RS60336B1 - Konjugati proteina i polimera - Google Patents

Description

Opis

ODELJAK SA UNAKRSNOM REFERENCOM NA POVEZANU PATENTNU PRIJAVU

[0001] Ova patentna prijava zahteva prednost privremene američke patentne prijave br.

61/285,411 koja je podneta 10. decembra 2009.

OSNOV PRONALASKA

[0002] Napredak u ćelijskoj biologiji i tehnologijama rekombinantnih proteina, doveo je do razvoja proteinskih terapeutskih sredstava.

[0003] Pa ipak, najveće prepreke i dalje opstaju. Veliki broj proteina je podložan proteolitičkoj degradaciji i stoga ima kratak poluživot u cirkulatornom sistemu. Drugi nedostaci uključuju rastvorljivost u vodi i indukciju neutrališućih antitela.

[0004] Vezivanje polimera, npr. politeilen glikola (PEG) za protein, onemogućava pristup proteolitičkih enzima proteinskoj kičmi, što za posledicu ima poboljšanu stabilnost proteina. Osim toga, ovo takođe poboljšava rastvorljivost u vodi i maksimalno smanjuje imunogenost. Postoji potreba za efikasnim postupcima za vezivanje polimera za protein.

KRATAK OPIS PRONALASKA

[0005] Jedan aspekt ovog pronalaska odnosi se na upotrebu konjugata proteina i polimera za lečenje različitih bolesti. Konjugat ima formulu

u kojoj mPEG ima molekulsku težinu od 20 kD i IFN je komponenta interferona-α2b. Poželjno, konjugat je u osnovi čist, npr., ima čistoću od više od 70%, 80% ili 90%. Bolesti koje se leče konjugatom su idiopatska mijelofibroza, primarna policitemija i esencijalna trombocitemija.

[0006] Izraz “alkil” odnosi se na monovalentni ugljovodonični radikal negranatog ili granatog lanca. Primeri alkil grupa uključuju metil, etil, n-propil, izopropil, terc-butil i n-pentil. Slično tome, izraz “alkenil” ili “alkinil” odnosi se na monovalentni ugljovodonični radikal negranatog ili granatog lanca koji sadrži jednu ili više C=C dvostrukih veza ili jednu ili više C≡C trostrukih veza.

[0007] Izraz “alkilen” odnosi se na dvovalentni ugljovodonični radikal negranatog ili granatog lanca. Slično tome, izraz "alkenilen” ili "alkinilen” odnosi se na dvovalentni ugljovodonični radikal negranatog ili granatog lanca koji sadrži jednu ili više C=C dvostrukih veza ili jednu ili više C≡C trostrukih veza.

[0008] Izraz “aril” odnosi se na prstenasti uglovodonični sistem (monocikličan ili bicikličan) koji ima najmanje jedan aromatični prsten. Primeri aril komponenti uključuju, ali nisu ograničeni na, fenil, naftil i pirenil.

[0009] Izraz “heteroaril” odnosi se na prstenasti uglovodonični sistem (monocikličan ili bicikličan) koji ima najmanje jedan aromatičan prsten koji sadrži najmanje jedan heteroatom kao što je O, N ili S kao deo prstenastog sistema, pri čemu su preostali atomi ugljenici. Primeri heteroarilnih komponenti uključuju, ali nisu ograničeni na, furil, pirolil, tienil, oksazolil, imidazolil, tiazolil, piridinil, pirimidinil, hinazolinil i indolil.

[0010] Izraz “cikloalkil” odnosi se na delimično ili potpuno zasićen monociklični ili biciklični prstenasti sistem koji ima samo atome ugljenika u prstenu. Primeri uključuju, ali nisu ograničeni na, ciklopropanil, ciklopentanil i cikloheksanil.

[0011] Izraz “heterocikloalkil” odnosi se na delimično ili potpuno zasićen monociklični ili biciklični prstenasti sistem koji osim ugljenika ima jedan ili više heteroatoma (npr., O, N ili S), kao atome prstena. Primeri uključuju, ali nisu ograničeni na, piperidin, piperazin, morfolin, tiomorfolin i 1,4-oksazepan.

[0012] Ovde pomenuti alkil, alkenil, alkinil, aril, heteroaril, cikloalkil i heterocikloalkil uključuju i supstituisane i nesupstituisane komponente. Primeri supstituenata uključuju C1-C10alkil, C2-C10alkenil, C2-C10alkinil, C3-C8cikloalkil, C5-C8cikloalkenil, C1-C10alkoksi, aril, ariloksi, heteroaril, heteroariloksi, amino, C1-C10alkilamino, C1-C20dialkilamino, arilamino, diarilamino, hidroksiamino, alkoksiamino, C1-C10alkilsulfonamid, arilsulfonamid, hidroksi, halogen, tio, C1-C10alkiltio, ariltio, cijano, nitro, acil, aciloksi, karboksil i karboksilni estar.

[0013] Izraz “polialkilen oksidna komponenta” odnosi se na monovalentni radikal dobijen od linearnog, granatog, ili zvezdastog polialkilen oksida. Molekulska težina polialkilen oksidne komponente može da bude 2-100 kD. Polialkilen oksidna komponenta je ili zasićena ili nezasićena. Primeri polialkilen oksidne komponente uključuju, ali nisu ograničene na, polietilen oksid, polietilen glikol, poliizopropilen oksid, polibutenilen oksid i njihove kopolimere. Drugi polimeri kao što su dekstran, polivinil alkoholi, poliakrilamidi ili polimeri na bazi ugljovodonika, takođe mogu da se koriste da se zameni polialkilen oksidna komponenta, pod uslovom da nisu antigeni, toksični ili da izazivaju imunski odgovor. Polialkilen oksidna komponenta je ili supstituisana ili nesupstituisana. Na primer, to može da bude polietilen glikol sa metoksi supstituentom (mPEG).

[0014] Izraz “komponenta interferona-α” odnosi se na monovalentni radikal dobijen od bilo kog interferona-α. “Interferon-α” odnosi se na familiju visoko homologih proteina specifičnih za vrstu, koji inhibiraju replikaciju virusa i proliferaciju ćelija i moduliraju imunski odgovor. Videti Bonnem et al., J. Biol. Response Mod., 1984, 3(6):580-598; i Finter, J. Hepatol., 1986, 3 Suppl 2:S157-160. Može da bude u obliku koji se javlja u prirodi ili u modifikovanom obliku. Modifikovani interferon-α, može da bude, npr., protein koji sadrži interferon-α i 1-4 dodatna amino kiselinska ostatka na N-kraju interferona. U skladu sa pronalaskom, modifikovani interferon je

gde IFN predstavlja komponentu interferona-α2b, čija je amino grupa na N-kraju vezana sa karbonilnom grupom.

[0015] Mnoge vrste interferon-α proteina su komercijalno dostupne, uključujući interferon Intron-A, koga obezbeđuje Schering Corporation, Kenilworth, N.J., interferon Roferon, koga obezbeđuje Hoffmann-La Roche, Nutley, N.J., interferon Berofor alfa 2, koga obezbeđuje Boehringer Ingelheim Pharmaceutical, Inc., Ridgefield, Conn., Sumiferon koga obezbeđuje Sumitomo, Japan, i interferon Velferon alfa-nl (INS) koga obezbeđuje Glaxo-Wellcome Ltd., London, Velika Britanija.

[0016] U tekstu koji sledi su date amino kiselinske sekvence pet primera humanih interferon-α proteina, bilo u obliku prekursora, bilo u zrelom obliku:

(Videti Krasagakis et al., Cancer Invest.26 (6), 562-568, 2008)

(Videti Klaus, et al., J. Mol. Biol.274 (4), 661-675, 1997)

(Videti pristupni broj, GenBank Accession Number AAP20099, verzija od 30-APR-2003.)

(Videti Capon et al., J. Mol. Cell. Biol.5 (4):768-779, 1985)

(Videti Lund et al., J. Interferon Res. 5 (2), 229-238, 1985)

[0017] U jednom primeru, interferon-α protein koji se koristi za pravljenje konjugata prema predmetnom prikazu, ima amino kiselinsku sekvencu najmanje 80% (npr., 85%, 90%, 95% ili 99%) identičnu sa jednom od sekvenci prethodno navedenih u tekstu, ili sa njihovim fragmentom koji odgovara zrelom interferonu alfa.

[0018] “Procenat identičnosti” dve aminokiselinske sekvence određuje se upotrebom algoritma prema publikaciji Karlin i Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990, modifikovanog kao u publikaciji Karlin i Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77, 1993. Ovaj algoritam je inkorporiran u programe NBLAST i XBLAST (verzija 2.0) prema Altschul, et al. J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990. BLAST pretrage proteina mogu da se izvode pomoću XBLAST programa, skor=50, dužina reči=3, kako bi se dobile amino kiselinske sekvence homologe sa molekulima proteina prema pronalasku. Tamo gde postoje međuprostori između dve sekvence, može da se koristi BLAST sa međuprostorima kao što je opisano u Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402, 1997. Kada se koriste programi BLAST i BLAST sa međuprostorima, mogu da se koriste zadati parametri tih programa (npr., XBLAST i NBLAST).

[0019] Izraz “povezujuća funkcionalna grupa” odnosi se na dvovalentnu funkcionalnu grupu, čiji je jedan kraj povezan sa komponentom polimera, a drugi kraj sa proteinskom komponentom. Primeri uključuju, ali nisu ograničeni na, -O-, -S-, karboksilno estarsku, karbonilnu, karbonatnu, amidnu, karbamatnu, urea, sulfonil, sulfinil, amino, imino, hidroksiamino, fosfonatnu ili fosfatnu grupu.

[0020] Prethodno u tekstu opisani konjugat proteina i polimera može da bude u slobodnom obliku ili u obliku soli, ako je primenjivo. So, na primer, može da se obrazuje između anjona i pozitivno naelektrisane grupe (npr., amino) na konjugatu proteina i polimera prema ovom pronalasku. Pogodni anjoni uključuju hlorid, bromid, jodid, sulfat, nitrat, fosfat, citrat, metansulfonat, trifluoroacetat i acetat. Na sličan način so može da se obrazuje i između katjona i negativno naelektrisane grupe (npr., karboksilne) na konjugatu proteina i polimera prema ovom pronalasku. Pogodni katjoni uključuju jon natrijuma, jon kalijuma, jon magnezijuma, jon kalcijuma, i amonijumski katjon kao što je tetrametilamonijum jon.

[0021] osim toga, konjugat proteina i polimera može da ima jednu ili više dvostrukih veza ili jedan ili više asimetričnih centara. Takav konjugat može da se javlja u vidu racemata, racemskih smeša, pojedinačnih enantiomera, individualnih dijasteroizomera, dijasteroizomernih smeša i izomernih oblika sa cis- ili trans- ili E- ili Z- dvostrukim vezama.

[0022] Sledi prikaz konjugata proteina i polimera prema ovom pronalasku:

gde mPEG ima molekulsku težinu od 20 kD i IFN je komponenta interferona-α2b.

[0023] Takođe je prikazana upotreba konjugata za proizvodnju medikamenta za lečenje jednog od poremećaja koji su prethodno pomenuti u tekstu.

[0024] Detalji jednog ili više primera izvođenja prema pronalasku izloženi su u opisu koji sledi. Druga svojstva, ciljevi i prednosti pronalaska biće očigledne iz opisa i iz patentnih zahteva.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0025] Konjugati proteina i polimera mogu da se pripremaju postupcima sinteze koji su dobro poznati u oblasti hemije, npr., postupcima opisanim u publikaciji U.S. Serial No. 12/192,485. Šema 1 prikazuje primer pripreme konjugata proteina i polimera. Diaminsko jedinjenje 1, koje sadrži acetalnu grupu, reaguje sa jedinjenjem N-hidroksisukcinimidil karbonat mPEG (tj., jedinjenjem 2) kako bi obrazovalo di-PEGilovano jedinjenje 3, koje se naknadno konvertuje u aldehid 4. Ovo aldehidno jedinjenje reaguje putem redukcione alkilacije sa proteinom koji ima slobodnu amino grupu tako da daje konjugat proteina i polimera.

Šema 1

[0026] Konjugat proteina i polimera sintetisan na ovaj način, može dalje da se prečišćava postupkom kao što je jonoizmenjivačka hromatografija, hromatografija sa gel filtracijom, elektroforeza, dijaliza, ultrafiltracija ili ultracentrifugiranje.

[0027] Hemijske reakcije, prethodno opisane u tekstu, uključuju upotrebu rastvarača, reagenasa, katalizatora, reagenasa za protektivne grupe i za deprotekciju grupa, kao i određenih uslova reakcije. One mogu da uključuju korake koji ili prethode ili slede nakon koraka koji su ovde specifično opisani, a u kojima se dodaju ili uklanjaju pogodne protektivne grupe kako bi se na kraju omogućila sinteza konjugata proteina i polimera. Pored toga, različiti koraci sinteze mogu da se izvode alternativnim redosledom ili redom kako bi se dobili željeni konjugati proteina i polimera. Sintetske hemijske transformacije i metodologije protektivnih grupa (protekcija i deprotekcija), korisne prilikom sinteze primenjivih konjugata proteina i polimera, poznate su u stanju tehnike i uključuju, na primer, one opisane u R. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers (1989); T.W. Greene i P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2d. Ed., John Wiley and Sons (1991); L. Fieser i M. Fieser, Fieser and Fieser’s Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1994); i L. Paquette, ed., Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1995), kao i u njihovim potonjim izdanjima.

[0028] Konjugat prema pronalasku može da ima veoma visoku čistoću. Naime, 60% ili više (npr., 70%, 80% ili 90%) molekula konjugata je identično u svim aspektima, uključujući sekvencu proteinske komponente i njene pozicije preko kojih se vezuje za polimernu komponentu.

[0029] Konjugat prema ovom pronalasku može da bude farmaceutski aktivan u konjugovanom obliku. Alternativno, može da oslobađa farmaceutski aktivan interferon-α, in vivo (npr., hidrolizom) putem enzimskog raskidanja veze između proteinske komponente i polimerne komponente. Primeri enzima uključenih u in vivo raskidanje veza uključuju oksidativne enzime (npr., peroksidaze, amin oksidaze ili dehidrogenaze), reduktivne enzime (npr., keto reduktaze), i hidrolitičke enzime (npr., proteaze, esteraze, sulfataze ili fosfataze).

[0030] Konjugat prema ovom pronalasku može da se koristi za lečenje multiple skleroze, hronične virusne infekcije (kao što su infekcija hepatitis B virusom, infekcija hepatitis C virusom i infekcija humanim papiloma virusom), kancera, idiopatske mijelofibroze, primarne policitemije i esencijalne trombocitemije. On ima neočekivano dugo vreme poluživota in vivo, smanjenu dozu leka i/ili produžen interval doziranja.

[0031] Kako se ovde koristi, izraz “lečenje” ili “tretman” definisan je kao aplikacija ili primena kompozicije koja uključuje konjugat proteina i polimera, kod subjekta (čoveka ili životinje) koji ima poremećaj, simptom poremećaja, bolest ili poremećaj koji su sekundarni u odnosu na taj poremećaj, ili predispoziciju za poremećaj, sa ciljem da se izleči, ublaži, olakša, popravi ili poboljša poremećaj, simptom poremećaja, bolest ili poremećaj koji su sekundarni u odnosu na taj poremećaj, ili predispozicija za taj poremećaj. “Efikasna količina” se odnosi na količinu konjugata proteina i polimera koja obezbeđuje terapeutski efekat kod lečenog subjekta. Terapeutski efekat može da bude objektivan (tj., merljiv pomoću nekih testova ili markera) ili subjektivan (tj., subjekat ukazuje na, ili oseća, efekat).

[0032] U obimu ovog pronalaska je takođe i farmaceutska kompozicija koja sadrži efikasnu količinu najmanje jednog od konjugata proteina i polimera koji su opisani prethodno u tekstu, i farmaceutski prihvatljiv nosač. Osim toga, ovaj pronalazak uključuje postupak za primenu efikasne količine jednog ili više konjugata proteina i polimera, kod pacijenta sa jednom ili više bolesti. Efikasne doze će varirati, kao što je to poznato stručnjacima u oblasti, u zavisnosti od, npr., brzine hidrolize konjugata proteina i polimera, vrsta bolesti koje se leče, rute primene, upotrebe ekscipijensa i mogućnosti istovremene upotrebe sa drugim terapeutskim tretmanom.

[0033] Kako bi se postupak prema predmetnom pronalasku primenjivao, kompozicija koja ima jedno ili više jedinjenja, prethodno pomenutih u tekstu, može da se primenjuje parenteralno, oralno, nazalno, rektalno, topikalno ili bukalno. Izraz “parenteralno” kako se ovde koristi, odnosi se na subkutanu, intrakutanu, intravensku, intramuskularnu, intraartikularnu, intraarterijsku, intrasinovijalnu, intrasternumsku, intratekalnu, intralezijsku, intraperitonealnu, intratrahealnu ili intrakranijalnu injekciju, kao i bilo koju pogodnu tehniku infuzije.

[0034] Sterilna kompozicija za injekciju može da bude rastvor ili suspenzija u netoksičnom, parenteralno prihvatljivom razblaživaču ili rastvaraču, kao što je rastvor u 1,3-butandiolu. U prihvatljive vehikulume i rastvarače koji mogu da se koriste spadaju manitol, voda, Ringerov rastvor i izotonični rastvor natrijum hlorida. Osim toga, neisparljiva ulja se konvencionalno koriste kao medijum za rastvaranje i za suspendovanje (npr., sintetski monogliceridi ili digliceridi). Masne kiselina, kao što su oleinska kiselina i njeni gliceridni derivati, korisne su za pripremu injekcija, kao i prirodna farmaceutski prihvatljiva ulja, kao što je maslinovo ulje ili ricinusovo ulje, naročito u svojim polioksietilovanim verzijama. Ovi uljani rastvori ili suspenzije mogu takođe da sadrže alkoholne razblaživače ili disperzante dugog lanca ili karboksimetil celulozu ili slična disperzivna sredstva. Drugi surfaktanti koji se uobičajeno koriste, kao Tween ili Span surfaktanti ili drugi slični emulgatori ili pojačavači biološke raspoloživosti koji se obično koriste u proizvodnji farmaceutski prihvatljivih, čvrstih, tečnih, ili drugih oblika doza, takođe mogu da se koriste u cilju formulisanja.

[0035] Kompozicija za oralnu primenu može da bude bilo koji oralno prihvatljiv oblik doze uključujući kapsule, tablete, emulzije, i vodene suspenzije, disperzije i rastvore. U slučaju tableta, nosači koji se uobičajeno koriste uključuju laktozu i kukuruzni skrob. Uobičajeno se dodaju i lubrikanti kao što je magnezijum stearat. Za oralnu primenu u obliku kapsule, korisni razblaživači uključuju laktozu i osušeni kukuruzni skrob. Kada se vodene suspenzije ili emulzije primenjuju oralno, aktivni sastojak može da bude suspendovan ili rastvoren u uljanoj fazi u kombinaciji sa emulgatorima ili sredstvima za suspendovanje. Po želji mogu da se dodaju i određeni zaslađivači, sredstva za davanje arome ili za bojenje.

[0036] Kompozicija nazalnog aerosola ili inhalaciona kompozicija može da se priprema u skladu sa tehnikama koje su dobro poznate u oblasti farmaceutskog formulisanja. Na primer, takva kompozicija može da se priprema kao rastvor u fiziološkom rastvoru, uz upotrebu benzil alkohola ili drugih pogodnih konzervanasa, promotora apsorpcije da bi se poboljšala biološka raspoloživost, fluorougljenika i/ili drugih sredstava za poboljšanje rastvorljivosti ili za dispergovanje, koji su poznati u stanju tehnike. Kompozicija koja ima jedno ili više upravo opisanih jedinjenja, takođe može da se primenjuje u obliku supozitorija za rektalnu primenu.

[0037] Farmaceutski prihvatljiv nosač rutinski se koristi sa jednim ili više aktivnih, prethodno pomenutih jedinjenja. Nosač u farmaceutskoj kompoziciji mora da bude “prihvatljiv” u tom smislu da je kompatibilan sa aktivnim sastojkom kompozicije (i, poželjno, u stanju da stabilizuje aktivni sastojak) i da nije štetan za subjekta koji se leči. Jedno ili više sredstava za povećanje rastvorljivosti mogu da se koriste kao farmaceutski ekscipijensi za isporuku prethodno pomenutih jedinjenja. Primeri drugih nosača uključuju koloidni silicijum oksid, magnezijum stearat, celulozu, natrijum lauril sulfat i hinolin žuto.

[0038] Pogodni testovi mogu da se koriste za preliminarnu procenu efikasnosti prethodno opisanih konjugata u lečenju različitih bolesti. Na primer, efikasnost konjugata u lečenju primarne policitemije i esencijalne trombocitemije, može da se oceni prateći postupke opisne u publikacijama Kiladjian et al., Blood 2008; 112(8): 3065-72 i Langer et al., Haetatologica 2005; 90: 1333-1338, redom.

[0039] Primer koji sledi je potrebno shvatiti kao puku ilustraciju, a ni na koji način ne kao ograničenje za ostatak prikaza. Bez daljeg zalaženja u detalje, veruje se da stručnjak u oblasti može, na osnovu ovde datog opisa, da koristi predmetni pronalazak u njegovom najpotpunijem obimu.

Priprema di-PEG aldehida

[0040]

[0041] 20 kD PEGO(C=O)OSu je pripremljen od 20 kD mPEGOH koji je kupljen od (SunBio Inc., CA, USA), u skladu sa postupkom opisanim u Bioconjugate Chem.1993, 4, 568-569.

[0042] Rastvor 6-(1,3-dioksolan-2-il)heksan-1,5-diamina u dihlorometanu (11.97 g rastvora koji sadrži 9.03 mg diamina, 47.8 µmol) dodat je u balon sa 20 kD PEGO(C=O)OSu (1.72 g, 86.0 µmol). Pošto se PEGO(C=O)OSu potpuno rastvorio, dodat je N, N-diizopropiletilamin (79 µL, 478 µmol). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 24h, a zatim je metil t-butil etar (200 mL) dodat u kapima, uz mešanje. Dobijeni precipitat je sakupljen i osušen pod vakuumom kako bi dao di-PEG acetal (1.69 g, 98%) u vidu bele čvrste supstance.

1H NMR (400 MHz, d6-DMSO) δ 7.16 (t, J = 5.2 Hz, 1 H), 7.06 (d, J = 8.8 Hz, 1 H), 4.76 (t, J = 4.8 Hz, 1 H), 4.10-3.95 (m, 4 H), 1.80-1.65 (m, 1 H), 1.65-1.50 (m, 1 H), 1.48-1.10 (m, 6 H).

[0043] Di-PEG acetal (4.0 g, 0.2 mmol) je suspendovan u puferu sa pH vrednošću 2.0 (limunska kiselina, 40 mL). Reakciona smeša je mešana na 35°C tokom 24 h i zatim ekstrahovana pomoću dihlorometana (3 x 50 mL). Kombinovani organski slojevi su osušeni preko magnezijum sulfata,

1

koncentrovani, a zatim ponovo rastvoreni u dihlorometanu (20 mL). Ovaj rastvor je dodat u kapima u metil t-butil etar (400 mL), uz mešanje. Dobijeni precipitat je sakupljen i osušen na sniženom pritisku kako bi dao di-PEG aldehid (3.8 g, 95%) u vidu bele čvrste supstance.

1H NMR (400 MHz, d6-DMSO) δ 9.60 (s, 1 H), 7.24 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 7.16 (t, J = 5.2 Hz, 1 H), 4.10-3.95 (m, 4 H), 3.95-3.80 (m, 1 H), 3.00-2.85 (m, 2 H), 2.58-2.36 (m, 2 H), 1.46-1.15 (m, 6 H).

Priprema modifikovanog interferona

[0044]

[0045] Modifikovani rekombinantni humani interferon-α2bkloniran je PCR metodom, koristeći humanu genomsku DNK kao matricu. Oligonukleotidi su sintetisani na osnovu graničnih sekvenci uz humani interferon-α2b(pristup GenBank Accession # J00207, 8. januara, 2008.). Dobijeni PCR proizvodi su subklonirani u pGEM-T vektor (Promega). IFN varijanta je ponovo amplifikovana pomoću PCR, preko pGEM-T klonova i zatim, koristeći NdeI/BamHI kao restrikciona mesta, subklonirana u proteinski ekspresioni vektor pET-24a (Novagen), koji predstavlja vektor propagiran pomoću promotora T7 RNK polimeraze. Vektor pET-24a je zatim transformisan u bakterijski soj E. coli BL21-CodonPlus (DE 3)-RIL (Stratagene). Klonovi sa visokom ekspresijom su selektovani tako što su transformisane E. coli BL21-CodonPlus (DE 3)-RIL održavane u prisustvu karamicina (50 µg/mL) i hloramfenikola (50 µg/mL).

[0046] Medijum pod nazivom Terrific broth medium (BD, 200 mL) je korišćen za propagaciju BL21-CodonPlus (DE 3)-RIL sa Pro-IFN genom u flasku od 1000 mL. Flask je mućkan na 37°C pri 230 rpm tokom 16 sati. Izvedene su fermentacije serija bez dodavanja i sa dodavanjem rastvora, u fermentoru sa sudovima od 5 litara (Bioflo 3000; New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ). U fermentaciji serije je korišćeno 150 mL inokuluma prekonoćne prekulture i 3 L medijuma Terrific broth medium sa karamicinom (50 µg/mL), hloramfenikolom (50 µg/mL), 0.4% glicerolom i 0.5% (zap./zap.) mikroelemenata (10 g/L FeSO4·7H2O, 2.25 g/L ZnSO4·7H2O, 1 g/L CuSO4·5H2O, 0.5 g/L MnSO4·H2O, 0.3 g/L H3BO3, 2 g/L CaCl2·2H2O, 0.1 g/L (NH4)6Mo7O24, 0.84 g/L EDTA, 50 ml/L HCl). Koncentracija rastvorenog kiseonika je kontrolisana na 35% i pH vrednost je održavana na 7.2 dodavanjem 5 N vodenog rastvora NaOH. Pripremljen je napojni rastvor sa 600 g/L glukoze i 20 g/L MgSO4·7H2O. Kada bi pH porastao do vrednosti više od podešene tačke, dodavana je odgovarajuća zapremina napojnog rastvora, kako bi se povećala koncentracija glukoze u medijumu. Ekspresija Pro-IFN gena je indukovana dodavanjem IPTG do finalne koncentracije od 1 mM i medijum je sakupljen nakon inkubacije od 3 sata.

[0047] Sakupljeni ćelijski talog je resuspendovan TEN puferom (50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl) u približnom odnosu od 1:10 (vlažna težina g/mL) i liziran pomoću mikrofluidizera, a zatim centrifugiran na 10,000 rpm tokom 20 min. Talog koji sadrži inkluziono telo (IB) opran je dvaput TEN puferom i centrifugiran kao što je već opisano. Talog koji sadrži IB zatim je suspendovan u 150 mL 4 M vodenog rastvora guanidijum HCl (GuHCl) i centrifugiran na 20,000 rpm tokom 15 min. IB je zatim solubilisano u 50 mL 6 M rastvora GuHCl. Materijal solubilisan pomoću GuHCl centrifugiran je na 20,000 rpm tokom 20 min. Renaturacija je inicirana razblaživanjem denaturisanog IB u 1.5 L sveže pripremljenog pufera za renaturaciju (100 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.5 M L-arginin, 2 mM EDTA) koji je mešan samo tokom dodavanja. Reakciona smeša za renaturaciju je ostavljena da se inkubira tokom 48 sati bez mešanja. Renaturisani rekombinantni humani interferon-α2b(tj., Pro-IFN) dijaliziran je pomoću 20 mM Tris pufera (sa 2 mM EDTA i 0.1M ureom, pH 7.0) kako bi dalje bio prečišćen hromatografijom na koloni sa Q-sefarozom.

[0048] Renaturisani rekombinantni humani protein Pro-IFN nanet je na kolonu sa Q-sefarozom (GE Amersham Pharmacia, Pittsburgh, PA). Kolona je preekvilibrisana i oprana 20 mM Tris-HCl puferom (pH 7.0). Proizvod je eluiran smešom 20 mM Tris-HCl pufera (pH 7.0) i 200 mM NaCl. Frakcije koje su sadržale Pro-IFN sakupljane su na osnovu svoje apsorbancije na 280 nm. Koncentracija Pro-IFN je određena pomoću kita za testiranje proteina koji koristi Bradfordov metod (Pierce, Rockford, IL).

Priprema konjugata proteina i polimera

[0049]

[0050] U rastvor di-PEG aldehida (1.2 g, 0.03 mmol) u vodi (72 mL), pripremljenog kao što je prethodno ovde opisano, dodat je 2 M natrijum fosfatni pufer (pH 4.0, 5 mL) i Pro-IFN (200 mg u 22.2 mL pufera na pH 7.0 koji sadrži 20 mM Tris-HCl i 0.2M NaCl, 0.01 mmol). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 10 min; zatim je dodat vodeni rastvor natrijum cijanoborohidrida (400 mM, 1.25 mL, 0.5 mmol). Reakciona smeša je mešana u mraku tokom 16 h i prečišćena hromatografijom pomoću sefaroze SP XL Sepharose. Frakcije koje sadrže željeni konjugat polimera i proteina sakupljane su na osnovu vremena retencije i apsorbancije na 280 nm. Koncentracija konjugata je određena pomoću kita za testiranje proteina koji koristi Bradfordov metod (Pierce, Rockford, IL). Prinos izolovanog konjugata iznosio je otprilike 40% ili više.

1

Claims (1)

1. Patentni zahtevi 1. Konjugat za upotrebu u lečenju idiopatske mijelofibroze, primarne policitemije i esencijalne trombocitemije, koji je formule

   u kojoj mPEG ima molekulsku težinu od 20 kD i IFN je komponenta interferona-α2b. Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5