RS60981B1

RS60981B1 - Radiooznačeni mglur2/3 pet ligandi

Info

Publication number: RS60981B1
Application number: RS20201288A
Authority: RS
Inventors: José Ignacio Andrés-Gil; Gool Michiel Luc Maria Van; Guy Maurits R Bormans; Joost Verbeek
Original assignee: Janssen Pharmaceutica Nv
Priority date: 2015-12-18
Filing date: 2016-12-16
Publication date: 2020-11-30
Also published as: JP6927974B2; SI3389727T1; LT3389727T; AU2016374571B2; WO2017103182A1; AU2016374571A1; HRP20201372T1; PL3389727T3; EP3389727B1; EP3389727A1; CY1124935T1; CA3003998A1; US11033641B2; HUE050665T2; DK3389727T3; US20200306389A1; ES2828976T3; SMT202000591T1; JP2019502700A; PT3389727T

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na nove, radiooznačene mGluR2/3 ligande, koji su selektivni u odnosu na druge mGlu receptore, koji su od koristi za pravljenje slika i kvantifikovanje metabotropnih glutamat receptora mGlu2 i 3 u tkivu, upotrebom pozitronske emisione tomografije (PET). Pronalazak se takođe odnosi na sastave koji sadrže takva jedinjenja, na postupke za pripremanje takvih jedinjenja i sastava, na upotrebu takvih jedinjenja i sastava za pravljenje slika tkiva, ćelija ili sisara, in vitro ili in vivo i na prekursore navedenih jedinjenja.

POZADINA PRONALASKA

[0002] Glutamatergički sistem u CNS je jedan od sistema neurotransmitera koji ima ključnu ulogu u nekoliko moždanih funkcija. Metabotropni receptori glutamata (mGluR) pripadaju G-protein-spojenoj familiji i identifikovano je osam različitih pod tipova do danas, koji su raspoređeni u različitim moždanim regionima (Ferraguti & Shigemoto, Cell & Tissue Research, 326:483-504, 2006). mGluR učestvuju u modulaciji sinaptičkog prenošenja i neuronske ekscitabilnosti u CNS vezivanjem glutamata. Ovo aktivira receptor kako bi došao u dodir sa parnjacima unutarćelijskog signaliziranja, što dovodi do ćelijskih pojava (Niswender & Conn, Annual Review of Pharmacology & Toxicology 50:295-322, 2010).

[0003] mGluR su dalje podeljeni na tri pod grupe na osnovu njihovih farmakoloških i strukturnih svojstava: grupa-I (mGluR1 i mGluR5), grupa-II (mGluR2 i mGluR3) i grupa-III (mGluR4, mGluR6, mGluR7 i mGluR8). Ligandi grupe-II, i ortosterni i alosterni modulatori, smatraju se da su potencijalno od koristi kod tretiranja različitih neuroloških poremećaja, uključujući psihozu, poremećaje raspoloženja, Alchajmerovu bolest i kognitivne i memorijske deficijencije. Ovo je dosledno sa njihovom primarnom lokalizacijom u oblastima mozga kao što su korteks, hipokampus i striatum (Ferraguti & Shigemoto, Cell & Tissue Research 326:483-504, 2006). Naročito su antagonisti i negativni alosterni modulatori zabeleženi da sadrže potencijal za tretiranje poremećaja raspoloženja i kognitivne i memorijske disfunkcije. Ovo je zasnovano na saznanjima vezanih za antagoniste i negativne alosterne modulatore grupe-II receptora testirane na laboratorijskim životinjama izloženim opsegu eksperimentalnih stanja smatranih relevantnim za ove kliničke sindrome (Goeldner i dr., Neuropharmacology 64:337-346, 2013). Klinička ispitivanja su, na primer, u toku za mGluR2/3 antagonist RO4995819 (F. Hoffmann-La Roche Ltd.) u dodatnoj terapiji kod pacijenata sa kliničkom depresijom koji nemaju adekvatan odgovor na trenutno tretiranje antidepresivima (ClinicalTrials.gov Identifier NCT01457677, dobijeno 19. februara 2014.). WO 2013066736 (Merck Sharp & Dohme Corp.) opisuje kvinolin karboksamid i kvinolin karbonitril jedinjenja kao mGluR2 NAM. WO2013174822 (Domain therapeutics) opisuje 4H-pirazolo[1,5-a]kvinazolin-5-one i 4H-pirolo [1,2-a]kvinazolin-5-one i njihovu in vitro mGluR2 NAM aktivnost. WO 2014064028 (F. Hoffman-La Roche AG) obelodanjuje selekciju mGlu2/3 negativnih alosternih modulatora i njihovu potencijalnu upotrebu pri tretiranju poremećaja autističnog spektra (ASD). WO2014195311 (Janssen Pharmaceutica NV) obelodanjuje 6,7-dihidropirazolo[1,5-a]pirazin-4(5H)-on jedinjenja i njihovu upotrebu kao mGluR2 NAM.

[0004] Receptori grupe-II su uglavnom locirani na presinaptičkim nervnim završecima gde ispoljavaju negativnu povratnu petlju kako bi oslobodili glutamat u sinapsu (Kelmendi i dr, Primary Psychiatry 13:80-86, 2006). Funkcija suzbijanja ovih receptora sa antagonistima ili negativnim alosternim modulatorima prema tome podiže kočenje oslobađanja glutamata što se ispoljava u pojačanom glutamatergičkom signaliziranju. Veruje se da je efekat osnova za efekte nalik antidepresivnim i prokognitivnim koji su uočeni kod pred kliničkih vrsta sa inhibitorima receptora Grupe-II. Dodatno, tretiranje miševa sa ortosternim antagonistima grupe-II pokazalo je pojačano signaliziranje sa rastom faktora kao što su neurotrofni faktor dobijen iz mozga (BDNF) (Koike i dr, Behavioural Brain Research 238:48-52, 2013). Kako je pokazano da su BDNF i drugi faktori rasta suštinski uključeni u posredovanju sinaptičke plastičnosti, ovaj mehanizam verovatno doprinosi i antidepresivnim i prokognitivnim svojstvima ovih jedinjenja. Suzbijanje mGluR familije receptora grupe-II stoga se smatra da predstavlja potencijalni terapeutski mehanizam za neurološke poremećaje, uključujući depresiju i kognitivnu ili memorijsku disfunkciju.

[0005] Pozitronska emisiona tomografija (PET) je neinvazivna tehnika pravljenja slika koja nudi najvišu prostornu i vremensku rezoluciju od svih nuklearnih tehnika pravljenja slika i ima dodatu prednost da može dozvoliti pravu kvantifikaciju koncentracija tragača u tkivu. Koristi radionukleotide koji emituju pozitrone, kao što su, na primer,<15>O,<13>N,<11>C i<18>F za detekciju. Do sad je zabeleženo nekoliko radiotragača pozitronske emisione tomografije za in vivo pravljenje slika mGluR. WO2012062752 obelodanjuje radiooznačene mGluR ligande koji su od koristi za pravljenje slika i kvantifikovanje metabotropnog receptora glutamata mGluR2 u tkivu upotrebom PET. I dalje postoji potreba da se pruže poboljšani radiotragači pozitronske emisione tomografije za pravljenje slika mGlu receptora grupe II.

REZIME PRONALASKA

[0006] Predmetni pronalazak se odnosi na jedinjenje koje ima Formulu (I)

gde je R<1>-CH2F a R<2>je -H, ili R<1>je -H a R<2>je -CH2F, i

gde je bar jedan atom radioaktivan, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili solvat.

[0007] U naročitom otelotvorenju, jedinjenje Formule (I) je jedinjenje 1

jedinjenje 1

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili solvat.

[0008] U naročitom otelotvorenju, jedinjenje Formule (I) je jedinjenje 2

jedinjenje 2

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili solvat.

[0009] Pronalazak se takođe odnosi na prekursor jedinjenja za sintezu jedinjenja 1. Zbog toga, predmetni pronalazak se takođe odnosi na jedinjenje Formule P-2 ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so ili solvat. Takođe je ovde obelodanjeno jedinjenje Formule P-1 ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili solvat ali ne čini deo predmetnog pronalaska.

P-2.

[0010] Zbog toga, predmetni pronalazak se takođe odnosi na jedinjenje Formule P-4 ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so ili solvat. Takođe je ovde obelodanjeno jedinjenje Formule P-3 ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili solvat ali ne čini deo predmetnog pronalaska.

Pronalazak se takođe odnosi na farmaceutski sastav koji sadrži jedinjenje Formule (I) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so i farmaceutski prihvatljiv nosač ili razblaživač. U naočitom otelotvorenju, navedeni farmaceutski sastav je naročito pogodan za dijagnostikovanje i prema tome se može ovde nazivati kao dijagnostički farmaceutski sastav. Naročito, navedeni farmaceutski sastav je sterilni rastvor. Zbog toga, prikaz pronalaska je sterilni rastvor koji sadrži jedinjenje Formule (I) koje je ovde opisano.

[0011] Pronalazak se dalje odnosi na upotrebu jedinjenja Formule (I) kao sredstvo za pravljenje slika. Prema tome, primer pronalaska je upotreba jedinjenja Formule (I) kao što je ovde opisano, za, ili metoda za pravljenje slika tkiva, ćelije ili sisara, in vitro ili in vivo. Naročito, pronalazak se odnosi na jedinjenje Formule (I) kao što je ovde opisano, za upotrebu kao sredstvo za kontrast za pravljenje slika tkiva, ćelija ili sisara, in vitro, ex vivo ili in vivo. Pronalazak se dalje odnosi na sastav koji sadrži jedinjenje Formule (I) za upotrebu kao sredstvo za kontrast za pravljenje slika tkiva, ćelija ili sisara, in vitro, ex vivo ili in vivo.

[0012] Pronalazak se takođe odnosi na metodu za pravljenje slika tkiva, ćelija ili sisara, koja obuhvata dovođenje u kontakt sa ili pružanje ili davanje detektabilne količine označenog jedinjenja Formule (I) kao što je ovde opisano u ćelije tkiva ili sisara, i detektovanje jedinjenja Formule (I).

[0013] Sledeći primer pronalaska je metoda za stvaranje slika tkiva, ćelija ili sisara koja obuhvata dovođenje u kontakt sa ili pružanje ili davanje u tkivo, ćeliju ili sisaru, količine jedinjenja Formule (I) kao što je ovde opisano, i pravljenje slika tkiva, ćelija ili sisara sistemom za pravljenje slika pozitronske emisione tomografije. Dodatno, pronalazak se odnosi na postupak za pripremanje jedinjenja prema Formuli (I) kao što je ovde opisano, koji obuhvata

(a) korake (a-1) reagovanja jedinjenja Formule (P-1) sa metansulfonskim anhidridom u prisustvu baze i inertnog rastvarača, na primer, trimetilamina ili trietilamina i dihlorometana, i (a-2) reagovanje jedinjenja dobijenog u koraku (a-1) sa nukleofilnim radioaktivnim reagensom za fluorisanje [<18>F]F<->u prisustvu baze u inertnom rastvaraču

ili

(b) korak reagovanja jedinjenja Formule (P-2) sa nukleofilnim radioaktivnim reagensom za fluorisanje [<18>F]F<->u prisustvu baze u inertnom rastvaraču

ili

(c) korake (c-1) reagovanja jedinjenja Formule (P-3) sa metansulfonskim anhidridom u prisustvu baze i inertnog rastvarača, na primer, trimetilamina ili trietilamina i dihlorometana, i (c-2) reagovanje jedinjenja dobijenog u koraku (c-1) sa nukleofilnim radioaktivnim reagensom za fluorisanje [<18>F]F<->u prisustvu baze u inertnom rastvaraču

ili

(d) korak reagovanja jedinjenja Formule (P-4) sa nukleofilnim radioaktivnim reagensom za fluorisanje [<18>F]F<->u prisustvu baze u inertnom rastvaraču

[0014] Pogodni nukleofilni radioaktivni reagensi za fluorisanje u koracima (a-2), (b), (c-2) i (d) su, na primer, K[<18>F]/Kryptofix 222 ili tetraalkilamonijum soli koje inkorporiraju radioaktivni fluorid [<18>F]F-.Pogodne baze u koracima (a-2), (b), (c-2) i (d), su, na primer K2CO3ili Cs2CO3. Pogodni rastvarači u koracima (a-2), (b), (c-2) i (d) su, na primer, DMSO, CH3CN ili DMF, opciono uz dodavanje male količine vode.

OPIS SLIKA

[0015]

Slika 1a prikazuje biodistribuciju [<18>F]-1 u oblastima mozga kod SD pacova.

Slika 1b prikazuje biodistribuciju [<18>F]-1 u periferiji kod SD pacova.

Slika 2 prikazuje krive vreme aktivnost za apsorpciju [<18>F]-1 sa i bez tretiranja jedinjenjem A (NAM jedinjenje, selektivno za mGlu2/3 (~ 20 puta selektivnije za 2 nego za 3) u poređenju sa drugim mGluR), što je na slici ukazano kao mGlu2/3 NAM kod SD pacova.

Slika 3a prikazuje biodistribuciju [<18>F]-2 u oblastima mozga kod SD pacova.

Slika 3b prikazuje biodistribuciju [<18>F]-1 u periferiji kod SD pacova.

Slika 4 prikazuje krive vreme aktivnost za apsorpciju [<18>F]-2 sa i bez tretiranja jedinjenjem A (NAM jedinjenje, selektivno za mGlu2/3 (~ 20 puta selektivnije za 2 nego za 3) u poređenju sa drugim mGluR), što je na slici ukazano kao mGlu2/3 NAM kod SD pacova.

[0016] Na Slikama 2 i 4 korišćena je sledeća legenda:

DETALJNI OPIS PRONALASKA

[0017] Kao što je već spomenuto, jedinjenja Formule (I) i sastavi koji sadrže jedinjenja Formule (I) se mogu koristiti za pravljenje slika tkiva, ćelija ili sisara, in vitro ili in vivo. Naročito, pronalazak se odnosi na metodu za pravljenje slika ili kvantifikaciju mGluR2/3 receptora u tkivu, ćelijama ili sisarima in vitro ili in vivo.

[0018] Ćelija i tkiva su poželjno ćelije i tkiva centralnog nervnog sistema gde su mGluR2/3 receptori u velikim količinama. Kao što je već spomenuto, mGluR2/3 receptori su u velikim količinama u tkivu centralnog nervnog sistema, naročito u tkivu centralnog nervnog sistema koje formira mozak, preciznije, koje formira cerebralni korteks, talamičke regione, dodatni olfaktorni bulbus, hipokampus, amigdalu, caudate-putamen i nucleus accumbens.

[0019] Kada se metoda vrši in vivo, jedinjenje Formule (I) se može dati intravenski, na primer, injektiranjem sa špricem ili pomoći periferne intravenske linije, kao što je kratki kateter.

[0020] Kada je sisar čovek, jedinjenje Formule (I) ili sterilni rastvor koji sadrži jedinjenje Formule (I), može naročito biti dat intravenski u ruku, ili bilo koji venu koja se može identifikovati, naročito na zadnje strane ruke ili u srednju venu lakta.

[0021] Zbog toga, u naročitom otelotvorenju, pronalazak se odnosi na metodu za pravljenje slika tkiva ili ćelija kod sisara, koja obuhvata intravensko davanje jedinjenja Formule (I) kao što je ovde definisano ili sastava koji sadrži jedinjenje Formule (I) sisaru, i pravljenje slika tkiva ili ćelija sistemom za pravljenje slika pozitronske emisione tomografije.

[0022] Zbog toga, u sledećem naročitom otelotvorenju, pronalazak se odnosi na metodu za pravljenje slika tkiva ili ćelija kod čoveka, koja obuhvata intravensko davanje jedinjenja Formule (I) kao što je ovde definisano ili sastava koji sadrži jedinjenje Formule (I) čoveku, i pravljenje slika tkiva ili ćelija sistemom za pravljenje slika pozitronske emisione tomografije.

[0023] U sledećem otelotvorenju, pronalazak se odnosi na metodu za pravljenje slika ili kvantifikovanje mGluR2/3 receptora kod sisara, koja obuhvata intravensko davanje jedinjenja Formule (I), ili sastava koji sadrži jedinjenje Formule (I) sisaru i pravljenje slika sistemom za pravljenje slika pozitronske emisione tomografije.

[0024] U drugom otelotvorenju, pronalazak se odnosi na upotrebu jedinjenja Formule (I) za pravljenje slika tkiva, ćelija ili sisara, in vitro ili in vivo, ili se pronalazak odnosi na jedinjenje Formule (i) za upotrebu pri pravljenju slika tkiva, ćelija ili sisara in vitro ili in vivo, upotrebom pozitronske emisione tomografije.

[0025] Pronalazak se takođe odnosi na metodu za pravljenje slika ili kvantifikovanje mGlu2 i 3 receptora kod sisara, metoda obuhvata pružanje detektabilne količine jedinjenja Formule (I) sisaru i detektovanje jedinjenja Formule (I) koje je povezano sa mGlu2 i 3 receptorima.

Metoda takođe omogućava određivanje popunjenosti mGlu2 i 3 receptora drugim jedinjenjima koja nisu radioobeležena, prema tome, pronalazak se odnosi na jedinjenje Formule (I) kao što je ovde definisano, ili farmaceutski sastav prema pronalasku, za upotrebu pri određivanju mesta popunjenosti mGlu2 i 3 receptora drugim jedinjenjima koja nisu radioobeležena.

1

[0026] U nastavku, pronalazak se odnosi na jedinjenje Formule (I) ili farmaceutski sastav prema pronalasku za upotrebu u metodu za procenjivanje poremećaja ili predispozicije koja je povezana sa mGlu2 i 3 receptorima kod ispitanika, metoda obuhvata pružanje detektabilne količine jedinjenja Formule (I) ili farmaceutskog sastava prema pronalasku, gde jedinjenje Formule (I) prolazi kroz krvno-moždanu barijeru i poželjno se vezuje za mGlu2 i 3 receptore u tkivu mozga, što omogućava jedinjenju da se distribuira u tkivu mozga, i da se naprave slike tkiva mozga.

[0027] Jedinjenje se daje ispitaniku u detektabilnoj količini i nakon prolaska dovoljnog vremena da jedinjenje postane povezano sa mGlu2 i 3 receptorima, označeno jedinjenje se detektuje neinvazivno.

DEFINICIJE

[0028] Kao što se ovde koristi, termin „sastav” je namenjen da obuhvati proizvod koji sadrži naznačene sastojke u naznačenim količinama, kao i bilo koji proizvod koji je rezultat, neposredno ili posredno, kombinacija naznačenih sastojaka u naznačenim količinama.

[0029] Termin „detektabilna količina” se odnosi na koncentraciju jedinjenja koja je iznad najniže granice detekcije instrumenta za pravljenje slika, naročito PET skenirajućeg instrumenta.

[0030] Apsolutna konfiguracija naznačena je u skladu sa Cahn-Ingold-Prelog sistemom.

[0031] Adicione soli jedinjenja prema pronalasku su takođe namenjene da budu obuhvaćene okvirom ovog pronalaska.

[0032] Prihvatljive soli jedinjenja pronalaska su one gde je suprotni jon farmaceutski prihvatljiv. Međutim, soli kiselina i baza koje nisu farmaceutski prihvatljive mogu takođe pronaći upotrebu, na primer, pri pripremanju ili prečišćavanju farmaceutski prihvatljivog jedinjenja. Sve soli, bilo farmaceutski prihvatljive ili ne, obuhvaćene su u okviru granica predmetnog pronalaska. Farmaceutski prihvatljive soli su definisane tako da sadrže terapeutski aktivne netoksične kisele oblike adicionih soli koje jedinjenja prema pronalasku mogu formirati. Navedene soli se mogu dobiti tretiranjem baznog oblika jedinjenja prema pronalasku sa odgovarajućim kiselinama, na primer neorganskim kiselinama, na primer, hidrohalnom kiselinom, naročito hlorovodoničnom kiselinom, bromovodoničnom kiselinom, sumpornom kiselinom, azotnom kiselinom i fosfornom kiselinom, organskim kiselinama, na primer sirćetnom kiselinom, hidroksisirćetnom kiselinom, propionskom kiselinom, mlečnom kiselinom, piruvinskom kiselinom, oksalnom kiselino, malonskom kiselinom, sukcinskom kiselinom, maleinskom kiselinom, fumarnom kiselinom, jabučnom kiselinom, vinskom kiselinom, limunskom kiselinom, metansulfonskom kiselinom, etansulfonskom kiselinom, benzensulfonskom kiselinom, p-toluensulfonskom kiselinom, ciklaminskom kiselinom, salicilnom kiselinom, p-aminosalicilnom kiselinom i pamoinskom kiselinom.

[0033] Suprotno tome, navedeni oblici soli se mogu konvertovati u oblik slobodne baze tretiranjem odgovarajućom bazom.

[0034] Pored toga, neka od jedinjenja predmetnog pronalaska mogu formirati solvate sa vodom (tj., hidrati) ili uobičajenim organskim rastvaračima, i takvi solvati su takođe namenjeni da budu obuhvaćeni u okviru ovog pronalaska.

[0035] Termin „ispitanik” kao što se ovde koristi, odnosi se na životinju, poželjno sisara, najpoželjnije čoveka, koji je ili je bio predmet tretiranja, praćenja ili ispitivanja. Ukoliko nije drugačije navedeno, „ispitanik” obuhvata i zdrave životinje i životinje pogođene različitim bolestima ili poremećajima.

[0036] Termin „sisar” se odnosi naročito na ljude, miševe, pse i pacove.

[0037] Termin „ćelija” se odnosi na ćeliju koja ispoljava ili inkorporira mGlu2 i/ili 3 receptor.

[0038] Nazivi jedinjenja predmetnog pronalaska su stvoreni u skladu sa pravilima nomenklaturom koja su dogovorena od strane Chemical Abstracts Service (CAS) upotrebom Advanced Chemical Development, Inc., softvera (ACD/Name product version 10.01; Build 15494, 1 Dec 2006).

PRIMENE

[0039] Jedinjenja prema predmetnom pronalasku pronalaze različite primene za pravljenje slika tkiva, ćelija ili sisara i in vitro i in vivo. Prema tome, na primer, mogu se koristiti za mapiranje diferencijalne distribucije mGluR2/3 kod ispitanika različite starosti i pola. U nastavku, omogućavaju istraživanje različite distribucije mGluR2/3 kod ispitanika pogođenih različitim bolestima ili poremećajima. Prema tome, abnormalna distribucija može biti od pomoći pri dijagnozi, pronalaženju slučaja, stratifikaciji ispitanih populacija i pri praćenju progresa bolesti kod pojedinačnih ispitanika. Radioligandi mogu dalje pronaći primenu pri određivanju mGluR2/3 mesta popunjenosti od strane drugih liganda. Kako se radioligand daje u tragovima, tj., u detektabilnim količinama, na primer za PET pravljenje slika, nikakav terapeutski efekat se ne može pripisati davanju radioliganda prema pronalasku.

EKSPERIMENTALNI ODELJAK OPŠTI DEO

[0040] Kao što se ovde koristi, termin „vod.” predstavlja vodeni, „DCM” predstavlja dihlorometan, „DIPE” predstavlja diizopropil etar, „DMF” predstavlja N, N-dimetilformamid, „DMSO” predstavlja dimetil sulfoksid, „DSC” predstavlja diferencijalnu skenirajuću kalorimetriju, „Et3N/TEA” predstavlja trietilamin, „EtOH” predstavlja etanol, „EtOAc” predstavlja etil acetat, „h” predstavlja sate, „HPLC” predstavlja tečnu hromatografiju tečnih performansi, „LCMS” predstavlja tečnu hromatografiju/masenu spektrometriju, „iPrOH” predstavlja izopropil alkohol, „MeOH” predstavlja metanol, „[M+H]<+>” predstavlja protonisanu masu slobodne baze jedinjenja, „min” predstavlja minute, „m.p.” predstavlja tačku topljenja, „PdCl2(PPh3)2” predstavlja bis(trifenilfosfin)paladijum(II) hlorid a PPh3predstavlja trifenilfosfin, „RP” predstavlja reverznu fazu, „s.t./ST” predstavlja sobnu temperaturu, „Rt” predstavlja vreme zadržavanja (u minutima), „zas.” predstavlja zasićeno, „ras.” predstavlja rastvor, „XtalFluor-E®” predstavlja (dietilamino)difluorosulfonijum tetrafluoroborat.

[0041] Tankoslojna hromatografija (TLC) izvršena je na 60 F254 pločama (Merck) sa silika gelom upotrebom rastvarača kvaliteta za reagens. Hromatografija sa otvorenom kolonom je izvršena na silika gelu, otvora 230-400 veličine čestica i 60 Å veličine pora (Merck) pod standardnim tehnikama. Automatizovana „flash” hromatografija na koloni je izvršena upotrebom spremnih za povezivanje kertridža od Merck, na neregularnom silika gelu, veličine čestica 15-40 µm (jednokratne „flash” kolone sa normalnom fazom) na SPOT ili LAFLASH sistemu od Armen Instrument.

1

[0042] Nekoliko metoda za pripremanje jedinjenja ovog pronalaska je prikazano u sledećim primerima, koji su namenjeni da prikažu a ne da ograniče okvir predmetnog pronalaska. Ukoliko nije drugačije navedeno, svi početni materijali su dobijeni iz komercijalnih dobavljača i korišćeni su bez daljeg prečišćavanja.

PRIPREMANJE MEĐUJEDINJENJA MEĐUJEDINJENJE 1 (I-1)

[0043]

[0044] K2CO3(171 mg, 1,24 mmol) je dat u mešani rastvor (7S)-6,7-dihidro-3-jodo-7-metil-5-[4-(trifluorometil)fenil]-pirazolo[1,5-a]pirazin-4(5H)-on ([1639901-88-4], WO 2014195311, 0,97 g, 2,48 mmol) u MeOH (10 mL) pri s.t. i pod azotom. Smeša je mešana na st u trajanju od 2h. Rastvarač je uklonjen u vakuumu i ostatak je razblažen vodom i izvađen sa EtOAc. Organski sloj je odvojen, osušen (Na2SO4), filtriran i rastvarači su ispareni u vakuumu. Sirovi proizvod je prečišćen „flash” hromatografijom na koloni (silika; EtOAc u DCM 0/100 to 30/70). Željene frakcije su sakupljene i rastvarači su ispareni in vacuo kako bi se dobilo međujedinjenje I-1 kao bež čvrsta supstanca (549 mg, 69%).

MEĐUJEDINJENJE 2 (I-2)

[0045]

[0046] Xtalfluor-E® (0,338 g; 1,478 mmol) i trimetilamin trihidrofluorid (0,241 mL; 1,478 mmol) su dodati u mešanu smešu 2-amino-5-bromo-4-piridinmetanol (0,2 g; 0,985 mmol) u DCM (14 mL) u zatvorenoj epruveti pri 0°C i pod azotom. Smeša je ostavljena da se zagreje i mešana je u trajanju od 18 h. Smeša je pažljivo tretirana sa zas. NaHCO3/slanim rastvorom pri 0 °C i izvađena je sa DCM. Organski sloj je odvojen, osušen (Na2SO4), filtriran i isparen u vakuumu. Ostatak je prečišćen „flash” hromatografijom na koloni (silika; etil acetat u DCM 0/100 do 30/70). Željene frakcije su sakupljene i koncentrovane u vakuumu kako bi se dobilo međujedinjenje 1-2 (94,4 mg; 47%) kao bež čvrsta supstanca.

Međujedinjenje 3 (I-3)

[0047]

[0048] Imidazol (0,41 g, 5,89 mmol) je dodat u smešu 2-amino-5-bromo-4-(hidroksimetil)piridina (0,797 g, 3,93 mmol) i terc-butildimetilsilil hlorida (0,89 g, 5,89 mmol) u DMF (7,9 mL) pri s.t. Dobijena smeša je mešana pri s.t.16 h. Smeša je tretirana sa zas. NaHCO3pri 0 °C i izvađena sa EtOAc. Organski sloj je odvojen, ispran sa slanim rastvorom, osušen (Na2SO4), filtriran i isparen u vakuumu. Sirovi proizvod je prečišćen sa „flash” hromatografijom na koloni (silika, EtOAc/DCM 0/100 to 50/50). Željene frakcije su sakupljene i isparene u vakuumu kako bi se dobilo 1-3 (0,34 g, 67%) kao bela čvrsta supstanca.

MEĐUJEDINJENJE 4 (I-4)

[0049]

1

[0050] Bakar(I) jod (3,20 mg, 0,0017 mmol) je dodat u dezoksigenisanu mešanu smešu I-1 (0,54 g, 1,68 mmol), 1-3 (0,64 g, 2,02 mmol), TEA (0,70 mL), PdCl2(PPh3)2(23,61 mg, 0,034 mmol) i PPh3(8,82 mg, 0,034 mmol) u DMF (11 mL) pod azotom. Reakciona smeša je mešana pri 70 °C u trajanju od 18 h. Smeša je razblažena sa NH4OH/slanim rastvorom i izvađena sa EtOAc. Organski sloj je odvojen, osušen (Na2SO4), filtriran i rastvarači su isparili u vakuumu. Sirovi proizvod je prečišćen „flash” hromatografijom na koloni (silika;

EtOAc/DCM 0/100 to 100/0). Željene frakcije su sakupljene i koncentrovane u vakuumu kako bi se dobilo 1-4 (0,53 g, 57%) kao bledo braon čvrsta supstanca.

(*)Međujedinjenje 25 (I-25) ;[0051] ;;; ;;; [0052] Bakar(I) jod (860,27 mg, 4,52 mmol) je dodat u mešanu suspenziju (7S)-6,7-dihidro-7-metil-pirazolo[1,5-a]pirazin-4(5H)-ona ([1639901-79-3, WO2014195311, 2,05 g, 13,55 mmol), 5-bromo-2-(trifluorometil)benzil alkohola (2,88 g, 11,29 mmol), K2CO3(3,12 g, 22,59 mmol) i N,N'-dimetiletilendiamina (571,3 µL, 4,52 mmol) u toluenu (15 mL) u zatvorenoj epruveti i pod azotom. Smeša je mešana pri 105 °C u trajanju od 18 h. Zatim je smeša razblažena sa vodom i NH332% i izvađena sa DCM. Organski sloj je odvojen, osušen (Na2SO4), filtriran i rastvarači su ispareni u vakuumu. Sirovi proizvod je prečišćen sa „flash” hromatografijom na koloni (silika, EtOAc/heptan 40/60 do 70/30). Željene frakcije su sakupljene i koncentrovane u vakuumu kako bi se dobilo 1-5 (3,24 g, 88%) kao bela čvrsta supstanca. ;;MEĐUJEDINJENJE 6 (I-6) ;[0053] ;;;1 ; ;;; [0054] Jod (1,75 g, 6,91 mmol) je dodat u rastvor I-5 (3,21 g, 9,87 mmol) i amonijum cerijum(IV) nitrata (3,79 g, 6,91 mmol) u CH3CN (46 mL) i smeša je mešana pri 75 °C u trajanju od 45 min. Zatim je smeša ohlađena do s.t., razblažena sa EtOAc i isprana sa razblaženim Na2S2O3. Organski sloj je odvojen, osušen (Na2SO4), filtriran i rastvarači su isparili u vakuumu. Sirovi proizvod je prečišćen „flash” hromatografijom na koloni (silika, EtOAc/heptan 20/80 do 40/60). Željene frakcije su sakupljene i isparene u vakuumu kako bi se dobilo 1-6 (4,1 g, 92%) kao bela pena. ;;PRIPREMANJE P-1 (komparativni primer) ;[0055] ;;; ;;; [0056] HCl (6M u iPrOH, 5,07 mL, 30,43 mmol) je dodat u rastvor I-4 (0,533 g, 0/96 mmol) u EtOH (111 mL) pri s.t. i r.m. je mešan u trajanju od 18 h. Smeša je zatim isparila u vakuumu. Ostatak je tretiran sa NH4OH i izvađen sa EtOAc. Organski sloj je odvojen, osušen (Na2SO4), filtriran i isparen u vakuumu. Sirovi proizvod je prečišćen „flash” hromatografijom na koloni (silika; EtOAc/DCM 0/100 to 100/0). Željene frakcije su sakupljene i isparene u vakuumu. Zatim je proizvod trituriran sa Ft2O, filtriran i osušen kako bi se dobilo P-1 (0,23 g, 54%) kao bež čvrsta supstanca. ;;;1 ;PRIPREMANJE P-2 ;[0057] ;;; ;;; [0058] Trifenilfosfin sa polimernom podlogom (0,24 g, 0,52 mmol) je dodat u smešu P-1 (45,5 mg, 0,10 mmol) i ugljenih tetrabromida (0,17 g, 0,52 mmol) u DCM (12. mL) pri 0 °C pod N2atmosferom. Smeša je mešana pri s.t. u trajanju od 18 h, zatim je tretirana sa DCM i filtrirana i zatim je polimerna smola isprana sa MeOH i DCM nekoliko puta. Filtrat je razblažen sa heptanom i isparen u vakuumu pri s.t. kako bi se dobilo P-2 kao braon sirup koji je korišćen bez daljeg prečišćavanja. ;;PRIPREMANJE P-3 (komparativni primer) ;[0059] ;;; ;;; [0060] Bakar (I) jod (4,22 mg, 0,022 mmol) je dodat u mešanu smešu I-6 (1 g, 2,22 mmol), 5-etinil-2piridinamin (523,68 mg, 4,43 mmol), TEA (924,23 µL, 6,65 mmol), PdCl2(PPh3)2(31,11 mg, 0,044 mmol) i PPh3(11,63 mg, 0,044 mmol) u DMF (10 mL). Smeša je ;;;1 ;prečišćena sa N2u trajanju od 5 min i zatim je mešana pri 90 °C u trajanju od 5 h. Ostatak je razblažen sa vodom i izvađen sa EtOAc. Organski sloj je odvojen, osušen (Na2SO4), filtriran i koncentrovan ispareni u vakuumu. Sirovi proizvod je prečišćen „flash” hromatografijom na koloni (silika, MeOH/DCM 0/100 to 05/95). Željene frakcije su sakupljene i koncentrovane u vakuumu kako bi se dobilo P-3 (923 mg, 92%). ;;PRIPREMANJE P-4 ;[0061] ;;; ;;; [0062] U mešani rastvor P-3 (200 mg, 0,45 mmol) u DCM (16 mL) je dodat fosforni tribromid (1 M u DCM, 679,64 µL, 0,68 mmol), pretvarajući žuti rastvor u belu suspenziju. Reakcija je mešana pri s.t. u trajanju od 30 min, rastvarajući belu suspenziju progresivno. Posle toga, reakcija je razblažena sa DCM/heptanom (krajnji 1/1 odnos) i isprana je sa zas. vod. rast. NaHCO3. Organski sloj je odvojen, osušen (MgSO4), filtriran i rastvarači su ispareni u vakuumu pri s.t. (N.B: proizvod reaguje samostalno nakon koncentrovanja) kako bi se dobilo P-4 (143 mg, 63%). ;;PRIPREMANJE JEDINJENJA [<19>F]-1 ;[0063] ;;;1 ; ;;; [0064] Bakar (I) jod (0,88 mg, 0,005 mmol) je dodat u dezoksigenisanu mešanu smešu I-1 (147,0 mg, 0,46 mmol), 1-2 (94,4 mg, 0,46 mmol), TEA (192 µL, 1,38 mmol), PdCl2(PPh3)2(6,46 mg, 0,009 mmol) i PPh3(2,42 mg, 0,009 mmol) u DMF (6,7 mL) pod azotom. Smeša je mešana pri 70 °C u trajanju od 2 dana. Smeša je razblažena sa NH4OH/vodom je izvađena sa EtOAc. Organski sloj je odvojen, osušen (Na2SO4), filtriran i rastvarači su isparili u vakuumu. Sirovi proizvod je prečišćen „flash” hromatografijom na koloni (silika; EtOAc/DCM 0/100 to 87/13). Željene frakcije su sakupljene i isparile su u vakuumu kako bi se dobila frakcija sa čistim jedinjenjem. Pomešana frakcija je rastvorena u Et2O sa nekoliko kapi 2-propanola i potom je pretvorena u so hlorovodonične kiseline tretiranjem sa HCl/2-propanolom. Čvrsta so je filtrirana, isprana sa Et2O i osušena, zatim je tretirana vodom/32% NH4OH dok pH nije postala bazna i izvađena je sa EtOAc. Organski sloj je odvojen, osušen (Na2SO4), filtriran i isparen u vakuumu kako bi se dobila druga frakcija čistog jedinjenja. Dve frakcije sa čistim jedinjenjem su kombinovane triturirane sa Et2O/DIPE, filtrirane i osušene kako bi se dobilo jedinjenje [<19>F]-1 (32,7 mg, 16%) kao bež čvrsta supstanca. ;;PRIPREMANJE JEDINJENJA [<19>F]-2 ;[0065] ;;;2 ; ;;; [0066] Bis(2-metoksietil)amino-sumpor trifluorid (0,915 mL, 4,961 mmol) je dodat u mešani rastvor jedinjenja P-3 (438 mg, 0,992 mmol) u DCM (6,2 mL) pri 0 °C i pod azotom. Smeša je mešana pri oko 0 °C u trajanju od 45 min. Zatim je smeša tretirana sa zas. vod. ;NaHCO3pri 0 °C i izvađena sa DCM i EtOAc. Organski sloj je odvojen, osušen (Na2SO4), filtriran i rastvarači su koncentrovani u vakuumu. Sirovi proizvod je prečišćen „flash” hromatografijom na koloni (silika; EtOAc u DCM 0/100 to 50/50). Željene frakcije su sakupljene i rastvarači su koncentrovani u vakuumu. Ostatak je trituriran sa Et2O kako bi se dobila nečista frakcija kao žuta čvrsta supstanca i prečišćena je sa RP HPLC (Stacionarna faza: C18 XBridge 50 x 100 5 µm, mobilna faza: gradijent od 80% 10mM NH4CO3H pH 9 rastvor u vodi, 20% CH3CN to 0% 10mM NH4CO3H pH rastvor u vodi, 100% CH3CN) kako bi se dobilo jedinjenje [<19>F]-2 (55 mg, 12%) kao bledo žuta čvrsta supstanca.<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 1,71 (d, J=6,5 Hz, 3 H) 3,99 (dd, J=12,7, 7,4 Hz, 1 H) 4,26 (dd, J=12,5, 4,2 Hz, 1 H) 4,59 (br. s, 2 H) 4,74 (pentd, J=6,7, 4,4 Hz, 1 H) 5,63 (d, J=46,7 Hz, 2 H) 6,43 (dd, J=8,6, 0,7 Hz, 1 H) 7,52 (dd, J=8,4, 0,8 Hz, 1 H) 7,57 (dd, J=8,6, 2,3 Hz, 1 H) 7,67 (s, 1 H) 7,72 - 7,76 (m, 2 H) 8,27 (dd, J=2,2, 0,6 Hz, 1 H). ;;PRIPREMANJE JEDINJENJA [<18>F]-1 I [<18>F]-2 ;OPŠTI DEO ;[0067] Hemikalije su dobijene od Sigma Aldrich (Saint Louis, SAD) i korišćene su bez daljeg prečišćavanja. [<18>F]F<->je proizvedeno od strane IBA Cycone 18/9 ciklotrona (Louvainla-Neuve, Belgija). ;;[0068] Preparativna HPLC je izvršena na Xbridge C18 koloni (4,6 × 250 mm, 5 µm; Waters, Milford SAD), upotrebom EtOH / 0,01 M fosfatnog pufera u vodi pH 7,4 (39/61 v/v) pri protoku 1 mL·min<-1>i talasnoj dužini od 254 nm (metoda A). ;[0069] Identitet radiotragača je potvrđen upotrebom istih analitičkih HPLC metoda kao što je opisano iznad nakon ko-injektiranja sa svojim analogom koji nije radioaktivan. ;;[0070] Millex GV filteri su dobijeni od Millipore (Amsterdam, Holandija). Radioaktivnost je izračunata upotrebom Wizard 1480 automatizovanog gama brojača (Perkin Elmer, Waltham, SAD). ;;[0071] Za [<18>F]-1 i [<18>F]-2, odgovarajući alkoholni prekursori PI i P-3, respektivno, su metilisani neposredno pre radiosinteze prema sledećem protokolu: ;P-1 ili P-3 (∼7,5 mg,1 ekv) je rastvoreno DCM (2 mL), zatim je trimetilamin (2,5 µL, 1,1 ekv) dodat, što je praćeno dodavanjem metansulfonskog anhidrida (3,5 mg, 1,1 ekv) i smeša je inkubirana u trajanju od 60 min pri s.t. Zatim je r.m. ispran sa vodom (2x) i osušen preko MgSO4, filtriran i isparen dok nije bio suv pri 30 °C u vakuumu. Posle toga je proizvod azeotropno osušen upotrebom CH3CN (3x 2 mL), takođe pri 30 °C u vakuumu. Nakon isparavanja poslednjeg dela CH3CN, metilisani prekursor je bio spreman za upotrebu. TLC (silika ploče eluirane sa 95% DCM i 5 % MeOH) je korišćen za proveravanje čistoće odgovarajućeg prekursora. ;;[0072] [<18>F]F<->je sakupljen prečišćavanjem protonski ozračenog ciljanog sadržaja (98%<18>O-H2O) preko QMA (Waters, Milford SAD) kertridža. Zatim je QMA kertridž eluiran, upotrebom CH3CN/vodi (700 µL od 95/5 v/v) koji je sadržao Kryptofix 222 (26 mg) i K2CO3(2,5 mg) u reakcionom sudu. Rastvor je osušen pod blagim protokom helijuma pri 110 °C u trajanju od 6 min, što je praćeno dva puta dodavanjem CH3CN (1 mL) i osušen pod helijumom pri 110 °C u trajanju od 5 min pojedinačno. Za standardne uslove mezil prekursor (2 mg) u suvom DMSO (0,5 mL) je dodat, i reagovan u trajanju od 10 min pri 120 °C. R.m. je razblažen i [<18>F]-1 ili [<18>F]-2 je zatim prečišćen upotrebom HPLC metode A. Sakupljena frakcija je zatim puštena kroz sterilni millex GV filter i zatim je dalje razblažena slanim rastvorom do koncentracije od 10% EtOH. ;;[0073] Konverzija je bila 50-80% (kao gruba procena) prema TCL. Frakcija nekonvertovanog alkohol prekursora je uvek prisutna u prekursor smeši korišćenoj za radiosintezu, kao i neke bočne proizvode. Radiohemijski prinosi počevši od ove metilisane prekursor smeše su bili 5-35% za [<18>F]-1 i 20-40% za [<18>F]-2, pod standardnim uslovima. Pod ovim standardnim uslovima takođe su testirani bromo prekursori, međutim prinosi je uvek bio < 3%. Radiohemijska čistoća je bila uvek >95% i specifična aktivnost na kraju sinteze je bila 165 ± 83 GBq/µmοl za [<18>F]-1, a 138 ± 37 GBq/µmοl za [<18>F]-2. ;;ANALITIČKI DEO TAČKE TOPLJENJA: ;[0074] Vrednosti su maksimalne vrednosti i dobijene su sa eksperimentalnim neizvesnostima koje su obično povezane sa ovom analitičkom metodom. ;;[0075] DSC823e (A): Za više jedinjenja, tačke topljenja su određene sa DSC823e (Mettler-Toledo) uređajem. Tačke topljenja su merene sa gradijentom temperature od 10 °C/minutu. Maksimalna temperatura je bila 300 °C. Vrednosti su maksimalne vrednosti. ;Mettler Toledo Mettler FP 81HT / FP90 uređaj (B): Za više jedinjenja, tačke topljenja su određene u otvorenim kapilarnim cevima na Mettler FP 81HT / FP90 uređaju. Tačke topljenja su merene sa gradijentom temperature od 1, 3, 5 ili 10 °C/minutu. Maksimalna temperatura je bila 300 °C. Tačka topljenja je očitana na digitalnom ekranu. ;;LCMS OPŠTI POSTUPAK ;[0076]Merenja na tečnoj hromatografiji visokih performansi (HPLC) su izvršena upotrebom LC pumpe, diodnog rednog (DAD) ili UV detektora i kolone kao što je naznačeno u respektivnim metodama. Ukoliko je neophodno, dodatni detektori su uključeni (videti tabelu metoda ispod). ;;[0077] Protok iz kolone je doveden do masenog spektrometra (MS) koji je konfigurisan sa jonskim izvorom na atmosferskom pritisku. U okviru je znanja stručne osobe da se kalibrišu parametri (npr., opseg skeniranja, vreme zadržavanja...) u cilju dobijanja jona koji dopuštaju identifikaciju nominalne monoizotopske molekularne mase (MW) jedinjenja i/ili tačne mase monoizotopne molekulske mase. Sakupljanje podataka je izvršena sa odgovarajućim softverom. ;;[0078] Jedinjenja su opisana sa svojim eksperimentalnim vremenima zadržavanja (Rt) i jonima. Ukoliko nije drugačije naznačeno u tabelama podataka, zabeleženi molekularni joni odgovaraju [M+H]<+>(protonirani molekul) i/ili [M-H]<->(deprotonirani molekul). U slučaju da ;;;2 ;se jedinjenje ne može direktno jonizovati tip adukta se određuje (tj., [M+NH4]<+>, [M+HCOO]-, [M+CH3COO]<->itd...). Za molekule sa više izotopskih parametara (Br, Cl..), zabeležena vrednost je ona dobijena za najnižu izotopsku masu. Svi rezultati su dobijeni sa eksperimentalnim neizvesnostima koje su obično povezane sa korišćenim postupkom. ;;[0079] U daljem tekstu, „SQD” pojedinačni kvadrupol detektor, „MSD” maseni selektivni detektor, „QTOF” kvadrupol-vreme letenja, „st” sobna temperatura, „BEH” premošćeni etilsiloksan/silika hibrid, „CSH” naelektrisani površinski hibrid, „UPLC” tečna hromatografija ultra performansi, „DAD” diodni redni detektor. ;;Tabela 1. LC-MS metode (Protok izražen u mL/min; temperatura kolone (T) u °C, vreme trajanja u min). ;; ;; (*) Različiti parametri MS kalibrisanja (zbog niske osetljivosti ili režima jonisanja)

Tabela 2. Analitički podaci - tačka topljenja (t.t.) i LCMS: [M+H]<+>predstavlja proteinisanu masu slobodne baze jedinjenja, [M-H]<->predstavlja deproteinisanu masu slobodne baze jedinjenja ili tipa adukta naznačenog [M+CH3COO]-). Rtpredstavlja vreme zadržavanja (u min). Za neka jedinjenja, određena je tačna masa.

n.p. označavada nema podataka.

Optičke rotacije:

[0080] Optičke rotacije su izmerene na Perkin-Elmer 341 polarimetru sa natrijumskom lampom i zabeleženo je kao što sledi: [α]° (λ, c g/100ml, rastvarač, T °C).

[α]λ<T>= (100α) / (l x c) : gde je l dužina puta u dm a c je koncentracija u g/100 ml za uzorak pri temperaturi T (°C) i talasnoj dužini λ (u nm). Ukoliko je korišćena talasna dužina 589 nm (natrijum D linija) onda se simbol D može koristiti umesto toga. Znak rotacije (+ ili -) bi trebalo da uvek bude dat. Kada se koristi ova jednačina koncentracija i rastvarač su uvek dati u zagradama nakon rotacije. Rotacija je zabeležena upotrebom stepena i nisu date jedinice koncentracije (pretpostavlja se da su g/100 ml).

Tabela-3: Podaci optičke rotacije.

NMR

[0081] Za više jedinjenja,<1>H NMR spektar je zabeležen na Bruker DPX-400 spektrometru koji radi pri 400 MHz ili na Bruker Avance I spektrometru koji radi pri 500MHz, upotrebom CHLOROFORM-d (deuterisani hloroform, CDCl3) ili DMSO-d6(razblaženi DMSO, dimetil-

2

d6 sulfoksid) kao rastvarača. Hemijska pomeranja (δ) zabeležena su u delovima po milionu (ppm) relativno u odnosu na tetrametilsilan (TMS), koji je korišćen kao interni standard.

Tabela 4:<1>H NMR rezultati

ANALIZA VEZIVANJA

[0082] Za vezivanje [<3>H]-jedinjenja A (NAM jedinjenje, selektivno za mGlu2/3 (∼20 puta selektivnije za 2 nego za 3) u odnosu na druge mGluR), membrane iz ljudskih mGlu2 i

2

mGlu3 HEK293 ćelija i takođe kortikalne membrane pacova su korišćene. Nakon odmrzavanja, membrane su homogenizovane upotrebom Ultra Turrax uređaja za homogenizaciju i suspendovane u ledeno hladnom puferu za vezivanje koji je sadržao 50 nM Tris-HCl (pH 7,4), 10 mM MgCl2, 2 mM CaCl2. Ispitivanja zamenjivanja su izvršena upotrebom 6 nM radioliganda, osim za ljudske mGlu3 membrane gde je korišćeno 25 nM. Smeše za analizu su inkubirane u trajanju od 60 min na ST u zapremini od 0,5 ml koje su sadržale 7,5 mg, 75-100 mg ili 75 µg membranskog proteina ljudskog mGlu2, ljudskog mGlu 3 ili korteksa pacova, respektivno. Nespecifično vezivanje je procenjeno u prisustvu 10 mM jedinjenja B (NAM sa IC50∼10 nM u odnosu na hmGlu2 i IC50∼200 nM u odnosu na hmGlu3). Filtracija je izvršena upotrebom Whatman GF/C filterskih listova prethodno potopljenih u 0,1% PEI i Brandell sakupljač 96.

[0083] Filteri iz ovih filterskih listova su stavljeni u epruvete. Nakon dodavanja tečnosti za scintilaciju, radioaktivnost na filterima je izbrojana u tečnom uređaju za analiziranje scintilacije od Perkin Elmer.

[0084] Podaci konkurentnog vezivanja radioliganda su izračunati kao procenti ukupnog vezivanja koje je izmereno u odsustvu test jedinjenja. Krive suzbijanja, procenti ukupnog vezivanja u odnosu na log koncentraciju test jedinjenja, su stvoreni Lexis softverom.

Sigmoidne krive suzbijanja su analizirane ne-linearnom regresionom analizom.

Tabela 5. Podaci vezivanja za jedinjenja 1 i 2.

ISPITIVANJA BIODISTRIBUCIJE OPŠTI DEO

[0085] Životinjsko PET pravljenje slika je izvršeno na lutecijum oksiortosilikat detektorbaziranom tomografu (microPET FOCUS-220; Siemens Medical Solutions USA, Knoxville,

2

TN), koji je imao transaksijalnu rezoluciju od 1,35 mm (puna širina pri polu-maksimumu). Podaci su dobijeni u 128x128x95 matrici sa širinom piksela od 0,475 mm i debljinom isečka od 0,796 mm. Za vreme PET pravljenja slika, pacovi su držani pod gasnom anestezijom (2,5 % izofuran u kiseoniku pri protoku od 1 l/min) i njihova telesna temperatura je održavana između 36,5 i 37 °C upotrebom podloge za zagrevanje. PET podaci su analizirane upotrebom Pmod softvera verzije 3.2 (Pmod, Cirih Švajcarska).

[0086] Sprague-Dawley pacovi dobijeni od Harlan (Holandija), su držani u grupama od četiri do šest po kavezu do tretiranja. Držani su pod konstantnom temperaturom od 21 °C i 12-h ciklusom svetlo/mrak, gde je svetlo gašeno u 8:00 pre podne. Životinje su imale neograničeni pristup hrani (Teklad Global 16% Protein Rodent Diet, Harlan, Madison, WI, SAD) i vodi. Svi životinjski eksperimenti su izvršeni u skladu sa belgijskim zakonima o životinjskim eksperimentima i nakon odobrenja od lokalnog etičkog komiteta za životinje.

EX-VIVO BIODISTRIBUCIJA

[0087] Biodistribucija [<18>F]-1 je određena pri 2, 10, 30 i 60 min, nakon injekcije ko Sprague Dawley (SD) pacova (n = 3 po vremenskoj tački) dok za [<18>F]-230 min vremenska tačka nije izvršena. Pacovi su injektirani intravenski sa 0,7-1,1 MBq u repnu venu i eutanazirani u vremenskim tačkama ukazanim iznad, pod izofluran anestezijom. Sva tkiva su secirana, izmerena i izbrojana za radioaktivnost u gama brojaču.

[0088] Biodistribucija [<18>F]-1 je određena 2, 10, 30 i 60 min, nakon injekcije kod Sprague Dawley pacova (n = 3 po vremenskoj tački). Pacovi su injektirani intravenski sa 0,7-1,1 MBq u repnu venu i eutanazirani u vremenskim tačkama ukazanim iznad, pod izofluran anestezijom. Sva tkiva su secirana, izmerena i izbrojana za radioaktivnost u gama brojaču.

[0089] Bio distribucija [<18>F]-1 je pokazala najveću apsorpciju u jetri sa ispiranjem primećenim u svim perifernim organima, dok se apsorpcija u kostima povećavala vremenom. Dodatno, apsorpcija u mišićima je niska i deluje da se vremenom stabilizuje.

[0090] Apsorpcija u mozgu za [<18>F]-1 je bila veoma visoka, dok je pokazivala povećanu apsorpciju vremenom za sve površine mozga osim za moždani most, čija se apsorpcija stabilizovala vremenom. Najveća apsorpcija je primećena u korteksu što je praćeno striatumom, moždani most je pokazao najmanju apsorpciju u mozgu.

2

Tabela 6. Biodistribucija podataka [<18>F]-1 prikazana u SUV ± SD .

[0091] Bio distribucija [<18>F]-2 je pokazala visoku apsorpciju u jetri i srednju apsorpciju u mozgu u cerebrumu i malom mozgu. Svi regioni su pokazali ispiranje, sa izuzetkom kostiju, koje su pokazale povećanje apsorpcije vremenom.

2

[0092] Apsorpcija u mozgu za [<18>F]-2 je pokazala promenljive koncentracije tragača sa niskim ispiranjem u ispitivanim regionima. Najveća apsorpcija je primećena u korteksu a najniža apsorpcija u mozgu u moždanom mostu.

Tabela 7. Podaci biodistribucije za [<18>F]-2 prikazani u SUV ± SD .

PET SKENIRANJE

[0093] Svi rastvori za prethodno tretiranje su bili 1 mg/mL rastvori u 20% β-ciklodekstrinu u slanom rastvoru sa pH u opsegu između 6 i 8 i sterilno su filtrirani kroz Millex GV filter pre upotrebe.

[0094] Za početno skeniranje, 36-43 MBq [<18>F]-1 je injektirano u 3 SD pacova težine 229-251 g u repnu venu i skenirani su istovremeno u dinamičkim PET skenerom u trajanju od 90 min. Za skeniranje prethodnog tretiranja upotrebom jedinjenja A (NAM jedinjenje selektivno za mGlu2/3 (~20 puta selektivnije za 2 u odnosu na 3) u odnosu na druge mGlu), iste životinje su injektirane sa 10 mg/kg jedinjenja A s.c.60 minuta pre injekcije od 38-37 Mbq [<18>F]-1 u repnu venu i istovremeno su skenirane dinamičkim PET skenerom u trajanju od 90 minuta.

[0095] Visoka apsorpcija u mozgu je primećena za [<18>F]-1, a naročito su frontalni korteks i striatum pokazali visoku apsorpciju. Apsorpcija je bila najmanja u moždanom mostu, dok je apsorpcija u moždanom mostu bila u istom opsegu nakon prethodnog tretiranja sa jedinjenjem A. U drugim regionima apsorpcija se smanjila nakon prethodnog tretiranja sa Jedinjenjem A. Maksimum apsorpcije verovatno nije dostignut za 90 min, kako su krive aktivnosti u vremenu nastavile da se povećavaju kao funkcija vremena nakon injekcije.

[0096] Za početno skeniranje, 39-49 MBq [<18>F]-2 je injektirano u 3 SD pacove težine 301-310 g u repnu venu i skenirani su istovremeno dinamičkim PET skenerom u trajanju od 90 min. Za skeniranje prethodnog tretiranja upotrebom jedinjenja A, iste životinje su injektirane sa 10 mg/kg jedinjenja A s.c.60 min pre injekcije od 46-50 [<18>F]-2 u repnu venu i skenirane su istovremeno dinamičkim PET skenerom u trajanju od 90 min.

[0097] µPET skeniranje dobijeno nakon injekcije [<18>F]-2 (Fig.4) je pokazalo pomešane rezultate. Maksimalna apsorpcija je bila veća nakon prethodnog tretiranja ali je uopšteno pokazala brže ispiranje, dok apsorpcija u regionima mozga pri početnom skeniranju nije pokazala rani maksimum. Dodatno korteks je pokazao povećanje apsorpcije vremenom, što je moglo biti delimično do efekata zapremine od lobanje koji su zbog defluorinacije tragača pokazali visoku i povećavajuću koncentraciju radioaktivnosti.

Diskusija

[0098] Apsorpcija u periferiji ex-vivo biodistribucije je pokazala da je najveća apsorpcija u jetri, kao i apsorpcija u bubrezima, što je praćeno urinarnom ekskrecijom. Apsorpcija u kostima [<18>F]-1 je u početku bila niska, ali se blago povećavala vremenom nagoveštavajući određenu količinu defluorinacije. [<18>F]-2 je pokazalo suštinsko povećanje apsorpcije u

1

kostima u toku vremena, ukazujući na veliku količinu defluorinacije, nakon čega je sledilo vezivanje [<18>F]F<->za kost.

[0099] Biodistribucija ex-vivo je pokazala visoku apsorpciju u mozgu za [<18>F]-2, što je praćeno sa [<18>F]-1. [<18>F]-2 je pokazalo brzo ispiranje iz različitih oblasti mozga. Moždani most se smatra referentnim regionom za odsustvo mGluR2 ili mGluR3 ispoljavanje, dok su svi kod svih drugih regiona i mGluR2 i mGluR3 prisutno, gde su najveći nivoi ispoljavanja u cerebralnom korteksu (Farinha A. i dr. BJPharmacol, 2015, 172, 2383-2396). [<18>F]-2 je pokazalo najveću apsorpciju u korteksu sa niskom apsorpciju u moždanom mostu u kombinaciji sa bržim ispiranjem iz moždanog mosta u poređenju sa drugim regionima, što predlaže dobru specifičnost za mGluR2/3, kako se apsorpcija u mozgu oslikava na zabeležene šablone distribucije za mGluR2/3. [<18>F]-1 je takođe pokazalo visoku apsorpciju u korteksu i nisku apsorpciju u moždanom mostu, međutim koncentracija tragača je nastavila da se vremenom povećava za sve regione mozga, osim za moždani most, gde je apsorpcija postala stabilna. Ipak se šablon apsorbovanja podudara sa šablonom distribucije za mGluR2/3 veoma dobro. Povećana apsorpcija nagoveštava ili na veoma visoki afinitet ili (pseudo) nepovratno vezivanje [<18>F]-1.

[0100] µPET skeniranje nakon injektiranja [<18>F]-2, je pokazalo visoku apsorpciju u mozgu i brže ispiranje iz frontalnog korteksa nakon prethodnog tretiranja sa jedinjenjem A u poređenju sa početnim skeniranjem, što ukazuje na mGluR2/3 specifično vezivanje. Visoka apsorpcija u kostima je međutim izazvala značajne delimične zapreminske efekte i rasipanje signala od kostiju je naročito primećeno u korteksu koji se nalazi blizu lobanje, ali takođe sadrži ispoljavanje mGluR2/3.

[0101] Kod PET skeniranja, [<18>F]-1 je pokazalo jedinstvenu kinetiku mozga sa uporno povećavajućom koncentracijom aktivnosti u frontalnom korteksu i striatumu kao funkcija vremena dok aktivnost u moždanom mostu ostaje niska. Visoka apsorpcija u frontalnom korteksu i hipokampusu bi se mogla blokirati prethodnim tretiranjem sa jedinjenjem A. Ovaj šablon kontinualnog apsorbovanja bi mogao biti usled visokog afiniteta [<18>F]-1 ili za bilo koji ili i za mGluR2 i mGluR3, ili bi mogao biti usled (pseudo) nepovratno vezivanja. Ovi podaci ukazuju na dobru mGluR2/3 specifičnost, kako je apsorpcija u svim regionima mozga smanjena prethodnim tretiranjem sa jedinjenjem A do iste granice kao što je apsorpcija u moždanom mostu.

2

Claims

Patentni zahtevi 1. Jedinjenje prema Formuli (I)

gde je R<1>-CH2F i R<2>je -H ili R<1>je -H a R<2>je -CH2F, i gde je bar jedan atom radioaktivan, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili solvat, za upotrebu pri pravljenju slika ili kvantifikovanju mGlu2 i 3 receptora.
2. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 1 koje ima Formulu

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili solvat.
3. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 1 koje ima Formulu

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili solvat.
4. Radio označeno jedinjenje Formule

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili solvat.
5. Radio označeno jedinjenje Formule

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili solvat.
6. Sterilni farmaceutski sastav koji sadrži jedinjenje Formule (I) kao što je definisano u bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 5, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so ili solvat i farmaceutski prihvatljiv nosač ili razblaživač.
7. Sterilni farmaceutski sastav prema patentnom zahtevu 6, gde je takav sastav sterilni rastvor.
8. Sterilni farmaceutski sastav kao što je definisano u patentnom zahtevu 6 ili 7, za upotrebu pri pravljenju slika ili kvantifikovanju mGlu2 i 3 receptora. 4
9. Sterilni farmaceutski sastav za upotrebu kao što je definisano u patentnom zahtevu 8, gde pravljenje slika obuhvata određivanje popunjenosti mesta mGlu2 i 3 receptora drugim jedinjenjima koja nisu radio označena.
10. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 5 ili farmaceutski sastav prema patentnom zahtevu 6 ili 7, za upotrebu kao sredstvo za kontrast za pravljenje slika tkiva, ćelija ili sisara.
11. Metoda za pravljenje slika tkiva, ćelija i sisara, koja obuhvata dovođenje u kontakt ili pružanje detektabilne količine označenog jedinjenja Formule (I) ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili solvata kao što je definisano u bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 5 sa tkivom, ćelijama ili sisarom i detektovanje označenog jedinjenja povezanog sa mGlu2 i 3 receptorom.
12. Metoda prema patentnom zahtevu 11 gde je tehnika pravljenja slika pozitronska emisiona tomografija.
13. Jedinjenje izabrano iz grupe koju čine

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili solvat.
14. Postupak za sintetisanje jedinjenja definisanog u patentnom zahtevu 2, koji obuhvata (a) korake (a-1) reagovanja jedinjenja Formule (P-1) sa metansulfonskim anhidridom u prisustvu baze i inertnog rastvarača, i (a-2) reagovanje jedinjenja dobijenog u koraku (a-1) sa[<18>F]F<->u prisustvu baze u inertnom rastvaraču

(b) korak reagovanja jedinjenja Formule (P-2) sa [<18>F]F<->u prisustvu baze u inertnom rastvaraču
15. Postupak za sintetisanje jedinjenja definisanog u patentnom zahtevu 3, koji obuhvata (a) korake (a-1) reagovanja jedinjenja Formule (P-3) sa metansulfonskim anhidridom u prisustvu baze i inertnog rastvarača, na primer, trimetilamina ili trietilamina i dihlorometana, i (a-2) reagovanje jedinjenja dobijenog u koraku (a-1) sa nukleofilnim radioaktivnim reagensom za fluorisanje [<18>F]F<->u prisustvu baze u inertnom rastvaraču

(b) korak reagovanja jedinjenja Formule (P-4) sa nukleofilnim radioaktivnim reagensom za fluorisanje [<18>F]F<->u prisustvu baze u inertnom rastvaraču