RS60774B1 - Lečenje transtiretinske (ttr) amiloidoze na bazi antitela i odgovarajuća antitela humanog porekla - Google Patents

Lečenje transtiretinske (ttr) amiloidoze na bazi antitela i odgovarajuća antitela humanog porekla

Info

Publication number
RS60774B1
RS60774B1 RS20201093A RSP20201093A RS60774B1 RS 60774 B1 RS60774 B1 RS 60774B1 RS 20201093 A RS20201093 A RS 20201093A RS P20201093 A RSP20201093 A RS P20201093A RS 60774 B1 RS60774 B1 RS 60774B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
seq
positions
ttr
antibody
cdr2
Prior art date
Application number
RS20201093A
Other languages
English (en)
Inventor
Jan Grimm
Aubin Michalon
Original Assignee
Neurimmune Holding Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Neurimmune Holding Ag filed Critical Neurimmune Holding Ag
Publication of RS60774B1 publication Critical patent/RS60774B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4709—Amyloid plaque core protein
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/70—Mechanisms involved in disease identification
    • G01N2800/7047—Fibrils-Filaments-Plaque formation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)

Description

Opis
OBLAST PRONALASKA
[0001] Predmetni pronalazak se uopšteno odnosi na lečenje transtiretinske (TTR) amiloidoze na bazi antitela. Konkretno, predmetni pronalazak se odnosi na nove molekule koji se specifično vezuju za humani transtiretin (TTR) i njegove antigene, koji su okarakterisani u patentnim zahtevima, naročito na rekombinantna antitela humanog porekla, kao i njihove fragmente, derivate i varijante, koje prepoznaju pogrešno savijene, pogrešno sastavljene ili agregirane oblike TTR molekula ili njihove fragmente, a koja su korisna u lečenju bolesti i stanja koje ovakve patogene izoforme TTR indukuju.
[0002] Pored toga, predmetni pronalazak se odnosi na farmaceutske i dijagnostičke kompozicije koje sadrže ovakve vezujuće molekule, antitela i njihove surogate koji imaju vrednost, kako dijagnostičkog oruđa za identifikaciju bolesti srodnih TTR amiloidozi, tako i strategije za pasivnu vakcinaciju u cilju lečenja poremećaja srodnih bolestima u vezi sa TTR amiloidozom, kao što su hereditarna amiloidna polineuropatija (FAP), hereditarna amiloidna kardiomiopatija (FAC), senilna sistemska amiloidoza (SSA), sistemska hereditarna amiloidoza, leptomeningealna amiloidoza / amiloidoza centralnog nervnog sistema (CNS), uključujući Alchajmerovu bolest, očnu amiloidozu u vezi sa TTR, bubrežnu amiloidozu u vezi sa TTR, hipertiroksinemiju u vezi sa TTR, amiloidozu ligamenata u vezi sa TTR, uključujući sindrom karpalnog tunela, povrede rotatorne manžetne i lumbalnu spinalnu stenozu, kao i preeklampsiju.
[0003] Osim toga, predmetni pronalazak se odnosi na postupak za dijagnostifikovanje bolesti ili stanja koje je indukovano patogenim TTR izoformama, kao što su pogrešno savijen i/ili agregiran TTR prisutan u amiloidnim depozitima, gde se nivoi patoloških TTR izoformi testiraju u uzorku telesne tečnosti dobijenom od subjekta nakon primene anti-TTR antitela, pri čemu, kada se porede sa kontrolnim uzorkom uzetim pre primene, prisustvo ili promena u nivou patogenih TTR izoformi, što se utvrđuje, na primer, na osnovu prisustva imunskog kompleksa TTR i anti-TTR antitela, ukazuje na bolest i/ili stanje.
OSNOV PRONALASKA
[0004] Transtiretin (TTR), prethodno označen kao prealbumin, predstavlja solubilan protein od 127 amino kiselina (NCBI referentna sekvenca: NP_000362.1) koji je uključen u transport tiroksina i retinola u telu. Jetra izlučuje TTR u krv, horoidni pleksus u cerebrospinalnu tečnost, a eksprimiran je i u specifičnim tkivima kao što su alfa ćelije pankreasa ili epitel mrežnjače.
Sinteza TTR počinje na stadijumu embriona i nastavlja se tokom celog života. Prisutan je u visokim koncentracijama u plazmi (3.6-7.2 mM) i CSF (0.04-0.4 mM) i u fiziološkim uslovima uobičajeno obrazuje solubilni homotetramer od 55 kDa.
[0005] U specifičnim uslovima, koji nisu dobro razjašnjeni i mogu da uključuju kiseli pH, oksidativni stres i lokalne faktore, TTR protein zauzima alternativnu trodimenzionalnu konformaciju i postaje toksičan.
[0006] Toksičnost pogrešno savijenog TTR proteina otkrivena je tokom ispitivanja retkog, autozomalno-dominantnog neurodegenerativnog poremećaja označenog kao hereditarna amiloidna polineuropatija (FAP), koji pogađa odrasle ljude u srednjim godinama (PlantéBordeneuve et al., Lancet Neurol. 10 (2011), 1086-1097). FAP se odlikuje progresivnim senzornim, motornim i oštećenjima autonomnog sistema, koje dovode do smrti deceniju nakon postavljanja dijagnoze. Lezije na nevima su povezane sa deponovanjem amorfnih agregata i amiloidnih fibrila sačinjenih od TTR proteina. Supstitucija Val30Met je najčešća mutacija koja izaziva FAP, naročito u oblastima gde je bolest endemska, kao što je severna Portugalija, premda je u TTR genu već identifikovano više od 100 različitih mutacija; videti Tabelu IV koja sledi u tekstu. Patofiziološki mahanizam koji se ovde odvija identičan je za sve patogene mutacije, u tom smislu što mutacije menjaju strukturnu stabilnost TTR tetramera, pospešujući pogrešno savijanje TTR i dovodeći do obrazovanja toksičnih TTR vrsta (Saraiva et al., Curr. Med. Chem.
19 (2012), 2304-2311).
[0007] TTR toksičnost se takođe uočava i kao posledica mutacije Val122Ile, koja se sa visokom učestalošću (3-5%) uočava u afričko-američkoj i zapadnoafričkoj populaciji. Ova mutacija se dovodi u vezu sa hereditarnom amiloidnom kardiomiopatijom (FAC), stanjem kod koga obilna akumulacija TTR u miokardijumu dovodi do srčane slabosti i, na kraju, do srčane insuficijencije (Ruberg et al., Circulation.126 (2012), 1286-1300).
[0008] Mutacije u proteinskoj sekvenci TTR nisu apsolutni uslov za TTR toksičnost, pa je TTR protein divljeg tipa takođe sklon pogrešnom savijanju i obrazovanju toksičnih agregata- Na primer, senilna sistemska amiloidoza (SSA) se odlikuje srčanom slabošću i akumulacijom agregata TTR divljeg tipa u miokardijumu (Ikeda, Amyloid. 18 Suppl 1 (2011), 155-156; Dungu et al., Heart. 98 (2012), 1546-1554). Depoziti TTR divljeg tipa uočavaju se i u više slučajeva zapaljenja ligamenata i tetiva, uključujući sindrom karpalnog tunela, povrede rotatorske manžetne i lumbalnu spinalnu stenozu (Sueyoshi et al., Hum. Pathol. 42 (2011), 1259-1264; Gioeva et al., Amyloid. 20 (2013), 1-6). Osim toga, TTR amiloidoza je nedavno zabeležena i u placenti majki koje pate od preeklampsije (Kalkunte et al., Am. J. Pathol. 183 (2013) 1425-1436).
[0009] Tretmani za bolesti sa TTR amiloidozom su ograničeni i uglavnom invazivni, pri čemu je tretman prvenstveno uslovljen simptomima. U slučaju FAP, tretmani se oslanjaju na analgetike za regulisanje neuropatijskog bola, na transplantaciju jetre kako bi bio uklonjen glavni izvor mutiranog TTR proteina, i na lečenje lekom Tafamidis. Tafamidis je mali molekul koji se vezuje za TTR tetramer i stabilizuje njegovu konformaciju. On deluje protiv disocijacije TTR tetramera, što je korak koji ograničava brzinu na putu pogrešnog savijanja koje dovodi do obrazovanja toksičnih TTR vrsta. Tafamidis je odobren za lečenje FAP u Evropi, ali nije odobren u SAD i njegova terapeutska efikasnost je ograničena, u najboljem slučaju, na to da usporava napredovanje bolesti. Trenutno ne postoji tretman koji ciljano deluje na pogrešno savijeni TTR protein.
[0010] Imajući ovo u vidu, potrebne su nove tarapeutske strategije za efikasnu i bezbednu terapiju bolesti povezanih sa TTR amiloidozom.
[0011] Ovaj tehnički problem je rešen primerima izvođenja koji su okarakterisani u patentnim zahtevima, opisani u tekstu koji sledi i ilustrovani u Primerima i na Slikama.
KRATAK OPIS PRONALASKA
[0012] Predmetni pronalazak se odnosi na primere izvođenja okarakterisane u patentnim zahtevima i obezbeđuje anti-transtiretinska antitela (TTR) i ekvivalentne molekule koji se vezuju za TTR za upotrebu u profilaktičkom ili terapeutskom lečenju bolesti i stanja povezanih sa TTR amiloidozom. Preciznije, obezbeđena su terapeutski korisna rekombinantna antitela humanog porekla, kao i njihovi fragmenti i derivati koji prepoznaju pogrešno savijene, pogrešno savijene ili agregirane oblike TTR.
[0013] Pogrešno savijeni TTR agregati povezani su sa markerima ćelijskog stresa, oksidativnog stresa, inflamatornog odgovora i apoptoze godinama pre pojave simptoma (Macedo et al., Mol. Med. 13 (2007), 584-91). Prirodna sposobnost tela da prepoznaje nenormalno savijene proteine i razgradi ih, predstavlja zaštitni faktor, a razlike između pacijenata u njihovoj sposobnosti da eliminišu toksične TTR proteine sigurno doprinose razlikama u životnoj dobi prilikom pojave bolesti i u brzini napredovanja bolesti. U prilog ovoj hipotezi pokazano je da pacijenti kojima je presađena jetra od davaoca sa FAP brzo razvijaju antitela protiv patogenog TTR proteina (Ando i sar., Transplantacija 73 (2002), 751-755) i da pacijenti sa FAP sa visokim titrima antitela protiv mutiranog TTR proteina imaju kasniji početak bolesti od pacijenata bez takvih antitela (Obaiashi et al., Clin. Chim. Acta. 419 (2013), 127-131). Pored toga, pokazalo se da aktivna imunizacija protiv patogene TTR konformacije gotovo u potpunosti uklanja depozite TTR kod FAP transgenih miševa (Terazaki et al., Lab. Invest. 86 (2006), 23-31).
[0014] Međutim, iako bi moglo da deluje interesantno da se imunološki zasnovana strategija terapeutske intervencije istraži, do sada se upotreba anti-TTR antitela nije primenjivala za lečenje bolesti povezanih sa TTR. Na primer, u međunarodnoj patentnoj prijavi WO2010/030203 je opisano konkretno izolovano mišije monoklonsko antitelo za TTR i predloženo je za upotrebu u skriningu na FAP i u istraživanju i lečenju pridruženih bolesti. Međutim, s obzirom da monoklonska antitela miša indukuju odgovor humanog anti-mišijeg antitela (HAMA), ona nisu pogodna za terapiju kod ljudi. Stoga, pošto je međunarodna prijava istekla i još nema publikacija o daljem razvoju, očigledno je da se pristup zasnovan na terapijskim antitelima nije dalje sledio. Umesto toga, do sada je za anti-TTR antitela dodatno ispitivana samo njihova dijagnostička korist kod pacijenata sa TTR amiloidozom; videti, na primer, Phay M. et al., Rejuvenation Res.
2013 Oct 28. [elektronska objava pre štampanja].
[0015] Suprotno tome, u eksperimentima izvedenim u skladu sa predmetnim pronalaskom uspešno su izolovana monoklonska antitela humanog porekla, specifična za TTR, koja su sazrela u ljudskom telu i koja su specifična za pogrešno savijene, pogrešno sastavljene, mutirane i/ili agregirane vrste TTR i/ili njihove fragmente. Ljudski subjekti i pacijenti, redom, budući da su izvor B ćelija iz kojih su izolovana monoklonska antitela humanog porekla i cDNK koja kodira njihov varijabilni domen, redom, nisu pokazali značajnu količinu pogrešno savijenih TTR i bili su bez simptoma stanja povezanih sa patogenim izoformama. Međutim, u drugom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, izvor B ćelija iz kojih mogu da se izoluju monoklonska antitela humanog porekla i cDNA koja kodira njihov promenljivi domen, redom, su pacijenti koji pokazuju simptome bolesti i/ili poremećaja povezanog sa TTR amiloidozom. Zbog toga je razumno očekivati da humana monoklonska anti-TTR antitela prema predmetnom pronalasku i njihovi derivati, pored toga što nisu imunogena za čoveka, pokazuju terapeutski korisno delovanje.
[0016] Predmetni pronalazak je prema tome usmeren na rekombinantna antitela humanog porekla, antigen-vezujuće fragmente i slične antigen-vezujuće molekule, kao što su okarakterisani u patentnim zahtevima, koji su sposobni da specifično prepoznaju TTR. Ako nije drugačije naznačeno, pod „specifično prepoznaju TTR”, “antitelo specifično na/za TTR” i “anti-TTR antitelo” misli se na antitela koja se konkretno, generalno, i kolektivno vezuju za nativni monomerni oblik TTR; antitela koja se specifično vezuju za bilo koji oblik TTR, npr. mutirani TTR, oligomerni, fibrilarni i/ili nefibrilarni TTR. Ovde su obezbeđena antitela humanog porekla, selektivna za oblike potpune dužine i/ili fragmente i/ili pogrešno savijene, pogrešno sastavljene i/ili agregirane oblike TTR.
[0017] Kao što je ranije pomenuto, poželjno je da anti-TTR antitelo prema predmetnom pronalasku bude rekombinantno antitelo, pri čemu tri regiona za određivanje komplementarnosti (CDR regioni) varijabilnog teškog i lakog lanca i/ili u osnovi ceo varijabilni region kodira cDNK izvedena iz mRNK koja je dobijena iz humane memorijske B ćelije koja je proizvela anti-TTR antitelo. U poželjnom primeru izvođenja, anti-TTR antitelo prema predmetnom pronalasku pokazuje, u bilo kojoj kombinaciji još jedno vezujuće i biološko svojstvo, kao što je prikazano za predmetna antitela ilustrovana u priloženim primerima i slikama, poželjno još jedno vezujuće i biološko svojstvo kao što je prikazano za primere antitela NI-301.59.F1, NI-301.35G11 i NI-301.37F1.
[0018] U posebno poželjnom primeru izvođenja prema predmetnom pronalasku, anti-TTR antitelo ili njegov TTR-vezujući fragment pokazuju imunološke karakteristike vezivanja antitela koje se karakteriše promenljivim regionima VH i VL, kao što je prikazano na Sl.1.
[0019] Antigen-vezujući fragment antitela može da bude jednolančani Fv fragment, F(ab’) fragment, F(ab) fragment i F (ab’)2fragment ili bilo koji drugi antigen-vezujući fragment. U specifičnom primeru izvođenja, u daljem tekstu, antitelo ili njegov fragment je humano antitelo IgG izotipa. Alternativno, antitelo je himerno humano-glodarsko ili rodentizovano, kao što je mišije ili murinizovano, pacovsko ili ratinizovano antitelo, pri čemu su glodarske verzije posebno korisne za dijagnostičke postupke i studije na životinjama.
[0020] Dodatno se predmetni pronalazak odnosi na kompozicije koje sadrže antitelo prema predmetnom pronalasku ili njegove aktivne fragmente i na imunoterapeutske i imunodijagnostičke postupke u kojima se koriste takve kompozicije u cilju prevencije, dijagnostifikovanja ili lečenja poremećaja povezanih sa TTR amiloidozom, pri čemu se efikasna količina kompozicije primenjuje kod pacijenta kome je to potrebno.
[0021] Predmetni pronalazak se takođe odnosi na polinukleotide koji kodiraju najmanje varijabilni region imunoglobulinskog lanca antitela prema pronalasku. Navedeni varijabilni region sadrži regione koji određuju komplementarnost (CDR regione) VH i VL promenljivog regiona, kao što je prikazano na Sl. 1. U poželjnom primeru izvođenja prema pronalasku, polinukleotid je cDNA, poželjno izvedena iz mRNK dobijene iz humanih memorijskihe B ćelija koje proizvode antitela reaktivna sa mutiranim, pogrešno savijenim, pogrešno sastavljenim i/ili agregiranim TTR vrstama.
[0022] Shodno tome, predmetni pronalazak takođe obuhvata vektore koji sadrže navedene polinukleotide i pomoću njih transformisane ćelije domaćina, kao i njihovu upotrebu za proizvodnju antitela i ekvivalentnih vezujućih molekula koji su specifični za TTR. U dodatnom primeru izvođenja prema predmetnom pronalasku, antitela ili vezujući molekuli mogu da vežu pogrešno savijene, pogrešno sastavljene ili agregirane TTR vrste ili njihove fragmente. U oblasti su poznati sredstva i postupci za rekombinantnu proizvodnju antitela i njihovih surogata, kao i postupci skrininga za kompetitivne vezujuće molekule, koji mogu ali ne moraju da budu antitela. Međutim, kako je ovde opisano, posebno u pogledu terapeutskih primena kod ljudi, antitelo prema predmetnom pronalasku je humano antitelo u tom smislu što je primena navedenog antitela u osnovi bez imunskog odgovora usmerenog protiv takvog antitela, koji se inače uočava za himerna, pa čak i humanizovana antitela.
[0023] Osim toga, ovde su prikazane kompozicije i postupci koji mogu da se koriste za identifikaciju TTR, posebno mutiranih, pogrešno savijenih, pogrešno sastavljenih ili agregiranih TTR vrsta ili fragmenata u uzorcima i/ili in vivo. Prikazana anti-TTR antitela i njihovi vezujući fragmenti mogu da se koriste za pretragu ljudske krvi, plazme, seruma, pljuvačke, peritonealne tečnosti, cerebrospinalne tečnosti ("CSF") i urina, na prisustvo TTR i/ili mutiranih, pogrešno savijenih, pogrešno sastavljenih ili agregiranih TTR vrsta ili njihovih fragmenata u uzorcima, na primer, korišćenjem ELISA testova ili površinski prilagođenog testa. U jednom primeru izvođenja, predmetni pronalazak se odnosi na postupak dijagnostifikovanja ili praćenja napredovanja poremećaja povezanog sa mutiranim, pogrešno savijenim, pogrešno sastavljenim ili agregiranim TTR vrstama ili njihovim fragmentima kod subjekta, pri čemu postupak uključuje utvrđivanje prisustva mutiranih, pogrešno savijenih, pogrešno sastavljenih, ili agregiranih TTR vrsta ili fragmenata u uzorku dobijenom od subjekta kome se postavlja dijagnoza, sa najmanje jednim antitelom prema predmetnom pronalasku, pri čemu prisustvo pogrešno savijenih, pogrešno sastavljenih ili agregiranih TTR vrsta ili fragmenata ukazuje na poremećaj.
[0024] Osim toga, u jednom primeru izvođenja prema predmetnom pronalasku, obezbeđena su anti-TTR antitela za pripremu kompozicije za in vivo detekciju (koja se takođe naziva in vivo vizualizacija) ili za ciljano delovanje terapijskog i/ili dijagnostičkog sredstva na TTR, naročito na mutirane, pogrešno savijene, pogrešno sastavljene ili agregirane TTR vrste ili fragmente u telu čoveka ili životinje. Ovde prikazani postupci i kompozicije mogu da pomognu kod poremećaja povezanih sa TTR amiloidozom i karakterišu se, npr., pojavom oblika TTR i mogu da se koriste za praćenje napredovanja bolesti i terapeutske efikasnosti terapije koja je obezbeđena subjektu, na primer kod in vivo dijagnostičkih metoda povezanih sa vizualizacijom. Prema tome, u jednom primeru izvođenja je obezbeđeno anti-TTR antitelo i/ili TTR vezujući molekul prema predmetnom pronalasku, pri čemu navedena in vivo detekcija (vizualizacija) obuhvata scintigrafiju, pozitronsku emisionu tomografiju (PET), jednofotonsku emisionu tomografiju (SPECT), blisko infracrveno (NIR) optičko snimanje ili magnetnu rezonancu (MRI).
[0025] Stoga ova prijava dodatno prikazuje postupke za lečenje, dijagnozu ili prevenciju bolesti povezane sa TTR amiloidozom. Ovi postupci uključuju primenu efikasne koncentracije poželjno humanog antitela ili derivata antitela kod subjekta gde antitelo ciljano deluje na TTR ili njegove fragmente, poželjno pogrešno savijene, pogrešno sastavljene ili agregirane vrste TTR ili njihove fragmente.
[0026] U dodatnom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na postupak dijagnostifikovanja bolesti povezane sa TTR amiloidozom, praćenja lečenja bolesti anti-TTR antitelom ili određivanja dijagnostičke ili terapeutske koristi od anti-TTR antitela, koji obuhvata određivanje nivoa pogrešno savijenog i/ili agregiranog TTR u uzorku, na primer u krvi dobijenoj od subjekta nakon primene anti-TTR antitela kod subjekta, pri čemu prisustvo ili povišeni nivo pogrešno savijenog i/ili agregiranog TTR u uzorku dobijenom od subjekta u poređenju sa kontrolom kao što je uzorak dobijen od subjekta pre primene anti-TTR antitela, ukazuje na bolest povezanu sa TTR amiloidozom, pri čemu anti-TTR antitelo predstavlja antitelo prema predmetnom pronalasku.
[0027] U jednom poželjnom primeru izvođenja prema predmetnom pronalasku, posebno kada se koriste ne-humane životinje za ispitivanje rekombinantnih antitela humanog porekla, kao što je prikazano u Primeru 13, i druga anti-TTR antitela predviđena za upotrebu kod ljudi, nivo pogrešno savijenog i/ili agregiranog TTR u uzorku se u principu ispituje određivanjem kompleksa obrazovanog između anti-TTR antitela i pogrešno savijenog i/ili agregiranog TTR, na primer imuno-precipitacijom sa anti-humanim IgG ili anti-idiotipskim antitelom.
[0028] Što se tiče dijagnostičkog aspekta, naročito za ljudskog subjekta i pacijenta, prisustvo i povišeni nivo pogrešno savijenog i/ili agregiranog TTR i njegovog kompleksa sa anti-TTR antitelom, ukazuje na prisustvo TTR amiloidnih depozita u ljudskom telu , na primer u srcu, perifernom nervnom sistemu (PNS), očima, mišićima, gastrointestinalnom traktu, bubrezima, vaskularnom sistemu i centralnom nervnom sistemu (CNS) pacijenta ili subjekta. Prema tome, postupak prema predmetnom pronalasku omogućava identifikaciju i određivanje bolesti povezane sa TTR amiloidozom u telu subjekta, sa jedne strane, i uklanjanje TTR depozita iz tela pacijenta, sa druge strane, što takođe ukazuje na terapeutski napredak datog lečenja i efikasnost leka kao što je anti-TTR antitelo, za lečenje TTR amiloidoze. Dakle, kao što je prikazano u Primeru 13, anti-TTR antitelo prema predmetnom pronalasku u stanju je da veže pogrešno savijeni i/ili agregirani TTR sa dovoljnim afinitetom da promeni stabilnost patoloških TTR depozita, kao što je hvatanje i uklanjanje pogrešno savijenog i/ili agregiranog TTR iz depozita u telesnu tečnost, posebno u krv. Navedeni vremenski interval nakon primene, tj. vremenski okvir nakon kog se meri nivo patološkog TTR i kompleksa sa anti-TTR antitelom, određuje ordinirajući lekar. Obično se koristi vremenski interval kraći od nedelje. U poželjnom primeru izvođenja, nivo patološkog TTR u uzorku dobijenom od pacijenta ili subjekta nakon primene anti-TTR antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta kod pacijenta ili subjekta određuje se nakon manje od 48 sati; videti takođe Primer 13.
[0029] Predmetni pronalazak se takođe odnosi na upotrebu bilo kog anti-TTR antitela i TTR vezujućeg molekula u postupku koji je opisan prethodno u tekstu. Međutim, zbog povoljnih svojstava i posebno zbog toga što je humanog porekla, poželjna je upotreba ovde prikazanog anti-TTR antitela. U poželjnom primeru izvođenja, antitelo pokazuje suštinski iste vezivne i biološke aktivnosti kao bilo koje antitelo odabrano od NI-301.59F1, NI-301.35G11, NI301.37F1, NI-301.2F5, NI-301.28B3, NI-301.119C12, NI -301.5D8, NI-301.9D5, NI-301.104F5, NI-301.21F10, NI301.9G12, NI-301.12D3, NI-301.37F1-PIMC, NI-301.44E4, NI-301.18C4, NI-301.11A10, NI-301.3C9, NI-301.14D8, NI301.9Ks4 i NI-301.14C3. Anti-TTR antitelo takođe može da se izmeni kako bi se olakšalo rukovanje postupkom dijagnostifikovanja, uključujući obeležavanje antitela, kao što je detaljno opisano u nastavku.
[0030] Dodatni primeri izvođenja prema predmetnom pronalasku biće očigledni iz opisa i primera koji slede.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0031]
Sl. 1: Amino kiselinske sekvence varijabilnih regiona humanih antitela NI-
301.59F1, NI301.35G11, NI-301.37F1, NI-301.2F5, NI-301.28B3, NI-
301.119C12, NI-301.5D8, NI301.9D5, NI-301.104F5, NI-301.21F10, NI-301.9G12, NI-301.12D3, NI-301.37F1PIMC, NI-301.44E4, NI-301.18C4, NI-301.11A10, NI-301.3C9, NI301.14D8, NI301.9X4 i NI-301.14C3. Okvirni regioni (FR) i regioni koji odeređuju komplementarnost (CDRs regioni) su označeni tako što su CDR regioni podvučeni. Korišćena je šema numeracije po Kabatu (cf. http://www.bioinf.org.uk/abs/).
Sl. 2: Vezivanje za agregirani TTR divljeg i mutiranog tipa pomoću direktnog ELISA testa. A, B, C: Ploče za ELISA test su obložene agregiranim humanim TTR divljeg tipa (●), agregiranim rekombinantnim V30M-TTR (▼) i goveđim serumskim albuminom (BSA) (■) pri 10 µg/ml, i inkubirane sa sledećim humanim monoklonskim antitelima u opsegu koncentracija od 4 pM do 400 nM: A) NI-301.59F1, B) NI-301.35G11 i C) NI-301.37F1. EC50
vrednosti su procenjene uklapanjem tačaka podataka putem metode najmanjih kvadrata. NI-301.59F1: agregirani wt-TTR EC50= 3.0 nM, agregirani V30M-TTR EC50= 15.5 nM NI-301.35G11: agregirani wt-TTR EC50= 3.9 nM, agregirani V30M-TTR EC50= 5.0 nM NI-301.37F1: agregirani wt-TTR EC50= 0.35 nM, agregirani V30M-TTR EC50= 0.15 nM
Sl. 3: Specifičnost za agregirani TTR na dot blotu. Humani TTR protein divljeg tipa nativnoj (1) ili agregiranoj (2) konformaciji, i agregirani rekombinantni V30M-TTR protein (3) deponovani su na nitroceluloznu membranu i inkubirani sa sledećim antitelima: A) komercijalnim zečijim monoklonskim antitelom protiv TTR (Dako-A0002; 150 ng/ml), B) NI-301.59F1 C) NI-301.35G11 i D) NI-301.37F1 (B, C i D: humana monoklonska antitela pri 50 nM).
Sl. 4: Specifičnost za agregirani TTR na Western blotu. Humani TTR protein divljeg tipa (300 ng) u nativnoj (1) ili agregiranoj (2) konformaciji, i ekstrakt mišije jetre divljeg tipa (10 µg ukupnog proteina) (3) naneseni su na SDS-PAGE gel i obrađeni za western-blot analizu, sa sledećim antitelima: A) komercijalnim zečijim monoklonskim antitelom protiv TTR (Dako-A0002; 150 ng/ml), B) NI-301.59F1 C) NI301.35G11 i D) NI-301.37F1 (B, C i D: humana monoklonska antitela pri 50 nM). Da bi se sprečila disocijacija agregata veće molekulske težine, uzorak agregiranog TTR bio je fiksiran glutaraldehidom (1%, 5 min) pre nego što je nanesen na gel.
Sl. 5: Odsustvo vezivanja za TTR iz humane plazme na western blotu. Uzorci plazme (0.5 ml) dobijeni od kontrola (n=5), asimptomatskih nosilaca mutacija (n=5) i FAP pacijenata (n=4) naneseni su na SDS-PAGE gel i obrađeni za western-blot analizu sa sledećim antitelima: A) komercijalnim zečijim monoklonskim antitelom protiv TTR (DakoA0002; 150 ng/ml), B) samo sekundarnim antitelom (anti-humano IgG-HRP, razblaženje 1/10000), C) NI301.35G11 i D) NI-301.37F1 (C i D: humana monoklonska antitela pri 50 nM).
Sl. 6: Odsustvo vezivanja za TTR iz humane plazme na dot blotu. Prečišćeni TTR protein divljeg i mutiranog tipa u nativnoj i agregiranoj konformaciji, i uzorci plazme dobijeni od kontrola, asimptomatskih nosilaca mutacija i FAP
pacijenata, deponovani su na nitroceluloznu membranu i inkubirani sa sledećim antitelima: A) komercijalnim zečijim monoklonskim antitelom protiv TTR (Dako-A0002; 150 ng/ml), B) samo sekundarnim antitelom (anti-mišiji IgG2a-HRP, razblaženje 1/10000), i C) mišijim himernim antitelom NI-301.mur35G11 (10 nM). Uzorci 1-6: 150 ng 1) agregirani wt-TTR, 2) nativni wt-TTR, 3) BSA, 4) nativni V30M-TTR, 5) nativni L55P-TTR i 6) nativni Y78F-TTR. Uzorci 7-18: 2 µl plazme sakupljene od 7-10) kontrola (n=4), 11-14) asimptomatskih nosilaca mutacije (n=4) i 15-18) FAP pacijenata (n=4).
Sl. 7: Specifično vezivanje za agregirani TTR u rastvoru. Humani TTR protein divljeg i rekombinantnog tipa u nativnoj i agregiranoj konformaciji i uzorak humane plazme u 3 različita razblaženja, korišćeni su za TTR imunoprecipitaciju (IP) upotrebom sledećih antitela: A) komercijalnog zečijeg monoklonskog antitela protiv TTR (Dako-A0002), B) NI-301.35G11 i C) NI-301.37F1. Imunoprecipitirani proteini podvrgnuti su SDS-PAGE i detektovani pomoću western blota (WB) sa Dako-A0002 antitelom (150 ng/ml). Trake 1-2: WB kontrole nanošenja: 300 ng 1) humani wt-TTR, 2) rekombinantni wt-TTR Trake 3-6: IP na prečišćenom TTR proteinu: 3) humani nativni wt-TTR, 4) humani agregirani wt-TTR, 5) rekombinantni nativni wt-TTR i 6) rekombinantni agregirani wt-TTR Trake 7-10: IP na humanoj plazmi razblaženoj 7) 10 puta, 8) 100 puta, 9) 1000 puta pomoću PBS, i 10) samo na PBS
Sl. 8: Specifično vezivanje za TTR na tkivu FAP miša. Transgeni miševi koji eksprimiraju humani V30M-TTR alel na TTR nokaut (KO) pozadini reprodukuju histopatološke oznake za FAP, uključujući amorfne i amiloidne depozite TTR u različitim tkivima. Preseci tkiva jetre i creva sakupljeni od A) FAP miševa i B) TTR-KO miševa obrađeni su za imunohistohemiju upotrebom sledećih antitela: 1) komercijalnog zečijeg monoklonskog antitela protiv TTR (DakoA0002; 1/1000 dilution), 2) NI-301.35G11 i 3) NI-301.37F1 (2 i 3: humana monoklonska antitela pri 50 nM).
Sl. 9: Specifično vezivanje za depozite pogrešno savijenog TTR ali ne i nativnog TTR u ljudskom tkivu. Antitela su okarakterisana u pogledu svoje sposobnosti da vezuju TTR na presecima biopsija kože FAP pacijenata i zdravog
pankreasa kao kontrole: akumulacije pogrešno savijenog TTR koje su karakteristične za FAP prisutne su u biopsijama kože pacijenta, dok alfa ćelije pankreasa pokazuju endogenu ekspresiju TTR. Preseci su obrađeni za imunohistohemiju upotrebom sledećih antitela: 1A) komercijalnog zečijeg monoklonskog antitela protiv TTR (DakoA0002; razblaženje 1/1000), 1B) HRP-konjugovanog anti-zečijeg IgG antitela (razblaženje 1/125), 2A) mišijeg himernog antitela NI-301.mur35G11 (50 nM), 2B) HRP-konjugovanog antimišijeg IgG2a antitela (razblaženje 1/125), 3A) NI301.37F1 (50 nM), i 3B) HRP-konjugovanog anti-humanog IgG (razblaženje 1/125).
Sl. 10: Procena vezivnih TTR epitopa pepsken analizom.Epitopi za vezivanje antitela na TTR određeni su upotrebom metode skeniranja peptida. Osim peptida koji pokrivaju celu sekvencu humanog TTR divljeg tipa (tačke 1 do 29), na membrani su predstavljene i odabrane TTR mutacije (tačke 30 do 44).
Membrana za skeniranje peptida je inkubirana sa sledećim antitelima pri 50 nM: A) NI301.59F1, B) NI301.35G11 i C) NI-301.37F1. Na osnovu pregleda datog u Tabeli D): NI-301.59F1 vezuje EEEFVEGIY (TTR 61-69); NI-301.35G11 vezuje GELHGLTTEEE (TTR 53-63); mutacija L55P sprečava vezivanje antitela; i NI301.37F1 vezuje WEPFA (TTR 41-45); mutacija E42G sprečava vezivanje antitela. Kako bi se odredili zahtevi pomenutih epitopa kad je u pitanju sekvenca, epitopi koji vezuju antitelo na TTR dodatno su identifikovani upotrebom metode alaninskog skena. Cela sekvenca humanog TTR proteina divljeg tipa je predstavljena na membrani u vidu seta od 151 sukcesivnog peptida dužine od po 15 amino kiselina, počevši od svake amino kiseline TTR proteina. Za svaki peptid, amino kiselina na poziciji 10 je zamenjena alaninom, ili glicinom ili prolinom, ukoliko je inicijalna amino kiselina bila alanin. Membrana za sken peptida je inkubirana sa sledećim antitelima pri 20 nM: E) NI-301.59F1, F) NI301.35G11 i G) NI-301.37F1. Na osnovu pregleda datog u Tabeli H):
NI-301.59F1 vezuje EEFXEGIY (TTR 62-69).
NI-301.35G11 vezuje ELXGLTXE (TTR 54-61).
NI-301.37F1 vezuje WEPFA (TTR 41-45), pri čemu X označava amino kiselinu; Zamena E42 alaninom nije onemogućila vezivanje, ali je zamena guaninom sprečila vezivanje antitela, kao što se vidi iz C.
Sl. 11: Kinetika vezivanja antitela za TTR protein u rastvoru procenjena je rezonancijom površinskog plazmona.
Kinetika vezivanja antitela NI-301.37F1 za TTR protein merena je rezonancijom površinskog plazmona (SPR). Antitelo NI-301.37F1 je uhvaćeno senzorom pomoću anti-humanog IgG antitela, a tok rastvora TTR proteina je išao preko površine senzora pri koncentracijama u opsegu od 3.2 do 316 nM. Jednostavan model vezivanja 1:1 upotrebljen je za uklapanje podataka i izvođenje odgovarajućih konstanti asocijacije (ka) i disocijacije (kd), kao i afiniteta (KD). Vezivna svojstva su određena za A) humani TTR protein divljeg tipa u nativnoj konformaciji, B) denaturisani humani TTR protein divljeg tipa (pogrešno savijena konformacija), i C) rekombinantni mutirani TTR-L55P protein. Nativni TTR divljeg tipa: ka= nije određena, kd= nije određena, KD>316 nM Denaturisani TTR divljeg tipa: ka=2.1 104 M-1s-1, kd=2.6 10-5 s-1, KD=1.2 nM Rekombinantni TTR-L55P: ka=3.3 104 M-1s-1, kd=4.610-5 s-1, KD=1.4 nM
Sl. 12: Hronični tretman anti-TTR antitelom smanjuje patološke depozite TTR kod modela FAP miša.
FAP miševi (Tg(6.0hMet30) x muTTR-KO) jednom nedeljno su primali mišije himerno antitelo NI-301.37F1 ili izotipsko kontrolno antitelo pri 3 mg/kg intraperitonealno tokom 12 nedelja. Na kraju tretmana, tkiva su sakupljena i mera u kojoj se TTR deponovao je kvantifikovana pomoću imunofluorescencije. A) Efekat tretmana kod miševa starih 7 meseci (n=14-15 miševa po grupi); B) Efekat tretmana kod miševa starih 17 meseci (n=10 miševa po grupi). Poređenje grupa pomoću dvostranog neuparenog t-testa.
Sl. 13: Vezivanje antitela za patološke depozite TTR in vivo.
Zauzetost ciljnih molekula je okarakterisana u adultnim FAP miševima (7 meseci) 48 sati nakon primene jedne doze antitela NI-301.37F1 pri 30 mg/kg intraperitonealno, ili PBS rastvora. Patološki depoziti TTR i lokalizacija injeciranog antitela detektovani su istovremeno imunofluorescencijom.
A, D) Patološki depoziti TTR deposits u bubrezima miša injeciranog sa (A) NI-301.37F1- ili (D) PBS. B, E) Detekcija humanog antitela u miševima injeciranim sa (B) NI-301.37F1- ili (E) PBS. C, F) Superponirane slike koje pokazuju kolokalizaciju TTR i NI-301.37F1 (C) i (F) odsustvo nespecifičnog bojenja.
Sl. 14: Detekcija van tkiva pogrešno savijenog TTR in vivo.
Adultni FAP miševi primili su jednokratno antitelo NI-301.37F1 ili izotipsko kontrolno antitelo pri 3 mg/kg, intraperitonealno. Uzorci krvi su sakupljeni pre injeciranja antitela (t=0) i 48 sati nakon injeciranja antitela (t=48h). Uzorci plazme su obrađeni imunoprecipitacijom pomoću anti-humanog IgG antitela, i analizirani western blot analizom pri čemu je za detekciju upotrebljeno: A) anti-TTR poliklonsko antitelo nezavisno od konformacije (Dako A0002, 150 ng/ml) i B) NI-301.37F1 (20 nM). Paralelno je uzorak plazme dobijen od FAP miša koji nije injeciran inkubiran sa antitelom NI-301.37F1 in vitro, pre
obrade.
Sl. 15: Specifičnost antitela je procenjena u odnosu na agregirajuće proteine ELISA testom. Specifičnost antitela za TTR protein procenjena je merenjem vezivanja za odabrane agregirajuće proteine direktnim ELISA testom. Vezivanje antitela je procenjeno pri 4 i 20 nM i intenzitet signala je izražen kao promena u odnosu na osnovne nivoe koji su za svaki test mereni u odsustvu anti-TTR antitela.
A-B) vezivanje NI-301.37F1 je testirano pri 20 (A) i 4 nM (B)
C-D) vezivanje NI-301.44E4 je testirano pri 20 (C) i 4 nM (D).
DETALJAN OPIS PRONALASKA
[0032] Predmetni pronalazak uopšteno se odnosi na imunoterapiju i neinvazivne postupke za detekciju bolesti i stanja povezanih sa prisustvom patoloških, često mutantnih i/ili pogrešno savijenih izoformi transtiretina (TTR). Specifičnije, predmetni pronalazak se odnosi na rekombinantna monoklonska antitela humanog porekla i njihove antigen-vezujuće fragmente, kao što su okarakterisani u patentnim zahtevima, koji su formirani na osnovu informacije o sekvenci dobijenoj od odabranih populacija humanih davalaca i koji su u stanju da se vezuju za ovakve TTR izoforme i njihove antigene. Rekombinantno monoklonsko antitelo humanog porekla prema predmetnom pronalasku pogodno pokazuje karakteristiku da se specifično vezuje za pogrešno savijene, pogrešno sastavljene, mutirane i/ili agregirane TTR vrste i/ili njihove fragmente, omogućavajući ciljano delovanje na patološki izmenjene TTR vrste, radi lečenja i/ili postavljanja dijagnoze. Može se opravdano očekivati da dobijena rekombinantna antitela prema predmetnom pronalasku, zahvaljujući svom humanom poreklu, budu efikasna i bezbedna kao terapeutska sredstva, kao i visoko specifična kao dijagnostički reagens za detekciju patološkog TTR, bez produkovanja lažno pozitivnih rezultata.
[0033] Pored toga, antitelo prema predmetnom pronalasku kao i njegovi derivati, mogu da se koriste za kombinovanu terapiju kod pacijenata nakon transplantacija organa, kod kojih svakako postoji rizik od razvoja TTR amiloidoze, usled npr. njegovog deponovanja, npr. naslednih mmutacija u TTR ili nedostatka u proizvodnji TTR u jetri. Dakle, kao naročito pogodan primer izvođenja, predmetni pronalazak se odnosi na humano monoklonsko antitelo i bilo koje njegove derivate, ovde opisane, za upotrebu u lečenju pacijenata, bilo kao jedini tretman, bilo pri lečenju pacijenata koji primaju npr. imunosupresivne lekove nakon transplantacije organa ili sa drugim sredstvima koja se koriste za simptome povezane sa TTR amiloidozom, pri čemu je antitelo prema predmetnom pronalasku i bilo koji od njegovih derivata dizajniran tako da se primenjuje istovremeno sa imunosupresivnim lekom i/ili sredstvom koje suprimira dodatne sporedne efekte ili sekvencijalno, pre ili posle primene tog sredstva. U ovom kontekstu, anti-TTR antitelo i TTR-vezujući fragment prema predmetnom pronalasku poželjno su suštinski neimunogeni kod ljudi non-immunogenic in human. U jednom primeru izvođenja prema predmetnom pronalasku, obezbeđene su farmaceutske kompozicije koje sadrže i humano monoklonsko antitelo prema predmetnom pronalasku ili bilo koje njegove derivate i jedan ili više imunosuprimirajućih lekova i/ili koje se koriste za simptome povezane sa TTR amiloidozom.
I. Definicije
[0034] Osim ako nije drugačije navedeno, izrazu koji se ovde koristi daje se značenje koje je obezbeđeno u rečniku Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, Oxford University Press, 1997, revised 2000 and reprinted 2003, ISBN 019 850673 2.
[0035] Osim ako drugačije nije specifično naznačeno, izraz "TTR", koristi se naizmenično da bi se secifično označili različiti oblici transtiretina (TTR). Izraz "TTR" se takođe koristi da se uopšteno identifikuju drugi konformeri TTR, na primer, oligomeri i/ili pogrešno savijeni, pogrešno sastavljeni i/ili agregirani oblici TTR. Izraz "TTR" takođe se koristi da se kolektivno označe sve vrste i oblici TTR, kao što je mutirani TTR. Slova dodata ispred izraza TTR koriste se da bi se naznačilo iz kog organizma konkretni ortolog potiče, npr. hTTR za humani TTR ili mTTR za mišije poreklo. Pored toga, osim ako nije drugačije naznačeno, sistem numeracije za amino kiselinsku sekvencu TTR koji se ovde koristi odnosi se na zreli TTR protein, tj.onakav TTR protein kakav se izlučuje iz ćelija nakon odvajanja signalnog peptida. Ova numeracija je ista ona koja se koristi kako bi se definisale mutacije TTR uočene kod pacijenata, kao što su TTR-V30M ili TTR-L55P, ali se razlikuje od numeracije koja se koristi za sekvencu transtiretinskog prekursorskog proteina (NCBI referentna sekvenca: NP_000362.1). U ovom kontekstu, pozicija i supstituisana amino kiselina u mutantnom TTR mogu da budu označene na različite ali ekvivalentne načine; videti, npr., "TTR-V30M" i "V30M-TTR".
[0036] Ovde prikazana anti-TTR antitela specifično vezuju TTR i njegove epitope i različite konformacije TTR i njegovih epitopa. Na primer, ovde su prikazana antitela koja specifično vezuju patološki izmenjene TTR vrste ili njihove fragmente, kao što su oligomeri/fibrili i/ili mutirane, pogrešno savijene, pogrešno sastavljene i/ili agregirane oblike TTR ili njihove fragmente. Izraz (patološki) mutiran, pogrešno savijen, pogrešno sastavljen agregiran/agregati TTR koristi se naizmenično da bi se specifično označili prethodno pomenuti oblici. Izraz (patološki) "agregirani oblici" ili "agregati", kako se ovde koristi, opisuje proizvod akumulacije ili obrazovanja klastera usled pogrešne/patološke međusobne interakcije TTR. Moguće je da se ovi agregati, akumulacije ili oblici klastera, u osnovi sastoje, ili sastoje, i od TTR i/ili TTR fragmenata, i od nefibrilnih oligomera i/ili fibrilnih oligomera i njihovih fibrila. Kako se ovde koristi, referenca na antitelo koje "specifično vezuje", "selektivno vezuje", ili "preferencijalno vezuje" TTR, odnosi se na antitelo koje ne vezuje druge nesrodne proteine. U jednom primeru, ovde prikazano TTR antitelo može da veže TTR ili njegov epitop, a ne pokazuje nikakvo vezivanje za druge proteine iznad vrednosti otprilike dvostruko veće od osnovnog nivoa. U poželjnom primeru izvođenja, antitelo prema predmetnom pronalasku u osnovi ne prepoznaje nesrodne proteine koji obrazuju amiloid, odabrane iz grupe koja se sastoji od alfa-sinukleina (asyn), Tau, DNK-vezujući protein transaktivacionog odgovora 43 (TDP-43), serumski amiloid A (SAA), hantingtin protein (HTT); videti, npr. Sl. 15. Antitelo koje "specifično vezuje" ili "selektivno vezuje" TTR konformer, odnosi se na antitelo koje ne vezuje sve konformacije TTR, tj., ne vezuje najmanje jedan TTR konformer.
[0037] Na primer, ovde su prikazana antitela koja mogu preferencijalno da se vezuju za te pogrešno savijene, pogrešno sastavljene i/ili agregirane oblike TTR kako in vitro, tako i u tkivima dobijenim od pacijenata koji imaju bolesti povezane sa TTR amiloidozom ili su pod rizikom da razviju bolesti povezane sa TTR amiloidozom. Pošto su sekvence TTR antitela prema predmetnom pronalasku dobijene od humanih subjekata, TTR antitela prema predmetnom pronalasku takođe mogu da se zovu i "humana auto-antitela" ili "antitela humanog porekla" kako bi se naglasilo da su ta antitela zaista inicijalno bila eksprimirana u subjektima i da nisu sintetski konstrukti stvoreni, na primer, pomoću fagnih biblioteka koje eksprimiraju humani imunoglobulin, što je so sada predstavljalo jedan od uobičajenih postupaka u pokušaju da se obezbede antitela slična humanim antitelima.
[0038] Podrazumeva se da izraz "peptid" u okviru svog značenja uključuje izraze "polipeptid" i "protein" (koji, povremeno, ovde mogu da se koriste naizmenično). Slično tome, fragmenti proteina i polipeptida se takođe uzimaju u razmatranje i u ovom dokumentu mogu da se označavaju kao "peptidi". Ipak, izraz "peptid" poželjno označava amino kiselinski polimer koji uključuje najmanje 5 susednih amino kiselina, poželjno najmanje 10 susednih amino kiselina, poželjnije najmanje 15 susednih amino kiselina, još poželjnije najmanje 20 susednih amino kiselina, i naročito poželjno najmanje 25 susednih amino kiselina. Pored toga, peptid u skladu sa predmetnim pronalaskom uobičajeno ima ne više od 100 susednih amino kiselina, poželjno manje od 80 susednih amino kiselina, poželjnije manje od 50 susednih amino kiselina i još poželjnije ne više od 15 susednih amino kiselina TTR polipeptida.
Polinukleotidi:
[0039] Predviđeno je da izraz "polinukleotid" obuhvata jednu nukleinsku kiselinu kao i više nukleinskih kiselina, i odnosi se na izolovani molekul nukleinske kiseline ili konstrukt, npr., informacionu RNK (mRNK) ili plazmidnu DNK (pDNK). Polinukleotid može da sadrži konvencionalnu fosfodiestarsku vezu i nekonvencionalnu vezu (npr., amidnu vezu, kakva se nalazi u peptidnim nukleinskim kiselinama (PNA)). Izraz "nukleinska kiselina" odnosi se na bilo koji jedan ili više segmenata nukleinske kiseline, npr., DNK ili RNK fragmente, prisutne u polinukleotidu. Pod "izolovana" nukleinska kiselina ili polinukleotid misli se na molekul nukleinske kiseline, DNK ili RNK, koji je uklonjen iz svoje nativne sredine. Na primer, za rekombinantni polinukleotid koji kodira antitelo, sadržan u vektoru, smatra se da je izolovan u smislu svrhe prema predmetnom pronalasku. Dodatni primeri izolovanog polinukleotida uključuju rekombinantne polinukleotide koji se održavaju u heterologim ćelijama domaćina ili prečišćene (delimično ili značajno) polinukleotide u rastvoru. Izolovani molekuli RNK uključuju in vivo ili in vitro RNK transkripte polinukleotida prema predmetnom pronalasku. Izolovani polinukleotidi ili nukleinske kiseline prema predmetnom pronalasku dodatno uključuju takve molekule koji su sintetski proizvedeni. Pored toga, polinukleotid ili nukleinska kiselina mogu da budu, ili mogu da uključuju, regulatorni element kao što je promotor, mesto za vezivanje ribozoma ili terminator transkripcije.
[0040] Kako se ovde koristi, "kodirajući region" je deo nukleinske kiseline koji se sastoji od kodona koji se prevode u amino kiseline. Iako se "stop kodon" (TAG, TGA ili TAA) ne prevodi u amino kiselinu, može se smatrati da predstavlja deo kodirajućeg regiona, ali bilo koje bočne sekvence, na primer promotori, mesta za vezivanje ribozoma, terminatori transkripcije, introni i slično, nisu deo kodirajućeg regiona. Dva ili više kodirajućih regiona prema predmetnom pronalasku može da bude prisutno u polinukleotidnom konstruktu, npr., na jednom vektoru, ili u posebnim polinukleotidnim konstruktima, npr., na posebnim (različitim) vektorima. Osim toga, bilo koji vektor može da sadrži samo jedan kodirajući region, ili može da sadrži dva ili više kodirajućih regiona, npr., jedan vektor može posebno da kodira varijabilni region imunoglobulinskog teškog lanca i varijabilni region imunoglobulinskog lakog lanca. Pored toga, vektor, polinukleotid ili nukleinska kiselina prema pronalasku mogu da kodiraju heterologe kodirajuće regione, bilo fuzionisane ili nefuzionisane sa nukleinskom kiselinom koja kodira vezujući molekul, antitelo, ili njegov fragment, varijantu ili derivat. Heterologi kodirajući regioni uključuju bez ograničenja specijalizovane elemente ili motive kao što su signalni peptid za sekreciju ili heterologi funkcionalni domen.
[0041] U nekim primerima izvođenja, polinukleotid ili nukleinska kiselina je DNK. U slučaju DNK, polinukleotid koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira polipeptid, uobičajeno može da uključuje promotor i/ili druge operabilne transkripcione ili translacione kontrolne elemente povezane sa jednim ili više kodirajućih regiona. Operabilna povezanost je kada je kodirajući region za genski proizvod, npr., polipeptid, povezan sa jednom ili više regulatornih sekvenci tako da se ekspresija genskog proizvoda smešta pod uticaj ili kontrolu regulatorne sekvence(i). Dva fragmenta DNK (kao što su kodirajući region polipeptida i sa njim povezani promotor) su "operabilno povezani" ili " operabilno vezani " ukoliko indukcija promotorske funkcije dovodi do transkripcije mRNK koja kodira željeni genski proizvod i ukoliko priroda veze između ova dva fragmenta DNK ne interferira sa sposobnošću regulatorne ekspresione sekvence da usmeri ekspresiju genskog proizvod ili interferira sa sposobnošću DNK matrice da se transkribuje. Dakle, promotorski region bi bio operabilno povezan sa nukleinskom kiselinom koja kodira polipeptid if promotor u stanju da utiče na transkripciju te nukleinske kiseline. Promotor može da bude promotor specifičan za ćeliju koji suštinski usmerava transkripciju DNK samo u predodređenim ćelijama. Drugi transkripcioni kontrolni elementi, pored promotora, na primer enhenseri, operatori, represori i signali za određivanje transkripcije, mogu da budu operabilno povezani sa polinkleotidom kako bi usmeravali transkripciju specifičnu za ćeliju. Pogodni promotori i drugi transkripcioni kontrolni regioni, prikazani su u ovom dokumentu.
[0042] "Vezujući molekul" kada se koristi u kontekstu prema predmetnom pronalasku odnosi se prevashodno na antitela i njihove fragmente.
Antitela:
[0043] Izrazi "antitelo" i "imunoglobulin" u ovom dokumentu se koriste naizmenično. Antitelo ili imunoglobulin je vezujući molekul koji sadrži najmanje varijabilni domen teškog lanca, a uobičajeno sadrži najmanje varijabilne domene teškog lanca i lakog lanca. Osnovne imunoglobulinske strukture u sistemima vertebrata relativno su dobro poznate; videti, npr., Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed.
1988).
[0044] Kao što će u daljem tekstu biti detaljnije razmatrano, izraz "imunoglobulin" sadrži različite široke klase polipeptida koji mogu da se razlikuju biohemijski. Stručnjaci u oblasti će znati da su teški lanci klasifikovani kao gama, mi, alfa, delta, ili epsilon, (γ, µ, α, δ, ε) sa nekoliko podklasa mađu njima (npr., γ1-γ4). Priroda ovog lanca je ono što određuje da li antitelo pripada "klasi" IgG, IgM, IgA IgG ili IgE, redom. Podklase imunoglobulina (izotipovi) npr., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, itd. su dobro okarakterisane i poznato je da obezbeđuju funkcionalnu specijalizaciju. Modifikovane verzije svake od ovih klasa i izotipova, stručnjak u oblasti će lako razlikovati u svetlu aktuelnog prikaza i, u skladu s tim, one se nalaze u obimu aktuelnog pronalaska. Jasno je da su sve klase imunoglobulina u okviru obima predmetnog pronalaska, a razmatranje koje sledi će u principu biti usmereno na IgG klasu imunoglobulinskih molekula. Kad je u pitanju IgG, standardni imunoglobulinski molekul sadrži dva identična polipeptida lakog lanca, molekulske težine od približno 23,000 daltona, i dva identična polipeptida teškog lanca molekulske težine od 53,000-70,000. Ova četiri lanca su uobičajeno povezana disulfidnim vezama u "Y" konfiguraciju u kojoj se teški lanci nalaze između lakih lanaca poševši od ulaznog dela "Y" i nastavljajući se kroz varijabilni region.
[0045] Laki lanci su klasifikovani ili kao kapa ili kao lambda (κ, λ). Svaka klasa teškog lanca može da bude vezana ili sa kapa ili sa lambda lakim lancem. U principu, laki i teški lanci su međusobno kovalentno povezani, a "repni" delovi dva teška lanca su jedan sa drugim povezani kovalentnim disulfidnim vezama ili nekovalentnim vezama, kada se imunoglobulini obrazuju ili pomoću hibridoma, B ćelija ili genetičkim inženjeringom izmenjenim ćelijama. U teškom lancu, amino kiselinska sekvenca se pruža od N-terminusa u krajevima Y konfiguracije koji se račvaju, pa do C-terminusa na dnu svakog lanca.
[0046] I laki i teški lanci su podeljeni u regione strukturne i funkcionalne homologije. Izrazi "konstantan" i "varijabilan" koriste se u funkcionalnom smislu. U tom smislu, biće jasno da varijabilni domeni, delova kako lakih (VL), tako i teških (VH) lanaca određuju prepoznavanje antigena i specifičnost. Obrnuto, konstantni domeni lakog lanca (CL) i teškog lanca (CH1, CH2 ili CH3) obezbeđuju važna biološka svojstva kao što su sekrecija, mobilnost kroz placentu, vezivanje Fc receptora, vezivanje komplementa, i slično. Po konvenciji se numeracija domena konstantnog regiona povećava što su oni više distalni u odnosu na antigen-vezujuće mesto ili amino-terminus antitela. N-terminalni deo je varijabilni region, a na C-terminalnom delu je konstantni region; CH3 i CL domens actually comprise the carboxy-izrazinus of the heavy i light chain, respectively.
[0047] Kao što je prethodno u tekstu naznačeno, varijabilni region omogućava antitelu da selektivno prepoznaje i specifično vezuje epitope na antigenima. Odnosno, VLdomen i VHdomen, ili podskup regiona za određivanje komplementarnosti (CDR regiona), jednog antitela kombinuju se da bi obrazovali varijabilni region koji definiše trodimenzionalno antigen-vezujuće mesto. Ova kvaternerna struktura antitela obrazuje antigen-vezujuće mesto prisutno na kraju svakog kraka Y formacije. Specifičnije, antigen-vezujuće mesto se definiše preko tri CDR regiona na svakom od VHi VLlanaca. Bilo koji fragment antitela ili imunoglobulina koji sadrži strukturu dovoljnu da se specifično veže za TTR, u ovom dokumentu se naizmenično označava kao "vezujući fragment" ili "imunospecifični fragment."
[0048] Kod prirodnih antitela, antitelo sadrži šest hipervarijabilnih regiona, koji se nekad označavaju kao "regioni koji određuju komplementarnost" ili "CDR regioni", prisutnih u svakom antigen-vezujućem domenu, koji predstavljaju kratke nesusedne sekvence amino kiselina koje su specifično pozicionirane tako da obrazuju antigen-vezujući domen kada antitelo zauzima svoju trodimenzionalnu konfiguraciju u vodenoj sredini. "CDR regioni" se graniče sa svojih spoljnih strana sa četiri relativno kozervisana "okvirna" regiona ili "FR regiona" koji pokazuju manje inter-molekularne varijabilnosti. Okvirni regioni uglavnom zauzimaju konformaciju β-ploče, a CDR regioni obrazuju petlje koje se povezuju, i u nekim slučajevima obrazuju deo strukture β-ploče. Dakle, okvirni regioni deluju tako što obezbeđuju strukturu koja omogućava pozicioniranje CDR regiona u pravilnoj orijentaciji putem interlančanih, nekovalentnih interakcija. Antigen-vezujući domen obrazovan pozicioniranim CDR regionima obezbeđuej površinu koja je komplementarna epitopu na imunoreaktivnom antigenu. Ova komplementarna površina pospešuje nekovalentno vezivanje antitela za sebi odgovarajući epitop. Amino kiseline koje sačinjavanju CDR regione i okvirne regione, redom, mogu lako da se identifikuju za varijabilni region bilo kog datog teškog ili lakog lanca by one of ordinary skill in the art, since they have been precisely defined; videti, "Sekvence of Proteins of Immunological Interest," Kabat, E., et al., U.S. Department of Health i Human Services, (1983); i Chothia i Lesk, J. Mol. Biol., 196 (1987), 901-917.
[0049] U slučaju kada postoje dve ili više definicija jednog izraza koji se koristi i/ili je prihvaćen u oblasti, predviđeno je da definicija izraza, kako se ovde koristi, uključuje sva ta značenja, osim ako je eksplicitno drugačije rečeno. Specifični primer je upotreba izraza "region koji određuje komplementarnost" ("CDR") za opisivanje nesusednih mesta za kombinovanje antigena koja se nalaze u okviru varijabilnog regiona polipeptida kako teškog tako i lakog lanca. Ovaj konkretni region su opisali Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983) i Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196 (1987), 901-917, pri čemu definicije uključuju preklapanja ili podskupove amino kiselinskih ostataka, kada se međusobno uporede. U svakom slučaju, predviđeno je da primena bilo koje definicije da bi se označio CDR region nekog antitela ili njegovih varijanti bude u obimu izraza kako je ovde definisan i kako se ovde koristi. Odgovarajući ostaci amino kiselina koji sačinavaju CDR regione onako kako su definisani u svakoj od prethodno citiranih referenci, izloženi su u Tabeli I u vidu poređenja. Tačni brojevi ostataka koji sačinjavaju konkretan CDR region, variraće u zavisnosti od sekvence i veličine CDR regiona. Stručnjaci u oblasti mogu rutinski da odrede koji ostaci sačinjavaju konkretan hipervarijabilni region ili CDR region IgG podtipa humanog antitela, imajući u vidu varijabilni region amino kiselinske sekvence antitela.
[0050] Kabat i sar. su takođe definisali sistem numeracije za sekvence varijabilnog domena koji je primenljiv na bilo koje antitelo. Stručnjak u ovoj oblasti može nedvosmisleno da dodeli ovaj sistem „Kabatovog numerisanja“ bilo kojoj sekvenci varijabilnog domena, bez oslanjanja na bilo koji eksperimentalni podatak mimo same sekvence. Kako se ovde koristi, „Kabat numeracija“ odnosi se na sistem numerisanja koji su postavili Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983).). Ako nije drugačije naznačeno, reference na numerisanje specifičnih pozicija amino kiselinski ostataka u antitelu ili njegovom antigen-vezujućem fragmentu, varijanti ili derivatu prema predmetnom pronalasku, u skladu su sa Kabat sistemom numeracije, koji je, međutim, teorijski i ne važi možda jednako za svako antitelo prema predmetnom pronalasku. Na primer, u zavisnosti od položaja prvog CDR regiona, sledeći CDR regioni mogu da se pomere u bilo kom smeru.
[0051] Antitela ili njihovi antigen vezujući fragmenti, imunospecifični fragmenti, varijante ili derivati prema pronalasku uključuju, ali nisu ograničeni na, poliklonska, monoklonska, multispecifična, humana, humanizovana, primatizovana, murinizovana ili himerna antitela, jednolančana antitela, epitop-vezujuće fragmente, npr. Fab, Fab' i F(ab')2, Fd, Fvs, jednolančane Fvs (scFv), jednolančana antitela, disulfidno vezane Fvs (sdFv), fragmente koji sadrže ili VLili VHdomen, fragmente prodobijene pomoću Fab ekspresione biblioteke i anti-idiotipska (anti-Id) antitela (uključujući, npr., anti-Id antitela na antitela koja su ove prikazana). ScFv molekuli su poznati u tehnici i opisani su, na primer, u SAD patentu 5,892,019. Molekuli imunoglobulina ili antitela prema pronalasku mogu da budu bilo koje vrste (npr. IgG, IgE, IgM, IgD, IgA i IgY), klase (npr. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 i IgA2) ili podklase imunoglobulinskih molekula.
[0052] U jednom primeru izvođenja, antitelo prema predmetnom pronalasku nije IgM ili njegov derivat sa petovalentnom strukturom. Posebno, u specifičnim primenama predmetnog pronalaska, posebno u terapeutskoj upotrebi, IgM su manje korisni od IgG i drugih bivalentnih antitela ili odgovarajućih vezujućih molekula, jer IgM zbog svoje petovalentne strukture i nedostatka afinitetnog sazrevanja često pokazuju nespecifične unakrsne reaktivnosti i vrlo nizak afinitet.
[0053] Antitelo prema ovom pronalasku nije poliklonsko antitelo, tj. ono se u osnovi sastoji od jedne konkretne vrste antitela, a ne od smeše dobijene iz uzorka imunoglobulina iz plazme.
[0054] Fragmenti antitela, uključujući jednolančana antitela, mogu da sadrže varijabilni region(e) sam ili u kombinaciji sa celinom ili delom sledećeg: zglobnog regiona, CH1, CH2 i CH3 domena. Takođe su u pronalazak uključeni TTR vezujući fragmenti koji sadrže bilo koju kombinaciju varijabilnog(ih) regiona(â) sa zglobnim regionom, CH1, CH2 i CH3 domenima.
[0055] U jednom aspektu, antitelo prema predmetnom pronalasku je humano monoklonsko antitelo izolovano iz čoveka. Po želji, okvirni region humanog antitela je poravnat i usvojen u skladu sa odgovarajućim sekvencama varijabilnog regiona humane klicine linije u bazi podataka; videti, npr., Vbase (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) čiji je vlasnik MRC Centre for Protein Engineering (Cambridge, Velika Britanija). Na primer, amino kiseline za koje se smatra da potencijalno odstupaju od prave sekvence klicine linije mogu da budu posledica PCR sekvenci prajmera koje su ugrađene tokom procesa kloniranja. U poređenju sa veštački generisanim antitelima nalik na humana, kao što su jednolančani fragmenti antitela (scFvs) iz biblioteke antitela prikazanih u fagu ili ksenogenih miševa, humano monoklonsko antitelo prema predmetnom pronalasku karakteriše to što je (i) dobijeno korišćenjem humanog imunskog odgovora, umesto odgovora životinjskih surogata, tj. antitelo je nastalo kao odgovor na prirodni TTR u svojoj relevantnoj konformaciji u ljudskom telu, (ii) zaštitilo pojedinca ili je u najmanju ruku značajno za prisustvo TTR, i (iii) pošto predstavlja antitelo ljudskog porekla, maksimalno smanjen rizik od unakrsne reaktivnosti protiv sopstvenih antigena. Prema tome, u skladu sa predmetnim pronalaskom, izrazi „humano monoklonsko antitelo“, „humano monoklonsko autoantitelo“, „humano antitelo“ i slično koriste se za označavanje TTR-vezujućeg molekul koji je humanog porekla, tj. koji je izolovan iz ljudske ćelije kao što je B ćelija ili njen hibridom ili čija je cDNK direktno klonirana iz mRNK ljudske ćelije, na primer humane memorijske B ćelije. Ljudsko antitelo je i dalje „humano“, tj. humanog porekla, čak i ako se u antitelu vrše amino kiselinske supstitucije, npr. radi poboljšanja vezujućih karakteristika.
[0056] U jednom primeru izvođenja, antitela humanog porekla prema predmetnom pronalasku, sadrže regione heterologe u odnosu na antitela koja se javljaju u prirodi, npr. amino kiselinske supstitucije u okvirnom regionu, konstantni region koji je egzogeno fuzionisan sa varijabilnim regionom, različite amino kiseline na C- ili N- izrazalnim krajevima i slično.
[0057] Antitela izvedena iz humanih imunoglobulinskih biblioteka ili od životinja transgenih za jedan ili više humanih imunoglobulina i koje ne eksprimiraju endogene imunoglobuline, kao što je opisano u tekstu koji sledi i, na primer, u SAD patentu br.5,939,598 autora Kucherlapati et al., označena su kao antitela nalik na humana kako bi se razlikovala od istinski humanih antitela prema predmetnom pronalasku.
[0058] Na primer, sparivanje teških i lakih lanaca antitela nalik na kumana, kao što su sintetička i polusintetička antitela koja su uobičajeno izoluju iz faga ne odražavaju nužno originalno sparivanje koje se javlja u originalnoj humanoj B ćeliji. Shodno tome, Fab i scFv fragmenti dobijeni iz rekombinantnih ekspresionih biblioteka, koje se obično koriste u stanju tehnike, mogu se smatrati veštačkim sa svim mogućim povezanim efektima na imunogenost i stabilnost.
[0059] Suprotno tome, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovana afinitetno sazrela antitela dobijena od odabranih humanih subjekata, koja se odlikuju svojom terapeutskom korisnošću i tolerancijom kod čoveka.
[0060] Kako se ovde koristi, izraz "rodentizovano antitelo" ili "rodentizovani imunoglobulin" odnosi se na antitelo koje sadrži jedan ili više CDR regiona iz humanog antitela prema predmetnom pronalasku; i humani okvirni region koji sadrži amino kiselinske supstitucije i/ili delecije i/ili insercije zasnovane na sekvenci glodarskog antitela. Kada se govori o glodarima, poželjno je da se koriste sekvence poreklom od miševa i pacova, pri čemu se antitela koja sadrže
2
takve sekvence nazivaju "murinizovana", odnosno "ratinizovana". Humani imunoglobulin koji obezbeđuje CDR regione naziva se „roditelj“ ili „akceptor“, a glodarsko antitelo koje obezbeđuje promene okvira naziva se „donor“. Konstantni regioni ne moraju da budu prisutni, ali ako jesu, obično su u osnovi identični sa konstantnim regionima glodarskih antitela, tj. najmanje oko 85% do 90%, poželjno oko 95% ili više identični. Otuda, u nekim primerima izvođenja, murinizovani humani imunoglobulin teškog ili lakog lanca pune dužine sadrži mišiji konstantni region, humane CDR regione i, u osnovi humani okvir koji ima određen broj "murinizujućih" amino kiselinskih supstitucija. Uobičajeno, "murinizovano antitelo" je antitelo koje sadrži murinizovani varijabilni laki lanac i/ili murinizovani varijabilni teški lanac. Na primer, murinizovano antitelo ne bi obuhvatalo tipično himerno antitelo, npr., zato što čitav varijabilni region himernog antitela nije mišiji. Modifikovano antitelo koje je „murinizovano“ postupkom „murinizacije“ vezuje se za isti antigen kao i matično antitelo koje obezbeđuje CDR regione i obično je manje imunogeno kod miševa nego matično antitelo. Objašnjenja data u prethonom tekstu u vezi sa "murinizovanim" antitelima, analogno se primenjuju na druga"rodentizovana" antitela, kao što su "ratinizovana antitela", pri čemu se umesto mišijih koriste pacovske sekvence.
[0061] Kako se ovde koristi, izraz "deo teškog lanca" uključuje amino kiselinske sekvence dobijene iz imunoglobulinskkog teškog lanca. Polipeptid koji sadrži deo teškog lanca sadrži najmanje jedno od: CH1 domen, zglobni (npr. gornji, srednji i/ili donji zglobni region) domen, CH2 domen, CH3 domen ili njihovu varijantu ili fragment. Na primer, vezujući polipeptid za upotrebu u pronalasku može da sadrži polipeptidni lanac koji sadrži CH1 domen; polipeptidni lanac koji sadrži CH1 domen, najmanje deo zglobnog domena i CH2 domen; polipeptidni lanac koji sadrži CH1 domen i CH3 domen; polipeptidni lanac koji sadrži CH1 domen, najmanje deo zglobnog domena i CH3 domen, ili polipeptidni lanac koji sadrži CH1 domen, najmanje deo zglobnog domena, CH2 domen i CH3 domen. U još jednom primeru izvođenja, polipeptid prema pronalasku sadrži polipeptidni lanac koji sadrži CH3 domen. Dalje, vezujućem polipeptidu za upotrebu u pronalasku može da nedostaje najmanje deo CH2 domena (npr. ceo domen ili deo CH2 domena). Kao što je gore izloženo, stručnjak u ovoj oblasti će razumeti da ovi domeni (npr. delovi teškog lanca) mogu da budu modifikovani tako da se razlikuju u amino kiselinskoj sekvenci od prirodnog molekula imunoglobulina.
[0062] U određenim antitelima ili njihovim antigen vezujućim fragmentima, varijantama ili derivatima, koji su ovde prikazani, delovi teškog lanca jednog polipeptidnog lanca multimera identični su delovima na drugom polipeptidnom lancu multimera. Alternativno, monomeri koji sadrže deo teškog lanca prema pronalasku nisu identični. Na primer, svaki monomer može da sadrži različito ciljno mesto za vezivanje, formirajući, na primer, bispecifično antitelo ili dijatelo.
[0063] U sledećem primeru izvođenja, ovde prikazana antitela ili njihovi antigen vezujući fragmenti, varijante ili derivati, sastoje se od jednog polipeptidnog lanca kao što je scFvs i potrebno je da budu eksprimirana unutarćelijski (intratela) u cilju potencijalnih in vivo terapeutskih i dijagnostičkih primena.
[0064] Delovi teškog lanca vezujućeg polipeptida za upotrebu u ovde prikazanim postupcima dijagnostike i lečenja mogu da budu dobijeni iz različitih imunoglobulinskih molekula. Na primer, deo polipeptida teškog lanca može da sadrži CH1 domen dobijen iz molekula IgG1 i zglobni region dobijen iz molekula IgG3. U drugom primeru izvođenja, deo teškog lanca može da sadrži zglobni region koji je delom dobijen iz molekula IgG1, a delom iz molekula IgG3. U sledećem primeru izvođenja, deo teškog lanca može da sadrži himerni zglob dobijen delom iz molekula IgG1, a delom iz molekula IgG4.
[0065] Kako se ovde koristi, izraz "deo lakog lanca" uključuje amino kiselinske sekvence dobijene iz lakog lanca imunoglobulina. Poželjno je da deo lakog lanca sadrži najmanje jedan od VL ili CL domena.
[0066] Smatra se da minimalna veličina peptida ili polipeptidnog epitopa za antitelo iznosi oko četiri do pet amino kiselina. Peptidni ili polipeptidni epitopi poželjno sadrže najmanje sedam, poželjnije najmanje devet, a najpoželjnije između najmanje oko 15 do oko 30 amino kiselina. Budući da CDR region može da prepozna antigeni peptid ili polipeptid u njegovom tercijarnom obliku, amino kiseline koje sadrže epitop ne moraju da budu susedne, a u nekim slučajevima čak i ne moraju da budu na istom peptidnom lancu. U predmetnom pronalasku, peptid ili polipeptidni epitop koga prepoznaju antitela prema predmetnom pronalasku sadrži sekvencu od najmanje 4, najmanje 5, najmanje 6, najmanje 7, još poželjnije najmanje 8, najmanje 9, najmanje 10 , najmanje 15, najmanje 20, najmanje 25 ili između oko 15 do oko 30 susednih ili nesusednih amino kiselina iz TTR.
[0067] Pod „specifičnim vezivanjem“ ili „specifičnim prepoznavanjem“, koji se ovde koriste naizmenično, u principu se podrazumeva se da se vezujući molekul, npr. antitelo, vezuje za epitop preko svog antigen-vezujućeg domena, i da vezivanje podrazumeva delimičnu komplementarnost između antigen-vezujućeg domena i epitopa. Prema ovoj definiciji, za antitelo se kaže da se „specifično vezuje“ za epitop kada se vezuje za taj epitop, preko svog antigenvezujućeg domena, lakše nego što bi se povezalo sa slučajnim, nesrodnim epitopom. Izraz "specifičnost" ovde se koristi da bi se okvalifikovao relativni afinitet kojim se određeno antitelo vezuje za određeni epitop. Na primer, može se smatrati da antitelo "A" ima veću specifičnost za dati epitop od antitela "B" ili se može reći da se antitelo "A" vezuje za epitop "C" sa većom specifičnošću nego što je poseduje za srodni epitop "D".
2
[0068] Tamo gde je prisutan, izraz "imunološke karakteristike vezivanja" ili druge karakteristike vezivanja antitela sa antigenom, u svim svojim gramatičkim oblicima, odnosi se na specifičnost, afinitet, unakrsnu reaktivnost i druge karakteristike vezivanja antitela.
[0069] Pod "preferencijalno vezanje" podrazumeva se da se vezujući molekul, npr. antitelo, specifično vezuje za epitop lakše nego što bi se vezao za srodni, sličan, homologni ili analogni epitop. Prema tome, antitelo koje se „preferencijalno vezuje“ za dati epitop, verovatnije bi se povezalo sa tim epitopom nego sa srodnim epitopom, iako takvo antitelo može unakrsno da reaguje sa srodnim epitopom.
[0070] U smislu neograničavajućeg primera, može se smatrati da se vezujući molekul, npr. antitelo, preferencijalno vezuje za prvi epitop ako se za navedeni prvi epitop vezuje sa konstantom disocijacije (KD) koja je manja od KD antitela za drugi epitop. U drugom neograničavajućem primeru, može se smatrati da se antitelo preferencijalno vezuje za prvi antigen ako se vezuje za prvi epitop sa afinitetom koji je najmanje jedan red veličine manji od KD antitela za drugi epitop. U drugom neograničavajućem primeru, može se smatrati da se antitelo preferencijalno vezuje prvi epitop ako se vezuje za prvi epitop sa afinitetom koji je najmanje dva reda veličine manji od KD antitela za drugi epitop.
[0071] U drugom neograničavajućem primeru, može se smatrati da se vezujući molekul, npr., antitelo, preferencijalno vezuje za prvi epitop ako se vezuje prvi epitop sa brzinom odvajanja (k(off)) koja je manja od k(off) antitela za drugi epitop. U drugom neograničavajućem primeru, može se smatrati da se antitelo preferencijalno vezuje za prvi epitop ako se vezuje za prvi epitop sa afinitetom koji je najmanje jedan red veličine manji od k(off)) antitela za drugi epitop. U drugom neograničavajućem primeru, može se smatrati da se antitelo preferencijalno vezuje za prvi epitop ako se vezuje za prvi epitop sa afinitetom koji je najmanje dva reda veličine manji od k(off) antitela za drugi epitop.
[0072] Može se reći da vezujući molekul, npr. antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, varijanta ili derivat koji su ovde prikazani, vezuje TTR ili njegov fragment, varijantu ili specifičnu konformaciju sa brzinom odvajanja (k (off)) koja je manja ili jednaka 5 x 10<-2>sec<- 1>, 10-2 sec- 1 , 5 x10-3 sec- 1 ili 10-3 sec<- 1>. Poželjnije, za antitelo prema pronalasku se može reći da vezuje TTR ili njegov fragment, varijantu ili specifičnu konformaciju sa brzinom odvajanja (k (off)) manjom ili jednakom 5 x 10-4 sec- 1 , 10-4 sec- 1 , 5 x 10-5 sec- 1 , ili 10-5 sec- 15 x 10-6 sec- 1 , 10-6 sec- 1 , 5 x 10-7 sec- 1 ili 10-7 sec- 1.
[0073] Može se reći da vezujući molekul, npr. antitelo ili antigen-vezujući fragment, varijanta ili derivat, koji su ovde prikazani, vezuje TTR ili njegov fragment, varijantu ili specifičnu konformaciju sa brzinom vezivanja (k (on)) većom od ili jednakom 10<3>M<-1>sec<- 1>, 5 x 10<3>M<-1>
2
sec- 1 , 104 M-1 sec- 1 ili 5 x 104 M-1 sec<- 1>. Poželjnije, za antitelo prema pronalasku se može reći da vezuje TTR ili njegov fragment, varijantu ili specifičnu konformaciju brzinom vezivanja (k (on)) većom od ili jednakom 10<5>M<-1>sec<- 1>, 5 x 10<5>M<-1>sec<- 1>, 10<6>M<-1>sec<- 1>ili 5 x 10<6>M<-1>sec<- 1>ili 10<7>M-1 sec- 1.
[0074] Kaže se da vezujući molekul, npr. antitelo, kompetitivno inhibira vezivanje referentnog antitela za dati epitop ako se preferencijalno vezuje za taj epitop u toj meri da blokira, do izvesnog stepena, vezivanje referentnog antitela za epitop. Kompetitivna inhibicija može da se odredi bilo kojim postupkom poznatim u struci, na primer, kompetitivnim ELISA testovima. Za antitelo se može reći da kompetitivno inhibira vezivanje referentnog antitela za dati epitop za najmanje 90%, najmanje 80%, najmanje 70%, najmanje 60% ili najmanje 50%.
[0075] Kako se ovde koristi, izraz "afinitet" odnosi se na meru jačine vezivanja pojedinačnog epitopa sa CDR regionom vezujućeg molekula, npr. molekula imunoglobulina; videti, npr., Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. (1988), na stranama 27-28. Kako se ovde koristi, izraz "aviditet" odnosi se na ukupnu stabilnost kompleksa između populacije imunoglobulina i antigena, odnosno funkcionalno kombinovanje snage smeše imunoglobulina sa antigenom; videti, npr, Harlow na stranicama 29-34. Aviditet je povezan kako sa afinitetom pojedinačnih molekula imunoglobulina u populaciji sa specifičnim epitopima, tako i sa valencom imunoglobulina i antigena. Na primer, interakcija između bivalentnog monoklonskog antitela i antigena sa visoko ponavljajućom strukturom epitopa, kao što je polimer, bila bi interakcija visokog aviditeta. Afinitet ili aviditet antitela za antigen mogu se eksperimentalno utvrditi bilo kojom pogodnom metodom; videti, na primer, Berzofsky et al., "Antibody-Antigen Interactions" In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press New York, N Y (1984), Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company New York, NY (1992)i ovde opisane metode. Opšte tehnike za merenje afiniteta antitela za antigen uključuju ELISA, RIA i površinsku rezonancu plazmona. Izmereni afinitet određene interakcije antiteloantigen može da varira ako se meri u različitim uslovima, npr. koncentracije soli, pH. Prema tome, merenja afiniteta i drugih parametara vezivanja za antigen, npr. KD, IC50, poželjno se vrše pomoću standardizovanih rastvora antitela i antigena i standardizovanog pufera.
[0076] Vezujući molekuli, npr. Antitela ili fragmenti koji vezuju antigen, njihove varijante ili derivati, takođe mogu biti opisani ili specificirani u smislu njihove unakrsne reaktivnosti. Kako se ovde koristi, izraz "unakrsna reaktivnost" odnosi se na sposobnost antitela, specifičnog za jedan antigen, da reaguje sa drugim antigenom; mera srodstva između dve različite antigene supstance. Dakle, antitelo je unakrsno reaktivno ako se vezuje za epitop koji nije onaj koji je indukovao njegovo formiranje. Unakrsno reaktivni epitop generalno sadrži mnoge iste komplementarne strukturne karakteristike kao induktivni epitop, i u nekim slučajevima može zaista odgovarati boljem od originala.
[0077] Na primer, određena antitela imaju određeni stepen unakrsne reaktivnosti, u tom smislu što vezuju srodne, ali neidentične epitope, npr. epitope sa najmanje 95%, najmanje 90%, najmanje 85%, najmanje 80 %, najmanje 75%, najmanje 70%, najmanje 65%, najmanje 60%, najmanje 55% i najmanje 50% identičnosti (što je izračunato korišćenjem postupaka koji su poznatih u struci i ovde opisani) sa referentnim epitopom. Može se reći da antitelo ima malu ili nikakvu unakrsnu reaktivnost ako ne vezuje epitope sa manje od 95%, manje od 90%, manje od 85%, manje od 80%, manje od 75%, manje od 70%, manje od 65%, manje od 60%, manje od 55% i manje od 50% identičnosti (što je izračunato korišćenjem postupaka koji su poznatih u struci i ovde opisani) sa referentnim epitopom. Antitelo se može smatrati „visoko specifičnim“ za određeni epitop, ako ne vezuje nijedan drugi analog, ortolog ili homolog tog epitopa.
[0078] Vezujući molekuli, npr. antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti, varijante ili derivati, takođe mogu da se opišu ili da se podaci specifično navedu na osnovu njihovog afiniteta za vezivanje za TTR i/ili mutirane, pogrešno savijene, pogrešno sastavljene i/ili agregirane TTR vrste i/ili njihove fragmente. Poželjni afiniteti vezivanja uključuju one sa konstantom disocijacije ili Kd manjom od 5 x 10-2 M, 10-2 M, 5 x 10-3 M, 10-3 M, 5 x 10-4 M, 10-4 M, 5 x 10-5 M, 10-5 M 5 x 10-6 M, 10-6 M, 5 x 10-7 M, 10-7 M, 5 x 10-8 M, 10-8 M, 5 x 10-9 M, 10-9 M, 5 x 10-10 M, 10-10 M, 5 x 10-11 M, 10-11 M, 5 x 10-12 M,10-12 M, 5 x 10-13 M, 10-13 M, 5 x 10-14 M, 10-14 M, 5 x 10-15 M ili 10-15 M.
[0079] U jednom primeru izvođenja, antitelo prema predmetnom pronalasku ima Kd za različite TTR izoforme kao što su ilustrovane za primere antitela u tabeli V koja sledi, tj. Kd od > 300 nM za nativni TTR divljeg tipa i/ili Kd od ≤ 15 nM, poželjno ≤ 5 nM, i najpoželjnije ≤ 2 nM za denaturisani TTR i/ili Kd od ≤ 35 nM, poželjno od ≤ 20 nM za nativni TTR-V30M, i/ili Kd od ≤ 150 nM, poželjno od ≤ 5 nM, i najpoželjnije ≤ 2 nM za nativni TTR-L55P.
[0080] Kao što je prethodno naznačeno, strukture subjedinica i trodimenzionalna konfiguracija konstantnih regiona različitih klasa imunoglobulina su dobro poznate. Kako se ovde koristi, izraz "VH domen" uključuje amino terminalni varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina, a izraz "CH1 domen" uključuje prvi domen (krajnji amino terminalni) konstantnih regiona imunoglobulinskog teškog lanca. CH1 domen se nalazi susedno u odnosu na VH domen i amino terminalno u osnosu na zglobni region molekula imunoglobulinskog teškog lanca.
[0081] Kako se ovde koristi, izraz "CH2 domen" uključuje deo molekula teškog lanca koji se proteže, npr., od oko ostatka 244 do ostatka 360 antitela, ako se koriste konvencionalne šeme numerisanja (ostaci 244 do 360, po Kabat sistemu numeracije; i ostaci 231-340, prema EU
2
sistemu numeracije; videti Kabat EA et al., op. cit). CH2 domen je jedinstven po tome što nije prostorno blisko uparen sa drugim domenom. Umesto toga, dva N-vezana razgranata lanca ugljenih hidrata su postavljena između dva CH2 domena intaktnog nativnog molekula IgG. Takođe je dobro dokumentovano da se CH3 domen proteže od CH2 domena do C-terminusa IgG molekula i da sadrži približno 108 ostataka.
[0082] Kako se ovde koristi, izraz "zglobni region" uključuje deo molekula teškog lanca koji se pridružuje CH1 domenu i CH2 domenu. Ovaj zglobni region sadrži približno 25 ostataka i fleksibilan je, omogućavajući tako da se dva N-iterminalna regiona za vezivanje antigena kreću nezavisno. Zglobni regioni mogu da se podele na tri različita domena: gornji, srednji i donji zglobni domen; videti Rouk et al., J. Immunol.161 (1998), 4083-4090.
[0083] Kako se ovde koristi, izraz "disulfidna veza" uključuje kovalentnu vezu koja se formira između dva atoma sumpora. Amino kiselina cistein sadrži tiol grupu koja može da formira disulfidnu vezu ili most sa drugom tiol grupom. U većini prirodno prisutnih molekula IgG, CH1 i CL regioni su povezani disulfidnom vezom, a dva teška lanca su povezana sa dve disulfidne veze na pozicijama koje odgovaraju 239 i 242 na osnovu Kabat sistema numeracije (pozicija 226 ili 229, EU sistem numeracije).
[0084] Kako se ovde koristi, izrazi "povezani", "fuzionisani" ili "fuzija" koriste se naizmenično. Ovi izrazi se odnose međusobno povezivanje dva elementa ili komponente, bilo kojim sredstvima, uključujući hemijsku konjugaciju ili rekombinantna sredstva. „Fuzija u okviru“ odnosi se na spajanje dva ili više polinukleotidnih otvorenih okvira za čitanje (ORF okvira) da bi se formirao kontinuirani duži ORF, na način koji održava tačan translacioni okvir čitanja originalnih ORF okvira. Prema tome, rekombinantni fuzioni protein predstavlja jedan protein koji sadrži dva ili više segmenata koji odgovaraju polipeptidima kodiranim od originalnih ORF okvira (a ti segmenti u prirodi nisu tako spojeni). Iako okvir čitanja na ovaj način postaje kontinuiran celom dužinom fuzionisanih segmenata, segmenti mogu da budu fizički ili prostorno razdvojeni, na primer, linkerskom sekvencom u okviru čitanja. Na primer, polinukleotidi koji kodiraju CDR regione varijabilnog imunoglobulinskog regiona mogu da budu fuzionisani, u okviru, ali odvojeni polinukleotidom koji kodira najmanje jedan okvirni region imunoglobulina ili dodatne CDR regione, sve dok se „fuzionisani“ CDR regioni kotranslatiraju kao deo kontinuiranog polipeptida.
[0085] Izraz "ekspresija", kako se ovde koristi, odnosi se na postupak kojim gen stvara biohemijsku supstancu, na primer, RNK ili polipeptid. Proces uključuje bilo koju manifestaciju funkcionalnog prisustva gena u ćeliji, uključujući, bez ograničenja, nokdaun gena, kao i privremenu ekspresiju i stabilnu ekspresiju. Uključuje bez ograničenja transkripciju gena u
2
informacionu RNK (mRNK), transportnu RNK (tRNK), malu RNK u obliku ukosnice (shRNK), malu interferirajuću RNK (siRNK) ili bilo koji drugi RNK proizvod, kao i translaciju mRNK u polipeptid(e). Ako je konačni željeni proizvod biohemijska supstanca, ovaj izraz uključuje stvaranje te biohemijske supstance i bilo kojih prekursora. Ekspresija gena daje „genski proizvod“. Kako se ovde koristi, genski proizvod može biti ili nukleinska kiselina, na primer, informaciona RNK proizvedena transkripcijom gena, ili polipeptid koji je translatiran na osnovu transkripta. Ovde opisani genski proizvodi dalje uključuju nukleinske kiseline sa posttranskripcionim modifikacijama, npr. poliadenilacijom, ili polipeptide sa post-translacionim modifikacijama, npr. metilacijom, glikozilacijom, dodavanjem lipida, povezivanjem sa drugim proteinskim subjedinicama, proteolitičkom razgradnjom, i slično.
[0086] Kako se ovde koristi, izraz "uzorak" odnosi se na bilo koji biološki materijal dobijen od subjekta ili pacijenta. U jednom aspektu, uzorak može da sadrži krv, peritonealnu tečnost, likvor, pljuvačku ili urin. U drugim aspektima, uzorak može da sadrži celu krv, krvnu plazmu, krvni serum, uzorke krvi obogaćene B ćelijama i gajene ćelije (npr. B ćelije dobijene od subjekta). Uzorak takođe može da uključujei biopsiju ili uzorak tkiva, uključujući nervno tkivo. U dodatnim drugim aspektima, uzorak može da sadrži cele ćelije i/ili lizat ćelija. Uzorci krvi mogu da se sakupljaju postupcima poznatim u struci. U jednom aspektu, pelet može da se resuspenduje vorteksovanjem na 4°C u 200 µl pufera (20 mM Tris, pH, 7,5, 0,5% Nonidet, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 0,1 M NaCl, IX Sigma inhibitor proteaza i IX inhibitori fosfataza Sigma 1 i 2). Suspenzija može da se drži na ledu 20 minuta uz povremeno vorteksovanje. Posle centrifugiranja na 15.000 x g tokom 5 minuta na oko 4 °C, alikvoti supernatanta mogu da se čuvaju na oko -70 °C.
Bolesti:
[0087] Ukoliko nije drugačije naglašeno izrazi “poremećaj” i “bolest” se koriste naizmenično u ovom tekstu i sadrže (bilo koju) neželjenu fiziološku promenu kod subjekta, životinje ili u izolovanom organu, tkivu ili ćeliji/ćelijskoj kulturi.
[0088] Transtiretin (TTR) amiloidoza je patofiziološki mehanizam u osnovi raznih bolesti koje se karakterišu abnormalnim deponovanjem TTR proteina u različitim tkivima kao rezultat strukturne (npr. konformacijske) promene TTR proteina. Pogrešno savijeni ili agregiran TTR protein je toksičan i javlja se često kao posledica mutacija u TTR genu. Toksičnost uzrokovana pogrešnim savijanjem TTR proteina prouzrokuje lokalna oštećenja u tkivu koja nakon nagomilavanja vremenom mogu prouzrokovati poremećaj u funkciji rada organa pa čak i otkazivanje organa. Postoje razne vrste tkiva i organa koja su podložna razvoju TTR amiloidoze kao što su periferni i autonomni nervni sistem, srce, leptomeninge, oči, tetive, ligamenti ili bubrezi. Širok spektar tkiva može biti oštećen TTR amilodazom što je i razlog različitih simptoma koji postoje kod pacijenata sa TTR amiloidozom. Zapravo, pacijenti sa TTR amiloidozom su klinički kategorisani kao da boluju od različitih bolesti u zavisnosti od tkiva ili organa koji je oštećen TTR amiloidazom i odgovarajućih simptoma.
[0089] Na osnovu ovoga, TTR amiloidoza je klasifikovana kao neuropatska forma, u kojoj su periferni i autonomni nervni sistem prvenstveno zahvaćeni i pacijenti većinom ispoljavaju bol, paresteziju, mišićnu slabost i autonomni poremećaj. Postoji i kardiološka forma TTR amiloidoze u kojoj je srce prvenstveno zahvaćeno i pacijenti ispoljavaju većinom ortostatsku hipo- ili hiperzenziju, aritmiju i kardiomegaliju (uvećanje srčane mase). Ove dve forme nisu međusobno isključive i mnogi pacijenti ispoljavaju simptome koji predstavljaju kombinaciju obe forme. Kada TTR amiloidoza zahvati druga tkiva, to može dovesti do zamućenosti staklastog tela, suvih očiju ili glaukoma, proteinurije, hipertiroksinemije, sindroma karpalnog tunela ili preeklampsije.
[0090] Stoga, u jednom primeru izvođenja prema predmetnom pronalasku, antitela prema predmetnom pronalasku, polinukleotidi, vektori i/ili ćelije prema predmetnom pronalasku su korišćeni za pripremu farmaceutske i dijagnostičke kompozicije za profilaktički i/ili terapijski tretman TTR amiloidnog oboljenja, za praćenje progresije bolesti i/ili odgovora na tretman i za dijagnozu bolesti povezanih sa TTR amiloidozom koju čine hereditarna amiloidna polineuropatija (FAP), hereditarna amiloidna kardiomiopatija (FAC), senilna sistemska amiloidoza (SSA), amiloidoza leptomeningi/centralnog nervnog sistema (CNS) uključujući Alchajmerovu bolest, okularnu amiloidozu, renalnu amiloidozu, hepertiroksinemiju, sindrom karpalnog kanala, oštećenje rotatorske manžetne i lumbalnu spinalnu stenozu, i preeklampsija.
Tretman:
[0091] Kao što je već korišćeno u ovom dokumentu, izrazi “tretirati” ili “tretman” se odnose zajedno na terapeutski tretman i profilaktičke ili preventivne mere, sa ciljem da se spreči ili uspori nepoželjna fiziološka promena ili poremećaj kao što je razvoj srčane deficijencije. Željeni ili klinički rezultati uključuju ali nisu ograničeni na otklanjanje simptoma, slabljenje jačine bolesti, stabilizacija (npr. odsustvo pogoršanja) stanja bolesti, odlaganje ili usporavanje progresije bolesti, otklanjanje ili palijativno tretiranje stanja bolesti i remisiju (bilo da je delimična ili potpuna), bilo onu koja može da se detektuje ili koja ne može. Tretman može takođe da znači produžetak preživljavanja u poređenju sa očekivanim preživljavanjem bez tretmana. Oni kojima je potreban tretman su osobe koje već imaju poremećaj kao i oni koji su podložni da razviju poremećaj ili oni kod kojih se ispoljavanje poremećaja može sprečiti.
1
[0092] Ukoliko nije drugačije naznačeno, izraz “lekovi”, “lek” ili “medikament” su korišćeni u ovom tekstu i uključiće ali neće biti ograničeni na sve (A) artikle, lekove i preparacije za unutrašnju ili spoljašnju upotrebu i za bilo koju supstancu ili smešu supstanci koje su namenjene za dijagnozu, izlečenje, ublažavanje, tretman ili sprečavanje bolesti bilo ljudi ili drugih životinja; i (B) artikala lekova i preparata (izuzev hrane) namenjenih da utiču na strukturu ili bilo koju funkciju čovekovog tela ili neke druge životinje; i (C) artikala namenjenih za upotrebu kao deo bilo kog artikla navedenog u rečenici (A) i (B). Izraz “lekovi”, “lek” ili “medikament” će podrazumevati potpunu formulu preparacija namenjenih za upotrebu bilo u ljudima ili u drugim životinjama koja sadrži jedan ili više “agenasa”, “jedinjenja”, “supstanci” ili “(hemijskih) kompozicija” kao i u nekom drugom kontekstu, takođe druge farmaceutski inertne pomoćne supstance kao što su punioci, sredstva za raspadanje, maziva, lubrikanti, veziva ili da obezbede lak transport, raspadanje, rasčlanjavanje, razlaganje i bioraspoloživost “lekova”, “leka” ili “medikamenta” na predviđenoj lokaciji unutar ljudskog tela ili tela neke druge životinje, npr. koži, u želucu ili crevima. Izrazi “agens”, “jedinjenje” ili “supstanca” su ovde naizmenično korišćeni i uključivaće u određenijem kontekstu ali neće biti ograničeni na sve farmakološki aktivne agense npr. agense koji izazivaju željeni biološki ili farmakološki efekat ili se istražuju ili ispituju da li mogu da indukuju takav mogući farmakološki efekat uz pomoć metode prema predmetnom pronalasku.
[0093] Pod "subjektom" ili "jedinkom" ili "životinjom" ili "pacijentom" ili "sisarom" podrazumeva se svaki subjekt, posebno sisarski subjekt, npr., čovek kao pacijent, kome je potrebna dijagnoza, prognoza, prevencija ili terapija.
Farmaceutski nosači:
[0094] Farmaceutski prihvatljivi nosači i načini primene mogu se uzeti iz odgovarajuće literature poznate stručnjaku u ovoj oblasti. Farmaceutski preparati prema predmetnom pronalasku mogu se formulisati prema metodama dobro poznatim u struci; videti na primer Remington: Nauka i praksa farmacije (2000) Univerziteta nauka u Filadelfiji, ISBN 0-683-306472, Protokoli o vakcinama, drugo izdanje Robinson i drugi, Humana Press, Totova, Nev Jersei, SAD, 2003. ; Banga, terapeutski peptidi i proteini: formulacija, obrada i sistemi isporuke. 2. izdanje Tailora i Francisa. (2006), ISBN: 0-8493-1630-8. Primeri pogodnih farmaceutskih nosača dobro su poznati u struci i uključuju fosfatni puferisani fiziološki rastvor, vodu, emulzije, kao što su emulzije ulje / voda, razne vrste sredstava za vlaženje, sterilne rastvore itd. Sastavi koji sadrže takve nosače mogu se formulisati dobro poznatim konvencionalnim metodama. Ove farmaceutski preparati mogu se davati subjektu u pogodnoj dozi. Primena pogodnih sastava
2
može se izvršiti na različite načine. Primeri uključuju primenu preparata koji sadrže farmaceutski prihvatljiv nosač oralnim, intranazalnim, rektalnim, topikalnim, intraperitonealnim, intravenskim, intramuskularnim, potkožnim, subdermalnim, transdermalnim, intratekalnim i intrakranijalnim metodama. Aerosolne formulacije kao što su formulacije za sprej za nos uključuju prečišćeni vodeni rastvor ili druge rastvore aktivnog agensa sa konzervansima i izotoničnim agensima. Takve formulacije se poželjno podešavaju na pH i izotonično stanje kompatibilno sa sluzokožom nosa. Farmaceutski preparati za oralnu primenu, kao što su molekuli antitela sa jednim domenom (tzv., „nanotela ™“) itd., takođe su predviđene u ovom pronalasku. Takve oralne formulacije mogu biti u tableti, kapsuli, prahu, tečnom ili polučvrstom obliku. Tableta može sadržati čvrsti nosač, kao što je želatin ili dodatak. Formulacije za rektalnu ili vaginalnu primenu mogu biti predstavljene u obliku supozitorija sa pogodnim nosačem; videti takođe O'Hagan i sar., Nature Reviews, Drug Discovery 2 (9) (2003), 727- 735. Dalje smernice u vezi sa formulacijama koje su pogodne za različite tipove primene mogu se naći u Remington's Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Company, Philadelphia, PA, 17. izdanje (1985) i odgovarajućim ažuriranim izdanjima. Kratak pregled metoda za isporuku lekova videti u Langer, Science 249 (1990), 1527-1533.
II. Antitela prema predmetnom pronalasku
[0095] Predmetni pronalazak se generalno odnosi na antitela izolovana iz čoveka i njihove fragmente koji se vezuju za antigen, kako su okarakterisani u zahtevima, koji poželjno pokazuju imunološke karakteristike vezivanja i/ili biološka svojstva kako su navedena za antitela ilustrovana u Primerima. U skladu sa ovim pronalaskom, humana monoklonska antitela specifična za TTR klonirana su iz skupa zdravih ljudi. Međutim, u sledećem primeru izvođenja prema predmetnom pronalasku, ljudska monoklonska antitela na TTR mogu se takođe klonirati od pacijenata koji pokazuju simptome bolesti i/ili poremećaja povezanih sa TTR amiloidozom.
[0096] Tokom eksperimenata izvedenih u skladu sa predmetnim pronalaskom, antitela prisutna u kondicioniranim medijumima kultivisanih humanih memorijskih B ćelija procenjena su u pogledu svoje sposobnosti da se vežu za TTR i za više od 10 drugih proteina, uključujući albumin iz goveđeg seruma (BSA). Samo supernatanti B-ćelija sposobni da se vežu za TTR protein, ali ne i za bilo koji drugi protein tokom provere, izabrani su za dalju analizu, uključujući određivanje klase antitela i podklase lakog lanca. Odabrane B-ćelije su zatim obrađene za kloniranje antitela.
[0097] Ukratko, ovo se sastojalo od ekstrakcije informacione RNK iz odabranih B-ćelija, reverzne transkripcije pomoću RT-PCR, umonžavanja regiona koji kodiraju antitela pomoću PCR-a, kloniranja u plazmidne vektore i sekvenciranja. Odabrana humana antitela su zatim proizvedena rekombinantnom ekspresijom u HEK293 ili CHO ćelijama i prečišćavanjem, a potom okarakterisana u pogledu svoje sposobnosti da vežu humani TTR protein. Kombinacija različitih testova, npr. rekombinantna ekspresija antitela u HEK293 ili CHO ćelijama i naknadna karakterizacija njihovih specifičnosti vezivanja za humani TTR protein i njihovo prepoznatljivo vezivanje za patološki pogrešno savijene, pogrešno sastavljene i/ili agregirane oblike potvrdilo je da su po prvi put klonirana humana antitela koja su visoko specifična za TTR i prepoznaju i selektivno vezuju patološki agregirane oblike TTR proteina, kao što su TTR fibrili. U nekim slučajevima, mišja himerna antitela su takođe generisana na osnovu varijabilnih domena humanih antitela prema predmetnom pronalasku. Ova himerna antitela miša pokazala su jednak afinitet vezivanja, specifičnost i selektivnost za humani TTR kao i humana antitela kao što je prikazano na Sl.6 i 9 i u Primerima 4 i 8.
[0098] Prema tome, ovaj pronalazak se generalno odnosi na rekombinantna monoklonska antitela protiv TTR poreklom iz čoveka i njihove fragmente, derivate i njihove varijante kako su okarakterisani u zahtevima. U u jednom primeru izvođenja pronalaska, antitelo je sposobno da veže humani TTR.
[0099] U jednom primeru izvođenja, ovaj pronalazak je usmeren na anti-TTR ili njegov fragment, varijantu ili derivate koji vezuju antigen, gde se antitelo specifično vezuje za isti epitop TTR kao referentno antitelo odabrano iz grupe koja se sastoji od NI-301.59F1, NI-301.35G11, NI-301.37F1 i NI-301.12D3. Mapiranje epitopa identifikovalo je sekvencu unutar humanog TTR uključujući amino kiseline 61-EEEFVEGIY-69 (SEQ ID NO: 49) kao jedinstveni linearni epitop prepoznat od antitela NI-301.59F1 prema predmetnom pronalasku, sekvencu unutar humanog TTR uključujući amino kiseline 53 -GELHGLTTEEE-63 (SEQ ID NO: 50) kao jedinstveni linearni epitop prepoznat od antitela NI-301.35G11 prema predmetnom pronalasku, sekvenca unutar humanog TTR koja uključuje amino kiseline 41-WEPFA-45 (SEQ ID NO: 51) kao jedinstveni linearni epitop prepoznat po antitelu NI-301.37F1 (videti Sliku 10 i Primer 9). Prema tome, u jednom primeru izvođenja je dato antitelo prema predmetnom pronalasku, pri čemu se antitelo specifično vezuje za TTR epitop koji sadrži amino kiselinsku sekvencu EEEFVEGIY (SEQ ID NO: 49), GELHGLTTEEE (SEQ ID NO: 50) ili WEPFA (SEQ ID NO: 51).
[0100] U tom kontekstu, kao što je objašnjeno u Primeru 9, vezivni epitopi primernih antitela NI-301.59F1, NI301.35G11 i NI-301.37F1 analizirani su korišćenjem panela od 29 sekvencijalnih peptida dužine 15 amino kiselina i 11 amino kiselina koji se preklapaju (tj. prvi peptid TTRak1-15; drugi peptid TTRak5-19; itd.), pri čemu antitelo NI-301.59F1 i 301.35G11 prepoznaju dva preklapajuća peptida, (15 i 16), odnosno (13 i 14), i antitelo NI 301.37 F1 prepoznaje tri peptida koji se preklapaju (9, 10 i 11); videti Primer 9 i Sl.10.
[0101] Prema tome, s obzirom na amino kiselinsku sekvencu zrelog TTR polipeptida i odgovarajuće mapiranje peptida, to znači da je antitelo NI-301.59F1 koje se vezuje za epitop EEEFVEGIY (SEQ ID NO: 49) sposobno da prepozna peptide koji imaju amino kiselinsku sekvencu GLTTEEEFVEGIYKV (SEQ ID NO: 85) i EEEFVEGIYKVEIDT (SEQ ID NO: 86).
[0102] Slično tome, anti-TTR antitelo NI-301.35G11 koje se vezuje za epitop GELHGLTTEEE (SEQ ID NO: 50) sposobno je da prepozna peptide koji imaju amino kiselinsku sekvencu TSESGELHGLTTEEE (SEQ ID NO: 87) i GELHGLTTEEEFVEG (SEQ ID NO: 88).
[0103] Slično tome, anti-TTR antitelo NI-301.37F1 koje se vezuje za epitop WEPFA (SEQ ID NO: 51) sposobno je da prepozna peptide sa amino kiselinskim sekvencama FRKAADDTWEPFASG (SEQ ID NO: 89), ADDTWEPFASGKTSE (SEQ ID NO: 90) i WEPFASGKTSESGEL (SEQ ID NO: 91).
[0104] Prema tome, predmetna antitela prema predmetnom pronalasku ilustrovana u primerima se razlikuju od antitela koja prepoznaju bilo koji od pomenutih epitopa u kontekstu samo dodatnih N- i/ili C-terminalnih amino kiselina. Prema tome, u poželjnom primeru izvođenja prema predmetnom pronalasku, specifično vezivanje anti-TTR antitela za TTR epitop koji sadrži amino kiselinsku sekvencu EEEFVEGIY (SEQ ID NO: 49), GELHGLTTEEE (SEQ ID NO: 50) ili WEPFA (SEQ ID NO: 51) određuje se pomoću sekvencijalnih peptida dužine 15 amino kiselina i 11 amino kiselina koji se preklapaju u skladu sa Primerom 9 i slikama 10 A do D.
[0105] U tom kontekstu, proširenim mapiranjem epitopa izvedenim u skladu sa ovim pronalaskom i opisanim u Primeru 9 pomoću panela od 151 sekvencijalnih peptida dužine 15 amino kiselina i 14 amino kiselina, pri čemu je za svaki peptid amino kiselina na položaju 10 zamenjena sa alaninom za ne-alaninske amino kiseline, dok su alanini zamenjeni glicinom ili prolinom otkriveno je da antitelo NI-301.59F1 vezuje epitop EEFXEGIY (TTRak62-69), a antitelo NI-301.35G11 ELXGLTXE (TTRak54-61) dok je utvrđeno da dodatne sekvence nisu potrebne za epitop antitela NI-301.37F1. Shodno tome, u još jednom izvođenju, potvrda da li se dato antitelo vezuje za isti epitop kao antitela NI-301.59F1, NI301.35G11 i NI-301.37F1, vršila se prema primeru 9 i slikama 10E do H.
[0106] Podrazumeva se da mapiranje epitopa i određivanje da li se dato antitelo vezuje za isti epitop kao predmetno antitelo korišćeno u primeru 9 i prikazanom na slici 10 može takođe da se primenjuje na bilo koje drugo anti- TTR prema predmetnom pronalasku opisano u Primerima sa promenljivim regionom prikazanim na slici 1A-1T.
[0107] Shodno tome, ovaj pronalazak se generalno odnosi na bilo koje antitelo na TTR i molekul sličan antitelu kako je okarakterisano u patentnim zahtevima, a koji se vezuju za isti epitop kao antitelo prikazano u primerima i koji ima najmanje CDR i/ili promenljivi teški i laki region kao što je prikazano na bilo kojoj od slika 1A-1T.
[0108] U daljem primeru izvođenja, antitelo se specifično vezuje za amino kiselinsku sekvencu GELHGLTTEEE (SEQ ID NO: 50), ali ne i za GELHGPTTEEE, što odgovara mutiranom epitopu TTR-L55P, ili antitelo specifično vezuje amino kiselinsku sekvencu WEPFA (SEQ ID NO: 51 ) ali ne i WGPFA, što odgovara mutiranom epitopu TTR-E42G.
[0109] Dalje, bez namere da budu vezani za početna eksperimentalna posmatranja kao što je prikazano u primerima 3 do 8 i prikazano na slikama 2, 3, 4, 7 i 9, humana monoklonalna NI-301.59F1, NI-301.35G11 i NI -301.37F1 antitela na TTR iz prema predmetnom pronalasku su okarakterisana kao poželjna zato što se specifično vezuju za patološki pogrešno savijeni, pogrešno sastavljeni ili agregirani TTR i ne prepoznaju suštinski TTR u fiziološkom obliku. Otuda, ovaj pronalazak obezbeđuje skup humanih antitela na TTR sa svojstvima vezivanja, posebno korisnim u dijagnostičke i terapeutske svrhe. Prema tome, u jednom primeru izvođenja ovaj pronalazak obezbeđuje antitela koja su sposobna da specifično vezuju patološki agregirane oblike TTR.
[0110] U jednom primeru izvođenja, antitelo prema predmetnom pronalasku pokazuje svojstva vezivanja antitela iz uzoraka antitela NI301.59F1, NI-301.35G11 i NI-301.37F1, kao što je opisano u primerima. Anti-TTR antitelo prema predmetnom pronalasku preferencijalno prepoznaje patološki izmenjeni TTR, kao što su mutirane, pogrešno savijene, pogrešno sastavljene ili agregirane vrste TTR i njihovi fragmenti, umesto fiziološkog TTR. Prema tome, u jednom izvođenju, antitelo prema predmetnom pronalasku u suštini ne prepoznaje fiziološke TTR vrste.
[0111] Izraz "u suštini ne prepoznaje" kada se koristi u ovoj prijavi za opisivanje afiniteta vezivanja molekula iz grupe koja sadrži antitelo, njegov fragment ili molekul vezivanja za specifični ciljni molekul, antigen i/ili konformaciju ciljnog molekula i/ili antigen znači da molekul gore pomenute grupe vezuje pomenuti molekul, antigen i/ili konformaciju sa afinitetom vezivanja koji je najmanje 2 puta, 3 puta, 4 puta, 5 puta, 6 puta, 7 puta, 8 puta ili 9 puta manjim od afiniteta vezivanja molekula gore pomenute grupe za vezivanje drugog molekula, antigena i/ili konformacije. Veoma često se konstanta disocijacije (KD) koristi kao mera afiniteta vezivanja. Ponekad se EC50 određenog testa, kao na primer ELISA testa, koristi kao mera afiniteta vezivanja. Poželjno je da izraz "u suštini ne prepoznaje" kada se koristi u ovoj prijavi znači da se molekul gore pomenute grupe vezuje za navedeni molekul, antigen i/ili konformaciju sa afinitetom vezivanja koji je barem ili 10 puta, 20 puta, 50 puta, 100 puta, 1000 puta ili 10000 puta manji od afiniteta vezivanja pomenutog molekula gore pomenute grupe za vezivanje za drugi molekul, antigen i/ili konformaciju.
[0112] Pored toga, ili alternativno, anti-TTR antitelo prema predmetnom pronalasku vezuje se za pogrešno savijene, pogrešno sastavljene ili agregirane oblike humanog TTR koje uzrokuju bolest. U tom kontekstu, afiniteti vezivanja mogu biti u opsegu kao što je prikazano za primere antitela NI-301.59F1, NI-301.35G11 i NI-301.37F1 na slici 2, odnosno slici 10, tj. da imaju polovinu maksimalne koncentracije (EC50) od oko 1 pM do 500 nM, poželjno EC50 od oko 50 pM do 100 nM, najpoželjnije EC50 od oko 1 nM do 20 nM za agregirani humani TTR i agregirani rekombinantni TTR kao što je prikazano za NI-301.59F1 i NI- 301.35G11, ili EC50 od oko 100 pM do 1 nM za humani agregirani TTR i agregirani rekombinantni TTR kao što je prikazano za NI-301.37F1.
[0113] Konkretno, antitelo na TTR, njegov fragment ili derivat ima afinitet vezivanja koji odgovara vrednosti EC50 od ≤ 5 nM za vezivanje agregatnog divljeg tipa i/ili EC50 od ≤ 20 nM, poželjno ≤ 10 nM i najpoželjnije ≤ 1 nM za vezivanje agregatnog V30M-TTR; videti primer 3 i sliku 2.
[0114] Neka antitela su u stanju da se vežu za širok spektar biomolekula, na primer, proteine. Kao što će stručnjak uvideti, termin specifičan ovde se koristi da ukaže da se drugi biomolekuli, osim TTR proteina ili njihovih fragmenata, ne vezuju značajno za molekule koji vezuju antigen, na primer, jedno od antitela prema predmetnom pronalasku. Poželjno, nivo vezivanja za biomolekul koji nije TTR rezultira afinitetom vezivanja koji iznosi najviše samo 20% ili manje, 10% ili manje, samo 5% ili manje, samo 2% ili manje ili samo 1% ili manje ( tj. najmanje 5, 10, 20, 50 ili 100 puta niži, ili bilo šta drugo iznad afiniteta prema TTR; vidi npr. sliku 2.
[0115] U jednom primeru izvođenja, anti- TTR prema predmetnom pronalasku se prvenstveno vezuje za agregirane oblike TTR, pogrešno savijene TTR, pogrešno sastavljene TTR i/ili fragmente, njihove derivate, fibrile i/ili oligomere. U još jednom primeru izvođenja, anti-TTR antitelo prema predmetnom pronalasku se preferencijalno vezuje i za nativni TTR i za patološki pogrešno savijene, pogrešno sastavljene ili agregirane oblike TTR.
[0116] Kao što je prethodno pomenuto, amorfne i amiloidne TTR naslage mogu dovesti do različitih bolesti, zavisno od toga gde se u telu pojavljuju pogrešno savijene, sastavljene i/ili agregirane vrste TTR ili njihovi fragmenti. Na primer, pacijenti sa hereditarnom amiloidnom polineuropatijom (FAP) pokazuju depozite TTR prvenstveno u nervnim vlaknima malog prečnika, i stoga predstavljaju prvenstveno simptome kao što su promenjena senzorna percepcija i autonomne disfunkcije, uključujući gastrointestinalne disfunkcije ili impotenciju; pacijenti sa hereditarnom amiloidnom kardiomiopatijom (FAC) ili senilnom sistemskom amiloidozom (SSA) pokazuju TTR naslage prvenstveno u srcu i stoga imaju simptome kao što su srčana insuficijencija ili srčana aritmija; pacijenti sa TTR depozitima u bubrezima mogu imati bubrežne disfunkcije i proteinuriju.
[0117] Prema tome, u jednom primeru izvođenja antitelo prema predmetnom pronalasku je korisno za lečenje hereditarne amiloidne polineuropatije (FAP), hereditarne amiloidne kardiomiopatije (FAC), senilne sistemske amiloidoze (SSA), sistemske hereditarne amiloidoze, amiloidoze leptomeningi/centralnog nervnog sistema (CNS) uključujući Alchajmerovu bolest, očnu amiloidozu, amiloidozu bubrega, hipertiroksinemiju, amiloidozu ligamenata uključujući sindrom karpalnog tunela, povrede rotatorne manžetne i lumbalna kičmena stenoza, i preeklampsija, i njihovi simptomi.
[0118] Predmetni pronalazak se takođe odnosi na antitelo ili njegov antigen-fragment, varijantu ili derivate, gde antitelo sadrži domen koji vezuje antigen, identičan domenu antitela odabranog iz grupe koju čine NI-301.59F1, NI-301.35 G11, NI-301.37F1, NI-301.2F5, NI-301.28B3, NI-301.119C12, NI-301.5D8, NI301.9D5, NI-301.104F5, NI-301.21F10, NI-301.9G12, NI-301.12D3 , NI-301.44E4, NI-301.18C4, NI-301.11A10, NI301.3C9, NI-301.14D8, NI-301.9Ks4
[0119] Predmetni pronalazak dalje ilustruje nekoliko molekula vezivanja, na primer, antitela i njihovi fragmenti vezivanja, koji se karakterišu tako što u svom promenljivom regionu, na primer, vezujućem domenu regiona koji određuju komplementarnost (CDR) VHi VLpromenljivog regiona koji sadrže bilo koji od amino kiselinske sekvence prikazane na slici 1. Odgovarajuće nukleotidne sekvence koje kodiraju gore identifikovane promenljive regione date su u Tabeli II dole. Primeri skupova CDR-a gore navedenih amino kiselinskih sekvenci VHi/ili VLregiona prikazani su na slici 1. Međutim, kao što je objašnjeno u nastavku, stručnjak u ovoj oblasti dobro zna činjenicu da dodatni ili alternativni CDR regioni mogu se koristiti, koji se razlikuju u svojim amino kiselinskim sekvencama od onih prikazanih na slici 1 za jednu, dve, tri ili čak više amino kiselina u slučaju CDR2 i CDR3. Prema tome, u jednom primeru izvođenja obezbeđeno je antitelo prema predmetnom pronalasku ili njegov fragment koji vezuje TTR, koji u svom promenljivom regionu sadrži regione koji određuju komplementarnost (CDR) kao što je prikazano na slici 1 i/ili jedan ili više njegovih CDR koji sadrže jedan ili više zamene amino kiselina.
[0120] U u jednom primeru izvođenja, antitelo prema predmetnom pronalasku je bilo koje od antitela koje sadrži amino kiselinsku sekvencu VHi VLregiona kao što je prikazano na slici 1 ili njegov VHi VLregion koji sadrži jednu ili više zamena amino kiselina. Poželjno je da antitelo prema predmetnom pronalasku karakteriše očuvanje srodnog uparivanja teškog i lakog lanca kakvo je bilo prisutno u humanoj B-ćeliji.
[0121] U dodatnom primeru izvođenja prema predmetnom pronalasku anti-TTR antitelo, TTR-vezujući fragment, njegova sintetička ili biotehnološka varijanta može da se optimizuje tako da ima odgovarajući afinitet vezivanja za ciljnu kategoriju, kao i farmakokinetička svojstva. Stoga najmanje jedna amino kiselina u CDR ili varijabilnom regionu, koja je podložna modifikacijama odabranim iz grupe koja se sastoji od glikozilacije, oksidacije, dezaminacije, razgradnje peptidne veze, obrazovanja izoaspartata i/ili nesparenog cisteina, supstituisana je mutiranom amino kiselinom kojoj nedostaje takva izmena ili kod koje je najmanje jedna ugljenohidratna komponenta uklonjena ili hemijski ili enzimski dodata antitelu. Primeri za optimizaciju amino kiselina mogu da se nađu u npr. međunarodnoj patentnoj prijavi WO 2010/121140 i WO 2012/049570. Dodatna modifikacija kojom se optimizuju svojstva antitela, opisana je u Gavel et al., Protein Engineering 3 (1990), 433-442 i Helenius et al., Annu. Rev. Biochem. 73 (2004), 1019-1049.
[0122] Alternativno, antitelo prema predmetnom pronalasku je antitelo ili njegov antigenvezujući fragment, derivat ili varijanta, koje ulazi u kompeticiju za vezivanje za TTR sa najmanje jednim od antitela koja imaju VHi VLregion kao što je prikazano na bilo kojoj od slika 1 A do T.
[0123] Eksperimentalni rezultati obezbeđeni na Sl. 2 i u Primeru 3 ukazuju na to da se neka od anti-TTR antitela prema predmetnom pronalasku preferencijalno vezuju za pogrešno savijene, pogrešno sastavljene ili agregirane oblike humanog anti-TTR, koji dovodi do pojave bolesti, u odnosu na fiziološke obike proteina. U jednom primeru izvođenja, dakle, antitelo prema predmetnom pronalasku preferencijalno prepoznaje pogrešno savijen, pogrešno sastavljene i/ili agregiran TTR i/ili njegove fragmente i/ili derivate u odnosu na fiziološki TTR.
[0124] Antitelo prema predmetnom pronalasku može da bude humano, naročito za terapeutske primene. Alternativno, antitela prema predmetnom pronalasku su glodarsko, rodentizovano ili himerno glodarsko-humano antitelo, poželjno mišije, murinizovano ili himerno mišije-humano antitelo ili pacovsko, ratinizovano ili himerno pacovsko-humano antitelo, koja su naročito korisna za dijagnostičke metode i studije na životinjama. U jednom primeru izvođenja, antitelo prema predmetnom pronalasku je himerno pacovsko-humano ili rodentizovano antitelo.
[0125] Osim toga, u jednom primeru izvođenja, himerno antitelo prema predmetnom pronalasku, tj. antitelo koje sadrži varijabilne domene humanog antitela, npr. NI-301.35G11 i generičke mišije lake i teške konstantne domene, prikazuje vezujuća svojstva primera antitela - mišijeg himernog antitela NI-301.mur35G11 koje je opisano u Primerima. Dodatno, mišija himerna antitela prema predmetnom pronalasku vezuju se sa visokim afinitetom za humani TTR, kao što je opisano u Primerima 4 i 8. Poželjno, afinitet vezivanja himernog antitela je sličan kao kod njegovih humanih pandana.
[0126] U jednom primeru izvođenja, antitelo prema predmetnom pronalasku je obezbeđeno kulturama jednoklonskih ili oligoklonskih B-ćelija koje su kultivisane, a supernatant kulture, koji sadrži antitela proizvedena od strane navedenih B-ćelija, podvrgnut je skriningu na prisustvo i afinitet anti-TTR antitela. Postupak skrininga obuhvata skrining vezivanja za nativne monomerne, fibrilarne ili nefibrilarne agregate kao što su oligomeri hTTR dobijeni od sintetičkog hTTR peptida pune dužine ili npr. prečišćeni iz humane plazme ili nakon rekombinantne ekspresije.
[0127] Kao dodatak, ili alternativno, postupak skrininga za prisustvo i afinitet anti-TTR antitela može da sadrži korake testa na tkivnu imunoreaktivnost amiloidnih plaka u senzitivnom tkivu (TAPIR), kao što je opisano u međunarodnoj patentnoj prijavi WO 2004/095031. Osim toga ili alternativno, moguće je sprovesti skrining na vezivanje za anti-TTR, na presecima bubrega i srca, kao što je u WO 2008/081008 analogno opisano za preseke mozga i kičmene moždine.
[0128] Kao što je prethodno u tekstu opisano, usled toga što se generiše tokom humanog imunskog odgovora, humano monoklonsko antitelo prema predmetnom pronalasku će prepoznavati epitope koji su od naročitog patološkog značaja i koji možda nisu pristupačni ili su manje imunogeni u slučaju postupka imunizacije kada je cilj da se generišu, na primer, mišija monoklonska antitela i u slučaju in vitro skrininga fagnih biblioteka, redom. Accordingly, it is prudent to stipulate that the epitope of the human anti-TTR antitelo prema predmetnom pronalasku is unique i no other antitelo which is capable of binding to the epitope recognized by the human monoklonsk antitelo prema predmetnom pronalasku exists; videti also Sl.10. Dodatni pokazatelj da su antitela prema predmetnom pronalasku jedinstvena je činjenica da, kao što je pokazano u Primeru 8, antitela NI-301.59F1, NI-301.35G11 i NI-301.37F1 prema predmetnom pronalasku vezuju epitope koji su specifični za pogrešno savijenu, pogrešno sastavljenu, i/ili agregiranu TTR konformaciju, koja, kao što je prethodno u tekstu naznačeno, ima poseban patološki značaj i možda se ne može postići uobičajenim postupkom generisanja antitela, kao što je imunizacija, ili in vitro skrininzi biblioteka.
[0129] Stoga se u jednom primeru izvođenja, predmetni pronalazak takođe uopšteno proteže na anti-TTR antitela i TTR-vezujuće molekule koji ulaze u kompeticiju sa humanim monoklonskim antitelom prema predmetnom pronalasku za specifično vezivanje za TTR. Predmetni pronalazak je specifičnije usmeren na antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, varijantu ili derivate, pri čemu se antitelo specifično vezuje za isti epitope na TTR kao i referentno antitelo odabrano iz grupe koja se sastoji od NI-301.59F1, NI-301.35G11, NI-301.37F1 i/ili NI-301.12D3.
[0130] Osim toga, u jednom primeru izvođenja, predmetni pronalazak se takođe uopšteno proteže na anti-TTR antitela i TTR-vezujuće molekule koji ulaze u kompeticiju sa humanim monoklonskim antitelom prema predmetnom pronalasku za specifično vezivanje za pogrešno savijene, pogrešno sastavljene i/ili agregirane TTR vrste ili njihove fragmente. Predmetni pronalazak je, dakle, takođe specifičnije usmeren na antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, varijantu ili derivate, pri čemu se antitelo specifično vezuje za isti epitop pogrešno savijenih, pogrešno sastavljenih ili agregiranih TTR vrsta ili njihove fragmente kao i referentno antitelo odabrano iz grupe koja se sastoji od NI-301.59F1, NI-301.35G11, NI-301.37F1 i/ili NI301.12D3.
[0131] Kompeticija između antitela se određuje pomoću testa u kome imunoglobulin koji se testira inhibira specifično vezivanje referentnog antitela za uobičajeni antigen, kao što je TTR. Poznati su brojni tipovi kompetitivnih testova vezivanja , na primer: direktni i indirektni radioimunoesej (RIA) na čvrstoj fazi, direktni i indirektni enzimski imunoesej (EIA), kompetitivni esej sendvič-formata; videti Stahli et al., Methods in Enzymology 9 (1983), 242-253; direktni biotin-avidin EIA na čvrstoj fazi; videti Kirkland et al., J. Immunol. 137 (1986), 3614-3619 i Cheung et al., Virology 176 (1990), 546-552; direktni obeleženi test na čvrstoj fazi, direktni obeleženi test na čvrstoj fazi u sendvič-formatu; videti Harlow and Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988); direktni obeleženi RIA na čvrstoj fazi koji koristi I125 kao obeleživač; videti Morel et al., Molec. Immunol. 25 (1988), 7-15 i Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32 (1990), 77-82. Uobičajeno, ovakav test uključuje upotrebu prečišćenog TTR ili pogrešno savijenog, pogrešno sastavljenog ili agregiranog TTR, kao što su njegovi oligomeri i/ili fibrili vezani za čvrstu površinu u ćelijama koje na sebi nose bilo koji od ovih oblika, neobeleženi imunoglobulin koji se testira i obeleženi referentni imunoglobulin, tj. humano monoklonsko antitelo prema predmetnom pronalasku. Kompetitivna inhibicija se meri određivanjem količine obeleživača vezanog za čvrstu površinu ili ćelije u prisustvu imunoglobulina koji se testira. Obično je imunoglobulin koji se testira prisutan u višku. Poželjno, test kompetitivnog vezivanja se izvodi u uslovima kao što su opisani za ELISA test u priloženim Primerima. Antitela identifikovana kompetitivnim testom (kompetitivna antitela) uključuju antitela koja se vezuju za isti epitop kao i referentno antitelo i antitela koja se vezuju za susedni epitop koji je dovoljno blizu epitopa za koji se vezuje referentno antitelo tako da može da dođe do prostornog ometanja. Obično, kada je kompetitivno antitelo prisutno u višku, ono će inhibirati specifično vezivanje referentnog antitela za zajednički antigen za najmanje 50% ili 75%. Dakle, predmetni pronalazak se dodatno usmerava prema antitelu, ili njegovom antigen-vezujućem fragmentu, varijanti ili derivatima, pri čemu antitelo kompetitivno inhibira vezivanje referentnog antitela odabranog iz grupe koja se sastoji od NI-301.59F1, NI-301.35G11, NI-301.37F1, NI-305.2F5, NI-301.28B3, NI-301.119C12, NI301.5D8, NI-301.9D5, NI-301.104F5, NI-301.21F10, NI-301.9G12, NI-301.12D3, NI.301.44E4, NI-301.18C4 NI301.11A10, NI-301.3C9, NI-301.14D8, NI-301.9X4 i/ili NI-301.14C3, za TTR.
[0132] Pored toga, predmetni pronalazak se dodatno usmerava na antitelo, ili njegov antigenvezujući fragment, varijantu ili derivate, pri čemu antitelo kompetitivno inhibira vezivanje referentnog antitela odabranog iz grupe koja se sastoji od NI301.59F1, NI-301.35G11, NI-301.37F1, NI-305.2F5, NI-301.28B3, NI-301.119C12, NI-301.5D8, NI-301.9D5, NI301.104F5, NI-301.21F10, NI-301.9G12, NI-301.12D3, NI-301.44E4 NI-301.18C4, NI-301.11A10, NI-301.3C9, NI301.14D8, NI-301.9X4, i/ili NI-301.14C3 za pogrešno savijene, pogrešno sastavljene ili agregirane TTR vrste ili njihove fragmente.
[0133] Imunoglobulin ili njegova kodirajuća cDNK mogu da budu dodatno modifikovani. Tako, u sledećem primeru izvođenja, postupak prema predmetnom pronalasku sadrži bilo koji od koraka(â) u kojima se proizvodi himerno antitelo, murinizovano antitelo, jednolančano antitelo, Fab-fragment, bi-specifično antitelo, fuziono antitelo, obeleženo antitelo ili analog bilo koje od ovih vrsta. Odgovarajući postupci su poznati stručnjaku u oblasti i opisani su, npr., u Harlow and Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor (1988). Kada se derivati navedenih antitela dobijaju tehnikom prikaza na fagu, rezonancija površinskog plazmona, kao što se koristi u sistemu BIAcore, može da se koristi kako bi se povećala efikasnost antitela faga koja se vezuju za isti epitop kao i bilo koje od ovde opisanih antitela (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7-13). Proizvodnja himernog antitela opisana je, na primer, u međunarodnoj patentnoj prijavi WO 89/09622. Postupci za proizvodnju humanizovanih antitela su opisani u, npr., evropskoj patentnoj prijavi EP-A1 0 239 400 i međunarodnoj patentnoj prijavi WO 90/07861. Dodatni izvori antitela za upotrebu u skladu sa predmetnim pronalaskom su takozvana ksenogena antitela. Opšti princip za proizvodnju ksenogenih antitela kao što su antitela nalik na humana u mišu, opisan je u, npr., međunarodnim patentnim prijavama WO 91/10741, WO 94/02602, WO 96/34096 i WO 96/33735. Kao što se prethodno u tekstu razmatra, antitelo prema pronalasku može da postoji u vidu različitih oblika, osim u obliku kompletnog antitela; uključujući, na primer, Fv, Fab i F(ab)2, kao i u vidu pojedinačnih lanaca; videti npr. međunarodnu patentnu prijavu WO 88/09344. Tako je u jednom primeru izvođenja obezbeđeno antitelo prema predmetnom pronalasku, koje je odabrano iz grupe koja se sastoji od jednolančanog Fv fragmenta (scFv), F(ab’) fragmenta, F(ab) fragmenta, i F(ab’)2fragmenta.
[0134] Antitela prema predmetnom pronalasku ili njihovi odgovarajući imunoglobulinski lanac(ci) mogu da budu dodatno modifikovani upotrebom konvencionalnih tehnika poznatih u oblasti, na primer, upotrebom amino kiselinske delecije(a), insercije(a), supstitucije(a), adicije(a) i/ili rekombinacije(a) i/ili bilo koje druge modifikacije(a) poznate u oblasti, same ili u kombinaciji. Postupci za uvođenje ovih modifikacija u sekvencu DNK koja se nalazi u osnovi amino kiselinske sekvence imunoglobulinskog lanca, dobro su poznati stručnjaku u oblasti; videti, npr., Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. i Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1994). Modifikacije antitela prema pronalasku uključuju hemijske i/ili enzimske derivatizacije na jednoj ili više sastavnih amino kiselina, uključujući modifikacije bočnog lanca, modifikacije kičme, i N- i C-terminalne modifikacije uključujući acetilaciju, hidroksilaciju, metilaciju, amidaciju, i vezivanje ugljenohidratnih ili lipidnih komponenti, kofaktora, i tome slično. Na sličan način, predmetni pronalazak obuhvata proizvodnju himernih proteina koji sadrže opisano antitelo ili neki njegov fragment koji je na amino terminusu fuzionisan sa heterologim molekulom kao što je imunostimulatorni ligand na karboksilnom terminusu; videti, npr., međunarodnu patentnu prijavu WO 00/30680 za odgovarajuće tehničke detalje. Ovakva antitela i vezujući molekuli mogu da se testiraju na svoju specifičnost vezivanja i afinitet putem ELISA testa i imunohistohemije, kao što je ovde opisano, videti, npr., Primere. Ove karakteristike antitela i vezujućih molekula mogu da se testiraju i tehnikom Western blotinga.
[0135] Primer humanog antitela, antitelo NI-301.37F1, pokazalo je izraženo bojenje pogrešno savijenog TTR na presecima biopsije kože pacijenata sa FAP, ali nije pokazalo bojenje na zdravom kontrolnom pankreasu, pri čemu alfa ćelije pankreasa prikazuju endogenu ekspresiju TTR, tj. nativnog TTR (videti Primer 8 i Sl. 9). Primeri antitela NI-301.35G11 i NI-301.37F1, prema predmetnom pronalasku takođe su dali pozitivne rezultate na FAP mišijem tkivu koje prikazuje poremećene depozite TTR u različitim tkivima uključujući crevo; videti Sl. 8. Ova specifičnost vezivanja za patološke oblike TTR u humanom i životinjskom tkivu, naglašava, pored ovde prikazanih biohemijskih eksperimenata (videti Sl. 10) upotrebljivost antitela prema predmetnom pronalasku u lečenju i dijagnostifikovanju bolesti povezanih sa TTR amiloidozom, do kojih dolazi poželjno usled pojave pogrešno savijenih, pogrešno sastavljenih, i/ili agregiranih TTR vrsta i/ili njihovih fragmenata i derivata.
4
[0136] Kao alternativa dobijanju imunoglobulina direktno iz kulture B ćelija ili memorijskih B ćelija, kao izvor rearanžiranih lokusa teškog lanca i lakog lanca, za dalju ekspresiju i/ili genetičku manipulaciju mogu da se koriste ćelije. Rearanžirani geni antitela mogu reverzno da se transkribuju na osnovu odgovarajućih mRNK kako bi se dobila cDNK. Po želji, konstantni region teškog lanca može da se zameni drugim izotipom, ili da se sasvim eliminiše. Varijabilni regioni mogu da se povežu tako da kodiraju jednolančane Fv regione. Više Fv regiona može da se poveže kako bi obezbedili sposobnost vezivanja za više od jedne ciljne ili himerne kombinacije teškog i lakog lanca. Kada genetički materijal postane dostupan, dizajn analoga, kao što je prethodno u takstu opisan, koji zadržavaju i svoju sposobnost da se vežu za željenu ciljnu sekvencu, postaje lak i direktan. Postupci za kloniranje varijabilnih regiona antitela i generisanje rekombinantnih antitela, poznati su stručnjaku u oblasti i opisani su, na primer, u Gilliland et al., Tissue Antigens 47 (1996), 1-20; Doenecke et al., Leukemia 11 (1997), 1787-1792.
[0137] Jednom kada se dobije odgovarajući genetski materijal i, po želji, modifikuje za kodiranje analoga, sekvence kodiranja, uključujući one koje kodiraju, u najmanju ruku, promenljive regione teškog i lakog lanca, mogu se umetnuti u ekspresijske sisteme sadržane na vektorima koji se mogu transfektovati u standardne rekombinantne ćelije domaćina. Mogu se koristiti razne takve ćelije domaćina; za efikasnu obradu, međutim, poželjne su ćelije sisara. Tipične ćelijske linije sisara korisne u ovu svrhu uključuju, ali nisu ograničene na, CHO ćelije, HEK 293 ćelije ili NSO ćelije.
[0138] U skladu sa gore navedenim, ovaj pronalazak se takođe odnosi na polinukleotid koji kodira antitelo iz ovog pronalaska, u slučaju antitela, poželjno najmanje promenljivog regiona lanca imunoglobulina gore opisanog antitela. Tipično, navedeni promenljivi region kodiran polinukleotidom sadrži regione koji određuju komplementarnost (CDR) VHi/ili VLpromenljivog regiona pomenutog antitela. U jednom primeru izvođenja ovog pronalaska, polinukleotid je cDNK.
[0139] U skladu sa prethodno navedenim, predmetni pronalazak se takođe odnosi na polinukleotid koji kodira antitelo prema predmetnom pronalasku, u slučaju antitela, poželjno najmanje varijabilni region imunoglobulinskog lanca antitela koje je opisano prethodno u tekstu. Uobičajeno, navedeni varijabilni region kodiran ovim polinukleotidom sadrži regione za određivanje komplementarnosti (CDR regione) koji pripadaju VHi/ili VLvarijabilnog regiona navedenog antitela. U jednom primeru izvođenja prema predmetnom pronalasku, polinkleotid je cDNK.
[0140] Stručnjak u oblasti će lako razumeti da varijabilni domen antitela koje ima prethodno opisani varijabilni domen može da se koristi za konstrukciju drugih polipeptida ili antitela željene specifičnosti i biološke funkcije. Stručnjak u oblasti zna da se afinitet vezivanja može pojačati uvođenjem amino kiselinskih supstitucija u okviru CDR regiona ili u okviru hipervarijabilnih petlji (Chothia i Lesk, J. Mol. Biol. 196 (1987), 901-917) koje se delimično preklapaju sa CDR regionima, kao što je definisao Kabat; videti, npr., Riechmann, et al, Nature 332 (1988), 323-327. Dakle, predmetni pronalazak se takođe odnosi na antitela kod kojih jedan ili više pomenutih CDR regiona sadrži jednu ili više, poželjno ne više od dve, amino kiselinske supstitucije. Poželjno, antitelo prema pronalasku sadrži u jednom ili oba svoja imunoglobulinska lanca, dva ili sva tri CDR regiona koji pripadaju varijabilnim regionima koji su izloženi na Sl.1.
[0141] Vezujući molekuli, npr. antitela ili njihovi fragmenti, varijante ili derivati koji vezuju antigen, pronalaska, poznati stručnjacima u ovoj oblasti, mogu da sadrže konstantni region koji posreduje u jednoj ili više efektorskih funkcija. Na primer, vezivanje komponente C1 komplementa za konstantni region antitela može aktivirati sistem komplementa. Aktivacija komplementa je važna za opsonizaciju i lizu ćelijskih patogena. Aktivacija komplementa takođe stimuliše upalni odgovor i takođe može biti uključena u autoimunsku preosetljivost. Dalje, antitela se vezuju za receptore na različitim ćelijama preko Fc regiona, sa mestom vezivanja Fc receptora na Fc regionu antitela koje se vezuje za Fc receptor (FcR) na ćeliji. Postoji veliki broj Fc receptora koji su specifični za različite klase antitela, uključujući IgG (gama receptori), IgE (epsilon receptori), IgA (alfa receptori) i IgM (mi receptori). Vezivanje antitela za Fc receptore na ćelijskim površinama pokreće brojne važne i raznovrsne biološke reakcije, uključujući progutanost i uništavanje čestica obloženih antitelima, uklanjanje imunih kompleksa, lizu ćelijaubica obloženih antitelima prekrivenim ćelijama (tzv. posredovana citotoksičnost, ili ADCC), oslobađanje medijatora upale, prenos kroz placentu i kontrolu proizvodnje imunoglobulina.
[0142] Shodno tome, određena ostvarenja ovog pronalaska uključuju antitelo ili njegov antigenvezujući fragment, varijantu ili derivat, u kojima je barem deo jednog ili više domena konstantnog regiona izbrisan ili na neki drugi način izmenjen tako da daje željeni biohemijske karakteristike kao što su smanjene efektorske funkcije, sposobnost nekovalentne dimerizacije, povećana sposobnost lokalizacije na mestu agregacije i taloženja TTR, smanjeni poluživot u serumu ili povećani poluživot u serumu u poređenju sa celim, nepromenjenim antitelom otprilike ista imunogenost. Na primer, određena antitela za upotrebu u ovde opisanim metodama dijagnostike i lečenja su antitela izbrisana iz domena koja sadrže polipeptidni lanac sličan teškom lancu imunoglobulina, ali kojima nedostaje barem deo jednog ili više domena teškog lanca. Na primer, u određenim antitelima će biti obrisan čitav jedan domen konstantnog regiona modifikovanog antitela, na primer, biće obrisan ceo ili deo CH2 domena. U drugim izvođenjima, određena antitela za upotrebu u ovde opisanim metodama dijagnostike i lečenja imaju konstantan region, npr., konstantan region IgG teškog lanca, koji je izmenjen da eliminiše glikozilaciju, a ovde se negde naziva aglikoziliranim ili "agli" antitelima. Takva "agli" antitela mogu se pripremiti enzimski, kao i inženjeringom konsenzusnih mesta glikozilacije u konstantnom regionu. Iako nisu vezani za teoriju, veruje se da „agli“ antitela mogu imati poboljšani profil bezbednosti i stabilnosti in vivo. Postupci za proizvodnju aglikoziliranih antitela sa željenom efektorskom funkcijom pronađeni su, na primer, u međunarodnoj prijavi WO 2005/018572.
[0143] U određenim antitelima ili antigen-vezujućim fragmentima, varijantama ili njihovim derivatima koji su ovde opisani, Fc deo može biti mutiran da smanji efektorsku funkciju korišćenjem tehnika poznatih u tehnici. Na primer, brisanje ili inaktivacija (tačkastim mutacijama ili drugim sredstvima) domena konstantnog regiona može smanjiti vezivanje za Fc receptor cirkulišućeg modifikovanog antitela, povećavajući tako lokalizaciju TTR. U drugim slučajevima može biti da modifikacije konstantnog regiona u skladu sa ovim pronalaskom umerju vezivanje komplementa i tako smanjuju poluživot u serumu i nespecifičnu povezanost konjugovanog citotoksina. Pa ipak, druge modifikacije konstantnog regiona mogu se koristiti za modifikovanje disulfidnih veza ili oligosaharidnih delova koji omogućavaju pojačanu lokalizaciju zbog povećane antigenske specifičnosti ili fleksibilnosti antitela. Rezultirajući fiziološki profil, bioraspoloživost i drugi biohemijski efekti modifikacija, kao što su lokalizacija TTR, biodistribucija i poluvreme u serumu, mogu se lako meriti i kvantifikovati upotrebom dobro poznatih imunoloških tehnika bez nepotrebnog eksperimentisanja.
[0144] U nekim ovde opisanim antitelima ili fragmentima, varijantama ili njihovim derivatima koji vezuju antigen, Fc deo može biti mutiran ili zamenjen alternativnim proteinskim sekvencama da bi se povećao ćelijski unos antitela, na primer, pojačavanjem receptorposredovane endocitoze antitela putem Fcg receptori, LRP ili Thi1 receptori ili pomoću „SuperAntibody Technology“, za koju se kaže da omogućava antitelima da se transportuju u žive ćelije, a da im se ne našteti (Expert Opin. Biol. Ther. (2005), 237-241). Na primer, generacija fuzionih proteina regiona vezivanja antitela i srodnih proteinskih liganada receptora ćelijske površine ili bi- ili multi-specifičnih antitela sa specifičnim sekvencama koje se vezuju za TTR, kao i receptor ćelijske površine mogu se projektovati korišćenjem poznatih tehnika u oblasti.
[0145] U određenim antitelima, ili ovde opisanim fragmentima, varijantama ili njihovim derivatima koji vezuju antigen, Fc deo može biti mutiran ili zamenjen za alternativne proteinske sekvence ili antitelo može biti hemijski modifikovano kako bi povećalo prodiranje kroz krvnomoždanu barijeru.
[0146] Modifikovani oblici antitela, ili njihovi fragmenti, varijante ili derivati koji vezuju antigen, mogu se napraviti od celih prekursora ili roditeljskih antitela, koristeći tehnike poznate u
4
oblasti. Primeri tehnika su ovde detaljnije razmotreni. Antitela, ili njihovi fragmenti, varijante ili derivati koji vezuju antigen, mogu se napraviti ili proizvesti korišćenjem tehnika koje su poznate u tehnici. U određenim primerima izvođenja, molekuli antitela ili njihovi fragmenti su "rekombinantno proizvedeni", tj. proizvedeni su upotrebom tehnologije rekombinantne DNK. Primerne tehnike za dobijanje molekula antitela ili njihovih fragmenata detaljnije su diskutovane na drugom mestu ovde.
[0147] Antitela, ili fragmenti, varijante ili njihovi derivati koji vezuju antigen takođe uključuju derivate koji su modifikovani, npr. kovalentnim vezivanjem bilo koje vrste molekula za antitelo, tako da kovalentna veza ne sprečava antitelo da se specifično veže za njegov srodni epitop. Na primer, ali ne kao ograničenje, derivati antitela uključuju antitela koja su modifikovana, npr. glikozilacijom, acetilacijom, pegilacijom, fosforilacijom, amidacijom, derivatizacijom poznatih zaštitnih/blokirnih grupa, proteolitičkim cepanjem, povezivanjem sa ćelijskim ligandom ili bilo koji drugi protein, itd. Bilo koja od brojnih hemijskih modifikacija može se izvršiti poznatim tehnikama, uključujući, ali ne ograničavajući se na specifično hemijsko cepanje, acetilaciju, formilaciju, metaboličku sintezu tunikamicina, itd. Pored toga, derivat može sadržati jednu ili više ne-klasičnih amino kiselina.
[0148] U posebno poželjnim rešenjima, antitela ili njihovi fragmenti, varijante ili derivati koji vezuju antigen prema pronalasku neće izazvati štetan imuni odgovor kod životinje koja se leči, na primer, kod čoveka. U određenim primerima izvođenja, molekuli koji se vezuju, npr. antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti, pronalaska potiču od pacijenta, npr. od humanog pacijenta, a zatim se koriste u istoj vrsti iz koje potiču, npr. za ublažavanje ili minimiziranje pojave štetnih imunoloških odgovora.
[0149] Deimunizacija se takođe može koristiti za smanjenje imunogenosti antitela. Kako se ovde koristi, termin "deimunizacija" uključuje promenu antitela radi modifikacije epitopa T ćelija; videti, na primer, međunarodne prijave WO 98/52976 i WO 00/34317. Na primer, analiziraju se sekvence VHi VLiz polaznog antitela i epitop humanih T ćelija iz svakog V regiona prikazuje lokaciju epitopa u odnosu na regione koji određuju komplementarnost (CDR regione) i druge ključne ostatke u sekvenci. Analiziraju se pojedinačni epitopi T ćelija sa mape epitopa T ćelija kako bi se identifikovale alternativne supstitucije amino kiselina sa malim rizikom od promene aktivnosti krajnjeg antitela. Dizajniran je niz alternativnih VHi VLsekvenci koje sadrže kombinacije supstitucija amino kiselina i te sekvence su naknadno ugrađene u niz polipeptida koji se vezuju, na primer, antitela specifična za TTR ili njihovi imunospecifični fragmenti za upotrebu u ovde otkrivenim metodama dijagnostike i lečenja, koji se zatim ispituju u funkciji. Tipično se generiše i testira između 12 i 24 varijante antitela. Kompletni geni teškog i lakog lanca koji sadrže modifikovane V i humane C regione se zatim kloniraju u ekspresione vektore i naknadni plazmidi uvode u ćelijske linije za proizvodnju celih antitela. Zatim se antitela upoređuju u odgovarajućim biohemijskim i biološkim testovima i identifikuje se optimalna varijanta.
[0150] Monoklonska antitela se mogu pripremiti korišćenjem širokog spektra tehnika poznatih u tehnici, uključujući upotrebu hibridoma, rekombinantnih i tehnologija prikazivanja faga ili njihove kombinacije. Na primer, monoklonska antitela mogu da se proizvedu hibridomskim tehnikama, uključujući one poznate u struci i kojima se podučava, na primer, u Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. (1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas Elsevier, N.Y., 563-681 (1981). Termin "monoklonsko antitelo", kako se ovde koristi, nije ograničen na antitela proizvedena tehnologijom hibridoma. Izraz "monoklonsko antitelo" odnosi se na antitelo koje je izvedeno iz jednog klona, uključujući bilo koji eukariotski, prokariotski ili fagovski klon, a ne na metod kojim je proizvedeno. Prema tome, termin „monoklonsko antitelo“ nije ograničen na antitela proizvedena tehnologijom hibridoma. U određenim primerima izvođenja, antitela iz ovog pronalaska su izvedena iz humanih B ćelija koje su ovekovečene transformacijom sa Epstein-Barr virusom, kako je ovde opisano.
[0151] U dobro poznatom procesu pravljenja hibridoma (Kohler et al., Nature 256 (1975), 495) relativno kratkotrajni ili smrtni limfociti sisara, npr. B ćelije izvedene od ljudskog subjekta kako je ovde opisano, fuzionišu se sa besmrtnom ćelijskom linijom tumora (npr., ćelijska linija mieloma), stvarajući tako hibridne ćelije ili "hibridome" koje su i besmrtne i sposobne da proizvedu genetski kodirano antitelo B ćelije. Dobijeni hibridi su segregirani u pojedinačne genetske sojeve selekcijom, razblaživanjem i ponovnim rastom, pri čemu svaki pojedinačni soj sadrži specifične gene za stvaranje jednog antitela. Oni proizvode antitela koja su homogena u odnosu na željeni antigen i, u odnosu na njihovo čisto genetsko poreklo, nazivaju se „monoklonska “.
[0152] Tako pripremljene ćelije hibridoma poseju se i uzgajaju u pogodnom medijumu za kulturu koji poželjno sadrži jednu ili više supstanci koje inhibiraju rast ili preživljavanje nekondenzovanih, roditeljskih ćelija mieloma. Stručnjaci u ovoj oblasti shvatiće da su reagensi, ćelijske linije i mediji za formiranje, selekciju i rast hibridoma komercijalno dostupni iz više izvora i da su standardizovani protokoli dobro uspostavljeni. Generalno, podloga za kulturu u kojoj raste ćelija hibridoma se ispituje za proizvodnju monoklonskih antitela protiv željenog antigena. Specifičnost vezivanja monoklonskih antitela proizvedenih od hibridomskih ćelija određuje se in vitro testovima kao što su imunoprecipitacija, radioimunološki test (RIA) ili
4
imunoabsorbentni test povezan sa enzimima (ELISA) kako je ovde opisano. Nakon što se identifikuju ćelije hibridoma koje proizvode antitela željene specifičnosti, afiniteta i/ili aktivnosti, klonovi mogu da se subkloniraju ograničenim postupcima razblaživanja i uzgajaju standardnim metodama; vidi, na primer, Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press (1986), 59-103. Dalje će se uvideti da se monoklonska antitela koja luče subkloni mogu odvojiti od medijuma za kulturu, ascites tečnosti ili seruma konvencionalnim postupcima prečišćavanja, kao što su, na primer, protein-A, hidroksilapatitna hromatografija, gel elektroforeza, dijaliza ili afinitetna hromatografija.
[0153] U još jednom izvođenju, limfociti se mogu odabrati mikromanipulacijom i izolovati varijabilni geni. Na primer, mononuklearne ćelije periferne krvi mogu se izolovati od imunizovanog ili prirodno imunog sisara, npr. čoveka, i kultivisati oko 7 dana in vitro. Kulture se mogu pregledati na specifične IgG molekule koji ispunjavaju kriterijume skrininga. Ćelije iz pozitivnih izvora mogu se izolovati. Pojedinačne B ćelije koje proizvode Ig mogu se izolovati pomoću FACS ili njihovim identifikovanjem u testu hemolitičkih plakova posredovanih komplementom. B ćelije koje proizvode Ig mogu se mikromanipulirati u epruvetu i geni VHi VLmogu se pojačati korišćenjem, na primer, RT-PCR. Geni VHi VLmogu da se kloniraju u vektor ekspresije antitela i transformišu u ćelije (npr. eukariotske ili prokariotske ćelije) za ekspresiju.
[0154] Alternativno, ćelijske linije koje proizvode antitela mogu se odabrati i kultivisati upotrebom tehnika dobro poznatih stručnjaku. Takve tehnike su opisane u raznim laboratorijskim priručnicima i primarnim publikacijama. U tom pogledu, tehnike pogodne za upotrebu u pronalasku, kao što je opisano u nastavku, opisane su u Current Protocols in Immunology, Coligan et al., Eds., Green Publishing Associates and Wiley-Interscience, John Wiley and Sons, New York (1991), uključujući suplemente.
[0155] Fragmenti antitela koji prepoznaju specifične epitope mogu se generisati poznatim tehnikama. Na primer, fragmenti Fab i F(ab’)2mogu se proizvesti rekombinantno ili proteolitičkim cepanjem molekula imunoglobulina, koristeći enzime kao što su papain (za proizvodnju fragmenata Fab) ili pepsin (za proizvodnju fragmenata F (ab’)2). F(ab’)2fragmenti sadrže promenljivi region, konstantni region lakog lanca i domen CH1 teškog lanca. Takvi fragmenti su dovoljni za upotrebu, na primer, u imunodijagnostičkim postupcima koji uključuju spajanje imunospecifičnih delova imunoglobulina sa detektorskim reagensima kao što su radioizotopi.
[0156] Antitela iz ovog pronalaska mogu se proizvesti bilo kojim postupkom poznatim u struci za sintezu antitela, naročito hemijskom sintezom ili poželjno tehnikama rekombinantne ekspresije kako je ovde opisano.
4
[0157] U jednoj realizaciji, antitelo ili njegov fragment, varijanta ili derivat koji veže antigen, pronalazak sadrži sintetički konstantni region u kojem su jedan ili više domena delimično ili u potpunosti izbrisani („antitela sa izbrisanim domenom“). U određenim rešenjima, kompatibilna modifikovana antitela će sadržati konstrukte ili varijante izbrisane iz domena gde je uklonjen ceo CH2 domen (ΔCH2 konstrukti). Za druga izvođenja, izbrisani domen može biti zamenjen kratkim peptidom koji povezuje kako bi se obezbedila fleksibilnost i sloboda kretanja za promenljivi region. Stručnjaci u ovoj oblasti shvatiće da su takvi konstrukti posebno poželjni zbog regulatornih svojstava CH2 domena na kataboličku brzinu antitela. Konstrukti obrisanih domena mogu se izvesti upotrebom vektora koji kodira IgG1 humani konstantni domen, videti, na primer, međunarodne prijave WO 02/060955 i WO 02/096948A2. Ovaj vektor je napravljen tako da briše CH2 domen i pruža sintetički vektor koji izražava domen izbrisani IgG1 konstantni region.
[0158] U određenim primerima izvođenja, antitela ili njihovi fragmenti, varijante ili derivati koji vezuju antigen, predstavljeni pronalazak su mini antitela. Mini-tela mogu da se naprave korišćenjem postupaka opisanih u tehnici, videti, na primer, SAD patent 5,837,821 ili međunarodnu prijavu WO 94/09817.
[0159] U jednoj realizaciji, antitelo ili njegov fragment, varijanta ili derivat koji veže antigen, pronalazak sadrži teški lanac imunoglobulina koji ima deleciju ili supstituciju nekoliko ili čak jednu aminokiselinu sve dok dozvoljava povezanost između monomernih podjedinica. Na primer, mutacija jedne aminokiseline u odabranim oblastima CH2 domena može biti dovoljna da značajno smanji Fc vezivanje i time poveća lokalizaciju TTR. Slično tome, možda će biti poželjno jednostavno izbrisati onaj deo jednog ili više domena konstantnog regiona koji kontrolišu efektorsku funkciju (npr. vezivanje komplementa) koji će biti moduliran. Takva delimična brisanja konstantnih regiona mogu poboljšati odabrane karakteristike antitela (poluživot u serumu), dok ostale poželjne funkcije povezane sa predmetnim domenom konstantnog regiona ostaju netaknute. Štaviše, kao što je prethodno navedeno, konstantni regioni prikazanih antitela mogu biti sintetički mutacijom ili supstitucijom jedne ili više aminokiselina koja poboljšava profil rezultujućeg konstrukta. S tim u vezi, može biti moguće poremetiti aktivnost koju pruža konzervativno mesto vezivanja (npr. vezivanje Fc), dok u suštini održava konfiguraciju i imunogeni profil modifikovanog antitela. Pa ipak, druga izvođenja sadrže dodavanje jedne ili više aminokiselina u konstantni region da bi se poboljšale poželjne karakteristike kao što je efektorska funkcija ili obezbedilo više vezivanja za citotoksin ili ugljene hidrate. U takvim primerima izvođenja može biti poželjno da se umetnu ili repliciraju određene sekvence izvedene iz izabranih domena konstantnog regiona.
[0160] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje antitela koja sadrže, sastoje se u osnovi ili se sastoje od varijanti (uključujući derivate) molekula antitela (npr. ovde opisanih VHregiona i/ili VLregiona), koja se antitela ili njihovi fragmenti imunospecifično vezuju za TTR. Standardne tehnike poznate stručnjacima u ovoj oblasti tehnike mogu se koristiti za uvođenje mutacija u nukleotidnu sekvencu koja kodira antitelo, uključujući, ali bez ograničenja, mutagenezu usmerenu na lokaciju i mutagenezu posredovanu PCR metodom, što rezultira supstitucijom aminokiselina. Poželjno je da varijante (uključujući derivate) kodiraju manje od 50 zamena aminokiselina, manje od 40 aminokiselinskih zamena, manje od 30 aminokiselinskih zamena, manje od 25 aminokiselinskih zamena, manje od 20 aminokiselinskih zamena, manje od 15 aminokiselinskih zamena, manje od 10 zamena aminokiselina, manje od 5 zamena aminokiselina, manje od 4 zamene aminokiselina, manje od 3 zamene aminokiselina ili manje od 2 zamene aminokiselina u odnosu na referentni VHregion, VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, VLregion, VL-CDR1, VL-CDR2 ili VL-CDR3. "Konzervativna supstitucija aminokiselina" je ona u kojoj je aminokiselinski ostatak zamenjen aminokiselinskim ostatkom koji ima bočni lanac sa sličnim punjenjem. Porodice aminokiselinskih ostataka koji imaju bočne lance sa sličnim naelektrisanjima definisane su u tehnici. U ove porodice spadaju aminokiseline sa osnovnim bočnim lancima (npr. lizin, arginin, histidin), kiseli bočni lanci (npr. asparaginska kiselina, glutaminska kiselina), nepopunjeni polarni bočni lanci (npr. glicin, asparagin, glutamin, serin, treonin, tirozin, cistein), nepolarni bočni lanci (npr. alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofan), beta-razgranati bočni lanci (npr. treonin, valin, izoleucin) i aromatični bočni lanci (npr. tirozin, fenilalanin, triptofan, histidin). Alternativno, mutacije se mogu uvesti nasumično duž cele ili dela kodirajuće sekvence, na primer zasićenom mutagenezom, a rezultujući mutanti mogu se pregledati na biološku aktivnost kako bi se identifikovali mutanti koji zadržavaju aktivnost (npr. sposobnost vezivanja TTR i/ili pogrešno savijenih, pogrešno sklopljenih ili agregiranih vrsta TTR i/ili njihovih fragmenata).
[0161] Na primer, moguće je uvesti mutacije samo u okvirne regione ili samo u CDR regione molekula antitela. Uvedene mutacije mogu biti tihe ili neutralne missense mutacije, npr. nemaju nikakav uticaj ili malo utiču na sposobnost antitela da veže antigen, zaista neke takve mutacije uopšte ne menjaju aminokiselinsku sekvencu. Ove vrste mutacija mogu biti korisne za optimizaciju upotrebe kodona ili za poboljšanje proizvodnje antitela na hibridomu. Kodonoptimizovani kodirajući regioni koji kodiraju antitela iz ovog pronalaska su ovde otkriveni na drugom mestu. Alternativno, neutralne missense mutacije mogu promeniti sposobnost antitela da veže antigen. Većina tihih i neutralnih missense mutacija verovatno će se nalaziti u okvirnim regionima, dok će se lokacija većine neutralnih missense mutacija verovatno nalaziti u CDR regionu, mada to nije apsolutni zahtev. Stručnjak u ovoj oblasti bio bi u stanju da dizajnira i testira mutirane molekule sa željenim svojstvima, kao što je promena u aktivnosti vezivanja antigena ili promena aktivnosti vezivanja (npr. poboljšanje aktivnosti vezivanja antigena ili promena specifičnosti antitela). Nakon mutageneze, kodirani protein može se rutinski eksprimirati i funkcionalna i / ili biološka aktivnost kodiranog proteina (npr. sposobnost da se imunospecifično veže najmanje jedan epitop TTR i / ili mutirani, pogrešno sklopljeni, pogrešno sastavljeni ili agregirani TTR i / ili njihovi fragmenti) mogu se odrediti upotrebom ovde opisanih tehnika ili rutinskom modifikacijom tehnika poznatih u oblasti.
III. Polinukleotidi koji kodiraju antitela
[0162] Polinukleotid koji kodira antitelo, ili njegov fragment, varijanta ili derivat koji veže antigen može biti sastavljen od bilo kog poliribonukleotida ili polideoksribonukleotida, koji može biti nemodifikovana RNK ili DNK ili modifikovana RNK ili DNK. Na primer, polinukleotid koji kodira antitelo, ili njegov fragment, varijanta ili derivat koji veže antigen može biti sastavljen od jednolančane i dvolančane DNK, DNK koja je mešavina jedno- i dvolančanih regiona, jedno- i dvostrukih -lančana RNK i RNK koja je mešavina jedno- i dvolančanih regiona, hibridni molekuli koji sadrže DNK i RNK koji mogu biti jednolančani ili, tipičnije, dvolančani ili smeša jednolančanih i dvolančanih regiona . Pored toga, polinukleotid koji kodira antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, varijanta ili derivat može biti sastavljen od trolančanih regiona koji sadrže RNK ili DNK ili obe RNK i DNK. Polinukleotid koji kodira antitelo, ili njegov fragment, varijanta ili derivat koji veže antigen može takođe da sadrži jednu ili više modifikovanih baza ili DNK ili RNK kičme modifikovane zbog stabilnosti ili iz drugih razloga. "Modifikovane" baze uključuju, na primer, tritilirane baze i neobične baze kao što je inozin. Na DNK i RNK mogu se izvršiti razne modifikacije; tako, „polinukleotid“ obuhvata hemijske, enzimske ili metabolički modifikovane oblike.
[0163] Izolovani polinukleotid koji kodira neprirodnu varijantu polipeptida izvedenog iz imunoglobulina (npr. Deo teškog lanca imunoglobulina ili deo lakog lanca) može se stvoriti uvođenjem jedne ili više zamena, dodavanja ili delecija nukleotida u nukleotidnu sekvencu imunoglobulina tako da se jedna ili više aminokiselinskih supstitucija, dodavanja ili delecija uvede u kodirani protein. Mutacije se mogu uvesti standardnim tehnikama, kao što je mutageneza usmerena na lokaciju i mutageneza posredovana PCR-om. Poželjno je da se konzervativne zamene aminokiselina vrše na jednom ili više ne-esencijalnih aminokiselinskih ostataka.
2
[0164] Kao što je dobro poznato, RNK se može izolovati iz originalnih B ćelija, ćelija hibridoma ili iz drugih transformisanih ćelija standardnim tehnikama, kao što su ekstrakcija gvanidinijum izotiocijanata i taloženje, praćeno centrifugiranjem ili hromatografijom. Tamo gde je poželjno, mRNK se može izolovati iz ukupne RNK standardnim tehnikama kao što je hromatografija na oligo dT celulozi. Pogodne tehnike su poznate u tehnici. U jednoj realizaciji, cDNA koje kodiraju laki i teški lanac antitela mogu da se naprave, istovremeno ili odvojeno, koristeći reverznu transkriptazu i DNK polimerazu u skladu sa dobro poznatim metodama. PCR može biti iniciran konsenzus konstantnim regionima ili specifičnijim prajmerima na osnovu objavljenih DNK teških i lakih lanaca i aminokiselinskih sekvenci. Kao što je gore pomenuto, PCR se takođe može koristiti za izolovanje DNK klonova koji kodiraju laki i teški lanac antitela. U ovom slučaju, biblioteke se mogu pregledati pomoću konsenzus prajmera ili većih homoloških sondi, kao što su sonde konstantnog regiona čoveka.
[0165] DNK, tipično plazmidna DNK, može se izolovati iz ćelija upotrebom tehnika poznatih u struci, restrikciono mapirati i sekvencirati u skladu sa standardnim, dobro poznatim tehnikama izloženim detaljno, npr. u prethodnim referencama koje se odnose na tehnike rekombinantne DNK. DNK može biti sintetička prema ovom pronalasku u bilo kom trenutku tokom procesa izolacije ili naknadne analize.
[0166] U ovom kontekstu, ovaj pronalazak se takođe odnosi na polinukleotid koji kodira najmanje vezujući domen ili promenljivi region lanca imunoglobulina antitela iz ovog pronalaska. U jednoj realizaciji, ovaj pronalazak obezbeđuje izolovani polinukleotid koji sadrži, sastoji se u osnovi ili se sastoji od nukleinske kiseline koja kodira promenljivi region teškog lanca imunoglobulina (VH).
[0167] U još jednom primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje izolovani polinukleotid koji sadrži, sastoji se u osnovi ili se sastoji od nukleinske kiseline koja kodira promenljivi region lakog lanca imunoglobulina (VL).
[0168] U još jednom primeru izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje izolovani polinukleotid koji sadrži, sastoji se u osnovi ili se sastoji od nukleinske kiseline koja kodira promenljivi region teškog lanca imunoglobulina (VH) u kome su VH-CDR1, VH-CDR2 i VH- CDR3 regioni imaju polipeptidne sekvence koje su identične VH-CDR1, VH-CDR2 i VH-CDR3 grupama prikazanim na slici 1.
[0169] U poželjnom primeru izvođenja prema predmetnom pronalasku, polinukleotid sadrži, sastoji se u osnovi od ili se sastoji, od nukleinske kiseline koja ima polinukleotidnu sekvencu VHili VLregiona anti-TTR antitela i/ili antitela koje prepoznaje pogrešno savijene, pogrešno sastavljene ili agregirane TTR vrste i/ili njihove fragmente kao što je prikazano u i Tabeli II. U tom pogledu, stručnjak u ovoj oblasti će lako uvideti da polinukleotidi koji kodiraju barem promenljivi domen lakog i / ili teškog lanca mogu kodirati promenljivi domen oba lanca imunoglobulina ili samo jednog. Prema tome, u jednoj realizaciji polinukleotid sadrži, sastoji se u osnovi ili se sastoji od nukleinske kiseline koja ima polinukleotidnu sekvencu VHi VLregion anti-TTR antitela prepoznajući pogrešno sklopljene, pogrešno sastavljene ili agregirane TTR vrste i / ili njihove fragmente kao prikazan u Tabeli II.
Tabela II : Nukleotidne sekvence VHi VLregiona antitela koja prepoznaju mutirane, pogrešno savijene, pogrešno sastavljene ili agregirane TTR vrste i/ili njihove fragmente
4
Antitelo Nukleotidne sekvence varijabilnih teških (VH) i varijabilnih lakih (VL) lanaca ili varijabilnih kapa-lakih lanaca (VK)
(nastavak)
Antitelo Nukleotidne sekvence varijabilnih teških (VH) i varijabilnih lakih (VL) lanaca ili varijabilnih kapa-lakih lanaca (VK)
(nastavak)
Antitelo Nukleotidne sekvence varijabilnih teških (VH) i varijabilnih lakih (VL) lanaca ili varijabilnih kapa-lakih lanaca (VK)
(nastavak)
Antitelo Nukleotidne sekvence varijabilnih teških (VH) i varijabilnih lakih (VL) lanaca ili varijabilnih kapa-lakih lanaca (VK)
(nastavak)
Antitelo Nukleotidne sekvence varijabilnih teških (VH) i varijabilnih lakih (VL) lanaca ili varijabilnih kapa-lakih lanaca (VK)
(nastavak)
Antitelo Nukleotidne sekvence varijabilnih teških (VH) i varijabilnih lakih (VL) lanaca ili varijabilnih kapa-lakih lanaca (VK)
(nastavak)
Antitelo Nukleotidne sekvence varijabilnih teških (VH) i varijabilnih lakih (VL) lanaca ili varijabilnih kapa-lakih lanaca (VK)
[0170] Zbog strategije kloniranja, aminokiselinska sekvenca na N- i C-kraju teškog lanca i lakog lanca potencijalno može sadržati promene izazvane prajmerom u FR1 i FR4, koje međutim ne utiču suštinski na biološku aktivnost antitela. Da bi se obezbedilo konsenzusno ljudsko antitelo, nukleotidne i aminokiselinske sekvence originalnog klona mogu se poravnati i prilagoditi u skladu sa odgovarajućim sekvencama promenljive regije humane klicne linije u bazi podataka; videti, na primer, Vbase2, kao što je gore opisano. Aminokiselinske sekvence humanih antitela označene su podebljanim slovima kada se smatra da aminokiseline N- i C-kraja potencijalno odstupaju od sekvence konsenzusnih klica zbog PCR prajmera i stoga su zamenjene korekcijom mutacije indukovane prajmerom (PIMC), videti Tabelu III. Shodno tome, u jednoj realizaciji ovog pronalaska, polinukleotid sadrži, sastoji se u osnovi ili se sastoji od nukleinske kiseline koja ima polinukleotidnu sekvencu VH kako je prikazano u tabeli III i odgovarajući VL region anti-TTR antitela kao što je prikazano u Tabela II.
Tabela III : Nukleotidne sekvence VHi VLregiona antitela koja prepoznaju mutirane, pogrešno savijene, pogrešno sastavljene ili agregirane TTR vrste i/ili njihove fragmente koje pokazuju zamenu sa PIMC (podebljano)
Alternativni
regioni
antitela sa Nukleotidne sekvence varijabilnih teških (VH) lanaca
PIMC
NI-301.37F1-PIMC-VH
[0171] Predmetni pronalazak takođe uključuje fragmente polinukleotida pronalaska, kao što je opisano na drugom mestu. Pored toga, polinukleotidi koji kodiraju fuzione polinukleotide, Fab fragmente i druge derivate, kako je ovde opisano, takođe su obuhvaćeni pronalaskom.
[0172] Polinukleotidi se mogu proizvesti ili proizvesti bilo kojim postupkom poznatim u tehnici. Na primer, ako je nukleotidna sekvenca antitela poznata, polinukleotid koji kodira antitelo može se sastaviti od hemijski sintetisanih oligonukleotida, na primer, kako je opisano u Kutmeier i sar., BioTechniques 17 (1994), 242, koji ukratko uključuje sinteza preklapajućih oligonukleotida koji sadrže delove sekvence koja kodira antitelo, žarenje i ligovanje tih oligonukleotida, a zatim pojačavanje ligiranih oligonukleotida pomoću PCR metode.
[0173] Alternativno, polinukleotid koji kodira antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, varijanta ili derivat može biti generisan iz nukleinske kiseline iz pogodnog izvora. Ako klon koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira određeno antitelo nije dostupan, ali je poznata sekvenca molekula antitela, nukleinska kiselina koja kodira antitelo može se hemijski sintetizovati ili dobiti iz pogodnog izvora (npr. biblioteka cDNK antitela, ili biblioteka cDNK generisana iz ili nukleinske kiseline, poželjno poliA<+>RNK, izolovane iz bilo kog tkiva ili ćelija koje eksprimiraju antitelo specifično za TTR, kao što su ćelije hibridoma odabrane za ekspresiju antitela) PCR amplifikacijom korišćenjem sintetičkih prajmera hibridiziranih na 3 'i 5 'krajeva sekvence ili kloniranjem pomoću oligonukleotidne sonde specifične za određenu sekvencu gena da bi se identifikovao, na primer, cDNK klon iz biblioteke cDNA koji kodira antitelo. Amplifikovane nukleinske kiseline generisane PCR metodom mogu se zatim klonirati u replicirajuće vektore kloniranja koristeći bilo koji postupak dobro poznat u struci. Shodno tome, u jednoj realizaciji ovog pronalaska cDNA koja kodira antitelo, imunoglobulinski lanac ili njegov fragment se koristi za proizvodnju anti-TTR antitela.
[0174] Jednom kada se odredi nukleotidna sekvenca i odgovarajuća aminokiselinska sekvenca antitela, ili njegov antigen-vezujući fragment, varijanta ili derivat, njegovom nukleotidnom sekvencom se može manipulisati upotrebom postupaka dobro poznatih u struci za manipulaciju nukleotidnim sekvencama, npr. rekombinantnim DNK tehnikama, mutagenezom usmerenom na lokaciju, PCR metodom, itd. (videti, na primer, tehnike opisane u Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990) and Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1998)), da bi se generisala antitela koja imaju drugačiju aminokiselinsku sekvencu, na primer, da bi se generisale amino kiselinske supstitucije, delecije i/ili insercije.
IV. Ekspresija polipeptida antitela
[0175] Nakon manipulacije izolovanog genskog materijala za dobijanje antitela ili antigenvezujućih fragmenata, varijanti ili derivata ovog pronalaska, polinukleotidi koji kodiraju antitela se obično ubacuju u ekspresioni vektor za uvođenje u ćelije domaćina koji se mogu koristiti za proizvodnju željene količine antitela. Ovde je opisana rekombinantna ekspresija antitela, ili njegovog fragmenta, derivata ili analoga, npr. teški ili laki lanac antitela koji se vezuje za ciljni molekul. Jednom kada se dobije polinukleotid koji kodira molekul antitela ili teški ili laki lanac antitela, ili njegov deo (poželjno je da sadrži varijabilni domen teškog ili lakog lanca) predstavljen ovim pronalaskom, vektor za proizvodnju molekula antitela može biti proizveden tehnologijom rekombinantne DNK, upotrebom tehnika dobro poznatih u oblasti. Prema tome, ovde su opisani postupci za pripremu proteina ekspresijom polinukleotida koji sadrži nukelotidnu sekvencu koja kodira antitelo. Postupci koji su dobro poznati stručnjacima u ovoj oblasti mogu se koristiti za konstruisanje ekspresionih vektora koji sadrže sekvence koje kodiraju antitela i odgovarajuće transkripcione i translacione regulatorne signale. Ove metode uključuju, na primer, in vitro tehnike rekombinantne DNK, sintetičke tehnike i genetičku rekombinaciju in vivo. Izum, prema tome, obezbeđuje replikacione vektore koji sadrže nukleotidnu sekvencu koja kodira molekul antitela prema pronalasku, ili njegov teški ili laki lanac, ili varijabilni domen teškog ili lakog lanca, koji je povezan sa promotorom. Takvi vektori mogu uključivati nukleotidnu sekvencu koja kodira konstantni region molekula antitela (videti, npr. Međunarodne prijave VO 86/05807 i VO 89/01036; i američki patent br. 5,122,464), a i promenljivi domen antitela može se klonirati u takav vektor za ekspresiju čitavog teškog ili lakog lanca.
[0176] Izraz "vektor" ili "ekspresioni vektor" ovde se koristi da označi vektore koji se koriste u skladu sa ovim pronalaskom kao nosač za uvođenje i ekspresiju željenog gena u ćeliju domaćina. Kao što je poznato stručnjacima, takvi vektori mogu lako biti izabrani iz grupe koja se sastoji od plazmida, faga, virusa i retrovirusa. Generalno, vektori kompatibilni sa ovim pronalaskom sadržaće selekcioni marker, odgovarajuća restrikciona mesta da olakšaju kloniranje željenog gena i sposobnost ulaska i / ili replikacije u eukariotske ili prokariontske ćelije. Za potrebe ovog pronalaska mogu se koristiti brojni vektorski ekspresioni sistemi. Na primer, jedna klasa vektora koristi DNK elemente koji su izvedeni iz životinjskih virusa kao što su goveđi papiloma virus, poliomavirus, adenovirus, virus vakcinije, bakulovirus, retrovirusi (RSV, MMTV ili MOMLV) ili virus SV40. Drugi uključuju upotrebu policistronskih sistema sa sopstvenim mestima vezivanja ribozoma. Pored toga, ćelije koje su integrisale DNK u svoje hromozome mogu se odabrati uvođenjem jednog ili više markera koji omogućavaju odabir transficiranih ćelija domaćina. Marker može da obezbedi prototrofiju za auksotrofnog domaćina, otpornost na biocide (npr. Antibiotike) ili otpornost na teške metale kao što je bakar. Gen za selektivni marker može biti direktno povezan sa sekvencama DNK koje treba eksprimirati ili se može uvesti u istu ćeliju ko-transformacijom. Dodatni elementi takođe mogu biti potrebni za optimalnu sintezu iRNK. Ovi elementi mogu da uključuju signalne sekvence, signale za splasovanje, kao i transkropcione promotore, pojačivače i terminacione signale.
[0177] U posebno poželjnim rešenjima, klonirani geni promenljivog regiona se ubacuju u ekspresioni vektor zajedno sa genima konstantnog regiona teškog i lakog lanca (poželjno humanog porekla), kao što je prethodno diskutovano. Ovaj vektor sadrži promotor / pojačivač citomegalovirusa, glavni promotor beta globina miša, poreklo replikacije iz SV40, sekvencu poliadenilacije goveđeg hormona rasta, egzon 1 i egzon 2 neomicin fosfotransferaze, gen dihidrofolat reduktaze i vodeću sekvencu. Utvrđeno je da ovaj vektor rezultira vrlo visokim nivoom ekspresije antitela nakon ugradnje gena promenljivog i konstantnog regiona, transfekcije u CHO ćelijama, praćene selekcijom u medijumu koji sadrži G418 i amplifikacijom metotreksatom. Naravno, bilo koji ekspresioni vektor koji je sposoban da izazove ekspresiju u eukariotskim ćelijama može se koristiti u ovom pronalasku. Primeri pogodnih vektora uključuju, ali nisu ograničeni na plazmide pcDNA3, pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEF1/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, pVAX1, and pZeoSV2 (dostupani od Invitrogen, San Diego, CA), i plazmid pCI (dostupan od Promega, Madison, VI). Generalno, skrining/trijaža velikog broja transformisanih ćelija na one koje eksprimiraju odgovarajuće visoke nivoe teških i lakih lanaca imunoglobulina, je rutinsko eksperimentisanje koje može da se izvrši, na primer, robotizovanim sistemima. Vektorski sistemi se takođe predati u američkim patentima br. 5.736.137 i 5.658.570. Ovaj sistem obezbeđuje visoke nivoe ekspresije, npr.> 30 pg / ćelija / dan. Ostali primeri vektorskih sistema su obelodanjeni, na primer, u američkom patentu br.6,413,777.
[0178] U drugim poželjnim/odabranim/opredeljenim rešenjima, antitela ili fragmenti koji se vezuju za antigen, varijante ili derivati predstavljeni u ovom pronalasku mogu se eksprimirati upotrebom policistronskih konstrukata kao što su oni obelodanjeni u US patentnoj prijavi br.
2003-0157641 A1. U ovim ekspresionim sistemima, više genskih proizvoda od interesa kao što su teški i laki lanci antitela mogu se proizvesti iz jednog policistronskog konstrukta. Prednost ovih sistema je u upotrebi interne sekvence za mesto ulazaska u ribozom (IRES) da bi se obezbedio relativno visok nivo antitela. Kompatibilne IRES sekvence su otkrivene u američkom patentu br. 6,193,980. Stručnjaci u ovoj oblasti shvatiće da se takvi ekspresioni sistemi mogu koristiti za efikasno stvaranje čitavog spektra antitela otkrivenih u trenutnom zahtevu. Prema tome, u jednom ostvarenju, ovaj pronalazak obezbeđuje vektor koji sadrži polinukleotid koji kodira najmanje vezujući domen ili promenljivi region lanca imunoglobulina antitela, opciono u kombinaciji sa polinukleotidom koji kodira promenljivi region drugog lanca imunoglobulina navedenog vezujućeg molekula.
[0179] Uopštenije, nakon što se pripremi vektor ili DNK sekvenca koja kodira monomernu subjedinicu antitela, ekspresioni vektor se može uvesti u odgovarajuću ćeliju domaćina. Uvođenje plazmida u ćeliju domaćina može se postići različitim tehnikama koje su dobro poznate stručnjacima. Oni uključuju, ali nisu ograničeni na, transfekciju, uključujući lipotransfekciju, koristeći, na primer, Fugene® ili lipofektamin, fuziju protoplasta, taloženje kalcijum-fosfatom, fuziju ćelija sa upakovanom DNK, mikroinjekciju i infekciju netaknutim virusom. Klasično, uvođenje plazmida u domaćina vrši se standardnom metodom ko-taloženja kalcijum-fosfatom. Ćelije domaćini u kojima se nalazi ekspresioni konstrukt uzgajaju se pod uslovima pogodnim za proizvodnju lakih i teških lanaca i ispituju se na sintezu teških i / ili lanaca lanaca. Primeri tehnika za ispitivanja uključuju enzimski imunološki test (ELISA), radioimunološki test (RIA) ili protočni citometar (FACS), imunohistohemiju i slično.
[0180] Ekspresioni vektor se prenosi u ćeliju domaćina konvencionalnim tehnikama, a transformisane ćelije se zatim uzgajaju konvencionalnim/uobičajenim tehnikama da bi se stvorilo antitelo za upotrebu u ovde opisanim metodama. Prema tome, pronalazak uključuje ćelije domaćina koje sadrže polinukleotid koji kodira antitelo prema pronalasku, ili njegov teški ili laki lanac, ili barem vezujući domen ili promenljivi region njegovog imunoglobulina, koji su poželjno operabilno/operativno/funkcijski povezani sa heterolognim promotorom. Pored toga, ili alternativno, pronalazak takođe uključuje ćelije domaćina koje sadrže vektor, kako je ovde prethodno definisano, koji sadrži polinukleotid koji kodira najmanje vezujući domen ili promenljivi region imunoglobulinskog lanca antitela, opciono u kombinaciji sa polinukleotidom koji kodira promenljivi region drugog lanca imunoglobulina pomenutog vezujućeg molekula. U poželjnim realizacijama za ekspresiju dvolančanih antitela, pojedinačni vektor ili vektori koji kodiraju i teški i laki lanac mogu se ko-eksprimirati u ćeliji domaćina za ekspresiju celokupnog molekula imunoglobulina, kao što je detaljno opisano u nastavku
[0181] Ćelija domaćin može biti ko-transfektovana sa dva ekspresiona vektora prema pronalasku, prvim vektorom koji kodira polipeptid izveden iz teškog lanca i drugim vektorom koji kodira polipeptid izveden iz lakog lanca. Dva vektora mogu sadržati identične markere za selekciju, što omogućava jednaku ekspresiju polipeptida teškog i lakog lanca. Alternativno, može se koristiti jedan vektor koji kodira i polipeptide teškog i lakog lanca. U takvim situacijama laki lanac se povoljno/adekvatno postavlja ispred teškog lanca kako bi se izbegao višak teškog lanca usled toksičnosti; videti Proudfoot, Nature 322 (1986), 52; Kohler, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980), 2197. Kodirajuće sekvence teškog i lakog lanca mogu sadržati cDNA ili genomsku DNK.
[0182] Kako se ovde koristi, "ćelije domaćina" se odnosi na ćelije koje sadrže vektore konstruisane korišćenjem tehnika rekombinantne DNK i kodiraju najmanje jedan heterologni gen. U opisima procesa za izolaciju antitela iz rekombinantnih domaćina, termini "ćelija" i "ćelijska kultura" koriste se naizmenično za označavanje izvora antitela, osim ako nije jasno naznačeno drugačije. Drugim rečima, izolacija polipeptida iz „ćelija“ može značiti ili iz iztaloženih ćelija, ili iz ćelijske kulture koja sadrži i medijum i suspendovane ćelije /ćelije u suspenziji.
[0183] Raznovrsni sistemi vektora ekspresije domaćina mogu se koristiti za ekspresiju molekula antitela za upotrebu u ovde opisanim postupcima. Takvi sistemi za ekspresiju domaćina predstavljaju nosače pomoću kojih se kodirajuće sekvence od interesa mogu proizvesti i naknadno prečistiti, ali takođe predstavljaju ćelije koje mogu, kada se transformišu ili transfekuju sa odgovarajućim nukleotidnim kodirajućim sekvencama, in situ eksprimirati molekul antitela prema pronalasku. Oni uključuju, ali nisu ograničeni na mikroorganizme kao što su bakterije (npr. Escherichia coli, Bacillus subtilis) transformisane sa rekombinantnim bakteriofagnim DNK, plazmidnim DNK ili kosmidnim DNK ekspresionim vektorima koji sadrže sekvence kodiranja antitela; kvasac (npr. Saccharomices, Pichia) transformisan rekombinantnim ekspresionim vektorima kvasca koji sadrže sekvence kodiranja antitela; ćelijski sistemi insekata inficirani/zaraženi ekspresionim vektorima rekombinantnih virusa (npr. bakulovirus) koji sadrže sekvence koje kodiraju antitela; sistemi biljnih ćelija zaraženi ekspresionim vektorima rekombinantnih virusa (npr. virus mozaika karfiola, CaMV; virus mozaika duvana, TMV) ili transformisani ekspresionim vektorima rekombinantnih plazmida (npr. Ti plazmid) koji sadrže sekvence kodiranja antitela; ili ćelijski sistemi sisara (npr. COS, CHO, NSO, BLK, 293, 3T3 ćelije) koji sadrže rekombinantne ekspresione konstrukte koji sadrže promotore izvedene iz genoma ćelija sisara (npr. promotor metalotioneina) ili viruse sisara (npr. kasni promotor adenovirusa); promotor virusa vakcinije 7,5K). Poželjno je da se za ekspresiju molekula rekombinantnog antitela koriste bakterijske ćelije kao što je E. coli, a još poželjnije eukariotske ćelije, posebno za ekspresiju celog molekula rekombinantnog antitela. Na primer, ćelije sisara kao što su ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO), u sprezi sa vektorom, kao što je glavni intermedijarni element ranog gena promotora iz humanog citomegalovirusa, efikasan je sistem ekspresije antitela; videti, na primer, Foecking et al., Gene 45 (1986), 101; Cockett et al., Bio/Technology 8 (1990), 2.
[0184] Ćelijska linija domaćina koja se koristi za ekspresiju proteina je često poreklom iz sisara; stručnjacima u ovoj oblasti pripisuje se sposobnost da preferencijalno odrede posebne/specifične ćelijske linije domaćina koje su najpogodnije za željeni genski proizvod koji se u njima eksprimira. Primeri ćelijskih linija domaćina uključuju, ali nisu ograničene na, CHO (ćelije jajnika kineskog hrčka), DG44 i DUKSB11 (ćelijske linije jajnika kineskog hrčka, DHFR minus), HELA (ćelije karcinoma grlića materice čoveka), CVI (ćelijska linija bubrega majmuna ), COS (derivat CVI sa SV40 T antigenom), VRLY, BHK (ćelije bubrega bebe hrčka), MDCK, VI38, R1610 (fibroblast kineskog hrčka) BALBC / 3T3 (fibroblast miša), HAK (ćelijska linija bubrega hrčka), SP2 / O (mielom miša), P3k63-Ag3.653 (mielom miša), BFA-1c1BPT (endotelne ćelije goveda), RAJI (humani limfociti) i 293 (humani bubreg). CHO i 293 ćelije su posebno poželjne. Ćelijske linije domaćina obično su dostupne u komercijalnim službama, poput Američke zbirke kultura tkiva ili iz objavljene literature.
[0185] Pored toga, može se odabrati soj ćelije domaćina koji modulira ekspresiju umetnutih sekvenci ili modifikuje i obrađuje genski proizvod na specifičano željeni način. Takve modifikacije (npr. glikozilacija) i obrada (npr. sečenje) proteinskih proizvoda mogu biti važne za funkciju proteina. Različite ćelije domaćini imaju karakteristične i specifične mehanizme za post-translacionu obradu i modifikaciju proteina i genskih proizvoda. Odgovarajuće ćelijske linije ili sistemi domaćina mogu se odabrati kako bi se osigurala ispravna modifikacija i obrada eksprimiranog stranog proteina. U tom cilju mogu se koristiti eukariotske ćelije domaćina koje poseduju ćelijsku mašineriju za pravilnu obradu primarnog transkripta, glikozilaciju i fosforilaciju genskog proizvoda.
[0186] Za dugoročnu proizvodnju rekombinantnih proteina visokog prinosa, poželjna je stabilna ekspresija. Na primer, ćelijske linije koje stabilno eksprimiraju molekul antitela mogu se konstruisati. Umesto da koriste ekspresione vektore koji sadrže replikaciju poreklom od virusa, ćelije domaćina mogu se transformisati DNK kontrolisanom odgovarajućim elementima za kontrolu ekspresije (npr. promotor, pojačivač, sekvence, terminatori transkripcije, mesta poliadenilacije, itd.) i selektivnim markerom. Nakon uvođenja stranog DNK, manipulisanim ćelijama se može dozvoliti da rastu 1-2 dana u obogaćenom medijumu, a zatim se prebacuju na selektivni medijum. Selektivni marker u rekombinantnom plazmidu obezbeđuje otpornost pri selekciji i omogućava ćelijama da stabilno integrišu plazmid u svoje hromozome i rastu da bi formirali žarišta koja zauzvrat mogu da se kloniraju i razviju u ćelijske linije. Ovaj postupak se može produktivno koristiti za projektovanje ćelijskih linija koje stabilno eksprimiraju molekul antitela.
[0187] Mogu se koristiti brojni selekcioni sistemi, uključujući, ali bez ograničenja, geni za timidin kinazu virusa herpes simpleksa (Wigler et al., Cell 11 (1977), 223), hipoksantin-guanin fosforiboziltransferazu (Szybalska and Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48 (1992), 202) i adenin fosforiboziltransferazu (Lowy et al., Cell 22 (1980), 817) mogu se koristiti u odgovarajućim tk-, hgprt- ili aprt-ćelijama. Takođe, rezistencija na metabolite može se koristiti kao osnova selekcije za sledeće gene: dhfr, koji daje rezistenciju na metotreksat (Wigler et al., Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980), 357; O’Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 1527); gpt, koji daje rezistenciju na mikofenolnu kiselinu (Mulligan and Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 2072); neo, koji daje rezistenciju na aminoglikozid G-418 Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 12 (1993), 488-505; Wu and Wu, Biotherapy 3 (1991), 87-95; Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32 (1993), 573-596; Mulligan, Science 260 (1993), 926-932; i Morgan and Anderson, Ann. Rev. Biochem.62 (1993), 191-217; TIB TECH 11 (1993), 155-215; i higro, koji daje rezistenciju na higromicin (Santerre et al., Gene 30 (1984), 147. Metode uobičajene u oblasti rekombinantne DNK tehnologije koje se mogu koristiti opisane su u Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); and in Chapters 12 and 13, Dracopoli et al. (eds), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol.150:1 (1981).
[0188] Ekspresioni nivoi molekula antitela mogu se povećati umnožavanjem vektora/vektorskom amplifikacijom, radi pregleda; videti Bebbington and Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Academic Press, New York, Vol. 3. (1987). Kada se marker u vektorskom sistemu koji eksprimira antitelo može pojačati/umnožiti, povećanje nivoa inhibitora prisutnog u kulturi ćelije domaćina povećaće broj kopija gena markera. Pošto je pojačani/umnoženi region povezan sa genom antitela, proizvodnja antitela će se takođe povećati; videti Crouse et al., Mol. Cell. Biol.3 (1983), 257.
[0189] Proizvodnja u in vitro uslovima omogućava povećavanje produkcije velikih količina željenih polipeptida. Tehnike za kultivaciju ćelija sisara u uslovima kulture tkiva poznate su u oblasti i uključuju kulturu homogene suspenzije, npr. u pneumatskom reaktoru ili u reaktoru sa kontinualnom mešalicom, ili imobilizovanoj ili zarobljenoj ćelijskoj kulturi, npr. u šupljim vlaknima, mikrokapsulama, na agaroznim mikrokuglicama ili keramičkim kertridžima. Ako je potrebno i / ili željeno, rastvori polipeptida mogu se prečistiti uobičajenim hromatografskim metodama, na primer, gel filtracijom, jonoizmenjivačkom hromatografijom, hromatografijom na DEAE-celulozi ili (imuno-) afinitetnom hromatografijom, na primer, nakon preferencijalne biosinteze sintetičkog polipeptida zglobne regije ili pre ili posle ovde opisanog koraka HIC hromatografije.
[0190] Geni koji kodiraju antitela, ili njihove fragmente koji vezuju antigen, varijante ili derivate, takođe mogu da se eksprimiraju i u drugim ćelijama izuzev sisarskih kao što su bakterije ili ćelije insekata ili kvasca ili biljaka. Bakterije koje lako preuzimaju nukleinske kiseline uključuju članove enterobakterija, kao što su sojevi E. coli ili Salmonella; Bacillaceae, kao što je B. subtilis; Pneumococcus; Streptococcus i Haemophilus influenzae. Dalje će se razumeti da, kada se eksprimiraju u bakterijama, heterologni polipeptidi tipično postaju deo inkluzionih tela. Heterologni polipeptidi moraju biti izolovani, prečišćeni i zatim sastavljeni u funkcionalne molekule. Tamo gde su željeni četvorovalentni oblici antitela, subjedinice će se zatim samostalno okupiti u četvorovalentna antitela; videti, npr. međunarodnu prijavu VO 02/096948.
[0191] U bakterijskim sistemima, broj ekspresionih vektora može se povoljno odabrati u zavisnosti od namenjene upotrebe molekula antitela koji se eksprimira. Na primer, kada treba da se proizvede velika količina takvog proteina, za proizvodnju farmaceutskih preparata molekula antitela mogu biti poželjni vektori koji obezbeđuju visoki nivo ekspresije fuzionih proteinskih proizvoda koji se lako prečišćavaju. Takvi vektori uključuju, ali nisu ograničeni, na vektor ekspresije E. coli pUR278 (Ruther et al., EMBO J.2 (1983), 1791), u kome sekvenca koja kodira antitela može biti pojedinačno ubačena u vektor u nizu sa regionom kodiranja lacZ tako da se stvara fuzioni protein; pIN vektori (Inouye and Inouye, Nucleic Acids Res. 13 (1985), 31013109; Van Heeke and Schuster, J. Biol. Chem. 24 (1989), 5503-5509); i slično. pGEKS vektori se takođe mogu koristiti za ekspresiju stranih polipeptida u obliku fuzionih proteina sa glutation S-transferazom (GST). Generalno, takvi fuzioni proteini su rastvorljivi i lako se mogu prečistiti iz liziranih ćelija adsorpcijom i vezivanjem za matricu od zrna/kuglica obloženih glutationagarozom, nakon čega sledi elucija u prisustvu slobodnog glutationa. pGEKS vektori su dizajnirani da uključuju mesta sečenja trombina ili proteaze faktora X, tako da se klonirani ciljni genski proizvod može osloboditi iz GST dela.
[0192] Pored prokariota, mogu se koristiti i eukariotski mikrobi. Saccharomices cerevisiae, ili uobičajeni pekarski kvasac, najčešće se koristi među eukariotskim mikroorganizmima, mada su često dostupni brojni drugi sojevi, npr. Pichia pastoris. Za ekspresiju u Saccharomices, na primer, plazmid YRp7 (Stinchcomb et al., Nature 282 (1979), 39; Kingsman et al., Gene 7 (1979), 141; Tschemper et al., Gene 10 (1980), 157) se obično koristi. Ovaj plazmid već sadrži gen TRP1 koji obezbeđuje selekcioni marker za mutirani soj kvasca kome nedostaje sposobnost rasta u prisustvu triptofana, na primer ATCC br. 44076 ili PEP4-1 (Jones, Genetics 85 (1977), 12). Prisustvo lezije trpl kao karakteristike genoma ćelije domaćina kvasca tada pruža efikasno okruženje za otkrivanje transformacije rastom u odsustvu triptofana.
[0193] U sistemu insekata, virus nuklearne polihedroze Autographa californica (AcNPV) obično se koristi kao vektor za ekspresiju stranih gena. Virus raste u ćelijama Spodoptera frugiperda. Kodirajuća sekvenca antitela može se pojedinačno klonirati u nepotrebne/nebitne regione (na primer u gen za polihedrin) virusa i staviti pod kontrolu promotora AcNPV (na primer promotora polihedrina).
[0194] Jednom kada se molekul antitela iz pronalaska rekombinantno eksprimira, cela antitela, njihovi dimeri, pojedinačni laki i teški lanci ili drugi imunoglobulinski oblici ovog pronalaska mogu se prečistiti u skladu sa standardnim postupcima u oblasti, uključujući, na primer, hromatografiju (npr. jonoizmenjivačka, afinitetna, posebno afinitetna prema specifičnom antigenu posle proteina A i hromatografija sa hromatografskim sitima (hromatografija na koloni za određivanje veličine)), centrifugiranje, diferencijalnu rastvorljivost, npr. taloženje amonijum sulfatom ili bilo kojom drugom standardnom tehnikom za prečišćavanje proteina; videti, na primer, Scopes, "Protein Purification", Springer Verlag, N.Y. (1982). Alternativno, poželjni/odabrani postupak za povećanje afiniteta antitela prema pronalasku otkriven je u US patentu 2002-0123057 A1. Prema tome, u jednom ostvarenju, ovaj pronalazak takođe obezbeđuje postupak za pripremu antitela protiv TTR ili antitela za prepoznavanje mutiranih, pogrešno savijenih, pogrešno sastavljenih ili agregiranih TTR vrsta i / ili njihovih fragmenata ili njihovih imunoglobulinskih lanaca, pri čemu pomenuti postupak obuhvata:
(a) kultivisanje ćelije domaćina, kako je ovde definisano, ćelija koja sadrži polinukleotid ili vektor kako je prethodno definisano; i
(b) izolovanja navedenog antitela ili njegovog lanca (la) imunoglobulina iz kulture.
[0195] Dalje, u jednom ostvarenju, ovaj pronalazak se takođe odnosi na antitelo ili lanac/lance imunoglobulina kodiranih polinukleotidom kako je gore definisano ili koji se mogu dobiti postupkom za pripremu antitela na/protiv TTR.
V. Fuzioni proteini i konjugati
[0196] U određenim primerima izvođenja, polipeptid antitela sadrži amino kiselinsku sekvencu ili jednu ili više komponenti, koji obično nisu povezani sa antitelom. Tipične modifikacije su detaljnije opisane u nastavku. Na primer, jednolančani Fv fragment antitela prema pronalasku može da sadrži fleksibilnu vezujuću sekvencu ili može da bude modifikovan da bi se dodala funkcionalna komponenta (npr. PEG, lek, toksin ili oznaka poput fluorescentne, radioaktivne, enzimske, nuklearno magnetne, od teškog metala i slično).
[0197] Polipeptid antitela prema pronalasku može da sadrži, ili da se u osnovi sastoji od, ili da se sastoji od, fuzionog proteina. Fuzioni proteini su himerni molekuli koji sadrže, na primer, imunoglobulinski TTR-vezujući domen sa najmanje jednim ciljnim vezivnim mestom i najmanje jednim heterologim delom, tj. delom sa kojim u prirodi nije prirodno povezan. Amino kiselinske sekvence mogu normalno da postoje u odvojenim proteinima koji su spojeni u fuzionom polipeptidu ili mogu normalno da postoje u istom proteinu, ali su raspoređeni u novom rasporedu u fuzionom polipeptidu. Fuzioni proteini se mogu obrazovati, na primer, hemijskom sintezom ili obrazovanjem i translacijom polinukleotida u kome su peptidni regioni kodirani u željenom odnosu.
[0198] Pojam "heterologi", primenjen na polinukleotid ili polipeptid, znači da je polinukleotid ili polipeptid izveden iz različitog entiteta u odnosu na ostatak entiteta sa kojim se upoređuje. Na primer, kako se ovde koristi, „heterologi polipeptid“ koji će se spojiti sa antitelom ili njegovim fragmentom, varijantom ili analogom koji vezuje antigen, izveden je iz neimunoglobulinskog polipeptida iste vrste, ili imunoglobulinskog ili neimunoglobulinskog polipeptida različite vrste. Kao što je već detaljnije izneto, antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti, varijante ili derivati, , mogu se dalje rekombinantno spojiti u heterologni polipeptid na N- ili C-terminusu ili hemijski konjugovati (uključujući kovalentne i nekovalentne konjugacije) na polipeptide ili druge kompozicije. Na primer, antitela mogu biti rekombinantno fuzionisana ili konjugovana sa molekulima koji su korisni kao obeleživači u testovima detekcije i efektorskim molekulima kao
1
što su heterologi polipeptidi, lekovi, radionuklidi ili toksini; videti, npr. međunarodne prijave WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; SAD patent br. 5,314,995; i evropske patentne prijave EP 0396 387.
[0199] Antitela, ili njihovi antigen-vezujući fragmenti, varijante ili derivati, mogu da se sastoje od amino kiselina međusobno povezanih peptidnim vezama ili modifikovanim peptidnim vezama, tj. peptidnim izosterima, i mogu da sadrže amino kiseline koje ne spadaju u 20 amino kiselina kodiranih genom. Antitela mogu da se modifikujui prirodnim procesima, kao što je posttranslaciona obrada, ili tehnikama hemijske modifikacije koje su dobro poznate u oblasti. Takve modifikacije su dobro opisane u osnovnim tekstovima i detaljnijim monografijama, kao i u obimnoj istraživačkoj literaturi. Modifikacije mogu da se jave bilo gde u antitelu, uključujući kičmu peptida, bočne lance aminokiselina i amino ili karboksilne terminuse, ili na komponentama kao što su ugljeni hidrati. Podrazumeva se da jedna vrsta modifikacije može biti prisutna u istom ili različitom stepenu na nekoliko mesta u datom antitelu. Takođe, dato antitelo može da sadrži mnogo vrsta modifikacija. Antitela mogu biti razgranata, na primer, kao rezultat ubikvitinacije, a mogu biti i ciklična, sa ili bez grananja. Ciklična, razgranata i razgranata ciklična antitela mogu da budu rezultat prirodnih post-translacionih procesa ili se mogu dobiti sintetičkim metodama. Modifikacije uključuju acetilaciju, acilaciju, ADP-ribozilaciju, amidaciju, kovalentno vezivanje flavina, kovalentno vezivanje hem grupe, kovalentno vezivanje nukleotida ili derivata nukleotida, kovalentno vezivanje lipida ili derivata lipida, kovalentno vezivanje fosfatidilinozitola, umrežavanje, ciklizacija, stvaranje disulfidnih veza, demetilacija, formiranje kovalentnih unakrsnih veza, stvaranje cisteina, stvaranje piroglutamata, formilacija, gamakarboksilacija, glikozilacija, formiranje GPI sidra, hidroksilacija, jodiranje, metilacija, miristoilacija, oksidacija, pegilacija, proteolitička obrada, prenilacija , racemizacija, selenoilacija, sulfacija, dodavanje aminokiselina proteinima kao što su arginilisanje i ubikvitinacija posredovano preko transportne RNK; videti, npr., Proteins - Structure And Molecular Properties, T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York 2nd Ed., (1993); Posttranslational Covalent Modification Of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, (1983) 1-12; Seifter et al., Meth. Enzymol.182 (1990), 626-646; Rattan et al., Ann. NY Acad. Sci.663 (1992), 48-62).
[0200] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje fuzione proteine koji sadrže antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment , i heterologi polipeptid. Fuzioni protein sadrži polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje jednog VH regiona antitela prema pronalasku i aminokiselinsku sekvencu najmanje jednog VL regiona antitela prema pronalasku ili njegove fragmente, derivate ili varijante i heterologu polipeptidnu sekvencu. Poželjno, VH i VL regioni fuzionog proteina odgovaraju jednom izvornom antitelu (ili scFv ili Fab fragmentu) koje se specifično vezuje za TTR. U drugom primeru izvođenja, fuzioni protein za upotrebu u ovde prikazanim dijagnostičkim metodama i metodama lečenja sadrži polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu bilo kog jednog, dva, tri ili više VH CDR regiona antitela i aminokiselinsku sekvencu bilo kog jednog, dva, tri ili više VL CDR regiona antitela, ili njegovih fragmenata ili varijanti, i heterologe polipeptidne sekvence. Poželjno je da dva, tri, četiri, pet, šest ili više VH-CDR regiona ili VL-CDR regiona odgovaraju jednom izvornom antitelu (ili scFv ili Fab fragmentu) prema pronalasku. Predmetni pronalazak takođe obuhvata molekule nukleinskih kiselina koji kodiraju ove fuzione proteine.
[0201] Tipični fuzioni proteini zabeleženi u literaturi su fuzije receptora za T ćelije (Gascoigne et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 2936-2940; CD4 (Capon et al., Nature 337 (1989), 525-531; Traunecker et al., Nature 339 (1989), 68-70; Zettmeissl et al., DNA Cell Biol. USA 9 (1990), 347-353; i Birn et al., Nature 344 (1990), 667-670); L-selektin (homing receptor) (Watson et al., J. Cell. Biol. 110 (1990), 2221-2229; i Watson et al., Nature 349 (1991), 164 -167); CD44 (Aruffo et al., Cell 61 (1990), 1303-1313); CD28 i B7 (Linslei et al., J. Exp. Med.
173 (1991), 721-730); CTLA-4 (Lislei et al., J. Exp. Med. 174 (1991), 561-569); CD22 (Stamenković et al., Cell 66 (1991), 1133-1144); TNF receptor (Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad Sci Sci USA 88 (1991), 10535-10539; Lesslauer et al., Eur. J. Immunol. 27 (1991), 2883-2886; i Peppel et al., J. Exp. Med. 174 ( 1991), 1483-1489 (1991) i IgE receptor a (Ridgvai and Gorman, J. Cell. Biol.115 (1991), Abstract No.1448).
[0202] Kao što je ranije rečeno u ovom dokumentu, antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti, varijante ili derivati mogu se spojiti sa heterologim polipeptidima da bi se povećao in vivo poluživot polipeptida ili za upotrebu u imunoesejima u kojima se koriste postupci poznati u ovoj oblasti. Na primer, u jednom primeru izvođenja, PEG može da budei konjugovan sa antitelima prema pronalasku da bi se povećao njihov poluživot in vivo; videti, npr., Leong et al., Cytokine 16 (2001), 106-119; Adv. in Drug Deliv. Rev.54 (2002), 531; ili Veir et al., Biochem.
[0203] Osim toga, antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti, varijante ili derivati mogu se spojiti sa marker sekvencama, kao što je peptid, da bi se olakšalo njihovo prečišćavanje ili detekcija. U poželjnim primerima izvođenja, marker amino kiselinska sekvenca je heksahistidinski peptid (HIS), kao što je oznaka data u pKE vektoru (KIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsvorth, CA, 91311), između ostalog, od kojih su mnogi komercijalno dostupni. Kao što je opisano u Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 821-824, na primer, heksahistidin omogućava pogodno prečišćavanje fuzionog proteina. Ostale peptidne oznake korisne za prečišćavanje uključuju, ali nisu ograničene na, oznaku "HA", koja odgovara epitopu izvedenom iz hemaglutininskog proteina virusa gripa (Vilson et al., Cell 37 (1984), 767), GST, c- myc i oznaku "flag"; videti, npr., Bill Brizzard, BioTechniques 44 (2008) 693-695 za pregled tehnika označavanja epitopa, i Tabelu 1 na strani 694 u kojoj su navedeni najčešće oznake epitopa upotrebljive u predmetnom pronalasku.
[0204] Fuzioni proteini se mogu pripremiti primenom postupaka koji su dobro poznati u ovoj oblasti; videti na primer SAD patente br. 5,116,964 i 5,225,538. Precizno mesto na kom se vrši fuzija može se empirijski odabrati kako bi se optimizovale sekretorne ili vezujuće karakteristike fuzionog proteina. DNK koja kodira fuzioni protein se zatim transfektuje u ćeliju domaćina radi ekspresije, koja se izvodi kao što je ranije opisano u ovom dokumentu.
[0205] Antitela prema predmetnom pronalasku mogu da se koriste u nekonjugovanom obliku ili mogu da budu konjugovana sa najmanje jednim od niza drugih molekula, npr. za poboljšanje terapeutskih svojstava molekula, za olakšavanje otkrivanja ciljnih sekvenci ili za snimanje ili terapiju pacijenta. Antitela, ili njihovi antigen-vezujući fragmenti, varijante ili derivati , mogu biti obeleženi ili konjugovani bilo pre ili posle prečišćavanja, ukoliko se vrši prečišćavanje. Konkretno, antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti, varijante ili derivati mogu se konjugovati sa terapeutskim agensima, prolekovima, peptidima, proteinima, enzimima, virusima, lipidima, modifikatorima biološkog odgovora, farmaceutskim agensima ili PEG molekulom.
[0206] Konjugati koji su imunotoksini, uključujući konvencionalna antitela, do sada su već detaljno opisani u ovoj oblasti. Toksini mogu da se kupluju sa antitelima konvencionalnim tehnikama kuplovanja ili se imunotoksini koji sadrže proteinske toksine mogu proizvesti kao fuzioni proteini. Antitela prema predmetnom pronalasku mogu da se koriste na odgovarajući način za dobijanje takvih imunotoksina. Ilustrativni primeri takvih imunotoksina su oni koje je opisao Byers, Seminars Cell. Biol.2 (1991), 59-70 i Fanger, Immunol. Today 12 (1991), 51-54.
[0207] Stručnjaci u ovoj oblasti znaju da se konjugati takođe mogu sastaviti upotrebom različitih tehnika u zavisnosti od izabranog agensa koji će se konjugovati. Na primer, konjugati sa biotinom se pripremaju, npr., reakcijom TTR-vezujućeg polipeptida sa aktiviranim estrom biotina, kao što je biotin N-hidroksisukcinimidni estar. Slično tome, konjugati sa fluorescentnim markerom mogu se pripremiti u prisustvu kuplujućeg agensa, npr. oni koji su ovde navedeni ili reakcijom sa izotiocijanatom, poželjno je sa fluorescein-izotiocijanatom. Konjugati antitela, ili njihovih antigen-vezujućih fragmenata , varijanti ili derivata prema predmetnom pronalasku pripremljeni su na takav analogan način.
[0208] Predmetni pronalazak obuhvata isto tako antitela ili njihove antigen-vezujuće fragmente, varijante ili derivate prema pronalasku konjugovane sa dijagnostičkim ili terapeutskim agensom. Antitela se mogu koristiti dijagnostički kako bi se, na primer, pokazalo prisustvo TTR amiloidoze i tako ukazalo na rizik od obolevanja ili poremećaja povezanog sa pogrešno savijenim, pogrešno sastavljenim ili agregiranim TTR; kako bi se pratio razvoj ili napredovanje takve bolesti, tj. bolesti koja ukazuje na pojavljivanje ili povezanost sa agregatnim TTR koji je pogrešno savijen, pogrešno sastavljen; ili kao deo postupka kliničkog ispitivanja da bi se, na primer, utvrdila efikasnost određene terapije i/ili preventivnog tretmana. Dakle, u jednom primeru izvođenja predmetni pronalazak se odnosi na antitelo, koje je obeleženo tako da može da se detektuje. Uz to, u istom primeru izvođenja, predmetni pronalazak se odnosi na antitelo koje je vezano za lek. Detekcija može da se olakša kuplovanjem antitela ili njegovog antigenvezujućeg fragmenta, varijante ili derivata sa supstancom koja može da se detektuje .Supstance ili oznake koje se mogu detektovati, u principu mogu da budu enzim; teški metal, poželjnozlato; boja, poželjno fluorescentna ili luminescentna boja; ili radioaktivnaoznaka. Primeri supstanci koje se mogu detektovati podrazumevaju razne enzime, prostetične grupe, fluorescentne materijale, luminescentne materijale, bioluminescentne materijale, radioaktivne materijale, pozitronske metale uz upotrebu različitih pozitronskih emisionih tomografija i neradioaktivne jone paramagnetnih metala; videti, npr., SAD patent br. 4,741,900 za jone metala koji se mogu konjugovati sa antitelima i koristiti u dijagnostici, u skladu sa predmetnim pronalaskom. Primeri odgovarajućih enzima su peroksidaza rena, alkalna fosfataza, beta-galaktozidaza ili acetilholin esteraza; primeri odgovarajućih kompleksa prostetičnih grupa uključuju streptavidin/biotin i avidin/biotin; primeri odgovarajućih fluorescentnih materijala uključuju umbeliferon, fluorescein, fluorescein izotiocijanat, rodamin, dihlorotriazinilamin fluorescein, dansil hlorid ili fikoeritrin; primer luminescentnog materijala je luminol; primeri bioluminescentnih materijala su luciferaza, luciferin i ekvorin; a primeri odgovarajućih radioaktivnih materijala su<125>I,<131>I,<111>In ili<99>Tc. Prema tome, u jednom primeru izvođenja predmetni pronalazak obezbeđuje obeleženo antitelo koje može da se detektuje, pri čemu se oznaka koja može da se detektuje bira iz grupe koja se sastoji od enzima, radioizotopa, fluorofore i teškog metala.
[0209] Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, varijanta ili derivat takođe se mogu obeležiti tako da je moguća njihova detekcija, ako se kupluju sa hemiluminescentnim jedinjenjem. Zatim se prisustvo antitela obeleženih hemiluminescentnom oznakom utvrđuje detekcijom prisustva luminescencije, koja nastaje tokom hemijske reakcije. Primeri naročito korisnih hemilumenescentnih jedinjenja za obeležavanje su luminol, izoluminol, aromatični estar akridinijuma, imidazol, sol akridinijuma i oksalatni estar.
[0210] Jedan od načina na koji se antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, varijanta ili derivat može detektovati obeležavanjem jeste njegovim povezivanjem sa enzimom i korišćenjem tog povezanog proizvoda u imunološkom testu enzima (EIA) (Voller, A., „Enzimski povezani imunosorbentni test (ELISA)“ Kvartalna publikacija Microbiological Associates, Valkersville, Md., Diagnostic Horizons 2 (1978), 1-7); Voller et al., J. Clin. Pathol. 31 (1978), 507-520; Batler, Meth. Enzimol.73 (1981), 482-523; Maggio, (ur.), Enzime Immunoassai, CRC Press, Boca Raton, Fla., (1980); Ishikava, et al., (Ur.), Enzimski imunološki test, Kgaku Shoin, Tokio (1981). Enzim, koji je vezan za antitelo, reagovaće sa odgovarajućim supstratom, poželjno hromogenim supstratom, na takav način da proizvodi hemijski deo koji se može otkriti, na primer, spektrofotometrijskim, fluorimetrijskim ili vizuelnim putem. Enzimi koji se mogu koristiti za detektujuće obeležavanje antitela podrazumevaju, ali nisu ograničeni na, malatdehidrogenazu, stafilokoknu nukleazu, delta-5-steroid-izomerazu, alkohol-dehidrogenazu kvasca, alfa-glicerofosfat, dehidrogenazu, triozu-fosfat-izomerazu, peren-oksidazu, alkalnu hronsfataza, alkalnu , asparaginaza, glukoza oksidaza, beta-galaktozidaza, ribonukleaza, ureaza, katalaza, glukoza-6-fosfat dehidrogenaza, glukoamilaza i acetilholinesteraza. Pored toga, detekcija se može postići kolorimetrijskim metodama koje koriste hromogeni supstrat za enzim. Detektovanje se takođe može postići vizuelnim upoređivanjem obima enzimske reakcije supstrata u poređenju sa slično pripremljenim standardima.
[0211] Detekcija se takođe može postići korišćenjem bilo kog u nizu drugih imunotestova. Na primer, radioaktivnim obeležavanjem antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, varijante ili derivata, moguće je detektovati antitelo upotrebom radioimunološkog testa (RIA) (videti, na primer, Veintraub, B., Principles of Radioimunotestovi, Sedmi kurs o tehnikama radioligandskog ispitivanja, Endokrino društvo, (mart, 1986). Radioaktivni izotop se može otkriti na način koji podrazumeva, ali nije ograničen na, gama brojač, scintilacioni brojač ili autoradiografiju.
[0212] Antitelo ili njegov fragment, varijanta ili derivat takođe mogu biti detektujuće obeleženi uočljivo označeni upotrebom metala koji emituju fluorescenciju, kao što je 152Eu, ili drugih iz lanca lantanida. Ovi metali se mogu vezati za antitelo koristeći takve metalne helatne grupe kao dietilenetriaminpentacetna kiselina (DTPA) ili etilendiamintetrasirćetna kiselina (EDTA).
[0213] Tehnike za konjugaciju različitih delova sa antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom, varijantom ili derivatom već su dobro poznate. Videti, na primer, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. (1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), Marcel Dekker, Inc., (1987) 623-53; Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies ’84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), (1985) 475-506; "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), Academic Press (1985) 303-16, and Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev.62 (1982), 119-158.
[0214] Kao što je rečeno, u određenim primerima izvođenja deo koji poboljšava stabilnost ili efikasnost vezujućeg molekula, na primer vezujući polipeptid, antitelo ili njegov imunospecifican fragment mogu se konjugovati. Na primer, u jednom primeru izvođenja, PEG se može konjugovati u (sa) vezujućim molekulima predmetnog pronalaska kako bi se povećao njihov poluživot in vivo. Leong i sar., Citokine 16 (2001), 106; Adv. u Drug Deliv. Rev. 54 (2002), 531; ili Veir i sar., Biochem. Soc. Transaction 30 (2002), 512.
PRIMERI
Primer 1: Izolacija i identifikacija anti-TTR antitela
[0255] Antitela humanog porekla koja ciljano deluju na TTR i/ili mutirane, pogrešno savijene, pogrešno sastavljene, i/ili agregirane TTR vrste i/ili njihove fragmente, identifikovana su upotrebom postupka koji je opisan u međunarodnoj patentnoj prijavi WO 2008/081008, sa modifikacijama. Konkretno, humani TTR protein divljeg tipa dobijen prečišćavanjem iz humane plazme, i TTR proteini divljeg i mutiranog tipa dobijeni rekombinantnom ekspresijom, upotrebljeni su, kako u nativnoj, tako i u pogrešno savijenoj-agregiranoj konformaciji, za identifikacija antitela koja ciljano deluju na TTR. Pogrešno savijene-agregirane konformacije su proizvedene in vitro u kiselim uslovima, upotrebom procedure slične proceduri opisanoj u Colon W. et al, Biochemistry, 31 (1992), 8654-8660, sa neznatnim modifikacijama.
Primer 2: Određivanje sekvence antitela
[0256] Amino kiselinske sekvence varijabilnih regiona anti-TTR antitela koje su identifikovana prethodno u tekstu, were određene su na osnovu njihovih mRNK sekvenci, videti Sl.1. Ukratko, sakupljene su žive B cells iz odabranih neimortalizovanih kultura memorijskih B ćelija. Zatim su mRNK iz ćelija koje proizvode odabrana anti-TTR antitela ekstrahovane i prevedene u cDNK, i sekvence koje kodiraju varijabile regione antitela amplifikovane su PCR tehnikom, kolonirane u plazmidne vektore i sekvencirane. Ukratko, kombinacije prajmera koji predstavljaju sve familije sekvenci iz repertoara humanih imunoglobulina iz klicinih ćelija, upotrebljene su za amplifikacije vodećih peptida, V-segmenata i J-segmenata. Prva runda amlifikacije je izvedena upotrebom prajmera specifičnih za vodeći peptid na 5’-kraju i prajmera specifičnih za konstantni region na 3’ kraju (Smith et al., Nat Protoc.4 (2009), 372-384). Za teške lance i kapa lake lance, izvedena je druga runda amplifikacije, upotrebom prajmera specifičnih za V-segment na 5’ kraju i prajmera specifičnih za J-segment na 3’ kraju. Za lambda lake lance, druga runda amplifikacije je izvedena upotrebom prajmera specifičnih za V-segment na 5’ kraju i prajmera specifičnih za C-region na 3’ kraju (Marks et al., Mol. Biol. 222 (1991), 581-597; de Haard et al., J. Biol. Chem. 26 (1999), 18218-18230).
[0257] Identifikacija klona antitela koji ima željenu specifičnost sprovedeno je ponovljenim skriningom na ELISA test, nakon rekombinantne eksprecije celog antitela. Rekombinantna ekspresija celog humanog IgG1 antitela postignuta je nakon insercije sekvenci varijabilnog teškog i lakog lanca "u korektnom okviru čitanja" u ekspresione vektore koji dopunjavaju sekvancu varijabilnog regiona sa sekvencom koja kodira leader peptide na 5’ kraju, i sa sekvencom koja kodira odovarajući konstantni domen(e) na 3’ kraju. Da bi se to postiglo, prajmeri su sadržali restrikciona mesta dizajnirana tako da olakšaju kloniranje sekvenci varijabilnog teškog i lakog lanca u ekspresione vektore za antitelo. Imunoglobulini teškog lanca su eksprimirani putem insercije RT-PCR proizvoda imunoglobulinskog teškog lanca u okviru čitanja u ekspresioni vektor za teški lanac koji nosi na sebi signalni peptid i konstanten domene humanog ili mišijeg imunoglobulina gama 1. Imunoglobulini kapa lakog lanca su eksprimirani putem insercije RT-PCR proizvoda kapa lakog lanca u okviru čitanja, u ekspresioni vektor za laki lanac koji obezbeđuje signalni peptid i konstantni domen humanog imunoglobulinskog kapa lakog lanca. Imunoglobulini lambda lakog lanca eksprimirani su putem insercije RT-PCR proizvoda lambda lakog lanca u okviru čitanja, u ekspresioni vektor za lambda laki lanac, koji obezbeđuje signalni peptid i konstantni domen humanog ili mišijeg imunoglobulinskog lambda lakog lanca.
[0258] Funkcionalna rekombinantna monoklonska antitela dobijena su nakon ko-transfekcije u HEK 293 ili CHO ćelije (ili bilo koju drugu pogodnu recipijentnu ćelijsku liniju humanog ili mišijeg porekla) ekspresionog vektora za Ig-teški lanac i ekspresionog vektora za kapa ili lambda Ig-laki lanac. Rekombinantno humano monoklonsko antitelo je zatim prečišćeno iz kondicioniranog medijuma upotrebom standardnog prečišćavanja na koloni sa proteinom A. Rekombinantno humano monoklonsko antitelo može da se proizvodi u neograničenim količinama upotrebom ili privremeno ili stabilno transfektovanih ćelija. Ćelijske linije koje proizvode rekombinantno humano monoklonsko antitelo mogu da se uspostave ili direktnom upotrebom Ig ekspresionih vektora ili ponovljenim kloniranjem Ig varijabilnih regiona u različite ekspresione vektore. Derivati kao što su F(ab), F(ab)2 i scFv mogu takođe da se generišu iz ovih Ig-varijabilnih regiona.
[0259] Okvirni regioni i regioni koji određuju komplementarnost utvrđeni su poređenjem referentnih sekvenci antitela koje su dostupne u bazama podataka kao što je Abysis (http://www.bioinf.org.uk/abysis/), i označene upotrebno Kabat šeme za numeraciju (http://www.bioinf.org.uk/abs/). Amino kiselinske sekvence varijabilnih regiona predmetnih antitela NI-301.59F1, NI-301.35G11, NI-301.37F1, NI-301.2F5, NI-301.28B3, NI-301.119C12, NI-301.5D8, NI301.9D5, NI-301.104F5, NI-301.21F10, NI-301.9G12, NI-301.12D3, NI-301.37F1-PIMC, NI-301.44E4, NI-301.18C4, NI-301.11A10, NI-301.3C9, NI-301.14D8, NI-301.9X4 i NI-301.14C3, uključujući oznake za okvirne regione (FR) i regione koji određuju komplementarnost (CDR regione), prikazane su na Slici 1A-1T.
[0260] U nastavku teksta su na primerima za antitela NI-301.59.F1, NI-301.35G11 i NI-301.37F1, ilustrovani visok afinitet predmetnih antitela za pogrešno savijene-agregirane TTR konformacije i suštinski izostanak vezivanja za nativne TTR konformacije divljeg tipa, čime je demonstrirana izražena selektivnost za mutantni, pogrešno savijeni, pogrešno sastavljen i/ili agregiran TTR. Međutim, preliminarni eksperimenti za druga predmetna antitela ukazuju na suštinski isto preferencijalno vezivanje za mutantni, pogrešno savijeni, pogrešno sastavljen i/ili agregiran TTR, u odnosu na fiziološke TTR vrste, kao i u slučaju antitela NI-301.59.F1, NI-301.35G11 i NI-301.37F1.
Primer 3: Afinitet vezivanja anti-TTR antitela koristeći ELISA test i određivanje EC50 deizrazination
[0261] Kapacitet antitela da veže TTR i/ili pogrešno savijen, pogrešno sastavljene i/ili agregirane oblike TTR procenjen je posredstvom direktnih ELISA testova pri različitim koncentracijama varying antitela. Ovo omogućava da se za svako antitelo odredi polovina maksimalne efikasne koncentracije (EC50) u ovom testu, što je uobičajena aproksimacija koja se koristi za afinitet vezivanja antitela, videti Sl. 2. Ukratko, mikrotitar ploče za ELISA test (visokovezujuće, od prozirnog polistirena, pola površine bunarčića, ravno dno) su obložene pogrešno savijenimagregiranim humanim TTR divljeg tipa, pogrešno savijenim-agregiranim rekombinantnim V30M-TTR (oba su pripremljena kao što je opisano u Primeru 1) i goveđim serumskim albuminom (BSA) pri koncentraciji od 10 mg/ml u fosfatnom puferskom rastvoru (PBS) tokom 1 h na 37°C, a zatim blokirane rastvorom sa 2% BSA i 0.1% tween-20 u PBS (PBS-T) tokom 1 h na sobnoj temperaturi (RT). Antitela protiv TTR su razblažena u PBS u 11 različitih koncentracija u opsegu od 4 do 400 nM, i inkubirana u pločama za ELISA test preko noći na 4°C. Nakon 3 ispiranja pomoću PBS-T, ploče za ELISA test su inkubirane sa HRP-kuplovanim, humanim IgG-specifičnim sekundarnim antitelom tokom 1 h na RT (razblaženje 1/4000). Nakon 3 ispiranja pomoću PBS-T, ELISA reakcije su razvijene pomoću TMB tokom tačno 10 min na RT i kvantifikovane merenjem opičke gustine na 450 nm (OD450nm).
[0262] Primeri antitela, antitela NI-301.59F1, NI-301.35G11 i NI-301.37F1 prikazala su čvrsto vezivanje za pogrešno savijeni-agregirani TTR divljeg i mutantnog tipa, ali ne i za kontrolni BSA, videti Sl. 2 A-C. Nakon toga su EC50 vrednosti za antitela određene uklapanjem podataka pomoću nelinearne regresije, upotrebom metode najmanjih kvadrata kako bi se procenio afinitet vezivanja antitela u ovim uslovima.
[0263] Primeri antitela, antitela NI-301.59F1, NI-301.35G11 i NI-301.37F1 prikazala su visok afinitet, koji je odgovarao EC50 vrednostima od 3.0 nM, 3.9 n, i 0.35 nM redom, za pogrešno savijen-agregiran humani TTR divljeg tipa. Primeri antitela su takođe prikazali visok afinitet koji je odgovarao EC50 vrednostima od 15.5 nM, 5.0 nM i 0.15 nM, redom, za pogrešno savijenagregiran rekombinantni mutant V30M-TTR.
Primer 4: Selektivnost vezivanja anti-TTR antitela upotrebom dot blot tehnike
[0264] Da bi se procenila selektivnost vezivanja TTR-antitela i/ili njihovih fragmenata za nativne ili pogrešno savijene, pogrešno sastavljene i/ili agregirane TTR konformacije, humani TTR protein divljeg soja u nativnoj ili pogrešno savijenim agregiranim konformacijama i rekombinantni V30M-TTR protein u pogrešno savijenim agregiranim konformacijama su razblaženi u PBS u 4 različite koncentracije i deponovani vakuumskom filtracijom na nitroceluloznu membranu. Membrana je na kratko osušena (10 min) i blokirana u rastvoru 3% mleka u PBS-T tokom 1 sata na sobnoj temperaturi, a zatim inkubirana sa anti-TTR antitelima preko noći na 4° C. Posle 3 ispiranja u rastvoru PBS-T tokom 5 minuta na sobnoj temperaturi, membrana je inkubirana u rastvoru odgovarajućeg sekundarnog antitela (HRP-kuplovano; razblaženja 1/10000) tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Posle 3 pranja sa PBS-T, signal na membrani je razvijen pomoću luminola i intenzitet signala je kvantifikovan merenjem luminescencije.
[0265] Tipično komercijalno antitelo protiv TTR vezuje sa sličnim afinitetom nativnu, kao i pogrešno savijenu agregiranu TTR konformaciju, što demonstrira odsustvo selektivnosti vezivanja za nativne ili pogrešno savijene, pogrešno sastavljene i/ili agregirane TTR konformacije, videti Sl. 3 A. Nasuprot tome, primeri antitela NI-301.59.F1, NI-301.35G11 i NI-301.37F1 vezuju sa visokim afinitetom samo pogrešno savijene agregirane TTR konformacije i ne pokazaju vezivanje za nativne TTR konformacije, ispoljavajući tako veliku selektivnost za pogrešno savijene, pogrešno sastavljene i/ili agregirane TTR (Sl. 3 B2, C2, D2). Shodno tome, antitela NI-301.35G11 i NI-301.37F1 takođe su pokazala snažno vezivanje za pogrešno savijeni agregirani rekombinantni V30M-TTR protein, kao što je prikazano na slikama 3 C3 i D3.
[0266] Da bi se dalje okarakterisala selektivnost vezivanja antitela, različiti preparacije TTR, uključujući nativne i pogrešno savijene-agregirane konformacije divljeg i mutantnog tipa, i kolekcija od 12 uzoraka humane plazme, obrađeni su slično za dot blot analizu, koristeći mišijemišija himerna anti-TTR antitela i HRP-konjugovano, sekundarno antitelo protiv mišijeg IgG2a za detekciju (Sl.6).
[0267] Komercijalno antitelo pokazalo je snažno vezivanje za sve preparacije TTR, uključujući nativne i pogrešno savijene-agregirane TTR preparacije divljeg i mutantnog tipa, i bilo je u stanju da detektuje TTR u svim uzorcima humane plazme. Ovo dalje pokazuje odsustvo selektivnosti za nativne ili agregirane konformacije, vidi Sl.6 A. Nasuprot tome, primer mišijeg himernog antitela, antitelo NI-301.mur35G11 pokazalo je veoma snažno vezivanje za pogrešno savijeni-agregirani uzorak TTR divljeg tipa (Sl. 6 C1), a takođe i snažno vezivanje za mutirani protein V30M-TTR (Sl.6 C4) i za mutirani protein I78F-TTR (Sl.6 C6). Međutim, antitelo NI-301.mur35G11 se nije vezivalo za TTR u uzorcima humane plazme. Ovo dalje pokazuje snažnu selektivnost NI-301.mur35G11 za mutirani, pogrešno savijeni, pogrešno sastavljeni i/ili agregirani TTR protein.
Primer 5: Specifičnost vezivanja i selektivnost anti-TTR antitela upotrebom Western blot metode
[0268] Specifičnost vezivanja i selektivnost anti-TTR antitela procenjena je pomoću Western blot metode, videti Sl. 4. Ukratko, humani TTR protein divljeg tipa (300 ng) u nativnoj ili pogrešno savijenim-agregiranim konformacijama i ekstrakt jetre miša divljeg tipa (10 µg ukupnog proteina) su naneti na SDS-PAGE gel i preneseni na nitroceluloznu membranu pomoću sistema za polusuvi prenos. Membrana je zatim blokirana u rastovoru 2% BSA u PBS-T tokom 1 sata na sobnoj temperaturi i inkubirana preko noći na 4 ° C sa antitelima protiv TTR razblaženim u puferu za blokiranje. Posle 4 ispiranja sa PBS-T tokom 5 minuta na sobnoj temperaturi, membrana je inkubirana sa odgovarajućim sekundarnim antitelom (HRP-konjugovanim; razblaženja 1/10000 u puferu za blokiranje) tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Posle 3 ispiranja sa PBS-T i završnog u PBS, signal na membrani je razvijen inkubacijom sa luminolom i intenzitet signala je kvantifikovan merenjem luminescencije. Neposredno pre upotrebe, pogrešno savijeni-agregirani TTR uzorak je podvrgnut umrežavanju sa glutaraldehidom (1%, 5 min, 37 ° C) kako bi se sprečila disocijacija TTR agregata tokom procesa pripreme za SDS-PAGE. Suprotno tome, nativni uzorak TTR nije umrežen pre upotrebe, tako da se homotetramer TTR (koji je nativna TTR konformacija u fiziološkim uslovima) gotovo u potpunosti razdvojio na monomere i dimere.
[0269] Komercijalno anti-TTR antitelo pokazalo je vrlo snažno vezivanje za TTR monomere i dimere ljudskog nativnog uzorka TTR (Sl. 4 A1), i u sličnoj meri jako vezivanje za umreženi uzorak pogrešno savijenog agregiranog uzorka TTR (Sl.4 A2), čime je demonstrirano odsustvo selektivnosti za nativne ili pogrešno savijene, pogrešno sastavljene i/ili agregirane TTR konformacije. Suprotno tome, primeri anti-TTR antitela NI-301.59F1, NI-301.35G11 i NI-301.37F1 pokazali su veoma snažno vezivanje za umreženi uzorak sa pogrešno savijenim agregatom TTR (Sl.4 B2, C2, D2), ali i odsustvo vezivanja za TTR monomere i dimere ljudskog nativnog TTR uzorka (Sl. 4 B1, C1, D1), demonstrirajući time snažnu selektivnost za pogrešno savijene, pogrešno sastavljene i/ili agregirane TTR konformacije u odnosu na nativne TTR konformacije.
[0270] Pored toga, komercijalna i anti-TTR antitela korišćena kao primeri imala su vrlo niske nivoe vezivanja za proteine sadržane u ekstraktu mišije jetre (Sl. 4 A3, B3, C3, D3). S obzirom na veliku količinu proteina jetre upotrebljenu za eksperiment i visoke koncentracije antitela uzimajući u obzir njihov afinitet vezivanja, ovo ukazuje na to da primeri antitela imaju izuzetnu specifičnost za TTR i da se ne vezuju značajno za druge proteine. Dalje, čini se da se primeri antitela ne vezuju za mišiji TTR protein, sadržan u visokom nivou u ekstraktu mišije jetre, što ukazuje na to da primeri antitela pokazuju specifičnost za pogrešno sastavljeni humani protein TTR. Međutim, epitop antitela NI-301.37F1 prisutan je na TTR proteinu pacova i miša. Shodno tome, primarna amino kiselinska sekvenca epitopa ne mora nužno biti presudna za otkrivanje pogrešno sastavljenog TTR, već konformacija.
[0271] Da bi se dalje okarakterisala sposobnost vezivanja antitela, ili odsustvo njegovog vezivanja za nativni TTR protein, antitela korišćena kao primer su procenjena prema svojoj sposobnosti da se vežu za TTR protein koji se nalazi u uzorcima humane plazme, primenom iste tehnike Western blota kao što je u tekstu prethodno opisano, (Sl. 5). Jedina tehnička razlika sastojala se u obrezivanju gornjeg dela gela na oko 25-30 kDa i korišćenju samo donjeg dela gela za prenos proteina na nitroceluloznu membranu. Na ovaj način su eliminisani teški i laki lanci humanih antitela prisutnih u visokoj koncentraciji u uzorcima plazme, što bi moglo potencijalno da ometa analizu.
[0272] Za razliku od komercijalnih antitela koja se koriste kao referenca, primeri antitela, antitela NI-301.35G11 i NI301.37F1 uopšte nisu detektovala humani protein TTR koji se nalazi u uzorcima humane plazme, što ukazuje na selektivno vezivanje za TTR konformaciju koja nije prisutna u analiziranim uzorcima pod ovim uslovima.
Primer 6: Selektivnost vezivanja anti-TTR antitela u rastvoru upotrebom imunoprecipitacije
[0273] Da bi se dalje verifikovala selektivnost vezivanja anti-TTR antitela prema predmetnom pronalasku, za imunoprecipitaciju (IP) korišćeni su TTR humani divlji soj i rekombinantni TTR protein u nativnim i pogrešno savijenim-agregiranim konformacijama i uzorak humane plazme u 3 različita razblaženja u rastvoru PBS. Ukratko, magnetne kuglice obložene proteinom A inkubirane su u rastvoru anti-TTR antitela razblaženih u komercijalnom puferu za vezivanje tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi. Kompleks antitelo/protein A je izolovan i inkubiran preko noći na 4 °C sa preparacijama TTR i uzorcima humane plazme. Posle ispiranja, kompleks antitelo/protein A je resuspendovan u SDS puferu za nalivanje, zagrevan 5 minuta na 90 °C i obrađen za Western blot analizu.
[0274] Kao što je prikazano na slici 7, primeri TTR antitela NI-301.35G11 i NI-301.37F1 pokazali su da za razliku od komercijalnog TTR antitela Dako A0002 ne vezuju uzorke plazme (Sl. 7 A7-9, B7-9, C7-9 ), kao i da nema vezivanja nativnog uzorka divljeg tipa i rekombinantnog TTR (Sl. 7 B3, C3, B5, C5). Međutim, u uzorku gde su bili prisutni pogrešno savijeni-agregirani oblici TTR, utvrđeno je vezivanje koje je ocenjeno kao jako (Sl. 7 B4, C4, B6, C6).
[0275] Ovi rezultati ukazuju na to da primeri antitela NI-301.35G11 i NI-301.37F1 mogu da vežu pogrešno savijene, pogrešno sastavljene i/ili agregirane TTR konformacije u rastvoru, i pokazuju izvanrednu selektivnost za ove konformacije.
Primer 7: Vezivanje za patološke TTR agregate u FAP tkivu miša
[0276] Urađena je procena tipičnih anti-TTR antitela putem imunohistohemije (IHC) u pogledu njihove sposobnosti da vežu patološki i nepatološki TTR protein prisutan u tkivima transgenih miševa, koji eksprimiraju isključivo humani protein V30M-TTR, a ne mišiji TTR protein (zbog čega se zovu FAP miševi). Ova antitela su takođe procenjena u pogledu sposobnosti vezivanja za tkiva miševa sa TTR nokautom (TTR-KO), koji ne eksprimiraju nijedan TTR protein, a odgovarajuće transgene i nokaut linije miša je prvi proizveo i opisao prof. Suichiro Maeda (Kohno K. et al., American Journal of Pathology 140(4) (1997), 1497-1508 ). Ukratko, imunohistohemija je izvedena mišjim tkivima ukalupljenim u parafin i isečenim na presecipreseke debljine 3-5 mm. PreseciPreseci su prvo deparafinisani i rehidrirani, a zatim tretirani primenom 3% H2O2 u metanolu 20 minuta na sobnoj temperaturi. Pufer za blokiranje (PBS 5% seruma (konj/koza) 4% BSA) primenjen je tokom 1 sata na sobnoj temperaturi i zamenjen anti –TTR antitelom razblaženim u PBS za inkubaciju preko noći na 4° C. Posle 3 ispiranja u PBS, preseci su sukcesivno inkubirani sa odgovarajućim biotinilovanim sekundarnim antitelima (anti-humani IgG, razblaženje anti-zečijeg IgG 1/125 u PBS, inkubacija 1h na RT i sistemom za detekciju avidin-HRP (razblaženje, odnos rastvora 1/125 u PBS, inkubacija 1h na RT). Reakcija sa diaminobenzidinom trajala je tačno 15 minuta na sobnoj temperaturi. Preseci tkiva su 1 minut na ST kontrastno obojeni hematoksilinom, dehidrirani u seriji etanola rastućih koncentracija i poklopljeni pokrovnim pločicama.
[0277] Kao što je prikazano na Sl.8, komercijalno TTR antitelo Dako A0002 dovelo je do jakog bojenja na presecima jetre i creva FAP miševa, ali nije uopšte dovelo do bojenja nikakve mrlje u odgovarajućim TTR KO presecima (Sl. 8 1A, 1B). Primer anti-TTR antitela,antitelo NI-301.35G11 stvorilo je mrlje sličnog oblika i intenziteta i na presecima jetre i creva kod FAP miševa (Slika 82A). Međutim, tipično antitelo NI-301.37F1 dovelo je do jakog bojenja samo na preseku creva, ali ne i na presecima jetre kod FAP miša (Sl.8 3A). To ukazuje da se antitelo NI-301.37F1 vezuje samo za patološke (tj. nefiziološke) agregate TTR, koji se vremenom akumuliraju u gastrointestinalnom traktu FAP miševa, a ne vezuje se za TTR u nativnoj konformaciji koji sintetiše jetra.
[0278] Pored toga,nijedno antitelo, ni NI-301.35G11 ni NI-301.37F1, nije dovelo ni do kakvog bojenja na presecima jetre i creva TTR-KO miševa (Sl. 8 2B, 3B). S obzirom na visoke koncentracije antitela korišćene u ovom eksperimentu koji se ticao afiniteta vezivanja antitela, odsustvo bojenja na TTR-KO presecima ukazuje na visoku specifičnost vezivanja za TTR protein.
Primer 8: Selektivnost vezivanja za pogrešno savijene, pogresno sastavljene i/ili agregirane depozite TTR u ljudskom tkivu
[0279] Isto tako, urađena je procena antitela prema predmetnom pronalasku u pogledu njihove sposobnosti da vežu patološke depozite TTR u ljudskom tkivu. Preseci kože dobijeni biopsijom od pacijenta sa FAP i preseci tkiva pankreasa zdrave osobe obrađeni su za imunohistohemiju primenom istog postupka kao što je opisano u Primeru 7, gore. Za taj eksperiment izabrana je biopsija kože koja sadrži značajnu količinu patoloških amiloidnih depozita TTR . U ovom slučaju, međutim, korišćeno je tkivo pankreasa, jer alfa ćelije pankreasa eksprimiraju visok nivo TTR.
[0280] Kao što je prikazano na Sl. 9, komercijalno antitelo Dako A0002 otkrilo je isto tako intenzivno bojenje patoloških depozita TTR u koži, kao i nativnog TTR u alfa ćelijama pankreasa (Sl. 91A). Slično tome, tipično mišije himerno antitelo NI-301.mur35G11 takođe je dovelo do intenzivnog bojenja kako patoloških depozita TTR u koži, tako i nativnog TTR u alfa ćelijama pankreasa (Sl. 9 1B). Nasuprot tome, antitelo NI-301.37F1 je obojilo samo patološki depozit TTR u koži, a ne i prirodni TTR u alfa ćelijama pankreasa (slika 93A). Ovaj rezultat pokazuje da je NI-301.37F1 visoko selektivno u IHC za patološke depozite TTR naslage, koji uključuju mutirane, pogrešno savijene, pogrešno sastavljene i/ili agregirane TTR konformacije.
[0281] Kontrolni uslovi „samo sekundarno antitelo", prikazani na panelima 1B, 2B i 3B na Slici 9, pokazuju bojenje tkiva koje se javlja u odsustvu primarnog antitela. Odsustvo (2B) ili vrlo
4
nizak nivo (1B, 3B) bojenja ukazuje da je bojenje, koje se može uočiti u panelima 1A, 2A i 3, zaista specifično za odgovarajuća primarna antitela.
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
11
11
11
11
11
11
11
12
12
12
12
12
12
12
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
14
14
14
14
14
14
14
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1

Claims (16)

Patentni zahtevi
1. Humano anti-transtiretinsko (TTR) antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, koje je u stanju da vezuje mutirane, pogrešno savijene, pogrešno asemblirane i/ili agregirane TTR vrste i/ili njihove fragmente, i u osnovi ne prepoznaje fiziološke TTR vrste,
(i) pri čemu je antitelo u stanju da se vezuje za TTR epitop koji sadrži ili se sastoji od amino kiselinske sekvence EEEFVEGIY (SEQ ID NO: 49), i pri čemu antitelo ili njegov antigenvezujući fragment u svom varijabilnom regionu ili vezujućem domenu sadrži sledećih šest regiona koji određuju komplementarnost (CDR regiona) VHi VLvarijabilnih regiona:
(a)
VH-CDR1: pozicije 31-35 sekvence SEQ ID NO: 2
VH-CDR2: pozicije 50-65 sekvence SEQ ID NO: 2
VH-CDR3: pozicije 98-115 sekvence SEQ ID NO: 2
VL-CDR1: pozicije 24-34 sekvence SEQ ID NO: 4
VL-CDR2: pozicije 50-56 sekvence SEQ ID NO: 4, i
VL-CDR3: pozicije 89-98 sekvence SEQ ID NO: 4, ili pri čemu jedan ili više CDR regiona može da sadrži jednu ili dve amino kiselinske supstitucije;
(ii) pri čemu je antitelo u stanju da se vezuje za TTR epitop koji sadrži ili se sastoji od amino kiselinske sekvence GELHGLTTEEE (SEQ ID NO: 50), i gde antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment u svom varijabilnom regionu ili vezujućem domenu sadrži sledećih šest CDR regiona VHi VLvarijabilnih regiona:
(b)
VH-CDR1: pozicije 31-35 sekvence SEQ ID NO: 6
VH-CDR2: pozicije 50-66 sekvence SEQ ID NO: 6
VH-CDR3: pozicije 99-109 sekvence SEQ ID NO: 6
VL-CDR1: pozicije 24-39 sekvence SEQ ID NO: 8
VL-CDR2: pozicije 55-61 sekvence SEQ ID NO: 8
VL-CDR3: pozicije 94-102 sekvence SEQ ID NO: 8, ili pri čemu jedan ili više CDR regiona može da sadrži jednu ili dve amino kiselinske supstitucije;
(iii) pri čemu je antitelo u stanju da se vezuje za TTR epitop koji sadrži ili se sastoji od amino kiselinske sekvence WEPFA (SEQ ID NO: 51), i pri čemu antitelo ili njegov antigenvezujući fragment u svom varijabilnom regionu ili vezujućem domenu sadrži šest CDR regiona VHi VLvarijabilnih regiona izabranih od:
(c)
VH-CDR1: pozicije 31-35 sekvence SEQ ID NO: 10
VH-CDR2: pozicije 52-67 sekvence SEQ ID NO: 10
VH-CDR3: pozicije 100-109 sekvence SEQ ID NO: 10
VL-CDR1: pozicije 24-34 sekvence SEQ ID NO: 12
VL-CDR2: pozicije 50-56 sekvence SEQ ID NO: 12
VL-CDR3: pozicije 89-97 sekvence SEQ ID NO: 12, ili pri čemu jedan ili više CDR regiona može da sadrži jednu ili dve amino kiselinske supstitucije;
(e)
VH-CDR1: pozicije 31-37 sekvence SEQ ID NO: 18
VH-CDR2: pozicije 52-67 sekvence SEQ ID NO: 18
VH-CDR3: pozicije 100-116 sekvence SEQ ID NO: 18
VL-CDR1: pozicije 24-34 sekvence SEQ ID NO: 20
VL-CDR2: pozicije 50-56 sekvence SEQ ID NO: 20
VL-CDR3: pozicije 89-98 sekvence SEQ ID NO: 20, ili pri čemu jedan ili više CDR regiona može da sadrži jednu ili dve amino kiselinske supstitucije;
(1)
VH-CDR1: pozicije 31-35 sekvence SEQ ID NO: 46
VH-CDR2: pozicije 50-66 sekvence SEQ ID NO: 46
VH-CDR3: pozicije 99-108 sekvence SEQ ID NO: 46
VL-CDR1: pozicije 23-36 sekvence SEQ ID NO: 48
VL-CDR2: pozicije 52-58 sekvence SEQ ID NO: 48
VL-CDR3: pozicije 91-100 sekvence SEQ ID NO: 48, ili pri čemu jedna ili više sekvenci CDR regiona može da sadrži jednu ili dve amino kiselinske supstitucije;
(m)
VH-CDR1: pozicije 31-35 sekvence SEQ ID NO: 53
VH-CDR2: pozicije 52-67 sekvence SEQ ID NO: 53
VH-CDR3: pozicije 100-109 sekvence SEQ ID NO: 53
VL-CDR1: pozicije 24-34 sekvence SEQ ID NO: 12
VL-CDR2: pozicije 50-56 sekvence SEQ ID NO: 12
VL-CDR3: pozicije 89-97 sekvence SEQ ID NO: 12, ili pri čemu jedan ili više CDR regiona može da sadrži jednu ili dve amino kiselinske supstitucije ili
(iv) pri čemu antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment u svom varijabilnom regionu ili vezujućem domenu sadrži šest CDR regiona VHi VLvarijabilnih regiona izabranih od:
(d)
VH-CDR1: pozicije 31-35 sekvence SEQ ID NO: 14
VH-CDR2: pozicije 50-66 sekvence SEQ ID NO: 14
VH-CDR3: pozicije 99-110 sekvence SEQ ID NO: 14
VL-CDR1: pozicije 23-36 sekvence SEQ ID NO: 16
VL-CDR2: pozicije 52-58 sekvence SEQ ID NO: 16
VL-CDR3: pozicije 91-102 sekvence SEQ ID NO: 16;
(f)
VH-CDR1: pozicije 31-37 sekvence SEQ ID NO: 22
VH-CDR2: pozicije 52-67 sekvence SEQ ID NO: 22
VH-CDR3: pozicije 100-117 sekvence SEQ ID NO: 22
VL-CDR1: pozicije 23-36 sekvence SEQ ID NO: 24
VL-CDR2: pozicije 52-58 sekvence SEQ ID NO: 24
VL-CDR3: pozicije 91-102 sekvence SEQ ID NO: 24;
(g)
VH-CDR1: pozicije 31-35 sekvence SEQ ID NO: 26
VH-CDR2: pozicije 50-65 sekvence SEQ ID NO: 26
VH-CDR3: pozicije 98-110 sekvence SEQ ID NO: 26
VL-CDR1: pozicije 31-36 sekvence SEQ ID NO: 28
VL-CDR2: pozicije 52-58 sekvence SEQ ID NO: 28
VL-CDR3: pozicije 91-99 sekvence SEQ ID NO: 28;
(h)
VH-CDR1: pozicije 31-37 sekvence SEQ ID NO: 30 VH-CDR2: pozicije 52-67 sekvence SEQ ID NO: 30 VH-CDR3: pozicije 100-113 sekvence SEQ ID NO: 30 VL-CDR1: pozicije 24-34 sekvence SEQ ID NO: 32 VL-CDR2: pozicije 50-56 sekvence SEQ ID NO: 32 VL-CDR3: pozicije 90-99 sekvence SEQ ID NO: 32;
(i)
VH-CDR1: pozicije 31-35 sekvence SEQ ID NO: 34 VH-CDR2: pozicije 50-66 sekvence SEQ ID NO: 34 VH-CDR3: pozicije 99-108 sekvence SEQ ID NO: 34 VL-CDR1: pozicije 24-34 sekvence SEQ ID NO: 36 VL-CDR2: pozicije 50-56 sekvence SEQ ID NO: 36 VL-CDR3: pozicije 89-97 sekvence SEQ ID NO: 36;
(j)
VH-CDR1: pozicije 31-38 sekvence SEQ ID NO: 38 VH-CDR2: pozicije 53-69 sekvence SEQ ID NO: 38 VH-CDR3: pozicije 102-114 sekvence SEQ ID NO: 38 VL-CDR1: pozicije 23-36 sekvence SEQ ID NO: 40 VL-CDR2: pozicije 52-58 sekvence SEQ ID NO: 40 VL-CDR3: pozicije 91-99 sekvence SEQ ID NO: 40;
(k)
VH-CDR1: pozicije 31-36 sekvence SEQ ID NO: 42 VH-CDR2: pozicije 51-66 sekvence SEQ ID NO: 42 VH-CDR3: pozicije 99-113 sekvence SEQ ID NO: 42 VL-CDR1: pozicije 23-35 sekvence SEQ ID NO: 44 VL-CDR2: pozicije 51-57 sekvence SEQ ID NO: 44 VL-CDR3: pozicije 90-100 sekvence SEQ ID NO: 44;
(n)
VH-CDR1: pozicije 31-35 sekvence SEQ ID NO: 55 VH-CDR2: pozicije 50-66 sekvence SEQ ID NO: 55 VH-CDR3: pozicije 99-109 sekvence SEQ ID NO: 55 VL-CDR1: pozicije 24-34 sekvence SEQ ID NO: 57 VL-CDR2: pozicije 50-56 sekvence SEQ ID NO: 57 VL-CDR3: pozicije 89-99 sekvence SEQ ID NO: 57;
(o)
VH-CDR1: pozicije 31-35 sekvence SEQ ID NO: 62 VH-CDR2: pozicije 50-66 sekvence SEQ ID NO: 62 VH-CDR3: pozicije 99-114 sekvence SEQ ID NO: 62 VL-CDR1: pozicije 23-35 sekvence SEQ ID NO: 64 VL-CDR2: pozicije 51-57 sekvence SEQ ID NO: 64 VL-CDR3: pozicije 90-101 sekvence SEQ ID NO: 64;
(p)
VH-CDR1: pozicije 31-35 sekvence SEQ ID NO: 66 VH-CDR2: pozicije 52-67 sekvence SEQ ID NO: 66 VH-CDR3: pozicije 100-107 sekvence SEQ ID NO: 66 VL-CDR1: pozicije 24-34 sekvence SEQ ID NO: 68 VL-CDR2: pozicije 50-56 sekvence SEQ ID NO: 68 VL-CDR3: pozicije 89-97 sekvence SEQ ID NO: 68;
(q)
VH-CDR1: pozicije 31-37 sekvence SEQ ID NO: 70 VH-CDR2: pozicije 52-67 sekvence SEQ ID NO: 70 VH-CDR3: pozicije 100-113 sekvence SEQ ID NO: 70 VL-CDR1: pozicije 23-33 sekvence SEQ ID NO: 72 VL-CDR2: pozicije 49-55 sekvence SEQ ID NO: 72 VL-CDR3: pozicije 88-96 sekvence SEQ ID NO: 72;
(r)
VH-CDR1: pozicije 31-35 sekvence SEQ ID NO: 74 VH-CDR2: pozicije 50-66 sekvence SEQ ID NO: 74
VH-CDR3: pozicije 99-113 sekvence SEQ ID NO: 74
VL-CDR1: pozicije 23-36 sekvence SEQ ID NO: 76
VL-CDR2: pozicije 52-58 sekvence SEQ ID NO: 76
VL-CDR3: pozicije 91-100 sekvence SEQ ID NO: 76;
(s)
VH-CDR1: pozicije 31-35 sekvence SEQ ID NO: 78
VH-CDR2: pozicije 50-65 sekvence SEQ ID NO: 78
VH-CDR3: pozicije 98-105 sekvence SEQ ID NO: 78
VL-CDR1: pozicije 23-33 sekvence SEQ ID NO: 80
VL-CDR2: pozicije 49-55 sekvence SEQ ID NO: 80
VL-CDR3: pozicije 88-98 sekvence SEQ ID NO: 80; i
(t)
VH-CDR1: pozicije 31-35 sekvence SEQ ID NO: 82
VH-CDR2: pozicije 50-65 sekvence SEQ ID NO: 82
VH-CDR3: pozicije 98-110 sekvence SEQ ID NO: 82
VL-CDR1: pozicije 23-33 sekvence SEQ ID NO: 84
VL-CDR2: pozicije 49-55 sekvence SEQ ID NO: 84
VL-CDR3: pozicije 88-98 sekvence SEQ ID NO: 84.
2. Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema patentnom zahtevu 1, koje u svom varijabilnom regionu ili vezujućem domenu sadrži amino kiselinske sekvence varijabilnog teškog (VH) i varijabilnog lakog (VL) lanca izabrane od:
(a) SEQ ID NO: 2 i SEQ ID NO: 4;
(b) SEQ ID NO: 6 i SEQ ID NO: 8;
(c) SEQ ID NO: 10 i SEQ ID NO: 12;
(d) SEQ ID NO: 14 i SEQ ID NO: 16;
(e) SEQ ID NO: 18 i SEQ ID NO: 20;
(f) SEQ ID NO: 22 i SEQ ID NO: 24;
(g) SEQ ID NO: 26 i SEQ ID NO: 28;
(h) SEQ ID NO: 30 i SEQ ID NO: 32;
(i) SEQ ID NO: 34 i SEQ ID NO: 36;
(j) SEQ ID NO: 38 i SEQ ID NO: 40;
(k) SEQ ID NO: 42 i SEQ ID NO: 44;
(l) SEQ ID NO: 46 i SEQ ID NO: 48;
(m) SEQ ID NO: 53 i SEQ ID NO: 12;
(n) SEQ ID NO: 55 i SEQ ID NO: 57;
(o) SEQ ID NO: 62 i SEQ ID NO: 64;
(p) SEQ ID NO: 66 i SEQ ID NO: 68;
(q) SEQ ID NO: 70 i SEQ ID NO: 72;
(r) SEQ ID NO: 74 i SEQ ID NO: 76;
(s) SEQ ID NO: 78 i SEQ ID NO: 80;
(t) SEQ ID NO: 82 i SEQ ID NO: 84; ili
VHi VLlanac sadrže amino kiselinske sekvence nastale kao rezultat delimične izmene bilo koje od amino kiselinskih sekvenci (a) do (t) pri čemu je izmena izabrana od amino kiselinske delecije(a), insercije(a), supstitucije(a) i/ili adicije(a).
3. Antitelo prema patentnom zahtevu 1 ili 2, naznačeno time što se antitelo vezuje za TTR epitop (e) GELHGLTTEEE (SEQ ID NO: 50) ali ne i za odgovarajući L55P mutantni epitop ili (ii) WEPFA (SEQ ID NO: 51) ali ne i za odgovarajućeg E42G mutanta.
4. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, naznačeno time što antitelo ili njegov antigen vezujući fragment dodatno sadrži konstantni domen, pri čemu, poželjno, konstantni domen predstavlja humani konstantni domen, poželjno IgG tipa.
5. Antitelo prema patentnom zahtevu 4, naznačeno time što konstantni domen pripada IgG1 klasi ili izotipu.
6. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5, koje predstavlja himerno mišije-ljudsko ili murinizovano antitelo.
7. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6, koje predstavlja fragment antitela odabran iz grupe koja se sastoji od jednolančanog Fv fragmenta (scFv), F(ab’) fragmenta, F(ab) fragmenta i F(ab’)2fragmenta.
1
8. Jedan ili više polinukleotida(a) koji kodiraju antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7 ili vektora(a) koji sadrže polinukleotid(e) pri čemu, poželjno, polinukleotid(i) predstavljaju cDNK.
9. Ćelija-domaćin koja sadrži polinukleotid(e) ili vektor(e) prema patentnom zahtevu 8.
10. Postupak za pripremu anti-TTR antitela ili njegovog biotehnološkog derivata, pri čemu navedeni postupak sadrži
(a) gajenje ćelije iz patentnog zahteva 9; i
(b) izolaciju antitela iz kulture.
11. Antitelo koje je kodirano polinukleotidom(ima) prema patentnom zahtevu 8 ili može da se dobije postupkom prema patentnom zahtevu 10.
12. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7 ili 11, koje
(i) sadrži marker koji je moguće detektovati, pri čemu je, poželjno, marker koji je moguće detektovati odabran iz grupe koja se sastoji od enzima, radioizotopa, fluorofore i teškog metala; i/ili
(ii) je vezano za lek.
13. Kompozicija koja sadrži antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7, 11 ili 12, polinukleotid(e) ili vektor(e) prema patentnom zahtevu 8 ili ćeliju prema patentnom zahtevu 9, naznačena time što je, poželjno, kompozicija
(i) farmaceutska kompozicija i dodatno sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač, pri čemu je, poželjno, kompozicija vakcina i/ili sadrži dodatno sredstvo, korisno za prevenciju ili lečenje bolesti povezanih sa TTR amiloidozom; ili
(ii) diagnostička kompozicija, koja poželjno dodatno sadrži reagense koji se koriste u imunološkim dijagnostičkim postupcima na bazi imunologije ili nukleinskih kiselina.
14. Anti-TTR antitelo ili TTR-vezujući fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7, 11 ili 12, polinukleotid(i) ili vektor(i) prema patentnom zahtevu 8 ili ćelija prema patentnom zahtevu 9 ili kompozicija prema patentnom zahtevu 13 za upotrebu u profilaktičkom ili terapeutskom tretmanu bolesti povezane sa TTR amiloidozom, pri čemu je, poželjno, bolest odabrana iz grupe koja se sastoji od familijarne amiloidne polineuropatije (FAP), familijarne amiloidne kardiomiopatije (FAC), senilne sistemske amiloidoze (SSA), sistemske familijarne amiloidoze, leptomeningealne amiloidoze/amiloidoze centralnog nervnog sistema (CNS) uključujući Alchajmerovu bolest, očne amiloidozu u vezi sa TTR, bubrežne amiloidozu u vezi sa TTR, hipertiroksinemije u vezi sa TTR, amiloidoze ligamenata u vezi sa TTR, uključujući sindrom karpalnog tunela, povrede rotatorne manžetne i lumbalnu spinalnu stenozu, i preeklampsije, ili antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7, 11 ili 12 za upotrebu u in vivo detekciji ili vizelizaciji ili ciljanom delovanju terapeutskog i/ili dijagnostičkog sredstva na TTR u telu čoveka ili životinje, gde, poželjno, navedena in vivo vizuelizacija obuhvata scintigrafiju, pozitronsku emisionu tomografiju (PET), jednofotonsku emisionu tomografiju (SPECT), blisko infracrveno (NIR), optičko snimanje ili snimanje pomoću magnetne rezonance (MRI).
15. Kit koji je od koristi za dijagnozu i praćenje poremećaja povezanog sa TTR amiloidozom, pri čemu navedeni kit sadrži najmanje jedno antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7, 11 ili 12, polinukleotid(e) ili vektor(e) prema patentnom zahtevu 8 i/ili ćeliju prema patentnom zahtevu 9, opciono sa reagensima i/ili uputstvom za upotrebu.
16. Postupak za dijagnostifikovanje bolesti povezane sa TTR amiloidozom, kao što je definisano u patentnom zahtevu 14, praćenje lečenja bolesti anti-TTR antitelom ili određivanje dijagnostičke ili teraputske korisnosti anti-TTR antitela, koji se sastoji od testiranja nivoa pogrešno savijenog i/ili agregiranog TTR u uzorku telesne tečnosti subjekta, nakon primene anti-TTR antitela kod tog subjekta, naznačen time što prisustvo povišenog nivoa pogrešno savijenog i/ili agregiranog TTR u uzorku dobijenom od subjekta, u poređenju sa kontrolom, ukazuje na bolest povezanu sa TTR amiloidozom, pri čemu se, poželjno, nivo pogrešno savijenog i/ili agregiranog TTR u uzorku testira određivanjem kompleksa koji se obrazuje između anti-TTR antitela i i/ili agregiranog TTR, pri čemu je, poželjno, kontrola uzorak koji se dobija od subjekta pre primene anti-TTR antitela, pri čemu je, poželjno, telesna tečnost krv i uzorak se dobija od nje i/ili kontrola je odgovarajući uzorak telesne tečnosti uzete od subjekta pre primene anti-TTR antitela, pri čemu je anti-TTR antitelo anti-TTR antitelo ili antigen-vezujući fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7, 11 ili 12.
RS20201093A 2013-12-20 2014-12-22 Lečenje transtiretinske (ttr) amiloidoze na bazi antitela i odgovarajuća antitela humanog porekla RS60774B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP13199251 2013-12-20
EP14833579.7A EP3083681B1 (en) 2013-12-20 2014-12-22 Antibody-based therapy of transthyretin (ttr) amyloidosis and human-derived antibodies therefor
PCT/EP2014/079094 WO2015092077A1 (en) 2013-12-20 2014-12-22 Antibody-based therapy of transthyretin (ttr) amyloidosis and human-derived antibodies therefor

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS60774B1 true RS60774B1 (sr) 2020-10-30

Family

ID=49876487

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20201093A RS60774B1 (sr) 2013-12-20 2014-12-22 Lečenje transtiretinske (ttr) amiloidoze na bazi antitela i odgovarajuća antitela humanog porekla

Country Status (26)

Country Link
US (5) US10344080B2 (sr)
EP (1) EP3083681B1 (sr)
JP (5) JP6623159B2 (sr)
KR (3) KR20250057056A (sr)
CN (3) CN119161473A (sr)
AU (1) AU2014369793B2 (sr)
BR (1) BR112016014328B1 (sr)
CA (2) CA3177155A1 (sr)
CY (1) CY1123329T1 (sr)
DK (1) DK3083681T3 (sr)
EA (1) EA201691060A1 (sr)
ES (1) ES2815527T3 (sr)
HR (1) HRP20201296T1 (sr)
HU (1) HUE051837T2 (sr)
IL (1) IL246048B (sr)
LT (1) LT3083681T (sr)
MX (1) MX380192B (sr)
NZ (2) NZ721048A (sr)
PE (3) PE20161093A1 (sr)
PL (1) PL3083681T3 (sr)
PT (1) PT3083681T (sr)
RS (1) RS60774B1 (sr)
SG (1) SG11201604831QA (sr)
SI (1) SI3083681T1 (sr)
SM (1) SMT202000498T1 (sr)
WO (1) WO2015092077A1 (sr)

Families Citing this family (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HRP20140049T1 (hr) 2007-01-05 2014-02-28 University Of Zürich Anti beta-amiloid antitijela i njihova upotreba
KR20250057056A (ko) 2013-12-20 2025-04-28 뉴리뮨 홀딩 아게 트랜스티레틴(ttr) 아밀로이드증의 항체-기반의 치료 및 이를 위한 인간-유래의 항체
MA41115A (fr) 2014-12-02 2017-10-10 Biogen Int Neuroscience Gmbh Procédé de traitement de la maladie d'alzheimer
US9879080B2 (en) 2015-01-28 2018-01-30 Prothena Biosciences Limited Anti-transthyretin antibodies
US10633433B2 (en) 2015-01-28 2020-04-28 Prothena Biosciences Limited Anti-transthyretin antibodies
US10464999B2 (en) 2015-01-28 2019-11-05 Prothena Biosciences Limited Anti-transthyretin antibodies
CN118370815A (zh) 2017-08-22 2024-07-23 渤健马萨诸塞州股份有限公司 含有抗β淀粉样蛋白抗体的药物组合物
US20190098879A1 (en) * 2017-09-29 2019-04-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-Human Animals Comprising A Humanized TTR Locus And Methods Of Use
EP3692061A1 (en) 2017-10-04 2020-08-12 Amgen Inc. Transthyretin immunoglobulin fusions
AU2018345807B2 (en) * 2017-10-06 2025-02-06 Novo Nordisk A/S Methods of detecting transthyretin
CU24731B1 (es) 2017-10-06 2025-01-15 Prothena Biosciences Ltd Anticuerpos anti-transtiretina
PE20211453A1 (es) 2017-11-29 2021-08-05 Prothena Biosciences Ltd Formulacion liofilizada de un anticuerpo monoclonal contra transtirretina
WO2020003172A1 (en) 2018-06-26 2020-01-02 Mor Research Applications Transthyretin antibodies and uses thereof
WO2020094883A1 (en) 2018-11-09 2020-05-14 Neurimmune Ag Patient-derived amyloid xenograft non-human animal model
US11891618B2 (en) 2019-06-04 2024-02-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mouse comprising a humanized TTR locus with a beta-slip mutation and methods of use
EP3997112A1 (en) * 2019-07-08 2022-05-18 Amgen, Inc Multispecific transthyretin immunoglobulin fusions
US20230399390A1 (en) 2019-10-24 2023-12-14 Novago Therapeutics Ag Novel anti-nogo-a antibodies
WO2021168156A1 (en) * 2020-02-20 2021-08-26 Prothena Biosciences Limited Monitoring transthyretin amyloidosis
MX2022014223A (es) * 2020-05-12 2023-04-14 Neurimmune Ag Terapia de combinacion para amiloidosis de la ttr.
KR20230039734A (ko) 2020-07-23 2023-03-21 오타이르 프로테나 리미티드 항-Aβ 항체
WO2022066899A1 (en) * 2020-09-23 2022-03-31 The Johns Hopkins University Method to improve protein quality control
US20250019425A1 (en) * 2021-11-12 2025-01-16 Adrx, Inc. Transthyretin (ttr) monomer binding antibodies
CN114058636A (zh) * 2021-11-16 2022-02-18 大连润生康泰医学检验实验室有限公司 一种转甲状腺素蛋白基因的克隆、表达与纯化方法
WO2023099788A1 (en) 2021-12-03 2023-06-08 Neurimmune Ag Novel potency assay for antibody-based drugs and useful means therefor
CN114755165B (zh) * 2022-04-21 2024-11-22 重庆医科大学附属第二医院 一种用于检测g-csfr的流式检测试剂及其制备方法和应用
EP4296279A1 (en) * 2022-06-23 2023-12-27 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Anti-transthyretin (ttr) binding proteins and uses thereof
CN115125316A (zh) * 2022-08-19 2022-09-30 中国医学科学院北京协和医院 肠道菌群在诊断转甲状腺素蛋白淀粉样变性中的应用
AU2023380952A1 (en) 2022-11-15 2025-06-26 Neurimmune Ag Pharmaceutical compositions for treating or preventing transthyretin-mediated amyloidosis
EP4619431A1 (en) 2022-11-15 2025-09-24 Neurimmune AG Methods for treating or preventing transthyretin-mediated amyloidosis
EP4630812A1 (en) 2022-12-05 2025-10-15 Neurimmune AG Cyclic compounds and their use in assays for detecting antibodies
CN115836667B (zh) * 2022-12-16 2025-07-08 中国医学科学院医学生物学研究所 全身性过表达人源α-Syn-NLS转基因鼠的构建方法
EP4713354A1 (en) 2023-05-19 2026-03-25 Neurimmune AG Novel immunotherapy for musculoskeletal disorders and conditions
WO2024251997A1 (en) 2023-06-07 2024-12-12 Neurimmune Ag Vaccine for the treatment of amyloidosis
EP4727650A1 (en) * 2023-06-14 2026-04-22 Immutrin Ltd Anti-fibril antibodies
AR134366A1 (es) 2023-11-15 2026-01-07 Neurimmune Ag Anticuerpo antitranstiretina, composiciones que comprenden dicho anticuerpo y métodos para tratar o prevenir la amiloidosis mediada por transtiretina
CN118191332B (zh) * 2024-03-19 2024-10-29 暨南大学 一种用于诊断术后认知功能障碍的血浆生物标志物及其应用
WO2025238147A1 (en) 2024-05-15 2025-11-20 Neurimmune Ag Maintenance treatment of cardiac ttr amyloidosis using anti-transthyretin antibodies
WO2026041734A1 (en) 2024-08-22 2026-02-26 Novago Therapeutics Ag Methods for treating neurological disorders using anti-nogo-a antibodies
WO2026080803A1 (en) 2024-10-11 2026-04-16 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods of removing contaminants from biological preparations

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008034016A2 (en) * 2006-09-15 2008-03-20 Foldrx Pharmaceuticals, Inc. Assays for detecting native-state proteins and identifying compounds that modulate the stability of native-state proteins
WO2008081008A1 (en) * 2007-01-05 2008-07-10 University Of Zurich Method of providing disease-specific binding molecules and targets
IL184478A (en) 2007-07-08 2017-07-31 Hadasit Medical Res Services & Development Ltd Preparations, methods and kits for identifying carriers of mutations in genes 1brca and 2brca and for the early detection of cancers associated with mutations in these genes
BRPI0818623A2 (pt) * 2007-10-05 2017-05-23 Ac Immune Sa composição farmacêutica, e, métodos para reduzir a carga da placa na camada de célula de gânglio retinal de um animal, para reduzir a quantidade de placas na camada de célula de gânglio retinal de um animal, para diminuir a quantidade total de amilóide-beta solúvel na camada de célula de gânglio retinal de um animal, para prevenir, tratar e/ou aliviar os efeitos de uma doença ocular associada com anormalidades patológicas/mudanças no tecido do sistema visual, para monitorar doença ocular residual mínima associada com anormalidades patológicas/mudanças nos tecidos do sistema visual, para predizer responsividade de um paciente, e para reter ou diminuir a pressão ocular nos olhos de um animal
WO2009079585A2 (en) * 2007-12-17 2009-06-25 Dyax Corp. Compositions and methods for treating osteolytic disorders comprising mmp-14 binding proteins
DK2237803T3 (en) 2007-12-28 2015-10-05 Prothena Biosciences Ltd Treatment and prophylaxis of amyloidosis
WO2010030203A1 (en) 2008-09-09 2010-03-18 Biocodex - Incubação De Empresas De Ciências Da Vida, S.A. Monoclonal antibody to human amyloidogenic and modified forms of transthyretin and its use in the detection and treatment of fap and pathologies presenting modified ttr
AU2009301580B2 (en) 2008-10-06 2015-11-26 The University Of British Columbia Methods and systems for predicting misfolded protein epitopes
JP2010195710A (ja) * 2009-02-25 2010-09-09 Kumamoto Univ アミロイド線維形成抑制剤及びその利用
US9790269B2 (en) 2013-02-08 2017-10-17 Misfolding Diagnostics, Inc. Transthyretin antibodies and uses thereof
KR20250057056A (ko) 2013-12-20 2025-04-28 뉴리뮨 홀딩 아게 트랜스티레틴(ttr) 아밀로이드증의 항체-기반의 치료 및 이를 위한 인간-유래의 항체
KR102538555B1 (ko) 2014-01-29 2023-05-30 케이엠 바이올로직스 가부시키가이샤 항-트랜스티레틴 인간화 항체

Also Published As

Publication number Publication date
IL246048A0 (en) 2016-07-31
SMT202000498T1 (it) 2020-11-10
MX380192B (es) 2025-03-12
CN106255702A (zh) 2016-12-21
JP7258366B6 (ja) 2024-02-19
HRP20201296T1 (hr) 2020-12-11
DK3083681T3 (da) 2020-08-24
JP2025063213A (ja) 2025-04-15
JP2020073464A (ja) 2020-05-14
AU2014369793A1 (en) 2016-06-30
WO2015092077A1 (en) 2015-06-25
CY1123329T1 (el) 2021-12-31
CA2933008A1 (en) 2015-06-25
IL246048B (en) 2021-12-01
SI3083681T1 (sl) 2020-10-30
KR20250057056A (ko) 2025-04-28
US10344080B2 (en) 2019-07-09
PE20161093A1 (es) 2016-10-23
US20220144928A1 (en) 2022-05-12
PE20251851A1 (es) 2025-07-22
HUE051837T2 (hu) 2021-03-29
EP3083681B1 (en) 2020-07-22
KR102924207B1 (ko) 2026-02-06
KR102496162B1 (ko) 2023-02-09
NZ721048A (en) 2020-08-28
US20160355576A1 (en) 2016-12-08
AU2014369793B2 (en) 2020-05-21
JP7258366B2 (ja) 2023-04-17
CN111471106A (zh) 2020-07-31
BR112016014328A2 (pt) 2017-10-31
PT3083681T (pt) 2020-09-03
US20250145699A1 (en) 2025-05-08
US12234281B2 (en) 2025-02-25
JP2023061993A (ja) 2023-05-02
KR20160093726A (ko) 2016-08-08
US20190345237A1 (en) 2019-11-14
NZ760022A (en) 2023-05-26
MX2016008250A (es) 2016-10-14
JP6623159B2 (ja) 2019-12-18
CN119161473A (zh) 2024-12-20
KR20220123754A (ko) 2022-09-08
PE20210650A1 (es) 2021-03-26
EP3083681A1 (en) 2016-10-26
US20250154235A1 (en) 2025-05-15
JP2017506501A (ja) 2017-03-09
JP2021087432A (ja) 2021-06-10
EA201691060A1 (ru) 2016-12-30
CN106255702B (zh) 2020-03-24
LT3083681T (lt) 2020-11-25
BR112016014328B1 (pt) 2024-02-06
JP6841449B2 (ja) 2021-03-10
ES2815527T3 (es) 2021-03-30
PL3083681T3 (pl) 2020-12-28
CA3177155A1 (en) 2015-06-25
SG11201604831QA (en) 2016-08-30
US11180545B2 (en) 2021-11-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7258366B6 (ja) トランスサイレチン（ｔｔｒ）アミロイドーシスに対する抗体療法及びそのためのヒト由来抗体
US10703808B2 (en) Human anti-alpha-synuclein antibodies
US20240279361A1 (en) Human-derived anti-dipeptide repeats (dprs) antibody
JP6302517B2 (ja) 抗アルファシヌクレイン結合分子
US11542322B2 (en) Nano-theranostics for Parkinson&#39;s disease
HK40008904A (en) Human anti-alpha-synuclein antibodies
HK1217722B (en) Human anti-alpha-synuclein antibodies
HK1156638B (en) Human anti-alpha-synuclein autoantibodies