RS60636B1 - Inhibitorni peptidi poreklom od trem-sličnog transkripta 1 (tlt-1) i njihove upotrebe - Google Patents

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA:

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na polipeptidne fragmente dobijene od proteina TLT- 1 i njihove upotrebe za lečenje zapaljenskih stanja i naročito za lečenje sepse.

OSNOV PRONALASKA:

[0002] Septični šok, kompleksni klinički sindrom koji nastaje usled škodljivog i oštećujućeg odgovora domaćina na infekciju, predstavlja vodeći uzrok smrtnosti u jedinicama intenzivne nege. Sepsa se razvija kada se izgubi regulacija inicijalnog odgovora domaćina na sistemsku infekciju ili kada dođe do njenog prekomernog pojačanja sa tesnom međusobnom povezanošću između zapaljenja i koagulacije. Među kandidatima koji deluju kao pojačavači urođenog imunog odgovora, neki pripadaju familiji aktivirajućih receptora eksprimiranih na mijeloidnim ćelijama (TREM) [Bouchon, A., et al., 2000; Bleharski, J.R. et al., 2003; Haselmayer, P., et al., 2007; Gibot, S. et al., 2007]. Humani klaster TREM gena smešten je na hromozomu 6p21.1 i kodira šest različitih proteina, TREM 1-5 i TLT-1 (TREM-slični transkript-1). Humani TREM-1 (hTREM-1) sastoji se od vanćelijskog regiona od 194 amino kiselinska (aa) ostatka, membranskog regiona od 29 ak i kratkog citoplazmatskog repa od 5 ak. Vanćelijski Ig-sličan domen sadrži motiv DxGxYxC koji odgovara Ig domenu V-tipa. Ig domen je povezan sa transmembranskim regionom preko dela od 60 ak koji sadrži tri N-glikozilaciona mesta. Membranski region sadrži Lys ostatak koji obrazuje soni most sa Asp ostatkom transmembranskog domena DAP 12 proteina koji sadrži ITAM, što omogućuje povezivanje između TREM-1 i njegovog adaptorskog proteina [Bouchon, A., et al., 2000; Kelker, M.S., et AL, 2004; Kelker, M.S. et al., 2004]. Angažovanje TREM proteina aktivira signalni put koji uključuje ZAP70 i SYK i sledstveno regrutovanje i fosforilaciju tirozina u adaptorskim molekulima kao što je GRB2, aktivacija PI3K, PLC-y, ERK-1,2 and p38 MAPK [Haselmayer, P. et al., 2009; Gibot, S, 2005]. Aktivacija ovih puteva koja na kraju dovodi do aktivacije transkripcionog faktora NF-kB regulisana je putem CARD9-BCL10-MALT1 [Hara, H. et al., 2007]. Treba napomenuti da, premda kristalografske analize mogu da predvide prepoznavanje TREM-1 upotrebom petlji za prepoznavanje antitelo-ekvivalentnih regiona koji određuju komplementarnost (CDR) (kao što su TCR, CD8 i CTLA-4), ostaje da se utvrdi koji su njegovi prirodni ligandi.

[0003] Eksperimenti blokiranja u kojima se koristi a TREM-1 fuzioni protein ili peptidi dizajniran prema CDR3 i “F” lancu vanćelijskog domena TREM-1, pokazali su smanjeno zapaljenje koje je dovelo do poboljšanog preživljavanja u mišijim modelima endotoksemije i polimikrobne sepse [Bouchon, A., et al., 2001; Gibot, S. et al., 2006].

[0004] Zaštitni efekti modulisanja TREM-1 signala takođe su očigledni i kod drugih modela akutnog (ishemija-reperfuzija, pankreatitis, hemoragijski šok) ili hroničnog zapaljenja (zapaljenska bolest creva, zapaljenski artritis). Sve ove studije ukazuju na ulogu TREM-1 u pojačavanju infektivnog ili sterilnog zapaljenja.

[0005] Osim TREM-1, klaster TREM gena uključuje TREM-sličan transkript 1 (TLT-1). TLT-1 je obilno, isključivo, eksprimiran na krvnim pločicama i megakariocitima, i sekvestrira se u α granulama krvnih pločica. Nakon aktivacije krvnih pločica, TLT-1 se translocira na njihovu površinu [Washington, A.V. et al., 2004]. TLT-1 sadrži v-set vanćelijski domen Ig tipa, transmembranski region i citoplazmatski rep koji sadrži imunoreceptorski inhibitorni motiv na bazi tirozina (ITIM) i domen bogat poliprolinom. Za razliku od drugih članova TREM familije, TLT-1 se ne kupluje sa DAP 12 aktivirajućim lance, dok je, međitim, pokazano da pojačava signalizaciju Ca++ u ćelijama bazofilne leukemije (RBL) kod pacova, što ukazuje da TLT-1 predstavlja ko-aktivirajući receptor [Barrow, AD. et al., 2004].

[0006] Specifičnost TLT-1 ekspresije na krvnim pločicama ukazuje na to da bi on trebalo da igra jedinstvenu ulogu u hemostazi i/ili trombozi. Zapravo, sugerisano je da modulacija TLT-1 može da ima nekoliko različitih potencijala u modulisanju funkcije krvnih pločica, sprečavajući time zapaljensku hiperkoagulaciju (ali ne direktno zapaljenje) ili poremećaj u vezi sa krvnim pločicama (npr. poremećaj krvarenja ili koagulacije) [Washington AV. et al., 2009]. Ova modulacija može da bude posredovana na direktan (interferencijom sa TLT-1-ligandom) ili indirektan način (modulacijom intracelularnog TLT-1 puta). Washington AV. et al., 2009 dalje sugerišu da TLT-1 može maksimalno da smanji oštećenje krvnih sudova i da poveća agregaciju krvnih pločica na mestu povrede krvnog suda, sprečavajući na taj način krvarenje. U publikaciji Washington AV. et al., 2009 takođe se pokazuje da peptid LR17 blokira ovu poboljšanu agregaciju usled delovanja TLT-1.

[0007] Pronalazači u ovom dokumantu po prvi put objavljuju da TLT-1 i peptidi dobijeni od TLT-1 prikazuju anti-zapaljenska svojstva time što specifično inhibiraju TREM-1 aktivnost. Ovi peptidi su u stanju da priguše TREM-1 signalizaciju i time se ponašaju kao prirodni inhibitori TREM-1. Oni dalje pokazuju da isti peptidi, kao posledica inhibicije TREM-1 i njegovog intracelularnog puta, takođe modulišu in vivo prozapaljensku kaskadu aktiviranu infekcijom, inhibirajući na taj način hiper-responsivnost u vezi sa TREM-1 i posledična oštećenja organa i smrt tokom sepse.

SAŽETAK PRONALASKA:

[0008] Pronalazak se zasniva na otkriću da su TLT-1 i peptidi poreklom od TLT-1 sposobni da specifično inhibiraju TREM-1.

[0009] Pronalazači su po prvi put pokazali da su humani TLT-1 (hTLT-1) i peptidi poreklom od hTLT-1 sposobni da specifično prepoznaju i vežu se za humani TREM-1 ligand.

[0010] Pronalazači su takođe pokazali da, kao rezultat vezivanja hTLT-1 i peptida poreklom od hTLT-1 koji se vezuju za hTREM-1 ligand, hTLT-1 i peptidi poreklom od hTLT-1 mogu da smanje in vitro i in vivo hTREM-1-indukovanu aktivaciju ćelija koje eksprimiraju humani TREM-1, što se karakteriše modulacijom unutarćelijske signalizacije (fosforilacioni putevi), formiranjem kompleksa CARD9-MALT1-BCL10, aktivacijom NF-KB (nuklearna translokacija), proizvodnjom ROS (reaktivne kiseonične vrste) i ekspresijom (mRNA) i sekrecijom (protein) citokina/hemokina.

[0011] Pronalazači su takođe pokazali da peptidi poreklom od TLT-1 mogu da leče poremećaje povezane sa TREM-1, tj. bolesti kod kojih aktivacija TREM-1 ima ulogu u fiziopatološkom procesu, poput akutnih zapaljenskih poremećaja (sepsa, teška sepsa ili septički šok, hemoragijski šok, ishemija-reperfuzija, pankreatitis) ili hroničnih inflamatornih poremećaja (upalne bolesti creva, reumatske bolesti, kancer).

[0012] Prema tome, pronalazak se odnosi na polipeptid od 6 do 16 amino kiselina koji sadrži najmanje 6 uzastopnih aminokiselina iz amino kiselinske sekvence SEK ID NO: 4 za upotrebu u lečenju upalnog stanja, pri čemu navedeni polipeptid sadrži amino kiselinsku sekvencu kao što je prikazano u SEK ID NO: 8.

[0013] U jednom primeru izvođenja, polipeptid za upotrebu u predmetnom pronalasku sadrži amino kiselinsku sekvencu kao što je prikazano u SEK ID NO: 9.

[0014] U jednom primeru izvođenja, polipeptid za upotrebu u predmetnom pronalasku sastoji se od amino kiselinske sekvence kao što je prikazano u SEK ID NO: 9.

[0015] U jednom primeru izvođenja, polipeptid za upotrebu u predmetnom pronalasku sastoji se od amino kiselinske sekvence kao što je prikazano u SEQ ID NO: 8.

[0016] Predmetni pronalazak se dodatno odnosi na polipeptid od 6 do 16 amino kiselina koji se sastoji od amino kiselinske sekvence kao što je prikazano u SEQ ID NO: 8 ili koji sadrži amino kiselinsku sekvencu kao što je prikazano u SEQ ID NO: 9.

[0017] U jednom primeru izvođenja, polipeptid prema pronalasku sastoji se od amino kiselinske sekvence kao što je prikazano u SEQ ID NO: 9.

[0018] U jednom primeru izvođenja, polipeptid prema pronalasku sastoji se od amino kiselinske sekvence kao što je prikazano u SEQ ID NO: 8.

[0019] Predmetni pronalazak se dodatno odnosi na izolovanu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira polipeptid kao što je opisano prethodno u ovom dokumentu.

[0020] Predmetni pronalazak se dodatno odnosi na plazmid koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline kao što je opisana prethodno u ovom dokumentu.

[0021] Predmetni pronalazak se dodatno odnosi na ekspresioni vektor koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline kao što je opisano prethodno u ovom dokumentu.

[0022] U jednom primeru izvođenja, zapaljensko stanje je sepsa, teška sepsa, septični šok, hemoragijski šok, ishemija-reperfuzija ili pankreatitis.

[0023] U jednom primeru izvođenja, zapaljensko stanje je sepsa.

[0024] Predmetni pronalazak se dodatno odnosi na farmaceutsku kompoziciju za upotrebu u lečenju zapaljenskog stanja, pri čemu navedena farmaceutska kompozicija sadrži terapeutski efikasnu količinu najmanje jednog polipeptida kao što je opisano prethodno u ovom dokumentu zajedno sa najmanje jednim farmaceutski prihvatljivim ekscipijensom.

[0025] Predmetni pronalazak se dodatno odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži najmanje jedan polipeptid kao što je opisano prethodno u ovom dokumentu, ili nukleinsku kiselinu kao što je opisano prethodno u ovom dokumentu, ili plazmid kao što je opisano prethodno u ovom dokumentu, ili ekspresioni vektor kao što je opisano prethodno u ovom dokumentu, zajedno sa najmanje jednim farmaceutski prihvatljivim ekscipijensom.

[0026] Predmetni pronalazak se dodatno odnosi na farmaceutsku kompoziciju za upotrebu u lečenju zapaljenskog stanja, pri čemu navedena farmaceutska kompozicija sadrži terapeutski efikasnu količinu najmanje jednog polipeptida od 6 do 16 amino kiselina koji sadrži najmanje 6 konsekutivnih amino kiselina iz amino kiselinske sevence SEQ ID NO: 4, pri čemu navedeni polipeptid sadrži amino kiselinsku sekvencu kako je navedeno u SEQ ID NO: 8, zajedno sa najmanje jednim farmaceutski prihvatljivim ekscipijensom.

DETALJAN OPIS PRONALASKA:

Definicije:

[0027] U specifikaciji se koristi nekoliko izraza i oni su definisani u sledećim paragrafima.

[0028] Kako se ovde koristi, izraz “TREM-1”, skraćeno od "aktivirajući receptor eksprimiran na mijeloidnim ćelijama 1" označava molekul ćelijske površine koji je identifikovan i na humanim i mišijim polimorfonuklearnim neutrofilima i zrelim monocitima. Pripada imunoglobulinskoj superfamiliji i aktivira nishodne signalne puteve uz pomoć adaptorskog proteina označenog kao DAP12. Ekspresija TREM-1 je snažno pojačana na neutrofilima i monocitima u prisustvu bakterija kao što su Pseudomonas aeruginosa ili Staphylococcus aureus, i u ćelijskoj kulturi, i u uzorcima tkiva uzetim od pacijenata sa infekcijom. Nasuprot tome, ekspresija TREM-1 nije pojačana u uzorcima uzetim od pacijenata sa neinfektivnim zapaljenskim oboljenjima kao što su psorijaza, ulcerozni kolitis ili vaskulitis izazvan imunskim kompleksima. Osim toga, kada je TREM-1 vezan za ligand, zapaža se sinergističko dejstvo LPS i pojačana sinteza prozapaljenskih citokina kao što je TNF-[alfa] zajedno sa inhibicijom proizvodnje IL-10.

[0029] Kako se koristi u ovom dokumentu, izraz “TLT-1” za “TREM-sličan transkript 1" označava člana TREM familije. Inicijalni rad Mekvikar grupe [Washington A.V. et al., 2004] pokazao je da je TLT-1 obilno zastupljen, specifičan za krvne pločice i megakariocitnu liniju, i sekvestrira se u α granulama krvnih pločica. Nakon aktivacije krvnih pločica pomoću trombina ili LPS, TLT- 1 se translocira na površinu krvnih pločica. TLT-1 sadrži sadrži v-set vanćelijski domen Ig tipa, transmembranski region i citoplazmatski rep koji sadrži imunoreceptorski inhibitorni motiv na bazi tirozina (ITIM) i domen bogat poliprolinom. Za razliku od drugih članova TREM familije, TLT-1 se ne kupluje sa DAP 12 aktivirajućim lancem dok je, međutim, pokazano da pojačava signaliziranje putem Ca<++>u ćelijama bazofilne leukemije (RBL) kod pacova, što ukazuje da TLT-1 predstavlja ko-aktivirajući receptor. Amino kiselinska sekvenca TLT-1 opisana je kao aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO 1.

[0030] Polipeptidi dobijeni od TLT-1 opisani su u tabeli 1 koja sledi.

Tabela 1: Polipeptidi dobijeni od TLT-1

[0031] Kako se ovde koristi, izraz “funkcionalno-konzervativne varijante” označava peptide poreklom od peptida prema pronalasku u kome je data aminokiselinska rezidua u proteinu ili enzimu izmenjena bez menjanja ukupne konformacije i funkcije peptida, uključujući, ali bez ograničenja, zamenu aminokiseline onom sa sličnim svojstvima (kao što je, na primer, polarnost, potencijal vezanja vodonika, kiselost, baznost, hidrofobnost, aromatičnost, i slično). Aminokiseline osim onih koje su označene kao konzervativne, mogu da se razlikuju u proteinu tako da procenat sličnosti proteinske ili aminokiselinske sekvence između bilo koja dva proteina slične funkcije može da varira i može da bude, na primer, od 70% do 99% određeno postupkom za poravnanje kao što je Metoda klastera, u kojoj se sličnost zasniva na algoritmu MEGALIGN. “Funkcionalno-konzervativna varijanta” takođe uključuje peptid koji ima najmanje 20% aminokiselinske identičnosti određeno pomoću algoritama BLAST ili FASTA, poželjno 40% poželjnije 60%, poželjno najmanje 75%, najpoželjnije najmanje 85%, i još poželjnije najmanje 90%, i koji ima ista ili suštinski ista svojstva ili funkcije kao nativni ili roditeljski protein sa kojim se poredi.

[0032] Kako se ovde koristi, izraz “derivat” se odnosi na varijaciju polipeptida prema pronalasku ili njegove funkcionalno-konzervativne varijante koja je drugačije modifikovana, tj. kovalentnim vezivanjem bilo kog tipa molekula za polipeptid, dodavanjem hemijskog jedinjenja u bilo kojoj od aminokiselina sekvence, u cilju modifikovanja in vitro ili in vivo konformacije, aktivnosti, specifičnosti, efikasnosti ili stabilnosti polipeptida.

[0033] Kako se ovde koristi, izrazi “lečiti” ili “lečenje”, označavaju reverziju, ublažavanje, inhibiciju napredovanja, ili prevenciju poremećaja ili stanja na koje se takav izraz primenjuje, ili jednog ili više simptoma takvog poremećaja ili stanja.

[0034] Prema pronalasku izrazi “farmaceutski” ili “farmaceutski prihvatljiv” označavaju entitete i kompozicije koji ne proizvode štetne, alergijske ili druge neželjene reakcije kada se primene kod sisara, posebno čoveka, ako je prikladno. Farmaceutski prihvatljiv nosač ili ekscipijens odnosi se na netoksični čvrsti, polu-čvrsti ili tečni punilac, razblaživač, materijal za inkapsulaciju ili pomoćno sredstvo za formulaciju bilo kog tipa.

[0035] Prema pronalasku, izraz “pacijent” ili “subjekt” koga treba lečiti, odnosi se na čoveka ili sisara koji nije čovek (kao što je glodar (miš, pacov), mačka, pas, ili primat) koji je pogođen ili je verovatno da će biti pogođen zapaljenskim poremećajima. Poželjno, subjekt je čovek.

Polipeptidi i njihove upotrebe:

[0036] Prvi aspekt predmetnog prikaza odnosi se na polipeptid koji sadrži najmanje 6 uzastopnih aminokiselina iz amino kiselinske sekvence SEK ID NO 4 i varijantu sa konzervativnom funkcijom.

[0037] U poželjnom primeru izvođenja, polipeptid prema prikazu ima dužinu od 6 do 20 aminokiselina, ili 10 do 20 aminokiselina, ili 12 do 18 aminokiselina ili 14 do 16 aminokiselina.

[0038] U drugom primeru izvođenja, polipeptid prema prikazu sadrži sekvencu od 6 uzastopnih amino kiselinska iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 ili SEQ ID NO: 8.

[0039] U drugom poželjnom primeru izvođenja, polipeptid prema prikazu sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazano u SEQ ID NO: 9.

[0040] U drugom poželjnom primeru izvođenja, polipeptid prema prikazu sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazano u SEQ ID NO: 4.

[0041] U drugom primeru izvođenja, polipeptid prema prikazu može da ima D- ili L-konfiguraciju.

[0042] U drugom primeru izvođenja, aminokiselina na amino-kraju polipeptida prema prikazu ima acetilovanu terminalnu amino grupu, a aminokiselina na karboksilnom kraju ima amidovanu terminalnu karboksilnu grupu. Prema tome, pronalazak takođe uključuje derivate peptida prema pronalasku u kojima je amino-terminalni kraj acetilovan ili u kojima je karboksi-terminalni kraj amidovan.

[0043] Pored toga, polipeptidi prema prikazu mogu da podležu reverzibilnim hemijskim modifikacijama u cilju povećanja njihove bioraspoloživosti (uključujući stabilnost i rastvorljivost u mastima) i njihovu sposobnost da prodru kroz krvno-moždanu barijeru i epitelno tkivo. Primeri takvih reverzibilnih hemijskih modifikacija uključuju esterifikaciju karboksi-grupa glutaminskih i asparaginskih aminokiselina alkoholom, čime se uklanja negativno naelektrisanje aminokiseline i povećava njena hidrofobnost. Ova esterifikacija je reverzibilna, jer formiranu estarsku vezu prepoznaju intracelularne esteraze koje je hidrolizuju, ponovo uspostavljajući naelektrisanje na asparaginskim i glutaminskim reziduama. Neto efekat je nagomilavanje intracelularnog peptida, jer internalizovani, deesterifikovani peptid ne može da prođe kroz ćelijsku membranu.

[0044] Još jedan primer takvih reverzibilnih hemijskih modifikacija uključuje dodavanje dodatne peptidne sekvence, koja omogućava povećanje membranske permeabilnosti, kao što je peptid TAT ili peptid Penetratin (videti - Charge-Dependent Translocation of the Trojan. A Molecular View on the Interaction of the Trojan Peptide Penetratin with the 15 Polar Interface of Lipid Bilayers. Biophysical Journal, Volume 87, Issue 1, 1 July 2004, Pages 332-343).

[0045] Peptidi prema pronalasku mogu da se dobiju uobičajenim postupcima hemijske sinteze peptida na čvrstoj fazi, praćenjem metodologije Fmoc i/ili metodologije na bazi Boc 20 (videti Pennington, M.W. i Dunn, B.N. (1994). Peptide synthesis protocols. Humana Press, Totowa.).

[0046] Alternativno, polipeptid prema pronalasku može da se dobije uobičajenim postupcima na bazi tehnologije rekombinantne DNK, npr., postupkom koji, ukratko, uključuje inserciju sekvence nukleinske kiseline koja kodira peptid prema pronalasku u odgovarajući plazmid ili vektor, transformaciju kompetentnih ćelija navedenim plazmidom ili vektorom, i gajenje navedenih ćelija pod uslovima koji omogućavaju ekspresiju peptida prema pronalasku i, ako je potrebno, izolovanje i (opciono) prečišćavanje peptida prema pronalasku uobičajenim sredstvima poznatim stručnjacima u ovoj oblasti. Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira peptid prema pronalasku može lako da se izvede iz korelacije koja postoji između amino kiselina i nukleotidnih kodona koji kodiraju te amino kiseline.

[0047] U tom slučaju, dodatni cilj pronalaska je izolovana sekvenca nukleinske kiseline koja kodira peptid prema pronalasku. U konkretnom primeru izvođenja, navedena nukleinska kiselina odabrana je od jednolančane DNK, dvolančane DNK, i RNK. Dodatni ciljevi pronalaska su plazmidi i ekspresioni vektori koji sadrže navedenu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira peptid prema pronalasku, kao i prokariotske ili eukariotske ćelije koje eksprimiraju peptid prema pronalasku. Pregled principa tehnologije rekombinantne DNK može da se nađe, na primer, u knjizi pod nazivom "Principles of Gene Manipulation: An 5 Introduction to Genetic Engineering," R.W. Old & S.B. Primrose, objavljenoj kod Blackwell Scientific Publications, 4. izdanje (1989).

[0048] Kao što je opisano, pronalazak takođe uključuje peptide koji su funkcionalno ekvivalentni peptidima prema pronalasku ili “funkcionalno-konzervativne varijante”. U smislu upotrebljenom u ovom opisu, izraz “funkcionalno ekvivalentan” znači da peptid o kome je reč ima najmanje jednu od bioloških aktivnosti kao peptid prema pronalasku, kao što je, na primer, sposobnost da smanji upalu.

[0049] Kapacitet polipeptida prema pronalasku da smanji zapaljenje postaće očigledno stručnjaku u ovoj oblasti primenom jednostavnog testa za procenu smanjenja zapaljenja zahvaljujući peptidima. Na primer, 5x10<5>izolovanih humanih neutrofila inkubira se u prisustvu 100 ng/mL LPS i/ili 10 µg/mL anti-TREM-1 mAb sa ili bez 20 µg/mL polipeptida, 24 časa na 37°C / 5% CO2. Zatim se sakupi supernatant i koncentracije TNF-α i IL-6 se izmere ELISA testom. Ako ispitivani peptid inhibira TREM-1, koncentracije citokina moraju da opadnu za do 30% ili više u poređenju sa uslovima sa LPS+mAb bez peptida.

Nukleinske kiseline, vektori i rekombinantne ćelije-domaćini:

[0050] Drugi aspekt pronalaska odnosi se na molekul nukleinske kiseline koja kodira polipeptide prema pronalasku.

[0051] U poželjnom primeru izvođenja prema prikazu, molekul nukleinske kiseline kodira polipeptid koji ima sekvencu SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9.

[0052] “Kodirajuća sekvenca” ili sekvenca “koja kodira” proizvod ekspresije, kao što je RNK, polipeptid, protein ili enzim, predstavlja nukleotidnu sekvencu koja, kada se eksprimira, rezultuje proizvodnjom te RNK, polipeptida, proteina ili enzima, tj., nukleotidna sekvenca kodira aminokiselinsku sekvencu za taj peptid, protein ili enzim. Kodirajuća sekvenca za protein može da uključuje start kodon (obično ATG) i stop kodon.

[0053] Ovi molekuli nukleinske kiseline mogu da se dobiju uobičajenim postupcima poznatim stručnjacima u ovoj oblasti, posebno usmerenom mutagenezom gena koji kodira nativni protein. Tipično, navedena nukleinska kiselina je molekul DNK ili RNK, koji može da bude ugrađen u pogodni vektor, kao što je plazmid, kozmid, epizom, veštački hromozom, fag ili virusni vektor.

[0054] Prema tome, sledeći cilj predmetnog prikaza odnosi se na vektor i ekspresionu kasetu u kojoj je molekul nukleinske kiseline prema pronalasku povezan sa odgovarajućim elementima za kontrolu transkripcije (konkretno promotorom, enhenserom i, izborno, terminatorom) i, izborno, translacije, kao i rekombinantne vektore u koje je ubačen molekul nukleinske kiseline prema pronalasku. Ovi rekombinantni vektori mogu, na primer, da budu klonirajući vektori, ili ekspresioni vektori.

[0055] Izrazi "vektor", "klonirajući vektor" i "ekspresioni vektor" označavaju nosač pomoću koga sekvenca DNK ili RNK (npr. strani gen) može da bude introdukovana u ćeliju-domaćina, tako da transformiše domaćina i podstakne ekspresiju (npr. transkripciju i translaciju) introdukovane sekvence.

[0056] Bilo koji ekspresioni vektor za životinjsku ćeliju može da bude upotrebljen, sve dok gen koji kodira peptid ili himerni derivat prema pronalasku može da bude insertovan i eksprimiran. Primeri pogodnih vektora uključuju pAGE107, pAGE103, pHSG274, pKCR, pSG1 beta d2-4 i slično.

[0057] Drugi primeri plazmidi uključuju replicirajuće plazmide koji sadrže oridžin replikacije, ili plazmide koji se integrišu, kao što su na primer pUC, pcDNA, pBR, i slično.

1

[0058] Drugi primeri virusnog vektora uključuju adenovirusne, retrovirusne vektore, vektore na bazi herpes virusa i AAV vektore. Takvi rekombinantni virusi mogu da budu proizvedeni tehnikama poznatim u ovoj oblasti, na primer transficiranjem ćelija za pakovanje ili tranzijentnom transfekcijom upotrebom pomoćnih plazmida ili 30 virusa. Tipični primeri ćelija za pakovanje virusa uključuju ćelije PA317, ćelije PsiCRIP, ćelije GPenv+, ćelije 293, itd. Detaljni protokoli za proizvodnju takvih replikativno-defektnih rekombinantnih virusa mogu da se nađu na primer u WO 95/14785, WO 96/22378, US 5,882,877, US 6,013,516, US 4,861,719, US 5,278,056 i WO 94/19478.

[0059] Primeri promotora i pojačivača upotrebljenih u ekspresionom vektoru za životinjsku ćeliju uključuju rani promotor i pojačivač SV40 (Mizukami T. et al. 1987), LTR promotor i pojačivač virusa mišje leukemije Moloney (Kuwana Y et al., 1987), promotor (Mason JO et al., 1985) i pojačivač (Gillies SD et al., 1983) H lanca imunoglobulina, i slično.

[0060] Predmetni prikaz takođe uključuje sisteme za isporuku gena koji sadrže molekul nukleinske kiseline prema pronalasku, koji mogu da se koriste u genskoj terapiji in vivo ili ex vivo. Ovo uključuje na primer virusne vektore za prenos kao što su oni poreklom od retrovirusa, adenovirusa, virusa povezanog sa adenovirusom, lentivirusa, koji se uobičajeno koriste u genskoj terapiji. Ovo takođe uključuje sisteme za isporuku gena koji sadrže molekul nukleinske kiseline prema pronalasku i nosač za isporuku gena koji nije virusnog porekla. Primeri nosača za isporuku gena koji nisu virusnog porekla uključuju lipozome i polimere kao što su polietilenimini, ciklodekstrini, polimeri histidin/lizin (HK), itd.

[0061] Još jedan cilj predmetnog prikaza takođe je prokariotska ili eukariotska ćelija-domaćin genetički transformisana najmanje jednim molekulom nukleinske kiseline prema pronalasku.

[0062] Izraz “transformacija” označava uvođenje “stranog” (tj. spoljašnjeg ili vanćelijskog) gena, DNK ili RNK sekvence u ćeliju-domaćina, tako da ćelija-domaćin eksprimira uvedeni gen ili sekvencu proizvodeći željenu supstancu, tipično protein ili enzim kodiran uvedenim genom ili sekvencom. Ćelija-domaćin koja primi i eksprimira uvedenu DNK ili RNK je “transformisana”.

[0063] Poželjno, za eksprimiranje i proizvodnju peptida, a posebno peptida prema pronalasku, biće odabrane eukariotske ćelije, konkretno sisarske ćelije, i konkretnije, humane ćelije.

[0064] Tipično, mogu da se koriste ćelijske linije kao što su CHO, BHK-21, COS-7, C127, PER.C6 ili HEK293, zbog njihove sposobnosti obrade u pravilne posttranslacione modifikacije derivata.

[0065] Konstruisanje ekspresionih vektora prema pronalasku, transformacija ćelija-domaćina može da se izvodi upotrebom uobičajenih tehnika molekularne biologije. Derivati c-subjedinice V-ATPaze prema prikazu, mogu, na primer, da se dobiju gajenjem genetski transformisanih ćelija prema pronalasku i izdvajanjem iz kulture derivata koga eksprimira navedena ćelija. Oni zatim mogu, ako je potrebno, da budu prečišćeni prema uobičajenim procedurama, poznatim stručnjacima u ovoj oblasti, na primer frakcionisanom precipitacijom, konkretno precipitacijom amonijum sulfatom, elektroforezom, gel filtracijom, afinitetnom hromatografijom, itd.

[0066] Konkretno, uobičajeni postupci za dobijanje i prečišćavanje rekombinantnih proteina mogu da se koriste za proizvodnju proteina u skladu sa pronalaskom.

Terapeutski postupci, upotrebe i farmaceutske kompozicije:

[0067] Drugi cilj predmetnog pronalaska odnosi se na polipeptid prema pronalasku za upotrebu u lečenju zapaljenskog stanja.

[0068] Zapaljenska stanja prema pronalasku uključuju, ali nisu ograničena na alergije, astmu, miopatije, kancer, zapaljenski artritis, zapaljenske bolesti creva, akutni respiratorni distres sindrom (ARDS), ptičiji grip, male boginje, i sindrom sistemskog zapaljenskog odgovora (SIRS), teški akutni respiratorni sindrom (SARS), sindromi ishemije i reperfuzije, hemoragijski šok.

[0069] Zapaljenska stanja prema pronalasku uključuju, ali nisu ograničena na sepsu, tešku sepsu, septični šok, hemoragijski šok, ishemiju-reperfuziju ili pankreatitis.

[0070] U poželjnom primeru izvođenja, zapaljensko stanje je sepsa.

[0071] Polipeptid prema pronalasku je u stanju da leči zapaljensko stanje preko svojih svojstava receptora-mamca.

[0072] Pod “receptorom-mamcem”, podrazumeva se da polipeptidi prema pronalasku zarobljavaju TREM-1 ligand i sprečavaju njegova fiziološka dejstva na TREM-1.

[0073] Polipeptidi prema pronalasku mogu stoga da čine deo kombinovane terapije (usmerene na nekoliko terapijskih ciljeva) u cilju efikasnijeg zaustavljanja sepse.

[0074] Dodatni cilj ovog pronalaska je farmaceutska kompozicija koja uključuje terapeutski efikasnu količinu najmanje jednog polipeptida prema pronalasku, zajedno sa najmanje jednim farmaceutski prihvatljivim ekscipijensom. U jednom određenom primeru izvođenja, navedena farmaceutska kompozicija takođe sadrži jedan ili više (COOH) peptida. Alternativno, farmaceutska kompozicija prema pronalasku može da sadrži terapeutski efikasnu količinu vektora koji sadrži najmanje jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira polipeptid prema pronalasku, zajedno sa najmanje jednim adjuvansom i/ili farmaceutski prihvatljivim ekscipijensom. Navedeni vektor može da se koristi u genskoj terapiji.

[0075] Pod “terapeutski efikasnom količinom” podrazumeva se dovoljna količina himernog derivata prema pronalasku, za lečenje zapaljenskog stanja pri razumnom odnosu korist/rizik primenljivom na bilo koji medicinski tretman.

[0076] Jasno je da će ukupnu dnevnu dozu jedinjenja i kompozicija predmetnog pronalaska odrediti nadležni lekar u okviru razumne medicinske procene. Specifični terapeutski efikasni nivo doze za bilo kog konkretnog pacijenta zavisiće od raznih faktora, uključujući poremećaj koji se leči i ozbiljnost poremećaja; aktivnost specifičnog jedinjenja koje se koristi; specifičnu kompoziciju koja se koristi, starost, telesnu težinu, opšte zdravstveno stanje, pol, i ishranu pacijenta; vreme primene, put primene, i brzinu ekskrecije specifičnog jedinjenja koje se koristi; trajanje lečenja; lekova koji se koriste u kombinaciji ili istovremeno sa specifičnim polipeptidom koji se koristi; i sličnih faktora dobro poznatih u oblasti medicine. Na primer, kao što je poznato stručnjaku u ovoj oblasti, lečenje može da se započne dozama jedinjenja na nivoima nižim od onih potrebnih za postizanje željenog terapijskog dejstva i da se doza postepeno povećava do postizanja željenog dejstva. Međutim, dnevna doza proizvoda može da varira u širokom rasponu od 0.01 do 1,000 mg po odrasloj jedinki na dan. Poželjno, kompozicije sadrže 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0, 10.0, 15.0, 25.0, 50.0, 100, 250 i 500 mg aktivnog sastojka za simptomatsko podešavanje doze prema pacijentu koji se leči. Lek tipično sadrži od oko 0.01 mg do oko 500 mg aktivnog sastojka, poželjno od 1 mg do oko 100 mg aktivnog sastojka. Efikasna količina leka obično se dostavlja na nivou doze od 0.0002 mg/kg do oko 20 mg/kg telesne težine na dan, posebno od oko 0.001 mg/kg do 7 mg/kg telesne težine na dan.

[0077] Aktivni proizvodi prema pronalasku (polipeptidi ili vektori) mogu da se primene za upotrebu u lečenju zapaljenskih stanja koja se manifestuju, na primer, crvenilom, povećanjem toplote, oticanjem, bolom i gubitkom funkcije.

[0078] Terapeutski efikasna količina aktivnog proizvoda prema pronalasku [peptidi ili vektori (konstrukcije)] koja treba da se primeni, kao i doza za lečenje patološkog stanja peptidima i/ili farmaceutskim kompozicijama prema pronalasku, zavisiće od brojnih faktora, uključujući starost i stanje pacijenta, ozbiljnosti smetnje ili poremećaja, načina i učestalosti primene i konkretnog peptida koji treba da se upotrebi.

[0079] Prezentacija farmaceutskih kompozicija koje sadrže peptide ili vektore (konstrukcije) prema pronalasku može da bude u bilo kom obliku koji je pogodan za primenu, npr., čvrstom, tečnom ili polu-čvrstom, kao što su kreme, masti, gelovi ili rastvori, i ove kompozicije mogu da se primene na bilo koje pogodne načine, na primer, oralno, parenteralno, inhalacijom ili topikalno, tako da će uključivati farmaceutski prihvatljive ekscipijense neophodne da se napravi željeni dozni oblik za određeni način primene. Pregled različitih farmaceutskih oblika za

1

primenu lekova i ekscipijenasa neophodnih za njihovo dobijanje može da se nađe, na primer, u "Tratado de Farmacia Gal nica" (Treatise on Galenic Pharmacy), C. Faul i Trillo, 1993, Luz n 5, S.A. Ediciones, Madrid.

[0080] U farmaceutskim kompozicijama predmetnog pronalaska za oralnu, sublingvalnu, subkutanu, intramuskularnu, intravensku, transdermalnu, lokalnu, pulmonalnu ili rektalnu primenu, aktivni princip, sam, ili u kombinaciji sa drugim aktivnim principom, može se davati životinjama i ljudima kao jedinični dozni oblik, kao smeša sa uobičajenim farmaceutskim podlogama. Pogodni jedinični dozni oblici obuhvataju oblike za oralnu primenu, kao što su tablete, gel kapsule, prahovi, granule i oralne suspenzije ili rastvori, oblike za sublingvalnu i bukalnu primenu, aerosoli, implantate, oblike za subkutanu, transdermalnu, topikalnu, intraperitonealnu, intramuskularnu, intravensku, subdermalnu, transdermalnu, intratekalnu i intranazalnu primenu i oblike za rektalnu primenu.

[0081] Poželjno, farmaceutske kompozicije sadrže vehikulume koji su farmaceutski prihvatljivi za formulaciju koja može da se injektuje. To mogu da budu naročito izotonični, sterilni, slani rastvori (mononatrijum ili dinatrijum fosfat, natrijum, kalijum, kalcijum ili magnezijum hlorid i slično, ili mešavine takvih soli), ili suve, posebno osušene zamrzavanjem, kompozicije koje nakon dodavanja, zavisno od slučaja, sterilizovane vode ili fiziološkog rastvora, omogućavaju konstituisanje injektabilnih rastvora.

[0082] Farmaceutski oblici pogodni za injektabilnu upotrebu uključuju sterilne vodene rastvore ili disperzije; formulacije koje uključuju susamovo ulje, ulje kikirikija ili vodeni propilen glikol; i sterilne prahove za pripremu neposredno pre upotrebe sterilnih injektabilnih rastvora ili disperzija. U svim slučajevima, oblik mora da bude sterilan i mora da bude fluidan do stepena u kome može lako da se istisne iz šprica. Mora da bude stabilan pod uslovima proizvodnje i skladištenja i mora da bude konzervisan protiv dejstva kontaminacije mikroorganizmima, kao što su bakterije i gljive.

[0083] Rastvori koji sadrže jedinjenja prema pronalasku su slobodne baze ili farmakološki prihvatljive soli koje mogu da se pripreme u vodi pogodno pomešanoj sa surfaktantom, kao što je hidroksipropilceluloza. Disperzije takođe mogu da se pripreme u glicerolu, tečnim polietilen glikolima i njihovim smešama, i u uljima. Pod uobičajenim uslovima skladištenja i upotrebe, ovi preparati sadrže konzervans za sprečavanje rasta mikroorganizama.

[0084] Polipeptidi prema pronalasku mogu da budu formulisani u kompoziciju u neutralnom obliku ili u obliku soli. Farmaceutski prihvatljive soli uključuju kisele adicione soli (obrazovane sa slobodnim amino grupama proteina) i koje su obrazovane sa neorganskim kiselinama kao što su, na primer, hlorovodonične ili fosforne kiseline, ili organskim kiselinama kao što su sirćetna, oksalna, vinska, mandelična, i slično. Soli obrazovane sa slobodnim karboksilnim grupama mogu takođe da se dobiju iz neorganskih baza kao što su, na primer, natrijum-, kalijum-, amonijum-, kalcijum-, ili feri-hidroksidi, i organskim bazama kao izopropilamin, trimetilamin, histidin, prokain i slično.

[0085] Nosač takođe može da sadrži rastvarač ili disperzioni medijum, na primer, vodu, etanol, poliol (na primer, glicerol, propilen glikol, i tečni polietilen glikol, i slično), njihove pogodne smeše, i biljna ulja. Pravilna fluidnost može da se održava, na primer, upotrebom premaza, kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzije i upotrebom surfaktanata. Sprečavanje delovanja mikroorganizama može da se postigne različitim antibakterijskim i antigljivičnim agensima, na primer, parabenima, hlorobutanolom, fenolom, sorbinskom kiselinom, timerosalom, i slično. U mnogim slučajevima, biće poželjno uključivanje izotoničnih agenasa, na primer, šećera ili natrijum hlorida. Produžena apsorpcija injektabilnih kompozicija može da se postigne upotrebom u kompozicijama agenasa koji odlažu apsorpciju, na primer, aluminijum monostearata i želatina.

[0086] Sterilni injektabilni rastvori se pripremaju tako što se aktivni peptidi unose u potrebnoj količini u odgovarajući rastvarač sa nekoliko gore nabrojanih sastojaka, nakon čega, po potrebi, sledi sterilizacija filtracijom. Uopšteno, disperzije se pripremaju tako što se različiti sterilizovani aktivni sastojci unose u sterilni vehikulum koji sadrži osnovni disperzioni medijum i ostale potrebne sastojke od onih koji su gore nabrojani. U slučaju sterilnih prahova za pripremu sterilnih injektabilnih rastvora, poželjni postupci za pripremu su tehnike sušenja vakuumom i sušenja zamrzavanjem koje daju prah aktivnog sastojka i bilo kog dodatnog željenog sastojka iz njegovog prethodno sterilno filtriranog rastvora.

[0087] Nakon formulacije, rastvori će se primenjivati na način kompatibilan sa doznom formulacijom i u količini koja je terapeutski efikasna. Formulacije se lako daju u različitim doznim oblicima, kao što je vrsta gore opisanih injektabilnih rastvora, ali se mogu koristiti i kapsule koje oslobađaju lek, i slično.

[0088] Za parenteralnu primenu u vodenom rastvoru, rastvor treba da bude pogodno puferisan ako je potrebno, i tečni razblaživač najpre učinjen izotoničnim sa dovoljno fiziološkog rastvora ili glukoze. Ovi konkretni vodeni rastvori su posebno pogodni za intravensku, intramuskularnu, subkutanu i intraperitonealnu primenu. S tim u vezi, sterilni vodeni medijumi koji mogu da se koriste biće poznati onima koji poznaju ovo područje u svetlu ovog otkrića. Na primer, jedna doza može da se rastvori u 1 ml izotoničnog rastvora NaCl i da se doda ili u 1000 ml tečnosti za hipodermoklizu ili da se injektuje na predloženo mesto infuzije. U zavisnosti od stanja subjekta

1

koji se leči, nužno će postojati neke varijacije u doziranju. Osoba odgovorna za primenu odrediće u svakom slučaju odgovarajuću dozu za svaku pojedinu osobu.

[0089] Polipeptid prema pronalasku može da bude formulisan kao terapeutska smeša tako da sadrži oko 0.0001 do 1.0 miligrama, ili oko 0.001 do 0.1 miligrama, ili oko 0.1 do 1.0 ili čak oko 10 miligrama po dozi ili slično. Mogu da se primene i višestruke doze.

[0090] Pored jedinjenja prema pronalasku formulisanih za parenteralnu primenu, kao što je intravenska ili intramuskularna injekcija, druge farmaceutski prihvatljive forme uključuju, npr. tablete ili druge čvrste oblike za oralnu primenu; lipozomalne formulacije; kapsule sa vremenskim oslobađanjem; i sve druge trenutno korišćene oblike.

[0091] Kao što je prethodno pomenuto, peptidi prema pronalasku mogu da budu deo kombinovane terapije u svrhu efikasnijeg zaustavljanja zapaljenja. U tom slučaju, predmetni prikaz obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja uključuje najmanje jedan peptid prema pronalasku; zajedno sa još jednim ili drugim jedinjenjem/jedinjenjima koja inhibiraju zapaljenje, na primer, nesteroidnim antizapaljenskim jedinjenjima.

[0092] Dodatni cilj ovog prikaza odnosi se na polipeptide prema pronalasku ili vektore koji sadrže najmanje jednu sekvencu koja kodira poliperid prema pronalasku za lečenje zapaljenskog stanja uključujući, ali ne i ograničeno na, alergije, astmu, miopatije, kancer, zapaljenski artritis, zapaljenske bolesti creva, akutni respiratorni distres sindrom (ARDS), sepsu, ptičiji grip, male boginje, i sindrom sistemskog zapaljenskog odgovora (SIRS), teški akutni respiratorni sindrom (SARS).

[0093] Dodatno, predmetni prikaz obezbeđuje postupak za lečenje zapaljenskih stanja kod sisara koji se sastoji od davanja navedenom sisaru koji pati od navedenog patološkog stanja terapeutski efikasne količine najmanje jednog polipeptida prema pronalasku, ili vektora koji sadrži najmanje jednu DNK sekvencu koja kodira polipeptid prema pronalasku, poželjno u obliku farmaceutske kompozicije koja ga sadrži. U jednom konkretnom primeru izvođenja, navedena farmaceutska kompozicija sadrži, pored peptida ili peptida prema pronalasku, jedan ili više (COOH) peptida.

Postupci skrininga:

[0094] Drugi cilj predmetnog prikaza se odnosi na postupak za skrining jedinjenja koje sprečava funkcionisanje TREM-1 proteina.

[0095] Konkretno, predmetni prikaz obezbeđuje postupak za skrining inhibitora TREM-1 proteina za lečenje zapaljenskog stanja.

1

[0096] Na primer, u postupku skrininga može da se meri vezivanje jedinjenja koje je kandidat, za TREM-1 protein, ili za ćelije ili membrane koje nose TREM-1 protein ili njegov fuzioni protein, posredstvom obeleživača koji je direktno ili indirektno povezan sa jedinjenjem koje je kandidat. Alternativno, postupak skrininga može da uključi merenje ili kvalitativnu ili kvantitativnu detekciju kompeticije vezivanja jedinjenja koje je kandidat, za receptor sa obeleženim kompetitorom (npr., antagonistom).

[0097] U konretnom primeru izvođenja, postupak skrininga sadrži korake koji se sastoje od:

a) obezbeđivanja velikog broja ćelija koje eksprimiraju proteinski TREM-1 ligand i ćelija koje eksprimiraju TREM-1 protein;

b) inkubacije navedenih ćelija sa jedinjenjem koje je kandidat;

c) utvrđivanja da li se navedeno jedinjenje koje je kandidat vezuje za proteinski TREM-1 ligand;

i

d) odabira jedinjenja koje je kandidat, a koje inhibira interakciju TREM-1/ TREM-1 ligand.

[0098] Neutrofili proizvode reaktivne kiseonične vrste u prisustvu LPS, anti-TREM-1 mAb ili krvnih pločica (koje konstitutivno eksprimiraju TREM-1 ligand) sa sinergističkim efektom ovih različitih inducera koji je posredovan pomoću TREM-1 koji je vezan za membranu neutrofila. Očekujemo smanjenje proizvodnje ROS kada se neutrofili inkubiraju u prisustvu nekih peptida koji inhibiraju interakciju TREM-1 / TREM-1 ligand.

[0099] Proizvodnja ROS vrsta može se lako kvantifikovati upotrebom fluorogenog supstrata (DCFDA: 5- (i-6) -karboksi-2 ', 7'-dihlorodihidrofluorescein diacetat (karboksi-H2DCFDA) * mešani izomeri *). Na primer, izolovani humani neutrofili 2,5x10<5>izolovanih humanih neutrofila inkubira se 2 sata na 37 ° C, 5% CO2, sa 5 µM DCFDA, u prisustvu 20 µg/ml anti-TREM-1 mAb, sa ili bez 100 ng/mL LPS. Proizvodnja ROS-a putem TREM-1 aktivacije i njegove modulacije polipeptidima, kvantifikuje se tako protočnom citometrijom: ako ispitivani peptid inhibira TREM-1, srednji intenzitet fluorescencije (MFI) mora se smanjiti u poređenju sa uslovima bez TREM-1 mAb.

[0100] Ovaj brzi test će nam omogućiti da odredimo najbolje TREM-1 inhibitorne peptide kako bi ih dalje proučavali u drugim eksperimentima kao što je aktivacija NF-kB, proizvodnja citokina, fosforilacija proteina.

[0101] U principu, ovi postupci skrininga uključuju obezbeđivanje pogodnih ćeloja koje eksprimiraju TREM-1 protein, njegove ortologe i derivate na svojoj površini. Konkretno, nukleinska kiselina koja kodira TREM-1 protein može da se koristi za transfekciju ćelija kako bi

1

one na taj način eksprimirale TREM-1 protein. Ovakva transfekcija može da se postigne postupcima koji su dobro poznati u stanju tehnike.

[0102] U konkretnom primeru izvođenja ćelije su izabrane iz grupe koja se sastoji od imunih ćelija uključenih u oslobađanje citokina i medijatora zapaljenja, uključujući, ali ne ograničeno na, monocite/makrofage i neutrofile.

[0103] Postupak skrininga prema pronalasku može da se koristi za određivanje inhibitora tako što se takve ćelije dovode u kontakt sa jedinjenjima koja se pregledaju i utvrdi se da li takvo jedinjenje sprečava funkcionisanje TREM-1 proteina ili ne.

[0104] Prema jednom primeru izvođenja, jedinjenje koje je kandidat može biti izabrano iz biblioteke jedinjenja koja su prethodno sintetisana, ili iz biblioteke jedinjenja za koja je struktura određena u bazi podataka, ili iz biblioteke jedinjenja koja su sintetisana de novo ili prirodna jedinjenja.

[0105] Jedinjenje koje je kandidat može da bude izabrano iz grupe (a) proteina ili peptida, (b) nukleinskih kiselina i (c) organskih ili hemijskih jedinjenja (prirodnih ili ne). Ilustrativno, biblioteke prethodno odabranih kandidatskih nukleinskih kiselina mogu se dobiti korišćenjem SELEX postupka kao što je opisano u dokumentima US 5,475,096 i US 5,270,163. Dodatno ilustrativno, jedinjenje koje je kandidat može biti izabrano iz grupe antitela usmerenih protiv PP1/GADD34 kompleksa.

[0106] Pronalazak će dalje biti ilustrovan sledećim slikama i primerima.

SLIKE:

[0107]

Slika 1: LRI7 se specifično vezuje za TREM-1 ligand.

Za ove ekspreimente, koristili smo LR17-skremblovani kao kontrolni peptid sa nasumičnim rasporedom amino kiselina.

Imunoblot rhTLT-1, rhTREM-1, LR17 i LR17-skremblovanog dobijen pomoću mišijeg anti-TREM-1 mAb (TREM-1 agonist).

Protočno citometrijska analiza pokazuje da se vezivanje LR17 (1 ili 5 mg/mL) obeleženog sa FITC, za TREM-1 ligand eksprimiran na mirujućim ili trombinom (5UI/mL) aktiviranim ljudskim krvnim pločicama sprečava putem koinkubacije sa neobeleženim LR17, sTLT-1 ili LP17, koji je peptid poreklom od TREM-1.

(C-D) Testovi rezonancije površinskog plazmona na supernatantima LPS-stimulisanih neutrofila pomoću senzora obloženih sa rsTREM-1, u odsustvu (C) ili prisustvu (D) LR17.

1

Slika 2: LRI7 specifično inhibira aktivaciju TREM-1 tako što zarobljava njegov ligand, delujući kao receptor-mamac.

Za ove eksperimente, izolovani humani neutrofili su stimulisani pomoću TREM-1 agonista (aTREM-1, 5mg/mL) sa ili bez LR17 (30µg/mL) ili kontrolnog LR17-skremblovanog peptida (30µg/mL), u naznačena vremena. Podaci predstavljaju najmanje 5 različitih eksperimenata. Rezultati su srednja vrednost±SD. p vrednosti su ***p<0.001 **p<0.01 *p<0.05 [aTREM-1 LR17] prema [aTREM-1].

(A) Aktivacija puta TREM-1 fosforilacije: Western blot lizata neutrofila koji su stimulisani tokom 1, 3,10, 30 i 60 minuta, analiziran pomoću antitela fosfo(p)- p38 i (p)-ERK1/2. (B) Obrazovanje kompleksa CARD9-MALT1-BCL10: Imunoblot MALT-1 nakon imunoprecipitacije pomoću anti-BCL 10 mAb lizata neutrofila stimulisanih tokom 20 minuta.

(C) Nuklearna translokacija NF-KB: ELISA test nuklearnih subjedinica NF-kB, p50 i p65, neutrofila tretiranih tokom 2 sata.

(D) Proizvodnja ROS: Kvantifikacija protočnom citometrijom (redukcija DCFDA) ROS proizvodnje neutrofila nakon 2 sata stimulacije.

(E) Ekspresija citokina: nivoi TNF-a mRNK u neutrofilima stimulisanim tokom 6 sati (F) Proizvodnja citokina: ELISA test TNF-a u neutrofilima tretiranim tokom 2, 6 i 24 sata.

Slika 3: LR17 prikazuje antizapaljenska svojstva tako što snižava ćelijsku aktivaciju indukovanu pomoću LPS ili LPS i aTREM-1.

Za ove eksperimente, izolovani humani neutrofili ili monociti su stimulisani pomoću LPS (0,1 µg/mL) i TREM-1 agonista (aTREM-1, 5µg/mL) sa ili bez LR17 (30µg/mL) ili kontrolnog LR17-skremblovanog peptida (30µg/mL), tokom naznačenih vremena. Podaci predstavljaju najmanje 5 različitih eksperimenata. Rezultati su srednja vrednost±SD. p vrednosti su ***p<0.001 **p<0.01 *p<0.05 [LPS / LR17] prema [LPS] ili [LPS aTREM-1/LR17] prema [LPS aTREM-1].

(A) Western blot lizata neutrofila koji su stimulisani tokom 1, 3,10, 30 i 60 minuta, analiziran pomoću antitela na fosfo(p)-p38 i (p)-ERK1/2.

(B) obrazovanje kompleksa CARD9-MALT1-BCL10: imunoblot MALT-1 nakon imunoprecipitacije pomoću anti-BCL može da bude od lizata neutrofila stimulisanih tokom 20 minuta.

1

(C) nuklearna translokacija NF-KB: ELISA test nuklearnih subjedinica NF-kB, p50 i p65, neutrofila tretiranih tokom 2 sata.

(D) Proizvodnja ROS: kvantifikacija protočnom citometrijom (redukcija DCFDA) ROS proizvodnje neutrofila nakon 2 sata stimulacije.

(E) Kvantitativno određivanje fagocitoze neutrofila i oksidativne eksplozije indukovano pomoću E. Coli sprovedeno je pomoću protočne citometrije. sTLT-1/LR17 nisu pokazali delovanje na oksidativnu eksploziju indukovanu pomoću PMA ili fMLP (nije prikazano). Podaci (srednja vrednost±SD) predstavljaju 6 različitih eksperimenata.

(F) Ekspresija citokina: nivoi TNF-a mRNK u neutrofilima stimulisanim satima.

(G-H) Proizvodnja citokina: ELISA test TNF-a u neutrofilima tretiranim tokom 2, 6 i 24 sata.

(I) ELISA test TNF-a proizvedenog od strane nativnih humanih monocita ili humanih monocita sa utišanim Trem-1.

Slika 4: Modulacija TREM-1 u vezi sa LR17 štiti endotoksemične miševe od smrti i sistemskog odgovora .

Mužjaci Balb/c miševa (20-23 g) nasumično su grupisani (15 miševa po grupi) i tretirani sa LD50 LPS. LR17 (100µg ili 250µg u 0.2 mL NaCl 0.9%), skremblovani-LR17 (1100 µg u 0.2 mL NaCl 0.9%), ili 0.2 mL NaCl 0.9% primenjeno je 60 min pre ili 60 minuta nakon LPS. 4-6 životinja po grupi je žrtvovano prekomernom dozom pentotala 2 i 4 sata nakon ubrizgavanja LPS i krv je uzorkovana putem kardijačne punkcije. Rezultati su srednja vrednost±SD. p vrednosti su *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001 u poređenju sa kontrolnim životinjama.

(A) tretman pomoću LR17 obezbeđuje prednost u preživljavanju kao što je prikazano na krivoj preživljavanja (Log Rank test, p=0.0032) bez razlika za različite doze ili vremena ubrizgavanja LR17. (B-E) ELISA test TNF-a, IL-6, IL-10 i sTREM-1 u plazmi.

Slika 5: Modulacija TREM-1 u vezi sa LR17 štiti miševe od polimikrobne sepse.

Odrasli mužjaci Balb/c miševa (20-23g) podvrgnuti su ligaciji i punkciji cekuma pod anestezijom izofluranom i nasumično su grupisani (n=5-10 po grupi) kako bi primili po jednu injekciju LR17 (100µg u 0.2 mL NaCl 0.9%), skremblovanog-LR17 (100 µg u 0.2 mL NaCl 0.9%), ili 0.2 mL NaCl 0.9%. Nakon 24 sata, životinje su žrtvovane pod anestezijom. Rezultati su srednja vrednost±SD. p vrednosti su *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001 u poređenju sa kontrolnim životinjama.

2

(A) ELISA test TNF-a, IL-6 i IL-10 u plazmi i tečnosti dobijenoj peritonealnom i bronhoalveolarnom lavažom.

(B) q-PCR kvantifikacija mRNK za IL-6 iTNF-a u plućima i jetri.

(C) ELISA test za TATc u plazmi i tečnosti dobijenoj bronho-alveolarnom lavažom.

(D) Broj krvnih pločica u punoj krvi.

(E) Broj ćelija u tečnostima dobijenim peritonealnom i bronho-alveolarnom lavažom. (F) Histopatološko ispitivanje pluća 24 sata nakon CLP. Intraalveolarno krvarenje, precipitacija proteina i infiltracija leukocita u alveole, kao i edematozno zadebljanje perivaskularnog prostora, atenuirani su kod miševa tretiranih pomoću LR17. Ovde je prikazana tipična ilustracija (x10).

(G) Brojevi bakterija iz slezine i krvi dobijeni 24 sata nakon CLP.

Slika 6: Modulacija TREM-1 u vezi sa LR17 štiti miševe od mortaliteta indukovanog putem CLP.

Odrasli mužjaci Balb/c miševa (20-23g) podvrgnuti su ligaciji i punkciji cekuma pod anestezijom izofluranom i nasumično su grupisani (n=25-40 po grupi) kako bi primili po jednu injekciju LR17, skremblovanog-LR17 ili 0.2 mL NaCl 0.9% u naznačena vremena. Preživljavanje je praćeno tokom jedne nedelje i analizirano Log Rank testom. LR17 je obezbedio značajnu zaštitu čak i kada je primenjen 24 sata nakon početka sepse.

Slika 7: Modulacija TREM-1 u vezi sa LR12 štiti miševe od polimikrobne sepse.

(a) Koncentracije TNF-a i IL-6 u plazmi i BAL.

(b) Kvantifikacija mRNK za IL-6, TNF-a i IL-10 u plućima i jetri.

(c) Broj krvnih pločica u punoj krvi.

(d) Histopatološko ispitivanje pluća 24h nakon CLP.

(e-f) Brojevi bakterija u slezini i krvi dobijeni 24h nakon CLP.

(g) Krive preživljavanja nakon CLP analizirane su Log Rank testom.

[0108] Rezultati su izraženi kao srednja vrednost±SD. p vrednosti su *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 u poređenju sa kontrolnim životinjama.

PRIMER:

Materijali i metode

[0109] Rezonancija površinskog plazmona. Detekcija TREM-1-liganda u supernatantima meutrofila stimulisanih pomoću LPS, procenjena je vezivanjem za rekombinantni solubilni oblik TREM-1 (rsTREM-1) kojim je obložen CM5 senzorski čip sa BIAcore X instrumentom na 25 ° C sa brzinom protoka od 5 mL/min. Specifičnost vezivanja verifikovana je putem kompeticije sa solubilnim rsTREM-1. Procenjena je inhibicija vezivanja TREM-1 liganda za LR17.

[0110] Peptidi. Na osnovu sekvenci za TLT-1 i TREM-1 u GenBank|EMBL|DDBJ (pristupni brojevi AY078502, AF534822, AF241219 i AF287008), dizajnirani su različiti TLT-1-peptidi koji podražavaju različite delove njegovih vanćelijskih domena: TLT-1-CDR2 (SAVDRRAPAGRR, SEQ ID N°2), TLT-1-CDR3 (CMVDGARGPQILHR, SEQ ID N°3) i dobro očuvana sekvenca između TREM-1 i TLT-1: TLT-1-LR17 (LQEEDAGEYGCMVDGAR, SEQ ID N°4), TLT-1-LR12 (LQEEDAGEYGCM, SEQ ID NO :9), LR6-1 (LQEEDA), LR6-2 (EDAGEY) i LR6-3 (GEYGCM). Hemijski su sintetisani (Pepscan Presto BV, Lelystad, Holandija) u vidu peptida amidovanih na COOH kraju, namenjenih za in vitro i in vivo testove, i obeleženih pomoću FITC, radi eksperimenata protočne citometrije. Korektni peptidi su dobijeni sa prinosima >99% i bili su homogeni nakon preparativnog prečišćavanja, što je potvrđeno masenom spektrometrijom i analitičkom obrnuto-faznom tečnom hromatografijom visokog učinka. Ovi peptidi nisu sadržali endotoksin. Sintetisan je skremblovani peptid koji sadrži iste amino kiselina kao i TLT-1-LR17 ali sa potpuno različitim redosledom u sekvenci, koji je služio kao kontrolni peptid (TLT-1-LR17 skrembl: GAEREVCMDEYGALQDG, SEQ ID N°5).

[0111] Izolacija i stimulacija humanih PMN ćelija i monocita. Uzorci ljudske periferne krvi prikupljeni su na EDTA od zdravih dobrovoljnih davalaca među laboratorijskim osobljem. PMN ćelije su izolovane pomoću gradijenta gustine sa natrijum-diatrizoatom 13,8% / dekstranom 500 8,0% (polimorfprep, AbCis). Monociti su izolovani negativnim sortiranjem ćelija PBMNC pomoću Kita za izolaciju monocita II (Miltenyi). Ćelije su zatim isprane dva puta sa PBS (BioMerieux) i resuspendovane u kompletnom medijumu (RPMI 1640 koji sadrži 100 UI / mL penicilina, 100 µg/mL streptomicina, 0,25 µg/mL amfotericina B i 10% FCS, Eurobio) pre stimulacije. Čistoća je procenjena protočnom citometrijom (anti-CD45, anti-CD14 i anti-CD66b, Beckman Coulter).

[0112] Izolacija krvnih pločica. Uzorci krvi sa citratom i dekstrozom su centrifugirani (100g, 10min) kako bi se dobila plazma bogata krvnim pločicama (engl. skr. PRP). PRP je zatim centrifugirana (550g, 10min) preko 36% (tež./zap.) BSA gradijenta i krvne pločice su sakupljene iz interfaze, pre nego što su oprane Tirodovim sonim puferom (Sigma-Aldrich) suplementiranim sa 5mM EGTA. U cilju aktivacije, krvne pločice su inkubirane tokom 30 minuta sa 5U/mL trombina (Sigma-Aldrich) ili 1 mg/mL LPS iz E. Coli (0111:B4, Sigma-Aldrich) na 37°C i nakon toga fiksirane sa 2% (tež./zap.) paraformaldehida (PFA, Sigma-Aldrich). Rezidualni PFA je uklonjen putem dva dodatna koraka ispiranja u Tirodovom puferu. Aktivacija je procenjena pomoću anti-CD62P (Beckman Coulter).

[0113] Stimulacija ćelija. U zavisnosti od eksperimenta, ćelije su stimulisane u kompletnom medijumu suplementiranom sa 100 ng/mL LPS iz E. Coli (0111 B4, Sigma-Aldrich), anti-TREM-1 mAb (R&Dsystems) i TLT-1-peptidima u različitim trenucima i koncentracijama, na pločama sa 96 bunarčića (Greiner Bio One). Supernatanti su sakupljeni u cilju merenja citokina i ćelije su podvrgnute protočnoj citometriji ili lizirane u cilju analize fosforilacije proteina i merenja aktivnosti NFkB.

[0114] FACS analiza. Izolovane ćelije (neutrofili, monociti ili krvne pločice) blokirane su za nespecifično vezivanje pomoću 10% humanog Ig (Sigma-Aldrich) tokom 1 sata, na ledu. Ćelije su inkubirane sa rekombinantnim solubilnim TLT-1-peptidima obeleženim pomoću FITC , LP17 obeleženim pomoću FITC (ili odgovarajućim skremblovanim peptidima obeleženim pomoću FITC), anti-TREM-1 mAb (R&Dsystems) obeleženim pomoću PE, CD62P-FITC, CD66b-PE, CD45-PE, CD14-FITC (sve nabavljeno od firme Beckman Coulter).

[0115] Merenje koncentracije citokina. Citokini u supernatantima stimulisanih ljudskih ćelija ili mišije plazme mereni su pomoću ELISA testa (ljudski i mišiji Quantikine ELISA kitovi, R&Dsystems) i testova sa panelima citokina (Proteome Profiler Human Cytokine Array Kit, Panel A i Proteome Profiler Mouse Cytokine Array Kit, Panel A, R&Dsystems) u skladu sa preporukama proizvođača.

[0116] Analiza fosforilacije proteina. Stimulisane PMN ćelije lizirane su na 1, 3, 10, 30 i 60 minuta pomoću reagensa PhosphoSafe Extraction (Novagen) i centrifugirane 5 minuta na 16,000g na 4°C kako bi se sakupio supernatant. Koncentracija proteina je određena u skladu sa Bredfordovom metodom (Pierce). Lizati su zatim analizirani pomoću metode Western blota (Criterion XT Bis Tris Gel, 4-12%, BioRad i PVDF membrana, Millipore), uz detekciju sa antifosfo-p38 i -pERK1/2 i odgovarajućim sekundarnim antitelima konjugovanim sa peroksidazom rena (Cell Signaling) i pomoću supstrata Super-Signal West Femto (Pierce). Za normalizaciju su korišćeni anti-p38 i anti-ERK1/2. Alternativno, PMN ćelije su analizirane nakon 20 minuta stimulacije panelom višestrukih fosforilisanih proteina, putem imunoblota (Human Phospho-Kinase Array, R&Dsystems). Beleženje podataka i analiza gustine kvantitativnih signala obavljeni su pomoću instrumenta LAS-4000 i softvera Multi-Gauge (Fujifilm).

[0117] Imunoprecipitacija. Ćelije su lizirane pomoću reagensa CytoBuster Protein Extraction (Novagen). Uzorci su normalizovani u odnosu na ukupnu koncentraciju proteina i lizati su izbistreni pre izvođenja imunoprecipitacije. Izbistreni lizati su zatim inkubirani preko noći na 4°

2

C sa zečijim-anti-Bcl10 mAb (Cell Signaling) ili zečijim-anti-CARD9 (Antibodies Online). Nakon toga su dodate zrnca sa anti-zečijim-Ig (eBioscience) tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Zrnca su zatim isprana 3 puta, denaturisana u Lemli puferu 5 minuta na 95°C i centrifugirana 1 min na 16,000g. Supernatant sa zadržanim proteinim analiziran je tehnikom Western blotovanja i detektovan pomoću anti-Malt-1 i odgovarajućih antitela konjugovanih sa HRP (Cell Signaling).

[0118] Merenje aktivnosti NF-kB. Stimulisane ćelije su sakupljene, nuklearni ekstrakti dobijeni pomoću kita za nuklearnu ekstrakciju i aktivnost NFkB je merena pomoću kita za humani p50/p65 kombinovani test za transkripcione faktore (Cayman Chemical), u skladu sa uputstvima proizvođača.

[0119] Procena proizvodnje ROS. Kvantitativno određivanje fagocitoze neutrofila i oksidativne eksplozije sprovedeno je pomoću protočne citometrije, upotrebom testova Phagotest i Bursttest (Orpegen Pharma, Heidelberg, Nemačka) prateći uputstva proizvođača. A FITC-labelled Opsonizovana E. coli obeležena pomoću FITC korišćena je kako bi se utvrdila opšta fagocitna aktivnost (ingestija jedne ili više bakterija po ćeliji) i individualna ćelijska fagocitna aktivnost (broj bakterija po ćeliji). Za procenu aktivnosti oksidativne eksplozije kao stimulansi su korišćene neobeležene opsonizovane E. coli, fMLP, PMA LPS i aktivirane ili neaktivirane krvne pločice (30:1) i DCFDA kao fluorogeni supstrat (Invitrogen), u skladu sa uputstvima proizvođača.

[0120] Priprema monocita sa onesposobljenim Trem-1. Utišavanje TREM-1 izvedeno je pomoću kita Human Monocyte Nucleofector (Amaxa) upotrebom siRNK sekvenci dobijenih od firme Qiagen. Izolovani monociti su izloženi elektroporaciji sa siRNK (bez siRNK i sa siRNK bez elektroporacije kao negativnom kontrolom, i sa GFP-reporterskim plazmidom kao pozitivnom kontrolom) i gajeni 24 sata u medijumu Human Monocyte Nucleofector (Amaxa) pre stimulisanja. Ekspresija TREM-1 je zatim procenjena kvantitativnom tehnikom RT-PCR i protočnom citometrijom, 24 sata nakon transfekcije. Medijum je promenjen i monociti su stimulisani pomoću LPS, anti-TREM-1 mAb i TLT-1-peptida tokom 24 sata. Medijum je zatim sakupljen radi merenja citokina.

[0121] Endotoksemija kod miševa indukovana pomoću LPS. Nakon odobrenja Lokalnog etičkog komiteta, mužjaci Balb/c miševa (4-6 nedelja) su nasumično grupisani i tretirani sa LPS, intraperitonealno, u kombinaciji sa LR17 (u 250µL normalnog fiziološkog rastvora) ili sa LR17 skremblovanim, 1 sat pre ili posle primene LPS. Vijabilnost miševa ispitivana je na svakih sat vremena ili su životinje žrtvovane u pravilnim intervalima. Uzorci seruma prikupljeni su srčanom punkcijom i testirani na nivoe citokina i sTREM-1 pomoću ELISA testa (R & Dsystems).

[0122] Ligacija i punkcija cekuma (CLP) u modelu polimikrobne sepse. Mužjaci Balb/c miševa (4-6 nedelja) su anestezirani izofluranom. Cekum je izložen kroz inciziju na sredini abdomena od 1.0 cm i podvrgnut je ligaciji distalne polovine nakon čega je usledila jedna punkcija iglom G21. Mala količina stolice odstranjena je iz punkciji kako bi se osigurala propusnost. Cekum je vraćen u peritonealnu šupljinu, a rez na trbuhu zatvoren u dva sloja. Nakon operacije, svim miševima ubrizgan je s.c. sa 0,5mL 0,9% rastvora NaCl za nadoknađivanje tečnosti. Životinje su nasumično grupisane i tretirane pomoću LR17 ili LR17-skremblovanog kao kontrola u 250 µl 0,9% rastvora NaCl i primenjene intraperitonealno. Da bi se odredio efekat različitih doza LR17 u različitim vremenima, miševi su tretirani sa 50, 100 ili 200 µg LR17 na HI posle operacije, ili sa 3 injekcije od 100 µg na 2, 6 i 24 sata ili sa I100 µg u jednom ubrizgavanje u toku 24 sata nakon CLP, a zatim je praćeno preživljavanje. Pet dodatnih životinja u grupi žrtvovano je pod anestezijom 24 sata nakon CLP kako bi se odredio broj bakterija i nivoi citokina. Tečnost od peritonealne lavaže je dobijena korišćenjem 2 mL RPMI 1640 (EuroBio), a krv je sakupljena srčanom punkcijom. Koncentracije citokina u plazmi su određene pomoću ELISA testa (R & Dsystems). Za procenu broja bakterija, krv i zgnječena slezina su zasejane u serijskim logaritamskim razblaženjima na triptološkim sojinim agar pločama suplemetniranim sa 5% ovčije krvi. Posle nanošenja, ploče sa triptološkim sojinim agarom se inkubiraju na 37 ° C aerobno tokom 24 sata, i anaerobno tokom 48 sati. Rezultati su izraženi kao CFU po ml krvi ili po gramu slezine.

Rezultati

LR17 se specifično vezuje za TREM-1 ligand

[0123] Kako bi se utvrdilo da li sTLT-1 može specifično da se veže za TREM-1 ligand i da tako ometa interakciju TREM-1/ TREM-1 ligand, koristili smo specifični TREM-1 agonist za koji se zna da se vezuje za, i aktivira TREM-1, imitirajući TREM-1 angažovanje sa svojim ligandom. Uočili smo da je kao kontrola, sam TREM-1 bio u stanju da prepozna svoj ligand (agonist) ali ne i kontrolni LR17 peptid sa nasumičnim rasporedom amino kiselina, i da su i sTLT-1 i LR17 bili u stanju da se vežu za TREM-1 ligand (sl.1A).

[0124] Zna se da ljudske krvne pločice konstitutivno eksprimiraju TREM-1 ligand. Stoga smo želeli da direktno potvrdimo interakciju između sTLT-1 i TREM-1 liganda proučavanjem fiksiranja LR17 za krvne poločice. Uočili smo da se LR17 obeležen sa FITC vezuje za krvne pločice u mirovanju i aktivirane trombinom. Ovo vezivanje se smanjivalo istovremenom inkubacijom sa LP17, peptidom dobijenim od TREM-1 za koji se zna da se vezuje za TREM-1

2

ligand. I obrnuto važi: vezivanje LP17 obeleženog sa FITC smanjivalo se inkubacijom sa rsTLT-1 ili LR17, ali ne i sa LR17 sa nasumičnim rasporedom amino kiselina. LR17 nije se vezivao za neutrofile ili monocite, za koje se zna da ne eksprimiraju TREM-1 ligand (Sl.1 B).

[0125] Premda neutrofili ne eksprimiraju TREM-1 ligand vezan za membranu, ove ćelije mogu da oslobađaju njegov solubilni oblik. Koristeći rezonanciju površinskog plazmona, uočili smo da LPS-aktivirani neutrofili na vremenski zavisan način luče TREM-1 ligand (Sl.1 C). LR17 je bio u stanju da blokira vezivanje TREM-1 liganda za imobilisani TREM-1 (Sl.1 D) što ukazuje na to da bi sTLT-1 mogao da ometa interakcije TREM-1/TREM-1 ligand.

[0126] Kada se zajedno razmatraju, ovi rezultati ukazuju na to da je LR17 u stanju da specifično veže i zarobi TREM-1 ligand, ukazujući na to da može da deluje kao receptor-mamac i da inhibira interakciju TREM-1 ligand/TREM-1.

LR17 inhibira aktivaciju TREM-1 i smanjuje aktivaciju neutrofila posredovanu pomoću TREM-1.

[0127] Angažman TREM -1 na mijeloidnim ćelijama dovodi do fosforilacije p38 MAPK i ERK 1/2. Ovaj efekat je delimično poništen putem LR17 (Sl. 2 A). Nizovi fosfoproteina takođe su pokazali da je fosforilacija proteina uključenih u signalizaciju TREM-1 (mTOR, Lin, AKT, MSKI/2, MEK 1/2, GSK 3a/, RSK i p53) takođe smanjena u prisustvu LR17 (podaci nisu pokazani). TREM-1 signalizira putem asocijacije sa DAP 12, ITAM koji sadrži adapter proteina. Pošto se formiranje CARD9-BCL10-MALT1 pokazalo kao neophodno u kuplovanji receptora povezanih sa ITAM, sa aktivacijom NF-kB, želeli smo da ispitamo uticaj LR17 na ovaj složeni sklop. Kao što se očekivalo, aktiviranje TREM-1 povezano je sa povećanim obrazovanjem kompleksa CARD9-MALT1-BCL10. Ovaj efekat je preokrenut delovanjem LR17 (sl. 2B). Signalni put TREM-1 konačno vodi do aktivacije NF-kB. Opet, LR17 je smanjio anti-TREM-1 indukovanu aktivnost NF-kB (Sl. 2C). Kao veličinu za očitavanje aktivacije ćelija pomoću TREM, izabrali smo proizvodnju ROS. Pokazano je da i agonist TREM-1 i trombociti (koji eksprimiraju TREM-1 ligand) povećavaju proizvodnju ROS pomoću neutrofila. Primetili smo da je ova proizvodnja delimično sprečena u prisustvu LR17 (sl. 2D). Konačno, LR17 je uspeo da smanji proizvodnju citokina aktiviranim neutrofilima, i na nivou gena i na nivou proteina, za TNF-a (sl.2E i F), IL-6 i IL-8 (podaci nisu prikazani).

[0128] Stoga ovi rezultati dalje podržavaju činjenicu da je LR17 prirodni neposredni inhibitor TREM-1.

2

LR17 prikazuje antizapaljenska svojstva smanjujući ćelijsku aktivaciju izazvanu pomoću LPS ili LPS i TREM-1.

[0129] Pokazano je da modulacija TREM-1 smanjuje aktivaciju neutrofila posredovanu pomoću TLR. Angažovanje TLR4 nakon stimulacije sa LPS vodi do aktivacije NF-kB i proizvodnje ROS od strane neutrofila. Zaista, LR17 je smanjio fosforilaciju p38 i ERK1/2 u vezi sa LPS (sa ili bez aTREM-1) (sl. 3A), formiranje kompleksa CARD9-MALT1-BCL10 (sl. 3B), translokaciju NF-KB (sl. 3C ) i intracelularnu proizvodnju ROS (sl. 3D). LR17 je takođe smanjio oksidativnu esploziju neutrofila posredovanu pomoću E. coli. nasuprot tome, sTLT-1 i LR17 nisu menjali fagocitne osobine neutrofila (sl.3 E)

[0130] Kao što se očekivalo, aTREM-1 je izazvao proizvodnju TNF-a pomoću neutrofila. Ovaj efekat je poništen dodatkom LR17. Anti-TREM-1 takođe je sinergistički delovao sa LPS prilikom indukcije proizvodnje citokina: i ova sinergija je blokirana pomoću LR17.

[0131] Konačno, sekrecija TNF povezana sa LPS, od strane neutrofila i monocita, zavisna je od doze u prisustvu LR17, kako na nivou gena tako i proteina. αTREM-1 je sinergistički delovao sa LPS prilikom indukcije proizvodnje citokina: i ova sinergija je blokirana pomoću LR17 (sl. 3F, G, H i I). Isto to važi i za IL-6 i IL-8 (nije prikazano). Koristeći široke nizove citokina, potvrdili smo smanjenu proizvodnju TNF-α, IL-6 i IL-8, ali i GRO-α, IL-1, IL-16, MCP-1, MIP-1β i RANTES pomoću LR17. Svi ovi efekti takođe su potvrđeni u ljudskim monocitima i po stimulaciji sa TLR2 (Pam3SK4) (nije prikazano).

[0132] Da bismo u potpunosti pokazali da sTLT-1 modulira zapaljenski odgovor izazvan sa LPS upravo preko TREM-1, istražen je efekat LR17 na monocite tretirane sa Trem-1 siRNK. Utišavanje Trem-1 postignuto je u monocitima sa više od 90% efikasnosti od 24 do 96 sati nakon transfekcije, što je verifikovano pomoću tehnike RT-qPCR. Utišani monociti su takođe stimulisani LPS / anti-TREM-1 mAb: iako su utišani monociti normalno reagovali na LPS, anti-TREM-1 mAb nije indukovalo proizvodnju TNF-α. Istovremeno, LR17 nije pokazao nikakav efekat na sintezu TNF u utišanim monocitima (sl.3I).

[0133] Ovi rezultati dodatno podržavaju hipotezu da je sTLT-1 prirodni inhibitor TREM-1.

LR17 štiti endotoksemične miševe od smrti

[0134] Zatim smo želeli da razjasnimo može li sTLT-1 imati neke zaštitne efekte tokom sepse. Kod odraslih mužjaka Balb/c miševa intraperitonealno je primenjena jedna doza LR17, LR17-skremblovani ili NaCl 0,9% 60 min pre primene LPS (LD50, 25 mg/kg). Sve životinje koje su bile tretirane sa LR17 preživele su (sl.4a). Da bismo istražili da li se lečenje LR17 može odložiti

2

do trenutka nakon što se primeni LPS, ubrizgavali smo LR17 počevši od 1 sata nakon ubrizgavanja LPS. Ovo odloženo lečenje pružilo je značajnu zaštitu (sl.4a). Tokom 10 dana nije došlo do naknadne smrti, što ukazuje na to da LR17 nije samo odložio početak umiranja usled od LPS, već je pružio trajnu zaštitu. Kontrolni miševi su svi razvili letargiju, piloerekciju i dijareju pre smrti. Suprotno tome, miševi koji su tretirani sa LP17 ostali su dobro negovani i aktivni, nisu imali dijareju i bili su živahni. Da bismo razjasnili mehanizam kojim je LR17 zaštitio miševe od umiranja usled LPS, odredili smo serumske nivoe TNF-a, IL-6, IL-10 i sTREM-1 endotoksemičnih miševa na 2 i 4 h. U poređenju sa kontrolama, tretman sa LR17 pre i posle LPS smanjio je citokine (sl.4b-e). Upotreba veće doze LR17 (250 µg) nije dala prednost u odnosu na dozu od 100 µg.

LR17 štiti miševe od polimikrobne sepse

[0135] Da bismo istražili ulogu LR17 u relevantnijem modelu septičkog šoka, izveli smo CLP eksperimente. Kontrolne grupe su činili miševi kojima je ubrizgan normalni fiziološki rastvor ili kontrolni peptid (skremblovani LR17). Prvo smo izmerili koncentracije IL-6 i IL-10 u plazmi, 24 sata nakon operacije. Obe koncentracije citokina smanjene su u životinjama tretiranim LR17 (100 µg intraperitonealno, 2 sata posle operacije) (sl.5a). IL-6 i IL-10 su takođe bili smanjeni u tečnosti dobijenoj bronho-alveolarnom lavažom nakon tretmana sa LR17, kao i u tečnosti dobijenoj peritonealnom lavažom (sl.5a). Pregled nivoa različitih citokina u plazmi pomoću niza citokina, pokazao je smanjenu koncentraciju nekoliko drugih važnih zapaljenskih citokina (C5a, IL-Ira, IL16, MCP-1, MIP-1 a, MIP-2). Aktivacija koagulacije često se javlja tokom sepse kao deo upalnog odgovora. I koncentracija D-dimera i TATc u plazmi i alveolama su značajno povišene kod CLP miševa.Ovi poremećaji koagulacije bili su sprečeni pomoću LR17 (sl.5b).

[0136] Zatim smo istražili da li LR17 utiče na lokalno regrutovanje ćelija kako na mestu infekcije (peritoneum) tako i distalno (alveolarni prostor). Zaista, ćelijska infiltracija je smanjena tretmanom LR17 na obe lokacije (sl.5c). Histološka studija otkrila je ozbiljna oštećenja pluća, tj. intraalveolarno krvarenje, taloženje proteina i infiltraciju leukocita u alveole i edematozno zadebljanje perivaskularnog prostora kod miševa sa sepsom. Ove promene su oslabljene kod životinja tretiranih sa LR17 (sl.5d). Stoga LP17 sprečava obilnu ćelijsku infiltraciju i histološka oštećenja izazvana peritonitisom. Konačno smo proučavali uticaj LR17 na klirens bakterija. Kao što se očekivalo, uočili smo veoma visok broj bakterija u slezini CLP miševa 24 sata nakon početka peritonitisa. Nadalje, kod svih kontrolnih životinja pronađena je bakterijemija. Suprotno tome, LR17 je poboljšao bakterijski klirens i gotovo u potpunosti sprečio septikemiju (sl. 5e).

2

[0137] Tretman pomoću LR17 je stoga mogao da modulira zapaljenski odgovor indukovan sepsom i lokalno i sistemski i da poboljša bakterijski klirens.

LR17 štiti miševe od mortaliteta koga indukuje CLP.

[0138] Istražili smo da li modulacija zapaljenskog odgovora obezbeđenog pomoću LR17 može da se prevede u poboljšanje preživljavanja tokom sepse. U ovom CLP modelu, na modelu polimikrobne sepse, LR17 pruža značajnu zaštitu od umiranja, koja zavisi od doze, čak i kada se primeni tako kasno kao što je 24 sata nakon početka sepse. Zanimljivo je da ponovljene injekcije LR17 nisu bile superiorne u odnosu na primenu jedne doze (sl.6).

TREM-1 modulacija u vezi sa LR12 štiti miševe od polimikrobne sepse.

[0139] LR12 predstavlja 12 amino kiselina poreklom od LR17, a sastoji se od N-terminalnih 12 aminokiselina iz LR17. Kada se LR12 primenjivao na miševima sa sepsom, on je i dalje pružao značajnu zaštitu od sistemskog, bronho-alveolarnog zapaljenja i zapaljenja organa (sl. 7a i b), poremećaja koagulacije (sl. 7c), disfunkcije organa (Sl. 7d), bakterijskog klirensa (sl. 7e i f ) i konačno poboljšavao je stopu preživljavanja (sl.7g).

[0140] Ovi rezultati sugeririšu da LR12 zadržava isti zaštitni efekat i efikasnost koji pokazuje LR17.

Peptidi od 6 aminokiselina (LR6-1, LR6-2 i LR6-3) štite miševe od polimikrobne sepse.

[0141] LR6-1, LR6-2 i LR6-3 predstavljaju 6 amino kiselina poreklom od LR17 (tabela 1). Peptidi se primenjuju kod miševa sa sepsom kao što je opisano za LR17 i LR12 (videti u prethodnom tekstu).

[0142] Zaštita od sistemskog, bronho-alveolarnog zapaljenja i zapaljenja organa, poremećaja koagulacije, disfunkcije organa, bakterijskog klirensa i stope preživljavanja procenjuje se kako bi se utvrdilo da li ti peptidi zadržavaju isti zaštitni efekat i efikasnost koji pokazuju LR12 i LR17.

REFERENCE:

[0143] U ovoj prijavi različite reference opisuju stanje tehnike na koje se ovaj pronalazak odnosi.

Barrow, AD. et al. Cutting edge: TREM-like transcript-1, a platelet immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif encoding costimulatory immunoreceptor that enhances, rather than inhibits, calcium signaling via SHP-2. J. Immunol 172, 5838-5842 (2004).

2

Bleharski, J.R. et al. A role for triggering receptor expressed on myeloid cells-1 in host defense during the early induced and adaptive phases of the immune response. J. Immunol 170, 3812-3818 (2003).

Bouchon, A., Facchetti, F., Weigand, M.A. & Colonna, M. TREM-1 amplifies inflammation and is a crucial mediator of septic shock. Nature 410, 1103-1107 (2001).

Bouchon, A., Dietrich, J. & Colonna, M. Cutting edge: inflammatory responses can be triggered by TREM-1, a novel receptor expressed on neutrophils and monocytes. J. Immunol 164, 4991-4995 (2000).

Gibot, S. Clinical review: role of triggering receptor expressed on myeloid cells-1 during sepsis. Crit Care 9, 485-489 (2005).

Gibot, S. et al. Modulation of the triggering receptor expressed on the myeloid cell type 1 pathway in murine septic shock. Infect. Immun 74, 2823-2830 (2006).

Gibot, S. et al. TREM-1 promotes survival during septic shock in mice. Eur. J. Immunol 37, 456-466 (2007).

Hara, H. et al. The adaptor protein CARD9 is essential for the activation of myeloid cells through ITAM-associated and Toll-like receptors. Nat Immunol 8, 619-629 (2007).

Haselmayer, P., Grosse-Hovest, L., von Landenberg, P., Child, H. & Radsak, M.P.TREM-1 ligand expression on platelets enhances neutrophil activation. Blood 110, 1029-1035 (2007).

Haselmayer, P. et al. Signaling Pathways of the TREM-1- and TLR4-Mediated Neutrophil Oxidative Burst. J Innate Immun 1, 582-591 (2009).

Kelker, M.S., Debler, E.W. & Wilson, I.A. Crystal structure of mouse triggering receptor expressed on myeloid cells 1 (TREM-1) at 1.76 A. J. Mol. Biol 344, 1175-1181 (2004).

Kelker, M.S. et al. Crystal structure of human triggering receptor expressed on 30 myeloid cells 1 (TREM-1) at 1.47 A. J. Mol. Biol 342, 1237-1248 (2004).

Washington, A.V. et al. A TREM family member, TLT-1, is found exclusively in the alpha-granules of megakaryocytes and platelets. Blood 104, 1042-1047 (2004).

Washington AV, Gibot S, Acevedo I, Gattis J, Quigley L, Feltz R, De La Mota A, Schubert RL, Gomez-Rodriguez J, Cheng J, Dutra A, Pak E, Chertov O, Rivera L, Morales J, Lubkowski J, Hunter R, Schwartzberg PL, McVicar DW. TREM-like transcript-1 protects against inflammation-associated hemorrhage by facilitating platelet aggregation in mice and humans. J Clin Invest. 2009 Jun;119(6):1489-50.

1

2

4

Claims (15)

Patentni zahtevi

1. Polipeptid od 6 do 16 amino kiselina koji sadrži najmanje 6 uzastopnih amino kiselina iz amino kiselinske sekvence SEQ ID NO: 4, za upotrebu u lečenju zapaljenskog stanja, naznačen time što navedeni polipeptid sadrži amino kiselinsku sekvencu kao što je prikazana u SEQ ID NO: 8.

2. Polipeptid za upotrebu prema patentnom zahtevu 1 koji sadrži amino kiselinsku sekvencu kao što je prikazana u SEQ ID NO: 9.

3. Polipeptid za upotrebu prema patentnom zahtevu 1 koji se sastoji od amino kiselinske sekvence kao što je prikazana u SEQ ID NO: 9.

4. Polipeptid za upotrebu prema patentnom zahtevu 1 koji se sastoji od amino kiselinske sekvence kao što je prikazana u SEQ ID NO: 8.

5. Polipeptid od 6 do 16 amino kiselina koji se sastoji od amino kiselinske sekvence kao što je prikazana u SEQ ID NO: 8 ili koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazana u SEQ ID NO: 9.

6. Polipeptid prema patentnom zahtevu 5 koji se sastoji od amino kiselinske sekvence kao što je prikazana u SEQ ID NO: 9.

7. Polipeptid prema patentnom zahtevu 5 koji se sastoji od amino kiselinske sekvence kao što je prikazana u SEQ ID NO: 8.

8. Izolovana sekvenca nukleinske kiseline koja kodira polipeptid prema bilo kom od patentnih zahteva 5 do 7.

9. Plazmid koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 8.

10. Ekspresioni vektor koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 8.

11. Polipeptid za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, naznačen time što je zapaljensko stanje sepsa, teška sepsa, septični šok, hemoragijski šok, ishemija-reperfuzija ili pankreatitis.

12. Polipeptid za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, naznačen time što je zapaljensko stanje septični šok.

13. Farmaceutska kompozicija za upotrebu u lečenju zapaljenskog stanja, naznačena time što navedena farmaceutska kompozicija sadrži terapeutski efikasnu količinu najmanje jednog polipeptida prema bilo kom od patentnih zahteva 5 do 7, zajedno sa najmanje jednim farmaceutski prihvatljivim ekscipijensom.

14. Farmaceutska kompozicija koja sadrži najmanje jedan polipeptid prema bilo kom od patentnih zahteva 5 do 7, ili nukleinsku kiselinu prema patentnom zahtevu 8, ili plazmid prema patentnom zahtevu 9 ili ekspresioni vektor prema patentnom zahtevu 10, zajedno sa najmanje jednim farmaceutski prihvatljivim ekscipijensom.

15. Farmaceutska kompozicija za upotrebu u lečenju zapaljenskog stanja, naznačena time što navedena farmaceutska kompozicija sadrži terapeutski efikasnu količinu jednog polipeptida od 6 do 16 amino kiselina koji sadrži najmanje 6 uzastopnih amino kiselina iz amino kiselinske sekvence SEQ ID NO: 4, pri čemu navedeni polipeptid sadrži amino kiselinsku sekvencu kao što je prikazana u SEQ ID NO: 8, zajedno sa najmanje jednim farmaceutski prihvatljivim ekscipijensom.