RS60424B1 - Modulatori nukleusnog transporta i njihove upotrebe - Google Patents

Modulatori nukleusnog transporta i njihove upotrebe

Info

Publication number
RS60424B1
RS60424B1 RS20200639A RSP20200639A RS60424B1 RS 60424 B1 RS60424 B1 RS 60424B1 RS 20200639 A RS20200639 A RS 20200639A RS P20200639 A RSP20200639 A RS P20200639A RS 60424 B1 RS60424 B1 RS 60424B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
compound
virus
disorder
cancer
group
Prior art date
Application number
RS20200639A
Other languages
English (en)
Inventor
Vincent P Sandanayaka
Sharon Shechter
Sharon Shacham
Dilara Mccauley
Erkan Baloglu
Original Assignee
Biogen Ma Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=49448240&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS60424(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Biogen Ma Inc filed Critical Biogen Ma Inc
Publication of RS60424B1 publication Critical patent/RS60424B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D403/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00
    • C07D403/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings
    • C07D403/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/4196—1,2,4-Triazoles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/445—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine
    • A61K31/4523—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems
    • A61K31/454—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems containing a five-membered ring with nitrogen as a ring hetero atom, e.g. pimozide, domperidone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/4965—Non-condensed pyrazines
    • A61K31/497—Non-condensed pyrazines containing further heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
    • A61K31/5375—1,4-Oxazines, e.g. morpholine
    • A61K31/5377—1,4-Oxazines, e.g. morpholine not condensed and containing further heterocyclic rings, e.g. timolol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D249/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having three nitrogen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D249/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having three nitrogen atoms as the only ring hetero atoms not condensed with other rings
    • C07D249/08—1,2,4-Triazoles; Hydrogenated 1,2,4-triazoles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings
    • C07D401/10—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings linked by a carbon chain containing aromatic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings
    • C07D401/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D413/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D413/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings
    • C07D413/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

Opis
POVEZANE PRIJAVE
[0001] Ova prijava zahteva prioritet od privremene SAD prijave br. 61/644,802, podnete 9.5.2012. i privremene SAD prijave br.61/798,188, podnete 15.3.2013.
OSNOV PRONALASKA
[0002] Ćelije poreklom iz većine humanih solidnih i hematoloških maligniteta ispoljavaju abnormalnu unutarćelijsku lokalizaciju različitih onkogenih proteina, tumorsupresorskih proteina i regulatora ćelijskog ciklusa (Cronshaw et al, 2004, Falini et al 2006). Na primer, neke mutacije p53 dovode do njegove lokalizacije u citoplazmi umesto u nukleusu. Ovo za rezultat ima gubitak normalne regulacije rasta, uprkos očuvanoj tumor-supresorskoj funkciji. U drugim tumorima, divlji tip p53 se sekvestrira u citoplazmi ili se ubrzano razgrađuje, što opet dovodi do gubitka njegove supresorske funkcije. Obnavljanje odgovarajuće lokalizacije funkcionalnog p53 proteina u nukleusu može normalizovati neke osobine neoplastičnih ćelija (Cai et al, 2008; Hoshino et al 2008; Lain et al 1999a; Lain et al 1999b; Smart et al 1999), obnoviti osetljivost kancerskih ćelija na sredstva koja oštećuju DNK (Cai et al, 2008), i dovesti do povlačenja uspostavljenih tumora (Sharpless & DePinho 2007, Xue et al, 2007). Slični podaci dobijeni su za druge tumor-supresorske proteine kao što su "forkhead" (Turner and Sullivan 2008) i c-Abl (Vignari and Wang 2001). Pored toga, abnormalna lokalizacija nekoliko tumor-supresorskih proteina i proteina koji regulišu rast može biti uključena u patogenezu autoimunskih bolesti (Davis 2007, Nakahara 2009). Inhibicija CRM1 može biti posebno korisna u porodičnim kancerskim sindromima (npr., Li-Fraumeni sindrom zbog gubitka jednog p53 alela, kancerski sindromi BRCA1 ili 2), gde su specifični tumor-supresorski proteini (tumor suppressor proteins, TSP) odstranjeni ili disfunkcionalni i gde porast nivoa TSP sistemskom (ili lokalnom) primenom inhibitora CRM1 može pomoći u obnavljanju normalne tumor-supresorske funkcije.
[0003] Specijalizovani transportni molekuli koji u nukleus unose i iz njega iznose specifične proteine i RNK, klasifikuju se kao importini ako transportuju molekule u nukleus, i eksportini ako transportuju molekule iz nukleusa (Terry et al, 2007; Sorokin et al 2007). Proteini koji se transportuju u nukleus ili iz nukleusa sadrže nukleusne importne/lokalizacione (nuclear import/localization, NLS) ili eksportne (nuclear export/localization, NES) sekvence koje im omogućavaju da interaguju sa relevantnim transporterima. "Chromosomal region maintenance 1" (Crm1), koji se naziva još i eksportin-1 ili Xpo1, glavni je eksportin.
[0004] Preterana ekspresija Crm1 saopštena je kod nekoliko tumora, uključujući humani kancer ovarijuma (Noske et al, 2008), kancer cerviksa (van der Watt et al, 2009), kancer pankreasa (Huang et al, 2009), hepatocelularni karcinom (Pascale et al, 2005) i osteosarkom (Yao et al, 2009) i nezavisno je korelisana sa lošim kliničkim ishodima ovih tipova tumora.
[0005] Inhibicija Crm1 blokira izlazak iz nukleusa tumor-supresorskih proteina i/ili regulatora rasta kao što su p53, c-Abl, p21, p27, pRB, BRCA1, IkB, ICp27, E2F4, KLF5, YAP1, ZAP, KLF5, HDAC4, HDAC5 ili "forkhead" proteini (npr. FOXO3a), udruženih sa ekspresijom gena, proliferacijom ćelija, angiogenezom i epigenezom. Pokazano je da inhibitori Crm1 indukuju apoptozu kancerkih ćelija čak i u prisustvu aktivirajućih onkogenih signala ili signala koji stimulišu rast, dok normalne (netransformisane) ćelije ostaju pošteđene. U većini studija inhibicije Crm1 koristi se prirodni Crm1-inhibitorni proizvod leptomicin B (LMB). LMB je sam po sebi visoko toksičan za neoplastične ćelije, ali se loše podnosi, i upadljivo je toksičan na nivou gastrointestinalnog sistema, kod životinja (Roberts et al, 1986) i ljudi (Newlands et al, 1996). Derivatizacijom LMB u cilju poboljšanja njegovih lekovitih osobina nastala su jedinjenja koja zadržavaju antitumorsku aktivnost i koja se, u životinjskim modelima tumora, bolje podnose (Yang et al, 2007, Yang et al, 2008, Mutka et al, 2009). Prema tome, inhibitori nukleusnog eksporta mogli bi imati korisne efekte u neoplastičnim i drugim proliferativnim poremećajima. Do danas su, međutim, leku slični Cmr1 inhibitori malih molekula, za upotrebu in vitro i in vivo, ostali retki.
[0006] Pored tumor-supresorskih proteina, Crm1 takođe eksportuje nekoliko ključnih proteina uključenih u mnoge zapaljenske procese. Tu se ubrajaju IkB, NF-kB, Cox-2, RXRα, Commd1, HIF1, HMGB1, FOXO, FOXP i drugi. Familija transkripcionih aktivatora nukleusni faktor kapa B (nuclear factor kappa B, NF-kB/rel), nazvana tako zbog otkrića da podstiče ekspresiju imunoglobulinskog kapa gena, reguliše ekspresiju iRNK različitih gena uključenih u inflamaciju, proliferaciju, imunitet i preživljavanje ćelija. Pod bazalnim uslovima, proteinski inhibitor NF-kB, nazvan IkB, vezuje se za NF-kB u nukleusu i kompleks IkB-NF-kB inaktivira transkripcionu funkciju NF-kB. U odgovoru na inflamatorne stimuluse, IkB se izdvaja iz IkB-NF-kB kompleksa, čime se oslobađa NF-kB i demaskira se njegova snažna transkripciona aktivnost. Mnogi signali koji aktiviraju NF-kB to čine upućivanjem IkB na proteolizu (fosforilacija IkB čini ga "obeleženim" za ubikvitinaciju i zatim proteolizu). Nukleusni kompleks IkBa-NF-kB može da se eksportuje u citoplazmu pomoću Crm1, gde dolazi do njegove disocijacije i NF-kB može da se reaktivira. Ubikvitinisani IkB takođe može da disosuje iz NF-kB kompleksa, čime se obnavlja transkripciona aktivnost NF-kB. Inhibicija Crm1-indukovanog eksporta u humanim neutrofilima i ćelijama sličnim makrofagima (U937) pomoću LMB ne samo što rezultuje akumulacijom transkripciono neaktivnog, nukleusnog IkBa-NF-kB kompleksa, nego i sprečava inicijalnu aktivaciju NF-kB čak i posle stimulacije ćelije (Ghosh 2008, Huang 2000). U drugoj studiji, tretman LMB inhibirao je IL-1β-indukovano vezivanje NF-kB za DNK (prvi korak transkripcione aktivacije NF-kB), ekspresiju IL-8 i ekspresiju unutarćelijskih adhezionih molekula u endotelskim ćelijama mikrovaskulature pluća (Walsh 2008). COMMD1 je još jedan nukleusni inhibitor transkripcione aktivnosti NF-kB i hipoksija-inducibilnog faktora 1 (hypoxia-inducible factor, 1, HIF1). Blokiranje nukleusnog eksporta COMMD1 inhibiranjem Crm1 rezultuje porastom inhibicije transkripcione aktivnosti NF-kB i HIF1 (Muller 2009).
[0007] Crm1 posreduje i u transportu retionoid-X-receptora α (retinoid X receptor α, RXRα). RXRα se visoko eksprimira u jetri i ima centralnu ulogu u regulaciji metabolizma i homeostaze žučnih kiselina, holesterola, masnih kiselina, steroida i ksenobiotika. Tokom zapaljenja jetre, nivoi RXRα u nukleusu se značajno smanjuju, uglavnom zbog zapaljenjem posredovanog eksporta RXRα iz nukleusa, pomoću Crm1. Lep B je sposoban da spreči IL-1β-indukovani citoplazmatski porast RXRα u ćelijama poreklom iz čovekove jetre (Zimmerman 2006).
[0008] Uloga Crm1-posredovanog nukleusnog eksporta u NF-kB, HIF-1 i RXRα signalizaciji sugeriše da blokiranje nukleusnog eksporta može biti potencijalno korisno u mnogim zapaljenskim procesima u različitim tkivima i organima, uključujući vaskulaturu (vaskulitis, arteritis, polimijalgija, reumatske bolesti, ateroskleroza), dermatološka oboljenja (vidi gore), reumatološka oboljenja (reumatoidni i srodni artritis, psorijazni artritis, spondiloartropatije, artropatije usled formiranja kristala, sistemski eritemski lupus, mešovito oboljenje vezivnog tkiva, miozitisni sindromi, dermatomiozitis, miozitis sa formiranjem inkluzionih tela, nediferencirano oboljenje vezivnog tkiva, Sjogrenov sindrom, skleroderma i preklapajući sindromi, itd.).
[0009] Inhibicija CRM1 utiče na gensku ekspresiju inhibiranjem/aktiviranjem niza transkripcionih faktora kao što su ICp27, E2F4, KLF5, YAP1, ZAP.
Inhibicija Crm1 ima potencijalne terapijske efekte u mnogim dermatološkim sindromima uključujući zapaljenske dermatoze (atopijski, alergijski dermatitis, hemijski dermatitis, psorijaza), oštećenja sunčevim zracima (oštećenje ultravioletnim zracima/UV oštećenje), i infekcije. Inhibicija CRM1, najbolje izučavana sa LMB, minimalno utiče na normalne keratinocite, i deluje antiinflamatorno na keratinocite izložene UV, TNFa, ili drugim inflamatornim stimulusima (Kobayashi & Shinkai 2005, Kannan & Jaiswal 2006). Inhibicija Crm1 takođe pozitivno reguliše aktivnost NRF2 (nuclear factor erythroid-related factor 2, nukleusni faktor eritroid-srodan faktor 2), koji štiti keratinocite (Schafer et al, 2010, Kannan & Jaiswal 2006) i druge tipove ćelija (Wang et al, 2009) od oksidativnog oštećenja. LMB indukuje apoptozu u keratinocitima inficiranim onkogenim sojevima humanog papiloma virusa (human papillomavirus, HPV) kao što je HPV16, ali ne i u neinficiranim keratinocitima (Jolly et al, 2009).
[0010] Crm1 takođe posreduje u transportu ključnih neuroprotektivnih proteina koji mogu biti korisni u neurodegenerativnim oboljenjima, uključujući Parkinsonovu bolest (Parkinson's disease, PD), Alzheimerovu bolest, i amiotrofičnu lateralnu sklerozu. Na primer, (1) forsiranjem unutarnukleusnog zadržavanja ključnih neuroprotektivnih regulatora kao što su NRF2 (Wang 2009), FOXA2 (Kittappa et al, 2007), smeštenih u neuronima i/ili (2) inhibiranjem transkripcione aktivnosti NFκB sekvestriranjem IκB u nukleusu glijskih ćelija, inhibicija Crm1 može da uspori ili spreči smrt neurona u ovim poremećajima. Postoje takođe dokazi koji povezuju abnormalnu proliferaciju glijskih ćelija sa abnormalnostima u nivoima CRM1 ili funkciji CR1 (Shen 2008).
[0011] Očuvani nukleusni eksport, prevashodno posredovan CRM1, takođe je potreban za očuvanje maturacije mnogih virusa. Virusi kod kojih su nukleusni eksport, i/ili CRM1 po sebi, uključeni u životni ciklus, uključuju virus humane imunodeficijencije (human immunodeficiency virus, HIV), adenovirus, simijan retrovirus tip 1, virus Borna bolesti, virus influence (uobičajeni sojevi kao i sojevi H1N1 i ptičji H5N1), viruse hepatitisa B (HBV) i C (HCV), humani papilomavirus (HPV), respiratorni sincicijalni virus (respiratory syncytial virus, RSV), denga (Dungee), koronavirus jakog akutnog respiratornog sindroma, virus žute groznice, virus Zapadnog Nila, herpes simpleks virus (HSV), citomegalovirus (CMV), i poliomavirus Merkelovih ćelija (Merkel cell polyomavirus, MCV). (Bhuvanakantham 2010, Cohen 2010, Whittaker 1998). Predviđa se da će u bliskoj budućnosti biti otkriveno još virusnih infekcija zasnovanih na intaktnom nukleusnom eksportu.
[0012] HIV-1 Rev protein, koji putuje kroz nukleolus i vrši prenos između nukleusa i citoplazme, olakšava eksport nesplajsovanih i jednom splajsovanih HIV transkripata koji sadrže elemente koji odgovaraju na Rev (Rev response elements, RRE) RNK preko CRM1-eksportnog puta. Inhibicija Rev-posredovanog RNK transporta korišćenjem inhibitora CRM1 kao što su LepB ili PKF050-638, može zaustaviti proces transkripcije HIV-1, inhibirati proizvodnju novih HIV-1 viriona, i time smanjiti nivoe HIV-1 (Pollard 1998, Daelemans 2002).
[0013] Denga virus (DENV) je uzročnik čestog virusnog oboljenja koje prenose artropode, denga groznice (dengue fever, DF), i ozbiljnije i potencijalno smrtonosne denga hemoragične groznice (dengue hemorrhagic fever, DHF). Izgleda da je DHF rezultat preterano snažnog zapaljenskog odgovora na DENV. NS5 je najveći i najkonzerviraniji protein DENV. CRM1 reguliše transport NS5 iz nukleusa u citoplazmu, gde se odvija najveći deo funkcija NS5. Inhibicija CRM1-posredovanog eksporta NS5 rezultuje izmenjenom kinetikom proizvodnje virusa i redukovanom indukcijom inflamatornog hemokina interleukina-8 (IL-8), čime se otvaraju nove mogućnosti lečenja bolesti izazvanih DENV i drugim medicinski važnim flavivirusima uključujući virus hepatitisa C (Rawlinson 2009).
[0014] Drugi virusima kodirani RNK-vezujući proteini koji koriste CRM1 da bi izašli iz nukleusa uključuju HSV tip 1 protein tegumenta (VP13/14, ili hUL47), humani CMV protein pp65, SARS koronavirus ORF 3b protein, i RSV matriksni (M) protein (Williams 2008, Sanchez 2007, Freundt 2009, Ghildyal 2009).
[0015] Interesantno, mnogi od ovih virusa udruženi su sa specifičnim tipovima humanih kancera, uključujući hepatocelularni karcinom (hepatocellular carcinoma, HCC) izazvan hroničnom HBV ili HCV infekcijom, kancer cerviksa izazvan HPV, i karcinom Merkelovih ćelija udružen sa MCV. Inhibitori CRM1 bi stoga mogli imati korisne efekte na proces virusne infekcije, kao i na proces neoplastične transformacije izazvane ovim virusima.
[0016] CRM1 kontroliše nukleusnu lokalizaciju, a tako i aktivnost mnogih DNK metabolišućih enzima, ukjučujući histon deacetilaze (histone deacetylases, HDAC), histon acetiltransferaze (histone acetyltransferases, HAT), i histon metiltransferaze (histone methyltransferases, HMT). Pokazano je da ireverzibilni inhibitori CRM1 suprimiraju hipertrofiju kardiomiocita, verovatno preko unutarnukleusnog zadržavanja (i aktivacije) HDAC 5, enzima za koji se zna da suprimira hipertrofični genski program (Monovich et al, 2009). Tako, inhibicija CRM1 može imati korisne efekte u hipertrofičnim sindromima, uključujući neke forme kongestivne srčane slabosti i hipertrofične kardiomiopatije.
[0017] CRM1 je povezan i sa drugim poremećajim. Leberov poremećaj je nasledni poremećaj koji se karakteriše degeneracijom ganglijskih ćelija retine i gubitkom vida, udružen je sa neaktivnošću CRM1 "prekidača" (Gupta N 2008). Postoje i podaci koji povezuju neurodegenerativne poremećaje i abnormalnosti nukleusnog transporta.
[0018] Imajući u vidu gore rečeno, otkrivanje jedinjenja koja modulišu nukleusni transport je poželjno.
[0019] WO 2011/109799 publikovan je 9.9.2011. i opisuje supstituisana heterociklična jedinjenja azola, sintezu i upotrebu ovih jedinjenja i njihove farmaceutske kompozicije.
KRATAK OPIS PRONALASKA
[0020] Predmetni pronalazak odnosi se na jedinjenja, i njihove farmaceutski prihvatljive soli, korisne kao modulatori nukleusnog transporta, farmaceutski prihvatljive smeše koje sadrže jedinjenja predmetnog pronalaska i postupke za upotrebu pomenutih smeša u lečenju različitih poremećaja. Ovde je nađeno da modulatori nukleusnog transporta predmetnog pronalaska i njihove farmaceutski prihvatljive soli i/ili smeše, obezbeđuju željeno in vivo izlaganje, mereno preko AUC kod miša, uz niže nivoe prodiranja u mozak, u poređenju sa drugim modulatorima. Jedinjenja pronalaska imaju opštu formulu I:
ili njihove farmaceutski prihvatljive soli, gde je svaka varijabla kako je definisano i opisano u nastavku.
[0021] Jedinjenja predmetnog pronalaska i njihove farmaceutski prihvatljive smeše, od koristi su u lečenju različitih oboljenja, poremećaja ili stanja udruženih sa abnormalnim ćelijskim odgovorima pokrenutim neodgovarajućim nukleusnim transportom. Takva oboljenja, poremećaji ili stanja uključuju ona opisana u ovom tekstu.
[0022] Jedinjenja obezbeđena ovim pronalaskom korisna su i za izučavanje modulacije nukleusnog transporta u biološkim i patološkim pojavama; izučavanje unutarćelijskih puteva prenosa signala posredovanih takvim kinazama; i uporednu evaluaciju novih modulatora nukleusnog transporta.
KRATAK OPIS SLIKA
[0023] Napred rečeno biće jasno posle detaljnijeg opisa primera izvođenja pronalaska, koji slede.
SL. 1 predstavlja grafikon srednje zapremine tumora u odnosu na vreme i pokazuje srednju zapreminu za grupu, za Z-138 ksenograftske tumore kod miševa tretiranih prenosnikom, ciklofosfamidom, 80 mg/kg, Jedinjenjem 2, 15 mg/kg ili Jedinjenjem 2, 7.5 mg/kg (barovi za grešku prikazuju SEM za svaku grupu).
SL. 2 predstavlja grafikon srednje zapremine tumora u odnosu na vreme i pokazuje srednju zapreminu za grupu, za A549 ksenograftske tumore kod miševa tretiranih prenosnikom, cisplatinom, 5 mg/kg, Jedinjenjem 2, 10 mg/kg ili Jedinjenjem 2, 5 mg/kg (barovi za grešku prikazuju SEM za svaku grupu). SL. 3A predstavlja grafikon ukupnog artritisnog skora u odnosu na vreme, i pokazuje klinički skor za artritis indukovan antikolagenim antitelom, kod mužjaka BALB/c miševa tretiranih prenosnikom, deksametazonom, Jedinjenjem 2, 4 mg/kg ili Jedinjenjem 2, 7.5 mg/kg, tokom 12-dnevnog perioda posmatranja (¥ = grupa tretirana deksametazonom značajno se razlikuje od grupe tretirane prenosnikom; # = grupa tretirana Jedinjenjem 2, 7.5 mg/kg, značajno se razlikuje od grupe tretirane prenosnikom; † = grupa tretirana Jedinjenjem 2, 4 mg/kg značajno se razlikuje od grupe tretirane prenosnikom).
SL. 3B predstavlja grafikon za debljinu zadnje šape u odnosu na vreme, i pokazuje srednju vrednost za grupu debljine zadnje šape kod mužjaka BALB/c miševa sa artritisom indukovanim antikolagenim antitelom, tretiranih prenosnikom, deksametazonom, Jedinjenjem 2, 4 mg/kg ili Jedinjenjem 2, 7.5 mg/kg, tokom 12-dnevnog perioda posmatranja (¥ = grupa tretirana deksametazonom značajno se razlikuje od grupe tretirane prenosnikom; # = grupa tretirana Jedinjenjem 2, 7.5 mg/kg, značajno se razlikuje od grupe tretirane prenosnikom; † = grupa tretirana Jedinjenjem 2, 4 mg/kg, značajno se razlikuje od grupe tretirane prenosnikom).
SL. 4A predstavlja grafikon otoka zgloba u odnosu na vreme, i pokazuje otok zgloba meren skalom 0-4 kod naivnih pacova i pacova tretiranih prema CIA modelu, pozitivnom kontrolom ili Jedinjenjem 2.
SL. 4B predstavlja grafikon kliničkih skorova u funkciji vremena, i pokazuje kliničke skorove naivnih pacova i pacova tretiranih prema CIA modelu, pozitivnom kontrolom ili Jedinjenjem 2.
SL. 5 predstavlja reprezentativne slike iz svake grupe tretmana u CIA modelu, i prikazuje histopatologiju zadnjih šapa naivnih pacova i pacova tretiranih prema modelu, pozitivnom kontrolom ili Jedinjenjem 2.
SL. 6A predstavlja grafikon debljine uva u odnosu na vreme, i prikazuje srednju vrednost za grupu debljine levog uva kod ženki BALB/c miševa tretiranih prenosnikom, PMA i prenosnikom, PMA i Jedinjenjem 2 ili PMA i betametazonom.
SL. 6B predstavlja grafikon debljine uva u odnosu na vreme, i prikazuje srednju vrednost za grupu debljine desnog uva kod ženki BALB/c miševa tretiranih prenosnikom, PMA i prenosnikom, PMA i Jedinjenjem 2 ili PMA i betametazonom.
SL. 6C je grafikon aktivnosti bolesti prema vremenu, i prikazuje grupnu srednju vrednost aktivnost bolesti na levom uvu kod ženki BALB/c miševa tretiranih prenosnikom, PMA i prenosnikom, PMA i Jedinjenjem 2 ili PMA i betametazonom.
SL. 6D je grafikon aktivnosti bolesti u odnosu na vreme, i prikazuje srednju vrednost za grupu aktivnost bolesti na desnom uvu kod ženki BALB/c miševa tretiranih prenosnikom, PMA i prenosnikom, PMA i Jedinjenjem 2 ili PMA i betametazonom.
SL. 7A predstavlja grafikon indeksa aktivnosti bolesti u odnosu na vreme, i pokazuje aktivnost bolesti kod mužjaka BALB/c miševa tretiranih prenosnikom, IMQ i prenosnikom, IMQ i 1 µM Jedinjenja 2, ili IMQ i 10 mg/kg ciklofosfamida pre primene IMQ.
SL. 7B predstavlja grafikon indeksa aktivnosti bolesti u odnosu na vreme, i pokazuje aktivnost bolesti kod mužjaka BALB/c miševa tretiranih prenosnikom, IMQ i prenosnikom, IMQ i 1 µM Jedinjenja 2, ili IMQ i 10 mg/kg ciklofosfamida posle primene IMQ.
SL. 8A predstavlja grafikon kumulativnog unosa hrane u odnosu na vreme, i prikazuje kumulativni unos hrane kod mršavih Zucker pacova i gojaznih Zucker pacova, tretiranih prenosnikom (vehicle, VEH), 1.5 mg/kg Jedinjenja ili 3.0 mg/kg Jedinjenja 2.
SL. 8B predstavlja grafikon prosečnog unosa hrane u odnosu na vreme, i prikazuje prosečan unos hrane kod mršavih Zucker pacova i gojaznih Zucker pacova, tretiranih prenosnikom (VEH), 1.5 mg/kg Jedinjenja ili 3.0 mg/kg Jedinjenja 2.
SL. 9 je grafikon sa stubićima procenta promene telesne težine u odnosu na vreme, i prikazuje procenat promene telesne težine kod mršavih Zucker pacova i gojaznih Zucker pacova tretiranih prenosnikom (VEH), 1.5 mg/kg Jedinjenja ili 3.0 mg/kg Jedinjenja 2 tokom perioda tretmana (dani studije 10 i 17) i tokom perioda ispiranja (dan studije 24), u eksperimentu.
SL. 10A predstavlja grafikon kumulativnog unosa hrane u odnosu na vreme, i prikazuje kumulativni unos hrane kod pacova hranjenih normalnom hranom za pacove i kod pacova hranjenih dijetom sa visokim sadržajem masti i tretiranih
1
prenosnikom, 1.5 mg/kg Jedinjenja ili 3.0 mg/kg Jedinjenja 2 tokom bazalne faze studije, faze tretmana i faze ispiranja.
SL. 10B predstavlja grafikon prosečne telesne težine u odnosu na vreme, i prikazuje prosečnu telesnu težinu pacova hranjenih normalnom hranom za pacove i pacova hranjenih dijetom sa visokim sadržajem masti i tretiranih prenosnikom, 1.5 mg/kg Jedinjenja ili 3.0 mg/kg Jedinjenja 2 tokom bazalne faze studije, faze tretmana i faze ispiranja.
SL. 11 predstavlja grafikon sa stubićima procenta promene telesne težine u odnosu na vreme, i prikazuje procenat promene telesne težine pacova hranjenih normalnom hranom za pacove i pacova hranjenih dijetom sa visokim sadržajem masti i tretiranih prenosnikom, 1.5 mg/kg Jedinjenja ili 3.0 mg/kg Jedinjenja 2. SL. 12A predstavlja grafikon ekspresije Nrf2 pod različitim uslovima, uključujući nokdaun uslove.
SL. 12B predstavlja grafikon ekspresije NQO1 pod različitim uslovima, uključujući nokdaun uslove.
SL. 12C predstavlja grafikon ekspresije EPHX1 pod različitim uslovima, uključujući nokdaun uslove.
SL. 13A predstavlja grafikon sa stubićima koji pokazuje koliko je puta promenjena ekspresija COX-2 iRNK, i prikazuje da Jedinjenje 1 ne utiče na transkripciju COX-2. Analiza ekspresije COX-2 iRNK pomoću qRT-PCR netretiranih HeLa ćelija (kontrola) upoređena je sa HeLa ćelijama tretiranim sa 10 µM Jedinjenja 1, 20 ng/ml TNFα, ili 10 µM Jedinjenja 1 20 ng/ml TNFα. SL. 13B predstavlja grafikon intenziteta ekspresije COX-2 proteina, i prikazuje da Jedinjenje 1 inhibira TNFα-indukovanu ekspresiju COX-2 proteina.
SL. 14A predstavlja sliku ćelija tretiranih sa DMSO, 20 ng/mL TNFα, ili Jedinjenjem 1 20 ng/mL TNFα, i pokazuje lokalizaciju različitih CRM1 tovarproteina povezanih sa inflamacijom.
SL. 14B predstavlja sliku ćelija tretiranih sa DMSO, 20 ng/mL TNFα, ili Jedinjenjem 1 20 ng/mL TNFα, i pokazuje lokalizaciju IκB, NFκB, NRF2, PPARγ i RXRα.
SL. 15A predstavlja grafikon latencije do dostizanja platoa u MWM testu u funkciji vremena, i pokazuje efekat lažnog ("sham") tretmana, kontrolnog tretmana, tretmana progesteronom i tretmana različitim dozama Jedinjenja 1, na latenciju miševa do dostizanja platoa tokom faze akvizicije MWM testa (podaci predstavljaju srednju vrednost ± SEM).
SL. 15B predstavlja grafikon koncentracije citokina, i prikazuje koncentraciju nekoliko citokina u plazmi pacova.
SL. 15C predstavlja fotografiju celog mozga životinja koje su dobile lažne lezije ("sham"), CCI prenosnik (kontrola), ili CCI Jedinjenje 1 (6 mg/kg), i prikazuje rezultate kvalitativne vizuelne inspekcije celih mozgova pre sečenja na vibratomu. Pregledanje je pokazalo da nijedna (0 od 4) od životinja koje su primile lažne lezije nije ispoljila oštećenje dorzo-medijalnog korteksnog tkiva. Potpuno obrnuto, sve četiri CCI kontrole ispoljile su jako bilateralno oštećenje ograničeno na ovaj region korteksa. CCI životinje koje su primile Jedinjenje 1 imale su oštećenje u opsegu od umerenog do minimalnog. Posebno treba napomenuti da je mozak sa najjačim oštećenjem u grupi koja je primila Jedinjenje 1, izgledao manje dramatično od svakog od mozgova u CCI kontrolnoj grupi.
SL. 15D predstavlja mikrografija na malom uveličanju NeuN obeležavanja dorzalne kortikalne zone i ventralne kortikalne zone lažno tretiranih ("sham"), CCI prenosnik-tretiranih (kontrola), i CCI Jedinjenje1-tretiranih (KPT) životinja.
SL. 15E prikazuje fotomikrografije imunofluorescentno obeleženih pacovskih IgG i TNFα kod lažno tretiranih ("sham"), CCI prenosnik-tretiranih (kontrola), i CCI Jedinjenje 1-tretiranih (KPT) životinja.
SL. 16A predstavlja grafikon kliničkog skora u funkciji vremena i pokazuje kliničke skorove za artritis naivnih ženki Lewis pacova, kontrolnih artritičnih ženki Lewis pacova ili artritičnih ženki Lewis pacova tretiranih Jedinjenjem 2. SL. 16B predstavlja grafikon otečenosti zgloba u funkciji vremena, i pokazuje otok zgloba meren na skali 0-4 kod naivnih ženki Lewis pacova, kontrolnih artritičnih ženki Lewis pacova ili artritičnih ženki Lewis pacova tretiranih Jedinjenjem 2.
SL. 17A predstavlja grafikon mineralne gustine kosti (bone mineral density, BMD) tarzalnih kostiju naivnih ženki Lewis pacova, kontrolnih artritičnih ženki Lewis pacova, i artritičnih ženki Lewis pacova tretiranih Jedinjenjem 2.
SL. 17B predstavlja vizuelizaciju trodimenzionalnim mikro CT skenerom zadnjih šapa naivnih ženki Lewis pacova, kontrolnih artritičnih ženki Lewis pacova, i artritičnih ženki Lewis pacova tretiranih Jedinjenjem 2.
SL. 17C predstavlja grafikon koncentracije IL-1β u sinovijalnoj tečnosti u funkciji vremena, i prikazuje koncentraciju IL-1β u sinovijalnoj tečnosti sakupljenoj iz pacova iz grupe A (naivni), grupe B (model) i grupe C (Jedinjenje 2, 5 mg/kg QoD) na dane 21 i 27 CIA studije br.2.
SL. 17D predstavlja grafikon koncentracije IL-6 u sinovijalnoj tečnosti u funkciji vremena, i prikazuje koncentraciju IL-6 u sinovijalnoj tečnosti sakupljenoj iz pacova iz grupe A (naivni), grupe B (model) i grupe C (Jedinjenje 2, 5 mg/kg QoD) na dane 21 i 27 CIA studije br.2.
SL. 17E je grafikon koncentracije MCP-1 u sinovijalnoj tečnosti u funkciji vremena, i prikazuje koncentraciju MCP-1 u sinovijalnoj tečnosti sakupljenoj iz pacova iz grupe A (naivni), grupe B (model) i grupe C (Jedinjenje 2, 5 mg/kg QoD) na dane 21 i 27 CIA studije br.2.
SL. 17F je grafikon koncentracije CRP u sinovijalnoj tečnosti u funkciji vremena, i prikazuje koncentraciju CRP u sinovijalnoj tečnosti sakupljenoj iz pacova iz grupe A (naivni), grupe B (model) i grupe C (Jedinjenje 2, 5 mg/kg QoD) na dane 21 i 27 CIA studije br.2.
SL. 17G je grafikon koncentracije IL-1β u serumu u funkciji vremena, i prikazuje koncentraciju IL-1β u uzorcima seruma pacova sakupljenim od pacova iz grupe A (naivni), grupe B (model) i grupe C (Jedinjenje 2, 5 mg/kg QoD) na dane 15, 21 i 27 CIA studije br.2.
SL. 18A predstavlja šemu MOG-indukovanog EAE mišjeg modela kod ženki miševa, opisanog u ovom tekstu.
SL. 18B je grafikon kliničkog skora u funkciji dana studije, i pokazuje efekte tretmana prenosnikom, tretmana deksametazonom i tretmana Jedinjenjem 1 na klinički skor kod ženki miševa u MOG-indukovanom EAE mišjem modelu opisanom u ovom tekstu.
1
SL. 19 predstavlja fotografije rana tretiranih površinski ili sistemski Jedinjenjem 1 ili njegovim odgovarajućim prenosnikom, i prikazuje rezultate procene morfologije rane sprovedene na dan 5 posle ranjavanja.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
Jedinjenja pronalaska
[0024] Prvi primer izvođenja obezbeđuje jedinjenje formule I:
ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, gde:
R<1>se bira između vodonika i C1-C4alkil;
R<2>se bira između O; i
R<3>se bira između -N(R<4>)-(C3-C6cikloalkil), -C1-C6alkil, -(C0-C4alkilen)-heterociklil, i -(C0-C4alkilen)-heteroaril, gde je bilo koji alkil, alkilen, heterociklil, ili heteroaril deo R<3>opciono i nezavisno supstituisan; i
R<4>se bira između vodonika i C1-C4alkil.
[0025] U prvom aspektu prvog primera izvođenja, R<1>se bira između vodonika i metil. Vrednosti ostalih varijabli su kao što je opisano u prvom primeru izvođenja.
[0026] U drugom aspektu prvog primera izvođenja, R<1>je vodonik. Vrednosti ostalih varijabli su kao što je opisano u prvom primeru izvođenja.
[0027] U trećem aspektu prvog primera izvođenja R<2>je O. Vrednosti ostalih varijabli su kao što je opisano u prvom primeru izvođenja, ili njegovom prvom ili drugom aspektu.
[0028] U četvrtom aspektu prvog primera izvođenja, R<4>je vodonik.
[0029] U petom aspektu prvog primera izvođenja, R<3>je odabran od -N(R<4>)-(C3-C6cikloalkil), -C3-C6alkil, -(C0-C1alkilen)-heterociklil, i -(C0-C1alkilen)-heteroaril, pri čemu je bilo koji alkil ili alkilen deo R<3>opciono i nezavisno supstituisan jednim ili većim brojem supstituenata odabranih iz grupe koja se sastoji od okso i -N(R<5>)2, gde je svaki R<5>nezavisno odabran od vodonika i C1-C4alkil; bilo koji heterociklil deo R3 sadrži najmanje jedan atom azota u prstenu, i opciono je supstituisan jednim ili većim brojem supstituenata izabranih iz grupe koja se sastoji od C1-C4alkil i okso; i bilo koji heteroaril deo R<3>sadrži najmanje jedan atom azota u prstenu, i opciono je supstituisan jednim ili većim brojem C1-C4alkil. Vrednosti ostalih varijabli su kao što je opisano u prvom primeru izvođenja, ili njegovom prvom do četvrtom aspektu. U šestom aspektu prvog primera izvođenja, bilo koji heteroaril deo R<3>je opciono i nezavisno supstituisan jednim ili većim brojem supstituenata odabranih iz grupe koja se sastoji od -OH,-SH, nitro, halogen, amino, cijano, C1-C12alkil, C2-C12alkenil, C2-C12alkinil grupe, C1-C12alkoksi, C1-C12haloalkil, C1-C12haloalkoksi i C1-C12alkil sulfanil; i bilo koji alkil, alkilen ili heterociklil deo R<3>opciono i nezavisno supstituisan jednim ili većim brojem supstituenata odabranih iz grupe koja se sastoji od okso, -OH, -SH, nitro, halogen, amino, cijano, C1-C12alkil, C2-C12alkenil, C2-C12alkinil, C1-C12alkoksi, C1-C12haloalkil, C1-C12haloalkoksi i C1-C12alkil sulfanil. Vrednosti ostalih varijabli su kao što je opisano u prvom primeru izvođenja, ili prvom do petom aspektu.
[0030] U sedmom aspektu prvog primera izvođenja, R<3>se bira između -C(CH3)3, -CH(NH2)-CH(CH3)2, -NH-ciklopropil, -(CH2)0-1-pirazinil, piperidinil, hidroksipiperidinil, N-metilpiperidinil, -CH2-morfolin-4-il, i metilpirazolil. Vrednosti ostalih varijabli su kao što je opisano u prvom primeru izvođenja, ili u njegovom prvom do petom aspektu.
[0031] U osmom aspektu prvog primera izvođenja, R<3>se bira između -C(CH3)3, -CH(NH2)-CH(CH3)2, -NH-ciklopropil, -(CH2)0-1-pirazin-2-il, piperidin-3-il, -CH2-morfolin-4-il, i 5-metil-1-H-pirazol-4-il. Vrednosti ostalih varijabli su kao što je opisano u prvom primeru izvođenja, ili u njegovom prvom do petom aspektu.
[0032] U devetom aspektu prvog primera izvođenja, R<3>se bira između -C(CH3)3, -NH-ciklopropil, -CH2-pirazin-2-il, -pirazin-2-il, -CH2-morfolin-4-il, i 5-metil-1-H-pirazol-4-il. Vrednosti ostalih varijabli su kao što je opisano u prvom primeru izvođenja, ili u njegovom prvom do petom aspektu.
[0033] Drugi primer izvođenja je jedinjenje formule (I), ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, gde se R<3>bira između -N(R<4>)-(C3-C6cikloalkil), -C3-C6alkil, -(C0-C1alkilen)-heterociklil, i -(C0-C1alkilen)-heteroaril, gde:
1
bilo koji alkil ili alkilen deo R<3>je opciono supstituisan sa -N(R<5>)2, gde je svaki R<5>nezavisno odabran između vodonika i C1-C4alkil;
bilo koji heterociklil, i heteroaril deo R<3>uključuje najmanje jedan atom azota u prstenu; i
bilo koji heterociklil, i heteroaril deo R<3>je opciono supstituisan sa C1-C4alkil.
[0034] U prvom aspektu drugog primera izvođenja, R<3>se bira između -C(CH3)3, -CH(NH2)-CH(CH3)2, -NH-ciklopropil, -(CH2)0-1-pirazinil, piperidinil, hidroksipiperidinil, N-metilpiperidinil, -CH2-morfolin-4-il, i metilpirazolil.
[0035] U drugom aspektu drugog primera izvođenja, R<3>se bira između -C(CH3)3, -CH(NH2)-CH(CH3)2, -NH-ciklopropil, -(CH2)0-1-pirazin-2-il, piperidin-3-il, -CH2-morfolin-4-il, i 5-metil-1-H-pirazol-4-il.
[0036] U trećem aspektu drugog primera izvođenja, R<3>se bira između -C(CH3)3, -NH-ciklopropil, -CH2-pirazin-2-il, -pirazin-2-il, -CH2-morfolin-4-il, i 5-metil-1-H-pirazol-4-il.
[0037] Treći primer izvođenja obezbeđuje jedinjenje formule I, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, gde se R<3>bira između -N(R<4>)-(C3-C6cikloalkil), -C3-C6alkil, -(C0-C1alkilen)-heterociklil, i -(C0-C1alkilen)-heteroaril, gde:
bilo koji alkil ili alkilen deo bilo kojeg R<3>je opciono i nezavisno supstituisan jednim ili većim brojem supstituenata odabranih iz grupe koja se sastoji od okso i -N(R<5>)2, gde se svaki R<5>nezavisno bira između vodonika i C1-C4alkil; bilo koji heterociklil deo R<3>sadrži najmanje jedan atom azota u prstenu, i opciono je supstituisan jednim ili većim brojem supstituenata koji se biraju iz grupe koja se sastoji od C1-C4alkil i okso; i
bilo koji heteroaril deo R<3>uključuje najmanje jedan atom azota u prstenu i opciono je supstituisan jednim ili više C1-C4alkil. Vrednosti ostalih varijabli su kao što je opisano u prvom primeru izvođenja, ili u njegovom prvom do petom aspektu.
[0038] U prvom aspektu trećeg primera izvođenja, R<3>je -(C0-C1alkilen)-heterociklil. Vrednosti ostalih varijabli su kao što je opisano u prvom primeru izvođenja, ili u njegovom prvom do petom aspektu.
1
[0039] U drugom aspektu trećeg primera izvođenja, R<3>je -(C0-C1alkilen)-heterociklil, gde se heterociklil bira između pirazinil, piperidinil, morfolinil, i pirazolil. Vrednosti ostalih varijabli su kao što je opisano u prvom primeru izvođenja, ili u njegovom prvom do petom aspektu.
[0040] U trećem aspektu trećeg primera izvođenja, R<3>je -(C0-C1alkilen)-heterociklil, gde je heterociklil morfolinil. Vrednosti ostalih varijabli su kao što je opisano u prvom primeru izvođenja, ili u njegovom prvom do petom aspektu.
[0041] U četvrtom aspektu trećeg primera izvođenja, R<3>je -(C1alkilen)-heterociklil. Vrednosti ostalih varijabli su kao što je opisano u prvom primeru izvođenja, ili u njegovom prvom do petom aspektu.
[0042] U petom aspektu trećeg primera izvođenja, R<3>je -(C1alkilen)-morfolinil. Vrednosti ostalih varijabli su kao što je opisano u prvom primeru izvođenja, ili u njegovom prvom do petom aspektu.
[0043] Primeri jedinjenja formule I navedeni su u Tabeli 1. Jedinjenje 4 je referentni primer.
Tabela 1. Primeri jedinjenja formule I.
1
1
1
2
[0044] U nekim primerima izvođenja, jedinjenje pronalaska se bira između bilo kojeg od jedinjenja 1 do 11. U jednom aspektu ovih primera izvođenja, jedinjenje se bira između bilo kojeg od jedinjenja 1, 2, 3, 4, 8 i 11.
[0045] Farmakokinetika (PK) ima sve veću ulogu u otkrivanju i razvoju lekova. Farmakokinetika je kvantitativna studija vremenskog toka apsorpcije, distribucije, metabolizma i/ili ekskrecije leka. Posle primene, lek brzo sa mesta primene ulazi u sistemsku cirkulaciju krvi. Jedna mera obima distribucije terapijskog sredstva je oblast ispod krive koncentracije u plazmi u odnosu na vreme (area under the plasma concentration-time curve, AUC), izračunata za poslednju merenu koncentraciju (AUCt) i ekstrapolirana ka beskonačnosti (AUCInf). AUC je prema tome jedinica koja se često koristi za kvantifikovanje izloženosti leku.
[0046] Uopšteno, što je veća izloženost terapijskom sredstvu, veći je efekat sredstva. Međutim, visoka izloženost terapijskom sredstvu može imati štetne efekte na neka tkiva kao što je mozak. Iako krvno-moždana barijera (blood-brain barrier, BBB), zaštitna mreža koja se sastoji od čvrstih spojeva između endotelskih ćelija, ograničava difuziju hidrofilnih i/ili velikih molekula, lekovi sa visokom AUC i dalje mogu da prođu kroz BBB i/ili uđu u cerebrospinalnu tečnost. Takav prodor je često nepoželjan i može dovesti do neželjnih sporednih efekata. Sadašnji napori u otkrivanju novih lekova za cilj imaju, delom, postojanje striktog balansa između maksimalnog izlaganja leku (tj. AUC) i minimiziranja prodora u mozak.
[0047] Odnos "mozak prema plazmi" (odnos nivoa terapijskog sredstva u mozgu i u plazmi, brain to plasma ratio, B:P) jedan je od metoda kvantifikovanja relativne distribucije terapijskog sredstva u moždanom tkivu u odnosu na cirkulaciju. Taj odnos je jedan pokazatelj prodiranja datog terapijskog sredstva u mozak. Visok odnos "mozak prema plazmi" poželjan je kada je bolest koja se leči lokalizovana u centralnom nervnom sistemu (CNS), uključujući tu mozak i cerebrospinalnu tečnost. Međutim, niži odnos "mozak prema plazmi" poželjan je obično za ne-CNS terapijska sredstva, kako bi se na najmanju meru svelo prodiranje u mozak i izbegli mogući sporedni efekti. Prema tome, nizak odnos "mozak prema plazmi" poželjan je da bi se izbegla neželjena akumulacija terapijskog sredstva u mozgu i tkivu CNS.
[0048] Kako će kasnije uz više detalja biti objašnjeno u odeljku Primeri, jedinjenja predmetnog pronalaska pokazuju višu AUC i/ili niži B:P u poređenju sa drugim inhibitorima nukleusnog transporta kao što su oni objavljeni u zajedničkoj U.S. patentnoj prijavi br. 13/041,377, podnetoj 5. marta 2011. i objavljenoj kao US 2009/0275607 10. novembra 2011. U nekim primerima izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje jedinjenje formule I, gde jedinjenje ima nukleusnu eksportnu aktivnost <1 µM (manje od 1µM), AUCInfveću od oko 3500; i B:P manji od oko 2.5, kada se daje mišu u dozi od 10 mg/kg po.
[0049] Nove osobine predmetnog pronalaska postaće očigledne stručnjacima u oblasti posle uvida u detaljan opis pronalaska, koji sledi.
Jedinjenja i definicije
[0050] Jedinjenja ovog pronalaska uključuju ona koja su uopšteno opisana ranije u ovom tekstu, i koja će dodatno biti ilustrovana klasama, podklasama i vrstama opisanim u nastavku ovog teksta. U ovom tekstu, koristiće se definicije koje slede, ukoliko nije drugačije napomenuto. Za potrebe ovog pronalaska, hemijski elementi su označeni u skladu sa tabelom periodnog sistema elemenata, CAS verzija, Handbook of Chemistry and Physics, 75th Ed. Pored toga, opšti principi organske hemije opisani su u "Organic Chemistry", Thomas Sorrell, University Science Books, Sausalito: 1999, i "March's Advanced Organic Chemistry", 5th Ed., Ed.: Smith, M.B. and March, J., John Wiley & Sons, New York: 2001.
[0051] Ukoliko nije drugačije napomenuto u ovoj specifikaciji, nomenklatura koja se u ovoj specifikaciji koristi uopšteno prati primere i pravila navedena u Nomenclature of Organic Chemistry, odeljci A, B, C, D, E, F, i H, Pergamon Press, Oxford, 1979, koji opisuje nazive ilustrativnih hemijskih struktura i pravila o imenovanju hemijskih struktura. Opciono, naziv jedinjenja može da se napravi korišćenjem programa za davanje hemijskih naziva: ACD/ChemSketch, verzija 5.09/septembar 2001, Advanced Chemistry Development, Inc., Toronto, Canada.
[0052] Jedinjenja predmetnog pronalaska mogu imati asimetrične centre, hiralne osovine, i hiralne ravni (npr., kako je opisano u: E. L. Eliel and S. H. Wilen, Stereochemistry of Carbon Compounds, John Wiley & Sons, New York, 1994, strane 1119-1190), i mogu se sretati kao racemati, racemske mešavine, i kao individualni dijastereomeri ili enantiomeri, sa svim mogućim izomerima i njihovim mešavinama, uključujući optičke izomere, pri čemu su svi uključeni u predmetni pronalazak.
[0053] Izraz "halo" ili "halogen" kako se koristi u ovom tekstu, označava halogen i uključuje, na primer, i bez ograničavanja na njih, fluoro, hloro, bromo, jodo i slično, u radioaktivnoj i neradioaktivnoj formi.
[0054] Izraz "alkil", kako se koristi u ovom tekstu, ukoliko nije drugačije naznačeno, označava linearne ili granate zasićene monovalentne ugljovodonične radikale, tipično C1-C12, poželjno C1-C6. Kao takav, "C1-C6alkil" označava linearni ili granati zasićeni monovalentni ugljovodonični radikal koji ima od jednog do šest ugljenikovih atoma (npr., 1, 2, 3, 4, 5 ili 6). Primeri alkil grupa uključuju, ali se ne ograničavaju na metil, etil, propil, izopropil, i t-butil.
[0055] Podrazumeva se da supstituente i supstitucione obrasce na jedinjenjima pronalaska može odabrati prosečno obučeni stručnjak u oblasti, da bi se dobila jedinjenja koja su hemijski stabilna i koja lako mogu da se sintetišu tehnikama poznatim
2
u struci, kao i metodima iznetim u nastavku ovog teksta. Uopšteno, izraz "supstituisan", bilo da mu prethodi izraz "opciono" ili ne, označava da su jedan ili više vodonika naznačene komponente zamenjeni odgovarajućim supstituentom. Ukoliko nije drugačije navedeno, "opciono supstituisana grupa" može imati odgovarajući supstituent na bilo kojoj pogodnoj poziciji grupe i, kada više od jedne pozicije u nekoj datoj strukturi može biti supstituisano više nego jednim supstituentom odabranim iz određene grupe, supstituent na svakoj od pozicija može biti isti ili različit. Alternativno, "opciono supstituisana grupa" može biti nesupstituisana.
[0056] Kombinacije supstituenata predviđene ovim pronalaskom poželjno su one koje za rezultat imaju formiranje stabilnih ili hemijski mogućih jedinjenja. Ako je sam supstituent supstituisan više nego jednom grupom, podrazumeva se da ove grupe mogu biti na istom ugljenikovom atomu ili na različitim ugljenikovim atomima, ako za rezultat imaju stabilnu strukturu. Izraz "stabilan", kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se na jedinjenja koja se suštinski ne menjaju kada se izlože uslovima potrebnim za njihovu proizvodnju, detekciju i, u nekim primerima izvođenja, njihovo preuzimanje, prečišćavanje i upotrebu za jednu ili više namena objavljenih u ovom tekstu.
[0057] Pogodni monovalentni supstituenti na supstitutabilnom ugljenikovom atomu "opciono supstituisane grupe" su nezavisno halogen; -(CH2)0-4R°; -(CH2)0-4OR°; -O(CH2)0-4R°, -O-(CH2)0-4C(O)OR°; -(CH2)0-4CH(OR°)2; -(CH2)0-4SR°; -(CH2)0-4Ph, koji može biti supstituisan sa R°; -(CH2)0-4O(CH2)0-1Ph koji može biti supstituisan sa R°; -CH=CHPh, koji može biti supstituisan sa R°; -(CH2)0-4O(CH2)0-1-piridil koji može biti supstituisan sa R°; -NO2; -CN; -N3; -(CH2)0-4N(R°)2; -(CH2)0-4N(R°)C(O)R°; -N(R°)C(S)R°; -(CH2)0-4N(R°)C(O)NR°2; -N(R°)C(S)NR°2; -(CH2)0-4N(R°)C(O)OR°; -N(R°)N(R°)C(O)R°; -N(R°)N(R°)C(O)NR°2; -N(R°)N(R°)C(O)OR°; -(CH2)0-4C(O)R°; -C(S)R°; -(CH2)0-4C(O)OR°; -(CH2)0-4C(O)SR°; -(CH2)0-4C(O)OSiR°3; -(CH2)0-
4OC(O)R°; -OC(O)(CH2)0-4SR-, SC(S)SR°; -(CH2)0-4SC(O)R°; -(CH2)0-4C(O)NR°2; -C(S)NR°2; -C(S)SR°; -SC(S)SR°, -(CH2)0-4OC(O)NR°2; -C(O)N(OR°)R°; -C(O)C(O)R°; -C(O)CH2C(O)R°; -C(NOR°)R°;-(CH2)0-4SSR°; -(CH2)0-4S(O)2R°; -(CH2)0-4S(O)2OR°; -(CH2)0-4OS(O)2R°; -S(O)2NR°2; -(CH2)0-4S(O)R°; -N(R°)S(O)2NR°2; -N(R°)S(O)2R°; -N(OR°)R°; -C(NH)NR°2; -P(O)2R°; -P(O)R°2; -OP(O)R°2; -OP(O)(OR°)2; SiR°3; -(C1-
4linearni ili granati alkilen)O-N(R°)2; ili -(C1-4linearni ili granati alkilen)C(O)O-N(R°)2, gde svaki R° može biti supstituisan kako je definisano dole i nezavisno je vodonik, C1-6alifatik, -CH2Ph, -O(CH2)0-1Ph, -CH2-(5-6-člani heteroaril prsten), ili 5-6-člani zasićeni, delimično nezasićeni ili aril prsten sa 0-4 heteroatoma nezavisno odabrana između azota, kiseonika, i sumpora, ili, nasuprot gornjoj definiciji, dva nezavisna R°, zajedno sa svojim međupovezujućim atomom/atomima, formiraju 3-12-člani zasićeni, delimično nezasićeni ili aril monociklični ili biciklični prsten sa 0-4 heteroatoma nezavisno odabrana između azota, kiseonika, i sumpora, koji može biti supstituisan kako je dole definisano.
[0058] Pogodni monovalentni supstituenti na R° (ili prstenu koji formiraju dva nezavisna R° zajedno sa svojim međupovezujućim atomima), su nezavisno halogen, -(CH2)0-2R<•>, -(haloR<•>), -(CH2)0-2OH, -(CH2)0-2OR<•>, -(CH2)0-2CH(OR<•>)2; -O(haloR<•>), -CN, -N3, -(CH2)0-2C(O)R<•>, -(CH2)0-2C(O)OH, -(CH2)0-2C(O)OR<•>, -(CH2)0-2SR<•>, -(CH2)0-2SH, -(CH2)0-2NH2, -(CH2)0-2NHR<•>, -(CH2)0-2NR<•>2, -NO2, -SiR<•>3, -OSiR<•>3, -C(O)SR<•>, -(C1-
4linearni ili granati alkilen)C(O)OR<•>, ili -SSR<•>gde je svaki R<•>nesupstituisan ili kada mu prethodi "halo" supstituisan samo jednim ili sa više halogena, i nezavisno odabran između C1-4alifatika, -CH2Ph, -O(CH2)0-1Ph, ili 5-6-članog zasićenog, delimično nezasićenog ili aril prstena sa 0-4 heteroatoma nezavisno odabrana između azota, kiseonika, i sumpora. Pogodni dvovalentni supstituenti na zasićenom ugljenikovom atomu R° uključuju =O i =S.
[0059] Pogodni dvovalentni supstituenti na zasićenom ugljenikovom atomu "opciono supstituisane grupe" uključuju sledeće: =O, =S, =NNR*2, =NNHC(O)R*, =NNHC(O)OR*, =NNHS(O)2R*, =NR*, =NOR*, -O(C(R*2))2-3O-, i -S(C(R*2))2-3S-, gde se svaki nezavisni R* bira između vodonika, C1-6alifatika koji može biti supstituisani kako je dole definisano, ili nesupstituisani 5-6-člani zasićeni, delimično nezasićeni ili aril prsten sa 0-4 heteroatoma nezavisno odabrana između azota, kiseonika, i sumpora. Pogodni dvovalentni supstituenti vezani za vicinalne supstitutabilne ugljenike "opciono supstituisane" grupe, uključuju: -O(CR*2)2-3O-, gde je svaki nezavisni R* odabran između vodonika, C1-6alifatika koji može biti supstituisani kako je dole definisano, ili nesupstituisani 5-6-člani zasićeni, delimično nezasićeni ili aril prsten sa 0-4 heteroatoma nezavisno odabrana između azota, kiseonika, i sumpora.
[0060] Pogodni supstituenti na alifatičnoj grupi R* uključuju halogen, -R<•>, -(haloR<•>), -OH, -OR<•>, -O(haloR<•>), -CN, -C(O)OH, -C(O)OR<•>, -NH2, -NHR<•>, -NR<•>2, i -NO2, gde je svaki R<•>nesupstituisan, ili kada mu prethodi "halo" supstituisan samo jednim ili sa više
2
halogena, i nezavisno je C1-4alifatik, -CH2Ph, -O(CH2)0-1Ph, ili 5-6-člani zasićeni, delimično nezasićeni ili aril prsten sa 0-4 heteroatoma nezavisno odabrana između azota, kiseonika, i sumpora.
[0061] Pogodni supstituenti na supstitutabilnom azotu, "opciono supstituisane grupe" uključuju -R<†>, -NR<†>2, -C(O)R<†>, -C(O)OR<†>, -C(O)C(O)R<†>, -C(O)CH2C(O)R<†>,-S(O)2R<†>, -S(O)2NR†2, -C(S)NR†2, -C(NH)NR†2, i -N(R<†>)S(O)2R<†>; gde je svaki R<†>nezavisno vodonik, C1-6alifatik koji može biti supstituisan kako je dole definisano, nesupstituisani -OPh, ili nesupstituisani 5-6-člani zasićeni, delimično nezasićeni ili aril prsten sa 0-4 heteroatoma nezavisno odabrana između azota, kiseonika, i sumpora, ili, suprotno gornjoj definiciji, dva nezavisna R<†>, zajedno sa svojim međupovezujućim atomom/atomima formiraju 3-12-člani zasićeni, delimično nezasićeni ili aril monociklični ili biciklični prsten sa 0-4 heteroatoma nezavisno odabrana između azota, kiseonika, i sumpora.
[0062] Pogodni supstituenti na alifatičnoj grupi R<†>su nezavisno halogen, -R<•>, -(haloR<•>), -OH, -OR<•>, -O(haloR<•>), -CN, -C(O)OH, -C(O)OR<•>, -NH2, -NHR<•>, -NR<•>2, ili -NO2, gde je svaki R<•>nesupstituisan, ili kada mu prethodi "halo" supstituisan samo jednim ili sa više halogena, i nezavisno je C1-4alifatik, -CH2Ph, -O(CH2)0-1Ph, ili 5-6-člani zasićeni, delimično nezasićeni ili aril prsten sa 0-4 heteroatoma nezavisno odabrana između azota, kiseonika, i sumpora.
[0063] Poželjni supstituenti na heteroarilu mogu da se biraju iz grupe koja sadrži -OH, -SH, nitro, halogen, amino, cijano, C1-C12alkil, C2-C12alkenil, C2-C12alkinil, C1-C12alkoksi, C1-C12haloalkil, C1-C12haloalkoksi i C1-C12alkil sulfanil. Poželjni supstituenti na alkil, alkilen i heterociklil uključuju poželjne supstituente na heteroaril i okso. U jednom primeru izvođenja, supstituent na alkil, alkilen, heterociklil ili heteroaril je amino grupa sa formulom -N(R<5>)2, gde se svaki R<5>nezavisno bira između vodonika i C1-C4alkil.
[0064] Supstituenti na alkil, alkilen, heterociklil i heteroaril mogu da se biraju između -OH, -SH, nitro, halogen, amino, cijano, C1-C12alkil, C2-C12alkenil, C2-C12alkinil grupe, C1-C12alkoksi, C1-C12haloalkil, C1-C12haloalkoksi i C1-C12alkil sulfanil. U jednom primeru izvođenja, supstituent je amino grupa sa formulom -N(R<5>)2, gde se svaki R<5>nezavisno bira između vodonika i C1-C4alkil.
2
[0065] Izraz "cikloalkil", kako se koristi u ovom tekstu, označava zasićene ciklične ugljovodonike, tj. jedinjenja u kojima su svi atomi u prstenu ugljenici. Primeri cikloalkila uključuju, ali se ne ograničavaju na ciklopropil, ciklobutil, ciklopentil, cikloheksil, i cikloheptil. U nekim primerima izvođenja, cikloalkil može opciono biti supstituisan jednim ili većim brojem supstituenata koji se biraju između -OH, -SH, halogen, amino, nitro, cijano, C1-C12alkil, C2-C12alkenil ili C2-C12alkinil grupe, C1-C12alkoksi, C1-C12haloalkil, i C1-C12haloalkoksi.
[0066] Izraz "heteroaril", kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se na aromatične grupe koje sadrže jedan ili više heteroatoma (O, S, ili N). Heteroaril grupa može biti monociklična ili policiklična, npr. monociklični heteroaril prsten fuzionisan sa jednom ili više karbocikličnih aromatičnih grupa ili drugih monocikličnih heteroaril grupa. Heteroaril grupe ovog pronalaska mogu uključivati i prstenaste sisteme supstituisane jednom ili većim brojem okso komponenti. Primeri heteroaril grupa uključuju, ali se ne ograničavaju na piridinil, piridazinil, imidazolil, pirimidinil, pirazolil, triazolil, pirazinil, hinolil, izohinolil, tetrazolil, furil, tienil, izoksazolil, tiazolil, oksazolil, izotiazolil, pirolil, hinolinil, izohinolinil, indolil, benzimidazolil, benzofuranil, cinolinil, indazolil, indolizinil, ftalazinil, piridazinil, triazinil, izoindolil, purinil, oksadiazolil, tiazolil, tiadiazolil, furazanil, benzofurazanil, benzotiofenil, benzotriazolil, benzotiazolil, benzoksazolil, hinazolinil, hinoksalinil, naftiridinil, dihidrohinolil, tetrahidrohinolil, dihidroizohinolil, tetrahidroizohinolil, benzofuril, furopiridinil, pirolopirimidinil, i azaindolil.
[0067] Gore navedene heteroaril grupe mogu biti C-spojene ili N-spojene (kada je to moguće). Na primer, grupa izvedena iz pirola može biti pirol-1-il (N-spojena) ili pirol-3-il (C-spojena).
[0068] "Heterociklil" označava ciklični 4-13-člani zasićeni ili nezasićeni alifatični prsten koji sadrži 1, 2, 3, 4 ili 5 heteroatoma nezavisno odabranih između N, O ili S. Kada je jedan heteroatom S, on može opciono biti mono- ili dioksigenisan (tj. -S(O)- ili -S(O)2-). Heterociklil može biti monociklik, fuzionisani biciklik, premošćeni biciklik, spiro biciklik ili policiklik.
[0069] "Okso" označava =O.
[0070] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "alkenil" označava zasićeni linearnolančani ili granati neciklični ugljovodonik sa 2 do 12 ugljenikovih atoma i sa najmanje jednom
2
dvostrukom vezom između dva ugljenika. Alkenil grupe mogu biti opciono supstituisane jednim ili većim brojem supstituenata.
[0071] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "alkinil" označava zasićeni linearnolančani ili granati neciklični ugljovodonik sa 2 do 12 ugljenikovih atoma i sa najmanje jednom trostrukom vezom između dva ugljenika. Alkinil grupe mogu biti opciono supstituisane jednim ili većim brojem supstituenata.
[0072] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "alkilen" odnosi se na alkil grupu koja ima dve tačke spoja sa ostatkom jedinjenja. Neograničavajući primeri alkilen grupa uključuju metilen (-CH2-), etilen (-CH2CH2-), n-propilen (-CH2CH2CH2-), izopropilen (-CH2CH(CH3)-), i slično. Alkilen grupe mogu biti opciono supstituisane jednim ili većim brojem supstituenata.
[0073] Izraz "haloalkil", kako se koristi u ovom tekstu, uključuje alkil supstituisan jednim ili više F, Cl, Br, ili I, gde je alkil definisan gore.
[0074] Izraz "alkoksi", kako se koristi u ovom tekstu, označava "alkil-O-" grupu, gde je alkil definisan gore. Primeri alkoksi grupe uključuju metoksi ili etoksi grupe.
[0075] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "farmaceutski prihvatljiva so" odnosi se na one soli koje su, u okvirima medicinske procene, pogodne za upotrebu u kontaktu sa tkivima čoveka i nižih životinja bez neželjene toksičnosti, iritacije, alergijskog odgovora i sličnog, i uz srazmerno razuman odnos koristi i rizika. Farmaceutski prihvatljive soli dobro su poznate u struci. Na primer, S. M. Berge et al., detaljno opisuju farmaceutski prihvatljive soli u J. Pharmaceutical Sciences, 1977, 66, 1-19. Farmaceutski prihvatljive soli jedinjenja pronalaska uključuju one koje su izvedene iz pogodnih neorganskih i organskih kiselina i baza. Primeri farmaceutski prihvatljivih, netoksičnih kiselih adicionih soli su soli amino grupe formirane sa neorganskim kiselinama kao što su hlorovodonična kiselina, bromovodonična kiselina, fosforna kiselina, sumporna kiselina i perhlorna kiselina ili sa organskim kiselinama kao što su sirćetna kiselina, trifluorosirćetna kiselina (2,2,2-trifluorosirćetna kiselina), oksalna kiselina, maleinska kiselina, tartarna kiselina, limunska kiselina, sukcinska kiselina ili malonska kiselina ili korišćenjem drugih metoda upotrebljivih u struci kao što je jonska razmena. Druge farmaceutski prihvatljive soli uključuju adipatne, alginatne, askorbatne, aspartatne, benzensulfonatne, benzoatne, bisulfatne, boratne, butiratne, kamforatne, kamforsulfonatne, citratne, ciklopentanpropionatne, diglukonatne, dodecilsulfatne,
2
etansulfonatne, formatne, fumaratne, glukoheptonatne, glicerofosfatne, glukonatne, hemisulfatne, heptanoatne, heksanoatne, hidrojodidne, 2-hidroksi-etansulfonatne, laktobionatne, laktatne, lauratne, lauril sulfatne, malatne, maleatne, malonatne, metansulfonatne, 2-naftalensulfonatne, nikotinatne, nitratne, oleatne, oksalatne, palmitatne, pamoatne, pektinatne, persulfatne, 3-fenilpropionatne, fosfatne, pivalatne, propionatne, stearatne, sukcinatne, sulfatne, tartaratne, tiocijanatne, p-toluensulfonatne, trifluoroacetatne (2,2,2-trifluoroacetatne), undekanoatne, valeratne soli, i slično.
[0076] Soli izvedene iz odgovarajućih baza uključuju soli alkalnih metala, zemnoalkalnih metala, amonijum i N<+>(C1-4alkil)4soli. Reprezentativne soli alkalnih ili zemno-alkalnih metala uključuju natrijumove, litijumove, kalijumove, kalcijumove, magnezijumove i slično. Dodatne farmaceutski prihvatljive soli uključuju, kada je pogodno, netoksične amonijum, kvaternarne amonijum, i aminske katjone, formirane korišćenjem kontrajona kao što su halid, hidroksid, karboksilat, sulfat, fosfat, nitrat, niži alkil sulfonat i aril sulfonat.
[0077] Ukoliko nije drugačije navedeno, strukture opisane u ovom tekstu treba da uključe i sve izomerne (npr., enantiomerne, dijastereomerne, i geometrijske (ili konformacione)) oblike strukture; na primer, R i S konfiguracije za svaki asimetrični centar, Z i E izomere dvostruke veze, i Z i E konformacione izomere. Prema tome, pojedinačni stereohemijski izomeri kao i mešavine enantiomera, dijastereomera, i geometrijskih (ili konformacionih) izomera predmetnih jedinjenja u okviru su pronalaska. Ukoliko nije drugačije navedeno, sve tautomerne forme jedinjenja pronalaska u okviru su pronalaska. Pored toga, ukoliko nije drugačije navedeno, strukture opisane u ovom tekstu treba da uključe jedinjenja koja se razlikuju samo po prisustvu jednog ili više izotopski obogaćenih atoma. Na primer, jedinjenja sa datom strukturom kod kojih je vodonik zamenjen deuterijomom ili tricijumom, ili ugljenik<13>C- ili<14>C-obogaćenim ugljenikom, u okviru su ovog pronalaska. Takva jedinjenja korisna su, na primer, kao analitička pomoćna sredstva, kao probe u biološkim testovima ili kao terapijska sredstva u skladu sa predmetnim pronalaskom.
[0078] Izraz "farmaceutski prihvatljiva so" označava kiselu adicionu so ili baznu adicionu so, kompatibilnu sa lečenjem pacijenata.
[0079] U nekim primerima izvođenja, primeri neorganskih kiselina koje formiraju pogodne soli uključuju, ali se ne ograničavaju na hlorovodoničnu, bromovodoničnu,
2
sumpornu i fosfornu kiselinu i soli kiseline i metala kao što su natrijum monohidrogen ortofosfat i kalijum hidrogen sulfat. Ilustrativne organske kiseline koje formiraju pogodne soli uključuju mono-, di- i trikarboksilne kiseline. Takve ilustrativne kiseline su, na primer, sirćetna, trifluorosirćetna kiselina (2,2,2-trifluorosirćetna kiselina), glikolna, mlečna, pirogrožđana, malonska, sukcinska, glutarna, fumarna, malična vinska, limunska, askorbinska, maleinska, hidroksimaleinska, benzoeva, hidroksibenzoeva, fenilsirćetna, cinaminska, salicilna, 2-fenoksibenzoeva, p-toluensulfonska kiselina i druge sulfonske kiseline kao što su metansulfonska kiselina i 2-hidroksietansulfonska kiselina. Mogu se formirati mono- ili di-kiselinske soli, i takve soli mogu postojati u hidratisanoj, solvatisanoj ili suštinski anhidrovanoj formi. Uopšteno, kisele adicione soli ovih jedinjenja su rastvorljivije u vodi i različitim hidrofilnim organskim rastvaračima, i obično pokazuju više tačke topljenja u poređenju sa svojim slobodno-baznim oblicima. Druge, farmaceutski neprihvatljive soli, npr. oksalati mogu da se koriste na primer za izolaciju jedinjenja formule I za laboratorijsku upotrebu, ili za posledičnu konverziju u farmaceutski prihvatljivu kiselu adicionu so.
[0080] "Farmaceutski prihvatljiva bazna adiciona so" je svaka netoksična organskobazna ili neorgansko-bazna adiciona so kiselih jedinjenja predstavljenih formulom I ili bilo kojeg od njegovih intermedijara. Ilustrativne neorganske baze koje formiraju pogodne soli uključuju, ali se ne ograničavaju na litijum, natrijum, kalijum, kalcijum, magnezijum ili barijum hidrokside. Ilustrativne organske baze koje formiraju pogodne soli uključuju alifatične, aliciklične ili aromatične organske amine kao što su metilamin, trimetil amin i pikolin ili amonijak. Izbor odgovarajuće soli može biti važan tako da estarska funkcionalnost, ako je prisutna, na drugom mestu u molekulu ne bude hidrolizovana. Kriterijumi za izbor pogodne soli poznati su stručnjacima u oblasti.
[0081] Kisele adicione soli jedinjenja formule I se najpogodnije formiraju od farmaceutski prihvatljivih kiselina, i uključuju na primer one formirane sa neorganskim kiselinama npr. hlorovodoničnom, sumpornom ili fosfornom kiselinom i organskim kiselinama npr. sukcinskom, maleinskom, sirćetnom, trifluorosirćetnom ili fumarnom kiselinom. Druge, farmaceutski neprihvatljive soli, npr. oksalati mogu da se koriste na primer za izolaciju jedinjenja formule I za laboratorijsku upotrebu, ili za kasniju konverziju u farmaceutski prihvatljivu kiselu adicionu so. Ovim pronalaskom obuhvaćene su i bazne adicione soli (kao što su natrijumove, kalijumove i amonijumove soli), solvati i hidrati jedinjenja pronalaska. Konverzija date soli jedinjenja u željenu so jedinjenja postiže se primenom standardnih tehnika, dobro poznatih stručnjaku u oblasti.
[0082] Izraz "stereoizomeri" je opšti izraz za sve izomere pojedinačnih molekula koji se razlikuju samo po prostornoj orijentaciji svojih atoma. Uključuju izomere tipa lika u ogledalu (enantiomere), geometrijske (cis/trans) izomere i izomere jedinjenja sa više od jednog hiralnog centra, koji nisu jedan drugome lik u ogledalu (dijastereomeri).
[0083] Izraz "leči/tretira" ili "lečiti/tretirati" znači ublažiti simptome, eliminisati uzrok simptoma, bilo privremeno ili stalno, ili sprečiti ili usporiti pojavu simptoma navedenog poremećaja ili stanja.
[0084] Izraz "terapijski efikasna količina" označava količinu jedinjenja efikasnu u lečenju ili smanjivanju jačine jednog ili više simptoma poremećaja ili stanja.
[0085] Kada se uvode elementi objavljeni u ovom tekstu, namera je da se naznači da postoje jedan ili više elemenata. Izrazi "sadrži", "ima", "uključuje" treba da budu otvoreni i označavaju da mogu postojati i dodatni elementi, različiti od elemenata koji su navedeni.
Upotrebe, formulisanje i primena
Farmaceutski prihvatljive smeše
[0086] Prema sledećem primeru izvođenja, pronalazak obezbeđuje smešu koja sadrži jedinjenje ovog pronalaska ili njegov farmaceutski prihvatljivi derivat i farmaceutski prihvatljivi nosač, adjuvans ili prenosnik. Količina jedinjenja u smešama pronalaska je takva da je efikasna u merljivom inhibiranju CRM1, u biološkom uzorku ili u pacijentu. U određenim primerima izvođenja, smeša ovog pronalaska formulisana je za primenu kod pacijenta kojem je takva smeša potrebna. Izraz "pacijent", kako se koristi u ovom tekstu, označava životinju. U nekim primerima izvođenja, životinja je sisar. U određenim primerima izvođenja, pacijent je veterinarski pacijent (tj., nehumani sisarski pacijent). U nekim primerima izvođenja, pacijent je pas. U drugim primerima izvođenja, pacijent je čovek.
[0087] Izraz "farmaceutski prihvatljivi nosač, adjuvans ili prenosnik" označava netoksični nosač, adjuvans ili prenosnik koji ne poništava farmakološku aktivnost
1
jedinjenja sa kojim je formulisan. Farmaceutski prihvatljivi nosači, adjuvansi ili prenosnici koji mogu da se koriste u smešama ovog pronalaska uključuju, ali se ne ograničavaju na izmenjivače jona, aluminijum oksid, aluminijum stearat, lecitin, serum proteine, kao što je humani serum albumin, puferske supstance kao što su fosfati, glicin, sorbinsku kiselinu, kalijum sorbat, parcijalne gliceridne mešavine zasićenih biljnih masnih kiselina, vodu, soli ili elektrolite, kao protamin sulfat, dinatrijum hidrogen fosfat, kalijum hidrogen fosfat, natrijum hlorid, cinkove soli, koloidni silicijum, magnezijum trisilikat, polivinil pirolidon, supstance na bazi celuloze, polietilen glikol, natrijum karboksimetilcelulozu, poliakrilate, voskove, polietilen-polioksipropilen-blok polimere, polietilen glikol i lanolin (vunenu mast).
[0088] Smeše predmetnog pronalaska mogu da se primenjuju oralno, parenteralno (uključujući subkutanu, intramuskularnu, intravensku i intradermalnu primenu), u vidu inhalacionog spreja, površinski, rektalno, nazalno, bukalno, vaginalno ili u vidu implantiranog rezervoara. U nekim primerima izvođenja, data jedinjenja ili smeše primenjuju se intravenski i/ili intraperitonealno.
[0089] Izraz"parenteralno" kako se koristi u ovom tekstu, uključuje subkutanu, intravensku, intramuskularnu, intraokularnu, intravitrealnu, intraartikularnu, intrasinovijalnu, intrasternalnu, intratekalnu, intrahepatičnu, intraperitonealnu intralezijsku i intrakranijalnu injekcionu ili infuzionu tehniku. Poželjno, smeše se primenjuju oralno, subkutano, intraperitonealno ili intravenski. Sterilne injektabilne forme smeša ovog pronalaska mogu biti vodene ili uljaste suspenzije. Ove suspenzije mogu da se formulišu prema tehnikama koje su poznate u struci, korišćenjem pogodnih dispergujućih ili vlažećih sredstava i suspendujućih sredstava. Sterilni injektabilni preparat može biti i sterilni injektabilni rastvor ili suspenzija u netoksičnom parenteralno prihvatljivom razblaživaču ili rastvaraču, na primer kao rastvor u 1,3-butandiolu. Među prihvatljivim prenosnicima i rastvaračima koji mogu da se koriste su voda, Ringerov rastvor i izotonični rastvor natrijum hlorida. Pored toga, sterilna, fiksna ulja konvencionalno se koriste kao rastvarač ili suspendujući medijum.
[0090] Farmaceutski prihvatljive smeše ovog pronalaska mogu da se oralno primene u bilo kojoj oralno prihvatljivoj doznoj formi uključujući, ali ne ograničavajući se na kapsule, tablete, vodene suspenzije ili rastvore. U slučaju tableta za oralnu upotrebu, nosači koji se obično koriste uključuju laktozu i kukuruzni skrob. Lubrikanti kao što je
2
magnezijum stearat, takođe se tipično dodaju. Za oralnu primenu u vidu kapsula, korisni razblaživači uključuju laktozu i sušeni kukuruzni skrob. Kada su za oralnu upotrebu potrebne vodene suspenzije, aktivni sastojak se kombinuje sa emulgujućim i suspendujućim sredstvima. Po želji, mogu se dodati i određena sredstva za zaslađivanje, poboljšanje ukusa ili bojenje. U nekim primerima izvođenja, data oralna formulacija se formuliše za trenutno oslobađanje ili produženo/odloženo oslobađanje. U nekim primerima izvođenja, smeša je pogodna za bukalnu ili sublingvalnu primenu, uključujući tablete, lozenge i pastile. Dato jedinjenje može biti i u mikroinkapsuliranoj formi.
[0091] Alternativno, farmaceutski prihvatljive smeše ovog pronalaska mogu da se primene u vidu supozitorija za rektalnu primenu. Farmaceutski prihvatljive smeše ovog pronalaska mogu se primeniti površinski, posebno kada cilj lečenja uključuje područje ili organe koji su lako dostupni putem površinskog nanošenja, uključujući oboljenja oka, kože ili donjeg intestinalnog trakta. Pogodne površinske formulacije lako se pripremaju za svako od ovih područja ili organa.
[0092] Površinska primena u donjem delu intestinalnog trakta može da se izvrši formulacijom u vidu rektalnih supozitorija (vidi gore) ili u pogodnoj fomulaciji u vidu eneme. Mogu da se koriste i površinski transdermalni flasteri.
[0093] Za oftalmusnu upotrebu, date farmaceutski prihvatljive smeše mogu da se formulišu kao mikronizovane suspenzije ili u vidu masti kao što je vazelin.
[0094] Farmaceutski prihvatljive smeše ovog pronalaska mogu da se primene i putem nazalnog aerosola ili inhalacije.
[0095] U nekim primerima izvođenja, farmaceutski prihvatljive smeše ovog pronalaska su formulisane za intraperitonealnu primenu.
[0096] Količina jedinjenja predmetnog pronalaska, koja može da se kombinuje sa nosačkim materijalima da bi se proizvela smeša u jediničnoj doznoj formi variraće u zavisnosti od domaćina koji se leči, posebnog načina primene. U jednom primeru izvođenja, date smeše treba da se formulišu tako da doza koja iznosi 0.01 - 100 mg/kg telesne težine/dan inhibitora može da se primeni kod pacijenta koji prima ove smeše. U drugom primeru izvođenja, doza iznosi od oko 0.5 do oko 100 mg/kg telesne težine, ili između 1 mg i 1000 mg/dozi, svaka 4 do 120 sati, ili kako je potrebno za određeni lek.
Tipično, farmaceutske smeše ovog pronalaska primenjivaće se od oko 1 do oko 6 puta na dan.
[0097] Treba takođe razumeti da će specifični režimi doziranja i lečenja za svakog pacijenta zavisiti od različitih faktora, uključujući aktivnost specifičnog jedinjenja koje se koristi, starost, telesnu težinu, opšte zdravstveno stanje, pol, ishranu, vreme primene, stopu ekskrecije, kombinaciju sa drugim lekovima, i procenu ordinirajućeg lekara i jačinu određene bolesti koja se leči. Količina jedinjenja predmetnog pronalaska u smeši zavisiće i od određenog jedinjenja u smeši.
[0098] Posle poboljšanja pacijentovog stanja, može se primeniti održavajuća doza jedinjenja, smeše ili kombinacije ovog pronalaska, ako je potrebno. Posle toga, doza ili učestalost primene, ili oba, mogu se smanjiti, u funkciji simptoma, do nivoa na kojem se održava poboljšano stanje kada su simptomi ublaženi do željenog nivoa. Pacijenti mogu, međutim, zahtevati intermitentni tretman na dugotrajnoj osnovi posle svakog povratka simptoma bolesti.
Upotrebe jedinjenja i farmaceutski prihvatljivih smeša
[0099] Jedinjenja i smeše opisani u ovom tekstu obično su od koristi u inhibiranju CRM1, a time i u lečenju jednog ili više poremećaja udruženih sa aktivnošću CRM1. Prema tome, u određenim primerima izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za lečenje CRM1- posredovanog poremećaja koji obuhvata korak davanja pacijentu kome je to potrebno jedinjenja predmetnog pronalaska, ili njegove farmaceutski prihvatljive smeše. Jedinjenja i smeše opisani u ovom tekstu mogu da se primenjuju i na ćelijskim kulturama, npr. in vitro ili ex vivo, ili kod subjekta, npr., in vivo, za lečenje, prevenciju, i/ili dijagnozu različitih poremećaja, uključujući one koji su opisani u nastavku ovog teksta.
[0100] Aktivnost jedinjenja upotrebljenih u ovom pronalasku kao inhibitora CRM1 može biti testirana in vitro, in vivo ili u ćelijskoj liniji. Detaljni uslovi testiranja jedinjenja upotrebljenih u ovom pronalasku kao inhibitora CRM1 navedeni su u Primerima kasnije u ovom tekstu.
[0101] U ovom tekstu, izraz "CRM1-posredovani" poremećaj ili stanje, kako se ovde koristi, označava svaku bolest ili drugo štetno stanje za koje se zna da u njemu ulogu
4
ima CRM1. Prema tome, sledeći primer izvođenja predmetnog pronalaska odnosi se na lečenje ili smanjivanje jačine jednog ili više oboljenja za koja se zna da u njima ulogu ima CRM1. U nekim primerima izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za lečenje bolesti udruženih sa ekspresijom ili aktivnošću p53, p73, p21, pRB, p27, IκB, NFκB, c-Abl, FOXO proteina, COX-2, ili HDAC (histon deacetilaze) kod subjekta koji obuhvata davanje pacijentu terapijski efikasne količine ovde opisanog jedinjenja. U drugom primeru izvođenja, predmetni pronalazak se odnosi na postupak za lečenje ili smanjenja jačine bolesti ili stanja odabranih između proliferativnog poremećaja (npr., kancer), zapaljenskog poremećaja, autoimunskog poremećaja, virusne infekcije, oftalmološkog poremećaja ili neurodegenerativnog poremećaja pri čemu navedeni postupak obuhvata davanje pacijentu kome je to potrebno jedinjenja ili smeše prema predmetnom pronalasku. U specifičnijem primeru izvođenja, predmetni pronalazak se odnosi na postupak za lečenje ili smanjivanje jačine kancera. Specifični primeri gornjih poremećaja navedeni su detaljno kasnije u ovom tekstu.
[0102] Kanceri koji se mogu lečiti jedinjenjima ovog pronalaska uključuju, ali se ne ograničavaju na hematološke malignitete (leukemije, limfome, mijelome uključujući multipli mijelom, mijelodisplastični i mijeloproliferativni sindrom) i solidne tumore (karcinome kao što su karcinomi prostate, dojke, pluća, kolona, pankreasa, bubrega, ovarijuma, kao i karcinome mekih tkiva i osteosarkome, i tumore strome). Kancer dojke (breast cancer, BC) može uključivati kancer dojke nalik bazalnom (basal-like breast cancer, BLBC), trostruko negativni kancer dojke (triple negative breast cancer, TNBC) i kancer dojke koji je i BLBC i TNBC. Pored toga, kancer dojke može uključivati invazivni ili neinvazivni duktusni ili lobulusni karcinom, tubularni, medularni, mucinozni, papilarni, kribriformni karcinom dojke, kancer dojke kod muškaraca, povratni ili metastatski kancer dojke, filoidni tumor dojke i Pagetovu bolest bradavice.
[0103] Inflamatorni poremećaji koji se mogu lečiti jedinjenjima ovog pronalaska uključuju, ali se ne ograničavaju na multiplu sklerozu, reumatoidni artritis, degenerativno oboljenje zgloba, sistemski eritemski lupus, sistemsku sklerozu, vaskulitisne sindrome (malih, srednjih i velikih sudova), aterosklerozu, zapaljensku bolest creva, sindrom iritabilnog kolona, Crohnovu bolest, mukozni kolitis, ulcerativni kolitis, gastritis, sepsu, psorijazu i druge dermatološke zapaljenske poremećaje (kao što su ekcem, atopijski dermatitis, kontaktni dermatitis, urtikarija, skleroderma, i dermatoza sa akutnim inflamatornim komponentama, pemfigus, pemfigoidni, alergijski dermatitis), i urtikarijski sindromi.
[0104] Virusne bolesti koje se mogu lečiti jedinjenjima ovog pronalaska uključuju, ali se ne ograničavaju na akutni febrilni faringitis, faringokojunktivalnu groznicu, epidemijski keratokonjunktivitis, infantilni gastroenteritis, koksaki infekcije, infektivnu mononukleozu, Burkittov limfom, akutni hepatitis, hronični hepatitis, hepatičnu cirozu, hepatocelularni karcinom, primarnu HSV-1 infekciju (npr., gingivostomatitis kod dece, tonzillitis i faringitis kod odraslih, keratokonjunktivitis), latentnu HSV-1 infekciju (npr., herpes labijalis i groznice na usni), primarnu HSV-2 infekciju, latentnu HSV-2 infekciju, aseptični meningitis, infektivnu mononukleozu, citomegalijsku inkluzionu bolest, Kaposijev sarkom, multicentričnu Castlemanovu bolest, primarni efuzioni limfom, AIDS, influencu, Reyev sindrom, morbile, postinfektivni encefalomijelitis, zauške, hiperplastične epitelne lezije (npr., obične, pločaste, plantarne i anogenitalne bradavice, laringealni papilomi, epidermodisplazija veruciformis), karcinom cerviksa, karcinom skvamoznih ćelija, krup, pneumoniju, bronhiolitis, običnu prehladu, poliomijelitis, besnilo, sindrom sličan influenci, jaki bronhiolitis sa pneumonijom, rubelu, kongenitalna rubelu, varičelu i herpes zoster. Virusne bolesti koje se mogu lečiti jedinjenjima ovog pronalaska uključuju i hronične virusne infekcije, uključujući hepatitis B i hepatitis C.
[0105] Primeri oftalmoloških poremećaja uključuju, ali se ne ograničavaju na makularni edem (dijabetički i nedijabetički makularni edem), makularnu degeneraciju udruženu sa starenjem, vlažna i suva forma, disciformnu makularnu degeneraciju udruženu sa starenjem, cistoidni makularni edem, palpebralni edem, retinalni edem, dijabetičnu retinopatiju, horioretinopatiju, neovaskularnu makulopatiju, neovaskularni glaukom, uveitis, iritis, retinalni vaskulitis, endoftalmitis, panoftalmitis, metastatsku oftalmiju, horoiditis, retinalni pigmentni epitelitis, konjunktivitis, ciklitis, skleritis, episkleritis, optički neuritis, retrobulbarni optički neuritis, keratitis, blefaritis, eksudativno odlubljivanje retine, kornealni ulcer, konjunktivalni ulcer, hronični numularni keratitis, oftalmičku bolest udruženu sa hipooksijom ili ishemijom, retinopatiju udruženu sa prevremenim rođenjem, proliferativnu dijabetičnu retinopatiju, polipoidnu horoidalnu vaskulopatiju, retinalnu angiomatoznu proliferaciju, retinalnu erterijsku okluziju, retinalnu vensku okluziju, Coatsovu bolest, porodičnu eksudativnu vitreoretinopatiju, pulsnu bolest (Takayasuova bolest), Ealesovu bolest, sindrom antifosfolipidnih antitela, leukemijskuu retinopatiju, sindrom hiperviskoznosti krvi, makroglobulinemiju, retinopatiju udruženu sa interferonom, hipertenzivnu retinopatiju, radijacionu retinopatiju, deficijenciju kornealnih epitelnih matičnih ćelija ili kataraktu.
[0106] Neurodegenerativne bolesti koje se mogu lečiti jedinjenjima formule I uključuju, ali se ne ograničavaju na Parkinsonovu, Alzheimerovu, i Huntingtonovu bolest, i amiotrofičnu lateralnu sklerozu (ALS/Lou Gehrigova bolest).
[0107] Jedinjenja i smeše opisani u ovom tekstu mogu da se koriste i za lečenje poremećaja nenormalnog rasta tkiva i fibroze uključujući dilatativnu kardiomiopatiju, hipertrofičnu kardiomiopatiju, restriktivnu kardiomiopatiju, plućnu fibrozu, hepatičnu fibrozu, glomerulonefritis, policistični poremećaj bubrega (polycystic kidney disorder, PKD) i druge poremećaje bubrega.
[0108] Jedinjenja i smeše opisani u ovom tekstu mogu da se koriste i za lečenje poremećaja povezanih sa unosom hrane kao što su gojaznost i hiperfagija.
[0109] U sledećem primeru izvođenja, jedinjenje ili smeša opisani u ovom tekstu mogu se koristiti za lečenje ili prevenciju alergija i respiratornih poremećaja, uključujući astmu, bronhitis, plućnu fibrozu, alergijski rinitis, kiseoničku toksičnost, emfizem, hronični bronhitis, sindrom akutnog respiratornog distresa, i svaku hroničnu opstruktivnu bolest pluća (chronic obstructive pulmonary disease, COPD).
[0110] U nekim primerima izvođenja, poremećaji ili stanja udružena sa aktivnošću CRM1 su mišićna distrofija, artritis, na primer, osteoartritis i reumatoidni artritis, ankilozni spondilitis, traumatska povreda mozga, povreda kičmene moždine, sepsa, reumatska bolest, kancer ateroskleroza, dijabetes tipa 1, dijabetes tipa 2, leptospirozna bolest bubrega, glaukom, retinalna bolest, starenje, glavobolja, bol, kompleksni regionalni sindrom bola, hipertrofija srca, mišićna atrofija, katabolički poremećaji, gojaznost, zaostajanje fetusa u rastu, hiperholesterolemija, bolest srca, hronična srčana slabost, ishemija/reperfuzija, moždani udar, cerebralna aneurizma, angina pektoris, bolest pluća, cistična fibroza, kiselinom izazvano oštećenje pluća, plućna hipertenzija, astma, hronična opstruktivna bolest pluća, Sjogrenov sindrom, hijalinomembranska bolest, bolest bubrega, glomerularna bolest, alkoholna bolest jetre, bolest creva, peritonealna endometrioza, bolest kože, nazalni sinuzitis, mezoteliom, anhidrotska ektodermalna displazija-ID, Behcetova bolest, pigmentna inkontinencija, tuberkuloza, astma, Crohnova bolest, kolitis, očna alergija, apendicitis, Pagetova bolest, pankreatitis, periodonitis, endometrioza, zapaljenska bolest creva, zapaljenska bolest pluća, silicijumom indukovane bolesti, apnea tokom spavanja, AIDS, HIV-1, autoimunske bolesti, antifosfolipidni sindrom, lupus, lupusni nefritis, porodična mediteranska groznica, sindrom nasledne periodične groznice, bolest psihosocijalnog stresa, neuropatološka oboljenja, porodična amiloidna polineuropatija, inflamatorna neuropatija, Parkinsonova bolest, multipla skleroza, Alzheimerova bolest, amiotrofična lateralna skleroza, Huntingtonova bolest, katarakta. ili gubitak sluha.
[0111] U drugim primerima izvođenja, poremećaji ili stanja udruženi sa CRM1 aktivnošću su povreda glave, uveitis, zapaljenski bol, alergenom indukovana astma, astma koja nije indukovana alergenom, glomerularni nefritis, ulcerativni kolitis, nekrotizujući enterokolitis, hiperimunoglobulinemija D sa rekurentnom groznicom (hyperimmunoglobulinemia D with recurrent fever, HIDS), periodični sindrom udružen sa TNF receptorom (TNF receptor associated periodic syndrome, TRAPS), periodični sindrom udružen sa kriopirinom, Muckle-Wellsov sindrom (urtikarija gluvoća amiloidoza), porodična hladna urtikarija, neonatalna multisistemska zapaljenska bolest (neonatal onset multisystem inflammatory disease, NOMID), periodična groznica, aftozni stomatitis, faringitis i adenitis (pharyngitis and adenitis, PFAPA sindrom), Blau sindrom, piogeni sterilni artritis, pioderma gangrenozum, akne (PAPA), deficijencija interleukin-1-receptorskog antagonista (deficiency of the interleukin-1-receptor antagonist, DIRA), subarahnoidna hemoragija, policistična bolest bubrega, transplant, transplant organa, tkivni transplant, mijelodisplastični sindrom, iritantom indukovano zapaljenje, biljnim iritantom indukovano zapaljenje, zapaljenje indukovano otrovnim bršljanom/urušiol uljem, zapaljenje indukovano hemijskim iritantom, zapaljenje indukovano ubodom pčele, zapaljenje indukovano ujedom insekta, opekotina od sunca, opekotine, dermatitis, endotoksemija, povreda pluća, sindrom akutnog respiratornog distresa, alkoholni hepatitis, ili oštećenje bubrega izazvano parazitskim infekcijama.
[0112] U drugim aspektima, predmetni pronalazak obezbeđuje upotrebu jedinjenja formule I za izradu leka za lečenje bolesti udružene sa ekspresijom ili aktivnošću p53, p73, p21, pRB, p27, IκB, NFκB, c-Abl, FOXO proteina, COX-2 ili HDAC kod subjekta. U nekim primerima izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje upotrebu jedinjenja formule I za izradu leka za lečenje nekog od kancerskih i/ili neoplastičnih poremećaja, angiogeneze, autoimunskih poremećaja, zapaljenskih poremećaja i/ili bolesti, epigenetskih promena, hormonskih poremećaja i/ili bolesti, virusnih bolesti, neurodegenerativnih poremećaja i/ili bolesti, rana i oftalmoloških poremećaja.
[0113] U nekim primerima izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za inhibiciju CRM1 u biološkom uzorku koji obuhvata dovođenje u kontakt biološkog uzorka sa, ili davanje pacijentu, farmaceutski prihvatljive soli jedinjenja formule I, ili njene farmaceutski prihvatljive smeše.
Neoplastični poremećaji
[0114] Jedinjenje ili smeša opisani u ovom tekstu mogu se koristiti za lečenje neoplastičnog poremećaja. "Neoplastični poremećaj" je bolest ili poremećaj koji se karakteriše ćelijama koje imaju kapacitet za autonomni rast ili replikaciju, npr., nenormalna situacija ili stanje koje se karakteriše proliferativnim ćelijskim rastom. Primeri neoplastičnih poremećaja uključuju: karcinom, sarkom, metastatske poremećaje, npr., tumore koji su poreklom iz prostate, mozga, kosti, kolona, pluća, dojke, ovarijuma i jetre, hematopoetske neoplastične poremećaje, npr., leukemije, limfome, mijelom i druge maligne poremećaje plazma ćelija, i metastatske tumore. Preovlađujući kanceri uključuju: kancere dojke, prostate, kolona, pluća, jetre, i pankreasa. Tretman jedinjenjem može biti u količini efikasnoj za olakšavanje bar jednog simptoma neoplastičnog poremećaja, npr., smanjenje proliferacije ćelija, smanjenje mase tumora, itd.
[0115] Objavljeni postupci korisni su za prevenciju i lečenje kancera, uključujući na primer, solidne tumore, tumore mekih tkiva, i njihove metastaze, kao i porodične kancerske sindrome kao što su Li Fraumeni sindrom, sindromi porodičnog kancera dojke-ovarijuma (BRCA1 ili BRAC2 mutacije) i drugi. Objavljeni postupci korisni su i za lečenje nesolidnih kancera. Primeri solidnih tumora uključuju malignitete (npr., sarkome, adenokarcinome, i karcinome) različitih organskih sistema, kao što su maligniteti pluća, dojke, limfoidnog sistema, gastrointestinalnog (npr., kolon), i genitourinarnog (npr., bubrežni, urotelni, ili testisni tumori) trakta, farinksa, prostate, i ovarijuma. Primeri adenokarcinoma uključuju kolorektalne kancere, karcinome bubrežnih ćelija, kancer jetre, nesitnoćelijski karcinom pluća, i kancer tankog creva.
[0116] Primeri kancera opisanih od strane Nacionalnog instituta za kancer (National Cancer Institute) uključuju: akutnu limfoblastnu leukemiju, kod odraslih; akutnu limfoblastnu leukemiju, kod dece; akutnu mijeloidnu leukemiju, kod odraslih; adrenokortikalni karcinom; adrenokortikalni karcinom, kod dece; limfom povezan sa AIDS; malignitete povezane sa AIDS; analni kancer; astrocitom, kod dece, cerebelarni; astrocitom, kod dece, cerebralni; kancer žučnog kanala, vanhepatični; kancer mokraćne bešike; kancer mokraćne bešike, kod dece; kancer kosti, osteosarkom/maligni fibrozni histiocitom; gliom moždanog stabla, kod dece; tumor mozga, kod odraslih; tumor mozga, gliom moždanog stabla, kod dece; tumor mozga, cerebelarni astrocitom, kod dece; tumor mozga, cerebralni astrocitom/maligni gliom, kod dece; tumor mozga, ependimom, kod dece; tumor mozga, meduloblastom, kod dece; tumor mozga, supratentorijalne primitivne neuroektodermalne tumore, kod dece; tumor mozga, gliom vizuelnih puteva i hipotalamusa, kod dece; tumor mozga, kod dece (drugi); tumor dojke; tumor dojke i trudnoću; tumor dojke, kod dece; tumor dojke, kod muškaraca; bronhijalne adenom/karcinoide, kod dece; karcinoidni tumor, kod dece; karcinoidni tumor, gastrointestinalni; karcinom, adrenokortikalni; karcinom, ćelije ostrvca; karcinom nepoznatog porekla; limfom centralnog nervnog sistema, primarni; cerebelarni astrocitom, kod dece; cerebralni astrocitom/maligni gliom, kod dece; cervikalni kancer; kancere kod dece; hroničnu limfocitnu leukemiju; hroničnu mijelogenu leukemiju; hronični mijeloproliferativni poremećaji; sarkom svetlih ćelija omotača tetive; kancer kolona; kolorektalni kancer, kod dece; limfom T-ćelija kože; kancer endometrijuma; ependimom, kod dece; epitelni kancer, ovarijum; kancer ezofagusa; kancer ezofagusa, kod dece; Ewingovu porodicu tumora; tumor ekstrakranijalnih germinativnih ćelija, kod dece; tumor ekstragonadalnih germinativnih ćelija; kancer ekstrahepatičnog žučnog kanala; kancer oka, intraokularni melanom; kancer oka, retinoblastom; kancer žučne kesice; kancer želuca (gastera); kancer želuca (gastera), kod dece; gastrointestinalni karcinoidni tumor; tumor germinativnih ćelija, ekstrakranijalni, kod dece; tumor germinativnih ćelija, ekstragonadalni; tumor germinativnih ćelija, ovarijalni; gestacioni trofoblastni tumor; gliom, moždano stablo kod dece; gliom vizuelnih puteva i hipotalamusa, kod dece; leukemiju vlasastih ćelija; kancer glave i vrata; hepatocelularni (jetra) kancer, kod odraslih (primarni); hepatocelularni (jetra) kancer, kod dece (primarni); Hodgkinov limfom, kod odraslih;
4
Hodgkinov limfom, kod dece; Hodgkinov limfom tokom trudnoće; hipofaringealni kancer; gliom hipotalamusa i vizuelnih puteva, kod dece; intraokularni melanom; karcinom ćelija ostrvaca (endokrini pankreas); Kaposijev sarkom; kancer bubrega; laringealni kancer; laringealni kancer, kod dece; leukemiju, akutnu limfoblastnu, kod odraslih; leukemiju, akutnu limfoblastnu, kod dece; leukemiju, akutnu mijeloidnu, kod odraslih; leukemiju, akutnu mijeloidnu, kod dece; leukemiju, hroničnu limfocitnu; leukemiju, hroničnu mijelogenu; leukemiju vlasastih ćelija; kancer usana i usne duplje; kancer jetre, kod odraslih (primarni); kancer jetre, kod dece (primarni); kancer pluća, nesitnoćelijski; kancer pluća, sitnoćelijski; limfoblastnu leukemiju, kod odraslih akutnu; limfoblastnu leukemiju, kod dece akutnu; limfocitnu leukemiju hroničnu; limfom, povezan sa AIDS; limfom centralnog nervnog sistema (primarni); limfom, T-ćelije kože; limfom, Hodgkinov, kod odraslih; limfom, Hodgkinov, kod dece; limfom, Hodgkinov tokom trudnoće; limfom ne-Hodgkinov, kod odraslih; limfom, ne-Hodgkinov, kod dece; limfom, ne-Hodgkinov tokom trudnoće; limfom, primarni centralnog nervnog sistema; makroglobulinemiju, Waldenstromovu; tumor dojke kod muškaraca; maligni mezoteliom, kod odraslih; maligni mezoteliom, kod dece; maligni timom; meduloblastom, kod dece; melanom; melanom, intraokularni; karcinom Merkelovih ćelija; mezoteliom, maligni; metastatski skvamozni kancer vrata skrivenog porekla; sindrom multiple endokrine neoplazije, kod dece; multipli mijelom/neoplaziju plazma ćelija; mikozis fungoides; mijelodisplastične sindrome; mijelogenu leukemiju, hroničnu; mijeloidnu leukemiju, kod dece akutnu; mijelom, multipli; mijeloproliferativni poremećaji, hronični; kancer nosne šupljine i paranazalnih sinusa; nazofaringealni kancer; nazofaringealni kancer, kod dece; neuroblastom; ne-Hodgkinov limfom, kod odraslih; ne-Hodgkinov limfom, kod dece; ne-Hodgkinov limfom tokom trudnoće; nesitnoćelijski kancer pluća; oralni kancer, kod dece; kancer usne duplje i usana; orofaringealni kancer; osteosarkom/maligni fibrozni histiocitom kosti; ovarijalni kancer, kod dece; ovarijalni epitelni kancer; tumor germinativnih ćelija ovarijuma; tumor ovarijuma niskog malignog potencijala; pankreasni kancer; pankreasni kancer, kod dece; pankreasni kancer, ćelije ostrvaca; kancer paranazalnog sinusa i nosne duplje; paratiroidni kancer; kancer penisa; feohromocitom; pinealne i supratentorijalne primitivne neuroektodermalne tumore, kod dece; tumore hipofize; neoplaziju plazma ćelija/multipli mijelom; pleuropulmonalni blastom; trudnoću i tumor dojke; trudnoću i Hodgkinov limfom; trudnoću i ne-Hodgkinov limfom; primarni limfom centralnog nervnog sistema; primarni kancer jetre, kod odraslih; primarni kancer jetre, kod dece; kancer prostate; rektalni kancer; kancer renalnih ćelija (bubreg); kancer renalnih ćelija, kod dece; kancer bubrežne karlice i uretera, prelazne ćelije; retinoblastom; rabdomiosarkom, kod dece; kancer pljuvačne žlezde; kancer pljuvačne žlezde, kod dece; sarkom, Ewingova familija tumora; sarkom, Kaposijev; sarkom (osteosarkom)/maligni fibrozni histiocitom kosti; sarkom, rabdomiosarkom, kod dece; sarkom, meka tkiva, kod odraslih; sarkom, meka tkiva, kod dece; Sezary sindrom; kancer kože; kancer kože, kod dece; kancer kože (melanom); karcinom kože, Merkelove ćelije; sitnoćelijski kancer pluća; kancer tankog creva; sarkom mekog tkiva, kod odraslih; sarkom mekog tkiva, kod dece; skvamozni kancer vrata sa skrivenim poreklom, metastatski; želudačni (gastrični) kancer; želudačni (gastrični) kancer, kod dece; supratentorijalne primitivne neuroektodermalne tumore, kod dece; limfom T-ćelija, kožni; kancer testisa; timom, kod dece; timom, maligni; tiroidni kancer; tiroidni kancer, kod dece; kancer prelaznih ćelija bubrežne karlice i uretera; trofoblastni tumor, gestacioni; nepoznato primarno mesto, kanceri, kod dece; neuobičajene kancere, kod dece; ureter i bubrežna karlica, kancer prelaznih ćelija; kancer uretre; sarkom uterusa; kancer vagine; gliom vizuelnih puteva i hipotalamusa, kod dece; kancer vulve; Waldenstromovu makroglobulinemiju; i Wilmsov tumor.
[0117] Drugi primeri kancera uključuju difuzni limfom velikih B-ćelija (diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL) i limfom plaštanih ćelija (mantle cell lymphoma, MCL).
[0118] Metastaze gore pomenutih kancera takođe mogu da se leče ili preveniraju u skladu sa postupcima opisanim u ovom tekstu.
Kombinovane terapije
[0119] U nekim primerima izvođenja, jedinjenje opisano u ovom tekstu primenjuje se zajedno sa dodatnim "drugim" terapijskim sredstvom ili tretmanom. Kao drugo terapijsko sredstvo može da se odabere bilo koje sredstvo koje se tipično koristi kao monoterapija za lečenje navedenih bolesti ili stanja. Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "primeniti zajedno" i srodni izrazi odnose se na istovremenu ili sekvencijalnu primenu terapijskih sredstava prema ovom pronalasku. Na primer, jedinjenje predmetnog pronalaska može da se primeni sa drugim terapijskim sredstvom istovremeno ili sekvencijalno u zasebnim jediničnim doznim formama ili zajedno u jednoj jediničnoj doznoj formi. Prema tome, predmetni pronalazak obezbeđuje jednu jediničnu doznu formu koja sadrži jedinjenje formule I, dodatno terapijsko sredstvo i farmaceutski prihvatljivi nosač. adjuvans ili prenosnik.
[0120] U jednom primeru izvođenja pronalaska, kada se kod subjekta primenjuje drugo terapijsko sredstvo, efikasna količina jedinjenja ovog pronalaska manja je nego što bi bila njegova efikasna količina kada se drugo terapijsko sredstvo ne bi primenjivalo. U drugom primeru izvođenja, efikasna količina drugog terapijskog sredstva manja je nego što bi bila njegova efikasna količina kada se jedinjenje ovog pronalaska ne bi primenjivalo. Na ovaj način, neželjeni sporedni efekti udruženi sa visokim dozama svakog od sredstava mogu da se svedu na najmanju meru. Druge potencijalne prednosti (uključujući bez ograničavanja poboljšani dozni režim i/ili smanjenje cene leka) biće očigledne stručnjaku u oblasti. Dodatna sredstva mogu da se primene odvojeno od jedinjenja ovog pronalaska, kao deo višestrukog doznog režima,. Alternativno, ova sredstva mogu biti deo jedne dozne forme, pomešana sa jedinjenjima ovog pronalaska u jednoj smeši.
Kombinovane terapije za kancer
[0121] U nekim primerima izvođenja, jedinjenje opisano u ovom tekstu primenjuje se zajedno sa dodatnim načinom lečenja kancera. Primeri dodatnih načina lečenja kancera uključuju, na primer: hemioterapiju, ciljanu terapiju kao što je terapija antitelima, inhibitore kinaza, imunoterapiju i hormonsku terapiju, epigenetičku terapiju, inhibitore proteazoma, i antiangiogene terapije. Primeri takvih tretmana dati su u nastavku. Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "kombinacija", "kombinovano" i srodni izrazi odnose se na istovremenu ili sekvencijalnu primenu terapijskih sredstava prema ovom pronalasku. Na primer, jedinjenje predmetnog pronalaska može da se primeni sa drugim terapijskim sredstvom istovremeno ili sekvencijalno u zasebnim jediničnim doznim formama ili zajedno u jednoj jediničnoj doznoj formi. Prema tome, predmetni pronalazak obezbeđuje jednu jediničnu doznu formu koja sadrži jedinjenje pronalaska, dodatno terapijsko sredstvo i farmaceutski prihvatljivi nosač. adjuvans ili prenosnik.
4
[0122] Količine jedinjenja pronalaska i dodatnog terapijskog sredstva (u onim smešama koje sadrže dodatno terapijsko sredstvo kako je gore opisano), koje mogu da se kombinuju sa nosačkim materijalima da bi se proizvela jedna dozna forma variraće u zavisnosti od domaćina koji se leči i posebnog načina primene. Poželjno, smeše pronalaska treba da se formulišu tako da može da se primeni doza koja iznosi 0.01 - 100 mg/kg telesne težine/dan jedinjenja pronalaska.
Hemioterapija
[0123] U nekim primerima izvođenja, jedinjenje opisano u ovom tekstu primenjuje se zajedno sa hemioterapijom. Hemioterapija je način lečenja kancera lekovima koji mogu da unište kancerske ćelije. "Hemioterapija" se obično odnosi na citotoksične lekove koji utiču na brzodeleće ćelije uopšte, nasuprot ciljanoj terapiji. Hemioterapijski lekovi interferiraju sa deobom ćelija na različite moguće načine, npr., interferiraju sa duplikacijom DNK ili razdvajanjem novoformiranih hromozoma. Većina formi hemioterapija usmerena je ka svim brzodelećim ćelijama i nije specifična za kancerske ćelije, mada neki stepen specifičnosti može da se postigne na osnovu nesposobnosti kancerskih ćelija da oprave oštećenja na DNK, dok normalne ćelije obično to mogu.
[0124] Primeri hemioterapijskih sredstava koja se koriste u terapiji kancera uključuju, na primer, antimetabolite (npr., folnu kiselinu, derivate purina i pirimidina) i alkilirajuća sredstva (npr., azotne iperite, nitrozouree, platinu, alkil sulfonate, hidrazine, triazene, aziridine, otrove vretena, citotoksična sredstva, inhibitore topoizomeraze i druge). Primeri sredstava uključuju aklarubicin, aktinomicin, alitretinoin, altretamin, aminopterin, aminolevulinsku kiselinu, amrubicin, amsakrin, anagrelid, arsen trioksid, asparaginazu, atrasentan, belotekan, beksaroten, bendamustin, bleomicin, bortezomib, busulfan, kamptotecin, kapecitabin, karboplatin, karbokvon, karmofur, karmustin, celekoksib, hlorambucil, hlormetin, cisplatin, kladribin, klofarabin, krisantaspazu, ciklofosfamid, citarabin, dakarbazin, daktinomicin, daunorubicin, decitabin, demekolcin, docetaksel, doksorubicin, efaproksiral, elesklomol, elsamitrucin, enocitabin, epirubicin, estramustin, etoglucid, etopozid, floksuridin, fludarabin, fluorouracil (5FU), fotemustin, gemcitabin, gliadel implante, hidroksikarbamid, hidroksiureu, idarubicin, ifosfamid, irinotekan, irofulven, iksabepilon, larotaksel, leukovorin, lipozomski doksorubicin, lipozomski daunorubicin, lonidamin, lomustin, lukanton, manosulfan, masoprokol, melfalan, merkaptopurin, mesnu, metotreksat, metil aminolevulinat, mitobronitol, mitoguazon, mitotan, mitomicin, mitoksantron, nedaplatin, nimustin, oblimersen, omacetaksin, ortataksel, oksaliplatin, paklitaksel, pegaspargazu, pemetreksed, pentostatin, pirarubicin, piksantron, plikamicin, porfimer natrijum, prednimustin, prokarbazin, raltitreksed, ranimustin, rubitekan, sapacitabin, semustin, sitimagen ceradenovek, strataplatin, streptozocin, talaporfin, tegafur-uracil, temoporfin, temozolomid, tenipozid, tesetaksel, testolakton, tetranitrat, tiotepa, tiazofurin, tioguanin, tipifarnib, topotekan, trabektedin, triazikvon, trietilenmelamin, triplatin, tretinoin, treosulfan, trofosfamid, uramustin, valrubicin, verteporfin, vinblastin, vinkristin, vindezin, vinflunin, vinorelbin, vorinostat, zorubicin, i druga citostatska ili citotoksična sredstva opisana u ovom tekstu.
[0125] Zbog toga što neki lekovi deluju bolje u kombinaciji nego sami, često se u isto vreme daju dva ili više lekova. Često se dva ili više hemioterapijskih sredstava koriste kao kombinovana hemioterapija. U nekim primerima izvođenja, hemioterapijska sredstva (uključujući kombinovanu hemioterapiju) mogu da se koriste u kombinaciji sa jedinjenjem opisanim u ovom tekstu.
Ciljana terapija
[0126] Ciljana terapija se sastoji od upotrebe sredstava koja su specifična za deregulisane proteine ili kancerske ćelije. Lekovi malih molekula ciljane terapije obično su inhibitori enzimskih domena na mutiranim, preterano eksprimiranim ili na drugi način kritičnim proteinima u kancerskim ćelijama. Istaknuti primeri su inhibitori tirozin kinaze kao što su aksitinib, bosutinib, cediranib, desatinib, erolotinib, imatinib, gefitinib, lapatinib, lestaurtinib, nilotinib, semaksanib, sorafenib, sunitinib, i vandetanib, i takođe inhibitori ciklin-zavisne kinaze kao što su alvocidib i seliciklib. Terapija monoklonskim antitelima je još jedna strategija u kojoj je terapijsko sredstvo antitelo koje se specifično vezuje za protein na površini kancerskih ćelija. Primeri uključuju anti-HER2/neu antitelo trastuzumab (Herceptin®) koji se tipično koristi kod kancera dojke, i anti-CD20 antitela rituksimab i tositumomab koja se tipično koriste u različitim malignitetima B-ćelija. Drugi primeri antitela uključuju cetuksimab, panitumumab, trastuzumab,
4
alemtuzumab, bevacizumab, edrekolomab, i gemtuzumab. primeri fuzionih proteina uključuju aflibercept i denileukin diftitoks. U nekim primerima izvođenja, ciljana terapija može da se koristi u kombinaciji sa jedinjenjem opisanim u ovom tekstu, npr., Gleevec (Vignari and Wang 2001).
[0127] Ciljana terapija može uključivati i male peptide kao "udomljavajuća sredstva" koja mogu da se vežu za receptore na površini ćelije ili za zahvaćeni vanćlijski matriks koji okružuje tumor. Radionuklidi koji su prikačeni za ove peptide (npr., RGD) na kraju ubijaju kancersku ćeliju ako se nuklid raspada u blizini ćelije. Primer takve terapije je BEXXAR®.
Angiogeneza
[0128] Jedinjenja i postupci opisani u ovom tekstu mogu da se koriste za lečenje ili prevenciju bolesti ili poremećaja udruženih sa angiogenezom. Bolesti udružene sa angiogenezom uključuju kancer, kardiovaskularna oboljenja i makularnu degeneraciju.
[0129] Angiogeneza je fiziološki proces koji uključuje rast novih krvnih sudova od prethodno postojećih sudova. Angiogeneza je normalan i vitalan proces u rastu i razviću, kao i u zarastanju rana i formiranju granulacionog tkiva. Međutim, ona je takođe i fundamentalni korak u prelasku tumora iz dormantnog stanja u maligno stanje. Angiogeneza može biti cilj za borbu protiv bolesti koje se karakterišu lošom vaskularizacijom ili nenormalnom vaskulaturom.
[0130] Primena specifičnih jedinjenja koja mogu inhibirati ili indukovati stvaranje novih krvnih sudova u telu može pomoći u borbi protiv takvih bolesti. Prisustvo krvnih sudova tamo gde ne bi trebalo da ih bude može uticati na mehanička svojstva tkiva, povećavajući verovatnoću slabljenja. Odsustvo krvnih sudova iz tkiva koja se repariraju ili su na drugi način metabolički aktivna može inhibirati reparaciju ili druge esencijalne funkcije. Nekoliko bolesti, kao što su hronične ishemične rane, rezultat su izostanka ili nedovoljnog formiranja krvnih sudova i mogu se lečiti lokalnom ekspanzijom krvnih sudova, čime se na dato mesto dopremaju novi nutrijenti i olakšava reparacija. Druge bolesti, kao što je makularna degeneracija povezana sa starenjem, mogu nastati lokalnom ekspanzijom krvnih sudova, koji interferiraju sa normalnim fiziološkim procesima.
4
[0131] Pokazano je da faktor rasta vaskularnog endotela (vascular endothelial growth factor, VEGF) daje glavni doprinos angiogenezi, povećavajući broj kapilara u datoj mreži. Pozitivna regulacija VEGF glavna je komponenta fiziološkog odgovora na vežbanje i misli se da bi njegova uloga u angiogenezi bila mogući tretman u vaskularnim povredama. In vitro studije jasno pokazuju da je VEGF snažni stimulator angiogeneze jer će, u prisustvu ovog faktora rasta, endotelske ćelije na podlozi proliferisati i migrirati, formirajući na kraju cevolike strukture koje podsećaju na kapilare.
[0132] Tumori indukuju rast krvnih sudova (angiogenezu) sekretovanjem različitih faktora rasta (npr., VEGF). Faktori rasta kao što su bFGF i VEGF mogu da indukuju urastanje kapilara u tumor, čime se po mišljenju nekih istraživača dopremaju potrebni nutrijenti, i omogućava širenje tumora.
[0133] Angiogeneza predstavlja odličan terapijski cilj za lečenje kardiovaskularnih bolesti. To je snažan, fiziološki proces koji podržava prirodan način na koji naše telo odgovara na smanjenje dotoka krvi u vitalne organe, tojest stvaranje novih kolateralnih sudova da bi se prevazišla pretnja ishemijom.
[0134] Pored toga što stimuliše angiogenezu, preterana ekspresija VEGF dovodi do povećane permeabilnosti krvnih sudova. U vlažnoj makularnoj degeneraciji, VEGF dovodi do proliferacije kapilara u retinu. Pošto porast angiogeneze dovodi i do edema, krv i druga retinalna tečnost ulaze u retinu dovodeći do gubitka vida.
[0135] Antiangiogena terapija može uključivati kinazne inhibitore koji ciljaju faktor rasta vaskularnog endotela (VEGF) kao što su sunitinib, sorafenib, ili monoklonska antitela ili receptorske "mamce" za VEGF ili VEGF receptor uključujući bevacizumab ili VEGF-Trap, ili talidomid ili njegove analoge (lenalidomid, pomalidomid), ili sredstva koja ciljaju ne-VEGF angiogene ciljeve kao što su faktor rasta fibroblasta (fibroblast growth factor, FGF), angiopoetini, ili angiostatin ili endostatin.
Epigenetika
[0136] Jedinjenja i postupci opisani u ovom tekstu mogu da se koriste za lečenje ili prevenciju bolesti udruženih sa epigenetikom. Epigenetika je izučavanje naslednih promena fenotipa ili genske ekspresije izazvanih mehanizmima različitim od promena u
4
odgovarajućoj sekvenci DNK. Jedan primer epigenetičkih promena u biologiji eukariota je proces ćelijske diferencijacije. Tokom morfogeneze, matične ćelije postaju različite ćelijske linije embriona, koje zatim postaju potpuno diferencirane ćelije. Drugim rečima, jedna oplođena jajna ćelija menja se tokom svojih deoba u mnoge tipove ćelija uključujući neurone, mišićne ćelije, epitel, krvne sudove itd. To čini aktiviranjem nekih gena, i inhibiranjem drugih.
[0137] Epigenetičke promene ostaju očuvane kada se ćelije dele. Većina epigenetičkih promena može se desiti samo tokom života jednog individualnog organizma, ali, ako je mutacija u DNK bila izazvana u spermatozoidu ili jajnoj ćeliji koji su učestvovali u fertilizaciji, tada se neke epigenetičke promene nasleđuju iz generacije u generaciju. Specifični epigenetički procesi uključuju paramutaciju, "bookmarking", "imprinting", utišavanje gena, inaktivaciju X hromozoma, pozicioni efekat, reprogramiranje, transvekciju, majčinske efekte, napredovanje karcinogeneze, mnoge efekte teratogena, regulaciju modifikacija histona i heterohromatina, i tehnička ograničenja koja utiču na partenogenezu i kloniranje.
[0138] Primeri bolesti koje su udružene sa epigenetikom uključuju ATR-sindrom, sindrom fragilnog X hromozoma, ICF sindrom, Angelmanov sindrom, Prader-Willsov sindrom, BWS, Rettov sindrom, α-talasemiju, kancer, leukemiju, Rubinstein-Taybi sindrom i Coffin-Lowry sindrom.
[0139] Prva bolest ljudi koja je povezana sa epigenetikom je kancer. Istraživači su pronašli da obolelo tkivo pacijenata sa kolorektalnim kancerom ima manju metilaciju DNK nego normalno tkivo istih pacijenata. Pošto su metilisani geni tipično neaktivni, gubitak metilacije DNK može da dovede do nenormalno visoke aktivacije gena menjanjem aranžmana hromatina. Sa druge strane, suviše metilacije može da isključi aktivnost zaštitnih tumor-supresor gena.
[0140] DNK metilacija dešava se na CpG mestima, i kod sisara je većina CpG citozina metilisana. Međutim, postoje delovi DNK u blizini promotorskih regiona, koji imaju više koncentracije CpG mesta (poznata kao CpG ostrvca) koja nisu metilisana u normalnim ćelijama. Ova CpG ostrvca postaju preterano metilisana u kancerskim ćelijama, čime se isključuju geni koji ne bi trebalo da budu utišani. Ova abnormalnost je zaštitni znak epigenetičke promene koja se sreće u tumorima i dešava se rano u razvoju kancera. Hipermetilacija CpG ostrvaca može da dovede do tumora isključivanjem
4
tumor-supresor gena. U stvari, ovi tipovi promena mogu biti češći kod humanih kancera nego mutacije DNK sekvence.
[0141] Pored toga, iako epigenetičke promene ne menjaju sekvencu DNK, one mogu izazvati mutacije. Oko polovine gena koji izazivaju porodične ili nasledne forme kancera isključuju se metilacijom. Većina ovih gena normalno suprimira formiranje tumora i pomaže u reparaciji DNK, uključujući O6-metilguanin-DNK metiltransferazu (MGMT), MLH1 ciklin-zavisna kinaza-inhibitor 2B (MLH1 cyclin-dependent kinase inhibitor 2B, CDKN2B), i RASSF1A. Na primer, hipermetilacija promotora za MGMT dovodi do porasta mutacija G-u-A.
[0142] Hipermetilacija može dovesti i do nestabilnosti mikrosatelita, ponavljajućih sekvenci DNK. Mikrosateliti su uobičajeni kod normalnih individua, i obično se sastoje od ponovaka dinukleotida CA. Prevelika metilacija promotora DNK reparacionog gena MLH1može da mikrosatelit učini nestabilnim i da ga produži ili skrati. Nestabilnost mikrosatelita povezana je sa mnogim kancerima, uključujući kolorektalni kancer, kancer endometrijuma, kancer ovarijuma i kancer želuca.
[0143] Sindrom fragilnog X hromozoma je najčešće nasledno mentalno oštećenje, posebno kod muškaraca. Ovo stanje može da se javi kod oba pola, ali pošto jedinke muškog pola imaju samo jedan X hromozom, jedna fragilni X će imati jači uticaj. Zaista, sindrom fragilnog X hromozoma zapaža se približno jednom na 4000 muškaraca i jednom na 8000 žena. Ljudi sa ovim sindromom imaju jaku intelektualnu onesposobljenost, odloženo verbalno razviće i ponašanje slično autističnom.
[0144] Sindrom fragilnog X hromozoma dobio je ime po izgledu dela X hromozoma koji sadrži gensku abnormalnost vidljivu pod mikroskopom; obično izgleda kao da visi na končiću i da se lako može otkinuti od ostatka hromozoma. Sindrom je prouzrokovan abnormalnošću gena FMR1 (fragilni X mentalna retardacija 1). Ljudi koji nemaju sindrom fragilnog X hromozoma imaju 6 do 50 ponovaka trinukleotida CGG u svom FMR1genu. Međutim, osobe sa preko 200 ponovaka imaju punu mutaciju, i one obično pokazuju simptome sindroma. Previše CGG dovodi do toga da CpG ostrvca u promotorskom regionu FMR1 gena postanu metilisana; normalno, ona to nisu. Ova metilacija isključuje gene, zaustavlja FMR1 gen u proizvodnji važnog proteina po imenu fragilni X mentalna retardacija-protein. Gubitak ovog specifičnog proteina dovodi do sindroma fragilnog X hromozoma. Iako je dosta pažnje posvećeno ekspanziji
4
mutacije CGG kao uzroku sindroma fragilnog X hromozoma, epigenetičke promene udružene sa metilacijom FMR1 zapravo su odgovorne za sindrom.
[0145] Sindrom fragilnog X hromozoma nije jedini poremećaj udružen sa mentalnom retardacijom, koji uključuje epigenetičke promene. Druga takva stanja uključuju Rubenstein-Taybijev, Coffin-Lowryjev, Prader-Willijev, Angelmanov, Beckwith-Wiedemannov, ATR-X, i Rettov sindrom.
[0146] Epigenetičke terapije uključuju inhibitore enzima koji kontrolišu epigenetičke modifikacije, specifično DNK metiltransferaza i histon deacetilaza, koji su pokazali obećavajuće antitumorogene efekte u nekim malignitetima, kao i besmislene oligonukleotide i siRNA.
Imunoterapija
[0147] U nekim primerima izvođenja, jedinjenje opisano u ovom tekstu primenjuje se sa imunoterapijom. Imunoterapija kancera odnosi se na raznovrsni set terapijskih strategija osmišljenih da podstaknu pacijentov imunski sistem da se bori protiv tumora. Savremeni metodi generisanja imunskog odgovora na tumore uključuju intravezikularnu BCG imunoterapiju za superficijalni kancer mokraćne bešike, vakcinu za kancer prostate Provenge, i upotrebu interferona i drugih citokina za indukovanje imunskog odgovora kod pacijenata sa karcinomom bubrega i melanomom.
[0148] Transplantacija alogenih hematopoetskih matičnih ćelija može da se razmatra kao vid imunoterapije, jer će donorove imunske ćelije obično napasti tumor u okviru efekta kalema protiv domaćina. U nekim primerima izvođenja, imunoterapijska sredstva mogu da se koriste u kombinaciji sa jedinjenjem opisanim u ovom tekstu.
Hormonska terapija
[0149] U nekim primerima izvođenja, jedinjenje opisano u ovom tekstu primenjuje se sa hormonskom terapijom. Rast nekih kancera može se zaustaviti obezbeđivanjem ili blokiranjem nekih hormona. Uobičajeni primeri hormon-senzitivnih tumora uključuju određene tipove kancera dojke i prostate, kao i određene tipove leukemija koje odgovaraju na određene retinoide/retinoinske kiseline. Uklanjanje ili blokiranje estrogena ili testosterona često je važan dodatni tretman. U određenim kancerima, primena hormonskih agonista, kao što su progestogeni može biti terapijski korisna. U nekim primerima izvođenja, hormonska terapijska sredstva mogu da se koriste u kombinaciji sa jedinjenjem opisanim u ovom tekstu.
[0150] Hormonska terapijska sredstva uključuju primenu hormonskih agonista ili hormonskih antagonista i uključuju retinoide/retinoinsku kiselinu, jedinjenja koja inhibiraju estrogen ili testosteron, kao i primenu progestogena.
Inflamacija i autoimunske bolesti
[0151] Jedinjenja i postupci opisani u ovom tekstu mogu da se koriste za lečenje ili prevenciju bolesti ili poremećaja udruženih sa inflamacijom, posebno kod ljudi i drugih sisara. Jedinjenje opisano u ovom tekstu može da se primeni pre pojave, u toku ili posle otpočinjanja inflamacije. Kada se koriste profilaktički, jedinjenja se obično daju pre bilo kakvog inflamatornog odgovora ili simptoma. Primena jedinjenja može da spreči ili ublaži inflamatorne odgovore ili simptome. Primeri inflamatornih stanja uključuju, na primer, multiplu sklerozu, reumatoidni artritis, psorijatični artritis, degenerativno oboljenje zgloba, spondiloartropatije, druge seronegativne inflamatorne artritise, reumatičnu polimijalgiju, različite vaskulitise (npr., arteritis džinovskih ćelija, ANCA+ vaskulitis), gihtni artritis, sistemski eritemski lupus, juvenilni artritis, juvenilni reumatoidni artritis, osteoartritis, osteoporozu, dijabetes (npr., insulin zavisni dijabetes melitus ili juvenilni dijabetes), menstrualne grčeve, cističnu fibrozu, zapaljensku bolest creva, sindrom iritabilnog kolona, Crohnovu bolest, mukozni kolitis, ulcerativni kolitis, gastritis, ezofagitis, pankreatitis, peritonitis, Alzheimerovu bolest, šok, ankilozni spondilitis, gastritis, konjunktivitis, pankreatitis (akutni ili hronični), sindrom višestrukog oštećenja organa (npr., posle septikemije ili traume), infarkt miokarda, aterosklerozu, moždani udar, reperfuzionu povredu (npr., zbog kardiopulmonalnog bajpasa ili bubrežne dijalize), akutni glomerulonefritis, termičku povredu (tj., opekotine od sunca), nekrotizujući enterokolitis, sindrom udružen sa transfuzijom granulociota, i/ili Sjogrenov sindrom. Primeri zapaljenskih stanja kože uključuju, na primer, ekcem, atopijski dermatitis, kontaktni dermatitis, urtikariju, sklerodermu, psorijazu, i dermatozu sa komponentama akutnog zapaljenja.
1
[0152] U drugom primeru izvođenja, jedinjenje ili postupak opisan u ovom tekstu može da se koristi za lečenje ili prevenciju alergija i respiratornih stanja, uključujući astmu, bronhitis, plućnu fibrozu, alergijski rinitis, kiseoničnu toksičnost, emfizem, hronični bronhitis, sindrom akutnog respiratornog distresa, i svaku hroničnu opstruktivnu bolest pluća (COPD). Jedinjenja mogu da se koriste za lečenje hroničnog infektivnog hepatitisa, uključujući hepatitis B i hepatitis C.
[0153] Pored toga, jedinjenje ili postupak opisan u ovom tekstu može da se koristi za lečenje autoimunskih bolesti i/ili zapaljenja udruženih sa autoimunskim bolestima, kao što su organ-tkivne autoimunske bolesti (npr., Raynaudov sindrom), skleroderma, mijastenija gravis, odbacivanje transplanta, endotoksinski šok, sepsa, psorijaza, ekcem, dermatitis, multipla skleroza, autoimunski tiroiditis, uveitis, sistemski eritemski lupus, Addisonova bolest, autoimunska poliglandularna bolest (poznata i kao autoimunski poliglandularni sindrom), i Graveova bolest.
[0154] U posebnom primeru izvođenja, jedinjenja opisana u ovom tekstu mogu da se koriste za lečenje multiple skleroze. U specifičnom aspektu, jedinjenje koje se koristi za lečenje multiple skleroze je Jedinjenje 1: (Z)-3-(3-(3,5-bis(trifluorometil)fenil)-1H-1,2,4-triazol-1-il)-1-(3,3-difluoroazetidin-1-il)prop-2-en-1-on).
Kombinovana terapija
[0155] U određenim primerima izvođenja, jedinjenje opisano u ovom tekstu može da se primenjuje samo ili u kombinaciji sa drugim jedinjenjima korisnim za lečenje ili prevenciju inflamacije. Primeri antiinflamatornih sredstava uključuju, na primer, steroide (npr., kortizol, kortizon, fludrokortizon, prednizon, 6[alfa]-metilprednizon, triamcinolon, betametazon ili deksametazon), nesteroidne antiinflamatorne lekove (nonsteroidal antiinflammatory drugs, NSAIDS (npr., aspirin, acetaminofen, tolmetin, ibuprofen, mefenaminska kiselina, piroksikam, nabumeton, rofekoksib, celekoksib, etodolak ili nimesulid). U sledećem primeru izvođenja, drugo terapijsko sredstvo je antibiotik (npr.,vankomicin, penicilin, amoksicilin, ampicilin, cefotaksim, ceftriakson, cefiksim, rifampinmetronidazol, doksiciklin ili streptomicin). U sledećem primeru izvođenja, drugo terapijsko sredstvo je PDE4 inhibitor (npr., roflumilast ili rolipram). U sledećem primeru izvođenja, drugo terapijsko sredstvo je antihistaminik (npr., ciklizin,
2
hidroksizin, prometazin ili difenhidramin). U sledećem primeru izvođenja, drugo terapijsko sredstvo je antimalarijsko sredstvo (npr., artemisinin, artemeter, artsunat, hlorokin fosfat, meflokin hidrohlorid, doksiciklin hiklat, proguanil hidrohlorid, atovakvon ili halofantrin). U jednom primeru izvođenja, drugo jedinjenje je drotrekogin alfa.
[0156] Drugi primeri antiinflamatornih sredstava uključuju, na primer, aceklofenak, acemetacin, e-acetamidokaproinsku kiselinu, acetaminofen, acetaminosalol, acetanilid, acetilsalicilnu kiselinu, S-adenozilmetionin, alklofenak, alklometazon, alfentanil, algeston, alilprodin, alminoprofen, aloksiprin, alfaprodin, aluminijum bis(acetilsalicilat), amcinonid, amfenak, aminohlortenoksazin, 3-amino-4-hidroksibuternu kiselinu, 2-amino-4-pikolin, aminopropilon, aminopirin, amiksetrin, amonijum salicilat, ampiroksikam, amtolmetin guacil, anileridin, antipirin, antrafenin, apazon, beklometazon, bendazak, benorilat, benoksaprofen, benzpiperilon, benzidamin, benzilmorfin, bermoprofen, betametazon, betametazon-17-valerat, bezitramid, [alfa]-bisabolol, bromfenak, p-bromoacetanilid, acetat 5-bromosalicilne kiseline, bromosaligenin, bucetin, bukloksinsku kiselinu, bukolom, budezonid, bufeksamak, bumadizon, buprenorfin, butacetin, butibufen, butorfanol, karbamazepin, karbifen, kaiprofen, karsalam, hlorobutanol, hloroprednizon, hlortenoksazin, holin salicilat, cinhofen, cinmetacin, ciramadol, klidanak, klobetazol, klokortolon, klometacin, klonitazen, kloniksin, klopirak, kloprednol, klov, kodein, kodein metil bromid, kodein fosfat, kodein sulfat, kortizon, kortivazol, kropropamid, krotetamid, ciklazocin, deflazakort, dehidrotestosteron, dezomorfin, dezonid, dezoksimetazon, deksametazon, deksametazon-21-izonikotinat, deksoksadrol, dekstromoramid, dekstropropoksifen, deoksikortikosteron, dezocin, diampromid, diamorfon, diklofenak, difenamizol, difenpiramid, diflorazon, diflukortolon, diflunizal, difluprednat, dihidrokodein, dihidrokodeinon enol acetat, dihidromorfin, dihidroksialuminijum acetilsalicilat, dimenoksadol, dimefeptanol, dimetiltiambuten, dioksafetil butirat, dipipanon, diprocetil, dipiron, ditazol, droksikam, emorfazon, enfenaminsku kiselinu, enoksolon, epirizol, eptazocin, etersalat, etenzamid, etoheptazin, etoksazen, etilmetiltiambuten, etilmorfin, etodolak, etofenamat, etonitazen, eugenol, felbinak, fenbufen, fenklozinsku kiselinu, fendozal, fenoprofen, fentanil, fentiazak, fepradinol, feprazon, floktafenin, fluazakort, flukloronid, flufenaminsku kiselinu, flumetazon, flunisolid, fluniksin, flunoksaprofen, fluocinolon acetonid, fluocinonid, fluocinolon acetonid, fluokortin butil, fluocoitolon, fluorezon, fluorometolon, fluperolon, flupirtin, flupredniden, fluprednizolon, fluprokvazon, flurandrenolid, flurbiprofen, flutikazon, formokortal, fosfozal, gentizinsku kiselinu, glafenin, glukametacin, glikol salicilat, guajazulen, halcinonid, halobetasol, halometazon, haloprednon, heroin, hidrokodon, hidro kortamat, hidrokortizon, hidrokortizon acetat, hidrokortizon sukcinat, hidrokortizon hemisukcinat, hidrokortizon 21-lizinat, hidrokortizon cipionat, hidromorfon, hidroksipetidin, ibufenak, ibuprofen, ibuproksam, imidazol salicilat, indometacin, indoprofen, izofezolak, izoflupredon, izoflupredon acetat, izoladol, izometadon, izoniksin, izoksepak, izoksikam, ketobemidon, ketoprofen, ketorolak, p-laktofenetid, lefetamin, levalorfan, levorfanol, levofenacil-morfan, lofentanil, lonazolak, lornoksikam, loksoprofen, lizin acetilsalicilat, mazipredon, meklofenaminsku kiselinu, medrizon, mefenaminsku kiselinu, meloksikam, meperidin, meprednizon, meptazinol, mesalamin, metazocin, metadon, metotrimeprazin, metilprednizolon, metilprednizolon acetat, metilprednizolon natrijum sukcinat, metilprednizolon suleptnat, metiazinsku kiselinu, metofolin, metopon, mofebutazon, mofezolak, mometazon, morazon, morfin, morfin hidrohlorid, morfin sulfat, morfolin salicilat, mirofin, nabumeton, nalbufin, nalorfin, 1-naftil salicilat, naproksen, narcein, nefopam, nikomorfin, nifenazon, nifluminsku kiselinu, nimesulid, 5'-nitro-2'-propoksiacetanilid, norlevorfanol, normetadon, normorfin, norpipanon, olsalazin, opijum, oksaceprol, oksametacin, oksaprozin, oksikodon, oksimorfon, oksifenbutazon, papaveretum, parametazon, paranilin, parsalmid, pentazocin, perisoksal, fenacetin, fenadokson, fenazocin, fenazopiridin hidrohlorid, fenokol, fenoperidin, fenopirazon, fenomorfan, fenil acetilsalicilat, fenilbutazon, fenil salicilat, feniramidol, piketoprofen, piminodin, pipebuzon, piperilon, pirazolak, piritramid, piroksikam, pirprofen, pranoprofen, prednikarbat, prednizolon, prednizon, prednival, predniliden, proglumetacin, proheptazin, promedol, propacetamol, properidin, propiram, propoksifen, propifenazon, prokvazon, protizinsku kiselinu, proksazol, ramifenazon, remifentanil, rimazolijum metilsulfat, salacetamid, salicin, salicilamid, salicilamid o-sirćetnu kiselinu, salicilnu kiselinu, salicilsumpornu kiselinu, salsalat, salverin, simetrid, sufentanil, sulfasalazin, sulindak, superoksid dismutazu, suprofen, suksibuzon, talniflumat, tenidap, tenoksikam, terofenamat, tetrandrin, tiazolinobutazon, tiaprofensku kiselinu, tiaramid, tilidin, tinoridin, tiksokortol, tolfenaminsku kiselinu, tolmetin, tramadol, triamcinolon,
4
triamcinolon acetonid, tropezin, viminol, ksenbucin, ksimoprofen, zaltoprofen i zomepirak.
[0157] U jednom primeru izvođenja, jedinjenje opisano u ovom tekstu može da se primeni sa selektivnim COX-2 inhibitorom za lečenje ili prevenciju inflamacije. Primeri selektivnih COX-2 inhibitora uključuju, na primer, derakoksib, parekoksib, celekoksib, valdekoksib, rofekoksib, etorikoksib, i lumirakoksib.
[0158] U nekim primerima izvođenja, dato jedinjenje se primenjuje u kombinaciji sa antraciklinom ili topo II-inhibitorom. U određenim primerima izvođenja, dato jedinjenje se primenjuje u kombinaciji sa doksorubicinom (Dox). U određenim primerima izvođenja, dato jedinjenje se primenjuje u kombinaciji sa bortezomibom (i šire uključujući karfilzomib). Neočekivano je nađeno da dato jedinjenje u kombinaciji sa Dox ili bortezomibom za rezultat ima sinergistički efekat (tj.,više nefo aditivan efekat).
Virusne infekcije
[0159] Jedinjenja i postupci opisani u ovom tekstu mogu da se koriste za lečenje ili prevenciju bolesti udruženih sa virusnom infekcijom, posebno kod ljudi i drugih sisara. Jedinjenje opisano u ovom tekstu može da se primeni pre pojave, u toku ili posle početka virusne infekcije. Kada se koriste profilaktički, jedinjenja se poželjno daju pre bilo kakve virusne infekcije ili njenih simptoma.
[0160] Primeri virusnih bolesti uključuju akutni febrilni faringitis, faringokonjunktivalnu groznicu, epidemijski keratokonjunktivitis, infantilni gastroenteritis, koksaki infekcije, infektivnu mononukleozu, Burkittov limfom, akutni hepatitis, hronični hepatitis, hepatičnu cirozu, hepatocelularni karcinom, primarnu infekciju HSV-1 (npr.,gingivostomatitis kod dece, tonzilitis i faringitis kod odraslih, keratokonjunktivitis), latentnu HSV-1 infekciju (npr., herpes labijalis i groznicu na usni), primarnu HSV-2 infekciju, latentnu HSV-2 infekciju, aseptični meningitis, infektivnu mononukleozu, citomegalijsku inkluzionu bolest, Kaposijev sarkom, multicentričnu Castlemanovu bolest, primarni efuzioni limfom, AIDS, influencu, Reyev sindrom, morbile, postinfektivni encefalomijelitis, zauške, hiperplastične epitelne lezije (npr., obične, pločaste, plantarne i anogenitalne bradavice, laringealni papilomi, epidermodisplazija veruciformis), karcinom cerviksa, karcinom skvamoznih ćelija, krup, pneumoniju, bronhiolitis, običnu prehladu, poliomijelitis, besnilo, sindrom sličan influenci, jaki bronhiolitis sa pneumonijom, rubelu, kongenitalnu rubelu, varičelu i herpes zoster.
[0161] Primeri virusnih patogena uključuju adenovirus, koksakivirus, denga virus, virus encefalitisa, Epstein-Barrov virus, virus hepatitisa A, virus hepatitisa B, virus hepatitisa C, herpes simpleks virus tip 1, herpes simpleks virus tip 2, citomegalovirus, humani herpesvirus tip 8, virus humane imunodeficijencije, virus influence, virus morbila, virus zauški, humani papilomavirus, virus parainfluence, poliovirus, virus besnila, respiratorni sincicijalni virus, virus rubele, varičela-zoster virus, virus Zapadnog Nila, denga (Dungee), i virus žute groznice. Virusni patogeni mogu uključivati i viruse koji izazivaju rezistentne virusne infekcije.
[0162] Antivirusni lekovi su klasa lekova koji se koriste specifično za lečenje virusnih infekcija. Antivirusno dejstvo se odvija obično prema jednom od tri mehanizma: interferencija sa sposobnošću virusa da infiltrira ciljnu ćeliju (npr., amantadin, rimantadin i plekonaril), inhibicija sinteze virusa (npr., nukleozidni analozi, npr., aciklovir i zidovudin (AZT), i inhibicija oslobađanja virusa (npr., zanamivir i oseltamivir).
Oftalmologija
[0163] Jedinjenja i postupci opisani u ovom tekstu mogu da se koriste za lečenje ili prevenciju oftalmoloških poremećaja. Primeri oftalmoloških poremećaja uključuju makularni edem (dijabetični i nedijabetični makularni edem), makularnu degeneraciju povezanu sa starenjem, vlažna ili suva forma, disciformnu makularnu degeneraciju povezanu sa starenjem, cistoidni makularni edem, palpebralni edem, edem retine, dijabetičnu retinopatiju, horioretinopatiju, neovaskularnu makulopatiju, neovaskularni glaukom, uveitis, iritis, retinalni vaskulitis, endoftalmitis, panoftalmitis, metastatsku oftalmiju, horoiditis, retinalni pigmentni epitelitis, konjunktivitis, ciklitis, skleritis, episkleritis, optički neuritis, retrobulbalni optički neuritis, keratitis, blefaritis, eksudativno odlubljivanje retine, kornealni ulcer, konjunktivalni ulcer, hronični numularni keratitis, oftalmusnu bolest udruženu sa hipoksijom ili ishemijom, retinopatiju udruženu sa prevremenim rođenjem, proliferativnu dijabetičnu retinopatiju, polipoidnu horoidnu vaskulopatiju, retinalnu angiomatoznu proliferaciju, retinalnu arterijsku okluziju, retinalnu vensku okluziju, Coatsovu bolest, porodičnu eksudativnu vitreoretinopatiju, pulsnu bolest (Takayasuovu bolest), Ealesovu bolest, sindrom antifosfolipidnih antitela, leukemijsku retinopatiju, sindrom hiperviskoznosti krvi, makroglobulinemiju, retinopatiju udruženu sa interferonom, hipertenzivnu retinopatiju, radijacionu retinopatiju, deficijenciju kornealnih matičnih ćelija i kataraktu.
[0164] Drugi oftalmološki poremećaji koji se leče korišćenjem jedinjenja i postupaka opisanih u ovom tekstu uključuju proliferativnu vitreoretinopatiju i hronično odlubljivanje retine.
[0165] Inflamatorna oboljenja očiju se takođe leče korišćenjem jedinjenja i postupaka opisanih u ovom tekstu.
Neurodegenerativne bolesti
[0166] Neurodegeneracija je pojam koji obuhvata progresivan gubitak strukture i funkcije neurona, uključujući smrt neurona. Mnoge neurodegenerativne bolesti uključujući Parkinsonovu, Alzheimerovu i Huntingtonovu, nastaju kao rezultat neurodegenerativnih procesa. Sa napretkom istraživanja, pojavile su se mnoge sličnosti koje na subćelijskom nivou povezuju međusobno ove bolesti. Otkriće ovih sličnosti pruža nadu u terapijska dostignuća koja bi mogla da dovedu do istovremenog ublažavanja većeg broja bolesti. Postoje mnoge paralele između različitih neurodegenerativnih poremećaja uključujući atipično udruživanje proteina kao i indukovanje ćelijske smrti.
[0167] Alzheimerova bolest se karakteriše gubljenjem neurona i sinapsi u cerebralnom korteksu i određenim subkorteksnim regionima. Ovaj gubitak za rezultat ima masivnu atrofiju zahvaćenih regiona, uključujući degeneraciju temporalnog lobusa i parijetalnog lobusa, i delova frontalnog korteksa i cingulatnog girusa.
[0168] Huntingtonova bolest izaziva astrogliozu i gubitak srednjih trnastih neurona. Oblasti mozga zahvaćene su u zavisnosti od svoje strukture i tipova neurona koje sadrže, smanjujući se u veličini uporedo sa kumulativnim gubitkom ćelija. Zahvaćene oblasti su uglavnom u strijatumu, ali i u frontalnom i temporalnom korteksu. Subtalamusni nukleusi strijatuma šalju kontrolne signale u globus palidus, koji inicira i moduliše kretanje. Slabiji signali iz subtalamusnih nukleusa dovode do smanjenja inicijacije i modulacije pokreta, što za rezultat ima karakteristične nekontrolisane pokrete. Primeri tretmana za Huntingtonovu bolest uključuju tetrabenazin, neuroleptike, benzodiazepine, amantadin, remacemid, valproinsku kiselinu, selektivne inhibitore preuzimanja serotonina (selective serotonin reuptake inhibitors, SSRI), mirtazapin i antipsihotike.
[0169] Mehanizam kojim se gube ćelije mozga u Parkinsonovoj bolesti može se sastojati od nenormalne akumulacije proteina alfa-sinukleina vezanog za ubikvitin u oštećenim ćelijama. Kompleks alfa-sinuklein-ubikvitin ne može da se uputi ka proteazomu. Akumulacije ovog proteina formiraju proteinske inkluzije u citoplazmi koje se nazivaju Lewyjeva tela. Poslednja istraživanja patogeneze bolesti pokazala su da do smrti dopaminergičkih neurona usled alfa-sinukleina dolazi usled defekta u mašineriji koja transportuje proteine između dve glavne ćelijske organele -endoplazminog retikuluma (ER) i Goldžijevog aparata. Određeni proteini kao Rab1 mogu da ponište ovaj defekt izazvan alfa-sinukleinom u animalnim modelima. Primeri terapija Parkinsonove bolesti uključuju levodopa, dopaminske agoniste kao što su bromokriptin, pergolid, pramipeksol, ropinirol, piribedil, kabergolin, apomorfin i lisurid, dopa dekarboksilatne inhibitore, MAO-B inhibitore kao selegilen i rasagilen, antiholinergike i amantadin.
[0170] Amiotrofična lateralna skleroza (ALS/Lou Gehrigova bolest) je bolest u kojoj motoneuroni bivaju selektivno ciljani za degeneraciju. Primeri terapija za ALS uključuju riluzol, baklofen, diazepam, triheksifenidil i amitriptilin.
[0171] Drugi primeri terapeutika za neurodegenerativna oboljenja uključuju besmislene oligonukleotide i matične ćelije.
Zarastanje rana
[0172] Rane su tip stanja koje se karakteriše oštećenjem ćelija ili tkiva. Zarastanje rana je dinamičan put koji optimalno dovodi do ponovnog uspostavljanja integriteta i funkcije tkiva. Proces zarastanja rana sastoji se od tri preklapajuće faze. Prva faza je zapaljenska faza koja se karakteriše homeostazom, agregacijom i degranulacijom pločica. Pločice kao prvi odgovor, oslobađaju različite faktore rasta da bi se regrutovale imunske ćelije, epitelne ćelije, i endotelske ćelije. Zapaljenska faza se tipično dešava tokom dana 0-5. Drugi stadijum zarastanja rane je proliferativna faza tokom koje makrofagi i granulociti naseljavaju ranu. Infiltrirajući fibroblasti počinju da proizvode kolagen. Glavne karakteristike ove faze su epitelizacija, angiogeneza, formiranje granulacionog tkiva i proizvodnja kolagena. Proliferativna faza se tipično dešava tokom dana 3-14. Treća faza je faza remodeliranja kada se dešava formiranje matriksa. Fibroblasti, epitelne ćelije i endotelske ćelije nastavljaju da proizvode kolagen i kolagenazu kao i matriksne metaloproteaze (MMP) za remodeliranje. Dešava se unakrsno povezivanje kolagena i rana se kontrahuje. Faza remodeliranja se obično odvija od dana 7 do isteka jedne godine.
[0173] Jedinjenja i smeše opisani u ovom tekstu mogu da se koriste za pokretanje zarastanja rane (npr., pokretanje ili ubrzavanje zatvaranja rane i/ili zarastanja rane, uz ublažavanje ožiljačne fibroze tkiva rane i/ili oko rane, inhibiranje apoptoze ćelija koje okružuju ili su u blizini rane). Tako, u određenim primerima izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za pokretanje zarastanja rane kod subjekta, koji obuhvata davanje subjektu jedinjenja (npr., inhibitor CRM1), ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili njegove smeše. Postupkom ne mora da se postigne potpuno zarastanje ili zatvaranje rane; dovoljno je da postupak pokrene bilo koji stepen zatvaranja rane. U tom smislu, postupak može da se upotrebi sam ili kao dodatak drugim postupcima za zarastanje povređenog tkiva.
[0174] Jedinjenja i smeše opisani u ovom tekstu mogu da se koriste za lečenje rana tokom zapaljenske (ili rane) faze, tokom proliferativne (ili srednje) faze zarastanja rane, i/ili tokom faze remodeliranja (ili kasne faze) procesa zarastanja rane.
[0175] U nekim primerima izvođenja, subjekt kod kojeg je potrebno da dođe do zarastanja rane je čovek ili životinja, na primer, konj, svinja, ili glodar, kao što je miš.
[0176] U nekim primerima izvođenja, jedinjenja i smeše opisani u ovom tekstu korisni za zarastanje rane primenjuju se površinski, na primer, u blizini mesta rane, ili sistemski.
[0177] Određenije, jedinjenje ili smeša opisani u ovom tekstu mogu se primeniti (opciono u kombinaciji sa drugim sredstvima) na mestu rane oblaganjem rane ili nanošenjem zavoja, pakujućeg materijala, kopči, itd., obloženih ili tretiranih jedinjenjem ili smešom opisanim u ovom tekstu. Kao takva, jedinjenja i smeše opisani u ovom tekstu mogu da se formulišu za površinsku primenu za lečenje površinskih rana. Površinske formulacije uključuju one za dostavu preko usta (bukalno) i kože tako da sloj kože (tj., epiderm, derm, i/ili potkožni sloj) bude u kontaktu sa jedinjenjem ili smešom opisanim u ovom tekstu. Sistemi za površinsku dostavu mogu da se koriste za primenu površinskih formulacija jedinjenja i smeša opisanih u ovom tekstu.
[0178] Alternativno, jedinjenja i smeše opisani u ovom tekstu mogu da se primene na ili u blizini mesta rane, na primer, injekcija rastvora, injekcija formulacije sa produženim oslobađanjem, ili uvođenje biodegradabilnog implanta koji sadrži jedinjenje ili smešu opisane u ovom tekstu.
[0179] Jedinjenja i smeše opisani u ovom tekstu mogu da se koriste za lečenje akutnih rana ili hroničnih rana. Hronična rana nastaje kada je narušen normalni proces reparacije. Hronične rane mogu da se razviju od akutnih povreda kao rezultat neprepoznate perzistentne infekcije ili neodgovarajućeg primarnog tretmana. U većini slučajeva, međutim, hronične lezije su završni stadijum progresivnog propadanja tkiva usled venske, arterijske ili metaboličke vaskularne bolesti, pritiska, radijacionog oštećenja ili tumora.
[0180] Kod hroničnih rana, do zarastanja ne dolazi iz različitih razloga, uključujući neodgovarajuću cirkulaciju u dijabetičnim ulcerima, značajnu nekrozu, kao u opekotinama, i infekcije. Kod ovih hroničnih rana, faza vijabilnosti ili oporavka često je ograničavajući korak. Ćelije više nisu vijabilne, pa je tako inicijalna faza oporavka produžena nepovoljnim okruženjem ležišta rane.
[0181] Hronične rane uključuju, ali se ne ograničavaju na sledeće: hronične ishemijske kožne lezije; ulceri kod skleroderme; arterijski ulceri; dijabetični ulceri stopala; ulceri izazvani pritiskom; venski ulceri; nezaceljujuće rane donjih ekstremiteta; ulceri usled zapaljenskih stanja; i/ili dugotrajne rane.
[0182] U posebnom primeru izvođenja, jedinjenja i smeše opisani u ovom tekstu mogu da se koriste za zarastanje dijabetične rane ili ubrzavanje zarastanja ulcera noge ili stopala nastalih usled dijabetesa ili ishemije kod subjekta.
[0183] U jednom primeru izvođenja, rana je površinska rana. U sledećem primeru izvođenja, rana je hirurška rana (npr., abdominalna ili gastrointestinalna hirurška rana). U sledećem primeru izvođenja, rana je opekotina. U još jednom primeru izvođenja, rana je rezultat izlaganja zračenju.
[0184] Jedinjenja i smeše opisani u ovom tekstu mogu da se koriste i za zarastanje dijabetične rane, zarastanje gastrointestinalne rane, ili zarastanje adhezije usled, na primer, operacije.
[0185] Jedinjenja i smeše opisani u ovom tekstu mogu da se koriste i za zarastanje rana koje su posledica druge bolesti. Na primer, u inflamatornim oboljenjima kože, kao što su psorijaza i dermatitis, pojavlju se brojne lezije na koži koje su posledica bolesti, i izazvane su dubokim naprslinama kože, ili grebanjem kože. Jedinjenja i smeše opisani u ovom tekstu mogu da se koriste za zarastanje rana koje su sekundarne u odnosu na ove bolesti, na primer, inflamatorne bolesti kože, kao što su psorijaza i dermatitis.
[0186] U sledećem primeru izvođenja, rana je unutrašnja rana. U specifičnom aspektu, unutrašnja rana je hronična rana. U još jednom specifičnom aspektu, rana je vaskularna rana. U još jednom specifičnom aspektu, unutrašnja rana je ulcer.
[0187] Primeri rana uključuju, ali se ne ograničavaju na, abrazije, avulzije, rane sa ispuštanjem vazduha (tj., otvoreni pneumotoraks), rane od opekotina, kontuzije, rane nanete vatrenim oružjem, imcizione rane, otvorene rane, probojne rane, perforirajuće rane, probodne rane, prostrelne rane, ubodne rane, hirurške rane, potkožne rane, dijabetične lezije, ili tangencijalne rane. Dodatni primeri rana koje se mogu lečiti jedinjenjima i smešama opisanim u ovom tekstu uključuju akutna stanja ili rane, kao što su opekotine toplotom, hemijske opekotine, radijacione opekotine, opekotine izazvane preteranim izlaganjem ultravioletnom zračenju (npr., opekotine od sunca); oštećenja telesnih tkiva, na primer perineuma kao posledica porođaja i rađanja deteta; povrede nastale tokom medicinskih procedura, kao što je epiziotomija; traumom indukovane povrede uključujući rezove, incizije, ekskorijacije; povrede nastale nesrećnim slučajem; postoperativne povrede, kao i hronična stanja, kao što su rane izazvane pritiskom, rane izazvane dugim ležanjem, stanja vezana za dijabetes i lošu cirkulaciju, i svi tipovi akni. Pored toga, rane mogu uključivati dermatitis, kao što su impetigo, intertrigo, folikulitis i ekcem, rane posle dentalne hirurške intervencije; periodontnu bolest; rane posle traume; i rane udružene sa tumorom. Drugi primeri rana uključuju ujede životinja, arterijsku bolest, ubode i ujede insekata, infekcije kosti, kompromitovane graftove koža/mišić, gangrenu, kidanje i cepanje kože, starenje kože, hirurške incizije, uključujući sporozarastajuće ili nezarastajuće hirurške rane, intracerebralnu hemoragiju, aneurizmu, dermalnu asteniju, i postoperativne infekcije.
1
[0188] U poželjnim primerima izvođenja, rana se bira iz grupe koja se sastoji od rane usled opekotine, rane usled incizije, otvorene rane, hirurške ili posthirurške rane, dijabetične lezije, termičke opekotine, hemijske opekotine, radijacione opekotine, rane izazvane pritiskom, rane izazvane dugim ležanjem, i stanja povezanog sa dijabetesom ili lošom cirkulacijom.
[0189] Predmetna objava se takođe odnosi na postupke i smeše za smanjenje formiranja ožiljka tokom zarastanja rane kod subjekta. Jedinjenja i smeše opisani u ovom tekstu mogu da se primene direktno na ranu ili na ćelije u blizini rane u količini koja je efikasna u smanjivanju formiranja ožiljka na mestu rane i/ili oko rane.
[0190] Rana može uključivati bilo koju povredu na bilo kom delu tela subjekta. Prema primerima izvođenja, obezbeđeni su postupci za ublažavanje, redukovanje ili smanjenje formiranja ožiljaka kod subjekta koji je pretrpeo povredu u vidu opekotine. Prema poželjnim primerima izvođenja, obezbeđeni su postupci za lečenje, redukovanje pojave ili redukovanje mogućnosti razvijanja hipertrofičnih ožiljaka kod subjekta koji je pretrpeo akutno ili hronično ranjavanje ili povredu.
Drugi poremećaji
[0191] Jedinjenja i smeše opisani u ovom tekstu mogu da se koriste i za lečenje poremećaja nenormalnog rasta tkiva i fibroze uključujući dilatativnu kardiomiopatiju, hipertrofičnu kardiomiopatiju, restriktivnu kardiomiopatiju, plućnu fibrozu, fibrozu jetre, glomerulonefritis, i druga oboljenja bubrega.
Kombinivana radijaciona terapija
[0192] Jedinjenja i smeše opisani u ovom tekstu korisni su kao radiosenzitizeri. Prema tome, jedinjenja i smeše opisani u ovom tekstu mogu da se koriste u kombinaciji sa radijacionom terapijom. Radijaciona terapija predstavlja medicinsko korišćenje visokoenergetskog zračenja (npr., x-zraci, gama zraci, naelektrisane čestice) za smanjenje tumora i ubijanje malignih ćelija, i obično se koristi u sklopu lečenja kancera. Radijaciona terapija ubija maligne ćelije oštećivanjem njihove DNK.
2
[0193] Radijaciona terapija može da se dostavi pacijentu na nekoliko načina. Na primer, radijacija može da se dostavi iz spoljnog izvora, kao što je aparat izvan pacijentovog tela, na primer u radijacionoj terapiji spoljnim zracima. Radijaciona terapija spoljnim zracima za lečenje kancera koristi izvor zračenja koji je izvan pacijenta, tipično to je radioizotop, kao<60>Co,<137>Cs, ili izvor x-zraka visoke energije, kao što je linearni akcelerator. Spoljni izvor proizvodi snop paralelnih zraka usmerenih ka mestu tumora kod pacijenta. Radijacionom terapijom iz spoljnog izvora izbegavaju se neki problemi radijacione terapije iz unutrašnjeg izvora, ali zajedno sa tumorskim tkivom neželjeno i neizbežno se ozračuje značajna zapremina netumorskog ili zdravog tkiva koje se nalazi na putu radijacionog snopa.
[0194] Neželjeni efekat ozračivanja zdravog tkiva može da se smanji, uz održavanje date doze zračenja u tumorskom tkivu, tako što se zraci usmereni ka pacijentu projektuju sa postolja pod različitim uglovima i konvergiraju ka mestu tumora. Određeni elementi zapremine zdravog tkiva duž puta snopa radijacije se menjaju, uz smanjenje ukupne doze dostavljene svakom takvom elementu zdravog tkiva tokom čitavog tretmana.
[0195] Ozračivanje zdravog tkiva može da se redukuje i striktnim usmeravanjem paralelnog snopa zraka ka opštem poprečnom preseku tumora koji je pod pravim uglom u odnosu na osu snopa radijacije. Postoje brojni sistemi za proizvodnju takve kružne kolimacije, od kojih neki koriste više kliznih poklopaca koji, deo po deo, mogu kreirati masku neprolaznu za zrake, sa arbitrarnim obodom.
[0196] Za primenu zračenja spoljnim snopom, količina može iznositi najmanje oko 1 Greja (Gy) po frakciji, najmanje jednom svakog drugog dana, na zapreminu tretmana. U određenom primeru izvođenja, zračenje se primenjuje u dozi od najmanje oko 2 Greja (Gy) po frakciji najmanje jednom dnevno, na zapreminu tretmana. U sledećem posebnom primeru izvođenja, zračenje se primenjuje u dozi od najmanje oko 2 Greja (Gy) po frakciji najmanje jednom dnevno, na zapreminu tretmana tokom pet uzastopnih dana u nedelji. U sledećem posebnom primeru izvođenja, zračenje se primenjuje u dozi od 10 Gy po frakciji, svaki drugi dan, tri puta nedeljno, na zapreminu tretmana. U sledećem posebnom primeru izvođenja, ukupno najmanje oko 20 Gy primenjuje se kod pacijenta kojem je to potrebno. U sledećem posebnom primeru izvođenja, ukupno najmanje oko 30 Gy primenjuje se kod pacijenta kojem je to potrebno. U sledećem posebnom primeru izvođenja, najmanje oko 40 Gy primenjuje se kod pacijenta kojem je to potrebno.
[0197] Tipično, pacijent prima spoljnu zračnu terapiju pet puta nedeljno. Čitav tretman traje od jedne do sedam nedelja zavisno od tipa kancera i cilja tretmana. Na primer, pacijent može primati dozu od 2 Gy/dan tokom 30 dana.
[0198] Unutrašnja radijaciona terapija je lokalizovana radijaciona terapija, što znači da je izvor radijacije smešten na mestu tumora ili zahvaćenog područja. Unutrašnja radijaciona terapija može da se dostavi stavljanjem izvora radijacije unutar ili u blizinu područja koje zahteva tretman. Unutrašnja radijaciona terapija se naziva i brahiterapija. Brahiterapija uključuje intrakavitarni tretman i intersticijalni tretman. U intrakavitarnom tretmanu, kontejneri u kojima se nalaze radioaktivni izvori stavljaju se u tumor ili blizu tumora. Izvori se stavljaju u telesne šupljine. U intersticijalnom tretmanu, sami radioaktivni izvori se stavljaju u tumor. Ovi radioaktivni izvori mogu da ostanu u pacijentu trajno. Tipično, radioaktivni izvori se uklanjaju iz pacijenta posle nekoliko dana. Radioaktivni izvori su u kontejnerima.
[0199] Postoje brojni metodi primene radiofarmaceutskog sredstva. Na primer, radiofarmaceutsko sredstvo može da se primeni ciljanom dostavom ili sistemskom dostavom usmerenih radioaktivnih konjugata, kao što su radioobeleženo antitelo, radioobeleženi peptid i lipozomski sistem dostave. U jednom posebnom primeru izvođenja ciljane dostave, radioobeleženo farmaceutsko sredstvo može biti radioobeleženo antitelo. Vidi, na primer, Ballangrud A. M., et al. Cancer Res., 2001; 61:2008-2014 i Goldenber, D.M. J. Nucl. Med., 2002; 43(5):693-713.
[0200] U sledećem posebnom primeru izvođenja ciljane dostave, radiofarmaceutsko sredstvo može da se primeni u vidu lipozomskih dostavnih sistema, kao što su male unilamelarne vezikule, velike unilamelarne vezikule i multilamelarne vezikule. Lipozomi mogu da se formiraju od različitih fosfolipida, na primer od holesterola, stearilamina ili fosfatidilholina. Vidi, na primer, Emfietzoglou D, Kostarelos K, Sgouros G. An analytical dosimetry study for the use of radionuclide-liposome conjugates in internal radiotherapy. J Nucl Med 2001; 42:499-504.
[0201] U još jednom posebnom primeru izvođenja ciljane dostave, radioobeleženo farmaceutsko sredstvo može biti radioobeleženi peptid. Vidi, na primer, Weiner RE,
4
Thakur ML. Radiolabeled peptides in the diagnosis and therapy of oncological diseases. Appl Radiat Isot 2002 Nov;57(5):749-63.
[0202] Pored ciljane dostave, brahiterapija može da se koristi za dostavu radiofarmaceutskog sredstva na ciljno mesto. Brahiterapija je tehnika kojom se izvori radijacije postavljaju što je moguće bliže mestu tumora. Često se izvor smešta direktno u tumor. Radioaktivni izvori mogu biti u vidu žica, semena ili štapića. Obično se koriste, cezijum, iridijum ili jod.
[0203] Sistemska radijaciona terapija je još jedan tip radijacione terapije i uključuje upotrebu radioaktivnih supstanci u krvi. Sistemska radijaciona terapija je forma ciljane terapije. U sistemskoj radijacionoj terapiji, pacijent tipično ingestira ili prima injekciju radioaktivne supstance, na primer radioaktivni jod ili radioaktivna supstanca vezana za monoklonsko antitelo.
[0204] "Radiofarmaceutsko sredstvo" kako se navodi u ovom tekstu, odnosi se na farmaceutsko sredstvo koje sadrži najmanje jedan radioemitujući radioizotop. Radiofarmaceutska sredstva se rutinski koriste u nuklearnoj medicini za dijagnozu i/ili lečenje različitih bolesti. Radioobeleženo farmaceutsko sredstvo, na primer, radioobeleženo antitelo, sadrži radioizotop (RI) koji služi kao izvor radijacije. Kako se ima u vidu u ovom tekstu, izraz "radioizotop" uključuje metalne i nemetalne radioizotope. Radioizotop se bira na osnovu medicinske primene radioobeleženih farmaceutskih sredstava. Kada je radioizotop metalni radioizotop, helator se tipično koristi za vezivanje metalnog radioizotopa za ostatak molekula. Kada je radioizotop nemetalni radioizotop, nemetalni radioizotop se tipično povezje direktno ili preko linkera sa ostatkom molekula.
[0205] Kako se koristi u ovom tekstu, "metalni radioizotop" je svaki pogodni metalni radioizotop koristan u terapijskoj ili dijagnostičkoj proceduri in vivo ili in vitro. Pogodni metalni radioizotopi uključuju, ali se ne ograničavaju na: aktinijum-225, antimon-124, antimon-125, arsen-74, barijum-103, barijum-140, berilijum-7, bizmut-206, bizmut-207, bizmut-212, bizmut-213, kadmijum-109, kadmijum-115m, kalcijum-45, cerijum-139, cerijum-141, cerijum-144, cezijum-137, hrom-51, kobalt-55, kobalt-56, kobalt-57, kobalt-58, kobalt-60, kobalt-64, bakar-60, bakar-62, bakar-64, bakar-67, erbijum-169, europijum-152, galijum-64, galijum-67, galijum-68, gadolinijum153, gadolinijum-157 zlato-195, zlato-199, hafnijum-175, hafnijum-175-181, holmijum-166, indijum-110, indijum-111, iridijum-192, gvožđe-55, gvožđe-59, kripton-85, olovo-203, olovo-210, lutecijum-177, mangan-54, živu-197, živu-203, molibden-99, neodimijum-147, neptunijum-237, nikl-63, niobijum-95, osmijum-185+191, paladijum-103, paladijum-109, platinu-195m, prazeodimijum-143, prometijum-147, prometijum-149, protaktinijum-233, radijum-226, renijum-186, renijum-188, rubidijum-86, rutenijum-97, rutenijum-103, rutenijum-105, rutenijum-106, samarijum-153, skandijum-44, skandijum-46, skandijum-47, selen-75, srebro-110m, srebro-111, natrijum-22, stroncijum-85, stroncijum-89, stroncijum-90, sumpor-35, tantal-182, tehnicijum-99m, telur-125, telur-132, talijum-204, torijum-228, torijum-232, talijum-170, kalaj-113, kalaj-114, kalaj-117m, titanijum-44, tungsten-185, vanadijum-48, vanadijum-49, iterbijum-169, itrijum-86, itrijum-88, itrijum-90, itrijum-91, cink-65, cirkonijum-89, i cirkonijum-95.
[0206] Kako se koristi u ovom tekstu, "nemetalni radioizotop" je svaki pogodni nemetalni radioizotop (ne-metalni radioizotop) koristan u medicinskoj ili terapijskoj proceduri in vivo ili in vitro. Pogodni nemetalni radioizotopi uključuju, ali se ne ograničavaju na: jod-131, jod-125, jod-123, fosfor-32, astatin-211, fluor-18, ugljenik-11, kiseonik-15, brom-76, i azot-13.
[0207] Identifikovanje najpogodnijeg izotopa za radioterapiju zahteva odmeravanje različitih faktora. Oni uključuju preuzimanje u tumor i zadržavanje, klirens u krvi, stopu dostave radijacije, poluživot i specifičnu aktivnost radioizotopa, i mogućnost ekonomične proizvodnje radioizotopa u velikom obimu. Ključna tačka za terapijska radiofarmaceutska sredstva je dostaviti potrebnu količinu doze radijacije tumorskim ćelijama i postići citotoksični ili tumoricidni efekat, a pri tome ne izazvati nepopravljive sporedne efekte.
[0208] Poželjno je da fizički poluživot terapijskog radioizotopa bude sličan biološkom poluživotu radiofarmaceutskog sredstva na mestu tumora. Na primer, ako je poluživot radioizotopa suviše kratak, veliki deo raspada desiće se pre nego što radiofarmaceutsko sredstvo dostigne maksimalni odnos cilj/pozadina. Sa druge strane, suviše dug poluživot mogao bi da dovede do nepotrebnog ozračivanja normalnih tkiva. Idealno, radioizotop bi trebalo da ima poluživot dovoljno dug da se postigne minimalni dozni odnos i da ozrači sve ćelije tokom većeg dela faza ćelijskog ciklusa osetljivih na radijaciju. Pored toga, poluživot radioizotopa treba da bude dovoljno dug da omogući odgovarajuće vreme za izradu, izdavanje i transport.
[0209] Druga praktična razmatranja u vezi sa izborom radioizotopa za datu primenu u terapiji tumora su dostupnost i kvalitet. Čistoća treba da bude dovoljna i reproducibilna, jer nečistoća u tragovima može da utiče na radioobeležavanje i radiohemijsku čistoću radiofarmaceutskog sredstva.
[0210] Ciljna receptorska mesta u tumorima su tipično brojčano ograničena. Zbog toga je poželjno da radioizotop ima visoku specifičnu aktivnost. Specifična aktivnost zavisi pre svega od metoda proizvodnje. Kontaminirajući metali u tragovima moraju da budu svedeni na najmanju meru jer oni obično kompetiraju sa radioizotopom za helator i njihovi metalni kompleksi kompetiraju sa radioobeleženim helirajućim sredstvom u vezivanju sa receptorom.
[0211] Tip radijacije pogodne za korišćenje u postupcima predmetnog pronalaska može varirati. Na primer, radijacija može biti elektromagnetne prirode ili čestične prirode. Elektromagnetna radijacija korisna u praktičnoj primeni ovog pronalaska uključuje, ali se ne ograničava na x-zrake i gama zrake. Čestična radijacija korisna u praktičnoj primeni ovog pronalaska uključuje, ali se ne ograničava na snopove elektrona (beta čestice), snopove protona, snopove neutrona, alfa čestice i negativne pi mezone. Radijacija može da se dostavi korišćenjem konvencionalnih aparata i metoda za radiološki tretman. Dodatna razmatranja o radijacionim tretmanima pogodnim za upotrebu u praktičnoj primeni ovog pronalaska mogu se naći u Steven A. Leibel et al., Textbook of Radiation Oncology (1998) (publ. W. B. Saunders Company), i posebno u poglavljima 13 i 14. Radijacija može da se dostavi i drugim metodima kao što je ciljana dostava, na primer radioaktivnim "semenima", ili sistemskom dostavom usmerenih radioaktivnih konjugata. J. Padawer et al., Combined Treatment with Radioestradiol lucanthone in Mouse C3HBA Mammary Adenocarcinoma and with Estradiol lucanthone in an Estrogen Bioassay, Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 7:347-357 (1981). Drugi metodi dostave radijacije mogu se koristiti u praktičnoj primeni ovog pronalaska.
[0212] Za terapiju tumora, ispitivani su emiteri α i β-čestica. Alfa čestice su posebno dobra citotoksična sredstva jer rasipaju veliku količinu energije u prečniku od jedne do dve ćelije. Emiteri β-čestica imaju relativno dug opseg prodiranja (2-12 mm u tkivu) zavisno od nivoa energije. Duboko prodiranje je posebno važno za solidne tumore koji imaju heterologi protok krvi i/ili ekspresiju receptora. Emiteri β-čestica daju homogeniju distribuciju doze čak i kada su heterogeno distribuirani u ciljnom tkivu.
[0213] U posebnom primeru izvođenja, terapijski efikasne količine jedinjenja i smeša opisanih u ovom tekstu primenjuju se u kombinaciji sa terapijski efikasnom količinom radijacione terapije za lečenje kancera (npr., kancera pluća kao što je nesitnoćelijski kancer pluća). Količinu potrebne radijacije može odrediti stručnjak u oblasti na osnovu poznatih doza za određeni tip kancera. Vidi, na primer, Cancer Medicine 5th ed., Edited by R.C. Bast et al., July 2000, BC Decker.
[0214] Gornja objava uopšteno opisuje predmetni pronalazak. Potpunije razumevanje može se postići pozivanjem na specifične Primere koji slede. Ovi Primeri opisani su samo radi ilustracije i nemaju za cilj ograničavanje okvira pronalaska. Promene u formi i supstituciji ekvivalenata imaju se u vidu kada to uslovi nalažu ili kada se učine celishodnim. Iako se u ovom tekstu koriste specifični izrazi, takvi izrazi imaju deskriptivan smisao, i nisu dati u svrhu ograničavanja.
PRIMERI
Skraćenice
[0215]
aq. vodeni
Boc tert-butoksikarbonil
CH2Cl2Dihlorometan
DABCO 1,4-diazabiciklo[2.2.2]oktan
DIPEA N,N-diizopropiletilamin
DMF N,N-dimetilformamid
DMSO Dimetilsulfoksid
eq. ekvivalent(i)
EtOAc Etil acetat
EtOH Etanol
h sat(i)
HPLC Tečna hromatografija visokih performansi
LCMS Tečna hromatografija-masena spektrometrija
LiOH Litijum hidroksid
NMR Nuklearno magnetna rezonanca
RT Sobna temperatura ili vreme retencije
T3P Propilfosfonski anhidrid
TFA Trifluorosirćetna kiselina
THF Tetrahidrofuran
[0216] U opisu procesa, koji sledi, podrazumeva se da će se, po potrebi, pogodne protektivne grupe dodavati i zatim uklanjati sa različitih reaktanata i intermedijara na način koji će lako razumeti stručnjak u oblasti organske sinteze. Uobičajene procedure korišćenja takvih grupa kao i primeri pogodnih protektivnih grupa opisani su, na primer, u "Protective Groups in Organic Synthesis", T.W. Green, P.G.M. Wuts, Wiley-Interscience, New York, (1999). Isto tako, podrazumeva se da transformacija grupe ili supstituenta u drugu grupu ili supstituent hemijskom manipulacijom može da se izvede na bilo kojem intermedijarnom ili finalnom proizvodu puta sinteze finalnog proizvoda, pri čemu je mogući tip transformacije ograničen jedino inherentnom inkompatibilnošću drugih funkcionalnih grupa koje nosi molekul na tom stupnju i uslova ili reagenasa upotrebljenih za transformaciju. Takve inherentne inkompatibilnosti, i načini njihovog prevazilaženja izvođenjem odgovarajućih transformacija i sintetskih koraka pogodnim redosledom, lako će razumeti stručnjak u oblasti organske sinteze. Primeri transformacija dati su u nastavku teksta, i razume se da opisane transformacije nisu ograničene samo na generičke grupe ili supstituente za koje je transformacija data kao primer. Reference i opisi u vezi sa drugim pogodnim transformacijama dati su u "Comprehensive Organic Transformations - A Guide to Functional Group Preparations" R. C. Larock, VHC Publishers, Inc. (1989). Reference i opisi drugih pogodnih reakcija opisani su u udžbenicima organske hemije, na primer, "Advanced Organic Chemistry", March, 4th ed. McGraw Hill (1992) ili, "Organic Synthesis", Smith, McGraw Hill, (1994). Tehnike prečišćavanja intermedijara i finalnih proizvoda uključuju na primer, normalno-faznu i reverzno-faznu hromatografiju na koloni ili rotirajućoj ploči, rekristalizaciju, destilaciju i tečno-tečnu ili čvrsto-tečnu ekstrakciju, što će lako razumeti stručnjak u oblasti. Definicije supstituenata i grupa su kao u formuli I izuzev kada je definisano drugačije. Izrazi "sobna temperatura" i "ambijentalna temperatura" označavaju, ako nije drugačije specifikovano, temperaturu između 16 i 25 °C. Izraz "refluks" označava, ako nije drugačije navedeno, u vezi sa upotrebljenim rastvaračem, temperaturu na ili iznad tačke ključanja navedenog rastvarača.
Primer 1. Sinteza (Z)-3-(3-(3,5-bis(trifluorometil)fenil)-1H-1,2,4-triazol-1-il)-N'-pivaloilakrilohidrazida (Jedinjenje 1). Jedinjenje 1 se sintetiše prema sledećoj [0217]
šemi:
[0218] 3,5-bis(trifluorometil)benzotioamid (Korak 1).2 L-ski 3-grli flakon sa okruglim dnom napuni se rastvorom 3,5-bis(trifluorometil)benzonitrila (200 g) u DMF (1 L). Rastvor se tretira korišćenjem NaSH (123.7 g, 2.0 eq.) i MgCl2(186.7 g, 1.0 eq.) i reakciona mešavina se meša na RT, 3 h. Mešavina se sipa na gustu suspenziju leda-vode (10 L) i jedinjenje se ekstrahuje pomoću EtOAc (3 x 1 L). Kombinovani organski slojevi se isperu zasićenim vodenim rastvorom natrijum hlorida (3 x 100 mL), suše preko anhidrovanog Na2SO4, filtriraju i koncentruju pod sniženim pritiskom dajući 205 g željenog sirovog 3,5-bis(trifluorometil)benzotioamida (prinos: 90%), koji se koristi u sledećem koraku bez dodatnog prečišćavanja.
[0219] 3-(3,5-bis(trifluorometil)fenil)-1H-1,2,4-triazol (Korak 2).5 L-ski 3-grli flakon sa okruglim dnom napuni se rastvorom 3,5-bis(trifluorometil)benzotioamida (205.65 g) u DMF (1.03 L). U kapima se doda hidrazin hidrat (73.2 mL, 2.0 eq.) i reakciona mešavina se meša na RT, 1 h. U kapima se doda HCOOH (1.03 L) i reakciona mešavina se refluktuje na 90 °C, 3 h. Pošto se ostavi da se ohladi do RT, reakciona mešavina se sipa u zasićeni vodeni rastvor natrijum bikarbonata (7 L) i ekstrahuje pomoću EtOAc (3 x 1 L). Kombinovani organski slojevi se isperu zasićenim vodenim rastvorom natrijum hlorida (3 x 500 mL), suše preko anhidrovanog Na2SO4, filtriraju i koncentruju pod sniženim pritiskom (35 °C, 20 mmHg) dajući 180 g sirovog proizvoda. Sirovi materijal se meša sa petrol etrom (3 x 500 mL), filtrira i suši da se dobije 160 g željenog 3-(3,5-bis(trifluorometil)fenil)-1H-1,2,4-triazola u vidu bledožute čvrste supstance (prinos: 75%).
[0220] (Z)-izopropil 3-(3-(3,5-bis(trifluorometil)fenil)-1H-1,2,4-triazol-1-il)akrilat (Korak 3).2 L-ski 3-grli flakon sa okruglim dnom napuni se rastvorom 3-(3,5-bis(trifluorometil)fenil)-1H-1,2,4-triazola (160 g) u DMF (960 mL). Rastvor se tretira pomoću DABCO (127.74 g, 2 eq.) i meša 30 min pre nego što mu se doda (Z)-izopropil 3-jodoakrilat (150.32g, 1.1 eq.) u kapima. Posle 1 h, reakciona mešavina se sipa preko guste suspenzije leda-vode (5 L) i ekstrahuje pomoću EtOAc (3 x 1 L). Kombinovani organski slojevi se isperu zasićenim vodenim rastvorom natrijum hlorida (3 x 100 mL), suše preko anhidrovanog Na2SO4, filtriraju i koncentruju pod sniženim pritiskom (35 °C, 20 mmHg) dajući 250 g sirovog proizvoda koji se prečišćava hromatografijom na koloni (60/120 silika gel) korišćenjem gradijenta etil acetat/n-heksan (kolona se pakuje u heksanu i željeno jedinjenje počinje da se eluira na 2% EtOAC/n-heksan). Frakcije koje sadrže željena jedinjenja kombinuju se dajući (Z)-izopropil 3-(3-(3,5-bis(trifluorometil)fenil)-1H-1,2,4-triazol-1-il)akrilat (138 g, prinos: 61%).
[0221] (Z)-3-(3-(3,5-bis(trifluorometil)fenil)-1H-1,2,4-triazol-1-il)akrilna kiselina (Korak 4). U 5 L-skom 3-grlom flakonu sa okruglim dnom rastvori se (Z)-izopropil 3-(3-(3,5-bis(trifluorometil)fenil)-1H-1,2,4-triazol-1-il)akrilat (130 g, 1.0 eq.) u THF (1.3 L). Rastvor LiOH (69.3 g, 5.0 eq.) u vodi (1.3 L) doda se u kapima u rastvor i reakciona mešavina se meša na RT 4 h pre nego što se reakcija prekine pomoću 400 mL guste suspenzije leda-vode i zakiseli (pH=2-3) razblaženim vodenim rastvorom HCl. Mešavina se ekstrahuje korišćenjem EtOAc (3 x 1 L) i kombinovani organski slojevi se isperu zasićenim vodenim rastvorom natrijum hlorida, suše preko anhidrovanog Na2SO4, i koncentruju pod sniženim pritiskom dajući 110 g (Z)-3-(3-(3,5-bis(trifluorometil)fenil)-1H-1,2,4-triazol-1-il)akrilne kiseline (prinos: 94%), (cis sadržaj= 90.0%, trans sadržaj= 8.2% po LCMS).
[0222] (Z)-3-(3-(3,5-bis(trifluorometil)fenil)-1H-1,2,4-triazol-1-il)-N'-pivaloilakrilohidra-zid (jedinjenje1). U 50 mL-skom, 3-grlom flakonu sa okruglim dnom rastvori se (Z)-3-(3-(3,5-bis(trifluorometil)fenil)-1H-1,2,4-triazol-1-il)akrilna
1
kiselina (0.2 g, 1.0 eq.) u EtOAc (20 mL) i ohladi na -60 °C u šta se uvede pivalohidrazid (0.08 g, 1.2 eq.) u kapima. U kapima se doda T3P (50% u EtOAc) (0.4 mL, 4 eq.), praćeno sa DIPEA (0.4 mL, 4 eq.) i reakciona mešavina se meša 1 h na -60 °C. Reakciona mešavina se koncentruje pod sniženim pritiskom (25 °C, 20 mm Hg) dajući sirovi proizvod koji se prečišćava hromatografijom na koloni (60/120 silika gel) korišćenjem gradijenta metanol/dihlorometan (kolona se pakuje u dihlorometanu i željeno jedinjenje počinje da se eluira na 3% metanol/dihlorometan). Frakcije koje sadrže željena jedinjenja kombinuju se dajući (Z)-3-(3-(3,5-bis(trifluorometil)fenil)-1H-1,2,4-triazol-1-il)-N'-pivaloilakrilohidrazid (0.11 g, prinos: 43%);
Primer 2. Sinteza (Z)-3-(3-(3,5-bis(trifluorometil)fenil)-1H-1,2,4-triazol-1-il)-N'-(2-morfolinoacetil)akrilohidrazida (Jedinjenje 2).
[0223] 2-morfolinoacetohidrazid. U 25 mL-skom, 3-grlom flakonu sa okruglim dnom, rastvori se metil 2-morfolinoacetat (0.25 g, 1.0 eq.) u etanolu (5 mL) na RT. Hidrazin hidrat (0.087 g, 1.1 eq.) se uvede u kapima na RT i reakciona mešavina se refluktuje na 95 °C, 20 h. Reakciona mešavina se koncentruje pod sniženim pritiskom (40 °C, 20 mm Hg) dajući sirovi 2-morfolinoacetohidrazid (0.23 g) koji se koristi u sledećem koraku bez dodatnog prečišćavanja.
[0224] (Z)-3-(3-(3,5-bis(trifluorometil)fenil)-1H-1,2,4-triazol-1-il)-N'-(2-morfolinoacetil) akrilohidrazid (Jedinjenje 2). U 50 mL-skom, 3-grlom flakonu sa okruglim dnom rastvori se (Z)-3-(3-(3,5-bis(trifluorometil)fenil)-1H-1,2,4-triazol-1-il)akrilna kiselina (Primer 1, Korak 4; 0.5 g, 1.0 eq.) u CH2Cl2: EtOAc (20 mL, 2:1) i ohladi na -60 °C gde se u kapima doda 2-morfolinoacetohidrazid (0.23 g, 1.0 eq.). T3P (50% u EtOAc) (1.27 mL, 1.5 eq.) doda se u kapima, praćeno sa DIPEA (0.96 mL, 2 eq.) i reakciona mešavina se meša 1 h na -60 °C. Reakciona mešavina se koncentruje pod sniženim pritiskom (25 °C, 20 mm Hg) dajući sirovi proizvod koji se prečisti hromatografijom na koloni (60/120 silika gel) korišćenjem gradijenta metanol/dihlorometan (kolona se pakuje u dihlorometanu i željeno jedinjenje počinje da se eluira na 3% metanol/dihlorometan). Frakcije koje sadrže željena jedinjenja kombinuju se dajući (Z)-3-(3-(3,5-bis(trifluorometil)fenil)-1H-1,2,4-triazol-1-il)-N'-(2-morfolinoacetil)akrilohidrazid (0.1 g, prinos: 14%).
2
Primer 3. Sinteza (Z)-N'-(3-(3-(3,5-bis(trifluorometil)fenil)-1H-1,2,4-triazol-1-il)akriloil)-5-metil-1H-pirazol-4-karbohidrazida (Jedinjenje 3).
[0225] 5-metil-1H-pirazol-4-karbohidrazid. U hermetički zatvorenoj 25 mL-skoj epruveti rastvori se etil 5-metil-1H-pirazol-4-karboksilat (0.25 g, 1.0 eq.) u etanolu (5 mL) na RT. Hidrazin hidrat (1 mL, 5 eq.) uvede se u kapima na RT i reakciona mešavina se zagreva na 120 °C, 20 h. Reakciona mešavina se koncentruje pod sniženim pritiskom (40 °C, 20 mm Hg) dajući sirovi 5-metil-1H-pirazol-4-karbohidrazid (0.24 g) koji se u sledećem koraku koristi bez dodatnog prečišćavanja.
[0226] (Z)-N'-(3-(3-(3,5-bis(trifluorometil)fenil)-1H-1,2,4-triazol-1-il)akriloil)-5-metil-1H-pirazol-4-karbohidrazid (Jedinjenje 3). U 50 mL-skom, 3-grlom flakonu sa okruglim dnom rastvori se (Z)-3-(3-(3,5-bis(trifluorometil)fenil)-1H-1,2,4-triazol-1-il)akrilna kiselina (Primer 1, Korak 4; 0.5 g, 1.0 eq.) u EtOAc:EtOH (15 mL, 2:1) i ohladi na -60 °C, gde se uvede u kapima 5-metil-1H-pirazol-4-karbohidrazid (0.24 g, 1.0 eq.). T3P (50% in EtOAc) (1.69 mL, 1.5 eq.) se doda u kapima, praćeno sa DIPEA (2 mL, 8 eq.) i reakciona mešavina se meša 1 h na -60 °C. Reakciona mešavina se koncentruje pod sniženim pritiskom (25 °C, 20 mm Hg) dajući sirovi proizvod koji se prečisti hromatografijom na koloni (60/120 silika gel) korišćenjem gradijenta metanol/dihlorometan (kolona se pakuje u dihlorometanu i željeno jedinjenje počinje da se eluira na 3% metanol/dihlorometan). Frakcije koje sadrže željena jedinjenja kombinuju se dajući (Z)-N'-(3-(3-(3,5-bis(trifluorometil)fenil)-1H-1,2,4-triazol-1-il)akriloil)-5-metil-1H-pirazol-4-karbohidrazid (0.2 g, prinos: 42%).
Referentni primer 4. Sinteza (Z)-2-(3-(3-(3,5-bis(trifluorometil)fenil)-1H-1,2,4-triazol-1-il)akriloil)-N-ciklopropilhidrazinkarbotioamida (Jedinjenje 4)
[0227] U 50 mL-skom, 3-grlom flakonu sa okruglim dnom rastvori se (Z)-3-(3-(3,5-bis(trifluorometil)fenil)-1H-1,2,4-triazol-1-il)akrilna kiselina (Primer 1, Korak 4; 0.5 g, 1.0 eq.) u EtOAc:EtOH (15 mL, 2:1) i ohladi na -60 °C, gde se u kapima uvede N-ciklopropilhidrazinkarbotioamid (0.22 g, 1.2 eq.). T3P (50% in EtOAc) (1.69 mL, 2 eq.) se doda u kapima, praćeno sa DIPEA (1 mL, 4 eq.) i reakciona mešavina se meša 1 h na -60 °C. Reakciona mešavina se koncentruje pod sniženim pritiskom (25 °C, 20 mm Hg) dajući sirovi proizvod koji se prečisti hromatografijom na koloni (60/120 silika gel) korišćenjem gradijenta metanol/dihlorometan (kolona se pakuje u dihlorometanu i željeno jedinjenje počinje da se eluira na 3% metanol/dihlorometan). Frakcije koje sadrže željena jedinjenja kombinuju se dajući (Z)-2-(3-(3-(3,5-bis(trifluorometil)fenil)-1H-1,2,4-triazol-1-il)akriloil)-N-ciklopropilhidrazinkarbotioamid (0.06 g, prinos: 9%).
Primer 5. Sinteza (Z)-3-(3-(3,5-bis(trifluorometil)fenil)-1H-1,2,4-triazol-1-il)-N'-metil-N'-(2-morfolinoacetil)akrilohidrazida (Jedinjenje 5).
[0228] N-metil-2-morfolinoacetohidrazid. U hermetički zatvorenoj 25 mL-skoj epruveti rastvori se metil 2-morfolinoacetat (0.5 g, 1.0 eq.) u etanolu (5 mL) na RT. Metilhidrazin (0.16 g, 1.1 eq.) se uvede u kapima na RT i reakciona mešavina se refluktuje na 95 °C, 48 h. Reakciona mešavina se koncentruje pod sniženim pritiskom (40 °C, 20 mm Hg) dajući sirovi N-metil-2-morfolinoacetohidrazid (0.27 g) koji se u sledećem koraku koristi bez dodatnog prečišćavanja.
[0229] (Z)-3-(3-(3,5-bis(trifluorometil)fenil)-1H-1,2,4-triazol-1-il)-N'-metil-N'-(2-morfoli-noacetil)akrilohidrazid (Jedinjenje 5). U 50 mL-skom, 3-grlom flakonu sa okruglim dnom rastvori se (Z)-3-(3-(3,5-bis(trifluorometil)fenil)-1H-1,2,4-triazol-1-il)akrilna kiselina (Primer 1, Korak 4; 0.3 g, 1.0 eq.) u THF: EtOAc (15 mL, 2:1) i ohladi na -60 °C, gde se u kapima uvede N-metil-2-morfolinoacetohidrazid (0.23 g, 1.5 eq.). T3P (50% u EtOAc) (1.27 mL, 2.5 eq.) doda se u kapima, praćeno sa DIPEA (0.45 mL, 3 eq.) i reakciona mešavina se meša 1 h na -60 °C. Reakciona mešavina se koncentruje pod sniženim pritiskom (25 °C, 20 mm Hg) dajući sirovi proizvod koji se prečisti hromatografijom na koloni (60/120 silika gel) korišćenjem gradijenta metanol/dihlorometan (kolona se pakuje u dihlorometanu i željeno jedinjenje počinje da se eluira na 3% metanol/dihlorometan). Frakcije koje sadrže željena jedinjenja kombinuju se dajući (Z)-3-(3-(3,5-bis(trifluorometil)fenil)-1H-1,2,4-triazol-1-il)-N'-metil-N'-(2-morfolinoacetil)akrilohidrazid (0.052 g, prinos: 12%).
Primer 6. Sinteza (Z)-N'-(3-(3-(3,5-bis(trifluorometil)fenil)-1H-1,2,4-triazol-1-il)akriloil)piperidin-3-karbohidrazida (Jedinjenje 6).
4
[0230] Piperidin-3-karbohidrazid. U hermetički zatvorenoj 30 mL-skoj epruveti rastvori se etil metil piperidin-3-karboksilat (1 g, 1.0 eq.) u etanolu (5 mL) na RT. Hidrazin hidrat (1.05 g, 3 eq.) se uvede u kapima na RT i reakciona mešavina se zagreva na 120 °C, 20 h. Reakciona mešavina se koncentruje pod sniženim pritiskom (40 °C, 20 mm Hg) dajući sirovi piperidin-3-karbohidrazid (0.8 g) koji se u sledećem koraku koristi bez dodatnog prečišćavanja.
[0231] (Z)-N'-(3-(3-(3,5-bis(trifluorometil)fenil)-1H-1,2,4-triazol-1-il)akriloil)piperidin-3-karbohidrazid (Jedinjenje 6). U 50 mL-skom, 3-grlom flakonu sa okruglim dnom rastvori se (Z)-3-(3-(3,5-bis(trifluorometil)fenil)-1H-1,2,4-triazol-1-il)akrilna kiselina (Primer 1, Korak 4; 0.25 g, 1.0 eq.) u THF: EtOAc (15 mL, 2:1) i ohladi na -60 °C, gde se u kapima doda piperidin-3-karbohidrazid (0.113 g, 1.1 eq.). T3P (50% in EtOAc) (1.69 mL, 4 eq.) se doda u kapima, praćeno sa DIPEA (0.25 mL, 2 eq.) i reakciona mešavina se meša 1 h na -60 °C. Reakciona mešavina se koncentruje pod sniženim pritiskom (25 °C, 20 mm Hg) dajući sirovi proizvod koji se prečisti hromatografijom na koloni (60/120 silika gel) korišćenjem gradijenta metanol/dihlorometan (kolona se pakuje u dihlorometanu i željeno jedinjenje počinje da se eluira na 3% metanol/dihlorometan). Frakcije koje sadrže željena jedinjenja kombinuju se dajući (Z)-N'-(3-(3-(3,5-bis(trifluorometil)fenil)-1H-1,2,4-triazol-1-il)akriloil)piperidin-3-karbohidrazid (0.01 g, prinos: 2.4%).
Primer 7. Sinteza (S,Z)-2-amino-N'-(3-(3-(3,5-bis(trifluorometil)fenil)-1H-1,2,4-triazol-1-il)akriloil)-3-metilbutanhidrazid 2,2,2-trifluoroacetata (Jedinjenje 7).
[0232] Jedinjenje 7 sintetiše se prema sledećoj šemi:
[0233] (Z)-3-(3-(3,5-bis(trifluorometil)fenil)-1H-1,2,4-triazol-1-il)akrilohidrazid (Korak 1). U 50 mL-skom, 3-grlom flakonu sa okruglim dnom rastvori se (Z)-3-(3-(3,5-bis(trifluorometil)fenil)-1H-1,2,4-triazol-1-il)akrilna kiselina (Primer 1, Korak 4; 0.5 g, 1.0 eq.) u THF (10 mL) i ohladi na -10 °C gde se doda NMP (0.3 g, 2.1 eq.) i reakciona mešavina se meša 5 min. Zatim se doda izobutil hloroformat (0.465 g, 2.4 eq.) i reakciona mešavina se meša 1 h. Formirana čvrsta supstanca se ukloni filtriranjem. Filtrat se ohladi na 0 °C i uvede se tert-butoksikarbonil hidrazid (0.21 g, 1.1 eq.). Reakciona mešavina se ostavi da se zagreje na RT, gde se meša 1 h. Reakciona mešavina se sipa u gustu suspenziju leda-vode i ekstrahuje pomoću EtOAc (3 X 50 mL). Kombinovani organski slojevi se isperu zasićenim vodenim rastvorom natrijum hlorida (25 mL), suše preko anhidrovanog Na2SO4, filtriraju i koncentruju pod sniženim pritiskom (25 °C, 20 mmHg) dajući 0.5 g sirovog proizvoda. Sirovi proizvod se zatim rastvori u THF (10 mL) i TFA (2 mL) se doda u kapima na RT i reakciona mešavina se meša 2 h. Reakciona mešavina se koncentruje pod sniženim pritiskom (25 °C, 20 mmHg) i formirana čvrsta supstanca se trituriše pentanom dajući (Z)-3-(3-(3,5-bis(trifluorometil)fenil)-1H-1,2,4-triazol-1-il)akrilohidrazid (0.25 g, prinos: 48.5%).
[0234] (S)-2-((tert-butoksikarbonil)amino)-3-metilbutanska kiselina. U 25 mL-skom, 3-grlom flakonu sa okruglim dnom rastvori se (S)-2-amino-3-metilbutanska kiselina (0.8 g, 1.0 eq.) u vodi (4 mL). Doda se natrijum bikarbonat (0.63 g, 1.1 eq.), što je praćeno dodavanjem di-tert-butil dikarbonata (2.97 g, 2.0 eq.) i reakciona mešavina se meša 2 h na RT. Reakciona mešavina se ekstrahuje pomoću EtOAc (3 X 10 mL). Kombinovani organski slojevi se isperu zasićenim vodenim rastvorom natrijum hlorida (25 mL), suše preko anhidrovanog Na2SO4, filtriraju i koncentruju pod sniženim pritiskom (25 °C, 20 mmHg) dajući 1.2 g sirovog proizvoda koji se prečisti hromatografijom na koloni (60/120 silika gel) korišćenjem gradijenta metanol/dihlorometan (kolona se pakuje u dihlorometanu i željeno jedinjenje počinje da se eluira na 3% metanol/dihlorometan). Frakcije koje sadrže željena jedinjenja kombinuju se dajući (S)-2-((tertbutoksikarbonil)amino)-3-metilbutansku kiselinu (0.7 g, prinos: 47.3%).
[0235] (S,Z)-2-amino-N'-(3-(3-(3,5-bis(trifluorometil)fenil)-1H-1,2,4-triazol-1-il)akriloil)-3-metilbutanhidrazid 2,2,2-trifluoroacetat (Jedinjenje 7). U 10 mL-skom, flakonu sa okruglim dnom rastvori se (Z)-3-(3-(3,5-bis(trifluorometil)fenil)-1H-1,2,4-triazol-1-il)akrilohidrazid (0.25 g, 1.0 eq.) u THF (5 mL) i ohladi na -60 °C, gde se u kapima uvede (S)-2-((tert-butoksikarbonil)amino)-3-metilbutanska kiselina (0.19 g, 1.3 eq.). T3P (50% u EtOAc) (0.81 mL, 2 eq.) doda se u kapima, praćeno sa DIPEA (0.48 mL, 4 eq.) i reakciona mešavina se meša 1 h na -60 °C. Reakciona mešavina se koncentruje pod sniženim pritiskom (25 °C, 20 mm Hg) dajući sirovi proizvod koji se prečisti hromatografijom na koloni (60/120 silika gel) korišćenjem gradijenta metanol/dihlorometan (kolona se pakuje u dihlorometanu i željeno jedinjenje počinje da se eluira na 3% metanol/dihlorometan). Frakcije koje sadrže željena jedinjenja kombinuju se dajući (S,Z)-tert-butil (1-(2-(3-(3-(3,5-bis(trifluorometil)fenil)-1H-1,2,4-triazol-1-il)akriloil)hidrazinil)-3-metil-1-oksobutan-2-il)karbamat (0.07 g, prinos: 18%). U 10 mL-skom, 3-grlom flakonu sa okruglim dnom zatim se rastvori (S,Z)-tert-butil (1-(2-(3-(3-(3,5-bis(trifluorometil)fenil)-1H-1,2,4-triazol-1-il)akriloil)hidrazinil)-3-metil-1-oksobutan-2-il)karbamat u dihlorometanu (2 mL). TFA (0.05 mL) se doda i reakciona mešavina se meša na RT 5 h. Reakciona mešavina se koncentruje pod sniženim pritiskom (25 °C, 20 mm Hg) dajući sirovi proizvod (0.01 g), koji se trituriše petrol etrom i suši pod sniženim pritiskom da se dobije (S,Z)-2-amino-N'-(3-(3-(3,5-bis(trifluorometil)fenil)-1H-1,2,4-triazol-1-il)akriloil)-3-metilbutanhidrazid 2,2,2-trifluoroacetat (0.006 g, prinos: 2%).
Primer 8. Sinteza (Z)-N'-(3-(3-(3,5-bis(trifluorometil)fenil)-1H-1,2,4-triazol-1-il)akriloil)pirazin-2-karbohidrazida (Jedinjenje 8).
[0236] U 25 mL-skom, 3-grlom flakonu sa okruglim dnom rastvori se (Z)-3-(3-(3,5-bis(trifluorometil)fenil)-1H-1,2,4-triazol-1-il)akrilna kiselina (Primer 1, Korak 4; 0.5 g, 1.0 eq.) u dihlorometanu (5 mL) i ohladi na -60 °C, gde se uvede pirazin-2-karbohidrazid (0.216 g, 1.1 eq.). T3P (50% u EtOAc) (3.39 mL, 4 eq.) doda se u kapima, praćeno sa DIPEA (0.5 mL, 2 eq.) i reakciona mešavina se meša 1 h na -60 °C. Reakciona mešavina se koncentruje pod sniženim pritiskom (25 °C, 20 mm Hg) dajući sirovi proizvod koji se prečisti hromatografijom na koloni (60/120 silika gel) korišćenjem gradijenta metanol/dihlorometan (kolona se pakuje u dihlorometanu i željeno jedinjenje počinje da se eluira na 3% metanol/dihlorometan). Frakcije koje sadrže željena jedinjenja kombinuju se dajući (Z)-N'-(3-(3-(3,5-bis(trifluorometil)fenil)-1H-1,2,4-triazol-1-il)akriloil)pirazin-2-karbohidrazid (0.13 g, prinos: 19.4%).
Primer 9. Sinteza (Z)-N'-(3-(3-(3,5-bis(trifluorometil)fenil)-1H-1,2,4-triazol-1-il)akriloil)-1-metilpiperidin-4-karbohidrazida (Jedinjenje 9).
[0237] 1-metilpiperidin-4-karbohidrazid. U hermetički zatvorenoj 25 mL-skoj epruveti rastvori se metil 1-metilpiperidin-4-karboksilat (0.2 g, 1.0 eq.) u etanolu (5 mL) na RT. Hidrazin hidrat (0.127 g, 2 eq.) se uvede u kapima na RT i reakciona mešavina se zagreva na 120 °C, 20 h. Reakciona mešavina se koncentruje pod sniženim pritiskom (40 °C, 20 mm Hg) dajući sirovi 1-metilpiperidin-4-karbohidrazid (0.145 g) koji se u sledećem koraku koristi bez dodatnog prečišćavanja.
[0238] (Z)-N'-(3-(3-(3,5-bis(trifluorometil)fenil)-1H-1,2,4-triazol-1-il)akriloil)-1-metilpi-peridin-4-karbohidrazid (Jedinjenje 9). U 50 mL-skom, 3-grlom flakonu sa okruglim dnom rastvori se (Z)-3-(3-(3,5-bis(trifluorometil)fenil)-1H-1,2,4-triazol-1-il)akrilna kiselina (0.25 g, 1.0 eq.) u EtOAc:THF (15 mL; 2:1) i ohladi na -60 °C, gde se uvede 1-metilpiperidin-4-karbohidrazid (0.123 g, 1.1 eq.). T3P (50% u EtOAc) (0.85 mL, 2 eq.) se doda u kapima, praćeno sa DIPEA (0.31 mL, 2.5 eq.) i reakciona mešavina se meša 1 h na -60 °C. Reakciona mešavina se koncentruje pod sniženim pritiskom (35 °C, 20 mm Hg) dajući sirovi proizvod koji se prečisti hromatografijom na koloni (60/120 silika gel) korišćenjem gradijenta metanol/dihlorometan (kolona se pakuje u dihlorometanu i željeno jedinjenje počinje da se eluira na 3% metanol/dihlorometan). Frakcije koje sadrže željena jedinjenja kombinuju se dajući (Z)-N'-(3-(3-(3,5-bis(trifluorometil)fenil)-1H-1,2,4-triazol-1-il)akriloil)-1-metilpiperidin-4-karbohidrazid (0.016 g, prinos: 4.5%).
Primer 10. Sinteza (R,Z)-2-amino-N'-(3-(3-(3,5-bis(trifluorometil)fenil)-1H-1,2,4-triazol-1-il)akriloil)-3-metilbutanhidrazid 2,2,2-trifluoroacetata (Jedinjenje 10).
[0239] (R)-2-((tert-butoksikarbonil)amino)-3-metilbutanska kiselina. U 25 mL-skom, 3-grlom flakonu sa okruglim dnom rastvori se (R)-2-amino-3-metilbutanska kiselina (0.8 g, 1.0 eq.) u vodi (4 mL). Doda se natrijum bikarbonat, (0.394 g, 1.1 eq.), što je praćeno di-tert-butil dikarbonatom (1.86 g, 2.0 eq.) i reakciona mešavina se meša 2 h na RT. Reakciona mešavina se ekstrahuje pomoću EtOAc (3 X 10 mL). Kombinovani organski slojevi se isperu zasićenim vodenim rastvorom natrijum hlorida (25 mL), suše preko anhidrovanog Na2SO4, filtriraju i koncentruju pod sniženim pritiskom (25 °C, 20 mmHg) dajući 0.75 g sirovog proizvoda koji se prečisti hromatografijom na koloni (60/120 silika gel) korišćenjem gradijenta metanol/dihlorometan (kolona se pakuje u dihlorometanu i željeno jedinjenje počinje da se eluira na 3% metanol/dihlorometan). Frakcije koje sadrže željena jedinjenja kombinuju se dajući (R)-2-((tertbutoksikarbonil)amino)-3-metilbutansku kiselinu (0.44 g, prinos: 47.3%).
[0240] (R,Z)-2-amino-N'-(3-(3-(3,5-bis(trifluorometil)fenil)-1H-1,2,4-triazol-1-il)akriloil)-3-metilbutanhidrazid 2,2,2-trifluoroacetat (Jedinjenje 10). U 10 mL-skom flakonu sa okruglim dnom rastvori se (Z)-3-(3-(3,5-bis(trifluorometil)fenil)-1H-1,2,4-triazol-1-il)akrilohidrazid (0.05 g, 1.0 eq.) u THF (5 mL) i ohladi na -60 °C, gde se u kapima uvede (R)-2-((tert-butoksikarbonil)amino)-3-metilbutanska kiselina (0.038 g, 1.3 eq.). T3P (50% u EtOAc) (0.16 mL, 2 eq.) doda se u kapima, praćeno sa DIPEA (0.095 mL, 4 eq.) i reakciona mešavina se meša 1 h na -60 °C. Reakciona mešavina se koncentruje pod sniženim pritiskom (25 °C, 20 mm Hg) dajući sirovi proizvod koji se prečisti hromatografijom na koloni (60/120 silika gel) korišćenjem gradijenta metanol/dihlorometan (kolona se pakuje u dihlorometanu i željeno jedinjenje počinje da se eluira na 3% metanol/dihlorometan). Frakcije koje sadrže željena jedinjenja kombinuju se dajući (R,Z)-tert-butil(1-(2-(3-(3-(3,5-bis(trifluorometil)fenil)-1H-1,2,4-triazol-1-il)akriloil)hidrazinil)-3-metil-1-oksobutan-2-il)karbamat (0.017 g, prinos: 26%). U 10 mL-skom, flakonu sa okruglim dnom zatim se rastvori (R,Z)-tert-butil (1-(2-(3-(3-(3,5-bis(trifluorometil)fenil)-1H-1,2,4-triazol-1-il)akriloil)hidrazinil)-3-metil-1-oksobutan-2-il)karbamat u dihlorometanu (2 mL). Doda se TFA (0.2 mL) i reakciona mešavina se meša na RT 5 h. Reakciona mešavina se koncentruje pod sniženim pritiskom (25 °C, 20 mm Hg) dajući sirovi proizvod (0.02 g), koji se trituriše petrol etrom i suši pod sniženim pritiskom da se dobije (R,Z)-2-amino-N'-(3-(3-(3,5-bis(trifluorometil)fenil)-1H-1,2,4-triazol-1-il)akriloil)-3-metilbutanhidrazid 2,2,2-trifluoroacetat (0.007 g, prinos: 35%).
Primer 11. Sinteza (Z)-3-(3-(3,5-bis(trifluorometil)fenil)-1H-1,2,4-triazol-1-il)-N'-(2-(pirazin-2-il)acetil)akrilohidrazida (Jedinjenje 11).
[0241] 2-(pirazin-2-il)acetohidrazid. U hermetički zatvorenoj 25 mL-skoj epruveti rastvori se metil 2-(pirazin-2-il)acetat (0.25 g, 1.0 eq.) u etanolu (5 mL) na RT. Hidrazin hidrat (0.33 g, 4 eq.) se uvede u kapima na RT i reakciona mešavina se zagreva na 120 °C, 20 h. Reakciona mešavina se koncentruje pod sniženim pritiskom (40 °C, 20 mm Hg) dajući sirovi 2-(pirazin-2-il)acetohidrazid (0.2 g) koji se u sledećem koraku koristi bez dodatnog prečišćavanja.
[0242] (Z)-3-(3-(3,5-bis(trifluorometil)fenil)-1H-1,2,4-triazol-1-il)-N'-(2-(pirazin-2-il)acetil)akrilohidrazid (Jedinjenje 11). U 50 mL-skom, 3-grlom flakonu sa okruglim dnom rastvori se (Z)-3-(3-(3,5-bis(trifluorometil)fenil)-1H-1,2,4-triazol-1-il)akrilna kiselina (0.3 g, 1.0 eq.) u EtOAc:THF (15 mL; 2:1) i ohladi na -60 °C gde se uvede 2-(pirazin-2-il)acetohidrazid (0.129 g, 1.1 eq.). T3P (50% u EtOAc) (1.01 mL, 2 eq.) doda se u kapima, praćeno sa DIPEA (0.35 mL, 2.5 eq.) i reakciona mešavina se meša 1 h na -60 °C. Reakciona mešavina se koncentruje pod sniženim pritiskom (25 °C, 20 mm Hg) dajući sirovi proizvod koji se prečisti hromatografijom na koloni (60/120 silika gel) korišćenjem gradijenta metanol/dihlorometan (kolona se pakuje u dihlorometanu i željeno jedinjenje počinje da se eluira na 3% metanol/dihlorometan). Frakcije koje sadrže željena jedinjenja kombinuju se dajući (Z)-3-(3-(3,5-bis(trifluorometil)fenil)-1H-1,2,4-triazol-1-il)-N'-(2-(pirazin-2-il)acetil)akrilohidrazid (0.025 g, prinos: 5%).
Primer 12. Sinteza (Z)-3-(3-(3,5-bis(trifluorometil)fenil)-1H-1,2,4-triazol-1-il)-N'-(2-morfolino-2-oksoacetil)akrilohidrazida (Jedinjenje 12).
[0243]
Sinteza etil 2-morfolino-2-oksoacetata:
[0244]
[0245] Rastvor etil 2-hloro-2-oksoacetata (1.25 g, 9.18 mmol) u dietil etru (5 mL) doda se u kapima u rastvor morfolina (1.0 g, 11.48 mmol) u dietil etru (20 mL) i trietilaminu (1.16 g, 11.48 mmol) na 0 °C. Reakciona mešavina se ostavi da se zagreje na sobnu temperaturu i meša 2 h. Reakciona mešavina se filtrira i filtrat se koncentruje pod sniženim pritiskom. Ulje žute boje se prenese u 25 mL ledene vode i ekstrahuje etil acetatom (3 x 20 mL). Kombinovani organski slojevi se isperu zasićenim slanim rastvorom, suše preko anhidrovanog natrijum sulfata, i koncentruju pod sniženim pritiskom dajući 1 g sirovog proizvoda, koji se koristi bez dodatnog prečišćavanja. Sirovi prinos 47%.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.33-4.38 (q, 2H), 3.72-3.76 (m, 4H),
1
3.65-3.68 (m, 2H), 3.47-3.50 (m, 2H), 1.37-1.40 (t, 3H). LCMS m/z 187.93 [M+H]<+>, tR= 0.525 min.
Sinteza 2-morfolino-2-oksoacetohidrazida:
[0246]
[0247] Etil 2-morfolino-2-oksoacetat (1.0 g, 5.34 mmol) se rastvori u etanolu (7 mL) i u kapima se doda hidrazin hidrat (0.267g, 5.34 mmol), na 0 °C. Reakciona mešavina se meša na sobnoj temperaturi 1.5 h. Reakciona mešavina se koncentruje pod sniženim pritiskom dajući 0.9 g sirovog proizvoda, koji se u sledećem koraku koristi bez dodatnog prečišćavanja. Sirovi prinos 90%.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.79 (s, 1H), 4.43-4.48 (m, 2H), 3.56-3.61 (m, 4H), 3.40-3.48 (m, 4H). LCMS m/z 174.16 [M+H]<+>, tR= 2.031 min.
Sinteza (Z)-3-(3-(3,5-bis(trifluorometil)fenil)-1H-1,2,4-triazol-1-il)-N'-(2-morfolino-2-oksoacetil)akrilohidrazida:
[0248]
[0249] Rastvor (Z)-3-(3-(3,5-bis(trifluorometil)fenil)-1H-1,2,4-triazol-1-il)akrilne
2
kiseline (0.2 g, 0.569 mmol) i 2-morfolino-2-oksoacetohidrazida (0.02 g, 0.175 mmol) u THF (3 mL) ohladi se na -60 °C. T3P (0.098 g, 0.569 mmol) (0.50 mL) se doda u kapima, praćeno sa DIPEA (0.11 g, 0.854 mmol) i meša na -60 °C, 1 h. Reakciona mešavina se prenese u 25 mL ledene vode i ekstrahuje etil acetatom (2 x 25 mL). Kombinovani organski slojevi se isperu zasićenim slanim rastvorom, suše preko anhidrovanog natrijum sulfata, i koncentruju pod sniženim pritiskom dajući 0.3 g sirovog proizvoda, koji se prečišćava hromatografijom (0-4% MeOH/CH2Cl2) dajući 0.15 g (Z)-3-(3-(3,5-bis(trifluorometil)fenil)-1H-1,2,4-triazol-1-il)-N'-(2-morfolino-2-oksoacetil) akrilohidrazida (Prinos 50%).<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.70-10.88 (m, 2H), 9.56 (s, 1H), 8.57 (s, 2H), 8.29 (s, 1H), 7.52-7.55 (d, J = 10.4 Hz, 1H), 6.0-6.03 (d, J = 10.4 Hz, 1H), 3.51-3.64 (m, 8H). LCMS m/z 507.25 [M+H]<+>, tR= 2.012 min.
Primer 13. Sinteza (Z)-3-(3-(3,5-bis(trifluorometil)fenil)-1H-1,2,4-triazol-1-il)-N'-(2-(3,5-dimetilmorfolino)acetil)akrilohidrazida (Jedinjenje 13).
[0250]
Sinteza 2,2'-azandiildipropan-1-ola:
[0252] 2-aminopropan-1-ol (5 g, 66.57 mmol) i 1-hidroksipropan-2-on (5.77g, 77.89 mmol) rastvore se u etanolu (115 mL) i doda se 50 mg PtO2. Reakciona mešavina se meša na pritisku od 50 psi H2na sobnoj temperaturi 24 h. Reakciona mešavina se filtrira i filtrat se koncentruje pod sniženim pritiskom dajući sirovi proizvod, koji se u sledećem koraku koristi bez dodatnog prečišćavanja. Sirovi prinos: 79%.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.45 (bs, 2H), 3.42-3.43 (m, 1H), 3.16-3.22 (m, 4H), 2.65-2.69 (m, 2H) 0.87-0.91(m, 6H): LCMS m/z 133.99 [M+H]<+>, tR: 4.077 min.
Sinteza 3,5-dimetilmorfolina:
[0253]
[0254] 2,2'-azandiildipropan-1-ol (7 g, 52 mmol) se suspenduje u konc. H2SO4(5.3 mL, 99.8 mmol) na sobnoj temperaturi i zagreva na 180 °C, 8 h. Reakciona mešavina se ohladi na 0 °C i u kapima se doda rastvor KOH (11.79 g, 21.02 mmol) u 60 mL vode. Reakciona mešavina se meša na sobnoj temperaturi 12 h. Reakciona mešavina se filtrira i fliltrat se ekstrahuje pomoću CHCl3:MeOH (85:15; 5X50 mL). Kombinovani organski slojevi se suše preko anhidrovanog natrijum sulfata, i koncentruju pod sniženim pritiskom dajući 3.5 g sirovog proizvoda koji se u sledećem koraku koristi bez dodatnog prečišćavanja. (Sirovi prinos: 58%).
Sinteza etil 2-(3,5-dimetilmorfolino)acetata:
4
[0256] Kalijum karbonat (0.311 g, 2.25 mmol) i etil bromoacetat (0.319 g, 1.91 mmol) dodaju se u rastvor 3,5-dimetilmorfolina (0.2 g, 1.73 mmol) u acetonitrilu (4 mL) na sobnoj temperaturi. Reakciona mešavina se meša na 60 °C 12 h. Reakciona mešavina se prenese u ledenu vodu i ekstrahuje etil acetatom (20 mL x 3). Kombinovani organski slojevi se isperu zasićenim slanim rastvorom, suše preko anhidrovanog Na2SO4, i koncentruju pod sniženim pritiskom dajući sirovi proizvod koji se u sledećem koraku koristi bez dodatnog prečišćavanja (Sirovi prinos: 54%).
Sinteza etil 2-(3,5-dimetilmorfolino)acetohidrazida:
[0257]
[0258] Etil-2-(3,5-dimetilmorfolino)acetat (0.19 g, 0.944 mmol) rastvori se u etanolu (4 mL) i u kapima se doda hidrazin hidrat (0.047 g, 0.944 mmol). Reakciona mešavina se meša na 80 °C, 20 h i reakciona mešavina se koncentruje pod sniženim pritiskom dajući sirovi proizvod koji se u sledećem koraku koristi bez dodatnog prečišćavanja. (Sirovi prinos: 97%).<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.95 (s, 2H), 8.84 (s, 1H), 3.60-3.63 (m, 2H), 3.25-3.29 (m, 2H), 3.14 (s, 2H), 3.05 (s, 2H), 0.86-0.88 (m, 6H): LCMS m/z 188.12 [M+H]<+>, tR4.716 min.
Sinteza (Z)-3-(3-(3,5-bis(trifluorometil)fenil)-1H-1,2,4-triazol-1-il)-N'-(2-(3,5-dimetilmorfolino)acetil)akrilohidrazida:
[0259]
[0260] U rastvor (Z)-3-(3-(3,5-bis(trifluorometil)fenil)-1H-1,2,4-triazol-1-il)akrilne kiseline (0.2 g, 0.569 mmol) i 2-(3,5-dimetilmorfolino)acetohidrazida (0.106 g, 0.569 mmol) u THF (10 mL) doda se T3P (0.543 g, 0.854 mmol), pa zatim DIPEA (0.110 g, 0.854 mmol) na -60 °C i meša se 2 h. Reakciona mešavina se prenese u 25 mL ledene vode i ekstrahuje etil acetatom (2 x 25 mL) i kombinovani organski slojevi se isperu zasićenim slanim rastvorom, suše preko anhidrovanog natrijum sulfata, i koncentruju pod sniženim pritiskom dajući sirovi proizvod koji se prečišćava hromatografijom (0-3% MeOH/CH2Cl2) dajući 0.02 g (Z)-3-(3-(3,5-bis(trifluorometil)fenil)-1H-1,2,4-triazol-1-il)-N'-(2-(3,5-dimetilmorfolino)acetil)akri-lohidrazida (Prinos: 7%).<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.58 (s, 1H), 9.83 (s, 1H), 9.56 (s, 1H), 8.54-8.56 (m, 2H), 8.25-8.30(m, 1H), 7.49-7.51 (d, J=10.4 Hz, 1H)), 6.01-6.04 (d, J=10.4 Hz, 1H), 3.44-3.57 (m, 2H), 3.28-3.34 (m, 2H), 3.21 (s, 1H), 3.15 (s, 1H), 2.84-2.88 (m, 2H), 0.93-1.04(m, 6H): LCMS m/z 521.18 [M+H]<+>, tR1.898 min.
Primer 14. Sinteza (Z)-3-(3-(3,5-bis(trifluorometil)fenil)-1H-1,2,4-triazol-1-il)-N'-(2-(3-oksomorfolino)acetil)akrilohidrazida (Jedinjenje 14).
[0261]
Sinteza etil 2-(3-oksomorfolino)acetata:
[0262]
[0263] Morfolin-3-on (3 g, 29.67 mmol) se rastvori u DMF (15 mL, 29.67 mmol) i NaH (1.78 g, 44.51 mmol) se doda na 0 °C. Reakciona mešavina se meša na sobnoj temperaturi 30 min i u kapima se doda etilbromo acetat (3.76 mL, 32.64 mmol). Reakciona mešavina se dalje meša na sobnoj temperaturi 3 h i prenese u 50 mL vode i ekstrahuje pomoću EtOAc (3 x 50 mL). Kombinovani organski slojevi se isperu zasićenim slanim rastvorom (2 x 50 mL), suše preko anhidrovanog natrijum sulfata i koncentruju pod sniženim pritiskom dajući sirovi proizvod koji se prečišćava hromatografijom (0-100% etil acetat/heksan) dajući 600 mg etil-2-(3-oksomorfolino)acetata (Prinos: 10%). LCMS m/z 187 [M+H]<+>, tR2.505 min.
Sinteza 2-(3-oksomorfolino)acetohidrazida:
[0265] Etil-2-(3-oksomorfolino)acetat (600 mg, 3.21 mmol) se rastvori u etanolu (3 mL) i doda se hidrazin hidrat (160.46 mg, 3.21 mmol) na sobnoj temperaturi. Reakciona mešavina se zagreva na 80 °C, 1 h. Reakciona mešavina se prenese u 50 mL vode i ekstrahuje pomoću EtOAc (3 x 50 mL). Kombinovani organski slojevi se isperu zasićenim slanim rastvorom, suše preko anhidrovanog natrijum sulfata, i koncentruju pod sniženim pritiskom dajući sirovi proizvod koji se u sledećem koraku koristi bez dodatnog prečišćavanja (Sirovi prinos: 54%). LCMS m/z 174.05 [M+H]<+>tR2.489 min.
Sinteza (Z)-3-(3-(3,5-bis(trifluorometil)fenil)-1H-1,2,4-triazol-1-il)-N'-(2-(3-oksomorfolino)acetil)akrilohidrazida:
[0266]
[0267] (Z)-3-(3-(3,5-bis(trifluorometil)fenil)-1H-1,2,4-triazol-1-il)akrilna kiselina (0.400 g, 1.14 mmol) se rastvori u THF (4 mL) i doda se 2-(3-oksomorfolino)acetohidrazid (0.295 g, 1.71 mmol). T3P (1.09 g, 1.71 mmol) se doda u kapima, praćeno sa DIPEA (220.80 mg, 1.71 mmol) na - 60 °C i reakciona mešavina se meša 1 h. Reakciona mešavina se prenese u 25 mL ledene vode i ekstrahuje pomoću EtOAc (2x25 mL). Kombinovani organski slojevi se isperu zasićenim slanim rastvorom, suše preko anhidrovanog natrijum sulfata, i koncentruju pod sniženim pritiskom dajući sirovi proizvod koji se prečišćava hromatografijom (0-4% MeOH/CH2Cl2) dajući 0.05 g (Z)-3-(3-(3,5-bis(trifluorometil) fenil)-1H-1,2,4-triazol-1-il)-N'-(2-(3-oksomorfolino)acetil) akrilohidrazida (Prinos: 8%).<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.33 (bs, 2H), 9.63 (s, 1H), 8.57 (s, 2H), 8.30 (s, 1H), 7.50-7.52 (d, J = 8 Hz, 1H)), 6.01-6.03 (d, J = 8 Hz, 1H), 4.08-4.12 (m, 4H), 3.85-3.87 (m, 2H), 3.41-3.44 (m, 2H). LCMS m/z 507.13 [M+H]<+>, tR1.950 min.
Primer 15. Sinteza (Z)-3-(3-(3,5-bis(trifluorometil)fenil)-1H-1,2,4-triazol-1-il)-N'-(2-(3,3-dimetilmorfolino)acetil)akrilohidrazida (Jedinjenje 15).
[0268]
Sinteza etil 2-(3,3-dimetilmorfolino)acetata:
[0269]
[0270] 3,3-dimetilmorfolin (1 g, 8.68 mmol) se rastvori u acetonitrilu (5 mL) i doda se kalijum karbonat (1.8 g, 13 mmol). Reakciona mešavina se meša na sobnoj temperaturi 30 min i doda se etilbromo acetat (1.1 mL, 9.55 mmol). Reakciona mešavina se zagreva na 60 °C, 1 h. Zatim se reakciona mešavina prenese u 50 mL vode i ekstrahuje etil acetatom (3x50 mL). Kombinovani organski slojevi se isperu zasićenim slanim rastvorom, suše preko anhidrovanog natrijum sulfata, i koncentruju pod sniženim pritiskom dajući sirovi proizvod koji se u sledećem koraku koristi bez dodatnog prečišćavanja (Sirovi prinos: 91%). LCMS m/z 202.9 [M+H]<+>, tR2.33 min.
Sinteza 2-(3,3-dimetilmorfolino)acetohidrazida:
[0271]
[0272] U rastvor etil 2-(3-oksomorfolino)acetata (600 mg, 2.98 mmol) u etanolu (3 mL) doda se hidrazin hidrat (0.20 mL, 2.98 mmol) na sobnoj temperaturi. Reakciona mešavina se zagreva na 80 °C, 1 h, ostavi se da se ohladi na sobnu temperaturu, prenese u 50 mL vode i ekstrahuje etil acetatom (3x25 mL). Kombinovani organski slojevi se isperu zasićenim slanim rastvorom, suše preko anhidrovanog natrijum sulfata, i koncentruju pod sniženim pritiskom dajući sirovi proizvod koji se u sledećem koraku koristi bez dodatnog prečišćavanja (Sirovi prinos: 28%). LCMS m/z 188 [M+H]<+>tR: 188 min.
Sinteza (Z)-3-(3-(3,5-bis(trifluorometil)fenil)-1H-1,2,4-triazol-1-il)-N'-(2-(3,3-dimetilmorfolino)acetil)akrilohidrazida:
[0273]
[0274] U rastvor (Z)-3-(3-(3,5-bis(trifluorometil)fenil)-1H-1,2,4-triazol-1-il)akrilne kiseline (0.250 g, 0.7 mmol) i 2-(3,3-dimetilmorfolino)acetohidrazida (0.160 g, 0.85 mmol) u THF (2.5 mL) T3P (0.63 mL, 1.06 mmol) se doda u kapima, praćeno sa DIPEA (0.18 mL, 1.06 mmol) na -60 °C. Reakciona mešavina se meša 1 h, prenese u 25 mL ledene vode, i ekstrahuje etil acetatom (2x25 mL). Kombinovani organski slojevi se isperu zasićenim slanim rastvorom, suše preko anhidrovanog natrijum sulfata, i koncentruju pod sniženim pritiskom dajući sirovi proizvod koji se prečišćava hromatografijom (0-4% MeOH:CH2Cl2) dajući 0.05 g (Z)-3-(3-(3,5-bis(trifluorometil)fenil)-1H-1,2,4-triazol-1-il)-N'-(2-(3,3-dimetilmorfolino)acetil) akrilohidrazida (Prinos: 13%).<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.55 (s, 1H), 9.81 (s, 1H), 9.62 (s, 1H), 8.56 (s, 2H), 8.29 (s, 1H), 7.49-7.51 (d, J = 10.4 Hz, 1H)), 6.01-6.03 (d, J = 10.4 Hz, 1H), 3.65-3.67 (m, 2H), 3.30-3.34 (m, 2H), 3.08 (bs, 2H), 2.55-2.58 (m, 2H), 0.96 (s, 6H). LCMS m/z 521.18 [M+H]<+>, tR1.937 min.
[0275] Primer 16. Testovi. Određena jedinjenja pronalaska, zajedno sa jedinjenjima X-1, X-2 i X-3 (prikazana dole) testirana su u različitim testovima.
1
Inhibicija nukleusnog eksporta
[0276] Određivana je inhibicija CRM1-posredovanog nukleusnog eksporta jedinjenjima pronalaska. Rezultati su prikazani u Tabeli 2. Inhibitorna aktivnost jedinjenja prema CRM1 proteinu određivana je pomoću RevGFP testa. Jedinjenja pronalaska su aktivna u Rev-GFP testu sa IC50< 10 µM, pri čemu najpoželjnija jedinjenja imaju aktivnosti sa IC50vrednostima od 1 µM.
[0277] Protokol eksperimenta: Rev je protein iz virusa humane imunodeficijencije tipa 1 (human immunodeficiency virus type 1, HIV-1) i sadrži nukleusni eksportni signal (nuclear export signal, NES) u svom C-terminalnom domenu i nukleusni lokalizacioni signal (nuclear localization signal, NLS) u svom N-terminalnom domenu. Nukleusni eksport Rev proteina zavisi od klasičnosg NES/CRM1 puta (Neville et al, 1997, Kau et al, 2003). Nukleusna akumulacija Rev zapažena je u ćelijama tretiranim specifičnim inhibitorima CRM1, kao što je LMB (Kau et al, 2003). U ovom testu, U2OS-RevGFP ćelije se zaseju na crne ploče sa 384 bunarčića sa providnim dnom, dan pre eksperimenta. Jedinjenja se serijski razblaže 1:2 počevši od 40 µM na zasebnoj ploči sa 384-bunarčića, u DMEM, i zatim prenesu na ćelije. Ćelije se inkubiraju sa jedinjenjem ∼1 h pre nego što se fiksiraju 3.7% formaldehidom i nukleusi im se oboje korišćenjem Hoechst 33258. Meri se količina GFP u nukleusima ćelija i određuje se IC50s jedinjenja (Kau et al, 2003).
2
MTT test proliferacije ćelija
[0278] CellTiter 96® AQueous One Solution test ćelijske proliferacije (Promega) upotrebljava se na MM1.S, Jurkat i HCT-116 ćelijama, za izučavanje citotoksičnih i citostatskih svojstava jedinjenja. Test se zasniva na odsecanju tetrazolijum soli, MTS, u prisustvu elektron-kuplujućeg reagensa PES (fenazin etosulfat). MTS tetrazolijum jedinjenje se bioredukuje ćelijama u obojeni formazanski proizvod rastvorljiv u medijumu za kulturu tkiva. Ova konverzija se verovatno odvija preko NADPH ili NADH proizvedenog dehidrogenaznim enzimima u metabolički aktivnim ćelijama. Testovi se izvode dodavanjem male količine CellTiter 96® AQueous One solution reagensa direktno u bunarčiće za kulturu, inkubiranjem 1-4 sata i zatim beleženjem apsorpcije na 490 nm pomoću čitača ploča sa 96 bunarčića. Apsorpcija je u direktnoj korelaciji sa brojem ćelija i njihovom metaboličkom aktivnošću. Ćelije se zaseju u koncentraciji od 5x10<3>do 1.5x10<4>ćelija (zavisno od tipa ćelija) u svaki bunarčić ploče sa 96 bunarčića, u 100 µL svežeg medijuma za kulturu i adherentne ćelije se ostave preko noći da se prikače. Stok rastvori jedinjenja se razblaže u medijumu za kulturu ćelija da se dobije osam koncentracija svakog leka, u opsegu od 1 nM do 30 µM, a DMSO u koncentraciji manjoj od 1% zapr./zapr. koristi se kao negativna kontrola. Posle 72 h tretmana 20 µL CellTiter 96® AQueous reagensa doda se u svaki bunarčić ploča sa 96 bunarčića i ploča se inkubira na 37 °C, 1-4 sata u humidifikovanoj atmosferi sa 5% CO2. Zatim se beleži apsorpcija svakog bunarčića na 490 nm pomoću čitača ploča sa 96 bunarčića. U većini slučajeva test se obavlja u triplikatima i rezultati se prikazuju kao polovina maksimalne inhibitorne koncentracije (IC50) opisane dole. Optička gustina u odnosu na koncentraciju jedinjenja nanosi se na dijagram i analizira korišćenjem nelinearnih regresionih jednačina (Excel Fit) i izračunava se IC50za svako jedinjenje. Rezultati su prikazani u Tabeli 2.
[0279] Određivanje farmakokinetike (PK) i određivanje odnosa "mozak:plazma". Krv se sakupi od miševa (N=3) u ukupno 10 vremenskih tačaka (pre doziranja, 5 min, 15 min, 30 min, 1 sat, 2 sata, 4 sata, 8 sati, 12 sati i 24 sata posle doziranja). Krv se od miševa uzima na bazi rotacije, svaki miš doprinosi sakupljanju krvi u tri vremenske tačke. U predviđenim vremenskim tačkama, životinje se anesteziraju izofluranom, i približno 110 µL krvi po vremenskoj tački sakupi se retroorbitalnom punkcijom u epruvete sa prethodno ohlađenim K2EDTA (antikoagulant). Uzorci krvi se stave na suvi led i centrifugiraju (2000g, 5 min na 4 °C) da se dobije plazma, najviše 30 minuta posle uzimanja uzoraka. Svi uzorci se skladište zamrznuti na približno -80 °C do analize. Pre analize, uzorci se pomešaju sa unutrašnjim standardom (deksametazon) u acetonitrilu, vorteksuju, centrifugiraju i supernatanti se injektiraju za analizu. Koncentracija jedinjenja u plazmi određuje se korišćenjem LC-MS-MS instrumenta (API 4000, Triple Quadruple sa elektrosprej jonizacijom; Acuity Ultra Performance Liquid Chromatography kolona C18, sa MeOH i mravljom kiselinom kao organskim rastvaračima). PK parametri uključujući, ali se ne ograničavajući na Tmax, Cmax, t1/2, AUCkrajnje, AUCinfizračunati su korišćenjem WinNonlin Professional 6.2 softverskog paketa, nekompartmentalni farmakokinetički model NCA200.
[0280] Odnos "mozak prema plazmi" (brain to plasma ratio (B:P). Zasebne grupe miševa (N=3) doziraju se (PO u dozi od 10 mg/kg ukoliko nije drugačije navedeno) i zatim žrtvuju u vreme maksimalne koncentracije u plazmi (procenjenoTmax2 sata posle doziranja) kada se uzimaju terminalna plazma i mozak. Posle izolovanja, tkivo mozga se ispere hladnim slanim rastvorom, suši na filter papiru, meri, i brzo zamrzne stavljanjem na suvi led. Svi uzorci ostaju zamrznuti na približno -80 °C do analize. U vreme analize, tkivo mozga se homogenizuje (rastvor za homogenizaciju PBS, pH 7.4), pomeša sa unutrašnjim standardom (deksametazon) u acetonitrilu, vorteksuje, centrifugira i supernatanti se injektiraju za analizu.koncentracije jedinjenja korišćenjem LC-MS-MS metodologije (API 4000, Triple Quadruple sa elektrosprej jonizacijom; Acuity Ultra Performance Liquid Chromatography kolona C18, sa MeOH i mravljom kiselinom kao organskim rastvaračima). Uzorci plazme se tretiraju po istom metodu (izuzev koraka homogenizacije) i koncentracija jedinjenja u matriksu se izračunava na osnovu napravljenih standardnih krivih. Rezultati su prikazani u Tabeli 2. Jedinjenje 4 je referentni primer.
Tabela 2. Rezultati testa za jedinjenja formule I i uporedna jedinjenja.
4
[0281] AUCInfza jedinjenje X-1 bila je ispod granice detekcije kada je dozirano miševima u količini od 10 mg/kg po. Kada je dozirano u količini od 5 mg/kg iv, jedinjenje X-1 ispoljilo je minimalnu izloženost, što je pokazano niskom AUCInfod 209 h•ng/mL. Odnos "mozak prema plazmi" za jedinjenje X-1 nije određivan zbog zanemarljivih nivoa (ispod granice kvantifikacije) u mozgu posle doziranja po.
[0282] Izračunato je da AUCInfza jedinjenje X-2 iznosi 68.3 h•ng/mL kada je dozirano pacovima u količini od 10 mg/kg po. Takvi nivoi izlaganja su premali u poređenju sa jedinjenjem X-3 i jedinjenjima formule I predmetnog pronalaska. Međutim, jedinjenje X-2 pokazuje umeren odnos "mozak prema plazmi". Niska AUCInfzajedno sa nezanemarljivim odnosom mozak prema plazmi ukazuje na to da jedinjenje X-2 može da prođe BBB uprkos niskom nivou izloženosti. Podnosioci veruju da bi jedinjenje X-2 imalo značajno viši odnos "mozak prema plazmi" ako bi se povećala njegova AUCInf.
[0283] Izračunato je da AUCInfza jedinjenje X-3 iznosi 12300 h•ng/mL kada se dozira pacovima u količini od 10 mg/kg po, što ukazuje na dobru izloženost. Međutim, X-3 pokazuje visok odnos B:P od 5.0.
[0284] Sva jedinjenja formule I, pokazuju visoke AUCInf(>3500 hr•ng/mL) i reativno niske B:P (<2.5). Uopšteno, veći nivoi izloženosti terapijskom sredstvu često povećavaju verovatnoću prodiranja u mozak. Zbog toga je iznenađujuće i neočekivano da jedinjenja formule I ispoljavaju visoke nivoe AUCInfuz ralativno niske odnose "mozak prema plazmi".
Primer 17. Modeli
Evaluacija efekata jedinjenja 2 na rast tumora u ćelijskoj liniji limfoma Z-138 kao ksenografta kod SCID miševa
[0285] Z-138 (ATCC # CRL-3001) ćelije limfoma plaštane zone dobijene su od ATCC. Ove ćelije rasle su u IMEM medijumu dopunjenom 10% konjskim serumom, 1% penicilinom i streptomicinom, 2mM L-glutaminom. Ćelije su subkultivisane uz razblaživanje stopom od 1:5 do 1:10. Korišćene su dvadeset četiri (24) ženke CB-17 SCID miševa (Charles River Labs soj, šifra 236), stare 5 do 6 nedelja. SCID miševi su inokulirani u levi bok Z-138 ćelijama u zapremini od 0.2 mL, što je ekvivalentno 4 x 10<7>ćelija po mišu.
[0286] Tretman je otpočeo kada su tumori dostigli srednju zapreminu od 84.3 mm<3>. Na osnovu zapremine tumora, miševi su svrstani u četiri (4) grupe od po osam (8) pre otpočinjanja tretmana, tako da je srednja zapremina tumora u svakoj grupi bila u opsegu od 77 do 92 mm<3>. Miševi su tretirani prenosnikom, standardnim lekom/lekompozitivnom kontrolom (ciklofosfamid) ili jedinjenjem 2, kako je pokazano u Tabeli 3.
Tabela 3. Grupe na početku studije
[0287] Životinje su hranjene Labdiet® 5001 hranom za glodare i sterilnom vodom ad libitum. Tumori su mereni jednom svaka dva dana pomoću mikrononijusa, i zapremina tumora je izračunavana kao (dužina x širina x širina)/2. Sve životinje su merene svakodnevno, da bi se procenile moguće razlike u težini životinja među grupama tretmana kao indikacija moguće toksičnosti tretmana. Životinje koje su izgubile više od 20% svoje početne težine bile su eutanazirane. Miševi sa gubitkom težine većim od 15% od svoje početne težine nisu ponovno tretirani dok se gubitak težine nije vratio na manje od 5% od početne težine. Sve životinje sa zapreminom tumora većom od 1500 mm<3>bile su eutanazirane.
[0288] Rastvori za doziranje pripremaju se sveži svakog dana doziranja. Jedinjenje 2 je dobijeno u vidu liofilizovanog praška koji sadrži 69.61% jedinjenja 2 uz balans napravljen korišćenjem Pluronic F-68 i PVP K29/32. Ovo se priprema rastvaranjem liofilizovanog praška u sterilnoj vodi. Ciklofosfamid je rastvoren u koncentraciji od 8 mg/mL u sterilnoj vodi za injekcije. Svi testni artikli se primenjuju u zapremini od 10 mL/kg telesne težine.
[0289] Statističke razlike između grupa tretmana određivane su korišćenjem Mann-Whitney Rank Sum ili ANOVA testova sa kritičnom vrednošću od 0.05.
[0290] SL.1 prikazuje da sve grupe tretmana ispoljavaju statistički značajno smanjenje rasta tumora u poređenju sa prenosnikom, kada se evaluiranje vrši upoređivanjem oblasti ispod krivih rasta korišćenjem ANOVA testa za zapreminu tumora i procenat zapremine tumora. Ove grupe tretmana pokazale su smanjenje rasta tumora sa značajnošću od p<0.0001. Izvesni gubitak težine zapažen je u grupi tretiranoj Jedinjenjem 2 pri dozi od 15 mg/kg i, iako statistički značajan, u poređenju sa kontrolama sa prenosnikom, izraženi gubitak težine bio je ograničen na samo nekoliko životinja.
[0291] Jedinjenje 2, primenjeno oralnim putem, imalo je antitumorski efekat pri dozama od 7.5 mg/kg i 15 mg/kg, uz prisustvo dozne zavisnosti.
Antitumorska aktivnost jedinjenja 2 na modelu A549 sitnoćelijskog karcinoma pluća
[0292] Ćelijska linija A549 izvedena je iz eksplanta kulture tkiva alveolarnog karcinoma 58-godišnjeg muškarca kavkazoidnog porekla. Ćelije su rasle u Hamovom medijumu za kulturu tkiva F12-K sa 10% fetalnim telećim serumom i 1% penicilinom/streptomicinom. Ćelije se rutinski tripsinizuju i pasažiraju 1:10. Korišćene su trideset dve (32) ženke CB-17 SCID miševa (Charles River Labs šifra soja 236), stare 5 do 6 nedelja, prosečne telesne težine pre tretmana od 16.3 grama. Na osnovu zapremine tumora, miševi su raspoređeni u četiri (4) grupe od po osam (8) pre otpočinjanja tretmana. Na dan implantacije, ćelije su isprane u PBS, tripsinizovane i resuspendovane u kompletnom medijumu do gustine od 2 x 10<7>ćelija/mL pre nego što su bile pomešane sa jednakom zapreminom Matrigel. Ova mešavina se zatim inokulira subkutano miševima u zapremini od 0.1 mL korišćenjem igle 23G.
[0293] Miševi su tretirani prenosnikom, standardnim lekom/lekom-pozitivnom kontrolom (cisplatin) ili Jedinjenjem 2, kako je pokazano u Tabeli 4. Težina i stanje životinja praćeni su na dnevnoj bazi i tumori su mereni ponedeljkom, sredom i petkom, korišćenjem mikrononijusa, a zapremina tumora izračunavana je kao (dužina x širina x širina)/2.
Tabela 4. Grupe na početku studije
[0294] Životinje koje su izgubile više od 20% svoje početne težine bile su eutanazirane. Miševi sa gubitkom težine većim od 15% od svoje početne težine nisu ponovno tretirani dok se gubitak težine nije vratio na manje od 5% od početne težine. Sve životinje sa zapreminom tumora većom od 1500 mm<3>bile su eutanazirane.
[0295] Rastvori za doziranje pripremaju se sveži svakog dana doziranja. Jedinjenje 2 je dobijeno u vidu liofilizovanog praška koji sadrži 69.61% jedinjenja 2 uz balans napravljen korišćenjem Pluronic F-68 i PVP K29/32. Ovo se priprema rastvaranjem liofilizovanog praška u sterilnoj vodi. Cisplatin je rastvoren u koncentraciji od 5 mg/mL u DMSO i razblažen 1:10 sterilnom vodom za injekcije. Svi testni artikli se primenjuju u zapremini od 0.1 mL/10 g telesne težine.
[0296] Statističke razlike između grupa tretmana određene su korišćenjem Mann-Whitney Rank Sum ili ANOVA testova sa kritičnom vrednošću od 0.05.
[0297] Podaci o promeni zapremine tumora tokom studije prikazani su na SL. 2. Srednja zapremina tumora kontrolne grupe sa prenosnikom porasla je od 95 mm<3>na dan 1 do 1669 mm<3>na dan 29. Grupa tretirana cisplatinom imala je srednju zapreminu tumora od 104 mm<3>na dan 1, koja je rasla do 1136 mm<3>na dan 29. Miševi tretirani Jedinjenjem 2 u dozi od 10 mg/kg PO (grupa 3) imali su srednju zapreminu tumora od 101 mm<3>na dan 1, koja se povećala na 686 mm<3>do dana 29. Miševi tretirani Jedinjenjem 2 u dozi od 5 mg/kg PO (grupa 6) imali su srednju zapreminu tumora od 101 mm<3>na dan 1, koja se povećala na1231 mm<3>do dana 29.
[0298] Dodatne analize podataka o zapremini tumora obavljene su izračunavanjem srednjeg područja ispod krive (AUC) za svaki tumor i upoređivanjem grupa korišćenjem jednofaktorskog ANOVA testa. Ova analiza je pokazala da postoje statistički značajne razlike između kontrolne grupe sa prenosnikom i grupe tretirane Jedinjenjem 2 u dozi od 10 mg/kg (p=0.0005). Treba napomenuti da nije bilo statistički značajnog smanjenja rasta tumora u grupi pozitivne kontrole (cisplatin).
[0299] Jedinjenje 2, primenjeno oralnim putem, imalo je antitumorski efekat pri dozama od 5 mg/kg i 10 mg/kg, uz prisustvo dozne zavisnosti. Međutim, samo je grupa tretirana sa 10 mg/kg pokazala statistički značajnu razliku u poređenju sa grupom tretiranom prenosnikom.
Evaluacija jedinjenja 2 u mišjem modelu reumatoidnog artritisa izazvanom antikolagenskim antitelima (CAIA)
[0300] Korišćena su dvadeset četiri (24) mužjaka Balb/c miševa, starosti 6 do 8 nedelja. Varijacije u težini miševa u vreme otpočinjanja tretmana nisu bile veće od ±20% od srednje vrednosti. Životinje su nasumično raspoređene u 3 grupe u kojima će primati prenosnik, deksametazon ili Jedinjenje 2. Na dan 0 studije (početak studije), svi miševi su dobili intravensku injekciju od 2 mg ArthritoMAbTM koktel-antitela (MD Biosciences #S1203001) što je bilo praćeno intraperitonealnom injekcijom LPS (100 µg/mišu) na dan 3 studije. Životinje studije tretirane su Jedinjenjem 2 u dozi od 7.5 mg/kg ili Jedinjenjem 2 u dozi od 4 mg/kg oralno; deksametazonom u dozi od 1 mg/kg intraperitonealno; ili prenosnikom oralno. Tretmani su davani jednom dnevno na dane 4, 6, 8 i 10 svim grupama, osim u periodima odmora od doziranja. Ako težina životinje padne ispod 87% njene početne težine na dan 0, životinja se ne dozira dok ne dostigne težinu koja iznosi 90% ili više od težine na dan 0.
[0301] Razvoj artritisa, klinički znaci i telesne težine praćene su kod svih miševa u studiji na dane studije 0, 3-8, 10 i 12. Posmatranja su uključivala promene na koži, krznu, očima, mukoznim membranama, pojavu sekrecije i ekskrecije (npr., dijareja) i promene autonomne aktivnosti (npr., suzenje, salivacija, piloerekcija, veličina zenice, neobičan obrazac disanja). Sve šape (prednja leva i desna, i zadnja leva i desna) svake životinje ispitivane su u pogledu znakova artritogenog odgovora pre indukcije artritisa i primene testnog artikla ili kontrolnog artikla na dan 0 studije i zatim na dane 3-8, 10 i 12 studije (završetak studije). Artritisne reakcije ocenjivane su i beležene prema skali 0-4 sa rastućom jačinom, kako pokazuje Tabela 5, dole. Merena je i debljina šape korišćenjem nonijusa sa skalom (Kroeplin, Munich, Germany).
1
Tabela 5. Klinički skor za artritis
[0302] Primenjena doza izračunata je na osnovu procene da je životinja teška, prosečno, 20 g. Pre upotrebe, stok rastvor deksametazona pripremljen je u 100% etanolu i razblažen u PNS do odgovarajuće koncentracije. Prenosnik za kontrolnu grupu koja prima prenosnik pripremljen je rastvaranjem 0.6 g Pluronic i 0.6 g PVP u 100 mL destilovane vode. Stok rastvor MAb (10 mg/mL) nabavljen je od MD Biosciences, Division, Morwell Diagnostics GmbH. LPS je razblažen sa PBS da bi se dobila odgovarajuća koncentracija. Opsežno vorteksovanje je potrebno obaviti neposredno pre injektiranja. Jedinjenje 2 nabavljeno je u vidu liofilizovanog leka u prahu koji sadrži 70.71% jedinjenja 2, pri čemu se balans pravi korišćenjem Pluronic F-68 i PVP K29/32. Fiksna zapremina od 200 µL data je svakom mišu.
[0303] Evaluacija je prvenstveno bazirana na merenjima srednjih vrednosti artritisnog skora i debljine šape. Kada je pogodno, rađena je ANOVA analiza podataka sa Tukeyjevom post hoc analizom da bi se odredio značaj efekata tretmana.
[0304] SL. 3A i 3B prikazuju rezultate eksperimenata na CAIA mišjem modelu. Klinički znaci udruženi sa primenom LPS razvili su se u svim grupama posle injekcije LPS na dan 3. U poređenju sa miševima tretiranim prenosnikom, miševi tretirani Jedinjenjem 2 u dozi od 7.5 mg/kg ili 4 mg/kg imali su značajno manje ukupne artritisne skorove na dane 5-12, odnosno 6-12. Tretman deksametazonom značajno je smanjio ukupni artritisni skor u poređenju sa grupom tretiranom prenosnikom na dane 6-12. U
1 1
poređenju sa miševima tretiranim prenosnikom, miševi tretirani sa 7.5 mg/kg ili 4 mg/kg jedinjenja 2 imali su značajno manje artritisne skorove zadnjih šapa na dane 5-12. Tretman deksametazonom značajno je smanjio artritisni skor zadnjih šapa u poređenju sa grupom tretiranom prenosnikom na dane 5 i 12. Nije bilo značajnih razlika u telesnoj težini između grupe tretirane prenosnikom i grupa tretiranih testinim artiklom.
[0305] Prema nalazima ove studije, jedinjenje 2 dostavljeno oralno u dozi od 7.5 mg/kg ili 4 mg/kg pokazalo je značajnu antiartritisnu aktivnost u modelu reumatoidnog artritisa indukovanog antikolagenskim antitelima, sa trajnim smanjenjima srednjih artritisnih skorova i smanjenom debljinom šapa.
Studija efikasnosti jedinjenja 2 u artritisu indukovanom kolagenom (collagen-induced arthritis, CIA) kod Lewis pacova
[0306] Četrdeset (40) ženki Lewis pacova (BK), starosti 6 do 8 nedelja, sa težinom pre tretmana u opsegu od 180 do 200 g podeljene su nasumično u četiri (4) grupe (grupe A-D) od po deset (10) pacova. Životinje u grupama B do D imunizovane su intradermalno goveđim CII u IFA na tri mesta u blizini baze repa i duž leđa, korišćenjem 500 µL emulzije na dan 0 (200 µL, 200 µL, 100 µL na svako od mesta). Na dan 7, pacovima u grupama B-D date su pojačavajuće injekcije sa istom količinom emulzije intradermalno blizu prethodnih injekcionih mesta. U modelu terapijskog tretmana (grupe C i D), deksametazon ili Jedinjenje 2 su oralno dati pacovima sa CIA posle uspostavljanja artritisa, kako je pokazano u Tabeli 6. Pacovi su mereni dnevno i odmor od leka davan je životinji kada bi gubitak težine bio veći od 13%.
Tabela 6. Grupe na početku studije
1 2
[0307] Razvoj CIA evaluiran je makroskopskim ocenjivanjem i merenjem otoka šapa. Procenjivanje je vršeno svakog dana tokom prvih 5 dana posle senzitizacije (dan 7) i zatim dva puta nedeljno (ponedeljak i četvrtak) preostalo vreme, sistemom kliničkog skora za svaku šapu prikazanim u Tabeli 7.
Tabela 7. Artritisni klinički skor
[0308] Zapremina stopala merena je pletizmometrijom istog dana kada i artritisne promene tokom studije. Zapremina svake šape i stopa otoka merene su korišćenjem sledeće jednačine:
Stopa otoka = (CN-C0)/C0×100%.
SL. 4A predstavlja grafikon otoka zgloba u odnosu na vreme, i prikazuje otok zgloba meren skalom 0-4 kod naivnih pacova i pacova tretiranih prema modelu, pozitivnom kontrolom ili Jedinjenjem 2.
[0309] Goveđi CII (u 10 mM sirćetnoj kiselini) u količini od 4 mg/mL emulguje se sa istom zapreminom IFA.
[0310] Klinički skorovi su sabrani za svaku životinju, i ukupna prosečna vrednost za sve životinje iz svake grupe izražava se kao srednji artritisni skor. SL. 4B predstavlja grafikon kliničkih skorova u funkciji vremena, i prikazuju kliničke skorove za artritis
1
naivnih pacova i pacova tretiranih prema modelu, pozitivnom kontrolom ili Jedinjenjem 2.
[0311] Na dan 28 studije, po tri reprezentativne životinje iz svake grupe su eutanazirane i uzete su zadnje šape i uskladištene u 4% neutralno puferisanom formalinu. Pripremljeni preseci zadnjih šapa bojeni su hematoksilinom i eozinom (H&E).
[0312] Histopatološka analiza kontrolnih životinja pokazala je eroziju hrskavice i formiranje granulacionog tkiva u skladu sa tokom bolesti. Međutim, kod pacova tretiranih Jedinjenjem 2, nađena je relativno intaktna hrskavica na zglobnoj površini i formiranje granulacionog tkiva bilo je minimalno. Rezultati histološke analize prikazani su na SL. 5.
[0313] Podaci o kliničkom skoru, otoku zglobova, kao i histološka analiza pokazali su korelaciju. Rezultati su ukazali i na terapijsku efikasnost Jedinjenja 2 u dozi od 4 mg/kg (MPK), što je pokazano njegovim efektima na kliničke skorove, oticanje zglobova i histološku analizu. Rezultati CIA modela kod Lewis pacova prikazani su na SL.4A i 4B, i SL.5.
Antipsorijazna aktivnost Jedinjenja 2 u psorijazi indukovanoj forbol-12-miristat-13-acetatom (phorbol-12-myristate-13-acetate, PMA) kod ženki BALB/C miševa
[0314] Korišćene su dvadeset četiri (24) ženke BALB/c miševa, starosti 6 do 8 nedelja, telesne težine između 22 i 30 g. Miševi su nasumično raspoređeni u četiri (4) grupe od po osam (8) miševa. Grupisani su na sledeći način: grupa I (naivni; etanol), grupa II (PMA; etanol), grupa III (PMA; Jedinjenje 2, 10 µM) i grupa IV (PMA; betametazon). Dvadeset (20) µL PMA (4 µg/20 µL acetona) primenjeno je površinski na gornju površinu ušne školjke svih životinja u grupi II do grupe IV. PMA je nanošen dnevno na levo uvo i alternativnih dana (P-S-P) na desno uvo od dana 1 do dana 9. Trideset (30) minuta posle nanošenja PMA, površinski se nanosi prenosnik ili standardno jedinjenje (betametazon) ili Jedinjenje 2 na uvo životinja iz različitih grupa. Treba napomenuti da se prenosnik, standardno jedinjenje, i Jedinjenje 2 nanose dnevno na oba uva različitih životinja od dana 1 do dana 12.
[0315] Životinje su posmatrane svakodnevno tokom 12 dana i praćeni su svi simptomi u vezi sa tretmanom. Bazalna debljina uva zabeležena je kod svih životinja (pre nanošenja
1 4
PMA) korišćenjem digitalnog mikrometarskog zavrtnja u vreme T0 (dan 1). Tokom čitave studije, 4 sata posle nanošenja prenosnika, standardnog jedinjenja, ili Jedinjenja 2, debljina uva merena je dnevno korišćenjem digitalnog mikrometarskog zavrtnja i beleženi su skorovi eritema, perutanja i nabiranja. Jačina oštećenja ušne školjke procenjivana je sistemima skorova prikazanim u Tabeli 8.
Tabela 8. Skorovi za psorijazu
[0316] Životinjama je davana nutritivno izbalansirana autoklavirana peletirana hrana (Nutrivet Life Sciences, Pune (India)) ad libitum i imale su pristup normalnoj vodi za piće, tokom eksperimentalnog perioda.
[0317] Komercijalno dostupni 100% DMSO (LR stupnja) i etanol (LR stupnja) korišćeni su za pripremanje formulacija. PMA se priprema rastvaranjem 10 mg PMA u 50.0 mL acetona. Jedinjenje 2 se priprema rastvaranjem 1.47 mg Jedinjenja 2 u 300 µL 100% DMSO.
[0318] Rezultati eksperimenta prikazani su na SL.6A-6D kao srednja vrednost ± SEM. Nije bilo značajnih razlika između grupa tretmana u telesnoj težini, i konzumaciji hrane i vode. Primena PMA pokazala je (i) porast debljine levog i desnog uva (grupa II prema naivnim životinjama) i (ii) porast indeksa aktivnosti bolesti (disease activity index, DAI) levog i desnog uva (grupa II prema naivnim životinjama). Važno je napomenuti da je površinska primena Jedinjenja 2 dovela do upadljive redukcije PMA-indukovanog porasta (i) debljine levog i desnog uva, i (ii) DAI levog i desnog uva. Ovaj efekat je bio izražen na dane 6-8 studije kada je više životinja tretiranih Jedinjenjem 2 imalo smanjenu debljinu levog/desnog uva (u poređenju sa životinjama iz grupe II), i DAI (u poređenju sa životinjama iz grupe II). Važno je napomenuti da su se smanjenja porasta debljine levog/desnog uva i DAI indukovana Jedinjenjem 2, smanjivala kako je studija odmicala (dan 10 i kasnije).
1
[0319] U modelu psorijaze indukovane PMA kod miševa, Jedinjenje 2 pokazalo je značajnu antipsorijaznu aktivnost.
Antipsorijazna aktivnost Jedinjenja 2 u modelu zapaljenja kože/psorijaze izazvane imikvimodom (imiquimod, IMQ) (STUDIJA 1)
[0320] Korišćeno je četrdeset (40) mužjaka BALB/c miševa, starosti 6 do 8 nedelja, telesne težine pre tretmana od 22 do 30 g. BALB/c miševi su nasumično raspoređeni u četiri (4) grupe od po deset (10) miševa po grupi. Malo područje (oko 2×2 cm<2>) kože na leđima svih životinja pažljivo je obrijano. Životinje grupe I služile su kao naivne životinje. Psorijaza je indukovana u grupama II do IV [Grupa II (IMQ; prenosnik), grupa III (IMQ; Jedinjenje 2 (1 µM)) i grupa IV (IMQ; ciklofosfamid (10 mg/kg)] površinskim nanošenjem 31.25 mg IMQ krema dnevno na leđa životinja od dana 1 do dana 13. Četiri sata posle primene IMQ, prenosnik ili standardno jedinjenje (ciklofosfamid) ili Jedinjenje 2 primenjivani su (površinski - 30 µL; oralno - prema telesnoj težini) u odgovarajućim grupama od dana 1 do dana 13, dnevno. Dva sata posle primene prenosnika ili standardnog jedinjenja ili Jedinjenja 2, beleže se eritem, perutanje, nabiranje i debljina kože, da bi se odredio indeks aktivnosti bolesti (DAI).
[0321] Životinje su posmatrane svakodnevno tokom perioda od 13 dana u vezi sa pojavom bilo kakvih simptoma povezanih sa tretmanom. Dnevno posmatranje obuhvatalo je telesnu težinu, unos hrane, zadebljanje kože, perutanje, nabiranje, eritem, sekret iz nosa, kretanje, disanje, dlaku, nadutost stomaka, stanje kože, krzno, mukozne membrane, prisustvo ili odsustvo sekrecije, stanje očiju, uzdignutost repa, motornu aktivnost, držanje tela i hod. Jačina oštećenja na dorzalnom delu kože procenjivana je određivanjem skora za eritem, perutanje, nabiranje i debljinu kože na osnovu spoljnog izgleda kože, prema rubrici u Tabeli 9.
Tabela 9. Skorovi za psorijazu
1
[0322] Komercijalno dostupni 100% DMSO (LR stupnja) i etanol (LR stupnja), ciklofosfamid (CMC), PVP i Pluronic, korišćeni su za pripremanje formulacija. Jedinjenje 2 se priprema rastvaranjem 1.47 mg Jedinjenja 2 u 300 µL 100% DMSO. Ciklofosfamid se priprema rastvaranjem 500 mg CMC u 100 mL destilovane vode.
[0323] Rezultati eksperimenta prikazani na SL.7A i 7B izraženi su kao srednja vrednost ± SEM.
[0324] Nije bilo značajnih razlika u telesnoj težini, i konzumaciji hrane i unosu vode u grupi tretmana u poređenju sa kontrolnom grupom tokom trajanja studije. Jedinjenje 2 smanjilo je manifestacije bolesti indukovane IMQ.
[0325] Jedinjenje 2 pokazalo je antipsorijaznu aktivnost, što je dokazano smanjenjem indeksa aktivnosti bolesti u poređenju sa grupom tretiranom prenosnikom. Pored toga, Jedinjenje 2 dovelo je do ovog efekta bez neželjenog uticaja na telesnu težinu i unos hrane i vode.
Antipsorijazna aktivnost Jedinjenja 2 u modelu zapaljenja kože/psorijaze izazvane imikvimodom (IMQ) (STUDIJA 2)
[0326] Četrdeset (40) mužjaka BALB/c miševa (Biological E Limited, Hyderabad (CPCSEA registarski broj: 36/99/CPCSEA)), podeljeno je u četiri (4) grupe koje su se sastojale od po deset (10) miševa. Životinje su nasumično raspoređene prema telesnoj težini. Grupe su označene kao grupa-I (naivne), grupa-II (IMQ; prenosnik (PEG 400 i HPBCD)), grupa-III (IMQ; Jedinjenje 2 (2.5 mg/kg)) i grupa-IX (IMQ; ciklofosfamid (10 mg/kg)).
[0327] Obrijano je malo područje leđa svakog miša, pri čemu su sva područja bila iste veličine/površine. Psorijaza je indukovana u grupama II do IV površinskim nanošenjem 50 mg IMQ krema dnevno, od dana 1 do dana 6, na leđa životinja. Na dan 1 i dan 2 studije, četiri sata posle površinske primene IMQ, Jedinjenje 2 ili pozitivna kontrola (ciklofosfamid) ili prenosnik primenjivani su kod životinja iz odgovarajućih grupa. Treba napomenuti da su životinjama iz grupe II i grupe III davane subkutane injekcije,
1
dok je kod životinja iz grupe IV primena vršena oralnim putem. Tretman Jedinjenjem 2, prenosnikom i ciklofosfamidom završen je na dan 2. Ove grupe životinja su održavane na dnevnom tretmanu IMQ do dana 6. Na dan 7, životinje kod kojih je indukovana psorijaza ponovo su nasumično raspoređene u 3 grupe od po 10 životinja, na osnovu kumulativnog indeksa aktivnosti bolesti (cumulative disease activity index, CDAI). Od dana 7 do dana 9, životinje su primale prenosnik ili pozitivnu kontrolu ili Jedinjenje 2. Napominje se da tim danima životinje nisu tretirane IMQ. Od dana 10 do dana 14, životinje su tretirane alternativno IMQ (dani 10, 12 i 14), ili prenosnikom, pozitivnom kontrolom ili Jedinjenjem 2 (dani 11, 13).
[0328] Sve životinje su praćene na dnevnoj bazi tokom perioda od 16 dana, u pogledu opšteg stanja, telesne težine i unosa hrane i vode. Na dane 1 i 2, beleženi su skorovi eritema, perutanja, nabiranja i zadebljavanja kože, 2 sata posle primene prenosnika/pozitivne kontrole/testnih jedinjenja, i na dane 3 do 14 skorovi su beleženi 4 sata posle nanošenja IMQ, ili primene pozitivne kontrole, prenosnika ili Jedinjenja 2. Jačina indukcije na leđima životinje procenjivana je i dodeljivani su joj skorovi kako je pokazano u Tabeli 10.
[0329] Prenosnik je pripremljen rastvaranjem 40 mg HPBCD u 70.0 mL destilovane vode. Jedinjenje 2 je pripremljeno rastvaranjem 3.59 mg u 0.5% PVP i 0.5% Pluronic. Ciklofosfamid je pripremljen rastvaranjem 500 mg CMC u 100 mL destilovane vode.
[0330] Rezultati eksperimenta prikazani u Tabeli 10 izraženi su kao srednja vrednost ± SEM. Podaci su procenjivani korišćenjem jednofaktorske ANOVA, i post hoc analiza je izvedena korišćenjem Dunnettovog testa.
1
[0331] Zapaženo je da je stopa redukcije indeksa aktivnosti bolesti kod životinja tretiranih Jedinjenjem 2 bila značajno viša od one koja je zapažena kod životinja tretiranih prenosnikom. Tokom trajanja studije, nije bilo značajne razlike u telesnoj težini, konzumaciji hrane i unosu vode u grupi tretmana u poređenju sa kontrolnom grupom.
[0332] Dobijeni rezultati pokazuju da tretman Jedinjenjem 2 smanjuje manifestacije bolesti indukovane IMQ, bez većeg uticaja na telesnu težinu životinja u tretiranim grupama.
Efekat Jedinjenja 2 kod Zucker pacova
[0333] Dvadeset jedan (21) mužjak Zucker pacova starosti 7 meseci raspoređen je u 3 grupe N=7 na osnovu ekvivalentnih telesnih težina i unosa hrane. Dodatna grupa od N=7 Zucker mršavih kontrolnih pacova iste starosti uključena je kao kontrola. Telesna težina i unos hrane i vode mereni su u približno isto vreme svakog dana (14:30-15:30 h). Na dane tretmana, doziranje je vršeno u 14:30-15:30 h (približno 2 sata pre isključivanja svetla).
[0334] Gojazni Zucker i mršavi kontrolni pacovi oralno su tretirani prenosnikom (10 mL/kg dozna zapremina; 0.5% Pluronic F68 i 0.5% PVP K29/32 u vodi) svakog dana u nedelji. Obe grupe koje su primale Jedinjenje 2 (1.5 mg/kg i 3 mg/kg) oralno su tretirane svakog dana u nedelji (10 mL/kg dozna zapremina; 0.5% Pluronic F68 i 0.5% PVP K29/32 u vodi). Pre faze tretmana, bazalni podaci su sakupljani tokom 4 dana. Faza tretmana trajala je 16 dana, a uključena je i faza ispiranja koja je trajala 6 dana.
[0335] SL 8A i 8B i SL.9 prikazuju efekte Jedinjenja 2 na Zucker pacove. Na bazalnom nivou, nije bilo značajnih razlika u telesnoj težini i dnevnom unosu hrane između 3 grupe Zucker gojaznih pacova. Međutim, sve grupe su se značajno razlikovale od grupe mršavih Zucker pacova.
[0336] Jedinjenje 2 (1.5-3 mg/kg oralno) proizvelo je dozno zavisno smanjenje dnevnog unosa hrane i telesne težine tokom perioda tretmana od 16 dana u poređenju sa Zucker kontrolnom grupom. Tretman Jedinjenjem 2 takođe je značajno povećao unos vode meren tokom istog perioda. Postojala je značajna razlika u prinosu telesne težine
1
između grupe koja je primala 3 mg/kg Jedinjenja 2 i grupe Zucker pacova koja je primala prenosnik. Nije bilo značajne razlike u prinosu težine između grupe tretirane 1.5 mg/kg Jedinjenja 2 i grupe Zucker pacova tretiranih prenosnikom.
[0337] Jedinjenje 2 pokazalo je dozno zavisno smanjenje dnevnog unosa hrane, pri čemu je viša doza (3 mg/kg) bila efikasnija od doze 1.5 mg/kg. Pored toga, grupa tretirana Jedinjenjem 2 u dozi od 3 mg/kg pokazala je manji prinos težine u poređenju sa Zucker kontrolnom grupom.
Efekat Jedinjenja 2 u modelu gojaznosti indukovane dijetom
[0338] Sprague-Dawley pacovi stari 2 meseca stavljeni su na dijetu sa visokim sadržajem masti (Research Diets Inc., šifra proizvoda D12492, 60% kcal% masti) tokom 3 meseca. Grupa pacova iste starosti hranjena je normalnom laboratorijskom hranom (LabDiet 5001, ∼13% kcal% masti), ove životinje služile su kao kontrola za DIO grupu.
[0339] Kada se bili stari 4 meseca i 2 meseca posle uvođenja dijete sa visokim sadržajem masti, svi pacovi su raspoređeni u 3 grupe od N=7, na osnovu ekvivalentnih telesnih težina i unosa hrane. Telesna težina i unos hrane i vode mereni su u približno isto vreme svakog dana. Na dane tretmana, doziranje je vršeno približno 2 sata pre isključivanja svetla.
[0340] DIO kontrolna grupa tretirana je prenosnikom (oralni, 10 mL/kg dozna zapremina; 0.5% Pluronic F68 i 0.5% PVP K29/32 u vodi) svakog dana u nedelji. Grupa koje je primala Jedinjenje 2, 1.5 mg/kg oralno tretirana je svakog dana u nedelji tokom faze tretmana (10 mL/kg dozna zapremina; 0.5% Pluronic F68 i 0.5% PVP K29/32 u vodi). Grupa koja je primala Jedinjenje 2, 3 mg/kg (10 mL/kg dozna zapremina; 0.5% Pluronic F68 i 0.5% PVP K29/32 u vodi) oralno je tretirana u početku jednom dnevno svakog dana u nedelji tokom nedelje 1, zatim dva puta nedeljno (ponedeljak, sreda) tokom nedelje 2. Tokom nedelja 3 i 4 tretmana, tetman Jedinjenjem 2, 3 mg/kg, nastavljen je dva puta nedeljno, osim što je doziranje bilo ponedeljkom i četvrtkom.
[0341] Pre faze tretmana, bazalni podaci su sakupljani tokom 3 dana. Faza tretmana trajala je 4 nedelje. Uključena je i faza ispiranja koja je trajala 10 dana.
11
[0342] Jedinjenje 2 dobijeno je u formi praška. Aktivni procenat testnog jedinjenja bio je 65.89%. Aktivni procenat bio je podešen korišćenjem BEW od 1.437 i pripremljen rastvaranjem u 0.5% tež./zapr. Pluronic F-68 i 0.5% tež./zapr. PVP K-29-32 rastvora prenosnika. Rastvor prenosnika pripreman je nedeljno dok je Jedinjenje 2 pripremano sveže svaka 2 dana i skladišteno na 4°C. Životinje su dozirane zapreminom od 10 mL/kg. Pojedinačne doze su izračunavane na bazi poslednje izmerene telesne težine da bi se obezbedilo odgovarajuće doziranje u mg/kg/dan.
[0343] SL. 10A i 10B i SL. 11 prikazuju efekte Jedinjenja 2 u modelu gojaznosti indukovane dijetom. Na bazalnom nivou, nije bilo značajne razlike u telesnoj težini i dnevnom unosu hrane i vode između 3 DIO grupe. Međutim, sve DIO grupe zančajno su se razlikovale od grupe koja je bila na regularnoj dijeti. Specifično, životinje hranjene regularnom dijetom imale su značajno manju telesnu težinu u odnosu na pacove hranjene dijetom sa visokim sadržajem masti. Nasuprot tome, pacovi hranjeni dijetom sa visokim sadržajem masti unosili su dnevno značajno manje hrane i vode u poređenju sa pacovima hranjenim regularnom dijetom.
[0344] Jedinjenje 2 (1.5-3 mg/kg oralno) proizvelo je dozno zavisno smanjenje dnevnog unosa hhrane i telesne težine tokom perioda tretmana od 28 dana u poređenju sa DIO kontrolnom grupom. Tretman Jedinjenjem 2 takođe je značajno povećao unos vode, meren tokom istog perioda (F3,27 = 11.2, P<0.01).
[0345] U pogledu efekta tretmana na prinos telesne težine, on je formalno meren kao procena promene telesne težine od dana 3 studije. Postojalo je značajno smanjenje prinosa težine u obe grupe tretirane Jedinjenjem 2 u poređenju sa DIO kontrolama na dane 7 tretmana (dan 10 studije) i 14 (dan 17 studije).
[0346] Telesna težina, unos hrane/vode mereni su svakog dana tokom faze ispiranja. Unos hrane u grupama tretiranim Jedinjenjem 2 bio je sličan kao u DIO kontrolama. Telesna težina u grupama tretiranim Jedinjenjem 2 ostala je niža nego u DIO kontrolama.
[0347] Jedinjenje 2 smanjilo je dnevni unos hrane na dozno zavisan način. Jedinjenje 2 uticalo je i na prinos telesne težine, i u dozi od 1.5 i u dozi od 3 mg/kg.
Indukcija Nrf2 antiinflamatornog puta Jedinjenjem 1
[0348] THP-1 ćelije (ćelije akutne humane monocitne leukemije) korišćene su za ispitivanje efekata Jedinjenja 1 na Nrf2 put u inflamatornom okruženju. Nukleusni (eritroid-izvedeni) sličan faktor 2 (nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2, Nrf2) je antiinflamatorni transkripcioni faktor. Pod normalnim uslovima, Nrf2 zadržava se u citoplazmi pomoću Kelch sličnog-ECH udruženog proteina 1 (Kelch like-ECH associated protein 1, KEAP1), koji razgrađuje Nrf2 ubikvitinacijom. Nrf2 može i da se kreće u nukleus i nazad u citoplazmu kao teret na CRM1. U ovoj studiji, Nrf2 je zaštićen od degradacije nokdaunom KEAP1 pomoću siRNK. Posle toga, KEAP1-depletovane ćelije se tretiraju TNFα da se indukuje inflamacija, i ispituje se sposobnost Jedinjenja 1 da ukloni inflamaciju pozitivnom regulacijom Nrf2 puta. Da bi se prikazala aktivnost Nrf2 puta, ekspresija njegova dva nishodna gena NAD(P)H dehidrogenaza [hinon]1 (NAD(P)H dehydrogenase [quinone]1, NQO1) i epoksid hidrolaze 1 (epoxide hydrolase 1, EPHX1) kvantifikovana je kvantitativnom PCR.
[0349] THP-1 (akutna monocitna leukemija) ćelije zaseju se na ploče u dve posude za kulturu tkiva od 10 cm (6*10<6>ćelija/po posudi) sa RPMI-1640 medijumom (Lonza) dopunjenim 10% toplotom inaktiviranim fetalnim goveđim serumom (Invitrogen) i 2-merkaptoetanolom do finalne koncentracije od 0.05 mM. Ćelije u jednoj posudi se transfektuju sa 50 nM KEAP1 siRNA (Life Technologies, Silencer Select, siRNA ID# s18982) korišćenjem Lipofectamine RNAiMax (Invitrogen), dok se ćelije u drugoj posudi transfektuju sa 50 nM kontrolne siRNK, Block-iT (Invitrogen). Transfektovane ćelije se ostave 72 h i efikasnost KEAP1 nokdauna se izračunava kvantitativnom PCR korišćenjem probe na KEAP1.
[0350] Zatim se ćelije iz svake od posuda podele jednako u 4 bunarčića na različitim pločama sa 6 bunarčića. Jedan od bunarčića sa svake ploče se prethodno tretira sa 1 µM Jedinjenja 1, 1 h, što je praćeno sa 20 ng/mL TNFα, 24 h. Drugi bunarčići se tretiraju ili sa 1 µM Jedinjenja 1 ili 20 ng/mL TNFα ili nijednim, 24 h. Posle tretmana, iz ćelija se ekstrahuje RNK korišćenjem kita za ekstrakciju RNK (Qiagen). Uzorci RNK iz svake grupe tretmana se reverzno transkribuju i izvrši se PCR u realnom vremenu na odgovarajućim cDNK sekvencama korišćenjem proba na Nrf2 i njegova dva nishodna gena, NQO1 i EPHX1. THP-1 ćelije se transfektuju sa KEAP1 siRNK. Postiže se 40% efikasnosti nokdauna. KEAP1 nokdaun ćelije se tretiraju ili sa 1 µM Jedinjenja 1 ili sa 20 ng/mL TNFα ili oba zajedno, tokom 24 h.
[0351] SL. 12A pokazuje porast ekspresije Nrf2 od 2.5 puta u ćelijama tretiranim kombinacijom TNFα i Jedinjenja 1, u poređenju sa netretiranim ćelijama. Ali, sličan (do 3 -struki) porast Nrf2 nivoa iRNK nađen je i u ćelijama tretiranim Jedinjenjem 1 i TNFα bez KEAP1 nokdauna. Jedinjenje 1 ili TNFα sami nisu imali značajan efekat na ekspresiju Nrf2 sa ili bez KEAP1 nokdauna.
[0352] SL. 12B prikazuje ekspresiju NAD(P)H dehidogenaze [hinon] 1 ili NQO1 u ćelijama sa ili bez KEAP1 nokdauna. SL. 12B pokazuje da KEAP1 nokdaun utiče na NQO1 ekspresiju. Čak i uzorak koji nije tretiran pokazuje 2-struko povećanje nivoa iRNK posle KEAP1 nokdauna. Kombinacija Jedinjenja 1 i TNFα rezultuje 4-strukim povećanjem ekspresije NQO1 za uzorke sa KEAP1 nokdaunom u poređenju sa 2-strukim porastom, uočenim za istu kombinaciju u ćelijama bez KEAP1 nokdauna.
[0353] SL.12C prikazuje nivoe iRNK za epoksi hidrolazu 1 ili EPHX1 u ćelijama sa ili bez KEAP1 nokdauna posle tretmana Jedinjenjem 1 i/ili TNFα. SL. 12C prikazuje da Jedinjenje 1 pozitivno reguliše ekspresiju EPHX1 u prisustvu ili odsustvu TNFα. KEAP1 nokdaun doprinosi efektu Jedinjenja 1, jer je indukcija do 2.5 puta bila zapažena u uzorcima sa Jedinjenjem 1 i KEAP1 nokdaunom.
[0354] Tretman 1 µM Jedinjenja 1 tokom 24 h u prisustvu 20 ng/mL TNFα pozitivno reguliše Nrf2 signalizaciju. KEAP1 nokadaun pojačava ovaj efekat, što se vidi po većoj indukciji NQO1 (4 puta prema 2 puta) i EPHX1 (2.5 puta prema 1.5 put) u odnosu na njihove nivoe ekspresije bez KEAP1 nokdauna. Rezultati pokazuju da inhibicija CRM1 može da aktivira Nrf2 put tokom inflamacije, i sugeriše da tretman Jedinjenjem 1 u kombinaciji sa KEAP1 inhibitorima može da bude efikasniji od tretmana samo Jedinjenjem 1.
Efekti Jedinjenja 1, 2, i 12 na transkripcionu aktivnost NF-κB
[0355] TNFα može da indukuje transkripcionu aktivnost NF-κB. Ova transkripciona aktivnost otpočinje kada se razgradi IκB, koji se vezuje za NFκB i inhibira njegovu aktivnost. Tada se član klase II familije NF-κB proteina, RelA ili p65, koji formira heterodimer sa članom klase I familije, p50, premešta u nukleus. p65 subjedinica ima
11
transaktivacioni domen na svom C terminusu, koji aktivira transkripciju gena povezanih sa inflamacijom. Kao NF-κB, IκB takođe može da se kreće u nukleus ćelije. Nukleusna akumulacija IκB štiti protein od degradacije, jer se degradacija dešava uglavnom u citoplazmi. CRM1 je odgovoran za eksport IκB iz nukleusa. Prema tome, blokiranje nukleusnog eksporta IκB preko inhibicije CRM1 smanjuje na najmanju meru NF-κB aktivnost, jer se nukleusni IκB vezuje za NF-κB i sprečava da se NF-κB veže za DNK sekvence.
[0356] Jedinjenja se testiraju na HeLa (adenokarcinom) ćelijama da bi se kvantifikovala sposobnost inhibiranja NF-κB transkripcione aktivnosti. NF-κB aktivnost je u HeLa ćelijama indukovana pomoću TNFα, i zatim su dodata jedinjenja da bi inhibirala indukovanu aktivnost NF-κB. Polovine maksimalnih inhibitornih koncentracija (IC50) nekoliko jedinjenja, Jedinjenja 1, Jedinjenja 2 i Jedinjenja 12, određivane su studijama dozne zavisnosti.
[0357] HeLa ćelije se zaseju na ploču sa 12 bunarčića (200 000 ćelija/bunarčiću) i kultivišu u Eagleovom minimalnom esencijalnom medijumu (Eagle's Minimal Essential medium, EMEM), Lonza, dopunjenom 10% toplotom inaktiviranim fetalnim goveđim serumom (Invitrogen) i uz 50 µg/mL penicilina/streptomicina (Invitrogen), i ostave se preko noći da adheriraju. Ćelije se pretretiraju serijskim razblaženjima (počevši od razblaženja 30 µM; 1:3) jedinjenja, 1 h i zatim izlože 20 ng/mL TNFα (Peprotech), 4 h, u medijumu bez seruma. Posle tretmana, ćelije se isperu pomoću PBS (Invitrogen), i liziraju korišćenjem RIPA pufera (Themo Scientific). Transkripciona aktivnost NF-κB u ćelijama meri se Chemiluminescent Transcription Factor Assay kitom (Thermo Scientific, kataloški br. 89859), prema uputstvu proizvođača. Ukratko, 1.5 mg/mL ekstrakta celih RIPA-liziranih ćelija iz svakog tretmana inkubira se na ploči sa 96 bunarčića sa NF-κB biotinisanom konsenzusnom sekvencom. Aktivni NF-κB transkripcioni faktor vezan za konsenzusnu sekvencu inkubira se sa NF-κB p65 primarnim antitelom i zatim sa sekundarnim HRP-konjugovanim antitelom. Hemiluminiscentni supstrat se doda u bunarčiće i dobijeni signal se detektuje korišćenjem luminometra. Tri odvojena eksperimenta se analiziraju za svaku koncentraciju IC50krivih. Za izračunavanje IC50krivih koristi se XLFit model 205.
[0358] Inhibicija transkripcione aktivnosti NF-κB meri se serijskim razblaženjima Jedinjenja 1, Jedinjenja 2 i Jedinjenja 12 posle 1 h pretretmana jedinjenjem, što je praćeno sa 4 h izlaganja 20 ng/mL TNFα. Tri nezavisna eksperimenta su ocenjivana za svaku koncentraciju, i prosečna vrednost je prikazana ovde. Jedinjenje 1 imalo je vrednost 1C50od 1.59 µM, Jedinjenje 2 IC50vrednost od 1.22 µM, i Jedinjenje 12 1C50vrednost od 1.46 µM.
Evaluacija efekata Jedinjenja 1 na ekspresiju proinflamatornog proteina, COX-2, u HeLa ćelijama gajenim in vitro
[0359] HeLa ćelije se zaseju u posude za kulturu sa 6 bunarčića (2.5x10<5>ćelija/bunarčiću) sa EMEM medijumom (Lonza) dopunjenim 10% toplotom inaktiviranim fetalnim goveđim serumom (Invitrogen). Dva bunarčića se pretretiraju sa 10 µM Jedinjenja 1, 30 minuta, kada se jedan od bunarčiča izloži delovanju 20 ng/mL TNFα (Preprotech), 1 sat. Drugi bunarčići se tretiraju sa 20 ng/mL TNFα ili ničim, 1 sat. Posle tretmana, RNK se ekstrahuje iz ovih ćelija korišćenjem kita za ekstrahovanje RNK (Qiagen). Uzorci RNK iz svake grupe tretmana reverzno se transkribuju i kvantitativna PCR u realnom vremenu (qRT PCR) se izvede na odgovarajućim cDNK sekvencama korišćenjem proba na COX-2 (Life Technologies).
[0360] HeLa ćelije se zaseju u posude za kulturu sa 6 bunarčića (5x10<5>ćelija/bunarčiću) sa EMEM medijumom (Lonza) dopunjenim 10% toplotom inaktiviranim fetalnim goveđim serumom (Invitrogen). Dva bunarčića se pretretiraju sa 1 µM Jedinjenja 1, 30 minuta, kada se jedan od bunarčiča izloži 20 ng/mL TNFα (Preprotech), 24 sata. Drugi bunarčići se tretiraju sa 20 ng/mL TNFα ili ničim, 24 sata. Posle tretmana, naprave se lizati celih ćelija lizom pomoću RIPA pufera dopunjenog proteaznim i fosfataznim inhibitorima (Roche). Imunoblot detekcija COX-2 proteina izvodi se korišćenjem anti-COX-2 antitela (Cayman). Jačina signala za COX-2 protein normalizuje se prema betaaktinu (Santa Cruz) za svaki uzorak i nanosi grafički u vidu arbitrarnih jedinica intenziteta.
[0361] Podaci analize iRNK korišćenjem qRT-PCR prikazani su na SL. 13A. Posle 1 sata tretmana, TNFα indukuje približno 8-struko povećanje ekspresije COX-2 iRNK u poređenju sa kontrolom, dok Jedinjenje 1 samo nema efekta na nivo ekspresije COX-2. Jedinjenje 1 nije uzrok porasta ekspresije COX-2 iRNK.
11
[0362] Podaci dobijeni analizom proteina imunoblotovanjem prikazani su na SL. 13B. HeLa ćelije su ostavljene netretirane, tretirane sa 20 ng/mL TNFα ili 1 µM Jedinjenja 1, ili sa 20 ng/mL TNFα i 1 µM Jedinjenja 1, 24 sata, zatim evaluirane imunoblot detekcijom u pogledu količine prisutnog COX-2 proteina. Nivo COX-2 proteina raste za 24 sata u ćelijama stimulisanim TNFα, u poređenju sa netretiranom kontrolom i ćelijama tretiranim Jedinjenjem 1, dok Jedinjenje 1 smanjuje količinu COX-2 proteina u prisustvu TNFα. Intenzitet imunoblot signala za COX-2 protein normalizuje se prema βaktinu za svaki uzorak i prikazuje grafički.
[0363] Jedinjenje 1 ne utiče na TNFα-indukovanu ekspresiju COX-2, ali smanjuje količinu TNFα-indukovane ekspresije COX-2 proteina.
Jedinjenje 1 lokalizuje u nukleusu terete na CRM1 povezane sa inflamacijom
[0364] HeLa i THP-1 (humana akutna monocitna leukemija) ćelije tretiraju se faktorom koji indukuje inflamaciju, TNFα, samim ili u kombinaciji sa 1-10 µM Jedinjenja 1, 4-24 h, i zatim analiziraju imunofluorescencijom (IF) u pogledu nukleusne lokalizacije proteina povezanih sa inflamacijom, koji su teret (kargo) za CRM1: IκB, Nrf2, HMGB1, FoxP3, FOXO1a, RxRα, PPARγ i NFκB (p65 subjedinica).
[0365] Za detekciju IkB, Nrf2, RxRα i PPARγ lokalizacije, ćelije se preinkubiraju sa 10 µM Jedinjenja 1, 30 minuta, posle čega sledi inkubacija sa 20 ng/mL TNFα, 4 h, u medijumu bez seruma. Za detekciju HMGB1, FoxP3 i Foxo1A, ćelije se preinkubiraju sa 1 µM Jedinjenja 1, 2 h, što je praćeno inkubacijom sa 20 ng/mL TNFα, 24 sata. Za detekciju NFκB, ćelije se preinkubiraju sa 1 µM Jedinjenja 1, 2 h, što je praćeno inkubacijom sa 20 ng/mL TNFα, 24 sata. Ćelije se fiksiraju 100% ledeno hladnim metanolom (MeOH) i permeabilizuju/blokiraju sa 0.1% Tween 20, 0.3 M glicinom, i 1% BSA u PBS, ili fiksiraju sa PFA (3% paraformaldehid i 2% saharoza u PBS) i permeabilizuju/blokiraju sa 0.1% Triton-X100 i 1% BSA u PBS. IκB se detektuje primarnim zečjim monoklonskim (E130) antitelom, Abcam (ab32518); Nrf2 se detektuje primarnim zečjim poliklonskim antitelom, Santa Cruz (sc722); RxR alfa se detektuje primarnim zečjim poliklonskim antitelom, Santa Cruz (sc553); PPAR gama se detektuje primarnim zečjim monoklonskim [E130] antitelom, Cell Signaling (#2443); Foxo1A se detektuje primarnim zečjim monoklonskim [C29H4] antitelom, Cell
11
Signaling (#2880); HMGB1 se detektuje primarnim zečjim poliklonskim antitelom, Abcam (ab18256); FoxP3 se detektuje primarnim zečjim poliklonskim antitelom, Abcam (ab10563); NFκB-p65 se detektuje primarnim zečjim monoklonskim [C22B4] antitelom, Cell Signaling (#4764). Zečje sekundarno antitelo, Alexa Fluor 488 (Invitrogen, A11008) koristi se za sva bojenja. Slike se snimaju na uveličanju 20X.
[0366] Zadržavanje CRM1 tereta povezanog sa inflamacijom u nukleusu ima negativne efekte na inflamaciju i, prema tome, IF testovi mogu da služe kao biomarkeri antiinflamatornih efekata CRMI inhibitora.
[0367] IκB je inhibitor NFκB koji indukuje ekspresiju proinflamatornih puteva. Zbog toga što se najveći deo degradacije IκB dešava u citoplazmi, lokalizacija u nukleusu štiti IκB od degradacije i omogućava mu vezivanje sa nukleusnim NFκB, blokirajući proinflamatornu aktivnost NFκB. Nrf2 je leucinski "zipper"-transkripcioni faktor koji u nukleusu indukuje ekspresiju antiinflamatorne aktivnosti. HMGB1 je faktor grupe visoke mobilnosti-boks 1 (high-mobility-group box 1), i obično je čvrsto vezan za hromatin. Posle aktivnog sekretovanja ili pasivnog oslobađanja iz oštećenih ćelija, HMGB1 funkcioniše kao citokin i indukuje proinflamatorni odgovor. Zadržavanje HMGB1 u nukleusu sprečava njegove proinflamatorne efekte. FoxP3, "forkhead" boks P3, funkcioniše kao master transkripcioni faktor u razviću i funkciji regulatornih T ćelija koje imaju imunosupresivnu aktivnost. FOXO1a je transkripcioni faktor sposoban da indukuje antiinflamatorne gene, kao što je angiopoetin-2. Prema tome, nukleusna lokalizacija štiti FOXO1a od fosforilacije, isključivanja iz nukleusa i potom degradacije. RxRα je retinoidni nukleusni receptor koji reguliše ekspresiju hemokina kao što su Ccl6 i Ccl9 u makrofagima. RxRα je esencijalan za regrutovanje leukocita na mesto inflamacije. Zadržavanje RxRα u nukleusu rezultuje regrutovanjem i deplecijom transkripcionih koaktivatora koji bi inače služili za vezivanje proinflamatornih transkripcionih faktora kao što su NFκB. PPARγ je ligandom aktivirani transkripcioni faktor koji pripada superfamiliji nukleusnih receptora i reguliše ekspresiju antiinflamatornih gena.
[0368] Rezultati, prikazani na SL. 14A i 14B, pokazuju nukleusnu lokalizaciju gornjeg tereta, čak i u prisustvu TNFα, za koji je poznato da indukuje inflamaciju. Rezultati ukazuju na sposobnost Jedinjenja 1 da indukuje antiinflamatorne puteve da bi se prevazišla inflamacija.
11
Evaluacija efekata Jedinjenja 1 na kognitivne deficite posle BCCI povrede kod pacova
[0369] Povreda bilateralnim kontrolisanim kortikalnim udarcem (bilateral controlled cortical impact, BCCI) u medijalnom frontalnom korteksu (medial frontal cortex, MFC) mužjaka Sprague Dawley pacova indukovana je pomoću uređaja za kontuziju korteksa. Posle CCI, kontroliše se površinsko krvarenje korteksa ako ga ima, i fascija i koža se zašiju. Lažno operisani pacovi se anesteziraju, postave u stereotaksični aparat, i obavi se kraniotomija.
[0370] Progesteron, 16 mg/mL, rastvori se u 22.5% 2-hidroksipropil-β-ciklodekstrinu i inicijalna injekcija (16 mg/kg) se daje i.p.1 h posle povrede. Ostale injekcije (sve 16 mg/kg) daju se subkutano, 6 h posle povrede, što se nastavlja tokom 5 dana posle povrede. Injekcije progesterona se pripremaju u koncentraciji od 1 mL/kg. Progesteron se koristi kao kontrola.
[0371] Jedinjenje 1, 0.2, 0.4, i 0.6 mg/mL, suspenduje se u prenosniku (0.6% tež./zapr. Pluronic® F-68 i 0.6% tež./zapr. PVP K-29/32 u vodi) i primenjuje p.o u koncentraciji od 10 mL/kg, 16 h pre povrede i 2 h posle povrede, i sa primenom se nastavlja tokom 4 dana. Kontrolni pacovi primaju ekvivalentne injekcije prenosnika Jedinjenja 1, u istim vremenskim tačkama. Grupe tretmana zbirno su prikazane u Tabeli 11.
Tabela 11. Grupe tretmana
11
[0372] Morrisov test vodenog polja (Morris water maze, MWM) je zadatak orijentacije u prostoru, kojim se kod glodara meri učenje i pamćenje pomoću korišćenja vizuelnih orijentira. Tokom nekoliko dana, subjekti uče da nađu skrivenu platformu. MWM test se izvodi dve nedelje posle povrede. Mužjaci Sprague Dawley pacova se ostave da plivaju u bazenu dok ne dođu do platforme locirane u jugozapadnom kvadrantu bazena, ili dok ne prođe 90 sekundi. Ponašanje se prati video kamerom koja je okačena iznad bazena i analizira se korišćenjem softvera za analizu video trake (ANY-maze).
[0373] Efekti Jedinjenja 1 i progesterona na učenje u MWM testu prikazani su na SL.
15A. Dvofaktorska ANOVA analiza ponovljenih merenja nalazi značajne efekte tretmana. U poređenju sa lažno povređenim pacovima, BCCI-povređeni pacovi pokazali su značajan deficit orijentacije u prostoru, na šta ukazuje značajan porast vremena potrebnog za pronalaženje skrivene platforme tokom 5-dnevne faze učenja (SL.15A). U poređenju sa BCCI-povređenim pacovima tretiranim prenosnikom, Jedinjenje 1 (2, 4 i 6 mg/kg) pokazuje dozno zavisno smanjenje vremena potrebnog za pronalaženje skrivene platforme, sa značajnim efektima na dane 17 i 18 posle povrede uz dozu od 6 mg/kg i na dan 18 uz dozu od 4 mg/kg. Podaci sugerišu da Jedinjenje 1 ima neuroprotektivni efekat.
[0374] SL.15C je fotografija celog mozga životinja koje su dobile lažne lezije ("sham"), CCI prenosnik (kontrola), ili CCI Jedinjenje 1 (6 mg/kg), i pokazuju rezultate kvalitativnog vizuelnog ispitivanja celog mozga pre sečenja vibratomom. Posmatranje
11
pokazuje da nijedna (0 od 4) "sham" životinja nije imala oštećenje dorzomedijalnog kortikalnog tkiva. Nasuprot tome, sve četiri CCI kontrole ispoljile su jaku bilateralnu povredu ograničenu na ovaj region korteksa. CCI životinje koje su primale Jedinjenje 1 pokazale su oštećenje u opsegu od umerenog do minimalnog. Treba napomenuti da je mozak sa najvećim oštećenjem u grupi životinja koje su primale Jedinjenje 1 bio manje oštećen nego svi mozgovi u CCI kontrolnoj grupi.
[0375] Meren je nivo ekspresije nekoliko citokina u plazmi uzetoj od pacova iz svih grupa tretmana. Uzorci su dobijeni, zamrznuti i držani su na -80 °C. Na dan eksperimenta, uzorci su otopljeni, razblaženi četiri puta i analizirani u pogledu ekspresije citokina, na Luminex platformi. Analizirana je ekspresija citokina GRO/KC, IFNγ, IL-1B, IL-6, IL-10, IL-12p70 i TNFa u uzorcima, korišćenjem multipleks kita, proizvođač Millipore. Kako je pokazano na SL. 15B, kod uzoraka su zapaženi isti obrasci nivoa ekspresije. Najveća promena bila je vezana za IL-10. Jedinjenje 1 u dozi od 6 mg/kg smanjilo je IL-10 u poređenju sa kontrolnom grupom tretiranom prenosnikom.
[0376] U mnogo slučajeva, traumatska povreda pokreće sekundarni odgovor na povredu. U mnogo slučajeva, rezultat će biti inflamacija. Inflamatorni odgovor je vođen citokinima i hemokinima i delom se propagira proizvodima poreklom iz oštećenog tkiva (sa povredom udruženi molekularni obrasci).
[0377] Sindrom multiple disfunkcije organa (multiple organ dysfunction syndrome, MODS), je nedovoljno shvaćen sindrom sekvencijalnog i postepenog gubitka funkcije organa, najčešći je uzrok kasnih smrti posle povrede, i značajno doprinosi mortalitetu i morbiditetu. Smatra se da do MODS dolazi, delom, zbog preterane ili loše prilagođene aktivacije inflamatornih puteva.
[0378] Podaci dobijeni kvantitativnim određivanjem ćelijske gustine sakupljeni su iz anti-NeuN imunoobeleženih podsekcija približno 2-3 mm anteriorno od bregme. Regioni od interesa (ROI) izvučeni su (slepo u odnosu na eksperimentalne uslove) oko slojeva IV-VI u kortikalnom regionu pored mesta povrede kod CCI-tretiranih životinja ili u ekvivalentnoj zoni (dorzalni korteka) kod "sham" životinja. ROI slične površine evaluiran je i u ventralnom koritikalnom regionu istog preseka. Identifikacija ćelija obavljena je korišćenjem modula za brojanje ćelija Keyence BZ-II Analyzer softvera. Koeficijenti oblasti ćelije-po-sivoj masi (cell-to-gray matter, CG) određivani su za svaki
12
ROI. "sham" životinje pokazale su uniformno gusto obeležavanje i u dorzalnim i u ventralnim regionima. Prema očekivanju, CCI kontrolne životinje pokazale su smanjene CG koeficijente i u dorzalnoj (-45% u poređenju sa "sham") i u ventralnoj (-30% u poređenju sa "sham") kortikalnoj zoni u odnosu na "sham" životinje (SL. 15D). The CCI-indukovana redukcija CG koeficijenta bila je ublažena tretmanom Jedinjenjem 1 u ventralnom korteksu (-3% u poređenju sa "sham"; p = 0.09). Iako efekat Jedinjenja 1 u odnosu na tretman prenosnikom u ventralnom korteksu nije statistički značajan, pretpostavlja se da bi u većoj studiji ovaj efekat dostigao statističku značajnost. Nije detektovan efekat Jedinjenja 1 u dorzalnom kortikalnom regionu (-32% u poređenju sa "sham") u neposrednoj blizini mesta povrede. Razlika u zapaženim efektima Jedinjenja 1 na ventralni region u odnosu na dorzalni region može biti posledica efekta praga u vezi sa stepenom povrede, koji je inverzno povezan sa udaljenošću od mesta povrede. Tako, oštećenje dorzalnog kortikalnog regiona može da bude suviše jako da bi moglo da se ispolji delovanje Jedinjenja 1 pod ovim uslovima.
[0379] Imunofluorescentni metod je upotrebljen za ispitivanje uticaja TBI na nekoliko puteva imunskog odgovora, i određivanje da li Jedinjenje 1 može da posreduje u njegovim neuroprotektivnim efektima preko jednog ili više ovih puteva. Semikvantitativna merenja sekundarnog odgovora na povredu vršena su korišćenjem imunofluorescentnog obeležavanja za antipacovski IgG (indikator permeabilnosti krvno-moždane barijerer (BBB)), i TNFα (indikator nervne inflamacije). Svi markeri su slikani na uveličanju 20X u oblastima korteksa koje okružuju mesto povrede, na susednim potpresecima unutar 300 µm od onih koji su korišćeni za procenu NeuN obeležavanja. Za svaki obeleživač, ciljni ROI bio je unutar slojeva IV-VI uz mesto povrede (ili u ekvivalentnom regionu dorzalnog korteksa "sham" životinja), i referentni ROI su bili iz istih lamina u ventralnom korteksu. Normalizovani inetnzitet fluorescencije procenjen je za svaki od dva ROI. Za sve obeleživače, određeno je da se referentno mesto u ventralnom korteksu nije razlikovalo između grupa (p>0.5); prema tome, određivan je procenat ciljne prema referentnoj vrednosti (IF).
[0380] Antipacovski IgG eksprimirao se u neuronima (označeno glavama strelice na SL.
15E) u povređenom tkivu. SL. 15E pokazuje da je antipacovski IgG distribuiran u neuropili oštećenih oblasti kortikalnog tkiva. Antipacovski IgG nije bio prisutan u "sham" tkivu. TNFα imunopozitivne ćelije (označene glavama strelice na SL. 15E) bile su jasno vidljive u oštećenom tkivu koje okružuje mesto povrede kod kontrolnih životinja. Ovi elementi su uglavnom odsutni kod životinja tretiranih Jedinjenjem 1 i "sham" životinja. SL. 15E pokazuje da Jedinjenje 1 smanjuje sekundarne odgovore na povredu kod pacova izloženih povredi mozga.
Kolagenom indukovani artritis (CIA), studija br.2
[0381] Da bi se dodatno ispitali efekti jedinjenja opisanih u ovom tekstu na biomarkere inflamacije, uspostavljen je drugi CIA model. U ovom modelu, grupe su označene kao grupa A (naivni), grupa B (model; tretirani prenosnikom), grupa C (Jedinjenje 2, 5 mg/kg QoD). Pacovi u grupama B i C imunizovani su intradermalno goveđim kolagenom tipa II u IFA na dan 0, i pojačavajuća injekcija im je data na dan 7. Jedinjenje 2 primenjeno je oralno kod pacova sa CIA, posle uspostavljanja artritisa (dan 11). Razvoj CIA ispitivan je makroskopskim dodeljivanjem skora i merenjima otoka šapa. Procenjivanje je vršeno svakog dana tokom prvih 5 dana posle senzitizacije (dan 7), i zatim dva puta nedeljno (ponedeljak i četvrtak) do dana 28, korišćenjem sistema kliničkog skora opisanog u Tabeli 7, gore. Pored toga, ELISA za CD45, CRP, CCL2/MCP-1, TNF-α, IL1-β, IL-6, IL-17, i merenja katepsina K i elastaze obavljena su 4 dana (dan 15 studije) i 10 dana (dan 21 studije - pik bolesti) posle tretmana jedinjenjem i na samom kraju studije (dan 28), na životinjama iz svih grupa. Pored toga, poslednjeg dana studije (dan 28), nekoliko reprezentativnih životinja iz svake grupe izloženo je trodimenzionalnoj mikrotomodenzitometriji petne kosti, i kvantifikovana je erozija kosti u šapama.
[0382] SL. 16A i 16B pokazuju da pacovi tretirani Jedinjenjem 2 u dozi od 5 mg/kg imaju značajno smanjenje otoka zgloba (SL. 16B) i kliničkih skorova (SL. 16A) u poređenju sa pacovima koji su tretirani prenosnikom.
[0383] SL. 17A i 17B pokazuju da pacovi tretirani Jedinjenjem 2 u dozi od 5 mg/kg imaju značajno smanjenje erozije kosti u zadnjim šapama u poređenju sa pacovima koji su tretirani prenosnikom. Stanje zgloba životinja tretiranih Jedinjenjem 2 bilo je uporedivo sa onim kod naivnih životinja Nasuprot tome, životinje tretirane prenosnikom ispoljile su statistički značajan porast erozije kosti u svojim zadnjim šapama.
[0384] LUMINEX® test i ELISA korišćeni su za merenje efekata Jedinjenja 2 na nivoe proinflamatornih citokina i markera inflamacije. Sinovijalna tečnost skuplja se na dan 21, posle prve imunizacije, od 2 pacova u model grupi i 2 pacova u grupi tretiranoj Jedinjenjem 2, i na kraju studije od 2 pacova iz naivne grupe, 3 pacova iz model grupe i 3 pacova iz grupe tretirane Jedinjenjem 2.
[0385] SL. 17C-17F pokazuju da, u poređenju sa model grupom, Jedinjenje 2 ima inhibitorne efekte na proizvodnju proinflamatornih citokina i inflamatornog markera u uzorcima sinovijalne tečnosti. Redukovani citokini uključivali su IL-1β, IL-6 i MCP-1, a marker inflamacije je C-reaktivni protein (CRP).
[0386] LUMINEX® test korišćen je i za merenje nivoa proinflamatornih citokina u serumu. Uzorci seruma (1 mL krvi po pacovu) sakupljeni su 4 dana posle tretmana jedinjenjem (dan15), 10 dana posle tretmana jedinjenjem (obično pri piku bolesti - dan 21) i na kraju studije (dan 27).
[0387] SL.17G pokazuje da, u poređenju sa model grupom, Jedinjenje 2 ima inhibitorni efekat na proizvodnju IL-1β u uzorcima seruma.
Model eksperimentalnog autoimunskog encefalomijelitisa (experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)
[0388] Model EAE je prihvaćeni model za izučavanje demijelinizujućih bolesti CNS kod ljudi, na primer multiple skleroze. Efekti Jedinjenja 1 ispitivani su u MOG-indukovanom EAE mišjem modelu, kod ženki C57B1/6J miševa. Životinje su podeljene u 3 grupe označene kao grupa I (prenosnik, kontrola), grupa II (deksametazon-pozitivna kontrola) i grupa III (Jedinjenje 1, 7.5 mg/kg). Slani rastvor, deksametazon i Jedinjenje 1 davani su prema rasporedu prikazanom na SL. 18A. Slani rastvor i deksametazon davani su intraperitonealno, svakog dana počevši od dana 0. Jedinjenje 1, 7.5 mg/kg, primenjivano je oralno počevši od dana 11 (početak bolesti) ponedeljkom, sredom i petkom, 3 uzastopne nedelje. Bolest je indukovana jednom intradermalnom injekcijom MOG emulgovanog u kompletnom Freundovom adjuvansu (CFA) na dan studije 0, praćeno intraperitonealnom suplementnom imunostimulacijom toksinom pertusisa (pertussis toxin, PT) izvedenom na dan 0 studije i ponovo 48 sati kasnije na dan 2 studije.
12
[0389] Kako je pokazano na SL. 18B, prvi znaci bolesti primećeni su 7-9 dana posle MOG imunizacije i pik bolesti razvio se na dan 17 studije. Tretman deksametazonom, koji je počeo na dan 0 u dozi od 1 mg/kg IP, značajno je redukovao kliničke skorove na dane 8-37 studije (grupa II) u poređenju sa kontrolnom grupom tretiranom prenosnikom (grupa I). Tretman Jedinjenjem 1, koji je počeo od dana 11 u dozi od 7.5 mg/kg (grupa III) značajno smanjuje skor i jačinu bolesti. Ovi rezultati prikazani su na SL.18B.
[0390] U svetlu rezultata dobijenih pod uslovima ove studije, tretman Jedinjenjem 1 u dozi od 7.5 mg/kg p.o. koji je počeo od dana 11 studije za rezultat ima smanjenje skora i jačine bolesti.
Primer 18. Modeli zarastanja rana
Materijali
[0391] Miševi - C57BL/6J, mužjaci, stari 6-8 nedelja, SPF, dobijeni su od Harlan Laboratories LTD. Miševi se drže u sterilnim individualno ventiliranim kavezima (individual ventilated cages, IVC), uz hranu i vodu dostupne ad libitum, 12h/12h cikluse dana i noći, kontrolisanu temperaturou 19-21°C, kontrolisanu vlažnost od 40 - 60%, pozitivni vazdušni pritisak unutar prostorije za životinje, i kontrolu zdravstvenog stanja svaka 3 meseca, koja se obavlja u odnosu na odabrane indikatore bolesti.
[0392] Svinje - Sus scrofa domestica, domaća svinja (uglavnom Landrace × velika bela), ženke, približno 60 kg, 4-5 meseci stare, Lahav Institute of Animal Research, Kibbutz Lahav, Israel. Svinje se drže u čistoj ne-SPF sredini, vodu dobijaju ad libitum direktno iz javnih izvora, hranu u skladu sa preporukom iz standardnih tabeli rasta pod veterinarskim nadzorom.
[0393] IZOFLURAN 99.9% za inhalaciju, partija 6027962, Abbot Laboratories Ltd, Velika Britanija
Voda - voda za injekcije, serija 11481012, B. Braun Melsungen AG, Nemačka
Slani rastvor - 0.9% natrijum hlorid za injekcije, serija 12224012, B. Braun Melsungen AG, Nemačka
DMSO - dimetil sulfoksid, D2650, Sigma-Aldrich Inc., SAD
PLURONIC® F-68
PVP K-29/32
Evaluacija efekata sistemske primene i površinske primene Jedinjenja 1 na rane na koži kod C57BL miševa
[0394] Efekti Jedinjenja 1 na zarastanje rane na koži izučavani su na mišjem modelu rane nanete uzdužnom incizijom kroz punu debljinu kože. Po dolasku, životinje su označene markerom na uvu, izmerene i ostavljene da se prilagode nekoliko dana pre početka eksperimenta. Na dan nanošenja rane, miševi su izmereni i podeljeni u 6 eksperimentalnih grupa sa po 6 životinja po grupi, u skladu sa nasumičnim raspoređivanjem stratifikovanim prema razlikama u težini. Pre hirurške procedure, miševi su anestezirani izofluranom i leđa životinja su ošišana. Uzdužne incizije kroz punu debljinu kože, duge 20 mm napravljene su na leđima životinja (paralelno sa kičmom) korišćenjem standardnog skalpela. Tri sata posle nanošenja rane, zbog elastičnosti kože i aktivnosti životinja, incizija je dobila elipsoidan oblik. Na ovom stupnju, meri se najšira oblast rane da bi se uspostavila bazalna vrednost širine rane. Evaluacija zarastanja rane vrši se merenjem najšire oblasti rane. Grupe tretmana sastojale su se od grupe tretirane oralnom gavažom ili grupe tretirane površinski. Tokom eksperimenta, rane su fotodokumentovane i obavljena je morfološka analiza. Na kraju eksperimenta, 8 dana posle nanošenja rane, miševi su žrtvovani, merena je širina rane, i sakupljeni su i analizirani isečci područja rane.
Tabela 12. Grupe na početku studije
12
[0395] Rastvori za doziranje pripremaju se sveži svakog dana doziranja. Jedinjenje 1 za oralnu gavažu dobijeno je u vidu liofilizovanog praška i rekonstituisano u vodenom rastvoru 0.6% tež./zapr. Pluronic® F-68 i 0.6% tež./zapr. PVP K-29/32 da se napravi 0.75 mg/mL stok suspenzije, koja se posle toga razblažuje vodenim 0.6% tež./zapr. Pluronic® F-68 i 0.6% tež./zapr. PVP K-29/32 za pripremanje radnih rastvora od 7.5 mg/kg i 4 mg/kg. Jedinjenje 1 za površinsku primenu dobijeno je u vidu liofilizovanog praška i suspendovano u vodi do koncentracije od 10 mM, i dodatno se razblažuje u vodi da se dobije konačna radna koncentracija za površinsku primenu.
[0396] Kao deo dnevne morfološke procene, obavlja se fotodokumentovanje korišćenjem digitalne kamere FinePix S700. SL. 19 predstavlja fotografije reprezentativnih rana iz svake eksperimentalne grupe na dan 5 posle nanošnja rane. Crni bar predstavlja 1 cm. Napravljene su ukupno 33 rane kod 33 miša. Morfološka procena pokazala je pozitivni efekat tretmana Jedinjenjem 1, davanim oralno ili površinski. Svi tretmani indukovali su bolje zarastanje rane nego u kontroli. Tretirane rane bile su manje i kraste su bile bleđe, tanje i homogene bez napuklina, što je ukazivalo na kasniji stadijum zarastanja rane. Evaluirane istog dana kao i grupa tretmana, rane iz kontrolne grupe izgledale su veće i bile su prekrivene debelim naprslim krastama u okviru kojih je bilo izloženo nezaraslo područje rane (zapaženo u vidu crvenkastih i ružišastih oblasti) na obodu i u sredini rana.
[0397] Morfološka analiza je primarni parametar koji se koristi za procenu zarastanja rana u prekliničkim studijama na životinjama i kliničkim tretmanima rana kod ljudi. Na
12
osnovu morfološke analize, Jedinjenje 1 pokazalo je efikasnost i pozitivno je uticalo na zarastanje rane. Treba pomenuti da su i površinska primena i sistemska primena Jedinjenja 1 rezultovale boljim zarastanjem rane, što je procenjeno smanjenjem rane i boljim osobinama kraste.
Evaluacija efekata površinske primene testnog jedinjenja na rane na koži svinje
[0398] Efekti testnog Jedinjenja na zarastanje rane na koži mogu se izučavati na modelu rane nanete uzdužnom incizijom kroz punu debljinu kože, kod svinje. Po dolasku, životinje su označene markerom na uvu, izmerene i ostavljene da se prilagode nekoliko dana pre početka eksperimenta. Tri dana pre intervencije, svinje se prebace u hospitalizacionu jedinicu na aklimaciju. Dvanaest sati pre procedure, ukida se hrana. Na dan intervencije, svinje se anestziraju korišćenjem ketamina, ksilazina, diazepama i izoflurana. Dlake na leđima torakalnog i abdominalnog dela tela se pažljivo iseku korišćenjem Oster® mašinice za šišanje (veličina sečiva 30) i napravi se 20 pojedinačnih regiona veličine po 4 cm<2>u dva reda (10 regiona po redu). Deset pari incizija kroz punu debljinu kože, dugih 2.5 cm naprave se korišćenjem sečiva za skalpel #11, na 4 cm udaljenosti bočno sa obe strane središnje dorzalne linije.
[0399] Posle hirurške procedure, rane se podele u eksperimentalne grupe i tretiraju dnevno površinskim nanošenjm na područje rane i na ivice rane. Područje tretmana sastojalo se od površine kože do 2 cm udaljeno od centra rane. Dozirajući rastvori nanošeni su postupno na svaku ranu korišćenjem pipete, dok tkivo ne apsorbuje čitavu zapreminu tretmana (na primer, 1 mL slanog rastvora ili testnog jedinjenja).
[0400] Nekoliko sati posle nanošenja rane, zbog elastičnosti kože i aktivnosti životinja, incizije dobijaju elipsoidan oblik. Na ovom stupnju, meri se najšira oblast rane da bi se uspostavila bazalna vrednost širine rane. Evaluacija zarastanja rane vrši se merenjem najšire oblasti rane. Tokom eksperimenta, rane su fotodokumentovane i obavljena je morfološka analiza. Na kraju eksperimenta, (na primer 12 dana posle nanošenja rane), svinje su žrtvovane primenom anestetika i KCl. Procenjivana je morfologija rane, merena je širina rane i sakupljeni su isečci područja rane i fiksirani 4% paraformaldehidom za dodatnu analizu. Posle fiksacije, isečci rane su fotodokumentovani digitalnom kamerom sa visokom rezolucijom, na primer, FinePix
12
S700, i isečci područja rane analizirani su histopatološki. Procena zarastanja rane obavljena je na paran način, u kojem je svaka rana tretirana testnim jedinjenjem direktno upoređivana sa kontrolnom ranom na istoj anatomskoj lokaciji sa druge strane središnje linije leđa. Ovo parno procenjivanje zarastanja ključno je u vezi sa objektivnom procenom i objektivnim upoređivanjem tretiranih rana i netretiranih rana, zbog varijabilnosti udružene sa stepenom vaskularizacije i cirkulacijom krvi u različitim oblastima kože leđa svinje. Rane locirane na prednjem delu bliže vratu pokazuju bolje osobine zarastanja nego rane locirane na zadnjem delu leđa.
Tabela 13. Grupe na početku studije
[0401] Rastvori za doziranje pripremaju se sveži svakog dana doziranja. Testno jedinjenje dobijeno je u vidu liofilizovanog praška i rekonstituisano u injektabilnom 0.9% natrijum hloridu da se dobije stok suspenzija koncentracije 3 mg/mL. Stok suspenzija se dodatno razblažuje injektabilnim 0.9% natrijum hloridom do finalne koncentracije od 3 µM i 1 µM, za površinsku primenu.
[0402] Homogene, tanke i ujednačeno organizovane površine kraste bez vlaženja, krvarenja ili sekrecije iz rane, ukazuju na zarastanje rane. Visoko heterogene, ispucale i tamne kraste ukazuju na pojavu brojnih eksudacija, vlaženja i krvarenja tokom procesa zarastanja rane-
12
Evaluacija efekata površinske primene testnog jedinjenja na procese ranog zarastanja rane kod svinja
[0403] Efekti testnog jedinjenja na rano zarastanje rane mogu se izučavati na modelu rane nanete uzdužnom incizijom kroz punu debljinu kože, kod svinje. Pet pari uzdužnih incizija dugih 2.5 cm kroz celu debljinu kože napravljeno je na prednjem delu leđa anesteziranih svinja korišćenjem sečiva za skalpel #11, na 4 cm udaljenosti bočno, sa obe strane dorzalne središnje linije. Nekoliko sati posle procedure, uzdužna incizija postaje elipsoidna rana.
[0404] Rane su podeljene u eksperimentalne grupe i tretirane svakog dana površinskim nanošenjem na oblast rane (uključujući ivicu i područje kože u blizini rane). Faza tretmana počinje 24 sata posle nanošenja rane. Dozirajući rastvori nanose se postepeno na svaku ranu korišćenjem pipete, dok tkivo ne apsorbuje čitavu zapreminu tretmana (na primer, 1 mL slanog rastvora ili testnog jedinjenja).
[0405] Na dan 5, stanje zarastanja rane i morfologija procenjuju se u odnosu na sledeće parametre: krvarenje, vlaženje, otok, zapaljenje, sekrcija gnoja i formiranje kraste. Procena se obavlja na paran način, u kojem se svaka rana tretirana testnim jedinjenjem direktno upoređuje sa kontrolnom ranom na istoj anatomskoj lokaciji sa druge strane središnje linije leđa.
Tabela 14. Grupe na početku studije
[0406] Rastvori za doziranje pripremaju se sveži svakog dana doziranja. Testno jedinjenje dobijeno je u vidu liofilizovanog praška i rekonstituisano u injektabilnom 0.9% natrijum hloridu da se dobije stok suspenzija koncentracije 3 mg/mL. Stok suspenzija se dodatno razblažuje 0.9% natrijum hloridom, za pripremanje konačnog površinskog rastvora koncentracije od 3 µM.
12
[0407] Procena morfologije zarastanja rane sprovodi se na dan 5 tretmana. Ispituje se otok, dodeljuje mu se skor prema jačini za svaku ranu i opisuje se kao blag, umeren ili jak. Rane koje pokazuju umeren i jak otok prikazuju se kao procenat od ukupnog broja rana u eksperimentalnoj grupi. Sekrecija se ispituje i dodeljuje joj se skor po binarnom modalitetu: rana koja pokazuje minimalnu sekreciju razmatra se kao pozitivna, a rana bez detektabilne sekrecije razmatra se kao negativna za ovaj parametar. Rane koje pokazuju sekreciju (pozitivne za ovaj parametar) predstavljaju se kao procenat od ukupnog broja rana u eksperimentalnoj grupi. Krasta se smatra kompletno formiranom kada kontinuirani sloj tvrde, suve, crvenkaste, tamnožute ili mrke formacije prekriva čitavo područje rane i snažno je priljubljeno uz ležište rane i prema tome, obezbeđuje kontinuiranu i snažnu barijeru između spoljašnje sredine i povređenih tkiva. Formiranje kraste se ispituje i dodeljuje mu se skor po binarnom modalitetu: rane koje pokazuju potpuno formiranu krastu koja je suva i jaka, smatraju se pozitivnim, a rane bez kraste ili sa krastom na ranijem stupnju smatraju se negativnim za ovaj parametar. Rane sa potpuno formiranim krastama prikazuju se kao procenat od ukupnog broja rana po grupi.
[0408] Otok, sekrecija i formiranje kraste takođe se procenjuju. Otok i sekrecija su delovi prekomernog inflamatornog odgovora koji može da odloži reparaciju tkiva i dovede do stvaranja neestetskog ožiljka.
Evaluacija efekata površinske primene testnog jedinjenja na rano zarastanje rane na koži svinje i iritacija i češanje udruženi sa oštećenom ili ranjenom kožom
[0409] Efekat testnog jedinjenja na zarastanje rane na koži može se izučavati na modelu rane nanete uzdužnom incizijom kroz punu debljinu kože, kod svinja. Tri dana pre intervencije, svinje se prebace u hospitalizacionu jedinicu na aklimaciju. Dvanaest sati pre procedure, ukida se hrana. Na dan intervencije, svinje se anesteziraju korišćenjem ketamina, ksilazina, diazepama i izoflurana. Dlake na leđima torakalnog i abdominalnog dela tela se pažljivo iseku korišćenjem Oster® mašinice za šišanje (veličina sečiva 30). Obeleži se deset pari područja od 4 cm<2>i uzdužne incizije kroz punu debljinu kože duge 2.5 cm naprave se korišćenjem sečiva za skalpel #11, bočno sa obe strane dorzalne središnje linije.
1
[0410] Posle hirurške procedure, rane se podele u eksperimentalne grupe i tretiraju dnevno površinskim nanošenjem na područje rane (uključujući ivice rane i područje kože u blizini rane udaljeno od rane do 2 cm u svim smerovima). Dozirajući rastvori se nanose postupno na svaku ranu korišćenjem pipete, dok tkivo ne apsorbuje čitavu zapreminu tretmana (na primer, 1 mL slanog rastvora ili testnog jedinjenja).
[0411] Nekoliko sati posle procedure, uzdužna incizija postaje elipsoidna rana, zbog elastičnosti kože i aktivnosti životinje. Tokom eksperimenta, rane su fotodokumentovane i obavljena je morfološka analiza. Procena se obavlja na paran način, u kojem se svaka rana tretirana testnim jedinjenjem direktno upoređuje sa kontrolnom ranom na istoj anatomskoj lokaciji sa druge strane središnje linije leđa. Tokom prvih 5 dana posle ranjavanja, beleže se morfologija rane i ponašanje životinja.
Tabela 15. Grupe na početku tretmana
[0412] Rastvori za doziranje pripremaju se sveži svakog dana doziranja. Testno jedinjenje dobijeno je u vidu liofilizovanog praška i rastvoreno u 100% DMSO do stok koncentracije od 15 mM. Dalje razblaživanje u injektabilnoj vodi obavlja se da se postigne finalna koncentracija od 3 µM i 1 µM za površinsku primenu.
[0413] Kao deo svakodnevne morfološke procene, obavlja se fotodokumentovanje rana korišćenjem, na primer, digitalne kamere sa visokom rezolucijom FinePix S700. Pored statusa rane, posmatraju se područja iritirane i izgrebane kože. Obično, češanje ne
1 1
dovodi do oštećenja rane ili ne interferira sa procesom zarastanja rane jer je rana naneta životinjama u blizini srednje linije leđa, tako da je životinji teško, gotovo nemoguće da dohvati ranu.
Evaluacija efekata Jedinjenja 1 u PVP/Pluronic® F-68 i Jedinjenja 1 u vodi na češanje udruženo sa zarastanjem kože kod miševa
[0414] U studijama rana na koži kod miševa, opisanim u ovom tekstu, posmatrano je i ponašanje životinja, i kvantifikovani su pokušaji uklanjanja ožiljaka, znaci nelagodnosti, i češanje rane. U svim studijama obavljenim na miševima analizirani su nenormalno ponašanje i nenormalno češanje i znaci bola. U ovim studijama, tretman je izvođen korišćenjem Jedinjenja 1 u PVP/Pluronic® F-68 i Jedinjenja 1 u vodi, uz upotrebu odgovarajućih prenosnika kao kontrola.
[0415] Tokom svih eksperimenata zarastanja rana kod miševa, praćeni su parametri udruženi sa zarastanjem rane, znaci iritacije kože i drugih stanja kože u području blizu rane i tretiranog područja kože. Pored toga, tokom faze tretmana u svim modelima zarastanja kože, posebna pažnja posvećena je ponašanju životinja, na primer pokazateljima nelagodnosti i bola; znacima češanja i ometenosti u vezi sa ranama i kožom. Umirujući i ublažujući efekti tretmana jedinjenjima bili su vidni u poređenju sa kontrolnim životinjama koje su bile sklone da se bave svojim ranama.
[0416] Kod miševa, tretman Jedinjenjem 1 u PVP/Pluronic® F-68 ili Jedinjenjem 1 u vodi smanjilo je pojavu bavljenja ranama u poređenju sa miševima tretiranim prenosnikom (DMSO u vodi, slani rastvor, PVP/pluronic ili voda).
[0417] Kod miševa, bavljenje ranama obično rezultuje uklanjanjem kraste i krvarenjem ili oštećenjem novoformiranog tkiva na ležištu rane, koje je čvrsto prikačeno za krastu. Veliki broj takvih događaja dešava se u grupama tretiranim prenosnikom (oko 20 - 30% u svim eksperimentima).
[0418] Sumirajući stanja kože i ponašanje životinja, može se zaključiti da tretman rana Jedinjenjem 1 u PVP/Pluronic® F-68 ili Jedinjenjem 1 u vodi sprečava bavljenje ranama kod miševa, moguće zbog ublažujućih i umirujućih efekata tretmana jedinjenjima na povređenu i iritiranu kožu.
1 2
Dozni odgovor testnog jedinjenja na zarastanje rane na koži kod miševa
[0419] Efekti testnog jedinjenja na zarastanje rane na koži mogu da se izučavaju na mišjem modelu rane na koži nanete uzdužnom incizijom kroz punu debljinu kože. Po dolasku, sve životinje su obeležene oznakom na uvu, izmerene i ostavljene da se prilagode nekoliko dana pre početka eksperimenta. Na dan nanošenja rane, miševi su podeljeni u 7 eksperimentalnih grupa (N=6 ili N=7), po modelu stratifikovane randomizacije prema razlikama u težini. Grupa sa prenosnikom prima 0.1% DMSO u vodi, dok se grupa pozitivne kontrole tretira vodenim rastvorom 0.6% tež./zapr. Pluronic® F-68 i 0.6% tež./zapr. PVP K-29/32. Pre hirurške procedure, miševi se anesteziraju izofluranom i ošiša im se dlaka na leđima. Uzdužne incizije duge 20 mm, kroz punu debljinu kože naprave se korišćenjem standardnog sečiva za skalpel, na leđima životinja (paralelno kičmi). Tri sata posle nanošenja rane, zbog elastičnosti kože i aktivnosti životinja, incizije dobijaju elipsoidni oblik. Na ovom stadijumu, meri se najširi deo rane da bi se uspostavila bazalna širina rane. Evaluacija zarastanja rane vrši se merenjem najšireg područja rane. Tretman rana obavlja se površinskim nanošenjem (svakog dana) dozirajućih rastvora (na primer, 0.2 mL) direktno na rane.
Tabela 16. Grupe na početku studije
1
[0420] Rastvori za doziranje pripremaju se sveži svakog dana doziranja. Testno jedinjenje dobijeno je u vidu liofilizovanog praška i rekonstituisano u 0.1% DMSO u vodi do stok suspenzije koncentracije 3 mg/mL. Stok suspenzija se dalje razblažuje u 0.1% DMSO u vodi da bi se pripremio finalni rastvor za površinsku primenu. Rane u kontrolnim grupama površinski se tretiraju 0.1% DMSO u vodi ili vodenim rastvorom 0.6% tež./zapr. Pluronic® F-68 i 0.6% tež./zapr. PVP K-29/32.
[0421] Na kraju eksperimenta, 8 dana posle nanošenja rane, miševi se žrtvuju inhalacijom CO2, meri se širina rane i sakupe se isečci područja rane i analiziraju histološki. Isečci se fiksiraju korišćenjem 4% paraformaldehida. Posle fiksacije čitavog područja rane, obavi se disekcija 5 mm najšireg dela rane i ovi uzorci se ukalupe u parafinu. Parafinski kalupi se pripremaju korišćenjem standardne procedure postepene dehidratacije i kalupljenja tkiva u parafinu. Posle toga, pripremaju se histološki preseci i tkiva se boje hematoksilinom i eozinom (H&E). Pločice obojene H&E se pregledaju i procenjuje se efikasnost zaceljivanja rane.
[0422] Odmaklo zatvaranje kože procenjeno je na dan 8 ispitivanjem eozinom obojenog zdravog derma i ivica novoformiranog derma na procepu rane. Rane sa obe dermalne ivice, posmatrane pod mikroskopom na uveličanju od 100x (BX41 Olympus ili Axiovert 25, Zeiss), smatrane su pozitivnim za parametar odmaklog zatvaranja derma, zarastanja kože. Broj rana u ovom odmaklom zatvaranju derma predstavljen je kao procenat od ukupnog broja rana u eksperimentalnim grupama.
[0423] Odmaklo zatvaranje epiderma procenjeno je na dan 8 korišćenjem bojenja H&E i analiziranjem histoloških preseka u oblasti najšireg dela rane. Rane koje pokazuju prisustvo kontinuiranog sloja epidrma koji pokriva čitav procep rane i rane sa najdalje odmaklom migracijom ivica epiderma posmatrane pod mikroskopm na uvličanju 400x smatrane su pozitivnim na parametar odmaklog zatvaranja epiderma. Rezultati su prikazani kao procenat od ukupnog, po eksperimentalnoj grupi.
[0424] Epidermalna migracija procenjena je na dan 8 korišćenjem bojenja H&E, analiziranjem kondenzovanog hematoksilinom obojenog novoformiranog epiderma na
1 4
obe ivice rane. Smatra se da je ivica epiderma migratorna kada novoformirana ivica epiderma prekriva oko 20-30% procepa rane. Migratorne epidermalne ivice po grupama broje se i predstavljaju kao procenat od ukupnog broja epidermalnih ivica (jednako dvostrukom broju rana u grupi). Smatra se da su obe epidermalne ivice migratorne u ranama koje ispoljavaju potpuno ili odmaklo zatvaranje epiderma. Napravljene su ukupno 62 rane kod 62 miša.
Tretiranje rana testnim jedinjenjem sprečava komplikacije pri zarastanju rane, kao što su hiperplazija epiderma i adhezije
[0425] Efekti testnog jedinjenja na zarastanje rane na koži mogu da se izučavaju na mišjem modelu rane na koži nanete uzdužnom incizijom kroz punu debljinu kože. Pre hirurške procedure, miševi se anesteziraju izofluranom i ošiša im se dlaka na leđima. Uzdužne incizije duge 20 mm kroz punu debljinu kože naprave se korišćenjem standardnog sečiva za skalpel, na leđima životinja (paralelno kičmi). Tri sata posle nanošenja rane, zbog elastičnosti kože i aktivnosti životinja, incizije dobijaju elipsoidni oblik. Evaluacija zarastanja rane vrši se merenjem najšireg područja rane. Tretman rana obavlja se površinskim nanošenjem na primer, 0.2 mL testnog jedinjenja direktno na ranu. Proces nege rane odvija se delimično u uslovima vlažnosti - svakodnevno posle tretmana rane su neko vreme vlažne. Na kraju eksperimenta, 8 dana posle nanošenja rane, miševi se žrtvuju, meri se širina rane i sakupe se isečci područja rane i histološki se analiziraju.
Tabela 17. Grupe na početku studije
1
[0426] Rastvori za doziranje pripremaju se sveži svakog dana doziranja. Testno jedinjenje dobijeno je u vidu liofilizovanog praška i rekonstituisano u 0.1% DMSO u vodi do stok suspenzije koncentracije 3 mg/mL, koja se dalje razblažuje u 0.1% DMSO u vodi da bi se pripremio finalni radni rastvor za površinsku primenu. Rane u kontrolnoj grupi površinski se tretiraju 0.1% DMSO u vodi ili vodenim rastvorom 0.6% tež./zapr. Pluronic® F-68 i 0.6% tež./zapr. PVP K-29/32.
[0427] Na kraju faze tretmana, na dan 8 posle nanošenja rane, miševi se žrtvuju inhalacijom CO2, i uradi se biopsija područja rane. Fiksacija tkiva rane vrši se 4% paraformaldehidom. Posle fiksacije čitavog područja rane, obavi se disekcija 5 mm najšireg dela rane i ovi uzorci se ukalupe u parafinu. Parafinski kalupi se pripremaju korišćnjem standardne procedure postupne dehidratacije. Posle toga, pripremaju se histološki preseci i tkiva se boje hematoksilinom i eozinom (H&E). Parametri zarastanja rane se procenjuju i prikazuju grafički.
[0428] Hiperplazija epiderma procenjuje se na dan 8. Broje se nemigratorne i hiperplastične ivice epiderma po grupi, i prikazuju kao procenat od ukupnog broja ivica epiderma (što iznosi dvostruki broj rana po grupi). Hiperplastične epidermske ivice se procenjuju korišćenjem bojenja H&E, analiziranjem kondenzovanih, hematoksilinom obojenih područja epiderma. Kada ivica epiderma izgleda deblja od normalnog epiderma u oblasti zdrave kože i kada takva ivica epiderma ne pokazuje migraciju prema zatvaranju procepa rane, smatra se da je hiperplastična i da nije migratorna.
[0429] Adhezije na procepu rane procenjuje se na dan 8. Adhezije se procenjuju analiziranjem ćelijskih i tkivnih struktura na procepu rane. Adhezijama rane se dodeljuje skor na skali blago, umereno ili jako. Za negativni skor se smatra onaj kada postoji ugrušak na procepu rane ili je normalno granulaciono tkivo zamenjeno drugim tkivom, kao što je su skeletni mišići ili ekstenzivno limfoidno tkivo. Nekoliko adhezija ili abnormalna granulacija, koje okupiraju više od 40% procepa rane smatraju se za jake. Smatra se da je adhezija slaba kada nije značajna i ne interferira sa normalnim obnavljanjem tkiva kože. Rane sa jakim adhezijama izračunate su kao procenat od
1
ukupnog broja rana po eksperimentalnoj grupi i prikazane na grafikonu kako je pokazano. Kod 32 miša napravljene su ukupno 32 rane (64 epidermske ivice).
[0430] Jedna od najvažnijih komplikacija zarastanja rane je hiperplazija epiderma. U odgovoru na stresne signale udružene sa ranjavanjem, dolazi do proliferacije ćelija u bazalnom sloju epiderma da bi se kompenzovao gubitak kože. Normalno, tokom uobičajenog zarastanja rane, ćelije epiderma počinju migraciju u pravcu zatvaranja procepa ubrzo posle proliferacije. Kada ne dođe do migracije ili kada je ona usporena, na primer, u kožnim komplikacijama izazvanih hiperglikemijom kod dijabetičnih rana, hiperplazija epiderma postaje prominentna, i može izazvati i dodatne komplikacije pri zarastanju rane. U akutnim otvorenim ranama, kao u modelu upotrebljenom u ovom eksperimentu, ili u akutnim zašivenim ranama, kao što su postoperativne rane, smanjenje zarastanja epiderma udruženo sa hiperplazijom ivica epiderma povećava rizik od kontaminacije i drugih komplikacija zarastanja rane kao što su ponovno otvaranje rane, drenaža tečnosti, ili ispupčenje tkiva na mestu rane.
[0431] U procesu efikasnog zarastanja rane, primarni krvni ugrušak podleže postupnim promenama sa ciljem formiranja granulacionog tkiva na procepu rane, koji, posle remodeliranja, na kraju postaje novoformirano tkivo kože sa potpuno obnovljenim funkcijama. Kada dođe do adhezije tkiva koja nisu vezana za kožu u procepu rane, granulaciono tkivo se ne formira na odgovarajući način i, kao rezultat, konačno remodeliranje tkiva je ograničeno. Ovo može prouzrokovati druga ograničenja u funkcijama zaceljene kože.
Tretman rana testnim jedinjenjem u formulacijama na bazi slanog rastvora poboljšava zarastanje rane i sprečava stvaranje jakih adhezija
[0432] Efekti testnog jedinjenja na zarastanje rane na koži mogu da se izučavaju na mišjem modelu rane na koži nanete uzdužnom incizijom kroz punu debljinu kože. Hirurške procedure se obavljaju na 7-8 nedelja starim mužjacima C57BL miševa anesteziranim izofluranom. Pre hirurške procedure, miševi se anesteziraju izofluranom i iseče im se krzno. Uzdužne incizije kroz celu debljinu kože, duge 20 mm, naprave se standardnim sečivom skalpela. Tri sata posle ranjavanja, zbog elastičnosti kože i aktivnosti životinja, incizije dobijaju elipsoidni oblik. Na ovom stupnju, meri se najširi
1
deo rane da bi se uspostavila bazalna širina rane. Evaluacija zarastanja rane vrši se merenjem najšireg dela rane. Tretman rana obavlja se površinskim svakodnevnim nanošenjem 0.2 ml rastvora direktno na ranu. Proces nege rane odvija se delimično u uslovima vlažnosti jer su posle tretmana rane neko vreme vlažne (3-5 sati). Na kraju eksperimenta, 8 dana posle nanošenja rane, miševi se žrtvuju, meri se širina rane i sakupe se isečci područja rane i histološki se analiziraju.
Tabela 18. Grupe na početku studije
[0433] Rastvori za doziranje pripremaju se sveži svakog dana doziranja. Testno jedinjenje dobijeno je u vidu liofilizovanog praška i rekonstituisano u slanom rastvoru da se napravi stok suspenzija koncenetracije 3 mg/mL, koja se dalje razblažuje u slanom rastvoru da bi se dobila radna koncentracija od 3 µM za površinsku primenu. Rane u kontrolnoj grupi površinski se tretiraju slanim rastvorom.
[0434] Na kraju faze tretmana, 8 dana posle nanošenja rane, miševi se žrtvuju inhalacijom CO2, i uradi se biopsija područja rane. Fiksacija tkiva rane vrši se 4% paraformaldehidom. Posle fiksacije čitavog područja rane, obavi se disekcija 5 mm najšireg dela rane i ovi uzorci se ukalupe u parafinu. Parafinski kalupi se pripremaju korišćenjem standardne procedure postupne dehidratacije. Posle toga se pripremaju histološki preseci i tkiva se boje hematoksilinom i eozinom (H&E). Parametri zarastanja rane se procenjuju i grafički prikazuju.
[0435] Zatvaranje epiderma procenjuje se korišćenjem bojenja H&E, analiziranjem histoloških preseka na mestu gde je rana najšira. Rane koje pokazuju prisustvo kontinuiranog sloja epiderma koji pokriva čitav procep rane, i rane sa najdalje odmaklom migracijom epidermskih ivica kada se obe ivice posmatraju pod mikroskopom na uveličanju od 400x smatraju se pozitivnim za parametar odmaklog
1
zatvaranja epiderma rane. Rezultati se prikazuju kao procenat od ukupnog, po eksperimentalnoj grupi.
[0436] Zarastanje derma procenjuje se ispitivanjem eozinom obojenog zdravog derma i novoformiranih ivica derma na procepu rane. Rane sa obe dermalne ivice zapažene na uveličanju od 100x mikroskopa (BX41 Olympus ili Axiovert 25, Zeiss) smatraju se za pozitivne za parametar zarastanja odmaklog zatvaranja derma. Broj rana sa odmaklim zatvaranjem derma prikazuje se kao procenat od ukupnog broja rana u eksperimentalnim grupama.
[0437] Granulaciono tkivo procenjuje se korišćenjem bojenja H&E. Kada se primarni fibrinski ugrušak zameni fibroznim vezivnim tkivom koje sadrži adipocite, nove kapilare i infiltratom koji sadrži limfoidne ćelije, makrofage i plazma ćelije granulaciono tkivo se razmatra kao rano. Rano granulaciono tkivo zamenjeno tkivom sa visokom zastupljenošću fibroblasta i kolagenih vlakana smatra se za odmaklo granulaciono tkivo. Ukupno uzevši, oblasti odmaklog granulacionog tkiva na procepu rane prikazuju se kao procenat od ukupnog područja procepa rane. Procep rane koji pokazuje prisustvo odmaklog granulacionog tkiva koje prekriva 40% procepa rane smatra se pozitivnim za ovaj parametar. Rezultati se izračunavaju kao procenat od ukupnog broja rana po grupi.
[0438] Adhezije se procenjuju analiziranjem ćelijskih i tkivnih struktura na procepu rane. Adhezijama rane se dodeljuje skor na skali blago, umereno ili jako. Za negativni skor se smatra onaj kada postoji ugrušak na procepu rane ili je normalno granulaciono tkivo zamenjeno drugim tkivom, kao što su skeletni mišići ili ekstenzivno limfoidno tkivo. Nekoliko adhezija ili abnormalna granulacija koje okupiraju više od 40% procepa rane smatraju se za jake. Smatra se da je adhezija slaba kada nije značajna i ne interferira sa normalnim obnavljanjem tkiva kože. Rane sa jakim adhezijama izračunate su kao procenat od ukupnog broja rana po eksperimentalnoj grupi. Ukupno 19 rana (38 epidermske ivice) napravljeno je kod 19 miševa.
Evaluacija efekata površinske primene testnog jedinjenja na proces zarastanja i stvaranja ožiljka u kasnim fazama zarastanja rane, na koži svinje
1
[0439] Efekti testnog jedinjenja na kasne faze zarastanje rane na koži mogu se izučavati na modelu rane kod svinje nanete uzdužnom incizijom kroz celu debljinu kože. Na dan hirurške intervencije, svinja se anestezira korišćenjem ketamina, ksilazina, diazepama i izoflurana. Dlaka na leđima torakalnog i abdominalnog dela tela se iseče i napravi se 10 pari uzdužnih incizija kroz celu debljinu kože dugih 2.5 cm, korišćenjem sečiva #11 za skalpel, na 4 cm udaljenosti bočno sa obe strane dorzalne središnje linije. Posle hirurške procedure, rane se podele u eksperimentalne grupe i tretiraju dnevno površinskim nanošenjem na područje rane i ivice rane, uključujući tretiranje kože blizu rane udaljeno do 2 cm od rane u svim smerovima. Dozirajući rastvori se nanose postupno na svaku ranu korišćenjem pipete, dok tkivo ne apsorbuje čitavu zapreminu tretmana (na primer, 1 mL prenosnika ili testnog jedinjenja). Koža u blizini rane tretira se gazom natopljenom testnim jedinjenjem ili rastvorom prenosnika.
[0440] Tokom eksperimenta, rane se fotodokumentuju i obavlja se morfološka analiza. Na kraju faze tretmana (dan 19 posle nanošenja rana), svinje se žrtvuju doziranjem anestetikom i KCl. Ispituje se morfologija rana, rane se fotodokumentuju i uzmu se isečci područja rane za fiksaciju i dalju morfološku i histološku analizu.
Tabela 19. Grupe na početku studije
14
[0441] Rastvori za doziranje pripremaju se sveži svakog dana doziranja. Testno jedinjenje dobijeno je u vidu liofilizovanog praška i rastvoreno u 100% DMSO da bi se pripremio stok rastvor koncentracije 15 mM. Posle toga, vrši se razblaživanje u injektabilnoj vodi do postizanja finalne koncentracije od 3 µM i 1 µM, za površinsku primenu.
[0442] Na kraju faze tretmana (dan 19 posle nanošenja rana), procenjuje se zarastanje rana. Potpuno zarasle rane se iskazuju kao procenat od ukupnog broja rana po grupi. Prosečna širina ožiljaka u ranama koje su potpuno zarasle i pokazuju potpuno odvajanje kraste takođe se saopštavaju. Ožiljci se mere (mm) i izračunavaju se prosečna širina ožiljka i standardna devijacija. Napravljeno je ukupno 20 rana.
[0443] Na kraju faze tretmana (dan 19 posle nanošenja rana), svinje se žrtvuju predoziranjem anestetikom i KCl i urade se biopsije područja rane. Fiksacija isečaka rane obavlja se 4% paraformaldehidom. Posle fiksacije, isečci rana se fotodokumentuju korišćenjem digitalne kamere FinePix S700 pri najvećoj rezoluciji.
BIBLIOGRAFIJA
[0444]
Cronshaw JM and Matunis MJ. 2004. The nuclear pore complex: disease associations and functional correlations TRENDS Endocrin Metab.15:34-39 Falini B et al. 2006. Both carboxy-terminus NES motif and mutated tryptophan(s) are crucial for aberrant nuclear export of nucleophosmin leukemic mutants in NPMc+ AML Blood.107:4514-4523.
Cai X and Liu X. 2008. Inhibition of Thr-55 phosphorylation restores p53 nuclear localization and sensitizes cancer cells to DNA damage.PNAS.
105:16958-16963.
Daelemans D, Afonina E, Nilsson J 2002 A synthetic HIV-1 Rev inhibitor interfering with the CRM1-mediated nuclear export. Proc Natl Acad Sci U S A 99(22):14440-5.98052-2517.
Davis JR et al. 2007. Controlling protein compartmentalization to overcome disease Pharmaceut Res.24:17-27.
Freundt E, Yu L, Park E, et al 2009 Molecular determinants for subcellular localization of the severe acute respiratory syndrome coronavirus open reading frame 3b protein. J Virol 83(13):6631-40.
Ghildyal R, Ho A, Dias M, et al 2009 The respiratory syncytial virus matrix protein possesses a Crm1-mediated nuclear export mechanism. J Virol 83(11):5353-62.
Ghosh CC et al 2008 Analysis of nucleocytoplasmic shuttling of NF kappa B proteins in human leukocytes.Methods Mol Biol.457:279-92.
Gupta N et al 2008 Retinal tau pathology in human glaucomas. Can J Ophthalmol. 2008 Feb;43(1):53-60.
HoshinoL et al. 2008. Combined effects of p53 gene therapy and leptomycin B in human esophageal squamous cell carcinoma. Oncology.75:113-119.
Lain S et al.1999a An inhibitor of nuclear export activates the p53 response and induces the localization of HDM2 and p53 to U1A-positive nuclear bodies associated with the PODs Exp Cell Res.248:457-472.
Lain S et al. 1999b. Accumulating active p53 in the nucleus by inhibition of nuclear export: a novel strategy to promote the p53 tumor suppressor function Exp Cell Res.253:315.
Muller PA et al. 2009 Nuclear-cytosolic transport of COMMD1 regulates NF-kappaB and HIF-1 activity. Traffic 10(5):514-27.
Mutka S 2007 Nuclear Export Inhibitors (NEIs) as novel cancer therapies AACR Annual Meeting. Poster 5609.
Mutka S, Yang W, Dong S, et al. 2009. Identification of nuclear export inhibitors with potent anticancer activity in vivo. Cancer Res.69: 510-7.
Nakahara J et al. 2009. Abnormal expression of TIP30 and arrested nucleocytoplasmic transport within oligodendrocyte precursor cells in multiple sclerosis J Clin Invest.119:169-181.
Noske A et al. 2008. Expression of the nuclear export protein chromosomal region maintenance/exportin 1/Xpo1 is a prognostic factor in human ovarian cancer. Cancer.112:1733-1743.
Pollard V & Malim M. 1998 The HIV-1 Rev protein Annu Rev Microbiol 52:491-532.
Rawlinson S, Pryor M, Wright P, Jans D 2009 CRM1-mediated nuclear export of dengue virus RNA polymerase NS5 modulates interleukin-8 induction and virus production. J Biol Chem 284(23):15589-97.
Sanchez V, Mahr J, Orazio N, et al 2007 Nuclear export of the human cytomegalovirus tegument protein pp65 requires cyclin-dependent kinase activity and the Crm1 exporter. J Virol 81(21):11730-6..
Sorokin AV et al.2007. Nucleocytoplasmic transport of proteins . Biochemistry 72:1439-1457.
Terry LJ et al. 2007. Crossing the nuclear envelope: hierarchical regulation of nucleocytoplasmic transport. Science 318:1412-1416.
Van der Watt PJ et al. 2008. The Karyopherin proteins, Crm1 and Karyopherin beta1, are overexpressed in cervical cancer and are critical for cancer cell survival and proliferation. Int J Canc.124:1829-1840.
Walsh MD et al. 2008 Exportin 1 inhibition attenuates nuclear factor-kappaB-dependent gene expression. Shock 29:160-166.
Williams P, Verhagen J, Elliott G 2008 Characterization of a CRM1-dependent nuclear export signal in the C terminus of herpes simplex virus type 1 tegument protein UL47. J Virol 82(21):10946-52.
Yang W 2007 Anti-tumor activity of novel nuclear export inhibitors (NEIs) in multiple murine leukemia models. AACR Annual Meeting. Poster 5597.
Yao Y et al. 2009. The expression of CRM1 is associated with prognosis in human osteosarcoma. Oncol Rep.21:229-35.
Zimmerman TL et al 2006 Nuclear export of retinoid X receptor alpha in response to interleukin-1beta-mediated cell signaling: roles for JNK and SER260. J Biol Chem281 :15434-15440.
14

Claims (15)

  1. PATENTNI ZAHTEVI 1. Jedinjenje formule I:
    ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, solvat ili hidrat, naznačeni time, što: R<1>se bira između vodonika i C1-C4alkil; R<2>je O; i R<3>se bira između -N(R<4>)-(C3-C6cikloalkil), -C1-C6alkil, -(C0-C4alkilen)-heterociklil, i -(C0-C4alkilen)-heteroaril, gde je bilo koji alkil, alkilen, heterociklil, i heteroaril deo R<3>opciono i nezavisno supstituisan; i R<4>se bira između vodonika i C1-C4alkil.
  2. 2. Jedinjenje, so, solvat ili hidrat prema patentnom zahtevu 1, naznačeni time, što: R<1>je vodonik; i R<3>se bira između -N(R<4>)-(C3-C6cikloalkil), -C3-C6alkil, -(C0-C1alkilen)-heterociklil, i -(C0-C1alkilen)-heteroaril, gde: bilo koji alkil ili alkilen deo R<3>je opciono i nezavisno supstituisan jednim ili većim brojem supstituenata odabranih iz grupe koja se sastoji od okso i -N(R<5>)2, gde se svaki R<5>nezavisno bira između vodonika i C1-C4alkil; bilo koji heterociklil deo R<3>sadrži najmanje jedan atom azota u prstenu, i opciono je supstituisan jednim ili većim brojem supstituenata koji se biraju iz grupe koja se sastoji od C1-C4alkil i okso; i bilo koji heteroaril deo R<3>uključuje najmanje jedan atom azota u prstenu i opciono je supstituisan jednim ili više C1-C4alkil.
  3. 3. Jedinjenje, so, solvat ili hidrat prema patentnom zahtevu 1, naznačeni time, što: bilo koji heteroaril deo R<3>je opciono i nezavisno supstituisan jednim ili većim brojem supstituenata odabranih iz grupe koja se sastoji od -OH, -SH, nitro, halogen, amino, cijano, C1-C12alkil, C2-C12alkenil, C2-C12alkinil grupe, C1-C12alkoksi, C1-C12haloalkil, C1-C12haloalkoksi i C1-C12alkil sulfanil; i bilo koji alkil, alkilen ili heterociklil deo R<3>je opciono i nezavisno supstituisan jednim ili većim brojem supstituenata odabranih iz grupe koja se sastoji od okso, -OH, -SH, nitro, halogen, amino, cijano, C1-C12alkil, C2-C12alkenil, C2-C12alkinil, C1-C12alkoksi, C1-C12haloalkil, C1-C12haloalkoksi i C1-C12alkil sulfanil.
  4. 4. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1, predstavljeno bilo kojom od dole navedenih strukturnih formula:
    ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, solvat ili hidrat.
  5. 5. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 4 predstavljeno sledećom strukturnom formulom:
    14 ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, solvat ili hidrat.
  6. 6. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 4 predstavljeno sledećom strukturnom formulom:
    ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, solvat ili hidrat.
  7. 7. Farmaceutska smeša, koja sadrži jedinjenje kao što je definisano u bilo kom od patentnih zahteva 1-6, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, solvat ili hidrat i farmaceutski prihvatljiv nosač.
  8. 8. Jedinjenje kao što je definisano u bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, solvat ili hidrat, ili farmaceutska smeša kao što je definisano u patentnom zahtevu 7, za upotrebu u lečenju poremećaja odabranog između proliferativnog poremećaja, inflamatornog poremećaja, autoimunskog poremećaja, virusne infekcije, oftalmološkog poremećaja, neurodegenerativnog poremećaja, poremećaja abnormalnog rasta tkiva, poremećaja vezanog za unos hrane, alergija i respiratornog poremećaja.
  9. 9. Jedinjenje za upotrebu ili smeša za upotrebu prema patentnom zahtevu 8, naznačeni time, što je poremećaj odabran između lupusa, multiple skleroze i amiotrofne lateralne skleroze.
  10. 10. Jedinjenje za upotrebu ili smeša za upotrebu prema patentnom zahtevu 8 ili 9, naznačeni time, što je poremećaj lupus.
  11. 11. Jedinjenje za upotrebu ili smeša za upotrebu prema patentnom zahtevu 8 ili 9, naznačeni time, što je poremećaj multipla skleroza. 14
  12. 12. Jedinjenje za upotrebu ili smeša za upotrebu prema patentnom zahtevu 8 ili 9, naznačeni time, što je poremećaj amiotrofna lateralna skleroza.
  13. 13. Jedinjenje za upotrebu ili smeša za upotrebu prema patentnom zahtevu 8, naznačeni time, što se jedinjenje primenjuje u kombinaciji sa dodatnim terapijskim sredstvom.
  14. 14. Jedinjenje za upotrebu ili smeša za upotrebu prema patentnom zahtevu 8, naznačeni time, što je poremećaj neurodegenerativna bolest odabrana od Parkinsonove bolesti, Alzheimerove bolest i Huntingtonove bolesti.
  15. 15. Jedinjenje za upotrebu ili smeša za upotrebu prema patentnom zahtevu 8, naznačeni time, što je poremećaj virusna infekcija izazvana virusnim patogenom odabranim od adenovirusa, koksakivirusa, denga virusa, virusa encefalitisa, Epstein-Barrovog virusa, virusa hepatitisa A, virusa hepatitisa B, virusa hepatitisa C, herpes simpleks virusa tip 1, herpes simpleks virusa tip 2, citomegalovirusa, humanog herpesvirusa tip 8, virusa humane imunodeficijencije, virusa influence, virusa morbila, virusa zauški, humanog papilomavirusa, virusa parainfluence, poliovirusa, virusa besnila, respiratornog sincicijalnog virusa, virusa rubele, varičela-zoster virusa, virusa Zapadnog Nila, denga (dungee) i virusa žute groznice.
RS20200639A 2012-05-09 2013-05-09 Modulatori nukleusnog transporta i njihove upotrebe RS60424B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261644802P 2012-05-09 2012-05-09
US201361798188P 2013-03-15 2013-03-15
EP18164757.9A EP3404027B1 (en) 2012-05-09 2013-05-09 Nuclear transport modulators and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS60424B1 true RS60424B1 (sr) 2020-07-31

Family

ID=49448240

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20181360A RS58058B1 (sr) 2012-05-09 2013-05-09 Modulatori nukleusnog transporta i njihove upotrebe
RS20200639A RS60424B1 (sr) 2012-05-09 2013-05-09 Modulatori nukleusnog transporta i njihove upotrebe

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20181360A RS58058B1 (sr) 2012-05-09 2013-05-09 Modulatori nukleusnog transporta i njihove upotrebe

Country Status (32)

Country Link
US (10) US9266843B2 (sr)
EP (3) EP2858991B1 (sr)
JP (5) JP6195909B2 (sr)
KR (5) KR102223028B1 (sr)
CN (1) CN104428295B (sr)
AU (5) AU2013259384B2 (sr)
BR (1) BR112014027860B8 (sr)
CA (1) CA2872190C (sr)
CL (1) CL2014003054A1 (sr)
CO (1) CO7190242A2 (sr)
CY (2) CY1120832T1 (sr)
DK (2) DK2858991T3 (sr)
EA (1) EA036639B1 (sr)
ES (3) ES2794866T3 (sr)
GE (2) GEAP202213653A (sr)
HR (2) HRP20181838T1 (sr)
HU (2) HUE040427T2 (sr)
IN (1) IN2014DN09434A (sr)
LT (2) LT3404027T (sr)
ME (1) ME03795B (sr)
MX (1) MX364992B (sr)
NZ (1) NZ702663A (sr)
PE (1) PE20150128A1 (sr)
PL (2) PL2858991T3 (sr)
PT (2) PT2858991T (sr)
RS (2) RS58058B1 (sr)
SG (1) SG11201407268SA (sr)
SI (2) SI3404027T1 (sr)
SM (2) SMT202000347T1 (sr)
UA (2) UA118085C2 (sr)
WO (1) WO2013170068A2 (sr)
ZA (1) ZA202004892B (sr)

Families Citing this family (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5816635B2 (ja) 2010-03-05 2015-11-18 カリオファーム セラピューティクス，インコーポレイテッド 核輸送調節剤およびその使用
CN103402359B (zh) 2011-01-17 2016-08-24 卡尔约药物治疗公司 含烯烃核运输调节剂及其用途
CA2842362C (en) 2011-07-29 2020-06-16 Karyopharm Therapeutics, Inc. Hydrazide containing nuclear transport modulators and uses thereof
EA201490406A1 (ru) 2011-07-29 2014-07-30 Кариофарм Терапевтикс, Инк. Модуляторы ядерного транспорта и их применение
WO2013170068A2 (en) * 2012-05-09 2013-11-14 Karyopharm Therapeutics, Inc. Nuclear transport modulators and uses thereof
TWI568722B (zh) 2012-06-15 2017-02-01 葛蘭馬克製藥公司 作爲ｍＰＧＥＳ－１抑制劑之三唑酮化合物
EP2943485B1 (en) 2013-01-14 2017-09-20 Incyte Holdings Corporation Bicyclic aromatic carboxamide compounds useful as pim kinase inhibitors
KR102403306B1 (ko) 2013-01-15 2022-06-02 인사이트 홀딩스 코포레이션 Pim 키나제 저해제로서 유용한 티아졸카복스아마이드 및 피리딘카복스아마이드 화합물
EP2968278B8 (en) * 2013-03-15 2019-05-22 Karyopharm Therapeutics Inc. Methods of promoting wound healing using crm1 inhibitors
WO2014205393A1 (en) * 2013-06-21 2014-12-24 Karyopharm Therapeutics Inc. Nuclear transport modulators and uses thereof
HUE042800T2 (hu) 2013-06-21 2019-07-29 Karyopharm Therapeutics Inc 1,2,4-triazolok mint nukleáris transzport modulátorok és ezek alkalmazása
EA201690458A1 (ru) 2013-08-23 2016-07-29 Инсайт Корпорейшн Фуро- и тиенопиридинкарбоксамиды, используемые в качестве ингибиторов pim-киназы
KR102391334B1 (ko) * 2014-05-13 2022-04-26 큐에스에이 글로벌 인크. 향상된 이리듐 감마 방사 선원을 위한 장치 및 방법
US9580418B2 (en) 2014-07-14 2017-02-28 Incyte Corporation Bicyclic aromatic carboxamide compounds useful as Pim kinase inhibitors
US9822124B2 (en) 2014-07-14 2017-11-21 Incyte Corporation Bicyclic heteroaromatic carboxamide compounds useful as Pim kinase inhibitors
WO2016025904A1 (en) 2014-08-15 2016-02-18 Karyopharm Therapeutics Inc. Polymorphs of selinexor
KR101734529B1 (ko) 2015-05-08 2017-05-11 건국대학교 산학협력단 패혈증 치료제의 스크리닝 방법 및 패혈증 치료용 약학 조성물
WO2016196244A1 (en) 2015-05-29 2016-12-08 Incyte Corporation Pyridineamine compounds useful as pim kinase inhibitors
EP3341079A4 (en) * 2015-08-25 2019-05-08 President and Fellows of Harvard College METHOD AND COMPOSITIONS RELATED TO DIAGNOSIS AND TREATMENT OF CANCER
AR105967A1 (es) 2015-09-09 2017-11-29 Incyte Corp Sales de un inhibidor de pim quinasa
US9920032B2 (en) 2015-10-02 2018-03-20 Incyte Corporation Heterocyclic compounds useful as pim kinase inhibitors
MA43530A (fr) 2015-12-31 2018-11-07 Karyopharm Therapeutics Inc Modulateurs de transport nucléaire et leurs utilisations
WO2017117529A1 (en) 2015-12-31 2017-07-06 Karyopharm Therapeutics Inc. Nuclear transport modulators and uses thereof
WO2017151587A1 (en) * 2016-02-29 2017-09-08 Ohio State Innovation Foundation Aza-peptide aldehydes and ketones
AU2017234678A1 (en) * 2016-03-16 2018-08-16 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Methods of modulating KEAP1
EP3448234A4 (en) 2016-04-30 2019-05-01 Envision Diagnostics, Inc. MEDICAL DEVICES, SYSTEMS AND METHODS FOR PERFORMING EYE EXAMINATIONS AND EYES TRACKING
US11602530B2 (en) 2016-11-28 2023-03-14 Biogen Ma Inc. CRM1 inhibitors for treating epilepsy
AR113922A1 (es) 2017-12-08 2020-07-01 Incyte Corp Terapia de combinación de dosis baja para el tratamiento de neoplasias mieloproliferativas
MX2020007479A (es) 2018-01-10 2020-11-24 Xwpharma Ltd Profármacos de ketamina, composiciones y usos de los mismos.
WO2019232724A1 (en) * 2018-06-06 2019-12-12 Xw Laboratories, Inc. Compounds as nuclear transport modulators and uses thereof
WO2020092965A1 (en) * 2018-11-01 2020-05-07 Karyopharm Therapeutics Inc. E2f1 as a biomarker for treatments using xpo1 inhibitors
CN113365640A (zh) 2018-12-06 2021-09-07 比奥根Ma公司 引导肌萎缩侧索硬化症的治疗性干预的神经丝蛋白
CN111606890A (zh) 2019-02-26 2020-09-01 微境生物医药科技(上海)有限公司 含丙烯酰基的核转运调节剂及其用途
CN109928939A (zh) * 2019-02-27 2019-06-25 上海卡洛化学有限公司 一种2,2,6,6-四甲基吗啉的制备方法
US12479806B2 (en) * 2019-05-01 2025-11-25 Karyopharm Therapeutics Inc. Process for preparing XPO1 inhibitors and intermediates for use in the preparation of XPO1 inhibitors
CN111145135B (zh) * 2019-12-30 2021-08-10 腾讯科技（深圳）有限公司 一种图像去扰处理方法、装置、设备及存储介质
DE112022001910T5 (de) 2021-04-01 2024-01-25 Alps Alpine Co., Ltd. Vorrichtung zur erkennung einer betätigung
BR112023021908A2 (pt) * 2021-04-21 2023-12-19 Natco Pharma Ltd Processos melhorados para a preparação de dimetano sulfonato, 5-[2-[(4-metilsulfonilpiperazin-1-il)metil]-7-morfolino-tieno[2,3-c]piridin-5-il]pirimidin-2-amina) dimetano sulfonato, composto, formas cristalinas, formas cristalinas de hidrato de dimetano sulfonato, hidrato de dimetano sulfonato e processo para a preparação da forma cristalina de hidrato de dimetano sulfonato
CN117881394A (zh) 2021-08-13 2024-04-12 凯瑞康宁生物工程（武汉）有限公司 氯胺酮衍生物的药物组合物和口服剂型
TWI857509B (zh) * 2022-03-07 2024-10-01 高雄醫學大學 用於治療 ｂ 型肝炎病毒感染的方法

Family Cites Families (67)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US1017398A (en) 1911-01-16 1912-02-13 John E Folsom Telegraph-key.
CS229934B2 (en) 1981-07-07 1984-07-16 Pfizer Production method subst.indolylacryte acid derivative
KR840000529A (ko) 1981-07-07 1984-02-25 콘스탄틴 루이스 클레멘트 인돌 유도체의 제조방법
US4778796A (en) 1985-07-19 1988-10-18 Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd. ω-(3-pyridyl)alkenamide derivatives and anti-allergenic pharmaceutical compositions containing same
JP3111321B2 (ja) 1990-02-23 2000-11-20 武田薬品工業株式会社 縮合チアゾール化合物
IL97249A (en) 1990-02-23 1995-01-24 Takeda Chemical Industries Ltd Compounds of 7,6,5,4-tetrahydrothiazole] B-5,4 [pyridine and compounds of 5,6-dihydro-H4-pyrrolo] D-3,2 [thiazole, their manufacture, and pharmaceutical compositions including or
US5541213A (en) 1993-06-24 1996-07-30 Eisai Co., Ltd. Propenoic acid derivatives diazole propenoic acid compounds which have useful pharmaceutical utility
US5468353A (en) 1994-05-05 1995-11-21 Minnesota Mining And Manufacturing Company Mist suppressant for solvent extraction metal electrowinning
JP2941950B2 (ja) 1994-11-23 1999-08-30 ニューロゲン コーポレイション 或る種の４−アミノメチル−２−置換イミダゾール誘導体および２−アミノメチル−４−置換イミダゾール誘導体；新規な種類のドーパミン リセプタ亜型特異性リガンド
US20030018025A1 (en) 1995-06-07 2003-01-23 Neurogen Corporation, Corporation Of The State Of Delaware Certain 4-aminomethyl-2-substituted imidazole derivatives and 2-aminomethyl-4-substituted imidazole derivatives: new classes of dopamine receptor subtype specific ligands
JPH11513382A (ja) 1995-10-20 1999-11-16 ドクトル カルル トーマエ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング ５員複素環化合物、これらの化合物を含む医薬品、それらの使用及びそれらの調製方法
CA2250002C (en) 1996-04-04 2008-03-25 Shionogi & Co., Ltd. Cephem compounds and drugs containing the compounds
JP4054992B2 (ja) 1996-04-25 2008-03-05 日産化学工業株式会社 エチレン誘導体および有害生物防除剤
ATE244219T1 (de) 1996-04-25 2003-07-15 Nissan Chemical Ind Ltd Ethylenderivate und pestizide
DE19624659A1 (de) * 1996-06-20 1998-01-08 Klinge Co Chem Pharm Fab Neue Pyridylalken- und Pyridylalkinsäureamide
US5994398A (en) 1996-12-11 1999-11-30 Elan Pharmaceuticals, Inc. Arylsulfonamides as phospholipase A2 inhibitors
JP4416198B2 (ja) 1997-12-19 2010-02-17 武田薬品工業株式会社 アニリド誘導体、その製造法および用途
WO1999050264A1 (en) 1998-03-30 1999-10-07 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Quinazoline derivatives
AR029803A1 (es) 2000-02-21 2003-07-16 Smithkline Beecham Plc Imidazoles sustituidos con piridilo y composiciones farmaceuticas que las comprenden
ATE430567T1 (de) 2000-09-29 2009-05-15 Topotarget Uk Ltd Carbaminsäurederivate enthaltend eine amidgruppe zur behandlung von malaria
JP3608050B2 (ja) 2001-07-24 2005-01-05 トヨタ自動車株式会社 ロールオーバ判別装置
KR20040048411A (ko) 2001-09-14 2004-06-09 메틸진, 인크. 히스톤 데아세틸라아제의 억제제
WO2004037248A2 (en) 2002-10-24 2004-05-06 Carex Sa Modulation of peroxisome proliferator activated receptors activity
DE10250743A1 (de) 2002-10-31 2004-05-19 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg Neue Amid-Verbindungen mit MCH-antagonistischer Wirkung und diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel
JP4145230B2 (ja) 2002-11-01 2008-09-03 武田薬品工業株式会社 神経障害の予防・治療剤
CN1731994A (zh) 2002-11-01 2006-02-08 武田药品工业株式会社 预防或治疗神经病的药剂
AU2003291403A1 (en) 2002-11-08 2004-06-03 Neurogen Corporation 3-substituted-6-aryl pyridined as ligands of c5a receptors
WO2004076418A1 (en) 2003-02-28 2004-09-10 Galderma Research & Development, S.N.C. Ligands that modulate lxr-type receptors
EP1757591A4 (en) 2004-05-26 2010-05-05 Eisai R&D Man Co Ltd ZIMTSÄUREAMIDVERBINDUNG
AU2005272389B2 (en) 2004-08-11 2011-08-04 Kyorin Pharmaceutical Co., Ltd. Novel cyclic aminobenzoic acid derivative
WO2006019020A1 (ja) 2004-08-16 2006-02-23 Sankyo Company, Limited 置換されたウレア化合物
US7514463B2 (en) * 2004-08-20 2009-04-07 University Of Kansas Lonidamine analogues and their use in male contraception and cancer treatment
US20100130737A1 (en) 2005-02-18 2010-05-27 Takeda Pharmaceutical Company Limited Regulating Agent of GPR34 Receptor Function
JP5305914B2 (ja) 2005-11-15 2013-10-02 大塚製薬株式会社 オキサゾール化合物及び医薬組成物
JP2007210929A (ja) 2006-02-09 2007-08-23 Sankyo Co Ltd ウレア化合物を含有する医薬
PL1992618T3 (pl) 2006-03-09 2012-06-29 Eisai R&D Man Co Ltd Policykliczna pochodna cynamidowa
WO2007118137A1 (en) 2006-04-07 2007-10-18 Methylgene Inc. Benzamide derivatives as inhibitors of histone deacetylase
NZ572268A (en) 2006-04-18 2011-09-30 Nippon Chemiphar Co Activating agent for peroxisome proliferator activated receptor delta (ppar)
EP2030974B1 (en) 2006-06-13 2016-02-17 Shanghai Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Sciences Thiazole non-nucleoside compounds, their preparation, pharmaceutical composition and their use as antiviral agents
CN100503571C (zh) 2006-07-12 2009-06-24 中国药科大学 四氢异喹啉类衍生物、其制备方法及其医药用途
CA2658925C (en) 2006-07-27 2015-07-14 Amorepacific Corporation Novel sulfonylamino acrylamide derivatives, isomer thereof,or pharmaceutically acceptable salts thereof as vanilloid receptor antagonist; and pharmaceutical compositions containing the same
KR101404360B1 (ko) 2006-09-05 2014-06-09 교와 핫꼬 기린 가부시키가이샤 이미다졸 유도체
EP1939180A1 (en) 2006-12-20 2008-07-02 sanofi-aventis Heteroarylacrylamides and their use as pharmaceuticals for the stimulation of the expression of endothelial NO synthase
EP1942104A1 (en) 2006-12-20 2008-07-09 sanofi-aventis Heteroarylcyclopropanecarboxamides and their use as pharmaceuticals
JP2010519337A (ja) 2007-02-26 2010-06-03 コーサン バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド カルバメート化合物
EP2003118A1 (de) 2007-06-13 2008-12-17 Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft Zimtsäurederivate als Modulatoren des EP2-Rezeptors
US20100179203A1 (en) * 2007-07-04 2010-07-15 Antonio Nardi Novel pyrazole derivatives useful as potassium channel modulators
MX2012000434A (es) 2009-07-09 2012-04-11 Crescendo Therapeutics Llc Metodo de sanacion de herida y modulacion de cicatriz.
WO2011069039A1 (en) * 2009-12-04 2011-06-09 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Hydrazone and diacyl hydrazine compounds and methods of use
JP5816635B2 (ja) 2010-03-05 2015-11-18 カリオファーム セラピューティクス，インコーポレイテッド 核輸送調節剤およびその使用
CN103402359B (zh) 2011-01-17 2016-08-24 卡尔约药物治疗公司 含烯烃核运输调节剂及其用途
CA2842362C (en) 2011-07-29 2020-06-16 Karyopharm Therapeutics, Inc. Hydrazide containing nuclear transport modulators and uses thereof
EA201490406A1 (ru) 2011-07-29 2014-07-30 Кариофарм Терапевтикс, Инк. Модуляторы ядерного транспорта и их применение
WO2013020024A2 (en) 2011-08-03 2013-02-07 Karyopharm Therapeutics, Inc. Maleimide compounds and methods of treatment
WO2013170068A2 (en) * 2012-05-09 2013-11-14 Karyopharm Therapeutics, Inc. Nuclear transport modulators and uses thereof
US20160016916A1 (en) 2013-03-15 2016-01-21 Karyopharm Therapeutics Inc. Exo Olefin-Containing Nuclear Transport Modulators and Uses Thereof
EP2968278B8 (en) 2013-03-15 2019-05-22 Karyopharm Therapeutics Inc. Methods of promoting wound healing using crm1 inhibitors
HUE042800T2 (hu) 2013-06-21 2019-07-29 Karyopharm Therapeutics Inc 1,2,4-triazolok mint nukleáris transzport modulátorok és ezek alkalmazása
WO2014205393A1 (en) 2013-06-21 2014-12-24 Karyopharm Therapeutics Inc. Nuclear transport modulators and uses thereof
US11567063B2 (en) 2013-11-15 2023-01-31 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. Methods for assessing cell viability or predicting cell response to a treatment using cell movement
US9828373B2 (en) 2014-07-26 2017-11-28 Sunshine Lake Pharma Co., Ltd. 2-amino-pyrido[2,3-D]pyrimidin-7(8H)-one derivatives as CDK inhibitors and uses thereof
WO2016025904A1 (en) 2014-08-15 2016-02-18 Karyopharm Therapeutics Inc. Polymorphs of selinexor
MA43530A (fr) 2015-12-31 2018-11-07 Karyopharm Therapeutics Inc Modulateurs de transport nucléaire et leurs utilisations
WO2017117529A1 (en) 2015-12-31 2017-07-06 Karyopharm Therapeutics Inc. Nuclear transport modulators and uses thereof
WO2017118940A1 (en) 2016-01-08 2017-07-13 Dr. Reddy's Laboratories Limited Solid forms of selinexor and process for their preparation
US11602530B2 (en) 2016-11-28 2023-03-14 Biogen Ma Inc. CRM1 inhibitors for treating epilepsy
EP3565813A1 (en) 2017-01-05 2019-11-13 Watson Laboratories, Inc. Novel crystalline forms of selinexor and process for their preparation

Also Published As

Publication number Publication date
JP2021063104A (ja) 2021-04-22
SG11201407268SA (en) 2015-01-29
MX2014013551A (es) 2015-01-16
CN104428295B (zh) 2017-08-08
US20200038373A1 (en) 2020-02-06
DK3404027T3 (da) 2020-06-02
JP2018012715A (ja) 2018-01-25
NZ702663A (en) 2017-03-31
JP2015516434A (ja) 2015-06-11
EA201492050A1 (ru) 2015-07-30
HUE050452T2 (hu) 2021-03-29
AU2019272017B2 (en) 2021-05-27
US10058535B2 (en) 2018-08-28
AU2021221398A1 (en) 2021-09-16
BR112014027860A2 (pt) 2017-06-27
EP2858991B1 (en) 2018-08-08
EP3663291B1 (en) 2024-12-18
CO7190242A2 (es) 2015-02-19
ES3016982T3 (en) 2025-05-12
AU2016222459A1 (en) 2016-09-22
WO2013170068A3 (en) 2014-02-20
US9096543B2 (en) 2015-08-04
US9585874B2 (en) 2017-03-07
EP3663291A1 (en) 2020-06-10
JP2018172444A (ja) 2018-11-08
US20200230110A1 (en) 2020-07-23
US10925859B2 (en) 2021-02-23
KR102163377B1 (ko) 2020-10-08
ES2794866T3 (es) 2020-11-19
HUE040427T2 (hu) 2019-03-28
US20210251968A1 (en) 2021-08-19
ES2702279T3 (es) 2019-02-28
SI3404027T1 (sl) 2020-08-31
UA124922C2 (uk) 2021-12-15
CY1120832T1 (el) 2019-12-11
AU2013259384B2 (en) 2016-06-02
HRP20200876T1 (hr) 2020-09-04
IN2014DN09434A (sr) 2015-07-17
PL2858991T3 (pl) 2019-01-31
EP2858991A2 (en) 2015-04-15
HRP20181838T1 (hr) 2018-12-28
JP6195909B2 (ja) 2017-09-13
US10617677B2 (en) 2020-04-14
US9266843B2 (en) 2016-02-23
CA2872190A1 (en) 2013-11-14
PE20150128A1 (es) 2015-02-23
EA036639B1 (ru) 2020-12-02
US20170319551A1 (en) 2017-11-09
AU2021221398B2 (en) 2023-08-17
JP6818849B2 (ja) 2021-01-20
KR102223028B1 (ko) 2021-03-03
CN104428295A (zh) 2015-03-18
BR112014027860B8 (pt) 2024-04-30
US11318120B2 (en) 2022-05-03
CY1123476T1 (el) 2022-03-24
KR20200115688A (ko) 2020-10-07
US20180289675A1 (en) 2018-10-11
GEAP202213653A (en) 2022-09-12
AU2018201012B2 (en) 2019-12-05
LT2858991T (lt) 2018-11-26
GEP20237477B (en) 2023-03-27
KR20200041986A (ko) 2020-04-22
WO2013170068A2 (en) 2013-11-14
AU2013259384A1 (en) 2014-12-18
RS58058B1 (sr) 2019-02-28
PT3404027T (pt) 2020-03-30
SI2858991T1 (sl) 2018-12-31
US20150111893A1 (en) 2015-04-23
KR20150018809A (ko) 2015-02-24
PT2858991T (pt) 2018-12-17
HK1209420A1 (en) 2016-04-01
AU2019272017A1 (en) 2019-12-19
BR112014027860B1 (pt) 2022-03-08
CL2014003054A1 (es) 2015-05-15
UA118085C2 (uk) 2018-11-26
ZA202004892B (en) 2023-03-29
US10335393B2 (en) 2019-07-02
US20130317031A1 (en) 2013-11-28
LT3404027T (lt) 2020-07-10
KR20200041984A (ko) 2020-04-22
KR20200118240A (ko) 2020-10-14
ME03795B (me) 2021-04-20
PL3404027T3 (pl) 2020-09-21
US9861614B2 (en) 2018-01-09
MX364992B (es) 2019-05-17
US20160145246A1 (en) 2016-05-26
US10722497B2 (en) 2020-07-28
US20190008833A1 (en) 2019-01-10
JP2020037585A (ja) 2020-03-12
DK2858991T3 (en) 2018-11-26
KR102095429B1 (ko) 2020-03-31
SMT201800686T1 (it) 2019-01-11
US20160354347A1 (en) 2016-12-08
EP3404027B1 (en) 2020-03-04
AU2018201012A1 (en) 2018-03-01
KR102165177B1 (ko) 2020-10-13
SMT202000347T1 (it) 2020-07-08
CA2872190C (en) 2024-06-25
EP3404027A1 (en) 2018-11-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11318120B2 (en) Nuclear transport modulators and uses thereof
HK40029380B (en) Nuclear transport modulators and uses thereof
HK40029380A (en) Nuclear transport modulators and uses thereof
HK40000942B (en) Nuclear transport modulators and uses thereof
HK40000942A (en) Nuclear transport modulators and uses thereof
HK1209420B (en) Nuclear transport modulators and uses thereof