RS60414B1 - Agensi rnki, kompozicije i postupci za njihovu primenu u lečenju bolesti povezanih sa transtiretinom (ttr) - Google Patents

Agensi rnki, kompozicije i postupci za njihovu primenu u lečenju bolesti povezanih sa transtiretinom (ttr)

Info

Publication number
RS60414B1
RS60414B1 RS20200699A RSP20200699A RS60414B1 RS 60414 B1 RS60414 B1 RS 60414B1 RS 20200699 A RS20200699 A RS 20200699A RS P20200699 A RSP20200699 A RS P20200699A RS 60414 B1 RS60414 B1 RS 60414B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
ttr
rnai agent
nucleotides
agent
subject
Prior art date
Application number
RS20200699A
Other languages
English (en)
Inventor
Rajeev G Kallanthottathil
Tracy Zimmermann
Muthiah Manoharan
Martin Maier
Satyanarayana Kuchimanchi
Klaus Charisse
Original Assignee
Alnylam Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=48430225&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS60414(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Alnylam Pharmaceuticals Inc filed Critical Alnylam Pharmaceuticals Inc
Publication of RS60414B1 publication Critical patent/RS60414B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7125—Nucleic acids or oligonucleotides having modified internucleoside linkage, i.e. other than 3'-5' phosphodiesters
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/02—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with ribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1136—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against growth factors, growth regulators, cytokines, lymphokines or hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering nucleic acids [NA]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/322—2'-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/343—Spatial arrangement of the modifications having patterns, e.g. ==--==--==--
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/346—Spatial arrangement of the modifications having a combination of backbone and sugar modifications
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/352—Nature of the modification linked to the nucleic acid via a carbon atom
    • C12N2310/3521—Methyl
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/353—Nature of the modification linked to the nucleic acid via an atom other than carbon
    • C12N2310/3533—Halogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Opis
Osnova pronalaska
[0001] Transtiretin (TTR) (poznat i kao prealbumin) nalazi se u serumu i cerebrospinalnoj tečnosti (CSF). TTR transportuje retinol-vezujući protein (RBP) i tiroksin (T4) i takođe deluje kao nosač retinola (vitamin A) putem svoje povezanosti sa RBP u krvi i CSF. Transtiretin je dobio ime po svom transportu tiroksina i retinola. TTR takođe deluje kao proteaza i može da cepa proteine, uključujući apoA-I (glavni HDL apolipoprotein), amiloid β-peptid i neuropeptid Y. Vidite Liz, M.A. i sar. (2010) IUBMB Life, 62(6):429-435.
[0002] TTR je tetramer četiri identične podjedinice od 127 aminokiselina (monomeri) koje su bogate strukturom beta ravni. Svaki monomer ima dve 4-lančane beta ravni i oblik izduženog elipsoida. Antiparalelne interakcije u beta ravni povezuju monomere u dimere. Kratka petlja od svakog monomera čini glavnu dimer-dimer interakciju. Ova dva para petlji razdvajaju suprotne, konveksne beta ravni dimera dajući interni kanal.
[0003] Jetra je značajno mesto ekspresije TTR. Druga bitna mesta ekspresije uključuju horoidni pleksus, mrežnjaču (posebno epitelijum pigmenta mrežnjače) i pankreas.
[0004] Transtiretin je jedan od najmanje 27 različitih vrsta proteina koji je prekursorski protein u nastajanju amiloidnih filamenata. Vidite Guan, J. i sar. (Nov.4, 2011) Current perspectives on cardiac amyloidosis, Am J Physiol Heart Circ Physiol, doi:10.1152/ajpheart.00815.2011. Vanćelijsko taloženje amiloidnih filamenata u organima i tkivima je pokazatelj amiloidoze. Amiloidni filamenti su sastavljeni od pogrešno presavijenih agregata proteina, koji mogu biti posledica prekomerne proizvodnje ili specifičnih mutacija u prekursorskim proteinima. Amiloidogeni potencijal TTR može biti povezan sa njegovom razvijenom strukturom beta ravni; studije rendgenske kristalografije pokazuju da određene amiloidogene mutacije destabilizuju tetramernu strukturu proteina. Vidite, npr., Saraiva M.J.M. (2002) Expert Reviews in Molecular Medicine, 4(12):1-11.
[0005] Amiloidoza je opšti termin za grupu amiloidnih bolesti koje su okarakterisane amiloidnim naslagama. Amiloidne bolesti se klasifikuju na osnovu njihovog prekursorskog proteina, na primer, naziv počinje sa „A“ što označava amiloid, praćeno skraćenicom za prekursorski protein, npr. ATTR za amiloidnogeni transtiretin. Ibid.
[0006] Postoje brojne bolesti povezane sa TTR, i većinom su amiloidne bolesti. TTR normalne sekvence je povezan sa srčanom amiloidozom kod starijih osoba, i naziva se senilna sistemska amiloidoza (SSA) (takođe se naziva i senilna srčana amiloidoza (SCA) ili srčana amiloidoza). SSA je često praćena mikroskopskim naslagama u mnogim drugim organima. TTR amiloidoza se manifestuje u različitim oblicima. Kada je periferni nervni sistem jače pogođen, bolest se naziva familijarna amiloidna polineuropatija (FAP). Kada je primarno pogođeno srce, ali ne i nervni sistem, bolest se naziva familijarna amiloidna kardiomiopatija (FAC). Treća značajna vrsta TTR amiloidoze je leptomeningealna amiloidoza, poznata i kao leptomeningealna ili meningocerebrovaskularna amiloidoza, amiloidoza centralnog nervnog sistema (CNS) ili amiloidoza VII oblika. Mutacije u TTR takođe mogu da izazovu amiloidna zamućenja staklastog tela, sindrom karpalnog tunela i eutiroidnu hipertiroksinemiju, koja je neamiloidna bolest za koju se smatra da prati povećano povezivanje tiroksina sa TTR usled mutantnog molekula TTR sa povećanim afinitetom prema tiroksinu. Vidite, npr. Moses i sar. (1982) J. Clin. Invest., 86, 2025-2033.
[0007] Abnormalni amiloidogeni proteini mogu biti nasleđeni ili stečeni putem somatskih mutacija. Guan, J. i sar. (Nov. 4, 2011) Current perspectives on cardiac amyloidosis, Am J Physiol Heart Circ Physiol, doi:10.1152/ajpheart.00815.2011. ATTR povezan sa transtiretinom je najčešći oblik nasledne sistemske amiloidoze. Lobato, L. (2003) J. Nephrol., 16:438-442. Mutacije TTR ubrzavaju proces amiloidnog nastajanja TTR i najznačajniji su faktor rizika pojave ATTR. Za više od 85 varijanti amiloidogenih TTR je poznato da izazivaju sistemsku familijarnu amiloidozu. Mutacije TTR obično dovode do sistemskog amiloidnog taloženja, uz posebno učešće perifernog nervnog sistema, mada su neke mutacije povezane sa kardiomiopatijom ili zamućenjem staklastog tela. Ibid.
[0008] Mutacija V30M je najzastupljenija TTR mutacija. Vidite, npr. Lobato, L. (2003) J.
Nephrol., 16:438-442. Mutaciju V122I nosi 3,9% populacije Afroamerikanaca, i najčešći je uzrok FAC. Jacobson, D.R. i sar. (1997) N. Engl. J. Med.336 (7): 466-73. Procenjeno je da se SSA javlja kod više od 25% populacije starijih od 80 godina. Westermark, P. i sar. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87 (7): 2843-5 WO 2011/056883 opisuje agense dvolančane RNKi za ciljanje transtiretina.
[0009] Shodno tome, u struci postoji potreba za delotvornim lečenjima bolesti povezanih sa TTR.
Sažetak
[0010] Pronalazak je definisan patentnim zahtevima. Odnosi se na dvolančani agens RNKi koji sadrži sens lanac komplementaran antisens lancu, pri čemu pomenuti antisens lanac sadrži region komplementaran delu mRNK koja kodira transtiretin (TTR), pri čemu svaki lanac ima oko 14 do oko 30 nukleotida, pri čemu je pomenuti dvolančani agens RNKi predstavljen formulom (III): sens: 5' np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y -Nb-(Z Z Z)j-Na- nq3' antisens: 3' np'-Na'-(X'X'X')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(Z'Z'Z')l-Na'-nq' 5' (III) pri čemu: i, j, k, i 1 su svaki nezavisno 0 ili 1, pri čemu, i je 0, j je 1; p, p', q, i q' su svaki nezavisno 0-6; svako Nai Na' nezavisno predstavlja sekvencu oligonukleotida koja sadrži 0-25 modifikovanih nukleotida, svaka sekvenca sadrži najmanje dva različito modifikovana nukleotida; svako Nbi Nb' nezavisno predstavlja sekvencu oligonukleotida koja sadrži 0-10 modifikovanih nukleotida; svako np, np', nq, i nq' nezavisno predstavlja nukleotidni prepust; XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y' i Z'Z'Z' nezavisno predstavljaju jedan motiv od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida; pri čemu Y nukleotidi imaju modifikaciju 2'-fluor, a Y' nukleotidi imaju modifikaciju 2'-O-metil; pri čemu se pomenuti motiv YYY javlja na pozicijama 9, 10 i 11 kada je region dupleksa 21 nukleotid; i pri čemu je sens lanac konjugovan sa najmanje jednim ligandom.
[0011] Predmetno otkriće obezbeđuje agense RNKi, npr. agense dvolančane RNKi, koji ciljaju gen transtiretina (TTR). Predmetno otkriće takođe pruža postupke za inhibiranje ekspresije TTR i postupke za lečenje ili prevenciju bolesti povezanih sa TTR kod ispitanika korišćenjem agenasa RNKi, npr. agenasa dvolančane RNKi, iz pronalaska. Predmetni pronalazak je zasnovan, barem delimično, na otkriću da agensi RNKi koji sadrže određene hemijske modifikacije pokazuju bolju sposobnost inhibiranja ekspresije TTR. Ovde je pokazano da su agensi koji uključuju određeni šablon hemijskih modifikacija (npr. naizmenični šablon) i ligand delotvorni u utišavanju aktivnosti gena TTR. Nadalje, agensi koji uključuju jedan ili više motiva od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida, uključujući jedan takav motiv na mestu cepanja agensa ili blizu njega, pokazuju iznenađujuće poboljšanu aktivnost utišavanja gena TTR. Kada je samo jedan takav hemijski motiv prisutan u agensu, poželjno je da bude u regionu cepanja ili blizu njega radi poboljšanja aktivnosti utišavanja gena. Region cepanja je region koji okružuje mesto cepanja, tj. mesto na ciljnoj mRNK na kojem dolazi do cepanja.
[0012] Shodno tome, u jednom aspektu, predmetno otkriće sadrži agense RNKi, npr. agense dvolančane RNKi, za inhibiranje ekspresije transtiretina (TTR). Dvolančani agens RNKi uključuje sens lanac komplementaran sa antisens lancem. Antisens lanac ima komplementarnost regiona sa delom mRNK koji kodira transtiretin. Svaki lanac ima 14 do 30 nukleotida, i dvolančani agens RNKi je predstavljen formulom (III):
U formuli III, i, j, k i l su svaki nezavisno 0 ili 1; p, p', q, i q' su svaki nezavisno 0-6; svako Nai Na' nezavisno predstavlja sekvencu oligonukleotida sa 0-25 nukleotida koji su modifikovani ili nemodifikovani ili kombinacija ta dva; svaka sekvenca uključuje najmanje dva različito modifikovana nukleotida; svako Nbi Nb' nezavisno predstavlja sekvencu oligonukleotida sa 0-10 nukleotida koji su modifikovani ili nemodifikovani ili kombinacija ta dva; svako np, np', nq, i nq' nezavisno predstavlja nukleotidni prepust; XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y', i Z'Z'Z' nezavisno predstavlja jedan motiv od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida; modifikacije na Nbse razlikuju od modifikacije na Y i modifikacije na Nb' se razlikuju od modifikacije na Y'. U nekim otelotvorenjima, sens lanac je konjugovan sa najmanje jednim ligandom, npr. najmanje jednim ligandom, npr. najmanje jednim ligandom spojenim na 3' kraju sens lanca. U drugim otelotvorenjima, ligand može biti konjugovan sa antisens lancem.
[0013] U nekim slučajevima, i je 1; j je 1; ili i i j su oba 1.
[0014] U nekim slučajevima, k je 1; l je 1; ili k i l su oba 1.
[0015] Prema pronalasku, i je 0; j je 1.
[0016] U nekim slučajevima, i je 1, j je 0.
[0017] Prema pronalasku, k je 0; l je 1.
[0018] U nekim slučajevima, k je 1, l je 0.
[0019] U nekim slučajevima, XXX je komplementarno sa X'X'X', YYY je komplementarno sa Y'Y'Y', i ZZZ je komplementarno sa Z'Z'Z'.
[0020] U nekim slučajevima, motiv YYY se javlja na mestu cepanja sens lanca ili blizu njega.
[0021] U nekim otelotvorenjima, motiv Y'Y'Y' se javlja na pozicijama 11, 12 i 13 antisens lanca od 5'-kraja.
[0022] Prema pronalasku, Y' je 2'-O-metil.
[0023] U nekim slučajevima, Y' je 2'-fluor.
[0024] U nekim slučajevima, formula (III) je predstavljena kao formula (IIIa):
U formuli IIIa, svako Nbi Nb' nezavisno predstavlja sekvencu oligonukleotida sa 1-5 modifikovanih nukleotida.
[0025] U nekim otelotvorenjima, formula (III) je predstavljena kao formula (IIIb):
U formuli IIIb, svako Nbi Nb' nezavisno predstavlja sekvencu oligonukleotida sa 1-5 modifikovanih nukleotida.
[0026] U nekim slučajevima, formula (III) je predstavljena kao formula (IIIc):
U formuli IIIc, svako Nbi -Nb' nezavisno predstavlja sekvencu nukleotida sa 1-5 modifikovanih nukleotida i svako Nai Na' nezavisno predstavlja sekvencu oligonukleotida sa 2-10 modifikovanih nukleotida.
[0027] U mnogim slučajevima, dupleks region je dužine 15-30 parova nukleotida. U nekim slučajevima, dupleks region je dužine 17-23 parova nukleotida, dužine 17-25 parova nukleotida, dužine 23-27 parova nukleotida, dužine 19-21 parova nukleotida ili dužine 21-23 parova nukleotida.
[0028] U nekim slučajevima, svaki lanac ima 15-30 nukleotida.
[0029] U nekim slučajevima, modifikacije na nukleotidima su izabrane iz grupe koja se sastoji od LNA, HNA, CeNA, 2'-metoksietil, 2'-O-alkil, 2'-O-alil, 2'-C-alil, 2'-fluor, 2'-dezoksi, 2'-hidroksil, i njihovih kombinacija. U nekim poželjnim slučajevima, modifikacije na nukleotidima su 2'-O-metil ili 2'-fluor.
[0030] U nekim otelotvorenjima, ligand je jedan ili više derivata N-acetilgalaktozamina (GalNAc) povezanih dvovalentnim ili trovalentnim razgranatim linkerom. U konkretnim otelotvorenjima, ligand je
[0031] U nekim otelotvorenjima, ligand je spojen na 3' kraju sens lanca.
[0032] U nekim otelotvorenjima, agens RNKi je konjugovan sa ligandom kako je prikazano u sledećem šematskom prikazu
pri čemu, X je O ili S.
[0033] U nekim otelotvorenjima, agens RNKi je konjugovan sa ligandom kako je prikazano u sledećem šematskom prikazu
[0034] U nekim slučajevima, agens RNKi dalje uključuje najmanje jednu fosforotioatnu ili metilfosfonatnu internukleotidnu vezu. U nekim slučajevima, fosforotioatna ili metilfosfonatna internukleotidna veza je na 3'-terminusu jednog lanca. U nekim slučajevima, lanac je antisens lanac. U drugim slučajevima, lanac je sens lanac.
[0035] U određenim slučajevima, bazni par na poziciji 15'-kraja dupleksa je bazni par AU.
[0036] Prema pronalasku, Y nukleotid sadrži 2'-fluor modifikaciju.
[0037] Prema pronalasku, Y' nukleotid sadrži 2'-O-metil modifikaciju.
[0038] U nekim slučajevima, p'>0. U nekim takvim slučajevima, svako n je komplementarno sa ciljnom mRNK. U drugim takvim slučajevima, svako n je nekomplementarno sa ciljnom mRNK. U nekim slučajevima, p, p', q i q' su 1-6. U nekim poželjnim slučajevima, p' = 1 ili 2. U nekim poželjnim slučajevima, p'=2. U nekim takvim slučajevima, q'=0, p=0, q=0, i p' nukleotidi prepusta su komplementarni sa ciljanom mRNK. U drugim takvim slučajevima, q'=0, p=0, q=0, i p' nukleotidi prepusta su nekomplementarni sa ciljnom mRNK.
[0039] Prema pronalasku, sens lanac ima ukupno 21 nukleotid, a antisens lanac ima ukupno 23 nukleotida.
[0040] U određenim slučajevima, veze između np' uključuju fosforotioatne veze. U nekim takvim slučajevima, veze između np' su fosforotioatne veze.
[0041] U nekim slučajevima, agens RNKi je izabran iz grupe agenasa nabrojanih u tabeli 1.
[0042] U poželjnim slučajevima, agens RNKi je izabran iz grupe koja se sastoji od AD-51544, AD-51545, AD-51546 i AD-51547.
[0043] U još poželjnijem slučaju, agens RNKi je AD-51547 koji ima sledeću strukturu:
sens: 5'- UfgGfgAfuUfuCfAfUfgUfaacCfaAfgAfL96-3' (SEQ ID NO:2) antisens: 5'- uCfuUfgGfUfUfaCfaugAfaAfuCfcCfasUfsc-3' (SEQ ID NO:3) pri čemu nukleotidi napisani malim slovom (a, u, g, c) označavaju 2'-O-metil nukleotide; Nf (npr. Af) označava 2'-fluor nukleotide; s označava fosfotioratnu vezu; L96 označava GalNAc3ligand.
[0044] U drugom aspektu, predmetni pronalazak obuhvata in vitro ćeliju koja sadrži agens RNKi za inhibiranje ekspresije TTR iz pronalaska.
U daljem aspektu, predmetni pronalazak obuhvata farmaceutsku kompoziciju koja sadrži agens RNKi za inhibiranje ekspresije TTR iz pronalaska. U nekim slučajevima, farmaceutska kompozicija je rastvor koji sadrži agens RNKi. U nekim otelotvorenjima, rastvor koji sadrži agens RNKi je nepuferovani rastvor, npr. fiziološki rastvor ili voda. U drugim otelotvorenjima, rastvor je puferovani rastvor, npr. fiziološki rastvor puferovan fosfatom (PBS). U drugim otelotvorenjima, farmaceutska kompozicija je lipozomska ili lipidna formulacija. U nekim slučajevima, lipidna formulacija sadrži XTC ili MC3.
[0045] U još jednom aspektu, predmetni pronalazak in vitro obuhvata postupke za inhibiranje ekspresije transtiretina (TTR) u ćeliji. Postupci uključuju dovođenje ćelije u kontakt sa agensom RNKi, npr. dvolančanim agensom RNKi, u količini koja je delotvorna za inhibiranje ekspresije TTR u ćeliji, time inhibirajući ekspresiju TTR u ćeliji.
[0046] U nekim otelotvorenjima, ekspresija TTR je inhibirana za najmanje oko 10%, najmanje oko 20%, najmanje oko 30%, najmanje oko 40%, najmanje oko 50%, najmanje oko 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 80% ili najmanje oko 90%.
[0047] Prema pronalasku, ćelija je in vitro dovedena u kontakt sa agensom RNKi. U drugim slučajevima, ćelija je prisutna u ispitaniku. U poželjnim slučajevima, ispitanik je čovek.
[0048] U daljim slučajevima, ispitanik je ispitanik koji boluje od bolesti povezanih sa TTR, i delotvorna količina je terapeutski delotvorna količina. U drugim slučajevima, ispitanik je ispitanik kod koga postoji rizik od nastanka bolesti povezane sa TTR, i delotvorna količina je profilaktički delotvorna količina. U nekim slučajevima, ispitanik sa rizikom od nastanka bolesti povezane sa TTR je ispitanik koji nosi TTR gensku mutaciju koja je povezana sa nastankom bolesti povezane sa TTR.
[0049] U određenim otelotvorenjima, bolest povezana sa TTR je izabrana iz grupe koja se sastoji od senilne sistemske amiloidoze (SSA), sistemske familijarne amiloidoze, familijarne amiloidne polineuropatije (FAP), familijarne amiloidne kardiomiopatije (FAC), leptomeningealne amiloidoze/amiloidoze centralnog nervnog sistema (CNS) i hipertiroksinemije.
[0050] U nekim slučajevima, ispitanik ima amiloidozu povezanu sa TTR, i postupak smanjuje amiloidne naslage TTR kod ispitanika.
[0051] U drugim slučajevima, agens RNKi se primenjuje na ispitaniku putem načina primene koji je izabran iz grupe koja se sastoji od supkutane, intravenske, intramuskularne, intrabronhijalne, intrapleuralne, intraperitonealne, intraarterijske, limfne, cerebrospinalne i bilo koje njihove kombinacije. U određenim slučajevima, agens RNKi se primenjuje na ispitaniku putem supkutane ili intravenske primene. U poželjnim slučajevima, agens RNKi se primenjuje na ispitaniku putem supkutane primene. U nekim takvim slučajevima, supkutana primena uključuje primenu putem supkutane pumpe ili supkutanog depoa.
[0052] U određenim slučajevima, agens RNKi se primenjuje na ispitaniku tako da je agens
1
RNKi isporučen na određeno mesto u ispitaniku. U nekim slučajevima, mesto je izabrano iz grupe koja se sastoji od jetre, horoidnog pleksusa, mrežnjače i pankreasa. U poželjnim slučajevima, mesto je jetra. U nekim slučajevima, isporuka agensa RNKi je posredovana asijaloglikoproteinskim receptorom (ASGP-R) koji je prisutan u hepatocitima.
[0053] U nekim slučajevima, agens RNKi se primenjuje u dozi od oko 0,25 mg/kg do oko 50 mg/kg, npr. od oko 0,25 mg/kg do oko 0,5 mg/kg, od oko 0,25 mg/kg do oko 1 mg/kg, od oko 0,25 mg/kg do oko 5 mg/kg, od oko 0,25 mg/kg do oko 10 mg/kg, od oko 1 mg/kg do oko 10 mg/kg, od oko 5 mg/kg do oko 15 mg/kg, od oko 10 mg/kg do oko 20 mg/kg, od oko 15 mg/kg do oko 25 mg/kg, od oko 20 mg/kg do oko 30 mg/kg, od oko 25 mg/kg do oko 35 mg/kg, ili od oko 40 mg/kg do oko 50 mg/kg.
[0054] U nekim slučajevima, agens RNKi se primenjuje u dozi od oko 0,25 mg/kg, oko 0,5 mg/kg, oko 1 mg/kg, oko 2 mg/kg, oko 3 mg/kg, oko 4 mg/kg, oko 5 mg/kg, oko 6 mg/kg, oko 7 mg/kg, oko 8 mg/kg, oko 9 mg/kg, oko 10 mg/kg, oko 11 mg/kg, oko 12 mg/kg, oko 13 mg/kg, oko 14 mg/kg, oko 15 mg/kg, oko 16 mg/kg, oko 17 mg/kg, oko 18 mg/kg, oko 19 mg/kg, oko 20 mg/kg, oko 21 mg/kg, oko 22 mg/kg, oko 23 mg/kg, oko 24 mg/kg, oko 25 mg/kg, oko 26 mg/kg, oko 27 mg/kg, oko 28 mg/kg, oko 29 mg/kg, 30 mg/kg, oko 31 mg/kg, oko 32 mg/kg, oko 33 mg/kg, oko 34 mg/kg, oko 35 mg/kg, oko 36 mg/kg, oko 37 mg/kg, oko 38 mg/kg, oko 39 mg/kg, oko 40 mg/kg, oko 41 mg/kg, oko 42 mg/kg, oko 43 mg/kg, oko 44 mg/kg, oko 45 mg/kg, oko 46 mg/kg, oko 47 mg/kg, oko 48 mg/kg, oko 49 mg/kg ili oko 50 mg/kg.
[0055] U nekim slučajevima, agens RNKi se primenjuje u dve ili više doza. U konkretnim otelotvorenjima, agens RNKi se primenjuje u intervalima izabranim iz grupe koja se sastoji od jednom na oko svaka 2 sata, jednom na oko svaka 3 sata, jednom na oko svaka 4 sata, jednom na oko svakih 6 sati, jednom na oko svakih 8 sati, jednom na oko svakih 12 sati, jednom na oko svaka 24 sata, jednom na oko svakih 48 sati, jednom na oko svaka 72 sata, jednom na oko svakih 96 sati, jednom na oko svakih 120 sati, jednom na oko svaka 144 sata, jednom na oko svakih 168 sati, jednom na oko svakih 240 sati, jednom na oko svakih 336 sati, jednom na oko svaka 504 sata, jednom na oko svaka 672 sata i jednom na oko svakih 720 sati.
[0056] U drugim slučajevima, postupak dalje obuhvata procenjivanje nivoa ekspresije TTR mRNK ili ekspresije TTR proteina u uzorku dobijenom od ispitanika.
[0057] U poželjnim slučajevima, primena agensa RNKi ne dovodi do inflamatornog odgovora kod ispitanika kako je procenjeno na osnovu nivoa citokina ili hemokina izabranog iz grupe koja se sastoji od G-CSF, IFN-γ, IL-10, IL-12 (p70), IL1β, IL-1ra, IL-6, IL-8, IP-10, MCP-1, MIP-1α, MIP-1β, TNFα, i svih njihovih kombinacija, u uzorku ispitanika.
[0058] U nekim slučajevima, agens RNKi se primenjuje korišćenjem farmaceutske kompozicije.
U poželjnim slučajevima, agens RNKi se primenjuje u rastvoru. U nekim takvim slučajevima, siRNK se primenjuje u nepuferovanom rastvoru. U jednom slučaju, siRNK se primenjuje u vodi. U drugim slučajevima, siRNK se primenjuje sa puferovanim rastvorom, kao što je acetatni pufer, citratni pufer, prolaminski pufer, karbonatni pufer ili fosfatni pufer ili bilo koja njihova kombinacija. U nekim slučajevima, puferovani rastvor je fiziološki rastvor puferovan fosfatom (PBS).
[0059] U drugom slučaju, farmaceutska kompozicija je lipozomska ili lipidna formulacija koja sadrži SNALP ili XTC. U jednom slučaju, lipidna formulacija sadrži MC3.
[0060] U drugom aspektu, otkriće pruža postupke za lečenje ili prevenciju bolesti povezane sa TTR kod ispitanika. Postupci uključuju primenu na ispitaniku terapeutski delotvorne količine ili profilaktički delotvorne količine agensa RNKi, npr. dvolančanog agensa RNKi, čime se leči ili sprečava bolest povezana sa TTR kod ispitanika.
[0061] U nekim slučajevima, ekspresija TTR u uzorku dobijenom od ispitanika je inhibirana za najmanje oko 10%, najmanje oko 20%, najmanje oko 30%, najmanje oko 40%, najmanje oko 50%, najmanje oko 60% ili najmanje oko 70%, najmanje oko 80%, ili najmanje oko 90%.
[0062] U nekim slučajevima, ispitanik je čovek.
[0063] U nekim slučajevima, ispitanik je ispitanik koji boluje od bolesti povezane sa TTR. U drugim slučajevima, ispitanik je ispitanik kod koga postoji rizik od nastanka bolesti povezane sa TTR.
[0064] U nekim slučajevima, ispitanik je ispitanik koji nosi TTR gensku mutaciju koja je povezana sa nastankom bolesti povezane sa TTR.
[0065] U određenim otelotvorenjima, bolest povezana sa TTR je izabrana iz grupe koja se sastoji od senilne sistemske amiloidoze (SSA), sistemske familijarne amiloidoze, familijarne amiloidne polineuropatije (FAP), familijarne amiloidne kardiomiopatije (FAC), leptomeningealne amiloidoze/amiloidoze centralnog nervnog sistema (CNS) i hipertiroksinemije.
[0066] U nekim slučajevima, ispitanik ima amiloidozu povezanu sa TTR, i postupak smanjuje amiloidne naslage TTR kod ispitanika.
[0067] U nekim slučajevima, agens RNKi se primenjuje na ispitaniku putem načina primene koji je izabran iz grupe koja se sastoji od supkutane, intravenske, intramuskularne, intrabronhijalne, intrapleuralne, intraperitonealne, intraarterijske, limfne, cerebrospinalne, i bilo koje njihove kombinacije. U određenim slučajevima, agens RNKi se primenjuje na ispitaniku putem supkutane ili intravenske primene. U poželjnim slučajevima, agens RNKi se primenjuje na ispitaniku putem supkutane primene. U nekim takvim slučajevima, supkutana primena uključuje primenu putem supkutane pumpe ili supkutanog depoa.
[0068] U određenim slučajevima, agens RNKi se primenjuje na ispitaniku tako da je agens RNKi isporučen na određeno mesto u ispitaniku. U nekim takvim slučajevima, mesto je izabrano iz grupe koja se sastoji od jetre, horoidnog pleksusa, mrežnjače i pankreasa. U poželjnim slučajevima, mesto je jetra. U nekim slučajevima, isporuka agensa RNKi je posredovana asijaloglikoproteinskim receptorom (ASGP-R) koji je prisutan u hepatocitima.
[0069] U nekim slučajevima, agens RNKi se primenjuje u dozi od oko 0,25 mg/kg do oko 50 mg/kg, npr. od oko 0,25 mg/kg do oko 0,5 mg/kg, od oko 0,25 mg/kg do oko 1 mg/kg, od oko 0,25 mg/kg do oko 5 mg/kg, od oko 0,25 mg/kg do oko 10 mg/kg, od oko 1 mg/kg do oko 10 mg/kg, od oko 5 mg/kg do oko 15 mg/kg, od oko 10 mg/kg do oko 20 mg/kg, od oko 15 mg/kg do oko 25 mg/kg, od oko 20 mg/kg do oko 30 mg/kg, od oko 25 mg/kg do oko 35 mg/kg, ili od oko 40 mg/kg do oko 50 mg/kg.
[0070] U nekim slučajevima, agens RNKi se primenjuje u dozi od oko 0,25 mg/kg, oko 0,5 mg/kg, oko 1 mg/kg, oko 2 mg/kg, oko 3 mg/kg, oko 4 mg/kg, oko 5 mg/kg, oko 6 mg/kg, oko
1
7 mg/kg, oko 8 mg/kg, oko 9 mg/kg, oko 10 mg/kg, oko 11 mg/kg, oko 12 mg/kg, oko 13 mg/kg, oko 14 mg/kg, oko 15 mg/kg, oko 16 mg/kg, oko 17 mg/kg, oko 18 mg/kg, oko 19 mg/kg, oko 20 mg/kg, oko 21 mg/kg, oko 22 mg/kg, oko 23 mg/kg, oko 24 mg/kg, oko 25 mg/kg, oko 26 mg/kg, oko 27 mg/kg, oko 28 mg/kg, oko 29 mg/kg, 30 mg/kg, oko 31 mg/kg, oko 32 mg/kg, oko 33 mg/kg, oko 34 mg/kg, oko 35 mg/kg, oko 36 mg/kg, oko 37 mg/kg, oko 38 mg/kg, oko 39 mg/kg, oko 40 mg/kg, oko 41 mg/kg, oko 42 mg/kg, oko 43 mg/kg, oko 44 mg/kg, oko 45 mg/kg, oko 46 mg/kg, oko 47 mg/kg, oko 48 mg/kg, oko 49 mg/kg ili oko 50 mg/kg.
[0071] U nekim slučajevima, agens RNKi se primenjuje u dve ili više doza. U konkretnim otelotvorenjima, agens RNKi se primenjuje u intervalima izabranim iz grupe koja se sastoji od jednom na oko svaka 2 sata, jednom na oko svaka 3 sata, jednom na oko svaka 4 sata, jednom na oko svakih 6 sati, jednom na oko svakih 8 sati, jednom na oko svakih 12 sati, jednom na oko svaka 24 sata, jednom na oko svakih 48 sati, jednom na oko svaka 72 sata, jednom na oko svakih 96 sati, jednom na oko svakih 120 sati, jednom na oko svaka 144 sata, jednom na oko svakih 168 sati, jednom na oko svakih 240 sati, jednom na oko svakih 336 sati, jednom na oko svaka 504 sata, jednom na oko svaka 672 sata i jednom na oko svakih 720 sati.
[0072] U drugim slučajevima, postupak dalje obuhvata procenjivanje nivoa ekspresije TTR mRNK ili ekspresije TTR proteina u uzorku dobijenom od ispitanika.
[0073] U poželjnim slučajevima, primena agensa RNKi ne dovodi do inflamatornog odgovora kod ispitanika kako je procenjeno na osnovu nivoa citokina ili hemokina izabranog iz grupe koja se sastoji od G-CSF, IFN-γ, IL-10, IL-12 (p70), IL1β, IL-1ra, IL-6, IL-8, IP-10, MCP-1, MIP-1α, MIP-1β, TNFα, i svih njihovih kombinacija, u uzorku ispitanika.
[0074] U nekim slučajevima, agens RNKi se primenjuje korišćenjem farmaceutske kompozicije, npr. lipozoma.
[0075] U nekim slučajevima, agens RNKi se primenjuje u rastvoru. U nekim takvim slučajevima, siRNK se primenjuje u nepuferovanom rastvoru. U jednom slučaju, siRNK se primenjuje u fiziološkom rastvoru ili vodi. U drugim slučajevima, siRNK se primenjuje sa puferovanim rastvorom, kao što je acetatni pufer, citratni pufer, prolaminski pufer, karbonatni pufer ili fosfatni pufer ili bilo koja njihova kombinacija. U nekim slučajevima, puferovani rastvor je fiziološki rastvor puferovan fosfatom (PBS).
[0076] U drugom aspektu, predmetno otkriće pruža postupak za inhibiranje ekspresije transtiretina (TTR) u ćeliji, uključujući dovođenje ćelije u kontakt sa agensom RNKi, npr. dvolančanim agensom RNKi, u količini koja je delotvorna za inhibiranje ekspresije TTR u ćeliji. U jednom aspektu, dvolančani agens RNKi je izabran iz grupe agenasa navedenih u tabeli 1, čime se inhibira ekspresija transtiretina (TTR) u ćeliji.
[0077] U drugom aspektu, predmetno otkriće pruža postupak za inhibiranje ekspresije transtiretina (TTR) u ćeliji, uključujući dovođenje ćelije u kontakt sa agensom RNKi, npr. dvolančanim agensom RNKi, u količini koja je delotvorna za inhibiranje ekspresije TTR u ćeliji. U jednom aspektu, dvolančani agens RNKi je izabran iz grupe koja se sastoji od AD-51544, AD-51545, AD-51546 i AD-51547, čime se inhibira ekspresija transtiretina (TTR) u ćeliji.
[0078] U daljem aspektu, predmetno otkriće pruža postupak za lečenje ili prevenciju bolesti povezane sa TTR kod ispitanika, koji uključuje primenu na ispitaniku terapeutski delotvorne količine ili profilaktički delotvorne količine agensa RNKi, npr. dvolančanog agensa RNKi. U jednom aspektu, dvolančani agens RNKi je izabran iz grupe agenasa navedenih u Tabeli 1, čime se leči ili sprečava bolest povezana sa TTR kod ispitanika.
[0079] U još jednom aspektu, predmetno otkriće pruža postupak za lečenje ili prevenciju bolesti povezane sa TTR kod ispitanika, koji uključuje primenu na ispitaniku terapeutski delotvorne količine ili profilaktički delotvorne količine agensa RNKi, npr. dvolančanog agensa RNKi. U jednom aspektu, dvolančani agens RNKi je izabran iz grupe koja se sastoji od AD-51544, AD-51545, AD-51546 i AD-51547, čime se leči ili sprečava bolest povezana sa TTR kod ispitanika.
[0080] U daljem aspektu, otkriće pruža komplete za sprovođenje postupaka iz pronalaska. U jednom aspektu, otkriće pruža komplet za sprovođenje postupka za inhibiranje ekspresije transtiretina (TTR) u ćeliji koji uključujući dovođenje ćelije u kontakt sa agensom RNKi, npr. dvolančanim agensom RNKi, u količini koja je delotvorna za inhibiranje ekspresije pomenutog TTR u ćeliji, čime se inhibira ekspresija TTR u ćeliji. Komplet sadrži agens RNKi i uputstvo za upotrebu i, opciono, sredstva za primenu agensa RNKi na ispitaniku.
1
[0081] Predmetni pronalazak je dalje ilustrovan sledećim detaljnim opisom i slikama.
Kratak opis slika
[0082]
Slika 1 je grafikon koji prikazuje da je primena na mišu jedne supkutane doze GalNAckonjugovanog agensa RNKi koji cilja TTR dovela do supresije TTR mRNK zavisne od doze.
Slika 2 je grafikon koji prikazuje da je primena na mišu jedne supkutane doze od 7,5 mg/kg ili 30 mg/kg GalNAc-konjugovanog agensa RNKi koji cilja TTR dovela do dugoročne supresije TTR mRNK.
Slika 3 prikazuje humanu sekvencu TTR mRNK.
Slika 4 je grafikon koji prikazuje poboljšanu aktivnost utišavanja RNKi agenasa modifikovanih u odnosu na matični AD-45163.
Slika 5 je grafikon koji prikazuje poboljšanu aktivnost utišavanja RNKi agenasa modifikovanih u odnosu na matični AD-45165.
Slika 6 je grafikon koji prikazuje poboljšano utišavanje slobodnim unosom nakon 4 sata inkubacije sa agensima RNKi modifikovanim u odnosu na matični AD-45163. Slika 7 je grafikon koji prikazuje poboljšano utišavanje slobodnim unosom nakon 24 sata inkubacije sa agensima RNKi modifikovanim u odnosu na matični AD-45163. Slika 8 je grafikon koji prikazuje poboljšano utišavanje slobodnim unosom nakon 4 sata inkubacije sa agensima RNKi modifikovanim u odnosu na matični AD-45165. Slika 9 je grafikon koji prikazuje poboljšano utišavanje slobodnim unosom nakon 24 sata inkubacije sa agensima RNKi modifikovanim u odnosu na matični AD-45165. Slika 10 je grafikon koji prikazuje utišavanje TTR mRNK kod transgenih miševa koji eksprimiraju hTTR V30M nakon primene jedne supkutane doze agensa RNKi AD-51544, AD-51545, AD-45163, AD-51546, AD-51547 ili AD-45165.
Slika 11 je grafikon koji prikazuje supresiju TTR proteina kod transgenih miševa koji eksprimiraju hTTR V30M nakon primene jedne supkutane doze od 5 mg/kg ili 1 mg/kg agensa RNKi AD-51544, AD-51545 ili AD-45163.
Slika 12 je grafikon koji prikazuje supresiju TTR proteina kod transgenih miševa koji eksprimiraju hTTR V30M nakon primene jedne supkutane doze od 5 mg/kg ili 1 mg/kg agensa RNKi AD-51546, AD-51547 ili AD-45165.
Slika 13 prikazuje protokol za vađenje krvi nakon doze kod majmuna koji su primili
1
5x5 mg/kg agensa RNKi (gornja linija) ili 1x25 mg/kg agensa RNKi (donja linija).
Slika 14 je grafikon koji prikazuje supresiju TTR proteina u neljudskim primatima nakon supkutane primene pet doza od 5 mg/kg (gornji panel) ili jedne doze od 25 mg/kg (donji panel) AD-45163, AD-51544, AD-51545, AD-51546 ili AD-51547.
Slika 15 je grafikon koji prikazuje supresiju TTR proteina u neljudskim primatima nakon supkutane primene AD-51547 pri 2,5 mg/kg (beli kvadrati), 5 mg/kg (crni kvadrati) ili 10 mg/kg (šareni kvadrati) po dozi, ili primene PBS kao negativne kontrole (sivi kvadrati).
Detaljan opis
[0083] Predmetno otkriće obezbeđuje agense RNKi, npr. agense dvolančane RNKi, i kompozicije koje ciljaju gen transtiretina (TTR). Predmetni pronalazak takođe pruža postupke za inhibiranje ekspresije TTR i postupke za lečenje ili prevenciju bolesti povezanih sa TTR kod ispitanika korišćenjem RNKi agenasa, npr. agenasa dvolančane RNKi, iz pronalaska. Predmetni pronalazak je zasnovan, barem delimično, na otkriću da agensi RNKi koji sadrže određene hemijske modifikacije pokazuju bolju sposobnost inhibiranja ekspresije TTR. Ovde je pokazano da su agensi koji uključuju određeni šablon hemijskih modifikacija (npr. naizmenični šablon) i ligand delotvorni u utišavanju aktivnosti gena TTR. Nadalje, agensi koji uključuju jedan ili više motiva od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida, uključujući jedan takav motiv na mestu cepanja agensa ili blizu njega, pokazuju iznenađujuće poboljšanu aktivnost utišavanja gena TTR. Kada je samo jedan takav hemijski motiv prisutan u agensu, poželjno je da bude u regionu cepanja ili blizu njega radi poboljšanja aktivnosti utišavanja gena. Region cepanja je region koji okružuje mesto cepanja, tj. mesto na ciljnoj mRNK na kojem dolazi do cepanja.
I. Definicije
[0084] Kako se ovde koristi, svaki od sledećih termina ima značenje povezano sa njim u ovom odeljku.
[0085] Termin „uključujući“ se ovde koristi da znači, i koristi se naizmenično sa frazom, „uključujući ali bez ograničenja“.
[0086] Termin „ili“ se ovde koristi da znači, i koristi se naizmenično sa terminom, „i/ili“, osim ako kontekst jasno ne nalaže drugačije.
1
[0087] Kako se ovde koristi, „transtiretin“ („TTR“) odnosi se na dobro poznati gen i protein. TTR je poznat i kao prealbumin, HsT2651, PALB i TBPA. TTR deluje kao transporter retinolvezujućeg proteina (RBP), tiroksina (T4) i retinola, a takođe deluje i kao proteaza. Jetra izlučuje TTR u krv, a horoidni pleksus izlučuje TTR u cerebrospinalnu tečnost. TTR se takođe eksprimira u pankreasu i epitelu retinalnog pigmenta. Najveći klinički značaj TTR je što i normalni i mutantni protein TTR mogu da grade amiloidne filamente koji se talože u vanćelijskim naslagama, izazivajući amiloidozu. Vidite, npr. Saraiva M.J.M. (2002) Expert Reviews in Molecular Medicine, 4(12):1-11 za pregled. Molekulsko kloniranje i nukleotidne sekvence transtiretina pacova, kao i distribuciju ekspresije mRNK, opisali su Dickson, P.W. i sar. (1985) J. Biol. Chem. 260(13)8214-8219. Rendgenska kristalna struktura humanog TTR je opisana u Blake, C.C. i sar. (1974) J Mol Biol 88, 1-12. Sekvenca humanog transkripta mRNK TTR može se naći u Nacionalnom centru za biotehnološke informacije (National Center for Biotechnology Information, NCBI) RefSeq pristupni broj NM000371. Mišja sekvenca mRNK TTR može se naći pod RefSeq pristupnim brojem NM_013697.2, a sekvenca mRNK TTR pacova može se naći pod RefSeq pristupnim brojem NM_012681.1
[0088] Kako se ovde koristi, „ciljna sekvenca“ se odnosi na susedni deo nukleotidne sekvence mRNK molekula formiran tokom transkripcije TTR gena, uključujući mRNK koja je proizvod RNK obrade primarnog proizvoda transkripcije.
[0089] Kako se ovde koristi, termin „lanac koja sadrži sekvencu“ odnosi se na oligonukleotid koji sadrži niz nukleotida koji je opisan sekvencom koja se označava korišćenjem standardne nomenklature nukleotida.
[0090] „G“, „C“, „A“ i „U“ generalno označavaju nukleotid koji sadrži guanin, citozin, adenin, odnosno uracil kao bazu. „T“ i „dT“ se ovde koriste naizmenično i označavaju dezoksiribonukleotid, pri čemu je nukleobaza timin, npr. dezoksiribotimin, 2'-dezoksitimidin ili timidin. Međutim, treba razumeti da termin „ribonukleotid“ ili „nukleotid“ ili „dezoksiribonukleotid“ takođe može da označava modifikovani nukleotid, kako je detaljnije prikazano u nastavku, ili surogatni zamenski ostatak. Osoba sa veštinama je svesna da se guanin, citozin, adenin i uracil mogu zameniti drugim ostacima bez značajne promene svojstava baznog para oligonukleotida koji sadrži nukleotid sa takvim zamenskim ostatkom. Na primer, bez ograničenja, nukleotid koji sadrži inozin kao bazu može se bazno uparivati sa
1
nukleotidima koji sadrže adenin, citozin ili uracil. Stoga, nukleotidi koji sadrže uracil, guanin ili adenin mogu se zameniti u nukleotidnoj sekvenci iz pronalaska nukleotidom koji sadrži, na primer, inozin. Razmatraju se sekvence koje sadrže takve zamenske ostatke.
[0091] „Dvolančani agens RNKi“, molekul dvolančane RNK (dsRNK), koji se naziva i „dsRNK agens“, „dsRNK“, „siRNK“, „agens iRNK“, kako se ovde naizmenično koristi, odnosi se na kompleks molekula ribonukleinske kiseline koji imaju dvolančanu strukturu koja sadrži dva antiparalelna i suštinski komplementarna, kako je definisano u nastavku, lanca nukleinske kiseline. Generalno, većina nukleotida oba lanca su ribonukleotidi, ali, kao što je ovde detaljno opisano, svaki ili oba lanca mogu takođe da uključe jedan ili više nukleotida koji nisu ribonukleotidi, npr. dezoksiribonukleotid i/ili modifikovani nukleotid. Dodatno, kako se koristi u ovoj specifikaciji, „agens RNKi“ može da uključuje ribonukleotide sa hemijskim modifikacijama; agens RNKi može da sadrži značajne modifikacije više nukleotida. Takve modifikacije mogu da uključuju sve vrste modifikacija koje su otkrivene ovde ili poznate u struci. Sve takve modifikacije, kako se koriste u molekulu tipa siRNK, obuhvaćene su terminom „agens RNKi“.
[0092] U drugom slučaju, RNKi može biti jednolančana siRNK koja se uvodi u ćeliju ili organizam da inhibira ciljnu mRNK. Jednolančani agensi RNKi se vezuji za RISC endonukleazu argonaut 2, koja zatim cepa ciljnu mRNK. Jednolančane siRNK su uopšteno 15-30 nukleotida, i hemijski su modifikovane. Konstruisanje i testiranje jednolančanih siRNK je opisano u U.S. patentu br.8,101,348, i u Lima i sar. (2012) Cell 150: 883-894, čiji je kompletan sadržaj ovim uključen u reference. Bilo koja od sekvenci antisens nukleotida koja je ovde opisana može se koristiti kao jednolančana siRNK kako je ovde opisano ili kao hemijski modifikovana postupcima opisanim u Lima i sar. (2012) Cell 150;:883-894.
[0093] Dva lanca koja formiraju dupleks strukturu mogu biti različiti delovi jednog većeg molekula RNK, ili mogu biti odvojeni molekuli RNK. Kada su dva lanca deo jednog većeg molekula, i stoga su povezani neprekinutim lancem nukleotida između 3'-kraja jednog lanca i 5'-kraja odgovarajućeg drugog lanca koji formira dupleks strukturu, povezujući lanac RNK se naziva „petlja ukosnice“. Kada su dva lanca povezana kovalentno drugim načinom sem neprekinutog lanca nukleotida između 3'-kraja jednog lanca i 5'-kraja odgovarajućeg drugog lanca koji formira dupleks strukturu, povezujuća struktura se naziva „linker“. Lanci RNK mogu imati isti ili različiti broj nukleotida. Maksimalni broj baznih parova je broj nukleotida u
1
najkraćem lancu dsRNK umanjen za prepuste koji su prisutni u dupleksu. Pored dupleks strukture, agens RNKi može da sadrži jedan ili više nukleotidnih prepusta. Termin „siRNK“ se takođe koristi ovde da se označi agens RNKi kako je prethodno opisan.
[0094] U drugom aspektu, agens je jednolančani antisens molekul RNK. Antisens molekul RNK je komplementaran sekvenci u ciljnoj mRNK. Antisens RNK može da inhibira translaciju na stehiometrijski način putem baznog uparivanja sa mRNK i fizičkog ometanja translacionog aparata, vidite Dias, N. i sar. (2002) Mol Cancer Ther 1:347-355. Antisens molekul RNK može imati oko 15-30 nukleotida koji su komplementarni sa ciljnom mRNK. Na primer, antisens molekul RNK može imati sekvencu od najmanje 15, 16, 17, 18, 19, 20 ili više susednih nukleotida iz jedne od antisens sekvenci iz Tabele 1.
[0095] Kako se ovde koristi, „nukleotidni prepust“ se odnosi na neupareni nukleotid ili nukleotide koji štrče iz dupleks strukture agensa RNKi kada se 3'-kraj jednog lanca agensa RNKi proteže dalje od 5'-kraja drugog lanca, ili obrnuto. „Tup“ ili „tupi kraj“ znači da nema neuparenih nukleotida na tom kraju dvolančanog agensa RNKi, tj. nema nukleotidnog prepusta. Agens RNKi sa „tupim krajevima“ je dsRNK koja je dvolančana celom svojom dužinom, tj. nema nukleotidnog prepusta ni na jednom kraju molekula. Agensi RNKi iz pronalaska uključuju agense RNKi sa nukleotidnim prepustima na jednom kraju (tj. agensi sa jednim prepustom i jednim tupim krajem) ili sa nukleotidnim prepustima na oba kraja.
[0096] Termin „antisens lanac“ odnosi se na lanac dvolančanog agensa RNKi koji obuhvata region koji je u velikoj meri komplementaran ciljnoj sekvenci (npr. mRNK humanog TTR). Kako se ovde koristi, termin „komplementarnost regiona sa delom mRNK koji kodira transtiretin“ odnosi se na region antisens lanca koji je suštinski komplementaran delu mRNK sekvence TTR. Kada region komplementarnosti nije u potpunosti komplementaran sa ciljnom sekvencom, pogrešno uparivanje se najviše toleriše u terminalnim regionima i, ukoliko su prisutna, generalno su u terminalnom regionu ili regionima, npr.6, 5, 4, 3 ili 2 nukleotida od 5' i/ili 3' terminusa.
[0097] Termin „sens lanac“, kako se ovde koristi, odnosi se na lanac dsRNK koji uključuje region koji je suštinski komplementaran regionu antisens lanca.
[0098] Kako se ovde koristi, termin „region cepanja“ odnosi se na region koji je lociran odmah
2
pored mesta cepanja. Mesto cepanja je mesto na cilju na kome dolazi do cepanja. U nekim slučajevima, region cepanja sadrži tri baze na bilo kom kraju, i odmah pored, mesta cepanja. U nekim otelotvorenjima, region cepanja sadrži dve baze na bilo kom kraju, i odmah pored, mesta cepanja. U nekim slučajevima, mesto cepanja se specifično javlja na mestu vezanom nukleotidima 10 i 11 antisens lanca, a region cepanja sadrži nukleotide 11, 12 i 13.
[0099] Kako se ovde koristi, i ako nije drugačije naznačeno, termin „komplementarnost“, kada se koristi da opiše prvu sekvencu nukleotida u odnosu na drugu sekvencu nukleotida, odnosi se na sposobnost oligonukleotida ili polinukleotida koji sadrži prvu sekvencu nukleotida da se hibridizuje i gradi dupleks strukturu u određenim uslovima sa oligonukleotidom ili polinukleotidom koji sadrži drugu sekvencu nukleotida, kao što će biti jasno osobi sa znanjem u oblasti. Takvi uslovi, na primer, mogu biti strogi uslovi, gde strogi uslovi mogu da uključuju: 400 mM NaCl, 40 mM PIPES pH 6,4, 1 mM EDTA, 50°C ili 70°C tokom 12-16 sati, nakon čega sledi ispiranje. Mogu da se primenjuju drugi uslovi, kao što su fiziološki relevantni uslovi kakvi se mogu susresti u organizmu. Osoba sa veštinama će znati da odredi set uslova koji su najpogodniji za test komplementarnosti dve sekvence u skladu sa krajnjom primenom hibridizovanih nukleotida.
[0100] Sekvence mogu biti „potpuno komplementarne“ u odnosu jedna na drugu kada postoji bazno uparivanje nukleotida prve sekvence nukleotida sa nukleotidima druge sekvence nukleotida duž čitave dužine prve i druge sekvence nukleotida. Međutim, kada se za prvu sekvencu kaže da je „suštinski komplementarna“ u odnosu na drugu sekvencu datu ovde, dve sekvence mogu biti potpuno komplementarne, ili može biti jedan ili više, ali generalno ne više od 4, 3 ili 2 neusklađena bazna para nakon hibridizacije, pri čemu zadržavaju sposobnost da se hibridizuje u uslovima koji su najrelevantniji za njihovu krajnju primenu. Međutim, kada su dva oligonukleotida konstruisana da grade, nakon hibridizacije, jedan ili više jednolančanih prepusta, takvi prepusti će se posmatrati kao neusklađeni parovi kada se utvrđuje komplementarnost. Na primer, dsRNK koja sadrži jedan oligonukleotid dužine 21 nukleotid i drugi oligonukleotid dužine 23 nukleotida, pri čemu duži oligonukleotid sadrži sekvencu od 21 nukleotida koja je potpuno komplementarna sa kraćim oligonukleotidom, može se i dalje nazvati „potpuno komplementarnom“ za ovde opisane svrhe.
[0101] „Komplementarne“ sekvence, kako se ovde koristi, mogu takođe da obuhvataju, ili da budu u potpunosti izgrađene od, baznih parova različitih od Votson-Krikovih i/ili baznih parova nastalih od neprirodnih i modifikovanih nukleotida, sve dok su prethodni zahtevi u pogledu njihove sposobnosti da se hibridizuju ispunjeni. Takvi bazni parovi različiti od Votson-Krikovih uključuju, ali nisu ograničeni na, G:U kolebljivo ili Hugštajnovo bazno sparivanje.
[0102] Termini „komplementarno“, „potpuno komplementarno“ i „suštinski komplementarno“ ovde mogu da se koriste u pogledu baznog uparivanja između sens lanca i antisens lanca dsRNK, ili između antisens lanca dsRNK i ciljne sekvence, što će biti jasno iz konteksta njihove upotrebe.
[0103] Kako se ovde koristi, polinukleotid koji je „suštinski komplementaran najmanje delu“ informacione RNK (mRNK) odnosi se na polinukleotid koji je suštinski komplementaran susednom delu željene mRNK (npr. mRNK koja kodira TTR), uključujući 5' UTR, otvoreni okvir za čitanje (ORF) ili 3' UTR. Na primer, polinukleotid je komplementaran najmanje delu mRNK TTR ako je sekvenca suštinski komplementarna neprekinutom delu mRNK koja kodira TTR.
[0104] Termin „inhibira“, kako se ovde koristi, koristi se naizmenično sa „smanjuje“, „utišava“, „nishodno reguliše“, „suzbija“ i drugim sličnim terminima, i obuhvata bilo koji nivo inhibicije.
[0105] Fraza „inhibira ekspresiju TTR“, kako se ovde koristi, uključuje inhibiciju ekspresije bilo kog gena TTR (kao što je, npr. mišji TTR gen, TTR gen pacova, TTR gen majmuna ili humani TTR gen) kao i varijanti ili mutanata TTR gena. Tako, TTR gen može biti TTR gen divljeg tipa, mutantni TTR gen (kao što je mutantni TTR gen koji uzrokuje sistemsko amiloidno taloženje) ili transgeni TTR gen u kontekstu genetski manipulisane ćelije, grupe ćelija ili organizma.
[0106] „Inhibiranje ekspresije TTR gena“ uključuje bilo koji nivo inhibicije TTR gena, npr. najmanje delimično suzbijanje ekspresije TTR gena, kao što je inhibicija od najmanje oko 5%, najmanje oko 10%, najmanje oko 15%, najmanje oko 20%, najmanje oko 25%, najmanje oko 30%, najmanje oko 35%, najmanje oko 40%, najmanje oko 45%, najmanje oko 50%, najmanje oko 55%, najmanje oko 60%, najmanje oko 65%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 91%, najmanje oko 92%, najmanje oko 93%, najmanje oko 94%. najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98%, ili najmanje oko 99%.
[0107] Ekspresija TTR gena može biti procenjena na osnovu nivoa bilo koje promenljive povezane sa ekspresijom TTR gena, npr. nivo mRNK TTR, nivo TTR proteina, nivo retinolvezujućeg proteina, nivo vitamina A ili broj ili opseg amiloidnih naslaga. Inhibicija može biti procenjena na osnovu smanjenja apsolutnog ili relativnog nivoa jedne ili više ovih promenljivih u poređenju sa kontrolnim nivoom. Kontrolni nivo može biti bilo koja vrsta kontrolnog nivoa koja se koristi u struci, npr. osnovni nivo pre doze, ili nivo utvrđen kod sličnog ispitanika, ćelije ili uzorka koji nije tretiran ili je tretiran kontrolom (kao što je, npr. kontrola koja se sastoji samo od pufera ili kontrola sa neaktivnim agensom).
[0108] Fraza „dovođenje ćelije u kontakt sa agensom RNKi“, kako se ovde koristi, uključuje kontaktiranje ćelije bilo kojim mogućim putem. Dovođenje ćelije u kontakt sa agensom RNKi, npr. agensom dvolančane RNKi, uključuje dovođenje ćelije in vitro u kontakt sa agensom RNKi ili dovođenje ćelije in vivo u kontakt sa agensom RNKi. Dovođenje u kontakt se može obaviti direktno ili indirektno. Tako, na primer, agens RNKi se može dovesti u fizički kontakt sa ćelijom putem pojedinačnog obavljanja postupka, ili alternativno, agens RNKi se može dovesti u situaciju koja će omogućiti ili izazvati da on nakon toga dođe u kontakt sa ćelijom.
[0109] Kontaktiranje ćelije in vitro može se obaviti, na primer, inkubiranjem ćelije sa agensom RNKi. Kontaktiranje ćelije in vivo može se obaviti, na primer, injektovanjem agensa RNKi u tkivo u kome je ćelija locirana ili blizu njega, ili injektovanjem agensa RNKi u drugu oblast, npr. krvotok ili supkutani prostor, tako da će agens nakon toga stići do tkiva u kome se nalazi ćelija koja treba da se kontaktira. Na primer, agens RNKi može da sadrži ligand i/ili da bude kuplovan sa ligandom, npr. GalNAc3ligandom, koji usmerava agens RNKi do željenog mesta, npr. jetre. Takođe su moguće i kombinacije in vitro i in vivo postupaka kontaktiranja. U vezi sa postupcima iz pronalaska, ćelija takođe može biti dovedena u kontakt in vitro sa agensom RNKi i naknadno transplantovana u ispitanika.
[0110] „Pacijent“ ili „ispitanik“, kako se ovde koristi, treba da uključi čoveka ili životinju koja nije čovek, poželjno sisara, npr. majmuna. Najpoželjnije, ispitanik ili pacijent je čovek.
[0111] „Bolest povezana sa TTR“, kako se ovde koristi, treba da uključuje svaku bolest povezanu sa genom ili proteinom TTR. Takva bolest može biti izazvana, na primer, prekomernom proizvodnjom proteina TTR, mutacijama gena TTR, abnormalnim cepanjem
2
proteina TTR, abnormalnim interakcijama između TTR i drugih proteina ili drugih endogenih ili egzogenih supstanci. „Bolest povezana sa TTR“ uključuje sve vrste amiloidoza povezanih sa TTR (ATTR), pri čemu TTR ima ulogu u nastanku abnormalnih vanćelijskih agregata ili amiloidnih naslaga. Bolesti povezane sa TTR uključuju senilnu sistemsku amiloidozu (SSA), sistemsku familijarnu amiloidozu, familijarnu amiloidnu polineuropatiju (FAP), familijarnu amiloidnu kardiomiopatiju (FAC), leptomeningealnu amiloidozu/amiloidozu centralnog nervnog sistema (CNS), amiloidna zamućenja staklastog tela, sindrom karpalnog tunela i hipertiroksinemiju. Simptomi TTR amiloidoze uključuju senzornu neuropatiju (npr. paresteziju, hipesteziju u distalnim udovima), autonomnu neuropatiju (npr. gastrointestinalnu disfunkciju, kao što je čir na želucu ili ortostatska hipotenzija), motornu neuropatiju, epi napade, demenciju, mijelopatiju, polineuropatiju, sindrom karpalnog tunela, autonomnu insuficijenciju, kardiomiopatiju, zamućenja staklastog tela, bubrežnu insuficijenciju, nefropatiju, značajno smanjeni mBMI (modifikovani indeks telesne mase), disfunkciju moždanih živaca i distrofiju strome rožnjače.
[0112] „Terapeutski delotvorna količina“, kako se ovde koristi, treba da uključi količinu agensa RNKi koja je, kada se primeni na pacijentu za lečenje bolesti povezane sa TTR, dovoljna da ostvari lečenje bolesti (npr. smanjivanjem, ublažavanjem ili održavanjem postojeće bolesti, ili jednog ili više simptoma bolesti). „Terapeutski delotvorna količina“ može da varira u zavisnosti od agensa RNKi, načina primene agensa, bolesti i njene ozbiljnosti i istorije, starosti, težine, porodične istorije, genetskog sklopa, stadijuma patoloških procesa posredovanih ekspresijom TTR, vrste prethodnih ili pratećih lečenja, ako ih ima, i svih drugih individualnih karakteristika pacijenta koji će se lečiti.
[0113] „Profilaktički delotvorna količina“, kako se ovde koristi, treba da uključi količinu agensa RNKi koja je, kada se primeni na ispitaniku koji još nije doživeo ili ispoljio simptome bolesti povezane sa TTR, ali koji možda ima predispozicije za bolest, dovoljna za prevenciju ili ublažavanje bolesti, ili jednog ili više simptoma bolesti. Simptomi koji se mogu ublažiti uključuju senzornu neuropatiju (npr. paresteziju, hipesteziju u distalnim udovima), autonomnu neuropatiju (npr. gastrointestinalnu disfunkciju, kao što je čir na želucu ili ortostatska hipotenzija), motornu neuropatiju, epi napade, demenciju, mijelopatiju, polineuropatiju, sindrom karpalnog tunela, autonomnu insuficijenciju, kardiomiopatiju, zamućenja staklastog tela, bubrežnu insuficijenciju, nefropatiju, značajno smanjeni mBMI (modifikovani indeks telesne mase), disfunkciju moždanih živaca i distrofiju strome rožnjače. Ublažavanje bolesti uključuje usporavanje toka bolesti ili smanjenje ozbiljnosti kasnije nastale bolesti. „Profilaktički delotvorna količina“ može da varira u zavisnosti od agensa RNKi, načina primene agensa, stepena rizika od bolesti i istorije, starosti, težine, porodične istorije, genetskog sklopa, vrsta prethodnih ili pratećih lečenja, ako ih ima, i drugih individualnih karakteristika pacijenta koji će se lečiti.
[0114] „Terapeutski delotvorna količina“ ili „profilaktički delotvorna količina“ takođe uključuje količinu agensa RNKi koja proizvodi željeni lokalni ili sistemski efekat sa prihvatljivim odnosom koristi/rizika primenljivim za svako lečenje. Agensi RNKi upotrebljeni u postupcima predmetnog pronalaska mogu se primeniti u dovoljnoj količini da daju prihvatljiv odnosom koristi/rizika primenljiv za takvo lečenje.
[0115] Termin „uzorak“, kako se ovde koristi, uključuje kolekciju sličnih tečnosti, ćelija ili tkiva izolovanih od ispitanika, kao i tečnosti, ćelija ili tkiva prisutnih u ispitaniku. Primeri bioloških tečnosti uključuju krv, serum i serumski fluid, plazmu, cerebrospinalnu tečnost, očnu tečnost, limfu, urin, pljuvačku, i slično. Uzorci tkiva mogu da uključuju uzorke iz tkiva, organa ili lokalizovanih regiona. Na primer, uzorci mogu biti dobijeni od pojedinačnih organa, delova organa, ili tečnosti ili ćelija u tim organima. U određenim otelotvorenjima, uzorci mogu biti dobijeni iz jetre (npr. cele jetre ili određenih segmenata jetre ili određenih vrsta ćelija u jetri, kao što su, na primer, hepatociti), mrežnjače ili delova mrežnjače (npr. epitela retinalnog pigmenta), centralnog nervnog sistema ili delova centralnog nervnog sistema (npr. komora ili horoidnog pleksusa) ili pankreasa ili određenih ćelija ili delova pankreasa. U nekim slučajevima, „uzorak dobijen od ispitanika“ odnosi se na cerebrospinalnu tečnost dobijenu od ispitanika. U poželjnim otelotvorenjima, „uzorak dobijen od ispitanika“ odnosi se na krv ili plazmu uzetu od ispitanika. U daljim slučajevima, „uzorak dobijen od ispitanika“ odnosi se na tkivo jetre (ili njenih potkomponenti) ili tkivo mrežnjače (ili njenih potkomponenti) dobijeno od ispitanika.
II. Agensi RNKi
[0116] Predmetno otkriće obezbeđuje agense koji imaju superiornu aktivnost utišavanja gena. Ovde i u Privremenoj aplikaciji br. 61/561,710 (u odnosu na koju predmetna aplikacija ima prvenstvo) pokazano je da poboljšan rezultat može biti dobijen uvođenjem jednog ili više motiva od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida u sens lancu i/ili antisens lancu agensa RNKi, naročito na mestu cepanja ili blizu njega. Sens lanac i antisens lanac agensa
2
RNKi inače mogu biti potpuno modifikovani. Uvođenje ovih motiva prekida šablon modifikacije, ako je prisutan, sens i/ili antisens lanca. Agens RNKi se takođe opciono konjuguje sa derivatnim ligandom GalNAc, na primer na sens lancu. Dobijeni agensi RNKi pokazuju superiornu aktivnost utišavanja gena.
[0117] Pronalazači su iznenađujuće otkrili da, kada su sens lanac i antisens lanac agensa RNKi potpuno modifikovani, i imaju jedan ili više motiva od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida na mestu cepanja ili blizu njega u najmanje jednom lancu agensa RNKi, dodatno je pojačana aktivnost utišavanja gena agensa RNKi.
[0118] Shodno tome, otkriće obezbeđuje agense RNKi, npr. agense dvolančane RNKi, sposobne da inhibiraju ekspresiju ciljnog gena (tj. TTR gena) in vivo. Agens RNKi sadrži sens lanac i antisens lanac. Svaki lanac agensa RNKi može imati dužinu u rasponu od 12-30 nukleotida. Na primer, svaki lanac može biti dužine od 14-30 nukleotida, dužine 17-30 nukleotida, dužine 25-30 nukleotida, dužine 27-30 nukleotida, dužine 17-23 nukleotida, dužine 17-21 nukleotida, dužine 17-19 nukleotida, dužine 19-25 nukleotida, dužine 19-23 nukleotida, dužine 19-21 nukleotida, dužine 21-25 nukleotida, ili dužine 21-23 nukleotida.
[0119] Sens lanac i antisens lanac uobičajeno grade dvojnu dvolančanu RNK („dsRNK“), koja se ovde naziva i „ agens RNKi“. Region dupleksa agensa RNKi može imati dužinu 12-30 parova nukleotida. Na primer, region dupleksa može biti dužine između 14-30 parova nukleotida, dužine 17-30 parova nukleotida, dužine 27-30 parova nukleotida, dužine 17 - 23 parova nukleotida, dužine 17-21 parova nukleotida, dužine 17-19 parova nukleotida, dužine 19-25 parova nukleotida, dužine 19-23 parova nukleotida, dužine 19- 21 parova nukleotida, dužine 21-25 parova nukleotida, ili dužine 21-23 parova nukleotida. U drugom primeru, region dupleksa je izabran od 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 i 27.
[0120] U jednom slučaju, agens RNKi može da sadrži jedan ili više regiona prepusta i/ili završne grupe agensa RNKi na 3' kraju, ili 5' kraju ili oba kraja lanca. Prepust može biti dužine 1-6 nukleotida, na primer dužine 2-6 nukleotida, dužine 1-5 nukleotida, dužine 2-5 nukleotida, dužine 1-4 nukleotida, dužine 2-4 nukleotida, dužine 1-3 nukleotida, dužine 2-3 nukleotida, ili dužine 1-2 nukleotida. Prepusti mogu biti posledica toga što je jedan lanac duži od drugog, ili posledica toga što su dva lanca iste dužine raspoređena. Prepust može da gradi neusklađeni par sa ciljnom mRNK ili može biti komplementaran sa sekvencama gena koje se ciljaju ili može
2
biti druga sekvenca. Prvi i drugi lanac takođe mogu biti spojeni, npr. pomoću dodatnih baza da formiraju ukosnicu, ili pomoću drugih nebaznih linkera.
[0121] Agensi RNKi obezbeđeni u predmetnom pronalasku uključuju agense sa hemijskim modifikacijama kao što je prikazano, na primer, u U.S. privremenoj prijavi br. 61/561,710, podnetoj 18. novembra 2011, Međunarodnoj prijavi br. PCT/US2011/051597, podnetoj 15. septembra 2010, i PCT Publikaciji WO 2009/073809.
[0122] U jednom slučaju, nukleotidi u regionu prepusta agensa RNKi mogu nezavisno biti modifikovani ili nemodifikovani nukleotid uključujući, bez ograničenja, 2'-šećerom modifikovane, kao što su, 2-F, 2'-O-metil, timidin (T), 2'-O-metoksietil-5-metiluridin (Teo), 2'-O-metoksietiladenozin (Aeo), 2'-O-metoksietil-5-metilcitidin (m5Ceo), i sve njihove kombinacije. Na primer, TT može biti sekvenca prepusta za bilo koji kraj na bilo kojem lancu. Prepust može da gradi neusklađeni par sa ciljnom mRNK ili može biti komplementaran sa sekvencama gena koje se ciljaju ili može biti druga sekvenca.
[0123] 5' ili 3' prepusti na sens lancu, antisens lancu ili oba lanca agensa RNKi mogu biti fosforilovani. U nekim slučajevima, region prepusta sadrži dva nukleotida sa fosforotioatom između dva nukleotida, pri čemu dva nukleotida mogu biti ista ili različita. U jednom slučaju, prepust je prisutan na 3' kraju sens lanca, antisens lanca ili oba lanca. U jednom otelotvorenju, ovaj 3' prepust je prisutan u antisens lancu. U jednom otelotvorenju, ovaj 3' prepust je prisutan u sens lancu.
[0124] Agens RNKi može da sadrži samo jedan prepust, koji može da ojača ometajuću aktivnost RNKi, bez uticaja na njegovu sveukupnu stabilnost. Na primer, jednolančani prepust je lociran na 3' terminalnom kraju sens lanca ili, alternativno, na 3' terminalnom kraju antisens lanca. RNKi takođe može imati tupi kraj, lociran na 5' kraju antisens lanca (ili 3' kraju sens lanca) ili obrnuto. Uopšteno, antisens lanac RNKi ima nukleotidni prepust na 3' kraju, a 5' kraj je tup. Mada podnosioci prijave nisu ograničeni teorijom, teorijski mehanizam je da asimetrični tupi kraj na 5' kraju antisens lanca i prepust na 3' kraju antisens lanca favorizuju unošenje vodećeg lanca u proces RISC.
[0125] U jednom slučaju, agens RNKi je zatupljen na dva kraja dužine 19 nt, pri čemu sens lanac sadrži najmanje jedan motiv od tri 2'-F modifikacije na tri uzastopna nukleotida na
2
pozicijama 7, 8, 9 od 5' kraja. Antisens lanac sadrži najmanje jedan motiv od tri 2'-O-metil modifikacije na tri uzastopna nukleotida na pozicijama 11, 12, 13 od 5' kraja.
[0126] U jednom slučaju, agens RNKi je zatupljen na dva kraja dužine 20 nt, pri čemu sens lanac sadrži najmanje jedan motiv od tri 2'-F modifikacije na tri uzastopna nukleotida na pozicijama 8, 9, 10 od 5' kraja. Antisens lanac sadrži najmanje jedan motiv od tri 2'-O-metil modifikacije na tri uzastopna nukleotida na pozicijama 11, 12, 13 od 5' kraja.
[0127] U jednom slučaju, agens RNKi je zatupljen na dva kraja dužine 21 nt, pri čemu sens lanac sadrži najmanje jedan motiv od tri 2'-F modifikacije na tri uzastopna nukleotida na pozicijama 9, 10, 11 od 5' kraja. Antisens lanac sadrži najmanje jedan motiv od tri 2'-O-metil modifikacije na tri uzastopna nukleotida na pozicijama 11, 12, 13 od 5' kraja.
[0128] U jednom slučaju, agens RNKi sadrži sens lanac od 21 nukleotida (nt) i antisens lanac od 23 nukleotida (nt), pri čemu sens lanac sadrži najmanje jedan motiv od tri 2'-F modifikacije na tri uzastopna nukleotida na pozicijama 9, 10, 11 od 5' kraja; antisens lanac sadrži najmanje jedan motiv od tri 2'-O-metil modifikacije na tri uzastopna nukleotida na pozicijama 11, 12, 13 od 5' kraja, pri čemu je jedan kraj agensa RNKi tup, dok drugi kraj sadrži prepust od 2 nt. Poželjno, prepust od 2 nt je na 3'-kraju antisensa. Opciono, agens RNKi dalje sadrži ligand (poželjno GalNAc3).
[0129] U jednom slučaju, agens RNKi sadrži sens i antisens lanac, pri čemu je sens lanac dužine 25-30 nukleotidnih ostataka, pri čemu, polazeći od 5' terminalnog nukleotida (pozicija 1), pozicije 1 do 23 prvog lanca sadrže najmanje 8 ribonukleotida; antisens lanac je dužine od 36-66 nukleotidnih ostataka i, polazeći od 3' terminalnog nukleotida, sadrži najmanje 8 ribonukleotida u pozicijama uparenim sa pozicijama 1-23 sens lanca dajući dupleks; pri čemu je najmanje 3' terminalni nukleotid antisens lanca neuparen sa sens lancem, i do 6 uzastopnih 3' terminalnih nukleotida je neupareno sa sens lancem, čime nastaje 3' jednolančani prepust od 1-6 nukleotida; pri čemu 5' terminus antisens lanca sadrži od 10-30 uzastopnih nukleotida koji su neupareni sa sens lancem, čime nastaje jednolančani 5' prepust od 10-30 nukleotida, pri čemu su barem 5' terminalni i 3' terminal nukleotidi sens lanca bazno upareni sa nukleotidima antisens lanca kada su sens i antisens lanac poravnati radi maksimalne komplementarnosti, čime suštinski nastaje region dupleksa između sens i antisens lanca; i antisens lanac je dovoljno komplementaran sa ciljnom RNK duž najmanje 19 ribonukleotida dužine antisens lanca da se
2
smanji ekspresija ciljnog gena kada je dvolančana nukleinska kiselina uvedena u ćeliju sisara; i pri čemu sens lanac sadrži najmanje jedan motiv od tri 2'-F modifikacije na tri uzastopna nukleotida, gde se najmanje jedan motiv javlja na mestu cepanja ili blizu njega. Antisens lanac sadrži najmanje jedan motiv od tri 2'-O-metil modifikacije na tri uzastopna nukleotida na mestu cepanja ili blizu njega.
[0130] U jednom slučaju, agens RNKi sadrži sens i antisens lance, pri čemu agens RNKi sadrži prvi lanac koja ima dužinu od najmanje 25 i najviše 29 nukleotida i drugi lanac koja ima dužinu od najviše 30 nukleotida sa najmanje jednim motivom od tri 2'-O-metil modifikacije na tri uzastopna nukleotida na poziciji 11,12,13 od 5' kraja; pri čemu 3' kraj prvog lanca i 5' kraj drugog lanca grade tupi kraj, a drugi lanac je 1-4 nukleotida duži na svom 3' kraju od prvog lanca, pri čemu je region dupleksa dužine najmanje 25 nukleotida, i drugi lanac je dovoljno komplementaran sa ciljnom mRNK duž najmanje 19 nt dužine drugog lanca radi smanjivanja ekspresije ciljnog gena kada je agens RNKi uveden u ćeliju sisara, i pri čemu cepanje dajserom agensa RNKi poželjno daje siRNK koja sadrži 3' kraj drugog lanca, čime se smanjuje ekspresija ciljnog gena u sisaru. Opciono, agens RNKi dalje sadrži ligand.
[0131] U jednom slučaju, sens lanac agensa RNKi sadrži najmanje jedan motiv tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida, kada se jedan od motiva javlja na mestu cepanja u sens lancu.
[0132] U jednom slučaju, antisens lanac agensa RNKi može takođe da sadrži najmanje jedan motiv tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida, kada se jedan od motiva javlja na mestu cepanja u antisens lancu ili blizu njega.
Za agens RNKi koji ima region dupleksa dužine 17-23 nt, mesto cepanja antisens lanca je obično oko pozicija 10, 11 i 12 od 5' kraja. Tako, motivi tri identične modifikacije se mogu javiti na pozicijama 9, 10, 11; pozicijama 10, 11, 12; pozicijama 11, 12, 13; pozicijama 12, 13, 14 ili pozicijama 13, 14, 15 antisens lanca, pri čemu brojanje počinje od 1. nukleotida od 5'-kraja antisens lanca, ili brojanje počinje od 1. uparenog nukleotida u regionu dupleksa od 5' kraja antisens lanca. Mesto cepanja u antisens lancu se takođe može promeniti u skladu sa dužinom regiona dupleksa RNKi od 5' kraja.
[0133] Sens lanac agensa RNKi može da sadrži najmanje jedan motiv od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida na mestu cepanja lanca; a antisens lanac može da ima
2
najmanje jedan motiv od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida na mestu cepanja lanca ili blizu njega. Kada sens lanac i antisens lanac grade dupleks dsRNK, sens lanac i antisens lanac mogu biti poravnati tako da jedan motiv od tri nukleotida na sens lancu i jedan motiv od tri nukleotida na antisens lancu imaju najmanje jedno nukleotidno preklapanje, tj. najmanje jedan od tri nukleotida motiva u sens lancu gradi bazni par sa najmanje jednim od tri nukleotida motiva u antisens lancu. Alternativno, najmanje dva nukleotida mogu da se preklapaju, ili sva tri nukleotida mogu da se preklapaju.
[0134] U jednom slučaju, sens lanac agensa RNKi može da sadrži više od jednog motiva od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida. Prvi motiv treba da se javi na mestu cepanja lanca ili blizu njega, a drugi motivi mogu biti bočne modifikacije. Termin „bočna modifikacija“ ovde se odnosi na motiv koji se javlja na drugom delu lanca koji je odvojen od motiva na mestu cepanja ili blizu njega u istom lancu. Bočna modifikacija je ili susedna prvom motivu ili je odvojena sa najmanje jednim ili više nukleotida. Kada su motivi neposredno susedni jedan drugom, hemija motiva je različita, a kada su motivi razdvojeni sa jednim ili više nukleotida, hemija onda može biti ista ili različita. Može biti prisutno dve ili više bočnih modifikacija. Na primer, kada su prisutne dve bočne modifikacije, svaka bočna modifikacija može se javiti na jednom kraju u odnosu na prvi motiv koji je na mestu cepanja ili blizu njega, ili sa bilo koje strane glavnog motiva.
[0135] Poput sens lanca, antisens lanac agensa RNKi može da sadrži najmanje dva motiva od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida, pri čemu se najmanje jedan motiv javlja na mestu cepanja lanca ili blizu njega. Antisens lanac takođe može da sadrži jednu ili više bočnih modifikacija u rasporedu sličnom sa bočnim modifikacijama koje su prisutne u sens lancu.
[0136] U jednom slučaju, bočna modifikacija na sens lancu ili antisens lancu agensa RNKi obično ne uključuje prvi terminalni nukleotid ili prva dva terminalna nukleotida na 3' kraju, 5' kraju, ili na oba kraja lanca.
[0137] U drugom slučaju, bočna modifikacija na sens lancu ili antisens lancu agensa RNKi obično ne uključuje prvi ili prva dva uparena nukleotida u regionu dupleksa na 3' kraju, 5' kraju, ili na oba kraja lanca.
[0138] Kada i sens lanac i antisens lanac agensa RNKi imaju najmanje jednu bočnu modifikaciju, bočna modifikacija može biti na istom kraju regiona dupleksa, i može imati preklapanje jednog, dva ili tri nukleotida.
[0139] Kada i sens lanac i antisens lanac agensa RNKi imaju najmanje dve bočne modifikacije, sens lanac i antisens lanac mogu biti poravnati tako da dve modifikacije iz jednog lanca budu na jednom kraju regiona dupleksa, uz preklapanje jednog, dva ili tri nukleotida; dve modifikacije iz jednog lanca da budu na drugom kraju regiona dupleksa, uz preklapanje jednog, dva ili tri nukleotida; dve modifikacije jednog lanca da budu sa obe strane glavnog motiva, uz preklapanje jednog, dva ili tri nukleotida u regionu dupleksa.
[0140] U jednom slučaju, svaki nukleotid u sens lancu i antisens lancu agensa RNKi, uključujući nukleotide koji su deo motiva, može biti modifikovan. Svaki nukleotid može biti modifikovan istom ili različitom modifikacijom koja može da uključuje jednu ili više izmena jednog ili oba nevezujuća fosfatna kiseonika i/ili jednog ili više vezujućih fosfatnih kiseonika; izmenu sastavnih delova šećera riboze, npr. 2' hidroksila na šećeru ribozi; potpunu zamenu fosfatnog ostatka „defosfo“ linkerima; modifikaciju ili zamenu prirodne baze; i zamenu ili modifikaciju skeleta riboza-fosfat.
[0141] Pošto su nukleinske kiseline polimeri podjedinica, mnoge modifikacije se javljaju na poziciji koja se ponavlja u nukleinskoj kiselini, npr. modifikacija baze, ili fosfatnog ostatka, ili nevezujućeg O fosfatnog ostatka. U nekim slučajevima, modifikacije će se javiti na svim podložnim pozicijama u nukleinskoj kiselini, ali u mnogim slučajevima neće. Na primer, modifikacija se može javiti samo na 3' ili 5' terminalnoj poziciji, može se javiti samo u terminalnom regionu, npr. na poziciji na terminalnom nukleotidu ili kod poslednjih 2, 3, 4, 5 ili 10 nukleotida lanca. Modifikacija se može javiti u dvolančanom regionu, jednolančanom regionu, ili u oba. Modifikacija se može javiti samo u dvolančanom regionu RNK ili se može javiti samo u jednolančanom regionu RNK. Na primer, modifikacija fosforotioata na nevezujućoj O poziciji može se javiti samo na jednom ili oba terminusa, može se javiti samo u terminalnom regionu, npr. na poziciji na terminalnom nukleotidu ili na poslednjih 2, 3, 4, 5 ili 10 nukleotida lanca, ili se može javiti u dvolančanim ili jednolančanim regionima, naročito na terminusima. 5' kraj ili krajevi mogu biti fosforilovani.
[0142] Može biti moguće, npr. da bi se povećala stabilnost, da se u prepuste uključe određene
1
baze, ili da se uključe modifikovani nukleotidi ili surogati nukleotida, u jednolančane prepuste, npr. u 5' ili 3' prepust, ili u oba. Na primer, može biti poželjno da se purinski nukleotidi uključe u prepuste. U nekim slučajevima, sve ili neke od baza u 5' ili 3' prepustu mogu biti modifikovane, npr. sa ovde opisanom modifikacijom. Modifikacije mogu da uključuju, npr. korišćenje modifikacija na 2' poziciji šećera riboze sa modifikacijama koje su poznate u struci, npr. korišćenje dezoksiribonukleotida, 2'-dezoksi-2'-fluor (2'-F) ili 2'-O-metil modifikovanih umesto ribošećera nukleobaze, i modifikacije u fosfatnoj grupi, npr. modifikacije fosforotioata. Prepusti ne moraju da budu homologi sa ciljnom sekvencom.
[0143] U jednom slučaju, svaki ostatak sens lanca i antisens lanca je nezavisno modifikovan sa LNA, HNA, CeNA, 2'-metoksietil, 2'-O-metil, 2'-O-alil, 2'-C-alil, 2'-dezoksi, 2'-hidroksil, ili 2'-fluor. Lanci mogu da sadrže više od jedne modifikacije. U jednom slučaju, svaki ostatak sens lanca i antisens lanca je nezavisno modifikovan sa 2'-O-metil ili 2'-fluor.
[0144] Najmanje dve različite modifikacije su obično prisutne u sens lancu i antisens lancu. Te dve modifikacije mogu biti 2'-O-metil ili 2'-fluor modifikacija, ili druge.
[0145] U jednom slučaju, Nai/ili Nbsadrže modifikacije sa naizmeničnim šablonom. Termin „naizmenični motiv“, kako se ovde koristi, odnosi se na motiv koji ima jednu ili više modifikacija, pri čemu se svaka modifikacija javlja na naizmeničnim nukleotidima jednog lanca. Naizmenični nukleotid može da se odnosi na jedan na svaka dva nukleotida ili na jedan na svaka tri nukleotida, ili na sličan šablon. Na primer, ako A, B i C predstavljaju jedan tip modifikacije nukleotida, naizmenični motiv može biti „ABABABABABAB...“, „AABBAABBAABB...“, „AABAABAABAAB...“, „AAABAAABAAAB...“, „AAABBBAAABBB...“, ili „ABCABCABCABC...“, itd.
[0146] Vrste modifikacija u naizmeničnom motivu mogu biti iste ili različite. Na primer, ako A, B, C, D predstavljaju vrstu modifikacije na nukleotidu, naizmenični šablon, tj. modifikacija na svakom drugom nukleotidu, može biti ista, ali svaki sens lanac ili antisens lanac može biti izabran od nekoliko mogućih modifikacija u naizmeničnom motivu, kao što je „ABABAB...“, „ACACAC...“ „BDBDBD...“ ili „CDCDCD“, itd.
[0147] U jednom slučaju, agens RNKi iz pronalaska sadrži šablon modifikacije za naizmenični motiv na sens lancu u odnosu na šablon modifikacije za naizmenični motiv na antisens lancu
2
koji je pomeren. Pomeranje može biti takvo da modifikovana grupa nukleotida sens lanca odgovara različito modifikovanoj grupi nukleotida antisens lanca, i obrnuto. Na primer, kada je sens lanac uparen sa antisens lancem u dupleksu dsRNK, naizmenični motiv sens lanca može početi sa „ABABAB“ od 5'-3' lanca, a naizmenični motiv antisens lanca može početi sa „BABABA“ od 5'-3' lanca u regionu dupleksa. Kao drugi primer, naizmenični motiv sens lanca može početi sa „AABBAABB“ od 5'-3' lanca, a naizmenični motiv antisens lanca može početi sa „BBAABBAA“ od 5'-3' lanca u regionu dupleksa, tako da dođe do potpunog ili delimičnog pomeranja šablona modifikacije između sens i antisens lanca.
[0148] U jednom slučaju, agens RNKi sadrži šablon naizmeničnog motiva 2'-O-metil modifikacije i 2'-F modifikacije na sens lancu koji je inicijalno pomeren u odnosu na šablon naizmeničnog motiva 2'-O-metil modifikacije i 2'-F modifikacije na antisens lancu, tj. 2'-O-metil modifikovani nukleotid na sens lancu se bazno sparuje sa 2'-F modifikovanim nukleotidom na antisens lancu, i obrnuto. Pozicija 1 sens lanca može početi sa 2'-F modifikacijom, a pozicija 1 antisens lanca može početi sa 2'-O-metil modifikacijom.
[0149] Uvođenje jednog ili više motiva od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida u sens lanac i/ili antisens lanac prekida inicijalni šablon modifikacija prisutan u sens lancu i/ili antisens lancu. Ovo prekidanje šablona modifikacije na sens i/ili antisens lancu uvođenjem jednog ili više motiva od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida u sens i/ili antisens lancu iznenađujuće je pojačalo aktivnost utišavanja ciljnog gena.
[0150] U jednom slučaju, kada je motiv od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida uveden u bilo koji lanac, modifikacija nukleotida koji je pored motiva je različita modifikacija od modifikacije motiva. Na primer, deo sekvence koji sadrži motiv je „...NaYYYNb...“, gde Y predstavlja modifikaciju motiva od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida, a „Na“ i „Nb“ predstavljaju modifikaciju nukleotida koji je pored motiva „YYY“ koja je različita od modifikacije Y, i pri čemu Nai Nbmogu biti različite ili iste modifikacije. Alternativno, Nai/ili Nbmogu biti prisutni ili odsutni kada je prisutna bočna modifikacija.
[0151] Agens RNKi može dalje da sadrži najmanje jednu fosforotioatnu ili metilfosfonatnu internukleotidnu vezu. Modifikacija fosforotioatne ili metilfosfonatne internukleotidne veze može se javiti na bilo kom nukleotidu sens lanca ili antisens lanca ili oba, na bilo kojoj poziciji u lancu. Na primer, modifikacija internukleotidne veze se može javiti na svakom nukleotidu sens lanca ili antisens lanca; svaka modifikacija internukleotidne veze se može javiti u naizmeničnom šablonu na sens lancu ili antisens lancu; ili sens lanac ili antisens lanac mogu da sadrže obe modifikacije internukleotidne veze u naizmeničnom šablonu. Naizmenični šablon modifikacije internukleotidne veze na sens lancu može biti isti ili različit od onog na antisens lancu, i naizmenični šablon modifikacije internukleotidne veze na sens lancu može imati pomeranje u odnosu na naizmenični šablon modifikacije internukleotidne veze na antisens lancu.
[0152] U jednom slučaju, RNKi sadrži modifikaciju fosforotioatne ili metilfosfonatne internukleotidne veze u regionu prepusta. Na primer, region prepusta može da sadrži dva nukleotida sa fosforotioatnom ili metilfosfonatnom internukleotidnom vezom između dva nukleotida. Modifikacije internukleotidnih veza takođe mogu biti načinjene da povežu nukleotide prepusta sa terminalno sparenim nukleotidima u regionu dupleksa. Na primer, najmanje 2, 3, 4 ili svi nukleotidi prepusta mogu biti povezani putem fosforotioatne ili metilfosfonatne internukleotidne veze, i opciono mogu postojati dodatne fosforotioatne ili metilfosfonatne internukleotidne veze koje povezuju nukleotid prepusta sa sparenim nukleotidom koji se nalazi pored nukleotida prepusta. Na primer, mogu postojati najmanje dve fosforotioatne internukleotidne veze između tri terminalna nukleotida, pri čemu su dva od tri nukleotida nukleotidi prepusta, a treći je sparen sa nukleotidom koji je pored nukleotida prepusta. Poželjno, ova tri terminalna nukleotida mogu biti na 3'-kraju antisens lanca.
[0153] U jednom slučaju, agens RNKi sadrži neusklađeni par (neusklađene parove) sa ciljem, u dupleksu, ili kombinaciju navedenog. Neusklađeno sparivanje se može javiti u regionu prepusta ili regionu dupleksa. Bazni par se može rangirati na osnovu njegove sklonosti da promoviše disocijaciju ili topljenje (npr. na osnovu slobodne energije asocijacije ili disocijacije određenog para, najjednostavniji način je da se parovi ispitaju na bazi pojedinačnog para, mada se može koristiti i analiza prvog susednog, ili slična). Što se tiče promovisanja disocijacije: A:U je poželjno u odnosu na G:C; G:U je poželjno u odnosu na G:C; a I:C je poželjno u odnosu na G:C (I=inozin). Neusklađeni parovi, npr. nekanonski ili parovi osim kanonskih (kao što je ovde opisano na drugim mestima) poželjni su u odnosu na kanonske (A:T, A:U, G:C) parove, i parovi koji uključuju univerzalnu bazu su poželjni u odnosu na kanonske parove.
[0154] U jednom slučaju, agens RNKi koji sadrži najmanje jedan od prvih 1, 2, 3, 4 ili 5 baznih
4
parova u regionima dupleksa od 5'-kraja antisens lanca može biti nezavisno izabran iz grupe od: A:U, G:U, I:C i neusklađenih parova, npr. nekanonskih parova ili parova osim kanonskih ili parova koji uključuju univerzalnu bazu, kako bi se promovisala disocijacija antisens lanca na 5'-kraju dupleksa.
[0155] U jednom slučaju, nukleotid na poziciji 1 u regionu dupleksa od 5'-kraja antisens lanca je izabran iz grupe koja se sastoji od A, dA, dU, U i dT. Alternativno, najmanje jedan od prvih 1, 2, ili 3 baznih parova u regionu dupleksa od 5'-kraja antisens lanca je bazni par AU. Na primer, prvi bazni bar u regionu dupleksa od 5'-kraja antisens lanca je bazni par AU.
[0156] U jednom slučaju, sekvenca sens lanca može biti predstavljena formulom (I):
5' np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y -Nb-(Z Z Z)j-Na-nq3' (I)
pri čemu:
i i j su svaki nezavisno 0 ili 1;
p i q su svaki nezavisno 0-6;
svako Nanezavisno predstavlja sekvencu oligonukleotida koja sadrži 0-25 modifikovanih nukleotida, svaka sekvenca sadrži najmanje dva različito modifikovana nukleotida;
svako Nbnezavisno predstavlja sekvencu oligonukleotida sa 0-10 modifikovanih nukleotida;
svako npi nqnezavisno predstavlja nukleotid prepusta;
pri čemu Nb i Y nemaju istu modifikaciju; i
XXX, YYY i ZZZ nezavisno predstavljaju jedan motiv od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida. Poželjno, YYY su svi 2'-F modifikovani nukleotidi.
[0157] U jednom slučaju, Nai/ili Nbsadrže modifikacije sa naizmeničnim šablonom.
[0158] U jednom slučaju, motiv YYY se javlja na mestu cepanja sens lanca ili blizu njega. Na primer, kada agens RNKi ima dupleks region dužine od 17-23 nukleotida, motiv YYY može da se javi na mestu cepanja sens lanca ili u njegovoj blizini (npr. može da se javi na pozicijama 6, 7, 8, 7, 8, 9, 8, 9, 10, 9, 10, 11, 10, 11,12 ili 11, 12, 13), pri čemu brojanje počinje od 1. nukleotida, od 5'-kraja, ili opciono, brojanje počinje od 1. sparenog nukleotida u regionu dupleksa, od 5'-kraja.
[0159] U jednom slučaju, i je 1 i j je 0, ili i je 0 i j je 1, ili i i j su oba 1. Sens lanac stoga može biti predstavljen sledećim formulama:
5' np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq3' (Ia);
5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq3' (Ib); ili
5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq3' (Ic).
[0160] Kada je sens lanac predstavljen formulom (Ia), Nbpredstavlja sekvencu oligonukleotida koja sadrži 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ili 0 modifikovanih nukleotida. Svako Namože nezavisno da predstavlja sekvencu oligonukleotida sa 2-20, 2-15, ili 2-10 modifikovanih nukleotida.
[0161] Kada je sens lanac predstavljen kao formula (Ib), Nbpredstavlja sekvencu oligonukleotida koja sadrži 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ili 0 modifikovanih nukleotida. Svako Namože nezavisno da predstavlja sekvencu oligonukleotida sa 2-20, 2-15, ili 2-10 modifikovanih nukleotida.
[0162] Kada je sens lanac predstavljen kao formula (Ic), svako Nbnezavisno predstavlja sekvencu oligonukleotida koja sadrži 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ili 0 modifikovanih nukleotida. Poželjno, svako Naje 0, 1, 2, 3, 4, 5 ili 6. Svako Namože nezavisno da predstavlja sekvencu oligonukleotida sa 2-20, 2-15 ili 2-10 modifikovanih nukleotida.
[0163] X, Y i Z mogu biti isti ili međusobno različiti.
[0164] U jednom slučaju, sekvenca antisens lanca RNKi može biti predstavljena formulom (II): 5' nq'-Na'-(Z'Z'Z')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(X'X'X')l-N'a-np' 3' (II)
pri čemu:
k i l su svaki nezavisno 0 ili 1;
p' i q' su svaki nezavisno 0-6;
svako Na' nezavisno predstavlja sekvencu oligonukleotida koja sadrži 0-25 modifikovanih nukleotida, svaka sekvenca sadrži najmanje dva različito modifikovana nukleotida;
svako Nb' nezavisno predstavlja sekvencu oligonukleotida sa 0-10 modifikovanih nukleotida;
svako np' i nq' nezavisno predstavlja nukleotid prepusta;
pri čemu Nb' i Y' nemaju istu modifikaciju;
X'X'X', Y'Y'Y' i Z'Z'Z' svaki nezavisno predstavlja jedan motiv od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida.
[0165] U jednom otelotvorenju, Na' i/ili Nb' sadrže modifikacije sa naizmeničnim šablonom.
[0166] Motiv Y'Y'Y' se javlja na mestu cepanja antisens lanca ili blizu njega. Na primer, kada agens RNKi ima dupleks region dužine od 17-23 nt, motiv Y'Y'Y' može da se javi na pozicijama 9, 10, 11;10, 11, 12; 11, 12, 13; 12, 13, 14; ili 13, 14, 15 antisens lanca, pri čemu brojanje počinje od 1. nukleotida, od 5'-kraja, ili opciono, brojanje počinje od 1. sparenog nukleotida u regionu dupleksa, od 5'-kraja. Poželjno, motiv Y'Y'Y' se javlja na pozicijama 11, 12, 13.
[0167] U jednom otelotvorenju, motiv Y'Y'Y' su svi 2'-OMe modifikovani nukleotidi.
[0168] U jednom otelotvorenju, k je 1 i 1 je 0, ili k je 0 i l je 1, ili k i 1 su oba 1.
[0169] Antisens lanac stoga može biti predstavljen sledećim formulama:
5' nq'-Na'-Z'Z'Z'-Nb'-Y'Y'Y'-Na'-np'3' (IIa);
5' nq'-Na'-Y'Y'Y'-Nb'-X'X'X'-np'3' (IIb); ili
5' nq'-Na'- Z'Z'Z'-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'- X'X'X'-Na'-np'3' (IIc).
[0170] Kada je antisens lanac predstavljen formulom (IIa), Nbpredstavlja sekvencu oligonukleotida koja sadrži 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ili 0 modifikovanih nukleotida. Svako Na' nezavisno predstavlja sekvencu oligonukleotida sa 2-20, 2-15, ili 2-10 modifikovanih nukleotida.
[0171] Kada je antisens lanac predstavljen formulom (IIb), Nb' predstavlja sekvencu oligonukleotida koja sadrži 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ili 0 modifikovanih nukleotida. Svako Na' nezavisno predstavlja sekvencu oligonukleotida sa 2-20, 2-15, ili 2-10 modifikovanih nukleotida.
[0172] Kada je antisens lanac predstavljen formulom (IIc), svako Nb' nezavisno predstavlja sekvencu oligonukleotida koja sadrži 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ili 0 modifikovanih nukleotida. Svako Na' nezavisno predstavlja sekvencu oligonukleotida sa 2-20, 2-15, ili 2-10 modifikovanih nukleotida. Poželjno, Nbje 0, 1, 2, 3, 4, 5 ili 6.
[0173] X', Y' i Z' mogu biti isti ili međusobno različiti.
[0174] Svaki nukleotid sens lanca i antisens lanca može biti nezavisno modifikovan sa LNA, HNA, CeNA, 2'-metoksietil, 2'-O-metil, 2'-O-alil, 2'-C-alil, 2'-hidroksil, 2'-dezoksi, ili 2'-fluor. Na primer, svaki nukleotid sens lanca i antisens lanca je nezavisno modifikovan sa 2'-O-metil ili 2'-fluor. Svaki X, Y, Z, X', Y' i Z', naročito, može da predstavlja 2'-O-metil modifikaciju ili 2'-fluor modifikaciju.
[0175] Prema pronalasku, sens lanac agensa RNKi sadrži motiv YYY koji se javlja na pozicijama 9, 10 i 11 lanca kada dupleks region ima 21 nt, pri čemu brojanje počinje od 1. nukleotida od 5' kraja, ili opciono, brojanje počinje od 1. sparenog nukleotida u regionu dupleksa od 5' kraja, a Y predstavlja 2'-F modifikaciju. Sens lanac može dodatno da sadrži motiv XXX ili motiv ZZZ kao bočne modifikacije na suprotnom kraju regiona dupleksa, a XXX i ZZZ svaki nezavisno predstavljaju 2'-OMe modifikaciju ili 2'-F modifikaciju.
[0176] U jednom otelotvorenju, antisens lanac može da sadrži motiv Y'Y'Y' koji se javlja na pozicijama 11, 12 i 13, pri čemu brojanje počinje od 1. nukleotida od 5' kraja, ili, opciono, brojanje počinje od 1. sparenog nukleotida u regionu dupleksa od 5' kraja, a Y' predstavlja 2'-O-metil modifikaciju. Antisens lanac može dodatno da sadrži motiv X'X'X' ili motiv Z'Z'Z' kao bočne modifikacije na suprotnom kraju regiona dupleksa, a X'X'X' i Z'Z'Z' nezavisno predstavljaju 2'-OMe modifikaciju ili 2'-F modifikaciju.
[0177] Sens lanac predstavljen bilo kojom od prethodnih formula (Ia), (Ib) i (Ic) gradi dupleks sa antisens lancem koji je predstavljen bilo kojom od formula (IIa), (IIb), odnosno (IIc).
[0178] Shodno tome, agens RNKi može da sadrži sens lanac i antisens lanac, svaki lanac ima 14 do 30 nukleotida, dupleks RNKi je predstavljen formulom (III):
pri čemu:
i, j, k i l su svaki nezavisno 0 ili 1;
p, p', q, i q' su svaki nezavisno 0-6;
svako Nai Na' nezavisno predstavlja sekvencu oligonukleotida koja sadrži 0-25 modifikovanih nukleotida, svaka sekvenca sadrži najmanje dva različito modifikovana nukleotida;
svako Nbi Nb' nezavisno predstavlja sekvencu oligonukleotida sa 0-10 modifikovanih nukleotida;
pri čemu
svako np', np, nq' i nqnezavisno predstavlja nukleotid prepusta; i
XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y' i Z'Z'Z' svaki nezavisno predstavlja jedan motiv od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida.
[0179] U jednom slučaju, i je 1 i j je 0; ili i je 0 i j je 1; ili i i j su oba 1. U drugom slučaju, k je 1 i 1 je 0; ili k je 0 i l je 1; ili k i 1 su oba 1.
[0180] Primeri kombinacija sens lanca i antisens lanca koje formiraju dupleks RNKi uključuju sledeće formule:
[0181] Kada je agens RNKi predstavljen formulom (IIIa), svako Nbnezavisno predstavlja sekvencu oligonukleotida koja sadrži 1-10, 1-7, 1-5, 0-4 ili 1-4 modifikovanih nukleotida.
Svako Nanezavisno predstavlja sekvencu oligonukleotida sa 2-20, 2-15, ili 2-10 modifikovanih nukleotida.
[0182] Kada je agens RNKi predstavljen formulom (IIIb), svako Nb, Nb' nezavisno predstavlja sekvencu oligonukleotida koja sadrži 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ili 0 modifikovanih nukleotida. Svako Nanezavisno predstavlja sekvencu oligonukleotida sa 2-20, 2-15, ili 2-10 modifikovanih nukleotida.
[0183] Kada je agens RNKi predstavljen formulom (IIIc), svako Nb, Nb' nezavisno predstavlja sekvencu oligonukleotida koja sadrži 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 ili 0 modifikovanih nukleotida. Svako Na, Na' nezavisno predstavlja sekvencu oligonukleotida sa 2-20, 2-15, ili 2-10 modifikovanih nukleotida. Svako Na, Na', Nbi Nb' nezavisno sadrži modifikaciju naizmeničnih šablona.
[0184] Svako X, Y i Z u formulama (III), (IIIa), (IIIb) i (IIIc) može biti isto ili međusobno različito.
[0185] Kada je agens RNKi predstavljen formulom (III), (IIIa), (IIIb) ili (IIIc), najmanje jedan od Y nukleotida može da gradi bazni par sa jednim od Y' nukleotida. Alternativno, najmanje dva Y nukleotida grade bazne parove sa odgovarajućim Y' nukleotidima, ili sva tri Y nukleotida grade bazne parove sa odgovarajućim Y' nukleotidima.
[0186] Kada je agens RNKi predstavljen formulom (IIIa) ili (IIIc), najmanje jedan od Z nukleotida može da gradi bazni par sa jednim od Z' nukleotida. Alternativno, najmanje dva Z nukleotida grade bazne parove sa odgovarajućim Z' nukleotidima; ili sva tri Z nukleotida grade bazne parove sa odgovarajućim Z' nukleotidima.
[0187] Kada je agens RNKi predstavljen formulom (IIIb) ili (IIIc), najmanje jedan od X nukleotida može da gradi bazni par sa jednim od X' nukleotida. Alternativno, najmanje dva X nukleotida grade bazne parove sa odgovarajućim X' nukleotidima, ili sva tri X nukleotida grade bazne parove sa odgovarajućim X' nukleotidima.
[0188] U jednom slučaju, modifikacija na Y nukleotidu je različita od modifikacije na Y' nukleotidu, modifikacija na Z nukleotidu je različita od modifikacije na Z' nukleotidu i/ili je
4
modifikacija na X nukleotidu različita od modifikacije na X' nukleotidu.
[0189] U jednom slučaju, agens RNKi je multimer koji sadrži najmanje dva dupleksa predstavljena formulom (III), (IIIa), (IIIb) ili (IIIc), pri čemu su dupleksi povezani linkerom. Linker može biti linker koji može da se cepa ili koji ne može da se cepa. Opciono, multimer dalje sadrži ligand. Svaki dupleks može da cilja isti gen ili dva različita gena; ili svaki dupleks može da cilja isti gen na dva različita ciljna mesta.
[0190] U jednom slučaju, agens RNKi je multimer koji sadrži tri, četiri, pet, šest ili više dupleksa predstavljenih formulom (III), (IIIa), (IIIb) ili (IIIc), pri čemu su dupleksi povezani linkerom. Linker može biti linker koji može da se cepa ili koji ne može da se cepa. Opciono, multimer dalje sadrži ligand. Svaki dupleks može da cilja isti gen ili dva različita gena; ili svaki dupleks može da cilja isti gen na dva različita ciljna mesta.
[0191] U jednom slučaju, dva agensa RNKi predstavljena formulom (III), (IIIa), (IIIb) ili (IIIc) su međusobno povezana na 5' kraju, a jedan ili oba 3' kraja su opciono konjugovana sa ligandom. Svaki agens može da cilja isti gen ili dva različita gena; ili svaki agens može da cilja isti gen na dva različita ciljna mesta.
[0192] Različite publikacije opisuju multimerne agense RNKi. Takve publikacije uključuju WO2007/091269, US Patent br. 7858769, WO2010/141511, WO2007/117686, WO2009/014887 i WO2011/031520.
[0193] Agens RNKi koji sadrži konjugacije jednog ili više ostataka ugljenih hidrata sa agensom RNKi može da optimizuje jedno ili više svojstava agensa RNKi. U mnogim slučajevima, ostatak ugljenog hidrata će biti vezan za modifikovanu podjedinicu agensa RNKi. Na primer, šećer riboza jedne ili više ribonukleotidnih podjedinica agensa dsRNK može se zameniti drugim ostatkom, npr. (poželjno cikličnim) nosačem koji nije ugljeni hidrat, za koji je vezan ligand ugljenog hidrata. Ribonukleotidna podjedinica u kojoj je šećer riboza podjedinice tako zamenjen ovde se naziva podjedinica sa modifikacijom zamene riboze (ribose replacement modification subunit, RRMS). Ciklični nosač može biti karbociklični sistem prstena, tj. svi atomi prstena su atomi ugljenika, ili heterociklični sistem prstena, tj. jedan ili više atoma u prstenu može biti heteroatom, npr. azot, kiseonik, sumpor. Ciklični nosač može biti monociklični sistem prstena, ili može da sadrži dva ili više prstenova, npr. kondenzovane prstenove. Ciklični nosač može biti potpuno zasićeni sistem prstena, ili može da sadrži jednu ili više dvostrukih veza.
[0194] Ligand može biti vezan za polinukleotid putem nosača. Nosači uključuju (i) najmanje jednu „tačku vezivanja skeleta“, poželjno dve „tačke vezivanja skeleta“ i (ii) najmanje jednu „vezujuću tačku kačenja“. „Tačka vezivanja skeleta“, kako se ovde koristi, odnosi se na funkcionalnu grupu, npr. hidroksilnu grupu, ili generalno vezu koja je dostupna i koja je pogodna za uključivanje nosača u skelet, npr. fosfata ili modifikovanog fosfata, npr. koji sadrži sumpor, skeleta, ribonukleinske kiseline. „Vezujuća tačka kačenja“ (tethering attachment point, TAP) u nekim otelotvorenjima ukazuje na sastavni atom prstena cikličnog nosača, npr. atom ugljenika ili heteroatom (različit od atoma koji obezbeđuje tačku vezivanja skeleta) koji povezuje odabrani ostatak. Ostatak može biti, npr. ugljeni hidrat, npr. monosaharid, disaharid, trisaharid, tetrasaharid, oligosaharid i polisaharid. Opciono, izabrani ostatak je povezan interventnom vezom sa cikličnim nosačem. Tako, ciklični nosač će često obuhvatati funkcionalnu grupu, npr. amino grupu, ili uopšteno, obezbeđivati vezu koja je pogodna za uključivanje ili vezivanje drugog hemijskog entiteta, npr. liganda za prsten konstituenta.
[0195] Agensi RNKi mogu biti konjugovani sa ligandom putem nosača, pri čemu nosač može biti ciklična grupa ili aciklična grupa; poželjno, ciklična grupa je izabrana od pirolidinila, pirazolinila, pirazolidinila, imidazolinila, imidazolidinila, piperidinila, piperazinila, [1,3]dioksolana, oksazolidinila, izoksazolidinila, morfolinila, tiazolidinila, izotiazolidinila, hinoksalinila, piridazinonila, tetrahidrofurila i dekalina; poželjno, aciklična grupa je izabrana od skeleta serinola ili skeleta dietanolamina.
[0196] U određenim specifičnim otelotvorenjima, agens RNKi iz pronalaska je agens izabran iz grupe agenasa navedenih u tabeli 1 koja se sastoji od D1000, D1001, D1002, D1003, D1004, D1005, D1006, D1007, D1008, D1009, D1010, D1011, D1012, D1013, D1014, D1015, D1016, D1017, D1018, D1019, D1020, D1021, D1022, D1023, D1024, D1025, D1026, D1027, D1028, D1029, D1030, D1031, D1032, D1033, D1034, D1035, D1036, D1037, D1038, D1039, D1040, D1041, D1042, D1043, D1044, D1045, D1046, D1047, D1048, D1049, D1050, D1051, D1052, D1053, D1054, D1055, D1056, D1057, D1058, D1059, D1060, D1061, D1062, D1063, D1064, D1065, D1066, D1067, D1068, D1069, D1070, D1071, D1072, D1073, D1074, D1075, D1076, D1077, D1078, D1079, D1080, D1081, D1082, D1083, D1084, D1085, D1086, D1087, D1088, D1089, D1090, D1091, D1092, D1093, D1094, D1095, D1096, D1097, D1098, D1099, D1100, D1101, D1102, D1103, D1104, D1105, D1106, D1107, D1108, D1109, D1110, D1111, D1112, D1113, D1114, D1115, D1116, D1117, D1118, D1119, D1120, D1121, D1122, D1123, D1124, D1125, D1126, D1127, D1128, D1129, D1130, D1131, D1132, D1133, D1134, D1135, D1136, D1137, D1138, D1139, D1140, D1141, D1142, D1143, D1144, D1145, D1146, D1147, D1148, D1149, D1150, D1151, D1152, D1153, D1154, D1155, D1156, D1157, D1158, D1159, D1160, D1161, D1162, D1163, D1164, D1165, D1166, D1167, D1168, D1169, D1170, D1171, D1172, D1173, D1174, D1175, D1176, D1177, D1178, D1179, D1180, D1181, D1182, D1183, D1184, D1185, D1186, D1187, D1188, D1189, D1190, D1191, D1192, D1193, D1194, D1195, D1196, D1197, D1198, D1199, D1200, D1201, D1202, D1203, D1204, D1205, D1206, D1207, D1208, D1209, D1210, D1211, D1212, D1213, D1214, D1215, D1216, D1217, D1218, D1219, D1220, D1221, D1222, D1223, D1224, D1225, D1226, D1227, D1228, D1229, D1230, D1231, D1232, D1233, D1234, D1235, D1236, D1237, D1238, D1239, D1240, D1241, D1242, D1243, D1244, D1245, D1246, D1247, D1248, D1249, D1250, D1251, D1252, D1253, D1254, D1255, D1256, D1257, D1258, D1259, D1260, D1261, D1262, D1263, D1264, D1265, D1266, D1267, D1268, D1269, D1270, D1271, D1272, D1273, D1274, D1275, D1276, D1277, D1278, D1279, D1280, D1281, D1282, D1283, D1284, D1285, D1286, D1287, D1288, D1289, D1290, D1291, D1292, D1293, D1294, D1295, D1296, D1297, D1298, D1299, D1300, D1301, D1302, D1303, D1304, D1305, D1306, D1307, D1308, D1309, D1310, D1311, D1312, D1313, D1314, D1315, D1316, D1317, D1318, D1319, D1320, D1321, D1322, D1323, D1324, D1325, D1326, D1327, D1328, D1329, D1330, D1331, D1332, D1333, D1334, D1335, D1336, D1337, D1338, D1339, D1340, D1341, D1342, D1343, D1344, D1345, D1346, D1347, D1348, D1349, D1350, D1351, D1352, D1353, D1354, D1355, D1356, D1357, D1358, D1359, D1360, D1361, D1362, D1363, D1364, D1365, D1366, D1367, D1368, D1369, D1370, D1371, D1372, D1373, D1374, D1375, D1376, D1377, D1378, D1379, D1380, D1381, D1382, D1383, D1384, D1385, D1386, D1387, D1388, D1389, D1390, D1391, D1392, D1393, D1394, D1395, D1396, D1397, D1398, D1399, D1400, D1401, D1402, D1403, D1404, D1405, D1406, D1407, D1408, D1409, D1410, D1411, D1412, D1413, D1414, D1415, D1416, D1417, D1418, D1419, D1420, D1421, D1422, D1423, D1424, D1425, D1426, D1427, D1428, D1429, D1430, D1431, D1432, D1433, D1434, D1435, D1436, D1437, D1438, D1439, D1440, D1441, D1442, D1443, D1444, D1445, D1446, D1447, D1448, D1449, D1450, D1451, D1452, D1453, D1454, D1455, D1456, D1457, D1458, D1459, D1460, D1461, D1462, D1463, D1464, D1465, D1466, D1467, D1468, D1469, D1470, D1471, D1472, D1473, D1474, D1475, D1476, D1477, D1478, D1479, D1480, D1481, D1482, D1483, D1484, D1485, D1486, D1487, D1488, D1489, D1490, D1491, D1492, D1493, D1494, D1495, D1496, D1497, D1498, D1499, . D1500, D1501, D1502, D1503, D1504, D1505, D1506, D1507,
4
D1508, D1509, D1510, D1511, D1512, D1513, D1514, D1515, D1516, D1517, D1518, D1519, D1520, D1521, D1522, D1523, D1524, D1525, D1526, D1527, D1528, D1529, D1530, D1531, D1532, D1533, D1534, D1535, D1536, D1537, D1538, D1539, D1540, D1541, D1542, D1543, D1544, D1545, D1546, D1547, D1548, D1549, D1550, D1551, D1552, D1553, D1554, D1555, D1556, D1557, D1558, D1559, D1560, D1561, D1562, D1563, D1564, D1565, D1566, D1567, D1568, D1569, D1570, D1571, D1572, D1573, D1574, D1575, D1576, D1577, D1578, D1579, D1580, D1581, D1582, D1583, D1584, D1585, D1586, D1587, D1588, D1589, D1590, D1591, D1592, D1593, D1594, D1595, D1596, D1597, D1598, D1599, D1600, D1601, D1602, D1603, D1604, D1605, D1606, D1607, D1608, D1609, D1610, D1611, D1612, D1613, D1614, D1615, D1616, D1617, D1618, D1619, D1620, D1621, D1622, D1623, D1624, D1625, D1626, D1627, D1628, D1629, D1630, D1631, D1632, D1633, D1634, D1635, D1636, D1637, D1638, D1639, D1640, D1641, D1642, D1643, D1644, D1645, D1646, D1647, D1648, D1649, D1650, D1651, D1652, D1653, D1654, D1655, D1656, D1657, D1658, D1659, D1660, D1661, D1662, D1663, D1664, D1665, D1666, D1667, D1668, D1669, D1670, D1671, D1672, D1673, D1674, D1675, D1676, D1677, D1678, D1679, D1680, D1681, D1682, D1683, D1684, D1685, D1686, D1687, D1688, D1689, D1690, D1691, D1692, D1693, D1694, D1695, D1696, D1697, D1698, D1699, D1700, D1701, D1702, D1703, D1704, D1705, D1706, D1707, D1708, D1709, D1710, D1711, D1712, D1713, D1714, D1715, D1716, D1717, D1718, D1719, D1720, D1721, D1722, D1723, D1724, D1725, D1726, D1727, D1728, D1729, D1730, D1731, D1732, D1733, D1734, D1735, D1736, D1737, D1738, D1739, D1740, D1741, D1742, D1743, D1744, D1745, D1746, D1747, D1748, D1749, D1750, D1751, D1752, D1753, D1754, D1755, D1756, D1757, D1758, D1759, D1760, D1761, D1762, D1763, D1764, D1765, D1766, D1767, D1768, D1769, D1770, D1771, D1772, D1773, D1774, D1775, D1776, D1777, D1778, D1779, D1780, D1781, D1782, D1783, D1784, D1785, D1786, D1787, D1788, D1789, D1790, D1791, D1792, D1793, D1794, D1795, D1796, D1797, D1798, D1799, D1800, D1801, D1802, D1803, D1804, D1805, D1806, D1807, D1808, D1809, D1810, D1811, D1812, D1813, D1814, D1815, D1816, D1817, D1818, D1819, D1820, D1821, D1822, D1823, D1824, D1825, D1826, D1827, D1828, D1829, D1830, D1831, D1832, D1833, D1834, D1835, D1836, D1837, D1838, D1839, D1840, D1841, D1842, D1843, D1844, D1845, D1846, D1847, D1848, D1849, D1850, D1851, D1852, D1853, D1854, D1855, D1856, D1857, D1858, D1859, D1860, D1861, D1862, D1863, D1864, D1865, D1866, D1867, D1868, D1869, D1870, D1871, D1872, D1873, D1874, D1875, D1876, D1877, D1878, D1879, D1880, D1881, D1882, D1883, D1884, D1885, D1886, D1887, D1888, D1889, D1890, D1891, D1892, D1893, D1894, D1895, D1896, D1897, D1898, D1899, D1900, D1901, D1902, D1903, D1904, D1905, D1906, D1907, D1908, D1909, D1910, D1911, D1912, D1913, D1914, D1915, D1916, D1917, D1918, D1919, D1920, D1921, D1922, D1923, D1924, D1925, D1926, D1927, D1928, D1929, D1930, D1931, D1932, D1933, D1934, D1935, D1936, D1937, D1938, D1939, D1940, D1941, D1942, D1943, D1944, D1945, D1946, D1947, D1948, D1949, D1950, D1951, D1952, D1953, D1954, D1955, D1956, D1957, D1958, D1959, D1960, D1961, D1962, D1963, D1964, D1965, D1966, D1967, D1968, D1969, D1970, D1971, D1972, D1973, D1974, D1975, D1976, D1977, D1978, D1979, D1980, D1981, D1982, D1983, D1984, D1985, D1986, D1987, D1988, D1989, D1990, D1991, D1992, D1993, D1994, D1995, D1996, D1997, D1998, D1999, D2000, D2001, D2002, D2003, D2004, D2005, D2006, D2007, D2008, D2009, D2010, D2011, D2012, D2013, D2014, D2015, D2016, D2017, D2018, D2019, D2020, D2021, D2022, D2023, D2024, D2025, D2026, D2027, D2028, D2029, D2030, D2031, D2032, D2033, D2034, D2035, D2036, D2037, D2038, D2039, D2040, D2041, D2042, D2043, D2044, D2045, D2046, D2047, D2048, D2049, D2050, D2051, D2052, D2053, D2054, D2055, D2056, D2057, D2058, D2059, D2060, D2061, D2062, D2063, D2064, D2065, D2066, D2067, D2068, D2069, D2070, D2071, D2072, D2073, D2074, D2075, D2076, D2077, D2078, D2079, D2080, D2081, D2082, D2083, D2084, D2085, D2086, D2087, D2088, D2089, D2090 i D2091.
[0197] Ovi agensi mogu dalje da sadrže ligand, kao što je ligand GalNAc.
Ligandi
[0198] Agensi RNKi iz otkrića, npr. agensi dvolančane RNKi, mogu opciono biti konjugovani sa jednim ili više liganada. Ligand može biti vezan za sens lanac, antisens lanac ili oba lanca, na 3' kraju, 5' kraju ili na oba kraja. Na primer, ligand može biti konjugovan sa sens lancem. U poželjnim otelotvorenjima, ligand je konjugovan sa 3'-krajem sens lanca. Kod agenasa RNKi iz pronalaska, ligand je ligand GalNAc. U naročito poželjnim otelotvorenjima, ligand je GalNAc3:
4
[0199] Širok raspon entiteta može biti kuplovan sa agensima RNKi iz predmetnog pronalaska. Poželjni ostaci su ligandi, koji su kuplovani, poželjno kovalentno, direktno ili indirektno putem interventne veze.
[0200] Ligand može da izmeni distribuciju, ciljanje ili životni vek molekula u koji je inkorporisan. U poželjnim slučajevima, ligand obezbeđuje pojačan afinitet prema izabranom cilju, npr. molekulu, ćeliji ili vrsti ćelija, odeljku, receptoru, npr. odeljku ćelije ili organa, tkivu, organu ili regionu tela, u poređenju, npr. sa vrstama bez takvog liganda. Ligandi koji obezbeđuju pojačani afinitet prema odabranom cilju nazivaju se i ciljni ligandi.
[0201] Neki ligandi mogu da imaju endozomolitička svojstva. Endozomolitički ligandi promovišu lizu endozoma i/ili transport kompozicije iz pronalaska, ili njenih komponenti, iz endozoma u citoplazmu ćelije. Endozomolitički ligand može biti polianjonski peptid ili peptidomimetik koji pokazuje aktivnost membrane zavisnu od pH i fuzogenost. U jednom otelotvorenju, endozomolitički ligand poprima svoju aktivnu konformaciju pri endozomskom pH. „Aktivna“ konformacija je konformacija u kojoj endozomolitički ligand promoviše lizu endozoma i/ili transport kompozicije iz pronalaska, ili njenih komponenti, iz endozoma u citoplazmu ćelije. Primeri endozomolitičkih liganada uključuju GALA peptid (Subbarao i sar. Biochemistry, 1987, 26: 2964-2972), EALA peptide (Vogel i sar J. Am. Chem. Soc., 1996, 118: 1581-1586) i njihove derivate (Turk i sar. Biochem. Biophys. Acta, 2002, 1559: 56-68). U jednom otelotvorenju, endozomolitička komponenta može da sadrži hemijsku grupu (npr. aminokiselinu) koja će pretrpeti promenu naelektrisanja ili protonacije kao odgovor na promenu u pH. Endozomolitička komponenta može biti linearna ili razgranata.
[0202] Ligandi mogu da unaprede transportna, hibridizaciona i specifična svojstva i mogu takođe da unaprede otpornost nukleaze dobijenog prirodnog ili modifikovanog oligoribonukleotida, ili polimernog molekula koji sadrži bilo koju kombinaciju ovde opisanih monomera i/ili prirodnih ili modifikovanih ribonukleotida.
[0203] Ligandi uopšteno mogu da uključuju terapeutske modifikatore, npr. za poboljšanje unosa; dijagnostička jedinjenja ili reporterske grupe, npr. za praćenje distribucije; agense za unakrsno vezivanje; i ostatke koji daju otpornost nukleaze. Uopšteni primeri uključuju lipide, steroide, vitamine, šećere, proteine, peptide, poliamine i imitacije peptida.
4
[0204] Ligand može da uključuje prirodnu supstancu, kao što je protein (npr. human serumski albumin (HSA), lipoprotein male gustine (LDL), lipoprotein velike gustine (HDL) ili globulin); ugljeni hidrat (npr. dekstran, pululan, hitin, hitozan, inulin, ciklodekstrin ili hijaluronsku kiselinu); ili lipid. Ligand takođe može biti rekombinantni ili sintetički molekul, kao što je sintetički polimer, npr. sintetička poliaminokiselina, oligonukleotid (npr. aptamer). Primeri za poliaminokiseline uključuju polilizin (PLL), poli L-asparaginsku kiselinu, poli L-glutaminsku kiselinu, kopolimer stirena-anhidrida maleinske kiseline, poli(L-laktid-ko-glikolizovani) kopolimer, kopolimer divinil etra-anhidrida maleinske kiseline, N-(2-hidroksipropil)metakrilamid kopolimer (HMPA), polietilen glikol (PEG), polivinil alkohol (PVA), poliuretan, poli(2-etilakrilnu kiselinu), polimere N-izopropilakrilamida, ili polifosfazin. Primeri za poliamin uključuju: polietilenimin, polilizin (PLL), spermin, spermidin, poliamin, pseudopeptid-poliamin, peptidomimetski poliamin, dendrimer poliamin, arginin, amidin, protamin, katjonski lipid, katjonski porfirin, kvaternernu so poliamina, ili alfa heliksni peptid.
[0205] Ligandi takođe uključuju grupe za ciljanje, npr. agens koji cilja ćeliju ili tkivo, npr. lektin, glikoprotein, lipid ili protein, npr. antitelo koje se vezuje za određenu vrstu ćelija, kao što je bubrežna ćelija. Grupa za ciljanje može biti tirotropin, melanotropin, lektin, glikoprotein, surfaktantski protein A, mucinski ugljeni hidrat, multivalentna laktoza, multivalentna galaktoza, N-acetil-galaktozamin, N-acetil-gulukozamin multivalentna manoza, multivalentna fukoza, glikozilovane poliaminokiseline, multivalentna galaktoza, transferin, bisfosfonat, poliglutamat, poliaspartat, lipid, holesterol, steroid, žučna kiselina, folat, vitamin B12, biotin, RGD peptid, RGD peptidni mimetik ili aptamer.
[0206] Drugi primeri liganda uključuju boje, interkalirajuće agense (npr. akridine), unakrsne linkere (npr. psoralen, mitomicin C), porfirine (TPPC4, teksafirin, safirin), policiklične aromatične ugljene hidrate (npr. fenazin, dihidrofenazin), veštačke endonukleaze ili helator (npr. EDTA), lipofilne molekule, npr. holesterol, holnu kiselinu, adamantan sirćetnu kiselinu, 1-piren buternu kiselinu, dihidrotestosteron, 1,3-bis-O(heksadecil)glicerol, geraniloksiheksilnu grupu, heksadecilglicerol, borneol, mentol, 1,3-propandiol, heptadecilnu grupu, palmitinsku kiselinu, miristinsku kiselinu,O3-(oleoil)litoholnu kiselinu, O3-(oleoil)holensku kiselinu, dimetoksitritil, ili fenoksazin) i peptidne konjugate (npr. antenapedija peptid, Tat peptid), alkilujuće agense, fosfat, amino, merkapto, PEG (npr. PEG-40K), MPEG, [MPEG]2, poliamino, alkil, supstituisani alkil, radiološki obeležene markere, enzime, haptene (npr. biotin), agense za olakšavanje transporta/apsorpcije (npr. aspirin, vitamin E, folna kiselina), sintetičke
4
ribonukleaze (npr. imidazol, bisimidazol, histamin, klasteri imidazola, konjugati akridinaimidazola, Eu3+ kompleksi tetraazamakrocikla), dinitrofenil, HRP, ili AP.
[0207] Ligandi mogu biti proteini, npr. glikoproteini, ili peptidi, npr. molekuli koji imaju specifičan afinitet prema koligandu, ili antitela, npr. antitelo koje se vezuje za određenu vrstu ćelija, kao što je ćelija kancera, ćelija endotela ili koštana ćelija. Ligandi mogu takođe da uključuju hormone i hormonske receptore. Takođe mogu da uključuju i nepeptidne vrste, kao što su lipidi, lektini, ugljeni hidrati, vitamini, kofaktori, multivalentna laktoza, multivalentna galaktoza, N-acetil-galaktozamin, N-acetil-gulukozamin multivalentna manoza, multivalentna fukoza, ili aptameri. Ligand može biti, na primer, lipopolisaharid, aktivator p38 MAP kinaze ili aktivator NF-κB.
[0208] Ligand može biti supstanca, npr. lek, koja povećava unos agensa iRNK u ćeliju, na primer, remećenjem ćelijskog citoskeleta, npr. remećenjem ćelijskih mikrotubula, mikrofilamenata i/ili intermedijernih filamenata. Lek može biti, na primer, takson, vinkristin, vinblastin, citohalazin, nokodazol, japlakinolid, latrunkulin A, faloidin, svinholid A, indanocin ili mioservin.
[0209] Ligand može da poveća unos oligonukleotida u ćeliju na primer, putem, aktivacije inflamatornog odgovora. Primeri liganada koji bi imali takvo dejstvo uključuju faktor nekroze tumora alfa (TNFalfa), interleukin-1 beta ili gama interferon.
[0210] U jednom aspektu, ligand je lipid ili molekul na bazi lipida. Takav lipid ili molekul na bazi lipida poželjno vezuje serumski protein, npr. humani serumski albumin (HSA). HSA vezujući ligand omogućava distribuciju konjugata u ciljno tkivo, npr. nebubrežno ciljno tkivo u telu. Na primer, ciljno tkivo može biti jetra, uključujući parenhimske ćelije jetre. Drugi molekuli koji mogu da vezuju HSA takođe mogu da se koriste kao ligandi. Na primer, mogu se koristiti i naproksen ili aspirin. Lipid ili ligand na bazi lipida mogu da (a) povećaju otpor degradaciji konjugata, (b) pojačaju ciljanje ili transport u ciljnu ćeliju ili ćelijsku membranu i/ili (c) mogu da se koriste za prilagođavanje vezivanja za serumski protein, npr. HSA.
[0211] Ligand na bazi lipida može se koristiti da modulira, npr. kontroliše vezivanje konjugata za ciljno tkivo. Na primer, za lipid ili ligand na bazi lipida koji se snažnije vezuje za HSA biće manje verovatno da cilja bubreg, i stoga manje verovatno da se brzo ukloni iz organizma. Lipid
4
ili ligand na bazi lipida koji se snažno vezuje za HSA može da se koristi za ciljanje konjugata prema bubregu.
[0212] U poželjnom slučaju, lipid na bazi lipida vezuje HSA. On poželjno vezuje HSA sa dovoljnim afinitetom tako da će konjugat poželjno biti distribuiran u nebubrežno tkivo. Međutim, poželjno je da afinitet ne bude toliko jak da se vezivanje HSA-ligand ne može preokrenuti.
[0213] U drugom poželjnom slučaju, ligand na bazi lipida vezuje HSA slabo ili uopšte ne vezuje, tako da će konjugat poželjno biti distribuiran bubregu. Drugi ostaci koji ciljaju ćelije bubrega takođe mogu da se koriste umesto liganda na bazi lipida, ili kao dodatak njemu.
[0214] U drugom aspektu, ligand je ostatak, npr. vitamin, koji preuzima ciljna ćelija, npr. proliferativna ćelija. Oni su posebno korisni za lečenje poremećaja okarakterisanih neželjenom ćelijskom proliferacijom, npr. malignog ili nemalignog tipa, npr. ćelijama kancera. Primeri za vitamine uključuju vitamin A, E i K. Drugi primeri za vitamine uključuju B vitamine, npr. folnu kiselinu, B12, riboflavin, biotin, piridoksal ili druge vitamine ili hranljive materije preuzete u ćelije kancera. Takođe su uključeni HAS, lipoprotein male gustine (LDL) i lipoprotein velike gustine (HDL).
[0215] U drugom aspektu, ligand je agens za ćelijsku permeaciju, poželjno spiralni agens za ćelijsku permeaciju. Poželjno, agens je amfipatički. Primer za agens je peptid, kao što je tat ili antenopedija. Ako je agens peptid, on može biti modifikovan, uključujući peptidilmimetik, invertomere, nepeptidne ili pseudopeptidne veze, i korišćenje D-aminokiselina. Spiralni agens je poželjno alfa-heliksni agens, koji poželjno ima lipofilnu i lipofobnu fazu.
[0216] Ligand može biti peptid ili peptidomimetik. Peptidomimetik (ovde se takođe naziva oligopeptidomimetik) je molekul sposoban da se presavija u definisanu trodimenzionalnu strukturu sličnu prirodnom peptidu. Peptid ili peptidomimetski ostatak može biti dužine oko 5-50 aminokiselina, npr. dužine oko 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ili 50 aminokiselina. Peptid ili peptidomimetik može biti, na primer, peptid za ćelijsku permeaciju, katjonski peptid, amfipatični peptid ili hidrofobni peptid (npr. koji se sastoji pretežno od Tyr, Trp ili Phe). Peptidni ostatak može biti peptidni dendrimer, ograničeni peptid ili unakrsno vezani peptid. U drugoj alternativi, peptidni ostatak može da uključuje hidrofobnu sekvencu translokacije
4
membrane (MTS). Primer peptida koji sadrži hidrofobnu MTS je RFGF sa aminokiselinskom sekvencom AAVALLPAVLLALLAP (SEQ ID NO:4). Analog RFGF (npr. aminokiselinska sekvenca AALLPVLLAAP) (SEQ ID NO:5) koji sadrži hidrofobnu MTS takođe može biti ostatak za ciljanje. Peptidni ostatak može biti peptid za „isporuku“ koji može da prenosi velike polarne molekule, uključujući peptide, oligonukleotide i proteine, kroz ćelijske membrane. Na primer, otkriveno je da su sekvence iz Tat proteina HIV (GRKKRRQRRRPPQ) (SEQ ID NO:6) i proteina Drosophila Antennapedia (RQIKIWFQNRRMKWKK) (SEQ ID NO:7) sposobne da deluju kao peptidi za isporuku. Peptid ili peptidomimetik može biti kodiran nasumičnom sekvencom DNK, kao što je peptid identifikovan iz biblioteke displeja faga, ili iz kombinatorne biblioteke jedno-zrnce-jedno-jedinjenje (one-bead-one-compound, OBOC) (Lam i sar. Nature, 354:82-84, 1991). Poželjno, peptid ili peptidomimetik vezan za agens iRNK putem inkorporisane jedinice monomera je peptid koji cilja ćeliju kao što je arginin-glicinasparaginska kiselina (RGD)-peptid, ili RGD mimetik. Peptidni ostatak može imati dužinu u rasponu od oko 5 aminokiselina do oko 40 aminokiselina. Peptidni ostaci mogu imati strukturnu modifikaciju, recimo radi poboljšanja stabilnosti ili direktnih konformacionih svojstava. Svaka od strukturnih modifikacija opisanih u nastavku može da se koristi. RGD peptidni ostatak može da se koristi da cilja ćeliju tumora, kao što je ćelija endotelnog tumora ili ćelija tumora kancera dojke (Zitzmann i sar. Cancer Res., 62:5139-43, 2002). RGD peptid može da olakša ciljanje agensa iRNK ka tumorima brojnih drugih tkiva, uključujući pluća, bubreg, slezinu ili jetru (Aoki i sar. Cancer Gene Therapy 8:783-787, 2001). Poželjno, RGD peptid će olakšati ciljanje agensa iRNK ka bubregu. RGD peptid može biti linearan ili cikličan, i može biti modifikovan, npr. glikozilovan ili metilovan da olakša ciljanje specifičnih tkiva. Na primer, glikozilovani RGD peptid može da isporuči agens iRNK u tumorsku ćeliju koja eksprimira αVβ3(Haubner i sar. Jour. Nucl. Med., 42:326-336, 2001). Mogu se koristiti peptidi koji ciljaju markere obogaćene proliferativnim ćelijama. Na primer, peptidi i peptidomimetici koji sadrže RGD mogu da ciljaju ćelije kancera, posebno ćelije koje izlažu integrin. Tako, mogu se koristiti RGD peptidi, ciklični peptidi koji sadrže RGD, RGD peptidi koji sadrže D-aminokiseline, kao i sintetički RGD mimetici. Pored RGD, mogu se koristiti drugi ostaci koji ciljaju integrinski ligand. Uopšteno, takvi ligandi se mogu koristiti da kontrolišu proliferativne ćelije i angiogenezu. Poželjni konjugati ove vrste liganda ciljaju PECAM-1, VEGF ili druge gene kancera, npr. ovde opisane gene kancera.
[0217] „Peptid za ćelijsku permeaciju“ je sposoban da prodre u ćeliju, npr. ćeliju mikroba, kao što je bakterijska ili gljivična ćelija, ili ćeliju sisara, kao što je ljudska ćelija. Peptid koji prodire u ćeliju mikroba može biti, na primer α-heliksni linearni peptid (npr. LL-37 ili Ceropin P1), peptid koji sadrži disulfidnu vezu (npr. α-defensin, β-defensin ili baktenecin), ili peptid koji sadrži samo jednu ili dve dominantne aminokiseline (npr. PR-39 ili indolicidin). Peptid za ćelijsku permeaciju takođe može da uključuje nuklearni lokalizacioni signal (NLS). Na primer, peptid za ćelijsku permeaciju može biti dvodelni amfipatični peptid, kao što je MPG, koji je dobijen iz fuzije peptidnog domena HIV-1 gp41 i NLS SV40 velikog T antigena (Simeoni i sar. Nucl. Acids Res.31:2717-2724, 2003).
[0218] U jednom slučaju, peptid za ciljanje može biti amfipatični α-heliksni peptid. Primeri za amfipatične α-heliksne peptide uključuju, ali nisu ograničeni na, cekropine, likotoksine, paradaksine, buforin, CPF, peptid sličan bombininu (BLP), katelicidine, ceratotoksine, peptide S. clava, antimikrobne crevne proteine slepulje (hagfish intestinal antimicrobial peptides, HFIAP), magainine, brevinine-2, dermaseptine, melitine, pleurocidin, H2A peptide, peptide žabe Xenopus, eskulentinis-1 i kaerine. Brojni faktori će poželjno biti razmotreni kako bi se održao integritet stabilnosti heliksa. Na primer, biće korišćen maksimalan broj ostataka za stabilizaciju heliksa (npr. leu, ala ili lys), i biće korišćen minimalan broj ostataka za destabilizaciju heliksa (npr. prolin ili jedinice cikličnog monomera). Završni ostatak će se uzeti u razmatranje (na primer, Gly je primer N-završnog ostatka i/ili C-terminalna amidacija može da se koristi da se obezbedi dodatna H-veza koja stabilizuje heliks. Nastajanje sonih mostova između ostataka sa suprotnim naelektrisanjima, razdvojenih sa i ± 3 ili i ± 4 pozicija može da obezbedi stabilnost. Na primer, katjonski ostaci, kao što je lizin, arginin, homo-arginin, ornitin ili histidin, mogu da grade sone mostove sa anjonskim ostacima glutamatom ili aspartatom.
[0219] Peptid i peptidomimetski ligandi uključuju one koji imaju prirodne ili modifikovane peptide, npr. D ili L peptide, α, β ili γ peptide; N-metil peptide; azapeptide; peptide koji imaju jednu ili više amidnih, tj. peptidnih, veza zamenjenih sa jednom ili više veza sa ureom, tioureom, karbamatom ili sulfonil ureom; ili ciklične peptide.
[0220] Ciljani ligand može biti svaki ligand koji je sposoban da cilja specifični receptor. Primeri su folat, GalNAc, galaktoza, manoza, manoza-6P, klasteri šećera kao što je GalNAc klaster, klaster manoze, klaster galaktoze ili apatamer. Klaster je kombinacija dve ili više jedinica šećera. Ciljani ligandi takođe uključuju ligande integrinskog receptora, ligande receptora hemokina, transferin, biotin, ligande receptora serotonina, PSMA, endotelin, GCPII, somatostatin, LDL i HDL ligande. Ligandi takođe mogu biti na bazi nukleinske kiseline, npr.
1
aptamer. Aptamer može biti nemodifikovan ili imati bilo koju kombinaciju ovde otkrivenih modifikacija.
[0221] Agensi za endozomsko otpuštanje uključuju imidazole, poli ili oligoimidazole, PEI, peptide, fuzogene peptide, polikaboksilate, poliakatjone, maskirane oligo ili poli katjone ili anjone, acetale, poliacetale, ketale/poliketale, ortoestre, polimere sa maskiranim ili nemaskiranim katjonskim ili anjonskim naelektrisanjem, dendrimere sa maskiranim ili nemaskiranim katjonskim ili anjonskim naelektrisanjem.
[0222] PK modulator označava farmakokinetički modulator. PK modulatori uključuju lipofile, žučne kiseline, steroide, analoge fosfolipida, peptide, agense za vezivanje proteina, PEG, vitamine itd. Primeri za PK modulatore uključuju, ali nisu ograničeni na, holesterol, masne kiseline, holnu kiselinu, litoholnu kiselinu, dialkilgliceride, diacilgliceride, fosfolipide, sfingolipide, naproksen, ibuprofen, vitamin E, biotin itd. Poznato je da oligonukleotidi koji sadrže određeni broj fosforotioatnih veza takođe vezuju serumski protein, te su kratki oligonukleotidi, npr. oligonukleotidi od oko 5 baza, 10 baza, 15 baza ili 20 baza, koji sadrže višestruke fosforotioatne veze u skeletu takođe podložni predmetnom pronalasku kao ligandi (npr. kao PK modulišući ligandi).
[0223] Dodatno, aptameri koji vezuju komponente seruma (npr. serumske proteine) takođe spadaju u predmetni pronalazak kao PK modulišući ligandi.
[0224] Drugi konjugati liganada koji spadaju u pronalazak su opisani u U.S. patentnim prijavama USSN: 10/916,185, podneta 10. avgusta 2004; USSN: 10/946,873, podneta 21. septembra 2004; USSN: 10/833,934, podneta 3. avgusta 2007; USSN: 11/115,989, podneta 27. aprila 2005; i USSN: 11/944,227, podneta 21. novembra 2007.
[0225] Kada je prisutno dva ili više liganada, svi ligandi mogu da imaju ista svojstva, svi mogu da imaju različita svojstva, ili neki ligandi mogu da imaju ista svojstva dok drugi mogu da imaju različita svojstva. Na primer, ligand može da ima svojstva ciljanja, da ima endozomolitičku aktivnost ili da ima PK modulišuća svojstva. U poželjnom otelotvorenju, svi ligandi imaju različita svojstva.
[0226] Ligandi mogu biti kuplovani sa oligonukleotidima na različitim mestima, na primer, 3'-
2
kraju, 5'-kraju i/ili na internoj poziciji. U poželjnim otelotvorenjima, ligand je povezan sa oligonukleotidima putem interventne veze, npr. ovde opisanog nosača. Ligand ili vezani ligand mogu biti prisutni na monomeru kada je monomer inkorporisan u rastući lanac. U nekim otelotvorenjima, ligand može biti inkorporisan putem kuplovanja za „prekursorski“ monomer nakon što je „prekursorski“ monomer inkorporisan u rastući lanac. Na primer, monomer koji ima, npr. vezu sa amino-krajem (tj. nema povezani ligand), npr. TAP-(CH2)nNH2može biti inkorporisan u rastući oligonukleotidni lanac. U sledećoj operaciji, tj. nakon inkorporisanja prekursorskog monomera u lanac, ligand koji ima elektrofilnu grupu, npr. pentafluorfenil estar ili aldehidnu grupu, može naknadno da se zakači za prekursorski monomer putem kuplovanja elektrofilne grupe liganda sa terminalnom nukleofilnom grupom veze prekursorskog monomera.
[0227] U drugom primeru, može biti inkorporisan monomer koji ima hemijsku grupu pogodnu za učešće u reakciji klik hemije, npr. veza/linker sa azidnim ili alkinskim krajem. U sledećoj operaciji, tj. nakon uključivanja prekursorskog monomera u lanac, ligand koji ima komplementarnu hemijsku grupu, npr. alkin ili azid, može biti vezan za prekursorski monomer putem kuplovanja alkina i azida jedan za drugi.
[0228] Kod dvolančanih oligonukleotida, ligandi mogu biti vezani za jedan ili oba lanca. U nekim otelotvorenjima, dvolančani agens iRNK sadrži ligand konjugovan sa sens lancem. U drugim otelotvorenjima, dvolančani agens iRNK sadrži ligand konjugovan sa antisens lancem.
[0229] U nekim slučajevima, ligand može biti konjugovan sa nukleobazama, ostacima šećera ili internukleozidnim vezama molekula nukleinske kiseline. Do konjugacije sa purinskim neurobazama ili njihovim derivatima može doći na bilo kojoj poziciji, uključujući endociklične i egzociklične atome. U nekim slučajevima, 2-, 6-, 7- ili 8- pozicije purinske nukleobaze su vezane za ostatak konjugata. Do konjugacije sa pirimidinskim nukleobazama ili njihovim derivatima takođe može doći na bilo kojoj poziciji. U nekim slučajevima, 2-, 5- ili 6- pozicije pirimidinske nukleobaze su supstituisane ostatkom konjugata. Do konjugacije sa ostacima šećera nukleozida može doći na bilo kom atomu ugljenika. Primeri za atome ugljenika ostatka šećera koji se mogu zakačiti za ostatak konjugata uključuju 2', 3' i 5' atome ugljenika. Pozicija 1' takođe može biti vezana za ostatak konjugata, kao u nebaznom ostatku. Internukleozidne veze takođe mogu da nose ostatke konjugata. Kod veza koje sadrže fosfor (npr. fosfodiestar, fosforotioat, fosforoditioat, fosforoamidat, i slično), ostatak konjugata može biti vezan direktno za atom fosfora ili za O, N ili S atom vezan za atom fosfora. Kod internukleozidnih veza koje sadrže amin ili amid (npr. PNA), ostatak konjugata može biti vezan za atom azota amina ili amida, ili za susedni atom ugljenika.
[0230] Svaki pogodni ligand u polju interferencije RNK može da se koristi, mada je ligand obično ugljeni hidrat, npr. monosaharid (poput GalNAc), disaharid, trisaharid, tetrasaharid, polisaharid.
[0231] Linkeri koji konjuguju ligand sa nukleinskom kiselinom uključuju one koji su prethodno razmotreni. Na primer, ligand može biti jedan ili više derivata GalNAc (N-acetilglukozamin) povezanih dvovalentnim ili trovalentnim razgranatim linkerom.
[0232] U jednom slučaju, dsRNK konjugovana sa dvovalentnim ili trovalentnim razgranatim linkerima uključuje strukture prikazane u bilo kojoj od formula (IV) - (VII):
pri čemu:
q<2A>, q<2B>, q<3A>, q<3B>, q<4A>, q<4B>, q<5A>, q<5B>i q<5C>nezavisno predstavljaju u svakom slučaju 0-20
4
i pri čemu ponavljajuća jedinica može biti ista ili različita;
P<2A>, P<2B>, P<3A>, P<3B>, P<4A>, P<4B>, P<5A>, P<5B>, P<SC>, T<2A>, T<2B>, T<3A>, T<3B>, T<4A>, T<4B>, T<4A>, T<5B>, T<5C>su nezavisno odsutni u svakom slučaju, CO, NH, O, S, OC(O), NHC(O), CH2, CH2NH ili CH2O;
Q<2A>, Q<2B>, Q<3A>, Q<3B>, Q<4A>, Q<4B>, Q<5A>, Q<5B>, Q<5C>su nezavisno odsutni u svakom slučaju, alkilen, supstituisani alkilen, pri čemu jedan ili više metilena može biti prekinuto ili završeno sa jednim ili više O, S, S(O), SO2, N(R<N>), C(R')=C(R"), C=C ili C(O);
R<2A>, R<2B>, R<3A>, R<3B>, R<4A>, R<4B>, R<5A>, R<5B>, R<5C>su nezavisno odsutni u svakom slučaju, NH,
ili heterociklil;
L<2A>, L<2B>, L<3A>, L<3B>, L<4A>, L<4B>, L<5A>, L<5B>i L<5C>predstavljaju ligand, tj. svaki nezavisno u svakom slučaju monosaharid (poput GalNAc), disaharid, trisaharid, tetrasaharid, oligosaharid ili polisaharid; i
R<a>je H ili bočni lanac aminokiseline.
[0233] Trovalentni konjugujući derivati GalNAc su posebno korisni za upotrebu sa agensima RNKi za inhibiranje ekspresije ciljnog gena, poput onih iz formule (VII):
pri čemu L<5A>, L<5B>i L<5C>predstavljaju monosaharid, poput GalNAc
derivata.
Primeri za pogodne dvovalentne i trovalentne grupe razgranatih linkera koje konjuguju derivate GalNAc uključuju,. bez ograničenja, sledeća jedinjenja:
[0234] U drugim otelotvorenjima, agens RNKi iz pronalaska je agens izabran iz grupe koja se sastoji od AD-45163, AD-45165, AD-51544, AD-51545, AD-51546 i AD-51547.
III. Farmaceutske kompozicije
[0235] Agens RNKi iz pronalaska može biti formulisan za primenu na bilo koji pogodan način za upotrebu u ljudskoj ili veterinarskoj medicini, analogno sa drugim farmaceutskim sredstvima. Farmaceutske kompozicije koje sadrže agens RNKi iz pronalaska mogu biti, na primer, rastvori sa puferom ili bez njega, ili kompozicije koje sadrže farmaceutski prihvatljive nosače. Takve kompozicije uključuju, na primer, vodene ili kristalne kompozicije, lipozomske formulacije, micelarne formulacije, emulzije i vektore genske terapije.
[0236] U postupcima, agens RNKi može da se primenjuje u rastvoru. Slobodni agens RNKi može da se primenjuje u nepuferovanom rastvoru, npr. u fiziološkom rastvoru ili vodi. Alternativno, slobodna siRNK može da se primenjuje u pogodnom puferskom rastvoru. Puferski rastvor može da sadrži acetat, citrat, prolamin, karbonat ili fosfat, ili bilo koju njihovu kombinaciju. U poželjnom otelotvorenju, puferovani rastvor je fiziološki rastvor puferovan fosfatom (PBS). pH i osmolaritet puferovanog rastvora koji sadrži agens RNKi mogu se prilagoditi tako da bude pogodan za primenu na ispitaniku.
[0237] U nekim slučajevima, puferovani rastvor dalje sadrži agens za kontrolisanje osmolariteta rastvora, tako da se osmolaritet održava na željenoj vrednosti, npr. fiziološkim vrednostima za ljudsku plazmu. Rastvorljive supstance koje mogu da se dodaju u puferski rastvor radi kontrole osmolariteta uključuju, ali nisu ograničene na, proteine, peptide, aminokiseline, nemetabolizovane polimere, vitamine, jone, šećere, metabolite, organske kiseline, lipide ili soli. U nekim slučajevima, agens za kontrolisanje osmolariteta rastvora je so. U određenim otelotvorenjima, agens za kontrolisanje osmolariteta rastvora je natrijum hlorid ili kalijum hlorid.
[0238] U drugim slučajevima, agens RNKi je formulisan kao kompozicija koja uključuje jedan ili više agenasa RNKi i farmaceutski prihvatljivi nosač. Kako se ovde koristi, izraz „farmaceutski prihvatljivi nosač“ treba da uključuje bilo koji i sve rastvarače, disperzione medijume, premaze, antibakterijske i antifungalne agense, izotonične agense i agense za odlaganje apsorpcije i slično, kompatibilne sa farmaceutskom primenom. Upotreba takvih medijuma i agenasa za farmaceutski aktivne supstance je dobro poznata u struci. Osim u onoj meri u kojoj je bilo koji konvencionalni medijum ili agens nekompatibilan sa aktivnim jedinjenjem, razmatrana je njihova upotreba u kompozicijama. Dopunska aktivna jedinjenja takođe mogu biti inkorporisana u kompozicije.
[0239] U jednom slučaju, priprema agensa RNKi uključuje najmanje drugi terapeutski agens (npr. agens koji nije RNK ili DNK). Na primer, kompozicija agensa RNKi za lečenje bolesti povezane sa TTR, npr. nasledne amiloidoze povezane sa transtiretinom (familijarna amiloidna polineuropatija, FAP), može uključivati poznati lek za ublažavanje FAP, npr. tafamidis (INN, ili Fx-1006A ili Vyndaqel).
[0240] Formulisana kompozicija agensa RNKi može da poprimi različita stanja. U nekim primerima, kompozicija je barem delimično kristalna, u potpunosti kristalna i/ili anhidrovana (npr. sadrži manje od 80, 50, 30, 20 ili 10% vode). U drugom primeru, agens RNKi je u vodenoj fazi, tj. u rastvoru koji sadrži vodu.
[0241] Vodena faza ili kristalne kompozicije mogu biti inkorporisane u vehikulum za isporuku, npr. lipozom (naročito za vodenu fazu) ili česticu (npr. mikročesticu, kao što može biti odgovarajuće za kristalnu kompoziciju). Uopšteno, kompozicija agensa RNKi je formulisana na način koji je kompatibilan sa nameravanim postupkom primene, kako je ovde opisano. Na primer, u konkretnim otelotvorenjima, kompozicija se priprema putem najmanje jedne od sledećih postupaka: sušenja raspršivanjem, liofilizacijom, vakuum sušenjem, uparavanjem, sušenjem u fluidnom sloju ili kombinacijom ovih tehnika; ili sonikacijom sa lipidom, liofilizacijom, kondenzacijom i drugim samostalnim sklapanjem.
[0242] Preparat agensa RNKi se može formulisati u kombinaciji sa drugim agensom, npr. drugim terapeutskim agensom ili agensom koji stabilizuje agens RNKi, npr. protein koji gradi kompleks sa agensom RNKi kako bi nastala iRNP. Drugi agensi uključuju helatore, npr. EDTA (npr. za uklanjanje dvovalentnih katjona, kao što je Mg<2+>), soli, inhibitore RNAze (npr. inhibitore RNAze široke specifičnosti kao što je RNAzin), i tako dalje.
[0243] U jednom slučaju, preparat agensa RNKi uključuje drugo jedinjenje siRNK, npr. drugi agens RNKi koji može da posreduje RNKi u pogledu drugog gena, ili u pogledu istog gena. Još neki preparati mogu da uključuju najmanje 3, 5, deset, dvadeset, pedeset ili sto ili više različitih vrsta agenasa RNKi. Takvi agensi RNKi mogu da posreduju RNKi u pogledu sličnog broja različitih gena.
[0244] Agensi iRNK iz pronalaska mogu biti formulisani za farmaceutsku upotrebu. Farmaceutski prihvatljive kompozicije sadrže terapeutski ili profilaktički delotvornu količinu jednog ili više agenasa dsRNK u bilo kom od prethodnih otelotvorenja, uzetog samostalno ili formulisanog zajedno sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih nosača (aditiva), ekscipijenasa i/ili razblaživača.
[0245] Postupci za pripremu farmaceutskih kompozicija iz pronalaska uključuju korak dovođenja u vezu agensa RNKi iz predmetnog pronalaska sa nosačem i, opciono, jednim ili više pomoćnih sastojaka. Uopšteno, kompozicije se pripremaju uniformnim i bliskim dovođenjem u vezu agensa RNKi iz predmetnog pronalaska sa tečnim nosačima, ili fino podeljenim čvrstim nosačima, ili oba, a zatim, ako je neophodno, oblikovanjem proizvoda.
[0246] Farmaceutske kompozicije mogu biti posebno formulisane za primenu u čvrstom ili tečnom obliku, uključujući one koji su prilagođeni za sledeće: (1) oralnu primenu, na primer, tečni oblici (vodeni i nevodeni rastvori ili suspenzije), tablete, npr. one namenjene za bukalnu, sublingvalnu ili sistemsku apsorpciju, bolusi, praškovi, granule, paste za nanošenje na jezik; (2) parenteralnu primenu, na primer, putem supkutane, intramuskularne, intravenske ili epiduralne injekcije, na primer, kao sterilni rastvor ili suspenzija, ili formulacija sa produženim otpuštanjem; (3) topikalnu primenu, na primer, kao krema, melem, ili flaster sa kontrolisanim otpuštanjem, ili sprej koji se nanosi na kožu; (4) intravaginalnu ili intrarektalnu primenu, na primer, kao pesar, krema ili pena; (5) sublingvalnu primenu; (6) okularnu primenu; (7) transdermalnu primenu; ili (8) nazalnu primenu. Isporuka putem supkutanih ili intravenskih postupaka može biti posebno pogodna.
[0247] Fraza „farmaceutski prihvatljiv“ se ovde koristi da označi ona jedinjenja, supstance, kompozicije i/ili dozne oblike koji su, u okviru zdravog medicinskog rasuđivanja, pogodni za kontakt sa tkivima ljudskih bića i životinja bez prekomerne toksičnosti, iritacije, alergijskog odgovora ili drugih problema ili komplikacija, srazmerno sa razumnim odnosom koristi/rizika.
[0248] Fraza „farmaceutski prihvatljiv nosač“, kako se ovde koristi, označava farmaceutski prihvatljivu supstancu, kompoziciju ili vehikulum, kao što je tečni ili čvrsti punilac, razblaživač, ekscipijens, pomoćno sredstvo u proizvodnji (npr. lubrikans, talk, magnezijum, kalcijum ili cink stearat, ili stearinska kiselina), ili rastvarač koji obuhvata supstancu, uključene u transport predmetnog jedinjenja iz jednog organa ili dela tela u drugi organ ili deo tela. Svaki nosač mora biti „prihvatljiv“ u smislu da je kompatibilan sa drugim sastojcima kompozicije i nije štetan za pacijenta. Neki primeri supstanci koje mogu da služe kao farmaceutski prihvatljivi nosači uključuju: (1) šećere, poput laktoze, glukoze i saharoze; (2) skrobove, poput kukuruznog skroba i skroba iz krompira; (3) celulozu i njene derivate, poput natrijum karboksimetil celuloze, etil celuloze i celuloza acetata; (4) tragakant u prahu; (5) slad; (6) želatin; (7) lubrikanse, poput magnezijum stearata, natrijum lauril sulfata i talka; (8) ekscipijense, poput kakao putera i voskova za supozitorije; (9) ulja, kao što je ulje kikirikija, ulje od semena pamuka, šafranovo ulje, susamovo ulje, maslinovo ulje, kukuruzno i sojino ulje; (10) glikole, poput propilen glikola; (11) poliole, poput glicerina, sorbitola, manitola i polietilen glikola; (12) estre, poput etil oleata i etil laurata; (13) agar; (14) puferujuće agense, poput magnezijum hidroksida i aluminijum hidroksida; (15) alginsku kiselinu; (16) vodu bez pirogena; (17) izotonični fiziološki rastvor; (18) Ringerov rastvor; (19) etil alkohol; (20) pH puferovane rastvore; (21) poliestre, polikarbonate i/ili polianhidride; (22) punioce, poput polipeptida i aminokiselina (23) serumsku komponentu, poput serumskog albumina, HDL i LDL; i (22) druge netoksične kompatibilne supstance korišćene u farmaceutskim kompozicijama.
[0249] Kompozicije mogu pogodno biti prisutne u pojedinačnim doznim oblicima i mogu biti pripremljene bilo kojim postupcima koji su dobro poznati u oblasti farmacije. Količina agensa RNKi koja može da se kombinuje sa supstancom nosača radi proizvodnje jednog doznog oblika će varirati u zavisnosti od domaćina koji se leči i konkretnog načina primene. Agens RNKi koji može da se kombinuje sa supstancom nosača radi proizvodnje jednog doznog oblika će generalno biti ona količina agensa RNKi koja proizvodi željeno dejstvo, npr. terapeutsko ili profilaktičko dejstvo. Uopšteno, od sto posto, količina će biti u opsegu od oko 0,1 posto do oko devedeset devet posto agensa RNKi, poželjno od oko 5 posto do oko 70 posto, najpoželjnije od oko 10 posto do oko 30 posto.
[0250] U određenim slučajevima, kompozicija iz predmetnog pronalaska sadrži ekscipijens izabran iz grupe koja se sastoji od ciklodekstrina, celuloza, lipozoma, agenasa koji formiraju micelu, npr. žučnih kiselina, i polimernih nosača, npr. poliestara i polianhidrida; i agensa RNKi iz predmetnog pronalaska. U određenim slučajevima, prethodno pomenuta kompozicija čini agens RNKi iz predmetnog pronalaska oralno biološki dostupnim.
[0251] U nekim slučajevima, kako bi se produžilo dejstvo agensa RNKi, poželjno je da se uspori apsorpcija agensa iz supkutane ili intramuskularne injekcije. To se može postići upotrebom tečne suspenzije kristalne ili amorfne supstance koja ima lošu rastvorljivost u vodi. Brzina apsorpcije agensa RNKi onda zavisi od njegove brzine rastvaranja koja, zauzvrat, može
1
zavisiti od veličine kristala i kristalnog oblika. Alternativno, odložena apsorpcija parenteralno primenjenog agensa RNKi može se postići rastvaranjem ili suspendovanjem agensa u uljanom vehikulumu.
Lipozomi
[0252] Agens RNKi iz pronalaska može biti formulisan za isporuku u membranskom molekulskom sklopu, npr. lipozomu ili miceli. Kako se ovde koristi, termin „lipozom“ se odnosi na vezikulu sastavljenu od amfifilnih lipida raspoređenih u najmanje jedan dvojni sloj, npr. jedan dvojni sloj ili više dvojnih slojeva. Lipozomi uključuju unilamelarne i multilamelarne vezikule koje imaju membranu sačinjenu od lipofilne supstance i vodenu unutrašnjost. Vodeni deo sadrži kompoziciju agensa RNKi. Lipofilna supstanca razdvaja vodenu unutrašnjost od vodene spoljašnjosti, koja obično ne uključuje kompoziciji agensa RNKi, mada u nekim slučajevima može. Lipozomi su korisni za transfer i isporuku aktivnih sastojaka na mesto delovanja. Pošto je struktura lipozomske membrane strukturno slična biološkim membranama, kada se lipozomi primene na tkivo, lipozomski dvojni sloj se fuzioniše sa dvojnim slojem ćelijskih membrana. Uz napredovanje spajanja lipozoma i ćelije, interni vodeni sadržaj koji obuhvata agens RNKi se isporučuje u ćeliju u kojoj agens RNKi može specifično da se vezuje za ciljnu RNK i može da posreduje RNKi. U nekim slučajevima, lipozomi su takođe specifično ciljani, npr. da usmeravaju agens RNKi u određene vrste ćelija.
[0253] Lipozom koji sadrži agens RNKi može se pripremiti različitim postupcima. U jednom primeru, lipidna komponenta lipozoma se rastvara u deterdžentu kako bi se micele formirale sa lipidnom komponentom. Na primer, lipidna komponenta može biti amfipatični katjonski lipid ili lipidni konjugat. Deterdžent može imati visoku koncentraciju kritičnih micela i može biti nejonski. Primeri deterdženata uključuju holat, CHAPS, oktilglukozid, dezoksiholat i lauroil sarkozin. Preparat agensa RNKi se zatim dodaje micelama koje sadrže lipidnu komponentu. Katjonske grupe na lipidu interaguju sa agensom RNKi i kondenzuju se oko agensa RNKi kako bi nastao lipozom. Nakon kondenzacije, deterdžent se uklanja, npr. putem dijalize, kako bi se dobio lipozomski preparat agensa RNKi.
[0254] Ako je to neophodno, jedinjenje nosač koje pomaže u kondenzaciji može se dodati tokom reakcije kondenzacije, npr. putem kontrolisanog dodavanja. Na primer, jedinjenje nosač može biti polimer koji nije nukleinska kiselina (npr. spermin ili spermidin). pH takođe može da se prilagodi da favorizuje kondenzaciju.
2
[0255] Postupci za proizvodnju stabilnih polinukleotidnih vehikuluma za isporuku, koji obuhvataju lipidni kompleks polinukleotid/katjon kao strukturne komponente vehikuluma za isporuku, dalje su opisani, npr., u WO 96/37194. Nastanak lipozoma takođe može da uključuje jedan ili više aspekata primera postupaka opisanih u Felgner, P. L. i sar. Proc. Natl. Acad. Sci., USA 8:7413-7417, 1987; U.S. Pat. br.4,897,355; U.S. Pat. br.5,171,678; Bangham, i sar. M. Mol. Biol.23:238, 1965; Olson, i sar. Biochim. Biophys. Acta 557:9, 1979; Szoka, i sar. Proc. Natl. Acad. Sci.75: 4194, 1978; Mayhew, i sar. Biochim. Biophys. Acta 775:169, 1984; Kim, i sar. Biochim. Biophys. Acta 728:339, 1983; i Fukunaga, i sar. Endocrinol. 115:757, 1984. Uobičajeno korišćene tehnike za pripremu lipidnih agregata odgovarajuće veličine za korišćenje kao vehikuluma za isporuku uključuju sonikaciju i zamrzavanje-otapanje plus istiskivanje (vidite, npr. Mayer, i sar. Biochim. Biophys. Acta 858:161, 1986). Mikrofluidizacija može da se koristi kada su poželjni konzistentno mali (50 do 200 nm) i relativno uniformni agregati (Mayhew, i sar. Biochim. Biophys. Acta 775:169, 1984). Ovi postupci se lako prilagođavaju za pakovanje preparata agenasa RNKi u lipozome.
[0256] Lipozomi koji su osetljivi na pH ili su negativno naelektrisani okružuju molekule nukleinskih kiselina umesto da grade kompleks sa njima. Pošto su i molekuli nukleinske kiseline i lipid slično naelektrisani, dolazi do odbijanja pre nego do nastanka kompleksa. Pa ipak, neki molekuli nukleinske kiseline su uhvaćeni u vodenoj unutrašnjosti ovih lipozoma. Lipozomi osetljivi na pH se koriste za isporuku DNK koja kodira gen timidin kinaze u monoslojeve ćelija u kulturi. Ekspresija egzogenog gena je detektovana u ciljnim ćelijama (Zhou i sar. Journal of Controlled Release, 19, (1992) 269-274).
[0257] Jedna značajna vrsta lipozomskih kompozicija obuhvata fosfolipide koji nisu prirodno dobijeni fosfatidilholin. Neutralne lipozomske kompozicije, na primer, mogu se formirati od dimiristoil fosfatidilholina (DMPC) ili dipalmitoil fosfatidilholina (DPPC). Anjonske lipozomske kompozicije se uopšteno grade od dimiristoil fosfatidilglicerola, dok se anjonski fuzogeni lipozomi grade prevashodno od dioleoil fosfatidiletanolamina (DOPE). Druga vrsta lipozomskih kompozicija nastaje od fosfatidilholina (PC) poput, na primer, sojinog PC i PC iz jaja. Druga vrsta nastaje iz smeša fosfolipida i/ili fosfatidilholina i/ili holesterola.
[0258] Primeri drugih postupaka za uvođenje lipozoma u ćelije in vitro i in vivo uključuju U.S. Pat. br. 5,283,185; U.S. Pat. br. 5,171,678; WO 94/00569; WO 93/24640; WO 91/16024; Feigner, J. Biol. Chem. 269:2550, 1994; Nabel, Proc. Natl. Acad. Sci.90:11307, 1993; Nabel, Human Gene Ther.3:649, 1992; Gershon, Biochem.32:7143, 1993; i Strauss EMBO J.11:417, 1992.
[0259] U jednom slučaju, koriste se katjonski lipozomi. Katjonski lipozomi imaju prednost što su sposobni da se fuzionišu sa ćelijskom membranom. Nekatjonski lipozome, iako nisu sposobni da se podjednako efikasno fuzionišu sa membranom plazme, preuzimaju makrofagi in vivo, i mogu se koristiti za isporuku agensa RNKi u makrofage.
[0260] Dalje prednosti lipozoma uključuju: lipozomi dobijeni od prirodnih fosfolipida su biokompatibilni i biorazgradivi; lipozomi mogu da inkorporiraju širok opseg lekova rastvorljivih u vodi i lipidima; lipozomi mogu da štite enkapsulirane agense RNKi u svom unutrašnjem odeljku od metabolizma i razgradnje (Rosoff, u "Pharmaceutical Dosage Forms," Lieberman, Rieger and Banker (izd.), 1988, tom 1, str. 245). Prilikom pripreme lipozomskih formulacija, važno je uzeti u obzir naelektrisanje površine lipida, veličinu vezikule i vodenu zapreminu lipozoma.
[0261] Pozitivno naelektrisani sintetički katjonski lipid, N-[1-(2,3-dioleiloksi)propil]-N,N,N-trimetilamonijum hlorid (DOTMA) može da se koristi da gradi male lipozome koji spontano interaguju sa nukleinskom kiselinom radi nastanka kompleksa lipid-nukleinska kiselina koji su sposobni da se fuzionišu sa negativno naelektrisanim lipidima ćelijskih membrana ćelija kulture tkiva, što dovodi do isporuke agensa RNKi (vidite, npr. Felgner, P. L. i sar. Proc. Natl. Acad. Sci., USA 8:7413-7417, 1987 i U.S. Pat. br. 4,897,355 za opis DOTMA i njegovog korišćenja sa DNK).
[0262] Analog DOTMA, 1,2-bis(oleoiloksi)-3-(trimetilamonijum)propan (DOTAP) može da se koristi u kombinaciji sa fosfolipidom da gradi DNK-kompleksirajuće vezikule. Lipofectin™ (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Md.) je delotvoran agens za isporuku veoma anjonskih nukleinskih kiselina u žive ćelije kulture tkiva koje sadrže pozitivno naelektrisane DOTMA lipozome koji spontano interaguju sa negativno naelektrisanim polinukleotidima radi nastanka kompleksa. Kada se koristi dovoljno pozitivno naelektrisanih lipozoma, ukupno naelektrisanje dobijenih kompleksa je takođe pozitivno. Pozitivno naelektrisani kompleksi pripremljeni na ovaj način spontano se kače za negativno naelektrisane ćelijske površine, fuzionišu sa membranom plazme i efikasno isporučuju funkcionalne nukleinske kiseline, na
4
primer, u ćelije kulture tkiva. Drugi komercijalno dostupni katjonski lipid, 1,2-bis(oleoiloksi)-3,3-(trimetilamonijum)propan („DOTAP“) (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana) razlikuje se od DOTMA po tome što su ostaci oleila vezani estarskim, a ne etarskim vezama.
[0263] Druga objavljena jedinjenja katjonskih lipida uključuju ona koja su konjugovana sa različitim ostacima uključujući, na primer, karboksispermin koji je konjugovan sa jednom od dve vrste lipida i uključuje jedinjenja poput 5-karboksispermilglicin dioktaoleoilamida („DOGS“) (Transfectam™, Promega, Madison, Wisconsin) i dipalmitoilfosfatidiletanolamin 5-karboksispermil-amida („DPPES“) (vidite, npr. U.S. Pat. br.5,171,678).
[0264] Drugi konjugat katjonskog lipida obuhvata derivatizaciju lipida holesterolom („DC-Chol“) koja se formuliše u lipozome u kombinaciji sa DOPE (vidite, Gao, X. i Huang, L., Biochim. Biophys. Res. Commun. 179:280, 1991). Objavljeno je da je lipopolilizin, nastao konjugacijom polilizina sa DOPE, delotvoran za transfekciju u prisustvu seruma (Zhou, X. i sar. Biochim. Biophys. Acta 1065:8, 1991). Za određene ćelijske linije, za ove lipozome koji sadrže konjugovane katjonske lipide je uočeno da ispoljavaju manju toksičnost i pružaju efikasniju transfekciju nego kompozicije koje sadrže DOTMA. Drugi komercijalno dostupni proizvodi katjonskih lipida uključuju DMRIE i DMRIE-HP (Vical, La Jolla, California) i Lipofektamin (DOSPA) (Life Technology, Inc., Gaithersburg, Maryland). Drugi katjonski lipidi pogodni za isporuku oligonukleotida su opisani u WO 98/39359 i WO 96/37194.
[0265] Lipozomske formulacije su naročito pogodne za topikalnu primenu, lipozomi imaju nekoliko prednosti u odnosu na druge formulacije. Takve prednosti uključuju smanjena neželjena dejstva vezana za veliku sistemsku apsorpciju primenjenog leka, povećanu akumulaciju primenjenog leka na željenom cilju i mogućnost da se agens RNKi primeni u koži. U nekim implementacijama, lipozomi se koriste za isporuku agensa RNKi do epidermalnih ćelija, i takođe da poboljšaju penetraciju agensa RNKi u dermalno tkivo, npr. u kožu. Na primer, lipozomi se mogu primeniti topikalno. Topikalna isporuka na kožu lekova formulisanih kao lipozomi je dokumentovana (vidite, npr. Weiner i sar. Journal of Drug Targeting, 1992, vol.
2,405-410 i du Plessis i sar. Antiviral Research, 18, 1992, 259-265; Mannino, R. J. i Fould-Fogerite, S., Biotechniques 6:682-690, 1988; Itani, T. i sar. Gene 56:267-276.1987; Nicolau, C.i sar. Meth. Enz.149:157-176, 1987; Straubinger, R. M. i Papahadjopoulos, D. Meth. Enz.
101:512-527, 1983; Wang, C. Y. i Huang, L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7851-7855, 1987).
[0266] Nejonski lipozomski sistemi su takođe ispitani kako bi se utvrdila njihova korisnost u isporuci lekova na kožu, naročito sistemi koji sadrže nejonske surfaktante i holesterol. Nejonske lipozomske formulacije koje sadrže novasom I (gliceril dilaurat/holesterol/polioksietilen-10-stearil etar) i novasom II (gliceril distearat/ holesterol/polioksietilen-10-stearil etar) korišćene su za isporuku leka u dermis kože miša. Takve formulacije sa agensom RNKi su korisne za lečenje dermatološkog poremećaja.
[0267] Lipozomi koji uključuju agens RNKi mogu biti u velikoj meri deformabilni. Takva deformabilnost može da omogući lipozomima da se probiju kroz pore koje su manje od prosečnog poluprečnika lipozoma. Na primer, transferzomi su vrsta deformabilnih lipozoma. Transferzomi se mogu napraviti dodavanjem površinskih aktivatora ivice, obično surfaktanata, u standardnu lipozomsku kompoziciju. Transferzomi koji obuhvataju agens RNKi mogu da se isporuče, na primer, supkutano putem infekcije kako bi se agens RNKi isporučio keratinocitima u koži. Kako bi netaknute prošle kožu sisara, lipidne vezikule moraju proći kroz niz finih pora, od kojih svaka ima prečnik manji od 50 nm, pod uticajem pogodnog transdermalnog gradijenta. Dodatno, usled svojstava lipida, ovi transferzomi mogu biti samo-optimizujući (prilagodljivi obliku pora, npr. u koži), samo-popravljajući, i često mogu dostići svoje ciljeve bez fragmentacije, i često su samo-nanoseći.
[0268] Druge formulacije obuhvaćene predmetnim pronalaskom su opisane u US privremenoj prijavi serijski broj 61/018,616, podnetoj 2. januara 2008; 61/018,611, podnetoj 2. januara 2008; 61/039,748, podnetoj 26. marta 2008; 61/047,087, podnetoj 22. aprila 2008 i 61/051,528, podnetoj 8. maja 2008. PCT prijava br. PCT/US2007/080331, podneta 3. oktobra 2007. takođe opisuje formulacije koje su obuhvaćene predmetnim pronalaskom.
Surfaktanti
[0269] Surfaktanti nalaze široku upotrebu u formulacijama kao što su emulzije (uključujući mikroemulzije) i lipozomi (videti prethodno). Kompozicije agensa RNKi (ili prekursora, npr. veća dsRNK koja može da se preradi u siRNK ili DNK koja kodira siRNK ili prekursor) mogu da sadrže surfaktant. U jednom otelotvorenju, siRNK je formulisana kao emulzija koja sadrži surfaktant. Najčešći način klasifikovanja i rangiranja svojstava mnogih brojnih različitih vrsta surfaktanata, i prirodnih i sintetičkih, je korišćenjem hidrofilnog/lipofilnog balansa (HLB). Priroda hidrofilnih grupa pruža najkorisnija sredstva za kategorizaciju različitih surfaktanata korišćenih u formulacijama (Rieger, u "Pharmaceutical Dosage Forms," Marcel Dekker, Inc., New York, NY, 1988, str.285).
[0270] Ako molekul surfaktanta nije jonizovan, klasifikuje se kao nejonski surfaktant. Nejonski surfaktanti nalaze široku primenu u farmaceutskim proizvodima i mogu se koristiti za širok raspon pH vrednosti. Uopšteno, njihove pH vrednosti su u rasponu od 2 do oko 18 u zavisnosti od njihove strukture. Nejonski surfaktanti uključuju nejonske estre, kao što su estri etilen glikola, estri propilen glikola, gliceril estri, poligliceril estri, sorbitanski estri, saharozni estri i etoksilovani estri. Nejonski alkanolamidi i etri, kao što su etoksilati masnih alkohola, propoksilovani alkoholi i etoksilovani/propoksilovani blok polimeri takođe su uključeni u ovu klasu. Polioksietilenski surfaktanti su najpopularniji članovi klase nejonskih surfaktnanata.
[0271] Ako molekul surfaktanta ima negativno naelektrisanje kada se rastvori ili disperguje u vodi, surfaktant se klasifikuje kao anjonski. Anjonski surfaktanti uključuju karboksilate, kao što su sapuni, acil laktilati, acil amidi aminokiselina, estri sumporne kiseline, kao što su alkil sulfati i etoksilovani alkil sulfati, sulfonati kao što su alkil benzen sulfonati, acil izetionati, acil taurati i sulfosukcinati, i fosfati. Najvažniji članovi klase anjonskih surfaktanata su alkil sulfati i sapuni.
[0272] Ako molekul surfaktanta nosi pozitivno naelektrisanje kada se rastvori ili disperguje u vodi, surfaktant se klasifikuje kao katjonski. Katjonski surfaktanti uključuju kvaternerne amonijumove soli i etoksilovane amine. Kvaternerne amonijumove soli su najčešće korišćeni članovi ove klase.
[0273] Ako je molekul surfaktanta sposoban da nosi pozitivno ili negativno naelektrisanje, surfaktant se klasifikuje kao amfoterni. Amfoterni surfaktanti uključuju derivate akrilne kiseline, supstituisane alkilamide, N-alkilbetaine i fosfatide.
[0274] Dat je pregled korišćenja surfaktanata u lekovitim proizvodima, formulacijama i u emulzijama (Rieger, u "Pharmaceutical Dosage Forms" Marcel Dekker, Inc., New York, NY, 1988, str.285).
Micele i druge membranske formulacije
[0275] Agensi RNKi iz pronalaska takođe mogu biti obezbeđeni kao micelarne formulacije. „Micele“ su ovde definisane kao posebna vrsta molekulskog sklopa u kojem su amfipatični molekuli organizovani u sfernoj strukturi tako da su svi hidrofobni delovi molekula okrenuti ka unutra, što ostavlja hidrofilne delove u kontaktu sa okružujućom vodenom fazom. Suprotno uređenje postoji kada je okruženje hidrofobno.
[0276] Mešovita micelarna formulacija pogodna za isporuku kroz transdermalne membrane može se pripremiti mešanjem vodenog rastvora kompozicije siRNK, alkil sulfata C8do C22alkalnog metala i jedinjenja koje gradi micele. Primeri za jedinjenja koja grade micele uključuju lecitin, hijaluronsku kiselinu, farmaceutski prihvatljive soli hijaluronske kiseline, glikolnu kiselinu, mlečnu kiselinu, ekstrakt kamilice, ekstrakt krastavca, oleinsku kiselinu, linolnu kiselinu, linolensku kiselinu, monoolein, monooleate, monolaurate, ulje borača, ulje žutog noćurka, mentol, trihidroksi okso holanil glicin i njegove farmaceutski prihvatljive soli, glicerin, poliglicerin, lizin, polilizin, triolein, polioksietilen etre i njihove analoge, polidokanol alkil etre i njihove analoge, henodezoksiholat, dezoksiholat i njihove smeše. Jedinjenja koja grade micele mogu se dodati u isto vreme ili nakon dodavanja alkil sulfata alkalnog metala. Mešovite micele će nastati uz suštinski bilo koje mešanje sastojaka, ali žustro mešanje daje manje micele.
[0277] U jednom postupku, priprema se prva micelarna kompozicija koja sadrži kompoziciju siRNK i barem alkil sulfat alkalnog metala. Prva micelarna kompozicija se zatim meša sa najmanje tri jedinjenja koja grade micele kako bi nastala mešovita micelarna kompozicija. U drugom postupku, micelarna kompozicija se priprema mešanjem kompozicije siRNK, alkil sulfata alkalnog metala i najmanje jednog jedinjenja koje gradi micele, nakon čega sledi dodavanje ostalih jedinjenja koja grade micele, uz žustro mešanje.
[0278] Fenol i/ili m-krezol se mogu dodati u mešovitu micelarnu kompoziciju kako bi se formulacija stabilizovala i zaštitila od bakterijskog rasta. Alternativno, fenol i/ili m-krezol se mogu dodati uz sastojke koji grade micele. Izotonični agens, kao što je glicerin, takođe se može dodati nakon nastanka mešovite micelarne kompozicije.
[0279] Radi isporuke micelarne formulacije u vidu spreja, formulacija se može staviti u aerosolni dozator i dozator se puni propelantom. Propelant, koji se nalazi pod pritiskom, u dozatoru se nalazi u tečnom obliku. Odnos sastojaka je podešen tako da vodena i pogonska faza postanu jedno, tj. postoji jedna faza. Ako ima dve faze, neophodno je promućkati dozator pre doziranja dela sadržaja, npr. putem doznog ventila. Ispuštena doza farmaceutskog agensa se izbacuje kroz dozni ventil u vidu finog spreja.
[0280] Propelanti mogu da uključuju hlorfluorugljenike koji sadrže vodonik, fluorugljenike koji sadrže vodonik, dimetil etar i dietil etar. U određenim otelotvorenjima, može se koristiti HFA 134a (1,1,1,2 tetrafluoretan).
[0281] Specifične koncentracije ključnih sastojaka mogu se odrediti relativno jednostavnim eksperimentisanjem. Za apsorpciju putem oralnih šupljina, često je poželjno povećati, npr. najmanje udvostručiti ili utrostručiti, dozu za injekciju ili primenu kroz gastrointestinalni trakt.
Čestice
[0282] U drugim slučajevima, agens RNKi iz pronalaska može biti inkorporiran u česticu, npr. mikročesticu. Mikročestice se mogu proizvesti putem sušenja raspršivanjem, ali se takođe mogu proizvesti drugim postupcima, uključujući liofilizaciju, uparavanje, sušenje fluidnog sloja, vakuum sušenje ili kombinaciju ovih tehnika.
IV. Postupci za inhibiranje ekspresije TTR
[0283] Predmetni pronalazak takođe pruža postupke za inhibiranje ekspresije transtiretina (TTR) u ćeliji. Postupci uključuju dovođenje ćelije u kontakt sa agensom RNKi, npr. dvolančanim agensom RNKi, u količini koja je delotvorna za inhibiranje ekspresije TTR u ćeliji, čime se inhibira ekspresija TTR u ćeliji.
[0284] Dovođenje ćelije u kontakt sa agensom RNKi, npr. dvolančanim agensom RNKi, može se obaviti in vitro ili in vivo. Dovođenje ćelije u kontakt sa agensom RNKi in vivo uključuje dovođenje ćelije ili grupe ćelija u ispitaniku, npr. humanom ispitaniku, u kontakt sa agensom RNKi. Takođe su moguće i kombinacije in vitro i in vivo postupaka kontakta sa ćelijom. Kontak sa ćelijom može biti direktan ili indirektan, kao što je prethodno razmotreno. Nadalje, kontak sa ćelijom se može ostvariti putem ciljajućeg liganda, uključujući svaki ligand koji je ovde opisan ili poznat u struci. U poželjnim slučajevima, ciljajući ligand je ostatak ugljenog hidrata, npr. GalNAc3ligand, ili bilo koji drugi ligand koji usmerava agens RNKi ka željenom mestu, npr. jetri ispitanika.
[0285] Termin „inhibira“, kako se ovde koristi, koristi se naizmenično sa „smanjuje“, „utišava“, „nishodno reguliše“, „suzbija“ i drugim sličnim terminima, i obuhvata bilo koji nivo inhibicije.
[0286] Fraza „inhibira ekspresiju TTR“ treba da se odnosi na inhibiciju ekspresije bilo kog gena TTR (kao što je, npr. mišji TTR gen, TTR gen pacova, TTR gen majmuna ili humani TTR gen) kao i varijanti ili mutanata TTR gena. Tako, TTR gen može biti TTR gen divljeg tipa, mutantni TTR gen (kao što je mutantni TTR gen koji uzrokuje amiloidno taloženje) ili transgeni TTR gen u kontekstu genetski manipulisane ćelije, grupe ćelija ili organizma.
[0287] „Inhibiranje ekspresije TTR gena“ obuhvata bilo koji nivo inhibicije TTR gena, npr. najmanje delimično suzbijanje ekspresije TTR gena. Ekspresija TTR gena može biti procenjena na osnovu nivoa, ili promene nivoa, bilo koje promenljive povezane sa ekspresijom TTR gena, npr. nivo mRNK TTR, nivo TTR proteina, ili broj ili opseg amiloidnih naslaga. Taj nivo može biti procenjen u pojedinačnoj ćeliji ili u grupi ćelija, uključujući, na primer, uzorak dobijen od ispitanika.
[0288] Inhibicija može biti procenjena na osnovu smanjenja apsolutnog ili relativnog nivoa jedne ili više promenljivih povezanih sa ekspresijom TTR u poređenju sa kontrolnim nivoom. Kontrolni nivo može biti bilo koja vrsta kontrolnog nivoa koja se koristi u struci, npr. osnovni nivo pre doze, ili nivo utvrđen kod sličnog ispitanika, ćelije ili uzorka koji nije tretiran, ili je tretiran kontrolom (kao što je, npr. kontrola koja se sastoji samo od pufera ili kontrola sa neaktivnim agensom).
[0289] U nekim slučajevima postupaka, ekspresija TTR gena je inhibirana najmanje oko 5%, najmanje oko 10%, najmanje oko 15%, najmanje oko 20%, najmanje oko 25%, najmanje oko 30%, najmanje oko 35%, najmanje oko 40%, najmanje oko 45%, najmanje oko 50%, najmanje oko 55%, najmanje oko 60%, najmanje oko 65%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 91%, najmanje oko 92%, najmanje oko 93%, najmanje oko 94%. najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98%, ili najmanje oko 99%.
[0290] Inhibicija ekspresije TTR gena može da se manifestuje smanjenjem količine mRNK koju eksprimira prva ćelija ili grupa ćelija (takve ćelije mogu biti prisutne, na primer, u uzorku dobijenom od ispitanika) u koju je TTR gen transkribovan i koja jeste ili nije bila tretirana (npr. dovođenjem ćelije ili ćelija u kontakt sa agensom RNKi iz pronalaska, ili primenom agensa RNKi iz pronalaska na ispitaniku u kome su ćelije prisutne, ili su bile prisutne) tako da je ekspresija TTR gena inhibirana, u poređenju sa drugom ćelijom ili grupom ćelija koja je suštinski identična prvoj ćeliji ili grupi ćelija, ali nije tretirana na taj način (kontrolna ćelija (kontrolne ćelije)). U poželjnim otelotvorenjima, inhibicija je procenjena eksprimiranjem nivoa mRNK u tretiranim ćelijama kao procenat nivoa mRNK u kontrolnim ćelijama, korišćenjem sledeće formule:
[0291] Alternativno, inhibicija ekspresije TTR gena se može proceniti u pogledu smanjenja parametra koji je funkcionalno povezan sa ekspresijom TTR gena, npr. ekspresija TTR proteina, nivo retinol vezujućeg proteina, nivo vitamina A, ili prisustvo amiloidnih naslaga koje sadrže TTR. Utišavanje TTR gena se može utvrditi u bilo kojoj ćeliji koja eksprimira TTR, bilo konstitutivno ili pomoću genomskog inženjerstva, i putem bilo kog testa poznatog u struci. Jetra je značajno mesto ekspresije TTR. Druga bitna mesta ekspresije uključuju horoidni pleksus, mrežnjaču i pankreas.
[0292] Inhibiranje ekspresije TTR proteina se može manifestovati putem smanjenja nivoa TTR proteina koji je eksprimiran od strane ćelije ili grupe ćelija (npr. nivo proteina eksprimiranog u uzorku dobijenom od ispitanika). Kao što je prethodno objašnjeno za procenu supresije mRNK, inhibiranje nivoa ekspresije proteina u tretiranoj ćeliji ili grupi ćelija može na sličan način da se prikaže kao procenat nivoa proteina u kontrolnoj ćeliji ili grupi ćelija.
[0293] Kontrolna ćelija ili grupa ćelija koja može da se koristi za procenu inhibiranja ekspresije TTR gena uključuje ćeliju ili grupu ćelija koja još nije dovedena u kontakt sa agensom RNKi iz pronalaska. Na primer, kontrolna ćelija ili grupa ćelija može biti dobijena od pojedinačnog ispitanika (npr. ljudskog ili životinjskog ispitanika) pre lečenja ispitanika agensom RNKi.
[0294] Nivo mRNK TTR koji eksprimira ćelija ili grupa ćelija, ili nivo cirkulišuće mRNK TTR, može se odrediti korišćenjem bilo kog postupka poznatog u struci za određivanje ekspresije mRNK. U jednom otelotvorenju, nivo ekspresije TTR u uzorku se određuje detektovanjem transkribovanog polinukleotida ili njegovog dela, npr. mRNK TTR gena. RNK može da se ekstrahuje iz ćelija korišćenjem tehnika za ekstrakciju RNK uključujući, na primer, korišćenje kisele ekstrakcije fenolom/guanidin izotiocijanatom (RNKzol B, Biogenesis), kompleta za pripremu RNK RNeasy (Qiagen) ili PAXgene (PreAnalytix, Švajcarska). Tipični formati testa
1
koji koristi hibridizaciju ribonukleinske kiseline uključuju testove nuklearnog ciklusa, testove protekcije RT-PCR, RNaze (Melton et al., Nuc. Acids Res. 12:7035), nortern blot, in situ hibridizaciju i analizu pomoću mikročipa. Cirkulišuća mRNK TTR se može detektovati korišćenjem postupaka opisanih u PCT/US2012/043584, čiji se ceo sadržaj ovim uključuje putem reference.
[0295] U jednom slučaju, nivo ekspresije TTR je određen korišćenjem probe nukleinske kiseline. Termin „proba“, kako se ovde koristi, odnosi se na svaki molekul koji je sposoban za selektivno vezivanje za specifični TTR. Osoba sa znanjem u oblasti može da sintetiše probe, ili one mogu biti dobijene iz odgovarajućih bioloških preparata. Probe se mogu specifično konstruisati da budu obeležene. Primeri za molekule koji se mogu koristiti kao probe uključuju, ali nisu ograničeni na, RNK, DNK, proteine, antitela i organske molekule.
[0296] Izolovana mRNK može da se koristi u testovima hibridizacije ili amplifikacije koji uključuju, ali nisu ograničeni na, sautern ili nortern analize, analizu lančane reakcije polimeraze (PCR) i nizove proba. Jedan postupak za određivanje nivoa mRNK uključuje dovođenje u kontakt izolovane mRNK sa molekulom nukleinske kiseline (proba) koji može da se hibridizuje u mRNK TTR. U jednom otelotvorenju, mRNK je imobilisana na čvrstoj površini i dovodi se u kontakt sa probom, na primer, propuštanjem izolovane mRNK na agaroznom gelu i prenošenjem mRNK sa gela na membranu, kao što je nitroceluloza. U alternativnom otelotvorenju, proba (probe) je imobilisana na čvrstoj površini, i mRNK je dovedena u kontakt sa probom (probama), na primer, na genskom mikročipu Affymetrix. Stručnjak može lako da prilagodi poznate postupke za detekciju mRNK za primenu u određivanju nivoa TTR mRNK.
[0297] Alternativni postupak za određivanje nivoa ekspresije TTR u uzorku uključuje proces amplifikacije nukleinske kiseline i/ili reversne transkriptaze (da se dobije cDNK), na primer, mRNK u uzorku, npr. putem RT-PCR (eksperimentalno otelotvorenje izneto u Mullis, 1987, U.S. Pat. br. 4,683,202), lančane reakcije ligaze (Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189-193), samoodržive replikacije sekvence (Guatelli i sar. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878), transkripcionog sistema amplifikacije (Kwoh i sar. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177), Q-beta replikaze (Lizardi i sar. (1988) Bio/Technology 6:1197), kružne replikacije (Lizardi i sar., U.S. Pat. No. 5,854,033), ili bilo kog drugog postupka amplifikacije nukleinske kiseline, praćenog detekcijom amplifikovanih molekula pomoću tehnika dobro poznatih stručnjacima. Te šeme detekcije su posebno korisne za
2
detekciju molekula nukleinske kiseline, ako su takvi molekuli prisutni u veoma malom broju. U konkretnim aspektima pronalaska, nivo ekspresije TTR je određen kvantitativnom fluorogenom RT-PCR (tj., sistemom TaqMan™).
[0298] Ekspresioni nivoi mRNK TTR se mogu pratiti koristeći membransko nanošenje (kao što se koristi u hibridizacionoj analizi, kao što je nortern, sautern, dot blot, i slično), ili mikrobunarčiće, epruvete za uzorke, gelove, perlice ili vlakna (ili bilo koji čvrsti nosač koji uključuje vezane nukleinske kiseline). Vidite U.S. Pat. br. 5,770,722, 5,874,219, 5,744,305, 5,677,195 i 5,445,934, koji su ovde obuhvaćeni putem referenci. Određivanje nivoa ekspresije TTR takođe može da obuhvata korišćenje proba nukleinske kiseline u rastvoru.
[0299] U poželjnim slučajevima, nivo ekspresije mRNK se procenjuje korišćenjem testova razgranate DNK (bDNK) ili PCR u realnom vremenu (qPCR). Upotreba ovih postupaka je opisana i prikazana u primerima datim u ovom tekstu.
[0300] Nivo ekspresije proteina TTR može da se odredi korišćenjem bilo kog postupka poznatog u struci za merenje nivoa proteina. Takvi postupci uključuju, na primer, elektroforezu, kapilarnu elektroforezu, tečnu hromatografiju visokih performansi (HPLC), tankoslojnu hromatografiju (TLC), hiperdifuzionu hromatografiju, tečne ili gel precipitinske reakcije, apsorpcionu spektroskopiju, kolorimetrijske testove, spektrofotometrijske testove, protočnu citometriju, imunodifuziju (jednostruku ili dvostruku), imunoelektroforezu, vestern blot, radioimunološki test (RIA), testove sa imunosorbentom vezanim za enzim (ELISA), imunofluorescentne testove, testove elektrohemiluminescenciju, i slično.
[0301] U nekim slučajevima, efikasnost postupaka može da se prati detektovanjem ili praćenjem smanjenja naslaga amiloidnog TTR. Smanjenje naslaga amiloidnog TTR, kako se ovde koristi, obuhvata svako smanjenje veličine, broja ili ozbiljnosti naslaga TTR, ili prevenciju ili smanjenje nastajanja naslaga TTR, u organu ili oblasti u ispitaniku, kako se može proceniti in vitro ili in vivo korišćenjem bilo kog postupka poznatog u struci. Na primer, neki postupci za procenu amiloidnih naslaga su opisani u Gertz, M.A. i Rajukumar, S.V. (urednici) (2010), Amyloidosis: Diagnosis and Treatment, New York: Humana Press. Postupci za procenu amiloidnih naslaga mogu da obuhvataju biohemijske analize, kao i vizuelnu ili kompjuterizovanu procenu amiloidnih naslaga, koje su postale vidljive, npr. korišćenjem imunohistohemijskog bojenja, fluorescentnog obeležavanja, svetlosne mikroskopije, elektronske mikroskopije, fluorescentne mikroskopije, ili drugih vrsta mikroskopije. Invazivne ili neinvazivne metode snimanja, uključujući, npr. CT, PET ili NMR/MR snimanje, mogu se koristiti za procenu amiloidnih naslaga.
[0302] Postupci mogu smanjiti TTR naslage u bilo kom broju tkiva ili regiona tela, uključujući, bez ograničenja, srce, jetru, slezinu, jednjak, želudac, creva (ileum, duodenum i kolon), mozak, veliki sedalni nerv, dorzalni koreni ganglion, bubreg i mrežnjaču.
[0303] Termin „uzorak“, kako se ovde koristi, odnosi se na skup sličnih tečnosti, ćelija ili tkiva izolovanih od ispitanika, kao i tečnosti, ćelija ili tkiva prisutnih u ispitaniku. Primeri za biološke tečnosti uključuju krv, serum i serumski fluid, plazmu, limfu, urin, cerebrospinalnu tečnost, pljuvačku, očnu tečnost, i slično. Uzorci tkiva mogu da uključuju uzorke iz tkiva, organa ili lokalizovanih regiona. Na primer, uzorci mogu biti dobijeni od pojedinačnih organa, delova organa, ili tečnosti ili ćelija u tim organima. U određenim otelotvorenjima, uzorci mogu biti dobijeni iz jetre (npr. cele jetre ili određenih segmenata jetre ili određenih vrsta ćelija u jetri, kao što su, na primer, hepatociti), mrežnjače ili delova mrežnjače (npr. epitela retinalnog pigmenta), centralnog nervnog sistema ili delova centralnog nervnog sistema (npr. komora ili horoidnog pleksusa) ili pankreasa ili određenih ćelija ili delova pankreasa. U poželjnim slučajevima, „uzorak dobijen od ispitanika“ odnosi se na krv ili plazmu uzetu od ispitanika. U daljim otelotvorenjima, „uzorak dobijen od ispitanika“ odnosi se na tkivo jetre ili tkivo mrežnjače dobijeno od ispitanika.
[0304] U nekim slučajevima, agens RNKi se primenjuje na ispitaniku tako da je agens RNKi isporučen na određeno mesto u ispitaniku. Inhibiranje ekspresije TTR može se proceniti putem merenja nivoa ili promene nivoa mRNK TTR ili TTR proteina u uzorku dobijenom iz tečnosti ili tkiva iz specifičnog mesta u ispitaniku. U poželjnim otelotvorenjima, mesto je izabrano iz grupe koja se sastoji od jetre, horoidnog pleksusa, mrežnjače i pankreasa. Mesto takođe može biti podsekcija ili podgrupa ćelija iz bilo kog od prethodno navedenih mesta (npr. hepatociti ili epitel retinalnog pigmenta). Mesto takođe može da obuhvata ćelije koje eksprimiraju određenu vrstu receptora (npr. hepatociti koji eksprimiraju receptor asiaglikoproteina).
Postupci za lečenje ili prevenciju bolesti povezane sa TTR
[0305] Predmetno otkriće takođe obezbeđuje postupke za lečenje ili prevenciju bolesti povezane sa TTR kod ispitanika. Postupci uključuju davanje ispitaniku terapeutski delotvorne
4
ili profilaktički delotvorne doze agensa RNKi iz pronalaska.
[0306] Kako se ovde koristi, „ispitanik“ obuhvata čoveka ili životinju koja nije čovek, poželjno kičmenjaka, a još poželjnije sisara. Ispitanik može da uključuje transgeni organizam. Najpoželjnije, ispitanik je čovek, kao što je čovek koji boluje, ili je podložan razvoju bolesti povezane sa TTR.
[0307] U nekim slučajevima, ispitanik boluje od bolesti povezane sa TTR. U drugim otelotvorenjima, ispitanik je ispitanik koji je pod rizikom od nastanka bolesti povezane sa TTR, npr. ispitanik sa TTR genskom mutacijom koja je povezana sa nastankom bolesti povezane sa TTR, ispitanik sa porodičnom istorijom bolesti povezane sa TTR, ili ispitanik koji ima znake ili simptome koji ukazuju na nastanak TTR amiloidoze.
[0308] „Bolest povezana sa TTR“, kako se ovde koristi, uključuje svaku bolest uzrokovanu ili povezanu sa nastankom amiloidnih naslaga kod kojih se filamentni prekursor sastoji od varijante ili divljeg tipa TTR proteina. Mutantni i divlji tip TTR dovode do različitih oblika amiloidnih naslaga (amiloidoza). Amiloidoza uključuje nastanak i agregaciju pogrešno savijenih proteina, što dovodi do ekstracelularnih naslaga koje ometaju rad organa. Klinički sindromi povezani sa agregacijom TTR uključuju, na primer, senilnu sistemsku amiloidozu (SSA), sistemsku familijarnu amiloidozu, familijarnu amiloidnu polineuropatiju (FAP), familijarnu amiloidnu kardiomiopatiju (FAC) i leptomeningealnu amiloidozu, poznatu i kao leptomeningealna ili meningocerebrovaskularna amiloidoza, amiloidoza centralnog nervnog sistema (CNS) ili oblik VII amiloidoze.
[0309] U nekim implementacijama postupaka iz pronalaska, agensi RNKi iz pronalaska se primenjuju na ispitanicima koji boluju od familijarne amiloidne kardiomiopatije (FAC) i senilne sistemske amiloidoze (SSA). TTR normalne sekvence izaziva srčanu amiloidozu kod starijih osoba, i naziva se senilna sistemska amiloidoza (SSA) (takođe se naziva i senilna srčana amiloidoza (SCA) ili srčana amiloidoza). SSA je često praćena mikroskopskim naslagama u mnogim drugim organima. Mutacije TTR ubrzavaju proces amiloidnog nastajanja TTR i najznačajniji su faktor rizika pojave klinički značajne TTR amiloidoze (naziva se i ATTR (amiloidoza transtiretinskog tipa)). Za više od 85 varijanti amiloidogenih TTR je poznato da izazivaju sistemsku familijarnu amiloidozu.
[0310] U nekim slučajevima postupaka iz pronalaska, agensi RNKi iz pronalaska se primenjuju na ispitanicima koji boluju od familijarne amiloidne polineuropatije (FAP) povezane sa transtiretinom (TTR). Takvi ispitanici mogu da pate od manifestacija na oku, kao što je zamućenje staklastog tela i glaukom. Stručnjaku u ovoj oblasti je poznato da amiloidogeni transtiretin (ATTR) sintetisan od strane epitela retinalnog pigmenta (RPE) ima važnu ulogu u progresiji okularne amiloidoze. Prethodne studije su pokazale da panretinalna laserska fotokoagulacija, koja smanjuje broj RPE ćelija, sprečava progresiju amiloidnih naslaga u staklastom telu, što ukazuje na to da delotvorna supresija ekspresije ATTR u RPE može postati nova terapija za okularnu amiloidozu (vidite, npr. Kawaji, T., i sar. Ophthalmology. (2010) 117: 552-555). Postupci iz pronalaska su korisni u lečenju očnih manifestacija FAP povezane sa TTR, npr. okularne amiloidoze. Agens RNKi može da se isporuči na način koji je pogodan za ciljanje određenog tkiva, kao što je oko. Režimi isporuke u oku uključuju retrobulbarnu injekciju, supkutanu u očni kapak, subkonjuktivnu, subtenonsku, injekciju u prednju komoru oka ili intravitrealnu injekciju (ili internu injekciju ili infuziju). Specifične formulacije za očnu isporuku uključuju kapi za oči i meleme.
[0311] Još jedna bolest povezana sa TTR je hipertiroksinemija, poznata i kao „distranstiretinemska hipertiroksinemija“ ili „disprealbumineminska hipertiroksinemija“. Ova vrsta hipertiroksinemije može biti posledica povećanog vezivanja tiroksina sa TTR usled mutantnog TTR molekula sa povećanim afinitetom prema tiroksinu. Vidite, npr. Moses i sar. (1982) J. Clin. Invest., 86, 2025-2033.
[0312] Agensi RNKi iz pronalaska se mogu primenjivati na ispitaniku korišćenjem bilo kog načina primene poznatog u struci, uključujući, bez ograničenja, supkutani, intravenski, intramuskularni, intraokularni, intrabronhijalni, intrapleuralni, intraperitonealni, intraarterijski, limfni, cerebrospinalni, i svaku njihovu kombinaciju. U poželjnim otelotvorenjima, agensi se primenjuju supkutano.
[0313] U nekim slučajevima, primena je putem depo injekcije. Depo injekcija može da otpušta agens RNKi na dosledan način tokom produženog vremenskog perioda. Tako, depo injekcija može da smanji potrebnu frekvenciju doziranja kako bi se dobilo željeno dejstvo, npr. željena inhibicija TTR ili terapeutsko ili profilaktičko dejstvo. Depo injekcija može takođe da obezbedi doslednije serumske koncentracije. Depo injekcije mogu da uključuju supkutane injekcije ili intramuskularne injekcije. U poželjnim slučajevima, depo injekcija je supkutana injekcija.
[0314] U nekim slučajevima, primena je putem pumpe. Pumpa može biti eksterna pumpa ili pumpa implantirana hirurškim putem. U određenim slučajevima, pumpa je supkutano implantirana osmotska pumpa. U drugim slučajevima, pumpa je infuziona pumpa. Infuziona pumpa može se koristiti za intravenske, supkutane, arterijske ili epiduralne infuzije. U poželjnim slučajevima, pumpa je supkutana infuziona pumpa. U drugim slučajevima, pumpa je hirurški implantirana pumpa koja isporučuje agens RNKi u jetru.
[0315] Drugi putevi primene uključuju epiduralnu, intracerebralnu, intracerebroventrikularnu, nazalnu primenu, intraarterijsku, intrakardijalnu, intrakoštanu infuziju, intratekalnu i intravitrealnu i pulmonarnu. Način primene se može odabrati na osnovu toga da li se želi lokalno ili sistemsko lečenje, i na osnovu oblasti koja se leči. Način i mesto primene se mogu izabrati da pojačaju ciljanje.
[0316] U nekim slučajevima, agens RNKi se primenjuje na ispitaniku u količini koja je delotvorna za inhibiranje ekspresije TTR u ćeliji ispitanika. Količina delotvorna za inhibiranje ekspresije TTR u ćeliji ispitanika može se proceniti korišćenjem prethodno razmotrenih postupaka, uključujući postupke koji obuhvataju procenu inhibicije mRNK TTR, TTR proteina ili povezanih promenljivih, kao što su amiloidne naslage.
[0317] U nekim slučajevima, agens RNKi se primenjuje na ispitaniku u terapeutski ili profilaktički delotvornoj količini.
[0318] „Terapeutski delotvorna količina“, kako se ovde koristi, treba da uključi količinu agensa RNKi koja je, kada se primeni na pacijentu za lečenje bolesti povezane sa TTR, dovoljna da se ostvari lečenje bolesti (npr. smanjivanjem, ublažavanjem ili održavanjem postojeće bolesti, ili jednog ili više simptoma bolesti). „Terapeutski delotvorna količina“ može da varira u zavisnosti od agensa RNKi, načina primene agensa, bolesti i njene ozbiljnosti i istorije, starosti, težine, porodične istorije, genetskog sklopa, stadijuma patoloških procesa posredovanih ekspresijom TTR, vrste prethodnih ili pratećih lečenja, ako ih ima, i svih drugih individualnih karakteristika pacijenta koji će se lečiti.
[0319] „Profilaktički delotvorna količina“, kako se ovde koristi, treba da uključi količinu agensa RNKi koja je, kada se primeni na ispitaniku koji još nije doživeo ili ispoljio simptome bolesti povezane sa TTR, ali koji možda ima predispozicije za bolest, dovoljna za prevenciju ili ublažavanje bolesti, ili jednog ili više simptoma bolesti. Simptomi koji se mogu ublažiti uključuju senzornu neuropatiju (npr. paresteziju, hipesteziju u distalnim udovima), autonomnu neuropatiju (npr. gastrointestinalnu disfunkciju, kao što je čir na želucu ili ortostatska hipotenzija), motornu neuropatiju, epi napade, demenciju, mijelopatiju, polineuropatiju, sindrom karpalnog tunela, autonomnu insuficijenciju, kardiomiopatiju, zamućenja staklastog tela, bubrežnu insuficijenciju, nefropatiju, značajno smanjeni mBMI (modifikovani indeks telesne mase), disfunkciju moždanih živaca i distrofiju strome rožnjače. Ublažavanje bolesti uključuje usporavanje toka bolesti ili smanjenje ozbiljnosti kasnije nastale bolesti. „Profilaktički delotvorna količina“ može da varira u zavisnosti od agensa RNKi, načina primene agensa, stepena rizika od bolesti i istorije, starosti, težine, porodične istorije, genetskog sklopa, vrsta prethodnih ili pratećih lečenja, ako ih ima, i drugih individualnih karakteristika pacijenta koji će se lečiti.
[0320] „Terapeutski delotvorna količina“ ili „profilaktički delotvorna količina“ takođe uključuje količinu agensa RNKi koja proizvodi željeni lokalni ili sistemski efekat sa prihvatljivim odnosom koristi/rizika primenljivim za svako lečenje. Agensi RNKi u postupcima predmetnog pronalaska mogu se primeniti u dovoljnoj količini da daju prihvatljivi odnos koristi/rizika primenljiv na takvo lečenje.
[0321] Kako se ovde koriste, fraze „terapeutski delotvorna količina“ i „profilaktički delotvorna količina“ takođe obuhvataju količinu koja pruža korist u lečenju, prevenciji ili upravljanju patološkim procesima ili simptomima patoloških procesa posredovanih ekspresijom TTR. Simptomi TTR amiloidoze uključuju senzornu neuropatiju (npr. paresteziju, hipesteziju u distalnim udovima), autonomnu neuropatiju (npr. gastrointestinalnu disfunkciju, kao što je čir na želucu ili ortostatska hipotenzija), motornu neuropatiju, epi napade, demenciju, mijelopatiju, polineuropatiju, sindrom karpalnog tunela, autonomnu insuficijenciju, kardiomiopatiju, zamućenja staklastog tela, bubrežnu insuficijenciju, nefropatiju, značajno smanjeni mBMI (modifikovani indeks telesne mase), disfunkciju moždanih živaca i distrofiju strome rožnjače.
[0322] Doza agensa RNKi koja se primenjuje na ispitaniku može biti prilagođena da se uravnoteže rizici i koristi konkretne doze, na primer, kako bi se ostvario željeni nivo supresije TTR gena (kako je procenjeno, npr. na osnovu supresije mRNK TTR, ekspresije TTR proteina ili smanjenja u amiloidnim naslagama, kako je prethodno definisano) ili željeno terapeutsko ili profilaktičko dejstvo, dok se istovremeno izbegavaju neželjena dejstva.
[0323] U jednom slučaju, agens RNKi se primenjuje u dozi od oko 0,25 mg/kg do oko 50 mg/kg, npr. od oko 0,25 mg/kg do oko 0,5 mg/kg, od oko 0,25 mg/kg do oko 1 mg/kg, od oko 0,25 mg/kg do oko 5 mg/kg, od oko 0,25 mg/kg do oko 10 mg/kg, od oko 1 mg/kg do oko 10 mg/kg, od oko 5 mg/kg do oko 15 mg/kg, od oko 10 mg/kg do oko 20 mg/kg, od oko 15 mg/kg do oko 25 mg/kg, od oko 20 mg/kg do oko 30 mg/kg, od oko 25 mg/kg do oko 35 mg/kg, ili od oko 40 mg/kg do oko 50 mg/kg.
[0324] U nekim slučajevima, agens RNKi se primenjuje u dozi od oko 0,25 mg/kg, oko 0,5 mg/kg, oko 1 mg/kg, oko 2 mg/kg, oko 3 mg/kg, oko 4 mg/kg, oko 5 mg/kg, oko 6 mg/kg, oko 7 mg/kg, oko 8 mg/kg, oko 9 mg/kg, oko 10 mg/kg, oko 11 mg/kg, oko 12 mg/kg, oko 13 mg/kg, oko 14 mg/kg, oko 15 mg/kg, oko 16 mg/kg, oko 17 mg/kg, oko 18 mg/kg, oko 19 mg/kg, oko 20 mg/kg, oko 21 mg/kg, oko 22 mg/kg, oko 23 mg/kg, oko 24 mg/kg, oko 25 mg/kg, oko 26 mg/kg, oko 27 mg/kg, oko 28 mg/kg, oko 29 mg/kg, 30 mg/kg, oko 31 mg/kg, oko 32 mg/kg, oko 33 mg/kg, oko 34 mg/kg, oko 35 mg/kg, oko 36 mg/kg, oko 37 mg/kg, oko 38 mg/kg, oko 39 mg/kg, oko 40 mg/kg, oko 41 mg/kg, oko 42 mg/kg, oko 43 mg/kg, oko 44 mg/kg, oko 45 mg/kg, oko 46 mg/kg, oko 47 mg/kg, oko 48 mg/kg, oko 49 mg/kg ili oko 50 mg/kg.
[0325] U nekim slučajevima, agens RNKi se primenjuje u dve ili više doza. Ukoliko je poželjno da se olakša ponovljena ili česta infuzija, implantacija uređaja za isporuku, npr. pumpe ili polupermanentnog stenta (npr. intravenskog, intraperitonealnog, intracisternalnog ili intrakapsularnog) ili rezervoara može biti preporučljiva. U nekim slučajevima, broj ili količina narednih doza zavisi od postizanja željenog dejstva, npr. supresije TTR gena, ili postizanja terapeutskog ili profilaktičkog dejstva, npr. smanjenja amiloidne naslage ili smanjenja simptoma bolesti povezane sa TTR. U nekim otelotvorenjima, agens RNKi se primenjuje prema rasporedu. Na primer, agens RNKi može da se primenjuje dva puta nedeljno, tri puta nedeljno, četiri puta nedeljno ili pet puta nedeljno. U nekim slučajevima, raspored obuhvata redovno raspoređene primene, npr. svakog sata, na svaka četiri sata, na svakih šest sati, svakih osam sati, svakih dvanaest sati, svakodnevno, na svaka 2 dana, svaka 3 dana, svaka 4 dana, svakih 5 dana, nedeljno, na dve nedelje ili mesečno. U drugim slučajevima, raspored obuhvata bliske primene praćene dužim vremenskim periodom tokom kog se agens ne primenjuje. Na primer, raspored može da obuhvati inicijalni set doza koje se primenjuju u relativno kratkom vremenskom periodu (npr. na oko svakih 6 sati, na oko svakih 12 sati, na oko svaka 24 sata, na oko svakih 48 sati, ili na oko svaka 72 sata), što je praćeno dužim vremenskim periodom (npr. oko 1 nedelja, oko 2 nedelje, oko 3 nedelje, oko 4 nedelje, oko 5 nedelja, oko 6 nedelja, oko 7 nedelja ili oko 8 nedelja) tokom koga se agens RNKi ne primenjuje. U jednom slučaju, agens RNKi se inicijalno primenjuje svakog sata, a kasnije se primenjuje u dužim intervalima (npr. dnevno, nedeljno, dvonedeljno ili mesečno). U drugom slučaju, agens RNKi se inicijalno primenjuje dnevno, a kasnije se primenjuje u dužim intervalima (npr. nedeljno, dvonedeljno ili mesečno). U određenim slučajevima, duži interval se povećava tokom vremena, ili se određuje na osnovu postizanja željenog dejstva. U specifičnom slučaju, agens RNKi se primenjuje jednom dnevno tokom prve nedelje, nakon čega sledi nedeljno doziranje počevši sa osmim danom primene. U drugom specifičnom slučaju, agens RNKi se primenjuje svakog drugog dana tokom prve nedelje, nakon čega sledi nedeljno doziranje počevši sa osmim danom primene.
[0326] Bilo koji od ovih rasporeda se može opciono ponoviti za jednu ili više iteracija. Broj iteracija može da zavisi od postizanja željenog dejstva, npr. supresije TTR gena, nivo proteina koji vezuje retinol, nivoa vitamina A i/ili postizanja terapeutskog ili profilaktičkog dejstva, npr. smanjenja amiloidnih naslaga ili smanjenja simptoma bolesti povezane sa TTR.
[0327] U nekim slučajevima, agens RNKi se primenjuje sa drugim terapeutskim agensima ili drugim terapeutskim režimima. Na primer, drugi agensi ili drugi terapeutski režimi pogodni za lečenje bolesti povezane sa TTR mogu uključivati transplantaciju jetre, što može smanjiti nivo mutantnih TTR u telu, tafamidis (Vyndaqel), koji kinetički stabilizuje tetramer TTR koji sprečava disocijaciju tetramera potrebnu za amiloidogenezu TTR; i diuretike, koji se mogu koristiti, na primer, za smanjenje edema kod TTR amiloidoze koja zahvata srce.
[0328] U jednom slučaju, ispitaniku se daje inicijalna doza i jedna ili više doza za održavanje agensa RNKi. Doza ili doze za održavanje mogu biti iste ili manje od inicijalne doze, npr. pola inicijalne doze. Režim održavanja može da uključuje tretiranje ispitanika dozom ili dozama u opsegu od 0,01 µg do 15 mg/kg telesne težine dnevno, npr. 10 mg/kg, 1 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,01 mg/kg, 0,001 mg/kg, ili 0,00001 mg/kg telesne težine dnevno. Doze za održavanje se, na primer, primenjuju ne češće nego jednom na svaka 2 dana, jednom na svakih 5 dana, jednom na svakih 7 dana, jednom na svakih 10 dana, jednom na svakih 14 dana, jednom na svaki 21 dan ili jednom na svakih 30 dana. Nadalje, režim lečenja može trajati u vremenskom periodu koji će varirati u zavisnosti od prirode konkretne bolesti, njene ozbiljnosti i sveukupnog stanja pacijenta. U određenim slučajevima, doza može biti isporučena ne češće nego jednom dnevno, npr. ne češće nego jednom na 24, 36, 48 ili više sati, npr. ne češće nego jednom na svakih 5 ili 8 dana. Nakon lečenja, pacijent može biti praćen radi uočavanja promena u njegovom/njenom stanju. Doza agensa RNKi može biti povećana u slučaju da pacijent nema značajan odgovor na trenutne dozne nivoe, ili doza može biti smanjena ako je uočeno ublažavanje simptoma bolesti, ako je bolest uklonjena operativnim putem ili su uočena neželjena dejstva.
VI. Kompleti
[0329] Predmetno otkriće takođe obezbeđuje komplete za sprovođenje bilo kojih postupaka iz pronalaska. Takvi kompleti sadrže jedan ili više agenasa RNKi i uputstvo za upotrebu, npr. uputstvo za inhibiciju ekspresije TTR u ćeliji putem dovođenja ćelije u kontakt sa agensom RNKi u količini koja je delotvorna za inhibiciju ekspresije TTR. Kompleti mogu opciono dalje da sadrže sredstva za dovođenje ćelije u kontakt sa agensom RNKi (npr. uređaj za injektovanje), ili sredstva za merenje inhibicije TTR (npr. sredstva za merenje inhibicije mRNK TTR ili TTR proteina). Takva sredstva za merenje inhibicije TTR mogu da obuhvataju sredstva za uzimanje uzorka od ispitanika, kao što je, npr. uzorak plazme. Kompleti mogu opciono dalje da sadrže sredstva za primenu agenasa RNki na ispitaniku ili sredstva za određivanje terapeutski delotvorne ili profilaktički delotvorne količine.
[0330] Pronalazak je dalje ilustrovan putem sledećih primera koje ne treba tumačiti kao ograničavajuće.
PRIMERI
Primer 1: Inhibicija TTR konjugatima TTR-GalNac
[0331] Jedna doza agensa RNKi TTR AD-43527 je supkutano data mišu, i nivoi mRNK TTR su utvrđeni 72 sata nakon primene.
[0332] Mišji/pacovski unakrsno reaktivni GalNAc konjugat, AD-43527, izabran je za in vivo procenu utišavanja mRNK TTR u jetri kod WT C57BL/6 miševa. Sekvenca svakog lanca AD-43527 je prikazana u nastavku.
1
Korišćeni ligand je GalNAc3:
Ovaj GalNAc3 ligand je konjugovan sa 3'-krajem sens lanca pomoću linkera i veze, kako je prikazano u nastavku:
Struktura dobijenog GalNAc3konjugovanog sens lanca je prikazana u sledećoj šemi:
Dodatni agensi RNKi koji targetiraju TTR i imaju sledeće sekvence i modifikacije su sintetisani i testirani.
Mišji/pacovski unakrsno reaktivni TTR agensi RNKi
2
Humani/cino unakrsno reaktivni TTR agens RNKi; matični dupleks je AD-18328 [koji ima sekvencu sens lanca 5'-3' GuAAccAAGAGuAuuccAudTdT (SEQ ID NO: 12) i sekvencu antisens lanca 5' do 3' AUGGAAuACUCUUGGUuACdTdT (SEQ ID NO: 13) sa sledećim modifikacijama: naizmenično 2'F/2'OMe s/2 PS na AS.
[0333] AD-43527 je dat ženkama C57BL/6 miševa (6-10 nedelja, 5 po grupi) putem supkutane injekcije sa zapreminom doze od 10µl/g pri dozi od 30, 15, 7,5, 3,5, 1,75 ili 0,5 mg/kg AD-43527. Kontrolne životinje su dobijale PBS putem supkutane injekcije u istoj zapremini doze.
[0334] Nakon oko sedamdeset dva sata, miševi su anestezirani sa 200 µl ketamina, pa su zatim iskrvarili zasecanjem desne kaudalne arterije. Sakupljeno je tkivo jetre, brzo zamrznuto i čuvano na -80°C do obrade.
[0335] Efikasnost lečenja je procenjena putem merenja mRNK TTR u jetri 72 sata nakon doze. Nivoi mRNK TTR u jetri su ispitivani korišćenjem testova razgranate DNK- QuantiGene 1.0 (Panomics). Ukratko, uzorci jetre miševa su samleveni, i pripremljeni su lizati tkiva. Smeša za lizu jetre (mešavina 1 zapremine smeše za lizu, 2 zapremine vode bez nukleaze i 10 µl proteinaze-K/ml za konačnu koncentraciju od 20 mg/ml) inkubirana je na 65°C tokom 35 minuta. 5µl lizata jetre i 95 µl kompleta za radnu probu (TTR proba za ciljni gen i GAPDH za endogenu kontrolu) dodato je na ploču za hvatanje. Ploče za hvatanje su inkubirane na 53°C ±1°C (oko 16-20 h). Sledećeg dana, ploče za hvatanje su isprane 3 puta 1X puferom za ispiranje (voda bez nukleaze, komponenta pufera 1 i komponenta pufera za ispiranje 2), zatim osušene centrifugiranjem tokom 1 minuta na 240 g. 100µl smeše za amplifikaciju probe po bunarčiću dodato je na ploču za hvatanje, koja je zatvorena aluminijumskom folijom i inkubirana 1 sat na 46°C ±1°C. Nakon 1 h inkubacije, ponovljen je korak ispiranja, pa je dodato 100 µl smeše za obeležavanje probe. Ploče za hvatanje su inkubirane na 46°C ± 1°C tokom 1 sata. Ploče su zatim isprane 1X puferom za ispiranje, osušene, i na ploče za hvatanje je dodato 100 µl supstrata po bunarčiću. Ploče za hvatanje su inkubirane tokom 30 minuta na 46°C, a zatim tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi. Ploče su nakon inkubacije očitane pomoću luminometra SpectraMax. Podaci za bDNK su analizirani oduzimanjem prosečne osnovne vrednosti od svakog uzorka urađenog u duplikatu, određivanjem proseka za dobijeni dupli GAPDH (kontrolna proba) i TTR (eksperimentalna proba), a zatim izračunavanjem odnosa: (eksperimentalna proba – osnovna vrednost)/(kontrolna proba – osnovna vrednost). Prosečni nivo mRNK TTR je izračunat za svaku grupu i normalizovan do proseka PBS grupe kako bi se dobila prosečna mRNK TTR kao % PBS kontrolne grupe.
[0336] Rezultati su prikazani na slici 1. Agens RNKi konjugovan sa GalNAc koji cilja na TTR imao je ED50oko 5 mg/kg za opadanje TTR mRNK. Ovi rezultati pokazuju da su GalNAc konjugovani agensi RNKi koji ciljaju TTR delotvorni u inhibiranju ekspresije mRNK TTR.
Primer 2: Inhibicija TTR konjugatima TTR-GalNac je dugotrajna
[0337] Miševima je data supkutana doza (ili 7,5 ili 30 mg/kg) AD-43527, GalNAc konjugovanog agensa RNKi koji cilja TTR. Nivoi mRNK TTR u jetri su procenjivani 1, 3, 5, 7, 10, 13, 15, 19, 26, 33 i 41 dan posle lečenja korišćenjem postupka opisanog u primeru 1.
[0338] Rezultati su prikazani na slici 2.19. dana, primena 30,0 mg/kg GalNAc konjugovanih agenasa RNKi je i dalje pokazivala utišavanje od oko 50%. Potpun oporavak ekspresije se javio 41. dana.
[0339] Ovi rezultati su pokazali da je inhibicija koju obezbeđuje GalNac konjugovana siRNK koja cilja TTR dugotrajna, i traje do 3, 5, 7, 10, 13, 15, 19, 26 ili 33 dana posle lečenja.
Primer 3. Sinteza RNK i zagrevanje dupleksa
1. Sinteze oligonukleotida
[0340] Oligonukleotidi su sintetisani na sintetizatoru AKTAoligopilot ili sintetizatoru ABI 394.
4
Komercijalno dostupni čvrsti nosač staklo sa kontrolisanim porama (dT-CPG, 500Ǻ, Prime Synthesis) i RNK fosforamiditi sa standardnim zaštitnim grupama, 5'-O-dimetoksitritil N6-benzoil-2'-t-butildimetilsilil-adenozin-3'-O-N,N'-diizopropil-2-cijanoetilfosforamidit, 5'-O-dimetoksitritil-N4-acetil-2'-t-butildimetilsilil-citidin-3'-O-N,N'-diizopropil-2-cijanoetilfosforamidit, 5'-O-dimetoksitritil-N2-izobutiril-2'-t-butildimetilsilil-guanozin-3'-O-N,N'-diizopropil-2-cijanoetilfosforamidit i 5'-O-dimetoksitritil-2'-t-butildimetilsilil-uridin-3'-O-N,N'-diizopropil-2-cijanoetilfosforamidit (Pierce Nucleic Acids Technologies) korišćeni su za sinteze oligonukleotida, ako nije drugačije naznačeno. 2'-F fosforamiditi, 5'-O-dimetoksitritil-N4-acetil-2'-fluor-citidin-3'-ON,N'-diizopropil-2-cijanoetil-fosforamidit i 5'-O-dimetoksitritil-2'-fluor-uridin-3'-O-N,N'-diizopropil-2-cijanoetil-fosforamidit su kupljeni od (Promega). Svi fosforamiditi su korišćeni u koncentraciji od 0,2 M u acetonitrilu (CH3CN), osim guanozina koji je korišćen u 0,2 M koncentraciji u 10% THF/ANC (V/V). Korišćeno je vreme kuplovanja/recikliranja od 16 minuta. Aktivator je bio 5-etil tiotetrazol (0,75 M, American International Chemicals), za PO oksidaciju korišćen je jod/voda/piridin, a za PS oksidaciju korišćen je PADS (2%) u 2,6-lutidinu/ACN (1:1 V/V).
[0341] Lanci vezani sa ligandima su sintetisani koristeći čvrsti nosač koji sadrži odgovarajući ligand. Na primer, uvođenje ugljenohidratnog ostatka/liganda (npr. GalNAc) na 3' kraju sekvence postignuto je započinjanjem sinteze sa odgovarajućim ugljenohidratnim čvrstim nosačem. Slično, ostatak holesterola na 3' kraju je uveden započinjanjem sinteze na nosaču holesterola. Generalno, ostatak liganda je spojen sa trans-4-hidroksiprolinolom preko spojnice po izboru, kako je opisano u prethodnim primerima, i dobijen je ostatak hidroksiprolinol-ligand. Ostatak hidroksiprolinol-ligand je zatim vezan za čvrsti nosač preko sukcinatnog linkera, ili je konvertovan u fosforamidit putem standardnih uslova fosfitilacije, dajući željene gradivne blokove konjugovanog ugljenog hidrata. Fluoroforom označene siRNK su sintetisane iz odgovarajućih fosforamidita ili čvrstog nosača, nabavljenog od Biosearch Technologies. Oleil litoholni (GalNAc)3polimerni nosač je interno napravljen sa 38,6 µmol/gram. Manozni (Man)3polimerni nosač je interno napravljen sa 42,0 µmol/gram.
[0342] Konjugacija izabranog liganda na željenoj poziciji, na primer na 5'-kraju sekvence, postignuta je kuplovanjem odgovarajućeg fosforamidita sa rastućim lancem pod standardnim uslovima kuplovanja fosforamidita, ako nije drugačije naznačeno. Produženo vezivanje od 15 minuta 0,1 M rastvora fosforamidita u anhidrovanom CH3CN u prisustvu aktivatora 5-(etiltio)-1H-tetrazola u oligonukleotidu vezanom za čvrstu podlogu. Oksidacija internukleotidnog fosfita u fosfat je obavljena korišćenjem standardnog joda-vode kako je objavljeno u Beaucage, S.L. (2008) Solid-phase synthesis of siRNA oligonucleotides. Curr. Opin. Drug Discov. Devel., 11, 203-216; Mueller, S., Wolf, J. i Ivanov, S.A. (2004) Current Strategies for the Synthesis of RNA. Curr. Org. Synth., 1, 293-307; Xia, J., Noronha, A., Toudjarska, I., Li, F., Akinc, A., Braich, R., Frank-Kamenetsky, M., Rajeev, K.G., Egli, M. i Manoharan, M. (2006) Gene Silencing Activity of siRNAs with a Ribo-difluorotoluyl Nucleotide. ACS Chem. Biol., 1, 176-183, ili putem tretiranja terc-butil hidroperoksidom/acetonitrilom/vodom (10: 87: 3) sa vremenom čekanja oksidacije konjugovanog oligonukleotida od 10 min. Fosforotioat je uveden putem oksidacije fosfita u fosforotioat putem korišćenja reagensa za transfer sumpora poput DDTT (kupljen od AM Chemicals), PADS i/ili Beaucage reagensa. Holesterol fosforamidit je sintetisan interno, i korišćen u koncentraciji od 0,1 M u dihlormetanu. Vreme kuplovanja holesterol fosforamidita je bilo 16 minuta.
2. Deprotekcija- I (deprotekcija nukleobaze)
[0343] Po završetku sinteze, nosač je prenet u staklenu bocu od 100 ml (VWR). Oligonukleotid je otcepljen sa nosača uz istovremenu deprotekciju baze i fosfatnih grupa sa 80 ml smeše etanolnog rastvora amonijaka [amonijak : etanol (3:1)] tokom 6,5 h na 55°C. Boca je kratko ohlađena na ledu, pa je etanolno amonijačna smeša filtrirana u novu bocu od 250 ml. CPG je ispran sa 2 x 40 ml etanola/vode (1:1 V/V). Zapremina smeše je zatim smanjena do ∼ 30 ml pomoću rotacionog uparivača. Smeša je zatim zaleđena na suvom ledu i osušena pod vakuumom na brzom vakuum uređaju.
3. Deprotekcija-II (uklanjanje 2' TBDMS grupe)
[0344] Osušeni ostatak je ponovo suspendovan u 26 ml trietilamina, trietilamin trihidrofluorida (TEA.3HF) ili piridin-HF i DMSO (3:4:6) i zagrevan na 60°C tokom 90 minuta kako bi se uklonile terc-butildimetilsilil (TBDMS) grupe na poziciji 2'. Reakcija je zatim prekinuta sa 50 ml 20 mM natrijum acetata, i pH je podešen na 6,5, i čuvana je u zamrzivaču do prečišćavanja.
4. Analiza
[0345] Oligonukleotidi su analizirani tečnom hromatografijom visokih performansi (HPLC) pre prečišćavanja, a izbor pufera i kolone zavisi od prirode sekvence i ili konjugovanog liganda.
5. HPLC prečišćavanje
[0346] Oligonukleotidi konjugovani sa ligandom su prečišćeni putem reversnofazne preparativne HPLC. Nekonjugovani oligonukleotidi su prečišćeni anjonsko izmenjivačkom HPLC na interno spakovanoj koloni sa TSK gelom. Puferi su bili 20 mM natrijum fosfat (pH 8,5) u 10% CH3CN (pufer A) i 20 mM natrijum fosfat (pH 8,5) u 10% CH3CN, 1M NaBr (pufer B). Frakcije koje sadrže oligonukleotide pune dužine su sakupljene, desalinizovane i liofilizovane. Približno 0,15 OD desalinizovanih oligonukleotida je razblaženo u vodi do 150 µl, a zatim pipetom prebačeno u posebne bočice za CGE i LC/MS analizu. Jedinjenja su konačno analizirana putem LC-ESMS i CGE.
6. Priprema agensa RNKi
[0347] Za pripremu agensa RNKi, ekvimolarne količine sens i antisens lanca su zagrevane u 1xPBS na 95°C tokom 5 minuta i polako ohlađene do sobne temperature. Integritet dupleksa je potvrđen pomoću HPLC analize. Tabela 1 u nastavku prikazuje agense RNKi koji ciljaju mRNK TTR čoveka ili glodara.
(Primer 4: In vitro skrining agenasa RNKi
Ćelijska kultura i transfekcije
[0348] Humane Hep3B ćelije ili pacovske H.II.4.E ćelije (ATCC, Manassas, VA) uzgajane su skoro do konfluence na 37°C u atmosferi 5% CO2 u RPMI (ATCC) sa dodatkom 10% FBS, streptomicina i glutamina (ATCC), pa su otpuštene sa ploče putem tripsinizacije. Transfekcija je obavljena dodavanjem 14,8 µl Opti-MEM i 0,2 µl reagensa Lipofectamine RNAiMax po bunarčiću (Invitrogen, Carlsbad CA. kat. br.13778-150) u 5 µl dupleksa siRNK po bunarčiću, na ploču sa 96 bunarčića, i inkubiranjem na sobnoj temperaturi tokom 15 minuta. 80 µl kompletnog medijuma za rast bez antibiotika koji sadrži ∼2 x104 Hep3B ćelija je zatim dodato u smešu siRNK. Ćelije su inkubirane 24 sata ili 120 sati pre prečišćavanja RNK. Eksperimenti sa jednom dozom su izvedeni u finalnim koncentracijama dupleksa od 10 nM i 0,1 nM, a eksperimenti sa doznim odgovorom su izvedeni pomoću 8, 4-strukih serijskih razblaženja sa maksimalnom dozom od 10 nM finalne koncentracije dupleksa.
Potpuno izolovanje RNK korišćenjem kompleta za izolovanje mRNK DYNABEADS (Invitrogen, deo br: 610-12)
[0349] Ćelije su sakupljene i lizirane u 150 µl pufera za lizu/vezujućeg pufera, a zatim mešane tokom 5 minuta pri 850 o/min pomoću uređaja Eppendorf Thermomixer (brzina mešanja je bila ista tokom celog procesa). Deset mikrolitara magnetnih perli i 80 µl smeše pufera za lizu/vezujućeg pufera je dodato na ploču sa okruglim dnom i mešano 1 minut. Magnetne perle su uhvaćene korišćenjem magnetnog postolja, i supernatant je uklonjen bez remećenja perli. Nakon uklanjanja supernatanta, lizirane ćelije su dodate preostalim perlama i mešane tokom 5 minuta. Nakon uklanjanja supernatanta, magnentne perle su isprane 2 puta sa 150 µl pufera za ispiranje A i mešane 1 minut. Perle su ponovo uhvaćene, i supernatant je uklonjen. Perle su zatim isprane sa 150 µl pufera za ispiranje B, uhvaćene, i supernatant je uklonjen. Perle su zatim isprane sa 150 µl pufera za eluiranje, uhvaćene, i supernatant je uklonjen. Perle su ostavljene da se suše tokom 2 minuta. Nakon sušenja, 50 µl pufera za eluiranje je dodato i mešano tokom 5 minuta na 70°C. Perle su uhvaćene na magnetu tokom 5 minuta. 40 µl supernatanta je uklonjeno i dodato drugoj ploči sa 96 bunarčića.
Sinteza cDNK pomoću kompleta za reversnu transkripciju cDNK velikog kapaciteta ABI (Applied Biosystems, Foster City, CA, kat. br. 4368813)
1
[0350] Osnovna smeša od 1 µl 10X pufera, 0,4 µl 25X dNTP, 1 µl nasumičnih prajmera (Random Primers), 0,5 µl reversne transkriptaze, 0,5 µl inhibitora RNaze i 1,6 µl H2O po reakciji dodato je u 5 µl ukupne RNK. cDNK je dobijena koristeći toplotni ciklizator Bio-Rad C-1000 ili S-1000 (Hercules, CA) u sledećim koracima: 25 °C 10 min, 37 °C 120 min, 85 °C 5 s, 4 °C zadržavanje.
PCR u realnom vremenu
[0351] 2 µl cDNK je dodato u osnovnu smešu sa 0,5 µl probe GAPDH TaqMan (Applied Biosystems kat. br.4326317E (humani) kat. br.4308313 (glodar)), 0,5 µl probe TTR TaqMan (Applied Biosystems kat. br. HS00174914_ml (humani) kat. br. Rn00562124_ml (pacov)) i 5 µl probe osnovne smeše Lightcycler 480 (Roche kat. br.04887301001) po bunarčiću na ploči sa 384 bunarčića (Roche kat. br.04887301001). PCR u realnom vremenu je izvršena u aparatu Roche LC 480 Real Time PCR (Roche). Svaki dupleks je ispitan u najmanje dve nezavisne transfekcije, i svaka transfekcija je ispitana u duplikatu, ako nije drugačije naznačeno.
[0352] Da bi se izračunala relativna promena, podaci u stvarnom vremenu su analizirani koristeći ΔΔCt postupak i normalizovani su na testove izvedene sa ćelijama transficiranim sa 10 nM AD-1955, ili lažno transficiranim ćelijama. Vrednosti IC50su izračunate koristeći model podešavanja 4 parametra, koristeći XLFit, i normalizovane su na ćelije transficirane sa AD-1955 (sens sekvenca: cuuAcGcuGAGuAcuucGAdTsdT (SEQ ID NO: 2202); antisens sekvenca: UCGAAGuCUcAGCGuAAGdTsdT (SEQ ID NO: 2203)) ili naivne ćelije u istom doznom opsegu, ili na svoju najnižu dozu. Vrednosti IC50su izračunate za svaku pojedinačnu transfekciju, kao i u kombinaciji, gde je pojedinačna vrednost IC50podešena prema podacima obe transfekcije.
Rezultati utišavanja gena primera dupleksa siRNK sa različitim modifikacijama motiva iz pronalaska prikazani su u Tabeli 1 iznad.
Primer 5: In vitro aktivnost utišavanja hemijski modifikovanih agenasa RNKi koji ciljaju TTR
[0353] Sledeći eksperimenti su pokazali korisno dejstvo hemijskih modifikacija, uključujući uvođenje motiva trostrukih ponavljanja, zajedno sa GalNAc3ligandom, na aktivnost utišavanja agenasa RNKi koji ciljaju TTR. Sekvence ispitivanih agenasa su obezbeđene u Tabeli 2 u nastavku. Regioni komplementarnosti sa mRNK TTR su sledeći: region komplementarnosti RNKi agenasa AD-45165, AD-51546 i AD-51547 je GGATGGGATTTCATGTAACCAAGA
1
(SEQ ID NO: 2204), a region komplementarnosti agenasa RNKi AD-45163, AD-51544 i AD-51545 je TTCATGTAACCAAGAGTATTCCAT (SEQ ID NO: 2205).
Protokol za procenu IC50 u Hep3B ćelijama
[0354] IC50za svaku modifikovanu siRNK je određena u Hep3B ćelijama (ćelijska linija humanog hepatoma) pomoću standardnog reverznog transficiranja korišćenjem Lipofectamine RNAiMAX. Ukratko, reverzna transfekcija je obavljena dodavanjem 5 µl Opti-MEM u 5 µl dupleksa siRNA po bunarčiću na ploču sa 96 bunarčića zajedno sa 10 µl Opti-MEM i 0,5 µl Lipofectamine RNAiMax po bunarčiću (Invitrogen, Carlsbad CA. kat. br. 13778-150) i inkubiranjem na sobnoj temperaturi tokom 15-20 minuta. Nakon inkubacije, 100 µl kompletnog medijuma za rast bez antibiotika koji sadrži 12.000-15.000 Hep3B ćelija je zatim dodato u svaki bunarčić. Ćelije su inkubirane 24 sata na 37°C u atmosferi 5% CO2pre liziranja i analize mRNK TTR i GAPDH pomoću bDNK (Quantigene). Sedam različitih koncentracija siRNK u rasponu od 10 nM do 0,6 pM je procenjeno radi utvrđivanja IC50, i TTR/GAPDH za siRNK transficirane ćelije je normalizovan na ćelije transficirane sa 10 nM Luc siRNK. Rezultati su prikazani u Tabeli 2.
Protokol za procenu IC50 slobodnog unosa
[0355] Utišavanje slobodnim unosom u primarnim hepatocitima cinomolgusa procenjeno je nakon inkubacije sa siRNK TTR tokom 4 sata ili 24 sata. Utišavanje je mereno 24 sata nakon inicijalne izloženosti. Ukratko, ploče sa 96 bunarčića za uzgajanje su premazane sa 0,05%-0,1% kolagena (Sigma C3867-1VL) na sobnoj temperaturi, 24 sata pre početka eksperimenta. Na dan ocenjivanja, siRNK su razblažene u prethodno zagrejanom medijumu za nanošenje na ploču koji se sastoji od DMEM sa dodatkom kompleta za održavanje medijuma GIBCO (bez seruma, Life Technologies CM4000), i dodate su na ploče za uzgajanje sa 96 bunarčića premazane kolagenom. Primarni hepatociti cinomolgusa čuvani u zamrzivaču su brzo otopljeni u vodenom kupatilu na 37°C, i odmah su razblaženi medijumom za nanošenje na ploču do koncentracije od 360.000 ćelija/ml. Zapremina ćelijske suspenzije je pažljivo pipetirana na prethodno nanete na ploču siRNK, tako da je finalni broj ćelija bio 18.000 ćelija/bunarčiću. Ploča je blago zarotirana radi mešanja i ravnomernog rasprostiranja ćelija u bunarčićima, i stavljena u inkubator na 37°C, 5% CO2tokom 24 sata pre lize i analize TTR u GAPDH mRNK putem bDNK (Quantigene, Affymetrix). U slučaju 4 h inkubacije sa siRNK, medijum je odliven nakon 4 sata izloženosti ćelijama, i zamenjen svežim medijumom za nanošenje na ploču za preostalih 20 sati inkubacije. Nishodna analiza za TTR i GAPDH mRNK je ista kao
2
što je gore opisano. Za tipičnu krivu doznog odgovora, siRNKsu titrisane od 1 uM do 0,24 nM sa 4-strukim serijskim razblaženjem.
Tabela 2: Sažetak in vitro aktivnosti za naizmenični TTR-GalNAc i varijante sa trostrukim motivima
Nukleotidi napisani malim slovom (a, u, g, c) označavaju 2'-O-metil nukleotide; Nf (npr. Af) označava 2'-fluor nukleotide; s označava fosforotioatnu vezu; L96 označava GalNAc3ligand; podebljano napisani nukleotidi označavaju promenu u odnosu na odgovarajući matični agens. Svaki podebljani nukleotid je u centru trostrukog motiva.
[0356] Rezultati su prikazani u Tabeli 2, i pokazuju da modifikovani agensi RNKi koji ciljaju
2 1
TTR pružaju poboljšanu aktivnost utišavanja.
Rezultati: Poboljšana aktivnost modifikovanih agenasa RNKi
[0357] Matični agensi RNKi sa naizmeničnim hemijskim modifikacijama i GalNAc3ligand dali su IC50u Hep3B ćelijama od oko 0,01 nM. Kao što je prikazano na slikama 4-5 i u Tabeli 2, agensi modifikovani u odnosu na matične agense, na primer, dodavanjem jednog ili više ponavljajućih tripleta modifikacija 2'-fluor i 2'-O-metil, pokazali su neočekivano pojačanu aktivnost utišavanja, dostižući IC50vrednosti u Hep3B ćelijama koje su bile 5-8 puta bolje od odgovarajućeg matičnog agensa.
Rezultati: IC50 slobodnog unosa u Hep3B ćelijama
[0358] Kao što je prikazano u Tabeli 2 i na slikama 6-7, agensi RNKi modifikovani u odnosu na matični AD-45163 takođe su pokazivali poboljšano utišavanje kod slobodnog unosa. Modifikovani agensi su pokazali više nego dvostruku aktivnost utišavanja u odnosu na matične nakon perioda inkubacije od 24 sata, i skoro 10-struku aktivnost utišavanja u odnosu na matične nakon perioda inkubacije od 4 sata.
[0359] Kao što je prikazano u Tabeli 2 i na slikama 8-9, agensi RNKi modifikovani u odnosu na matični AD-45165 takođe su pokazivali povećano utišavanje kod slobodnog unosa. Modifikovani agensi su pokazali 2-3 puta veću aktivnost utišavanja u odnosu na matične nakon perioda inkubacije od 24 sata, i 5-8-puta veću aktivnost utišavanja u odnosu na matične nakon perioda inkubacije od 4 sata.
[0360] Ovi rezultati zajedno pokazuju da su ovde predstavljeni modifikovani agensi RNKi, npr. AD-51544, AD-51545, AD-51546 i AD-51547, pokazali neočekivano dobru inhibiciju mRNK TTR u in vitro eksperimentima utišavanja.
Primer 6: Utišavanje mRNK TTR i supresija TTR proteina kod transgenih miševa [0361] Da bi se procenila efikasnost agenasa RNKi AD-45163, AD-51544, AD-51545, AD45165, AD-51546 i AD-51547, ti agensi su dati transgenim miševima koji eksprimiraju humani transtiretin sa mutacijom V30M (vidite Santos, SD., Fernaandes, R., i Saraiva, MJ. (2010) Neurobiology of Aging, 31, 280-289). Za mutaciju V30M je poznato da izaziva familijarnu amiloidnu polineuropatiju tipa I kod ljudi. Vidite, npr. Lobato, L. (2003) J Nephrol., 16(3):438-42.
2 2
[0362] Agensi RNKi (u PBS puferu) ili PBS kontrola su dati miševima (2 mužjaka i 2 ženke) starosti 18-24 meseca u jednoj supkutanoj dozi od 5 mg/kg ili 1 mg/kg. Nakon oko 48 sati, miševi su anestezirani sa 200 µl ketamina, pa su zatim iskrvarili zasecanjem desne kaudalne arterije. Izolovana su bela krvna zrnca i plazma i čuvani na -80°C do ispitivanja. Sakupljeno je tkivo jetre, brzo zamrznuto i čuvano na -80°C do obrade.
[0363] Efikasnost tretmana je ocenjena putem (i) merenja mRNK TTR u jetri 48 sati posle doze, i (ii) merenja TTR proteina u plazmi pre puštanja krvi i 48 sati posle doze. Nivoi mRNK TTR u jetri su ispitivani korišćenjem testova razgranate DNK- QuantiGene 2.0 (Panomics kat. br. QS0011). Ukratko, uzorci jetre miševa su samleveni, i pripremljeni su lizati tkiva. Smeša za lizu jetre (mešavina 1 zapremine smeše za lizu, 2 zapremine vode bez nukleaze i 10 ul proteinaze-K/ml za konačnu koncentraciju od 20 mg/ml) inkubirana je na 65°C tokom 35 minuta. 20 µl kompleta za radnu probu (TTR proba za ciljni gen i GAPDH za endogenu kontrolu) i 80 ul lizata tkiva je zatim dodato na ploču za hvatanje. Ploče za hvatanje su inkubirane na 55 °C ±1°C (oko 16-20 h). Sledećeg dana, ploče za hvatanje su isprane 3 puta 1X puferom za ispiranje (voda bez nukleaze, komponenta pufera 1 i komponenta pufera za ispiranje 2), zatim osušene centrifugiranjem tokom 1 minuta na 240 g.100 µl radnog reagensa za pre amplifikacije dodato je na ploču za hvatanje, koja je zatvorena aluminijumskom folijom i inkubirana 1 sat na 55°C ±1°C. Nakon 1 h inkubacije, ponovljen je korak ispiranja, pa je dodato 100 µl radnog reagensa za amplifikaciju. Nakon 1 sata, koraci ispiranja i sušenja su ponovljeni, i dodato je 100 µl probe za obeležavanje. Ploče za hvatanje su inkubirane na 50°C ± 1°C tokom 1 sata. Ploča je zatim isprana 1X puferom za ispiranje, osušena, i na ploču za hvatanje je dodato 100 µl supstrata. Ploče za hvatanje su nakon 5 do 15 minuta inkubacije očitane pomoću luminometra SpectraMax. Podaci za bDNK su analizirani oduzimanjem prosečne osnovne vrednosti od svakog uzorka urađenog u triplikatu, određivanjem proseka za dobijeni trostruki GAPDH (kontrolna proba) i TTR (eksperimentalna proba), a zatim izračunavanjem odnosa: (eksperimentalna proba – osnovna vrednost)/(kontrolna proba – osnovna vrednost).
[0364] Nivoi TTR u plazmi su procenjeni korišćenjem komercijalno dostupnog kompleta „AssayMax Human Prealbumin ELISA Kit“ (AssayPro, St. Charles, MO, kataloški br. EP3010-1) prema smernicama proizvođača. Ukratko, mišja plazma je razblažena 1:10.000 u 1X mešanim razblaživačima, i dodata je na prethodno premazane ploče uz standarde iz
2
kompleta, i inkubirana 2 sata na sobnoj temperaturi, i zatim 5X isprana puferom za ispiranje iz kompleta. Pedeset mikrolitara biotinilovanog prealbuminskog antitela je dodato u svaki bunarčić i inkubirano tokom 1 h na sobnoj temperaturi, nakon čega sledi 5X ispiranje puferom za ispiranje. Pedeset mikrolitara konjugata streptaviidn-peroksidaze je dodato u svaki bunarčić, i ploče su inkubirane tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi, nakon čega sledi ispiranje, kao što je prethodno opisano. Reakcija je razvijena dodavanjem 50 µl/bunarčiću supstrata hromogena i inkubiranjem 10 minuta na sobnoj temperaturi, uz zaustavljanje reakcije dodavanjem 50 µl/bunarčiću zaustavnog rastvora. Apsorbanca na 450 nm je očitana na čitaču mikroploča Versamax (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) i podaci su analizirani korišćenjem softverskog paketa Softmax 4.6 (Molecular Devices).
[0365] Rezultati su prikazani na slikama 10-12. Slika 10 pokazuje da su agensi RNKi modifikovani u odnosu na matične agense AD-45163 i AD-45165 pokazali aktivnost utišavanja RNK koja je bila slična ili jača u poređenju sa aktivnošću matičnih agenasa. Slika 11 pokazuje da su agensi AD-51544 i AD-51545 pokazali aktivnost utišavanja zavisnu od doze, i da je aktivnost utišavanja ovih agenasa pri dozi od 5mg/kg bila slična aktivnosti odgovarajućeg matičnog AD-45163. Slika 12 pokazuje da agensi AD-51546 i AD-51547 takođe pokazuju aktivnost utišavanja zavisnu od doze. Nadalje, aktivnost utišavanja AD-51546 i AD-51547 pri dozi od 5mg/kg bila je veća u odnosu na aktivnost odgovarajućeg matičnog AD-45165.
Primer 7: Farmakokinetički profili seruma i jetre agenasa RNKi koji ciljaju TTR u miševima
[0366] Da bi se procenili farmakokinetički profili agenasa RNKi AD-45163, AD-51544, AD-51545, AD-51546 i AD-51547, ti agensi, u PBS puferu, dati su C57BL/6 miševima korišćenjem jednog i.v. bolusa ili supkutane (SC) primene. Koncentracije agenasa u plazmi i koncentracije u jetri su procenjene u različitim terminima nakon primene.
[0367] Farmakokinetički parametri plazme su predstavljeni u Tabelama 3 i 4 u nastavku. Prosečno vreme zadržavanja u plazmi (MRT) bilo je oko 0,2 sata nakon i.v. doze, i oko 1 sat nakon SC doze. Pri dozi od 25 mg/kg, AD-51544, AD-51545, AD-51546 i AD-51547 su pokazali slična farmakokinetička svojstva plazme. Svaki od ovih agenasa je imao više od 75% bioraspoloživosti iz supkutanog prostora. Njihova bioraspoloživost je bila veća u odnosu na matični agens AD-45163 koji je primenjen u većoj dozi od 30 mg/kg. Supkutana
2 4
bioraspoloživost AD-51544 i AD-51547 je bila oko 100%, dok je bioraspoloživost AD-51545 bila 90%, a za AD-5154676%.
Tabela 3: Sažetak procena PK parametara plazme nakon SC primene TTR-GalNAc siRNK kod miševa
30 mg/kg 25 mg/kg 25 mg/kg 25 mg/kg 25 mg/kg Parametar
Tabela 4: PK parametri siRNK plazme kod miševa nakon i.v. bolusa ili SC doze AD-51544, 51545, 51546 ili 51547 pri 25 mg/kg
2
[0368] Rezultati takođe pokazuju da su agensi RNKi AD-45163, AD-51544, AD-51545, AD-51546 i AD-51547 postigli slične ili veće koncentracije u jetri kada su primenjeni supkutano nego kada su primenjeni putem i.v. bolusa. Farmakokinetički parametri jetre su predstavljeni u Tabelama 5 i 6 u nastavku. Pik koncentracije (Cmax) i površina ispod krive (AUC0-last) u jetri bili su dva do tri puta veći nakon supkutane primene u poređenju sa i.v. primenom istog agensa u istoj dozi. Izloženost jetre je bila najveća kod AD-51547 a najmanja kod AD-51545. Prosečno vreme zadržavanja (MRT) i poluživot eliminacije bili su duži za AD-51546 i AD-51547 u poređenju sa AD-51544 i AD-51545. Nakon supkutane primene, približno MRT je bilo 40 sati za AD-51546 i 25 sati za AD-51547, dok je MRT za AD-51544 i AD-51545 bilo niže (oko 6-9 sati). Poluživot eliminacije AD-51546 i AD-51547 je takođe bio viši (41-53 sati) od poluživota eliminacije AD-51544 i AD-51545 (6-10 sati).
Tabela 5: Sažetak procena PK parametara jetre nakon SC primene TTR-GalNAc siRNK kod miševa
2
Tabela 6: siRNK PK parametri jetre kod miševa nakon i.v. bolusa ili SC doze AD-51544, 51545, 51546 ili 51547 pri 25 mg/kg
Primer 8: In vitro stabilnost agenasa RNKi u serumu majmuna
[0369] Stabilnost agenasa RNKi AD-51544, AD-51545, AD-51546 i AD-51547 u serumu je takođe procenjena kod majmuna. Rezultati su pokazali da su antisens i sens lanci AD-51544, AD-51545, i AD-51547 imali stabilnost u serumu u periodu od oko 24 sata (podaci nisu prikazani).
Primer 9: Agensi RNKi su ostvarili dugotrajnu supresiju TTR proteina kod primata koji nisu ljudi
[0370] RNK utišavajuća aktivnost agenasa RNKi AD-45163, AD-51544, AD-51545, AD-51546 i AD-51547 je procenjena merenjem supresije TTR proteina u serumu majmuna cinomolgus nakon supkutane primene pet doza od 5 mg/kg (jedna doza svakog dana tokom 5 dana) ili jedne doze od 25 mg/kg. Nivoi TTR proteina u serumu pre doze su procenjeni
2
uprosečavanjem nivoa 11 dana pre prve doze, 7 dana pre prve doze i 1 dan pre prve doze. Nivoi TTR proteina u serumu posle doze su procenjeni utvrđivanjem nivoa u serumu počevši od 1. dana nakon poslednje doze (tj.5. studijskog dana u grupi sa 5x5 mg/kg i 1. studijskog dana u grupi sa 1x25 mg/kg) do 49 dana nakon poslednje doze (tj. 53. studijski dan u grupi sa 5x5 mg/kg i 49. studijski dan u grupi sa 1x25 mg/kg). Vidite sliku 13.
[0371] Nivoi TTR proteina su procenjeni kako je opisano u primeru 6. Rezultati su prikazani na slici 14 i u Tabelama 7 i 8.
[0372] Maksimalna supresija TTR proteina do oko 50% je ostvarena u grupama koje su dobile 25 mg/kg AD-45163, AD-51544, AD-51546 i AD-51547 (vidite Tabelu 8). Veća maksimalna supresija TTR proteina do oko 70% je ostvarena u grupama koje su dobile 5x5 mg/kg AD-45163, AD-51544, AD-51546 i AD-51547 (vidite Tabelu 7). Agens AD-51545 je doveo do manjeg stepena supresije u oba protokola primene. Značajna supresija od oko 20% ili više je potrajala do 49 dana nakon poslednje doze AD-51546 i AD-51547, i u protokolu sa 1x25 mg/kg i sa 5x5 mg/kg. Uopšteno, bolja supresija je postignuta u protokolu sa 5x5 mg/kg nego u protokolu sa 1x25 mg/kg.
Tabela 7 Frakcije transtiretina u serumu u odnosu na stanje pre doze kod majmuna cinomolgus (5 mg/kg dnevno tokom 5 dana)
Tabela 8 Frakcije transtiretina u serumu u odnosu na stanje pre doze kod majmuna cinomolgus (25 mg/kg)
2
Primer 10: Podnošljivost agenasa RNKi koji ciljaju TTR
Kod ocene citokina na testu pune krvi
[0373] Da bi se ocenila podnošljivost agenasa RNKi koji ciljaju TTR (uključujući AD-45163, AD-51544, AD-51545, AD-51546, i AD-51547), svaki agens je ispitan na testu pune krvi koristeći krv tri ljudska davaoca. Agensi su bili ili 300 nM transficirani DOTAP-om ili 1 µM bez reagensa za transfekciju (slobodna siRNK). Promena je bila manja od dvostruke za sledeće citokine/hemokine: G-CSF, IFN-γ, IL-10, IL-12 (p70), IL1β, IL-1ra, IL-6, IL-8, IP-10, MCP-1, MIP-1α, MIP-1β, TNFα. (Rezultati nisu prikazani).
In vivo procena
[0374] Kako bi se procenila in vivo podnošljivost, agensi RNKi su injektovani supkutano u CD1 miševe u dozi od 125 mg/kg. Nije uočena indukcija citokina 2, 4, 6, 24 ili 48 sati nakon supkutane injekcije AD-45163. Nije uočena značajna indukcija citokina 6 ili 24 sati nakon supkutane injekcije AD-51544, AD-51545, AD-51546 ili AD-51547.
[0375] Da bi se dalje procenila in vivo podnošljivost, više agenasa RNKi (uključujući AD-45163, AD-51544, AD-51545, AD-51546 i AD-51547) testirano je putem supkutane injekcije od 5 i 25 mg kod ne-humanih primata (majmuni cinomolgus) sa zapreminama doze od 1-2 ml po mestu. Eritemi i edemi nisu uočeni na mestima injektovanja.
Studija podnošljivosti pojedinačne SC doze kod pacova
[0376] Kako bi se procenila toksičnost, pacovima je injektovana jedna supkutana doza od 100, 250, 500 ili 750 mg/kg AD-45163 (vidite Tabelu 9). Urađene su sledeće procene: klinički znaci toksičnosti, telesna težina, hematologija, klinička biohemija i koagulacija, težina organa (jetra i slezina); gruba i mikroskopska ocena (bubreg, jetra, pluća, limfni čvor, slezina, testis, timus,
2
aorta, srce, creva (tanko i debelo)).
Tabela 9: Studija podnošljivosti pojedinačne SC doze kod pacova: 100, 250, 500 i 750 mg/kg AD-45163 kod pacova tipa Sprag-Doli
nivo doze ml/k rimene i acova ti a nekro si e
[0377] Rezultati su pokazali da nema kliničkih znakova toksičnosti povezanih sa ispitivanim proizvodom, efekata na telesnu težinu, težinu organa ili kliničku biohemiju. Nije uočena histopatologija na srcu, bubrezima, testisima, slezini, jetri i timusu. Postojao je porast WBC, neškodljiv i po malo povezan sa ispitivanim proizvodom (↑68%, prvenstveno pripisan porastu NEUT i MONO) pri 750 mg/kg. Ovi rezultati pokazuju da je jedna doza do 750 mg/kg dobro podnošljiva kod pacova.
Podnošljivost ponovljenih supkutanih primena kod pacova
[0378] Kako bi se procenila podnošljivost ponovljenih supkutanih primena AD-45163, dnevene supkutane injekcije od 300 mg/kg su davane tokom 5 dana, i nekropsija je obavljena 6. dana. Dizajn studije je prikazan u Tabeli 10.
Tabela 10: Studija podnošljivosti pet dnevnih ponovljenih doza kod pacova
Dozni nivo Konc. Broj toks. Nx 6.
21
[0379] Sledeće promenljive ishoda su procenjene: klinički znaci, telesna masa, hematologija, klinička biohemija i koagulacija, težina organa, gruba i mikroskopska ocena (jetra, slezina, bubreg, srce, GI trakt i prvo i poslednje mesto injektovanja). Rezultati su pokazali da nema kliničkih znakova povezanih sa ispitivanim proizvodom, efekata na telesnu težinu ili težinu organa, i takođe nije bilo nalaza kliničke hematologije ili biohemije povezanih sa ispitivanim proizvodom. Postojalo je moguće malo produženje aktiviranog parcijalnog tromboplastinskog vremena (APTT) 6. dana (20,4 prema 17,4 s). Histopatologija nije pokazala nalaze na jetri, slezini, srcu i GI traktu povezane sa ispitivanim proizvodom. U bubregu je primećena minimalna do blaga hipertrofija tubularnog epitela (neškodljiva). Na poslednjem mestu injekcije, postojala je minimalna multifokalna mononuklearna infiltracija, neškodljiva. Ovi rezultati pokazuju da je pet dnevnih doza od 300 mg/kg matičnog agensa RNKi AD-45163 dobro podnošljivo kod pacova.
Primer 11: Agensi RNKi su ostvarili dugotrajnu supresiju TTR proteina kod primata koji nisu ljudi
[0380] RNK utišavajuća aktivnost agensa RNKi AD-51547 je procenjena putem merenja supresije TTR proteina u serumu majmuna cinomolgus nakon supkutane primene „faze punjenja“ agensa RNKi: pet dnevnih doza od 2,5 mg/kg, 5 mg/kg ili 10 mg/kg (jedna doza svaki dan tokom 5 dana), nakon čega sledi „faza održavanja“ agensa RNKi: nedeljne doze od 2,5 mg/kg, 5 mg/kg ili 10 mg/kg tokom 4 nedelje. Nivoi TTR proteina u serumu pre doze su procenjeni uprosečavanjem nivoa 11 dana pre prve doze, 7 dana pre prve doze i 1 dan pre prve doze. Nivoi TTR proteina u serumu posle doze su procenjeni utvrđivanjem nivoa u serumu u odnosu na početak pre doze 1. dana nakon što je faza punjenja završena do 40 dana nakon poslednje doze faze održavanja (tj.70. studijski dan).
[0381] Nivoi TTR proteina su procenjeni kako je opisano u primeru 6. Rezultati su prikazani na slici 15.
[0382] Maksimalna supresija TTR proteina do oko 80% je postignuta u svim grupama koje su dobijale 2,5 mg/kg, 5 mg/kg ili 10 mg/kg AD-51547. Najniža tačka opadanja postignuta je u svim grupama oko 14. dana, supresija je održana na najnižem nivou opadanja sa dozama nedeljnog održavanja od 2,5 mg/kg, 5 mg/kg ili 10 mg/kg AD-51547. Nivoi TTR se nisu vratili na početnu vrednost više od 40 dana nakon dana primene poslednje doze za održavanje za dozne nivoe od 5 i 2,5 mg/kg.

Claims (16)

  1. Patentni zahtevi 1. Dvolančani agens RNKi koji sadrži sens lanac komplementaran antisens lancu, pri čemu pomenuti antisens lanac sadrži region koji je suštinski komplementaran nukleotidnoj sekvenci 5'-GGATGGGATTTCATGTAACCAAGA-3' (SEQ ID NO:2204), pri čemu sens lanac ima ukupno 21 nukleotid, a antisens lanac ima ukupno 23 nukleotida, pri čemu, pomenuti dvolančani agens RNKi je predstavljen formulom (III):
    pri čemu: i, j, k, i l su svaki nezavisno 0 ili 1, pri čemu, i je 0, j je 1; p, p', q, i q' su svaki nezavisno 0-6; svako Nai Na' nezavisno predstavlja sekvencu oligonukleotida koja sadrži 0-25 modifikovanih nukleotida, svaka sekvenca sadrži najmanje dva različito modifikovana nukleotida; svako Nbi Nb' nezavisno predstavlja sekvencu oligonukleotida sa 0-10 modifikovanih nukleotida; pri čemu, modifikacije su 2'-O-metil, 2'-fluor, ili obe; svako np, np', nqi nq' nezavisno predstavlja nukleotid prepusta; XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y' i Z'Z'Z' nezavisno predstavljaju jedan motiv od tri identične modifikacije na tri uzastopna nukleotida; pri čemu Y nukleotidi sadrže modifikaciju 2'-fluor, a Y' nukleotidi sadrže modifikaciju 2'-O-metil, pri čemu, pomenuti motiv YYY se javlja na pozicijama 9, 10 i 11 kada region dupleksa ima 21 nukleotid; pri čemu, sens lanac je konjugovan sa najmanje jednim ligandom, pri čemu, ligand je jedan ili više derivata GalNAc povezanih putem dvovalentnog ili trovalentnog razgranatog linkera; pri čemu „suštinski komplementaran“ znači ne više od 2 neusklađeno sparena bazna para u okviru 2 nukleotida 5' i/ili 3' terminusa; i pri čemu, fosforotioat je prisutan u poslednja 2 nukleotida na jednom ili oba terminusa.
  2. 2. Agens RNKi iz zahteva 1, pri čemu, k je 0 i l je 1.
  3. 3. Agens RNKi iz zahteva 1 ili 2, pri čemu (a) YYY je komplementarno sa Y'Y'Y', i ZZZ je komplementarno sa Z'Z'Z'; i/ili (b) motiv Y'Y'Y' se javlja na pozicijama 11, 12 i 13 antisens lanca od 5'-kraja.
  4. 4. Agens RNKi iz bilo kog od zahteva 1 do 3, pri čemu, region dupleksa je dužine 21 par nukleotida.
  5. 5. Agens RNKi iz bilo kog od zahteva 1 do 4, pri čemu, ligand je
    ; ili (b) povezan sa 3' krajem sens lanca.
  6. 6. Agens RNKi iz zahteva 5, pri čemu, agens RNKi je konjugovan sa ligandom kako je prikazano u sledećem šematskom prikazu
    pri čemu, X je O ili S, ili kako je prikazano na sledećem šematskom prikazu
  7. 7. In vitro ćelija koja sadrži dvolančani agens RNKi iz bilo kog od zahteva 1 do 6.
  8. 8. Farmaceutska kompozicija koja sadrži agens RNKi iz bilo kog od zahteva 1 do 6.
  9. 9. Farmaceutska kompozicija iz zahteva 8, pri čemu (a) pomenuti agens RNKi se primenjuje (i) u nepuferovanom rastvoru, pri čemu je pomenuti nepuferovani rastvor poželjno fiziološki rastvor ili voda; (ii) sa puferovanim rastvorom, pri čemu pomenuti puferovani rastvor poželjno sadrži acetat, citrat, prolamin, karbonat ili fosfat ili bilo koju njihovu kombinaciju, pri čemu, pomenuti puferovani rastvor je poželjnije fiziološki rastvor puferovan fosfatom (PBS); ili (b) pomenuta farmaceutska kompozicija je (i) lipozom; ili (ii) lipidna formulacija.
  10. 10. In vitro postupak za inhibiranje ekspresije transtiretina (TTR) u ćeliji koji obuhvata dovođenje pomenute ćelije u kontakt sa agensom RNKi iz bilo kog od zahteva 1 do 6 ili sa farmaceutskom kompozicijom iz bilo kog od zahteva 8 ili 9 u količini koja je delotvorna za inhibiranje ekspresije pomenutog TTR u pomenutoj ćeliji, čime se inhibira ekspresija pomenutog transtiretina (TTR) u pomenutoj ćeliji, pri čemu, ekspresija pomenutog TTR je poželjno inhibirana najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80% ili najmanje 90%.
  11. 11. Agens RNKi iz bilo kog od zahteva 1 do 6 ili farmaceutska kompozicija iz zahteva 8 ili 9 za korišćenje u postupku za lečenje ili prevenciju bolesti povezane sa TTR kod ispitanika.
  12. 12. Agens ili kompozicija za upotrebu iz zahteva 11, pri čemu, ekspresija TTR u uzorku dobijenom od ispitanika je inhibirana najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80% ili najmanje 90%.
  13. 13. Agens ili kompozicija za upotrebu iz zahteva 11, pri čemu, pomenuti ispitanik je čovek.
  14. 14. Agens ili kompozicija za upotrebu iz zahteva 11, pri čemu, pomenuti ispitanik je ispitanik koji (a) boluje od bolesti povezane sa TTR; ili (b) pod rizikom je od nastanka bolesti povezane sa TTR.
  15. 15. Agens ili kompozicija za upotrebu iz bilo kog od zahteva 11 do 14, pri čemu pomenuti ispitanik ima mutaciju TTR gena koja je povezana sa razvojem bolesti povezane sa TTR, pri čemu, pomenuta bolest povezana sa TTR je poželjno izabrana iz grupe koja se sastoji od senilne sistemske amiloidoze (SSA), sistemske familijarne amiloidoze, familijarne amiloidne polineuropatije (FAP), familijarne amiloidne kardiomiopatije (FAC), leptomeningealne amiloidoze/amiloidoze centralnog nervnog sistema (CNS) i hipertiroksinemije.
  16. 16. Agens ili kompozicija za upotrebu iz bilo kog od zahteva 11 do 15, pri čemu pomenuti agens RNKi treba da se primenjuje u dozi od 0,05-50 mg/kg. 21
RS20200699A 2011-11-18 2012-11-16 Agensi rnki, kompozicije i postupci za njihovu primenu u lečenju bolesti povezanih sa transtiretinom (ttr) RS60414B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161561710P 2011-11-18 2011-11-18
US201261615618P 2012-03-26 2012-03-26
US201261680098P 2012-08-06 2012-08-06
EP17184486.3A EP3301177B1 (en) 2011-11-18 2012-11-16 Rnai agents, compositions and methods of use thereof for treating transthyretin (ttr) associated diseases

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS60414B1 true RS60414B1 (sr) 2020-07-31

Family

ID=48430225

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20200699A RS60414B1 (sr) 2011-11-18 2012-11-16 Agensi rnki, kompozicije i postupci za njihovu primenu u lečenju bolesti povezanih sa transtiretinom (ttr)

Country Status (38)

Country Link
US (5) US9399775B2 (sr)
EP (4) EP3730618A1 (sr)
JP (4) JP6165158B2 (sr)
KR (4) KR102385013B1 (sr)
CN (2) CN104080794B (sr)
AR (1) AR088911A1 (sr)
AU (5) AU2012340159B2 (sr)
BR (1) BR112014011896B1 (sr)
CA (2) CA2856243C (sr)
CL (3) CL2014001291A1 (sr)
CO (1) CO7020872A2 (sr)
CR (1) CR20140232A (sr)
CY (1) CY1123693T1 (sr)
DK (1) DK3301177T3 (sr)
DO (1) DOP2014000107A (sr)
EC (1) ECSP14005606A (sr)
ES (1) ES2800065T3 (sr)
GT (1) GT201400097A (sr)
HK (2) HK1200171A1 (sr)
HR (1) HRP20200672T1 (sr)
HU (1) HUE048622T2 (sr)
IL (6) IL293434B2 (sr)
IN (1) IN2014CN03463A (sr)
LT (1) LT3301177T (sr)
MX (3) MX391815B (sr)
MY (1) MY167390A (sr)
NI (1) NI201400046A (sr)
PE (1) PE20142362A1 (sr)
PH (1) PH12014501106B1 (sr)
PL (1) PL3301177T3 (sr)
PT (1) PT3301177T (sr)
RS (1) RS60414B1 (sr)
RU (1) RU2678807C2 (sr)
SG (2) SG10201912170WA (sr)
SI (1) SI3301177T1 (sr)
SM (1) SMT202000308T1 (sr)
UA (1) UA118649C2 (sr)
WO (1) WO2013075035A1 (sr)

Families Citing this family (221)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9228186B2 (en) 2002-11-14 2016-01-05 Thermo Fisher Scientific Inc. Methods and compositions for selecting siRNA of improved functionality
US9879266B2 (en) 2002-11-14 2018-01-30 Thermo Fisher Scientific Inc. Methods and compositions for selecting siRNA of improved functionality
US20050244869A1 (en) * 2004-04-05 2005-11-03 Brown-Driver Vickie L Modulation of transthyretin expression
MX360460B (es) 2008-10-20 2018-11-05 Alnylam Pharmaceuticals Inc Composiciones y metodos para inhibir la expresion de transtiretina.
PL2563920T3 (pl) 2010-04-29 2017-08-31 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulacja ekspresji transtyretyny
WO2013033230A1 (en) 2011-08-29 2013-03-07 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomer-conjugate complexes and their use
EP3730618A1 (en) * 2011-11-18 2020-10-28 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Rnai agents, compositions and methods of use thereof for treating transthyretin (ttr) associated diseases
SI3366775T2 (sl) 2011-11-18 2025-12-31 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Modificirana sredstva RNAI
AU2013299717B2 (en) 2012-08-06 2018-06-28 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Carbohydrate conjugated RNA agents and process for their preparation
IL292159B1 (en) 2012-12-05 2026-04-01 Alnylam Pharmaceuticals Inc PCSK9 iRNA compositions and methods of using them
IL288931B2 (en) * 2013-03-14 2025-05-01 Alnylam Pharmaceuticals Inc Compositions comprising a complementary portion of C5 IRNA and methods of using them
DK2992098T3 (da) 2013-05-01 2019-06-17 Ionis Pharmaceuticals Inc Sammensætninger og fremgangsmåder til modulering af hbv- og ttr-ekspression
WO2015006740A2 (en) 2013-07-11 2015-01-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide-ligand conjugates and process for their preparation
WO2015042564A1 (en) 2013-09-23 2015-03-26 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating or preventing transthyretin (ttr) associated diseases
CA2925107A1 (en) 2013-10-02 2015-04-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of the lect2 gene
US9994846B2 (en) * 2013-10-25 2018-06-12 Regulus Therapeutics Inc. MicroRNA compounds and methods for modulating miR-21 activity
US10150965B2 (en) 2013-12-06 2018-12-11 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the specific inhibition of transthyretin (TTR) by double-stranded RNA
SG10201804960RA (en) * 2013-12-12 2018-07-30 Alnylam Pharmaceuticals Inc Complement component irna compositions and methods of use thereof
EP3581654B1 (en) 2013-12-27 2021-03-31 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the specific inhibition of glycolate oxidase (hao1) by double-stranded rna
CN113057959B (zh) * 2014-02-11 2024-07-16 阿尔尼拉姆医药品有限公司 己酮糖激酶（KHK）iRNA组合物及其使用方法
JP6771387B2 (ja) * 2014-03-25 2020-10-21 アークトゥラス・セラピューティクス・インコーポレイテッドＡｒｃｔｕｒｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． 遺伝子サイレンシング用トランスサイレチン対立遺伝子選択的ｕｎａオリゴマー
US9856475B2 (en) 2014-03-25 2018-01-02 Arcturus Therapeutics, Inc. Formulations for treating amyloidosis
AU2015236215B2 (en) * 2014-03-25 2020-03-19 Arcturus Therapeutics, Inc. UNA oligomers having reduced off-target effects in gene silencing
WO2015168172A1 (en) 2014-04-28 2015-11-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Linkage modified oligomeric compounds
US9382540B2 (en) 2014-05-01 2016-07-05 Isis Pharmaceuticals, Inc Compositions and methods for modulating angiopoietin-like 3 expression
BR112016022742B1 (pt) 2014-05-01 2022-06-14 Ionis Pharmaceuticals, Inc Composto químico, composição compreendendo o composto e uso dos mesmos
HUE052709T2 (hu) 2014-05-01 2021-05-28 Ionis Pharmaceuticals Inc Módosított antiszensz oligonukleotidok konjugátumai és azok alkalmazása PKK expressziójának módosítására
EA036496B1 (ru) 2014-05-01 2020-11-17 Ионис Фармасьютикалз, Инк. Конъюгированные олигонуклеотиды для модулирования экспрессии фактора комплемента b
AU2015264038B2 (en) * 2014-05-22 2021-02-11 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Angiotensinogen (AGT) iRNA compositions and methods of use thereof
WO2015179693A1 (en) 2014-05-22 2015-11-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated antisense compounds and their use
IL316808A (en) 2014-08-20 2025-01-01 Alnylam Pharmaceuticals Inc Modified double-stranded RNA materials and their uses
CN113599539A (zh) 2014-08-29 2021-11-05 阿尔尼拉姆医药品有限公司 治疗甲状腺素运载蛋白（ttr）介导的淀粉样变性的方法
JP7242180B2 (ja) 2014-09-07 2023-03-20 セレクタ バイオサイエンシーズ インコーポレーテッド 抗ウイルス導入ベクター免疫応答を減弱化するための方法および組成物
US10436802B2 (en) 2014-09-12 2019-10-08 Biogen Ma Inc. Methods for treating spinal muscular atrophy
TW202503057A (zh) * 2014-10-10 2025-01-16 美商艾爾妮蘭製藥公司 用於抑制hao1(羥酸氧化酶1(乙醇酸鹽氧化酶))基因表現的組合物及方法
KR102545316B1 (ko) * 2014-11-10 2023-06-22 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 Ｂ형 간염 바이러스(ｈｂｖ) ｉｒｎａ 조성물 및 그의 이용 방법
JP2017535552A (ja) 2014-11-17 2017-11-30 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッドＡｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． アポリポタンパク質Ｃ３（ＡＰＯＣ３）ｉＲＮＡ組成物およびその使用方法
DK3569711T3 (da) 2014-12-15 2021-02-22 Dicerna Pharmaceuticals Inc Ligandmodificerede dobbeltstrengede nukleinsyrer
EP3234134B1 (en) 2014-12-17 2020-05-27 ProQR Therapeutics II B.V. Targeted rna editing
JP2018504380A (ja) * 2014-12-18 2018-02-15 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッドＡｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． Ｒｅｖｅｒｓｉｒ（商標）化合物
CA2976445A1 (en) 2015-02-13 2016-08-18 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Patatin-like phospholipase domain containing 3 (pnpla3) irna compositions and methods of use thereof
CA2979703A1 (en) * 2015-03-17 2016-09-22 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting gene expression of factor xii
US10519447B2 (en) 2015-04-01 2019-12-31 Arcturus Therapeutics, Inc. Therapeutic UNA oligomers and uses thereof
US10745702B2 (en) 2015-04-08 2020-08-18 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of the LECT2 gene
WO2016201301A1 (en) * 2015-06-12 2016-12-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Complement component c5 irna compositions and methods of use thereof
CN107849567B (zh) * 2015-06-26 2024-07-23 苏州瑞博生物技术股份有限公司 一种siRNA、含有该siRNA的药物组合物和缀合物及它们的应用
WO2017011286A1 (en) 2015-07-10 2017-01-19 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Insulin-like growth factor binding protein, acid labile subunit (igfals) and insulin-like growth factor 1 (igf-1) irna compositions and methods of use thereof
MX2018000412A (es) 2015-07-10 2018-03-14 Ionis Pharmaceuticals Inc Moduladores de diaciglicerol aciltransferasa 2 (dgat2).
WO2017015671A1 (en) 2015-07-23 2017-01-26 Arcturus Therapeutics, Inc. Compositions for treating amyloidosis
PT3329002T (pt) 2015-07-31 2021-01-12 Alnylam Pharmaceuticals Inc Composições de iarn de transtirretina (ttr) e métodos de seu uso para tratamento ou prevenção de doenças associadas à ttr
KR20180031025A (ko) 2015-07-31 2018-03-27 아크투루스 쎄라퓨틱스, 인크. 약물 전달을 위한 다중 리간드 제제
AU2016306275A1 (en) 2015-08-07 2018-02-08 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. RNAi therapy for Hepatitis B virus infection
CN108348541A (zh) 2015-08-25 2018-07-31 阿尔尼拉姆医药品有限公司 用于治疗前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶kexin(pcsk9)基因相关障碍的方法和组合物
CA2996873A1 (en) 2015-09-02 2017-03-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Programmed cell death 1 ligand 1 (pd-l1) irna compositions and methods of use thereof
CN108513588A (zh) 2015-09-24 2018-09-07 Ionis制药公司 Kras表达的调节剂
JOP20160211B1 (ar) * 2015-10-01 2021-08-17 Arrowhead Pharmaceuticals Inc تراكيب وأساليب لتثبيط تعبير جيني للـ lpa
PL4119569T3 (pl) 2015-11-06 2024-11-18 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Sprzężone związki antysensowne do zastosowania w terapii
KR20250078597A (ko) 2015-11-06 2025-06-02 아이오니스 파마수티컬즈, 인코포레이티드 아포리포프로테인 (a) 발현 조정
EP3387129A1 (en) 2015-12-10 2018-10-17 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. STEROL REGULATORY ELEMENT BINDING PROTEIN (SREBP) CHAPERONE (SCAP) iRNA COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF
AU2017213404A1 (en) 2016-01-29 2018-09-20 Kyowa Kirin Co., Ltd. Nucleic acid conjugate
CA3020585A1 (en) * 2016-04-11 2017-10-19 Arbutus Biopharma Corporation Targeted nucleic acid conjugate compositions
WO2017220751A1 (en) 2016-06-22 2017-12-28 Proqr Therapeutics Ii B.V. Single-stranded rna-editing oligonucleotides
JPWO2018003739A1 (ja) * 2016-06-30 2019-04-18 レナセラピューティクス株式会社 機能的リガンドを含む核酸複合体
TWI746590B (zh) 2016-06-30 2021-11-21 日商協和麒麟股份有限公司 核酸複合體
EP3484524B1 (en) 2016-07-15 2022-11-09 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for modulation of smn2
JOP20190015A1 (ar) 2016-08-04 2019-02-04 Arrowhead Pharmaceuticals Inc عوامل (ار ان ايه آي) لعدوى فيروس الالتهاب الكبدي الوبائي ب
CN110352244B (zh) 2016-09-01 2023-03-21 ProQR治疗上市公司Ⅱ 化学修饰的编辑rna的单链寡核苷酸
US11400161B2 (en) 2016-10-06 2022-08-02 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Method of conjugating oligomeric compounds
PE20210255A1 (es) 2016-12-01 2021-02-10 Takeda Pharmaceuticals Co Dinucleotido ciclico como agonistas de sting (estimulador de genes de interferon)
WO2018112320A1 (en) * 2016-12-16 2018-06-21 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating or preventing ttr-associated diseases using transthyretin (ttr) irna compositions
EP3571300A1 (en) 2017-01-19 2019-11-27 ProQR Therapeutics II B.V. Oligonucleotide complexes for use in rna editing
CN110612353A (zh) 2017-03-03 2019-12-24 加利福尼亚大学董事会 经由抑制性tRNAs和脱氨酶对突变进行RNA靶向
JOP20190215A1 (ar) 2017-03-24 2019-09-19 Ionis Pharmaceuticals Inc مُعدّلات التعبير الوراثي عن pcsk9
DK3607069T3 (da) * 2017-04-05 2022-11-21 Silence Therapeutics Gmbh Produkter og sammensætninger
MX2019012280A (es) * 2017-04-11 2020-01-23 Arbutus Biopharma Corp Composiciones dirigidas.
US11324820B2 (en) 2017-04-18 2022-05-10 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods for the treatment of subjects having a hepatitis b virus (HBV) infection
CA3069451A1 (en) 2017-07-13 2019-01-17 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods for inhibition of hao1 (hydroxyacid oxidase 1 (glycolate oxidase)) gene expression
TW201920668A (zh) * 2017-08-02 2019-06-01 日商協和醱酵麒麟有限公司 核酸複合體
WO2019027015A1 (ja) * 2017-08-02 2019-02-07 協和発酵キリン株式会社 核酸複合体
JP2019043857A (ja) * 2017-08-30 2019-03-22 花王株式会社 ＡｐｏＡ１又はＴＴＲ産生促進剤
JP7392954B2 (ja) 2017-09-18 2023-12-06 シーゼット・バイオハブ・エスエフ・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー トリプルネガティブ乳癌の治療方法
BR112020005230A2 (pt) 2017-09-19 2020-09-24 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. composições e métodos para o tratamento da amiloidose mediada por transtiretina (ttr)
EP3688161A1 (en) 2017-09-29 2020-08-05 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for ttr gene editing and treating attr amyloidosis
BR112020007157A2 (pt) 2017-10-13 2020-09-24 Selecta Biosciences, Inc. métodos e composições para a atenuação de respostas de igm antivetor de transferência viral
US20200385719A1 (en) 2017-11-16 2020-12-10 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Kisspeptin 1 (kiss1) irna compositions and methods of use thereof
EP3728593A1 (en) 2017-12-18 2020-10-28 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. High mobility group box-1 (hmgb1) irna compositions and methods of use thereof
AU2019206731A1 (en) 2018-01-15 2020-07-30 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulators of DNM2 expression
WO2019157531A1 (en) 2018-02-12 2019-08-15 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modified compounds and uses thereof
AU2019236469A1 (en) * 2018-03-12 2020-10-08 Corino Therapeutics, Inc. Combination therapy for TTR amyloidosis
EP3769769A4 (en) 2018-03-19 2022-05-04 National University Corporation Tokyo Medical and Dental University NUCLEIC ACID WITH REDUCED TOXICITY
CU20200082A7 (es) 2018-05-09 2021-06-08 Ionis Pharmaceuticals Inc Compuestos y métodos para la reducción de la expresión de fxi
TWI851574B (zh) 2018-05-14 2024-08-11 美商阿尼拉製藥公司 血管收縮素原（ＡＧＴ）ｉＲＮＡ組成物及其使用方法
GB201808146D0 (en) 2018-05-18 2018-07-11 Proqr Therapeutics Ii Bv Stereospecific Linkages in RNA Editing Oligonucleotides
US12496311B2 (en) 2018-07-17 2025-12-16 Aronora, Inc. Methods for safely reducing thrombopoietin
EP3833397A4 (en) 2018-08-08 2023-06-14 Arcturus Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS AND AGENTS AGAINST NON-ALCOHOLIC STEATOHEPATITIS
JP7625512B2 (ja) 2018-08-13 2025-02-03 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ｄｓＲＮＡ物質組成物およびその使用方法
US20210332367A1 (en) 2018-09-18 2021-10-28 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. KETOHEXOKINASE (KHK) iRNA COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF
TW202542311A (zh) 2018-09-19 2025-11-01 美商Ionis製藥公司 Pnpla3表現之調節劑
WO2020069055A1 (en) 2018-09-28 2020-04-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Transthyretin (ttr) irna compositions and methods of use thereof for treating or preventing ttr-associated ocular diseases
WO2020097044A1 (en) 2018-11-09 2020-05-14 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Modified double stranded oligonucleotides
AU2019390097A1 (en) 2018-11-30 2021-07-15 Kyowa Kirin Co., Ltd. Nucleic acid conjugate
CR20210395A (es) 2018-12-21 2021-11-05 Ionis Pharmaceuticals Inc Moduladores de la expresión de hsd17b13
GB201821269D0 (en) 2018-12-28 2019-02-13 Nippon Shinyaku Co Ltd Myostatin signal inhibitor
CN111377985B (zh) * 2018-12-29 2023-11-10 苏州瑞博生物技术股份有限公司 化合物和缀合物及其制备方法和用途
EP3956448A4 (en) * 2019-04-18 2022-10-19 University of Massachusetts AIM2 INHIBITORS AND USES THEREOF
CN114206396A (zh) 2019-05-28 2022-03-18 西莱克塔生物科技公司 用于减弱抗病毒转移载体免疫应答的方法和组合物
JP7692829B2 (ja) 2019-07-30 2025-06-16 塩野義製薬株式会社 Ｍｕｒｆ１を標的とする核酸医薬
EP4007812A1 (en) 2019-08-01 2022-06-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Serpin family f member 2 (serpinf2) irna compositions and methods of use thereof
EP4007811A2 (en) 2019-08-01 2022-06-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Carboxypeptidase b2 (cpb2) irna compositions and methods of use thereof
EP4013870A1 (en) 2019-08-13 2022-06-22 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Small ribosomal protein subunit 25 (rps25) irna agent compositions and methods of use thereof
KR20220062517A (ko) 2019-08-15 2022-05-17 아이오니스 파마수티컬즈, 인코포레이티드 결합 변형된 올리고머 화합물 및 이의 용도
EP4022062A1 (en) 2019-08-30 2022-07-06 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Neurofilament light chain (nfl) as a biomarker for transthyretin amyloidosis polyneuropathy
US12503699B2 (en) 2019-10-04 2025-12-23 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for silencing UGT1a1 gene expression
WO2021072330A1 (en) 2019-10-09 2021-04-15 Silverback Therapeutics, Inc. Galnac-tgfbr1 inhibitor conjugates for the treatment of liver diseases
WO2021074772A1 (en) 2019-10-14 2021-04-22 Astrazeneca Ab Modulators of pnpla3 expression
EP4045652A1 (en) 2019-10-18 2022-08-24 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Solute carrier family member irna compositions and methods of use thereof
WO2021081026A1 (en) 2019-10-22 2021-04-29 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Complement component c3 irna compositions and methods of use thereof
EP4051795A1 (en) 2019-11-01 2022-09-07 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Huntingtin (htt) irna agent compositions and methods of use thereof
WO2021092145A1 (en) 2019-11-06 2021-05-14 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Transthyretin (ttr) irna composition and methods of use thereof for treating or preventing ttr-associated ocular diseases
BR112022009216A2 (pt) 2019-11-13 2022-08-02 Alnylam Pharmaceuticals Inc Métodos e composições para tratar um distúrbio associado a angiotensinogênio (agt)
US12565653B2 (en) 2019-11-22 2026-03-03 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. ATAXIN3 (ATXN3) RNAi agent compositions and methods of use thereof
AU2020395113A1 (en) 2019-12-02 2022-06-09 Shape Therapeutics Inc. Therapeutic editing
KR20220115995A (ko) 2019-12-13 2022-08-19 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 인간 염색체 ９ 개방 판독 프레임 72 (C9orf72) iRNA 제제 조성물 및 이의 사용 방법
WO2021126734A1 (en) 2019-12-16 2021-06-24 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Patatin-like phospholipase domain containing 3 (pnpla3) irna compositions and methods of use thereof
EP4077666A1 (en) 2019-12-16 2022-10-26 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Patatin-like phospholipase domain containing 3 (pnpla3) irna compositions and methods of use thereof
US20230243834A1 (en) * 2020-01-17 2023-08-03 Mercy Bioanalytics, Inc. Compositions and methods for detection of ovarian cancer
US20210301287A1 (en) * 2020-01-22 2021-09-30 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Treatment Of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease, Non-Alcoholic Steatohepatitis, And Liver Fibrosis
CN114929729B (zh) 2020-01-30 2024-12-03 卫材R&D管理有限公司 核酸复合体及包含该核酸复合体的医药组合物
WO2021154941A1 (en) 2020-01-31 2021-08-05 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Complement component c5 irna compositions for use in the treatment of amyotrophic lateral sclerosis (als)
IL295445A (en) 2020-02-10 2022-10-01 Alnylam Pharmaceuticals Inc Preparations and methods for silencing vegf-a expression
JP7735288B2 (ja) 2020-02-18 2025-09-08 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド アポリポタンパク質Ｃ３（ＡＰＯＣ３）ｉＲＮＡ組成物およびその使用法
CN120505310A (zh) 2020-02-28 2025-08-19 Ionis制药公司 用于调节smn2的化合物和方法
EP4114947A1 (en) 2020-03-05 2023-01-11 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Complement component c3 irna compositions and methods of use thereof for treating or preventing complement component c3-associated diseases
BR112022017822A2 (pt) 2020-03-06 2022-11-08 Alnylam Pharmaceuticals Inc Composições de irna de cetoexocinase (khk) e métodos de uso das mesmas
CN115461460A (zh) 2020-03-06 2022-12-09 阿尔尼拉姆医药品有限公司 用于抑制转甲状腺素蛋白(ttr)的表达的组合物和方法
EP4121534A1 (en) 2020-03-18 2023-01-25 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating subjects having a heterozygous alanine-glyoxylate aminotransferase gene (agxt) variant
TW202204615A (zh) 2020-03-26 2022-02-01 美商阿尼拉製藥公司 冠狀病毒ｉＲＮＡ組成物及其使用方法
US12534731B2 (en) 2020-04-01 2026-01-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Alpha-2A adrenergic receptor (ADRA2A) iRNA agent compositions and methods of use thereof
KR20230008729A (ko) 2020-04-06 2023-01-16 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 Myoc 발현을 사일런싱하기 위한 조성물 및 방법
JP2023521094A (ja) 2020-04-07 2023-05-23 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド Ｓｃｎ９ａ発現をサイレンシングするための組成物および方法
EP4133077A1 (en) 2020-04-07 2023-02-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Transmembrane serine protease 2 (tmprss2) irna compositions and methods of use thereof
EP4133076A1 (en) 2020-04-07 2023-02-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Angiotensin-converting enzyme 2 (ace2) irna compositions and methods of use thereof
CN115916262A (zh) 2020-04-21 2023-04-04 旗舰创业股份有限公司 双官能分子及其使用方法
IL297702A (en) 2020-04-27 2022-12-01 Alnylam Pharmaceuticals Inc Apolipoprotein e (apoe) irna agent compositions and methods of use thereof
JP2023523790A (ja) 2020-04-30 2023-06-07 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 補体因子Ｂ（ＣＦＢ）ｉＲＮＡ組成物およびその使用方法
EP4162050A1 (en) 2020-06-09 2023-04-12 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Rnai compositions and methods of use thereof for delivery by inhalation
WO2021252649A2 (en) 2020-06-09 2021-12-16 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Sirna compositions and methods for silencing gpam (glycerol-3-phosphate acyltransferase 1, mitochondrial) expression
WO2021257782A1 (en) 2020-06-18 2021-12-23 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. XANTHINE DEHYDROGENASE (XDH) iRNA COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF
WO2022066847A1 (en) 2020-09-24 2022-03-31 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Dipeptidyl peptidase 4 (dpp4) irna compositions and methods of use thereof
EP4225917A1 (en) 2020-10-05 2023-08-16 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. G protein-coupled receptor 75 (gpr75) irna compositions and methods of use thereof
CA3198823A1 (en) 2020-10-21 2022-04-28 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for treating primary hyperoxaluria
EP4232582A1 (en) 2020-10-23 2023-08-30 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Mucin 5b (muc5b) irna compositions and methods of use thereof
KR20230107625A (ko) 2020-11-13 2023-07-17 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 응고 인자 V(F5) iRNA 조성물 및 이의 사용 방법
LT4136092T (lt) 2020-11-18 2024-09-25 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Junginiai ir būdai, skirti angiotenzinogeno raiškos moduliavimui
TW202237150A (zh) 2020-12-01 2022-10-01 美商艾拉倫製藥股份有限公司 用於抑制ｈａｏ１（羥基酸氧化酶１（乙醇酸氧化酶））基因表現的方法及組成物
WO2022125490A1 (en) 2020-12-08 2022-06-16 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Coagulation factor x (f10) irna compositions and methods of use thereof
EP4274896A1 (en) 2021-01-05 2023-11-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Complement component 9 (c9) irna compositions and methods of use thereof
EP4291654A2 (en) 2021-02-12 2023-12-20 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Superoxide dismutase 1 (sod1) irna compositions and methods of use thereof for treating or preventing superoxide dismutase 1- (sod1-) associated neurodegenerative diseases
EP4298220A1 (en) 2021-02-25 2024-01-03 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Prion protein (prnp) irna compositions and methods of use thereof
AU2022226098A1 (en) 2021-02-26 2023-08-24 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. KETOHEXOKINASE (KHK) iRNA COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF
JP2024508896A (ja) 2021-03-04 2024-02-28 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド アンジオポエチン様３（ＡＮＧＰＴＬ３）ｉＲＮＡ組成物およびその使用方法
WO2022192519A1 (en) 2021-03-12 2022-09-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Glycogen synthase kinase 3 alpha (gsk3a) irna compositions and methods of use thereof
EP4314296A2 (en) 2021-03-29 2024-02-07 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Huntingtin (htt) irna agent compositions and methods of use thereof
EP4314293A1 (en) 2021-04-01 2024-02-07 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Proline dehydrogenase 2 (prodh2) irna compositions and methods of use thereof
EP4330392A1 (en) 2021-04-26 2024-03-06 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Transmembrane protease, serine 6 (tmprss6) irna compositions and methods of use thereof
WO2022232343A1 (en) 2021-04-29 2022-11-03 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Signal transducer and activator of transcription factor 6 (stat6) irna compositions and methods of use thereof
JP2024518374A (ja) 2021-05-03 2024-05-01 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド トランスサイレチン（ｔｔｒ）媒介性アミロイドーシスを治療するための組成物および方法
EP4341401A1 (en) 2021-05-18 2024-03-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Sodium-glucose cotransporter-2 (sglt2) irna compositions and methods of use thereof
EP4347823A1 (en) 2021-06-02 2024-04-10 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Patatin-like phospholipase domain containing 3 (pnpla3) irna compositions and methods of use thereof
EP4347822A2 (en) 2021-06-04 2024-04-10 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Human chromosome 9 open reading frame 72 (c9orf72) irna agent compositions and methods of use thereof
AR126070A1 (es) 2021-06-08 2023-09-06 Alnylam Pharmaceuticals Inc Composiciones y métodos para tratar o prevenir la enfermedad de stargardt y/o trastornos asociados con la proteína transportadora de retinol 4 (rbp4)
AU2022303164A1 (en) 2021-06-30 2024-01-18 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for treating an angiotensinogen- (agt-) associated disorder
CA3225139A1 (en) * 2021-07-01 2023-01-05 Albert Einstein College Of Medicine Compositions and methods for inhibiting the expression of tmigd2
CA3225573A1 (en) 2021-07-08 2023-01-12 Nippon Shinyaku Co., Ltd. Precipitation suppressing agent
CN118475355A (zh) 2021-07-08 2024-08-09 日本新药株式会社 肾毒性减轻剂
TW202308664A (zh) 2021-07-08 2023-03-01 日商日本新藥股份有限公司 腎毒性減輕劑
WO2023003805A1 (en) 2021-07-19 2023-01-26 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for treating subjects having or at risk of developing a non-primary hyperoxaluria disease or disorder
AU2022316139A1 (en) 2021-07-23 2024-01-18 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Beta-catenin (ctnnb1) irna compositions and methods of use thereof
WO2023009687A1 (en) 2021-07-29 2023-02-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coa reductase (hmgcr) irna compositions and methods of use thereof
CA3227852A1 (en) 2021-08-03 2023-02-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Transthyretin (ttr) irna compositions and methods of use thereof
EP4381071A1 (en) 2021-08-04 2024-06-12 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Irna compositions and methods for silencing angiotensinogen (agt)
CN118076737A (zh) 2021-08-13 2024-05-24 阿尔尼拉姆医药品有限公司 因子XII（F12）iRNA组合物及其使用方法
JP2024538859A (ja) 2021-08-31 2024-10-24 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 細胞死誘導ＤＦＦＡ様エフェクターＢ（ＣＩＤＥＢ）ｉＲＮＡ組成物およびその使用方法
JP2024535850A (ja) 2021-09-17 2024-10-02 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 補体成分（Ｃ３）をサイレンシングするためのｉＲＮＡ組成物および方法
AU2022345881A1 (en) 2021-09-20 2024-03-21 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Inhibin subunit beta e (inhbe) modulator compositions and methods of use thereof
TW202328449A (zh) 2021-09-24 2023-07-16 美商艾拉倫製藥公司 微管相關蛋白ＴＡＵ（ＭＡＰＴ）ｉＲＮＡ試劑組合物及其使用方法
US12042509B2 (en) 2021-10-01 2024-07-23 Adarx Pharmaceuticals, Inc. Prekallikrein-modulating compositions and methods of use thereof
US20230141563A1 (en) 2021-10-12 2023-05-11 Selecta Biosciences, Inc. Methods and compositions for attenuating anti-viral transfer vector igm responses
JP7732840B2 (ja) * 2021-10-14 2025-09-02 株式会社三共 遊技機
JP7732839B2 (ja) * 2021-10-14 2025-09-02 株式会社三共 遊技機
JP7732842B2 (ja) * 2021-10-14 2025-09-02 株式会社三共 遊技機
JP7732843B2 (ja) * 2021-10-14 2025-09-02 株式会社三共 遊技機
JP7732841B2 (ja) * 2021-10-14 2025-09-02 株式会社三共 遊技機
CN118302525A (zh) 2021-10-29 2024-07-05 阿尔尼拉姆医药品有限公司 补体因子B（CFB）iRNA组合物及其使用方法
EP4423272A2 (en) 2021-10-29 2024-09-04 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Huntingtin (htt) irna agent compositions and methods of use thereof
WO2023141314A2 (en) 2022-01-24 2023-07-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Heparin sulfate biosynthesis pathway enzyme irna agent compositions and methods of use thereof
WO2023172624A1 (en) 2022-03-09 2023-09-14 Selecta Biosciences, Inc. Immunosuppressants in combination with anti-igm agents and related dosing
WO2023171804A1 (ja) 2022-03-10 2023-09-14 日本新薬株式会社 抗ウイルスアンチセンスオリゴマー
US20250188477A1 (en) 2022-03-16 2025-06-12 Daiichi Sankyo Company, Limited CHEMICALLY MODIFIED OLIGONUCLEOTIDE HAVING RNAi ACTIVITY
EP4495240A1 (en) 2022-03-16 2025-01-22 Daiichi Sankyo Company, Limited Sirna for suppressing expression of transferrin receptor-2
AU2023245603A1 (en) 2022-03-28 2024-11-07 Empirico Inc. Modified oligonucleotides
WO2024039776A2 (en) 2022-08-18 2024-02-22 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Universal non-targeting sirna compositions and methods of use thereof
EP4569113A1 (en) 2022-09-15 2025-06-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. 17b-hydroxysteroid dehydrogenase type 13 (hsd17b13) irna compositions and methods of use thereof
WO2024175062A1 (zh) * 2023-02-23 2024-08-29 大睿生物医药科技(上海)有限公司 调控KHK基因活性的dsRNA分子
TW202448484A (zh) 2023-04-20 2024-12-16 美商雅迪克斯製藥公司 Ｍａｐｔ調節組合物及其使用方法
WO2024220746A2 (en) 2023-04-21 2024-10-24 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Rnai agents targeting fatty acid synthase and related methods
WO2024238396A1 (en) 2023-05-12 2024-11-21 Adarx Pharmaceuticals, Inc. Nmda ligand conjugated compounds and uses thereof
CN121335980A (zh) 2023-05-26 2026-01-13 阿达尔克斯制药有限公司 Sod1调节组合物及其使用方法
EP4731763A1 (en) 2023-06-20 2026-04-29 Adarx Pharmaceuticals, Inc. Lrrk2-modulating compositions and methods of use thereof
CN119265190A (zh) * 2023-07-06 2025-01-07 上海交通大学 一种靶向TTR的saCas9 sgRNA及其修饰方式
AU2024299328A1 (en) 2023-07-21 2026-01-22 Marrow Therapeutics, Inc. Hematopoietic cell targeting conjugates and related methods
KR20260049597A (ko) 2023-08-04 2026-04-14 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 Ctnnb1-관련 질환을 치료하기 위한 방법 및 조성물
WO2025076031A2 (en) 2023-10-03 2025-04-10 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Peritoneal macrophages comprising a nanoparticle encapsulating a nucleic acid molecule and methods of use thereof
WO2025077916A1 (zh) * 2023-10-13 2025-04-17 北京安龙生物医药有限公司 靶向转甲状腺素蛋白的寡核苷酸及其用途
WO2025098117A1 (zh) * 2023-11-06 2025-05-15 成都倍特药业股份有限公司 一种抑制甲状腺素转运蛋白(TTR)表达的RNAi试剂、组合物及应用
WO2025128622A1 (en) * 2023-12-12 2025-06-19 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for treating transthyretin (ttr)- associated diseases
WO2025178854A2 (en) 2024-02-19 2025-08-28 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Rnai agents targeting cideb and related methods
US12553050B2 (en) 2024-03-22 2026-02-17 Takeda Pharmaceutical Company Limited Compositions and methods for inhibiting cytochrome P450 family 7 subfamily a member 1 (CYP7A1) expression
WO2025217275A2 (en) 2024-04-10 2025-10-16 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Immune cell targeted compositions and related methods
CN118311273B (zh) * 2024-04-12 2025-03-04 四川大学华西医院 尿蛋白标志物组在制备预测癫痫发作的试剂盒中的用途
WO2025259743A1 (en) 2024-06-12 2025-12-18 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Dual conjugate compounds for extrahepatic delivery

Family Cites Families (100)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US1861608A (en) 1929-12-21 1932-06-07 Emerson Electric Mfg Co Fan and means for directing the air current therethrough
US1861108A (en) 1930-01-24 1932-05-31 Eugene O Brace Integral clutch and transmission control
US3974808A (en) 1975-07-02 1976-08-17 Ford Motor Company Air intake duct assembly
US4708708A (en) 1982-12-06 1987-11-24 International Paper Company Method and apparatus for skiving and hemming
US4897355A (en) 1985-01-07 1990-01-30 Syntex (U.S.A.) Inc. N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
FR2645866B1 (fr) 1989-04-17 1991-07-05 Centre Nat Rech Scient Nouvelles lipopolyamines, leur preparation et leur emploi
US5744101A (en) 1989-06-07 1998-04-28 Affymax Technologies N.V. Photolabile nucleoside protecting groups
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
NL8901881A (nl) 1989-07-20 1991-02-18 Rockwool Grodan Bv Drainagekoppelelement.
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
US5283185A (en) 1991-08-28 1994-02-01 University Of Tennessee Research Corporation Method for delivering nucleic acids into cells
CA2124087C (en) 1991-11-22 2002-10-01 James L. Winkler Combinatorial strategies for polymer synthesis
EP0646178A1 (en) 1992-06-04 1995-04-05 The Regents Of The University Of California expression cassette with regularoty regions functional in the mammmlian host
AU4541093A (en) 1992-06-18 1994-01-24 Genpharm International, Inc. Methods for producing transgenic non-human animals harboring a yeast artificial chromosome
US5556752A (en) 1994-10-24 1996-09-17 Affymetrix, Inc. Surface-bound, unimolecular, double-stranded DNA
US20030027216A1 (en) 2001-07-02 2003-02-06 Kiernan Urban A. Analysis of proteins from biological fluids using mass spectrometric immunoassay
CA2220950A1 (en) 1995-05-26 1996-11-28 Somatix Therapy Corporation Delivery vehicles comprising stable lipid/nucleic acid complexes
US5545531A (en) 1995-06-07 1996-08-13 Affymax Technologies N.V. Methods for making a device for concurrently processing multiple biological chip assays
US5854033A (en) 1995-11-21 1998-12-29 Yale University Rolling circle replication reporter systems
US20080119427A1 (en) 1996-06-06 2008-05-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Double Strand Compositions Comprising Differentially Modified Strands for Use in Gene Modulation
US6034135A (en) 1997-03-06 2000-03-07 Promega Biosciences, Inc. Dimeric cationic lipids
US20030229037A1 (en) 2000-02-07 2003-12-11 Ulrich Massing Novel cationic amphiphiles
US20030072794A1 (en) 2000-06-09 2003-04-17 Teni Boulikas Encapsulation of plasmid DNA (lipogenes™) and therapeutic agents with nuclear localization signal/fusogenic peptide conjugates into targeted liposome complexes
CA2429814C (en) 2000-12-01 2014-02-18 Thomas Tuschl Rna interference mediating small rna molecules
WO2002059621A2 (en) 2001-01-24 2002-08-01 Bayer Corporation Regulation of transthyretin to treat obesity
EP1386004A4 (en) 2001-04-05 2005-02-16 Ribozyme Pharm Inc MODULATION OF GENE EXPRESSION ASSOCIATED WITH INFLAMMATORY PROLIFERATION AND GROWTH OF NEURITIES BY METHODS INVOLVING NUCLEIC ACID
US20060217331A1 (en) * 2001-05-18 2006-09-28 Sirna Therapeutics, Inc. Chemically modified double stranded nucleic acid molecules that mediate RNA interference
US20030170891A1 (en) 2001-06-06 2003-09-11 Mcswiggen James A. RNA interference mediated inhibition of epidermal growth factor receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20030124616A1 (en) 2001-06-21 2003-07-03 Jacobsen Donald W. Homocysteinylated transthyretin
US9657294B2 (en) * 2002-02-20 2017-05-23 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
US20030191056A1 (en) 2002-04-04 2003-10-09 Kenneth Walker Use of transthyretin peptide/protein fusions to increase the serum half-life of pharmacologically active peptides/proteins
US8101348B2 (en) 2002-07-10 2012-01-24 Max-Planck-Gesellschaft Zur Foerderung Der Wissenschaften E.V. RNA-interference by single-stranded RNA molecules
DE60310944T3 (de) 2002-08-05 2017-08-03 Silence Therapeutics Gmbh Weitere neue formen von interferierende rns moleküle
US7923547B2 (en) 2002-09-05 2011-04-12 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
CA2502413A1 (en) 2002-11-01 2004-05-21 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Quantitative analysis of protein isoforms using matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry
US9228186B2 (en) 2002-11-14 2016-01-05 Thermo Fisher Scientific Inc. Methods and compositions for selecting siRNA of improved functionality
AU2003295600A1 (en) 2002-11-14 2004-06-15 Dharmacon, Inc. Functional and hyperfunctional sirna
US7250496B2 (en) 2002-11-14 2007-07-31 Rosetta Genomics Ltd. Bioinformatically detectable group of novel regulatory genes and uses thereof
WO2004090108A2 (en) 2003-04-03 2004-10-21 Alnylam Pharmaceuticals Irna conjugates
CA2518475C (en) 2003-03-07 2014-12-23 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Irna agents comprising asymmetrical modifications
ATE420160T1 (de) * 2003-06-18 2009-01-15 Genelux Corp Modifizierte rekombinante vacciniaviren, verwendungen davon
CA2532228C (en) 2003-07-16 2017-02-14 Protiva Biotherapeutics, Inc. Lipid encapsulated interfering rna
ATE452188T1 (de) 2004-02-10 2010-01-15 Sirna Therapeutics Inc Rna-interferenz-vermittelte hemmung der genexpression unter verwendung multifunktioneller sina (short interfering nucleic acid)
US20070087448A1 (en) * 2004-02-16 2007-04-19 Nelsestuen Gary L Biological profiles and methods of use
US20050244869A1 (en) * 2004-04-05 2005-11-03 Brown-Driver Vickie L Modulation of transthyretin expression
WO2005113523A1 (en) * 2004-05-20 2005-12-01 Foldrx Pharmaceuticals, Inc. 2-((hetero) aryl)-benzoxazole compounds and derivatives, compositions and methods for stabilizing transthyretin and inhibiting transthyretin misfolding
CA2569664C (en) 2004-06-07 2013-07-16 Protiva Biotherapeutics, Inc. Lipid encapsulated interfering rna
JP4764426B2 (ja) 2004-06-07 2011-09-07 プロチバ バイオセラピューティクス インコーポレイティッド カチオン性脂質および使用方法
WO2005120583A2 (en) 2004-06-14 2005-12-22 Wisconsin Alumni Research Foundation Method for preventing or treating cardiac hypertrophy
CA2584845C (en) 2004-12-08 2009-02-17 Sirion Therapeutics, Inc. Methods, assays and compositions for treating retinol-related diseases
WO2007086881A2 (en) 2005-02-14 2007-08-02 Sirna Therapeutics, Inc. Cationic lipids and formulated molecular compositions containing them
JP2008537551A (ja) 2005-03-31 2008-09-18 カランド ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド リボヌクレオチドレダクターゼサブユニット２の阻害剤およびその使用
US7915230B2 (en) 2005-05-17 2011-03-29 Molecular Transfer, Inc. Reagents for transfection of eukaryotic cells
CN101267805A (zh) 2005-07-27 2008-09-17 普洛体维生物治疗公司 制造脂质体的系统和方法
CN101346393B (zh) 2005-11-02 2015-07-22 普洛体维生物治疗公司 修饰的siRNA分子及其应用
EP1989307B1 (en) 2006-02-08 2012-08-08 Quark Pharmaceuticals, Inc. NOVEL TANDEM siRNAS
NZ571568A (en) 2006-03-31 2010-11-26 Alnylam Pharmaceuticals Inc Double-stranded RNA molecule compositions and methods for inhibiting expression of Eg5 gene
KR101221589B1 (ko) 2006-04-07 2013-01-15 이데라 파마슈티칼즈, 인코포레이티드 Ｔｌｒ７ 및 ｔｌｒ８에 대한 안정화된 면역 조절성 ｒｎａ〔ｓｉｍｒａ〕 화합물
US8598333B2 (en) 2006-05-26 2013-12-03 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. SiRNA silencing of genes expressed in cancer
CA2927045A1 (en) 2006-10-03 2008-04-10 Muthiah Manoharan Lipid containing formulations
GB0704764D0 (en) 2007-03-12 2007-04-18 Electrophoretics Ltd Isobarically labelled reagents and methods of their use
WO2009002944A1 (en) 2007-06-22 2008-12-31 Isis Pharmaceuticals, Inc. Double strand compositions comprising differentially modified strands for use in gene modulation
EP2357231A2 (en) 2007-07-09 2011-08-17 Idera Pharmaceuticals, Inc. Stabilized immune modulatory RNA (SIMRA) compounds
WO2009073809A2 (en) * 2007-12-04 2009-06-11 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Carbohydrate conjugates as delivery agents for oligonucleotides
WO2009082606A2 (en) * 2007-12-04 2009-07-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Folate conjugates
ES2535419T3 (es) 2007-12-27 2015-05-11 Protiva Biotherapeutics Inc. Silenciamiento de expresión de quinasa tipo polo usando ARN interferente
WO2009086558A1 (en) 2008-01-02 2009-07-09 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Improved compositions and methods for the delivery of nucleic acids
CA2713379A1 (en) * 2008-01-31 2009-11-05 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Optimized methods for delivery of dsrna targeting the pcsk9 gene
WO2009100390A2 (en) 2008-02-08 2009-08-13 Mayo Foundation For Medical Education And Research Classifying amyloidosis
US20110130440A1 (en) * 2008-03-26 2011-06-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Non-natural ribonucleotides, and methods of use thereof
CA2721333C (en) 2008-04-15 2020-12-01 Protiva Biotherapeutics, Inc. Novel lipid formulations for nucleic acid delivery
TWI455944B (zh) 2008-07-01 2014-10-11 Daiichi Sankyo Co Ltd 雙股多核苷酸
EP2323667A4 (en) * 2008-08-07 2012-07-25 Isis Pharmaceuticals Inc MODULATION OF TRANSTHYRETIN EXPRESSION BY TREATMENT OF CNS DISEASES
AU2009298802A1 (en) * 2008-09-23 2010-04-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Chemical modifications of monomers and oligonucleotides with cycloaddition
CA2740000C (en) 2008-10-09 2017-12-12 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Improved amino lipids and methods for the delivery of nucleic acids
MX360460B (es) * 2008-10-20 2018-11-05 Alnylam Pharmaceuticals Inc Composiciones y metodos para inhibir la expresion de transtiretina.
EP3269395A1 (en) 2008-11-07 2018-01-17 Massachusetts Institute Of Technology Aminoalcohol lipidoids and uses thereof
CN111808084A (zh) 2008-11-10 2020-10-23 阿布特斯生物制药公司 用于递送治疗剂的新型脂质和组合物
WO2010078536A1 (en) * 2009-01-05 2010-07-08 Rxi Pharmaceuticals Corporation Inhibition of pcsk9 through rnai
EP3243504A1 (en) 2009-01-29 2017-11-15 Arbutus Biopharma Corporation Improved lipid formulation
SG10201911942UA (en) 2009-05-05 2020-02-27 Muthiah Manoharan Lipid compositions
WO2010141511A2 (en) 2009-06-01 2010-12-09 Halo-Bio Rnai Therapeutics, Inc. Polynucleotides for multivalent rna interference, compositions and methods of use thereof
KR101766408B1 (ko) 2009-06-10 2017-08-10 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 향상된 지질 조성물
US9051567B2 (en) 2009-06-15 2015-06-09 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Methods for increasing efficacy of lipid formulated siRNA
JP5894913B2 (ja) * 2009-06-15 2016-03-30 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッドＡｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． Ｐｃｓｋ９遺伝子を標的とする、脂質で製剤化されたｄｓｒｎａ
EP2470656B1 (en) 2009-08-27 2015-05-06 Idera Pharmaceuticals, Inc. Composition for inhibiting gene expression and uses thereof
US9101643B2 (en) 2009-11-03 2015-08-11 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Lipid formulated compositions and methods for inhibiting expression of transthyretin (TTR)
AU2011235276B2 (en) 2010-03-29 2015-09-03 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. SiRNA therapy for transthyretin (TTR) related ocular amyloidosis
US10913767B2 (en) * 2010-04-22 2021-02-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides comprising acyclic and abasic nucleosides and analogs
PL2563920T3 (pl) * 2010-04-29 2017-08-31 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulacja ekspresji transtyretyny
CA2812046A1 (en) 2010-09-15 2012-03-22 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Modified irna agents
WO2012058210A1 (en) * 2010-10-29 2012-05-03 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACIDS (siNA)
CN102206645B (zh) * 2011-04-29 2013-11-27 中国科学院武汉病毒研究所 利用慢病毒载体介导RNAi的方法
US20140275211A1 (en) * 2011-06-21 2014-09-18 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Assays and methods for determining activity of a therapeutic agent in a subject
SI3366775T2 (sl) * 2011-11-18 2025-12-31 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Modificirana sredstva RNAI
EP3730618A1 (en) * 2011-11-18 2020-10-28 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Rnai agents, compositions and methods of use thereof for treating transthyretin (ttr) associated diseases
AU2013296321B2 (en) * 2012-08-03 2019-05-16 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Modified RNAi agents
PT3329002T (pt) 2015-07-31 2021-01-12 Alnylam Pharmaceuticals Inc Composições de iarn de transtirretina (ttr) e métodos de seu uso para tratamento ou prevenção de doenças associadas à ttr
KR102318555B1 (ko) 2020-03-19 2021-10-29 한국과학기술연구원 광소자용 역나노콘과 그 제조방법

Also Published As

Publication number Publication date
KR102263352B1 (ko) 2021-06-11
IL284530A (en) 2021-08-31
IL257166A (en) 2018-03-29
JP2018007657A (ja) 2018-01-18
AU2022231749B2 (en) 2024-09-19
AU2024278344A1 (en) 2025-01-16
CY1123693T1 (el) 2022-03-24
AU2022231749A1 (en) 2022-12-01
MX2014005972A (es) 2014-08-27
CR20140232A (es) 2014-09-25
EP2780353A1 (en) 2014-09-24
JP2021168677A (ja) 2021-10-28
ECSP14005606A (es) 2015-06-30
HUE048622T2 (hu) 2020-08-28
JP7853769B2 (ja) 2026-04-30
US20200318111A1 (en) 2020-10-08
IL308752A (en) 2024-01-01
US20240279652A1 (en) 2024-08-22
AU2019240658A1 (en) 2019-10-24
KR102385013B1 (ko) 2022-04-12
EP3913056A1 (en) 2021-11-24
CN108186667A (zh) 2018-06-22
NZ624336A (en) 2016-06-24
KR102095699B1 (ko) 2020-04-02
CL2014002742A1 (es) 2015-02-13
HK1200171A1 (en) 2015-07-31
RU2019101617A (ru) 2019-06-04
IL232435A0 (en) 2014-06-30
IL293434B1 (en) 2024-01-01
CL2014001291A1 (es) 2014-09-26
AU2017225076B2 (en) 2019-10-24
SG11201402392QA (en) 2014-06-27
JP2019131595A (ja) 2019-08-08
DOP2014000107A (es) 2014-11-30
CN104080794A (zh) 2014-10-01
EP3301177B1 (en) 2020-03-25
HRP20200672T1 (hr) 2020-07-10
EP2780353B1 (en) 2017-08-16
BR112014011896B1 (pt) 2021-01-19
KR20210068624A (ko) 2021-06-09
SMT202000308T1 (it) 2020-07-08
US9399775B2 (en) 2016-07-26
AU2012340159B2 (en) 2017-09-07
RU2014124683A (ru) 2015-12-27
HK1253410A1 (en) 2019-06-14
IL263458B (en) 2021-07-29
AU2012340159A1 (en) 2014-05-22
JP6165158B2 (ja) 2017-07-19
RU2678807C2 (ru) 2019-02-01
US20140315835A1 (en) 2014-10-23
IL284530B (en) 2022-07-01
PE20142362A1 (es) 2015-01-30
US10570391B2 (en) 2020-02-25
PL3301177T3 (pl) 2020-08-24
KR20140092921A (ko) 2014-07-24
US20230010288A1 (en) 2023-01-12
CO7020872A2 (es) 2014-08-11
IL308752B2 (en) 2025-10-01
CA2856243C (en) 2025-07-22
AU2019240658B2 (en) 2022-06-16
IL293434B2 (en) 2024-05-01
DK3301177T3 (da) 2020-06-15
NI201400046A (es) 2014-12-23
KR20220045091A (ko) 2022-04-12
GT201400097A (es) 2017-11-09
MX391815B (es) 2025-03-21
IL263458A (en) 2018-12-31
PH12014501106B1 (en) 2020-10-30
IL308752B1 (en) 2025-06-01
IN2014CN03463A (sr) 2015-10-09
AU2017225076C1 (en) 2025-02-27
SG10201912170WA (en) 2020-02-27
AR088911A1 (es) 2014-07-16
SI3301177T1 (sl) 2020-07-31
JP2014534244A (ja) 2014-12-18
WO2013075035A1 (en) 2013-05-23
AU2012340159A8 (en) 2016-01-28
UA118649C2 (uk) 2019-02-25
PT3301177T (pt) 2020-06-29
EP2780353A4 (en) 2015-06-10
CA3252673A1 (en) 2025-10-31
LT3301177T (lt) 2020-08-10
CL2018002703A1 (es) 2018-12-28
PH12014501106A1 (en) 2014-08-11
CA2856243A1 (en) 2013-05-23
JP6513135B2 (ja) 2019-05-15
EP3730618A1 (en) 2020-10-28
EP3301177A1 (en) 2018-04-04
MY167390A (en) 2018-08-16
ES2800065T3 (es) 2020-12-23
CN108186667B (zh) 2021-07-20
AU2017225076A1 (en) 2017-09-28
BR112014011896A2 (pt) 2017-05-16
IL293434A (en) 2022-07-01
CN104080794B (zh) 2018-03-16
KR20200035480A (ko) 2020-04-03
US20160355817A1 (en) 2016-12-08
MX348575B (es) 2017-06-20
MX2021014393A (es) 2022-01-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7853769B2 (ja) トランスサイレチン（ＴＴＲ）関連疾患を治療するためのＲＮＡｉ剤、組成物、およびこれらの使用方法
KR102689177B1 (ko) 변형된 ＲＮＡｉ 제제
WO2015042564A1 (en) Methods for treating or preventing transthyretin (ttr) associated diseases
CA3205809A1 (en) Modified double stranded oligonucleotides
TW202532647A (zh) 甲狀腺素運載蛋白（ＴＴＲ）ｉＲＮＡ組成物及其治療或預防ＴＴＲ相關疾病之使用方法
KR20160079793A (ko) Ａｌａｓ1 유전자의 발현을 억제하기 위한 조성물 및 방법
TW202305134A (zh) 杭丁頓蛋白（ＨＴＴ）ｉＲＮＡ劑組成物及其使用方法
JP2024528701A (ja) ベータカテニン（ＣＴＮＮＢ１）ｉＲＮＡ組成物およびその使用方法
US12485136B2 (en) Methods for the treatment of trinucleotide repeat expansion disorders associated with MLH3 activity
RU2804776C2 (ru) СРЕДСТВА ДЛЯ РНКи, КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ, АССОЦИИРОВАННЫХ С ТРАНСТИРЕТИНОМ (TTR)