RS60596B1 - Kompozicije za poboljšanje ćelijske vijabilnosti i postupci za njihovu upotrebu - Google Patents

Description

Opis

TEHNIČKA OBLAST

[0001] Pronalazak se odnosi na postupke i kompozicije koje imaju za cilj da povećaju ćelijsku vijabilnost, pogotovo vijabilnost neurona, i naročito na postupke i kompozicije koje su usmerene na povećanje ćelijske vijabilnosti smanjenjem oksidativnih oštećenja izazvanih reaktivnim kiseoničnim metabolitima unutar ćelije, regulisanjem ćelijske oksidoredukcione homeostaze, ili smanjenjem mitohondrijske disfunkcije u ćeliji. Ovaj pronalazak se odnosi na oblast farmaceutskih tretmana, i tačnije na lečenje Alchajmerove bolesti i druge patologije u vezi sa amiloidozom.

STANJE TEHNIKE

[0002] Neurodegenerativna oboljenja centralnog nervnog sistema (CNS) uzrokuju progresivni gubitak neuronske strukture i funkcija i predstavljaju razarajuće bolesti za obolele i njihove porodice. Medju ova neurodegenerativna oboljenja spadaju na primer, multipla skleroza (MS), Parkinsonova bolest, Alchajmerova bolest, Hantingtonova bolest, amiotrofična lateralna skleroza (ALS) i šlog. Zbog složenosti ovih bolesti, mnoge od njih su do danas slabo shvaćene.

[0003] Alchajmerova bolest je najrasporstranjenije neurodegenerativno oboljenje i jedan od najvećih medicinskih problema u Americi. U 2012.godini, procenjeno je da je 5.4 miliona Amerikanaca ima ovo oboljenje, koje je predstavljalo šesti vodeći uzrok smrti. Budući da je produženje života u starosti najveći faktor rizika za pojavu Alchajmerove bolesti, očekuje se da će broj obolelih porasti na 7.1 miliona do 2025.godine, kako stanovništvo Sjedinjenih Američkih Državama bude starilo. Ostali faktori rizika uključuju odredjene genetske mutacije, dijabetes i razne vrste oboljenja.

[0004] Alchajmerovu bolest karakteriše agregacija proteina amiloid beta u plakove i formiranje neurofibrijalnih klubadi posredovanih različitim oblicima fosforilizovanog tau proteina. Neki od glavnih simptoma ovog oboljenja obuhvataju gubitak pamćenja, teškoće u izvršavanju i planiranju rutinskih zadataka, konfuziju u vezi sa vremenom ili mestom, probleme sa rečima ili govorom, i promene ličnosti.

[0005] Alchajmer je najčešće pripadnik široke klase demencija, za koje se smatra da su posredovane putem amiloidnih plakova, stvaranja amiloidnog oligomera, i/ili fosforilovanog tau proteina. Ova oboljenja obuhvataju, ali nisu ograničena na Pikovu bolest (Pikova demencija), multi-infarktnu demenciju, Creutzfeldt-Jakobovu bolest, demenciju sa Levijevim telima, mešanu demenciju, i frontotemporalnu demenciju.

[0006] Liu Na et al, Journal of Neurovirology, vol.8,br.4, 2002, strane 318-325, opisuju da peroksizomski proliferator fenilbuterne kiseline (PBA) štiti astrocite od oksidativne ćelijske smrti izazvane ts1 MoMuLV. Objavljena prijava br. WO2006050165 (A2) opisuje bistre vodene rastvore jedne ili više žučnih kiselina ili vodenih rastvorljivih proizvoda nastalih konverzijom skroba ili polisaharida bez skroba.

[0007] Trenutno odobreni lekovi koji se koriste u lečenju Alchajmerove bolesti ili blokiraju receptore glutamata tipa NMDA ili su inhibitori acetil holinesteraze; pri čemu su se ovi drugi pokazali umereno delotvorni po pitanju efikasnosti tokom oko 6-12 meseci kod samo pedeset procenata pacijenata i to samo pod odredjenim kognitivnim testovima. Obe klase lekova zasnovane su na modelu povećanja opšte neuronske ekscitiranosti na generalno inhibiran mozak, čineći ih sklonim da izazovu mnoge sporedne efekte i bez efekata na patologiju oboljenja. Iako je poznato nekoliko klasa lekova ili su predložene za lečenje neurodegenerativnih oboljenja, efikasne terapije su oskudne ili su nepostojeće. Stoga su potrebne poboljšane terapije za lečenje neurodegenerativnih oboljenja.

SUŠTINA PRONALASKA

[0008] U jednom aspektu, dati pronalazak se odnosi na kompoziciju koja obuhvata efikasnu količinu tauroursodezoksiholinske kiseline (TUDCA) ili njene farmaceutski prihvatljive soli, i efikasne količine 4-fenilbuterne kiseline (4- PBA) ili njene farmaceutski prihvatljive soli, za upotrebu u postupku lečenja subjekta koji ima oboljenje ili je u riziku od neurodegenerativnog oboljenja.

[0009] U jednom aspektu, dati pronalazak se odnosi na postupak smanjenja, oksidativnih oštećenja izazvanih reaktivnim kiseoničnim metabolitima unutar ćelije ex vivo, gde takav postupak obuhvata stupanje u kontakt ćelije sa tauroursodezoksiholinskom kiselinom (TUDCA) ili njenom farmaceutski prihvatljivom soli i 4-fenilbuternom kiselinom (4-PBA) ili njenom farmaceutski prihvatljivom soli.

[0010] U jednom aspektu, dati pronalazak odnosi se na tauroursodezoksiholinsku kiselinu (TUDCA) ili na njenu farmaceutski prihvatljivu so i 4-fenilbuternu kiselinu (4-PBA) ili farmaceutski prihvatljivu so za upotrebu kod subjekta u postupku lečenja neurodegenerativnog oboljenja povezanim sa oksidativnim oštećenjem izazvanim reaktivnim kiseoničnim metabolitom, gde postupak obuhvata identifikaciju subjekta koji ima neurodegenerativno oboljenje u vezi sa oksidativnim oštećenjem izazvanim reaktivnim kiseoničnim metabolitom; davanje datom subjektu TUDCA ili njene farmaceutski prihvatljive soli i 4-PBA ili njene farmaceutski prihvatljive soli, gde se količina 4-PBA koja se primenjuje u kombinaciji sa TUDCA smanjuje za 10% do 50% u poredjenju sa time kada se daje samo 4-PBA.

[0011] U jednom aspektu, dati pronalazak odnosi se na tauroursodezoksiholinsku kiselinu (TUDCA) ili na njenu farmaceutski prihvatljivu so za upotrebu u postupku lečenja neurodegenerativnog oboljenja povezanim sa oksidativnim oštećenjem izazvanim reaktivnim kiseoničnim metabolitom kod subjekta, gde postupak obuhvata identifikaciju subjekta koji ima neurodegenerativno oboljenje u vezi sa oksidativnim oštećenjem izazvanim reaktivnim kiseoničnim metabolitom; davanje datom subjektu TUDCA ili njene farmaceutski prihvatljive so i 4-PBA ili njene farmaceutski prihvatljive soli, gde se količina 4-PBA koja se primenjuje u kombinaciji sa TUDCA smanjuje za 10% do 50% u poredjenju sa time kada se daje samo 4-PBA.

[0012] U jednom aspektu, dati pronalazak odnosi se na 4-fenilbuternu kiselinu (4-PBA) ili njenu farmaceutski prihvatljivu so za upotrebu u postupku lečenja neurodegenerativnog oboljenja kod subjekta povezanim sa oksidativnim oštećenjem izazvanim reaktivnim kiseoničnim metabolitom, gde postupak obuhvata identifikaciju subjekta koji ima neurodegenerativno oboljenje u vezi sa oksidativnim oštećenjem izazvanim reaktivnim kiseoničnim metabolitom; davanje datom subjektu TUDCA ili njene farmaceutski prihvatljive soli i 4-PBA ili njene farmaceutski prihvatljive soli, gde se količina 4-PBA koja se primenjuje u kombinaciji sa TUDCA smanjuje za 10% do 50% u poredjenju sa time kada se daje samo 4-PBA.

[0013] Bar delimično, ovde je navedeno da kompozicije koje obuhvataju tauroursodezoksiholinsku kiselinu (TUDCA) u kombinaciji sa 4-fenilbuternom kiselinom (4-PBA) značajno utiču na smanjenje oksidativnog oštećenja izazvanog reaktivnim kiseoničnim metabolitom unutar ćelije, što za rezultat ima poboljšanje ćelijske vijabilnosti (na primer, neuronske vijabilnosti). Kao što je rečeno u sledećim primerima, jedinjenja TUDCA i 4-PBA su procenjena individualno i u kombinaciji kao zaštitna sredstva protiv ćelijske apoptoze izazvane vodonik peroksidom. Smatra se da je ćelijska apoptoza izazvana vodonik peroksidom uzrokovana izmenom redoks homeostaze, prevelikom proizvodnjom reaktivnih vrsta kiseonika i mitohondrijskom disfunkcijom. Ovi primeri pokazuju da TUDCA i 4-PBA ( 4-fenilbuterna kiselina), kada se meri ćelijska vijabilnost i/ili ćelijska smrt, imaju veće nego aditivno delovanje u zaštiti ćelija od oštećenja nastalih delovanjem vodonik-peroksida. Ovo iznenadjujuće otkriće sugeriše da ovi lekovi jedni drugima sinergijski povećavaju delotvornost u smanjenju navedenih oblika bolesti.

[0014] Ovim otkrićem obezbedjeni su postupci i kompozicije za upotrebu u poboljšanju vitalnosti ćelije, naročito neuronske održivosti, i još preciznije postupci i kompozicije za upotrebu za poboljšane vitalnosti ćelije regulisanjem redoks homeostaze u ćeliji, ili redukcijom mitohondrijske disfunkcije u ćeliji. Davanje žučne kiseline (na primer, tauroursodezoksiholinske kiseline (TUDCA)) u kombinaciji sa fenilbuternom kiselinom (na primer, 4-PBA) može biti korisno u postupcima za poboljšanje vitalnosti ćelije i za lečenje barem jednog simptoma u vezi za tim, sprečavaju vreme nastanka, ili usporavaju razvoja oboljenja u vezi sa oksidativnim stresom.

[0015] Ovde je dat pristup za smanjenje neuronskog oksidativnog stresa koji može biti koristan u lečenju bar jednog simptoma u vezi sa tim, sprečavanju nastanka ili usporavanju razvoja bolesti u vezi sa oksidativnim stresom, koji obuhvata, ali nije ograničen na neurodegenerativna oboljenja (na primer, Alchajmerovu bolest (AD), Hantingtonovu bolest (HD), Parkinsonovu bolest (PD), amiotrofičnu lateralnu sklerozu, Pikovu bolest, (Pikova demencija), multi-infarktnu demenciju, Creutzfeldt-Jakobovu bolest, demenciju sa Levijevim telima, frontotemporalnu demenciju) koji obuhvata davanje kompozicije sa kombinacijom tauroursodezoksiholinske kiseline (TUDCA) i 4-PBA ili njihove soli u farmaceutskoj kompoziciji ili formulaciji.

[0016] U jednom aspektu, otkrićem je predstavljen postupak za smanjenje oksidativnog oštećenja izazvanog reaktivnim kiseoničnim metabolitom unutar ćelije, gde postupak obuhvata dovodjenje u kontakt ćelije sa žučnom kiselinom, ili farmaceutski prihvatljivom soli, analogom, derivatom, ili prolekom; i fenilbuternom kiselinom (PBA), ili njenom farmaceutski prihvatljivom soli, analogom, derivatom, ili prolekom. U jednom izvodjenju, oksidativno oštećenje izazvano reaktivnim kiseoničnim metabolitom predstavlja oštećenje izazvano vodonik peroksidom (H2O2).

[0017] U narednom aspektu, otkrićem je predstavljen postupak za regulaciju redoks homeostaze unutar ćelije, gde postupak obuhvata dovodjenje u kontakt ćelije sa žučnom kiselinom, ili farmaceutski prihvatljivom soli, analogom, derivatom, ili prolekom; i fenilbuternom kiselinom (PBA), ili farmaceutski prihvatljivom soli, analogom, derivatom, ili prolekom.

[0018] U još jednom aspektu, otkrićem je predstavljen postupak za smanjenje mitohondrijske disfunkcije unutar ćelije, gde postupak obuhvata dovodjenje u kontakt ćelije sa žučnom kiselinom, ili farmaceutski prihvatljivom soli, analogom, derivatom, ili prolekom; i fenilbuternom kiselinom (PBA), ili njenom farmaceutski prihvatljivom soli, analogom, derivatom, ili prolekom.

[0019] Žučna kiselina je tauroursodezoksiholinska kiselina (TUDCA). U jednom ili više izvodjenja ovog pronalaska, žučna kiselina je izabrana iz grupe koju čine, ursodezoksiholinska kiselina (UDCA), henodeoksiholna kiselina, holna kiselina, hiodeoksiholna kiselina, deoksiholna kiselina, 7-oksolitoholna kiselina, litoholna kiselina, jododeoksiholna kiselina, hioholna kiselina, taurohenodeoksiholna kiselina, taurodeoksiholna kiselina, glikoursodeoksiholna kiselina, tauroholna kiselina, glikoholna kiselina, ili njihov analog, ili derivat.

[0020] U nekim izvodjenima, ćelija je u kontaktu sa TUDCA u koncentraciji od oko 80 μM do oko 120 μM.

[0021] PBA je 4-PBA. U jednom ili više izvodjenja datog pronalaska, PBA predstavlja gliceril (Tri-4-PBA), fenil sirćetnu kiselinu, 2-POAA-OMe, 2-POAA-NO2, 2-NOAA ili farmaceutski prihvatljive soli, analog, derivat, ili prolek.

[0022] U nekim izvodjenjima, ćelija je dovedena u kontakt sa 4-fenilbuternom kiselinom u koncentraciji od oko 0.8 mM do oko 1.2 mM. U nekim aspektima, ćelija predstavlja ćeliju sisara. U izvodjenju, ćelija je ljudska ćelija. U narednom izvodjenju, ćelija je neuron.

[0023] U odredjenim aspektima, otkrićem je predstavljen postupak lečenja neurodegenerativnog oboljenja u vezi sa smanjenjem oksidativnog oštećenja izazvanog reaktivnim kiseoničnim metabolitom kod subjekta, gde postupak obuhvata identifikaciju subjekta koji ima neurodegenerativno oboljenje u vezi sa oksidativnim oštećenjem izazvanim reaktivnim kiseoničnim metabolitom; davanje pomenutom subjektu žučne kiseline ili njene farmaceutski prihvatljive soli, analoga, derivata ili proleka i fenilbuterne kiseline (PBA) ili njene farmaceutski prihvatljive soli, analoga, derivata ili proleka, gde je količina PBA koja se daje u kombinaciji sa žučnom kiselinom smanjena za 10% do 50% u poredjenju sa time kada se daje samo PBA.

[0024] U još jednom aspektu, otkrićem je predstavljen postupak za lečenje neurodegenerativnog oboljenja kod subjekta kome je to potrebno, gde postupak obuhvata identifikaciju subjekta sa najmanje jednom kopijom APOEε4 alela, pri čemu se tom subjektu daje kompozicija koja obuhvata žučnu kiselinu, ili njenu farmaceutski prihvatljivu so, analog, derivat ili prolek; i fenilbuternu kiselinu (PBA) ili njenu farmaceutski prihvatljivu so, analog, derivat ili prolek, i gde se na taj način leči neurodegenerativno oboljenje.

[0025] Ako drugačije nije definisano, svi tehnički i naučni pojmovi koje se ovde korišćeni, imaju isto značenje, kao što je obično shvaćeno od strane stručnjaka iz stanja tehnike, kojoj pripada ovaj pronalazak. U ovom tekstu su opisani postupci i materijali za upotrebu u datom pronalasku; mogu se koristi i drugi pogodni postupci i materijali poznati u stanju tehnike. U slučaju konflikta, dati opis, uključujući definicije će imati prednost.

[0026] Ostale karakteristike i prednosti pronalaska biće vidljive iz sledećeg detaljnog opisa i slika, kao i iz patentnih zahteva.

OPIS SLIKA NACRTA

[0027]

SL. 1 predstavlja grafikon koji prikazuje sposobnost TUDCA i PBA u kombinaciji da povećaju ćelijsku vijabilnost procenjenu pomoću reagensa PrestoBlue nakon izlaganja vodonik peroksidu u kulturi kortikalnih neurona pacova. * označava značajnost od p < .0001 u odnosu na kontrolu. ## označava značajnost od p < .01 u odnosu na izlaganje peroksidu. # označava značajnost od p < .05 u odnosu na izlaganje peroksidu. Kombinacija pruža značajnu zaštitu, dok ni jedan od lekova pojedinačno ne pruža značajnu zaštitu. Izlaganje NMDA pri 300uM koristi se kao negativna kontrola. DFX (nije prikazano) nije uključen u grafikon jer se smatra da ometa merenje pomoću reagensa PrestoBlue i dovodi do dobijanja pogrešnih rezultata. ;SL. 2 predstavlja grafikon koji prikazuje sposobnost TUDCA i PBA u kombinaciji da ublaže ćelijsku smrt procenjenu pomoću LDH posle izlaganja vodonik peroksidu (H2O2) u kulturi kortikalnih neurona pacova. * označava značajnost od p < 10<-4>u odnosu na kontrolu. ## označava značajnost od p < .01 u odnosu na izlaganje peroksidu. # označava značajnost od p < .05 u odnosu na izlaganje peroksidu. Kombinacija pruža značajnu zaštitu, dok ni jedan od lekova pojedinačno ne pruža značajnu zaštitu. Izlaganje NMDA pri 300uM koristi se kao negativna kontrola, dok je DFX pozitivna kontrola u LDH studiji.

SL. 3 prikazuje hemijsku strukturu TUDCA (formula I) sa označenim ugljenicima da bi se razumelo gde se mogu izvršiti zamene.

SL. 4 prikazuje hemijsku strukturu UDCA (formula II) sa označenim ugljenicima da bi se razumelo gde se mogu izvršiti zamene.

SL. 5 prikazuje hemijsku strukturu PBA stabilizovanog jonom natrijuma (formula III). Derivati dostupni za upotrebu u okviru ovog otkrića opisani su u odeljku Osnova pronalaska.

DETALJAN OPIS

[0028] Dijabetes, zapaljenje, starenje, odredjene genetske varijante, i mnoga druga stanja su faktori rizika za Alchajmerovu bolest. Zajedničko za ova stanja je to što su sva povezana sa povećanom proizvodnjom slobodnih radikala, neravnotežom u redoks homeostazi i/ili povećanim oštećenjima ćelija i tkiva posredovanim slobodnim radikalima. Superoksid i drugi slobodni radikali su uključeni u povećanje količine patogenih amiloidnih proteina i povećanje agregacije u amiloidne plakove, oligomere i druge vrste. Bez vezivanja za odredjenu teoriju, neki naučnici pripisuju ovu agregaciju procesu koji uključuje oksidaciju aminokiseline amiloidnog lanca, posebno metioninske rezidue na poziciji 35.

[0029] Ugradjivanje amiloidnih proteinskih grupa u mitohondrije uključeno je u oslobadjanje citohroma c, kiseoničnih radikala i drugih slobodnih radikala. Pokazalo se da ovi radikali povećavaju odgovor na stres u endoplazmatičnom retikulumu, a povećavaju i agregaciju amiloidnog proteina.

[0030] Nedavni izveštaji sugerišu da reaktivni kiseonični metaboliti mogu da budu uključeni u patologiju Alchajmerove bolesti. Kiseonični radikali, kao i lipidni i azotni radikali, predstavljaju prekursore u putevima apoptoze posredovanim BAX, citohromom C i JNK. Dokazi takodje sugerišu da promena redoks stanja nastala zbog prisustva ovih vrsta izaziva povećanje proteolitičke aktivnosti ključne u patologiji mnogih bolesti izazvanih, bar delom, abnormalnom obradom proteina. Promena redoks stanja ćelije takodje dovodi do redukcije glavnih antioksidantnih vrsta kao što su glutation (GSH) i vitamin E.

Oštećenje izazvano reaktivnim kiseoničnim metabolitima

[0031] Nedavne studije su takodje počele da ukazuju na oštećenje izazvano reaktivnim kiseoničnim metabolitima kao na jedan od glavnih faktora neurodegenerativne bolesti. Na primer, pokazalo se da vodonik peroksid utiče na mitohondrije, proteolitičko stanje ćelije, proizvodnju amiloida beta, redoks homeostazu i mnoge apoptotske puteve unutar ćelije. Pokazalo se da vodonik peroksid reaguje i sa jonima metala, kao što su gvoždje i bakar, čime se formiraju reaktivnije kiseonične vrste putem Fenton hemijskog procesa. Smanjenje antioksidanata kao što su vitamin E i glutation kod niza neurodegenerativnih patologija ukazuje na povećanje oksidativnog oštećenja kod ovih bolesti.

[0032] Smatra se da PINK1 i Parkin (Parkinson protein 2, E3 ubikvitin protein ligaza) regulišu kontrolu kvaliteta u mitohondrijama i mutacije ovih gena mogu da predstavljaju uzrok Parkinsonove bolesti. Studije su pokazale da se transkripcija Parkina povećava nakon uvodjenja vodonik peroksida u ćeliju. MPTP ((1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetra/hidropiridin) koji indukuje simptome slične Parkinsonovoj bolesti takodje direktno dovodi do stvaranja vodonik peroksida. Neke studije su pokazale povećanje nivoa vodonik peroksida kod ove bolesti koje iznosi i do 90%.

[0033] Pokazano je da amiloid beta, kod Alchajmerove bolesti, direktno stvara vodonik peroksid pri dodiru sa jonima metala, kao što su gvoždje i bakar, koji se nalaze u većim koncentracijama u mozgu pacijenata koji pate od ove bolesti. Vodonik peroksid takodje može da poveća preradu amiloida beta u patogeni oblik. Smatra se i da su putevi posredovani vodonik peroksidom i reaktivnim kiseoničnim metabolitima glavni put ćelijske smrti kod ove bolesti.

[0034] Hantingtonova bolest takodje pokazuje proteolitičke proizvode koji mogu da budu izazvani vodonik peroksidom, kao i široko rasprostranjenu poremećenu funkciju mitohondrija. Porast 3-hidroksikineurina smatra se glavnim patološkim korakom kod Hantingtonove bolesti i poznato je da direktno indukuje proizvodnju vodonik peroksida i hidroksil radikala.

[0035] Pokazalo se da je i vodonik peroksid potencijalni medijator u patologiji ALS. Agensi koji hvataju vodonik peroksid razmatraju se kao terapeutici u ovoj oblasti.

Regulacija redoks homeostaze

[0036] Redoks homeostaza se odnosi na pokušaj ćelije da upravlja reduktivnim i oksidativnim vrstama u ćeliji kako bi održala konstantno redoks stanje. Narušavanje redoks homeostaze može da promeni potrebe za slobodnom energijom i omogući odvijanje procesa u ćelijama koji se ne bi javljali u uslovima koji nisu patološki. Neki procesi koji mogu biti uzrokovani neuspehom regulacije redoks homeostaze uključuju agregaciju amiloida beta u plakove karakteristične za Alchajmerovu bolest, Levijeva tela kod Parkinsonove bolesti i demencije sa Levijevim telima, senilne plakove Hantingtonove bolesti, plakove koji uključuju amiloidne plakove nadjene kod ALS, i poremećaje tauopatije. Pod tipičnim fiziološkim uslovima, ovi proteini se neće agregirati, ali se smatra da povećane koncentracije, kao i atipična redoks stanja, menjaju slobodnu energiju agregacije, što dovodi do nastanka plakova zapaženih kod ovih patologija. Izmenjeno redoks stanje takodje može da stvara slobodne radikale koji uzajamno deluju sa mitohondrijalnim putevima izazivajući apoptozu. Stoga postoji potreba da se razvije agens koji može da pomogne u regulisanju redoks stanja ćelije. Budući da vodonik peroksid indukuje izmenjeno redoks stanje ćelije, on se može koristiti da izazove redoks-posredovano oštećenje ćelije.

Poremećaj funkcije mitohondrija

[0037] Poremećaj funkcije mitohondrija je široko rasprostranjen u neurodegenerativnoj bolesti. Kod Alchajmerove bolesti, potencijal mitohondrijalne membrane ćelija je upadljivo snižen, metabolizam glukoze u mitohondrijama je narušen, a propustljivost mitohondrija je povećana. Zapaženo je da mitohondrije posreduju u više apoptotskih puteva koji dovode do smrti neurona kod Alchajmerove bolesti.

[0038] PINK1 i Parkin su proteini mitohondrijalne kontrole kvaliteta. Mutacije ili nedostatak ovih proteina su snažno povezani sa Parkinsonovom bolešću. MPTP, molekul koji se koristi za indukovanje trajnih simptoma Parkinsonove bolesti, deluje putem narušavanja kompleksa I u mitohondrijama, što izaziva poremećaj funkcije mitohondrija, menjanja redoks stanja ćelije, i apoptoze.

[0039] Na ćelijskoj kulturi je direktno pokazano da mutantni gen hantingtin i njegov rezultujući protein, za koji se smatra da je primarni medijator Hantingtonove bolesti, dovode do gubitka membranskog potencijala i snižene ekspresije ključnih gena oksidativne fosforilacije u mitohondrijama. Patologija Hantingtonove bolesti takodje je povezana sa smanjenjem broja mitohondrija prisutnih u centralnom nervnom sistemu.

[0040] Smatra se da promena položaja mitohondrija, narušavanje energetskog metabolizma, i apoptotski putevi posreduju u amiotrofičnoj lateralnoj sklerozi. Takodje je pokazano da mitohondrije u tkivima zahvaćenim bolešću prekomerno proizvode reaktivne kiseonične metabolite i ispuštaju ih u citosol.

[0041] Kod mnogih neurodegenerativnih bolesti, mitohondrije prekomerno proizvode slobodne radikale, izazivaju snižavanje energetskog metabolizma, imaju povećanu propustljivost, imaju snižem membranski potencijal, imaju snižene antioksidanse, ispuštaju jone metala u ćeliju, menjaju redoks stanje ćelije, i vode ćeliju niz pro-apoptotske puteve. Prema tome, postoji potreba za agensima koji mogu da promene i oslabe mehanizme poremećaja funkcije mitohondrija.

Alel APOEε4

[0042] Genetika Alchajmerove bolesti je složena. Mutacije u najmanje četiri genetska lokusa povezane su sa naslednom podložnošću AD (tj., familijarnom AD). Tri gena su povezana sa ranom pojavom AD: APP [β-amiloidni prekursorski protein na hromozomu 21], PS1 (presenilin 1) i PS2 (presenilin 2). Alel ε4 gena apolipoprotein E (APOE) na hromozomu 19 povezan je sa kasnom pojavom AD. Izgleda da je povezanost APOEε4 sa AD najjača kod osoba kod kojih se bolest javlja pre 70. godine života i slabi sa daljim starenjem. Pokazano je da pacijenti koji imaju najmanje jednu kopiju alela APOE ε4 imaju posebno povišene nivoe peroksidnih metabolita, kao i oštećenje mitohondrija. Lečenje ove populacije pacijenata može da bude posebno efikasno.

[0043] U odredjenim aspektima, ovim pronalaskom razmotren je postupak za lečenje neurodegenerativnog oboljenja kod subjekta kojem je to potrebno, gde postupak obuhvata identifikaciju subjekta sa najmanje jednom kopijom APOEε4 alela, pri čemu se tom subjektu daje kompozicija koja obuhvata žučnu kiselinu, ili njenu farmaceutski prihvatljivu so, analog, derivat ili prolek; i fenilbuternu kiselinu (PBA) ili njenu farmaceutski prihvatljivu so, analog, derivat ili prolek, i gde se na taj način leči neurodegenerativno oboljenje.

[0044] U odredjenom aspektu, pronalaskom je prikazan postupak koji obuhvata kontakt ćelije sa žučnom kiselinom. U ovom tekstu, "žučna kiselina" (na primer, vodeni rastvorljivi derivati žučne kiseline, soli žučnih kiselina, ili žučna kiselina konjugovana aminom) odnosi se na prirodne surfaktante koji imaju jezgro izvedeno iz holanske kiseline supstituisane 3α-hidroksil grupom kao i po slobodnom izboru sa drugim hidroksilnim grupama, obično u položaju C6, C7 ili C12 jezgra sterola. Derivati žučne kiseline, ali nisu ograničeni na derivate formirane na hidroksilnim i karboksilnim kiselim grupama žučne kiseline sa drugim funkcionalnim grupama uključujući bez ograničenja halogene i amino grupe. Rastvorljiva žučna kiselina može da sadrži vodeni preparat slobodnog oblika žične kiseline u kombinaciji sa HCl, fosfornom kiselinom, limunskom kiselinom, sirćetnom kiselinom ili argininom.

[0045] U odredjenim aspektima, postupci ovog pronalaska obuhvataju kontakt ćelije sa žučnom kiselinom, ili njenom farmaceutski prihvatljivom soli, analogom, derivatom, ili prolekom. Žučna kiselina je tauroursodezoksiholinska kiselina (TUDCA) kako je prikazano u formuli I (SL. 3), i sa označenim ugljenicima pomaže u razumevanju gde se mogu izvršiti supstitucije.

[0046] U jednom ili više izvodjenja pronalaska, ursodeoksiholna kiselina (UDCA) iz grupe žučnih kiselina kako je prikazano u formuli II (SL. 4), sa označenim ugljenicima pomaže u razumevanju gde se mogu izvršiti supstitucije.

[0047] Fiziološki povezani derivati žučne kiseline uključuju bilo koju kombinaciju za supstitucije vodonika u položaju 3 ili 7, pomeranju u stereohemiji hidroksilne grupe u položajima 3 ili 7, i njihove farmaceutski prihvatjive soli, solvate ili aminokiselinske konjugate od TUDCA ili UDCA.

[0048] U nekim izvodjenjima pronalaska, žučna kiselina predstavlja TUDCA jedinjenje formule IV:

u kojoj R predstavlja - H ili C1-C4alkil;

R1predstavlja -CH2-SO3R3i gde R2predstavlja -H; ili R1predstavlja -COOH i R2je -CH2-CH2-CONH2, -CH2-CONH2, -CH2-CH2-SCH3ili -CH2-S-CH2-COOH; i

R3predstavlja - H ili ostatak bazne aminokiseline, ili njenog farmaceutski prihvatljivog analoga, derivata, proleka ili njihove smeše.

[0049] Ovim pronalaskom takodje se razmatra upotreba žučnih kiselina pored TUDCA i UDCA, uključujući na primer, henodeoksiholnu kiselinu (koja se takodje naziva "henodiol" ili "henska kiselina"), holnu kiselinu, hiodeoksiholnu kiselinu, deoksiholnu kiselinu, 7-oksolitoholnu kiselinu, litoholnu kiselinu, jododeoksiholnu kiselinu, hioholnu kiselinu, taurohenodeoksiholnu kiselinu, taurodeoksiholnu kiselinu, glikoursodeoksiholnu kiselinu, tauroholnu kiselinu, glikoholnu kiselinu, ili njihov analog, ili derivat.

[0050] U odredjenom aspektu, pronalaskom su predstavljeni postupci koji obuhvataju kontakt ćelije sa fenilbuternom kiselinom. Fenilbuterna kiselina (PBA) (SL.4, natrijumova so) je inhibitor HDAC2 (Histon Deacetilaze 2). Unošenje PBA i derivata rezultuje diferencijalnom genskom ekspresijom za koju se pokazalo da ima različite efekte. Takodje je pokazano da PBA deluje kao hemijski šaperon sa različitim efektima. Jedan od efekata je smanjenje proizvodnje patogenih amiloidnih proteina. Drugi efekat je povećana neuroplastičnost. Takodje je pokazano da PBA poboljšava bilijarnu ekskreciju. Medjutim, poznato je da PBA citotoksičan za više različitih tipova ćelija.

[0051] Fiziološki srodne vrste fenilbuterne kiseline (PBA) obuhvataju bilo kakve supstitucije vodonika deuterijumom. Bilo koji soli, solvati, konjugati i farmakološki srodna jedinjenja takodje su znatno fiziološki slična. Takodje će se svi derivati fenilbuterne kiseline koji su opisani u prethodnom stanju tehnike smatrati fiziološki povezanima. Ostali HDAC2 inhibitori takodje će se smatrati zamenama za fenilbutirat. Fenilsirćetna kiselina, aktivni metabolit PBA takodje se može smatrati zamenom.

[0052] PBA jedinjenje predstavlja 4-Fenilbuternu kiselinu (4-PBA). 4-PBA predstavlja aromatičnu karbokslinu kiselinu male molekulske mase. U ovom tekstu, 4-PBA je definisan tako da obuhvata ne samo 4-fenibuternu kiselinu kao slobodnu kiselinu već i njene fiziološki prihvatljive soli. Naročito je "4-fenilbuterna kiselina" ili "4-PBA" takodje definisana kao njena slobodna kiselina, ali takodje i u obliku farmaceutski prihvatljive soli, ko-kristala, polimorfa, hidrata, ili solvata 4-fenilbuterne kiseline. Najpoželjnije je da "4-fenilbuterna kiselina" ili "4-PBA" bude ili u obliku slobodne kiseline ili farmaceutski prihvatljive soli 4-PBA, kao što je njena natrijumova so. Analozi 4-PBA uključuju, na primer, Glicerli (Tri4-PBA), fenilsirćetnu kiselinu, 2-POAA-OMe, 2- POAA-NO2, 2-NOAA. Fiziološki prihvatljive soli 4-fenilbutirata, obuhvataju, na primer, natrijumove, kalijumove, magnezijumove ili kalcijumove soli.

Farmaceutske kompozicije i postupci primene

[0053] U odredjenim aspektima, ovde opisani postupci obuhvataju proizvodnju i upotrebu farmaceutskih kompozicija i lekova koji uključuju jedinjenja identifikovana ovde opisanim postupkom kao aktivne sastojke. Takodje su uključene i farmaceutske kompozicije.

[0054] U nekim slučajevima, kompozicije koje su opisane u ovom tekstu mogu da obuhvataju ostala jedinjenja, lekove, i/ili agense koji se koriste u lečenju neurodegenerativnih oboljenja. U nekim slučajevima, na primer, ovde opisane terapijske kompozicije mogu se kombinovati sa jednim ili više (na primer, jedan, dva, tri, četiri, pet, ili manje od deset) jedinjenja.

[0055] U nekim slučajevima, kompozicije koje su opisane u ovom tekstu mogu da obuhvate druga jedinjenja koja uključuju COX2 inhibitore, lekove za astmu, lekove za dijabetes, druge antioksidante, inhibitore acetil holinesteraze (na primer, donepezil, takrin, rivastigmin, galantamin, fizostigmin, neostigmin, Huperzin A, icopezil (CP-118954, 5,7-dihidro-3-[2-[1- (fenilmetil)-4- piperidinil]etil]-6H-pirolo-[4,5-f]-1 ,2-benzisoksazol-6-on maleat), ER-127528 (4-[(5,6-dimetoksi-2-fluoro-1-indanon)-2-il]metil-1-(3-fluorobenzil) piperidin hidrohlorid), zanapezil (TAK-147; 3-[1-(fenilmetil)piperidin-4-il]- 1-(2,3,4,5-tetrahidro-1H-1-benzazepin-8-il)-1-propan fumarat), Metrifonat (T-588; (-)- R-a-[[2-(dimetilamino)etoksi]metil]benzo[b]tiiofen-5-metanol hidrohlorid), FK-960 (N-(4-acetil-1-piperazinil)-pfluorobenzamid-hidrat), TCH-346 (N-metil-N-2-piropinildibenz[b,f]oksepin-10-metanamin), SDZ-220-581 ((S)-a-amino5-(fosfonometil)-[1,1’-bifenil]-3-propionska kiselina), i kombinacije ovih lekova), antagoniste NMDA receptora (na primer, memantin, nerameksan, rimantadin, ili amantadin, inhibitore lipoksigenaze, inhibitore leukotriena, kokosovo ulje, ostale HDAC inhibitore, statine, amfetamine, ostale MAO inhibitore, metalne helatore, BACE1-inhibitore, antitela na amiloidne beta proteine, modulatore gama-sekretaze, sredstva za čišćenje amiloida, fosforilizovana tau antitela, Aβ inhibitore, agense za uklanjanje Aβ plakova, inhibitore formiranja Aβ plakova, inhibitori enzima za obradu amiloidonog prekosuroskog proteina, inhibitore enzima za konverziju β-amloida, inhibitore β-sekretaze, modulatore γsekretaze, agoniste nervnog faktorarasta i agense za čišćenje neurofibrilarne klubadi).

[0056] U nekim slučajevima, kompozicije koje su opisane u ovom tekstu mogu da budu formulisane za upotrebu kao farmaceutske kompozicije ili u farmaceutskim kompozicijama. Takve kompozicije mogu da budu formulisane ili prilagodjene za primenu kod subjekta bilo kojim putem, npr., bilo kojim putem odobrenim od strane Agencije za hranu i lekove (FDA). Primeri postupaka opisani su u Priručniku za standarde podataka FDA, CDER, verzija broj 004 (koji je dostupan na fda.give/cder/dsm/DRG/drg00301.htm). Farmaceutske kompozicije mogu da budu formulisane za oralnu, parenteralnu, ili transdermalnu isporuku. Jedinjenja iz pronalaska se takodje mogu kombinovati sa drugim farmaceutskim agensima. U nekim aspektima, pronalaskom je obezbedjen komplet (kit) koji uključuje jedinjenja TUDCA i 4-PBA korišćena u pronalasku. Komplet takodje može da sadrži uputstva za lekara i/ili pacijenta, špriceve, igle, kutije, boce, vajle, itd. U jednom aspektu, pronalaskom su predstavljene kompozicije koje obuhvataju TUDCA i 4-PBA za upotrebu u postupcima koji su korisni u prevenciji ili lečenju neurodegenerativnog oboljenja, koja uključuju multipla sklerozu (MS), Parkinsonovu bolest, Alchajmerovu bolest, Hantingtonovu bolest, amiotrofičnu lateralnu sklerozu (ALS), moždani udar, Pikovu bolest, multi-infarktnu demenciju, Creutzfeldt-Jakobovu bolest, demenciju sa Levijevim telima, mešanu demenciju, i frontotemporalnu demenciju i pridružene bolesti. Pronalaskom su posebno prikazane farmaceutske kompozicije koje obuhvataju TUDCA i 4-PBA koje se mogu koristiti za lečenje ili prevenciju Alchajmerove bolesti i druge patologije povezane sa amiloidozom, i za prevenciju komplikacije ovih stanja.

[0057] Farmaceutske kompozicije uključuju efikasnu količinu TUDCA i 4-fenilbuterne kiseline kao što je opisano ranije u tekstu. U ovom tekstu, izrazi "efikasna količina" i "efikasno za lečenje,", odnose se na količinu ili koncentraciju jednog ili više lekova tokom odredjenog vremena (uključujući akutno ili hronično davanje i periodičnu ili kontinuiranu primenu) koja je efikasna u kontekstu njegove primene, a radi izazivanja odredjenog planiranog dejstva ili fiziološkog rezultata.

[0058] U nekim slučajevima, farmaceutske kompozicije uključuju TUDCA, 4-fenilbuternu kiselinu, i bilo koja farmaceutski prihvatljivi nosač, adjuvans i/ili vehikulum. U nekim slučajevima, farmaceutski preparati mogu dalje da sadrže jedan ili više dodatnih terapijskih agenasa u količinama koje su efikasne u postizanju modulacije oboljenja ili simptoma bolesti.

[0059] Farmaceutske kompozicije tipično uključuju farmaceutski prihvatljiv nosač. Pojam "farmaceutski prihvatljiv nosač ili adjuvans" odnosi se na nosač ili adjuvans koji može da se da pacijentu, zajedno sa jedinjenjem ovog pronalaska, i koji ne uništava njegovu farmakološku aktivnost i koji je netoksičan kada se primeni u dozama dovoljnim za isporuku terapeutske količine jedinjenja. Kako se ovde koristi, izraz "farmaceutski prihvatljiv nosač" uključuje fiziološke rastvore, rastvarače, medijume za dispergovanje, premaze, antibakterijske i antigljivične agense, izotonične agense i agense za odlaganje apsorpcije, i slično, kompatibilne sa farmaceutskom primenom.

[0060] Farmaceutske kompozicije ovog pronalaska mogu da sadrže bilo koje uobičajene netoksične farmaceutski prihvatljive nosače, adjuvanse ili vehikulume. U nekim slučajevima, pH formulacije može da se podesi farmaceutski prihvatljivim kiselinama, bazama ili puferima da bi se poboljšala stabilnost formulisanog jedinjenja ili njegovog oblika za isporuku. Pojam parenteralni, kako se ovde koristi, uključuje tehnike potkožne, intrakutane, intravenske, intramuskularne, intraartikularne, intraarterijalne, intrasinovijalne, intrasternalne, intratekalne, intralezione i intrakranijalne injekcije ili infuzije.

[0061] Farmaceutske kompozicije su tipično formulisane tako da budu kompatibilne sa predvidjenim putem primene. Primeri puteva primene uključuju parenteralnu, npr., intravensku, intradermalnu, potkožnu, oralnu (npr., inhalacija), transdermalnu (topikalnu), transmukoznu, i rektalnu primenu.

[0062] Farmaceutske kompozicije mogu da budu u obliku rastvora ili praha za inhalaciju i/ili nazalnu primenu. Takve kompozicije mogu da budu formulisane u skladu sa tehnikama poznatim u ovoj oblasti upotrebom pogodnih agenasa za dispergovanje ili kvašenje (kao, na primer, Tween 80) i agenasa za suspendovanje. Sterilni injektabilni preparat može takodje da bude sterilni injektabilni rastvor ili suspenzija u netoksičnom parenteralno prihvatljivom razblaživaču ili rastvaraču, na primer, kao rastvor u 1,3-butandiolu. Medju prihvatljivim vehikulumima i rastvaračima koji mogu da se koriste su manitol, voda, Ringerov rastvor i izotonični rastvor natrijum hlorida. Pored toga, sterilna, fiksna ulja se uobičajeno koriste kao rastvarač ili medijum za suspendovanje. U ovu svrhu, svako blago fiksno ulje može da se koristi uključujući sintetske mono- ili digliceride. Masne kiseline, kao što je oleinska kiselina i njeni gliceridni derivati korisni su u pripremi injektabilnih oblika, kao što su i prirodna farmaceutski prihvatljiva ulja, poput maslinovog ili ricinusovog ulja, posebno u polioksietilovanim verzijama. Ovi uljani rastvori ili suspenzije mogu da sadrže i razblaživač ili disperzant u vidu alkohola dugog lanca, ili karboksimetil celulozu ili slične agense za dispergovanje koji se uobičajeno koriste u formulaciji farmaceutski prihvatljivih doznih oblika kao što su emulzije i/ili suspenzije. Druge uobičajeno korišćene površinski aktivne supstance kao Tweens ili Spans i/ili drugi slični emulgatori ili agensi za poboljšanje biološke raspoloživosti koji se uobičajeno koriste u proizvodnji farmaceutski prihvatljivih čvrstih, tečnih, ili drugih doznih oblika mogu takodje da se koriste u svrhu formulacije.

[0063] Farmaceutske kompozicije mogu da se primene oralno u bilo kom oralno prihvatljivom doznom obliku uključujući, ali bez ograničenja, kapsule, tablete, emulzije i vodene suspenzije, disperzije i rastvore. U slučaju tableta za oralnu upotrebu, nosači koji se obično koriste uključuju laktozu i kukuruzni skrob. Tipično se dodaju i lubrikansi, poput magnezijum stearata. Za oralnu primenu u obliku kapsula, korisni razblaživači uključuju laktozu i suvi kukuruzni skrob. Kada se vodene suspenzije i/ili emulzije primenjuju oralno, aktivni sastojak može da bude suspendovan ili rastvoren u uljanoj fazi kombinovanoj sa emulgatorima i/ili agensima za suspendovanje. Po želji, mogu da se dodaju odredjeni zasladjivači i/ili agensi za davanje arome i/ili boje.

[0064] Alternativno ili dodatno, farmaceutske kompozicije mogu da se primene pomoću nazalnog aerosola ili inhalacije. Takve kompozicije se pripremaju u skladu sa tehnikama koje su dobro poznate u oblasti farmaceutske formulacije i mogu da se pripreme kao rastvori u fiziološkom rastvoru, uz korišćenje benzil alkohola ili drugih pogodnih konzervanasa, sredstava za podsticanje apsorpcije za poboljšanje bioraspoloživosti, fluoro-ugljenika i/ili drugih agenasa za rastvaranje ili raspršivanje poznatih u stanju tehnike.

[0065] U nekim izvodjenjima, datim pronalaskom predstavljeni su postupci za upotrebu kompozicije koja sadrži žučnu kiselinu (na primer, TUDCA) i fenilbuternu kiselinu (na primer, 4-PBA), uključujući farmaceutske kompozicije, (koje su označene dalje u tekstu kao ’X’) koje su opisane u ovom tekstu u sledećim postupcima: Supstanca X za upotrebu kao leka u lečenju jednog ili više oboljenja ili stanja opisanih u ovom tekstu (na primer, neurodegenerativno oboljenje, koje se navodi u sledećim primerima kao ’Y’). Upotreba supstance X za proizvodnju leka za lečenje Y; i supstance X za upotrebu u lečenju Y.

[0066] U nekim slučajevima, ovde opisane terapijske kompozicije mogu biti formulisane za prodaju u Sjedinjenim Američkim Državama, za uvoz u US, i/ili izvoz iz Sjedinjenih Američkih Država.

[0067] Farmaceutske kompozicije mogu biti sadržane u kontejneru, pakovanju, ili dispenzeru (dozatoru) zajedno sa instrukcijama za primenu.

DOZIRANJE

[0068] U nekim aspektima pronalaska, TUDCA (Tauroursodezoksiholinska kiselina) i PBA (4-fenilbutirat), se primenjuju pojedinačno (tj., kroz odvojene dozne oblike). U nekim izvodjenjima, TUDCA se primenjuje u količini od oko 10mg/po kg telesne težine, oko 15mg/po kg telesne težine, oko 20mg/po kg telesne težine, oko 30mg/ po kg telesne težine, oko 40mg/ po kg telesne težine, ili oko 40mg/ po kg telesne težine. U nekim izvodjenjima, PBA se daje u količini od oko 10mg/ po kg telesne težine, oko 30 mg/kg telesne težine, oko 50 mg/kg telesne težine, oko 100 mg/kg telesne težine, oko 200 mg/kg telesne težine, ili oko 400mg/kg telesne težine. Jedinjenja se mogu davati odvojeno ili zajedno, uključujući deo režima lečenja.

[0069] Pronalaskom je dalje predstavljen režim doziranja, tako da se dozni oblici za TUDCA i/ili PBA daju, odvojeno ili zajedno, kao pojedinačna dnevna doza, na dnevnoj bazi, nedeljno ili na neki drugi način. Nadalje, pacijent može primiti odredjenu dozu tokom nedelje, meseca, ili godina. Na primer, tokom 1 nedelje, 2 nedelje, 3 nedelje, 1 meseca, 2 meseca, 3 meseca, 4 meseca, 5 meseci, 6 meseci, 7 meseci, 8 meseci, 9 meseci, 10 meseci, 11 meseci, 1 godine, 2 godine, 3 godine, 4 godine, 5 godina i slično.

[0070] Prednosti kompozicija iz pronalaska uključuju, (1) manju dozu čvrstog PBA; i (2) manje doze PBA potrebne za dobijanje istog farmakološkog efekta. Stoga, u odredjenim aspektima, ovim pronalaskom predstavljene su kompozicije koje sadrže TUDCA i 4-PBA za upotrebu u poboljšanim postupcima za lečenje neurodegenerativnog oboljenja koje podrazumeva davanje 4-PBA, u kombinaciji sa TUDCA, u smanjenoj dozi u poredjenju sa lečenjem neurodegenerativnog oboljenja sa 4-PBA (na primer, u poredjenju sa standardnom količinom doze za 4-PBA). U nekim izvodjenjima, količina 4-PBA koja se daje u kombinaciji sa TUDCA smanjuje se za oko 10%, oko 15%, oko 20%, oko 25%, oko 30%, oko 40%, oko 45%, ili oko 50% u poredjenju sa doznom količinom koja je korišćena kada se 4-PBA dodaje sama.

Postupci lečenja

[0071] U ovom tekstu opisane su kompozicije koje obuhvataju TUDCA i 4-PBA za upotrebu u postupcima za lečenje poremećaja u vezi sa ćelijskim oksidativnim stresom (na primer, oksidativno oštećenje izazvano reaktivnim kiseoničnim metabolitom) gde je poremećaj neurodegenerativno oboljenje (na primer, Alchajmerova bolest (AD), Huntingtonova bolest (HD), Parkinsonova bolest (PD), Amiotrofična Lateralna Skleroza). Uopšteno, TUDCA i 4-PBA su dati za upotrebu u traženim postupcima koji uključuju davanje subjektu terapijski efikasne količine TUDCA u kombinaciji sa 4- fenilbuternom kiselinom (4-PBA), (na primer, subjektu sisaru, čoveku) kome je potrebno, ili za koga je utvrdjeno da ima potrebu za takvim tretmanom.

[0072] U nekim slučajevima, postupci mogu da uključuju selekciju subjekta koji ima ili je imao odredjeni zdravstveni problem ili bolest. U nekim slučajevima, pogodni subjekti obuhvataju na primer, subjekte koji imaju ili su imali odredjeni zdravstveni problem ili bolest, ali koji su se izlečili od te bolesti ili nekog njenog aspekta, kod kojih su simptomi oboljenja oslabili (na primer, u odnosu na ostale subjekte (odnosno na većinu subjekata) sa istim zdravstvenim problemom ili oboljenjem), i/ili koji sa tim zdravstvenim problemom ili oboljenjem ostaju živi u dužem periodu) na primer, u odnosu na ostale subjekte (odnosno na većinu subjekata) sa istim zdravstvenim problemom ili oboljenjem), na primer, u asimtomatskom stanju (na primer, u odnosu na druge subjekte (odnosno na većinu subjekata) sa istim zdravstvenim problemom ili oboljenjem).

[0073] Ovde opisani postupci mogu se primeniti na širok spektar vrsta, na primer, ljude, primate koji nisu ljudi (na primer, majmune), konje, stoku, svinje, ovce, jelene, losove, koze, pse, mačke, zečeve, zamorce, hrčke, pacove, i miševe.

[0074] Izrazi "lečiti", "lečiti", "lečenje", kada se primenjuju na izolovanu ćeliju, uključuju izlaganje ćelije bilo kojoj vrsti postupka ili stanja ili izvodjenje bilo kakve manipulacije ili postupka na ćeliji. Kada se primenjuje na subjekta, izraz "lečiti" odnosi se na pružanje medicinske ili hirurške pomoći, nege, ili na tretman odredjenog lica. Pojedinac je obično bolestan ili povredjen, ili je pod povećanim rizikom da se razboli u odnosu na prosečnog člana populacije i kome je potrebna takva pažnja, nega ili upravljanje.

[0075] U nekim primerima izvodjenja, pojam "lečiti" i "lečenje" odnosi se na davanje subjektu efikasne količine kompozicije, npr., kompozicije koja sadrži žučnu kiselinu i fenilbuternu kiselinu, tako da kod subjekta dolazi do smanjenja najmanje jednog simptoma bolesti ili poboljšanja bolesti, na primer, dolazi do korisnih ili željenih kliničkih rezultata. U svrhu ovog pronalaska, korisni ili željeni klinički rezultati uključuju, ali nisu ograničeni na, ublažavanje jednog ili više simptoma, smanjivanje obima bolesti, stabilizovanje (tj., izostanak pogoršanja) stanja bolesti, odlaganje ili usporavanje napredovanja bolesti, ublažavanje ili palijaciju bolesnog stanja, i remisiju (delimičnu ili potpunu), kako onu koja može da se otkrije, tako i onu koja ne može da se otkrije. Lečenje može da se odnosi na produžavanje preživljavanja u poredjenju sa očekivanim preživljavanjem kada se tretman ne prima. Prema tome, stručnjak u datoj oblasti shvata da tretman može da dovede do poboljšanja kod stanja bolesti, ali ne mora da predstavlja potpuno izlečenje bolesti. U nekim primerima izvodjenja, tretman može da bude "profilaktički tretman", pri čemu se kompozicija opisana u ovom tekstu (npr., kompozicija koja sadrži žučnu kiselinu i fenilbuternu kiselinu), daje subjektu kod koga postoji rizik od razvoja neurodegenerativne bolesti kao što je ovde opisano. U nekim primerima izvodjenja, tretman je "efikasan" ako se napredovanje bolesti smanji ili zaustavi.

[0076] Pojam "subjekt", kako se ovde koristi, odnosi se na bilo koju životinju. U nekim slučajevima, subjekt je sisar. U nekim slučajevima, pojam "subjekt", kako se ovde koristi, odnosi se na čoveka (npr., muškarca, ženu, ili dete).

[0077] U nekim slučajevima, izbor subjekta može da uključuje uzimanje uzorka od subjekta (npr., kandidata za subjekta) i ispitivanje u uzorku indikacije da je subjekt pogodan da bude izabran. U nekim slučajevima, subjekt može da bude potvrdjen ili identifikovan, npr. od strane zdravstvenog radnika, kao neko koje imao ili ima stanje ili bolest. U nekim slučajevima, ispoljavanje pozitivnog imunog odgovora u odnosu na stanje ili bolest može se izvesti iz podataka o pacijentu, porodične anamneze i/ili otkrivanja indikacija pozitivnog imunološkog odgovora. U nekim slučajevima više strana može da bude uključeno u izbor subjekta. Na primer, prva strana može da uzme uzorak od kandidata za subjekta, a druga strana može da ispita uzorak. U nekim slučajevima, subjekti mogu da budu izabrani i/ili označeni od strane lekara (npr. lekara opšte prakse). U nekim slučajevima, izbor subjekta može da uključuje dobijanje uzorka od odabranog subjekta i čuvanje uzorka i/ili njegovu upotrebu u ovde opisanim postupcima. Uzorci mogu da uključuju, na primer, ćelije ili populacije ćelija.

[0078] U nekim slučajevima, postupci lečenja mogu da uključuju jednu primenu, višestruke primene, i ponovljene primene prema potrebi za sprečavanje ili lečenje bolesti ili stanja od koga subjekt pati. U nekim slučajevima postupci lečenja mogu da uključuju procenu nivoa bolesti kod subjekta pre lečenja, tokom lečenja, i/ili posle lečenja. U nekim slučajevima, lečenje može da se nastavi dok se kod subjekta ne otkrije smanjenje nivoa bolesti.

[0079] Pojmovi "primeniti", "primenjivanje" ili "primena", kako se ovde koriste odnose se na implantiranje, apsorbovanje, gutanje, injektovanje, ili inhaliranje, inventivnog leka, bez obzira na njegov oblik. U nekim slučajevima, jedno ili više ovde opisanih jedinjenja mogu da se primene kod subjekta topikalno (npr., nazalno) i/ili oralno. Na primer, ovde opisani postupci uključuju primenu efikasne količine jedinjenja ili kompozicije jedinjenja za postizanje željenog ili navedenog dejstva. Specifični režimi doziranja i lečenja za svakog konkretnog pacijenta zavisiće od niza faktora, uključujući aktivnost konkretnog jedinjenja koje se koristi, starost, telesnu težinu, status opšteg zdravstvenog stanja, pol, ishranu, vreme primene, brzinu izlučivanja, kombinaciju lekova, ozbiljnost i tok bolesti, stanja ili simptoma, pacijentov odnos prema bolesti, stanju ili simptomima, i procenu nadležnog lekara.

[0080] Posle primene, subjekt može da bude podvrgnut proceni kako bi se otkrio, procenio ili utvrdio nivo njegove bolesti. U nekim slučajevima, lečenje može da se nastavi dok se ne otkrije promena (npr., smanjenje) nivoa bolesti kod subjekta.

[0081] Nakon poboljšanja pacijentovog stanja (npr., promene (npr., smanjenja) nivoa bolesti kod subjekta), može da se primenjuje doza održavanja jedinjenja, kompozicije ili kombinacije prema ovom pronalasku, ako je neophodno. Zatim, doza ili učestalost primene, ili oba, mogu da se smanje, u odnosu na simptome, do nivoa pri kome se poboljšano stanje održava. Pacijentima može, medjutim, da bude potrebno dugoročno periodično lečenje nakon bilo kakvog recidiva simptoma bolesti.

PRIMERI

[0082] Pronalazak je dodatno opisan u primerima koji slede.

Materijali i metode:

[0083] Jedinjenja su ispitivana u modelu izlaganja neuronskih ćelija peroksidu u laboratorijama finske kompanije Charles River Discovery Research Services, kao što je ovde opisano.

[0084] Mešane kortikalne kulture pripremljene su od embriona pacova E18 Wistar (Laboratory Animal Center, Kuopio, Finska). Korteksi su disekovani i tkivo je isečeno na male komade. Ćelije su razdvojene 15-minutnom inkubacijom sa enzimima DNase i papain. Ćelije su sakupljene centrifugiranjem (1500 rpm, 5 min). Tkivo je usitnjeno pipetom i ćelije su zasejane (3x10<5>ćelija/cm<2>) na ploče sa 48 bunarčića obložene poli-L-lizinom u medijumu MEM obogaćenom sa 2 g/l glukoze, 2 mM glutamina, 0,1 µg/ml gentamicina, i 10% toplotom inaktivisanog konjskog seruma (HS-HI) i toplotom inaktivisanog govedjeg seruma (FBS-HI). Posle tri dana in vitro, medijum koji sadrži MEM sa dodacima i 5 % oba seruma dodat je ćelijama umesto prethodnog. Posle 6 dana kultivacije in vitro, neželjena deoba ćelija inhibirana je dodavanjem citozin arabinozida (10 µM finalne koncentracije) tokom 24 h. U kulture je ponovo dodat svež MEM sa dodacima i 5 % HS-HI pre sprovodjenja eksperimenata.

[0085] Za eksperiment su odabrani bunarčići koji su bili u dobrom stanju 10. dana kultivacije in vitro. Ispitivana jedinjenja razblažena su u MEM sa dodacima i 5 % HS-HI.24 h kasnije, 300 µM NMDA tokom 24 h upotrebljeno je kao kontrola za ukupnu neuronsku smrt, a H2O2tokom 1 h upotrebljen je za indukciju približno 30-60% ćelijske smrti. DFX (100 µM) upotrebljen je kao potencijalna pozitivna kontrola za inhibiciju ćelijske smrti indukovane sa H2O2. Bunarčići tretirani samo medijumom služili su kao 0. kontrola.

Ispitivana jedinjenja su pipetom naneta na ćelije 24 h pre dodavanja H2O2. Posle 60 min, medijum je uklonjen i medijum koji sadrži jedinjenja nanet je pipetom u bunarčiće na 24 h.

[0086] Posle 24 h sakupljeni su medijumi za kulturu iz svih bunarčića i mogući ćelijski debris je uklonjen centrifugiranjem (13000 rpm, 3 min). Alikvoti od 100 µl su pipetom dodati u mikrotitarsku ploču kao duplikati, i jednaka količina reagensa LDH je pipetom dodata u bunarčiće. Apsorbancija na 340 nm je odmah izmerena upotrebom protokola 3-min kinetičkog merenja na ELISA čitaču Multiskan Ascent (Thermo, Finska). Odredjena je promena apsorbancije/min, koja je direktno proporcionalna oslobođenom LDH (=ćelijska smrt).

[0087] Posle sakupljanja medijuma za kulturu ćelija za merenje LDH, 100 µl rastvora PrestoBlue (razblaženje 1:10 reagensa PrestoBlue (Invitrogen, #A13261, lot 915815C) u medijumu za kulturu) dodato je u bunarčiće za inkubaciju tokom 1 h na 37°C u CO2inkubatoru. Fluorescencija pri ekscitaciji na 560 nm/emisiji na 615 nm izmerena je upotrebom čitača Victor fluororeader (PerkinElmer).

[0088] Broj bunarčića po upotrebljenoj koncentraciji jedinjenja bio je 6 (n=6). Ispitivane su jedna (1) koncentracija od 100 µM TUDCA i 1 mM 4-PBA posebno i zajedno. Statistička analiza uradjena je pomoću programa Microsoft excel. Vrednosti su analizirane dvostranim t-testovima sa jednakom varijansom poredjenjem svih uslova sa svim drugim uslovima.

Primer 1

[0089] Pronalazači su ispitivali TUDCA i 4-PBA u kombinaciji u modelu izlaganja neuronskih ćelija peroksidu da bi ispitali kakva dejstva oni mogu da imaju pri zajedničkom delovanju. Model izlaganja neuronskih ćelija peroksidu izabran je zbog svoje korelacije sa oksidativnim stresom i patologijom različitih neurodegenerativnih bolesti. U ovoj studiji, pronalazači su procenjivali efikasnost na bazi ćelijske vijabilnosti i ćelijske smrti.

[0090] Upotreba TUDCA i 4-PBA, u kombinaciji, rezultovala je u 90.4% ćelijske vijabilnosti, što je statistički značajno poboljšanje u odnosu na vijabilnost kontrolnih ćelija od 48.6% (p < .003). (SL.1, Tabela 1) Pojedinačni tretmani sa TUDCA i 4-PBA rezultovali su ćelijskom vijabilnošću od 59% odnosno 72%, što nije statistički značajno u odnosu na kontrolu (p < .414 odnosno p < .071) (SL.1, Tabela 1). Kombinacija prema tome dovodi do povećanja efikasnosti od 24% u odnosu na zbir efikasnosti tretmana pojedinačnim lekom. NMDA pri 300 uM je upotrebljen kao negativna kontrola i rezultovao je u oko 0% ćelijske vijabilnosti. DFX je dao pogrešan rezultat od oko 11% manje ćelijske vijabilnosti nego stanje izloženosti peroksidu. Ovaj rezultat je verovatno dobijen zbog interferencije DFX sa modalitetom merenja PrestoBlue, tako da je ovaj rezultat isključen. Efikasnost je izračunata kao apsolutna razlika srednje vrednosti vijabilnosti i srednje vrednosti vijabilnosti kontrole.

[0091] Povratak gotovo na nivo kontrole koji obezbedjuje kombinacija molekula kao što se može videti u PrestoBlue studiji je zaista iznenadjujući i ističe potencijal ove kombinacije kao terapije za bolesti povezane sa toksičnošću peroksida. Kombinacija je poboljšala vijabilnost i smanjila ćelijsku smrt više od zbira korisnih dejstava koje daje svako jedinjenje pojedinačno.

Tabela 1. Ćelijska vijabilnost procenjena pomoću reagensa PrestoBlue nakon izlaganja delovanju H2O2

[0092] Upotreba TUDCA i 4-PBA, u kombinaciji, rezultovala je u 31.5% procenata ćelijske smrti, što je statistički značajno poboljšanje u odnosu na procenat ćelijske smrti kontrolnih ćelija od 62.5% (p < .021) (SL. 2) Pojedinačni tretmani sa TUDCA i 4-PBA rezultovali su u procentom ćelijske smrti od 60.4% odnosno 46.5%, što nije statistički značajno drugačije od kontrole (p<.808 odnosno p<.162). (SL. 2) Kombinacija, prema tome, dovodi do povećanja efikasnosti od 71% u odnosu na zbir efikasnosti tretmana pojedinačnim lekom. DFX i NMDA su upotrebljeni kao pozitivna, odnosno negativna kontrola i rezultovali su u 38.5% odnosno 100% ćelijske smrti. Efikasnost je izračunata kao apsolutna razlika srednje vrednosti vijabilnosti i srednje vrednosti vijabilnosti kontrole.

[0093] Ovi iznenadjujući i sinergistički rezultati sugerišu da kombinacija TUDCA i 4-PBA može da bude novi, efikasan, i snažan tretman za oksidativno oštećenje izazvano reaktivnim kiseoničnim metabolitima, čime se snižava oksidativni stres neurona, i za lečenje najmanje jednog simptoma udruženog sa bolešću povezanom sa oksidativnim stresom, sprečavanje početka, ili usporavanje razvoja bolesti povezane sa oksidativnim stresom.

Tabela 2. Ćelijska smrt procenjena pomoću LDH nakon izlaganja delovanju H2O2

DRUGI PRIMERI IZVODJENJA

[0094] Treba razumeti da, iako je pronalazak opisan zajedno sa njegovim detaljnim opisom, prethodni opis ima za cilj da ilustruje, a ne da ograniči obim pronalaska, koji je definisan obimom priloženih patentnih zahteva.

Claims (16)

PATENTNI ZAHTEVI

1. Kompozicija koja obuhvata efikasnu količinu tauroursodezoksiholinske kiseline (TUDCA) ili njenu farmaceutski prihvatljivu so, i efikasnu količinu 4-fenilbuterne kiseline (4-PBA) ili njenu farmaceutski prihvatljivu so, za upotrebu u postupku lečenja subjekta koji ima oboljenje ili je u riziku od neurodegenerativnog oboljenja.

2. Kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, što su TUDCA i 4-PBA u kompoziciji prisutni u efikasnoj količini da bi se smanjilo oksidativno oštećenje izazvano reaktivnim kiseoničnim metabolitom unutar ćelije subjekta.

3. Kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 2, što je količina 4-PBA smanjena za 10% do 50% u poredjenju sa kompozicijom koja obuhvata efikasnu količinu 4-PBA koja ne sadrži TUDCA.

4. Kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, što je subjekt identifikovan kao da ima najmanje jednu kopiju APOEε4 alela.

5. Kompozicija za upotrebu prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 4, što se TUDCA i 4-PBA primenjuju odvojeno.

6. Kompozicija za upotrebu prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 4, što se TUDCA i 4-PBA primenjuju zajedno.

7. Postupak smanjenja oksidativnog oštećenja izazvanog reaktivnim kiseoničnim metabolitom unutar ćelije ex vivo, gde postupak obuhvata kontakt ćelije sa tauroursodezoksiholinskom kiselinom (TUDCA) ili njenom farmaceutski prihvatljivom soli i 4-fenilbuternom kiselinom (4-PBA) ili njenom farmaceutski prihvatljivom soli.

8. Postupak prema patentnom zahtevu 7, što je ćelija u kontaktu sa TUDCA u koncentraciji od oko 80 μM do oko 120 μM; i/ili, gde je ćelija u kontaktu sa 4-PBA u koncentraciji od oko 0.8 mM do oko 1.2 mM.

9. Postupak prema patentnim zahtevima 7 ili 8, što:

a) ćelija predstavlja ćeliju sisara;

b) ćelija predstavlja ljudsku ćeliju; ili

c) je ćelija neuron.

10. Tauroursodezoksiholinska kiselina (TUDCA) ili njena farmaceutski prihvatljiva so i 4-fenilbuterna kiselina (4-PBA) ili njena farmaceutski prihvatljiva so za upotrebu u postupku lečenja neurodegenerativnog oboljenja u vezi sa oksidativnim oštećenjem izazvanim reaktivnim kiseoničnim metabolitom kod subjekta, gde postupak obuhvata identifikaciju subjekta koji ima neurodegenerativno oboljenje u vezi sa oksidativnim oštećenjem izazvanim reaktivnim kiseoničnim metabolitom;

gde se pomenutom subjektu daje TUDCA ili njena farmaceutski prihvatljiva so i 4-PBA ili farmaceutski prihvatljiva so, pri čemu se količina 4-PBA koja se primenjuje u kombinaciji sa TUDCA smanjuje za 10% do 50% u poredjenju sa time kada se daje samo 4-PBA.

11. Tauroursodezoksiholinska kiselina (TUDCA) ili njena farmaceutski prihvatljiva so za upotrebu u postupku lečenja neurodegenerativnog oboljenja u vezi sa oksidativnim oštećenjem izazvanim reaktivnim kiseoničnim metabolitom kod subjekta, što postupak obuhvata identifikaciju subjekta koji ima neurodegenerativno oboljenje u vezi sa oksidativnim oštećenjem izazvanim reaktivnim kiseoničnim metabolitom; davanje datom subjektu TUDCA ili njene farmaceutski prihvatljive soli i 4-PBA ili njene farmaceutski prihvatljive soli, gde se količina 4-PBA koja se primenjuje u kombinaciji sa TUDCA smanjuje za 10% do 50% u poredjenju sa time kada se daje samo 4-PBA.

12. 4-fenilbuterna kiselina (4-PBA) ili njena farmaceutski prihvatljiva so za upotrebu u postupku lečenja neurodegenerativnog oboljenja kod subjekta povezanog sa oksidativnim oštećenjem izazvanim reaktivnim kiseoničnim metabolitom, gde postupak obuhvata identifikaciju subjekta koji ima neurodegenerativno oboljenje u vezi sa oksidativnim oštećenjem izazvanim reaktivnim kiseoničnim metabolitom; davanje datom subjektu TUDCA ili njene farmaceutski prihvatljive soli i 4-PBA ili njene farmaceutski prihvatljive soli, gde se količina 4-PBA koja se primenjuje u kombinaciji sa TUDCA smanjuje za 10% do 50% u poredjenju sa time kada se daje samo 4-PBA.

13. TUDCA ili njena farmaceutski prihvatljiva so i 4-PBA ili njena farmaceutski prihvatljiva so za upotrebu prema patentnom zahtevu 10, TUDCA ili njena farmaceutski prihvatljiva so za upotrebu prema patentnom zahtevu 11, ili 4-PBA ili njena farmaceutski prihvatljiva so za upotrebu prema patentnom zahtevu 12, što se TUDCA i 4-PBA pojedinačno daju u odvojenim doznim oblicima; i po slobodnom izboru, pri čemu se dozni oblici za TUDCA i/ili 4-PBA daju odvojeno ili zajedno, kao pojedinačna dnevna doza, na dnevnoj ili nedeljnoj bazi.

14. Kompozicija za upotrebu prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 6, TUDCA ili njena farmaceutski prihvatljiva so i 4-PBA ili njena farmaceutski prihvatljiva so za upotrebu prema patentnim zahtevima 10 ili 13, TUDCA ili njena farmaceutski prihvatljiva so za upotrebu prema patentnim zahtevima 11 ili 13, ili 4-PBA ili njena farmaceutski prihvatljiva so za upotrebu prema patentnim zahtevima 12 ili 13, gde se TUDCA primenjuje u količini od oko 10mg/po kg telesne težine, oko 15mg/po kg telesne težine, oko 20mg/po kg telesne težine, oko 30mg/ po kg telesne težine, ili oko 40mg/ po kg telesne težine i gde se 4-PBA daje u količini od oko 10mg/ po kg telesne težine, oko 30 mg/kg telesne težine, oko 50 mg/kg telesne težine, oko 100 mg/kg telesne težine, oko 200 mg/kg telesne težine, ili oko 400mg/kg telesne težine.

15. Kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, TUDCA ili njena farmaceutski prihvatljiva so i 4-PBA ili njena farmaceutski prihvatljiva so za upotrebu prema bilo kojem od patentnih zahteva 10 i 13 do 14, TUDCA ili njena farmaceutski prihvatljiva so za upotrebu prema bilo kojem od patentnih zahteva 11 i 13 do 14, ili 4-PBA ili njena farmaceutski prihvatljiva so za upotrebu prema bilo kojem od patentnih zahteva od 12 do 14, što je neurodegenerativno oboljenje odabrano iz grupe koju čine Alchajmerova bolest, Hantingtonova bolest, Parkinsonova bolest, amiotrofična lateralna skleroza, Pikova bolest (Pikova demencija), multi-infarktna demencija, Creutzfeldt-Jakobova bolest, demencija sa Levijevim telima, mešana demencija, i frontotemporalna demencija.

16. Kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, TUDCA ili njena farmaceutski prihvatljiva so i 4-PBA ili njena farmaceutski prihvatljiva so za upotrebu prema bilo kojem od patentnih zahteva 10 i 13 do 15, TUDCA ili njena farmaceutski prihvatljiva so za upotrebu prema bilo kojem od patentnih zahteva 11 i 13 do 15, ili 4-PBA ili njena farmaceutski prihvatljiva so za upotrebu prema bio kojem od patentnih zahteva 12 do 15, pri čemu je subjekt životinja, sisar ili čovek.