RS60823B1 - Biparatopski polipeptidi koji antagonizuju wnt signalizaciju u tumorskim ćelijama - Google Patents

Biparatopski polipeptidi koji antagonizuju wnt signalizaciju u tumorskim ćelijama

Info

Publication number
RS60823B1
RS60823B1 RS20201124A RSP20201124A RS60823B1 RS 60823 B1 RS60823 B1 RS 60823B1 RS 20201124 A RS20201124 A RS 20201124A RS P20201124 A RSP20201124 A RS P20201124A RS 60823 B1 RS60823 B1 RS 60823B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
seq
lrp6
single variable
immunoglobulin single
lrp5
Prior art date
Application number
RS20201124A
Other languages
English (en)
Inventor
Vittoria Zinzalla
Klaus-Peter Kuenkele
Marie-Ange Buyse
Karen Cromie
Stephanie Staelens
Beatrijs Strubbe
Original Assignee
Boehringer Ingelheim Int
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Boehringer Ingelheim Int filed Critical Boehringer Ingelheim Int
Publication of RS60823B1 publication Critical patent/RS60823B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/22—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from camelids, e.g. camel, llama or dromedary
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

OBLAST PRONALASKA
Ovaj pronalazak se odnosi na novi protein 5 (LRP5) koji je sličan lipoproteinskom receptoru male gustine i na protein 6 (LRP6) koji je sličan lipoproteinskom receptoru male gustine, vezujuće polipeptide. Pronalazak se takođe odnosi na ekspresioni vektor koji kodira nukleinsku kiselinu koja kodira takav polipeptid; na metode za pripremu takvih polipeptida; na ćelije domaćina koje eksprimiraju ili su sposobne za ekspresiju takvih polipeptida; i na upotrebu takvih polipeptida ili takvih kompozicija, posebno u terapeutske svrhe u području bolesti karcinoma.
STANJE TEHNIKE
Aktiviranje Wnt signalnog puta zahteva vezivanje ekstracelularnih Wnt liganada za Frizzled receptor i za ko-receptor LRP5 (pristupni broj: UniProtKB -O75197 / LRP5_HUMAN) ili za njegov blisko srodni homolog LRP6 (pristupni broj: UniProtKB -O75581 / LRP6_HUMAN). U ćelijama sisara postoji 19 Wnt proteina i 10 Frizzled receptora. U odsustvu Wnt liganda, citoplazmatski beta-katenin se fosforilizuje uz pomoć proteinskog kompleksa koji se sastoji od skeletnih proteina Axin i APC i kinaza GSK3beta i CK1a. Naknadno prepoznavanje ubikvitin ligaze beta-TrcP dovodi do ubikvitin-posredovane razgradnje beta-katenina. U prisustvu Wnt liganda, vezivanje Wnt za Frizzled i LRP5 ili LRP6 dovodi do regrutacije citoplazmatskog efektorskog proteina Dvl i fosforilacije LRP5 ili LRP6 citoplazmatskog repa, što obezbeđuje mesto pristajanja za Axin. Sekvestracija aksina pomoću LRP5 ili LRP6 dovodi do inaktivacije kompleksa Axin-APC- GSK3beta i, prema tome, do unutarćelijske stabilizacije i akumulacije betakatenina. Dakle, citoplazmatski nivo beta-katenina raste, a beta- katenin migrira u jezgro i kompleksira sa članovima familije transkripcijskih faktora T-ćelijski faktor (TCF)/limfoidni pojačivač-vezujući faktor (LEF). Zatim se regrutuje bazalna transkripcijska mašinerija i transkripcijski koaktivatori, uključuju ći cAMP element odgovora-vezujući protein (CREB)-vezujući protein (CBP) ili njegov homolog p300, što dovodi do ekspresije različitih ciljnih gena, uklju čujući Axin2, ciklin D1 i c-Myc.
Dodatni nivo regulacije ligand zavisnog Wnt puta posredovan je uz pomoć E3 ligaze RNF43 i njenog blisko srodnog homologa ZNRF3 i uz pomoć sekretovanog R-spondin proteina (de Lau et al. “The R-spondin/Lgr5/Rnf43 module: regulator of Wnt signal strength”. Genes Dev.2014; 28(4):305-16). RNF43 posreduje ubikvitinaciju kompleksa Frizzled/LRP5 ili LRP6 receptorni kompleks na ćelijskoj površini, što dovodi do njegove degradacije i, samim tim, do inhibicije aktivnosti ligand zavisnog Wnt puta. Aktivnosti RNF43 je suprotstavljen sa članovima porodice R spondina (R-spondin 1 do 4 liganda). Kada je prisutan R-spondin ligand, on uklanja RNF43 sa ćelijske površine, omogućavajući akumuliranje Frizzled/LRP5 ili LRP6 kompleksa i pojačavanje Wnt signalizacije u prisustvu Wnt liganda.
LRP5 i LRP6 funkcionišu kao čuvari vrata, od aktivacije ligand zavisne Wnt signalizacije i, prema tome, mogu se smatrati ciljanim za postizanje potpune blokade puta posredovanog uz pomoć svih 19 Wnt liganada i 10 Frizzled receptora i pojačanim uz pomoć R-spondin liganda. Konkretno, Wnt ligandi se mogu podeliti na klasu Wnt1 i klasu Wnt3a, od kojih se svaka vezuje za različite epitope/regione na LRP5 i LRP6 za signalizaciju. Ektodomen na LRP5 i LRP6 sastoji se od četiri ponavljajuće jedinice beta propelera povezanih sa EGF-sličnim domenom, praćene sa tri LDLR tip A ponavljanja. Kombinovane strukturne i funkcionalne analize LRP5 i LRP6 sugerišu da se Wnt1 (ligand klase Wnt1) vezuje za fragment koji sadrži beta-propeler 1 i 2, a Wnt3a se vezuje za fragment koji sadrži beta-propeler 3 i 4 na LRP6. Do sada je zabeležena samo slika sa niskom rezolucijom LRP6 ektodomena koji sadrži beta propeler iz 1 do 4 regiona (Ahn et al.” Structural basis of Wnt signaling inhibition by Dickkopf binding to LRP5/6”. Dev Cell.
2011; 21(5):862-73). Međutim, nesigurnost ovih rekonstrukcija niske rezolucije (40 A°) i odsustvo strukturnih podataka za LRP6 ektodomen u kompleksu sa Wnt ligandima ne omogućavaju definisanje tačnih epitopa koji su uključeni u vezivanje Wnt1 ili Wnt3a liganda.
Hiperaktivacija Wnt signalizacije je uključena u patogenezu različitih vrsta karcinoma. Kod nekih vrsta karcinoma, česte mutacije u nizvodnim signalnim molekulima doprinose konstitutivno aktiviranom Wnt putu (na pr. APC mutacije kod karcinoma debelog creva; mutacija aktiviranja beta-katenina u hepatocelularnom karcinomu). Suprotno tome, kod trostruko negativnog karcinoma dojke (TNBC), karcinoma plućnih nemalih ćelija (NSCLC), adenokarcinoma pankreasa i u podgrupi karcinoma kolorektuma (CRC) i endometrijuma, aktiviranje signalizacije Wnt je pokrenuto uz pomoć ligand -zavisnog mehanizma (tj. uz pomoć autokrine/parakrine Wnt aktivacije), što je otkriveno uz pomoć unutarćelijske akumulacije beta-katenina.
U NSCLC, TNBC i adenokarcinomu pankreasa, ligand zavisna Wnt aktivacija je posredovana sa višestrukim mehanizmima, uključujući povećanu ekspresiju Wnt liganada i/ili LRP5 i LRP6 receptora, ili utišavanje LRP5 i LRP6 negativnog regulatora DKK1 (TNBC: Liu et al.” LRP6 overexpression defines a class of breast cancer subtype and is a target for therapy”. Proc Natl Acad Sci U S A 2010; 107 (11):5136-41;
Khramtsov et al. “Wnt/beta-catenin pathway activation is enriched in basal-like breast cancers and predicts poor outcome”. Am J Pathol.2010; 176(6): 2911-20; NSCLC:
Nakashima et al. “Wnt1 overexpression associated with tumor proliferation and a poor prognosis in non-small cell lung cancer patients”. Oncol Rep.2008; 19(1):203-9;
Pancreatic cancer: Zhang et al. “Canonical wnt signaling is required for pancreatic carcinogenesis”. Cancer Res.2013; 73(15):4909-22). Objavljeni podaci su naročito pokazali da je beta-katenin u zdravim tkivima (na pr. epitel mlečnih žlezda i pluća) lokalizovan samo na plazminoj membrani. Suprotno tome, većina primarnih kliničkih uzoraka TNBC, NSCLC i adenokarcinoma pankreasa pokazala je unutarćelijsku akumulaciju beta-katenina (tj. u citoplazmi/jedru; biomarker za aktivaciju Wnt signalizacije), usled nepravilne Wnt signalizacije. Nedavne publikacije su pokazale da je ligand zavisna aktivacija Wnt signalizacije posredovana sa mutiranim/inaktiviranim RNF43 (Giannakis et al. “RNF43 is frequently mutated in colorectal and endometrial cancers”. Nat Genet.2014; 46(12):1264-6) ili uz pomoć aktiviranja R-spondin fuzijskih transkripata (kodirajući R-spondin2 ili R-spondin3 proteini pokrenuti konstitutivno aktivnim snažnim promotorima; Seshagiri et al. “Recurrent R-spondin fusions in colon cancer”. Nature 2012; 488(7413):660-4) u podskupu CRC i karcinoma endometrijuma. Pokazalo se da se inaktivacijom mutacija RNF43 kao i R-spondin fuzijskih transkripta povećava ligand zavisna Wnt signalizacija in vitro tako što se povećava obilnost Frizzleda na površini ćelije. Pokazano je da ligand zavisna Wnt aktivacija pokreće rast tumora i rezistenciju na hemoterapiju ili imunoterapiju i povezana je sa recidivom u predkliničkim modelima.
Neki od molekula koji vezuju LRP5 ili LRP6, sposobni da moduliraju Wnt signalni put, poznati su u struci:
Dickkopf-1 (DKK1) je LRP5 i LRP6 inhibitor. DKK1 se povezuje sa Wnt ko-receptorima, kao i sa LRP5 i 6, i transmembranskim proteinima. Kremen, inhibira Wnt signalizaciju i dovodi do brze internalizacije LRP5 i LRP6. Pokazano je da DKK1 inhibira i Wnt1 i Wnt3a posredovanu signalizaciju. Studije strukturnog modelovanja pokazuju da se jedan molekul DKK1 kooperativno vezuje za prošireni region LRP6 ektodomena (od betapropelera 1 do 3). Strukturne analize sugerišu DKK1 kooperativnu vezivnu interakciju sa LRP6 sa početnim vezivanjem za regiju beta-propelera 3 koja olakšava interakciju/vezivanje za regiju beta-propelera 1 i 2 kroz promenu konformacije LRP6 ektodomena. Međutim, nedostaje razjašnjenje definisanih epitopa u domenima betapropelera 1, 2 i 3 koji su uključeni u vezivanje DKK1 za LRP6 zbog niske rezolucije strukturnih rekonstrukcija punog LRP6 ektodomena vezanog za DKK1, kao što je pomenuto.
Pokazano je da tretman DKK1 in vivo uzrokuje ozbiljnu toksičnost u gastrointestinalnom traktu. Konkretno, pokazano je da adenovirusom posredovana ekspresija DKK1 kod odraslih miševa izrazito inhibira proliferaciju u tankom crevu i debelom crevu, što je praćeno progresivnom arhitektonskom degeneracijom, ozbiljnim gubitkom telesne težine i smrtnošću od kolitisa i sistemskih infekcija. Konkretno, LRP5 i LRP6 se eksprimiraju u crevima u proliferativnim epitelnim ćelijama i potrebni su za proliferaciju crevnog epitela, što sugeriše da inhibicija LRP5 i LRP6 može biti toksična za ovo i druga normalna tkiva (Zhong et al. ”Lrp5 and Lrp6 play compensatory roles in mouse intestinal development”. J Cell Biochem.2012; 113(1):31-8). To dovodi u pitanje da li se agensi koji inhibiraju LRP5 i LRP6 ili koji inhibiraju Wnt (Wnt1 i Wnt3a) signalni put uopšte mogu koristiti u terapeutske svrhe, na pr. da li se mogu se razviti kao lekovi protiv raka.
WO2009/056634 se odnosi na molekule koji vezuju LRP6 koji mogu ili da interaguju sa Wnt1 signalnim putem ili sa Wnt3/3a signalnim putem, koji mogu biti antagonistički ili agonistički, i koji se mogu koristiti u dijagnostičke svrhe ili za lečenje „poremećaja povezanih sa Wnt signalnim putem“, kao što je osteoartritis, policistična bolest bubrega ili rak. U ovom dokumentu nisu dati konkretni primeri za takve vezujuće molekule, definisane njihovom aminokiselinskom sekvencom.
WO2011/138391 i WO2011/138392 otkrivaju multivalentna LRP6 vezujuća antitela. WO2011/138391 polaže pravo na antitela koja blokiraju jedan Wnt signalni put (Wnt1 ili Wnt3), a da ne potenciraju drugi put (Wnt3 ili Wnt1, respektivno). WO2011/138392 i.a. obezbeđuje antitela ili fragmente antitela koji potenciraju Wnt signalizaciju uz pomoć grupisanja LRP6 receptora.
WO2011/138391 objašnjava da za postizanje željenog efekta, molekuli koji se vezuju za LRP6 treba da se formatiraju u IgG antitela pune dužine. Navedeni su primeri LRP6 biparatopskih molekula koji uključuju jedan IgG molekul, koji ima prvu specifičnost vezivanja, udružen sa jednolančanim Fv delom, koji ima drugu specifičnost vezivanja. Opisani su neki formati koji imaju značajno smanjenu toplotnu stabilnost (Tm od 50 do 52°C). Jedan Fc deo može pružati efektorske funkcije na nekom molekulu IgG, kao što je citotoksičnost zavisna od komplementa (CDC) ili ćelijska toksičnost zavisna od antitela (ADCC).
WO2013/067355 otkriva za poluživot produžene biparatopske LRP6 vezujuće scFv imunoglobulinske konstrukcije, izvedene iz IgG molekula otkrivenih u WO2011/138391.
WO2011/119661 otkriva antitela koja se vezuju za LRP6 i inhibiraju signalizaciju indukovanu prvom Wnt izoformom, posebno uz pomoć Wnt3 ili Wnt3a, ali potenciraju signalizaciju indukovanu drugom Wnt izoformom, koja može biti Wnt1, 2, 2b, 4, 6, 7a, 7b, 8a, 9a, 9b, 10a ili 10b izoforma. Otkriveni su bispecifični molekuli koji se vezuju za E1-E2 region iz LRP6 kao i za E3-E4 region iz LRP6. Tehnika “knob-in-hole” je korišćena za generisanje bispecifičnih antitela.
Identifikacija vezujućih epitopa (definisanih aminokiselinskih ostataka unutar LRP6 ektodomen/beta-propeler regiona) koji su uključeni u vezivanje LRP6 antitela nije data u WO2009/056634, niti u WO2011/138391 ili WO2013/067355, a samo delimično u WO2011/119661. Konkretno, antitela koja vezuju LRP6 mogu inhibirati Wnt signalizaciju putem alternativnih mehanizama u skladu sa vezivanjem za različite regione iz LRP6, uključujući direktno nadmetanje sa Wnts ili inhibiranje formiranja ternarnih kompleksa receptora (Wnt-LRP6-Frizzled), dok druga pojačavaju signalizaciju, verovatno uz pomoć grupisanja receptora (Ahn et al.” Structural basis of Wnt signaling inhibition by Dickkopf binding to LRP5/6”. Dev Cell.2011; 21(5):862-73).
Međutim, nijedan od vezujućih molekula opisanih u tehnici do sada nije odobren od strane zdravstvenih autoriteta za upotrebu kao lek za lečenje bilo koje bolesti. Konkretno, takva upotreba zahteva vrlo specifična svojstva vezivanja, pravu specifičnost, tako da se takvi molekuli vezuju ili ne vezuju za, aktiviraju ili inhibiraju druge targete (na pr. rezultiraju neželjenom aktivacijom ili inhibicijom drugih signalnih puteva ili nedostatkom aktivacije ili inhibicije u odnosu na ciljane izoforme), u slučaju dvo- ili multispecifičnih agenasa, prava ravnoteža između dve ili više specifičnosti vezivanja, pogodnih farmakokinetičkih i –dinamičkih svojstava, prihvatljivog toksikološkog profila i, naravno, in vivo efikasnosti.
S obzirom na gore navedeno, postoji potreba za novim terapijskim agensima koji omogućavaju efikasno lečenje nekoliko vrsta bolesti karcinoma i tumora. Stoga je cilj pronalaska da obezbedi takve farmakološki aktivne agense koji se mogu koristiti u lečenju nekoliko bolesti karcinoma, uključujući NSCLC i TNBC.
Naročito je cilj pronalaska da obezbedi takve farmakološki aktivne agense, kompozicije i/ili metode lečenja koji pružaju određene prednosti u poređenju sa agensima, kompozicijama i/ili postupcima koji se trenutno koriste i/ili su poznati u struci. Te prednosti uključuju in vivo efikasnost, poboljšana terapeutska i farmakološka svojstva, manje neželjenih efekata i druga korisna svojstva kao što su poboljšana jednostavnost pripreme ili smanjeni troškovi robe, posebno u poređenju sa lekovima-kandidata koji su već poznati u struci.
KRATAK OPIS PRONALASKA
U skladu sa prvim aspektom pronalaska, ovaj pronalazak obezbeđuje polipeptide koji se specifično vezuju za LRP5 ili LRP6, pri čemu takav polipeptid u skladu sa pronalaskom sadrži prvi imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen (a) izabran iz grupe imunoglobulinskih pojedinačnih varijabilnih domena (i) do (iii) definisanih tako što sadrže sledeće CDR sekvence:
(i):
CDR1: TYTVG (= SEKV ID BR:1)
CDR2: AIRRRGSSTYYADSVKG (= SEKV ID BR:2)
CDR3: DTRTVALLQYRYDY (= SEKV ID BR:3)
(ii):
CDR1: SYAMG (= SEKV ID BR:4)
CDR2: AIRRSGRRTYYADSVKG (= SEKV ID BR:5)
CDR3: ARRVRSSTRYNTGTWWWEY (= SEKV ID BR:6)
(iii):
CDR1: RYTMG (= SEKV ID BR:7)
CDR2: AIVRSGGSTYYADSVKG (= SEKV ID BR:8)
CDR3: DRRGRGENYILLYSSGRYEY (= SEKV ID BR:9),
i drugi imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen (b) izabran iz grupe imunoglobulinskih pojedinačnih varijabilnih domena (iv) i (v) definisanih tako što sadrže sledeće CDR sekvence:
(iv):
CDR1: SYAMG (= SEKV ID BR:10)
CDR2: AISWSGGSTYYADSVKG (= SEKV ID BR:11)
CDR3: SPIPYGSLLRRRNNYDY (= SEKV ID BR:12)
(v):
CDR1: SYAMG (= SEKV ID BR:13)
CDR2: AISWRSGSTYYADSVKG (= SEKV ID BR:14)
CDR3: DPRGYGVAYVSAYYEY (= SEKV ID BR:15).
Izrazi „prvi“ i „drugi“ u odnosu na takve imunoglobulinske pojedinačne varijabilne domene imaju za cilj samo da ukažu da su ovi domeni dva različita domena (jer će u najmanju ruku uključivati različite CDR sekvence). Stoga se ovi pojmovi neće razumeti da se odnosi na tačan redosled ili sekvencu domena unutar takvog polipeptidnog lanca.
Polipeptidi pronalaska opciono sadrže treći imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen, kao što je posebno albumin koji vezuje imunoglobulinske pojedinačne varijabilne domene, poput domena Alb11, koja sadrži sledeće CDR:
CDR1(Alb11): SFGMS (= SEKV ID BR:16)
CDR2(Alb11): SISGSGSDTLYADSVKG (= SEKV ID BR:17)
CDR3(Alb11): GGSLSR (= SEKV ID BR:18).
Prema specifičnijoj realizaciji, polipeptidi pronalaska uključuju imunoglobulinske pojedinačne varijabilne domene koji su VHH domeni, a poželjno humanizovani VHH domeni.
Prema još specifičnijoj realizaciji, polipeptidi pronalaska uključuju prvi imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen (a) izabran iz grupe imunoglobulinskih pojedinačnih varijabilnih domena (i) do (iii) koji imaju sledeće sekvence:
(i):
AVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSTYTVGWFRQAPGKEREFVAAIR RRGSSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAADTRTVAL LQYRYDYWGQGTLVTVSS
(= SEKV ID BR:19)
(ii):
AVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGGTFSSYAMGWFRQAPGKEREFVAAI RRSGRRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAAARRVR SSTRYNTGTWWWEYWGQGTLVTVSS
(= SEKV ID BR:20)
(iii):
AVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGLTFSRYTMGWFRQAPGKEREFVAAIV RSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAADRRGRG ENYILLYSSGRYEYWGQGTLVTVSS
(= SEKV ID BR:21),
i drugi imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen (b) izabran iz grupe koja se sastoji od imunoglobulinskih pojedinačnih varijabilnih domena (iv) i (v) i koji ima sledeće sekvence:
(iv):
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYAMGWFRQAPGKEREFVAAI SWSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAASPIPY GSLLRRRNNYDYWGQGTLVTVSS
(= SEKV ID BR:22), i
(v):
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGGTFSSYAMGWFRQAPGKEREFVAAI SWRSGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAADPRG YGVAYVSAYYEYWGQGTLVTVSS
(= SEKV ID BR:23).
Prema specifično poželjnoj realizaciji, polipeptidi pronalaska dodatno uključuju za poluživot produženi ostatak, pri čemu je navedeni deo za poluživot produženi ostatak kovalentno vezan za navedeni polipeptid i opciono je izabran iz grupe koja se sastoji od albumin vezujućeg ostatka, kao što je albumin vezujući peptid ili albumin vezujući imunoglobulinski domen, poželjno albumin vezujući imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen, još poželjnije Alb11 domen, transferin vezujući ostatak, kao što je antitransferin imnoglobulinski domen, molekul polietilen-glikola, albumin humanog seruma, i fragment albumina humanog seruma.
Naročito su poželjni polipeptidi koji uključuju, pored dva imunoglobulinska pojedinačna varijabilna domena (a) i (b), kao što je gore navedeno, domen Alb11 koji ima sledeću sekvencu:
EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSIS
GSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTI
GGSLSRSSQGTLVTVSS
(= SEKV ID BR:24)
U skladu sa daljom realizacijom, pronalazak posebno uključuje polipeptide koji sadrže ili se sastoje od bilo kog od sledeća tri polipeptidna lanca:
F13500575, koji ima sekvencu SEKV ID BR:25,
F13500571, koji ima sekvencu SEKV ID BR:26, i
F13500720, koji ima sekvencu SEKV ID BR:27.
U skladu sa daljim aspektima, pronalazak se odnosi na molekule nukleinske kiseline, vektore ekspresije, ćelije domaćina, i postupke proizvodnje koji se koriste u proizvodnji polipeptida pronalaska. Molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju polipeptide pronalaska mogu se koristiti u izolovanom obliku za konstruisanje odgovarajućih ekspresioniih vektora, koji se zatim mogu transfektovati u ćelije domaćina koje se koriste za biofarmaceutsku proizvodnju polipeptida pronalaska. Takav postupak proizvodnje obično obuhvata korake kultivacije ćelije domaćina pod uslovima koji omogućavaju ekspresiju polipeptida, izdvajanje polipeptida i njegovo prečišćavanje u skladu sa postupcima poznatim u tehnici.
Dalji aspekti, realizacije, upotrebe i postupci koji uključuju polipeptid pronalaska postaće jasni iz sledećeg detaljnog opisa pronalaska i iz dodatih zahteva.
Pronalazak obezbeđuje nove molekule koji omogućavaju efikasnije lečenje nekoliko vrsta karcinoma, kao što su TNBC, CRC i NSCLC, sa manje neželjenih efekata.
Polipeptidi pronalaska pružaju iznenađujući terapeutski efekat (tj. efikasnost) u lečenju pacijenata sa karcinomom, tako što mogu da indukuju regresiju tumora što rezultira u patološkom potpunom odgovoru (pCR). Očekuje se da će ovo, zauzvrat, rezultirati značajnim poboljšanjem preživljavanja bez progresije i ukupnog preživljavanja, posebno u visoko nezadovoljenim indikacijama medicinske potrebe kao što je na pr. kod raka dojke. Prema tome, polipeptidi pronalaska pružaju nove terapijske mogućnosti u lečenju nekoliko vrsta karcinoma, posebno onih koji pokazuju neregulisani Wnt signalni put i akumulaciju beta-katenina.
Dalje, polipeptidi pronalaska su jednostavni za proizvodnju, imaju visoku stabilnost i nisku antigenost i nude niz opcija u vezi sa načinima primene, pored injekcije i infuzije.
1
KRATAK OPIS SLIKA
Slika 1 prikazuje šematski prikaz biparatopskih polipeptida koji antagonizuju Wnt1 i Wnt3a signalizaciju. Oni se sastoje od tri domena, sa dva domena koja se vezuju za različite epitope iz LRP5 i LRP6 (Wnt1 i Wnt3a blokatori) i sa jednim domenom za produženje poluživota (vezivno sredstvo za humani serumski albumin).
Slika 2 prikazuje nedostatak korelacije između FACS i ELISA testova vezivanja za reprezentativni broj VHH-a koji vezuju LRP6 izvedene iz Llama imunizacije. Panel broj „1“ za VHH-ove karakteriše visoki afinitet prema ćelijama koje eksprimiraju LRP6 na plazminoj membrani, što je detektovano uz pomoć FACS testova vezivanja (na y osi su prikazane vrednosti MCF). Panel broj „2“ za VHH-ove karakteriše visok afinitet prema rekombinantnom humanom LRP6 ektodomenu (rhLRP6-Fc), kako je detektovano uz pomoć ELISA testova vezivanja (na x osi su prikazane vrednosti OD405).
Slika 3 prikazuje vezivanje tri za poluživot produžena biparatopska LRP5/LRP6 unakrsno reaktivnog VHH konstrukta za humani LRP5 (slika 3A) i humani LRP6 (slika 3B) koji prekomerno eksprimira HEK293 ćelijske linije u poređenju sa negativnom kontrolom koja se sastoji od neciljanog vezujućeg agensa (VHH konstrukt koji se vezuje za bakterijski protein koji nije eksprimiran u HEK293 ćelijama).
Slika 4 prikazuje kompletnu DKK1 konkurenciju tri za poluživot produžena biparatopska LRP5/LRP6 unakrsno reaktivnog VHH konstrukta za vezivanje na humani LRP5 (Slika 4A) i humani LRP6 (Slika 4B) koji prekomerno eksprimira HEK293 ćelijske linije, kako je detektovano analizom DKK1 kompeticije uz pomoć FACS testa.
Slika 5 prikazuje potpunu inhibiciju Wnt1 i Wnt3a puta za poluživot produžena biparatopska LRP5/LRP6 unakrsno reaktivnog VHH konstrukta (Slika 5A) i poređenje sa ostalim LRP6 vezujućim molekulima (Slika 5B: Knob HC YW210.09 i MOR08168IgG1LALA 6475 scfv; Slika 5C: 802T) u kombinovanom Wnt1 i Wnt3a reporter testu.
Slika 6 prikazuje inhibiciju Wnt signalizacije u ćelijama karcinoma, kako je otkriveno inhibicijom relativne ekspresije Axin2 iRNK (Slika 6A) i proliferaciju ćelija (Slika 6B), kako je otkriveno smanjenim procentom (%) vijabilnih ćelija, nakon tretmana sa tri za poluživot produžena biparatopska LRP5/LRP6 unakrsno reaktivnog VHH konstrukta (finalna koncentracija 1 mM) i tretiranjem sa 802T, u poređenju sa F013500571 i netretiranim (kontrolnim) ćelijama (na dijagramu levo / na dijagramu desno na Slici 6B); prikazane su krive doza-odgovor za lečenje sa jednim za poluživot produženim biparatopskim LRP5/LRP6 konstruktom (Slika 6C) i 802T (Slika 6D).
Slika 7 prikazuje in vivo efikasnost za poluživot produženih biparatopskih LRP5/LRP6 unakrsno reaktivnih VHH konstrukta (F013500571 na Slici 7A i F013500720 na Slici 7B) i za Knob HC YW210.09 (Slika 7C) u modelima tumora izazvanih sa Wnt (MMTV-Wnt1 ksenograft model).
Slika 8 prikazuje inhibiciju Wnt puta u tumorima lečenim sa za poluživot produženim biparatopskimh LRP5/LRP6 unakrsno reaktivnih VHH konstrukata F013500571 i F013500720, kako je detektovano smanjenjem ekspresije Axin2 iRNK u odnosu na kontrolnu grupu.
Slika 9 prikazuje efekat inhibicije Wnt3a vođene signalizacije na oslobađanje proinflamatornih ćelija citokina TNFalfa od strane dendritičnih ćelija (Slika 9A) i efekat na aktivaciju T-ćelija, kako je utvrđeno uz pomoć oslobađanja gama interferona (Slika 9B) nakon tretmana sa za poluživot produženim biparatopskim LRP5/LRP6 unakrsno reaktivnim VHH konstruktima. Svaki simbol predstavlja jedinstvenog donora dendritične ćelije (DC). Prikazani podaci su normalizovani na TNFalfa nivoe kod netretirane kontrole (Slika 9A) i svaki simbol predstavlja jedinstveni donatorski par za DC i T ćelije (Panel B).
DETALJAN OPIS PRONALASKA
Definicije
Gore navedeni i drugi aspekti i realizacije iz pronalaska postaće jasni iz daljeg opisa ovde, u kome:
a) Ukoliko nije drugačije naznačeno ili definisano, svi upotrebljeni pojmovi imaju svoje uobičajeno značenje u tehnici, što će biti jasno stručnjaku. Na primer, upućuju se na standardne priručnike, kao što su Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2nd Ed.), VoIs.1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Lewin, "Genes IV", Oxford University Press, New York, (1990), and Roitt et al., "Immunology" (2<nd>Ed.), Gower Medical Publishing, London, New York (1989),, kao i na opštu pozadinu tehnike ovde citiranu. Dalje, ukoliko nije drugačije naznačeno, svi postupci, koraci, tehnike i manipulacije koji nisu posebno detaljno opisani mogu se izvoditi i biti izvedeni na način poznat per se, što će stručnjaku biti jasno. Na primer, ponovo se upućuje na standardne priručnike, na opštu pozadinu tehnike koja je prethodno navedena i na dalje reference koje su tamo citirane.
b) Ukoliko nije drugačije naznačeno, izrazi „imunoglobulin“ i „imunoglobulinska sekvenca“ - bilo da se ovde koriste za označavanje antitela teškog lanca ili konvencionalnog antitela sa 4 lanca - koriste se kao opšti izrazi koji uključuju i antitelo pune veličine, njegove individualne lance, kao i sve njihove delove, domene ili njihove fragmente (uključujući, ali bez ograničenja, domene koji vežu antigen ili fragmente kao što su VHH domeni, odnosno VH/VL domeni, respektivno). Pored toga, termin „sekvenca“ kako se ovde koristi (na primer u terminima kao što su „ imunoglobulinska sekvenca“, „sekvenca antitela“, „sekvenca (pojedinačnog) varijabilnog domena“, „VHH sekvenca“ ili „sekvenca proteina“), generalno treba da bude razumevana tako da uključuje i relevantnu aminokiselinsku sekvencu, kao i sekvence nukleinske kiseline ili nukleotidne sekvence koje iste kodiraju, osim ako kontekst ne zahteva ograničenije tumačenje;
c) Termin "domen" (polipeptida ili proteina) kako se ovde koristi odnosi se na presavijenu proteinsku strukturu koja ima sposobnost da zadrži svoju tercijarnu strukturu nezavisno od ostatka proteina. Generalno, domeni su odgovorni za diskretna funkcionalna svojstva proteina i u mnogim slučajevima mogu da se dodaju, uklone ili prenesu na druge proteine bez gubitka funkcije ostatka proteina i/ili domena.
d) Termin "imunoglobulinski domen" kako se ovde koristi odnosi se na globularni region lanca antitela (kao što je na pr. lanac konvencionalnog antitela sa 4 lanca ili antitela teškog lanca) ili na polipeptid koji se u suštini sastoji od takvog globularnog regiona. Imunoglobulinski domeni su karakteristični po tome što zadržavaju imunoglobulinski nabor karakterističan za molekule antitela, koji se sastoji od dvoslojnog sendviča od oko 7 antiparalelnih beta-lanaca raspoređenih u dva beta-lista, opciono stabilizovana konzervisanom disulfidnom vezom.
e) Izraz "imunoglobulinski varijabilni domen", kako se ovde koristi, označava imunoglobulinski domen, koji se u osnovi sastoji od četiri "okvirna regiona", koji su u struci navedeni, a ovde dalje kao "okvirni region 1" ili "FR1"; kao „okvirni region 2“ ili
1
„FR2“; kao „okvirni region 3“ ili „FR3“; i kao „okvirni region 4“, odnosno „FR4“, respektivno; čiji okvirni regioni su prekinuti sa tri „regiona koji određuju komplementarnost“ ili „CDR-ovi“, kako se u struci nazivaju i ovde dalje kao „region koji određuje komplementarnost 1“ ili „CDR1“; kao „region koji određuje komplementarnost 2“ ili „CDR2“; i kao „region 3 koji određuje komplementarnost“, odnosno „CDR3“. Dakle, opšta struktura ili sekvenca varijabilnog imunoglobulinskog domena može se naznačiti na sledeći način: FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4. Imunoglobulinski varijabilni domen(i) je taj koji daje antitelu specifičnost za antigen tako što nosi mesto vezivanja antigena.
f) Izraz "imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen" kako se ovde koristi označava imunoglobulinski varijabilni domen koji je sposoban da se specifično veže za epitop antigena bez uparivanja sa dodatnim imunoglobulinskim varijabilnim domenom. Jedan primer imunoglobulinskih pojedinačnih varijabilnih domena u značenju ovog pronalaska su „domen antitela“, poput imunoglobulinskih pojedinačnih varijabilnih domena VH i VL (VH domeni i VL domeni). Još jedan važan primer imunoglobulinskih pojedinačnih varijabilnih domena su „VHH domeni“ (ili jednostavno „VHH“) od kamelida, kako je ovde definisano.
S obzirom na gornju definiciju, antigen-vezujući domen konvencionalnog antitela sa 4 lanca (poput IgG, IgM, IgA, IgD ili IgE molekula; koji su poznati u struci) ili Fab fragmenta, F(ab')2 fragment, Fv fragment kao što je disulfidno povezan Fv ili scFv fragment ili dijatelo (sve poznato u struci) izvedeno iz takvog konvencionalnog antitela sa 4 lanca, obično se ne bi smatrali imunoglobulinskim pojedinačnim varijabilnim domenima, jer, u ovim slučajevima, do vezivanja za odgovarajući epitop antigena obično ne bi došlo sa jednim (pojedinačnim) imunoglobulinskim domenom, već sa parom (pridruženim) imunoglobulinskih domena, kao što su varijabilni domeni lakog i teškog lanca, tj. VH-VL par imunoglobulinskih domena, koji se zajednički vezuju za epitop određenog antigena.
f1) „VHH domeni“, takođe poznati kao VHH, VHH domeni, VHH fragmenti antitela i VHH antitela, prvobitno su opisani kao antigen vezujući imunoglobulinski (varijabilni) domen iz „antitela teškog lanca“ (tj. „antitela lišenih lakih lanaca“ ; Hamers-Casterman C, Atarhouch T, Muyldermans S, Robinson G, Hamers C, Songa EB, Bendahman N, Hamers R.: "Naturally occurring antibodies devoid of light chains"; Nature 363, 446-448 (1993)). Termin „VHH domen“ je izabran da bi se razlikovali ovi varijabilni domeni od varijabilnih domena teškog lanca koji su prisutni u konvencionalnim antitelima sa 4 lanca (koja su ovde označena kao „VHdomeni“ ili „VH domeni“) i od varijabilnih domena lakog lanca koji su prisutni u konvencionalnim antitelima sa 4 lanca (koja su ovde označena kao "VLdomeni" ili "VL domeni"). VHH domeni mogu se specifično vezati za epitop bez nekog dodatnog antigen vezujućeg domena (za razliku od VH ili VL domena u konvencionalnom antitelu sa 4 lanca, u kom slučaju epitop je prepoznat od strane VL domena zajedno sa VH domenom). VHH domeni su male, robusne i efikasne jedinice za prepoznavanje antigena formirane od pojedinačnog domena imunoglobulina.
U kontekstu ovog pronalaska, pojmovi VHH domen, VHH, VHH domen, VHH fragment antitela, VHH antitelo, kao i „Nanobodi®“ i „Nanobodi® domen“ („Nanobodi“ je zaštitni znak kompanije Ablynx N.V.; Ghent; Belgium) koriste se naizmenično i predstavljaju predstavnike imunoglobulinskih pojedinačnih varijabilnih domena (koji imaju strukturu: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 i specifično se vezuju za neki epitop bez potrebe za prisustvom drugog imunoglobulinskog varijabilnog domena), a koji se takođe mogu razlikovati od VH domena takozvanim „ostacima žiga“ kako je definisano u na pr. WO2009/109635, slika 1.
Aminokiselinski ostaci VHH domena numerisani su u skladu sa opštim numerisanjem za VHdomene dato od srane Kabat et al. ("Sequence of proteins of immunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No.91), kako se primenjuje na VHH domene iz Kameleida, kao što je prikazano na pr. na Slici 2 iz Riechmann and Muyldermans, J. Immunol. Methods 231, 25-38 (1999). U skladu sa ovom numeracijom,
- FR1 sadrži aminokiselinske ostatke na pozicijama 1-30,
- CDR1 sadrži aminokiselinske ostatke na pozicijama 31-35,
- FR2 sadrži aminokiseline na pozicijama 36-49,
- CDR2 sadrži aminokiselinske ostatke na pozicijama 50-65,
- FR3 sadrži aminokiselinske ostatke na pozicijama 66-94,
- CDR3 sadrži aminokiselinske ostatke na pozicijama 95-102 i
- FR4 sadrži aminokiselinske ostatke na pozicijama 103-113.
Međutim, treba napomenuti da - kao što je u struci dobro poznato za VHdomene i za VHH domene - ukupan broj aminokiselinskih ostataka u svakom od CDR-a može varirati i ne mora odgovarati ukupnom broju naznačenih aminokiselinskih ostataka u Kabat numeraciji (to jest, jedan ili više položaja u skladu sa Kabat numeracijom ne smeju biti
1
zauzeti u stvarnoj sekvenci ili stvarna sekvenca može sadržavati više aminokiselinskih ostataka od broja dozvoljenog u Kabat numeraciji). To znači da, generalno, numerisanje u skladu sa Kabat može ili ne mora odgovarati stvarnom numerisanju aminokiselinskih ostataka u stvarnoj sekvenci.
Alternativni postupci za numerisanje aminokiselinskih ostataka VHdomena, koji se takođe mogu primeniti na analogan način na VHH domene, poznati su u struci. Međutim, u ovom opisu, zahtevima i slikama slediće se numerisanje u skladu sa Kabat i primenjivati na VHH domene kako je gore opisano, ukoliko nije drugačije naznačeno.
Ukupan broj aminokiselinskih ostataka u VHH domenu obično će biti u opsegu od 110 do 120, često između 112 i 115. Međutim, treba napomenuti da kraće i duže sekvence takođe mogu biti pogodne za ovde opisane svrhe.
Dalje strukturne karakteristike i funkcionalne osobine VHH domena i polipeptida koji ih sadrže mogu se rezimirati na sledeći način:
VHH domeni (koji su po prirodi „dizajnirani“ da se funkcionalno vezuju za antigen bez prisustva i bez ikakve interakcije sa varijabilnim domenom lakog lanca) mogu da funkcionišu kao pojedinačna, relativno mala, funkcionalna antigen vezujuća strukturna jedinica, domen ili polipeptid. Ovo razlikuje VHH domene od VH i VL domena konvencionalnih antitela sa 4 lanca, koja sama po sebi uglavnom nisu pogodna za praktičnu primenu kao pojedinačni antigen-vezujući proteini ili imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domeni, ali ih treba kombinovati u nekom ili drugom obliku da se obezbedi antigen vezujuća funkcionalna jedinica (kao na primer u konvencionalnim fragmentima antitela kao što su Fab fragmenti; u scFv's, koji se sastoje od VH domena kovalentno povezanog sa VL domenom).
Zbog ovih jedinstvenih svojstava, upotreba VHH domena - bilo samostalno ili kao deo većeg polipeptida - nudi niz značajnih prednosti u odnosu na upotrebu konvencionalnih VH i VL domena, scFv ili fragmenata konvencionalnih antitela (kao što su Fab- ili F(ab') 2-fragmenti):
- samo jedan domen je potreban da veže antigen sa visokim afinitetom i sa velikom selektivnošću, tako da nema potrebe da postoje dva odvojena domena, niti da se osigura
1
da su ova dva domena prisutna u pravoj prostornoj konformaciji i konfiguraciji (tj. kroz upotrebu posebno dizajniranih povezivača, kao kod scFv-a);
- VHH domeni se mogu eksprimirati iz jednog gena i ne zahtevaju post-translaciono presavijanje ili modifikacije;
- VHH domeni se lako mogu inženjerski transformisati u multivalentne i multispecifične formate (kao što je ovde dalje objašnjeno);
- VHH domeni su visoko rastvorljivi i nemaju tendenciju da se agregiraju (kao kod antigen vzujućih domena izvedenih iz miševa i koje opisuje Ward et al., Nature 341: 544-546 (1989));
- VHH domeni su visoko stabilni na toplotu, pH, proteaze i druga sredstva za denaturaciju ili na uslove i, prema tome, mogu se pripremiti, skladištiti ili transportovati bez upotrebe rashladne opreme, što donosi uštedu troškova, vremena i životne sredine; - VHH domeni se lako i relativno jeftino pripremaju, čak i na skali potrebnoj za proizvodnju. Na primer, VHH domeni i polipeptidi koji ih sadrže mogu se proizvesti korišćenjem mikrobiološke fermentacije (na pr. kako je dalje opisano u nastavku) i ne zahtevaju upotrebu sistema ekspresije iz sisara, kao na primer kod konvencionalnih fragmenata antitela;
- VHH domeni su relativno mali (približno 15 kDa ili 10 puta manji od konvencionalnog IgG) u poređenju sa konvencionalnim antitelima sa 4 lanca i njihovim antigen-vezujućim fragmentima, pa prema tome
- pokazuju visoku(ši) penetraciju u tkiva i
- mogu se primenjivati u većim dozama
nego takva konvencionalna antitela sa 4 lanca i njihovi fragmenti koji vezuju antigen; - VHH domeni mogu pokazivati takozvana svojstva vezivanja za šupljinu (između ostalog zbog njihove proširene CDR3 petlje, u poređenju sa konvencionalnim VH domenima) i stoga mogu takođe pristupiti ciljevima i epitopima koji nisu dostupni konvencionalnim antitelima sa 4 lanca i njihovim antigen-vezujućim fragmentima.
Postupci za dobijanje VHH domena koji se vezuju za određeni antigen ili epitop su opisani ranije, na pr. u WO2006/040153 i WO2006/122786. Kao što je tamo takođe detaljno opisano, VHH domeni izvedeni iz kameleida mogu se „humanizovati“ zamenom jednog ili više aminokiselinskih ostataka u aminokiselinskoj sekvenci originalne VHH sekvence jednim ili više aminokiselinskih ostataka koji se javljaju na odgovarajućem položaju(ima) u VH domenu iz konvencionalnog antitela sa 4 lanca kod čoveka.
Humanizovani VHH domen može da sadrži jednu ili više potpuno humanih okvirnih regiona sekvenci i, u još konkretnijem izvođenju, može sadržati sekvence humanih
1
okvira regiona izvedenih iz DP-29, DP-47, DP-51 ili njihovih delova, opciono kombinovanih sa JH sekvencom, kao što je JH5.
f2) „Domen antitela“, takođe poznati kao „Dab“, „Domeni Antitela“ i „dAbs“ (izrazi „Domeni Antitela“ i „dAbs“kao zaštitne znakove koristi grupa kompanija GlaxoSmithKline) što je opisano u na pr. Ward, E.S., et al.: "Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin varijabilni domeni secreted from Escherichia coli"; Nature 341: 544-546 (1989); Holt, L.J. et al.: "Domen antibodies: proteins for therapy"; TRENDS in Biotechnology 21(11): 484-490 (2003); i u WO2003/002609.
Domeni antitela u suštini odgovaraju VH ili VL domenima ne-kamiloidnih sisara, naročito humanim antitelima sa 4 lanca. Da bi se epitop povezao kao pojedinačni antigen vezujući domen, tj. bez uparivanja sa VL odnosno VH domenom, potreban je specifičan izbor za takva svojstva vezivanja antigena, na pr. korišćenjem biblioteka sekvenci humanih pojedinačnih VH ili VL domena.
Domeni antitela imaju, poput VHH, molekulsku težinu od približno 13 do približno 16 kDa i, ako su izvedena iz potpuno humane sekvence, ne zahtevaju humanizaciju, za na pr. terapeutsku upotrebu kod ljudi. Kao i u slučaju VHH domena, oni su dobro eksprimirani i u prokariotskim ekspresionim sistemima, pružajući značajno smanjenje ukupnih proizvodnih troškova.
Domeni antitela, kao i VHH domeni, mogu biti podvrgnuti sazrevanju afiniteta uz pomoć uvođenja jedne ili više alteracija u aminokiselinskoj sekvenci iz jednog ili više CDR-ova, gde alteracija rezultira poboljšanim afinitetom rezultujućeg imunoglobulinskog pojedinačnog varijabilnog domena za njegov odgovarajući antigen, u poređenju sa odgovarajućim matičnim molekulom. Afinitetno sazreli imunoglobulinski pojedinačni varijabilni molekuli domena iz pronalaska mogu se pripremiti postupcima poznatim u struci, na primer, kako je opisano u Marks et al., 1992, Biotechnology 10:779-783, or Barbas, et al., 1994, Proc. Nat. Acad. Sci, USA 91: 3809-3813.; Shier et al., 1995, Gene 169:147-155; Yelton et al., 1995, Immunol.155: 1994-2004; Jackson et al., 1995, J. Immunol.154(7):3310-9; and Hawkins et al., 1992, J. MoI. Biol.226(3): 889896; KS Johnson and RE Hawkins, "Affinity maturation of antibodies using phage display", Oxford University Press 1996.
f3) Dalje, stručnoj osobi će takođe biti jasno da je moguće “graftovati” jedan ili više od gore navedenih CDR-a na druge „skafolde“, uključujući, ali ne ograničavajući se na
1
humane skafolde ili neimunoglobulinske skafolde. Pogodni skafoldi i tehnike za takvo CDR graftovanje su poznate u tehnici.
g) Termini "epitop" i "antigena determinanta", koji se mogu koristiti naizmenično, odnose se na deo makromolekula, kao što je polipeptid, koji prepoznaju antigen vezujući molekuli, kao što su konvencionalna antitela ili polipeptidi iz pronalaska, a naročito uz pomoć antigen vezujućeg mesta pomenutih molekula. Epitopi definišu minimum mesta vezivanja za imunoglobulin i tako predstavljaju ciljano mesto specifičnosti imunoglobulina.
Deo antigen vezujućeg molekula (kao što je konvencionalno antitelo ili polipeptid prema pronalasku) koji prepoznaje epitop naziva se paratop.
h) Termin "biparatopski" (antigen) vezujući molekul ili "biparatopski" polipeptid, kako se ovde koristi, treba da podrazumeva polipeptid koji sadrži prvi imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen i drugi imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen, kako je ovde definisano, pri čemu su ova dva varijabilna domena sposobna da se vežu za dva različita epitopa jednog antigena, gde epitopi obično nisu istovremeno povezani jednim monospecifičnim imunoglobulinom, kao što je na pr. konvencionalno antitelo ili jedan imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen. Biparatopski polipeptidi u skladu sa pronalaskom sastoje se od varijabilnih domena koji imaju različite epitopske specifičnosti i ne sadrže međusobno komplementarne parove promenljivog domena koji se vezuju za isti epitop. Stoga se ne takmiče jedni sa drugima za vezivanje za LRP5 ili LRP6.
i) Polipeptid (kao što je imunoglobulin, antitelo, imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen, polipeptid pronalaska ili generalno antigen vezujući molekul ili njegov fragment) koji se može „vezati“, „vezati za“, „specifično vezati“, ili „specifično se vezuje za“, koji „ima afinitet za“ i/ili koji „ima specifičnost za“ određeni epitop, antigen ili protein (ili za bar jedan njihov deo, fragment ili epitop) kaže se da je „protiv“ ili "usmeren protiv" navedenog epitopa, antigena ili proteina ili je "vezujući" molekul u odnosu na takav epitop, antigen ili protein.
k) Generalno, izraz "specifičnost" odnosi se na broj različitih vrsta antigena ili epitopa za koje se određeni antigen vezujući molekul ili antigen vezujući protein (kao što su imunoglobulin, antitelo, imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen ili polipeptid iz pronalaska) može vezati. Specifičnost antigen vezujućeg proteina može se odrediti na
1
osnovu njegovog afiniteta i/ili avidnosti. Afinitet, predstavljen konstantom ravnoteže za disocijaciju antigena sa antigen vezujućim proteinom (KD), je mera za snagu vezivanja između epitopa i antigen vezujućeg mesta na antigen vezujućem proteinu: što je manja vrednost KD, to je jača snaga vezivanja između epitopa i antigen vezujućeg molekula (alternativno, afinitet se takođe može izraziti kao konstanta afiniteta (KA), koja je jednaka 1/KD). Kao što će stručnoj osobi biti jasno (na primer na osnovu daljeg otkrića ovde), afinitet se može odrediti na način poznat per se, u zavisnosti od specifičnog antigena od interesa. Avidnost je mera jačine vezivanja između antigen vezujućeg molekula (kao što je imunoglobulin, antitelo, imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen ili polipeptid prema pronalasku) i odgovarajućeg antigena. Avidnost je povezana i sa afinitetom između epitopa i njegovog antigen vezujućeg mesta na antigen vezujućem molekulu i sa brojem odgovarajućih mesta za vezivanje koja su prisutna na antigen vezujućem molekulu.
Obično, antigen vezujući proteini (kao što su polipeptidi iz pronalaska) vezuju se konstantom disocijacije (KD) od 10E-5 do 10E-14 mola/litar (M) ili manje, a poželjno 10E-7 do 10E-14 mola/litar (M) ili manje, još poželjnije 10E-8 do 10E-14 mola/litar, a još poželjnije 10E-11 do 10E-13 (mereno na pr. u Kineka testu; poznatom u struci), i/ili sa konstantom asocijacije (KA) od najmanje 10E7 ME-1, poželjno najmanje 10E8 ME-1, još poželjnije najmanje 10E9 ME-1, kao što je najmanje 10E11 ME-1. Generalno se smatra da svaka vrednost KDveća od 10E-4 M ukazuje na nespecifično vezivanje. Poželjno je da se polipeptid iz pronalaska veže za željeni antigen sa KDmanjim od 500 nM, poželjno manjim od 200 nM, poželjnije manjim od 10 nM, kao što je manje od 500 pM. Specifično vezivanje antigen vezujućeg proteina za antigen ili epitop može se odrediti na bilo koji pogodan način per se, uključujući, na primer, ovde opisane testove, Scatchard-ovu analizu i/ili kompetitivne testove vezivanja, kao što su radioimunoanalize (RIA), enzim imunoanalize (EIA) i sendvič testovi kompeticije, kao i njihove različite varijante poznate per se u tehnici.
l) Izraz „unakrsno reaktivan“ u vezi sa vezujućim molekulima koji su sposobni da se vežu za LRP5, kao i za LRP6 („LRP5/LRP6 unakrsno reaktivan“), podrazumeva da se takvi vezujući molekuli mogu specifično vezati za epitop koji se nalazi u molekulu LRP5, a može se, alternativno, takođe specifično vezati za epitop koji se sadrži u molekulu LRP6. Obično takva unakrsna reaktivnost može nastati u slučaju da epitopi različitih proteina vezanih takvim vezujućim molekulom imaju sličnu strukturu i/ili sekvencu, na pr.
2
predstavljaju konzervisane epitope, na pr. dele se između proteina koji pripadaju istoj porodici proteina (na pr. LRP5 i LRP6, koji pripadaju porodici LRP proteina).
m) Ostaci aminokiselina će biti naznačeni u skladu sa standardnim kodom od tri slova ili od jednog slova aminokiseline, kao što je opšte poznato i dogovoreno u struci. Kada se upoređuju dve sekvence aminokiselina, termin "razlika u aminokiselinama" odnosi se na insercije, delecije ili supstitucije naznačenog broja aminokiselinskih ostataka na položaju referentne sekvence, u poređenju sa drugom sekvencom. U slučaju supstitucije(a), takva supstitucija(e) će po mogućnosti biti konzervativna supstitucija(e) aminokiseline, što znači da se aminokiselinski ostatak zamenjuje drugim aminokiselinskim ostatkom slične hemijske strukture i koji ima mali ili suštinski nikakav uticaj na funkciju, aktivnost ili druga biološka svojstva polipeptida. Takve konzervativne supstitucije aminokiselina su dobro poznate u struci, na primer iz WO 98/49185, gde su konzervativne supstitucije aminokiselina poželjno supstitucije u kojima je jedna aminokiselina u okviru sledećih grupa (i) - (v) supstituisana drugim aminokiselinskim ostatkom u okviru iste grupe: (i) mali alifatski, nepolarni ili blago polarni ostaci: Ala, Ser, Thr, Pro i GIy; (ii) polarni, negativno naelektrisani ostaci i njihovi (nenaelektrisani) amidi: Asp, Asn, GIu i GIn; (iii) polarni, pozitivno naelektrisani ostaci: His, Arg i Lys; (iv) veliki alifatski, nepolarni ostaci: Met, Leu, Ile, VaI i Cys; i (v) aromatični ostaci: Phe, Tyr i Trp. Naročito poželjne konzervativne supstitucije aminokiselina su sledeće:
Ala u GIy ili u Ser;
Arg u Lys;
Asn u GIn ili u His;
Asp u GIu;
Cys u Ser;
GIn u Asn;
GIu u Asp;
GIy u Ala ili u Pro;
His u Asn ili u GIn;
Ile u Leu ili u VaI;
Leu u Ile ili u VaI;
Lys u Arg, u GIn ili u GIu;
Met u Leu, u Tyr ili u Ile;
Phe u Met, u Leu ili u Tyr;
Ser u Thr;
Thr u Ser;
Trp u Tyr;
Tyr u Trp ili u Phe;
VaI u Ile ili u Leu.
n) Smatra se da je molekul nukleinske kiseline ili polipeptida „(u) suštinski izolovan (oblik)“ - na primer, u poređenju sa prirodnim biološkim izvorom i/ili reakcionim medijumom ili kultivacionim medijumom iz kojeg je dobijen - kada je odvojen od najmanje jedne druge komponente sa kojom je obično povezan u navedenom izvoru ili medijumu, kao što je druga nukleinska kiselina, drugi protein/polipeptid, druga biološka komponenta ili makromolekul ili bar jedan kontaminant, nečistoća ili sporedna komponenta. Posebno, molekul nukleinske kiseline ili polipeptida smatra se „suštinski izolovanim“ kada je prečišćen najmanje 2 puta, posebno najmanje 10 puta, tačnije najmanje 100 puta i do 1000 puta ili više. Molekul nukleinske kiseline ili polipeptida koji je "u suštinski izolovanom obliku" je poželjno u osnovi homogen, što se određuje upotrebom odgovarajuće tehnike, kao što je pogodna hromatografska tehnika, kao što je elektroforeza na poliakrilamid gelu;
o) „Identitet sekvence“ između na pr. dve sekvence imunoglobulinskog pojedinačnog varijabilnog domena ukazuju na procenat aminokiselina koje su identične između ove dve sekvence. Može se izračunati ili utvrditi kako je opisano u paragrafu f) na stranicama 49 i 50 iz WO2008/020079. „Sličnost sekvenci“ označava procenat aminokiselina koje su ili identične ili predstavljaju konzervativne supstituente aminokiselina.
Ciljana specifiþnost
Polipeptidi iz pronalaska imaju specifičnost za LRP5, kao i za LRP6, na taj način što sadrže imunoglobulinske pojedinačne varijabilne domene, specifično vezane za epitope koji su uključeni u oba ova molekula (LRP5/LRP6 molekuli sa unakrsno reaktivnim vezivanjem).
Molekuli iz pronalaska će se vezati za humane oblike LRP5 i LRP6, a poželjno i za odgovarajuće pandane iz drugih vrsta značajnih za razvoj lekova, tj. LRP5 i LRP6 iz cinomolga i miša.
Polipeptidi iz pronalaska
U svom najširem smislu, pronalazak pruža nova farmakološki aktivne agense za lečenje bolesti karcinoma. Agensi u skladu sa pronalaskom pripadaju novoj klasi vezujućih molekula, naime LRP5/LRP6 unakrsno reaktivni biparatopski polipeptidi, koji sadrže dva ili više imunoglobulinskih pojedinačnih varijabilnih domena koji se vezuju za LRP5 i/ili LRP6 na različitim epitopima. Termini „unakrsna reaktivni“ i „biparatopski“ objašnjeni su gore, tako da se LRP5/LRP6 unakrsno reaktivni biparatopski molekuli mogu definisati kao molekuli koji se mogu vezati za LRP5 na dva različita epitopa sadržana u LRP5 proteinu i koji takođe mogu da se vežu za LRP6 na odgovarajuća dva epitopa sadržana u LRP6 proteinu.
Još specifičnije, polipeptidi iz pronalaska uključuju:
- prvi imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen koji je sposoban da se specifično veže za LRP5 kao i za LRP6 (LRP5/LRP6 unakrsno reaktivni) putem epitopa / na način koji rezultira inhibicijom signalnog puta Wnt1, tako da je inhibirana sa Wnt1 vođena transkripcija ciljnog gena i
- drugi imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen koji je sposoban da se specifično veže za LRP5, kao i za LRP6 (LRP5/LRP6 unakrsna reaktivnost) preko epitopa / na način koji rezultira inhibicijom signalnog puta Wnt3a, tako da je inhibirana sa Wnt3a vođena transkripcija ciljnog gena.
Zbog dva imunoglobulinska pojedinačna varijabilna domena prisutna u takvom polipeptidu, pri čemu su dva domena vezana za različite epitope (Wnt1 / Wnt3a vezani za signalizaciju), ovi molekuli su biparatopski vezujući molekuli. Ovaj način biparatopskog vezivanja šematski je prikazan na Slici 1.
U tom kontekstu, treba napomenuti da se pretpostavlja da se polipeptidi iz pronalaska mogu vezati za jedan pojedinačni molekul LRP5 ili LRP6 preko oba njegova LRP5/LRP6 vezujuća domena, kao što je prikazano na Slici 1 (režim intramolekularnog vezivanja). Međutim, mogu se pojaviti i drugi načini vezivanja.
Na kraju, pretpostavlja se da su polipeptidi iz pronalaska sposobni da se takmiče sa DKK1 - prirodnim ligandom LRP5 i LRP6, i ometajući signalizaciju Wnt1 i Wnt3a - za vezivanje za LRP5 i LRP6, čime inhibiraju Wnt1 kao i Wnt3a signalni put. Međutim, takođe ovu teoriju ne treba shvatiti kao ograničenje obima pronalaska.
Preciznije, polipeptidi u skladu sa pronalaskom specifično se vezuju za LRP5 ili LRP6, pri čemu takvi polipeptidi sadrže prvi imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen (a)
2
izabran iz grupe imunoglobulinskih pojedinačnih varijabilnih domena (i) do (iii) definisanih tako što sadrže sledeće CDR sekvence:
(i):
CDR1: TYTVG (= SEKV ID BR:1)
CDR2: AIRRRGSSTYYADSVKG (= SEKV ID BR:2)
CDR3: DTRTVALLQYRYDY (= SEKV ID BR:3)
[= CDRovi iz Wnt1-333E06mod domena]
(ii):
CDR1: SYAMG (= SEKV ID BR:4)
CDR2: AIRRSGRRTYYADSVKG (= SEKV ID BR:5)
CDR3: ARRVRSSTRYNTGTWWWEY (= SEKV ID BR:6)
[= CDRovi iz Wnt1-333G06 domena]
(iii):
CDR1: RYTMG (= SEKV ID BR:7)
CDR2: AIVRSGGSTYYADSVKG (= SEKV ID BR:8)
CDR3: DRRGRGENYILLYSSGRYEY (= SEKV ID BR:9)
[= CDRovi iz Wnt1-332D03mod domena],
i drugi imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen (b) izabran iz grupe imunoglobulinskih pojedinačnih varijabilnih domena (iv) i (v) definisanih tako što sadrže sledeće CDR sekvence:
(iv):
CDR1: SYAMG (= SEKV ID BR:10)
CDR2: AISWSGGSTYYADSVKG (= SEKV ID BR:11)
CDR3: SPIPYGSLLRRRNNYDY (= SEKV ID BR:12)
[= CDRovi iz Wnt3a-093A01 domena]
(v):
CDR1: SYAMG (= SEKV ID BR:13)
CDR2: AISWRSGSTYYADSVKG (= SEKV ID BR:14)
CDR3: DPRGYGVAYVSAYYEY (= SEKV ID BR:15)
[= CDRovi iz Wnt3a-367B10 domena].
Upotreba izraza „prvi“ i „drugi“ u odnosu na takve imunoglobulinske pojedinačne varijabilne domene ima za cilj samo da ukaže da su ti domeni različiti domeni, jer će uključivati različite CDR sekvence i vezaće se za različite epitope. Međutim, neće se razumeti da se ovi termini odnose na tačan redosled ili sekvencu domena unutar takvog polipeptidnog lanca. Drugim rečima, gornji imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domeni (a) i (b) mogu biti raspoređeni po redosledu (a) - (b) ili po redosledu (b) - (a) u okviru takvog polipeptida prema pronalasku.
Izraz „specifično vezan za LRP5 ili LRP6“ namerava da znači da su imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domeni (a) i (b) unakrsno reaktivni u odnosu na LRP5 i LRP6. Naravno, svojstva vezivanja takvih molekula određena su njihovom (CDR) sekvencom, tako da je karakteristika „specifičnog vezivanja za LRP5 ili LRP6“ navedena gore i u zahtevima namenjena samo radi ilustracije korisnosti pronalaska, a ne i da ograniči obim ovog pronalaska.
Imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domeni obično se u osnovi sastoje od četiri okvirna regiona (FR1 do FR4, respektivno) i tri regiona koja određuju komplementarnost (CDR1 do CDR3, respektivno). Da bi bili locirani unutar jednog polipeptida, ili polipeptidnog lanca, navedeni prvi i pomenuti drugi imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domeni treba da budu kovalentno povezani, bilo direktno ili pomoću veznog peptida.
Na taj način, opšta struktura molekula iz pronalaska takođe može biti prikazana na sledeći način:
FR(a)1 - CDR(a)1 - FR(a)2 - CDR(a)2 - FR(a)3 - CDR(a)3 - FR(a)4 – [vezni peptid] -FR(b)1 - CDR(b)1 - FR(b)2 - CDR(b)2 - FR(b)3 - CDR(b)3 - FR(b)4
gde
FR(a) označava okvirni region prvog imunoglobulinskog pojedinačnog varijabilnog domena,
FR(b) označava okvirni region drugog imunoglobulinskog pojedinačnog varijabilnog domena,
CDR(a) označava CDR prvog imunoglobulinskog pojedinačnog varijabilnog domena, CDR(b) označava CDR drugog imunoglobulinskog pojedinačnog varijabilnog domena, [vezni peptid] označava vezni peptid koji opciono može biti prisutan,
pri čemu CDR imaju sekvence kao što je gore navedeno.
Još jednom, treba razumeti da se (a) i (b) mogu razmenjivati, tj. da molekuli koji imaju opštu strukturu
FR(b)1 - CDR(b)1 - FR(b)2 - CDR(b)2 - FR(b)3 - CDR(b)3 - FR(b)4 – [vezni peptid] -FR(a)1 - CDR(a)1 - FR(a)2 - CDR(a)2 - FR(a)3 - CDR(a)3 - FR(a)4
2
takođe trebaju biti obuhvaćeni ovim pronalaskom.
Vezni peptid opciono sadrži ili se sastoji od trećeg domena, kao što je na pr. albumin vezujući imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen, kao što je Alb11 domen, koji sadrži sledeće CDRove:
CDR(Alb11)1: SFGMS (= SEKV ID BR:16)
CDR(Alb11)2: SISGSGSDTLYADSVKG (= SEKV ID BR:17)
CDR(Alb11)3: GGSLSR (= SEKV ID BR:18)
Ovo rezultira grupom polipeptida iz pronalaska koji imaju sledeću opštu strukturu:
FR(a)1 - CDR(a)1 - FR(a)2 - CDR(a)2 - FR(a)3 - CDR(a)3 - FR(a)4 – [vezni peptid] -FR(Alb11)1 - CDR(Alb11)1 - FR(Alb11)2 - CDR(Alb11)2 - FR(Alb11)3 - CDR(Alb11)3 -FR(Alb11)4 - [vezni peptid] - FR(b)1 - CDR(b)1 - FR(b)2 - CDR(b)2 - FR(b)3 - CDR(b)3 -FR(b)4.
Još jednom, redosled tri imunoglobulinska pojedinačna varijabilna domena (a), (b) i Alb11 nije fiksiran već polipeptidi u kojima su navedeni domeni poređani po redosledu: (b) – Alb11 – (a)
takođe trebaju biti obuhvaćeni.
Pored toga, polipeptidi koji imaju domen Alb11 na N- ili C-terminalnom kraju polipeptida (na pr. Alb11 - (a) - (b), Alb11 - (b) - (a), (a) - (b) - Alb11, ili (b) - (a) - Alb11) takođe trebaju biti obuhvaćeni pronalaskom
U tri poželjne realizacije, polipeptidi iz pronalaska uključuju imunoglobulinske pojedinačne varijabilne domene definisane na sledeći način:
Prva poželjna relizacija: Polipeptidi koji sadrže prvi imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen koji ima sledeću CDR sekvencu:
CDR1: TYTVG (= SEKV ID BR:1)
CDR2: AIRRRGSSTYYADSVKG (= SEKV ID BR:2)
CDR3: DTRTVALLQYRYDY (= SEKV ID BR:3)
i drugi imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen koji ima sledeću CDR sekvencu:
CDR1: SYAMG (= SEKV ID BR:10)
CDR2: AISWSGGSTYYADSVKG (= SEKV ID BR:11)
CDR3: SPIPYGSLLRRRNNYDY (= SEKV ID BR:12).
2
Druga poželjna relizacija: Polipeptidi koji sadrže prvi imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen koji ima sledeću CDR sekvencu:
CDR1: SYAMG (= SEKV ID BR:4)
CDR2: AIRRSGRRTYYADSVKG (= SEKV ID BR:5)
CDR3: ARRVRSSTRYNTGTWWWEY (= SEKV ID BR:6)
i drugi imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen koji ima sledeću CDR sekvencu:
CDR1: SYAMG (= SEKV ID BR:13)
CDR2: AISWRSGSTYYADSVKG (= SEKV ID BR:14)
CDR3: DPRGYGVAYVSAYYEY (= SEKV ID BR:15).
Treća poželjna relizacija: Polipeptidi koji sadrže prvi imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen koji ima sledeću CDR sekvencu:
CDR1: RYTMG (= SEKV ID BR:7)
CDR2: AIVRSGGSTYYADSVKG (= SEKV ID BR:8)
CDR3: DRRGRGENYILLYSSGRYEY (= SEKV ID BR:9)
i drugi imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen koji ima sledeću CDR sekvencu:
CDR1: SYAMG (= SEKV ID BR:13)
CDR2: AISWRSGSTYYADSVKG (= SEKV ID BR:14)
CDR3: DPRGYGVAYVSAYYEY (= SEKV ID BR:15).
Naravno, gore navedene verzije - tj. opciono uključujući vezne peptide i/ili dalje domene, posebno, uključujući domen Alb11, različiti redosledi imunoglobulinskih pojedinačnih varijabilnih domena - primenjivaće se i na ove tri poželjne realizacije.
U posebno poželjnoj realizaciji, albumin vezujući imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen nalazi se između dva LRP5/LRP6 vezujuća imunoglobulska pojedinačna varijabilna domena. Prema tome, mogu se predvideti tri posebno poželjne realizacije:
Prva posebno poželjna realizacija: Polipeptidi koji sadrže prvi (LRP5/LRP6 vezujući) imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen koji ima sledeću CDR sekvencu:
CDR1: TYTVG (= SEKV ID BR:1)
CDR2: AIRRRGSSTYYADSVKG (= SEKV ID BR:2)
CDR3: DTRTVALLQYRYDY (= SEKV ID BR:3)
albumin vezujući imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen koji ima sledeću CDR sekvencu:
CDR1: SFGMS (= SEKV ID BR:16)
2
CDR2: SISGSGSDTLYADSVKG (= SEKV ID BR:17)
CDR3: GGSLSR (= SEKV ID BR:18);
i drugi (LRP5/LRP6 vezujući) imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen koji ima sledeću CDR sekvencu:
CDR1: SYAMG (= SEKV ID BR:10)
CDR2: AISWSGGSTYYADSVKG (= SEKV ID BR:11)
CDR3: SPIPYGSLLRRRNNYDY (= SEKV ID BR:12);
bilo ovim redosledom, bilo redosledom gore navedenih domena koji se menjaju.
Druga posebno poželjna realizacija: Polipeptidi koji sadrže prvi (LRP5/LRP6 vezujući) imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen koji ima sledeću CDR sekvencu:
CDR1: SYAMG (= SEKV ID BR:4)
CDR2: AIRRSGRRTYYADSVKG (= SEKV ID BR:5)
CDR3: ARRVRSSTRYNTGTWWWEY (= SEKV ID BR:6);
albumin vezujući imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen koji ima sledeću CDR sekvencu:
CDR1: SFGMS (= SEKV ID BR:16)
CDR2: SISGSGSDTLYADSVKG (= SEKV ID BR:17)
CDR3: GGSLSR (= SEKV ID BR:18);
i drugi (LRP5/LRP6 vezujući) imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen koji ima sledeću CDR sekvencu:
CDR1: SYAMG (= SEKV ID BR:13)
CDR2: AISWRSGSTYYADSVKG (= SEKV ID BR:14)
CDR3: DPRGYGVAYVSAYYEY (= SEKV ID BR:15);
bilo ovim redosledom, bilo redosledom gore navedenih domena koji se menjaju.
Treća posebno poželjna realizacija: Polipeptidi koji sadrže prvi (LRP5/LRP6 vezujući) imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen koji ima sledeću CDR sekvencu:
CDR1: RYTMG (= SEKV ID BR:7)
CDR2: AIVRSGGSTYYADSVKG (= SEKV ID BR:8)
CDR3: DRRGRGENYILLYSSGRYEY (= SEKV ID BR:9);
albumin vezujući imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen koji ima sledeću CDR sekvencu:
CDR1: SFGMS (= SEKV ID BR:16)
CDR2: SISGSGSDTLYADSVKG (= SEKV ID BR:17)
CDR3: GGSLSR (= SEKV ID BR:18);
2
i drugi (LRP5/LRP6 vezujući) imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen koji ima sledeću CDR sekvencu:
CDR1: SYAMG (= SEKV ID BR:13)
CDR2: AISWRSGSTYYADSVKG (= SEKV ID BR:14)
CDR3: DPRGYGVAYVSAYYEY (= SEKV ID BR:15);
bilo ovim redosledom, bilo redosledom gore navedenih domena koji se menjaju.
Gore pomenute CDR sekvence su sažete u Tabelama IA, IB i IC:
TABELA IA: CDR sekvence imunoglobulinskih pojedinačnih varijabilnih domena koji ometaju Wnt1 signalizaciju :
TABELA IB: CDR sekvence imunoglobulinskih pojedinačnih varijabilnih domena koji ometaju Wnt3a signalizaciju :
TABELA IC: CDR sekvence imunoglobulinskih pojedinačnih varijabilnih domena koji se vezuju za serumski albumin (Alb11 domen):
2
Pored CDR sekvence kao što je gore navedeno, imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domeni sadržani u polipeptidima iz pronalaska uključuju sekvence imunoglobulinskih okvirnih regiona (FR). Ove sekvence poželjno nisu imunogene za ljude, i stoga su poželjno humane ili humanizovane FR sekvence. Pogodne humane ili humanizovane FR sekvence su poznate u tehnici. Specifično poželjne FR sekvence mogu se preuzeti iz realizacija prikazanih u nastavku, otkrivajući kompletne imunoglobulinske pojedinačne varijabilne domene i time CDR sekvence kao i FR sekvence.
U skladu sa još specifičnijom realizacijom, polipeptidi iz pronalaska uključuju imunoglobulinske pojedinačne varijabilne domene koji su VHH domeni, i poželjno humanizovani VHH domeni.
U skladu sa još specifičnijom realizacijom, polipeptidi iz pronalaska uključuju prvi imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen (a) izabran iz grupe koja se sastoji od imunoglobulinskih pojedinačnih varijabilnih domena (i) do (iii) i koja ima sledeće sekvence:
(i)
AVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSTYTVGWFRQAPGKEREFVA
AIRRRGSSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAA
DTRTVALLQYRYDYWGQGTLVTVSS
[= Wnt1-333E06mod domen; = SEKV ID BR:19]
(ii)
AVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGGTFSSYAMGWFRQAPGKEREFVA
AIRRSGRRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAA
ARRVRSSTRYNTGTWWWEYWGQGTLVTVSS
[= Wnt1-333G06 domen; = SEKV ID BR:20], i
(iii)
AVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGLTFSRYTMGWFRQAPGKEREFVA
AIVRSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAA
DRRGRGENYILLYSSGRYEYWGQGTLVTVSS
[= Wnt1-332D03mod domen; = SEKV ID BR:21],
i drugi imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen (b) izabran iz grupe koja se sastoji od imunoglobulinskih pojedinačnih varijabilnih domena (iv) i (v) i koji ima sledeće sekvence:
(iv)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSSYAMGWFRQAPGKEREFVA
AISWSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAA
SPIPYGSLLRRRNNYDYWGQGTLVTVSS
[= Wnt3a-093A01 domen; = SEKV ID BR:22], i
(v)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGGTFSSYAMGWFRQAPGKEREFVA
AISWRSGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYYCAA
DPRGYGVAYVSAYYEYWGQGTLVTVSS
[= Wnt3a-367B10 domen; = SEKV ID BR:23].
Poželjne realizacije su polipeptidi koji sadrže
- prvi imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen koji ima aminokiselinsku sekvencu kako je prikazano u SEKV ID BR:19 i drugi imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen koji ima aminokiselinsku sekvencu kako je prikazano u SEKV ID BR:22; ili - prvi imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen koji ima aminokiselinsku sekvencu kako je prikazano u SEKV ID BR:20 i drugi imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen koji ima aminokiselinsku sekvencu kako je prikazano u SEKV ID BR:23; ili - prvi imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen koji ima aminokiselinsku sekvencu kako je prikazano u SEKV ID BR:21 i drugi imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen koji ima aminokiselinsku sekvencu kako je prikazano u SEKV ID BR:23.
Stoga se gornje realizacije šematski mogu predstaviti kao
isvd(a) – [vezni peptid] – isvd(b),
gde “isvd” označava odgovarajući imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen, i pri čemu se u suprotnom primenjuju iste definicije i varijante kao što je gore navedeno, naročito s obzirom na prisustvo opcionih veznih peptida i/ili daljih domena, posebno jednog Alb11 domena, i u odnosu na različite redove imunoglobulinskih pojedinačnih varijabilnih domena.
1
U skladu sa specifičnim realizacijama iz pronalaska, gore navedeni polipeptidi mogu dodatno da sadrže za poluživot produženi deo gde je navedeni za poluživot produženi deo kovalentno povezan sa navedenim polipeptidom i po izboru je izabran iz grupe koja se sastoji od albumin vezujućeg dela, kao što je albumin vezujući peptid ili albumin vezujući domen, poželjno albumin vezujući imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen, još poželjnije Alb11 domen, transferin vezujući ostatak, kao što je anti-transferin imunoglobulinski domen, molekul polietilen glikola, serumski albumin, poželjno humani serumski albumin i fragment (humanog) serumskog albumina.
Sekvenca gore pomenutog Alb11 imunoglobulinskog pojedinačnog varijabilnog domena je kako sledi:
EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSIS
GSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTI
GGSLSRSSQGTLVTVSS
(= Alb11 domen; = SEKV ID BR:24)
Dalji primeri imunoglobulinskih pojedinačnih varijabilnih domena koji se vezuju za humani serumski albumin poznati su u tehnici, a detaljnije su opisani u na pr. međunarodnim patentnim publikacijama WO2006/122787 i WO2008/028977. Drugi peptidi koji se vezuju za humani serumski albumin su opisani na pr. u WO2008/068280, WO2009/127691, i WO2011/095545.
Dakle, tri poželjne specifične realizacije iz pronalaska su sledeće:
Prva poželjna specifična realizacija: Polipeptidi koji sadrže
- prvi (LRP5/LRP6 vezujući) imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen koji ima aminokiselinsku sekvencu kako je prikazano u SEKV ID BR:19;
- albumin vezujući imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen koji ima aminokiselinsku sekvencu kako je prikazano u SEKV ID BR:24;
- drugi (LRP5/LRP6 vezujući) imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen koji ima aminokiselinsku sekvencu kako je prikazano u SEKV ID BR:22;
bilo ovim redosledom, bilo redosledom gore navedena tri domena koji se izmenjuju.
Druga poželjna specifična realizacija: Polipeptidi koji sadrže
- prvi (LRP5/LRP6 vezujući) imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen koji ima aminokiselinsku sekvencu kako je prikazano u SEKV ID BR:20;
2
- albumin vezujući imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen koji ima aminokiselinsku sekvencu kako je prikazano u SEKV ID BR:24;
- drugi (LRP5/LRP6 vezujući) imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen koji ima aminokiselinsku sekvencu kako je prikazano u SEKV ID BR:23;
bilo ovim redosledom, bilo redosledom gore navedena tri domena koji se izmenjuju.
Treća poželjna specifična realizacija: Polipeptidi koji sadrže
- prvi (LRP5/LRP6 vezujući) imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen koji ima aminokiselinsku sekvencu kako je prikazano u SEKV ID BR:21;
- albumin vezujući imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen koji ima aminokiselinsku sekvencu kako je prikazano u SEKV ID BR:24;
- drugi (LRP5/LRP6 vezujući) imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen koji ima aminokiselinsku sekvencu kako je prikazano u SEKV ID BR:23;
bilo ovim redosledom, bilo redosledom gore navedena tri domena koji se izmenjuju.
U još posebnijoj poželjnoj realizaciji, albumin vezujući imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen je lociran između dva LRP5/LRP6 vezujuća imunoglobulinska pojedinačna varijabilna domena.
Sekvence gore navedenih imunoglobulinskih pojedinačnih varijabilnih domena su rezimirane u Tabelama IIA, IIB i IIC:
TABELA IIA: Sekvence imunoglobulinskih pojedinačnih varijabilnih domena koji ometaju Wnt1 signalizaciju :
TABELA IIB: Sekvence imunoglobulinskih pojedinačnih varijabilnih domena koji ometaju Wnt3a signalizaciju :
TABELA IIC: Sekvence imunoglobulinskih pojedinačnih varijabilnih domena koji se vezuju za serumski albumin (Alb11 domen):
Kao što je gore navedeno, (najmanje dva) imunoglobulinska pojedinačna varijabilna domena prisutna u polipeptidu prema pronalasku mogu se međusobno povezati bilo direktno, bez upotrebe veznika, bilo preko veznika. Veznik je poželjno vezni peptid i, u skladu sa pronalaskom, biće odabran tako da omogući vezivanje najmanje dva različita imunoglobulinska pojedinačna varijabilna domena za svaki od njihovih ciljnih epitopa.
Pogodni veznici će, između ostalog, zavisiti od epitopa i, posebno, od udaljenosti između epitopa na ciljnim molekulima za koje će se vezati imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domeni. Ovo će biti jasno stručnoj osobi na osnovu ovde otkrivenog opisa, opciono nakon određenog ograničenog stepena rutinskog eksperimentisanja.
4
Prema tome, pogodni veznici mogu sadržati aminokiselinsku sekvencu, na pr. koja ima dužinu od 9 ili više aminokiselina, poželjno najmanje 17 aminokiselina, kao što je oko 20 do 40 aminokiselina. Sekvenca veznika može biti sekvenca koja se prirodno javlja ili sekvenca koja se ne pojavljuje u prirodi. Ako se koristi u terapeutske svrhe, veznik je poželjno neimunogen kod subjekta kome se daje polipeptid iz pronalaska.
Jedna korisna grupa veznih sekvenci su veznici izvedeni iz zglobnog regiona antitela teškog lanca kako je opisano u WO1996/34103 i WO1994/04678. Drugi primeri su polialanin vezne sekvence kao što je Ala-Ala-Ala.
Dalji poželjni primeri veznih sekvence su Gly/Ser veznici različite dužine kao što su (glyxsery)zveznici, uključujući na pr. (gly4ser)3, (gly4ser)5, (gly4ser)7, (gly3ser)3, (gly3ser)5, (gly3ser)7, (gly3ser2)3, (gly3ser2)5, i (gly3ser2)7.
Alternativno, ili kao dodatak, na polipeptidni linker, najmanje dva imunoglobulinska pojedinačna varijabilna domena prisutna u polipeptidu prema pronalasku mogu biti povezana jedan sa drugim preko drugog ostatka, kao što je drugi polipeptid koji, u poželjnoj, ali neograničavajućoj realizaciji, može biti dalji imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen kao što je već gore opisano. Takav ostatak može biti u osnovi neaktivan ili može imati biološki efekat kao što je poboljšanje željenih svojstava polipeptida ili može polipeptidu dodeliti jedno ili više dodatnih željenih svojstava. Kao što je već gore navedeno, poželjan dodatni polipeptidni domen će povećati poluživot polipeptida, kao što je (humani) za serumski albumin vezujući domen, kao što je Alb11 domen.
Prema tome, u skladu sa daljom realizacijom, pronalazak posebno uključuje polipeptide koji sadrže bilo koju od sledećih sekvenci, pri čemu se tačna sekvenca aminokiselina može preuzeti iz Tabele III dole:
SEKV ID BR:25 (= sekvenca polipeptida F013500575),
SEKV ID BR:26 (= sekvenca polipeptida F013500571),
i
SEKV ID BR:27 (= sekvenca polipeptida F013500720.
U skladu sa još specifičnijom realizacijom, polipeptidi iz pronalaska su izabrani od sledeće grupe molekula:
Polipeptid F013500575, koji ima sekvencu SEKV ID BR:25,
Polipeptid F013500571, koji ima sekvencu SEKV ID BR:26, i
Polipeptid F013500720, koji ima sekvencu SEKV ID BR:27.
Tabela III: Sekvence tri specifične realizacije polipeptida iz pronalaska
Kao što je prethodno objašnjeno, ukoliko nije drugačije naznačeno, polipeptidi prema pronalasku mogu da uključuju dalje ostatke i/ili dodatne polipeptidne domene, sve dok njihovo vezivanje za LRP5/LRP6 neće biti sprečeno takvim dodatnim ostatkom ili domenom.
Polipeptidi prema pronalasku mogu dodatno da sadrže modifikacije kao što su glikozilni ostaci ili modifikovani bočni lanci aminokiselina, i mogu biti PEGilisani kako bi se povećao poluživot i druga svojstva takvog molekula. Tehnike i reagensi korisni za PEGilaciju biparatopskih imunoglobulinskih pojedinačnih varijabilnih domenskih konstrukcija mogu se uzeti na pr. iz WO2011/107507.
Polipeptidi iz pronalaska mogu imati modifikovanu N-terminalnu sekvencu, na pr. delecija jedne ili više N-terminalnih aminokiselina ili razmena na pr. prve, N-terminalne aminokiseline (na pr. glutamat u alanin), da bi se optimizovao molekul koji će biti eksprimiran korišćenjem određenih ekspresijskih sistema (kao što su specifični vektori ili ćelije domaćina), ili da bi se eksprimirao u vidu inkluzijskog tela ili u rastvorljivom obliku, ili da bi se izlučio u medijum ili u periplazmični prostor ili da bi se zadržao u ćeliji ili da bi se dobio homogeniji proizvod. Polipeptidi iz pronalaska mogu imati modifikovanu C-terminalnu sekvencu, kao što je dodatni alanin (kao što je prikazano za tri realizacije prikazane u Tabeli III gore), i/ili dalju razmenu aminokiselina u C-terminalnom delu ili na drugoj definisanoj poziciji unutar bilo koje od okvirnih regija, kao što je objašnjeno na pr. u WO2012/175741, WO2011/075861 ili WO2013/024059, kako bi se na pr. dalje poboljšala stabilnost ili da bi se smanjila imunogenost takvih polipeptida.
Dalje, poluživot polipeptida prema pronalasku može se povećati dodavanjem domena albumina, tj. konvertovanjem u fuzione proteine albumina. Primeri korisnih albuminskih ostataka i kako ih dodati veznim molekulima su na pr. dati u WO2001/079271 i WO2003/059934.
Poželjno je da polipeptidi prema pronalasku imaju vrednosti vezivanja (EC50), merene u FACS testu vezivanja kako je opisano u Primeru 7.1 dole, u opsegu od 10<-6>mola/litar ili manje, još poželjnije 10<-9>mola/litar ili manje, a još poželjnije u opsegu od 10<-10>do 10<-13>mola/litar, ili imaju IC50vrednost izmerenu u kombinovanom Wnt1 i Wnt3a reporter testu, kako je prikazano u Primeru 7.3 dole, od 10<-9>mola/litar ili manje, i poželjno u rasponu od 5 x 10<-10>mola/litar do 10<-12>mola/litar.
Polipeptidi iz pronalaska omogućavaju efikasnije lečenje nekoliko vrsta karcinoma, kao što su TNBC, CRC i NSCLC. Oni imaju poboljšane in vitro karakteristike (tj. veću efikasnost inhibicije Wnt puta), cf. na primer, Primeri 7 i 8 u nastavku, i značajna svojstva in vivo inhibicije rasta tumora, što dovodi do veće in vivo efikasnosti u poređenju sa drugim LRP6 vezujućim molekulima, opisanim u tehnici, kao što je prikazano u na pr. Primerima 9 i 10 u nastavku.
Konkretno, kao što je prikazano in vivo u modelu tumora podstaknutih sa Wnt, LRP5/LRP6 unakrsno reaktivni za poluživot produženi biparatopski humanizovani VHH konstrukti mogu inhibirati Wnt signalizaciju i rast tumora in vivo, pa čak i obezbediti značajno smanjenje tumora (tj. inhibicija rasta tumora viša od 100%), što se pod istim eksperimentalnim postavkama nije moglo postići pomoću LRP6 veznika poznatog u tehnici. Smanjenje tumora (tj. regresija tumora) je naravno željeni terapeutski efekat (tj. efikasnost) za lečenje pacijenata sa kancerom. Dalje, regresija tumora, koja rezultira sa patološki kompletnim odgovorom (pCR), priznata je klinička krajnja tačka, koja ukazuje na značajno poboljšanje preživljavanja bez progresije i ukupnog preživljavanja.
U istim eksperimentima in vivo nisu primećene značajne promene telesne težine (<10%), a rezultati gastrointestinalnih histopatoloških analiza nisu ukazali na bilo kakve toksične efekte gore navedenih polipeptida prema pronalasku. Ovo je posebno iznenađujuće s obzirom na prethodno razmatrane in vivo studije DKK1 ekspresije (tj. koje su rezultirale ulceracijom crevne sluznice i gubitkom telesne težine).
Prema tome, polipeptidi iz pronalaska u stvari pružaju nove terapeutske mogućnosti za lečenje bolesti karcinoma, a posebno čak za upotrebu kod visoko nezadovoljenih medicinskih potreba kao što je (trostruko negativni) rak dojke.
Iznenađujuće, pronalazači su došli do ove realizacije ne time što su išli uobičajenim putem, tj. pokušavajući da razviju inhibitore ili vezne molekule koji imaju visoku specifičnost / selektivnost za jedan zadati cilj, kao što je LRP6 (pomenut kao cilj za lečenje „bolesti nastalih posredstvom Wnt signalizacije“ “na pr. u WO2009/056634). Nasuprot tome, pronalazači su razvili molekule koji istovremeno ciljaju dva srodna proteina - LRP6 i LRP5 - i time postigli gore navedeno značajno poboljšane in vitro i in vivo efekte koji se nisu mogli očekivati iz prethodnog stanja tehnike.
Osnovni molekularni mehanizam za ovu superiornost nije potpuno jasan, ali može se pretpostaviti - bez želje da se veže za određenu teoriju - da takvi unakrsno reaktivni molekuli mogu imati dodatne, a samim tim i snažnije efekte na visoko komplikovanu signalnu kaskadu Wnt signalnog puta.
Gore navedeni povoljni efekti će biti dalje ilustrovani u primerima dole i putem uporednih podataka koji su tamo uključeni.
Štaviše, polipeptidi prema pronalasku su jednostavni za proizvodnju i rastvorljiviji su, što znači da mogu da se čuvaju i/ili daju u višim koncentracijama u poređenju sa konvencionalnim antitelima. Stabilini su na sobnoj temperaturi i imaju produženu stabilnost čak i pri ekstremnim vrednostima pH, tako da se mogu pripremiti, skladištiti i/ili transportovati bez upotrebe rashladne opreme, dajući uštedu troškova, vremena i životne sredine. Zbog gore navedenog i zbog njihove niske imunogenosti, oni dalje nude niz opcija u vezi sa načinima primene pored injekcije i infuzije, kao i u vezi sa režimima primene i upotrebom određenih uređaja.
Nukleinske kiseline, vektori, üelije domaüina
U skladu sa daljim aspektima, pronalazak se odnosi na molekule nukleinske kiseline i vektore ekspresije koji kodiraju polipeptide prema pronalasku, kao i na ćelije domaćina koje ih isto eksprimiraju. Ove nukleinske kiseline, vektori i ćelije domaćina korisni su za proizvodnju polipeptida prema pronalasku, a dalji aspekti i njihove realizacije će biti dalje opisani u nastavku i povezani sa pregledom postupaka za proizvodnju polipeptida prema pronalasku.
Terapijska upotreba
Zbog svojih bioloških svojstava, polipeptidi iz pronalaska pogodni su za lečenje bolesti koje karakteriše prekomerna ili abnormalna proliferacija ćelija, poput karcinoma i idiopatske plućne fibroze (IPF).
Na primer, sledeći karcinomi, tumori i druga proliferativna oboljenja mogu se lečiti polipeptidima u skladu sa pronalaskom, bez da se ograničeva na njih:
Karcinom glave i vrata; rak pluća, kao što je na pr. rak pluća ne-malih ćelija (NSCLC) i rak pluća malih ćelija (SCLC); neoplazme medijastinuma, kao na pr. neurogeni tumori i mezenhimalni tumori; karcinomi gastrointestinalnog (GI) trakta, kao što je na pr. karcinomi jednjaka, želuca (rak želuca), pankreasa, jetre i žučnog stabla (uključujući na pr. hepatocelularni karcinom (HCC)) i tankog i debelog creva (uključujući na pr. rak debelog creva); rak prostate; rak testisa; ginekološki karcinomi, kao što su na pr. karcinomi jajnika; rak dojke, kao što je na pr. karcinom dojke, rak dojke pozitivan na hormonske receptore, Her2 pozitivni rak dojke i trostruko negativni rak dojke; karcinomi endokrinog sistema; sarkomi mekih tkiva, kao što su na pr. fibrosarkom, rabdomiosarkom, angiosarkom, Kapošijev sarkom; sarkomi kostiju, kao što su na pr. mijelom, osteosarkom, Evingov tumor, fibrosarkom, osteohondrom, osteoblastom i hondroblastom; mezoteliomi; rak kože, kao što je na pr. karcinom bazalnih ćelija, karcinom skvamoznih ćelija, karcinom merkelovih ćelija i melanom; neoplazme centralnog nervnog sistema i mozga, kao što su na pr. astrocitom, glioblastom, neuroblastomi glioma i retinoblastomi; limfomi i leukemije poput na pr. B-ćelijski ne-Hodgkin-ovi limfomi (NHL), T-ćelijski ne-Hodgkin-ovi limfomi, hronična B-ćelijska limfocitna leukemija (B-CLL), hronična T-ćelijska limfocitna leukemija (T CLL), Hodgkinova bolest (HD), leukemija velikih granularnih limfocita (LGL), hronična mijelogena leukemija (CML), akutna mijelogena/mijeloidna leukemija (AML), akutna limfna/limfoblastna leukemija (ALL), multipli mijelom (MM), plazmacitom i mijelodisplastični sindromi (MDS); i karcinomi nepoznatog primarnog mesta.
Svi gore pomenuti karcinomi, tumori, neoplazme itd., koji se odlikuju svojom specifičnom lokacijom/poreklom u telu, trebalo bi da uključuju i primarne tumore i metastatske tumore koji su iz njih izvedeni.
Još specifičnije, polipeptidi iz pronalaska su korisni za lečenje bolesti, a naročito bolesti karcinoma kod kojih je abnormalna proliferacija ćelija prouzrokovana ili uključuje abnormalnu (aktiviranu) Wnt signalizaciju.
Prema tome, polipeptidi iz pronalaska su posebno korisni za lečenje čvrstih tumora, a tačnije za lečenje karcinoma pluća, jetre, debelog creva, mozga, štitne žlezde, pankreasa, dojke, jajnika i prostate, i još preciznije za lečenje karcinoma pluća ne-malih ćelija (NSCLC), trostruko negativnog karcinoma dojke (TNBC) i karcinoma kolorektuma (CRC). Posebno, polipeptidi iz ovog pronalaska mogu se koristiti za lečenje pacijenata sa lokalno uznapredovalim ili metastatskim TNBC, pacijenata sa metastatskim NSCLC ili lokalno uznapredovalim ili metastatskim CRC, kao pojedinačno sredstvo ili u kombinaciji, za produženje preživljavanja bez progresije bolesti (PFS) i ukupnog preživljavanja (OS). Dalje, polipeptidi iz ovog pronalaska mogu se koristiti kao neoadjuvantni tretman za pacijente sa rakom dojke radi postizanja potpunog patološkog odgovora (pCR; definisanog kao odsustvo rezidualnog invazivnog i in situ karcinoma histo-patološkom procenom kompletnog resektovanog uzorka dojke i svih uzoraka regionalnih limfnih čvorova nakon završetka neoadjuvantne sistemske terapije).
Polipeptidi prema pronalasku mogu se koristiti u terapijskim režimima u kontekstu prve linije, druge linije ili bilo koje dalje linije tretmana.
Polipeptidi prema pronalasku mogu se koristiti za prevenciju, kratkotrajno ili dugotrajno lečenje gore pomenutih bolesti, opciono takođe i u kombinaciji sa radioterapijom i/ili operacijom.
4
Slično tome, polipeptidi iz pronalaska su posebno korisni za lečenje drugih bolesti izazvanih abnormalnom proliferacijom ćelija koje uključuju Wnt signalni put, kao što je idiopatska plućna fibroza (IPF) (Königshoff et al. “Functional Wnt signaling is increased in idiopathic pulmonary fibrosis”. PLoS One 2008;3(5):e2142; Lam et al. “Wnt coreceptor Lrp5 is a driver of idiopathic pulmonary fibrosis”. Am J Respir Crit Care Med.
2014;190(2):185-95).
Dalje, polipeptidi iz pronalaska su posebno korisni za lečenje retinopatija, a naročito za lečenje dijabetičke retinopatije, usled abnormalne Wnt aktivacije u unutrašnjim ćelijama mrežnjače, uzrokujući povećanje abnormalnog formiranja novih retinalnih sudova što dovodi do razvoja i progresije dijabetičke retinopatije (Chen, Y., et al. “Activation of the Wnt pathway plays a pathogenic role in diabetic retinopathy in humans and animal models” The Am J Pathol.2009; 175(6):2676-85., Gao et al. “Elevated LRP6 levels correlate with vascular endothelial growth factor in the vitreous of proliferative diabetic retinopathy” Mol Vis.2015;21:665-72).
Konačno, kao što se moglo pokazati da inhibicija Wnt1/Wnt3a signalnih puteva takođe može imati efekat na dendritične ćelije (DC) i funkciju dendritičnih ćelija, polipeptidi iz pronalaska takođe mogu biti korisni u lečenju imunoloških i infektivnih bolesti, kao kao i da utiču na mikrookolinu tumora u raznim gore navedenim bolestima karcinoma. Tumori aktivno potiskuju antitumorski imunitet, a DC igraju važnu ulogu u mehanizmu imunološkog bekstva karcinoma. Studije su posebno pokazale da Wnt ligandi u mikrookolini tumora takođe mogu inicirati parakrinu signalizaciju unutar imunih ćelija i regulisati antitumorski imunitet domaćina (Hong et al. “beta-catenin promotes regulatory T-cell responses in tumors by inducing vitamin A metabolism in dendritic cells”. Cancer Res.2015;75(4):656-65).
Naravno, gore navedeno takođe uključuje upotrebu polipeptida prema pronalasku u različitim postupcima lečenja gore navedenih bolesti davanjem terapeutski efektivne doze pacijentu kome je to potrebno, kao i upotrebu ovih polipeptida za proizvodnju lekova za lečenje takvih bolesti, kao i farmaceutskih kompozicija, uključujući takve polipeptide iz pronalaska, kao i pripremu i/ili proizvodnju lekova koji uključuju takve polipeptide iz pronalaska, i slično.
Kombinacije sa drugim aktivnim supstancama
Polipeptidi prema pronalasku mogu se koristiti sami ili u kombinaciji sa drugim farmakološki aktivnim supstancama, kao što su jedinjenja iz stanja tehnike ili jedinjenja standardne nege, kao što su na pr. citostatske ili citotoksične supstance, inhibitori ćelijske proliferacije, anti-angiogene supstance, steroidi, imunološki modulatori / inhibitori kontrolne tačke i slično.
Citostatske i/ili citotoksične aktivne supstance koje se mogu primenjivati u kombinaciji sa jedinjenjima u skladu sa pronalaskom uključuju, bez ograničenja na njih, hormone, analoge hormona i antihormone, inhibitore aromataze, LHRH agoniste i antagoniste, inhibitore faktora rasta (faktori rasta kao što su na primer faktor rasta izveden iz trombocita (PDGF), faktor rasta fibroblasta (FGF), vaskularni endotelni faktor rasta (VEGF), faktor epidermalnog rasta (EGF), faktori rasta slični insulinu (IGF), humani faktor epidermalnog rasta (HER, na pr. HER2, HER3, HER4) i faktor rasta hepatocita (HGF)): inhibitori su na primer faktori (ant-)rasta antitela, inhibitori faktora (anti-)rasta reveptornih antitela i inhibitori tirozin kinaze, kao što su na primer cetuksimab, gefitinib, afatinib, nintedanib, imatinib, lapatinib, bosutinib i trastuzumab; antimetaboliti (na pr. antifolati kao što su metotreksat, raltitreksed, analogi pirimidina kao što su 5-fluorouracil (5-FU), kapecitabin i gemcitabin, analozi purina i adenozina kao što su merkaptopurin, tioguanin, kladribin i pentostatin, citarabin (ara C), fludarabine); antitumorski antibiotici (na pr. antraciklini); derivati platine (na pr. cisplatin, oksaliplatin, karboplatin); agensi za alkilovanje (na pr. estramustin, mekloretamin, melfalan, hlorambucil, busulfan, dakarbazin, ciklofosfamid, ifosfamid, temozolomid, nitrosoureje kao što su na primer karmustin i lomustin, tiotepa); antimitotička sredstva (na pr. vinka alkaloidi kao što su na primer vinblastin, vindesin, vinorelbin i vinkristin; i taksani kao što su paklitaksel, docetaksel); inhibitori angiogeneze, inhibitori tubulina; Inhibitori sinteze DNK, PARP inhibitori, inhibitori topoizomeraze (na pr. epipodofilotoksini kao što su na primer etopozid i etopofos, tenipozid, amsakrin, topotekan, irinotekan, mitoksantron), inhibitori serin/treonin kinaze (na pr. PDK1 inhibitori, Raf inhibitori, A-Raf inhibitori, B-Raf inhibitori, C-Raf inhibitori, mTOR inhibitori, mTORC1/2 inhibitori, PI3K inhibitori, PI3KĮ inhibitori, dualni mTOR/PI3K inhibitori, STK33 inhibitori, AKT inhibitori, PLK1 inhibitori (poput volasertiba), inhibitori CDK, inhibitori Aurora kinaze ), inhibitori tirozin kinaze (na pr. PTK2/FAK inhibitori), inhibitori protein protein interakcije, MEK inhibitori, ERK inhibitori, FLT3 inhibitori, BRD4 inhibitori, IGF-1R inhibitori, TRAILR2 agonisti, Bcl-xL inhibitori, Bcl-2 inhibitori, Bcl-2/Bcl-xL inhibitori, inhibitori ErbB receptora, BCR ABL inhibitori, ABL inhibitori, Src inhibitori, analozi rapamicina (na pr. everolimus, temsirolimus, ridaforolimus, sirolimus), inhibitori sinteze androgena, inhibitori androgenih receptora, DNMT inhibitori, HDAC inhibitori, ANG1/2 nhibitori, CYP17 inhibitori, radiofarmaceutici, imunoterapeutski agensi kao što su inhibitori imunih kontrolnih tačaka (na pr. CTLA4, PD1, PD-L1, LAG3 i TIM3 vezujući molekuli / imunoglobulini, kao što su ipilimumab, nivolumab, pembrolizumab), vakcine protiv karcinoma kao što su tradicionalne vakcine protiv tumora (vakcine na bazi ćelija, na pr. sipuleucel-T za lečenje karcinoma prostate), personalizovane neoantigenske vakcine i onkolitički virusi i različita hemoterapeutska sredstva kao što su amifostin, anagrelid, klodronat, filgrastin, interferon, interferon alfa, leukovorin, rituksimab, prokarbazin, levamisol, mesna, mitotan, pamidronat i porfimer.
Naročito su poželjne metode lečenja koje uključuju upotrebu polipeptida prema pronalasku u kombinaciji sa lekom odabranim iz grupe koju čine:
(i) anti-VEGF antitela (bevacizumab i druge anti-angiogene supstance) sa ili bez kombinacije hemoterapije (uključujući kombinaciju doksorubicin/ciklofosfamid i/ili kombinaciju kapecitabin/docetaksel u neoadjuvantnom režimu; režim taksana/platina za prvu i kasniju liniju lečenja) kod pacijenata sa rakom dojke ;
(ii) EGFR TKI za EGFR mutirani NSCLC ili krizotinib za ALK translocirani NSCLC sa ili bez kombinacije hemoterapije (kombinacija citotoksične terapije na bazi platine, uključujući gemcitabin/cisplatin u lečenju prve linije; docetaksel ili pemetreksed u drugoj liniji lečenja kod pacijenata sa rakom pluća;
(iii) anti-EGFR antitela (cetuksimab i panitumumab u KRAS tumorima divljeg tipa) sa ili bez kombinacije hemoterapije (uključujući irinotekan), kombinacija anti-VEGF antitela (bevacizumab i druge anti-angiogene supstance) ili kombinacija regorafeniba, na pr. za lečenje CRC pacijenata.
(iv) imunoterapijska sredstva, uključujući anti-PD-1 agense, kao što su pembrolizumab i nivolumab, anti-PD-L1 agensi, anti-CTLA4 agensi, anti-BTLA agensi, anti-LAG3 agensi i anti-TIM3 agensi, kao anti-PDL1 antitela itd., na pr za lečenje raka dojke, raka pluća i CRC pacijenata
(v) hemoterapeutski agensi, poput antineoplastičnih agenasa na bazi platine, ili u kombinaciji sa FOLFOX režimom hemoterapije, uključujući folinsku kiselinu, 5'-fluorouracil i oksaliplatin, ili u kombinaciji sa FOLFOXIRI režimom hemoterapije,
4
uključujući folinsku kiselinu, 5'-fluorouracil, oksaliplatin i irinotekan, na pr. za lečenje raka dojke ili pacijenata sa CRC.
Kada se dve ili više supstanci ili principa koriste kao deo kombinovanog režima lečenja, mogu se primenjivati istim putem davanja ili različitim načinima primene, u suštini u isto vreme (tj. simultano, istovremeno) ili u različito vreme (na pr. sekvencijalno, sukcesivno, naizmenično, konsekutivno ili u skladu sa bilo kojom drugom vrstom naizmeničnog režima).
Kada supstance ili principi treba da se daju istovremeno istim putem davanja, mogu se primenjivati kao različite farmaceutske formulacije ili smeše ili kao deo kombinovane farmaceutske formulacije ili smeše. Takođe, kada se dve ili više aktivnih supstanci ili principa mogu da se koriste kao deo kombinovanog režima lečenja, svaka od supstanci ili principa može se primenjivati u istoj količini i u skladu sa istim režimom koji se koristi kada se jedinjenje ili princip koristi samostalno, a takva kombinovana upotreba može ili ne mora dovesti do sinergijskog efekta. Međutim, kada kombinovana upotreba dve ili više aktivnih supstanci ili principa dovede do sinergijskog efekta, takođe može biti moguće smanjiti količinu jedne, više ili svih supstanci ili principa koji se daju, a istovremeno postići željeno terapijsko dejstvo. Ovo na primer može biti korisno za izbegavanje, ograničavanje ili smanjenje neželjenih sporednih efekata koji su povezani sa upotrebom jedne ili više supstanci ili principa kada se koriste u uobičajenim količinama, a istovremeno se postiže željeni farmakološki ili terapeutski efekat .
Naravno, gore navedeno uključuje pripremu i metode pripreme polipeptida iz pronalaska za kombinovanu upotrebu sa gore navedenim kombinacionim partnerima. Takođe su uključeni priprema i postupci pripreme, gore pomenutih kombinacionih partnera za kombinovanu upotrebu sa polipeptidima pronalaska. Dakle, pronalazak ovime na pr. pruža metode korišćenja ili pripreme za upotrebu nekog imunološkog modulatora/inhibitora kontrolne tačke, poput anti-PD1 antitela, kao što je pembrolizumab ili nivolumab, za primenu u kombinaciji sa polipeptidom prema pronalasku, i tačnije za primenu u režimu kombinovane terapije sa polipeptidom prema pronalasku.
Dalje, pronalazak takođe obuhvata komplete koji sadrže najmanje jedan polipeptid iz pronalaska i jednu ili više drugih komponenata izabranih iz grupe koja se sastoji od drugih lekova koji se koriste za lečenje bolesti i poremećaja, kao što je gore opisano, i uređaje kako je opisano u nastavku.
Farmaceutske kompozicije, naþini primene, doziranja
Stručnoj osobi će biti jasno da gore navedeni postupci lečenja bolesti uključuju pripremu leka za lečenje pomenute bolesti. Prema tome, pronalazak se dalje odnosi na farmaceutske kompozicije za lečenje gore pomenutih bolesti, pri čemu takve kompozicije sadrže najmanje jedan polipeptid prema pronalasku.
Polipeptidi iz pronalaska i/ili kompozicije koje ih sadrže mogu se primeniti pacijentu kome je to potrebno na bilo koji pogodan način, u zavisnosti od specifične farmaceutske formulacije ili kompozicije koja će se koristiti. Prema tome, polipeptidi iz pronalaska i/ili kompozicije koje ih sadrže mogu se primeniti, na primer, intravenozno (i.v.), subkutano (s.c.), intramuskularno (i.m.), intraperitonealno (i.p.), transdermalno, oralno, sublingvalno (na pr. u obliku sublingvalnih tableta, spreja ili kapi koji se stavljaju pod jezik i apsorbuju kroz mukusne membrane u kapilarnoj mreži ispod jezika), (intra-)nazalno (na pr. u obliku spreja za nos i/ili kao aerosol), topikalno, uz pomoć supozitorija, inhalacijom ili bilo kojim drugim pogodnim načinom u efektivnoj količini ili dozi.
Polipeptidi iz pronalaska i/ili kompozicije koje ih sadrže daju se u skladu sa režimom lečenja koji je pogodan za lečenje i/ili ublažavanje bolesti, poremećaja ili stanja koje treba lečiti ili ublažiti. Kliničar će uglavnom biti u mogućnosti da odredi pogodni režim lečenja, u zavisnosti od faktora kao što su bolest, poremećaj ili stanje koje treba lečiti ili ublažiti, težinu bolesti, težinu njenih simptoma, od specifičnog polipeptida iz pronalaska, specifičnog načina primene i farmaceutske formulacije ili kompozicije koja će se koristiti, od starosti, pola, težine, dijete, opšteg stanja pacijenta i od sličnih faktora koji su dobro poznati kliničaru. Generalno, režim lečenja obuhvataće primenu jednog ili više polipeptida prema pronalasku ili jedne ili više kompozicija koje se sastoje od istog, u terapeutski efektivnim količinama ili dozama.
Generalno, za lečenje i/ili ublažavanje ovde pomenutih bolesti, poremećaja i stanja i u zavisnosti od specifične bolesti, poremećaja ili stanja koje se leči, potentnosti specifičnog polipeptida iz pronalaska koji se koristi, od specifičnog način primene i specifične farmaceutske formulacije ili kompozicije koja se koristi, polipeptidi prema pronalasku će se generalno primenjivati u količini između 0,005 i 20,0 mg po kilogramu telesne težine i po dozi, poželjno između 0,05 i 10,0 mg/kg/dozi, a poželjnije između 0,5 i 10 mg/kg/dozi, bilo kontinuirano (na pr. infuzijom) ili još poželjnije kao pojedinačne doze (kao što su na pr. dva puta nedeljno, nedeljne ili mesečne doze; sf. dole), ali mogu značajno da variraju,
4
posebno u zavisnosti od prethodno pomenutih parametara. Prema tome, u nekim slučajevima može biti dovoljno koristiti manju dozu od prethodno date minimalne doze, dok će u drugim slučajevima gornja granica možda biti prekoračena. Kada se daju velike količine, bilo bi uputno podeliti ih u niz manjih doza raspoređenih tokom dana.
U zavisnosti od specifičnog polipeptida iz pronalaska i njegovih specifičnih farmakokinetičkih i drugih svojstava, može se davati svakodnevno, svaki drugi, treći, četvrti, peti ili šesti dan, nedeljno, mesečno i slično. Režim primene mogao bi da uključuje dugotrajno sedmično lečenje. Pod „dugoročnim“ se podrazumevaju najmanje dve nedelje, a poželjno meseci ili godine trajanja.
Efikasnost polipeptida iz pronalaska i kompozicija koje ih sadrže mogu se testirati korišćenjem bilo kog pogodnog in vitro testa, eseja na bazi ćelija, in vivo testa i/ili životinjskog modela poznatog per se, ili bilo koje njihove kombinacije, u zavisnosti od specifična bolest koja je uključena. Pogodni testovi i životinjski modeli biće jasni stručnoj osobi, a na primer uključuju testove i životinjske modele koji se koriste u primerima dole. Poželjno je da polipeptidi prema pronalasku imaju bolje karakteristike od konvencionalnih antitela poznatih u struci (poput LRP6 veznika opisanih u odeljku „Pozadina pronalaska“ ranije) u najmanje jednom od ovih testova ili modela, a poželjno u jednom ili više in vivo modela.
Formulacije
Za farmaceutsku upotrebu, polipeptidi prema pronalasku mogu se formulisati kao farmaceutski preparati koji sadrže (i) najmanje jedan polipeptid prema pronalasku i (ii) najmanje jedan farmaceutski prihvatljivi nosač, razblaživač, ekscipijent, adjuvans i/ili stabilizator, i (iii) opciono jedan ili više daljih farmakološki aktivnih polipeptida i/ili jedinjenja. Pod „farmaceutski prihvatljivim“ podrazumeva se da odgovarajući materijal ne pokazuje bilo kakve biološke ili na drugi način neželjene efekte kada se daje pojedincu i ne deluje štetno u interakciji sa bilo kojom drugom komponentom farmaceutske kompozcije (kao što je na pr. farmaceutski aktivan sastojak) u kome je sadržan.
Konkretni primeri mogu se naći u standardnim priručnicima, kao što je na pr.
Remington's Pharmaceutical Sciences, 18<th>Ed., Mack Publishing Company, USA (1990). Na primer, polipeptidi iz ovog pronalaska mogu se formulisati i primenjivati na bilo koji način koji je sam po sebi poznat za konvencionalna antitela i fragmente antitela i
4
druge farmaceutski aktivne proteine. Prema tome, u skladu sa daljom realizacijom, pronalazak se odnosi na farmaceutsku kompoziciju ili preparat koji sadrži najmanje jedan polipeptid prema pronalasku i najmanje jedan farmaceutski prihvatljivi nosač, razblaživač, ekscipijent, adjuvans i/ili stabilizator, i opciono još jednu ili više farmakološki aktivnih supstanci.
Farmaceutski preparati za parenteralnu primenu, poput intravenske, intramuskularne, subkutane injekcije ili intravenske infuzije, mogu biti, na primer, sterilni rastvori, suspenzije, disperzije, emulzije ili prahovi koji sadrže aktivni sastojak i koji su pogodni, opciono nakon daljeg koraka rastvaranja ili razblaživanja, za infuziju ili injekciju. Pogodni nosači ili razblaživači za takve preparate, na primer, uključuju, bez ograničenja, sterilnu vodu i farmaceutski prihvatljive vodene pufere i rastvore kao što su fiziološki rastvor puferisan fosfatom, Ringerovi rastvori, rastvor dekstroze i Hankov rastvor; vodena ulja; glicerol; etanol; glikoli kao što je propilen glikol, kao i mineralna ulja, životinjska ulja i biljna ulja, na primer ulje kikirikija, sojino ulje, kao i pogodne njihove smeše.
Rastvori polipeptida prema pronalasku mogu takođe da sadrže konzervans za sprečavanje rasta mikroorganizama, kao što su antibakterijska i antifungalna sredstva, na primer, p-hidroksibenzoati, parabeni, hlorobutanol, fenol, sorbinska kiselina, tiomersal, (soli alkalnih metala sa) etilendiamin tetrosirćetnom kiselinom i slično. U mnogim slučajevima bi bilo poželjno uključiti izotonične agense, na primer, šećere, pufere ili natrijum hlorid. Po želji se mogu koristiti emulgatori i/ili disperzanti.
Odgovarajuća fluidnost se može održavati, na primer, formiranjem lipozoma, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzija ili upotrebom površinski aktivnih sredstava. Takođe se mogu dodati i druga sredstva koja odlažu apsorpciju, na primer aluminijum monostearat i želatin. Rastvori mogu biti punjeni u bočice za injekcije, ampule, bočice za infuziju i slično.
U svim slučajevima, krajnji oblik doziranja mora biti sterilan, tečan i stabilan pod uslovima proizvodnje i skladištenja. Sterilni rastvori za injektiranje se pripremaju uključivanjem aktivnog jedinjenja u potrebnoj količini u odgovarajući rastvarač sa raznim ostalim gore navedenim sastojcima, po potrebi, nakon čega sledi filter sterilizacija. U slučaju sterilnih prahova za pripremu sterilnih rastvora za injektiranje, poželjni postupci pripreme su vakuum sušenje i tehnike sušenja sa zamrzavanjem, pri kojima nstaje prah aktivnog sastojka plus bilo koji dodatni željeni sastojak prisutan u prethodno sterilno filtriranim rastvorima.
4
Obično se preferiraju vodeni rastvori ili suspenzije. Generalno, pogodne formulacije za terapijske proteine kao što su polipeptidi iz pronalaska su puferski rastvor proteina, kao što su rastvori koji uključuju protein u pogodnoj koncentraciji (kao što je od 0,001 do 400 mg/ml, poželjno od 0,005 do 200 mg/ml, više poželjno 0,01 do 200 mg/ml, još poželjnije 1,0 - 100 mg/ml, kao što je 1,0 mg/ml (i.v. primena) ili 100 mg/ml (s.c. primena) i neki vodeni puferni rastvor kao što su:
- fiziološki rastvor u puferu sa fosfatom, pH 7,4,
- ostali fosfatni puferi, pH 6,2 do 8,2,
- acetatni puferi, pH 3,2 do 7,5, poželjno pH 4,8 do 5,5
- histidinski puferi, pH 5,5 do 7,0,
- sukcinatni puferi, pH 3,2 do 6,6, i
- citratni puferi, pH 2,1 do 6,2,
i, opciono, soli (na pr. NaCl) i/ili šećeri (kao što su na pr. saharoza i trehaloza) i/ili drugi poliakoholi (kao što su na pr. manitol i glicerol) za obezbeđivanje izotoničnosti rastvora.
Poželjni puferski rastvori proteina su rastvori koji uključuju oko 0,05 mg/ml polipeptida prema pronalasku rastvorenih u 25 mM fosfatnom puferu, pH 6,5, podešen na izotoničnost dodavanjem 220 mM trehaloze. Pored toga, druga sredstva kao što je deterdžent, na pr.0,02% Tween-20 ili Tween-80, mogu biti uključeni u takve rastvore. Formulacije za subkutanu primenu mogu da uključuju značajno veće koncentracije polipeptida prema pronalasku, kao što su do 100 mg/ml ili čak iznad 100 mg/ml.
Međutim, stručnoj osobi u ovoj oblasti biće jasno da sastojci i njihove količine, kao što je gore dato, predstavljaju samo jednu, poželjnu opciju. Njihove alternative i njihove varijacije biće odmah vidljive stručnoj osobi ili se lako mogu zamisliti polazeći od gore navedenog otkrića.
Takođe, u poređenju sa konvencionalnim antitelima ili fragmentima antitela, jedna od glavnih prednosti upotrebe polipeptida prema pronalasku je što se oni takođe mogu lako primenjivati na druge načine, a ne parenteralno, i mogu se lako formulisati za takvu primenu. Na primer, kao što je opisano u međunarodnoj patentnoj prijavi WO2004/041867, takvi polipeptidi mogu biti formulisani za oralnu, intranazalnu, intrapulmonalnu i transdermalnu primenu.
U skladu sa daljim aspektom pronalaska, polipeptid iz pronalaska može se koristiti u kombinaciji sa uređajem korisnim za davanje polipeptida, kao što su špric, injektorska olovka, mikro pumpa ili drugi uređaj.
4
Metode proizvodnje i preþišüavanja
Pronalazak dalje obezbeđuje postupke za proizvodnju polipeptida prema pronalasku, koji obično sadrže sledeće korake:
- kultivisanje ćelija domaćina koje sadrže nukleinsku kiselinu koja kodira polipeptid prema pronalasku (u daljem tekstu: „nukleinska kiselina prema pronalasku“) pod uslovima koji omogućavaju ekspresiju polipeptida prema pronalasku; i,
- izdvajanje ili izolovanje polipeptida eksprimiranog uz pomoć ćelija domaćina iz kulture; i - opciono dalje prečišćavanje i/ili modifikovanje i/ili formulisanje polipeptida prema pronalasku.
Nukleinska kiselina prema pronalasku može na pr. biti molekul DNK koji sadrži kodirajuće sekvence, kao i regulatorne sekvence i opciono prirodne ili veštačke introne, ili može biti molekul cDNK. Može imati originalne kodone ili može imati optimizovanu upotrebu kodona koja je posebno prilagođena za ekspresiju u predviđenoj ćeliji domaćina ili organizmu domaćina. U skladu sa jednom realizacijom pronalaska, nukleinska kiselina iz pronalaska je u osnovi u izolovanom obliku, kako je gore definisano.
Nukleinska kiselina pronalaska takođe može biti u obliku, biti prisutna i/ili biti deo vektora, kao što je na primer plazmid, kosmid ili YAC, koji opet može biti u suštinski izolovanom obliku. Vektor može posebno biti ekspresijski vektor, tj. vektor koji može obezbediti ekspresiju polipeptida in vitro i/ili in vivo (na pr. u pogodnoj ćeliji domaćina, organizmu domaćina i/ili ekspresionom sistemu). Takav ekspresijski vektor generalno sadrži najmanje jednu nukleinsku kiselinu iz pronalaska koja je operativno povezana sa jednim ili više pogodnih regulatornih elemenata, kao što su promoteri, pojačivači, terminatori i slično. Konkretni primeri takvih regulatornih elemenata i drugih elemenata, kao što su integracioni faktor(i), selekcioni marker(i), signalna ili vodeća sekvenca(e), reporter gen(i) i slično, korisni ili neophodni za ekspresiju polipeptida iz pronalaska, otkriveni su na pr. na str.131 do 133 u WO2006/040153.
Nukleinske kiseline prema pronalasku mogu se pripremiti ili dobiti na način poznat sam po sebi (na pr. automatizovanoom sintezom DNK i/ili tehnologijom rekombinantne DNK), na osnovu informacija o sekvenci aminokiselina za polipeptide iz pronalaska koji su ovde dati.
4
U skladu sa drugom realizacijom, pronalazak se odnosi na domaćina ili ćeliju domaćina koji eksprimiraju ili su sposobni da eksprimiraju polipeptid iz pronalaska; i/ili koji sadrže nukleinsku kiselinu koja kodira polipeptid prema pronalasku. U skladu sa posebno poželjnom realizacijom, pomenute ćelije domaćina su ćelije bakterija, ćelije kvasca, ćelije gljivica ili ćelije sisara.
Za proizvodnju u industrijskim razmerama, poželjni heterologni domaćini za (industrijsku) proizvodnju imunoglobulinskih pojedinačnih varijabilnih domena polipeptida i proteinskih terapeutika koji ih sadrže uključuju sojeve E. coli, Pichia pastoris i S. cerevisiae koji su pogodni za ekspresiju, proizvodnju i fermentaciju u velikim razmerama, posebno za (bio-) farmaceutske ekspresije, proizvodnju i fermentaciju u velikim razmerama.
Polipeptidi prema pronalasku proizvedeni u ćeliji kako je gore navedeno mogu se proizvesti bilo intracelularno (na pr. u citozolu, u periplazmi ili u inkluzivnim telima), a zatim mogu biti izolovani iz ćelija domaćina i opciono dalje prečišćeni; ili se mogu proizvesti ekstracelularno (izlučuju se u medijum u kome se gaje ćelije domaćina), a zatim izolovati iz medijuma za kultivaciju i opciono dalje prečišćavati.
Dalji postupci i reagensi koji se koriste za rekombinantnu proizvodnju polipeptida, kao što su pogodni ekspresioni vektori, postupci transformacije ili transfekcije, selekcioni markeri, postupci indukcije ekspresije proteina, uslovi kultivacije i slično, poznati su u struci.
Slično tome, tehnike izolacije i prečišćavanja proteina korisne u postupku proizvodnje polipeptida prema pronalasku dobro su poznate stručnoj osobi.
Proizvodnja polipeptida prema pronalasku fermentacijom u prikladnim rekombinantnim organizmima domaćinima kao što su E. coli i kvasac je isplativa u poređenju sa konvencionalnim proizvodnjama antitela koje obično zahtevaju skupu opremu za gajenje kulture ćelija sisara. Dalje, dostižni nivoi ekspresije su visoki, a prinosi polipeptida prema pronalasku su u opsegu od 1 do 10 g/l (E. coli) i do 10 g/l i više (kvasac).
PRIMERI
Primer 1: Imunizacija llama sa LRP5 i LRP6 za indukciju humoralnih imunih odgovora
Nekoliko protokola za imunizaciju llama trebalo je razraditi i primeniti za identifikaciju LRP5/LRP6 unakrsno reaktivnog vezivanja VHH domena: Llama su u početku imunizovane rekombinantnim ekstracelularnim domenama LRP6 i LRP5 proteina čoveka i miša). Međutim, funkcionalna karakterizacija gore pomenutog LRP5 rekombinantnog proteina otkrila je da je samo za Wnt1 klasu vezujući epitop pravilno savijen. Suprotno tome, nije bilo indikacija za pravilno umotvanje za LRP5-Wnt3a klasu vezujućeg domena. Zbog toga je potreban dalji rad na razvoju pogodnih antigena za imunizaciju. Kao zaobilazni postupak, llama su imunizovane sa HEK293 ćelijama, stabilno transfektovanim sa humanim LRP5 ili humanim LRP6. Međutim, takođe se tada mogla postići samo vrlo niska ekspresija humanog LRP5, uz pomoć privremene ili stabilne transfekcije, i korišćenjem različitih ćelijskih linija (HEK293, CHO i NIH-3T3 ćelije). Stoga je potreban još dalji rad da bi se postigla dovoljna ekspresija LRP5. Na kraju, i nakon neuspelih pokušaja i grešaka, to bi se moglo postići razvijanjem protokola koji uključuje stabilnu ko-transfekciju ćelija HEK293 sa MesDC-2, čaperonom namenjenim povećanju egzogene LRP5 ekspresije. ýak i tada, tj. pri koekspresiji MesDC-2 tokom generisanja LRP5 stabilne transfektovane ćelijske linije, više puta je primećena nestabilnost ekspresije proteina. To je rezultiralo problemom da se LRP5 ekspresija može izgubiti tokom imunizacije i selekcije. Da bi se rešio ovaj dalji problem, prolaz ćelija koje eksprimiraju LRP5 bio je ograničen što je više moguće i izvršeno je dodatno sortiranje ćelija radi obogaćivanja ćelija koje eksprimiraju LRP5.
Llama su dodatno imunizovane sa DNK koja kodira LRP5 i sa DNK koja kodira LRP6 sa i bez hMesDC-2 čaperona u suprotnim bokovima. Dodatni pojačivači isporučeni su do nekoliko llama u pokušaju da se pojača unakrsno reaktivni imuni odgovor, sa ciljem povećanja šansi za identifikovanje LRP5/LRP6 unakrsno reaktivnih VHH domena.
Uzorci imune krvi (PBL) uzimani su u redovnim intervalima, određivani su odgovori seruma, a ukupna RNK je pripremljena iz izolovanog PBL. Primećeni su srednji serumski odgovori na LRP6, za razliku od niskih serumskih odgovora na LRP5 nakon imunizacije rekombinantnim proteinom. Uočen je srednji imunološki odgovor na LRP5 za llama imunizovane sa DNK. Suprotno tome, primećen je vrlo nizak imunološki odgovor za imunizaciju ćelija. Pored toga, istražene su i sintetičke biblioteke. Ipak, konačno, mogla bi se postići dovoljna raznolikost repertoara za nastavak sledećih koraka, kako je navedeno u Primeru 2.
Primer 2: Izolacija LRP5 i LRP6 vezujućih monovalentnih VHH domena (VHHa)
1
Konstrukcija biblioteke:
Ukupna RNK je ekstrahovana neposredno nakon sakupljanja imunoloških tkiva i verifikovani su integritet i koncentracija RNK. Uzorci cDNK su napravljeni od ovih RNK preparata. Nukleotidne sekvence koje kodiraju VHH su amplificirane iz uzoraka cDNK u jednostepenoj RT-PCR reakciji. Amplikoni od 700 bp, posebno amplificirani iz IgG2 i IgG3 cDNK u uzorku, su izolovani iz agaroza gela i naknadno korišćeni kao šablon u grupisanoj PCR reakciji. PCR proizvodi su naknadno digestirani sa SfiI i BstEII i ligirani u odgovarajuća restrikciona mesta fagemidnog vektora pAX50. Smeše za ligaciju su elektroporirane u Escherichia coli TG-1. Rezultirajući fond transformanta predstavljao je genetsku raznolikost biblioteke fagova za prikaz.
pAX50 je ekspresijski vektor izveden iz pUC119, koji sadrži rezistentni gen za ampicilin i lac promotor koji je praćen kodirajućom sekvencom pIII proteinskog signalnog peptida u okviru sa nizvodnim VHH domenskim mestom kloniranja. U okviru sa VHH kodirajućom sekvencom domena, vektor kodira C terminalni Myc i heksa-histidin oznaku i pIII protein coli faga. Nakon infekcije E. coli TG-1 bibliotečkih klonova sa helper fagom, prisustvo pAX50 omogućava proizvodnju fagnih čestica iz ovih klonova, prikazujući pojedinačne VHH domene kao fuzioni protein sa pIII proteinom.
Selekcija:
VHH domen-fagemid biblioteke su konstruisane i korišćene za selekciju. S obzirom na vrlo visoku homologiju vrsta među vrstama (između llama i humanog LRP5 i LRP6), bilo je neizvesno da li će imuni odgovor podignut u llama podići dovoljnu raznolikost VHH domena. Stoga su dve sintetičke biblioteke korišćene paralelno sa imunološkim bibliotekama tokom selekcije.
Tokom selekcije korišćene su različite strategije, kao što sledi:
- Alternacija iz LRP5 i LRP6 izvedenih alata radi povećanja šansi za identifikovanje LRP5/LRP6 unakrsno reaktivnih VHH domena, na pr. selekcija biblioteka iz imunizovanih LRP5 llama sa proteinima izvedenim iz LRP6 ili upotreba i LRP5 i LRP6 proteina tokom selekcije u sintetičkim bibliotekama.
- Alternacija izvora vrsta za odabir humani/mišiji LRP5/LRP6 unakrsno reaktivnih VHH domena (mišja unakrsna reaktivnost takvih LRP5 i LRP6 antagonista omogućava procenu efikasnosti, odnosno inhibiciju rasta tumora i sigurnosnih profila, potrebnih za
2
procenu terapijskog prozora, u istim predkliničkim modelima (tj. u ksenograftskim tumormiš modelima)).
- Selekcija „u rastvoru“ sa rekombinantnim proteinima da se održavaju epitopi u njihovoj nativnoj konformaciji: Kao dodatna prepreka, utvrđeno je da rekombinantni proteini LRP5 i LRP6 gube svoje pravilno presavijanje ako su direktno obloženi na ELISA vezujućim pločama. Zbog toga su rekombinantni proteini biotinilirani i, nakon potvrđivanja pravilnog savijanja u funkcionalnim testovima, korišćeni su za selekciju „u rastvoru“.
- Selekcije koje koriste ćelije koje prekomerno eksprimiraju LRP5 ili LRP6, da bi imale nativnu konformaciju receptora. Ovo se iznenađujuće ispostavilo kao važan trik, posebno potreban za poboljšanje selekcije veznika za klasu Wnt3a vezujućih domena iz LRP5, jer su funkcionalni podaci rekombinantnog proteina pokazali nedostatak pravilnog presavijanja Wnt3a vezujućeg epitopa.
Primer 3: Skrining monovalentnih VHH
Nakon selekcije, klonovi su uzgajani u pločama sa 96 dubokih bunarčLća (zapremina od 1 ml), a ekspresija VHH je indukovana dodavanjem IPTG. Periplazmatski ekstrakti pojedinačnih klonova pripremljeni su u skladu sa standardnim metodama, kao na pr. prikazanih u WO2011/107507 i ispitani na vezivanje za humane LRP6 i LRP5. U početku su periplazmatski ekstrakti ispitani u ELISA testovima vezivanja pomoću rekombinantnih LRP5 i LRP6, koji predstavljaju osetljive, robusne i visokopropusne testove, u poređenju sa na FACS baziranim testovima vezivanja. Posle prečišćavanja, VHH identifikovani u ELISA testovima su dalje okarakterisani korišćenjem FACS testa vezivanja za potvrđivanje vezivanja prečišćenih VHH za LRP5 i LRP6 receptore u njihovoj nativnoj konformaciji.
Obično se očekuje dobra korelacija između ELISA i FACS testova vezivanja. Međutim, u ovom slučaju, najbolji LRP5 i LRP6 vezujući VHH u ELISA testovima (tj. sa velikim afinitetom za rekombinantne LRP5 ili LRP6 ektodomene) nisu pokazali nikakvo vezivanje ili vrlo slabo vezivanje za humane LRP5 i LRP6 u FACS testu vezivanja, kao što je prikazano na Slici 2 za panel „2“ veznike. Upotreba različitih pufera za oblaganje (dPBS nasuprot bikarbonatnom puferu) i rastvora za blokiranje u ELISA sistemu (Marvel naspram BSA) nisu rešili uočene razlike. Umesto toga, otkriveno je da su vrlo slabi veznici u ELISA pokazala visok afinitet za LRP5 i LRP6 u FACS testovima vezivanja koristeći ćelije koje eksprimiraju LRP5 i LRP6, kao što je prikazano na Slici 2 za panel „1“ veznike. Ovi dalji podaci i eksperimenti su tako omogućili odabir veznika sa visokim afinitetom koji prepoznaju nativnu konformaciju dva receptora. Pored toga, dobijena je potvrda da ovi veznici sa visokim afinitetom prepoznaju epitop zavisan od konformacije, a ne linearni epitop u proteinima LRP5 i LRP6. Ovi dalji ne-rutinski podaci i eksperimenti su na taj način omogućili odabir terapeutski relevantnih LRP5 i LRP6 veznika, koji bi trebalo da imaju visok afinitet prema LRP5 i LRP6, eksprimiranim na plazminoj membrani u njihovoj matičnoj konformaciji.
Prema tome, uprkos (i) niskoj propusnosti FACS testova vezivanja, (ii) manje robusnoj postavci testa i (iii) gore opisanim poteškoćama koje su se naišle zbog gubitka ekspresije rekombinantnog proteina pri pasažiranju ćelija koje prekomerno eksprimiraju LRP5, ovi testovi su naknadno korišćeni za dalju selekciju i karakterizaciju VHH veznika visokog afiniteta. Ukratko, ćelije su inkubirane prečišćenim VHH razblaženjima (serijska razblaženja 1:5 od P1 M do 1 pM, konačne koncentracije) tokom 1,5 sata na 4°C na pločastom šejkeru. Posle petostrukog ispiranja ćelija sa FACS puferom, koji se sastoji od 1x fiziološkog rastvora puferiranog sa fosfatom (PBS) 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS) 0,05% natrijum azida, one su inkubirane 30 minuta do 1 sata na 4°C sa poliklonalnim mišjim antitelom koje se vezuje za VHH okvirne regione i, na taj način, vezuje se za sve testirane LRP5 i/ili LRP6 veznike. Posle trostrukog ispiranja ćelija sa FACS puferom, ćelije su inkubirane 30 minuta do 1 sata na 4°C sa obeleženim sekundarnim antitelom (anti-mišji PE), što je praćeno sa korakom 3x ispiranja sa FACS puferom. Fluorescencija je merena korišćenjem FACS niza (BD).
Identifikovano je ukupno stotinu LRP5/LRP6 unakrsno reaktivnih VHH porodica/klastera iz imunoloških biblioteka i iz sintetičkog porekla, na osnovu FACS podataka vezivanja i analize sekvence. Njihovi reprezentativni primeri su prikazani i definisani sa njihovim sekvencama dalje u nastavku. VHH su eksprimirani u E.coli i prečišćeni. U slučaju da se ekspresija u E.coli pokaže nedovoljnom, VHH su proizvedeni u Pichia pastoris. Kratki opis ekspresije i prečišćavanja VHH dat je dalje u nastavku.
Generička ekspresija VHH u E.coli:
Kodirajuće sekvence su klonirane u pAX100 ekspresijski vektor i eksprimirane u E.coli kao c-Myc heksa-histidin-obeleženi proteini. ûelije E.coli TG-1 koje sadrže VHH konstrukte od interesa uzgajane su (37 °C, 250 rpm) u šejkiranim bocama u TB medijumu obogaćenom kanamicinom i indukovane dodavanjem 1 mM IPTG za
4
ekspresiju. Posle odvajanja ćelijskih kultura, pripremljeni su periplazmatski ekstrakti zamrzavanjem-odmrzavanjem peleta i resuspendovanjem u dPBS.
Generička ekspresija VHH u Pichia (P.) pastoris:
Kodirajuće sekvence su klonirane u pAX159 ekspresijski vektor i eksprimirane u P. pastoris kao c-Myc heksa-histidin-obeleženi proteini. ûelije P. pastoris X-33 koje sadrže VHH konstrukte od interesa su uzgajane (30 °C, 250 rpm) u BGCM (puferisani glicerolkompleksni medijum; invitrogen). Trećeg dana, medijum je prebačen u BMCM (puferisani metanolni kompleksni medijum; invitrogen) i kultura je dalje uzgajana i redovno je indukovana dodavanjem 0,5 vol.% metanola (100%). Posle izdvajanja ćelijske kulture sakupljen je supernatant (koji sadrži izlučeni VHH).
VHH prečišćavanje:
Heksa-histidinom označeni VHH-ovi su prečišćeni na Tecan EVO150 uz pomoć metal imobilisane afinitetne hromatografije (RoboColumns 100ul Nickel Sepharose<TM>6 FF, Atoll), eluirani iz kolone sa 250mM imidazola i potom desalinirani prema dPBS. ýistoća i integritet VHH su verifikovani uz pomoć SDS-PAGE i/ili vestern blotom koristeći anti-Myc i anti-VHH detekciju.
Primer 4: In vitro karakterizacija prečišćenih monovalentnih VHH
Nakon VHH skrininga, prečišćeni VHH koji imaju visok afinitet prema ćelijama koje eksprimiraju LRP5 i LRP6 su okarakterisani upotrebom nekoliko funkcionalnih i biofizičkih testova kako je opisano u nastavku:
4.1 Potencijal vezivanja LRP5 i LRP6 i unakrsna reaktivnost: FACS-bazirani DKK1 test kompeticije
Tokom karakterizacije LRP5/LRP6 unakrsno reaktivnih monovalentnih VHH, primećeno je da podaci dobijeni u FACS testu vezivanju nisu uvek u korelaciji sa potencijom primećenom u Wnt1 i Wnt3a reporter testovima, najverovatnije zbog brzog vremena zadržavanja nekih VHH. Zbog toga je trebalo uspostaviti ovaj dodatni test (tj. DKK1 kometitivni FACS), koji se pokazao pouzdanijim za određivanje selektivnosti i potencijala vezivanja i za poređenje između LRP5 i LRP6 vezivanja. Cilj je bio odabrati funkcionalne VHH-ove koji se vezuju za LRP5 i LRP6 sa sličnom snagom, kako bi se postigla blokada oba receptora u istoj koncentraciji. Identifikovani Wnt1 i Wnt3a funkcionalni VHH su tako okarakterisani u DKK-1 kompetitivnom FACS na sledeći način:
Za FACS zasnovani test DKK1 kompeticije, korišćene su HEK293 ćelije sa stabilnom prekomernom ekspresijom humanog LRP5 ili humanog LRP6. Humani rekombinantni DKK1 (rhDKK1 - R&D Systems, Cat 5439-DK/CF) je dodat ćelijama uz konstantnu konačnu koncentraciju od 1 nM. ûelije su inkubirane sa razblaženjima rhDKK1 i LRP5 i/ili LRP6 veznika (serijsko razblaživanje prečišćenih VHH 1:5) tokom 1,5 sata na 4 °C na pločastom šejkeru. Posle ispiranja ćelija tri puta sa FACS puferom, one su inkubirane sa biotiniliranim kozjim anti-humanim DKK1 (R&D Systems, Cat BAF1096) tokom 30 minuta na 4 °C na pločastom šejkeru. Posle ispiranja ćelija tri puta sa FACS puferom, one su inkubirane sa Streptavidin PE (BD Biosciences, Cat 554061) tokom 30 minuta do 1 sata na 4 °C na pločastom šejkeru u mraku. ûelije su isprane dva puta sa FACS puferom i merena je fluorescencija korišćenjem FACS niza (BD) a MCF vrednosti su zabeležene.
2čekuje se da će se LRP5/LRP6 unakrsno reaktivni VHH nadmetati sa humanim DKK1 za vezivanje za HEK293 prekomerno eksprimirijućim humanim LRP5, kao i za vezivanje za HEK293 prekomerno eksprimirijućim humanim LRP6. Suprotno tome, LRP5 specifični VHH bi se takmičio sa humanim DKK1 za vezivanje za HEK293 ćelije koje prekomerno eksprimiraju humani LRP5, ali ne, ili sa vrlo niskom snagom (> 200nM) za vezivanje za HEK293 ćelije koje prekomerno eksprimiraju humani LRP6 (a isto bi važilo i obrnuto, za LRP6 specifične VHH). Kao rezultat ovog eksperimenta moglo bi se pokazati da su se prisutni LRP5/LRP6 unakrsno reaktivni VHH takmičili sa humanim DKK1 za vezivanje za HEK293 ćelije koje prekomerno eksprimiraju humani LRP5, kao i za one koje prekomerno eksprimiraju humani LRP6 (tj. smanjenje vrednosti MCF sa porastom koncentracija veznika sa potpunom inhibicijom DKK1 vezivanja odgovarala je 60 MCF vrednosti pri najvišoj ispitivanoj koncentraciji).
4.2 Unakrsna reaktivnost vrsta: miš i cinomolgni majmun
Da bi se utvrdilo da li je izabrani panel LRP5/LRP6 unakrsno reaktivnih VHH uspeo da se veže za LRP5 i LRP6 porekla iz miša i cinomolgnog majmuna, DKK1 kompetitivni FACS je izveden na sledeći način:
Serijska razblaženja VHH su inkubirana sa HEK293 ćelijama koje stabilno eksprimiraju mišji LRP5, cino LRP5, mišji LRP6 ili cino LRP6 u prisustvu 1 i 0,3 nM hDKK1 (koncentracija ispod EC50 vrednosti za mišji i cino, respektivno). Vezivanje DKK1 za ćelije je detektovano korišćenjem biotinilovanog anti-DKK1 antitela sa Streptavidin-PE kao sekundarnom detekcijom, kao što je gore opisano. Kao rezultat, takva unakrsna reaktivnost bi mogla biti pokazana.
4.3 Binovanje epitopa
Izvedeni su eksperimenti binovanja za najpotentnije LRP5/LRP6 unakrsno reaktivne VHH koji blokiraju Wnt1 signalizaciju, da bi se identifikovale različite epitopski binovi. Konkretno, pojedinačni VHH analizirani su na njihovu sposobnosti da se takmiče sa drugim biotinilovanim VHH (zvanim referentni VHH) za LRP5 i LRP6 vezivanje receptora korišćenjem testova zasnovanih na FACS. Serijska razblaženja pojedinačnih VHH inkubirana su na HEK293, stabilno eksprimirajući humani LRP5 ili LRP6, zajedno sa 200 pM ili 500 pM biotinilovanog referentnog VHH (koncentracije ispod vrednosti EC50). Vezivanje biotiniliranog referentnog VHH za ćelije je detektovano upotrebom streptavidin-PE. VHH koji se takmiči sa referentnim VHH za vezivanje za LRP5 i LRP6 pokazuje smanjenje u fluorescenciji izmerenoj pomoću FACS niza.
Kao rezultat ovih eksperimenata, blokatori Wnt1 mogli bi se svrstati u tri bina. Za blokatore Wnt3a, niži afinitet VHH ne dozvoljava izvođenje eksperimenata binovanja epitopa.
4.4 Wnt1 i Wnt3a reporter test
Sposobnost LRP5/LRP6 unakrsno reaktivnih VHH da inhibiraju Wnt signalizaciju testirana je u funkcionalnim Wnt1 i Wnt3a testovima. Takođe u vezi s tim, nije mogao da se koristi uspostavljeni protokol, ali trebalo je pokušati nekoliko pokušaja uspostavljanja biohemijskih funkcionalnih testova, kao što su Wnt1/Wnt3a – LRP5 / LRP6 testovi blokiranja: Pored poteškoća sa kojima se susreću rekombinantni LRP5 i LRP6 proteini (videti Primer 1), funkcionalni rekombinantni Wnt1 ligand (uključujući komercijalno dostupan) nije dostupan. Wnt proteini sadrže mnogo konzervisanih cisteina i modifikovani su sa mono-nezasićenom masnom kiselinom (palmitoleinska kiselina), koja je vezana za konzervisani serin. Ove post-translacione modifikacije su potrebne za efikasnu signalizaciju i za Wnt sekreciju. Strukturne analize pokazuju da je jedan od domena, koji sadrži lipid palmitoleinske kiseline, potreban za vezivanje za Frizzled receptore, što dovodi do konformacione promene koja omogućava interakciju Wnt liganda sa LRP5 i LRP6 na površini ćelije. Tako se ispostavilo da je takva posttranslaciona modifikacija potrebna za funkcionalne studije koje uključuju ovaj protein, ali istovremeno takve post-translacione modifikacije zasnovane na lipidima čine ove proteine vrlo teškim za ekspresiju i prečišćavanje (niska rastvorljivost). Stoga se ispostavilo da je ovo glavna prepreka za biohemijske testove.
Tako je razvijen funkcionalni test na ćelijskoj bazi za karakterizaciju prečišćenih VHH-ova: Wnt beta-laktamazni reporter test. Naročito za inhibiciju Wnt1 puta, CellSensor LEF/TCF-bla FreeStyle 293F ćelije (Invitrogen, Cat. K1677) su transfektovane sa humanim Wnt1, a izabrani su klonovi sa stabilnom prekomernom ekspresijom humanih Wnt1. Za ispitivanje inhibicije Wnt3a puta, generisane su CellSensor LEF/TCF-bla FreeStyle 293F ćelije sa stabilnom prekomernom ekspresijom humanog Wnt3a.
CellSensor® LEF/TCF - bla FreeStyle™ 293 ćelijska linija sadrži beta-laktamazni reporter gen pod kontrolom Wnt inducibilnog LEF/TCF promotora, koji je stabilno integrisan u FreeStile™ 293 ćelije (Invitrogen). Ekspresija Wnt1 ili Wnt3a u ovim ćelijama rezultira konstitutivnom ekspresijom i, prema tome, enzimskom aktivnošću betalaktamaze. Stoga se očekuje da će tretman sa LRP5/LRP6 unakrsno reaktivnim funkcionalnim VHH-ovima dovesti do inhibicije Wnt1 i Wnt3a puta što dovodi do inhibicije enzimske aktivnosti beta-laktamaze.
Za ispitivanje, 1E06 / ml ćelija sa prekomernom ekspresijom Wnt1 ili Wnt3a posejane su u ploču za kulturu tkiva sa 384 bunarčLća i inkubirane su preko noći na 37 °C. Sledećeg dana su pripremljena serijska razblaženja različitih LRP5/LRP6 unakrsno reaktivnih VHH rastvora i dodata ćelijama u prisustvu LiCl u konačnoj koncentraciji od 10 nM. DKK1, kao pozitivna kontrola, dodat je ćelijama u konačnoj koncentraciji od 200 nM. DKK1 tretman rezultirao je potpunom inhibicijom Wnt1 i Wnt3a puta, a samim tim i potpunom inhibicijom enzimske aktivnosti beta-laktamaze. ûelije su inkubirane preko noći na 37 °C. Sledećeg dana izmerena je enzimska aktivnost beta-laktamaze u skladu sa uputstvima proizvođDča (Invitrogen, Cat K1085). Za emisiju fluorescencije, vrednosti pri 460 nm i 530 nm su dobijene korišćenjem standardnog čitača fluorescentnih ploča i 460/530 nm emisioni odnosi su ucrtani za naznačeni tretman. Efikasnost je izračunata naspram pozitivne kontrole (DKK1; finalna koncentracija 200 nM).
Ukupno je odabrano dvanaest LRP5/LRP6 unakrsno reaktivnih Wnt1 blokatora sa potpunom efikasnošću i snagom boljom od 50 nM. Identifikovano je četrnaest unakrsno reaktivnih blokatora Wnt3a, uglavnom sa niskom potencijom. Samo jedan Wnt3a blokator pokazao je dobru potenciju (ispod 5nM).
4.5 Testovi fosforilacije Wnt1 i Wnt3a
Najpotentniji i najefikasniji lideri iz svakog bina za Wnt1 blokatore i najpotentniji i najefikasniji Wnt3a blokatori su naknadno testirani u Wnt1 i Wnt3a zavisnih LRP5 i LRP6 testovima fosforilacije. Cellsensor LEF/TCF 293F ćelije iz Invitrogena (cat K1677), koje su ko-transfektovane sa ekspresijskim vektorima koji kodiraju ili Wnt1 ili Wnt3a, korišćene su u testovima fosforilacije. Pošto formiranje kompleksa Wnt-Frizzled-LRP5 ili -LRP6 rezultira fosforilacijom LRP5 ili LRP6 i posledično signalizacijom nizvodno, kvantifikacija fosforilacije može se koristiti za merenje takve signalizacije. Da bi se dobilo specifično očitavanje za LRP5 i LRP6, ćelije su lizirane i izvršena je imuno-precipitacija sa nekim LRP6 ili LRP5 selektivnim antitelom (usmerenim na intraćelijski domen dva receptora). U Western blot-u, fosforilisani LRP6 ili LRP5 je detektovan upotrebom poliklonalnog anti-fosfo-LRP6 (Ser1490) antitela (Cell Signaling Technology), koji detektuje i LRP6 i LRP5 fosforilisani protein. Odabrani panel prečišćenih Wnt1 i Wnt3a blokirajućih VHH, koji sadrži najmanje jedan reprezentativni VHH iz svakog bina, testiran je u konačnim koncentracijama od 10 do 100 nM. Konkretno, ćelije su inkubirane preko noći u prisustvu blokirajućih VHH pre lize ćelija i LRP5 i LRP6 imuno-precipitacije.
Efikasnost Wnt1 i Wnt3a blokirajućih VHH u blokiranju LRP5 i LRP6 fosforilacije izračunata je kvantifikacijom Western blot traka u odnosu na pozitivnu kontrolu (DKK1, finalna koncentracija od 1 uM).
4.6 Biofizička karakterizacija
LRP5/LRP6 unakrsno reaktivni VHHovi su dalje okarakterisani za ekspresiju i prečišćavanje u E. coli i u Pichia pastoris, kako je navedeno u Primeru 3. Konkretno, prinosi ekspresije za monovalentne VHH vodeće panele smatrani su prihvatljivim ako su bili iznad 0,1 mg/L. Odabrani LRP5/LRP6 unakrsno reaktivni VHH-ovi pokazali su ekspresiju u rasponu od 0,1 do 8,2 mg/L kod E. coli i većem kod Pichia pastoris (> 1 mg/L). Ekspresija je procenjena SDS-PPAGE analizom.
Termička stabilnost monovalentnih LRP5/LRP6 unakrsno reaktivnih VHHova utvrđena je u testu termičkog pomeranja na osnovu fluorescencije (TSA) korišćenjem Lightcycler (Roche). VHH-ovi su inkubirani na različitim pH vrednostima u prisustvu Sypro Orange i primenjen je gradijent temperature. Nakon odvijanja izazvanog toplotom, izlažu se hidrofobna mesta proteina na koje se vezuje Sypro Orange što rezultira povećanjem intenziteta fluorescencije (Ex/Em = 465/580nm). Tačka pregiba prvog derivata krive intenziteta fluorescencije služi kao mera temperature topljenja (Tm). Za sve VHH-ove, Tm se povećavao sa porastom pH i zaravnio na pH 6, što je tipičan Tm obrazac viđen za VHH-ove. Dobijeno je prosečno 82 °C pri pH 7 za LRP5/LRP6 unakrsno reaktivne Wnt1 blokirajuće VHH i Wnt3a blokirajuće VHH.
Potencijalna pojava agregacije i multimerizacije za LRP5 i LRP6 VHHove ispitivane su analitičkom hromatografijom za isključivanje veličine (SEC). U tu svrhu ubrizgano je 8 ug prečišćenog uzorka VHH u količini od 0,5 mg/ml putem Dionex Ultimate 3000 opreme na Agilent SEC-3 koloni. Kao mobilna faza korišćen je L-arginin pufer (10 mM fosfata, 300 mM Arg-HCl, pH 6,0) i primenjena je brzina protoka od 1 ml/min. Nijedan od LRP5/LRP6 VHHova nije pokazao velike probleme sa agregacijom tokom SEC analize: profili su pokazali više od 95% monomera za većinu uzoraka.
Primer 5: Generisanje i karakterizacija za poluživot produženih biparatopskih konstrukta
LRP5/LRP6 unakrsno reaktivni Wnt1 i Wnt3a VHHovi su korišćeni kao gradivni blokovi za generisanje biparatopskog konstrukta kao što je prikazano na Slici 1.
Genetička fuzija serum albumin vezujućeg VHH je korišćena kao metodologija produženja poluživota. Tri gradivna bloka (Wnt1 blokator, Wnt3a blokator i albumin veznik) povezani su fleksibilnim veznikom. VHH su proizvedeni u P. pastoris i prečišćeni kako je opisano u Primeru 3. Dobijeni konstrukti, tj. biparatopski, za poluživot produženi LRP5/LRP6 unakrsno reaktivni VHH konstrukti, klonirani su u P. pastoris ekspresioni vektor pAX159, u obliku C-terminalnog cMyc-heksa-histidin označenočenog VHH konstrukta, u skladu sa standardnim procedurama kao na pr.opisanim u WO2012/131078. Različita orijentacija gradivnih blokova i različiti spojni elementi, naročito GS-veznici su istraženi. Odabran je relativno dugačak GS-veznik, na osnovu podataka modelovanja koji odražavaju proširenu površinu između potencijalnih Wnt1 i Wnt3a mesta vezivanja u LRP6 (tj. beta-propeleri 1 i 2 nisu u neposrednoj blizini betapropelera 3). Najbolji rezultati u pogledu potencije u kombinovanom Wnt1 i Wnt3a reporter testu dobijeni su stavljanjem humani serum albumin/HSA vezujući VHH u sredinu. Korišćen je 35 GS veznik i Wnt1 i Wnt3a VHH blokatori raspoređeni u željenom redosledu.
Za selekciju optimalnih VHH veznika i kombinacija veznika, generisana je biblioteka gde je za humani serumski albumin (HSA) vezujući VHH smešten između LRP5/LRP6 Wnt1-Wnt3a blokatora. Konkretno, panel veznika visokog afiniteta sa visokom potencijom i efikasnošću u Wnt1 ili Wnt3a testovima (reporter i testovi fosforilacije) korišćeni su u biblioteci za generisanje za poluživot produženih biparatopskih konstrukta dizajniranih kao što je prikazano na slici 1. Nakon ekspresije u Pichia pastoris (kao što je opisano u Primeru 3), nakon čega sledi prečišćavanje, za poluživot produženi biparatopski konstrukti su naknadno ispitani u Wnt1 i Wnt3a reporter testovima (opisanim u Primeru 4) u prisustvu 30 uM HSA u tri razblaženja (1/100, 1/1000, 1/7000), da bi se procenila efikasnosti i relativna potencija. Generalno, primećena je dobra korelacija između podataka u Wnt1 i Wnt3a reporter analizama i visoka efikasnost je izmerena za brojne formate. Ukupno 11 za poluživot produženih biparatopskih LRP5 i LRP6 konstrukta je odabrano za dalju karakterizaciju, uzimajući u obzir efikasnost u oba reporter testa i raznolikost Wnt1 i Wnt3a blokatora. Ovi dalji testovi karakterizacije opisani su u nastavku.
Wnt1 / Wnt3a reporter analize:
Wnt1 i Wnt3a reporter analize izvedene su kako je opisano u Primeru 4.4, u prisustvu 30 uM HSA u konačnoj koncentraciji. Prečišćeni biparatopski LRP5/LRP6 konstrukti su testirani u 12 razblaženja, počev od 2,5 uM.
Većina konstrukata pokazala je visoku potentnost - u rasponu od 1,7 nM do 0,16 nM - i potpunu efikasnost u oba reporter testa, kao što je prikazano u Tabeli IV dole. Sekvence pojedinačnih Wnt1 i Wnt3a inhibirajućih VHH domena koje su tamo izložene, date su u Tabeli V ispod:
Tabela IV: Potencija i efikasnost odabranih za poluživot produženih biparatopskih LRP5/LRP6 unakrsno reaktivnih VHH konstrukata u reporter testovima u prisustvu HSA
1
Tabela V: Sekvence VHH domena prikazanih u Tabeli IV
2
4
(Napomena: Molekuli opisani u ovoj tabeli V uključuju myc-heksa-histidin oznaku (podvučena), kako bi se omogućilo lakše prečišćavanje rekombinantno eksprimiranih polipeptida; ova oznaka nije potrebna za - niti obično ometa - vezivanje molekule do njihovih ciljeva)
Primer 6: Optimizacija sekvence VHH i VHH konstrukti
Optimizacija sekvence je proces u kome je roditeljska sekvenca mutirana da bi postala identičnija konsenzusnoj sekvenci humane zametne linije IGHV3-IGHJ. Na primer, specifične aminokiseline u okvirnim regionima (sa izuzetkom takozvanih ostataka oznaka) zamenjuju se za svoje humane pandane, na način da treba da se očuva struktura, aktivnost i stabilnost proteina.
Ove mutacije mogu se kategorisati na sledeći način:
1. Standardne : Ne očekuje se da će optimizacija sekvence ovih položaja dramatično promeniti stabilnost ili aktivnost ili afinitet VHH i zbog toga se menjaju odjednom, dajući osnovnu varijantu.
2. Jedinstvene: Nije poznato da li optimizacija sekvence ovih položaja utiče na stabilnost ili aktivnost ili afinitet VHH, pa se stoga istražuju na pojedinačnoj osnovi povrh osnovne varijante.
Poznato je da su ostaci oznaka presudni za stabilnost, aktivnost i afinitet VHH i stoga nisu mutirani.
Pored toga, aminokiseline prisutne u CDR-ima za koje postoje eksperimentalni dokazi da su osetljive na post-translacione modifikacije (PTM) izmenjene su na takav način da je PTM mesto inaktivirano dok će struktura, aktivnost i stabilnost proteina ostati netaknuti. Najčešće post-translacione modifikacije opisane za antitela i VHH navedene su u Tabeli VI ispod. Osetljivost VHH za post-translacione modifikacije analizirana je u studijama ubrzanog stresa, primenjujući nekoliko standardnih uslova, uključujući tretman sa H2O2za analizu oksidacije metionina, visoke temperature, visoki pH i dugo skladištenja za proučavanje deamidacije asparagina i izomerizacije aspartata. Procenat oksidacije, deamidacije i izomerizacije izmeren je u skladu sa standardnim postupcima i upoređen sa referentnim uzorcima (VHH čuvani na -20 °C). Analiza celog proteina u reverzno faznoj hromatografiji (RPC) i mapiranje peptida primenom masene spektrometrije (MS) izvedeni su da bi se identifikovali potencijalno senzitivni ostaci. U slučaju posttranslacionih modifikacija zabeleženih u VHHovima nakon testa otpornosti na stres, odgovarajuća aminokiselina(e) su mutirane.
Tabela VI: Potencijalne post-translacijske modifikacije i motivi koji ih potencijalno mogu pokrenuti
Kao rezultat, nekoliko mutacija je uvedeno u gore navedene konstrukte, što je rezultiralo i.a. u tri konstrukta prikazana u Tabeli III gore, koji su odabrani za dalju karakterizaciju in vitro i in vivo, kako je izloženo u Primerima dalje u tekstu.
Primer 7: In vitro karakterizacija tri za poluvreme produžena biparatopska LRP5/LRP6 unakrsno reaktivna VHH konstrukta; Poređenje sa drugim LRP6 vezujućim molekulima
Nakon optimizacije VHH sekvence, tri za poluvreme produžena biparatopska LRP5/LRP6 unakrsno reaktivna VHH konstrukta su rekombinantno eksprimovana i prečišćena, i okarakterisana su upotrebom nekoliko funkcionalnih i biofizičkih testova kako je opisano u nastavku.
7.1 FACS vezujući testovi
Vezivanje za humani LRP5 i LRP6 određeno je na ćelijama FACS analizom, kako je navedeno u Slikama 3A i 3B. Konkretno, vezivanje za humani LRP5 je testirano na ćelijama HEK293 sa stabilnom prekomernom ekspresijom humanog LRP5. Za vezivanje za humani LRP6, korišćene su ćelije HEK293 sa stabilnom prekomernom ekspresijom humanog LRP6. ûelije su inkubirane sa razblaženjima LRP5 i LRP6 veznika (serijsko razblaživanje veznika 1:5 koje odgovara konačnim koncentracijama naznačenim na slici 3A i slici 3B) tokom 1,5 sata na 4°C na pločastoj tresilici. Nakon ispiranja ćelija 5 puta sa FACS puferom (1x PBS (Invitrogen kat. br.141190-094) 10% FBS (Sigma kat. br. F7524) 0,05% natrijum azida), one su inkubirane 1 sat na 4 °C sa poliklonalnim mišjim antitelom koje se vezuje za okvirne regione VHH. Posle ispiranja ćelija 3 puta sa FACS puferom, ćelije su inkubirane 1 sat na 4 °C sa obeleženim sekundarnim antitelom (antimiš PE (115-116-071), što je praćeno sa 3 puta ispiranjem sa FACS puferom.
Fluorescencija je merena korišćenjem FACS niza (BD). Vezivanje za humani LRP5 i LRP6 odgovara 600 MCF vrednosti u najvišoj ispitivanoj koncentraciji. Negativna kontrola sastojala se od neciljajućeg veznika (VHH konstrukt koji se vezuje za bakterijski protein koji nije eksprimiran u HEK293 ćelijama). Kao što je prikazano na Slici 3A, odnosno Slici 3B, vezivanje za humani LRP5 i LRP6 odgovara 600 MCF, i 1600 MCF, vrednostima, respektivno, pri najvišim ispitivanim koncentracijama tri za poluživot produžena biparatopska LRP5/LRP6 unakrsno reaktivna VHH konstrukta. Ovi podaci potvrđuju da se formatirani, biparatopski i molekuli vezivanja sa optimizovanom sekvencom vezuju i za humani LRP5 i za humani LRP6 u njihovoj nativnoj konformaciji u ćelijskom sistemu za ispitivanje. EC50 vrednosti vezivanja za hLRP5 i hLRP6 su prikazane u Tabeli VII dole.
Tabela VII: EC50vrednosti vezivanja za humani LRP5 i LRP6 određene FACS testovima vezivanja
7.2 FACS - DKK1 test kompeticije
Potencijal i efikasnost tri LRP5/LRP6 unakrsno reaktivna VHH konstrukta dalje su analizirane pomoću FACS baziranog DKK1 testa kompeticije, kao što je opisano u Primeru 4.1. HEK293 ćelije sa stabilnom prekomernom ekspresijom humanog LRP5 ili humanog LRP6 inkubirane su serijskim razređivanjem LRP5/LRP6 unakrsno reaktivnih VHH konstrukta (1:5 serijsko razređivanje koje odgovara konačnim koncentracijama naznačenim na Slici 4A i Slici 4B). LRP5/LRP6 unakrsno reaktivni VHH su u kompeticiji sa humanim DKK1 za vezivanje za HEK293 ćelije koje prekomerno eksprimiraju humani LRP5, kao i za vezivanje za HEK293 ćelije koje prekomerno eksprimiraju humani LRP6, kao što je prikazano u Slikama 4A i 4B, respektivno. Potpuna inhibicija DKK1 vezivanja postignuta je pri najvišim ispitivanim koncentracijama ( 10 nM) i odgovarala je vrednostima MCF 60. Za razliku od njih, za LRP5 specifičan VHH bi bio u kompeticiji sa humanim DKK1 za vezivanje za HEK293 ćelija koje prekomerno eksprimiraju humani LRP5, ali ne ili sa vrlo niskom potencijom (> 200 nM) za vezivanje za HEK293 ćelija koje prekomerno eksprimiraju humani LRP6 (a isto bi se primenjivalo i obrnuto, za LRP6 specifične VHH). Kao rezultat ovog eksperimenta, moglo bi se pokazati da su prisutni LRP5/LRP6 unakrsno reaktivni VHH u kompeticiji sa humanim DKK1 za vezivanje za HEK293 ćelije koje prekomerno eksprimiraju humani LRP5, kao i za one koje prekomerno eksprimiraju humani LRP6 (tj. smanjenje vrednosti MCF sa porastom koncentracija veznika sa potpunom inhibicijom DKK1 vezivanja odgovarala je 60 MCF vrednosti pri najvišoj ispitivanoj koncentraciji). IC50 vrednosti u DKK1 kompeticiji za vezivanje za hLRP5 i hLRP6 tri LRP5/LRP6 unakrsno reaktivna VHH konstrukta prikazane su u Tabeli VIII dole. Ovi podaci su potvrdili vezivanje tri LRP5/LRP6 unakrsno reaktivna VHH konstrukta za humani LRP5 i humani LRP6 i pokazali su vrlo sličan afinitet (ovde definisan pomoću IC50 vrednosti potencije u DKK1 testu kompeticije) između dva receptora. Dalje, podaci jačaju predstavu da se formatirani, biparatopski i molekuli vezivanja sa optimizovanim sekvencama vezuju za humani LRP5, kao i za humani LRP6, u svojoj nativnoj konformaciji.
Tabela VIII: IC50vrednosti za DKK1 konpeticiju za vezivanje za humani LEP5 i LRP6 utvrđene uz pomoć FACS testova vezivanja
7.3 Kombinovani Wnt1 i Wnt3a reporter test
Potencija i efikasnost formatiranih, biparatopskih i molekula vezivanja sa optimizovanom sekvencem su analizirani korišćenjem Wnt1 i Wnt3a kombinovanog reporter testa kako bi se omogućilo funkcionalno testiranje i Wnt1 i Wnt3a blokatora u istom testu.
Kombinovani Wnt1 i Wnt3a reporter test zasnovan je na testu opisanom u Primeru 4.4 sa sledećim promenama u protokolu.1E06 / ml ćelija sa prekomernom ekspresijom Wnt1, posejane su u ploče zs kulturu tkiva sa 384 bunarčLća gde su tretirane su rekombinantnim humanim Wnt3a (rec.human Wnt3a: R&D #5036-WN/CF) u konačnoj koncentraciji od 500 ng/ml, a zatim su ćelije inkubirane preko noći na 37 °C. Sledećeg dana su pripremljena serijska razblaženja različitih LRP5/LRP6 biparatopskih unakrsno reaktivnih VHH rastvora koji su dodati ćelijama u prisustvu LiCl u konačnoj koncentraciji od 10 nM. DKK1, kao pozitivna kontrola, dodat je ćelijama u konačnoj koncentraciji od 200 nM. Tretman sa DKK1 rezultirao je potpunom inhibicijom kombinovanog Wnt1 i Wnt3a puta, a samim tim i potpunom inhibicijom enzimske aktivnosti beta-laktamaze. ûelije su inkubirane preko noći na 37 °C. Sledećeg dana izmerena je enzimska aktivnost beta-laktamaze u skladu sa uputstvima proizvođDča. Kao što je navedeno u Primeru 4.4., za emisiju fluorescencije, vrednosti na 460 nm i 530 nm su dobijene korišćenjem standardnog fluorescentnog čitača ploča i 460/530 nm emisioni odnosi ucrtani su za navedeni tretman. Vrednost odnosa fluorescencije [460/535nm] prijavljene kao „bazna linija“ na slici 5A odgovara potpunoj inhibiciji Wnt1 i Wnt3a puta, utvrđenoj tretmanom sa pozitivnom kontrolom (DKK1; finalna koncentracija 200 nM). Vrednost odnosa fluorescencije [460/535nm] prijavljena kao „Wnt1“ odgovara samo aktivaciji Wnt1 puta, utvrđenog iz ćelija sa prekomernim ekspresijom Wnt1 (tj. bez tretmana sa rekombinantnim humanim Wnt3a). Vrednost odnosa fluorescencije [460/535nm] prijavljena kao „Wnt1 Wnt3a“ odgovara kombinovanoj aktivaciji Wnt1 i Wnt3 puteva, utvrđenih tretmanom ćelija sa prekomernim ekspresijom Wnt1 rekombinantnim humanim Wnt3a. Kao što je prikazano na Slici 5A, potpuna inhibicija (tj. odnos fluorescencije [460/535nm] koji odgovara baznoj liniji) postiže se tretmanom sa tri LRP5/LRP6 unakrsno reaktivna, formatirana, biparatopska i molekula vezivanja sa optimizovanom sekvencem. Dalje, takođe se izveštava o visokoj potenciji, kao što je prikazano u Tabeli IX ispod sa IC50 vrednostima.
Tabela IX: IC50vrednosti inhibicije Wnt1 i Wnt3a puta u kombinovanom Wnt1 i Wnt3a reporter testu
Dalje, potencija i efikasnost molekula LRP5/LRP6 unakrsno reaktivnih, formatiranih, biparatopskih i molekula za vezanje sa optimizovanim sekvencama upoređeni su sa prethodno otkrivenim molekulima vezivanja LRP6, prijavljenim u WO2011/138391 i WO2011/119661:
U WO2011/138391 su otkrivena multivalentna antitela koja se vezuju za LRP6 i inhibiraju interakciju liganda i propelera 1 (na pr. Wnt1) i propelera 3 (na pr. Wnt 3). Ova multivalentna LRP6 vezujuća antitela su biparatopični LRP6 vezujući molekuli koji se sastoje od IgG antitela kao prvog receptor vezujućeg domene i od scFv fragmenta kao drugog receptor vezujućeg domena, gde su IgG antitelo i scFv fragment veznikom povezani zajedno. U WO2011/138391 je prijavljeno da svi LRP6 vezujući molekuli imaju približno istu potenciju u Wnt1 i Wnt3a reporter testu (Slika 18 iz WO2011/138391). Prema tome, bilo koji od tih multivalentnih LRP6 vezujućih molekula može biti izabran za uporedne eksprimese. Stoga je odlučeno da se „901“ konstrukt (koji se naziva MOR08168IgG1LALA 6475 scfv; takođe prikazan na Slici 27 iz WO2011/138391) koristi kao prvo uporedno jedinjenje.
Derivati ovog "901" konstrukta prikazani su u WO2013/067355. Konkretno, otkrivena su jedinjenja nazvana 801T i 802T (cf. otkriće na str.132 specifikacije), koja oba imaju dva LRP6 vezujuća scFv domena, plus za poluživot produženi ostatak. Kako se čini da 801T i 802T imaju iste in vitro potenciju i biofizičke karakteristike, samo jedna od njih -varijanta 802T - bila je uključena u eksperimente opisane u nastavku.
U WO2011/119661, su otkrivena bispecifična antitela koja se vezuju za LRP6 i inhibiraju signalizaciju pomoću višestrukih Wnt izoformi. Ova bispecifična anti- LRP6 se vezuju se na dva različita regiona u LRP6 i inhibiraju signalizaciju indukovanu sa Wnt izoformama, među kojima su Wnt1 i Wnt3a. Za izgradnju ovih bispecifičnih anti-LRP6 antitela korišćen je inženjering „knobs-u-holes“ (Atwell et al. “Stable heterodimers from remodeling the domen interface of a homodimer using a phage display library”. J Mol Biol.1997;
270(1):26-35). Primer 11 iz WO2011/119661 otkriva IgG hibrid sa YW211.31.62 i YW210.09 heterodimerima teškog lanca. Dakle, za uporedne svrhe, dva bispecifična IgG hibridna antitela sa heterodimerima teškog lanca YW211.31.62 and YW210.09 su generisana uz pomoć inženjerske tehnologije knobs-u-holes, tj. sa promenama aminokiselina projektovanim da stvore čvor na CH3 teškog lanca u YW210.09 i rupu na CH3 teškog lanca YW211.31.62 ili obrnuto, i ovde se nazivaju Knob HC YW210.09 i Knob HC YW211.31.62. Ova dva konstrukta su okarakterisana u Wnt1 i Wnt3a reporter testovima u skladu sa Primerom 4.4. Kao što se očekivalo, dva bispecifična IgG hibrida sa heterodimerima teškog lanca YW211.31.62 i YW210.09 pokazali su slične potencijale u Wnt1 i Wnt3a testovima, kako je navedeno u Tabeli X dole. Dakle, za uporedne primere prikazane dalje u nastavku, Knob HC YW210.09 je izabran kao drugo uporedno jedinjenje.
Tabela X: IC50vrednosti inhibicije Wnt1 i Wnt3a puta u Wnt1 i Wnt3a reporter testovima
Potencija i efikasnost za poluživot produženih biparatopskih LRP5/LRP6 unakrsno reaktivnih VHH konstrukta su upoređivane sa MOR08168IgG1LALA 6475 scfv biparatopskim LRP6 vezujućim molekulom, sa Knob HC YW210.09 bispecifičnim anti-
1
LRP6 molekulom i 802TR bispecifičnim anti-LRP6 molekulom korišćenjem kombinovanog Wnt1 i Wnt3a reporter testa. Kao što je prikazano na Slici 5B, potpuna inhibicija (tj. odnos fluorescencije [460/535nm] koji odgovara baznoj liniji na Slici 5B) postignuta je tretmanom sa Knob HC YW210.09 (bispecifično IgG hibridno antitelo sa YW211.31.62 i YW210.09 heterodimerima teškog lanca) slično sa LRP5/LRP6 unakrsno reaktivnim, formatiranim, biparatopskim i molekulom F013500571 sa optimizovanom sekvencom. Međutim, F013500571 je pokazao veću efikasnost, kako je navedeno u Tabeli XI dole. Umesto toga, MOR08168IgG1LALA 6475 scfv i 802T biparatopični LRP6 vezujući molekuli pokazali su nedostatak potpune Wnt1 i Wnt3a inhibicije (tj. odnos fluorescencije [460/535nm] značajno veći od bazne linije na Slici 5B, i na Slici 5C, respektivno). Ovi podaci ukazuju da i molekuli MOR08168IgG1LALA 6475 scfv i 802T biparatopni LRP6 vezujući molekuli imaju značajno nižu efikasnost u inhibiciji Wnt1 i Wnt3a puta u poređenju sa F013500571. Zbog toga je Knob YW210.09 izabran kao uporedno jedinjenje za in vivo eksperimente kako je dalje opisano u nastavku (Primer 9; in vivo efikasnost).
Tabela XI: IC50vrednosti inhibicije Wnt1 i Wnt3a puta u kombinovanim Wnt1 i Wnt3a reporter testovima
Primer 8: Efekti tri za poluživot produženih biparatopskih LRP5/LRP6 unakrsno reaktivnih VHH konstrukta na Wnt signalizaciju i vijabilnost u ćelijskim linijama karcinoma
Sposobnost za poluživot produženih biparatopskih LRP5/LRP6 unakrsno reaktivnih VHH konstrukta da inhibiraju aktivnu Wnt signalizaciju je dalje karakterisano koristeći ćelijske linije kancera sa aktivnom Wnt signalizacijom, kako je prethodno opisano (Bafico et al. “An autocrine mechanism for constitutive Wnt pathway activation in human cancer cells”. Cancer Cell 2004;6(5):497-506; DeAlmeida et al. “The soluble wnt receptor Frizzled8CRD-hFc inhibits the growth of teratocarcinomas in vivo”. Cancer Res.
2007;67(11):5371-9); Akiri et al. “Wnt pathway aberrations including autocrine Wnt activation occur at high frequency in human non-small-cell lung carcinoma”. Oncogene.
2
2009; 28(21):2163-72). Ukratko ćelijske linije kancera sa aktivnom Wnt signalizacijom, PA-1 i PA-TU-8988S, su zasejane u ploče sa 12 bunarčLća i tretirane u toku dva dana sa LRP5/LRP6 unakrsno reaktivna VHH konstrukta u finalnoj koncentraciji od 1 uM.
Sposobnost inhibicije Wnt signalizacije detektovana je inhibicijom iRNK ekspresije Axin2, endogenog Wnt ciljnog gena. qPCR analiza ekspresije izvršena je korišćenjem standardnih RNK tehnika: Izolacija RNK izvedena je pomoću QIAGEN RNeasy Mini Kit u skladu sa protokolom koji je obezbedio QIAGEN; Sinteza cDNA pomoću SuperScript VILO cDNK kompleta za sintezu (Invitrogen, kat. br.11754050) i qPCR koristeći TaqMan test za ekspresiju gena sa Axin2 TaqMan prajmerima/sondom (Hs00610344_m1 AXIN2 FAM, Life Technologies) i sa eukariotskom 18s endogenom kontrolom VIC-MGB (4319413E-1307061, Applied Biosystems).
Kao što je prikazano na Slici 6A, i PA-TU8988S i PA-1 ćelije karcinoma tretirane sa tri za poluživot produžena biparatopska LRP5/LRP6 unakrsno reaktivnih VHH konstrukta pokazale su značajno smanjene Axin2 relativne iRNK nivoe (tj. normalizovane na endogenu kontrolu) u poređenju sa netretiranim (kontrola) ćelijama. Ovi podaci pokazali su sposobnost za poluživot produženih biparatopskih LRP5/LRP6 unakrsno reaktivnih VHH konstrukta da inhibiraju Wnt signalizaciju u ćelijskim linijama kancera sa aktivnom Wnt signalizacijom. Dalje, efekat blokade Wnt signalizacije na vijabilnost ćelija istražen je u ćelijskim linijama kancera PA-TU8988S i YAPC, za čiju je proliferaciju ranije izveštavano da zavisi od aktivne Wnt signalizacije (J Jiang et al. “Inactivating mutations of RNF43 confer Wnt dependency in pancreatic ductal adenocarcinoma”. Proc Natl Acad Sci U S A.2013; 110(31):12649-54). Vijabilnost ćelija merena je izvođenjem Alamar Blue testa (Invitrogen, kat. # DAL1100) posle deset dana tretmana sa za poluživot produženih biparatopskih LRP5/LRP6 unakrsno reaktivnih VHH konstruktima (finalna koncentracija 1 uM) ili uporednim jedinjenjem 802T (finalna koncentracija 1 uM). Kao što je prikazano na Slici 6B, PA-TU8988S ćelije karcinoma tretirane sa tri za poluživot produžena biparatopska LRP5/LRP6 unakrsno reaktivna VHH konstrukta pokazale su značajno smanjen procenat vijabilnih ćelija t ( 75% smanjenje) u poređenju sa netretiranim (kontrolnim) ćelijama. Nakon tretmana sa 802T nije detektovan efekat na vijabilnost ćelije (Slika 6B, dijagram na desnoj strani). Ovi podaci pokazuju sposobnost za poluživot produženih biparatopskih LRP5/LRP6 unakrsno reaktivnih VHH konstrukta da inhibiraju proliferaciju ćelija karcinoma koje zavise od aktivne Wnt signalizacije, a takođe pokazuju i superiorni efekat ovih konstrukta u poređenju sa 802T.
Dalje, zavisnost vijabilnosti ćelija od doze procenjena je za F013500571 u poređenju sa 802T, u PA-TU8988S (Slika 6C) i YAPC (Slika 6D) ćelijskim linijama karcinoma, kako je gore opisano. Smanjenje vijabilnosti ćelije zavisno od doze otkriveno je nakon tretmana sa F013500571. Suprotno tome, nije pokazan efekat na vijabilnost ćelija prilikom uporednog tretmana sa jedinjenjem 802T i u ćelijskim linijama PA-TU8988S i YAPC. Ovi podaci pokazuju da za poluživot produženi biparatopski LRP5/LRP6 unakrsno reaktivni VHH konstrukti imaju superiorniji efekat u poređenju sa 802T.
Primer 9: In vivo efikasnost
LRP5/LRP6 unakrsno reaktivna za poluživot produženi VHH konstrukti / vezujući molekuli su dalje karakterisani in vivo u sa Wnt podstaknutom modelu tumora.
Sprovedeni su eksperimenti kako bi se utvrdilo da li ovi vezujući molekuli inhibiraju rast tumora in vivo. Efikasnost uporednog jedinjenja Knob HC YW210.09 je takođe utvrđena primenom istog sa Wnt podstaknutom modelu tumora. Transgena ekspresija Wnt liganada korišćenjem virusnog LTR pojačivača tumora dojke kod miša (MMTV promotor) dovodi kod miša do ekstenzivne duktalne hiperplazije koja je praćene adenokarcinomima dojke kod transgenih (TG) miševa do 6 meseca starosti. Ovi tumori dojke podstaknuti su prekomernom ekspresijom Wnt liganada izazvanom glukokortikoidima i imaju karakteristike slične TNBC tumorima, uključujući ekspresiju epitelnih i mezenhimskih markera (bazalni fenotip) i aktivnu Wnt signalizaciju kako je procenjeno uz pomoć intracelularne lokalizacijom beta-katenina. Konkretno, tumori dojke izvedeni od transgenih miševa MMTV-Wnt-1 su zavisni od Wnt1. Zapravo, blokiranje Wnt aktivnosti korišćenjem rastvornog Wnt receptora koji sadrži Frizzled8 cisteinom bogat domen (CRD) spojen na humani Fc domen (F8CRDhFc) (DeAlmeida et al. “The soluble wnt receptor Frizzled8CRD-hFc inhibits the growth of teratocarcinomas in vivo”. Cancer Res.
2007;67(11):5371-9) je prijavljeno da inhibira rast tumora in vivo. Prema tome, tumori izolovani iz MMTV-Wnt1 transgenih miševa pasažirani su supkutano kao komadići tumora u gole miševe tokom 2 do 5 pasaža pre započinjanja eksperimenta o efikasnosti. Između 14 do 21 dana nakon implantacije, kada su tumori dostigli srednju zapreminu od približno 150 do 250 mm<3>, miševi su randomizovani u grupe sa 7 miševa po grupi i dozirane i.v. sa jedinjenjima. LRP5/LRP6 unakrsno reaktivni za poluživot produženi VHH konstrukti, administrirani su miševima i.v. dva puta nedeljno, sa dozama prikazanim na Slici 7A za F013500571 i na Slici 7B za F013500720. Komparativno jedinjenje Knob HC YW210.09 je takođe dozirano i.v. dva puta nedeljno, ali u većim dozama, tj.30 i 45 mg/kg (Slika 7C), zbog podataka dobijenih sa ovim jedinjenjem u prethodno opisanim in
4
vitro eksperimentima. Zapremina tumora i telesna težina praćeni su tokom eksperimenta efikasnosti, a srednja zapremina tumora je zabeležena u Slikama 7A do 7C. Inhibicija rasta tumora (TGI) određena je na kraju eksperimenta efikasnosti. Konkretno, TGI je određen za svaku tretiranu grupu u poređenju sa kontrolom grupom (tretman miševa sa histidinskim puferom - 20mM histidina pH 6,5 pufer - u eksperimentu prikazanom na Slikama 7A i 7B, ili sa citratnim puferom za eksperiment prikazan na Slici 7C). Dalje, gastro-intestinalna (GI) histo-patološka analiza (putem H&E bojenja delova GI trakta od dvanaestopalačnog creva do rektuma) izvedena je na kraju eksperimenta efikasnosti da bi se procenila potencijalna toksičnost LRP5 i LRP6 antagonista. Inhibicija rasta tumora (TGI), ishod GI histopatološke analize na kraju in vivo studije efikasnosti, mortalitet koji odgovara broju miševa koje je trebalo žrtvovati zbog značajnog gubitka telesne težine (> 18% gubitka telesne težine u poređenju sa početkom eksperimenta o efikasnosti) i broj regresija tumora (zapremina tumora na kraju eksperimenta manja od mere zapremine tumora na početku tretmana) prikazani su za svaku tretiranu grupu u Tabelama XIIA, XIIB, i XIIC, koje se odnose na eksperimente i podatke prikazane takođe na Slikama 7A, 7B i 7C, respektivno.
Tabela XIIA: In vivo efikasnost F013500571 primenjenog i.v. dva puta nedeljno.
Rezultati ovog eksperimenta su takođe prikazani na Slici 7A
Tabela XIIB: In vivo efikasnost F013500720 primenjenog i.v. dva puta nedeljno.
Rezultati ovog eksperimenta su takođe prikazani na Slici 7B
Tabela XIIC: In vivo efikasnost Knob HC YW210.09 primenjenog i.v. dva puta nedeljno. Rezultati ovog eksperimenta su takođe prikazani na Slici 7C
Kao što se može uzeti iz Slika 7A do 7C i Tabela XIIA do XIIC gore, tretman sa LRP5/LRP6 unakrsno reaktivnim za poluživot produženim biparatopskim VHH konstruktima (F013500571 pri 4 i 10 mg/kg i F013500720 pri 1 mg/kg u 2x nedeljnom rasporedu) zaista je rezultirao regresijom tumora (tj. inhibicijom rasta tumora (TGI) > 100% što odgovara skupljanju tumora; smanjenje zapremine tumora na kraju eksperimenta efikasnosti u poređenju sa zapreminom tumora na početku eksperimenta), bez značajnih promena telesne težine (<10%) i nema nalaza prijavljenih nakon GI histopatološke analize. Važno, za razliku od toga, nije mogla da se primeti regresija tumora pri tretmanu sa LRP6 specifičnim veznikom Knob HC YW210.09, čak i pri maksimalno primenljivom i.v. dozom/rasporedom kod miševa, koji odgovara 90 mg/kg sa 3x nedeljnim rasporedom.
Da bi se dalje istražile razlike u in vivo efikasnosti, kao što je primećeno u prethodno objašnjenom eksperimentu, postavljen je dalji eksperiment koji omogućava češće davanje (tri puta nedeljno) još veće doze uporednog jedinjenja miševima. Ukratko, da bi se postigla takva veća izloženost, uporedno jedinjenje je dato i.p., kako je naznačeno u sledećoj Tabeli XIID:
Tabela XIID: In vivo efikasnost Knob HC YW210.09 primenjenog i.v. dva puta ili tri puta nedeljno kako je naznačeno.
Kao što se može videti iz podataka prikazanih u Tabeli XIID, takođe u ovoj postavci nije postignut značajno jači efekat u pogledu TGI. Drugim rečima, ovi eksperimenti, podaci i rezultati jasno ukazuju na veću efikasnost za poluživot produženih biparatopskih VHH konstrukta u poređenju sa Knob HC YW210.09 i na neviđenu sposobnost polipeptida prema pronalasku ne samo da smanje rast tumora, već čak da izazovu skupljanje tumora. Naravno, skupljanje tumora (tj. regresija tumora) je željeni terapeutski efekat (tj. efikasnost) za lečenje pacijenata sa karcinomom. Zapravo, u kliničkim studijama tretmani koji indukuju regresiju tumora što rezultira patološkim kompletnim odgovorom (pCR) pozitivno dovode do značajnog poboljšanja preživljavanja bez progresije bolesti i ukupnog preživljavanja kod indikacija sa visoko nezadovoljenim medicinskim potrebama, kao što je rak dojke.
Gornji uporedni primeri takođe pokazuju da LRP5/LRP6 unakrsno reaktivni za poluživot produženi VHH konstrukti nisu superiorni samo u pogledu svojih karakteristika vezivanja, kao što su afinitet ili KD vrednosti, već i da imaju vrlo korisna i superiorna svojstva u in vivo postavci.
Dalje, istraženo je da li jedinjenje MOR08168IgG1LALA 6475 scfv može pružiti sličan povoljan efekat. U tu svrhu izvedena je in vivo studija podnošljivosti na miševima na sledeći način: MOR08168IgG1LALA 6475 scfv jedinjenje je dato i.v. pri 3 mg/kg, dva puta nedeljno (2qw); ista doza/režim pri kojem je detektovana in vivo efikasnost u modelu tumora ksenografta u WO2011/138391, kao što je opisano na Slici 22 u njemu. Prvo tretiranje sa MOR08168IgG1LALA 6475 scfv izvedeno je 1. dana i počev od 6.
dana detektovan je značajan gubitak telesne težine kod miševa. Na 10. dan, neki miševi tretirani jedinjenjem MOR08168IgG1LALA 6475 scfv pokazali su značajan gubitak telesne težine (> 10%). Na 11. dan miševi su žrtvovani, a gastrointestinalna (GI) histopatološka analiza otkrila je upalu sa erozijom u debelom crevu i cekumu miša. Ovi podaci sugerišu da se MOR08168IgG1LALA 6475 scfv ne podnosi kod efikasne doze/režima. Prema tome, LRP5/LRP6 unakrsno reaktivni za poluživot produženi VHH konstrukti su superiorni u odnosu na terapijski prozor; tj. indukuju regresiju tumora bez značajnih promena telesne težine (<10%) i nema nalaza prijavljenih nakon GI histopatološke analize.
Primer 10: In vivo inhibicija Wnt puta
Da bi se dalje okarakterisao efekat LRP5/LRP6 unakrsno reaktivnih za poluživot produženih VHH konstrukta/vezujućih molekula na Wnt signalizaciju, tumori su izolovani na kraju eksperimenta efikasnosti, opisanog u Primeru 9. Konkretno, tumori su izolovani 16 sati posle poslednje injekcije sa jedinjenjima ili sa kontrolnim tretmanom. Inhibicija Wnt signalizacije određena je smanjenjem iRNK ekspresije Axin2 u tumorima, što je analizirano kako je opisano u Primeru 8. Stepen promene Axin2 iRNK ekspresije u odnosu na kontrolnu grupu zabeležen je na Slici 8A za in vivo efikasnost sa F013500571 i na Slici 8B za in vivo efikasnost sa F013500720. Kvantifikacija Axin2 iRNK redukcije za svaku tretiranu grupu je navedena u Tabelama XIIIA i XIIIB u nastavku.
Tabela XIIIA: Redukcija Axin2 iRNK ekspresije u tumorima tretiranim sa F013500571. Podaci se odnose na Slike 7A i 8A.
Tabela XIIIB: Redukcija Axin2 iRNK ekspresije u tumorima tretiranim sa F013500720. Podaci se odnose na Slike 7B i 8B.
Kao što se može videti iz Slika 8A i 8B i Tabela XIIIA i XIIIB, značajna redukcija i zavisno od doze smanjenje (posebno za tretman sa F013500571) u ekspresije Axin2 iRNK primećeno je u tumorima tretiranim sa LRP5/LRP6 unakrsno reaktivnim vezujućim molekulima, u poređenju sa kontrolnom grupom. Ovi rezultati sugerišu da su LRP5/LRP6 unakrsno reaktivni vezujući molekuli zaista sposobni da inhibiraju rast tumora potiskivanjem Wnt signalizacije u ćelijama tumora.
Primer 11: Proces industrijske proizvodnje
11.1 Fermentacija: Bilo koji od polipeptida navedenih u Tabelama III i V gore može se eksprimirati u citoplazmi različitih sojeva E. coli poput W3110, TG1, BL21, BL21(DE3), HMS174, HMS174(DE3), MM294 pod kontrolom nekog inducibilnog promotora. Ovaj promotor se može odabrati između lacUV5, tac, T7, trp, T5, araB. Medijumi za uzgoj su poželjno potpuno definisani u skladu sa Wilms et al., 2001 (Wilms, B., Hauck, A., Reuss, M., Syldatk, C., Mattes, R., Siemann, M., and Altenbuchner, J.: High-Cell-Density Fermentation for Production of L-N-Carbamoylase Using an Expression System Based on the Escherichia coli rhaBAD Promoter. Biotechnology and Bioengineering, 73: 95-103 (2001)), DeLisa et al., 1999 (DeLisa, M. P., Li, J. C., Rao, G., Weigand, W. A., i Bentley, W. E.: Monitoring GFP-operon fusion protein expression during high cell density cultivation of Escherichia coli using an on-line optical sensor. Biotechnology and Bioengineering, 65: 54–64.(1999)) ili ekvivalentom. Međutim, obogaćivanje medijuma aminokiselinama poput izoleucina, leucina, lizina, metionina, fenilalanina, treonina, triptofana i valina ili složenim komponentama medijuma, kao što su sojin pepton ili ekstrakt kvasca, mogu biti korisni. Proces fermentacije se izvodi u šaržnom režimu. Uslovi: temperatura 30 - 40 °C, pH 6 - 7,5, rastvoreni kiseonik se drži iznad 20%. Nakon konzumiranja početnog C-izvora, kultura se hrani gore navedenim hranjivim sastojcima medijuma (ili ekvivalentima). Kada se dostigne težina suve materije ćelija u fermentoru od 40 do 90 g/L, kultura se indukuje odgovarajućim induktorom koji odgovara korišćenom promotorskom sistemu (na pr. IPTG, laktoza, arabinoza). Indukcija se može izvesti kao pulsna puna indukcija ili kao delimična indukcija hranjenjem odgovarajućeg induktora u fermentoru tokom dužeg vremena. Faza proizvodnje bi trebalo da traje najmanje 4 sata. ûelije se izdvajaju centrifugiranjem u centrifugam sa posudama, centrifugama sa cevastim posudama ili centrifugama sa diskovima, supernatant kulture se odbacuje.
11.2 Preþišüavanje: ûelijska masa E. coli se resuspenduje u količini 6- do 8 puta pufera za lizu (fosfatni ili Tris pufer, pH 7-8,5). Liza ćelija se poželjno izvodi homogenizacijom pod visokim pritiskom, nakon čega sledi uklanjanje ćelijskih ostataka centrifugiranjem u posudi, cevastoj posudi ili centrifugama sa diskovima. Supernatant koji sadrži ciljani protein opciono se filtrira uz pomoć filtra od 0,22-10 µm i odvaji hromatografijom sa izmenjivanjem katjona (na pr. Toyopearl MegaCap<®>II SP-550EC, Toyopearl GigaCap S-650M, SP Sepharose BB, SP Sepharose FF or S HyperCel<TM>) na pH 7-8.5. Eluacija se vrši linearnim povećanjem NaCl gradijenta pri pH 7-8,5. Frakcije koje sadrže ciljani protein se udružuju i potom inkubiraju sa 5-10 mM DTT kako bi se sprečila dimerizacija ili agregacija posredovana slobodnim ostacima cisteina. Posle daljeg dodavanja 0,8-1 M amonijum sulfata ili 2-3 M NaCl, rastvor se razdvaja hromatografijom sa hidrofilnom interakcijom (na pr. Phenyl Sepharose HP, Phenyl Sepharose FF, Butyl Sepharose HP, Butyl Sephrose FF, Butyl Toyopearl 650 (S,M,C), Phenyl Toyopearl 650 (S,M,C)) na pH 7-8.5. Eluacija se izvodi na pH 7-8,5 linearno opadajućim amonijum sulfatom ili NaCl gradijentom u prisustvu 5 mM DTT. Frakcije koje sadrže ciljani protein sa nivoom čistoće od minimalno 90% se objedinjuju i desaltifikuju dijafiltracijom u prisustvu 5 mM DTT, nakon čega sledi koncentracija na približno 5 mg/ml. Naknadno ponovno presavijanje se izvodi razređivanjem proteinskog rastvora 1:5-1:20 sa 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 4 mM cistamina, 10 mM CHAPS na pH 8,5 do krajnje koncentracije proteina od 0,25-1 mg/ml. Rastvor za presavijanje se inkubira uz mešanje 12-36 h na sobnoj temperaturi, a zatim se odvaja hromatografijom sa izmenjivanjem katjona (na pr. SP Sepharose FF, SP Sepharose HP, Toyopearl SP-650 (S, M, C)) na pH 7-8.5.
Elucija se vrši linearnim povećanjem NaCl gradijenta pri pH 7-8,5. Frakcije koje sadrže monomerni ciljani protein se objedinjuju i formulišu u 25 mM Na fosfata, 220 mM trehaloze bez endotoksina, pH 7,5 dijafiltracijom. Rastvor se steriliše filtracijom i čuva na 2 do 8 °C.
Primer 12: Farmaceutska formulacija za s.c. administraciju
Bilo koji od gore navedenih biparatopskih polipeptidnih konstrukata prema pronalasku može se odabrati za proizvodnju farmaceutske formulacije za subkutanu primenu koja ima sastav kako sledi:
Lekovita supstanca: 100 mg/ml (1 do 3 nmol/ml)
Acetatni pufer: 25 mM
Trehaloza: 220 mM
Tween-20: 0.02 %
Lekovita supstanca je formulisana u rastvoru gore navedenog sastava, sterilisana i čuvana na temperaturi od 2 do 8 °C.
Primer 13: Farmaceutska upotreba kod ljudi
Rastvor pripremljen u Primeru 11.2 gore primenjuje se kod pacijenta kome je to potrebno, kao što je ljudsko biće koje pati od karcinoma osetljivog na inhibitore Wnt signalizacije, intravenskom infuzijom (doza od 100 do 200 mg) svake dve do četiri nedelje.
Primer 14: Efekat inhibicije Wnt3a signalizacije na proinflamatorno oslobađanje citokina od strane dendritičnih ćelija u ex-vivo testu
PBMC su dobijeni od zdravih donatora uz informisani pristanak. Dendritične ćelije izvedene iz ljudskih monocita (Mo-DCs) su generisane na sledeći način: PBMC su kultivisani u X-VIVO medijumu obogaćenom sa 50 ng/ml GM-CSF i 50 ng/ml IL-4. Posle 24 sata kultivacije, supernatant je pažljivo uklonjen i zamenjen sa X-VIVO podlogom dopunjenom istim GM-CSF i IL-4. Četvrtog dana, supernatant je pažljivo uklonjen i zamenjen sa X-VIVO medijumom u prisustvu samo LPS ili u kombinaciji sa humanim Wnt3a ili sa humanim Wnt3a i LRP5/LRP6 unakrsno reaktivnim vezujućim molekulima. Sledećeg dana, supernatanti su sakupljeni i podvrgnuti analizi TNF-alfa putem ELISA u skladu sa uputstvima proizvođDča. Kao što je prethodno objavljeno (Oderup et al.” Canonical and noncanonical Wnt proteins program dendritic cell responses for tolerance”. J Immunol.2013;190(12): 6126-34), i kao što je prikazano na slici 9A, Wnt3a direktno inhibira sekreciju pro-inflamatornih citokina (tj. oslobađanje TNF alfa) uz pomoć diferenciranih dendritičnih ćelija (DC). Wnt3a podstaknuto suzbijanje TNF-alfa
1
oslobađanja iz DC je obnovljeno dodavanjem LRP5/LRP6 unakrsno reaktivnih vezujućih molekula.
Ovi podaci pokazuju da su formatirani, biparatopski i vezujući molekuli sa optimizovanom sekvencom sposobni da obnavljaju sekreciju TNFalfa uz pomoć dendritičkih ćelija tretiranih sa Wnt3a, čime se suzbija Wnt inhibitorni efekat na dendritične ćelije.
Važno je primetiti da blokiranje Wnt puta u dendritičnim ćelijama u mikrosredini tumora može predstavljati potencijalni terapijski pristup ka razbijanju tumorom posredovane imunološke supresije i povećanju antitumorskog imuniteta.
Da bi se istražili efekti DC-a na T-ćelije (efektorske T-ćelije), DC-ovi prethodno tretirani sa Wnt3a sa ili bez LRP5/LRP6 unakrsno reaktivnih vezujućih molekula su zajedno kultivisani sa T-ćelijama, koje su izolovane iz PBMC-ova, kako je prethodno opsiano (Oderup et al. "Canonical and noncanonical Wnt proteins program dendritic cell responses for tolerance". J Immunol.2013;190(12): 6126-34). Posle 3 dana kokultivacije DC/T ćelija, supernatanti su sakupljeni i podvrgnuti analizi IFN gama pomoću ELISA, u skladu sa uputstvima proizvođDča.
IFNgamma sekrecija je marker aktivacije T ćelija. Kao što je prikazano na Slici 9B, sa Wnt3a posredovana DC inhibicija dovodi do smanjene sekrecije IFNgama iz T ćelija (inhibicija funkcije T ćelija), koja se u potpunosti obnavlja tretmanom sa LRP5/LRP6 unakrsno reaktivnim vezujućim molekulima.
Ukratko, ovi podaci pokazuju da LRP5/LRP6 unakrsno reaktivni vezujući molekuli potiskuju Wnt inhibitorni efekat na dendritične ćelije, što dovodi do obnavljanja funkcije T ćelija.
Poznato je da kontinuirana aktivacija/stimulacija T ćelija indukuje terminalnu diferencijaciju, što rezultira iscrpljenim fenotipom T ćelija, progresivnim gubitkom funkcije T ćelija. Prema tome, predočeno je da efekat LRP5/LRP6 unakrsno reaktivnih vezujućih molekula na T ćelije, koji je posredovan aktivacijom DC, može biti ograničen iscrpljivanjem T ćelija. Kombinovani tretmani, koji kombinuju primenu LRP5/LRP6 unakrsno reaktivnih vezujućih molekula sa primenom inhibitora imunog kontrolnog punkta blokiraju iscrpljivanje T ćelija, stoga se očekuju da mogu da pomognu u
2
aktiviranju i održavanju funkcije T ćelija, menjajući time mikrookruženje tumora, a time i
podržavajući terapeutski efekat molekula iz pronalaska.

Claims (17)

Patentni zahtevi
1. Polipeptid koji se specifično vezuje za LRP5 i LRP6, koji sadrži
- prvi imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen izabran iz grupe imunoglobulinskih pojedinačnih varijabilnih domena (i) do (iii) definisanih tako što sadrže sledeće CDR sekvence:
(i):
CDR1: TYTVG (= SEKV ID BR:1)
CDR2: AIRRRGSSTYYADSVKG (= SEKV ID BR:2)
CDR3: DTRTVALLQYRYDY (= SEKV ID BR:3)
(ii):
CDR1: SYAMG (= SEKV ID BR:4)
CDR2: AIRRSGRRTYYADSVKG (= SEKV ID BR:5)
CDR3: ARRVRSSTRYNTGTWWWEY (= SEKV ID BR:6)
(iii):
CDR1: RYTMG (= SEKV ID BR:7)
CDR2: AIVRSGGSTYYADSVKG (= SEKV ID BR:8)
CDR3: DRRGRGENYILLYSSGRYEY (= SEKV ID BR:9),
i
- drugi imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen izabran iz grupe imunoglobulinskih pojedinačnih varijabilnih domena (iv) i (v) definisanih tako što sadrže sledeće CDR sekvence:
(iv):
CDR1: SYAMG (= SEKV ID BR:10)
CDR2: AISWSGGSTYYADSVKG (= SEKV ID BR:11)
CDR3: SPIPYGSLLRRRNNYDY (= SEKV ID BR:12)
(v):
CDR1: SYAMG (= SEKV ID BR:13)
CDR2: AISWRSGSTYYADSVKG (= SEKV ID BR:14)
CDR3: DPRGYGVAYVSAYYEY (= SEKV ID BR:15).
2. Polipeptid prema zahtevu 1, u kojem
- pomenuti prvi imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen sadrži sledeće CDR sekvence:
CDR1: TYTVG (= SEKV ID BR:1)
CDR2: AIRRRGSSTYYADSVKG (= SEKV ID BR:2)
4
CDR3: DTRTVALLQYRYDY (= SEKV ID BR:3)
i u kojem
- navedeni drugi imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen sadrži sledeće CDR sekvence:
CDR1: SYAMG (= SEKV ID BR:10)
CDR2: AISWSGGSTYYADSVKG (= SEKV ID BR:11)
CDR3: SPIPYGSLLRRRNNYDY (= SEKV ID BR:12).
3. Polipeptid prema zahtevu 1, u kojem
- navedeni prvi imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen sadrži sledeće CDR sekvence:
CDR1: SYAMG (= SEKV ID BR:4)
CDR2: AIRRSGRRTYYADSVKG (= SEKV ID BR:5)
CDR3: ARRVRSSTRYNTGTWWWEY (= SEKV ID BR:6)
i u kojem
- navedeni drugi imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen sadrži sledeće CDR sekvence:
CDR1: SYAMG (= SEKV ID BR:13)
CDR2: AISWRSGSTYYADSVKG (= SEKV ID BR:14)
CDR3: DPRGYGVAYVSAYYEY (= SEKV ID BR:15).
4. Polipeptid prema zahtevu 1, u kojem
- navedeni prvi imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen sadrži sledeće CDR sekvence:
CDR1: RYTMG (= SEKV ID BR:7)
CDR2: AIVRSGGSTYYADSVKG (= SEKV ID BR:8)
CDR3: DRRGRGENYILLYSSGRYEY (= SEKV ID BR:9)
i u kojem
- navedeni drugi imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen sadrži sledeće CDR sekvence:
CDR1: SYAMG (= SEKV ID BR:13)
CDR2: AISWRSGSTYYADSVKG (= SEKV ID BR:14)
CDR3: DPRGYGVAYVSAYYEY (= SEKV ID BR:15).
5. Polipeptid prema bilo kom od zahteva 1 do 4, u kojem navedeni imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domeni su VHH domeni i poželjno humanizovani VHH domeni.
6. Polipeptid prema zahtevu 1 ili zahtevu 2, u kojem
- navedeni prvi imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen ima sekvencu aminokiselina kao što je prikazano u SEKV ID BR: 19 i
- navedeni drugi imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen ima sekvencu aminokiselina kao što je prikazano u SEKV ID BR: 22.
7. Polipeptid prema zahtevu 1 ili zahtevu 3, u kojem
- navedeni prvi imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen ima sekvencu aminokiselina kao što je prikazano u SEKV ID BR:20 i
- navedeni drugi imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen ima sekvencu aminokiselina kao što je prikazano u SEKV ID BR:23.
8. Polipeptid prema zahtevu 1 ili zahtevu 4, u kojem
- navedeni prvi imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen ima sekvencu aminokiselina kao što je prikazano u SEKV ID BR:21 i
- navedeni drugi imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen ima sekvencu aminokiselina kao što je prikazano u SEKV ID BR:23.
9. Polipeptid prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8, pri čemu su navedeni prvi i navedeni drugi imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domeni kovalentno povezani vezujućim peptidom, pri čemu navedeni vezujući peptid opciono sadrži ili se sastoji od trećeg imunoglobulinskog pojedinačnog varijabilnog domena.
10. Polipeptid prema zahtevu 9, u kojem je navedeni treći imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen albumin koji spaja imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen i poželjno Alb11 domen, definisan sa SEKV ID BR: 24.
11. Polipeptid izabran iz grupe polipeptida koji sadrži ili se sastoji od SEKV ID BR: 25, SEKV ID BR: 26 i SEKV ID BR: 27.
12. Ekspresioni vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira polipeptid prema bilo kom od zahteva 1 do 11.
13. ûelija domaćina koja nosi ekspresioni vektor prema zahtevu 12.
14. Postupak za proizvodnju polipeptida prema bilo kom od zahteva 1 do 11, koji sadrži korake
- kultivaciju domaćinske ćelije prema zahtevu 13 pod uslovima koji omogućavaju ekspresiju polipeptida prema bilo kom od zahteva 1 do 11; i
- izdvajanje i opciono prečišćavanje navedenog polipeptida.
15. Farmaceutska kompozicija koja sadrži (i) kao aktivni sastojak polipeptid prema bilo kom od zahteva 1 do 11, i (ii) farmaceutski prihvatljiv nosač, i opciono (iii) razblaživač, ekscipijens, adjuvans i/ili stabilizator.
16. Polipeptid prema bilo kom od zahteva 1 do 11, za primenu u vidu leka u postupku za lečenje, prevenciju ili ublažavanje bolesti, poremećaja ili stanja kod čoveka ili životinje, poželjno za upotrebu u postupku (a) za lečenje karcinoma, kao što su karcinom dojke, rak pluća, karcinom pankreasa, kolorektalni karcinom, sarkomi, rak jajnika ili hepatocelularni karcinom, ili (b) za lečenje idiopatske plućne bolesti, ili (c) za lečenje retinopatije izazvane abnormalnom Wnt signalizacijom.
17. Polipeptid prema bilo kom od zahteva 1 do 11, za primenu u lečenju raka u kombinaciji sa nekim inhibitorom imune kontrolne tačke, izabranim iz grupe koja se sastoji od anti-PD1 antitela, anti-PDL1 antitela, anti-CTLA4 antitela, anti-BTLA antitela, anti -LAG3 antitela, i anti-TIM3 antitela, ili u kombinaciji sa vakcinom protiv raka.
RS20201124A 2015-12-04 2016-12-02 Biparatopski polipeptidi koji antagonizuju wnt signalizaciju u tumorskim ćelijama RS60823B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP15197999 2015-12-04
EP16808971.2A EP3383425B1 (en) 2015-12-04 2016-12-02 Biparatopic polypeptides antagonizing wnt signaling in tumor cells
PCT/EP2016/079575 WO2017093478A1 (en) 2015-12-04 2016-12-02 Biparatopic polypeptides antagonizing wnt signaling in tumor cells

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS60823B1 true RS60823B1 (sr) 2020-10-30

Family

ID=54782606

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20201124A RS60823B1 (sr) 2015-12-04 2016-12-02 Biparatopski polipeptidi koji antagonizuju wnt signalizaciju u tumorskim ćelijama

Country Status (32)

Country Link
US (2) US10597449B2 (sr)
EP (2) EP3383425B1 (sr)
JP (2) JP6728355B2 (sr)
KR (1) KR102802241B1 (sr)
CN (1) CN108289943B (sr)
AR (1) AR106949A1 (sr)
AU (1) AU2016363787B2 (sr)
BR (1) BR112018010537A2 (sr)
CL (1) CL2018001384A1 (sr)
CO (1) CO2018005680A2 (sr)
CY (1) CY1123454T1 (sr)
DK (1) DK3383425T3 (sr)
EA (1) EA201891331A1 (sr)
ES (1) ES2821099T3 (sr)
HR (1) HRP20201528T1 (sr)
HU (1) HUE051777T2 (sr)
IL (1) IL259119B (sr)
LT (1) LT3383425T (sr)
MA (2) MA43368B1 (sr)
MX (1) MX380414B (sr)
MY (1) MY200933A (sr)
PE (1) PE20181515A1 (sr)
PH (1) PH12018501155B1 (sr)
PL (1) PL3383425T3 (sr)
PT (1) PT3383425T (sr)
RS (1) RS60823B1 (sr)
SA (1) SA518391728B1 (sr)
SG (1) SG11201804510PA (sr)
SI (1) SI3383425T1 (sr)
TW (1) TWI734719B (sr)
UA (1) UA122079C2 (sr)
WO (1) WO2017093478A1 (sr)

Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2797533T3 (es) 2012-02-28 2020-12-02 Novartis Ag Selección de pacientes con cáncer para la administración de inhibidores de la señalización Wnt utilizando el estado mutacional de Rnf43
SG11201804178YA (en) 2015-11-18 2018-06-28 Merck Sharp & Dohme Pd1 and/or lag3 binders
LT3383425T (lt) 2015-12-04 2020-10-12 Boehringer Ingelheim International Gmbh Biparatopiniai polipeptidai, veikiantys antagonistiškai wnt signaliniam keliui vėžinėse ląstelėse
TWI794171B (zh) 2016-05-11 2023-03-01 美商滬亞生物國際有限公司 Ｈｄａｃ抑制劑與ｐｄ-ｌ１抑制劑之組合治療
TWI808055B (zh) 2016-05-11 2023-07-11 美商滬亞生物國際有限公司 Hdac 抑制劑與 pd-1 抑制劑之組合治療
EP3630816B1 (en) * 2017-05-31 2024-03-20 Boehringer Ingelheim International GmbH Polypeptides antagonizing wnt signaling in tumor cells
KR102776166B1 (ko) 2017-08-07 2025-03-04 더 리전트 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 안전한 세포 치료제를 생성하기 위한 플랫폼
CN112040970A (zh) 2017-11-29 2020-12-04 得克萨斯大学体系董事会 用于癌症疗法的组合物和方法
WO2019126398A1 (en) 2017-12-19 2019-06-27 Surrozen, Inc. Wnt surrogate molecules and uses thereof
US20210292422A1 (en) * 2018-07-05 2021-09-23 Surrozen, Inc. Multi-specific wnt surrogate molecules and uses thereof
WO2020080941A1 (en) * 2018-10-16 2020-04-23 Umc Utrecht Holding B.V. Anti- low-density lipoprotein receptor-related protein 5/6 antibodies
EP3947455A1 (en) * 2019-03-29 2022-02-09 Boehringer Ingelheim International GmbH Anticancer combination therapy
JP2022526166A (ja) 2019-03-29 2022-05-23 ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 抗癌併用療法
AU2020269268A1 (en) 2019-05-04 2021-11-11 Inhibrx Biosciences, Inc. CD123-binding polypeptides and uses thereof
CA3139512A1 (en) * 2019-05-08 2020-11-12 Inhibrx, Inc. Cd123 targeted immunotherapies
AU2020331424A1 (en) * 2019-08-14 2022-03-31 Antlera Therapeutics Inc. Antibodies that bind to LRP6 proteins and methods of use
CN119798435A (zh) * 2019-08-14 2025-04-11 安托拉诊疗公司 与lrp5蛋白结合的抗体及使用方法
WO2021061842A1 (en) 2019-09-23 2021-04-01 Twist Bioscience Corporation Variant nucleic acid libraries for single domain antibodies
CN112794914B (zh) * 2019-11-14 2022-09-16 深圳华大生命科学研究院 一种基于噬菌体展示技术开发的alk纳米抗体及其应用
WO2021163490A1 (en) * 2020-02-14 2021-08-19 University Of Washington Targeted depletion of bacteria from mixed populations through programmable cell-cell adhesion
EP4314075A4 (en) * 2021-03-24 2025-04-09 Twist Bioscience Corporation VARIANT NUCLEIC ACID BANKS FOR CD3
JPWO2023286854A1 (sr) * 2021-07-16 2023-01-19
JP2026502002A (ja) * 2023-01-05 2026-01-20 ハープーン セラピューティクス，インク． 癌の治療のためのｔｒｏｐ２標的化三重特異性タンパク質
CN116375851B (zh) * 2023-03-03 2024-03-22 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种抗禽流感病毒np蛋白的纳米抗体及其制备方法与应用

Family Cites Families (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1498427B1 (en) 1992-08-21 2009-12-16 Vrije Universiteit Brussel Immunoglobulins devoid of light chains
EP0739981A1 (en) 1995-04-25 1996-10-30 Vrije Universiteit Brussel Variable fragments of immunoglobulins - use for therapeutic or veterinary purposes
US6329516B1 (en) 1997-04-28 2001-12-11 Fmc Corporation Lepidopteran GABA-gated chloride channels
US6528054B1 (en) 1998-12-28 2003-03-04 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of breast cancer
JP2003530838A (ja) 2000-04-12 2003-10-21 ヒューマン ゲノム サイエンシズ インコーポレイテッド アルブミン融合タンパク質
CA2447851C (en) 2001-06-28 2012-08-28 Domantis Limited Dual-specific ligand and its use
AU2002364587A1 (en) 2001-12-21 2003-07-30 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
EP1558647B1 (en) 2002-11-08 2015-06-10 Ablynx N.V. Single domain antibodies directed against tumour necrosis factor-alpha and uses therefor
AU2005293752A1 (en) 2004-10-13 2006-04-20 Ablynx N.V. Single domain camelide anti-amyloid beta antibodies and polypeptides comprising the same for the treatment and diagnosis of degenarative neural diseases such as Alzheimer's disease
RU2464276C2 (ru) 2005-05-18 2012-10-20 Аблинкс Н.В. Улучшенные нанотела против фактора некроза опухоли-альфа
US7563619B2 (en) * 2006-05-30 2009-07-21 Van Andel Research Institute Mammary stem cell marker
EP2022995B1 (en) 2006-06-08 2013-02-20 NSK Ltd. Shell needle bearing with seal ring and its manufacturing method
AU2007285695B2 (en) 2006-08-18 2012-05-24 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against IL-6R and polypeptides comprising the same for the treatment of diseases and disorders associated with IL-6-mediated signalling
CN100428934C (zh) 2006-09-07 2008-10-29 中国人民解放军第二军医大学 香豆素类化合物在制备诱导神经干细胞定向分化药物中的应用
EP2069402A2 (en) 2006-09-08 2009-06-17 Ablynx N.V. Serum albumin binding proteins with long half-lives
US20080267949A1 (en) 2006-12-05 2008-10-30 Ablynx N.V. Peptides capable of binding to serum proteins
PL2567709T3 (pl) 2007-11-02 2018-06-29 Novartis Ag Cząsteczki i sposoby modulowania białka związanego z receptorem dla lipoproteiny o niskiej gęstości 6 (LRP6)
CN101965362A (zh) 2008-03-05 2011-02-02 埃博灵克斯股份有限公司 新型抗原结合二聚体-复合物及其制备方法和应用
JP2011516603A (ja) 2008-04-17 2011-05-26 アブリンクス エン．ヴェー． 血清タンパク質と結合することが可能なペプチド、並びにこれを含む化合物、構築物及びポリペプチド
WO2010127216A2 (en) 2009-05-01 2010-11-04 Telcodia Technologies, Inc. Automated determination of quasi-identifiers using program analysis
US8276148B2 (en) 2009-12-04 2012-09-25 International Business Machines Corporation Continuous optimization of archive management scheduling by use of integrated content-resource analytic model
KR101758703B1 (ko) 2009-12-23 2017-07-18 에스바테크 - 어 노바티스 컴파니 엘엘씨 면역원성의 감소 방법
CA2788993A1 (en) 2010-02-05 2011-08-11 Ablynx N.V. Peptides capable of binding to serum albumin and compounds, constructs and polypeptides comprising the same
AP2012006359A0 (en) 2010-03-03 2012-08-31 Boehringer Ingelheim Int Biparatopic abeta binding polypeptides
MX2012010853A (es) * 2010-03-24 2013-01-29 Genentech Inc Anticuerpos anti-lrp6.
EA201291180A1 (ru) 2010-05-06 2013-05-30 Новартис Аг Композиции и способы применения терапевтических антител против белка, родственного рецептору липопротеинов низкой плотности 6 (lrp6)
PH12012502193A1 (en) * 2010-05-06 2021-08-09 Novartis Ag Compositions and methods of use for therapeutic low density lipoprotein - related protein 6 (lrp6) multivalent antibodies
US20120100562A1 (en) * 2010-10-20 2012-04-26 Genentech, Inc. Methods and compositions for modulating the wnt pathway
US9527925B2 (en) 2011-04-01 2016-12-27 Boehringer Ingelheim International Gmbh Bispecific binding molecules binding to VEGF and ANG2
US8790650B2 (en) * 2011-04-28 2014-07-29 Vanderbilt University Methods of using an antibody to inhibit WNT-mediated cardiac remodeling
PH12022550313A1 (en) 2011-06-23 2023-01-23 Ablynx Nv Techniques for predicting, detecting and reducing aspecific protein interference in assays involving immunoglobulin single variable domains
PH12014500380A1 (en) 2011-08-17 2022-05-02 Glaxo Group Ltd Modified proteins and peptides
SG11201401717VA (en) 2011-11-04 2014-05-29 Novartis Ag Low density lipoprotein-related protein 6 (lrp6) - half life extender constructs
JP5949270B2 (ja) 2012-07-24 2016-07-06 富士通株式会社 オーディオ復号装置、オーディオ復号方法、オーディオ復号用コンピュータプログラム
EP2888279A1 (en) * 2012-08-22 2015-07-01 Glaxo Group Limited Anti lrp6 antibodies
LT3383425T (lt) * 2015-12-04 2020-10-12 Boehringer Ingelheim International Gmbh Biparatopiniai polipeptidai, veikiantys antagonistiškai wnt signaliniam keliui vėžinėse ląstelėse

Also Published As

Publication number Publication date
PE20181515A1 (es) 2018-09-21
SA518391728B1 (ar) 2022-03-28
PT3383425T (pt) 2020-10-07
LT3383425T (lt) 2020-10-12
HRP20201528T1 (hr) 2020-12-11
EP3383425A1 (en) 2018-10-10
EP3797790A1 (en) 2021-03-31
AR106949A1 (es) 2018-03-07
MA54648A (fr) 2021-11-10
MA43368B1 (fr) 2020-09-30
PL3383425T3 (pl) 2021-01-11
MX2018006760A (es) 2018-08-01
CN108289943A (zh) 2018-07-17
DK3383425T3 (da) 2020-09-28
JP2020178701A (ja) 2020-11-05
SI3383425T1 (sl) 2020-11-30
CL2018001384A1 (es) 2018-09-14
MY200933A (en) 2024-01-24
PH12018501155B1 (en) 2024-06-28
JP2019506841A (ja) 2019-03-14
IL259119A (en) 2018-06-28
AU2016363787B2 (en) 2023-02-02
CN108289943B (zh) 2023-06-20
CO2018005680A2 (es) 2018-06-12
IL259119B (en) 2022-04-01
EA201891331A1 (ru) 2018-12-28
US20200199222A1 (en) 2020-06-25
UA122079C2 (uk) 2020-09-10
HUE051777T2 (hu) 2021-03-29
CA3006235A1 (en) 2017-06-08
ES2821099T3 (es) 2021-04-23
US10597449B2 (en) 2020-03-24
JP6728355B2 (ja) 2020-07-22
US20170174762A1 (en) 2017-06-22
AU2016363787A1 (en) 2018-05-17
HK1255725A1 (en) 2019-08-23
MX380414B (es) 2025-03-12
MA43368A (fr) 2018-10-10
US11952418B2 (en) 2024-04-09
BR112018010537A2 (pt) 2018-11-13
TWI734719B (zh) 2021-08-01
NZ742037A (en) 2025-07-25
EP3383425B1 (en) 2020-07-15
WO2017093478A1 (en) 2017-06-08
SG11201804510PA (en) 2018-06-28
TW201731868A (zh) 2017-09-16
KR20180081825A (ko) 2018-07-17
KR102802241B1 (ko) 2025-05-07
PH12018501155A1 (en) 2019-01-28
CY1123454T1 (el) 2022-03-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11952418B2 (en) Biparatopic polypeptides antagonizing Wnt signaling in tumor cells
US12285493B2 (en) Polypeptides antagonizing Wnt signaling in tumor cells
CA3006235C (en) Biparatopic polypeptides antagonizing wnt signaling in tumor cells
HK40040630A (en) Biparatopic polypeptides antagonizing wnt signaling in tumor cells
HK1255725B (en) Biparatopic polypeptides antagonizing wnt signaling in tumor cells
EA040170B1 (ru) БИПАРАТОПНЫЕ ПОЛИПЕПТИДЫ-АНТАГОНИСТЫ ПЕРЕДАЧИ СИГНАЛА Wnt В ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТКАХ
EA046752B1 (ru) Полипептиды, препятствующие передаче wnt сигналов в опухолевых клетках