RS60441B1 - De-imunizovane, strukture shiga toksin a podjedinice i ciljani ćelijski molekuli koji sadrže isti - Google Patents

De-imunizovane, strukture shiga toksin a podjedinice i ciljani ćelijski molekuli koji sadrže isti

Info

Publication number
RS60441B1
RS60441B1 RS20200732A RSP20200732A RS60441B1 RS 60441 B1 RS60441 B1 RS 60441B1 RS 20200732 A RS20200732 A RS 20200732A RS P20200732 A RSP20200732 A RS P20200732A RS 60441 B1 RS60441 B1 RS 60441B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
seq
cell
shiga toxin
amino acid
targeting molecule
Prior art date
Application number
RS20200732A
Other languages
English (en)
Inventor
Eric Poma
Erin Willert
Garrett Lee Robinson
Sangeetha Rajagopalan
Brigitte Brieschke
Original Assignee
Molecular Templates Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Molecular Templates Inc filed Critical Molecular Templates Inc
Publication of RS60441B1 publication Critical patent/RS60441B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/25—Shigella (G)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)

Description

OBLAST TEHNIKE
Predmetni pronalazak se odnosi na efektorske polipeptide Shiga toksina, izveden iz Podjedinica A Shiga toksina koji se javlja u prirodi, koji obuhvata kombinaciju mutacija koje obezbeđuju (1) de-imunizaciju, (2) redukciju u senzitivnosti proteaze, i/ili (3) ugrađen, epitop(e) T-ćelije; pri čemu efektorski polipeptid Shiga toksina zadržava jednu ili više funkcija Shiga toksina, kao što je, npr., snažna citotoksičnost. U određenim primerima izvođenja, efektorski polipeptidi Shiga toksina predmetnog pronalaska (1) pokazuju smanjeni imunogenetski potencijal kod sisara i/ili (2) je svaki sposoban da dostavi epitop CD8+ T-ćelije MHC klasi I sistema ćelije u kome je prisutan polipeptid.
Predmetni pronalazak se takođe odnosi na ciljane ćelijske molekule koji sadrže efektorski polipeptid Shiga toksina predmetnog pronalaska. Efektorski polipeptidi Shiga toksina predmetnog pronalaska imaju korist kao strukture ili komponente ciljanih ćelijskih molekula, kao što su, npr., imunotoksini i fuzije ligand-toksin, za ubijanje ćelija i/ili podćelijske isporuke tereta do određenih podćelijskih komponenti, kao što je, npr., isporuka ugrađenog epitopa T-ćelija u citozol. Uopšteno, efektorski polipeptidi Shiga toksina i ciljani ćelijski molekuli predmetnog pronalaska su korisni za primenu na multićelijske organizme, kao što je, npr., kada je poželjno (1) eliminisati ili smanjiti nespecifične toksičnosti, (2) eliminisati ili smanjiti određene imunološke odgovore i/ili (3) usmeriti povoljan imuni odgovor na određeni epitop koji je dostavljen određenom ćelijskom tipu, kao što je, npr., regrutovanje CD8+ T-ćelija. Ciljani ćelijski molekuli predmetnog pronalaska su korisni (1) za selektivno ubijanje određenog(ih) tipa(ova) ćelije među drugim ćelijama i (2) kao terapeutski molekuli za lečenje raznih oboljenja, poremećaja, i stanja, uključujući kancere, tumore, druge rastuće abnormalnosti, imuni poremećaji, i mikrobne infekcije.
STANJE TEHNIKE
Koncept "magični metak" jeste taj da terapeutici mogu biti otkriveni da naročito napadaju samo obolele ćelije ili patogene unutar humanog pacijenta dok ostavlja pacijenta neoštećenog. Imunotoksini, ligand-toksin hibridi, imuno-RNaze, i drugi molekularni ciljani lekovi su potomci koncepta Dr. Paul Ehrlich's "magični metak" ranog 20. veka (Strebhardt K, Ullrich A, Nat Rev Cancer 8: 473-80 (2008)). Toksin proizveden od strane S. dysenteriae nazvan je "Shiga toksin" po Dr. Ehrlich-ovom saradniku Dr. Kiyoshi Shiga za njegovo otkriće ove bakterije još 1897. Skoro, Shiga toksini postali su poznati po tome što imaju jedinstvene karakteristike pogodne za upotrebu u molekulama za internalizaciju ćelija za ciljane terapije (videti npr. US20150259428). Shiga toksini se mogu kombinovati sa imunoglobulinskim domenima, ligandima i drugim ciljanim delovima da bi se stvorili ciljani ćelijski terapeutici (npr., imunotoksini i fuzije ligand-toksin) koji su "magični meci."
Shiga toksini mogu imati pogodna svojstva za upotrebu u terapeuticima, kao što su, npr., mehanizam snažnog toksina koji je efikasan prema eukariotskim ćelijama, sposobnost da se pokrene ćelijska internalizacija, i sposobnost da se usmeri podćelijska ruta. Shiga toksini su sitentnički konstruisani za medicinske primene racionalnim izmenama na strukturama, karakteristikama, i biološkim aktivnostima toksina (videti, npr. WO 1999/040185, WO 2005/092917, EP1051482, DE69835695, WO 2007/033497, US2009/0156417, JP4339511, US7713915, EP1727827, DE602004027168, EP1945660, JP4934761, EP2228383, US2013/0196928, WO 2014/164680, WO 2014/164693, US20150259428, WO 2015/138435, WO 2015/138452, WO 2015/113005, WO 2015/113007, i WO 2015/191764). Shiga toksin A Podjedinice su stabilne, enzimski aktivne, i citotoksične čak i ako su skraćene ili spojene sa drugim proteinima.
Glavna ograničenja u terapijskim primenama koja uključuju sintetički modifikovane molekule izvedene iz bakterijskih toksina uključuju i štetne imunogene reakcije kod primatelja i nespecifične toksičnosti izazvane toksičnim komponentama. Neželjena imunogenost terapijskog proizvoda može rezultirati nepovoljnim posledicama, kao što su smanjena efikasnost, proizvodnja neutralizujućih antitela, izmenjena farmakokinetika, opšte reakcije imunološkog sistema i preosjetljivosti, anafilaksija, anafilaktoidne reakcije i ograničenja broja ponovljenih doza koje primalac može sigurno primati. Smanjivanje nespecifične toksičnosti terapijskog molekula može poboljšati njegove bezbednosne karakteristike kada se daje primaocu, kao i izmeniti njegov potencijalni terapijski prozor povećanjem maksimalne doze koja se može bezbedno davati. Budući da i neželjeni imuni odgovori i nespecifične toksičnosti mogu predstavljati značajnu sigurnost i/ili efikasnost(e) lečenja lekovima, smanjenje ili minimiziranje verovatnoće oboje je često poželjno prilikom razvijanja terapijskih molekula.
Stabilnost terapeutskog ili dijagnostičkog molekula tokom vremena i u određenim okruženjima (npr. cirkulacioni sistem čoveka) su važne karakteristike i mogu uticati na to za koje aplikacije se molekul može praktično upotrebiti. Za određene imunotoksine ili fuzije ligand-toksin, stabilnost veze između toksina i drugih komponenti može uticati na količinu nespecifične toksičnosti prouzrokovanu oslobađanjem neciljanog toksina tokom vremena u telu višećelijskog organizma. Prema tome, za molekule koji sadrže komponente toksina, određene nespecifične toksičnosti su direktno povezane sa stabilnošću veze između komponente toksina i druge komponente, kao što je, na primer, komponenta koja cilja ćeliju.
Shiga toksini može biti kombinovan sa heterolognim epitopima kako bi stvorio ciljane ćelijske terapeutike koji dostavljaju izabrane terete epitopa za svrhu izazivanja željenih imunih odgovora (videti WO 2015/113007). Ovi imuni odgovori mogu da se iskoriste od strane terapijskih molekula za ciljano ubijanje specifičnih tipova ćelija unutar pacijenta, kao i za senzibilizaciju pacijentovog imunološkog sistema na identifikovanje određenih ćelija kao stranih (odn. probijanje imunotolerancije). Na primer, Glavni Histo-Kompatibilni (Major Histo-Compatibility (MHC)) klasa I prezentacijski put se može iskoristiti takvim pristupima da se indukuje regrutovanje imunih ćelija do lokusa tumora unutar pacijenta i da se poboljša prepoznavanje određenih neoplastičnih ćelija sa mehanizmima imunog nadzora.
Bilo bi poželjno imati izvedene polipeptide Shiga toksin A Podjedinice sa niskom antigenosti, niskom imunogenosti i/ili sadrži heterologne epitope, ali koji zadržavaju značajan nivo funkcije(a) Shiga toksina, kao što su, na primer, snažna citotoksičnost, sposobnost forsiranja ćelijske internalizacije i/ili sposobnost efikasnog usmeravanja do željene intraćelijske lokacije (a). Dalje, bilo bi poželjno imati terapeutske i/ili dijagnostičke molekule koji sadrže komponente Shiga toksina A Podjedinice koje imaju nisku antigenost, nisku imunogenost, visoku stabilnost, nisku nespecifičnu toksičnost i/ili sposobnost isporuke peptidno-epitopnih tereta za prezentaciju od strane MHC sistema klase I ciljane ćelije. Konkretno, bilo bi poželjno imati molekule koji ciljaju ćelije koji sadrže komponente Shiga toksina A podjedinice koje održavaju snažnu citotoksičnost, dok 1) smanjuju potencijal za neželjene antigene i/ili imunogenosti, 2) smanjuju potencijal za nespecifične toksičnosti i/ili 3) koji imaju mogućnost isporuke tereta peptida-epitopa za prezentaciju od strane MHC sistema klase I ciljane ćelije.
KRATAK OPIS PRONALASKA
Svaka izvedena struktura Shiga toksin A Podjedinice predmetnog pronalaska obuhvata kombinaciju karakteristika (npr., de-imunizovanu(e) pod-regija(e), heterologni epitop koji sadrži pod-regija(e), pod-regija otporna na cepanje proteaze, i/ili karboksi-terminal, endoplazmični retikulum signalnog motiva zadržavanja/pronalaženja) što ih čini korisnijima, kao što su, npr., kao komponente molekula ciljanih ćelija poput imunotoksina i fuzija ligandtoksin. Određene kombinacije efektorskih polipeptida Shiga toksina predmetnog pronalaska su korisnije jer obezbeđuju nekoliko efektorskih funkcija Shiga toksina u jednom polipeptidu, kao što su, na primer, promocija ćelijske internalizacije, usmeravanje subćelijske rutine prema citozolu, inaktivacija ribozoma i/ili isporuka heterolognih, T-ćelijskih epitopa na putanju ćelije MHC I klase. Izvesni molekuli koji ciljaju ćeliju predmetnog pronalaska su korisniji jer obezbeđuju kombinaciju više karakteristika u jednom molekulu, kao što su, na primer, efikasna ćelijska internalizacija, snažna ćelijska ciljana toksičnost, selektivna citotoksičnost, de-imunizacija, niska ne-specifična toksičnost pri visokim dozama, visoka stabilnost, hiper-imunizacija CD T-ćelije i/ili sposobnost davanja heterolognog epitopa (T-ćelija) na putanju ciljane ćelije MHC I klase.
Različiti primeri izvođenja efektorskih polipeptida Shiga toksina i ćelijski ciljanih molekula predmetnog pronalaska su opisani u nastavku sa pozivanjem na setove primera izvođenja numerisani #1-11.
Set Primera Izvođenja #1 - De-imunizovan, Shiga Toksin Efektorski Polipeptid Koji Sadrži Ugrađen ili Umetnut, Heterologni, Epitop T-Ćelije
Predmetni pronalazak obezbeđuje de-imunizovani, efektorski polipeptid Shiga toksina koji sadrži najmanje jedan ubačen ili ugrađen, heterologni epitop (a) i najmanje jedan poremećeni, endogeni, B-ćelijski i/ili CD4+ T-ćelijski epitop regiona (b), pri čemu heterologni epitop se ne preklapa sa najmanje jednim poremećenim, endogenim, B-ćelijskim i / ili CD4 T-ćelijskim epitopom; i pri čemu efektorski polipeptid Shiga toksina je sposoban da izloži bar jednu efektorsku funkciju Shiga toksina (videti npr. Slika 1, prikazuje ilustrativne primere tri, ogledna izvođenja deimunizovanog efektorskog polipeptida Shiga toksina ovog primera izvođenja, set # 1 označen kao efektor Shiga toksina 1, 2, i 3). U određenim drugim primerima izvođenja, heterologni epitop je CD8+ T-ćelijski epitop sposoban da bude predstavljen od strane molekula ćelije MHC klase I. U određenim drugim primerima izvođenja, heterologni epitop u (a) je ugrađen i zamenjuje ekvivalentan broj ostataka amino kiseline u divljem soju polipeptidnog regiona Shiga toksina tako da efektorski polipeptidi Shiga toksina imaju isti broj ostataka amino kiseline kao i divlji soj polipeptidskog regiona Shiga toksina iz kog je izveden. U određenim drugim primerima izvođenja bilo kog prethodno navedenog, de-imunizovani, efektorski polipeptid Shiga toksina je sposoban da pokazuje najmanje jednu efektorsku funkciju Shiga toksina odabranu između: upravljanja intraćelijskog usmeravanja prema citozolu ćelije u kojoj je polipeptid prisutan, inhibiranja funkcije ribozoma, enzimskog inaktiviranja ribozoma, i citotoksičnost.
U određenim primerima izvođenja, de-imunizovani, efektorski polipeptid Shiga toksina predmetnog pronalaska obuhvata (i) ugrađeni ili ubačeni, heterologni, T-ćelijski epitop i (ii) prekidanje najmanje jednog, endogenog, B-ćelijskog i/ili T-ćelijskog epitopa koji se ne preklapa sa ugrađenim ili ubačenim, heterolognim, T-ćelijskim epitopom. U određenim drugim primerima izvođenja, efektorski polipeptid Shiga toksina je sposoban da pokazuje najmanje jednu efektorsku funkciju Shiga toksina, kao što je, npr., upravljanje intraćelijskog usmeravanja endoplazmatičnog retikuluma i/ili citozola ćelije u kojoj je polipeptid prisutan, inhibiranje ribozomske funkcije, ezimsko inaktiviranje ribozoma, izazivanje citostaze, i/ili izazivanje citotoksičnosti. U određenim drugim primerima izvođenja, heterologni, T-ćelijski epitop je CD8+ T-ćelijski epitop, kao što je, npr., u odnosu na ljudski imuni sistem. U određenim drugim primerima izvođenja, heterologni, T-ćelijski epitop je sposoban da bude predstavljen od strane molekula ćelije MHC klase I. U određenim drugim primerima izvođenja, endogeni, T-ćelijski epitop je CD4+ T-ćelijski epitop, kao što je, npr., u odnosu na ljudski imuni sistem.
U određenim primerima izvođenja, de-imunizovani, efektorski polipeptid Shiga toksina predmetnog pronalaska obuhvata (i) ugrađeni ili ubačeni, heterologni, T-ćelijski epitop i (ii) poremećaj najmanje jednog, endogenog, B-ćelijskog i/ili T-ćelijskog epitopa regiona koji se ne preklapa sa ugrađenim ili umetnutim, heterolognim, T-ćelijskim epitopom. U određenim drugim primerima izvođenja, efektorski polipeptid Shiga toksina je sposoban da pokazuje najmanje jednu efektorsku funkciju Shiga toksina, kao što je, npr., upravljanje intraćelijskog usmeravanja endoplazmatičnog retikuluma i/ili citozola ćelije u kojoj je polipeptid prisutan, inhibiranje ribozomske funkcije, ezimsko inaktiviranje ribozoma, izazivanje citostaze, i/ili izazivanje citotoksičnosti. U određenim drugim primerima izvođenja, heterologni, T-ćelijski epitop je CD8+ T-ćelijski epitop, kao što je, npr., u odnosu na ljudski imuni sistem. U određenim drugim primerima izvođenja, heterologni, T-ćelijski epitop je sposoban da bude predstavljen od strane molekula ćelije MHC klase I. U određenim drugim primerima izvođenja, endogeni, region T-ćelijskog epitopa je region CD4+ T-ćelijskog epitopa, kao što je, npr., u odnosu na ljudski imuni sistem.
U određenim primerima izvođenja, de-imunizovani, efektorski polipeptid Shiga toksina predmetnog pronalaska obuhvata (i) ugrađeni ili ubačeni, heterologni, T-ćelijski epitop i (ii) poremećaj najmanje jednog, endogenog, B-ćelijskog i/ili T-ćelijskog epitopa regiona koji se ne preklapa sa ugrađenim ili umetnutim, heterolognim, T-ćelijskim epitopom. U određenim drugim primerima izvođenja, efektorski polipeptid Shiga toksina je sposoban da pokazuje najmanje jednu efektorsku funkciju Shiga toksina, kao što je, npr., upravljanje intraćelijskog usmeravanja endoplazmatičnog retikuluma i/ili citozola ćelije u kojoj je polipeptid prisutan, inhibiranje ribozomske funkcije, ezimsko inaktiviranje ribozoma, izazivanje citostaze, i/ili izazivanje citotoksičnosti. U određenim drugim primerima izvođenja, heterologni, T-ćelijski epitop je CD8+ T-ćelijski epitop, kao što je, npr., u odnosu na ljudski imuni sistem. U određenim drugim primerima izvođenja, heterologni, T-ćelijski epitop je sposoban da bude predstavljen od strane molekula ćelije MHC klase I. U određenim drugim primerima izvođenja, endogeni, T-ćelijski epitop je CD4+ T-ćelijski epitop, kao što je, npr., u odnosu na ljudski imuni sistem.
U određenim primerima izvođenja, de-imunizovani, efektorski polipeptid Shiga toksina predmetnog pronalaska obuhvata (i) ugrađeni ili ubačeni, heterologni, T-ćelijski epitop i (ii) poremećaj najmanje jednog, endogenog, B-ćelijskog i/ili T-ćelijskog epitopa regiona koji se ne preklapa sa ugrađenim ili umetnutim, heterolognim, T-ćelijskim epitopom. U određenim drugim primerima izvođenja, efektorski polipeptid Shiga toksina je sposoban da pokazuje najmanje jednu efektorsku funkciju Shiga toksina, kao što je, npr., upravljanje intraćelijskog usmeravanja endoplazmatičnog retikuluma i/ili citozola ćelije u kojoj je polipeptid prisutan, inhibiranje ribozomske funkcije, ezimsko inaktiviranje ribozoma, izazivanje citostaze, i/ili izazivanje citotoksičnosti. U određenim drugim primerima izvođenja, heterologni, T-ćelijski epitop je CD8+ T-ćelijski epitop, kao što je, npr., u odnosu na ljudski imuni sistem. U određenim drugim primerima izvođenja, heterologni, T-ćelijski epitop je sposoban da bude predstavljen od strane molekula ćelije MHC klase I. U određenim drugim primerima izvođenja, endogeni, region T-ćelijskog epitopa je region CD4+ T-ćelijskog epitopa, kao što je, npr., u odnosu na ljudski imuni sistem.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #1, efektorski polipeptid Shiga toksina obuhvata mutaciju, u odnosu na divlji soj Shiga toksin A Podjedinice, u regionu B-ćelijskog i/ili T-ćelijskog epitopa je odabran između grupe izvorno pozicioniranih regiona Shiga toksin A Podjedinice koji se sastoje od: 1-15 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 3-14 SEQ ID NO:3; 26-37 SEQ ID NO:3; 27-37 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 39-48 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 42-48 SEQ ID NO:3; 53-66 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 94-115 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 141-153 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 140-156 SEQ ID NO:3; 179-190 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 179-191 SEQ ID NO:3; 204 SEQ ID NO:3; 205 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2, i 210-218 SEQ ID NO:3; 240-260 SEQ ID NO:3; 243-257 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 254-268 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 262-278 SEQ ID NO:3; 281-297 SEQ ID NO:3; 285-293 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 4-33 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 34-78 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 77-103 SEQ ID NO:1 ili SEQ IDNO:2; 128-168 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 160-183 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 236-258 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; i 274-293 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; ili ekvivalentni region u Shiga toksin A Podjedinice ili njegovom derivatu. U određenim primerima izvođenja, nema poremećaja koji predstavlja karboksi-terminalno skraćenje amino kiselinskih ostataka koji se preklapaju sa delom ili celim bar jednim poremećenim, endogenim, B-ćelijskim i/ili T-ćelijskim epitopom i/ili epitopskim regionom.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #1, efektorski polipeptid Shiga toksina obuhvata mutaciju, u odnosu na divlji soj Shiga toksin A Podjedinice, u B-ćelijskoj imunogenosti, ostataka amino kiseline odabranog između grupe izvorno pozicioniranih ostataka amino kiseline Shiga toksin A Podjedinice: L49, D197, D198, R204, i R205.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #1, građeni ili ubačeni, heterologni, T-ćelijski epitop koji prekida endogeni, region B-ćelijskog i/ili T-ćelijskog epitopa je odabran između grupe izvorno pozicioniranih regiona Shiga toksin A Podjedinice koji se sastoje od: (i) 1-15 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 3-14 SEQ ID NO:3; 26-37 SEQ ID NO:3; 27-37 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 39-48 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 42-48 SEQ ID NO:3; i 53-66 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; ili ekvivalentni region u Shiga toksin A Podjedinice ili njegovom derivatu, pri čemu nema uništavanja koje predstavlja amino-krajnje skraćivanje sekvenci koje se preklapaju sa delom ili celim najmanje jednim poremećenim epitopskim regionom; (ii) 94-115 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, ili SEQ IDNO:3; 141-153 ili SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 140-156 SEQ ID NO:3; 179-190 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 179-191 SEQ ID NO:3; 204 SEQ ID NO:3; 205 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; i 210-218 SEQ ID NO:3; i (iii) 240-260 SEQ ID NO:3; 243-257 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 254-268 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 262-278 SEQ ID NO:3; 281-297 SEQ ID NO:3; i 285-293 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; ili ekvivalentni region u Shiga toksin A Podjedinice ili njegovom derivatu.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #1, efektorski polipeptid Shiga toksina obuhvata mutaciju, u odnosu na divlji soj Shiga toksin A Podjedinice, u regionu B-ćelijskog i/ili T-ćelijskog epitopa je odabran između grupe izvorno pozicioniranih regiona Shiga toksin A Podjedinice koji se sastoje od: (i) 1-15 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 3-14 SEQ ID NO:3; 26-37 SEQ ID NO:3; 27-37 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 39-48 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 42-48 SEQ ID NO:3; i 53-66 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; ili ekvivalentni region u Shiga toksin A Podjedinice ili njegovom derivatu, pri čemu nema uništavanja koje predstavlja amino-krajnje skraćivanje sekvenci koje se preklapaju sa delom ili celim najmanje jednim poremećenim epitopskim regionom; (ii) 94-115 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 141-153 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 140-156 SEQ ID NO:3; 179-190 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 179-191 SEQ ID NO:3; 204 SEQ IDNO:3; 205 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; i 210-218 SEQ ID NO:3; i (iii) 240-260 SEQ ID NO:3; 243-257 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 254-268 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 262-278 SEQ ID NO:3; 281-297 SEQ ID NO:3; i 285-293 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; ili ekvivalentni region u Shiga toksin A Podjedinice ili njegovom derivatu, pri čemu nema uništavanja koje predstavlja amino-krajnje skraćivanje sekvenci koje se preklapaju sa delom ili celim najmanje jednim poremećenim epitopskim regionom.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #1, efektorski polipeptid Shiga toksina obuhvata uništavanje najmanje jednog regiona endogenog epitopa odabran između grupe izvorno pozicioniranih regiona Shiga toksin A Podjedinice koji se sastoje od: 94-115 SEQ ID NO:1, SEQ IDNO:2, ili SEQ ID NO:3; 141-153 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 140-156 SEQ ID NO:3; 179-190 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 179-191 SEQ ID NO:3; 204 SEQ ID NO:3; 205 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; ili 210-218 SEQ ID NO:3.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #1, efektorski polipeptid Shiga toksina ne obuhvata heterologni, MHC klasa I-ograničeni, T-ćelijski epitop. MHC klasa I-ograničeni, T-ćelijski epitopi su poznati u tehnici ili mogu biti zaštićeni od strane stručnog lica. Termin heterologni se odnosi na MHC klasa I-ograničene, T-ćelijske epitope koji nisu izvorno prisutni u divljem soju Shiga toksin A Podjedinica, kao što je, npr., divlji soj Shiga toksin A Podjedinica koja je najuže povezana sa efektorskim polipeptidom Shiga toksina od interesa.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #1, efektorski polipeptid Shiga toksina obuhvata uništavanje najmanje dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, ili više endogena, B-ćelijska i/ili T-ćelijska regiona epitopa.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #1, jedno ili više uništavanje obuhvataju supstituciju ostatka amino kiseline u odnosu na divlji soj Shiga toksin A Podjedinice.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #1, jedan ili više endogenih, B-ćelijskih i/ili T-ćelijskih regiona epitopa obuhvataju više supstitucija ostatka amino kiseline u odnosu na divlji soj Shiga toksin A Podjedinice.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #1, najmanje jedan, dva, tri, ili četiri uništavanja obuhvata mnoštvo supstitucija ostatka amino kiseline u endogenom, B-ćelijskom i/ili T-ćelijskom regionu epitopa u odnosu na divlji soj Shiga toksina A Podjedinice.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #1, najmanje jedno uništavanje obuhvata jedan, dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam ili više supstitucija ostatka amino kiseline u odnosu na divlji soj Shiga toksin A Podjedinice, i opciono gde najmanje jedna supstitucija se dešava na izvorno pozicioniranom ostatku amino kiseline Shiga toksin A Podjedinice odabranom između grupe koja se sastoji od: 1 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 4 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 6 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 8 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 9 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 11 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 12 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 33 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 43 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 44 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 45 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 46 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 47 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 48 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 49 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 50 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 51 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 53 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 54 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 55 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 56 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 57 SEQ ID NO:1, SEQ IDNO:2, ili SEQ IDNO:3; 58 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 59 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 60 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 61 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 62 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 84 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 88 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 94 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 96 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 104 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 105 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 107 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ IDNO:3; 108 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 109 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 110 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 111 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 112 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 141 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 147 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 154 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 179 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 180 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 181 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 183 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 184 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 185 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 186 ili SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 187 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 188 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 189 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 197 SEQ ID NO:3; 198 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 204 SEQ ID NO:3; 205 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 247 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 247 SEQ ID
1
NO:3; 248 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 250 SEQ ID NO:3; 251 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 264 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 265 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; i 286 of SEQ ID NO: 1 orili SEQ ID NO:2; ili ekvivalentni ostatak amino kiseline u Shiga toksin A Podjedinici ili njegovom derivatu. U određenim daljim primerima izvođenja, najmanje dva uništavanja svako obuhvata najmanje jednu supstituciju amino kiseline u odnosu na divlji soj Shiga toksin A Podjedinice odabrane između grupe koja se sastoji od: 1 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 4 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 8 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 9 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 11 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 33 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 43 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 45 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 47 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 48 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 49 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 53 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 55 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 58 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 59 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 60 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 61 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 62 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 94 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 96 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 109 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 110 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 112 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 147 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 179 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 180 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 181 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 183 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 184 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 185 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 186 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 187 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 188 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 189 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 204 SEQ ID NO:3; 205 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 247 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 247 SEQ ID NO:3; 250 SEQ ID NO:3; 264 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 265 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; i 286 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; ili ekvivalentni ostatak amino kiseline Shiga toksin A Podjedinice ili njegov derivat.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #1, efektorski polipeptid Shiga toksina obuhvata uništavanje najmanje tri, endogena, B-ćelijska i/ili T-ćelijska regiona epitopa odabrana između grupe koja se sastoji od: (i) 1-15 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 3-14 SEQ ID NO:3; 26-37 SEQ ID NO:3; 27-37 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 39-48 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 42-48 SEQ ID NO:3; i 53-66 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3, ili ekvivalentni region Shiga toksin A Podjedinice ili njegov derivat, pri čemu nema uništavanja koje predstavlja amino-krajnje skraćivanje sekvenci koje se preklapaju sa delom ili celim najmanje jednim prekinutim, endogenim, B-ćelijskim i/ili T-ćelijskim regionom epitopa; (ii) 94-115 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 141-153 SEQ ID NO:1 ili SEQ IDNO:2; 140-156 SEQ ID NO:3; 179-190 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 179-191 SEQ ID NO:3; 204 SEQ ID NO:3; 205 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; i 210-218 SEQ ID NO:3; i (iii) 240-260 SEQ ID NO:3; 243-257 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 254-268 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 262-278 SEQ ID NO:3; 281-297 SEQ ID NO:3; i 285-293 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; ili ekvivalentnim regionom u Shiga toksin A Podjedinici ili njegovom derivatu, pri čemu nema uništavanja koje predstavlja amino-krajnje skraćivanje sekvenci koje se preklapaju sa delom ili celim najmanje jednim prekinutim, endogenim, B-ćelijskim i/ili T-ćelijskim epitopom i/ili regionom epitopa.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #1, efektorski polipeptid Shiga toksina obuhvata uništavanje najmanje dva, endogena, B-ćelijska i/ili T-ćelijska regiona epitopa, pri čemu svako uništavanje obuhvata jednu ili više supstitucija ostatka amino kiseline, i pri čemu endogeni, B-ćelijski i/ili T-ćelijski regioni epitopa su odabrani između grupe izvorno pozicionirani regiona Shiga toksin A Podjedinice koja se sastoji od: 3-14 SEQ ID NO:3; 26-37 SEQ ID NO:3; 27-37 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 39-48 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 42-48 SEQ ID NO:3; 53-66 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; ili ekvivalenti region u Shiga toksin A Podjedinici ili njegov derivat.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #1, ugrađeni ili umetnuti, heterologni, T-ćelijski epitop ne uništava bilo koji endogeni, B-ćelijski i/ili CD4+ T-ćelijski region epitopa koji je ovde opisan.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #1, najmanje jedno uništavanje obuhvata jednu ili više supstitucija ostatka amino kiseline u odnosu na divlji soj Shiga toksin A Podjedinice je odabran između grupe koja se sastoji od: D do A, D do G, D do V, D do L, D do I, D do F, D do S, D do Q, D do M, D do R, E do A, E do G, E do V, E do L, E do I, E do F, E do S, E do Q, E do N, E do D, E do M, E do R, F do A, F do G, F do V, F do L, F do I, G do A, G do P, H do A, H do G, H do V, H do L, H do I, H do F, H do M, I do A, I do V, I do G, I do C, K do A, K do G, K do V, K do L, K do I, K do M, K do H, L do A, L do V, L do G, L do C, N do A, N do G, N do V, N do L, N do I, N do F, P do A, P do G, P do F, R do A, R do G, R do V, R do L, R do I, R do F, R do M, R do Q, R do S, R do K, R do H, S do A, S do G, S do V, S do L, S do I, S do F, S do M, T do A, T do G, T do V, T do L, T do I, T do F, T do M, T do S, V do A, V do G, Y do A, Y do G, Y do V, Y do L, Y do I, Y do F, Y do M, i Y do T. U određenim daljim primerima izvođenja, jedna ili više supstitucija ostatka amino kiseline u odnosu na divlji soj Shiga toksin A Podjedinice0 je odabrana između grupe koja se sastoji od: D do A, D do G, D do V, D do L, D do I, D do F, D do S, D do Q, E do A, E do G, E do V, E do L, E do I, E do F, E do S, E do Q, E do N, E do D, E do M, E do R, G do A, H do A, H do G, H do V, H do L, H do I, H do F, H do M, K do A, K do G, K do V, K do L, K do I, K do M, K do H, L do A, L do G, N do A, N do G, N do V, N do L, N do I, N do F, P do A, P do G, P do F, R do A, R do G, R do V, R do L, R do I, R do F, R do M, R do Q, R do S, R do K, R do H, S do A, S do G, S do V, S do L, S do I, S do F, S do M, T do A, T do G, T do V, T do L, T do I, T do F, T do M, T do S, Y do A, Y do G, Y do V, Y do L, Y do I, Y do F, i Y do M.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #1, najmanje jedno od uništenja obuhvata supstitucije jednog ili više ostataka amino kiseline u odnosu na divlji soj Shiga toksin A Podjedinice odabrane između grupe koja se sastoji od: Kl do A, G, V, L, I, F, M i H; T4 do A, G, V, L, I, F, M, i S; D6 do A, G, V, L, I, F, S, Q i R; S8 do A, G, V, I, L, F, i M; T9 do A, G, V, I, L, F, M, i S; S9 do A, G, V, L, I, F, i M; K11 do A, G, V, L, I, F, M i H; T12 do A, G, V, I, L, F, M, S, i K; S12 do A, G, V, I, L, F, i M; S33 do A, G, V, L, I, F, M, i C; S43 do A, G, V, L, I, F, i M; G44 do A ili L; S45 do A, G, V, L, I, F, i M; T45 do A, G, V, L, I, F, i M; G46 do A i P; D47 do A, G, V, L, I, F, S, M, i Q; N48 do A, G, V, L, M i F; L49 do A, V, C, i G; Y49 do A, G, V, L, I, F, M, i T; F50 do A, G, V, L, I, i T; A51 do V; D53 do A, G, V, L, I, F, S, i Q; V54 do A, G, I, i L; R55 do A, G, V, L, I, F, M, Q, S, K, i H; G56 do A i P; 157 do A, G, V, i M; L57 do A, V, C, G, M, i F; D58 do A, G, V, L, I, F, S, i Q; P59 do A, G, i F; E60 do A, G, V, L, I, F, S, Q, N, D, M, T, i R; E61 do A, G, V, L, I, F, S, Q, N, D, M, i R; G62 do A; R84 do A, G, V, L, I, F, M, Q, S, K, i H; V88 do A i G; I88 do A, V, C, i G; D94 do A,G, V, L, I, F, S, i Q; S96 do A, G, V, I, L, F, i M; T104 do A, G, V, L, I, F, M; i N; A105 do L; T107 do A, G, V, L, I, F, M, i P; S107 do A, G, V, L, I, F, M, i P; L108 do A, V, C, i G; S109 do A, G, V, I, L, F, i M; T109 do A, G, V, I, L, F, M, i S; G110 do A; SI 12 do A, G, V, L, I, F, i M; D111 do A, G, V, L, I, F, S, Q, i T; S112 do A, G, V, L, I, F, i M; D141 do A, G, V, L, I, F, S, i Q; G147 do A; V154 do A i G. R179 do A, G, V, L, I, F, M, Q, S, K, i H; T180 do A, G, V, L, I, F, M, i S; T181 do A, G, V, L, I, F, M, i S; D183 do A, G, V, L, I, F, S, i Q; D184 do A, G, V, L, I, F, S, i Q; L185 do A, G, V i C; S186 do A, G, V, I, L, F, i M; G187 do A; R188 do A, G, V, L, I, F, M, Q, S, K, i H; S189 do A, G, V, I, L, F, i M; D197 do A, G, V, L, I, F, S, i Q; D198 do A, G, V, L, I, F, S, i Q; R204 do A, G, V, L, I, F, M, Q, S, K, i H; R205 do A, G, V, L, I, F, M, Q, S, K i H; S247 do A, G, V, I, L, F, i M; Y247 do A, G, V, L, I, F, i M; R248 do A, G, V, L, I, F, M, Q, S, K, i H; R250 do A, G, V, L, I, F, M, Q, S, K, i H; R251 do A, G, V, L, I, F, M, Q, S, K, i H; D264 do A, G, V, L, I, F, S, i Q; G264 do A; i T286 do A, G, V, L, I, F, M, i S.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #1, efektorski polipeptid Shiga toksina sastoji se uglavnom od polipeptida prikazanog u bilo kojim SEQ ID NOs: 355-369
1
koji dalje sadrži uništenje najmanje jedan, endogeni, B-ćelijski i/ili T-ćelijski region epitopa koja se ne preklapa sa umetnutim ili ubačenim, heterogenim, CD8+ T-ćelijskim epitopom.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #1, efektorski polipeptid Shiga toksina sadrži ili se sastoji u suštini od polipeptida prikazani u bilo kom SEQ ID NOs: 6-32, 340-354, i 370-438.
Za određene primere izvođenja Set Primera Izvođenja #1, efektorski polipeptid Shiga toksina je sposoban da pokazuje (i) nivo katalitičke aktivnosti uporediv sa divljim sojem Shiga toksina A1 fragmenta ili divlji soj efektorskog polipeptida Shiga toksina, (ii) inhibicionu aktivnost ribozoma sa vrednosti polu-maksimalnom inhibitornom koncentracijom (IC50) od10,000 pikomola ili manje, i/ili(iii) značajan nivo katalitičke aktivnosti Shiga toksina.
Za određene primere izvođenja Set Primera Izvođenja #1, efektorski polipeptid Shiga toksina je sposoban da pokazuje podćelijsko efikasno usmeravanje u poređenju sa divljim sojem efektorskog polipeptida Shiga toksina i/ili sposoban da pokazuje značajan nivo intraćelijskog usmeravanja aktivnosti na endoplazmatični retikulum i/ili citozol iz endozomalne polazne lokacije ćelije.
Za određene primere izvođenja Set Primera Izvođenja #1, efektorski polipeptid Shiga toksina je sposoban za intraćelijsku dostavu ugrađenog ili ubačenog, heterolognog, T-ćelijskog epitopa iz ranije endozomalne pregrade u ćelijski molekul MHC klase I gde je efektorski polipeptid Shiga toksina prisutan. Za određene dalje primere izvođenja, efektorski polipeptid Shiga toksina je sposoban za pokazivanje jednog ili više efektorskih funkcija Shiga toksina u odnosu na intraćelijsku dostavu, kao što je, npr., efektorske funkcije Shiga toksina: promovisanje ćelijske internalizacije, upravljanje podćelijskim usmeravanjem na citozol, ribozomska inaktivacija, indukovanje aktivnosti kaspaze, izazivanje citostaze, i/ili izazivanje smrti ćelije. U određenim daljim primerima izvođenja, heterlogni, T-ćelijski epitop je CD8+ T-ćelijski epitop, kao što je, npr., u pogledu na humani imuni sistem.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #1, efektorski polipeptid Shiga toksina obuhvata uništenje najmanje dva, endogena, epitopska regiona odabrana između grupe izvorno pozicioniranih regiona Shiga toksin A Podjedinice koji se sastoje od: 94-115 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 141-153 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 140-156 SEQ ID NO:3; 179-190 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 179-191 SEQ ID NO:3; 204 SEQ ID NO:3; 205 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; ili 210-218 SEQ ID NO:3; pri čemu uništenje se ne sastoji samo od supstitucije ostatka amino kiseline odabrane između grupe koja se sastoji od: S96Y SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; Y114S SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; R179A SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; R179H SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; L185A SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; R188A SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; R205A SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; R179A/R188A SEQ ID NO: 1; ili SEQ ID NO:2; ili A188V SEQ ID NO:3.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #1, efektorski polipeptid Shiga toksina obuhvata uništenje koje obuhvata mutaciju najmanje jednog ostatka amino kiseline u najmanje jednom, endogenom epitopskom regionu odabranom između grupe koja se sastoji od izvorno pozicioniranih regiona Shiga toksin A Podjedinice koja se sastoji od: 1-15 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 3-14 SEQ ID NO:3; 26-37 SEQ ID NO:3; 27-37 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 39-48 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 42-48 SEQ ID NO:3; 53-66 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; pri čemu efektorski polipeptid Shiga toksina ne sadrži skraćenje amino-kraja koje se preklapa sa gore spomenutim uništenim regionom epitopa.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #1, efektorski polipeptid Shiga toksina obuhvata uništenje koje obuhvata mutaciju najmanje jednog ostatka amino kiseline u najmanje dva, endogena epitopska regiona odabrana između grupe koja se sastoji od izvorno pozicioniranih regiona Shiga toksin A Podjedinice koja se sastoji od: 1 -15 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 3-14 SEQ ID NO:3; 26-37 SEQ ID NO:3; 27-37 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 39-48 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 42-48 SEQ ID NO:3; 53-66 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; pri čemu se uništenje ne sastoji samo od supstitucije ostatka amino kiseline R63 W SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; i pri čemu efektorski polipeptid Shiga toksina ne sadrži skraćenje amino-kraja koje se preklapa sa gore spomenutim uništenim, dva, epitopska regiona.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #1, efektorski polipeptid Shiga toksina obuhvata uništenje koje obuhvata mutaciju najmanje jednog ostatka amino kiseline u najmanje jednom, endogenom epitopskom regionu odabranom između grupe koja se sastoji od izvorno pozicioniranih regiona Shiga toksin A Podjedinice koja se sastoji od: 240-260 SEQ ID NO:3; 243-257 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 254-268 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 262-278 SEQ ID NO:3; 281-297 SEQ ID NO:3; i 285-293 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; pri čemu efektorski polipeptid Shiga toksina ne sadrži skraćenje karboksi-kraja koje se preklapa sa gore spomenutim uništenim epitopskim regionom.
1
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #1, efektorski polipeptid Shiga toksina obuhvata uništenje koje obuhvata mutaciju najmanje jednog ostatka amino kiseline u najmanje dva, endogena epitopska regiona odabrana između grupe koja se sastoji od izvorno pozicioniranih regiona Shiga toksin A Podjedinice koja se sastoji od: 240-260 SEQ ID NO:3; 243-257 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 254-268 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 262-278 SEQ ID NO:3; 281-297 SEQ ID NO:3; i 285-293 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; pri čemu efektorski polipeptid Shiga toksina ne sadrži mutaciju odabranu između grupe koja se sastoji od: R248H SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; A250V SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; R251H SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; A253G SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; S254T SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; C261A SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; R289K SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; R248H i R251H SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; A253G i S254T SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; delecija (gubitak) S247-M252 SEQ ID NO:1; S246F SEQ ID NO:3; A282V SEQ ID NO:3; I291V SEQ ID NO:3; S246F SEQ ID NO:3; i pri čemu efektorski polipeptid Shiga toskina ne sadrži skraćenje karboksi-kraja koje se preklapa sa gore spomenutim uništenim dva epitopska regiona.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #1, de-imunizovani, efektorski polipeptid Shiga toksina sadrži ili se sastoji bitno od polipeptida koji je prikazan u bilo kom SEQ ID NOs: 6-27, 29-32, 340-354, i 370-438.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #1, efektorski polipeptid Shiga toksina predmetnog pronalaska sadrži jedan ili više mutacija u odnosu na A Podjedinicu člana familije Shiga toksina koja se javlja u prirodi koja menja enzimsku aktivnost efektorskog polipeptida Shiga toksina, mutacija odabrana najmanje od jedne delecije (gubitka), ubacivanja, ili supstitucije ostatka amino kiseline. U određenim daljim primerima izvođenja, mutacija u odnosu na A Podjedinicu koja se javlja u prirodi smanjuje ili eliminiše citotoksičnu aktivnost efektorskog polipeptida Shiga toksina ali efektorski polipeptid Shiga toksina zadržava najmanje jednu drugu efektorsku funkciju Shiga toksina, kao što je, npr., promovisanje ćelijske internalizacije i/ili upravljanje intraćelijskog usmeravanja na određenu(e) podćelijsku(e) pregradu(e). U određenim daljim primerima izvođenja, mutacija u odnosu na A Podjedinicu koja se javlja u prirodi je odabrana iz najmanje jedne supstitucije ostatka amino kiseline, kao što je, npr., A231E, R75A, Y77S, Y114S, E167D, R170A, R176K, i/ili W203A u SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #1, efektorski polipeptid Shiga toksina sadrži (i) fragment Shiga toksina A1 izvedenog regiona koji ima karboksi kraj i (ii)
1
uništeni furin-odcepljeni motiv na karboksi kraju A1 fragment regiona. U određenim daljim primerima izvođenja, uništeni furin-odcepljeni motiv koji sadrži jedan ili više mutacija, u odnosu na divlji soj Shiga toksin A Podjedinice, mutacija koja menja barem jedan ostatak amino kiseline u regionu koji je izvorno pozicioniran na 248-251 A Podjedinici Shiga-slični toksin 1 (SEQ ID NO: 1) ili Shiga toksin (SEQ ID NO:2), ili na 247-250 A Podjedinici Shigaslični toksin (SEQ ID NO:3); ili ekvivalentni region u Shiga toksin A Podjedinici ili njegov derivat. U određenim daljim primerima izvođenja, uništeni furin-odcepljeni motiv sadrži jedan ili više mutacija, u odnosu na divlji soj Shiga toksin A Podjedinice, na minimalnom furinskom odcepljenom mestu furinskog odcepljenog motiva. U određenim drugim primerima izvođenja, minimalno mesto cepljena furina je predstavljeno sa konsenzus amino kiselinskom sekvencom R/Y-x-x-R i/ili R-x-x-R.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #1, efektorski polipeptid Shiga toksina sadrži (i) fragment Shiga toksin A1 izvedenog regiona koji ima karboksi kraj i (ii) uništeni furin odcepljeni motiv na karboksi kraju A1 fragmentnog regiona. U određenim daljim primerima izvođenja, uništeni furin odcepljeni motiv sadrži supstituciju ostataka amino kiseline u furin odcepljenom motivu u odnosu na divlji soj Shiga toksin A Podjedinice. U određenim daljim primerima izvođenja, supstitucija ostatka amino kiseline u furin odcepljenom motivu jeste arginin ostatak sa negativno naelektrisanim, amino kiselinskim ostatkom odabranim između grupe koja se sastoji od: alanina, glicina, prolina, serina, treonina, aspartata, asparagina, glutamata, glutamina, cisteina, izoleucina, leucina, metionina, valina, fenilalanina, triptofana, i tirozina. U određenim primerima izvođenja, supstitucija ostatka amino kiseline u furinsko odcepljenom motivu jeste arginin ostatak sa histidinom.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #1, efektorski polipeptid Shiga toksina, ili sam ili kao komponenta prvog ćelijsko ciljanog molekula, je sposoban kada se uvodi u ćelije ispoljavajući citotoksičnost koja je uporediva sa citotoksičnošću divlje soja Shiga toksin A1 polipeptida i/ili drugog ćelijskog ciljanog molekula koji se sastoji od prvog ćelijskog ciljanog molekula osim za sve njegove komponente efektorskog polipeptida Shiga toksina svaka sadrži divlji soj Shiga toksina A1 fragmenta.
Za određene primere izvođenja efektorski polipeptid Shiga toksina Set Primera Izvođenja #1, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska koji sadrži efektorski polipeptid Shiga toksina je sposoban kada je unet u hordat koja ispoljava poboljšanu, in vivo podnošljivost u poređenju sa drugim ćelijskim ciljanim molekulom koji se sastoji od prvog ćelijski ciljanog
1
molekula osim za sve njegove komponente efektorskog polipeptida Shiga toksina svaka sadrži divlji soj Shiga toksina A1 fragmenta i/ili divljeg soja Shiga toksina furin-odcepljenog mesta na karboksi kraju njegovog regiona A1 fragmenta.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #1, efektorski polipeptid Shiga toksina predmetnog pronalaska obuhvata efektorski region Shiga toksina izveden iz amino kiselina 75 do 251 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #1, efektorski polipeptid Shiga toksina predmetnog pronalaska obuhvata efektorski region Shiga toksina izveden iz amino kiselina 1 do 241 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3. U određenim daljim primerima izvođenja, efektorski region Shiga toksina je izveden iz amino kiselina 1 do 251 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3. U određenim daljim primerima izvođenja, efektorski region Shiga toksina je izveden iz amino kiselina 1 do 261 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3.
Set Primera Izvođenja #2 - Ćelijski-Ciljani Molekul koji Sadrži De-imunizovani Efektorski Polipeptid Shiga Toksina koji Sadrži Ugrađeni ili Ubačeni, Heterologni, T-Ćelijski Epitop i Nepreklapajući De-Imunizovani Pod-Region
Predmetni pronalazak obezbeđuje ćelijski ciljane molekule, svaki obuhvata (i) vezujući region sposoban da specijalno veže ekstraćelijski ciljani biomolekul i (ii) a de-imunizovani, efektorski polipeptid Shiga toksina Set Primera Izvođenja #1 (videti npr. Slika 1, prikazujući ilustrativne primere četiri, primerna rešenja ćelijsko ciljanih molekula ovog seta primera izvođenja #2). Na primer, određeni set primera izvođenja #2 jeste ćelijsko ciljani molekul koji sadrži (i) vezujući region sposoban da specijalno veže ekstraćelijski ciljani biomolekul i (ii) a de-imunizovani, efektorski polipeptid Shiga toksina koji sadrži najmanje jedan ubačen ili ugrađen, heterologni epitop (a) i najmanje jedan uništen, endogeni, B-ćelijski i/ili CD4+ T-ćelijski epitopski region (b), pri čemu heterologni epitop se ne preklapa sa ugrađenim ili ubačenim, heterolognim, T-ćelijskim epitopom. Za određene druge primere izvođenja, efektorski polipeptid Shiga toksina je sposoban da prikaže najmanje jednu efektorsku funkciju Shiga toksina, kao što je, npr., upravljanje podćelijskim usmeravanjem na endoplazmični retikulum i/ili citozol ćelije u kojoj je polipeptid prisutan, inhibiranje funkcije ribozoma, enzimsko inaktiviranje ribozoma, izazivanje citostaze, i/ili izazivanje citotoksičnosti. U određenim drugim primerima izvođenja, heterologni, T-ćelijski epitop je CD8+ T-ćelijski epitop, kao što je, npr., u odnosu na humani imuni sistem. Za određene
1
druge primere izvođenja, heterologni, T-ćelijski epitop je sposoban da bude predstavljen sa molekulom ćelije MHC klase I. U određenim drugim primerima izvođenja, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska je sposoban za jedno ili više sledećeg: ulazak u ćeliju, inhibirajući funkciju ribozoma, izazivajući citostazu, uzrokujući ćelijsku smrt i/ili dostavljanje ugrađenog ili ubačenog, heterolognog, T-ćelijskog epitopa u molekul MHC klase I za prezentaciju na ćelijskoj površini. Prema određenim daljim primerima izvođenja, ćelijski ciljani molekul je sposoban kada se uvede u ćelije koje pokazuju citotoksičnost koja je uporediva ili bolja od referentnog molekula, kao što je, na primer, drugi ćelijsko ciljani molekul koji se sastoji od ćelijsko ciljanog molekula osim za sve njegove komponente efektorskog polipeptida Shiga toksina svaki sadrži fragment Shiga toksina A1 divljeg soja.
Za određene primere izvođenja Set Primera Izvođenja #2, ćelijski ciljani molekul sadrži ostatak molekula vezujući karboksi kraj za karboksi kraj Shiga toksina A1 fragment regiona.
Za određene primere izvođenja Set Primera Izvođenja #2, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska je sposoban kada se uvodi u hordat pokazujući poboljšanu in vivo podnošljivost i/ili stabilnost u poređenju sa referentnim molekulom, kao što je, npr., drugi ćelijski ciljani molekul koji se sastoji od ćelijskog ciljanog molekula osi za sve njegove komponente efektorskog polipeptida Shiga toksina svaki sadrži fragment Shiga toksina A1 divljeg soja i/ili mesto furinskog cepanja divljeg soja Shiga toksina na karboksi kraju njegovog A1 fragment regiona. U određenim drugim primerima izvođenja, efektorski polipeptid Shiga toksina nije citotoskičan, a ostatak molekula jeste citotoksičan.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #2, vezujući region i efektorski polipeptid Shiga toksina su povezani zajedno, ili direktno ili indirektno.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #2, vezujući region sadrži polipeptid koji sadrži vezujući region imunoglobulinskog tipa. U određenim drugim primerima izvođenja, vezujući region sadrži polipeptid odabran između grupe koja se sastoji od: autonomni VHdomen, singl-domen fragmenta antitela f (sdAb), nanotelo, domen antitela teškog lanca izveden iz kamile (VHH ili VHfragment domena), domen antitela teškog lanca izveden iz hrskave ribe (VHH ili VHfragment domena), novi antigenski receptor imunoglobulina (IgNAR), VNARfragment, jedno-lančani varijabilni fragment (scFv), varijabilni fragment antitela (Fv), komplementarni utvrđeni region 3 fragment (CDR3), ograničeni FR3-CDR3-FR4 polipeptid (FR3-CDR3-FR4), Fd fragment, mali modularni imunofarmaceutski (SMIP) domen, antigen-vezujući fragment (Fab), Armadillo ponovljeni polipeptid (ArmRP),
1
fibronectin-izvedeni 10 fibronectin tipa III domen (10Fn3), tenascin tipa III domen (TNfn3), ankirin ponovljeni motivni domen, niske-gustine-lipoprotein- receptor-izvedeni A-domen (LDLR-A), lipokalin (antikalin), Kunitz domen, Protein-A-izvedeni Z domen, gama-B kristalniizvedeni domen, ubihitin-izvedeni domen, Sac7d-izvedeni polipeptid (afitin), Fyn-izvedeni SH2 domen, miniprotein, C-tipa lektin-sličan domen skelet, dizajnirana mimika antitela, i bilo koji genetski manipulisani duplikat bilo kog gore navedenog koji zadržava vezujuću funkcionalnost.
Za određene primere izvođenja Set Primera Izvođenja #2, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska je sposoban da iskazuje (i) nivo katalitičke aktivnosti u poređenju sa divljim sojem Shiga toksin A1 fragmenta ili divljim sojem Shiga toksin efektorskog polipeptida, (ii) ribozomsku inhibicionu aktivnost sa vrednosti polu-maksimalne inhibitorne koncentracije (IC50) od 10,000 pikomola ili manje, i/ili (iii) značajan nivo katalitičke aktivnosti Shiga toksina.
Za određene primere izvođenja Set Primera Izvođenja #2, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska i/ili njegov efektorski polipeptid Shiga toksina je sposoban da iskazuje podćelijsku usmerenu efikasnost u poređenju sa ćelijski ciljanim molekulom koji sadrži divlji soj Shiga toksin A1 fragment ili divlji soj Shiga toksina efektorskog polipeptida i/ili sposoban da iskazuje značajan nivo intraćelijskog usmeravanja aktivnosti na endoplazmični retikulum i/ili citozol iz endozomalne početne lokacije ćelije.
Za određene primere izvođenja Set Primera Izvođenja #2, pri čemu primena ćelijskog ciljanog molekula predmetnog pronalaska u ćeliju koja je fizički spojena sa ekstraćelijskim ciljanim biomolekulom vezujućeg regiona ćelijski ciljanog molekula, ćelijski ciljani molekul može izazvati smrt ćelije. U nekim drugim primerima izvođenja, primena ćelijskog ciljanog molekula pronalaska na dve različite populacije ćelijskih tipova, koje se razlikuju s obzirom na prisustvo ili nivo ekstraćelijskog ciljanog biomolekula, ćelijski ciljani molekul može izazvati smrt ćelije ćelijskog tipa koji je fizički povezan sa ekstraćelijskim ciljanim biomolekulom vezujućeg regiona citotoskičnog ćelijski ciljanog molekula na CD50najmanje tri puta ili manje od CD50na ćelijskim tipovima koji nisu fizički spojeni sa ekstraćelijskim ciljanim biomolekulom vezujućeg regiona ćelijskog ciljanog molekula. Za određene primere izvođenja, pri čemu primena ćelijski ciljanog molekula predmetnog pronalaska na prvu populaciju ćelija čiji članovi su fizički spojeni za esktraćelijske ciljane biomolekule vezujućeg regiona ćelijski ciljanog molekula, i drugu populaciju ćelija čiji članovi nisu fizički spojeni za bilo koji esktraćelijski ciljani biomolekul vezujućeg regiona, citotoskična efikasnost članova ćelijski ciljanog molekula navedene prve populacije ćelija u odnosu na članove navedene
2
druge populacije ćelija je najmanje 3 puta veća. Za određene primere izvođenja, pri čemu primena ćelijski ciljanog molekula predmetnog pronalaska na prvu populaciju ćelija čiji članovi su fizički spojeni za značajnu količinu ekstraćelijskog ciljanog biomolekula vezujućeg regiona ćelijski ciljanog molekula, i drugu populaciju ćelija čiji članovi nisu fizički spojeni za značajnu količinu bilo kog ekstraćelijskog ciljanog biomolekula vezujućeg regiona, citotoskična efikasnost članova ćelijski ciljanog molekula navedene prve populacije ćelija u odnosu na članove navedene druge populacije ćelija je najmanje 3 puta veća. Za određene primere izvođenja, pri čemu primena ćelijski ciljanog molekula predmetnog pronalaska na prvu populaciju pozitivnih ćelija ciljanog biomolekula, i na drugu populaciju ćelija čiji članovi ne iskazuju značajnu količinu ciljanog biomolekula vezujućeg regiona ćelijski ciljanog molekula na ćelijskoj površini, citotoskična efikasnost članova ćelijski ciljanog molekula navedene prve populacije ćelija u odnosu na članove navedene druge populacije ćelija je najmanje 3 puta veća.
Za određene primere izvođenja Set Primera Izvođenja #2, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska je sposoban kada se uvodi u ćelije da pokazuje citotoksičnost sa vrednosti polumaksimalne inhibicione koncentracije (CD50) od 300 nM ili manje i/ili sposobni da pokazuju značajan nivo citotoksičnosti Shiga toksina.
Za određene primere izvođenja Set Primera Izvođenja #2, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska je sposoban da dostavi ugrađeni ili ubačeni, heterologni, CD8+ T-ćelijski epitop za prezentaciju putanje ćelije MHC klase I za prezentaciju ćelijske površine epitop vezan za molekul MHC klase I.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #2, ćelijski ciljani molekul obuhvata molekulski ostatak povezan sa karboksi krajem efektorskog polipeptida Shiga toksina. U određenim primerima izvođenja, molekulski ostatak obuhvata ili se sastoji od vezujućeg regiona. U određenim primerima izvođenja, molekulski ostatak koji obuhvata najmanje jednu amino kiselinu i efektorski polipeptid Shiga toksina je povezan sa najmanje jednim amino kiselinskim ostatkom molekulskog ostatka. U određenim drugim primerima izvođenja, molekulski ostatak i efektorski polipeptid Shiga toksina su spojeni tako da obrazuju kontinuirani polipeptid.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #2, ćelijski ciljani molekul dalje obuhvata citotoksični molekulski ostatak povezan sa karboksi krajem efektorskog polipeptida Shiga toksina. Za određene primere izvođenja, citotoksični molekulski ostatak je citotoksični agens, kao što je, npr., mali molekul hemoterapeutskog agensa, anti-neoplastični agens, citotoksični antibiotik, alkilacioni agens, antimetabolit, topoizomerazni inhibitor, i/ili tubulin inhibitor koji je poznat stručnom licu i/ili koji je ovde opisan. Za određene druge primere izvođenja, citotoksični molekulski ostatak je citotoksičnost pri koncentracijama manjim od 10,000, 5,000, 1,000, 500, ili 200 pM.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #2, vezujući region je sposoban da se veže za esktraćelijski ciljani biomolekul odabran između grupe koja se sastoji od: CD20, CD22, CD40, CD74, CD79, CD25, CD30, HER2/neu/ErbB2, EGFR, EpCAM, EphB2, prostatski specifični membranski antigen, Cripto, CDCP1, endoglin, protein aktivacije fibroblasta, Lewis-Y, CD19, CD21, CS1/ SLAMF7, CD33, CD52, CD133, gpA33, mucin, TAG-72, tirozin-protein kinaza transmembranski receptor (ROR1 or NTRKRl), karbonska anhidraza IX, folatni vezujući protein, gangliozid GD2, gangliozid GD3, gangliozid GM2, gangliozid Lewis-Y2, VEGFR, Alfa Vbeta3, Alfa5beta1, ErbBl/EGFR, Erb3, c-MET, IGF1R, EphA3, TRAIL-R1, TRAIL-R2, RANK, FAP, tenascin, CD64, mezotelin, BRCA1, tirozinaza, TRP-1, TRP-2, MAGE-1, MAGE-3, GAGE-1/2, BAGE, RAGE, NY-ESO-1, CDK-4, betakatenin, MUM-1, kaspaza-8, KIAA0205, HPVE6, SART-1, PRAME, karcinoembrionski antigen, specifični antigen prostate, antigen matičnih ćelija prostate, human aspartil (asparaginil) beta-hidroksilaza, EphA2, HER3/ErbB-3, MUC1, MART-l/MelanA, gplOO, antigen povezan sa tirozinazom, HPV-E7, Epstein-Barr virus antigen, Bcr-Abl, alfafetoprotein antigen, 17-A1, antigen tumora mokraćne bešike, CD38, CD15, CD23, CD45 (protein tirozin fosfatazni receptor tip C), CD53, CD88, CD129, CD183, CD191, CD193, CD244, CD294, CD305, C3AR, galectin-9, IL-1R (interleukin-1 receptor), mrp-14, NKG2D ligand, programirana smrt ligand 1 (PD-L1), Siglec-8, Siglec-10, CD49d, CD13, CD44, CD54, CD63, CD69, CD123, TLR4, FceRIa, IgE, CD107a, CD203c, CD14, CD68, CD80, CD86, CD105, CD115, F4/80, ILT-3, galektin-3, CD1 la-c, GITRL, MHC klasa I molekul, MHC klasa II molekul (opciono kompleksovan sa peptidom), CD284 (TLR4), CD107-Mac3, CD195 (CCR5), HLA-DR, CD16/32, CD282 (TLR2), CD1 lc, i bilo koji imunogenski fragment bilo kog od navedenog.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #2, vezujući region je direktno ili indirektno povezan sa efektorskim polipeptidom Shiga toksina sa najmanje jednom kovalentnom vezom koja nije disulfidna veza. U određenim drugim primerima izvođenja, vezujući region je spojen, ili direktno ili indirektno, za karboksi kraj efektorskog polipeptida Shiga toksina da obrazuje pojedinačni, kontinualni polipeptid. U određenim drugim primerima izvođenja, vezujući region je vezujući region imunoglobulinskog tipa.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #2, uništeni furinski odcepljeni motiv sadrži jednu ili više mutacija na minimalnom, furinskom odcepljenom mestu u odnosu na divlji soj Shiga toksin A Podjedinice. U određenim primerima izvođenja, uništeni furinski odcepljeni motiv ne predstavlja skraćenje amino kraja sekvenci koje se preklapaju sa delom ili čitavim bar jednim amino kiselinskim ostatkom minimalnog furinskog odcepljenog mesta. U određenim primerima izvođenja, mutacija na minimalnom, furinskom odcepljenom mestu je delecija (gubitak), ubacivanje, i/ili supstitucija najmanje jednog amino kiselinskog ostatku R/Y-x-x-R furinskom odcepljenom motivu. U određenim drugim primerima izvođenja, uništeni furinski odcepljeni motiv sadrži najmanje jednu mutaciju u odnosu na divlji soj Shiga toksin A Podjedinice, mutacija menja najmanje jedan amino kiselinski ostatak u regionu izvorno pozicioniranim 1) na 248-251 A Podjedinice Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO: 1) ili Shiga toksina (SEQ ID NO: 2), ili 2) na 247-250 A Podjedinici Shiga-sličnog toksina 2 (SEQ ID NO:3), ili ekvivalente amino kiselinske sekvence pozicionirane na bilo kojoj Shiga toksin A Podjedinici. U određenim drugim primerima izvođenja, mutacija je supstitucija amino kiselinskog ostatka arginin ostatka sa negativno naelektrisanim, amino kiselinskim ostatkom.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #2, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska je sposoban kada se uvodi u ćelije koje pokazuju citotoksičnost u poređenju sa citotoksičnošću referentnog molekula, kao što je, npr., drugi ćelijski ciljani molekul koji se sastoji od ćelijskog ciljanog molekula osim svih njegovih komponenti efektorskog polipeptida Shiga toksina svaki obuhvata divlji soj Shiga toksina A1 fragmenta.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #2, vezujući region sadrži peptid ili polipeptid prikazan u bilo kom SEQ ID NOs: 83-339. U određenim drugim primerima izvođenja, vezujući region obuhvata ili se sastoji bitno od polipeptida predstavljen sa bilo kojom sledećom: amino kiselinom 1-245 bilo kog SEQ ID NOs: 33, 64, i 65; 269-513 SEQ ID NO:40 ili SEQ ID NO:80; amino kiselinom 269-520 ili 269-521 bilo kog SEQ ID NOs: 36, 66, i 67; amino kiselinom 1-232, 1-233, 1-234, 1-235, 1-236, 1-242, 1-243, 1-244, 1-245, 1246, 1-252, 1-253, 1-254, 1-255, ili 1-256 bilo kog SEQ ID NOs: 47-119 i 176-248; amino kiselinom 269-498 ili 269-499 bilo kog SEQ ID NOs: 37-39, 68-79, i 81; amino kiselinom 269-499, 269-512, 269-513, ili 280-510 bilo kog SEQ ID NOs: 34, 35, 41-56, i 82.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #2, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska sadrži ili se sastoji bitno od polipeptida prikazanog u bilo kom SEQ ID NOs: 43-62, 64-82, i 439-513.
2
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #2, vezujući region sterikalno pokriva karboksi kraj regiona A1 fragmenta.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #2, molekularni ostatak sterikalno pokriva karboksi kraj regiona A1 fragmenta. U određenim drugim primerima izvođenja, molekularni ostatak uključuje vezujući region.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #2, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska obuhvata vezujući region i/ili molekularni ostatak smeštenog karboksi kraja na karboksi kraju Shiga toksin A1 fragment regiona. U određenim drugim primerima izvođenja, masa vezujućeg regiona i/ili molekularnog ostatka je najmanje 4.5 kDa, 6 kDa, 9 kDa, 12 kDa, 15 kDa, 20 kDa, 25 kDa, 28 kDa, 30 kDa, 41 kDa, 50 kDa, 100 kDa, ili više.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #2, ćelijski ciljani molekul obuhvata vezujući region sa masom od najmanje 4.5 kDa, 6 kDa, 9 kDa, 12 kDa, 15 kDa, 20 kDa, 25 kDa, 28 kDa, 30 kDa, 41 kDa, 50 kDa, 100 kDa, ili više, sve dok ćelijski ciljani molekul zadržava određeni nivo biološke aktivnosti Shiga toksina koja je ovde zabeležena (npr., citotoksičnost i/ili intraćelijsko usmeravanje).
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #2, vezujući region je uključen unutar relativno velikog, molekularnog ostatka koji sadrži kao što je, npr., molekularni ostatak sa masom od najmanje 4.5 kDa, 6 kDa, 9 kDa, 12 kDa, 15 kDa, 20 kDa, 25 kDa, 28 kDa, 30 kDa, 41 kDa, 50 kDa, 100 kDa, ili više, sve dok ćelijski ciljani molekul zadržava određeni nivo biološke aktivnosti Shiga toksina koja je ovde zabeležena.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #2, amino kraj efektorskog polipeptida Shiga toksina je na i/ili bliže amino kraj polipeptidne komponente ćelijski ciljanog molekula. U određenim drugim primerima izvođenja, vezujući region nije postavljen bliže amino kraju ćelijski ciljanog molekula u odnosu na efektorski polipeptid Shiga toksina. U određenim drugim primerima izvođenja, vezujući region i efektorski polipeptid Shiga toksina su fizički raspoređeni ili orijentisani unutar ćelijski ciljanog molekula tako da vezujući region nije postavljen bliže amino kraj efektorskog polipeptida Shiga toksina. U određenim drugim primerima izvođenja, vezujući region se nalazi unutar ćelijskog ciljanog molekula bliže Shiga toksina. Za određene druge primere izvođenja, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska je sposoban kada se uvodi u ćelije koje pokazuju citotoksičnost koja je veća nego ona kod trećeg ćelijskog ciljanog molekula koji ima amino kraj i sadrži vezujući region i efektorski polipeptid Shiga toksina koji nije postavljen na ili bliže amino kraju trećeg ciljanog molekula. Za određene druge primere izvođenja, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska pokazuje citotoksičnost sa boljom optimizujućom, citotoksičnom jačinom, kao što je, npr., 4-puta, 5-puta, 6-puta, 9-puta, ili većom citotoksičnošću kada se poredi sa citotoksičnošću trećeg ćelijskog ciljanog molekula. Za određene druge primere izvođenja, citotoksičnost ćelijski ciljanog molekula predmetnog pronalaska na populaciju ciljanih pozitivnih ćelija je 3-puta, 4-puta, 5-puta, 6-puta, 7-puta, 8-puta, 9-puta, 10-puta ili više nego citotoksičnost trećeg ćelijski ciljanog molekula prema drugoj populaciji ciljanih pozitivnih ćelija kako je testirano sa CD50vrednostima. U određenim drugim primerima izvođenja, treći ćelijski ciljani molekul ne sadrži bilo koji karboksi kraj, zadržavajući / povratni signalni motiv endoplazmičnog retikuluma KDEL familije.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #2, amino kraj efektorskog polipeptida Shiga toksina je na i/ili bliže amino kraju polipeptidne komponente ćelijski ciljanog molekula. U određenim drugim primerima izvođenja, vezujući region nije postavljen bliže amino kraju ćelijski ciljanog molekula u odnosu na efektorski polipeptid Shiga toksina. U određenim drugim primerima izvođenja, vezujući region i efektorski polipeptid Shiga toksina su fizički raspoređeni ili orijentisani unutar ćelijski ciljanog molekula tako da vezujući region nije postavljen bliže amino kraju efektorskog polipeptida Shiga toksina. U određenim drugim primerima izvođenja, vezujući region je postavljen unutar ćelijskog ciljanog molekula bliže karboksi kraju efektorskog polipeptida Shiga toksina nego za amino kraj efektorskog polipeptida Shiga toksina. Za određene druge primere izvođenja, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska nije citotoksičan i sposoban je kada se uvodi u ćelije pokazujući veću podćelijsku efikasnost usmeravanja za esktraćelijski prostor podćelijskoj pregradi endoplazmatičnog retikuluma i/ili citozola kada se poredi sa podćelijskom efikasnošću usmeravanja trećeg ćelijskog ciljanog molekula koji ima amino kraj i sadrži vezujući region i efektorski polipeptid Shiga toksina koji nije postavljen na ili bliže amino kraju trećeg ćelijskog ciljanog molekula. U određenim drugim primerima izvođenja, treći ćelijski ciljani molekul ne sadrži bilo koji karboksi kraj, zadržavajući / povratni signalni motiv endoplazmičnog retikuluma KDEL familije.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #2, amino kraj efektorskog polipeptida Shiga toksina je na i/ili bliže amino kraju polipeptidne komponente ćelijski ciljanog molekula. U određenim drugim primerima izvođenja, vezujući region nije postavljen bliže amino kraju ćelijski ciljanog molekula u odnosu na efektorski polipeptid Shiga toksina. U određenim drugim primerima izvođenja, vezujući region i efektorski polipeptid Shiga toksina su fizički raspoređeni ili orijentisani unutar ćelijski ciljanog molekula tako da vezujući region nije postavljen bliže amino kraju efektorskog polipeptida Shiga toksina. U određenim drugim primerima izvođenja, vezujući region je postavljen unutar ćelijskog ciljanog molekula bliže karboksi kraj efektorskog polipeptida Shiga toksina nego za amino kraj efektorskog
2
polipeptida Shiga toksina. Za određene druge primere izvođenja, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska pokazuje nisku jačinu citotoksičnosti (odn. nije sposoban kada se uvede u određene pozitivne tipove ćelija koje pokazuju citotoksičnost veću od 1% ćelijske smrti ćelijske populacije u koncentraciji ćelijskog ciljanog molekula 1000 nM, 500nM, 100 nM, 75 nM, ili 50 nM) i sposoban je kada se uvodi u ćelije pokazujući veću podćelijsku efikasnost usmeravanja za esktraćelijski prostor podćelijskoj pregradi endoplazmatičnog retikuluma i/ili citozola kada se poredi sa podćelijskom efikasnošću usmeravanja trećeg ćelijskog ciljanog molekula koji ima amino kraj i sadrži vezujući region i efektorski polipeptid Shiga toksina koji nije postavljen na ili bliže amino kraju trećeg ćelijskog ciljanog molekula. U određenim drugim primerima izvođenja, treći ćelijski ciljani molekul ne sadrži bilo koji karboksi kraj, zadržavajući / povratni signalni motiv endoplazmičnog retikuluma KDEL familije.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #2, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska, ili njegova polipeptida komponenta, sadrži karboksi kraj, zadržavajući / povratni signalni motiv endoplazmičnog retikuluma člana KDEL familije. Za određene primere izvođenja, karboksi kraj zadržavajućeg / povratnog signala motiva endoplazmičnog retikuluma je odabran iz grupe koja se sastoji od: KDEL, HDEF, HDEL, RDEF, RDEL, WDEL, YDEL, HEEF, HEEL, KEEL, REEL, KAEL, KCEL, KFEL, KGEL, KHEL, KLEL, KNEL, KQEL, KREL, KSEL, KVEL, KWEL, KYEL, KEDL, KIEL, DKEL, FDEL, KDEF, KKEL, HADL, HAEL, HIEL, HNEL, HTEL, KTEL, HVEL, NDEL, QDEL, REDL, RNEL, RTDL, RTEL, SDEL, TDEL, SKEL, STEL, i EDEL. U određenim drugim primerima izvođenja, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska je sposoban kada se uvodi u ćelije koje pokazuju citotoksičnost da je veći nego onaj kod četvrtog ćelijskog ciljanog molekula koji se sastoji od ćelijski ciljanog molekula osim što ne obuhvata bilo koji karboksi kraj, zadržavajućeg / povratnog signala motiva endoplazmičnog retikuluma KDEL familije. U određenim drugim primerima izvođenja, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska je sposoban da pokazuje citotoksičnost sa boljom optimizovanom, citotoksičnom jačinom, kao što je, npr., 4-puta, 5-puta, 6-puta, 9-puta, ili više citotoksičnosti kada se poredi sa referentnim molekulom, kao što je, npr., četvrti ćelijski ciljani molekul. U određenim drugim primerima izvođenja, citotoksičnost ćelijski ciljanog molekula predmetnog pronalaska prema populaciji ciljanih pozitivnih ćelija je 3-puta, 4-puta, 5-puta, 6-puta, 7-puta, 8-puta, 9-puta, 10-puta ili više nego citotoksičnost četvrtog ćelijski ciljanog molekula prema drugoj populaciji ciljanih pozitivnih ćelija kao što je analizirano sa CD50vrednostima.
Set Primera Izvođenja #3 - Ćelijski Ciljani Molekul koji Sadrži Karboksi Kraj Zadržavajućeg / Povratnog Signala Motiva Endoplazmičnog Retikuluma i Efektorski Polipeptid Shiga Toksina koji Sadrži Ugrađen ili Ubačen, Heterologni, T-Ćelijski Epitop
2
Predmetni pronalazak obezbeđuje ćelijske ciljane molekule, svako sadrži (i) vezujući region sposoban posebno da veže ekstraćelijski ciljani biomolekul; (ii) efektorski polipeptid Shiga toksina koji sadrži ubačeni ili ugrađeni, heterologni epitop; i (iii) karboksi kraj, zadržavajućeg/povratnog signala motiva endoplazmičnog retikuluma. U određenim primerima izvođenja, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska obuhvata (a) vezujući region sposoban posebno da veže ekstraćelijski ciljani biomolekul; (b) efektorski polipeptid Shiga toksina koji sadrži ubačeni ili ugrađeni, heterologni epitop; i (c) karboksi kraj, zadržavajućeg / povratnog signala motiva endoplazmičnog retikuluma člana KDEL familije. Za određene druge primere izvođenja, efektorski polipeptid Shiga toksina je sposoban da pokaže najmanje jednu efektorsku funkciju Shiga toksina, kao što je, npr., upravljanje intraćelijskim usmeravanjem u endoplazmični retikulum i/ili citozol ćelije u kojoj je prisutan polipeptid, inhibiranje funkcije ribozoma, enzimsko inaktiviranje ribozoma, izazivanje citostaze, i/ili izazivanje citotoksičnosti. U određenim drugim primerima izvođenja, heterologni, T-ćelijski epitop je CD8+ T-ćelijski epitop, kao što je, npr., u pogledu na humani imuni sistem. Za određene druge primere izvođenja, heterologni, T-ćelijski epitop može da bude predstavljen od strane MHC klase I molekula ćelije. U određenim drugim primerima izvođenja, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska je sposoban za jedno ili više sledećih: ulazak u ćeliju, inhibiranje funkcije ribozoma, izazivanje citostaze, izazivanje smrti ćelije i / ili dostavljanje ugrađenog ili ubačenog, heterolognog, T-ćelijskog epitopa molekulu MHC klase I za prezentaciju na ćelijskoj površini.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #3, karboksi kraj zadržavajućeg / povratnog signala motiva endoplazmičnog retikuluma je odabran iz grupe koja se sastoji od: KDEL, HDEF, HDEL, RDEF, RDEL, WDEL, YDEL, HEEF, HEEL, KEEL, REEL, KAEL, KCEL, KFEL, KGEL, KHEL, KLEL, KNEL, KQEL, KREL, KSEL, KVEL, KWEL, KYEL, KEDL, KIEL, DKEL, FDEL, KDEF, KKEL, HADL, HAEL, HIEL, HNEL, HTEL, KTEL, HVEL, NDEL, QDEL, REDL, RNEL, RTDL, RTEL, SDEL, TDEL, SKEL, STEL, i EDEL.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #3, ugrađeni ili ubačeni, heterologni, T-ćelijski epitop uništava endogeni, B-ćelijski i/ili T-ćelijski epitop regiona odabran između grupe izvorno pozicioniranih regiona Shiga toksin A Podjedinice koja se sastoji od: (i) 1-15 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 3-14 SEQ ID NO:3; 26-37 SEQ ID NO:3; 27-37 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 39-48 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 42-48 SEQ ID NO:3; i 53-66 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3, ili ekvivalentnog regiona u Shiga toksin A Podjedinici ili njegovom derivatu; (ii) 94-115 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 141-153 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 140-156 SEQ ID NO:3; 179-190 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 179-191 SEQ ID NO:3; 204 SEQ ID NO:3; 205 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; i 210-218 SEQ ID NO:3; i (iii) 240-260 SEQ ID NO:3; 243-257 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 254-268 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 262-278 SEQ ID NO:3; 281-297
2
SEQ ID NO:3; i 285-293 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2, ili ekvivalentnog regiona u Shiga toksin A Podjedinici ili njegovom derivatu.
U određenim drugim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #3, heterologni epitop je CD8+ T-ćelijski epitop koji može da bude predstavljen od strane MHC klase I molekula ćelije. U određenim drugim primerima izvođenja, heterologni epitop je ugrađen i zamenjuje ekvivalentan broj amino kiselinskih ostataka u polipeptidnom regionu divljeg soja Shiga toksina tako da efektorski polipeptid Shiga toksina ima isti ukupan broj amino kiselinskih ostataka kao i polipeptidni region divljeg tipa Shiga toksina iz kog je izveden. U određenim drugim bilo kojim primerima izvođenja navedenih ranije, efektorski polipeptid Shiga toksina je sposoban da pokazuje najmanje jednu efektorsku funkciju Shiga toksina odabranu između: upravljanje intraćelijskim usmeravanjem u endoplazmični retikulum i/ili citozol ćelije u kojoj je prisutan polipeptid, inhibiranje funkcije ribozoma, enzimsko inaktiviranje ribozoma, i citotoksičnost.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #3, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska je sposoban kada se uvodi u ćelije da pokazuje citotoksičnost koja je veća nego ona u petom ćelijskom ciljanom molekulu osim što ne sadrži bilo koji karboksi kraj, zadržavajućeg / povratnog signala motiva endoplazmičnog retikuluma KDEL familije. U određenim drugim primerima izvođenja, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska je sposoban da pokazuje citotoksičnost sa boljom optimizovanom, citotoksičnom jačinom, kao što je, npr., 4-puta, 5-puta, 6-puta, 9-puta, ili više citotoksičnosti kada se poredi sa petim ćelijskim ciljanim molekulom. U određenim drugim primerima izvođenja, citotoksičnost ćelijski ciljanog molekula predmetnog pronalaska prema populaciji ciljanih pozitivnih ćelija je 3-puta, 4-puta, 5-puta, 6-puta, 7-puta, 8-puta, 9-puta, 10-puta ili više nego citotoksičnost petog ćelijskog ciljanog molekula prema drugoj populaciji ciljanih pozitivnih ćelija kao što je analizirano sa CD50vrednostima.
Za određene primere izvođenja Set Primera Izvođenja #3, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska je sposoban da dostavi ugrađeni ili ubačeni, heterologni, CD8+ T-ćelijski epitop prezentacijsku putanju MHC klase I ćelije za prezentaciju ćelijske površine epitopa vezanog sa molekulom MHC klase I.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #3, ćelijski ciljani molekul je deimunizovan usled ugrađenog ili ubačenog, heterolognog epitopa. U određenim drugim primerima izvođenja, ćelijski ciljani molekul je sposoban da pokazuje manju relativnu antigenost i/ili relativnu imunogenost kada se poredi sa referentnim molekulom, kao što je, npr., šesti ćelijski ciljani molekul koji se sastoji od ćelijski ciljanog molekula osim što nema jednog ili više ugrađenih ili umetnutih epitopa prisutnih u ćelijski ciljanom molekulu.
2
Za određene primere izvođenja Ser Primera Izvođenja #3, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska nije citotoksičan i sposoban je kada se uvodi u ćelije da pokazuje veću podćelijsku efikasnost usmeravanja iz ekstraćelijskog prostora na podćelijsku pregradu endoplazmatičnog retikuluma i/ili citozola kada se poredi sa podćelijskom efikasnošću usmeravanja referentnog molekula, kao što je, npr., peti ćelijski ciljani molekul.
Set Primera Izvođenja #4 - Ćelijski Ciljani Molekul koji Sadrži Efektorski Polipeptid Shiga Toksina koji Sadrži (i) Ugrađeni ili Umetnuti, Heterologni, T-Ćelijski Epitop i (ii) Uništeni, Furinski Odcepljeni Motiv
Predmetni pronalazak obezbeđuje ćelijske ciljane molekule, svaki obuhvata (i) vezujući region sposoban posebno da veže ekstraćelijski ciljani biomolekul; (ii) efektorski polipeptid Shiga toksina koji sadrži ubačeni ili ugrađeni, heterologni epitop; i (iii) uništeni furinski odcepljeni motiv. U određenim primerima izvođenja, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska obuhvata (i) vezujući region sposoban posebno da veže ekstraćelijski ciljani biomolekul; (ii) efektorski polipeptid Shiga toksina koji sadrži (a) ubačeni ili ugrađeni, heterologni epitop; (b) izvedeni region Shiga toksin A1 fragmenta koji ima karboksi kraj; i (c) uništeni furinski odcepljeni motiv na karboksi kraju regiona A1 fragmenta. Za određene druge primere izvođenja, efektorski polipeptid Shiga toksina je sposoban da pokazuje najmanje jednu efektorsku funkciju Shiga toksina, kao što je, npr., upravljanje intraćelijskim usmeravanjem u endoplazmični retikulum i/ili citozol ćelije u kojoj je prisutan polipeptid, inhibiranje funkcije ribozoma, enzimsko inaktiviranje ribozoma, izazivanje citostaze, i/ili izazivanje citotoksičnosti. U određenim drugim primerima izvođenja, heterologni, T-ćelijski epitop je CD8+ T-ćelijski epitop, kao što je, npr., u pogledu na humani imuni sistem. Za određene druge primere izvođenja, heterologni, T-ćelijski epitop može da bude predstavljen od strane MHC klase I molekula ćelije. U određenim drugim primerima izvođenja, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska je sposoban za jedno ili više sledećih: ulazak u ćeliju, inhibiranje funkcije ribozoma, izazivanje citostaze, izazivanje smrti ćelije i / ili dostavljanje ugrađenog ili ubačenog, heterolognog, T-ćelijskog epitopa molekulu MHC klase I za prezentaciju na ćelijskoj površini. Za određene druge primere izvođenja, ćelijski ciljani molekul je sposoban kada se uvodi u ćelije da pokazuje citotoksičnost uporedivu ili bolju od referentnog molekula, kao što je, npr., drugi ćelijski ciljani molekul koji se sastoji od ćelijskog ciljanog molekula osim svih njegovih komponenti efektorskog polipeptida Shiga toksina koji sadrže mesto furinskog cepanja divljeg soja Shiga toksina na karboksi kraju njegovog regiona A1 fragmenta.
2
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #4, ugrađeni ili ubačeni, heterologni, T-ćelijski epitop uništava endogeni, B-ćelijski i/ili T-ćelijski epitopski region odabran između grupe izvorno pozicioniranih regiona Shiga toksin A Podjedinice koji se sastoje od: (i) 1-15 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 3-14 SEQ ID NO:3; 26-37 SEQ ID NO:3; 27-37 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 39-48 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 42-48 SEQ ID NO:3; i 53-66 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3, ili ekvivalentni region u Shiga toksin A Podjedinici ili njegovom derivatu; (ii) 94-115 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 141-153 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 140-156 SEQ ID NO:3; 179-190 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 179-191 SEQ ID NO:3; 204 SEQ ID NO:3; 205 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; i 210-218 SEQ ID NO:3; i (iii) 240-260 SEQ ID NO:3; 243-257 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 254-268 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 262-278 SEQ ID NO:3; 281-297 SEQ ID NO:3; i 285-293 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2, ili ekvivalentni region u Shiga toksin A Podjedinici ili njegovom derivatu.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #4, uništeni furinski odcepljeni motiv sadrži jednu ili više mutacija, u odnosu na divlji soj Shiga toksin A Podjedinice, mutacija koja menja barem jedan amino kiselinski ostatak u regionu koji je izvorno pozicioniran na 248-251 A Podjedinici Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO:1) ili Shiga toksin (SEQ ID NO:2), ili na 247-250 A Podjedinici Shiga-sličnog toksina (SEQ ID NO:3); ili ekvivalentni region u Shiga toksin A Podjedinici ili njegovom derivatu. U određenim drugim primerima izvođenja, uništeni furinski odcepljeni motiv sadrži jednu ili više mutacija, u odnosu na divlji soj Shiga toksin A Podjedinice, na minimalnom mestu furinskog odcepljena motiva furinskog odcepljenog motiva. U određenim drugim primerima izvođenja, minimalno mesto furinskog odcepljena je predstavljeno konsenzusnom amino kiselinskom sekvencom R/Y-x-x-R i/ili R-x-x-R.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #4, ćelijski ciljani molekul sadrži molekulski ostatak lociranog karboksi kraja na karboksi kraju regiona A1 fragmenta Shiga toksina.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #4, vezujući region sterikalno pokriva karboksi kraj regiona A1 fragmenta.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #4, molekulski ostatak sterikalno pokriva karboksi kraj regiona A1 fragmenta. U nekim drugim primerima izvođenja, molekulski ostatak sadrži vezujući region.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #4, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska sadrži vezujući region i/ili molekulski ostatak lociranog karboksi kraja na karboksi kraju regiona A1 fragmenta Shiga toksina. U određenim drugim primerima izvođenja, masa vezujućeg regiona i/ili molekulskog ostatka je najmanje 4.5 kDa, 6 kDa, 9 kDa, 12 kDa, 15 kDa, 20 kDa, 25 kDa, 28 kDa, 30 kDa, 41 kDa, 50 kDa, 100 kDa, ili više.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #4, ćelijski ciljani molekul sadrži vezujući region sa masom najmanje 4.5 kDa, 6 kDa, 9 kDa, 12 kDa, 15 kDa, 20 kDa, 25 kDa, 28 kDa, 30 kDa, 41 kDa, 50 kDa, 100 kDa, ili više, sve dok ćelijski ciljani molekul zadržava odgovarajući nivo biološke aktivnosti Shiga toksina koja je ovde zabeležena (npr., citotoksičnost i/ili intraćelijsko usmeravanje).
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #4, vezujući region je sadržan unutar relativno velikog, molekulskog ostatka koji sadrži kao što je, npr., molekulski ostatak sa masom najmanje 4.5 kDa, 6 kDa, 9 kDa, 12 kDa, 15 kDa, 20 kDa, 25 kDa, 28 kDa, 30 kDa, 41 kDa, 50 kDa, 100 kDa, ili više, sve dok ćelijski ciljani molekul zadržava odgovarajući nivo biološke aktivnosti Shiga toksina koja je ovde zabeležena.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #4, uništeni furinski odcepljeni motiv sadrži supstituciju amino kiselinskog ostatka u furinskom odcepljenom motivu u odnosu na divlji soj Shiga toksin A Podjedinice. U određenim drugim primerima izvođenja, supstitucija amino kiselinskog ostatka u furinskom odcepljenom motivu jeste ostatak arginina sa negativno naelektrisanim, amino kiselinskim ostatkom odabranom između grupe koja se sastoji od: alanina, glicina, prolina, serina, treonina, aspartata, asparagina, glutamata, glutamina, cisteina, izoleucina, leucina, metionina, valina, fenilalanina, triptofana, i tirozina. U određenim primerima izvođenja, supstitucija amino kiselinskog ostatka u furinskom odcepljenom motivu je ostatak arginina sa histidinom.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #4, ćelijski ciljani molekul je sposoban kada se uvodi u ćelije pokazujući citotoksičnost u poređenju sa citotoksičnošću sedmog ćelijskog ciljanog molekula koji se sastoji od ćelijskog ciljanog molekula osim za sve njegove komponente efektorskog polipeptida Shiga toksina koji sadrže A1 fragment divljeg soja Shiga toksina i/ili mesto furinskog cepanja divljeg soja Shiga toksina na karboksi kraju njegovog regiona A1 fragmenta. U određenim daljim primerima izvođenja, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska je sposoban kada se uvodi u ćelije da pokazuje
1
citotoksičnost koja je u opsegu od 0.1 -puta, 0.5-puta, ili 0.75-puta do 1.2-puta, 1.5puta, 1.75-puta, 2-puta, 3-puta, 4-puta, ili 5-puta citotoksičnosti pokazane od strane sedmog ćelijskog ciljanog molekula.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #4, ćelijski ciljani molekul je sposoban kada se uvodi u hordat pokazujući poboljšanu, in vivo podnošljivost u poređenju sa in vivo podnošljivosti sedmog ćelijskog ciljanog molekula.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #4, ćelijski ciljani molekul je deimuniziran zbog ugrađenog ili ubačenog, heterolognog epitopa. U određenim daljim primerima izvođenja, ćelijski ciljani molekul je sposoban da pokaže manju relativnu antigenost i/ili relativnu imunogenost kada se poredi sa referentnim molekulom, kao što je, npr., osmi ćelijski ciljani molekulom koji se sastoji od ćelijskog ciljanog molekula osim što mu nedostaju jedan ili više ugrađenih ili umetnutih epitopa koji su prisutni u ćelijskom ciljanom molekulu.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #4, ćelijski ciljani molekul je deimuniziran zbog uništenja furinskog odcepljenog motiva. U određenim daljim primerima izvođenja, ćelijski ciljani molekul može da pokazuje manju relativnu antigenost i/ili relativnu imunogenost u poređenju sa devetim ćelijskim ciljanim molekulom koji se sastoji od ćelijskog ciljanog molekula osim za furinski odcepljeni motiv je divljih soj i/ili se sve komponente efektorskog polipeptidna Shiga toksina sastoje od A1 fragmenta Shiga toksina divljeg soja.
Set Primera Izvođenja #5 - Ćelijski Ciljani Molekul koji Sadrži Efektorski Polipeptid Shiga Toksina na ili Bliže Amino-Kraju i Pri Čemu Efektorski Polipeptid Shiga Toksina Sadrži Ugrađeni ili Umetnuti, Heterologni, T- Ćelijski Epitop
Predmetni pronalazak obezbeđuje ćelijske ciljane molekule, svaki obuhvata (i) vezujući region sposoban posebno da veže ekstraćelijski ciljani biomolekul; (ii) efektorski polipeptid Shiga toksina koji sadrži ubačeni ili ugrađeni, heterologni epitop; pri čemu efektorski polipeptid Shiga toksina je na ili bliže amino-kraju polipeptida. U određenim primerima izvođenja, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska obuhvata (i) vezujući region sposoban posebno da veže ekstraćelijski ciljani biomolekul; (ii) polipeptidnu komponentu, i (iii) efektorski polipeptid Shiga toksina koji sadrži ubačeni ili ugrađeni, heterologni epitop; pri čemu efektorski polipeptid Shiga toksina je na ili bliže na aminokraju polipeptidne komponente ćelijski ciljanog molekula. U određenim drugim primerima
2
izvođenja, vezujući region i efektorski polipeptid Shiga toksina su fizički raspoređeni ili orijentisani unutar ćelijskog ciljanog molekula tako da vezujući region nije lociran blizu amino kraja efektorskog polipeptida Shiga toksina. U određenim drugim primerima izvođenja, vezujući region se nalazi unutar ćelijskog ciljanog molekula bliže karboksi kraju efektorskog polipeptida Shiga toksina nego amino kraju efektorskog polipeptida Shiga toksina. U određenim drugim primerima izvođenja, vezujući region se ne nalazi bliže amino kraju ćelijskog ciljanog molekula u odnosu na efektorski polipeptid Shiga toksina. Za određene druge primere izvođenja, efektorski polipeptid Shiga toksina je sposoban da iskaže najmanje jednu efektorsku funkciju Shiga toksina, kao što je, npr., upravljanje intraćelijskim usmeravanjem u endoplazmični retikulum i/ili citozol ćelije u kojoj je prisutan polipeptid, inhibiranje funkcije ribozoma, enzimsko inaktiviranje ribozoma, izazivanje citostaze, i/ili izazivanje citotoksičnosti. U određenim drugim primerima izvođenja, heterologni, T-ćelijski epitop je CD8+ T-ćelijski epitop, , kao što je, npr., u pogledu na humani imuni sistem. Za određene druge primere izvođenja, heterologni, T-ćelijski epitop može da bude predstavljen od strane MHC klase I molekula ćelije. U određenim drugim primerima izvođenja, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska je sposoban za jedno ili više sledećih: ulazak u ćeliju, inhibiranje funkcije ribozoma, izazivanje citostaze, izazivanje smrti ćelije i / ili dostavljanje ugrađenog ili ubačenog, heterolognog, T-ćelijskog epitopa molekulu MHC klase I za prezentaciju na ćelijskoj površini.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #5, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska je sposoban kada se uvodi u ćelije da pokazuje citotoksičnost koja je veća nego ona u desetom ćelijskom ciljanom molekulu koji ima amino kraj i obuhvata vezujući region i region efektorskog polipeptida Shiga toksina koji se ne nalazi na ili blizu amino kraja desetog ćelijskog ciljanog molekula. U određenim drugim primerima izvođenja, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska je sposoban da pokazuje citotoksičnost sa boljom optimizovanom, citotoksičnom jačinom, kao što je, npr., 4-puta, 5-puta, 6-puta, 9-puta, ili više citotoksičnosti kada se poredi sa desetim ćelijskim ciljanim molekulom. U određenim drugim primerima izvođenja, citotoksičnost ćelijski ciljanog molekula predmetnog pronalaska prema populaciji ciljanih pozitivnih ćelija je 3-puta, 4-puta, 5-puta, 6-puta, 7-puta, 8-puta, 9-puta, 10-puta ili više nego citotoksičnost desetog ćelijskog ciljanog molekula prema drugoj populaciji ciljanih pozitivnih ćelija kao što je analizirano sa CD50vrednostima.
Za određene primere izvođenja Set Primera Izvođenja #5, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska je sposoban da dostavi ugrađeni ili ubačeni, heterologni, CD8+ T-ćelijski epitop prezentacijsku putanju MHC klase I ćelije za prezentaciju ćelijske površine epitopa vezanog sa molekulom MHC klase I.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #5, ćelijski ciljani molekul je deimunizovan usled ugrađenog ili ubačenog, heterolognog epitopa. U određenim drugim primerima izvođenja, ćelijski ciljani molekul je sposoban da pokazuje manju relativnu antigenost i/ili relativnu imunogenost kada se poredi sa referentnim molekulom, kao što je, npr., jedanaesti ćelijski ciljani molekul koji se sastoji od ćelijski ciljanog molekula osim što nema jednog ili više ugrađenih ili umetnutih epitopa prisutnih u ćelijski ciljanom molekulu.
Za određene primere izvođenja Set Primera Izvođenja #5, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska nije citotoksičan i sposoban je kada se uvodi u ćelije da pokazuje veću podćelijsku efikasnost usmeravanja iz ekstraćelijskog prostora na podćelijsku pregradu endoplazmatičnog retikuluma i/ili citozola kada se poredi sa podćelijskom efikasnošću usmeravanja referentnog molekula, kao što je, npr., deseti ćelijski ciljani molekul.
Set Primera Izvođenja #6 - Ćelijski Ciljani Molekul koji Sadrži De-imunizovani Efektorski Polipeptid Shiga Toksina koji Sadrži Uništeni, Furinski Odcepljeni Motiv
Predmetni pronalazak obezbeđuje ćelijske ciljane molekule, svaki obuhvata (i) vezujući region sposoban posebno da veže ekstraćelijski ciljani biomolekul i (ii) de-imunizovani, efektorski polipeptid Shiga toksina koji sadrži uništeni furinski odcepljeni motiv. U određenim primerima izvođenja, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska obuhvata (i) vezujući region sposoban posebno da veže ekstraćelijski ciljani biomolekul i (ii) de-imunizovani, efektorski polipeptid Shiga toksina koji sadrži (a) izvedeni region Shiga toksin A1 fragmenta koji ima karboksi kraj, (b) uništeni furinski odcepljeni motiv na karboksi kraju regiona A1 fragmenta, i (c) bar jedan uništeni, endogeni, B-ćelijski i/ili CD4+ T-ćelijski epitop i/ili epitopski region. Za određene druge primere izvođenja, efektorski polipeptid Shiga toksina je sposoban da iskaže najmanje jednu efektorsku funkciju Shiga toksina, kao što je, npr., upravljanje intraćelijskim usmeravanjem u endoplazmični retikulum i/ili citozol ćelije u kojoj je prisutan polipeptid, inhibiranje funkcije ribozoma, enzimsko inaktiviranje ribozoma, izazivanje citostaze, i/ili izazivanje citotoksičnosti. U određenim drugim primerima izvođenja, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska je sposoban za jedno ili više sledećih: ulazak u ćeliju, inhibiranje funkciju ribozoma, izazivanje citostaze i/ili izazivanje ćelijske smrti. Za određene druge primere izvođenja, ćelijski ciljani molekul je sposoban kada se uvodi u ćelije pokazujući citotoksičnost u poređenju sa ili bolje od referentnog molekula, kao što je, npr.,
4
drugi ćelijski ciljani molekul koji se sastoji od ćelijski ciljanog molekula osim svih njegovih komponenti efektorskog polipeptida koji sadrži mesto furinskog odcepljenja divljeg soja Shiga toksina na karboksi kraju njegovog regiona A1 fragmenta.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #6, efektorski polipeptid Shiga toksina obuhvata mutacije, u odnosu na divlji soj A Podjedinice Shiga toksina, u B-ćelijskom i/ili T-ćelijskom epitopskom regionu odabran između grupe izvorno pozicioniranih regiona Shiga toksin A Podjedinice koji se sastoje od: 1-15 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 3-14 SEQ ID NO:3; 26-37 SEQ ID NO:3; 27-37 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 39-48 SEQ ID NO:1 ili SEQ IDNO:2; 42-48 SEQ ID NO:3; 53-66 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 94-115 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 141-153 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 140-156 SEQ ID NO:3; 179-190 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 179-191 SEQ ID NO:3; 204 SEQ ID NO:3; 205 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2, i 210-218 SEQ ID NO:3; 240-260 SEQ ID NO:3; 243-257 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 254-268 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 262-278 SEQ ID NO:3; 281-297 SEQ ID NO:3; 285-293 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 4-33 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 34-78 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 77-103 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 128-168 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 160-183 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 236-258 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; i 274-293 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; ili ekvivalentni region u Shiga toksin A Podjedinici ili njegovom derivatu. U određenim drugim primerima izvođenja, nema uništavanja koja je karboksi krajnje skraćivanje amino kiselinskih ostataka koji se preklapaju sa delom ili celim najmanje jednim uništenim, endogenim, B-ćelijskim i/ili T-ćelijskim epitopom i/ili epitopskim regionom.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #6, uništeni furinski odcepljeni motiv sadrži jednu ili više mutacija, u odnosu na divlji soj Shiga toksin A Podjedinice, mutacija koja menja barem jedan amino kiselinski ostatak u regionu koji je izvorno pozicioniran na 248-251 A Podjedinice Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO:1) ili Shiga toksina (SEQ ID NO:2), ili na 247-250 A Podjedinice Shiga-sličnog toksina (SEQ ID NO:3); ili ekvivalentni region u Shiga toksin A Podjedinici ili njegovom derivatu. U određenim drugim primerima izvođenja, uništeni furinski odcepljeni motiv sadrži jednu ili više mutacija, u odnosu na divlji soj Shiga toksin A Podjedinice, na minimalnom mestu furinskog odcepljena motiva furinskog odcepljenog motiva. U određenim drugim primerima izvođenja, minimalno mesto furinskog odcepljena je predstavljeno konsenzusnom amino kiselinskom sekvencom R/Y-x-x-R i/ili R-x-x-R.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #6, ćelijski ciljani molekul sadrži molekulski ostatak lociranog karboksi kraja na karboksi kraju regiona A1 fragmenta Shiga toksina.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #6, vezujući region sterikalno pokriva karboksi kraj regiona A1 fragmenta.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #6, molekulski ostatak sterikalno pokriva karboksi kraj regiona A1 fragmenta. U nekim drugim primerima izvođenja, molekulski ostatak sadrži vezujući region.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #6, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska sadrži vezujući region i/ili molekulski ostatak lociranog karboksi kraja na karboksi kraju regiona A1 fragmenta Shiga toksina. U određenim drugim primerima izvođenja, masa vezujućeg regiona i/ili molekulskog ostatka je najmanje 4.5 kDa, 6 kDa, 9 kDa, 12 kDa, 15 kDa, 20 kDa, 25 kDa, 28 kDa, 30 kDa, 41 kDa, 50 kDa, 100 kDa, ili više.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #6, ćelijski ciljani molekul sadrži vezujući region sa masom najmanje 4.5 kDa, 6 kDa, 9 kDa, 12 kDa, 15 kDa, 20 kDa, 25 kDa, 28 kDa, 30 kDa, 41 kDa, 50 kDa, 100 kDa, ili više, sve dok ćelijski ciljani molekul zadržava odgovarajući nivo biološke aktivnosti Shiga toksina koja je ovde zabeležena (npr., citotoksičnost i/ili intraćelijsko usmeravanje).
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #6, vezujući region je sadržan unutar relativno velikog, molekulskog ostatka koji sadrži kao što je, npr., molekulski ostatak sa masom najmanje 4.5 kDa, 6 kDa, 9 kDa, 12 kDa, 15 kDa, 20 kDa, 25 kDa, 28 kDa, 30 kDa, 41 kDa, 50 kDa, 100 kDa, ili više, sve dok ćelijski ciljani molekul zadržava odgovarajući nivo biološke aktivnosti Shiga toksina koja je ovde zabeležena.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #6, uništeni furinski odcepljeni motiv sadrži supstituciju amino kiselinskog ostatka u furinskom odcepljenom motivu u odnosu na divlji soj Shiga toksin A Podjedinice. U određenim drugim primerima izvođenja, supstitucija amino kiselinskog ostatka u furinskom odcepljenom motivu jeste ostatak arginina sa negativno naelektrisanim, amino kiselinskim ostatkom odabranom između grupe koja se sastoji od: alanina, glicina, prolina, serina, treonina, aspartata, asparagina, glutamata, glutamina, cisteina, izoleucina, leucina, metionina, valina, fenilalanina, triptofana, i tirozina. U određenim primerima izvođenja, supstitucija amino kiselinskog ostatka u furinskom odcepljenom motivu je ostatak arginina sa histidinom.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #6, ćelijski ciljani molekul je sposoban kada se uvodi u ćelije pokazujući citotoksičnost u poređenju sa citotoksičnošću referentnog molekula, kao što je, npr., dvanaesti ćelijski ciljani molekul koji se sastoji od ćelijskog ciljanog molekula osim za sve njegove komponente efektorskog polipeptida Shiga toksina koji sadrže A1 fragment divljeg soja Shiga toksina i/ili mesto furinskog cepanja divljeg soja Shiga toksina na karboksi kraju njegovog regiona A1 fragmenta. U određenim daljim primerima izvođenja, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska je sposoban kada se uvodi u ćelije da pokazuje citotoksičnost koja je u opsegu od 0.1-puta, 0.5-puta, ili 0.75-puta do 1.2-puta, 1.5-puta, 1.75-puta, 2-puta, 3-puta, 4-puta, ili 5-puta citotoksičnosti pokazane od strane dvanaestog ćelijskog ciljanog molekula.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #6, ćelijski ciljani molekul je sposoban kada se uvodi u hordat pokazujući poboljšanu, in vivo podnošljivost u poređenju sa in vivo podnošljivosti sedmog ćelijskog ciljanog molekula.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #6, ćelijski ciljani molekul je deimuniziran zbog uništenja furinskog odcepljenog motiva. U određenim daljim primerima izvođenja, ćelijski ciljani molekul može da pokazuje manju relativnu antigenost i/ili relativnu imunogenost u poređenju sa referentnim ćelijskim ciljanim molekulom koji se sastoji od ćelijskog ciljanog molekula osim za furinski odcepljeni motiv je divljih soj i/ili se sve komponente efektorskog polipeptidna Shiga toksina sastoje od A1 fragmenta Shiga toksina divljeg soja, kao što je, npr., dvanaesti ćelijski ciljani molekul.
Set Primera Izvođenja #7 - Ćelijski Ciljani Molekul koji Sadrži Karboksi Kraj Zadržavajućeg / Povratnog Signala Motiva Endoplazmičnog Retikuluma i De-imunizovani Efektorski Polipeptid Shiga Toksina
Predmetni pronalazak obezbeđuje ćelijske ciljane molekule, svaki obuhvata (i) vezujući region sposoban posebno da veže ekstraćelijski ciljani biomolekul; (ii) de-imunizovani, efektorski polipeptid Shiga toksina, i (iii) karboksi kraj, zadržavajućeg / povratnog signala motiva endoplazmičnog retikuluma. U određenim primerima izvođenja, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska obuhvata (i) vezujući region sposoban posebno da veže ekstraćelijski ciljani biomolekul; (ii) de-imunizovani, efektorski polipeptid Shiga toksina koji sadrži bar jedan uništeni, endogeni, B-ćelijski i/ili CD4+ T-ćelijski epitop i/ili epitopski region, i (iii) karboksi kraj, zadržavajućeg / povratnog signala motiva endoplazmičnog retikuluma člana KDEL familije. Za određene druge primere izvođenja, efektorski polipeptid Shiga toksina je sposoban da iskaže najmanje jednu efektorsku funkciju Shiga toksina, kao što je, npr., upravljanje intraćelijskim usmeravanjem u endoplazmični retikulum i/ili citozol ćelije u kojoj je prisutan polipeptid, inhibiranje funkcije ribozoma, enzimsko inaktiviranje ribozoma, izazivanje citostaze, i/ili izazivanje citotoksičnosti. U određenim drugim primerima izvođenja, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska je sposoban za jedno ili više sledećih: ulazak u ćeliju, inhibiranje funkciju ribozoma, izazivanje citostaze i/ili izazivanje ćelijske smrti.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #7, karboksi kraj zadržavajućeg / povratnog signala motiva endoplazmičnog retikuluma je odabran iz grupe koja se sastoji od: KDEL, HDEF, HDEL, RDEF, RDEL, WDEL, YDEL, HEEF, HEEL, KEEL, REEL, KAEL, KCEL, KFEL, KGEL, KHEL, KLEL, KNEL, KQEL, KREL, KSEL, KVEL, KWEL, KYEL, KEDL, KIEL, DKEL, FDEL, KDEF, KKEL, HADL, HAEL, HIEL, HNEL, HTEL, KTEL, HVEL, NDEL, QDEL, REDL, RNEL, RTDL, RTEL, SDEL, TDEL, SKEL, STEL, i EDEL.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #7, efektorski polipeptid Shiga toksina obuhvata mutacije, u odnosu na divlji soj A Podjedinice Shiga toksina, u B-ćelijskom i/ili T-ćelijskom epitopskom regionu odabran između grupe izvorno pozicioniranih regiona Shiga toksin A Podjedinice koji se sastoje od: 1-15 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 3-14 SEQ ID NO:3; 26-37 SEQ ID NO:3; 27-37 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 39-48 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 42-48 SEQ ID NO:3; 53-66 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 94-115 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 141-153 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 140-156 SEQ ID NO:3; 179-190 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 179-191 SEQ ID NO:3; 204 SEQ ID NO:3; 205 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2, i 210-218 SEQ ID NO:3; 240-260 SEQ ID NO:3; 243-257 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 254-268 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 262-278 SEQ ID NO:3; 281-297 SEQ ID NO:3; 285-293 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 4-33 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 34-78 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 77-103 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 128-168 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 160-183 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 236-258 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; i 274-293 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; ili ekvivalentni region u Shiga toksin A Podjedinici ili njegovom derivatu. U određenim drugim primerima izvođenja, nema uništavanja koja je karboksi krajnje skraćivanje amino kiselinskih ostataka koji se preklapaju sa delom ili celim najmanje jednim uništenim, endogenim, B-ćelijskim i/ili T-ćelijskim epitopom i/ili epitopskim regionom.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #7, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska je sposoban kada se uvodi u ćelije da pokazuje citotoksičnost koja je veća nego ona u trinaestom ćelijsko ciljanom molekulu koji se sastoji od ćelijski ciljanog molekula osim što ne sadrži bilo koji karboksi kraj, zadržavajućeg / povratnog signala motiva endoplazmičnog retikuluma KDEL familije. U određenim drugim primerima izvođenja, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska je sposoban da pokazuje citotoksičnost sa boljom optimizovanom, citotoksičnom jačinom, kao što je, npr., 4-puta, 5-puta, 6-puta, 9-puta, ili više citotoksičnosti kada se poredi sa trinaestim ćelijskim ciljanim molekulom. U određenim drugim primerima izvođenja, citotoksičnost ćelijski ciljanog molekula predmetnog pronalaska prema populaciji ciljanih pozitivnih ćelija je 3-puta, 4-puta, 5-puta, 6-puta, 7-puta, 8-puta, 9-puta, 10-puta ili više nego citotoksičnost trinaestog ćelijskog ciljanog molekula prema drugoj populaciji ciljanih pozitivnih ćelija kao što je analizirano sa CD50vrednostima.
Za određene primere izvođenja Set Primera Izvođenja #7, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska nije citotoksičan i sposoban je kada se uvodi u ćelije da pokazuje veću podćelijsku efikasnost usmeravanja iz ekstraćelijskog prostora na podćelijsku pregradu endoplazmatičnog retikuluma i/ili citozola kada se poredi sa podćelijskom efikasnošću usmeravanja referentnog molekula, kao što je, npr. trinaesti ćelijski ciljani molekul.
Set Primera Izvođenja #8 - Ćelijski Ciljani Molekul koji Sadrži De-imunizovani Efektorski Polipeptid Shiga Toksina na ili Bliže Amino-Kraju Ćelijski Ciljanog Molekula
Predmetni pronalazak obezbeđuje ćelijske ciljane molekule, svaki obuhvata (i) vezujući region sposoban posebno da veže ekstraćelijski ciljani biomolekul i (ii) de-imunizovani, efektorski polipeptid Shiga toksina; pri čemu efektorski polipeptid Shiga toksina je na ili bliže amino-kraju polipeptida. U određenim primerima izvođenja, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska obuhvata (i) vezujući region sposoban posebno da veže ekstraćelijski ciljani biomolekul; (ii) polipeptidnu komponentu, i (iii) a de-imunizovani, efektorski polipeptid Shiga toksina koji sadrži bar jedan uništeni, endogeni, B-ćelijski i/ili CD4+ T-ćelijski epitop i/ili epitopski region; pri čemu efektorski polipeptid Shiga toksina je na ili bliže na amino-kraju polipeptidne komponente ćelijski ciljanog molekula. U određenim drugim primerima izvođenja, vezujući region i efektorski polipeptid Shiga toksina su fizički raspoređeni ili orijentisani unutar ćelijskog ciljanog molekula tako da vezujući region nije lociran blizu amino kraja efektorskog polipeptida Shiga toksina. U određenim drugim primerima izvođenja, vezujući region se nalazi unutar ćelijskog ciljanog molekula bliže karboksi kraju efektorskog polipeptida Shiga toksina nego amino kraju efektorskog polipeptida Shiga toksina. U određenim drugim primerima izvođenja, vezujući region se ne nalazi bliže amino kraju ćelijskog ciljanog molekula u odnosu na efektorski polipeptid Shiga toksina. Za određene druge primere izvođenja, efektorski polipeptid Shiga toksina je sposoban da iskaže najmanje jednu efektorsku funkciju Shiga toksina, kao što je, npr., upravljanje intraćelijskim usmeravanjem u endoplazmični retikulum i/ili citozol ćelije u kojoj je prisutan polipeptid, inhibiranje funkcije ribozoma, enzimsko inaktiviranje ribozoma, izazivanje citostaze, i/ili izazivanje citotoksičnosti. U određenim drugim primerima izvođenja, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska je sposoban za jedno ili više sledećih: ulazak u ćeliju, inhibiranje funkciju ribozoma, izazivanje citostaze i/ili izazivanje ćelijske smrti.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #8, efektorski polipeptid Shiga toksina obuhvata mutacije, u odnosu na divlji soj A Podjedinice Shiga toksina, u B-ćelijskom i/ili T-ćelijskom epitopskom regionu odabran između grupe izvorno pozicioniranih regiona Shiga toksin A Podjedinice koji se sastoje od: 1-15 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 3-14 SEQ ID NO:3; 26-37 SEQ ID NO:3; 27-37 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 39-48 SEQ ID NO:1 ili SEQ IDNO:2; 42-48 SEQ ID NO:3; 53-66 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 94-115 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 141-153 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 140-156 SEQ ID NO:3; 179-190 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 179-191 SEQ ID NO:3; 204 SEQ ID NO:3; 205 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2, i 210-218 SEQ ID NO:3; 240-260 SEQ ID NO:3; 243-257 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 254-268 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 262-278 SEQ ID NO:3; 281-297 SEQ ID NO:3; 285-293 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 4-33 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 34-78 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 77-103 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 128-168 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 160-183 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 236-258 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; i 274-293 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; ili ekvivalentni region u Shiga toksin A Podjedinici ili njegovom derivatu. U određenim drugim primerima izvođenja, nema uništavanja koja je karboksi krajnje skraćivanje amino kiselinskih ostataka koji se preklapaju sa delom ili celim najmanje jednim uništenim, endogenim, B-ćelijskim i/ili T-ćelijskim epitopom i/ili epitopskim regionom.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #8, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska je sposoban kada se uvodi u ćelije da pokazuje citotoksičnost koja je veća nego ona u četrnaestom ćelijsko ciljanom molekulu koji ima amino kraj i koji sadrži vezujući region i region efektorskog polipeptida Shiga toksina koji nije postavljen na ili blizu amino kraja četrnaestog ćelijskog ciljanog molekula. U određenim drugim primerima izvođenja, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska je sposoban da pokazuje citotoksičnost sa boljom optimizovanom, citotoksičnom jačinom, kao što je, npr., 4-puta, 5-
4
puta, 6-puta, 9-puta, ili više citotoksičnosti kada se poredi sa četrnaestim ćelijskim ciljanim molekulom. U određenim drugim primerima izvođenja, citotoksičnost ćelijski ciljanog molekula predmetnog pronalaska prema populaciji ciljanih pozitivnih ćelija je 3-puta, 4-puta, 5-puta, 6-puta, 7-puta, 8-puta, 9-puta, 10-puta ili više nego citotoksičnost četrnaestog ćelijskog ciljanog molekula prema drugoj populaciji ciljanih pozitivnih ćelija kao što je analizirano sa CD50vrednostima.
Za određene primere izvođenja Set Primera Izvođenja #8, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska nije citotoksičan i sposoban je kada se uvodi u ćelije da pokazuje veću podćelijsku efikasnost usmeravanja iz ekstraćelijskog prostora na podćelijsku pregradu endoplazmatičnog retikuluma i/ili citozola kada se poredi sa podćelijskom efikasnošću usmeravanja referentnog molekula, kao što je, npr., četrnaesti ćelijski ciljani molekul.
Set Primera Izvođenja #9 - Ćelijski Ciljani Molekul koji Sadrži Karboksi Kraj Zadržavajućeg / Povratnog Signala Motiva Endoplazmičnog Retikuluma i Efektorski Polipeptid Shiga Toksina koji Sadrži Uništeni, Furinski Odcepljeni Motiv
Predmetni pronalazak obezbeđuje ćelijske ciljane molekule, svaki obuhvata (i) vezujući region sposoban posebno da veže ekstraćelijski ciljani biomolekul; (ii) efektorski polipeptid Shiga toksina koji sadrži uništeni furinski odcepljeni motiv; i (iii) karboksi kraj, zadržavajućeg / povratnog signala motiva endoplazmičnog retikuluma. Predmetni pronalazak obezbeđuje ćelijski ciljane molekule, svaki sadrži (i) vezujući region sposoban posebno da veže ekstraćelijski ciljani biomolekul; (ii) efektorski polipeptid Shiga toksina koji sadrži uništeni furinski odcepljeni motiv; i (iii) karboksi kraj, zadržavajućeg / povratnog signala motiva endoplazmičnog retikuluma člana KDEL familije. U određenim drugim primerima izvođenja, efektorski polipeptid Shiga toksina je sposoban da iskaže najmanje jednu efektorsku funkciju Shiga toksina, kao što je, npr., upravljanje intraćelijskim usmeravanjem u endoplazmični retikulum i/ili citozol ćelije u kojoj je prisutan polipeptid, inhibiranje funkcije ribozoma, enzimsko inaktiviranje ribozoma, izazivanje citostaze, i/ili izazivanje citotoksičnosti. U određenim drugim primerima izvođenja, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska je sposoban za jedno ili više sledećih: ulazak u ćeliju, inhibiranje funkciju ribozoma, izazivanje citostaze i/ili izazivanje ćelijske smrti. Za određene druge primere izvođenja, ćelijski ciljani molekul je sposoban kada se uvodi u ćelije da pokazuje citotoksičnost uporedivu ili bolju nego referentni molekul, kao što je, npr. drugi ćelijski ciljani molekul koji se sastoji od ćelijski ciljanog molekula osim za njegove komponente efektorskog polipeptida Shiga toksina koje sadrže mesto furinskog odcepljenja divljeg soja Shiga toksina na karboksi kraju njegovog regiona A1 fragmenta.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #9, uništeni furinski odcepljeni motiv sadrži jednu ili više mutacija, u odnosu na divlji soj Shiga toksina A Podjedinice, mutacija koja menja barem jedan amino kiselinski ostatak u regionu koji je izvorno pozicioniran na 248-251 A Podjedinice Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO:1) ili Shiga toksina (SEQ ID NO:2), ili na 247-250 A Podjedinici Shiga-sličnog toksina (SEQ ID NO:3); ili ekvivalentnog regiona u Shiga toksin A Podjedinici ili njegovom derivatu. U određenim drugim primerima izvođenja, uništeni furinski odcepljeni motiv sadrži jednu ili više mutacija, u odnosu na divlji soj Shiga toksina A Podjedinice, na minimalnom mestu furinskog odcepljenja furin-odcepljenog motiva. U određenim drugim primerima izvođenja, minimalno mesto furinskog odcepljenja je predstavljeno sa konsenzusnom sekvencom amino kiseline R/Y-x-x-R i/ili R-x-x-R.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #9, ćelijski ciljani molekul sadrži molekulski ostatak postavljenog karboksi kraja za karboksi kraj regiona Shiga toksina A1 fragmenta.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #9, vezujući region sterikalno pokriva karboksi kraj regiona A1 fragmenta.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #9, molekulski ostatak sterikalno pokriva karboksi kraj regiona A1 fragmenta. U određenim drugim primerima izvođenja, molekulski ostatak sadrži vezujući region.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #9, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska obuhvata vezujući region i/ili molekulski ostatak postavljenog karboksi kraja na karboksi kraju Shiga toksina A1 fragmenta. U određenim drugim primerima izvođenja, masa vezujućeg regiona i/ili molekulskog ostatka je najmanje 4.5 kDa, 6 kDa, 9 kDa, 12 kDa, 15 kDa, 20 kDa, 25 kDa, 28 kDa, 30 kDa, 41 kDa, 50 kDa, 100 kDa, ili više.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #9, ćelijski ciljani molekul obuhvata vezujući region sa masom od najmanje 4.5 kDa, 6 kDa, 9 kDa, 12 kDa, 15 kDa, 20 kDa, 25 kDa, 28 kDa, 30 kDa, 41 kDa, 50 kDa, 100 kDa, ili više, sve dok ćelijski ciljani molekul zadržava odgovarajući nivo biološke aktivnosti Shiga toksina koji je ovde zabeležen (npr., citotoksičnost i/ili intraćelijsko usmeravanje).
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #9, vezujući region je sadržan unutar relativno velikog, molekulskog ostatka koji sadrži kao što je, npr., molekulski ostatak sa masom od najmanje 4.5 kDa, 6 kDa, 9 kDa, 12 kDa, 15 kDa, 20 kDa, 25 kDa, 28 kDa, 30 kDa, 41 kDa, 50 kDa, 100 kDa, ili više sve dok ćelijski ciljani molekul zadržava odgovarajući nivo biološke aktivnosti Shiga toksina koja je ovde zabeležena.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #9, uništeni furinski odcepljeni motiv sadrži supstituciju amino kiselinskog ostatka u furinskom odcepljenom motivu u odnosu na divlji soj Shiga toksin A Podjedinice. U određenim drugim primerima izvođenja, supstitucija amino kiselinskog ostatka u furinskom odcepljenom motivu jeste ostatak arginina sa negativno naelektrisanim, amino kiselinskim ostatkom odabranom između grupe koja se sastoji od: alanina, glicina, prolina, serina, treonina, aspartata, asparagina, glutamata, glutamina, cisteina, izoleucina, leucina, metionina, valina, fenilalanina, triptofana, i tirozina. U određenim primerima izvođenja, supstitucija amino kiselinskog ostatka u furinskom odcepljenom motivu je ostatak arginina sa histidinom.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #9, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska je sposoban kada se uvodi u ćelije da pokazuje citotoksičnost koja je veća nego ona u petnaestom ćelijsko ciljanom molekulu koji se sastoji od ćelijski ciljanog molekula osim što ne sadrži bilo koji karboksi kraj, zadržavajućeg / povratnog signala motiva endoplazmičnog retikuluma KDEL familije. U određenim drugim primerima izvođenja, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska je sposoban da pokazuje citotoksičnost sa boljom optimizovanom, citotoksičnom jačinom, kao što je, npr., 4-puta, 5-puta, 6-puta, 9-puta, ili više citotoksičnosti kada se poredi sa petnaestim ćelijskim ciljanim molekulom. U određenim drugim primerima izvođenja, citotoksičnost ćelijski ciljanog molekula predmetnog pronalaska prema populaciji ciljanih pozitivnih ćelija je 3-puta, 4-puta, 5-puta, 6-puta, 7-puta, 8-puta, 9-puta, 10-puta ili više nego citotoksičnost petnaestog ćelijskog ciljanog molekula prema drugoj populaciji ciljanih pozitivnih ćelija kao što je analizirano sa CD50vrednostima.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #9, ćelijski ciljani molekul je sposoban kada se uvodi u hordat da pokazuje poboljšanu, in vivo tolerantnost kada se poredi sa in vivo tolerantnošću šesnaestog ćelijski ciljanog molekula koji se sastoji od ćelijskog ciljanog molekula osim za sve njegove komponente efektorskog polipeptida Shiga
4
toksina svaki sadrži divlji soj Shiga toksin A1 fragment i/ili mesto furinskog odcepljenja divljeg soja Shiga toksina na karboksi kraju njegovog regiona A1 fragmenta.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #9, ćelijski ciljani molekul je deimunizovan usled uništenja furinsko odcepljenog motiva. U određenim daljim primerima izvođenja, ćelijski ciljani molekul može da pokazuje manju relativnu antigenost i/ili relativnu imunogenost u poređenju sa referentnim ćelijskim ciljanim molekulom koji se sastoji od ćelijskog ciljanog molekula osim za furinski odcepljeni motiv je divljih soj i/ili se sve komponente efektorskog polipeptida Shiga toksina sastoje od A1 fragmenta divljeg soja Shiga toksina, kao što je, npr., šesnaesti ćelijski ciljani molekul.
Za određene primere izvođenja Set Primera Izvođenja #9, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska nije citotoksičan i sposoban je kada se uvodi u ćelije da pokazuje veću podćelijsku efikasnost usmeravanja iz ekstraćelijskog prostora na podćelijsku pregradu endoplazmatičnog retikuluma i/ili citozola kada se poredi sa podćelijskom efikasnošću usmeravanja referentnog molekula, kao što je, npr., petnaesti ćelijski ciljani molekul.
Set Primera Izvođenja #10 - Ćelijski Ciljani Molekul koji Sadrži Otporni Furinski Odcepljeni Efektorski Polipeptid Shiga Toksina na ili Blizu Amino-Kraja Ćelijski Ciljanog Molekula
Predmetni pronalazak obezbeđuje ćelijske ciljane molekule, svaki obuhvata (i) vezujući region sposoban posebno da veže ekstraćelijski ciljani biomolekul; (ii) efektorski polipeptid Shiga toksina koji sadrži uništeni furinski odcepljeni motiv na karboksi kraju njegovog regiona Shiga toksin A1 fragmenta; pri čemu amino kraj efektorskog polipeptida Shiga toksina je na i/ili blizu amino kraja polipeptidne komponente ćelijskog ciljanog molekula. U određenim primerima izvođenja, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska sadrži (i) vezujući region sposoban da posebno veže ekstraćelijski ciljani biomolekul, (ii) efektorski polipeptid Shiga toksina koji ima amino kraj i izvedeni region Shiga toksin A1 fragmenta koji ima karboksi kraj, i (iii) uništeni furinsko odcepljeni motiv na karboksi kraju regiona A1 fragmenta; pri čemu vezujući region nije postavljen blizu amino kraja ćelijski ciljanog molekula u odnosu na efektorski polipeptid Shiga toksina. U određenim drugim primerima izvođenja, vezujući region i efektorski polipeptid Shiga toksina su fizički postavljeni ili orjentisani unutar ćelijski ciljanog molekula tako da vezujući region nije postavljen blizu amino kraja efektorskog polipeptida Shiga toksina. U određenim drugim primerima izvođenja, vezujući region je postavljen unutar ćelijski ciljanog molekula još bliži karboksi kraju efektorskog polipeptida Shiga toksina nego amino kraju efektorskog polipeptida Shiga toksina. U određenim drugim primerima izvođenja, vezujući region nije postavljen blizu amino kraja ćelijski ciljanog molekula u odnosu na efektorski polipeptid Shiga toksina. Za određene druge primere izvođenja, efektorski polipeptid Shiga toksina je sposoban da pokaže najmanje jednu efektorsku funkciju Shiga toksina, kao što je, npr., upravljanje intraćelijskim usmeravanjem u endoplazmični retikulum i/ili citozol ćelije u kojoj je prisutan polipeptid, inhibiranje funkcije ribozoma, enzimsko inaktiviranje ribozoma, izazivanje citostaze, i/ili izazivanje citotoksičnosti. U određenim drugim primerima izvođenja, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska je sposoban za jedno ili više sledećih: ulazak u ćeliju, inhibiranje funkciju ribozoma, izazivanje citostaze i/ili izazivanje ćelijske smrti. Za određene druge primere izvođenja, ćelijski ciljani molekul je sposoban kada se uvodi u ćelije da pokazuje citotoksičnost u poređenju sa ili bolju nego referentni molekul, kao što je, npr., sedamnaesti ćelijski ciljani molekul koji se sastoji od ćelijski ciljanog molekula osim za njegove komponente efektorskog polipeptida Shiga toksina koje sadrže mesto furinskog odcepljenja divljeg soja Shiga toksina na karboksi kraju njegovog regiona A1 fragmenta.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #10, uništeni furinski odcepljeni motiv sadrži jednu ili više mutacija, u odnosu na divlji soj Shiga toksina A Podjedinice, mutacija koja menja barem jedan amino kiselinski ostatak u regionu koji je izvorno pozicioniran na 248-251 A Podjedinice Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO:1) ili Shiga toksin (SEQ ID NO:2), ili na 247-250 A Podjedinice Shiga-sličnog toksina (SEQ ID NO:3); ili ekvivalentnog regiona u Shiga toksin A Podjedinici ili njegovom derivatu. U određenim drugim primerima izvođenja, uništeni furinski odcepljeni motiv sadrži jednu ili više mutacija, u odnosu na divlji soj Shiga toksina A Podjedinice, na minimalnom mestu furinskog odcepljenja furin-odcepljenog motiva. U određenim drugim primerima izvođenja, minimalno mesto furinskog odcepljenja je predstavljeno sa konsenzusnom sekvencom amino kiseline R/Y-x-x-R i/ili R-x-x-R.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #10, ćelijski ciljani molekul sadrži molekulski ostatak postavljenog karboksi kraja za karboksi kraj regiona Shiga toksina A1 fragmenta.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #10, vezujući region sterikalno pokriva karboksi kraj regiona A1 fragmenta.
4
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #10, molekulski ostatak sterikalno pokriva karboksi kraj regiona A1 fragmenta. U određenim drugim primerima izvođenja, molekulski ostatak sadrži vezujući region.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #10, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska obuhvata vezujući region i/ili molekulski ostatak postavljenog karboksi kraja na karboksi kraju Shiga toksina A1 fragmenta. U određenim drugim primerima izvođenja, masa vezujućeg regiona i/ili molekulskog ostatka je najmanje 4.5 kDa, 6 kDa, 9 kDa, 12 kDa, 15 kDa, 20 kDa, 25 kDa, 28 kDa, 30 kDa, 41 kDa, 50 kDa, 100 kDa, ili više.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #10, ćelijski ciljani molekul obuhvata vezujući region sa masom od najmanje 4.5 kDa, 6 kDa, 9 kDa, 12 kDa, 15 kDa, 20 kDa, 25 kDa, 28 kDa, 30 kDa, 41 kDa, 50 kDa, 100 kDa, ili više, sve dok ćelijski ciljani molekul zadržava odgovarajući nivo biološke aktivnosti Shiga toksina koji je ovde zabeležen (npr., citotoksičnost i/ili intraćelijsko usmeravanje).
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #10, vezujući region je sadržan unutar relativno velikog, molekulskog ostatka koji sadrži kao što je, npr., molekulski ostatak sa masom od najmanje 4.5 kDa, 6 kDa, 9 kDa, 12 kDa, 15 kDa, 20 kDa, 25 kDa, 28 kDa, 30 kDa, 41 kDa, 50 kDa, 100 kDa, ili više sve dok ćelijski ciljani molekul zadržava odgovarajući nivo biološke aktivnosti Shiga toksina koja je ovde zabeležena.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #10, uništeni furinski odcepljeni motiv sadrži supstituciju amino kiselinskog ostatka u furinskom odcepljenom motivu u odnosu na divlji soj Shiga toksin A Podjedinice. U određenim drugim primerima izvođenja, supstitucija amino kiselinskog ostatka u furinskom odcepljenom motivu jeste ostatak arginina sa negativno naelektrisanim, amino kiselinskim ostatkom odabranom između grupe koja se sastoji od: alanina, glicina, prolina, serina, treonina, aspartata, asparagina, glutamata, glutamina, cisteina, izoleucina, leucina, metionina, valina, fenilalanina, triptofana, i tirozina. U određenim primerima izvođenja, supstitucija amino kiselinskog ostatka u furinskom odcepljenom motivu je ostatak arginina sa histidinom.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #10, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska je sposoban kada se uvodi u ćelije da pokazuje citotoksičnost koja je veća nego ona u osamnaestom ćelijsko ciljanom molekulu koji ima amino kraj i sadrži vezujući region i region efektorski polipeptid Shiga toksina koji nije pozicioniran na ili blizu
4
amino kraja osamnaestog ćelijski ciljanog molekula. U određenim drugim primerima izvođenja, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska je sposoban da pokazuje citotoksičnost sa boljom optimizovanom, citotoksičnom jačinom, kao što je, npr., 4-puta, 5-puta, 6-puta, 9-puta, ili više citotoksičnosti kada se poredi sa osamnaestim ćelijskim ciljanim molekulom. U određenim drugim primerima izvođenja, citotoksičnost ćelijski ciljanog molekula predmetnog pronalaska prema populaciji ciljanih pozitivnih ćelija je 3-puta, 4-puta, 5-puta, 6-puta, 7-puta, 8-puta, 9-puta, 10-puta ili više nego citotoksičnost osamnaestog ćelijskog ciljanog molekula prema drugoj populaciji ciljanih pozitivnih ćelija kao što je analizirano sa CD50vrednostima.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #10, ćelijski ciljani molekul je sposoban kada se uvodi u hordat da pokazuje poboljšanu, in vivo tolerantnost kada se poredi sa in vivo tolerantnošću devetnaestog ćelijski ciljanog molekula koji se sastoji od ćelijskog ciljanog molekula osim za sve njegove komponente efektorskog polipeptida Shiga toksina svaki sadrži divlji soj Shiga toksin A1 fragmenta i/ili mesto furinskog odcepljenja divljeg soja Shiga toksina na karboksi kraju njegovog regiona A1 fragmenta.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #10, ćelijski ciljani molekul je deimunizovan usled uništenja furinsko odcepljenog motiva. U određenim daljim primerima izvođenja, ćelijski ciljani molekul može da pokazuje manju relativnu antigenost i/ili relativnu imunogenost u poređenju sa referentnim ćelijskim ciljanim molekulom koji se sastoji od ćelijskog ciljanog molekula osim za furinski odcepljeni motiv je divljih soj i/ili se sve komponente efektorskog polipeptida Shiga toksina sastoje od A1 fragmenta divljeg soja Shiga toksina, kao što je, npr., devetnaesti ćelijski ciljani molekul.
Za određene primere izvođenja Set Primera Izvođenja # 10, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska nije citotoksičan i sposoban je kada se uvodi u ćelije da pokazuje veću podćelijsku efikasnost usmeravanja iz ekstraćelijskog prostora na podćelijsku pregradu endoplazmatičnog retikuluma i/ili citozola kada se poredi sa podćelijskom efikasnošću usmeravanja referentnog molekula, kao što je, npr., devetnaesti ćelijski ciljani molekul.
Set Primera Izvođenja #11 - Ćelijski Ciljani Molekul koji Sadrži Karboksi Kraj Zadržavajućeg / Povratnog Signala Motiva Endoplazmičnog Retikuluma i Efektorski Polipeptid Shiga Toksina na ili Blizu Amino Kraju Ćelijski Ciljanog Molekula
4
Predmetni pronalazak obezbeđuje ćelijske ciljane molekule, svaki obuhvata (i) vezujući region sposoban posebno da veže ekstraćelijski ciljani biomolekul, (ii) karboksi kraj, zadržavajućeg / povratnog signala motiva endoplazmičnog retikuluma, i (iii) efektorski polipeptid Shiga toksina; pri čemu amino kraj efektorskog polipeptida Shiga toksina je na i/ili blizu amino kraju polipeptidne komponente ćelijski ciljanog molekula. U određenim primerima izvođenja, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska sadrži (i) vezujući region sposoban posebno da veže ekstraćelijski ciljani biomolekul, (ii) karboksi kraj, zadržavajućeg / povratnog signala motiva endoplazmičnog retikulum člana KDEL familije, (iii) polipeptidnu komponentu, i (iv) efektorski polipeptid Shiga toksina; pri čemu amino kraj efektorskog polipeptida Shiga toksina je na i/ili blizu amino kraja peptidne komponente ćelijski ciljanog molekula. U određenim drugim primerima izvođenja, vezujući region i efektorski polipeptid Shiga toksina su fizički postavljeni ili orjentisani unutar ćelijski ciljanog molekula tako da vezujući region nije postavljen blizu amino kraja efektorskog polipeptida Shiga toksina. U određenim drugim primerima izvođenja, vezujući region je postavljen unutar ćelijskog ciljanog molekula još bliže karboksi kraju efektorskog polipeptida Shiga toksina nego za amino kraj efektorskog polipeptida Shiga toksina. U određenim drugim primerima izvođenja, vezujući region nije postavljen blizu amino kraja ćelijski ciljanog molekula u odnosu na efektorski polipeptid Shiga toksina.
Za određene druge primere izvođenja, efektorski polipeptid Shiga toksina je sposoban da pokaže najmanje jednu efektorsku funkciju Shiga toksina, kao što je, npr., upravljanje intraćelijskim usmeravanjem u endoplazmični retikulum i/ili citozol ćelije u kojoj je prisutan polipeptid, inhibiranje funkcije ribozoma, enzimsko inaktiviranje ribozoma, izazivanje citostaze, i/ili izazivanje citotoksičnosti. U određenim drugim primerima izvođenja, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska je sposoban za jedno ili više sledećih: ulazak u ćeliju, inhibiranje funkciju ribozoma, izazivanje citostaze i/ili izazivanje ćelijske smrti.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #11, karboksi kraj zadržavajućeg / povratnog signala motiva endoplazmičnog retikuluma je odabran između grupe koja se sastoji od: KDEL, HDEF, HDEL, RDEF, RDEL, WDEL, YDEL, HEEF, HEEL, KEEL, REEL, KAEL, KCEL, KFEL, KGEL, KHEL, KLEL, KNEL, KQEL, KREL, KSEL, KVEL, KWEL, KYEL, KEDL, KIEL, DKEL, FDEL, KDEF, KKEL, HADL, HAEL, HIEL, HNEL, HTEL, KTEL, HVEL, NDEL, QDEL, REDL, RNEL, RTDL, RTEL, SDEL, TDEL, SKEL, STEL, i EDEL.
U određenim primerima izvođenja Set Primera Izvođenja #11, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska je sposoban kada se uvodi u ćelije da pokazuje citotoksičnost koja
4
je veća od dvadesetog ćelijski ciljanog molekula koji ima amino kraj i koji se sastoji od vezujućeg regiona i regiona efektorskog polipeptida Shiga toksina koji nije postavljen na ili blizu amino kraja dvadesetog ćelijskog ciljanog molekula i/ili veći nego dvadeseti ćelijski ciljani molekul koji sadrži ćelijski ciljani molekul osim što ne sadrži bilo koji karboksi kraj, zadržavajućeg / povratnog signala motiva endoplazmičnog retikulum člana KDEL familije. U određenim drugim primerima izvođenja, dvadeseti ćelijski ciljani molekul ne sadrži karboksi kraj, zadržavajućeg / povratnog signala motiva endoplazmičnog retikulum člana KDEL familije. U određenim drugim primerima izvođenja, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska je sposoban da pokazuje citotoksičnost sa boljom optimizovanom, citotoksičnom jačinom, kao što je, npr., 4-puta, 5-puta, 6-puta, 9-puta, ili više citotoksičnosti kada se poredi sa referentnim molekulom, kao što je, npr., dvadeseti i/ili dvadeset prvi ćelijskim ciljanim molekulom. U određenim drugim primerima izvođenja, citotoksičnost ćelijski ciljanog molekula predmetnog pronalaska prema populaciji ciljanih pozitivnih ćelija je 3-puta, 4-puta, 5-puta, 6-puta, 7-puta, 8-puta, 9-puta, 10-puta ili više nego citotoksičnost dvadesetog i/ili dvadeset prvog ćelijskog ciljanog molekula prema drugoj populaciji ciljanih pozitivnih ćelija kao što je analizirano sa CD50vrednostima.
Za određene primere izvođenja Set Primera Izvođenja #11, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska nije citotoksičan i sposoban je kada se uvodi u ćelije da pokazuje veću podćelijsku efikasnost usmeravanja iz ekstraćelijskog prostora na podćelijsku pregradu endoplazmatičnog retikuluma i/ili citozola kada se poredi sa podćelijskom efikasnošću usmeravanja referentnog molekula, kao što je, npr., dvadeseti i/ili dvadeset prvi ćelijski ciljani molekuli.
Drugi Primeri Izvođenja Setova Primera Izvođenja #1 - #11
U određenim primerima izvođenja Setova Primera Izvođenja #2 do #11, efektorski polipeptid Shiga toksina je spojen za vezujući region, ili direktno ili indirektno, kao što je, npr., preko linkera koji je poznat stručnom licu.
U određenim primerima izvođenja Setova Primera Izvođenja #2 do #11, ćelijski ciljani molekul sadrži molekulski ostatak postavljenog karboksi kraja na karboksi kraju regiona Shiga toksin Al fragmenta.
4
U određenim primerima izvođenja Setova Primera Izvođenja #2 do #11, efektorski polipeptid Shiga toksina ima izvedeni region A1 fragmenta Shiga toksina koji ima karboksi kraj i dalje obuhvata uništeni furinsko odcepljeni motiv na karboksi kraju regiona A1 fragmenta.
U određenim primerima izvođenja Setova Primera Izvođenja #2 do #11, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska, ili njegova polipeptidna komponenta, sadrži karboksi kraj, zadržavajućeg / povratnog signala motiva endoplazmičnog retikulum člana KDEL familije. Za određene druge primere izvođenja, karboksi kraj zadržavajućeg / povratnog signala motiva endoplazmičnog retikuluma je odabran između grupe koja se sastoji od: KDEL, HDEF, HDEL, RDEF, RDEL, WDEL, YDEL, HEEF, HEEL, KEEL, REEL, KAEL, KCEL, KFEL, KGEL, KHEL, KLEL, KNEL, KQEL, KREL, KSEL, KVEL, KWEL, KYEL, KEDL, KIEL, DKEL, FDEL, KDEF, KKEL, HADL, HAEL, HIEL, HNEL, HTEL, KTEL, HVEL, NDEL, QDEL, REDL, RNEL, RTDL, RTEL, SDEL, TDEL, SKEL, STEL, i EDEL. U određenim drugim primerima izvođenja, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska je sposoban kada se uvodi u ćelije da pokazuje citotoksičnost koja je veća od referentnog molekula, kao što je, npr., dvadeset drugi ćelijski ciljani molekul koji se sastoji od ćelijski ciljanog molekula osim što ne sadrži bilo koji karboksi kraj, zadržavajućeg / povratnog signala motiva endoplazmičnog retikulum člana KDEL familije. U određenim drugim primerima izvođenja, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska je sposoban da pokazuje citotoksičnost sa boljom optimizovanom, citotoksičnom jačinom, kao što je, npr., 4-puta, 5-puta, 6-puta, 9-puta, ili više citotoksičnosti kada se poredi sa referentnim molekulom, kao što je, npr., dvadeset drugi ćelijski ciljani molekul. U određenim drugim primerima izvođenja, citotoksičnost ćelijski ciljanog molekula predmetnog pronalaska prema populaciji ciljanih pozitivnih ćelija je 3-puta, 4-puta, 5-puta, 6-puta, 7-puta, 8-puta, 9-puta, 10-puta ili više nego citotoksičnost dvadeset drugog ćelijskog ciljanog molekula prema drugoj populaciji ciljanih pozitivnih ćelija kao što je analizirano sa CD50vrednostima.
U određenim primerima izvođenja Setova Primera Izvođenja #2 do #11, efektorski polipeptid Shiga toksina dalje obuhvata najmanje jedan ubačeni ili ugrađeni, heterologni epitop.
U određenim primerima izvođenja Setova Primera Izvođenja #2 do #11, efektorski polipeptid Shiga toksina dalje obuhvata najmanje jedan, dva, ili tri uništena, endogena, B-ćelijska i/ili CD4+ T-ćelijska epitopska regiona. U određenim drugim primerima izvođenja, efektorski polipeptid Shiga toksina obuhvata uništenje najmanje jednog, dva, ili tri endogena, B-ćelijska i/ili T-ćelijska epitopa i/ili epitopska regiona. U određenim drugim primerima izvođenja, efektorski polipeptid Shiga toksina dalje obuhvata najmanje jedan uništeni, endogeni, Bćelijski i/ili CD4+ T-ćelijski epitopski region koji se ne preklapa sa najmanje jednim ubačenim ili ugrađenim, heterolognim epitopom.
U određenim primerima izvođenja Setova Primera Izvođenja #2 do #11, amino kraj efektorskog polipeptida Shiga toksina je na i/ili blizu amino kraja polipeptidne komponente ćelijski ciljanog molekula. U određenim drugim primerima izvođenja, vezujući region nije postavljen blizu amino kraja ćelijski ciljanog molekula u odnosu na efektorski polipeptid Shiga toksina. U određenim drugim primerima izvođenja, vezujući region i efektorski polipeptid Shiga toksina su fizički postavljeni ili orjentisani unutar ćelijski ciljanog molekula tako da vezujući region nije postavljen blizu amino kraja efektorskog polipeptida Shiga toksina. U određenim drugim primerima izvođenja, vezujući region je postavljen unutar ćelijskog ciljanog molekula još bliže karboksi kraju efektorskog polipeptida Shiga toksina nego za amino kraj efektorskog polipeptida Shiga toksina. Za određene druge primere izvođenja, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska nije citotoksičan i sposoban je kada se uvodi u ćelije pokazujući veću efikasnost podćelijskog usmeravanja iz ekstraćelijskog prostora ka podćelijskoj pregradi endoplazmatičnog retikuluma i/ili citozola kada se poredi sa efikasnošću podćelijskog usmeravanja referentnog molekula, kao što je, npr., dvadeset treći ćelijski molekul koji ima amino kraj i koji sadrži vezujući region i efektorski polipeptid Shiga toksina koji nije postavljen na ili blizu amino kraja trećeg ćelijsko ciljanog molekula. Za određene druge primere izvođenja, ćelijski ciljani molekul predmetnog pokazuje citotoksičnost sa boljom optimizovanom, citotoksičnom jačinom, kao što je, npr., 4-puta, 5-puta, 6-puta, 9-puta, ili više citotoksičnosti kada se poredi sa citotoksičnošću dvadeset trećeg ćelijsko ciljanog molekula. Za određene druge primere izvođenja, citotoksičnost ćelijski ciljanog molekula predmetnog pronalaska prema populaciji ciljanih pozitivnih ćelija je 3-puta, 4-puta, 5-puta, 6-puta, 7-puta, 8-puta, 9-puta, 10-puta ili više nego citotoksičnost dvadeset trećeg ćelijskog ciljanog molekula prema drugoj populaciji ciljanih pozitivnih ćelija kao što je analizirano sa CD50vrednostima. U određenim drugim primerima izvođenja, dvadeset treći ćelijski ciljani molekul ne sadrži bilo koji karboksi kraj, zadržavajućeg / povratnog signala motiva endoplazmičnog retikulum člana KDEL familije.
U određenim primerima izvođenja Setova Primera Izvođenja #2 do #11, efektorski polipeptid Shiga toksina dalje obuhvata uništeni B-ćelijski i/ili T-ćelijski epitopski region odabran između grupe koja se sastoji od izvorno pozicioniranih regiona Shiga toksin A Podjedinice koji se sastoje od: 1-15 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 3-14 SEQ ID NO:3; 26-37 SEQ ID NO:3; 27-37 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 39-48 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 42-48 SEQ IDNO:3; 53-66 SEQ ID NO:1, SEQ IDNO:2, ili SEQ IDNO:3; 94-115 SEQ ID NO:1,
1
SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 141-153 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 140-156 SEQ ID NO:3; 179-190 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 179-191 SEQ ID NO:3; 204 SEQ ID NO:3; 205 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2, i 210-218 SEQ IDNO:3; 240-260 SEQ ID NO:3; 243-257 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 254-268 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 262-278 SEQ ID NO:3; 281-297 SEQ ID NO:3; 285-293 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 4-33 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 34-78 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 77-103 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 128-168 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 160-183 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 236-258 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; i 274-293 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; ili ekvivalentni region u Shiga toksin A Podjedinici ili njegovom derivatu. U određenim drugim primerima izvođenja, nema uništenja koji je skraćenje karboksi kraja amino kiselinskih ostataka koji se preklapaju sa delom ili celim bar jednim uništenim, endogenim, B-ćelijskim i/ili T-ćelijskim epitopom i/ili epitopskim regionom.
U određenim primerima izvođenja Setova Primera Izvođenja #2 do #11, efektorski polipeptid Shiga toksina dalje obuhvata mutaciju, u odnosu na divlji soj Shiga toksin A Podjedinice, u B-ćelijskoj imunogenosti, amino kiselinski ostatak odabran između grupe izvorno pozicioniranih Shiga toksin A Podjedinice amino kiselinskih ostataka: L49, D197, D198, R204, i R205.
U određenim primerima izvođenja Setova Primera Izvođenja #2 do #11, ugrađeni ili ubačeni, heterologni, T-ćelijski epitop koji uništava endogeni, B-ćelijski i/ili T-ćelijski epitopski region je odabran između grupe prirodno pozicioniranih regiona Shiga toksin A Podjedinice koji se sastoje od: (i) 1-15 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 3-14 SEQ ID NO:3; 26-37 SEQ ID NO:3; 27-37 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 39-48 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 42-48 SEQ ID NO:3; i 53-66 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; ili ekvivalentni region u Shiga toksin A Podjedinici ili njegovom derivatu, pri čemu nema uništenja koji je skraćenje karboksi kraja amino kiselinskih ostataka koji se preklapaju sa delom ili celim najmanje jednim uništenim epitopskim regionom; (ii) 94-115 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 141-153 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 140-156 SEQ ID NO:3; 179-190 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 179-191 SEQ ID NO:3; 204 SEQ ID NO:3; 205 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; i 210-218 SEQ ID NO:3; i (iii) 240-260 SEQ ID NO:3; 243-257 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 254-268 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 262-278 SEQ ID NO:3; 281-297 SEQ ID NO:3; i 285-293 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; ili ekvivalentni region u Shiga toksin A Podjedinici ili njegovom derivatu.
2
U određenim primerima izvođenja Setova Primera Izvođenja #2 do #11, efektorski polipeptid Shiga toksina obuhvata mutaciju, u odnosu na divlji soj Shiga toksin A Podjedinice, u B-ćelijskom i/ili T-ćelijskom epitopskom regionu odabranom između grupe prirodno pozicioniranih regiona Shiga toksin A Podjedinice koji se sastoje od: (i) 1-15 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 3-14 SEQ ID NO:3; 26-37 SEQ ID NO:3; 27-37 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 39-48 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 42-48 SEQ ID NO:3; i 53-66 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; ili ekvivalentni region u Shiga toksin A Podjedinici ili njegovom derivatu, pri čemu nema uništenja koji je skraćenje amino kraja sekvence koja se preklapaju sa delom ili celim najmanje jednim uništenim epitopskim regionom; (ii) 94115 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 141-153 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 140-156 SEQ ID NO:3; 179-190 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 179-191 SEQ ID NO:3; 204 SEQ ID NO:3; 205 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; i 210-218 SEQ ID NO:3; i (iii) 240-260 SEQ ID NO:3; 243-257 SEQ ID NO:1 ili SEQ IDNO:2; 254-268 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 262-278 SEQ ID NO:3; 281-297 SEQ ID NO:3; i 285-293 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; ili ekvivalentni region u Shiga toksin A Podjedinici ili njegovom derivatu, pri čemu nema uništenja koji je skraćenje amino kraja sekvence koja se preklapaju sa delom ili celim najmanje jednim uništenim epitopskim regionom.
U određenim primerima izvođenja Setova Primera Izvođenja #2 do #11, efektorski polipeptid Shiga toksina obuhvata uništeni najmanje jedan endogeni epitopski region odabran između grupe prirodno pozicioniranih Shiga toksin A Podjedinica koji se sastoje od: 94-115 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 141-153 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 140-156 SEQ ID NO:3; 179-190 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 179-191 SEQ ID NO:3; 204 SEQ ID NO:3; 205 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; ili 210-218 SEQ ID NO:3.
U određenim primerima izvođenja Setova Primera Izvođenja #2 do #11, efektorski polipeptid Shiga toksina ne sadrži heterologni, MHC klasa 1-ograničeni, T-ćelijski epitop. MHC kasa 1-ograničeni, T-ćelijski epitopi su poznati u tehnici ili se mogu predvideti od strane stručnog lica. Izraz heterologni odnosi se na MHC klasu 1-ograničene, T-ćelijske epitope koji nisu izvorno predstavljeni u divljem soju Shiga toksin A Podjedinica, kao što je, npr., divlji soj Shiga toksin A Podjedinice koja je najuže povezana sa efektorskim polipeptidom Shiga toksina od interesa.
U određenim primerima izvođenja Setova Primera Izvođenja #2 do #11, efektorski polipeptid Shiga toksina obuhvata uništenje najmanje četiri, pet, šest, sedam, osam, ili više endogenih, B-ćelijskih i/ili T-ćelijskih epitopskih regiona.
U određenim primerima izvođenja Setova Primera Izvođenja #2 do #11, jedno ili više uništenja obuhvata supstituciju amino kiselinskog ostatka u odnosu na divlji soj Shiga toksin A Podjedinice.
U određenim primerima izvođenja Setova Primera Izvođenja #2 do #11, jedan ili više endogenih, B-ćelijskih i/ili T-ćelijskih epitopskih regiona obuhvata mnoštvo supstitucija amino kiselinskog ostatka u odnosu na divlji soj Shiga toksin A Podjedinice.
U određenim primerima izvođenja Setova Primera Izvođenja #2 do #11, najmanje jedan, dva, tri, ili više uništenja obuhvata mnoštvo supstitucija amino kiselinskog ostatka u endogenom, B-ćelijskom i/ili T-ćelijskom epitopskom regionu u odnosu na divlji soj Shiga toksin A Podjedinice.
U određenim primerima izvođenja Setova Primera Izvođenja #2 do #11, najmanje jedno uništenje obuhvata najmanje jednu, dve, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, ili više supstitucija amino kiselinskog ostatka u odnosu na divlji soj Shiga toksin A Podjedinice, i opciono pri čemu najmanje jedna supstitucija se dešava na izvorno pozicioniranom amino kiselinskom ostatku Shiga toksin A Podjedinice odabranom između grupe koja se sastoji od: 1 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 4 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 6 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 8 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 9 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 11 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 12 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 33 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 43 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 44 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 45 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 46 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 47 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 48 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 49 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 50 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 51 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 53 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 54 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 55 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 56 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 57 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 58 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 59 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 60 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 61 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 62 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 84 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 88 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 94 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 96 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 104 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 105 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 107 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 108 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 109 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 110 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 111 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 112 SEQ ID NO:1,
4
SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 141 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 147 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 154 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 179 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 180 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 181 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 183 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 184 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 185 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 186 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 187 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 188 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 189 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 197 SEQ ID NO:3; 198 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 204 SEQ ID NO:3; 205 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 247 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 247 SEQ ID NO:3; 248 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 250 SEQ ID NO:3; 251 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 264 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 265 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; i 286 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; ili ekvivalentni amino kiselinski ostatak u Shiga toksin A Podjedinici ili njegovom derivatu. U određenim drugim primerima izvođenja, najmanje dva uništenja svaki obuhvata najmanje jednu supstituciju amino kiselinskog ostatka u odnosu na divlji soj Shiga toksin A Podjedinice odabran između grupe koja se sastoji od: 1 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 4 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 8 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 9 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 11 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 33 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 43 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 45 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 47 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 48 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 49 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 53 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 55 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 58 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 59 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 60 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 61 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 62 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 94 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 96 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 109 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 110 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 112 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 147 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 179 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 180 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 181 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 183 SEQ ID NO:1, SEQ ID SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 184 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2,ili SEQ ID NO:3; 185 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 186 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 187 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 188 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 189 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 204 SEQ ID NO:3; 205 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 247 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 247 SEQ ID NO:3; 250 SEQ ID NO:3; 264 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 265 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; i 286 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; ili ekvivalentni amino kiselinski ostatak u Shiga toksin A Podjedinici ili njegovom derivatu.
U određenim primerima izvođenja Setova Primera Izvođenja #2 do #11, efektorski polipeptid Shiga toksina obuhvata uništenje najmanje tri, endogena, B-ćelijska i/ili T-ćelijska epitopska regiona odabrani između grupe koja se sastoji od: (i) 1-15 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 3-14 SEQ ID NO:3; 26-37 SEQ ID NO:3; 27-37 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 39-48 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 42-48 SEQ ID NO:3; i 53-66 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3, ili ekvivalentni region u Shiga toksin A Podjedinici ili njegovom derivatu, pri čemu nema uništenja koje predstavlja skraćenje amino kraja amino kiselinskog ostatka koje se preklapa sa delom ili celim najmanje jednim uništenjem, endogenog, B-ćelijskog i/ili T-ćelijskog epitopskog regiona; (ii) 94-115 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 141-153 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 140-156 SEQ ID NO:3; 179-190 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 179-191 SEQ ID NO:3; 204 SEQ ID NO:3; 205 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; i 210-218 SEQ ID NO:3; i (iii) 240-260 SEQ ID NO:3; 243-257 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 254-268 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 262-278 SEQ ID NO:3; 281-297 SEQ ID NO:3; i 285-293 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; ili ekvivalentni region u Shiga toksin A Podjedinici ili njegovom derivatu, pri čemu nema uništenja koje predstavlja skraćenje karboksi kraja amino kiselinskog ostatka koje se preklapa sa delom ili celim najmanje jednim uništenjem, endogenog, B-ćelijskog i/ili T-ćelijskog epitopskog regiona.
U određenim primerima izvođenja Setova Primera Izvođenja #2 do #11, efektorski polipeptid Shiga toksina obuhvata uništenja najmanje dva, endogena, B-ćelijska i/ili T-ćelijska epitopska regiona, pri čemu svako uništenje obuhvata jednu ili više supstitucija amino kiselinskih ostataka, i pri čemu endogeni, B-ćelijski i/ili T-ćelijski epitopski regioni su odabrani između grupe izvorno pozicioniranih regiona Shiga toksin A Podjedinice koji se sastoje od: 3-14 SEQ ID NO:3; 26-37 SEQ ID NO:3; 27-37 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 39-48 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 42-48 SEQ ID NO:3; 53-66 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; ili ekvivalentni region u Shiga toksin A Podjedinici ili njegovom derivatu.
U određenim primerima izvođenja Setova Primera Izvođenja #2 do #11, ugrađeni ili ubačeni, heterogeni, T-ćelijski epitop ne uništava bilo koji endogeni, B-ćelijski i/ili CD4+ T-ćelijski epitopski region opisan ovde.
U određenim primerima izvođenja Setova Primera Izvođenja #2 do #11, najmanje jedno uništenje obuhvata jednu ili više supstitucija amino kiselinskog ostatka u odnosu na divlji soj Shiga toksin A Podjedinice je odabrano između grupe koja se sastoji od: D do A, D do G, D do V, D do L, D do I, D do F, D do S, D do Q, D do M, D do R, E do A, E do G, E do V, E do L, E do I, E do F, E do S, E do Q, E do N, E do D, E do M, E do R, F do A, F do G, F do V, F do L, F do I, G do A, G do P, H do A, H do G, H do V, H do L, H do I, H do F, H do M, I do A, I do V, I do G, I do C, K do A, K do G, K do V, K do L, K do I, K do M, K do H, L do A, L do V, L do G, L do C, N do A, N do G, N do V, N do L, N do I, N do F, P do A, P do G, P do F, R do A, R do G, R do V, R do L, R do I, R do F, R do M, R do Q, R do S, R do K, R do H, S do A, S do G, S do V, S do L, S do I, S do F, S do M, T do A, T do G, T do V, T do L, T do I, T do F, T do M, T do S, V do A, V do G, Y do A, Y do G, Y do V, Y do L, Y do I, Y do F, Y do M, i Y do T. U određenim drugim primerima izvođenja, jedna ili više supstitucija amino kiselinskog ostatka u odnosu na divlji soj Shiga toksin A Podjedinice je odabrana između grupe koja se sastoji od: D do A, D do G, D do V, D do L, D do I, D do F, D do S, D do Q, E do A, E do G, E do V, E do L, E do I, E do F, E do S, E do Q, E do N, E do D, E do M, E do R, G do A, H do A, H do G, H do V, H do L, H do I, H do F, H do M, K do A, K do G, K do V, K do L, K do I, K do M, K do H, L do A, L do G, N do A, N do G, N do V, N do L, N do I, N do F, P do A, P do G, P do F, R do A, R do G, R do V, R do L, R do I, R do F, R do M, R do Q, R do S, R do K, R do H, S do A, S do G, S do V, S do L, S do I, S do F, S do M, T do A, T do G, T do V, T do L, T do I, T do F, T do M, T do S, Y do A, Y do G, Y do V, Y do L, Y do I, Y do F, i Y do M.
U određenim primerima izvođenja Setova Primera Izvođenja #2 do #11, najmanje jedno uništenje obuhvata supstitucije amino kiselinskog ostatka u odnosu na divlji soj Shiga toksin A Podjedinice odabrane između grupe koja se sastoji od: K1 do A, G, V, L, I, F, M i H; T4 do A, G, V, L, I, F, M, i S; D6 do A, G, V, L, I, F, S, Q i R; S8 do A, G, V, I, L, F, i M; T9 do A, G, V, I, L, F, M, i S; S9 do A, G, V, L, I, F, i M; K11 do A, G, V, L, I, F, M i H; T12 do A, G, V, I, L, F, M, S, i K; S12 do A, G, V, I, L, F, i M; S33 do A, G, V, L, I, F, M, i C; S43 do A, G, V, L, I, F, i M; G44 do A ili0 L; S45 do A, G, V, L, I, F, i M; T45 do A, G, V, L, I, F, i M; G46 do A i P; D47 do A, G, V, L, I, F, S, M, i Q; N48 do A, G, V, L, M i F; L49 do A, V, C, i G; Y49 do A, G, V, L, I, F, M, i T; F50 do A, G, V, L, I, i T; A51 do V; D53 do A, G, V, L, I, F, S, i Q; V54 do A, G, I, i L; R55 do A, G, V, L, I, F, M, Q, S, K, i H; G56 do A i P; 157 do A, G, V, i M; L57 do A, V, C, G, M, i F; D58 do A, G, V, L, I, F, S, i Q; P59 do A, G, i F; E60 do A, G, V, L, I, F, S, Q, N, D, M, T, i R; E61 do A, G, V, L, I, F, S, Q, N, D, M, i R; G62 do A; R84 do A, G, V, L, I, F, M, Q, S, K, i H; V88 do A i G; 188 do A, V, C, i G; D94 do A, G, V, L, I, F, S, i Q; S96 do A, G, V, I, L, F, i M; T104 do A, G, V, L, I, F, M; i N; A105 do L; T107 do A, G, V, L, I, F, M, i P; S107 do A, G, V, L, I, F, M, i P; L108 do A, V, C, i G; S109 do A, G, V, I, L, F, i M; T109 do A, G, V, I, L, F, M, i S; G110 do A; S112 do A, G, V, L, I, F, i M; D111 do A, G, V, L, I, F, S, Q, i T; S112 do A, G, V, L, I, F, i M; D141 do A, G, V, L, I, F, S, i Q; G147 do A; V154 do A i G. R179 do A, G, V, L, I, F, M, Q, S, K, i H; T180 do A, G, V, L, I, F, M, i S; T181 do A, G, V, L, I, F, M, i S; D183 do A, G, V, L, I, F, S, i Q; D184 do A, G, V, L, I, F, S, i Q; L185 do A, G, V i C; S186 do A, G, V, I, L, F, i M; G187 do A; R188 do A, G, V, L, I, F, M, Q, S, K, i H; S189 do A, G, V, I, L, F, i M; D197 do A, G, V, L, I, F, S, i Q; D198 do A, G, V, L, I, F, S, i Q; R204 do A, G, V, L, I, F, M, Q, S, K, i H; R205 do A, G, V, L, I, F, M, Q, S, K i H; S247 do A, G, V, I, L, F, i M; Y247 do A, G, V, L, I, F, i M; R248 do A, G, V, L, I, F, M, Q, S, K, i H; R250 do A, G, V, L, I, F, M, Q, S, K, i H; R251 do A, G, V, L, I, F, M, Q, S, K, i H; D264 do A, G, V, L, I, F, S, i Q; G264 do A; i T286 do A, G, V, L, I, F, M, i S.
U određenim primerima izvođenja Setova Primera Izvođenja #2 do #11, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska je sposoban kada se uvodi u hordat da pokazuje poboljšanu in vivo tolerantnost i/ili stabilnost u poređenju sa referentnim molekulom, kao što je, npr., dvadeset četvrti ćelijski ciljani molekul koji se sastoji od ćelijski ciljanog molekula osim za sve njegove komponente efektorskog polipeptida Shiga toksina svaki sadrži divlji soj Shiga toksin A1 fragment i/ili divlji soj Shiga toksin furinskog odcepljenog mesta na karboksi kraju njegovog regiona A1 fragmenta. U određenim drugim primerima izvođenja, efektorski polipeptid Shiga toksina nije citotoksičan, a molekulski deo je citotoksičan.
U određenim primerima izvođenja Setova Primera Izvođenja #2 do # 11, vezujući region i efektorski polipeptid Shiga toksina su povezani zajedno, ili direktno ili indirektno.
U određenim primerima izvođenja Setova Primera Izvođenja #2 do #11, vezujući region sadrži najmanje jedan peptid i/ili polipeptid. U određenim drugim primerima izvođenja, vezujući region je ili sadrži vezujući region imunoglobulinskog tipa. U određenim drugim primerima izvođenja, vezujući region obuhvata polipeptid odabran između grupe koja se sastoji od: autonomnog VHdomen, single-domen fragmenta antitela (sdAb), nanotelo, domen antitela teškog lanca izvedenog iz kamile (VHH ili VHfragment domena), domen antitela teškog lanca izvedenog iz hrskave ribe (VHH ili VHfragment domena), imunoglobulinski novi antigenski receptor (IgNAR), VNARfragment, varijabilni fragment pojedinačnog lanca (scFv), varijabilni fragment antitela (Fv), komplementarni određeni region 3 fragmenta (CDR3), ograničeni FR3-CDR3-FR4 polipeptid (FR3-CDR3-FR4), Fd fragment, mali modularni imunofarmaceutski (SMIP) domen, antigenski vezujući fragment (Fab), Armadillo ponavljajući polipeptid (ArmRP), fibronektin-izvedeni 10<h>fibronektin tipa III domen (10Fn3), tenascin tip III domen (TNfn3), ankirin ponavljajući motiv domena, niske-gustinelipoproteinski-receptor-izvedeni A-domen (LDLR-A), lipokalin (antikalin), Kunitz domen, Protein-A-izvedeni Z domen, gama-B kristalni-izvedeni domen, ubihitin-izvedeni domen, Sac7d-izvedeni polipeptid (afitin), Fyn-izvedeni SH2 domen, miniprotein, C-tip lektin-slični domenski kostur, dizajnirana mimika antitela, i bilo koji genetski manipulisani duplikati bilo kog prethodno navedenog koji zadržavaju vezujuću funkcionalnost.
Za određene primere izvođenja Setova Primera Izvođenja #2 do #11, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska je sposoban da pokazuje (i) nivo katalitičke aktivnosti u poređenju sa divljim sojem Shiga toksin A1 fragmenta ili efektorskog polipeptida divljeg soja Shiga toksina, (ii) aktivnost inhibicije ribozoma sa polovinom maksimalne inhibicijske koncentracije (IC50) vrednosti od 10,000 pikomola ili manje, i/ili (iii) značajan nivo katalitičke aktivnosti Shiga toksina.
Za određene primere izvođenja Setova Primera Izvođenja #2 do #11, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska i/ili njegov efektorski polipeptid Shiga toksina je sposoban da pokazuje efikasnost podćelijskog usmeravanja u poređenju sa referentnim ćelijski ciljanim molekulom koji sadrži divlji soj Shiga toksin A1 fragmenta ili efektorski polipeptid divljeg soja Shiga toksina i/ili sposobni da pokazuju značajan nivo intraćelijske aktivnosti usmeravanja na endoplazmatični retikulum i/ili citozol iz endozomatske početne lokacije ćelije.
Za određene primere izvođenja Setova Primera Izvođenja #2 do #11, gde primena ćelijski ciljanog molekula predmetnog pronalaska na ćeliju fizički spojenu sa ekstraćelijskim ciljanim biomolekulom vezujućeg regiona ćelijski ciljanog molekula, ćelijski ciljani molekul je sposoban da izazove smrt ćelije. U određenim drugim primerima izvođenja, primena ćelijski ciljanog molekula pronalaska na dve različite populacije ćelijskih tipova koje se razlikuju s obzirom na prisustvo ili nivo ekstraćelijskog ciljanog biomolekula, ćelijski ciljani molekul je sposoban da prouzrokuje smrt ćelija kod tipova ćelija koji su fizički spojeni sa ekstraćelijskim ciljnim biomolekulom za citotoksični vezujući region ćelijski ciljanog molekula na CD50najmanje tri ili manje od CD50na ćelijske tipove koji nisu fizički spojeni sa ekstraćelijskim ciljnim biomolekulom vezujućeg regiona ćelijski ciljanog molekula. Za određene primere izvođenja, pri čemu se primena ćelijski ciljanog molekula predmetnog pronalasku na prvu populaciju ćelija čiji su članovi fizički spojeni za ekstraćelijske ciljane biomolekule vezujućeg regiona ćelijski ciljanog molekula, i druge populacije ćelija čiji članovi nisu fizički spojeni za bilo koji ekstraćelijski ciljani biomolekul vezujućeg regiona, efekat citotoksičnosti ćelijski ciljanog molekula za članove navedene prve populacije ćelija u odnosu na članove navedene druge populacije ćelija je najmanje 3-puta veća. Za određene primere izvođenja, pri čemu primena ćelijski ciljanog molekula predmetnog pronalasku na prvu populaciju ćelija čiji su članovi fizički spojeni za značajnu količinu ekstraćelijskog ciljanog biomolekula vezujućeg regiona ćelijski ciljanog molekula, i drugu populaciju ćelija čiji članovi nisu fizički spojeni za značajnu količinu ekstraćelijskog ciljanog biomolekula vezujućeg regiona, efekat citotoksičnosti ćelijski ciljanog molekula za članove navedene prve populacije ćelija u odnosu na članove navedene druge populacije ćelija je najmanje 3-puta veća. Za određene primere izvođenja, pri čemu primena ćelijski ciljanog molekula predmetnog pronalasku na prvu populaciju pozitivnih ćelija ciljanog biomolekula, i drugu populaciju ćelija čiji članovi ne iskazuju značajnu količinu ciljanog biomolekula vezujućeg regiona ćelijski ciljanog molekula na ćelijskoj površini, efekat citotoksičnosti ćelijski ciljanog molekula za članove prve populacije ćelija u odnosu na članove druge populacije ćelija je najmanje 3-puta veća.
Za određene primere izvođenja Setova Primera Izvođenja #2 do #11, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska je sposoban kada se uvodi u ćelije da pokazuje citotoksičnost sa polu maksimalnom inhibitornom koncentracijom (CD50) vrednosti od 300 nM ili manje i/ili sposoban da pokazuje značajan nivo citotoksičnosti Shiga toksina.
Za određene primere izvođenja Setova Primera Izvođenja #2 do #11, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska je sposoban da dostavi ugrađeni ili ubačeni, heterologni, CD8+ T-ćelijski epitope do MHC klase 1 prezentacijskim putem ćelije za prezentaciju ćelijske površine epitopa vezanog za molekul MHC klase 1.
U određenim primerima izvođenja Setova Primera Izvođenja #2 do #11, ćelijski ciljani molekul obuhvata molekulski ostatak povezan sa karboksi krajem efektorskog polipeptida Shiga toksina. U određenim primerima izvođenja, molekulski ostatak sadrži ili se sastoji od vezujućeg regiona. U određenim primerima izvođenja, molekulski ostatak sadrži najmanje jednu amino kiselinu i efektorski polipeptid Shiga toksina je povezan za najmanje jedan amino kiselinski ostatak molekulskog ostatka U određenim primerima izvođenja, molekulski ostatak i efektorski polipeptid Shiga toksina su spojeni tako da obrazuju kontinuirani polipeptid.
U određenim primerima izvođenja Setova Primera Izvođenja #2 do #11, ćelijski ciljani molekul dalje sadrži citotoksični molekulski ostatak povezan sa karboksi krajem efektorskog polipeptida Shiga toksina. Za određene primere izvođenja, citotoksični molekulski ostatak je citotoksični agens, kao što je, npr., hemoterapeutski agens sa malim molekulima, antineoplastični agens, citotoksični antibiotik, alkilacioni agens, antimetabolit, inhibitor topoizomeraze i/ili inhibitor tubulina poznat stručnom licu i/ili je ovde opisan. Za određene druge primere izvođenja, citotoksični molekulski ostatak je citotoksičan u koncentracijama manjim od 10,000, 5,000, 1,000, 500, ili 200 pM.
U određenim primerima izvođenja Setova Primera Izvođenja #2 do #11, vezujući region je sposoban da se veže za ekstraćelijski ciljani biomolekul odabran između grupe koja se sastoji od: CD20, CD22, CD40, CD74, CD79, CD25, CD30, HER2/neu/ErbB2, EGFR, EpCAM, EphB2, prostatski specifični membranski antigen, Kripto, CDCP1, endoglin, protein aktivacije fibroblasta, Lewis-Y, CD19, CD21, CS1/ SLAMF7, CD33, CD52, CD133, gpA33, mucin, TAG-72, transmembranski receptor za tirozin-protein kinaze (ROR1 ili NTRKRl), karbonska anhidraza IX, protein za vezivanje folata, gangliozid GD2, gangliozid GD3, gangliozid GM2, gangliozid Lewis-Y2, VEGFR, Alfa Vbeta3, Alfa5betal, ErbB1/EGFR, Erb3, c-MET, IGF1R, EphA3, TRAIL-R1, TRAIL-R2, RANK, FAP, tenascin, CD64, mesotelin, BRCA1, tirozinaza, TRP-1, TRP-2, MAGE-1, MAGE-3, GAGE-1/2, BAGE, RAGE, NY-ESO-1, CDK-4, beta-catenin, MUM-1, caspaza-8, KIAA0205, HPVE6, SART-1, PRAME, karcinoembrionski antigen, specifični antigen prostate, antigen matičnih ćelija prostate, human aspartil (asparaginil) beta-hidrokslaze, EphA2, HER3/ErbB-3, MUC1, MART-1/MelanA, gp100, antigen povezan sa tirozinazom, HPV-E7, Epstein-Barr virusni antigen, Bcr-Abl, alfa-fetoprotein antigen, 17-A1, antigen tumora mokraćne bešike, CD38, CD15, CD23, CD45 (protein tirozin fosfataza receptor tipa C), CD53, CD88, CD129, CD183, CD191, CD193, CD244, CD294, CD305, C3AR, galectin-9, IL-1R (interleukin-1 receptor), mrp-14, NKG2D ligand, programirani ligand smrti 1 (PD-L1), Siglec-8, Siglec-10, CD49d, CD13, CD44, CD54, CD63, CD69, CD123, TLR4, FceRIa, IgE, CD107a, CD203c, CD14, CD68, CD80, CD86, CD105, CD115, F4/80, ILT-3, galectin-3, CD1 la-c, GITRL, MHC klasa 1 molekul, MHC klasa II molekul (opciono složeni sa peptidom), CD284 (TLR4), CD107-Mac3, CD195 (CCR5), HLA-DR, CD16/32, CD282 (TLR2), CD1 lc, i bilo koji imunogen fragment bilo kog od prethodno navedenih.
U određenim primerima izvođenja Setova Primera Izvođenja #2 do #11, vezujući region je direktno ili indirektno povezan sa efektorskim polipeptidom Shiga toksina najmanje jednom kovalentnom vezom koja nije disulfidna veza. U određenim daljim primerima izvođenja, vezujući region je direktno ili indirektno povezan sa karboksi krajem efektorskog polipeptida Shiga toksina, čime se formira jedan kontinuirani polipeptid. U nekim daljim primerima izvođenja, vezujući region je vezujući region imunoglobulinskog tipa.
U određenim primerima izvođenja Setova Primera Izvođenja #2 do #11, uništeni furinski odcepljeni motiv sadrži jednu ili više mutacija na minimalnom, furinski odcepljenom u odnosu na divlji soj Shiga toksin A Podjedinice. U određenim primerima izvođenja, uništeni furinski odcepljeni motiv nije amino krajnja skraćena sekvenca koja se preklapa sa delom ili svim od najmanje jednog amino kiselinskog ostatka minimalnog furinskog odcepljenog mesta. U
1
određenim primerima izvođenja, mutacija u minimalnom furinski odcepljenom mestu je amino kiselinsko brisanje, ubacivanje, i/ili supstitucija najmanje jednog amino kiselinskog ostatka u R/Y-x-x-R furinskom odcepljenom motivu. U određenim drugim primerima izvođenja, uništeni furinsko odcepljeni motiv sadrži najmanje jednu mutaciju u odnosu na divlji soj Shiga toksin A Podjedinice, mutacija menja bar jedan amino kiselinski ostatak u regionu koji je izvorno postavljen 1) na 248-251 A Podjedinice Shiga-sličnog toksin 1 (SEQ ID NO: 1) ili Shiga toksina (SEQ ID NO: 2), ili 2) na 247-250 A Podjedinici Shiga-sličnog toksina 2 (SEQ ID NO:3), ili ekvivalentne pozicije sekvence amino kiseline u bilo kojoj Shiga toksin A Podjedinici. U određenim daljim primerima izvođenja, mutacija je supstitucija amino kiselinskog ostatka argininskog ostatka sa negativnim naelektrisanim, amino kiselinskim ostatkom.
U određenim primerima izvođenja Setova Primera Izvođenja #2 do #11, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska je sposoban kada se uvodi u ćelije da pokazuje citotoksičnost koja je uporediva sa citotoksičnošću referentnog molekula, kao što je, npr., dvadeset peti ćelijski ciljani molekul koji se sastoji od ćelijskog ciljanog molekula osim za sve njegove komponente efektorskog polipeptida Shiga toksina svaki sadrži divlji soj Shiga toksin A1 fragment.
U određenim primerima izvođenja Setova Primera Izvođenja #2 do #11, vezujući region sadrži peptid ili polipeptid prikazan u bilo kojoj SEQ ID NOs: 83-339. U nekim daljim primerima izvođenja, vezujući region sadrži ili se sastoji pretežno od polipeptida koji je predstavljen bilo kojim od sledećih: amino kiselina 1-245 bilo koga od SEQ ID NOs: 33, 64, i 65; 269-513 SEQ ID NO:40 ili SEQ ID NO:80; amino kiselina 269-520 ili 269521 bilo koga od SEQ ID NOs: 36, 66, i 67; amino kiselina 1-232, 1-233, 1-234, 1-235, 1-236, 1-242, 1-243, 1-244, 1-245, 1-246, 1-252, 1-253, 1-254, 1-255, ili 1-256 bilo koga od SEQ ID NOs: 47-119 i 176-248; amino kiselina 269-498 ili 269-499 bilo koga od SEQ ID NOs: 37-39, 68-79, i 81; amino kiselina 269-499, 269-512, 269-513, ili 280-510 bilo koga od SEQ ID NOs: 34, 35, 41-56, i 82.
U određenim primerima izvođenja Setova Primera Izvođenja #2 do #11, vezujući region sterikalno pokriva karboksi kraj regiona A1 fragmenta.
U određenim primerima izvođenja Setova Primera Izvođenja #2 do #11, molekulski ostatak sterikalno pokriva karboksi kraj regiona A1 fragmenta. U određenim drugim primerima izvođenja, molekulski ostatak sadrži vezujući region.
2
U određenim primerima izvođenja Setova Primera Izvođenja #2 do #11, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska sadrži vezujući region i/ili molekulski ostatak postavljenog karboksi kraja za karboksi kraj regiona Shiga toksin A1 fragmenta. U određenim drugim primerima izvođenja, masa vezujućeg regiona i/ili molekulskog ostatka je najmanje 4.5 kDa, 6 kDa, 9 kDa, 12 kDa, 15 kDa, 20 kDa, 25 kDa, 28 kDa, 30 kDa, 41 kDa, 50 kDa, 100 kDa, ili viša.
U određenim primerima izvođenja Setova Primera Izvođenja #2 do #11, ćelijski ciljani molekul obuhvata vezujući region sa masom od najmanje 4.5 kDa, 6 kDa, 9 kDa, 12 kDa, 15 kDa, 20 kDa, 25 kDa, 28 kDa, 30 kDa, 41 kDa, 50 kDa, 100 kDa, ili više, sve dok ćelijski ciljani molekul zadržava odgovarajući nivo biološke aktivnosti Shiga toksina koja je ovde zabeležen (npr., citotoksičnost i/ili intraćelijsko usmeravanje).
U određenim primerima izvođenja Setova Primera Izvođenja #2 do #11, vezujući region je sadržan unutar relativno velikog, molekulskog ostatka koji sadrži kao što je, npr., molekulski ostatak sa masom od najmanje 4.5 kDa, 6 kDa, 9 kDa, 12 kDa, 15 kDa, 20 kDa, 25 kDa, 28 kDa, 30 kDa, 41 kDa, 50 kDa, 100 kDa, ili više, sve dok ćelijski ciljani molekul zadržava odgovarajući nivo biološke aktivnosti Shiga toksina koja je ovde zabeležen.
Za određene primere izvođenja Setova Primera Izvođenja #2 do #11, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska pokazuje nisku citotoksičnu jačinu (odn. nije sposoban kada se uvede u određene pozitivne tipove ćelija koje pokazuju citotoksičnost veću od 1% ćelijske smrti ćelijske populacije pri koncentraciji ćelijski ciljanog molekula od 1000 nM, 500nM, 100 nM, 75 nM, ili 50 nM) i sposoban je kada se uvodi u ćelije koje pokazuju veću efikasnost podćelijskog usmeravanja iz ekstraćelijskog prostora u podćelijski odeljak endoplazmatskog retikuluma i/ili citozola u poređenju sa efikasnošću podćelijskog usmeravanja referentnog molekula, kao što je, npr., dvadeset šesti ciljani ćelijski molekul koji ima amino kraj i koji obuhvata vezujući region i efektorski polipeptid Shiga toksina koji nije pozicioniran na ili blizu amino kraja trećeg ćelijski ciljanog molekula. U određenim drugim primerima izvođenja, dvadeset šesti ćelijski ciljani molekul ne sadrži bilo koji karboksi kraj, zadržavajućeg / pronalazačkog signalnog motiva endoplazmatičnog retikuluma KDEL familije.
U određenim primerima izvođenja Setova Primera Izvođenja #2 do #11, molekulski ostatak sadrži peptid i/ili polipeptid izveden iz A2 fragmenta Shiga toksina koji može da se nađe u prirodi Shiga toksina.
Primeri izvođenja predmetnog pronalaska nisu namenjeni da pokrivanju bilo koji Shiga holotoksin ili Shiga toksin A Podjedinicu. U nekim primerima izvođenja Setova Primera Izvođenja # 2-11, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska ne sadrži Shiga toksin Podjedinicu B, koja se javlja u prirodni. U određenim daljim primerima izvođenja, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska ne sadrži nijedan polipeptid koji sadrži ili se sastoji u osnovi funkcionalnog vezujućeg domena Shiga toksin B Podjedinice koja se javlja u prirodi. Umesto toga, u određenim primerima izvođenja ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalasku, izvedeni regioni Shiga toksin A Podjedinice su funkcionalno povezani sa heterolognim vezujućim regionima kako bi se ostvarilo ciljanje ćelije.
U određenim primerima izvođenja Setova Primera Izvođenja #2 do #11, vezujući region ne sadrži fragment humanog CD4 koji odgovara amino kiselinskim ostacima 19-183. U nekim daljim primerima izvođenja, vezujući region ne sadrži fragment humanog CD4, transmembranskog glikoproteina tipa 1. U nekim daljim primerima izvođenja, vezujući region ne sadrži fragment humanog, površinski ko-receptora imune ćelije.
U određenim primerima izvođenja Setova Primera Izvođenja #2 do #11, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska ne sadrži karboksi krajnji, vezujući region koji sadrži fragment površinskog receptora imune ćelije.
U određenim primerima izvođenja Setova Primera Izvođenja #1 do #11, efektorski polipeptid Shiga toksina sadrži najmanje dva, ugrađena ili umetnuta, heterologna epitopa.
U određenim primerima izvođenja Setova Primera Izvođenja #1 do #11, efektorski polipeptid Shiga toksina ne sadrži set supstitucija amino kiselinskih ostataka u odnosu na divlji soj Shiga toksin A Podjedinica izabran iz sledećih setova: (1) R248H i R251H; (2) R248G i R251G; (3) A246G, S247A, A253G, i S254A; i (4) A246G, S247A, R248G, R251G, A253G, i S254A.
U određenim primerima izvođenja Setova Primera Izvođenja #1 do #11, efektorski polipeptid Shiga toksina ne sadrži uništenje regiona izvorno pozicioniranog na 247-252 u divljem soju Shiga toksin A Podjedinice. U određenim primerima izvođenja Setova Primera Izvođenja #2-11, efektorski polipeptid Shiga toksina ne sadrži uništenja regiona izvorno pozicioniranih na 245-247 i 253-255 u divljem soju Shiga toksin A Podjedinice.
4
U određenim primerima izvođenja Setova Primera Izvođenja #1 do #11, efektorski polipeptid Shiga toksina obuhvata jednu ili više mutacija u odnosu na A Podjedinicu člana familije Shiga toksina koja se javlja u prirodi i koja menja enzimatsku aktivnost efektorskog polipeptida Shiga toksina, mutaciju izabranu između najmanje jedne delecije, umetanja ili supstitucije amino kiselina. U određenim daljim primerima izvođenja, mutacija u odnosu na A Podjedinicu koja se javlja u prirodi smanjuje ili eliminiše citotoksičnu aktivnost efektorskog polipeptida Shiga toksina, ali efektorski polipeptid Shiga toksina zadržava bar još jednu efektorsku funkciju Shiga toksina, kao što je, npr., promocija ćelijske internalizacije i/ili upravljanje intraćelijskog usmeravanja do određenog podćelijskog odeljenja. U određenim daljim primerima izvođenja, mutacija u odnosu na A Podjedinicu koja se javlja u prirodi je izabrana iz najmanje jedne supstitucije amino kiselinskih ostataka, kao što je, npr., A23IE, R75A, Y77S, Y114S, E167D, R170A, R176K, i/ili W203A u SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO: 3.
Za određene primere izvođenja Setova Primera Izvođenja #1 do #11, efektorski polipeptid Shiga toksina je sposoban da: (i) usmerava prema podćelijskom odeljku ćelije u kojoj je prisutan efektorski polipeptid Shiga toksina odabran iz sledećeg: citozol, endoplazmatski retikulum i lizozom; (ii) intraćelijska isporuka epitopa iz ranog endozomskog odeljka u proteazom ćelije u kojoj je prisutan efektorski polipeptid Shiga toksina; i/ili (iii) intraćelijska isporuka epitopa molekula MHC klase 1 iz ranog endozomskog odeljka ćelije u kojoj je prisutan efektorski polipeptid Shiga toksina. U nekim daljim primerima izvođenja, efektorski polipeptid Shiga toksina je sposoban za intraćelijsku isporuku epitopa CD 8 T-ćelija za prezentaciju molekula MHC klase I na površini ćelije u kojoj je prisutan efektorski polipeptid Shiga toksina.
U određenim primerima izvođenja, molekul predmetnog pronalaska ne sadrži, na poziciji karboksi-kraja efektorskog polipeptida Shiga toksina i/ili karboksi kraja u regionu fragmenta A1 Shiga toksina, bilo koji dodatni egzogeni materijal koji predstavlja antigen i/ili heterologni, CD8 , T-ćelijski epitop-peptid.
U određenim primerima izvođenja Setova Primera Izvođenja #2 do #11, vezujući region ne sadrži ligand. U određenim primerima izvođenja Setova Primera Izvođenja #2 do #11, vezujući region ne sadrži hemokin ili TNF-povezani apoptozno-uključeni ligand (TRAIL) niti njegov fragment vezujućeg receptora. U određenim primerima izvođenja Setova Primera Izvođenja #2 do #11, vezujući region ne sadrži humani hemokin ili humani TRAIL niti njegov fragment vezujućeg receptora. U određenim primerima izvođenja Setova Primera Izvođenja #2 do #11, vezujući region imunoglobulinskog tipa ne sadrži ligand niti njegov fragment vezujućeg receptora. U određenim primerima izvođenja Setova Primera Izvođenja #2 do #11, vezujući region imunoglobulinskog tipa ne sadrži hemokin ili TNF-povezani apoptozniindukovani ligand (TRAIL) niti njegov fragment vezujućeg receptora. U određenim primerima izvođenja Setova Primera Izvođenja #2 do #11, vezujući region ne sadrži humani CC hemokin niti njegov fragment vezujućeg receptora. U određenim primerima izvođenja Setova Primera Izvođenja #2 do #11, vezujući region ne sadrži humani CC hemokin CCL2 (videti Bose S, Cho J et al., Arch Pharm Res 36: 1039-50 (2013)). U određenim primerima izvođenja Setova Primera Izvođenja #2 do #11, vezujući region ne sadrži humani, CC hemokin CCL2, niti njegov fragment vezujućeg receptora, i karboksi kraj, efektorskog polipeptida Shiga toksina koji se sastoji od amino kiselina 75-247 StxA. U određenim primerima izvođenja ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska, vezujući region ne sadrži humani, CC hemokin CCL2, niti njegov fragment vezujućeg receptora, spojen za karboksi kraj, efektorskog polipeptida Shiga toksina koji se sastoji od amino kiselina 75-247 StxA (SEQ ID NO:2). U primerima izvođenja Setova Primera Izvođenja #2 do #11, vezujući region ne sadrži humani TRAIL niti njegov fragment vezujućeg receptora.
Između određenih primera izvođenja predmetnog pronalaska jeste farmaceutska kompozicija koja sadrži bilo koji od gore navedenih efektorskih polipeptida Shiga toksina predmetnog pronalaska i/ili bilo koji od gore navedenih ćelijski ciljanih molekula predmetnog pronalaska; i najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv ekscipijens ili nosač.
Između određenih primera izvođenja predmetnog pronalaska jeste dijagnostička kompozicija koja sadrži bilo koji od gore navedenih ćelijski ciljanih molekula predmetnog pronalaska i agens za poboljšanje detekcije. Izvesni dalji primeri izvođenja su ćelijski ciljani molekuli predmetnog pronalasku, pri čemu je agens za poboljšanje detekcije heterologni epitop, a ćelijski ciljani molekul sadrži heterologni epitop.
Pored efektorskih polipeptida Shiga toksina predmetnog pronalaska, ćelijski ciljani molekuli predmetnog pronalaska i njihove kompozicije, polinukleotidi koji mogu da kodiraju efektorski polipeptid Shiga toksina ili ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska su u okviru predmetnog pronalaska kao i vektori ekspresije koji sadrže polinukleotid predmetnog pronalaska i ćelije domaćina koji sadrže bilo koji polinukleotid i/ili ekspresijski vektor predmetnog pronalaska. Ćelije domaćina koje sadrže ekspresijski vektor mogu se koristiti, npr., u postupcima za proizvodnju molekula predmetnog pronalaska ili polipeptidne komponente ili njegovog fragmenta sa rekombinantnom ekspresijom.
Između određenih primera izvođenja predmetnog pronalaska je postupak ubijanja ćelije koji sadrži korak kontakta ćelije sa bilo kojim od gore navedenih ćelijski ciljanih molekula predmetnog pronalaska ili gore navedenih farmaceutskim kompozicijama predmetnog pronalaska. U nekim primerima izvođenja, korak kontakta sa ćelijama se događa in vitro. U određenim drugim primerima izvođenja, korak kontakta sa ćelijama se događa ili in vivo. U drugim primerima izvođenja postupaka ubijanja ćelija, postupak je sposoban da selektivno ubije ćelije i/ili tipove ćelija preferirano u odnosu na druge ćelije i/ili tipove ćelija kada kontaktira smešu ćelija koja se razlikuje u odnosu na ekstraćelijsku prisutnost i/ili nivo ekspresije ekstraćelijski ciljanog biomolekula vezujućeg regiona ćelijski ciljanog molekula.
Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje postupke za lečenje bolesti, poremećaja i/ili stanja kod pacijenata koji sadrže korak primene na pacijentu kome je potrebna terapeutski efikasna količina ćelijski ciljanog molekula i/ili farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska. U nekim primerima izvođenja, bolest, poremećaj ili stanje koje se leči korišćenjem postupka pronalaska je izabrano između: kancera, tumora, abnormalnosti rasta, imunog poremećaja ili mikrobne infekcije. U određenim primerima izvođenja ovih postupaka, kancer koji se leči je izabran iz grupe koja se sastoji od: karcinoma kostiju, kancera dojke, kancera centralnog / perifernog nervnog sistema, kancera gastrointestinalnog sistema, kancera germ ćelije, kancer žlezde, kancer glave i vrata, hematološkog karcinoma, kancera bubrežnih i mokraćnih puteva, kancera jetre, kancera pluća / pleure, kancera prostate, sarkoma, kancera kože i kancera materice. U nekim primerima izvođenja ovih postupaka, imuni poremećaj koji se leči je imuni poremećaj povezan sa bolešću odabranom iz grupe koja se sastoji od: amiloidoza, ankilozirajući spondilitis, astma, Crohnova bolest, dijabetes, odbacivanje transplantata, bolest transplantata prema domaćinu, Hashimotov tireoiditis, hemolitički uremički sindrom, bolest povezana sa HIV-om, eritematozni lupus, multipla skleroza, poliarteritis nodoza, poliartritis, psorijaza, psorijatični artritis, reumatoidni artritis, skleroderma, septički šok, Sjogrenov sindrom, ulcerozni kolitis i vascululit.
Upotreba bilo koje kompozicije materije predmetnog pronalaska za lečenje ili sprečavanje kancera, tumora, abnormalnosti rasta i/ili imunog poremećaja je u obimu predmetnog pronalaska. Među određenim realizacijama predmetnog pronalaska je ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska i/ili njegova farmaceutska kompozicija za lečenje ili prevenciju kancera, tumora, abnormalnosti rasta, imunog poremećaja i/ili mikrobne infekcije. Između određenih primera izvođenja predmetnog pronalaska je upotreba ćelijski ciljanog molekula predmetnog pronalaska i/ili njegove farmaceutske kompozicije u proizvodnji leka za lečenje ili sprečavanje kancera, tumora, abnormalnosti rasta, imunog poremećaja ili mikrobne infekcije.
Izvesni primeri izvođenja ćelijski ciljanog molekula predmetnog pronalaska mogu se koristiti za isporuku dodatnog egzogenog materijala u ćeliju fizički spojenu sa ekstraćelijskim ciljanim biomolekulom ćelijski ciljanog molekula predmetnog pronalaska. Pored toga, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za isporuku egzogenog materijala u unutrašnjost ćelije(a) koji sadrži kontakt sa ćelijama (in vitro ili in vivo), sa ćelijski ciljanim molekulima, farmaceutskom kompozicijom i/ili dijagnostičkim kompozicija predmetnog pronalaska.
Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje postupak za isporuku egzogenog materijala u unutrašnjost ćelije(a) kod pacijenta, pri čemu postupak obuhvata korak davanja pacijentu ćelijski ciljanog molekula predmetnog pronalaska (sa ili bez citotoksične aktivnosti) gde su ciljane ćelije fizički povezane sa ekstaćelijskim ciljanim biomolekulom ćelijski ciljanog molekula.
Među određenim primerima izvođenja predmetnog pronalaska je postupak isporuke u ćeliju T-ćelijskog epitopa koji može biti predstavljen ćelijskim molekulom MHC klase 1, postupak koji obuhvata korak kontakta ćelije sa ćelisjki ciljanim molekulom predmetnog pronalaska koji je povezan sa heterolognim T-ćelijskim epitopom i/ili njegovom kompozicijom (npr., farmaceutska ili dijagnostička kompozicija predmetnog pronalaska).
Između određenih primera izvođenja predmetnog pronalaska je postupak za "sejanje" lokusa tkiva u hordate, postupak koji obuhvata korak: davanja u hordat ćelisjki ciljanog molekula predmetnog pronalaska, farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska, i/ili dijagnostička kompozicija predmetnog pronalaska. U nekim daljim primerima izvođenja, postupci pronalaska za „sejanje“ lokusa tkiva su za „sejanje“ lokusa tkiva koji sadrži zloćudno, bolesno ili upaljeno tkivo. U nekim daljim primerima izvođenja, postupci pronalaska za „sejanje“ lokusa tkiva su za „sejanje“ lokusa tkiva koji sadrži tkivo izabrano iz grupe koja se sastoji od: obolelog tkiva, tumorske mase, karcinoma rasta, tumora, inficiranog tkiva, ili nenormalne ćelijske mase. U određenim daljim primerima izvođenja, postupci pronalaska za „sejanje“ lokusa tkiva obuhvataju primenu u hordate ćelisjki ciljanog molekula pronalaska, farmaceutske kompozicije pronalaska ili dijagnostičke kompozicije pronalaska koji sadrže heterologni, T - ćelijski epitop izabran iz grupe koja se sastoji od: peptida koji prirodno nisu predstavljeni ciljanim ćelijama ćelijsko ciljanog molekula u kompleksima MHC klase 1, peptida koji nisu prirodno prisutni u okviru bilo kog proteina iskazanog sa ciljanom ćelijom, peptida koji nisu izvorno prisutni u proteomu ciljane ćelije, peptidi koji nisu izvorno prisutni u ekstraćelijskom mikro okruženju mesta na koje se seje, i peptidi koji nisu izvorno prisutni u masi tumora ili na mestu zaraženih tkiva koje treba ciljati.
Upotreba bilo koje kompozicije od značaja predmetnog pronalaska za dijagnozu, prognozu i / ili karakterizaciju bolesti, poremećaja i / ili stanja je unutar obima predmetnog pronalaska. Između primera izvođenja predmetnog pronalaska je postupak upotrebe ćelijski ciljanog molekula predmetnog pronalaska koji sadrži agens za promociju detekcije i / ili kompoziciju pronalaska (npr., dijagnostička kompozicija) za prikupljanje informacija korisnih u dijagnozi, prognozi ili karakterizacija bolesti, poremećaja ili stanja. Među određenim primerima izvođenja predmetnog pronalaska je postupak detekcije ćelije (ili njenog podćelijskog odeljka) korišćenjem ćelijski ciljanog molekula i / ili dijagnostičke kompozicije predmetnog pronalaska, pri čemu postupak sadrži korake kontakta ćelije sa ćelijski ciljanim molekulom i / ili dijagnostičkom kompozicijom i detektovanje prisustva pomenutog ćelijski ciljanim molekulom i / ili dijagnostičke kompozicije. U nekim primerima izvođenja, korak kontakta sa ćelijama se događa in vitro. U nekim primerima izvođenja, korak kontaktiranja ćelije(a) događa se in vivo. U nekim primerima izvođenja, korak detekcije ćelije(a) događa se in vitro. U nekim primerima izvođenja, korak detekcije ćelije(a) događa se in vivo. U nekim daljim primerima izvođenja, metoda uključuje detekciju lokacije ćelijski ciljanog molekula u organizmu korišćenjem jednog ili više postupaka za slikanje nakon primene ćelijski ciljanog molekula u navedenom organizmu. Na primer, ćelijski ciljani molekuli pronalaska koji sadrže agense za podsticanje detekcije kao što je ovde opisano mogu se koristiti za opisivanje bolesti koja se mogu lečiti srodnim farmaceutskim kompozicijama predmetnog pronalaska. Na primer, određeni ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska i njihove kompozicije (npr., farmaceutske kompozicije i dijagnostičke kompozicije predmetnog pronalaska) i metode ovog pronalaska mogu se koristiti da se utvrdi da li pacijent pripada grupi koja reaguje na farmaceutsku kompoziciju predmetnog pronalaska. Na primer, određeni ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska i njihove kompozicije mogu se koristiti za identifikaciju ćelija koje predstavljaju isporučeni heterologni epitope-peptid na ćelijskoj površini i / ili za identifikovanje subjekata koji sadrže ćelije koji predstavljaju heterologni epitope-peptid isporučen od strane ćelijski ciljanog molekula predmetnog pronalaska.
Između određenih primera izvođenja predmetnog pronalaska je postupak proizvodnje molekula predmetnog pronalaska, pri čemu postupak obuhvata korak prečišćavanja molekula predmetnog pronalaska ili njegove polipeptidne komponente korišćenjem bakterijske interakcije proteina u ćelijskom zidu, kao što je, npr., protein L iz P. magnus ili derivata i njegovih vezujućih domenskih fragmenata. U određenim drugim primerima izvođenja, korak pročišćavanja postupka uključuje efektorski polipeptid Shiga toksina koji sadrži ili obuhvata u suštini od bilo kojeg od polipeptida prikazanih u SEQ ID NOs: 6-32 i 340-383. U određenim drugim primerima izvođenja, korak pročišćavanja postupka uključuje ćelijski ciljani molekul koji sadrži ili obuhvata u suštini od bilo kojeg od polipeptida prikazanih u SEQ ID NOs: 43-82 i 439-513.
Izvesni primeri izvođenja efektorskog polipeptida Shiga toksina predmetnog pronalaska mogu se koristiti kao imunogen ili kao komponenta imunogen za imunizaciju i / ili vakcinaciju hordata. Među određenim primerima izvođenja predmetnog pronalaska je postupak imunizacije hordata korišćenjem efektorskog polipeptida Shiga toksina predmetnog pronalaska, postupak koji obuhvata primenu hordata efektorskog polipeptida Shiga toksina pronalaska. U nekim daljim primerima izvođenja, efektorski polipeptid Shiga toksina sadrži ili se u osnovi sastoji od bilo kojeg od polipeptida prikazanih u SEQ ID NOs: 6-32 i 340-383.
Među određenim primerima izvođenja predmetnog pronalaska su setovi koji sadrže kompoziciju od značaja pronalaska i, opciono, uputstva za upotrebu, dodatni reagensi(e) i / ili farmaceutski uređaj(e) za isporuku. Komplet može dalje da sadrži reagense i druge alate za otkrivanje ćelijskog tipa (npr., ćeliju tumora) u uzorku ili subjektu.
Ove i druge karakteristike, aspekti i prednosti predmetnog pronalaska će se bolje razumeti u pogledu sledećeg opisa, dodatih zahteva i pratećih slika. Gore navedeni elementi pronalaska mogu se pojedinačno kombinovati ili uklanjati kako bi se napravili drugi primeri izvođenja pronalaska, bez ikakvih izjava o prigovoru takvoj sintezi ili uklanjanju u daljem tekstu.
KRATAK OPIS SLIKA
Slika 1 prikazuje kao primer, efektorske polipeptide Shiga toksin A Podjedinice predmetnog pronalaska (numerisan 1-5) i ćelisjki ciljane molekule koji sadrže iste (npr. "2/3" označava ili efektorski polipeptid Shiga toksina 2 ili 3). Prikazani uzorci molekula na Slici 1 su radi ilustracije nekih, opštih rasporeda strukturalnih karakteristika ograničenog seta primera izvođenja predmetnog pronalaska. Treba shvatiti da ovi primerni molekuli ne nameravaju niti ih treba tumačiti kao potpuno definisane u pogledu rasporeda bilo kojih strukturnih karakteristika i / ili komponenata molekula predmetnog pronalaska. Relativna veličina, lokacija ili broj karakteristika prikazanih na šemama Slike 1 su pojednostavljene. Na primer, relativni položaji ugrađenih, heteroloških epitopa i uništenih endogenih epitopskih regiona nisu fiksni. Slično tome, ukupan broj ugrađenih, heteroloških epitopa i uništenih endogenih epitopskih regiona nije fiksiran. Izvesni primeri izvođenja molekula predmetnog pronalaska sadrže mnoštvo uništenih, endogenih, epitopskih regiona u jednom, efektorskom polipeptidu Shiga toksina, kao što su, na primer, uništena četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, ili više regiona; pri čemu se ovi uništeni, endogeni, epitopski regioni mogu distribuirati preko efektorskog polipeptida Shiga toksina, uključujući uništenja koja se preklapaju ili su unutar furinski odcepljenog motiva karboksi krajnjeg regiona izvedenog regiona Shiga toksin A1 fragmenta (vidi Tabelu 8, infra). Izvesni primeri izvođenja predmetnog pronalaska obuhvataju uništenje endogenih, epitopnih regiona koji su karboksi krajnji do karboksi kraja Shiga toksina A1 fragmenta, ili njegov derivat, kao što su, npr., na poziciji karboksi kraja na bilo kom uništenom mestu furinski odcepljenog motiva. Šeme na Slici 1 nisu predviđene za tačno prikazivanje bilo kakvih informacija u vezi sa relativnim veličinama molekularnih struktura u bilo kom primeru izvođenja predmetnog pronalaska.
Slika 2 grafički prikazuje inhibicijsku aktivnost protein sintaze primernih ćelijski ciljanih molekula predmetnog pronalaska in vitro i u rasponu koncentracija. Za svaki molekul uzorka, luminescentni intenzitet luciferaze izražen tokom testa u relativnim luminiscentnim jedinicama (RLU) je crtan preko logaritma na osnovu 10 koncentracije ćelijski ciljanog molekula testiranog u pikomolaru. Ovi primerni ćelijski ciljani molekuli pokazali su inhibicijsku aktivnost ribozoma koja je uporediva sa „kontrolnim“ ćelijski ciljanim molekulom, čije komponente efektorskog polipeptida Shiga toksina se sastoje od divljeg soja fragmenta Shiga toksin A Podjedinice fragment osim što se sastoji od uništenog, furinski odcepljenog mesta na karboksi kraju njegovog regiona Shiga toksin A1 fragmenta (SLT-1A-FR (SEQ ID NO:5)). Slika 2 pokazuje da primerne izmene polipeptida Shiga toksin A Podjedinice, koja se javlja u prirodi, kao što su, npr., de-imunizirajuće supstitucije i ugrađeni, heterologni, epitopi T-ćelija, nisu značajno umanjile katalitičku aktivnost Shiga toksina.
Slike 3-7 i 9-10 grafički prikazuju da kao primer ćelijski ciljani molekuli predmetnog pronalaska SLT-1A-kombo(n)::scFv-(n) pokazuju ćelijski ciljanu citotoksičnost u poređenju sa "kontrolnim" ćelijski ciljanim molekulima SLT-1A-FR::scFv-(n), čija komponenta efektorskog polipeptida Shiga toksina sastoji od fragmenta divljeg soja Shiga toksin A Podjedinice osim što se sastoji od uništenog, furinski odcepljenog mesta na karboksi kraju njegovog regiona Shiga toksin A1 fragmenta (SLT-1A-FR (SEQ ID NO:5)). Procentualna održivost ciljanih pozitivnih ćelija za svaku vrstu ćelije iscrtana je preko logaritma na bazi 10 koncentracije ćelijski ciljanog molekula koja se daje odgovarajućim ćelijama.
1
Slika 3 grafički prikazuje da kao primer ćelijski ciljani molekuli SLT-1A-kombo7::scFv-1 (SEQ ID NO:44) pokazuju citotoksičnost na dva, različita ćelijska tipa u poređenju sa "kontrolnim" ćelijski ciljanim molekulom SLT-1A-FR::scFv-1 (SEQ IDNO:34).
Slika 4 grafički prikazuje da kao primer ćelijski ciljani molekuli SLT-1A-kombo7::scFv-1 (SEQ ID NO:44) pokazuju citotoksičnost na ciljani pozitivni ćelijski tip u poređenju sa "kontrolnim" ćelijski ciljanim molekulom SLT-1A-FR::SCFV-1 (SEQ ID NO:34). Specifičnost ćelijskog ciljana je pokazana korišćenjem iste analize sa ćelijskom linijom negativnom za ekspresiju ćelijske površine ciljanog biomolekula scFv-1. Na Slici 4 za ćelijsku liniju H, procenat vijabilnosti ciljanih negativnih ćelija je određen tokom logaritma na bazi 10 koncentracije ćelijski ciljanog molekula koja se daje odgovarajućim ćelijama. Slika 4 pokazuje da ćelijski ciljani molekul SLT-1A-kombo7::scFv-1 (SEQ ID NO:44) ne pokazuje citotoksičnost za ciljani negativni ćelijski tip pri testiranim koncentracijama.
Slika 5 grafički prikazuje da kao primer ćelijski ciljani molekuli SLT-1A-kombo10::scFv-1 (SEQ IDNO:47), SLT-1A-kombo16::scFv-1 (SEQ ID NO:52), i SLT-1A-kombo19::scFv-1 (SEQ IDNO:55) pokazuju citotoksičnost na dva, različita ćelijska tipa u poređenju sa "kontrolnim" ćelijski ciljanim molekulom SLT-1A-FR::scFv-1 (SEQ ID NO:34).
Slika 6 grafički prikazuje da kao primer ćelijski ciljani molekul SLT-1A-kombo17::scFv-1 (SEQ ID NO:53) prikazuje citotoksičnost na ćelijsku liniju A u poređenju sa "kontrolnim" ćelijski ciljanim molekulom SLT-1A-FR::scFv-1 (SEQ ID NO:34); pri čemu SLT-1A-kombo17::scFv-1 (SEQ ID NO:53) prikazuje oslabljenu citotoksičnost na ćelijskoj liniji B kada se poredi sa kontrolnom. Slika 6 pokazuje da ćelijski ciljani molekul SLT-1A-kombo18::scFv-1(SEQ ID NO:54) ne pokazuje citotoskičnost na oba ćelijska tipa pri koncentracijama višim od 100 nM. Rezultati citotoksičnosti iz ove analize za neciljani, sivlji soj Shiga toksin A1 fragmenta umesto ćelijski ciljanog molekula su takođe prikazani.
Slika 7 grafički prikazuje da kao primer ćelijski ciljani molekul SLT-1A-kombo2::scFv-2 (SEQ ID NO:58) prikazuje citotoksičnost na ćelijske linije B i G u poređenju sa "kontrolnim" ćelijski ciljanim molekulom SLT-1A-FR::scFv-2 (SEQ ID NO:35); pri čemu SLT-1A-kombo2::scFv-2 (SEQ ID NO:58) pokazuje blago oslabljenu citotoksičnost na ćelijskoj liniji A kada se poredi sa kontrolnom. Slika 7 pokazuje da ćelijski ciljani molekul SLT-1A-kombo13::scFv-2 (SEQ ID NO:62) pokazuje jako oslabljenu citotoskičnost na tri testirana ćelijska tipa kada se poredi sa kontrolnim.
2
Slika 8 grafički prikazuje da kao primer ćelijski ciljani molekuli predmetnog pronalaska scFv-3::SLT-1A-kombo5 (SEQ ID NO:64) i scFv-3::SLT-1A-kombo6 (SEQ ID NO:65) pokazuju ćelijski ciljanu citotoksičnost na dva, različita ćelijska tipa u poređenju sa "kontrolnim" ćelijski ciljanim molekulom scFv-3::SLT-1A-WT (SEQ ID NO:33), pri čemu komponenta Shiga toksin A Podjedinice jeste fragment divljeg soja Shiga toksin A Podjedinice. Procenat vijabilnosti ciljanih pozitivnih ćelija dva različita ćelijska tipa je bilo ucrtano kao logaritam na bazi 10 koncentracije ćelijski ciljanog molekula koja se daje odgovarajućim ćelijama. Za ćelijsku liniju B, oba scFv-3::SLT-1A-kombo5 (SEQ ID NO:64) i scFv-3::SLT-1A-kombo6 (SEQ ID NO:65) pokazuju jačinu citotoksičnosti kao što je izmereno sa CD50vrednostima nižim od ekvivalentnog nivoa kontrole. Specifičnost ćelijskog ciljana je pokazana korišćenjem iste analize sa ćelijskom linijom negativnom za ekspresiju ćelijske površine ciljanog biomolekula scFv-3. Na Slici 8 za ćelijsku liniju A, procenat vijabilnosti ciljanih negativnih ćelija je određen tokom logaritma na bazi 10 koncentracije ćelijski ciljanog molekula koja se daje odgovarajućim ćelijama. Slika 8 pokazuje da ćelijski ciljani molekuli scFv-3::SLT-1A-kombo5 (SEQ ID NO:64) i scFv-3::SLT-1A-kombo6 (SEQ ID NO:65) pokazuju neiskorišćenu citotoksičnost za ciljani negativni ćelijski tip u poređenju sa kontrolnim.
Slika 9 grafički prikazuje da kao primer ćelijski ciljani molekuli SLT-1A-kombo7::scFv-4 (SEQ ID NO:66) i SLT-1A-kombol4::scFv-4 (SEQ ID NO:67) pokazuju ćelijski ciljanu citotoksičnost na ciljani pozitivni ćelijski tip u poređenju sa "kontrolnim" ćelijski ciljanim molekulom SLT-1A-FR::scFv-4 (SEQ ID NO:36). Specifičnost ćelijskog ciljana je pokazana korišćenjem iste analize sa ćelijskom linijom negativnom za ekspresiju ćelijske površine ciljanog biomolekula scFv-4. Na Slici 9 za ćelijsku liniju E, procenat vijabilnosti ciljanih negativnih ćelija je određen tokom logaritma na bazi 10 koncentracije ćelijski ciljanog molekula koja se daje odgovarajućim ćelijama. Slika 9 pokazuje da ćelijski ciljani molekuli SLT-1A-kombo7::scFv-4 (SEQ ID NO:66) i SLT-1A-kombo14::scFv-4 (SEQ ID NO:67) pokazaju neiskorišćenu citotoksičnost za ciljani negativni ćelijski tip u poređenju sa kontrolnim.
Slika 10 grafički prikazuje da kao primer ćelijski ciljani molekul SLT-1A-kombo8::scFv-5 (SEQ ID NO:69) pokazuju ćelijski ciljanu citotoksičnost na ciljani pozitivni ćelijski tip u poređenju sa "kontrolnim" ćelijski ciljanim molekulom SLT-1A-FR::scFv-5 (SEQ ID NO:37). Ćelijski ciljani molekul SLT-1A-kombo9::scFv-5 (SEQ ID NO:70) pokazuje oslabljenu citotoksičnost na ovu ćelijsku liniju kada se poredi sa kontrolnom, a SLT-1A-kombo11::scFv-5 (SEQ ID NO:71) pokazuje jako nisku jačinu citotoksičnosti u poređenju sa kontrolnom.
Slike 11-12 grafički prikazuju aktivnost kaspaze indukovana kao primer ćelijski ciljanim molekulima predmetnog pronalaska SLT-1A-kombo(n)::scFv-1 kada se poredi sa "kontrolnim" ćelijski ciljanim molekulom SLT-1A-FR::scFv-(n), čija komponenta efektorskog polipeptida Shiga toksina se sastoji od fragmenta divljeg soja Shiga toksin A Podjedinice osim što se sastoji od uništenog, furinski odcepljenog mesta na karboksi kraju njegovog regiona Shiga toksin A1 fragmenta (SLT-1A-FR (SEQ ID NO:5)). Procenat aktivnosti kaspaze je iscrtan tokom logaritma na bazi 10 koncentracije ćelijski ciljanog molekula koja se daje odgovarajućim ćelijama. Slike 11-12 pokazuju da primerni, ćelijski ciljani molekuli SLT-1A-kombo7::scFv-1 (SEQ ID NO:44), SLT-1A-kombo14::scFv-1 (SEQ ID NO:50), i SLT-1A-kombo7::scFv-7 (SEQ ID NO:81) indukuju aktivnost kaspaze u poređenju sa kontrolnim ćelijski ciljanim molekulom za najmanje jednu testiranu ćelijsku liniju.
Slika 13 pokazuje relativnu antigenost kao primer ćelijske ciljane molekule predmetnog pronalaska i kontrolni ćelijski ciljani molekul Western blot analizom u uslovima denaturiranja koristeći tri, različita prepoznavanja antitela Shiga toksin A1 fragmenta. Slika 13 pokazuje slike višestrukih ponovljenih gelova i membrana. Prva traka sa oznakom "MW Marker" pokazuje obrazac migracije proteina molekulske težine, a približna veličina svake trake proteinske lestvice je označena sa kiloDaltonima (kDa). Učitani uzorci i niz u redovima numerisanim 1-4 su navedeni na legendi slike: #1) SLT-1A::kombo7::scFv-1 (SEQ ID NO:44); #2) SLT-1A-FR::SCFV-1 (SEQ ID NO:34); #3 SLT-1A::combo14::scFv-1 (SEQ ID NO:50); i SLT-1A::combo10::scFv-1 (SEQ ID NO:47). Gornji panel pokazuje slike Coomassie- obojeni replikativni gel; drugi panel (od vrha) pokazuju slike replicirane membrane sondirane sa Į-SLT-1A pAb1, treći panel (od vrha) pokazuju slike replicirane membrane sondirane sa Į-SLT-1A pAb2, i poslednji panel (od vrha) pokazuju slike replicirane membrane sondirane sa Į-StxA mAb1. Slika 13 pokazuje da primerni ćelijski ciljanih molekula SLT-1A kombo7::scFv-1 (SEQ ID NO:44), SLT-1A-kombo10::scFv-1 (SEQ ID NO:47), i SLT-1A-kombo14::scFv-1 (SEQ ID NO:50) svaki ima redukovani antigenost u ovoj analizi u poređenju sa referentnim molekulom SLT-1A-FR::scFv-1 (SEQ ID NO:34).
Slika 14 grafički pokazuje relativnu antigenost kao primer ćelijske ciljane molekule predmetnog pronalaska i kontrolni ćelijski ciljani molekul sa ELISA analizom koristeći dva, različita antitela koja prepoznaju Shiga toksin A1 fragmente. Normalizovani ELISA signal absorbance je prikazan grafički kao procenat kontrolnog molekula SLT-1A-FR::scFv-1 (SEQ ID NO:34). Slika 14 pokazuje da primerni ćelijski ciljani molekuli SLT-1A-kombo7::scFv-1 (SEQ ID NO:44), SLT-1A-kombo10::scFv-1 (SEQ ID NO:47), i SLT-1A-kombo14::scFv-1 (SEQ ID NO:50) svaki ima redukovani antigenost u ovoj analizi u poređenju sa kontrolnom.
4
Slike 15-16 grafički pokazuje relativnu imunogenost kao primer ćelijski ciljanih molekula predmetnog pronalaska izmerna iz seruma prikupljenih iz modela sisara i korišćenjem ELISA analiza u rastvoru da se u serumu svake životinje detektuje količina antitela koja prepoznaju administrirani izvedeni molekul Shiga toksin A Podjedinice. Referentni ćelijski ciljani molekuli korišćeni za relativno poređenje su SLT-1A-FR::scFv-(n), čija komponenta efektorskog polipeptida Shiga toksina se sastoji od furinski odcepljenog otpornog, efektorskog polipeptida Shiga toksina SLT-1A-FR (SEQ ID NO:5). Za svaku grupu životinja za lečenje kojoj je davan ćelijski ciljan molekul predmetnog pronalaska, procentualne vrednosti SLT-1A-FR::scFv-(n) referentnog molekula lečene grupe je izračunata deljenjem prosečnog ELISA signala iz svih subjekata u ćelijski ciljanom molekulu grupe koja se leči u datim vremenskim tačkama sa prosečnim ELISA signalom subjekata u SLT-1A-FR::scFv-(n) referentnoj grupi koja se leči. Procenat referentne vrednosti za svaku eksperimentalnu grupu za lečenje grafiran je na osi Y, a dan sakupljanja seruma je grafiran na X-osi. Simboli u Slikama 15-16 predstavljaju prosečan signal za pojedine subjekte u naznačenoj grupi, a trake grešaka označavaju standardnu grešku srednje vrednosti za subjekte u grupi u naznačenoj tački. Slike 15-16 prikazuju da primerni ćelijski ciljani molekuli SLT-1A-kombo1::scFv-1 (SEQ ID NO:43), SLT-1A-kombo7::scFv-1 (SEQ ID NO:44), SLT-1A-kombo10::scFv-1 (SEQ ID NO:47), SLT-1A-kombo12::scFv-1 (SEQ ID NO:49), SLT-1A-kombo15::scFv-1 (SEQ ID NO:51), SLT-1A-kombo16::scFv-1 (SEQ ID NO:52), SLT-1A-kombo19::scFv-1 (SEQ ID NO:55), SLT-1A-kombo10::scFv-2 (SEQ ID NO:61), i SLT-1A-kombo22::scFv-2 (SEQ ID NO:63) pokazuju redukovanu imunogenost u ovoj analizi u odnosu na odgovarajući, referentni molekul SLT-1A-FR::scFv-(n) ( SEQ ID NO:34 ili 35).
Slika 17 prikazuje otpornost furinskog odcepljena ćelijski ciljanog molekula SLT-1A-FR::scFv-9, koji sadrži efektorski polipeptid Shiga toksina koji sadrži uništeni furinski odcepljeni motiv, kada se poredi sa skoro, identičnim, citotoksičnim, ćelijski ciljanim molekulom koji sadrži divlji soj Shiga toksin A1 fragment sa divljim sojem furinski odcepljenim mestom (SLT-1A-WT::scFv-9). Slika 17 prikazuje Coomassie-bojenje, poliacrilamide gelom posle elektroforeze uzoraka proteina koji su tretirani sa ili pufernim, rekombinantnim, humanim furinom ili raznim negativnom kontrolnim stanjima. Trake gela su numerisane, a legenda slike prikazuje uslove prethodne obrade svakog uzorka ćelijski ciljanog molekula pre nanošenja uzorka u gel: temperatura u stepenima Celzijusa (°C), trajanje prethodne obrade u satima, i da li je dodat furin označavanjem količine dodanih jedinica aktivnosti furina (U) po mikrogramu (µg) ćelijski ciljanog molekula (označene sa "U/µg furin") ili "bez furina" za nulu dodanog furina U/µg. Prva traka sa oznakom "MW Marker" pokazuje obrazac migracije proteina molekulske težine, a približna veličina svake trake proteinske lestvice je označena sa kiloDaltonima (kDa). Slika legende označava koji je efektorski region Shiga toksina prisutan u svakom uzorku ćelijski ciljanog molekula po traci, bilo 1) divlji soj furin mesta (WT) ili 2) uništeni furin motiv (FR). Tretirani uzorci su podvrgnuti sa 0.5 furinske aktivacione jedinice po mikrogramu ćelijski ciljanog molekula (U/µg furin) na 30 °C 30 sati. Slika 17 pokazuje da je SLT-1A-FR::scFv-9 otporan na 0.5 furinsku aktivnu jedinicu po mikrogramu SLT-1A-FR::scFv-9 na 30° C.
Slika 18 grafički prikazuje specifično vezivanje kao primer ćelijski ciljanog molekula predmetnog pronalaska (SEQ ID NO:82) za ciljane pozitivne ćelije kada se poredi sa ciljanim negativnim ćelijama. Količina ćelijski ciljanog molekula koji se vezuje za ćelije je izračunata kao integrisani, srednji intenzitet fluorescencije (iMFI) i prikazan u odnosu na koncentraciju ćelijski ciljanog molekula. Podešavanje krive podataka je korišćeno za pravljenje linija za dva ispitana ciljana pozitivna ćelijska tipa.
Slika 19 grafički prikazuje promena opterećenja humanog tumora tokom vremena za grupe ispitanika u modelu ksenografta miševa nakon primanja primernog ćelijski ciljanog molekula predmetnog pronalaska ili kontrolnog uzorka namenjenog samo nosaču. Opterećenje tumora mereno kao bioluminescencija celog tela u fotonima / sekundi sakupljano je u zavisnosti od vremena (danima posle tumorskog implanta). Primena ćelijski ciljanog molekula SLT1-A-kombo7::ĮCD38-scFv-1 (SEQ ID NO:82) sprečava porast opterećenja tumora primećen samo za kontrolnu grupu nosača.
DETALJAN OPIS
Predmetni pronalazak je opisan detaljnije u daljem tekstu pomoću ilustrativnih, neograničavajućih primera izvođenja i referenci pratećih slika. Ovaj pronalazak se, međutim, može izvesti u više različitih oblika i ne treba ga tumačiti da je na set primera izvođenja koji su u nastavku navedeni. Umesto toga, ovi primeri izvođenja su data tako da je ovo otkriće temeljno i prenosi obim pronalaska onima koji poznaju ovo područje.
Da bi se predmetni pronalazak mogao lakše razumeti, određeni pojmovi su definisani u daljem tekstu. Dodatne definicije mogu se naći u detaljnom opisu pronalaska.
Kao što je korišćeno u opisu i priloženim zahtevima, izrazi "a", "a" i "the" uključuju i jednine i množinu, osim ako kontekst jasno ne diktira drugačije.
Kao što je korišćeno u opisu i priloženim zahtevima, izraz "i/ili" kada se odnosi na dve vrste, A i B, označava najmanje jednu od A i B. Kako se koristi u opisu i priloženim zahtevima, izraz "i/ili" kada se odnosi na više od dve vrste , kao što su A, B i C, znači najmanje jedan od A, B ili C, ili bar jednu od bilo koje kombinacije A, B ili C (sa svakom vrstom u pojedinačnoj ili višestrukoj mogućnosti).
Kroz ovaj opis, reč "obuhvata" ili varijacije poput "sadrži" ili "koji sadrži" podrazumevaće uključivanje navedenog celog broja (ili komponenti) ili grupe celih brojeva (ili komponenti), ali ne i isključenje bilo koji drugi celi broj (ili komponente) ili grupu celih brojeva (ili komponenti).
Kroz ovaj opis, termin "uključujući" se koristi da znači "uključuje, ali nije ograničen na".
"Uključujući" i "uključujući, ali ne ograničavajući se na njih" koriste se naizmenično.
Izraz "amino kiselinski ostatak" ili "amino kiselina" uključuje referencu na amino kiselinu koja je ugrađena u protein, polipeptid ili peptid. Izraz "polipeptid" uključuje bilo koji polimer amino kiselina ili amino kiselinskih ostataka. Izraz "polipeptidna sekvenca" odnosi se na niz amino kiselina ili amino kiselinskih ostataka koji fizički sadrže polipeptid. "Protein" je makromolekul koji sadrži jedan ili više polipeptida ili polipeptidnih lanaca. "Peptid" je mali polipeptid veličine manje od oko 15 do 20 amino kiselinskih ostataka. Izraz "amino kiselinska sekvenca" odnosi se na niz amino kiselina ili amino kiselinskih ostataka koji fizički sadrže peptid ili polipeptid u zavisnosti od dužine. Ako nije drugačije naznačeno, ovde opisane polipeptidne i proteinske sekvence su napisane se levo na desno, predstavljajući njihov redosled od amino kraja do karboksi kraja.
Izrazi "amino kiselina", "amino kiselinski ostatak", "amino kiselinska sekvenca" ili polipeptidna sekvenca uključuju amino kiseline koje se javljaju u prirodi (uključujući L i D izosteriomere) i, ako nije drugačije ograničeno, uključuju i poznate analoge prirodnih amino kiselina koje mogu funkcionišu na sličan način kao i prirodne amino kiseline, kao što su selenocistein, pirolizin, Af-formilmetionin, gama-karboksiglutamat, hidroksiprolinhipusin, piroglutaminska kiselina i selenometionin. Amino kiseline koje su ovde navedene su opisane skraćenim oznakama, kao što sledi u Tabeli A:
TABELA A. Amino Kiselinska Nomenklatura
Fraza "konzervativna supstitucija" u vezi sa amino kiselinskim ostatkom peptida, peptidnog regiona, polipeptidnog regiona, proteina ili molekula odnosi se na promenu amino kiselinskog sastava peptida, peptidnog regiona, polipeptidnog regiona, proteina ili molekula koji ne menja suštinski funkciju i strukturu celokupnog peptida, peptidnog regiona, polipeptidnog regiona, proteina ili molekula (videti Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W. H. Freeman and Company, New York (2. izdanje, 1992))).
Za svrhu predmetnog pronalaska, fraza "izveden iz" kada se odnosi na polipeptid ili polipeptidni region znači da polipeptidni ili polipeptidni region sadrži sekvence amino kiselina koje su prvobitno pronađene u "roditeljskom" proteinu i koje sada mogu da sadrže određene amino kiselinske ostatke, brisanja, skraćenja, preuređenja ili druge izmene u odnosu na izvorni polipeptid ili polipeptidni region sve dok se određena funkcija(e) i struktura(e) "roditeljskog" molekula značajno očuvaju. Iskusni radnik će moći da identifikuje roditeljski molekul iz kojeg je izveden polipeptid ili polipeptidni region koristeći tehnike poznate u struci, npr. softver za podešavanje sekvenci proteina.
U svrhe prijavljenog pronalaska i u vezi sa polipeptidnom sekvencom Shiga toksina ili izvedenog polipeptida Shiga toksina, izraz "divlji soj" uopšteno se odnosi na proteinske sekvence Shiga toksina koji se nalaze u prirodi, kao što su, npr., patogena bakterija, gde je ova proteinska(e) sekvenca(e) Shiga toksina jedna od varijanti koje se najčešće javljaju. To je za razliku od retko prisutnih proteinskih sekvenci Shiga toksina koji se, iako se još uvek javljaju, nalaze u manje od jednog procenta pojedinačnih organizama određene vrste prilikom uzorkovanja statistički moćnijeg broja pojedinačnih organizama te vrste koji sadrže najmanje jednu varijantu proteina Shiga toksina. Klonsko širenje prirodnog izolata izvan njegovog prirodnog okruženja (bez obzira da li je izolat organizam ili molekul koji sadrži informacije o biološkoj sekvenci) ne menja prirodne potrebe sve dok klonska ekspanzija ne uvodi novu raznolikost sekvence koja nije prisutna u prirodi populacije te vrste i/ili ne menja relativne proporcije varijanti sekvence jedna drugoj.
Izrazi „povezani“, „udruženi“, „povezani“ ili „koji povezuju“ u odnosu na zahtevani pronalazak se odnose na stanje dve ili više komponenti molekula koji su spojeni, vezani, povezani ili na neki drugi način povezani zajedno da formiraju jedinstven molekul ili čin stvaranja dva molekula povezana jedan sa drugim da formiraju jedan molekul stvaranjem asocijacije, veze, vezanosti i/ili bilo koje druge veze između dva molekula. Na primer, izraz "povezan" može se odnositi na dve ili više komponenti povezane jednim ili više atomskih interakcija tako da se formira jedan molekul i gde atomske interakcije mogu biti kovalentne i/ili nekovalentne.
Neograničavajući primeri kovalentnih veza između dve komponente uključuju peptidne veze i cistein-cistein disulfidne veze. Neograničavajući primeri nekovalentnih veza između dve molekularne komponente uključuju jonske veze.
Za svrhu predmetnog pronalaska, termin "povezan" odnosi se na dve ili više molekularnih komponenti povezani jednim ili više atomskih interakcija tako da se formira jedan molekul i gde atomske interakcije uključuju najmanje jednu kovalentnu vezu. Za svrhu predmetnog pronalaska, termin "povezivanje" odnosi se na čin stvaranja povezanog molekula kako je gore opisano.
Za svrhu predmetnog pronalaska, izraz "spojen" se odnosi na dve ili više proteinastih komponenti povezane najmanje jednom kovalentnom vezom koja je peptidna veza, bez obzira da li peptidna veza uključuje učešće atoma ugljenika grupe karboksilne kiseline ili uključuje drugi atom ugljenika, kao što je, npr., α-ugljenik, β-ugljenik, γ-ugljenik, δ-ugljenik, itd. Neograničavajući primeri dve komponente proteina, spojene zajedno, uključuju, npr., amino kiselinu, peptid ili polipeptid kondenzovan sa polipeptidom preko peptidne veze tako da je rezultovani molekul jedan, kontinuirani polipeptid. Za svrhe predmetnog pronalaska, izraz "spojen" se odnosi na čin stvaranja spojenog molekula kao što je opisano gore, kao što je, npr., spojeni protein generisan iz rekombinantnog spojenog genetskog regiona koji, kada je preveden, proizvodi jedan molekul proteina.
Simbol "::" označava polipeptidne regione pre i posle kada su fizički povezani zajedno da formiraju kontinuirani polipeptid.
Kao što je korišćeno ovde, izrazi "izražen", "koji izražava" ili "izražava", kao i njene gramatičke varijante, odnose se na prevođenje polinukleotida ili nukleinske kiseline u protein. Izraženi protein može ostati intraćelijski, postati komponenta ćelijske površinske membrane ili se izlučiti u ekstraćelijski prostor.
Kao što je ovde korišćeno, ćelije koje izražavaju značajnu količinu ekstraćelijskog ciljanog biomolekula najmanje jedne ćelijske površine su „ciljane pozitivne ćelije“ ili „ciljana ćelije“ i ćelije su fizički povezane sa navedenim, ekstraćelijskim ciljanim biomolekulom.
Kao što je ovde korišćeno, simbol "Į" je skraćenica za vezujući region imunoglobulinskog tipa koji je sposoban da se veže za biomolekul prateći simbol. Simbol "Į" je korišćen za označavanje funkcionalnih karakteristika vezujućeg regiona imunoglobulinskog tipa zasnovan na svojoj sposobnosti da se veže za biomolekul prateći simbol sa afinitetom vezanja opisanim sa konstantom disocijacije (KD) od 10<-5>ili manje.
Kao što je ovde korišćeno, izraz varijabilni domen teškog lanca (VH)" ili "varijabilni domen lakog lanca (VL)" respektivno se odnosi na bilo koje antitelo VHili VLdomena (npr. humani VHili VLdomen) kao i bilo koji njegov derivat koji zadržava najmanje sposobnost kvalitativnog antigenskog vezivanja odgovarajućeg prirodnog antitela (npr. humanizovani VHili VLdomen izveden iz prirodnog murinskog VHil VLdomena). VHili VLdomen sastoji se od "okvira" regiona i prekinut sa tri CDRs ili ABRs. Okviri regiona služe da se poravna CDRs ili ABRs za specifično vezivanje za epitop antigena. Od amino kraja do karboksi kraja, oba VHi VLdomena obuhvataju sledeći okvir (FR) i CDR regiona ili ABR regiona: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, i FR4; ili, slično, FR1, ABR1, FR2, ABR2, FR3, ABR3, i FR4. Kao što je ovde korišćeno, izrazi "HCDR1," "HCDR2," ili "HCDR3" se koriste za upućivanje na CDRs 1, 2, ili 3, respektivno, u VHdomenu, a izrazi "LCDR1," "LCDR2," i "LCDR3" se koriste za upućivanje na CDRs 1, 2, ili 3, respektivno, u VLdomenu. Kao što je korišćeno ovde, izrazi "HABR1," "HABR2," ili "HABR3" se koriste za upućivanje na ABRs 1, 2, ili 3, respektivno, u VHdomenu, a izrazi "LABR1," "LABR2," ili "LABR3" se koriste za upućivanje na CDRs 1, 2, ili 3, respektivno, u VLdomenu. Za zahtevane VHH fragmente, IgNARs hrskave ribe, VNARfragmente, određene pojedinačne domene antitela, i njihove derivate, postoji pojedinačni, varijabilni domen teškog lanca koji sadrži isti osnovi raspored: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, i FR4. Kao što je korišćeno ovde, izrazi "HCDR1," "HCDR2," ili "HCDR3" mogu da se koristite za upućivanje na CDRs 1, 2, ili 3, respektivno, u pojedinačnom varijabilnom domenu teškog lanca.
Za svrhu predmetnog pronalaska, izraz "efektor" znači obezbeđivanje biološke aktivnosti, kao što je citotoksičnost, biološka signalizacija, enzimska kataliza, podćelijsko usmeravanje i/ili međumolekularno vezivanje što rezultira alosternim efektima i/ili regrutovanjem jednog ili više faktora.
Za svrhu predmetnog pronalaska, fraze "efektorski polipeptid Shiga toksina," "region efektorskog polipeptida Shiga toksina," i "efektorski region Shiga toksina" odnose se na polipeptid ili polipeptidni region izveden iz najmanje jedne Shiga toksin A Podjedinice člana familije Shiga toksina pri čemu polipeptid ili peolipeptidni region je sposoban da pokaže najmanje jednu funkciju Shiga toksina. Na primer, SEQ ID NOs: 8, 11-27, 29-32, 348, 356-358, 363, 370-371, 373, 378-438 su izvedene iz StxA i SLT-1A.
Za svrhu predmetnog pronalaska, efektorska funkcija Shiga toksina je biološka aktivnost koju prenosi polipeptidni region izveden iz Shiga toksin A Podjedinice. Neograničavajući primeri efektorskih funkcija Shiga toksina uključuju promovisanje unosa ćelija; deformaciju membrane lipida; promociju ćelijske internalizacije; stimulacija endocitoze posredovane klatrinom; usmeravanje intraćelijskog usmeravanja na različite intraćelijske pregrade kao što su, npr., Golgi, endoplasmatični retikulum, i citozol; usmeravanje intraćelijske rute sa teretom; inhibiranje funkcije(a) ribozoma; katalitičke aktivnosti, kao što su, npr., N-glikozidazna aktivnost i katalitički inhibirajući ribozomi; smanjuje sintezu proteina, indukuje kaspaznu aktivnost, aktivira efektorske kaspaze, pojačava citostatičke efekte i citotoksičnost. Katalitičke aktivnosti Shiga toksina uključuju, na primer, inaktivaciju ribozoma, inhibiciju sinteze proteina, aktivnost N-glikozidaze, polinukleotid: aktivnost adenozin glikozidaze, aktivnost RNKaze, i aktivnost DNKaze. Shiga toksini su ribozom inaktivirajući proteini (RIPs). RIPs mogu odvajati nukleinske kiseline, polinukleozide, polinukleotide, rRNK, ssDNK, dsDNK, mRNK (i poli A), i virusne nukleinske kiseline (videti npr., Barbieri L et al., Biochem J 286: 1-4 (1992); Barbieri L et al., Nature 372: 624 (1994); Ling J et al., FEBS Lett 345: 143-6 (1994); Barbieri L et al., Biochem J 319: 507-13 (1996); Roncuzzi L, Gasperi-Campani A, FEBS Lett 392: 16-20 (1996); Stirpe F et al., FEBS Lett 382: 309-12 (1996); Barbieri L et al., Nucleic Acids Res 25: 518-22 (1997); Wang P, Turner N, Nucleic Acids Res 27: 1900-5 (1999); Barbieri L et al., Biochim Biophys Acta 1480: 258-66 (2000); Barbieri L et al., J Biochem 128: 883-9 (2000); Brigotti M et al., Toxicon 39: 341-8 (2001); Brigotti M et al., FASEB J 16: 365-72 (2002); Bagga S et al., J Biol Chem 278: 4813-20 (2003); Picard D et
1
al., J Biol Chem 280: 20069-75 (2005)). Neki RIP-ovi pokazuju antivirusnu aktivnost i aktivnost superoksid dismutaze (Erice A et al., Antimicrob Agents Chemother 37: 835-8 (1993); Au T et al., FEBS Lett 471: 169-72 (2000); Parikh B, Turner N, Mini Rev Med Chem 4: 523-43 (2004); Sharma N et al., Plant Physiol 134: 171-81 (2004)). Katalitičke aktivnosti Shiga toksina su posmatrane i in vitro i in vivo. Neograničavajući primeri ispitivanja za Shiga toksin efektorsku aktivnost mere razne aktivnosti, kao što je, npr., inhibitorna aktivnost sinteze proteina, aktivnost depurinacije, inhibicija rasta ćelije, citotoksičnost, aktivnost relaksacije super namotane DNK i nuklearna aktivnost.
Kao što je korišćeno ovde, zadržavanje efektorske funkcije Shiga toksina odnosi se na to da može da pokaže nivo funkcionalne aktivnosti Shiga toksina, mereno odgovarajućim kvantitativnim testom reproduktivnosti, uporedivim sa kontrolom efektorskog polipeptida divljeg soja Shiga toksina, (npr. fragment Shiga toksina A1 ) ili ćelijski ciljanog molekula koji sadrži efektorksi polipeptid divljeg soja Shiga toksina (npr. fragment Shiga toksina A1) pod istim uslovima. Za efektorsku funkciju Shiga toksina inaktivacija ribozoma ili inhibicija ribozoma, zadržana funkcija Shiga toksina pokazuje IC50od 10,000 pM ili manje u in vitro okruženju, kao što je, npr., korišćenjem analize poznate stručnjaku i/ili koja je ovde opisana. Za citotoksičnost efektorske funkcije Shiga toksina u analizi ciljanog pozitivnog ubijanja ćelije, zadržana efektorska funkcija Shiga toksina pokazuje CD50od 1,000 nM ili manje, u zavisnosti od ćelijskog tipa i njegove ekspresije odgovarajućeg ekstraćelijskog ciljanog biomolekula, kao što je prikazano, npr., korišćenjem analize koja je poznata stručnjaku i/ili koja je ovde opisana.
Za potrebe zahtevanog pronalaska, izraz "ekvivalent" u pogledu inhibicije ribozoma označava empirijski izmeren nivo inhibicije aktivnosti ribozoma, mereno odgovarajućim kvantitativnim testom sa obnovljivošću, koji se može reproducirati unutar 10% ili manje od aktivnosti referentnog molekula (npr. drugi ćelijski ciljani molekul ili treći ćelijski ciljani molekul) pod istim uslovima.
Za potrebe zahtevanog pronalaska, izraz "ekvivalent" u pogledu citotoksičnosti označava empirijski izmeren nivo citotoksičnosti, merena odgovarajućim kvantitativnim testom sa obnovljivošću, koji se može reproducirati unutar 10% ili manje od aktivnosti referentnog molekula (npr. drugi ćelijski ciljani molekul ili treći ćelijski ciljani molekul) pod istim uslovima.
2
Kao što je korišćeno ovde, izraz "oslabljen" u pogledu citotoksičnosti znači da molekul pokazuje ili pokazuje CD50između 10-puta do 100-puta CD50izloženi referentnim molekulom pod istim uslovima.
Netačne IC50i CD50vrednosti ne treba uzimati u obzir pri određivanju nivoa aktivnosti efektorske funkcije Shiga toksina. Za neke uzorke, tačne vrednosti za ili IC50ili CD50mogu biti nedostižne zbog nemogućnosti sakupljanja potrebnih tačaka podataka za tačno uklapanje krive. Na primer, teoretski, ni IC50ni CD50se ne mogu utvrditi ako se ne dogodi više od 50% inhibicije ribozoma ili ćelijske smrti u nizu koncentracija za dati uzorak. Podaci nedovoljni za tačno podešavanje krive kao što je opisano u analizi podataka iz primerskih analiza efektorske funkcije Shiga toksina, kao što su, na primer, analize opisane u nižim primerima, ne treba smatrati reprezentativnim za stvarnu efektorsku funkciju Shiga toksina.
Neuspeh u otkrivanju aktivnosti efektorske funkcije Shiga toksina može biti posledica nepravilne ekspresije, savijanja polipeptida i/ili stabilnosti proteina, a ne nedostatak ulaska u ćeliju, podćelijskog usmeravanja i/ili enzimske aktivnosti. Analize za efektorske funkcije Shiga toksina mogu da ne zahtevaju mnogo polipeptida pronalaska da bi merili značajne količine aktivnosti efektorske funkcije Shiga toksina. U meri u kojoj je osnovni uzrok slaba ili nikakva efektorska funkcija empirijski je određena da bi se odnosio na ekspresiju ili stabilnost proteina, stručnjak može da nadoknadi takve faktore korišćenjem hemije proteina i tehnika molekularnog inženjeringa koje su poznate u tehnici, tako da se aktivnost efektorske funkcije Shiga toksina može obnoviti i meriti. Kao primeri, nepravilna ekspresija zasnovana na ćelijama može se nadoknaditi korišćenjem različitih sekvenci za kontrolu ekspresije; i nepravilno savijanje polipeptida i/ili stabilnost mogu imati koristi od stabilizacije terminalnih sekvenci ili kompenzacijskih mutacija u ne-efektorskim regionima koji stabilišu trodimenzionalnu strukturu molekula.
Neke efektorske funkcije Shiga toksina nisu lako merljive, npr., funkcije podćelijskog usmeravanja. Na primer, ne postoji rutinska, kvantitativna analiza koja bi razlikovala da li je neuspeh efektorskog polipeptida Shiga toksina da bude citotoksičan i/ili isporučuje heterologni epitop posledica nepravilnog podćelijskog usmeravanja, ali u trenutku kada su dostupni testovi, tada se efektorski polipeptidi Shiga toksina mogu analizirati na bilo koji značajan nivo podćelijske putanje u poređenju sa odgovarajućim efektorskim polipeptidom divljeg soja Shiga toksina. Međutim, ako komponenta efektorskog polipeptida Shiga toksina ćelijski ciljanog molekula predmetnog pronalasku pokazuje citotoksičnost uporedivu ili ekvivalentnu konstrukciji divljeg soja Shiga toksina Podjedinice A, tada se zaključuje da je nivo aktivnosti podćelijskog rutiranja uporediv ili ekvivalentan, respektivno, do nivoa aktivnosti podćelijskog usmeravanja konstrukcije divljeg soja Shiga toksina Podjedinice A, barem pod testiranim uslovima.
Kada novi testovi za pojedine funkcije Shiga toksina postanu dostupni, efektorski polipeptidi Shiga toksina i/ili ćelijski ciljanog molekula koji sadrži efektorski polipeptid Shiga toksina mogu se analizirati za bilo koji nivo tih efektorskih funkcija Shiga toksina, kao što je unutar 1000-puta ili 100 -puta ili manja aktivnost efektorskog polipeptida divljeg soja Shiga toksina ili koji pokazuju 3-puta do 30-puta veću ili veću aktivnost u poređenju sa funkcionalnim nokautom, efektorskog polipeptida Shiga toksina.
Dovoljno podćelijsko usmeravanje može se tek utvrditi posmatranjem nivoa citotoksične aktivnosti molekula u testovima citotoksičnosti, kao što su, na primer, testovi citotoksičnosti zasnovani na prezentaciji epitopa T-ćelija ili na osnovu efektorske funkcije toksina koji uključuje citozolni i/ili endoplazmatični retikulum, lokalizovan, ciljni supstrat.
Kao što je korišćeno ovde, zadržavanje "značajne" efektorske funkcije Shiga toksin odnosi se na nivo funkcionalne aktivnosti Shiga toksina, kao što je izmereno sa odgovarajućom kvantitativnom analizom sa reproduktivnosti koja je uporediva sa kontrolnim efektorskim polipeptidom divljeg soja Shiga toksina (npr. fragment Shiga toksina A1). Za in vitro inhibiciju ribozoma, značajna efektorska funkcija Shiga toksina pokazuje IC50od 300 pM ili manje u zavisnosti od izvora ribozoma korišćenih u analizi (npr. baterijski, arhealni ili eukariotski izvor (alge, gljivice, biljke ili životinje)). Ovo je značajno veća inhibicija kada se poredi sa približno IC50od 100,000 pM za katalitički prekinuti SLT-1A 1-251 dvostruki mutant (Y77S/E167D). Za citotoksičnost u analizi ubijanja ciljane pozitivne ćelije u laboratorijskog ćelijskoj kulturi, značajna efektorska funkcija Shiga pokazuje CD50od 100, 50, 30 nM, ili manje, u zavisnosti od ciljanog(ih) biomolekula(a) vezujućeg regiona i ćelijskog tipa, naročito ekspresije ćelijskog tipa i/ili reprezentacija ćelijske površine odgovarajućeg(ih) ekstraćelijskog(ih) ciljanog(ih) biomolekula(a) i/ili ekstraćelijskog epitopa(i) koji je ciljan molekulom koji se procenjuje. Ovo je značajno veća citotoksičnost u odnosu na odgovarajuću, ciljanu pozitivnu ćelijsku populaciju u poređenju sa samom Shiga toksin A Podjedinicom (ili fragmentom divljeg soja Shiga toksin A1), bez ćelijski ciljanog vezujućeg regiona, koji ima CD50od 100-10,000 nM, u zavisnosti od ćelijske linije.
Za svrhe predmetnog pronalaska i u pogledu na efektorsku funkciju Shiga toksina molekula predmetnog pronalaska, izraz "razumna aktivnost" odnosi se na ispoljavanje bar umerenog
4
nivoa (npr. unutar 11 -puta do 1,000 -puta) efektorske aktivnosti Shiga toksina kako je ovde definisano u odnosu na molekul koji sadrži prirodni Shiga toksin, gde je efektorska aktivnost Shiga toksina izabrana između grupe koja se sastoji od: efikasnosti internalizacije, efikasnosti podćelijskog usmeravanja prema citozolu, prezentaciji epitopa pomoću ciljane ćelije, inhibiciji ribozoma i citotoksičnosti. Što se tiče citotoksičnosti, razuman nivo efektorske aktivnosti Shiga toksina uključuje da bude unutar 1,000 -puta konstrukcije divljeg soja Shiga toksina, kao što je, npr., izlaganje CD50od 500 nM ili manje kada konstrukcija divljeg soja Shiga toksina pokazuje CD50od 0.5 nM (npr. ćelijski ciljani molekul koji sadrži fragment divljeg soja Shiga toksina A1).
Za svrhe predmetnog pronalaska i u pogledu na citotoksičnost molekula predmetnog pronalaska, izraz "optimalan" se odnosi na nivo katalitičkog domena Shiga toksina posredovane citotoksičnosti koja je unutar 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 -puta citotoksičnosti molekula koji sadrži fragment divljeg soja Shiga toksina A1 (npr. Shiga toksin A Podjedinica ili njegove skraćene varijante) i/ili Shiga toksin koji se javlja u prirodi.
Treba napomenuti da čak i ako je citotoksičnost efektorskog polipeptida Shiga toksina smanjena u odnosu na divlji soj Shiga toksina A Podjedinice ili njegov fragment, u praksi aplikacije koje koriste oslabljene, efektorske polipeptide Shiga toksina mogu biti podjednako ili efikasnije od korišćenja efektorskog polipeptida divljeg soja Shiga toksina zbog toga što najviše moguće varijante mogu pokazati nepoželjne efekte koji su minimizirani ili smanjeni u varijantama smanjene citotoksične potencije. Shiga toksini divljeg soja su veoma moćni i sposobni su da ubiju intoksiciranu ćeliju nakon što samo jedan molekul toksina dođe do citozola intoksicirane ćelije ili možda nakon što je samo četrdeset molekula toksina integrisano u intoksiciranu ćeliju. Efektorski polipeptid Shiga toksina sa čak znatno smanjenim efektorskim funkcijama Shiga toksina, kao što su, na primer, podćelijsko usmeravanje ili citotoksičnost, u poređenju sa efektorskim polipeptidima divljeg soja Shiga toksina, mogu i dalje biti dovoljno jaki za praktične primene, kao što su, npr., primene koje uključuju ciljane ćelije koja se ubija, izdavanje heterolognih epitopa i/ili detekcija specifičnih ćelija i njihovih ćelija. Pored toga, određeni efektorski polipeptidi Shiga toksina sa smanjenom aktivnošću mogu biti posebno korisni za isporuku tereta (npr. dodatni egzogeni materijal ili T-ćelijski epitop) do određenih intraćelijskih mesta ili podćelijskih odeljaka ciljanih ćelija.
Izraz "selektivna citotoksičnost" u pogledu citotoksične aktivnosti molekula odnosi se na relativni nivo citotoksičnosti između populacije biomolekula ciljane pozitivne ćelije (npr. ciljani ćelijski tip) i neciljane populacije ćelija koje prolaze (npr. biomolekul ciljanog negativnog ćelijskog tipa), koji se može izraziti kao odnos polovine maksimalne citotoksične koncentracije (CD50) za ciljani ćelijski tip prema CD50za neciljani ćelijski tip kako bi se obezbedila metrična citotoksična selektivnost ili indikacija preferencijalnosti ubijanja ciljane ćelije u odnosu na neosetljivu ćeliju.
Reprezentacija ćelijske površine i/ili gustina date ekstraćelijskog ciljanog biomolekula (ili ekstraćelijski epitop datog ciljanog biomolekula) mogu uticati na primene u kojima se mogu pogodno koristiti određeni ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska. Razlike u zastupljenosti ćelijske površine i/ili gustine datog ciljanog biomolekula između ćelija mogu izmeniti, kvantitativno i kvalitativno, efikasnost ćelijske internalizacije i/ili potencijala citotoksičnosti datog ćelijski ciljanog molekula predmetnog pronalaska. Reprezentacija ćelijske površine i/ili gustine datog ciljanog biomolekula može se uvelike razlikovati između biomolekula pozitivnih ćelija ili čak na istoj ćeliji u različitim tačkama ćelijskog ciklusa ili diferencijacije ćelija. Ukupni prikaz ćelijske površine datog ciljanog biomolekula i/ili određenih ekstraćelijskih epitopa datog ciljanog biomolekula na određenoj ćeliji ili populaciji ćelija može se odrediti metodama poznatim stručnjacima, kao što su metode koje uključuju sortiranje ćelija aktivirane fluorescencijom (FACS) protočna citometrija.
Kao što je korišćeno ovde, izrazi "uništeni," "uništavanje," ili "koji uništava," i njegove gramatičke varijante, u pogledu na polipeptidni region ili karakteristiku unutar polipeptida se odnosi na promene najmanje jedne amino kiseline unutar regiona ili sastavljanje uništene karakteristike. Promene amino kiselina uključuju različite mutacije, kao što su, npr., delecija, inverzija, ubacivanje ili supstitucija koje menjaju amino kiselinsku sekvencu polipeptida. Promene amino kiselina takođe uključuju hemijske promene, kao što su, npr., promena jednog ili više atoma u funkcionalnoj grupi amino kiselina ili dodavanje jednog ili više atoma funkcionalnoj grupi amino kiselina.
Kao što je korišćeno ovde, "de-imunizovan" znači smanjeni antigenski i/ili imunogenski potencijal nakon davanja hordatu u poređenju sa referentnim molekulom, kao što je, npr., peptidni region divljeg soja, polipeptidni region ili polipeptid. Ovo uključuje smanjenje ukupnog antigenskog i/ili imunogenskog potencijala uprkos unošenju jednog ili više, de novo, antigenskih i/ili imunogenskih epitopa u poređenju sa referentnim molekulom. U nekim primerima izvođenja, "de-imunizovan" znači molekul koji pokazuje smanjenu antigenost i/ili imunogenost posle primene na sisara u poređenju sa "roditeljskim" molekulom iz koga je dobijen, kao što je, npr., divlji soj Shiga toksina A1 fragmenta. U nekim primerima izvođenja, de-imunizovani efektorski polipeptid Shiga toksina predmetnog pronalaska može da pokaže relativnu antigenost u poređenju sa referentnim molekulom koji je smanjen za 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% , 70%, 80%, 90% ili više od antigenosti referentnog molekula pod istim uslovima merenim istim testom, kao što je, npr., test poznat stručnjaku i/ili ovde opisan kao kvantitativna ELISA ili Western blot analiza. U određenim primerima izvođenja, deimunizovani efektorski polipeptid Shiga toksina predmetnog pronalaska može da pokaže relativnu imunogenost u poređenju sa referentnim molekulom koja je smanjena za 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% , 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 99% ili više od imunogenosti referentnog molekula pod istim uslovima merenim istim testom, kao što je, npr., test poznat stručnjaku i/ili ovde opisani kao kvantitativno merenje antitela za antitela proizvedena kod sisara(a) posle primanja parenteralne primene molekula u datoj tački.283
Relativna imunogenost primernih ćelijski ciljanih molekula određena je korišćenjem testa za in vivo odgovore antitela na ćelijski ciljanje molekule nakon ponovljenih, parenteralnih primena tokom mnogih perioda.
Za svrhe predmetnog pronalaska, fraza "B-ćelija i / ili CD4 T-ćelija de-imunizovana" znači da molekul ima smanjeni antigenski i/ili imunogenski potencijal nakon davanja sisaru u pogledu sa B-ćelijskom antigenošću ili imunogenošću i/ili CD4 T-ćelijskom antigenošću ili imunogenošću. U nekim primerima izvođenja, "de-imunizovana B-ćelija" znači molekul koji pokazuje smanjenu B-ćelijsku antigenost i/ili imunogenost nakon davanja sisaru u poređenju sa "roditeljskim" molekulom iz koga je dobijen, kao što je, npr., fragment divljeg soja Shiga toksina A1. U nekim primerima izvođenja, "CD4 T-ćelija de-imunizovana" znači molekul koji pokazuje smanjenu CD4 T-ćelijsku antigenost i/ili imunogenost nakon davanja sisaru u poređenju sa "roditeljskim" molekulom iz koga je dobijen, kao što je, npr., fragment divljeg soja Shiga toksina A1.
Izraz "endogeni" u vezi sa B-ćelijskim epitopom, CD4 T-ćelijskim epitopom, B-ćelijskim epitopskim regionom, ili CD4 T-ćelijskim epitopskim regionom u efektorskom polipeptidu Shiga toksina odnosi se na epitop prisutan u divljem soju Shiga toksina A Podjedinice.
Za svrhe predmetnog pronalaska, fraza "CD8 T-ćelijski hiper-imunizovan" znači da molekul, kada je prisutan u nuklizovanoj, hordatnoj ćeliji u živom hordatu, ima povećan antigenski i/ili imunogenski potencijal u odnosu na CD8 T-ćelijsku antigenost ili imunogenost. Obično, CD8 T-ćelijski imunizovani molekuli su sposobni za ćelijsku internalizaciju do ranog endozomskog odeljka nuklirane, hordatne9 ćelije ili zbog inherentnih svojstva(ava) ili kao komponenta ćelijski ciljanog molekula.
Za svrhe predmetnog pronalaska, izraz "heterologni" znači izvor različit od A Podjedinice prirodnog Shiga toksina, npr. heterologni polipeptid nije prirodno pronađen kao deo A Podjedinice nativnog Shiga toksina. Izraz "heterologni" s obzirom na T-ćelijski epitop ili komponentu T-ćelijski epitop-peptid polipeptida predmetnog pronalaska odnosi se na epitop ili peptidnu sekvencu koja se nije u početku pojavila da bi polipeptid bio modifikovan, ali koji je bio dodat polipeptidu, bilo da je dodat postupcima ugradnje, fuzije, umetanja i/ili supstitucije amino kiselina kao što je ovde opisano, ili bilo kojim drugim inženjerskim sredstvima. Rezultat je modifikovani polipeptid koji sadrži T-ćelijski epitop koji je strani u odnosu na izvorni, nemodifikovani polipeptid, odn. T-ćelijski epitop nije bio prisutan u originalnom polipeptidu.
Izraz "ugrađen" i njegove gramatičke varijante u vezi sa T-ćelijskim epitopom ili komponentomT-ćelijski epitop-peptid polipeptida predmetnog pronalaska odnosi se na unutrašnju zamenu jedne ili više amino kiselina unutar polipeptidnog regiona sa različitim amino kiselinama u cilju stvaranja nove polipeptidne sekvence koja deli isti ukupni broj amino kiselinskih ostataka sa početnim polipeptidnim regionom. Prema tome, izraz "ugrađen" ne uključuje bilo kakvu spoljno, krajnje spajanje bilo koje dodatne amino kiseline, peptida ili polipeptidne komponente sa početnim polipeptidom niti bilo kakvo dodatno unutrašnje ubacivanje bilo kakvih dodatnih amino kiselinskih ostataka, već uključuje samo supstituciju za postojeće amino kiseline. Unutrašnja zamena može se izvršiti samo supstitucijom amino kiselinskih ostataka ili serijom supstitucija, delecija, ubacivanja i/ili inverzije. Ako se koristi umetanje jedne ili više amino kiselina, tada se ekvivalentni broj proksimalnih amino kiselina mora izbrisati pored umetanja da bi se dobio epitop ugrađene T-ćelije. To je u suprotnosti sa upotrebom termina "ubačenog" u pogledu T-ćelijskog epitopa koji se nalazi u polipeptidu predmetnog pronalaska da bi se odnosio na umetanje jedne ili više amino kiselina unutra polipeptida što rezultira da novi polipeptid ima povećani broj amino kiselinskih ostataka u poređenju sa početnim polipeptidom.
Izraz "ubačen" i njegove gramatičke varijante u vezi sa T-ćelijskim epitopom sadržanim u polipeptidu predmetnog pronalaska odnosi se na ubacivanje jedne ili više amino kiseline u polipeptid što rezultira novom sekvencom polipeptida sa povećanim brojem amino kiselinskih ostataka u poređenju sa početnim polipeptidom. "ýista" ugradnja T-ćelijski epitoppeptid je kada se dobijeni polipeptid u dužini poveća za broj amino kiselinskih ostataka ekvivalentan broju amino kiselinskih ostataka u celom, ubačenom T-ćelijski epitop-peptid.
Izrazi "delimično ubačen", "ugrađen i ubačen", i njihove gramatičke varijante u pogledu T-ćelijskog epitopa sadržanih u polipeptidu predmetnog pronalaska, odnose se na to kada se rezultirajući polipeptid povećao u dužini, ali za manje od broja amino kiselinskih ostataka ekvivalentnom dužini celog, ubačenog T-ćelijski epitop-peptid. Umetanja, bilo da su „čista“ ili „delimična“, uključuju bilo koji od ranije opisanih umetanja, čak i ako su izbrisani drugi delovi polipeptida koji nisu proksimalni do mesta umetanja unutar polipeptida, što rezultira smanjenjem ukupne dužine konačnog polipeptida, jer konačni polipeptid još uvek sadrži unutrašnje ubacivanje jedne ili više amino kiselina T-ćelijski epitop-peptid unutar polipeptidnog regiona.
Kao što je korišćeno ovde, izraz "isporuka T-ćelijskog epitopa" kada opisuje funkcionalnu aktivnost molekula znači da molekul pruža biološku aktivnost lokalizacije unutar ćelije u podćelijskom odeljku koji je kompetentan da rezultira proteazomskim cepanjem proteinskog dela molekule koji sadrži T-ćelijski epitop-peptid. Funkcija "isporuke T-ćelijskog epitopa " molekula može se testirati posmatranjem MHC prezentacije tereta molekula T-ćelijski epitoppeptid na ćelijskoj površini ćelije egzogeno administriranom molekulom ili u kojoj je ispitivanje započelo sa ćelijom koja sadrži molekulu u jednom ili više njegovih endozomskih delova. Uopšteno, sposobnost molekula da isporučuje T-ćelijski epitop proteazomu može se odrediti gde je početna lokacija molekula „T-ćelijski epitop koji isporučuje“ rani endozomski odeljak ćelije, a zatim, molekul je empirijski prikazao da isporučuje epitop-peptid proteazomu ćelije. Međutim, sposobnost "isporuka T-ćelijskog epitopa" takođe se može odrediti tamo gde molekul počinje na ekstraćelijskoj lokaciji i empirijski je prikazan, ili direktno ili indirektno, da isporučuje epitop u ćeliju i u proteazome ćelije. Na primer, određeni molekuli "koji isporučuju T-ćelijski epitop" prolaze kroz endozomski deo ćelije, kao što je, npr. nakon ulaska endocitoze u tu ćeliju. Alternativno, aktivnost "isporuka T-ćelijskog epitopa" može se posmatrati za molekul koji počinje na ekstraćelijskoj lokaciji gde molekul ne ulazi u bilo koji endozomski deo ćelije - umesto toga, "T-ćelijski epitop koji isporučuje" molekul ulazi u ćeliju i donosi T-ćelijski epitop-peptid prema proteazomima ćelije, verovatno zato što je molekul " koji isporučuju T-ćelijski epitop " usmeravao sopstveno usmeravanje u podćelijski odeljak kompetentan da rezultira proteazomskim cepanjem epitopsko-peptidne komponente T-ćelije.
Za svrhe predmetnog pronalaska, fraza "blizu na amino-kraju" u odnosu na položaj efektorskog polipeptidnog regiona Shiga toksina ćelijski ciljanog molekula predmetnog pronalaska odnosi se na rastojanje u kome je najmanje jedan amino kiselinski ostatak polipeptidnog regiona Shiga toksina unutar 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ili više, npr. do 18-20 ostataka amino kiselina, amino-kraja ćelijski ciljanog molekula sve dok ćelijski ciljani molekul može da pokaže odgovarajući nivo efektorske funkcionalne aktivnosti Shiga toksina (npr. određeni nivo potencijala citotoksičnosti). Prema tome, za određene primere izvođenja predmetnog pronalaska, bilo koji amino kiselinski ostatak(ci) spojeni na amino kraju efektorskog polipeptida Shiga toksina ne bi trebalo da smanji bilo kakvu funkciju Shiga toksina (npr. tako što sterično ometa strukturu(e) u blizini amino-kraja efektorskog polipeptida Shiga toksina) tako da se funkcionalna aktivnost efektorskog polipeptida Shiga toksina smanji ispod odgovarajućeg nivoa aktivnosti koja je ovde potrebna.
Za svrhe predmetnog pronalaska, fraza "još bliže amino kraju " u odnosu na položaj efektorskog polipeptidnog regiona Shiga toksina unutar ćelijski ciljanog molekula predmetnog pronalaska kada se poredi sa drugom komponentom (npr., ciljanje ćelije, vezujući region, molekulski ostatak, i/ili dodatni eksogeni materijal) odnosi se na poziciju pri čemu najmanje jedan amino kiselinski ostatak amino kraja efektorskog polipeptida Shiga toksina je bliže amino kraju linearne, polipeptidne komponente ćelijski ciljanog molekula predmetnog pronalaska kada se poredi sa drugom referetnom komponentom.293
Za svrhe predmetnog pronalaska, fraza "aktivni enzimatski domen izveden iz jedne A Podjedinice člana porodice Shiga toksina" odnosi se na sposobnost inhibicije proteinske sinteze putem katalitičkog mehanizma inaktivacije ribozoma. Enzimske aktivnosti Shiga toksina koji je prisutan u prirodi mogu se definisati sposobnošću inhibicije prevođenjem proteina korišćenjem analiza koje su poznate stručnim licima, kao što su, npr., in vitro analize koje uključuju RNK translaciju u odsustvu živih ćelija ili in vivo analize koje uključuju RNK translaciju u živoj ćeliji. Upotrebom analiza poznatih stručnjacima i/ili koje su ovde opisane, potencijal enzimske aktivnosti Shiga toksina može se proceniti direktnim posmatranjem aktivnosti N-glikozidaze prema ribozomalnoj RNK (rRNK), kao što je, npr., analiza odrezavanja ribozoma i/ili indirektno posmatranjem inhibicijske funkcije ribozoma i/ili sinteze proteina.
Za svrhe predmetnog pronalaska, izraz "region fragmenta Shiga toksina A1" odnosi se na polipeptidni region koji se sastoji u osnovi od fragmenta Shiga toksina A1 i/ili je izveden iz fragmenta Shiga toksina A1 od Shiga toksina.
Za svrhe predmetnog pronalaska, izrazi "krajnji", "amino kraj" ili "karboksi kraj" u vezi sa ćelijski ciljanim molekulom se uglavnom odnosi na poslednji amino kiselinski ostatak polipeptidnog lanca ćelijski ciljanog molekula (npr., jedan, kontinuirani polipeptidni lanac). Ćelijski ciljani molekul može da sadrži više od jednog polipeptida ili proteina, i, prema tome, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalasku može da sadrži više amino krajeva i karboksi krajeva. Na primer, "amino kraj" ćelijski ciljanog molekula može biti definisan prvim amino kiselinskim ostatkom polipeptidnog lanca koji predstavlja amino kraj polipeptida, a koji generalno karakteriše početni, amino kiselinski ostatak koji nema peptidnu vezu sa bilo kojim amino kiselinskim ostatkom koji uključuje primarnu amino grupu početnog amino kiselinskog ostatka ili uključuje ekvivalentni azot za početne amino kiselinske ostatke koji su članovi klase N-alkiliranih alfa amino kiselinskih ostataka. Slično tome, "karboksi kraj" ćelijski ciljanog molekula može biti definisan poslednjim amino kiselinskim ostatkom polipeptidnog lanca koji predstavlja karboksi kraj polipeptida, koji generalno karakteriše konačni amino kiselinski ostatak koji nema nikakvih amino kiselinskih ostataka povezanih peptidnom vezom sa alfa-ugljenikom njegove primarne karboksilne grupe.
Za svrhe predmetnog pronalaska, izrazi „krajnji“, „amino kraj“ ili „karboksi kraj“ u odnosu na polipeptidni region se odnose na regionalne granice tog regiona, bez obzira da li su dodatni amino kiselinski ostaci povezani peptidnim vezama van tog regiona. Drugim rečima, krajnji polipeptidni regioni bez obzira da li je taj region spojen sa drugim peptidima ili polipeptidima. Na primer, spajanje protein koji sadrži dva proteinska regiona, npr., vezujući region koje sadrži peptid ili polipeptid i efektorski polipeptid Shiga toksina, može imati efektorski polipeptid Shiga toksina sa karboksi krajem koji završava na amino kiselinskom ostatku 251 efektorskog polipeptidnog regiona Shiga toksina uprkos peptidnoj vezi koja uključuje ostatak 251 prema amino kiselinskom ostatku na položaju 252 koji predstavlja početak drugog proteinskog regiona, npr. vezujući region. U ovom primeru, karboksi kraj efektorskog polipeptidnog regiona Shiga toksina odnosi se na ostatak 251, koji nije kraj spojenog proteina, već predstavlja unutrašnju, regionalnu granicu. Tako se za polipeptidne regione izrazi „krajnji“, „amino kraj“ i „karboksi kraj“ koriste za označavanje granica polipeptidnih regiona, bilo da je granica fizički kraj ili unutrašnji, položaj ugrađen u veći polipeptidni lanac.
Za svrhe predmetnog pronalaska, fraza "karboksi krajnji region fragmenta Shiga toksina A1" odnosi se na polipeptidni region dobijen iz fragmenta Shiga toksina A1 koji se javlja u prirodi, region koji započinje hidrofobnim ostatkom (npr. V236 od StkA-A1 i SLT-1A1, i V235 od SLT-2A1) praćen hidrofobnim ostatkom i regionom koji završava mestom cepanja furina sačuvanom između polipeptida fragmenta Shiga toksina A1 i završava na mestu spajanja između fragmenta A1 i fragmenta A2 u Shiga toksin A Podjedinicama koje se javljaju u prirodi. Za potrebe predmetnog pronalaska, karboksi krajnji region fragmenta Shiga toksina A1 uključuje peptidni region izveden iz karboksi krajnjeg polipeptida fragmenta Shiga toksina A1, kao što je, na primer, peptidni region koji se sastoji ili se sastoji pretežno od karboksi
1
krajnjeg fragmenta Shiga toksina A1. Neograničavajući primeri peptidnih regiona izvedenih iz karboksi krajnjeg fragmenta Shiga toksina uključuju sekvence amino kiselinskog ostatka koje su izvorno pozicionirane od pozicije 236 do pozicije 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250 ili 251 u Stx1A (SEQ ID NO:2) ili SLT-1A (SEQ ID NO:1); i od pozicije 235 do pozicije 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, ili 250 u SLT-2A (SEQ ID NO:3).
Za svrhe predmetnog pronalaska, fraza "blizu karboksi kraju polipeptidnog fragmenta A1" u pogledu povezanog molekulskog ostatka i/ili vezujućeg regiona odnosi se na 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ili 12 amino kiselinskih ostataka iz amino kiselinskog ostatka koji definiše poslednji ostatak polipeptidnog fragmenta Shiga toksina A1.
Za svrhe predmetnog pronalaska, fraza "sterikalno pokriva karboksi kraj A1 fragmentnog izvedenog regiona" uključuje bilo koju molekularnu jedinicu veličine 4,5 kDa ili veće (npr., vezujući region imunoglobulinskog tipa) povezanu i/ili spojenu sa amino kiselinskim ostatkom u karboksi kraju A1-fragmentnog izvedenog regiona, kao što je, npr., amino kiselinski ostatak izveden iz amino kiselinskog ostatka, koji je izvorno postavljen na bilo kom od položaja 236 do 251 u Stx1A (SEQ ID NO:2) ili SLT-1A (SEQ ID NO:1) ili od 235 do 250 u SLT-2A (SEQ ID NO:3). Za svrhe predmetnog pronalaska, fraza "sterikalno pokriva karboksi kraj A1 fragmentnog izvedenog regiona" takođe uključuje bilo koji molekulski ostatak veličine od 4.5 kDa ili veće (npr., vezujući region imunoglobulinskog tipa) povezan i/ili spojen sa amino kiselinskim ostatkom u karboksi kraju A1-fragmentnog izvedenog regiona, kao što je, npr., amino kiselinski ostatak karboksi kraja za poslednju amino kiselinu A1 fragmentnog izvedenog regiona i/ili efektorski polipeptid Shiga toksina. Za svrhe predmetnog pronalaska, fraza "sterikalno pokriva karboksi kraj A1 fragmentnog izvedenog regiona" takođe uključuje bilo koji molekulski ostatak veličine od 4.5 kDa ili veće (npr., vezujući region imunoglobulinskog tipa) koji fizički sprečava ćelijsko prepoznavanje karboksi kraja A1 fragmentog izvedenog regiona, kao što je, npr., prepoznavanje od strane ERAD mašine eukariotske ćelije.
Za svrhe predmetnog pronalaska, vezujući region, kao što je, npr., vezivni region imunoglobulinskog tipa, koji sadrži polipeptid koji sadrži najmanje četrdeset amino kiselina i koji je povezan (npr., spojen) sa karboksi krajem efektorskog polipeptidnog regiona Shiga toksina koji sadrži A1 fragmentni izvedeni region je molekulski ostatak koji "sterikalno pokriva karboksi kraj A1-fragmento izvedenog regiona."
2
Za svrhe predmetnog pronalaska, vezujući region, kao što je, npr., vezivni region imunoglobulinskog tipa, koji sadrži polipeptid koji sadrži najmanje četrdeset amino kiselina i koji je povezan (npr., spojen) sa karboksi krajem efektorskog polipeptidnog regiona Shiga toksina koji sadrži A1 fragmentni izvedeni region je molekulski ostatak koji "opterećuje karboksi kraj A1-fragmento izvedenog regiona."
Za svrhe predmetnog pronalaska, izraz "A1 fragment člana familije Shiga toksina" odnosi se na preostali amino krajnji fragment Shiga toksin A Podjedinice posle proteolize sa furinom na mestu cepanja furina sačuvanog između Shiga toksin A Podjedinica i smešten između A1 fragmenta i A2 fragment u divljem soju Shiga toksin A Podjedinica.
Za svrhe zahtevanog pronalaska, fraza "furniski odcepljeni motiv na karboksi kraju fragmentnog regiona A1 " odnosi se na specifični, furinski odcepljeni motiv sačuvan između Shiga toksin A Podjedinica i premoštava spojnice između A1 fragmenta i A2 fragmenta u Shiga toksin A Podjedinicama koji se javljaju u prirodi.
Za svrhe predmetnog pronalaska, fraza "mesto cepljenja furina blizu karboksi kraja fragmentnog regiona A1" odnosi se na svako prepoznatljivo mesto cepljenja furina koje ima amino kiselinski ostatak na udaljenosti manjoj od 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7 ili više amino kiselinskih ostataka amino kiselinskog ostatka koji definiše poslednji amino kiselinski ostatak u fragmentnom regionu A1 ili A1 fragmentu, uključujući furinski odcepljeni motiv koji se nalazi na karboksi kraju fragmentnog regiona A1 ili izvedenog fragmentnog regiona A1 kao što je, npr., na položaju blizu veze izvedenog fragmentnog regiona A1 sa drugom komponentom molekula, kao što je, npr., molekulski ostatak ćelijski ciljanog molekula predmetnog pronalaska.
Za svrhe predmetnog pronalaska, fraza "uništeni furinsko odcepljeni motiv " odnosi se na (i) specifičan furinski odcepljeni motiv kako je ovde opisano u Odeljku I-B i (ii) koji sadrži mutaciju i/ili skraćenje koje može dati molekulu sa smanjenjem u furinskom odcepljenju kada se poredi sa referentnim molekulom, kao što je, npr., smanjenje u furinskoj odcepljenoj reproduktivnosti posmatrano da iznosi 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98% , 99% ili manje (uključujući 100% bez cepanja) nego furinsko cepanje referentnog molekula uočenog u istom testu pod istim uslovima. Procenat furinskog odcepljenja u odnosu na referentni molekul može se izraziti kao odnos odcepljenog:neodcepljenog materijala molekule od interesa podeljenog sa odcepljenim: neodcepljenim materijalom referentnog molekula (videti Primere, supra). Neograničavajući primeri odgovarajućih referentnih molekula uključuju određene molekule koje sadrže divlji soj Shiga toksina furinski odcepljenog motiva i/ili mesto furinskog odcepljenja kako je ovde opisano u Odeljku I-B, Odeljak IV-B, i/ili Primeri) i/ili molekuli koji se koriste kao referentni molekuli u Primerima koji su navedeni u nastavku.
Za svrhe predmetnog pronalaska, fraza "otporna na cepanje furin" znači molekul ili njegov specifični polipeptidni region koji ima reproduktivno manje odcepljenje furina nego (i) karboksi krajnji fragment Shiga toksin A1 u divljem soju Shiga toksin A Podjedinice ili (ii) karboksi kraj konstrukcijski izvedenog regiona fragmenta Shiga toksin A1 u kome mesto prirodnog cepanja furina prirodno smeštenog na mestu između fragmenata A1 i A2 nije poremećeno; kao što je testirano bilo kojim raspoloživim sredstvima od strane stručnog lica, uključujući korišćenje postupka koji je ovde opisan.
Za svrhe predmetnog pronalaska, izraz "aktivni enzimski domen izveden iz A Podjedinice člana familije Shiga toksina" odnosi se na polipeptidnu strukturu koja ima sposobnost inhibiranja proteinske sinteze katalitičkom inaktivacijom ribozoma zasnovanom na enzimskoj aktivnosti Shiga toksina. Sposobnost molekulske strukture da ispoljava inhibitornu aktivnost sinteze proteina i/ili katalitičku inaktivaciju ribozoma može se primeniti korišćenjem različitih ispitivanja koji su poznati stručnjaku, kao što su, npr., in vitro analiza koji uključuju testove RNK translacije u odsustvu živih ćelije ili in vivo analiza koja uključuju ribozome živih ćelija. Na primer, korišćenjem analiza koje su poznate stručnjaku, enzimatska aktivnost molekula zasnovana na enzimatskoj aktivnosti Shiga toksina može se proceniti direktno posmatranjem aktivnosti N-glikozidaze prema ribozomalnoj RNK (rRNK), kao što je, na primer, analiza odrezavanja ribozoma i/ili indirektno posmatranjem inhibicije funkcije ribozoma, transformacije RNK, i/ili sinteze proteina.
Kao što je korišćeno ovde u odnosu na efektorski polipeptid Shiga toksina, "kombinacija" opisuje efektorski polipeptid Shiga toksina koji sadrži dva ili više pod-regiona gde svaki podregion sadrži najmanje jedno od sledećeg: (1) poremećaj u endogenom epitop ili epitopskom regionu; (2) ugrađeni, heterologni, T-ćelijski epitop-peptid; (3) ubačeni, heterologni, T-ćelijski epitop-peptid; i (4) furinsko odcepljeni motiv na karboksi kraju fragmentnog regiona A1.
Uvod
Predmetni pronalazak obezbeđuje razne, kombinacije, efektorskih polipeptida Shiga toksina i ćelijski ciljanih molekula koji sadrže iste. Određeni primeri izvođenja efektorskih polipeptida
4
Shiga toksina predmetnog pronalaska kombinuju strukturne elemente rezultujući u dva ili više svojstava u jednom molekulu, kao što je, npr., sposobnost da 1) ispoljavanja smanjene antigenosti i/ili imunogenosti u poređenju sa molekularnim varijantama kojima nedostaje posebna kombinacija elemenata; 2) pokazuje smanjeno cepanje proteaze u poređenju sa molekularnim varijantama kojima nedostaje ta posebna kombinacija elemenata; 3) pokazuje smanjenu nespecifičnu toksičnost za višećelijski organizam u određenim dozama u poređenju sa molekularnim varijantama kojima nedostaje ta posebna kombinacija elemenata, 4) dostavi ugrađeni ili umetnuti T-ćelijski epitop u sistemu MHC klase I ćelije za prezentaciju na ćelijskoj površini i/ili 5) pokaže moćnu citotoksičnost. Efektorski polipeptidi Shiga toksina predmetnog pronalaska mogu služiti kao skele za stvaranje različitih ćelijski ciljanih molekula, kao što su, npr., ćelijski ciljani, citotoksični, terapeutski molekuli; ćelijski ciljani netoksični, dostavni nosači; i dijagnostički ćelijski ciljani molekuli.
I. Opšte Strukture Efektorskih Polipeptida Shiga Toksina Pronalaska
Efektorski polipeptidi Shiga toksina i ćelijski ciljani molekuli predmetnog pronalaska sadrže najmanje jedan, efektorski polipeptid Shiga toksina izveden iz divljeg soja Shiga toksin A Podjedinice, ali sadrži jednu ili više strukturalnih modifikacija, kao što su, npr., mutacija poput skraćenja i/ili supstitucija amino kiselinskih ostataka. Za određene primere izvođenja, predmetni pronalazak uključuje konstrukcijski poboljšane efektorske polipeptide Shiga toksina A Podjedinice koji sadrže kombinaciju dva ili više sledećih pod-regiona efektorskog polipeptida Shiga toksina: (1) de-imunizovani pod-region, (2 ) pod-region otporan na cepanje proteaze blizu karboksi kraja regiona fragmenta Shiga toksina A1 i (3) T-ćelijski epitoppeptid ugrađeni ili ubačeni pod-region.
Efektorski polipeptid Shiga toksina je polipeptid izveden iz Shiga toksin A Podjedinice člana familije Shiga toksina koji je sposoban da pokazuje jedan ili više funkcija Shiga toksina (videti npr., Cheung M et al., Mol Cancer 9: 28 (2010); WO 2014/164693; WO 2015/113005; WO 2015/113007; WO 2015/138452; WO 2015/191764). Funkcije Shiga toksina uključuju, npr., povećavanje ćelijske internalizacije, usmeravanje podćelijskog usmeravanja iz endozomskog odeljka u citozol, izbegavanje ekstraćelijske degradacije, katalitički inaktivirajući ribozomi, i efekti citostatskih i/ili citotoksičnih efekata.
Familija Shiga toksina proteinskih toksina je sastavljena od različitih prirodnih toksina koji su strukturno i funkcionalno povezani, npr., Shiga toksin, Shiga-slični toksin 1, i Shiga-slični toksin 2 (Johannes L, Romer W, Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (2010)). ýlanovi holotoksina familije Shiga toksina sadrže ciljne domene koji preferirano vezuju specifični glikofingolipid prisutan na površini ćelija domaćina i enzimski domen koji može trajno inaktivirati ribozome jednom unutar ćelije (Johannes L, Romer W, Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (2010)). ýlanovi familije Shiga toksina dele istu ukupnu strukturu i mehanizam delovanja (Engedal N et al., Microbial Biotech 4: 32-46 (2011)). Na primer, Stx, SLT-1 i SLT-2 pokazuju nerazlučivu enzimsku aktivnost u sistemima bez ćelija (Head S et al., J Biol Chem 266: 3617-21 (1991); Tesh V et al., Infect Immun 61: 3392-402 (1993); Brigotti M et al., Toxicon 35:1431-1437 (1997)).
Familija Shiga toksina obuhvata istinski Shiga toksin (Stx) izolovan iz S. dysenteriae serotipa 1, Shiga-slični toksin 1 varijante (SLT1 ili Stxl ili SLT-1 ili Slt-1) izolovan iz serotipova enterohemorhagične E. coli, i Shiga-slični toksin 2 varijante (SLT2 ili Stx2 ili SLT-2) izolovan iz serotipova enterohemorhagične E. coli. SLT1 razlikuje se samo po jednom amino kiselinskom ostatku od Stx, a oba su pomenuta kao Verocitotoksini ili Verotoksini (VTs) (O'Brien A, Curr Top Microbiol Immunol 180: 65-94 (1992)). Iako su varijante SLT1 i SLT2 samo oko 53-60% slične jedna drugoj na nivou primarne amino kiselinske sekvence, one dele mehanizme enzimske aktivnosti i citotoksičnosti zajedničkih članova familije Shiga toksina (Johannes L, Romer W, Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (2010)). Opisano je preko 39 različitih Shiga toksina, kao što su definisane podvrste Stx1a, Stx1c, Stx1d, i Stx2a-g (Scheutz F et al., J Clin Microbiol 50: 2951-63 (2012)). ýlanovi familije Shiga toksina nisu prirodno ograničeni na bilo koju bakterijsku vrstu, jer se geni koji kodiraju Shiga toksine mogu širiti među bakterijskim vrstama horizontalnim prenosom gena (Strauch E et al., Infect Immun 69: 7588-95 (2001); Bielaszewska M et al., Appl Environ Micrbiol 73: 3144-50 (2007); Zhaxybayeva O, Doolittle W, Curr Biol 21: R242-6 (2011)). Kao primer prenosa među vrstama, otkriven je Shiga toksin u soju A. haemolyticus izolovan iz pacijenta (Grotiuz G et al., J Clin Microbiol 44: 3838-41 (2006)). Jednom kada Shiga toksin koji kodira polinukleotid ulazi u novu podvrstu ili vrstu, pretpostavlja se da je sekvenca amino kiseline Shiga toksina sposobna da razvije male varijacije u sekvenci zbog genetskog odliva i/ili selektivnog pritiska, a da pritom održava mehanizam citotoksičnosti koji je zajednički za članove familije Shiga toksina (videti Scheutz F et al., J Clin Microbiol 50: 2951-63 (2012)).
A. De-Imunizovani, Efektorski polipeptidi Shiga Toksin A Podjedinice
U određenim primerima izvođenja, efektorski polipeptid Shiga toksina predmetnog pronalaska je de-imunizovano, kao što je, npr., kada se poredi sa divljim sojem Shiga toksina, polipeptidom divljeg soja Shiga toksin, i/ili efektorskim polipeptidom Shiga toksina koji sadrži samo sekvence divljeg soja. De-imunizovani, efektorski polipeptidi Shiga toksina predmetnog pronalaska svaki sadrži uništeni najmanje jedan, pretpostavljeni, endogeni, epitopski region kako bi se smanjio antigenski i/ili imunogenski potencijal efektorskog polipeptida Shiga toksina nakon primene polipeptida u hordatu. Efektorski polipeptid Shiga toksina i/ili polipeptid Shiga toksin Podjedinice bez obzira da li se javlja u prirodi ili ne, može se de-imunizovati ovde opisanim postupkom, opisanim u WO 2015/113005 i/ili WO 2015/113007, i/ili koji je poznat stručnjaku, pri čemu dobijeni molekul zadržava jednu ili više funkcija Shiga toksina A Podjedinice.
U određenim primerima izvođenja, efektorski polipeptid Shiga toksina predmetnog pronalaska obuhvata uništeni endogeni epitop ili epitopski region, kao što je, npr., B-ćelijski i/ili CD4+ T-ćelijski epitop. U određenim primerima izvođenja, efektorski polipeptid Shiga toksina predmetnog pronalaska obuhvata uništenje najmanje jedan endogeni, epitopski region koji je ovde opisan, pri čemu uništavanje smanjuje antigenski i/ili imunogenski potencijal efektorskog polipeptida Shiga toksina posle primene polipeptida na hordat, i pri čemu efektorski polipeptid Shiga toksina je sposoban da pokazuje jednu ili više funkcija Shiga toksin A Podjedinice, kao što je, npr., dovoljan nivo citotoksičnosti Shiga toksina.
Izraz "uništen" ili "uništenje" kao što je ovde korišćeno u vezi sa epitopskim regionom odnosi se na uništenje najmanje jednog amino kiselinskog ostatka u epitopskom regionu, inverziju dva ili više amino kiselinskih ostataka gde je najmanje jedan od invertiranih amino kiselinski ostataka u epitopskom regionu, ubacivanje najmanje jedne amino kiseline u epitopski region i supstitucija najmanje jednog amino kiselinskog ostatka u epitopskom regionu. Uništenje epitopskog regiona mutacijom uključuje zamene amino kiselina sa nestandardnim amino kiselinama i/ili ne-prirodnim amino kiselinama. Epitopski regioni mogu alternativno biti uništeni mutacijama koje sadrže modifikaciju amino kiseline dodavanjem kovalentno vezane hemijske strukture koja maskira najmanje jednu amino kiselinu u epitopskom regionu, videti, npr. PEGlacija (videti Zhang C et al., BioDrugs 26: 209-15 (2012), adjuvans malog molekula (Flower D, Expert Opin Drug Discov 7: 807-17 (2012), i albuminacija na određenom mestu (Lim S et al., J Control Release 207-93 (2015)).
Određeni epitopski regioni i uništenja su ovde naznačena pozivanjem na specifične položaje amino kiselina izvornog Shiga toksin A Podjedinice navedene u Listi Sekvenci, primećujući da Shiga toksin A Podjedinice koje se javljaju u prirodi mogu da sadrže oblike prekursora koji sadrže signalne sekvence od oko 22 amino kiseline na njihovom amino kraju koji se uklanjaju za proizvodnju zrelih Shiga toksin A Podjedinica i prepoznatljivi su od strane stručnjaka. Dalje, ovde su naznačena određena uništenja epitopskih regiona pozivanjem na specifične amino kiseline (npr. S za ostatak serina) koji su izvorno prisutni na specifičnim pozicijama unutar izvorne Shiga toksin A Podjedinice (npr. S33 za ostatak serina na poziciji 33 sa amino kraju) nakon čega sledi amino kiselina sa kojom je taj ostatak supstituisan u određenoj mutaciji o kojoj se raspravlja (npr. S33I predstavlja supstituciju amino kiseline izoleucina sa serinom na amino kiselinskom ostatku 33 iz amino kraja).
U određenim primerima izvođenja, de-imunizovani, efektorski polipeptid Shiga toksina predmetnog pronalaska uništava najmanje jedan epitopski region koji je ovde obezbeđen (videti npr. Tabele 1-7 i/ili 12). U određenim primerima izvođenja, de-imunizovani, efektorski polipeptid Shiga toksina predmetnog pronalaska obuhvata uništenje najmanje jednog epitopskog regiona koji je opisan u WO 2015/113005 ili WO 2015/113007.
U određenim primerima izvođenja, de-imunizovani, efektorski polipeptid Shiga toksina predmetnog pronalaska obezbeđuje ili se sastoji bitno od Shiga toksin A Podjedinice pune dužine (npr. SLT-1A (SEQ ID NO:1), StxA (SEQ ID NO:2), ili SLT-2A (SEQ ID NO:3)) koji sadrži najmanje jednu uništenu amino kiselinsku sekvencu odabranu između grupe izvorno pozicioniranih amino kiselina koje se sastoje od: 1-15 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 3-14 SEQ ID NO:3; 26-37 SEQ ID NO:3; 27-37 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 39-48 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 42-48 SEQ ID NO:3; 53-66 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 94-115 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 141-153 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 140-156 SEQ ID NO:3; 179-190 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 179-191 SEQ ID NO:3; 204 SEQ ID NO:3;205 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 210-218 SEQ ID NO:3; 240-258 SEQ ID NO:3; 243-257 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 254-268 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 262-278 SEQ ID NO:3; 281-297 SEQ ID NO:3; i 285-293 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2, ili ekvivalentna pozicija u polipeptidu Shiga toksin A Podjedinice, očuvanog podregiona efektorskog polipeptida Shiga toksina, i/ili ne-izvorna sekvenca efektorskog polipeptida Shiga toksina.
U određenim primerima izvođenja, efektorski polipeptid Shiga toksina predmetnog pronalaska obuhvata ili se sastoji bitno od skraćene Shiga toksin A Podjedinice. Skraćenja Shiga toksin A Podjedinice mogu rezultovati brisanjem celog epitopskog(ih) regiona(a) bez uticaja efektorsku(e) funkciju(e) Shiga toksina. Najmanji, fragment Shiga toksin A Podjedinice za koji je pokazano da pokazuje značajnu enzimsku aktivnost bio je polipeptidni sastavljeni ostaci od 75-247 StxA (Al-Jaufy A et al., Infect Immun 62: 956-60 (1994)).
Skraćivanje karboksi kraja SLT-1A, StxA, ili SLT-2A na amino kiseline 1-251 uklanja dva predviđena B-ćelijska epitopska regiona, dva predviđena CD4 pozitivna (CD4+) T-ćelijska epitopa, i predviđeni, isprekidani, B-ćelijski epitop. Skraćivanje amino kraja SLT-1A, StkA ili SLT-2A na 75-293 uklanja najmanje tri, predviđena B-ćelijska epitopska regiona i tri predviđena CD4 T-ćelijska epitopa. Skraćivanje i amino- i karboksi kraja SLT-1A, StkA ili SLT-2A do 75-251 briše najmanje pet, predviđenih B-ćelijskih epitopskih regiona; četiri, pretpostavljena, CD4 T-ćelijska epitopa; i jedan, predviđeni, isprekidani, Bćelijski epitop.
U određenim primerima izvođenja, efektorski polipeptid Shiga toksina pronalaska može obuhvatati ili se sastojati bitno od Shiga toksin A Podjedinice pune dužine ili skraćen sa najmanje jednom mutacijom, npr., brisanje, umetanje, inverzija ili supstitucija u obezbeđenom epitopskom regionu. U nekim daljim primerima izvođenja, polipeptidi sadrže uništenje koje obuhvata brisanje najmanje jedne amino kiseline unutar epitopskog regiona. U nekim daljim primerima izvođenja, polipeptidi sadrže uništenje koje sadrži umetanje najmanje jedne amino kiseline u epitopski region. U nekim daljim primerima izvođenja, polipeptidi sadrže uništenje koje sadrži inverzijske amino kiseline, pri čemu je najmanje jedna invertirana amino kiselina unutar epitopskog regiona. U nekim daljim primerima izvođenja, polipeptidi sadrže uništenje koje obuhvata mutaciju, kao što je amino kiselinska supstitucija na ne-standardnoj amino kiselini ili amino kiselina sa hemijski modifikovanim bočnim lancem. Brojni primeri jednostruke amino kiselinske supstitucije dati su u Primerima koji su navedeni u nastavku.
U određenim primerima izvođenja, efektorski polipeptid Shiga toksina pronalaska obuhvatati ili se sastojati bitno od Shiga toksin A Podjedinice pune dužine ili skraćen sa jednom ili više mutacija kada se poredi sa izvornom sekvencom koja sadrži najmanje jednu amino kiselinsku supstituciju odabranu između grupe koja se sastoji od: A, G, V, L, I, P, C, M, F, S, D, N, Q, H, i K. U određenim drugim primerima izvođenja, polipeptid može obuhvatati ili se sastojati bitno od Shiga toksin A Podjedinice pune dužine ili skraćen sa jednom mutacijom kada se poredi sa izvornom sekvencom pri čemu je supstitucija odabrana između grupe koja se sastoji od: D do A, D do G, D do V, D do L, D do I, D do F, D do S, D do Q, E do A, E do G, E do V, E do L, E do I, E do F, E do S, E do Q, E do N, E do D, E do M, E do R, G do A, H do A, H do G, H do V, H do L, H do I, H do F, H do M, K do A, K do G, K do V, K do L, K do I, K do M, K do H, L do A, L do G, N do A, N do G, N do V, N do L, N do I, N do F, P do A, P do G, P do F, R do A, R do G, R do V, R do L, R do I, R do F, R do M, R do Q, R do S, R to K, R do H, S do A, S do G, S do V, S do L, S do I, S do F, S do M, T do A, T do G, T do V, T do L, T do I, T do F, T do M, T do S, Y do A, Y do G, Y do V, Y do L, Y do I, Y do F, i Y do M.
U određenim primerima izvođenja, efektorski polipeptid Shiga toksina pronalaska obuhvatati ili se sastojati bitno od Shiga toksin A Podjedinice pune dužine ili skraćen sa jednom ili više mutacija kada se poredi sa izvornom sekvencom amino kiselinskog ostatka koja sadrži najmanje jednu amino kiselinsku supstituciju imunogenskog ostatka i/ili unutar epitopskog regiona, pri čemu najmanje jedna supstitucija se dešava na izvorno pozicioniranoj grupi amino kiselina odabranih između grupe koja se sastoji: 1 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 4 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 8 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 9 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 11 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 33 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 43 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 44 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 45 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 46 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 47 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 48 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 49 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 50 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 51 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 53 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 54 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 55 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 56 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 57 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 58 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 59 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 60 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 61 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 62 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 84 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 88 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 94 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 96 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ IDNO:3; 104 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 105 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 107 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 108 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 109 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 110 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 111 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 112 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 141 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 147 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 154 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 179 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2,ili SEQ ID NO:3; 180 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 181 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 183 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 184 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 185 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 186 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 187 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 188 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 189 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 198 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 204 SEQ ID NO:3; 205 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 241 SEQ ID NO:3; 242 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 247 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 247 SEQ ID NO:3; 248 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 250 SEQ ID NO:3; 251 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 264 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 265 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; i 286 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2.
1
U određenim primerima izvođenja, efektorski polipeptid Shiga toksina pronalaska obuhvatati ili se sastojati bitno od Shiga toksin A Podjedinice pune dužine ili skraćen sa jednom ili više supstitucija imunogenskog ostatka i/ili unutar epitopskog regiona, pri čemu najmanje jedna amino kiselinska supstitucija jeste ne-konzervativna amino kiselina (videti, npr., Tabelu C, infra) u odnosu na izvornu amino kiselinu pozicioniranu na jednom od sledećih izvornih pozicija: 1 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 4 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 8 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 9 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 11 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 33 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 43 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 44 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 45 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 46 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 47 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 48 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 49 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 50 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 51 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 53 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 54 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 55 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 56 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 57 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 58 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 59 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 60 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 61 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 62 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 84 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 88 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 94 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 96 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 104 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 105 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 107 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 108 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 109 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 110 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 111 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 112 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 141 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 147 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 154 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 179 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2,ili SEQ ID NO:3; 180 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 181 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 183 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 184 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 185 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 186 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 187 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 188 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 189 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 198 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 204 SEQ ID NO:3; 205 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 241 SEQ ID NO:3; 242 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 247 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 247 SEQ ID NO:3; 248 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 250 SEQ ID NO:3; 251 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 264 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 265 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; i 286 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2..
U određenim primerima izvođenja, efektorski polipeptid Shiga toksina pronalaska obuhvatati ili se sastojati bitno od Shiga toksin A Podjedinice pune dužine ili skraćen sa najmanje
1 1
jednom amino kiselinskom supstitucijom odabranom između grupe koja se sastoji od : K1 do A, G, V, L, I, F, M i H; T4 do A, G, V, L, I, F, M, i S; D6 do A, G, V, L, I, F, S, i Q; S8 do A, G, V, I, L, F, i M; T8 do A, G, V, I, L, F, M, i S; T9 do A, G, V, I, L, F, M, i S; S9 do A, G, V, L, I, F, i M; Kl 1 do A, G, V, L, I, F, M i H; T12 do A, G, V, I, L, F, M, i S; S33 do A, G, V, L, I, F, i M; S43 do A, G, V, L, I, F, i M; G44 do A i L; S45 do A, G, V, L, I, F, i M; T45 do A, G, V, L, I, F, i M; G46 do A i P; D47 do A, G, V, L, I, F, S, i Q; N48 do A, G, V, L, i M; L49 do A ili G; F50 do A, G, V, L, I, i T; A51 do V; D53 do A, G, V, L, I, F, S, i Q; V54 do A, G, i L; R55 do A, G, V, L, I, F, M, Q, S, K, i H; G56 do A i P; 157 do A, G, M, i F; L57 do A, G, M, i F; D58 do A, G, V, L, I, F, S, i Q; P59 do A, G, i F; E60 do A, G, V, L, I, F, S, Q, N, D, M, i R; E61 do A, G, V, L, I, F, S, Q, N, D, M, i R; G62 do A; D94 do A, G, V, L, I, F, S, i Q; R84 do A, G, V, L, I, F, M, Q, S, K, i H; V88 do A i G; 188 do A, G, i V; D94; S96 do A, G, V, I, L, F, i M; T104 do A, G, V, I, L, F, M, i S; A105 do L; T107 do A, G, V, I, L, F, M, i S; S107 do A, G, V, L, I, F, i M; L108 do A, G, i M; S109 do A, G, V, I, L, F, i M; T109 do A, G, V, I, L, F, M, i S; Gl 10 do A; Dl 11 do A, G, V, L, I, F, S, i Q; SI 12 do A, G, V, L, I, F, i M; D141 do A, G, V, L, I, F, S, i Q; G147 do A; VI54 do A i G; R179 do A, G, V, L, I, F, M, Q, S, K, i H; T180 do A, G, V, L, I, F, M, i S; T181 do A, G, V, L, I, F, M, i S; D183 do A, G, V, L, I, F, S, i Q; D184 do A, G, V, L, I, F, S, i Q; L185 do A, G, i V; SI86 do A, G, V, I, L, F, i M; G187 do A; R188 do A, G, V, L, I, F, M, Q, S, K, i H; SI89 do A, G, V, I, L, F, i M; D197 do A, G, V, L, I, F, S, i Q; D198 do A, G, V, L, I, F, S, i Q; R204 do A, G, V, L, I, F, M, Q, S, K, i H; R205 do A, G, V, L, I, F, M, Q, S, K i H; C242 do A, G, V, i S; S247 do A, G, V, I, L, F, i M; Y247 do A, G, V, L, I, F, i M; R248 do A, G, V, L, I, F, M, Q, S, K, i H; R250 do A, G, V, L, I, F, M, Q, S, K, i H; R251 do A, G, V, L, I, F, M, Q, S, K, i H; C262 do A, G, V, i S; D264 do A, G, V, L, I, F, S, i Q; G264 do A; i T286 do A, G, V, L, I, F, M, i S.
U određenim primerima izvođenja, efektorski polipeptid Shiga toksina pronalaska obuhvatati ili se sastojati bitno od Shiga toksin A Podjedinice pune dužine ili skraćen sa najmanje jednom od sledećih amino kiselinskih supstitucija K1A, KIM, T4I, D6R, S8I, T8V, T9I, S9I, K11A, K11H, T12K, S33I, S33C, S43N, G44L, S45V, S45I, T45V, T45I, G46P, D47M, D47G, N48V, N48F, L49A, F50T, A51V, D53A, D53N, D53G, V54L, V54I, R55A, R55V, R55L, G56P, I57F, I57M, D58A, D58V, D58F, P59A, P59F, E60I, E60T, E60R, E61A, E61V, E61L, G62A, R84A, V88A, D94A, S96I, T104N, A105L, T107P, L108M, S109V, T109V, G110A, D111T, SI 12V, D141A, G147A, V154A, R179A, T180G, T181I, D183A, D183G, D184A, D184F, L185V, L185D, S186A, S186F, G187A, G187T, R188A, R188L, S189A, D198A, R204A, R205A, C242S, S247I, Y247A, R248A, R250A, R251A, ili D264A, G264A, T286A, i/ili T286I. Ove supstitucije koje ometaju epitop mogu se kombinovati da bi se formirao de-imunizovani efektorski polipeptid Shiga toksin sa višestrukim supstitucijama po
1 2
regionu epitopa i/ili više epitopa koji su uništeni dok još uvek zadržavaju efektorsku funkciju Shiga toksin. Na primer, zamene na izvorno postavljenom položaju K1A, KIM, T4I, D6R, S8I, T8V, T9I, S9I, K11A, K11H, T12K, S33I, S33C, S43N, G44L, S45V, S45I, T45V, T45I, G46P, D47M, D47G, N48V, N48F, L49A, F50T, A51V, D53A, D53N, D53G, V54L, V54I, R55A, R55V, R55L, G56P, I57F, I57M, D58A, D58V, D58F, P59A, P59F, E60I, E60T, E60R, E61A, E61V, E61L, G62A, R84A, V88A, D94A, S96I, T104N, A105L, T107P, L108M, S109V, T109V, G110A, D111T, SI 12V, D141A, G147A, V154A, R179A, T180G, T181I, D183A, D183G, D184A, D184F, L185V, L185D, S186A, S186F, G187A, G187T, R188A, R188L, S189A, D198A, R204A, R205A, C242S, S247I, Y247A, R248A, R250A, R251A, ili D264A, G264A, T286A, i/ili T286I mogu biti kombinovane, gde je moguće, sa supstitucijom na izvorno pozicioniranim ostacima K1A, KIM, T4I, D6R, S8I, T8V, T9I, S9I, K11A, K11H, T12K, S33I, S33C, S43N, G44L, S45V, S45I, T45V, T45I, G46P, D47M, D47G, N48V, N48F, L49A, F50T, A51V, D53A, D53N, D53G, V54L, V54I, R55A, R55V, R55L, G56P, I57F, I57M, D58A, D58V, D58F, P59A, P59F, E60I, E60T, E60R, E61A, E61V, E61L, G62A, R84A, V88A, D94A, S96I, T104N, A105L, T107P, L108M, S109V, T109V, G110A, D111T, S112V, D141A, G147A, V154A, R179A, T180G, T181I, D183A, D183G, D184A, D184F, L185V, L185D, S186A, S186F, G187A, G187T, R188A, R188L, S189A, D198A, R204A, R205A, C242S, S247I, Y247A, R248A, R250A, R251A, ili D264A, G264A, T286A, i/ili T286I kako bi se obrazovao de-imunizovani, efektorski polipeptid Shiga toksina pronalaska.
Bilo koji de-imunizovani, efektorski polipeptidni pod-region i/ili epitop Shiga toksina pronalaska koji uništavaju mutacije opisane ovde mogu se koristiti same ili u kombinaciji sa svakim pojedinačnim primerom izvođenja predmetnog pronalaska, uključujući postupak predmetnog pronalaska.
B. Otporni, Efektorski Polipeptidi Shiga Toksin A Podjedinice na Cepanje Proteaze
U određenim primerima izvođenja, efektorski polipeptid Shiga toksina predmetnog pronalaska obuhvata (1) izvedeni region Shiga toksin A1 fragmenta koji ima karboksi kraj i (2) uništeni furinski odcepljeni motiv na karboksi-kraju regiona Shiga toksin A1 fragmenta. Poboljšanje stabilnosti veza između komponente Shiga toksina i drugih komponenata ćelijski ciljanog molekula, npr., ćelijski ciljajući vezujući regioni mogu poboljšati njihove profile toksičnosti nakon primene u organizme smanjenjem nespecifičnih toksičnosti izazvanih prekidom veze i gubitkom ciljanja ćelija, kao što je, npr., rezultat proteolize.
1
ýlanovi Shiga toksin A Podjedinica familije Shiga toksina obuhvataju sačuvano, furinsko odcepljeno mesto na karboksi kraju njihovog regiona A1 fragmenta koji su važni za Shiga toksin funkciju. Mesto furinsko odcepljenih motiva i furinskih odcepljenih mesta se može identifikovati od strane stručnog lica koji koristi standardne tehnike i/ili koristi informacije koje su ovde navedene.
Model citotoksičnosti Shiga toksina jeste da je intraćelijska proteolitička obrada Shiga toksin A Podjedinica sa furinom u intoksiranim ćelijama neophodna za 1) oslobađanje A1 fragmenta iz ostatka Shiga holotoksina, 2) izlazak A1 fragmenta iz endoplazmatičnog retikuluma izlaganjem hidrofobnog domena u karboksi kraju A1 fragmenta i 3) enzimatsku aktivaciju A1 fragmenta (videti Johannes L, Romer V, Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (2010)). Efikasno oslobađanje fragmenta Shiga toksin A1 iz A2 fragmenta i ostalih komponenti Shiga holotoksina u endoplazmatičnom retikulumu intoksiranih ćelija od suštinskog je značaja za efikasno intraćelijsko usmeravanje prema citozolu, maksimalnu enzimsku aktivnost, efikasnu inaktivaciju ribozoma i postizanje optimalna citotoksičnost, odn., uporediva sa divljim sojem Shiga toksina (videti npr. WO 2015/191764 i njihove reference).
Tokom intoksikacije Shiga toksina, Podjedinica A je proteolitički odcepljena furinom na karboksi vezi konzerviranog ostatka arginina (npr. ostatak arginina na položaju 251 u StxA i SLT-1A i ostatak arginina na položaju 250 u Stx2A i SLT-2A). Furinsko cepanje Shiga toksin A Podjedinica događa se u endozomskim i/ili Golgijevim pregradama. Furin je specijalizovani serin endoproteaze koja se izražava velikim brojem ćelijskih tipova, u svim ispitivanim ljudskim tkivima i u većini životinjskih ćelija. Furin cepa polipeptide koji sadrže pristupačne motive često usredsređene na minimalan, dibazni, konsenzusni motiv R-x-(R/K/x)-R.
Podjedinice članova familije Shiga toksina sadrže očuvanu, površinski izloženu, produženu petlju (npr.242-261 u StxA i SLT-1A i 241-68-60-260 u SLT-2) sa sačuvanim SR/Y-x-x-R motivom koji je odcepljen furinom. Površinsko izložena, proširena struktura petlje pozicionirana na amino kiselinskim ostacima 242-261 u StxA potrebna je za deformaciju StxA izazvanu furinom, uključujući karakteristike koje počivaju na minimalnom, furinsko odcepljenom motivu R-x-x-R.
Furinsko odcepljeni motivi i furinski odcepljena mesta u Shiga toksin A Podjedinicama i efektorskim polipeptidima Shiga toksina može biti identifikovana od strane stručnjaka koristeći postupke i/ili koristeći informacije koje su ovde opisane. Furin cepa minimalni, konsenzusni motiv R-x-x-R (Schalken J et al., J Clin Invest 80: 1545-9 (1987); Bresnahan P et al., J Cell Biol 111: 2851-9 (1990); Hatsuzawa K et al., JBiol Chem 265: 22075-8 (1990);
1 4
Wise R et al., Proc Natl Acad Sci USA 87: 9378-82 (1990); Molloy S et al., J Biol Chem 267: 16396-402 (1992)). U skladu sa tim, mnogi inhibitori furina sadrže peptide koji sadrže motiv R-x-x-R. Primer sintetskog inhibitora furina je molekul koji sadrži peptid R-V-K-R (SEQ ID NO:537) (Henrich S et al., Nat Struct Biol 10: 520-6 (2003)). Uopšteno, za peptid ili protein koji sadrži površinski motiv dibazne amino kiseline sa dve pozitivno naelektrisane amino kiseline odvojene od dva amino kiselinska ostatka može se predvideti da budu osetljivi na cepanje furina sa cepanjem koje se dešava na karboksi vezi poslednje bazne amino kiseline u motivu.
Motivi konsenzusa u supstratima odcepljeni furinom identifikovani su sa određenim stepenom specifičnosti. Opisan je motiv mesta cepanja furinom koji sadrži oblast od dvadeset, kontinuiranih amino kiselinskih ostataka, koji se mogu označiti P14 kroz P6' (Tian S et al., Int JMol Sci 12: 1060-5 (2011)) koristeći nomenklaturu opisanu u Schechter I, Berger, A, Biochem Biophys Res Commun 32: 898-902 (1968). Prema ovoj nomenklaturi, mesto cepljenja furina nalazi se na karboksi vezi amino kiselinskog ostatka označenog P1, a amino kiselinski ostaci furinski odcepljenog motiva su označeni brojevima P2, P3, P4, itd., u smeru koji ide prema amino kraj iz ovog referentnog P1 ostatka. Amino kiselinski ostaci motiva koji idu prema karboksi kraju iz referentnog ostatka P1 numerisani su sa početnom naznakom P2', P3', P4', itd. Koristeći ovu nomenklaturu, P6 do P2' region označava srž supstrata furinski odcepljenog motiva koji je vezan enzimskim domenom furina. Dva bočna regiona P14 do P7 i P3 'do P6' često su bogata polarnim, amino kiselinskim ostacima da bi povećali pristupačnost mestu cepanja jezgra furina koje se nalazi između njih.
Uopšteno, mesto cepanja furina je često opisano sa konsenzusnim motivom R-x-x-R koji odgovara P4-P3-P2-P1; gde "R" predstavlja ostatak arginina (videti Tabelu A, supra), crtica "-" predstavlja peptidnu vezu, a malo slovo "x" predstavlja bilo koji amino kiselinski ostatak. Međutim, drugi ostaci i položaji mogu pomoći u daljem definisanju furinski odcepljenog motiva. Nešto više rafinisano mesto cepanja furina, konsenzusni motiv često se navodi kao konsenzusni motiv R-x-[K/R]-R (gde kosa crta "/" označava "ili" deli iste amino kiselinske ostatke na istoj poziciji), koji odgovara P4-P3-P2-P1, jer je primećeno da furin ima veliku prednost pri cepanju supstrata koji sadrži ovaj motiv.
Pored minimalnog mesta cepanja furina R-x-x-R, opisan je veći furinsko odcepljeni motiv sa određenim preferencijama amino kiselinskih ostataka na određenim pozicijama.
Upoređivanjem raznih poznatih supstrata furina, određena su fizičko-hemijska svojstva amino kiselinskih ostataka u 20 amino kiselinskih ostataka dugog, mesta furinsko
1
odcepljenog motiva. Područje P6 do P2' furinski odcepljenog motiva definiše jezgro mesta cepanja furina koje fizički deluje na enzimski domen furina. Dva bočna regiona P14 do P7 i P3' do P6' često su hidrofilni koje su bogati polarnim, amino kiselinskim ostacima da bi povećali površinsku dostupnost jezgra mesta cepanja furina smeštenog između njih.
Uopšteno, region furinski odcepljenog motiva od pozicije P5 do P1 obično sadrži amino kiselinske ostatke sa pozitivnim naelektrisanjem i/ili visokim izoelektričnim tačkama.
Naročito, P1 pozicija, koja označava položaj furin proteolize, je uopšteno zauzeto sa argininom, ali mogu se pojaviti i drugi pozitivno naelektrisani amino kiselinski ostaci. Pozicije P2 i P3 imaju tendenciju da budu zauzeti sa fleksibilnim, amino kiselinskim ostacima, a naročito P2 ima tendenciju da bude zauzet sa argininom, lizinom ili ponekad vrlo mali i fleksibilnim ostacima amino kiselina kao što je glicin. Poziciju P4 obično zauzimaju pozitivno naelektrisani amino kiselinski ostaci u furinskim supstratima. Međutim, ako je pozicija P4 zauzeta alifatičnim, amino kiselinskim ostatkom, onda nedostatak pozitivno naelektrisane funkcionalne grupe može se nadoknaditi pozitivno naelektrisanim ostatkom smeštenim u poziciji (pozicijama) P5 i/ili P6. Pozicije P1' i P2' su obično zauzete alifatskim i/ili hidrofobnim amino kiselinskim ostacima, pri čemu P1'položaj najčešće zauzima serin.
Dva, hidrofilna, bočna regiona imaju tendenciju da budu zauzeta amino kiselinskim ostacima koji su polarni, hidrofilni i imaju manje amino kiselinske funkcionalne grupe; međutim, u određenim proverenim furinskim supstratima, bočni regioni ne sadrže bilo koje hidrofilne, amino kiselinske ostatke (videti Tian S, Biochem Insights 2: 9-20 (2009)).
Dvadeset amino kiselinskih ostataka, furinski odcepljeni motiv i mesto cepljenja furina pronađeno u izvornoj, Shiga toksin A Podjedinici na mestu spajanja između fragmenta Shiga toksin A1 i fragmenta A2 je dobro okarakterisano u određenim Shiga toksinima. Na primer u StxA (SEQ ID NO:2) i SLT-1A (SEQ ID NO:1), ovaj furinsko odcepljeni motiv je izvorno pozicioniran od L238 do F257, i u SLT-2A (SEQ ID NO:3), ovaj furinsko odcepljeni motiv je izvorno pozicioniran od V237 do Q256. Na osnovu amino kiselinske homologije, eksperiment, i/ili analize cepanja furina opisanih ovde, stručno lice može identifikovati furinski odcepljen motiv u drugim izvornim, Shiga toksin A Podjedinicama ili efektorskim polipeptidima Shiga toksina, gde su motivi stvarni furin odcepljeni motivi ili su predviđene da će rezultirati proizvodnjom fragmenata A1 i A2 nakon furinskog odvajanja tih molekula unutar eukariotske ćelije.
1
U određenim primerima izvođenja, efektorski polipeptid Shiga toksina predmetnog pronalaska obuhvata (1) izvedeni polipeptid Shiga toksin A1 fragmenta koji ima karboksi kraj i (2) uništeni furinsko odcepljeni motiv na karboksi kraju izvedenog polipeptida Shiga toksin A1 fragmenta. Karboksi kraj izvedenog polipeptida Shiga toksin A1 fragmenta može biti identifikovan od strane stručnjaka koristeći tehnike koje su poznate u praksi, kao što je, npr., korišćenjem softvera za poravnavanje proteinskih sekvenci za identifikovanje (i) furinski odcepljenog motiva sačuvanog sa Shiga toksinom koji se javlja u prirodi, (ii) izložene površine, produžene petlje očuvane od Shiga toksina koji se javlja u prirodi, i/ili (iii) protezanje amino kiselinski ostaci koji su pretežno hidrofobni (odn. hidrofobni „flaster“) koji mogu da budu prepoznati od strane ERAD sistema.
Otporni na cepanje proteaze, efektorski polipeptidi Shiga toksina predmetnog pronalaska (1) može u potpunosti da nedostaje bilo koji furinsko odcepljeni motiv na karboksi kraju njegovog regiona Shiga toksin A1 fragmenta i/ili (2) sadrži uništeni furinski odcepljeni motiv na karboksi kraju njegovog regiona Shiga toksin A1 fragmenta i/ili regiona izvedenog iz karboksi kraja Shiga toksin A1 fragmenta. Uništenje furinski odcepljenog motiva uključuje razne promene amino kiselinskog ostatka u furinsko odcepljenom motivu, kao što su, npr., modifikacija(e) koja sledi posle prevođenja, promena jednog ili više atoma u funkcionalnoj grupi amino kiselina, dodavanje jednog ili više atoma funkcionalnoj grupi amino kiselina, povezanost sa ne-proteinskim delom (i), i/ili veza sa amino kiselinskim ostatkom, peptidom, polipeptidom, što rezultira razgranatom proteinastom strukturom.
Otporni na cepanje proteaze, efektorski polipeptidi Shiga toksina mogu se stvoriti iz efektorskog polipeptida Shiga toksina i/ili polipeptida Shiga toksin A Podjedinice, bilo da se javlja u prirodi ili ne, koristeći postupak koji je ovde opisan, opisanu u WO 2015/191764, i/ili koji je poznat stručnjaku, pri čemu rezultujući molekul i dalje zadržava jednu ili više funkcija Shiga toksin A Podjedinice.
Za svrhe predmetnog pronalaska u vezi sa mestom cepanja furina ili furinski odcepljenim motivom, izraz "uništavajući" ili "uništen" odnosi se na promenu mesta prirodnog cepanja furina i/ili furinski odcepljenog motiva, kao što je, npr., mutacija, koja rezultira smanjenjem deformacije furina blizu karboksi kraju regiona Shiga toksin A1 fragmenta, ili iz njega izvedeni identifikovani region, u poređenju sa cepanjem furina divljeg soja Shiga toksin A Podjedinice ili polipeptida izvedenog iz divljeg soja Shiga toksin A Podjedinice koja sadrži samo polipeptidne sekvence divljeg soja. Skraćivanje amino kiselinskog ostatka u furinsko odcepljenom motivu uključuje mutaciju u furinski odcepljenom motivu, kao što je, npr.,
1
brisanja, umetanja, inverzije, supstitucije i/ili skraćenje karboksi-kraja furinski odcepljenog motiva, kao i modifikacije posle prevođenja, kao što su, na primer, rezultat glikozilacije, albuminiranja i slično, koje uključuju konjugiranje ili povezivanje molekula sa funkcionalnom grupom amino kiselinskog ostatka. Pošto se furinski odcepljeni motiv sastoji od dvadesetak, amino kiselinskih ostataka, u teoriji, promene, modifikacije, mutacije, brisanja, ubacivanja i / ili skraćenja koja uključuju jedan ili više amino kiselinskih ostataka bilo kojeg od ovih dvadeset položaja mogu dovesti do smanjene osetljivosti na cepanje furina (Tian S et al., Sci Rep 2: 261 (2012)). Uništavnje mesta cepanja furina i/ili furinski odcepljenog motiva može ili ne mora povećati otpornost na cepanje drugim proteazama, kao što su, na primer, tripsin i ekstraćelijske proteaze uobičajene u vaskularnom sistemu sisara. Efekti datog poremećaja na cepanje osetljivosti date proteaze može da testira stručnjak tehnikama poznatim u tehnici.
Za svrhe predmetnog pronalaska, "uništeni furinski odcepljeni motiv je furinski odcepljeni motiv koji sadrži izmenu jednog ili više amino kiselinskih ostataka dobijenih iz 20 ostataka amino kiselina koji predstavljaju sačuvani furinsko odcepljeni motiv nađen u izvornoj, Shiga toksin A Podjedinici na spoju regiona između Shiga toksin A1 fragment i A2 fragmenta i postavljen tako da furinsko cepanje Shiga toksin A Podjedinice rezultira proizvodnjom A1 i A2 fragmenata; pri čemu furinski odcepljeni motiv pokazuje smanjeno cepanje furina na eksperimentalno reprodukovani način u poređenju sa referentnim molekulom koji sadrži region divljeg soja Shiga toksin A1 fragmenta spojenog na karboksi kraju polipeptida veličine dovoljno velike da nadgleda cepanje furina korišćenjem odgovarajuće analize koja je poznata stručnjaku i/ili je ovde opisana.
Primeri vrsta mutacija koje mogu da poremete mesto cepljenja furina i furinski odcepljeni motiv su brisanja ostataka amino kiselina, ubacivanja, skraćenja, inverzije i/ili supstitucije, uključujući supstitucije sa nestandardnim amino kiselinama i/ili ne-prirodnim amino kiselinama. Pored toga, mesta cepljenja furina i furinski odcepljenog motiva mogu se prekinuti mutacijama koje sadrže modifikaciju amino kiseline dodavanjem kovalentno vezane strukture koja maskira najmanje jednu amino kiselinu na mestu ili motivu, kao što je, npr., kao rezultat PEGilacije, spajanja malih molekula adjuvansa i/ili albuminiranje specifično za lokaciju.
Ako je furinsko odcepljeni motiv uništen mutacijom i/ili prisustvom ne-prirodnih amino kiselinskih ostataka, neki uništeni furinsko odcepljeni motivi ne mogu se lako prepoznati kao da su povezani sa bilo kojim furinsko odcepljenim motivom; međutim, karboksi kraj regiona
1
izvedenog iz Shiga toksin A1 fragmenta biće prepoznatljiv i definisaće gde će se nalazio furinsko odcepljeni motiv a da nije uništen. Na primer, furinski odcepljeni motiv može da sadrži manje od dvadeset amino kiselinskih ostataka furinski odcepljenog motiva usled skraćenja karboksi kraja kada se poredi sa Shiga toksin A Podjedinicom i/ili Shiga toksin A1 fragmentom.
U određenim primerima izvođenja, efektorski polipeptid Shiga toksina predmetnog obuhvataju (1) polipeptid izveden iz Shiga toksin A1 fragmenta koji ima karboksi kraj i (2) uništeni furinski odcepljeni motiv na karboksi kraju regiona polipeptida Shiga toksin A1 fragmenta; pri čemu je efektorski polipeptid Shiga toksina (i bilo koji ćelijski ciljani molekul koji ga sadrži) otporniji na cepanje furina u odnosu na referentni molekul, kao što je, npr., polipeptid divljeg soja Shiga toksina koji sadrži karboksi kraj A1-fragmenta i/ili sačuvani furinski odcepljeni motiv između fragmenata A1 i A2. Na primer, redukcija u cepljenja furina jednog molekula u poređenju sa referentnim molekulom može se odrediti upotrebom in vitro analize cepanja furina opisanog u Primerima koji su navedeni u nastavku, sprovedenog koristeći iste uslove, a zatim izvođenjem kvantacije gustine opsega od bilo kojih fragmenata koji su rezultat cepanja da bi se kvantitativno odmerila promena u cepanju furina.
U određenim primerima izvođenja, efektorski polipeptid Shiga toksina otporniji je na cepanje furina u vitro i/ili u vivo u poreÿenju sa divljim tipom A Podjedinice Shiga toksina.
Uopšteno, osetljivost na cepanje proteaze ćelijski ciljanog molekula predmetnog pronalaska je testirana poređenjem sa istim molekulom koji ima svoj otporni na cepanje furinom, efektorski polipeptid Shiga toksina zamenjen efektorskim polipeptidom divljeg soja Shiga toksina koji sadrži Shiga toksin A1 fragment. U nekim primerima izvođenja, molekuli predmetnog pronalaska koji sadrže furinski odcepljeni motiv pokazuju redukciju u in vitro cepanju furina za 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98% ili više u poređenju sa referentnim molekulom koji sadrži divlji soj Shiga toksin A1 fragmenta spojen na svom karboksi kraju sa peptidom ili polipeptidom, kao što je, na primer, referentni molekul SLT-1A-WT::scFv-1 opisan u Primeru 2, u nastavku.
Opisano je uništenje nekoliko furinsko odcepljenih motiva. Na primer, mutiranje dva sačuvana arginina na alanini u minimalnom R-x-x-R motivu potpuno blokira obradu sa furinom i/ili proteazom sličnom furinu (videti npr. Duda A et al., J Virology 78: 13865-70 (2004)). Budući da se mesto furinskog cepanja motiva sastoji od dvadesetak amino kiselinskih ostataka, u teoriji, određene mutacije koje uključuju jednu ili više bilo kojih od ovih
1
dvadeset, pozicija amino kiselinskih ostataka mogu ukinuti cepanje furina ili smanjiti efikasnost cepanja furina (videti npr. Tian S et al., Sci Rep 2: 261 (2012)).
U određenim primerima izvođenja, molekuli predmetnog pronalaska sadrže efektorski polipeptid Shiga toksina izvedenog is najmanje jedne A Podjedinice člana familije Shiga toksina pri čemu efektorski polipeptid Shiga toksina obuhvata uništenje jedni ili više amino kiselina izvedenih iz očuvane, veoma dostupne, osetljive petlje cepanja proteaze Shiga toksin A Podjedinice. Na primer, u StxA i SLT-1A, ova visoko dostupna, proteazno osetljiva petlja je izvorno pozicionirana iz amino kiselinskih ostataka 242 do 261, a u SLT-2A, ova sačuvana petlja je izvorno pozicionirana iz amino kiselinskih ostataka 241 do 260. Na osnovu homologije polipeptidne sekvence, stručnjak može da identifikuje ovu očuvanu, vrlo dostupnu strukturnu petlju u ostalim Shiga toksin A Podjedinicama. Određene mutacije na amino kiselinskim ostacima u ovoj petlji mogu smanjiti dostupnost određenih amino kiselinskih ostataka unutar petlje do proteolitičkog cepanja i to može umanjiti osetljivost na cepanje furina.
U određenim primerima izvođenja, molekul predmetnog pronalaska sadrži efektorski polipeptid Shiga toksina koji sadrži furinski odcepljeni motiv, koji sadrži mutaciju na površinski izloženoj petlji osetljivoj na proteazu, sačuvanu među Shiga toksin A Podjedinicama. U određenim daljim primerima izvođenja, molekul predmetnog pronalaska sadrži efektorski polipeptid Shiga toksina koji sadrži furinski odcepljeni motiv koji sadrži mutaciju u ovoj proteaza osetljivoj petlji Shiga toksin A Podjedinica, mutacija koja smanjuje površinsku pristupačnost određenih amino kiselina ostaci unutar petlje, tako da je smanjena osetljivost na cepanje furina.
U određenim primerima izvođenja, uništeni furinsko odcepljeni motiv efektorskog polipeptida Shiga toksina predmetnog pronalaska sadrži uništenje u pogledu postojanja, položaja ili funkcionalne grupe jednog ili oba konsenzusa amino kiselinska ostatka P1 i P4, kao što su, na primer, amino kiselinski ostaci u pozicijama 1 i 4 minimalnog furinski odcepljenog motiva R/Y-x-x-R. Na primer, mutiranje jednog ili oba ostatka arginina na minimalnom, furin konsenzusnom mestu R-x-x-R na alaninu će uništiti furinsko odcepljeni motiv i sprečiti cepanje furina na tom mestu. Slično tome, supstitucije amino kiselinskih ostataka jednog ili oba ostatka arginina u minimalnom furinsko odcepljenom mestu R-x-x-R na bilo koji nekonzervativni amino kiselinski ostatak koji je poznat stručnjaku će smanjiti osetljivost furinski odcepljenog motiva. Naročito, supstitucije amino kiselinskih ostataka arginina bilo kojim osnovnim amino kiselinskim ostatkom koji nema pozitivno naelektrisanje, kao što je, npr., A,
11
G, P, S, T, D, E, Q, N, C, I, L, M, V, F, W, i Y, će rezultovati u uništenom furinski odcepljenom motivu.
U određenim primerima izvođenja, uništeni furinski odcepljeni motiv efektorskog polipeptida Shiga toksina predmetnog pronalaska obuhvata uništenje u razmaku između konsenzusnih amino kiselinskih ostataka P4 i P1 u smislu broja intervenirajućih amino kiselinskih ostataka koji nije dva, i, prema tome, promena ili P4 i/ili P1 u drugi položaj i eliminisanje P4 i/ili P1 oznaka. Na primer, uništenje unutar furinski odcepljenog motiva minimalnog mesta cepanja furina ili jezgra, furinski odcepljeni motiv smanjuje osetljivost na cepanje furina furinskog odcepljenog motiva.
U određenim primerima izvođenja, uništeni furinski odcepljeni motiv sadrži jednu ili više supstitucija amino kiselinskih ostataka, u poređenju sa divljim sojem, Shiga toksin A Podjedinice. U određenim daljim primerima izvođenja, furinski odcepljeni motiv sadrži jednu ili više supstitucija amino kiselinskih ostataka unutar minimalnog mesta cepanja furina R/Y-xx-R, kao što je, npr., za StxA i SLT-1 A izvedeni efektorski polipeptidi Shiga toksina, izvorno pozicionirani amino kiselinski ostatak R248 supstituisan sa bilo kojim negativno naelektrisanim, amino kiselinskim ostatkom i/ili R251 R248 supstituisan sa bilo kojim negativno naelektrisanim, amino kiselinskim ostatkom; i za SLT-2A izvedeni efektorski polipeptidi Shiga toksina, izvorno pozicionirani amino kiselinski ostatak Y247 supstituisan sa bilo kojim negativno naelektrisanim napunjenim, amino kiselinskim ostatkom i/ili R250 supstituisan sa bilo kojim negativno naelektrisanim napunjenim, amino kiselinskim ostatkom.
U određenim primerima izvođenja, uništenje furinski odcepljeni motiv sadrži ne-uništeno, minimalno mesto cepanja furina R/Y-x-x-R ali umesto toga sadrži uništeni bočni region, kao što su, npr., supstitucije amino kiselinskih ostataka u jednoj ili više amino kiselinskih ostataka u bočnim regionima furinski odcepljenog motiva, koji se nalaze u poziciji koja se nalazi, npr., 241-247 i/ili 252-259. U nekim drugim primerima izvođenja, furinski odcepljeni motiv obuhvata supstituciju jednog ili više amino kiselinskih ostataka smeštenih u P1-P6 regionu furinsko odcepljenom motivu; mutiranje P1' u velikoj amino kiselini, kao što su, na primer, R, V, I, F i H; i mutiranje P2' na polarnom i hidrofilnom amino kiselinskom ostatku; i supstituisanje jednog ili više amino kiselinskih ostataka smeštenih u P1'-P6 ' regionu furinski odcepljenog motiva sa jednim ili više glomaznih i hidrofobnih amino kiselinskih ostataka.
U određenim primerima izvođenja, uništenje furinski odcepljeni motiv sadrži brisanje, umetanje, inverziju i/ili mutaciju najmanje jednog amino kiselinskog ostatka unutar furinski odcepljenog motiva. U određenim primerima izvođenja, otporni na cepljenje proteaze, efektorski polipeptid Shiga toksina predmetnog pronalaska može sadržati uništenu sekvencu amino kiseline koja je izvorno postavljena na 249-251 A Podjedinicu Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO: 1) ili Shiga toksina (SEQ ID NO:2), ili na 247-250 A Podjedinice Shiga-sličnog toksina 2 (SEQ ID NO:3) ili ekvivalentna pozicija u očuvanom efektorskom polipeptidu Shiga toksina i/ili ne izvornoj sekvenci efektorskog polipeptida Shiga toksina. U nekim daljim primerima izvođenja, otporni na cepanje proteaze, efektorski polipeptid Shiga toksina sadrži uništenje koje obuhvata brisanje najmanje jedne amino kiseline unutar furinski odcepljenog motiva. U nekim daljim primerima izvođenja, otporni na cepanje proteaze, efektorski polipeptid Shiga toksina sadrže uništenje koje sadrži umetanje najmanje jedne amino kiseline unutar regiona proteaznog cepanja motiva. U nekim daljim primerima izvođenja, otporni na cepanje proteaze, efektorski polipeptid Shiga toksina sadrže uništenje koje obuhvata inverziju amino kiselina, pri čemu je najmanje jedna invertirana amino kiselina u regionu motiva proteaze. U određenim daljim primerima izvođenja, otporni na cepljenje proteaze, efektorski polipeptid Shiga toksina sadrže uništenje koje sadrži mutaciju, kao što je supstitucija amino kiseline ne-standardnoj amino kiselini ili amino kiselina sa hemijski modifikovanim bočnim lancem. Primeri pojedinačnih supstitucija amino kiselina navedeni su u Primerima koji su navedeni u nastavku.
U određenim primerima izvođenja molekula predmetnog pronalaska, uništeni furinski odcepljeni motiv sadrži brisanje devet, deset, jedanaest ili više karboksi krajnjih ostataka amino kiselina unutar furinski odcepljenog motiva. U ovim primerima izvođenja, furinski odcepljeni motiv neće sadržati mesto cepanja furina ili minimalni furinski odcepljeni motiv. Drugim rečima, određenim primerima izvođenja nedostaje mesto cepanja furina na karboksi kraju regiona A1 fragment.
U određenim primerima izvođenja, uništeni furinski odcepljeni motiv sadrži i brisanje amino kiselinskih ostataka i supstituciju amino kiselinskih ostataka u poređenju sa divljim sojem, Shiga toksin A Podjedinice. U određenim daljim primerima izvođenja, furinski odcepljeni motiv sadrži jedno ili više brisanja i supstitucija amino kiselina unutar minimalnog mesta cepanja furina R/Y-x-x-R, kao što je, npr., za StxA i SLT-1 A izvedeni efektorski polipeptid Shiga toksina, izvorno pozicionirani amino kiselinski ostatak R248 supstituisan sa bilo kojim negativno naelektrisanim, amino kiselinskim ostatkom i/ili R251 supstituisan sa bilo kojim negativno naelektrisanim, amino kiselinskim ostatkom; i za SLT-2A izvedeni efektorski polipeptid Shiga toksina, izvorno pozicionirani amino kiselinski ostatak Y247 supstituisan sa bilo kojim negativno naelektrisanim napunjenim, amino kiselinskim ostatkom i/ili R250 supstituisan sa bilo kojim negativno naelektrisanim napunjenim, amino kiselinskim ostatkom.
U određenim primerima izvođenja, uništeni furinski odcepljeni motiv sadrži brisanje amino kiselinskih ostataka i supstituciju amino kiselinskih ostataka, kao i skraćenje karboksi kraja u poređenju sa divljim sojem, Shiga toksin A Podjedinice. U određenim daljim primerima izvođenja, furinski odcepljeni motiv sadrži jedno ili više brisanja i supstitucija amino kiselina unutar minimalnog mesta cepanja furina R/Y-x-x-R, kao što je, npr., za StxA i SLT-1 A izvedeni efektorski polipeptid Shiga toksina, izvorno pozicionirani amino kiselinski ostatak R248 supstituisan sa bilo kojim negativno naelektrisanim napunjenim, amino kiselinskim ostatkom i/ili R251 supstituisan sa bilo kojim negativno naelektrisanim napunjenim, amino kiselinskim ostatkom; i za SLT-2A izvedeni efektorski polipeptid Shiga toksina, izvorno pozicionirani amino kiselinski ostatak Y247 supstituisan sa bilo kojim negativno naelektrisanim napunjenim, amino kiselinskim ostatkom i/ili R250 supstituisan sa bilo kojim negativno naelektrisanim napunjenim, amino kiselinskim ostatkom.
U određenim primerima izvođenja, uništeni furinski odcepljeni motiv sadrži i amino kiselinsku supstituciju unutar minimalnog mesta cepanja furina R/Y-x-x-R i skraćivanje karboksi raja kada se poredi sa divljim sojem, Shiga toksin A Podjedinice, kao što je, npr., za StxA i SLT-1 A izvedene efektorske polipeptide Shiga toksina, skraćenja koja završavaju na početnoj amino kiselinskoj poziciji 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, ili veće i koji sadrži izvorno pozicionirani amino kiselinski ostatak R248 i/ili R251 supstituisan bilo kojim negativno naelektrisanim napunjenim, amino kiselinskim ostatkom; i za SLIF-2A izvedene efektorske polipeptide Shiga toksina, skraćenja koja završavaju na izvornoj amino kiselinskoj poziciji 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, li veće i koji sadrži izvorno pozicionirani amino kiselinski ostatak Y247 i/ili R250 supstituisan bilo kojim negativno naelektrisanim napunjenim, amino kiselinskim ostatkom gde je odgovarajuće.
U određenim primerima izvođenja, uništeni furinski odcepljeni motiv sadrži ubacivanje jednog ili više amino kiselinskih ostataka u poređenju sa divljim sojem, Shiga toksin A Podjedinice sve dok umetnut(i) amino ostatak(c)i ne stvaraju de novo furinsko mesto cepanja. U određenim daljim primerima izvođenja, furinski odcepljeni motiv sadrži jedno ili
11
više brisanja i supstitucija amino kiselina unutar minimalnog mesta cepanja furina R/Y-x-x-R, kao što je, npr., za StxA i SLT-1 A izvedene polipeptide koje sadrže ubacivanje jednog ili više amino kiselinskih ostataka na 249 ili 250 i stoga između R248 i R251; ili SLT-2A izvedene polipeptide koje sadrže ubacivanje jednog ili više amino kiselinskih ostataka na 248 ili 249 i stoga između Y247 i R250.
U određenim primerima izvođenja, uništeni furinski odcepljeni motiv sadrži i ubacivanje amino kiselinskih ostataka i skraćenje karboksi kraja u poređenju sa divljim sojem, Shiga toksin A Podjedinice. U nekim primerima izvođenja, furinski odcepljeni motiv obuhvata i ubacivanje amino kiselinskih ostataka i supstituciju amino kiselinskih ostataka u poređenju sa divljim sojem, Shiga toksin A Podjedinice. U određenim primerima izvođenja, furinski odcepljeni motiv obuhvata i umetanje amino kiselinskih ostataka i brisanje ostataka amino kiselina u poređenju sa divljim sojem, Shiga toksin A Podjedinice.
U određenim primerima izvođenja, uništeni furinski odcepljeni motiv sadrži brisanje amino kiselinskih ostataka, ubacivanje amino kiselinskih ostataka i supstituciju amino kiselinskih ostataka u poređenju sa divljim sojem, Shiga toksin A Podjedinice.
U određenim primerima izvođenja, uništeni furinski odcepljeni motiv brisanje amino kiselinskih ostataka, umetanje, supstituciju i skraćenje karboksi kraja u poređenju sa divljim sojem, Shiga toksin A Podjedinice.
U određenim primerima izvođenja, efektorski polipeptid Shiga toksina koji sadrži uništeni furinski odcepljeni motiv je direktno spojen peptidnom vezom za molekularnu jedinicu koja sadrži amino kiselinu, peptid i/ili polipeptid, pri čemu spojena struktura uključuje jedan kontinuirani polipeptid. U ovim primerima spajanja, amino kiselinska sekvenca koja prati uništeni furinski odcepljeni motiv ne bi trebalo da stvara de novo, mesto cepanja furina na mestu spajanja.
Bilo koji od gore navedenih otpornih na cepljenje proteaze, pod-regiona efektorskog polipeptida Shiga toksina i/ili furinski odcepljenog motiva mogu se koristiti sami ili u kombinaciji sa svakom pojedinačnom realizacijom ovog pronalaska, uključujući metode ovog pronalaska.
C. T-Ćelijski Hiper-Imunizovani, Efektorski Polipeptidi Shiga Toksin A Podjedinice
U određenim primerima izvođenja, efektorski polipeptid Shiga toksina predmetnog pronalaska obuhvata ugrađeni ili ubačeni epitope-peptid. U određenim daljim primerima izvođenja, epitop-peptid je heterologan, T-ćelijski epitop-peptid, kao što je, npr., epitop koji se smatra heterološkim za Shiga toksin A Podjedinice. U nekim daljim primerima izvođenja, epitop-peptid je CD8 T-ćelijski epitop. U nekim daljim primerima izvođenja, CD8 T-ćelijski epitop-peptid ima afinitet vezivanja za molekul MHC klase I koji je karakterističan konstantom disocijacije (KD) od 10<-4>mola ili manje i/ili rezultirajući MHC kompleks I-epitoppeptid ima afinitet vezanja na T-ćelijski receptor (TCR) koji je karakterističan konstantom disocijacije (KD) od 10<-4>mola ili manje.
U određenim primerima izvođenja efektorski polipeptid Shiga toksina predmetnog pronalaska obuhvata ugrađeni ili ubačeni, heterologni, T-ćelijski epitop, kao što je, npr., humani CD8+ T-ćelijski epitop. U određenim drugim primerima izvođenja, heterologni, T-ćelijski epitop je ugrađen ili ubačen tako da poremeti endogeni epitop ili epitopski region (npr. B-ćelijski epitop i/ili CD4 T-ćelijski epitop) koji se može identifikovati u polipeptidu Shiga toksin koji se javlja u prirodi ili roditeljskom efektorskom polipeptidu Shiga toksin iz kojeg je izveden efektorski polipeptid Shiga toksina predmetnog pronalaska.
Za određene primere izvođenja predmetnog pronalaska, efektorski polipeptid Shiga toksina (i bilo koji ćelijski ciljani molekul koji ga sadrži) je CD8+ T-ćelijski hiper-imunizovan, kao što je, npr., kada se poredi sa polipeptidom divljeg soja Shiga toksina. CD8+ T-ćelijski hiperimunizovani, efektorski polipeptidi Shiga toksina predmetnog pronalaska svaki sadrži ugrađeni ili ubačeni T-ćelijski epitop-peptid. Hiper-imunizovani, efektorski polipeptidi Shiga toksina mogu se stvoriti iz efektorskih polipeptida Shiga toksina i/ili Shiga toksin A Podjedinice, bilo da se javljaju u prirodi ili ne, koristeći postupak koji je ovde opisan, opisan u WO 2015/113007, i/ili poznatu stručnjaku, pri čemu dobijeni molekul još uvek zadržava jednu ili više funkcija Shiga toksin A Podjedinice.
Za svrhe zahtevanog pronalaska, T-ćelijski epitop je molekularne strukture koji je obuhvaćen sa antigenskim peptidom i može biti predstavljen lineranom, amino kiselinskom sekvencom. Uobičajeno, T-ćelijski epitopi su peptidi veličine od osam do jedanaest amino kiselinskih ostataka (Townsend A, Bodmer H, Annu Rev Immunol 7: 601-24 (1989)); međutim, određeni T-ćelijski epitop-peptidi imaju dužinu manju od osam ili veću od jedanaest amino kiselina (videti npr. Livingstone A, Fathman C, Annu Rev Immunol 5: 477-501 (1987); Green K et al., Eur J Immunol 34: 2510-9 (2004)). U određenim primerima izvođenja, ugrađeni ili umetnuti epitop je najmanje sedam amino kiselinskih ostataka u dužini. U određenim primerima
11
izvođenja, ugrađeni ili umetnuti epitop je vezan sa TCR sa vezujućim afinitetom koji je okarakterisan sa KDmanjom 10 mM (npr.1-100 µM) kao što je izračunato korišćenjem formule u Stone J et al., Immunology 126: 165-76 (2009). Međutim, treba napomenuti da afinitet vezivanja u datom rasponu između MHC-epitopa i TCR možda ne odgovara korelaciji sa antigenošću i/ili imunogenošću (videti npr. Al-Ramadi B et al., J Immunol 155: 662-73 (1995)), poput faktora kao što su stabilnost MHC-peptid-TCR, gustina MHC-peptida i MHC-nezavisne funkcije TCR kofaktora kao što su CD8 (Baker B et al., Immunity 13: 475-84 (2000); Hornell T et al., JImmunol 170: 4506-14 (2003); Woolridge L et al., JImmunol 111: 6650-60 (2003)).
Heterološki, T-ćelijski epitop je epitop koji već nije prisutan u divljem soju Shiga toksin A Podjedinice; Shiga toksin A Podjedinice koja se javlja u prirodi; i / ili roditeljski, efektorski polipeptid Shiga toksina korišćen kao izvorni polipeptid za modifikaciju postupkom opisanim ovde, opisanom u WO 2015/113007, i/ili koji je poznat stručnjaku.
Heterološki, T-ćelijski epitop-peptid može biti ugrađen u izvorni polipeptid brojnim postupcima koji su poznati stručnjaku, uključujući, na primer, procese stvaranja jedne ili više amino kiselinskih supstitucija unutar izvornog polipeptida, spajajući jednu ili više amino kiselina na izvorni polipeptid, ubacivanje jedne ili više amino kiselina u izvorni polipeptid, povezivanje peptida sa izvornim polipeptidom i/ili kombinacija gore pomenutih procesa. Rezultat takvog postupka je stvaranje modifikovane varijante izvornog polipeptida koja sadrži jedan ili više ugrađenih ili ubačenih, heteroloških, T-ćelijskih epitop-peptida.
T-ćelijski epitopi mogu biti izabrani ili izvedeni iz više izvornih molekula za upotrebu u predmetnom pronalasku. T-ćelijski epitopi mogu biti stvoreni ili izvedeni iz različitih proteina koji se javljaju u prirodi. T-ćelijski epitopi mogu biti stvoreni ili izvedeni iz različitih proteina koji se javljaju prirodno, sisara, kao što su, na primer, proteini mikroorganizama. T-ćelijski epitopi mogu biti stvoreni ili izvedeni iz mutiranih humanih proteina i/ili humanih proteina koji su izgleda eksprimirani sa malignim ljudskim ćelijama. T-ćelijski epitopi mogu biti sintetički stvoreni ili izvedeni iz sintetskih molekula (videti npr., Carbone F et al., J Exp Med 167:
1767-9 (1988); Del Val M et al., J Virol 65: 3641-6 (1991); Appella E et al., Biomed Pept Proteins Nucleic Acids 1: 177-84 (1995); Perez S et al., Cancer 116: 2071-80 (2010)).
Iako se smatra da se bilo koji T-ćelijski epitop-peptid koristi kao heterologni, T-ćelijski epitop predmetnog pronalaska, određeni epitopi mogu biti odabrani na osnovu poželjnih svojstava. Jedan cilj predmetnog pronalaska je stvaranje CD8+ T-ćelijskih hiper-imunizovanih
11
efektorskih polipeptida Shiga toksina za davanje kičmenjacima, što znači da je heterologni, T-ćelijski epitop visoko imunogen i da može da izazove snažne imune odgovore in vivo kada su prikazani kompleksno sa molekulom MHC klase I na površini ćelije. U određenim primerima izvođenja, efektorski polipeptid Shiga toksina predmetnog pronalaska sadrži jedan ili više, ugrađenih ili ubačenih, heterolognih T-ćelijskih epitopa koji su CD8 T-ćelijski epitopi. Efektorski polipeptid Shiga toksina predmetnog pronalaska koji sadrži heterologni, CD8 T-ćelijski epitop se smatra CD8 T ćelijski hiper-imunizovanim, efektorskim polipeptidom Shiga toksina.
Komponente T-ćelijskog epitopa predmetnog pronalaska mogu biti izabrane ili izvedene iz većeg broja izvornih molekula za koje je već poznato da su sposobni da izazovu imuni odgovor na kičmenjaka. T-ćelijski epitopi mogu da se dobiju iz različitih proteina koji se javljaju u prirodi, drugačijih od kičmenjaka, kao što su, npr., proteini patogenih mikroorganizama i samo-anti, antigeni kancera. Konkretno, zarazni mikroorganizmi mogu sadržati brojne proteine poznatih antigenskih i/ili imunogenskih svojstava. Nadalje, zarazni mikroorganizmi mogu sadržavati brojne proteine sa poznatim antigenskim i/ili imunogenskim pod-regionima ili epitopima.
Na primer, proteini intraćelijskih patogena kod sisara domaćina su izvori za T ćelijske epitope. Postoje brojni intraćelijski patogeni, poput virusa, bakterija, gljivica i jednoćelijskih eukariota, sa dobro proučenim antigenim proteinima ili peptidima. T-ćelijski epitopi mogu biti odabrani ili identifikovani iz humanih virusa ili drugih intraćelijskih patogena, kao što su, npr., bakterije poput mikobakterija, gljivica poput toksoplazmi, i protisti kao što su tripanozomi.
Na primer, postoji mnogo imunogenih, virusnih peptidnih komponenata virusnih proteina iz virusa koji su zarazni za ljude. Brojni, humanih T-ćelijski epitopi su mapirani na peptide unutar proteina virusa gripe A, kao što su peptidi u proteinima HA glikoproteina FE17, S139/1, CH65, C05, hemaglutinin 1 (HA1), hemaglutinin 2 (HA2), nestrukturni protein 1 i 2 (NS1 i NS2), matriks proteini 1 i 2 (M1 i M2), nukleoprotein (NP), neuraminidaza (NA)), i mnogi od ovih peptida su pokazali da izazivaju humani imuni odgovor, kao što je korišćenje ex vivo analize. Slično tome, brojni humanih T-ćelijski epitopi preslikani su na peptidne komponente proteina iz humanih citomegalovirusa (HCMV), kao što su peptidi u proteinima pp65 (UL83), UL128-131, neposredno-rano 1 (IE-1; UL123), pokazano je da glikoprotein B, proteini tegument i mnogi od ovih peptida izazivaju humani imuni odgovor, kao što je korišćenje ex vivo analiza.
11
Drugi primer je da kod ljudi postoji mnogo imunogenskih antigena kancera. Stručnjak može identifikovati CD8 T-ćelijske epitope kancera i/ili antigene tumorskih ćelija tehnikama poznatim u struci, kao što su, na primer, diferencijalna genomika, diferencijalna proteomika, imunoproteomija, predviđanje, zatim validacija, i genetski pristupi poput obrnute-genetske transfekcije (videti npr., Admon A et al., Mol Cell Proteomics 2: 388-98 (2003); Purcell A, Gorman J, Mol Cell Proteomics 3: 193-208 (2004); Comber J, Philip R, TherAdv Vaccines 2: 77-89 (2014)). Postoji mnogo antigenskih i/ili imunogenski T-ćelijskih epitopa koji su već identifikovani ili se predviđaju da će se pojaviti u ćelijama kancera i/ili tumorskim ćelijama. Na primer, T-ćelijski epitopi su predviđeni u humanim proteinima koji su obično mutirani ili prekomerno eksprimirani u neoplastičnim ćelijama, kao što su, npr., ALK, CEA, N-acetilglukozaminil-transferaza V (GnT-V), HCA587, HER-2/neu, MAGE, Melan-A/MART-1, MUC-1, p53, i TRAG-3 (videti npr., van der Bruggen P et al., Science 254: 1643-7 (1991); Kawakami Y et al., J Exp Med 180: 347-52 (1994); Fisk B et al., J Exp Med 181: 2109-17 (1995); Guilloux Y et al., J Exp Med 183: 1173 (1996); Skipper J et al., J Exp Med 183: 527 (1996); Brossart P et al., 93: 4309-17 (1999); Kawashima I et al., Cancer Res 59: 431-5 (1999); Papadopoulos K et al., Clin Cancer Res 5: 2089-93 (1999); Zhu B et al., Clin Cancer Res 9: 1850-7 (2003); Li B et al., Clin Exp Immunol 140: 310-9 (2005); Ait-Tahar K et al., Int J Cancer 118: 688-95 (2006); Akiyama Y et al., Cancer Immunol Immunother 61: 2311-9 (2012)). Pored toga, stvorene su sintetičke varijante T-ćelijskog epitopa iz ćelija kancera čoveka (videti npr., Lazoura E, Apostolopoulos V, Curr Med Chem 12: 629-39 (2005); Douat-Casassus C et al., J Med Chem 50: 1598-609 (2007)).
Iako se bilo koji T-ćelijski epitop može koristiti u polipeptidima i molekulima predmetnog pronalaska, određeni T-ćelijski epitopi mogu biti poželjni na osnovu njihovih poznatih i/ili empirijski određenih karakteristika. Na primer, u mnogim vrstama MHC aleli u svom genomu kodiraju više MHC-I molekularnih varijanti. Budući da MHC proteinski polimorfizmi mogu da utiču na antigen-MHC klase I kompleksa prepoznatog od strane CD8 T-ćelija, T-ćelijski epitopi mogu biti izabrani za upotrebu u predmetnom pronalasku na osnovu saznanja o određenim MHC polimorfizmima i/ili sposobnosti nekih antigen-MHC klase I kompleksa koji će prepoznati T-ćelije koje imaju različite genotipove.
Postoje dobro definisani peptidni epitopi za koje se zna da su imunogeni, MHC klasa I ograničeni i/ili se podudaraju sa specifičnom varijantom humanog leukocitnog antigena (HLA). Za primenu kod ljudi ili uključivanjem humanih ciljanih ćelija, stručnjak može da odabere ili identifikuje epitope sa ograničenom HLA klasom I koristeći standardne tehnike poznate u tehnici. Sposobnost peptida da se vežu za humane molekule MHC klase I može
11
se upotrebiti za predviđanje imunogenog potencijala sumnjivih T-ćelijskih epitopa.
Sposobnost peptida da se vežu na humane molekule MHC klase I mogu se oceniti uz pomoću softverskih alata. T-ćelijski epitopi mogu biti izabrani za upotrebu kao heterologna, T-ćelijska epitopna komponenta predmetnog pronalaska na osnovu peptidne selektivnosti HLA varijanti kodiranih alelima koji su prevladavajući u određenoj ljudskoj populaciji. Na primer, ljudska populacija je polimorfna za alfa lanac molekula MHC klase I zbog različitih alela HLA gena od pojedinca do pojedinca. U određenim T-ćelijskim epitopima mogu biti efikasnije predstavljeni specifičnim HLA molekulima, kao što su, npr., uobičajene HLA varijante kodirane od HLA-A alelnih grupa HLA-A2 i HLA-A3.
Kada se bira T-ćelijski za upotrebu kao heterologna, T-ćelijska epitopna komponenta predmetnog pronalaska, može se uzeti u obzir više faktora koji mogu uticati na stvaranje epitopa i transport do receptivnih molekula MHC klase I, kao što su, na primer, prisustvo i specifičnost epitopa sledećih faktora u ciljanoj ćeliji: proteazoma, ERAAP/ERAP1, tapasin, i TAPs.
Kada se izaberu T-ćelijski epitopi za upotrebu kao heterologna, T-ćelijska epitopna komponenta predmetnog pronalaska, može se izabrati epitop koji najbolje odgovara molekulima MHC klase I koji su prisutni u ćelijskom tipu ili ćelijskoj populaciji koja će biti ciljana. Različiti molekuli klase MHC I pokazuju preferencijalno vezivanje za određene peptidne sekvence, a određeni kompleksi varijante peptida-MHC klase I posebno su prepoznati od strane receptora t-ćelija (TCR) efektorskih T-ćelija. Stručnjak može da koristi znanje o specifičnostima molekula MHC klase I i specifičnostima TCR da optimizira izbor heterolognih T-ćelijskih epitopa koji se koriste u predmetnom pronalasku.
Pored toga, više, imunogenih, T-ćelijskih epitopa za prezentaciju MHC klase I može biti ugrađeno u isti efektorski polipeptid Shiga toksina predmetnog pronalaska, kao što je, na primer, upotreba u ciljanoj isporuci mnoštva T-ćelijskih epitopa istovremeno. Primer ćelijski ciljanog molekula predmetnog pronalaska koji sadrži više CD8 T-ćelijskih epitopa je SEQ ID NO:26.
Bilo koji od rezistentnih cepanja proteaze, pod-regiona i/ili uništenih furinski odcepljenih motiva efektorskog polipeptida Shiga toksina koji su ovde opisani ovde mogu se koristiti sami ili u kombinaciji sa svakom pojedinačnim primerom izvođenja predmetnog, uključujući postupke predmetnog pronalaska.
11
II. Uopštena Struktura Ćelijski Ciljanih Molekula Pronalaska
Efektorski polipeptidi Shiga toksina predmetnog pronalaska pružaju robusne i snažne skele za nove inženjerske ćelijski ciljane molekule. Povezani vezujući regioni koji ciljaju ćeliju sa efektorskim polipeptidima Shiga toksin predmetnog pronalaska omogućavaju projektovanje terapeutskih i dijagnostičkih molekula sa poželjnim karakteristikama, kao što su, npr., deimunizacija, jaka citotoksičnost, efikasna intraćelijska usmeravanje, T-ćelijska hiperimunizacija, molekularna stabilnost i in vivo podnošljivost pri visokim dozama.
Predmetni pronalazak obezbeđuje različite ćelijski ciljane molekule, svaki sadrži (1) vezujući region koji cilja ćeliju i (2) efektorski polipeptid Shiga toksina predmetnog pronalaska.
Efektorski polipeptidi Shiga toksina predmetnog pronalaska mogu biti povezani i/ili kuplovani sa različitim, raznovrsnim komponentama koje ciljaju ćeliju (npr., molekulski ostatak i/ili agens) da bi se stvorili ćelijski ciljajući molekuli predmetnog pronalaska. Ćelijski ciljajući molekuli predmetnog pronalasku sadrže (1) vezujući region koji može specifično da vezuje ekstraćelijski deo ciljanog biomolekula i (2) region efektorskog polipeptida Shiga toksina koji sadrži efektorski polipeptid Shiga toksina predmetnog pronalaska.
Efektorski polipeptidi Shiga toksina predmetnog pronalaska mogu biti povezani sa jednim ili više vezujućih regiona, koji ciljaju ćeliju, koji posreduju ciljanje ćelije preko specifičnog vezivanja za ekstraćelijske delove ciljanih biomolekula, kao što je, npr., ciljani biomolekula koji je fizički spojen za ćelijsku površinu ćelije. Jedan neograničavajući primer ćelijski ciljanog molekula predmetnog pronalaska je efektorski polipeptid Shiga toksina predmetnog pronalaska spojenog za proteinski, ćelijski ciljani, vezujući region, kao što je, npr., vezujući region imunoglobulinskog tipa.
A. Vezujući Regioni
U određenim primerima izvođenja, vezujući region ćelijski ciljanog molekula predmetnog pronalaska je komponenta za ciljanje ćelija, kao što je, npr., domen, molekulski ostatak, ili agens, sposoban da se veže specifično za ekstraćelijski deo ciljanog biomolekula (npr. ekstraćelijski ciljani biomolekul) sa visokim afinitetom. Postoje brojni tipovi vezujućih regiona koji su poznati stručnjaku ili koje stručnjak može otkriti koristeći tehnike koje su poznate u tehnici. Na primer, svaka komponenta za ciljanje ćelija koja pokazuje potrebne karakteristike vezivanja koje su ovde opisane se može koristiti kao vezujući region u određenim primerima izvođenja ćelijski ciljanih molekula predmetnog pronalaska.
12
Ekstraćelijski deo ciljanog biomolekula se odnosi na deo njegove strukture izložen ekstraćelijskom okruženju kada se molekul fizički spaja sa ćelijom, kao što je, npr., kada se ciljani biomolekul iskazuje na ćelijskoj površini od strane ćelije. U tom kontekstu, izložen ekstraćelijskom okruženju znači da je deo ciljanog biomolekula dostupno, npr., od strane antitela ili barem vezujućeg ostatka koji je manji od antitela, kao što je domen antitela sa jednim domenom, nano antitelo, domen antitela teškog lanca izveden iz kamile ili hrskavičnih riba, jedno-lančani varijabilni fragment, ili bilo koji broj inženjerskih alternativnih skela na imunoglobulinima (videti u nastavku). Izloženost ekstraćelijskom okruženju ili dostupnost delu ciljanog biomolekula fizički spojenog sa ćelijom može empirijski odrediti stručnjak koristeći postupke dobro poznate u tehnici.
Vezujući region ćelijski ciljanog molekula predmetnog pronalasku može biti, npr., ligand, peptid, vezujući region imunoglobulinskog tipa, monoklonsko antitelo, konstruisani derivat antitela, ili konstruisano alternativno antitelo.
U određenim primerima izvođenja, vezujući region ćelijski ciljanog molekula predmetnog pronalaska jeste proteinski ostatak sposoban da se specifično veže za ekstraćelijski deo ciljanog biomolekula sa visokim afinitetom. Vezujući region ćelijski ciljanog molekula predmetnog pronalasku može sadržati jedan ili više raznih peptidnih ili polipeptidnih ostataka, kao što su nasumično generisane peptidne sekvence, izvorni ligandi ili njegovi derivati, imunoglobulinski izvedeni domeni, sintetski konstruisani skeleti kao alternativa na imunoglobulinske domene, i slično (videti npr., WO 2005/092917; WO 2007/033497; Cheung M et al., Mol Cancer 9: 28 (2010); US 2013/0196928; WO 2014/164693; WO 2015/113005; WO 2015/113007; WO 2015/138452; WO 2015/191764). U određenim primerima izvođenja, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska obuhvata vezujući region koji sadrži jedan ili više polipeptida sposobni za selektivno i specifično vezivanje ekstraćelijskog ciljanog biomolekula.
Postoji veliki broj vezujućih regiona koji su poznati u tehnici i koja su korisna za ciljanje molekula za određene ćelijske tipove preko njihovih vezujućih karakteristika, kao što su određeni ligandi, monoklonska antitela, konstruisani derivati antitela, i konstruisane alternative u odnosu na antitela.
Prema jednom specifičnom, ali neograničavajućem aspektu, vezujući region ćelijski ciljanog molekula predmetnog pronalaska sadrži ligand ili njegov derivat koji se javlja u prirodi koji zadržava funkcionalnost vezivanja za ekstraćelijski ciljani biomolekul, obično receptor ćelijske površine. Na primer, različiti citokini, faktori rasta i hormoni koji su poznati u stanju tehnike mogu se koristiti za ciljanje ćelijski ciljanog molekula predmetnog pronalaska na ćelijsku površinu specifičnih ćelijskih tipova koji ekspresiraju kognitivni citokinski receptor, receptor faktora rasta ili hormon receptor. Određeni neograničavajući primeri ligandi uključuju (alternativni nazivi su naznačeni u zagradama) angiogenin, B-ćelijski aktivacioni faktori (BAFFs, APRIL), faktori koji stimulišu koloniju (CSFs), epidermalni faktori rasta (EGFs), fibroblastni faktori rasta (FGFs), vaskularni endotelialni faktori rasta (VEGFs), faktori rasta slični insulinu (IGFs), interferoni, interleukini (kao što su IL-2, IL-6, i IL-23), nervni faktori rasta (NGFs), faktori rasta izvedeni iz trombocita, transformišući faktori rasta (TGFs), i faktori nekroze tumora (TNFs).
Prema određenim drugim primerima izvođenja ćelijski ciljanih molekula predmetnog pronalaska, vezujući region obuhvataju sintetički ligand sposoban da veže ekstraćelijski ciljani biomolekul (videti npr. Liang S et al, J Mol Med 84: 764-73 (2006); Ahmed S et al., Anal Chem 82: 7533-41 (2010); Kaur K et al., Methods Mol Biol 1248: 239-47 (2015)).
U određenim primerima izvođenja, vezujući region obuhvata peptidomimetik, kao što je, npr., AApeptid, gama-AApeptid, i/ili sulfono-y-AApeptid (videti npr., Pilsl L, Reiser O, Amino Acids 41: 709-18 (2011); Akram O et al., Mol Cancer Res 12: 967-78 (2014); Wu H et al., Chemistry 21: 2501-7 (2015); Teng P et al., Chemistry 2016 Mar 4)).
Prema jednom specifičnom, ali neograničavajućem aspektu, vezujući region može da sadrži vezujući region imunoglobulinskog tipa. Termin "vezujući region imunoglobulinskog tipa" kako se ovde koristi odnosi se na polipeptidni region koji može da vezuje jedan ili više ciljanih biomolekula, kao što je antigen ili epitop. Vezujući regioni mogu se funkcionalno definisati njihovom sposobnošću da se vežu za ciljane molekule. Vezujući regioni imunoglobulinskog tipa su obično izvedeni iz antitela ili strukture koja je slična antitelu; međutim, alternativni skeleti iz drugih izvora razmatraju se u okviru termina.
Proteini imunoglobulina (Ig) imaju strukturni domen poznat kao Ig domen. Ig domeni se kreću u dužini od oko 70-110 amino kiselinskih ostataka i imaju karakterističan Ig-nabor, u kome se obično 7 do 9 antiparalnih beta lanaca raspoređuje u dva beta lista koja obrazuju sendvič strukturu. Ig nabor je stabilizovan sa hidrofobnim amino kiselinskim interakcijama na unutrašnjim površinama sendviča i visoko očuvanim disulfidnim vezama između cisteinskih ostataka u lancima. Ig domeni mogu biti promenljivi (IgV ili V-set), konstantni (IgC ili C-set) ili intermedijarni (Igl ili I-set). Neki Ig domeni mogu biti povezani sa regionom koji određuje komplementarnost (CDR), takođe se naziva i „komplementarni određujući region“, što je važno za specifičnost antitela koje se vezuju za njihove epitope. Ig-slični domeni se takođe nalaze u ne-imunoglobulinskim proteinima i na osnovu toga su klasifikovani kao članovi Ig superfamilije proteina. HUGO Komitet Genetske Nomenklature (HGNC) daje spisak članova Ig-sličnih domena koje sadrži familija.
Vezujući region imunoglobulinskog tipa može biti polipeptidna sekvenca antitela ili njegovog antigenskog vezujućeg fragmenta pri čemu amino kiselinska sekvenca varira od onog antitela koji se javlja u prirodi ili Ig-sličnog domena ne-imunoglobulinskog proteina, na primer molekularnim inženjeringom ili selekcijom bibliotetskim skriningom. Zbog važnosti tehnika rekombinantne DNK i in vitro bibliotetskog skrininga u generisanju regiona koji vezuju imunoglobulin, antitela se mogu redizajnirati tako da dobiju željene karakteristike, kao što su manja veličina, unos ćelije ili druga poboljšanja za in vivo i/ili terapijske aplikacije. Moguće varijacije su mnoge i mogu se kretati od promene samo jedne amino kiseline do potpunog redizajna, na primer, varijabilnog regiona. Tipično, promene u varijabilnom regionu će se izvršiti u cilju poboljšanja karakteristika vezivanja antigena, poboljšanja stabilnosti varijabilnog regiona ili smanjenja potencijala za imunogene odgovore.
Postoje brojne vezujući regioni imunoglobulinskog tipa za koje se smatra da su komponente predmetnog pronalaska. U nekim primerima izvođenja, vezujući region imunoglobulinskog tipa je izveden iz vezujućeg regiona imunoglobulina, kao što je paratop antitela koji može da vezuje ekstraćelijski ciljani biomolekul. U nekim drugim primerima izvođenja, vezujući region imunoglobulinskog tipa sadrži konstruisani polipeptid koji nije izveden iz bilo kog imunoglobulinskog domene, ali koji funkcioniše kao imunoglobulinski vezujući region obezbeđivanjem vezivanje visokog afiniteta za ekstraćelijski ciljani biomolekul. Ovaj konstruisani polipeptid može opciono da uključuje polipeptidne skelete koji sadrže ili se sastoje u osnovi od komplementarnih određujućih regiona iz imunoglobulina kao što je ovde opisano.
Takođe postoje brojni vezujući regioni u stanju tehnike koji su korisni za ciljanje polipeptida na specifične ćelijske tipove preko njihovih vezujućih karakteristika visokog afiniteta. U određenim primerima izvođenja, vezujući region ćelijski ciljanog molekula predmetnog pronalaska je izabran iz grupe koja uključuje autonomne VHdomene, domene antitela sa jednim domenom (sdAbs), domene antitela teških lanaca izvedeni iz kamile (VHH fragmenti ili VHfragmenti domena), domeni antitela teškog lanca izvedeni iz kamiljih VHH fragmenata ili fragmenti VHdomena, domeni antitela teškog lanca izvedeni od hrskavičnih riba,
12
imunoglobulinski novi antigenski receptori (IgNARs), fragmenti VNAR, fragmenti jedno-lančani promenljivi (scFv) fragmenti, nanotela , Fd fragmenti koji se sastoje od teškog lanca i CH1 domena, jedno lančana Fv-CH3 minititela, fragmenti dimernog CH2 domena (CH2D), Fc domene koji vezuju antigen (Fcabs), izolovani komplementarni određujući region 3 (CDR3) fragmente, ograničeni okvirni region 3, CDR3, polipeptidi okvira 4 (FR3-CDR3-FR4), mali modularni domeni imunofarmaceutski (SMIP), scFv-Fc fuzije, multimerizirajući scFv fragmenti (diatela, triatela, tetratela), fragmenti sa promenljivim antitelom stabilizovanim disulfidom (Fv), fragmenti stabilizovani disulfidom koji vezuju antigen (Fab), koji se sastoje od domena VL, VH, CLi CH1, bivalentna nanotela, bivalentna mini antitela, bivalentni F(ab')2 fragmenti (Fab dimera) ), bispecifični tandemski VHH fragmenti, bispecifični tandemski scFv fragmenti, bispecifična nanotela, bispecifična minitela, i bilo koji genetski manipulisani duplikat iz prethodnog, koji zadržavaju svoj paratop i vezujuću funkciju (videti Ward E et al., Nature 341: 544-6 (1989); Davies J, Riechmann L, Biotechnology (NY) 13: 475-9 (1995); Reiter Y et al., Mol Biol 290: 685-98 (1999); Riechmann L, Muyldermans S, J Immunol Methods 231: 25-38 (1999); Tanha J et al., J Immunol Methods 263: 97-109 (2002); Vranken W et al., Biochemistry 41: 8570-9 (2002); Jespers L et al., J Mol Biol 337: 893-903 (2004); Jespers L et al., Nat Biotechnol 22: 1161-5 (2004); To R et al., J Biol Chem 280: 41395403 (2005); Saerens D et al., Curr Opin Pharmacol 8: 600-8 (2008); Dimitrov D, MAbs 1: 26-8 (2009); Weiner L, Cell 148: 1081-4 (2012); Ahmad Z et al., Clin Dev Immunol 2012: 980250 (2012)).
Postoji mnoštvo vezujućih regiona koji sadrže polipeptide izvedene iz konstantnih regiona imunoglobulina, kao što su, npr., konstruisani dimerni Fc domeni, monomerni Fes (mFcs), scFv-Fcs, VHH-Fcs, CH2 domeni, monomerni CH3s domeni (mCH3s), sintetski reprogramirani imunoglobulinski domeni, i/ili hibridne fuzije imunoglobulinskih domena sa ligandima (Hofer T et al., Proc Natl Acad Sci U. S. A.105: 12451-6 (2008); Xiao J et al., J Am Chem Soc 131: 13616-13618 (2009); Xiao X et al., Biochem Biophys Res Commun 387: 387-92 (2009); Wozniak-Knopp G et al., Protein Eng Des Sel 23289-97 (2010); Gong R et al., PLoS ONE 7: e42288 (2012); Wozniak-Knopp G et al., PLoS ONE 7: e30083 (2012); Ying T et al., J Biol Chem 287: 19399-408 (2012); Ying T et a\.,JBiol Chem 288: 25154-64 (2013); Chiang M et al., J Am Chem Soc 136: 3370-3 (2014); Rader C, Trends Biotechnol 32: 186-97 (2014); Ying T et al., Biochimica Biophys Acta 1844: 1977-82 (2014)).
U skladu sa određenim drugim primerima izvođenja, vezujući region sadrži konstruisani, alternativni skelet za imunoglobulinske domene. U struci su poznati alternativni skeleti koji pokazuju slične funkcionalne karakteristike kao strukture dobijene imunoglobulinom, poput visokog afiniteta i specifičnog vezivanja ciljanih biomolekula, i mogu da daju poboljšane karakteristike određenim domenima imunoglobulina, kao što su, na primer, veća stabilnost ili smanjena imunogenost. Uopšteno, alternativni skeleti imunoglobulina su manje od 20 kilodaltona, sastoje se od jednog polipeptidnog lanca, nemaju cisteinske ostatke i pokazuju relativno visoku termodinamičku stabilnost.
Za izvesne primere izvođenja ćelijski ciljani molekuli predmetnog pronalaska, vezujući regioni sadrže alternativni skelet izabran iz grupe koja uključuje autonomne VHdomene, pojedinačni domen antitela domena (sdAbs), domene antitela teškog lanca koji su izvedeni iz kamile (VHH fragmenti ili VHdomenski fragmenti), domene antitela teškog lanca koji su izvedeni iz kamiljih VHH fragmenata ili VHdomenskih fragmenata, domeni antitela teškog lanca izvedeni od hrskavičnih riba, imunoglobulinski novi antigenski receptori (IgNARs), fragmenti VNAR, fragmenti jedno-lančani promenljivi (scFv) fragmenti, nanotela , Fd fragmenti koji se sastoje od teškog lanca i CH1 domeni, permutovani Fvs (pFv), jednolančana Fv-CH3 minitela, dimerni CH2 domenski fragmenti (CH2D), Fc antigenski vezujući fragmenti (Fcabs), izolovani komlementarni određeni region 3 (CDR3) fragmenata, ograničeni okvirni region 3, CDR3, okvirni region 4 (FR3-CDR3-FR4) polipeptidi, mali modularni imunofarmaceutski (SMIP) domeni, scFv-Fc fuzije, multimerizirajući fragmenti scFv (dijatela, triatitela, tetratela), promenljivi stabilizovani disulfidom (Fv) fragmenti, fragmenti stabilizovani disulfidom koji vežu antigen (Fab) koji se sastoje od VL, VH, CLi CH1 domena, bivalentna nanotela, bivalentna minitela, bivalentni F(ab')2fragmenti (Fab dimeri), bispecifični tandemski VHH fragmenti, bispecifični tandemski scFv fragmenti, bispecifična nanotela, bispecifična minitela, i bilo koja genetički manipulisana komponenta prethodnog, koja zadržava svoju vezujuću funkcionalnost (Worn A, Pluckthun A, J Mol Biol 305: 989-1010 (2001); Xu L et al., Chem Biol 9: 933-42 (2002); Wikman M et al., Protein Eng Des Sel 17: 455-62 (2004); Binz H et al., Nat Biotechnol 23: 1257-68 (2005); Hey T et al., Trends Biotechnol 23 :514-522 (2005); Holliger P, Hudson P, Nat Biotechnol 23: 1126-36 (2005); Gill D, Damle N, Curr Opin Biotech 17: 653-8 (2006); Koide A, Koide S, Methods Mol Biol 352: 95-109 (2007); Byla P et al., J Biol Chem 285: 12096 (2010); Zoller F et al., Molecules 16: 2467-85 (2011); Alfarano P et al., Protein Sci 21: 1298-314 (2012); Madhurantakam C et al., Protein Sci 21: 1015-28 (2012); Varadamsetty G et al., J Mol Biol 424: 68-87 (2012); Reichen C et al., J Struct Biol 185: 147-62 (2014)).
Na primer, identifikovane su brojni alternativni skeleti koji se vezuju za ekstraćelijski receptor HER2 (videti npr. Wikman M et al., Protein Eng Des Sel 17: 455-62 (2004); Orlova A et al. Cancer Res 66: 4339-8 (2006); Ahlgren S et al., Bioconjug Chem 19: 235-43 (2008);
12
Feldwisch J et al., J Mol Biol 398: 232-47 (2010); U.S. patenti 5,578,482; 5,856,110;
5,869,445; 5,985,553; 6,333,169; 6,987,088; 7,019,017; 7,282,365; 7,306,801; 7,435,797; 7,446,185; 7,449,480; 7,560,111; 7,674,460; 7,815,906; 7,879,325; 7,884,194; 7,993,650; 8,241,630; 8,349,585; 8,389,227; 8,501,909; 8,512,967; 8,652,474; i U.S. patentna prijava 2011/0059090). Pored alternativnih formata antitela, sposobnost vezivanja na antitelo može se preneti ne-proteinskim jedinjenjima, kao što su, na primer, oligomeri, molekuli RNK, molekuli DNK, ugljeni hidrati i glikokaliksalkaksarereni (videti npr. Sansone F, Casnati A, Chem Soc Rev 42: 4623-39 (2013)) ili delimično proteinasta jedinjenja, kao što su, na primer, fenol-formaldehidni ciklički oligomeri u kombinaciji sa peptidima i kaliksarenskim peptidnim kompozicijama (videti npr. U.S.5,770,380).
Bilo koja od gore navedenih struktura vezujućeg regiona može se koristiti kao komponenta molekula predmetnog pronalaska sve dok komponenta vezujućeg regiona ima konstantu disocijacije od 10<-5>do 10<-12>mola po litru, poželjno manje od 200 nanomola (nM), prema ekstraćelijskom ciljanom biomolekulu.
U određenim primerima izvođenja, ćelijski ciljani molekuli predmetnog pronalaska sadrže efektorski polipeptid Shiga toksina predmetnog pronalaska povezan i/ili spojen na vezujuće regione koje može specifično da vezuje ekstraćelijski deo ciljanog biomolekula ili ekstra ćelijski ciljni biomolekul. Ekstraćelijski ciljani biomolekuli se mogu odabrati na osnovu brojnih kriterijuma, kao što je kriterijum opisan ovde.
B. Ekstraćelijski Ciljani Biomolekuli Vezani sa Vezujućim Regionima
U određenim primerima izvođenja, vezujući region ćelijski ciljani molekuli predmetnog pronalaska sadrže proteinski region koji se može vezati specifično za ekstraćelijski deo ciljanog biomolekula ili ekstraćelijski ciljani biomolekul, poželjno koji je fizički povezan sa površinom interesantnog tipa ćelije, kao što su, na primer, ćelija kancera, ćelija tumora, plazma ćelija, zaražene ćelije ili ćelije domaćina koji sadrže intraćelijski patogen. Ciljani biomolekuli koji su vezani za vezujući region ćelijski ciljanog molekula predmetnog pronalaska mogu obuhvatati biomarkere srazmerno ili isključivo prisutne na ćelijama kancera, imunim ćelijama i/ili ćelija zaraženim intraćelijskim patogenima, kao što su, na primer, virusi, bakterije, gljivice, prioni ili protozoi.
Izraz "ciljani biomolekul" odnosi na biološki molekul, obično proteinski molekul ili protein modifikovan post-translacionim modifikacijama, kao što je glikozilacija, koji je vezan
12
vezujućim regionom ćelijski ciljanog molekula predmetnog pronalaska što rezultira u ciljanju ciljanja ćelijski ciljanog molekula za određenu ćeliju, ćelijski tip i/ili lokaciji u multićelijskom organizmu.
Za potrebe predmetnog pronalaska, izraz "ekstraćelijski" u odnosu na ciljani biomolekul odnosi se na biomolekul koji ima bar deo svoje strukture izložen ekstraćelijskoj sredini. Izloženost ekstraćelijskog okruženja ili dostupnost delu ciljanog biomolekula spojenog sa ćelijom može empirijski odrediti stručnjak koristeći postupke dobro poznate u struci.
Neograničavajući primeri ekstraćelijski ciljanih biomolekula uključuju komponente ćelijske membrane, transmembranske proteinske proteine, biomolekule vezane ćelijskom membranom, biomolekule vezane za ćelijsku površinu i izlučene biomolekule.
U vezi sa predmetnim pronalaskom, fraza "fizički spojen" kada se koristi za opis ciljanog biomolekula znači kovalentnu i/ili nekovalentnu intermolekularnu interakciju koja spaja ciljani biomolekul ili njen deo sa spoljne strane ćelije, kao što je mnoštvo nekovalentnih interakcija između ciljanog biomolekula i ćelije u kojoj je energija svake pojedinačne interakcije reda najmanje oko 1-5 kiloKalorija (npr., elektrostatičke veze, vodonične veze, jonske veze, Van der Walls-ove interakcije, hidrofobne sile itd.). Svi proteini integralne membrane se mogu fizički povezati sa ćelijskom membranom, kao i proteinima periferne membrane. Na primer, ekstraćelijski ciljani biomolekul može da sadrži transmembransko opruženo područje, lipidno sidro, glikolipidno sidro i/ili da bude nekovalentno povezana (npr., putem nespecifičnih hidrofobnih interakcija i/ili interakcija vezivanja lipida) sa faktorom koji sadrži bilo koji jedan od gore navedenih.
Ekstraćelijski delovi ciljanog biomolekula mogu da obuhvataju različite epitope, uključujući nepromenjene polipeptide, polipeptide modifikovane dodatkom biohemijskih funkcionalnih grupa i glikolipide (videti npr. US 5,091,178; EP2431743).
Vezujući regioni ćelijski ciljanog molekula predmetnog pronalasku mogu biti dizajnirana ili odabrana na osnovu brojnih kriterijuma, kao što je ćelijski specifični izraz njihovih ciljanih biomolekula, fizička lokalizacija njihovih ciljanih biomolekula u odnosu na specifične ćelijske tipove, i/ili svojstva njihovih ciljanih biomolekula. Na primer, određeni ćelijski ciljani molekuli predmetnog pronalasku sadrže vezujuće regione sposobni da vezuju ciljane biomolekule ćelijske površine koje se na ćelijskoj površini eksprimiraju isključivo samo jednom vrstom ćelijskog tipa ili samo jednim tipom ćelija unutar multićelijskog organizma.. Poželjno je, ali nije i neophodno, da ekstraćelijski ciljani biomolekul bude intrinzično internalizovano ili da
12
bude lako primorana na internalizaciju tokom interakcije sa ćelijski ciljanim-molekulom predmetnog pronalaska.
Među određenim primerima izvođenja ćelijski ciljajućih molekula predmetnog pronalaska, vezujući region je izveden iz imunoglobulinskog tipa polipeptida odabranog za specifično i visoko-afinitetno vezivanje za površinski antigen na ćelijskoj površini kancera ili ćelije tumora, gde je antigen ograničen u ekspresiji na ćelije kancera ili tumora (videti Glokler J et al., Molecules 15: 2478-90 (2010); Liu Y et al., Lab Chip 9: 1033-6 (2009). U skladu sa drugim primerima izvođenja, vezujući region je izabran za specifično i visoko afinitetno vezivanje za površinski antigen na ćelijskoj površini ćelije kancera, gde je antigen prekomerno izražen ili preferirano izražen od ćelija kancera u poređenju sa ne-kancerom ćelije. Neki reprezentativni ciljani biomolekuli uključuju, ali nisu ograničeni na, sledeće nabrojane ciljeve povezane sa kancerima i/ili specifičnim tipovima imunih ćelija.
Mnogi vezujući regioni imunoglobulinskog tipa koji vezuju sa visokim afinitetom za ekstraćelijske epitope povezane sa ćelijama kancera su poznati stručnjaku, kao što su vezujući regioni koji vezuju bilo koji od sledećih ciljanih biomolekula: aneksin A1, B3 melanoma antigen, B4 melanoma antigen, CD2, CD3, CD4, CD 19, CD20 (B-limfocitni antigenski protein CD20), CD22, CD25 (interleukin-2 receptor IL2R), CD30 (TNFRSF8), CD37, CD38 (ciklična ADP ribozna hidroliza), CD40, CD44 (hijaluronan receptor), ITGAV (CD51), CD56, CD66, CD70, CD71 (transferin receptor), CD73, CD74 (HLA-DR antigenipridruženi invariantni lanac), CD79, CD98, endoglin (END, CD105), CD106 (VCAM-1), CD138, hemokinski receptor tipa 4 (CDCR-4, fusin, CD184), CD200, receptor faktora rasta sličan insulinu 1 (CD221), mucin 1 (MUC1, CD227, CA6, CanAg), molekul adhezije bazalnih ćelija (B-CAM, CD239), CD248 (endosialin, TEM1), receptor faktora nekroze tumora 10b (TNFRSF10B, CD262), receptor faktora nekroze tumora 13B (TNFRSF13B, TACI, CD276), receptor vaskularnog endotelnog faktora rasta 2 (KDR, CD309), molekul adhezije epitelnih ćelija (EpCAM, CD326), receptor 2 ljudskog epidermalnog faktora rasta (HER2, Neu, ErbB2, CD340), antigen raka 15-3 (CA15-3), antigen raka 19-9 (CA 19-9), rak antigen 125 (CA125, MUC16), CA242, molekularni ćelijski adhezivni molekuli povezani sa karcinoembrionskim antigenom (npr. CEACAM3 (CD66d) i CEACAM5), karcinoembrionski protein antigena (CEA), protein 4 sličnog transporteru holina (SLC44A4), hondroitin sulfat proteoglikan 4 (CSP4, MCSP, NG2), CTLA4, delta-slični proteini (npr. DLL3, DLL4), proteini ektonukleotid pirofosfataze / fosfodiesteraze (npr. ENPP3), endotelinski receptori (ETBRs), receptor faktora rasta epidermalnih (EGFR, ErbBl), receptor folata (FOLRs, npr. FRa), G-28, gangliozid GD2, gangliozid GD3, HLA-DrlO, HLA-DRB, receptor faktora rasta humanog
12
epidermalnog faktora rasta 1 (HER1), HER3/ErbB-3, receptor tipa Efrin 2 (EphB2), molekulski adhezivni epitelni ćelijski epitel (EpCAM), protein aktivacije fibroblasta (FAP / sepraza), gvanilil ciklaza c (GCC), receptor faktora rasta inzulina 1 (IGF1R), receptor interleukina 2 (IL-2R), receptor interleukina 6 (IL-6R), integrin alfa-V beta-3 (αvβ3), integrins alpha-V beta-5 (αvβ5), integrins alfa-5 beta-1 (α5β1), L6, cink transporter (LIV-1), MPG, melanoma-povezani antigen 1 protein (MAGE-1), melanoma-povezani antigen 3 (MAGE-3), mezotelin (MSLN), metaloreduktaza STEAP1, MPG, MS4A, NaPi2b, nektini (npr. nektin-4), p21, p97, polio virus receptor-sličan 4 (PVRL4), receptori aktivirani proteazom (kao što je PARI), prostanski specifični proteinski membranski antigeni (PSMAs), SLIT i NTRK-slični proteini (npr. SLITRK6), Thomas-Friedenreich antigen, transmembranski glikoprotein (GPNMB), trofoblast glikoproteini (TPGB, 5T4, WAIF1), i signal kalcijuma povezan sa tumorima transducers (TACSTDs, npr. Trop-2, EGP-1, etc.) (videti npr. Lui B et al., Cancer Res 64: 704-10 (2004); Novellino L et al., Cancer Immunol Immunother 54: 187-207 (2005); Bagley R et al., Int J Oncol 34: 619-27 (2009); Gerber H et al., mAbs 1: 247-53 (2009); Beck A et al., Nat Rev Immunol 10: 345-52 (2010); Andersen J et al., J Biol Chem 287: 22927-37 (2012); Nolan-Stevaux O et al., PLoS One 7: e50920 (2012); Rust S et al., Mol Cancer 12: 11 (2013)). Ova lista ciljanih biomolekula predviđena je da bude neograničavajuća. Stručnjak će razumeti da se svaki željeni ciljani biomolekul povezan sa ćelijom kancera ili drugim željenim tipom ćelija može koristiti za projektovanje ili izbor vezujućeg regiona koji može biti pogodan za upotrebu kao komponenta ćelijski ciljanog molekula predmetnog pronalaska.
Primeri drugih ciljanih biomolekula koje su snažno povezane sa ćelijama kancera i povezani su sa visokim afinitetom sa poznatim vezujućim regionom imunoglobulinskog tipa uključuju BAGE proteine (B antigene melanoma), molekule bazalne ćelije (BCAMs ili glikoproteini luteranske krvne grupe), bešika tumorski antigen (BTA), antigen za rak-testis NI-ESO-1, antigeni protein LAGE proteina, CD19 (B-limfocitni antigen protein CD19), CD21 (receptor komplementa-2 ili komplement 3d receptora), CD26 (dipeptidil peptidaza- 4, DPP4 ili protein 2 kompleksirajući adenozin deaminazu, CD33 (imunolobulinski lektin-3 koji vezuje sijalnu kiselinu), CD52 (antigen CAMPATH-1), CD56, CS1 (porodica SLAM broj 7 ili SLAMF7), antigeni ćelijska površina A33 protein (gpA33), protein antigena virusa Epstein-Barr, proteini GAGE / PAGE (antigeni povezani sa rakom testisa / melanomom), receptor faktora rasta hepatocita (HGFR ili c-Met), proteini MAGE, antigen melanoma prepoznatljiv iz proteina T-ćelija 1 ( MART-l / MelanA, MARTI), mucini, Preferencijalni br presovani protein antigena melanoma (PRAME), protein specifični antigen za prostatu (PSA), protein antigenih matičnih ćelija prostate (PSCA), receptor za napredne endoklikacije glikacije (RAGE), glikoprotein 72
12
(TAG-72) povezan sa tumorom, faktor rasta vaskularnog endotela receptore (VEGFR) i Wilmsov tumorski antigen.
Primeri drugih ciljanih biomolekula koji su snažno povezani sa ćelijama kancera su karbonska anhidraza IX (CA9/CAIX), klaudinski proteini (CLDN3, CLDN4), receptor tipa efrin tipa A (EphA3), proteini koji vezuju folat (FBP), gangliozid GM2, receptor faktora rasta slični insulinu, integrali (poput CD11a-c), aktivator receptora nuklearnog faktora kappa B (RANK), receptor tirozin-protein kinaza erB-3, receptor faktora nekroze tumora 10A (TRAIL-R1/DR4), receptor faktora nekroze tumora 10B (TRAIL-R2), tenascin C, i CD64 (FcyRI) (videti Hough Cetal., Cancer Res 60: 6281-7 (2000); Thepen T et al., Nat Biotechnol 18: 48-51 (2000); Pastan I et al., Nat Rev Cancer 6: 559-65 (2006); Pastan, Annu Rev Med 58: 221-37 (2007); Fitzgerald D et al., Cancer Res 71: 6300-9 (2011); Scott A et al., Cancer Immun 12: 14-22 (2012)). Lista ciljanih biomolekula ima za nameru da bude neograničavajuća.
Pored toga, postoje brojni drugi primeri razmatranih, ciljanih biomolekula, kao što su, npr., ADAM metaloproteinaze (npr. ADAM-9, ADAM-10, ADAM-12, ADAM-15, ADAM-17), ADP-ribosiltransferaze (ART1, ART4), antigen F4/80, antigeni koštane srži (BST1, BST2), prelomna tačka klastera regije-c-abl onkogena (BCR-ABL) proteini, C3aR (komplementa 3a receptora komplementa), CD7, CD13, CD 14, CD 15 (Lewis X ili embrionalni antigen specifičan za fazu 1), CD23 (FC epsilon RII), CD45 (receptora za proteinske tirozin fosfatazu tip C), CD49d, CD53, CD54 (interćelijski adhezioni molekul 1), CD63 (tetraspanin), CD69, CD80, CD86, CD88 (komplement komponent 5a receptor 1), CD115 (receptor faktora 1 koji stimuliše koloniju), IL-1R (interleukin-1 receptor), CD123 (interleukin-3 receptor), CD129 (interleukin 9 receptor), CD183 (hemokin receptor CXCR3), CD191 (CCR1), CD193 (CCR3), CD195 (hemokin receptor CCR5), CD203c, CD225 (interferon-indukovani transmembranski protein 1), CD244 (Natural Killer Cell Receptor 2B4), CD282 (Toll-slični receptor 2), CD284 (Toll-slični receptor 4), CD294 (GPR44), CD305 (leukocit-povezani imunoglobulin-slični receptor 1), efrin tip-A receptor 2 (EphA2), FceRIa, galektin-9, alfa-fetoprotein antigen 17-A1 protein, humani aspartil (asparaginil) beta-hidroksilaza (HAAH), imunoglobulin-sličan transkript ILT-3, lizofosfatidlglicerol aciltransferaza 1 (LPGAT1/IAA0205), lizosom-povezani membranski proteini (LAMPs, kao što je CD107), melanocitni protein PMEL (gp100), mieloidni-povezani protein-14 (mrp-14), NKG2D ligandi (npr., MICA, MICB, ULBP1, ULBP2, UL-16-vezujući proteini, H-60s, Rae-ls, i njegovi homolozi), receptor tirozin-protein kinaza erbB-3, SART proteini, scavenger receptori (kao što su CD64 i CD68), Siglecs (sialicna kiselina koja vezuje imunoglobulinski tip lecitina), sindecani (kao što je SDC1 ili CD 138), tirozinaza, tirozinaza-povezani protein 1 (TRP-1), tirozinaza-povezani protein 2 (TRP-2),
1
tirozinaza povezani antigen (TAA), APO-3, BCMA, CD2, CD3, CD4, CD8, CD 18, CD27, CD28, CD29, CD41, CD49, CD90, CD95 (Fas), CD103, CD104, CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD152 (CTLA-4), hemokin receptori, komplement proteini, receptori citokina, histokompatibilni proteini, ICOS, interferon-alfa, interferon-beta, c-myc, osteoprotegerin, PD-1, RANK, TACI, TNF receptor član superfamilije (TNF-R1, TNFR-2), Apo2/TRAIL-Rl, TRAIL-R2, TRAIL-R3, i TRAIL-R4 (see Scott A et al., Cancer Immunity 12: 14 (2012); Cheever M et al., Clin Cancer Res 15: 5323-37 (2009)), za ciljane biomolekule i imajte na umu da su ciljani biomolekuli ovde opisani neograničavajući primeri).
U određenim primerima izvođenja, vezujući region obuhvata ili se sastoji bitno od vezujućeg regiona imunoglobulinskog tipa sposoban za specifično vezivanje sa visokim afinitetom za ćelijsku površinu ćelijskog tipa imunog sistema. Na primer, domeni vezujućeg regiona imunoglobulinskog tipa su poznati da se vezuju za imune faktore ćelijske površine, kao što su, npr., CD1, CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD9, CD10, CD11, CD12, CD13, CD14, CD15, CD16, CD17, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD26, CD27, CD28, CD29, CD30, CD31, CD33, CD34, CD35, CD36, CD37, CD38, CD40, CD41, CD56, CD61, CD62, CD66, CD95, CD117, CD123, CD235, CD146, CD326, interleukin-1 receptor (IL-1R), interleukin-2 receptor (IL-2R), aktivator receptora nuklearnog faktora kapa B (RANKL), SLAM-povezani protein (SAP), i TNFSF18 (ligand tumor nekroza faktor 18 ili GITRL).
Za dalje primere ciljanih biomolekula i vezujućih regiona koji su predviđeni za upotrebu u molekulima predmetnog pronalaska, videti WO 2005/092917, WO 2007/033497, US2009/0156417, JP4339511, EP1727827, DE602004027168, EP1945660, JP4934761, EP2228383, US2013/0196928, WO 2014/164680, WO 2014/164693, WO 2015/138435, WO 2015/138452, WO 2015/113005, WO 2015/113007, WO 2015/191764, US20150259428, 62/168,758, 62/168,759, 62/168,760, 62/168,761, 62/168,762, 62/168,763, i PCT/US2016/016580.
Stručnjak će razumeti da se bilo koji željeni ciljana biomolekul može koristiti za dizajniranje ili odabir pogodnog vezujućeg regiona koji će biti povezan i/ili spojen sa efektorskim polipeptidom Shiga toksina da bi se stvorio ćelijski ciljajući molekul predmetnog pronalaska.
Bilo koji od gore navedenih vezujućih regiona koji su ovde opisani može se koristiti sami ili u kombinaciji sa svakom pojedinačnim primerom izvođenja predmetnog pronalaska, uključujući postupke predmetnog pronalaska.
1 1
Opšta struktura ćelijski ciljanih molekula predmetnog pronalaska je modularna, tako da različiti, raznoliki, vezujući regioni koji ciljaju ćeliju mogu biti povezani sa različitim, efektorskim polipeptidima Shiga toksina predmetnog pronalaska da bi se stvorili različiti ćelijski ciljajući molekuli predmetnog pronalaska koji pokazuju razlike u aktivnostima koje ciljaju ćelije zbog razlika u njihovim vezujućim regionima. Ovo omogućava da se razne aktivnosti ciljanja ćelije prikazuju sa različitim primerima izvođenja ćelijski ciljanih molekula predmetnog pronalaska tako da različiti primeri izvođenja ciljaju različite tipove ćelija sa efektivnim funkcijama Shiga toksina, kao što su, npr., citostaza, citotoksičnost i intraćelijska isporuka egzogenih materijala. Dalje, neki primeri izvođenja ćelijski ciljajućih molekula predmetnog pronalaska pokazuju određene karakteristike zbog razlika u njihovim regionima efektorskog polipeptida Shiga toksina, kao što su, npr., niska antigenost i/ili imunogenost kada se daju hordatu, otpornost na proteolitičko cepanje sa određenim proteazama, visoka stabilnost kada se daje multićelijskom organizmu, in vivo podnošljivost pri visokim dozama, sposobnost dostavljanja tereta na intraćelijsku lokaciju i/ili sposobnost davanja T-ćelijskog epitopa molekulu MHC klase I radi prezentacije na ćelijskoj površini.
Za potrebe predmetnog pronalaska, određeni redosled ili orijentacija regiona efektorskog polipeptida Shiga toksina i vezujući region ćelijskog ciljanja nisu fiksirani u odnosu jedni na druge ili unutar ćelijski ciljanog molekula predmetnog pronalaska, osim ako nije izričito naznačeno . Na primer, kada je ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska fuzioni protein sa amino krajem i karboksi krajem, mogu biti pogodni različiti rasporedi komponenti ovog pronalaska (videti npr. Sliku 1). U određenim primerima izvođenja ćelijski ciljanih molekula predmetnog pronalaska, raspored njihovih komponenti u odnosu jedan prema drugom ili unutar ćelijski ciljanog molekula je ograničen kao što je ovde opisano. Na primer, određeni motivi signala zadržavanja/pronalaženja endoplazmatičnog retikuluma obično su smešteni na karboksi kraju ćelijski ciljanog molekula predmetnog pronalaska i/ili karboksi kraju proteinske komponente ćelijski ciljanog molekula predmetnog pronalaska.
C. Motivi Signala Zadržavanja/Pronalaženja Endoplazmatičnog Retikuluma ýlana KDEL Familije
Određeni primeri izvođenja ćelijski ciljanih molekula predmetnog pronalaska sadrže jedan ili više karboksi krajeva, signalnog motiva zadržavanja/pronalaženja endoplazmatičnog retikuluma motiva člana KDEL familije. Bilo koji motiv signala zadržavanja/pronalaženja endoplazmatičnog retikuluma opisanog u WO 2015/138435 može biti pogodan za upotrebu kao komponenta određenih ćelijski ciljanih molekula predmetnog pronalaska.
1 2
Za svrhe predmetnog pronalaska, fraza "motiv signala zadržavanja/pronalaženja endoplazmatičnog retikuluma", motiv signala KDEL tipa, ili motiv signala odnosi se na bilo koji član KDEL familije koji može funkcionisati u eukariotskoj ćeliji tako da promoviše podćelijsku lokalizaciju ćelijski ciljanog molekula predmetnog pronalaska ili njegovu komponenta u endoplazmatičnom retikulumu preko KDEL receptora.
Karboksi kraj lizin-asparagin-glutamat-leucin (KDEL) sekvence (SEQ ID NO: 514) jeste kanonički, zadržavajući endoplazmatični retikulum i pronalaženje signala motiva za rastvorljive proteine u eukariotskim ćelijama i prepoznat je od strane KDEL receptora (videti, Capitani M, Sallese M, FEBS Lett 583: 3863-71 (2009), za pregled). KDEL familija signalnih motiva uključuje mnoge KDEL-slične motive, kao što je HDEL (SEQ ID NO: 515), RDEL (SEQ ID NO:516), WDEL (SEQ IDNO:517), YDEL (SEQ IDNO:518), HEEL (SEQ IDNO:519), KEEL (SEQ IDNO:520), REEL (SEQ ID NO:521), KFEL (SEQ ID NO:522), KIEL (SEQ ID NO:523), DKEL (SEQ ID NO:524), KKEL (SEQ ID NO:525), HNEL (SEQ ID NO:526), HTEL (SEQ ID NO:527), KTEL (SEQ ID NO:528), i HVEL (SEQ ID NO:529), svi oni se nalaze na karboksi krajevima proteina za koje se zna da su stanovnici lumena endoplazmatičnog retikuluma u višestrukim filogenetskim kraljevstvima (Munro S, Pelham H, Cell 48: 899-907 (1987); Raykhel I et al., J Cell Biol 179: 1193-204 (2007)). Familija KDEL signalnog motiva uključuje najmanje 46 polipeptidnih prikazanih varijanti koje koriste sintetičke konstrukcije (Raykhel, J Cell Biol 179: 1193-204 (2007)). Dodatni KDEL signalni motivi uključuju ALEDEL (SEQ ID NO:530), HAEDEL (SEQ ID NO:531), HLEDEL (SEQ ID NO:532), KLEDEL (SEQ ID NO:533), IRSDEL (SEQ ID NO:534), ERSTEL (SEQ ID NO:535), i RPSTEL (SEQ ID NO:536) (Alanen H et al., J Mol Biol 409: 291-7 (2011)).
Opisani su generalizovani konsenzusni motivi koji predstavljaju većinu KDEL motiva kao [KRHQSA]-[DENQ]-E-L (Hulo N et al., Nucleic Acids Res 34: D227-30 (2006)).
Proteini koji sadrže signalne motive familije KDEL vežu se KDEL receptorima distribuiranim po Golgi kompleksu i transportuju se u endoplazmatični retikulum mehanizmom koji zavisi od mikrotubula za puštanje u lumen endoplazmatičnog retikuluma (Griffiths G et al., J Cell Biol 127: 1557-74 (1994); Miesenbock G, Rothman J, J Cell Biol 129: 309-19 (1995)). KDEL receptori dinamički krug između Golgi kompleksa i ensfoplazmatičnog retikuluma (Jackson M et al., EMBO J.9: 3153-62 (1990); Schutze M et al., EMBO J.13: 1696-1705 (1994)).
Za svrhe predmetnog pronalaska, članovi familije KDEL uključuju sintetičke signalne motive koji mogu da funkcionišu u eukariotskoj ćeliji kako bi promovisali podćelijsku lokalizaciju proteina u endoplazmatičnom retikulumu preko KDEL receptora. Drugim rečima, neki članovi
1
familije KDEL možda se neće pojaviti u prirodi ili ih tek treba primetiti u prirodi, ali ih treba ili može konstruisati i empirijski potvrditi stručnjak koristeći metode poznate u tehnici; videti npr., Raykhel I et al., J Cell Biol 179: 1193-204 (2007).
Kao komponenta određenih ćelijskih ciljanih molekula predmetnog pronalaska, signalni motiv KDEL tipa je fizički lociran, orijentisan ili smešten unutar ćelijski ciljanog molekula tako da se nalazi na karboksi kraju polipeptidne komponente ćelijski ciljanog molekula predmetnog pronalaska.
U određenim primerima izvođenja ćelijski ciljani molekuli predmetnog pronalaska, vezujući region i region efektorskog polipeptida Shiga toksina, i/ili signalni motiv zadržavanja/ pronalaženja endoplazmatičnog retikuluma mogu biti direktno povezani jedni sa drugima i/ili na odgovarajući način međusobno povezani pomoću jedne ili više komponenti koje intervenišu, kao što je jedan ili više linkera koji su dobro poznati stručnjaku i/ili koji su ovde opisani.
D. Dodatni Egzogeni Materijali
U određenim primerima izvođenja, ćelijski ciljani molekuli predmetnog pronalaska obuhvataju dodatni egzogeni materijal. "Dodatni egzogeni materijal" kako se ovde koristi odnosi se na jedan ili više atoma ili molekula, koji obično nisu prisutni i u Shiga toksinima i u izvornim ciljanim ćelijama, pri čemu se ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska može koristiti za specifični transport takvog materijala u unutrašnjost ćelije. U jednom smislu, ceo ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalasku je egzogeni materijal koji će ući u ćeliju; prema tome, "dodatni" egzogeni materijali su heterologni materijali koji su povezani sa, ali drugačiji od samog ćelijski ciljanog molekula. Neograničavajući primeri dodatnih egzogenih materijala su radionukleidi, peptidi, agensi za podsticanje detekcije, proteini, hemoterapijski agensi sa malim molekulima i polinukleotidi.
U određenim primerima izvođenja ćelijskih ciljanih molekula predmetnog pronalaska, dodatni egzogeni materijal je jedan ili više radionukleida, kao što su, npr.,<211>AX,<131>I,<125>I,<90>Y,<m>In,<186>Re,<188>Re,<153>Sm,<212>Bi,<32>P,<60>C, i/ili radioaktivni izotopi lutetiuma.
U određenim primerima izvođenja, dodatni egzogeni materijal sadrži proapoptotski peptid, polipeptid ili protein, kao što su, npr., BCL-2, kaspaze (npr. fragmenti kaspaze-3 ili kaspaze-6), citohromi, granzim B, faktor izazivanja apoptoze (AIF), BAX, tBid (truncated Bid), i
1 4
proapoptotski fragmenti ili njihovi derivati (videti npr., Ellerby H et al., Nat Med 5: 1032-8 (1999); Mai J et al., Cancer Res 61: 7709-12 (2001); Jia L et al., Cancer Res 63: 3257-62 (2003); Liu Y et al., Mol Cancer Ther 2: 1341-50 (2003); Perea S et al., Cancer Res 64: 7127-9 (2004); Xu Y et al.,./ Immunol 173: 61-7 (2004); Dalken B et al., Cell Death Differ 13: 576-85 (2006); Wang T et al., Cancer Res 67: 11830-9 (2007); Kwon M et al., Mol Cancer Ther 7: 1514-22 (2008); Qiu X et al., Mol Cancer Ther 7: 1890-9 (2008); Shan L et al., Cancer Biol Ther 11: 1717-22 (2008); Wang F et al., Clin Cancer Res 16: 2284-94 (2010); Kim J et al., J Virol 85: 1507-16 (2011)).
U određenim primerima izvođenja, dodatni egzogeni materijal sadrži protein ili polipeptid koji sadrži enzim. U nekim drugim primerima izvođenja, dodatni egzogeni materijal je nukleinska kiselina, kao što je, npr., ribonukleinska kiselina koja deluje kao mala inhibirajuća RNK (siRNK) ili mikroRNK (miRNK). U nekim primerima izvođenja, dodatni egzogeni materijal je antigen, kao što su antigeni izvedeni iz patogena, bakterijski proteini, virusni proteini, proteini mutirani u kanceru, proteini aberantno eksprimirani u kanceru ili T-ćelijski komplementarni određujući regioni. Na primer, egzogeni materijali uključuju antigene, poput onih karakterističnih ćelija koje predstavljaju antigene inficirane sa bakterijama, i T-ćelijski komplementarni determinirajući regioni koji mogu da funkcionišu kao egzogeni antigeni. Egzogeni materijali koji sadrže polipeptide ili proteine mogu opciono da sadrže jedan ili više antigena koji su poznati ili nepoznati stručnjaku.
U određenim primerima izvođenja ćelijski ciljani molekuli predmetnog pronalaska, svi heterologni antigeni i/ili epitopi povezani sa efektorskim polipeptidom Shiga toksina su raspoređeni na amino kraju ćelijski ciljanog molekula za karboksi kraj regiona Shiga toksin A1 fragmenta efektorskog polipeptida Shiga toksina. U određenim drugim primerima izvođenja, svi heterologni antigeni i/ili epitopi povezani sa efektorskim polipeptidom Shiga toksina su povezani, ili direktno ili indirektno, sa efektorskim polipeptidom Shiga toksina na poziciji amino kraja za karboksi kraj regiona Shiga toksin A1 fragmenta efektorskog polipeptida Shiga toksina. U određenim drugim primerima izvođenja, sav dodatni egzogeni materijal(i) koji je antigen je postavljeni amino kraj za efektorski polipeptid Shiga toksina, kao što je, npr., spojen direktno ili indirektno na amino kraj efektorskog polipeptida Shiga toksina.
U određenim primerima izvođenja ćelijski ciljani molekuli predmetnog pronalaska, dodatni egzogeni materijal je citotoksični agens, kao što je, npr., hemoterapijski agens sa malim molekulom, anti-neoplastični agens, citotoksični antibiotik, alkilacioni agens, antimetabolit, topoizomerazni inhibitor, i/ili tubulin inhibitor. Neograničavajući primeri citotoksičnih agenasa
1
pogodni za primenu sa predmetnim pronalaskom obuhvataju aziridine, cisplatine, tetrazine, procarbazin, heksametillmelamin, vinca alkaloidi, taksani, camptotecini, etopozid, doksorubicin, mitoksantron, teniposid, novobiocin, aclarubicin, antraciklini, actinomicin, amanitin, amatoksini, bleomicin, centanamicin (indolekarboksamid), plicamicin, mitomicin, daunorubicin, epirubicin, idarubicini, dolastatins, maitansini, maitansionoidi, duromicin, docetaksel, duocarmicini, adriamicin, calicheamicin, auristatini, pirolobenzodiazepini, pirolobenzodiazepin dimeri (PBDs), karboplatin, 5-fluorouracil (5-FU), kapecitabin, mitomicin C, paclitaksel, 1,3-Bis(2-chloroetill)-1-nitrosourea (BCNU), rifampicin, cisplatin, metotreksat, gemcitabin, aceglaton, acetogenini (npr. bulatacin i bulatacinon), aklacinomisini, AG1478, AG1571, aldofosfamid glikozid, alkil sulfonati (npr., busulfan, improsulfan, i piposulfan), alkilating agensi (npr. tiotepa i ciklosfosfamid), aminolevulininska kiselina, aminopterin, amsacrin, ancitabin, antramicin, arabinoside, azacitidin, azaserine, aziridini (npr., benzodopa, karbohon, meturedopa, i uredopa), azauridin, bestrabucil, bisantren, bisfosfonati (npr. clodronate), bleomicini, bortezomib, briostatin, cactinomicin, calistatin, karabicin, carminomicin, carmofur, carmustin, carzinofilin, CC-1065, hlorambucil, hloranbucil, hlornafazin, hlorozotocin, hromomicosis, hromoprotein enedin antibiotik hromofores, CPT-11, kriptoficini (npr. kriptoficin 1 i kriptoficin 8), ciklofosfamid, citarabin, dacarbazin, dactinomicin, daunomicin, defofamin, demecolcin, detorubicin, diazihon, 6-diazo-5-okso-L-norleucin, dideoksiuridin, difluorometilornitin (DMFO), doksifluridin, doksorubicini (npr., morfolinodoksorubicin, cijanomorfolino-doksorubicin, 2-pirolinodoksorubicin, i deoksidoksorubicin), dinemicini, edatraksat, edatreksat, eleuterobini, elformitin, eliptinium acetat, enedin antibiotici (npr. caliheamicini), eniluracil, enocitabin, epirubicini, epotilon, ezorubicini, esperamicini, estramustin, etilenimini, 2-etilhidrazid, etoglucid, fludarabin, analozi folne kiseline (npr., denopterin, metotreksat, pteropterin, i trimetreksat), replenišeri folne kiseline (npr. frolininska kiselina), fotemustine, fulvestrant, gacitozin, gallium nitrat, gefitinib, gemcitabin, hidroksiurea, ibandronat, ifosfamid, imatinib mesilat, erlotinib, fulvestrant, letrozol, PTK787/ZK 222584 (Novartis, Basel, CH), oksaliplatin, leucovorin, rapamicin, lapatinib, lonafarnib, sorafenib, metillamelamini (npr., altretamin, trietil lenemelamin, trietil lenefosforamid, trietillentiofosforamid i trimetillomelamine), pancratistatini, sarkodictiini, spongistatini, nitrogen mustardi (npr., hlorambucil, hlornafazin, ciklofosfamid, mehloretamin, mehloretamin oksid hidrohlorid, melfalan, novembicin, fenesterin, prednimustin, trofosfamid, i uracil mustard), nitrosureas (npr., carmustin, fotemustin, lomustine, nimustine, and ranimnustine), dinemicini, neocarzinostatin hromofori, detorubicin, epirubicini, marcelomicini, mitomicini (npr. mitomicin C), mikofenolna kiselina, nogalamicini, olivomicini, peplomicini, potfiromicini, puromicini, helamicini, rodorubicini, ubenimeks, zinostatini, zorubicini, purin analozi (npr., fludarabin, 6-merkaptopurin, tiamiprin,
1
i tioguanin), pirimidin analozi (npr., ancitabin, azacitidin, 6-azauridin, dideoksiuridin, doksifluridin, enocitabin, i floksuridin), aceglaton, lentinan, lonidainin, maitanzinoidi (npr. maitanzinz and ansamitocini), mitoguazon, mitoksantron, mopidanmol, nitraerin, pentostatin, fenamet, pirarubicin, podofilinska kiselina, 2-etilhidrazid, rizoksin, sizofuran, spirogermanium, tenuazonska kiselina, triazihon, 2,2',2"trihlorotrietilamin, trihoteceni (npr., T-2 toksin, veracurin A, roridin A, i anguidin), uretan, vindezin, manomustin, mitobronitol, mitolaktol, pipobroman, arabinozid, ciklofosfamid, toksoidi (npr. paclitaksel i doksetaksel), 6-tioguanin, merkaptopurin, platinum, platinum analozi (npr. cisplatin i karboplatin), etopozid (VP-16), mitoksantron, vinorelbin, novantron, daunomicin, kseloda, topoizomerazni inhibitor RFS 2000, retinoidi (npr. retinoinska kiselina), capecitabin, lomustine, losoksantron, merkaptopurini, nimustin, nitraerin, razoksan, roridin A, spongistatini, streptonigrini, streptozocini, sutent, T-2 toksin, tiamiprin, tiotepa, toksoidi (npr. paclitaksel i doksetaksel), tubercidini, veracurin A, vinblastin, vincristin, i strukturni antagonisti bilo kog prethodno navedenog (npr. sintetički antagonisti), i/ili derivati bilo kog prethodno navedenog (videti npr., Lindell T et al., Science 170: 447-9 (1970); Remillard S et al., Science 189: 1002-5 (1975); Ravry M et al., Am J Clin Oncol 8: 148-50 (1985); Ravry M et al., Cancer Treat Rep 69: 1457-8 (1985); Sternberg C et al., Cancer 64: 2448-58 (1989); Bai R et al., Biochem Pharmacol 39: 1941-9 (1990); Boger D, Johnson D, Proc Natl Acad Sci USA 92: 3642-9 (1995); Beck J et al., Leuk Lymphoma 41: 117-24 (2001); Cassady J et al., Chem Pharm Bull (Tokyo) 52: 126 (2004); Sapra P et al., Clin Cancer Res 11: 5257-64 (2005); Okeley N et al., Clinc Cancer Res 16: 888-97 (2010); Oroudjev E et al., Mol Cancer Ther 9: 2700-13 (2010); Ellestad G, Chirality 23: 660-71 (2011); Kantarjian H et al., Lancet Oncol 13: 403-11 (2012); Moldenhauer G et al., J Natl Cancer Inst 104: 622-34 (2012); Meulendijks D et al., Invest New Drugs 34: 119-28 (2016)).
E. Strukturno-Funkcionalni Odnosi Ćelijski Ciljanih Molekula Pronalaska
Za određene primere izvođenja ćelijski ciljanih molekula predmetnog pronalasku, primećeni su specifični odnosi strukture i funkcije, kao što su, npr., efekti relativne orijentacije komponenata na citotoksični potencijal; efekti osetljivosti cepanja furina na in vivo podnošljivost u određenim dozama; efekti osetljivosti cepanje furina na in vitro stabilnost; efekti osetljivosti cepanje furina na in vivo poluživot; i efekti osetljivosti cepanje furina na in vivo, nespecifičnu toksičnost u multićelijskim organizmima.
U određenim primerima izvođenja ćelijski ciljani molekuli predmetnog pronalaska, specifični redosled ili orijentacija Shiga toksin efektorskog polipeptidnog regiona i vezujućeg regiona je
1
fiksiran tako da se vezujući region nalazi unutar ćelijski ciljanog molekula bliže karboksi kraju regiona efektorskog polipeptida Shiga toksina nego amino kraju od regiona efektorskog polipeptida Shiga toksina. U određenim primerima izvođenja ćelijski ciljanih molekula predmetnog pronalaska, raspored regiona efektorskog polipeptida Shiga toksina unutar ćelijski ciljanog molekula je ograničen na i/ili blizu amino kraju polipeptidne komponente ćelijski ciljanog molekula (videti Sliku 1). Na primer, određeni primeri izvođenja ćelijski ciljanog molekula predmetnog pronalaska sadrže 1) vezujući region koja je orijentisana unutar ćelijski ciljanog molekula na položaju karboksi kraja na regionu efektorskog polipeptida Shiga toksina, 2) vezujući region povezan sa regionom efektorskog polipeptida Shiga toksina na položaju udaljenom od amino kraja regiona efektorskog polipeptida Shiga toksina (npr. udaljenosti od 50, 100, 200 ili 250 amino kiselinskih ostataka ili više), 3) vezujući region koji sterikalno ne pokriva amino kraj regiona efektorskog polipeptida Shiga toksina i/ili 4) vezujući region koji sterikalno ne ometa strukturu(e) blizu amino kraja regiona efektorskog polipeptida Shiga toksina videti npr. Sliku 1; WO 2015138452). U određenim primerima izvođenja, ćelijski ciljani molekuli predmetnog pronalaska su sposobni da pokazuju optimalni citotoksični potencijal, kao što je, npr., pokazivanje CD50vrednosti koja je 3-puta, 4-puta, 5-puta, 6-puta, 7- puta, 8- puta, 9- puta, 10- puta, ili više nego srodni ćelijski ciljani molekul koji sadrži isti region(e) efektorskog polipeptida Shiga toksin A Podjedinice i vezujući(e) region(e), pri čemu je vezujući region 1) amino kraj za region efektorskog polipeptida Shiga toksin A Podjedinice, 2) povezan sa regionom efektorskog polipeptida Shiga toksina na položaju blizu amino kraju regiona efektorskog polipeptida Shiga toksina (npr. udaljenosti od manje od 50, 40, 30, 20 ili 10 amino kiselinskih ostataka ili manje), 3) ne sterikalno pokriva amino kraj regiona efektorskog polipeptida Shiga toksina i/ili 4) ne sterikalno ometa strukturu(e) u blizini amino kraj regiona efektorskog polipeptida Shiga toksina (videti npr. Sliku 1; WO 2015/138452).
U određenim primerima izvođenja, efektorski polipeptid Shiga toksin A podjedinice predmetnog pronalaska obuhvata region izveden iz Shiga toksin A1 fragmenta koji sadrži uništeni furinski odcepljeni motiv na karboksi kraju regiona izvedenog iz Shiga toksin A1 fragmenta (kao što je uništeno mesto cepanja furina pozicionirano na karboksi kraju regiona Shiga toksin A1 fragmenta) (videti npr. Sliku 1; WO 2015/191764). U određenim primerima izvođenja, efektorski polipeptid Shiga toksina je više otporan na cepanje furina kada se poredi sa srodnim referentnim molekulom, kao što je, npr., molekul koji sadrži divlji soj, Shiga toksin A Podjedinice ili Shiga toksin A1 fragment (videti npr. WO 2015/191764). U određenim drugim primerima izvođenja, efektorski polipeptid Shiga toksina predmetnog pronalaska pokazuje smanjenje u cepanju furina reproduktivno za 30%, 40%, 50%, 60%,
1
70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ili manje (uključujući 100% bez cepanja) od cepanja furina referentnog molekula uočenog u istoj analizi pod istim uslovima. U drugim primerima izvođenja, efektorski polipeptid Shiga toksina je otporan na cepanje proteazom osim furina u poređenju sa srodnim referentnim molekulom, kao što je, npr., molekul koji sadrži divlji soj, Shiga toksin A Podjedinice ili Shiga toksin A1 fragment.
Određeni ćelijski ciljani molekuli predmetnog pronalaska pokazuju citotoksične potencije u okviru od 100-puta, 20-puta, 10-puta, 5-puta ili manje od referentnog molekula koji sadrži divlji soj Shiga toksina efektorskog polipeptidnog regiona uprkos nedostatku bilo koje kompenzacijsko strukturne karakteristike za furinsko odcepljeni motiv u efektorskom polipeptidu Shiga toksina. Za ćelijski ciljane molekule koji sadrže regione izvedene iz Shiga toksin A Podjedinice koji ne održavaju događaj cepanja furina, odn. molekuli koji sadrže komponente Shiga toksin A Podjedinice koje nisu odcepljene sa furinom unutar ciljanih ćelija, jedna od alternativa za očuvanje maksimalne citotoksičnosti je kompenzacija.
Nadoknada nedostatka cepanja furina regiona Shiga toksin A Podjedinice u citotoksičnom molekulu može se ostvariti predstavljanjem regiona Shiga toksin A Podjedinice u "prethodno obrađenom" obliku. Na primer, ćelijski ciljani molekul koji sadrži region Shiga toksin A Podjedinice može biti konstruiran tako da karboksi kraj izvedenog polipeptida Shiga toksin A Podjedinice je 1) blizu karboksi kraju molekula i 2) odgovara ili podseća na izvorni Shiga toksin A1 fragment nakon cepanja furinom (videti WO 2015/191764). Takva kompenzacija nije potrebna u određenim ćelijski ciljanim molekulima predmetnog pronalaska, već se namerno izbegava da se obezbedi jedna ili više funkcija, kao što su, npr., poboljšana in vivo podnošljivost u određenim dozama; povećana in vitro stabilnost; povećani poluživot in vivo; i/ili smanjena in vivo, nespecifična toksičnost za multićelijske organizme. U određenim primerima izvođenja, ove korisne funkcije su prisutne bez značajnog smanjenja citotoksičnog potencijala ćelijski ciljanog molekula predmetnog pronalaska u poređenju sa referentnim molekulom koji sadrži efektorski polipeptid divljeg soja Shiga toksina.
U određenim primerima izvođenja, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska sadrži efektorski polipeptid Shiga toksin A Podjedinice koji sadrži region izveden iz Shiga toksin A1 fragmenta koja sadrži furinski odcepljeni motiv na karboksi izvedenog regiona Shiga toksin A1 fragmenta (kao što je uništeno mesto cepanja furina koje se nalazi na karboksi kraj regiona Shiga toksin A1 fragmenta) (videti npr. Sliku 1; WO 2015/191764) ali ne sadrže nijedno kompenzacijsko mesto cepanja proteaze blizu karboksi kraju izvedenog regiona Shiga toksin A1 fragmenta i/ili orijentisano između efektorskog polipeptida Shiga toksina i relativno velikog, molekulskog ostatka (npr. vezujući region veličine veće od 4.5 kDa, 6 kDa,
1
9 kDa, 12 kDa, 15 kDa, 20 kDa, 25 kDa, 28 kDa, 30 kDa, 41 kDa, ili 50 kDa). U određenim drugim primerima izvođenja, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska sadrži efektorski polipeptid Shiga toksina koji je više otporan na cepanje furina kada se poredi sa srodnim referentnim molekulom, kao što je, npr., molekul koji sadrži divlji soj, Shiga toksin A Podjedinice ili Shiga toksin A1 fragment (videti npr. WO 2015/191764). U određenim drugim primerima izvođenja, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska pokazuje redukciju u cepanju furina od 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, ili 100% manje od cepanja furina referentnog molekula koji je posmatran u istoj analizi pod istim uslovima dok ćelijski ciljani molekul pokazuje citotoksični potencijal u okviru 100-puta, 20-puta, 10-puta, 5-puta, ili manje nego referentni molekul koji sadrži region efektorskog polipeptida divljeg soja Shiga toksina. U određenim drugim primerima izvođenja, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska pokazuje poboljšanje u in vivo podnošljivost u poređenju sa srodnim referentnim molekulom koji sadrži efektorski polipeptid Shiga toksina koji ima furinski odcepljenog motiv divljeg soja i/ili mesto cepanja divljeg soja na karboksi terminusu njegovog Shiga toksin A1 fragmenta (videti npr. WO 2015/191764 ). Na primer, povećanje podnošljivosti in vivo može se utvrditi upoređivanjem merenja smrtnosti, znakova morbiditeta i/ili određenih kliničkih znakova u grupama laboratorijskih životinja kojima su davane različiti molekuli u istim dozama (videti npr. Primere, infra; WO 2015/191764).
U određenim primerima izvođenja, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska sadrži efektorski polipeptid Shiga toksin A Podjedinice koji sadrži izvedeni region Shiga toksin A1 fragmenta koji sadrži furinski odcepljeni motiv na karboksi kraju izvedenog regiona Shiga toksin A1 fragmenta (kao što je uništeno mesto cepanja furina pozicionirano na karboksi kraju regiona izvedenog iz Shiga toksin A1 fragmenta) (videti npr. Sliku 1; WO 2015/191764). Za određene druge primere izvođenja, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska koji sadrži citotoksičnu komponentu, ćelijski ciljani molekul pokazuje smanjenu nespecifičnu toksičnost u poređenju sa više osetljivih varijanti na cepanje proteaza, koje imaju veću sklonost da se raspadnu i na taj način oslobode citotoksičnu komponentu iz vezujućeg regiona, posebno kada se daju živim materijalima, kao što su, npr., populacija ćelija, tkiva i/ili organizma. Pored toga, određeni ćelijski ciljani molekuli predmetnog pronalaska otporni na cepanje proteaze mogu da pokazuju, in vivo, poluživot nakon primene živim materijalima (npr., određeni hordati) u poređenju sa više varijanti osetljivih na cepanje proteaze zasnovanih na otpornost cepanja proteaze dodeljeni ćelijski ciljanom molekulu sa uništenim furinski odcepljenim motivom karboksi kraju izvedenog regiona Shiga toksin A1 fragmenta.
14
III. Veze koje Povezuju Komponente Pronalaska i/ili Njihove Podkomponente
Pojedinačni ćelijski ciljani vezujući regioni efektorskog polipeptida Shiga toksina i/ili komponente ćelijski ciljanih molekula predmetnog pronalasku mogu se na odgovarajući način povezati jedni sa drugima putem jednog ili više linkera koji su dobro poznati u tehnici i/ili koji su ovde opisani. Pojedinačne polipeptidne podkomponente vezajućih regiona, npr. varijabilni regioni teškog lanca (VH), varijabilni regioni lakog lanca (VL), CDR i/ili ABR regioni mogu se na odgovarajući način povezati jedni sa drugima preko jednog ili više linkera dobro poznatih u tehnici i/ili koji su ovde opisani. Proteinske komponente predmetnog pronalaska, npr., vezujući regioni sa više lanaca, mogu biti na odgovarajući način povezani jedni sa drugima ili sa drugim polipeptidnim komponentama pronalaska preko jednog ili više linkera koji su dobro poznati u tehnici. Peptidne komponente pronalaska, npr., signalni motivi zadržavanja/pronalaženja endoplazmatičnog retikuluma familije KDEL, mogu se na odgovarajući način povezati sa drugom komponentom pronalaska putem jednog ili više linkera, kao što je proteinacezni linker, koji su dobro poznati u tehnici.
Pogodni linkeri su obično oni koji omogućavaju da svaka polipeptidna komponenta predmetnog pronalaska ima trodimenzionalnu strukturu vrlo sličnu polipeptidnim komponentama proizvedenim pojedinačno, bez ikakvog linkera ili druge komponente.
Pogodni linkeri uključuju jednostruke amino kiseline, peptide, polipeptide i linkere koji nemaju bilo koji od gore pomenutog, kao što su razni ne-proteinatni lanci ugljenika, bilo razgranati ili ciklični.
Pogodni linkeri mogu biti proteinski i sadržati jednu ili više amino kiselina, peptida i/ili polipeptida. Proteinski linkeri su pogodni i za rekombinantno spajanje proteina i za hemijski povezane konjugate. Proteinski linkeri obično imaju od oko 2 do oko 50 amino kiselinskih ostataka, kao što je, na primer, od oko 5 do oko 30 ili od oko 6 do oko 25 amino kiselinskih ostataka. Dužina odabranog linkera zavisiće od različitih faktora, kao što su, npr., željena svojstva ili svojstva za koja se linker bira. U nekim primerima izvođenja, linker je proteinski i povezan je blizu kraja proteinske komponente predmetnog pronalaska, obično unutar oko 20 amino kiselina kraja.
Pogodni linkeri mogu biti ne-proteinski, kao što su, npr., hemijski linkeri. Različiti neproteinski linkeri poznati u stanju tehnike mogu se koristiti za povezivanje vezujućih regiona koji ciljaju ćeliju za komponente efektorskog polipeptida Shiga toksin ćelijski ciljanih molekula predmetnog pronalaska, kao što su linkeri koji se obično koriste za konjugaciju imunoglobulinskih polipeptida sa heterolognim polipeptidima. Na primer, polipeptidni regioni mogu biti povezani upotrebom funkcionalnih bočnih lanaca njihovih amino kiselinskih ostataka i ostataka ugljenih hidrata kao što su, npr., karboksi, amin, sulfhidril, karboksilna kiselina, karbonil, hidroksil i/ili ciklička prstenasta grupa. Na primer, disulfidne veze i tioetarske veze mogu se koristiti za povezivanje dva ili više polipeptida. Pored toga, neprirodni amino kiselinski ostaci mogu se koristiti sa drugim funkcionalnim bočnim lancima, kao što su ketonske grupe. Primeri ne-proteinskih hemijskih povezivača uključuju, ali nisu ograničeni na njih N-sukcinimidil (4-jodoacetil)-aminobenzoat, S-(N-sukcinimidil) tioacetat (SATA), N-sukcinimidil-oksikarbonil-cu-metil-α-(2-piridilditio) toluen (SMPT), N-sukcinimidil 4-(2-piridilditio)-pentanoat (SPP), sukcinimidil 4-(N-maleimidometill) cikloheksan karboksilat (SMCC ili MCC), sulfosukcinimidil (4-jodoacetil)-aminobenzoat, 4-sukcinimidil-oksikarbonil-α-(2-piridilditio) toluen, sulfosukcinimidil-6-(α-metill-α-(piridilditiol)-toluamido) heksanoat, N-sukcinimidil-3-(-2-piridilditio)-proprionat (SPDP), sukcinimidil 6(3(-(-2-piridilditio)-proprionamido) heksanoat, sulfosukcinimidil 6(3 (-(-2-piridilditio)-propionamido) heksanoat, maleimidocaproil (MC), maleimidocaproil-valin-citrulin-p-aminobenziloksikarbonil (MC-vc-PAB), 3-maleimidobenzoeva kiselina N-hidroksisukcinimide estar (MBS), alfa-alkil derivati, sulfoNHS-ATMBA (sulfosukcinimidil N-[3-(acetiltio)-3-metilbutiril-beta-alanin]), sulfodihlorofenol, 2-iminotiolan, 3-(2-piridilditio)-propionil hidrazid, Ellman's reagens, dihlorotriazinska kiselina, i S-(2-tiopiridil)-L-cistein.
Pogodni linkeri, bili proteinski ili ne-proteinski, mogu obuhvatati, npr., osetljive na proteazu, okolišni redoks potencijalno osetljiv, pH osetljiv, na kiseline odcepljive, foto-cepljive i/ili osetljive na toplotu.
Proteinski linkeri mogu biti odabrani za uključivanje u rekombinantno spojene ćelijski ciljane molekule predmetnog pronalaska. Za rekombinantne spojene ćelijski ciljane proteine pronalaska, linkeri obično sadrže oko 2 do 50 amino kiselinskih ostataka, poželjno oko 5 do 30 amino kiselinskih ostataka. Obično, proteinski linkeri sadrže većinu amino kiselinskih ostataka sa polarnim, nenaelektrisanim i/ili naelektrisanim ostacima, kao što su, npr., treonin, prolin, glutamin, glicin i alanin. Neograničavajući primeri proteinskih linkera uključuju alanine-serine -glicin-glicin-proline-glutamat (ASGGPE) (SEQ IDNO:538), valin-metionin (VM), alanin-metionin (AM), AM(G2to4S)xAM (SEQ ID NO: 539) gde G je glicin, S je serin, a x je ceo broj od 1 do 10.
Proteinski linkeri mogu biti izabrani na osnovu željenih svojstava. Proteinski linkeri mogu biti odabrani od strane stručnjaka sa specifičnim karakteristikama, kao što su optimizacija jednog ili više spojenih molekula, stabilnosti, ekspresije, rastvorljivosti, farmakokinetičkih svojstava, farmakodinamičkih svojstava i/ili aktivnosti spojenih domena u kontekst spojenog konstrukta u poređenju sa aktivnošću istog domena sam po sebi. Na primer, proteinski linkeri mogu biti izabrani na osnovu fleksibilnosti, krutosti i/ili cepljivosti. Stručnjak može koristiti baze podataka i softverske alate za dizajn linkera prilikom izbora linkera. U nekim primerima izvođenja predmetnog pronalaska linkeri se mogu odabrati da optimiziraju ekspresiju. U određenim primerima izvođenja, linkeri mogu biti izabrani da promovišu intermolekularne interakcije između identičnih polipeptida ili proteina da bi formirali homomultimere ili različite polipeptide ili proteine da bi formirali heteromultimere. Na primer, proteinski linkeri mogu biti odabrani koji omogućavaju željene nekovalentne interakcije između polipeptidnih komponenti ćelijski ciljanih molekula pronalasku, kao što su, npr., interakcije koje se odnose na dimer formacije i druge multimere višeg reda.
Fleksibilni proteinski linkeri često su veći od 12 amino kiselinskih ostataka i bogati su malim, nepolarnim amino kiselinskim ostacima, polarnim ostacima amino kiselina i/ili ostacima hidrofilnih amino kiselina, kao što su, npr., glicini, serini i treonini. Fleksibilni proteinski linkeri mogu se izabrati da povećaju prostorno razdvajanje komponenata i/ili da omoguće intramolekularne interakcije između komponenata. Na primer, razni „GS“ linkeri su poznati stručnjaku i sastoje se od više glicina i/ili jednog ili više serina, ponekad u ponavljajućim jedinicama, kao što su, npr., (GxS)n(SEQ ID NO:540), (SxG)n(SEQ ID NO:541), (GGGGS)n(SEQ ID NO:542), i (G)„ (SEQ ID NO:543), gde x je 1 do 6 a n je 1 do 30. Neograničavajući primeri fleksibilnih proteinskih linkera uključuju GKSSGSGSESKS (SEQ ID NO:544), EGKSSGSGSESKEF (SEQ ID NO:545), GSTSGSGKSSEGKG (SEQ ID NO:546), GSTSGSGKSSEGSGSTKG (SEQ ID NO:547), GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO:548), SRSSG (SEQ ID NO:549), i SGSSC (SEQ ID NO:550).
Kruti proteinski linkeri često su krute alfa-spiralne strukture i bogate ostacima prolina i/ili jednim ili više strateški postavljenih prolina. Kruti linkeri mogu biti izabrani da spreče intramolekularne interakcije između povezanih komponenti.
Pogodni linkeri mogu biti izabrani da omoguće in vivo razdvajanje komponenti, kao što je, npr., zbog cepanja i/ili nestabilnosti specifična za okolinu. In vivo proteinski odcepljeni linkeri su sposobni da se vezuju proteolitičkom obradom i/ili smanjenjem okruženja često na određenom mestu u organizmu ili unutar određenog tipa ćelije. In vivo proteinski odcepljeni linkeri često sadrže motive koji su osetljivi na proteazu i/ili disulfidne veze formirane od jednog ili više cisteinskih parova. In vivo proteinski odcepljeni linkeri mogu biti dizajnirani
14
tako da budu osetljivi na proteaze koje postoje samo na određenim lokacijama u organizmu, odeljku unutar ćelije, i/ili postaju aktivni samo pod određenim fiziološkim ili patološkim uslovima (kao što su, npr., uključivanje proteaza sa nenormalno visokim nivoima, proteaze prekomerno izražene na određenim mestima bolesti i proteaze koje su posebno izražene patogenim mikroorganizmom). Na primer, postoje proteinski linkeri poznati u tehnici, koji se cepaju proteazama koji su prisutni samo intraćelijski, proteaze su prisutne samo unutar specifičnih ćelijskih vrsta, a proteaze prisutne samo u patološkim uslovima kao što su kancer ili upala, kao što su, npr., R-x-x-R motiv i AMGRSGGGCAGNRVGSSLSCGGLNLQAM (SEQ ID NO:551).
U određenim primerima izvođenja ćelijski ciljanog molekula predmetnog pronalasku, može se koristiti linker koji sadrži jedno ili više mesta osetljivih na proteazu da bi se obezbedilo cepanje proteazom prisutnom unutar ciljane ćelije. U određenim primerima izvođenja ćelijski ciljanog molekula predmetnog pronalasku, može se koristiti linker koji nije cepljiv kako bi se smanjila neželjena toksičnost nakon primene u organizmu kičmenjaka.
Pogodni linkeri mogu obuhvatati, npr., linkere koji su osetljivi na proteazu, osetljivi na redoks potencijal okruženja, osetljivi na pH, cepljivi na kiselinu, fotocepljivi, i/ili osetljivi na toplotu, bilo da su proteinski ili ne proteinski (videti npr., Doronina S et al., Bioconjug Chem 17: 114-24 (2003); Saito G et al., Adv Drug Deliv Rev 55: 199-215 (2003); Jeffrey S et al., J Med Chem 48: 1344-58 (2005); Sanderson R et al., Clin Cancer Res 11: 843-52 (2005); Erickson H et al., Cancer Res 66: 4426-33 (2006); Chen X et al., Adv Drug Deliv Rev 65: 1357-69 (2013)). Pogodni linkeri za cepanje mogu obuhvatati linkere koji sadrže cepljive grupe koje su poznate u tehnici.
Pogodni linkeri mogu da sadrže linkere osetljive na pH. Na primer, određeni pogodni linkeri mogu biti izabrani zbog svoje nestabilnosti u sredinama sa nižim pH da bi se obezbedila disocijacija unutar podćelijskog odeljka ciljane ćelije (videti npr., van Der Velden V et al., Blood 97: 3197-204 (2001); Ulbrich K, Subr V, Adv Drug Deliv Rev 56: 1023-50 (2004)). Na primer, linkeri koji sadrže jednu ili više tritilnih grupa, derivatizovane tritilne grupe, bismaleimideotoksi-propanske grupe, dihidrazidne grupe adipinske kiseline, i/ili kiseline labilne transferin grupe mogu obezbediti oslobađanje komponenata ćelijski ciljanog molekula pronalaska, npr. polipeptidna komponenta, u okruženjima sa specifičnim opsegom pH. U određenim primerima izvođenja linkeri se mogu odabrati koji se cepaju u pH vrednostima koje odgovaraju fiziološkim pH razlikama između tkiva, kao što je, npr., pH tkiva tumora je niže nego kod zdravog tkiva.
Fotocepljivi linkeri su linkeri koji se cepaju nakon izlaganja elektromagnetnom zračenju određenih opsega talasnih dužina, poput svetlosti u vidljivom opsegu. Fotocepljivi veznici se mogu koristiti za oslobađanje komponente ćelijski ciljanog molekula pronalaska, npr. polipeptidna komponenta, nakon izlaganja svetlosti određenih talasnih dužina.
Neograničavajući primeri fotocepljivih linkera uključuju nitrobenzil grupu kao zaštitnu grupu koja se može uklanjati za cistein, nitrobenziloksikarbonil-hloridne unakrsne veze, hidroksipropil-metakrilamidni kopolimer, kopolimer glicina, kopolimer fluoresceina i kopolimer metilrodamina. Fotocepljivi linkeri mogu imati naročitu primenu u vezivanju komponenata radi formiranja ćelijski ciljanih molekula pronalaska namenjenih lečenju bolesti, poremećaja i stanja koja mogu biti izložena svetlosti korišćenjem optičkih vlakana.
U određenim primerima izvođenja ćelijski ciljanih molekula predmetnog pronalaska, ćelijski ciljani vezujući region je veza za efektorski polipeptid Shiga toksina predmetnog pronalaska korišćenjem bilo koji broj sredstava poznat stručnjaku, uključujući kovalentne i nekovalentne veze.
U određenim primerima izvođenja ćelijski ciljanih molekula predmetnog pronalaska, molekul sadrži vezujući region koji je scFv sa linkerom koji povezuje varijabilni domen teškog lanca (VH) i varijabilni domen lakog lanca (VL). Postoji veliki broj linkera koji su poznati u tehnici koji su pogodni zaove svrhe, kao što su, npr., 15-ostatak (Gly4Ser)3peptid (SEQ ID NO:552). Pogodni scFv linkeri koje se mogu koristiti u formiranju nekovalentnih multivalentnih struktura uključuju GGS (SEQ ID NO:553), GGGS (SEQ ID NO:554), GGGGS (SEQ ID NO:555), GGGGSGGG (SEQ ID NO:556), GGSGGGG (SEQ ID NO:557), GSTSGGGSGGGSGGGGSS (SEQ ID NO:558), i GSTSGSGKPGSSEGSTKG (SEQ ID NO:559).
Pogodni postupci za povezivanje komponenata ćelijski ciljanih molekula predmetnog pronalaska mogu biti sa bilo kojim postupcima koji su trenutno poznati u tehnici za postizanje takvih, sve dok vezivanje ne ometa značajno sposobnost ćelijski ciljanog vezujućeg regiona, ćelijske internalizacije komponente efektorskog polipeptida Shiga toksina, i/ili kada je pogodno željena efektorska funkcija(e) Shiga toksina izmerena odgovarajućom analizom, uključujući analize opisane ovde.
Za potrebe ćelijski ciljanih molekula predmetnog pronalaska, određeni redosled ili orijentacija nije fiksan za komponente: efektorski polipeptid(i) Shiga toksina, vezujući region(i), i bilo koji opcioni linker(i), u odnosu jedan na drugi ili na ceo ćelijski ciljan molekul (videti npr.. Sliku 1),
14
osim ako nije posebno naznačeno. Komponente ćelijski ciljanih molekula predmetnog pronalaska mogu biti raspoređene bilo kojim redosledom pod uslovom da se ne eliminišu željena(e) aktivnost(i) vezujućeg regiona i efektorskog polipeptida Shiga toksina.
IV. Primeri Strukturnih Varijanti Efektorskih Polipeptida Shiga Toksina i Ćelijski Ciljanih Molekula Pronalaska
U određenim primerima izvođenja, efektorski polipeptid Shiga toksina predmetnog pronalaska može sadržati ili se sastojati bitno od skraćene Shiga toksin A Podjedinice. Skraćene Shiga toksin A Podjedinice mogu rezultovati u brisanju celog(ih) epitopa(a) i/ili epitopskog(ih) regiona(a), B-ćelijskih epitopa, CD4+ T-ćelijskih epitopa, i/ili mesta cepanja furina bez uticanja na efektorske funkcije Shiga toksina, kao što je, npr., katalitička aktivnost i citotoksičnost. Najmanji fragment Shiga toksina A Podjedinice za koji je pokazano da pokazuje potpunu enzimsku aktivnost bio je polipeptid sastavljen od ostataka 1-239 Slt1A (LaPointe P et al., J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)). Najmanji fragment Shiga toksina A Podjedinice za koji je pokazano da pokazuje značajnu enzimsku aktivnost bio je polipeptid sastavljen od ostataka 75-247 StxA (Al-Jaufy A et al., Infect Immun 62: 956-60 (1994)).
Iako efektorski polipeptidi Shiga toksina predmetnog pronalaska obično mogu biti manji od Shiga toksin A Podjedinice pune dužine, poželjno je da region efektorskog polipeptida Shiga toksina ćelijski ciljanog molekula predmetnog pronalaska održava polipeptidni region iz amino kiselinske pozicije 77 do 239 (SLT-1A (SEQ ID NO:1) ili StxA (SEQ ID NO:2)) ili ekvivalent u drugim A Podjedinicama članova familije Shiga toksina (npr.77 do 238 (SEQ ID NO:3)). Na primer, u određenim primerima izvođenja molekula predmetnog pronalaska, efektorski polipeptid Shiga toksina predmetnog pronalaska izvedenog iz SLT-1 A mogu sadržati ili se uglavnom sastojati od amino kiselina 75 do 251 SEQ ID NO: 1, 1 do 241 SEQ ID NO: 1, 1 do 251 SEQ ID NO: 1, ili amino kiselina 1 do 261 SEQ ID NO: 1, gde je u odnosu na divlji soj Shiga toksin A Podjedinice najmanje jedan amino kiselinski ostatak mutiran ili je izbrisan u endogenom epitopu i/ili epitopskom regionu, i/ili gde postoji uništeni furinski odcepljeni motiv na karboksi kraju regiona izvedenog iz Shiga toksin A1 fragmenta. Slično tome, regioni efektorskog polipeptida Shiga toksina izvedeni iz StkA mogu sadržati ili se uglavnom sastojati od amino kiselina 75 do 251 SEQ ID NO:2, 1 do 241 SEQ ID NO:2, 1 do 251 SEQ ID NO:2, ili amino kiselina 1 do 261 SEQ ID NO:2, gde je u odnosu na divlji soj Shiga toksin A Podjedinice najmanje jedan amino kiselinski ostatak mutiran ili je izbrisan u endogenom, epitopu i/ili epitopskom regionu, i/ili gde postoji poremećen furinski odcepljeni motiv na karboksi kraju regiona izvedenog iz Shiga toksin A1 fragmenta. Pored toga, regioni
14
efektorskog polipeptida Shiga toksina izvedeni iz SLT-2 mogu sadržati ili se uglavnom sastojati od amino kiselina 75 do 251 SEQ ID NO:3, 1 do 241 SEQ ID NO:3, 1 do 251 SEQ ID NO:3, ili amino kiseline 1 do 261 SEQ ID NO:3, gde je u odnosu na divlji soj Shiga toksin A Podjedinice najmanje jedan amino kiselinski ostatak mutiran ili je izbrisan u endogenom epitopu i/ili epitopskom regionu, i/ili gde je uništeni furinski odcepljeni motiv na karboksi kraju regiona izvedenog iz Shiga toksin A1 fragmenta.
Pronalazak dalje pruža varijante efektorskih polipeptida Shiga toksina i ćelijski ciljane molekule predmetnog pronalaska, pri čemu se efektorski polipeptid Shiga toksina razlikuje od prirodne Shiga toksin A Podjedinice samo ili do 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 ili više amino kiselinskih ostataka (ali ne više od onih koji zadržavaju najmanje 85%, 90%, 95%, 99% ili više identiteta amino kiselinske sekvence). Prema tome, molekul predmetnog pronalaska koji je dobijen iz člana familije Shiga toksin A Podjedinice može obuhvatati dodavanje, brisanje, skraćenje ili druge izmene u originalnoj sekvenci sve dok je najmanje 85%, 90%, 95%, 99% ili više identiteta amino kiselinske sekvence zadržano u Shiga toksin A Podjedinici koja se javlja u prirodi i gde je u odnosu na divlji soj Shiga toksin A Podjedinice najmanje jedan amino kiselinski ostatak mutiran ili je izbrisan iz endogenog epitopa i/ili epitopskog regiona, i/ili gde postoji uništen furinski odcepljeni motiv na karboksi kraju regiona izvedenog iz Shiga toksin A1 fragmenta.
Shodno tome, u određenim primerima izvođenja, efektorski polipeptid Shiga toksin molekula predmetnog pronalaska sadrži ili se sastoji pretežno od amino kiselinskih sekvenci koje imaju najmanje 55%, 60%>, 65%, 10%, 15%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99.5% ili 99.7% ukupnog identiteta sekvence u prirodnoj Shiga toksin A Podjedinici, kao što su SLT-1A (SEQ ID NO:1), StxA (SEQ ID NO:2), i/ili SLT-2A (SEQ ID NO:3) gde je u odnosu na divlji soj Shiga toksin A Podjedinice najmanje jedan amino kiselinski ostatak mutiran ili je izbrisan u endogenom epitopu i/ili epitopskom regionu, i/ili gde postoji uništen furinski odcepljeni motiv na karboksi kraju regiona izvedenog iz Shiga toksin A1 fragmenta.
Opciono, bilo cela dužina ili skraćena verzija Shiga toksin A Podjedinice može da sadrži region efektorskog polipeptida Shiga toksin molekule predmetnog pronalaska, pri čemu polipeptid izveden iz Shiga toksina sadrži jednu ili više mutacija (npr. supstitucije, brisanje, umetanja ili inverzije) u poređenju sa Shiga toksinom koji se javlja u prirodi. U nekim primerima izvođenja pronalaska je poželjno da efektorski polipeptidi Shiga toksina imaju dovoljan identitet sekvence Shiga toksin A Podjedinice koja se javlja u prirodi da zadrže citotoksičnost nakon ulaska u ćeliju, bilo poznatim postupcima transformacije ćelije
14
domaćina, transfekcije, infekcije ili indukcijom, ili internalizacijom posredovanom sa ćelijski ciljanim vezujućim regionom povezan sa efektorskim polipeptidom Shiga toksina. Najkritičniji ostaci za enzimsku aktivnost i/ili citotoksičnost u Shiga toksin A Podjedinici preslikani su na sledeće položaje ostataka: asparagin-75, tirozin-77, glutamat-167, arginin-170 i arginin-176, između ostalih (Di R et al., Toxicon 57: 525-39 (2011)). U bilo kojim primerima izvođenja pronalaska, efektorski polipeptidi Shiga toksina može poželjno, ali ne nužno da održava jednu ili više sačuvanih amino kiselina na pozicijama, kao što su one koje se nalaze na pozicijama 77, 167, 170 i 176 u StxA, SLT-1 A ili ekvivalentno očuvanoj poziciji kod drugih članova familije Shiga toksina koji su obično potrebni za citotoksičnu aktivnost. Kapacitet citotoksičnog molekula pronalaska da izazove smrt ćelija, npr., njegova citotoksičnost, može da se meriti korišćenjem bilo koje ili više brojnih analiza koje su dobro poznate u tehnici.
A. Primeri De-Imunizovanih, Efektorskih Polipeptida Shiga Toksina
U određenim primerima izvođenja, de-imunizovani, efektorski polipeptid Shiga toksina predmetnog pronalaska se može sastojati u osnovi od skraćenja Shiga toksin A Podjedinice koja ima dve ili više mutacija. Skraćenje Shiga toksin A Podjedinice može rezultirati brisanjem celog epitopa(e) i/ili epitopskog(ih) regiona, B-ćelijskih epitopa, CD4 T-ćelijskih epitopa i/ili mesta cepanja furina bez uticaja na efektorske funkcije Shiga toksina, kao što su, npr., katalitička aktivnost i citotoksičnost. Skraćenje karboksi kraja SLT-1A, StxA, ili SLT-2A do amino kiselina 1-251 uklanja dva predviđena B-ćelijska epitopska regiona, dva predviđena CD4 pozitivna (CD4 ) T-ćelijska epitopa i predviđeni diskontinuirani B-ćelijski epitop. Skraćenje amino kraja SLT-1A, StxA, ili SLT-2A do 75-293 uklanja najmanje tri predviđena B-ćelijska epitopska regiona i tri predviđena CD4+ T-ćelijska epitopa. Skraćenje oba i amino i karboksi kraja SLT-1A, StxA, ili SLT-2A to 75-251 uklanja najmanje pet predviđenih B- ćelijska epitopska regiona, četiri predviđena CD4+ T- ćelijska epitopa i jedan predviđeni uništeni B-ćelijski epitop.
U određenim primerima izvođenja, de-imunizovani, efektorski polipeptid Shiga toksina predmetnog pronalaska može da sadrži ili se sastoji u osnovi od cele ili skraćene Shiga toksin A Podjedinice sa najmanje jednom mutacijom (u odnosu na polipeptid divljeg soja Shiga toksina), npr., brisanje, ubacivanje, inverzija ili supstitucija u obezbeđenom endogenom B-ćelijskom i/ili CD4 T-ćelijskom epitopskom regionu. U nekim primerima izvođenja, efektorski polipeptid Shiga toksina predmetnog pronalaska sadrži uništenje koje sadrži mutaciju (u odnosu na polipeptid divljeg soja Shiga toksina) koja uključuje brisanje najmanje jednog amino kiselinskog ostatka unutar endogenog, B-ćelijskog i/ili CD4 T-
14
ćelijskog epitopskog regiona. U nekim primerima izvođenja, efektorski polipeptid Shiga toksina predmetnog pronalaska sadrži uništenje koje sadrži umetanje najmanje jednog amino kiselinskog ostatka u endogeni, B-ćelijski i / ili CD4 T-ćelijski epitopski region. U nekim primerima izvođenja, efektorski polipeptid Shiga toksina predmetnog pronalaska sadrži uništenje koje sadrži inverziju amino kiselinskih ostataka, pri čemu je najmanje jedan obrnuti amino kiselinski ostatak unutar endogenog, B-ćelijskog i/ili CD4 T-ćelijskog epitopskog regiona. U nekim primerima izvođenja, efektorski polipeptid Shiga toksina predmetnog pronalaska sadrži uništenje koje sadrži mutaciju (u odnosu na polipeptid divljeg soja Shiga toksina), kao što je, npr., supstitucija amino kiselinama, supstitucija amino kiselina sa ne-standardnim amino kiselinama i/ili amino kiselinskim ostacima sa hemijski modifikovanim bočnim lancem. Neograničavajući primeri de imunizovanih, pod-regiona efektorskog Shiga toksina pogodnih za upotrebu u predmetnom pronalasku su opisani u WO 2015/113005, WO 2015/113007 i WO 2015/191764. Brojni, neograničavajući primeri efektorskih polipeptida Shiga toksina predmetnog pronalaska koji sadrže amino kiselinske supstitucije su dati u Primerima.
U drugim primerima izvođenja, de-imunizovani, efektorski polipeptid Shiga toksina predmetnog pronalaska obuhvata skraćenu Shiga toksin A Podjedinicu koja je kraća od celokupne Shiga toksin A Podjedinice, pri čemu je najmanje jedan amino kiselinski ostatak uništen u izvornoj poziciji, B-ćelijskog i/ili CD4 T-ćelijskog epitopa koji je dat u Primerima (videti npr. Tabele 1-7 i/ili Tabelu B).
Da bi se stvorio de-imunizovani, efektorski polipeptid Shiga toksina, u principu izmena bilo kog amino kiselinskog ostatka u obezbeđenom epitopskom regionu na različite načine može da dovede do uništenja epitopa, kao što je, na primer, modifikacija koja predstavlja brisanje, umetanje, inverzija, preuređivanje, supstitucija i hemijska modifikacija bočnog lanca u odnosu na polipeptid divljeg soja Shiga toksina. Međutim, verovatnoća da će modifikovanje određenih amino kiselinskih ostataka i korišćenje određenih modifikacija amino kiselina uspešno smanjiti antigenost i/ili imunogenost uz zadržavanje određenog nivoa efektorskih funkcija Shiga toksina. Na primer, krajnja skraćenja i unutrašnje supstitucije amino kiselina su poželjne jer ove vrste modifikacija održavaju ukupni razmak amino kiselinskih ostataka u efektorskom polipeptidu Shiga toksina i na taj način je verovatnije da će održavati strukturu i funkciju efektorskog polipeptida Shiga toksina.
Među određenim primerima izvođenja predmetnog pronalaska, de-imunizovani, efektorski polipeptid Shiga toksina sadrži ili se sastoji u osnovi od amino kiselina 75 do 251 SLT-1A
14
(SEQ ID NO:1), StxA (SEQ ID NO:2), i/ili SLT-2A (SEQ ID NO:3) pri čemu je najmanje jedan amino kiselinski ostatak uništen u izvorno pozicioniranom epitopskom regionu datom u Primerima (videti npr. Tabele 1-7 i/ili 12). Među određenim primerima izvođenja su deimunizovani, efektorski polipeptidi Shiga toksina sadrže ili se sastoje u osnovi od amino kiselina 1 do 241 SLT-1A (SEQ ID NO:1), StxA (SEQ ID NO:2), i/ili SLT-2A (SEQ ID NO:3) pri čemu je najmanje jedan amino kiselinski ostatak uništen u izvorno pozicioniranom epitopskom regionu datom u Primerima (videti npr. Tabele 1-7 i/ili 12). Drugi primeri izvođenja su de-imunizovani, efektorski polipeptid Shiga toksina koji se sadrži ili se sastoji u osnovi od 1 do 251 SLT-1A (SEQ ID NO:1), StxA (SEQ ID NO:2), i/ili SLT-2A (SEQ ID NO:3) pri čemu je najmanje jedan amino kiselinski ostatak uništen u izvorno pozicioniranom epitopskom regionu datom u Primerima (videti npr. Tabele 1-7 i/ili 12). Drugi primeri izvođenja su Shiga toksin efektorski polipeptid Shiga toksina koji sadrže amino kiseline 1 do 261 SLT-1A (SEQ ID NO: 1), StxA (SEQ ID NO:2), i/ili SLT-2A (SEQ ID NO:3) pri čemu je najmanje jedan amino kiselinski ostatak uništen u izvorno pozicioniranom epitopskom regionu datom u Primerima (videti npr. Tabele 1-7 i/ili 12).
Postoje brojne, raznolike, unutrašnje amino kiselinske supstitucije koje se mogu koristiti za stvaranje de-imunizovanih efektorskih polipeptida Shiga toksina pronalaska. Od mogućih supstituisanih amino kiselina koje se koriste u epitopskom regionu, predviđa se da će sledeći supstituisani amino kiselinski ostaci najverovatnije smanjiti antigenost i/ili imunogenost epitopa - G, D, E, S, T, R, K i H. Osim glicina, ovi amino kiselinski ostaci mogu se klasifikovati kao polarni i/ili napunjeni ostaci. Od mogućih amino kiselina koje se mogu supstituisati sa, sledeće amino kiseline A, G, V, L, I, P, C, M, F, S, D, N, K, H i K se predviđaju kao najverovatnije za smanjenje antigenosti i / ili imunogenosti uz obezbeđivanje zadržavanja značajnog nivoa efektorske(ih) funkcije(a) Shiga toksina, u zavisnosti od amino kiseline koja se supstituiše. Uopšteno, supstitucija treba da promeni polarne i/ili naelektrisani amino kiselinski ostatak u nepolarni i nenaelektrisani ostatak (videti npr. WO 2015/113005). Pored toga, može biti korisno uništiti epitop kako bi se smanjila ukupna veličina i/ili dužina funkcionalnog bočnog lanca amino kiselinskog ostatka (videti npr. WO 2015/113005).
Međutim, uprkos ovim uopštenim supstitucija, koje najverovatnije dovode do uništenja epitopa, jer je cilj očuvanje značajnih efektorskih funkcija Shiga toksina, amino kiselinska supstitucija će verovatnije sačuvati efektorske funkcije Shiga toksin ako liči na amino kiselinu supstituisanu za, kao što je, npr., nepolarni i/ili nenaelektrisani ostatak slične veličine, supstituisan za polarni i/ili naelektrisani ostatak.
1
U navedenim primerima u nastavku i u WO 2015/113005, mnoge mutacije su empirijski testirane na efekat(te) na efektorskoj funkciju Shiga toksina raznih efektorskih polipeptida Shiga toksina i ćelijski ciljanih molekula. Tabela B rezimira rezultate opisane u Primerima i u WO 2015/113005 gde supstitucija amino kiselina, sama ili u kombinaciji sa jednom ili više drugih supstitucija, nije sprečila pojavu moćnog nivoa efektorske funkcije Shiga toksina. Tabela B koristi šemu numerisanja epitopskog regiona opisanog u navedenim Primerima u nastavku (videti Primer 1-Tabela 7, infra).
TABELA B. Amino Kiselinske Supstitucije u Shiga Toksinu
1 1
12
Na osnovu empirijskih dokaza u Primerima koji su ovde navedeni i u WO 2015/113005, predviđa se da će određene amino kiselinske pozicije u Shiga toksin A Podjedinici tolerisati epitopsko uništenje uz zadržavanje značajnih efektorskih funkcija Shiga toksina. Na primer, sledeće pozicije koje se javljaju u prirodi tolerišu amino kiselinsku supstituciju, samostalno ili u kombinaciji, zadržavajući efektorsku funkciju Shiga toksin, kao što je citotoksičnost - 1 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 4 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 8 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 9 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 11 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 33 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 43 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 44 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 45 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 46 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 47 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 48 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 49 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 50 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 51 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 53 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 54 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 55 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 56 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 57 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 58 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 59 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 60 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 61 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 62 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 84 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 88 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 94 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 96 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 104 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 105 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 107 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 108 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 109 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 110 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 111 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 112 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 141 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 147 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 154 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 179 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 180 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 181 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 183 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 184 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 185 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 186 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 187 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 188 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 189 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 198 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 204 SEQ ID NO:3; 205 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 241 SEQ ID NO:3; 242 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 247 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 247 SEQ ID NO:3; 248 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 250
1
SEQ ID NO:3; 251 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 264 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 265 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; i 286 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2.
Empirijski podaci u Primerima i u WO 2015/113005 upućuju na druge supstitucije koje ometaju epitop i kombinacije supstitucija koje ometaju epitop i koje mogu umanjiti antigenost i/ili imunogenost efektorskog polipeptida Shiga toksina, zadržavajući sposobnost da efektorski polipeptid Shiga toksina ispoljava značajnu efektorsku funkciju Shiga toksina, kao što su, npr., nove kombinacije gore spomenutih skraćenja i pozicija koje tolerišu supstitucije, kao i nove supstitucije na identičnim pozicijama ili sačuvanim pozicijama u srodnim Shiga toksin A Podjedinicama.
Predvidljivo je da druge amino kiselinske supstitucije na amino kiselinskim ostacima konzervativne funkcionalne grupe supstitucije testirane ovde mogu da smanje antigenost i/ili imunogenost uz očuvanje značajne efektorske funkcije Shiga toksina. Na primer, druge supstitucije koje su poznate stručnjaku da su slične bilo kojoj od K1A, KIM, T4I, D6R, S8I, T8V, T9I, S9I, K11A, K11H, T12K, S33I, S33C, S43N, G44L, S45V, S45I, T45V, T45I, G46P, D47M, D47G, N48V, N48F, L49A, F50T, A51V, D53A, D53N, D53G, V54L, V54I, R55A, R55V, R55L, G56P, I57F, I57M, D58A, D58V, D58F, P59A, P59F, E60I, E60T, E60R, E61A, E61V, E61L, G62A, R84A, V88A, D94A, S96I, T104N, A105L, T107P, L108M, S109V, T109V, G110A, D111T, S112V, D141A, G147A, V154A, R179A, T180G, T181I, D183A, D183G, D184A, D184F, L185V, L185D, S186A, S186F, G187A, G187T, R188A, R188L, S189A, D198A, R204A, R205A, C242S, S247I, Y247A, R248A, R250A, R251A, ili D264A, G264A, T286A, i/ili T286I može da poremeti endogeni epitop uz održavanje najmanje jedne efektorske funkcije Shiga toksina. Posebno, amino kiselinske supstitucije konzervativnim amino kiselinskim ostacima sličnim onima K1A, K1M, T4I, S8I, T8V, T9I, S9I, K11A, K11H, S33I, S33C, S43N, G44L, S45V, S45I, T45V, T45I, G46P, D47M, N48V, N48F, L49A, A51V, D53A, D53N, V54L, V54I, R55A, R55V, R55L, G56P, I57F, I57M, D58A, D58V, D58F, P59A, E60I, E60T, E61A, E61V, E61L, G62A, R84A, V88A, D94A, S96I, T104N, T107P, L108M, S109V, T109V, G110A, D111T, SI 12V, D141A, G147A, V154A, R179A, T180G, T181I, D183A, D183G, D184A, D184F, L185V, S186A, S186F, G187A, R188A, R188L, S189A, D198A, R204A, R205A, C242S, S247I, Y247A, R248A, R250A, R251A, D264A, G264A, T286A, i T286I mogu imati iste ili slične efekte. U određenim primerima izvođenja, efektorski polipeptid Shiga toksina pronalaska može sadržati slične konzervativne amino kiselinske supstitucije kao empirijski testirane, kao što su, npr., K1 do G, V, L, I, F, i H; T4 do A, G, V, L, F, M, i S; S8 do A, G, V, L, F, i M; T9 do A, G, L, F, M, i S; S9 do A, G, L, I, F, i M; K11 do G, V, L, I, F, i M; S33 do A, G, V, L, F, i M; S43 do A, G, V, L, I, F, i M; S45 do
1 4
A, G, L, F, i M; T45 do A, G, L, F, i M; D47 do A, V, L, I, F, S, i Q; N48 do A, G, L, i M; L49 do G; Y49 do A; D53 do V, L, I, F, S, i Q; R55 do G, I, F, M, Q, S, K, i H; D58 do G, L, I, S, i Q; P59 do G; E60 do A, G, V, L, F, S, Q, N, D, i M; E61 do G, I, F, S, Q, N, D, M, i R; R84 do G, V, L, I, F, M, Q, S, K, i H; V88 do G; 188 do G; D94 do G, V, L, I, F, S, i Q; S96 do A, G, V, L, F, i M; T107 do A, G, V, L, I, F, M, i S; S107 do A, G, V, L, I, F, i M; S109 do A, G, I, L, F, i M; T109 do A, G, I, L, F, M, i S; S112 do A, G, L, I, F, i M; D141 do V, L, I, F, S, i Q; V154 do G; R179 do G, V, L, I, F, M, Q, S, K, i H; T180 do A, V, L, I, F, M, i S; T181 do A, G, V, L, F, M, i S; D183 do V, L, I, F, S, i Q; D184 do G, V, L, I, S, i Q; S186 do G, V, I, L, i M; R188 do G, V, I, F, M, Q, S, K, i H; S189 do G, V, I, L, F, i M; D197 do V, L, I, F, S, i Q; D198 do A, V, L, I, F, S, i Q; R204 do G, V, L, I, F, M, Q, S, K, i H; R205 do G, V, L, I, F, M, Q, S, K i H; S247 do A, G, V, I, L, F, i M; Y247 do A, G, V, L, I, F, i M; R248 do G, V, L, I, F, M, Q, S, K, i H; R250 do G, V, L, I, F, M, Q, S, K, i H; R251 do G, V, L, I, F, M, Q, S, K, i H; D264 do A, G, V, L, I, F, S, i Q; i T286 do A, G, V, L, I, F, M, i S.
Slično tome, amino kiselinske supstitucije koje uklanjaju naelektrisanje, polaritet, i/ili smanjuju dužinu bočnog lanca mogu poremetiti epitop uz održavanje barem jedne efektroske funkcije Shiga toksina. U određenim primerima izvođenja, efektorski polipeptid Shiga toksina predmetnog pronalaska može sadržati jedan ili više epitopa uništenih sa supstitucijama tako da se uklanja navedeno naelektrisanje bočnog lanca, uklanja polaritet, i/ili dužina bočnog lanca se smanjuje kao što je, npr., zamena odgovarajuće amino kiseline odabrane iz sledeće grupe A, G, V, L, I, P, C, M, F, S, D, N, Q, H, ili K za amino kiselinski ostatak na poziciji 1 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 4 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 6 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 8 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 9 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 11 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 12 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 33 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 43 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 44 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 45 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 46 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 47 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 48 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 49 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 50 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 51 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 53 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 54 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 55 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 56 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 57 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 58 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 59 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 60 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 61 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 62 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 84 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 88 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 94 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 96 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 104 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 105 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 107 SEQ ID NO: 1, SEQ ID
1
NO:2, ili SEQ ID NO:3; 108 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 109 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 110 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 111 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 112 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 141 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 147 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 154 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 179 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 180 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 181 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 183 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 184 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 185 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 186 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 187 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 188 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 189 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 197 SEQ ID NO:3; 198 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 204 SEQ ID NO:3; 205 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 241 SEQ ID NO:3; 242 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 247 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 247 SEQ ID NO:3; 248 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 250 SEQ ID NO:3; 251 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2; 264 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 265 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; i 286 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2. U određenim primerima izvođenja, efektorski polipeptid Shiga toksina predmetnog pronalaska može da sadrži jednu ili više sledećih amino kiselinskih supstitucija: K1 do A, G, V, L, I, F, M i H; T4 do A, G, V, L, I, F, M, i S; D6 do A, G, V, L, I, F, S, i Q; S8 do A, G, V, I, L, F, i M; T8 do A, G, V, I, L, F, M, i S; T9 do A, G, V, I, L, F, M, i S; S9 do A, G, V, L, I, F, i M; K11 do A, G, V, L, I, F, M i H; T12 do A, G, V, I, L, F, M, i S; S33 do A, G, V, L, I, F, i M; S43 do A, G, V, L, I, F, i M; G44 do A i L; S45 do A, G, V, L, I, F, i M; T45 do A, G, V, L, I, F, i M; G46 do A i P; D47 do A, G, V, L, I, F, S, i Q; N48 do A, G, V, L, i M; L49 do A ili G; F50 do A, G, V, L, I, i T; A51 do V; D53 do A, G, V, L, I, F, S, i Q; V54 do A, G, i L; R55 do A, G, V, L, I, F, M, Q, S, K, i H; G56 do A i P; 157 do A, G, M, i F; L57 do A, G, M, i F; D58 to A, G, V, L, I, F, S, i Q; P59 do A, G, i F; E60 do A, G, V, L, I, F, S, Q, N, D, M, i R; E61 do A, G, V, L, I, F, S, Q, N, D, M, i R; G62 do A; D94 do A, G, V, L, I, F, S, i Q; R84 do A, G, V, L, I, F, M, Q, S, K, i H; V88 do A i G; 188 do A, G, i V; D94; S96 do A, G, V, I, L, F, i M; T104 do A, G, V, I, L, F, M, i S; A105 do L; T107 do A, G, V, I, L, F, M, i S; S107 do A, G, V, L, I, F, i M; L108 do A, G, i M; S109 do A, G, V, I, L, F, i M; T109 do A, G, V, I, L, F, M, i S; G110 do A; D111 do A, G, V, L, I, F, S, i Q; S112 do A, G, V, L, I, F, i M; D141 do A, G, V, L, I, F, S, i Q; G147 do A; V154 do A i G; R179 do A, G, V, L, I, F, M, Q, S, K, i H; T180 do A, G, V, L, I, F, M, i S; T181 do A, G, V, L, I, F, M, i S; D183 do A, G, V, L, I, F, S, i Q; D184 do A, G, V, L, I, F, S, i Q; L185 do A, G, i V; S186 do A, G, V, I, L, F, i M; G187 do A; R188 do A, G, V, L, I, F, M, Q, S, K, i H; S189 do A, G, V, I, L, F, i M; D197 do A, G, V, L, I, F, S, i Q; D198 do A, G, V, L, I, F, S, i Q; R204 do A, G, V, L, I, F, M, Q, S, K, i H; R205 do A, G, V, L, I, F, M, Q, S, K i H; C242 do A, G, V, i S; S247 do A, G, V, I, L, F, i M; Y247 do A, G, V, L, I, F, i M; R248 do A, G, V, L, I, F, M, Q, S, K, i H; R250 do A, G, V, L, I,
1
F, M, Q, S, K, i H; R251 do A, G, V, L, I, F, M, Q, S, K, i H; C262 do A, G, V, i S; D264 do A, G, V, L, I, F, S, i Q; G264 d A; i T286 do A, G, V, L, I, F, M, i S.
Pored toga, svaka amino kiselinska supstitucija u jednom epitopskom regionu efektorskog polipeptida Shiga toksina koja uništava epitop uz zadržavanje značajne efektorske funkcije Shiga toksina može se kombinovati sa bilo kojom drugom amino kiselinskom supstitucijom u istom ili drugom epitopskom regionu koji uništava epitop zadržavajući značajnu efektorsku funkciju Shiga toksina da formira de-imunizovani, efektorski polipeptid Shiga toksina sa višestrukim epitopskim regionima koji su uništeni, a da pritom zadrži značajan nivo efektorske funkcije Shiga toksina. U određenim primerima izvođenja, efektorski polipeptid Shiga toksina predmetnog pronalaska može da sadrži kombinaciju dve ili više prethodno navedenih supstitucija i/ili kombinacija supstitucija opisanih u WO 2015/113005.
Na osnovu empirijskih dokaza u Primerima i u WO 2015/113005, određeni amino kiselinski regioni u A Podjedinici Shiga toksina predviđa da tolerišu uništenje epitopa uz zadržavanje značajnih efektorskih funkcija Shiga toksina. Na primer, epitopski regioni koji su izvorno pozicionirani na 1-15, 39-48, 53-66, 55-66, 94-115, 180-190, 179-190, i 243-257 tolerisali su višestruke kombinacije amino kiselinske supstitucije istovremeno bez ugrožavanja enzimske aktivnost i citotoksičnost Shiga toksina.
B. Primeri Efektorskih Polipeptida Shiga Toksina Otporni na Cepanje Furina
U određenim primerima izvođenja, efektorski polipeptid Shiga toksin predmetnog pronalaska može sadržati uništeni, furinski odcepljeni motiv i/ili mesto cepanja na karboksi kraju regiona izvedenog iz Shiga toksin A1 fragmenta. U određenim drugim primerima izvođenja, efektorski polipeptid Shiga toksina ne sadrži bilo koju poznatu kompenzatorsku strukturu koja može da obezbedi cepanje furina blizu karboksi kraja regiona izvedenog iz Shiga toksin A1 fragmenta. Ne ograničavajući primeri uništenog furinskog odcepljenog motiva i mesta cepanja furina za primenu u predmetnom pronalasku su opisani u WO 2015/191764.
Određena uništenja furinski odcepljenog motiva su ovde naznačeni pozivajući se na specifične položaje amino kiselina izvorne Shiga toksin A Podjedinice navedene u Listi Sekvenci, primećujući da Shiga toksin A Podjedinice koje se nalaze u prirodi uključuju oblike prekursora koji sadrže sekvence signala od oko 22 amino kiseline na njihovim amino krajevima koji su uklonjeni kako bi se stvorile zrele Shiga toksin A Podjedinice i prepoznatljive su od strane stručnjaka. Nadalje, određena uništenja furinski odcepljenog
1
motiva koja sadrže mutacije su ovde naznačena referencama na specifične amino kiseline (npr. R za ostatak arginina) koji su izvorno prisutni na specifičnim pozicijama unutar izvornih Shiga toksin A Podjedinica (npr. R251 za ostatak arginina na poziciji 251 od amino kraj), a zatim amino kiselina sa kojom je taj ostatak supstituisan u određenoj mutaciji o kojoj se raspravlja (npr. R251A predstavlja amino kiselinsku supstituciju alanina za arginin na amino kiselinskom ostatku 251 od amino kraja).
U određenim primerima izvođenja, efektorski polipeptid Shiga toksina predmetnog pronalaska obuhvata furinski odcepljeni motiv na karboksi kraju regiona izvedenog iz Shiga toksin A1 fragmenta, i takvi primeri izvođenja se ovde nazivaju "otporni na cepanje furin" ili "otporni na cepljenje proteaze", efektorski polipeptidi Shiga toksin da bi se opisali njihovo(a) svojstvo(a) u odnosu na divlji soj, Shiga toksin A Podjedinice i/ili divlji soj, Shiga toksin A1 fragmenta spojenog proteina.
U određenim primerima izvođenja, efektorski polipeptid Shiga toksina koji je otporan na cepanje proteaze predmetnog pronalaska sastoji se u osnovi od skraćene Shiga toksin A Podjedinice koja ima dve ili više mutacija.
U određenim primerima izvođenja, efektorski polipeptid Shiga toksina koji je otporan na cepanje proteaze predmetnog pronalaska obuhvata uništeni furinski odcepljeni motiv koji sadrži supstituciju amino kiselinskog ostatka (u odnosu na divlji soj Shiga toksin polipeptida) jednog ili oba ostatka arginina u minimalnom, konsenzusnom motivu furinskog cepanja sa A, G, ili H. U određenim primerima izvođenja, efektorski polipeptid Shiga toksina koji je otporan na cepanje proteaze predmetnog pronalaska obuhvata uništenje koje sadrži amino kiselinsku supstituciju unutar regiona furinski odcepljenog motiva, gde se u supstituciji dešava kod izvorno postavljene amino kiseline odabrane iz grupe koju čine: 247 SEQ ID NO:3, 248 SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2, 250 SEQ ID NO:3, 251 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2, ili ekvivalentni položaj u očuvanom efektorskom polipeptidu Shiga toksina i/ili neizvorne sekvence efektorskog polipeptida Shiga toksina. U određenim daljim primerima izvođenja, supstitucija je bilo koja nekonzervativna amino kiselini i zamena se dešava na izvorno postavljenom položaju amino kiselinskog ostataka. U određenim daljim primerima izvođenja, mutacija sadrži amino kiselinsku supstituciju odabranu iz grupe koja se sastoji od: R247A, R248A, R250A R251A, ili ekvivalentni položaj u očuvanom efektorskom polipeptidu Shiga toksina i/ili ne-izvornoj sekvenci efektorskog polipeptida Shiga toksina.
1
U određenim primerima izvođenja, efektorski polipeptid Shiga toksina koji je otporan na cepanje proteaze predmetnog pronalaska obuhvata uništeni furinski odcepljeni motiv koji sadrži mutaciju koja predstavlja brisanje. U određenim daljim primerima izvođenja, uništeni furinski odcepljeni motiv obuhvata mutaciju koja predstavlja brisanje regiona izvorno pozicioniran na 247-252 u StxA (SEQ ID NO:2) i SLT-1A (SEQ ID NO:3), ili regiona izvorno pozicioniran na 246-251 u SLT-2A (SEQ ID NO:3); brisanje regiona izvorno pozicioniran na 244-246 u StxA (SEQ ID NO:2) i SLT-1A (SEQ ID NO:3), ili regiona izvorno pozicioniran na 243-245 u SLT-2A (SEQ ID NO:3); ili brisanje regiona izvorno pozicioniran na 253-259 u StxA (SEQ ID NO:2) i SLT-1A (SEQ ID NO:3), ili regiona izvorno pozicioniran na 252-258 u SLT-2A (SEQ ID NO:3).
U određenim primerima izvođenja, efektorski polipeptid Shiga toksina koji je otporan na cepanje proteaze predmetnog pronalaska, uništeni furinski odcepljeni motiv obuhvata mutaciju koja predstavlja skraćenje karboksi kraja kada se poredi sa divljim sojem Shiga toksin A Podjedinice, skraćenje koje rezultuje u brisanju jednog ili više amino kiselinskih ostataka unutar furinski odcepljenog motiva U određenim daljim primerima izvođenja, uništeni furinski odcepljeni motiv obuhvata skraćenje karboksi kraja koje briše jdan ili više amino kiselinskih ostataka unutar minimalnog mesta cepanja Y/R-x-x-R, kao što je, npr., za StxA i SLT-1A izvedene efektorske polipeptide Shiga toksina, skraćenja koja završavaju na poziciji izvornog amino kiselinskog ostatka 250, 249, 248, 247, 246, 245, 244, 243, 242, 241, 240, ili manje; i za SLT-2A izvedene efektorske polipeptide Shiga toksina, kraćenja koja završavaju na poziciji izvornog amino kiselinskog ostatka 249, 248, 247, 246, 245, 244, 243, 242, 241, ili manje. Određeni drugi primeri izvođenja obuhvataju uništeni furinski odcepljeni motiv koji sadrži kombinaciju bilo kojih prethodno navedenih mutacija, gde je moguće.
U određenim primerima izvođenja, uništeni furinski odcepljeni motiv obuhvata mutaciju(e) koja je delimično, skraćenje karboksi kraja furinski odcepljenog motiva; međutim, određeni molkeuli predmetnog pronalaska ne sadrže uništeni furinski odcepljeni motiv koji je kompletan, skraćenje karboksi kraja svih 20 amino kiselinskih ostataka, furisnki odcepljenog motiva. Na primer, određeni, efektorski polipeptidi Shiga toksina predmetnog pronalaska sadrže furinski odcepljeni motiv koji sadrži delimično, skraćenje karboksi kraja regiona Shiga toksin A1 fragmenta do izvorne pozicije 240 u StxA (SEQ ID NO:2) ili SLT-1A (SEQ ID NO:1) ali ne skraćenje karboksi kraja na poziciji 239 ili manje. Slično, određeni efektorski polipeptidi Shiga toksina predmetnog pronalaska obuhvataju unišetni furinski odcepljeni motiv koji sadrži delimično, skraćenje karboksi kraja regiona Shiga toksin A1 fragmenta do izvorne pozicije 239 u SLT-2A (SEQ ID NO:3) ali ne skraćenje karboksi kraja na poziciji 238
1
ili manje. U najvećem skraćenju karboksi kraja otpornog na cepanje furinom, efektorski polipeptid Shiga toksina predmetnog pronalaska, mutacije koje sadrže uništeni furinski odcepljeni motiv, pozicija P14 i P13 furinski odcepljenog motiva i dalje su prisutni.
U određenim primerima izvođenja, uništeni furinski odcepljeni motiv obuhvata oba i supstituciju amino kiselinskog ostatka unutar furinski odcepljenog motiva i skraćenje karboksi kraja kada se poredi sa divljim sojem, Shiga toksin A Podjedinice. U određenim primerima izvođenja, uništeni furinski odcepljeni motiv obuhvata oba i supstituciju amino kiselinskog ostatka unutar minimalnog mesta cepanja furina R/Y-x-x-R i skraćenje karboksi kraja kada se poredi sa divljim sojem, Shiga toksin A Podjedinice, kao što je, npr., za StxA i SLT-1 A izvedene Shiga toksin efektorske polipeptide, skraćenja koja završavaju na izvornoj poziciji amino kiselinskog ostatka 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, ili više i sadrže izvorno pozicionirane amino kiselinske ostatke R248 i/ili R251 supstituisan sa bilo kojim negativno naelektrisanim, amino kiselinskim ostatkom gde odgovara; i za SLT-2A izvedene Shiga toksin efektorske polipeptide, skraćenja koja završavaju na izvornoj poziciji amino kiselinskog ostatka 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, ili više i sadrže izvorno pozicionirane amino kiselinske ostatke Y247 i/ili R250 supstituisane bilo kojim amino kiselinskim ostatkom koji nisu pozitivno naelektrisani, gde je to potrebno. U određenim primerima izvođenja, skraćeni efektorski polipeptid Shiga toksina koji sadrži furinski odcepljeni motiv takođe sadrži furinski odcepljeni motiv, amino kiselinske ostatke na pozicijama P9, P8, i/ili P7 da bi se održala optimalna citotoksičnost.
U određenim primerima izvođenja, uništeni furinski odcepljeni motiv obuhvata mutaciju(e) koja predstavlja jedno ili više unutrašnjih brisanja amino kiselinskih ostataka, u poređenju sa divljim sojem, Shiga toksin A Podjedinice. U određenim drugim primerima izvođenja, uništeni furinski odcepljeni motiv obuhvata mutaciju(e) koja ima jedno ili više brisanja amino kiselinskih ostataka unutar minimalnog mesta cepanja furina R/Y-x-x-R. Na primer, StxA i SLT-1A izvedeni efektorski polipeptidi Shiga toksina koji sdarže unutrašenje brisanje izvorno pozicioniranih amino kiselinskih ostataka R248 i/ili R251, koji mogu biti kombinovani sa brisanjima ostataka u okruženju kao što su, npr., 249, 250, 247, 252, itd.; i SLT-2A izvedeni efektorski polipeptidi Shiga toksina koji sadrže unutrašnje brisanje izvorno pozicioniranih amino kiselinskih ostataka Y247 i/ili R250, koji mogu biti kombinovani uz brisanje ostataka u
1
okruženju kao što su, npr., 248, 249, 246, 251, itd. U određenim drugim primerima izvođenja, uništeni furinski odcepljeni motiv obuhvata mutaciju koja predstavlja brisanje četiri, konsekutivna, amino kiselinska ostatka koji brišu minimalno mesto cepanja furina R/Y-x-x-R, kao što je, npr., StxA i SLT-1A izvedeni efektorski polipeptidi Shiga toksina kojima nedostaje R248-R251 SLT-2A izvedeni efektorski polipeptidi Shiga toksina kojima nedostajeY247-R250. U određenim drugim primerima izvođenja, uništeni furinski odcepljeni motiv obuhvata mutaciju(e) koja ima jedno ili više brisanja amino kiselinskih ostataka u amino kiselinskim ostacima bočnog jezgra furinski odcepljenog motiva, kao što je, npr., brisanje 244-247 i/ili 252-255 u SLT-1A ili StxA. U određenim drugim primerima izvođenja, uništeni furinski odcepljeni motiv obuhvata mutaciju koja predstavlja unutrašnje brisanje cele površinski izložene, osetljive petlje cepanja proteaze kada se poredi sa divljim sojem, Shiga toksin A Podjedinice, kao što je, npr., za StxA i SLT-1A izvedene efektoorske polipeptide Shiga toksina, brisanje izvorno pozicioniranih amino kiselinskih ostataka 241-262; i za SLT-2A izvedene efektoorske polipeptide Shiga toksina, brisanje izvorno pozicioniranih amino kiselinskih ostataka 240-261.
U određenim primerima izvođenja, uništeni furinski odcepljeni motiv obuhvata obe i mutaciju koja predstavlja unutrašnje brisanje amino kiselinskog ostatka unutar furinski odcepljenog motiva i mutaciju koja predstavlja skraćenje karboksi kraja kada se poredi sa divljim sojem, Shiga toksin A Podjedinice. U određenim drugim primerima izvođenja, uništeni furinski odcepljeni motiv obuhvata obe i mutaciju koja predstavlja unutrašnje brisanje amino kiselinskog ostatka unutar minimalnog mesta cepanja furina R/Y-x-x-R i mutaciju koja predstavlja skraćenje karboksi kraja kada se poredi sa divljim sojem, Shiga toksin A Podjedinice. Na primer, otporni na cepanje protozoe, efektorski polipeptidi Shiga toksina mogu sadržati uništeni furinski odcepljeni motiv koji sadrži mutaciju(e) koje predstavljaju brisanje izvorno pozicioniranih amino kiselinskih ostataka 248-249 i/ili 250-251 u skraćenom StxA ili SLT-1A polipeptidu koji još uvek ima amino kiselinski ostatak 247 i/ili 252, ili amino ksielinske ostatke 247-248 i/ili 249-250 u skraćenom SLT-2A koji još uvek ima amino kiselinski ostatak 246 i/ili 251. U određenim drugim primerima izvođenja, uništeni furinski odcepljeni motiv obuhvata mutaciju koja ima brisanje četiri, konsekutivna, amino kiselinska ostatka koji brišu minimalno mesto cepanja furina R/Y-x-x-R i skraćenje karboksi kraja kada se poredi sa divljim sojem, Shiga toksin A Podjedinice, kao što je, npr., za StxA i SLT-1A izvedene efektorske polipeptide Shiga toksina, skraćenja koja završavaju na izvornim pozicijama amino kiselinskog ostatka 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, ili više i nedostajenje R248-R251; i
1 1
za SLT-2A izvedene efektorske polipeptide Shiga toksina, skraćenja koja završavaju na izvornim pozicijama amino kiselinskog ostatka 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, ili više i nedostajenje Y247-R250.
C. Primeri Efektorskih Polipeptida Shiga Toksina Koji Imaju Ugrađeni Epitop
U određenim primerima izvođenje, efektorski polipeptid Shiga toksina predmetnog pronalaska može sadržati jedan ili više ugrađenih ili ubačenih, heterolognih, T-ćelijskih epitopa za svrhu de-imunizacije i/ili dostave do MHC klasa I prezentacijskog puta ciljane ćelije. Za određene primere izvođenja i/ili određene pod-regione efektorskog polipeptida Shiga toksina, ugrađeni ili ubačeni ili delimično ugrađeni T-ćelijski epitop može biti poželjan tokom ubacivanja T-ćelijskog epitopa zato što, npr., modifikacije ugrađenog tipa su više slične da budu uspešnije u raznolikim pod-regionima efektorskog polipeptida Shiga toksina gde uspešno ubacivanje može biti više ograničeno na manji podset pod-regiona efektorskog polipeptida Shiga toksina. Izraz "uspešan" se koristi ovde da označi modifikaciju na efektorskom polipeptidu Shiga toksina (npr. uvođenje heterolognog, T-ćelijskog epitopa) koji rezultuje u modifikovanom efektorskom polipeptidu Shiga toksina koji zadržava jednu ili više efektorskih funkcija Shiga toksina na potreban nivo aktivnosti ili sam ili kao komponenta ćelijski ciljanog molekula.
Bilo koji pod-regioni efektorskog polipeptida Shiga toksina opisnai u WO 2015/113007 mogu biti pogodni za određene primere izvođenja predmetnog pronalaska, i bilo koji efektorski polipeptidi Shiga toksina opisani u WO 2015/113007 mogu biti modifikovani u efektorski polipeptid Shiga predmetnog pronalaska, npr., dodavanjem jednog ili više novih unuštenih epitoipskih regiona za de-imunizaciju (kao jedna koji je opisan ovde) i/ili uništenje furinski odcepljenog motiva (kao jedan koji je ovde opisan).
U određenim primerima izvođenja, efektorski polipeptid Shiga toksina predmetnog pronalaska sastoji se u osnovi od skraćene Shiga toksin A Podjedinice koja sadrži ugrađeni ili ubačeni, heterologni, T-ćelijski epitop i jednu ili više drugih mutacija. U određenim primerima izvođenja, efektorski polipeptid Shiga toksina predmetnog pronalaska sadrži ugrađeni ili ubačeni, heterologni, T-ćelijski epitop i manji je nego pune dužine, Shiga toksin A Podjedinica, kao što je, npr., koja se sastoji od polipeptida predstavljen sa amino kiselinama 77 do 239 SLT-1A (SEQ ID NO:1) ili StxA (SEQ ID NO:2) ili ekvivalent u drugim A
1 2
Podjedinicama članova familije Shiga toksina (npr. amino kiseline 77 do 238 SLT-2A (SEQ ID NO:3)). Na primer, u određenim primerima izvođenja predmetnog pronalaska, efektorski polipeptidi Shiga toksina su izvedeni iz amino kiselina 75 do 251 SEQ ID NO: 1, 1 do 241 SEQ ID NO: 1, 1 do 251 SEQ ID NO: 1, ili amino kiselina 1 do 261 SEQ ID NO: 1, pri čemu efektorski polipeptid Shiga toksina sadrži najmanje jedan ugrađen ili ubačen, heterologni T-ćelijski epitop i najmanje jedna amino kiselina je uništena u endogenom, B-ćelijskom i/ili CD4+ T-ćelijskom epitopskom regionu obezbeđen u Primerima (videti npr. Tabele 1-7 i/ili 12) i pri čemu uništena amino kiselina se ne preklapa sa ugrađenim ili ubačenim epitopom. Slično u drugim primerima izvođenja, efektorski polipeptid Shiga toksina predmetnog pronalaska je izveden iz amino kiselina 75 do 251 SEQ ID NO:2, 1 do 241 SEQ ID NO:2, 1 do 251 SEQ ID NO:2, ili amino kiselina 1 do 261 SEQ ID NO:2, pri čemu efektorski polipeptid Shiga toksina sadrži najmanje jedan ugrađen ili ubačen, heterologni T-ćelijski epitop i najmanje jedna amino kiselina je uništena u endogenom, B-ćelijskom i/ili CD4+ T-ćelijskom epitopskom regionu obezbeđen u Primerima (videti npr. Tabele 1-7 i/ili 12) i pri čemu uništena amino kiselina se ne preklapa sa ugrađenim ili ubačenim epitopom. Dodatno, efektorski polipeptid Shiga toksina može biti izveden iz amino kiselina 75 do 251 SEQ ID NO:3, 1 do 241 SEQ IDNO:3, 1 do 251 SEQ ID NO:3, ili amino kiselina 1 do 261 SEQ ID NO:3, pri čemu efektorski polipeptid Shiga toksina obuhvata najmanje jedan ugrađeni ili ubačeni, heterologni T-ćelijski epitop i najmanje jedna amino kiselina je uništena u endogenom, B-ćelijskom i/ili CD4+ T-ćelijskom epitopskom regionu obezbeđen u Primerima (videti npr. Tabele 1-7 i/ili 12) i pri čemu uništena amino kiselina se ne preklapa sa ugrađenim ili ubačenim epitopom. U određenim primerima izvođenja predmetnog pronalaska, efektorski polipeptid Shiga toksina obuhvata ugrađeni ili ubačeni, heterologni T-ćelijski epitop i uništeni furinski odcepljeni motiv na karboksi kraju regiona izvedenog iz Shiga toksin A1 fragmenta. Na primer u određenim primerima izvođenja, efektorski polipeptid Shiga toksina predmetnog pronalaska je izveden iz amino kiselina 75 do 251 SEQ ID NO: 1, 1 do 241 SEQ ID NO: 1, 1 do 251 SEQ ID NO: 1, ili amino kiselina 1 do 261 SEQ ID NO: 1, pri čemu efektorski polipeptid Shiga toksina obuhvata ugrađeni ili ubačeni, heterologni T-ćelijski epitop i uništeni furinski odcepljeni motiv na karboksi kraju regiona izvedenog iz Shiga toksin A1 fragmenta. Slično u drugim primerima izvođenja, efektorski polipeptid Shiga toksina predmetnog pronalaska je izveden iz amino kiselina 75 do 251 SEQ ID NO:2, 1 do 241 SEQ ID NO:2, 1 do 251 SEQ ID NO:2, ili amino kiselina 1 do 261 SEQ ID NO:2, pri čemu efektorski polipeptid Shiga toksina obuhvata ugrađeni ili ubačeni, heterologni T-ćelijski epitop i uništeni furinski odcepljeni motiv na karboksi kraju regiona izvedenog iz Shiga toksin A1 fragmenta. Dodatno, efektorski polipeptid Shiga toksina može biti izveden iz amino kiselina 75 do 251 SEQ ID NO: 3, 1 do 241 SEQ ID NO: 3, 1 do 251 SEQ ID NO:3, ili
1
amino kiselina 1 do 261 SEQ ID NO:3, pri čemu efektorski polipeptid Shiga toksina obuhvata ugrađeni ili ubačeni, heterologni T-ćelijski epitop i uništeni furinski odcepljeni motiv na karboksi kraju regiona izvedenog iz Shiga toksin A1 fragmenta.
D. Primeri Kombinacija Efektorskih Polipeptida Shiga Toksina
Kombinacija efektorskog polipeptida Shiga toksina predmetnog pronalaska obuhvata dva ili više pod-regiona (odn. ne-preklapajuće pod-regione) pri čemu svaki pod-region sadrži najmanje jedno od sledećih: (1) uništenje u endogenom epitopu ili epitopskom regionu; (2) ugrađeni, heterologni, T-ćelijski epitop-peptid; (3) ubačeni, heterologni, T-ćelijski epitoppeptid; i (4) uništeni furinski odcepljeni motiv na karboksi kraju regiona izvedenog iz A1 fragmenta.
Određeni primeri izvođenja kombinacije efektorskih polipeptida Shiga toksina predmetnog pronalaska obuhvata oba (1) uništenje u endogenom epitopu ili epitopskom regionu i (2) uništeni furinski odcepljeni motiv na karboksi kraju regiona izvedenog iz A1 fragmenta. Predviđeno je da bilo koji pojedinačni, de-imunizovani, efektorski pod-regioni Shiga toksina opisani u Primerima u nastavku ili opisani u WO 2015/113005 (videti npr. Tabelu B, supra) mogu uopšteno da budu kombinovani sa bilo kojim efektorskim pod-regionom Shiga toksina koji sadrži uništeni furinski odcepljeni motiv koji je ovde opisan, opisan u WO 2015/191764, i/ili je poznat iz tehnike u cilju da se obrazuje efektorski polipeptid Shiga toksina predmetnog pronalaska.
U određenim primerima izvođenja predmetnog pronalaska, efektorski polipeptid Shiga toksina sastoji se u osnovi od polipeptida koji je prikazan u bilo kojoj SEQ ID NOs: 355-438 koja dalje sadrži uništenje najmanje jednog, endogenog, B-ćlijskog i/ili T-ćelijskog epitopskog regiona koji se ne preklapa sa ugrađenim ili ubačenim, heterolognim, CD8+ T-ćelijskim epitopom; pri čemu uništenje obuhvata jednu ili više supstitucija amino kiselinskih ostataka u odnosu na divlji soj Shiga toksina. U određenim drugim primerima izvođenja supstitucija je odabrana između grupe koja se sastoji od: K1 do A, G, V, L, I, F, M i H; T4 do A, G, V, L, I, F, M, i S; D6 do A, G, V, L, I, F, S, Q i R; S8 do A, G, V, I, L, F, i M; T9 do A, G, V, I, L, F, M, i S; S9 do A, G, V, L, I, F, i M; K11 do A, G, V, L, I, F, M i H; T12 do A, G, V, I, L, F, M, S, i K; S12 do A, G, V, I, L, F, i M; S33 do A, G, V, L, I, F, M, i C; S43 do A, G, V, L, I, F i M; G44 do A or L; S45 do A, G, V, L, I, F, i M; T45 do A, G, V, L, I, F, i M; G46 do A i P; D47 do A, G, V, L, I, F, S, M, i Q; N48 do A, G, V, L, M i F; L49 do A, V, C, i G; Y49 do A, G, V, L, I, F, M, i T; F50 do A, G, V, L, I, i T; A51 do V; D53 do A, G, V, L, I, F, S, i Q; V54 do A,
1 4
G, I, i L; R55 do A, G, V, L, I, F, M, Q, S, K, i H; G56 do A i P; 157 do A, G, V, i M; L57 do A, V, C, G, M, i F; D58 do A, G, V, L, I, F, S, i Q; P59 do A, G, i F; E60 do A, G, V, L, I, F, S, Q, N, D, M, T, i R; E61 do A, G, V, L, I, F, S, Q, N, D, M, i R; G62 do A; R84 do A, G, V, L, I, F, M, Q, S, K, i H; V88 do A i G; I88 do A, V, C, i G; D94 do A, V, L, I, F, S, i Q; S96 do A, G, V, I, L, F, i M; T104 do A, G, V, L, I, F, M; i N; A105 do L; T107 do A, G, V, L, I, F, M, i P; S107 do A, G, V, L, I, F, M, i P; L108 do A, V, C, i G; S109 do A, G, V, I, L, F, i M; T109 do A, G, V, I, L, F, M, i S; G110 do A; S112 do A, G, V, L, I, F, i M; D111 do A, G, V, L, I, F, S, Q, i T; S112 do A, G, V, L, I, F, i M; D141 do A, G, V, L, I, F, S, i Q; G147 do A; V154 do A i G. R179 do A, G, V, L, I, F, M, Q, S, K, i H; T180 do A, G, V, L, I, F, M, i S; T181 do A, G, V, L, I, F, M, i S; D183 do A, G, V, L, I, F, S, i Q; D184 do A, G, V, L, I, F, S, i Q; L185 do A, G, V i C; S186 do A, G, V, I, L, F, i M; G187 to A; R188 do A, G, V, L, I, F, M, Q, S, K, i H; S189 do A, G, V, I, L, F, i M; D198 do A, G, V, L, I, F, S, i Q; R204 do A, G, V, L, I, F, M, Q, S, K, i H; R205 do A, G, V, L, I, F, M, Q, S, K i H; S247 do A, G, V, I, L, F, i M; Y247 do A, G, V, L, I, F, i M; R248 do A, G, V, L, I, F, M, Q, S, K, i H; R250 do A, G, V, L, I, F, M, Q, S, K, i H; R251 do A, G, V, L, I, F, M, Q, S, K, i H; D264 do A, G, V, L, I, F, S, i Q; G264 do A; i T286 do A, G, V, L, I, F, M, i S. U određenim primerima izvođenja, postoje višestruka uništenja višestrukih, endogenih B-ćelijskih i/ili CD8 T-ćelijskih epitopskih regiona gde svako uništenje uključuje najmanje jednu amino kiselinsku supstituciju ostatka izabranu iz grupe koja se sastoji od: K1 d A, G, V, L, I, F, M i H; T4 do A, G, V, L, I, F, M, i S; D6 do A, G, V, L, I, F, S, Q i R; S8 do A, G, V, I, L, F, i M; T9 do A, G, V, I, L, F, M, i S; S9 do A, G, V, L, I, F, i M; K11 do A, G, V, L, I, F, M i H; T12 do A, G, V, I, L, F, M, S, i K; S12 do A, G, V, I, L, F, i M; S33 do A, G, V, L, I, F, M, i C; S43 do A, G, V, L, I, F, i M; G44 do A ili L; S45 do A, G, V, L, I, F, i M; T45 do A, G, V, L, I, F, i M; G46 do A i P; D47 do A, G, V, L, I, F, S, M, i Q; N48 do A, G, V, L, M i F; L49 d A, V, C, i G; Y49 do A, G, V, L, I, F, M, i T; F50 do A, G, V, L, I, i T; A51 do V; D53 do A, G, V, L, I, F, S, i Q; V54 do A, G, I, i L; R55 do A, G, V, L, I, F, M, Q, S, K, i H; G56 do A i P; 157 do A, G, V, i M; L57 do A, V, C, G, M, i F; D58 do A, G, V, L, I, F, S, i Q; P59 do A, G, i F; E60 do A, G, V, L, I, F, S, Q, N, D, M, T, i R; E61 do A, G, V, L, I, F, S, Q, N, D, M, i R; G62 do A; R84 do A, G, V, L, I, F, M, Q, S, K, i H; V88 do A i G; 188 do A, V, C, i G; D94 do A, G, V, L, I, F, S, i Q; S96 do A, G, V, I, L, F, i M; T104 do A, G, V, L, I, F, M; i N; A105 do L; T107 do A, G, V, L, I, F, M, i P; S107 do A, G, V, L, I, F, M, i P; L108 do A, V, C, i G; S109 do A, G, V, I, L, F, i M; T109 do A, G, V, I, L, F, M, i S; G110 do A; S112 do A, G, V, L, I, F, i M; D111 do A, G, V, L, I, F, S, Q, i T; S112 do A, G, V, L, I, F, i M; D141 do A, G, V, L, I, F, S, i Q; G147 do A; V154 do A i G. R179 do A, G, V, L, I, F, M, Q, S, K, i H; T180 do A, G, V, L, I, F, M, i S; T181 do A, G, V, L, I, F, M, i S; D183 do A, G, V, L, I, F, S, i Q; D184 do A, G, V, L, I, F, S, i Q; L185 do A, G, V i C; S186 do A, G, V, I, L, F, i M; G187 do A; R188 do A, G, V, L, I, F, M, Q, S, K, i H; S189 do A, G, V, I, L, F, i M; D198 do A,
1
G, V, L, I, F, S, i Q; R204 do A, G, V, L, I, F, M, Q, S, K, i H; R205 do A, G, V, L, I, F, M, Q, S, K and H; S247 to A, G, V, I, L, F, and M; Y247 to A, G, V, L, I, F, and M; R248 to A, G, V, L, I, F, M, Q, S, K, i H; R250 do A, G, V, L, I, F, M, Q, S, K, i H; R251 do A, G, V, L, I, F, M, Q, S, K, i H; D264 do A, G, V, L, I, F, S, i Q; G264 do A; i T286 do A, G, V, L, I, F, M, i S.
Određeni primeri izvođenja efektorskih polipeptida Shiga toksina predmetnog pronalaska sadrže oba i (1) ugrađeni ili ubačeni, heterologni, T-ćelijski epitop-peptid i (2) furinski odcepljeni motiv na karboksi-kraju regiona izvedenog iz A1 fragmenta. Bilo koji pod-regioni efektorskih polipeptida Shiga toksina koji sadrže ugrađeni ili ubačeni, heterologni T-ćelijski epitop opisan u Primerima u nastavku ili u WO 2015/113007 može se generalno kombinovati sa bilo kojim rezistentnim na proteazno odcepljenim, pod-regionom efektorskog polipeptida Shiga toksina (npr., modifikovani, pod-regioni Shiga toksin A Podjedinice koja je ovde opisana, opisana u WO 2015/191764, i/ili koji su poznati u tehnici) u cilju da bi se stvorila kombinacija, efektorskog polipeptida Shiga toksina koji je, kao komponenta ćelijski ciljanog molekula, otporan na cepanje proteaze i sposoban da isporuči heterologni, T-ćelijski epitop na put prezentacije MHC klase 1 ciljane ćelije. Neograničavajući primeri ovog tipa kombinacije efektorskog polipeptida Shiga toksina su prikazani u SEQ ID NOs: 6-27, 29-32, 340-355, i 370-438.
Određeni primeri izvođenja kombinacije efektorskih polipeptida Shiga toksina predmetnog pronalaska sadrže oba i (1) uništenje u endogenom epitopu ili epitopskom regionu i (2) ugrađeni, heterologni, T-ćelijski epitop-peptid. Međutim, efektorski polipeptid Shiga toksina koji sadrži umetnute ili ugrađene, heterološke, T-ćelijske epitope opisane ovde ili u WO 2015/191764, uglavnom se ne mogu kombinovati sa svakim de-imunizovanim efektorskim pod-regionima Shiga toksina, osim tamo gde je empirijski pokazano da je uspešno kombinovano tako da je dobijeni kombinovani molekul zadržao dovoljan nivo efektorske funkcije Shiga toksina. Ovde otkriveno pokazuje kako se mogu ostvariti i testirati takvi primeri izvođenja kako bi se empirijski pokazao uspeh.
Izraz "uspešan" se ovde koristi da označi dve ili više amino kiselinske supstitucije ostatka u efektorskom polipeptidu Shiga toksina, što rezultuje u funkcionalnim karakteristikama, kao što su, npr., de-imunizacija, smanjeno odcepljivanje furina, i/ili sposobnost davanja ugrađenog ili umetnutog epitopa, dok modifikovani efektorski polipeptid Shiga toksina zadržava jednu ili više efektorskih funkcija Shiga toksina. Ovde opisani pristupi i ispitivanja pokazuju kako da se dizajniraju, naprave i empirijski testiraju primeri izvođenja predmetnog
1
pronalaska, koje predstavljaju kombinaciju, efektorskog podregiona Shiga toksina i ćelijski icljanog molekula koji sadrže isti.
Kombinacija, efektorskog polipeptida Shiga toksina predmetnog pronalaska kombinuje karakteristike njihovih odgovarajućih pod-regiona, kao što su, npr., furinski odcepljeni motiv, pojedinačna epitopska uništenja, i/ili heterologni T-ćelijski epitopski teret, i ove kombinacije ponekad rezultuju kod efektorskih polipeptida Shiga toksina sa sinergističkim smanjenjem imunogenosti u poređenju sa zbirom njihovih delimično de-imunizovanih pod-regiona.
Posebno prikazani primeri, efektorskih polipepitda Shiga toksina u SEQ ID NOs: 13,16 i 21 su sinergistički de-imunizovani zbog kombinacije dva ili više pod-regiona, od kojih jedan sadrži ugrađeni, heterologni, T-ćelijski epitop, a drugi sadrži endogeni epitop uništen sa jednom ili više amino kiselinskom supstitucijom ostatka.
Za određene primere izvođenja, efektorski polipeptidi Shiga toksina predmetnog pronalaska sadrži ili se u osnovi sastoji od polipeptida prikazanog u bilo kom od SEQ ID NOs: 6-32, 340-354, i 370-438. Za određene primere izvođenja, kombinacija, de-imunizovanih, otpornih na cepanje proteaze, efektorski polipeptidi Shiga toksina koji sadrže ugrađene, T-ćelijske epitope predmetnog pronalaska sadrži ili se u osnovi sastoji od jednog od polipeptida predstavljen sa SEQ ID NOs: 6-10, 13-32, 340-354, i 370-438.
De imunizovani, efektorski polipeptidi Shiga toksina predmetnog pronalaska koji ne pokazuju citotoksičnost ili smanjenu citotoksičnost u određenim koncentracijama, npr. efektorski polipeptidi Shiga toksina koji sadrže R179A, još uvek mogu biti korisni kao de-imunizovani, efektorski polipeptidi Shiga toksina za isporuku egzogenih materija u ćelije. Slično tome, CD8 T-ćelijski hiper-imuniziovani, efektorski polipeptidi Shiga toksina predmetnog pronalaska koji ne pokazuju citotoksičnost ili smanjenu citotoksičnost u određenim koncentracijama, npr. efektorski polipeptid Shiga toksina koji sadrži epitop ugrađen u njegov katalitički domen (videti npr. WO 2015/113007, Primer 1-F) može da bude još uvek koristan za isporuku T-ćelijskog(ih) epitopa(a) do željenog podćelijskog odeljka ćelije u koji je prisutan efektorski polipeptid Shiga toksina ili kao komponenta ćelijski icljanog molekula za isporuku T-ćelijskog(ih) epitopa(a) u ciljanu ćeliju.
E. Primeri Ćelijski Ciljanih Molekula Predmetnog Pronalaska
Efektorski polipeptidi Shiga toksina predmetnog pronalaska mogu se koristiti kao komponente ćelijski ciljanih molekula koji ciljaju različite ekstraćelijske ciljane biomolekule.
1
Sledeći primeri detaljnije opisuju određene strukture primernih ćelijski ciljanih molekula predmetnog pronalaska koji ciljaju ćelije koje ekspresuju ekstraćelijske ciljane biomolekule kao što su, npr., CD19, CD20, CD22, CD30, CD38, CD45, HER2, PD-L1, i TYRP1.
1. Ćelijski Ciljani Molekuli koji Ciljaju Humani CD 19
CD19, takođe prepoznat u struci kao B4, je 95 kDa, B-linija specifični, trans-membranski glikoprotein tipa 1, prisutan na površini B-ćelija u razvoju, ali nije eksprimiran sa terminalno diferenciranim ćelijama plazme. Dok se naziv CD 19 može odnositi na više proteina sa srodnim strukturama i polipeptidnim sekvencama različitih vrsta, u svrhu strukturnih primera ovog odeljka, izraz "CD 19" se odnosi na B-limfocitne antigenske CD 19 proteine, koji su prisutni kod ljudi čija tačna sekvenca može malo varirati na osnovu izooblika i od pojedinca do pojedinca. Što se tiče ljudi, CD 19 se odnosi na protein predstavljen preovlađujućom polipeptidnom sekvencom UniProt P15391 i (National Center Biotechnology Institute, U.S.) (NCBI) pristupnom oznakom AAA69966.1 ili AAB60697.1; međutim, postoje različiti izooblici i varijante zbog spajanja, polimorfizama i/ili mutacija (videti npr., Kuroki K et al., Genes Immun Suppl 1: S21-30 (2002); TsuchiyaN et al., Arthritis Rheum 50: 4002-7 (2004);
Dawidowicz K et al., Clin Exp Rheumatol 29: 839-42 (2011)). Iskusan radnik će biti u stanju da identifikuje druge CD19 proteine kod ljudi, čak i ako se razlikuju od referentnih sekvenci.
CD19 je atraktivna meta za ciljane terapije raka, npr. zbog sveprisutne ekspresije CD 19 na ćelijskoj površini od strane neoplastičnih ćelija i tumora B-ćelijskih rodova. Na primer, nađeno je da većina malignih B ćelija eksprimira CD19 (videti npr., Anderson K et al., Blood 63: 1424 (1984); Uckun F et al., Blood 71: 13 (1988); Bradbury L et al., J Immunol 149: 2841-50 (1992); Haas K, Tedder T, Adv Exp Med Biol 560: 125-39 (2005); Tedder T, Nat Rev Rheumatol 5: 572-7 (2009)). Iako se CD19 smatra markerom pan B-ćelije izraženim kroz razvoj B-ćelije, primećeno je da zrele B-ćelije i tumorske ćelije B-ćelijskih rodova izražavaju trostruko više CD 19 u poređenju sa nezrelim B-ćelijama. Konkretno, ekspresija CD 19 je primećena kod indolentnih i agresivnih podtipova ne-Hodgkinovog limfoma (NHL), hronične limfocitne leukemije B-ćelija (B-CLL) i oblika akutne limfoblastične leukemije. Pored toga, zbog razlika u ekspresiji CD 19 u poređenju sa ekspresijom CD20, terapije koje ciljaju CD19 mogu biti u stanju ciljati B-ćeliju neoplazmi u ranim fazama nego terapije koje ciljaju CD20.
Postoje brojni vezujući regioni CD 19 koji su poznati stručnjaku koji mogu biti povezani sa efektorskim polipeptidom Shiga toksina predmetnog pronalaska da bi se stvorio ćelijski
1
ciljani molekul predmetnog pronalaska. U svrhu predmetnog pronalaska, izraz "vezujući region CD 19" odnosi se na molekuski deo (npr. proteinski molekul) ili agens koji može specifično da vezuje ekstraćelijski deo molekula CD19 sa visokim afinitetom, kao što je, npr., koji ima konstantu disocijacije u odnosu na CD20 od 10<-5>do 10<-12>mola po litru. Kao što je ovde korišćeno, vezujući CD19 se odnosi na sposobnost vezivanja na ekstraćelijski deo izooblika ili varijante humanog CD19.
U određenim primerima izvođenja, vezujući region CD19 je vezujući region imunoglobulinskog tipa. U određenim primerima izvođenja, imunoglobulinski tip, vezujućeg regiona CD19 je izvede iz imunoglobulinskog, vezujućeg regiona CD19, kao što je paratop antitela koji može da vezuje ekstraćelijski deo CD19. U nekim drugim primerima izvođenja, imunolobulinski tip, vezujućeg regiona CD19 sadrži konstruisani polipeptid koji nije izveden iz bilo kog imunoglobulinskog domena, ali koji funkcioniše poput imunoglobulinskog, vezujućeg regiona CD19 obezbeđujući vezivanje visokog afiniteta za ekstraćelijski deo CD19. Ovaj projektovani polipeptid može opciono da uključuje polipeptidne skele koje sadrže ili se sastoje u osnovi od komplementarnih određujućih regiona i/ili regiona koji vezuju antigen iz imunoglobulina kao što je ovde opisano.
Postoje brojni vezujući regioni CD19 koji se smatraju komponentama predmetnog pronalaska. Neograničavajući primeri imunoglobulinskog tipa, vezujućeg regiona CD 19 uključuju monoklonalna antitela koja vezuju CD19 i njihove derivate, kao što su humanizovane varijante i rekombinantni imunoglobulinski domeni, npr., B4 (npr. klon eBiolD3), Leu-12 (Leul2), HD37, B43, CLB-CD19, MOPC 21 komponente, FMC63, MB19-1, cCD19, B489B, SJ25-C1, hA19, huB4, hBU12, XmAb5574, MOR208, MEDI-551, SAR3419, AFM11, GBR 401, XmAb 5871, Hm2E8b, B-l, 5F3, 2E2, 1G9, C-20, F-3, HD237, H-300, M-20, R-20, PDR134, BCE19, HIB19, LE-CD19, LT19, CB19, 6D5, 4G7, AB-1, F974A2, J3-119, MDX-1342, MAB7489 (klon 771404), i MAB4867 (klon 4G7-2E3) (videti npr., Caligaris-Cappio F et al., J Clin Invest 76: 1243-51 (1985); Chen Z et al., LeukRes 10: 1411-7 (1986); Pezzutto A et al., JImmunol 138: 2793-9 (1987); De Rie M et al., LeukRes 12: 135-41 (1988); Uckun F et al., Blood 71: 13-29 (1988); Vuist Wet al., Cancer Res 49: 3783-8 (1989); Carter R et al., J Immunol 147: 3663-71 (1991); Zola H et al., Immunol Cell Biol 69: 411-22 (1991); Holder M et al., Eur J Immunol 22: 2725-8 (1992); Engel P et al., Immunity 3: 39-50 (1995); Pietersz G et al., Cancer Immunol Immunother 41: 53-60 (1995); Tisone J et al., Am J Clin Pathol 107: 283-91 (1997); WO 2005/012493; Lutz R et al., Proc Am Assoc Cancer Res 47: 3731 (2006); Horton H et al., Cancer Res 6%: 8049-57 (2008); Gerber H et al., Blood 113: 4352-61 (2009); Awan F et al., Blood 115: 1204-13 (2010); Herbst R et al., J
1
Pharmacol Exp Ther 335: 213-22 (2010); Coiffier B et al., J Clin Oncol 29: 1182-9 (2011); Reusch U et al., Blood 122: 4405 (2013); Breton C et al., J Hematol Oncol 7: 33 (2014); Horton H et al., J Immunol 186: 4223-33 (2014); Shen D et al., Monoclon Antib Immunodiagn Immunother 33: 215-20 (2014)). Neograničavajući primeri od CD19 vezujući region uključuje scFvs, kao što su npr., FVS191, FVS192, scFv-HD37, scFv-FMC63, HD37-C, HD37-CCH, FMC63-28Z, 4G7mut, 4G7-graft (videti npr., Bejeck B et al., Cancer Res 55: 2346-51 (1995); Kipriyanov et al., J Immunol Meth 196: 51-62 (1996); Nicholson I et al., Mol Immunol 34: 1157-65 (1997); WO 2002/050118; Peipp M et al., J Immunol Methods 285: 265-80 (2004); Cheng W et al., Biochim Biophys Acta 1768: 21-9 (2007); Kochenderfer J et al., J Immunother 32: 689-702 (2009); Kiigler M et al., Protein Eng Des Sel 22: 135-47 (2009); WO 2012/079000; Kneissi S et al., PLoS One 8: e79047 (2013)).
U određenim primerima izvođenja, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska obuhvata vezujući region koji sadrži polipeptid imunoglobulinskog tipa odabranog iz određenog i sa visokim afinitetom vezivanja za humani CD19 i/ili ćelijsku površinu CD19+ ćelije. U određenim primerima izvođenja ćelijskog ciljanog molekula predmetnog pronalaska, vezujući region sadrži polipeptid(e) odabran između grupe koja se sastoji od: a) varijabilnog domena teškog lanca (VH) koji sadrži (i) HABR1 koji sadrži ili se u osnovi sastoji od jedne od amino kiselinskih sekvenci prikazanih u SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:89, ili SEQ ID NO:96; (ii) HABR2 koji sadrži ili se u osnovi sastoji od jedne od amino kiselinskih sekvenci prikazanih u SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:95, ili SEQ ID NO:97; i (iii) HABR3 koji sadrži ili se u osnovi sastoji od jedne od amino kiselinskih sekvenci prikazanih u SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:91, ili SEQ ID NO:98; i b) varijabilni domen lakog lanca (VL) koji sadrži (i) LABR1 koji sadrži ili se u osnovi sastoji od jedne od amino kiselinskih sekvenci prikazanih u SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO:92, ili SEQ ID NO:99; (ii) LABR2 koji sadrži ili se u osnovi sastoji od jedne od amino kiselinskih sekvenci prikazanih u SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:93, ili SEQ ID NO:100; i (iii) LABR3 koji sadrži ili se u osnovi sastoji od jedne od amino kiselinskih sekvenci prikazanih u SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:94, ili SEQ ID NO:101 U određenim primerima izvođenja, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska sadrži vezujući region koji se sadrži ili se u osnovi sastoji od amino kiselina 1-232, 1-233, 1-234, 1-235, 1-236, 1-242, 1-243, 1-244, 1-245, 1-246, 1252, 1-253, 1-254, 1-255, ili 1-256 bilo koga od SEQ ID NOs: 47-119 i 176-248.
Prema jednom određenom ali neograničavajućem aspektu, vezujući region ćelijski ciljanog molekula predmetnog pronalaska obuhvata ligand (bilo onaj koji se nalazi u prirodi ili sintetički) ili njegov derivat koji zadržava vezujuću funkcionalnost za ekstraćelijski deo CD19.
1
Izvorni (prirodni) CD19 je poznat da vezuje najmanje jedan ligand, CD19-L, grupa visoke mobilnosti (HMG) boks protein (videti npr., Uckun F et al., Br J Haematol 153: 15-23 (2011); US 20120141505).
Bilo koji od gore spomenutih molekula CD 19 može biti pogodan za upotrebu kao vezujući region CD 19 ili modifikovan da stvori jedan ili više vezujućih regiona CD 19 za upotrebu u ćelijski ciljanom molekulu predmetnog pronalaska.
2. Ćelijski Ciljani Molekuli koji Ciljaju Humani CD20
CD20 (B-limfocit antigen CD20) Dok se naziv CD20 može odnositi na više proteina sa srodnim strukturama i polipeptidnim sekvencama različitih vrsta, u svrhu strukturalnih primera ovog odeljka, termin "CD20" se odnosi na B-limfocit antigen CD20 proteine prisutni kod ljudi čija tačna sekvenca se može malo razlikovati na osnovu izooblika i od pojedinca do pojedinca. Što se tiče ljudi, CD20 se odnosi na protein predstavljen preovlađujućom polipeptidnom sekvencom UnitProt PI 1836 i NCBI pristupnim NP 690605.1; međutim, postoje različiti izooblici i varijante zbog spajanja, polimorfizma i/ili mutacija (videti npr., Dawidowicz K et al., Clin Exp Rheumatol 29: 839-42 (2011); Fang C et al., Int J Clin Exp Med 8: 11235-43 (2015)). Stručnjak će moći da identifikuje druge proteine CD20 kod ljudi, čak i ako se razlikuju od referentnih sekvenci.
CD20 je glikoprotein ćelijske površine izražen normalnim ćelijama B-ćelijskih rodova u određenim fazama ćelijskog razvoja, kao i ćelijama brojnih, zrelih B-ćelijskih neoplazmi, kao što su NHL i hronične limfocitne leukemije (CLL). Pored toga, CD20 se izražava zrelim T-ćelijskim i NK-ćelijskim neoplazmama. CD20 se izražava podskupom normalnih T-ćelija kao i malignim T-ćelijama, kao što su, npr., T-ćelijski limfomi (TCL), uključujući fungoide mikoze (MF), prirodne ubice ćelijskog limfoma (NK-ćelijski limfom), periferni T-ćelijski limfomi (PTCLs), kožni T-ćelijski limfomi i T-ćelijska velika zrnasta limfocitna leukemija (T-LGLL). Povezanost CD20 ćelijske površine sa malignim ćelijama čini je privlačnom metom za ćelijski ciljane terapije.
Postoje brojni vezujući regioni CD20 koji su poznati stručnjaku koji mogu biti povezani sa efektorskim polipeptidom Shiga toksina predmetnog pronalaska da bi se stvorio ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska. U svrhu predmetnog pronalaska, izraz "vezujući region CD 20" odnosi se na molekulski deo (npr. proteinski molekul) ili agens koji može specifično da vezuje ekstraćelijski deo molekula CD20 sa visokim afinitetom, kao što je, npr.,
1 1
koji ima konstantu disocijacije u odnosu na CD20 od 10<-5>do 10<-12>mola po litru. Kao što je ovde korišćeno, vezujući CD20 se odnosi na sposobnost vezivanja na ekstraćelijski deo izooblika ili varijante humanog CD20.
U određenim primerima izvođenja, vezujući region CD20 je vezujući region imunoglobulinskog tipa. U određenim primerima izvođenja, imunoglobulinski tip, vezujući region CD 20 je izvede iz imunoglobulinskog, vezujućeg regiona CD20, kao što je paratop antitela koji može da vezuje ekstraćelijski deo CD20. U nekim drugim primerima izvođenja, imunolobulinski tip, vezujućeg regiona CD20 sadrži konstruisani polipeptid koji nije izveden iz bilo kog imunoglobulinskog domena, ali koji funkcioniše poput imunoglobulinskog, vezujućeg regiona CD20 obezbeđujući vezivanje visokog afiniteta za ekstraćelijski deo CD20. Ovaj projektovani polipeptid može opciono da uključuje polipeptidne skelete koje sadrže ili se sastoje u osnovi od komplementarnih određujućih regiona i/ili regiona koji vezuju antigen iz imunoglobulina kao što je ovde opisano.
Postoje brojni vezujući regioni CD20 koji se smatraju komponentama predmetnog pronalaska, kao što je, npr., vezujući region CD20 opisan u PCT/US2016/016580.
Neograničavajući primeri imunoglobulinskog tipa, vezujućeg regiona CD20 uključuju monoklonalna antitela i derivate (npr., humanizovane varijante i scFvs) kao što je, npr., 1F5, 1H4, 1K1791, 2B8, Leul6, Leu5, 2F2, 2H7, 7D8, 8E4, 11B8, AME-133v, LY2469298, B9E9, BM-ca, C2B8, CKI, GA101, RO5072759, LT20, ibritumomab, HB20-1-25, MB20-1-18, obinutuzumab, ocaratuzumab, ocrelizumab, PRO70769, ofatumumab, OUBM1-OUBM8, PR0131921, rituximab, TOLA, tositumomab, TRU-015, ublituksimab, veltuzumab, IMMU-106, hA20, CD20-vezujući fibronektin domen FN3CD20, i HL23 -scFvs: scFv-1, scFv-3, scFv-5, i scFv-8 (videti npr. Golay J et al., J Immunol 135: 3795-801 (1985); Tedder T et al., Eur J Immunol 16: 881-7 (1986); Liu A et al., Proc Natl Acad Sci USA 84: 3439-43 (1987); Press O et al., Blood 69: 584-11491 (1987); Maloney D et al., Blood 84: 2457-66 (1994); Reff M et al., Blood 83: 435-45 (1994); Hooijberg E et al., Cancer Res 55: 840-6 (1995); Hooijberg E et al., Hybridoma 15: 23-31 (1996); Anderson D et al., Biochem Soc Trans 25: 705-8 (1997); Haisma H et al., Blood 92: 184-90 (1998); Wiseman G et al., Clin Cancer Res 5: 3281s-3286s (1999); Schultz J et al., Cancer Res 60: 6663-9 (2000); Cardarelli P et al., Cancer Immunol Immunother 51: 15-24 (2002); Cheson B, Curr Opin Investig Drugs 3: 165-70 (2002); Polyak M et al., Blood 99: 3256-62 (2002); Teeling J et al., Blood 104: 1793-800 (2004); Geng S et al., Cell Mol Immunol 3: 439-43 (2006); de Boer O et al., PLoS One 2: e779 (2007); Burge D et al., Clin Ther 30: 1806-16 (2008); Hagenbeek A et al., Blood 111: 5486-95 (2008); Nishida M et al., Ml J Oncol 32: 1263-74 (2008); Morschhauser F et al., J
1 2
Clin Oncol 27: 3346-53 (2009); Lim S et al., Haematologica 95: 135-43 (2010); Lv M et al., Cancer Lett 294: 66-73 (2010); Morschhauser F et al., Ann Oncol 21: 1870-6 (2010);
Mossner E et al., Blood 115: 4393-402 (2010); Olafesn T et al., Protein Eng Des Sel 23: 243-9 (2010); Uchiyama S et al., Cancer Sci 101: 201-9 (2010); Wu L et al., Cancer Lett 292: 208-14 (2010); Alduaij W et al., Blood 117: 4519-29 (2011); Boross P et al., Haematologica 96: 1822-30 (2011); Fang H et al., Sci China Life Sci 54: 255-62 (2011); Nickerson-Nutter C et al., Rheumatology 50: 1033-44 (2011); Robak T, Robak E, BioDrugs 25: 13-25 (2011); Cang S et al., JHematol Oncol 5: 64 (2012); Salles G et al., Blood 119: 5126-32 (2012); Abdelwahed R et al., Invest Ophthalmol Vis Sci 54: 3657-65 (2013); Golay J et al., Blood 122: 3482-91 (2013); Kinder M et al., J Biol Chem 288: 3084-54 (2013);
Kobayashi H et al., Cancer Med 2: 130-43 (2013); Natarajan A et al., Clin Cancer Res 19: 6820-9 (2013); Zhang H et al., Cell Physiol Biochem 32: 645-54 (2013); Ahmadzadeh V et al., Protein Expr Purif 102: 45-41 (2014); Ellbrecht C et al., JAMA Dermatol 1939 (2014); Garff-Tavernier M et al., Leukemia 28: 230-3 (2014); U.S. patenti 4,861,579; 5,500,362; 5,595,721; 5,677,180; 5,721,108; 5,736,137; 5,776,456; 5,843,398; 5,849,898; 6,015,542; 6,090,365; 6,120,767; 6,171,586; 6,194,551; 6,224,866; 6,242,195; 6,287,537; 6,306,393; 6,368,596; 6,399,061; 6,410,391; 6,455,043; 6,528,624; 6,538,124; 6,565,827; 6,652,852; 6,682,734; 7,879,984; 8,101,179; 8,153,125; 8,337,844; i objavljene patentne prijave WO 1995/03770; WO 1998/58964; WO 1999/22764; WO 2000/09160; WO 2000/27428; WO 2000/27433; WO 2000/42072; WO 2000/44788; WO 2000/67795; WO 2000/67796; WO 2000/76542; WO 2001/03734; WO 2001/10460; WO 2001/10461; WO 2001/10462; WO 2001/13945; WO 2001/72333; WO 2001/80884; WO 2001/97858; WO 2002/060955; WO 2002/079255; WO 2002/096948; WO 2002/102312; WO 2003/002607; WO 2003/061694; WO 2004/032828; WO 2005/000901; WO 2005016969; WO 2006/106959; WO 2009/031230; WO 2014/076292; US 2011/0091483; US 12/0941,583; PCT/US2010/055826; EP20140151932; PCT/GB2012/052532; US 13/048,135; EP20140151932;
PCT/GB2012/052532; US 13/048,135; PCT/US2006/046034).
U određenim primerima izvođenja, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska obuhvata vezujući region koji sadrži polipeptid imunoglobulinskog tipa odabranog iz određenog i sa visokim afinitetom vezivanja za humani CD20 i/ili ćelijsku površinu CD20+ ćelije. U određenim primerima izvođenja ćelijskog ciljanog molekula predmetnog pronalaska, vezujući region sadrži polipeptid(e) odabran između grupe koja se sastoji od: a) varijabilnog domena teškog lanca (VH) koji sadrži (i) HCDR1 koji sadrži ili se u osnovi sastoji od jedne od amino kiselinskih sekvenci prikazanih u SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO:114, SEQ ID NO: 120, ili SEQ ID NO: 124; (ii) HCDR2 koji sadrži ili se u osnovi sastoji od jedne od
1
amino kiselinskih sekvenci prikazanih u SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO:115, ili SEQ ID NO:125; i (iii) HCDR3 koji sadrži ili se u osnovi sastoji od jedne od amino kiselinskih sekvenci prikazanih u SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:109, SEQ ID NO:111, SEQ ID NO:116, SEQ ID NO:121, ili SEQ ID NO: 126; i b) varijabilni domen lakog lanca (VL) koji sadrži (i) LCDR1 koji sadrži ili se u osnovi sastoji od jedne od amino kiselinskih sekvenci prikazanih u SEQ ID NO:105, SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:112, SEQ ID NO:117, ili SEQ ID NO: 127; (ii) LCDR2 koji sadrži ili se u osnovi sastoji od jedne od amino kiselinskih sekvenci prikazanih u SEQ ID NO:106, SEQ ID NO:118, SEQ ID NO:122, ili SEQ ID NO:128; i (iii) LCDR3 koji sadrži ili se u osnovi sastoji od jedne od amino kiselinskih sekvenci prikazanih u SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 123, ili SEQ ID NO: 129. U određenim drugim primerima izvođenja, vezujući region sadrži ili se u osnovi sastoji od amino kiselina 1-245 bilo kog od SEQ ID NOs: 33, 64, i 65.
Bilo koji od gore spomenutih vezujućih molekula CD20 može biti pogodno za upotrebu kao vezujući region CD20 ili modifikovan da stvori jedan ili više vezujućih regiona CD20 za upotrebu u ćelijski ciljanom molekulu predmetnog pronalaska.
3. Ćelijski Ciljani Molekuli koji Ciljaju Humani CD22
CD22, takođe prepoznat u struci kao Siglec-2, SIGLEC2, BL-CAM, B3, Leu-14 i Lib-8, je transmembranski glikoprotein od oko 120-140 kDa (u zavisnosti od spliceoform) koji veže ligande sijalne kiseline. CD22 se eksprimira specifično B-ćelijama tokom razvoja i specifičnim podskupom zrelih B ćelija. Dok se naziv CD22 može odnositi na više proteina sa srodnim strukturama i polipeptidnim sekvencama različitih vrsta, u svrhu strukturnih primera ovog odeljka, pojam "CD22" odnosi se na lektinske proteine koji vezuju sijalinu kiselinu kod ljudi čija tačna sekvenca može neznatno variraju na osnovu izoforme i od pojedinca do pojedinca. Što se tiče ljudi, CD22 se odnosi na protein predstavljen preovlađujućom polipeptidnom sekvencom UniProt P20273 i NCBI pridruživanjem NP_001265346.1; međutim, postoje različiti izooblici i varijante zbog spajanja, polimorfizma i/ili mutacija (videti npr., Hitomi Y et al., Tissue Antigens 69: 242-9 (2007); Dawidowicz K et al., Clin Exp Rheumatol 29: 839-42 (2011)). Stručnjak će moći da identifikuje druge CD22 proteine kod ljudi, čak i ako se razlikuju od referentnih sekvenci.
Kao specifični marker B-ćelije, CD22 je atraktivan cilj za ćelijske terapije za bolesti i stanja koja uključuju B-ćelije, kao što su, na primer, stanja koja uključuju preaktivne B-ćelije, povišene B-ćelije, autoimune bolesti posredovane B ćelijama, leukemije, i limfomi (videti npr.
1 4
Nitschke L, Glycobiology 24: 807-17 (2014)). Pored toga, CD22 može biti prekomerno izložen različitim malignim B ćelijama, kao što su, npr., neoplazme B-ćelija za koje je većina koja je analizirana izražena CD22 ćelijska površina.
Postoje brojni vezujući regioni CD22 koji su poznati stručnjaku koji mogu biti povezani sa efektorskim polipeptidom Shiga toksina predmetnog pronalaska da bi se stvorio ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska. U svrhu predmetnog pronalaska, izraz "vezujući region CD 22" odnosi se na molekulski deo (npr. proteinski molekul) ili agens koji može specifično da vezuje ekstraćelijski deo molekula CD22 sa visokim afinitetom, kao što je, npr., koji ima konstantu disocijacije u odnosu na CD22 od 10<-5>do 10<-12>mola po litru. Kao što je ovde korišćeno, vezujući CD22 se odnosi na sposobnost vezivanja na ekstraćelijski deo izooblika ili varijante humanog CD22.
U određenim primerima izvođenja, vezujući region CD22 je vezujući region imunoglobulinskog tipa. U određenim primerima izvođenja, imunoglobulinski tip, vezujući region CD22 je izvede iz imunoglobulinskog, vezujućeg regiona CD22, kao što je paratop antitela koji može da vezuje ekstraćelijski deo CD22. U nekim drugim primerima izvođenja, imunolobulinski tip, vezujućeg regiona CD22 sadrži konstruisani polipeptid koji nije izveden iz bilo kog imunoglobulinskog domena, ali koji funkcioniše poput imunoglobulinskog, vezujućeg regiona CD22 obezbeđujući vezivanje visokog afiniteta za ekstraćelijski deo CD22. Ovaj projektovani polipeptid može opciono da uključuje polipeptidne skelete koje sadrže ili se sastoje u osnovi od komplementarnih određujućih regiona i/ili regiona koji vezuju antigen iz imunoglobulina kao što je ovde opisano.
Postoje brojni vezujući regioni CD22 koji se smatraju komponentama predmetnog pronalaska. Neograničavajući primeri imunoglobulinskog tipa, vezujućeg regiona CD22 uključuju CD22-vezujuća monoklonalna antitela i njihove derivate, kao što su humanizovane varijante i rekombinantni imunoglobulinski domeni, npr., RFB4, alfa S- HCL-1 (alfa Leu-14), HD39, Tol5, 4KB128, HD37, EPB, HD6, LL2, HA22-LR, HB22.7, HulOF4 (MCDT2219A ili pinatuzumab), epratuzumab, inotuzumab, CAT-3888 (BL22), CAT-8015 (moksetumomab), i scFv-4KB128 (videti npr., Campana D et al., J Immunol 134: 1524-30 (1985); Schwarting R et al., Blood 65: 974-83 (1985); Dorken B et al., J Immunol 136: 4470-9 (1986); Mason D et al., Blood 69: 836-40 (1987); Ghetie M et al., Cancer Res 48: 2610-7 (1988); Pawlak-Byczkowska E et al., Cancer Res 49: 4568-77 (1989); Press O et al., Cancer Res 49: 4906-12 (1989); Stein R et al., Cancer Immunol Immunother 37: 293-8 (1993); Leung S et al., Hybridoma 13: 469-76 (1994); WO 1994/027638; Leung S et al., Mol Immunol 32: 1413-27
1
(1995); WO 1998/041641; WO 2000/074718; Coleman M et al., Clin Cancer Res 9: 3991S-4S (2003); WO 2003/027135; WO 2003/072036; Arndt M et al., FEBS Lett 578: 257-61 (2004); Furman et al., Curr Treat Options Oncol 5: 283-8 (2004); WO 2005/012493; Ho M et al., Proc Natl Acad Sci USA 103: 9637-42 (2006); U.S.7,074,403; WO 2008/070569;
O'Donnell et al., Caner Immunol Immunother 58: 1715-22 (2009); Mussai Et al., Br J Haematol 150: 352-8 (2010); Poison A et al., Leukemia 24: 1566-73 (2010); Wayne et al., Clin Cancer Res 16: 1894-903 (2010); Wong et al., Expert Opin Biol Ther 10: 1251-8 (2010); US 20140248278; JP201518404).
U određenim primerima izvođenja, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska obuhvata vezujući region koji sadrži polipeptid imunoglobulinskog tipa odabranog iz određenog i sa visokim afinitetom vezivanja za humani CD22 i/ili ćelijsku površinu CD22+ ćelije. U određenim primerima izvođenja ćelijskog ciljanog molekula predmetnog pronalaska, vezujući region sadrži polipeptid(e) odabran između grupe koja se sastoji od: a) varijabilnog domena teškog lanca (VH) koji sadrži (i) HABR1 koji sadrži ili se u osnovi sastoji od jedne od amino kiselinskih sekvenci prikazanih u SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 142, ili SEQ ID NO: 148; (ii) HABR2 koji sadrži ili se u osnovi sastoji od jedne od amino kiselinskih sekvenci prikazanih u SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO:137, SEQ ID NO: 143, ili SEQ ID NO:149; i (iii) HABR3 koji sadrži ili se u osnovi sastoji od jedne od amino kiselinskih sekvenci prikazanih u SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO:138, SEQ ID NO:144 ili SEQ ID NO: 150; i b) varijabilni domen lakog lanca (VL) koji sadrži (i) LABR1 koji sadrži ili se u osnovi sastoji od jedne od amino kiselinskih sekvenci prikazanih u SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 145, ili SEQ ID NO: 151; (ii) LABR2 koji sadrži ili se u osnovi sastoji od jedne od amino kiselinskih sekvenci prikazanih u SEQ ID NO:134, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 146, ili SEQ ID NO: 152; i (iii) LABR3 koji sadrži ili se u osnovi sastoji od jedne od amino kiselinskih sekvenci prikazanih u SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 147, ili SEQ ID NO: 153. Alternativno, vezujući regioni mogu biti opisani sa CDRs, koji se dosta preklapaju sa ABRs i opisani su u SEQ ID NOs: 154-165. U određenim primerima izvođenja, vezujući region sadrži ili se u osnovi sastoji od amino kiselina 269-513 SEQ ID NO: 40 ili 80.
Prema jednom određenom ali neograničavajućem aspektu, vezujući region ćelijski ciljanog molekula predmetnog pronalaska obuhvata ligand (bilo onaj koji se nalazi u prirodi ili sintetički) ili njegov derivat koji zadržava vezujuću funkcionalnost za CD22, kao što su, npr., sialne kiseline, sialna kiselina koja sadrži glikokonjugate, i domeni rastvorljivog tipa-M imunoglobulina (IgMs) (videti npr. Bakker T et al., Eur J Immunol 32: 1924-32 (2002); Chen
1
W et al., Blood 115: 4778-86 (2010); Chen W et al., Leuk Lymphoma 53: 208-10 (2012); Schweizer A et al., Eur J Immunol 42: 2792-802 (2012)). Sintetički CD22 ligandi sa visokim vezujućim afinitetima su konstruisani i mogu da se koriste za ciljane ćelija (videti npr., Razi N, Varki A et al., Proc Natl Acad Sci USA 95: 7469-74 (1998); Sliedregt L et al., Bioorg Med Chem 9: 85-97 (2001); van Rossenberg S et al., J Biol Chem 276: 12967-73 (2001); Kelm S et al., J Exp Med 195: 1207-13 (2002); Collins B et al., J Immunol 111: 2994-3003 (2006); Yu J et al., Biochem Biophys Res Commun 360: 759-64 (2007); Abdu-Allah H et al., J Med Chem 51: 6665-81 (2008); O'Reilly M et al., J Am Chem Soc 130: 7736-45 (2008); Abdu-Allah H et al., Bioorg Med Chem Lett 19: 5573-5 (2009); Chen W et al., Blood 115: 4778-86 (2010); Lepenies B et al., Curr Opin Chem Biol 14: 404-11 (2010); Abdu-Allah H et al., Bioorg Med Chem 19: 1966-71 (2011); Chen W et al., Leuk Lymphoma 53: 208-10 (2012); Mesch S et al., ChemMedChem 7: 134-43 (2012); Kelm S et al., Angew Chem Int Ed Engl 52: 3616-20 (2013); Macauley M et al., J Clin Invest 123: 3074-83 (2013); Preshcer H et al., ACS Chem Biol 9: 1444-50 (2014)).
Bilo koji od gore spomenutih vezujućih molekula CD22 može biti pogodno za upotrebu kao vezujući region CD22 ili modifikovan da stvori jedan ili više vezujućih regiona CD22 za upotrebu u ćelijski ciljanom molekulu predmetnog pronalaska.
4. Ćelijski Ciljani Molekuli koji Ciljaju Humani CD30
CD30, u tehnici je takođe prepoznat kao receptor tumor nekroze faktora superfamilije 8 (TNFRSF8) ili Ki-1/120, je transmembranski glikoprotein tipa I veličine oko 90 do 120 kDa. CD30 funkcioniše kao receptor ćelijske površine (ili ko-receptora) familije receptora tumor nekroze faktora i veže ligand, CD30L. CD30 antigen je prvi put opisan kao marker klasičnog Hodgkinovog limfoma i Reed-Sternbergovih ćelije prisutnih kod pacijenata sa Hodgkinovom bolešću (Schwab U et al., Nature 299: 65-7 (1982); Stein H et al., Int J Cancer 30: 445-459 (1982)), i CD30 antigen je kasnije posmatran na ne-Hodgkin limfomskim ćelijama (videti npr. Stein H et al., Blood 66: 848-58 (1985)). Dok se naziv CD30 može odnositi na više proteina sa srodnim strukturama i polipeptidnim sekvencama različitih vrsta, u svrhu strukturnih primera ovog odeljka, izraz "CD30" odnosi se na receptore proteina tumor nekroze faktora prisutne kod ljudi čija tačna sekvenca može neznatno varirati na osnovu izooblika i od pojedinca do pojedinca. Što se tiče ljudi, CD30 se odnosi na protein predstavljen preovlađujućom polipeptidnom sekvencom UniProt P28908 i NCBI pristupnom oznakom AAA51947.1; međutim, različiti izooblici i varijante mogu postojati usled spajanja,
1
polimorfizama i/ili mutacija. Stručnjak će moći da identifikuje druge CD30 proteine kod ljudi, čak i ako se razlikuju od referentnih sekvenci.
CD30 je atraktivna meta za ćelijski ciljane terapije, npr., jer je njegova ekspresija uglavnom ograničena na aktivirane i/ili proliferirajuće limfocite i maligne ćelije. U normalnim ili upalnim tkivima, ekspresija CD30 je u velikoj meri ograničena na srednje/velike aktivirane B-ćelije i/ili aktivirane T-ćelije koje proizvode Th2-tip citokina (Chiarle R et al., Clin Immunol 90: 157-64 (1990); Werner B et al., J Cutan Pathol 35: 1100-7 (2008); Buchan S, Al-Shamkhani A, PLoS One 7: e45244 (2012)). CD30 je visoko eksprimiran određenim ćelijskim tipovima, kao što su, npr., određene ćelije limfoma, druge maligne ćelije limfida i ne-limfoidne ćelije tumora, dok samo ograničen podset zdravih ćelija izražava CD30 i na nižim nivoima (Deutsch Y et al., Leuk Lymphoma 52: 1641-54 (2011)). CD30 se izražava ćelijama uključenim u limfoproliferativne poremećaje, limfoidne neoplazme i mijeloidne neoplazme. Na primer, CD30 se eksprimira na podset ne-Hodgkinovih ćelija limfoma, uključujući Burkittove, anaplastične ćelijske limfome velikog broja (ALCL), T-ćelijske limfome, kožne T-ćelijske limfome, nodularne ćelije malih cepajućih limfoma, limfocitne limfomske ćelije, periferna T-ćelija limfomske ćelije, Lennertove ćelije limfoma, ćelije imunoblastičnih limfoma, ćelije leukemidimfoma T-ćelija (ATLL), leukemija T-ćelija odraslih (T-ALL), centroblastične / centrocitne (cb/cc) folikularne ćelije limfoma, i ćelije limfomatoidne papuloze (videti npr., Stein H et al., Blood 66: 848-58 (1985); Stein et al., Neoplastic Hematophathology, pg 675, (Baltimore, Williams & Wilkins, Knowles D, ed.) (1985); Stein H et al., Pathology of Cells Receptors and Tumor Markers, pg 121 (Stuttgart, Gustav Fischer Verlag, Sefert G, Hubner K (eds) (1987); Suchi T et al., J Clin Pathol 40: 995 (1987); Eckert F et al., Am J Dermatopathol 11: 345-52 (1989); Moller P et al., Am J Clin Pathol 91: 18-23 (1989); Burns B, Dardick I, Am J Clin Pathol 93: 327-32 (1990); Piris M et al., Histopathology 17: 211-8 (1990); Miettinen M, Arch Pathol Lab Med 116: 1197-201 (1992); Norduyn L et al., J Clin Pathol 47: 33-7 (1994); Sabattini E et al., Haematologica 98: e81-2 (2013)). CD30 ekspresija primećena je u embrionalnim karcinomima, nenembrionalnim karcinomima, malignim melanomima, mezenhimskim tumorima i mijeloidnim ćelijskim linijama i makrofazima u kasnim fazama diferencijacije (videti npr., Andreesen R et al., Blood 63: 1299-1302 (1984); Schaadt M et al., Int Rev Exp Pathol 27: 185-202 (1985); Stein H et al., Haematol Blood Transfus 29: 441-4 (1985); Froese P et al., J Immunol 139: 2081-7 (1987); Pallesen G, Hamilton-Dutoit S, Am J Pathol 133: 446-50 (1988); Andreesen R et al., Am J Pathol 134: 187-92 (1989); Hansen H et al., Biol Chem Hoppe-Seyler 370: 409-16 (1989); Schwarting R et al., Blood 74: 1678-89 (1989); Mechtersheimer G, Moller P, Cancer 66: 1732-7 (1990); Pallesen G, Histopathology 16: 409-13 (1990); Diirkop H et al., Cell 68: 421-7
1
(1992); Latza U et al., Am J Pathol 146: 463-71 (1995)). CD30 ekspresija izgleda neregulisana od neoplastičnih mastocita naprednih neoplazmi, kao što su neoplazme koje su uključene u mastocitozu i sistemsku mastocitozu (videti npr., Soltar K et al., Mod Pathol 24: 585-95 (2011); Valent P et al., Leuk Lymphoma 52: 740-4 (2011)). CD30 ekspresija se takođe navodi da se povećava niz autoimunih i upalnih bolesti, kao što su, npr., limfoidne neoplazme, mijeloidne neoplazme, atopijske alergije (atopijski dermatitis, atopijska astma, rinokonjunktivitis, alergijski rinitis), sistemski lupusni eritematozus, sistemska skleroza (skleroderma), bolest transplantata protiv domaćina, infekcija HIV-om, infekcija virusom Epstein-Barra, ospice, mononukleozna infekcija, Omenov sindrom, ulcerozni kolitis, reumatoidni artritis, multipla skleroza, psorijaza, Hashimotov tireoiditis, primarna bilijarna ciroza, Sjogrenov sindrom, toksoplazmoza, Velomner-ov granom i tuberkuloza (videti npr., Ralfkiaer E et al., Arch Dermatol Res 279: 28292 (1987); Romagnani S et al., J Leukocyte Biol 57: 726-30 (1995); Grass H et al., Immunol Today 18: 156-63 (1997); Horie R, Watababe T, Semin Immunol 10: 457-70 (1998); Bengtsson A, Allergy 561: 593-603 (2001); Gerli R et al., Trends Immunol 22: 72-7 (2001)). CD30 ekspresija je marker za mastocitoze (videti npr. Marie J, Calvo K, Leuk Lymphoma 52: 732-3 (2011)).
Postoje brojni vezujući regioni CD30 koji su poznati stručnjaku koji mogu biti povezani sa efektorskim polipeptidom Shiga toksina predmetnog pronalaska da bi se stvorio ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska. U svrhu predmetnog pronalaska, izraz "vezujući region CD 30" odnosi se na molekulski deo (npr. proteinski molekul) ili agens koji može specifično da vezuje ekstraćelijski deo molekula CD30 sa visokim afinitetom, kao što je, npr., koji ima konstantu disocijacije u odnosu na CD30 od 10<-5>do 10<-12>mola po litru. Kao što je ovde korišćeno, vezujući CD30 se odnosi na sposobnost vezivanja na ekstraćelijski deo izooblika ili varijante humanog CD30.
U određenim primerima izvođenja, vezujući region CD30 je vezujući region imunoglobulinskog tipa. U određenim primerima izvođenja, imunoglobulinski tip, vezujući region CD30 je izvede iz imunoglobulinskog, vezujućeg regiona CD30, kao što je paratop antitela koji može da vezuje ekstraćelijski deo CD30. U nekim drugim primerima izvođenja, imunolobulinski tip, vezujućeg regiona CD30 sadrži konstruisani polipeptid koji nije izveden iz bilo kog imunoglobulinskog domena, ali koji funkcioniše poput imunoglobulinskog, vezujućeg regiona CD30 obezbeđujući vezivanje visokog afiniteta za ekstraćelijski deo CD30. Ovaj projektovani polipeptid može opciono da uključuje polipeptidne skelete koje sadrže ili se sastoje u osnovi od komplementarnih određujućih regiona i/ili regiona koji vezuju antigen iz imunoglobulina kao što je ovde opisano.
1
Postoje brojni vezujući regioni CD30 koji se smatraju komponentama predmetnog pronalaska. Neograničavajući primeri imunoglobulinskog tipa, vezujućeg regiona CD30 uključuju CD30-vezujuća monoklonalna antitela i njihove derivate, kao što su humanizovane verijante i rekombinantni imunoglobulinski domeni, npr., Ki-1, HeFi-1, Ber-H2, Ber-H4, Ber-H6, Ber-H8, Ber-HIO, HRS-1, HRS-3, HRS-4, AC10, C10, Ki-2, Ki-3, Ki-4, Ki-5, Ki-6, Ki-7, M44, M67, scFv-Ki-4, scFv 4E3, T6, T7, T13, T14, T21, T24, T25, T104, T105, T107, Tl 12, T201, T214, T215, T405, T406, T408, T411, T420, T426, T427 (videti npr., Schwab U et al., Nature 299: 65-7 (1982); Hecht T et al., J Immunol 134: 4231-6 (1985); Schwarting R et al., Issue Sections. In: J. A. McMichael (ed.). Leucocyte Typing 3: 574-75. Oxford: Oxford University Press, (1987); Schwarting R et al., Leucocyte Typing IV: 419-22. Oxford, UK, Oxford University (1989); Bowen M et al., J Immunol 151: 5896-906 (1993); Gruss H et al., Blood 83: 2045-56 (1994); Horn-Lohrens O et al., Int J Cancer 60: 539-44 (1995); WO 1996/022384; Barth S et al., Blood 95: 3909-14 (2000); Klimka A et al., Br J Cancer 83: 252-60 (2000); WO 2002/043661; WO 2003/059282; US 2004/018194; WO 2005/001038; WO 2007/040653; WO 2008/025020; WO 2015/028444).
U određenim primerima izvođenja, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska obuhvata vezujući region koji sadrži polipeptid imunoglobulinskog tipa odabranog iz određenog i sa visokim afinitetom vezivanja za humani CD30 i/ili ćelijsku površinu CD30+ ćelije. U određenim primerima izvođenja ćelijskog ciljanog molekula predmetnog pronalaska, vezujući region sadrži polipeptid(e) odabran između grupe koja se sastoji od: a) varijabilnog domena teško glanca (VH) koji sadrži (i) HABR1 koji sadrži ili se u osnovi sastoji od jedne od amino kiselinskih sekvenci prikazanih u SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 178, ili SEQ ID NO: 184; (ii) HABR2 koji sadrži ili se u osnovi sastoji od jedne od amino kiselinskih sekvenci prikazanih u SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 179, ili SEQ ID NO: 185; i (iii) HABR3 koji sadrži ili se u osnovi sastoji od jedne od amino kiselinskih sekvenci prikazanih u SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 174, ili SEQ ID NO: 180; i b) varijabilni domen lakog lanca (VL) koji sadrži (i) LABR1 koji sadrži ili se u osnovi sastoji od jedne od amino kiselinskih sekvenci prikazanih u SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 181 ili SEQ ID NO: 186; (ii) LABR2 koji sadrži ili se u osnovi sastoji od jedne od amino kiselinskih sekvenci prikazanih u SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 182, ili SEQ ID NO: 187; i (iii) LABR3 koji sadrži ili se u osnovi sastoji od jedne od amino kiselinskih sekvenci prikazanih u SEQ ID NO:171, SEQ IDNO:177, SEQ ID NO:183, ili SEQ ID NO:188. U određenim primerima izvođenja, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska obuhvata
1
vezujući region koji sadrži ili se u osnovi sastoji od amino kiselina 268-500 bilo kog od SEQ ID NOs: 452, 472, 487, i 503.
Prema jednom određenom ali neograničavajućem aspektu, vezujući region ćelijski ciljanog molekula predmetnog pronalaska obuhvata ligand (bilo onaj koji se nalazi u prirodi ili sintetički) ili njegov derivat koji zadržava vezujuću funkcionalnost za ekstraćelijski deo CD30 (videti npr. Powell I et al., J Leukoc Biol 63: 752-7 (1998); Gruss H et al., Eur J Immunol 25: 2083 (1995); Gattei V et al., Leuk Lymphoma 35: 21-35 (1999); Zhang P et al., Lab Invest 89: 1423-32 (2009); Parekh P et al., Biomaterials 34: 8909-17 (2013); Shinoda K et al., J Autoimmun 57: 1423 (2015); WO 1993/024135).
Bilo koji od gore spomenutih vezujućih molekula CD30 može biti pogodno za upotrebu kao vezujući region CD30 ili modifikovan da stvori jedan ili više vezujućih regiona CD30 za upotrebu u ćelijski ciljanom molekulu predmetnog pronalaska.
5. Ćelijski Ciljani Molekuli koji Ciljaju Humani CD38
CD38 je transmembranski protein koji se karakteriše i kao površinski receptor ćelije i kao ekstraćelijska ciklična ADP riboza hidrolaza (ADP-ribosilaza). Dok se naziv CD38 može odnositi na više proteina sa srodnim strukturama i polipeptidnim sekvencama različitih vrsta, u svrhu strukturalnih primera ovog odeljka, izraz "CD38" odnosi se na ciklične ADP riboze hidrolaze prisutne kod ljudi čija tačna sekvenca može neznatno varirati na osnovu izooblika i od pojedinca do pojedinca. Što se tiče ljudi, CD38 se odnosi na protein predstavljen preovlađujućom polipeptidnom sekvencom UniProt P28907 i NCBI pridruživanjem BAA18964; međutim, različiti izooblici i varijante mogu postojati usled spajanja, polimorfizama i/ili mutacija (videti npr. Ferrero E et al., Immunogenetics 49: 597-604 (1999); Gonzalez-Escribano M et al., Hum Immunol 65: 660-664 (2004); Drummond F et al., JBone Miner Metab 24: 28-35 (2006); Aydin S et al., Blood 111: 5646-53 (2008); WO 2006/099875). Stručnjak će moći da identifikuje druge CD38 proteine kod ljudi, čak i ako se razlikuju od referentnih sekvenci.
Postoje brojni vezujući regioni CD38 koji su poznati stručnjaku koji mogu biti povezani sa efektorskim polipeptidom Shiga toksina predmetnog pronalaska da bi se stvorio ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska. U svrhu predmetnog pronalaska, izraz "vezujući region CD 38" odnosi se na molekulski deo (npr. proteinski molekul) ili agens koji može specifično da vezuje ekstraćelijski deo molekula CD38 sa visokim afinitetom, kao što je, npr.,
1 1
koji ima konstantu disocijacije u odnosu na CD38 od 10<-5>do 10<-12>mola po litru. Kao što je ovde korišćeno, vezujući CD38 se odnosi na sposobnost vezivanja na ekstraćelijski deo izooblika ili varijante humanog CD38.
U određenim primerima izvođenja, vezujući region CD38 je vezujući region imunoglobulinskog tipa. U određenim primerima izvođenja, imunoglobulinski tip, vezujući region CD38 je izvede iz imunoglobulinskog, vezujućeg regiona CD38, kao što je paratop antitela koji može da vezuje ekstraćelijski deo CD38. U nekim drugim primerima izvođenja, imunolobulinski tip, vezujućeg regiona CD38 sadrži konstruisani polipeptid koji nije izveden iz bilo kog imunoglobulinskog domena, ali koji funkcioniše poput imunoglobulinskog, vezujućeg regiona CD38 obezbeđujući vezivanje visokog afiniteta za ekstraćelijski deo CD38. Ovaj projektovani polipeptid može opciono da uključuje polipeptidne skelete koje sadrže ili se sastoje u osnovi od komplementarnih određujućih regiona i/ili regiona koji vezuju antigen iz imunoglobulina kao što je ovde opisano.
Postoje brojni vezujući regioni CD38 koji se smatraju komponentama predmetnog pronalaska. Neograničavajući primeri imunoglobulinskog tipa, vezujućeg regiona CD38 uključuju CD30-vezujuća monoklonalna antitela i scFvs kao što je, npr. daratumumab, isatuksimab, i MOR202 (videti npr. Deaglio S et al., Trends Mol Med 14: 210-8 (2008); van de Donk N et al., Immunol Rev 270: 95-112 (2016); WO 1996/016990; WO 2002/006347; WO 2005/103083; WO 2008/047242; WO 2012/092612; WO 2012/092616;
US20020164788; US20100285004; US 20150118251).
U određenim primerima izvođenja, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska obuhvata vezujući region koji sadrži polipeptid imunoglobulinskog tipa odabranog iz određenog i sa visokim afinitetom vezivanja za humani CD38 i/ili ćelijsku površinu CD38+ ćelije. U određenim primerima izvođenja ćelijskog ciljanog molekula predmetnog pronalaska, vezujući region sadrži polipeptid(e) odabran između grupe koja se sastoji od: a) varijabilni domen teškog lanca (VH) koji sadrži (i) HABR1 koji sadrži ili se u osnovi sastoji od jedne od amino kiselinskih sekvenci prikazanih u SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO:201, SEQ ID NO:207, SEQ ID NO:213, ili SEQ ID NO:219; (ii) HABR2 koji sadrži ili se u osnovi sastoji od jedne od amino kiselinskih sekvenci prikazanih u SEQ ID NO:190, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO:202, SEQ ID NO:208, SEQ ID NO:214, ili SEQ ID NO:220; i (iii) HABR3 koji sadrži ili se u osnovi sastoji od jedne od amino kiselinskih sekvenci prikazanih u SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO:197, SEQ ID NO:203, SEQ ID NO:209, SEQ ID NO:215, ili SEQ ID NO:221; i b) varijabilni domen lakog lanca (VL) koji sadrži (i) LABR1 koji sadrži ili se u osnovi sastoji od
1 2
jedne od amino kiselinskih sekvenci prikazanih u SEQ ID NO:192, SEQ ID NO:198, SEQ ID NO:204, SEQ ID NO:210, SEQ ID NO:216, ili SEQ ID NO:222; (ii) LABR2 koji sadrži ili se u osnovi sastoji od jedne od amino kiselinskih sekvenci prikazanih u SEQ ID NO:193, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO:205, SEQ ID NO:211, SEQ ID NO:217, ili SEQ ID NO:223; i (iii) LABR3 koji sadrži ili se u osnovi sastoji od jedne od amino kiselinskih sekvenci prikazanih u SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO:200, SEQ ID NO:206, SEQ ID NO:212, SEQ ID NO:218, ili SEQ ID NO:224. Alternativno, vezujući regioni mogu biti opisani sa CDRs, koji se većinski preklapaju sa ABRs i opisani su u SEQ ID NOs: 225-242. U određenim primerima izvođenja, vezujući region sadrži ili se u osnovi sastoji od amino kiselina 269-499, 269-512, 269-513, ili 280-510 bilo kog od SEQ ID NOs: 34, 35, 41-56, i 82.
Prirodni CD38 ligand ili njegov derivat mogu se koristiti kao vezujući region ćelijski ciljanog molekula predmetnog pronalaska. Za izvorni CD38 se zna da veže bar jedan ligand, CD38L, Ig protein takođe poznat kao adhezijski molekul endotelijalne ćelije trombocita 1 (PECAM1) or CD31 (Cesano A et al., J Immunol 160: 110615 (1998); Deaglio S et al., J Immunol 160: 395-402 (1998)). CD31 ili deo CD31 koji se povećava sa CD38 ili njegov derivat mogu biti spojeni za efektorski polipeptid Shiga toksina pronalaska kako bi se konstruisali CD38-ciljani, ćelijski ciljani molekuli koji vezuju ekstraćelijski deo CD38.
Bilo koji od gore spomenutih vezujućih molekula CD38 može biti pogodno za upotrebu kao vezujući region CD38 ili modifikovan da stvori jedan ili više vezujućih regiona CD38 za upotrebu u ćelijski ciljanom molekulu predmetnog pronalaska.
6. Ćelijski Ciljani Molekuli koji Ciljaju Humani CD45
CD45, takođe prepoznat u struci kao PTPRC (protein tirozin fosfataza, tip receptora, C) i leukocitni uobičajeni antigen (LCA), je tipa I transmembranska, protein tirozin fosfataza izražena na ćelijskim površinama mnogih diferenciranih hematopoetskih ćelija, posebno malignih, hematoloških ćelija, poput limfoma, B-ćelijske hronične limfocitne leukemije (B-CLL), vlaknaste ćelijske leukemije i akutne ne-limfocitne leukemije (AML) ćelije. Dok se naziv CD45 može odnositi na više proteina sa srodnim strukturama i polipeptidnim sekvencama različitih vrsta, u svrhu strukturnih primera ovog odeljka, izraz "CD45" odnosi se na proteine tirozin fosfataze koji su prisutni kod ljudi čija tačna sekvenca može varirati neznatno na osnovu izooblika i od pojedinca do pojedinca. Što se tiče ljudi, CD45 se odnosi na protein predstavljen preovlađujućom polipeptidnom sekvencom UniProt Q6QIQ5 i, npr., NCBI pristupni NP_563578.2 ili NP_002829.3; međutim, različiti izooblici i varijante postoje
1
usled spajanja, polimorfizama i/ili mutacija (videti npr. Motta-Mena L et al., J Biol Chem 286: 20043-53 (2011); Marme F et al., Breast Cancer Res Treat 132: 819-31 (2012); Pokoyski C et al., Genes Immun 16: 519-27 (2015)). Stručnjak će moći da identifikuje druge CD45 proteine kod ljudi, čak i ako se razlikuju od referentnih sekvenci.
Postoje brojni vezujući regioni CD45 koji su poznati stručnjaku koji mogu biti povezani sa efektorskim polipeptidom Shiga toksina predmetnog pronalaska da bi se stvorio ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska. U svrhu predmetnog pronalaska, izraz "vezujući region CD45" odnosi se na molekulski deo (npr. proteinski molekul) ili agens koji može specifično da vezuje ekstraćelijski deo molekula CD45 sa visokim afinitetom, kao što je, npr., koji ima konstantu disocijacije u odnosu na CD45 od 10<-5>do 10<-12>mola po litru. Kao što je ovde korišćeno, vezujući CD45 se odnosi na sposobnost vezivanja na ekstraćelijski deo izooblika ili varijante humanog CD45.
U određenim primerima izvođenja, vezujući region CD45 je vezujući region imunoglobulinskog tipa. U određenim primerima izvođenja, imunoglobulinski tip, vezujući region CD45 je izveden iz imunoglobulinskog, vezujućeg regiona CD45, kao što je paratop antitela koji može da vezuje ekstraćelijski deo CD45. U nekim drugim primerima izvođenja, imunolobulinski tip, vezujućeg regiona CD45 sadrži konstruisani polipeptid koji nije izveden iz bilo kog imunoglobulinskog domena, ali koji funkcioniše poput imunoglobulinskog, vezujućeg regiona CD45 obezbeđujući vezivanje visokog afiniteta za ekstraćelijski deo CD45. Ovaj projektovani polipeptid može opciono da uključuje polipeptidne skelete koje sadrže ili se sastoje u osnovi od komplementarnih određujućih regiona i/ili regiona koji vezuju antigen iz imunoglobulina kao što je ovde opisano.
Postoje brojni vezujući regioni CD45 koji se smatraju komponentama predmetnog pronalaska. Neograničavajući primeri imunoglobulinskog tipa, vezujućeg regiona CD45 uključuju CD45-vezujuća monoklonalna antitela i scFvs, kao što je, npr., anti-CD45RB (videti npr., Luke P et al., Curr Mol Med 1: 533-43 (2001); Lin Y et al., Cancer Res 66: 3884-92 (2006)).
U određenim primerima izvođenja, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska obuhvata vezujući region koji sadrži polipeptid imunoglobulinskog tipa odabranog iz određenog i sa visokim afinitetom vezivanja za humani CD45 i/ili ćelijsku površinu CD45+ ćelije. U određenim primerima izvođenja ćelijskog ciljanog molekula predmetnog pronalaska, vezujući region sadrži polipeptid(e) odabran između grupe koja se sastoji od: a) varijabilni domen
1 4
teškog lanca (VH) koji sadrži (i) HABR1 koji sadrži ili se u osnovi sastoji od jedne od amino kiselinskih sekvenci prikazanih u SEQ ID NO:243, SEQ ID NO:249, ili SEQ ID NO:255; (ii) HABR2 koji sadrži ili se u osnovi sastoji od jedne od amino kiselinskih sekvenci prikazanih u SEQ ID NO:244, SEQ ID NO:250, ili SEQ ID NO:256; i (iii) HABR3 koji sadrži ili se u osnovi sastoji od jedne od amino kiselinskih sekvenci prikazanih u SEQ ID NO:245, SEQ ID NO:251, ili SEQ ID NO:257; i b) varijabilni domen lakog lanca (VL) koji sadrži (i) LABR1 koji sadrži ili se u osnovi sastoji od jedne od amino kiselinskih sekvenci prikazanih u SEQ ID NO:246, SEQ ID NO:252, ili SEQ ID NO:258; (ii) LABR2 koji sadrži ili se u osnovi sastoji od jedne od amino kiselinskih sekvenci prikazanih u SEQ ID NO:247, SEQ ID NO:253, ili SEQ ID NO:259; i (iii) LABR3 koji sadrži ili se u osnovi sastoji od jedne od amino kiselinskih sekvenci prikazanih u SEQ ID NO:248, SEQ ID NO:254, ili SEQ ID NO:260.
Bilo koji od gore spomenutih vezujućih molekula CD45 može biti pogodno za upotrebu kao vezujući region CD45 ili modifikovan da stvori jedan ili više vezujućih regiona CD45 za upotrebu u ćelijski ciljanom molekulu predmetnog pronalaska.
7. Ćelijski Ciljani Molekuli koji Ciljaju Humani HER2
HER2, takođe prepoznat u tehnici kao Receptor tirozin-protein kinaza erbB-2, je transmembranski protein koji deluje kao receptor ćelijske površine za prenošenje signala kroz ćelijsku membranu u intraćelijske regulatore ćelijske proliferacije i apoptoze. HER2 je takođe prepoznat u struci kao Neu, erbB-2, p185, CD340, NGL, i HER2/neu (Coussens L et al., Science 230: 1132-39 (1985); King C et al., Science 229: 974-6 (1985); Semba K et al., Proc Natl Acad Sci USA 82: 6497-501 (1985); Yamamoto T et al., Nature 319:230-234 (1986); Kokai Y et al., Proc Natl Acad Sci USA 85: 5389-93 (1988); Disis M et al., Cancer Res 54: 16-20 (1994); Yoshino I et al, J Immunol 152: 2393-400 (1994) see, e.g., GenBank Acc. Nos. X03363; Ml 7730; NMJ304448; SEG_HUMHER20). Iako se naziv HER2 može odnositi na više proteina sa srodnim strukturama i polipeptidnim sekvencama različitih vrsta, u svrhu strukturnih primera ovog odeljka, izraz "HER2" odnosi se na receptore proteina epidermalnog faktora rasta prisutan kod ljudi čija tačna sekvenca može neznatno varirati na osnovu izooblika i od pojedinca do pojedinca. Na primer, HER2 se odnosi na humani protein predstavljen primernim polipeptidnim sekvencama UniProt P04626 i NCBI pristupni kod NP_004439.2, NP_001005862.1, NP_001276865.1, NP_001276866.1, i NP_001276867.1; međutim, mogu postojati različiti izooblici i varijante usled spajanja, polimorfizama i/ili mutacija (videti npr., Siddig A et al., Ann N YAcad Sci 1138: 84-94 (2008); Poole E et al., Int
1
J Mol Epidemiol Genet 2: 300-15 (2011); WO 2000/020579). Stručnjak će moći da identifikuje druge HER2 proteine kod ljudi, čak i ako se razlikuju od referentnih sekvenci.
HER2 je iskazan mnogim ćelijama kancera, naročito ćelije karcinoma dojke, i njegova preterana ekspresija je jako povezana sa povećanim metastazama, povećanim ponavljanjem bolesti, i lošom prognozom (videti npr. Slamon D et al., Science 235: 177-82 (1987)).
Postoje brojni vezujući regioni HER2 koji su poznati stručnjaku koji mogu biti povezani sa efektorskim polipeptidom Shiga toksina predmetnog pronalaska da bi se stvorio ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska. U svrhu predmetnog pronalaska, izraz "vezujući region HER2" odnosi se na molekulski deo (npr. proteinski molekul) ili agens koji može specifično da vezuje ekstraćelijski deo molekula HER2 sa visokim afinitetom, kao što je, npr., koji ima konstantu disocijacije u odnosu na HER2 od 10<-5>do 10<-12>mola po litru. Kao što je ovde korišćeno, vezujući HER2 se odnosi na sposobnost vezivanja na ekstraćelijski deo izooblika ili varijante humanog HER2.
U određenim primerima izvođenja, vezujući region HER2 je vezujući region imunoglobulinskog tipa. U određenim primerima izvođenja, imunoglobulinski tip, vezujući region HER2 je izveden iz imunoglobulinskog, vezujućeg regiona HER2, kao što je paratop antitela koji može da vezuje ekstraćelijski deo HER2. U nekim drugim primerima izvođenja, imunolobulinski tip, vezujućeg regiona HER2 sadrži konstruisani polipeptid koji nije izveden iz bilo kog imunoglobulinskog domena, ali koji funkcioniše poput imunoglobulinskog, vezujućeg regiona HER2 obezbeđujući vezivanje visokog afiniteta za ekstraćelijski deo HER2. Ovaj projektovani polipeptid može opciono da uključuje polipeptidne skelete koje sadrže ili se sastoje u osnovi od komplementarnih određujućih regiona i/ili regiona koji vezuju antigen iz imunoglobulina kao što je ovde opisano.
Postoje brojni vezujući regioni HER2 koji se smatraju komponentama predmetnog pronalaska. Neograničavajući primeri imunoglobulinskog tipa, vezujućeg regiona HER2 uključuju HER2-vezujuća monoklonalna antitela i njegove derivate, kao što su, npr., anti-ErbB2, 4D5, 2C4, 7F3, 7C2, mumAb 4D5, chmAb 4D5, (rhu)mAb 4D5, huMAb4D5-l, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7, huMAb4D5-8, trastuzumab, humanizovani 520C9, 4D5Fc8, hingeless rhu4D5, nonglikozilatni rhu4D5 sa mutiranim ostacima cisteina, pertuzumab, i humanizovani 2C4 (Hudziak R et al., Mol Cell Biol 9: 1165-72 (1989); McKenzie S et al., Oncogene 4:543-8
1
(1989); Bacus S et al., Molecular Carcinogenesis 3: 350-62 (1990); Hancock M et al., Cancer Res 51: 4575-80 (1991); Maier L et al. Cancer Res 51: 5361-5369 (1991); Stancovski I et al, Proc Natl Acad Sci USA 88: 8691-5 (1991); Tagliabue E et al, Int J Cancer 47: 933-937 (1991); Bacus S et al. Cancer Res 52: 2580-9 (1992); Carter P et al, Proc Natl Acad Sci USA 89: 4285-89 (1992); Harwerth I et al. J Biol Chem 267: 15160-7 (1992); Kasprzyk P et al. Cancer Res 52: 2771-6 (1992); Lewis G et al. Cancer Immunol Immunother 37: 255-63 (1993); Xu F et al, Int J Cancer 53: 401-8 (1993); Arteaga C et al. Cancer Res 54: 3758-65 (1994); Shawver L et al. Cancer Res 54: 1367-73 (1994); Klapper L et al. Oncogene 14: 2099-109 (1997); WO 1993/21319; WO 1994/00136; WO 1997/00271; WO 1998/77797; US 5,772,997; US 5,783,186; US 5,821,337; US 5,840,525; US 6,949,245; i US 7,625,859).
U određenim primerima izvođenja, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska obuhvata vezujući region koji sadrži polipeptid imunoglobulinskog tipa odabranog iz određenog i sa visokim afinitetom vezivanja za humani HER2 i/ili ćelijsku površinu HER2+ ćelije. U određenim primerima izvođenja ćelijskog ciljanog molekula predmetnog pronalaska, vezujući region sadrži polipeptid(e) odabran između grupe koja se sastoji od: a) varijabilnog domena teškog lanca (VH) koji sadrži (i) HABR1 koji sadrži ili se u osnovi sastoji od jedne od amino kiselinskih sekvenci prikazanih u SEQ ID NO:261, SEQ ID NO:268, ili SEQ ID NO:274; (ii) HABR2 koji sadrži ili se u osnovi sastoji od jedne od amino kiselinskih sekvenci prikazanih u SEQ ID NO:262, SEQ ID NO:269, ili SEQ ID NO:275; i (iii) HABR3 koji sadrži ili se u osnovi sastoji od jedne od amino kiselinskih sekvenci prikazanih u SEQ ID NO:263, SEQ ID NO:267, SEQ ID NO:270, ili SEQ ID NO:276; i b) varijabilnog domena lakog lanca (VL) koji sadrži (i) LABR1 koji sadrži ili se u osnovi sastoji od jedne od amino kiselinskih sekvenci prikazanih u SEQ ID NO:264, SEQ ID NO:271, ili SEQ ID NO:277; (ii) LABR2 koji sadrži ili se u osnovi sastoji od jedne od amino kiselinskih sekvenci prikazanih u SEQ ID NO:265, SEQ ID NO:272, ili SEQ ID NO:278; i (iii) LABR3 koji sadrži ili se u osnovi sastoji od jedne od amino kiselinskih sekvenci prikazanih u SEQ ID NO:266, SEQ ID NO:273, ili SEQ ID NO:279. Alternativno, vezujući regioni mogu biti opisani sa CDRs, koji se većinski preklapaju sa ABRs i opisani su sa SEQ ID NOs: 283-303. U drugim primerima izvođenja ćelijski ciljanog molekula predmetnog pronalaska, vezujući region sadrži polipeptid(e) odabrane između grupe koja se sastoji od: a) samo varijabilnog domena teškog lanca (VHH) koji sadrži (i) HABR1 koji sadrži ili se u osnovi sastoji od jedne od amino kiselinskih sekvenci prikazanih u SEQ ID NO:280; (ii) HABR2 koji sadrži ili se u osnovi sastoji od jedne od amino kiselinskih sekvenci prikazanih u SEQ ID NO:281; i (iii) HABR3 koji sadrži ili se u osnovi sastoji od jedne od amino kiselinskih sekvenci prikazanih u SEQ ID NO:282. U određenim drugim
1
primerima izvođenja, vezujući region sadrži ili se u osnovi sastoji od amino kiselina 269-520 ili 269-521 bilo kog od SEQ ID NOs: 36, 66, i 67.
Prirodni ligand ili njegov derivat mogu se koristiti kao HER2 vezujući region za ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalasku. Poznato je da je izvorni HER2 heterodimeriziran sa ostalim članovima familije ErbB vezujućeg regiona kao što su epidermalni faktori rasta poput epiregulina i heregulina (Moasser M, Oncogene 26: 6469-87 (2007); Riese D, Cullum R, Semin Cell Dev Biol 28: 49-56 (2014); Sollome J et al. Cell Signal 26: 70-82 (2014)). ErbB ligandi koji vezuju članove familije ErbB uključuju EGF, TGF-α, amfiregulin, betacelulin, HB-EGF, epiregulin, HER2-68 and HER2-100, heregulins, herstatin, NRG-2, NRG-3, i NRG-4 (Justman Q et al, J Biol Chem 277: 20618-24 (2002); Jhabvala-Romero F, et al. Oncogene 22: 8178-86 (2003)). Primeri ErbB liganda uključuju hereguline (HRG), kao što je prototip heregulin opisan u U.S. Patentu 5,641,869 i Marchionni M et al. Nature 362: 312-8 (1993). Primeri heregulina uključuju heregulin-α, heregulin-β1, heregulin-β2 i heregulin-β3 (Holmes W et al. Science 256: 1205-10 (1992); US 5,641,869); neu diferencialni faktor (NDF) (Peles et al. Cell 69: 205-16 (1992)); acetilholin receptor-koji indukuju aktivnost (ARIA) (Falls D et al. Cell 72: 801-15 (1993)); glial rastući faktori (GGFs) (Marchionni M et al. Nature 362: 312-8 (1993)); faktor senzornog i motoričkog neurona (SMDF) (Ho W et al, J Biol Chem 270: 14523-32 (1995)); y-heregulin (Schaefer G et al. Oncogene 15: 1385-94 (1997)).
ErbB ligand prema predmetnom pronalasku takođe može biti sintetički ErbB ligand. Sintetički ligand može biti specifičan za određeni ErbB receptor, ili može prepoznati određene komplekse ErbB receptora. Primer sintetičkog liganda je sintetički heregulin/EGF himera biregulin (Jones J et al, FEBS Lett, 447: 22731 (1999)) i EGF- slični domenski fragment HRGβ1177-244. ErbB ligandi ili delovi ErbB liganda koji međusobno reaguju sa HER2 ili njegovim derivatom mogu biti spojeni za efektorske polipeptide Shiga toksina pronalaska kako bi se konstruisali HER2-ciljani, ćelijski ciljani molekuli pronalaska koji vezuju ekstraćelijski deo HER2.
Sintetički peptidi koji vezuju ekstraćelijski deo HER2 mogu se koristiti kao vezujući region za ciljanje. Opisani su mnogi peptidi koji su sposobni da se vezuju za HER2 (videti npr. U.S. patente 5,578,482; 5,856,110; 5,869,445; 5,985,553; 6,333,169; 6,987,088; 7,019,017;
7,282,365; 7,306,801; 7,435,797; 7,446,185; 7,449,480; 7,560,111; 7,674,460; 7,815,906, 7,879,325; 7,884,194; 7,993,650; 8,241,630; 8,349,585; 8,389,227; 8,501,909; 8,512,967; 8,652,474; i US 2011/0059090).
1
U određenim primerima izvođenja, mali molekuli koji vezuju ekstraćelijski deo HER2 mogu se koristiti kao vezujući region za ciljanje. Opisani su mnogi mali molekuli koji su sposobni da se vezuju za HER2 kao što su inhibitori tirozin kinaze, AZD8931, lapatinib, neratinib (HKI-272), dacomitinib (PF-00299804), afatinib (BIBW 2992) (Barlaam B et al, ACS Med Chem Lett 4: 742-6 (2013); Yu H, Riley G, J Natl Compr Cane Netw 11: 161-9 (2013); Roskoski R, Pharmacol Res 87C: 42-59 (2014)). Ostali mali molekuli koji se vezuju za ekstraćelijski deo HER2 mogu se identifikovati metodama koje su dobro poznate stručnjacima, kao što je derivatizacija poznatih EGFR veziva poput gefitinib, erlotinib, AEE788, AG1478, AG1571 (SU-5271), AP26113, CO-1686, XL647, vandetanib, i BMS-690514 (Kurokawa H, Arteaga C, Clin Cancer Res 7: 4436s-4442s (2001); Yigitbasi O et al, CancerRes 64: 7977-84 (2004); Yu H, Riley G, J Natl Compr Cane Netw 11: 161-9 (2013); Roskoski R, Pharmacol Res 87C: 42-59 (2014)).
Bilo koji od gore spomenutih vezujućih molekula HER2 može biti pogodno za upotrebu kao vezujući region HER2 ili modifikovan da stvori jedan ili više vezujućih regiona HER2 za upotrebu u ćelijski ciljanom molekulu predmetnog pronalaska.
8. Ćelijski Ciljani Molekuli koji Ciljaju Humani PD-L1
PD-L1, takođe poznat u tehnici kao PDL1, programirani ligand 1 za ćelijsku smrt, PDCD1 Ligand 1, PDCD1L1, PDCD1LG1, B7 homolog 1 (B7-H1), i CD274, je ligand za programiranu smrt ćelije -1 receptor T- i B-ćelija (Dong H et al, Nat Med 5: 1365-9 (1999); Freeman G et al, J Exp Med 192: 1027-34 (2000); Latchman Y et al, Nat Immunol 2: 261-8 (2001)) and the B7-1 receptor and CD80 receptor found on T-cells (Butte M et al. Immunity 27:111-22 (2007); Park J et al. Blood 116: 1291-8 (2010)). Dok se naziv PD-L1 može odnositi na više proteina sa srodnim strukturama i polipeptidnim sekvencama različitih vrsta, u svrhu strukturnih primera ovog odeljka, izraz "PD-L1" odnosi se na PD-1 ligande prisutne kod ljudi čiji se tačan niz može malo razlikovati na osnovu izooblika i od pojedinca do pojedinca. U odnosu na ljude, PD-L1 se odnosi na protein predstavljen preovlađujućom polipeptidnom sekvencom UniProt Q9NZQ7 ili Q9EP73 i NCBI pristupnim kodom AAI13735.1; međutim, postoje različiti izooblici i varijante zbog spajanja, polimorfizama i/ili mutacija (videti npr.. Abelson A et al. Genes Immun 8: 69-74 (2007); Wang S et al, J Clin Immunol 27: 563-7 (2007); Hayashi M et al, Eur J Endocrinol 158: 817-22 (2008); Mitchell A et al, J Clin Endocrinol Metab 94: 5139-45 (2009); Yang Q et al, Clin Exp Rheumatol 29: 13-8 (2011); Ma Y et al, Int J Clin Exp Med 15: 16585-91 (2015)). Stručnjak će moći da identifikuje druge PD-L1 proteine kod ljudi, čak i ako se razlikuju od referentnih sekvenci.
1
PD-L1 izostaje iz većine zdravih tkiva u normalnim uslovima; međutim, ekspresija PD-L1 se može indukovati izlaganjem većine nukleazovanih ćelija sisara interferona(a) (videti npr., Dong H et al, Nat Med 8: 793800 (2002); Chen L, Nat Rev Immunol 4: 336-47 (2004); Hirano F et al. Cancer Res 65: 1089-96 (2005); Zou W, Chen L, Nat Rev Immunol 8: 467-7 (2008); Flies D et al, Yale J Biol Med 84: 409-21 (2011); Chen Jet al, Immunobiology 217: 385-93 (2012); Spranger S et al. Sci Transl Med 5: 200rall6 (2013)). Tokom određenih malignih oboljenja, regulacija PD-L1 u mikro-okruženju tumora može dovesti do prevelike supresije imunih odgovora na ćelije tumora, što se uklapa u uobičajene predstave o učešću PD-L1 u adaptivnoj imunoj otpornosti tumorskih ćelija na imunološki sistem domaćina (videti npr., Zou W, Chen L, Nat Rev Immunol 8: 467-7 (2008); Zheng P, Zho Z, Biomark Cancer 7: 15-8 (2015)).
PD-L1 je atraktivna meta za terapije, jer PD-L1 je snažno ekspresioniran određenim tumorskim ćelijama i limfocitima koji infiltriraju tumor, dok zdrava, ljudska tkiva i ćelije retko izražavaju visoki nivo PD-L1 na ćelijskoj površini (videti npr. Dong H et al, Nat Med 8: 793-800 (2002); Chen L, Nat Rev Immunol 4: 336-47 (2004); Hirano F et al. Cancer Res 65: 1089-96 (2005); Chen L, Han X, J Clin Invest 125: 3384-91 (2015)). Kod ljudi je primećena ekspresija PD-L1 ćelijske površine od strane ćelija tumora u većini primarnih tumorskih biopsija i ćelija koje su kultivisane tumorskim ćelijama procenjene imunohistohemijom, uključujući ćelije i tkiva povezana sa, npr., karcinoma, glioma, B-ćelijskih limfoma, leukemija/limfom T-ćelija kod odraslih (ATLL), angioimunoblastični T-ćelijski limfomi (AITL), karcinomi mokraćne bešike, hronične limfocitne leukemije (CLL), epitelni maligniteti, oralni karcinomi pločastih ćelija, karcinomi pločastih ćelija jednjaka (ESC), karcinom pluća, ne-Hodgkinovi limfomi (NHL), karcinom pankreasa, karcinom bubrežnih ćelija (RCC), mali limfociti limfomi (SLL), karcinomi pločastih ćelija glave i vrata (SCCHN), i zloćudne pojave povezane sa virusom (videti npr., Brown J et al, Immunol 170: 1257-66 (2003); Strome S et al. Cancer Res 63: 6501-5 (2003); Wintterle et al. Cancer Res 63: 7462-7 (2003); Thompson R et al. Cancer Res 66: 3381-5 (2006); Nomi T et al, Clin Cancer Res 13: 2151-7 (2007); Thompson et al, Clin Cancer Res 13: 1757-61 (2007); Andorsky D et al, Clin Cancer Res 17: 4232-44 (2011); Chen B et al, Clin Cancer Res 19: 3462-73 (2013); Chen M et al, Oncotarget 7: 7913-24 (2016); Wu C et al, Sci Rep 6: 19740 (2016)).
Postoje brojni vezujući regioni PD-L1 koji su poznati stručnjaku koji mogu biti povezani sa efektorskim polipeptidom Shiga toksina predmetnog pronalaska da bi se stvorio ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska. U svrhu predmetnog pronalaska, izraz "vezujući
1
region PD-L1" odnosi se na molekulski deo (npr. proteinski molekul) ili agens koji može specifično da vezuje ekstraćelijski deo molekula PD-L1 sa visokim afinitetom, kao što je, npr., koji ima konstantu disocijacije u odnosu na PD-L1 od 10<-5>do 10<-12>mola po litru. Kao što je ovde korišćeno, vezujući PD-L1 se odnosi na sposobnost vezivanja na ekstraćelijski deo izooblika ili varijante humanog PD-L1.
U određenim primerima izvođenja, vezujući region PD-L1 je vezujući region imunoglobulinskog tipa. U određenim primerima izvođenja, imunoglobulinski tip, vezujući region PD-L1 je izvede iz imunoglobulinskog, vezujućeg regiona PD-L1, kao što je paratop antitela koji može da vezuje ekstraćelijski deo PD-L1. U nekim drugim primerima izvođenja, imunolobulinski tip, vezujućeg regiona HER2 sadrži konstruisani polipeptid koji nije izveden iz bilo kog imunoglobulinskog domena, ali koji funkcioniše poput imunoglobulinskog, vezujućeg regiona PD-L1 obezbeđujući vezivanje visokog afiniteta za ekstraćelijski deo PD-L1. Ovaj projektovani polipeptid može opciono da uključuje polipeptidne skelete koje sadrže ili se sastoje u osnovi od komplementarnih određujućih regiona i/ili regiona koji vezuju antigen iz imunoglobulina kao što je ovde opisano.
Postoje brojni PD-L1 vezujući regioni koji se smatraju komponentama predmetnog pronalaska. Neograničavajući primeri imunoglobulinskog tipa, PD-L1 vezujući regioni uključuju brojna antitela i imunoglobulinske domene za koje je već poznato da vezuju ekstraćelijski deo PD-L1 prisutan na ćelijskoj površini MDX-1105, MOM-18534-S(P), i razni scFvs (videti npr., Latchman Y et al, Nat Immunol 2: 261-8 (2001); Xerri L et al. Human Pathol 39: 1050-8 (2008); Chen B et al, Clin Cancer Res 19: 3462-73 (2013); Drees J et al. Protein Expr Purif94: 60-6 (2014); WO 2007/005874; WO 2010/036959; WO 2013/019906; US 7,943,743; US 8,552,154; US 9,102,727; US 9,273,135, i U.S. patentne prijave US20110271358 i US20160075782).
U određenim primerima izvođenja, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska obuhvata vezujući region koji sadrži polipeptid imunoglobulinskog tipa odabranog iz određenog i sa visokim afinitetom vezivanja za humani PD-L1 i/ili ćelijsku površinu PD-L1 ćelije. U određenim primerima izvođenja ćelijskog ciljanog molekula predmetnog pronalaska, vezujući region sadrži polipeptid(e) odabran između grupe koja se sastoji od: a) varijabilnog domena teškog lanca (VH) koji sadrži (i) HCDR1 koji sadrži ili se u osnovi sastoji od jedne od amino kiselinskih sekvenci prikazanih u SEQ ID NO:304, SEQ ID NO:310, SEQ ID NO:316, SEQ ID NO:322, ili SEQ ID NO:328; (ii) HCDR2 koji sadrži ili se u osnovi sastoji od jedne od amino kiselinskih sekvenci prikazanih u SEQ ID NO: 305, SEQ ID NO:311, SEQ ID NO:317,
1 1
SEQ ID NO:323, ili SEQ ID NO:329; i (iii) HCDR3 koji sadrži ili se u osnovi sastoji od jedne od amino kiselinskih sekvenci prikazanih u SEQ ID NO:306, SEQ ID NO:312, SEQ ID NO:318, SEQ ID NO:324, ili SEQ ID NO:330; i b) varijabilni domen lakog lanca (VL) koji sadrži (i) LCDR1 koji sadrži ili se u osnovi sastoji od jedne od amino kiselinskih sekvenci prikazanih u SEQ ID NO:307, SEQ ID NO:313, SEQ ID NO:319, SEQ ID NO:325, ili SEQ ID NO:331; (ii) LCDR2 koji sadrži ili se u osnovi sastoji od jedne od amino kiselinskih sekvenci prikazanih u SEQ ID NO:308, SEQ ID NO:314, SEQ ID NO:320, SEQ ID NO:326, ili SEQ ID NO:332; i (iii) LCDR3 koji sadrži ili se u osnovi sastoji od jedne od amino kiselinskih sekvenci prikazanih u SEQ ID NO:309, SEQ ID NO:315, SEQ ID NO:321, SEQ ID NO:327, ili SEQ ID NO:333. U određenim primerima izvođenja, vezujući region sadrži ili se u osnovi sastoji od amino kiselina 269-498 ili 269-499 od bilo kog SEQ ID NOs: 37-39, 68-79, i 81.
Bilo koji od gore spomenutih vezujućih molekula PD-L1 može biti pogodno za upotrebu kao vezujući region PD-L1 ili modifikovan da stvori jedan ili više vezujućih regiona PD-L1 za upotrebu u ćelijski ciljanom molekulu predmetnog pronalaska.
Druge Strukturne Varijacije
U određenim primerima izvođenja ćelijski ciljanih molekula predmetnog pronalaska, vezujući region je prethodno bio opisan, npr., u WO 2005/092917, WO 2007/033497, US2009/0156417, JP4339511, EP1727827, DE602004027168, EP1945660, JP4934761, EP2228383, US2013/0196928, WO 2014/164680, WO 2014/164693, WO 2015/138435, WO 2015/138452, WO 2015/113005, WO 2015/113007, WO 2015/191764, US20150259428, 62/168,758, 62/168,759, 62/168,760, 62/168,761, 62/168,762, 62/168,763, i PCT/US2016/016580.
U određenim primerima izvođenja ćelijski ciljanih molekula predmetnog pronalaska, vezujući region sadrži polipeptid(e) odabrane između grupe koja se sastoji od: (a) varijabilni domen teškog lanca (VH) koji sadrži HCDR1 koji sadrži ili se u osnovi sastoji od jedne od amino kiselinskih sekvenci prikazanih u SEQ ID NO: 334, HCDR2 koji sadrži ili se u osnovi sastoji od jedne od amino kiselinskih sekvenci prikazanih u HCDR2, i HCDR3 koji sadrži ili se u osnovi sastoji od jedne od amino kiselinskih sekvenci prikazanih u SEQ ID NO:336; i (b) a varijabilnog domena lakog lanca (VL) koji sadrži LCDR1 koji sadrži ili se u osnovi sastoji od jedne od amino kiselinskih sekvenci prikazanih u SEQ ID NO:337, LCDR2 koji sadrži ili se u osnovi sastoji od jedne od amino kiselinskih sekvenci prikazanih u SEQ ID NO:338, i LCDR3
1 2
koji sadrži ili se u osnovi sastoji od jedne od amino kiselinskih sekvenci prikazanih u n SEQ IDNO:339.
U opsegu predmetnog pronalaska je upotreba fragmenata, varijanti, i/ili derivata ćelijski ciljanih molekula predmetnog pronalaska koji sadrže funkcionalno mesto vezivanja za bilo koji ekstraćelijski deo ciljanog biomolekula, i još poželjnije sposobno za vezivanje ciljanog biomolekula visokog afiniteta (npr. kao što je prikazano sa KD). Na primer, bilo koji vezujući region koje veže ekstraćelijski deo ciljanog biomolekula sa konstantom disocijacije (KD) od 10<-5>do 10<-12>mola/litru, poželjno manje od 200 nM, može da bude zamenjeno za upotrebu u pravljenju ćelijski ciljanih molekula predmetnog pronalasku i postupcima pronalaska.
Stručnjak će prepoznati da se mogu načiniti varijacije u efektorskim polipeptidima Shiga toksina i ćelijski ciljanim molekulima predmetnog pronalaska, i polinukleotidima koji kodiraju bilo koji od prethodnih, bez umanjivanja njihovih bioloških aktivnosti, npr., održavanjem ukupne strukture i funkcije efektorskog polipeptida Shiga toksina, kao što je u konjukcijama sa jednim ili više 1) endogenih uništenih epitopa koji smanjuju antigenski i/ili imunogenski potencijal, 2) uništenih furinski odcepljenih motiva koje smanjuju proteolitičko cepanje i/ili 3) ugrađenih ili ubačenih epitopa koji smanjuju antigenski i/ili imunogenski potencijal ili su sposobni da se isporuče MHC I molekulu radi prezentacije na ćelijskoj površini. Na primer, neke modifikacije mogu olakšati ekspresiju, olakšati prečišćavanje, poboljšati farmakokinetička svojstva i/ili poboljšati imunogenost. Takve modifikacije su dobro poznate stručnjaku i uključuju, na primer, metionin dodan na amino kraju da bi se obezbedilo mesto inicijacije, dodatne amino kiseline postavljene na bilo koji kraj da bi se stvorila prikladno smeštena restrikciona mesta ili terminacioni kodoni, i biohemijske oznake afiniteta spojeni na bilo koji kraj da bi se obezbedilo pogodna detekcija i/ili prečišćavanje. Uobičajena modifikacija za poboljšanje imunogenosti polipeptida proizvedenog korišćenjem nehordat sistema (npr. prokariotske ćelije) je uklanjanje, nakon proizvodnje polipeptida, početnog ostatka metionina, koji se može formirati tokom proizvodnje, kao što su, npr., u bakterijskom sistemu domaćina, jer, npr., prisustvo N-formilmetitionina (fMet) može izazvati neželjene imune odgovore u hordatama.
Ovde se takođe razmišlja o uključivanju dodatnih amino kiselinskih ostataka na amino i/ili karboksi kraj efektorskog polipeptida Shiga toksina predmetnog pronalaska, ćelijski ciljanog molekula predmetnog pronalaska ili proteinskih komponenata ćelijski ciljanih molekula predmetnog pronalaska, kao što su sekvence za epitopske oznake ili druge delove. Dodatni amino kiselinski ostaci mogu se koristiti u različite svrhe, uključujući, npr., olakšavanje
1
kloniranja, olakšavanje ekspresije, post-translacione modifikacije, olakšavanje sinteze, prečišćavanje, olakšavanje detekcije i davanje. Neograničavajući primeri epitopskih oznaka i ostataka su domeni proteina koji vezuju hitin, mesta cepanja enteropeptidaze, mesta cepanja Factor Ksa, FIAsH oznake, FLAG oznake, zeleni fluorescentni proteini (GFP), ostaci glutation-S-transferaze, HA oznake, protein koji se veže za maltozu domene, mic tagove, polihistidinske oznake, ReAsH oznake, strep-tagove, strep-tag II, mesta za TEV proteazu, domene tioredoksina, mesta cepanja trombina i V5 epitopske oznake.
U određenim prethodnim primerima izvođenja, polipeptidna sekvenca efektorskih polipeptida Shiga toskina i/ili ćelijski ciljanih molekula predmetnog pronalaska variraju sa jednom ili više konzervativnih supstitucija amino kiselina uvedenih u polipeptidni(e) region(e) sve dok su sva tražena strukturna svojstva još uvek prisutna i efektorski polipeptid Shiga toksina može da pokaže bilo koju potrebnu funkciju, bilo sam ili kao komponenta ćelijski ciljanog molekula. Kao što je ovde korišćen, izraz "konzervativna supstitucija" označava da je jedna ili više amino kiselina zamenjeno drugom, biološki sličnim amino kiselinskim ostatkom. Primeri uključuju amino kiselinsku supstituciju ostataka sa sličnim karakteristikama, npr. male amino kiseline, kiselinske amino kiseline, polarne amino kiseline, osnovne amino kiseline, hidrofobne amino kiseline i aromatske amino kiseline (videti, na primer, Tabelu C). Primer konzervativne supstitucije sa ostatkom koji se obično ne nalazi u endogenim, sisarskim peptidima i proteinima je konzervativna supstitucija ostatka arginina ili lizina, na primer, ornitinom, kanavaninom, aminoetilcisteinom ili drugom osnovnom amino kiselinom. Za dalje informacije koje se tiču fenotipsko tihih supstitucija u peptidima i proteinima videti, npr., Bowie J et al. Science 247: 1306-10 (1990).
TABELA C. Primeri Konzervativnih Supstitucija Amino Kiseline
1 4
U šemi konzervativne supstitucije u Tabeli C, ogledne konzervativne amino kiselinske supstitucije su grupisane po fizičko-hemijskim svojstvima -1: neutralna, hidrofilna; II: kiseline i amidi; III: osnovni; IV: hidrofobni; V: aromatične, glomazne amino kiseline, VI hidrofilne nenaelektrisane, VII alifatične nenaelektrisane, VIII nepolarne nenaelektrisane, IX cikloalkeniln povezan, X hidrofobne, XI polarne, XII male, XIII okretne, i XIV fleksibilne. Na primer, konzervativne supstitucije amino kiselina uključuju sledeće: 1) S može biti supstituisan za C; 2) M ili L može biti supstituisan za F; 3) Y može biti supstituisan za M; 4) Q ili E mogu biti zamenjeni za K; 5) N ili Q može biti supstituisan za H; i 6) H može biti supstituisan za N.
Dodatne konzervativne amino kiselinske supstitucije uključuju sledeće: 1) S može biti supstituisan za C; 2) M ili L može biti supstituisan za F; 3) Y može biti supstituisan za M; 4) Q ili E mogu biti zamenjeni za K; 5) N ili Q može biti supstituisan za H; i 6) H može biti supstituisan za N.
U određenim primerima izvođenja, efektorski polipeptidi Shiga toksina i ćelijski ciljani molekuli predmetnog pronalaska može sadržati funkcionalne fragmente ili varijante polipeptidnog regiona predmetnog pronalaska koji su ovde opisani koji imaju, najviše, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, ili 1 amino kiselinske supstitucije u poređenju sa polipeptidnom sekvencom koja je ovde navedena, sve dok (1) sadrži najmanje jedan ugrađeni ili ubačeni, heterologni T-ćelijski epitope i najmanje jedna amino kiselina je prekinuta u endogenom, B-ćelijskom i/ili CD4+ T-ćelijskom epitopnom regionu obezbeđenom u Primerima (videti npr. Tabele 1-7 i/ili 12), pri čemu se uništena amino kiselina ne preklapa sa ugrađenim ili ubačenim epitopom; (2) sadrži najmanje jedan ugrađeni ili ubačeni, heterologni T-ćelijski epitop i uništeni furinski odcepljeni motiv na karboksi kraju izvedenog regiona iz Shiga toksin A1 fragmenta; ili (3) sadrži uništeni furinski odcepljeni motiv na karboksi kraju izvedenog regiona Shiga toksin A1 fragmenta i sadrži najmanje jednu amino kiselinu koja je uništena u endogenom, B-ćelijskom i/ili CD4+ T-ćelijskom epitopskom regionu obezbeđenom u Primerima (videti npr. Tabele 1-7 i/ili 12), pri čemu se uništena amino kiselina ne preklapa sa uništenim furinskim odcepljenim motivom. Varijante efektorskih polipeptida Shiga toksina i ćelijski ciljajućih molekula predmetnog pronalasku su unutar obima predmetnog pronalaska kao rezultat promene ovde opisanog polipeptida promenom jednog ili više amino kiselinskih ostataka ili brisanjem ili ubacivanjem jednog ili više amino kiselinskih ostataka, kao što je u vezujućem regionu ili regionu efektorskog polipeptidna Shiga toksina, u cilju da se postignu željena svojstva, kao što su promenjena citotoksičnosti, promenjeni citostatski efekti, promenjena imunogenost i/ili promenjen poluživot u serumu. Efektorski polipeptidi Shiga
1
toksina i ćelijski ciljajući molekuli predmetnog pronalaska mogu dalje biti sa ili bez signalne sekvence.
Prema tome, u određenim primerima izvođenja, efektorski polipeptidi Shiga toksina predmetnog pronalaska sadrže ili se u osnovi sastoje od amino kiselinskih sekvenci koje imaju najmanje 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, ili 99%, ukupni identitet sekvence prirodno prisutnog Shiga toksina A Podjedinica ili njegovog fragment, kao što su, npr., Shiga toksin A Podjedinica, kao što je SLT-1A (SEQ ID NO:1), StxA (SEQ ID NO:2), i/ili SLT-2A (SEQ ID NO:3), pri čemu efektorski polipeptid Shiga toskina (1) sadrži najmanje jedan ugrađeni ili umetnuti, heterologni T-ćelijski epitop i najmanje jedna amino kiselina je uništena u endogenom, B-ćelijskom i/ili CD4 T-ćelijskom epitopu koji je dat u Primerima (videti npr. Tabele 1-7 i/ili 12), i gde se uništena amino kiselina ne preklapa sa ugrađenim ili ubačenim epitopom; (2) sadrži najmanje jedan ugrađeni ili umetnuti, heterologni T-ćelijski epitop i furinski odcepljeni motiv na karboksi kraju izvedenog regiona Shiga toksin A1 fragmenta; ili (3) sadrži furinski odcepljeni motiv na karboksi kraju izvedenog regiona iz Shiga toksin A1 fragmenta i sadrži najmanje jednu amino kiselinu koja je uništena u endogenom, B-ćelijskom i/ili CD4 T-ćelijskom epitopskom regionu u Primerima (videti npr. Tabele 1-7 i/ili 12), i pri čemu se uništena amino kiselina ne preklapa sa uništenim furinskim odcepljenim motivom.
U određenim primerima izvođenja efektorski polipeptidi Shiga toksina predmetnog pronalaska, jedan ili više amino kiselinskih ostataka mogu biti mutirani, ubačeni ili izbrisani kako bi se povećala enzimska aktivnost efektorskog polipeptida Shiga toksina. U određenim primerima izvođenja efektorski polipeptid Shiga toksina predmetnog pronalaska, jedan ili više amino kiselinskih ostataka mogu biti mutirani ili izbrisani kako bi se smanjila ili eliminisala katalitička i/ili citotoksična aktivnost efektorskog polipeptida Shiga toksina. Na primer, katalitička i/ili citotoksična aktivnost A Podjedinica članova familije Shiga toksina može se umanjiti ili eliminisati mutacijom ili skraćivanjem.
Citotoksičnost A Podjedinica članova familije Shiga toksina može biti izmenjena, smanjena ili eliminisana mutacijom i/ili skraćivanjem. Pozicije obeležene tirozin-77, glutamat-167, arginin-170, tirozin-114 i triptofan-203 pokazali su se važnim za katalitičku aktivnost Stx, Stx1, i Stx2 (Hovde C et al, Proc Natl Acad Sci USA 85: 2568-72 (1988); Deresiewicz R et al.
Biochemistry 31: 3272-80 (1992); Deresiewicz R et al, Mol Gen Genet 241: 467-73 (1993); Ohmura M et al, Microb Pathog 15: 169-76 (1993); Cao C et al, Microbiol Immunol 38: 441-7 (1994); Suhan M, Hovde C, Infect Immun 66: 5252-9 (1998)). Mutiranje i glutamata-167 i
1
arginina-170 eliminisalo je enzimsku aktivnost Slt-I A1 u testu inaktivacije ribozoma bez ćelije (LaPointe P et al, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)). U drugom pristupu koji koristi de novo ekspresiju Slt-I A1 u endoplazmatičnom retikulumu, mutiranje oba i glutamata-167 i arginina-170 eliminisao je citotoksičnost fragmenta Slt-I A1 na tom nivou ekspresije (LaPointe P et al, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)). Analiza skraćenja pokazala je da fragment StxA iz ostataka 75 do 268 i dalje zadržava značajno enzimsko delovanje in vitro (Haddad J et al, J Bacteriol 175: 4970-8 (1993)). Skraćenje fragmenta Slt-I A1 koji sadrži ostatke 1-239 pokazao je značajnu enzimsku aktivnost in vitro i citotoksičnost de novo ekspresijom u citozolu (LaPointe P et al, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)). Ekspresija Slt-1 A1 fragmenta skraćenog do ostataka 1-239 u endoplazmatičnom retikulumu nije citotoksična, jer se ne može retrotranslocirati u citozolu (LaPointe P et al, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)).
Najkritičniji ostaci za enzimatsku aktivnost i/ili citotoksičnost u Shiga toksin A Podjedinicama mapirani su u sledeće ostatke: asparagin-75, tirozin-77, tirozin-114, glutamat-167, arginin-170, arginin-176, i triptofan-203, između ostalih (Di R et al, Toxicon 57: 525-39 (2011)). Naročito, dvostruko mutirana konstrukcija Stx2A koja sadrži glutamat-E167-u-lizin i arginin-176-u-lizin mutacije bila je potpuno inaktivirana; dok su mnoge pojedinačne mutacije u Stx1 i Stx2 pokazale desetostruko smanjenje citotoksičnosti. Dalje, skraćivanje Stx1A na 1-239 ili 1-240 smanjuje njegovu citotoksičnost, a slično tome, skraćivanje Stx2A na konzerviranom hidrofobnom ostatku smanjuje mu citotoksičnost. Najkritičniji ostaci za vezivanje eukariotskih ribozoma i/ili inhibicija eukariotskog ribozoma u Shiga toksinu A Podjedinici su preslikani na sledeće pozicije ostataka arginin-172, arginin-176, arginin-179, arginin-188, tirozin-189, valin -191, i leucin-233, između ostalih (McCluskey A et al, PLoS One 7: e31191 (2012). Međutim, određene modifikacije mogu povećati funkcionalnu aktivnost Shiga toksina koje pokazuje efektorski polipeptid Shiga toksina predmetnog pronalaska. Na primer, mutiranje alanin-231 u položaju Stx1A u glutamatu povećava enzimsku aktivnost Stx1A in vitro (Suhan M, Hovde C, Infect Immun 66: 5252-9 (1998)).
U određenim primerima izvođenja efektorski polipeptidi Shiga toksina predmetnog pronalaska izvedeni iz SLT-1A (SEQ ID NO: 1) ili StxA (SEQ ID NO:2), jedan ili više amino kiselinskih ostataka mutiranih uključuju supstituciju asparagina na poziciji 75, tirozin na poziciji 77, tirozin na poziciji 114, glutamat na poziciji 167, arginin na poziciji 170, arginin na poziciji 176, i/ili supstituciju triptofana na poziciji 203. Primeri takvih supstitucija biće poznati stručnjaku zasnovanom na prethodnom stanju tehnike, kao što su asparagin na poziciji 75 do alanina, tirozin na poziciji 77 serinom, zamena tirozina na poziciji114 serinom, zamena
1
glutamata na poziciji 167 glutamatom, supstitucijom arginina na poziciji 170 alaninom, supstitucijom arginina na poziciji 176 lizinom, supstitucijom triptofana na poziciji 203 alaninom, i/ili supstitucijom alanina na 231 sa glutamatom. Ostale mutacije koje ili pojačavaju ili smanjuju enzimatsku aktivnost Shiga toksina i/ili citotoksičnost su unutar obima pronalaska i mogu se utvrditi korišćenjem dobro poznatih tehnika i analiza ovde otkrivenih.
Efektorski polipeptidi Shiga toksina i ćelijski ciljanih molekula predmetnog pronalaska mogu opciono biti konjugovani do jednog ili više dodatnih agenasa, koji mogu uključiti terapeutske agense, dijagnostičke agense, i/ili druge dodatne egzogene materijale koji su poznati u tehnici, uključujući takve agense kao što je ovde opisano. U određenim primerima izvođenja, efektorski polipeptid Shiga toksina ili ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska je PEGilacija ili albuminacija, kao što je, npr., da se obezbedi de-imunizacija, uništenje furinskog cepanja maskiranjem proširene petlje i/ili furinski cepanje motiva na karboksi kraju izvedenog regiona iz Shiga toksin A1 fragmenta, poboljšaju farmakokinetičke osobine, i/ili poboljša imunogenost (videti npr., Wang Q et al. Cancer Res 53: 4588-94 (1993); Tsutsumi Y et al, Proc Natl Acad Sci USA 97: 8548-53 (2000); Buse J, El-Aneed A, Nanomed 5: 1237-60 (2010); Lim S et al, J Control Release 207-93 (2015)).
V. Opšte Funkcije Ćelijski Ciljanih Molekula Predmetnog Pronalaska
Funkcionalno povezivanje efektorskog polipeptida Shiga toksina predmetnog pronalaska sa vezujućim regionima koji ciljaju ćeliju omogućava stvaranje ćelijski ciljanih molekula koji selektivno ubijaju, inhibiraju rast, isporučuju egzogeni materijal i/ili otkrivaju specifične ćelijske tipove. Svojstva efektorskog polipeptida Shiga toksina predmetnog pronalaska omogućavaju stvaranje ćelijski ciljanih molekula sa poboljšanim terapeutskim prizorom u hordatima u poređenju sa prethodnim efektorskim polipeptidima Shiga toksina.
Za određene primere izvođenja, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska obezbeđuje, nakon davanja hordatu, jedno ili više od sledećeg: 1) snažno i selektivno ubijanje ciljanih ćelija, npr., inficiranih ili malignih ćelija, u malim dozama primene, 2) stabilnost veze između ćelijski ciljanog vezujućeg regiona i regiona efektorskog polipeptida Shiga toksina dok je ćelijski ciljani molekul prisutan u ekstraćelijskim prostorima; 3) nizak nivo ćelijske smrti i/ili neželjenog oštećenja tkiva; i 4) ćelijski ciljano davanje heterolognih, CD8+ Tćelijskih epitopa za prezentaciju od strane ciljanih ćelija u cilju pokretanja poželjnih, imunoloških odgovora posredovani T-ćelijama, kao što je, npr., regrutovanje CD8+ T-ćelija i lokalizovano oslobađanje citokina na lokusu tkiva.
1
Efektorski polipeptidi Shiga toksina ćelijski ciljani molekuli predmetnog pronalaska su korisni u raznolikoj primeni koja uključuje, npr., ubijanje ćelija; inhibicija rasta ćelije; interćelijska, dostava tereta; prikupljanje bioloških informacija; stimulacija imunog odgovora i/ili saniranje zdravstvenog stanja. Efektorski polipeptidi Shiga toksina predmetnog pronalaska su korisni kao komponente različitih terapeutskih i/ili dijagnostičkih molekula, kao što su, npr., spajanje ligand-toksina, imunotoksina i/ili imuno-konjugata. Ćelijski ciljani molekuli predmetnog pronalasku su korisni kao terapeutski i/ili dijagnostički molekuli, kao što su, npr., ćelijski ciljani, citotoksični, terapeutski molekuli; ćelijski ciljani, netoksični, dostavni nosači; i/ili ćelijski ciljani, dijagnostički molekuli; na primere u aplikacijama koje uključuju in vivo ciljanje specifičnih tipova ćelija za dijagnozu ili lečenje raznih bolesti, uključujući karcinom, imuni poremećaj i mikrobne infekcije.
U zavisnosti od primera izvođenja, efektorski polipeptid Shiga toksina ili ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska može imati ili pružiti jednu ili više sledećih karakteristika ili funkcionalnosti: (1) de imunizaciju, (2) otpornost na cepanje proteaze, (3 ) snažna citotoksičnost u određenim koncentracijama, (4) intraćelijska isporuka tereta koja se sastoji od dodatnog materijala (npr. heterologni, T-ćelijski epitop), (4) selektivnu citotoksičnost, (6) nisku bez-ciljana toksičnost kod višećelijskih organizama kod određene doze ili doza, (7) isporuku heterolognog T-ćelijskog epitopa na prezentacijski put MHC klase I ciljane ćelije i/ili (8) stimulaciju imunog(ih) odgovora(a) CD8 T-ćelija. Izvesni primeri izvođenja efektorskih polipeptida Shiga toksina i ćelijski ciljanih molekula predmetnog pronalaska su multifunkcionalni jer molekuli imaju dve ili više karakteristika ili funkcionalnosti koje su ovde opisani. Izvesni dalji primeri izvođenja ćelijski ciljanih molekula predmetnog pronalaska pružaju sve gore navedene karakteristike i funkcionalnosti u jednom molekulu.
Pridruživanje, spajanje, i/ili povezivanje ćelijski ciljanog(ih) vezujućeg(ih) regiona(a) ćeliju sa efektorskim polipeptidom(ima) Shiga toksina predmetnog pronalaska omogućava konstruisanje ćelijski ciljanih molekula sa funkcijom(ama) Shiga toksina koja može proizvesti manje štetnih efekata nakon primene određene doze ili doza na multićelijski organizam, kao što je sisar. Neograničavajući primeri neželjenih efekata uključuju van ciljanih toksičnosti, neiskorišćenih citotoksičnosti i/ili neželjenih imunih reakcija. Određeni primeri izvođenja efektorskih polipeptida Shiga toksina i ćelijski ciljanih molekula predmetnog pronalaska su posebno korisne u primenama koje uključuju davanje efektorskih polipeptida Shiga toksina i/ili ćelijski ciljanih molekula u hordate zbog funkcionalnih svojstava, kao što su, npr., deimunizacija, smanjena van ciljana toksičnost i/ili ciljana stimulacija poželjnih imunoloških
1
odgovora, kao što je putem prezentacije ćelijske površine ćelijski ciljanog molekula koji je na dostavljen, CD8+ T-ćelijskom epitopu.
U određenim primerima izvođenja, ćelisjki ciljani molekuli predmetnog pronalaska su sposobni za vezivanje ekstraćelijskih ciljanih biomolekula povezani sa ćelijskom površinom određenih ćelijskih tipova i unos takvih ćelija. Jednom internalizovani unutar ciljanog ćelijskog tipa, određeni primeri izvođenja ćelijski ciljanih molekula predmetnog pronalasku su sposobni da usmere enzimski aktivan, citotoksični, fragment efektorskog polipeptida Shiga toksina u citozol ciljne ćelije i na kraju ubiju ćeliju. Alternativno, netoksične varijante ili varijante sa smanjenom toksičnosti ćelijski ciljanih molekula predmetnog pronalaska mogu se koristiti za isporuku dodatnih egzogenih materija u ciljane ćelije, kao što su epitopi, peptidi, proteini, polinukleotidi i agensi za promociju detekcije. Ovaj sistem je modularan, tako da se bilo koji broj različitih vezujućih regiona može koristiti da bi se ciljao efektorski polipeptid Shiga toksina predmetnog pronalaska na različite, raznolike ćelijske tipove.
A. De-Imunizacija za Aplikacije koje Uključuju Primenu na Hordat
De-imunizacija efektorskih polipeptida Shiga toksina predmetnog pronalaska je postignuta sa konstruisanim uništavanjem jednog ili više, endogenih, B-ćelijskih i/ili CD4+ T-ćelijskih epitopskih regiona Shiga toksin A Podjedinice ili efektorskog polipeptida Shiga toksin, uključujući putem mutacije i/ili skraćivanja ili putem konjugacije kovalentno povezane hemijske strukture. Pošto se B-ćelijski epitopi često poklapaju ili preklapaju sa zrelih CD4+ T-ćelijskim epitopima, uništenje endogenog B-ćelijskog epitopskog regiona često istovremeno uništava endogeni, CD4+ T-ćelijski epitop ili obrnuto.
Određeni primeri izvođenja efektorskih polipeptida Shiga toksina i ćelijski ciljanih molekula predmetnog pronalaska su de-imunizirani u pogledu na jedan ili više B-ćelijskih i/ili CD4+ T-ćelijskih epitopa što znači da ovi molekuli pokazuju smanjeni antigenski i/ili imunogenski potencijal u poređenju sa prethodnim, efektorskim polipeptidima Shiga toksina i ćelijski ciljanim molekulima kojima nedostaju identična uništenja istih B-ćelijskih i/ili CD4+ T-ćelijskih epitopa ili epitopskih regiona i/ili nedostaju bilo kakva ometanja istih B-ćelijskih i/ili CD4+ T-ćelijskih epitopa ili epitopskih regiona. Neki dalji primeri izvođenja pokazuju snažan potencijal ako nisu nivoi divljeg soja Shiga toksin A Podjedinice katalitičkog domena zavisne citotoksičnosti uprkos prisustvu višestrukih mutacija koje pružaju de-imunizirano svojstvo. De-imunizovani, efektorski polipeptidi Shiga toksina i ćelijski ciljanih molekula predmetnog pronalaska su korisni za aplikacije koje uključuju
2
parenteralnu primenu efektorskog polipeptida Shiga toksina i/ili ćelijski ciljanog molekula u hordat, kao što je, npr., sisar, vodozemac, ptica, riba, gmizavci ili morski pas, zbog smanjene verovatnoće stvaranja neželjenih imunoloških odgovora izazvani sa primenjenim molekulom.
Različiti de-imunizovani, efektorski polipeptidi Shiga toksina predmetnog pronalaska mogu se razlikovati u njihovim profilima antigenosti kada se primenjuju na razne vrste hordata, ali svi de-imunizovani polipeptidi pronalaska pokazuju smanjenu antigenost i/ili imunogenost u najmanje jednom organizmu kao što je izmereno najmanje jednim kvantitativnim testom. Naročito, pojedini primeri izvođenja ćelijski ciljanih molekula predmetnog pronalaska su de-imunizovani u odnosu na primaoca sisara, kao što je, npr., molekul koji priziva niže količine i/ili frekvencije „anti-ćelijski ciljani molekuli“ antitela kada se daje tom sisaru u poređenju sa referentnim molekulom (npr. srodni ćelijski ciljani molekul koji sadrži divlji soj Shiga toksin A1 fragmenta). Pored toga, očekuje se da će efektorski polipeptidi Shiga toksina predmetnog pronalaska koji imaju uništene višestruke, endogene, epitopske regione značajno smanjiti verovatnoću pojave nepoželjnih imunoloških odgovora kod hordata primaoca takvog polipeptida.
Za određene primere izvođenja efektorskih polipeptida Shiga toksina i ćelijski ciljanih molekula predmetnog pronalaska, de-imunizacijska(e) osobina(e) je rezultat strukturne(ih) promene(a) koja uključuje uništeni furinski odcepljeni motiv na karboksi kraju izvedenog regiona Shiga toksin A1 fragmenta.
Za određene primere izvođenja efektorskih polipeptida Shiga toksina i ćelijski ciljanih molekula predmetnog pronalaska, de-imunizacijska(e) osobina(e) je rezultat strukturne(ih) promene(a) koja uključuje ugrađivanje i/ili ubacivanje T-ćelijskog epitopa koji uništava endogeni, B-ćelijski i/ili CD4+ T-ćelijski epitopski region.
Za određene primere izvođenja, željena(e) biološka(e) funkcija(e) roditeljskog, polipeptida Shiga toksina iz kojeg je izveden de-imunizovani, efektortski polipeptid Shiga toksina, sačuvani su, kao što su, npr., funkcije Shiga toksin A Podjedinice promovisane ćelijske internalizacije, usmeravanja intraćelijskog usmeravanja, i snažna citotoksičnost. Očuvanje se odnosi na zadržavanje minimalnog nivoa aktivnosti kao što je ovde opisano.
B. Smanjena Osteljivost Cepanja Proteaze
2 1
Određeni primeri izvođenja efektorskih polipeptida Shiga toksina i ćelijski ciljanih molekula predmetnog pronalaska pokazuju smanjenu osetljivost na cepanje proteaze u poređenju sa srodnim molekulima koji sadrže regione divljeg soja Shiga toksin A1 fragmenta. Određeni drugi primeri izvođenja pokazuju moćnu, ako ne i optimalnu, citotoksičnu zavisnost katalitičkog domena Shiga toksin A Podjedinice uprkos ovoj smanjenoj osetljivosti na cepanje proteaze i nedostatku kanoničnog događaja cepanja furina unutar intoksirane ćelije.
Određeni primeri izvođenja osetljivosti na cepanje proteaze, ćelijski ciljani molekuli predmetnog pronalaska (odn. ćelijski ciljani molekul koji sadrži efektorski polipeptid Shiga toksina obuhvata uništeni furinski odcepljeni motiv na karboksi kraju njegovog regiona Shiga toksin A1 fragmenta) pokazuje poboljšanu in vivo tolerantnost kada se poredi sa srodnim molekulima koji sadrže region divljeg soja, Shiga toksin A1 fragmenta. Određeni drugi primeri izvođenja pokazuju moćnu, ako ne i optimalnu, citotoksičnu zavisnost katalitičkog domena Shiga toksin A Podjedinice uprkos ovoj smanjenoj osetljivosti na cepanje proteaze i nedostatku kanoničnog događaja cepanja furina unutar intoksirane ćelije.
Ranije se verovalo da citotoksični, konstrukti Shiga toksin A Podjedinice koji sadrže katalitičke regione Shiga toksin A1 fragmenta moraju održavati ili nekako kompenzovati prirodnu proteolitičku obradu furinom unutar intoksiranih ćelija kako bi se očuvale prirodne adaptacije Shiga toksina za efikasnu i snažnu citotoksičnost. Neočekivano je otkriveno da događaj cepanja furina nije potreban za snažnu citotoksičnost, jer je snažna citotoksičnost Shiga toksina na nivou divljeg soja Shiga toksin kontrolne konstrukcije postignuta u odsustvu bilo kakvog događaja cepanja furina na karboksi kraju Shiga toksin A1 fragment uprkos prisustvu ostatka karboksi kraja (videti Primere, infra i WO 2015/191764). Nedostatak događaja cepanja furina unutar intoksirane ćelije može sprečiti efikasno oslobađanje sličnog regiona Shiga toksin A1 fragmenta i na taj način rezultirati u kontinuiranom povezivanju relativno velikog ostatka (npr. veće od 28 kDa u veličini) za region Shiga toksin A1 fragmenta. Međutim, i pored ove mogućnosti, snažna, citotoksičnost Shiga toksina postignuta je konstrukcijama furinski odcepljenog motiva koje sadrže region efektorskog polipeptida Shiga toksina i nedostaju bilo koja poznata kompenzatorna svojstva, kao što su, na primer, obezbeđivanje intraćelijskog cepanja blizu karboksi kraja izvedenog regiona iz Shiga toksin A1 fragmenta (videti Primere, infra; WO 2015/191764).
Ovo sugeriše da postojanost i/ili neefikasno oslobađanje relativno velikog, molekulskog ostatka povezanog za region A1 fragmenta nije nužno umanjilo potencijal citotoksičnosti Shiga toksina. To je iznenađujuće jer se smatralo da optimalni proces intoksikacije Shiga
2 2
toksina zahteva oslobađanje Shiga toksin A1 fragmenata iz svih drugih velikih molekulskih ostataka da bi se efikasno retrotranslocirano oslobodio A1 fragment iz endoplazmatičnog retikuluma u citozol gde A1 fragmenti mogu formirati enzimski aktivnu strukturu koja katalitički inaktivira ribozome intoksirane ćelije. Naročito, očekivano je da istrajnost i/ili neefikasno oslobađanje relativno velikog molekulskog ostatka koji pokriva karboksi kraj Shiga toksin A1 fragmenta ometa prirodni mehanizam Shiga toksin A1 fragmenta u efikasnom pristupu citozolu, koji uključuje izloženost A1 fragmenta, hidrofobnog, karboksi krajnjeg domena i prepoznavanje ovog domena od strane ERAD sistema (videti Di R et al, Toxicon 57: 525-39 (2011); Li S et al, PLoS One 7: e41119 (2012)).
Nedostatak intoksiranog ćelijskog posredovanog dejstva, događaja cepanja furina za molekul koji sadrži derivat Shiga toksin A Podjedinice može se hipotetski nadoknaditi. Neograničavajući primeri potencijalnih, kompenzatorskih pristupa uključuju 1) završavanje jednog karboksi kraja konstrukta sa karboksi krajem polipeptidnog regiona sličnog Shiga toksina A1 fragmenta, 2) stvaranje izvedenog konstrukta Shiga toksina tako da je Shiga toksin A Podjedinica polipeptida već nazvana blizu karboksi kraja njegovog polipeptida Shiga toksin A1 sličnog fragmenta, 3) konstruisanje heterolognog i/ili ektopičnog mesta proteaze koje može funkcionalno nadoknaditi nedostatak nativnog, Shiga toksin, događaja cepanja furina, i 4) kombinaciju pristupa 3 i 4.
U prvom pristupu, karboksi kraj polipeptida Shiga toksin A1 sličnog fragmenta nije obuhvaćen nijednom karboksi krajnjom jedinicom, i stoga je karboksi kraj polipeptida Shiga toksin A1 sličnog fragmenta trajno izložen za prepoznavanje od strane ERAD mašinerije u endoplazmatičnom retikulumu. U poslednja tri pristupa, polipeptid Shiga toksin A1 sličnog fragmenta može biti konstruisan tako da se intraćelijski disocira od jedne ili više drugih komponenti konstrukcije u trenutku kada molekul dostigne endoplazmatični retikulum intoksirane ćelije, tako da u endoplazmatičnom retikulumu karboksi kraj polipeptida Shiga toksin A1 sličnog fragmenta postaje izložen za prepoznavanje od strane ERAD mašinerije. Na primer, citotoksični molekul koji sadrži efektorski polipeptid Shiga toksin A Podjedinice može biti prethodno tretiran proteazom kako bi probio polipeptidini region blizu karboksi kraja A1-fragmenta sličnog regiona pre nego što dođe u kontakt sa ciljanom ćelijom.
Alternativno, citotoksični molekul može biti konstruisan da sadrži mesto proteaze koje se cepa intraćelijskom proteazom ciljane ćelije.
Ovi hipotetički pristupi konstruisanja efektorskih polipeptida Shiga toksin A Podjedinice koji nadoknađuju nedostatak posredovanja intoksiranih ćelija, događaj cepanja furina može
2
značajno izmeniti efikasnost i moć citotoksičnosti u poređenju sa konstruktorom divljeg soja Shiga holotoksina ili Shiga toksin A Podjedinice koja sadrži samo sekvence divljeg soja koje uključuju optimalno mesto cepanja furina. Na primer, trenutno nije poznat kompenzatorni pristup koji se oslanja na endoproteazu ciljane ćelije osim furina koji može da pruži potpunu kompenzacijsku citotoksičnost ekvivalentno cepanju furina, a alternativne ćelijske proteaze da se oblažu poput kalpaina pokazale su se manje efikasnim u olakšavanju citotoksičnosti Shiga toksina (Garred O et al, Exp Cell Res 21%: 39-49 (1995); Garred O et al, J Biol Chem 270: 10817-21 (1995); Kurmanova A et al, Biochem Biophys Res Commun 357: 144-9 (2007)).
Predmetni pronalazak obezbeđuje efektorske polipeptide Shiga toksin A Podjedinice koji su otporni na cepanje furina koji su snažni citotoksini, bilo zbog nadoknade zbog nedostatka događaja cepanja furina unutar intoksirane ćelije ili iz nekog neobjašnjivog razloga. Određeni ćelijski ciljani molekuli predmetnog pronalaska su bar jednako efikasni i snažno citotoksični kao i ćelijski ciljani molekuli koji sadrže osetljive na cepanje proteaze, polipeptidne regione divljeg soja Shiga toksina (videti Primere, infra).
C. Poboljšana Stabilnost i In Vivo Tolerantnost
U određenim primerima izvođenja, molekuli predmetnog pronalaska (npr. ćelijski ciljani molekul pronalaska) pokazuje povećanu stabilnost i/ili poboljšanu in vivo tolerantnost kada se porede sa više osetljivih analoga na cepanje furina i/ili manje de-imunizovane analoge (analog koji je blisko srodan molekulu kome nedostaje jedna ili više strukturnih karakteristika predmetnog pronalaska).
Povećana stabilnost ćelijski ciljanog molekula u poređenju sa referentnim molekulom može se pokazati in vitro i/ili in vivo. Stabilnost terapeutskog ili dijagnostičkog molekula tokom vremena je važno svojstvo i može uticati na to za koje aplikacije se molekul može praktično upotrebiti. Molekulska stabilnost uključuje in vitro i in vivo, kao što je, npr., stabilnost u organizmu nakon primene i tokom skladištenja u toku različitih temperatura i koncentracija. Za određene imunotoksine ili fuzije ligand-toksin, stabilnost veze između toksina i drugih komponenti može uticati na količinu nespecifične toksičnosti izazvane prisustvom i/ili količinom neiskorišćenog toksina tokom vremena u organizmu.
Izvesni ćelijski ciljani molekuli predmetnog pronalaska pokazuju smanjenu nespecifičnu toksičnost in vivo, što se manifestuje povećanom podnošljivošću in vivo u poređenju sa više
2 4
varijanti osetljivih na cepanje proteaza. In vivo tolerantnost može da odredi stručnjak koristeći tehnike poznate u tehnici i/ili koje su ovde opisane. Pored procene in vivo podnošljivosti primenom mortaliteta, za procenu podnošljivosti in vivo mogu se koristiti i znakovi morbiditeta, kao što su, npr., aspekti telesne težine, fizički izgled, merljivi klinički znaci, neprovocirano ponašanje i reakcije na spoljašnje stimulanse (videti npr. Morton D, Griffiths P, Vet Rec 116: 431-43 (1985); Montgomery C, Cancer Bull 42: 230-7 (1990); Ullman-Cullere M, Foltz C, Lab Anim Sci 49: 319-23 (1999); Clingerman K, Summers L, J Am Assoc Lab Anim Sci 51: 31 -6 (2012)). Eutanazija se može koristiti kao odgovor na znake morbiditeta i/ili moribunditeta i tako stvoriti tačku mortaliteta. Na primer, smanjenje telesne težine od 15-20% za 2-3 dana može se koristiti kao znak morbiditeta kod glodara i kao opravdanje za eutanaziju (videti npr. Institute of Laboratory Animal Research 2011. Guide for the care and use of laboratory animals, 8th ed, Washington, DC, U.S.: National Academies Press).
Poboljšana in vivo tolerancija primećena za uzorne, ćelijski ciljane molekule predmetnog pronalaska u poređenju sa više analoga osetljivih na cepanje furina sugeriše da mnogo veće doze ovih molekula usmerenih na ćelije mogu biti sigurno primenjivane na sisare u poređenju sa dozama srodnih molekula koji sadrže polipeptidni region Shiga toksina osetljiv na cepanje furina. Određeni ćelijski ciljani molekuli predmetnog pronalasku mogu da pokazuju smanjenu nespecifičnu toksičnost u poređenju sa više varijanti osetljivih na proteaze, jer otpornost na proteazu služi za zaštitu i očuvanje veze između efektorske komponente Shiga toksina i komponente koja cilja ćeliju.
Pored toga, in vivo tolerancija za ćelijski ciljane molekule predmetnog pronalaska može biti povezana sa svojstvima de-imunizacije datog ćelijski ciljanog molekula. Stoga, veće doze takvih de-imunizovanih ćelijski ciljanih molekula predmetnog pronalasku mogu se sigurno davati sisarima u poređenju sa dozama srodnih molekula koji sadrže „ne-de-imunizovan“ ili manje de-imunizovan, efektorski polipeptid Shiga toksina (npr. divlji soj Shiga toksin A1 fragment).
Pored toga, određeni molekuli pronalaska pokazuju povećani poluživot, in vitro i/ili in vivo, u poređenju sa više varijanti osetljivih na cepanje proteaze. Molekulska stabilnost može se utvrditi određivanjem poluživota molekula od interesa s obzirom na povezanost njegovih komponenti. Izvesni primeri izvođenja molekula pronalaska će imati duži poluživot u poređenju sa varijantama osetljivim na cepanje furinom, posebno u pogledu kontinuirane
2
povezanosti komponente efektorskog polipeptida Shiga toksina i jedne ili više drugih komponenti.
Na primer, neki primeri izvođenja molekula pronalaska će imati duži poluživot u pogledu na kontinuirane povezanosti komponente efektorskog polipeptida Shiga toksina i druge komponente, npr. ćelijski ciljani vezujući region, kada se poredi sa varijantom osetljivosti cepanja furina, pri čemu mesto(a) osetljivo na cepanje furina leži između ove dve komponente.
D. Ubijanje Ćelija putem Citotoksičnosti Shiga Toksin A Podjedinice
Određeni primeri izvođenja efektorskih polipeptida Shiga toksina i ćelijski ciljanih molekula predmetnog pronalaska su citotoksični. Određeni drugi primeri izvođenja ćelijski ciljanih molekula predmetnog pronalaska su citotoksičnu usled prisustva jednog ili više komponenti efektorskog polipeptida Shiga toksina. A Podjedinice članova familije Shiga toksina svaka sadrži enzimski aktivni polipeptidni region koji može ubiti eukariotsku ćeliju jednom u ćelijskom citozolu. Pošto su članovi porodice Shiga toksina prilagođeni za ubijanje eukariotskih ćelija, molekuli izvedeni iz Shiga toksina, kao što su, na primer, molekuli koji sadrže određene primere izvođenja efektorskog polipeptida Shiga toksina predmetnog pronalaska mogu da pokazuju snažne aktivnosti ubijanja ćelija.
Za određene primere izvođenja ćelijski ciljanih molekula predmetnog pronalaska, nakon kontakta sa ćelijom koja je fizički spojena sa ekstraćelijskim ciljnim biomolekulom vezujućeg regiona ćelijski ciljanog molekula (npr. ciljana pozitivna ćelija), ćelijski ciljani molekul može izazvati smrt ćelije. Za određene druge primere izvođenja, vrednost CD50 ćelijski ciljanog molekula je manja od 5, 2.5, 1, 0.5 ili 0.25 nM, što je znatno jače od neiskorišćenog, divljeg soja, efektorskog polipeptida Shiga toskina (npr. SEQ ID NO:4).
Ubijanje ćelija može se izvršiti korišćenjem molekula predmetnog pronalaska pod različitim uslovima ciljanih ćelija, kao što su, na primer, ciljana ćelija kojom se manipuliše ex vivo, ciljana ćelija kultivisana in vitro, ciljana ćelija unutar uzorka tkiva uzgojenog in vitro, ili ciljana ćelija u in vivo okruženju, poput multićelijskog organizma.
U određenim primerima izvođenja, efektorski polipeptidi Shiga toksina i ćelijski ciljani molekuli predmetnog pronalaska sadrže (1) de-imunizovani podregion efektorskog Shiga toksina (2) region otporan na cepljenje proteaze u blizini karboksi kraja iz izvedenog regiona
2
Shiga toksin fragmenta, (3) karboksi kraj, zadržavanje/preuzimanje signala motiva endoplazmatičnog retikuluma; i/ili (4) heterologni, T-ćelijski epitop ugrađenog ili ubačenog regiona; međutim, za određene dalje primere izvođenja, ove strukturne modifikacije ne menjaju značajno potencijal citotoksičnosti Shiga toksina u poređenju sa referentnim molekulima koji sadrže polipeptid divljeg soja Shiga toksina A Podjedinice, kao što je, npr., divlji soj Shiga toksin A1 fragment. Stoga, efektorski polipeptidi Shiga toksina i ćelijski ciljanih molekuli predmetnog pronalasku koji su de-imunizovani, otporni na cepanje proteazom i/ili nose ugrađene ili ubačene, heterologne epitope mogu da održavaju snažnu citotoksičnost istovremeno pružajući jednu ili više različitih drugih funkcionalnosti ili svojstava.
Citotoksični ćelijski ciljani molekuli koji već sadrže efektorske polipeptide Shiga toksina mogu biti konstruisani korišćenjem ovde navedenih informacija i postupaka kako bi bili više citotoksični i/ili imali suvišne, rezervne citotoksičnosti koje deluju preko potpuno različitih mehanizama. Ovi višestruki citotoksični mehanizmi mogu se međusobno dopunjavati raznovrsnim funkcijama (poput pružanja snažnog ubijanja pomoću dva mehanizma ubijanja ćelija, direktnog i indirektnog, kao i mehanizama imuno-stimulacije na lokalno područje), suvišnom podrškom jedno drugom (kao što je obezbeđivanje jednog mehanizma za ubijanje ćelija u odsustvu drugih mehanizama - kao što je ukoliko je ciljana ćelija otporna ili je stekla neki imunitet na podset prethodno aktivnih mehanizama) i/ili zaštitu od razvijene otpornosti (ograničavanjem otpora na manje verovatnu situaciju da maligna ili inficirana ćelija blokira više različitih mehanizama ubijanja ćelija istovremeno).
E. Dostava T-Ćelijskog Epitopa za MHC Klasu I Prezentacije na Ćelijskoj Površini
U određenim primerima izvođenja, efektorski polipeptidi Shiga toksina i ćelijski ciljani molekuli predmetnog pronalaska obuhvataju T-ćelijski epitop koji omogućava konstruisanje molekula „isporuka T-ćelijskog epitopa“ sa praktično neograničenim izborom tereta epitoppeptid za isporuku i prezentaciju ćelijske površine pomoću nuklearne, ćelije hordata. Za određene primere izvođenja, efektorski polipeptidi Shiga toksina i ćelijski ciljani molekuli predmetnog pronalasku su svaki sposobni da isporuče jedan ili više T-ćelijskih epitopa, povezanih sa efektorskim polipeptidima Shiga toksina i/ili ćelijski ciljanim molekulima, proteazomima ćelije. Dostavljeni T-ćelijski epitop se zatim proteolitički obrađuje i prezentuje putanjom MHC klase I na površini ćelije. Konstruisanjem epitopa MHC klase I u ćelijski ciljane molekule koji ciljaju dostavu i prezentaciju imuno-stimulativnih antigena može se postići u cilju da se iskoristi i usmeri blagotvorna(e) funkcija(e) hordata imunog sistema.
2
Za određene primere izvođenja, efektorski polipeptid Shiga toksina ili ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska je sposoban da isporuči T-ćelijski epitop molekulu ćelije MHC klase I za prezentaciju ćelijske površine. U određenim primerima izvođenja, efektorski polipeptid Shiga toksina ili ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska sadrži heterologni T-ćelijski epitop, bilo da je dodatni egzogeni materijal ili je ugrađen ili ubačen u efektorski polipeptid Shiga toksina. Za određene druge primere izvođenja, efektorski polipeptid Shiga toksina ili ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska je sposoban da isporuči ugrađeni ili ubačeni T-ćelijski epitop u molekul MHC klase I za prezentaciju ćelijske površine.
Za određene primere izvođenja, efektorski polipeptid Shiga toksina predmetnog pronalaska je sposoban da isporuči T-ćelijski epitop, koji je ugrađen ili ubačen u efektorski polipeptid Shiga toksina, u molekul MHC klase I ćelije gde je efektorski polipeptid Shiga toksina prisutan za prezentaciju T-ćelijskog epitopa pomoću molekula MHC klase I na površini ćelije. Za određene druge primere izvođenja, T-ćelijski epitop je heterologni T-ćelijski epitop. Za određene druge primere izvođenja, T-ćelijski epitop funkcioniše kao CD8+ T-ćelijski epitop, bez obzira da li je u budućnosti već poznat ili identifikovan koristeći metode koje su trenutno rutinske za stručnjaka.
Za određene primere izvođenja, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska je sposoban da isporuči T-ćelijski epitop, koji je povezan sa ćelijski ciljanim molekulom, u molekul MHC klase I, za prezentaciju T-ćelijskog epitopa molekulom MHC klase I na površini ćelije. Za određene druge primere izvođenja, T-ćelijski epitop je heterologni T-ćelijski epitop koji je ugrađen ili ubačen u efektorski polipeptid Shiga toksina. Za određene druge primere izvođenja, T-ćelijski epitop funkcioniše kao CD8+ T-ćelijski epitop, bilo da je već poznat ili identifikovan u budućnosti koristeći metode koje su trenutno rutinske za stručnjaka.
Za određene primere izvođenja, nakon kontakta sa ćelijski ciljanim molekulom predmetnog pronalaska, ćelijski ciljani molekul može da isporuči T-ćelijskom epitop-peptidu, koji je povezan sa ćelijski ciljanim molekulom u molekulu MHC I klase ćelija za prezentaciju T-ćelijskog epitopa-peptida pomoću molekula MHC klase I na površini ćelije. Za određene druge primere izvođenja, T-ćelijski epitop-peptid je heterologni epitop koji je ugrađen ili ubačen u efektorski polipeptid Shiga toksina. Za određene druge primere izvođenja, T-ćelijski epitop-peptid funkcioniše kao CD8+ T-ćelijski epitop, bez obzira da li je u budućnosti već poznat ili identifikovan koristeći metode koje su trenutno rutinske za stručnjaka.
2
Dodavanje heterolognog epitopa u ili prisustvo heterolognog epitopa u ćelijski ciljanom molekulu predmetnog pronalaska, bilo da je dodatni egzogeni materijal ili je ugrađen ili ubačen u efektorski polipeptid Shiga toksina, omogućava postupke upotrebe takvih ćelijski ciljanih molekula za ćelijski ciljano isporučivanje izabranog epitopa za prezentaciju površine ćelije pomoću nuklearne ciljane ćelije unutar hordata.
Jedna funkcija izvesnih, CD8+ T-ćelijski hiper-imunizovanih, efektorskih polipeptida Shiga toksina i ćelijski ciljanih molekula predmetnog pronalaska je isporuka jednog ili više T-ćelijskih epitop-peptida u molekulu MHC klase I za prezentaciju MHC klase I od strane ćelije. Dostava egzogenih, T-ćelijskih epitop-peptida u sistem MHC klase I ciljane ćelije može se upotrebiti da indukuje ciljanu ćeliju da predstavi T-ćelijski epitop-peptid u vezi sa molekulima MHC klase I na ćelijskoj površini, koja posle toga vodi do aktivacije CD8+ efektorskih T-ćelija za napad na ciljanu ćeliju.
Stručnjak, koristeći tehnike poznate u struci, može da udruži, upari i/ili poveže određene efektorske polipeptide Shiga toksina predmetnog pronalaska sa različitim drugim ćelijski ciljanim vezujućim regionom kako bi stvorili ćelijski ciljane molekule predmetnog pronalaska koji ciljaju specifične, ekstaćelijske, ciljane biomolekule koje su fizički povezane sa ćelijama i promovišu internalizaciju ciljanih ćelija ovih ćelijski ciljanih molekula. Smatra se da su sve nukleirane ćelije kičmenjaka sposobne da predstavljaju intraćelijske epitope koristeći sistem MHC klase I. Prema tome, ekstraćelijski ciljani biomolekuli ćelijski ciljanih molekula predmetnog pronalasku mogu u principu ciljati bilo koju nuklearnu ćeliju kičmenjaka za isporuku T-ćelijskog epitopa na MHC klase I put prezentacije takve ćelije.
Funkcije isporuke epitopa efektorskih polipeptida Shiga toksina i ćelijski ciljanih molekula predmetnog pronalaska mogu se detektovati i nadgledati različitim standardnim postupcima koji su poznati u tehnici od strane stručnjaka i/ili koji su ovde opisani. Na primer, sposobnost ćelijski ciljanih molekula predmetnog pronalaska da isporučuju T-ćelijski epitop-peptid i pokreću prezentaciju epitop-peptida od strane sistema MHC klase I ciljane ćelije može se ispitivati korišćenjem različitih in vitro i in vivo ispitivanja, uključujući, npr., direktnu detekciju/ vizualizaciju MHC klase I/peptidnih kompleksa, merenje afinitetima vezivanja heterolognih, T-ćelijskog epitop-peptida za molekule MHC klase I, i/ili merenje funkcionalnih posledica kompleksne prezentacije MHC klase I peptida na ciljanim ćelijama nadgledanjem reakcija citotoksičnih T-limfocita (CTL) (videti npr. Primere, infra).
2
Izvesne analize za nadgledanje ove funkcije polipeptida i molekula predmetnog pronalaska uključuju direktnu detekciju specifičnog kompleksa antigena MHC klase I/peptida in vitro ili ex vivo. Uobičajene metode za direktnu vizualizaciju i kvantizaciju kompleksa peptid-MHC klase I uključuju razne reagense za detekciju imunoloških sistema koji su poznati stručnjaku. Na primer, specifična monoklonska antitela se mogu razviti tako da prepoznaju određeni kompleks antigena MHC/klase I/peptida. Slično tome, rastvorljivi, multimerni T ćelijski receptori, kao što su TCR-STAR reagensi (Altor Bioscience Corp, Miramar, FL, U.S.) mogu se koristiti za direktnu vizualizaciju ili kvantizaciju specifičnih MHC I/antigenih kompleksa (Zhu X et al, J Immunol 176: 3223-32 (2006)). Ovi specifični mAbs ili rastvorljivi, multimerni T-ćelijski receptori mogu se koristiti sa različitim metodama detekcije, uključujući, npr. imunohistohemija, protočna citometrija, i imunološki test povezan sa enzimima (ELISA).
Alternativna metoda za direktnu identifikaciju i kvantifikaciju MHC I/peptidnih kompleksa uključuje analize masene spektrometrije, kao što je, npr., the ProPresent Antigen Prezentacijska Analiza (Prolmmune, Inc., Sarasota, FL, U.S.) u kojima se kompleksi peptida-MCH klase I izvlače sa površina ćelija, zatim se peptidi prečišćavaju i identifikuju sekvencionisanjem masene spektrometrije (Falk K et al. Nature 351: 290-6 (1991)).
U određenim ispitivanjima za nadgledanje isporuke T-ćelijskog epitopa i funkcije prezentacije MHC class I polipeptida i molekula pronalaska obuhvataju računske i/ili eksperimentalne metode za praćenje MHC klase I i vezanje i stabilnost peptida. Nekoliko softverskih programa je dostupno za upotrebu od strane stručnjaka za predviđanje reakcija vezivanja peptida na alele MHC klase I, kao što je, npr., Baza Podataka Imunog Epitopa i Izvori Analize (Immune Epitope Database and Analysis Resource (IEDB)) Resurs za analizu MHC-I za predviđanje vezivanja Konsenzusni alat (Kim Y et al. Nucleic Acid Res 40: W525-30 (2012). Nekoliko eksperimentalnih ispitivanja je rutinski primenjeno, kao što su, npr., analize vezivanja ćelijske površine i/ili analize površinske plazmonske rezonance i/ili upoređivanje kinetike vezivanja (Miles K et al, Mol Immunol 48: 728-32 (2011)). Pored toga, razvijeni su i druge analize vezivanja MHC-peptida zasnovane na merenju sposobnosti peptida da stabilizuje ternarni MHC-peptidni kompleks za dati alele MHC klase I, kada se poredi sa poznatim kontrolama (npr., analiza vezivanja MHC-peptida iz Prolmmmune, Inc.).
Alternativno, merenja posledica prezentacije kompleksa MHC klase I/peptidnog antigena na ćelijskoj površini se mogu izvesti nadgledanjem odgovora citotoksičnih T-ćelija (CTL) na specifični kompleks. Ova merenja uključuju direktno obeležavanje CTLs sa MHC klasa I tetramerima ili pentamernim reagensima. Tetrameri ili pentameri direktno se vezuju na T
21
ćelijske receptore određene specifičnosti, određeni sa Glavnim Histokompatibilnim Kompleksom (MHC) alele i peptidnog kompleksa. Pored toga, kvantifikacija oslobođenih citokina, kao što su interferon gama ili interleukini pomoću ELISA ili imunospota povezanog sa enzimom (ELIspot) se obično analizira da bi se identifikovali određeni CTL odgovori. Citotoksični kapacitet CTL se može meriti korišćenjem brojnih analiza, uključujući i klasičnu 51 Hromium (Cr) analizu otpuštanja ili alternativnu analizu ne-radioaktivne citotoksičnosti (npr., CytoTox96® ne-radioactivni kitovi i CellTox™ CellTiter-GLO® kitovi dostupni od Promega Corp, Madison, WI, U.S.), Granzyme B ELISpot, Analiza Aktivnosti Kaspaze ili LAMP-1 citometrijski testovi translokacionog protoka. Da bi se posebno nadgledalo ubijanje ciljanih ćelija, karboksifluoresceinski diacetat sukcinimidil estar (CFSE) može se upotrebiti za lako i brzo obeležavanje ćelijske populacije od interesa za in vitro ili in vivo ispitivanje za nadgledanje ubijanja epitop specifičnih CSFE obeleženih ciljanih ćelija (Durward M et al, J Vis Exp 45 pii 2250 (2010)).
In vivo odgovori na prezentaciju MHC klase I mogu biti praćeni primenom agensa za promociju MHC klase I/antigena (npr., vakcina protiv peptida, proteina ili inaktiviranog/ atenuisanog virusa) nakon čega sledi izazov sa aktivnim agensom (npr. virus) i nadgledanje reakcija na taj agens, obično u poređenju sa nevakcinisanim kontrolama. Ex vivo uzorci se mogu nadgledati radi CTL aktivnosti sa sličnim prethodno opisanim metodama (npr. CTL citotoksična analiza i kvantifikacija oslobađanja citokina).
HLA-A, HLA-B, i/ili HLA-C molekuli su izolovani iz intoksiranih ćelija posle lize koristeći imunološki afinitet (npr., prečišćavanje "pucanja" anti-MHC antitela) i pridruženi peptidi (odn., peptidi predstavljeni sa izolovanim molekulima MHC) su dobijeni iz prečišćenih komplekasa. Oporavljeni peptidi su analizirani sa sekvenciranjem masene spektrometrije. Podaci masene spektrometrije se upoređuju sa bibliotekom baze podataka proteina koja se sastoji od sekvence egzogenih (ne-sopstvenih) peptida (T-ćelijski epitop X) i međunarodnog indeksa proteina za ljude (koji predstavljaju "samo- ili ne-imunogenske peptide). Peptidi su rangirani po značaju prema bazi podataka verovatnoće. Sve detektovane antigenske (ne-sopstveni) peptidne sekvence su navedene. Podaci su verifikovani pretragom u kodiranoj dekoj bazi podataka kako bi se smanjili lažni pogoci (videti npr. Ma B, Johnson R, Mol Cell Proteomics 11: O111.014902 (2012)). Rezultati će pokazati da su peptidi iz T-ćelijskog epitopa X predstavljeni u MHC kompleksima na površini intoskiranih ciljanih ćelija.
Set predstavljenih peptid-antigen-MHC komplekasa može varirati između ćelija zbog izraženih HLA molekula specifičnih za antigen. T-ćelije mogu zatim prepoznati specifične peptid-antigen-MHC komplekse prikazane na ćelijskoj površini koristeći različite TCR molekule sa različitim specifičnostima antigena.
Budući da se više T-ćelijskih epitopa može isporuči pomoću ćelijski ciljanog molekula pronalasku, kao što je, npr., ugradnjom dva ili više različitih T-ćelijskih epitopa u jedan proteazom koji isporučuje efektorski polipeptid, pojedinačni ćelijski ciljani molekul pronalaska mogu biti efikasni hordati istih vrsta sa različitim varijantama klase MHC, kao što su, npr., kod ljudi sa različitim HLA alelima. Ovo može omogućiti kombinovanje unutar jednog molekula različitih T-ćelijskih epitopa sa različitom efikasnošću kod različitih pod-populacija subjekata zasnovanih na MHC kompleksnoj raznolikosti proteina i polimorfizama. Na primer, humani MHC-kompleksni proteini, HLA proteini, variraju kod ljudi na osnovu genetskog pretka, npr., afrički (subsaharski), američki, kavkaziodni, monguloidni, novo gvinejski i australijski, ili pacifičko ostrvo.
Prijave koje uključuju T-ćelijske epitope koji dostavljaju polipeptide i molekule predmetnog pronalaska su dodeljenje. Svaka nukleirana ćelija u sisarskom organizmu može biti sposobna da predstavlja MHC klase I prezentaciju imunogenskih, T-ćelijskih epitop-peptida na njihovim ćelijskim spoljašnjim površinama složenih u molekulu MHC klase I. Pored toga, osetljivost prepoznavanja T-ćelijskih epitopa je tako sjajna da je potrebno da bude prezentovano samo nekoliko MHC-I peptidnih kompleksa da bi se dobio imunološki odgovor, npr., čak i prezentacija jednog kompleksa može biti dovoljna za prepoznavanje od strane efektorskih T-ćelija (Sykulev Y et al. Immunity 4: 565-71 (1996)).
Aktivacija T-ćelijskih odgovora je željena karakteristika određenih antikancerogenih, antineoplastičnih, anti-tumorskih i/ili antimikrobnih bioloških lekova da stimulišu pacijentov imuni sistem prema ciljanim ćelijama. Aktivacija robusnog i snažnog T-ćelijskog odgovora je takođe željena karakteristika mnogih vakcina. Prezentacija T-ćelijskog epitopa od strane ciljane ćelije u organizmu može dovesti do aktiviranja snažnih imunoloških odgovora na ciljanu ćeliju i/ili njenog opšteg lokaliteta unutar organizma. Stoga, ciljana dostava T-ćelijskog epitopa za prezentaciju se može koristiti kao mehanizam za aktiviranje odgovora T-ćelije tokom terapijskog režima.
Prezentacija imunogenskog T-ćelijskog epitop-peptida od strane sistema MHC klase I cilja prezentovanu ćeliju za ubijanje pomoću lize posredovane CTL-om i takođe pokreće imunološku stimulaciju u lokalnom mikro-okruženju. Konstruisanjem sekvenci imunogenskog epitopa u komponentama efektorskog polipeptida Shiga toksina ciljanih ćelija koje internalizuju terapeutske molekule, može se postići ciljano oslobađanje i prezentacija imunostimulativnih antigena. Prezentacija imuno-stimulativnih ne-sopstvenih antigena, kao što su, npr., poznati virusni antigeni sa visokom imunogenošću, pomoću ciljanih ćelija signaliziraju do drugih imunoloških ćelija kako bi uništili ciljane ćelije, kao i da regrutuju više imunih ćelija u to područje.
Prezentacija imunogenog, T ćelijskog epitop-peptida od strane kompleksa MHC klase I cilja prezentovanu ćeliju za ubijanje pomoću citolize posredovane CTL-om. Prezentacija ciljanih ćelija imuno-stimulativnih ne-sopstvenih antigena, kao što su, npr., poznati virusni epitoppeptidi sa visokom imunogenošću, može signalizirati drugim imunim ćelijama da uništavaju ciljane ćelije i regrutuju više imunih ćelija na mestu ciljane ćelije unutar hordata.
Stoga, već citotoksični molekuli, kao što su, npr., terapeutski ili potencijalno terapeutski molekuli koji sadrže efektorske polipeptide Shiga toksina, mogu se konstruisati korišćenjem metoda predmetnog pronalaska u više citotoksičnih molekula i/ili imati dodatni citotoksični mehanizam koji deluje preko isporuke T ćelijskog epitopa, prezentacije, i stimulacije efektorskih T-ćelija. Ovi višestruki citotoksični mehanizmi mogu se međusobno dopunjavati (kao što su obezbeđivanjem i direktnog ubijanja ciljanih ćelija i indirektnog (CTL-posredovanog) ubijanja ćelija, suvišna podrška jedno drugom (kao što je obezbeđivanje jednog mehanizma ubijanja ćelija u odsustvu drugi), i/ili zaštititi od razvoja terapijske otpornosti (ograničavanjem otpornosti na manje verovatnu situaciju da se maligna ili inficirana ćelija razvija i blokira dva različita mehanizma ubijanja ćelija istovremeno).
Dodatno, citotoksični molekul koji sadrži efektorski polipeptid Shiga toskina koji pokazuje citotoksičnost zasnovanu na katalitičkom testu može biti konstruisana od strane stručnjaka koristeći rutinske metode u enzimski neaktivne varijante. Na primer, citotoksična komponenta efektorskog polipeptida Shiga toksina citotoksičnog molekula može se dati smanjenom aktivnošću i/ili učiniti neaktivnom uvođenjem jedne ili više mutacija i/ili skraćivanja tako da rezultirajući molekul još uvek može da bude citotoksičan zahvaljujući svojoj sposobnosti da se isporuči T-ćelijski epitop u sistem MHC klase I ciljane ćelije i zatim predstavlja na površini ciljane ćelije. U drugom primeru, T-ćelijski epitop može biti ubačen ili ugrađen u efektorski polipeptid Shiga toksina tako da je efektorski polipeptid Shiga toksina inaktiviran dodavanjem epitopa (videti npr. WO 2015/113007). Ovaj pristup uklanja jedan citotoksični mehanizam dok zadržava ili dodaje drugi i može takođe obezbediti molekul koji je spsoban da pokazuje imuno-stimulaciju na lokalnom području ciljane(ih) ćelije(a) u organizmu putem isporučenog T-ćelijskog epitopa ili „zasejavanja antigena“. Pored toga, ne-
21
citotoksične varijante ćelijski ciljanih molekula predmetnog pronalaska koje sadrže ugrađene ili ubačene, heterološke, T-ćelijske epitope mogu biti korisne u aplikacijama koje uključuju imuno-stimulaciju unutar hordata i/ili obeležavanje ciljanih ćelija unutar hordata sa prikazanim epitopima molekula MHC klase I.
Sposobnost isporuke T-ćelijskog epitopa određenih efektorskih polipeptida Shiga toksina i ćelijski ciljanih molekula predmetnog pronalaska može se postići pod različitim uslovima i u prisustvu neciljanih ćelija posmatrača, kao što su, npr., ex vivo manipulisana ciljana ćelija, ciljana ćelija uzgojena in vitro, ciljna ćelija unutar uzorka tkiva uzgojenog in vitro ili ciljna ćelija u okruženju in vivo kao u višećelijskom organizmu.
F. Ćelijsko Ubijanje pomoću Ciljane Citotoksičnosti i/ili Angažovanjem Citotoksičnih T-Ćelija
Za određene primere izvođenja, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska može da obezbedi 1) isporuku T-ćelijskog epitopa za prezentaciju MHC klase I od strane ciljane ćelije i/ili 2) moćnu citotoksičnost. Za određene primere izvođenja ćelijski ciljanih molekula predmetnog pronalaska, nakon kontakta sa ćelijom fizički spojenom sa ekstraćelijskim ciljanim biomolekulom ćelijski ciljanog vezujućeg regiona, ćelijski ciljani molekul pronalaska može da izazove smrt ćelije. Mehanizam ubijanja ćelija može biti direktan, npr. preko enzimske aktivnosti regiona efektorskog polipeptidna toksina, ili indirektno pomoću citolize posredovane CTL-om.
1. Indirektno Ubijanje Ćelija putem Isporuke T-ćelijskog epitopa i Prezentacije MHC klase I
Određeni primeri izvođenja ćelijski ciljanih molekula predmetnog pronalaska su citotoksični zato što sadrže CD8+ T-ćelijski epitop sposoban da bude dostavljen na put prezentacije MHC klase I ciljane ćelije i predstavljen na ćelijskoj površini ciljane ćelije. Na primer, dostava T-ćelijskog epitopa, CD8+ T-ćelijski hiper-imunizovanih, efektorskih polipeptida Shiga toksina predmetnog pronalaska, sa ili bez endogene epitopske de-imunizacije, može se koristiti kao komponente ćelijski ciljanih molekula za primene koje obuhvataju indirektno ubijanje ćelije.
U određenim primerima izvođenja ćelijski ciljanih molekula predmetnog pronalaska, nakon kontakta sa ćelijom koja je fizički spojena sa ekstraćelijskim ciljnim biomolekulom ćelijski ciljanog vezujućeg regiona, ćelijski ciljani molekul pronalaska može da indirektno izazove smrt ćelije, kao što je, npr., putem prezentacije jednog ili više T-ćelijskih epitopa ciljane ćelije i kasnije regrutovanje CTL koji ubijaju ciljanu ćeliju.
Prezentacija antigenskog peptida kompleksiranog sa molekulom MHC klase I sa ćelijom senzitiviše prezentovanje ćelije do ciljanog ubijanja citotoksičnim T-ćelijama (CTL) putem indukcije apoptoze, lize i/ili nekroze. Pored toga, CTLs koji prepoznaju ciljanu ćeliju mogu da oslobode imuno-stimulativne citokine, kao što su, npr., interferonski gama (IFN-gama), faktor nekroze tumora alfa (TNF), makrofagi, inflamatorni protein-1 beta (MIP-lbeta), i interleukini kao što su IL-17, IL-4, i IL-22. Dalje, CTLs aktivirani prepoznavanjem predstavljenog epitopa mogu bez diskriminacije ubiti ostale ćelije blizu prezentovanih ćelija bez obzira na kompleksni repertoar klase peptid-MHC klase I prezentovan sa ovim bližim ćelijama (Wiedemann A et al, Proc Natl Acad Sci USA 103: 10985-90 (2006)).
Zbog raznolikosti alela MHC unutar različitih vrsta, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska koji sadrži samo jedan epitop može pokazati različitu efikasnost kod različitih pacijenata ili subjekata iste vrste. Međutim, pojedini primeri izvođenja ćelijski ciljanih molekula predmetnog pronalaska mogu sadržavati više T-ćelijskih epitopa koji mogu istovremeno da se isporuče u sistem MHC klase I ciljane ćelije istovremeno. Stoga, za određene primere izvođenja ćelijski ciljani molekuli predmetnog pronalaska, ćelijski ciljan molekul je korišćen za lečenje različitih subjekata sa znatnim razlikama u afinitetima vezivanja epitopa-peptida njihovih molekula MHC (odn. značajnim razlikama u njihovim MHC alelima i/ili MHC genotipovi). Pored toga, određeni primeri izvođenja ćelijski ciljanih molekula predmetnog pronalaska smanjuju ili sprečavaju prilagođavanje ciljanih ćelija da bi izbegle ubijanje (npr., ciljana kancer ćelija koja mutira da bi se izbegla terapeutska efikasnost ili "mutantski beg") istovremenim korišćenjem višestrukih mehanizama ubijanja ćelija (npr., direktno ubijanje i indirektno ubijanje putem više različitih T-ćelijskih epitopa istovremeno).
2. Direktno Ubijanje Ćelije putem Ciljane Ćelije. Citotoksičnost Shiga Toksina
Određeni primeri izvođenja ćelijski ciljanih molekula predmetnog pronalaska su citotoksični zbog toga što oni sadrže katalitički aktivni, efektorski polipeptid Shiga toksina i bez obzira na prisustvo imunogenog, CD8 T-ćelijskog epitopa u molekulu. Na primer, CD8+ T-ćelijski hiper-imunizovani, efektorski polipeptidi Shiga toksina predmetnog pronalaska, sa ili bez endogene epitopske deimunizacije, mogu se koristiti kao komponente ćelijski ciljanih molekula za aplikacije koje uključuju direktno ubijanje ćelija, kao što su, npr., putem
21
ribotoksične, enzimske aktivnosti efektorskog polipeptida Shiga toksina ili vezivanje ribozoma i ometanja funkcije ribozoma zbog nekatalitičkog(ih) mehanizma(ama).
Za određene primere izvođenja CD8+ T-ćelijski hiper-imunizovani, ćelijski ciljani molekuli predmetnog pronalaska, nakon kontakta ćelije fizički spojene sa ekstraćelijskim ciljanim biomolekulom ćelijski ciljanog vezujućeg regiona, ćelijski ciljani molekul pronalaska je sposoban da direktno izazove smrt ćelije, kao što su, npr., bez učešća neciljane, citotoksične T-ćelije (videti Odeljak V-D, supra).
G. Selektivna Citotoksičnost među Ćelijskim Tipovima
Određeni ćelijski ciljani molekuli predmetnog pronalaska koriste se u selektivnom ubijanju specifičnih ciljanih ćelija u prisustvu neciljanih, ćelija koje prolaze. Ciljanjem dostave efektorskih polipeptida Shiga toksina predmetnog pronalaska u specifične ćelije preko ćelijski ciljanog(ih) vezujućeg(ih) region(a), ćelijski ciljani molekuli predmetnog pronalaska mogu da pokazuju specifične aktivnosti ograničenih ćelija koje ubijaju ćeliju, što rezultira u ekskluzivnom ili preferencijalnom ubijanju odabranih tipova ćelija u prisustvu neciljanih ćelija. Slično tome, ciljanjem dostave imunogenih T-ćelijskih epitopa na put MHC klase I ciljanih ćelija, naknadna prezentacija T-ćelijskih epitopa i CLT posredovane citolize ciljanih ćelija indukovanih sa ćelijski ciljanim molekulima pronalaska može biti ograničena na isključivo ili preferirano ubijanje odabranih tipova ćelija u prisustvu neciljanih ćelija. Pored toga, i ćelijski ciljana dostava citotoksičnog, regiona efektorskog polipeptida Shiga toksina i imunogenog, T-ćelijskog epitopa može da se izvede pomoću jednog ćelijski ciljanog molekula predmetnog pronalaska, tako da je dostava obe potencijalno citotoksične komponente ograničena isključivo ili preferirano da cilja ćelije u prisustvu neciljanih ćelija.
Za određene primere izvođenja, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska je citotoksičan u određenim koncentracijama. U određenim primerima izvođenja, posle primene ćelijski ciljanog molekula predmetnog pronalaska smeši ćelijskih tipova, citotoksični ćelijski ciljani molekul može da selektivno ubije one ćelije koje su fizički povezane sa ekstraćelijskim ciljnim biomolekulom u poređenju sa tipovima ćelija koji nisu fizički spojene sa ekstraćelijskim ciljnim biomolekulom. Za određene primere izvođenja, citotoksični ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska može selektivno ili preferirano da izazove smrt određenog ćelijskog tipa u smeši dve ili više različitih ćelijskih vrsta. To omogućava ciljanje citotoksične aktivnosti na specifične ćelijske tipove sa velikom preferencijalnošću, kao što je trostruki citotoksični efekat, nad tipovima ćelija koji su „prolazni“ koji ne izražavaju ciljani
21
biomolekul. Alternativno, ekspresija ciljanog biomolekula vezujućeg regiona može biti neekskluzivno za jedan tip ćelije ako je ciljani biomolekul izražen u dovoljno malim količinama i/ili fizički povezan u malim količinama sa tipovima ćelija koje se ne želi ciljati. Ovo omogućava ciljano ubijanje ćelija specifičnih tipova ćelija sa velikom preferencijalnošću, kao što je trostruki citotoksični efekat, nad tipovima ćelija koji su „prolazni“ koji ne izražavaju značajne količine ciljanih biomolekula ili nisu fizički povezani sa značajnim količinama ciljanog biomolekula.
Za druge primere izvođenja, nakon primene citotoksičnog ćelijski ciljanog molekula na dve različite populacije ćelijskih tipova, citotoksični ćelijski ciljani molekul je sposoban da izazove smrt kao što je definisano od strane polu maksimalne citotoksične koncentracije (CD50) na populaciji ciljanih ćelija, čiji članovi iskazuju ekstraćelijski ciljani biomolekul vezujućeg regiona citotoksičnog čelijski ciljanog molekula, u dozi koja je najmanje tri puta niža od CD50doze istog citotoksičnog ćelijski ciljanog molekula za populaciju ćelija čiji članovi ne iskazuju ekstraćelijski ciljani biomolekul vezujućeg regiona citotoksičnog ćelijski ciljanog molekula.
Za određene primere izvođenja, citotoksična aktivnost ćelijski ciljanog predmetnog pronalaska prema populaciji ćelijskih tipova fizički spojenih sa ekstraćelijskim ciljnim biomolekulom je najmanje 3-puta veća od citotoksične aktivnosti prema populacijama ćelijskih tipova koji nisu fizički povezani sa bilo kojim ekstraćelijskim ciljanim biomolekulom vezujućeg regiona. Prema predmetnom pronalasku, selektivna citotoksičnost se može kvantifikovati u odnosu na odnos (a/b) od (a) citotoksičnosti prema populaciji ćelija određenog ćelijskog tipa fizički spojenog sa ciljanim biomolekulom vezujućeg regiona za (b) citotoksičnost prema populaciji ćelija ćelijskog tipa koja nije fizički spojenog sa ciljanim biomolekulom vezujućeg regiona. U nekim primerima izvođenja, odnos citotoksičnosti ukazuje na selektivnu citotoksičnost koja je najmanje 3-puta, 5-puta, 10-puta, 15-puta, 20-puta, 25-puta, 30-puta, 40-puta, 50- pregibni, 75 puta, 100 puta, 250 puta, 500 puta, 750 puta ili 1000 puta veći za populacije ćelija ili tipova ćelija fizički spojenih sa ciljanim biomolekulom vezujućeg regiona u poređenju sa populacijom ćelija ili tipovi ćelija koji nisu fizički spojeni sa ciljanim biomolekulom vezujućeg regiona.
Za određene primere izvođenja, preferencijalna funkcija ubijanja ćelija ili selektivna citotoksičnost ćelijski ciljanog molekula predmetnog pronalaska je posledica dodatnog egzogenog materijala (npr. citotoksičnog materijala) i/ili heterolognog T-ćelijskog epitopa prisutnog u efektorskom polipeptidu Shiga toksina predmetnog pronalaska i nije nužno rezultat katalitičke aktivnosti polipeptidnog regiona Shiga toksina.
21
Ova preferencijalna funkcija ubijanja ćelija omogućava da određeni citotoksični ćelijski ciljani molekuli budu ubijeni pod različitim uslovima i u prisustvu neciljanih ćelija prolaznika, kao što su smeše ćelija koje manipulišu ex vivo, in vitro kultivisana tkiva sa mešavinama ćelijskih tipova, ili in vivo u prisustvu više tipova ćelija (npr. in situ ili na izvornom mestu u višećelijskom organizmu).
H. Dostava Dodatnog Egzogenog Materijala u Unutrašnjost Ciljanih Ćelija
Pored primene citotoksične, citostatične, i imuno stimulacije, ćelijski ciljani molekuli predmetnog pronalasku mogu se takođe koristiti za ciljane funkcije intraćelijske dostave, kao što su, npr., u aplikacijama koje uključuju funkcije prikupljanja informacija i dijagnostičke funkcije.
Zbog toga što ćelijski ciljani molekuli pronalaska, koji uključuju smanjenu citotoksičnost i/ili netoksične oblike istih, su sposobni da uđu u ćelije fizički spojene sa ekstraćelijskim ciljanim biomolekulom prepoznatom od strane vezujućeg regiona ćelijski ciljanog molekula, određeni primeri izvođenja ćelijski ciljanog molekula pronalaska mogu se koristiti za isporuku dodatnih egzogenih materijala u unutrašnjost ciljanih ćelija. Na primer, netoksične varijante citotoksičnih, ćelijski ciljanih molekula pronalaska, ili opciono citotoksične varijante, mogu se koristiti za isporuku dodatnih egzogenih materijala i/ili obeležavanje unutrašnjosti ćelija fizički spojenih sa ekstraćelijskim ciljanim biomolekulom vezujućeg regiona ćelijski ciljanog molekula. Različiti tipovi ćelija i/ili ćelijske populacije koji eksprimiraju ciljani biomolekul na najmanje jednu ćelijsku površinu mogu biti ciljani pomoću molekula koji ciljaju ćeliju pronalaska radi primanja egzogenih materijala. Funkcionalne komponente predmetnog pronalaska su modularne, tako što različiti efektorski polipeptidi Shiga toksina, dodatni egzogeni materijali, i vezujući region mogu biti međusobno povezan radi dobijanja molekula ciljanih ćelija pogodnih za različite primene koje uključuju isporuku tereta, kao što su, npr. neinvazivno, in vivo snimanje tumorskih ćelija.
Ova isporuka funkcije egzogenih materijala određenih ćelijski ciljanih molekula predmetnog pronalaska može se izvesti pod različitim uslovima i u prisustvu neciljanih ćelija promatrača, kao što su, npr., ciljane ćelije koje manipulišu ex vivo, ciljane ćelije uzgajane in vitro, ciljana ćelija u uzorku tkiva uzgojenog in vitro, ili ciljana ćelija u in vivo okruženju, kao u višećelijskom organizmu. Pored toga, selektivna isporuka egzogenog materijala određenim ćelijama pomoću određenih ćelijski ciljanih molekula predmetnog pronalaska može se izvesti pod različitim uslovima i u prisustvu neciljanih ćelija prolaznika, kao što su mešavine ćelija
21
tipa ex vivo, in vitro kultivisana tkiva sa smešom ćelijskih tipova, ili in vivo u prisustvu više tipova ćelija (npr. in situ ili na izvornom mestu u višećelijskom organizmu).
Efektorski polipeptidi Shiga toksina i ćelijski ciljani molekuli koji nisu sposobni, poput određenog raspona koncentracije, da ubiju ciljanu ćeliju i/ili isporuče ugrađeni ili umetnuti epitop za prezentaciju na ćelijskoj površini pomoću MHC molekula ciljane ćelije i dalje mogu biti korisne za isporuku egzogenih materija u ćelije, kao što su, npr., agensi za promociju detekcije.
Za određene primere izvođenja, efektorski polipeptidi Shiga toksina predmetnog pronalaska pokazuje citotoksičnost niske do nule i stoga se ovde nazivaju "necitotoksični i/ili smanjeni citotoksični". U nekim primerima izvođenja, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska pokazuje nisku ili nultu citotoksičnosti i može se nazvati „necitotoksičnom“ i/ili „reduciranom citotoksičnom varijantom“. Na primer, neki primeri izvođenja molekula predmetnog pronalaska ne pokazuju značajan nivo citotoksičnosti zasnovane na Shiga toksinu gde pri dozama manjim od 1000 nM, 500 nM, 100 nM, 75 nM, 50 nM, nema značajne količine ćelijske smrt u poređenju sa odgovarajućim referentnim molekulom, kao što je, npr., mereno testom koji je poznat stručnjaku i/ili ovde opisanom. Za određene dalje primere izvođenja, molekuli predmetnog pronalaska ne pokazuju nikakvu toksičnost u dozama od 1-100 µg po kg primaoca sisara. Varijante redukovane citotoksičnosti mogu i dalje biti citotoksične u određenim koncentracijama ili dozama, ali pokazuju smanjenu citotoksičnost, kao što su, na primer, koje nisu sposobne da pokazuju značajan nivo citotoksičnosti Shiga toksina u određenim situacijama.
Efektorski polipeptidi Shiga toksina predmetnog pronalaska, i određeni ćelijski ciljani molekuli koji sadrže isti, može se dobiti ne-citotoksična, kao što je, npr., dodavanjem jedne ili više amino kiselinskih supstitucija poznatih stručnjaku da neaktivira efektorski polipeptid Shiga toksina A Podjedinicu i/ili Shiga toksin efektorski polipeptid koji uključuje primerne supstitucije koje su opisane ovde. Ne-citotoksične i redukovane citotoksične varijante ćelijski ciljanih molekula predmetnog pronalaska mogu biti u određenim situacijama pogodnije za isporuku dodatnih egzogenih materija nego više citotoksičnih varijanti.
Prikupljanje Informacija za Dijagnostičke Funkcije
U određenim ćelijski ciljanim molekulima predmetnog pronalaska koriste se u in vitro i/ili in vivo detekciji specifičnih ćelija, tipova ćelija i/ili ćelijske populacije, kao i specifičnih
21
podćelijskih delova bilo kog od gore pomenutog. Redukovana citotoksičnost i/ili netoksični oblici citotoksičnih, ćelijski ciljanih molekula pronalaska koji su konjugovani za agens za promociju detekcije mogu se koristiti za dijagnostičke funkcije, kao što su prateća dijagnostika koja se koristi u kombinaciji sa terapijskim režimom koji sadrži isti ili povezan vezujući region, kao što je, npr., vezujući region sa visokim afinitetom vezivanja za isti ciljani biomolekulu, prekrivajući epitop i/ili isti epitop.
U određenim primerima izvođenja, ćelijski ciljani molekuli opisani ovde se koriste i za dijagnostikovanje i za lečenje, ili samo za dijagnostikovanje. Kada se isti citotoksični ćelijski ciljani molekul koristi i za dijagnostikovanje i za lečenje, za određene primere izvođenja predmetnog pronalaska varijanta ćelijski ciljanog molekula koji inkorporira detekciju promovisanog agensa za dijagnostikovanje može imati smanjenu citotoksičnost ili može biti doneta netoksičnost od strane katalitičke inaktivacije njegovog(ih) regiona(a) efektorskog polipeptida Shiga toksina putem jedne ili više amino kiselinskih supstitucija, uključujući primerne supstitucije koje su ovde opisane. Na primer, određene netoksične varijante ćelijski ciljanih molekula predmetnog pronalaska pokazuju manje od 5%, 4%, 3%, 2%, ili 1% smrti ciljanih ćelija posle primene doze koja je manja od 1 mg/kg. Varijante smanjene citotoksičnosti mogu još uvek biti citotoksične pri određenim koncentracijama ili dozama ali pokazuju smanjenu citotoksičnost, kao što je, npr., da nisu sposobni da pokazuju značajan nivo citotoksičnosti Shiga toksina kao što je ovde opisano.
Sposobnost da se konjuguje detekcija promovišućih agenasa koji su poznati u tehnici na razne ćelijski ciljane molekule predmetnog pronalaska obezbeđuju korisne kompozicije za detekciju određenih ćelija, kao što su, npr., kancer, tumor, imune, i/ili inficirane ćelije. Ova dijagnostička rešenja ćelijski ciljanih molekula pronalaska mogu se koristiti za informaciju prikupljene putem raznih slikovitih tehnika i analiza koji su poznati u tehnici. Na primer, dijagnostička rešenja ćelijski ciljanih molekula predmetnog pronalaska mogu biti korišćena za informacije prikupljene putem snimanja intraćelijskih organela (npr. endocitotične, Golgi, endoplazmatični retukulum, i citostolične komponente) pojedinačnih ćelija kancera, imunih ćelija, i/ili inficiranih ćelija kod pacijenta ili biopsiom uzorka.
Razni tipovi informacije mogu biti sakupljeni korišćenjem dijagnostičkih rešenja ćelijski ciljanog molekula pronalaska bilo za dijagnostičke ili za druge namene. Ove informacije mogu biti korisne, na primer, u dijagnostikovanju neoplastičnih ćelijskih tipova, određivanju terapijske osetljivosti pacijentove bolesti, proceni progresije anti-neoplastičnih terapija tokom vremena, proceni progresije imunomodulatorne terapije tokom vremena, proceni
22
napredovanja antimikrobnih terapija tokom vreme, procena prisustva zaraženih ćelija u materijalima za transplantaciju, procena prisustva neželjenih ćelijskih vrsta u transplantacijskim materijalima i/ili procena prisustva rezidualnih ćelija tumora posle hirurške ekscizije tumorske mase.
Na primer, podpopulacije pacijenata mogu se utvrditi korišćenjem informacija prikupljenih pomoću dijagnostičkih varijanti ćelijski ciljanih molekula pronalaska, a zatim se pojedini pacijenti mogu dalje kategorisati u podpopulacije na osnovu njihovih jedinstvenih karakteristika otkrivenih pomoću tih dijagnostičkih rešenja. Na primer, efikasnost specifičnih lekova ili terapija može biti kriterijum korišćen za definisanje podpopulacije pacijenta. Na primer, netoksična dijagnostička varijanta određenog citotoksičnog, ćelijski ciljanog molekula pronalaska može se upotrebiti za razlikovanje pacijenata koji su u klasi ili podpopulaciji pacijenata za koje se predviđa da pozitivno reaguju na citotoksičnu varijantu tog ćelijski ciljanog molekula pronalaska. Shodno tome, povezane metode za identifikaciju pacijenta, stratifikaciju pacijenta, i dijagnozu koristeći ćelijski ciljane molekule predmetnog pronalaska, uključujući netoksične varijante citotoksičnih, ćelijski ciljanih molekula predmetnog pronalaska, smatraju se da spadaju u opseg predmetnog pronalaska.
Ekspresija ciljanog biomolekula od strane ćelije ne mora biti izvorna kako bi se ćelijski ciljana usmerio ćelijski ciljan molekul predmetnog pronalaska, kao što je, npr., direktno ubijanje ćelije, indirektno ubijanje ćelija, isporuka egzogenih materijala poput T-ćelijskog epitopa i/ili prikupljanja informacija. Ekspresija ćelijske površinske ciljanog biomolekula može biti rezultat infekcije, prisustva patogena i/ili prisustva intraćelijskog mikrobiološkog patogena. Ekspresija ciljanog biomolekula može biti veštačka, kao što je, npr., prisilna ili indukovana ekspresija nakon infekcije virusnim ekspresijskim vektorom, videti npr. adenovirus, adenopridruženi virus i retrovirusni sistemi. Primer indukcije ekspresije ciljanog biomolekula je pojačavanje CD38 ekspresije ćelija izloženih retinoidima, kao što je svi-trans retinoinska kiselina i razni sintetički retinoidi, ili bilo koji receptor retinoinske kiseline (RAR) agonist (Drach J et al. Cancer Res 54: 1746-52 (1994); Uruno A et al, J Leukoc Biol 90: 235-47 (2011)). Ekspresija CD30 se može indukovati i u B-ćelijama i u T-ćelijama izlaganjem mitogenima, fitohemaglutininom (PHA), stafilokoknim proteinima A, EBV virusom, humanom T-ćelijom virusa leukemije 1 ili 2 (HTLV-1 ili HTLV-2) (videti npr. Stein H et al. Blood 66: 848-58 (1985)). U drugim primerima, CD20, HER2, i EGFR ekspresija se može indukovati izlaganjem ćelije jonizujućem zračenju (Wattenberg M et al, Br J Cancer 110: 1472-80 (2014)). Dalje, ekspresija PSMA se reguliše kao odgovor na lišavanje androgena (videti npr. Chang S et al. Cancer 88: 407-15 (2000); Meller B et al, EJNMMIRes 5: 66 (2015)).
VI. Proizvodnja, Izrada, i Pročišćavanje Efektorskih Polipeptida Shiga Toksina Pronalaska i Ćelijski Ciljani Molekuli Koje Sadrže Isti
Efektorski polipeptidi Shiga toksina i određeni ćelijski ciljani molekuli predmetnog pronalaska mogu se proizvesti korišćenjem tehnika dobro poznatih onima koji poznaju ovu oblast. Na primer, efektorski polipeptidi Shiga toksina i ćelijski ciljani molekuli pronalasku mogu se proizvesti standardnim sintetskim postupcima, korišćenjem rekombinantnih ekspresijskih sistema ili bilo kojim drugim pogodnim postupkom. Prema tome, efektorski polipeptidi Shiga toksina i ćelijski ciljani molekuli pronalasku mogu se sintetizovati na više načina, uključujući npr. postupke koji sadrže: (1) sintetizovanje polipeptida ili polipeptidne komponente ćelijski ciljanog molekula koristeći standardnu metodologiju čvrste ili tečne faze, bilo korak po korak ili po sastavu fragmenta, i izolovanje i pročišćavanje finalnog proizvoda od polipeptidnog jedinjenja; (2) eksprimiranje polinukleotida koji kodira protein ili proteinsku komponentu ćelijski ciljanog molekula pronalasku u ćeliji domaćina i vraćanje proizvoda ekspresije iz ćelije domaćina ili kulture ćelije domaćina; ili (3) in vitro ekspresija polinukleotida koji kodira polipeptid ili polipeptidnu komponentu ćelijski ciljanog molekula pronalasku, i oporavak proizvoda ekspresije; ili bilo kojom kombinacijom postupaka iz (1), (2) ili (3) kako bi se dobili fragmenti proteinske komponente, naknadnim spajanjem (npr. ligaciji) peptida ili polipeptida da bi se dobila polipeptidna komponenta, i oporavkom polipeptidne komponente.
Može biti poželjnije sintetizovati efektorski polipeptid Shiga toksina predmetnog pronalaska, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska, ili proteinsku komponentu ćelijski ciljanog molekula pronalaska pomoću sinteze peptida u čvrstoj fazi ili tečnoj fazi. Polipeptidi i ćelijski ciljani molekuli predmetnog pronalaska mogu se prikladno proizvesti standardnim sintetskim postupcima. Stoga, peptidi se mogu sintetizovati sa, npr. postupcima koji obuhvataju sintetizaciju peptida standardnom metodologijom čvrste faze ili tečne faze, bilo korak po korak ili sastavom fragmenta, i izolovanje i prečišćavanje konačnog peptidnog proizvoda. U tom kontekstu, referenca se može uputiti na WO 1998/011125 ili, inter alia, Fields G et al. Principles and Practice of Solid-Phase Peptide Synthesis (Synthetic Peptides, Grant G, ed, Oxford University Press, U.K., 2nd ed, 2002) i primerima sinteza koji su ovde navedeni.
Efektorski polipeptidi Shiga toksina i ćelijski ciljani molekuli predmetnog pronalaska mogu se pripremiti (proizvesti i prečistiti) korišćenjem rekombinantnih tehnika koje su dobro poznate u tehnici. Uopšteno, postupci za pripremu proteina kultivacijom ćelija domaćina transformisanih ili transficiranih vektorom koji sadrži kodirajući polinukleotid i pročišćavanje ili obnavljanji protein iz ćelijske kulture su opisani u, npr., Sambrook J et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, U.S., 1989); Dieffenbach C et al, PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y, U.S., 1995). Svaka pogodna ćelija domaćina može da se koristi za proizvodnju polipeptida i/ili ćelijski ciljanog proteina pronalaska. Ćelije domaćini mogu biti ćelije stabilno ili prolazno transficirane, transformisane, transducirane ili inficirane jednim ili više ekspresijskih vektora koji pokreću ekspresiju polipeptida pronalaska. Dodatno, efektorski polipeptid Shiga toksina i/ili ćelijski ciljani molekul pronalaska može se proizvesti modifikovanjem polinukleotida koji kodira polipeptid ili ćelijski ciljani protein pronalasku, što rezultira promenom jedne ili više amino kiselina ili brisanjem ili ubacivanjem jedne ili više amino kiselina radi postizanja željenih svojstava, kao što su promenjena citotoksičnost, promenjeni citostatički efekti, i/ili promenjeni poluživot u serumu.
Postoji širok spektar ekspresijskih sistema koji se mogu izabrati za proizvodnju polipeptida ili ćelijski ciljanog proteina pronalaska. Na primer, organizmi domaćina za ekspresiju ćelijski ciljanog proteina predmetnog pronalaska uključuju prokariote, kao što su E. coli i B. subtilis, eukariotske ćelije, kao što su kvasci i filamentozne gljivice (poput S. cerevisiae, P. pastoris, A. awamori, i K. lactis), alga (poput C. reinhardtii), ćelijske linije insekata, ćelije sisara (poput CHO ćelija), biljne ćelijske linije i eukariotski organizmi poput transgenih biljaka (poput A. thaliana i Af. benthamiana).
Prema tome, predmetni pronalazak takođe obezbeđuje postupke za proizvodnju efektorskog polipeptida Shiga toksina i/ili ćelijski ciljanog molekule predmetnog pronalaska, prema gore opisanim postupcima, i korišćenjem polinukleotida koji kodira deo ili ceo polipeptid pronalaska ili proteinske komponente ćelijski ciljanog proteina pronalaska, ekspresijski vektor koji sadrži najmanje jedan polinukleotid pronalaska koji može da kodira deo ili ceo polipeptid ili ćelijski ciljani protein pronalaska kada se unese u ćeliju domaćina i/ili ćeliju domaćinu koji sadrži polinukleotidni ili ekspresijski vektor pronalaska.
Kada se protein eksprimira rekombinantnim tehnikama u ćeliji domaćina ili sistemu bez ćelija, pogodno je odvojiti (ili pročistiti) željeni protein od drugih komponenti, kao što su faktori ćelije domaćina, da bi se dobili preparati visoke čistoće ili su uglavnom homogeni. Prečišćavanje se može izvesti postupcima dobro poznatim u tehnici, kao što su tehnike centrifugiranja, tehnike ekstrakcije, hromatografske i frakcionske tehnike (npr. odvajanje veličine filtracijom gela, razdvajanje naelektrisanjem sa kolonom za razmenu jona, hromatografija hidrofobne interakcije, hromatografija reverzne faze, hromatografija na silika
22
ili katjonske razmene kao što su DEAE i slično, hromatofokusiranje i hromatografija Proteina A Sefaroze za uklanjanje kontaminanata) i tehnike taloženja (npr. taloženje etanolom ili taloženje amonijum sulfata). Bilo koji broj tehnika biohemijskog prečišćavanja može se koristiti za povećanje čistoće polipeptida i/ili ćelijski ciljanog molekula predmetnog pronalaska. U određenim primerima izvođenja, polipeptidi i ćelijski ciljani molekuli pronalaska mogu opcionalno biti prečišćeni u homo-multimernim oblicima (npr. molekularni kompleks koji sadrži dva ili više polipeptida ili ćelijski ciljana molekula pronalaska).
U Primerima koji su navedeni u nastavku su opisi neograničavajućih primera postupaka za proizvodnju primernih, efektorskih polipeptida Shiga toksina i ćelijski ciljanih molekula predmetnog pronalaska, kao i specifični, ali neograničavajući aspekti proizvodnih postupaka.
VII. Farmaceutske i Dijagnostičke Kompozicije koje Sadrže Ćelijski Ciljane Molekule Predmetnog Pronalaska
Predmetni pronalazak obezbeđuje efektorske polipeptide Shiga toksina i ćelijski ciljane molekule za upotrebu, samostalno ili u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih terapeutskih agenasa, u farmaceutskoj kompoziciji, za lečenje ili profilaksu stanja, bolesti, poremećaja ili simptoma koji su detaljnije opisani u nastavku (npr. karcinomi, maligni tumori, nemaligni tumori, abnormalnosti rasta, imuni poremećaji i mikrobne infekcije). Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje sadrže efektorski polipeptid Shiga toksina ili ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so ili solvat, prema pronalasku, zajedno sa najmanje jednim farmaceutski prihvatljivim nosačem, ekscipijentom, ili nosačem. U nekim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija pronalaska može da sadrži homo-multimerne i/ili hetero-multimerne oblike efektorskog polipeptida Shiga toksina ili ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska. Farmaceutske kompozicije pronalaska su korisne u postupcima lečenja, ublažavanja ili sprečavanja bolesti, stanja, poremećaja ili simptoma koji su detaljnije opisani u daljem tekstu. Svaka takva bolest, stanje, poremećaj ili simptom je predviđen kao zasebna realizacija u pogledu upotrebe farmaceutskih kompozicija prema pronalasku. Pronalazak dalje obezbeđuje farmaceutske kompozicije za upotrebu u bar jednom postupku lečenja prema pronalasku, kao što je detaljnije opisano u daljem tekstu.
Kao što je ovde korišćeno, izrazi "pacijent" i "subjekt" upotrebljavaju se naizmenično kako bi se odnosili na bilo koji organizam, obično kičmenjake, kao što su ljudi i životinje, koji predstavlja simptome, znake i/ili indikacije za najmanje jednu bolest, poremećaj ili stanje. Ovi izrazi uključuju sisare, kao što su neograničavajući primeri primata, stočnih životinja (npr. goveda, konji, svinje, ovce, koze, itd.), životinje u pratnji (npr. mačke, psi itd.) i laboratorijskih životinja (npr. miševi, zečevi, pacovi, itd.).
Kao što je korišćeno ovde, "lečiti", "koji se leči" ili "lečenje" i njihove gramatičke varijante odnose se na pristup za dobijanje korisnih ili željenih kliničkih rezultata. Izrazi se mogu odnositi na usporavanje početka ili stope razvoja stanja, poremećaja ili bolesti, smanjenje ili ublažavanje simptoma povezanih sa njim, generisanje potpune ili delimične regresije stanja ili neku kombinaciju bilo čega od gore navedenog. Za svrhe ovog pronalaska, korisni ili željeni klinički rezultati uključuju, ali nisu ograničeni na, smanjenje ili ublažavanje simptoma, smanjenje stepena bolesti, stabilizaciju (npr. ne pogoršanje) stanja bolesti, odlaganje ili usporavanje napredovanja bolesti, ublažavanje ili ublažavanje bolesnog stanja i remisija (bilo delimična ili totalna), bilo da se može otkriti ili neotkriti. "Lečiti", "koji se leči" ili "lečenje" takođe može značiti produženje preživljavanja u odnosu na očekivano vreme preživljavanja ako ne bude primljeno. Subjekt (npr. čovek) kome je potrebno lečenje može biti subjekt koji je već pogođen bolešću ili poremećajem koje se dovodi u pitanje. Izrazi „lečiti“, „koji se leči“ ili „lečenje“ uključuju inhibiciju ili smanjenje povećanja težine patološkog stanja ili simptoma u odnosu na odsustvo lečenja, a ne mora nužno da podrazumeva potpuni prekid relevantne bolesti, poremećaj ili stanje. U pogledu tumora i/ili kancera, lečenje uključuje smanjenje ukupnog opterećenja tumora i/ili pojedinačne veličine tumora.
Kao što je korišćeno ovde, izrazi "sprečavaju", "koji se sprečava", "sprečavanje" i gramatičke njihove varijante odnose se na pristup sprečavanju razvoja ili promene patologije stanja, bolesti ili poremećaja. Prema tome, „prevencija“ se može odnositi na profilaktičke ili preventivne mere. Za svrhe ovog pronalaska, korisni ili željeni klinički rezultati uključuju, ali nisu ograničeni na, sprečavanje ili usporavanje simptoma, napredovanje ili razvoj bolesti, bilo detektibilnu ili neotkrivenu. Subjekt (npr. čovek) kome je potrebna prevencija može, dakle, biti subjekt koji još nije suočen sa određenom bolešću ili poremećajem. Izraz "prevencija" uključuje usporavanje početka bolesti u odnosu na odsustvo lečenja, a ne mora nužno da podrazumeva i trajnu prevenciju relevantne bolesti, poremećaja ili stanja. Prema tome, „koji se sprečava “ ili „sprečavanje“ stanja može se u određenim kontekstima odnositi na smanjenje rizika od razvoja stanja ili sprečavanje ili odlaganje razvoja simptoma povezanih sa stanjem.
Kao što je korišćeno ovde, "efikasna količina" ili "terapeutski efikasna količina" je količina ili doza kompozicije (npr. terapeutska kompozicija, jedinjenje, ili agens) koja proizvodi
22
najmanje jedan željeni terapeutski efekat kod subjekta, kao što je sprečavanje ili lečenje ciljanog stanja ili blagotvorno ublažavanje simptoma povezanih sa stanjem. Najpoželjnija terapeutski efikasna količina je količina koja će proizvesti željenu efikasnost određenog lečenja odabranog od strane stručnjaka za dati subjekt kome je to potrebno. Ova količina će se razlikovati u zavisnosti od različitih faktora koje stručnjak podrazumeva, uključujući, ali ne ograničavajući se na karakteristike terapijske kompozicije (uključujući aktivnost, farmakokinetiku, farmakodinamiku i bioraspoloživost), fiziološka stanja subjekta (uključujući starost, pol, tip bolesti, stadijum bolesti, opšte fizičko stanje, reaktivnost na dato doziranje i vrstu leka), prirodu farmaceutski prihvatljivog nosača ili nosača u formulaciji, i puta primene. Stručnjak u kliničkoj i farmakološkoj nauci moći će da odredi terapeutski efikasnu količinu rutinskim eksperimentisanjem, naime praćenjem reakcije subjekta na primenu kompozicije i prilagođavanje doze u skladu sa tim (videti npr. Remington: The Science and Practice of Pharmacy (Gennaro A, ed. Mack Publishing Co, Easton, PA, U.S., 19th ed, 1995)).
Dijagnostičke kompozicije predmetnog pronalaska sadrže ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalasku i jedan ili više agenasa za promovisanje detekcije. Kada se proizvodi ili proizvodi dijagnostička kompozicija predmetnog pronalaska, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalasku može biti direktno ili indirektno povezan sa jednim ili više agenasa za podsticanje detekcije. Mnogo je standardnih tehnika poznatih stručnjaku za uključivanje, fiksiranje i/ili konjugaciju različitih sredstava za promociju agenasa za detekciju proteina ili proteinskih komponenti molekula, posebno na imunoglobuline i imunoglobulinski izvedene domene.
Postoje brojni agensi za promociju detekcije koji su poznati stručnjacima, kao što su izotopi, boje, kolorimetrijski agensi, agensi za pojačavanje kontrasta, fluorescentni agensi, bioluminescentni agensi, i magnetni agensi, koja se mogu operativno povezati sa polipeptidima ili ćelijski ciljanim molekulima pronalaska za metode prikupljanja informacija, kao što su za dijagnostičku i/ili prognostičku primenu na bolesti, poremećaje, ili stanja organizma (videti npr. Cai W et al, J Nucl Med 48: 304-10 (2007); Nayak T, Brechbiel M, Bioconjug Chem 20: 825-41 (2009); Paudyal P et al, Oncol Rep 22: 115-9 (2009); Qiao J et al, PLoS ONE 6: e18103 (2011); Sano K et al. Breast Cancer Res 14: R61 (2012)). Ovi agensi mogu biti povezana sa, vezani za, i/ili inkorporirana u polipeptida ili ćelijski ciljani molekul pronalaska u bilo kojoj pogodnoj poziciji. Na primer, povezivanje ili uklapanje agensa za promociju detekcije može biti preko amino kiselinskih ostataka molekula predmetnog pronalaska ili preko neke vrste veze poznate u struci, uključujući preko povezivača i/ili helatora. Uključivanje agensa je na taj način da omogući otkrivanje prisustva
22
dijagnostičke kompozicije u skriningu, ispitivanju, dijagnostičkoj proceduri i/ili tehnici snimanja.
Slično tome, postoje brojni pristupi za snimanje slika poznati stručnjacima, kao što su neinvazivne tehnike in vivo snimanja koje se obično koriste u medicinskoj areni, na primer: računarska tomografija (CT skeniranje), optička slika (uključujući direktno, fluorescentno i bioluminescentno snimanje), snimanje magnetnom rezonancom (MRI), pozitronskoemisijska tomografija (PET), jednofotonska emisijska računarska tomografija (SPECT), ultrazvuk i rendgenska računarska tomografija.
VIII. Proizvodnja ili Manufaktura Farmaceutskih i/ili Dijagnostičkih Kompozicija Koje Sadrže Ćelijski Ciljane Molekule Predmetnog Pronalaska
Farmaceutski prihvatljive soli ili solvati bilo kojih efektorskih polipeptida Shiga toksina i ćelijski ciljanih molekula predmetnog pronalaska su u obimu predmetnog pronalaska.
Izraz "solvat" u kontekstu predmetnog pronalaska odnosi se na kompleks definisane stehiometrije formirane između rastvora (in casu, proteinskog jedinjenja ili njegove farmaceutski prihvatljive soli prema pronalasku) i rastvarača. Rastvarač u ovoj vezi može, na primer, biti voda, etanol ili druga farmaceutski prihvatljiva, tipično mala molekulska organska vrsta, kao što je, ali nije ograničena na, sirćetna kiselina ili mlečna kiselina. Kada je rastvarač voda, takav solvat se obično naziva hidrat.
Polipeptidi i proteini predmetnog pronalaska, ili njihove soli, mogu biti formulisani kao farmaceutske kompozicije pripremljene za skladištenje ili primenu, koje obično sadrže terapeutski efikasnu količinu molekula predmetnog pronalaska ili njegove soli, u farmaceutski prihvatljivom nosaču. Izraz "farmaceutski prihvatljiv nosač" uključuje bilo koji od standardnih farmaceutskih nosača. Farmaceutski prihvatljivi nosači za upotrebu terapeutskih molekula su dobro poznati u farmaceutskoj struci, i opisani su, na primer, u Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co. (A. Gennaro, ed, 1985). Kao što je ovde korišćeno, "farmaceutski prihvatljiv nosač" uključuje bilo koji fiziološki prihvatljiv, tj. kompatibilan, rastvarače, disperzione medije, obloge, antimikrobne agense, izotonične, i agense za odlaganje apsorpcije, i slično. Farmaceutski prihvatljivi nosači ili razblaživači uključuju one koji se koriste u formulacijama pogodnim za oralnu, rektalnu, nazalnu ili parenteralnu (uključujući potkožno, intramuskularno, intravenozno, intradermalno i transdermalno) davanje. Primeri farmaceutski prihvatljivih nosača uključuju sterilne vodene
22
rastvore ili disperzije i sterilne praškove za trenutnu pripremu sterilnih injekcionih rastvora ili disperzija. Primeri pogodnih vodenih i nevodenih nosača koji se mogu koristiti u farmaceutskim kompozicijama pronalaska uključuju vodu, etanol, poliole (kao što su glicerol, propilen glikol, polietilen glikol i slično), i njihove odgovarajuće smeše, biljna ulja, kao što su maslinovo ulje i organski estri koji se mogu injektirati, poput etiloletata. Pravilna fluidnost može se održati, na primer, upotrebom materijala za oblaganje, kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzija i upotrebom površinski aktivnih materija. U nekim primerima izvođenja, nosač je pogodan za intravensku, intramuskularnu, potkožnu, parenteralnu, spinalnu ili epidermalnu primenu (npr. ubrizgavanjem ili infuzijom). U zavisnosti od odabranog puta primene, protein ili druga farmaceutska komponenta može biti obložena materijalom namenjenim da zaštiti jedinjenje od dejstva niskog pH i drugih prirodnih inaktiviranih uslova sa kojima se aktivni protein može susresti kada se primeni na pacijenta određenim načinom primene.
Formulacije farmaceutskih kompozicija pronalaska mogu se prikladno predstaviti u obliku jedinične doze i mogu se pripremiti bilo kojim postupkom dobro poznatim u farmaceutskoj struci. U takvom obliku, kompozicija je podeljena u jedinične doze koje sadrže odgovarajuće količine aktivne komponente. Jedinični dozni oblik može biti upakovani preparat, pakovanje koje sadrži diskretne količine preparata, na primer, upakovane tablete, kapsule, i praškovi u bočicama ili ampulama. Jedinični dozni oblik može takođe biti sama kapsula, kašeta ili tableta, ili može biti odgovarajući broj bilo kojeg od ovih pakovanih oblika. Može se dobiti u obliku injekcije u jednoj dozi, na primer u obliku olovke. Kompozicije se mogu formulisati za bilo koji pogodan put i način davanja. Subkutani ili transdermalni načini primene mogu biti naročito pogodni za ovde opisane terapeutske proteine.
Farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska mogu takođe da sadrže pomoćne supstance kao što su konzervansi, sredstva za vlaženje, emulgatori i sredstva za raspršivanje. Sprečavanje prisustva mikroorganizama može se obezbediti i postupcima sterilizacije i uključivanjem različitih antibakterijskih i antifungalnih agenasa, na primer, parabena, hlorobutanola, fenola, sorbinske kiseline i slično. Takođe mogu biti poželjni izotonični agensi, poput šećera, natrijum hlorida i slično u kompozicijama. Pored toga, produžena apsorpcija injekcionog farmaceutskog oblika može se postići uključivanjem agenasa koja odlažu apsorpciju, kao što su aluminijum monostearat i želatin.
Farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska takođe opciono uključuje farmaceutski prihvatljiv antioksidans. Primeri farmaceutski prihvatljivih antioksidanasa su antioksidansi
22
rastvorljivi u vodi kao što su askorbinska kiselina, cistein hidrohlorid, natrijum bisulfat, natrijum metabisulfit, natrijum sulfit i slično; antioksidansi rastvorljivi u ulju, kao što su askorbil palmitat, butilirani hidroksianizol (BHA), butilirani hidroksitoluen (BHT), lecitin, propilgallat, alfa-tokoferol i slično; i metal helatni agensi, kao što su limunska kiselina, etilendiamin tetra sirćetna kiselina (EDTA), sorbitol, vinska kiselina, fosforna kiselina i slično.
U drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje sadrže jedan ili kombinaciju različitih polipeptida i/ili ćelijski ciljanih molekula pronalaska, ili estra, so ili amid bilo kog od prethodnog, i najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv nosač.
Terapeutske kompozicije su obično sterilne i stabilne u uslovima proizvodnje i skladištenja. Kompozicija se može formulisati kao rastvor, mikroemulzija, lipozom, ili druga naručena struktura pogodna visokoj koncentraciji leka. Nosač može biti rastvarač ili disperzijski medijum koji sadrži, na primer, vodu, alkohol kao što je etanol, poliol (npr. glicerol, propilen glikol i tečni polietilen glikol), ili bilo koje pogodne smeše. Odgovarajuća fluidnost može se održati, na primer, upotrebom obloga kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzije i upotrebom površinski aktivnih supstanci prema hemijskoj formulaciji koja je dobro poznata u tehnici. U određenim primerima izvođenja, izotonični agensi, npr. šećeri i polialkoholi kao što su manitol, sorbitol ili natrijum hlorid, mogu biti poželjni u kompoziciji. Produžena apsorpcija kompozicija za injektiranje može se postići uključivanjem u sastav agensa koja odlaže apsorpciju, na primer, monostearatne soli i želatin.
Rastvori ili suspenzije koji se koriste za intradermalnu ili subkutanu primenu obično uključuju jedan ili više: sterilnog razblaživača poput vode za injekcije, fiziološkog rastvora, fiksiranih ulja, polietilen glikola, glicerina, propilen glikola ili drugih sintetskih rastvarača; antibakterijski agensi poput benzil alkohola ili metil parabena; antioksidansi kao što su askorbinska kiselina ili natrijum bisulfit; helatni agensi kao što je etilendiamintetrasirćetna kiselina; puferi poput acetata, citrata ili fosfata; agensi za podešavanje toničnosti, kao što su, npr., natrijum hlorid ili dekstroza. pH se može podesiti sa kiselinama ili bazama, kao što su hlorovodonična kiselina ili natrijum hidroksid, ili puferi sa citratom, fosfatom, acetatom i slično. Takvi preparati se mogu zatvoriti u ampule, špriceve za jednokratnu upotrebu ili bočice sa više doza napravljene od stakla ili plastike.
Sterilni rastvori za ubrizgavanje mogu se pripremiti tako da se u potrebnu količinu ugradi polipeptidni ili ćelijski ciljani molekul u potrebnoj količini u odgovarajućem rastvaraču sa
22
jednim ili kombinacijom gore opisanih sastojaka, a po potrebi, sledi sterilizacijska mikrofiltracija. Disperzije se mogu pripremiti uključivanjem aktivnog jedinjenja u sterilni nosač koji sadrži disperzioni medijum i druge sastojke, poput onih opisanih gore. U slučaju sterilnih prahova za pripremu sterilnih injekcionih rastvora, postupci pripreme su sušenje vakuumom i sušenje smrzavanjem (liofilizacijom) koji daju prašak aktivnog sastojka pored bilo kog dodatnog željenog sastojka iz sterilno filtriranog rastvora.
Kada je konstruisana terapeutski efikasna količina polipeptida i/ili ćelijski ciljanog molekula pronalasku, npr. intravenozno, kožno ili subkutano ubrizgavanje, vezujući agens će biti u obliku parenteralno prihvatljivog vodenog rastvora bez pirogena. Postupci za pripremu parenteralno prihvatljivih proteinskih rastvora, uzimajući u obzir odgovarajući pH, izotoničnost, stabilnost i slično, su uokviru struke. Poželjna farmaceutska kompozicija za intravensku, kožnu ili supkutanu injekciju sadrži, pored vezujućih agenasa, izotonični nosač, kao što su ubrizgavanje natrijum-hlorida, Ringerova injekcija, injekcija dekstroze, injekcija dekstroze i natrijum-hlorida, laktairana Ringerova injekcija ili drugi agens kao poznato u tehnici. Farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska može takođe da sadrži stabilizatore, konzervanse, pufere, antioksidanse ili druge aditive koji su dobro poznati onima koji poznaju ovu oblast.
Kao što je ovde opisano, polipeptid i/ili ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska može se pripremiti sa nosačima koji će zaštititi aktivni terapeutski agens od brzog otpuštanja, kao što je formulacija sa kontrolisanim oslobađanjem, uključujući implantate, transdermalne flastere i mikrokapsuliranu primenu sistema. Biorazgradivi, biokompatibilni polimeri se mogu koristiti, kao što su etilen vinil acetat, polihidridi, poliglikolna kiselina, kolagen, polorthoesteri i pollaktična kiselina. Mnogi postupci za pripremu takvih formulacija su patentirani ili su opšte poznati onima koji poznaju ovo područje (videti npr. Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems (Robinson J, ed. Marcel Dekker, Inc., NY, U.S., 1978)).
U određenim primerima izvođenja, kompozicija predmetnog pronalaska (npr. farmaceutska i/ili dijagnostička kompozicija) može biti formulisana tako da obezbedi željenu distribuciju in vivo ćelijski ciljanog molekula predmetnog pronalaska. Na primer, krvno-moždana barijera isključuje mnoga velika i/ili hidrofilna jedinjenja. Da bi se terapeutski molekul ili kompozicija predmetnog pronalaska usmerila na određeno mesto in vivo, oni mogu da se formulišu, na primer, u lipozome koji mogu da sadrže jednu ili više grupa koje se selektivno transportuju u određene ćelije ili organe, poboljšavajući na taj način ciljanu isporuku leka. Primeri ciljanih
2
grupa uključuju folat ili biotin; manosidi; antitela; surfaktantski receptor proteina A; pl20 katenin i slično.
Farmaceutske kompozicije uključuju parenteralne formulacije dizajnirane da se koriste kao implantati ili čestični sistemi. Primeri implantata su depo formulacije sastavljene od polimernih ili hidrofobnih komponenti poput emulzija, jonoizmenljivih smola i rastvorljivih rastvora soli. Primeri sistema čestica su mikrosfere, mikročestice, nanokapsule, nanosfere i nanočestice (videti npr. Honda M et al, Int J Nanomedicine 8: 495503 (2013); Sharma A et al, Biomed Res Int 2013: 960821 (2013); Ramishetti S, Huang L, Ther Deliv 3: 1429-45 (2012)). Formulacije sa kontrolisanim oslobađanjem mogu se pripremiti korišćenjem polimera osetljivih na jone, kao što su, npr. lipozomi, polaksamer 407 i hidroksiapatit.
IX. Polinukleotidi, Ekspresijski Vektori, i Ćelije Domaćina Predmetnog Pronalaska
Pored polipeptida i ćelijski ciljanih molekula predmetnog pronalaska, polinukleotidi koji kodiraju polipeptide i ćelijski ciljane molekule pronalaska, ili njihovi funkcionalni delovi, takođe su obuhvaćeni obimom predmetnog pronalaska. Izraz "polinukleotid" ekvivalentan je izrazu "nukleinska kiselina", od kojih svaki uključuje jedan ili više od: polimera deoksiribonukleinske kiseline (DNK), polimera ribonukleinske kiseline (RNA), analoga ovih DNK ili RNK generisanih pomoću nukleotidnih analoga i njihovi derivati, fragmenti i homolozi. Polinukleotid predmetnog pronalaska može biti jedno-, dvo- ili trolančani. Takvi polinukleotidi su posebno otkriveni da uključuju sve polinukleotide koji mogu da kodiraju primeran protein, na primer, uzimajući u obzir kolebanje za koje se zna da se toleriše u trećem položaju RNK kodona, a istovremeno kodira za istu amino kiselinu kao i različiti RNK kodon (videti Stothard P, Biotechniques 28: 1102-4 (2000)).
U jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje polinukleotide koji kodiraju efektorski polipeptid Shiga toksina i/ili ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska, ili njegov fragment ili derivat. Polinukleotidi mogu da uključuju, na primer, sekvencu nukleinskih kiselina koja kodira polipeptid najmanje 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ili više, identičan je polipeptidu koji sadrži jednu od amino kiselinskih sekvenci polipeptida ili ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska. Pronalazak takođe uključuje polinukleotide koji sadrže nukleotidne sekvence koje se hibridizuju pod strogim uslovima do polinukleotida koji kodira efektorski polipeptid Shiga toksina i/ili ćelijki ciljani molekul pronalaska, ili njegov fragment ili derivat, ili antisens ili komplement bilo koje takve sekvence.
2 1
Derivati ili analozi molekula predmetnog pronalaska (npr. efektorski polipeptidi Shiga toksina predmetnog pronalaska i ćelijski ciljani molekuli koji sadrže isti) uključuju, između ostalog, polinukleotidne (ili polipeptidne) molekule koji imaju regione koji su uglavnom homolozi za polinukleotide (ili efektorski polipeptid Shiga toksina i ćelijski ciljani molekuli predmetnog pronalaska), npr. barem oko 45%, 50%, 70%, 80%, 95%, 98% ili čak 99% identiteta (sa preferiranim identitetom od 80-99%) preko polinukleotidne (ili polipeptidne) sekvence iste veličine ili u poređenju sa poravnatim redosledom u kome se poravnanje vrši računarskim programom homologije poznatim u stanju tehnike. Primer programa je GAP program (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for UNIX, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison, WI, U.S.) koristeći početna podešavanja, koja koriste algoritam Smith T, Waterman M, Adv Appl Math 2: 482-9 (1981). Takođe su obuhvaćeni polinukleotidi sposobni hibridizirati se na komplement sekvence koja kodira ciljane proteine pronalaska pod strogim uslovima (videti npr. Ausubel F et al. Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, New York, NY, U.S., 1993)), i spod. Stručnjacima su poznati strogi uslovi i mogu se naći, npr., u Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, NY, U.S., Ch. Sec.6.3.16.3.6 (1989)).
Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje ekspresione vektore koji sadrže polinukleotide unutar obima predmetnog pronalaska. Polinukleotidi koji mogu da kodiraju efektorske polipeptide Shiga toksina i/ili ćelijski ciljane molekule pronalaska mogu biti ubačeni u poznate vektore, uključujući bakterijske plazmide, virusne vektore i vektore faga, koristeći materijal i postupke dobro poznate u struci za proizvodnju ekspresionih vektora. Takvi ekspresioni vektori će uključivati polinukleotide potrebne za podršku stvaranju razmatranih efektorskih polipeptida Shiga toksina i/ili ćelijski ciljanih molekula pronalaska u bilo kojoj ćeliji domaćina po izboru ili ekspresionim sistemima bez ćelija (npr. PTxbl i pIVEX2.3). Specifični polinukleotidi koji sadrže ekspresione vektore za upotrebu sa specifičnim tipovima ćelija domaćina ili sistemima za ekspresiju bez ćelija poznati su stručnjacima uobičajene struke, mogu se odrediti rutinskim eksperimentisanjem i/ili se mogu kupiti.
Izraz "ekspresioni vektor ", kako se ovde koristi, odnosi se na polinukleotid, linearni ili kružni oblik, koji sadrži jednu ili više ekspresionih jedinica. Izraz "ekspresiona jedinica" označava polinukleotidni segment koji kodira polipeptid od interesa i sposoban je da obezbedi ekspresiju segmenta nukleinske kiseline u ćeliji domaćina. Ekspresiona jedinica obično sadrži promoter transkripcije, otvoreni okvir za čitanje koji kodira interesantni polipeptid i terminator transkripcije, sve u operativnoj konfiguraciji. Ekspresioni vektor sadrži jednu ili
2 2
više ekspresionih jedinica. Prema tome, u kontekstu predmetnog pronalaska, ekspresioni vektor koji kodira efektorski polipeptid Shiga toksina i/ili ćelijski ciljani molekul pronalaska koji sadrži jedan polipeptidni lanac koji uključuje najmanje ekspresionu jedinicu za jedan polipeptidni lanac, dok protein sadrži, npr. dva ili više lanaca polipeptida (npr. jedan lanac koji sadrži VLdomen i drugi lanac koji sadrži VHdomen vezan za efektorski polipeptid toksina) uključuje najmanje dve ekspresione jedinice, po jednu za svaki od dva polipeptidna lanca proteina. Za ekspresiju višestrukog lanca ćelijski ciljanih proteina pronalaska, ekspresiona jedinica za svaki polipeptidni lanac može takođe zasebno da bude sadržana na različitim ekspresionim vektorima (npr. ekspresija se može postići sa jednom ćelijom domaćina u koju ekspresijski vektori za svaki polipeptidni lanac imaju predstavljen).
Ekspresioni vektori koji su sposobni da usmeravaju prolaznu ili stabilnu ekspresiju polipeptida i proteina dobro su poznati u stanju tehnike. Ekspresioni vektori obično uključuju, ali nisu ograničeni na, jedno ili više sledećeg: heterologni signalni niz ili peptid, poreklo replikacije, jedan ili više marker gena, pojačivač, promoter, i sekvencu prekida transkripcije, od kojih je svaki dobro poznat u tehnici. Opcione regulatorne kontrolne sekvence, integracione sekvence i korisni markeri koji se mogu koristiti su poznati u stanju tehnike.
Izraz "ćelija domaćina" odnosi se na ćeliju koja može podržati replikaciju ili ekspresiju ekspresionog vektora. Ćelije domaćina mogu biti prokariotske ćelije, poput E. coli ili eukariotske ćelije (npr. ćelije kvasca, insekata, vodozemaca, ptica ili sisara). Stvaranje i izolacija ćelijskih linija domaćina koje sadrže polinukleotid pronalaska ili sposobne da proizvode polipeptid i/ili ćelijski ciljani molekul pronalaska mogu se izvršiti korišćenjem standardnih tehnika poznatih u tehnici.
Efektorski polipeptidi Shiga toksina i/ili proteini unutar obima predmetnog pronalaska mogu biti varijante ili derivati polipeptida i molekula koji su ovde opisani koji su proizvedeni modifikacijom polinukleotida koji kodira polipeptid i/ili proteinsku komponentu ćelijski ciljanog molekula promenom jedne ili više amino kiselina ili brisanjem ili ubacivanjem jedne ili više amino kiselina koje mogu učiniti pogodnijim za postizanje željenih svojstava, kao što je optimalnija ekspresija od strane ćelije domaćina.
X. Molekuli Predmetnog Pronalaska Imobilisani na ývrstim Supstratima
Određeni primeri izvođenja predmetnog pronalaska uključuju molekule predmetnog pronalaska npr. efektorski polipeptid Shiga toksina, ćelijski ciljani molekul, spojeni protein, ili
2
polinukleotid predmetnog pronalaska), ili bilo koji njihov efektorski fragment, imobilisan na čvrstom supstratu. Ovde razmatrani čvrsti supstrati uključuju, ali nisu ograničeni na, mikrokuglice, nanočestice, polimere, matrične materijale, mikropodručja, mikrotitarske ploče, ili bilo koja čvrsta površina poznatu u tehnici (videti npr. US 7,771,955). U skladu sa ovim aspektima, molekul predmetnog pronalaska može biti kovalentno ili nekovalentno povezan sa čvrstim supstratom, kao što je, npr., kuglica, čestica ili ploča, koristeći tehnike poznate stručnjacima (videti npr. Jung Y et al. Analyst 133: 697-701 (2008)). Imobilisani molekuli pronalaska mogu se koristiti za skrining apliukacije koje se koriste u tehnikama poznatim u struci (videti npr. Bradbury A et al, Nat Biotechnol 29: 245-54 (2011); Sutton C, Br J Pharmacol 166: 457-75 (2012); Diamante L et al. Protein Eng Des Sel 26: 713-24 (2013); Houlihan G et al., J Immunol Methods 405: 47-56 (2014)).
Neograničavajući primeri čvrstih supstrata na kojima se molekul pronalaska može imobilisati uključuju: mikro-kuglice, nanočestice, polimere, nanopolimere, nanocevčice, magnetne kuglice, paramagnetne kuglice, superparamagnetne kuglice, kuglice obložene streptavidinom, magnetne kuglice obrnute faze, karboksi kuglice sa završenom hidrazinom, silika (natrijum-silicijem) kuglice i kuglice modifikovane sa iminodisirćetnom kiselinom (IDA), kuglice modifikovane aldehidom, kuglice koje se aktiviraju epoksidom, diaminodipropilamin (DADPA) kuglice modifikovane (kuglice sa primarnom površinskom grupom amina), biorazgradiva polimerne kuglice, polistirenske supstrate, čestice amino-polistirena, čestice karboksil-polistirena, čestice epoksi-polistirena, čestice dimetilamino-polistirena, čestice hidroksi-polistirena, obojene čestice, čestice protočne citometrije, čestice sulfonatpolistirena, nitrocelulozne površine, ojačane membrane nitroceluloze, najlonske membrane, staklene površine, aktivirane staklene površine, aktivirane kvarcne površine, polivinilidendifluorid (PVDF) membrane, supstrati na bazi poliakrilamida, supstrati poli-vinil hlorida, supstrati polimetil-metakrilata, poli (dimetil-siloksan) supstrati i fotopolimeri koji sadrže fotoreaktivne vrste (poput nitrena, karbena i ketil radikala) sposobni da formiraju kovalentne veza. Ostali primeri čvrstih supstrata na kojima se molekul pronalaska može imobilisati se obično koriste u sistemima molekularnog prikazivanja, kao što su, npr., ćelijske površine, fage, i virusne čestice.
XI. Uređaji Dostave i Kitovi
U određenim primerima pronalaska, pronalazak se odnosi na uređaj koji sadrži jednu ili više kompozicija materije predmetnog pronalaska, kao što su farmaceutska kompozicija ili dijagnostička kompozicija, za isporuku subjektu kome je potreban. Prema tome, uređaj za
2 4
isporuku koji sadrži jednu ili više kompozicija predmetnog pronalaska može se koristiti za davanje pacijentu kompozicije od značaja predmetnog pronalaska različitim postupcima davanja, uključujući: intravensku, potkožnu, intramuskularnu ili intraperitonealnu injekciju; oralna primene; transdermalna primena; plućna ili transmukozna primena; davanje implantatom, osmotskom pumpom, kertridžom ili mikro pumpom; ili na drugi način prepoznat od strane stručnjaka u datoj oblasti.
Takođe su u obimu predmetnog pronalaska kitovi koji sadrže najmanje jednu kompoziciju od značaja pronalaska, i opciono, pakovanje i uputstva za upotrebu. Kitovi mogu biti korisni za davanje lekova i/ili prikupljanje dijagnostičkih informacija. Kit pronalaska može opciono da sadrži najmanje jedan dodatni reagens (npr. standarde, markere i slično). Kitovi obično sadrže nalepnicu koja označava namensku upotrebu sadržaja kita. Kit može dalje da sadrži reagense i druge alate za otkrivanje ćelijskog tipa (npr. tumorske ćelije) u uzorku ili subjektu, ili za dijagnostikovanje da li pacijent pripada grupi koja reaguje na terapijsku strategiju koja koristi jedinjenje, kompoziciju, ili srodni postupak predmetnog pronalaska, npr., kao što je postupak koji je ovde opisan.
XII. Postupci za Korišćenje Ćelijski Ciljanih Molekula Predmetnog Pronalaska i/ili Njihovih Farmaceutskih i/ili Dijagnostičkih Kompozicija
Uopšteno, cilj predmetnog pronalaska je da obezbedi farmakološki aktivne agense, kao i kompozicije koje sadrže iste, koje se mogu koristiti u prevenciji i/ili lečenju bolesti, poremećaja i stanja, poput određenih karcinoma, tumora, abnormalnosti rasta, imunih poremećaja ili drugih patoloških stanja koja su ovde navedena. Shodno tome, predmetni pronalazak pruža postupke korišćenja polipeptida, ćelijski ciljanih molekula i farmaceutskih kompozicija pronalaska za ciljano ubijanje ćelija, za isporuku dodatnih egzogenih materija u ciljane ćelije, za obeležavanje unutrašnjosti ciljanih ćelija, za prikupljanje dijagnostičke informacije za isporuku T-ćelijskih epitopa na put prezentacije MHC klase I ciljanih ćelija i za lečenje bolesti, poremećaja i stanja kao što je ovde opisano. Na primer, postupci ovog pronalaska mogu se koristiti za sprečavanje ili lečenje kancera, iniciranja kancera, iniciranje tumora, metastaza i/ili ponovnog pojavljivanja bolesti.
Posebno, cilj pronalaska je da se obezbede takvi farmakološki aktivni agensi, kompozicije i/ili postupci koji imaju određene prednosti u poređenju sa agensima, kompozicijama i/ili postupcima koji su trenutno poznati u stanju tehnike. Shodno tome, predmetni pronalazak pruža postupke upotrebe efektorskih polipeptida Shiga toksina i ćelijksi ciljanih molekula sa
2
određenim proteinskim sekvencama i njihovim farmaceutskim kompozicijama. Na primer, bilo koja od amino kiselinskih sekvenci u SEQ ID NO: 6-354 i 370-513 može se posebno koristiti kao komponenta ćelijski ciljanog molekula koji se koristi u sledećim postupcima ili bilo kom postupku za upotrebu ćelijski ciljanog molekula koji je poznat stručnjaku, kao što su, npr., razni postupci opisani u WO 2014/164680, WO 2014/164693, WO 2015/138435, WO 2015/138452, WO 2015/113005, WO 2015/113007, WO 2015/191764, US 20150259428, 62/168,758, 62/168,759, 62/168,760, 62/168,761, 62/168,762, 62/168,763, i PCT/US2016/016580.
Predmetni pronalazak obezbeđuje postupke ubijanja ćelije koji sadrže korak kontakta sa ćelijom, in vitro ili in vivo, sa efektorskim polipeptidom Shiga toksina, ćelijski ciljanim molekulom ili farmaceutskom kompozicijom predmetnog pronalaska. Efektorski polipeptidi Shiga toksina, ćelijski ciljani molekuli i farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska mogu se koristiti za ubijanje određenog tipa ćelije nakon kontakta sa ćelijom ili ćelijama sa jednom od zahtevanih kompozicija od značaja. U određenim primerima izvođenja, ćelijski ciljani molekul ili farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska mogu se koristiti za ubijanje specifičnih tipova ćelija u smeši različitih tipova ćelija, kao što su smeše koje sadrže ćelije kancera, inficirane ćelije i/ili hematološke ćelije. U određenim primerima izvođenja, ćelijski ciljani molekul ili farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska može se koristiti za ubijanje ćelija kancera u smeši različitih tipova ćelija. U određenim primerima izvođenja, citotoksični Shiga ćelijski ciljani molekul ili farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska mogu se koristiti za ubijanje specifičnih tipova ćelija u smeši različitih tipova ćelija, kao što su tkiva pre transplantacije. U određenim primerima izvođenja, efektorski polipeptid Shiga toksina, ćelijski ciljani molekul ili farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska mogu se koristiti za ubijanje specifičnih tipova ćelija u smeši ćelijskih tipova, kao što je tkivni materijal pre primene u terapeutske svrhe. U određenim priomerima izvođenja, ćelijski ciljani molekul ili farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska može se koristiti za selektivno ubijanje ćelija zaraženih virusima ili mikroorganizmima, ili na drugi način selektivno ubijanje ćelija koje eksprimiraju određeni ekstraćelijski ciljani biomolekul, kao što je biomolekul površinske ćelije. Efektorski polipeptidi Shiga toksina, ćelijski ciljani molekuli i farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska imaju različite primene, uključujući, npr., primenu u iscrpljivanju neželjenih ćelijskih tipova iz tkiva bilo in vitro ili in vivo, koristi u modulaciji imunih odgovora za lečenje graft-versus-domaćin, koristi se kao antivirusni agensi, koristi se kao antiparazitski agensi, i koristi se u pročišćavanju transplantacijskih tkiva neželjenih tipova ćelija.
2
U određenim primerima izvođenja, određeni efektorski polipeptidi Shiga toksina, ćelijski ciljani molekuli i farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska, sami ili u kombinaciji sa drugim jedinjenjima ili farmaceutskim kompozicijama, mogu pokazati moćnu aktivnost ubijanja ćelija kada se daju populaciji ćelija, in vitro ili in vivo kod subjekta kao što je pacijent kome je potrebno lečenje. Ciljanjem isporuke enzimski aktivnih efektorskih polipeptida Shiga toksin A Podjedinice i/ili T-ćelijskih epitopa koristeći vezujuće regione sa visokim afinitetom za specifične ćelijske tipove, aktivnosti ubijanja ćelija mogu biti ograničene na specifično i selektivno ubijanje određenih tipova ćelija u organizmu, kao što su određene ćelije kancera, neoplastične ćelije, maligne ćelije, nemaligne ćelije tumora i/ili inficirane ćelije.
Predmetni pronalazak obezbeđuje postupak ubijanja ćelije kod pacijenta kome je potreban, pri čemu postupak obuhvata korak davanja pacijentu najmanje jednog ćelijski ciljanog molekula predmetnog pronalaska ili njegove farmaceutske kompozicije.
U određenim primerima izvođenja, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska ili njegove farmaceutske kompozicije može se koristiti za ubijanje ćelije kancera kod pacijenta ciljajući ekstraćelijski biomolekul koji je fizički povezan sa karcinomom ili ćelijom tumora. Izrazi "ćelija kancera" ili "kancerska ćelija" odnose se na različite neoplastične ćelije koje rastu i dele se na nenormalno ubrzan i/ili neregulisan način i biće jasne stručnoj osobi. Izraz "tumorska ćelija" obuhvata i maligne i nemaligne ćelije. Uopšteno, karcinom i/ili tumori mogu se definisati kao bolesti, poremećaji ili stanja koja podležu lečenju i/ili prevenciji. Kanceri i tumori (maligni ili nemaligni) koji se sastoje od ćelija kancera i/ili ćelija tumora koji mogu imati koristi od postupaka i kompozicija pronalaska biće jasni stručnjaku. Neoplastične ćelije su često povezane sa jednim ili više sledećeg: neregulisan rast, nedostatak diferencijacije, lokalna invazija tkiva, angiogeneza i metastaza. Bolesti, poremećaji i stanja koji proizilaze iz kancera i/ili tumora (malignih ili nemalignih) koji mogu imati koristi od postupaka i kompozicija pronalaska koji ciljaju određene ćelije kancera i/ili ćelije tumora biće jasne stručnjaku.
Određeni primeri izvođenja ćelijski ciljanih molekula i kompozicija predmetnog pronalaska mogu se koristiti za ubijanje matičnih ćelija kancera, matičnih ćelija tumora, pre-malignih ćelija koje iniciraju kancer i ćelije koje iniciraju tumor, koje se obično sporo dele i otporne na kancer terapije poput hemoterapije i zračenja. Na primer, akutna mijeloidna leukemija (AML) može da se leči ovim pronalaskom ubijanjem matičnih ćelija AML i/ili uspavanih AML progenitornih ćelija (videti npr. Shlush L et al. Blood 120: 603-12 (2012)). Matične ćelije kancera često prekomerno izražavaju ciljane ćelijske površine, kao što su, npr., CD44,
2
CD200, i drugi koji su ovde navedeni, koji mogu biti meta određenih vezujućih regiona određenih primera izvođenja ćelijski ciljanih molekula predmetnog pronalaska (videti npr. Kawasaki B et al, Biochem Biophys Res Commun 364:778-82 (2007); Reim F et al, CancerRes 69: 8058-66 (2009)).
Zbog mehanizma delovanja zasnovanog na Shiga toksin A Podjedinici, kompozicije od značaja predmetnog pronalaska mogu se efikasnije koristiti u postupcima koje uključuju njihovu kombinaciju sa ili na komplementaran način sa drugim terapijama, kao što su, npr., hemoterapije, imunoterapije, zračenje, transplantacija matičnih ćelija i inhibitori imunoloških kontrolnih tačaka, i/ili efikasni protiv hemorezistentnih/otpornih na zračenje, i/ili odmornih tumorskih ćelija/ćelija koje iniciraju tumor/matičnih ćelija. Slično tome, kompozicije od značaja predmetnog pronalaska mogu se efikasnije koristiti u postupcima koji uključuju kombinaciju sa drugim ćelijski ciljanim terapijama koje ciljaju drugačije nego isti epitop na, ne preklapajuće se, ili različite ciljeve za isti poremećaj ili stanje bolesti.
Određeni primeri izvođenja ćelijski ciljanih molekula predmetnog pronalaska, ili njihove farmaceutske kompozicije, mogu se koristiti za ubijanje imunoloških ćelija (bilo da su zdrave ili maligne) kod pacijenta ciljajući ekstraćelijski biomolekul koji je fizički povezana sa imunološkom ćelijom.
U obimu predmetnog pronalaska je da se koristi ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska, ili njegova farmaceutska kompozicija, za prečišćavanje populacija ćelija pacijenata (npr. koštane srži) od malignih, neoplastičnih ili na drugi način neželjenih T-ćelija i/ili B-ćelije, a zatim ponovno infuziranje T-ćelijskog i/ili B-ćelijskog osiromašenog materijala kod pacijenta (videti npr. van Heeckeren W et al, Br J Haematol 132: 42-55 (2006); (videti npr. Alpdogan O, van den Brink M, Semin Oncol 39: 629-42 (2012)).
U opsegu predmetnog pronalaska je da se koristi ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska ili njegova farmaceutska kompozicija, za potrebe ex vivo iscrpljivanja T-ćelija i/ili B-ćelija iz izolovane ćelijske populacije uklonjene iz pacijenta. U jednom neograničavajućem primeru, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska može se koristiti u postupku za profilaksu odbacivanja transplantacije organa i/ili tkiva gde je donorski organ ili tkivo perfuzija pre transplantacije citotoksičnim ćelijskim ciljanim molekulom predmetnog pronalaska ili njegove farmaceutske kompozicije u cilju pročišćavanja organa donora T-ćelija i/ili B-ćelija (videti npr. Alpdogan O, van den Brink M, Semin Oncol 39: 629-42 (2012)).
2
Takođe je u obimu predmetnog pronalaska da se koristi ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska, ili njegova farmaceutska kompozicija, u svrhu iscrpljivanja T-ćelija i/ili B-ćelija iz populacije ćelija donora kao profilaksa protiv bolesti graft-versus-domaćin i indukcija tolerancije, kod pacijenta koji će biti podvrgnut transplantaciji koštane srži i/ili matičnih ćelija (videti npr. van Heeckeren W et al, Br J Haematol 132: 42-55 (2006); (videti npr. Alpdogan O, van den Brink M, Semin Oncol 39: 629-42 (2012)).
U određenim primerima izvođenja efektorski polipeptidi Shiga toksina ili ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska, ili njegova farmaceutska kompozicija, može se koristiti za ubijanje zaražene ćelije kod pacijenta ciljajući ekstaćelijski biomolekul koji je fizički povezana sa zaraženom ćelijom.
U određenim primerima izvođenja ćelijski ciljani molekuli predmetnog pronalaska, ili njihove farmaceutske kompozicije, se mogu koristiti za "zasejavanje" lokusa unutar hordata sa nesopstveni, T-ćelijskim epitop-peptidom koji predstavlja ćelije kako bi se aktivirao imuni sistem da bi se poboljšala čistoća lokusa. U nekim drugim primerima izvođenja ovog postupka "zasejavanja" predmetnog pronalaska, lokus je tumorska masa ili inficirano mesto tkiva. U poželjnim primerima izvođenja ovog postupka „zasejavanja“ predmetnog pronalaska, nesopstveni T-ćelijski epitop-peptid je izabran iz grupe koja se sastoji od: peptida koji još nisu predstavljeni ciljanim ćelijama ćelijskog ciljanog molekula, peptida koji nisu prisutni unutar bilo kog proteina eksprimiranog od ciljane ćelije, peptida koji nisu prisutni u proteomu ili transkriptom ciljane ćelije, peptida koji nisu prisutni u ekstraćelijskom mikro okruženju mesta na kojem se zasejava, i peptida koji nisu prisutni u masi tumora ili inficiraju na mestu tkiva koje se cilja.
Ovaj postupak "zasejavanja" funkcioniše kako bi obeležio jednu ili više ciljanih ćelija unutar hordata sa jednim ili više MHC klase I prezentovanog T-ćelijskog epitope radi prepoznavanja pomoću efektorskih T-ćelija i aktiviranja imunih odgovora nizvodno. Iskorištavanjem internalizacije ćelija, intracelularnog usmeravanja i T-ćelijskog epitopa koji isporučuje funkcije ćelijski ciljanog molekula predmetnog pronalaska, ciljane ćelije koje prikazuju isporučeni T-ćelijski epitop su iskorišćene da bi inducirale prepoznavanje prisutne ciljane ćelije od strane domaćina T-ćelije i indukcija daljih imunoloških odgovora, uključujući ubijanje ciljanih ćelija pomoću CTLs. Ovaj postupak "zasejavanja" koristeći ćelijski ciljanog molekula predmetnog pronalaska može da obezbedi privremeni efekat vakcinacije indukujući adaptivne imune odgovore da napadnu ćelije unutar zasijanog mikro okruženja, kao što je, npr. masa tumora ili inficirano mesto tkiva, bilo da predstavlja T-ćelijski(e) epitop(e) koji je
2
ciljan na ćeliju, ili ne. Ovaj postupak "zasejavanja" može takođe da indukuje probijanje imuno-tolerancije na populaciju ciljanih ćelija, tumorsku masu i/ili mesto inficiranog tkiva unutar hordata.
Neki postupci predmetnog pronalaska koji uključuju zasejavanje lokusa unutar hordate sa jednim ili više antigenskih i/ili imunogenskih epitopa mogu se kombinovati sa davanjem imunoloških adjuvansa, bilo da se daju lokalno ili sistemski, da bi se stimulisao imuni odgovor na određene antigene, kao što je, npr, istovremena primena kompozicije predmetnog pronalaska sa jednim ili više imunoloških adjuvanasa kao što su citokin, bakterijski proizvod ili biljni saponin. Ostali primeri imunoloških adjuvanasa koji mogu biti pogodni za upotrebu u postupcima predmetnog pronalaska uključuju aluminijumske soli i ulja, kao što su, npr, alumi, aluminijum hidroksid, mineralna ulja, skvalen, parafinska ulja, ulja kikirikija i timrosal.
Pored toga, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak lečenja bolesti, poremećaja ili stanja kod pacijenta koji sadrži korak primene pacijentu kome je potrebna terapeutski efikasna količina najmanje jednog od ćelijski ciljanih molekula predmetnog pronalaska, ili njegove farmaceutske kompozicije. Posmatrane bolesti, poremećaji i stanja koja se mogu lečiti ovim postupkom uključuju kancere, maligne tumore, nemaligne tumore, abnormalnosti rasta, imuni poremećaji i mikrobne infekcije. Davanje "terapeutski efikasne doze" smeša predmetnog pronalaska može rezultirati smanjenjem težine simptoma bolesti, povećanjem Xčestalosti i trajanja perioda bez simptoma bolesti ili prevencijom oštećenja ili invaliditeta zbog patnje tokom bolesti.
Terapeutski efikasna količina kompozicije predmetnog pronalaska će zavisiti od načina primene, vrste organizma koji se leči i fizičkih karakteristika konkretnog pacijenta koji se razmatra. Ovi faktori i njihov odnos prema određivanju ovog iznosa dobro su poznati iskusnim stručnjacima iz medicinske oblasti. Ova količina i način davanja mogu se prilagoditi tako da postignu optimalnu efikasnost, a mogu zavisiti od faktora kao što su težina, ishrana, istovremeni lekovi i drugi faktori, dobro poznati stručnjacima u medicini. Veličine doze i režim doziranja koji su najprikladniji za ljudsku upotrebu mogu se voditi rezultatima dobijenim predmetnim pronalaskom i mogu biti potvrđeni u pravilno konstruisanim kliničkim ispitivanjima. Efikasan protokol doziranja i lečenja može se odrediti uobičajenim načinom, počevši od male doze kod laboratorijskih životinja, a zatim povećavajući dozu tokom praćenja dejstva, a takođe i sistematski menjati režim doziranja. Brojni faktori mogu se uzeti
24
u obzir od strane lekara prilikom određivanja optimalne doze za određeni subjekt. Takva razmišljanja su poznata stručnjaku.
Prihvatljiv način davanja može se odnositi na bilo koji način davanja koji je poznat u stanju tehnike, uključujući, ali ne ograničavajući se na aerosol, enteral, nazalni, oftalmološki, oralni, parenteralni, rektalni, vaginalni ili transdermalni (npr. lokalno davanje kreme, gela ili masti ili preko transdermalnog flastera). "Parenteralna primena" je obično povezana sa injekcijom na ili u komunikaciji sa predviđenim mestom dejstva, uključujući infraorbitalnu, infuziju, intraarterijsku, intrakapsularnu, intrakardijalnu, intradermalnu, intramuskularnu, intraperitonealnu, intrapulmonarnu, intraspinalnu, intrasternalnu, intratekalnu, intrauterinu, intravensku, subarahnoidnu subkapsularnu, subkutanu, transmukoznu ili transtrahealnu primenu.
Za primenu farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska opseg doziranja će uglavnom biti od oko 0.001 do 10 miligrama po kilogramu (mg/kg) i više, obično 0.001 do 0.5 mg/kg telesne težine subjekta. Primeri doziranja mogu biti 0.01 mg/kg telesne težine, 0.03 mg/kg telesne težine, 0.07 mg/kg telesne težine, 0.9 mg/kg telesne težine ili 0.1 mg/kg telesne težine ili u rasponu od 0.01 do 0.1 mg/kg. Primer režima lečenja je davanje jednom ili dva puta dnevno, ili jednom ili dva puta nedeljno, jednom u dve nedelje, jednom u tri nedelje, jednom u četiri nedelje, jednom mesečno, jednom u dva ili tri meseca ili jednom u tri do 6 meseci. Doziranje može da odabere i prilagodi stručnjak po potrebi kako bi se maksimizirala terapijska korist za određenog pacijenta.
Farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska će se tipično davati istom pacijentu u više navrata. Intervali između pojedinih doza mogu biti, na primer, dva do pet dana, nedeljno, mesečno, svaka dva ili tri meseca, svakih šest meseci ili godišnje. Intervali između davanja takođe mogu biti neredovni, zasnovani na regulisanju nivoa u krvi ili drugim markerima kod subjekta ili pacijenta. Režimi doziranja za kompoziciju predmetnog pronalaska uključuju intravensku primenu 1 mg/kg telesne težine ili 3 mg/kg telesne težine sa kompozicijom koja se primenjuje svake dve do četiri nedelje tokom šest doza, a zatim svaka tri meseca u telesnoj težini od 3 mg/kg ili 1 mg/kg telesne težine.
Farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska može se primeniti preko jednog ili više načina primene, koristeći jedan ili više različitih postupaka poznatih u stanju tehnike. Kao što će znati stručnjak, put i/ili način davanja će se razlikovati u zavisnosti od željenih rezultata. Načini davanja ćelijski ciljanih molekula i farmaceutskih kompozicija predmetnog pronalaska uključuju, npr. intravenski, intramuskularni, intradermalni, intraperitonealni, potkožni, spinalni ili drugi parenteralni putevi primene, na primer injekcijom ili infuzijom. Za druge primere izvođenja, ćelijski ciljani molekul ili farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska može se primeniti ne-parenteralnim putem, kao što su topikalni, epidermalni ili mukozni način primene, na primer, intranazalno, oralno, vaginalno, rektalno, sublingvalno, ili topikalno.
Terapeutski ćelijski ciljani molekuli ili farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska mogu se primeniti sa jednim ili više različitih medicinskih uređaja poznatih u stanju tehnike. Na primer, u jednom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija pronalaska može se primeniti sa injekcijskim uređajem za injekcije bez igla. Primeri dobro poznatih implantata i modula korisnih u ovom pronalasku su u oblasti tehnike, uključujući npr. implantabilne mikroinfuzione pumpe za isporuku sa kontrolisanom brzinom; uređaji za ordiniranje kroz kožu; infuzione pumpe za isporuku sa preciznom brzinom infuzije; uređaji za infuziju sa varijabilnim protokom za kontinuirano davanje lekova; i osmotski sistemi za isporuku lekova. Ovi i drugi takvi implantati, sistemi za isporuku i moduli poznati su stručnjacima.
Ćelijski ciljani molekuli ili farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska mogu se davati sami ili u kombinaciji sa jednim ili više drugih terapijskih ili dijagnostičkih agenasa.
Kombinovana terapija može da sadrži ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska ili njegovu farmaceutsku kompoziciju, kombinovan sa najmanje jednim drugim terapeutskim agensom koji je izabran na osnovu određenog pacijenta, bolesti ili stanja koje treba lečiti. Primeri drugih takvih agenasa uključuju, između ostalog, citotoksični, antikancerni ili hemoterapijski agens, anti-inflamatorni ili anti-proliferativni agens, antimikrobni ili antivirusni agens, faktore rasta, citokine, analgetik, terapeutski aktivan mali molekul ili polipeptid, jedno lančano antitelo, klasično antitelo ili njegov fragment, ili molekul nukleinske kiseline koji modulira jedan ili više signalnih puteva, i slični modulirajući terapeutski molekuli koji mogu nadopunjavati ili na drugi način biti korisni u terapijskom ili profilaktičkom režimu lečenja.
Lečenje pacijenta sa ćelijski ciljanim molekulom ili farmaceutskom kompozicijom predmetnog pronalaska pogodno vodi do ćelijske smrti ciljanih ćelija i/ili inhibicije rasta ciljanih ćelija. Kao takvi, citotoksični, ćelijski ciljani molekuli predmetnog pronalaska i farmaceutske kompozicije koje ih sadrže, biće korisni u postupcima lečenja različitih patoloških poremećaja u kojima ubijanje ili iscrpljivanje ciljanih ćelija može biti korisno, kao što je, između ostalog, kancer, tumori, druge nepravilnosti rasta, imuni poremećaji i zaražene ćelije. Predmetni pronalazak pruža postupke za suzbijanje ćelijske proliferacije i lečenje ćelijskih poremećaja, uključujući neoplaziju, preaktivne B-ćelije i preaktivne T-ćelije.
U određenim primerima izvođenja, ćelijski ciljani molekuli ili farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska mogu se koristiti za lečenje ili sprečavanje kancera, tumora (malignih i nemalignih), abnormalnosti rasta, imunih poremećaja i mikrobnih infekcija. U sledećem aspektu, gornji ex vivo postupak se može kombinovati sa gornjim in vivo postupkom kako bi se obezbedili postupci za lečenje ili sprečavanje odbacivanja kod primalaca transplantacije koštane srži i postizanje imunološke tolerancije.
U određenim primerima izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje postupke za lečenje malignih oboljenja ili neoplazme i drugih vrsta kancera povezanih sa ćelijama krvi kod sisara, kao što je čovek, postupak koji obuhvata korak primene subjektu kome je potrebna terapeutski efikasna količina citotoksičnog ćelijski ciljanog molekula ili farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska.
Ćelijski ciljani molekuli i farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska imaju različite primene, uključujući, npr., primenu u uklanjanju neželjenih T-ćelija, primenu u modulaciji imunih odgovora za lečenje grafta prema domaćinu, primenu kao antivirusni agensi, primenu kao antimikrobni agensi, i primenu u pročišćavanju tkiva za transplantaciju neželjenih ćelijskih tipova. Ćelijski ciljani molekuli i farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska su obično anti-neoplastični agensi - što znači da su sposobni da leče i/ili sprečavaju razvoj, sazrevanje ili širenje neoplastičnih ili malignih ćelija inhibiranjem rasta i/ili izazivanjem smrt kancera ili ćelija tumora.
U određenim primerima izvođenja, ćelijski ciljani molekul i farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska je korišćena za lečenje bolesti ili poremećaja posredovanih B-ćelijama, plazma ćelijama ili antitelom, kao što su na primer leukemija, limfom, mijelom, bolest povezana sa virusom humane imunodeficijencije, amiloidoza, hemolitički uremički sindrom, poliarteritis, septički šok, Crohnov bolest, reumatoidni artritis, ankilozantni spondilitis, psorijatični artritis, ulcerozni kolitis, psorijaza, astma, Sjogrenov sindrom, bolest grafta prema domaćinu, odbacivanje transplantata, dijabetes, vaskulitis, skleroderma i sistemski eritematozni lupus.
U drugom aspektu, pojedini primeri izvođenja ćelijski ciljanih molekula i farmaceutskih kompozicija predmetnog pronalaska su antimikrobni agensi - što znači da su sposobna da leče i/ili sprečavaju sticanje, razvoj ili posledice mikrobioloških patogenih infekcija, kao što su izazvane virusima, bakterije, gljivice, prioni, ili protozoi.
24
U opsegu predmetnog pronalaska je da se obezbedi profilaksa ili lečenje bolesti ili stanja posredovanih T-ćelijama ili B-ćelijama davanjem ćelijski ciljanog molekula predmetnog pronalaska ili njegove farmaceutske kompozicije pacijentu za svrha ubijanja T-ćelija ili B-ćelija kod pacijenta. Ova upotreba je kompatibilna sa pripremom ili kondicioniranjem pacijenta za transplantaciju koštane srži, transplantaciju matičnih ćelija, transplantaciju tkiva ili transplantaciju organa, bez obzira na izvor transplantiranog materijala, npr. ljudski ili neljudski izvori.
U obimu predmetnog pronalaska je da se obezbedi primalac koštane srži za profilaksu ili lečenje bolesti domaćina u odnosu na transplantaciju putem ciljanog ubijanja ćelija domaćina T-ćelija korišćenjem citotoksičnog ćelijski ciljanog molekula ili farmaceutske kompozicije predmetnoga pronalaska.
Određeni primeri izvođenja ćelijski ciljanih molekula i farmaceutskih kompozicija predmetnog pronalaska mogu se koristiti u postupku lečenja kancera koji uključuje davanje pacijentu, kome je to potrebno, terapeutski efikasne količine ćelijski ciljanih molekula i/ili farmaceutskih kompozicija predmetnog pronalaska. U određenim primerima izvođenja postupaka predmetnog pronalaska, kancer koji se leči je izabran iz grupe koja se sastoji od: kancera kostiju (kao što je multipli mijelom ili Evingov sarkom), kancera dojke, kancera centralnog / perifernog nervnog sistema (poput kancera mozga, neurofibromatoza ili glioblastoma), gastrointestinalni kancera (kao što je kancer želuca ili kolorektalni kancer), kancer germ ćelija (poput kancera jajnika i kancera testisa, kancera žlezdi (poput kancera pankreasa, paratiroidnog kancera, feokromocitoma, kancer pljuvačke ili štitne žlezde) ), kancer glave (vrata kao što su kancer nazofarinksa, oralni kancer ili kancer faringeksa), hematološki kancer (kao što su leukemija, limfom ili mijelom), kancer bubrežnih i mokraćnih puteva (poput kancera bubrega i mokraćne bešike), kancer jetre, kancer pluća / pleure (poput mezotelioma, kancera pluća malih ćelija ili ne-mali ćelijski kancer pluća), kancer prostate, sarkom (poput angiosarkoma, fibrosarkoma, Kaposijev sarkom ili sinovijalni sarkoma), kancer kože (kao što je bazalna ćelija, kancer pločastih ćelija ili melanom) i kancer maternice.
Određeni primeri izvođenja ćelijski ciljanih molekula i farmaceutskih kompozicija predmetnog pronalaska mogu se koristiti u postupku lečenja imunog poremećaja koji obuhvata primenu pacijentu, kome je to potrebno, terapeutski efikasne količine ćelijskih ciljanih molekula i/ili farmaceutskih kompozicija predmetnog pronalaska. U nekim primerima izvođenja postupak predmetnog pronalaska, imuni poremećaj je povezan sa upalom povezane sa bolešću odabranom iz grupe koja se sastoji od: amiloidoza, ankilozirajući spondilitis, astma, Crohnova bolest, dijabetes, odbacivanje transplantata, bolest graft-vs.-domaćina, Hashimotov tiroiditis, hemolitički uremički sindrom, HIV vezana bolest, lupus eritematozus, multipla skleroza, poliarteritis, psorijaza, psorijatični artritis, reumatoidni artritis, skleroderma, septički šok, Sjogrenov sindrom, ulcerozni kolitis i vaskulitis.
Među određenim primerima izvođenja predmetnog pronalaska je korišćenje efektorskog polipeptida Shiga toksina ili ćelijski ciljanog molekula predmetnog pronalaska kao komponente farmaceutske kompozicije ili leka za lečenje ili sprečavanje kancera, tumora, drugih poremećaja rasta, imunog poremećaja, i/ili mikrobna infekcija. Na primer, imuni poremećaji koji se javljaju na koži pacijenta mogu se lečiti takvim lekom u nastojanju da smanje upalu. U drugom primeru, kožni tumori se mogu lečiti takvim lekom u nastojanju da se smanji veličina tumora ili potpuno eliminiše tumor.
Određeni citotoksični ćelijski ciljani molekuli predmetnog pronalaska, i njihove kompozicije, mogu se koristiti u aplikacijama molekularne neurohirurgije, kao što su imunolezija i traganje neurona (videti, Wiley R, Lappi D, Adv Drug Deliv Rev 55: 1043-54 (2003), za pregled). Na primer, ciljani domen može biti izabran ili izveden iz različitih liganda, kao što su neurotransmiteri i neuropeptidi, koji ciljaju specifične tipove ćelija neurona vezujući receptore površinskih neurona, kao što je neuronski kružni specifični G-protein spojeni receptor. Slično tome, ciljani domen može biti izabran od antitela koja se vežu za površinske receptore neurona. Budući da određeni efektorski polipeptidi Shiga toksina snažno usmeravaju sopstveni retrogradni aksonski transport, određeni ćelijski ciljani molekuli predmetnog pronalaska mogu se koristiti za ubijanje neurona(a) koji izražava ekstraćelijski cilj na mestu ubrizgavanja citotoksičnog proteina udaljenom od ćelijskog tela (videti Llewellyn-Smith I et al, J Neuro sci Methods 103: 83-90 (2000)). Ovi ciljani citotoksični molekuli pronalaska koji specifično ciljaju tipove neuronskih ćelija koriste se u istraživanjima neuronauke, kao što su za razjašnjavanje mehanizama senzacija (videti npr. Mishra S, Hoon M, Science 340: 968-71 (2013), i kreiranje sistemskih modela neurodegenerativnih bolesti, kao što je Parkinskonova i Alzhajmerova (videti npr. Hamlin A et al, PLoS One e53472 (2013)).
Među određenim primerima izvođenja predmetnog pronalaska je postupak upotrebe efektorskog polipeptida Shiga toksina, ćelijski ciljanog molekula, farmaceutske kompozicije i/ili dijagnostičke kompozicije predmetnog pronalaska za obeležavanje ili otkrivanje unutrašnjosti neoplastičnih ćelija i/ili tipova imunih ćelija. Ovaj postupak se može zasnivati na mogućnosti određenih ćelijski ciljanih molekula predmetnog pronalaska da uđu u
24
specifične tipove ćelija i kreću se kroz ćelije retrogradnim intraćelijskim transportom, do unutrašnjih pregrada specifičnih tipova ćelija obeleženi su za detekciju. To se može izvesti na ćelijama in situ kod pacijenta ili na ćelijama i tkivima uklonjenim iz organizma, npr. materijal za biopsiju.
Među određenim primerima izvođenja predmetnog pronalaska je postupak upotrebe efektorskog polipeptida Shiga toksina, ćelijski ciljanog molekula, farmaceutske kompozicije i/ili dijagnostičke kompozicije predmetnog pronalaska za otkrivanje prisustva ćelijskog tipa u svrhu prikupljanja informacija u vezi sa bolesti, stanja i/ili poremećajima. Postupak obuhvata kontaktiranje ćelije sa dijagnostički dovoljnom količinom ćelijski ciljanog molekula predmetnog pronalaska u cilju da se detektuje molekul testom ili dijagnostičkom tehnikom. Izraz "dijagnostički dovoljna količina" odnosi se na količinu koja omogućava odgovarajuću detekciju i tačno merenje za potrebe prikupljanja informacija pomoću određenog ispitivanja ili dijagnostičke tehnike koja se koristi. Uopšteno, dijagnostički dovoljna količina za ceo organizam in vivo dijagnostičke upotrebe biće nekumulativna doza između 0,001 do 10 miligrama detekciono promovišućeh agensa povezanog za ćelijski ciljani molekul pronalaska po kg subjekta po subjektu. Tipično, količina efektorskog polipeptida Shiga toksina ili ćelijski ciljanog molekula predmetnog pronalasku koji se koristi u ovim postupcima prikupljanja informacija biće što manja, pod uslovom da je još uvek dijagnostički dovoljna količina. Na primer, za otkrivanje in vivo u organizmu, količina efektorkog polipeptida Shiga toksina, ćelijski ciljanog molekula, ili farmaceutske kompozicije pronalaska koja se daje subjektu će biti što manja.
Specifično ciljanje ćelijski ciljnih molekula predmetnog pronalaska u kombinaciji sa agensima koji promovišu detekciju pruža način detekcije i slike ćelija fizički spojenih sa ekstraćelijskim ciljnim biomolekulom vezujućeg regiona molekula pronalaska. Slika ćelija koristeći ćelijski ciljane molekule predmetnog pronalaska može se izvesti in vitro ili in vivo bilo kojom pogodnom tehnikom poznatom u tehnici. Dijagnostičke informacije mogu se prikupiti pomoću različitih postupaka poznatih u tehnici, uključujući snimanje organizma celog tela ili korišćenjem ex vivo uzoraka uzetih iz organizma. Izraz "uzorak" ovde korišćen odnosi se na bilo koji broj stvari, ali nije ograničeno na tečnosti kao što su krv, urin, serum, limfa, slina, analni sekret, vaginalni sekret i seme, i tkiva dobijena postupcima biopsije. Na primer, različiti agensi za poticanje detekcije mogu se koristiti za neinvazivno in vivo snimanje tumora tehnikama kao što su snimanje magnetnom rezonancom (MRI), optičkim metodama (kao što su direktno, fluorescentno i bioluminescentno snimanje), pozitronsko-emisionom tomografijom (PET), jednofotonska emisijska računarska tomografija (SPECT), ultrazvuk,
24
rendgenska računarska tomografija i kombinacije gore pomenutih (videti, Kaur S et al.
Cancer Lett 315: 97-111 (2012), za pregled).
Među određenim primerima izvođenje predmetnog pronalaska je postupak upotrebe efektorskog polipeptida Shiga toksina, ćelijski ciljanog molekula ili farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska u dijagnostičkoj kompoziciji za obeležavanje ili otkrivanje unutrašnjosti hematološke ćelije, ćelije kancera, ćelije tumora, inficiranu ćeliju i/ili imunu ćeliju (videti npr., Koyama Y et al, Clin Cancer Res 13: 2936-45 (2007); Ogawa M et al. Cancer Res 69: 126872 (2009); Yang L et al. Small 5: 235-43 (2009)). Na osnovu sposobnosti određenih ćelijski ciljanih molekula pronalaska da uđu u određene ćelijske tipove i kreću se kroz ćelije retrogradnim intraćelijskim transportom, unutrašnji odeljci specifičnih tipova ćelija označeni su za detekciju. To se može izvesti na ćelijama in situ kod pacijenta ili na ćelijama i tkivima uklonjenim iz organizma, npr. materijal za biopsiju.
Dijagnostičke kompozicije predmetnog pronalaska mogu se koristiti da se karakteriše bolest, poremećaj, ili stanje koje se potencijalno leči srodnom farmaceutskom kompozicijom predmetnog pronalaska. U nekim kompozicijama od značaja predmetnog pronalaska se mogu koristiti da se utvrdi da li pacijent pripada grupi koja reaguje na terapijsku strategiju koja koristi jedinjenje, kompoziciju ili srodni postupak predmetnog pronalaska kao što je ovde opisano ili je pogodno za korišćenje uređaja za isporuku prema pronalasku.
Dijagnostičke kompozicije predmetnog pronalaska mogu se koristiti posle bolesti, npr. kancer, je otkriven da bi ga bolje okarakterisao, kao što je praćenje udaljenih metastaza, heterogenosti i stadijuma progresije raka. Fenotipska procena poremećaja ili infekcije može pomoći prognoziranju i predviđanju tokom donošenja terapijskih odluka. U ponovnom pojavljivanju bolesti, određeni postupci pronalaska mogu se koristiti kako bi se utvrdilo da li je lokalni ili sistemski problem.
Dijagnostičke kompozicije predmetnog pronalaska mogu se koristiti za procenu odgovora na terapije bez obzira na tip vrste terapije, npr. lekovi sa malim molekulama, biološki lekovi ili terapija na bazi ćelija. Na primer, neki primeri izvođenja dijagnostike pronalaska mogu se koristiti za merenje promena u veličini tumora, promene populacije ćelija pozitivnih na antigen, uključujući broj i distribuciju, ili praćenje različitog markera od antigena ciljanog terapijom koja je već primenjena pacijentu (videti Smith-Jones P et al, Nat. Biotechnol 22: 701-6 (2004); Evans M et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108: 9578-82 (2011)).
24
U određenim primerima izvođenja postupci koji se koristi za otkrivanje prisustva ćelijskog tipa može se koristiti za prikupljanje informacija o bolestima, poremećajima i stanjima, kao što su, npr., kancer kosti (poput multiplog mijeloma ili Evingov sarkom), kancer dojke, kancera centralnog/perifernog nervnog sistema (poput kancera mozga, neurofibromatoze ili glioblastoma), kancera gastrointestinalnog sistema (poput kancera želuca ili kolorektalnog kancera), kancera mikroba (kao što su kancer jajnika i testisa, kancera žlezde (kao što je kancer gušterače, paratiroidi kancer, feokromocitom, kancer pljuvačne žlezde ili kancer štitne žlezde), kancer glave (kao što su kancer nazofarinksa, kancer oralne dojke ili faringealnog kancera), hematološki kanceri (poput leukemije, limfoma ili mijeloma), kancera bubrega i mokraćnih puteva ( kao što su bubrežni kancer i kancer mokraćne bešike, kancer jetre, kancer pluća/pleure (poput mezotelioma, kancer pluća malih ćelija ili ne-sitnoćelijski kancer pluća), kancer prostate, sarkom (poput angiosara koma, fibrosarkom, Kaposijev sarkom ili sinovijalni sarkom), kancer kože (kao što je bazalnocelularni kancer, pločasti ćelijski kancer ili melanom), kancer materice, AIDS, amiloidoza, ankilozirajući spondilitis, astma, autizam, kardiogeneza, Crohnova bolest, dijabetes, eritematozus, gastritis, odbacivanje transplantata, bolest transplantata protiv domaćina, Graveova bolest, Hashimotov tireoiditis, hemolitički uremički sindrom, bolest povezana sa HIV-om, lupusni eritematozus, limfoproliferativni poremećaji (uključujući post-transplantacione limfoproliferativne poremećaje), multipla skleroza, miastenija, gravitacija , poliarteritis, psorijaza, psorijatični artritis, reumatoidni artritis, skleroderma, septički šok, Sjogrenov sindrom, sistemski eritematozni lupus, ulcerozni kolitis, vaskulitis, ćelijska proliferacija, upala, aktivacija leukocita, adhezija leukocita, hemikacija leukocita, leukocita, hemocijacija leukocita, leukocita, hemocijacija, leukocita, hemocijacija, leukocita, hemocijacija, akutna limfoblastična leukemija (ALL), T akutna limfocitna leukemija/limfoma (ALL), akutna meloična leukemija, akutna mijeloidna leukemija (AML), hronična limfocitna leukemija B-ćelija (B-CLL), prompfocitni limfom B-ćelije, Burkittov limfom (BL), hronična limfocitna leukemija (CLL), hronična mieloska leukemija (CML-BP), hronična mijeloidna leukemija (CML), difuzna velika B-ćelijska limfoma, folikularni limfom, vlaknasta ćelijska leukemija (HCL), Hodgkinov limfom (HL), intravaskularni veliki B-ćelijski limfom, limfomatoidna granulomatoza, limfoplazmacitni limfom, MALT limfom, limfom plaštete ćelije, multipli mijelom (MM), prirodnu ubica ćelije leukemije, nodalni marginalni B-ćelijski limfom, ne-Hodgkinov limfom (NHL), leukemija plazma ćelije, plazmacitoma, primarni izlivni limfom, prolimfocitna leukemija, promielocitična leukemija, mali limfocitni limfom, limfom slezalne marginalne zone, T-ćelijska limfoma (TCL), bolest teškog lanca, bolest monoklonske gamopatije, bolest monoklonskog taloženja imunolobulina, mijelodusplastični sindromi (MDS), tinjajući multipli mijelom i makrof Valdenstrom lobulinemija.
24
U određenim primerima izvođenja, efektorski polipeptidi Shiga toksina i ćelijski ciljani molekuli predmetnog pronalaska, ili njihove farmaceutske kompozicije, koriste se i za dijagnozu i za lečenje, ili samo za dijagnozu. U nekim situacijama, bilo bi poželjno odrediti ili verifikovati HLA varijantu i/ili HLA alele izražene u subjektu i/ili bolesnom tkivu kod subjekta, kao što je, npr., pacijent kome je potrebno lečenje, pre nego što se odabere efektorski polipeptid Shiga toksina ili ćelijski ciljani molekuli predmetnog pronalaska za upotrebu u lečenju.
Bilo koji primer izvođenja efektorskog polipeptida Shiga toksina predmetnog pronalaska i ćelijski ciljanog molekula predmetnog pronalaska (npr. primeri izvođenja seta izvođenja br.
1-11 u Kratkom opisu) može se koristiti sa svakom pojedinačnim primerom izvođenja postupaka predmetnog pronalaska.
Ovaj pronalazak je dalje ilustrovan sledećim sa neograničavajućim primerima 1) efektorski polipeptidi Shiga toksina predmetnog pronalaska, 2) ćelijski ciljani molekuli predmetnog pronalaska i 3) citotoksični, ćelijski ciljani molekuli predmetnog pronalaska koji sadrže prethodno pomenute polipeptide i sposobnih da specifično ciljaju određene tipove ćelija.
PRIMERI
Sledeći primeri pokazuju određene primere izvođenja predmetnog pronalaska. Međutim, treba razumeti da su ovi primeri samo u ilustrativne svrhe i ne nameravaju se niti tumačiti u potpunosti, definisati uslove i obim ovog pronalaska. Eksperimenti u sledećim primerima izvedeni su korišćenjem standardnih tehnika, koje su dobro poznate i rutinske onima koji poznaju ovo područje, osim ako je drugačije opisano.
Sledeći primeri opisuju nekoliko, primernih, citotoksičnih, Shiga toksina A Podjedinice izvedenih polipeptidnih kosturova koji sadrže efektorske polipeptide Shiga toksina predmetnog pronalaska. Efektorski polipeptidi Shiga toksina u Primerima su de-imunizovani zadržavajući katalitičke i/ili citotoksične aktivnosti.
Sledeći primeri takođe opisuju nekoliko, citotoksičnih, ćelijski ciljanih molekula, a svaki molekul sadrži efektorski polipeptid Shiga toksina vezan, direktno ili indirektno, na ćelijski ciljane vezujuće regione sposobni da vezuju ekstraćelijski deo ciljanog biomolekula koji je fizički povezan sa ćelijskom površinom ćelije. Primeri, citotoksičnih, ćelijski ciljanih molekula,
24
opisani u nastavku vezuju se za ćelijsku površinu, ciljane biomolekule izražene sa ciljanim, tumorskim ćelijskim tipovima i unose te ciljane ćelije. Internalizovani, ćelijski ciljani molekuli efektivno su usmeravali svoje efektorske polipeptide Shiga toksina u citozol ciljanih ćelija gde su efektorski polipeptidi Shiga toksina inaktivirali ribozome i posle toga prouzrokovali apoptotsku smrt ciljanih ćelija. Primeri ćelijski ciljanih molekula predmetnog pronalasku su u stanju da efikasno isporuče imunogene, T-ćelijske epitope na put MHC klase I ciljanih ćelija.
Dodatno, neki od primernih ćelijski ciljanih molekula sadrže otporne na cepanje proteazom, de-imunizovane, efektorske polipeptide Shiga toksina koji su pokazali poboljšane profile imunogenosti in vivo (smanjenje odgovora antitela) u poređenju sa roditeljskim citotoksičnim molekulima koji sadrže otpornost na cepanje furina, efektorski polipeptid Shiga toksina koji nije dalje de-imunizovan uništenjem dodatnih, endogenih epitopskih regiona. Dalje, ti primerni, otporni na cepanje proteaze, de-imunizovani, ćelijski ciljani molekuli pokazuju poboljšanu podnošljivost in vivo u poređenju sa srodnim ćelijski ciljanim molekulima koji ciljaju ćelije, a koji sadrže više polipeptidnih regiona Shiga toksina osetljivih na cepanje proteaze.
Primeri u nastavku opisuju određene, efektorske polipeptide Shiga toksina predmetnog pronalaska i njihove osobine. Određeni Primeri opisuju de-imunizovane, efektorske polipeptide Shiga toskina predmetnog pronalaska koji sadrže ugrađene, heterologne, CD8+ T-ćelijske epitope. Određeni Primeri opisuju de-imunizovane, efektorske polipeptide Shiga toskina predmetnog pronalaska koji su otporni na cepanje furina. Određeni Primeri opisuju otporne na cepanje furina, de-imunizovane, efektorske polipeptide Shiga toksina predmetnog pronalaska koji sadrže ugrađene, heterologne, CD8+ T-ćelijske epitope.
Određeni Primeri opisuju otporne na cepanje furina, efektorske polipeptide Shiga toksina predmetnog pronalaska koji sadrže ugrađene, heterologne, CD8+ T-ćelijske epitope samo sa minimalnom de-imunizacijom. Dalje, Primeri u nastavku opisuju određene, ćelijski ciljane molekule predmetnog pronalaska i njihove osobine. Određeni Primeri opisuju ćelijski ciljane molekule predmetnog pronalaska gde je komponenta efektorskog polipeptida Shiga toksina (1) de-imunizovan; (2) na ili blizu amino kraju polipeptidne komponente ćelijski ciljanog molekula; (3) otporan na cepanje furina; i/ili (4) sadrži ugrađeni ili ubačeni T-ćelijski epitop. Određeni Primeri opisuju ćelijski ciljane molekule gde polipeptidna komponenta ćelijski ciljanog molekula sadrži karboksi kraj, endoplazmatični retikulum/ povratnog signalnog motiva.
2
Primer 1. Identifikovanje Endogenih, Epitopskih Regiona u Efektorskim Plipeptidima Shiga Toksn A Podjedinice
Polipeptidne sekvence A Podjedinica iz višestrukih Shiga toksina familije Shiga toksina su analizirane da se identifikuju sumnjivi, antigenski i/ili imunogenski epitopi. Ovaj Primer pokazuje kako se antigenski i imunogenski epitopi mogu identifikovati u Shiga toksin A Podjedinicama i srodnim polipeptidima (videti takoÿe WO 2015/113005; WO 2015/113007). Računarski postupci su korišćeni za predviđanje antigenskih i/ili imunogenskih epitopa u različitim Shiga toksin A Podjedinicama, uključujući korišćenje javno dostupnih podataka o proteinskim strukturama. Predviđeni su B-ćelijski epitopi i CD4+ T-ćelijski epitopi sa potencijalom da izazovu imunološke odgovore in silico. Predviđanja epitopa potvrđena su empirijski (videti Primer 2, infra; WO 2015/113005; WO 2015/113007).
Linearni, B-ćelijski epitopi su predviđeni za zrele A Podjedinice Shiga-sličnog toksina 1 (SLT-1A; SEQ ID NO: 1) iz polipeptidne sekvence i 3D strukturalnih podataka Shiga-Sličnog Toksinskog Lanca A (PDB ID: 1DM0_A) od strane Prolmmune Inc. (Sarasota, FL, U.S.) koristeći njihov REVEAL® sistem.
Dodatno, B-ćelijski epitopi su predviđeni u polipeptidnim sekvencama A Podjedinica Shiga toksina (StxA; SEQ ID NO:2), Shiga-sličnog toksina 1 (SLT-1A; SEQ ID NO:1), i Shigasličnog toksina 2 (Stx2A; SEQ ID NO:3) koristeći BcePred webserver (Saha S, Raghava G, Lecture Notes in Comput Sci 3239: 197-204 (2004)), Bepipred Linear Epitope Prediction (Larsen J et al., Immunome Res 2: 2 (2006)), i ElliPro Antibody epitopsko predviđanje (Haste Andersen P et al., Protein Sci 15: 2558-67 (2006); Ponomarenko J, Bourne P, BMC Struct Biol 7: 64 (2007)). Razni računarski postupci otkrivaju slična predviđanja za B-ćelijske epitopske regione u tri, prototipične, Shiga toksin A Podjedinice (Tabele 1-3).
Tabela 1. Predviđanja B-Ćelijskog Epitopa za Zrelu, Izvornu A Podjedinicu Shigasličnog Toksina 1 (SEQ ID NO:1)
2 1
Tabela 2. Predviđanja B-Ćelijskog Epitopa za Zrelu, Izvornu A Podjedinicu Shiga Toksina (SEQ ID NO:2)
Tabela 3. Predviđanja B-Ćelijskog Epitopa za Zrelu, Izvornu A Podjedinicu Shigasličnog Toksina 2 (SEQ ID NO:3)
2 2
Postoji devet, predviđenih, B-ćelijskih epitopskih regiona u SLT-1A koji su identifikovani sa više od jednog postupka kao preklapajući regioni (Tabela 4).
Tabela 4. Pretpostavljeni, B-Ćelijski Epitopski Regioni u Prototipičnim, Shiga Toksin A
Podjedinicama
Dodatno, Shiga toksin A Podjedinice su analizirane korišćenjem Epitopia webserver za predviđanje B-ćelijskih epitopa i imunogenskih ostataka (Rubinstein N et al, BMC Bioinformatics 10: 287 (2009)). Epitopia je korišćena za identifikovanje linearnih, regiona amino kiselinskog ostatka predviđeni da budu imunogenski u SLT-1 A zasnovanoj na Epitopia rezultatu 4 ili 5 ("visok") za većinu amino kiselinskih ostataka unutar linearnog, regiona amino kiselinskog ostatka.
Epitopia analiza predviđa imunogenski region koji nastaje iz amino kiselinskih ostataka 1 do 15 u SLT-1 A (označen kao "Epitope Region 1", videti Tabelu 5). Zasnovano na Epitopia analizi, imunogenski epitopski region 39-48 u SLT-1A (videti Tabelu 4) može uključiti poziciju 49 (označen kao "Epitope Region 3", videti Tabela 5). Zasnovano na Epitopia analizi, imunogenski epitopski region 55-66 u SLT-1 A (videti Tabela 4) može uključiti poziciju 53 i proširi se oko pozicije 62-66 (označen kao "Epitopski Region 4", videti Tabela 5), epitopski region 96-115 u SLT-1 A (videti Tabela 4) može uključiti poziciju 94 (označen kao "Epitopski
2
Region 5", videti Tabela 5), i epitopski region 180-190 u SLT-1A (videti Tabela 4) može početi na poziciji 179 i proširi se oko pozicije 188-190 (označen kao "Epitopski Region 7", videti Tabela 5).
Tabela 5. Prototipične, Shiga Toksin A Podjedinice Share Ten, Predpostavljeni, B-Ćelijski Epitopski Regioni
T-ćelijski epitopi su predviđeni za zrelu, A Podjedinicu Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO:1) sa REVEAL™ Imunogenskim Sistemom (IS) T-ćelijske analize izvedene sa ProImmune, Inc. (Sarasota, FL, U.S.). Ova analiza koristi višestruke, preklapajuće peptide iz proteina od interesa za testiranje izlučivanja bilo kakvog imunog odgovora kod sisara, CD4+ T-ćelija iz zdravih donora ćelijskih uzoraka, osiromašenih CD8 T-ćelijama. ProImmune’s REVEAL™ analiza predviđa sedam, T-ćelijskih epitopa u SLT-1A (Tabela 6).
Tabela 6. Pretpostavljeni, CD4+ T-Ćelijski Epitopi u Prototipičnoj, Shiga Toksin A
Podjedinici
2 4
Svih deset, predviđenih B-ćelijskih epitopskih regiona (Tabela 5) se preklapaju sa najmanje jednim CD4+ T-ćelijskim epitopom predviđen sa REVEAL™ testom (Tabela 7).
Tabela 7. B-Ćelijski Epitopski Regioni u Prototipičnim, Shiga Toksin A Podjedinicama koje se Preklapaju sa Predviđenim, CD4+ T-Ćelijskim Epitopima
Da bi se poboljšali polipeptidi izvedeni iz Shiga toksina za terapijsku i dijagnostičku primenu u hordatima, konstruisani su različiti efektorski polipeptidi Shiga toksin A Podjedinice da budu de-imunizovani i otporni na cepanje furina, kao i da u nekim slučajevima sadrže ugrađeni, heterologni, CD8 T-ćelijski epitop (koji se ovde naziva "CD8 T-ćelijski hiperimunizovan"). CD8 T-ćelijski epitopi su ugrađeni ili ubačeni u efektorske polipeptide Shiga toksina konstruisanjem unutrašnjih podregiona efektorskih polipeptida Shiga toksina koji sadrže heterologni T-ćelijski epitop (videti npr. WO 2015/113007). Ugrađivanje ili ubacivanje heterolognih T-ćelijskih epitopa može se upotrebiti za ometanje endogenog, B-ćelijskog i/ili CD4+ T-ćelijskog epitopskog regiona(e) kako bi se dodatno de-imunizovao izvedeni kostur Shiga toksin A Podjedinice (WO 2015/113007). Svi predviđeni, B-ćelijski epitopski regioni i T-ćelijski epitopi u Tabeli 7 su uništeni i/ili izbrisani pojedinačno ili u kombinaciji u sledećim primerima.
Primer 2. Konstruisanje i Testiranje Primernih, Efektorskih Polipeptida Shiga Toksina i Ćelijski Ciljanih Molekula Predmetnog Pronalaska
2
Ovaj primer opisuje stvaranje i testiranje različitih kostura koji sadrže efektorske polipeptide Shiga toksina koji su de-imunizovani, kao što su, npr., kao što je pokazano smanjenjem antigenosti i/ili imunogenosti u odnosu na druge efektorske polipeptide Shiga toksina.
Dodatno, neki od efektorskih polipeptida Shiga toksina iz ovog primera su mnogo otporniji na cepanje proteaze od efektorskih polipeptida divljeg soja Shiga toksina i/ili sadrže ugrađene ili ubačene, heterološke, CD8+ T-ćelijske epitope. Efektorski polipeptidi Shiga toksina iz ovog primera su testirani kao komponente raznih, ćelijski ciljanih molekula predmetnog pronalaska.
Konstrukcija Primernih, Efektorskih Polipeptida Shiga Toksina (SLT-1A-kombo(n)) i Ćelijski Ciljanih Molekula koji sadrže Iste (SLT-1A-kombo(n)::scFv-(n))
De-imunizovani, efektorski polipeptidi Shiga toksin A Podjedinice su obrazovani i testirani u kontekstu ćelijski ciljanih molekula, svaki sadrži ćelijski ciljani, vezujući region imunoglobulinskog tipa koji je vezan za efektorski polipeptidni region Shiga toksina.
Da bi se stvorila otpornost na cepanje proteaze u izvedenom polipeptidu Shiga toksin A Podjedinice, supstitucije amino kiselinskih ostataka, R248A i/ili R251A, uvedene su u efektorske polipeptide Shiga toksina (videti npr. WO 2015/191764). Supstitucije R248A i R251A, pojedinačno ili u kombinaciji, remete motiv cepanja furina na karboksi-kraju regiona Shiga toksin A1 fragmenta i predstavljaju jednu ili više mutacija u minimalnom motivu cepanja furina u odnosu na divlji soj Shiga toksin A Podjedinice (videti WO 2015/191764).
Za ovaj Primer, R248A i R251A su uvedeni u efektorski polipeptid Shiga toksina izveden iz A podjedinice Shiga-sličnog Toksina 1 (SLT-1 A) koji sadrži amino kiseline 1-251 SLT-1A (SEQ ID NO:4). SLT-1A 1-251 R248A/R251A dvostruki mutant (SEQ ID NO:5) se ovde navodi kao otporan na cepanje furina SLT-1 A ili još jednostavniji "SLT-1A-FR." Uništenje minimalnog mesta cepanja furina R-x-x-R u furinski odcepljenom motivu na akrboksi kraju regiona Shiga toksin A1 fragmenta sa R248A i R251A rezultuje u smanjenom cepanju od strane furina (Videti Primer 3, infra; WO 2015/191764). Uništenje minimalnog mesta cepanja furina R-x-x-R u firinski odcepljenom motivu izvorno pozicioniranom iz amino kiselinskih ostataka 238 do 257 u StxA i SLT-1A predviđeno je da smanji osetljivost ovog regiona na proteolizu drugih proteaza, kao što su, npr., proprotein konvertaze i visoko promiskuitentne proteaze. Dodatno, R248A i/ili R251A mutacije uništavaju (1) B-ćelijski epitopski region #8, koji je izvorno pozicioniran na amino kiselinskom ostatku 243-259 u StxA i SLT-1A, i (2)
2
CD4+ T-ćelijski epitop izvorno pozicioniran na amino kiselinskom ostatku 236-258 u StxA and SLT-1A.
De-imunizirani, efektorski polipeptidi Shiga toksina su stvoreni dodavanjem višestrukih supstitucija amino kiselinskih ostataka da se unište predviđeni B-ćelijski i/ili CD4+ T-ćelijski epitopski regioni, uključujući modifikacije koje rezultiraju u ugrađivanju, heterolognih CD8+ T-ćelijskih epitopa (videti Tabelu 8; WO 2015/113005; WO 2015/113007). Da bi se stvorili efektorski polipeptidi Shiga toksina koji su dodatno de-imunizovani, SLT-1A-FR (SEQ ID NO: 5) je modifikovan tako da uključuje višestruke supstitucije amino kiselinskih ostataka da se unište predviđeni B-ćelijski i/ili CD4+ T-ćelijski epitopski regioni, uključujući modifikacije koje rezultiraju u ugrađivanju, heterolognih CD8+ T-ćelijskih epitopa (videti Tabelu 8; WO 2015/113005; WO 2015/113007). Tabela 8 prikazuje dvadeset, različitih, de-imuniziranih, otpornih na cepanje proteaze, efektorskih polipeptida Shiga toksin A Podjedinice nazvanih SLT-1A-kombo(n), gde n predstavlja ceo broj kao što su 0, 1, 2, 3, itd. kako bi označili različite varijacije. Numerisanje endogenih epitopskih regiona pomenutih u Tabeli 8 je u skladu sa šemom numerisanja u Tabelama 6-7. Efektorski polipeptidi Shiga toksina iz Tabele 8 su testirani kao što je opisano u kasnijim odeljcima.
Tabela 8. Primerni, De-Imunizovani, CD8+ T-Ćelijski Hiper-Imunizovani, Efektorski Polipeptidi Shiga Toksina Predmetnog Pronalaska
2
2
2
2
21
Svaki od de-imunizovanih, efektorskih polipeptida Shiga toksina SLT-1A-kombo(n) (SEQ ID NOs: 6-21, 2327, i 29-32) obuhvata kombinaciju jednog ili više de-imunizovanih pod-regiona
2 2
sa jednim ili više pod-regiona koji sadrže ugrađeni, heterologni, CD8+ T-ćelijski epitop. Većina od ovih polipeptida takođe ima uništeni, minimalni, furinski odcepljeni motiv na karboksi kraju njihovih pod-regiona Shiga toksin A1 fragment (SEQ ID NOs: 6-10, 13-21, 23-27, i 29-32). Računarske analize in silico predviđaju (1) da najmanje dva, B-ćelijska epitopa predstavljena u divljem soju Shiga toksina StxA ili SLT-1 A eliminisani su za sve efektorske polipeptide kombo(n) Shiga toksina navedeni u Tabeli 8, i (2) da nisu stvoreni novi B-ćelijski epitopi u nijednom od efektorskih polipeptida Shiga toksina navedenih u Tabeli 8. Svojstva i funkcionalne posledice mnogih modifikacija pojedinih pod-regiona u efektorskim polipeptidima kombo(n) Shiga toksina su opisane u Primeru 3, WO 2015/113005, WO 2015/113007, i WO 2015/191764.
Polinukleotidi koji kodiraju konstrukcijske kombinacije efektorskog polipeptida Shiga toksin Podjedinice su napravljene i spojene za ćelijski ciljani, vezujući region imunoglobulinskog tipa, koji kodira konstrukcije koristeći tehnike poznate stručnjacima. Dobiveni polinukleotidi kodiraju ćelijski ciljane molekule, a svaki polipeptid sadrži (1) kombinaciju, regiona efektorskog polipeptida Shiga toksin SLT-1A-kombo (n), (2) ćelijski ciljani vezujući region "scFv- (n)," gde n predstavlja ceo broj kao što je 1,2, 3, itd. da označi različite scFvs, i (3) linker poznat u struci, smešten između efektorskog polipeptida Shiga toksina i vezujućeg regiona.
Koristeći bakterijski ekspresioni sistem koji je poznat u tehnici, ovi polinukleotidi su korišćeni za proizvodnju najmanje dvadeset sedam, kombinacija, de-imunizovanih, efektorskih polipeptida Shiga toksina (Tabela 8; SEQ ID NOs: 6-21, 23-27, i 29-32), u kontekstu jednog ili više ćelijski ciljanih molekula. Nakon što je povezan za ćelijski ciljani vezujući region, dvadeset šest od dvadeset sedam skeleta SLT-1A-kombo(n) proizvodi stabilni, pune dužine, katalitički aktivni, ćelijski ciljani molekul. Međutim, ćelijski ciljani molekul SLT-1A-kombo18::scFv-1 (SEQ ID NO:54) pokazao je dokaz nestabilnosti jer SLT-1A-kombo18::scFv-1 uništenje je posmatrano sa natrijum dodecil sulfat (SDS), poliakrilamid gel elektroforetskom (SDS-PAGE) analizom napunjenih gelova i izveden sa pripremama SLT-1A-kombo18::scFv-1 i molekulskom težinom u rasponu kao referentni.
A. Testiranje Primernih Ribozomskih Inhibitornih Aktivnosti, Ćelijski Ciljanih Molekula koje sadrže Efektorske Polipeptide Shiga toksina SLT-1A-kombo(n)
Enzimske aktivnosti različitih, kombinovanih, de-imuniziranih, rezistentnih na cepljenje proteazom, efektorskih polipeptida Shiga toksina testirane su u kontekstu ćelijski ciljanih
2
molekula korišćenjem in vitro analize inhibicije ribozoma koja je poznata stručnjaku (TNT® Quick Coupled Transcription/Translation Kit, Promega Corp, Madison, WI, U.S.). Ova analiza in vitro bez ćelija, korišten je za određivanje sposobnosti inaktivacije ribozoma SLT-1A-kombo10:scFv-1 (SEQ IDNO:47), SLT-1A-kombo16::scFv-1 (SEQ IDNO:52), SLT-1A-kombo19::scFv-1 (SEQ IDNO:55), SLT-1A-kombo0::scFv-2 (SEQ IDNO:57), SLT-1A-kombo2::scFv-2 (SEQ ID NO:58), SLT-1A-kombo3::scFv-2 (SEQ ID NO:59), SLT-1A-kombo4::scFv-2 (SEQ ID NO:60), i SLT-1A-kombo13::scFv-2 (SEQ IDNO:62).
Reakcija aktivnosti ribozoma pripremljena je prema uputstvima proizvođDča. Serija od 10-puta razblaživanja ćelijski ciljanog molekula koja se testira pripremljena je u odgovarajućem puferu i stvoren je niz identičnih komponenata TNT® reakcione smeše za svako razblaženje. Svaki uzorak iz serije razblaživanja je kombinovan sa svakom od TNT® reakcionih smeša, zajedno sa Luciferazom T7 kontrolnom DNK (Promega Corp, Madison, WI, U.S.). Analizirani uzorci su inkubirani tokom 1.5 sata na 30 stepeni Celzijusa (°C). Nakon inkubacije, svim ispitivanim uzorcima je dodan reagens za ispitivanje luciferaze (Promega Corp, Madison, VI, U.S.), a količina protein luciferaze translacije je izmerena luminescencijom prema uputstvima proizvođDča. Korišćene su tri pozitivne kontrole: divlji soj, SLT-1A1 fragment (SLT-1A1-WT) (SEQ ID NO:4) i dva ćelijski ciljana molekula SLT-1A-FR::scFv-1 (SEQ ID NO:34) i SLT-1A-FR::scFv-2 (SEQ ID NO:35) koji sadrže otporan na cepanje proteaze, efektorskog polipeptida Shiga toksina SLT-1A-FR (SEQ ID NO:5) (videti WO 2015/191764).
Nivo inhibicije sinteze proteina je određen nelinearnom regresijskom analizom logtransformisanih koncentracija ukupnog ćelijski ciljanog molekula nasuprot relativnim jedinicama luminiscencije. Korišćenje statističkog softvera (GraphPad Prism, San Diego, CA, U.S.), vrednost polu maksimalne inhibicione (IC50) je izračunata za svaki uzorak koršćenjem Prism softverske funkcije log(inhibitor) vs. odgovor (tri parametra) [Y = Dno ((Vrh - Dno) / (1 10^(X - Log IC50)))] ispod naslova doza-odgovor-inhibicija. IC50za svaki uzorak je izračunato i prikazano je u Tabeli 9. U ovom ispitivanju, merenja inhibicije sinteze proteina predstavljaju aktivnost inaktivacije ribozoma molekule uzorka, koja je jedna metrična katalitička aktivnost efektorskog polipeptida Shiga toksina ili Shiga toksin A Podjedinice. Kao što je rečeno u Primerima, molekul koji pokazuje IC50sa 10-puta IC50za koji je izložen referentni molekul smatra se da pokazuje aktivnost inhibicije ribozoma uporedivu sa onim referentnim molekulom. Kao što je rečeno u Primerima, molekul koji pokazuje IC50manje od ili unutar 10 procenata od IC50za koji je izložen referentni molekul smatra se da pokazuje aktivnost inhibicije ribozoma koja je ekvivalentna tom referentnom molekulu.
2 4
Tabela 9. Kombinacija, De-Imunizovanih, Otpornih na Cepanje Proteaze, Efektorskih Polipeptida Shiga Toksin koji Pokazuju Ribozomsku Inhibitornu Aktivnost Poredivu sa Divljim Sojem Shiga toksin A1 Fragmenta
Aktivnosti inaktivacije ribozoma svih ispitivanih efektorskih polipeptida Shiga toksina kombo(n) bile su uporedive sa katalitičkom aktivnošću fragmenta divljeg soja Shiga toksina (SEQ ID NO: 4) i/ili SLT-1A-FR polipeptida (SEQ ID NO: 5) kao komponenta ćelijski ciljanog molekula (Tabela 9; Slika 2). Aktivnosti inaktivacije ribozoma SLT-1A-kombo10::scFv-1, SLT-1A-kombo16::scFv-1, SLT-1A-kombo19::scFv-1, SLT-1A-kombo0::scFv-2, SLT-1A-kombo2::scFv-2, SLT-1A-kombo4::scFv-1 i SLT-1A-kombo13::scFv2 su bili ekvivalentni katalitičkoj aktivnosti fragmenta divljeg soja Shiga toksina A1 (SEQ ID NO: 4) i/ili SLT-1A-FR polipeptid (SEQ ID NO: 5) kao komponenta ćelijski ciljanog molekula (Tabela 9; Slika 2).
Ovi rezultati pokazuju da su aktivnosti inhibicije ribozoma određenih, oglednih, kombinacionih, de-imuniziovanih, rezistentnih na cepljenje proteazom, efektorskih polipeptida Shiga toksina u kontekstu ćelijski ciljanog molekula, uporedive sa katalitičkom aktivnošću divljeg soja Shiga toksina A1 fragmenta (SEQ ID NO: 4) sam ili efektorskog polipeptida Shiga toksina SLT-1A-FR (SEQ ID NO: 5) u kontekstu ćelijski ciljanog molekula (Tabela 9; Slika 2). Stoga su katalitičke aktivnosti određenih, oglednih, kombinacijskih, deimunizovanih, rezistentnih na proteazno cepanje, polipeptida Shiga toksina u kontekstu ćelijski ciljanih molekula u ovom testu pokazale uporedive sa katalitičkom aktivnošću divljeg soja Shiga toskin A Podjedinice (Tabela 9; Slika 2).
B. Testiranje Ciljanih Citotoksičnih Primernih, Ćelijski Ciljanih Molekula koji Sadrže Efektorske Polipeptide Shiga Toksina SLT-1A-kombo(n)
2
Potencijal i specifičnost citotoksičnosti su testirani na kombinovane, de-imunizovane, efektorske polipeptide Shiga toksine SLT-1A-kombo(n) predmetnog pronalaska kao kostur za izgradnju različitih ćelijski ciljanih molekula. Citotoksične aktivnosti primernih, ćelijski ciljanih molekula koji sadrže kombinaciju, de-imunizovanog, rezistentnog na cepljenje proteazom, efektorskog polipeptida Shiga toksina SLT-1A-kombo(n) određene su korišćenjem analize ciljanog biomolekula za ubijanje ćelija koji je poznat stručnjaku. Ova analiza ciljanog pozitivnog ubijanja ćelije korišćen je za određivanje citotoksičnih aktivnosti različitih ćelijski ciljanih molekula, a svaki od njih sadrži ćelijski ciljani vezujući region scFv-(n) i genetski je spojen na jednu od kombinacija, efektorskih polipeptida Shiga toksina SLTA-1A kombo(n) (SEQ ID NO: 6-32) (vidi Tabelu 8 za reprezentativni podskup takvih molekula) da formiraju molekule koji ciljaju ćeliju SEQ ID NOs: 43-81.
Citotoksičnosti ćelijski ciljanih molekula koji sadrže de-imunizovane, otporne na cepanje proteaze, efektorskih polipeptida Shiga toksina su određene korišćenjem ćelija koje iskazuju, na ćelijskoj površini, značajnu količinu odgovarajućeg, ekstraćelijskog ciljanog biomolekula, kao što je, meta vezujućeg regiona scFv-1-8. Imunoglobulinski izvedeni vezujući regioni scFv-1, scFv-2, scFv-3, scFv-4, scFv-5, scFv-6, scFv-7, scFv-8 i scFv-9 svaki se vezuje sa visokim afinitetom za humani ciljani biomolekul fizički spojen za ćelijsku površinu određenih humanih ćelija. Ćelije korišćene u ovom primeru su ovekovečene, humane tumorske ćelije dostupne od ATCC (Manassas VA, US), Nacionalnog instituta za rak SAD (Frederick, MD, SAD), i/ili DSZM (Braunschweig, DE). Ćelije koje su navedene u nastavku su bile H929, Daudi, NCI-ADR / RES (izražavajući HER-2 iz transficiranog vektora), HCC1419, MDA-MB-231, MOLP-8, ST486, HDLM-2 i L1236 ili još jednostavnije ćelijske-linije A, B, C, D, E, F, G, H i I, respektivno. Koristeći metodu poznatu stručnjaku, ćelije iz ćelijske linije C korišćene u ovom primeru su transficirane ekspresijskim vektorom i napravljene da izraze značajnu količinu ćelijske površine HER-2.
Analiza ćelijskog ubijanja je izvedena na sledeći način. Određene, humane tumorne, ćelije ćelijske linije su postavljene (na oko 2 do 8 x 10<3>ćelija po bunaru) u 20 mikrolitru (µL) medijuma ćelijske kulture u ploči od 384-bunarčLća. Serija od 10 puta razblaženja ćelijski ciljanih molekula koji se testiraju su pripremljeni u odgovarajućem puferi, i 5 µL razblaženja ili kontrolnog pufera su dodati u postavljene ćelije. Kontrolni bunarčLći koji sadrže samo ćelijski kulturni medijum su korišćeni za osnovnu ispravku. Uzorci ćelije su inkubirani sa ćelijski ciljanim molekulima ili samo puferom za tri ili pet dana na 37°C i u atmosferi od pet procenata ugljen dioksida (CO2). Ukupni opstanak ćelija ili procentna održivost određena je korišćenjem luminescentnog očitavanja koristeći CellTiter-Glo® Analiza Luminescentne
2
Ćelijske Vitalnosti (G7573, Promega Corp, Madison, WI, U.S.) prema uputstvima proizvođDča.
Procenat Vijabilnosti eksperimentalnih bunarčLća je izračunata korišćenjem sledeće jednačine: (Test RLU -Prosečni Medijum RLU) / (Prosečne Ćelije samo RLU - Prosečni Medijum RLU) * 100. Zamišljen je logaritam koncentracije ćelijski ciljanog naspram Procentne održivosti od strane Prism (GraphPad Prism, San Diego, CA, U.S.), i log (inhibitor) versus odgovor (3 parametra) analiza je kroišćena za određivanje vrednosti poli maksimalne citotoksične (CD50) za testirani ćelijski ciljani molekul. CD50za svaki uzorak je izračunat i prikazan u Tabeli 10. Kada CD50vrednosti nisu u mogučnosti da se izračunaju na osnovu oblika krive tokom testiranja koncertacija, onda je maksimalna CD50vrednost zabeležena kao da je iznad maksimalne testirane vrednosti, npr., veća od 100 nM ("> 100.000 nM") ili 200 nM ("> 200.000 nM"), za uzorke koji nisu ubili 50% ćelija pri najvišoj, testiranoj, koncentraciji uzorka, npr., 100.000 nM ili 200.000 nM. Ako je vitalnost ćelije u testu bila približno 50% pri najvećoj testiranoj koncentraciji uzorka, onda CD50vrednost za taj molekul je zabeležena u Tabeli 10 kao otprilike maksimalna testirana koncentracija gde je vitalnost ćelije bila približno 50%, npr., "~ 100.000 nM." Kao što je rečeno u Primerima, molekul koji pokazuje CD50u roku od 10 puta od CD50za koji je izložen referentni molekul smatra se da pokazuje citotoksičnu aktivnost uporedivu sa onim referentnim molekulom.
Tabela 10. Primerni, De-Imunizovani. Otporni na Cepanje Proteaze, Efektorski Polipeptidi Shiga Toksina koji Pokazuju Snažnu Citotoksičnost
2
2
2
Vrednosti CD50za primerne, ćelijski ciljane molekule na SLT-1A-kombo kosturu prikazane su u Tabeli 10, a povezani podaci ispitivanja ćelije-ubijanja prikazani su na slikama 3-10. Ovi rezultati pokazuju rezultate ispitivanja ćelijskog ubijanja za najmanje trideset četiri, jedinstvena ćelijski ciljana molekula, a svaki od njih sadrži kombinaciju, de-imunizovanog, efektorskog polipeptida Shiga toksina SLT-1A-kombo(n) odabranog od najmanje dvadeset šest efektorskig polipeptida Shiga toksina (SEQ ID NO: 6-27 i 29-32). Trideset i dve od trideset četiri kombinacije, de-imunizovanih, efektorskih polipeptida Shiga toksina SLT-1A-kombo (0-12, 14-17, 19-21, 23-27 i 29-32), su prouzrokovali citotoksičnost, u kontekstu ćelijski ciljanog molekula, okarakterisanog sa vrednosti CD50jednake ili manje od 100 nM, dok dva ćelijski ciljana molekula, koji sadrže ili SLT-1A-kombo13 (SEQ ID NO: 19) i SLT-1 A-kombo18 (SEQ ID NO: 24), pokazuju citotoksičnost okarakterisanu sa vrednosti CD50veće od 100 nM prema dvema testiranim ćelijskim linijama (Tabela 10; Slike 6-7).
Rezultati prikazani u Tabeli 10 pokazuju da ćelijski ciljani molekuli koji sadrže SLT-1A-kombo0, SLT-1A-kombol, SLT-1A-kombo4, SLT-1A-kombo7, SLT-1A-kombo8, SLT-1A-kombo9, SLT-1A-kombo10, SLT-1A-kombo11, SLT-1A-kombo12, SLT-1A-kombo14, SLT-1A-kombo15, SLT-1A-kombo16, SLT-1A-kombo17, SLT-1A-kombo19 ili SLT -1A-kombo25 pokazuju snažne citotoksičnosti okarakterisane sa vrednosti CD50od 0.2 nM ili manje, zavisno od testirane ćelijske linije (Tabela 10; Slike 3-10). Citotoksičnosti većine efektorskih polipeptida Shiga toksina kombo(n) testirane kao komponenta ćelijski ciljanog molekula su uporedive sa citotoksičnostima SLT-1A-FR polipeptida (SEQ ID NO: 5) kao komponente srodnog, ćelijski ciljanog molekula (Tabela 10; Slike 3-7; 9-10). Na primer, citotoksičnost na bar jednom ćelijskom tipu testirana za bar jedan ćelijski ciljani molekul koji sadrži jedan od efektorskih polipeptida Shiga toksina kombo (0-2, 4, 7-8, 10, 12, 14-19, ili 23-26) su uporedive sa citotoksičnostima srodnih, ćelijski ciljanih molekula koji sadrže SLT-1A-FR polipeptid (SEQ ID NO: 5) (Tabela 10; Slike 3-7; 9-10).
Specifičnost citotoksičnosti primernih, ćelijski ciljanih molekula koji sadrže određene, kombinacione, de-imunizovane, efektorske polipeptide Shiga toksina SLT-1A-kombo(n) određene su korišćenjem analiza ciljanog negativnog ubijanja ćelija koje su poznate
2
stručnjacima. Analiza ciljanog biomolekula negativnog ubijanja ćelija identična je analizi pozitivnog ubijanja ćelije, osim za korišćeni ćelijski tip. Analiza ciljanog negativnog ubijanja ćelija izvedena je korišćenjem ćelija koje ne izražavaju značajne količine ekstraćelijskog ciljanog biomolekula vezanog sa visokim afinitetom odgovarajućeg vezujućeg regiona scFv(n) ćelijski ciljanog molekula koji se testira. Citotoksične specifičnosti primernih, ćelijski ciljanih molekula koji sadrže određene, kombinacije, de-imunizovanih, kostura efektorskih polipeptida Shiga toksina SLT-1A-kombo(n) određene su poređenjem rezultata iz analize ciljanog pozitivnog ubijanja ćelija sa rezultatima iz analize ciljanog negativnog ubijanja ćelija (videti npr. Tabelu 10; Slike 8-9). Citotoksični, ćelijski ciljani molekuli koji sadrže deimunizovane, efektorske polipeptide Shiga toksina SLT-1A-kombo (5-7, 14 ili 21) ili SLT-1A-FR (SEQ ID NO: 5) nisu ubili uporedne procente ciljanih negativnih ćelija u poređenju sa ciljanim pozitivnim ćelijama istovremeno, koncentracije ćelijski ciljanih molekula (Tabela 10; Slike 8-9).
C. Testiranje Aktivacije Kaspaze Indukovane sa Primernim, Ćelijski Ciljanim Molekulima koji Sadrže Efektorske Polipeptide Shiga Toksina SLT-1A-kombo(n)
Apoptoza je programirana ćelijska smrt koja uključuje degradaciju ćelijskih komponenti sa kaspazama. Apoptoza se može otkriti nadgledanjem aktivnosti efektorskih kaspaza 3 i 7, kao što je, npr., stanje aktivacije bilo kaspaze 3 ili kaspaze 7. Aktivacija kaspaze, primernih, ćelijski ciljanih molekula koji sadrže kombinaciju, de-imunizovanih, otpronih na cepanje proteaze, efektorskih polipeptida Shiga SLT-1A-kombo(n) predmetnog pronalaska je određena korišćenjem ciljanog biomolekula pozitivne ćelije, testa kaspazne aktivnosti poznate stručnjaku. Postupak analize ciljane pozitivne ćelije, aktivnosti kaspaze je analogna ranije opisanoj analizi ciljano pozitivno ubijanje ćelije.
Kataliztička aktivnost Shiga toskina može izazvati apoptozu Shiga toksin-intoksiranih, ćelija sisara preko intrizične putanje (videti npr., Inward C et al, J Infect 30: 213-8 (1995); Fujii J et al. Infect Immun 71: 2724-35 (2003); Jandhyala D et al, Curr Top Microbiol Immunol 357: 41-65 (2012); Tesh V, Curr Top Microbiol Immunol 357: 13778 (2012)). Kaspazna aktivnost se može koristiti kao očitavanje za aktiviranje apoptotskih mehanizama koji vode do ćelijske smrti (videti Pop C, Salvesen G, J Biol Chem 284: 21777-81 (2009); Nicholls S, Hyman B, Methods Enzymol 544: 251-69 (2014)). Potentnost i specifičnost aktivacije kaspaze indukovane kombinacijom, de-imunizovanih, otpornih na cepljenje proteaze, efektorskih polipeptida Shiga toksin SLT-1A-kombo7 i SLT-1A-kombo14 u kontekstu ćelijski ciljanih molekula su određene na sledeći način.
2 1
Kaspazna aktivacija ćelijski ciljanog molekula koji sadrže de-imunizovane, otporne na cepanje proteaze, skelete fektorskih polipeptida Shiga toksina određene su upotrebom ćelija koje na ćelijskoj površini ispoljavaju značajne količine ekstraćelijskog ciljanog biomolekula vezujućeg regiona scFv-1 ili scFv-6.
Analiza kaspazne aktivnosti je izvedena na sledeći način. Određene, humane tumorske, ćelijske linije ćelija su postavljene (na oko 2-8 x 10<3>ćelija po bunarčLću) u 20 mikrolitara (µL) medijuma ćelijske kulture u 384-bunarčLča ploče. Serija 10 puta razblaženja ćelijski ciljanih molekula koje treba da se testira su pripremljeni u odgovarajućem puferu, a dodato je 5 µL razblaženja ili kontrolnog pufera u postavljene ćelije. Kontrolni bunarčLći koji sadrže samo kulturni medijum ćelija su korišćeni za osnovnu korekciju. Uzorci ćelija su inkubirane sa ćelijski ciljanim molekulima ili samo sa puferom na 18-20 sati na 37°C i u atmosferi od pet procenata CO2. Kaspazna aktivnost je određena korišćenjem luminescentnog očitavanja pomoću Caspase-Glo 3/7® Test Vitalnosti Luminescentne Ćelije (Promega Corp, Madison, WI, U.S.) prema instrukcijama proizvođDča.
Količina aktivacije kaspaze u eksperimentalnim bunarčLćima je izračunata pomoću sledeće jednačine: ((Test RLU – Prosečni Medijum RLU) / (Prosečne Ćelije RLU – Prosečni Medijum RLU)) * 100. Logaritam koncentracije ćelijski ciljanog molekula nasuprot Kaspazne Aktivacije je prikazan u Prism (GraphPad Prism, San Diego, CA, U.S.) i log (agonist) versus odgovor (3 parametra) analiza je korišćena za svaki, testirani, ćelijski icljani molekul kako bi se izračunala vrednost polu maksimalne efektivne koncentracije (EC50) za kaspaznu aktivaciju u analizi (Slike 11-12; Tabela 11). Maksimalni procenat kaspazne aktivnosti (procenat aktivacije tokom kontrolnih merenja "samo ćelija") za svaki eksperiment (maksimalna aktivacija) je izračunat korišćenjem merenja kaspazne aktivacije iz uzoraka sa "samo ćelije" kao osnova (Tabela 11). EC50i maksimalna aktivnost za kaspaznu aktivaciju za primerne ćelijski ciljane molekule su prikazane u Tabeli 11.
Tabela 11. Primerni, De-Imunizovani, Otporni na Cepanje Proteaze, Ćelijski Ciljani Molekuli Koji Indukuju Aktivaciju Kaspaze
2 2
Aktivnost kaspaze u ciljanim ćelijama indukovane sa efektorskim polipeptidima Shiga toksina kombo 7 i 14, od kojih je svaki testiran kao komponenta ćelijski ciljanog molekula, bila je uporediva sa aktivnošću kaspaze indukove sa SLT-1A-FR polipeptidom (SEQ ID NO: 5) kao komponenta srodnog ćelijski ciljanog molekula (SEQ ID NO: 34 i SEK ID NO: 39, respektivno) za većinu testiranih ćelijskih linija (Tabela 11; Slike 11-12).
D. Endogeni Epitop koji Uništava Mutacije u Efektorskim Polipeptidima Shiga Toksina
Ovaj Primer pokazuje da efektorski polipeptidi Shiga toksin A Podjedinice mogu biti deimunizovani sa određenim skraćenjima i kombinacijama supstitucija amino kiselinskih ostataka. Uništenja i/ili amino kiselinske supstitucije su napravljene u pretpostavljene, B-ćelijske i/ili T-ćelijske epitope efektorskih polipeptida Shiga toksina izvedenih iz A Podjedinice Shiga-sličnog Toksina 1 (SLT-1A) kao što je navedeno u Tabeli 12. U ovom Primeru i u WO 2015/113005, mnoge mutacije su empirijski testirane na efekat(te) na efektorskoj funkciji Shiga toksina raznih efektorskih polipeptida Shiga toksina i ćelijski ciljanih molekula. Tabela 12 rezimira rezultate opisane u Primerima i u WO 2015/113005 gde amino kiselinska supstitucija ili kombinacija amino kiselinskih supstitucija nije sprečila pojavu moćnog nivoa efektorske funkcije Shiga toksina. Tabela 12 koristi šema numerisanja epitopskog regiona opisanu u Primeru 1 (videti Tabelu 7, supra), navodi bilo kakve promene B-ćelijskih epitopa koje je predvidio BcePred softver.
Tabela 12. Supstitucije i Kombinacije Supstitucija Empirijski Verifikovane kako se ne bi Sprečila Egzibicija Snažne(ih) Efektorske(ih) Funkcije(a) Shiga Toksina
2
24
2
2
2
2
U epitopskim regionima 1-5 i 7-8, različite amino kiselinske supstitucije su napravljene i testirane (videti Tabelu 12). U epitopskom regionu #1 (videti Tabelu 7), lizin izvorno pozicioniran na poziciji 1 u zrelim A Podjedinicama Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO:1) i Shiga toksina (SEQ ID NO:2) je mutiran u alanin (K1A) i metionin (KIM)). U epitopskom regionu #1, treonin izvorno pozicioniran na poziciji 4 u zrelim A Podjedinicama Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO: 1) i Shiga toksina (SEQ ID NO:2) je mutiran u izoleucin (T4I). U epitopskom regionu #1, aspartat izvorno pozicioniran na poziciji 6 u zrelim A Podjedinicama Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO: 1) i Shiga toksina (SEQ ID NO:2) je mutiran u arginin (D6R). U epitopskom regionu #1, serin izvorno pozicioniran na poziciji 8 u zrelim A Podjedinicama Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO: 1) i Shiga toksina (SEQ ID NO:2) je mutiran u izoleucin (S8I). U epitopskom regionu #1, treonin izvorno pozicioniran na poziciji 9 u zrelim A Podjedinicama Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO: 1) i Shiga toksina (SEQ ID NO:2) je mutiran izoleucin (T9I) i u valin (T9V). U epitopskom regionu # 1, lizin izvorno pozicioniran na poziciji 11 u zrelim A Podjedinicama Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO: 1) i Shiga toksina (SEQ ID NO:2) je mutiran u alanin (Kl 1A) i u histidin (K11H). U epitopskom regionu #1, treonin izvorno pozicioniran na poziciji 12 u zrelim A Podjedinicama Shigasličnog toksina 1 (SEQ ID NO:1) i Shiga toksina (SEQ ID NO:2) je mutiran u lizin (T12K).
U epitopskom regionu #2 (videti Tabelu 7), serin izvorno pozicioniran na poziciji 33 u zrelim A Podjedinicama Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO: 1) i Shiga toksina (SEQ ID NO:2) je mutiran u izoleucin (S33I).
U epitopskom regionu #3 (videti Tabelu 7), serin izvorno pozicioniran na poziciji 43 u zreloj A Podjedinici Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO:1) je mutiran u asparagin (S43N). U epitopskom regionu #3, glicin izvorno pozicioniran na poziciji 44 u zreloj A Podjedinici Shigasličnog toksina 1 (SEQ ID NO: 1) je mutiran u leucin (G44L). U epitopskom regionu #3, serin izvorno pozicioniran na poziciji 45 u zreloj A Podjedinici Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO: 1) je mutiran u valin (S45V) i u izoleucin (S45I). U epitopskom regionu #3, treonin izvorno pozicioniran na poziciji 45 u zreloj A Podjedinici Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID
2
NO:2) je mutiran u valin (T45V) i u izoleucin (T45I). U epitopskom regionu #3, glicin izvorno pozicioniran na poziciji 46 u zreloj A Podjedinici Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO:1) j emutiran u prolin (G46P). U epitopskom regionu #3, aspartat izvorno pozicioniran na poziciji 47 u zreloj A Podjedinici Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO: 1) je mutiran u glicin (D47G) i u metionin (D47M). U epitopskom regionu #3, asparagin izvorno pozicioniran na poziciji 48 u zreloj A Podjedinici Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO:1) je mutiran u valin (N48V) i u fenilalanin (N48F).
U epitopskom regionu #4 (videti Tabelu 7), aspartat izvorno pozicioniran na poziciji 53 u zreloj A Podjedinici Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO:1) i Shiga toksina (SEQ ID NO:2) je mutiran u alanin (D53A), glicin (D53G), i asparagin (D53N). D53 ostatak je predviđen od strane Epitopia webservera da bude izložen rastvaraču i ima imunogenu sklanu vrednost od 5 ili "više." U epitopskom regionu #4, valin izvorno pozicioniran na poziciji 54 u zreloj A Podjedinici Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO: 1) i Shiga toksina (SEQ ID NO:2) je mutiran u izoleucin (V54I). U epitopskom regionu #4, arginin izvorno pozicioniran na poziciji 55 u zreloj A Podjedinici Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO: 1) i Shiga toksina (SEQ ID NO:2) j emutiran u alanin (R55A), u valin (R55V), i u leucin (R55L). U epitopskom regionu #4, glicin izvorno pozicioniran na poziciji 56 u zreloj A Podjedinici Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO: 1) i Shiga toksina (SEQ ID NO:2) je mutiran u prolin (G56P). U epitopskom regionu #4, izoleucin izvorno pozicioniran na poziciji 57 u zreloj A Podjedinici Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO: 1) i Shiga toksina (SEQ ID NO:2) je mutiran u metionin (D57M) i u fenilalanin (D57F). U epitopskom regionu #4, aspartat izvorno pozicioniran na poziciji 58 u zreloj A Podjedinici Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO: 1) i Shiga toksina (SEQ ID NO:2) je mutiran u alanin (D58A), u valin (D58V), i u fenilalanin (D58F). U epitopskom regionu #4, prolin izvorno pozicioniran na poziciji 59 u zreloj A Podjedinici Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO: 1) i Shiga toksina (SEQ ID NO:2) je mutiran u alanin (P59A). U epitopskom regionu #4, glutamat izvorno pozicioniran na poziciji 60 u zreloj A Podjedinici Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO: 1) i Shiga toksina (SEQ ID NO:2) je mutiran u izoleucin (E60I), u treonin (E60T), i u arginin (E60R). U epitopskom regionu #4, glutamat izvorno pozicioniran na poziciji 61 u zreloj A Podjedinici Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO: 1) i Shiga toksina (SEQ ID NO:2) je mutiran u alanin (E61A), u valin (E61V), i u leucin (E61L). U epitopskom regionu #4, glicin izvorno pozicioniran na poziciji 62 u zreloj A Podjedinici Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO: 1) i Shiga toksina (SEQ ID NO:2) je mutiran u alanin (G62A).
U epitopskom regionu #5 (videti Tabelu 7), aspartat izvorno pozicioniran na poziciji 94 u zreloj A Podjedinici Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO:1) i Shiga toksina (SEQ ID NO:2) je
2
mutiran u alanin (D94A). U epitopskom regionu #5, serin izvorno pozicioniran na poziciji 96 u zreloj A Podjedinici Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO: 1) i Shiga toksina (SEQ ID NO:2) je mutiran u izoleucin (S96I). U epitopskom regionu #5, treonin izvorno pozicioniran na poziciji 104 u zreloj A Podjedinici Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO: 1) i Shiga toksina (SEQ ID NO:2) je mutiran u asparagin (T104N). U epitopskom regionu #5, alanin izvorno pozicioniran na poziciji 105 u zreloj A Podjedinici Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO: 1) i Shiga toksina (SEQ ID NO:2) je mutiran u leucin (A105L). U epitopskom regionu #5, treonin izvorno pozicioniran na poziciji 107 u zreloj A Podjedinici Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO:1) i Shiga toksina (SEQ ID NO:2) je mutiran u prolin (T107P). U epitopskom regionu #5, leucin izvorno pozicioniran na poziciji 108 u zreloj A Podjedinici Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO: 1) i Shiga toksina (SEQ ID NO:2) je mutiran metionin (L108M). U epitopskom regionu #5, serin izvorno pozicioniran na poziciji 109 u zreloj A Podjedinici Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO:1) i Shiga toksina (SEQ ID NO:2) je mutiran u valin (SI09V). U epitopskom regionu #5, glicin izvorno pozicioniran na poziciji 110 u zreloj A Podjedinici Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO: 1) i Shiga toksina (SEQ ID NO:2) je mutiran u alanin (Gl 10A). U epitopskom regionu #5, aspartat izvorno pozicioniran na poziciji 111 u zreloj A Podjedinici Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO: 1) i Shiga toksina (SEQ ID NO:2) je mutiran u treonin (Dl 1 IT). U epitopskom regionu #5, serin izvorno pozicioniran na poziciji 112 u zreloj A Podjedinici Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO: 1) i Shiga toksina (SEQ ID NO:2) je mutiran u valin (SI 12V).
U epitopskom regionu #6 (videti Tabelu 7), aspartat izvorno pozicioniran na poziciji 141 u zreloj A Podjedinici Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO:1) i Shiga toksina (SEQ ID NO:2) je mutiran u alanin (D141A). U epitopskom regionu #6, glicin izvorno pozicioniran na poziciji 147 u zreloj A Podjedinici Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO: 1) i Shiga toksina (SEQ ID NO:2) je mutiran u alanin (G147A).
U epitopskom regionu #7 (videti Tabelu 7), arginin izvorno pozicioniran na poziciji 179 u zreloj A Podjedinici Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO:1) i Shiga toksina (SEQ ID NO:2) je mutiran u alanin (R179A). Ovaj R179 ostatak je predviđen od strane Epitopia webservera da bude izložen i ima vrednost imunogenosti od 5 ili "više." U epitopskom regionu #7 (videti Tabela 7), treonin izvorno pozicioniran na poziciji 180 u zreloj A Podjedinici Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO:1) i Shiga toksina (SEQ ID NO:2) je mutiran u glicin (T180G). U epitopskom regionu #7 (videti Tabelu 7), treonin izvorno pozicioniran na poziciji 181 u zreloj A Podjedinici Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO: 1) i Shiga toksina (SEQ ID NO:2) je mutiran u izoleucin (Tl811). U epitopskom regionu #7 (videti Tabela 7), aspartat izvorno
2 1
pozicioniran na poziciji 183 u zreloj A Podjedinici Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO: 1) i Shiga toksina (SEQ ID NO:2) je mutiran u alanin (D183A) i u glicin (D183G). U epitopskom regionu #7, aspartat izvorno pozicioniran na poziciji 184 u zreloj A Podjedinici Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO: 1) i Shiga toksina (SEQ ID NO:2) je mutiran u alanin (D184A) ili fenilalanin (D184F). U epitopskom regionu #7 (videti Tabela 7), leucin izvorno pozicioniran na poziciji 185 u zreloj A Podjedinici Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO: 1) i Shiga toksina (SEQ ID NO:2) je mutiran u valin (L185V) ili aspartat (L185D). U epitopskom regionu #7, serin izvorno pozicioniran na poziciji 186 u zreloj A Podjedinici Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO:1) i Shiga toksina (SEQ ID NO:2) je mutiran u alanin (S186A) i u fenilalanin (S186F). U epitopskom regionu #7, glicin izvorno pozicioniran na poziciji 187 u zreloj A Podjedinici Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO:1) i Shiga toksina (SEQ ID NO:2) je mutiran u alanin (G187A) i u treonin (G187T). U epitopskom regionu #7, arginin izvorno pozicioniran na poziciji 188 u zreloj A Podjedinici Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO: 1) i Shiga toksina (SEQ ID NO:2) je mutiran u alanin (R188A) i u leucin (R188L). U epitopskom regionu #7, serin izvorno pozicioniran na poziciji 189 u zreloj A Podjedinici Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO: 1) i Shiga toksina (SEQ ID NO:2) je mutiran u alanin (S189A).
U epitopskom regionu #8 (videti Tabelu 7), arginin izvorno pozicioniran na poziciji 248 u zreloj A Podjedinici Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO:1) i Shiga toksina (SEQ ID NO:2) je mutiran u alanin (R248A). U epitopskom regionu #8, arginin izvorno pozicioniran na poziciji 251 u zreloj A Podjedinici Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO: 1) i Shiga toksina (SEQ ID NO:2) je mutiran u alanin (R251A).
Leucin izvorno pozicioniran na poziciji 49 u zreloj A Podjedinici Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO: 1) i Shiga toksina (SEQ ID NO:2) je mutiran u alanin (L49A). Ovaj L49 ostatak je predviđen od strane Epitopia webservera da bude izložen rastvaraču i ima vrednost imunogenosti od 4 i prisutan je u T-ćelijskom epitopu #2 (videti Tabelu 7). Glutamat izvorno pozicioniran na poziciji 198 u zreloj A Podjedinici Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO:1) i Shiga toksina (SEQ ID NO:2) je mutiran u alanin (D198A). Ovaj D198 ostatak je predviđen od strane Epitopia webservera da bude izložen rastvaraču i ima vrednost imunogenosti od 5 ili "višu." Arginin izvorno pozicioniran na poziciji 205 u zreloj A Podjedinici Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO: 1) i Shiga toksina (SEQ ID NO:2) je mutiran u alanin (R205A). Ovaj R205 ostatak je predviđen od strane Epitopia webservera da bude izložen rastvaraču i ima vrednost imunogenosti od 5 ili "više."
2 2
U T-ćelijskim epitopima #1 do #6, različite amino kiselinske supstitucije su napravljene i testirane (videti Tabelu 12).
U T-ćelijskom epitopu #1 (videti Tabelu 7), treonin izvorno pozicioniran na poziciji 4 u zreloj A Podjedinici Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO:1) i Shiga toksina (SEQ ID NO:2) je mutiran u izoleucin (T4I), aspartat izvorno pozicioniran na poziciji 6 u zreloj A Podjedinici Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO: 1) i Shiga toksina (SEQ ID NO:2) je mutiran u arginin (D6R), serin izvorno pozicioniran na poziciji 8 u zreloj A Podjedinici Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO:1) i Shiga toksina (SEQ ID NO:2) je mutiran u izoleucin (S8I), treonin izvorno pozicioniran na poziciji 9 u zreloj A Podjedinici Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO:1) i Shiga toksina (SEQ ID NO:2) je mutiran u izoleucin (T9I) i u valin (T9V), lizin izvorno pozicioniran na poziciji 11 u zreloj A Podjedinici Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO: 1) i Shiga toksina (SEQ ID NO:2) je mutiran u alanin (Kl 1 A) i u histidin (Kl 1H), treonin izvorno pozicioniran na poziciji 12 u zreloj A Podjedinici Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO: 1) i Shiga toksina (SEQ ID NO:2) je mutiran u lizin (T12K), i serin izvorno pozicioniran na poziciji 33 u zreloj A Podjedinici Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO: 1) i Shiga toksina (SEQ ID NO:2) je mutiran u izoleucin (S33I).
U T-ćelijskom epitopu #2 (videti Tabelu 7), serin izvorno pozicioniran na poziciji 43 u zreloj A Podjedinici Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO:1) je mutiran u asparagin (S43N); glicin izvorno pozicioniran na poziciji 44 u zreloj A Podjedinici Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO: 1) je mutiran u leucin (G44L); serin izvorno pozicioniran na poziciji 45 u zreloj A Podjedinici Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO: 1) je mutiran u valin (S45V) i u izoleucin (S45I); glicin izvorno pozicioniran na poziciji 46 u zreloj A Podjedinici Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO: 1) je mutiran u prolin (G46P); aspartat izvorno pozicioniran na poziciji 47 u zreloj A Podjedinici Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO: 1) je mutiran u glicin (D47G) i u metionin (D47M); asparagin izvorno pozicioniran na poziciji 48 u zreloj A Podjedinici Shigasličnog toksina 1 (SEQ ID NO:1) je mutiran u valin (N48V) i u fenilalanin (N48F); fenilalanin izvorno pozicioniran na poziciji 50 u zreloj A Podjedinici Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO:1) i Shiga toksina (SEQ ID NO:2) je mutiran u alanin (F50T); alanin izvorno pozicioniran na poziciji 51 u zreloj A Podjedinici Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO:1) i Shiga toksina (SEQ ID NO:2) je mutiran u valin (A51V); aspartat izvorno pozicioniran na poziciji 53 u zreloj A Podjedinici Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO:1) i Shiga toksina (SEQ ID NO:2) je mutiran u alanin (D53A), glicin (D53G), i asparagin (D53N); valin izvorno pozicioniran na poziciji 56 u zreloj A Podjedinici Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO:1) i Shiga toksina (SEQ ID NO:2) je mutiran u leucin (V54L); arginin izvorno pozicioniran na poziciji 55 u zreloj A
2
Podjedinici Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO:1) i Shiga toksina (SEQ ID NO:2) je mutiran u alanin (R55A), u valin (R55V), i u leucin (R55L); glicin izvorno pozicioniran na poziciji 56 u zreloj A Podjedinici Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO:1) i Shiga toksina (SEQ ID NO:2) je mutiran u prolin (G56P); izoleucin izvorno pozicioniran na poziciji 57 u zreloj A Podjedinici Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO:1) i Shiga toksina (SEQ ID NO:2) je mutiran u metionin (D57M) i u fenilalanin (D57F); aspartat izvorno pozicioniran na poziciji 58 u zreloj A Podjedinici Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO:1) i Shiga toksina (SEQ ID NO:2) je mutiran u alanin (D58A), u valin (D58V), i u fenilalanin (D58F); prolin izvorno pozicioniran na poziciji 59 u zreloj A Podjedinici Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO:1) i Shiga toksina (SEQ ID NO:2) je mutiran u alanin (P59A); glutamat izvorno pozicioniran na poziciji 60 u zreloj A Podjedinici Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO:1) i Shiga toksina (SEQ ID NO:2) je mutiran u izoleucin (E60I), u treonin (E60T), i u arginin (E60R); glutamat izvorno pozicioniran na poziciji 61 u zreloj A Podjedinici Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO:1) i Shiga toksina (SEQ ID NO:2) je mutiran u alanin (E61A), u valin (E61V), i u leucin (E61L); glicin izvorno pozicioniran na poziciji 62 u zreloj A Podjedinici Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO:1) i Shiga toksina (SEQ ID NO:2) je mutiran u alanin (G62A).
U T-ćelijskom epitopu #3 (videti Tabelu 7), aspartat izvorno pozicioniran na poziciji 94 u zreloj A Podjedinici Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO:1) i Shiga toksina (SEQ ID NO:2) je mutiran u alanin (D94A), i serin izvorno pozicioniran na poziciji 96 u zreloj A Podjedinici Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO:1) i Shiga toksina (SEQ ID NO:2) je mutiran u izoleucin (S96I).
U T-ćelijskom epitopu #4 (videti Tabelu 7), glicin izvorno pozicioniran na poziciji 147 u zreloj A Podjedinici Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO:1) i Shiga toksina (SEQ ID NO:2) je mutiran u alanin (G147A).
U T-ćelijskom epitopu #5 (videti Tabelu 7), arginin izvorno pozicioniran na poziciji 179 u zreloj A Podjedinici Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO:1) i Shiga toksina (SEQ ID NO:2) je mutiran u alanin (R179A), treonin izvorno pozicioniran na poziciji 180 u zreloj A Podjedinici Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO:1) i Shiga toksina (SEQ ID NO:2) je mutiran u glicin (T180G), treonin izvorno pozicioniran na poziciji 181 u zreloj A Podjedinici Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO:1) i Shiga toksina (SEQ ID NO:2) je mutiran u izoleucin (T181I), i aspartat izvorno pozicioniran na poziciji 183 u zreloj A Podjedinici Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO: 1) i Shiga toksina (SEQ ID NO:2) je mutiran u alanin (D183A) i u glicin (D183G).
2 4
U T-ćelijskom epitopu #6 (videti Tabelu 7), cistein izvorno pozicioniran na poziciji 242 u zreloj A Podjedinici Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO:1) i Shiga toksina (SEQ ID NO:2) je mutiran u serin (C242S), arginin izvorno pozicioniran na poziciji 248 u zreloj A Podjedinici Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO: 1) i Shiga toksina (SEQ ID NO:2) je mutiran u alanin (R248A), i arginin izvorno pozicioniran na poziciji 251 u zreloj A Podjedinici Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO: 1) i Shiga toksina (SEQ ID NO:2) je mutiran u alanin (R251 A).
Pored toga, skraćivanje karboksi-kraja SLT-1A sa amino kiselinama 1-251 SEQ ID NO: 1 uklonilo je poslednja dva epitopska regiona (Tabela 7, # 9 i # 10), poslednji CD4 T-ćelijski epitop (Tabela 6 , # 7), i najveće diskontinuirano odstupanje B-ćelijskih epitopa koje je predvidio ElliPro (289-293). Pored toga, skraćenje na položaju 251 remeti T-ćelije epitop # 6 i epitopski region # 8 (Tabela 7).
Primerni, de-imunizovani, efektorski polipeptid Shiga toksina u ovom Primeru je SLT-1A-kombo22 (SEQ ID NO:28), koji ima sedam, supstitucija amino kiselinskih ostataka u odnosu na divlji soj Shiga-sličnog toksina 1A Podjedinice (SEQ ID NO: 1) i sve ove supstitucije su predviđene da unište endogene epitope. Prema oznaka u Tabeli 8, efektorski polipeptid Shiga toksina SLT-1A-kombo22 sadrži supstituciju uništenog epitopskog regiona 4; supstituciju uništenog epitopskog regiona 5; supstituciju uništenog epitopskog regiona 6; supstituciju uništenog epitopskog regiona 7; supstituciju uništenog epitopskog regiona 8; epitopske regione 8, 9, i 10 uništene skraćivanjem; i supstitucije uništene furinskim mestom cepanja na karboksi kraju A1 fragmentno izvedenog regiona. Dodatno, SLT-1A-kombo22 sadrži supstituciju uništenog T-ćelijskog epitopa #2, supstituciju uništenog T-ćelijskog epitopa #4, supstituciju uništenog epitopa #6, i T-ćelijske epitope #6 i #7 uništeni skraćivanjem.
E. Testiranje za Redukcije u Antigenosti Primernih, Efektorskih Polipeptida Shiga Toksina SLT-1A-kombo(n) Koristeći ELISA i Western Blot Analize
Rutinski postupci mogu se koristiti za procenu relativne antigenosti efektorskih polipeptida Shiga toksina u kontekstu ćelijski ciljanih molekula (videti npr. WO 2015/113005; WO 2015/113007). Antigenost primernih, ćelijski ciljanih molekula koji sadrže određene, kombinacije, de-imunizovanih, otpornih na cepanje proteaze, efektorskih polipeptida Shiga toksina SLT-1A-kombo(n) je procenjena sa Western blots i ELISAs koristeći oba i poliklonska i monoklonska antitela koja se vezuju sa visokim afinitetom za divlji soj Shiga-
2
sličnog toksina A1 fragmenta (SLT-1A1). Ćelijski ciljani molekul SLT-1A-FR::scFv-1 (SEQ ID NO:34) je korišćen kao referentni molekul.
Western analize koje su ovde korišćene utvrđuju relativne antigenosti pod denaturacijskim uslovima, dok se ELISA analizama koje su ovde korišćene meri relativna antigenost pod prirodnim uslovima savijanja proteina.
Za Western analize, primerni, ćelijski ciljani molekuli koji sadrže efektorske polieptide Shiga toksina SLT-1A-kombo7, SLT-1A-kombo10, ili SLT-1A-kombo14 su testirani i upoređivani sa razultatima za referentni molekul SLT-1A-FR: :scFv-1. Uzorci gore navedenih molekula su napunjeni u jednakim količinana kako bi se zamenili, 4-20% SDS poliakrilamidni gelovi (Lonza, Basel, CH) i elektroforezovao u denaturacijskim uslovima. Rezultujući gelovi su ili analizirani sa Coomassie bojenjem ili prebačeni u polivinil difluorid (PVDF) membrane koristeći iBlot® (Life Technologies, Carlsbad, CA, U.S.) sistem prema uputstvima proizvođDča. Rezultujuće membrane su sondirane pod standardnim uslovima koristeći sledeća antitela: mišiji monoklon α-Stx (mAbl) (BEINR-867 BEI Resources, Manassas, VA, U.S.; unakrsno reaktivan sa Shiga-sličnim toksinom 1 A Podjedinice), zečije poliklonalno antitelo α-SLT-1A (pAbl) (Harlan Laboratories, Inc. Indianapolis, IN, U.S., prilagođena proizvodnja antitela podignuta protiv divljeg soja SLT-1A1, i zečje poliklonalno antitelo α-SLT-1A (pAb2) (Genscript, Piscataway, NJ, U.S., prilagođena proizvodnja antitela) koja je podignuta protiv peptida iz divljeg soja Shiga toksina A1 fragmenta: RGIDPEEGRFNN i HGQDSVRVGR. Peptidna sekvenca RGIDPEEGRFNN je locirana na amino kiselinama 55-66, a peptidna sekvenca HGQDSVRVGR je locirana na 214-223 u SLT-1A i StxA. Antitela vezana za membranu otkrivena su korišćenjem standardnih uslova i, prema potrebi, korišćenjem ren peroksidaze (HRP) - konjugovana sekundarna antitela (kozji anti-zečiji-HRP ili koziji anti-mišji-HRP, Thermo Scientific, Rockford, IL, U.S.). Slika 13 pokazuje Western blots sa trakama gelova i/ili membrana numerisanih i slikom legende označene sa istim odgovarajućim numerisanjem koji regioni efektroskog polipeptida Shiga toksin su bili prisutni u ćelijski ciljanom molekulu učitanom u svaku traku. Coomassie obojene trake prikazane su kao uzorci kontrole punjenja.
Slika 13 pokazuje da, pod denaturisanim uslovima, primerni ćelijski ciljani molekuli SLT-1A-kombo7::scFv-1, SLT-1A-kombo10::scFv-1, i SLT-1A-kombo14::scFv-1 pokazuju povećanu antigenost kada se poredi sa SLT-1A-FR::scFv-1 u ovoj analizi. Ovi rezultati pokazuju da SLT-1A-kombo7, SLT-1 A-kombo10, i SLT-1A-kombo14 imaju povećanu antigenost kada se poredi sa SLT-1A-FR, ili sa interferncijom SLT-1A-WT, kada su na isti način povezani sa istim ciljanim domenom (scFv-1) koristeći isti linker. Dodatno, rezultati prikazanu na Slici 13
2
predlažu da SLT-1A-kombo7 ima smanjenu relativnu antigenost kada se poredi sa SLT-1A-kombo10 i SLT-1A-kombo14 u ovoj analizi pod testiranim uslovima.
Standardna ELISA je korišćena kako bi se izmerila sposobnost α-SLT-1A mAb1 da prepozna razne de-imunizovane, efektorske polipeptide Shiga toksina, svaki sa višestrukim epitopskim regionima uništeni, u kontekstu ćelijski ciljanog molekula. Sposobnost svakog ćelijski ciljanog molekula testiranog da se vezuje za ciljani biomolekul njegovog scFv vezujućeg regiona je korišćen u ovoj analizi. BunarčLći Nunc MaxiSorp® ploča u fosfatnom puferizovanom slanim rastvoru (IX PBS) (Hyclone Brand, Fisher Scientific, Waltham, MA, U.S.) su presvučeni sa rekombinantnim, humanim ciljanim biomolekulom vezujućeg regiona (scFv-1). Ploče su inkubirane preko noći na 4°C. BunarčLći su isprani sa IX PBS 0.05% Tween-20 (PBS-T), a ne-specifično vezivanje je blokirano sa inkubiranjem bunarčLća sa 3% mlekom u PBS-T na jedan sat na sobnoj temperaturi. Primerni ćelijski ciljani molekuli su dodati bunarčLćima, gde određeni bunarčLći primaju samo jedan ćelijski ciljani molkeul koji sadrži jednu, kombinaciju, de-imunizovanog, efektorskog polieptida Shiga toksina SLT-1A-kombo(n): SLT-1A-kombo7::scFv-1, SLT-1A-kombo10::scFv-1, ili SLT-1A-kombo14::scFv-1. Dodatno, ćelijski ciljani molekul SLT-1A-FR::scFv-1 je dodat u određene bunarčLće kai referentni molekul. Svu ćelijski ciljani molekuli su dodati u bunarčLće kao koncentracija određena da bude iznad maksimuma vezivanja (Bmax) koji je prethodno određen sa ELISA koristeći Protein L konjugovan u HRP kako bi se detektovao SLT-1A-FR::scFv-1, čime se omogućava da se 100% raspoloživih ciljanih biomolekula veže sa uzorkom ćelijski ciljanog molekula, koji je u višku. Ploče su inkubirane na sobnoj temperaturi na jedan sat kako bi dozvolili ćelijski ciljanom molekulu da se veže za ciljani biomolekul pod ne-denaturisanim uslovima. BunarčLći su isprani sa PBS-T i potom inkubirani sa anti-SxtA mišijim monoklonskim antitelom konjugovanim u HRP (anti-SLT-1A mAbl-HRP) ili zečijim poliklonskim antitelom α-SLT-1A konjugovanim u HRP (anti-SLT-1A pAb2-HRP) ili protein L-HRP (koji se veže za scFv-1 i koji je korišćen kao kontrolno punjenje) na 1 sat na sobnoj temperaturi. BunarčLći su isprani u PBS-T potom inkubirani sa Pierce TMB Ultra (Thermo Scientific Inc., Rockford, IL, U.S.). Reakcija je zaustavljena sa 250 mM hlorovodonične kiseline (HC1). HRP aktivnost je detektovana u bunarčLćima dodavanjem hromogenskog HRP supstrata a potom detektovana svetlosna emisija, koja je rezultat hemiluminiscencije, korišćenjem uređaja za očitavanje ploča za merenje apsorbancije (Abs) svetlosti podešene na talasnu dužinu od 450 nanometara (nm).
Izmerene vrednosti apsorpcije korigovane su za pozadinu sa oduzimanjem vrednosti apsorbancije za obložene, blokirane bunarčLće inkubirane samo sa PBS umesto bilo kog
2
uzorka ćelijski ciljanog molekula. Da bi se normalizovali signali iz tri različita antitela za detekciju, signali iz SLT-1A-FR::scFv1 su postavljeni na 100%, a relativni signali kao procenat ove kontrole određeni su za svaki uzorak ćelijski ciljanog molekula testiran od strane izračunavanje (Abs signal uzorka / Prosečni Abs signal kontrole) x 100. ELISA rezultati su prikazani na Slici 14.
Slika 14 pokazuje da, pod izvornim uslovima, primerni ćelijski ciljani molekuli SLT-1A-kombo7::scFv-1 (SEQ ID NO:44), SLT-1A-kombo10::scFv-1 (SEQ ID NO:47), ili SLT-1A-kombo14::scFv-1 (SEQ ID NO:50) pokazuju povećanu antigenost kada se poredi sa SLT-1A-FR::scFv-1 (SEQ ID NO:34). Ovi rezultati pokazuju da SLT-1A-kombo7, SLT-1A-kombo10, i SLT-1A-kombo14 pokazuju povećanu antigenost kada se poredi sa SLT-1 A-FR (SEQ ID NO:5), ili sa interferencijom ili SLT-1A1-WT (SEQ ID NO:4), kada su povezani na isti način za isti ciljani domen (scFv-1) koristeći isti linker. Dodatno, rezultati prikazani na Slici 14 sugerišu da SLT-1A-kombo7 i SLT-1A-kombo14 imaju smanjenu relativnu antigenost kada se poredi sa SLT-1A-kombo10 pod izvorni uslovima ove ELISA analize.
F. Testiranje CD4+ T-Ćelijske De-Imunizacije Primernih, Efektorskih Polipeptida Shiga Toksina SLT-1A-kombo(n)
Uništavanje u predviđenim CD4+ T-ćelijskim epitopskim regionima su testirana za redukcije u CD4+ T-ćelijskom imunogenosti koristeći analize humane CD4+ T-ćelijske proliferacije u prisustvu eksogeno primenjenih polipeptida i analiza humane CD4+ dendritske T-ćelijske stimulacije u prisustvu humanih monocita tretiranih sa primenjenim polipeptidima.
Analize T-ćelijske proliferacije koje su poznate stručnjaku se koriste za testiranje efikasnosti CD4+ T-ćelijske epitopske de-imunizacije efektorskih polipeptida Shiga toksina SLT-1A-kombo(n). Analiza T-ćelijske proliferacije ovog Primera uključuje označavanje CD4+ T-ćelija a potom merenje promena u proliferaciji koristeći postupke protočne citometrije u odgovoru na primenu različitih peptida izvedenih iz ili efektorskog polipeptida Shiga toksina kombo(n) ili referentnog molekula, kao što je, npr., divlji soj Shiga toksin A1 fragmenta, SLT-1 A-FR, i/ili srodnog ćelijski ciljanog molekula koji sadrži gore navedeno.
Serije preklapajućih peptida izvedenih iz izabranog molekula su sintetizovane i testirane u analizi CFSE CD4+ T-ćelijske proliferacije (Prolmmune Inc., Sarasota, FL, U.S). Humane CD8+ T-ćelije osiromašene, mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) označene sa CFSE se uzgajaju sa 5 µM svakog od peptida od interesa tokom sedam dana u šest ponovljenih
2
bunarčića. Svaka ploča za analizu sadrži set neobrađenih kontrolnih bunarčića. Analiza takođe uključuje referentne antigene kontrole, koje sadrže sintetičke peptide za poznate MHC klase II antigene ili agretope.
Istrošeni CD8+ T-ćelije, PBMCs koji se razmnožavaju kao odgovor na primenjeni peptid pokazaće smanjenje intenziteta fluorescencije CFSE, mereno direktno protočnom citometrijom. Za izvornu analizu T-ćelija, Procenat Stimulacije iznad pozadine određuje se za svaki stimulisani uzorak, kroz upoređivanje sa rezultatima nestimulisanog uzorka, kao što je rangiranje s obzirom na fluorescentni signal, kao negativan, prigušen ili visok. Brojanja za CD4+ CFSE T-ćelijske dim populacije u svakom uzorku izražena su u odnosu na ukupnu CD4+ T-ćelijsku populaciju. Replicirane vrednosti koriste se za izračunavanje procenatne stimulacije iznad pozadine (udeo CD4+ T-ćelijskih CFSE dim ćelija sa antigenom stimulacijom, minus udeo CD4 T-ćelijskih CFSE dim ćelija bez antigenske stimulacije). Srednja i standardna greška srednje vrijednosti izračunavaju se iz repliciranih vrijednosti. Rezultat se smatra „pozitivnim“ ako je Procentualna Stimulacija iznad pozadine veća od 0.5%, a takođe veća od dvostruke od standardne greške iznad pozadine. Da bi se omogućila za poređenje peptida, izračunat je Indeks Odgovora. Ovaj indeks zasnovan je na umnožavanju veličine odgovora (Procenatna Stimulacija iznad pozadine) za svaki peptid sa brojem reaktorskih davalaca (Procenat Antigenosti) za svaki peptid.
G. Određivanje Relativne, CD4+ T-Ćelijske Imunogenosti Primernih, Efektorskih Polipeptida Shiga Toksina SLT-1A-kombo(n)
Relativna CD4+ T-ćelijska imunogenost molekula pronalaska je određena korišćenjem sledeće dendritične ćelijske (DC) T-ćelijske proliferacione analize. Ova DC T-ćelijska analiza meri CD4+ T-ćelijske odgovore na egzogeno primenjene polipeptide ili proteine. DC T-ćelijska analiza se izvodi korišćenjem DC-T usluge analize Prolmmune-a za određivanje relativnih nivoa CD4+ T-ćelijski izvedene imunogenosti između proteina i ćelijski ciljanih molekula predmetnog pronalaska u poređenju sa referentnim molekulima. DC T-ćelijska analiza ovog Primera uključuje testiranje humanih dendritičnih ćelija za antigen prezentaciju peptida izvedenih iz primenjenih uzoraka polipeptida, proteina ili ćelijski ciljanog molekula.
Ukratko, zdravo ljudsko tkivo davaoca koristi se za izolovanje tipiziranih uzoraka na osnovu MHC tipizacije tkiva klase II visoke rezolucije. Koristi se kohorta od 20, 40 ili 50 davalaca. Prvo, monociti dobijeni od humanog domora PBMCs se kultivisani u definisanom medijumu da bi se stvorile nezrele dendritičke ćelije. Zatim, nezrele dendritičke ćelije se stimulišu
2
dobro definisanim kontrolnim antigenom i indukuju u zreliji fenotip sa drugom kulturom u definisanom medijumu. Dalje, CD8+ T-ćelijski osiromašeni donor PBMCs iz istog uzorka humanog donora obeleženi su sa CFSE. CFSE obeleženi, CD8+ T-ćelijski osiromašeni PBMCs su potom kultivisani sa antigenskim dendritičkim ćelijama na sedan dana da bi se omogućila stimulacija dendritičkih ćelija CD4+, nakon čega je osam replika za svaki uzorak testirano. Kao negativne kontrole, svaka serija kulture dendritičke ćelije takođe uključuje skup neobrađenih dendritičnih ćelija. Za pozitivnu kontrolu, test uključuje dva dobro definisana referentna antigena, od kojih svaki sadrži protein pune dužine.
Da bi se procenila imunogenost zasnovana na dendritičkim ćelijama, frekvencija odgovora donorske ćelije je analizirana tokom studije kohorta. Pozitivni odgovori u analizi su smatrani pokazateljima potencijala in vivo CD4+ T-ćelijskog odgovora. Pozitivan odgovor, izmeren kao procenat stimulacije iznad pozadinske, je definisan kao procenat veći od 0.5 procenata (%) u dva ili više nezavisnih donorskih uzoraka. Jačina pozitivnih odgovora ćelijskog donora je određena uzimanjem srednje vrednsoti procentne stimulacije iznad pozadine dobijene duž prihvaćenih donora za svaki uzorak. Indeks Odgovora je izračunat sa višestrukom vrednosti jačine odgovora sa frekvencijom donora koji odgovaraju na određene nivoe CD4+ T-ćelijske imunogenosti za svaki uzorak. Dodatno, Indeks Odgovora, koji predstavlja relativnu CD4+ T-ćelijsku imunogenost je određen poređenjem rezultata iz dva uzorka, jedan obuhvata Efektorske Polipeptide Shiga Toksina SLT-1A-kombo(n) a drugi variajntu koja je srodna molekulu kome nedostaje jedan ili više predviđenih uništenih CD4+ T-ćelijskih epitopa i/ili epitopskih regiona kao referentni molekul.
H. Testiranje za Redukciju Imunogenosti Primernih, Ćelijski Ciljanih Molekula koji Sadrže Efektorske Polipeptide Shiga Toksina SLT-1A-kombo(n)
Korišćenu su miševi kako bi se ispitala jačina imunogenosti određenih primernih molekula predmetnog pronalaska. Relativne imunogenosti primernih ćelijski ciljanih molekula su određene korišćenjem analize za in vivo odgovore antitela na ćelijski ciljane molekule posle ponovljenih, parenteralnih primena tokom period od više nedelja (videti npr. WO 2015/113005). ELISA u rastvoru je korišćena kako bi se odredila relativna količina antitela u serumu koji su bili specifični za različite ćelijski ciljane molekule. Ova analiza imunogenosti uključuje upotrebu miševa koji su indikativni za relativnu imunogenost molekula u sisara uopšte.
2
Ova analiza je korišćena za određivanje relativne imunogenosti primernih ćelijski ciljanih molekula koji sadrže SLT-1A-kombo(n)::scFv-(n) kada se poredi sa manje de-imunizovanim, ćelijski ciljanim molekulom SLT-1A-FR::scFv(n) ili sa referentnim molekulom scFv-3::SLT-1A-WT (SEQ ID NO:33). Referentni molekul scFv-3::SLT-1A-WT je konstruisan u reverznoj, amino-karboksi spojenoj orjentaciji primernih ćelijski ciljanih molekula predmetnog molekula testiranih u relativnoj imunogenskoj analizi, i komponenta efektorskog polipeptida Shiga toksina scFv-3::SLT-1A-WT koji se sastoji od divljeg soja Shiga toksin A1 fragmenta (SEQ ID NO:4), koji predstavlja "un-de-imunizovani" efektorski polipeptid Shiga toksina.
Izvršena su četiri različita ispitivanja na miševima gde su miševi BALB/c ili C57BL/6 nasumično dodeljeni grupama za tretiranje koje se sastoje od šest miševa po grupi i gde su se miševima u različitim grupama za lečenje davali različiti ćelijski ciljani molekuli. Prvo, uzorci seruma su prikupljeni od svakog miša pre izlaganja ćelijskom ciljanom molekulu. Zatim, svakom mišu u grupi za lečenje je davano 0.25 miligrama molekula uzorka po kilogramu telesne mase (mg/kg) po dozi uzorka ćelijski ciljanog molekula pomoću intraperitonealne injekcije tri puta nedeljno u trajanju od dve nedelje. Posle nedelju dana bez davanja bilo kakvih uzoraka, intra-peritonealne injekcije od 0.25 mg/kg po dozi uzoraka ćelijski ciljanog molekula su primenjene tri puta nedeljno tokom dodatne dve nedelje, što je rezultiralo sa ukupno 12 doza ćelijski ciljanih molekula tokom intervala od pet nedelja. Za sve studije, administrirani molekuli SLT-1A-kombo1::scFv-1 (SEQ ID NO:43), SLT-1A-kombo7::scFv-1 (SEQ ID NO:44), SLT-1A-kombo10::scFv-1 (SEQ ID NO:47), SLT-lA-kombo10::scFv-2 (SEQ ID NO:61), SLT-1A-kombo12::scFv-1 (SEQ ID NO:49), SLT-1A-kombo15::scFv-1 (SEQ ID NO:51), SLT-1A-kombo16::scFv-1 (SEQ ID NO:52), SLT-1A-kombo19::scFv-1 (SEQ ID NO:55), SLT-1A-kombo22::scFv-2 (SEQ ID NO:63), i referentni molekuli SLT-1A-FR::scFv-1 (SEQ ID NO:34) i SLT-1A-FR::scFv-2 (SEQ ID NO:35) su se dobro podnosile, što je rezultiralo nikakvim ili samo minimalnim efektima na telesnu težinu i nije bilo kliničkih znakova. Tokom i nakon intervala davanja od pet nedelja, serumi su prikupljeni od svih miševa da bi se posmatrala antitela koja ciljaju primenjene ćelijski ciljane molekule koristeći ELISA u rastvoru. Studije na mišu urađene su u Charles River Laboratories in Piedmont, NC, U.S. Rezultati ovih studija su prikazani u Tabelama 13-16 i Slikama15-16.
ELISA u rastvoru za otkrivanje antitela koja prepoznaju primenjene ćelijski ciljane molekule bili su specifični za vezujući region scFv- (n) ćelijski ciljanog molekula koji se testira i izvode se na sledeći način. Za svaki ćelijski ciljani molekul i njegovu odgovarajuću grupu miševa za lečenje, izvršen je drugačiji test ELISA, ali koristeći istu opštu postavku ELISA testa u
2 1
rastvoru. Za svaki ćelijski ciljani molekul i njegovu odgovarajuću grupu miševa za lečenje, postavljanje ELISA testa u rastvoru uključivalo je samo odgovarajući ciljani biomolekul scFv-(n) ćelijski ciljanog molekula te grupe. Za sve ELISA testove u rastvoru, bunarčLći ELISA ploče bile su obloženi ciljanim biomolekulom ćelijski ciljanog vezujućeg regiona scFv-(n). Isti ćelijski ciljani molekul koji se koristi za injekcije u grupi miševa za lečenje inkubiran je preko noći na 4 °C u rastvoru sa serumom prikupljenim od jednog miša iz te grupe, a zatim su formirani svi kompleksi (npr. kompleksi koji sadrže ćelijski ciljani molekul i antitela koja su prisutna u serumu) su zarobljena pomoću obloženih bunarčLća ELISA na ploči. Uhvaćeni, imuni kompleksi koji sadrže mišje, imunoglobulin G molekule (IgGs) su otkriveni korišćenjem antimišjeg IgG, sekundarnog antitela konjugovanog sa ren peroksidazom. HRP aktivnost je otkrivena u bunarčLćima dodavanjem hromogenog HRP supstrata i zatim detekcijom svetlosne emisije kao rezultat hemiluminscencije. Reakcija je zaustavljena dodavanjem HCl, a HRP aktivnost ili "ELISA signal" je meren na 450 nM korišćenjem čitača ploča. Vrednosti ELISA signala izračunate su kao vrednosti Apsorpcije (Abs 450 nM) nakon oduzimanja pozadinskog signala, mereno iz negativnih kontrolnih bunarčLća "bez seruma". Serum je razblažen da bi se omogućilo očitavanje vrednosti apsorpcije ispod nivoa zasićenosti za ispitivanje, a odnos razblaženja bio je isti za sve miševe u svim grupama za tretiranje mereni određenim danom. Za opšte podešavanje ovih ELISA analiza u rastvoru, veće vrednosti ELISA signala ukazuju na prisustvo više mišjih IgG antitela koja prepoznaju primenjeni ćelijski ciljani molekul ili drugim rečima veću imunogenost.
Na osnovu ovih ELISA analiza u rastvoru nije primećeno da nijedan od miševa u bilo kojoj grupi lečenja u četiri studije nije prethodno formirao antitela u serumu koja bi prepoznala ćelijski ciljane molekule testirane pre izloženosti injekcijom. Prema tome, svako otkrivanje posle primene anti-"ćelijski ciljani molekul" IgG antitela u serumu miševa ovih studija korišćenjem ELISA analize u rastvoru predstavlja de novo, proizvodnju antitela indukovanu posle davanja ćelijski ciljanog molekula.
Odgovori mišjeg IgG antitela na primenjene ćelijski ciljane molekule su izmereni u četiri studije u različitim vremenskim tačkama korišćenjem odgovarajuće ELISA analize u rastvoru, a rezultati su prikazani u Tabelama 13-16 i Slikama 15-16. U svakoj vremenskoj tački uzorci seruma su razblaženi tako da vrednosti ELISA signala ostaju u dinamičkom opsegu ispitivanja. Za jednu vremensku tačku u pojedinačnoj studiji, svi su uzorci seruma razblaženi identično. Izračunate su prosečne vrednosti Apsorpcije ELISA za svaku tretiranu grupu miševa u pojedinim vremenskim tačkama za prikupljanje seruma („prosečni ELISA signal“). U sprovođenju ovih relativnih studija imunogenosti, isti ćelijski ciljani molekul
2 2
ubrizgan u miševe određene tretirane grupe je korišćen u ELISA testu za hvatanje antitela iz seruma prikupljenih samo iz miševa te iste grupe. Drugim rečima, anti-"ćelijski ciljani molekul" IgG antitela prisutnih u serumu iz miševa primenjeni SLT-1A-FR::scFv-1 (SLT-1A-FR::scFv-1 referentna grupa) su zarobljeni i otkriveni u ELISA testu dizajniranom specifično i samo sa SLT-1A-FR::scFv-1, i, slično, anti-"ćelijski ciljani molekul" IgG antitela prisutni u serumu za miševe primenjeni SLT-1A-kombo7::scFv-1 (npr. SLT-1A-kombo7::scFv-1 grupa) snimljeni su i otkriveni pomoću ELISA testa u rastvoru dizajniranog posebno i samo sa SLT-1A-kombo7::scFv-1.
Prosečne vrednosti ELISA signala za svaku grupu miševa za lečenje u pojedinim vremenskim tačkama sakupljanja seruma su izračunate, zatim je izračunata relativna imunogenost za svaku grupu u svakoj vremenskoj tački u odnosu na prosečnu vrednost Apsorpcije ELISA u istoj vremenskoj tački za referentnu grupu koja je tretirana referentnim ćelijski ciljanim molekulom kao što je gore opisano. Relativna imunogenost svakog, testiranog, primernog ćelijski ciljanog molekula (SLT-1A-kombo (n)::scFv- (n)) u datoj studiji u određenoj vremenskoj tački u poređenju sa imunogenošću referentnog molekula (npr., SLT-1A-FR::scFv- (n) ili scFv-3::SLT-1A-VT) je izračunato pomoću formule: (ELISA signal ćelijski ciljanog molekula - prosečni ELISA signal za kontrolu "bez seruma" ) / (prosečni ELISA signal referentnog molekula - prosečan ELISA signal kontrole „bez seruma“) x 100. Da biste se stvorile Slike 15-16, procenat ELISA signala referentnog molekula za svaku grupu miševa koja je tretirana je prikazan na Y- osi, a dan sakupljanja seruma je prikazan na X-osi. Za merenje odgovora IgG kod sisara na svaki ćelijski ciljani molekul prosečni ELISA signal („avg signal“) i procenat avg signala referentnog molekula SLT-1A-FR::scFv- (n) („procenat ref.') su izračunati za svaku grupu miševa koja je tretirana (Tabele 13-16).
Rezultati analize relativne imunogenosti iz prve studije miševa su predstavljeni na Slici 15-panel A i Tabeli 13. Izraz "N/A" je korišćen za označavanje "nije primenljivo", jer su izračunavanja prvog dana uključivala serum za pred-tretman sa vrednostima ELISA signala nula.
Tabela 13. Relativne Imunogenosti Primernog, Ćelijski Ciljanog Molekula SLT-1A-kombo7::scFv-1 u Poređenju sa SLT-1A-FR::scFv-1
2
Rezultati prve, mišije studije, relativne imunogenosti, su da je primerni, ćelijski ciljani molekul SLT-1A-kombo7::scFv-1 pokazao smanjenu imunogenost u poređenju sa referentnim, ćelijski ciljanim molekulom SLT-1A-FR::scFv-1 u svim vremenskim tačkama. Prosečne vrednosti apsorpcije ELISA za tretiranu grupu SLT-1A-kombo7::scFv-1 bile su niže nego za tretiranu grupu SLT-1A-FR::scFv-1 u svim vremenskim tačkama posle 1. dana (serumi su prikupljeni pre-lečenje prvog dana). Za ispitivane ćelijski ciljanih molekula, anti-„ćelijski ciljani moleku “ IgG odgovori su prvo primećeni 15. dana (3. dana nakon davanja šeste doze), a zatim, mišji IgG odgovori primećeni su u svim narednim vremenskim tačkama: 22. dan (10 dana nakon primene 6. doze, pre primene 7. doze), 29. dan (3 dana nakon primene 9. doze pre primene 10. doze), dan 36 (3 dana posle davanja poslednje doze), dana 43 (10 dana posle primene 11. doze) i dana 50 (17 dana posle primene poslednje doze) (slika 15-panel A; Tabela 13). Podaci u Tabeli 13 pokazuju da ćelijski ciljani molekul SLT-1A-kombo7 :: scFv-1 koji sadrži de-imunizovani, otporan na cepanje furina, efektorski polipeptid Shiga toksina kombo7 ima smanjenu imunogenost u poređenju sa ćelijski ciljanim molekulom SLT -1A-FR::scFv-1 koji sadrži divlji soj Shiga toksin A1 fragmenta. Ovi rezultati sugerišu da molekuli koji sadrže samo efektorske polipeptide Shiga toksina koji se sastoje od kombinacije, de-imunizovanog, otpornog na cepanje proteaze, skeleta efektorskog polipeptida Shiga toksina kombo7 pokazuju smanjenu imunogenost u poređenju sa molekulima koji sadrže efektorski polipeptid Shiga toksina koji sadrži (1) divlji soj, Shiga sličnog toksina A1 fragmenta ili (2) otporan na rascepljivanje furina, efektorski polipeptid Shiga toksina SLT-1A-FR.
Rezultati analize relativne imunogenosti iz druge mišije studije su prikazani na Slici 15-panel B i Tabele 14.
Table 14. Relativne Imunogenosti Primernih, Ćelijski Ciljanih Molekula koji Sadrže De-Imunizovane, Otporne na Cepanje Proteaze, Efektorske Polipeptide Shiga Toksina
2 4
Rezultati druge, mišije studije, relativne imunogenosti, pokazali su da su testirani primerni ćelijski ciljani molekuli (SLT-1A-kombo10::scFv-1, SLT-1A-kombo16::scFv-1 i SLT-1A-kombo19::scFv-1) pokazali smanjenu imunogenost u poređenju sa referentnim ćeliji ciljanim molekulom SLT-1A-FR::scFv-1 u svim vremenskim tačkama do 36. dana (Slika 15-panel B; Tabela 14). Za ispitivane ćelijski ciljanih molekula, anti-„ćelijski ciljani molekul“ IgG odgovori prvi put su primećeni 15. dana (3 dana nakon primene 6. doze), a zatim, mišji IgG odgovori primećeni su u svim narednim vremenskim tačkama: 22. dan (10 dana nakon primene 6. doze, pre primene 7. doze), 29. dan (3 dana nakon primene 9. doze pre primene 10. doze), dan 36 (3 dana nakon davanja poslednje doze) i 40. dana (7 dana nakon primene poslednje doze) (Slika 15-panel B; Tabela 14). I 15. i 22. dana, miševi u grupi kojima je davan referentni ćelijski ciljani molekul SLT-1A-FR::scFv-1 pokazali su veće veličine ukupnih odgovora na IgG antitela kao što je pokazano ELISA signalom u odnosu na miševe u grupama kojima su davani primerni ćelijski ciljani molekuli koji sadrže de-imunizovane, otporne na cepanje proteaze, efektorske skelete Shiga toskina (SLT-1A-kombo10, SLT-1A-kombo16 i SLT-1A-kombo19) (Slika 15; Tabela 14). U danima 29, 36 i 40, procenti prosečnog referentnog ELISA signala prosečnih vrednosti ELISA signala za grupe kojima su davani SLT-1A-kombo16::scFv-1 i SLT-1A-kombo19::scFv-1 su bile veće nego za grupu kojim ase davao SLT-1A-kombo1::scFv-1. U svim vremenskim tačkama procenat prosečnog referentnog ELISA signala prosečnih vrednosti ELISA signala za SLT-1A-kombo19::scFv-1 grupu bio je veći od procenta prosečnih vrednosti ELISA signala za grupu koja upravlja SLT-1A-kombo10::scFv-1 ili SLT-1A-kombo16::scFv-1.
Rezultati analize relativne imunogenosti iz treće mišije studije su prikazani u Tabeli 15 i Slici 15-panel C.
Tabela 15. Relativne Imunogenosti Primernih, Ćelijski Ciljanih Molekula u Poređenju sa Referentnim Molekulima i Svaki Drugi
2
Prosečne ELISA vrednosti Absorbance za SLT-1A-kombo10::scFv-2 i SLT-1A-kombo22::scFv-2 tretirane grupe bile su niže nego za SLT-1A-FR::scFv-2 i scFv-3::SLT-1A-WT tretirane grupe u svim vremenskim tačkama posle 1. do 29. dana. Podaci u Tabeli 15 pokazuju da je ćelijski ciljani molekuli SLT-1A-kombo10::scFv-2 i SLT-1A-kombo22::scFv-2, od kojih svaki sadrži de-imunizovani, otporan na cepanje furina, efektorski polipeptid Shiga toksina, pokazao smanjenu imunogenost u poređenju sa ćelijski ciljanim molekulom SLT-1A-FR::scFv2 i divljim sojem SLT-1 A1 fragmenta u kontekstu različitog scFv (scFv-3) u obrnutoj, karboksi-amino spojenoj orijentaciji. Ovi rezultati sugerišu da ćelijski ciljani molekuli čija se region efektorskog polipeptida Shiga toksina sastoji od kombinacije, deimunizovanog, otpornog na cepanje proteaze, skeleta efektorskog polipeptida Shiga toksina kombo 10 ili kombo22 pokazuju smanjenu imunogenost u poređenju sa ćelijski ciljanim molekulima čiji efektorski polipeptid Shiga toksina se sastoji od (1) divljeg soja, efektorskog polipeptida Shiga toksina ili (2) otpornog na cepanje furina, efektorskog polipeptida Shiga toksina SLT-1A-FR.
Rezultati analize relativne imunogenosti iz četvrte mišije studije su prikazani na Slici 16 i Tabeli 16.
Tabela 16. Relativne Imunogenosti Primernih, Ćelijski Ciljanih Molekula u Poređenju sa SLT-1A-FR::scFv-1
2
Rezultati četvrte studije imunogenosti bili su da primerni, ćelijski ciljani molekuli pokazuju smanjenu imunogenost u poređenju sa referentnim ćelijski ciljanim molekulom SLT-1A-FR:: scFv-1, bar u ranijim vremenskim tačkama (Slika 14-panel A; Tabela 16). Serum je prikupljen pre tretmana 1. dana. Za ispitivane ćelijski ciljanih molekula, anti-"ćelijski ciljani molekuli" IgG odgovori prvi put su primećeni 15. dana (3 dana nakon davanja šeste doze), a zatim, mišji IgG odgovori primećeni su u svim narednim vremenskim tačkama: 22. dan (10 dana nakon primene šeste doze, pre primene 7. doze), 29. dan (3 dana nakon primene 9. doze pre primene 10. doza), 36. dan (3 dana nakon primene poslednje doze) i 40. dan (7 dana nakon primene poslednje doze) (slika 14; Tabela 16). Oba dana 15., dana 22. i 29. dana, miševi u grupi na koje se primenjivao referentni ćelijski ciljani molekul SLT-1A-FR::scFv-1 pokazali su veće veličine ukupnih odgovora na IgG antitela kao što je pokazano ELISA signalom u odnosu na miševe u grupama na koje su primenjivani primerni ćelijski ciljani molekuli koji sadrže de-imunizovane, otporne na cepanje proteaze, efektorske skelete Shiga toksina (SLT-1A-kombo1, SLT-1A-kombo10, SLT-1A-kombo12 i SLT-1A-kombo15) (Slika 16; Tabela 16). U svim vremenskim tačkama procenat prosečnog referentnog ELISA signala prosečnih vrednosti ELISA signala za tretiranu grupu na koju se primenjivao SLT-1A-kombo1::scFv-1 bio je veći od procenta prosečnih vrednosti signala ELISA za tretirane grupe
2
na koje su primenjivane SLT-1A-kombo10::scFv-1, SLT-1A-kombo12::scFv-1 i SLT-1A-kombo15::scFv-1. U danima 36. i 40., procenti prosečnog referentnog ELISA signala prosečnih vrednosti signala ELISA za tretiranu grupu na koju je primenjivan SLT-1A-kombo12::scFv-1 bili su viši nego za tretiranu grupu na koja je primenjivan SLT-1A-kombo10::scFv-1 i SLT-1A-kombo15::scFv-1. Ovi rezultati sugerišu da se ćelijski ciljani molekuli čija region efektorskog polipeptidna Shiga toksina sastoji od kombinacije, deimunizovanog, otpornog na cepanje proteaznog, skeleta efektorskog polipeptida Shiga toksina SLT-1A-kombo1, SLT-1A-kombo10, SLT-1A-kombo12 i SLT-1A-kombo15 pokazuju smanjenu imunogenost u poređenju sa ćelijski ciljanim molekulima čiji se region efektorskog polipeptida Shiga toksina sastoji od (1) divljeg soja, efektorskog polipeptida Shiga toksina ili (2) otpornog na cepanje furina, efektorskog polipeptida Shiga toksina SLT-1A-FR.
Od ćelijski ciljanih molekula testiranih u drugoj, trećoj i četvrtoj studiji na mišu, čini se da je kombinacija, de-imunizovanog, otpornog na cepljenje proteazom, efektorskog kostura Shiga toksina SLT-1A-kombo10 bila većinski de-imunizovana od strane ove relativne analize imunogenosti pod testiranim uslovima (videti Slike 15-16; Tabele 14-16). Ovaj efektorski skelet Shiga toksina sadrži (1) pet, uništenih epitopskih regiona, od kojih su dva podrazumevala višestruke supstitucije amino kiselinskih ostataka i (2) endogeni epitopski region uništen ugrađenim, heterolognim T-ćelijskim epitopom. U drugoj studiji, čini se da je kombinacija, de-imunizovanog, otpornog na cepanje proteaze, efektorskog skeleta Shiga toksina SLT-1A-kombo16 bila većinski de-imunizovana nego kombinacije, de-imunizovanog, otpornog na cepanje proteaze, efektorskog skeleta Shiga toksina SLT-1A-kombo19, posebno u ranijim vremenskim tačkama (videti Slika 15-panel B; Tabela 14). U četvrtoj studiji čini se da je kombinacija, de-imunizovanog, otpornog na cepanje proteaze, efektorskog skeleta Shiga toksina SLT-1A-kombo1 najmanje de-imunizovana od testiranih, efektorskih polipeptida Shiga toksina SLT-1A-kombo (1, 10, 12 i 15) (videti Slika 16-panel A; Tabela 16). U četvrtoj studiji čini se da je kombinacija, de-imunizovanog, otpornog na cepanje proteaze, efektorskog skeleta Shiga toksina SLT-1A-kombo15 bila većinski deimunizovana od SLT-1A-kombo12, posebno u kasnijim vremenskim tačkama (videti Slika 16 -panel A; Tabela 16).
Rezultati ovih studija imunogenosti pokazuju da dve vrste uništenja epitopskog regiona, supstitucije amino kiselinskih ostataka i ugrađeni, heterologni, CD+8 T-ćelijski epitopi, mogu doprineti de-imunizaciji efektorskog polipeptida Shiga toksina. Nadalje, kombinacija obe vrste uništenja u istom efektorskom polipeptidu Shiga toksina može rezultirati više deimunizovanih efektroskih polipeptida Shiga toksina. Ukupna jačina indukcije antitela kod
2
miševa u grupama kojima se daje primerni, citotoksični ćelijski ciljani molekuli koji sadrže ove kombinacije, de-imunizovanih, CD8 T-ćelijskih hiper-imunizovanih, otpornih na cepljenje proteaze, efektorskih polipeptida Shiga toksina, smanjeni su kada se poredi sa uvećanjem indukcije antitela kod miševa iz grupe na koje se primenjuje ćelijski ciljani molekul koji sadrži, otporan na cepanje proteazem, ali inače divlji soj regiona efektorskog polipeptida Shiga toksina. Smanjenje vrednosti signala ELISA ćelijski ciljanih molekula koji obuhvataju određene, kombinacione, de-imunizovanih, otpornih na cepanje, efektorskih skeleta Shiga toksina pokazuje da su ovi skeleti uspešno de-imunizovani (odn. da su smanjile imunogenski potencijal kod sisara). Stoga, efektorski polipeptidi Shiga toksina SLT-1A-kombo1, SLT-1A-kombo7, SLT-1A-kombo10, SLT-1A-kombo12, SLT-1A-kombo15, SLT-1A-kombo16 i SLT-1A-kombo19 pokazuju smanjeni imunogenski potencijal kod sisara, i bilo koji, primerni, ćelijski ciljani molekul koji sadrži ove polipeptide treba da bude de-imunizovan u poređenju sa analognim molekulom koji sadrži samo divlji soj ili samo otporan na cepanje proteaze, efektorske polipeptide Shiga toksina usled mutacije motiva otpornog na cepanje furina u izvorno pozicioniranom regionu iz amino kiselinskih ostataka 238 do 257 u StxA i SLT-1 A.
Razlike primećene u imunogenskim potencijalima različitih kombinacija, de-imunizovanih, otpornih na cepanje proteaze, testiranih efektorskih polipeptidi Shiga toksina pokazuju da određene kombinacije de-imunizovanih pod-regiona i/ili ugrađenih T-ćelijskih epitopskih podregiona smanjuju imunogenost za različite veličine. Na primer, u studiji 2, SLT-1A-kombo10 je bio više de-imunizovan nego SLT-1A-kombo16 i SLT-1A-kombo19, posebno u kasnijim vremenskim tačkama (Tabela 14; Slika 15-panel B), uprkos kombo16 i kombo19 koji sadrže više uništenih epitopskih regiona i ukupne supstitucije amino kiselinskih ostataka u poređenju sa divljim soje Shiga toksina A Podjedinice nego što sadrži SLT-1A-kombo10 (Tabela 8). U studiji 4, SLT-1A-kombo10 je bio više de-imunizovan nego SLT-1A-kombo12, posebno u kasnijim vremenskim tačkama (Tabela 16; Slika 16-panel A), uprkos tome što i SLT-1A-kombo12 i SLT-1A-kombo15 sadrže više poremećenih epitopskih regiona i ukupnih supstitucija amino kiselinskih ostataka u poređenju sa divljim sojem Shiga toksin A Podjedinica nego SLT-1A-kombo10 (Tabela 8). Stoga, kumulativna kombinacija dodatnih uništenih B-ćelijskih epitopskih regiona ne mora nužno rezultirati dodatnim padom imunogenosti, već može rezultirati povećanjem neželjenih imunogenosti, kao što su, na primer, u kasnijim tačkama vremena (videti Sliku 15-panel B i uporedite rezultate za SLT-1A-kombo10 sa rezultatima za SLT-1A-kombo16 i SLT-1A-kombo19).
2
I. Testiranje Sposobnosti Primernih, Ćelijski Ciljanih Molekula da Dostave T-Ćelijski Epitop-Peptid na Put MHC Klasa I Ćelije za Prezentaciju
Predstavljanje T-ćelijskog epitopa sistemom MHC klase I cilja na prisutnu ćeliju za ubijanje pomoću CTL posredovan lizom i takođe pokreće imunološku stimulaciju u lokalnom području. Konstruisanjem ćelijski ciljanih molekula koji sadrže efektorske polipeptide Shiga toksina koji sadrže heterologne, imunogenske epitope, može se postići ciljano davanje i prezentacija imuno-stimulativnih antigena. Prezentacija imuno-stimulativnih ne-sopstvenih antigena, kao što su npr. poznati virusni antigeni sa visokom imunogenošću, pomoću ciljanih ćelijskih signala drugim imunološkim ćelijama da unište ciljane ćelije, kao i da regrutuju više imunih ćelija na to područje unutar organizma.
Da bi se istovremeno de-imunizovala i obezbedila prezentacija T-ćelijskog epitopa na površini ciljane ćelije unutar istog polipeptidnog regiona Shiga toksina, predviđeni region B-ćelijskog epitopa je uništen zamenom amino kiselinskih ostataka unutar njega imunogenim T- ćelijskim epitopskim regionom koji predviđa da se vezuje za humane MHC molekule klase I.
U ovom primeru, istražuju se sposobnosti primernih ćelijski ciljanih molekula predmetnog pronalaska da isporučuju T-ćelijske epitope na put MHC klase I ciljanih ćelija za prezentaciju na površini ciljane ćelije. Pored toga, funkcionalne posledice prezentacije T-ćelijskih epitopa od strane ciljanih ćelija MHC klase I dostavljeni primernim ćelijski ciljanih molekula predmetnog pronalaska se istražuju posmatranjem različitih imunih odgovora indukovanih prezentacijom isporučenog epitop-peptida pomoću MHC I molekula.
1. Testiranje Sposobnosti Molekula da Dostavi T-Ćelijski Epitop-Peptid na Put MHC Klase I za Prezentaciju Ćelijske Površine
Rutinske analize poznate u oblasti tehnike koriste se za ispitivanje sposobnosti primernih molekula predmetnog pronalaska da isporučuju T-ćelijski epitop u molekul MHC klase I (videti npr. WO 2015/113007). Konkretno, metoda protočne citometrije koristi se za demonstraciju isporuke i ekstraćelijskog prikaza T-ćelijskog epitop-peptida (ubačenog ili ugrađenog u efektorski polipeptid Shiga toksina) u kompleks sa molekulima MHC klase I na površinama ciljanih ćelija. Ova metoda protočne citometrije koristi rastvorljive multimerne reagense humanog T-ćelijskog receptora (TCR) (Soluble T-Cell Antigen Receptor STAR™ Multimer, Altor Bioscience Corp, Miramar, FL, U.S.), svaki sa visokim afinitetom koji se vezuje za različit epitop-human HLA kompleks.
Svaki STAR™ TCR multimer reagens je izveden iz određenog T-ćelijskog receptora i dozvoljava detekciju određenog peptid-MHC kompleksa zasnovanog na sposobnosti izabranog TCR da prepozna određeni peptid predstavljen u kontekstu određenog molekula MHC klase I. Ovi TCR multimeri sačinjeni su od rekombinantnih humanih TCRs koji su biotinilovani i multimerizovani streptavidinom. TCR multimeri su obeleženi fikoetrininom (PE). Ovi TCR multimerni reagensi omogućavaju detekciju specifičnih kompleksa peptid-MHC klase I predstavljenih na površinama humanih ćelija, jer svaki rastvorljivi TCR multimerni tip prepoznaje i stabilno se vezuje za određeni kompleks peptid-MHC pod različitim uslovima (Zhu X et al, J Immunol 176: 3223-32 (2006)). Ovi TCR multimerni reagensi omogućavaju identifikaciju i kvantizaciju protočnom citometrijom peptid-MHC klase I kompleksa prisutnih na površinama ćelija.
Ciljane ćelije korišćene u ovom Primeru su dostupni iz ATCC (Manassas VA, U.S.), National Cancer Institute of the U.S. (Frederick, MD, U.S.), i/ili DSZM (Braunschweig, DE).
Korišćenjem standardnih postupaka protočne citometrije poznate u struci, potvrđeno je da ciljane ćelije izražavaju na svojim ćelijskim površinama i odgovarajući molekul MHC klase I i ekstra ćelijski ciljani biomolekul ćelijski ciljanog ostatka ćelijski ciljanih molekula koji su korišćeni u ovom Primeru.
Ciljane ćelije su tretirane sa primernim ćelijski ciljanim molekulima predmetnog pronalaska gde svaki sadrži efektorski polipeptid Shiga toksina koji sadrži ugrađeni ili umetnuti T-ćelijski epitop. Određeni primerni molekuli predmetnog pronalaska testirani u ovom Primeru su katalitički oslabljeni ili inaktivirani dodavanjem jedne ili obe sledeće mutacije: I77S i E167D. Setovi ciljanih ćelija su tretirani sa egzogenim davanjem različitih primernih ćelijskih ciljanih molekula predmetnog pronalaska u koncentracijama sličnim onima koje koriste drugi uzimajući u obzir specifičnu osetljivost ćelije na Shiga toksine (videti npr. Noakes K et al, FEBS Lett 453: 95-9 (1999)). Tretirane ćelije su zatim inkubirane tokom šest sati u standardnim uslovima, uključujući na 37 °C i atmosferi sa 5% ugljen-dioksida, da se omogući intoksikacija posredovana efektorskim polipeptidnim regionom Shiga toksina.
Zatim su ćelije isprane medijumom ćelijske kulture, ponovo suspendovane u svežem medijumu ćelijske kulture i inkubirane 20 sati pre bojenja odgovarajućim STAR™
1
multimernim reagensom. Takođe su testirani dodatne vremenske tačke i uslovi podešavanja.
Kao kontrole, setovi ciljanih ćelija tretiraju se u tri stanja: 1) bez ikakvog tretmana („neobrađen“) što znači da se ne dodaju egzogeni molekuli, 2) sa egzogeno primenjenim kontrolnim antigen-peptidom i 3) sa egzogenim primenjenim kontrolnim antigen-peptidom kombinovan sa Peptidnim Pojačivačem Učitavanja ("PLE," Altor Bioscience Corp, Miramar, FL, U.S.). Kontrolni antigen-peptidni peptid kombinovan sa PLE tretmanom dozvolio je egzogeno nanošenje peptida i služio je kao pozitivna kontrola. Ćelije koje pokazuju odgovarajuću MHC klasu I haplotipa mogu biti primorane da učitaju odgovarajući egzogeno primenjeni peptid iz ekstraćelijskog prostora (odn. u odsustvu ćelijske internalizacije primenjenog peptida) ili u prisustvu PLE, koji predstavlja mešavinu B2-mikroglobulina i druge komponente.
Nakon tretmana, svi setovi ćelija se ispiraju i inkubiraju sa odgovarajućim STAR multimernim reagensom tokom jednog sata na ledu. Ćelije su isprane i fluorescencija uzoraka se meri protočnom citometrijom korišćenjem Accuri™ C6 protočne citometrije (BD Biosciences, San Jose, CA, U.S.) kako bi se detektovalo prisustvo i kvantifikovao bilo koji STAR™ multimer vezan za ćelije u populaciji (koji se ovde ponekad naziva "bojenjem").
Neobrađena kontrola se koristi za identifikaciju pozitivne i negativne ćelijske populacije korišćenjem kapije koja rezultira sa manje od 1% ćelija iz netretirane kontrole u "pozitivnoj" kapiji (koja predstavlja pozadinski signal). Ista kapija se zatim primenjuje na ostale uzorke kako bi se karakterisala pozitivna populacija za svaki uzorak.
Detekcija egzogeno primenjenog, ugrađenog ili ubačenog T-ćelijskog epitopa kompleksovanog sa molekulima humane MHC klase I na ćelijskoj površini intoksiciranih ciljanih ćelija pokazuje da ćelijski ciljani molekuli koji sadrže ugrađeni ili ubačeni T-ćelijski epitop-peptid mogu da uđu u ciljane ćelije, izvodeći dovoljno pod-ćelijskog rutiranja, i isporučujući dovoljno T-ćelijskog epitopa putu MHC klase I za površinsku prezentaciju na površini ciljane ćelije.
2. Testiranje Sposobnosti Molekula da Izazove Citotoksičnu T-Ćelijsku Posredovanu Citolizu i Druge Imune Odgovore
2
Rutinske analize poznate u oblasti tehnike koriste se za ispitivanje funkcionalnih posledica ciljanih ćelija MHC klase I prezentacije T-ćelijskih epitopa isporučenih primernim ćelijski ciljanim molekulima pronalaska (videti npr. WO 2015/113007). Funkcionalne posledice koje se istražuju uključuju CTL aktivaciju, ubijanje ciljanih ćelija posredovanih CTL-om i oslobađanje citokina pomoću CTL-a.
Analiza citotoksičnosti zasnovana na CTL-u je korišćena za procenu posledica epitopske prezentacije. Analiza uključuje ciljane ćelije i T-ćelije koje su uzgajane tkivom. Ciljane ćelije su intoksirane kako je opisano u WO 2015/113007. Ukratko, ciljane ćelije se inkubiraju tokom šest sati u standardnim uslovima sa različitim egzogeno primenjenim ćelijski ciljanim molekulima, pri čemu određeni ćelijski ciljani molekuli sadrže efektorski polipeptid Shiga toksina pronalaska. Zatim se CTLs se dodaju intoksikiranim ciljanim ćelijama i inkubiraju kako bi se omogućilo da T-ćelije prepoznaju i vežu sve ciljane ćelije koje pokazuju komplekse epitop-peptid/MHC klase I. Zatim se istražuju određene funkcionalne posledice korišćenjem standardnih metoda poznatih stručnjaku, uključujući vezivanje CTL za ciljane ćelije, ubijanje ciljane ćelije CTL-posredovanom citolizom i oslobađanje citokina, kao što su interferon gama ili interleukini pomoću ELISA ili ELIspot.
Aktivacija CTLs od strane ciljanih ćelija koja prikazuju komplekse epitop-peptid/MHC klase I kvantifikuje se pomoću komercijalno dostupnih testova CTL odgovora, npr. CytoTox96® neradioaktivne analize (Promega Corp, Madison, WI, U.S.), Granzyme B ELISpot analize (Mabtech, Inc., Cincinnati, OH, U.S.), aktivaciona analiza kaspaze, i LAMP-1 translokacijska protočno citometrijska analiza. Za posebno nadgledanje ubijanja ciljanih ćelija posredovanih CTL-om, karboksifluorescenski sukcinimidilni estar (CFSE) koristi se za ciljane ćelije za ispitivanje in vitro i in vivo kako je opisano u tehnici (videti npr. Durward M et al, J Vis Exp 45 pii 2250 (2010)).
Kratak opis Primera 2
Primerni, ćelijski ciljani molekuli koji uključuju kombinaciju, efektroskog polipeptida Shiga toksina sa višestrukim unuštenjima B-ćeljskog epitopskog regiona su de-munizovani, što pokazuje smanjenje antigenosti i imunogenosti u poređenju sa referentnim molekulima. Pored toga, ovaj primer pokazuje da se određeni, de-imunizovani ćelijski ciljani molkeuli koji sadrže kombinaciju, efektorskog polipeptida Shiga toksina koji sadrže višestruke uništene B-ćelijske epitopske regione, uništenja furinski odcepljenog motiva, i ili ugrađene T-ćelijske epitope zadržavaju na značajnom nivou jednu ili više efektivnih funkcija Shiga toksina, kao što su, na primer, katalitička inhibicija ribozoma, intracelularna rutina i citotoksičnost.
Tabela 17 sumira rezultate iz Primera 2 za primerne, otporne na cepanje proteaze, deimunizovane, ćelijski ciljane molekule predmetnog pronalaska koji sadrže efektorski polipeptid Shiga toksina SLT-1A-kombo1, SLT-1A-kombo7, SLT-1A-kombo10, SLT-1A-kombo12, SLT-1A-kombo15, SLT-1A-kombo16, ili SLT-1A-kombo 19.
Table 17. Rezime Primernih Ćelijski Ciljanih Molekula koji su Empirijski Testirani na Citotoksičnost i Smanjeni Imunogeni Potencijal kod Sisara
Primerni, otporni na cepanje proteaze, de-imunizovani, ćelijski ciljani molekuli pronalaska prikazani u Tabeli 17 svi prikazuju značajne nivoe citotoksičnosti koje su uporedive sa ćelijski ciljanim molekulima divljeg soja Shiga toksin A1 fragmenata. Ovi primerni, otporni na cepanje proteaze, de-imunizovani, ćelijski ciljani molekuli pronalaska pokazuju katalitičku inhibiciju translacije sa ribozomima, intraćelijskom rutinom koja je uporediva sa divljim sojem Shiga toksin A Podjedinice i/ili A1 fragmenta, i citotoksičnosti uporedive sa ćelijski ciljanim molekulima koji sadrže divlji soj Shiga toksin A1 fragmenta i/ili A Podjedinice. Ovi primerni, otporni na cepanje proteaze, de-imunizovani, ćelijski ciljani molekuli pronalaska pokazuju nivoe katalitičke aktivnosti uporedive sa divljim sojem, Shiga toksin A Podjedinice i/ili A1 fragmentom. primerni, otporni na cepanje proteaze, de-imunizovani, ćelijski ciljani molekuli pronalaska pokazuju nivoe citotoksičnosti uporedive sa divljim sojem Shiga toksin A Podjedinice i/ili A1 fragmenta. Ovi ćelijski ciljani molekuli pronalasku pokazuju smanjenu imunogenost kod sisara u poređenju sa ćelijski ciljanim molekulima koji sadrže region efektorskog polipeptidna Shiga toksina koji se sastoji od (1) divljeg soja, efektorskog
4
polipeptida Shiga toksin A1 fragmenta i/ili (2) otporan na cepanje furina, efektorski polipeptid Shiga toksina SLT-1 A-FR. Dalje, određeni ćelijski ciljani molekuli predmetnog pronalaska pokazuju povećanu stabilnost, poboljšanu in vivo podnošljivost i/ili sposobnost davanja heterolognih T-ćelijskih epitopa za prezentaciju MHC klase I od strane ciljanih ćelija.
Rezultati prikazani u Primeru 2 pojačavaju ideju da se različiti, primerni uništeni epitopski regioni mogu kombinovati zajedno u jedan molekul da bi se stvorila veća smanjenja antigenosti i/ili imunogenosti, a da se pri tome zadrže značajni nivoi jedne ili više efektorskih funkcija Shiga toksina (videti npr.. WO 2015/113005) i ponekad pružaju drugu funkcionalnu karakteristiku koja nije prisutna u divljem soju Shiga toksin A Podjedinice, kao što je, npr., otpornost na cepanje furina i/ili sposobnost davanja heterolognog T-ćelijskog epitopa ciljanoj ćeliji. Određena, kombinacija, de-imunizovanih, efektorskih polipeptida Shiga toksin A Podjedinice predmetnog pronalaska pokazuje sinergijsko smanjenje imunogenosti u poređenju sa zbirom njihovih delimično de-imunizovanih pod-regiona, kao što su, npr., SLT-1A-kombo7 SLT-1A-kombo10 i SLT-1A-kombo15.
Sledeće supstitucije su napravljene i testirane u najmanje jednom efektorskom polipeptidu Shiga toksina koji je zadržao značajan nivo in vitro, inhibicije ribozoma i/ili citotoksičnost: K1A, KIM, T4I, S8I, T9I, K11A, S33I, S33C, S43N, G44L, S45V, T45V, S45I, T45I, G46P, D47M, N48V, L49A, F50T, A51V, D53A, D53N, V54L, V54I, R55A, R55V, R55L, G56P, I57F, I57M, D58A, D58V, D58F, P59A, P59F, E60I, E60T, E60R, E61A, E61V, E61L, G62A, D94A, S96I, T104N, A105L, T107P, L108M, S109V, G110A, D11qT, D141A, V154A, G147A, T180G, T181I, D183A, D183G, D184A, D184F, L185D, S186A, S186F, G187A, G187T, R188A, S189A, D198A, R205A, C242S, R248A, i R251A.
Uprkos izazovima koji predviđaju uspešne supstitucije a priori, podaci navedeni u ovde prikazanim primerima daju razloga za verovanje da će neke supstitucije amino kiselina verovatno uspešno smanjiti antigenost i/ili imunogenost uz zadržavanje značajnih efektorskih funkcija Shiga toksina. Izraz "uspešan" se ovde koristi da označi jednu ili više supstitucija amino kiselinskih ostataka u predviđenom epitopskom regionu što je rezultiralo u efektorskom polipeptidu Shiga toksina koji je zadržao jednu ili više efektorskih funkcija Shiga toksina. Na primer, supstitucije na određenim pozicijama amino kiselina koje su ovde prikazane kao uspešno tolerisane supstitucije verovatno će biti uspešne za zadržavanje bar jedne efektorske funkcije Shiga toksina kada su supstituisane sa određenim drugim amino kiselinama. Uspešna pojedinačna supstitucija amino kiselina može se generalno kombinovati sa drugim uspešnim supstitucijama amino kiselina u različitom epitopskom regionu da bi se stvorili de-imunizovani, efektorski polipeptidi Shiga toksina koji zadržavaju značajnu efektorsku(e) funkciju(e) Shiga toksina. Slično tome, demonstracija da ćelijski ciljani molekuli koji sadrže regione efektorskog polipeptida Shiga toksina sa višestrukim pojedinačnim supstitucijama amino kiselina unutar istog epitopskog regiona zadržavaju enzimsku aktivnost sugerišu da se uspešna supstitucija jedne amino kiseline u istom epitopskom regionu može generalno kombinovati sa drugim pojedinačnim supstitucijama amino kiselina u istom epitopskom regionu da bi se stvorili de-imunizovani, efektorski polipeptidi Shiga toksina koji zadržavaju značajnu(e) efektorsku(e) funkciju(e) Shiga toksina.
Empirijski je pokazano da određene supstitucije (K1A, K1M, T4I, S8I, T9I, K11 A, S33I, S33C, S43N, G44L, S45V, T45V, S45I, T45I, G46P, D47M, N48V, L49A, F50T, A51V, D53A, D53N, V54L, V54I, R55A, R55V, R55L, G56P, I57F, I57M, D58A, D58V, D58F, P59A, P59F, E60I, E60T, E60R, E61A, E61V, E61L, G62A, D94A, S96I, T104N, A105L, T107P, L108M, S109V, G110A, D111T, D141A, G147A, V154A, G147A, T180G, T181I, D183A, D183G, D184A, D184F, L185D, S186A, S186F, G187A, G187T, R188A, S189A, D198A, R205A, C242S, R248A, R251A, i/ili njihove kombinacije) i određene pozicije tolerisanih supstitucija (1, 4, 8, 9, 11, 33, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 94, 96, 104, 105, 107, 108, 109, 110, 111, 141, 147, 154, 180, 181, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 198, 205,242, 248, i 251) zadržavaju značajan nivo aktivnosti za najmanje jednu efektorsku funkciju Shiga toksina. Ovi empirijski podaci sugerišu određene druge epitopski uništene supstitucije i kombinacije epitopskih uništenih supstitucija koje se mogu koristiti za generisanje de-imunizovanih, efektorskih polipeptida Shiga toksina koji zadržavaju značajnu(e) efektosku(e) funkciju(e) Shiga toksina. Predvidljivo je da će se tolerisati i druge amino kiselinske supstitucije amino kiselinskih ostataka konzervativne funkcionalne grupe. Na primer, druge supstitucije koje su poznate stručnjaku da su slične bilo kojoj K1A, K1M, T4I, S8I, T9I, K11A, S33I, S33C, S43N, G44L, S45V, T45V, S45I, T45I, G46P, D47M, N48V, L49A, F50T, A51V, D53A, D53N, V54L, V54I, R55A, R55V, R55L, G56P, I57F, I57M, D58A, D58V, D58F, P59A, P59F, E60I, E60T, E60R, E61A, E61V, E61L, G62A, D94A, S96I, T104N, A105L, T107P, L108M, S109V, G110A, D111T, D141A, G147A, V154A, G147A, T180G, T181I, D183A, D183G, D184A, D184F, L185D, S186A, S186F, G187A, G187T, R188A, S189A, D198A, R205A, C242S, R248A, ili R251A će takođe biti u mogućnosti uništiti epitop dok se zadržava najmanje jedna efektorska funkcija Shiga toksina.
Primer 3. Otporni na Cepanje Furina, Efektorskih Polipeptida Shiga Toksin A Podjedinice i Ćelijski Ciljani Molekuli koji Sadrže Iste
Otporni na cepanje furina, efektorski polipeptidi Shiga toksin A Podjedinica su stvoreni i testirani kao komponente ćelijski ciljanih molekula pri čemu svaki ćelijski ciljani molekul sadrži ćelijski ciljani, imunoglobulinski tip, vezujućeg regiona. Da bi se stvorila otpornost na proteazu u efektorskom polipeptidu Shiga toksina, dve supstitucije amino kiselinskog ostatka, R248A i R251A, su uvedeni u efektorske polipeptide Shiga toksina kao što je opisano u Primeru 2. Efektorski polipeptid Shiga toksina SLT-1A-FR (SEQ ID NO:5) je korišćen kako bi se obrazovao ćelijski ciljani molekul SLT-1A-FR::scFv-9 (SEQ ID NO:41).
A. Kvantifikovanje Cepanje Furina Molekula Predmetnog Pronalaska u Odnosu na Referentni Molekul
Ćelijski ciljani molekul SLT-1A-FR::scFv-9 (SEQ ID NO:41) je testiran koristeći in vitro, analizu cepanja furina kako bi se kvantifikovalo cepanje furina kada se poredi sa kontrolnim divljim sojem koristeći postupke koji su poznati stručnjaku (videti npr. WO 2015/191764). Kako bi se procenila sposobnost furina da odcepi SLT-1lA-FR::scFv-9, prečišćeni uzorci proteina u forsfatnom puferu slanog rastvora (PBS) su inkubirani sa furinom (New England Biolabs, Ipswich, MA, U.S.) na 0.5 furinskih aktivacionih jedinica (U) po mikrogramu (µg) uzorka proteina u puferu za cepanje furina (100 millimola (mM) HEPES (4-(2-hidroksietil)-1-piperazinetansulfonska kiselina), pH 7, 1 mM CaCy na 30 sati na 30°C. Kontrolni uzorci su inkubirani bez furina na 4°C ili 30°C u istom puferu. Razni, uzorci ćelijski ciljanog molekula su elektroforezovani na SDS, poliakrilamidni gelovi pod uslovima za denaturaciju i obojen Coomassie (Slika 17).
Slika 17 prikazuje sliku gela sa numerisanim linijama i legendom slike koja ukazuje koja linija je napunjena sa kojim uzorkom: ili ćelijski ciljani molekul koji sadrži region efektroskog polipeptida divljeg soja Shiga toksina (SLT-1A-WT) ili uništeno mesto furinskog odcepljenja, efektorskog polipeptida Shiga toksina (SLT-1A-FR). Trake koje su markirane "MW Marker" pokazuju šablon migracije lestvičaste proteinske molekulske težine zajedno sa približnom veličinom pojedinačnih lestvičastih proteinskih traka u kiloDaltonima (kDa) za primenu kao referenca unutrašnje molekulske težine koja dozvoljava za procenu veličina proteina u numerisanim trakama. Legenda slike prikazuje uslove pred-tretmana uzoraka ćelijski ciljanih molekula sa temperaturom u stepenu Celzijusa (°C), trajanjem, i da li je dodat furin označavanjem količine jedinica aktivnosti furina po mikrogramu (sa oznakom "U/µg furina") ili" bez furina" za nulte jedinice.
Slika 17 pokazuje da je SLT-1A-FR::scFv-9 (SEQ ID NO: 41) otporan na proteolitičko cepanje humanim furinom. Ćelijski ciljani molekuli testirani u ovoj analizi su bili veličine oko 56 kDa i sadržavali su efektorski polipeptid Shiga toksina od oko 28 kDa (veličine su identične za SLT-1A-WT ili SLT-1A-FR) povezane za karboksi krajnji linker i vezujući region koji su zajedno imali oko 28 kDa u veličini. Da se cepanje furina dogodilo na površini izloženoj, produženoj petlji 242-251 SLT-1A, tada bi očekivani rezultat bio dve proteinske trake sa približno jednakim molekulskim težinama od oko 28 kDa svaka. Ako se cepanje furina događa upravo na karboksi peptidnoj vezi arginina na poziciji 251 WT skeleta u SLT-1A-WT:: cFv-9, tada bi dve rezultirajuće proteinske trake trebale da imaju molekulsku težinu od 27.5 kDa za SLT-1A (ili WT ili FR) i od 28.3 kDa za scFv-9.
Gel je analiziran korišćenjem softvera GelAnalyzer 2010. Ovaj softver je otkrio trake gela prikazane na Slici 17 i trake unutar svake trake. Korišćenjem načina oduzimanja pozadine, pozadina je automatski definisana i oduzeta od zapremine svih traka analiziranih korišćenjem pozadinske substrakcije valjkaste kuglice sa prečnikom kuglice postavljenim na 25. Rezultati ove kvantitativne analize gela prikazani na Slici 17 sažeti su u Tabeli 18.
Tabela 18 prikazuje vrednosti relativne pokretljivosti i sirove zapremine za određene trake koje migriraju oko 56 kDa u trakama 1-6 u gelu prikazanom na Slici 17. Tretman „bez furina“ na 4 °C ćelijski ciljanog molekula (SLT-1A-WT::scFv-9) (SEQ ID NO: 42), koji sadrži efektorski polipeptid divljeg soja Shiga toksina, rezultati u traci # 2 korišćeni su kao kontrola za određivanje procenta neodcepljenog materijala na 30 °C u odsustvu ili prisustvu furina (trake # 2 i # 3, respektivno). Za uzorke SLT-1A-FR::scFv-9, traka "bez furina" od 4 °C (traka # 4) korišćena je za određivanje procenta neodcepljenog materijala na 30 °C u odsustvu ili prisustvu furina (trake # 5 i # 6, respektivno). Za svaki molekul, "procenat neodcepljenog" od 56 kDa trake za svaki uzorak tretiran sa furinom je izračunat sledećom formulom: (Sirova Zapremina 56 kDa uzorak trake) / (Sirova Zapremina ~56 kDa traka iz "bez furina" 4°C tretman) x 100 (videti Tabelu 18).
Tabela 18. Kvantifikacija Furinskog Cepanja u Odnosu na Referentni Molekul
Za divlji soj uzoraka furinskog mesta, količina proteina u ~ 56 kDa trake za uzorak inkubiran sa furinom je smanjen u poređenju sa količinom proteina u ~ 56 kDa trake za "bez furina" uzorke (Tabela 18; Slika17, traka #3 u poređenju sa trakom #1 i #2). Tretiranje furinom SLT-1A-WT::scFv-9 rezultuje u proizvodnji dve nove trake od oko 28 kDa (Slika 17, traka # 3), koje odgovaraju očekivanim veličinama proizvoda furinskog cepanja rezultujući iz cepanja karboski kraja regiona Shia toksin A1 fragmenta SLT-1A-WT::scFv-9. Za SLT-1A-FR::scFv9 uzorke, količina proteina u ~ 55 kDa traci u uzorku inkubiranom sa furinom traka izgleda nepromenjeno na osnovu količine proteina u ~ 55 kDa traci za uzorke "bez furina" (Tabela 18; Slika 17, traka #6 u poređenju sa trakom #4 i #5).
Kvantitativna analiza pokazuje da ćelijski ciljani molekul kontruisan sa efektorskim polipeptidom divljeg soja Shiga toksina SLT-1A-WT i vezujućeg regiona na karboksi kraju pokazuje oko 67.3% cepanja sa oko 32.7% SLT-1A-WT::scFv-9 koji ostaje neodcepljen. Procenat cepanja furinom kada se proedi sa referentnim molekulom može se iskazati kao odnos [(dostupni materijal - neodcepljeni) / dostupni materijal] molekula od interesa za [(dostupni materijal - neodcepljeni)/dostupan materijal] referentnog molekula. U ovoj analizi, SLT-1A-FR::scFv-9 pokazuje [(985-1000)/1000] / [(766-246)/766] = -1.5 % cepanja referentnog otprilike nula cepanja.
Ova anliza pokazuje da ćelijski ciljani molekul konstruisan sa efektorskim polipeptidom Shiga toksina SLT-1AFR pokazje 0% cepanja sa 100% ćelijski ciljanim molekulom ostaje neodcepljeno. Prema tome, čini se da je skelet SLT-1A-FR otporan na cepanje furinom u ovoj analizi u testiranim uslovima.
B. Testiranje In Vivo Tolerantnosti Ćelijski Ciljanih Molekula Predmetnog Pronalaska Koristeći Laboratorijske Životinje
In vivo tolerancija primera, ćelijski ciljani molekuli predmetnog pronalaska testirani su pomoću miševa da bi se utvrdio stepen otkrivanja očiglednih štetnih efekata u različitim dozama uzoraka ćelijski ciljanih molekula. Studije tolerancije izvode se upotrebom postupaka koji su poznati stručnjaku i/ili ovde opisanih (videti npr. WO 2015/191764). Na primer, miševima se ubrizgavaju uzorci ćelijski ciljanih molekula ili kontrolni nosači u dozama u rasponu od 0.25 do 5.00 miligrama po kilogramu telesne mase po injekciji (mg/kg/inj) tri puta nedeljno u toku nekoliko nedelja. Da bi se procenila in vivo podnošljivost, ubrizgani miševi se prate radi promene zdravlja i kliničkih znakova, kao što su, npr., aspekti morbiliteta, morbunditeta, telesne težine, fizičkog izgleda, merljivi klinički znakovi, neprovocirano ponašanje, i reakcije na spoljašnje podražaje, kao takav, (videti npr. Morton D, Griffiths P, Vet Rec 116: 431-43 (1985); Montgomery C, Cancer Bull 42: 230-7 (1990); Ullman-Cullere M, Foltz C, Lab Anim Sc 49: 319-23 (1999); Clingerman K, Summers L, J Am Assoc Lab Anim Sci 51: 31-6 (2012)). Eutanazija se može koristiti kao odgovor na znake morbiditeta i/ili morbunditeta i tako stvoriti tačku mortaliteta. Na primer, smanjenje telesne težine od 15-20% za 2-3 dana može se koristiti kao znak morbititeta kod glodara i kao opravdanje za eutanaziju (videti npr. Institute of Laboratory Animal Research 2011. Guide for the care and use of laboratory animals, 8th ed, Washington, DC, U.S.: National Academies Press).
Ćelijski ciljani molekuli predmetnog pronalaska koji sadrže otporne na cepanje furinom, efektorske polipeptide Shiga toksina pokazuju poboljšanu tolerantnost (npr. poboljšani profili nespecifične toksičnosti) u poređenju sa srodnim, referentnim molekulima koji sadrže fragmente divljeg soja Shiga toksin A1 (videti npr. WO 2015/191764). Takva poboljšana in vivo tolerancija može biti posledica povećane stabilnosti veze između efektorskog polipeptida Shiga toskina i vezujućeg regiona i/ili toksične komponente ćelijski ciljanog molekula.
C. Testiranje Ciljanih Citotoksičnih i Efektivnih Primernih, Ćelijski Ciljanih Moelkula Predmetnog Pronalaska In Vivo Koristeći Životinjske Modele
Životinjski modeli se koriste za određivanje in vivo efekata primernih, efektorskih polipeptida Shiga toksin kombo(n) i ćelijski ciljanih molekula koji sadrže gore pomenute ciljane pozitivne, neoplastične ćelije. Različiti sojevi miševa koriste se za testiranje efekata ćelijski ciljanih molekula na ksenograft tumore kod miševa nakon intravenske aplikacije svakog molekula tim miševima. U nekim eksperimentima, diseminovani model ksenografta za humane tumore se koristi da se odredi in vivo efikasnost primernih, ćelijski ciljanih molekula predmetnog pronalaska kod miševa koji nose humani tumor. U ovom ksenograft modelu koriste se ćelije humanog tumora koje konstitutivno eksprimiraju luciferazu i pokazuju ekspresiju mete odgovarajućeg scFv-(n) na ćelijskoj površini. Metode poznate stručnjaku upotrebljavaju se za testiranje ciljane citotoksičnosti molekula predmetnog pronalaska (videti npr. WO 2014/164680, WO 2014/164693, WO 2015/191764). Određeni ćelijski ciljani molekuli
1
predmetnog pronalaska su sposobni da značajno smanje opterećenje humanog tumora kod miševa koji su izazvani sa ćelijama humanog tumora.
Kao što je prikazano u Primerima 1-4, kombinacija efektorskih polipeptida Shiga toksina A Podjedinice predmetnog pronalaska može se koristiti kao skelet za stvaranje ćelijski ciljanih molekula koji pokazuju: 1) povećanu stabilnost, 2) poboljšanu toleranciju in vivo u hordatima, 2) smanjeni imunogeni potencijal nakon primene na hordate i/ili sposobnost da se ugradi ili umetne T-ćelijski epitop za prezentaciju MHC klase I pomoću nuklirane, hordatne ćelije. U određenim kombinacijama, rezultirajući nivo de-imunizacije predstavlja sinergističko delovanje pojedinačnih de-imunizovanih pod-regiona koji su kombinovani zajedno.
Primer 4. Primerni Ćelijski Ciljani Molekul koji Cilja CD38+ Ćelije
Vezujuća karakteristika "SLT-1A-kombo7::αCD38-scFv-1" proteina (SEQ ID NO:82) za ekstraćelijsku, humanu CD38 metu je određena sa analizom protočne citometrije na bazi fluorescencije. Uzorci koji sadrže CD38 pozitivne (CD38 ) ćelije (ili ćelijske linije A ili F) su suspendovani u IX PBS koji sadrže jedan procenat goveđeg seruma albumina (BSA) (Calbiochem, San Diego, CA, U.S.), koji se ovde dalje označava kao "IX PBS+1%BSA", i inkubirani na jedan sat na 4°C sa 100 µL raznih razblaženja SLT-1A-kombo7::αCD38-scFv-1. Najveća koncentracija SLT-1A-kombo7::αCD38-scFv-1 testirane u analizi je odabrana da zasiti sve vezujuće mogućnosti. CD38 negativne (CD38 -) ćelije (ćelijskih linija H i I) su tretirane sa najvećom koncentracijom SLT-1A-kombo7::αCD38-scFv-1 testiranom na ciljanim pozitivnim ćelijama u ovoj analizi. Posle jednog sata inkubacije, ćelijski uzorci su isprani dva puta sa IX PBS+1%BSA. Ćelijski uzorci su inkubirani na jedan sat na 4°C sa 100 µL IX PBS+1%BSA koji sadrže α-SLT-1A pAb1, potom ponovo isprani i inkubirani jedan sat na 4°C sa 100 µL IX PBS+1%BSA rastvorom koji sadrži anti-zečije sekundarno antitelo konjugovano do fluorescein izotiocijanat (FITC).
Ćelijski uzorci su isprani dva puta sa IX PBS+1%BSA, resuspendovani u 200 µL IX PBS podvrgnuti analizi protočne citometrije na bazi fluorescencije kako bi se procenio procenat ćelija vezanih sa dovoljnim sekundarnim antitelom, indikativno za nivo vezivanja SLT-1A-kombo7::αCD38-scFv-1 za ćelije u svakom uzorku. Podaci za sve uzorke u srednjim jedinicama intenziteta fluorescencije (MFI), u relativnim jedinicama fluorescencije, su dobijeni obijanjem podataka korišćenjem negativnog kontrolnog uzorka ćelija koji nije tretiran nijednim ćelijski ciljanim molekulom, već je inkubiran sa α-SLT-1A pAb1 primarnim antitelom i anti-zečijim sekundarnim antitelom kao što je opisano gore. Integrisani MFI (iMFI) je izračunat množenjem procenta pozitivnih ćelija sa MFI. Grafikoni su prikazani iMFI nasuprot
11
"koncentraciji proteina" u nanomolu korišćenjem Prism softvera (GraphPad Software, San Diego, CA, U.S.). Korišćenjem Prism softverske funkcija vezivanja na jedno mesto [Y = BMAX*X / (KD+ X)] pod naslovom vezivanje-zasićenost, Bmaxi KDsu izračunati korišćenjem korigovanih podataka osnovne vrednosti. Bmaxje maksimalno specifično vezivanje prijavljeno u iMFI. KDje konstanta vezivanja ravnoteže, prijavljena nanomolovima.
Bmaxza SLT-1A-kombo7::αCD38-scFv-1 (SEQ ID NO:82) koji se vezuje za dva, različita, CD38+ ćelijska tipa je izmeren da bude približno 100,000 iMFI, a KDSLT-lA-kombo7::αCD38-scFv-1 koji vezuje ove CD38+ ćelije je izmeren da bude približno 2-7 nM (Tabela 19; Slika 18). SLT-1A-kombo7::αCD38-scFv-1 nije pokazao specifično vezivanje za CD38- ćelije ili viši afinitet vezivanja za CD38- ćelije u ovoj analizi pod opisanim uslovima (Slika 18).
Tabela 19. Vezujuće Karakteristike: Reprezentativne vrednosti za Bmaxi KDza Ćelijsko Vezivanje sa Primernim, Ćelijski Ciljanim Molekulom Predmetnog Pronalaska
Primerni, CD38-ciljani, ćelijski ciljani molekul SLT-1A-kombo7::αCD38-scFv-1 je testiran na katalitičku aktivnost kao što je opisano u Primeru 2. SLT-1A-kombo7::αCD38-scFv-1 (SEQ ID NO:82) pokazuje ribozomsku inaktivacionu aktivnost u poređenju sa divljim sojem.
Primerni, CD38-ciljani, ćelijski ciljani molekul SLT-1A-kombo7::αCD38-scFv-1 je testiran na citotoksičnost kao što je opisano u Primeru 2. SLT-1A-kombo7::αCD38-scFv-1 (SEQ ID NO:82) je snažno citotoksičan na CD38+ ćelije.
Primerni, CD38-ciljani, ćelijski ciljani molekul SLT-1A-kombo7::αCD38-scFv-1 je testiran na smanjenu imunogenost kao što je opisano u Primeru 2. SLT-1A-kombo7:: αCD38-scFv-1 (SEQ ID NO:82) pokazuje sniženu imunogenost kada se poredi sa kontrolnim SLT-1A-FR:: αCD38-scFv-1.
Primerni, CD38-ciljani, ćelijski ciljani molekul SLT-1A-kombo7:: αCD38-scFv-1 je testiran u ksenograft modelu humanog kancera koristeći humane ćelije koje iskazuju CD38 i analizu koja je poznata stručnjaku (videti npr. WO 2014/164693). SLT-1A-kombo7:: αCD38-scFv-1 (SEQ ID NO:82) pokazuje sposobnost da smanji opterećenje tumora kod miševa ubrizganih
12
pozitivnim CD38, humanim, neoplastičnim ćelijama u poređenju sa kontrolnom grupom koja je bila tretirana nosačem. U ovoj studiji, miševima su ubrizgane 2.5 x 10<6>Daudi-Luc ćelije (humana, CD38 pozitivna ćelijska linija tumora koja je projektovana da iskazuje gen luciferaze). ýetiri dana nakon ubrizgavanja tumora, miševi su nasumično raspoređeni u grupe od osam miševa po grupi i lečenje je započeto. Miševi u kontrolnim grupama i grupama za lečenje sa ćelijski ciljanim molekulom su primili samo nosač ili ćelijski ciljani molekul, respektivno, za dvanaest doza tokom pet nedelja (tri puta nedeljno dve nedelje, nedeljno bez doziranja, a zatim tri puta nedeljno ponovo za 2 nedelje). U različitim danima studije, merenje bioluminiscencije celog tela (BLI) mereno je u fotonima u sekundi kako bi se nadgledalo opterećenje tumora tokom vremena sa otkrivanjem luciferaze koja izražava Daudi ćelije. Pre lečenja, miševi su nasumično korišćeni pomoću BLI očitanja kako bi se stvorile grupe miševa sa sličnim srednjim i srednjim vrednostima BLI. Rezultati ove studije prikazani su u Tabeli 20 i Slici 19. U Tabeli 20 je prikazan srednji BLI signal za tretiranu grupu sa ćelijski ciljanim molekulom i kontrolnu grupu koja je samo nosač i procenat „tretirane u odnosu na kontrolnu“ (% T/C ), definisano formulom: (srednji BLI signal tretirane grupe) / (srednji BLI signal kontrolne grupe samo za nosač) x 100. Dan 4 uključivao je merenja pre lečenja.
Tabela 20. Lečenje sa Primernim, Ćelijski Ciljanim Molekulom SLT-1A-kombo7::αCD38-scFv-1 Smanjuje Opterećenje Tumora In Vivo
BLI merenja uzeta u ispitivanju Dani 7, 14, 22, 36 i 40 pokazali su da je kontrolna grupa koja je samo nosač imala veće opterećenje tumora nego grupa tretirana sa 0.5 miligrama SLT-1A-kombo7::αCD38-scFv-1 po kg telesne težine po dozi. U zadnjoj vremenskoj tački (Dan
1
40), procenat BLI za lečenje u odnosu na kontrolnu samo nosač (T/C) je bio 11%>, što ukazuje da je bilo 89% smanjenja srednjeg opterećenja tumora u grupi tretiranoj sa SLT-1A-kombo7:: αCD38-scFv-1 (SEQ ID NO:82).
Primer 5. Ćelijski Ciljani Molekuli koji Sadrže Efektorski Polipeptid Shiga Toksina Predmetnog Pronalaska Vezan za HER2 Vezujući Region (αHER2-VHH spojen sa SLT-1A-kombo(n))
U ovom primeru, bilo koji efektorski polipeptid Shiga toksina SLT-1A-kombo0-26, kao što je prethodno opisano, je operativno povezan sa anti-HER2 vezujućim regionom imunoglobulina, koji se specifično i sa visokim afinitetom vezuje za ekstraćelijski antigen na humanom HER2, kao što je varijabilni region pojedinačnog domena kamelid, antitela 5F7 αHER2-VHH) kao što je opisano u Objavljenoj U.S. Patentnoj Prijavi 2011/59,090, kako bi se obrazovao primerni, ćelijski ciljani molekul predmetnog pronalaska.
Konstrukcija, Proizvodnja, i Prečišćavanje Citotoksičnog, HER2-Vezujućeg, Spojenog Proteina "SLT-1A-kombo(n)::αHER2-VHH"
Za određene primere izođenja, imunoglobulinski izvedeni vezujući region αHER2-VHH i efektorski polipeptid Shiga toksina su spojeni zajedno kako bi obrazovali pojedinačni, kontinuirani polipeptid "SLT-1A-kombo(n)::αHER2-VHH." U ovom primeru, polinukleotid koji kodira αHER2-VHH, vezujući region koji sadrži VHH varijabilni domen izveden iz imunoglobulina 5F7, je kloniran u okvir sa polinukleotidom koji kodira linker poznat iz tehnike i u okvir sa polinukleotidom koji kodira efektorski polipeptid Shiga toksina SLT-1A-kombo(n). Ekspresija ćelijski ciljanog molekula SLT-1A-kombo(n)::αHER2-VHH je izvodena upotrebom bilo sistema bakterija i/ili ćelija, bez proteina, koji su poznati stručnjaku i/ili kako je opisano u prethodnim primerima.
Određivanje In Vitro Karakteristika SLT-1A-kombo(n)::αHER2-VHH
Vezujuće karakteristike ćelijski ciljanog molekula predmetnog pronalaska ovog primera za HER2+ ćelije i HER2- ćelije su određene sa protočnom citometrijom na bazi fluorescencije. Bmaxza SLT-1A-kombo(n)::αHER2-VHH za HER2+ ćelije je izmeren da bude pribiližno 50,000-200,000 MFI sa KDu opsegu od 0.01-100 nM, pri čemu u ovoj analizi nema značajnog vezivanja za HER2-ćelije.
14
Sposobnosti inaktivacije ribozoma SLT-1A-kombo(n)::αHER2-VHH ćelijski ciljanog molekula je određena u in vitro proteinskoj translaciji bez ćelije kao što je ranije opisano u prethodnim primerima. Inhibitorni efekat ćelijski ciljanog molekula ovog primera na sintezu proteina bez ćelije je značajan. IC50SLT-1A-kombo(n)::αHER2-VHH na sintezi proteina u ovom testu bez ćelija je približno 0.1-100 pM.
Određivanje Citotoksičnosti SLT-1A-kombo(n)::αHER2-VHH Koristeći Analizu HER2+ Ubijanja Ćelije
Citotoksične karakteristike SLT-1A-kombo(n)::αHER2-VHH su određene pomoću opšteg testa ubijanja ćelija kao što je opisano gore u prethodnim primerima koristeći HER2+ ćelije. Pored toga, karakteristike selektivne citotoksičnosti SLT-1A-kombo(n)::αHER2-VHH su određene istim opštim testom ubijanja ćelija koristeći HER2- ćelije u poređenju sa HER2+ ćelijama. CD50ćelijski ciljanog molekula ovog primera je približno 0.01-100 nM za HER2 ćelije, zavisno od ćelijske linije. CD50SLT-1A-kombo(n)::αHER2-VHH je otprilike 10-10.000 puta veći (manje citotoksičnih) za ćelije koje ne izražavaju HER2 na površini ćelije u poređenju sa ćelijama koje izražavaju HER2 na površini ćelije. Pored toga, citotoksičnost SLT-1A-kombo(n)::αHER2-VHH se ispituje i za direktnu citotoksičnost i za indirektnu citotoksičnost primenom dostave T-ćelijskog epitopa i prezentacijom što dovodi do citotoksičnosti posredovane CTL korišćenjem analiza poznatih stručnjacima i/ili kao što je ovde opisano.
Određivanje In Vivo Efekata Primernog, Ćelijski Ciljanog Molekula SLT-1A-kombo(n)::αHER2-VHH Koristeći Životinjske Modele
Životinjski modeli se koriste za određivanje in vivo efekata ćelijski ciljanog molekula SLT-1A-kombo(n)::αHER2-VHH prema neoplastičnim ćelijama. Različiti sojevi miševa koriste se za testiranje efekta SLT-1A-kombo(n):: αHER2-VHH nakon intravenske primene na ksenograft tumorima kod miševa koji su posledica ubrizgavanja u one miševe humanih neoplsstičnih ćelija koje izražavaju HER2 na njihovim ćelijskim površinama. Ubijanje ćelija istražuje se i za direktnu citotoksičnost i za indirektnu citotoksičnost dostavom T-ćelijskog epitopa i prezentacijom što dovodi do CTL-posredovane citotoksičnosti korišćenjem analiza poznatih stručnjacima i/ili kao što je ovde opisano.
1
Primer 6. Ćelijski Ciljani Molekuli koji Sadrže Efektorski Polipeptid Shiga Toksin A Podjedinice Predmetnog Pronalaska, Spojenog, T-Ćelijski Epitop-Peptid, i ligand Vezujućeg Regiona specifičan za IL-2R
U ovom primeru, efektorski polipeptid Shiga toksina je izveden iz A podjedinice Shigasličnog Toksina 1 (SLT-1 A) kao što je prethodno opisano, opciono sa supstitucijom amino kiselinskog ostatka koji pruža otpornost na cepanje furina, kao što je, npr., R248A/R251A (videti Primer 3, supra). Human, CD8+ T-ćelijski epitop-peptid je odabran na osnovu MHC I molekulskih vezujućih predviđanja, H1A tipova, već karakteriše imunogenost i lako dostupni raspoloživi reagensi kao što je gore opisano, kao što je epitop GVMTRGRLK (SEQ ID NO:560). Vezujući region je izveden iz liganda (citokin interleukin 2 ili IL-2) za humani interleukin 2 receptor (IL-2R), koji je u stanju da specifično vezuje ekstraćelijski deo humanog IL-2R. IL-2R je ćelijski površinski receptor eksprimiran različitim imunološkim ćelijskim tipovima, kao što su T-ćelije i prirodne ubice ćelije.
Konstrukcija, Proizvodnja, i Prečišćavanje Ćelijski Ciljanih Spojenih Proteina T-epitop::SLT-1A::IL-2 i IL-2::T-epitop::SLT-1A
Vezujući region ligandnog tipa αIL-2R, efektorski polipeptid Shiga toksina, i T-ćelijski epitop su povezani zajedno kako bi obrazovali pojedinačni, kontinuirani polipeptid, kao što je "T-epitop::SLT-1A::IL-2" ili "IL-2::T-epitop::SLT-1A," i, opciono, KDEL je dodat na karboksi kraju rezultujućeg polipeptida. Na primer, spojeni proteini su proizvedeni sa ekspresijom iz polinukleotida koji kodiraju T-epitop::SLT-1A::IL-2 i IL-2::T-epitop::SLT-1A. Ekspresija T-epitop::SLT-1A::IL-2 ili IL-2::T-epitop::SLT-1A ćelijski ciljanih molekula je postignuta korišćenjem bakterijskih i/ili ćelijskih slobodnih, proteinskih translacionih sistema kao što je opisano u prethodnim primerima.
Određivanje In Vitro Karakteristika Ćelijski Ciljanih Molekula SLT-1A::T-epitop::IL-2 i IL-2::SLT-1A::T-epitop
Vezujuće karakteristike ćelijski ciljanih molekula ovog primera za IL-2R pozitivne ćelije i IL-2R negativne ćelije su određene sa protočnom citometrijom na osnovu fluorescencije. Bmaxza oba T-epitop::SLT-1A::IL-2 i IL-2::T-epitop::SLT-1A za IL-2R pozitivne ćelije je izmeren da bude približno 50,000-200,000 MFI sa KDunutar opsega od 0.01-100 nM, pri čemu nema značajnog vezivanja za IL-2R negativne ćelije u ovoj analizi.
1
Sposobnost inaktivacije ribozoma T-epitop::SLT-1A::IL-2 i IL-2::T-epitop::SLT-1A je određena u in vitro proteinskoj translaciji bez ćelije kao što je ranije opisano u prethodnim primerima. Inhibitorni efekat ćelijski ciljanog molekula ovog primera na sintezu proteina bez ćelije je značajan. Za oba T-epitop::SLT-1A::IL-2 i IL-2::T-epitop::SLT-1A, IC50na sintezi proteina u ovom testu bez ćelija je približno 0.1-100 pM.
Određivanje Citotoksičnosti Ćelijski Ciljanih Molekula T-epitop::SLT-1A::IL-2 ili IL-2::T-epitop::SLT-1A Koristeći Analizu Ubijanja Ćelije
Citotoksične karakteristike T-epitop::SLT-1A::IL-2 ili IL-2::T-epitop::SLT-1A su određene generalnom analizom ubijanja ćelija kao što je opisano gore u prethodnim primerima koristeći IL-2R pozitivne ćelije. Pored toga, karakteristike selektivne citotoksičnosti T-epitop::SLT-1A::IL-2 ili IL-2::T-epitop::SLT-1A su određene istom opštom analizom ubijanja ćelije korišćenjem negativne IL-2R ćelije kao poređenje sa pozitivnim ćelijama IL-2R. CD50ćelijski ciljanih molekula ovog primera je približno 0.01-100 nM za IL-2R pozitivne ćelije u zavisnosti od ćelijske linije. CD50T-epitop::SLT-1A::IL-2 ili IL-2::T-epitop::SLT-je približno 10-10,000 puta veći (manje citotoksični) za ćelije koje ne eksprimiraju IL-2R na površini ćelije u poređenju sa ćelijama koje izražavaju IL-2R na površini ćelije. Pored toga, citotoksičnost T-epitop::SLT-1A::IL-2 ili IL-2::T-epitop::SLT-1A se istražuje i za direktnu citotoksičnost i za indirektnu citotoksičnost primenom i prezentacijom T-ćelijskog epitopa što dovodi do citotoksičnosti posredovane CTL korišćenjem testova poznatih stručnjaku i/ili ovde opisanih.
Određivanje In Vivo Efekata Primernog, Ćelijski Ciljanog Molekula T-epitop::SLT-1A::IL-2 ili IL-2::T-epitop::SLT-1A Koristeći Životinjske Modele
Životinjski modeli se koriste za određivanje in vivo efekata ćelijski ciljanih molekula T-epitop::SLT-1A::IL-2 i IL-2::T-epitop::SLT-1A na neoplastičnim ćelijama. Različiti sojevi miševa koriste se za testiranje efekta T-epitop::SLT-1A::IL-2 i IL-2::T-epitopa::SLT-1A nakon intravenske primene na ksenograft tumorima kod miševa koji su posledica injekcije u one miševe humanih neoplastičnih ćelija koji izražavaju IL-2R na svojim ćelijskim površinama. Ubijanje ćelija istražuje se i za direktnu citotoksičnost i za indirektnu citotoksičnost davanjem T-ćelijskog epitopa i prezentacijom što dovodi do CTL-posredovane citotoksičnosti korišćenjem testova poznatih stručnjacima i/ili ovde opisanih.
1
Primer 7. Ćelijski Ciljani Molekuli koji Sadrže Efektorski Polipeptid Shiga Toksina Predmetnog Pronalaska Vezani za CEA Vezujući Region (αCEA-(Fn3) vezujući region spojen sa SLT-1A-kombo(n))
U ovom primeru, efektorski polipeptid Shiga toksina SLT-1A-kombo(n), kao što je prethodno opisano, je operativno povezan sa vezujućim regionom anti-CEA (Fn3) vezujućeg regiona imunoglobulinskog tipa, koji se specifično i sa visokim afinitetom vezuje za ekstraćelijski antigen na humani karcinoembrionski antigen (CEA), kao što je deseti humani fibronektin tipa III domen izvedenog vezujućeg regiona C743 kako je opisano u Pirie C et al, J Biol Chem 286: 4165-72 (2011), za obrazovanje primernog, ćelijski ciljanog molekula predmetnog pronalaska. Dodatno, imunogenski, CD8+ T-ćelijski epitope je spojen za amino kraj efektroskog polipeptida Shiga toksina ovog primera kako bi se obrazovao epitop-SLT-1A-kombo(n).
Konstrukcija, Proizvodnja, i Prečišćavanje Citotoksičnog, CEA-Vezujućeg, Spojenog Proteina "αCEA-(Fn3) spojen sa epitop-SLT-1A-kombo(n)"
Za određene primere izvođenja, vezujući regioni imunoglobulinskog tipa αCEA-(Fn3) i efektorski polipeptid Shiga toksina su spojeni zajedno kako bi se obrazovao pojedinačni, kontinuirani polipeptid "αCEA-(Fn3) spojen sa epitop-SLT-1A-kombo(n)." U ovom primeru, spojeni protein "αCEA-(Fn3) spojen sa epitop-SLT-1A-kombo(n)" je konstruisan i proizveden kao što je opisano u prethodnim primerima.
Određivanje In Vitro Karakteristika "αCEA-(Fn3) spojenog sa epitop-SLT-1A-kombo(n)"
Vezujuće karakteristike ćelijski ciljanih molekula ovog primera CEA+ ćelije i CEA- ćelije su određene sa protočnom citometrijom na osnovu fluorescencije. BmaxαCEA-(Fn3) spojen sa epitop-SLT-1A-kombo(n) za CEA+ ćelije je izmeren da bude približno 50,000-200,000 MFI sa KDunutar opsega od 0.01100 nM, pri čemu nema značajnog vezivanja za CEA- ćelije u analizi.
Sposobnost inaktivacije ribozoma αCEA-(Fn3) spojenog sa epitop-SLT-1A-kombo(n) ćelijski ciljanim molekulom je određena u in vitro proteinskoj translaciji bez ćelije kao što je ranije opisano u prethodnim primerima. Inhibitorni efekat ćelijski ciljanog molekula ovog primera na sintezu proteina bez ćelije je značajan. IC50αCEA-(Fn3) spojenog sa epitop-SLT-1A-kombo(n) na sintezi proteina u ovoj analizi bez ćelija je približno 0.1-100 pM.
1
Određivanje Citotoksičnosti "αCEA-(Fn3) spojen sa epitop-SLT-1A-kombo(n)" Koristeći CEA+ Analizu Ubijanja Ćelije
Citotoksične karakteristike αCEA-(Fn3) spojen sa epitop-SLT-1A-kombo(n) su određene opštom analizom ubijanja ćelija kao što je opisano gore u prethodnim primerima koristeći CEA+ ćelije. Dodatno, selektivne citotoksične karakteristike αCEA-(Fn3) spojen sa epitop-SLT-1A-kombo(n) su određene sa istom opštom analizom ubijanja ćelije koristeći CEA-ćelije kao poređenje sa CEA+ ćelijama. CD50ćelijski ciljanog molekula ovog primera je približno 0.01-100 nM za CEA+ ćelije u zavisnosti od ćelijske linije. CD50αCEA-(Fn3) spojen sa epitop-SLT-1A-kombo(n) je približno 10-10,000 puta veći (manja citotoksičnost) za ćelije koje ne iskazuju CEA na ćelijskoj površini kada se poredi sa ćelijama koje iskazuju CEA na ćelijskoj površini. Dodatno, citotoksičnost αCEA-(Fn3) spojena sa epitop-SLT-1A-kombo(n) istražuje se i za direktnu citotoksičnost i za indirektnu citotoksičnost primenom T-ćelijskog epitopa i prezentacijom koja dovodi do citotoksičnosti posredovane CTL korišćenjem testova poznatih stručnjaku i/ili ovde opisani.
Određivanje In Vivo Efekata Primernog, Ćelijski Ciljanog Molekula "αCEA-(Fn3) spojen sa epitop-SLT -1A-kombo(n)" Koristeći Životinjski Model
Životinjski modeli se koriste za određivanje in vivo efekata ćelijski ciljanih molekula αCEA-(Fn3) spojeni sa epitop-SLT-1A-kombo(n) prema neoplastičnim ćelijama. Različiti sojevi miševa koriste se za testiranje efekta αCEA-(Fn3) spojen sa epitop-SLT-1A-kombo(n) nakon intravenske primene na ksenograft tumorima kod miševa koji su posledica ubrizgavanja u one miševe humanih neoplastičnih ćelija koji izražavaju CEA na njihove ćelijske površine. Ubijanje ćelija istražuje se i za direktnu citotoksičnost i za indirektnu citotoksičnost davanjem T-ćelijskog epitopa i prezentacijom što dovodi do CTL-posredovane citotoksičnosti korišćenjem testova poznatih stručnjacima i/ili ovde opisanih.
Primer 8. Citotoksični, ćelijski ciljani molekuli koji sadrže efektorske polipeptide Shiga toksina SLT-1A-kombo(n) i antitelo αhelmint-intestinalni-antigen
U ovom primeru, bilo koji efektroski polipeptidi Shiga toksina SLT-1A-kombo0-26, kao što je ranije opisano, je operaciono vezan za vezujući region imunoglobulinskog tipa koji cilja helmint antigen. Vezujući region imunoglobulinskog tipa αhelmint-intestinalnog-antigena je izveden iz antitela uopšteno, koristeći tehnike koje su poznate u tehnici, za helmint ortolog
1
humanog transferin receptora (videti npr. nematodni gen gcp-2.1 UniProt G8JYE4CAEEL; Rosa B et al, Mol Cell Proteomics Ml 14.046227 (2015)).
Konstrukcija, Proizvodnja, i Prečišćavanje Citotoksičnog, Ćelijski Ciljanog Molekula "SLT-1A-kombo(n)::αHelmint-Intestinalni-Antigen"
Vezujući region imunoglobulinskog tipa αhelmint-intestinalnog-antigena i efektorski region Shiga toksina, koji je opciono otporan na cepanje proteaze efektorski region Shiga toksina, su vezani zajedno kako bi se obrazovao protein u kome vezujući region imunoglobulinskiog tipa nije postavljen blizu proteinskog amino kraja kada se poredi sa efektorskim regionom Shiga toksina. Na primer, spojeni protein je proizveden ekspresijom polinukleotida koji kodira protein koji se veže za αhelmint-intestinalni-antigen, spojen na amino kraju SLT-1A-kombo0-26. Ekspresija SLT-1A-kombo(n)::αhelmint-intestinalnog-antigenskog-vezujućeg protein je izvodeno upotrebom ili bakterijskih i/ili bez ćelija, proteinskih translacionih sistema kao što je opisano u prethodnim primerima.
Određivanje In Vitro Karakteristika Citotoksičnog, Ćelijski Ciljanog Molekula SLT-1A-kombo(n)::αHelmint-Intestinalnog-Antigena
Vezujuće karakteristike citotoksičnog, ćelijski ciljanog molekula ovog primera su određene sa analizom molekulskog vezivanja koji je poznat u tehnici korišćenjem prečišćenog, rekombinantnog, ciljanog proteina. KDza SLT-1A::αhelmint-intestinalni-antigen i/ili SLT-1A-FR::αhelmint-intestinalni-antigen da cilja protein je izmeren da bude približno 100 nM, dok nema značajnog vezivanja za negativni kontrolni protein (npr. prečišćen, rekombinantni, helmint ortolog humanog transferin receptora) u ovoj analizi.
Sposobnosti inaktivacije ribozoma SLT-1A::αhelmint-intestinalnog-antigena se određuje u in vitro translaciji proteina bez ćelija kao što je gore opisano u prethodnim primerima. Inhibitorni efekat citotoksičnog, ćelijski ciljanog molekula ovog primera na sintezi proteina bez ćelije je značajan. IC50SLT-1A::αhelmint-intestinalnog-antigena na sintezi proteina u ovoj analizi bez ćelija je približno 0.1-100 pM.
Određivanje Toksičnosti Citotoksičnog, Ćelijski Ciljanog Molekula SLT-1A-kombo(n):: αHelmint-Intestinalnog-Antigena
2
Toksičnost SLT-1A::αhelmint-intestinalnog-antigena na helmintima je određena korišćenjem modela helminta videti npr. Iatsenko I et al. Toksins 2050-63 (2014)). Helmint se može primeniti prečišćen SLT-1 A::αhelmint-intestinalni-antigen natapanjem ili alternativnim načinom hranjenja helminta sa bakterijama koje izražavaju SLT-1A::αhelmint-intestinalniantigenski spojeni protein.
Pored toga, laboratorijskim životinjama koje se bave helmintima i/ili širenjem bolesti povezanih sa helmintima se daje SLT-1A::αhelmint-intestinalni antigen i nadgleda se radi smanjenja ili eliminacije helminta i/ili pridruženih simptoma parazitskog(ih) helminta(a).
Primer 9. Ćelijski ciljani m olekuli ef ektorskog polipeptida Shi ga t oksina SL T-1A-kombo(n) spojenih za vezujući region imunoglobulinskog tipa specifičan za HIV-1 Gag
U ovom primeru, bilo koji efektorski polipeptid Shiga toksina SLT-1A-kombo0-26, kao što je prethodno opisano, je operativno povezan za vezujući region imunoglobulinskog tipa αGagantigen, koji je izveden iz domena imunoglobulinskog tipa koji prepoznaje HIV kapsidni protein HIV-1 Gag poliprotein (videti npr. Nago1A S et al, Retrovirology 9: 17 (2012)) i koji sadrži veštački, Ankirin domen ponovljeni polipeptid koji je sposoban da veže ekstraćelijski deo Gag. Gag je glavni strukturni protein uključen u skupljanje virusa HIV-a i oligomerizira se u rešetku od čak 700 do 5000 kopija po virionu kako bi se formiralo CA jezgro u obliku konusnog oblika (videti npr. Chen Y et al, Biophys J 96: 1961-9 (2009); Pornillos O et al. Nature 469: 424-7 (2011)).
Konstrukcija, Proizvodnja, i Prečišćavanje Ćelijskih Ciljanih Molekula "SLT-1A-kombo(n) vezani za αGag"
Vezujući region imunoglobulinskog tipa αGag i efektorski polipeptid Shiga toksina SLT-1A-kombo(n) su spojeni kako bi se obrazovao citotoksični protein. Na primer, spojeni protein je proizveden sa ekspresijom polinukleotida koji kodira αGag-antigenski-vezujući protein SLT-1A-kombo(n)::αGag. Ekspresija SLT-1A-kombo(n)::αGag citotoskičnog proteina je postignuta korišćenjem ili bakterijskog i/ili bez ćelije, proteinskih translacionih sistema kao što je opisano u prethodnim primerima.
Određivanje In Vitro Karakteristika Citotoksičnog, Ćelijski Ciljanog Molekula "SLT-1A-kombo(n)::αGag"
21
Vezujuće karakteristike citotoksičnog proteina ovog primera za prečišćeni, rekombinantni HIV-1 Gag se određuju analizom koja je poznata u tehnici, kao što je analiza enzimski povezanog imunosorbenta. KDza SLT-1A-kombo(n)::αGag koji se vezuje za Gag je izmeren da bude približno unutar opsega od 0.01-100 nanomola (nM).
Sposobnosti inaktivacije ribozoma SLT-1A-kombo(n)::αGag citotoksičnog proteina je određena u slobodnoj ćeliji, in vitro proteinskom translatacijom kao što je prethodno opisano u prethodnim primerima. Inhibitorni efekat citotoksičnog proteina ovog primera na sintezi proteina bez ćelije je značajna. IC50SLT-1A-kombo(n)::αGag na sintezi proteina u ovoj analizi bez ćelija je približno 0.1-100 pM.
Određivanje Citotksičnosti Ćelijski Ciljanog Moelkula "SLT-1A-kombo(n)::αGag" Koristeći Analizu Ubijanja Ćelije
Citotoksične karakteristike SLT-1A-kombo(n)::αGag su određene uopštenom analizom ubijanja ćelije kao što je opisano gore u prethodnim primerima koristeći HIV-inficirane humane T-ćelije. Dodatno, selektivne citotoksične karakteristike SLT-1A-kombo(n)::αGag su određene istom uopštenom analizom ubijanja ćelije koristeći neinficirane T-ćelije kao poređenje u odnosu na inficirane T-ćelije. CD50citotoksičnog proteina ovog primera je približno 0.01-100 nM za inficirane T-ćelije sa aktivno replicirajućim virusom. CD50citotoksičnog proteina je približno 10-10,000 puta veća (manja citotoksičnost) za neinficirane T-ćelije.
Određivanje In Vivo Efekata Citotoksičnog, Ćelijski Ciljanog Molekula "SLT-1A-kombo(n):: αGag" Koristeći Životinjske Modele
Korišćenje SLT-1 A-kombo(n)::αGag da se inhibira napredovanje HIV infekcije testira se primenom SLT-1A-kombo(n)::αGag na simian virus imunodeficijencije (SIV) zaraženi primati koji nisu ljudi (videti Sellier P et al, PLoS Owe 5: el0570 (2010)).
Primer 10. Citotoksični, ćelijski ciljani molekul izveden iz A Podjedinice Shiga toksina i antitelo αhistoplazma-antigen
U ovom primeru, bilo koji efektorski polipeptidi Shiga toksina SLT-1A-kombo0-26, kao što je opisano gore, je operativno povezan za vezujući region imunoglobulinskog tipa αhistoplazma-antigen, koji je izveden iz poznatog antitela ili generisanog antitela, koristeći
22
tehnike koje su poznate u tehnici, na Histoplazma capsulatum površinu antigena videti npr., H. capsulatum H antigen (Deepe G, Durose G, Infect Immun 63: 3151-7 (1995)) i mAb H1C (Lopes L et al, Clin Vaccine Immunol 17: 1155-8 (2010); H. capsulatum, ćelijsku površinu, histon-sličnog proteina H2B (Nosanchuk J et al, J Clin Invest 112: 1164-1175 (2003))).
Konstrukcija, Proizvodnja, i Prečišćavanje Ćelijski Ciljanog Molekula SLT-1A-kombo(n):: αHistoplazma-Antigen
Vezujući region imunoglobulinskog tipa αhelmint-intestinalni-antigen i efektorski polipeptid Shiga toksina, koji je opciono otporan na cepanje proteaze efektorskog regiona Shiga toksina, povezane su zajedno da formiraju protein u kojem vezujući region imunoglobulinskog tipa nije lociran blizu proteinskog amino kraja kada se poredi sa efektorskim polipeptidom Shiga toksina. Na primer, spojeni protein je proizveden ekspresijom polinukleotida koji kodira Histoplazma-površinski-antigen-vezujući protein spojen za amino kraj, SLT-1A-kombo(n). Ekspresija SLT-1A-kombo(n)::αHistoplazmaantigen-vezujućeg proteina je postignuta koristeći ili bakterijske i/ili bez ćelije, proteinske translacione sisteme kao što je opisano u prethodnim primerima.
Određivanje In Vitro Karakteristika Citotoksičnog, Ćelijski Ciljanog Molekula SLT-1A-kombo(n):: αHistoplazma-Antigen
Vezujuće karakteristike citotoksičnog, ćelijski ciljanog molekula ovog primera su određene sa analizom molekulskog vezivanja koja je poznata u tehnici koristeći prečišćeni rekombinantni ciljani protein. KDza SLT-1A-kombo(n)::αHistoplazma-antigen za ciljani protein (npr. prečišćeni, rekombinantni, H. capsulatum površinski antigen) je izmeren da bude približno 100 nM, s obzirom da u ovom testu nema značajnog vezivanja za negativni kontrolni protein.
Sposobnosti inaktivacije ribozoma SLT-1A-kombo(n)::αHistoplazma-antigen citotoksični protein su određene u bez ćelije, in vitro proteinskoj translataciji kao što je opisano gore u prethodnim primerima. Inhibitorni efekat citotoksičnog, ćelijski ciljanog molekula ovog primera na sintezi proteina bez ćelije je značajno. IC50SLT-1A-kombo(n)::αHistoplazmaantigen na sintezi proteina u ovoj bez ćelije analizi je približno 0.1-100 pM.
Određivanje Anti-Gljivične Aktivnosti Citotoksičnog, Ćelijski Ciljanog Molekula SLT-1A-kombo(n)::αHistoplazma-Antigen Koristeći Gljive
2
Fungicidna aktivnost SLT-1A-kombo(n)::αHistoplazma-antigena na ćelije gljive je određena. Prečišćen, StxA::αHistoplazma-antigen i/ili StxA-FR::αHistoplazma-antigen se direktno primenjuje na kulture gljiva u cilju da se izmeri fungicidna aktivnost (videti npr. Li R et al, Antimicrob Agents Chemother 44: 1734-6 (2000)). Dodatno, laboratorijske životinje zaražene gljivicama (npr. H. capsulatum) i/ili prikazivanje histoplazmoze, sistemskih mikoza i/ili drugih H. capsulatum-srodnih oboljenja se primenjuje SLT-1A-kombo(n)::αHistoplazma-antigen i nadgleda se radi smanjenja ili eliminacije gljivičnih patogena i/ili pridruženih simptoma gljivičnih infekcija (videti npr. Kobayashi G et al, Antimicrob Agents Chemother 34: 524-8 (1990)).
Primer 11. Citotoksičnost Ćelijski Ciljanih Molekula koji Ciljaju Razne Ćelijske Tipove
U ovom primeru, efektorski region Shiga toksina je izvedeno iz A Podjedinice Shiga-sličnog toksina 1 (SLT-1A), Shiga toksina (StxA) i/ili Shiga-sličnog Toksina 2 (SLT-2A) tako da sadrži kombinaciju pod-regiona koji su ovde opisani kako bi se obezbedilo dve ili više sledećeg: 1) de-imunizacija, 2) otpornost na cepanje proteaze i/ili 3) ugrađeni ili ubačeni, heterologni T-ćelijski epitop. Vezujući region je izveden iz molekula izabranih iz kolone 1 Tabele 21 i koja veže ekstraćelijski ciljani biomolekul naveden u koloni 2 Tabele 21.
Dobijena kombinacija, efektorski polipeptidi Shiga toksina i vezujući region spajaju se zajedno da obrazuju različite, jednostruke- lančane polipeptide. Primeri proteina ovog primera su opciono kreirani pomoću karboksi-krajnjeg signala tipa KDEL koristeći tehnike poznate u struci i opciono povezani sa dodatnim egzogenim materijalom, kao što je agens(i) za promovisanje detekcije. Primeri proteina ovog primera testirani su kao što je opisano u prethodnim primerima koristeći ćelije koje eksprimiraju odgovarajuće ekstraćelijske ciljane biomolekule. Primeri proteina ovog primera mogu se upotrebiti, na primer, za obeležavanje podćelijskih delova ciljanih ćelija i za dijagnostiku i lečenje bolesti, stanja i/ili poremećaja navedenih u koloni 3 Tabele 21.
Tabela 21. Razni Vezujući Regioni za Ćelijske Ciljane Citotoskične Proteine
24
2
2
2
2
2
1
2
4
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1

Claims (46)

Patentni zahtevi
1. Efektorski polipeptid Shiga toksina koji sadrži:
i) ugrađeni ili ubačeni, heterologni, CD8+ T-ćelijski epitope; i
ii) uništeni najmanje jedan, endogeni, B-ćelijski i/ili CD4+ T-ćelijski epitopski region koji se ne preklapa sa ugrađenim ili ubačenim, heterolognim, CD8+ T-ćelijskim epitopom;
pri čemu efektorski polipeptid Shiga toksina je sposoban da iskazuje efektorsku funkciju Shiga toksina odabranu između jedne ili više:
usmeravanje intraćelijskog usmeravanja do citozola ćelije u kojoj je polipeptid prisutan, usmeravanje intraćelijske putanje sa teretom, inhibiranje funkcije ribozoma, enzimsko inaktiviranje ribozoma i citotoksičnost; i
pri čemu efektorski polipeptid Shiga toksina obuhvata ili se sastoji od sekvence koja je najmanje 85% identična sekvenci odabranoj između:
(i) amino kiselina 75 do 251 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, ili SEQ ID NO: 3;
(ii) amino kiselina 1 do 241 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, ili SEQ ID NO: 3;
(iii) amino kiselina 1 do 251 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, ili SEQ ID NO: 3; i
(iv) amino kiselina 1 do 261 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, ili SEQ ID NO: 3.
2. Efektorski polipeptid Shiga toksina prema zahtevu 1, koji sadrži ugrađeni, heterologni, CD8+ T-ćelijski epitop; pri čemu ugrađeni, heterologni CD8+ T-ćelijski epitop menja ekvivalentan broj amino kiselinskih ostataka u roditeljskom efektorskom polipeptidu Shiga toksina tako da efektorski polipeptid Shiga toksina ima isti ukupan broj amino kiselina kao roditeljski efektorski polipeptid Shiga toksina.
3. Efektorski polipeptid Shiga toksina prema zahtevu 1 ili zahtevu 2, pri čemu efektorski polipeptid Shiga toksina je sposoban za intraćelijsku dostavu ugrađenog ili ubačenog, heterolognog, CD8+ T-ćelijskog epitopa iz ranije endozomalne pregrade ćelije u kojoj efektorski polipeptid Shiga toksina je prisutan u molekulu ćelije MHC klase I; opciono pri čemu efektorski polipeptid Shiga toksina je sposoban da iskazuje jednu ili više efektorskih funkcija Shiga toksina u odnosu na intraćelijsku dostavu ugrađenog, heterolognog, CD8+ T-ćelijskog epitopa iz ranije endozomalne pregrade ćelije u kojoj efektorski polipeptid Shiga
2
toksina je prisutan u molekulu ćelije MHC klase I.
4. Efektorski polipeptid Shiga toksina prema bilo kom zahtevu 1-3, pri čemu uništenje obuhvata mutaciju, u odnosu na divlji soj Shiga toksin A Podjedinice, u B-ćelijskom i/ili CD4+ T-ćelijskom epitopskom regionu odabranom iz grupe izvorno pozicioniranih regiona Shiga toksin A Podjedinice koji se sastoji od: 1-15 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 3-14 SEQ ID NO:3; 26-37 SEQ ID NO:3; 27-37 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 39-48 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 42-48 SEQ ID NO:3; 53-66 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 94-115 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 141-153 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 140-156 SEQ ID NO:3; 179-190 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 179-191 SEQ ID NO:3; 204 SEQ ID NO:3; 205 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 210-218 SEQ ID NO:3; 240-260 SEQ ID NO:3; 243-257 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 254-268 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 262-278 SEQ ID NO:3; 281-297 SEQ ID NO:3; 285-293 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 4-33 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 34-78 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 77-103 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 128-168 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 160-183 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 236-258 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; i 274-293 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2.
5. Efektorski polipeptid Shiga toksina prema bilo kom zahtevu 1-4, pri čemu ugrađeni ili ubačeni, heterologni, CD8+ T-ćelijski epitop uništava endogeni, B-ćelijski epitop i/ili CD4+ T-ćelijski epitopski region odabran iz grupe izvorno pozicioniranih regiona Shiga toksin A Podjedinice koji se sastoje od: 1-15 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 3-14 SEQ ID NO:3; 26-37 SEQ ID NO:3; 27-37 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 39-48 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 42-48 SEQ ID NO:3; 53-66 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 94-115 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 141-153 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 140-156 SEQ ID NO:3; 179-190 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 179-191 SEQ ID NO:3; 204 SEQ ID NO:3; 205 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 210-218 SEQ ID NO:3; 240-260 SEQ ID NO:3; 243-257 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 254-268 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 262-278 SEQ ID NO:3; 281-297 SEQ ID NO:3; 285-293 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 4-33 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 34-78 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 77-103 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 128-168 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 160-183 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 236-258 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; i 274-293 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2.
6. Efektorski polipeptid Shiga toksina prema bilo kom zahtevu 1-5, koji obuhvata uništenje najmanje dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, ili više endogenih, B-ćelijskih i/ili CD4+ T-ćelijskih epitopskih regiona.
7. Efektorski polipeptid Shiga toksina prema bilo kom zahtevu 1-6, pri čemu najmanje jedan uništeni sadrži supstituciju amino kiselinskog ostatka u odnosu na divlji soj Shiga toksin A Podjedinice; opciono pri čemu najmanje jedno uništenje obuhvata više supstitucija amino kiselinskog ostatka u epitopskom regionu u odnosu na divlji soj Shiga toksin A Podjedinice.
8. Efektorski polipeptid Shiga toksina prema zahtevu 7, pri čemu:
(i) najmanje jedna supstitucija se dešava na izvorno pozicioniranom amino kiselinskom ostatku Shiga toksin A Podjedinice iz grupe koja se sastoji od: 1 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 4 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 6 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 8 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 9 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 11 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 12 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 33 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 43 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 44 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 45 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 46 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 47 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 48 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 49 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 50 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 51 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 53 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 54 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 55 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 56 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 57 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 58 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 59 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 60 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 61 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 62 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 84 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 88 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 94 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 96 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 104 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 105 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 107 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 108 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 109 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 110 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 111 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 112 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 141 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 147 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 154 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 179 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 180 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 181 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 183 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 184 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 185 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 186 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 187 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 188 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 189 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 197 SEQ ID NO:3; 198 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 204 SEQ ID NO:3; 205 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 247 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 247 SEQ ID NO:3; 248 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 250 SEQ ID NO:3; 251 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; 264 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, ili SEQ ID NO:3; 265 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2; i 286 SEQ ID
4
NO:1 ili SEQ ID NO:2;
(ii) najmanje jedna supstitucija je odabrana iz grupe koja se sastoji od: D do A, D do G, D do V, D do L, D do I, D do F, D do S, D do Q, D do M, D do R, E do A, E do G, E do V, E do L, E do I, E do F, E do S, E do Q, E do N, E do D, E do M, E do R, F do A, F do G, F do V, F do L, F do I, G do A, G do P, H do A, H do G, H do V, H do L, H do I, H do F, H do M, I do A, I do V, I do G, I do C, K do A, K do G, K do V, K do L, K do I, K do M, K do H, L do A, L do V, L do G, L do C, N do A, N do G, N do V, N do L, N do I, N do F, P do A, P do G, P do F, R do A, R do G, R do V, R do L, R do I, R do F, R do M, R do Q, R do S, R do K, R do H, S do A, S do G, S do V, S do L, S do I, S do F, S do M, T do A, T do G, T do V, T do L, T do I, T do F, T do M, T do S, V do A, V do G, Y do A, Y do G, Y do V, Y do L, Y do I, Y do F, Y do M, i Y do T; i/ili
(iii) najmanje jedna supstitucija je odabrana iz grupe supstitucija na izvornim pozicijama u Shiga toksin A Podjedinice koja se sastoji od: K1 do A, G, V, L, I, F, M ili H; T4 do A, G, V, L, I, F, M, ili S; D6 do A, G, V, L, I, F, S, Q ili R; S8 do A, G, V, I, L, F, ili M; T9 do A, G, V, I, L, F, M, ili S; S9 do A, G, V, L, I, F, ili M; K11 do A, G, V, L, I, F, M ili H; T12 do A, G, V, I, L, F, M, S, ili K; S12 do A, G, V, I, L, F, ili M; S33 do A, G, V, L, I, F, M, ili C; S43 do A, G, V, L, I, F, ili M; G44 do A ili L; S45 do A, G, V, L, I, F, ili M; T45 do A, G, V, L, I, F, ili M; G46 do A ili P; D47 do A, G, V, L, I, F, S, M, ili Q; N48 do A, G, V, L, M ili F; L49 do A, V, C, ili G; Y49 do A, G, V, L, I, F, M, ili T; F50 do A, G, V, L, I, ili T; A51 do V; D53 do A, G, V, L, I, F, S, ili Q; V54 do A, G, I, ili L; R55 do A, G, V, L, I, F, M, Q, S, K, ili H; G56 do A ili P; 157 do A, G, V, ili M; L57 do A, V, C, G, M, ili F; D58 do A, G, V, L, I, F, S, ili Q; P59 do A, G, ili F; E60 do A, G, V, L, I, F, S, Q, N, D, M, T, ili R; E61 do A, G, V, L, I, F, S, Q, N, D, M, ili R; G62 do A; R84 do A, G, V, L, I, F, M, Q, S, K, ili H; V88 do A ili G; 188 do A, V, C, ili G; D94 do A, G, V, L, I, F, S, ili Q; S96 do A, G, V, I, L, F, ili M; T104 do A, G, V, L, I, F, M; ili N; A105 do L; T107 do A, G, V, L, I, F, M, ili P; S107 do A, G, V, L, I, F, M, ili P; L108 do A, V, C, ili G; S109 do A, G, V, I, L, F, ili M; T109 do A, G, V, I, L, F, M, ili S; G110 do A; S112 do A, G, V, L, I, F, ili M; D111 do A, G, V, L, I, F, S, Q, ili T; S112 do A, G, V, L, I, F, ili M; D141 do A, G, V, L, I, F, S, ili Q; G147 do A; V154 do A ili G. R179 do A, G, V, L, I, F, M, Q, S, K, ili H; T180 do A, G, V, L, I, F, M, ili S; T181 do A, G, V, L, I, F, M, ili S; D183 do A, G, V, L, I, F, S, ili Q; D184 do A, G, V, L, I, F, S, ili Q; L185 do A, G, V ili C; S186 do A, G, V, I, L, F, ili M; G187 do A; R188 do A, G, V, L, I, F, M, Q, S, K, ili H; S189 do A, G, V, I, L, F, ili M; D198 do A, G, V, L, I, F, S, ili Q; R204 do A, G, V, L, I, F, M, Q, S, K, ili H; R205 do A, G, V, L, I, F, M, Q, S, K ili H; S247 do A, G, V, I, L, F, ili M; Y247 do A, G, V, L, I, F, ili M; R248 do A, G, V, L, I, F, M, Q, S, K, ili H; R250 do A, G, V, L, I, F, M, Q, S, K, ili H; R251 do A, G, V, L, I, F, M, Q, S, K, ili H; D264 do A, G, V, L, I, F, S, ili Q; G264 do A; i T286 do A, G, V, L, I, F, M, ili S.
9. Efektorski polipeptid Shiga toksina prema bilo kom zahtevu 1-8, pri čemu efektorski polipeptid Shiga toskina obuhvata ili se sastoji od polipeptida prikazanom u bilo kom od:
SEQ ID NO:5, koji dalje obuhvata: (i) ugrađeni ili ubačeni, heterologni, CD8+ T-ćelijski epitop koji se ne preklapa sa najmanje jednim uništenim, endogenim, B-ćelijskim i/ili CD4+ T-ćelijskim epitopskim regionom; ili SEQ ID NO: 4, koji dalje obuhvata: (i) ugrađeni ili ubačeni, heterologni, CD8+ T-ćelijski epitop; i (ii) uništeni najmanje jedan, endogeni, B-ćelijski i/ili CD4+ T-ćelijski epitop koji se ne preklapa sa ugrađenim ili ubačenim, heterolognim, CD8+ T-ćelijskim epitopom.
10. Efektorski polipeptid Shiga toksina prema bilo kom zahtevu 1-9, pri čemu efektorski polipeptid Shiga toksina je sposoban da iskaže inhibitornu aktivnost ribozoma sa polu maksimalnom inhibitornom koncentracijom (IC50) vrednosti od 10,000 pikomola ili manje.
11. Efektorski polipeptid Shiga toksina prema bilo kom zahtevu 1-10, pri čemu efektorski polipeptid Shiga toksina sadrži jednu ili više mutacija u odnosu na A Podjedinicu člana familije Shiga toksina koji se javlja u prirodi koji menja enzimsku aktivnost efektorskog polipeptida Shiga toksina, mutacija odabrana od najmanje jedne delecije, ubacivanja, ili supstitucije amino kiselinskog ostatka; opciono pri čemu jedna ili više mutacija smanjuje ili eliminiše citotoksičnost efektorskog polipeptida Shiga toksina.
12. Efektorski polipeptid Shiga toksina prema bilo kom zahtevu 1-11, pri čemu efektorski polipeptid Shiga toksina sadrži:
region Shiga toksin A1 fragmenta koji ima karboksi kraj i uništeni furinski odcepljeni motiv na karboksi kraju regiona A1 fragmenta.
13. Efektorski polipeptid Shiga toksina prema zahtevu 12, pri čemu uništeni furinski odcepljeni motiv sadrži jednu ili više mutacija, u odnosu na divlji soj Shiga toksin A Podjedinice, menjanje mutacije na najmanje jednom amino kiselinskom ostatku u regionu izvorno pozicioniranom
na 248-251 A Podjedinice Shiga-sličnog toksina 1 (SEQ ID NO: 1) ili Shiga toksina (SEQ ID NO: 2), ili
na 247-250 A Podjedinice Shiga-sličnog toksina 2 (SEQ ID NO:3).
14. Efektorski polipeptid Shiga toksina prema zahtevu 12 ili zahtevu 13, pri čemu uništeni furinski odcepljeni motivi na supstituciji amino kiselinskog ostatka u furinski odcepljenom motivu u odnosu na divlji soj Shiga toksin A Podjedinice; opciono pri čemu supstitucija amino kiselinskog ostatka u furinski odcepljenom motivu je arginin ostatak sa negativno naelektrisanim, amino kiselinskim ostatkom odabranim između grupe koja se sastoji od: alanin, glicin, proline, serin, treonin, aspartat, asparagin, glutamat, glutamin, cistein, izoleucin, leucin, metionin, valin, fenilalanin, triptofan, i tirozin.
15. Efektorski polipeptid Shiga toksina prema bilo kom zahtevu 1-9, koji sadrži ili se sastoji od polipeptida prikazanom u bilo kojoj SEQ ID NOs: 6-27, 29-32, 340-354, i 370-438.
16. Efektorski polipeptid Shiga toksina prema zahtevu 15, koji sadrži ili se sastoji od polipeptida prikazanom u SEQ ID NO: 12.
17. Efektorski polipeptid Shiga toksina prema zahtevu 15, koji sadrži ili se sastoji od polipeptida prikazanom u bilo kojoj SEQ ID NOs: 6-10, 13-27, 29-32, 340-354, i 370-438.
18. Efektorski polipeptid Shiga toksina prema zahtevu 17, koji sadrži ili se sastoji od polipeptida prikazanom u SEQ ID NO: 13.
19. Efektorski polipeptid Shiga toksina prema zahtevu 17, koji sadrži ili se sastoji od polipeptida prikazanom u SEQ ID NO: 31.
20. Ćelijski ciljani molekul koji sadrži
i) vezujući region sposoban da posebno veže ekstraćelijski ciljani biomolekul fizički spojen za ćelijsku površinu na ćeliji, i ii) efektorski polipeptid Shiga toksina prema bilo kom zahtevu 1-19.
21. Ćelijski ciljani molekul prema zahtevu 20, pri čemu vezujući region sadrži vezujući region imunoglobulinskog tipa; opciono pri čemu vezujući region imunoglobulinskog tipa sadrži polipeptid odabran između grupe koja se sastoji od:
pojedinačnog domena fragmenta antitela, pojedinačni lanac varijabilnog fragmenta, varijabilni fragment antitela, komplementarni određujući region 3 fragment, ograničeni FR3-CDR3-FR4 polipeptid, Fd fragment, antigenski-vezujući fragment, Armadillo ponavljajući polipeptid, fibronektin-izvedeni 10. fibronektin tipa III domen, tenascin tipa III domen, ankirin ponavljaući motivski domen, niske-gustine-lipoprotein-receptor-izvedeni A-domen, lipokalin, Kunitz domen, Protein-A-izvedeni Z domen, gama-B kristalni-izvedeni domen, ubihitinizvedeni domen, Sac7d-izvedeni polipeptid, Fyn-izvedeni SH2 domen, miniprotein, C-tip lektin-slični domenski skelet, konstruisano imitirajuće antitelo, i bilo koji genetski manipulisani duplikat bilo kojeg od prethodnog koji zadržava vezujuću funkcionalnost.
22. Ćelijski ciljani molekul prema zahtevu 20, pri čemu vezujući region sadrži autonomni VHdomen, domen antitela teškog lanca izveden iz kamiljeg VHH fragmenta ili VHdomenskog fragmenta, domen antitela teškog lanca izveden iz cartilaginous ribe, imunoglobulinski novi antigenski receptor (IgNAR), VNARfragment, multimerizujući scFv fragment (diatelo, triatelo, tetratelo), bivalentno minitelo, bispecifični tandem scFv, bispecifični tandem VHH, ili bispecifično minitelo.
23. Ćelijski ciljani molekul prema bilo kom zahtevu 20-22, koji sadrži molekulski ostatak povezan sa karboksi krajem efektorskog polipeptida Shiga toksina; opciono pri čemu molekulski ostatak sadrži najmanje jednu amino kiselinu koja vezuje efektorski polipeptid Shiga toksina za molekulski ostatak, tako da su molekulski ostatak i efektorski polipeptid Shiga toksina spojeni pri čemu se obrazuje kontinuirani polipeptid.
24. Ćelijski ciljani molekul prema zahtevu 23, pri čemu molekulski ostatak sadrži ili se sastoji od vezujućeg regiona; ili pri čemu molekulski ostatak je citotoksičan.
25. Ćelijski ciljani molekul prema zahtevu 24, pri čemu efektorski polipeptid Shiga toksina nije citotoksičan, a molekulski ostatak je citotoksičan.
26. Ćelijski ciljani molekul prema bilo kom zahtevu 20-25, gde nakon primene ćelijski ciljanog molekula na ćeliju fizički spojenu sa ekstraćelijskim ciljanim biomolekulom vezujućeg regiona, ćelijski ciljani molekul je sposoban da izazove smrt ćelije.
27. Ćelijski ciljani molekul prema zahtevu 26, pri čemu navedena ćelija ili prva populacija ćelija je fizički spojena sa navedenim ekstraćelijskim ciljanim biomolekulom pomoću kovalentnih i/ili ne-kovalentnih intermolekulskih interakcija koje spajaju ekstraćelijski ciljani biomolekul, ili njegov deo, za spoljašnjost ćelije; ili pri čemu navedeni ekstraćelijski ciljani biomolekul je integralni membranski protein ili periferni membranski protein iskazan sa ćelijom ili prvom populacijom ćelija.
28. Ćelijski ciljani molekul prema zahtevu 26 ili zahtevu 27, pri čemu ćelijski ciljani molekul je sposoban da pokaže citotoksični efekat koji je najmanje tri puta veći kod prve populacije ćelija čiji su članovi fizički povezani sa ekstraćelijskim ciljanim biomolekulama vezujućeg regiona u poređenju sa drugom populacijom ćelija čiji članovi nisu fizički povezani sa bilo kojim ekstraćelijskim ciljanim biomolekulom vezujućeg regiona.
29. Ćelijski ciljani molekul prema bilo kom zahtevu 20-28, pri čemu vezujući region je sposoban da se veže za ekstraćelijski ciljani biomolekul odabran između grupe koja se sastoji od:
CD20, CD22, CD40, CD74, CD79, CD25, CD30, HER2/neu/ErbB2, EGFR, EpCAM, EphB2, specifični membranski antigen prostate, Cripto, CDCP1, endoglin, fibroblast aktivacioni protein, Lewis-Y, CD19, CD21, CS1/ SLAMF7, CD33, CD52, CD133, gpA33, mucin, TAG-72, tirozin-protein kinaza transmembranski receptor, karbonska anhidraza IX, folatni vezujući protein, ganglioside GD2, ganglioside GD3, ganglioside GM2, ganglioside Lewis-Y2, VEGFR, Alfa V beta3, Alfa5beta1, ErbB1/EGFR, Erb3, c-MET, IGF1R, EphA3, TRAIL-R1, TRAIL-R2, RANK, tenascin, CD64, mesotelin, BRCA1, tirozinaza, TRP-1, TRP-2, MAGE-1, MAGE-3, GAGE-1/2, BAGE, RAGE, NY-ESO-1, CDK-4, beta-catenin, MUM-1, kaspaza-8, KIAA0205, HPVE6, SART-1, PRAME, karcinoembrionski antigen, specifični antigen prostate, antigen matičnih ćelija prostate, humani aspartil (asparaginil) beta-hidroksilaza, EphA2, HER3/ErbB-3, MUC1, MART-1/MelanA, gp100, tirozinaza povezani antigen, HPV-E7, Epstein-Barr virus antigen, Bcr-Ab1, alfa-fetoprotein antigen, 17-A1, antigen tumora mokraćne bešike, CD38, CD15, CD23, CD45, CD53, CD88, CD129, CD183, CD191, CD193, CD244, CD294, CD305, C3AR, IL-1R, galectin-9, mrp-14, NKG2D, PD-L1, Siglec-8, Siglec-10, CD49d, CD13, CD44, CD54, CD63, CD69, CD123, TLR4, FceRIa, IgE, CD107a, CD203c, CD14, CD68, CD80, CD86, CD105, CD115, F4/80, ILT-3, galektin-3, CD11a-c, GITRL, molekul MHC klase I, molekul MHC klase II, CD284, CD107-Mac3, CD195, HLA-DR, CD16/32, CD282, CD11c, i bilo koji imunogenski fragment bilo kog od prethodnog.
30. Ćelijski ciljani molekul prema bilo kom zahtevu 20-29, koji obuhvata peptidni linker prikazan u SEQ ID NO: 540-543, 544-550, ili 553-559.
31. Ćelijski ciljani molekul prema bilo kom zahtevu 20-30, pri čemu vezujući region obuhvata polipeptidnu sekvencu odabranu između bilo koje SEQ ID NOs: 83-339.
32. Ćelijski ciljani molekul prema zahtevu 31, pri čemu vezujući region obuhvata:
a) varijabilni domen teškog lanca (VH) koji sadrži: (i) HCDR1 koji sadrži ili se sastoji od amino kiselinskih sekvenci kao što je prikazano u SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 120, ili SEQ ID NO: 124; (ii) HCDR2 koji sadrži ili se sastoji od amino kiselinske sekvencekao što je prikazano u SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 115, ili SEQ ID NO: 125; i (iii) HCDR3 koji sadrži ili se sastoji od amino kiselinske sekvence kao što je prikazano u SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 121, ili SEQ ID NO: 126; i
b) varijabilni domen lakog lanca (VL) koji sadrži: (i) LCDR1 koji sadrži ili se sastoji od amino kiselinske sekvence kao što je prikazano u SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 117, ili SEQ ID NO: 127; (ii) LCDR2 koji sadrži ili se sastoji od amino kiselinske sekvence kao što je prikazano u SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 122, ili SEQ ID NO: 128; i (iii) LCDR3 koji sadrži ili se sastoji od amino kiselinske sekvence kao što je prikazano u SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 123, ili SEQ ID NO: 129.
33. Ćelijski ciljani molekul prema zahtevu 31, pri čemu vezujući region obuhvata:
a) varijabilni domen teškog lanca (VH) koji sadrži: (i) HCDR1 koji sadrži ili se sastoji od amino kiselinske sekvence kao što je prikazano u SEQ ID NO: 283, SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO: 295, ili SEQ ID NO: 301; (ii) HCDR2 koji sadrži ili se sastoji od amino kiselinske sekvence kao što je prikazano u SEQ ID NO: 284, SEQ ID NO: 290, SEQ ID NO: 296, ili SEQ ID NO: 302; and (iii) HCDR3 koji sadrži ili se sastoji od amino kiselinske sekvence kao što je prikazano u SEQ ID NO: 285, SEQ ID NO: 291, SEQ ID NO: 297, ili SEQ ID NO: 303; i
b) varijabilni domen lakog lanca (VL) koji sadrži: (i) LCDR1 koji sadrži ili se sastoji od amino kiselinske sekvence kao što je prikazano u SEQ ID NO: 286, SEQ ID NO: 292, ili SEQ ID NO: 298; (ii) LCDR2 koji sadrži ili se sastoji od amino kiselinske sekvence kao što je prikazano u SEQ ID NO: 287, SEQ ID NO: 293, ili SEQ ID NO: 299; i (iii) a LCDR3 koji sadrži ili se sastoji od amino kiselinske sekvence kao što je prikazano u SEQ ID NO: 288, SEQ ID NO: 294, ili SEQ ID NO: 300;
ili
a) varijabilni domen teškog lanca (VH) koji sadrži: (i) HABR1 koji sadrži ili se sastoji od amino kiselinske sekvence kao što je prikazano u SEQ ID NO: 261, SEQ ID NO: 268, ili SEQ ID NO: 274; (ii) HABR2 koji sadrži ili se sastoji od amino kiselinske sekvence kao što je prikazano u SEQ ID NO: 262, SEQ ID NO: 269, ili SEQ ID NO: 275; i (iii) HABR3 koji sadrži ili se sastoji od amino kiselinske sekvence kao što je prikazano u
4
SEQ ID NO: 263, SEQ ID NO: 267, SEQ ID NO: 270, ili SEQ ID NO: 276; i b) varijabilni domen lakog lanca (VL) koji sadrži: (i) LABR1 koji sadrži ili se sastoji od amino kiselinske sekvence kao što je prikazano u SEQ ID NO: 264, SEQ ID NO: 271, ili SEQ ID NO: 277; (ii) LABR2 koji sadrži ili se sastoji od amino kiselinske sekvence kao što je prikazano u SEQ ID NO: 265, SEQ ID NO: 272, ili SEQ ID NO: 278; i (iii) LABR3 koji sadrži ili se sastoji od amino kiselinske sekvence kao što je prikazano u SEQ ID NO: 266, SEQ ID NO: 273, ili SEQ ID NO: 279;
ili
a) varijabilni domen teškog lanca (VH) koji sadrži: (i) HABR1 koji sadrži ili se sastoji od amino kiselinske sekvence kao što je prikazano u SEQ ID NO: 280; (ii) HABR2 koji sadrži ili se sastoji od amino kiselinske sekvence kao što je prikazano u SEQ ID NO: 281; i (iii) HABR3 koji sadrži ili se sastoji od amino kiselinske sekvence kao što je prikazano u SEQ ID NO: 282.
34. Ćelijski ciljani molekul prema zahtevu 31, pri čemu vezujući region obuhvata:
a) varijabilni domen teškog lanca (VH) koji sadrži: (i) HCDR1 koji sadrži ili se sastoji od amino kiselinske sekvence kao što je prikazano u SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 231, ili SEQ ID NO: 237; (ii) HCDR2 koji sadrži ili se sastoji od amino kiselinske sekvence kao što je prikazano u SEQ ID NO: 226, SEQ ID NO: 232, ili SEQ ID NO: 238; i (iii) HCDR3 koji sadrži ili se sastoji od amino kiselinske sekvence kao što je prikazano u SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 233, ili SEQ ID NO: 239; i
b) varijabilni domen lakog lanca (VL) koji sadrži: (i) LCDR1 koji sadrži ili se sastoji od amino kiselinske sekvence kao što je prikazano u SEQ ID NO: 228, SEQ ID NO: 234, ili SEQ ID NO: 240; (ii) LCDR2 comprising or consisting of one of the amino acid sequence as shown in koji sadrži ili se sastoji od amino kiselinske sekvence kao što je prikazano u SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 235, ili SEQ ID NO: 241; i (iii) LCDR3 koji sadrži ili se sastoji od amino kiselinske sekvence kao što je prikazano u SEQ ID NO: 230, SEQ ID NO: 236, ili SEQ ID NO: 242;
ili
a) varijabilni domen teškog lanca (VH) koji sadrži: (i) HABR1 koji sadrži ili se sastoji od amino kiselinske sekvence kao što je prikazano u SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 213, ili SEQ ID NO: 219; (ii) HABR2 koji sadrži ili se sastoji od amino kiselinske sekvence kao što je prikazano u SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 214, ili SEQ ID NO: 220; i (iii) HABR3 koji sadrži ili se sastoji od amino kiselinske sekvence
4 1
kao što je prikazano u SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 215, ili SEQ ID NO: 221; i
b) varijabilni domen lakog lanca (VL) koji sadrži: (i) LABR1 koji sadrži ili se sastoji od amino kiselinske sekvence kao što je prikazano u SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 210, SEQ ID NO: 216, ili SEQ ID NO: 222; (ii) LABR2 koji sadrži ili se sastoji od amino kiselinske sekvence kao što je prikazano u SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 217, ili SEQ ID NO: 223; i (iii) LABR3 koji sadrži ili se sastoji od amino kiselinske sekvence kao što je prikazano u SEQ ID NO:194, SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 206, SEQ ID NO: 212, SEQ ID NO: 218, ili SEQ ID NO: 224.
35. Ćelijski ciljani molekul prema zahtevu 31, pri čemu vezujući region obuhvata ili se sastoji od polipeptida predstavljen sa bilo kojim sledećim:
(i) amino kiselinama 1-245 bilo koje SEQ ID NOs: 33, 64, i 65;
(ii) amino kiselinama 269-513 bilo koje SEQ ID NOs: 40 i 80; ili
(iii) amino kiselinama 269-520 ili 269-521 bilo koje SEQ ID NOs: 36, 66, i 67.
36. Ćelijski ciljani molekul prema bilo kom zahtevu 20-35 koji sadrži efektorski polipeptid Shiga toksin koji obuhvata ili se sastoji od SEQ ID NO: 13.
37. Ćelijski ciljani molekul prema bilo kom zahtevu 20-35, koji obuhvata ili se sastoji od polipeptida prikazanog u bilo kojoj SEQ ID NOs: 43-62, 64-82, 439-500, i 502-513.
38. Ćelijski ciljani molekul prema zahtevu 37, koji obuhvata ili se sastoji od polipeptida prikazanog u bilo kojoj SEQ ID NOs: 44, 82 ili 453.
39. Ćelijski ciljani molekul prema bilo kom zahtevu 20-38, u obliku homo-multimera ili heteromultimera.
40. Ćelijski ciljani molekul prema bilo kom zahtevu 20-39, u obliku farmaceutski prihvatljive soli ili solvata.
41. Farmaceutska kompozicija koja sadrži:
efektorski polipeptid Shiga toksina prema bilo kom zahtevu 1-19 ili ćelijski ciljani
4 2
molekul prema bilo kom zahtevu 20-40, i najmanje jedan farmaceutski prihvatljivi ekscipijens ili nosač.
42. Dijagnostička kompozicija koja sadrži:
ćelijski ciljani molekul prema bilo kom zahtevu 20-40 i agens za promociju detekcije.
43. Polinukleotid sposoban da kodira efektorski polipeptid Shiga toksina prema bilo kom zahtevu 1-19 ili ćelijski ciljani molekul prema bilo kom zahtevu 20-40, ili njihov komplement.
44. Efektorski polipeptid Shiga toksina prema bilo kom zahtevu 1-19, ćelijski ciljani molekul prema bilo kom zahtevu 20-40, ili farmaceutska kompozicija prema zahtevu 41, za primenu u lečenju bolesti, poremećaja ili stanja kod pacijenta kome je to potrebno.
45. Efektorski polipeptid Shiga toksina prema bilo kom zahtevu 1-19, ćelijski ciljani molekul prema bilo kom zahtevu 20-40, ili farmaceutska kompozicija prema zahtevu 41, za primenu u lečenju ili prevenciji kancera, tumora, imunog poremećaja i mikrobne infekcije; opciono gde je kancer izabran iz grupe koja se sastoji od: kancera kostiju, kancera dojke, kancera centralnog/perifernog nervnog sistema, kancera gastrointestinalnog sistema, kancera germskih ćelija, kancera žlezda, kancera glave, hematološkog kancera, kancera bubrega i mokraćnih puteva, kancera jetre, kancera pluća/pleure, kancera prostate, sarkoma, kancera kože, kancera materice; ili gde je imuni poremećaj izabran iz grupe koja se sastoji od: amiloidoza, ankilozirajući spondilitisa, astme, Crohnove bolesti, dijabetesa, odbacivanje transplantata, bolest grafta prema domaćinu, Hashimotov tiroiditis, hemolitički uremički sindrom, HIV povezana bolest, lupus eritematozus, multipla skleroza, poliarteritis, psorijaza, psorijatični artritis, reumatoidni artritis, skleroderma, septički šok, Sjogrenov sindrom, ulcerozni kolitis i vaskulitis.
46. Primena efektorskog polipeptida Shiga toksina prema bilo kom zahtevu 1-19, ćelijski ciljanog molekula prema bilo kom zahtevu 20-40, farmaceutske kompozicije prema zahtevu 41, ili dijagnostičke kompozicije prema zahtevu 42 u in vitro dijagnozi, prognozi ili karakterizaciji bolesti, poremećaja ili stanja.
4
RS20200732A 2015-05-30 2016-05-27 De-imunizovane, strukture shiga toksin a podjedinice i ciljani ćelijski molekuli koji sadrže isti RS60441B1 (sr)

Applications Claiming Priority (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562168760P 2015-05-30 2015-05-30
US201562168763P 2015-05-30 2015-05-30
US201562168758P 2015-05-30 2015-05-30
US201562168759P 2015-05-30 2015-05-30
US201562168762P 2015-05-30 2015-05-30
US201562168761P 2015-05-30 2015-05-30
EP16729701.9A EP3303373B1 (en) 2015-05-30 2016-05-27 De-immunized, shiga toxin a subunit scaffolds and cell-targeting molecules comprising the same
PCT/US2016/034778 WO2016196344A1 (en) 2015-05-30 2016-05-27 De-immunized, shiga toxin a subunit scaffolds and cell-targeting molecules comprising the same

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS60441B1 true RS60441B1 (sr) 2020-07-31

Family

ID=56133070

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20200732A RS60441B1 (sr) 2015-05-30 2016-05-27 De-imunizovane, strukture shiga toksin a podjedinice i ciljani ćelijski molekuli koji sadrže isti

Country Status (21)

Country Link
US (3) US20180258143A1 (sr)
EP (3) EP3636660A1 (sr)
JP (4) JP6771492B2 (sr)
KR (2) KR102647100B1 (sr)
CN (2) CN114656573B (sr)
AU (3) AU2016271124C1 (sr)
CA (1) CA2984635A1 (sr)
CY (1) CY1123315T1 (sr)
DK (1) DK3303373T3 (sr)
ES (1) ES2847373T3 (sr)
HR (1) HRP20200640T1 (sr)
HU (1) HUE051246T2 (sr)
IL (3) IL292708B2 (sr)
LT (1) LT3303373T (sr)
MX (2) MX2017015493A (sr)
PL (1) PL3303373T3 (sr)
PT (1) PT3303373T (sr)
RS (1) RS60441B1 (sr)
SI (1) SI3303373T1 (sr)
SM (1) SMT202000226T1 (sr)
WO (1) WO2016196344A1 (sr)

Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101990341B1 (ko) * 2013-03-12 2019-06-19 몰레큘러 템플레이츠, 인코퍼레이션. 세포 내재화를 유도하기 위한 ｃｄ20-결합 면역독소 및 이의 사용 방법
IL294746B2 (en) 2014-01-27 2024-04-01 Molecular Templates Inc SHIGA toxin-free effector subunit-containing polypeptides for mammalian applications
US11142584B2 (en) 2014-03-11 2021-10-12 Molecular Templates, Inc. CD20-binding proteins comprising Shiga toxin A subunit effector regions for inducing cellular internalization and methods using same
CA2947048C (en) 2014-06-11 2023-10-17 Molecular Templates, Inc. Protease-cleavage resistant, shiga toxin a subunit effector polypeptides and cell-targeted molecules comprising the same
MX2017010072A (es) 2015-02-05 2017-11-09 Molecular Templates Inc Moleculas multivalentes que se enlazan a cd20, las cuales comprenden regiones efectoras de la subunidad a de la toxina shiga, y composiciones enriquecidas de las mismas.
RS60441B1 (sr) 2015-05-30 2020-07-31 Molecular Templates Inc De-imunizovane, strukture shiga toksin a podjedinice i ciljani ćelijski molekuli koji sadrže isti
HK1248258A1 (zh) * 2015-07-26 2018-10-12 Molecular Templates, Inc. 包含志贺毒素a亚基效应物和cd8+ t-细胞表位的细胞靶向分子
JP7075134B2 (ja) 2016-12-07 2022-05-25 モレキュラー テンプレーツ，インク． 部位特異的コンジュゲーションのための志賀毒素ａサブユニットエフェクターポリペプチド、志賀毒素エフェクター足場、及び細胞標的化分子
WO2018140427A1 (en) * 2017-01-25 2018-08-02 Molecular Templates, Inc. Cell-targeting molecules comprising de-immunized, shiga toxin a subunit effectors and cd8+ t-cell epitopes
JP7368856B2 (ja) 2017-07-25 2023-10-25 トゥルーバインディング，インコーポレイテッド Ｔｉｍ－３とそのリガンドとの相互作用の遮断によるがん治療
IT201800003464A1 (it) * 2018-03-13 2019-09-13 Ospedale Pediatrico Bambino Gesu Cellule T CAR-CD30 per il trattamento di tumori CD30+
IL268443B2 (en) * 2018-04-17 2024-07-01 Molecular Templates Inc HER2-targeted molecules containing Shiga toxin subunit A scaffolds, without vaccination
WO2020081493A1 (en) 2018-10-16 2020-04-23 Molecular Templates, Inc. Pd-l1 binding proteins
KR20210119421A (ko) * 2019-01-23 2021-10-05 밀레니엄 파머슈티컬스 인코퍼레이티드 탈면역화된 시가 독소 a 서브유닛 이펙터를 포함하는 cd38-결합 단백질(cd38-binding proteins comprising de-immunized shiga toxin a subunit effectors)
AU2020211407A1 (en) 2019-01-23 2021-08-12 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Anti-CD38 antibodies
WO2020154475A1 (en) 2019-01-23 2020-07-30 Molecular Templates, Inc. Proteins comprising modified immunoglobulin variable light chains
CN120058944A (zh) 2019-01-30 2025-05-30 真和制药有限公司 抗gal3抗体及其用途
KR20220081977A (ko) * 2019-09-18 2022-06-16 몰레큘러 템플레이츠, 인코퍼레이션. 시가 독소 a 서브유닛 스캐폴드를 포함하는 pd-l1 결합분자(pd-l1 binding molecules comprising shiga toxin a subunit scaffolds)
WO2021055816A1 (en) 2019-09-18 2021-03-25 Molecular Templates, Inc. Pd-l1 binding molecules comprising shiga toxin a subunit scaffolds
WO2021102445A1 (en) * 2019-11-24 2021-05-27 Molecular Templates, Inc. Uses of cd20-binding molecules and additional therapeutic agents
CA3185040A1 (en) 2020-05-26 2021-12-02 Truebinding, Inc. Methods of treating inflammatory diseases by blocking galectin-3
KR20230042263A (ko) * 2020-06-09 2023-03-28 이노자임 파마, 인코포레이티드 가용성 enpp1 또는 enpp3 단백질 및 이의 사용
JP2023530675A (ja) * 2020-06-17 2023-07-19 ワイ－マブス セラピューティクス， インコーポレイテッド ヒト疾患の治療のためのｃｄ３８抗体
CN115210262B (zh) * 2020-09-29 2023-07-14 昆明赛诺制药股份有限公司 人源化抗-cd22重组免疫毒素及其应用
JP7825633B2 (ja) * 2020-12-08 2026-03-06 メモリアル スローン ケタリング キャンサー センター ガレクチン－３に対する抗体及びその使用方法
US12180284B2 (en) 2020-12-16 2024-12-31 Molecular Templates, Inc. Clinical methods for use of a PD-L1-binding molecule comprising a Shiga toxin effector
CA3213295A1 (en) 2021-03-17 2022-09-22 Molecular Templates, Inc. Pd-l1 binding proteins comprising shiga toxin a subunit scaffolds and cd8+ t cell antigens
EP4486787A4 (en) * 2022-03-03 2026-02-11 Univ Texas Chimeric antigenic receptors anti-CD19 and anti-CD79B and their methods of use
JP7650313B2 (ja) 2023-03-29 2025-03-24 テクノＵｍｇ株式会社 熱可塑性樹脂組成物及び成形品
WO2024254149A2 (en) * 2023-06-06 2024-12-12 Verlmmune Inc. Virus-inspired compositions comprising virus-like proteins and checkpoint inhibitors, and methods of use thereof to treat cancer

Family Cites Families (225)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS4934761B1 (sr) 1969-03-10 1974-09-18
US5080898A (en) 1982-05-12 1992-01-14 The University Hospital Enzymatically active toxin coupled to a cell-specific ligand
US6022950A (en) 1984-06-07 2000-02-08 Seragen, Inc. Hybrid molecules having translocation region and cell-binding region
US5668255A (en) 1984-06-07 1997-09-16 Seragen, Inc. Hybrid molecules having translocation region and cell-binding region
US5091178A (en) 1986-02-21 1992-02-25 Oncogen Tumor therapy with biologically active anti-tumor antibodies
US7838216B1 (en) 1986-03-05 2010-11-23 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Human gene related to but distinct from EGF receptor gene
US6893625B1 (en) 1986-10-27 2005-05-17 Royalty Pharma Finance Trust Chimeric antibody with specificity to human B cell surface antigen
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
JP3040121B2 (ja) 1988-01-12 2000-05-08 ジェネンテク，インコーポレイテッド 増殖因子レセプターの機能を阻害することにより腫瘍細胞を処置する方法
US5506126A (en) 1988-02-25 1996-04-09 The General Hospital Corporation Rapid immunoselection cloning method
US4861579A (en) 1988-03-17 1989-08-29 American Cyanamid Company Suppression of B-lymphocytes in mammals by administration of anti-B-lymphocyte antibodies
US5135736A (en) 1988-08-15 1992-08-04 Neorx Corporation Covalently-linked complexes and methods for enhanced cytotoxicity and imaging
DE69031120T2 (de) 1989-05-19 1998-01-15 Genentech, Inc., South San Francisco, Calif. Her2 extrazellulare domäne
CA2071969A1 (en) 1989-12-22 1991-06-23 John R. Murphy Hybrid molecules having translocation region and cell-binding region
US5578482A (en) 1990-05-25 1996-11-26 Georgetown University Ligand growth factors that bind to the erbB-2 receptor protein and induce cellular responses
US5635384A (en) 1990-06-11 1997-06-03 Dowelanco Ribosome-inactivating proteins, inactive precursor forms thereof, a process for making and a method of using
IL101943A0 (en) 1991-05-24 1992-12-30 Genentech Inc Structure,production and use of heregulin
US5834229A (en) 1991-05-24 1998-11-10 Genentech, Inc. Nucleic acids vectors and host cells encoding and expressing heregulin 2-α
ES2206447T3 (es) 1991-06-14 2004-05-16 Genentech, Inc. Anticuerpo humanizado para heregulina.
US6146850A (en) 1991-11-04 2000-11-14 Xoma Corporation Proteins encoding gelonin sequences
US5621083A (en) 1991-11-04 1997-04-15 Xoma Corporation Immunotoxins comprising ribosome-inactivating proteins
US5552144A (en) * 1992-01-22 1996-09-03 Microcarb, Inc. Immunogenic shiga-like toxin II variant mutants
AU4025193A (en) 1992-04-08 1993-11-18 Cetus Oncology Corporation Humanized C-erbB-2 specific antibodies
EP0615451B1 (en) 1992-05-26 2005-12-07 Immunex Corporation Novel cytokine that binds cd30
JPH08504172A (ja) 1992-06-30 1996-05-07 オンコロジクス，インコーポレイティド 抗−ｅｒｂＢ−２モノクロナール抗体の組み合わせ物及び使用方法
PL174494B1 (pl) 1992-11-13 1998-08-31 Idec Pharma Corp Kompozycja farmaceutyczna do leczenia chłoniaka z limfocytów B i sposób wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia chłoniaka z limfocytów B
US5736137A (en) 1992-11-13 1998-04-07 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
US5869445A (en) 1993-03-17 1999-02-09 University Of Washington Methods for eliciting or enhancing reactivity to HER-2/neu protein
EP0700444B1 (en) 1993-05-12 2003-04-02 XOMA Corporation Immunotoxins comprising gelonin and an antibody
US5484892A (en) 1993-05-21 1996-01-16 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Monoclonal antibodies that block ligand binding to the CD22 receptor in mature B cells
US5417972A (en) 1993-08-02 1995-05-23 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Method of killing B-cells in a complement independent and an ADCC independent manner using antibodies which specifically bind CDIM
US5595721A (en) 1993-09-16 1997-01-21 Coulter Pharmaceutical, Inc. Radioimmunotherapy of lymphoma using anti-CD20
US20020164788A1 (en) 1994-12-02 2002-11-07 The Wellcome Foundation Limited Humanized antibodies to CD38
GB9424449D0 (en) 1994-12-02 1995-01-18 Wellcome Found Antibodies
WO1996022384A1 (en) 1995-01-18 1996-07-25 Boehringer Mannheim Gmbh Anti-cd 30 antibodies preventing proteolytic cleavage and release of membrane-bound cd 30 antigen
CA2218601A1 (en) 1995-03-24 1996-10-03 Ophidian Pharmaceuticals, Inc. Treatment for verotoxin-producing escherichia coli
US5667786A (en) * 1995-06-07 1997-09-16 Novavax, Inc. Method for treating tumors with a toxin
EP0873363B1 (en) 1995-06-14 2010-10-06 The Regents of The University of California High affinity human antibodies to tumor antigens
AU6777596A (en) 1995-08-25 1997-03-19 Dana-Farber Cancer Institute Treatment of human prostate disease with beta-lapachone derivatives
US5783186A (en) 1995-12-05 1998-07-21 Amgen Inc. Antibody-induced apoptosis
US5858682A (en) 1996-08-02 1999-01-12 Pharmingen E2A/pbx1 fusion protein specific monoclonal antibodies
AU723268B2 (en) 1996-09-09 2000-08-24 Zealand Pharma A/S Improved solid-phase peptide synthesis and agent for use in such synthesis
EP0929679A2 (en) 1996-09-10 1999-07-21 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Histidine-tagged shiga toxins, toxoids, and protein fusions with such toxins and toxoids, methods for the purification and preparation thereof
US5770380A (en) 1996-09-13 1998-06-23 University Of Pittsburgh Synthetic antibody mimics--multiple peptide loops attached to a molecular scaffold
KR100628846B1 (ko) 1996-10-18 2006-09-29 제넨테크, 인크. 항-ＥｒｂＢ２ 항체
EP0970227B1 (en) 1997-03-20 2008-01-09 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA as represented by THE SECRETARY OF THE DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Recombinant antibodies and immunoconjugates targeted to cd-22 bearing cells and tumors
US6306393B1 (en) 1997-03-24 2001-10-23 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of B-cell malignancies using anti-CD22 antibodies
WO1998047797A1 (en) 1997-04-24 1998-10-29 Crisplant A/S A conveyor unit for use in a closed loop conveyor system and a conveyor system
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
CA2293829C (en) 1997-06-24 2011-06-14 Genentech, Inc. Methods and compositions for galactosylated glycoproteins
US6368596B1 (en) 1997-07-08 2002-04-09 Board Of Regents, The University Of Texas System Compositions and methods for homoconjugates of antibodies which induce growth arrest or apoptosis of tumor cells
FR2766193B1 (fr) 1997-07-18 2001-09-14 Inst Curie Polypeptide chimerique comprenant le fragment b de la toxine shiga et des peptides d'interet therapeutique
DE69840412D1 (de) 1997-10-31 2009-02-12 Genentech Inc Methoden und zusammensetzungen bestehend aus glykoprotein-glykoformen
CA2222993A1 (en) 1998-02-04 1999-08-04 The Ontario Cancer Institute A method for using a ribosome-inactivating protein complex as a structural template and a molecular search engine in the design, construction and screening of combinatorial protein libraries
US6242195B1 (en) 1998-04-02 2001-06-05 Genentech, Inc. Methods for determining binding of an analyte to a receptor
US6528624B1 (en) 1998-04-02 2003-03-04 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
CA2329940A1 (en) 1998-06-05 1999-12-09 Mayo Foundation For Medical Education And Research Use of genetically engineered antibodies to cd38 to treat multiple myeloma
US7157418B1 (en) * 1998-07-22 2007-01-02 Osprey Pharmaceuticals, Ltd. Methods and compositions for treating secondary tissue damage and other inflammatory conditions and disorders
DE69934337T2 (de) 1998-07-22 2007-05-24 Osprey Pharmaceuticals Ltd., Calgary Konjugate zur Behandlung von Entzündungskrankheiten und von assozierter Gewebeschädigung
US6770456B1 (en) 1998-07-29 2004-08-03 Ludwig Institute For Cancer Research Endogenous retrovirus tumor associated nucleic acids and antigens
CN1320044A (zh) 1998-08-11 2001-10-31 Idec药物公司 包括施用抗－cd20抗体的b－细胞淋巴瘤联合疗法
AU5963699A (en) 1998-10-02 2000-04-26 Mcmaster University Spliced form of (erb)b-2/neu oncogene
US6224866B1 (en) 1998-10-07 2001-05-01 Biocrystal Ltd. Immunotherapy of B cell involvement in progression of solid, nonlymphoid tumors
MY155913A (en) 1998-11-09 2015-12-15 Biogen Inc Chimeric anti-cd20 antibody treatment of patients receiving bmt or pbsc transpants
PT2055313E (pt) 1998-11-09 2015-08-25 Biogen Idec Inc Tratamento de malignidades hematológicas associadas a células tumorais em circulação utilizando anticorpo quimérico anti-cd20
HUP0104865A3 (en) 1999-01-15 2004-07-28 Genentech Inc Polypeptide variants with altered effector function
US7625859B1 (en) 2000-02-16 2009-12-01 Oregon Health & Science University HER-2 binding antagonists
US6897044B1 (en) 1999-01-28 2005-05-24 Biogen Idec, Inc. Production of tetravalent antibodies
ES2313886T3 (es) * 1999-03-16 2009-03-16 The Government Of The Usa, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Nueva proteina quimerica para la prevencion y tratamiento de infeccion por hiv.
EP1637160A3 (en) 1999-05-07 2006-05-03 Genentech, Inc. Treatment of autoimmune diseases with antagonists which bind to B cell surface markers
US7527787B2 (en) 2005-10-19 2009-05-05 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Multivalent immunoglobulin-based bioactive assemblies
US7144991B2 (en) 1999-06-07 2006-12-05 Aletheon Pharmaceuticals, Inc. Streptavidin expressed gene fusions and methods of use thereof
HK1046635B (en) 1999-06-09 2009-10-09 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of autoimmune disorders using antibodies which target b-cells
ITMI991299A1 (it) 1999-06-11 2000-12-11 Consiglio Nazionale Ricerche Uso di anticorpi contro antigeni di superficie per il trattamento della malattia trapianto contro ospite
US6949245B1 (en) 1999-06-25 2005-09-27 Genentech, Inc. Humanized anti-ErbB2 antibodies and treatment with anti-ErbB2 antibodies
DE19930748C2 (de) 1999-07-02 2001-05-17 Infineon Technologies Ag Verfahren zur Herstellung von EEPROM- und DRAM-Grabenspeicherzellbereichen auf einem Chip
AU779612C (en) 1999-07-02 2005-12-15 Genentech Inc. Peptide compounds that bind HER2
KR20080075044A (ko) 1999-07-12 2008-08-13 제넨테크, 인크. Ｃｄ20에 결합하는 길항제를 사용한 외래 항원에 대한 면역반응 차단 방법
US8557244B1 (en) 1999-08-11 2013-10-15 Biogen Idec Inc. Treatment of aggressive non-Hodgkins lymphoma with anti-CD20 antibody
US6451284B1 (en) 1999-08-11 2002-09-17 Idec Pharmaceuticals Corporation Clinical parameters for determining hematologic toxicity prior to radioimmunotheraphy
EP1207906A4 (en) 1999-08-11 2005-07-06 Biogen Idec Inc TREATMENT OF NON-HODGKIN LYMPHOMA PATIENTS WITH BONE MARROW WITH INVOLVEMENT OF ANTI-CD20 ANTIBODIES
AU6929100A (en) 1999-08-23 2001-03-19 Biocrystal Limited Methods and compositions for immunotherapy of b cell involvement in promotion ofa disease condition comprising multiple sclerosis
US6492498B1 (en) 1999-11-15 2002-12-10 Regents Of The University Of Minnesota Multimeric immunotoxins
US7267973B2 (en) 2000-03-22 2007-09-11 Sibtech, Inc. Nucleic acids encoding recombinant proteins containing Shiga-like toxin and vascular endothelial growth factor
US20010031485A1 (en) 2000-03-22 2001-10-18 Sibtech, Inc. Recombinant proteins containing Shiga-like toxin and vascular endothelial growth factor fragments
EP1267927A1 (en) 2000-03-24 2003-01-02 Chiron Corporation Methods of therapy for non-hodgkin's lymphoma using a combination of an antibody to cd20 and interleukin-2
LT2857516T (lt) 2000-04-11 2017-09-11 Genentech, Inc. Multivalentiniai antikūnai ir jų panaudojimas
US20020009444A1 (en) 2000-04-25 2002-01-24 Idec Pharmaceuticals Corporation Intrathecal administration of rituximab for treatment of central nervous system lymphomas
US7306801B2 (en) 2000-05-15 2007-12-11 Health Research, Inc. Methods of therapy for cancers characterized by overexpression of the HER2 receptor protein
WO2001097858A2 (en) 2000-06-20 2001-12-27 Idec Pharmaceuticals Corporation Cold anti-cd20 antibody/radiolabeled anti-cd22 antibody combination
EP1174440A1 (en) 2000-07-19 2002-01-23 U-BISys B.V. A selectively-expressed epitope on the human CD38 molecule detected by a phage display library-derived human scFv antibody fragment
US20020127247A1 (en) 2000-11-17 2002-09-12 Allergen Sales, Inc. Modified clostridial neurotoxins with altered biological persistence
US7090843B1 (en) 2000-11-28 2006-08-15 Seattle Genetics, Inc. Recombinant anti-CD30 antibodies and uses thereof
US20040018194A1 (en) 2000-11-28 2004-01-29 Francisco Joseph A. Recombinant anti-CD30 antibodies and uses thereof
DE10063048A1 (de) 2000-12-18 2002-07-11 Deutsches Krebsforsch Einzelketten-Antikörper mit verbesserter Stabilität
US7829084B2 (en) 2001-01-17 2010-11-09 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding constructs and methods for use thereof
AU2002327164A1 (en) 2001-01-29 2002-12-09 Idec Pharmaceuticals Corporation Engineered tetravalent antibodies and methods of use
CA2436092A1 (en) 2001-01-29 2002-08-08 Idec Pharmaceutical Corporation Modified antibodies and methods of use
CA2442801A1 (en) 2001-04-02 2002-10-10 Idec Pharmaceutical Corporation Recombinant antibodies coexpressed with gntiii
WO2003061694A1 (en) 2001-05-10 2003-07-31 Seattle Genetics, Inc. Immunosuppression of the humoral immune response by anti-cd20 antibodies
WO2002102312A2 (en) 2001-06-14 2002-12-27 Intermune, Inc. Combination therapy of gamma-interferon and b cell specific antibodies
US7321026B2 (en) 2001-06-27 2008-01-22 Skytech Technology Limited Framework-patched immunoglobulins
US7446185B2 (en) 2001-07-18 2008-11-04 The Regents Of The University Of California Her2/neu target antigen and use of same to stimulate an immune response
DE60236450D1 (de) 2001-09-26 2010-07-01 Us Health Mutierte anti-cd22-antikörper mit erhöhter affinität zu cd22-exprimierenden leukämiezellen
KR100668538B1 (ko) 2002-01-09 2007-01-16 메다렉스, 인코포레이티드 Ｃｄ３０에 대한 인간 모노클로날 항체
AU2003208097A1 (en) 2002-02-04 2003-09-02 Hideo Yoshida Anticancer agents using vero toxin variants
WO2003072736A2 (en) 2002-02-21 2003-09-04 Duke University Reagents and treatment methods for autoimmune diseases
AU2003213580A1 (en) * 2002-02-26 2003-09-09 Genencor International, Inc. Subtilisin carlsberg proteins with reduced immunogenicity
EP2308898B1 (en) 2002-03-01 2016-06-08 Immunomedics, Inc. Internalizing anti-CD74 antibodies and methods of use
US20040248151A1 (en) 2002-04-05 2004-12-09 Ventana Medical Systems, Inc. Method for predicting the response to HER2-directed therapy
CA2481515C (en) 2002-04-10 2013-10-01 Genentech, Inc. Anti-her2 antibody variants
US7449480B2 (en) 2002-05-14 2008-11-11 Baylor College Of Medicine Small molecule inhibitors of HER2 expression
WO2003097855A2 (en) 2002-05-14 2003-11-27 Baylor College Of Medicine Small molecule inhibitors of her2 expression
EP1575514A2 (en) 2002-07-31 2005-09-21 Seattle Genetics, Inc. Anti-cd20 antibody-drug conjugates for the treatment of cancer and immune disorders
CN103833854B (zh) 2002-12-16 2017-12-12 健泰科生物技术公司 免疫球蛋白变体及其用途
AU2003303374A1 (en) 2002-12-20 2004-07-22 The Johns Hopkins University Treatment of metastatic cancer with the b-subunit of shiga toxin
EP1583833A1 (en) 2003-01-03 2005-10-12 Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P. Angeletti S.P.A. Rhesus her2/neu, nucleotides encoding same, and uses thereof
CN1802388B (zh) 2003-05-09 2011-01-05 杜克大学 Cd20特异抗体及使用它们的方法
AR044388A1 (es) 2003-05-20 2005-09-07 Applied Molecular Evolution Moleculas de union a cd20
WO2005000902A1 (en) 2003-06-30 2005-01-06 Mu-Hyeon Choe The dimer of chimeric recombinant binding domain-functional group fusion formed via disulfide-bond-bridge and the processes for producing the same
DE602004018141D1 (de) 2003-07-04 2009-01-15 Affibody Ab Polypeptide mit bindungsaffinität für her2
EP2216342B1 (en) 2003-07-31 2015-04-22 Immunomedics, Inc. Anti-CD19 antibodies
WO2005011590A2 (en) 2003-08-01 2005-02-10 A & G Pharmaceutical, Inc. Compositions and methods for restoring sensitivity to treatment with her2 antagonists
US8147832B2 (en) 2003-08-14 2012-04-03 Merck Patent Gmbh CD20-binding polypeptide compositions and methods
DE602004027291D1 (de) 2003-11-25 2010-07-01 Us Gov Health & Human Serv Mutierte anti-cd22-antikörper und immunkonjugate
US7585942B2 (en) 2003-11-25 2009-09-08 Anjin Corporation Diphtheria toxin variant
SI2511297T1 (sl) 2004-02-06 2015-07-31 Morphosys Ag Proti -CD38 humana protitelesa in njihova uporaba
EP1720907B1 (en) 2004-02-06 2015-04-08 MorphoSys AG Anti-cd38 human antibodies and uses therefor
WO2005092917A1 (en) 2004-03-26 2005-10-06 Jean Gariepy Library of toxin mutants, and methods of using same
US9228008B2 (en) 2004-05-28 2016-01-05 Idexx Laboratories, Inc. Canine anti-CD20 antibodies
ZA200701234B (en) 2004-07-22 2008-12-31 Genentech Inc HER2 antibody composition
IL296666A (en) 2005-03-23 2022-11-01 Genmab As Antibodies against 38cd for the treatment of multiple myeloma
EP2143795B1 (en) 2005-03-31 2011-07-20 Biomedics Inc. Anti-CD20 monoclonal antibody
WO2007040653A2 (en) 2005-05-16 2007-04-12 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of Health And Human Services National Institutes Of Health Anti-cd30 antibodies that bind to intact cd30 but not soluble cd30
US7771955B2 (en) 2005-06-09 2010-08-10 University Of Maryland Affinity membrane for capture of a target biomolecule and formation thereof by site-directed immobilization of a capture biomolecule
WO2007005874A2 (en) 2005-07-01 2007-01-11 Medarex, Inc. Human monoclonal antibodies to programmed death ligand 1 (pd-l1)
FI20055417A0 (fi) 2005-07-20 2005-07-20 Glykos Finland Oy Syöpäpesifiset glykaanit ja niiden käyttö
NZ565173A (en) 2005-07-25 2012-01-12 Emergent Product Dev Seattle Single dose use of CD20 scFv for rheumatoid arthritis
US20090156417A1 (en) 2005-09-26 2009-06-18 Jean Gariepy Library From Toxin Mutants, And Methods Of Using Same
AU2006329208B2 (en) 2005-12-23 2012-03-08 Viventia Bio Inc. Methods for generating and screening fusion protein libraries and uses thereof
US8846058B2 (en) 2006-02-16 2014-09-30 The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine, Inc. Shiga toxoid chimeric proteins
US7373982B2 (en) 2006-03-21 2008-05-20 Halliburton Energy Services, Inc. Cements for use across formations containing gas hydrates
WO2008073160A2 (en) * 2006-08-17 2008-06-19 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods for converting or inducing protective immunity
US8257706B2 (en) 2006-08-25 2012-09-04 Seattle Genetics, Inc. CD30 binding agents and uses thereof
EP1914242A1 (en) 2006-10-19 2008-04-23 Sanofi-Aventis Novel anti-CD38 antibodies for the treatment of cancer
ES2678060T3 (es) 2006-12-01 2018-08-08 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Anticuerpos, en particular, anticuerpos humanos, que se unen a CD22 y usos de los mismos
CA2673668A1 (en) 2006-12-29 2008-07-10 Osprey Pharmaceuticals Usa, Inc. Methods of selecting and producing modified toxins, conjugates containing modified toxins and uses thereof
CN101622352A (zh) * 2006-12-29 2010-01-06 美国奥斯普瑞医药公司 选择和产生修饰的毒素、含有修饰的毒素的缀合物的方法及其应用
AU2008262391A1 (en) 2007-06-06 2008-12-18 Avi Biopharma, Inc. Soluble HER2 and HER3 splice variant proteins, splice-switching oligonucleotides, and their use in the treatment of disease
WO2008157776A2 (en) 2007-06-21 2008-12-24 Angelica Therapeutics, Inc. Modified diphtheria toxins
US7887801B2 (en) 2007-07-13 2011-02-15 Topotarget Germany Ag Optimized DNA and protein sequence of an antibody to improve quality and yield of bacterially expressed antibody fusion proteins
EP2178916B1 (en) 2007-07-31 2014-12-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Human antibodies to human cd20 and method of using thereof
US9364557B2 (en) 2007-08-01 2016-06-14 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Fold-back diabody diphtheria toxin immunotoxin and methods of use
ES2525488T3 (es) 2007-09-04 2014-12-23 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Deleciones en el dominio II de la exotoxina A de pseudomonas que reducen la toxicidad inespecífica
CN101848999A (zh) 2007-09-06 2010-09-29 国立大学法人大阪大学 抗-cd20单克隆抗体
WO2009088403A2 (en) 2007-10-08 2009-07-16 Rutgers, The State University Nontoxic shiga-like toxin mutant compositions and methods
WO2009064815A1 (en) 2007-11-13 2009-05-22 The Scripps Research Institute Production of cytotoxic antibody-toxin fusion in eukaryotic algae
WO2009068627A2 (en) 2007-11-27 2009-06-04 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against heterodimeric cytokines and/or their receptors and polypeptides comprising the same
US8315343B2 (en) 2007-12-17 2012-11-20 Telefonaktiebolaget Lm Ericsson (Publ) Multi-antenna receiver interference cancellation method and apparatus
EP2072525A1 (en) 2007-12-21 2009-06-24 Affibody AB New polypeptides having affinity for HER2
TWI472339B (zh) 2008-01-30 2015-02-11 Genentech Inc 包含結合至ｈｅｒ２結構域ii之抗體及其酸性變異體的組合物
WO2009110944A1 (en) 2008-02-29 2009-09-11 Angelica Therapeutics, Inc. Modified toxins
ES2342646B1 (es) 2008-06-02 2011-04-26 Institut De Recerca Hospital Universitari Vall Hebron Metodo de diagnostico de canceres que expresan el receptor her-2 o sus variantes truncadas.
BRPI0917204A2 (pt) 2008-07-21 2015-12-01 Immunomedics Inc variantes estruturais de anticorpos para melhores características terapêuticas
AU2009293640A1 (en) 2008-09-22 2010-03-25 Calmune Corporation Methods and vectors for display of 2G12 -derived domain exchanged antibodies
US8552154B2 (en) 2008-09-26 2013-10-08 Emory University Anti-PD-L1 antibodies and uses therefor
WO2010085539A1 (en) 2009-01-23 2010-07-29 The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine, Inc. Methods and compositions based on shiga toxin type 2 protein
CA2757079C (en) 2009-04-20 2015-05-19 Pfizer Inc. Control of protein glycosylation and compositions and methods relating thereto
CA2768598A1 (en) 2009-07-22 2011-01-27 Cenix Bioscience Gmbh Delivery system and conjugates for compound delivery via naturally occurring intracellular transport routes
EP2464836A2 (en) 2009-08-14 2012-06-20 Unifrax I LLC Mounting mat for exhaust gas treatment device
US9616120B2 (en) 2010-03-04 2017-04-11 Vet Therapeutics, Inc. Monoclonal antibodies directed to CD20
EP2371864A1 (en) 2010-03-23 2011-10-05 Ganymed Pharmaceuticals AG Monoclonal antibodies for treatment of cancer
WO2011130580A1 (en) 2010-04-15 2011-10-20 Alper Biotech, Llc Monoclonal antibodies against her2 antigens, and uses therefor
CN114805583A (zh) 2010-05-27 2022-07-29 根马布股份公司 针对her2的单克隆抗体
GB201013989D0 (en) 2010-08-20 2010-10-06 Univ Southampton Biological materials and methods of using the same
CN101948546B (zh) * 2010-09-25 2012-11-07 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 融合蛋白SAmB及其编码基因与应用
US20120141505A1 (en) 2010-11-01 2012-06-07 Fatih M. Uckun Cd19-ligand and use
PH12013501201A1 (en) 2010-12-09 2013-07-29 Univ Pennsylvania Use of chimeric antigen receptor-modified t cells to treat cancer
JOP20210044A1 (ar) 2010-12-30 2017-06-16 Takeda Pharmaceuticals Co الأجسام المضادة لـ cd38
PL219845B1 (pl) 2011-01-05 2015-07-31 Adamed Spółka Z Ograniczoną Odpowiedzialnością Przeciwnowotworowe białko fuzyjne
US20140065172A1 (en) 2011-01-26 2014-03-06 Cenix Bioscience Gmbh Delivery system and conjugates for compound delivery via naturally occurring intracellular transport routes
ES2700514T3 (es) 2011-02-01 2019-02-18 Genmab As Anticuerpos humanos y conjugados de anticuerpo-fármaco contra CD74
US8895006B2 (en) 2011-03-04 2014-11-25 Rutgers, The State University Of New Jersey Ricin ribosome binding protein compositions and methods of use thereof
PE20141454A1 (es) 2011-05-06 2014-10-23 Us Gov Health & Human Serv Inmunotoxina recombinante dirigida a la mesotelina
CN103717236A (zh) 2011-06-08 2014-04-09 加利福尼亚大学董事会 治疗肺癌和前列腺癌的抗-cd22抗原结合分子
WO2013019906A1 (en) 2011-08-01 2013-02-07 Genentech, Inc. Methods of treating cancer using pd-1 axis binding antagonists and mek inhibitors
PL397167A1 (pl) * 2011-11-28 2013-06-10 Adamed Spólka Z Ograniczona Odpowiedzialnoscia Przeciwnowotworowe bialko fuzyjne
US20150044210A1 (en) 2012-02-23 2015-02-12 President And Fellows Of Harvard College Modified microbial toxin receptor for delivering agents into cells
CN105229029B (zh) 2012-11-19 2020-07-14 巴利奥医药股份公司 结合到cd20和cd95的重组双特异性抗体
EP2740493A1 (en) * 2012-12-05 2014-06-11 Institut Curie Conjugates of the B-subunit of Shiga toxin for anticancer therapies
KR101990341B1 (ko) 2013-03-12 2019-06-19 몰레큘러 템플레이츠, 인코퍼레이션. 세포 내재화를 유도하기 위한 ｃｄ20-결합 면역독소 및 이의 사용 방법
EP2778173A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-17 Laboratoire Français du Fractionnement et des Biotechnologies Antibody directed against anthrax toxins and its uses
JP6090020B2 (ja) 2013-07-10 2017-03-08 富士ゼロックス株式会社 画像形成システム
CN105940102B (zh) 2013-08-26 2020-02-18 海瑞克·亚柏坎 抗cd30嵌合抗原受体及其用途
GB2519786A (en) 2013-10-30 2015-05-06 Sergej Michailovic Kiprijanov Multivalent antigen-binding protein molecules
EP3063173B1 (en) 2013-10-31 2020-07-29 Sanofi Specific anti-cd38 antibodies for treating human cancers
WO2015138452A1 (en) 2014-03-11 2015-09-17 Molecular Templates, Inc. Proteins comprising amino-terminal proximal shiga toxin a subunit effector regions and cell-targeting immunoglobulin-type binding regions
IL294746B2 (en) 2014-01-27 2024-04-01 Molecular Templates Inc SHIGA toxin-free effector subunit-containing polypeptides for mammalian applications
US20210138076A2 (en) 2014-01-27 2021-05-13 Molecular Templates, Inc. Cell-targeting molecules comprising shiga toxin a subunit effectors and cd8+ t-cell epitopes
US20160177284A1 (en) 2014-01-27 2016-06-23 Molecular Templates, Inc. Cell-targeted molecules comprising amino-terminus proximal or amino-terminal shiga toxin a subunit effector regions
EP3102245B1 (en) 2014-02-05 2021-09-08 Molecular Templates, Inc. Methods of screening, selecting, and identifying cytotoxic recombinant polypeptides based on an interim diminution of ribotoxicity
US11142584B2 (en) 2014-03-11 2021-10-12 Molecular Templates, Inc. CD20-binding proteins comprising Shiga toxin A subunit effector regions for inducing cellular internalization and methods using same
ES2864124T3 (es) 2014-03-11 2021-10-13 Molecular Templates Inc Proteínas que comprenden regiones de unión, regiones efectoras de la subunidad A de toxina Shiga y motivos señal de localización de retículo endoplasmático carboxi terminal
CN106103416B (zh) 2014-03-14 2021-03-02 拉夸里亚创药株式会社 作为trpm8拮抗剂的氮杂螺衍生物
CA2947048C (en) 2014-06-11 2023-10-17 Molecular Templates, Inc. Protease-cleavage resistant, shiga toxin a subunit effector polypeptides and cell-targeted molecules comprising the same
KR102451080B1 (ko) 2014-06-12 2022-10-06 씨에스피씨 메가리스 바이오파마슈티칼 씨오., 엘티디. 효소적 방법을 통한 균일한 항체 약물 접합체
CA2951355C (en) 2014-06-18 2023-10-31 Chemotherapeutisches Forschungsinstitut Georg-Speyer-Haus Car-expressing nk-92 cells as cell therapeutic agents
CN105713087B (zh) 2014-11-12 2020-05-08 北京康乐卫士生物技术股份有限公司 人乳头瘤病毒58型单克隆抗体及其应用
MX2017010072A (es) 2015-02-05 2017-11-09 Molecular Templates Inc Moleculas multivalentes que se enlazan a cd20, las cuales comprenden regiones efectoras de la subunidad a de la toxina shiga, y composiciones enriquecidas de las mismas.
DK3265575T3 (da) 2015-03-04 2021-05-31 Igm Biosciences Inc Cd20-bindende molekyler og anvendelser deraf
RS60441B1 (sr) 2015-05-30 2020-07-31 Molecular Templates Inc De-imunizovane, strukture shiga toksin a podjedinice i ciljani ćelijski molekuli koji sadrže isti
HK1248258A1 (zh) 2015-07-26 2018-10-12 Molecular Templates, Inc. 包含志贺毒素a亚基效应物和cd8+ t-细胞表位的细胞靶向分子
EP3436481B1 (en) 2016-03-29 2021-06-30 Stcube, Inc. Dual function antibodies specific to glycosylated pd-l1 and methods of use thereof
EP3448874A4 (en) 2016-04-29 2020-04-22 Voyager Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS FOR TREATING A DISEASE
CN117088979A (zh) 2016-10-30 2023-11-21 上海复宏汉霖生物技术股份有限公司 抗-pd-l1抗体及变异体
JP7075134B2 (ja) 2016-12-07 2022-05-25 モレキュラー テンプレーツ，インク． 部位特異的コンジュゲーションのための志賀毒素ａサブユニットエフェクターポリペプチド、志賀毒素エフェクター足場、及び細胞標的化分子
EP3434693A4 (en) 2016-12-26 2019-10-02 Dankook University Cheonan Campus Industry Academic Cooperation Foundation COMPOSITION FOR THE DIFFERENTIATION OF DENTAL STRAIN CELLS IN ODONTOBLAST FIELD CELLS AND MONOCLONAL IGG OR IGM-TYPE ANTIBODIES WITH SPECIFIC BINDING TO SURFACES OF ODOBOBLAST FIELD CELLS
WO2018140427A1 (en) 2017-01-25 2018-08-02 Molecular Templates, Inc. Cell-targeting molecules comprising de-immunized, shiga toxin a subunit effectors and cd8+ t-cell epitopes
EP3589640A4 (en) 2017-02-28 2020-12-30 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha PROTEIN PURIFICATION WITH PROTEIN L
KR20250007025A (ko) 2017-03-09 2025-01-13 젠맵 에이/에스 Pd-l1에 대한 항체
JP7159151B2 (ja) 2017-09-25 2022-10-24 Jsr株式会社 イムノグロブリン結合タンパク質、及びそれを用いたアフィニティー担体
WO2020081493A1 (en) 2018-10-16 2020-04-23 Molecular Templates, Inc. Pd-l1 binding proteins
WO2020154475A1 (en) 2019-01-23 2020-07-30 Molecular Templates, Inc. Proteins comprising modified immunoglobulin variable light chains
KR20220081977A (ko) 2019-09-18 2022-06-16 몰레큘러 템플레이츠, 인코퍼레이션. 시가 독소 a 서브유닛 스캐폴드를 포함하는 pd-l1 결합분자(pd-l1 binding molecules comprising shiga toxin a subunit scaffolds)

Also Published As

Publication number Publication date
US20210253649A1 (en) 2021-08-19
CY1123315T1 (el) 2021-12-31
JP2022058385A (ja) 2022-04-12
KR20180010259A (ko) 2018-01-30
DK3303373T3 (da) 2020-06-02
IL292708A (en) 2022-07-01
MX2021005092A (es) 2021-07-02
KR20240038121A (ko) 2024-03-22
JP7228931B2 (ja) 2023-02-27
PL3303373T3 (pl) 2020-09-21
IL285032B (en) 2022-06-01
HUE051246T2 (hu) 2021-03-01
CN114656573B (zh) 2024-09-27
KR102673972B1 (ko) 2024-06-10
SI3303373T1 (sl) 2020-07-31
JP6771492B2 (ja) 2020-10-21
JP2018527882A (ja) 2018-09-27
IL292708B1 (en) 2024-04-01
EP3636660A1 (en) 2020-04-15
KR102647100B1 (ko) 2024-03-13
AU2020201807A1 (en) 2020-04-02
AU2016271124A1 (en) 2017-11-16
PT3303373T (pt) 2020-07-14
HRP20200640T1 (hr) 2020-07-10
EP3660035A1 (en) 2020-06-03
MX2017015493A (es) 2018-02-09
CN107849096B (zh) 2022-05-24
SMT202000226T1 (it) 2020-05-08
AU2016271124C1 (en) 2020-05-14
EP3303373B1 (en) 2020-04-08
IL255492B (en) 2021-08-31
ES2847373T3 (es) 2021-08-03
JP2021020905A (ja) 2021-02-18
JP7079522B2 (ja) 2022-06-02
WO2016196344A1 (en) 2016-12-08
IL255492A (en) 2018-01-31
IL285032A (en) 2021-08-31
US20180258143A1 (en) 2018-09-13
US20220281926A1 (en) 2022-09-08
AU2016271124B2 (en) 2020-01-02
EP3303373A1 (en) 2018-04-11
JP2023052919A (ja) 2023-04-12
IL292708B2 (en) 2024-08-01
AU2020201807B2 (en) 2021-09-02
AU2021240294B2 (en) 2022-12-01
CN114656573A (zh) 2022-06-24
CN107849096A (zh) 2018-03-27
LT3303373T (lt) 2020-07-10
AU2021240294A1 (en) 2021-10-28
US11365223B2 (en) 2022-06-21
HK1246309A1 (en) 2018-09-07
CA2984635A1 (en) 2016-12-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7228931B2 (ja) 脱免疫化された志賀毒素ａサブユニット足場及びそれを含む細胞標的化分子
US11857628B2 (en) Shiga toxin A subunit effector polypeptides, Shiga toxin effector scaffolds, and cell-targeting molecules for site-specific conjugation
AU2020348861B2 (en) PD-L1 binding molecules comprising Shiga toxin A Subunit scaffolds
US20210079097A1 (en) Pd-l1-binding molecules comprising shiga toxin a subunit scaffolds
HK40028032A (en) De-immunized, shiga toxin a subunit scaffolds and cell-targeting molecules comprising the same
HK40024891A (en) De-immunized, shiga toxin a subunit scaffolds and cell-targeting molecules comprising the same
HK1246309B (en) De-immunized, shiga toxin a subunit scaffolds and cell-targeting molecules comprising the same
HK40020086A (en) Shiga toxin a subunit effector polypeptides, shiga toxin effector scaffolds, and cell-targeting molecules for site-specific conjugation