RS60256B1 - Antitela i konjugati protiv teihoinske kiseline zida - Google Patents

Antitela i konjugati protiv teihoinske kiseline zida

Info

Publication number
RS60256B1
RS60256B1 RS20200548A RSP20200548A RS60256B1 RS 60256 B1 RS60256 B1 RS 60256B1 RS 20200548 A RS20200548 A RS 20200548A RS P20200548 A RSP20200548 A RS P20200548A RS 60256 B1 RS60256 B1 RS 60256B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
seq
antibiotic
conjugate compound
aac
Prior art date
Application number
RS20200548A
Other languages
English (en)
Inventor
Eric Brown
Martine Darwish
John Flygare
Wouter Hazenbos
Byoung-Chul Lee
Sophie M Lehar
Sanjeev Mariathasan
John Hiroshi Morisaki
Thomas H Pillow
Leanna Staben
Richard Vandlen
Klaus Koefoed
Magnus Strandh
Peter S Andersen
Original Assignee
Genentech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US14/284,609 external-priority patent/US20140356375A1/en
Priority claimed from PCT/US2014/039113 external-priority patent/WO2014193722A1/en
Application filed by Genentech Inc filed Critical Genentech Inc
Publication of RS60256B1 publication Critical patent/RS60256B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1267—Gram-positive bacteria
    • C07K16/1271—Micrococcaceae (F); Staphylococcaceae (F), e.g. Staphylococcus (G)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6807—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug or compound being a sugar, nucleoside, nucleotide, nucleic acid, e.g. RNA antisense
    • A61K47/6809—Antibiotics, e.g. antitumor antibiotics anthracyclins, adriamycin, doxorubicin or daunomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/522—CH1 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/624—Disulfide-stabilized antibody (dsFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Opis
UPUĆIVANJE NA POVEZANE PATENTNE PRIJAVE
[0001] Ova aplikacija tvrdi prednost prioriteta serijski br. patentne prijave SAD 14/284,609, podneto 22. maja 2014., što nije privremena patentna prijava podnesena pod 37 CFR §1.53 (b), zahteva korist pod 35 USC §119(e) od serijski br. patentne prijave SAD 61/829,461 podneto 31. maja 2013.
PODNOŠENJE SPISKA SEKVENCI NA ASCII TEKSTUALNOJ DATOTECI
[0002] Sadržaj sledećeg podnošenja u ASCII tekstualnoj datoteci ovde je inkorporiran referencom u celosti: računarski čitljiv obrazac (CRF) liste sekvenci (naziv datoteke: P4960R2WO_PCTSekuenceListing.txt, zabeleženo datuma: 30. maja 2014., veličina: 195,240 bajtova).
OBLAST PRONALASKA
[0003] Pronalazak se odnosi na antitela protiv tehionske kiseline zida („anti-WTA“) konjugovana na antibiotike tipa rifamicin i na upotrebu dobijenih konjugata antitelo-antibiotik u lečenju infektivnih bolesti.
POZADINA PRONALASKA
[0004] Patogene bakterije su značajan uzrok bolesti i smrti i kod ljudi i kod životinja. Istaknuta među njima je Staphylococcus aureus (S. aureus; SA) koja je vodeći uzrok bakterijskih infekcija kod ljudi širom sveta. S. aureus može izazvati niz bolesti, od manjih kožnih infekcija do bolesti opasnih po život, kao što su upala pluća, meningitis, osteomijelitis, endokarditis, sindrom toksičnog šoka (TSS), bakteremija i sepsa. Učestalost mu je od kože, mekih tkiva, respiratornih, koštanih, zglobova, endovaskularnih do infekcija rana. I dalje je jedna od pet najčešćih uzroka nozokomijalnih infekcija i često je uzrok post-hirurških infekcija rana. Svake godine oko 500000 pacijenata u američkim bolnicama oboli od stafilokokne infekcije.
[0005] Tokom poslednjih nekoliko decenija S. aureus infekcija postaje sve teža za lečenje pretežno zbog pojave S. aureusa rezistentnog na meticilin (MRSA) koji je rezistentan na sve poznate beta-laktamske antibiotike (Boucher, H.W. i dr.. Bad bugs, no drugs: no ESKAPE! An update from the Infectious Diseases Society of America. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America 48, 1-12 (2009)). Okolnosti su toliko akutne da je do 2005. godine, zabeleženo da je infekcija MRSA-om vodeći uzrok smrti zbog jednog infektivnog sredstva - odgovornog za preko 15,000 smrti u Sjedinjenim Državama (DeLeo, F.R. & Chambers, H.F. Reemergence of antibioticresistant Staphylococcus aureus in the genomics era. The Journal of Clinical Investigation 119:2464-2474 (2009)). Vankomicin, linezolid i daptomicin postali su antibiotici izbora za lečenje invazivnih MRSA infekcija (Boucher, H., Miller, L.G. & Razonable, R.R. Serious infections caused by methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America 51 Suppl 2, S183-197 (2010)). Međutim, smanjena osetljivost na vankomicin i unakrsna rezistencija na linezolid i daptomicin takođe su prijavljeni u kliničkim sojevima MRSA (Nannini, E., Murray, B.E. & Arias, C.A. Resistance or decreased susceptibility to glycopeptides, daptomycin, and linezolid in methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Current opinion in pharmacology 10, 516-521 (2010)). Vremenom, doza vankomicina neophodna za prevazilaženje otpornosti povećala se na nivoe gde se javlja nefrotoksičnost. Dakle, mortalitet i morbiditet od invazivnih MRSA infekcija i dalje su visoki uprkos ovim antibioticima.
[0006] Iako se SA smatra da je vanćelijski patogen, istraživanja koja su trajala najmanje 50 godina otkrila su njegovu sposobnost da inficira i opstane u različitim vrstama ćelija domaćina, i profesionalnim fagocitima i nefagocitnim ćelijama (Gresham, H.D. i dr.. Survival of Staphylococcus aureus inside neutrophils contributes to infection. J Immunol 164, 3713-3722 (2000); Anwar, S., Prince, L.R., Foster, S.J., Whyte, M.K. & Sabroe, I. The rise and rise of Staphylococcus aureus: laughing in the face of granulocytes. Clinical and Experimental Immunology 157, 216-224 (2009); Fraunholz, M. & Sinha, B. Intracellular staphylococcus aureus: Live-in and let die. Frontiers in cellular and infection microbiology 2, 43 (2012); Garzoni, C. & Kelley, W.L. Return of the Trojan horse: intracellular phenotype switching and immune evasion by Staphylococcus aureus. EMBO molecular medicine 3:115-117 (2011)). Ova fakultativna unutarćelijska upornost omogućava imunološku evaziju domaćina, dugotrajnu kolonizaciju domaćina, održavanje hronično inficiranog stanja i verovatno je uzrok kliničkih neuspeha i relapsa posle konvencionalne antibiotske terapije. U nastavku, izlaganje unutarćelijskih bakterija suboptimalnim koncentracijama antibiotika može podstaći pojavu sojeva otpornih na antibiotike, čineći ovaj klinički problem akutnijim. Dosledno sa ovim zapažanjima, lečenje pacijenata sa invazivnom MRSA infekcijom, poput bakteremije ili endokarditisa vankomicinom ili daptomicinom, bilo je povezano sa stopom neuspeha većom od 50% (Kullar, R., Davis, S.L., Levine, D.P. & Rybak, M.J. Impact of vancomycin exposure on outcomes in patients with methicillin-resistant Staphylococcus aureus bacteremia: support for consensus guidelines suggested targets. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America 52, 975-981 (2011); Fowler, V.G., Jr. i dr.. Daptomycin versus standard therapy for bacteremia and endocarditis caused by Staphylococcus aureus. The New England journal of medicine 355, 653-665 (2006); Yoon, Y.K., Kim, J.Y., Park, D.W., Sohn, J.W. & Kim, M.J. Predictors of persistent methicillin-resistant Staphylococcus aureus bacteraemia in patients treated with vancomycin. The Journal of antimicrobial chemotherapy 65:1015-1018 (2010)). Zbog toga, uspešnija antistafilokokna terapija treba da uključi eliminaciju unutarćelijskih bakterija.
[0007] Većina današnjih antibakterijskih sredstava hemijski je polisintetička modifikacija različitih prirodnih jedinjenja. Tu spadaju, na primer, beta-laktamski antibakterijski lekovi, koji uključuju peniciline (proizvedene gljivicama iz roda Penicillium), cefalosporine i karbapeneme. Antimikrobna jedinjenja koja su još uvek izolovana od živih organizama uključuju aminoglikozide, dok se drugi antibakterijski lekovi - na primer, sulfonamidi, hinoloni i oksazolidinoni, proizvode isključivo hemijskom sintezom. U skladu s tim, mnoga antibakterijska jedinjenja su klasifikovana na osnovu hemijskog/biosintetskog porekla u prirodna, polusintetička i sintetička. Drugi sistem klasifikacije zasnovan je na biološkoj aktivnosti; u ovoj klasifikaciji, antibakterijski lekovi su podeljeni u dve široke grupe prema svom biološkom dejstvu na mikroorganizme: baktericidna sredstva ubijaju bakterije, a bakteriostatska sredstva usporavaju ili zaustavljaju rast bakterija.
[0008] Ansamicini su klasa antibiotika, uključujući rifamicin, rifampin, rifampicin, rifabutin, rifapentin, rifalazil, ABI-1657 i njihove analoge, koji inhibiraju bakterijsku RNK polimerazu i imaju izuzetnu moć protiv gram-pozitivnih i selektivnih gram-negativnih bakterija (Rothstein, D.M., i dr. (2003) Expert Opin. Invest. Drugs 12(2):255-271; US 7,342,011; US 7,271,165).
[0009] Zabeležene su imunoterapije za sprečavanje i lečenje infekcija S. aureus (uključujući MRSA). US2011/0262477 odnosi se na upotrebu bakterijskih adhezionih proteina Eap, Emp i AdsA kao vakcine za podsticanje imunološkog odgovora protiv MRSA. WO2000071585 opisuje izolovana monoklonska antitela koja su reaktivna na specifične izolate soja S. aureus. US20110059085A1 predlaže strategiju zasnovanu na Ab, koja koristi IgM Abs specifičan za jedan ili više SA kapsularnih antigena, iako nisu opisana stvarna antitela.
[0010] Teihoinske kiseline (TA) su bakterijski polisaharidi koji se nalaze unutar ćelijskog zida grampozitivnih bakterija uključujući SA. Teihoinske kiseline zida (WTA) su one kovalentno povezane sa peptidoglikanskim (PDG) slojem ćelijskog zida; dok su lipoteihoinske kiseline (LTA) kovalentno povezane sa lipidima citoplazmatske membrane. Xia i dr. (2010) Intl. J. Med. Microbiol. 300:148-54. Ovi glikopolimeri igraju ključnu ulogu u preživljavanju bakterija u nepovoljnim uslovima i u drugim osnovnim ćelijskim procesima. Poznate WTA strukture veoma se razlikuju između bakterijskih vrsta. S aureus TA se sastoje od ponavljajućih podjedinica poliol fosfata, poput ribitol fosfata ili glicerol fosfata. S obzirom na njihovu strukturnu raznolikost i varijabilnost, WTA se smatraju privlačnim metama za antitela i kao vakcine, ibid.
[0011] Konjugati antitelo-lek (ADC), takođe poznati kao imunokonjugati, su ciljani hemoterapeutski molekuli koji kombinuju idealna svojstva i antitela i citotoksičnih lekova ciljajući moćne citotoksične lekove na tumorske ćelije koje ispoljavaju antigen (Teicher, B.A. (2009) Curr. Cancer Drug Targets 9:982-1004), thereby enhancing the therapeutic index by maximizing efficacy and minimizing off-target toxicity (Carter, P.J. and Senter P.D. (2008) The Cancer J..14(3):154-169; Chari, R.V. (2008) Acc. Chem. Res.41:98-107. ADC sadrži ciljno antitelo kovalentno vezano preko jedinice za vezu na citotoksični deo leka. Imunokonjugati omogućavaju ciljano isporučivanje dela leka tumoru i intracelularno nakupljanje u njemu, pri čemu sistemska primena nekonjugovanih lekova može da rezultira neprihvatljivim nivoom toksičnosti za normalne ćelije, kao i ćelije tumora koje se žele eliminisati (Polakis P. (2005) Curr. Opin. Pharmacol.5:382-387). Efikasan razvoj ADC za određeni ciljani antigen zavisi od optimizacije parametara poput nivoa ekspresije ciljnog antigena, pristupačnosti tumora (Kovtun, Y.V. and Goldmacher V.S. (2007) Cancer Lett. 255:232-240), stabilnost veznika (Erickson i dr. (2006) Cancer Res. 66(8):4426-4433; Doronina i dr. (2006) Bioconjugate Chem.
17:114-124; Alley i dr. (2008) Bioconjugate Chem. 19:759-765), citotoksični mehanizam delovanja leka i potencija, punjenje lekova (Hamblett i dr. (2004) Clin. Cancer Res.10:7063-7070) i način konjugacije vezniklek sa antitelom (Lyon, R. i dr. (2012) Methods in Enzym.502:123-138; Xie i dr. (2006) Expert. Opin. Biol. Ther. 6(3):281-291; Kovtun i dr. (2006) Cancer Res. 66(6):3214-3121; Law i dr. (2006) Cancer Res.
66(4):2328-2337; Wu i dr. (2005) Nature Biotech. 23(9):1137-1145; Lambert J. (2005) Current Opin. in Pharmacol. 5:543-549; Hamann P. (2005) Expert Opin. Ther. Patents 15(9):1087-1103; Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207-212; Trail i dr. (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Res.19:605-614).
[0012] Koncept ADC u terapiji raka takođe je proširen na antibakterijsku terapiju, u ovom slučaju deo leka je antibiotik, što rezultira antitelom-antibiotičkim konjugatom (AAC). US 5545721 i US 6660267 opisuju sintezu nespecifičnog konjugata imunoglobulin-antibiotik koji se vezuje za površinu ciljnih bakterija preko antibiotika i koristi ih za lečenje sepse. US 7569677 i srodni patenti predlažu antitela konjugovana sa antibioticima koja imaju deo koji vezuje antigen specifičan za bakterijski antigen (kao što je SA kapsularni polisaharid), ali nemaju konstantni region koji reaguje sa bakterijskim proteinima koji vezuju Fc (npr., stafilokokni protein A).
[0013] WO 2004/050846 opisuje upotrebu sastava koji sadrže anti-WTA antitela za upotrebu kao vakcine za lečenje stafilokoknih infekcija vezivanjem na S. aureus za blokiranje infekcije.
[0014] US 6,322,788 opisuje antitela koja su sposobna da se vezuju za bakterijski antigen kojem nedostaje sposobnost da se vezuju za bakterijske Fc vezujuće proteine.
[0015] WO 2006/081711 opisuje konjugate antitela i leka koristeći auristatin peptide, uključujući MeVal-Val-Dil-Dap-Norefedrin (MMAE) i MeVal-Val-Dil-Dap-Phe (MMAF).
REZIME PRONALASKA
[0016] Pronalazak je definisan u priloženim patentnim zahtevima.
[0017] Bilo koji primer u saglasnosti sa pronalaskom kako je definisan u patentnim zahtevima formira oblik izvođenja pronalaska.
[0018] Pronalazak obezbeđuje sastave koji se nazivaju "antitelo-antibiotički konjugati" ili "AAC") koji sadrže antitelo konjugovano kovalentnim vezanom za jedan ili više delova antibiotika tipa rifamicin, kako je navedeno u patentnim zahtevima.
[0019] Konjugati antitela-antibiotika predmetnog pronalaska mogu da koriste monoklonsko antitelo anti-WTA, koji sadrži
lanac i H lanac, L lanac koji sadrži CDR L1, CDR L2 i CDR L3 i H lanac koji sadrži CDR H1, CDR H2 i CDR H3, gde CDR L1, CDR L2, i CDR L3 i CDR H1, CDR H2 i CDR H3 sadrže aminokiselinske sekvence CDR svakog od Abs 4461 (SEQ ID NO. 1-6), 4624 (SEQ ID NO. 7-12), 4399 (SEQ ID NO. 13-18), i 6267 (SEQ ID NO.19-24) respektivno, kao što je prikazano u Tabelama 6A i 6B.
[0020] U jednom primeru, izolovano anti-WTA monoklonsko antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca koja sadrži varijabilni region teškog lanca (VH), pri čemu VH sadrži najmanje 95% identitet sekvence po dužini VH regiona odabranog iz VH sekvence SEQ ID NO.26, SEQ ID NO.28, SEQ ID NO.30, SEQ ID NO.32 antitela 4461, 4624, 4399 i 6267, respektivno. U jednom primeru, ovo antitelo dalje sadrži varijabilni region L lanca (VL) gde VL sadrži najmanje 95% identičnost sekvence dužine VL regiona odabranog iz VL sekvence SEQ ID NO.25, SEQ ID NO.27 SEQ ID NO.29, SEQ ID NO.31 antitela 4461, 4624, 4399 i 6267, respektivno. U drugom primeru, izolovano anti-VTA monoklonsko antitelo sadrži varijabilni region L lanca (VL) gde VL sadrži najmanje 95% identitet sekvence dužine VL regiona odabranog iz VL sekvence SEQ ID NO.25, SEQ ID NO.27, SEQ ID NO.29, SEQ ID NO.31 antitela 4461, 4624, 4399 i 6267, respektivno. U bilo kojem od prethodnih primera, identitet sekvence može biti 96%, 97%, 98%, 99% ili 100%.
[0021] U konkretnijim primerima, antitelo sadrži:
(i) VL SEQ ID NO.25 i VH SEQ ID NO.26;
(ii) VL SEQ ID NO.27 i VH SEQ ID NO.28;
(iii) VL SEQ ID NO.29 i VH SEQ ID NO.30; ili
(iv) VL SEQ ID NO.31 i VH SEQ ID NO.32.
[0022] U nekim primerima, izolovano anti-WTA (teihoinska kiselina zida) monoklonsko antitelo koje sadrži laki (L) lanac i teški (H) lanac, gde:
(a) L lanac koji sadrži CDR L1 koji sadrži sekvencu KSSQSVLSRANNNYYVA (SEQ ID NO:1), CDR L2 sadrži sekvencu WASTREF (SEQ ID NO:2), i CDR L3 sadrži sekvencu QQYYTSRRT (SEQ ID NO:3); i H lanac koji sadrži CDR H1 koji sadrži sekvencu DYYMH (SEQ ID NO:4), CDR H2 sadrži sekvencu WINPKSGGTNYAQRFQG (SEQ ID NO:5), i CDR H3 sadrži sekvencu DCGSGGLRDF (SEQ ID NO:6);
(b) L lanac koji sadrži CDR L1 koji sadrži sekvencu RSNQNLLSSSNNNYLA (SEQ ID NO:7), CDR L2 sadrži sekvencu WASTRES (SEQ ID NO:8), i CDR L3 sadrži sekvencu QQYYANPRT (SEQ ID NO:9); i H lanac koji sadrži CDR H1 koji sadrži sekvencu DYYIH (SEQ ID NO:10), CDR H2 sadrži sekvencu WINPNTGGTYYAQKFRD (SEQ ID NO:11), i CDR H3 sadrži sekvencu DCGRGGLRDI (SEQ ID NO:12);
(c) L lanac koji sadrži CDR L1 koji sadrži sekvencu KSNQNVLASSNDKNYLA (SEQ ID NO:13), CDR L2 sadrži sekvencu WASIRES (SEQ ID NO:14), i CDR L3 sadrži sekvencu QQYYTNPRT (SEQ ID NO:15); i H lanac koji sadrži CDR H1 koji sadrži sekvencu DYYIH (SEQ ID NO:16), CDR H2 sadrži sekvencu WINPNTGGTNYAQKFQG (SEQ ID NO:17), i CDR H3 sadrži sekvencu DCGNAGLRDI (SEQ ID NO:18); ili
(d) L lanac koji sadrži CDR L1 koji sadrži sekvencu KSSQNVLYSSNNKNYLA (SEQ ID NO:19), CDR L2 sadrži sekvencu WASTRES (SEQ ID NO:20), i CDR L3 sadrži sekvencu QQYYTSPPYT (SEQ ID NO:21); i H lanac koji sadrži CDR H1 koji sadrži sekvencu SYWIG (SEQ ID NO:22), CDR H2 sadrži sekvencu IIHPGDSKTRYSPSFQG (SEQ ID NO:23), i CDR H3 sadrži sekvencu LYCSGGSCYSDRAFSSLGAGGYYYYGMGV (SEQ ID NO:24).
[0023] U bilo kojem od prethodnih otelotvorenja, antitelo može biti fragment koji vezuje antigen koji nedostaje Fc region. U nekim otelotvorenjima, antitelo je F(ab) ili F(ab')2. U nekim otelotvorenjima, antitelo dalje sadrži konstantni region teškog lanca i/ili konstantni region lakog lanca, pri čemu konstantni region teškog lanca i/ili konstantni region lakog lanca sadrži jednu ili više aminokiselina koje su supstituisane cisteinskim ostacima. U nekim otelotvorenjima, konstantni region teškog lanca sadrži supstituciju aminokiselina A118C i/ili S400C, i/ili konstantni region lakog lanca sadrži supstituciju aminokiselinama V205C, pri čemu je numerisanje prema EU numerisanju. U nekim primerima, konstantni region teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:149 i/ili konstantni region lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:151. U nekim primerima, konstantni region teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:149 i konstantni region lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:150. U nekim primerima, konstantni region teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:148 i konstantni region lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:151.
[0024] U jednom aspektu, Ab bilo kojeg od prethodnih ostvarenja vezuje WTA alfa.
[0025] U drugom aspektu, pronalazak koristi izolovano anti-WTA monoklonsko antitelo koje sadrži laki lanac i H lanac, L lanac koji sadrži CDR L1, CDR L2 i CDR L3 i/ili lanac H koji sadrži CDR H1, CDR H2 i CDR H3, pri čemu CDR L1, CDR L2 i CDR L3 i CDR H1, CDR H2 i CDR H3 sadrže aminokiselinske sekvence odgovarajućih CDR svakog od Abs prikazanih na Slici 14 (SEQ ID NO. 33-110). U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje izolovano anti-WTA monoklonsko antitelo koje sadrži laki lanac i H lanac, L lanac koji sadrži CDR L1, CDR L2 i CDR L3 i/ili lanac H koji sadrži CDR H1, CDR H2 i CDR H3, pri čemu CDR L1, CDR L2 i CDR L3 i CDR H1, CDR H2 i CDR H3 sadrže aminokiselinske sekvence odgovarajućih CDR svakog od Abs prikazanih na Slici 15A, 15B, 16A i 16B (antitela 6078, 6078.v2HC-Cys, 6078.v2LC-Cys, 6078.v3HC-Cys, 6078.v3LC-Cys, 6078.v4HC-Cys, 6078.v4LC-Cys, 6078.v4HCLC-Cys, 4497, 4497.v8HC-Cys, 4497.v8LC-Cys, i 4497.v8HCLC-Cys). U specifičnom otelotvorenju ovi Abs vezuju WTA beta.
[0026] U drugom aspektu, pronalazak koristi izolovano anti-WTA monoklonsko antitelo, konkretno anti-WTA beta monoklonsko antitelo koje sadrži promenljivi region L lanca (VL) gde VL sadrži najmanje 95% identičnosti sekvence po dužini odabranog VL regiona iz VL sekvence koja odgovara svakom od antitela 6078, 6263, 4450, 6297, 6239, 6232, 6259, 6292, 4462, 6265, 6253, 4497 i 4487, kako je prikazano na Slikama 17A-1 do 17A-2 na Kabat pozicijama 1-107. U sledećim primerima, antitelo dalje sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži varijabilni region teškog lanca (VH), pri čemu VH sadrži najmanje 95% identičnosti sekvence po dužini VH regiona odabranog od VH sekvenci koje odgovaraju svakom od antitela 6078, 6263, 4450, 6297, 6239, 6232, 6259, 6292, 4462, 6265, 6253, 4497 i 4487 respektivno, kao što je prikazano na Slikama 17B-1 do 17B-2 na Kabat pozicijama 1-113. U bilo kojem od prethodnih otelotvorenja, identitet sekvence može biti 96%, 97%, 98%, 99% ili 100%. U konkretnijem primeru antitela, VH sadrži sekvencu SEQ ID NO.112 i VL sadrži SEQ ID NO.111.
[0027] U drugom aspektu, pronalazak koristi izolovano anti-WTA monoklonsko antitelo, konkretno anti-WTA beta monoklonsko antitelo koje sadrži promenljivi region L lanca (VL) gde VL sadrži najmanje 95% identičnosti sekvence po dužini odabranog VL regiona iz VL sekvence koja odgovara svakom od antitela kao što je prikazano na Slikama 15A ili 16A (antitela 6078, 6078.v2HC-Cys, 6078.v2LC-Cys, 6078.v3HC-Cys, 6078.v3LC-Cys, 6078.v4HC-Cys, 6078.v4LC-Cys, 6078.v4HCLC-Cys, 4497, 4497.v8HC-Cys, 4497.v8LC-Cys, i 4497.v8HCLC-Cys) na Kabat pozicijama 1-107. U sledećim primerima, antitelo dalje sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži varijabilni region teškog lanca (VH), pri čemu VH sadrži najmanje 95% identičnosti sekvence po dužini VH regiona odabranog od VH sekvenci koje odgovaraju svakom od antitela kao što je prikazano na Slikama 15B i 16B (antitela 6078, 6078.v2HC-Cys, 6078.v2LC-Cys, 6078.v3HC-Cys, 6078.v3LC-Cys, 6078.v4HC-Cys, 6078.v4LC-Cys, 6078.v4HCLC-Cys, 4497, 4497.v8HC-Cys, 4497.v8LC-Cys, i 4497.v8HCLC-Cys) na Kabat pozicijama 1-113. U bilo kojem od prethodnih otelotvorenja, identitet sekvence može biti 96%, 97%, 98%, 99% ili 100%. U dodatnom otelotvorenju, ovo antitelo nadalje sadrži VL koji ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO.119.
[0028] Varijante H i L lanca zasnovanih na anti-WTA beta Cys mogu biti sparene u bilo kojoj od sledećih kombinacija da bi se formirao potpuni Abs za konjugaciju sa međujedinjenjima veznik-Abx da bi se generisali anti-WTA AAC pronalaska. U jednom aspektu, L lanac sadrži sekvencu SEQ ID NO.121, a H lanac sadrži sekvencu SEQ ID NO. 124. U drugom otelotvorenju, izolovano antitelo sadrži L lanac SEQ ID NO.123 i H lanac koji sadrži sekvencu SEQ ID N0.124 ili SEQ ID NO.157. U posebnom otelotvorenju, anti-WTA beta antitelo kao i anti-WTA beta AAC pronalaska sadrži L lanac SEQ ID NO.123.
[0029] Još jedan primer je antitelo koje se vezuje za isti epitop kao i svaki od anti-WTA alfa Abs sa Slike 13A i Slike 13B. Takođe je obezbeđeno antitelo koje se vezuje na isti epitop kao i svaki od anti-WTA beta Abs sa Slike 14, Slike 15A i 15B, Slike 16A i 16B i Slike 17A i 17B.
[0030] U sledećem otelotvorenju, anti-WTA beta i anti-WTA alfa antitela predmetnog pronalaska su fragmenti koji vezuju antigen koji nedostaju Fc region, poželjno F(ab')2ili F(ab). Prema tome, predmetni pronalazak obezbeđuje konjugate antitela-antibiotika gde je WTA antitelo F(ab')2ili F(ab).
[0031] U drugom aspektu, pronalazak koristi anti-WTA monoklonsko antitelo koje se vezuje za WTA beta.
[0032] U nekim primerima, izolovano anti-WTA (teihoinska kiselina zida) monoklonsko antitelo koje sadrži laki (L) lanac i teški (H) lanac, gde:
(a) L lanac koji sadrži CDR L1 koji sadrži sekvencu KSSQSIFRTSRNKNLLN (SEQ ID NO:99), CDR L2 sadrži sekvencu WASTRKS (SEQ ID NO:100), i CDR L3 sadrži sekvencu QQYFSPPYT (SEQ ID NO:101); i H lanac koji sadrži CDR H1 koji sadrži sekvencu SFWMH (SEQ ID NO:102), CDR H2 sadrži sekvencu FTNNEGTTTAYADSVRG (SEQ ID NO:103), i CDR H3 sadrži sekvencu GDGGLDD (SEQ ID NO:104); ili
(b) L lanac koji sadrži CDR L1 koji sadrži sekvencu KSSQSIFRTSRNKNLLN (SEQ ID NO:99), CDR L2 sadrži sekvencu WASTRKS (SEQ ID NO:100), i CDR L3 sadrži sekvencu QQYFSPPYT (SEQ ID NO:101); i H lanac koji sadrži CDR H1 koji sadrži sekvencu SFWMH (SEQ ID NO:102), CDR H2 sadrži sekvencu FTNNEGTTTAYADSVRG (SEQ ID NO:103), i CDR H3 sadrži sekvencu GEGGLDD (SEQ ID NO:118).
[0033] U nekim otelotvorenjima, izolovano anti-WTA monoklonsko antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca (VH), pri čemu VH sadrži sekvencu aminokiselina koja ima najmanje 95% identičnosti sekvence po dužini VH sekvence SEQ ID NO.120 ili SEQ ID NO.156. U nekim otelotvorenjima, antitelo dalje sadrži varijabilni region lakog lanca (VL), pri čemu VL sadrži sekvencu aminokiselina koja ima najmanje 95% identičnosti sekvence po dužini VL sekvence SEQ ID NO.119. U nekim otelotvorenjima, izolovano anti-WTA monoklonsko antitelo koje sadrži varijabilni region lakog lanca (VL), pri čemu VL sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 95% identičnosti sekvence po dužini VL sekvence SEQ ID NO.119. U bilo kojem od prethodnih otelotvorenja, identičnost sekvence može biti 96%, 97%, 98%, 99% ili 100%. U nekim otelotvorenjima, izolovano anti-WTA monoklonsko antitelo koje sadrži varijabilni region lakog lanca (VL) i varijabilni region teškog lanca (VH), pri čemu VL sadrži sekvencu SEQ ID NO.119, a VH sadrži sekvencu SEQ ID N0.120 ili SEQ ID NO.156.
[0034] U nekim otelotvorenjima opisanim iznad, antitelo je fragment koji vezuje antigen kojem nedostaje Fc region. U nekim otelotvorenjima, antitelo je F (ab) ili F(ab')2. U nekim otelotvorenjima, antitelo dalje sadrži konstantni region teškog lanca i/ili konstantni region lakog lanca, pri čemu konstantni region teškog lanca i/ili konstantni region lakog lanca sadrži jednu ili više aminokiselina koje su supstituisane cisteinskim ostacima. U nekim otelotvorenjima, konstantni region teškog lanca sadrži supstituciju aminokiselina A118C i/ili S400C, i/ili konstantni region lakog lanca sadrži supstituciju aminokiselinama V205C, pri čemu je numerisanje prema EU numerisanju. U nekim otelotvorenjima, konstantni region teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:149 i/ili konstantni region lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:151. U nekim otelotvorenjima, konstantni region teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:149 i konstantni region lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:150. U nekim otelotvorenjima, konstantni region teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:148 i konstantni region lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:151.
[0035] U nekim otelotvorenjima, izolovano anti-WTA monoklonsko antitelo koje sadrži teški i laki lanac, pri čemu teški lanac sadrži sekvencu SEQ ID NO:146, SEQ ID NO.147, SEQ ID N0.157 ili SEQ ID NO.124, a laki lanac sadrži sekvencu SEQ ID NO.121. U nekim otelotvorenjima, izolovano anti-WTA monoklonsko antitelo koje sadrži teški i laki lanac, pri čemu teški lanac sadrži sekvencu SEQ ID NO:146, SEQ ID NO.147, SEQ ID NO.157 ili SEQ ID NO.124, a laki lanac sadrži sekvencu SEQ ID NO.123. U nekim otelotvorenjima, izolovano anti-WTA monoklonsko antitelo koje sadrži teški i laki lanac, pri čemu teški lanac sadrži sekvencu SEQ ID NO:146, SEQ ID NO.147, SEQ ID NO.157 ili SEQ ID NO.124, a laki lanac sadrži sekvencu SEQ ID NO.145.
[0036] U nekim otelotvorenjima bilo kog od antitela koja su iznad opisana, antitelo nije IgM izotip. U nekim otelotvorenjima bilo kog od antitela koja su iznad opisana, antitelo je IgG (npr., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgE, IgD, ili IgA (npr., IgA1 ili IgA2) izotip. U nekim otelotvorenjima bilo kog od antitela koja su iznad opisana, antitelo se proizvodi od strane ćelije domaćina u ćelijskoj kulturi. U nekim otelotvorenjima, ćelija domaćin je ćelija koja nije čovek. U nekim otelotvorenjima, ćelija domaćin je prokariotska ili eukariotska. U nekim otelotvorenjima ćelija domaćin je sisar (npr., humana ili ne-humana ćelija sisara). U nekim otelotvorenjima ćelija domaćin je CHO ćelija.
[0037] Takođe je opisana izolovana nukleinska kiselina koja kodira bilo koje od ovde obelodanjenih antitela. Takođe je opisan vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira bilo koje od ovde obelodanjenih antitela. Ekspresioni vektor može biti ekspresioni vektor.
[0038] Takođe je opisana ćelija domaćin koja sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira bilo koje od ovde obelodanjenih antitela. Ćelija domaćina može biti prokariotska ili eukariotska. Ćelija domaćin može biti ćelija sisara (npr., humana ili ne-humana ćelija sisara). Ćelija domaćin može biti ćelija sisara (npr., humana ili nehumana ćelija sisara).
[0039] Takođe je opisan postupak proizvodnje antitela koje sadrži kultivisanje ćelije domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira bilo koje od ovde navedenih antitela pod uslovima pogodnim za ekspresiju nukleinske kiseline; i obnavljanje antitela koje proizvodi ćelija. Postupak može dalje da obuhvata prečišćavanje antitela.
[0040] Sledeći aspekt predmetnog pronalaska je jedinjenje antitelo-antibiotik konjugata (AAC), koje sadrži antitelo protiv teihoinske kiseline zida (WTA) pronalaska, kovalentno vezano peptidnom vezom sa antibiotikom tipa rifamicin, kako je navedeno u patentnim zahtevima. U nekim otelotvorenjima antitelo protiv teihoinske kiseline zida (WTA) se vezuje za Staphylococcus aureus. U nekim otelotvorenjima, antitelo protiv teihoinske kiseline zida se vezuje za meticilin rezistentni Staphylococcus aureus (MRSA).
[0041] U nekim primerima ovde opisanih konjugata antitelo-antibiotik, antitelo sadrži: i) L lanac i H lanac CDR SEQ ID NO 99-104 ili ii) VL SEQ ID NO.119 ili SEQ ID NO. 123 sparen sa VH SEQ ID NO.120 ili SEQ ID NO.156; ili iii) VL SEQ ID NO.111 sparen sa VH SEQ ID NO.112.
[0042] U nekim primerima, antibiotik tipa rifamicin je antibiotik tipa rifalazil. U nekim otelotvorenjima, antibiotik tipa rifamicin sadrži kvarterni amin vezan na peptidni veznik. U nekim otelotvorenjima, antibiotik je vezan za antitelo preko peptidnog veznika koji je vezan za konstruisani cistein anti-WTA antitela. Konstruisani cistein može biti u L ili H lancu modifikovanog antitela. U nekim otelotvorenjima cisteinski ostatak je u L lancu. U nekim otelotvorenjima cisteinski ostatak je u H lancu.
[0043] Jedinjenja konjugata antitelo-antibiotik predmetnog pronalaska mogu da sadrže peptidni veznik koji je deljiv veznik za proteazu cistein S. aureus; takvi veznici uključuju stafopain B ili deljiv veznik stafopain A. U jednom otelotvorenju, proteaza S. aureus je endopeptidaza. U drugom otelotvorenju veznik je deljivi veznik proteaze domaćina, poželjno deljivi veznik katepsin B (npr., val-cit dipeptidni veznik).
[0044] Primer otelotvorenja jedinjenja konjugata antitelo-antibiotik ima formulu:
Ab-(L-abx)p
gde:
Ab je antitelo protiv teihoinske kiseline zida;
L je peptidni veznik koji ima formulu:
-Str-Pep-Y-gde je Str jedinica nosača; Pep je peptid sa dva do dvanaest aminokiselinskih ostataka, a Y je razdelnik; abx je antibiotik tipa rifamicin; i
p je ceo broj od 1 do 8.
[0045] U jednom otelotvorenju, jedinjenje konjugata antitelo-antibiotik bilo kog od prethodnog sadrži odnos antitela i antibiotika (AAR) od 2 ili 4.
[0046] U nekim otelotvorenjima, jedinjenje konjugata antitelo-antibiotik je formule I:
gde:
isprekidane linije označavaju fakultativnu vezu;
R je H, C1-C12alkil, ili C(O)CH3;
R<1>je OH;
R<2>je CH=N-(heterociklil), pri čemu je heterociklil opciono supstituisan sa jednom ili više grupa nezavisno izabranih između (O)CH3, C1-C12alkil, C1-C12heteroaril, C2-C20heterocikil, C6-C20aril, i3-C12karbocikil;
ili R<1>i R<2>formiraju pet- ili šestočlani fuzioni heteroaril ili heterociklil, i opciono formiraju spiro ili kondenzovani šestočlani heteroaril, heterociklil, aril ili karbociklil prsten, pri čemu je spiro ili spojeni šestočlani heteroaril, heterociklil, aril ili je karbociklil prsten opciono supstituisan sa H, F, Cl, Br, I, C1-C12alkilom ili OH;
L je peptidni veznik vezan za R<2>ili spojen sa heteroarilom ili heterociklilom formiranim od R<1>i R<2>; i Ab je antitelo protiv teihoinske kiseline zida (WTA);
[0047] U nekim od ovih otelotvorenja, jedinjenje konjugata antitelo-antibiotik formule I je formule:
[0048] U nekim od ovih otelotvorenja, jedinjenje konjugata antitelo-antibiotik formule I je formule:
gde je R<5>nezavisno izabran od H i C1-C12alkila; i n je 0 ili 1.
[0049] U nekim od ovih otelotvorenja, jedinjenje konjugata antitelo-antibiotik formule I je formule:
gde je R<3>nezavisno izabran od H i C1-C12alkila; i n je 1 ili 2.
[0050] U nekim određenim otelotvorenjima, jedinjenje konjugata antitelo-antibiotik formule I je formule:
[0051] U nekim otelotvorenjima, obezbeđeno je jedinjenje antitelo-antibiotik konjugata (AAC), koje sadrži antitelo protiv teihoinske kiseline zida (WTA) pronalaska, kovalentno povezano peptidnim vezom na antibiotik tipa rifamicin, pri čemu peptidni veznik ima formulu:
-Str-Pep-Y-gde je Str jedinica nosača koja je kovalentno vezana za antitelo protiv teihoinske kiseline zida (WTA); Pep je peptid sa dva do dvanaest aminokiselinskih ostataka, a Y je razdelnička jedinica kovalentno vezana za antibiotik tipa rifamicin. U nekim od ovih otelotvorenja, Str ima formulu:
gde je R<6>izabran iz grupe koju čine C1-C10alkilen-, -C3-C8karbociklo, -O-(C1-C8alkil)-, -arilen-, -C1-C10alkilen-arilen-, -arilen-C1-C10alkilen-, -C1-C10alkilen-(C3-C8karbociklo)-, -(C3-C8karbociklo)-C1-C10alkilen-, -C3-C8heterociklo-,-C1-C10alkilen-(C3-C8heterociklo)-, -(C3-C8heterociklo)-C1-C10alkilen-, -(CH2CH2O)r-, i -(CH2CH2O)r-CH2-; i r je celi broj u rasponu od 1 do 10. U jednoj varijanti, R<6>je -(CH2)5-. U nekim od ovih otelotvorenja, Pep sadrži dva do dvanaest aminokiselinskih ostataka nezavisno izabranih između glicina, alanina, fenilalanina, lizina, arginina, valina i citrulina. U jednoj varijanti, Pep se bira između valin-citrulina (val-cit, vc); fenilalanin-lizin (fk); GGAFAGGG (SEQ ID NO:126); tpm-cit; GPImeLFF (SEQ ID NO:129); valin-citrulin-fenilalanin (val-cit-phe); GGAFA (SEQ ID NO:131); i LAFG (SEQ ID NO:128). U nekim od ovih otelotvorenja, Y sadrži para-aminobenzil ili para-aminobenziloksikarbonil.
[0052] U nekim otelotvorenjima, jedinjenje konjugata antitelo-antibiotik je formule:
gde su Ab, Str, I i abx kako je ovde definisano, a AA1 i AA2 su nezavisno odabrani iz bočnog lanca aminokiseline. U nekim od ovih otelotvorenja, bočni lanac aminokiselina je nezavisno izabran iz H, -CH3, -CH2(C6H5), -CH2CH2CH2CH2NH2, -CH2CH2CH2NHC(NH)NH2, -CHCH(CH3)CH3, i -CH2CH2CH2NHC(O)NH2. U nekim od ovih otelotvorenjima, jedinjenje konjugata antitelo-antibiotik je formule:
1
U nekim od ovih otelotvorenjima, jedinjenje konjugata antitelo-antibiotik je formule:
gde je R<7>nezavisno izabran od H i C1-C12alkila. U nekim od ovih otelotvorenjima, jedinjenje konjugata antitelo-antibiotik je formule:
[0053] Sledeći aspekt pronalaska je farmaceutski sastav koji sadrži jedinjenje konjugata antitelo-antibiotik predmetnog pronalaska.
[0054] U jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje konjugat antitelo-antibiotik kao što je navedeno u patentnim zahtevima za upotrebu u postupku lečenja bakterijske infekcije kod pacijenta, pri čemu je bakterijska infekcija Staphylococcus aureus infekcija. U nekim otelotvorenjima, pacijentu je dijagnostikovana infekcija Staph aureusom. U nekim otelotvorenjima, lečenje bakterijske infekcije obuhvata smanjenje bakterijskog opterećenja.
[0055] U jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje konjugat antitelo-antibiotik kao što je navedeno u patentnim zahtevima za upotrebu u postupku smanjenja broja intracelularnih bakterija Staphylococcus aureus u ćelijama domaćina obolelog od Staphylococcus aureus bez smanjenja broja ćelija domaćina. Ova upotreba može da obuhvata ubijanje perzistentnih bakterijskih ćelija (npr., staph A) in vivo kontaktom trajnih bakterija sa AAC bilo kog od prethodnih otelotvorenja.
[0056] U još jednom otelotvorenju, medicinska upotreba dalje uključuje primenu drugog terapeutskog sredstva. U sledećem otelotvorenju, drugo terapeutsko sredstvo je antibiotik, uključujući antibiotik protiv Staph aureusa uopšte ili MRSA naročito.
[0057] U jednom otelotvorenju, drugi antibiotik koji se daje u kombinaciji sa jedinjenjem konjugata antiteloantibiotik predmetnog pronalaska je izabran iz strukturalnih klasa: (i) aminoglikozidi; (ii) beta-laktami; (iii) makrolidi/ciklični peptidi; (iv) tetraciklini; (v) fluorohinolini/fluorohinoloni; (vi) i oksazolidinoni.
[0058] U jednom aspektu, drugi antibiotik koji se daje u kombinaciji sa jedinjenjem konjugata antiteloantibiotik prema pronalasku je izabran između klindamicina, novobiocina, retapamulina, daptomicina, GSK-2140944, CG-400549, sitafloksacina, teikoplanina, triklosana, naftiridona, radezolida, doksorubicina, ampicilina, vankomicina, imipenema, doripenema, gemcitabina, dalbavancina i azitromicina.
[0059] U nekim ovdašnjim otelotvorenjima, opterećenje bakterija kod ispitanika smanjeno je na neodredivi nivo posle tretmana. U jednom otelotvorenju, kultura pacijenta je negativna nakon lečenja u poređenju sa pozitivnom kulturom krvi pre lečenja. U nekim ovdašnjim otelotvorenjima, bakterijska rezistencija kod ispitanika nije otkrivena ili niska. U nekim ovdašnjim otelotvorenjima, ispitanik ne reaguje na lečenje meticilinom ili vankomicinom.
[0060] Sledeći aspekt predmetnog pronalaska je postupak za pravljenje antitela ili jedinjenja konjugata antitelo-antibiotik prema pronalasku koji obuhvata konjugaciju antibiotika tipa rifamicin u antitelo protiv teihoinske kiseline zida (WTA), kako je navedeno u patentnim zahtevima.
[0061] Sledeći aspekt predmetnog pronalaska je komplet za lečenje bakterijske infekcije koji sadrži farmaceutski sastav predmetnog pronalaska i uputstva za upotrebu kako su navedena u patentnim zahtevima.
[0062] Takođe je opisano međujedinjenje veznik-antibiotik koje ima formulu II:
gde:
isprekidane linije označavaju fakultativnu vezu;
R je H, C1-C12alkil, ili C(O)CH3;
R<1>je OH;
R<2>je CH=N-(heterociklil), pri čemu je heterociklil opciono supstituisan sa jednom ili više grupa nezavisno izabranih između (O)CH3, C1-C12alkil, C1-C12heteroaril, C2-C20heterocikil, C6-C20aril, i3-C12karbocikil;
ili R<1>i R<2>formiraju pet- ili šestočlani fuzioni heteroaril ili heterociklil, i opciono formiraju spiro ili kondenzovani šestočlani heteroaril, heterociklil, aril ili karbociklil prsten, pri čemu je spiro ili spojeni šestočlani heteroaril, heterociklil, aril ili je karbociklil prsten opciono supstituisan sa H, F, Cl, Br, I, C1-C12alkilom ili OH;
L je peptidni veznik vezan za R<2>ili je spojen sa heteroarilom ili heterociklilom formiranim od R<1>i R<2>; i ima formulu:
-Str-Pep-Y-gde je Str jedinica nosača; Pep je peptid sa dva do dvanaest aminokiselinskih ostataka, a Y je razdelnik; i
X je reaktivna funkcionalna grupa izabrana iz maleimida, tiola, amino, bromida, bromoacetamida, jodoacetamida, p-toluensulfonata, jodida, hidroksila, karboksila, piridil-disulfida i N-hidroksisukcinimida.
[0063] U nekom od međujedinjenja veznik -antibiotik formule II, X je
1
[0064] Međujedinjenje veznik-antibiotik formule II može imati formulu:
gde
R<3>je nezavisno izabran od H i C1-C12alkila;
n je 1 ili 2;
R<4>je izabran iz H, F, Cl, Br, I, C1-C12alkila i OH; i
Z je izabran iz NH, N(C1-C12alkil), O i S.
[0065] Međujedinjenje veznik-antibiotik formule II može imati formulu:
ili
[0066] Takođe je obezbeđen postupak ubijanja unutarćelijskog Staph aureusa u ćelijama domaćina obolelog od Staph aureusa bez ubijanja ćelija domaćina koji sadrži davanje detaljno opisanog konjugata anti-WTA-antibiotika.
[0067] Trebalo bi prihvatiti da se jedno, neka ili sva svojstva različitih otelotvorenja ovde opisanih mogu kombinovati kako bi se formirala druga otelotvorenja prema predmetnom pronalasku. Ovi i drugi aspekti predmetnog pronalaska postaće očigledni stručnjaku iz ove oblasti.
KRATAK OPIS SLIKA
[0068]
Slika 1 pokazuje da izloženost vankomicinu ili rifampicinu ubija MRSA postepeno. Vankomicin je testiran na 2 µg/mL (otvoreni kvadrat) i 20 µg/mL (zatvoreni kvadrat). Rifampicin je testiran na 0.02 µg/mL (otvoreni trougao) i 0.2 µg/mL (zatvoreni trougao).
Slika 2 pokazuje da su inficirane peritonealne ćelije bile u stanju da prenesu infekciju u osteoblaste u prisustvu vankomicina.
Na Slici 3 prikazan je ćelijski zid gram-pozitivnih bakterija, kao što je S. aureus sa crtanim prikazom zidnih teihoinskih kiselina (WTA), lipo-teihoinske kiseline (LTA) i omotača peptidoglikana (PGN), koji stabilizuju ćelijsku membranu i obezbeđuju mesta vezivanja.
Slika 4 prikazuje hemijsku strukturu i modifikacije glikozila teihoinske kiseline zida (WTA), detaljno opisane u Definicijama.
Slika 5 prikazuje mogući mehanizam aktivacije leka za antitelo-antibiotičke konjugate (AAC). Aktivni antibiotik (Abx) se oslobađa nakon internalizacije AAC unutar ćelija sisara.
Slike 6A i 6B sumiraju karakteristike Abs iz primarnog skrininga biblioteke mAbs koji pokazuju pozitivno vezanje ELISA na preparate ćelijskog zida iz USA300 ili Wood46 soja S. aureus, kao što je opisano u Primeru 21. Od Aps koji se vezuje za WTA, 4 su specifične za WTA alfa i 13 se specifično vezuju za WTA beta.
Slika 7A prikazuje in vitro test makrofaga koji pokazuje da AAC ubija unutarćelijsku MRSA.
Slika 7B prikazuje intracelularno ubijanje MRSA (USA300 soj) sa 50 µg/mL tio-S4497-HC-A118C-pipBOR 102 u makrofazima, osteoblastima (MG63), epitelnim ćelijama disajnih puteva (A549) i endotelnim ćelijama pupčane vene (HUVEC) u poređenju sa golim, nekonjugovanim anti-WTA antitelom S4497. Isprekidana linija označava granicu detekcije za test.
Slika 7C prikazuje poređenje AAC napravljenog sa međujedinjenjima veznik-antibiotik LA-51 i LA-54 (Tabela 2). MRSA je opsonizovana samo antitelom S4497 ili sa AAC: AAC-102 ili AAC-105 (Tabela 3) u različitim koncentracijama u rasponu od 10 µg/mL do .003 µg/mL.
Slika 7D prikazuje AAC ubija unutarćelijske bakterije bez štetnosti makrofaga.
Slika 7E prikazuje oporavak živog USA300 iz unutrašnjih makrofaga iz gornje ćelije makrofagnih ćelija. Nekoliko (10 000 puta manje) živih S. aureus oporavljeno je iz makrofaga zaraženih bakterijama opsonizovanim S-4497-AAC u poređenju sa kontrolama tretiranim golim antitelom.
Slika 8A pokazuje in vivo efikasnost tio-S4497-HC-A118C-MC-vc-PAB-pipBOR 102 AAC u modelu intraperitonealne infekcije kod A/J miševa. Miševi su inficirani MRSA intraperitonealnom injekcijom i tretirani sa 50 mg/Kg samo antitela S4497 ili sa 50 mg/Kg 102 AAC (HC-A114C Kabat = HC-A118C EU) intraperitonealnom injekcijom. Miševi su žrtvovani 2 dana nakon infekcije i celokupno opterećenje bakterija procenjeno je u peritonealnom supernatantu (vanćelijske bakterije), peritonealnim ćelijama (unutarćelijske bakterije) ili u bubregu.
Slika 8B prikazuje intravenski, in vivo, model infekcije u A/J miševima. Miševi su inficirani MRSA intravenskom injekcijom i tretirani sa 50 mg/Kg antitela S4497, 50 mg/Kg tio-S4497-HC-A118C-MC-vc-PAB-pipBOR 102 AAC ili jednostavnom mešavinom od 50 mg/kg S4497 antitela .5 mg/Kg slobodnog rifamicina. Siva isprekidana linija označava granicu detekcije za svaki organ.
Slika 9A prikazuje efikasnost tio-S4497-HC-A118C-MC-vc-PAB-pipBOR 102 AAC u modelu intravenske infekcije titracijom S4497-pipBOR AAC.
Slika 9B prikazuje tio-S4497-HC-A118C-MC-vc-PAB-dimetilpipBOR 105 AAC je efikasniji od tio-S4497-HC-A118C-MC-vc-PAB-pipBOR 102 AAC u modelu intravenske infekcije titracijom. Tretmani sa S4497 antitelom, 102 AAC ili tio-S4497-HC-A118C-MC-vc-PAB-dimetil-pipBOR 112 AAC
1
primenjeni su u naznačenim dozama 30 minuta nakon infekcije. Miševi su žrtvovani 4 dana nakon infekcije i ukupnim brojem preživelih bakterija po mišu (2 bubrega sakupljena) utvrđen je nanošenjem prevlake.
Slika 9C pokazuje da je tio-S4497-HC-A118C-MC-vc-PAB-dimetilpipBOR 105 AAC efikasniji od S4497 antitela ili samo dimetilpipBOR 7 antibiotika u modelu intravenske infekcije. CB17.SCID miševi inficirani 2x10<7>CFU MRSA intravenskom injekcijom. Dan nakon infekcije, miševi su tretirani sa 50 mg/Kg S4497 antitela, 50 mg/Kg AAC 105 ili sa 0.5 mg/Kg dimetil-pipBOR 7, ekvivalentne doze antibiotika koja je sadržana u 50 mg/Kg AAC). Miševi su žrtvovani 4 dana nakon infekcije i ukupnim brojem preživelih bakterija po mišu (2 bubrega sakupljena) utvrđen je nanošenjem prevlake.
Slika 10A prikazuje prevalenciju anti-S. aureus antitela u ljudskom serumu. Pacijenti zaraženi S. aureusom ili normalna kontrola sadrže velike količine WTA specifičnih serumskih antitela iste specifičnosti kao anti-WTA S4497. Vezanje različitih uzoraka seruma divljeg tipa (WT) na MRSA koji su eksprimirali S4497 antigen je ispitano nasuprot vezivanju na mutant MRSA soja TarM/TarS DKO (dupli nokaut) kome nedostaju šećerne modifikacije prepoznate u antitelu S4497.
Slika 10B pokazuje AAC efikasan u prisustvu fizioloških nivoa humanog IgG (10 mg/mL) u in vitro testu makrofaga sa USA300 sojem MRSA. Tio-S4497-HC-A118C-MC-vc-PAB-dimetilpipBOR 105 efikasan je u prisustvu 10 mg/mL humanog IgG. USA300 soj MRSA opsonizovan je samo AAC ili AAC razređenim u 10 mg/mL humanog IgG. Ukupan broj preživelih unutarćelijskih bakterija procenjen je 2 dana nakon infekcije.
Slika 10C prikazuje in vivo model infekcije koji pokazuje da je AAC efikasan u prisustvu fizioloških nivoa humanog IgG. Kombinovani podaci su iz 3 nezavisna eksperimenta koji koriste dva odvojena preparata od tio-S4497-HC-A118C-MC-vc-PAB-dimetilpipBOR 105 ili 112 AAC. Miševi tretirani sa AAC imali su smanjenje bakterijskog opterećenja veće od 4 log (učenikov t-test p=.0005).
Slika 11A prikazuje in vivo model infekcije koji pokazuje da je AAC efikasniji od trenutnog standarda (SOC) antibiotika vankomicina kod miševa koji su rekonstituisani sa normalnim nivoom humanog IgG. Miševi su tretirani antitelom S4497 (50 mg/Kg), vankomicinom (100 mg/kg), tio-S4497-HC-A118C-MC-vc-PAB-dimetilpipBOR 105 AAC (50 mg/Kg), ili AAC načinjenim sa antitelo za kontrolu izotipa koje ne prepoznaje MRSA, tio-hu-anti gD 5B5-HC-A118C-MC-vc-PAB-dimetilpipBOR 110 AAC (50 mg/Kg).
Slika 11B prikazuje relativno vezivanje anti-Staph. aureus antitela na soj USA300 izolovana iz bubrega u in vivo modelu infekcije, kako je utvrđeno u FACS. Antitelo S4497 prepoznaje modifikaciju N-acetilglukozamina koja je povezana sa teihoinskom kiselinom zida (WTA) preko beta-anomerne veze na ćelijskom zidu S. aureus. Antitelo na S7578 se vezuje za sličnu N-acetilglukozaminsku modifikaciju koja je pridružena WTA putem alfa-anomerne veze. RF1 antitelo je pozitivno kontrolno anti-MRSA antitela koje prepoznaje modifikacije šećera pronađene u porodici proteina usidrenih u ćelijskom zidu usidrenih proteina SDR koji se ponavljaju. GD antitelo je negativni kontrolni humani IgGl koji ne prepoznaje S. aureus.
Slika 11C prikazuje in vivo model infekcije koji pokazuje da je AAC, tio-S6078-HCl14C-LCVT-MC-vc-PAB-dimetilpipBOR 129 efikasniji od golog anti-WTA antitela S4497, prema istom režimu kao na Slici 11A, u miševi koji su rekonstituisani sa normalnim nivoima humanog IgG. Miševi su tretirani antitelom S4497 (50 mg/Kg), ili tio-S6078-HC A114C-LCVT-MC-vc-PAB-dimetilpipBOR 129 AAC (50 mg/Kg).
Slika 12 prikazuje test inhibicije rasta koji pokazuje da AAC nije toksičan za S. aureus, osim ako veznik nije podeljen katepsinom B. Na levoj strani je prikazan šematski test oslobađanja katepsina (Primer 20). AAC se tretira katepsinom B da bi se oslobodio besplatan antibiotik. Ukupna količina aktivnosti antibiotika u netaknutom u odnosu na AAC tretiranom katepsinom B određuje se pripremom serijskih razblaženja rezultirajuće reakcije i određivanjem minimalne doze AAC koja može inhibirati rast S. aureus. Gornji desni grafik prikazuje test oslobađanja katepsina za tio-S4497-HC-A118C-MC-vc-PAB-pipBOR 102, a donji desni grafik prikazuje test oslobađanja katepsina za tio-S4497-HC-A118C-MC-vc-PAB-dimetilpipBOR 105.
Slika 13A prikazuje poravnavanje redosleda aminokiselinskih promenljivih regiona lakog lanca (VL) četiri humana anti-WTA alfa antitela (SEQ ID NOS 25, 27, 29 i 31, redosledom pojavljivanja). CDR
1
sekvence CDRL1, L2 i L3 prema Kabat numerisanju su podvučene.
Slika 13B prikazuje poravnavanje redosleda aminokiselinskih varijabilnih regiona teškog lanca (VH) četiri humana anti-WTA alfa antitela sa Slike 13A. CDR sekvence CDR H1, H2 i H3 prema Kabat numerisanju su podvučene (SEQ ID NOS 26, 28, 30 i 32, redosledom pojavljivanja).
Slika 14 prikazuje CDR sekvence L i H lanaca od 13 humanih anti-WTA beta antitela (SEQ ID NOS 33-110).
Slike 15A-1 i 15A-2 pokazuju poravnanje L lanca pune dužine (lakog lanca) anti-WTA beta Ab 6078 (nemodifikovani) i njegove varijante, v2, v3, v4 (SEQ ID NOS 113, 113, 115, 113, 115, 113, 115 i 115, prema redosledu pojavljivanja). CDR sekvence CDRL1, L2 i L3 prema Kabat numerisanju su podvučene. Kutije prikazuju kontaktne ostatke i CDR ostatke prema Kabat i Čotiju. Varijante L lanca koje sadrže dizajnirani Cys su označeni sa C u crnoj kutiji na kraju stalnog područja (na EU ostatak br.
205 u ovom slučaju). Oznaka varijante, na primer, v2LC-Cys znači varijanta 2 koja sadrži Cys konstruisan u L lanac. HCLC-Cys znači da svaki od H i L lanaca sadrži inženjerski Cys. Varijante 2, 3 i 4 imaju promene na početku H lanca kao što je prikazano na Slikama 15B.
Slike 15B-1, 15B-2, 15B-3, 15B-4 pokazuju poravnavanje H lanca pune dužine (teški lanac) anti-WTA beta Ab 6078 (nemodifikovani) i njegove varijante, v2, v3, v4 (SEQ ID NOS 114, 139-144, odnosno 143, prema redosledu izgleda) koji imaju promene na početku H lanca. Varijante H lanca koje sadrže dizajnirani Cys su označeni sa C u crnoj kutiji na kraju stalnog područja (na EU ostatak br.118 u ovom slučaju).
Slike 16A-1 i 16A-2 prikazuju poravnanje lanca L pune dužine anti-WTA beta Ab 4497 (nemodifikovanog) i Cys projektovanog L lanca (SEQ ID NOS 121, 123, 145 i 145, redosledom pojavljivanja). CDR sekvence CDRL1, L2 i L3 prema Kabat numerisanju su podvučene. Kutije prikazuju kontaktne ostatke i CDR ostatke prema Kabat i Čotiju. Varijante L lanca koje sadrže dizajnirani Cys su označeni sa C u tačkastoj kutiji blizu kraja stalnog područja (na EU ostatak br.205 u ovom slučaju).
Slike 16B-1, 16B-2, 16B-3 prikazuju poravnanje H lanca pune dužine anti-WTA beta Ab 4497 (nemodifikovano) i njegovu v8 varijantu sa D izmenjenom u E u CDR H3 položaju 96, sa ili bez dizajniran Cys (SEQ ID NOS 146-147, 157 i 147, redosledom pojavljivanja). Varijante H lanca koje sadrže dizajnirani Cys su označeni sa C u crnoj kutiji na kraju stalnog područja (na EU ostatak br.118 u ovom slučaju).
Slike 17A-1, 17A-2, 17A-3 pokazuju poravnavanje redosleda aminokiselina lakog lanca pune dužine trinaest humanih anti-WTA beta antitela (SEQ ID NOS 113, 158-167, 121 i 168, respektivno, redosledom pojavljivanja). Varijabilni region (VL) obuhvata Kabat aminokiselinske položaje 1 do 107. CDR sekvence CDRL1, L2 i L3 prema Kabat numerisanju su podvučene.
Slike 17B-1 do 17B-6 prikazuju poravnavanje redosleda aminokiselina celog teškog lanca trinaest humanih anti-WTA beta antitela sa Slika 17A-1, 17A-2, 17A-3 (SEQ ID NOS 114, 169- 176, 133-134, 138 i 127, redosledom pojavljivanja). Varijabilni region (VH) obuhvata Kabat aminokiselinske položaje 1-113. CDR sekvence CDR H1, H2 i H3 prema Kabat numerisanju su podvučene. H lanac Eu pozicija 118 označen zvezdicom može se promeniti u Cys za konjugaciju lekova. Ostaci označeni crnom bojom mogu se zameniti drugim ostacima koji ne utiču na vezivanje antigena da bi se izbegla deamidacija, izomerizacija aspartanske kiseline, oksidacija ili N-vezana glikozilacija.
Slika 18A prikazuje vezivanje mutanata Ab 4497 na ćelijski zid S. aureus kako je analizirano sa ELISA. Slika 18B prikazuje poređenje Ab 4497 i njegovih mutanta (SEQ ID NOS 177, 177, 177-178, 178-179, 179-180, 180 i 180, redosledom pojavljivanja) u istaknutim položajima aminokiselina i njihovim relativna snaga vezanja antigena testirana ELISA testom.
Slika 19 pokazuje rezultate FACS analize Ab 6078 VT i mutanata koji se vezuju za soj sa nedostatkom proteina A USA300 (USA300-SPA), kao što je opisano u Primeru 23. Mutanti su pokazali nesmetano vezivanje za S. aureus.
Slika 20 pokazuje da pre tretman sa 50 mg/kg slobodnih antitela nije efikasan u modelu intravenske infekcije. Balb/c miševima je data jednostruka doza kontrolisanog sredstva (PBS) ili 50 mg/kg antitela intravenskom injekcijom 30 minuta pre infekcije sa 2x10<7>CFU USA300. Grupe za lečenje uključuju
1
izotipsko kontrolno antitelo koje se ne vezuje za S. aureus (gD), antitelo usmereno protiv beta modifikacije teihoinske kiseline zida (4497) ili antitelo usmereno protiv alfa modifikacije teihoinske kiseline zida (7578). Kontrolni miševi su davani dva puta dnevno sa 110 mg/kg vankomicina intraperitonealnom injekcijom (Vanco).
Slike 21 i Slika 22 pokazuju da su AAC usmereni bilo na beta modifikaciju teihoinske kiseline zida ili alfa modifikaciju teihoinske kiseline zida efikasni u modelu intravenske infekcije korišćenjem miševa koji su rekonstituisani sa normalnim nivoima humanog IgG. CB17.SCID miševi su rekonstituisani humanim IgG korišćenjem režima doziranja optimizovanog da daje konstantne nivoe od najmanje 10 mg/mL humanog IgG u serumu i inficirani sa 2x10<7>CFU USA300 intravenskom injekcijom. Tretman je započet 1 dan nakon infekcije samo kontrolom pufera (PBS), 60 mg/kg beta-WTA AAC (136 AAC) ili 60 mg/kg alfa-WTA AAC (155 AAC).
Na Slici 23A i na Slici 23B prikazana je sinteza veznog i antibiotskog međujedinjenja 51 iz 2-nitrobenzena-1,3-diola 1.
Slika 24 prikazuje sintezu međujedinjenja veznik-antibiotika, MC-vc-PAB-dimetilpipBOR 54 iz benzoksazino rifamicina 4 zaštićenog TBS.
Na Slici 25A i na Slici 25B prikazana je sinteza dimetil pipBOR 7 iz (5-fluoro-2-nitro-1,3-fenilen)bis(oksi)bis(metilen)dibenzena 9.
Slika 26 prikazuje strukturu FRET peptidnog supstrata za validaciju deljenja, mal-K(TAMRA)GGAFAGGGK (fluorescein) (SEQ ID NO:125) koji sadrži najobilnije ostatke u PI, P2 i P3 sa ekrana aktivnosti REPLi proteaze. Konzervirani su ostaci Gly iz peptidne strukture REPLi FRET. Tiol-reaktivna maleimidna grupa na N-kraju omogućila je konjugaciju u antitelima sa reaktivnim cisteinima. Posle deljenja peptida FRET gubi se efekat gašenja i primećuje se povećanje fluorescencije.
Slika 27 prikazuje strukturu tioFAB S4497-MC-GGAFAGGG-(pipBOR) ("peptid jezgra" obelodanjenog kao SEQ ID NO:126), jedinjenje alata koje se koristi za identifikaciju aktivnih frakcija koje sadrže proteazu od interesa. Mal-GGAFAGGG-DNA31 ("peptid jezgra" obelodanjenog kao SEQ ID NO:126) je konjugovan sa THIOFAB 4497. THIOFAB sadrže jedan reaktivni cistein. Proteaza S. aureus odvojila je C-kraj za povezivanje na Ala, oslobađajući Gly-Gly-Gly- (pipBOR).
Slika 28 i Slika 29 prikazuju Mal-K(tamra)GGAFAGGGK (fluorescein) (SEQ ID NO:125) AAC se deli i u Wood46 (Slika 28) i u USA300 (Slika 29) kada se konjuguje sa antitelom koje vezuje S. aureus (tio-S4497), a ne kada se konjuguje sa antitelom koje se ne veže za S. aureus (tio-trastuzumab). Intenzitet fluorescencije izmeren tokom vremena tioMAB 4497 mal-K(tamra)GGAFAGGGK (fluorescein) (SEQ ID NO:125) inkubira se sa kulturama faza logaritma Wood46 i USA300 MRSA. TioMAB 4497 FRET peptidni konjugati napravljeni od mal-K(TAMRA)GGAFAGGGK(fluorescein) (SEQ ID NO:125) sa Slike 26 prikazuju porast fluorescencije u oba soja, što ukazuje da se eksperimentalni veznik deli proteazom S. aureus i da je proteaza prisutna u klinički relevantnom soju MRSA, USA300 (Slika 29). Gustina ćelije utiče na brzinu deljenja, pri čemu se deljenje događa ranije u kulturama veće ćelijske gustine (10<8>ćelija/ml). Konjugat za kontrolu izotopa (tio-trastuzumab) nije pokazao porast fluorescencije ni u jednom stanju.
Na slici 30 prikazana su dva optimizovana veznika za deljenje stafopaina B u AAC. Veznici optimizovani za deljenje stafopainom B, uključujući preferencije ostataka za P4 i P1'. Veznici su dizajnirani pomoću podataka sa REPLi ekrana. QSI7 je dodat C-kraju svakog veznika da deluje kao surogat antibiotika.
Slika 31 prikazuje rezultate analize makrofaga, pokazujući da AAC koji se može podeliti stafopainom može ubiti unutarćelijske bakterije. USA300 soj S. aureus inkubiran je sa različitim dozama (100 µg/mL, 10 µg/mL, 1 µg/mL ili 0.1 ug/mL) samo antitela S4497, tio-S4497 HC WT (v8), LC V205C-MC-vc-PAB- (dimetilpipBOR) AAC-192 ili tio-S4497 HC v1-MP-LAFG-PABC-(piperazinoBOR) ("peptid jezgra" obelodanjen kao SEQ ID NO:128) AAC-193 da se dozvoli vezivanje AAC na bakterije (Slika 31). Posle jednosatne inkubacije, opsonizovane bakterije su hranjene makrofagovima od miševa i inkubirane 2 sata na 37°C da se dozvoli fagocitoza. Nakon završetka fagocitoze, infekciona mešavina je zamenjena sa normalnom podlogom za rast, dopunjenim sa 50 ug/mL gentamicina da bi se ubile preostale vanćelijske bakterije, a ukupan broj preživelih unutarćelijskih bakterija je određen dva dana kasnije nanošenjem serijskih razblaženja lizata makrofaga na triptične ploče od sojinog agara. AAC koji
1
se odvaja stafopainom uspevao je da ubije unutarćelijsku USA300 sa sličnom potencijom u poređenju sa AAC koji se deli katepsinom B. Siva isprekidana linija označava granicu detekcije za test (10 CFU/udubljenju).
Slika 32 prikazuje rezultate analize makrofaga, pokazujući da AAC koji se može podeliti stafopainom može ubiti unutarćelijske bakterije. AAC ciljaju ubijanje antibiotika na S. aureus preko antigena specifičnog vezivanja antitela. Za ovaj eksperiment odabran je Wood46 soj S. aureus, jer ne eksprimira protein A, molekul koji se vezuje za Fc region IgG antitela. Wood46 soj S. aureus inkubiran je sa 10 µg/mL ili 0.5 µg/mL S4497 antitela, izotip kontrolni-AAC koji sadrži katepsin B deljivog veznika tiotrastuzumab HC A118C-MC-vc-PAB- (dimetil-pipBOR) AAC-101, tio-S4497 HC WT (v8), LC V205C-MC-vc-PAB-(dimetilpipBOR) AAC-192, Izotip kontrolni-AAC koji sadrži veznik tiotrastuzumab koji se može deliti od stafopaina HC A118C-MP-LAFG-PABC- (piperazinoBOR) ("peptid jezgra" obelodanjen kao SEQ ID NO:128), ili tio-S4497 HC v1-MP-LAFG-PABC-(piperazinoBOR) ("peptid jezgra" obelodanjen kao SEQ ID NO:128) AAC-193 u trajanju od 1 sata da se dozvoli vezivanje AAC na bakterije. Da bi se ograničilo nespecifično vezivanje AAC, opsonizovane bakterije su centrifugirane, isprane jednom i resuspendovane u puferu pre nego što su bile postavljene u mišje makrofage. Nakon završetka fagocitoze, infekciona mešavina je zamenjena sa normalnom podlogom za rast, dopunjenim sa 50 µg/mL gentamicina da bi se ubile preostale vanćelijske bakterije, a ukupan broj preživelih unutarćelijskih bakterija je određen dva dana kasnije nanošenjem serijskih razblaženja lizata makrofaga na triptične ploče od sojinog agara. 4497-AAC koji sadrži veznik koji se može podeliti stafopainom uspeo je da ubije sve bakterije koje se mogu detektovati, dok AAC za kontrolu izotipa nije pokazao aktivnost.
Slike 33 i 34 pokazuju da je Staphopain AAC aktivan in vivo u modelu intravenske infekcije kod miša. CB17.SCID miševi su rekonstituisani humanim IgG korišćenjem režima doziranja optimizovanog da daje konstantne nivoe od najmanje 10 mg/mL humanog IgG u serumu. Miševi su tretirani sa 4497 antitela (50 mg/kg), AAC-215 sa veznikom za deljenje stafopainom (50 mg/kg,) ili izotipskom kontrolom, anti-gD AAC koji sadrži deljivi veznik stafopaina (50 mg/kg). Miševima je data pojedinačna doza AAC-215 prvog dana posle infekcije intravenskom injekcijom. Ukupan broj preživelih bakterija u 2 bubrega (slika 33) ili u srcu (slika 34) određen je nanošenjem prevlake.
Slike 35 i 36 prikazuju rezultate ispitivanja in vitro makrofaga za tio-S6078 AAC. Na Slici 35, tio-S6078.v4.HC-VT, LC-Cys-MC-vc-PAB-(dimetilpipBOR) AAC je bio efikasan u ubijanju unutarćelijskih bakterija u dozama iznad ili iznad 0.5 µg/mL sa opterećenjem antibioticima od 2.0 ( AAC-173) ili 3.9 (AAC-171) dimetilpipBOR antibiotika (LA-54) po tio-S6078 antitelu. Na Slici 36, tio-S6078.v4.HC-VT, LC-Cys-MC-vc-PAB-(piperazBOR) AAC je bio efikasan u ubijanju unutarćelijskih bakterija u dozama iznad ili iznad 0.5 µg/mL sa opterećenjem antibioticima od 1.8 ( AAC-174) ili 3.9 (AAC-172) piperazBOR antibiotika (LA-65) po tio-S6078 antitelu.
Slike 37 i 38 pokazuju rezultate in vivo efikasnosti tio-S6078 AAC u modelu intravenske infekcije kod miševa. CB17.SCID miševi su rekonstituisani humanim IgG korišćenjem režima doziranja optimizovanog da daje konstantne nivoe od najmanje 10 mg/mL humanog IgG u serumu. Miševi su zaraženi sa USA300 i tretirani sa kontrolnim nosačem (PBS), tio-S6078.v4.HC-VT, LC-Cys-MC-vc-PAB- (dimetilpipBOR) AAC sa opterećenjem antibioticima od 2,0 (AAC-173) ili 3.9 (AAC-171) dimetilpipBOR antibioticima (LA-54) po tio-S6078 antitelu (Slika 37) i tio-S6078.v4.HC-VT, LC-Cys-MC-vc-PAB- (piperazBOR) sa punjenjem antibioticima od 1.8 (AAC-174) ili 3.9 (AAC-172) piperazBOR antibiotika (LA-65) po tio-S6078 antitelu (Slika 38). Miševima je data jedna doza AAC prvog dana posle infekcije intravenskom injekcijom i žrtvovani su 4. dana nakon infekcije. Ukupan broj preživelih bakterija u 2 bubrega određen je nanošenjem prevlake. Tretman sa AAC koji sadrži niže opterećenje antibioticima smanjuje opterećenje bakterija za približno 1,000 puta, a lečenje sa AAC koji sadrži veće opterećenje antibioticima smanjuje opterećenje bakterija za više od 10,000 puta.
DETALJNI OPIS OTELOTVORENJA PRONALASKA
[0069] Sada će se detaljno uputiti na određena otelotvorenja predmetnog pronalaska, čiji su primeri ilustrovani u pratećim strukturama i formulama. Iako će pronalazak biti opisan zajedno sa nabrojanim otelotvorenjima, uključujući postupke, materijale i primere, takav opis je neograničavajući i pronalazak je namenjen da obuhvati sve alternative, modifikacije i ekvivalente, bez obzira da li su opšte poznate ili su ovde uključene. U slučaju da se jedna ili više ugrađene literature, patenata i sličnih materijala razlikuje ili suprotstavlja ovoj patentnoj prijavi, uključujući, ali ne ograničavajući se na definisane pojmove, upotrebu termina, opisane tehnike ili
1
slično, ova patentna prijava kontroliše. Osim ako nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini koji se ovde koriste imaju isto značenje kao što se uobičajeno shvataju oni koji su uobičajeno upoznati sa stanjem tehnike kojem pripada pronalazak. Stručnjak u ovoj oblasti prepoznaće mnoge postupke i materijale slične ili ekvivalentne onima opisanim u ovom dokumentu, koji bi se mogli koristiti u praksi predmetnog pronalaska. Predmetni pronalazak ni na koji način nije ograničen na opisane postupke i materijale.
I. GENERALNE TEHNIKE
[0070] Ovde opisane tehnike ili postupci se uglavnom dobro razumeju i uobičajeno se koriste konvencionalnom metodologijom od strane stručnjaka, kao što su, na primer, široko korišćene metodologije opisane u Sambrook i dr.., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3d edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, i dr. eds., (2003)); serije Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow i Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, and Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1987)); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney), ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, i D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir i C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis i dr., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan i dr., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); i Cancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita i dr., eds., J.B. Lippincott Company, 1993).
[0071] Nomenklatura koja se koristi u ovoj patentnoj prijavi temelji se na sistematskoj nomenklaturi IUPAC, osim ako nije drugačije naznačeno. Ako nije drugačije definisano, ovde korišćeni tehnički i naučni pojmovi imaju isto značenje kao što ih uobičajeno razume stručnjak u oblasti kojoj pripada predmetni pronalazak i koji su u skladu sa: Singleton i dr. (1994) Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2nd Ed., J. Wiley & Sons, New York, NY; i Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik (2001) Immunobiology, 5th Ed., Garland Publishing, New York.
II. DEFIINICIJE
[0072] Kada označava broj supstituenata, termin "jedan ili više" odnosi se na raspon od jednog supstituenta do najvećeg mogućeg broja supstitucija, tj. supstitucija jednog vodonika do supstitucije svih vodonika supstituentima. Termin "supstituent" označava atom ili grupu atoma koji zamenjuju atom vodonika na matičnom molekulu. Termin "supstituisani" označava da određena grupa sadrži jedan ili više supstituenata. Ako bilo koja grupa može imati više supstituenata i pruža se mnoštvo mogućih supstituenata, supstituenti su nezavisno odabrani i ne moraju biti isti. Termin "nesupstituisan" znači da navedena grupa ne sadrži supstituente. Termin "opciono supstituisan" znači da je određena grupa nesupstituisana ili supstituisana jednim ili više supstituenata, nezavisno izabranih iz grupe mogućih supstituenata. Kada označava broj supstituenata, termin "jedan ili više" znači od jednog supstituenta do najvećeg mogućeg broja supstitucija, tj. zamena jednog vodonika do zamene svih vodonika supstituentima.
[0073] Termin "teihoinska kiselina zida" (WTA) označava anjonske glikopolimere koji su kovalentno vezani za peptidoglikan preko fosfodiesterske veze na C6 hidroksil šećere N-acetilneraminske kiseline. Iako precizna hemijska struktura može varirati među organizmima, u jednom otelotvorenju WTA je ribitol-teihoinska kiselina sa ponavljajućim jedinicama 1,5-fosfodiesterskih veza D-ribitola i D-alanil estra na položaju 2 i glikozilnih supstituenata na položaju 4. Glikozilne grupe mogu biti N-acetilglukozaminil α (alfa) ili β (beta) kao što je prisutno u S. Aureus. Hidroksili u ponavljanjima alditola/šećera-alkohol-fosfata supstituisani su katjonskim esterima D-alanina i monosaharidima, kao što je N-acetilglukozamin. U jednom aspektu, hidroksilni supstituenti uključuju D-alanil i alfa (α) ili beta (β) GlcNHAc. U jednom specifičnom aspektu, WTA sadrži jedinjenje formule:
2
gde talasne linije označavaju ponavljajuće jedinice za vezivanje ili mesta vezivanja polialditola-P ili peptidoglikana, gde je X D-alanil ili -H; a Y je α (alfa) -GlcNHAc ili β (beta) -GlcNHAc.
[0074] U S. aureus, WTA je kovalentno povezan sa 6-OH N-acetil muramne kiseline (MurNAc) preko disaharida sastavljenog od N-acetilglukozamina (GlcNAc)-1-P i N-acetilmanozamina (ManNAc), nakon čega sledi dve ili tri jedinice glicerol-fosfata. Stvarni WTA polimer se zatim sastoji od 11-40 ribitol-fosfatnih (Rbo-P) jedinica koje se ponavljaju. Postepena sinteza WTA najpre se pokreće enzimom zvanim TagO, a sojevi S. aureus kojima nedostaje TagO gen (veštačkom delecijom gena) ne čine WTA. Ponavljajuće jedinice mogu se dalje prilagoditi D-alaninu (D-Ala) u C2-OH i/ili sa N-acetilglukozaminom (GlcNAc) na položaju C4-OH, putem α- (alfa) ili β- (beta) glikozidnih veza. Zavisno od soja S. aureus, ili faze rasta bakterija, glikozidne veze mogu biti α -, β - ili smeša dvaju anomera.
[0075] Termin "antibiotik" (abx ili Abx) uključuje bilo koji molekul koji specifično inhibira rast ili ubijanje mikroorganizama, poput bakterija, ali nije smrtonosan za domaćina u intervalima koncentracije i doziranja koji se sprovode. U specifičnom aspektu, antibiotik nije netoksičan za domaćina u primenjenim intervalima koncentracije i doziranja. Antibiotici efikasni protiv bakterija mogu se široko klasifikovati ili kao baktericidni (tj., direktno ubijaju) ili bakteriostatski (tj., sprečavaju deljenje). Antibaktericidni antibiotici mogu se dalje pod klasifikovati kao uski ili široki spektar. Antibiotik širokog spektra je efikasan protiv širokog spektra bakterija, uključujući i gram-pozitivne i gram-negativne bakterije, za razliku od antibiotika uskog spektra, koji je efikasan protiv manjeg spektra ili specifičnih porodica bakterija. Primeri antibiotika uključuju: (i) aminoglikozidi, npr., amikacin, gentamicin, kanamicin, neomicin, netilmicin, streptomicin, tobramicin, paromicin, (ii) ansamicini, npr., geldanamicin, herbimicin, (iii) karbacefemi, npr., lorakarbef, (iv), karbapenemi, npr., ertapenum, doripenem, imipenem/cilastatin, meropenem, (v) cefalosporini (prva generacija), npr., cefadroksil, cefazolin, cefalotin, cefaleksin, (vi) cefalosporini (druga generacija), npr., cefaklor, cefamandol, cefoksitin, cefprozil, cefuroksim, (vi) cefalosporini (treća generacija), npr., cefiksim, cefdinir, cefditoren, cefoperazon, cefotaksim, cefpodoksim, ceftazidim, ceftibuten, ceftizoksim, ceftriakson, (vii) cefalosporini (četvrta generacija), npr., cefepim, (viii), cefalosporini (peta generacija), npr., ceftobiprol, (ix) glikopeptidi, npr., teikoplanin, vankomicin, (x) makrolidi, npr., aksitromicin, klaritromicin, diritromicin, eritromicin, roksitromicin, troleandomicin, telitromicin, spektinomicin, (xi) monobaktami, npr., akstreonam, (xii) penicilini, npr., amoksicilin, ampicillin, azlocilin, karbenicilin, kloksacilin, dikloksacilin, flukloksacilin, mezlocilin, meticilin, nafcilin, oksacilin, penicilin, peperacilin, tikarcilin, (xiii) antibiotski polipeptidi, npr., bacitracin, kolistin, polimiksin B, (xiv) hinoloni, npr., ciprofloksacin, enoksacin, gatifloksacin, levofloksacin, lemefloksacin, moksifloksacin, norfloksacin, orfloksacin, trovafloksacin, (xv) sulfonamidi, npr., mafenid, prontosil, sulfacetamid, sulfametizol, sulfanilamid, sulfasalazin, sulfisoksazol, trimetoprim, trimetoprimsulfametoksazol (TMP-SMX), (xvi) tetraciklini, npr., demeklociklin, doksiciklin, minociklin, oksitetraciklin, tetraciklin i (xvii) drugi kao što je arspenamin, hloramfenikol, klindamicin, linkomicin, etambutol, fosfomicin, fuzidinska kiselina, furazolidon, izoniazid, linezolid, metronidazol, mupirocin, nitrofurantoin, platensimicin, pirazinamid, hinupristin/dalfopristin, rifampin/rifampicin ili tinidazol.
[0076] Kako se ovde koristi, termin "WTA antitelo" odnosi se na bilo koje antitelo koje se vezuje na WTA bilo WTA alfa ili WTA beta. Termini "antitela teihoinske kiseline alfa" ili "anti-WTA alfa antitelo" ili "antiaWTA" ili "anti-aGlcNac WTA antitelo" koriste se naizmenično za označavanje antitela koje specifično vezuje teihoinsku kiselinu zida (WTA) alfa. Slično tome, termini „beta antitelo protiv teihoinske kiseline zida“ ili „anti-WTA beta antitelo“ ili „anti-βWTA“ ili „antitelo na βglcNac WTA“ se upotrebljavaju naizmenično kako bi se odnosilo na antitelo koje specifično vezuje teihoinsku kiselinu zida (WTA) beta. Termini "anti-Staph antitelo" i "antitelo koje se vezuje za Staph" odnose se na antitelo koje je sposobno da vezuje antigen za Staphylococcus aureus ("Staph" ili "S. aureus") sa dovoljnim afinitetom tako da antitelo bude korisno kao dijagnostičko i/ili terapijsko sredstvo za ciljanje Staph. U jednom otelotvorenju, stepen vezivanja anti-Staph antitela za nepovezani, ne-Staph protein je manji od oko 10% vezivanja antitela za MRSA, mereno, na primer, radioimunološkom analizom (RIA). U nekim otelotvorenjima, antitelo koje se vezuje za Staph ima konstantu disocijacije (Kd) ≤ 1µM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM,, ≤ 5 Nm,, ≤ 4 nM,, ≤ 3 nM,, ≤ 2 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, ili ≤ 0.001 nM (npr., 10<-8>M ili manje, npr. od 10<-8>M do 10<-13>M, npr., od 10<-9>M do 10<-13>M). U nekim otelotvorenjima, anti-Staph antitelo se vezuje za epitop Staph koji je konzerviran među Staph iz različitih vrsta.
[0077] Termin "meticilin-rezistentni Staphylococcus aureus" (MRSA), alternativno poznat kao Staphylococcus aureus otporan na više lekova ili Staphylococcus aureus otporan na oksaciline (ORSA), odnosi se na bilo koji soj Staphylococcus aureus koji je rezistentan na beta-laktamske antibiotike, a koji uključuju i antibiotike penicilini (npr., meticilin, dikloksacilin, nafcilin, oksacilin, itd.) i cefalosporini. "Meticilin osetljiv Staphylococcus aureus" (MSSA) odnosi se na bilo koji soj Staphylococcus aureus koji je osetljiv na betalaktamske antibiotike.
[0078] Termin "minimalna inhibitorna koncentracija" ("MIC") odnosi se na najnižu koncentraciju antimikrobnog leka koja će inhibirati vidljivi rast mikroorganizma nakon inkubacije preko noći. Testovi za određivanje MIC su poznati. Jedan postupak je opisan u Primeru 18 ispod.
[0079] Termin "antitelo" se ovde koristi u najširem smislu i posebno obuhvata monoklonska antitela, poliklonska antitela, dimere, multimere, multispecifična antitela (npr., bispecifična antitela) i njihove fragmente koji vezuju antigen, (Miller i dr. (2003) J. of Immunology 170:4854-4861). Antitela mogu biti mišja, ljudska, humanizovana, himerna ili izvedena iz drugih vrsta. Antitelo je protein koji stvara imuni sistem koji je sposoban da prepozna i da se vezuje za određeni antigen (Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik (2001) Immuno Biology, 5th Ed., Garland Publishing, New York). Ciljani antigen generalno ima mnoga mesta vezivanja, koja se takođe nazivaju epitopi, prepoznata od strane CDR na više antitela. Svako antitelo koje se specifično vezuje za drugi epitop ima različitu strukturu. Prema tome, jedan antigen može biti prepoznat i vezan sa više odgovarajućih antitela. Antitelo uključuje molekul imunoglobulina pune dužine ili imunološki aktivni deo molekula imunoglobulina cele dužine, tj., molekul koji sadrži mesto vezivanja antigena koji imunospecifično vezuje antigen ciljane celine ili njegov deo, takvi ciljevi, uključujući ali nije ograničeno na ćeliju raka ili ćelije koje proizvode autoimuna antitela povezana sa autoimunom bolešću, inficiranom ćelijom ili mikroorganizmom kao što je bakterija. Ovde obelodanjeni imunoglobulin (Ig) može biti bilo kojeg izotipa, osim IgM (npr., IgG, IgE, IgD, i IgA) i podklase (npr., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 i IgA2. Imunoglobulini se mogu dobiti od bilo koje vrste. U jednom aspektu, Ig je ljudskog, mišjeg ili zečjeg porekla. U specifičnom otelotvorenju, Ig je ljudskog porekla.
[0080] "Klasa" antitela odnosi se na tip konstantnog domena ili konstantnog regiona koji poseduje njegov teški lanac. Postoji pet glavnih klasa antitela: IgA, IgD, IgE, IgG, i IgM, i nekoliko njih se može dalje podeliti u podklase (izotipove), npr., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, i IgA2. Konstantni domeni teških lanaca koji odgovaraju različitim klasama imunoglobulina zovu se α, δ, ε, γ, i µ, respektivno.
[0081] "Matična antitela" se odnose na prirodne molekule imunoglobulina sa različitim strukturama. Na primer, izvorna IgG antitela su heterotetramerni glikoproteini od oko 150 000 daltona, sastavljeni od dva identična lagana lanca i dva identična teška lanca koja su disulfidno vezana. Od N- do C-kraja, svaki teški lanac ima varijabilni region (VH), koji se takođe naziva varijabilni domen teškog ili varijabilni domen teškog lanca, a zatim slede tri konstantna domena (CHI, CH2 i CH3). Slično tome, od N- do C-kraja, svaki laki lanac ima varijabilni region (VL), koji se takođe naziva varijabilni domen lakog ili varijabilni domen teškog lanca, a sledi konstantni laki (CL) domen. Laki lanac antitela može se dodeliti jednoj od dve vrste, nazvanoj kappa (k) i lambda (λ), na osnovu aminokiselinske sekvence njegovog konstantnog domena.
[0082] Termini "antitelo pune dužine", "neoštećeno antitelo" i "celo antitelo" ovde se koriste naizmenično da bi se odnosilo na antitelo koje ima strukturu u osnovi sličnu izvornoj strukturi antitela ili ima teške lance koji sadrže Fc region kao što je ovde definisano.
[0083] "Fragment koji se vezuje za antigen" antitela odnosi se na molekul koji nije neoštećeno antitelo koji sadrži deo neoštećenog antitela za koji se vezuje antigen za koji se neoštećeno antitelo vezuje. Primeri fragmenata antitela uključuju, ali nisu ograničeni na Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; diatela; linearna antitela; jednolančane molekule antitela (npr. scFv); i multispecifična antitela formirana iz fragmenata antitela.
[0084] Termin "monoklonska antitela", kao što je ovde korišćen, odnosi se na antitelo dobijeno iz populacije suštinski homogenih antitela, tj., pojedinačna antitela koja obuhvataju populaciju su identična i/ili vezuje isti epitop, osim mogućih varijanti antitela, npr., koja prirodno sadrže mutacije ili nastaju tokom proizvodnje monoklonskog preparata antitela (npr., prirodna varijacija glikozilacije), a takve varijante su uglavnom prisutne u manjim količinama. Jedna takva moguća varijanta za IgG1 antitela je cepanje C-terminalnog lizina (K) konstantnog regiona teškog lanca. Za razliku od preparata za poliklonalna antitela, koji obično uključuju različita antitela usmerena protiv različitih determinanti (epitopi), svako monoklonsko antitelo monoklonskog preparata za antitelo usmereno je protiv jedne odrednice antigena. Prema tome, modifikator "monoklonski" ukazuje na karakter antitela koje je dobijeno iz suštinski homogene populacije antitela i ne treba ga tumačiti kao da zahteva proizvodnju antitela bilo kojim određenim postupkom. Na primer, monoklonska antitela koja će se koristiti u skladu sa predmetnim pronalaskom mogu se načiniti različitim tehnikama, uključujući, ali ne ograničavajući se na postupak hibridoma, rekombinantne DNK postupke, postupke fago-prikaza i postupke korišćenja transgenih životinja koje sadrže sve ili deo humanog imunoglobulinskog lokusa, takve postupke i drugi primeri primera za pravljenje monoklonskih antitela koja su ovde opisana. Pored svoje specifičnosti, monoklonska antitela su povoljna i po tome što mogu da se sintetišu ne kontaminirana drugim antitelima.
[0085] Termin "himerno antitelo" odnosi se na antitelo kod kojeg je deo teškog i/ili lakog lanca izveden iz određenog izvora ili vrste, dok je ostatak teškog i/ili lakog lanca izveden iz drugog izvora ili vrste.
[0086] "Humano antitelo" je ono koje poseduje aminokiselinsku sekvencu koja odgovara sekvenci antitela koje proizvodi čovek ili ljudska ćelija ili je izvedena iz izvora koji nije čovek, a koji koristi repertoar ljudskih antitela ili druge sekvence koje kodiraju ljudska antitela. Ova definicija humanog antitela izričito isključuje humanizovano antitelo koje sadrži ostatke koji se ne vezuju za humani antigen.
[0087] "Humanizovano antitelo" odnosi se na himerno antitelo koje sadrži aminokiselinske ostatke nehumanih HVR i aminokiselinske ostatke humanih FR. U određenim otelotvorenjima, humanizovano antitelo će sadržati uglavnom sve najmanje jednu, i obično dve, varijabilne domene, u kojima svi ili suštinski svi HVR (npr., CDR) odgovaraju onima ne-humanih antitela, i svi ili u osnovi svi FR odgovaraju onima humanih antitela. Humanizovano antitelo opciono može da sadrži bar deo konstantnog regiona antitela izvedenog iz humanog antitela. "Humanizovani oblik" antitela, npr., ne-humano antitelo, odnosi se na antitelo koje je pretrpelo humanizaciju.
[0088] Termin "promenljivi region" ili "promenljivi domen" odnosi se na domen antitela teškog ili lakog lanca koji je uključen u vezivanje antitela na antigen. Varijabilni domeni teškog i lakog lanca (VH i VL, respektivno) izvornog antitela generalno imaju slične strukture, pri čemu svaki domen sadrži četiri sačuvana okvirna regiona (FR) i tri hipervarijabilna regiona (HVR). (Videti, npr., Kindt i dr.. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007).) Jedan VH ili VL domen može biti dovoljan da prenese specifičnost vezivanja antigena. U nastavku, antitela koja vezuju određeni antigen mogu biti izolovana korišćenjem VH ili VL domena iz antitela koje veže antigen za skrining biblioteke komplementarnih VL ili VH domena, respektivno. Videti, npr., Portolano i dr.., J. Immunol.150:880-887 (1993); Clarkson i dr.., Nature 352:624-628 (1991).
[0089] Termin "hipervarijabilni region", "HVR" ili "HV", kada se ovde koristi odnosi se na oblasti varijabilne domene antitela koje su hipervarijabilne u sekvenci ("regioni koji određuju komplementarnost" ili "CDRs") i/ili formiraju strukturno definisane petlje i/ili sadrže ostatke koji dovode u dodir sa antigenom ("antigenski kontakti"). Opšte, antitela sadrže šest HVR; tri u VH (HI, H2, H3), i tri u VL (LI, L2, L3). U izvornim antitelima, H3 i L3 pokazuju najviše raznolikosti od šest HVR, a veruje se da posebno H3 ima jedinstvenu ulogu u davanju finih specifičnosti antitela. Videti, npr., Xu i dr.., Immunity 13:37-45 (2000); Johnson and Wu, in Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003). Zaista, antitela koja se pojavljuju u prirodi koja se sastoje samo od teškog lanca su funkcionalna i stabilna u odsustvu lakog lanca (Hamers-Casterman i dr.., (1993) Nature 363:446-448; Sheriff i dr.., (1996) Nature Struct. Biol.3:733-736).
[0090] Brojni HVR obrisi su u upotrebi i ovde su obuhvaćeni. Regioni za određivanje komplementarnosti Kabat (CDR) zasnivaju se na varijabilnosti sekvenci i najčešće se koriste (Kabat i dr.., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Čotija se umesto toga odnosi na lokaciju strukturalnih petlji (Chothia and Lesk, (1987) J. Mol. Biol.196:901-917). Za kontakte antigena,pogledajte MacCallum i dr.. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996). AbM HVR predstavljaju kompromis između kabatskih HVR-ova i strukturnih petlji Chothia, a koristi ih softver za modeliranje AbM antitela kompanije Oxford Molecular. HVR „kontakta“ zasnivaju se na analizi raspoloživih složenih kristalnih struktura. Ostaci svakog od ovih HVR navedeni su u daljem tekstu.
2
[0091] HVR mogu sadržavati "proširene HVR" kako sledi: 24-36 ili 24-34 (LI), 46-56 ili 50-56 (L2) i 89-97 or 89-96 (L3) u VL i 26-35 (HI), 50-65 ili 49-65 (H2) i 93-102, 94-102, ili 95-102 (H3) u VH. Ako nije drugačije naznačeno, HVR ostaci, CDR ostaci i drugi ostaci u varijabilnom domenu (npr., FR ostaci) su ovde numerisani prema Kabat i dr.., supra.
[0092] Termin "numerisanje ostataka promenljivog domena kao u Kabatu" ili "numerisanje položaja aminokiselina kao u Kabatu", i njegove varijacije, odnosi se na sistem numerisanja koji se koristi za varijabilne domene teških lanaca ili promenljive domene lakog lanca kompilacija antitela u Kabat i dr.., supra. Koristeći ovaj sistem numerisanja, stvarna linearna sekvenca aminokiselina može da sadrži manje ili dodatnih aminokiselina koje odgovaraju skraćenju ili ubacivanju u FR ili HVR promenljivog domena. Na primer, varijabilni domen teškog lanca može da sadrži jedan umetak aminokiselina (ostatak 52a prema Kabatu) posle ostatka 52 H2 i ubačene ostatke (npr., ostatke 82a, 82b i 82c, itd. prema Kabatu) posle teškog lanca FR ostatak 82. Kabat numerisanje ostataka može se odrediti za dato antitelo podešavanjem u oblastima homologije sekvence antitela sa "standardnom" Kabat numerisanom sekvencom.
[0093] "Okvir" ili "FR" odnosi se na ostatke promenljivih domena koji nisu ostaci hipervarijabilnog regiona (HVR). FR promenljivog domena se obično sastoji od četiri FR domena: FR1, FR2, FR3 i FR4. Prema tome, HVR i FR sekvence obično se pojavljuju u sledećem nizu u VH (ili VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
[0094] "Akceptorski humani okvir" za ovdašnje potrebe je okvir koji sadrži aminokiselinsku sekvencu okvira varijabilnog domena lakog lanca (VL) ili okvir varijabilnog domena teškog lanca (VH) izveden iz okvira humanog imunoglobulina ili okvira humanog konsenzusa, kako je definisano ispod. Akceptorski humani okvir „izveden“ iz okvira humanog imunoglobulina ili okvira humanog konsenzusa može sadržati istu njegovu sekvencu aminokiselina ili može sadržati promene sekvence aminokiselina. U nekim otelotvorenjima, broj promena aminokiselina je 10 ili manji, 9 ili manje, 8 ili manje, 7 ili manje, 6 ili manje, 5 ili manje, 4 ili manje, 3 ili manje, ili 2 ili manje. U nekim otelotvorenjima, humani okvir akceptorskih VL identičan je sekvencijalno sekvenci VL humanog imunoglobulina ili sekvenci humanog konsenzusa.
[0095] "Okvir humanog konsenzusa" je okvir koji predstavlja najčešće prisutne aminokiselinske ostatke u izboru sekvenci humanog imunoglobulina VL ili VH okvira. Generalno, izbor VL ili VH sekvenci humanog imunoglobulina je iz podgrupe nizova promenljivih domena. Generalno, podgrupa nizova je podgrupa kao u Kabat i dr.., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols.1-3. U jednom otelotvorenju, za VL, podgrupa je podgrupa kappa I kao u Kabat i dr., supra. U jednom otelotvorenju, za VH, podgrupa je podgrupa III kao u Kabat i dr., supra.
[0096] "Afinitet" se odnosi na jačinu ukupnog broja nekovalentnih interakcija između jednog mesta vezivanja molekula (npr., antitela) i njegovog vezujućeg partnera (npr., antigena). Ako nije drugačije naznačeno, kako se ovde koristi, "afinitet vezivanja" odnosi se na afinitet vezivanja koji odražava 1:1 interakciju između članova vezujućeg para (na primer, antitelo i antigen). Afinitet molekula X za njegovog partnera Y uopšteno može biti predstavljen konstantom disocijacije (Kd). Afinitet se može meriti uobičajenim postupcima poznatim u struci, uključujući one opisane ovde.
[0097] Antitelo sazrelo za afinitet odnosi se na antitelo sa jednom ili više izmena u jednom ili više hipervarijabilnih regiona (HVRs), u poređenju sa matičnim antitelom koje nema takve promene, a takve promene rezultiraju poboljšanjem afiniteta antitela za antigen.
[0098] Termin "epitop" odnosi se na određeno mesto na molekulu antigena za koje se antitelo vezuje.
[0099] "Antitelo koje se vezuje za isti epitop" kao referentno antitelo odnosi se na antitelo koje blokira vezivanje referentnog antitela za njegov antigen u oglednom testu za 50% ili više, i obrnuto, referentno antitelo blokira vezivanje antitela za njegov antigen u oglednom testu za 50% ili više. Ovde je dat primer oglednog takmičenja.
[0100] "Golo antitelo" se odnosi na antitelo koje nije konjugovano sa heterološkom grupom (npr., citotoksičnom jedinicom) ili radio-obeležavanjem. Golo antitelo može biti prisutno u farmaceutskoj formulaciji.
[0101] "Efektorske funkcije" se odnose na one biološke aktivnosti koje se mogu pripisati Fc regionu antitela, a koje se razlikuju u zavisnosti od izotipa antitela. Primeri efektorskih efekata antitela uključuju: C1q vezivanje i citotoksičnost zavisna od komplemenata (CDC); Fc receptor vezivanja; citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC); fagocitoza; donja regulacija ćelijskih površinskih receptora (npr. B ćelijski receptor); i aktivacija B ćelija.
[0102] "Citotoksičnost posredovana antitelima" ili ADCC se odnosi na oblik citotoksičnosti u kojem se izlučeni Ig vezuje za Fc receptore (FcRs) prisutne na određenim citotoksičnim ćelijama (npr., ćelije prirodnih ubica (NK), neutrofili i makrofagi) omogućavaju ove citotoksične efektorske ćelije da se specifično vezuju za ciljnu ćeliju koja nosi antigen i posle toga ubiju ciljnu ćeliju citotoksina. Antitela "naoružavaju" citotoksične ćelije i potrebna su za ubijanje ciljane ćelije ovim mehanizmom. Primarne ćelije za posredovanje ADCC, NK ćelije, eksprimiraju samo Fcγ(gamma)RIII, dok monociti izražavaju Fcγ(gamma)RI, Fcγ(gamma)RII i Fcy(gamma)RIII. Ekspresija Fc na hematopoetskim ćelijama rezimirana je u Tabeli 3 na strani 464 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol.9: 457-92 (1991). Da bi se procenila ADCC aktivnost molekula od interesa, in vitro ADCC test, kakav je opisan u US 5,500,362 ili US 5,821,337 mogu biti izvedeni. Korisne ćelije efektora za takve testove uključuju mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) i ćelije prirodnih ubica (NK). Alternativno, ili dodatno, ADCC aktivnost molekula od interesa može se proceniti in vivo, npr., na životinjskom modelu kakav je obelodanjen u Clynes i dr.., PNAS USA 95:652-656 (1998).
[0103] "Fagocitoza" se odnosi na proces u kojem patogen zahvata ili internalizuje ćelija domaćin (npr., makrofag ili neutrofil). Fagociti posreduju fagocitozu tri puta: (i) direktni receptori ćelijske površine (na primer, lektini, integralini i receptori za uklanjanje smeća) (ii) komplementirani poboljšani - korišćenjem komplementa receptora (uključujući CRI, receptor za C3b, CR3 i CR4) za vezivanje i gutanje komplementa opsonizovanih patogena, i (iii ) antitela poboljšana - korišćenjem Fc receptora (uključujući FcygammaRI, FcγamgamRIIA i FcyγammaRIIIA) za vezivanje čestica opsonizovanih antitela koja se zatim internalizuju i spajaju sa lizosomima kako bi postali fagolizomi. U predmetnom pronalasku, veruje se da put (iii) igra značajnu ulogu u isporuci anti-MRSA AAC terapeuta inficiranim leukocitima, npr., neutrofilima i makrofagama (fagocitoza mikroba: složenost u Akciji D. Underhill and A Ozinsky. (2002) Annual Review of Immunology, Vol 20:825).
[0104] "Citotoksičnost zavisna od komplementa" ili "CDC" odnosi se na lizu ciljne ćelije u prisustvu komplementa. Aktivacija klasičnog puta komplementa započinje vezanjem prve komponente sistema komplementa (C1q) na antitela (odgovarajućeg podklasa) koja su vezana za njihov kognitivni antigen. Za procenu aktivacije komplementa, CDC test, npr., kao što je opisano u Gazzano-Santoro i dr.., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996), mogu biti izvedeni.
[0105] Termin "Fc region" ovde se koristi da definiše region C-kraja teškog lanca imunoglobulina. Termin uključuje Fc regione izvorne sekvence i varijante Fc regiona. Iako granice Fc regiona teškog lanca imunoglobulina mogu varirati, humani IgG teški lanac Fc regiona obično je definisan da se proteže od aminokiselinskog ostatka na položaju Cys226, ili od Pro230, do njegovog karboksilnog kraja. C-kraj lizina (ostatak 447 prema EU sistemu numerisanja - koji se takođe naziva EU indeks, kao što je opisano u Kabat i dr.., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991) regiona Fc može se ukloniti, na primer, tokom proizvodnje ili prečišćavanja antitela ili rekombinantnim inženjeringom nukleinske kiseline koja kodira teški lanac antitela. Shodno tome, sastav netaknutih antitela može da sadrži populacije antitela sa uklonjenim svim ostacima K447, populacije antitela bez uklonjenih ostataka K447 i populacije antitela koja imaju mešavinu antitela sa i bez K447 ostatka. Termin "Fc receptor" ili "FcR" takođe uključuje neonatalni receptor, FcRn, koji je odgovoran za prenos majčinih IgG na fetus. Guyer i dr.., J. Immunol. 117: 587 (1976) i Kim i dr.., J. Immunol. 24: 249 (1994). Postupci za merenje vezivanja za FcRn su poznati (videti npr., Ghetie and Ward, Immunol. Danas 18: (12):
2
592-8 (1997); Ghetie i dr.., Nature Biotechnology 15 (7): 637-40 (1997); Hinton i dr.., J. Biol. Chem.279(8): 6213-6 (2004); WO 2004/92219 (Hinton i dr..). Vezivanje za FcRn in vivo i serumski polu-raspad humanih FcRn polipeptida koji se vezuju visokim afinitetom mogu se testirati, npr., kod transgenskih miševa ili transficiranih humanih ćelijskih linija koje ispoljavaju humani FcRn, ili kod primata kojima su primenjeni polipeptidi koji imaju varijantu Fc regiona. WO 2004/42072 (Presta) opisuje varijante antitela koje poboljšavaju ili smanjuju vezivanje za FcR. Videti takođe, npr., Shields i dr.., J. Biol. Chem.9(2):6591-6604 (2001).
[0106] Ugljeni hidrati vezani za Fc region mogu se izmeniti. Izvorna antitela proizvedena od sisarskih ćelija obično sadrže razgranat, biantenarni oligosaharid koji je generalno vezan N-vezom na Asn297 domena CH2 u regionu Fc. Videti npr., Wright i dr.. (1997) TIBTECH 15:26-32. Oligosaharid može da obuhvata različite ugljene hidrate, npr., manozu, N-acetil glukozamin (GIcNAc), galaktozu i sijalnu kiselinu, kao i fukozu vezanu za GIcNAc u "struku" biantenarne oligosaharidne strukture. U nekim otelotvorenjima, modifikacije oligosaharida u IgG mogu biti napravljene da bi se stvorili IgG sa određenim dodatno poboljšanim svojstvima. Na primer, obezbeđene su modifikacije antitela koja imaju strukturu ugljenih hidrata kojoj nedostaje fukoza vezana (direktno ili indirektno) na Fc region. Takve modifikacije su možda poboljšale funkciju ADCC. Videti, npr. US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Primeri publikacija koje se odnose na modifikacije antitela sa „defukoziliranim“ ili „manjkom fukoze“ uključuju: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki i dr.., J. Mol. Biol. 336: 1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki i dr.. Biotech. Bioeng.87: 614 (2004). Primeri ćelijskih linija sposobnih da proizvode defukozilirana antitela uključuju Lee 13 CHO ćelije sa nedostatkom fukozilacije proteina (Ripka i dr.. Arch. Biochem. Biophys.249:533-545 (1986); Pat. SAD prijava. obj. br.2003/0157108 A1, Presta, L; i WO 2004/056312 A1, Adams i dr.., posebno u Primeru 11), i nokaut ćelijske linije, kao što je alfa-1,6-fukoziltransferaza gen, FUT8, nokaut CHO ćelije (videti npr., Yamane-Ohnuki i dr.., Biotech. Bioeng.
87: 614 (2004); Kanda, Y. i dr., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); i WO2003/085107).
[0107] "Izolovano antitelo" je ono koje je izdvojeno iz komponente prirodnog okruženja. U nekim otelotvorenjima, antitelo se prečišćava do čistoće veće od 95% ili 99%, kako je određeno, na primer, elektroforetskim (npr., SDS-PAGE, izoelektričnim fokusiranjem (IEF), kapilarnom elektroforezom) ili hromatografskim (npr., jonoizmenjivačkom ili reverzno faznom HPLC). Za pregled postupaka za procenu čistoće antitela, videti npr., Flatman i dr.., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007).
[0108] "Izolovana nukleinska kiselina" odnosi se na molekul nukleinske kiseline koji je odvojen od komponente prirodnog okruženja. Izolovana nukleinska kiselina uključuje molekul nukleinske kiseline sadržan u ćelijama koje obično sadrže molekulu nukleinske kiseline, ali je molekul nukleinske kiseline prisutan ekstrahromozomalno ili na hromozomskoj lokaciji koja je različita od njegove prirodne hromozomske lokacije.
[0109] "Izolovana nukleinska kiselina koja kodira anti-WTA beta antitelo" odnosi se na jedan ili više molekula nukleinske kiseline koji kodiraju teška i laka lanca antitela, uključujući takve molekule nukleinske kiseline u jednom vektoru ili odvojenim vektorima, i takve molekule nukleinske kiseline prisutne na jednoj ili više lokacija u ćeliji domaćina.
[0110] Kao što je ovde korišćeno, termin "specifično se vezuje za" ili je "specifičan za" odnosi se na merljive i obnovljive interakcije, kao što su vezivanje između cilja i antitela, što je odlučujuće za prisustvo cilja u prisustvu heterogene populacije od molekuli uključujući biološke molekule. Na primer, antitelo koje se specifično vezuje za cilj (što može biti epitop) je antitelo koje se veže za ovaj cilj s većim afinitetom, avidnošću, spremnije i/ili sa dužim trajanjem nego što se vezuje za druge ciljeve. U jednom otelotvorenju, stepen vezivanja antitela za cilj koji nije povezan sa WTA-beta je manji od oko 10% vezivanja antitela za cilj, mereno, na primer, radioimunološkom analizom (RIA). U nekim otelotvorenjima, antitelo koje se specifično vezuje za WTA beta ima konstantu disocijacije (Kd) od ≤ 1µM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ili ≤ 0.1 nM. U nekim otelotvorenjima, antitelo se specifično vezuje za epitop na kome je sačuvano od različitih vrsta. U drugom otelotvorenju, specifično vezivanje može obuhvatati, ali ne zahteva ekskluzivno vezivanje.
[0111] "Afinitet vezivanja" uopšteno se odnosi na jačinu ukupnog broja nekovalentnih interakcija između jednog vezivnog mesta molekula (npr., antitela) i njegovog vezujućeg partnera (npr., antigena). Ako nije drugačije naznačeno, kako se ovde koristi, "afinitet vezivanja" odnosi se na afinitet vezivanja koji odražava 1:1 interakciju između članova vezujućeg para (na primer, antitelo i antigen). Afinitet molekula X za njegovog partnera Y uopšteno može biti predstavljen konstantom disocijacije (Kd). Afinitet se može meriti uobičajenim
2
postupcima poznatim u struci, uključujući one opisane ovde. Antitela niskog afiniteta uglavnom se polako vezuju antigen i imaju tendenciju lake disocijacije, dok antitela visokog afiniteta uglavnom vezuju antigen brže i teže ostanu duže vezani. U oblasti su poznati razni postupci za merenje afiniteta vezivanja, od kojih se bilo koji može koristiti u svrhu predmetnog pronalaska. Specifična ilustrativna i ogledna otelotvorenja za merenje afiniteta vezivanja su opisane u sledećem.
[0112] U jednom otelotvorenju, "Kd" ili "Kd vrednost" prema predmetnom pronalasku meri se radioobeleženim testom vezivanja antigena (RIA) izvedenim sa Fab verzijom antitela koje nas zanima i njegovog antigena kako je opisano u sledećem testu. Afinitet vezivanja Fabs za antigen koji se vezuje za rastvor meri se izjednačavanjem Fab sa minimalnom koncentracijom (<125>I) obeleženih antigena u prisustvu serije titracije neobeleženih antigena, zatim hvatanjem vezanog antigena sa pločom prekrivenom anti-Fab antitelom (videti, npr., Chen i dr.., (1999) J. Mol. Biol.293:865-881). Da bi se uspostavili uslovi za ispitivanje, mikrotitar ploče (DYNEX Technologies, Inc.) preko noći su obložene sa 5 µg/ml hvatajućeg anti-Fab antitela (Cappel Labs) u 50 mM natrijum-karbonata (pH 9.6), a potom blokirane sa 2% (w/v) goveđeg serumskog albumina u PBS tokom dva do pet sati na sobnoj temperaturi (približno 23°C). U ne-adsorbentnoj ploči (Nunc #269620) 100 pM ili 26 pM [<125>I]-antigena se meša sa serijskim razblaživanjem Fab od interesa (npr., u skladu sa procenom anti-VEGF antitela u Presta i dr.., Cancer Res.57:4593-4599 (1997)). Fab od interesa se zatim inkubira preko noći; međutim, inkubacija može da traje duže vreme (npr., oko 65 sati) da se obezbedi postizanje ravnoteže. Nakon toga, smeše se prenose na hvatajuću ploču za inkubaciju na sobnoj temperaturi (npr., tokom jednog sata). Rastvor je zatim uklonjen i ploča je isprana osam puta sa 0.1% površinskim aktivnim sredstvom TWEEN-20™ u PBS. Kada se ploče osuše, dodaje se 150 µl/udubljenju scintiltaneta (MICROSCINT-20™; Packard) i ploče se broje na TOPCOUNT™ gama brojaču (Packard) tokom deset minuta. Koncentracije svakog Fab koje daju manje ili jednako 20% maksimalnog vezivanja su izabrane za upotrebu u kompetetivnim testovima vezivanja.
[0113] Prema drugom otelotvorenju, Kd se meri korišćenjem površinsko-plazmonske rezonancije pomoću BIACORE<®>-2000 or a BIACORE<®>-3000 instrumenata (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) na 25°C sa imobilizovanim antigenom CM5 čipovima na ∼10 jedinica odgovora (RU). Ukratko, karboksimetilirani biosenzorni čipovi dekstrana (CM5, BIAcore Inc.) aktiviraju se sa N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-karbodiimid hidrohloridom (EDC) i N-hidroksisukcinimidom (NHS) prema uputstvima dobavljača. Antigen je razblažen sa 10 mM natrijum acetata, pH 4.8, do 5 µg/ml (∼0.2 µM) pre injekcije brzinom protoka od 5 µl/minutu da bi se postiglo približno 10 jedinica odgovora (RU) povezanog proteina. Nakon ubrizgavanja antigena, ubrizgava se 1 M etanolamin koji blokira grupe koje ne reaguju. Za kinetička merenja, dvostruka serijska razblaženja Fab (0.78 nM do 500 nM) ubrizgavaju se u PBS sa 0.05% TWEEN 20™ surfaktanata (PBST) na 25°C pri brzini protoka od približno 25 µl/min. Stope asocijacije (kon) i stope disocijacije (koff) izračunavaju se korišćenjem jednostavnog Langmuirovog modela vezivanja (BIAcore® Evaluacijski softver verzija 3.2) istovremeno prilagođavanjem asocijacijskih i disocijacijskih senzora. Ravnotežna konstanta disocijacije (Kd) izračunava se kao odnos koff/kon. Videti, npr., Chen i dr.., J. Mol. Biol.293:865-881 (1999). ako brzina prekorači 10<6>M<-1>s<-1>testom površinske plazmonske rezonance iznad, tada se brzina može odrediti upotrebom fluorescentne tehnike gašenja koja meri povećanje ili smanjenje intenziteta emisije fluorescencije (pobuda = 295 nm; emisija = 340 nm, 16 nm opsega) na 25 °C 20 nM antitela antigena (Fab oblik) u PBS, pH 7,2, u prisustvu povećanih koncentracija antigena merenih u spektrometru, kao što je spektrofotometar opremljen zaustavljanjem protoka (Aviv Instruments) ili SLM-AMINCO™ spektrofotometar serije 8000 (ThermoSpectronic) sa mešanom kivetom.
[0114] "Asocijacija", "brzina asocijacije", "stopa asocijacije" ili "kon" prema predmetnom pronalasku takođe se može odrediti kao što je iznad opisano korišćenjem BIACORE®-2000 ili BIACORE®-3000 sistema (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ).
[0115] Pojmovi „ćelija domaćina“, „ćelijska linija domaćina“ i „ćelijska kultura domaćina“ se koriste naizmenično i odnose se na ćelije u koje je uvedena egzogena nukleinska kiselina, uključujući potomstvo takvih ćelija. Ćelije domaćine uključuju „transformatore“ i „transformisane ćelije“, koje uključuju primarnu transformisanu ćeliju i potomstvo dobijeno od njih bez obzira na broj prolazaka. Potomstvo možda nije u potpunosti identično po sadržaju nukleinske kiseline kao matična ćelija, ali može sadržati mutacije Ovde su uključeni mutirani potomci koji imaju istu funkciju ili biološku aktivnost kao što su ekranizovani ili odabrani u prvobitno transformisanoj ćeliji.
[0116] Termin "vektor", kako se ovde koristi, odnosi se na molekul nukleinske kiseline koji je sposoban da propagira drugu nukleinsku kiselinu na koju je povezan. Termin uključuje vektor kao samoobnavljajuću
2
strukturu nukleinske kiseline kao i vektor ugrađen u genom ćelije domaćina u koju je uveden. Određeni vektori su u stanju da usmere ekspresiju nukleinskih kiselina sa kojima su operativno vezani. Takvi se vektori ovde nazivaju "vektori ekspresije".
[0117] "Procentualni (%) identitet aminokiselinske sekvence" u odnosu na referentnu polipeptidnu sekvencu se definiše kao procenat aminokiselinskih ostataka u kandidatskoj sekvenci koji su identični sa aminokiselinskim ostacima u referentnoj polipeptidnoj sekvenci, nakon poravnavanja sekvenci i uvođenja međuprostora, ako je potrebno, za postizanje maksimalnog procenta identiteta sekvence, i ne razmatranje bilo koje konzervativne supstitucije kao dela identiteta sekvence. Usklađivanje radi određivanja postotka aminokiselinskih procenata može se postići na različite načine koji su poznati u struci, na primer, korišćenjem javno dostupnog računarskog softvera, poput softvera BLAST, BLAST-2, ALIGN ili Megalign (DNASTAR). Oni koji poznaju ovu oblast mogu odrediti odgovarajuće parametre za poravnanje sekvenci, uključujući bilo koje algoritme potrebne za postizanje maksimalnog poravnanja po celoj dužini sekvence koja se upoređuje. Međutim, u svrhe ovde,% identičnosti sekvenci aminokiselina se generišu korišćenjem računarskog programa za poređenje sekvenci ALIGN-2. Kompjuterski program za poređenje ALIGN-2 autor je Genentech, Inc., a izvorni kod je podnesen sa korisničkom dokumentacijom u američkom uredu za autorska prava, Vašington D.C., 20559, gde je registrovan pod američkim registracionim brojem TXU510087. Program ALIGN-2 javno je dostupan od Genentech, Inc., Južni San Francisko, Kalifornija, ili se može sastaviti iz izvornog koda. Program ALIGN-2 treba da bude sastavljen za upotrebu u UNIX operativnom sistemu, uključujući digitalni UNIX V4.0D. Sve parametre za poređenje sekvenci postavlja program ALIGN-2 i ne variraju.
[0118] U situacijama kada se ALIGN-2 koristi za poređenje aminokiselinskih sekvenci, % identičnosti aminokiselinske sekvence date aminokiselinske sekvence A do, sa ili protiv date aminokiselinske sekvence B (koja se alternativno može formulisati kao data aminokiselina sekvenca A koja ima ili sadrži izvestan % identičnosti sekvence aminokiselina sa, sa ili protiv date aminokiselinske sekvence B) izračunava se na sledeći način: 100 puta veći od frakcije X/Y, gde je X broj ostataka aminokiselina postignut kao identični podudaranje programom za poravnavanje redosleda ALIGN-2 u poravnavanju A i B tog programa, a gde je Y ukupni broj aminokiselinskih ostataka u B. Razumeće se da tamo gde dužina sekvence A aminokiselina A nije jednaka dužini sekvence B aminokiselina, % identičnosti A-B sekvence aminokiselina neće biti jednak% identifikaciji sekvence B aminokiselina od B do A Ukoliko nije izričito drugačije navedeno, sve identične vrednosti identifikovanih sekvenci aminokiselina ovde su dobijene kako je opisano.
[0119] Termin "antibiotik tipa rifamicina" označava klasu ili grupu antibiotika koji imaju strukturu ili sličnu strukturu rifamicina.
[0120] Termin "antibiotik tipa rifalazil" označava klasu ili grupu antibiotika koji imaju strukturu ili sličnu strukturu rifalazil.
[0121] Kada označava broj supstituenata, termin "jedan ili više" odnosi se na raspon od jednog supstituenta do najvećeg mogućeg broja supstitucija, tj. supstitucija jednog vodonika do supstitucije svih vodonika supstituentima. Termin "supstituent" označava atom ili grupu atoma koji zamenjuju atom vodonika na matičnom molekulu. Termin "supstituisani" označava da određena grupa sadrži jedan ili više supstituenata. Ako bilo koja grupa može imati više supstituenata i pruža se mnoštvo mogućih supstituenata, supstituenti su nezavisno odabrani i ne moraju biti isti. Termin "nesupstituisani" znači da navedena grupa ne sadrži supstituente. Termin "opciono supstituisan" znači da je određena grupa nesupstituisana ili supstituisana jednim ili više supstituenata, nezavisno izabranih iz grupe mogućih supstituenata. Kada označava broj supstituenata, termin "jedan ili više" znači od jednog supstituenta do najvećeg mogućeg broja supstitucija, tj. zamena jednog vodonika do zamene svih vodonika supstituentima.
[0122] Termin "alkil" kako se ovde koristi odnosi se na zasićeni jednovalentni ugljovodonični radikal sa linearnim ili razgranatim lancem od jednog do dvanaest atoma ugljenika (C1-C12), pri čemu alkil radikal može biti opciono supstituisan sa jednim ili više opisanih supstituenata. U drugom otelotvorenju, alkil radikal je jedan do osam atoma ugljenika (C1-C8), ili jedan do šest atoma ugljenika (C1-C6). Primeri alkil grupa uključuju, ali nisu ograničeni na, metil (Me, -CH3), etil (Et, -CH2CH3), 1-propil (n-Pr, n-propil, -CH2CH2CH3), 2-propil (i-Pr, i-propil, -CH(CH3)2), 1-butil (n-Bu, n-butil, -CH2CH2CH2CH3), 2-metil-1-propil (i-Bu, i-butil, -CH2CH(CH3)2), 2-butil (s-Bu, s-butil, -CH(CH3)CH2CH3), 2-metil-2-propil (t-Bu, t-butil, -C(CH3)3), 1-pentil (n-pentil, -CH2CH2CH2CH2CH3), 2-pentil (-CH(CH3)CH2CH2CH3), 3-pentil (-CH(CH2CH3)2), 2-metil-2-butil (-C(CH3)2CH2CH3), 3-metil-2-butil (-CH(CH3)CH(CH3)2), 3-metil-1-butil (-CH2CH2CH(CH3)2), 2-metil-1-butil (-CH2CH(CH3)CH2CH3), 1-heksil (-CH2CH2CH2CH2CH2CH3), 2-heksil (-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3), 3-heksil (-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3)), 2-metil-2-pentil (-C(CH3)2CH2CH2CH3), 3-metil-2-pentil (-
2
CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3), 4-metil-2-pentil (-CH(CH3)CH2CH(CH3)2), 3-metil-3-pentil (-C(CH3)(CH2CH3)2), 2-metil-3-pentil (-CH(CH2CH3)CH(CH3)2), 2,3-dimetil-2-butil (-C(CH3)2CH(CH3)2), 3,3-dimetil-2-butil (-CH(CH3)C(CH3)3, 1-heptil, 1-oktil, i slično.
[0123] Termin "alkilen" kako se ovde koristi odnosi se na zasićeni dvovalentni ugljovodonični radikal sa linearnim ili razgranatim lancem od jednog do dvanaest atoma ugljenika (C1-C12), pri čemu alkil radikal može biti opciono supstituisan sa jednim ili više opisanih supstituenata. U drugom otelotvorenju, alkilen radikal je jedan do osam atoma ugljenika (C1-C8), ili jedan do šest atoma ugljenika (C1-C6). Primeri alkilenskih grupa uključuju, ali nisu ograničeni na, metilen (-CH2-), etilen (-CH2CH2-), propilen (-CH2CH2CH2-), i slično.
[0124] Termin "alkenil" odnosi se na jednovalentni ugljovodonični radikal linearnog ili razgranatog lanca sa dva do osam atoma ugljenika (C2-C8) sa najmanje jednim mestom nezasićenja, tj. dvostrukom vezom ugljenikugljenik, sp<2>, pri čemu alkenil radikal može biti opciono supstituisan sa jednim ili više ovde opisanih supstituenata, i uključuje radikale koji imaju "cis" i "trans" orijentacije, ili alternativno, "E" i "Z" orijentacije. Primeri uključuju, ali nisu ograničeni na, etilenil ili vinil (-CH=CH2), alil (-CH2CH=CH2) i slično.
[0125] Termin "alkenilen" odnosi se na dvovalentni ugljovodonični radikal linearnog ili razgranatog lanca sa dva do osam atoma ugljenika (C2-C8) sa najmanje jednim mestom nezasićenja, tj. dvostrukom vezom ugljenikugljenik, sp<2>, pri čemu alkenilen radikal može biti opciono supstituisan sa jednim ili više ovde opisanih supstituenata, i uključuje radikale koji imaju "cis" i "trans" orijentacije, ili alternativno, "E" i "Z" orijentacije. Primeri uključuju, ali nisu ograničeni na, etilenilen ili vinilen (-CH=CH-), alil (-CH2CH=CH-), i slično.
[0126] Termin "alkinil" odnosi se na linearni ili razgranati monovalentni ugljovodonični radikal sa dva do osam atoma ugljenika (C2-C8) sa najmanje jednim mestom nezasićenja, tj., trostrukom vezom ugljenikugljenik, sp, pri čemu alkinil radikal može biti opciono supstituisan nezavisno jednim ili više supstituenata ovde opisanih. Primeri uključuju, ali nisu ograničeni na, etinil (-C≡CH), propinil (propargil, -CH2C≡CH) i slično.
[0127] Termin "alkinilen" odnosi se na linearni ili razgranati divalentni ugljovodonični radikal sa dva do osam atoma ugljenika (C2-C8) sa najmanje jednim mestom nezasićenja, tj., trostrukom vezom ugljenik-ugljenik, sp, pri čemu alkinilen radikal može biti opciono supstituisan nezavisno jednim ili više supstituenata ovde opisanih. Primeri uključuju, ali nisu ograničeni na, etinilen (-C≡C-), propininilen (propargilen, -CH2C≡C-) i slično.
[0128] Termini "karbocikl", "karbociklil", "karbociklični prsten" i "cikloalkil" odnose se na monovalentni nearomatski, zasićeni ili delimično nezasićeni prsten sa 3 do 12 atoma ugljenika (C3-C12) kao monociklični prsten ili 7 do 12 atomi ugljenika kao biciklični prsten. Biciklični karbocikli sa 7 do 12 atoma mogu biti raspoređeni, na primer, kao biciklo [4,5], [5,5], [5,6] ili [6,6] sistem i biciklični karbocikli sa 9 ili 10 atoma u prstenu mogu biti raspoređeni kao biciklo [5,6] ili [6,6] sistem ili kao premošćeni sistemi kao što su biciklo[2.2.1]heptan, biciklo[2.2.2]oktan i biciklo[3.2.2]nonan. Spiro delovi su takođe obuhvaćeni opsegom ove definicije. Primeri monocikličnih karbocikla uključuju, ali nisu ograničeni na, ciklopropil, ciklobutil, ciklopentil, 1-ciklopent-1-enil, 1-ciklopent-2-enil, 1-ciklopent-3-enil, cikloheksil, 1-cikloheks-1-enil, 1-cikloheks-2-enil, 1-cikloheks-3-enil, cikloheksadienil, cikloheptil, ciklooktil, ciklononil, ciklodecil, cikloundecil, ciklododecil i slično. Karbociklil grupe su opciono supstituisane jednim ili više ovde opisanih supstituenata.
[0129] "Aril" znači monovalentni aromatični ugljovodonični radikal od 6-20 atoma ugljenika (C6-C20) koji se dobija uklanjanjem jednog atoma vodonika iz jednog ugljeničnog atoma matičnog aromatičnog prstenastog sistema. Neke arilne grupe predstavljene su u oglednim strukturama kao „Ar“. Aril uključuje biciklične radikale koji sadrže aromatski prsten spojen sa zasićenim, delimično nezasićenim prstenom ili aromatičnim karbocikličnim prstenom. Tipične arilne grupe uključuju, ali nisu ograničene na, radikale izvedene iz benzena (fenil), supstituisanih benzena, naftalena, antracena, bifenila, indenila, indanila, 1,2-dihidronaftalena, 1,2,3,4-tetrahidronaftila i slično. Aril grupe su opciono supstituisane jednim ili više ovde opisanih supstituenata.
[0130] "Arilen" znači divalentni aromatični ugljovodonični radikal od 6-20 atoma ugljenika (C6-C20) koji se dobija uklanjanjem dva atoma vodonika iz dva ugljeničnog atoma matičnog aromatičnog prstenastog sistema. Neke arilen grupe predstavljene su u oglednim strukturama kao „Ar“. Arilen uključuje biciklične radikale koji sadrže aromatski prsten spojen sa zasićenim, delimično nezasićenim prstenom ili aromatičnim karbocikličnim prstenom. Tipične arilenske grupe uključuju, ali nisu ograničene na, radikale koji potiču iz benzena (fenilen), supstituisanih benzena, naftalena, antracena, bifenilena, indenilena, indalena, 1,2-dihidronaftalena, 1,2,3,4-tetrahidronaftila i slično. Arilen grupe su po izboru supstituisane sa jednim ili više ovde opisanih supstituenata.
2
[0131] Termini "heterocikl", "heterociklil" i "heterociklični prsten" ovde su korišćeni naizmenično i odnose se na zasićeni ili delimično nezasićeni (tj., koji ima jednu ili više dvostrukih i/ili trostrukih veza unutar prstena) karbociklični radikal od 3 do oko 20 atoma u prstenu u kojima je najmanje jedan atom prstena heteroatom odabran između azota, kiseonika, fosfora i sumpora, a preostali atomi prstena su C, pri čemu je jedan ili više atoma u prstenu opciono supstituisano jednim ili više supstituenata opisanih u daljem tekstu. Heterocikl može biti monocikl koji sadrži 3 do 7 članova prstena (2 do 6 atoma ugljenika i 1 do 4 heteroatoma odabranih između N, O, P i S) ili bicikl sa 7 do 10 članova prstena (4 do 9 atoma ugljenika i 1 do 6 heteroatoma izabranih između N, O, P i S), na primer: biciklo [4,5], [5,5], [5,6], ili [6,6] sistem. Heterocikli su opisani u Paquette, Leo A.; "Principles of Modern Heterocyclic Chemistry" (W.A. Benjamin, New York, 1968), posebno u Poglavljima 1, 3, 4, 6, 7, i 9; "The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs" (John Wiley & Sons, New York, 1950 to present), in particular Volumes 13, 14, 16, 19, and 28; i J. Am. Chem. Soc. (1960) 82:5566. "Heterociklil" takođe uključuje radikale gde su heterocikl radikali spojeni sa zasićenim, delimično nezasićenim prstenom ili aromatičnim karbocikličnim ili heterocikličnim prstenom. Primeri heterocikličnih prstenova uključuju, ali nisu ograničeni na, morfolin-4-il, piperidin-1-il, piperazinil, piperazin-4-il-2-on, piperazin-4-il-3-on, pirolidin-1-il, tiomorfolin-4-il, S-dioksotiomorfolin-4-il, azokan-1-il, azetidin-1-il, oktahidropirido[1,2-a]pirazin-2-il, [1,4]diazepan-1-il, pirolidinil, tetrahidrofuranil, dihidrofuranil, tetrahidrotienil, tetrahidropyranyl, dihydropiranil, tetrahidrotiopiranil, piperidino, morfolino, tiomorfolino, tioksanil, piperazinil, homopiperazinil, azetidinil, oksetanil, tietanil, homopiperidinil, oksepanil, tiepanil, oksazepinil, diazepinil, tiazepinil, 2-pirolinil, 3-pirolinil, indolinil, 2H-piranil, 4H-piranil, dioksanil, 1,3-dioksolanil, pirazolinil, ditianil, ditiolanil, dihidropiranil, dihidrotienil, dihidrofuranil, pirazolidinilimidazolinil, imidazolidinil, 3-azabiciklo[3.1.0]heksanil, 3-azabiciklo[4.1.0]heptanil, azabiciklo[2.2.2]heksanil, 3H-indolil hinolizinil i N-piridil uree. Spiro delovi su takođe obuhvaćeni opsegom ove definicije. Primeri heterociklične grupe u kojoj su 2 atoma prstena supstituisana okso (=O) delovima pirimidinonil i 1,1-diokso-tiomorfolinil. Ovde su heterociklične grupe opciono supstituisane jednim ili više ovde opisanih supstituenata.
[0132] Termin "heteroaril" odnosi se na monovalentni aromatski radikal sa 5-, 6- ili 7-članim prstenovima i uključuje kondenzovane prstenaste sisteme (od kojih je najmanje jedan aromatičan) od 5-20 atoma, koji sadrže jedan ili više heteroatoma nezavisno izabran između azota, kiseonika i sumpora. Primeri heteroarilnih grupa su piridinil (uključujući, na primer, 2-hidroksipiridinil), imidazolil, imidazopiridinil, pirimidinil (uključujući, na primer, 4-hidroksipirimidinil), pirazolil, triazolil, pirazinil, tetrazolil, furil, tienil, izoksazolil, tiazolil, oksadiazolil, oksazolil, izotiazolil, pirolil, hinolinil, izohinolinil, tetrahidroizohinolinil, indolil, benzimidazolil, benzofuranil, cinolinil, indazolil, indolizinil, ftalazinil, piridazinil, triazinil, izoindolil, pteridinil, purinil, oksadiazolil, triazolil, tiadiazolil, tiadiazolil, furazanil, benzofurazanil, benzotiofenil, benzotiazolil, benzoksazolil, hinazolinil, hinoksalinil, naftiridinil i furopiridinil. Heteroarilne grupe su opciono supstituisane jednim ili više ovde opisanih supstituenata.
[0133] Heterocikl ili heteroaril grupa može biti vezana ugljenikom (ugljenik-veza) ili azotom (azot-veza) gde je to moguće. Kao primer i bez ograničenja, heterocikli ili heteroarili vezani ugljenikom su vezani na položaju 2, 3, 4, 5 ili 6 piridina, položaju 3, 4, 5 ili 6 piridazina, položaju 2, 4, 5 ili 6 pirimidina, položaj 2, 3, 5 ili 6 pirazina, položaj 2, 3, 4, ili 5 furana, tetrahidrofurana, tiofurana, tiofena, pirola ili tetrahidropirola, pozicija 2, 4 ili 5 oksazola, imidazola ili tiazola, položaj 3, 4 ili 5 izoksazola, pirazola ili izotiazola, položaj 2 ili 3 aziridina, položaj 2, 3 ili 4 azetidina, položaj 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8 hinolina ili položaja 1, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8 izohinolina.
[0134] Kao primer i bez ograničenja, heterocikli ili heteroarili vezani na azot su povezani na položaju 1 aziridina, azetidina, pirola, pirolidina, 2-pirolina, 3-pirolina, imidazola, imidazolidina, 2-imidazolina, 3-imidazolina, pirazola, pirazolin, 2-pirazolin, 3-pirazolin, piperidin, piperazin, indol, indolin, 1H-indazol, položaj 2 izoindol ili izoindolin, položaj 4 morfolina, i položaj 9 karbazola, ili β-karbolina.
[0135] "Metabolit" je proizvod koji nastaje metabolizmom određenog jedinjenja ili njegove soli u telu. Metaboliti jedinjenja mogu se identifikovati upotrebom rutinskih tehnika poznatih u tehnici i njihovih aktivnosti određenih upotrebom testova kao što su oni opisani ovde. Takvi proizvodi mogu da nastanu, na primer, od oksidacije, redukcije, hidrolize, amidacije, deamidacije, esterifikacije, deesterifikacije, enzimskog odvajanja i slično, primenjenog jedinjenja. Shodno tome, pronalazak uključuje metabolite jedinjenja pronalaska, uključujući jedinjenja dobijena postupkom koji uključuje kontakt jedinjenja Formule I predmetnog pronalaska sa sisarom tokom perioda koji je dovoljan da se dobije njegov metabolički proizvod.
[0136] Termin "farmaceutska formulacija" odnosi se na sastav koji je u takvom obliku koji omogućava da biološka aktivnost aktivnog sastojka koji se nalazi u njemu bude efikasna i koja ne sadrži dodatne komponente koje su neprihvatljivo toksične za ispitanika kojem bi se davala formulacija.
[0137] "Sterilna" formulacija je aseptična ili ne sadrži sve žive mikroorganizme i njihove spore.
[0138] "Stabilna" formulacija je ona u kojoj protein u njoj zadržava fizičku i hemijsku stabilnost i integritet nakon skladištenja. U stanju tehnike su dostupne različite analitičke tehnike za merenje stabilnosti proteina Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, New York, Pubs. (1991) i Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993). Stabilnost se može meriti na izabranoj temperaturi tokom izabranog vremenskog perioda. Za brzi skrining, formulacija se može držati na 40°C tokom dve nedelje do jednog meseca, pri čemu se meri stabilnost vremena. Tamo gde bi formulacija trebalo da se čuva na 2-8°C, generalno formulacija treba da bude stabilna na 30°C ili 40°C najmanje 1 mesec i/ili stabilna na 2-8°C tokom najmanje 2 godine. Ako se formulacija treba čuvati na 30 °C, obično bi formulacija trebala biti stabilna najmanje 2 godine na 30 °C i/ili stabilna na 40 °C tokom najmanje 6 meseci. Na primer, količina agregacije tokom skladištenja može se koristiti kao pokazatelj stabilnosti proteina. Prema tome, "stabilna" formulacija može biti ona u kojoj je manje od oko 10%, a poželjno manje od oko 5% proteina prisutno kao agregat u formulaciji. U drugim otelotvorenjima, može se odrediti svaki porast formiranja agregata tokom skladištenja formulacije.
[0139] "Izotonična" formulacija je ona koja ima u osnovi isti osmotski pritisak kao i ljudska krv. Izotonične formulacije će generalno imati osmotski pritisak od oko 250 do 350 mOsm. Termin "hipotonik" opisuje formulaciju sa osmotskim pritiskom ispod onog u ljudskoj krvi. U skladu s tim, termin "hipertonični" se koristi za opisivanje formulacije sa osmotskim pritiskom većim od ljudske krvi. Izotoničnost se može meriti, na primer, pritiskom pare ili osmometrom sa smrzavanjem leda. Formulacije predmetnog pronalaska su hipertonične kao rezultat dodavanja soli i/ili pufera.
[0140] "Nosači" kako se ovde koriste obuhvataju farmaceutski prihvatljive nosače, ekscipijense ili stabilizatore koji nisu toksični za ćeliju ili sisara koji su izloženi tamo u korišćenim dozama i koncentracijama. Često je fiziološki prihvatljiv nosač voden rastvor sa pH. Primeri fiziološki prihvatljivih nosača uključuju pufere poput fosfata, citrata i drugih organskih kiselina; antioksidanti uključujući askorbinsku kiselinu; polipeptid niske molekularne mase (manje od oko 10 ostataka); proteini, kao što su albumin u serumu, želatina ili imunoglobulini; hidrofilni polimeri, poput polivinilpirolidona; aminokiseline kao što su glicin, glutamin, asparagin, arginin ili lizin; monosaharidi, disaharidi i drugi ugljeni hidrati uključujući glukozu, manozu ili dekstrine; helirajuća sredstva kao što je EDTA; šećerni alkoholi kao što su manitol ili sorbitol; kontra-joni koji stvaraju sol kao što je natrijum; i/ili nejonski površinski aktivni surfakanti kao što su TWEEN®, polietilen glikol (PEG) i PLURONICS™.
[0141] "Farmaceutski prihvatljiv nosač" odnosi se na sastojak u farmaceutskoj formulaciji, osim aktivnog sastojka, koji nije netoksičan za ispitanika. Farmaceutski prihvatljiv nosač uključuje, ali nije ograničen na, pufer, ekscipijens, stabilizator ili konzervans. "Farmaceutski prihvatljiva kiselina" uključuje neorganske i organske kiseline koje nisu toksične koncentracijom i načinom na koji su formulisane. Na primer, odgovarajuće neorganske kiseline uključuju hlorovodoničnu, perhlornu, bromovodoničnu, hidrojodnu, azotnu, sumpornu, sulfonsku, sumpornu, sulfanilnu, fosfornu, ugljeničnu itd. Pogodne organske kiseline uključuju ravan i razgranat lanac alkila, aromatični, ciklični, cikloalifatski, arilalifatični, heterociklični, zasićeni, nezasićeni, mono, di- i trikarboksilni, uključujući na primer, mravlji, sirćetni, 2-hidroksirćetni, trifluorosirćetni, fenilsirćetni, trimetilsirćetni, t-butil sirćetni, antranil, propanoički, 2-hidroksipropanojska, 2-oksopropanska, propandijonska, ciklopentanopropionska, ciklopentanska propionska, 3-fenilpropionska, butanska, butandioksa, benzojeva, 3-(4-hidroksibenzoil)benzojeva, 2-acetoksibenzojeva, askorbinska, cimetna, lauril sumporna, stearinska, mukoniska, mandelična, jantarna, embonska, fumarna, jabučna, maleinska, hidroksimeleinska, malonska, mlečna, citrična, tartarska, glikolna, glikonska, glukonska, piruvična, glioksalna, oksalna, mesilna, sukcinata, salicilna, ftalna, palmoična, palmeinska, tiocijanska, metansulfonska, etansulfonska, 1,2-etandisulfonska, 2-hidroksietansulfonska, benzensulfonska, 4-hlorobenzensulfonska, naftalen-2-sulfonska, p-toluensulfonska, kamforsulfonska, 4-metilbiciklo[2.2.2]-okt-2-en-1-karboksilna, glukoheptonska, 4,4'-metilenbis-3- (hidroksi-2-en-1-karboksilna kiselina), hidroksinaftolična.
[0142] "Farmaceutski prihvatljive baze" uključuju neorganske i organske baze koje nisu toksične koncentracijom i načinom na koji su formulisane. Na primer, pogodne baze uključuju one formirane od metala koji čine neorganske baze, kao što su litijum, natrijum, kalijum, magnezijum, kalcijum, amonijum, gvožđe, cink, bakar, mangan, aluminijum, N-metilglukamin, morfolin, piperidin i organske netoksične baze, uključujući, primarni, sekundarni i tercijarni amini, supstituisani amini, ciklični amini i bazične jonoizmenjivačke smole, [npr., N(R')4<+>(gde je R' nezavisno H ili C1-4alkil, npr. amonijak, Tris)], na primer, izopropilamin, trimetilamin, dietilamin, trietilamin, tripropilamin, etanolamin, 2-dietilaminoetanol,
1
trimetamin, dikloheksilamin, lizin, arginin, histidin, kofein, glukamin, betaina, hemain, betakain, metilglukamin, teobromin, purini, piperazin, piperidin, N-etilpiperidin, poliaminske smole i slično. Posebno poželjne organske netoksične baze su izopropilamin, dietilamin, etanolamin, trimetamin, dicikloheksilamin, holin i kofein.
[0143] Dodatne farmaceutski prihvatljive kiseline i baze koje se mogu koristiti u skladu sa predmetnim pronalaskom uključuju one koje su izvedene iz aminokiselina, na primer, histidin, glicin, fenilalanin, asparaginska kiselina, glutaminska kiselina, lizin i asparagin.
[0144] "Farmaceutski prihvatljivi" puferi i soli uključuju one koji su izvedeni i od kiselinskih i baznih adicionih soli iznad navedenih kiselina i baza. Specifični puferi i/ili soli uključuju histidin, sukcinat i acetat.
[0145] "Farmaceutski prihvatljiv šećer" je molekul koji, kada se kombinuje sa proteinima od interesa, značajno sprečava ili smanjuje hemijsku i/ili fizičku nestabilnost proteina nakon skladištenja. Kada je formulacija namenjena liofilizaciji i potom rekonstituciji, "farmaceutski prihvatljivi šećeri" takođe mogu biti poznati kao "lioprotektanti". Primeri šećera i odgovarajući šećerni alkoholi uključuju: aminokiselina kao što je mononatrijum glutamat ili histidin; metilamin kao što je betain; liotropna so, poput magnezijum sulfata; poliola kao što su trihidrični ili šećerni alkoholi veće molekulske težine, npr. glicerin, dekstran, eritritol, glicerol, arabitol, ksilitol, sorbitol i manitol; propilen glikol; polietilen glikol; PLURONICS®; i njihove kombinacije. Dodatni uzorni lioprotektanti uključuju glicerin i želatinu, a šećere melibiozu, melezitozu, rafinozu, manotriozu i stahiozu. Primeri redukcije šećera uključuju glukozu, maltozu, laktozu, maltozu, izo-maltozu i laktulozu. Primeri ne-redukcionih ih šećera uključuju ne-redukcione glikozide polihidroksi jedinjenja izabranih između šećernih alkohola i drugih ravnolančanih polialkohola. Poželjni šećerni alkoholi su monoglikozidi, naročito ona jedinjenja dobijena redukcijom disaharida kao što su laktoza, maltoza, laktuloza i maltuloza. Glikozidna bočna grupa može biti ili glukozida ili galaktozidna. Dodatni primeri šećernih alkohola su glucitol, maltitol, laktitol i izo-maltuloza. Poželjni farmaceutski prihvatljivi šećeri su bez redukcionih šećera trehaloza ili saharoza. Farmaceutski prihvatljivi šećeri se dodaju formulaciji u "zaštitnoj količini" (npr. pre liofilizacije) što znači da protein u suštini zadržava svoju fizičku i hemijsku stabilnost i integritet tokom skladištenja (npr., nakon rekonstitucije i skladištenja).
[0146] Ovde je "razblaživač" od interesa koji je farmaceutski prihvatljiv (bezbedan i netoksičan za primenu kod čoveka) i koristan za pripremu tečne formulacije, poput formulacije koja je rekonstituisana nakon liofilizacije. Primeri za razređivanje uključuju sterilnu vodu, bakteriostatsku vodu za injekcije (BWFI), pH puferski rastvor (npr. fiziološki pufer sa fosfatom), sterilni fiziološki rastvor, Ringerov rastvor ili rastvor dekstroze. U alternativnom otelotvorenju, razblaživači mogu da sadrže vodene rastvore soli i/ili pufere.
[0147] "Konzervans" je jedinjenje koje se može dodati formulacijama ovde da se smanji aktivnost bakterija. Dodavanje konzervansa može, na primer, olakšati proizvodnju višenamenske (višestruke doze) formulacije. Primeri potencijalnih konzervansa uključuju oktadecildimetilbenzil amonijak hlorid, heksametonijum hlorid, benzalkonijum hlorid (mešavina alkilbenzildimetilamonijak hlorida u kojoj su alkilne grupe jedinjenja dugog lanca) i benzetonijum hlorid. Ostale vrste konzervansa uključuju aromatske alkohole poput fenola, butil i benzil alkohola, alkil parabene poput metil ili propil parabena, katehola, resorcinola, cikloheksanola, 3-pentanola i m-krezola. Najpoželjniji konzervans ovde je benzil alkohol.
[0148] "Pojedinac" ili "ispitanik" ili "pacijent" je sisar. Sisari uključuju, ali nisu ograničeni na, domaće životinje (npr., krave, ovce, mačke, pse i konje), primate (npr., ljude i ne-humane primate poput majmuna), zečeve i glodare (npr., miševe i pacovi). U određenim otelotvorenjima, pojedinac ili ispitanik je čovek.
[0149] Kao što je ovde korišćeno, "lečenje" (i njegove gramatičke varijante, kao što je "tretiranje" ili "tretirati") odnosi se na kliničku intervenciju osmišljenu da promeni prirodni tok pojedinca, tkiva ili ćelije koja se leči tokom kliničke patologije. Poželjni efekti lečenja uključuju, ali nisu ograničeni na, smanjenje brzine napredovanja bolesti, ublažavanje ili ublažavanje bolesnog stanja, remisiju ili poboljšanje prognoze, a sve se može meriti sa stručnjakom u oblasti kao što je lekar. U jednom aspektu, lečenje može značiti ublažavanje simptoma, umanjenje bilo kojih direktnih ili indirektnih patoloških posledica bolesti, smanjenje stope napredovanja zarazne bolesti, poboljšanje ili ublažavanje stanja bolesti i remisiju ili poboljšanje prognoze. U nekim otelotvorenjima, antitela iz predmetnog pronalaska se koriste da odlože razvoj bolesti ili da usporavaju napredovanje infektivne bolesti.
[0150] Kao što je ovde korišćeno, "u saradnji sa" odnosi se na primenu jednog načina lečenja pored drugog načina lečenja. Kao takav, "u vezi sa" odnosi se na primenu jednog načina lečenja pre, tokom ili posle primene drugog načina lečenja kod pojedinca.
2
[0151] Termin "fagozom" odnosi se na internalizovani endocitni sud zatvoreni membranom fagocitne ćelije. Može se pokrenuti fagocitozom pojačanom direktnom, antitelom ili komplementom. Termin "fagolizom" odnosi se na internalizovani ćelijski sud koji se stopio sa jednim ili više lizozoma.
[0152] Bakterije su tradicionalno podeljene u dve glavne grupe, gram-pozitivne (Gm+) i gram-negativne (Gm-), na osnovu zadržavanja gram-mrlja. Gram-pozitivne bakterije su ograničene lipidnom membranom s jednom jedinicom i one obično sadrže debeli sloj peptidoglikana (20-80 nm) koji je odgovoran za zadržavanje Grammrlje. Gram-pozitivne bakterije su one koje su bojenjem po Gramu obojene tamno plavom ili ljubičastom bojom. Nasuprot tome, gram-negativne bakterije ne mogu zadržati kristalno ljubičastu mrlju, umesto toga uzimaju kontrasta (safranin ili fuksin) i izgledaju crveno ili ružičasto. Gram-pozitivnim ćelijskim zidovima obično nedostaje spoljašnja membrana koja se nalazi u gram-negativnim bakterijama.
[0153] Termin "bakteremija" odnosi se na prisustvo bakterija u krvotoku koje se najčešće otkriva kroz krvnu kulturu. Bakterije mogu ući u krvotok kao teška komplikacija infekcija (poput upale pluća ili meningitisa), tokom hirurške operacije (naročito kada su uključene sluznice poput gastrointestinalnog trakta) ili zbog katetera i drugih stranih tela koja ulaze u arterije ili vene. Baktermija može imati nekoliko posledica. Imuni odgovor na bakterije može izazvati sepsu i septički šok, koji ima relativno visoku stopu smrtnosti. Bakterije mogu takođe da upotrebe krv za širenje u druge delove tela, izazivajući infekcije dalje od originalnog mesta infekcije. Primeri uključuju endokarditis ili osteomijelitis.
[0154] "Terapeutski efikasna količina" je minimalna koncentracija potrebna za postizanje merljivog poboljšanja određenog poremećaja. Terapeutski efikasna količina ovde može da varira u zavisnosti od faktora kao što su stanje bolesti, starost, pol i težina pacijenta, i sposobnost antitela da izazove željeni odgovor kod pojedinca. Terapeutski efikasna količina je takođe ona u kojoj bilo koji toksični ili štetni efekti antitela nadmašuju terapeutski blagotvorno dejstvo. U jednom aspektu, terapeutski efikasna količina je količina efikasna za smanjivanje bakteremije kod in vivo infekcije. U jednom aspektu, "terapeutski efikasna količina" je najmanje količina koja je efikasna za smanjivanje bakterijskog opterećenja ili jedinica koje formiraju koloniju (CFU) izolovanih iz uzorka pacijenta, kao što je krv, najmanje za jedan logaritam u odnosu na davanje leka. U specifičnijem aspektu, smanjenje je najmanje 2 logaritma. U drugom aspektu, smanjenje je 3, 4, 5 logaritma. U još jednom aspektu, smanjenje je ispod detektabilnih nivoa. U drugom otelotvorenju, terapeutski efikasna količina je količina AAC u jednoj ili više doza data tokom perioda lečenja, čime se postiže negativna krvna kultura (tj., ne rastu bakterije koje su meta AAC) u poređenju sa pozitivnom kulturom krvi pre ili na početku lečenja inficiranog pacijenta.
[0155] "Profilaktički efikasna količina" se odnosi na količinu koja je efektivna, u dozama i periodima potrebnim za postizanje željenog profilaktičkog rezultata. Tipično, ali ne i neophodno, pošto se profilaktička doza koristi kod ispitanika pre, u ranijem stadijumu bolesti ili čak pre izlaganja uslovima gde je rizik od infekcije povećan, profilaktički efikasna količina može biti manja od terapeutski efikasne količine. U jednom otelotvorenju, profilaktički efikasna količina je najmanje količina koja je efikasna za smanjivanje, sprečavanje pojave ili širenja infekcije iz jedne ćelije u drugu.
[0156] "Hronično" davanje se odnosi na davanje lekova u kontinuiranom, za razliku od akutnog načina, tako da se održi početni terapeutski efekat (aktivnost) tokom dužeg vremenskog perioda. "Isprekidano" davanje je tretman koji se ne vrši uzastopno bez prekida, već je ciklične prirode.
[0157] Termin "dodatak za pakovanje" koristi se za upućivanje na uputstva koja su obično uključena u komercijalna pakovanja terapijskih proizvoda, koja sadrže informacije o indikacijama, upotrebi, doziranju, davanju, kombinovanoj terapiji, kontraindikacijama i/ili upozorenjima za upotrebu takvih terapijskih proizvoda.
[0158] Termin "hiralno" odnosi se na molekule koji imaju svojstvo ne-preklapanja partnera sa slikom u ogledalu, dok se termin "ahiralni" odnosi na molekule koji se mogu preklopiti na partneru sa slikom u ogledalu.
[0159] Termin "stereoizomeri" odnosi se na jedinjenja koja imaju identičan hemijski sastav, ali se razlikuju s obzirom na raspored atoma ili grupa u prostoru.
[0160] "Dijastereomer" se odnosi na stereoizomer sa dva ili više hiralnih centara i čiji molekuli nisu ogledalo jedan drugom. Dijastereomeri imaju različita fizička svojstva, npr. tačke topljenja, tačke ključanja, spektralna svojstva i reaktivnost. Smeše dijastereomera mogu se razdvojiti pod analitičkim postupcima visoke rezolucije, kao što su elektroforeza i hromatografija.
[0161] "Enantiomeri" se odnose na dva stereoizomera jedinjenja koji su slike u ogledalu koje se ne mogu preklopiti.
[0162] Stereohemijske definicije i ovde korišćene uopšteno slede S. P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, New York; i Eliel, E. and Wilen, S., Stereochemistry of Organic Compounds (1994) John Wiley & Sons, Inc., New York. Mnoga organska jedinjenja postoje u optički aktivnim oblicima, tj. Imaju sposobnost rotacije ravni polarizovane svetlosti. U opisu optički aktivnog jedinjenja, prefiksi D i L, ili R i S, koriste se za označavanje apsolutne konfiguracije molekula o njegovom hiralnom centru. Prefiksi d i 1 ili (+) i (-) se koriste da označe znak rotacije ravnomerno polarizovanog svetla od jedinjenja, pri čemu (-) ili 1 znači da je jedinjenje levorotaciono. Jedinjenje sa prefiksom (+) ili d je dekstrorotaciono. Za datu hemijsku strukturu, ovi stereoizomeri su identični osim što su slike u ogledalu jedan drugog. Specifični stereoizomer se takođe može nazvati enantiomerom, a smeša takvih izomera se često naziva enantiomerna smeša. Mešavina enantiomera od 50:50 naziva se racemska smeša ili racemat, a može se pojaviti tamo gde nije bilo stereoselekcije ili stereospecifičnosti u hemijskoj reakciji ili procesu. Termini "racemska smeša" i "racemat" odnose se na ekvimolarnu mešavinu dve enantiomerne vrste lišene optičke aktivnosti.
[0163] Termin "zaštitna grupa" odnosi se na supstituent koji se obično koristi da blokira ili zaštiti određenu funkcionalnost, dok ostale funkcionalne grupe reaguju na jedinjenje. Na primer, "amino-zaštitna grupa" je supstituent vezan za amino grupu koji blokira ili štiti amino funkcionalnost u jedinjenju. Pogodne aminozaštitne grupe uključuju, ali nisu ograničene na, acetil, trifluoroacetil, t-butoksikarbonil (BOC), benziloksikarbonil (CBZ) i 9-fluorenilmetilenoksikarbonil (Fmoc). Za opšti opis zaštitnih grupa i njihovu upotrebu, pogledajte T. W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, New York, 1991, ili kasnije izdanje.
[0164] Termin "približno" kako se ovde koristi odnosi se na uobičajeni opseg grešaka za odgovarajuću vrednost koja je lako poznata stručnjaku iz ove tehničke oblasti. Referenca na „oko“ vrednosti ili parametra ovde uključuje (i opisuje) otelotvorenja koja su usmerena na tu vrednost ili parametar sam po sebi.
[0165] Kao što se ovde koristi i u priloženim patentnim zahtevima, oblici jednine „a“, „an“ i „the“ uključuju množinu sa referencom osim ukoliko kontekstom nije drugačije ukazano. Na primer, referenca na "antitelo" je referenca od jednog do mnogih antitela, kao što su molarne količine, i uključuje njihove ekvivalente poznate stručnjacima u oblasti, i tako dalje.
III. SASTAVI I POSTUPCI
KONJUGATI ANITELO-ANTIBIOTIK (AAC)
[0166] AAC jedinjenja predmetnog pronalaska uključuju ona sa antibakterijskim delovanjem, efikasnim protiv mnogih humanih i veterinarskih Gram pozitivnih, gram negativnih patogena, uključujući stafilokoke. U primernom otelotvorenju, AAC jedinjenja uključuju antitela zasnovana na cisteinu, tj. kovalentno spojena vezom, na antibiotički deo rifamicina. Biološka aktivnost antibiotika tipa rifamicin se modulira konjugacijom sa antitelom. Konjugati antitela-antibiotika (AAC) pronalaska selektivno isporučuju efikasnu dozu antibakterijskog sredstva na mesto infekcije pri čemu se može postići veća selektivnost, tj. manja efikasna doza, uz povećanje terapeutskog indeksa („terapijski prozor“).
[0167] Pronalazak pruža novu antibakterijsku terapiju koja ima za cilj da spreči izbacivanje antibiotika ciljajući na populaciju bakterija koje izbegavaju konvencionalnu antibiotsku terapiju. Nova antibakterijska terapija je postignuta antitelo-antibiotičkim konjugatom (AAC), u kojem je antitelo specifično za komponente ćelijske stijenke koje se nalaze na S. aureus (uključujući MRSA) hemijski povezano sa moćnim antibiotikom (derivatom rifamicina). Antibiotik se pridružuje antitelu preko proteazno deljivog peptidnog veznika koji je osmišljen za deljenje katepsinom B, lizosomalnom proteazom koja se nalazi u većini vrsta ćelija sisara (Dubowchik i dr. (2002) Bioconj. Chem.13:855-869). AAC deluje kao lek iz razloga što je antibiotik neaktivan (zbog velike veličine antitela) dok se veznik ne podeli. Budući da značajan deo S. aureusa koji se nalazi u prirodnoj infekciji zauzimaju ćelije domaćina, pre svega neutrofili i makrofagi, u nekom trenutku infekcije kod domaćina i da vreme provedeno unutar ćelija domaćina pruža značajnu priliku za bakterija da izbegne aktivnost antibiotika. AAC prema pronalasku dizajnirani su tako da se vezuju za S. aureus i oslobađaju antibiotik u fagolizomu nakon što bakterije preuzmu stanice domaćina. Pomoću ovog mehanizma, AAC su u stanju da koncentrišu aktivni antibiotik na mestu gde S. aureus slabo leči konvencionalnim antibioticima. Iako pronalazak nije ograničen ili definisan određenim mehanizmom delovanja, AAC poboljšava aktivnost antibiotika pomoću tri potencijalna mehanizma: (1) AAC isporučuje antibiotik u sisarima koji uzimaju bakterije i na taj način povećava snagu antibiotika koji slabo difundiraju u fagolizosome gde se bakterije izdvajaju. (2) AAC opsonizuje bakterije - na taj način povećavajući unos slobodnih bakterija u fagocitne ćelije
4
- i lokalno oslobađa antibiotik da ubije bakterije dok se one izdvajaju u fagolizom. (3) AAC poboljšava poluraspad antibiotika in vivo (poboljšana farmakokinetika) povezivanjem antibiotika sa antitelom. Poboljšana farmakokinetika AAC omogućava isporuku dovoljnog broja antibiotika u regionima u kojima je koncentrisan S. aureus uz ograničavanje ukupne doze antibiotika koju je potrebno sistemski davati. Ovo svojstvo bi trebalo da omogući dugotrajnu terapiju AAC da cilja trajnu infekciju sa minimalnim nuspojavama antibiotika.
[0168] Predmetna aplikacija opisuje proizvodnju novih konjugovanih terapijskih sredstava anti-WTA antitela i njihovu upotrebu u lečenju infekcija gram-pozitivnim (Gm+) bakterijama, uključujući infekcije S. aureus. Ova antitela su sposobna da ciljaju populaciju Gm+ bakterija koje izbegavaju konvencionalnu antibiotsku terapiju.
[0169] Jedinjenje konjugata antitelo-antibiotik prema pronalasku sadrži antitelo protiv teihoinske kiseline zida beta (WTA beta) kovalentno povezano peptidnim vezom na antibiotik tipa rifamicin.
[0170] U jednom primeru, konjugat antitelo-antibiotik je formule
Ab-(L-abx)p
gde:
Ab je antitelo protiv teihoinske kiseline zida;
L je peptidni veznik koji ima formulu:
-Str-Pep-Y-gde je Str jedinica nosača; Pep je peptid sa dva do dvanaest aminokiselinskih ostataka, a Y je razdelnik; abx je antibiotik tipa rifamicin; i
p je ceo broj od 1 do 8.
[0171] Broj antibiotičkih delova koji mogu biti konjugovani preko reaktivnog dela veziva sa molekulom antitela može biti ograničen brojem slobodnih cisteinskih ostataka, koji se uvode ovde opisanim postupcima. Primer AAC formule I stoga sadrži antitela koja imaju 1, 2, 3 ili 4 dizajnirane aminokiseline cisteina. (Lyon, R. i dr. (2012) Methods in Enzym.502:123-138).
ANTITELA PROTIV TEIHOINSKOG (WTA) ZIDA
[0172] Ovde su obelodanjena određena anti-WTA Abs i konjugovana anti-WTA antitela koja se vezuju za WTA eksprimirana na velikom broju Gm+ bakterija, uključujući Staphylococcus aureus. Antitela anti-WTA mogu biti odabrana i proizvedena postupcima podučenim u US 8283294; Meijer PJ i dr. (2006) J Mol Biol.
358(3):764-72; Lantto J, i dr. (2011) J Virol. 85(4):1820-33, i u Primeru 21 ispod. Pronalazak obezbeđuje sastave ovih anti-WTA Abs.
[0173] Ćelijski zid gram-pozitivnih bakterija sastoji se iz debelog sloja višestrukih omotača peptidoglikana (PGN), koji ne samo da stabiliziraju ćelijsku membranu, već pružaju i mnoga mesta na koja bi se drugi molekuli mogli vezati (Slika 3). Glavna klasa ovih ćelijskih površinskih glikoproteina su teihoinske kiseline („TA“), koje su molekuli bogati fosfatima koji se nalaze u mnogim proteinima koji vezuju glikon (GPB). TA dolaze u dve vrste: (1) lipo-teihoinska kiselina ("LTA"), koja je usidrena na plazma membrani i proteže se od ćelijske površine u peptidoglikanski sloj; i (2) zid TA (WTA), koji su kovalentno vezani za peptidoglikan i protežu se kroz ćelijski zid i izvan nje (Slika 3). WTA može činiti čak 60% ukupne mase ćelijskih zidova u GPB. Kao rezultat, predstavlja visoko izraženi antigen ćelijske površine.
[0174] Hemijske strukture WTA razlikuju se među organizmima. U S. aureus, WTA je kovalentno povezan sa 6-OH N-acetil muramne kiseline (MurNAc) preko disaharida sastavljenog od N-acetilglikozamina (GlcNAc)-1-P i N-acetilmanozamina (ManNAc), nakon čega sledi oko dve ili tri jedinice glicerol-fosfata (Slika 4) stvarni WTA polimer se zatim sastoji iz oko 11-40 jedinica ribitol-fosfata (Rbo-P) koje se ponavljaju. Postepena sinteza WTA najpre se pokreće enzimom zvanim TagO, a sojevi S. aureus kojima nedostaje TagO gen (gena) ne čine WTA. Ponavljajuće jedinice mogu se dalje prilagoditi D-alaninu (D-Ala) u C2-OH i/ili sa N-acetilglukozaminom (GlcNAc) na položaju C4-OH, putem α-(alfa) ili β-(beta) glikozidnih veza. Zavisno od soja S. aureus, ili faze rasta bakterija, glikozidne veze mogu biti α -, β - ili smeša dvaju anomera. Ove modifikacije šećera GlcNAc prilagođene su dvema specifičnim glikoziltransferazama (Gtfs) dobijenim od S. aureus: TarM Gtf posreduje α -glikozidne veze, dok TarS Gtfs posreduje β-(beta) glikozidne veze.
[0175] Obzirom na značajne dokaze da su unutarćelijske zalihe MRSA zaštićene od antibiotika, nove terapijske sastave pronalaska su razvijene da spreče ovaj postupak evazije antibiotika korišćenjem antitela specifičnog za S. aureus da priveže antibiotik na bakteriju, tako da kada bakterija bude in vivo zahvaćen ili na neki drugi način internalizovan od strane ćelije domaćina, on donosi antibiotik zajedno u ćeliju domaćina.
[0176] U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje anti-WTA antitela koja su anti-WTAa ili anti-WTAβ. U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje anti-Staph aureus Abs. Primer klona je kloniran iz B ćelija kod pacijenata zaraženih sa S. aureus (kako je opisano u Primeru 21). U jednom aspektu, anti-WTA i anti-Staph aureus Abs su ljudska monoklonska antitela. Pronalazak obuhvata himerni Abs i humanizovani Abs koji sadrži CDR ovog WTA Abs.
[0177] Za terapeutsku upotrebu, WTA Abs predmetnog pronalaska za konjugaciju sa antibioticima za generisanje AAC, može biti bilo kojeg izotipa, osim IgM. U jednom aspektu, WTA Abs su humani IgG izotipa. U specifičnijim otelotvorenjima, WTA Abs su humani IgGl.
[0178] Slike 6A i 6B prikazuju Abs koji su anti-WTAa ili anti-WTA β. Kroz specifikacije i slike, Abs označen četvorocifrenim brojem (npr., 4497) može se takođe odnositi sa prethodnim "S", npr., S4497; oba naziva se odnose na isto antitelo koje je modifikovana sekvenca antitela divljeg tipa (WT). Varijante antitela su označene sa "v" posle broja antitela, npr., 4497.v8. Ako nije specificirano (npr. kao varijantni broj), prikazane aminokiselinske sekvence su originalne, neizmenjene/nepromenjene sekvence. Ovi Abs se mogu izmeniti u jednom ili više ostataka, na primer da se poboljša pK, stabilnost, ekspresija, obradivost (npr., kao što je opisano u donjim primerima), istovremeno održavajući približno isti ili poboljšani afinitet vezivanja antigena u poređenju sa divlji tip, nemodifikovano antitelo. Varijante sadašnjih WTA antitela koja imaju konzervativne supstitucije aminokiselina su obuhvaćena pronalaskom. Ispod, ako nije drugačije određeno, numerisanje CDR je prema Kabatu, a stalna numeracija domena prema EU numerisanju.
[0179] Slike 13A i Slika 13B pružaju poravnavanje redosleda aminokiselina promenljivih regiona lakog lanca (VL) i promenljivog regiona teškog lanca (VH), odnosno četiri humana anti-WTA alfa antitela. CDR sekvence CDR L1, L2, L3 i CDR H1, H2, H3 prema Kabat numerisanju su podvučene.
Tabele 6A: Laki lanac CDR sekvenci anti-WTAα.
Tabela 6B: Teški lanac CDR sekvenci anti-WTAα.
[0180] Sekvence svakog para od VL i VH su kao što sledi:
4461 laki lanac varijabilnog regiona
[0181] Dati su primeri izolovanog monoklonskog antitela koje vezuje teihoinsku kiselinu zida (WTA) koja sadrži laki lanac i H lanac, L lanac koji sadrži CDR L1, L2, L3 i H lanac koji sadrži CDR H1, H2, H3 gde je CDR L1 , L2, L3 i H1, H2, H3 sadrže aminokiselinske sekvence CDR svakog od Abs 4461 (SEQ ID NO.1-6), 4624 (SEQ ID NO. 7-12), 4399 (SEQ ID NO.13-18), i 6267 (SEQ ID NO.19-24) respektivno, kao što je prikazano u Tabeli 6A i 6B.
[0182] U drugim primerima, izolovani monoklonski Ab koji vezuje WTA sadrži varijabilni region lanca H (VH) i promenljivi region lanca L (VL), pri čemu VH sadrži najmanje 95% identičnost sekvence po dužini sekvence VH regiona svako od antitela 4461, 4624, 4399 i 6267, respektivno. U još jednom specifičnom aspektu, identitet sekvence je 96%, 97%, 98%, 99% ili 100%.
[0183] Takođe su opisani anti-WTA beta Abs koji sadrže CDR sekvence L i H lanca kao što je prikazano na Slici 14. U jednom otelotvorenju, izolovani anti-WTA beta monoklonski Abs sadrži CDR L1, L2, L3 i H1, H2, H3 izabran iz grupe koja se sastoji iz CDR svakog od 13 Abs na Slici 14. U drugom otelotvorenju, pronalazak obezbeđuje izolovani anti-WTA beta Abs koji sadrži najmanje 95% identičnosti sekvence po dužini domena V regiona svakog od 13 antitela. U još jednom specifičnom aspektu, identitet sekvence je 96%, 97%, 98%, 99% ili 100%.
[0184] Od 13 anti-WTA beta Abs, 6078 i 4497 su modifikovani tako da stvaraju varijante i) koji imaju konstruisan Cys u jednom ili oba L i H lanca za konjugaciju sa međujedinjenjima veznik-antibiotik; i ii) gde je prvi ostatak u lancu H izmenjen u E (v2) ili su prva dva ostatka QM promenjena u EI ili EV (v3 i v4).
[0185] Slike 15A-1 i 15A-2 daju aminokiselinsku sekvencu celog L lanca anti-WTA beta Ab 6078 (nemodifikovana) i njegove varijante, v2, v3, v4. Varijante L lanca koje sadrže dizajnirani Cys su označeni sa C u crnoj kutiji na kraju stalnog područja (na EU ostatak br.205 u ovom slučaju). Oznaka varijante, na primer, v2LC-Cys znači varijanta 2 koja sadrži Cys konstruisan u L lanac. HCLC-Cys znači da i H i L lanci antitela sadrže projektovan Cys. Slike 15B-1 do 15B-4 prikazuju poravnanje H lanca pune dužine anti-WTA beta Ab 6078 (nemodifikovani) i njegove varijante, v2, v3, v4 koje imaju promene u prva ili prva 2 ostatka H lanca. Varijante H lanca koje sadrže dizajnirani Cys su označeni sa C u crnoj kutiji na kraju stalnog područja (na EU ostatak br.118).
gde je X M, I ili V.
[0186] Takođe je opisano izolovano anti-WTA beta antitelo koje sadrži teški lanac i lagano, pri čemu teški lanac sadrži VH koji ima najmanje 95% identičnost sekvence sa SEQ ID NO.112. U dodatnom otelotvorenju, ovo antitelo nadalje sadrži VL koji ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO.111. U primeru, anti-WTA beta antitelo sadrži laki i teški lanac, pri čemu L lanac sadrži VL SEQ ID NO.111 i H lanac sadrži VH SEQ ID NO. 112. U još specifičnijem primeru, izolovano anti-WTA beta antitelo sadrži L lanac od SEQ ID NO.113 i H lanac SEQ ID NO.114.
[0187] Varijante H i L lanca zasnovanih 6078 projektovanom Cys mogu biti sparene u bilo kojoj od sledećih kombinacija da bi se formirao potpuni Abs za konjugaciju sa međujedinjenjima veznik-Abx da bi se generisali anti-WTA AAC pronalaska. Nemodifikovani L lanac (SEQ ID NO.113) može biti uparen sa Cys-inženjerskom varijantom H lanca SEQ ID NO. 117; varijanta može biti gde je X M, I ili V. Cys-projektovani L lanac SEQ ID NO. 115 se može upariti sa: H lanac SEQ ID NO.114; varijanta H lanca SEQ ID NO.116; ili varijanta H lanca zasnovane na SEQ ID NO.117 (u ovoj verziji su i H i L lanci projektovani od Cys). U posebnom primeru, anti-WTA beta antitelo i anti-WTA beta AAC predmetnog pronalaska sadrži L lanac SEQ ID NO. 115 i H lanac SEQ ID NO.116.
[0188] Slike 16A-1 i 16A-2 daju L lanac pune dužine anti-WTA beta Ab 4497 (nemodifikovan) i njegove verzije v8. Varijante L lanca koje sadrže dizajnirani Cys su označeni sa C u crnoj kutiji na kraju stalnog područja (na EU ostatak br.205). Slike 16B-1, 16B-2, 16B-3 prikazuju poravnanje H lanca pune dužine anti-WTA beta Ab 4497 (nemodifikovano) i njegovu v8 varijantu sa D izmenjenom u E u CDR H3 položaju 96, sa ili bez dizajniran Cys. Varijante H lanca koje sadrže dizajnirani Cys su označeni sa C u crnoj kutiji na kraju stalnog područja (na EU ostatak br. 118 u ovom slučaju). Nemodifikovani CDR H3 je GDGGLDD (SEQ ID NO.104); 4497v8 CDR H3 je GEGGLDD (SEQ ID NO.118).
[0189] Drugo izolovano anti-WTA beta antitelo koje je obezbeđeno predmetnim pronalaskom sadrži teški lanac i lagano, pri čemu teški lanac sadrži VH koji ima najmanje 95% identičnost sekvence sa SEQ ID NO.
120. U dodatnom otelotvorenju, ovo antitelo nadalje sadrži VL koji ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO.119. U specifičnom otelotvorenju, anti-WTA beta antitelo sadrži laki i teški lanac, pri čemu L lanac sadrži VL SEQ ID NO.119 i H lanac sadrži VH SEQ ID NO.120. U još specifičnijem primeru, izolovano anti-WTA beta antitelo sadrži L lanac od SEQ ID NO.121 i H lanac SEQ ID NO.122.
[0190] Varijante H i L lanca zasnovanih 4497 projektovanom Cys mogu biti sparene u bilo kojoj od sledećih kombinacija da bi se formirao potpuni Abs za konjugaciju sa međujedinjenjima veznik-Abx da bi se generisali anti-WTA AAC pronalaska. Nemodifikovani L lanac (SEQ ID NO.121) može biti uparen sa Cys-inženjerskom varijantom H lanca SEQ ID NO. 124. L lanac proizveden od strane Cys sa SEQ ID NO. 123 se može upariti sa: varijanta H lanca SEQ ID NO.157; ili varijanta H lanca zasnovane na SEQ ID NO.124 (u ovoj verziji su i H i L lanci projektovani od Cys). U posebnom otelotvorenju, anti-WTA beta antitelo i anti-WTA beta AAC predmetnog pronalaska sadrži L lanac SEQ ID NO.123.
[0191] Još jedan primer je antitelo koje se vezuje za isti epitop kao i svaki od anti-WTA alfa Abs sa Slike 13A i Slike 13B. Takođe je obezbeđeno antitelo koje se vezuje na isti epitop kao i svaki od anti-WTA beta Abs sa Slike 14, Slike 15A i 15B i Slike 16A i 16B.
[0192] Vezivanje anti-WTA antitela na WTA je pod uticajem anomerne orijentacije modifikacija šećera GlcNAc na WTA. VTA su modifikovane modifikacijama šećera N-acetilglukozamina (GlcNAc) na položaju C4-OH preko α- ili β-glikozidnih veza, TarM glikoziltransferaza ili TarS glikoziltransferaza, respektivno. Shodno tome, preparati ćelijskih zidova iz mutantnih sojeva glikoziltransferaze kojima nedostaju TarM (ΔTarM), TarS (ΔTarS), ili oba TarM i TarS (ΔTarM/ΔTarS) podvrgnuti su imunobloting analiziranju antitelom protiv WTA. WTA antitelo (S7574) specifično za modifikacije α-GlcNAc na WTA ne vezuje se za pripremu ćelijskih zidova iz soja ΔTarM. Suprotno tome, WTA antitelo (S4462) specifično za β-GlcNAc modifikacije na WTA ne vezuje se za pripremu ćelijskih zidova iz soja ΔTarS. Kao što se očekivalo, obe ove antitela se ne vežu za preparate ćelijske stijenke iz deletacionog soja kojem nedostaju obe glikoziltransferaze (ΔTarM/ΔTarS), kao i soja koji nedostaje bilo koji WTA (ΔTagO). Prema takvoj analizi, antitela su naznačena kao anti-α-GlcNAc WTA mAbs ili kao anti-β-GlcNAc WTA mAbs kao što je navedeno u tabeli na Slikama 6A i 6B.
[0193] Cisteinske aminokiseline mogu se konstruisati na reaktivnim mestima antitela i koje ne formiraju međulančane ili međumolekularne disulfidne veze (Junutula, i dr.., 2008b Nature Biotech., 26(8):925-932; Dornan i dr. (2009) Blood 114(13):2721-2729; US 7,521,541; US 7,723,485; WO2009/052249, Shen i dr. (2012) Nature Biotech., 30(2):184-191; Junutula i dr. (2008) Jour of Immun. Methods 332:41-52). Konstruisani cistein tioli mogu reagovati sa veznim reagensima ili vezom-antibiotičkim međujedinjenjima predmetnog pronalaska koji imaju tiol-reaktivne, elektrofilične grupe kao što su maleimid ili alfa-halo amidi da formiraju AAC sa antitelom proizvedenim od delova cisteina (tioMabs) i antibiotika (abx). Lokacija antibiotičkog dela može se tako dizajnirati, kontrolisati i znati. Punjenje antibioticima može se kontrolisati s obzirom da konstruisane cistein tiolne grupe obično reaguju sa tiol-reaktivnim povezivim reagensima ili međujedinjenjima veznik-antibiotika sa visokim prinosom. Inženjering antitela anti-WTA za uvođenje
4
aminokiseline cisteina supstitucijom na jednom mestu teškog ili lakog lanca daje dva nova cisteina na simetričnom tetramer antitelu. Može se postići opterećenje antibioticima blizu 2 i gotovo homogenost proizvoda AAC konjugacije.
[0194] U nekim otelotvorenjima, može biti poželjno stvoriti antitela zasnovana na cisteinu, na primer, "tioMAbs", u kojima su jedan ili više ostataka antitela supstituisani cistein ostacima. U posebnim otelotvorenjima, supstituisani ostaci se javljaju na pristupačnim mestima antitela. Supstitucijom tih ostataka cisteinom, reaktivne tiolne grupe se tako postavljaju na pristupačnim mestima antitela i mogu se koristiti za konjugaciju antitela sa drugim delovima, kao što su antibiotski delovi ili delovi antibiotika-veznika, da bi se stvorio imunokonjugat, kao što je opisano dalje u tekstu. U nekim otelotvorenjima, bilo koji ili više sledećih ostataka može biti supstituisan cisteinom, uključujući V205 (Kabat numerisanje) lakog lanca; A118 (EU numerisanje) teškog lanca; i S400 (EU numerisanje) teškog lanca Fc regiona. Neograničavajući primer teškog lanca A118C konstruisanog cisteinom (SEQ ID NO:149) i laki lanac V205C (SEQ ID NO:151) prikazani su mutanti anti-WTA antitela. Anti-WTA antitela zasnovana na cisteinom mogu biti generisana kako je opisano (Junutula, i dr.., 2008b Nature Biotech., 26(8):925-932; US 7,521,541; US-2011/0301334.
[0195] U drugom primeru, pronalazak se odnosi na izolovano anti-WTA antitelo koje sadrži teški lanac i laki lanac, pri čemu teški lanac sadrži sekvencu konstantnih regiona teškog lanca divljeg tipa ili mutant mutirani cisteinom (ThioMab), a laki lanac sadrži sekvencija stalnog regiona lakog lanca divljih vrsta ili mutant dizajniran cisteinom (ThioMab). U jednom aspektu, teški lanac ima najmanje 95% identitet sekvence za:
Konstantan region teškog lanca (IgG1), divlji tip
Ko
a laki lanac ima najmanje 95% identitet sekvence za:
Konstantan region lakog lanca (kappa), divljih vrsta
Konstantni region lakog lanca (kappa), V205C „ThioMab“
[0196] AAC pronalaska uključuje antitela zasnovana na cisteinu gde je jedna ili više aminokiselina divljih ili roditeljskih antitela WTA zamenjeno aminokiselinom cisteina. Bilo koji oblik antitela može biti konstruisan, tj. mutiran. Na primer, fragment antitela nadređenog Fab može se konstruisati tako da formira cistein konstruisan Fab, koji se ovde naziva "ThioFab." Slično tome, roditeljsko monoklonsko antitelo može se konstruisati tako da formira "ThioMab." Treba napomenuti da mutacija jednog mesta daje pojedinačno konstruisan ostatak cisteina u ThioFab, dok mutacija jednog mesta daje dva konstruisana cisteinska ostatka u tioMabu, zbog dimerne prirode IgG antitela. Mutanti sa zamenjenim ostacima cisteina (Cys) koji su zamenjeni (konstruisani) ocenjuju se reaktivnošću novootvorenih, konstruisanih cistein tiol grupa.
[0197] Ovde opisana antitela mogu se proizvesti korišćenjem ćelija domaćina u kulturi. Ćelije domaćina mogu se transformisati vektorima (vektori ekspresije ili kloniranje) koji sadrže jednu ili više nukleinskih kiselina koje kodiraju ovde opisana antitela. Ćelije se mogu uzgajati u uslovima pogodnim za proizvodnju antitela, a antitela proizvedena od ove ćelije mogu se dalje očistiti. Pogodne ćelije za proizvodnju antitela mogu obuhvatati prokariotske, kvasce ili više eukariotske (npr., sisar) ćelije. U nekim otelotvorenjima koristi se ćelija sisara (ljudska ili sisara ćelija koja nije čovek). U nekim otelotvorenjima koristi se ćelija jajnika kineskog hrčka (CHO).
[0198] Ćelije sisara mogu se uzgajati, a razmnožavanje ćelija sisara u kulturi (kultura tkiva) postalo je rutinski postupak. Primeri ćelijskih linija domaćina sisara mogu uključivati, bez ograničenja, CV1 liniju bubrega majmuna transformisanu od SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); humana embrionalna linija bubrega (293 ili 293 ćelije podklonirane za rast kulture suspenzije, Graham i dr.., J. Gen Virol.36:59 (1977)); ćelije bubrega bebe hrčka (BHK, ATCC CCL 10); mišje sertolijske ćelije (TM4, Mather, Biol. Reprod.23:243-251 (1980)); ćelije bubrega majmuna (CV1 ATCC CCL 70); Ćelije bubrega afričkog zelenog majmuna (VERO-76, ATCC CRL-1587); ćelije karcinoma grlića materice (HELA, ATCC CCL 2); bubrežne ćelije psa (MDCK, ATCC CCL 34); ćelije jetre bizamskog pacova (BRL 3A, ATCC CRL 1442); ćelije pluća čoveka (W138, ATCC CCL 75); ćelije jetre čoveka (Hep G2, HB 8065); tumor dojke kod miša (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI ćelije (Mather i dr.., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); MRC 5 ćelije; FS4 ćelije; i humana hepatomska linija (Hep G2). Ostale korisne ćelijske linije domaćina sisara uključuju ćelijske linije mijeloma kao što su NS0 i Sp2/0. Za pregled određenih ćelijskih linija domaćina sisara pogodnih za proizvodnju antitela, videti, npr., Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol.248 (B. K. C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J., 2003), pp.255-268.
[0199] Biljne kulture pamuka, kukuruza, krompira, soje, petunije, paradajza, patke (Leninaceae), lucerke (M. truncatula) i duvana mogu se takođe koristiti kao domaćini.
[0200] Pogodne prokariotske ćelije za ovu svrhu uključuju eubakterije, kao što su Gram-negativni ili Grampozitivni organizmi, na primer, Enterobacteriaceae, poput Escherichia, npr., E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, npr., Salmonella typhimurium, Serratia npr., Serratia marcescans i Shigella, kao i Bacilli kao B. subtilis i B. licheniformis (npr., B. licheniformis 41P obelodanjen u DD 266,710 objavljeno 12 Apr.1989), Pseudomonas kao što su P. aeruginosa i Streptomyces. Poželjan E. coli domaćin kloniranja je E. coli 294 (ATCC 31,446), iako su drugi sojevi kao što su E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31,537), i E. coli W3110 (ATCC 27,325) pogodni. Ovi primeri su ilustrativni, a ne ograničavajući.
[0201] Pored prokariota, eukariotski mikrobi poput nitastih gljivica ili kvasca su pogodni domaćini za kloniranje ili ekspresiju za vektore koji kodiraju antitela. Saccharomyces cerevisiae, ili obični pekarski kvas, najčešće se koristi među nižim eukariotskim mikroorganizmima domaćina. Međutim, mnogi drugi rodovi, vrste i sojevi su ovde dostupni i korisni, kao što je Schizosaccharomyces pombe; Kluyveromyces domaćono kao što su npr., K. lactis, K. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24,178), K. waltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906), K. thermotolerans i K. marxianus; yarrowia (EP 402,226); Pichia pastoris (EP 183,070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa; Schwanniomyces kao što je Schwanniomyces occidentalis; i nitaste gljivice, npr., Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, i Aspergillus domaćini kao što su A. nidulans i A. niger.
DELOVI ANTIBIOTIKA TIPA RIFAMICIN
[0202] Antibiotska grupa (abx) antitela-antibiotičkih konjugata (AAC) pronalaska je antibiotik tipa rifamicin ili grupa koja ima citotoksično ili citostatsko dejstvo. Rifamicini su grupa antibiotika koji se prirodnim putem dobijaju bakterijama, Nocardia mediterranei, Amycolatopsis mediterranei ili veštački. Oni su podklasa šire porodice Ansamicina koja inhibira bakterijsku RNK polimerazu (Fujii i dr. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:1489-1492; Feklistov, i dr. (2008) Proc Natl Acad Sci USA, 105(39): 14820-5) i imaju moć protiv gram-pozitivnih i selektivnih gram-negativnih bakterija. Rifamicini su posebno efikasni protiv mikobakterija, i zato se koriste za lečenje infekcija tuberkuloze, lepre i mikobakterijskog avijumskog kompleksa (MAC). Grupa tipa rifamicin uključuje „klasične“ lekove rifamicina, kao i derivate rifamicina rifampicin (rifampin, CA, br. 13292-46-1), rifabutin (CA, br. 72559-06-9; US 2011/0178001), rifapentin i rifalazil (CA br. 129791-92-0, Rothstein i dr. (2003) Expert Opin. Investig. Drugs 12(2):255-271; Fujii i dr. (1994) Antimicrob. Agents Chemother. 38:1118-1122. Mnogi antibiotici tipa rifamicin dele štetno svojstvo razvoja otpornosti (Wichelhaus i dr. (2001) J. Antimicrob. Chemother. 47:153-156). Rifamicini su prvi put izolovani 1957. godine iz fermentacione kulture Streptomyces mediterranei. Obelodanjeno je oko sedam rifamicina, nazvanih Rifamicin A, B, C, D, E, S, i SV (US 3150046). Rifamicin B prvi je komercijalno uveden i bio je koristan u lečenju rezistentne tuberkuloze tokom 1960-ih godina. Rifamicini se koriste za lečenje mnogih bolesti, od kojih je najvažnija tuberkuloza povezana sa HIV. Zbog velikog broja dostupnih analoga i derivata, rifamicini se široko koriste u eliminaciji patogenih bakterija koje su postale otporne na uobičajene antibiotike. Na primer, Rifampicin je poznat po svom moćnom dejstvu i sposobnosti da spreči rezistenciju na lekove. Brzo ubija sojeve bacila koji se brzo deliju, kao i ćelije „perzisteri“, koje ostaju biološki neaktivne kroz duži vremenski period, što im omogućava da izbegnu aktivnost antibiotika. Pored toga, rifabutin i rifapentin koriste se protiv tuberkuloze stečene kod HIV pozitivnih pacijenata.
[0203] Antibiotički delovi (abx) antitela-antibiotički konjugati formule I su delovi tipa rifamicina koji imaju strukturu:
gde:
isprekidane linije označavaju fakultativnu vezu;
R je H, C1-C12alkil, ili C(O)CH3;
R<1>je OH;
R<2>je CH=N-(heterociklil), pri čemu je heterociklil opciono supstituisan sa jednom ili više grupa nezavisno izabranih između (O)CH3, C1-C12alkil, C1-C12heteroaril, C2-C20heterocikil, C6-C20aril, i3-C12karbocikil;
ili R<1>i R<2>formiraju pet- ili šestočlani fuzioni heteroaril ili heterociklil, i opciono formiraju spiro ili kondenzovani šestočlani heteroaril, heterociklil, aril ili karbociklil prsten, pri čemu je spiro ili spojeni šestočlani heteroaril, heterociklil, aril ili je karbociklil prsten opciono supstituisan saH, F, Cl, Br, I, C1-C12alkilom ili OH; i
gde je peptidni veznik L kovalentno vezan za R<2>.
[0204] Primer dela nalik rifamicinu je:
4
gde je R<3>nezavisno izabran od H i C1-C12alkila; R<4>je izabran iz H, F, Cl, Br, I, C1-C12alkila i OH; i Z je izabran iz NH, N(C1-C12alkil), O i S; i gde je peptidni veznik L kovalentno vezan na atom azota N(R<3>)2.
[0205] Primer dela nalik rifampicinu je:
gde
R<5>je nezavisno izabran od H i C1-C12alkila; i gde je peptidni veznik L kovalentno vezan na atom azota NR<5>.
[0206] Primer dela nalik rifabutinu je:
gde je R<5>izabran od H i C1-C12alkila; i gde je peptidni veznik L kovalentno vezan na atom azota NR<5>.
[0207] Otelotvorenje dela nalik benzoksazinorifamicinu je:
gde je R<5>izabran od H i C1-C12alkila; i gde je peptidni veznik L kovalentno vezan na atom azota NR<5>.
[0208] Otelotvorenje dela nalik benzoksazinorifamicinu, koja se ovde naziva pipBOR, je:
gde je R<3>nezavisno izabran od H i C1-C12alkila; i gde je peptidni veznik L kovalentno vezan na atom azota N(R<3>)2.
[0209] Otelotvorenje dela nalik benzoksazinorifamicinu, koja se ovde naziva dimetil pipBOR, je:
gde je peptidni veznik L kovalentno vezan na atom azota N(CH3)2.
[0210] Polusintetički derivat rifamicin S, ili redukovana natrijumova sol u obliku rifamicina SV, može se pretvoriti u antibiotike tipa rifalazil u nekoliko koraka, gde je R H, ili Ac, R<3>je nezavisno izabran od H i C1-C12alkila; R<4>je izabran iz H, F, Cl, Br, I, C1-C12alkila i OH; i Z je odabran od NH, N(C1-C12alkil), O i S, kao što je prikazano na Slikama 9-11. Benzoksazino (Z = O), benztiazino (Z = S), benzdiazino (Z = NH, N(C1-C12alkil) rifamicini mogu se pripremiti (US 7271165). Analozi benzoksazinorifamicina (BOR), benztiazinorifamicina (BTR) i benzdijazinorifamicina (BDR) koji sadrže supstituente koji su numerisani prema šemi numerisanja iz formule A u koloni 28 u US 7271165. Pod "25-O-deacetil" rifamicin se podrazumeva analog rifamicina u kome je uklonjena acetil grupa u položaju 25. Analozi u kojima je ova pozicija dalje derivatizovana nazivaju se "25-O-deacetil-25-(supstituent)rifamicinom", u kome nomenklatura derivatne grupe zamenjuje "supstituent" u kompletnom nazivu jedinjenja.
[0211] Delovi sa antibioticima tipa rifamicina mogu se sintetizovati postupcima analognim onima obelodanjenim u US 4610919; US 4,983,602; US 5,786,349; US5981522; US 4,859,661; US 7,271,165; US 2011/0178001; Seligson, i dr.., (2001) Anti-Cancer Drugs 12:305-13; Chem. Pharm. Bull., (1993) 41:148). Antibiotički delovi tipa rifamicin mogu se pregledati na antimikrobno delovanje merenjem njihove minimalne inhibitorne koncentracije (MIC), koristeći standardne MIC in vitro testove (Tomioka i dr.., (1993) Antimicrob. Agents
4
PEPTIDNI VEZNICI
[0212] "Peptidni veznik" (L) je bifunkcionalna ili multifunkcionalna grupa koja je kovalentno vezana za jednu ili više grupa antibiotika (abx) i jedinicu antitela (Ab) da bi se formirali konjugati antitela-antibiotika (AAC) formule I. Veznici peptida u AAC su supstrati za deljenje međućelijskim proteazama, uključujući lizosomalna stanja. Proteaze uključuju različite katepsine i kaspaze. Deljenjem peptidnog veznika AAC unutar ćelije može se osloboditi antibiotik tipa rifamicin sa antibakterijskim efektima.
[0213] Količina aktivnog antibiotika oslobođenog pri deljenju AAC može se meriti pomoću Kaspaze ispitivanja oslobađanja iz Primera 20.
[0214] Antitelo-antibiotički konjugati (AAC) mogu se pogodno pripremiti korišćenjem vezujućeg reagensa ili međujedinjenja veznik-antibiotik koji ima reaktivnu funkciju za vezivanje za antibiotik (aby) i za antitelo (Ab). U jednom oglednom otelotvorenju, cistein tiol antitela napravljenog cisteinom (Ab) može da formira vezu sa funkcionalnom grupom vezujućeg reagensa, antibiotičkog dela ili međujedinjenja koje povezuje antibiotik.
[0215] Deo peptidnog vezujućeg AAC u jednom aspektu, vezujući reagens ili međujedinjenje veznikantibiotik ima reaktivno mesto koje ima elektrofilnu grupu koja je reaktivna na nukleofilni cistein prisutan na antitelu. Cistein tiol antitela reagira s elektrofilnom grupom na vezujućem reagensu ili veznik-antibiotiku, formirajući kovalentnu vezu. Korisne elektrofilne grupe uključuju, ali nisu ograničene na, maleimidne i haloacetamidne grupe.
[0216] Antitela proizvedena cisteinom reaguju sa povezujućim reagensima ili međujedinjenjima veznikantibiotika, sa elektrofilnim funkcionalnim grupama kao što su maleimid ili α-halo karbonil, prema postupku konjugacije na strani 766 od Klussman, i dr. (2004), Bioconjugate Chemistry 15(4):765-773, i prema protokolu iz Primera 19.
[0217] U drugom otelotvorenju, reaktivna grupa vezujućeg reagensa ili međujedinjenja veznika-antibiotika sadrži tiol-reaktivnu funkcionalnu grupu koja može da formira vezu sa slobodnim cistein tiolom antitela. Primeri funkcionalnih grupa sa tiol reakcijama uključuju, ali nisu ograničeni na, maleimid, α-haloacetil, aktivirane estre kao što su sukcinimidni estri, 4-nitrofenil esteri, pentafluorofenil ester, tetrafluorofenil ester, anhidridi, kiseli hloridi, sulfonil hloridi, izocijanati i izotiocijanati.
[0218] U sledećem otelotvorenju, vezujući reagens ili međujedinjenje vezivanja antibiotika ima reaktivnu funkcionalnu grupu koja ima nukleofilnu grupu koja je reaktivna na elektrofilnu grupu koja je prisutna na antitelu. Korisne elektrofilne grupe antitela uključuju, ali nisu ograničene na, piridil-disulfid, aldehid i keton karbonilne grupe. Heteroatom nukleofilne grupe veznog reagensa ili intermedijera koji povezuje antibiotike može reagovati sa elektrofilnom grupom na antitelu i formirati kovalentnu vezu sa jedinicom antitela. Korisne nukleofilne grupe na vezujućem reagensu ili medikamentu koji vezuju antibiotike uključuju, ali nisu ograničeni na, hidrazid, oksim, amino, tiol, hidrazin, tiosemikarbazon, hidrazin karboksilat i arilhidrazid. Elektrofilna grupa antitela pruža pogodno mesto za vezivanje na međujedinjenje za vezu ili reagens za vezu antibiotika.
[0219] Peptidni veznik može sadržavati jednu ili više komponenata veznika. Primeri komponenata povezivača uključuju peptidnu jedinicu, 6-maleimidokaproil ("MC"), maleimidopropanoil ("MP"), valin-citrulin ("val-cit" ili "vc"), alanin-fenilalanin ("ala-fe"), i p-aminobenziloksikarbonil ("PAB"), N-sukcinimidil 4-(2-piridiltio) pentanoat ("SPP") i 4- (N-maleimidometil) cikloheksan-1 karboksilat ("MCC"). U struci su poznate različite komponente veznika, od kojih su neke opisane ispod.
[0220] U drugom otelotvorenju, veznik može biti supstituisan grupama koje moduliraju rastvorljivost ili reaktivnost. Na primer, naelektrisani supstituent kao što je sulfonat (-SO3<->) ili amonijak, može povećati rastvorljivost u reagensu u vodi i olakšati reakciju povezivanja vezujućeg reagensa sa antitelom ili antibiotičkim delom, ili olakšati reakciju spajanja Ab-L (međujedinjenje veznik-antitela) sa abx, ili abx-L (međujedinjenje antibiotika-veznika) sa Ab, u zavisnosti od sintetičkog puta koji se koristi za pripremu AAC.
[0221] AAC predmetnog pronalaska izričito razmatra, ali nije ograničeno na, one pripremljene sa vezničkim reagensima: BMPEO, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, sulfo-SMPB, SVSB (sukcinimidil-(4-vinilsulfon)benzoat) i reagensa bis-maleimida kao što su DTME, BMB, BMDB, BMH, BMOE, BM(PEG)2, i BM(PEG)3. Bis-maleimidni reagensi omogućavaju vezivanje tiol grupe antitela zasnovanog na cisteinom na antibiotički deo koji sadrži tiol, etiketu ili veznik međujedinjenja, na sekvencijalni ili konvergentni način. Ostale funkcionalne grupe pored maleimida, koje su reaktivne sa tiolnom grupom antitela konstruisanog cisteinom, antibiotičkim delom ili međujedinjenjem veznika-antibiotika uključuju
4
jodoacetamid, bromoacetamid, vinil piridin, disulfid, piridil disulfid, izocijanat i izotiocijanat.
[0222] Korisni vezujući reagensi se takođe mogu dobiti preko drugih komercijalnih izvora, kao što je Molecular Biosciences Inc. (Boulder, CO), ili sintetizovati u skladu sa procedurama opisanim u Toki i dr. (2002) J. Org. Chem.67:1866-1872; Dubowchik, i dr.. (1997) Tetrahedron Letters, 38:5257-60; Walker, M.A. (1995) J. Org. Chem. 60:5352-5355; Frisch i dr. (1996) Bioconjugate Chem. 7:180-186; US 6,214,345; WO 02/088172; US 2,003,130,189; US2003096743; WO 03/026577; WO 03/043583; i WO 04/032828.
[0223] U drugom otelotvorenju, peptidni vezni deo AAC sadrži veznik dendritičnog tipa za kovalentno vezivanje više od jedne grupe antibiotika kroz razgranati, multifunkcionalni vezujući deo na antitelo (Sun i dr. (2002) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12:2213-2215; Sun i dr. (2003) Bioorganic & Medicinal Chemistry 11:1761-1768). Dendritični veznici mogu povećati molarni odnos antibiotika prema antitelu, tj. punjenje, što je povezano sa potencijom AAC. Prema tome, tamo gde antitelo proizvedeno od cisteina ima samo jednu reaktivnu cistein tiolnu grupu, mnoštvo antibiotskih ostataka može biti vezano kroz dendritični veznik.
[0224] U određenim otelotvorenjima Formule I AAC, peptidni veznik ima formulu:
-Str-Pep-Y-gde je Str jedinica nosača koja je kovalentno vezana za antitelo protiv teihoinske kiseline zida (WTA); Pep je peptid sa dva do dvanaest aminokiselinskih ostataka, a Y je razdelnička jedinica kovalentno vezana za antibiotik tipa rifamicin. Primerna otelotvorenja takvih veznika su opisana u US 7498298.
[0225] U jednom otelotvorenju, jedinica nosača "Str" ima formulu:
gde je R<6>izabran iz grupe koju čine C1-C10alkilen-, -C3-C8karbociklo, -O-(C1-C8alkil)-, -arilen-, -C1-C10alkilen-arilen-, -arilen-C1-C10alkilen-, -C1-C10alkilen-(C3-C8karbociklo)-, -(C3-C8karbociklo)-C1-C10alkilen-, -C3-C8heterociklo-,-C1-C10alkilen-(C3-C8heterociklo)-, -(C3-C8heterociklo)-C1-C10alkilen-, -(CH2CH2O)r-, i -(CH2CH2O)r-CH2-; i r je celi broj u rasponu od 1 do 10.
[0226] Primeri jedinice nosača su prikazane ispod (gde talasna linija označava mesta kovalentnog vezivanja za antitelo):
4
[0227] Peptidna jedinica "Pep" sadrži dve ili više aminokiselinskih ostataka koji se prirodno javljaju, uključujući dvadeset glavnih aminokiselina kao i manje aminokiseline poput citrulina, koje su dobro poznate u oblasti biohemije. Aminokiseline se odlikuju po bočnom lancu. Peptidna jedinica na taj način sadrži dva ili više aminokiselinskih bočnih lanaca, uključujući, ali ne ograničavajući se na, -CH3(alanin), -CH2CH2CH2NHC(NH)NH2(arginin), -CH2C(O)NH2(asparagin), -CH2CO2H (asparaginska kiselina), -CH2CH2CH2NHC(O)NH2(citrulin), -CH2SH (cistein), -CH2CH2CO2H (glutaminska kiselina), -CH2CH2C(O)NH2(glutamin), -H (glicin), -CH2(imidazolil) (histidin), -CH(CH3)CH2CH3(izoleucin), -CH2CH(CH3)CH3(leucin), -CH2CH2CH2CH2NH2(lizin), -CH2CH2SCH3(metionin), -CH2(C6H5) (fenilalanin), -CH2CH2CH2- (prolin), -CH2OH (serin), -CH(OH)CH3(treonin), -CH2(indol) (triptofan), -CH2(p-C6H4OH) (tirozin), -CHCH(CH3)CH3(valin). Videti strana 1076-1077, "Organic Chemistry" 5th Ed. John McMurry, Brooks/Cole pub. (2000). Ostaci aminokiselina peptidne jedinice uključuju sve stereoizomere, a mogu biti u D ili L konfiguraciji. U jednom otelotvorenju, Pep sadrži dva do dvanaest aminokiselinskih ostataka nezavisno izabranih između glicina, alanina, fenilalanina, lizina, arginina, valina i citrulina. U jednom takvom otelotvorenju, jedinica aminokiselina omogućava deljenje veznika proteazom, omogućavajući oslobađanje antibiotika iz AAC nakon izlaganja međućelijskim proteazama, kao što su lizosomalni enzimi (Doronina i dr.. (2003) Nat. Biotechnol. 21:778-784). Primeri jedinica aminokiselina uključuju, ali nisu ograničeni na, dipeptid, tripeptid, tetrapeptid, pentapeptid i heksapeptid. Primeri dipeptida uključuju: valincitrulin (vc ili val-cit), alanin-fenilalanin (af ili ala-phe); fenilalanin-lizin (fk ili phe-lys); ili N-metil-valincitrulin (Me-val-cit). Primeri tripeptida uključuju: glicin-valin-citrulin (gly-val-cit), valin-citrulin-fenilalanin (val-cit-phe) i glicin-glicin-glicin (gly-gly-gly). Dodatni peptidni veznici uključuju GGAFAGGG (SEQ ID NO:126); tpm-cit; GPImeLFF (SEQ ID NO:129); i LAFG (SEQ ID NO:128). Peptidni veznici se mogu pripremiti formiranjem peptidne veze između dve ili više aminokiselina i/ili fragmenata peptida. Takve peptidne veze mogu se pripremiti, na primer, postupkom sinteze u tečnoj fazi (E. Schroder and K. Lübke (1965) "The Peptides", volume 1, pp 76-136, Academic Press) koji je dobro poznat u polju hemije peptida. Jedinice aminokiselina mogu biti dizajnirane i optimizovane u svojoj selektivnosti za enzimsko deljenje određenim enzimom, na primer, proteazom povezana proteaza, katepsin B, C i D ili plazminska proteaza.
[0228] U jednom otelotvorenju, razdelnička jedinica Y sadrži para-aminobenzil ili paraaminobenziloksikarbonil. "Ne-samo-imolativna" razdelnička jedinica je ona u kojoj deo ili cela razdelnička jedinica ostaje vezana za antibiotsku jedinicu nakon enzimskog (npr., proteolitičkog) deljenja AAC. Primeri ne-samo-imolativnih razdelničkih jedinica uključuju, ali nisu ograničeni na, glicinski razdelnik i glicinglicinski razdelnik. Takođe se razmatraju druge kombinacije peptidnih razdelnika podložnih enzimskom odvajanju specifičnom za sekvencu. Na primer, enzimatsko deljenje AAC koji sadrži glicin-glicinski razdelnički blok proteazom pridruženom tumorskom ćelijom bi rezultiralo oslobađanjem dela glicin-glicinantibiotik iz ostatka AAC. U jednom takvom otelotvorenju, deo glicin-glicin-antibiotik se zatim podvrgava posebnom koraku hidrolize u tumorskoj ćeliji, čime se deljive jedinice glicin-glicin odvaja od grupe antibiotika.
[0229] Razdelnička jedinica omogućava oslobađanje grupe antibiotika bez odvojenog koraka hidrolize. Razdelnička jedinica može biti „samo-imolativna“ ili „ne-samo-imolativna“. U određenim otelotvorenjima, razdelnička jedinica veznika sadrži p-aminobenzil jedinicu (PAB). U jednom takvom otelotvorenju, paminobenzil alkohol je vezan na jedinicu aminokiseline preko amidne veze, karbamata, metilkarbamata ili
4
karbonata između p-aminobenzil grupe i grupe antibiotika (Hamann i dr.. (2005) Expert Opin. Ther. Patents (2005) 15:1087-1103). U jednom otelotvorenju, razdelnička jedinica je p-aminobenziloksikarbonil (PAB).
[0230] U jednom otelotvorenju, antibiotik formira kvaterni amin, poput dimetilaminopiperidilne grupe, kada je vezan za PAB razdelničku jedinicu peptidnog veznika. Primeri takvih kvaternarnih amina su međujedinjenja veznika-antibiotika (LA) su 54, 61, 66, 67, 73, 74, 76, 78, 79, 83, 84 iz Tabele 2. Kvatarna aminska grupa može modulirati deljenje antibiotičkog dela da bi se optimizovali antibakterijski efekti AAC. U drugom otelotvorenju, antibiotik je povezan sa PABC razdelničkom jedinicom peptidnog veznika, formirajući karbamata funkcionalnu grupu u AAC. Takva funkcionalna grupa karbamata takođe može da optimizuje antibakterijske efekte AAC. Primeri međujedinjenja veznika-antibiotika PABC karbamata (LA) su 51, 52, 53, 55, 56, 57, 58, 62, 63, 64, 65, 72, 75, 80, 81, 87 iz Tabele 2. Ostala međujedinjenja veznika-antibiotika (LA) koriste amidnu (59, 69, 70, 71, 77, 82, 85) ili fenolnu (60, 68, 86) grupu.
[0231] Ostali primeri samo-imolativnih razdelnika uključuju, ali nisu ograničeni na, aromatična jedinjenja koja su elektronski slična PAB grupi, kao što su derivati 2-aminoimidazol-5-metanola (US 7375078; Hay i dr.. (1999) Bioorg. Med. Chem. Lett.9:2237) i orto- ili para-aminobenzilacetali. Mogu se koristiti razdelnici koji podvrgavaju ciklizaciju nakon hidrolize amidne veze, kao što su supstituisani i nesupstituisani amidi 4-aminobuterne kiseline (Rodrigues i dr. (1995) Chemistry Biology 2:223), odgovarajuće supstituisan biciklo[2.2.1] i biciklo[2.2.2] sistemi prstenova (Storm i dr. (1972) J. Amer. Chem. Soc. 94:5815) amidi 2-aminofenilpropionske kiseline (Amsberry, i dr. (1990) J. Org. Chem.55:5867). Eliminacija lekova koji sadrže amin i koji su supstituisani glicinom (Kingsbury i dr. (1984) J. Med. Chem.27:1447) je takođe primer samoimolativnih razdelnika korisnih u AAC.
VEZNIK-ANTIBIOTIČKA MEĐUJEDINJENJA KORISNA ZA AAC
[0232] Međujedinjenja veznik-antibiotika (LA) formule II i Tabele 2 su pripremljeni spajanjem antibiotičkog dela rifamicina sa peptidnim vezujućim reagensom, kao što je prikazano na Slikama 23-25 i Primerima 1-17. Veznik reagensi su pripremljeni postupcima opisanim u WO 2012/113847; US 7,659,241; US 7,498,298; US 20,090,111,756; US 2009/0018086; US 6,214,345; Dubowchik i dr. (2002) Bioconjugate Chem. 13(4):855-869, uključujući:
4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)heksanamido)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)benzil 4-nitrofenil karbonat 6
6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)-N-((S)-1-((S)-1-(4-(hidroksimetil)fenilamino)-1-okso-5-ureidopentan-2-ilamino)-3-metil-1 -oksobutan-2-il)heksanamid 8
N-((S)-1-((S)-1-(4-(hlorometil)fenilamino)-1-okso-5-ureidopentan-2-ilamino)-3-metil-1-oksobutan-2-il)-6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)heksanamid 9
4
Tabela 2 Međujedinjenja veznik-antibiotik (LA)
1
2
4
1
2
OTELOTVORENJA KONJUGATA ANTITELA-ANTIBIOTIKA
[0233] Antitelo na S4497 povezano je sa derivatima rifamicina u Tabeli 3, nazvanim pipBOR i drugima, pomoću peptidnog veznika koji se može podeliti proteazom. Veznik je dizajniran da se podeli lizosomalnim proteazama uključujući katepsine B, D i druge, koje prepoznaju peptidne jedinice, uključujući Valin-citrulin (val-cit, vc) dipeptid (Dubowchik i dr. (2002) Bioconj. Chem. 13:855-869). Generisanje međujedinjenja veznik-antibiotik koji se sastoji iz antibiotika i MC-vc-PAB veze i ostalih, detaljno je opisano u Primerima 1-17. Veznik je dizajniran tako da deljenje amidne veze na PAB delu odvaja antitelo od antibiotika u aktivnom stanju.
[0234] AAC nazvan S4497-dimetil-pipBOR identičan je SAC497-pipBOR AAC, osim dimetilirane amino antibiotike i oksikarbonilne grupe na vezniku.
[0235] Slika 5 prikazuje mogući mehanizam aktivacije leka za antitelo-antibiotičke konjugate (AAC). Aktivni antibiotik (Ab) se oslobađa samo nakon internalizacije AAC unutar ćelija sisara. Fab deo antitela u AAC vezuje S. aureus dok Fc deo AAC pojačava prihvatanje bakterija vezivanjem posredovanim Fc receptorima na
4
fagocitne ćelije, uključujući neutrofile i makrofage. Nakon internalizacije u fagolizome, Val-Cit veznik se cepa lizosomalnim proteazama koje oslobađaju aktivni antibiotik unutar fagolizoma.
[0236] Otelotvorenje jedinjenja antitelo-antibiotik konjugata (AAC) pronalaska uključuje sledeće:
gde su AA1 i AA2 nezavisno odabrani iz bočnog lanca aminokiseline, uključujući H, -CH3, -CH2(C6H5), -CH2CH2CH2CH2NH2, -CH2CH2CH2NHC(NH)NH2, -CHCH(CH3)CH3, i -CH2CH2CH2NHC(O)NH2; i obuhvata formule:
[0237] Primer jedinjenja konjugata antitelo-antibiotik predmetnog pronalaska uključuje sledeće:
gde:
isprekidane linije označavaju fakultativnu vezu;
R je H, C1-C12alkil, ili C(O)CH3;
R<1>je OH;
R<2>je CH=N-(heterociklil), pri čemu je heterociklil opciono supstituisan sa jednom ili više grupa nezavisno izabranih između (O)CH3, C1-C12alkil, C1-C12heteroaril, C2-C20heterocikil, C6-C20aril, i3-C12karbocikil;
ili R<1>i R<2>formiraju pet- ili šestočlani fuzioni heteroaril ili heterociklil, i opciono formiraju spiro ili kondenzovani šestočlani heteroaril, heterociklil, aril ili karbociklil prsten, pri čemu je spiro ili spojeni šestočlani heteroaril, heterociklil, aril ili je karbociklil prsten opciono supstituisan sa H, F, Cl, Br, I, C1-C12alkilom ili OH;
L je peptidni veznik vezan za R<2>ili spojen sa heteroarilom ili heterociklilom formiranim od R<1>i R<2>; i Ab je antitelo protiv teihoinske kiseline zida (WTA);
[0238] Primer jedinjenja konjugata antitelo-antibiotik predmetnog pronalaska uključuje sledeće:
gde je R<3>nezavisno izabran od H i C1-C12alkila; n je 1 ili 2; R<4>je izabran iz H, F, Cl, Br, I, C1-C12alkila i OH; i Z je izabran iz NH, N(C1-C12alkil), O i S.
[0239] Primer jedinjenja konjugata antitelo-antibiotik predmetnog pronalaska uključuje sledeću grupu antibiotika tipa rifampin:
gde je R<5>izabran od H i C1-C12alkila; i n je 0 ili 1.
[0240] Primer jedinjenja konjugata antitelo-antibiotik predmetnog pronalaska uključuje sledeći deo antibiotika tipa rifampin:
gde je R<5>izabran od H i C1-C12alkila; i n je 0 ili 1.
[0241] Otelotvorenje jedinjenja konjugata antitelo-antibiotik predmetnog pronalaska uključuje sledeći deo antibiotika tipa rifampin:
gde je R<5>nezavisno izabran od H i C1-C12alkila; i n je 0 ili 1.
[0242] Otelotvorenje jedinjenja konjugata antitelo-antibiotik predmetnog pronalaska uključuje sledeći deo antibiotika tipa pipBOR:
gde je R<3>nezavisno izabran od H i C1-C12alkila; i n je 1 ili 2.
[0243] Otelotvorenje jedinjenja konjugata antitelo-antibiotik predmetnog pronalaska uključuje sledeće:
[0244] Dalja otelotvorenja jedinjenja konjugata antitelo-antibiotik predmetnog pronalaska uključuje sledeće:
[0245] Punjenje antibioticima predstavljeno je sa p, prosečnim brojem ostataka antibiotika (abx) po antitelu u molekuli Formule I. Punjenje antibiotika može biti u opsegu od 1 do 20 delova antibiotika (D) po antitelu. AAC formule I uključuje kolekcije ili skup antitela konjugiranih sa nizom antibiotskih ostataka, od 1 do 20. Prosečan broj antibiotičkih delova po antitelu u preparatima AAC iz reakcija konjugacije može se naznačiti uobičajenim sredstvima kao što su masena spektroskopija, test ELISA i HPLC. Takođe se može odrediti kvantitativna raspodela AAC u smislu p. U nekim slučajevima, odvajanje, prečišćavanje i naznačivanje homogenih AAC gde je p određena vrednost od AAC sa drugim opterećenjima antibioticima može se postići sredstvima kao što su HPLC reverzne faze ili elektroforeza.
[0246] Za neke konjugate antitelo-antibiotik, p može biti ograničen brojem mesta vezanja na antitelo. Na primer, tamo gde je vezanost cistein tiol, kao u gornjim primerima otelotvorenja, antitelo može imati samo jednu ili više cistein tiol grupa, ili može imati samo jednu ili nekoliko dovoljno reaktivnih tiol grupa preko kojih se može povezati veznik. U nekim otelotvorenjima, veće opterećenje antibioticima, npr. p > 5, može da izazove agregaciju, nerastvorljivost, toksičnost ili gubitak ćelijske propustljivosti određenih konjugata antiteloantibiotik. U nekim otelotvorenjima, opterećenje antibiotika za AAC predmetnog pronalaska se kreće od 1 do oko 8; od oko 2 do oko 6; od oko 2 do oko 4; ili od oko 3 do oko 5; oko 4; ili oko 2.
[0247] U nekim otelotvorenjima, manje od teoretskog maksimuma delova antibiotika je konjugovano sa antitelom tokom reakcije konjugacije. Antitelo može da sadrži, na primer, lizinske ostatke koji ne reaguju sa međujedinjenjem antibiotika-veznik ili vezom, kao što je diskutovano u daljem tekstu. Opšte, antitela ne sadrže mnogo slobodnih i reaktivnih cistein tiol grupa koje mogu biti povezane sa grupom antibiotika; zaista većina cistein tiolnih ostataka u antitelima postoji kao disulfidni mostovi. U nekim otelotvorenjima, antitelo može biti redukovano redukcionim sredstvom kao što je ditiotreitol (DTT) ili trikarboniletilfosfin (TCEP), pod delimičnim ili potpunim redukcionim uslovima, da bi se stvorile reaktivne cistein tiolne grupe. U nekim otelotvorenjima, antitelo je podvrgnuto uslovima za denaturaciju da bi se otkrile reaktivne nukleofilne grupe kao što su lizin ili cistein.
[0248] Učitavanje (odnos antibiotika/antitela, „AAR“) AAC može se kontrolisati na različite načine, npr., sa: (i) ograničavanjem molarnog viška međujedinjenja ili vezivnog reagensa za antibiotik-veznik u odnosu na antitelo, (ii) ograničavanjem vremena ili temperature reakcione konjugacije, i (iii) delimičnim ili ograničavajućim reduktivnim uslovima za modifikaciju cistein tiola.
[0249] Treba shvatiti da gde više nukleofilnih grupa reaguje sa međujedinjenjem ili vezujućim reagensom sa antibiotik-veznikom, praćenim reagensom za antibiotske delove, tada je dobijeni proizvod mešavina AAC jedinjenja sa distribucijom jednog ili više antibiotskih delova vezanih za antitelo. Prosečan broj antibiotika po antitelu može se izračunati iz smeše dvostrukim testom ELISA antitela, koji su specifični za antitelo i specifični za antibiotik. Pojedinačni AAC molekuli mogu se identifikovati u smeši pomoću masene spektroskopije i razdvojiti HPLC, npr. hidrofobna hromatografija interakcije (videti npr., McDonagh i dr. (2006) Prot. Engr. Design & Selection 19(7):299-307; Hamblett i dr. (2004) Clin. Cancer Res. 10:7063-7070; Hamblett, K.J., i dr.. "Effect of drug loading on the pharmacology, pharmacokinetics, and toxicity of an anti-CD30 antibodydrug conjugate," Abstract No.624, American Association for Cancer Research, 2004 Annual Meeting, March 27-31, 2004, Proceedings of the AACR, Volume 45, March 2004; Alley, S.C., i dr.. "Controlling the location of drug attachment in antibody-drug conjugates," Abstract No. 627, American Association for Cancer Research, 2004 Annual Meeting, March 27-31, 2004, Proceedings of the AACR, Volume 45, March 2004). U određenim otelotvorenjima, homogeni AAC sa jednom vrednosti opterećenja može biti izolovan iz smeše konjugacije elektroforezom ili hromatografijom. Antitela zasnovana na cisteinu prema predmetnom pronalasku omogućavaju više homogenih preparata pošto je reaktivno mesto na antitelu prevashodno ograničeno na konstruisani cistein tiol. U jednom otelotvorenju, prosečan broj ostataka antibiotika po antitelu je u opsegu od oko 1 do oko 20. U nekim otelotvorenjima opseg je odabran i kontrolisan od oko 1 do 4.
POSTUPCI PRIPREME ANTITELO-ANTIBIOTIČKIH KONJUGATA
[0250] AAC formule I može se pripremiti na nekoliko načina koji koriste reakcije organske hemije, stanja i reagense poznate stručnjacima u ovoj oblasti, uključujući: (1) reakcija nukleofilne grupe antitela sa bivalentnim veznim reagensom da formira Ab-L preko kovalentne veze, posle čega sledi reakcija sa antibiotičkim delom (abX); i (2) reakcija nukleofilne grupe antibiotičkog dela sa bivalentnim veznim reagensom, da bi se formirao L-abX, putem kovalentne veze, posle čega je usledila reakcija sa nukleofilnom grupom antitela. Primerni postupci za pripremanje AAC Formule I preko potonjeg puta opisani su u US 7498298.
[0251] Nukleofilne grupe antitela uključuju, ali nisu ograničene na: (i) N-terminalne aminske grupe, (ii) aminske grupe bočnih lanaca, npr. lizin, (iii) tiolne grupe bočnih lanaca, npr. cistein i (iv) šećerna hidroksilna ili amino grupa gde je antitelo glikozilovano. Aminske, tiolne i hidroksilne grupe su nukleofilne i sposobne su da reaguju da formiraju kovalentne veze sa elektrofilnim grupama na veznim delovima i veznim reagensima, uključujući: (i) aktivni estri kao što su NHS estri, HOBt estri, haloformati i halogenidi kiseline; (ii) alkil i benzil halogenidi kao što su haloacetamidi; (iii) aldehidi, ketoni, karboksil i maleimidne grupe. Određena antitela imaju redukovane međulančane disulfide, tj. cisteinske mostove. Antitela se mogu učiniti reaktivnim za konjugaciju sa vezujućim reagensima tretmanom redukcionim sredstvom kao što je DTT (ditiotreitol) ili trikarboniletilfosfin (TCEP), tako da se antitelo u potpunosti ili delimično redukuje. Svaki cisteinski most će tako teoretski formirati dva reaktivna tiolna nukleofila. Dodatne nukleofilne grupe mogu se uvesti u antitela modifikovanjem lizinskih ostataka, npr., reakcijom lizinskih ostataka sa 2-iminotiolanom (Trautov reagens), što rezultira konverzijom amina u tiol. Reaktivne tiolne grupe mogu se uvesti u antitelo unošenjem jednog, dva, tri, četiri, ili više cisteinskih ostataka (npr., pripremanjem varijantnih antitela koja sadrže jedan ili više ne-izvornih ostataka cisteinskih aminokiselina).
[0252] Konjugati antitela i antibiotika predmetnog pronalaska se takođe mogu proizvesti reakcijom između elektrofilne grupe na antitelo, kao što je aldehid ili keton karbonilna grupa, sa nukleofilnom grupom na vezujućem reagensu ili antibiotiku. Korisne nukleofilne grupe na vezujućem reagensu uključuju, ali nisu ograničene na, hidrazid, oksim, amino, hidrazin, tiosemikarbazon, hidrazin karboksilat i arilhidrazid. U jednom otelotvorenju, antitelo je modifikovano tako da uvodi elektrofilne delove koji su sposobni da reaguju sa nukleofilnim supstituentima na vezujućem reagensu ili antibiotiku. U drugom otelotvorenju, šećeri glikozovanih antitela mogu da se oksidu ju, npr. sa periodnim oksidantnim reagensima, da bi se formirale aldehidne ili ketonske grupe koje mogu reagovati sa aminskom grupom vezujućih reagensa ili antibiotskih ostataka. Dobijene iminske Šifove bazne grupe mogu formirati stabilnu vezu ili se mogu redukovati, npr. borohidridnim reagensima za formiranje stabilnih aminskih veza. U jednom otelotvorenju, reakcija ugljovodonikovog dela glikozilovanog antitela bilo sa galaktozo oksidazom ili natrijum metapo periodatom mogu da se dobiju karbonilne (aldehidne i ketonske) grupe u antitelu koje mogu reagovati sa odgovarajućim grupama na antibiotik (Hermanson, Bioconjugate Techniques). U drugom otelotvorenju, antitela koja sadrže N-kraj ostatka serina ili treonina mogu reagovati sa natrijum meta-periodatom, što rezultira stvaranjem aldehida umesto prve aminokiseline (Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146; US 5,362,852). Takav aldehid može da reaguje sa antibiotičkim delom ili nukleofilom koji ima vezu.
[0253] Nukleofilne grupe na grupi sa antibioticima uključuju, ali nisu ograničene na: amin, tiol, hidroksil, hidrazid, oksim, hidrazin, tiosemikarbazon, hidrazin karboksilat i arilhidrazid grupe sposobne da reaguju da formiraju kovalentne veze sa elektrofilnim grupama na vezničkim delovima i vezničkim reagensima, uključujući: (i) aktivni estri kao što su NHS estri, HOBt estri, haloformati i halogenidi kiseline; (ii) alkil i benzil halogenidi kao što su haloacetamidi; (iii) aldehidi, ketoni, karboksil i maleimidne grupe.
[0254] Konjugati antitela-antibiotika (AAC) u Tabeli 3 su pripremljeni konjugacijom opisanih anti-WTA antitela i međujedinjenja veznik-antibiotika iz Tabele 2, i prema opisanim postupcima u Primeru 24. AAC je testiran na efikasnost in vitro ispitivanjem makrofaga (Primer 18) i in vivo modelom bubrega miša (Primer 19).
Tabela 3 Konjugati antitela i antibiotika (AAC)
1
2
4
IN VITRO ANALIZA KOJA DEMONSTRIRA DA AAC UBIJA UNUTARĆELIJSKI MRSA
[0255] Eksperimenti in vitro potvrđuju da AAC oslobađa aktivni antibiotik tek nakon što se veznik između antitela i antibiotika odvoji odgovarajućim enzimom, poput katepsina B. MRSA je uzgajana preko noći u normalnoj podlozi za kultivisanje bakterija i do 10 µg/mL AAC. Inkubacija MRSA sa S4497-pipBOR ili S4497-dimetil-pipBOR AAC nije rezultirala inhibicijom rasta bakterija ukoliko AAC nisu prethodno tretirani katepsinom B da bi se oslobodio aktivni antibiotik. In vitro ispitivanje upotrebom mišjih peritonealnih makrofaga potvrdilo je da AAC oslobađa aktivni antibiotik i ubija MRSA unutar ćelija fagocita (Primer 18). AAC koji sadrži antitelo rF1, koje se vezuje za porodicu proteina povezanih sa ćelijskom zidom, konjuguje se na derivat rifamicina. S. aureus (Newman soj) je tretiran sa različitim dozama rF1-AAC ili sa ekvivalentnim dozama bilo jednog antitela, samog rifampicina ili mešavine antitela i slobodnog rifampicina da bi se omogućilo vezivanje antitela za bakterije (opsonizacija) i posle 1 sata inkubacijom, opsonizovane bakterije su dovedene u makrofage (Slika 7A).
[0256] Slika 7A prikazuje in vitro test makrofaga koji pokazuje da AAC ubija unutarćelijsku MRSA. S. aureus (Newman) je inkubiran sam sa rF1 antitelom, samim slobodnim rifampicinom, jednostavnom mešavinom rF1 antitela plus slobodnim rifampicinom kombinovanim u istom odnosu antitela prema antibiotiku koji se nalazi u AAC, ili rF1-AAC tokom 1 sata i dodato mišjim makrofagovima. Makrofagi su inkubirani 2 sata na 37°C da se dozvoli fagocitoza. Nakon završetka fagocitoze, infekciona mešavina je zamenjena sa normalnim podlogama za rast sa 50 µg/mL gentamicina kako bi se inhibirao rast vanćelijskih bakterija, a ukupan broj preživelih unutarćelijskih bakterija određen je 2 dana nakon infekcije nanošenje prevlake.
[0257] Makrofagi su bili zaraženi tokom 2 sata i infekcija je uklonjena i zamenjena podlogom koja sadrži gentamicin da bi se ubile preostale vanćelijske bakterije koje makrofagi nisu preuzeli. Nakon 2 dana, makrofazi su lizirani i ukupnim brojem preživelih unutarćelijskih bakterija utvrđen je nanošenjem prevlake na agar pločama. Analiza je otkrila da je lečenje sa AAC rezultiralo više od 100 puta smanjenjem broja unutarćelijskih bakterija u poređenju sa tretmanom jednostavnom mešavinom rF1 antitela plus slobodnim rifampicinom kombinovanim u istom odnosu antitela prema antibioticima koji su pronađeni u AAC (Slika 7A).
[0258] MRSA je sposobna da napadne brojne nefagocitne ćelijske tipove uključujući osteoblaste i različite vrste epitela i endotelija. (Garzoni and Kelly, (2008) Trends in Microbiology). MRSA je u stanju da inficira ćelijsku liniju osteoblasta (MG63), ćelijsku liniju epitela disajnih puteva (A549) i primarne kulture endotelnih ćelija pupčane vene (HUVEC). Slika 7B prikazuje unutarćelijsko ubijanje MRSA (USA300 soj) sa 50 µg/mL S4497-pipBOR AAC 102 u makrofagima, osteoblastima (MG63), epitelnim ćelijama disajnih puteva (A549) i endotelnim ćelijama pupčane vene kod ljudi (HUVEC) gde je golo, nekonjugovano antitelo S4497 nije. Ovi tipovi ćelija verovatno iskazuju niži ukupni nivo katepsina B od profesionalnih fagocitnih ćelija kao što su makrofagi, međutim MRSA tretirana sa 50 µg/mL efektivno je ubijena nakon internalizacije u sve tri ove ćelijske linije. Isprekidana linija označava granicu detekcije za test.
[0259] In vitro analiza je izvedena da bi se uporedila aktivnost AAC napravljena sa varijacijama u vezniku koji spaja antitelo sa antibiotikom. S4497-dimetil-pipBOR AAC je jači od S4497-pipBOR AAC u testu unutarćelijskog ubijanja makrofaga. S4497-pipBOR AAC i S4497-dimetil-pipBOR AAC su titrirani kako bi se odredila minimalna efektivna doza u našem testiranom unutarćelijskom ubijanju makrofaga (Slika 7C). Tretman sa najmanje 2 µg/mL AAC može biti potreban da bi se postigao optimalni klirens unutarćelijskih bakterija.
[0260] Slika 7C prikazuje poređenje AAC-a sa pipBOR 51 naspram dimetil-pipBOR (diMe-pipBOR) 54. MRSA je opsonizovana samo antitelom S4497 ili sa AACs: S4497-pipBOR 102 ili S4497-diMetil-pipBOR 105 u različitim koncentracijama u rasponu od 10 µg/mL do 0.003 µg/mL. Ovi podaci otkrivaju da je za oba AAC došlo do optimalnog ubijanja kada je AAC testiran na više od 2 µg/mL, s gubitkom u zavisnosti od doze koji je postao očigledan na 0.4 µg/mL. Ukupni nivo ubijanja je značajno nadmašen kod S4497 dimetil-pipBOR AAC 105. Tretman sa većim dozama S4497-dimetil-pipBOR AAC 105 eliminisao je unutarćelijske bakterije ispod granice detekcije i primećeno je preko 300 puta ubijanje korišćenjem podoptimalne doze od 4 µg/mL AAC.
[0261] Slika 7D prikazuje AAC ubija unutarćelijske bakterije bez štetnosti makrofaga. USA300 soj S. aureus prethodno je inkubiran sa 50 µg/mL S4497 anti-S. aureus antitela (antitelo) ili sa 50 µg/mL tio-S4497-HC-A118C-MC-vc-PAB-dimetilpipBOR 105 AAC, u trajanju od 1 sata da se omogući vezivanje antitela na bakterije. Opsonizovane bakterije su dodate u mišji peritonealni makrofag kod mnoštva infekcije 10-20 bakterija po makrofagu i inkubirane su na 37°C tokom 2 sata da se dozvoli fagocitoza. Nakon što je fagocitoza bila završena, uklonjene su slobodne bakterije i makrofagi su kultivisani dva dana u normalnom mediju za rast sa dodatkom 50 µg/mL gentamicina da se ubiju ne-internalizovane bakterije. Na kraju perioda kulture, preživljavanje makrofaga je procenjeno otkrivanjem otpuštanja citoplazmatske laktat dehidrogenaze (LDH) u supernatant kulture. Ukupna količina LDH oslobođenog iz svakog udubljenja je upoređena sa kontrolnim udubljenjima koja sadrže makrofage koji su lizirani dodavanjem deterdženta u udubljenja. Opseg lize ćelija makrofaga u udubljenjima tretiranim deterdžentom, neinficiranim makrofagama, makrofazima inficiranim USA300 pre-opsonizovanim antitelom S4497 ili makrofagama inficiranim USA300 pre-opsonizovanim sa tio-S4497-HC-A118C-MC-vc-PAB-dimetilpipBOR 105 Izmeren je AAC.
[0262] Slika 7E prikazuje oporavak živog USA300 iz unutrašnjih makrofaga iz gornje ćelije makrofagnih ćelija. Makrofagi su lizirani i serijska razblaženja ćelijskog lizata su postavljena tako da nabroje broj preživelih unutarćelijskih bakterija.
[0263] Slika 9 prikazuje test inhibicije rasta koji pokazuje da AAC nije toksičan za S. aureus, osim ako veznik nije podeljen katepsinom B. Na levoj strani je prikazan šematski test oslobađanja katepsina (Primer 20). AAC se tretira katepsinom B da bi se oslobodio besplatan antibiotik. Ukupna količina aktivnosti antibiotika u netaknutom u odnosu na AAC tretiranom katepsinom B određuje se pripremom serijskih razblaženja rezultirajuće reakcije i određivanjem minimalne doze AAC koja može inhibirati rast S. aureus. Gornji desni grafik prikazuje test oslobađanja katepsina za tio-S4497-HC-A118C-MC-vc-PAB-pipBOR 102, a donji desni grafik prikazuje test oslobađanja katepsina za tio-S4497-HC-A118C-MC-vc-PAB-dimetilpipBOR 105.
IN VIVO EFIKASNOST ANTITELA ANTIBIOTIČNIH KONJUGATA:
[0264] Osnovan je in vivo model peritonitisa kod miševa da bi se testirala efikasnost AAC. U ovom modelu, miševi su zaraženi intraperitonealnom injekcijom (I.P.) MRSA, a opterećenje bakterija se prati 2 dana nakon infekcije u peritonealnoj tečnosti i bubregu. Bakterije sakupljene iz peritoneuma mogu se naći ili kao slobodne plutajuće vanćelijske bakterije ili internalizovane unutar peritonealnih ćelija - pre svega neutrofila i makrofaga - koje se regrutuju do mesta infekcije. Iako se činilo da su vanćelijske bakterije identifikovane na ovom modelu osetljive na lečenje antibioticima, pokazalo se da unutarćelijske bakterije nisu reagovale na lečenje određenim brojem klinički relevantnih antibiotika, uključujući rifampin (Sandberg i dr. (2009) Antimicrobial Agents Chemother) i zbog toga se činilo da odličan cilj za testiranje efikasnosti našeg AAC.
[0265] Slika 8A prikazuje in vivo prikazuje S4497-pipBOR AAC 102. Model intraperitonealne infekcije kod A/J miševa. Miševi su inficirani sa 5x10<7>CFU MRSA intraperitonealnom injekcijom i tretirani sa 50 mg/Kg samo antitela S4497 ili sa 50 mg/Kg S4497-pipBOR AAC 102 intraperitonealnom injekcijom (protokol 11-2032A). Miševi su žrtvovani 2 dana nakon infekcije i celokupno opterećenje bakterija procenjeno je u peritonealnom supernatantu (vanćelijske bakterije), peritonealnim ćelijama (unutarćelijske bakterije) ili u bubregu.
[0266] A/J miševi su inficirani sa USA300 i primenjeni 50 mg/Kg bilo S4497 antitela ili S4497-pipBOR AAC 102 trideset minuta nakon infekcije. Nakon 2 dana, miševi su žrtvovani i praćeno je bakterijsko opterećenje u peritonealnom ispiranju i bubregu. Da bi se napravila razlika između vanćelijskih i unutarćelijskih bakterija, peritonealno ispiranje je nežno centrifugirano da bi odvojilo supernatant, koji sadrži vanćelijske bakterije i peritonealne ćelije. Peritonealne ćelije su tretirane lizostafinom da se ubiju sve kontaminirajuće vanćelijske bakterije i liziraju da bi se nabrajao ukupan broj unutarćelijskih bakterija u vreme berbe. Iako su miševi koji su tretirani antitelom samostalno sadržavali između 10<5>i 10<6>CFU i unutarćelijskih i vanćelijskih bakterija u peritonealnom ispiranju i između 10<4>i 10<6>bakterija u bubregu, miševi koji su tretirani S4497-pipBOR AAC uklonili su infekciju ispod granice detekcije. Ovi podaci otkrivaju da je, iako je AAC dizajniran da oslobađa aktivni antibiotik unutar fagolizoma, primećen odličan klirens i unutarćelijskog i vanćelijskog bazena MRSA. Budući da vanćelijske bakterije ne ubijaju direktno AAC, činjenica da su ove bakterije takođe očišćene lečenjem AAC ukazuje da se ili značajan deo vanćelijskih bakterija u nekom trenutku inficira zarazom, ili da je AAC u stanju da poboljšaju unošenje vanćelijskih bakterija i na taj način povećavaju relativni udeo bakterija koje su unutarćelijskih gde ih efikasno ubija AAC.
[0267] Takođe je ispitivana efikasnost AAC u modelu intravenske infekcije. U ovom modelu, S. aureus preuzima se cirkuliranjem neutrofila ubrzo nakon infekcije, tako da se većina bakterija koja se nalaze u krvi povezana sa ćelijama domaćina u roku od nekoliko minuta nakon infekcije (Rogers, etal (1956) J. Exp. Med.
103:713-742). A/J miševi su inficirani 2x10<6>CFU MRSA intravenskom injekcijom, a zatim su tretirani sa 50 mg/Kg AAC intravenskom injekcijom 30 minuta nakon infekcije. U ovom modelu, primarno mesto infekcije je bubreg, a miševi razvijaju velike apscese koje mogu otkriti dva dana nakon infekcije i ne uspevaju da se očiste do 30 dana u odsustvu lečenja. Tretman sa 50 mg/Kg S4497-pipBOR AAC 102 očistio je infekciju kod svih testiranih miševa (Slika 8B).
[0268] Slika 8B prikazuje intravenski model infekcije u A/J miševima. Miševi su inficirani 2x10<6>CFU intravenskom injekcijom i tretirani sa 50 mg/Kg S4497 antitela, 50 mg/Kg S4497-pipBOR AAC 102 ili jednostavnom mešavinom od 50 mg/Kg S4497 antitela .5 mg/Kg slobodnog rifamicina. Tretmani su davani IV injekcijom 30 minuta nakon infekcije, a bubrezi su prikupljeni 4 dana posle infekcije. Siva isprekidana linija označava granicu detekcije za svaki organ. Kontrolne grupe lečene sa 50 mg/Kg samo antitela S4497, ili jednostavnom mešavinom od 50 mg/Kg antitela na S4497 plus 0.5 mg/Kg slobodnog rifamicina (ekvivalentna doza antibiotika prisutnog u 50 mg/Kg AAC) nisu bile efikasan.
[0269] Efikasnost AAC napravljena sa pipBOR i dimetil-pipBOR antibiotskim delovima poređena je in vivo u modelu intravenske infekcije kod A/J miševa. S4497-pipBOR AAC 102 (Slika 9A) ili S4497-dimetilpipBOR AAC 105 (Slika 9B) su primenjeni u različitim dozama u rasponu od 50 mg/Kg do 2 m/Kg 30 minuta nakon infekcije, a bubrezi su pregledani 4 dana nakon infekcije radi određivanja ukupnog opterećenja bakterija. Slika 9A prikazuje efikasnost pipBOR AAC 102 u modelu intravenske infekcije titracijom S4497-pipBOR AAC 102. Sedam nedelja stare ženke A/J miševa inficirani su 2x10<6>CFU MRSA (soj USA300) intravenskom injekcijom u repnu venu. Slika 9B prikazuje efikasnost diMetil-pipBOR AAC 105 u modelu intravenske infekcije titracijom S4497-dimetil-pipBOR AAC 105. Tretmani sa antitelom S4497, AAC 102 ili AAC 105 primenjeni su u naznačenim dozama 30 minuta nakon infekcije. Miševi su žrtvovani 4 dana nakon infekcije i ukupnim brojem preživelih bakterija po mišu (2 bubrega sakupljena) utvrđen je nanošenjem prevlake.
[0270] Oba AAC su bila efikasna u najvećoj dozi od 50 mg/Kg, međutim S4497-pipBOR AAC 102 bio je samo delimično efikasan u nižim dozama. S4497-dimetil-pipBOR AAC 105 dao je potpuni klirens bakterija u dozama većim od 10 mg/Kg. Naknadni eksperimenti pokazali su da su za dosledno uklanjanje bakterija potrebne doze veće od 15 mg/Kg. Slike 9A i 9B prikazuju tio-S4497-HC-A118C-MC-vc-PAB-dimetilpipBOR 105 AAC efikasniji od tio-S4497-HC-A118C-MC-vc-PAB-pipBOR 102 AAC u modelu intravenske infekcije koja ukazuje na efekat karbamatne (51) i dimetilpiperidilne (54) strukturne razlike između 102 i 105, respektivno.
[0271] Miševi su tretirani s AAC 30 minuta nakon infekcije. Da bi se bolja replikacija stanja verovatno pojavila kod pacijenata sa MRSA koji traže lečenje, utvrđeno je da li je AAC efikasan u uklanjanju utvrđene infekcije i povezivanju antibiotika sa anti-S. aureus antitelom pruža definitivnu prednost u odnosu na lečenje antibiotikom. U tom cilju, upoređena je efikasnost AAC sa ekvivalentnom dozom antibiotika dimetil-pipBOR.
[0272] Slika 9C prikazuje CB17.SCID miševe inficirane 2x10<7>CFU MRSA intravenskom injekcijom (protokol 12-2418). Dan nakon infekcije, miševi su tretirani sa 50 mg/Kg S4497 antitela, 50 mg/kg S4497 dimetil-pipBOR AAC 105 ili sa 0.5 mg/Kg dimetil-pipBOR antibiotika 7, ekvivalentne doze antibiotika koja se sadrži u 50 mg/Kg AAC). Miševi su žrtvovani 4 dana nakon infekcije i ukupnim brojem preživelih bakterija po mišu (2 bubrega sakupljena) utvrđen je nanošenjem prevlake. Tretman sa 50 mg/Kg S4497-dimetil-pipBOR AAC bio je očigledno efikasan kada se primenjuje 1 dan posle infekcije, dok samo tretman ekvivalentnom dozom dimetil-pipBOR nije uspeo da očisti infekciju.
LEČENJE SA AAC JE EFIKASNO U PRISUSTVU HUMANIH ANTITELA I SUPERIRONIJE JE U ODNOSU NA LEČENJE SA TRENUTNIM STANDARDOM NEGE (SOC) VANKOMICINOM
[0273] Antitelo na S4497 je klonirano iz B ćelija dobijenih od pacijenata zaraženih S. aureusom. To je izazvalo zabrinutost da normalan humani serum, ili serum prisutan kod pacijenata zaraženih MRSA, mogu da sadrže antitela protiv MRSA koja bi se nadmetala za vezivanje sa našim AAC. Da bi se rešio ovaj problem, testiran je humani serum dobijen od normalnih zdravih davalaca i panela pacijenata sa MRSA kako bi se procenio ukupni nivo antitela protiv MRSA koja prepoznaju isti antigen kao AAC. Izvršen je test zasnovan na ELISA upotrebi preparata ćelijskih zidova od MRSA. Da bi se ograničilo ne-antigensko vezivanje za preparate ćelijskog zida u ovim ispitivanjima, korišćen je soj MRSA koji ima nedostatak u genu za protein A. Protein A se vezuje za Fc region IgG antitela. Vezanje različitih uzoraka seruma divljeg tipa (WT) na MRSA koji su eksprimirali S4497 antigen (Slika 10A, WT) je ispitano nasuprot vezivanju na mutant MRSA soja TarM/TarS DKO (dupli nokaut) kome nedostaju šećerne modifikacije prepoznate u antitelu S4497. Slika 10A prikazuje prevalenciju anti-S. aureus antitela u ljudskom serumu. Pacijenti zaraženi S. aureusom ili normalna kontrola sadrže velike količine WTA specifičnih serumskih antitela iste specifičnosti kao anti-WTA S4497.
[0274] Standardna kriva je generisana korišćenjem monoklonskog antitela koje se dobro vezuje na isti antigen koji je prepoznat u S4497. Upoređivanjem nivoa vezivanja u uzorcima seruma sa signalom dobijenim iz antitela korišćenog za generisanje standardne krive, nivoa antitela protiv MRSA prisutnih u uzorcima seruma dobijenih od normalnih zdravih davalaca ili bolesnika sa MRSA, ili u ukupnim IgG preparatima izolovanim iz procenjen je normalan serum (Slika 10A). Normalni humani serum sadrži 10-15 mg/mL ukupnog IgG (Manz i dr.. (2005) Annu Rev. Immunol. 23:367). Analiza anti-MRSA reaktivnosti u različitim uzorcima seruma otkrila je da je do 300 µg/mL ovih antitela potencijalno reaktivno sa istim antigenom koji je prepoznao S4497 i zbog toga će se verovatno nadmetati za vezivanje sa AAC.
[0275] S4497 antitelo je korišćeno za generisanje AAC za svojstva koja uključuju veoma visoko vezivanje na MRSA (procenjeno je 50000 mesta vezivanja po bakteriji). Dovoljan broj AAC se može povezati sa MRSA čak i u prisustvu konkurentskih antitela koja se nalaze u ljudskom serumu. Da bi se ovo direktno testiralo, S4497-dimetil-pipBOR AAC u puferu dopunjenom sa 10 mg/mL humanog IgG (Slika 10B, IGIV) je titran i nivo unutarćelijskog ubijanja je meren u makrofagnom ispitivanju unutarćelijskog ubijanja.
[0276] Slika 10B prikazuje in vivo model infekcije koji pokazuje da je AAC efikasan u prisustvu fizioloških nivoa humanog IgG. Analiza makrofaga in vitro sa USA300 sojem MRSA pokazuje da je S4497-dimetilpipBOR AAC 105 efikasan u prisustvu 10 mg/mL humanog IgG. Američki soj MRSA je opsonizovan samo AAC ili AAC razređenim u 10 mg/mL humanog IgG tokom 1 sata na 37 °C uz mućkanje. Opsonizovane bakterije su dodavane direktno u mišji peritonealni makrofag i inkubirane su 2 sata da se omogući fagocitoza. Nakon infekcije, kulture makrofaga održavane su u potpunoj podlozi dopunjenom gentamicinom, a ukupan broj preživelih unutarćelijskih bakterija procenjen je 2 dana nakon infekcije. Ovi podaci otkrili su da iako je humani IgG inhibirao ubijanje AAC u nižim dozama, postignuto je odlično ubijanje primenom doza iznad 10 ug/mL, koncentracije antitela koja je lako dostižna in vivo. Normalni serum IgG može umanjiti funkcionalni efekat 105 AAC. Budući da maksimalna aktivnost unutarćelijskog ubijanja AAC makrofaga može zahtevati i visoko vezanje antigena i efikasnu interakciju sa FcRs (za opsonofagocitozu), postojeća antitela u serumu mogu se nadmetati za vezivanje na WTA, a odgovarajući formirani imuni kompleksi se takmiče za vezivanje na FcRs na makrofazima.
[0277] Da bi potvrdili da bi AAC bio efikasan u prisustvu kompetitivnih humanih antitela in vivo, model in vivo infekcije je modifikovan tako da generiše miševe koji izražavaju normalne nivoe humanog IgG u serumu.
CB17:SCID miševi kojima nedostaju i T ćelije i B ćelije i stoga nemaju antitela u serumu (Bosna & Carroll, (1991) Ann Rev Immunol. 9:323, rekonstituisano je sa 10 mg/mL humanog IgG svakodnevnim doziranjem visoko koncentrovanog humanog IgG (IGIV). Preliminarna ispitivanja su potvrdila da su ovi miševi, nazvani SCID:huIgG, zaista imali održavane nivoe od najmanje 10 mg/mL humanog IgG u serumu i da su ti miševi podložni infekciji MRSA u poređenju sa neobrađenim kontrolama. SCID:huIgG miševi su inficirani s MRSA i tretirani ili s antitelom S4497 ili sa S4497-dimetil-pipBOR AAC (50 mg/Kg) 1 dan nakon infekcije. Četiri dana nakon infekcije procenjeno je opterećenje bakterija u bubrezima (Sl.10C).
[0278] Slika 10C prikazuje kombinovane podatke iz 3 nezavisna eksperimenta koristeći 2 odvojena preparata tio-S4497-HC-A118C-MC-vc-PAB-dimetil-pipBOR AAC 105 ili 112. CB17.SCID miševi su rekonstituisani humanim IgG korišćenjem režima doziranja optimizovanog da daje konstantne nivoe od najmanje 10 mg/mL humanog IgG u serumu. Miševi su tretirani sa S4497 antitelom (50 mg/Kg), ili S4497-dimetil-pipBOR AAC (50 mg/Kg). Miševi tretirani sa AAC imali su smanjenje bakterijskog opterećenja veće od 4 log (učenikov ttest p=.0005). Bakterijsko opterećenje je u proseku preko 10000 puta niže kod miševa koji su tretirani S4497-dimetil-pipBOR AAC u poređenju sa miševima koji su tretirani kontrolom antitela S4497, što ukazuje da je AAC bio očigledno efikasan čak i u prisustvu visokog nivoa konkurentnog humanog anti-MRSA antitela.
[0279] Efikasnost AAC je upoređena sa onom lečenja vankomicinom, trenutnim standardom lečenja za MRSA infekcije. Slika 11A prikazuje in vivo model infekcije koji pokazuje da je AAC efikasniji od trenutnog standarda (SOC) antibiotika vankomicina kod miševa koji su rekonstituisani sa normalnim nivoom humanog IgG. CB17.SCID miševi su rekonstituisani humanim IgG korišćenjem režima doziranja optimizovanog da daje konstantne nivoe od najmanje 10 mg/mL humanog IgG u serumu. Miševi su tretirani antitelom S4497 (50 mg/Kg), vankomicinom (100 mg/Kg), S4497-dimetil-pipBOR AAC (50 mg/Kg, 112 ili AAC načinjenim sa izotipskim kontrolnim antitelom koje ne prepoznaje MRSA, tio-hu-anti gD 5B5-HC-A118C-MC-vc-PAB-dimetilpipBOR AAC 110 (50 mg/kg). Miševima koji su primali AAC data je jedna doza AAC, prvog dana posle infekcije, intravenskom injekcijom. Miševima koji su primili tretmane vankomicinom dodeljene su dva puta dnevno injekcije antibiotika intraperitonealnom injekcijom. Svi miševi su žrtvovani na 4. dan posle infekcije, a ukupan broj preživelih bakterija po mišu (2 bubrega sakupljena) određen je nanošenje prevlake.
[0280] Tretman vankomicinom je efikasan u lečenju MRSA infekcije u našem modelu intravenske infekcije kod mišića ako se lečenje započne 30 minuta nakon infekcije. Dva puta dnevno doziranje sa 100 mg/Kg vankomicina nije uspelo da očisti infekciju, a bio je u stanju da smanji opterećenje bakterija za oko 50 puta, kada je lečenje započeto više od jednog dana posle infekcije (Slika 11A). Zapanjujuće je da je tretman jednom dozom S4497-dimetil-pipBOR AAC 1 dan nakon infekcije uspeo da očisti infekciju kod većine miševa. Iznenađujuće, lečenje kontrolnim AAC-om izvršeno humanim IgG antitelom koje ne prepoznaje S. aureus (gD-AAC) imalo je neku efikasnost u ovom modelu. GD antitelo ne prepoznaje S. aureus kroz mesto vezivanja antigena, međutim antitelo se može vezati za protein A koji se nalazi na S. aureus.
[0281] Slika 11C prikazuje in vivo model infekcije koji pokazuje da je AAC, tio-S6078-HC A114C-LCWT-MC-vc-PAB-dimetilpipBOR 129 efikasniji od golog anti-WTA antitela S4497, prema istom režimu kao na Slici 11A, u miševi koji su rekonstituisani sa normalnim nivoima humanog IgG. CB17.SCID miševi su rekonstituisani humanim IgG korišćenjem režima doziranja optimizovanog da daje konstantne nivoe od najmanje 10 mg/mL humanog IgG u serumu. Miševi su tretirani antitelom S4497 (50 mg/Kg), ili tio-S6078-HC A114C-LCVT-MC-vc-PAB-dimetilpipBOR 129 AAC (50 mg/Kg).
[0282] FACS analiza pokazala je da bojenje sa visokim koncentracijama gD antitela na bakterije izolovane iz in vivo infekcije dovodi do niskog vezivanja na S. aureus u odnosu na vezivanje antitela anti-MRSA na MRSA izolovanih iz zaraženih bubrega (Slika 11B). Miševi su inficirani MRSA intravenskom injekcijom, a inficirani bubrezi su uklonjeni 3 dana nakon infekcije i homogenizovani. Anti-MRSA ili kontrolna antitela su obeležena sa Aleka-488 i testirana u opsegu koncentracija između 0.08 µg/mL i 50 µg/mL. Antitelo S4497 prepoznaje modifikaciju N-acetilglukozamina koja je povezana sa teihoinskom kiselinom zida (WTA) preko betaanomerne veze na ćelijskom zidu S. aureus. Antitelo na S7578 se vezuje za sličnu N-acetilglukozaminsku modifikaciju koja je pridružena WTA putem alfa-anomerne veze. RF1 antitelo je pozitivno kontrolno anti-MRSA antitela koje prepoznaje modifikacije šećera pronađene u porodici proteina usidrenih u ćelijskom zidu usidrenih proteina SDR koji se ponavljaju. GD antitelo je negativni kontrolni humani IgGl koji ne prepoznaje S. aureus. Iako je ukupni nivo vezivanja sa gD antitelom značajno niži od onog koji je dobijen antitelom na S4497 (procenjeno da je najmanje 30 puta niži prema FACS analizi, Slika 11B), ograničena efikasnost koja se vidi kod gD-AAC ukazuje da je čak i niski nivo vezivanja AAC na MRSA in vivo je dovoljan da se dobije efikasnost koja je izgledala ekvivalentna smanjenju CFU dobijenih vankomicinom.
[0283] Gornji podaci jasno pokazuju da je AAC u stanju da ubije unutarćelijsku MRSA i da su S4497-pipBOR i S4497 dimetil-pipBOR AAC efikasni u ograničavanju infekcije MRSA i in vitro i in vivo. AAC predmetnog pronalaska deluje ubijanjem bakterija u ćelijama sisara i na taj način pruža jedinstvenu terapiju koja je efikasnija u ubijanju populacija bakterija koje su rezistentne na lečenje vankomicinom.
[0284] Slika 20 pokazuje da pre tretman sa 50 mg/kg slobodnih antitela nije efikasan u modelu intravenske infekcije. Balb/c miševima je data jednostruka doza kontrolisanog sredstva (PBS) ili 50 mg/kg antitela intravenskom injekcijom 30 minuta pre infekcije sa 2x10<7>CFU USA300. Grupe za lečenje uključuju izotipsko kontrolno antitelo koje se ne vezuje za S. aureus (gD), antitelo usmereno protiv beta modifikacije teihoinske kiseline zida (4497) ili antitelo usmereno protiv alfa modifikacije teihoinske kiseline zida (7578). Kontrolni miševi su davani dva puta dnevno sa 110 mg/kg vankomicina intraperitonealnom injekcijom (Vanco). Svi miševi su žrtvovani na 4. dan posle infekcije, a ukupan broj preživelih bakterija u bubrezima (2 bubrega sakupljena) određen je nanošenje prevlake. Iako je prethodno lečenje vankomicinom uklonilo infekciju kod svih testiranih miševa, prethodno lečenje antitela usmerenim prema ćelijskom zidu S. aureus nije uticalo na bakterijsko opterećenje.
[0285] Slike 21 i 22 pokazuju da su AAC usmereni bilo na beta modifikaciju teihoinske kiseline zida ili alfa modifikaciju teihoinske kiseline zida efikasni u modelu intravenske infekcije korišćenjem miševa koji su rekonstituisani sa normalnim nivoima humanog IgG. CB17.SCID miševi su rekonstituisani humanim IgG korišćenjem režima doziranja optimizovanog da daje konstantne nivoe od najmanje 10 mg/mL humanog IgG u serumu i inficirani sa 2x10<7>CFU USA300 intravenskom injekcijom. Tretman je započet 1 dan nakon infekcije samo kontrolom pufera (PBS), 60 mg/kg beta-WTA AAC (136 AAC) ili 60 mg/kg alfa-WTA AAC (155 AAC). Miševi su žrtvovani 4. dana posle infekcije, a ukupnim brojem preživelih bakterija u bubrezima (dva bubrega sakupljena, Slika 21) i srcu (Slika 22) je određivan nanošenjem prevlake. Tretman beta-WTA AAC rezultirao je smanjenjem opterećenja bakterija u bubregu za 100000 puta u poređenju sa miševima koji su tretirani kontrolom nosača. Lečenje alfa-WTA AAC dovelo je do prosečnog smanjenja opterećenja bakterija u bubregu u 9000 puta.
[0286] Do danas ostaje neizvesno zašto su trenutno dostupni antibiotici često neefikasni u uništavanju unutarćelijskih zaliha bakterija. Antibiotici mogu da propadnu zato što ne dostignu dovoljne koncentracije unutar ćelija, bilo zato što ne uđu u fagolizosomalni odeljak u kome se nalaze unutarćelijske zalihe bakterija, ili zato što mogu biti podložne aktivnosti pumpi za odlivanje koje uklanjaju antibiotik iz ćelija sisara. Antibiotici mogu da se oštete od oštrih uslova koji se nalaze u fagolizosomu, uključujući nisku pH vrednost, redukciona sredstva i oksidaciona sredstva koja se posebno oslobađaju da ubiju bakteriju fagocitozu. Alternativno, antibiotici mogu da propadnu, jer bakterije regulišu odbrambene mehanizme ili se ne deli u fagolizosome i zbog toga su prolazno neosetljive na antibiotike. Relativna važnost ovih mehanizama rezistencije na antibiotike će se razlikovati za različite patogene i za svaki antibiotik. Antibiotska komponenta našeg AAC, pipBOR i dimetil-pipBOR je zaista jača od rifampicina pri ubijanju unutarćelijskog MRSA kada je testirana na slobodne antibiotike. Povezanost ovih antibiotika sa antitelom omogućava stvarno efikasno povećanje efikasnosti koje je očigledno in vivo (Slika 9C). U ovom slučaju, poboljšana efikasnost AAC u odnosu na sam antibiotik verovatno je posledica kombinacije njegove sposobnosti da opsonizuje bakterije i poboljšane farmakokinetike AAC. Većina besplatnih antibiotika brzo se uklanja in vivo i zahteva ih višekratno doziranje sa visokim koncentracijama antibiotika da bi se održale dovoljne koncentracije antibiotika u serumu. Suprotno tome, AAC imaju dugi polu-raspad u serumu zbog dela antitela u molekuli. Pošto AAC oslobađa antibiotik tek nakon vezivanja za S. aureus i transportuje se zajedno sa bakterijom u ograđeni prostor fagolizoma, oni koncentrišu male doze antibiotika posebno u niši u kojoj većina antibiotika ne uspe. Stoga, pored ciljanja zaštićenih rezervoara unutarćelijskih bakterija, AAC može olakšati upotrebu snažnijih antibiotika koji se mogu pokazati previše toksičnim za upotrebu kao pojedinačno sredstvo ograničavanjem oslobađanja antibiotika tamo gde je najpotrebnije.
[0287] Slike 35 i 36 prikazuju rezultate ispitivanja in vitro makrofaga za tio-S6078 AAC. S. aureus (USA300 NRS384) je inkubiran nekonjugovanim antitelom S6078 pri 50 u/mL i AAC na 50 µg/mL, 5 µg/mL, .5 µg/mL ili 0.05 µg/mL 1 sat da bi se omogućilo vezivanje antitela na bakterije. Nastale opsonizovane bakterije su hranjene makrofagima od miševa i inkubirane na 37°C da se omogući fagocitoza. Nakon 2 sata, uklonjena je infekciona mešavina i zamenjena je normalnom podlogom za rast dodatkom 50 µg/mL gentamicina da se unište preostale vanćelijske bakterije. Ukupan broj preživelih intracelularnih bakterija određen je 2 dana kasnije postavljanjem serijskih razblaživanja lizata makrofaga na ploče sa triptičnim sojinim agarom. Na Slici 35, tio-S6078.v4.HC-VT, LC-Cys-MC-vc-PAB-(dimetilpipBOR) AAC je bio efikasan u ubijanju unutarćelijskih bakterija u dozama iznad ili iznad 0.5 µg/mL sa opterećenjem antibioticima od 2.0 ( AAC-173) ili 3.9 (AAC-171) dimetilpipBOR antibiotika (LA-54) po tio-S6078 antitelu. Na Slici 36, tio-S6078.v4.HC-VT, LC-Cys-MC-vc-PAB-(piperazBOR) AAC je bio efikasan u ubijanju unutarćelijskih bakterija u dozama iznad ili iznad 0.5 µg/mL sa opterećenjem antibioticima od 1.8 ( AAC-174) ili 3.9 (AAC-172) piperazBOR antibiotika (LA-65) po tio-S6078 antitelu.
[0288] Slike 37 i 38 pokazuju rezultate in vivo efikasnosti tio-S6078 AAC u modelu intravenske infekcije kod miševa. CB17.SCID miševi su rekonstituisani humanim IgG korišćenjem režima doziranja optimizovanog da daje konstantne nivoe od najmanje 10 mg/mL humanog IgG u serumu. Miševi su zaraženi sa USA300 i tretirani sa kontrolnim nosačem (PBS), tio-S6078.v4.HC-VT, LC-Cys-MC-vc-PAB- (dimetilpipBOR) AAC sa opterećenjem antibioticima od 2,0 (AAC-173) ili 3.9 (AAC-171) dimetilpipBOR antibioticima (LA-54) po tio-S6078 antitelu (Slika 37) i tio-S6078.v4.HC-VT, LC-Cys-MC-vc-PAB- (piperazBOR) sa punjenjem antibioticima od 1.8 (AAC-174) ili 3.9 (AAC-172) piperazBOR antibiotika (LA-65) po tio-S6078 antitelu (Slika 38). Miševima je data jedna doza AAC prvog dana posle infekcije intravenskom injekcijom i žrtvovani su 4. dana nakon infekcije. Ukupan broj preživelih bakterija u 2 bubrega određen je nanošenjem prevlake. Tretman sa AAC koji sadrži niže opterećenje antibioticima smanjuje opterećenje bakterija za približno 1000 puta, a lečenje sa AAC koji sadrži veće opterećenje antibioticima smanjuje opterećenje bakterija za više od 10 000 puta.
STAPHOPAIN B DELJIVI VEZNICI ZA KONJUGATE ANTITELA-ANTIBIOTIKA
[0289] Ovde je opisan veznik koji se može podeliti proteazom, a podeljeni je stafopainom B, endopeptidazom iz sekrecije S. aureus. Da bi se konstruisao veznik odsečen specifično bakterijom Staphylococcus aureus, aktivnost proteaze supernatanta kulture S. aureus opisana je pomoću peptidne biblioteke FRET. Sa ovog ekrana identifikovana je jedinstvena specifičnost supstrata. Koristeći ovaj supstrat, enzim odgovoran za aktivnost je prečišćen od supernatanta kulture i identifikovan kao stafopain B. Na osnovu ove identifikacije generisan je veznik optimizovan za stafopain B i povezan sa piperazino-rifamicinom:
[0290] Piperazino-rifamicin je moćan antibiotik sličan rifalazilu. Rezultirajući AAC pokazao je efikasnost u in vitro i in vivo modelima MRSA infekcije, pružajući novi mehanizam za ciljanje MRSA infekcija. Stafopain B je izlučena cisteinska proteaza iz porodice papaina, endopeptidaza (CAS Reg. No. 347841-89-8, Sigma-Aldrich #S3951, Filipek i dr. (2005) J. Biol. Chem. 280 (15): 14669-74) i razvio se tako da ima jedinstvenu specifičnost supstrata, preferirajući glomazne aromatične bočne lance u položaju P2. Ekspresija stafopaina B kontroliše agr (ili pomoćni regulator gena) kvorum senzorski sistem (Janzon, L. i S. Arvidson (1990) The EMBO journal 9(5): 1391-1399) kao deo proteolitičke kaskade stafilokoka (SCP). Agr modulira ekspresiju izlučenih proteaza i drugih faktora virulencije S. aureus uključujući aureolizin, V8 i stafopain A (Shaw, L., E. Golonka, i dr.. (2004) Microbiology 150(Pt 1):217-228). Stafopain B je predstavljen kao moćan faktor virulencije zbog svoje sposobnosti da razgrađuje vezivno tkivo domaćina i povećava nekoliko proteina imunološkog sistema (Imamura, T., S. Tanase, i dr. (2005) Journal of experimental medicine 201(10): 1669-1676; Potempa, J., A. Dubin, i dr.. (1988) Journal of biological chemistry 263(6): 2664-2667; Ohbayashi, T., A. Irie, i dr.. (2011) Microbiology 157(Pt 3):786-792; Smagur, J., K. Guzik, i dr. (2009); Biological chemistry 390(4):361-371; Smagur, J., K. Guzik, i dr. (2009); Journal of innate immunity 1(2): 98-108; Kulig, P., B. A. Zabel, i dr. (2007); Journal of immunology 178(6): 3713-3720). Uloga stafopaina B kao važnog faktora virulencije čini ga atraktivnom metom za oslobađanje antibiotika posredovanog proteazom.
[0291] Identifikacija supstrata podeljeni proteazama Staphylococcus aureus:
Za identifikaciju supstrata koji su lako podeljeni endopeptidazama S. aureus, supernatant iz kulture preko noći Wood46 soja S. aureus inkubiran je sa komercijalno dostupnom bibliotekom peptida FRET. Wood46 soj ima konstitutivno aktivan lokus agr, tako da Wood46 soj pokazuje pojačanu ekspresiju proteaze u poređenju s divljim tipom. Biblioteka peptida FRET, Biblioteka za brzo dobijanje endopeptidaze ili PepSets ™ REPLi
1
(Mimotopes, Victoria, Australija), sastoji se od 512 udubljenja sa 8 unutrašnjih ugašenih fluorogenih peptida po udubljenju u formatu ploče sa 96 udubljenja. Peptidi fluoresciraju nakon deljenja omogućujući praćenje proteolitičke aktivnosti u realnom vremenu. Svaki peptid ima tripeptidno varijabilno bočno jezgro sa nizom glicinskih ostataka sa obe strane i dodatna dva lizinska ostatka na C-kraju za rastvorljivost. Supernatant iz Wood46 kulture je dodat u biblioteku i ploče su inkubirane preko noći na 37°C. Udubljenja koja pokazuju fluorescenciju veće od 15 puta (12 od 512 udubljenja ukupno) analizirana su pomoću LC-MS (Agilent Q-TOF) da bi se odredili produkti deljenja. Mesta deljenja rangirana su na osnovu učestalosti (Tabela 4). Među vrhovima pogodaka, primećen je obrazac specifičnosti supstrata, posebno prednost za glomazne hidrofobne bočne lance Phe i Tyr u položaju P2.
Tabela 4. Aminokiselinske postavke REPLi sekvence podeljene Wood46 izlučenim proteazama. Obilje na svakoj poziciji (%)
[0292] Obilje na svakoj poziciji aminokiselinskih ostataka prisutnih u FRET peptidima udubljenja koji su pokazali najveći porast fluorescencije. REPLi peptidi sadrže sekvencu MCA-Gly-Gly-Gly-Xaa-Yaa-Zaa-Gly-Gly-DPA-Lys-Lys (SEQ ID NO:132), gde Xaa, Yaa, i Zaa variraju. Ostaci glicina predstavljeni su u tabeli kako bi predstavili Gly ostatke koji obrubljuju promenljivo jezgro. Iako su Gly ostaci najzastupljeniji u nekoliko položaja, oni pružaju malo uvida u specifičnost supstrata. Prilikom dizajniranja veznika, prednost je data aminokiselinama iz promenljivog jezgra. Aminokiseline koje nisu bile u nijednom od najboljih hitova izostavljene su iz tabele.
[0293] Dizajn i konjugacija FRET supstrata podeljenog MRSA proteazom in vitro:
Peptid je dizajniran i sintetizovan koristeći najčešće naslage u deljivim peptidima sa REPLi ekrana koristeći specifične informacije za PI, P2 i P3. Peptid je imao GGAFAGGG sekvencu (SEQ ID NO:126) sa deljenjem očekivanim između GGAFA (SEQ ID NO:131) i GGG. Peptid je sintetizovan korišćenjem sinteze na čvrstoj fazi, koja uključuje fluorescentne boje, tetrametilrodamin (TAMRA) i fluorescein kao FRET par (Slika 26) sa maleimido-propionskom kiselinom koja je dodata u N-kraj da bi se omogućila konjugacija sa cisteinskim ostacima antitela. Dobijeni mal-FRET-peptid, maleimido-propionski (MP)-Lys(TAMRA)-Gly-Gly-Ala-Phe-Ala-Gly-Gly-Gly-Lys(fluorescein) ("peptid jezgra" obelodanjen kao SEQ ID NO:125), konjugovan je na antitelo tioMab dizajnirano cisteinom, tio-S4497. Mal-FRET-peptid je takođe konjugovan sa cisteinkonstruisanim anti-Her2 tioMab trastuzumabom, nevezujućom kontrolom.
[0294] Tio-S4497-MP-K(Tamra)GGAFAGGGK(Fluorescein) ("peptid jezgra" obelodanjen kao SEQ ID NO:125) FRET konjugat i neobavezujući kontrolni FRET konjugat, tio-trastuzumab-MP-K(Tamra)GGAFAGGGK (fluorescein) ("peptid jezgra" obelodanjen kao SEQ ID NO:125), inkubirane su sa kulturama logaritma faze Wood46 (Slika 28) i divljim tipom, USA300 (slika 29), pri gustini ćelija od 10<8>ćelija/ml i 10<7>ćelija/ml u triptičinom soju (TSB). Konačna koncentracija MP-Lys(TAMRA)-Gly-Gly-Ala-Phe-Ala-Gly-Gly-Gly-Lys(fluorescein) ("peptida jezgra" obelodanjen kao SEQ ID NO:125) za sva udubljenja je 2µM. Fluorescencija je tokom vremena praćena na 37 °C, uzbuđenost λ495nm/emisija λ518nm. Primećeno je povećanje fluorescencije kod konjugata 4497-mal-FRET-peptida u Wood46 i USA300, što ukazuje da se FRET peptid deli proteazom S. aureus i da je proteaza prisutna u oba soja. Jedinica za povezivanje MP-K(Tamra)GGAFAGGGK (fluorescein) ("peptid jezgra" obelodanjen kao SEQ ID NO:125) se deli i u Wood46 i u USA300 kada se konjuguje sa antitelom koje veže S. aureus. Validacija deljenja ovog modela veznika u USA300 bila je kritična zbog njegove važnosti za klinički soj MRSA kojem bi ciljao potencijalni terapeutski
2
antitelo-antibiotički konjugat (AAC). Tio-S4497-MP-K(Tamra)GGAFAGGGK(Fluorescein) ("peptid jezgra" obelodanjen kao SEQ ID NO:125) konjugat FRET pokazuje porast fluorescencije u oba soja, što ukazuje da je veznik deljen proteazom S. aureus i da je proteaza prisutna u klinički relevantnom soju MRSA, USA300. Gustina ćelije utiče na brzinu deljenja, pri čemu se deljenje događa ranije u kulturama veće ćelijske gustine. Neobavezujući kontrolni tio-trastuzumab-MP-K(Tamra)GGAFAGGGK(fluorescein) ("peptid jezgra" obelodanjen kao SEQ ID NO:125) konjugat nije pokazao porast fluorescencije u bilo kom ispitivanom stanju.
[0295] Na osnovu podeljenog supstrata iz ispitivanja zasnovanih na ćeliji, pripremljeno je međujedinjenje veznik-antibiotik LA-59 (Tabela 2) i konjugovan na antitela da bi se formirao teški lanac protiv MRSA, cistein konstruisan tio-S4497 (AAC-113) i tio-S4462 (AAC-114) i tio-trastuzumab lakog lanca anti-HER2 (AAC-115) iz Tabele 3. GGAFAGGG (SEQ ID NO:126) povezani AAC pokazali su bolje stope deljenja od FRET-peptida kada se inkubiraju koncentrovanim supernatantom iz Wood46 kulture preko noći, što ukazuje da je veznik-antibiotik bolji supstrat za nepoznatu proteazu od interesa. Do deljenja je došlo na očekivanom mestu između alanina i glicina u GGAFAGGG-vezanom ("peptid jezgra" obelodanjen kao SEQ ID NO:126) AAC (AAC-113, AAC-114, AAC-115). Ovaj veznik-antibiotik (LA-59) nije optimizovani sistem za isporuku antibiotika, jer se nakon deljenja oslobađa GGG-rifamicin, za razliku od slobodnog rifamicina. Iako terapeutski potencijal ovog vezujućeg antibiotika može biti neizvestan, njegova sposobnost da se efikasno podeli proteazom čini ga korisnim jedinjenjem za prepoznavanje frakcija koje sadrže aktivnu proteazu od interesa. Međujedinjenje veznik-antibiotika LA-59 je konjugovan sa Fab delom tio-S4497 antitela (Scheer, J. M., W. Sandoval, i dr.. (2012). PloS one 7(12): e51817). Fab antitela koja su projektovana cisteinom, "tioFABs", imaju jedno reaktivno cistein koji omogućava konjugaciju jednog tiol reaktivnog jedinjenja za specifičnu lokaciju. tioFAB S-4497 je reagovao sa trostrukim molarnim viškom LA-59 nad tioFAB tokom 1 sata u 50mM TRIS pH 7.5, 150mM NaCl, na sobnoj temperaturi. Višak LA-59 je odvojen od AAC dijafiltracijom u PBS. Rezultat konjugata, tioFAB S4497-MC-GGAFAGGG-(pipBOR) ("peptid jezgra" obelodanjen kao SEQ ID NO:126) (Slika 27), korišćeno je kao jedinjenje alata za identifikaciju aktivnih frakcija, sa deljenjem veznika otkrivenim LC-MS analizom.
[0296] Optimizacija veziva za efikasno cepanje stafopainom B:
Međujedinjenje veznik-antibiotik LA-59, MC-GGAFAGGG- (pipBOR) („peptid jezgra“ obelodanjen kao SEQ ID NO:126), ima ostatke supstrata optimizovane za položaje PI, P2 i P3. Koristeći rezultate sa REPLi ekrana dizajnirana su i sintetizovana su dva nova veznika koji sadrže preferencijal za ostatak za P4 (Slika 30). Maleimido-propionski-Leu-Ala-Phe-Ala-Ala ("peptid jezgra" obelodanjen kao SEQ ID NO:136) i maleimidopropionski-Leu-Ala-Phe-Gli-Ala ("peptid jezgra" obelodanjen kao SEQ ID NO:135) sintetizovani su korišćenjem sinteze u čvrstoj fazi. Izoleucin i leucin su bili najčešći ostaci P4 na REPLi ekranu (zanemarujući glicin). Samo je jedan ostatak, Leucin, izabran da ograniči broj sintetizovanih veznika. Ala i Gly su naizmenično postavljeni u položaju P1 kako bi ispitali uticaj na deljivost. Takođe je uključen ostatak u P1', Ala. QSY®7 (ksantilijum, 9-[2-[[4-[[(2,5-diokso-1-pirolidinil)oksi]karbonil]-1-piperidinil]sulfonil]fenil]-3,6-bis(metilfenilamino)-NHS ester, hlorid, CAS Reg. br.304014-12-8, Life Technologies) dodat je na C-kraj oba veznika da bi delovao kao antibiotski surogat (Slika 30). Uključivanjem QY®7 omogućeno je procenjivanje deljivosti ovih veznika bez trošenja skupih i napornih antibiotika.
[0297] Eksperimentalni mal-peptidni-QY7 veznici su konjugovani sa THIOFAB S4497 da bi se procenila deljivost ovih veznika. Konjugacije su izvedene kao što je prethodno opisano. Rezultirajući konjugati THIOFAB S4497 veznik-QY7 procenjeni su na deljenje pomoću stafopaina B, stafopaina A i humanog katepsina B pri pH 7.2 (Tabela 5). Poput stafopaina B, i stafopain A je izlučena cisteinska proteaza S. aureus iz porodice proteaza iz porodice papaina. Strukturno je sličan stafopainu B, ali ima širu specifičnost supstrata (Filipek, R., M. Rzychon, i dr.. (2003). The Journal of biological chemistry 278(42): 40959-40966). Katepsin B, lizosomska proteaza cisteina sisara, takođe je član endopeptidaze porodice papaina. Smatra se da cepa valincitrulinske veze koje se koriste u drugim AAC veznicima opisanim u ovom patentu.
Tabela 5. Deljenje optimizovanih veznika stafopainom i ljudskim katepsinom B
[0298] Tabela 5 prikazuje podatke iz cepanja optimizovanih veznika konjugiranih na tioFAB stafopainom A, stafopainom B i katepsinom B. Konačni veznik-antibiotik, MP-LAFG-piperazino-rifamicin ("peptid jezgra" obelodanjen kao SEQ ID NO:128) efikasno se dele sve tri proteaze. Deljenje stafopaina rezultira slobodnim oslobađanjem rifamicina. Deljenje katepsinom B oslobađa Phe-Gly-piperazino-rifamicin (Primer 26).
[0299] Dizajn i konjugacija veznika za deljenje stafopaina B koji oslobađa besplatni antibiotik:
Iz ispitivanja deljenja testiranih eksperimentalnih veznika, mal-LAFGA ("peptid jezgra" obelodanjen kao SEQ ID NO:135) izabran je za spajanje antibiotika. Daljnja optimizacija ovog veznika bila je potrebna da bi se postiglo slobodno oslobađanje antibiotika nakon proteolitičkog deljenja. Da bi se ovo postiglo, Ala u P1' je zamenjen p-aminobenzilom (PAB) ili p-aminobenziloksikarbonilom (PABC). Piperazino-rifamicin je dodat na C-kraj ovog veznika kako bi se kompletiralo međujedinjenje veznik-antibiotik LA-88 MC-LAFG-PAB-(dimetilamino-3-piroloBOR) („peptid jezgra“ obelodanjen kao SEQ ID NO:128) i LA-104, MP-LAFG-PABC-(piperazinoBOR) ("peptid jezgra" obelodanjen kao SEQ ID NO:128). Nakon deljenja posle Gly u položaju P1, PAB i PABC grupe su dizajnirane da se samo-imoliraju, oslobađajući slobodni antibiotik. LA-88 je konjugovan da formira tio-S4497-v8-LCV205C-MC-LAFG-PAB-(dimetilamino-3-piroloBOR) AAC-163 ("peptid jezgra" obelodanjen kao SEQ ID NO:128) (Tabela 3). LA-104 je konjugovan da formira AAC-193, AAC-215 i AAC-222. Testovi deljenja AAC 193 sa stafopainom A, stafopainom B i katepsinom B izvedeni su pri pH 7.2 i pH 5. Ove pH vrednosti su izabrane ili za mimičnu plazmu (pH 7.2) ili za okolinu fagolizoma (pH 5). Stafopain B je postigao 100% deljenje i kod pH 5 i 7.2. Stafopain A je pokazao 100% deljenje pri pH5 i 64% deljenje pri pH 7.2.
[0300] Supstitucija PABC sa Ala u P1' grupi promenila je lokaciju na kojoj katepsin B deli veznik. Posle deljenja katepsinom B, Phe-Gly-PABC-(piperazinoBOR) je oslobođen. Kao terapijsko, potencijalno deljenje ovog veznika katepsinom B najverovatnije će se dogoditi u lizosomalnom delu makrofaga. Pod ovim okolnostima, druge proteaze, uključujući stafopain B, mogu dalje preraditi FG-PABC-piperazino-rifamicin da bi se oslobodio slobodni antibiotik.
[0301] Međujedinjenje veznik-antibiotika, MP-LAFG-PABC-(piperazinoBOR) („peptid jezgra“ obelodanjen kao SEQ ID NO:128) LA-104 je konjugovan sa tioMAB S4497 radi procene in vitro i in vivo efikasnosti rezultirajućih AAC-a AAC-193, AAC-215, AAC-222. Dva kontrolna konjugata su takođe napravljena konjugacijom LA-104 u tioMAB anti-Her2 i tioMAB anti-gD, obe izotipske kontrole. Laki lanac povezan, tioMAB 4497 MP-LAFG-PABC-piperazino-rifamicinski konjugat ("peptid jezgra" obelodanjen kao SEQ ID NO:128) AAC-215 je imao odnos leka prema antitelu (DAR) 1.6, kao i tioMAB anti-gD kontrolni konjugat. ThioMAB anti-Her2 mal-LAFG-PABC-piperazino-rifamicin ("peptid jezgra" obelodanjen kao SEQ ID NO:128) konjugat ima DAR od 1.5.
[0302] S. aureus supernatant kulture ekranizovan je pomoću biblioteke FRET peptida da bi se identifikovali supstrati lako deljivi pomoću izlučenih proteaza. Rezultati ovog skrininga pokazali su da se velika većina izmerenih proteaznih aktivnosti može pripisati jednoj izlučenoj cisteinskoj proteazi S. aureus, stafopainu B. Peptidni veznici dizajnirani za deljenje stafopainom B su optimizovane i identifikovan je efikasno deljivi supstrat koji oslobađa slobodni antibiotik. Rezultirajući veznik se takođe odvaja stafopainom A proteus S. aureus i katepsinom B proteaze čoveka, obe cisteinske proteaze.
[0303] Kada se konjuguje sa antitelom koje vezuje S. aureus, rezultirajući AAC pokazuje efikasnost i in vitro i in vivo. Endogena endopeptidaza MRSA pruža mehanizam za ciljanje MRSA infekcije i oslobađanje korisnog opterećenja na specifičan način. Sposobnost deljenja ovog veznika pomoću izlučenih proteaza S. aureus omogućava ciljanje MRSA prisutnog i u ljudskim neutrofilima, kao i vanćelijski u plazmi/tkivu domaćina.
4
Ovo dvostruko ciljanje može omogućiti oslobađanje velike koncentracije antibiotika i na unutar- i vanćelijskim mestima infekcije.
[0304] Ekspresija stafopaina A i B je regulisana u ljudskim neutrofilima i smatra se da su važni faktori virulencije (Burlak, C., i dr.. (2007) Cellular microbiology 9(5):1172-1190), čineći ih atraktivnim metama za oslobađanje antibiotika posredovanog proteazom. Ljudski katepsin B takođe odstranjuje veznik, predstavljajući alternativni put oslobađanja. Posmatrana efikasnost AAC verovatno je rezultat višestrukih proteaza, kako od S. aureus, tako i od domaćina, koji su uključeni u oslobađanje ostataka antibiotika ili delova antibiotika. Serumski-stabilan veznik koji se deli izborom proteaza pruža mehanizam oslobađanja koji može nadmašiti mutacije rezistentnosti bakterije.
POSTUPCI LEČANJA I SPREČAVANJA INFEKCIJA SA ANTIBODIČNO-ANTIBIOTIČKIM KONJUGATIMA
[0305] AAC predmetnog pronalaska su korisni kao antimikrobna sredstva efikasna protiv mnogih humanih i veterinarskih gram pozitivnih bakterija, uključujući Staphylococci, na primer S. aureus, S. saprophyticus i S. simulans; Listeria, na primer Listeria monocytogenes; Enterococci, na primer E. faecalis; Streptococci, na primer S. pneumoniae; Clostridium, na primer C. difficile.
[0306] Trajna bakteremija može biti rezultat internalizacije u ćelije domaćina. Iako nisu u potpunosti shvaćeni, internalizovani patogeni mogu izbeći imunološko prepoznavanje preživljavanjem unutar ćelija domaćina. Takvi organizmi uključuju S. aureus, Salmonella (npr., S. typi, S. choreraesuis i S. enteritidis), Legionella (npr., L. pneumophila), Listeria (npr., L. monocytogenes), Brucella (npr., B. abortus, B. melitensis, B. suis), Chlamydia (C. pneumoniea, C. trachomati), Rickettsia spp., Shigella (npr., S. flexneri), i mycobacteria.
[0307] Nakon ulaska u krvotok, S. aureus može izazvati metastatsku infekciju u gotovo svim organima. Sekundarne infekcije javljaju se u otprilike jednoj trećini slučajeva pre početka terapije (Fowler i dr.., (2003) Arch. Intern. Med. 163:2066-2072), pa čak i kod 10% pacijenata posle početka terapije (Khatib i dr.., (2006) Scand. J. Infect. Dis., 38:7-14). Karakteristike infekcije su veliki rezervoari gnoja, uništavanje tkiva i stvaranje apscesa (koji svi sadrže velike količine neutrofila). Dok samo oko 5% pacijenata razvije komplikacije ako se bakteremija ugasi u roku od 48 sati, nivoi narastu na 40%, ako bakterijaemija potraje duže od tri dana.
[0308] Iako se S. aureus obično smatra vanćelijskim patogenom koji luči toksine, postoje dokazi da on može preživeti u endotelnim ćelijama, keratinocitima, fibroblastima i osteoklastima (Alexander i dr., (2001) Appl. Microbiol. Biotechnol.56:361-366; Garzoni i dr., (2009) Trends Microbiol.17:59-65). Neutrofili i makrofagi su ključne komponente imunološkog odgovora domaćina na bakterijsku infekciju. Ove ćelije internaliziraju S. aureus fagocitozom, koja može biti pojačana antitelom, komplementom ili lektinom domaćina, kao što je protein koji veže manozu, a koji se istovremeno može vezati za patogene i neutrofile, makrofage i druge profesionalne fagocite. Kao što je ranije spomenuto, S. aureus ne samo da preživljava u lizosomalnom okruženju, već ga zapravo može iskoristiti kao mehanizam za razvijanje upornosti kod domaćina.
[0309] Konjugati antitela i antibiotika (AAC) predmetnog pronalaska imaju značajne terapeutske prednosti za lečenje unutarćelijskih patogena, uključujući one koji borave u fagolizomima. U jednom otelotvorenju, patogen je internalizovan u ćelije leukocita, a unutarćelijska komponenta je fagolizom. U netaknutom AAC, promenljivi region antitela se vezuje za antigen ćelijske površine na bakteriji (opsonizacija). Da se ne ograniči nijednom teorijom, u jednom mehanizmu, komponentom antitela AAC vezivanja na površinu ćelije bakterija, fagociti privlače bakteriju. Fc deo antitela se vezuje za Fc receptor na fagocitu, olakšavajući fagocitozu. Nakon što se kompleks AAC-bakterija fagocitozira, nakon spajanja sa lizosomom, AAC veznik se deli izlaganjem fagolizomalnim enzimima, oslobađajući aktivni antibiotik. Zbog ograničenog prostora i relativno visoke lokalne koncentracije Abx (oko 104 po bakteriji), rezultat je da fagolizom više ne podržava preživljavanje unutarćelijskog patogena (Slika 5). Pošto je AAC u suštini neaktivan prolek, terapeutski indeks antibiotika može se proširiti u odnosu na slobodni (nekonjugovani) oblik. Antitelo obezbeđuje ciljanje specifično za patogene, dok se deljivi veznik deli pod uslovima specifičnim za unutarćelijsku lokaciju patogena. Efekat može biti kako direktno na opsonizovani patogen, tako i na druge patogene koji su lokalizovani u fagolizomu. U specifičnom aspektu, patogen je S. aureus.
[0310] Tolerancija na antibiotike je sposobnost patogena koji uzrokuje bolest da odoli ubijanju antibioticima i drugim antimikrobnim lekovima i mehanički se razlikuje od rezistencije na više lekova (Lewis K (2007). "Persister cells, dormancy and infectious disease". Nature Reviews Microbiology 5 (1): 48-56. doi:10.1038/nrmicro1557). Umesto toga, ovaj oblik tolerancije prouzrokuje mala pod-populacija mikrobnih ćelija koja se naziva perzistenti (Bigger JW (14 October 1944). "Treatment of staphylococcal infections with penicillin by intermittent sterilization". Lancet 244 (6320):497-500). Ove ćelije nisu klasične rezistentne u klasičnom smislu, već su uspavane ćelije koje su tolerantne na lečenje antibioticima koje mogu ubiti njihove genetski identične sestre. To tolerancija na antibiotike je indukovana fiziološkim stanjem koje se ne deli ili je izuzetno sporo. Kada antimikrobnim lečenjem ne uspeju da iskorene ove trajne ćelije, one postaju rezervoar za ponavljajuće hronične infekcije. Konjugati antitela i antibiotika predmetnog pronalaska poseduju jedinstveno svojstvo da uništavaju ove trajne ćelije i suzbijaju nastajanje bakterijske populacije tolerantne na više lekova.
[0311] U drugom otelotvorenju, AAC pronalaska se može koristiti za lečenje infekcije bez obzira na unutarćelijski deo u kojem patogen preživljava.
[0312] U drugom otelotvorenju, AAC se takođe mogu koristiti za ciljanje bakterija u planktonskom ili biofilmskom obliku (primer: S. aureus, K. pneumonija, E. coli, A. barmani, P. aeruginosa i Enterobacteriaceae) opsonizacijom posredovanom antitelom, što dovodi do internalizacije profesionalnih fagocita. Kada se fagozom spoji sa lizosomom, dovoljno visoke koncentracije slobodnog antibiotika će se osloboditi iz AAC u kiselom ili proteolitičkom okruženju fagolizoma da ubiju fagocitozni patogen.
[0313] Postupci lečenja infekcije antitelom-antibiotskim konjugatima (AAC) predmetnog pronalaska uključuju lečenje bakterijskim infekcijama pluća, kao što su S. aureus pneumonija ili tuberkulozna infekcija, bakterijske okularne infekcije, poput trahoma i konjuktivitisa, infekcije srca, mozga ili kože, infekcije gastrointestinalnog trakta, poput dijareje kod putnika, osteomijelitisa, ulceroznog kolitisa, sindroma iritabilnog creva (IBS), Kronove bolesti i IBD (inflamatorne bolesti creva) uopšte, bakterijskog meningitisa i apscesa u bilo kojem organu, kao što su mišići, jetra i dr. meninge ili pluća. Bakterijske infekcije mogu biti u drugim delovima tela poput urinarnog trakta, krvotoka, rane ili mesta umetanja katetera. AAC prema pronalasku su korisni za teško lečene infekcije koje uključuju biofilmove, implantate ili utočišta (npr., osteomijelitis i infekcije protetskih zglobova) i infekcije visokog smrtnosti, poput bolnice koja je stekla pneumoniju i bakteremiju. Ranjive grupe pacijenata koje se mogu lečiti za sprečavanje infekcije stafilokoknim aureusom uključuju hemodijalizu, pacijente sa kompromisom imunog sistema, pacijente u odeljenjima intenzivne nege i određene hirurške pacijente. U drugom aspektu, pronalazak pruža postupak ubijanja, lečenja ili sprečavanja mikrobnih infekcija kod životinja, poželjno sisara, a najpoželjnije čoveka, koja uključuje davanje životinji AAC ili farmaceutske formulacije AAC predmetnog pronalaska. Pronalazak dalje obuhvata lečenje ili sprečavanje bolesti povezanih ili koje oportunistički proizilaze iz takvih mikrobnih infekcija. Takvi postupci lečenja ili prevencije mogu da uključuju oralnu, topikalnu, intravensku, intramuskularnu ili subkutanu primenu sastava predmetnog pronalaska. Na primer, pre operacije ili ubacivanja IV katetera, u negu ICU, u transplantacijskoj medicini, sa hemoterapijom ili posle hemoterapije, ili drugim aktivnostima koje nose visoki rizik od infekcije, AAC pronalaska se može primeniti da spreči nastanak ili širenje infekcije.
[0314] Bakterijska infekcija može biti izazvana bakterijama aktivnog i neaktivnog oblika, a AAC se daje u količini i u trajanju dovoljnom za lečenje aktivnog i neaktivnog, latentnog oblika bakterijske infekcije, čije trajanje je duže od potreban je za lečenje aktivnog oblika bakterijske infekcije.
[0315] Analizom različitih Gram+ bakterija utvrđeno je da se WTA beta eksprimira na svim S. aureus, uključujući sojeve MRSA i MSSA, kao i ne-aureus Staph sojeve poput S. saprophyticus i S. simulansa. WTA alfa (Alfa-GLcNAc ribitol WTA) prisutan je na većini, ali ne i na svim S. aureus, a takođe je prisutan i na Listeria monocitogenima. WTA nije prisutan u Gram-bakterijama. Prema tome, jedan aspekt predmetnog pronalaska je postupak lečenja pacijenta inficiranog S. aureus ili S. saprophyticus ili S. simulama davanjem terapeutski efikasne količine anti-WTA beta-AAC pronalaska. Sledeći aspekt predmetnog pronalaska je postupak lečenja pacijenta inficiranog S. aureus ili Listeria monocitogenima davanjem terapeutski efikasne količine anti-WTA alfa-AAC pronalaska. Pronalazak takođe razmatra postupak za sprečavanje infekcije S. aureus ili S. saprophyticus ili S. simulansa davanjem terapeutski efikasne količine anti-WTA beta-AAC pronalaska u bolničkim okolnostima kao što su operacija, opekotina i organ transplantacija.
[0316] Pacijent kojem je potrebno lečenje bakterijske infekcije kako je utvrdio lekar iz veštine možda je već bio, ali ne treba mu biti dijagnostikovana vrsta bakterija kojima je zaražen. Budući da pacijent sa bakterijskom infekcijom može brzo da krene na još gore, za nekoliko sati, pacijentu po prijemu u bolnicu mogu se dati anti-WTA-AAC pronalaska zajedno sa jednim ili više standarda nege Abx, kao što je vankomicin. Kada postanu dostupni dijagnostički rezultati i ukazuju na prisustvo, na primer, S. aureus u infekciji, pacijent može nastaviti sa lečenjem anti-WTA AAC. Zbog toga, u jednom otelotvorenju postupka lečenja bakterijske infekcije ili konkretno infekcije S. aureus, pacijentu se daje terapeutski efikasna količina anti-WTA beta AAC. U postupcima lečenja ili prevencije predmetnog pronalaska, AAC pronalaska se može primeniti kao jedino terapeutsko sredstvo ili u kombinaciji sa drugim sredstvima kao što su ona opisana ispod. AAC pronalaska pokazuju superiornost nad vankomicinom u lečenju MRSA u predkliničkim modelima. Poređenje AAC sa SOC može se meriti, npr., smanjenjem stope smrtnosti. Pacijent koji se leči ocenjivao bi se na reaktivnost na lečenje AAC različitim merljivim faktorima. Primeri znakova i simptoma koje kliničari mogu koristiti za procenu poboljšanja na svojim pacijentima uključuju sledeće: normalizacija broja belih krvnih zrnaca ako je povišena prilikom dijagnoze, normalizacija telesne temperature ako je povišena (groznica) u vreme postavljanja dijagnoze, čišćenje krvnih kultura, vizuelno poboljšanje rane, uključujući manje eritema i drenažu gnoja, smanjenje potreba za ventilatorom kao što je za koji je potrebna manja količina kiseonika ili smanjena stopa ventilacije kod pacijenta koji je provetravan, potpuno odustajanje od ventilatora ako je pacijent u vreme dijagnoze ventiliran, upotreba manje lekova za podršku stabilnom krvnom pritisku ako su ti lekovi bili potrebni u to vreme dijagnoze, normalizacije laboratorijskih abnormalnosti koje sugerišu zatajenje krajnjih organa, kao što su povišeni testovi funkcije kreatinina ili jetre ako su bili ne-normalni u vreme postavljanja dijagnoze, i poboljšanje radiološkog snimanja (npr. rendgen grudnog koša koji je ranije predložio upalu pluća sa rezolucijom). Kod pacijenta koji se nalazi u ICU ovi se faktori mogu meriti barem dnevno. Groznica se pažljivo nadgleda, kao i broj belih krvnih zrnaca, uključujući apsolutni broj neutrofila, kao i dokazi da je „pomeranje ulevo“ (pojava eksplozija ukazuje na povećanu proizvodnju neutrofila kao odgovor na aktivnu infekciju) razrešena.
[0317] U kontekstu sadašnjih postupaka lečenja pronalaska, smatra se da se pacijent sa bakterijskom infekcijom leči ako postoji značajno merljivo poboljšanje kako je procenio lekar veštine, u najmanje dve ili više prethodnih faktori u poređenju sa vrednostima, znakovima ili simptomima pre ili na početku lečenja ili u vreme postavljanja dijagnoze. U nekim otelotvorenjima je merljivo poboljšanje u 3, 4, 5, 6 ili više iznad navedenih faktora. Ako su neki aspekti, poboljšanje izmerenih faktora je najmanje za 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ili 100% u poređenju sa vrednostima pre lečenja. Obično se može smatrati da se pacijent potpuno leči od bakterijske infekcije (npr., infekcije S. aureus) ako pacijentova merljiva poboljšanja uključuju sledeće: i) ponoviti kulture krvi ili tkiva (obično nekoliko) koje ne izrastu bakterije koje su prvobitno identifikovane; ii) groznica se normalizuje; iii) normalizacija WBC; i iv) dokaz da je zatajenje krajnjih organa (pluća, jetra, bubrezi, vaskularni kolaps) rešilo u potpunosti ili delimično s obzirom na postojeće komorbiditete koje je imao pacijent.
Doziranje
[0318] U bilo kojem od prethodnih aspekata, za lečenje inficiranog pacijenta, doza AAC je obično oko 0.001 do 1000 mg/kg/dan. U jednom otelotvorenju, pacijent sa bakterijskom infekcijom se leči dozom AAC u opsegu od oko 1 mg/kg do oko 100 mg/kg, obično oko 5 mg/kg do oko 90 mg/kg, tačnije 10 mg/kg do 50 mg/kg. AAC se može davati svakodnevno (npr., jedna doza od 5 do 50 mg/kg/dan) ili ređe (npr., jedna doza od 5, 12.5 ili 25 mg/kg nedeljno). Jedna doza može se deliti tokom 2 dana, na primer, 25 mg/kg jedan dan i 25 mg/kg sledećeg dana. Pacijentu se može davati doza jednom u 3 dana (k3D), jednom nedeljno do svake druge nedelje (kOV), u trajanju od 1-8 nedelja. U jednom otelotvorenju, pacijentu se primenjuje AAC predmetnog pronalaska putem IV jednom nedeljno tokom 2-6 nedelja sa standardnom negom (SOC) za lečenje bakterijske infekcije, poput infekcije staph A. Dužina tretmana bila bi diktirana stanjem pacijenta ili obimom infekcije, npr. u trajanju od 2 nedelje za ne komplikovanu bakteremiju ili 6 nedelja za bakteremiju sa endokarditisom.
[0319] U jednom otelotvorenju, AAC primenjen u početnoj dozi od 2.5 do 100 mg/kg tokom jednog do sedam uzastopnih dana, nakon čega sledi doza održavanja od 0.005 do 10 mg/kg jednom u svakih sedam dana tokom jednog meseca.
Načina davanja
[0320] Za lečenje bakterijskih infekcija, AAC pronalaska se može davati u bilo kojoj od prethodnih doza intravenski (i.v.) ili subkutano. U jednom otelotvorenju, WTA-AAC se daje intravenski. U specifičnom otelotvorenju, WTA-AAC davan preko i.v. je WTA-beta AAC, tačnije, pri čemu je WTA-beta antitelo izabrano iz grupe Abs sa aminokiselinskim sekvencama kako je obelodanjeno na Slici 14, Slici 15A, Slici 15B, Slici 16A i Slici 16B.
Kombinovane terapije
[0321] AAC se može primeniti zajedno sa jednim ili više dodatnih, npr. drugim, terapeutskim ili profilaktičkim sredstvima koja su odgovarajuća kako odredi lekar koji leči pacijenta.
[0322] U jednom otelotvorenju, drugi antibiotik koji se daje u kombinaciji sa jedinjenjem konjugata antiteloantibiotik predmetnog pronalaska je izabran iz strukturalnih klasa: (i) aminoglikozidi; (ii) beta-laktami; (iii) makrolidi/ciklični peptidi; (iv) tetraciklini; (v) fluorohinolini/fluorohinoloni; (vi) i oksazolidinoni. Videti: Shaw, K. i Barbachyn, M. (2011) Ann. N.Y. Acad. Sci.1241:48-70; Sutcliffe, J. (2011) Ann. N.Y. Acad. Sci.
1241:122-152.
[0323] U jednom aspektu, drugi antibiotik koji se daje u kombinaciji sa jedinjenjem konjugata antiteloantibiotik prema pronalasku je izabran između klindamicina, novobiocina, retapamulina, daptomicina, GSK-2140944, CG-400549, sitafloksacina, teikoplanina, triklosana, naftiridona, radezolida, doksorubicina, ampicilina, vankomicina, imipenema, doripenema, gemcitabina, dalbavancina i azitromicina.
[0324] Dodatni primeri ovih dodatnih terapijskih ili profilaktičkih sredstava su anti-inflamatorna sredstva (npr., nesteroidni protivupalni lekovi (NSAID); npr. detoprofen, diklofenak, difunizal, etodolak, fenoprofen, flurbiprofen, ibuprofen, indometacin, ketoprofen, meklofenamat, mefenamična kiselina, meloksikam, nabumeton, naproksen natrijum, oksaprozin, piroksikam, sulindak, tolmetin, celekoksib, rofekoksib, aspirin, holin salicilat, salsal, natrijum i magnezijum salicilat) i steroidi (npr. kortizon, deksametazon, hidrokortizon, metilprednizolon, prednizolon, prednizon, triamcinolon)), antibakterijska sredstva (npr. azitromicin, klaritromicin, eritromicin, gatifloksacin, levofloksacin, amoksicilin, metronidazol, penicilin G, penicilin V, meticilin, oksacilin, kloksacilin, dikloksacilin, nafcilin, ampicilin, karbenicilin, tikarcilin, mezlocilin, peperacilin, azlocilin, temocilin, cefalotin, cefapirin, cefradin, cefaloridin, cefazolin, cefamandol, cefuroksim, cefaleksin, cefprozil, cefaklor, lorakarbef, cefoksitin, cefmatozol, cefotaksim, ceftizoksim, ceftriakson, cefoperazon, ceftazidim, cefiksim, cefpodoksim, ceftibuten, cefdinir, cefpirom, cefepim, BAL5788, BAL9141, imipenem, ertapenum, meropenem, akstreonam, klavulanat, sulbaktam, tazobaktam, streptomicin, neomicin, kanamicin, paromicin, gentamicin, tobramicin, amikacin, netilmicin, spektinomicin, sisomicin, dibekalin, isepamicin, tetraciklin, hlortetraciklin, demeciklociklin, minociklin, oksitetraciklin, metaciklin, doksiciklin, telitromicin, ABT-773, linkomicin, klindamicin, vankomicin, oritavancin, dalbavancin, teikoplanin, hinupristin i dalfopristin, sulfanilamid, para-aminobenzojeva kiselina, sulfadiazin, sulfisoksazol, sulfametoksazol, sulfatalidin, linezolid, nalidiksinska kiselina, oksolinska kiselina, norfloksacin, perfloksacin, enoksacin, ofloksacin, ciprofloksacin, temafloksacin, lemefloksacin, fleroksacin, grepafloksacin, sparfloksacin, trovafloksacin, klinafloksacin, moksifloksacin, gemifloksacin, sitafloksacin, daptomicin, garenoksacin, ramoplanin, faropenem, polimiksin, tigeciklin, AZD2563, ili trimetoprim), antibakterijska antitela, uključujući antitela na isti ili različiti antigen iz AAC ciljanog Ag, inhibitore agregacije trombocita (npr. abciksimab, aspirin, cilostazol, klopidogrel, dipiridamol, eptifibatida, tiklopidin ili tirofiban), antikoagulansima (npr. dalteparin, danaparoid, enoksaparin, heparin, tinzaparin ili varfarin), antipiretike (npr. acetaminofen) ili sredstva za snižavanje lipida (npr., holestiramin, kolestipol, nikotinska kiselina, gemfibrozil, probukol, ezetimib ili statini kao što su atorvastatin, rosuvastatin, lovastatin simvastatin, pravastatin, cerivastatin i fluvastatin). U jednom otelotvorenju, AAC pronalaska se primenjuje u kombinaciji sa standardom nege (SOC) za S. aureus (uključujući sojeve rezistentne na meticilin i metililin). MSSA se obično leči nafcilinom ili oksacilinom, a MRSA se obično leči vankomicinom ili cefazolinom.
[0325] Ova dodatna sredstva mogu se primeniti u roku od 14 dana, 7 dana, 1 dan, 12 sati ili 1 sat primene AAC, ili istovremeno sa njima. Dodatna terapeutska sredstva mogu biti prisutna u istim ili različitim farmaceutskim sastavima kao AAC. Kad su prisutni u različitim farmaceutskim sastavima, mogu se koristiti različiti putevi davanja. Na primer, AAC se može davati intravenski ili subkutano, dok se drugo sredstvo može primeniti oralno.
FARMACEUTSKE FORMULACIJE
[0326] Predmetni pronalazak takođe pruža farmaceutske sastave koji sadrže AAC i postupke za lečenje bakterijske infekcije korišćenjem farmaceutskih sastava koji sadrže AAC. Takvi sastavi mogu dalje da sadrže pogodne ekscipijense, kao što su farmaceutski prihvatljivi ekscipijensi (nosači), uključujući pufere, kiseline, baze, šećere, razblaživače, sredstva za klizanje, konzervanse i slično, koji su dobro poznati u tehnici i ovde su opisani. Sadašnji postupci i sastavi mogu se koristiti sami ili u kombinaciji sa drugim konvencionalnim postupcima i/ili sredstvima za lečenje zaraznih bolesti. U jednom aspektu, pronalazak dalje obezbeđuje farmaceutske formulacije koji sadrže najmanje jedno antitelo pronalaska i/ili najmanje jedan konjugat antiteloantibiotik (AAC). U nekim otelotvorenjima, farmaceutska formulacija sadrži 1) antitelo pronalaska i/ili njegov AAC, i 2) farmaceutski prihvatljiv nosač. U nekim otelotvorenjima, farmaceutska formulacija sadrži 1) antitelo pronalaska i/ili njegov AAC, i opciono, 2) najmanje jedno dodatno terapeutsko sredstvo.
[0327] Farmaceutske formulacije koje sadrže antitelo ili AAC predmetnog pronalaska pripremaju se za čuvanje mešanjem antitela ili AAC koji ima željeni stepen čistoće sa opcionalnim fiziološki prihvatljivim nosačima, ekscipijensima ili stabilizatorima (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)) u obliku vodenih rastvora ili liofiliziranih ili drugih osušenih formulacija. Prihvatljivi nosači, pomoćni ekscipijensi ili stabilizatori nisu toksični za primaoce u korišćenim dozama i koncentracijama i uključuju pufere kao što su fosfat, citrat, histidin i druge organske kiseline; antioksidanti uključujući askorbinsku kiselinu i metionin; konzervansi (kao što je oktadecildimetilbenzil amonijak hlorid; heksametonijum hlorid; benzalkonijum hlorid, benzetonijum hlorid); fenol, butil ili benzil alkohol; alkil paraben poput metila ili propil parabena; katehol; resorcinol; cikloheksanol; 3-pentanol; i m-krezol); polipeptidi niske molekularne mase (manje od oko 10 ostataka); proteini, kao što su albumin u serumu, želatina ili imunoglobulini; hidrofilni polimeri, poput polivinilpirolidona; aminokiseline kao što su glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin ili lizin; monosaharidi, disaharidi i drugi ugljeni hidrati uključujući glukozu, manozu ili dekstrine; helirajuća sredstva kao što je EDTA; šećeri kao što su saharoza, manitol, trehaloza ili sorbitol; kontra-joni koji stvaraju sol kao što je natrijum; metalni kompleksi (npr., Zn-protein kompleksi); i/ili nejonske površinski aktivne tvari kao što su TWEEN™, PLURONICS™ ili polietilen glikol (PEG). Farmaceutske formulacije koje se koriste za in vivo primenu su obično sterilne, lako se postižu filtracijom kroz sterilne filtracione membrane.
[0328] Aktivni sastojci se takođe mogu ugraditi u mikrokapsulu pripremljenu, na primer, tehnikama koacervacije ili interfacijalnom polimerizacijom, na primer, hidroksimetilcelulozom ili želatinskomikrokapsulom, odnosno poli-(metilmetakrilatskim) mikrokapsulama, u sistemima za koloidnu primenu lekova (na primer, lipozomi, mikrosfere albumina, mikroemulzije, nano-čestice i nanokapsule) ili u makroemulzijama. Takve tehnike su obelodanjene u Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).
[0329] Mogu se pripremiti preparati sa odloženim oslobađanjem. Pogodni primeri preparata sa produženim oslobađanjem uključuju polupropusne matrice čvrstih hidrofobnih polimera koji sadrže antitelo ili AAC ovog pronalaska, koji su u obliku oblikovanih predmeta, npr., filmova ili mikrokapsula. Primeri matrica sa produženim oslobađanjem uključuju poliestere, hidrogele (na primer, poli(2-hidroksietil-metakrilat) ili poli(vinilalkohol)), polaktide (U.S. Pat. No.3,773,919), kopolimeri L-glutaminske kiseline i i etil-L-glutamat, nerazgradivi etilen-vinil acetat, razgradivi kopolimeri mlečne kiseline-glikolne kiseline kao što je LUPRON DEPOT™ (injekcijske mikrosfere sastavljene od mlečne kiseline-glikolne kiseline kopolimer i leuprolid acetat) i poli-D-(-)-3-hidroksibuternu kiselinu. Dok polimeri poput etilen-vinil acetata i mlečne kiselineglikolne kiseline omogućavaju oslobađanje molekula preko 100 dana, određeni hidrogelovi oslobađaju proteine tokom kraćeg vremenskog perioda. Kada inkapsulirana antitela ili AAC ostanu u telu duže vreme, mogu denaturisati ili se agregirati kao rezultat izloženosti vlazi na 37 °C, što rezultira gubitkom biološke aktivnosti i mogućim promenama imunogenosti. Racionalne strategije mogu se osmisliti za stabilizaciju u zavisnosti od mehanizma koji je uključen. Na primer, ako je otkriveno da mehanizam agregacije formira međumolekularnu S-S vezu kroz tio-disulfidnu razmenu, stabilizacija se može postići modifikovanjem sulfhidrilnih ostataka, liofilizacijom iz kiselih rastvora, kontrolom sadržaja vlage, korišćenjem odgovarajućih aditiva i razvojem specifičnih sastava polimerne matrice.
[0330] Antitelo može biti formulisano u bilo kom pogodnom obliku za isporuku u ciljanu ćeliju/tkivo. Na primer, antitela se mogu formulisati kao lipozomi, mali vezikuli sastavljeni od različitih vrsta lipida, fosfolipida i/ili surfaktanata koji su korisni za isporuku leka sisaru. Komponente lipozoma obično su raspoređene u dvoslojnoj formaciji, slično lipidnom rasporedu bioloških membrana. Lipozomi koji sadrže antitelo su pripremljeni postupcima poznatim u struci, kao što je opisano u Epstein i dr.., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688; Hwang i dr.., (1980) Proc. Natl Acad. Sci. USA 77:4030; US 4,485,045; US 4,544,545; WO 97/38731; US 5013556.
[0331] Posebno korisni lipozomi mogu se proizvesti metodom isparavanja reverzne faze sa lipidnim sastavom koji sadrži fosfatidilholin, holesterol i PEG-derivatizovani fosfatidiletanolamin (PEG-PE). Lipozomi se ekstrudiraju pomoću filtera definisane veličine pora da bi se dobili lipozomi sa željenim prečnikom. Fab' fragmenti antitela predmetnog pronalaska mogu se konjugovati sa lipozomima kako je opisano u Martin i dr.., (1982) J. Biol. Chem. 257:286-288 reakcijom razmena disulfida. Hemoterapeutsko sredstvo je opciono sadržano u lipozomu (Gabizon i dr.., (1989) J. National Cancer Inst.81(19):1484).
POSTUCI I SASTAVI ZA DIJAGNOSTIKU I DETEKCIJU
[0332] U nekim otelotvorenjima, bilo koje od antitela koje su ovde date je korisno za detekciju prisustva MRSA u biološkom uzorku. Termin "otkrivanje" kako se ovde koristi obuhvata kvantitativnu ili kvalitativnu detekciju. "Biološki uzorak" sadrži, na primer, krv, serum, plazmu, tkivo, ispljuvak, aspirat, bris, itd.
[0333] U jednom otelotvorenju je obezbeđeno anti-WTA antitelo za upotrebu u postupku dijagnostike ili detekcije. U sledećem aspektu, dat je postupak detekcije prisustva WTA u biološkom uzorku. U određenim otelotvorenjima, postupak obuhvata kontaktiranje biološkog uzorka sa anti-WTA antitelom kako je ovde opisano pod uslovima dopuštenim za vezivanje anti-WTA antitela na WTA, i detekcijom da li je formiran kompleks između anti-WTA antitela i WTA u biološki uzorak. Takav postupak može biti in vitro ili in vivo postupak. U jednom otelotvorenju, anti-MRSA antitelo se koristi za izbor ispitanika koji ispunjavaju uslove za terapiju antitelom protiv MRSA, npr. gde je MRSA biomarker za izbor pacijenata.
[0334] U jednom oglednom otelotvorenju, anti-WTA antitelo se koristi in vivo za detekciju, na primer, in vivo snimanjem, infekcije pozitivnom na MRSA, kod ispitanika, npr., u svrhu dijagnosticiranja, napredovanja ili faze lečenja infekcije, određivanje odgovarajućeg toka terapije ili praćenje odgovora infekcije na terapiju. Jedan postupak poznat u oblasti za in vivo otkrivanje je imuno-pozitronska emisijska tomografija (imuno-PET), kao što je opisano, npr., u van Dongen i dr.., (2007) The Oncologist 12:1379-1389 i Verel i dr., (2003) J. Nucl. Med.44:1271-1281. U takvim otelotvorenjima, obezbeđen je postupak za otkrivanje Staph-pozitivne infekcije kod ispitanika, postupak koji uključuje davanje obeleženih anti-Staph antitela ispitaniku koji ima ili sumnja da ima staph-pozitivnu infekciju i detekciju obeleženih anti-Staph. antitela kod ispitanika, pri čemu detekcija obeleženih anti-Staph antitela ukazuje na Staph-pozitivnu infekciju kod ispitanika. U izvesnim takvim otelotvorenjima, obeleženo anti-Staph antitelo sadrži anti-Staph antitelo konjugovano sa pozitronskim emiterom, kao što su<68>Ga,<18>F,<64>Cu,<86>Y,<76>Br,<89>Zr, i<124>I. U naročitim otelotvorenjima, pozitron emiter je<89>Zr.
[0335] U daljim otelotvorenjima, postupak dijagnoze ili detekcije obuhvata kontaktiranje prvog anti-Staph antitela imobilizovanog na supstratu sa biološkim uzorkom koji se testira na prisustvo Staph, izlaganje supstrata drugom anti-Staph antitelu i detektovanje da li se drugo anti-Staph antitelo vezuje na kompleks između prvog anti-Staph antitela i Staph u biološkom uzorku. Supstrat može biti bilo koja nosiva podloga, na primer, staklo, metal, keramika, polimerne kuglice, tobogani, čips i druge podloge. U nekim otelotvorenjima, biološki uzorak sadrži ćeliju ili tkivo (npr., materijal za biopsiju, uključujući kancerozno ili potencijalno kancerozno kolorektalno, endometrija, pankreasno ili jajničko tkivo). U nekim otelotvorenjima, prvo ili drugo antitelo na Staph je bilo koje od ovde opisanih antitela. U takvim otelotvorenjima, drugo anti-WTA antitelo može biti anti-WTA antitela S4497, S4462, S6978, S4487, ili antitela izvedena iz njih kao što je ovde opisano.
[0336] Primeri poremećaja koji se mogu dijagnostifikovati ili otkriti prema bilo kojem od gornjih otelotvorenja uključuju MRSA-pozitivnu infekciju, koristeći test poput imunohistohemije (IHC) ili in situ hibridizacije (ISH). U nekim otelotvorenjima, Staph-pozitivna infekcija je infekcija koja ispoljava Staph prema testu PCR reverzne transkriptaze (RT-PCR) koji detektuje Staph mRNK. U nekim otelotvorenjima, RT-PCR je kvantitativni RT-PCR (Francois P and Schrenzel J (2008). "Rapid Diagnosis and Typing of Staphylococcus aureus". Staphylococcus: Molecular Genetics. Caister Academic Press; Mackay IM, ed. (2007)), i PCR u realnom vremenu ("Real-Time PCR in Microbiology: From Diagnosis to Characterization. Caister Academic Press).
[0337] U nekim otelotvorenjima, su obezbeđena obeležena antitela protiv teihoinske kiseline zida (WTA). Oznake uključuju, ali nisu ograničene na, etikete ili delove koji se detektuju direktno (kao što su fluorescentne, hromoforne, elektro-guste, hemiluminiscentne i radioaktivne oznake), kao i delove, kao što su enzimi ili ligandi, koji se otkrivaju indirektno, npr., enzimatskom reakcijom ili molekularnom interakcijom. Primeri etiketa uključuju, ali nisu ograničeni na, radioizotope<32>P,<14>C,<125>I,<3>H, i<131>I, fluorofori kao što su retki zemljani helati ili fluorescein i njegovi derivati, rodamin i njegovi derivati, danzil, umeliferon, luciferaze, npr., luciferaza leptira i bakterijska luciferaza (US 4737456),luciferin, 2,3-dihidroftalazindioni, renova peroksidaza (HRP), alkalna fosfataza, β-galaktoza, glukoamilaza, lizocim, saharidne oksidaze, npr., ksantin oksidaza, zajedno sa enzimom koji koristi vodonik peroksid za oksidaciju prekursora bojila kao što su HRP, laktoperoksidaza ili mikroperoksidaza, biotin/avidin, spin etikete, oznake bakteriofaga, stabilni slobodni radikali i slično. U drugom otelotvorenju, etiketa je pozitronski emiter. Pozitronski emiteri uključuju, ali nisu ograničeni na njih<68>Ga,<18>F,<64>Cu,<86>Y,<76>Br,<89>Zr, i<124>I. U naročitom otelotvorenju, pozitron emiter je<89>Zr.
[0338] Klinički su simptomi infekcije MRSA slični simptomima meticilinskog osetljivog Staphylococcus aureus (MSSA) i uključuju apscese i celulitis. Često apscesi prate područja centralne nekroze. Furunkuli (čir) su takođe uobičajeni, posebno u slučaju epidemije MRSA. Lezije se takođe mogu pogrešno prijaviti kao paukov ugriz zbog opšteg crvenila koje napreduje do nekrotičnog centra. Pored toga, infekcije se mogu pojaviti kao impetigo, folikulitis, duboko smešteni apscesi, piomiozitis, osteomijelitis, nekrotizirajući fasciitis, stafilokokni toksično-šok sindrom, upala pluća i sepsa. Ozbiljne sistemske infekcije su češće među osobama sa istorijskom upotrebom injekcionih lekova, dijabetesom ili drugim imunokompromitirajućim stanjima.
[0339] Standardne opcije lečenja za MRSA infekcije uključuju konzervativne, mehaničke opcije kao što su: (i) toplo usisavanje i komprimiranje, (ii) rez i odvodnjavanje, i (iii) uklanjanje stranih uređaja (npr., katetera) koji izazivaju infekciju. Za ozbiljnije infekcije, posebno one koje pokazuju celulitis, propisani su antibiotici (Abx). Za blage do umerene infekcije, antibiotici uključuju trimetoprim-sulfametoksazol (TMP-SMX), klindamicin, doksiciklin, minociklin, tetraciklin, rifampin, vankomicin, linezolid. Obično se režim lečenja javlja za 5-10 uz periodično preispitivanje i procenu i tokom i posle perioda lečenja.
[0340] Dodatne mogućnosti lečenja uključuju dekolonizaciju, posebno u okruženju gde pacijent doživi ponavljajuću infekciju ili gde se nalazi u okruženju gde je izbijanje MRSA u toku. Dekolonizacija je postupak gde se uklanja flora koja inhibira pore pacijenta. To se postiže lokalnom primenom 2% mupirocinske masti koja se velikodušno nanosi u obe nozdrve 5-10 dana i lokalnom čišćenju sa hlorheksidin glukonatom 4% tokom 5 dana.
ARTIKLI PROIZVODNJE
[0341] U drugom aspektu predmetnog pronalaska obezbeđen je proizvodni proizvod koji sadrži materijale korisne za lečenje, prevenciju i/ili dijagnozu iznad opisanih poremećaja. Proizvodni proizvod sadrži kontejner i etiketu ili umetak za pakovanje na ili je povezan sa ambalažom. Pogodne ambalaže uključuju, na primer, boce, bočice, špriceve, vrećice sa IV rastvorom, itd. ambalaže mogu da se formiraju od različitih materijala kao što su staklo ili plastika. Ambalaža sadrži smešu koja je sama po sebi ili kombinovana sa drugim sastavom efikasnim za lečenje, sprečavanje i/ili dijagnostikovanje poremećaja i može imati sterilni pristupni otvor (na primer, kontejner može biti vrećica za intravenski rastvor ili bočica sa čepom koji se može probiti pomoću igle za injektiranje). Barem jedno aktivno sredstvo u sastavu je antitelo ili imunokonjugat ovog pronalaska. Etiketa ili uložak na pakovanju označava da se sastav koristi za lečenje stanja izbora. Štaviše, proizvodni proizvod može sadržavati (a) prvi kontejner sa smešom koja se nalazi u njemu, pri čemu smeša sadrži antitelo ili imunokonjugat predmetnog pronalaska; i (b) drugi kontejner sa smešom koja se nalazi u njemu, pri čemu smeša sadrži dodatno citotoksično ili na drugi način terapeutsko sredstvo. Proizvodni proizvod u ovom otelotvorenju pronalaska može dalje da sadrži uložak za pakovanje koji pokazuje da se sastavi mogu koristiti za lečenje određenog stanja. Alternativno, ili dodatno, proizvodni proizvod može dalje sadržavati drugi (ili treći) kontejner koji sadrži farmaceutski prihvatljiv pufer, kao što je bakteriostatska voda za injekcije (BWFI), fiziološki puferni fosfatni rastvor, Ringerov rastvor ili rastvor dekstroze. Takođe može da obuhvata i druge materijale poželjne sa komercijalnog i korisničkog stanovišta, uključujući druge pufere, razblaživače, filtere, igle i špriceve.
PRIMERI
[0342] Slede primeri postupaka i sastava pronalaska. Podrazumeva se da se mogu primeniti razna druga otelotvorenja, imajući u vidu iznad opisani opšti opis.
Primer 1 MC-vc-PAB-pipBOR 51
[0343] 2-nitrobenzen-1,3-diol 1 je hidrogenizovan pod gasom vodonika sa paladijum/ugljenikom katalizatorom u etanolnom rastvaraču da bi se dobio 2-aminobenzen-1,3-diol 2, izolovan kao hidrohloridna so (Slike 23A i 23B). Mono-zaštita 2 sa tercbutil-dimetilsilil-hloridom i trietilaminom u dihlorometanu/tetrahidrofuranu dala je 2-amino-3-(terc-butildimetilsililoksi)fenol 3. Rifamicin S (ChemShuttle Inc., Fremont, CA, US 7342011; US 7,271,165; US 7547692) reagovala je sa 3 oksidativnom kondenzacijom sa manganovim oksidom ili gasom kiseonika u toluenu na sobnoj temperaturi da bi se dobio benzoksazino rifamicin zaštićen TBS. Reakcijom 4 sa piperidin-4-aminom i manganovim oksidom dobije se piperidil benzoksazino rifamicin (pipBOR) 5.
[0344] Piperidil benzoksazino rifamicin (pipBOR) 5 (0.02 mmol) i 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)heksanamido)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)benzil 4-nitrofenil karbonat 6 (0.02 mmol) je pomešan u DMF (0.4 ml) na sobnoj temperaturi (RT). Ovome je dodato 2.5 ekvivalenta N,N'-diizopropiletilamina. Rastvor je mešan od jedan do oko 12 sati i praćen je LC/MS. Po završetku, rastvor je razblažen DMF-om i ubrizgan u HPLC i prečišćen pod kiselim uslovima da bi se dobio MC-vc-PAB-pipBOR 51. M/Z = 1498.9. Prinos 40%
Primer 2 MC-fk-PAB-pipBOR 52
[0345] Sledeći proceduru Primera 1, 6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)-N-((S)-1-((S)-5-guanidino-1-(4-(hidroksimetil)fenilamino)-1-oksopentan-2-ilamino)-1-okso-3-fenilpropan-2-il)heksanamid 12 je konvertovan u 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)hesanamido)-3-fenilpropanamido)-5-
1
guanidinopentanamido)benzil 4-nitrofenil karbonat 13.
[0346] Piperidil benzoksazino rifamicin (pipBOR) 5 (0.02 mmol) i 13 (0.02 mmol) su pomešani u DMF (0.4 ml) na sobnoj temperaturi (RT). Ovome je dodato 2.5 ekvivalenta N,N'-diizopropiletilamina. Rastvor je mešan od jedan do oko 12 sati i praćen je LC/MS. Po završetku, rastvor je razblažen DMF-om i ubrizgan u HPLC i prečišćen pod kiselim uslovima da bi se dobio MC-fk-PAB-pipBOR 52. M/Z = 1545.8. Prinos 32% Primer 3 MP-vc-PAB-pipBOR 53
[0347] Sledeći proceduru Primera 1,6-(2-(2-(2-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)etoksi)etoksi)acetamido)-N-((S)-1-((S)-1-(4-(hidroksimetil)fenilamino)-1-okso-5-ureidopentan-2-ilamino)-3-metil-1-oksobutan-2-il)heksanamid 14 je konvertovan u 4-((17S,20S)-1-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)-17-izopropil-8,15,18-triokso-20-(3-ureidopropil)-3,6-dioksa-9,16,19-triazahenikosanamido)benzil 4-nitrofenil karbonat 15.
[0348] Piperidil benzoksazino rifamicin (pipBOR) 5 (0.02 mmol) i 15 (0.02 mmol) su pomešani u DMF (0.4 ml) na sobnoj temperaturi (RT). Ovome je dodato 2.5 ekvivalenta N,N'-diizopropiletilamina. Rastvor je mešan od jedan do oko 12 sati i praćen je LC/MS. Po završetku, rastvor je razblažen DMF-om i ubrizgan u HPLC i prečišćen pod kiselim uslovima da bi se dobio MP-vc-PAB-pipBOR 53. M/Z = 1644.8. Prinos 57% Primer 4 MC-vc-PAB-dimetilpipBOR 54
[0349] Reakcijom N, N-dimetilpiperidin-4-amina sa benzoksazino rifamicinom 4 zaštićenim TBS dobije se dimetilpiperidil benzoksazino rifamicin (dimetil pipBOR) 7 (Slika 24).
2
[0350] Alternativno, (5-fluoro-2-nitro-1,3-fenilen)bis(oksi)bis(metilen)dibenzen 9 hidrogenizovan je pod gasom vodonika sa paladijum/ugljenikom katalizatorom u tetrahidrofuranu/metanol rastvaraču da bi se dobile benzilne grupe da bi se dobile 2-amino-5-fluorobenzen-1,3-diol 10. Komercijalno dostupna natrijumova so Rifamicin S ili Rifamicin SV (ChemShuttle Inc., Fremont, CA) reaguje sa 2-amino-5-fluorobenzen-1,3-diolom 10 oksidativnom kondenzacijom u vazduhu ili kalijum-ferat cijanidom u etilacetatu na 60°C da se dobije fluoro benzoksazino rifamicin 11. Izmeštanje fluora sa N,N-dimetilpiperidin-4-aminom dalo je dimetil pipBOR 7 (Slike 25A i 25B).
[0351] 6-(2,5-Diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)-N-((S)-1-((S)-1-(4-(hidroksimetil)fenilamino)-1-okso-5-ureidopentan-2-ilamino)-3-metil-1-oksobutan-2-il)heksanamid 8, pripremljeno prema procedurama u WO 2012113847; US 7,659,241; US 7,498,298; US 20,090,111,756; US 20,090,018,086; US 6,214,345; Dubowchik i dr. (2002) Bioconjugate Chem. 13(4):855-869 (1.009 g, 1.762 mmol, 1.000, 1009 mg) je uzeto u N,N-dimetilformamid (6 mL, 77 mmol, 44, 5700 mg). Ovome je dodat rastvor tionil hlorida (1.1 ekv., 1.938 mmol, 1.100, 231 mg) u dihlorometanu (DCM) (1 mL, 15.44 mmol, 8.765, 1325 mg) u vidu kapi (1/2 je dodato tokom jednog sata, mešati jedan sat na sobnoj temperaturi (RT), a zatim dodati drugu polovinu tokom još jednog sata). Rastvor je ostao žute boje. Još 0.6 ekvivalenta tionil hlorida je pažljivo dodat kao rastvor u 0.5 ml DCM, kap po kap. Reakcija je ostala žuta i mešana je preko noći zatvorena na RT. Reakcija je praćena pomoću LC/MS na 88% proizvoda benzil hlorida 9. Još 0.22 ekv. tionil hlorida dodato je u vidu kapi u rastvor u 0.3 mL DCM. Kada se reakcija približila 92% benzil hloridu 9, reakcija je dodata u vidu mehurova sa N2. Koncentracija je redukovana od 0.3 M do 0.6 M. Proizvod N-((S)-1-((S)-1-(4-(hlorometil)fenilamino)-1-okso-5 -ureidopentan-2-ilamino)-3-metil-1-oksobutan-2-il)-6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)heksanamid 9 je čuvan u frižideru kao 0.6 M rastvor i tako upotrebljen. M/Z 591.3, 92% prinos.
[0352] U flašici, N-((S)-1-((S)-1-(4-(hlorometil)fenilamino)-1-okso-5-ureidopentan-2-ilamino)-3-metil-1-oksobutan-2-il)-6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)heksanamid 9, (0.9 mmol) je ohlađen do 0 °C i dimetilpiperidil benzoksazino rifamicin (dimetil pipBOR) 7 (0.75 g, 0.81 mmol, 0.46, 750 mg) je dodat. Smeša je razblažena sa još 1.5 ml DMF-a da bi se dostiglo 0.3 M. Mešana je otvorena za vazduh 30 minuta. Dodaje se N,N-diizopropiletilamin (3.5 mmol, 3.5 mmol, 2.0, 460 mg) i reakcija se meša preko noći na otvorenom. Tokom 4 dana, dodaju se 4 dodavanja 0.2 eq N, N-diizopropiletilamin baze dok se reakcija meša na otvorenom, sve dok reakcija ne prestaje da napreduje. Reakcija je razblažena DMF-om i prečišćena na HPLC (20-60% ACN/FA · H20) u nekoliko serija da bi se dobio MC-vc-PAB-dimetilpipBOR 54.
M/Z=1482.8 prinos: 32%
Primer 5 MC-vc-PAB-monometilpip, desacetilBOR 55
[0353] Sledeći postupke iz Primera 1, N-metilpiperidin-4-amin i TBS-zaštićeni desacetil, benzoksazino rifamicin je reagovao sa manganovim oksidom da bi se dobio monometilpiperidil benzoksazino rifamicin (pipBOR) 16.
[0354] 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-Diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)heksanamido)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)benzil 4-nitrofenil karbonat 6 i 16 su dodat kako bi se dobio MC-vc-PAB-monometilpip, desacetilBOR 55 u 26% prinosu (M/Z = 1456.5).
Primer 6 MC-vc-PAB-monometilpipBOR 56
[0355] Sledeći postupke iz Primera 1, N-metilpiperidin-4-amin i TBS-zaštićeni, benzoksazino rifamicin 4 je reagovao sa manganovim oksidom da bi se dobio monometilpiperidil benzoksazino rifamicin (pipBOR) 17.
[0356] 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-Diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)heksanamido)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)benzil 4-nitrofenil karbonat 6 i 17 su dodat kako bi se dobio MC-vc-PAB-monometilpipBOR 56 u 25% prinosu (M/Z = 1471.0).
Primer 7 MC-vc-PAB- pip, desacetilBOR 57
[0357] Sledeći postupke iz Primera 1, piperidin-4-amin i TBS-zaštićeni desacetil, benzoksazino rifamicin 18 reaguje sa manganovim oksidom da bi se dobio piperidil, des-acetil benzoksazino rifamicin (pip desacetil BOR) 19.
[0358] Piperidil, des-acetil benzoksazino rifamicin 19 (0.02 mmol) i 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)heksanamido) -3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)benzil 4-nitrofenil karbonat 6 (0.02 mmol) reaguje, čime se dobije MC-vc-PAB-pips, desacetilBOR 57. M/Z = 1456.6. Prinos 13% Primer 8 MC-vc-PAB-rifabutin 58
[0359]
[0360] Sledeći postupke iz primera 1, des-izobutil rifabutin 20 (0.02 mmol) i 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)heksanamido)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)benzil 4-nitrofenil karbonat 6 (0.02 mmol) su reagovali da daju MC-vc-PAB-rifabutin 58. M/Z=1389.6. Prinos 21% Primer 9 MC-GGAFAGGG-pipBOR ("peptid jezgra" obelodanjen kao SEQ ID NO:126)59
[0361]
[0362] Sledeći postupke iz primera 1, maleimidni peptid 21 je spojen sa piperidil benzoksazino rifamicinom (pipBOR) 5, pod standardnim uslovima formiranja amidne veze da bi se dobio MC-GGAFAGGG-pipBOR
4
(„peptid jezgra“ obelodanjen kao SEQ ID NO:126) 59. M/Z=1626.0. Prinos 13%
Primer 10 MC-vc-PAB-rif 60
[0363]
[0364] U maloj bočici, 0.05 mL 0.6 M rastvora N-((S)-1-((S)-1-(4-(hlorometil)fenilamino)-1-okso-5 -ureidopentan-2-ilamino)-3 -metil-1 -oksobutan-2-il)-6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)heksanamid 9, pripremljen postupkom primera 4 ohlađen je do 0 °C i 1 ekviv. benzoksazino rifamicina 22 dodat je i smeša je mešana 5 minuta. Ovom 0 °C rastvora je dodat K2CO3(15 ekv.), i bočice su isprane sa 0.05 ml DMF. Reakcija je mešana otvorena na vazduhu do sobne temperature 1-4 sata. Kada se potroši svih 9, čvrste materije su odfiltrirane, a sakupljeni filtrat je razblažen DMF. Prečišćavanje pomoću HPLC dalo je MC-vc-PAB-rif 60 u 11% prinosu (M/Z = 1356.9).
Primer 11 MC-vc-PAB-dimetilpip, desacetilBOR 61
[0365]
[0366] Sledeći postupke iz primera 4, N-((S)-1-((S)-1-(4-(hlorometil)fenilamino)-1-okso-5-ureidopentan-2-ilamino)-3-metil-1-oksobutan-2-il)-6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-lH-pirol-l-il)heksanamid 9 reaguje sa dimetilpiperidil, desacetil benzoksazino rifamicinom (dimetil, desacetil pipBOR) 23 da bi se dobio MC-vc-PAB-dimetilpip, desacetilBOR 61. M/Z = 1440.66
Primer 12 MC-vc-PAB-piperazBTR 62
[0367]
[0368] Sledeći postupke iz Primera 1, 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-lH-pirol-l-il)heksanamido)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)benzil 4-nitrofenil karbonat 6 reaguje sa piperazino benztiazino rifamicinom (piperazBTR) 24 dajući MC-vc-PAB-piperazBTR 62. M/Z = 1483.7
Primer 13 MC-vc-PAB- piperaz, desacetilBTR 63
[0370] Sledeći procedure Primera 1, 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)heksanamido)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)benzil 4-nitrofenil karbonat 6 su reagovale sa piperazino, desacetil benztiazino rifamicin (pipBTR) 25 da bi dali MC-vc-PAB- piperaz, desacetilBTR 63. M/Z = 1441.6 Primer 14 MC-vc-PAB-piperaz, desacetilBOR 64
[0371]
[0372] Sledeći procedure Primera 1, 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)heksanamido)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)benzil 4-nitrofenil karbonat 6 je reagovao sa piperazil, desacetil benzoksazino rifamicin (desacetil pipBOR) 26 kako bi dali MC-vc-PAB-piperaz, desacetilBOR 64. M/Z = 1441.6
Primer 15 MC-vc-PAB-piperazBOR 65
[0373]
[0374] Sledeći procedure Primera 1, 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)heksanamido)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)benzil 4-nitrofenil karbonat 6 je reagovao sa piperazil benzoksazino rifamicin (piperazilBOR) 27 kako bi dali MC-vc-PAB-piperazBOR 65. M/Z = 1482.7 Primer 16 MC-vc-bisPAB-dimetilpipBOR 66
[0375] U bočicu, 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)heksanamido)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)benzil 4-nitrofenil karbonat 6 (1.56 g, 2.11 mmol, 100 %težine) je stavljen u DMF (55 ekviv., 116 mmol, 55.0, 8.5 g) i mešan na RT. U ovu mutno žutu smešu je dodat (4-aminofenil)metanol (PAB, 1.1 ekviv., 2.33 mmol, 1.10, 286 mg) i 1-hidroksibenzotriazol (0.37 ekviv., 0.782 mmol, 0.370, 106 mg) praćeno sa N,N'-diizopropiletilamin (1 ekviv., 2.11 mmol, 1.00, 276 mg). Reakcija je mešana tokom 2 sata i praćena pomoću LC/MS. Dodati su dodatni 1 ekvivalent N,N'-diizopropiletilamin (Hunigs baza) i 100 mg (4-aminofenil)metanola. Reakcija je mešana zatvorena preko noći na RT. Oko 0.5 L dietil etra je dodato u kapima da bi se istaložio proizvod. Eter je dekantiran, čvrsta supstanca je ponovo rastvorena u DMF, i prečišćena direktno na HPLC u nekoliko serija, da se dobije 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)heksanamido)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)benzil 4-(hidroksimetil)fenilkarbamat 28 (0.435g) u 28% ukupnom izolovanom prinosu (M/Z: 722.5), koji ima strukturu:
[0376] Sledeći proceduru Primera 4, 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)heksanamido)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)benzil 4-(hidroksimetil)fenilkarbamat 28 je reagovao sa tionil hloridom kako bi dali 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)heksanamido)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)benzil 4-(hlorometil)fenilkarbamat 29 u 47% izolovanom prinosu (M/Z: 740.4), koji ima strukturu:
[0377] Sledeći proceduru Primera 4, 4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)heksanamido)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)benzil 4-(hlorometil)fenilkarbamat 29 je reagovao sa dimetilpiperidil benzoksazino rifamicin (dimetil pipBOR) 7 kako bi dali MC-vc-bisPAB-dimetilpipBOR 66 u 5% prinosu (M/Z: 1632.1)
Primer 17 MC-vc-PAB-metilpiperaz BOR 67
[0378]
[0379] Sledeći postupak Primera 4, N-((S)-1-((S) -1-(4-(hlorometil)fenilamino)-1-okso-5-ureidopentan-2-ilamino)-3-metil-1 -oksobutan-2-il)-6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-lH-pirol-l-il)heksanamid 9 je reagovao sa metilpiperazino benzoksazino rifamucinom (metil piperazBOR) 30 kako bi dali MC-vc-PAB-metilpiperaz BOR 67. M/Z = 1454.68
Primer 18 Unutarćelijska MRSA zaštićena je od antibiotika
[0380] Ovaj primer pruža dokaz da MRSA može preživeti unutar ćelije in vivo. Kod infekcije, unutarćelijska MRSA je zaštićena od i sposobna da preživi lečenje antibioticima (kao što je SOC Vankomicin), omogućavajući prenos infekcije iz jedne ćelije u drugu.
[0381] MIC određivanja za vanćelijske bakterije: MIC za vanćelijske bakterije je određen pripremanjem serijskih dvostrukih razblaženja antibiotika u triptičnom sojinom agaru. Razblaženja antibiotika rađena su u četvorostrukom u posudama sa kulturom od 96 udubljenja. MRSA (NRS384 soj USA300) je uzet iz eksponencijalno rastuće kulture i razblažen do 1x10<4>CFU/mL. Bakterije su kultivisane u prisustvu antibiotika tokom 18-24 sata uz mućkanje na 37 °C i rast bakterija je određen očitavanjem optičke gustine (OD) na 630 nM. MIC je određena kao doza antibiotika koja inhibira rast bakterija za >90%.
[0382] MIC određivanja za unutarćelijske bakterije: Unutarćelijski MIC je određen na bakterijama koje su sekvencirane unutar mišjih peritonealnih makrofaga. Makrofagi su postavljeni u posude sa 24 udubljenja za kultivisanje sa gustinom 4x10<5>ćelija/mL i inficirane MRSA (NRS384 sojem USA300) u odnosu 10-20 bakterija po makrofagu. Kulture makrofaga su održavane u podlozi za kultivisanje dopunjenom sa 50 µg/mL gentamicina za inhibiciju rasta vanćelijskih bakterija, a testirani antibiotici su dodavani u podlogu za rast 1 dan nakon infekcije. Preživljavanje unutarćelijskih bakterija procenjeno je 24 sata nakon dodavanja antibiotika. Makrofagi su lizirani sa punjenom fiziološkom rastvorom Hanks sa dodatkom .1% goveđeg serumskog albumina i .1% Triton-X, a serijska razblaženja lizata su napravljena u vodenom rastvoru fosfatnog slanog rastvora koji sadrži 0.05% Tween-20. Broj preživelih unutarćelijskih bakterija određen je nanošenjem prevlake sa triptičnim sojinim agarom sa 5% defibrinirane ovčje krvi.
[0383] Izolacija peritonealnih makrofaga: Peritonealni makrofagi su izolovani iz peritoneuma 6-8 nedeljnih Balb/c miševa (Charles River Laboratories, Hollister, CA). Da bi se povećao prinos makrofaga, miševi su prethodno tretirani intraperitonealnom injekcijom sa 1 ml tioglikolatnog medijuma (Becton Dickinson). Tioglikolatna podloga je pripremljena u koncentraciji od 4% u vodi, sterilisan autoklaviranjem i stario je 20 dana do 6 meseci pre upotrebe. Peritonealni makrofagi su prikupljeni 4 dana nakon tretmana tioglikolatom ispiranjem peritonealne šupljine hladnim fiziološkim rastvorom fosfata. Makrofagi su posijani u Dulbecco modifikovanom Eagle medijumu (DMEM) sa dodatkom 10% fetalnog telećeg seruma i 10 mM HEPES, bez antibiotika, pri gustoći 4x10<5>ćelija/udubljenju u 24 posude sa kulturom od 24 udubljenja. Makrofagi su kultivisani preko noći kako bi se omogućilo prianjanje na ploču. Ovaj test je takođe korišćen za testiranje unutarćelijskog ubijanja kod nefagocitnih ćelija. MG63 (CRL-1427) i A549 (CCL185) ćelijske linije su dobijene od ATCC i održavane u RPMI 1640 medijumu kulture tkiva sa dodatkom 10 mM Hepes i 10% fetalnog telećeg seruma (RPMI-10). HUVEC ćelije su dobijene iz Lonze i održavane u kompletnom medijumu endotelnih ćelija EGM (Lonza, Walkersville, MD).
[0384] Infekcija makrofaga opsonizovanim MRSA: USA300 soj MRSA (NRS384) je dobijen iz NARSA skladišta (Chantilly, Virginia). Neki eksperimenti koristili su Njumanov soj S. aureus (ATCC25904). U svim eksperimentima bakterije su kultivisane u triptičnom sojinom agaru. Za procenu unutarćelijskog ubijanja sa AAC, USA300 je uzet iz eksponencijalno rastuće kulture i ispran sa HB (Hanksov balansirani slani rastvor dopunjen sa 10 mM HEPES i 0.1% goveđim serumskim albuminom). AAC ili antitela su razblažena u HB i inkubirana sa bakterijama tokom 1 sata da se dozvoli vezivanje antitela na bakterije (opsonizacija), a opsonizovane bakterije su korišćene za inficiranje makrofaga u odnosu 10-20 bakterija po makrofagu (4x10<6>bakterija u 250 µL HB po udubljenju. Makrofagi su prethodno isprani DMEM podlogom bez seruma neposredno pre infekcije, i inficirani inkubacijom na 37 °C u inkubatoru vlažne kulture tkiva sa 5% CO2da se omogući fagocitoza bakterija. Nakon 2 sata, uklonjena je infekciona mešavina i zamenjena je normalnom podlogom za rast (DMEM dopunjen 10% fetalnim telećim serumom, 10 mM HEPES i gentamicin je dodat u 50 µg/ml da se spreči rast vanćelijskih bakterija. Na kraju perioda inkubacije, makrofagi su isprani podlogom bez seruma, a ćelije su lizirane u HB dopunjenom sa 0.1% Triton-X (liziraju makrofage bez oštećenja unutarćelijskih bakterija). U nekim eksperimentima procenjena je održivost makrofaga na kraju perioda kulture detekcijom oslobađanja citoplazmatske laktat dehidrogenaze (LDH) u supernatant kulture uz pomoć LDH citotoksičnosti za detekciju (Proizvod 11644793001, Roche Diagnostics Corp, Indianapolis, IN). Supernatanti su sakupljeni i analizirani odmah prema uputstvima proizvođača. Serijska razblaživanja lizata su napravljena u fiziološkom rastvoru puferisanim fosfatom sa dodatkom 0.05% Tween-20 (da bi se poremetili agregati bakterija), a ukupan broj preživelih unutarćelijskih bakterija određen je nanošenjem prevlake na triptični sojini agar sa 5% defibrinirane ovčje krvi.
[0385] Generacija peritonealnih ćelija inficiranih sa MRSA. 6-8 nedeljni ženski A/J miševi (JAX™ miševi, Jackson Laboratories) zaraženi su 1x10<8>CFU soja NRS384 od USA300 peritonealnom injekcijom. Peritonealno ispiranje je sakupljeno 1 dan nakon infekcije, a inficirane ćelije peritoneja su tretirane sa 50 µg/mL lizostafina razblaženog u Hepes puferu sa dodatkom 0.1% BSA (HB pufer) tokom 30 minuta na 37 °C. Peritonealne ćelije su zatim isprane 2x u ledeno hladnom puferu HB. Peritonealne ćelije su razblažene do 1x10<6>ćelija/mL u podlozi za kultivisanje RPMI 1640 sa dodatkom 10 mM Hepes i 10% fetalnog telećeg seruma i 5 µg/mL vankomicina. Slobodna MRSA od primarne infekcije čuvana je preko noći na 4 °C u fiziološkom rastvoru sa fosfatom kao kontrola vanćelijskih bakterija koje nisu bile podložne ubijanju neutrofila.
[0386] Prenos infekcije sa peritonealnih ćelija na osteoblaste: MG63 osteoblastna ćelijska linija dobijena je od ATCC (CRL-1427) i održavana u RPMI 1640 podlozi za kultivisanje tkiva sa dodatkom 10 mM Hepes i 10% fetalnog telećeg seruma (RPMI-10). Osteoblasti su posejani u ploče sa kulturama za 24 udubljenja sa kulturom i kultivisani da se dobije spojni sloj. Na dan eksperimenta, osteoblasti su isprani jednom u RPMI (bez dodataka). MRSA ili inficirane peritonealne ćelije su razblažene u kompletnom RPMI-10 i vankomicin je dodat u 5 µg/mL neposredno pre infekcije. Peritonealne ćelije su dodate u osteoblaste pri 1x10<6>peritonealnih ćelija/mL. Uzorak ćelija je liziran sa 0.1% triton-x da bi se utvrdila stvarna koncentracija živih unutarćelijskih bakterija u trenutku infekcije. Stvarni titar za sve infekcije utvrđen je nanošenjem serijskih razblaživanja bakterija na triptičnom sojinom agaru sa 5% defibrinirane ovčje krvi.
[0387] MG63 osteoblasti su postavljeni u staklene komore sa 4 udubljenja i kultivisani u RPMI 1640 podlozi za kultivisanje tkiva dopunjenom sa 10 mM Hepes i 10% fetalnim telećim serumom (RPMI-10) dok se ne formiraju spojni slojevi. Na dan infekcije, udubljenja su isprana podlogom bez seruma i inficirane suspenzijom inficiranih peritonealnih ćelija, ili s USA300 sojem MRSA razblaženim u kompletnom RPMI-10 dopunjenom sa 5 µg/mL vankomicina. Dan nakon infekcije, ćelije su isprane fiziološkom otopinom puferiranom fosfatom (PBS) i fiksirane 30 minuta na sobnoj temperaturi u PBS sa 2% paraformaldehida. Udubljenja su isprana 3x u PBS i permeabilisane PBS sa 0.1% saponina tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi.
[0388] Imunofluorescencija: MRSA je identifikovana bojenjem sa 20 µg/mL zečjeg anti-Staph 20920 (abcam, Cambridge, MA), a zatim anti-zečjim rodaminom (Jackson ImmunoResearch, 711-026-152). Ćelijske membrane peritonealnih ćelija obojene su Cholera-Toxin-Beta podjedinicom-biotinom (Invitrogen, Carlsbad, CA), a zatim streptavidin Cy5 (BD Biosciences San Jose, CA). Vezanje kolere-toksina za peritonealne ćelije potvrđeno je koloritom sa anti-CD 11b klonom Alexa 488 klon M1/70 (BD Biosciences). Slajdovi su montirani sa Prolong Gold sa DAPI (Invitrogen, Carlsbad CA). Slajdovi su pregledani upotrebom Leica SPE konfokalnog mikroskopa. Slike su sakupljene u nizu Z-nizova i sastavljene da bi se generisale maksimalne prikazane slike.
[0389] Preživljavanje S. aureus unutar sisarskih ćelija pruža održivu nišu koja omogućava postojanu infekciju u prisustvu antibiotske terapije. S. aureus je sposoban da inficira i opstane u velikom broju vrsta sisara, uključujući neutrofile, makrofage, osteoblaste i epitelne ćelije (Garzoni, C. and W. L. Kelley (2009) Trends Microbiol 17(2):59-65). Da bi se direktno ispitivalo da li je unutarćelijska MRSA zaštićena od antibiotika, upoređeni su brojni klinički odobreni antibiotici zbog njihove sposobnosti da uništavaju vanćelijsku MRSA, uzgajanu u standardnim podlogama za rast bakterija, sa njihovom sposobnošću da uništavaju unutarćelijsku MRSA koja je zasečena unutar mišjih makrofaga (Tabela 1). Za ovu analizu su odabrani mišji peritonealni makrofagi, jer ove ćelije predstavljaju genetski normalan tip primarne ćelije koji je prirodna komponenta urođenog imunog odgovora na S. aureus. Analiza je potvrdila da se ove ćelije lako inficiraju i uzgajaju in vitro. MRSA je sposobna da preživi unutar ćelije do šest dana nakon infekcije makrofaga (Kubica, M., K. Guzik, i dr.. (2008) PLoS One 3(1): e1409). Da bi se testirao unutarćelijski efekat antibiotika, makrofagi su inficirani MRSA i kultivisani u prisustvu gentamicina, antibiotika za koji se zna da je neaktivan unutar fagolizoma zbog lošeg ćelijskog unosa antibiotika. (Vaudaux, P. and F. A. Waldvogel (1979) Antimicrob Agents Chemother 16(6): 743-749). Testirani antibiotici dodati su u podloge za kultivisanje (pored gentamicina) dan nakon infekcije u rasponu doza izabranih da uključe klinički dostižne nivoe u serumu (prikazano kao serumski Cmax u Tabeli 1). Ova analiza otkrila je da iako je vanćelijska MRSA podložna inhibiciji rasta niskim dozama vankomicina, daptomicina, linezolida ili rifampicina u tečnoj kulturi, sva četiri antibiotika nisu uspela da ubiju isti soj unutarćelijskog MRSA koji je izdvojen unutar makrofaga. Izuzetno je da je čak i rifampicin, za koji se navodi da je jedan od najboljih antibiotika za lečenje unutarćelijskih infekcija, poput tuberkuloze, doveo do minimalnog ubijanja unutarćelijske MRSA tokom vremena i raspona doze eksperimenta.
Tabela 1. Minimalne inhibitorne koncentracije (MIC) nekoliko antibiotika
[0390] Gornji podaci potvrđuju da su unutarćelijske bakterije zaštićene od antibiotika tokom vremena koje su izlučene unutar ćelija. Međutim, ne smatra se da je MRSA pravi unutarćelijski patogen zato što nije u stanju da inficira susedne ćelije direktnim prenošenjem ćelija na ćeliju, a većina inficiranih ćelija će na kraju lizirati oslobađajući unutarćelijske bakterije. Zbog toga je ostalo moguće da će intracelularni bazen, kad se jednom oslobodi, neprolazno biti izložen vanćelijskim antibioticima makar prolazno, čak i ako bi bakterije odmah preuzele susedne ćelije. Unos besplatnog MRSA od makrofaga zahteva između 15 i 90 minuta (podaci nisu prikazani), što sugeriše da ako bi bakterije bile u stanju da se odupru kratkom izlaganju antibioticima, one bi mogle ostati zaštićene u unutarćelijskoj niši prelazeći sekvencijalno iz ćelije koja umire u novi domaćin. Da bi se utvrdilo da li je kratko izlaganje antibioticima dovoljno za uništavanje MRSA, testirani su vankomicin, trenutni standard lečenja za MRSA infekcije i rifampin. MRSA je uzeta iz aktivno rastuće kulture i razblažena do 1x10<6>bakterija/mL u normalnoj podlozi za rast. Antibiotici su dodavani u dve doze, što predstavlja očekivanu minimalnu inhibitornu koncentraciju (MIC) između 2x i 10x. Uzorci su odstranjeni u različitim periodima između 30 minuta i 5 sati, a antibiotik je uklonjen centrifugiranjem i razblaživanjem. Ukupan broj preživelih bakterija u kulturi utvrđen je postavljanjem na ploče sa agarima.
[0391] Slika 1 prikazuje poređenje vremena ubistva za vankomicin (vanco) i rifampicin (Rifa) na aktivno deljenju MRSA. MRSA je uzgajana 5 sati u TSB podlozi u prisustvu antibiotika. U naznačeno vreme uzet je uzorak kulture i antibiotik je uklonjen centrifugiranjem. Ukupan broj preživelih bakterija određen je u svakom trenutku prekrivanjem. Vankomicin je testiran na 2 µg/mL (otvoreni kvadrat) i 20 µg/mL (zatvoreni kvadrat). Rifampin je testiran na 0.02 µg/mL (otvoreni trougao) i 0.2 µg/mL (zatvoreni trougao). Ovi podaci (Slika 1) otkrivaju da, iako su oba antibiotika uspela da efikasno inhibiraju rast bakterija i tokom 5 sati primećen je gubitak održivih bakterija u 100 puta, bakterije su ubijale postepeno tokom perioda posmatranja od 5 sati i 90% bakterija ostala održiva tokom prva dva sata lečenja antibioticima, omogućavajući dovoljno vremena za potencijalno unošenje ćelija domaćina.
[0392] Unutarćelijska skladišta MRSA ispitivane su za prenos infekcije u permisivnu unutarćelijsku nišu u prisustvu vankomicina. S. aureus može preživeti unutar osteoblasta, a unutar ćelija S. aureus primećene su kod pacijenata sa osteomijelitisom, stanje u kome je poznato da hronična infekcija sa S. aureus podseća na lečenje antibioticima
(Thwaites and Gant, (2011) Nature Reviews Microbiology 9:215-222; Ellington i dr.., (2006) J. Orthopedic Research 24(1): 87-93; Bosse i dr., (2005) J. Bone i Joint Surgery, 87(6):1343-1347). In vitro ispitivanje je razvijeno korišćenjem ćelijske linije osteoblasta MG63, pošto je objavljeno da je ova ćelijska linija sposobna da nosi unutarćelijsku S. aureus (Garzoni and Kelly, (2008) Trends in Microbiology). Ovim testom potvrđeno je da je MRSA sposobna da inficira MG63 ćelije, a održive unutarćelijske bakterije se mogu in vitro oporaviti iz zaraženih MG63 ćelija do 6 dana. Da bi se stvorio bazen intracelularne S. aureus, peritonealne ćelije su sakupljene od miševa koji su zaraženi peritonealnom injekcijom MRSA (Slika 2).
[0393] Slika 2 prikazuje prenos infekcije sa inficiranih peritonealnih ćelija do osteoblasta u prisustvu vankomicina. Da bi se stvorio bazen intracelularne S. aureus, A/J miševi su inficirani MRSA, a zaražene peritonealne ćelije uzete su 1 dan nakon infekcije. Izveštava se da su slične generisane ćelije u kojima žive humane ćelije koje su sposobne da prenesu infekciju u in vivo modelu infekcije (Gresham i dr. J Immunol 2000; 164:3713-3722). Zaražene ćelije peritoneja sastojale su se od mešavine primarno neutrofila i makrofaga i otprilike 10% ćelija koje su bile smeštene u ćelijama. Ćelije su tretirane lizostafinom za uklanjanje vanćelijskih bakterija i suspendovane u podlozi za rast sa dodatkom 5 µg/mL vankomicina. Uzorak peritonealnih ćelija korišćenih za infekciju lišen je da se odredi tačna doza održivog intracelularnog MRSA u vreme kada je infekcija započeta, a različite doze slobodne vanćelijske MRSA su takođe razblažene u medijum sa vankomicinom radi poređenja. Peritonealne ćelije (unutarćelijska MRSA) ili slobodne bakterije (vanćelijska MRSA) su zatim dodate monoplazme MG63 osteoblasta i uzgajane 4 sata (otvorene table) ili 1 dan (zatvorene table). Ukupan broj preživelih unutarćelijskih bakterija u svakom ležištu određen je stavljanjem ćelija lizata na ploče sa agarima. Unutarćelijska MRSA zaštićena je od vankomicina u poređenju sa vanćelijskim MRSA kontrolama. Udubljenje zaraženo 3x10<4>unutarćelijskim bakterijama dao je 8,750 unutarćelijskih bakterija 1 dan nakon infekcije, dok su vanćelijske bakterije efikasno ubijene kao infekcija sličnom dozom slobodnog
1
MRSA davale samo 375 unutarćelijskih bakterija 1 dan posle infekcije
[0394] Imunofluorescentna mikroskopija je takođe pokazala prenos infekcije sa peritonealnih ćelija na MG63 osteoblaste. Peritonealne ćelije su sakupljene od miševa 1 dan nakon infekcije MRSA i tretirane lizostafinom da se ubiju sve kontaminirajuće vanćelijske bakterije (Unutarćelijska infekcija). Slobodna MRSA uzeta je iz aktivno rastuće kulture i isprana je sa PBS (vanćelijska infekcija). Ukupan broj održivih bakterija u uzorcima unutarćelijske i vanćelijske infekcije potvrđen je nanošenjem na ploče sa agarima, a oba uzorka su suspendovana u podlozi dopunjenoj sa 5 µg/mL vankomicina neposredno pre dodavanja spojnim slojevima osteoblasta MG63, kultivisanih u komori. Dan nakon infekcije, MG63 ćelije su isprane da bi uklonile vanćelijske bakterije, permealizovale i obojene anti-S. antitela za aureus da identifikuju unutarćelijske MRSA i kolere toksin koji se preferirano vezuje na ćelije peritonealnih ćelija. Sva ćelijska jezgra su obojena sa DAPI kako bi se potvrdilo da je mono-sloj MG63 netaknut. Slajdovi su pregledani konfokalnom mikroskopijom.
[0395] Udubljenje inficirano peritonealnim ćelijama sadržavao je spajajući mono sloj ćelija MG63, a peritonealni makrofagi su bili jasno vidljivi na vrhu MG63 sloja. Mnogi makrofagi su bili jasno inficirani MRSA koji je vidljiv kao nakupina crvenih bakterija u jednobojnoj slici ili belih čestica na prekrivanoj slici. Pored zaraženih makrofaga, primećeni su jasni primeri bakterija koje su povezane samo sa ćelijama MG63. Ove inficirane ćelije MG63 su takođe bile vidljive u otvorima koji su bili inficirani slobodnim MRSA. Infekcija slobodnim MRSA zahtevala je mnogo veći inokulum da bi se postigao sličan nivo infekcije u ćelijama MG63.
[0396] Gornjim rezultatima utvrđeno je da su i slobodne MRSA i unutarćelijske MRSA sposobne da prežive i inficiraju MG63 ćelije u prisustvu vankomicina. Bakterije iz unutarćelijske infekcije bile su znatno bolje sposobne da prežive te lekove vankomicinom nego slobodne bakterije u tim uslovima. Infekcija 3x10<4>CFU intracelularnih bakterija dala je 8.7x10<3>CFU unutarćelijskih bakterija 1 dan nakon infekcije. Infekcija sličnom dozom slobodnih bakterija dala je samo 375 unutarćelijskih bakterija 1 dan nakon infekcije, što ukazuje da su intracelularne bakterije do 20 puta bolje preživele od slobodnih bakterija. Sve doze infekcije povratile su više intracelularnih bakterija (između 1.5 i 6 puta) kada su udubljenja izvađena 1 dan u odnosu na 4 sata nakon infekcije. Budući da vankomicin potpuno inhibira rast kada se doda slobodnom MRSA (Slika 1), ovi podaci sugerišu da se MRSA mora ponavljati neko vreme uprkos stalnom izlaganju vankomicinu u podlozi za kultivisanje. Iako se MRSA ne replicira značajno unutar mišjih makrofaga (naša neobjavljena zapažanja), postoje značajni dokazi da je S. aureus sposoban da izbegne fagolizom i umnoži se unutar citoplazme nefagocitnih tipova ćelija (Jarry, T. M., G. Memmi, i dr. (2008) Cell Microbiol 10(9):1801-1814). Zajedno gornja zapažanja sugerišu da čak i pod stalnom izloženošću vankomicinu, slobodna MRSA može inficirati ćelije, a unutarćelijski MRSA može se prebaciti iz jedne ćelije u drugu ćeliju. Ova zapažanja otkrivaju potencijalni mehanizam za održavanje i čak širenje infekcije do kojih može doći u prisustvu stalne terapije antibioticima.
Primer 19 Modeli in vivo infekcije.
[0397] Peritonitis Model. 7-nedeljni ženski A/J miševi (Jackson Laboratories) inficirani su peritonealnom injekcijom sa 5x10<7>CFU USA300. Miševi su žrtvovani 2 dana posle infekcije i peritoneum je ispran sa 5 mL fiziološkog rastvora puferisanog hladnog fosfata (PBS). Bubrezi su homogenizovani u 5 mL PBS kako je opisano ispod za model intravenske infekcije. Peritonealni ispiranja su centrifugirana 5 minuta pri 1,000 o/min na 4°C u stolnoj centrifugi. Supernatant je sakupljen kao vanćelijske bakterije, a ćelijski pelet koji sadrži peritonealne ćelije je sakupljen kao unutarćelijska frakcija. Ćelije su tretirane sa 50 µg/mL lizostafina tokom 20 minuta na 37 °C da bi se ubile kontaminirajuće vanćelijske bakterije. Peritonealne ćelije su isprane 3x ledenim PBS da bi se uklonio lizostafin pre analize. Da bi se računao broj unutarćelijskih CFU, peritonealne ćelije su lizirane u HB (Hanks balansirani rastvor soli sa dodatkom 10 mM HEPES i .1% goveđeg serumskog albuma) sa 0.1% Triton-X, a serijska razblaženja lizata su napravljena u PBS sa 0.05% tween-20.
[0398] Model intravenske infekcije: 7-nedeljni ženski miševi korišćeni su za sve in vivo eksperimente, a infekcije su izvedene intravenskom injekcijom u repnu venu. A/J miševi (Jackson Lab) zaraženi su dozom 2x10<6>CFU. Balb/c miševi (Charles River Laboratories, Hollister, CA) inficirani su dozom 2x10<7>CFU. Za ispitivanja koja su ispitivala ulogu konkurentskih humanih IgG (SCID IVIG model), CB17.SCID miševi (Charles River Laboratories, Hollister, CA) bili su rekonstituisani sa GammaGard S/D IGIV imuni globulin (ASD Healthcare, Brooks KY) koristeći režim doziranja optimizovan da se postignu konstantni nivoi seruma od > 10 mg/mL humanog IgG. IGIV je primenjen sa početnom intravenoznom dozom od 30 mg po mišu, a zatim drugom dozom od 15 mg/mišom intraperitonealnom injekcijom nakon 6 sati, i sledećim dnevnim dozama od 15 mg po mišu intraperitonealnom injekcijom 3 dana zaredom. Miševi su inficirani 4 sata posle prve doze IGIV sa 2x10<7>CFU MRSA razređenim u fiziološkom puferu punjenim fosfatom intravenskom
1 1
injekcijom. Miševi koji su primili vankomicin lečeni su dva puta dnevno intraperitonealnim injekcijama od 100 mg/kg vankomicina počevši između 6 i 24 sata nakon infekcije tokom trajanja ispitivanja. Eksperimentalni terapeutici (AAC, anti-MRSA antitela ili slobodni dimetil-pipBOR antibiotik) su razblaženi u fiziološkom puferu i primenjeni jednom intravenskom injekcijom 30 minuta do 24 sata posle infekcije. Svi miševi su žrtvovani 4 dana nakon infekcije, a bubrezi su sakupljeni u 5 mL fiziološke otopine puferirane fosfatima. Uzorci tkiva su homogenizovani korišćenjem GentleMACS Dissociator™ (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Ukupan broj bakterija oporavljenih po mišu (2 bubrega) određen je nanošenjem serijskih razblaživanja homogenata tkiva u PBS .05% Tween na triptični sojin agar sa 5% defibrinirane ovčje krvi.
Primer 20 Test oslobađanja Katepsin/Kaspaze
[0399] Da bi se utvrdila količina aktivnog antibiotika oslobođenog iz AAC posle tretmana katepsinom B, AAC je razblažen do 200 µg/mL u katepinskom puferu (20 mM natrijum acetata, 1 mM EDTA, 5 mM L-cisteina). Videti: stranica 863 Dubowchik i dr. (2002) Bioconj. Chem. 13:855-869. Katepsin B (iz goveđe slezine, SIGMA C7800) je dodat u 10 µg/mL, a uzorci su inkubirani tokom 1 sata na 37 °C. Kao kontrola, AAC se inkubira samo u puferu. Reakcija je zaustavljena dodavanjem 10 količina medijuma za rast bakterija, triptičnog sojinog agara pH 7.4 (TSB). Da bi se procenilo ukupno oslobađanje aktivnog antibiotika, napravljena su serijska razblaženja reakcione smeše u četvorostrukom u TSB u pločicama sa 96 udubljenja i USA300 soj S. aureus je dodat u svako udubljenje sa krajnjom gustinom 2x10<3>CFU/mL. Kulture su inkubirane tokom noći na 3 °C uz mućkanje i rast bakterija je meren apsorpcijom očitanja na 630 nM pomoću čitača ploča.
Primer 21 Proizvodnja anti-WTA antitela
Generacija, skrining i selekcija antitela
[0400] Skraćenice: MRSA (S. aureus otporan na meticilin); MSSA (S. aureus osetljiv na meticilin); VISA (S. aureus otporan na međujedinjenje vankomicina); LTA (lipoteihoinska kiselina); TSB (triptični sojin agar); CWP (pripremanje ćelijskog zida).
[0401] Humana IgG antitela klonirana su iz perifernih B ćelija kod pacijenata posle infekcije S. aureus korišćenjem Simplex™ tehnologije (Simphogen, Lyngby, Danska) koja čuva kognitivno uparivanje teških i lakih lanaca, kao što je opisano u US 8,283,294: "Method for cloning cognate antibodies"; Meijer PJ i dr.. Journal of Molecular Biology 358:764-772 (2006); i Lantto J i dr.. J Virol.85(4):1820-33 (Feb 2011); Ćelije plazme i memorije korišćene su kao genetski izvor rekombinantnih IgG repertoara celom dužinom. Pojedinačni kloni antitela su eksprimirani transfekcijom ćelija sisara kao što je opisano u Meijer PJ, i dr.. Methods in Molecular Biology 525:261-277, xiv. (2009). Supernatanti koji sadrže IgG1 antitela pune dužine su sakupljeni nakon sedam dana i korišćeni su za testiranje vezanja antigena indirektnim ELISA u primarnom skriningu. Stvorena je biblioteka mAbs koja pokazuje pozitivno vezanje ELISA na preparate ćelijskog zida iz sojeva S.300 ili Wood46 soja S. aureus. Antitela su zatim proizvedena u 200 ml prolaznim transfekcijama i prečišćena hromatografijom Protein A (MabSelect SuRe, GE Life Sciences, Piscataway, NJ) radi daljeg testiranja. Za veću proizvodnju antitela, antitela su proizvedena u CHO ćelijama. Vektori koji kodiraju VL i VH transficirani su u CHO ćelije i IgG je prečišćen iz podloge ćelijske kulture pomoću afinitetne hromatografije proteina A.
Tabela 7: Lista antigena korišćenih za izolovanje Abs
[0402] Slika 6 sumira primarni skrining antitela pomoću ELISA. Svi (osim 4569) izolovani su kada su ekranizovani preparativnom smešom USA300 ćelijskog zida (osiromašeno gvožđe:TSB u odnosu 96:4). Svi GlcNAc beta (osim 6259), SDR i PGN (4479) mAbs su takođe bili pozitivni na PGN i WTA u primarnom
1 2
skriningu. Sva GlcNAc alfa pronađena je isključivo skriningom za vezivanje sa USA300 CW miksom. Pronalazak 4569 (specifičan za LTA) pretragom na Wood46 CVP.
Izbor anti-WTA mAb iz biblioteke korišćenjem ex vivo protočne citometrije
[0403] Svaki mAb u ovoj biblioteci je ispitivan za tri kriterijuma odabira: (1) relativni intenzitet vezivanja mAb na površinu MRSA, kao pokazatelj velike ekspresije odgovarajućeg kognitivnog antigena koji bi pogodovao visokoj isporuci antibiotika; (2) konzistentnost vezivanja mAb za MRSA izolovanu iz raznih vrsta inficiranih tkiva, kao pokazatelj stabilne ekspresije kontnog antigena na površini MRSA in vivo tokom infekcija; i (3) sposobnost vezivanja mAb za ploču kliničkih sojeva S. aureus, kao pokazatelj očuvanja ekspresije kontnog površinskog antigena. U tu svrhu, protočna citometrija korišćena je za ispitivanje svih ovih prethodno odabranih supernatanta kulture mAbs u biblioteci na reaktivnost sa S. aureus iz različitih inficiranih tkiva i iz različitih sojeva S. aureus.
[0404] Svi mAbs u biblioteci analizirani su na njihovu sposobnost da vežu MRSA iz inficiranih bubrega, slezine, jetre i pluća miševa koji su bili inficirani MRSA USA300; i unutar srca ili bubrega od kunića koji su bili inficirani USA300 COL u modelu endokarditisa kunića. Kapacitet antitela da prepozna S. aureus iz raznih inficiranih tkiva povećava verovatnoću da je terapeutsko antitelo aktivno u velikom broju različitih kliničkih infekcija sa S. aureus. Bakterije su analizirane odmah po žetvi organa, tj. bez subkulture, kako bi se sprečile fenotipske promene izazvane uslovima in vitro kulture. Ranije smo primetili da je nekoliko površinskih antigena S. aureus, iako se eksprimiralo tokom in vitro kulture, izgubilo ekspresiju u inficiranim tkivima. Antitela usmerena protiv takvih antigena ne bi bila korisna za lečenje infekcija. Tokom analize ove biblioteke mAb na raznim inficiranim tkivima, ovo zapažanje je potvrđeno za značajan broj antitela koja su pokazala značajno vezanje bakterija S. aureus iz kulture, ali odsustvo vezivanja za bakterije iz svih testiranih inficiranih tkiva. Neka antitela se vezuju za bakterije iz nekih, ali ne svih testiranih inficiranih tkiva. Stoga smo u predmetnom pronalasku izabrali za antitela koja su bila u stanju da prepoznaju bakterije iz svih testiranih stanja infekcije. Parametri koji su procenjeni bili su (1) relativni intenzitet fluorescencije, kao merilo za obim antigena; (2) broj organa koji su obojeni pozitivno, kao merilo stabilnosti ekspresije antigena; i (3) sposobnost vezivanja mAb za ploču kliničkih sojeva S. aureus, kao pokazatelj očuvanja ekspresije kontnog površinskog antigena. Intenzitet fluorescencije ispitivanih antitela određen je u odnosu na izotipsko kontrolno antitelo koje je usmereno protiv nerelevantnog antigena, na primer, IgG1 mAb anti-herpes virus gD:5237 (referenca dole). mAbs protiv WTA-beta ne samo da je pokazao najveće obilje antigena, već je pokazao i veoma konzistentno vezivanje za MRSA iz svih inficiranih tkiva testiranih i iznad navedenih.
[0405] Pored toga, testirali smo sposobnost ovih mAbs da se vezuju za sledeće sojeve S. aureus, koji su kultivisani in vitro u TSB: USA300 (MRSA), USA400 (MRSA), COL (MRSA), MRSA252 (MRSA), Wood46 (MSSA), Rosenbach (MSSA), Newman (MSSA), i Mu50 (VISA). Otkriveno je da anti-WTA beta mAbs, ali ne i anti-WTA alfa mAbs, deluju sa svim tim sojevima. Analiza vezivanja za različite sojeve pokazala je da je WTA beta sačuvaniji od WTA alfa i samim tim je pogodniji za AAC.
[0406] Primer 22 Karakterizacija antitela sa specifičnošću za teihoinske kiseline zida na S. aureus.
i) Potvrđivanje WTA specifičnosti Abs
[0407] Preparati ćelijskih zidova (CWP) od soja divljeg tipa S. aureus (WT) i mutiranog soja S. aureus koji nedostaje WTA (ΔTagO; soj bez WTA) je generisan inkubiranjem 40 mg peleta S. aureus sa 1 mL 10 mM Tris-HCl (pH 7.4) sa 30% rafinoze, 100 µg/ml lizostafina (Cell Sciences, Canton, MA) i koktel sa inhibitorima proteaze bez EDTA (Roche, Pleasanton, CA), tokom 30 minuta na 37 °C. Lizati su centrifugirani na 11,600 x g tokom 5 minuta, a supernatanti koji sadrže komponente ćelijskog zida su sakupljeni. Za imunoblotsku analizu, proteini su razdvojeni na 4-12% Tris-glicin gelu i prebačeni na nitroceluloznu membranu (Invitrogen, Carlsbad, CA), zatim blotovanjem naznačenim test antitelom protiv WTA, ili sa kontrolnim antitelom protiv PGN i LTA.
[0408] Imunobloting pokazuje da se antitela protiv WTA vezuju na preparate WT ćelijskog zida iz WT S. aureus, ali ne i na preparate ćelijskih zidova iz ΔTagO soja kojem nedostaje WTA. Kontrolna antitela protiv peptidoglikana (anti-PGN) i lipoteihoinske kiseline (anti-LTA) dobro se vezuju za oba preparata ćelijskog zida. Ovi podaci ukazuju na specifičnost test antitela protiv WTA.
ii) Citometrijom protoka da se odredi stepen vezivanja mAb na površinu MRSA
[0409] Ekspresija površinskog antigena na čitavim bakterijama iz inficiranog tkiva analizirana je protočnom citometrijom sledećim protokolom. Za bojenje antitela bakterija iz inficiranog mišjeg tkiva, ženskim miševima
1
C57B1/6 starim 6-8 nedelja (Charles River, Wilmington, MA) ubrizgano je intravenski sa 10<8>CFU log3 faze uzgojene USA300 u PBS. Miševi su uzeti dva dana nakon infekcije. Inficirani endokarditis kunića (IE) ustanovljen je kao što je prethodno opisano u Tattevin P. i dr. Antimicrobial agents and chemotherapy 54: 610-613 (2010). Zečevima su ubrizgane intravenski 5x10<7>CFU stacionarnog faza MRSA uzgajanog COL, a srčane vegetacije su skupljene osamnaest sati kasnije. Tretman sa 30 mg/kg vankomicina primenjen je intravenski b.i.d.18 h nakon infekcije sa stacionarnom fazom 7x10<7>CFU
[0410] Da bi se lizirale mišje ili zečje ćelije, tkiva su homogenizovana u M epruvetama (Miltenyi, Auburn, CA) korišćenjem nežnog MACS ćelijskog disocijatora (Miltenyi), a zatim je inkubirana 10 minuta na RT u PBS koja sadrži 0.1% Triton-X100 (Thermo), 10 µg/mL DNAseI (Roche) i Potpuni mini koktel sa inhibitorima proteaze (Roche). Suspenzije su propuštene kroz filter od 40 mikrona (BD), i isprane sa HBSS bez fenol crvenog uz dodatak 0.1% bez GG BSA (Sigma) i 10 mM Hepes, pH 7.4 (HB pufer). Sledeće bakterijske suspenzije inkubiraju se sa 300 µg/mL zečjeg IgG (Sigma) u HB puferu tokom 1 sata na sobnoj temperaturi (RT) da se blokira nespecifično vezivanje IgG. Bakterije su obojene sa 2 µg/mL primarnih antitela, uključujući rF1 ili IgG1 mAb anti-herpes virus kontrole gD:5237 (Nakamura GR i dr.., J Virol 67: 6179-6191 (1993)), a sledeće sa fluorescentnim anti-humanim IgG sekundarnim antitelima (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA). Da bi se omogućila diferencijacija bakterija od krhotina miša ili zečeva, izvršeno je dvostruko bojenje korišćenjem mišjeg mAb 702 anti-S. aureus 20 µg/mL peptidoglikana (Abcam, Cambridge, MA) i sekundarno antitelo IgG mišjeg obeleženog fluorohromom (Jackson Immunoresearch). Bakterije su isprane i analizirane od FACSCalibur (BD). Tokom analize protočne citometrije, bakterije su postavljene za pozitivno bojenje mAb 702 sa parcela sa dvostrukom fluorescencijom.
iii) Merenje afiniteta vezivanja za S. aureus i gustinu antigena na MRSA
[0411] Tabela 8 prikazuje analizu ravnotežnog vezivanja MRSA antitela koja se vezuju za soj Newman-ΔSPA i gustine antigena na bakteriji.
Tabela 8
[0412] Gustina KDi antigena izvedena je korišćenjem radioligand testa vezivanja ćelija pod sledećim uslovima ispitivanja: DMEM 2.5% pufer za vezivanje mišjeg seruma; vezivanje rastvora tokom 2 sata na sobnoj temperaturi (RT); i koristeći 400,000 bakterija/bunar.
[0413] Ab 6263 je 6078 sličan po tome što su sekvence veoma slične. Izuzev drugog ostatka (R prema G) u CDR H3, sve ostale CDR sekvence L i H lanca su identične.
Primer 23 Inženjerski mutanti WTA antitela
[0414] Ukratko, VH region svakog anti-WTA beta Abs je kloniran i povezan sa humanim H lancem konstantnim regionom i VL povezan sa kappa konstantnim regionom da bi izrazio Abs kao IgGl. U nekim slučajevima sekvence divljeg tipa su izmenjene na određenim pozicijama da bi se poboljšala stabilnost antitela kao što je opisano u daljem tekstu. Zatim su generisani cistein projektovani Abs (ThioMabs).
i. Povezivanje promenljivih regiona sa konstantnim regionima
[0415] VH regioni WTA beta Abs identifikovani iz gornje biblioteke humanih antitela bili su povezani sa humanim γ1 konstantnim regionima da bi se napravio IgG1 Abs po celoj dužini. L lanci su bili lanci kappa L. ii. Generisanje varijanti stabilnosti
[0416] WTA Abs na Slici 14 (videti naročito Slike 15A, 15B, 16A, 16B) napravljeni su radi poboljšanja
1 4
određenih svojstava (kao što su izbegavanje deamidacije, izomerizacije aspartanske kiseline, oksidacije ili N-vezane glikozilacije) i testirani na zadržavanje vezivanje antigena, kao i hemijska stabilnost nakon zamena aminokiselina. Jednolančana DNK klonova koji kodiraju teške ili lagane lance je pročišćena od čestica faga M13KO7 uzgojene u ćelijama E. coli CJ236 pomoću QIAprep Spin M13 kompleta (Qiagen).5' fosforilisani sintetički oligonukleotidi sa sekvencama:
5'- CCCAGACTGCACCAGCTGGATCTCTGAATGTACTCCAGTTGC- 3' (SEQ ID NO.152)
5'- CCAGACTGCACCAGCTGCACCTCTGAATGTACTCCAGTTGC- 3' (SEQ ID NO.153)
i
5'- CCTGGCCCCAGTCGTCAAGTCCTCCTTCACCTCTTGCACAGTAATAGACAGC-3' (SEQ ID NO. 155) (IUPAC kodovi)
korišćeni su za mutiranje klonova koji kodiraju antitela mutagenezom usmerenom na oligonukleotid kao što je opisano mutagenezom specifičnom za lokaciju sledeći metodologiji opisanoj u Kunkel, T.A. (1985). Brza i efikasna mutageneza specifična za lokaciju bez fenotipske selekcije. Zbornik radova Nacionalne akademije nauka SAD 82(2): 488-492. Mutagenizovana DNK korišćena je za transformisanje E. Coli XL1-plavih ćelija (Agilent Technologies) i premeštena na ploče Luria supe koje sadrže 50 µg/ml Karbenicilina. Kolonije su pojedinačno ubrane i uzgajane u tečnoj podlozi Luria supe koja sadrži 50 µg/ml karbenicilina. Miniprep DNK je sekvencioniran da bi se potvrdilo prisustvo mutacija.
[0417] Za Ab 6078, druga aminokiselina u VH, sastana (met-2), je sklona oksidaciji. Zbog toga je met-2 mutiran na Ile ili Val, da se izbegne oksidacija ostatka. Pošto promena met-2 može uticati na afinitet vezivanja, mutanti su testirani na vezivanje na Staph CWP pomoću ELISA.
[0418] Otkriveno je da motivi CDR H3 "DG" ili "DD" imaju tendenciju da se transformišu u izo-asparaginsku kiselinu. Ab 4497 sadrži DG u CDR H3 pozicijama 96 i 97 (videti Sliku 18B) i izmenjen je radi stabilnosti. CDR H3 je uglavnom kritičan za vezanje antigena, pa je testirano nekoliko mutanata na vezivanje antigena i hemijsku stabilnost (videti Sliku 18A). Mutant D96E (v8) zadržava vezivanje za antigen, slično divljom tipu Ab 4497 (Slika 18A; Slika 18B), i stabilna je i ne formira izo-asparaginsku kiselinu.
Staph CWP ELISA
[0419] Za analizu mutanata sa 6078 antitela, preparat koji je tretiran lizostafinom USA300 ΔSPA S. aureus ćelijski otvor (WT) koji se sastoji iz IX109 bagova/ml razblažen je 1/100 u 0.05 natrijum-karbonata pH 9.6 i premazan na ELISA ploče sa 384 udubljenja (Nunc; Neptun, NJ) tokom inkubacije preko noći na 4°C. Ploče su isprane sa PBS plus 0.05% Tween-20 i blokirane tokom dvočasovne inkubacije sa PBS plus 0.5% goveđeg serumskog albuma (BSA). Ova i sve sledeće inkubacije izvedene su na sobnoj temperaturi uz blago mešanje. Uzorci antitela su razređeni u uzorku/standardnom puferu za razblaživanje (PBS, 0.5% BSA, 0.05% Tween 20, 0.25% CHAPS, 5 mM EDTA, 0.35M NaCl, 15 ppm Proclin, (pH 7.4)), dodati u oprane ploče i inkubirati tokom 1.5 do 2 sata. Ploča vezana anti-S. aureus antitela otkrivena su tokom jednosatne inkubacije sa kozjim anti-humanim fragmentom IgG(Fc) F(ab')2 konjugiranim peroksidazom (Jackson ImmunoResearch; West Grove, PA) razblažen do 40 ng/mL u puferu za ispitivanje (PBS, 0.5% BSA, 15 ppm Proclin, 0.05% Tween 20). Posle konačnog ispitanja, dodat je tetrametil benzidin (KPL, Gaithersburg, MD), boja je razvijana 5-10 minuta, a reakcija je zaustavljena sa 1M fosfornom kiselinom. Ploče su očitane na 450 nm sa referencom 620 nm koristeći čitač mikroploča.
iii. Generisanje Cys projektovanih mutanata (ThioMabs)
[0420] ThioMabs pune dužine proizvedeni su uvođenjem cisteina u H lanac (u CHI) ili L lanac (Ck) na unapred određenom položaju, kao što je prethodno opisano i opisano u nastavku da se omogući konjugacija antitela sa međujedinjenjem veznik-antibiotik. H i L lanci se tada kloniraju u odvojene plazmide, a plazmidi koji kodiraju H i L zajedno transfektuju se u 293 ćelije gde su eksprimirani i montirani u netaknuti Abs. Oba H i L lanca se takođe mogu klonirati u isti ekspresijski plazmid. IgG1 su napravljeni sa 2 inženjerska Cys, po jedan u H lancima ili 2 projektovana Cys, po jedan u svakom od L-lanaca, ili kombinacija 2 H i 2L lanca sa inženjerskim Cys (HCLCCys), generisani su izražavanjem željenog kombinacija lanaca cys mutanata i lanaca divljeg tipa.
[0421] Slike 15A i 15B prikazuju 6078 WT i mutirani Abs sa kombinacijom HC Cys i LC Cys. Mutanti 6078
1
su takođe testirani na njihovu sposobnost da vežu protein A sa USA300 Staph A sa preko noći kulturom. Iz rezultata FACS analize kao što je prikazano na Slici 19, mutirani Abs se vezuje USA300 slično 6060 WT (nepromenjenom) antitelu; promene aminokiselina u mutantima nisu smanjile vezivanje za Staph A. gD je nespecifično negativno kontrolno antitelo.
Primer 24 Priprema anti-WTA antitela-antibiotskih konjugata
[0422] Teihoinska kiselina protiv zida antitelo-antibiotik konjugata Tabela 3 pripremljena je konjugacijom anti-WTA antitela u međujedinjenju veznik-antibiotik, uključujući ona iz Tabele 2. Pre konjugacije, anti-WTA antitela su delimično redukovana TCEP korišćenjem standardnih postupaka u skladu sa metodologijom opisanom u WO 2004/010957. Delimično redukovana antitela su konjugovana sa međujedinjenjem veznikantibiotik korišćenjem standardnih postupaka u skladu sa metodologijom opisanom, npr., Doronina i dr.. (2003) Nat. Biotechnol. 21:778-784 i US 2005/0238649 A1. Ukratko, delimično redukovana antitela su kombinovana sa međujedinjenjem veznik-antibiotik da bi se omogućila konjugacija međujedinjenja veznikantibiotik sa smanjenim ostacima cisteina antitela. Reakcije konjugacije su ugašene i AAC je prečišćen. Utvrđeno je antibiotsko opterećenje (prosečan broj ostataka antibiotika po antitelu) za svaki AAC i bilo je između oko 1 do oko 2 za antitela protiv zida teihoinske kiseline koja su proizvedena sa jednim mutantnim mestom cisteina.
[0423] Redukcija/oksidacija tiomaba za konjugaciju: Monoklonalna antitela proizvedena cisteinom (ThioMabs - Junutula, i dr.., 2008b Nature Biotech., 26(8):925-932; Dornan i dr. (2009) Blood 114(13):2721-2729; US 7,521,541; US 7,723,485; WO2009/052249, Shen i dr. (2012) Nature Biotech., 30(2):184-191; Junutula i dr. (2008) Jour of Immun. Methods 332:41-52) eksprimirane u CHO ćelijama su smanjene sa oko 20-40 puta viška TCEP (tris (2-karboksietil) fosfin hidrohlorid ili DTT (ditiotritol) u 50 mM Tris pH 7.5 sa 2 mM EDTA tokom 3 sata na 37 °C ili preko noći na sobnoj temperaturi.(Getz i dr. (1999) Anal. Biochem. Vol 273:73-80; Soltec Ventures, Beverly, MA). Redukovani ThioMab je razblažen i napunjen na HiTrap S kolonu u 10 mM natrijum acetata, pH 5 i eluiran sa PBS koji sadrži 0.3M natrijum hlorida. Alternativno, antitelo je zakišeljeno dodatkom 1/20 zapremine 10% sirćetne kiseline, razblaženo sa 10 mM sukcinata pH 5, napunjeno na kolonu i zatim isprano sa 10 zapremina kolonskog sukcinatnog pufera. Kolona je eluirana sa 50 mM Tris pH 7.5, 2 mM EDTA.
[0424] Eluirani redukovani ThioMab je tretiran sa 15 puta molarnim viškom DHAA (dehidroaskorbinska kiselina) ili 200 nM vodenim sulfatom bakra (CuSO4). Oksidacija međulančanih disulfidnih veza bila je potpuna za oko tri sata ili više. Oksidacija ambijentalnog vazduha je takođe bila efikasna. Reoksidovano antitelo je dijalizirano u 20 mM natrijum sukcinata pH 5, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA i skladišteno smrznuto na -20 °C.
[0425] Konjugacija Thio-Mabs sa međujedinjenjem veznik-antibiotik: Deblokirana, reoksidirana, tio-antitela (ThioMab) su reagovala sa 6-8 puta molarnim viškom vezanja-antibiotik međujedinjenja Tabele 2 (iz DMSO zaliha u koncentraciji 20 mM) u 50 mM Tris, pH 8, do reakcija je završena (16-24 sata) kako je utvrđeno LC-MS analizom reakcione smeše.
[0426] Sirovi antitelo-antibiotički konjugati (AAC) su zatim naneti na kolonu za razmenu katjonima posle razblaživanja sa 20 mM natrijum-sukcinata, pH 5. Kolona je isprana sa najmanje 10 zapremina kolone od 20 mM natrijum sukcinata, pH 5, i antitelo je eluirano sa PBS. AAC su formulisani u 20 mM His/acetat, pH 5, sa 240 mM saharoze, koristeći gel filtracione kolone. Za AAC je karakteristična UV spektroskopija za određivanje koncentracije proteina, analitička SEC (hromatografija za isključivanje veličine) za analizu agregacije i LC-MS pre i posle tretmana endopeptidazom lizin C.
[0427] Ekskluziona hromatografija veličine izvedena je korišćenjem Shodex KW802.5 kolone u 0.2M kalijum-fosfatu pH 6.2 sa 0.25 mM kalijum hlorida i 15% IPA pri protoku od 0.75 ml/min. Stanje agregacije AAC je određeno integriranjem apsorbancije površine eluiranog vrha pri 280 nm.
[0428] LC-MS analiza izvedena je korišćenjem Agilent QTOF 6520 ESI instrumenta. Kao primer, AAC generisan ovom hemijom je tretiran sa 1:500 w/w Endoproteinaza Lys C (Promega) u Trisu, pH 7.5, tokom 30 minuta na 37 °C. Rezultujući fragmenti deljenja su stavljeni na 1000A, 8 um PLRP-S kolonu zagrevanu do 80 °C i eluiranu sa gradijentom od 30% B do 40% B u 5 minuta. Mobilna faza A: H2O sa 0.05% TFA. Mobilna faza B: acetonitril sa 0.04% TFA. Protok: 0.5ml/min. Elucija proteina je praćena otkrivanjem apsorpcije UV na 280 nm pre jonizacije elektrosprejom i MS analizom. Obično je postignuta hromatografska rezolucija nekonjugovanog Fc fragmenta, rezidualnog nekonjugovanog Fab i antibiotika-Fab. Dobijeni m/z spektri dekonvolucionisani su korišćenjem Mass Hunter™ softvera (Agilent Technologies) za izračunavanje mase
1
fragmenata antitela.
Primer 25 Identifikacija i prečišćavanje stafopaina B kao proteaze odgovorne za deljenje
[0429] Supernatant iz 3 litarske kulture Wood46 preko noći je koncentrovan i pufer izmenjen pomoću TFF (10kDa) u 50 mM natrijum-fosfata pH 7. Uzorak je nanet na K Sefarozu FF i proteini su odvojeni hromatografski, koristeći gradijent od 0-300 mM NaCl u 50 mM natrijum-fosfata pH 7. Aktivne frakcije su identifikovane inkubacijom sa tioFAB S4497-MC-GGAFAGGG-(pipBOR) ("peptid jezgra" obelodanjen kao SEQ ID NO:126) sa Slike 27 i procena deljenje veznika na očekivanom mestu pomoću LC-MS analize. Aktivne frakcije su sakupljene i dopunjene amonijum sulfatom do koncentracije 2M. Proteini su dalje prečišćeni hidrofobnom hromatografijom za interakciju na Fenil Sefarozi korišćenjem gradijenta 2-0M amonijum sulfata u 50 mM TRIS pH 7.5. Ponovo su identifikovane aktivne frakcije korišćenjem alatnog jedinjenja. Ove frakcije su skupljene i dalje prečišćene na Mono K u 50 mM natrijum acetata pH 5.5 korišćenjem gradijenta soli od 0-1M NaCl. Aktivne frakcije iz ovog koraka hromatografije identifikovane su kao i ranije, sakupljene i primenjene na ekskluzionu hromatografiju veličine u PBS. Identifikovane su aktivne frakcije i utvrdile su da sadrže jedan jedini protein koji sadrži SDS-PAGE.
[0430] Obogaćene aktivne frakcije iz prečišćavanja Q sefaroze su okarakterisane da bi se identifikovala klasa proteaze koja je odgovorna za aktivnost. Otkriveno je da proteazu inhibira N-etilmaleimid, što ukazuje da je taj enzim verovatno cisteinska proteaza. Nakon pregleda poznatih izlučenih cisteinskih proteaza Staphylococcus aureus, ustanovljeno je da stafopain B ima specifičnu supstratnu specifičnost kao specifičnost koja je primećena na skriningu REPLi (Kalinska, M., T. Kantyka, i dr.. (2012). Biochimie 94(2): 318). Prečišćen stafopain B je kupljen (Sigma-Aldrich) i inkubiran sa tioFAB S4497-MC-GGAFAGGG-(pipBOR) ("peptid jezgra" obelodanjen kao SEQ ID NO:126) sa Slike 27. Otkriveno je da stafopain B deli vezu na istom mestu gde je aktivna proteaza prečišćena od Wood46 supernatanta. Stafopain B i aktivna proteaza prečišćena od supernatanta kulture inkubirani su sa maleimidom Aleka Fluor® 488 C5(Invitrogen, Life Technologies, Thermo Fisher Scientific Inc.) da bi se obeležili cisteini na aktivnom mestu. Uzorci su vođeni na SDS-PAGE radi identifikacije proteaze kao stafopaina B. SDS-PAGE gelovi aktivnih frakcija iz prečišćavanja SEC provedeni su uporedo sa prečišćenim stafopainom B, sa i bez Alexa Fluor 488.
[0431] Obogaćene aktivne frakcije za pročišćavanje Q sefaroze su takođe analizirane proteomskom masenom spektrometrijom. Deset mikrograma aktivnih frakcija B11, B12 i C02 i deset mikrograma aktivne frakcije, 1, 2, 3 i deset mikrograma neaktivne frakcije uključeno je na SDS-PAGE. Trake su izrezane i podvrgnute preko noći probavi tripsina. Digestirani uzorci su analizirani pomoću LC-MS/MS i rezultati tandemskih masenih spektra predati su za pretraživanje baze podataka koristeći algoritam pretraživanja Mascot. Stafopain B bio je udarni hit cisteinskih proteaza prisutnih u aktivnim frakcijama. Autolizin, koji je takođe cisteinska proteaza, takođe se pojavljuje kao vrhunski hit, a najveće obilje jedinstvenih peptida nastaje u neaktivnoj frakciji, negativna kontrola, pa je autolizin izostavljen iz razmatranja. Masna spektralna proteomska analiza aktivnih frakcija iz prečišćenja Q Sepharose pokazuje veliko izobilje stafopaina B. Podaci o mirovanju su filtrirani za proteine S. aureus i rangirani po broju peptida u aktivnoj frakciji 1.
[0432] Aktivna proteaza je prečišćena od supernatanta kulture Wood46 S. aureus. Ćelije su uzgajane preko noći na 37°C u 3 litre TSB. Ćelije su uklonjene centrifugiranjem na 10,000 x g tokom 10 min. Supernatant je sakupljen i propušten kroz dva 0.22um filtera. Zatim je koncentrovana i pufer izmenjen u 50mM Natrijum Fosfat pH 7 korišćenjem TFF sa 10 kD membranom. Uzorak je koncentrovan desetostruko do zapremine 300ml. Uzorak je nanet na K Sefarozu FF (GE Healthcare Biosciences AB) i proteini su odvojeni hromatografski, koristeći gradijent od 0-300 mM NaCl u 50 mM natrijum-fosfata pH 7. Aktivne frakcije su sakupljene i dopunjene amonijum sulfatom do koncentracije 2M. Proteini su dalje prečišćeni hidrofobnom hromatografijom za interakciju na Fenil Sefarozi (GE Healthcare Biosciences AB) korišćenjem gradijenta 2-0M amonijum sulfata u 50 mM TRIS pH 7.5. Aktivne frakcije su skupljene i dalje prečišćene na Mono Q (GE Healthcare Biosciences AB) u 50 mM natrijum acetata pH 5.5 korišćenjem gradijenta soli od 0-1M NaCl. Aktivne frakcije iz ovog koraka hromatografije identifikovane su kao i ranije, sakupljene i primenjene na ekskluzionu hromatografiju veličine (Zenix-150, Sepax Technologies) u PBS.
[0433] Da bi se identifikovali frakcije koje sadrže našu aktivnu proteazu od interesa, 100ul iz svake frakcije je prebačeno na pločicu sa 96 udubljenja gde je inkubirana sa 25 ug THIOFAB 4497 mal-GGAFAGGG-DNA31 („peptid jezgra“ obelodanjen kao SEQ ID NO:126). Frakcije iz svakog koraka hromatografije analizirane su na aktivnost i korišćeno je 100ul bez obzira na koncentraciju proteina. Uzorci su inkubirani preko noći na 37°C i potom analizirani pomoću LC-MS da bi se identifikovali frakcije na kojima je došlo do deljenja proteaze veznika-antibiotika. Izmerene aktivne frakcije sa Q Sepharose FF hromatografijom su merene tako da imaju
1
ukupnu koncentraciju proteina od 14 mg/ml.200 µg bazena je razblaženo na 2 mg/ml u PBS-u i inkubirano sa i bez N-etilmaleimida (NEM, Sigma) u koncentraciji od konačne koncentracije od 0.1 mM. Uzorci su inkubirani na sobnoj temperaturi tokom 1 sata. 25ug THIOFAB 4497 mal-GGGAFAGGG-DNA31 ("peptid jezgra" obelodanjen kao SEQ ID NO:126) je dodat u oba uzorka i inkubiran 2 sata na 37°C. Posle 2 sata, uzorci su analizirani pomoću LC-MS da bi se utvrdilo da li je došlo do deljenja proteaze veznika-antibiotika. Oko 50 ul aktivnih frakcija iz SEC-a inkubirano je tokom 1 sata sa 0.1 mM maleimida Alexa Fluor 488 C5(Invitrogen), bez obzira na koncentraciju proteina za obeležavanje. Testovi deljenja sa prečišćenim proteazama su izvršeni inkubacijom 5uM tioFAB konjugata sa 50nM proteazom u krajnjoj zapremini od 100 ul. Testovi su ili izvedeni u PBS pH 7.2, 4mM L-Cys, 2.5 mM EDTA ili 100mM Natrijum Citrat pH 5, 100mM NaCl, 4mM L-Cys, 2.5mM EDTA. Uzorci su inkubirani tokom 2 sata na 37°C. Nakon 2 sata, reakcije deljenja su ugašene razblaživanjem 1:1 sa 1% TFA. Uzorci su zatim izvršeni na LC-MS da bi se odredio procenat deljenja veznika. Procenat deljenja je određen integrisanjem A280hromatograma deljenih i netaknutih vrsta. Antibiotički ili hromoforski delovi dodani na C-kraju vezujućih elemenata daju značajnu hidrofobnost, tako da su tioFAB sa netaknutim vezama i tioFAB sa deljivim veznicima osnovni nivo razrešeni.
[0434] Za proteomsku analizu obogaćenih frakcija, deset mikrograma obogaćenih aktivnih frakcija iz Q pročišćavanja Sepahrose® (GE Healthcare Life Sciences) je stavljeno na 4-12% Bis-Tris gel (Life Technologies). Izrezane su čitave gel trake i podeljene su od vrha do dna u 11 traka. Trake gela su zadržane sa 50% acetonitril/50 mM amonijum bikarbonatom, redukovano ditiotreitolom (50mM krajnja koncentracija) tokom 30 minuta na 50 °C i alkilirano jodacetamidom (konačna koncentracija 50 mM) na sobnoj temperaturi u mraku tokom 30 minuta. Uzorci su zatim digestirani na 37 °C preko noći sa 0.02 µg/µl tripsina (Promega) u 50 mM amonijum bikarbonatu. Digestirani uzorci ubrizgavaju se u kapilarnu kolonu unutrašnjeg prečnika 100 µm (NanoAcquity UPLC kolona, 100µm x 100mm, 1.7 µm, BEH130 C18, Waters Corp) i razdvajaju se kapilarnom reverznom fazom hromatografijom na NanoAcquity UPLC sistemu (Waters Corp). Uzorci su napunjeni u 0.1% trifluorosirćetne kiseline u vodi i eluirani gradijentom 2-90% pufera B (gde pufer A je 0.1% mravlje kiseline/2% acetonitrila/98% vode i pufer B je 0.1% mravlje kiseline/2% voda/98% acetonitril) na 1.00 µl/min sa ukupnim vremenom analize od 45 minuta. Peptidi su eluirani direktno u LTQ-Orbitrap XL (ThermoFisher) masni spektrometar i jonizovani korišćenjem izvora ADVANCE (Michrom-Bruker) sa naponom raspršivanja od 1.4 kV. Podaci masenog spektra prikupljeni su metodom koja se sastoji od jednog potpunog skeniranja MS (375-1600 m/z) u Orbitrap-u pri rezoluciji od 60000 M/ΔM na m/z 400, nakon čega sledi disocijacija izazvana sudarom (CID) gornjih 8 najobičniji joni detektovani tokom potpunog skeniranja MS u ciklusu ponovljenom tokom LC gradijenta u linearnom jonskom zamku. Tandemski masni spektralni rezultati predati su za pretraživanje baze podataka koristeći Mascot® algoritam pretraživanja verzije 2.3.02 (Matrix Sciences) prema združenoj bazi podataka ciljanih mamaca, Uniprot ver 2010_12, koja se sastoji od proteina S. aureus i uobičajenih laboratorijskih kontaminanata. Podaci su pretraženi sa triptološkom specifičnošću, promenljivim modifikacijama cistein karbamidometilacije (+57.0215 Da) i oksidacijom metioninom (+15.995 Da), omogućujući 2 pogrešna razređivanja, 20 ppm mase preciznog jona i 0.5 Da frakcije tolerancije mase jona. Peptidni spektralni podudaranja su filtrirani pomoću algoritma linearnog diskriminiranja (LDA) do stope lažnog otkrivanja (FDR) od 1%.
Primer 26 Stafopain deljenje tioFab FRET peptida i AAC
[0435] 5µM od tioFAB 4497 MP-LAFGA-QSY7("peptid jezgra" obelodanjen kao SEQ ID NO:135) i tioFAB 4497 MP-LAFAA-QSY7 ("peptid jezgra" obelodanjen kao SEQ ID NO:136) (Slika 30) su inkubirani sa 50nM proteaze u PBS pH 7.2, 4mM L-Cys, 2.5 mM EDTA na 2 sata pri 37 °C. Nakon 2 sata, reakcije deljenja su ugašene razblaživanjem 1:1 sa 1% TFA. Uzorci su zatim izvršeni na LC-MS da bi se odredio procenat deljenja veznika. Sve testirane proteaze su odvojile dva veznika, mada na različitom stepenu i lokacijama (Tabela 4). Stafopain A i stafopain B dele veznike na istim mestima: MP-LAFG↓A-QSY7 ("peptid jezgra" obelodanjen kao SEQ ID NO:135) i P-LAFA↓A-QSY7("peptid jezgra" obelodanjen kao SEQ ID NO:136). Stafopain B postiže 100% deljenje oba veznika u ispitivanoj koncentraciji. Katepsin B je takođe postigao 100% deljenje za oba veznika pod ovim uslovima, iako su mesta deljenja pomešana. Katepsin B podeljen mal-LAFGA-QSY7 ("peptid jezgra" obelodanjen kao SEQ ID NO:135) ekskluzivno na MP-LAFG↓A-QSY7 ("peptid jezgra" obelodanjen kao SEQ ID NO:135), dok je delio mal-LAFAA-QSY7 ("peptid jezgra" obelodanjen kao SEQ ID NO:136) na oba MP-LAFA↓A-QSY7 ("peptid jezgra" obelodanjen kao SEQ ID NO:136) i P-LAFAA↓QSY7("peptid jezgra" obelodanjen kao SEQ ID NO:136). MP-LAFAA-QSY7 ("peptid jezgra" obelodanjen kao SEQ ID NO:136) deljenje stafopainom A je bilo 23%, dok je deljenje m MP-LAFGA-KSI7 ("peptid jezgra" obelodanjen kao SEQ ID NO:135) je 38%.
[0436] 5µM AAC-193 je inkubirano sa 50 nM proteaze bilo u PBS pH 7.2, 4 mM L-Cys, 2.5 mM EDTA ili
1
100 mM Natrijum citrat pH 5, 100 mM NaCl, 4 mM L-Cys, 2,5 mM EDTA za 2 sati na 37 °C. Nakon 2 sata, reakcije deljenja su ugašene razblaživanjem 1:1 sa 1% TFA. Uzorci su zatim izvršeni na LC-MS da bi se odredio procenat deljenja veznika. Optimizovani veznik-antibiotik efikasno je podeljen od strane svih testiranih proteaza. Posle deljenja stafopainom A i stafopainom B, oslobođen je slobodni piperazino-rifamicin. Stafopain B je postigao 100% deljenje i kod pH 5 i 7.2. Stafopain A je pokazao 100% deljenje pri pH5 i 64% deljenje pri pH 7.2.
Primer 27 Konjugat antitelo-antibiotik, tio-S4497 LC v8-MP-LAFG-PABC-(piperazinoBOR) ("peptid jezgra" obelodanjen kao SEQ ID NO:128) AAC-215, inhibira S. aureus in vitro:
[0437] 1x10<8>stacionarna faza Wood46 bakterija je suspendovana u 10 µL pufera HB (Hankov balansirani rastvor soli sa dodatkom 0.1% goveđeg serumskog albumina) koji sadrži 100 µg/mL tio-S4497 LC v8-MP-LAFG-PABC-(piperazinoBOR) („peptid jezgra" obelodanjen kao SEQ ID NO:128) AAC-215 ili tio-S4497-HC-A118C-MC-vc-PABC-(piperazBOR) AAC-126. Potonji koristi vezujući vabil-citrulin (vc) katepsin B koji se deli za davanje istog antibiotika.
[0438] Nakon 1 sata, uzorci su razblaženi 10 puta dodatkom 90 µL HB, ili 90 µL katepsina B (10 µg/mL katepsina B u 20 mM natrijum acetata, 1 mM EDTA, 5 mM L-cisteina pH 5) i inkubirati tokom 37 °C tokom dodatna 3 sata. Oslobađanje aktivnog antibiotika zaključeno je određivanjem da li inkubacija AAC sa bakterijama može da inhibira kasniji rast bakterija. Suspenzije bakterija/AAC primećene su direktno na ploče sa triptičnim sojinim agarom i rast bakterija je vizuelno prikazan nakon inkubacije preko noći na 37 °C. Aktivni lek se oslobađa iz AAC konjugovan sa MC-LAFG-PAB- (piperazinoBOR) ("peptid jezgra" obelodanjen kao SEQ ID NO:128) međujedinjenje veznik -antibiotik.
[0439] Bakterije koje su inkubirane bez AAC dobro su rasle i na njih nije uticao tretman katepsinom B. Bakterije tretirane AAC-126 koji sadrže vezujući deljivi katepsin B, valin-citrulin (vc) rasle su dobro nakon inkubacije u HB puferu, ali nisu uspevale da rastu nakon tretmana AAC-126 Katepsin B, što ukazuje da je za tretiranje enzimom potrebno da otpustiti aktivni antibiotik. Suprotno tome, bakterije inkubirane sa AAC-215 koji sadrži vezujući sloj LAFG koji se odvaja stafopainom (SEQ ID NO:128) nije uspevao da raste posle inkubacije samo sa HB puferom, što sugeriše da suspenzija bakterija sadrži enzimatsku aktivnost koja je bila dovoljna za oslobađanje aktivnog antibiotika iz vezujućeg AAC koji se razgrađuje stafopainom.
Primer 28 Konjugat antitelo-antibiotik, tio-S4497 HC v1-MP-LAFG-PABC-(piperazinoBOR) ("peptid jezgra" obelodanjen kao SEQ ID NO:128) AAC-193 ubija unutarćelijski MRSA u testu makrofaga:
[0440] USA300 soj S. aureus inkubiran je sa različitim dozama (100 µg/mL, 10 µg/mL, 1 µg/mL ili 0.1 µg/mL) S4497 samo antitela, tio-S4497 HC WT (v8) (SEQ ID NO:137), LC V205C-MC-vc-PAB-(dimetilpipBOR) ("peptid jezgra" obelodanjen kao SEQ ID NO:128) AAC-192, ili tio-S4497 HC v1-MP-LAFG-PABC-(piperazinoBOR) AAC-193 da bi se omogućilo vezivanje AAC na bakterije (Slika 31).
[0441] Posle jednosatne inkubacije, opsonizovane bakterije su hranjene makrofagovima od miševa i inkubirane 2 sata na 37°C da se dozvoli fagocitoza. Nakon završetka fagocitoze, infekciona mešavina je zamenjena sa normalnom podlogom za rast, dopunjenim sa 50 µg/mL gentamicina da bi se ubile preostale vanćelijske bakterije, a ukupan broj preživelih unutarćelijskih bakterija je određen dva dana kasnije nanošenjem serijskih razblaženja lizata makrofaga na triptične ploče od sojinog agara (Slika 31). AAC koji se odvaja stafopainom uspevao je da ubije unutarćelijsku USA300 sa sličnom potencijom u poređenju sa AAC koji se deli katepsinom B. Siva isprekidana linija označava granicu detekcije za test (10 CFU/udubljenju).
Primer 29 AAC ciljaju ubijanje antibiotika na S. aureus preko antigena specifičnog vezivanja antitela.
[0442] Odabran je Wood46 soj S. aureus, jer ne eksprimira protein A, molekul koji se vezuje za Fc region IgG antitela. Wood46 soj S. aureus inkubiran je sa 10 µg/mL ili 0.5 µg/m L S4497 antitela, izotip kontrolni-AAC
1
koji sadrži katepsin B deljivi veznik tio-trastuzumab HC A118C-MC-vc-PAB-(dimetil-pipBOR) AAC-101, tio-S4497 HC WT (v8), LC V205C-MC-vc-PAB-(dimetilpipBOR) AAC-192, Izotip kontrolni-AAC koji sadrži veznik tio-trastuzumab koji se može deliti od stafopaina HC A118C-MP-LAFG-PABC-(piperazinoBOR) ("peptid jezgra" obelodanjen kao SEQ ID NO:128) ili tio-S4497 HC v1-MP-LAFG-PABC-(piperazinoBOR) ("peptid jezgra" obelodanjen kao SEQ ID NO:128) AAC-193 u trajanju od 1 sata da se dozvoli vezivanje AAC na bakterije (Slika 32). Da bi se ograničilo nespecifično vezivanje AAC, opsonizovane bakterije su centrifugirane, isprane jednom i resuspendovane u puferu pre nego što su bile postavljene u mišje makrofage. Nakon završetka fagocitoze, infekciona mešavina je zamenjena sa normalnom podlogom za rast, dopunjenim sa 50 µg/mL gentamicina da bi se ubile preostale vanćelijske bakterije, a ukupan broj preživelih unutarćelijskih bakterija je određen dva dana kasnije nanošenjem serijskih razblaženja lizata makrofaga na triptične ploče od sojinog agara (Slika 32). AAC koji sadrži veznik koji se može podeliti stafopainom, AAC-193, uspeo je da ubije sve bakterije koje se mogu detektovati, dok AAC za kontrolu izotipa nije pokazao aktivnost. Analiza makrofaga pokazuje da su AAC koji se odvaja stafopainom mogu ubiti unutarćelijske bakterije. Konjugat antitelo-antibiotik, tio-S4497 LC v8-MP-LAFG-PABC- (piperazinoBOR) („peptid jezgra“ obelodanjen kao SEQ ID NO:128) AAC-215 je efikasan in vivo u modelu MRSA infekcije:
[0443] CB17.SCID miševi su rekonstituisani humanim IgG korišćenjem režima doziranja optimizovanog da daje konstantne nivoe od najmanje 10 mg/mL humanog IgG u serumu. Miševi su tretirani sa 4497 antitela (50 mg/kg), AAC-215 sa veznikom za deljenje stafopainom (50 mg/kg,) ili izotipskom kontrolom, anti-gD AAC koji sadrži deljivi veznik stafopaina (50 mg/kg). Miševima je data pojedinačna doza AAC-215 prvog dana posle infekcije intravenskom injekcijom. Svi miševi su žrtvovani na dan 4 posle infekcije, a ukupan broj preživelih bakterija u 2 bubrega (Slika 33) ili u srcu (Slika 34) određen je nanošenjem prevlake. Tretman sa AAC-215 koji sadrži veznik koji se deli stafopainom smanjio je opterećenje bakterija na ispod granice detekcije kod 6 od 8 testiranih miševa, dok je izotipska kontrola AAC pokazala ograničenu aktivnost. Isprekidana linija označava granicu detekcije za test (333 CFU/miš).
Primer 30 Profilisanje S. aureus i proteazne aktivnosti:
[0444] Staphylococcus aureus soj Wood46 (ATCC10832) je uzgojen preko noći na 37 °C u triptičnom sojinom agaru (TSB) sa mućkanjem. Kulture su centrifugirane na 10,000 x g tokom 10 min. Supernatant je sakupljen i propušten kroz dva 0.22um filtera.
[0445] Profilisanje aktivnosti proteaze S. aureus: 150 ml supernatanta kulture koncentrisano je i pufer izmenjen u fiziološkom rastvoru sa fosfatom (PBS) korišćenjem TFF (Millipore Pellicon XL kaseta Biomax 10kDa) do krajnjeg volumena od 38 ml sa krajnjom ukupnom koncentracijom proteina od 1 mg/ml. Ispitivanje aktivnosti proteaze supernatanta Wood46 izvedeno je korišćenjem biblioteke za brzo profiliranje endoproptidaza ili REPLi (Mimotopes, Victoria, Australija). Biblioteka se sastoji iz 3375 interno ugašenih fluorogenih peptida u 96-udubljenja formatu raspoređenih u 512 grupa. Biblioteka peptida sadrži sekvencu MCA-Gly-Gly-Gly-Xaa-Yaa-Zaa-Gly-Gly-DPA-Lys-Lys (SEQ ID NO:132) gde MCA odgovara 7-metoksikumarin-4-sirćetnoj kiselini (fluorescentni donor), a DPA odgovara Nb-(2,4-dinitrofenil)-L-2,3-diaminopropionskoj kiselini (akceptor fluorescencije). Udubljenja koja sadrže 5 nmol FRET peptida su rastvorena u 5ul 50% acetonitrila (Sigma). U svako udubljenje je dodato 50 µl (mikrolitara) koncentrovanog Wood46 supernatanta i 50ul PBS. Ploče su inkubirane na 37 °C i merenja fluorescencije su vršena na 0, 30, 60, 140 i 170 minuta. Podaci fluorescencije dobijeni su na Tecan Saphire<2>, pobuđenje λ320nm/emisija λ400nm. Promena intenziteta pregiba intenziteta fluorescencije krajnje tačke izračunata je kao Fpočetni/Fkrajnji.
[0446] Mesta deljenja supstrata određena su pomoću LC-MS izvedena s Agilent Q-TOF korišćenjem ESI izvora. 10ul iz svakog udubljenja ubrizgava se i odvaja hromatografijom sa reverznom fazom na Waters Xbridge OST C182.5um koloni (4.6 x 50 mm) korišćenjem Agilent 1260 HPLC sistema. Uzorci su eluirani sa gradijentom od 2-90% pufera B (gde pufer A iznosi 0.05% trifluorosirćetne kiseline/99.95% vode i pufer B je 0.04% trifluorosirćetne kiseline/99.96% acetonitrila) sa 500 µl/min sa ukupnim vremenom analize od 20 minuta. Peptidi su eluirani direktno u Q-TOF masenom spektrometru. Proizvodi deljenja su dodeljeni na osnovu upoređivanja posmatranih molekulskih težina sa izračunatim masama koje odgovaraju deljenju na svakom mogućem mestu.
Primer 31 Sinteza maleimido FRET peptidnog veznika:
[0447] Maleimido FRET peptid, (MP-Lys(TAMRA)-Gly-Gly-Ala-Phe-Ala-Gly-Gly-Gly-Lys(fluorescein) ("peptid jezgra" obelodanjen kao SEQ ID NO:125) sa Slike 26 sintetizovan je standardnom Fmoc hemijom na čvrstoj fazi koristeći PS3 peptidni sintetizator (Protein Technologies, Inc.). 0.1 mmol Fmoc-Lys(Boc)-Rink
11
amidne smole (Novabiochem) korišćeno je za generisanje C-terminalnog karboksamida. Fmoc-Lis(Mtt)-OH (Novabiochem) je dodat na prvom N-terminalnom ostatku da bi se omogućila dodatna hemija bočnog lanca nakon uklanjanja Mtt grupe. Akceptor fluorescencije, 5(6)-karboksi tetrametil-rodamin, ili TAMRA (Novabiochem), vezan je na ovaj amin bočnog lanca na smoli nakon što je Mtt grupa uklonjena tri uzastopna pranja 1% TFA u dihlorometanu sa 3% triizopropilsilan (TIS). Reakcija je ostavljena tokom 20 sati. Nakon ovog koraka, terminalna Fmoc grupa je uklonjena sa 20% piperidina u DMF i spajana sa maleimidopropionskom kiselinom (Bachem AG) od strane HBTU. Peptidi međujedinjenja obeleženi TAMRA odstranjeni su od smole sa 95:2.5:2.5 trifluorosirćetnom kiselinom (TFA)/TIS/vodom (v/v/v) tokom 2 sata na sobnoj temperaturi uz lagano mućkanje. Rastvor za odvajanje je filtriran i uparen pod strujom azota da se ukloni TFA. Sirova međujedinjenja rastvorena u mešavini vode i acetonitrila su podvrgnuti daljem prečišćavanju HPLC obrnutim fazama sa Jupiterovim 5µl C4 kolonom (5 µm, 10 mm x 250 mm) iz Phenomenex. Posle liofilizacije, prečišćena međujedinjenja su zatim reagovala sa 10 ekv. NHS-fluorescein (Thermo Scientific) u 50/50 fiziološkom rastvoru sa fosfatom (PBS)/dimetilformamid (DMF) (v/v) tokom 20 sati da bi se označio slobodni amin na C-terminalnom lizinu. FRET peptid je zatim prečišćen i liofilizovan kao što je iznad opisano. Sve reakcione smeše i krajnji proizvodi su analizirani i potvrđeni pomoću LC-MS.
[0448] Čvrsta faza sinteze veziva: Svi opisani veznici sintetizovani su korišćenjem standardne Fmoc hemije na čvrstoj fazi na PS3 peptidnom sintetizatoru (Protein Technologies, Inc.). 0.1 mM Fmoc-aminokiseline-Wang smole (Novabiochem) korišćeno je za sve veznike za generisanje C-terminalnog karboksila. Veznici su prečišćeni kao što je iznad opisano. QSY7 amin (Invitrogen) vezivanje je izvedeno reakcijom prečišćenih veziva sa 1.1 puta molarnim viškom QSY7 amina, 1.1 puta molarnim viškom HATU i 2.2 puta molarnim viškom DIEA u DMF preko noći na sobnoj temperaturi. Vrste veznik-QSY7 su zatim prečišćene kao što je iznad opisano. Sve reakcione smeše i krajnji proizvodi su analizirani i potvrđeni pomoću LC-MS.
Primer 32 FRET testovi deljenja:
[0449] Kulture Wood46 i USA300 inokulirane su 1:200 razblaživanjem kultura preko noći (0.1ml u 20 ml) u TSB i inkubirane uz mućkanje na 37 °C. Sojevi su kultivisani u eksponencijalnu fazu rasta i zasađeni na gustini ćelija od 10<8>ćelija/ml i 10<7>ćelija/ml u triptičinom sojinom agaru (TSB). tioMAB FRET peptidni konjugati dodati su u udubljenja u konačnoj koncentraciji FRET peptida od 2µM. Ploče su inkubirane na 37 °C i fluorescencija je praćena tokom vremena, pobuda λ495nm/emisija λ518nm, tokom 210 minuta.
[0450] Deljenje tioFAB FRET peptida i tioFAB mal-GGAFAGGG-DNA31 ("peptid jezgra" obelodanjenog kao SEQ ID NO:126) koncentrovanim aktivnim supernatantom: tioFAB S4497 konjugovan sa bilo MP-Lys(TAMRA)-Gly-Gly-Ala-Phe-Ala-Gly-Gly-Gly-Lys(fluorescein) ("peptid jezgra" obelodanjen kao SEQ ID NO:125) ili MP-Gly-Gly-Ala-Phe-Ala-Gly-Gly-Gly-(pipBOR) LA-59 ("peptid jezgra" obelodanjen kao SEQ ID NO:126) se inkubiraju sa koncentrovanim supernatantom Wood46 koji je obrađen kao što je iznad opisano. tioFAB S4497 i supernatant pomešani su 1:1 na miligramskoj osnovi (25 µg tioFAB S4497 i 25 µg proteinskog supernatanta) u PBS. Uzorci su inkubirani tokom 2 sata na 37 °C. Posle 2 sata, reakcija je ugašena razblaživanjem 1:1 sa 0.1% TFA. Uzorci su analizirani pomoću LC-MS da bi se utvrdila količina deljenja i proizvoda raspadanja.
[0451] Iako je prethodni izum detaljno opisan ilustracijom i primerom radi jasnoće razumevanja, opisi i primeri ne smeju se tumačiti kao ograničavajući obim pronalaska.
11
11
11
11
11
11
12
12
12
12
12
12
12
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
14
14
14
��
14
14
14
1
11
12
1
��
1
1
�
1
1
�
11
12
1
14
1
1
1
�
1
�
11
��
1
��
1
�
1
�
1
�
11
��
1
14
�
1
�
1
1
�
11
12
1
14
1
1
1
1
1
2
21
22
2
24
2
2
�
2
�
21
21
21
21
21
21
21
22
22

Claims (52)

  1. Patentni zahtevi 1. Jedinjenje konjugata antitelo-antibiotik sadrži monoklonsko antitelo protiv teihoinske kiseline zida (WTA), pri čemu se monoklonsko antitelo protiv teihoinske kiseline zida vezuje za Staphylococcus aureus i kovalentno je vezano za antibiotik tipa rifamicin pomoću endopeptidaze S. aureus ili deljive cisteinske proteaze, peptidni veznik (L), jedinjenje konjugata antitelo-antibiotik je izabrano iz formula:
    gde je R<5>nezavisno izabran iz H i C1-C12alkila; i n je 0 ili 1 ; i
    gde je R<3>nezavisno izabran od H i C1-C12alkila; i n je 1 ili 2 ; gde je R H, C1-C12alkil, ili C(O)CH3; L je peptidni veznik koji ima formulu: -Str-Pep-Y-gde je Str jedinica nosača; Pep je peptid sa dva do dvanaest aminokiselinskih ostataka, a Y je razdelnik; Ab je monoklonsko antitelo protiv teihoinske kiseline zida; i p je ceo broj od 1 do 8; pri čemu VL anti-WTA monoklonskog antitela sadrži-CDR L1 koji sadrži sekvencu KSSQSIFRTSRNKNLLN (SEQ ID NO:99), CDR L2 sadrži sekvencu WASTRKS (SEQ ID NO:100), i CDR L3 sadrži sekvencu QQYFSPPYT (SEQ ID NO:101); i VH anti-WTA monoklonskog antitela sadrži CDR H1 koji sadrži sekvencu SFVMH (SEQ ID NO:102), CDR H2 koja sadrži sekvencu FTNNEGTTTAYADSVRG (SEQ ID NO:103), i CDR H3 sadrži sekvencu GEGGLDD (SEQ ID NO:118) ili GDGGLDD (SEQ ID NO:104).
  2. 2. Konjugat jedinjenja antitelo-antibiotik prema patentnom zahtevu 1, gde antitelo sadrži VL koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:119.
  3. 3. Konjugat jedinjenja antitelo-antibiotik prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2, gde antitelo sadrži VH koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:156.
  4. 4. Jedinjenje konjugata antitelo-antibiotik prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 3, pri čemu antitelo sadrži VL i VH, gde VL sadrži sekvencu SEQ ID NO:119, a VH sadrži sekvencu SEQ ID NO:156.
  5. 5. Jedinjenje konjugata antitelo-antibiotik prema patentnom zahtevu 1, gde antitelo sadrži laki lanac (LC) gde LC sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:121, i teški lanac (HC) gde HC sadrži aminokiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:146, SEQ ID NO:147, SEQ ID NO:157 ili SEQ ID NO:124.
  6. 6. Jedinjenje konjugata antitelo-antibiotik prema patentnom zahtevu 1, pri čemu antitelo sadrži laki lanac (LC) gde LC sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:123 i teški lanac (HC) gde HC sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:146, SEQ ID NO:147, SEQ ID NO:157 ili SEQ ID NO:124.
  7. 7. Jedinjenje konjugata antitelo-antibiotik prema patentnom zahtevu 1, pri čemu antitelo sadrži laki lanac (LC) gde LC sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:145 i teški lanac (HC) gde HC sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:146, SEQ ID NO:147, SEQ ID NO:157 ili SEQ ID NO:124.
  8. 8. Jedinjenje konjugata antitelo-antibiotik prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2, gde antitelo sadrži VH koji sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:120.
  9. 9. Jedinjenje konjugata antitelo-antibiotik prema bilo kojem od patentnih zahteva 1, 2 ili patentnom zahtevu 8, pri čemu antitelo sadrži VL i VH, pri čemu VL sadrži sekvencu SEQ ID NO:119, a VH sadrži sekvencu SEQ ID NO:120.
  10. 10. Jedinjenje konjugata antitelo-antibiotik prema patentnom zahtevu 1, pri čemu antitelo sadrži laki lanac (LC) gde LC sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:121 i teški lanac (HC) gde HC sadrži aminokiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:146.
  11. 11. Jedinjenje konjugata antitelo-antibiotik prema patentnom zahtevu 1, pri čemu antitelo sadrži laki lanac (LC) gde LC sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:123 i teški lanac (HC) gde HC sadrži aminokiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:147.
  12. 12. Jedinjenje konjugata antitelo-antibiotik prema patentnom zahtevu 1, pri čemu antitelo sadrži laki lanac (LC) gde LC sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:145 i teški lanac (HC) gde HC sadrži aminokiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:157.
  13. 13. Jedinjenje konjugata antitelo-antibiotik prema patentnom zahtevu 1, pri čemu antitelo sadrži laki lanac (LC) gde LC sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:145 i teški lanac (HC) gde HC sadrži aminokiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:147.
  14. 14. Jedinjenje konjugata antitelo-antibiotik prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu antibiotik tipa rifamicin sadrži kvarterni amin vezan na peptidni veznik.
  15. 15. Jedinjenje konjugata antitelo-antibiotik prema patentnom zahtevu 14, pri čemu je peptidni veznik vezan na cistein ili konstruisan cistein anti-WTA antitela.
  16. 16. Jedinjenje konjugata antitelo-antibiotik prema patentnom zahtevu 1, gde je peptidni veznik stafopain B ili deljivi veznik stafopaina A.
  17. 17. Jedinjenje konjugata antitelo-antibiotik prema patentnom zahtevu 16, gde je peptidni veznik humani deljivi veznik koji se može podeliti od proteaze katepsina B.
  18. 18. Jedinjenje konjugata antitelo-antibiotik prema patentnom zahtevu 17, gde je peptidni veznik val-cit dipeptidni veznik.
  19. 19. Jedinjenje konjugata antitelo-antibiotik prema bilo kojem od prethodnih zahteva, gde je p 2 do 4.
  20. 20. Jedinjenje konjugata antitelo-antibiotik prema patentnom zahtevu 1, ima formulu:
  21. 21. Jedinjenje konjugata antitelo-antibiotik prema bilo kojem od prethodnih zahteva, gde Str ima formulu:
    gde je R<6>izabran iz grupe koja se sastoji iz C1-C10alkilena-, -C3-C8karbociklo, -O-(C1-C8alkil)-, -arilen-, -C1-C10alkilen-arilen-, -arilen- C1-C10alkilen-, -C1-C10alkilen-(C3-C8karbociklo)-, -(C3-C8karbociklo)-C1-C10alkilen-, -C3-C8heterociklo-, -C1-C10alkilen-(C3-C8heterociklo)-, -(C3-C8heterociklo)-C1-C10alkilen-, -(CH2CH2O)r-, i -(CH2CH2O)r-CH2-; i r je celi broj u rasponu od 1 do 10.
  22. 22. Jedinjenje konjugata antitelo-antibiotik prema patentnom zahtevu 21, naznačen time što R<6>je -(CH2)5-.
  23. 23. Jedinjenje konjugata antitelo-antibiotik prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu Pep sadrži dve do dvanaest aminokiselinskih ostataka nezavisno izabranih između glicina, alanina, fenilalanina, lizina, arginina, valina i citrulina.
  24. 24. Jedinjenje konjugata antitelo-antibiotik prema patentnom zahtevu 23, pri čemu je Pep izabran od valincitrulina (val-cit, vc); fenilalanin-lizina (fk); i valin-citrulin-fenilalanina (val-cit-phe).
  25. 25. Jedinjenje konjugata antitelo-antibiotik prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva, gde Y sadrži para-aminobenzil ili para-aminobenziloksikarbonil.
  26. 26. Jedinjenje konjugata antitelo-antibiotik prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva, gde je L peptidni veznik koji ima formulu:
    gde su AA1 i AA2 nezavisno odabrani iz bočnog lanca aminokiseline.
  27. 27. Jedinjenje konjugata antitelo-antibiotik prema patentnom zahtevu 26, pri čemu je bočni lanac aminokiseline nezavisno izabran iz H, -CH3, -CH2(C6H5), -CH2CH2CH2CH2NH2, -CH2CH2CH2NHC(NH)NH2, -CHCH(CH3)CH3, i -CH2CH2CH2NHC(O)NH2.
  28. 28. Jedinjenje konjugata antitelo-antibiotik prema patentnom zahtevu 26, gde je L peptidni veznik koji ima formulu: 22
  29. 29. Jedinjenje konjugata antitelo-antibiotik prema patentnom zahtevu 26, gde je L peptidni veznik koji ima formulu:
  30. 30. Jedinjenje konjugata antitelo-antibiotik prema patentnom zahtevu 29, gde je L peptidni veznik koji ima formulu:
  31. 31. Jedinjenje konjugata antitelo-antibiotik prema patentnom zahtevu 26, gde je L peptidni veznik koji ima formulu:
  32. 32. Jedinjenje konjugata antitelo-antibiotik prema patentnom zahtevu 31, gde je L peptidni veznik koji ima formulu:
  33. 33. Jedinjenje konjugata antitelo-antibiotik prema patentnom zahtevu 26, gde je L peptidni veznik koji ima formulu: 22
  34. 34. Jedinjenje konjugata antitelo-antibiotik prema patentnom zahtevu 33, gde je L peptidni veznik koji ima formulu:
  35. 35. Jedinjenje konjugata antitelo-antibiotik prema patentnom zahtevu 26, gde je L peptidni veznik koji ima formulu:
  36. gde je R<7>nezavisno izabran od H i C1-C12alkila. 36. Jedinjenje konjugata antitelo-antibiotik prema patentnom zahtevu 26, ima formulu:
  37. 37. Jedinjenje konjugata antitelo-antibiotik prema patentnom zahtevu 36, ima formulu:
  38. 22 38. Jedinjenje konjugata antitelo-antibiotik prema patentnom zahtevu 26, ima formulu:
  39. 39. Jedinjenje konjugata antitelo-antibiotik prema patentnom zahtevu 38, ima formulu:
  40. 40. Jedinjenje konjugata antitelo-antibiotik prema patentnom zahtevu 1, ima formulu:
    gde je Ab monoklonsko antitelo protiv tehionske kiseline zida (WTA) koje se vezuje za Staphylococcus aureus, pri čemu VL monoklonskog antitela protiv tehionske kiseline zida sadrži CDR L1 koji sadrži sekvencu KSSKSIFRTSRNKNLLN (SEQ ID NO:99), CDR L2 redosled WASTRKS (SEQ ID NO:100), i CDR L3 sadrži sekvencu QQYFSPPYT (SEQ ID NO:101); i VH anti-WTA monoklonskog antitela sadrži CDR H1 koji sadrži sekvencu SFVMH (SEQ ID NO:102), CDR H2 koji sadrži sekvencu FTNNEGTTTAYADSVRG (SEQ ID NO:103), i CDR H3 koji sadrži sekvencu GEGGLDD (SEQ ID NO:118); i p je ceo broj od 1 do 8.
  41. 41. Farmaceutski sastav koji sadrži jedinjenje konjugata antitelo-antibiotik prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva i farmaceutski prihvatljiv nosač, klizno sredstvo, razblaživač ili ekscipijens.
  42. 42. Postupak za pravljenje jedinjenja konjugata antitelo-antibiotik prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 40, koji sadrži konjugaciju antibiotika tipa rifamicin u WTA-monoklonsko antitelo.
  43. 43. Jedinjenje konjugata antitelo-antibiotik prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 40 za upotrebu u terapiji. 22
  44. 44. Jedinjenje konjugata antitelo-antibiotik prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 40 za upotrebu u postupku lečenja bakterijske infekcije kod pacijenta, pri čemu je bakterijska infekcija Staphylococcus aureus infekcija.
  45. 45. Jedinjenje konjugata antitelo-antibiotik za upotrebu u postupku iz patentnih zahteva 44, pri čemu se opterećenje bakterija kod pacijenta smanjuje lečenjem.
  46. 46. Jedinjenje konjugata antitelo-antibiotik prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 40, koje se koristi u postupku smanjenja broja ćelija domaćih bakterija Staphylococcus aureus u ćelijama domaćina obolelog od Staphylococcus aureus bez smanjenja broja ćelija domaćina.
  47. 47. Jedinjenje konjugata antitelo-antibiotik za upotrebu u postupku iz patentnog zahteva 46, gde je broj perzistentnih bakterijskih ćelija smanjen.
  48. 48. Jedinjenje konjugata antitelo-antibiotik za upotrebu u postupku prema bilo kojem od patentnih zahteva 44 do 47, pri čemu je pacijent čovek.
  49. 49. Jedinjenje konjugata antitelo-antibiotik za upotrebu u postupku prema bilo kom od patentnih zahteva 44 do 48, koje dalje obuhvata davanje drugog terapeutskog sredstva.
  50. 50. Jedinjenje konjugata antitelo-antibiotik za upotrebu u postupku iz patentnog zahteva 49, gde je drugo terapeutsko sredstvo antibiotik.
  51. 51. Jedinjenje konjugata antitelo-antibiotik za upotrebu u postupku iz patentnog zahteva 50, pri čemu je drugo terapeutsko sredstvo antibiotik izabran iz strukturne klase koja se sastoji iz (i) aminoglikozida; (ii) beta-laktama; (iii) makrolida/ciklični peptida; (iv) tetraciklina; (v) fluorohinolina/fluorohinolona; i (vi) oksazolidinona.
  52. 52. Jedinjenje konjugata antitelo-antibiotik za upotrebu u postupku iz patentnog zahteva 50, pri čemu je drugo terapeutsko sredstvo antibiotik izabran iz grupe koja se sastoji iz klindamicina, novobiocina, retapamulina, daptomicina, GSK-2140944 (gepotidacin) koji ima strukturu:
    CG-400549 strukture:
    sitafloksacin, teikoplanin, triklosan, naptiridon, radezolid, doksorubicin, ampicilin, vankomicin, imipenem, doripenem, gemcitabin, dalbavancin i azitromicin. 2
RS20200548A 2013-05-31 2014-05-30 Antitela i konjugati protiv teihoinske kiseline zida RS60256B1 (sr)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361829466P 2013-05-31 2013-05-31
US201361829461P 2013-05-31 2013-05-31
US14/284,609 US20140356375A1 (en) 2013-05-31 2014-05-22 Anti-wall teichoic antibodies and conjugates
PCT/US2014/039113 WO2014193722A1 (en) 2013-05-31 2014-05-22 Anti-wall teichoic antibodies and conjugates
PCT/US2014/040324 WO2014194247A1 (en) 2013-05-31 2014-05-30 Anti-wall teichoic antibodies and conjugates
EP14732800.9A EP3004162B1 (en) 2013-05-31 2014-05-30 Anti-wall teichoic antibodies and conjugates

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS60256B1 true RS60256B1 (sr) 2020-06-30

Family

ID=51989438

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20200548A RS60256B1 (sr) 2013-05-31 2014-05-30 Antitela i konjugati protiv teihoinske kiseline zida

Country Status (30)

Country Link
EP (2) EP3004162B1 (sr)
JP (2) JP6469094B2 (sr)
KR (1) KR20160015227A (sr)
CN (2) CN105358573B (sr)
AU (2) AU2014273939B2 (sr)
BR (1) BR112015029838A2 (sr)
CA (1) CA2910029A1 (sr)
CL (1) CL2015003496A1 (sr)
CR (1) CR20150626A (sr)
DK (1) DK3004162T3 (sr)
EA (1) EA201592078A1 (sr)
ES (1) ES2793174T3 (sr)
HK (1) HK1220982A1 (sr)
HR (1) HRP20200812T1 (sr)
HU (1) HUE050451T2 (sr)
IL (1) IL242175B (sr)
LT (1) LT3004162T (sr)
MA (1) MA38686A1 (sr)
MX (2) MX369022B (sr)
MY (1) MY177774A (sr)
PE (1) PE20160715A1 (sr)
PH (1) PH12015502636A1 (sr)
PL (1) PL3004162T3 (sr)
PT (1) PT3004162T (sr)
RS (1) RS60256B1 (sr)
SG (1) SG11201509839TA (sr)
SI (1) SI3004162T1 (sr)
UA (1) UA120088C2 (sr)
WO (1) WO2014194247A1 (sr)
ZA (1) ZA201507977B (sr)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2687044C2 (ru) 2013-05-31 2019-05-06 Дженентек, Инк. Антитела против стеночной тейхоевой кислоты и их конъюгаты
WO2015095227A2 (en) 2013-12-16 2015-06-25 Genentech, Inc. Peptidomimetic compounds and antibody-drug conjugates thereof
KR102337414B1 (ko) 2013-12-16 2021-12-10 제넨테크, 인크. 펩타이드 모방체 화합물 및 이의 항체-약물 컨쥬게이트
FI3900742T3 (fi) * 2014-09-11 2024-08-16 Seagen Inc Tertiääristä amiinia sisältävien lääkeaineiden kohdennettu antaminen
AU2015358532C1 (en) * 2014-12-03 2020-10-29 Genentech, Inc. Quaternary amine compounds and antibody-drug conjugates thereof
RU2017118792A (ru) 2014-12-03 2019-01-09 Дженентек, Инк. Конъюгаты антитела к staphylococcus aureus с рифамицином и их применение
HK1243931A1 (zh) 2014-12-03 2018-07-27 F. Hoffmann-La Roche Ag 抗金黄色葡萄球菌抗体利福霉素缀合物及其用途
CN108064246A (zh) * 2015-06-15 2018-05-22 基因泰克公司 抗体和免疫结合物
KR20180090290A (ko) * 2015-12-04 2018-08-10 시애틀 지네틱스, 인크. 사차화 튜불리신 화합물들의 컨쥬게이트들
US11793880B2 (en) 2015-12-04 2023-10-24 Seagen Inc. Conjugates of quaternized tubulysin compounds
KR102204805B1 (ko) 2016-03-04 2021-01-20 제넨테크, 인크. 항체-리파마이신 접합체의 제조 방법
WO2017198731A1 (en) 2016-05-18 2017-11-23 Genmab B.V. Antibodies and methods of use thereof in treatment of infectious disease
WO2017214024A1 (en) 2016-06-06 2017-12-14 Genentech, Inc. Silvestrol antibody-drug conjugates and methods of use
KR20200051733A (ko) 2017-09-08 2020-05-13 시애틀 지네틱스, 인크. 튜불리신 및 그 중간물의 제조 공정
WO2020023871A1 (en) 2018-07-27 2020-01-30 Promega Corporation Quinone-containing conjugates
WO2021195716A1 (en) * 2020-04-02 2021-10-07 Monash University Antibiotic conjugates
GB202214756D0 (en) * 2022-10-07 2022-11-23 Univ Oxford Innovation Ltd Product

Family Cites Families (70)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB877732A (en) 1958-08-12 1961-09-20 Lepetit Spa The antibiotic rifomycin, its components and methods of preparing same
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4485045A (en) 1981-07-06 1984-11-27 Research Corporation Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes
US4867973A (en) * 1984-08-31 1989-09-19 Cytogen Corporation Antibody-therapeutic agent conjugates
DD266710A3 (de) 1983-06-06 1989-04-12 Ve Forschungszentrum Biotechnologie Verfahren zur biotechnischen Herstellung van alkalischer Phosphatase
US4544545A (en) 1983-06-20 1985-10-01 Trustees University Of Massachusetts Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting
US4879231A (en) 1984-10-30 1989-11-07 Phillips Petroleum Company Transformation of yeasts of the genus pichia
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
US4610919A (en) 1985-06-14 1986-09-09 Fiber Bond Corporation Binder for fibrous padding
GB8610600D0 (en) 1986-04-30 1986-06-04 Novo Industri As Transformation of trichoderma
JP2544375B2 (ja) 1986-07-14 1996-10-16 鐘淵化学工業株式会社 アルキル置換ベンゾキサジノリフアマイシン誘導体
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
CA1304363C (en) 1988-11-01 1992-06-30 Takehiko Yamane 3'-hydroxybenzoxazinorifamycin derivative, process for preparing the same and antibacterial agent containing the same
EP0402226A1 (en) 1989-06-06 1990-12-12 Institut National De La Recherche Agronomique Transformation vectors for yeast yarrowia
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
EP1400536A1 (en) 1991-06-14 2004-03-24 Genentech Inc. Method for making humanized antibodies
US5362852A (en) 1991-09-27 1994-11-08 Pfizer Inc. Modified peptide derivatives conjugated at 2-hydroxyethylamine moieties
US6660267B1 (en) 1992-12-21 2003-12-09 Promega Corporation Prevention and treatment of sepsis
US5545721A (en) 1992-12-21 1996-08-13 Ophidian Pharmaceuticals, Inc. Conjugates for the prevention and treatment of sepsis
US6214345B1 (en) 1993-05-14 2001-04-10 Bristol-Myers Squibb Co. Lysosomal enzyme-cleavable antitumor drug conjugates
US6214388B1 (en) 1994-11-09 2001-04-10 The Regents Of The University Of California Immunoliposomes that optimize internalization into target cells
US5981522A (en) 1995-09-01 1999-11-09 Kaneka Corporation Treatment of disease caused by infection of Helicobacter
JP3963976B2 (ja) 1995-12-08 2007-08-22 株式会社カネカ クラミジア感染症治療剤
US6322788B1 (en) 1998-08-20 2001-11-27 Stanley Arthur Kim Anti-bacterial antibodies and methods of use
CA2704600C (en) 1999-04-09 2016-10-25 Kyowa Kirin Co., Ltd. A method for producing antibodies with increased adcc activity
WO2000071585A1 (en) 1999-05-03 2000-11-30 Medarex, Inc. Human antibodies to staphylococcus aureus
EP1229125A4 (en) 1999-10-19 2005-06-01 Kyowa Hakko Kogyo Kk PROCESS FOR PREPARING A POLYPEPTIDE
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
CA2953239A1 (en) 2000-10-06 2002-04-18 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Antibody composition-producing cell
US6884869B2 (en) 2001-04-30 2005-04-26 Seattle Genetics, Inc. Pentapeptide compounds and uses related thereto
WO2003026577A2 (en) 2001-09-24 2003-04-03 Seattle Genetics, Inc. P-amidobenzylethers in drug delivery agents
US7091186B2 (en) 2001-09-24 2006-08-15 Seattle Genetics, Inc. p-Amidobenzylethers in drug delivery agents
CA2463879C (en) 2001-10-25 2012-12-04 Genentech, Inc. Glycoprotein compositions
CA2467242A1 (en) 2001-11-20 2003-05-30 Seattle Genetics, Inc. Treatment of immunological disorders using anti-cd30 antibodies
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
BR0309145A (pt) 2002-04-09 2005-02-01 Kyowa Hakko Kogyo Kk Células das quais o genoma é modificado
EP1498490A4 (en) 2002-04-09 2006-11-29 Kyowa Hakko Kogyo Kk PROCESS FOR PREPARING ANTIBODY COMPOSITION
CA2481925A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Therapeutic agent for patients having human fc.gamma.riiia
EP1500400A4 (en) 2002-04-09 2006-10-11 Kyowa Hakko Kogyo Kk MEDICAMENT WITH ANTIBODY COMPOSITION
CA2481658A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Method of enhancing of binding activity of antibody composition to fcy receptor iiia
ATE503829T1 (de) 2002-04-09 2011-04-15 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Zelle mit erniedrigter oder deletierter aktivität eines am gdp-fucosetransport beteiligten proteins
US20050180972A1 (en) 2002-07-31 2005-08-18 Wahl Alan F. Anti-CD20 antibody-drug conjugates for the treatment of cancer and immune disorders
DK1545613T3 (da) 2002-07-31 2011-11-14 Seattle Genetics Inc Auristatinkonjugater og deres anvendelse til behandling af cancer, en autoimmun sygdom eller en infektiøs sygdom
US7217797B2 (en) 2002-10-15 2007-05-15 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
CA2502413A1 (en) 2002-11-01 2004-05-21 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Quantitative analysis of protein isoforms using matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry
AU2003298770A1 (en) * 2002-12-02 2004-06-23 Biosynexus Inc Wall teichoic acid as a target for anti-staphylococcal therapies and vaccines
TWI335821B (en) 2002-12-16 2011-01-11 Genentech Inc Immunoglobulin variants and uses thereof
CN1894259A (zh) 2003-08-22 2007-01-10 活跃生物工艺学公司 利福霉素类似物及其应用
JPWO2005035586A1 (ja) 2003-10-08 2007-11-22 協和醗酵工業株式会社 融合蛋白質組成物
JPWO2005035778A1 (ja) 2003-10-09 2006-12-21 協和醗酵工業株式会社 α１，６−フコシルトランスフェラーゼの機能を抑制するＲＮＡを用いた抗体組成物の製造法
EP2478912B1 (en) * 2003-11-06 2016-08-31 Seattle Genetics, Inc. Auristatin conjugates with anti-HER2 or anti-CD22 antibodies and their use in therapy
WO2005053742A1 (ja) 2003-12-04 2005-06-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 抗体組成物を含有する医薬
CN1918172B (zh) 2003-12-23 2011-09-14 活跃生物工艺学公司 利福霉素类似物及其用途
CA2556752C (en) 2004-02-23 2016-02-02 Genentech, Inc. Heterocyclic self-immolative linkers and conjugates
DK1791565T3 (en) 2004-09-23 2016-08-01 Genentech Inc Cysteingensplejsede antibodies and conjugates
WO2007008848A2 (en) 2005-07-07 2007-01-18 Seattle Genetics, Inc. Monomethylvaline compounds having phenylalanine carboxy modifications at the c-terminus
ES2708763T3 (es) 2005-07-07 2019-04-11 Seattle Genetics Inc Compuestos de monometilvalina que tienen modificaciones de la cadena lateral de fenilalanina en el extremo C
EP1928890B1 (en) * 2005-08-11 2013-04-03 Targanta Therapeutics Inc. Phosphonated rifamycins and uses thereof for the prevention and treatment of bone and joint infections
CN101395259A (zh) 2005-12-14 2009-03-25 活跃生物药物学有限公司 利福霉素类似物及其应用
DK2121920T3 (da) 2007-03-01 2011-11-21 Symphogen As Fremgangsmåde til kloning af sammenhørende antistoffer
CL2008001334A1 (es) 2007-05-08 2008-09-22 Genentech Inc Anticuerpo anti-muc16 disenado con cisteina; conjugado que lo comprende; metodo de produccion; formulacion farmaceutica que lo comprende; y su uso para tratar el cancer.
NZ584514A (en) 2007-10-19 2012-07-27 Genentech Inc Cysteine engineered anti-tenb2 antibodies and antibody drug conjugates
EP2291196A4 (en) 2008-05-12 2012-05-30 Strox Biopharmaceuticals Llc FOR STAPHYLOCOCCUS AUREUS SPECIFIC ANTIBODY PREPARATIONS
WO2010019511A2 (en) 2008-08-13 2010-02-18 Targanta Therapeutics Corp. Phosphonated rifamycins and uses thereof for the prevention and treatment of bone and joint infections
EP2341929B1 (en) 2008-10-06 2017-01-25 University Of Chicago Compositions and methods related to bacterial emp proteins
JP6192294B2 (ja) * 2009-07-15 2017-09-06 エーアイエムエム セラピューティクス ベー．フェー． グラム陽性菌特異的結合化合物
CA2799540A1 (en) 2010-06-08 2011-12-15 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
WO2012113847A1 (en) 2011-02-25 2012-08-30 Lonza Ltd Branched linker for protein drug conjugates
WO2013168965A2 (ko) * 2012-05-07 2013-11-14 목암생명공학연구소 포도상구균 감염 예방용 백신 조성물

Also Published As

Publication number Publication date
MX2019012708A (es) 2019-12-16
PH12015502636A1 (en) 2016-03-07
CR20150626A (es) 2016-01-29
CA2910029A1 (en) 2014-12-04
CL2015003496A1 (es) 2016-12-23
JP2016525343A (ja) 2016-08-25
PE20160715A1 (es) 2016-08-01
KR20160015227A (ko) 2016-02-12
EP3381939A1 (en) 2018-10-03
SI3004162T1 (sl) 2020-07-31
HK1220982A1 (zh) 2017-05-19
CN105358573B (zh) 2020-10-30
HUE050451T2 (hu) 2020-12-28
AU2014273939B2 (en) 2019-09-19
MA38686A1 (fr) 2017-10-31
DK3004162T3 (da) 2020-05-18
HRP20200812T1 (hr) 2020-08-07
CN105358573A (zh) 2016-02-24
MX2015016405A (es) 2016-04-11
EP3004162A1 (en) 2016-04-13
LT3004162T (lt) 2020-06-10
JP6469094B2 (ja) 2019-02-13
SG11201509839TA (en) 2016-01-28
ZA201507977B (en) 2017-01-25
CN112430266A (zh) 2021-03-02
EA201592078A1 (ru) 2016-04-29
WO2014194247A1 (en) 2014-12-04
MX369022B (es) 2019-10-25
ES2793174T3 (es) 2020-11-13
JP2019054801A (ja) 2019-04-11
UA120088C2 (uk) 2019-10-10
PT3004162T (pt) 2020-05-27
IL242175B (en) 2020-02-27
MY177774A (en) 2020-09-23
PL3004162T3 (pl) 2020-07-27
EP3004162B1 (en) 2020-03-11
AU2019279986A1 (en) 2020-01-16
AU2014273939A1 (en) 2015-11-26
BR112015029838A2 (pt) 2017-09-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3004162B1 (en) Anti-wall teichoic antibodies and conjugates
RU2731055C2 (ru) Конъюгаты антитела к staphylococcus aureus с рифамицином и их применение
US10570192B2 (en) Anti-wall teichoic antibodies and conjugates
US9895450B2 (en) Anti-wall teichoic antibodies and conjugates
TWI692483B (zh) 抗壁磷壁酸抗體（ａｎｔｉ-ｗａｌｌ ｔｅｉｃｈｏｉｃ ａｃｉｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）及結合物
HK1261352A1 (en) Anti-wall teichoic antibodies and conjugates