 u svakoj ćeliji. Kao što je prikazano na slici 24D, da bi se odredila relativna količina površinski eksprimiranog CD166 na svakoj endometrijalnoj ćelijskoj liniji, sproveden je test protočne citometrije upotrebom anti-CD166 antitela predmetnog otkrića.
PRIMER 18. In vitro citotoksičnost konjugata anti-CD166 antitela sa lekom protiv različitih ćelijskih linija poreklom od kancera
[0496] Ilustrativne studije koje su ovde prikazane, razvijene su za procenu in vitro efikasnosti konjugata anti-CD166 antitela sa lekom predmetnog otkrića protiv ćelijskih linija poreklom od kancera endometrijuma.
[0497] U ovim ilustrativnim studijama, in vitro citotoksičnost konjugata anti-CD166 antitela sa lekom (anti-CD166 (vk-1/HcC)-spdb-DM4, "CD166-ADC") ispitivana je protiv više ćelijskih
1
linija poreklom od humanih kancera. U tipičnom testu, ćelije su inkubirane tokom 3 do 5 dana sa CD166-ADC u različitim koncentracijama (od 0.1 nM do 50 nM). Vijabilnost ćelija merena je upotrebom testa CellTiter Glo. Citotoksičnost CD166-ADC upoređena je sa negativnom izotipskom kontrolom (chKTI-spdb-DM4). U slučaju ćelijske linije PC3 kancera prostate i ćelijskih linija SAS karcinoma skvamoznih ćelija glave i vrata, ispitivan je anti-CD166-vc-MMAD, a negativna kontrola bio je izotipski palivizumab-vc-MMAD. Rezultati ovih testova citotoksičnosti ukratko su prikazani ispod u tabeli 8.
Tabela 8: In vitro citotoksičnost konjugata anti-CD166 antitela sa lekom za ćelije kancera čoveka
PRIMER 19: In Vivo vizualizacija anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju u mišjem modelu ksenotransplantata kancera pluća
[0498] Ovaj primer pokazuje da anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju predmetnog otkrića ispoljavaju in vivo aktivaciju zavisnu od proteaze povezane sa tumorom, i vezivanje za CD166 eksprimiran u mišjem modelu ksenotransplantata kancera pluća (NSCLC), pomoću in vivo fluorescentne vizualizacije.
[0499] Slika 25A prikazuje in vivo vizualizaciju živih miševa sa ksenotransplantatima tumora pluća (H292 ćelije) upotrebom fluorescentno-konjugovanog anti-CD166 i anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju prema predmetnom otkriću. U ovoj studiji, 7-8 nedelja starim ženkama miševa nu/nu (n=3) implantirano je potkožno u desni bok 5 x 10<6>H292 ćelija, ćelijske linije poreklom od nesitnoćelijskog kancera pluća čoveka. Nakon što su tumori porasli do zapremine od 300 do 380 mm3, anti-CD166 antitelo (vk-1/HcC) predmetnog otkrića ("CD166-
1
Ab"), anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju sa različitim maskirajućim sekvencama i sekvencama supstrata prema predmetnom otkriću (anti-CD166-7614.6-3001, anti-CD166-7614.8-2001), ili maskirano anti-CD166 antitelo predmetnog otkrića bez CM domena ("CD166 7614.6-NSUB") primenjeni su kao pre-blokirajući reagens kod svakog miša u dozi od 5 mg/kg. Kao kontrola, na sličan način primenjeno je izotipsko antitelo (palivizumab). Oko 48 časova kasnije, miševima je injektirano anti-CD166 antitelo obeleženo sa AlexaFluor 750 (anti-CD166-AF750). Miševi su podvrgnuti in vivo fluorescentnoj vizualizaciji 24, 72, i 96 časova posle primene anti-CD166-AF750, upotrebom ekscitacionog signala na 745 nm i detekcijom emisionog signala na 800 nm. Prikazani su reprezentativni miševi snimljeni na 96 časova. Skala pokazuje relativnu jačinu detektovanog fluorescentnog signala. Na slici 25B prikazan je srednji odnos tumora i pozadinskog šuma (TBR) izmerenog kod miševa za svaku ispitivanu supstancu.
[0500] Rezultati ove ilustrativne studije pokazali su, prema fluorescentnim signalima nemaskiranog anti-CD166 antitela predmetnog otkrića i anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju predmetnog otkrića, da ona mogu da vežu CD166 u ksenotransplantatu, blokirajući tako naredno vezivanje fluorescentno-obeleženog anti-CD166. Nasuprot tome, odgovarajuće maskirano anti-CD166 antitelo kome nedostaje mesto cepanja proteazom (CM) nije blokiralo naredno vezivanje CD166-AF750 u stepenu uporedivom sa izotipskom kontrolom. Bez želje za vezivanjem za neku određenu teoriju, ova ilustrativna studija pokazala je da anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju predmetnog otkrića mogu da se aktiviraju in vivo cepanjem proteazom povezanom sa tumorom, omogućavajući tako aktiviranom anti-CD166 antitelu koje može da se aktivira da veže CD166 u ksenotransplantatu tumora do stepena uporedivog sa nemaskiranim anti-CD166 antitelom predmetnog otkrića. Maskirano anti-CD166 antitelo bez domena za cepanje proteazom (CM) predmetnog otkrića nije moglo da se aktivira na isti način, i prema tome, nije se značajno vezalo za ksenotransplantat tumora.
PRIMER 20. Efikasnost konjugovanih anti-CD166 antitela koja mogu da se aktiviraju protiv modela tumorskih ksenotransplantata poreklom od ćelija
[0501] Ilustrativne studije koje su ovde prikazane, razvijene su za procenu in vivo efikasnosti konjugata anti-CD166 antitela koje može da se aktivira sa lekom (AADC) predmetnog otkrića protiv ksenotransplantata poreklom od ćelija u mišjem modelu tumora.
[0502] U ovim ilustrativnim studijama, ispitivana je efikasnost konjugata anti-CD166 antitela koje može da se aktivira sa lekom predmetnog otkrića protiv modela mišjeg ksenotransplantata tumora u modelu kancera pluća (H292 ćelije nesitnoćelijskog karcinoma pluća čoveka (NSCLC)). U ovoj studiji, miševi koji nose tumor tretirani su konjugatima anti-CD166 antitela sa lekom i konjugatima anti-CD166 antitela koje može da se aktivira sa lekom (AADC)
1
predmetnog otkrića, uključujući anti-CD166-7614-2001-spdb-DM4 ("CD166-7614-2001-DM4"), anti-CD166-7614.6-2001-spdb-DM4 ("CD166-7614.6-2001-DM4"), anti-CD166-7614.8-3001-spdb-DM4 ("CD166-7614.8-3001-DM4"), anti-huCD166-spdb-DM4 ("CD166-DM4"), i izotipsku kontrolu (palivizumab-spdb-DM4; "Izotip-DM4"). Kod svakog miša, 1. i 8. dana studije intravenski je primenjeno 5 mg/kg ispitivanih supstanci, i naznačenih dana izmerena je srednja zapremina tumora (MTV) H292 ksenotransplantata.
[0503] Kao što je prikazano na slici 26, tretman konjugatima anti-CD166 antitela koje može da se aktivira sa lekom predmetnog otkrića rezultovao je smanjenjem MTV tokom vremena do stepena uporedivog sa onim koji je zapažen kod nemaskiranih konjugata anti-CD166-DM4 sa lekom. Izgleda da anti-CD166-DM4 AADC koji ima maskirajući fragment sa merljivo većim dejstvom na snižavanje afiniteta vezivanja parentalnog antitela za CD166 (videti, npr., tabelu 17) ima merljivo nižu efikasnost nego anti-CD166 AADC koji su slabije maskirani.
1

Claims (21)

Patentni zahtevi
1. Antitelo koje može da se aktivira koje, u aktiviranom stanju, vezuje CD166, pri čemu antitelo sadrži:
antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB) koji specifično vezuje sisarski CD166, pri čemu AB specifično vezuje CD166 čoveka i CD166 cinomolgus majmuna, gde AB sadrži CDR1 VH aminokiselinske sekvence GFSLSTYGMGVG (SEQ ID NO: 127), CDR2 VH aminokiselinske sekvence NIWWSEDKH (SEQ ID NO: 128), CDR3 VH aminokiselinske sekvence IDYGNDYAFTY (SEQ ID NO: 129), CDR1 VL aminokiselinske sekvence RSSKSLLHSNGITYLY (SEQ ID NO: 130) ili RSSQSLLHSNGITYLY (SEQ ID NO: 131), CDR2 VL aminokiselinske sekvence QMSNLAS (SEQ ID NO: 132) ili QMSNRAS (SEQ ID NO: 133), i CDR3 VL aminokiselinske sekvence AQNLELPYT (SEQ ID NO: 134);
maskirajući fragment (MM) koji inhibira vezivanje AB za CD166 kada je antitelo koje može da se aktivira u neotcepljenom stanju, i gde je MM polipeptid dužine ne veće od 40 aminokiselina;
fragment koji može da se otcepi (CM) kuplovan sa AB, pri čemu je CM polipeptid koji je supstrat za proteazu; i
prvi povezujući peptid (LP1) i drugi povezujući peptid (LP2),
gde antitelo koje može da se aktivira, u neotcepljenom stanju, ima sledeći strukturni raspored od N-terminalnog kraja ka C-terminalnom kraju: MM-LP1-CM-LP2-AB i gde je svaki od LP1 i LP2 peptid dužine od 1 do 20 aminokiselina.
2. Antitelo koje može da se aktivira prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time, što MM:
(i) ima konstantu disocijacije za vezivanje sa AB koja je veća od konstante disocijacije AB sa CD166; i/ili
(ii) ne interferira ili kompetira sa AB u vezivanju sa CD166 kada je antitelo koje može da se aktivira u otcepljenom stanju; i/ili
(iii) polipeptidna sekvenca je drugačija od one kod CD166 čoveka; i/ili
(iv) polipeptidna sekvenca nije više od 50% identična sa bilo kojim prirodnim vezujućim partnerom AB.
3. Antitelo koje može da se aktivira prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2, naznačeno time, što:
(i) njegov antigen-vezujući fragment je odabran iz grupe koja se sastoji od Fab fragmenta, F(ab')2fragmenta, scFv, scAb, i dAb; i/ili
(ii) AB specifično vezuje CD166 čoveka; i/ili
(iii) AB sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 121 ili SEQ ID NO: 122, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 123-126; i/ili
(iv) dva povezujuća peptida ne moraju da budu međusobno identična.
4. Antitelo koje može da se aktivira prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2, naznačeno time, što antitelo koje može da se aktivira sadrži:
teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NOS: 121, 122 ili 239; i
sekvencu lakog lanca koja sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOS: 123-126, 242, 244, 246, 248, 303, 310, 312, 314, 316, i 363-474.
5. Konjugovano antitelo koje može da se aktivira koje, u aktiviranom stanju, vezuje CD166 koje sadrži:
antitelo koje može da se aktivira prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4; i
agens konjugovan sa AB.
6. Antitelo koje može da se aktivira prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4, ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira prema patentnom zahtevu 5 naznačeno time, što
MM sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 135-238; i/ili
CM sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 18-87 i 318-358.
7. Antitelo koje može da se aktivira prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4, ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira prema patentnom zahtevu 5 ili patentnom zahtevu 6, naznačeno time, što
MM sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 219-238, i/ili
CM sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 70-87 i 336-358.
8. Konjugovano antitelo koje može da se aktivira prema bilo kom od patentnih zahteva 5-7; gde je opciono agens toksin ili njegov fragment; i/ili gde je opciono:
(i) agens je inhibitor mikrotubula; ili
(ii) agens je agens koji oštećuje nukleinsku kiselinu; ili
(iii) agens je odabran iz grupe koja se sastoji od dolastatina ili njegovog derivata, auristatina ili njegovog derivata, majtanzinoida ili njegovog derivata, duokarmicina ili njegovog derivata, kaliheamicina ili njegovog derivata, i pirolobenzodiazepina ili njegovog derivata; ili
(iv) agens je auristatin E ili njegov derivat, monometil auristatin E (MMAE), monometil auristatin F (MMAF), monometil auristatin D (MMAD), majtanzinoid izabran iz grupe koja se sastoji od DM1 i DM4, majtanzinoid DM4, majtanzinoid DM1, duokarmicin, pirolobenzodiazepin, ili dimer pirolobenzodiazepina; i/ili
(v) agens je detektabilni fragment; gde je opciono detektabilni fragment dijagnostički agens.
9. Antitelo koje može da se aktivira prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4, 6 i 7, ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira prema bilo kom od patentnih zahteva 5-8, naznačeno time, što antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB) sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 121 i 122, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 123-126, 363-370, 373, 374, 377, 378, 381, 382, 385, 386, 389, 390, 393, 394, 397, 398, 401, 402, 405, 406, 409, 410, 413, 414, 417, 418, 421, 422, 425, 426, 429, 430, 433, 434, 437, 438, 441, 442, 445, 446, 449, 450, 453, 454, 457, 458, 461, 462, 465, 466, 469, 470, 473, i 474.
10. Antitelo koje može da se aktivira prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4, 6, 7, i 9, ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira prema bilo kom od patentnih zahteva 5-9, naznačeno time, što:
(i) antitelo koje može da se aktivira sadrži kombinaciju aminokiselinskih sekvenci, gde je kombinacija aminokiselinskih sekvenci izabrana iz jednog reda u tabeli A,
pri čemu, za datu kombinaciju,
(a) teški lanac AB sadrži aminokiselinske sekvence CDR VH sekvenci koje odgovaraju datoj kombinaciji u jednom redu navedenom u tabeli A,
2 1
(b) laki lanac AB sadrži aminokiselinske sekvence CDR VL sekvenci koje odgovaraju datoj kombinaciji u jednom redu navedenom u tabeli A, (c) MM sadrži aminokiselinsku sekvencu maskirajuće sekvence (MM) koja odgovara datoj kombinaciji u jednom redu navedenom u tabeli A, i (d) CM sadrži aminokiselinsku sekvencu sekvence supstrata (CM) koja odgovara datoj kombinaciji u jednom redu navedenom u tabeli A; i/ili
(ii) antitelo koje može da se aktivira sadrži kombinaciju aminokiselinskih sekvenci, gde za datu kombinaciju aminokiselinskih sekvenci,
(a) teški lanac AB sadrži aminokiselinske sekvence VH sekvence ili CDR VH sekvenci izabranu iz grupe koja se sastoji od: VH sekvence ili CDR VH sekvenci navedenih u odgovarajućoj koloni tabele B,
(b) laki lanac AB sadrži aminokiselinske sekvence VL sekvence ili CDR VL sekvenci izabranih iz grupe koja se sastoji od: VL sekvence ili CDR VL sekvenci navedenih u odgovarajućoj koloni tabele B,
(c) MM sadrži aminokiselinsku sekvencu maskirajuće sekvence (MM) izabranu iz grupe koja se sastoji od: MM sekvenci navedenih u odgovarajućoj koloni tabele B, i
(d) CM sadrži aminokiselinsku sekvencu sekvence supstrata (CM) izabranu iz grupe koja se sastoji od: CM sekvenci navedenih u odgovarajućoj koloni tabele B; i/ili
(iii) antitelo koje može da se aktivira sadrži: teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 121, 122 ili 239; i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOS: 123-126, 242, 244, 246, 248, 303, 310, 312, 314, 316, i 363-474.
11. Konjugovano antitelo koje može da se aktivira prema bilo kom od patentnih zahteva 5-10, naznačeno time, što je agens konjugovan sa AB preko linkera, i opciono
gde linker kojim je agens konjugovan sa AB sadrži fragment SPDB, fragment vc, ili fragment PEG2-vc, i/ili
gde linker i toksin konjugovan sa AB sadrži fragment SPDB-DM4, fragment vc-MMAD, fragment vc-MMAE, fragment vc-duokarmicin, ili fragment PEG2-vc-MMAD; ili
gde je linker, linker koji može da se otcepi, ili linker koji ne može da se otcepi.
2 2
12. Konjugovano antitelo koje može da se aktivira prema patentnom zahtevu 5, naznačeno time, što konjugovano antitelo koje može da se aktivira sadrži aminokiselinske sekvence, linker, i toksin izabran iz jednog reda u tabeli C, gde za datu kombinaciju:
(a) AB sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sekvence teškog lanca ili sekvence varijabilnog domena teškog lanca koja odgovara datoj kombinaciji u jednom redu navedenom u tabeli C,
(b) AB sadrži laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sekvence lakog lanca ili sekvence varijabilnog domena lakog lanca koja odgovara datoj kombinaciji u jednom redu navedenom u tabeli C, i
(c) linker i toksin sadrže linker i toksin koji odgovaraju datoj kombinaciji u jednom redu navedenom u tabeli C.
13. Farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo koje može da se aktivira prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4, 6, 7, 9, i 10, ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira prema bilo kom od patentnih zahteva 5-12 i nosač.
14. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 13 koja sadrži dodatni agens, gde opciono dodatni agens predstavlja terapijski agens.
15. Molekul izolovane nukleinske kiseline koja kodira antitelo koje može da se aktivira prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4, 6, 7, 9, i 10.
16. Vektor koji sadrži molekul izolovane nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 15.
17. Postupak za proizvodnju antitela koje može da se aktivira kultivacijom ćelije pod uslovima koji vode ekspresiji antitela ili antitela koje može da se aktivira, naznačen time, što ćelija sadrži molekul nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 15 ili vektor prema patentnom zahtevu 16.
18. Postupak za proizvodnju antitela koje može da se aktivira koje, u aktiviranom stanju, vezuje CD166, gde postupak sadrži:
(a) kultivisanje ćelije koja sadrži konstrukt nukleinske kiseline koja kodira antitelo koje može da se aktivira pod uslovima koji vode ekspresiji antitela koje može da se aktivira, gde antitelo koje može da se aktivira sadrži antitelo koje može da se aktivira prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4, 6, 7, 9, i 10;
2
(b) izdvajanje antitela koje može da se aktivira; i/ili opciono
(c) konjugovanje agensa prema patentnom zahtevu 8 sa izdvojenim antitelom koje može da se aktivira.
19. Antitelo koje može da se aktivira prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4, 6, 7, 9, i 10, konjugovano antitelo koje može da se aktivira prema bilo kom od patentnih zahteva 6-12, ili farmaceutska kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 13 ili 14, za upotrebu kao lek.
20. Antitelo koje može da se aktivira prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4, 6, 7, 9, i 10, konjugovano antitelo koje može da se aktivira prema bilo kom od patentnih zahteva 5-12, ili farmaceutska kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 13 ili 14, za upotrebu u postupku za lečenje, ublažavanje simptoma, ili odlaganje progresije poremećaja ili bolesti udružene sa ćelijama koje eksprimiraju CD166, gde je poremećaj ili bolest kancer.
21. Antitelo koje može da se aktivira, konjugovano antitelo koje može da se aktivira, ili farmaceutska kompozicija, za upotrebu prema patentnom zahtevu 20, naznačeni time, što je:
(i) kancer adenokarcinom, kancer žučnih kanala (bilijarnog trakta), kancer bešike, kancer kostiju, kancer dojke, Her2-negativni kancer dojke, trostruko-negativni kancer dojke, kancer endometrijuma, kancer dojke pozitivan na estrogenski receptor, karcinoid, kancer grlića materice, holangiokarcinom, kolorektalni kancer, kancer debelog creva, kancer endometrijuma, gliom, kancer glave i vrata, kancer skvamoznih ćelija glave i vrata, leukemija, kancer jetre, kancer pluća, nesitnoćelijski kancer pluća, sitnoćelijski kancer pluća, limfom, melanom, orofaringealni kancer, kancer jajnika, kancer pankreasa, kancer prostate, metastatski karcinom prostate otporan na kastraciju, bubrežni kancer, sarkom, kancer kože, kancer skvamoznih ćelija, kancer želuca, kancer testisa, tiroidni kancer, urogenitalni kancer, ili urotelijalni kancer; ili
(ii) kancer odabran iz grupe koja se sastoji od holangiokarcinoma, kancera endometrijuma, trostruko negativnog kancera dojke (TNBC), kancera dojke pozitivnog na estrogenski receptor, nesitnoćelijskog kancera pluća (NSCLC), karcinoma prostate, sitnoćelijskog kancera pluća (SCLC), orofaringealnog kancera, kancera grlića materice, kancera jajnika, karcinoma skvamoznih ćelija glave i vrata (HNSCC) i kancera prostate.
2 4
RS20200511A 2015-05-04 2016-05-04 Anti-cd166 antitela koja mogu da se aktiviraju i postupci za njihovu upotrebu RS60222B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562156835P 2015-05-04 2015-05-04
US201562220805P 2015-09-18 2015-09-18
EP16722502.8A EP3292150B1 (en) 2015-05-04 2016-05-04 Activatable anti-cd166 antibodies, and methods of use thereof
PCT/US2016/030785 WO2016179285A1 (en) 2015-05-04 2016-05-04 Anti-cd166 antibodies, activatable anti-cd166 antibodies, and methods of use thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS60222B1 true RS60222B1 (sr) 2020-06-30

Family

ID=55967468

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20200511A RS60222B1 (sr) 2015-05-04 2016-05-04 Anti-cd166 antitela koja mogu da se aktiviraju i postupci za njihovu upotrebu

Country Status (20)

Country Link
US (3) US10745481B2 (sr)
EP (2) EP3292150B1 (sr)
JP (2) JP7028648B2 (sr)
KR (1) KR20180010203A (sr)
CN (2) CN107849133B (sr)
AU (1) AU2016257929B2 (sr)
BR (1) BR112017023872A2 (sr)
CA (1) CA2984948A1 (sr)
DK (1) DK3292150T3 (sr)
EA (1) EA201792414A1 (sr)
ES (1) ES2796698T3 (sr)
HR (1) HRP20200721T1 (sr)
HU (1) HUE049866T2 (sr)
IL (2) IL292798A (sr)
MX (2) MX388350B (sr)
PL (1) PL3292150T3 (sr)
PT (1) PT3292150T (sr)
RS (1) RS60222B1 (sr)
SG (2) SG10201913767VA (sr)
WO (1) WO2016179285A1 (sr)

Families Citing this family (80)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9782075B2 (en) 2013-03-15 2017-10-10 I2Dx, Inc. Electronic delivery of information in personalized medicine
US11089959B2 (en) 2013-03-15 2021-08-17 I2Dx, Inc. Electronic delivery of information in personalized medicine
CN105722859B (zh) * 2013-07-25 2021-05-07 西托姆克斯治疗公司 多特异性抗体、多特异性可活化抗体及其使用方法
NZ718283A (en) 2013-09-25 2022-05-27 Cytomx Therapeutics Inc Matrix metalloproteinase substrates and other cleavable moieties and methods of use thereof
US9562073B2 (en) * 2014-01-31 2017-02-07 Cytomx Therapeutics, Inc. Matriptase and u-plasminogen activator substrates and other cleavable moieties and methods of use thereof
MA41374A (fr) * 2015-01-20 2017-11-28 Cytomx Therapeutics Inc Substrats clivables par métalloprotéase matricielle et clivables par sérine protéase et procédés d'utilisation de ceux-ci
IL292798A (en) 2015-05-04 2022-07-01 Cytomx Therapeutics Inc Anti-cd166 antibodies, activatable anti-cd166 antibodies, preparations containing them and their uses
US12128102B2 (en) 2016-03-08 2024-10-29 Takeda Pharmaceutical Company Limited Constrained conditionally activated binding proteins
CN109843327B (zh) 2016-07-07 2022-05-13 小利兰·斯坦福大学托管委员会 抗体佐剂缀合物
JP7626577B2 (ja) 2016-11-28 2025-02-07 中外製薬株式会社 リガンド結合活性が調整可能なリガンド結合分子
BR112019008727A2 (pt) 2016-11-28 2019-07-16 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha domínio de ligação ao antígeno, e polipeptídeo incluindo seção de transporte
BR112019011564A2 (pt) 2016-12-09 2019-10-22 Seattle Genetics Inc anticorpos bivalentes mascarados por hélices superenroladas
CN111133006A (zh) 2017-07-14 2020-05-08 西托姆克斯治疗公司 抗cd166抗体及其用途
CN111201030B (zh) 2017-07-25 2024-11-01 真和制药有限公司 通过阻断tim-3和其配体的相互作用治疗癌症
JP2020531430A (ja) 2017-08-16 2020-11-05 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙ 抗体を標的とする抗ｃｔｌａ４プロボディ療法
WO2019036855A1 (en) 2017-08-21 2019-02-28 Adagene Inc. Anti-cd137 molecules and use thereof
WO2019046652A1 (en) * 2017-08-30 2019-03-07 Cytomx Therapeutics, Inc. ANTI-CD166 ACTIVABLE ANTIBODIES, AND METHODS OF USE
CN111356700A (zh) 2017-09-08 2020-06-30 马弗里克治疗公司 受约束的条件性活化的结合蛋白
CN111315773A (zh) * 2017-09-08 2020-06-19 马弗里克治疗公司 含有Fc区的条件性活化的结合部分
TWI880235B (zh) 2017-11-28 2025-04-11 日商中外製藥股份有限公司 可調整配體結合活性的配體結合分子
JP7482630B2 (ja) 2017-11-28 2024-05-14 中外製薬株式会社 抗原結合ドメインおよび運搬部分を含むポリペプチド
WO2019148445A1 (en) * 2018-02-02 2019-08-08 Adagene Inc. Precision/context-dependent activatable antibodies, and methods of making and using the same
WO2019148444A1 (en) 2018-02-02 2019-08-08 Adagene Inc. Anti-ctla4 antibodies and methods of making and using the same
JP2021518603A (ja) 2018-03-20 2021-08-02 シートムエックス セラピューティクス，インコーポレイテッド 哺乳動物対象における活性化可能抗体種の定量薬理学モデリングのためのシステムおよび方法
AU2019271148B9 (en) 2018-05-14 2025-05-29 Werewolf Therapeutics, Inc. Activatable interleukin-2 polypeptides and methods of use thereof
WO2019222296A1 (en) 2018-05-14 2019-11-21 Werewolf Therapeutics, Inc. Activatable interleukin 12 polypeptides and methods of use thereof
US20210253672A1 (en) 2018-05-30 2021-08-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Ligand-binding molecule containing single domain antibody
US12331320B2 (en) 2018-10-10 2025-06-17 The Research Foundation For The State University Of New York Genome edited cancer cell vaccines
TWI897855B (zh) 2018-10-26 2025-09-21 美商免疫遺傳股份有限公司 Ｅ ｐ Ｃ Ａ Ｍ 抗體、可活化抗體及免疫偶聯物以及其用途
US20220023439A1 (en) * 2018-11-02 2022-01-27 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable anti-cd166 antibodies and methods of use thereof
CA3120327A1 (en) 2018-12-06 2020-06-11 Cytomx Therapeutics, Inc. Matrix metalloprotease-cleavable and serine or cysteine protease-cleavable substrates and methods of use thereof
WO2020180398A1 (en) * 2019-01-14 2020-09-10 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for modulating cellular internalization
WO2020160156A2 (en) 2019-01-30 2020-08-06 Immutics, Inc. Anti-gal3 antibodies and uses thereof
WO2020176672A1 (en) * 2019-02-26 2020-09-03 Cytomx Therapeutics, Inc. Combined therapies of activatable immune checkpoint inhibitors and conjugated activatable antibodies
EP4592313A3 (en) 2019-03-05 2025-11-19 Takeda Pharmaceutical Company Limited Constrained conditionally activated binding proteins
WO2020190725A1 (en) 2019-03-15 2020-09-24 Bolt Biotherapeutics, Inc. Immunoconjugates targeting her2
KR20220022112A (ko) 2019-03-21 2022-02-24 이뮤노젠 아이엔씨 세포-결합 제제-약물 콘쥬게이트를 준비하는 방법
KR102212149B1 (ko) * 2019-03-28 2021-02-04 부산대학교 산학협력단 암 줄기세포에 특이적으로 결합하는 압타머 및 이의 용도
SG11202110922QA (en) 2019-04-26 2021-10-28 Immunogen Inc Camptothecin derivatives
EP3969035A4 (en) 2019-05-14 2023-06-21 Werewolf Therapeutics, Inc. SEPARATION UNITS AND METHODS AND THEIR USE
US20220226514A1 (en) * 2019-05-17 2022-07-21 Cytomx Therapeutics, Inc. Methods and compositions for determining the biodistribution of activatable anti-cd166 antibody conjugates
WO2020246563A1 (ja) 2019-06-05 2020-12-10 中外製薬株式会社 抗体切断部位結合分子
WO2020251878A1 (en) 2019-06-11 2020-12-17 Bristol-Myers Squibb Company Anti-ctla4 antibody prodruggable (probody) at a cdr position
JP2022548310A (ja) * 2019-09-23 2022-11-17 シートムエックス セラピューティクス，インコーポレイテッド 抗ｃｄ４７抗体、活性化可能抗ｃｄ４７抗体、およびその使用方法
MX2022005666A (es) 2019-11-14 2022-10-07 Werewolf Therapeutics Inc Polipeptidos de citocina activables y metodos de uso de los mismos.
JP2023521384A (ja) 2020-04-09 2023-05-24 シートムエックス セラピューティクス，インコーポレイテッド 活性化可能抗体を含む組成物
EP4157338A4 (en) 2020-05-26 2024-11-13 TrueBinding, Inc. METHOD FOR TREATING INFLAMMATORY DISEASES BY GALECTIN-3 BLOCKING
US20240000960A1 (en) * 2020-11-16 2024-01-04 The Cleveland Clinic Foundation Anti-cd6 antibody conjugates for treating t-cell mediated disorders and t-cell lymphoma/leukemia
EP4288455A1 (en) 2021-02-03 2023-12-13 Mozart Therapeutics, Inc. Binding agents and methods of using the same
US20230174995A1 (en) 2021-10-15 2023-06-08 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable polypeptide complex
WO2023076876A1 (en) 2021-10-26 2023-05-04 Mozart Therapeutics, Inc. Modulation of immune responses to viral vectors
US20250011422A1 (en) * 2021-11-12 2025-01-09 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Siglec-6 antibodies, derivative compounds and related uses
CN114621348B (zh) * 2022-01-24 2023-09-22 深圳市乐土生物医药有限公司 一种多肽及其抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体
US20250333539A1 (en) 2022-03-23 2025-10-30 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable antigen-binding protein constructs and uses of the same
JP2025512798A (ja) 2022-03-25 2025-04-22 サイトムエックス セラピューティクス，インク． 活性化可能な二重アンカー型マスク化分子及びその使用方法
WO2023192973A1 (en) 2022-04-01 2023-10-05 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable multispecific molecules and methods of use thereof
EP4504782A2 (en) 2022-04-01 2025-02-12 CytomX Therapeutics, Inc. Cd3-binding proteins and methods of use thereof
AU2023271317A1 (en) 2022-05-16 2024-11-07 Byondis B.V. Novel masked antibodies
JP2025524628A (ja) 2022-07-12 2025-07-30 シートムエックス セラピューティクス，インコーポレイテッド Ｅｐｃａｍイムノコンジュゲート及びその使用
EP4565250A1 (en) 2022-08-01 2025-06-11 CytomX Therapeutics, Inc. Protease-cleavable substrates and methods of use thereof
JP2025525867A (ja) 2022-08-01 2025-08-07 サイトムエックス セラピューティクス，インク． プロテアーゼ切断性部分及びその使用方法
JP2025525868A (ja) 2022-08-01 2025-08-07 サイトムエックス セラピューティクス，インク． プロテアーゼ切断性部分及びその使用方法
AR130078A1 (es) 2022-08-01 2024-10-30 Cytomx Therapeutics Inc Substratos escindibles por proteasas, y métodos de uso de los mismos
JP2025525880A (ja) 2022-08-01 2025-08-07 サイトムエックス セラピューティクス，インク． プロテアーゼ切断性部分及びその使用方法
WO2024040194A1 (en) 2022-08-17 2024-02-22 Capstan Therapeutics, Inc. Conditioning for in vivo immune cell engineering
EP4695281A1 (en) 2023-04-12 2026-02-18 CytomX Therapeutics, Inc. Masking polypeptides, activatable cytokine constructs, and related compositions and methods
CN120936384A (zh) 2023-04-12 2025-11-11 西托姆克斯治疗公司 掩蔽多肽、可活化细胞因子构建体以及相关组合物和方法
WO2024216170A2 (en) 2023-04-12 2024-10-17 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable cytokine constructs and related compositions and methods
AU2024279278A1 (en) 2023-05-31 2025-12-18 Capstan Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle formulations and compositions
IL326788A (en) * 2023-08-28 2026-04-01 Pharosgen Co Ltd Anti-Duple antibody conjugates
US20250127728A1 (en) 2023-10-05 2025-04-24 Capstan Therapeutics, Inc. Constrained Ionizable Cationic Lipids and Lipid Nanoparticles
WO2025076113A1 (en) 2023-10-05 2025-04-10 Capstan Therapeutics, Inc. Ionizable cationic lipids with conserved spacing and lipid nanoparticles
WO2025149667A1 (en) 2024-01-12 2025-07-17 Pheon Therapeutics Ltd Antibody drug conjugates and uses thereof
US20250302763A1 (en) 2024-02-22 2025-10-02 Capstan Therapeutics, Inc. Immune engineering amplification
WO2025217452A1 (en) 2024-04-11 2025-10-16 Capstan Therapeutics, Inc. Constrained ionizable cationic lipids and lipid nanoparticles
WO2025217454A2 (en) 2024-04-11 2025-10-16 Capstan Therapeutics, Inc. Ionizable cationic lipids and lipid nanoparticles
WO2025240659A2 (en) 2024-05-14 2025-11-20 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable constructs, compositions and methods
WO2026020161A1 (en) 2024-07-19 2026-01-22 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable il-12 constructs and related compositions and methods
WO2026024841A1 (en) 2024-07-24 2026-01-29 Astellas Us Llc Bispecific antibodies that bind cd3 and muc1 and methods of use thereof
WO2026035650A2 (en) 2024-08-05 2026-02-12 Cytomx Therapeutics, Inc. Cleavable polypeptides and methods of use thereof

Family Cites Families (58)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4485045A (en) 1981-07-06 1984-11-27 Research Corporation Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4544545A (en) 1983-06-20 1985-10-01 Trustees University Of Massachusetts Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting
EP0279862B1 (en) 1986-08-28 1993-11-03 Teijin Limited Cytocidal antibody complex and process for its preparation
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5151510A (en) 1990-04-20 1992-09-29 Applied Biosystems, Inc. Method of synethesizing sulfurized oligonucleotide analogs
DK0752248T3 (da) 1992-11-13 2000-11-13 Idec Pharma Corp Terapeutisk anvendelse af kimæriske og radioaktivt mærkede antistoffer mod humant B-lymfocytbegrænset differentieringsantig
US5998172A (en) 1993-11-02 1999-12-07 Duke University Anti-CD6 ligand antibodies
AU9127098A (en) 1997-09-04 1999-03-22 Osiris Therapeutics, Inc. Ligands that modulate differentiation of mesenchymal stem cells
US6302855B1 (en) 1998-05-20 2001-10-16 Novo Nordisk A/S Medical apparatus for use by a patient for medical self treatment of diabetes
EP1286700A2 (en) 2000-06-01 2003-03-05 Universite Catholique De Louvain Tumor activated prodrug compounds
WO2002030460A2 (en) 2000-10-09 2002-04-18 Isis Innovation Ltd. Therapeutic antibodies
US7465790B2 (en) 2000-10-09 2008-12-16 Isis Innovation, Inc. Therapeutic antibodies
US20040048319A1 (en) 2002-05-03 2004-03-11 Mather Jennie P. ALCAM and ALCAM modulators
US20040109855A1 (en) 2002-07-23 2004-06-10 Herman Waldmann Therapeutic antibodies with reduced side effect
US8809504B2 (en) 2002-09-03 2014-08-19 Vit Lauermann Inhibitor which is deactivatable by a reagent produced by a target cell
EP2213684A3 (en) 2003-12-22 2011-05-18 Glaxo Group Limited Nogo-a antibodies for the treatment of Alzheimer disease
AU2006285850A1 (en) 2005-08-29 2007-03-08 Japan Science And Technology Agency Antibody produced using ostrich and method for production thereof
AU2006284651C1 (en) 2005-08-31 2013-09-12 The Regents Of The University Of California Cellular libraries of peptide sequences (CLiPS) and methods of using the same
US7582441B1 (en) 2005-10-17 2009-09-01 Celera Corporation Methods and compositions for treating and diagnosing disease
WO2007063825A1 (ja) 2005-11-29 2007-06-07 Japan Science And Technology Agency Cd166に対するモノクローナル抗体およびその産生方法
JP2009529522A (ja) 2006-03-10 2009-08-20 ディアト 酵素で切断可能なリンカーを介して抗体に複合された抗癌剤
JP5382692B2 (ja) 2006-07-10 2014-01-08 学校法人藤田学園 抗体の分類法、抗原の同定法、抗体又は抗体セットの取得法、抗体パネルの作成法、並びに抗体又は抗体セット及びその用途
GB0705775D0 (en) 2007-03-26 2007-05-02 Affitech As Product
JP2009055899A (ja) 2007-08-07 2009-03-19 Igaku Seibutsugaku Kenkyusho:Kk Ａｄｃｃ活性を増強させた抗体及びその製造方法
US20090304719A1 (en) 2007-08-22 2009-12-10 Patrick Daugherty Activatable binding polypeptides and methods of identification and use thereof
CA2699394C (en) 2007-09-17 2020-03-24 The Regents Of The University Of California Internalizing human monoclonal antibodies targeting prostate cancer cells in situ
RU2010138612A (ru) 2008-02-20 2012-03-27 Джи2 ИНФЛЕММЕЙШН ПТИ ЛТД (AU) ГУМАНИЗИРОВАННЫЕ АНТИТЕЛА ПРОТИВ C5аR
SG189817A1 (en) 2008-04-30 2013-05-31 Immunogen Inc Potent conjugates and hydrophilic linkers
WO2010074049A1 (ja) 2008-12-22 2010-07-01 株式会社 未来創薬研究所 抗hs6st2抗体及びその用途
RU2636046C2 (ru) 2009-01-12 2017-11-17 Сайтомкс Терапьютикс, Инк Композиции модифицированных антител, способы их получения и применения
CN102459335B (zh) 2009-04-17 2015-11-25 伊缪纳斯制药株式会社 特异性结合Aβ寡聚体的抗体及其用途
CA2761310C (en) 2009-05-07 2017-02-28 Charles S. Craik Antibodies and methods of use thereof
AU2011323316B2 (en) 2010-11-03 2016-02-25 Immunogen, Inc. Cytotoxic agents comprising new ansamitocin derivatives
US20140199233A1 (en) 2011-05-11 2014-07-17 The Regents Of The University Of California Enhanced Growth Inhibition of Osteosarcoma by Cytotoxic Polymerized Liposomal Nanoparticles Targeting the Alcam Cell Surface Receptor
BR112014020826A8 (pt) * 2012-02-24 2017-09-19 Stem Centrx Inc Anticorpo que se liga especificamente a um epítopo, ácido nucleico, vetor ou célula hospedeira, conjugado de fármaco – anticorpo, composição farmacêutica compreendendo o referido anticorpo, uso do mesmo, kit e método de preparação do conjugado
CN110078827A (zh) 2012-04-27 2019-08-02 西托姆克斯治疗公司 结合表皮生长因子受体的可活化的抗体其使用方法
US9856314B2 (en) 2012-06-22 2018-01-02 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable antibodies having non-binding steric moieties and methods of using the same
EP2882844B1 (en) 2012-08-10 2018-10-03 Cytomx Therapeutics Inc. Protease-resistant systems for polypeptide display and methods of making and using thereof
CA2894879A1 (en) 2012-12-19 2014-06-26 Amplimmune, Inc. B7-h4 specific antibodies, and compositions and methods of use thereof
CN105008918A (zh) 2013-01-04 2015-10-28 西托姆克斯治疗公司 用于检测生物系统中的蛋白酶活性的组合物和方法
EP3566750A3 (en) 2013-02-28 2020-04-08 ImmunoGen, Inc. Conjugates comprising cell-binding agents and cytotoxic agents
KR20160018579A (ko) 2013-06-04 2016-02-17 싸이톰스 테라퓨틱스, 인크. 활성화가능 항체를 접합하기 위한 조성물 및 방법
CN105722859B (zh) * 2013-07-25 2021-05-07 西托姆克斯治疗公司 多特异性抗体、多特异性可活化抗体及其使用方法
IL292798A (en) 2015-05-04 2022-07-01 Cytomx Therapeutics Inc Anti-cd166 antibodies, activatable anti-cd166 antibodies, preparations containing them and their uses
WO2017015227A1 (en) 2015-07-17 2017-01-26 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods of treating cd166-expressing cancer
SG11201803145RA (en) 2015-11-04 2018-05-30 Fate Therapeutics Inc Methods and compositions for inducing hematopoietic cell differentiation
US10562975B2 (en) 2016-06-15 2020-02-18 The Regents Of The University Of Michigan CD6 antibody for treatment of T-cell mediated diseases or disorders
JP6183523B2 (ja) 2016-09-14 2017-08-23 株式会社アンセイ 車両用開閉体の開閉装置及び車両用開閉体の開閉装置用リンク機構
US12447213B2 (en) 2016-10-07 2025-10-21 The Broad Institute, Inc. Modulation of novel immune checkpoint targets
US11376332B2 (en) 2016-10-15 2022-07-05 Baylor College Of Medicine Platform for enhanced targeted delivery
CN110914302A (zh) 2017-06-01 2020-03-24 赛托姆克斯治疗学股份有限公司 可活化抗pdl1抗体及其使用方法
CN111133006A (zh) 2017-07-14 2020-05-08 西托姆克斯治疗公司 抗cd166抗体及其用途
WO2019046652A1 (en) 2017-08-30 2019-03-07 Cytomx Therapeutics, Inc. ANTI-CD166 ACTIVABLE ANTIBODIES, AND METHODS OF USE
US20220023439A1 (en) 2018-11-02 2022-01-27 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable anti-cd166 antibodies and methods of use thereof
WO2020176672A1 (en) 2019-02-26 2020-09-03 Cytomx Therapeutics, Inc. Combined therapies of activatable immune checkpoint inhibitors and conjugated activatable antibodies

Also Published As

Publication number Publication date
CN107849133A (zh) 2018-03-27
SG10202110908WA (en) 2021-11-29
PT3292150T (pt) 2020-06-01
JP2018520091A (ja) 2018-07-26
MX388350B (es) 2025-03-19
US20200291113A1 (en) 2020-09-17
KR20180010203A (ko) 2018-01-30
EA201792414A1 (ru) 2018-06-29
AU2016257929B2 (en) 2022-10-20
CA2984948A1 (en) 2016-11-10
IL255414A0 (en) 2017-12-31
EP3708585A1 (en) 2020-09-16
US11753466B2 (en) 2023-09-12
US20160355587A1 (en) 2016-12-08
HUE049866T2 (hu) 2020-11-30
US20240076374A1 (en) 2024-03-07
EP3292150B1 (en) 2020-02-05
JP7028648B2 (ja) 2022-03-02
MX2021014735A (es) 2022-01-18
IL292798A (en) 2022-07-01
AU2016257929A1 (en) 2017-11-30
ES2796698T3 (es) 2020-11-30
DK3292150T3 (da) 2020-04-27
IL255414B (en) 2022-06-01
MX2017014136A (es) 2018-07-06
HRP20200721T1 (hr) 2020-10-02
CN107849133B (zh) 2022-08-23
PL3292150T3 (pl) 2020-07-13
HK1250036A1 (en) 2018-11-23
SG10201913767VA (en) 2020-03-30
US10745481B2 (en) 2020-08-18
EP3292150A1 (en) 2018-03-14
BR112017023872A2 (pt) 2018-07-24
CN115340607A (zh) 2022-11-15
JP2022065115A (ja) 2022-04-26
WO2016179285A1 (en) 2016-11-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240076374A1 (en) Anti-cd166 antibodies, activatable anti-cd166 antibodies, and methods of use thereof
TWI855012B (zh) 基質金屬蛋白酶可切割且絲胺酸蛋白酶或半胱胺酸蛋白酶可切割之受質和彼之使用方法
US10233244B2 (en) Anti-ITGA3 antibodies, activatable anti-ITGA3 antibodies, and methods of use thereof
JP2024170436A (ja) マトリックスメタロプロテアーゼ切断可能及びセリンプロテアーゼ切断可能な基質並びにそれらの使用方法
US20220233705A1 (en) Combined therapies of activatable immune checkpoint inhibitors and conjugated activatable antibodies
JP2022548310A (ja) 抗ｃｄ４７抗体、活性化可能抗ｃｄ４７抗体、およびその使用方法
KR20190134654A (ko) Cd147 항체, 활성화가능한 cd147 항체, 그리고 이를 만들고, 이용하는 방법
KR20200058406A (ko) 활성화 가능한 항-cd166 항체 및 이의 사용 방법
JP2018520991A (ja) 抗ｃｄ７１抗体、活性化可能抗ｃｄ７１抗体、およびその使用方法
EP3762420A1 (en) Activatable cd147 antibodies and methods of making and use thereof
HK40038123A (en) Anti-cd166 antibodies, activatable anti-cd166 antibodies, and methods of use thereof
HK1250036B (en) Activatable anti-cd166 antibodies, and methods of use thereof
EA041958B1 (ru) Антитела против cd166, активируемые антитела против cd166 и способы их применения