RS60817B1 - Postupak za pripremu indukovanih pluripotentnih matičnih ćelija iz mezenhimalnih matičnih ćelija pomoću frakcije florotanina - Google Patents

Postupak za pripremu indukovanih pluripotentnih matičnih ćelija iz mezenhimalnih matičnih ćelija pomoću frakcije florotanina

Info

Publication number
RS60817B1
RS60817B1 RS20201114A RSP20201114A RS60817B1 RS 60817 B1 RS60817 B1 RS 60817B1 RS 20201114 A RS20201114 A RS 20201114A RS P20201114 A RSP20201114 A RS P20201114A RS 60817 B1 RS60817 B1 RS 60817B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
stem cells
medium
cells
pluripotent stem
chemical formula
Prior art date
Application number
RS20201114A
Other languages
English (en)
Inventor
Sang Yeon Lee
Won Ju Jung
Ho Bin Kim
Min Sun Oh
Kye Ho Lee
Original Assignee
Bbhc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bbhc filed Critical Bbhc
Priority claimed from PCT/KR2015/005183 external-priority patent/WO2015178728A1/ko
Publication of RS60817B1 publication Critical patent/RS60817B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/357—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having two or more oxygen atoms in the same ring, e.g. crown ethers, guanadrel
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0668—Mesenchymal stem cells from other natural sources
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/70—Undefined extracts
    • C12N2500/76—Undefined extracts from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
    • C12N2506/025—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells from extra-embryonic cells, e.g. trophoblast, placenta
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1346—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1346—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells
    • C12N2506/1392—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells from mesenchymal stem cells from other natural sources

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

Opis
[Tehnička oblast]
[0001] Ovaj pronalazak odnosi se na kompoziciju podloge indukovanih pluripotentnih matičnih ćelija od mezenhimalnih matičnih ćelija koja sadrži frakciju florotanina ekstrahovanu iz mrkih algi i postupak za pripremu indukovanih pluripotentnih matičnih ćelija pomoću nje.
[Stanje tehnike]
[0002] Matične ćelije su ćelije koje se mogu diferencirati u različite ćelije koje sačinjavaju tkivo organizma i koje se zajednički zovu nediferencirane ćelije pre diferencijacije koje se mogu dobiti iz svakog tkiva embriona, fetusa i odrasle osobe. Matične ćelije mogu se klasifikovati različitim postupcima. Jedan od najčešćih postupaka zavisi od objekta sa izolovanim matičnim ćelijama pa se tako matične ćelije mogu podeliti na embrionske matične ćelije (ES ćelije) izolovane iz embriona i odrasle matične ćelije izolovane iz odrasle osobe. Drugi uobičajeni način klasifikacije prati sposobnost diferencijacije matičnih ćelija pa se tako matične ćelije mogu podeliti na pluripotentne, multipotentne i unipotentne matične ćelije. Pluripotentnim matičnim ćelijama zovu se matične ćelije sa više funkcija koje se mogu diferencirati u tri klicina lista koja sačinjavaju živo telo i generalno, njima odgovaraju embrionske matične ćelije.
[0003] Odrasle matične ćelije mogu se klasifikovati na multipotentne ili unipotentne matične ćelije. Reprezentativne odrasle matične ćelije uključuju mezenhimalne matične ćelije (MSC-ove) i hematopoetske matične ćelije (HSC-ove). Poznato je da se MSC-ovi diferenciraju u hondroblast, osteoblast, adipocit, miocit i neurion, a da se HSC-ovi diferenciraju u krvna zrnca u krvi uključujući crvena krvna zrnca, bela krvna zrnca, trombocite i slično. Odrasle matične ćelije mogu se dobiti iz koštane srži, krvi, mozga, kože, itd. kako bi bilo manje etičkih problema, ali one imaju ograničenu multipotenciju u poređenju sa embrionskim matičnim ćelijama.
[0004] Sa druge strane, pluripotentnim matičnim ćelijama zovu se matične ćelije sa više funkcija koje se mogu diferencirati u tri klicina lista koja sačinjavaju živo telo, koje se mogu diferencirati u sve ćelije ili tkiva organa ljudskog tela i generalno, njima odgovaraju embrionske matične ćelije. Embrionske matične ćelije su pluripotentne matične ćelije sa potencijom koja se može diferencirati u ćelije svih tkiva koja sačinjavaju jedan objekat, ali postoje ozbiljni etički problemi u tome što se embrioni uništavaju u postupku za pripremanje ćelija.
[0005] Kao alternativa za rešavanje ovih problema pokušalo se sa raznim postupcima za pripremu prilagođenih pluripotentnih matičnih ćelija sličnih embrionskim matičnim ćelijama dediferenciranjem ćelija dobijenih iz odrasle osobe. Poznato je da se humane embrionske matične ćelije stvaraju od embriona koji mogu da generišu ljudski organizam i stoga postoje mnogi etički problemi, ali embrionske matične ćelije imaju odličnu proliferaciju i multipotenciju ćelija u poređenju sa odraslim matičnim ćelijama. Odrasle matične ćelije mogu se dobiti iz koštane srži, krvi, mozga, kože, itd. kako bi bilo manje etičkih problema, ali imaju ograničenu multipotenciju u poređenju sa embrionskim matičnim ćelijama.
[0006] Kao reprezentativni postupak, postoje postupci, na primer, fuzija sa ES ćelijom, nuklearni transfer somatskih ćelija, reprogramiranje genskim faktorom i slično. Fuzija sa ES ćelijom ima problem u pogledu stabilnosti ćelije jer indukovane ćelije dalje imaju dva para gena, dok nuklearni transfer somatskih ćelija ima problem u tome što zahteva veliki broj jajašaca, a efikasnost je previše niska. Uz to, reprogramiranje genskim faktorom je postupak u kom se koristi virus koji sadrži onkogene kako bi se umetanjem specifičnih gena indukovala dediferencijacija i stoga postoji visok rizik od pojavljivanja kancera, a takođe postoji problem u pogledu razvijanja agenasa ćelijske terapije zbog niske efikasnosti i poteškoće u postupnom aspektu.
[0007] Kako bi se uspešno dobila velika količina pluripotentnih matičnih ćelija, kompozicija za uzgajanje je veoma važna u uzgajanju mononuklearnih ćelija izvedenih iz izolovane pupčane vrpce pa su stoga neophodna istraživanja za pripremu veće količine pluripotentnih matičnih ćelija visokoefikasnim indukcionim postupkom.
[0008] Međutim, u objavi korejskog patenta br.2009-0043115, opisana je kompozicija za lečenje ili prevenciju atopičnih bolesti pomoću Ecklonia cava vrste mrkih algi, a u objavi korejskog patenta br. 2012-0126148, opisana je kompozicija za farbanje kose radi oksidacionog farbanja.
[0009] Ovi pronalazači uspešno razvijaju kompoziciju podloge za dediferencijaciju indukovanih pluripotentnih matičnih ćelija pomoću Ecklonia cava ekstrakta (objava korejskog patenta br.2015-0050823). Međutim, još uvek nije poznato koja komponenta Ecklonia cava ekstrakta ima dediferencijacijski efekat indukovanih pluripotentnih matičnih ćelija.
[0010] Detalji opisani u stanju tehnike su tu samo radi boljeg razumevanja stanja tehnike ovog pronalaska i stoga mogu sadržati informacije koje ne obrazuju stanje tehnike koje je već poznato stručnjaku iz oblasti u ovoj državi.
[Otkrivanje]
[Tehnički problem]
[0011] Ovi su pronalazači nastojali da pronađu visokoefikasni postupak indukovanja pluripotentnih matičnih ćelija kako bi se komercijalizovao razvoj agenasa ćelijske terapije sa visokom stabilnošću i visokom efikasnošću proizvodnje. Kao rezultat, pronalazači su potvrdili da kada se neka jedinjenja ekstrahovana i izolovana iz mrkih algi kao stabilne prirodne supstance dodaju podlozi za uzgajanje ćelija, indukovane pluripotentne matične ćelije se mogu pripremati sa stabilnošću i visokom efikasnošću primenom mezenhimalnih matičnih ćelija, a time se ovo otkrivanje ispunjava.
[0012] Ovo je otkrivanje usmereno obezbeđivanju kompozicije podloge za dediferenciranje mezenhimalnih matičnih ćelija koja sadrži frakciju florotanina u indukovane pluripotentne matične ćelije.
[0013] Ovo je otkrivanje takođe usmereno obezbeđivanju postupka za pripremu indukovanih pluripotentnih matičnih ćelija koji obuhvata dediferenciranje pluripotentnih matičnih ćelija u indukovane pluripotentne matične ćelije u podlozi koja sadrži frakciju florotanina. Nadalje je ovo otkrivanje takođe usmereno obezbeđivanju kompozicije ćelijske terapije uključujući indukovane pluripotentne matične ćelije pripremljene postupkom za pripremanje. Drugi predmeti i prednosti ovog otkrivanja biće jasniji iz detaljnog opisa ovog otkrivanja, patentnih zahteva i crteža koji će biti opisani u nastavku.
[Tehničko rešenje]
[0014] Jedan aspekt ovog otkrivanja obezbeđuje kompoziciju podloge za dediferenciranje mezenhimalnih matičnih ćelija koja sadrži frakciju florotanina u indukovane pluripotentne matične ćelije.
[0015] Frakcija florotanina može poželjno biti jedinjenje biekola predstavljeno sledećom hemijskom formulom 1 ili njegove soli.
[0016] Frakcija florotanina može se poželjno ekstrahovati i izolovati iz jednog tipa mrkih algi odabranog iz grupe koju čine Ecklonia cava, Dictyopteris prolifera Okamura, Dictyota dichotoma Lamouroux, Sargassum horneri C. Agardh, Sargassum patens C. Agardh i Ishige okamurae Yendo ili je veštački sintetizovana.
[0017] Frakcija florotanina može se poželjno ekstrahovati i izolovati iz Ecklonia cava.
[0018] Frakcija florotanina može poželjno biti uključena u podlozi odabranoj iz grupe koju čine DMEM (Dulbecco-ova modifikovana Eagle-ova podloga), MEM (Minimalna esencijalna podloga), BME (Osnovna podloga Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, DMEM F-12, α-MEM (α-Minimalna esencijalna podloga), G-MEM (Glasgow-ova Minimalna esencijalna podloga), IMDM (Iscove-ova modifikovana Dulbecco-ova podloga), MacCoy-ova 5A podloga, AminoMaxII kompletna podloga i MesenCult-XF podloga.
[0019] Frakcija florotanina može poželjno biti uključena u količini od 10 do 500 µg/ml u odnosu na kompoziciju podloge.
[0020] Kompozicija podloge može dodatno uključivati 1 do 10 vol./vol.% energetske vode.
[0021] Drugi aspekt ovog otkrivanja obezbeđuje postupak za pripremu indukovanih pluripotentnih matičnih ćelija koji obuhvata: dodavanje frakcije florotanina podlozi za uzgajanje ćelija; i dediferenciranje mezenhimalnih matičnih ćelija u indukovane pluripotentne matične ćelije u toj podlozi.
[0022] Frakcija florotanina može poželjno biti jedinjenje biekola predstavljeno sledećom hemijskom formulom 1 ili njegove soli.
[0023] Još jedan aspekt ovog otkrivanja poželjno obezbeđuje kompoziciju ćelijske terapije koja sadrži indukovane pluripotentne matične ćelije pripremljene ovim postupkom.
[Povoljni efekti]
[0024] Svojstva i prednosti ovog otkrivanja su kao što sledi.
(i) Ovo otkrivanje obezbeđuje kompoziciju podloge za dediferencijaciju indukovanih pluripotentnih matičnih ćelija pomoću frakcije florotanina ekstrahovane iz mrkih algi.
(ii) Nadalje, ovo otkrivanje obezbeđuje postupak za pripremu indukovanih pluripotentnih matičnih ćelija pomoću kompozicije podloge.
(iii) Indukovane pluripotentne matične ćelije mogu se efektivno pripremati upotrebom mezenhimalnih matičnih ćelija pomoću kompozicije podloge ovog otkrivanja, a pripremljene indukovane pluripotentne matične ćelije mogu se diferencirati u različite ćelije i stoga mogu biti korisne kao agensi ćelijske terapije.
[Opis crteža]
[0025]
FIG.1 ilustruje uslov za izolovanje frakcije iz Ecklonia cava ekstrakta.
FIG.2 ilustruje rezultat masenog spektra 2-O-(2,4,6-trihidroksifenil)-6,6'-biekola predstavljenog hemijskom formulom 1.
FIG.3 ilustruje rezultat<1>H-NMR spektra 2-O-(2,4,6-trihidroksifenil)-6,6'-biekola predstavljenog hemijskom formulom 1.
FIG.4 ilustruje rezultat<13>C-NMR spektra 2-O-(2,4,6-trihidroksifenil)-6,6'-biekola predstavljenog hemijskom formulom 1.
FIG.5 ilustruje rezultat masenog spektra diekola predstavljenog hemijskom formulom 2.
FIG.6 ilustruje rezultat<1>H-NMR spektra diekola predstavljenog hemijskom formulom 2.
FIG.7 ilustruje rezultat<13>C-NMR spektra diekola predstavljenog hemijskom formulom 2.
FIG.8 ilustruje rezultat masenog spektra florofukofuroekol-A (PFF-A) predstavljenog hemijskom formulom 3.
FIG.9 ilustruje rezultat<1>H-NMR spektra florofukofuroekol-A (PFF-A) predstavljenog hemijskom formulom 3.
FIG.10 ilustruje rezultat<13>C-NMR spektra florofukofuroekol-A (PFF-A) predstavljenog hemijskom formulom 3.
FIG.11 ilustruje rezultat masenog spektra 974-A predstavljenog hemijskom formulom 4.
FIG.12 ilustruje rezultat<1>H-NMR spektra 974-A predstavljenog hemijskom formulom 4.
FIG.13 ilustruje rezultat<13>C-NMR spektra 974-A predstavljenog hemijskom formulom 4.
FIG.14 ilustruje rezultat masenog spektra 974-B predstavljenog hemijskom formulom 4.
FIG.15 ilustruje rezultat<1>H-NMR spektra 974-B predstavljenog hemijskom formulom 5.
FIG.16 ilustruje rezultat<13>C-NMR spektra 974-B predstavljenog hemijskom formulom 5.
FIG.17 ilustruje formiranje indukovanih kolonija pluripotentnih matičnih ćelija u odnosu na koncentraciju tretiranjem frakcije florotanina iz Ecklonia cava ekstrakta primenom postupka (eksperimentalni primer 1-1) prema ovom otkrivanju.
FIG.18 potvrđuje da ćelije indukovane postupkom prema ovom otkrivanju (eksperimentalni primer 1-1) predstavljaju pluripotentne matične ćelije pomoću ekspresije SSEA-4 i alkalne fosfataze koji su proteini specifični za pluripotentne matične ćelije.
FIG.19 potvrđuje da ćelije indukovane postupkom prema ovom otkrivanju (eksperimentalni primer 1-1) predstavljaju pluripotentne matične ćelije pomoću ekspresije OCT4 i SOX2 koji su geni specifični za pluripotentne matične ćelije.
FIG.20 ilustruje formiranje kolonija pluripotentnih matičnih ćelija indukovanih u odnosu na koncentraciju tretiranjem jedinjenja u frakciji florotanina primenom postupka (eksperimentalni primer 1-2) prema ovom otkrivanju.
FIG.21 potvrđuje da ćelije indukovane postupkom ovog otkrivanja (eksperimentalni primer 1-2) predstavljaju pluripotentne matične ćelije pomoću ekspresije SSEA-4 i alkalne fosfataze koji su proteini specifični za pluripotentne matične ćelije.
FIG.22 potvrđuje da ćelije indukovane postupkom ovog otkrivanja (eksperimentalni primer 1-2) predstavljaju pluripotentne matične ćelije pomoću ekspresije OCT4 i SOX2 koji su geni specifični za pluripotentne matične ćelije.
[Načini ostvarivanja ovog pronalaska]
[0026] Prema jednom aspektu ovog otkrivanja, ovo otkrivanje obezbeđuje kompoziciju podloge za dediferenciranje mezenhimalnih matičnih ćelija koja sadrži frakciju florotanina ekstrahovanu i izolovanu iz mrkih algi u indukovane pluripotentne matične ćelije.
[0027] Ovaj pronalazač nastojao je da pronađe postupak za visokoefikasno indukovanje pluripotentnih matičnih ćelija kako bi se komercijalizovao razvoj agenasa ćelijske terapije sa stabilnošću i visokom proizvodnom efikasnošću bez etičkog problema sa uništavanjem embriona. Kao rezultat, potvrđeno je da se, zapanjujuće, indukovane pluripotentne matične ćelije mogu pripremati sa visokom efikasnošću kada se frakcija florotanina izolovana iz ekstrakta mrkih algi kao stabilni prirodni ekstrakt, poželjno, Ecklonia cava ekstrakt doda podlozi za uzgajanje ćelija.
[0028] Prema primernom aspektu ovog otkrivanja, ekstrakt mrkih algi može biti ekstrakt mrke algevoda, ekstrakt mrke alge-etanol, ekstrakt mrke alge-metanol ili ekstrakt mrkih algi koji koristi mešani rastvarač od dva ili više odabranih od vode, etanola i metanola.
[0029] Prema primernom aspektu ovog otkrivanja, ekstrakt mrke alge-voda može se pripremati ekstrakcijom mrkih algi sa vodom od 40 do 100°C tokom 2 do 48 sati. Ekstrakt mrke alge-etanol može se pripremati ekstrakcijom mrkih algi sa 35 do 80% etanola na 20 do 60°C tokom 2 do 36 sati. Nadalje, ekstrakt mrke alge-metanol može se pripremati ekstrakcijom mrkih algi sa 35 do 80% metanola na 20 do 60°C tokom 2 do 36 sati.
[0030] Ecklonia cava među mrkim algama uključenim u kompoziciju podloge prema ovom otkrivanju predstavlja višegodišnju algu smeđe biljke iz porodice laminariaceae reda laminariales koja uglavnom živi na južnoj obali, obali ostrva Džedžu i obali ostrva Uleungdo, uglavnom je hrana za abalone, turbane i slične, a koristi se kao glavna sirovina za pravljene alginata ili kalijumjodida ili za hranu.
[0031] Ecklonia cava ekstrakt uključen u ovo otkrivanje može se ekstrahovati primenom vode i organskih rastvarača koji uključuju (a) anhidrovani ili niži alkohol koji sadrži vodu, sa 1 do 4 atoma ugljenika (metanol, etanol, propanol, butanol, n-propanol, izo-propanol, n-butanol, itd.), (b) smešu rastvarača nižeg alkohola i vode, (c) aceton, (d) etilacetat, (e) hloroform, (f) 1,3- butilenglikol, (g) heksan, (h) dietiletar i slične, a poželjno se može ekstrahovati pomoću smeše rastvarača metanola ili etanola i vode. U slučaju ekstrakcije Ecklonia cava ekstrakta primenom smeše rastvarača, udeo metanola ili etanola može biti 50 do 80 vol./vol.%. Međutim, ovo otkrivanje nije nužno ograničeno na to.
[0032] Florotanin izolovan iz ekstrakta mrkih algi predstavlja jedinjenje zasnovano na polifenolu koje sadrži floroglucinol kao osnovnu jedinicu građe. Florotanin se nalazi u dosta morskih biljaka, naročito, u mrkim algama u prirodnom svetu, a prijavljeno je da florotanin ima razna korisna dejstva poput antibakterijskog dejstva, antioksidativnog dejstva, hepatoprotektivnog dejstva, dejstva inhibicije elastaze, dejstva inhibicije hijaluronidaze, dejstva kardiovaskularne zaštite i antivirusnog dejstva.
[0033] Naročito u ovom otkrivanju, iz frakcije florotanina Ecklonia cava ekstrakta izolovani su i identifikovani jedinjenje biekola predstavljeno sledećom hemijskom formulom 1, jedinjenje diekola predstavljeno sledećom hemijskom formulom 2, jedinjenje florofukofuroekola predstavljeno sledećom hemijskom formulom 3, jedinjenje zasnovano na ekolu predstavljeno sledećom hemijskom formulom 4 i jedinjenje zasnovano na ekolu predstavljeno sledećom hemijskom formulom 5 i potvrđena je sposobnost ekspresije njihovih indukovanih pluripotentnih matičnih ćelija. Kada se jedinjenje biekola predstavljeno sledećom hemijskom formulom 1 među jedinjenjima doda podlozi za uzgajanje ćelija, potvrđeno je da se indukovane pluripotentne matične ćelije mogu pripremati sa visokom efikasnošću.
[0034] Tačnije, hemijska formula 1 predstavljena je 2-O-(2,4,6-trihidroksifenil)-6,6'-biekolom, hemijska formula 2 predstavljena je diekolom, hemijska formula 3 predstavljena je florofukofuroekol-A (PFF-A), hemijska formula 4 predstavljena je 974-A i hemijska formula 5 predstavljena je 974-B, a u ovom otkrivanju, jedinjenja se podlozi za uzgajanje ćelija mogu dodati sama ili u njihovoj kombinaciji.
[0035] Pojam „embrionske matične ćelijeˮ korišćen u ovom otkrivanju označava ćelije sa pluripotencijom kao ćelije koje su izolovane i uzgajane iz unutrašnje ćelijske mase blastocista u ranim danima njihovog razvoja posle oplodnje. Pojam „pluripotentne matične ćelijeˮ korišćen u ovom otkrivanju označava matične ćelije sa pluripotencijom koja se može diferencirati u tri klicina lista koja sačinjavaju odraslu osobu, odnosno endoderm, mezoderm i ektoderm.
[0036] Pojam „diferencijacijaˮ korišćen u ovom otkrivanju znači da se dok se ćelije dele, proliferuju i rastu, njihove strukture ili funkcije specijalizuju, odnosno, oblici ili funkcije se menjaju kako bi se izvodili zadaci koji se daju ćelijama, tkivima i sličnima u organizmu.
[0037] Pojam „agens ćelijske terapijeˮ prema ovom otkrivanju, kao lek korišćen u lečenju, dijagnostikovanju i prevenciji primenom ćelija i tkiva pripremljenih izolovanjem iz čoveka, kulture i specifičnom manipulacijom, označava lek korišćen za lečenje, dijagnostikovanje i prevenciju putem serija aktivnosti poput proliferacije i skrininga homogenih i heterogenih ćelija kako bi se vratile funkcije ćelija ili tkiva, menjanjem bioloških osobina ćelija drugim postupkom i slično. Taj se agens ćelijske terapije uglavnom klasifikuje kao agens terapije somatskim ćelijama, agens terapije matičnim ćelijama u skladu sa diferencijacijom ćelija, a ovo se otkrivanje naročito odnosi na agens terapije matičnim ćelijama.
[0038] Mezenhimalne matične ćelije prema ovom otkrivanju predstavljaju ćelije izolovane iz embrionskih matičnih ćelija ili odraslih matičnih ćelija izvedenih iz sisara, poželjno mezenhimalne matične ćelije izvedene iz pupčane vrpce, a poželjnije mezenhimalne matične ćelije izvedene iz ljudske pupčane vrpce. Ove se matične ćelije mogu ekstrahovati i dobiti iz pupčane vrpce koja povezuje placentu i fetus u ljudskom telu. Ekstrakcija mezenhimalnih matičnih ćelija iz pupčane vrpce može se
1
izvoditi primenom raznih postupaka, i na primer, pupčana vrpca se ekstrahuje iz ljudskog tela kako bi se isprala sa DPBS-om dok krv ne prestane da teče, a isprana pupčana vrpca se preseca hirurškim sečivom i inkubira na 37°C da bi se dobio rastvor koji sadrži mononuklearne ćelije.
[0039] Pojam „podlogaˮ korišćen u ovom otkrivanju označava mešavinu za in vitro uzgajanje ili dediferencijaciju ćelija poput matičnih ćelija, koja sadrži elemente neophodne za rast i proliferaciju ćelije, uključujući šećere, aminokiseline, razne nutrijente, serume, faktore rasta, minerale i slično.
[0040] Razne podloge su komercijalizovane u struci i mogu se veštački pripremiti i koristiti. U komercijalizovane podloge uključene su DMEM (Dulbecco-ova modifikovana Eagle-ova podloga), MEM (Minimalna esencijalna podloga), BME (Osnovna podloga Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, DMEM F-12, α-MEM (α-Minimalna esencijalna podloga), G-MEM (Glasgow-ova Minimalna esencijalna podloga), IMPM (Iscove-ova modifikovana Dulbecco-ova podloga), AmnioMax, AminoMaxII kompletna podloga (Gibco, Newyork, USA), MesenCult-XF podloga i slične i mogu se koristiti kao osnovna podloga sadržana u kompoziciji podloge pored podloge koja se može veštački pripremiti.
[0041] Osnovnoj podlozi mogu se dodati komponente seruma (na primer, fetalnog goveđeg seruma (FBS)), antibiotika (na primer, penicilina i streptomicina) koje se obično dodaju i slične. Koncentracija komponente seruma ili komponente antibiotika koja se dodaje osnovnoj podlozi može se modifikovati unutar opsega koji može postići efekat ovog pronalaska, a poželjno se može dodati 10% FBS-a, 100 jedinica/ml penicilina, 50 µg/ml streptomicina i slično.
[0042] Međutim, koncentracija jedinjenja dodatog DMEM-u može se modifikovati unutar opsega koji može postići efekat ovog otkrivanja.
[0043] Nadalje, podloga ovog otkrivanja može dodatno uključivati mešavinu nutrijenata. Ta mešavina nutrijenata je mešavina koja sadrži razne aminokiseline, vitamine, neorganske soli i slične koje se generalno koriste u uzgajanju ćelija, i može koristiti mešavinu nutrijenata koja se priprema mešanjem aminokiselina, vitamina, neorganskih soli i sličnih ili se komercijalno priprema. Komercijalno pripremljena mešavina nutrijenata može uključivati na primer M199, MCDB110, MCDB202, MCDB302 i slične, ali nisu ograničene na njih.
[0044] Nadalje, podloga ovog otkrivanja može dodatno uključivati energetsku vodu za indukovanje i stabilizaciju pluripotentnih matičnih ćelija. Ta se energetska voda poželjno dodaje sa 0.05 do 20 vol./vol.%, a poželjnije 0.1 do 10 vol./vol.%.
[0045] Kompozicija podloge ovog otkrivanja je specifična podloga za indukovanje pluripotentnih matičnih ćelija i može se postići dodavanjem frakcije florotanina izolovane iz ekstrakta mrkih algi osnovnoj podlozi, a može uključivati i frakciju florotanina izolovanu iz Ecklonia cava ekstrakta poželjno pri koncentraciji od 1 do 1,000 µg/ml, a poželjnije pri koncentraciji od 10 do 50 µg/ml u odnosu na ukupnu kompoziciju podloge.
[0046] Nadalje, najmanje jedan tip odabran iz grupe koju čine 2-O-(2,4,6-trihidroksifenil)-6,6'-biekol hemijske formule 1, diekol hemijske formule 2, florofukofuroekol-A (PFF-A) hemijske formule 3, 974-A hemijske formule 4 i 974-B hemijske formule 5 može se koristiti pri 10 do 200 µg/ml, poželjnije 20 do 150 µg/ml u odnosu na ukupnu kompoziciju podloge.
[0047] Prema drugom aspektu ovog otkrivanja, ovo otkrivanje obezbeđuje postupak za pripremu indukovanih pluripotentnih matičnih ćelija koji uključuje: dodavanje frakcije florotanina izolovane iz Ecklonia cava ekstrakta podlozi za uzgajanje ćelija; i dediferenciranje mezenhimalnih matičnih ćelija u indukovane pluripotentne matične ćelije u toj podlozi.
[0048] U tom slučaju, mononuklearne ćelije izvedene iz pupčane vrpce dodaju se kompoziciji osnovne podloge koja sadrži 2-O-(2,4,6-trihidroksifenil)-6,6'-biekol ili mešavinu koja sadrži 2-O-(2,4,6-trihidroksifenil)-6,6'-biekol i mogu se inkubirati u inkubatoru pod uslovom vlažnosti 95%, 37°C i 5% CO2.
[0049] U primernom aspektu ovog otkrivanja, mononuklearne ćelije izvedene iz pupčane vrpce inkubiraju se u inkubatoru pod ovim uslovima, a zatim se ćelijski supernatant uklanja posle 5 dana i te ćelije se inkubiraju zamenom podloge na svakih 3 do 4 dana. Kada se matične ćelije inkubiraju pomoću kompozicije podloge za uzagajanje koja sadrži 2-O-(2,4,6-trihidroksifenil)-6,6'-biekol, posmatra se indukcija pluripotentnih matičnih ćelija u odnosu na koncentraciju 2-O-(2,4,6-trihidroksifenil)-6,6'-biekola. DMEM F-12 podloga se koristi kao kontrolna grupa, a podloga koja sadrži -O-(2,4,6-trihidroksifenil)-6,6'-biekol u DMEM F-12 podlozi koristi se kao eksperimentalna grupa, a mezenhimalne matične ćelije izvedene iz ljudske pupčane vrpce inkubiraju se u podlozi tretiranoj za svaku koncentraciju.
[0050] Kao rezultat, može se videti da se kada se mezenhimalne matične ćelije inkubiraju u kompoziciji podloge ovog otkrivanja, obrazuju kolonije poput pluripotentnih matičnih ćelija. Mezenhimalne matične ćelije izvedene iz ljudske pupčane vrpce obrazuju kolonije matičnih ćelija u podlozi ovog otkrivanja na 10 do 14 dana. To jest, može se videti da kompozicija podloge za uzgajanje ovog otkrivanja obrazuje kolonije pluripotentnih matičnih ćelija iz mezenhimalnih matičnih ćelija izvedenih iz ljudske pupčane vrpce (vidi FIG.17 do 19).
[0051] Prema još jednom aspektu ovog otkrivanja, ovo otkrivanje obezbeđuje indukovane pluripotentne matične ćelije pripremljene postupkom za pripremanje.
[0052] Indukovane pluripotentne matične ćelije ovog otkrivanja imaju istu diferencijaciju kao i embrionske matične ćelije i skoro su iste kao embrionske matične ćelije čak i u oblicima ćelija. Prema primernom aspektu ovog otkrivanja, nakon ispitivanja ekspresije gena (Nanog, Oct4, Sox2, Klf) i proteina (SSEA-4) specifičnih za embrionske matične ćelije, kao rezultat se može videti da su gen i protein eksprimirani u pluripotentnim matičnim ćelijama indukovanim ovim otkrivanjem kao i embrionskim matičnim ćelija (vidi FIG.19).
[0053] Prema još nekom drugom aspektu ovog otkrivanja, ovo otkrivanje obezbeđuje kompoziciju ćelijske terapije koja sadrži indukovane pluripotentne matične ćelije pripremljene postupkom za pripremanje.
[0054] Može se videti da indukovane pluripotentne matične ćelije ovog otkrivanja imaju istu pluripotenciju kao i embrionske matične ćelije, a prema primernom aspektu ovog otkrivanja, imaju pluripotenciju koja se može diferencirati u ektoderm, mezoderm i endoderm.
[0055] Prema tome, indukovane pluripotentne matične ćelije ovog otkrivanja mogu se koristiti kao efektivan agens ćelijske terapije.
[0056] Kompozicija ovog otkrivanja može se davati bilo kojim načinom davanja, naročito, postupkom poput davanja u peritonealnu ili torakalnu šupljinu, subkutanog davanja, intravenskog ili endovaskularnog davanja, intramuskularnog davanja, lokalnog davanja injekcijom i slično.
[0057] U ovom otkrivanju, kompozicija se može davati u obliku poput injekcija, suspenzija i emulzija na osnovu opšteg postupka, a ukoliko je potrebno, može se suspendovati u adjuvansu poput kompletnog Freund-ovog adjuvansa ili se može davati zajedno sa materijalom koji ima neku adjuvansko dejstvo poput BCG-a. Ova kompozicija je sterilisana ili može sadržati adjuvanse uključujući stabilizatore, kvašljive ili akceleratore emulgovanja, soli ili pufere za prilagođavanje osmotskog pritiska i slične, i druge terapeutski značajne supstance, i može se pripremati opštim postupkom mešanja, granulisanja ili oblaganja.
[0058] Kompozicija ćelijske terapije prema ovom otkrivanju može sadržati farmaceutski prihvatljive nosače ili aditive i može sadržati razblaživače (na primer, dekstrozu, sorbitol, celulozu, glicin, laktozu, saharozu i manitol), veziva (na primer, magnezijumaluminijumsilikat, skrobnu pastu, tragakant gumu, natrijumkarboksimetil celulozu), sredstva za razgradnju (na primer, skrob, agar, algininsku kiselinu ili njenu natrijumovu so) ili mešavinu za ključanje i/ili agense za apsorpciju, zaslađivače, aromu i agense za bojenje, pored aktivnih sastojaka.
[0059] Kompozicija ćelijske terapije prema ovom otkrivanju može se primeniti za artritis, neurološke poremećaje, endokrine poremećaje, bolesti jetre i slične i postoji mogućnost da se koriste kao agens alogenske terapije za ljude prema naknadnim rezultatima kliničkih ispitivanja za čoveka.
[0060] U nastavku će kroz Primere ovo otkrivanje biti detaljnije opisano. Međutim, ovo otkrivanje nije ograničeno na primerne aspekte opisane u nastavku nego se može implementirati u različitim oblicima. Sledeći primerni aspekti opisani su kako bi se omogućilo stručnjacima iz oblasti da ostvare i praktikuju ovo otkrivanje.
Primeri
Primer 1: Priprema frakcije florotanina i jedinjenja hemijskih formula 1 do 5
Primer 1-1: Priprema frakcije florotanina iz Ecklonia cava ekstrakta
[0061] Uzorci biljnog leka korišćeni u eksperimentu kupljeni su na ostrvu Džedžu, procenjeni od strane stručnjaka i upotrebljeni u eksperimentu.100 g osušenog uzorka biljnog leka dodato je u 1 L 70%
1
metanola, ekstrahovano pod refluksom tokom 16 sati i filtrirano primenom filtera. Filtrat je koncentrovan u rotacionom dekompresionom isparivaču i odmah je osušen zamrzavanjem radi pripreme Ecklonia cava ekstrakta.
[0062] 5g Ecklonia cava ekstrakta rastvoreno je sa 500 µl metanola, apsorbovano na C4 smoli (Sepia tech), osušeno dekompresijom na 30°C pomoću rotacionog vakuumskog isparivača i podeljeno za svaki rastvarač pomoću Diaion HP-20 na male frakcije. Dat je gradijent i pripremljeni su metanolski rastvarači sa koncentracijama od 0%, 25%, 50%, 75% i 100% za izvođenje frakcije. Podeljeno je 5 malih frakcija i potvrđen je HPLC profil (vidi FIG.1). Odabrana je frakcija sa najvišim HPLC pikom među pet malih frakcija.
Primer 1-2: Izolovanje i prečišćavanje frakcije florotanina
[0063] Frakcije dobijene u Primeru 1-1 primenjene su na C-18 HPLC-u na reverznim fazama koji ima 60 min uslov gradijenta rastvarača acetonitrila 10 min, 20 do 55% acetonitrila 40 min i 55 do 100% acetonitrila 10 min pomoću C18 kolone (Phenomenex Luna C18 oprema, 10 µm, 21.2 × 250 mm) i pomoću rastvarača acetonitrila koji sadrži 0.02% TFA-a i vodu pri protoku 10 ml/min i UV 243 nm koje treba izolovati u pikove C (RT 25 min), E (RT 33 min), G (RT 37.5 min), H (RT 38 min) i I (RT 38.5 min). Frakcija od vremena zadržavanja 0 do pika C označena je sa c, frakcija između pika C i pika E označena je sa D, frakcija između pikova E i G označena je sa F, a frakcija posle pika I označena je sa J.
[0064] Svaki pik je prečišćen pomoću C18 kolone (Phenomenex Luna C18 oprema, 10 µm, 21.2 × 250 mm), pomoću rastvarača acetonitrila koji sadrži 0.02% TFA-a, metanol i vodu pri protoku 4 ml/min i UV 230 nm u svakom izokratskom uslovu. U acetonitril 28% izokratskom uslovu respektivno su prečišćeni pik E (RT 10 min), pik G (RT 22 min), pik H (RT 23 min) i pik I (RT 27 min).
[0065] Međutim, kao rezultat analize posle prečišćavanja, potvrđeno je da su u piku C pomešane dve supstance, a zatim su dve supstance ponovo izolovane u C-1 (RT 10 min) i C-2 (RT 13.5 min) u metanol 26% izokratskom uslovu.
Primer 1-3: Strukturna analiza jedinjenja zasnovanog na polifenolu
[0066] Molekulska masa i molekulska formula jedinjenja prečišćenog u Primeru 1-2 određene su pomoću masene hromatografije sa tečnom hromatografijom visokih performansi (HPLC-MS), a strukturna identifikacija jedinjenja izvedena je analiziranjem<1>H NMR i<13>C-NMR spektara pomoću nuklearne magnetne rezonance (NMR).
[0067] Kao rezultat, identifikovano je da hemijska formula 1 predstavlja 2-O-(2,4,6-trihidroksifenil)-6,6'-biekol, hemijska formula 2 predstavlja Diekol, hemijska formula 3 predstavlja florofukofuroekol-A, hemijska formula 4 predstavlja 974-A, hemijska formula 3 predstavlja 974-B. Struktura izolovanog jedinjenja zasnovanog na polifenolu ilustrovana je u sledećoj Tabeli 1, a strukturne karakteristike svakog jedinjenja bile su kao što sledi.
[Tabela 1]
[Hemijska Formula 1] 2-O-(2,4,6-trihidroksifenil)-6,6'-biekol
[0068]
1) Molekulska masa: 866.65
2) Molekulska formula: C42H26O21
3)<1>H NMR (400 MHz, DMSO) δ 9.28, 9.25, 9.14, 9.09, 9.06, 9.04, 8.95, 8.66, 8.61, 6.09, 6.07, 6.05, 5.91(d, J=2.0Hz, 1H), 5.84, 5.80,δ, 5.75(d, J=2.0Hz, 1H).
4)<13>C NMR (100 MHz, dmso)δ 160.6, 160.5, 158.9, 158.9, 154.8, 151.5, 151.4, 151.2, 147.4, 146.5, 144.6, 144.6, 141.7, 141.6, 141.5, 141.5, 137.4, 137.4, 125.0, 123.9, 123.0, 123.0, 122.8, 122.3, 122.3, 99.9, 99.8, 98.1, 98.1, 98.0, 96.2, 96.2, 96.1,95.0,94.3,94.1.
[0069] FIG.2 ilustruje maseni spektar 2-O-(2,4,6-trihidroksifenil)-6,6'-biekola. Nadalje, FIG.3 i 4 respektivno ilustruju<1>H-NMR spektar i<13>C-NMR spektar 2-O-(2,4,6-trihidroksifenil)-6,6'-biekola, a brojevi naznačeni u svakom piku odgovaraju brojevima označenim u hemijskim formulama sa FIG.3 i 4.
[Hemijska Formula 2] Diekol
[0070]
1) Molekulska masa: 742.08
2) Molekulska formula: C36H22O18
1
3)<1>H NMR (400 MHz, MeOD) δ 6.16 (s, 1H), 6.14 (s, 1H), 6.10 (s, 2H), 6.07(d, J = 2.9 Hz, 1H), 6.06 (d, J = 2.9 Hz, 1H), 5.99 (d, J = 2.8 Hz, 1H), 5.96(d, J = 2.8 Hz, 1H).
4)<13>C NMR (125MHz, MeOD)δ 162.70, 160.95, 160.91, 158.63, 156.82, 155.34, 153.22, 148.17, 148.13, 147.97, 147.75, 145.11, 144.95, 144.22, 144.13, 139.46, 139.29, 127.22, 126.98, 126.42,
126.37, 125.66, 125.40, 125.34, 100.65, 100.51, 100.25, 100.14, 98.44, 96.99, 96.63, 96.55,
96.15.
[0071] FIG.5 ilustruje maseni spektar diekola. Nadalje, FIG.6 i 7 respektivno ilustruju<1>H-NMR spektar i 13C-NMR spektar diekola, a brojevi označeni na svakom piku odgovaraju brojevima označenim u hemijskim formulama sa FIG.6 i 7.
[Hemijska Formula 3] florofukofuroekol-A
[0072]
1) Molekulska masa: 602.07
2) Molekulska formula: C30H18O14
3)<1>H NMR (400 MHz, MeOD) δ 6.63 (s, 1H), 6.40 (s, 1H), 6.26 (s, 1H), 5.96 (d, J=2.1Hz,2H), 5.955.93 (t.poput,1H), 5.92 (t,J=2.1Hz,1H), 5.88(d,J=2.1Hz,2H).
4)<13>C NMR (125 MHz, MeOD) δ 161.87, 161.84, 160.18, 153.15, 151.73, 151.15, 148.31, 148.21,
145.97, 143.92, 138.37, 135.29, 128.04, 124.94, 124.64, 122.27, 105.29, 99.91, 99.28, 97.69,
97.57, 96.18, 95.35, 95.29.
[0073] FIG.8 ilustruje maseni spektar florofukofuroekol-A (PFF-A). Nadalje, FIG.9 i 10 respektivno ilustruju 1H-NMR spektar i 13C-NMR spektar PFF-A, a brojevi označeni na svakom piku odgovaraju brojevima označenim u hemijskim formulama sa FIG.9 i 10.
[Hemijska Formula 4] 974-A
[0074]
1) Molekulska masa: 974.73
2) Molekulska formula: C48H30O23
3)<1>H NMR (400 MHz, MeOD) δ 6.63 (s, 1H), 6.40 (s, 1H), 6.25 (s, 1H), 6.20 (d, J=2.3Hz,1H), 6.18(d,J=2.3Hz,1H), 6.12(d,J=2.3Hz,1H, 6.04(d,J=2.8Hz,1H), 5.92(s,2H), 5.925.91(m,1H), 5.90(d,J=2.3Hz,1H), 5.87(d,J=2.1Hz,2H), 5.74(d,J=2.8Hz,1H).
1
4)<13>C NMR (125 MHz, MeOD) δ 163.16, 162.88, 161.83, 160.16, 159.64, 159.54, 159.14, 159.09, 156.55, 156.49, 156.48, 153.85, 153.35, 152.26, 151.92, 151.77, 151.18, 148.21, 147.78, 145.82, 144.31, 138.15, 135.16, 127.62, 124.93, 124.90, 124.25, 124.22, 122.27, 119.40, 118.15, 105.22,
105.21, 102.62, 102.44, 99.91, 99.24, 98.61, 98.32, 97.68, 97.57, 96.34, 96.11, 95.28, 95.20,
94.37, 94.18.
[0075] FIG.11 ilustruje maseni spektar 974-A. Nadalje, FIG.12 i 13 respektivno ilustruju<1>H-NMR spektar i 13C-NMR spektar 974-A, a brojevi označeni na svakom piku odgovaraju brojevima označenim u hemijskim formulama sa FIG.12 i 13.
[Hemijska Formula 5] 974-B
[0076]
1) Molekulska masa: 947.73
2) Molekulska formula: C48H30O23
3)<1>H NMR (400 MHz, MeOD)δ 6.69 (s, 1H), 6.38 (s, 1H), 6.21 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.19 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.17 (s, 1H), 6.14 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.05 (d, J = 2.8 Hz, 1H), 6.00 (s, 2H), 5.91 (t, J = 2.1 Hz, 1H), 5.89 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 5.87 (d, J = 2.1 Hz, 2H), 5.76 (d, J = 2.8 Hz, 1H).
4)<13>C NMR (125 MHz, MeOD) δ 161.85, 160.16, 159.64, 159.53, 159.19, 158.97, 157.45, 156.81, 156.63, 156.47, 153.79, 152.65, 152.22, 151.95, 151.66, 150.89, 148.32, 147.03, 143.86, 142.83, 138.07, 137.95, 127.35, 125.23, 124.65, 124.01, 123.93, 122.11, 109.85, 106.33, 102.68, 102.49, 99.62, 99.47, 98.61, 98.32, 97.61, 97.56, 96.45, 95.28, 95.13, 94.23, 92.83.
[0077] FIG.14 ilustruje maseni spektar 974-B. Nadalje, FIG.15 i 16 respektivno ilustruju<1>H-NMR spektar i 13C-NMR spektar 974-B, a brojevi označeni na svakom piku odgovaraju brojevima označenim u hemijskim formulama sa FIG.15 i 16.
Primer 2: Izolovanje i inkubacija mezenhimalnih matičnih ćelija iz ljudske pupčane vrpce
Primer 2-1: Ekstrakcija ljudske pupčane vrpce
[0078] Tkivo pupčane vrpce sakupljeno je odmah posle porođaja. Uzorak je prvo temeljno opran pre nego što je prebačen u laboratoriju, a zatim je odmah prebačen u sterilizovanu staklenu bocu od 500 ml koja sadrži F-12 podlogu u koju je dodata podloga za transport (50 µg/ml penicilina i 50 µg/ml streptomicina (kupljeni od Invitrogena)). U laboratoriji, matične ćelije su ekstrahovane u protočnom
1
digestoru klase 100 u sterilnim uslovima. Uzorak je zatim prvo prebačen u kontejner od nerđajućeg čelika. Uzorak je ispran nekoliko puta primenom PBS-a, a zatim je uzorak tkiva pupčane vrpce isečen na dužinu od 2 cm i prebačen u posudu za uzgajanje ćelija prečnika 10 cm i u njima je dodatno ispran i tretiran 70% etanolom radi dezinfekcije, a zatim je ispran nekoliko puta primenom PBS-a u koji je dodata mešavina antibiotika (50 µg/ml penicilina i 50 µg/ml streptomicina (kupljeni od Invitrogena) dok rastvor nije bio očišćen.
Primer 2-2: Izolovanje i inkubacija matičnih ćelija iz ljudske pupčane vrpce
[0079] Da bi se Wharton-ov želatin (supstrat pupčane vrpce) izolovao iz krvnog suda pupčane vrpce i drugih unutrašnjih elemenata, prvo je izvedeno isecanje tkiva pupčane vrpce. Wharton-ov želatin izolovan nakon uklanjanja krvnog suda isečen je na male komade veličine (0.5 cm × 0.5 cm) radi ekstrakcije ćelija. Eksplantovanje je izvedeno dodavanjem komada Wharton-ovog želatina iz pupčane vrpce u različite posude za uzgajanje tkiva koje imaju uslove za uzgajanje ćelija pogodne za ekstrakciju epitelnih matičnih ćelija ili mezenhimalnih matičnih ćelija.
[0080] Za izolovanje/inkubaciju mezenhimalnih matičnih ćelija, eksplantovano tkivo je potopljeno u 5 ml DMEM (Dulbecco-ove modifikovane Eagle-ove podloge) F-12 (Gibco) dopunjeno sa 10% fetalnim goveđim serumom (FBS, Hyclone), 10% FBS-om, 100 jedinica/ml penicilina i 50 µg/ml streptomicina i održavano na 37°C u inkubatoru ćelija sa ugljendioksidom. Podloga se menjala svaka 3 ili 4 dana. Rast ćelija praćen je optičkim mikroskopom. Izrasle ćelije tretirane su Tripsinom (0.125% Tripsin/0.05% EDTA) radi dodatnog širenja i refrigeracije (primenom DMEM/10% FBS).
[0081] Podloga se menjala svaka 3 ili 4 dana. Rast ćelija iz eksplantovanog tkiva praćen je optičkim mikroskopom.
[0082] Za ekstrakciju mezenhimalnih matičnih ćelija, trombociti ćelija su resuspendovani i izbrojani u podlozi DMEM F-12 (Gibco), 10% FBS-a, 100 jedinica/ml penicilina i 50 µg/ml streptomicina i inokulisane su na 10 cm posudi za uzgajanje tkiva pri gustini od 1 × 10<6>ćelija/posuda. Podloga se menjala svaka 3 ili 4 dana. Rast i formiranje kolonije ćelija praćeno je optičkim mikroskopom. Na oko 90% broja ćelija (konfluencije), ćelije su subkultivisane kako je prethodno opisano.
Eksperimentalni primer 1: Indukovanje pluripotentnih matičnih ćelija iz mezenhimalnih matičnih ćelija
[0083] Eksperimentalni primer 1-1: Priprema pluripotentnih matičnih ćelija od mezenhimalnih matičnih ćelija izvedenih iz čoveka prema koncentraciji frakcije florotanina
[0084] Izveden je eksperiment za merenje sposobnosti indukovanja pluripotentnih matičnih ćelija iz mezenhimalnih matičnih ćelija izvedenih iz ljudske pupčane vrpce u odnosu na koncentraciju frakcije florotanina pripremljenom u Primeru 1-1. U kontrolnoj grupi, DMEM F-12 (Gibco) kao određena podloga
1
za MSC, 10% FBS-a, 100 jedinica/ml penicilina i 50 µg/ml streptomicina upotrebljene su kao osnovna podloga (Normalna), a u eksperimentalnoj grupi, upotrebljene su mezenhimalne matične ćelije izvedene iz čoveka koje su podvrgnute subkultivisanju tri puta i frakcije florotanina sa koncentracijama od 1 µg/ml, 20 µg/ml, 50 µg/ml, 100 µg/ml, 400 µg/ml, 800 µg/ml i 1000 µg/ml i 0.1 vol./vol.% energetske vode (prečišćene dejonizovane vode koja sadrži SiO2, Al2O3, TiO3, Fe2O3, CaO, Na2O, K2O i LiO, STC) dodati su podlozi. Mezenhimalne matične ćelije izvedene iz ljudske pupčane vrpce su izolovane i isprane, a mononuklearne ćelije su inokulisane u ploči (sudu) sa 6 bazenčića sa 1 × 10<4>ćelija i održavane i inkubirane na 37°C i 5% CO2.
[0085] Uzimajući u obzir pluripotentne matične ćelije indukovane postupkom ovog otkrivanja, analizirana je ekspresija faza-specifičnog embrionskog antigena4 (SSEA-4), alkalne fosfataze (AP), OCT4 i SOX2 kao specifičnih proteina za embrionske matične ćelije primenom njihovih antitela i postupkom za imunohemijsko bojenje. Tokom postupka za bojenje, ćelije su prvo fiksirane pomoću 4% paraformaldehida i isprane primenom PBS-a i blokirane 1% BSA rastvorom. Ćelije su tretirane primarnim antitelima za OCT4, SOX2 i SSEA-4 i reagovane na 4°C tokom 18 sati, a zatim isprane primenom PBS-a, tretirane sekundarnim antitelima sa fluorescencijom (FITC) do primarnih antitela i reagovane na sobnoj temperaturi tokom 1 sata. Ćelije su isprane primenom PBS-a, a zatim je ekspresija analizirana pomoću konfokalnog mikroskopa. BF označava svetlo polje, a drugi crtež ilustrovao je rezultat bojenja za ekspresiju proteina, dok je treći crtež ilustrovao kombinovana dva crteža (vidi FIG.19A, 19B, 20A i 20B). AP bojenje izvedeno je bojom ćelijski propusnog fluorogenog supstrata za alkalnu fosfatazu, pri čemu je AP fluorogena boja razblažena u DMEM F-12 rastvoru za uzgajanje kog treba tretirati u kolonijama, a zatim reagovana tokom 20 do 30 min, isprana DMEM F-12 rastvorom za uzgajanje dva puta dok je ekspresija analizirana pomoću konfokalnog mikroskopa, a rezultat je ilustrovan na FIG.17.
[0086] Kao rezultat, u eksperimentalnoj grupi, samo kada je koncentracija frakcije florotanina bila 10 do 500 µg/ml, primećeno je da se kolonije stvaraju posle 10 dana (vidi FIG.17) i potvrđeno je da samo kolonije obojene od strane OCT4, SOX2, SSEA-4 i AP kao specifičnih markera pluripotentnih matičnih ćelija postaju pluripotentne matične ćelije (vidi FIG.18 i 19).
Eksperimentalni primer 1-2: Priprema pluripotentnih matičnih ćelija od mezenhimalnih matičnih ćelija izvedenih iz čoveka prema koncentraciji jedinjenja u frakciji florotanina
[0087] Izveden je eksperiment za merenje sposobnosti indukovanja pluripotentnih matičnih ćelija iz mezenhimalnih matičnih ćelija izvedenih iz čoveka prema koncentraciji jedinjenja 1 među jedinjenjima izolovanih u Primeru 1-2. U kontrolnoj grupi, DMEM F-12 (Gibco) kao određena podloga za MSC, 10% FBS-a, 100 jedinica/ml penicilina i 50 µg/ml streptomicina upotrebljeni su kao osnovna podloga (Normalna), a u eksperimentalnoj grupi korišćene su mezenhimalne matične ćelije izvedene iz ljudske pupčane vrpce koje su podvrgnute subkultivisanju tri puta i jedinjenje biekola 1 predstavljeno
1

Claims (6)

  1. hemijskom formulom 1 sa koncentracijama 1 µg/ml, 20 µg/ml, 50 µg/ml, 100 µg/ml, 400 µg/ml, 800 µg/ml i 1000 µg/ml i 0.1 vol./vol.% energetske vode (prečišćena dejonizovana voda koja sadrži SiO2, Al2O3, TiO3, Fe2O3, CaO, Na2O, K2O i LiO, STC) dodate su podlozi. Mezenhimalne matične ćelije izvedene iz ljudske pupčane vrpce su izolovane i isprane, a mononuklearne ćelije inkubirane su u ploči (sudu) sa 6 bazenčića sa 1 × 10<4>ćelija i održavane i inkubirane na 37°C i 5% CO2. [0088] Uzimajući u obzir indukovane pluripotentne matične ćelije, analizirana je ekspresija fazaspecifičnog embrionskog antigena4 (SSEA-4), alkalne fosfataze, OCT4 i SOX2 kao specifičnih proteina za embrionske matične ćelije primenom njihovih antitela i postupkom za imunohemijsko bojenje. Tokom postupka bojenja, ćelije su prvo fiksirane pomoću 4% paraformaldehida i isprane primenom PBS-a i blokirane 1% BSA rastvorom. Ćelije su tretirane primarnim antitelima za OCT4, SOX2 i SSEA-4 i reagovane su na 4°C tokom 18 sati, a zatim isprane primenom PBS-a, tretirane sekundarnim antitelima sa fluorescencijom (FITC) do primarnih antitela i reagovane na sobnoj temperaturi tokom 1 sata. Ćelije su isprane primenom PBS-a, a zatim je ekspresija analizirana pomoću konfokalnog mikroskopa, dok je njegov rezultat ilustrovan na FIG.20. BF označava svetlo polje, a drugi crtež ilustrovao je rezultat bojenja za ekspresiju proteina, dok je treći rezultat ilustrovao kombinovana dva crteža (vidi FIG.21A, 21B, 22A i 22B). [0089] AP bojenje izvedeno je bojom ćelijski propusnog fluorogenog supstrata za alkalne fosfataze, pri čemu je AP fluorogena boja razblažena u DMEM F-12 rastvoru za uzgajanje kog treba tretirati u kolonijama, a zatim je reagovana tokom 20 do 30 min, isprana DMEM F-12 rastvorom za uzgajanje dva puta dok je ekspresija analizirana pomoću konfokalnog mikroskopa, a rezultat je ilustrovan na FIG.22B. [0090] Kao rezultat, u eksperimentalnoj grupi, samo kada je koncentracija jedinjenja biekola 1 predstavljenog hemijskom formulom 1 bila 50 µg/ml i 100 µg/ml, primećeno je da se kolonije stvaraju posle 14 dana (vidi FIG.20) i potvrđeno je da samo kolonije obojene od strane OCT4, SOX2, SSEA-4 i AP kao specifičnih markera pluripotentnih matičnih ćelija postaju pluripotentne matične ćelije (vidi FIG.21 i 22). Patentni zahtevi 1. Upotreba kompozicije podloge koja obuhvata 20 do 150 µg/ml frakcije florotanina koja je jedinjenje biekola predstavljeno sledećom hemijskom formulom 1 ili njegove soli za dediferenciranje mezenhimalnih matičnih ćelija u indukovane pluripotentne matične ćelije 2
  2. 2. Upotreba kompozicije podloge prema zahtevu 1, u kojoj se frakcija florotanina ekstrahuje i izoluje iz jednog tipa mrkih algi odabranog iz grupe koju čine Ecklonia cava, Dictyopteris prolifera Okamura, Dictyota dichotoma Lamouroux, Sargassum horneri C. Agardh, Sargassum patens C. Agardh i Ishige okamurae Yendo ili je veštački sintetizovana.
  3. 3. Upotreba kompozicije podloge prema zahtevu 1, u kojoj je frakcija florotanina uključena u podlozi odabranoj iz grupe koju čine DMEM (Dulbecco-ova modifikovana Eagle-ova podloga), MEM (Minimalna esencijalna podloga), BME (Osnovna podloga Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, DMEM F-12, α-MEM (α-Minimalna esencijalna podloga), G-MEM (Glasgow-ova Minimalna esencijalna podloga), IMDM (Iscoveova modifikovana Dulbecco-ova podloga), MacCoy-ova 5A podloga, AminoMax II kompletna podloga i MesenCult-XF podloga.
  4. 4. Upotreba kompozicije podloge prema zahtevu 1, u kojoj kompozicija podloge dalje obuhvata 1 do 10 vol./vol.% prečišćene dejonizovane vode koja sadrži SiO2, Al2O3, TiO3, Fe2O3, CaO, Na2O, K2O i LiO.
  5. 5. Postupak za pripremu indukovanih pluripotentnih matičnih ćelija, pri čemu ovaj postupak obuhvata: dodavanje 20 do 150 µg/ml frakcije florotanina koja je jedinjenje biekola predstavljeno sledećom hemijskom formulom 1 ili njegovih soli podlozi za uzgajanje ćelija; i dediferenciranje mezenhimalnih matičnih ćelija u indukovane pluripotentne matične ćelije u toj podlozi
  6. 6. Postupak prema zahtevu 5, u kom se frakcija florotanina ekstrahuje i izoluje iz jednog tipa mrkih algi odabranog iz grupe koju čine Ecklonia cava, Dictyopteris prolifera Okamura, Dictyota dichotoma Lamouroux, Sargassum horneri C. Agardh, Sargassum patens C. Agardh i Ishige okamurae Yendo ili je veštački sintetizovana.
RS20201114A 2014-05-23 2015-05-22 Postupak za pripremu indukovanih pluripotentnih matičnih ćelija iz mezenhimalnih matičnih ćelija pomoću frakcije florotanina RS60817B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20140062526 2014-05-23
KR1020150071240A KR101699761B1 (ko) 2014-05-23 2015-05-21 플로로탄닌 분획물을 이용한 중간엽 줄기세포로부터 유도만능 줄기세포를 제조하는 방법
PCT/KR2015/005183 WO2015178728A1 (ko) 2014-05-23 2015-05-22 플로로탄닌 분획물을 이용한 중간엽 줄기세포로부터 유도만능 줄기세포를 제조하는 방법
EP15795825.7A EP3147352B1 (en) 2014-05-23 2015-05-22 Method for preparing induced pluripotency stem cells from mesenchymal stem cells by using phlorotannin fraction

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS60817B1 true RS60817B1 (sr) 2020-10-30

Family

ID=54883407

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20201114A RS60817B1 (sr) 2014-05-23 2015-05-22 Postupak za pripremu indukovanih pluripotentnih matičnih ćelija iz mezenhimalnih matičnih ćelija pomoću frakcije florotanina

Country Status (24)

Country Link
US (1) US10131881B2 (sr)
EP (1) EP3147352B1 (sr)
JP (1) JP6839982B2 (sr)
KR (1) KR101699761B1 (sr)
CN (1) CN105960452B (sr)
AU (1) AU2015262123B2 (sr)
CA (1) CA2949949C (sr)
CY (1) CY1123348T1 (sr)
DK (1) DK3147352T3 (sr)
ES (1) ES2820577T3 (sr)
HR (1) HRP20201525T1 (sr)
HU (1) HUE050877T2 (sr)
IL (1) IL249170A0 (sr)
LT (1) LT3147352T (sr)
MX (1) MX380687B (sr)
MY (1) MY179152A (sr)
PH (1) PH12016502330B1 (sr)
PL (1) PL3147352T3 (sr)
PT (1) PT3147352T (sr)
RS (1) RS60817B1 (sr)
RU (1) RU2668803C2 (sr)
SG (1) SG11201609804RA (sr)
SI (1) SI3147352T1 (sr)
SM (1) SMT202000487T1 (sr)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL3064572T3 (pl) 2013-11-01 2020-07-13 Bbhc Co. Ltd. Sposób wytwarzania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z mezenchymalnych komórek macierzystych i indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste wytworzone tym sposobem
KR101966315B1 (ko) * 2017-04-26 2019-04-08 제주대학교 산학협력단 감태 추출물과 괭생이모자반 추출물을 이용한 면역억제용 조성물
WO2020116890A1 (ko) * 2018-12-05 2020-06-11 주식회사 보타메디 플로로탄닌을 유효성분으로 포함하는 음식 향미 개선용 조성물
WO2021145742A1 (ko) * 2020-01-17 2021-07-22 주식회사 만나스 플로로탄닌을 유효성분으로 포함하는 운동 기능 개선용 조성물
CN111557869A (zh) * 2020-06-19 2020-08-21 湖北楚天香妆生物科技有限公司 昆布提取物的应用
CN114438037B (zh) * 2022-01-25 2024-06-04 深圳市乐土生物医药有限公司 一种制备诱导性间充质干细胞的方法

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5818874A (ja) * 1981-07-28 1983-02-03 Shin Kobe Electric Mach Co Ltd 鉛蓄電池の製造法
JP2932660B2 (ja) 1990-10-09 1999-08-09 松下電器産業株式会社 スクリーン印刷用スキージ装置
JP4146146B2 (ja) 2002-03-25 2008-09-03 熊本県 フロロタンニン類を主成分とする抗菌剤
US7910755B2 (en) * 2004-09-29 2011-03-22 Harbor Biosciences, Inc. Stem cell expansion and uses
AU2007294731B2 (en) * 2006-09-13 2014-04-17 Abbvie Inc. Cell culture improvements
WO2009157610A1 (en) * 2008-06-26 2009-12-30 Pusan National University Industry-University Cooperation Foundation Selenium dedifferentiated cell, preparation method and usage thereof
JP2010030917A (ja) * 2008-07-25 2010-02-12 Guraiko Materials:Kk 肝炎予防剤又は肝炎治療剤
CN101748096B (zh) * 2008-12-17 2013-03-13 北京汉氏联合生物技术有限公司 亚全能干细胞、其制备方法及其用途
KR101166257B1 (ko) 2009-06-16 2012-07-19 한국생명공학연구원 미분화 다능성줄기세포의 제작, 유지 및 증식을 위한 뉴로펩타이드 ｙ를 포함하는 배지 조성물 및 이를 이용한 다능성줄기세포의 배양 방법
CN103210082A (zh) * 2010-09-15 2013-07-17 雷蒙特亚特特拉维夫大学有限公司 扩增胰岛β细胞和使其再分化的方法
KR101807704B1 (ko) 2011-04-12 2017-12-13 차의과학대학교 산학협력단 역분화-증진제를 이용한 역분화 만능 줄기세포의 제조방법
US20150072416A1 (en) 2012-05-29 2015-03-12 Korea Research Institute Of Bioscience And Biotech Metabolite for improving production, maintenance and proliferation of pluripotent stem cells, composition comprising the same, and method of culturing pluripotent stem cell using the same
KR101542850B1 (ko) * 2013-11-01 2015-08-10 주식회사 비비에이치씨 중간엽 줄기세포로부터 유도된 만능 줄기세포를 이용하여 지방세포로 분화시키는 방법
KR101542847B1 (ko) * 2013-11-01 2015-08-10 주식회사 비비에이치씨 중간엽 줄기세포로부터 유도된 만능 줄기세포를 이용하여 신경세포로 분화시키는 방법
KR101542849B1 (ko) * 2013-11-01 2015-08-10 주식회사 비비에이치씨 중간엽 줄기세포로부터 유도된 만능 줄기세포를 이용하여 간세포로 분화시키는 방법
KR101542848B1 (ko) * 2013-11-01 2015-08-10 주식회사 비비에이치씨 중간엽 줄기세포로부터 유도된 만능 줄기세포를 이용하여 골아세포로 분화시키는 방법
KR101544195B1 (ko) 2013-11-01 2015-08-12 주식회사 비비에이치씨 중간엽 줄기세포로부터 유도만능 줄기세포를 제조하는 방법 및 그 방법에 의해 제조된 유도만능 줄기세포
KR101542846B1 (ko) * 2013-11-01 2015-08-10 주식회사 비비에이치씨 중간엽 줄기세포로부터 유도된 만능 줄기세포를 이용하여 연골세포로 분화시키는 방법

Also Published As

Publication number Publication date
PL3147352T3 (pl) 2021-01-25
CY1123348T1 (el) 2021-12-31
KR20150135136A (ko) 2015-12-02
AU2015262123B2 (en) 2018-04-19
KR101699761B1 (ko) 2017-01-25
SG11201609804RA (en) 2016-12-29
IL249170A0 (en) 2017-01-31
EP3147352A1 (en) 2017-03-29
SMT202000487T1 (it) 2020-11-10
ES2820577T3 (es) 2021-04-21
MY179152A (en) 2020-10-29
CA2949949A1 (en) 2015-11-26
CA2949949C (en) 2023-03-28
PH12016502330A1 (en) 2017-02-06
CN105960452B (zh) 2019-11-22
HUE050877T2 (hu) 2021-01-28
HRP20201525T1 (hr) 2021-02-19
MX380687B (es) 2025-03-12
JP6839982B2 (ja) 2021-03-10
MX2016015357A (es) 2017-06-20
JP2017516455A (ja) 2017-06-22
RU2668803C2 (ru) 2018-10-02
AU2015262123A1 (en) 2016-08-25
EP3147352B1 (en) 2020-08-12
PH12016502330B1 (en) 2017-02-06
US10131881B2 (en) 2018-11-20
RU2016150687A3 (sr) 2018-06-25
DK3147352T3 (da) 2020-09-28
CN105960452A (zh) 2016-09-21
SI3147352T1 (sl) 2021-01-29
EP3147352A4 (en) 2018-01-24
PT3147352T (pt) 2020-09-29
US20170107481A1 (en) 2017-04-20
LT3147352T (lt) 2020-12-10
RU2016150687A (ru) 2018-06-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101542849B1 (ko) 중간엽 줄기세포로부터 유도된 만능 줄기세포를 이용하여 간세포로 분화시키는 방법
EP3064573B1 (en) Method for differentiating pluripotent stem cell induced from mesenchymal stem cell into neuron
EP3147352B1 (en) Method for preparing induced pluripotency stem cells from mesenchymal stem cells by using phlorotannin fraction
KR101542846B1 (ko) 중간엽 줄기세포로부터 유도된 만능 줄기세포를 이용하여 연골세포로 분화시키는 방법
KR101542850B1 (ko) 중간엽 줄기세포로부터 유도된 만능 줄기세포를 이용하여 지방세포로 분화시키는 방법
US10053669B2 (en) Method for differentiating pluripotent stem cell induced from mesenchymal stem cell into osteoblast
KR101544195B1 (ko) 중간엽 줄기세포로부터 유도만능 줄기세포를 제조하는 방법 및 그 방법에 의해 제조된 유도만능 줄기세포
KR101982835B1 (ko) 중간엽 줄기세포로부터 유도된 만능 줄기세포를 췌장의 베타세포로 분화시키는 방법
CN105264066B (zh) 由间充质干细胞生产诱导性多能干细胞的方法以及由该方法生产的诱导性多能干细胞