RS61039B1 - Aav vektori koji sadrže gen koji kodira faktor viii - Google Patents

Aav vektori koji sadrže gen koji kodira faktor viii

Info

Publication number
RS61039B1
RS61039B1 RS20201018A RSP20201018A RS61039B1 RS 61039 B1 RS61039 B1 RS 61039B1 RS 20201018 A RS20201018 A RS 20201018A RS P20201018 A RSP20201018 A RS P20201018A RS 61039 B1 RS61039 B1 RS 61039B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
bases
aav
fviii
vector
construct
Prior art date
Application number
RS20201018A
Other languages
English (en)
Inventor
Peter Cameron Colosi
Amit Nathwani
Jenny Mcintosh
Edward Tuddenham
Original Assignee
Biomarin Pharm Inc
Univ London
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=51585244&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS61039(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Biomarin Pharm Inc, Univ London filed Critical Biomarin Pharm Inc
Publication of RS61039B1 publication Critical patent/RS61039B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/36—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • A61K38/37—Factors VIII
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A61K48/0058—Nucleic acids adapted for tissue specific expression, e.g. having tissue specific promoters as part of a contruct
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A61K48/0066—Manipulation of the nucleic acid to modify its expression pattern, e.g. enhance its duration of expression, achieved by the presence of particular introns in the delivered nucleic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14132—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14142—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector virus or viral particle as vehicle, e.g. encapsulating small organic molecule
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14151—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

Opis
[0001] Ova patentna prijava se poziva na prioritet provizorne patentne prijave SAD serijski br. 61/877,042, koja je podneta 12. septembra, 2013.
OBLAST PRONALASKA
[0002] Pronalazak se odnosi na vektore faktora VIII (FVIII) adeno-asociranog virusa (AAV), koji obuhvata AAV FVIII vektore koji imaju visoku aktivnost ispoljavanja i AAV FVIII vektore koji ispoljavaju funkcionalni FVIII koji je ili pune dužine ili je skraćen. Pronalazak se takođe odnosi na metode za pravljenje ovde opisanih AAV FVIII vektora i na njihove povezane terapeutske upotrebe.
POZADINA
[0003] Adeno-asocirani virus (AAV) je mali životinjski virus, sa neispravnom replikacijom i bez omotača koji inficira ljude i neke druge primate. Nekoliko svojstava AAV čine ovaj virus privlačnim vehikulumom za isporuku terapeutskih proteina terapijom gena, uključujući, na primer, činjenicu da nije poznato da AAV izaziva ljudske bolesti i da izaziva blagi imuni odgovor, i da AAV vektori mogu inficirati i ćelije koje se dele i koje miruju bez integrisanja u genom ćelije domaćina. Vektori za gensku terapiju koji koriste AAV su uspešno korišćeni u nekim kliničkim ispitivanjima, na primer, za isporuku ljudskog faktora IX (FIX) u jetru za tretiranje hemofilije B (Nathwani i dr., New Engl. J. Med.365:2357-2365, 2011).
[0004] Genska terapija sa AAV vektorima međutim ima neke nedostatke. Naročito, kapacitet kloniranja AAV vektora je ograničen kao posledica kapaciteta DNK pakovanja virusa.
Genom jednolančane DNK AAV divljeg tipa je oko 4,7 kilobaza (kb). U praksi, AAV genomi do 5,0 kb deluju da su u potpunosti upakovani, tj., da su pune dužine, u česticama AAV virusa. Uz potrebu da genom nukleinske kiseline u AAV vektorima mora imati dva AAV inverzna terminalna ponavljanja (ITR) od oko 145 baza, kapacitet DNK pakovanja AAV vektora je takav da se maksimalno 4,4 kb sekvence za kodiranje proteina može obuhvatiti.
[0005] Zbog ovakvog ograničenja veličine, veliki terapeutski geni, tj., oni koji su duži od oko 4,4 kb, uopšteno nisu pogodni za upotrebu kod AAV vektora. Jedan takav terapeutski gen je Faktor VIII (FVIII) gen, koji ima iRNK od oko 7,0 kb koja kodira polipeptid od 2332 aminokiselina koji obuhvata, od N- do C-terminusa, 19 aminokiselinskih signalnih peptida i tri velika domena (tj., teški lanac ili A domen, centralni ili B domen i laki lanac ili C domen). Jedna strategija koja je korišćena za prevazilaženje ograničenja veličine AAV vektora za FVIII je bila upotreba dva AAV vektora, gde jedan kodira teški lanac ili A domen a drugi kodira laki lanac ili C domen (videti, npr., Coutu i dr., pat. SAD br.6,221349, 6,200,560 i 7,351,577). Druga strategija za zaobilaženje ograničenja veličine je stvaranje AAV vektora koji kodiraju FVIII gde je centralni deo ili B domen proteina izbrisan i zamenjen sa 14 aminokiselinskih veznika, koji su poznati kao SQ sekvenca (Ward i dr., Blood, 117:798-807, 2011, i McIntosh i dr., Blood 121:3335-3344, 2013).
[0006] Dok je zabeleženo u literaturi da AAV vektori imaju AAV genome > 5,0 kb, u mnogo takvih slučajeva 5' ili 3' krajevi kodiranih gena deluju da su skraćeni (videti Hirsch i dr., Molec. Ther.18-6-8, 2010, i Ghosh i dr., Biotech. Genet. Engin. Rev. 24:165-178, 2007). Pokazano je, međutim, da se javlja preklapajuća homologna rekombinacija u ćelijama inficiranim AAV između nukleinskih kiselina koje imaju skraćenje na 5' kraju i skraćenje na 3' kraju tako da se dobija „potpuna“ nukleinska kiselina koja kodira veliki protein, čime se rekonstruiše funkcionalni gen pune dužine.
[0007] Postoji potreba za novim AAV vektorima koji kodiraju funkcionalni protein Faktora VIII koji je od koristi kod genske terapije za pristupe tretiranja hemofilije A. Kao takav, predmetni pronalazak se odnosi na AAV vektori koji kodiraju funkcionalno aktivni FVIII tako da bilo koji od AAV virona obuhvata celu nukleinsku kiselinu koja kodira terapeutski protein, tj., u potpunosti upakovane AAV FVIII vektore, čime se izbegavaju iznad spomenuti problemi prevelikih genoma, ili se bar proizvodi funkcionalno aktivni protein Faktora FVIII, koji može ili ne mora biti skraćen. Pored toga, za izbegavanje imunog odgovora usmerenog kapsidom, AAV vektori bi trebalo da imaju najveću moguću aktivnost transdukcije/ispoljavanja ciljanog proteina po čestici kapsida. Ovaj pronalazak se takođe odnosi na proizvodnju potpuno AAV FVIII vektora sa visokom aktivnošću ispoljavanja. Na kraju, predmetni pronalazak se odnosi na metode za proizvodnju ovde opisanih AAV vektora Faktora VIII i povezane metode za upotrebu istog.
REZIME PRONALASKA
[0008] Predmetni pronalazak pruža AAV vektore koji kodiraju funkcionalno aktivni FVIII (koji se ovde nazivaju kao „AAV FVIII vektori“).
[0009] Kako se ovde koristi, „funkcionalno aktivni FVIII“ je FVIII protein koji ima funkcionalnost FVIII proteina divljeg tipa in vitro, kada se ispoljava u kultivisanim ćelijama, ili in vivo, kada se ispoljava u ćelijama ili tkivu. Ovo obuhvata, na primer, omogućavanje javljanja koagulacije krvi i smanjenje vremena koje je potrebno da dođe do zgrušavanja krvi kod ispitanika koji boluje od Hemofilije A. FVIII divljeg tipa učestvuje u koagulaciji krvi preko kaskade za koagulaciju, tako što deluje kao ko-faktor za aktiviranje FIX (FIXa) koji, u prisustvu kalcijumovih jona i fosfolipida formira kompleks koji pretvara Faktor X (FX) u aktivirani FX (FXa). Prema tome, funkcionalno aktivni FVIII može formirati kompleks sa FIXa, koji može pretvoriti FX u FXa.
[0010] Kako se ovde koristi, „AAV vektor“ se odnosi na nukleinske kiseline ili jednolančane ili dvolančane, koje imaju sekvencu AAV 5' inverznog terminalnog ponavljanja (ITR) i AAV 3' ITR koje krivi sekvencu koja kodira protein operativno povezan za transkripcione regulatorne elemente, tj., jedan ili više promotera i/ili pojačivača, i poliadenilacionu sekvencu i opciono, jedan ili više introna uvedenih između egzona i sekvence koja kodira protein.
Jednolančani AAV vektori se odnose na nukleinske kiseline koje su prisutne u genomu čestice AAV virusa i mogu bili ili smisao lanac ili antismisao lanac sekvenci nukleinske kiseline koje su ovde opisane. Veličina takvih jednolančanih nukleinskih kiselina je data u bazama.
Dvolančani AAV vektor se odnosi na nukleinske kiseline koje su prisutne u DNK plazmida, npr., pUC19 ili genomu dvolančanog virusa, npr., bakulovirusa, koji se koristi za ispoljavanje ili transfer nukleinskih kiselina AAV vektora. Veličina takvih dvolančanih nukleinskih kiselina je data u baznim parovima (bp).
[0011] Termin „inverzno terminalno ponavljanje (ITR)“ kako se ovde koristi se odnosi na regione prepoznate u struci koji se nalaze na 5' i 3' terminusima AAV genoma koji funkcionišu u cis kao poreklo DNK replikacije i kao signali za pakovanje virusnog genoma. AAV ITR, zajedno sa AAV rep regionom kodiranja, pružaju efikasno proširenje i čuvanje od, i integraciju nukleotidne sekvence postavljene između dva bočna ITR u genom ćelije domaćina. Sekvence određenih AAV-asociranih ITR su obelodanjene od strane Yan i dr., J. Virol. 79(1):364-379 (2005) što je ovde obuhvaćeno referencom u svojoj potpunosti.
[0012] „Transkripcioni regulatorni element” se odnosi na nukleotidne sekvence gena uključenog u regulaciju genetske transkripcije uključujući promoter, plus elemente odgovora, aktivatorske i pojačivačke sekvence za vezivanje transkripcionih faktora za pomaganje vezivanja RNK polimeraze i promovisanje ispoljavanja i operatorske i utišavačke sekvence za koje se represor proteini vezuju za blokiranje povezivanja RNK polimeraze i sprečavanje ispoljavanja. Termin „transkripcioni regulatorni element specifičan za jetru“ se odnosi na regulatorni element koji modulira ispoljavanje gena specifično u tkivu jetre. Primeri regulatornih elemenata specifičnih za jetru obuhvataju, ali nisu ograničeni na, tiretin promoter miša (mTTR), endogeni ljudski faktor VIII promoter (F8), ljudski alfa-1-antitripsin promoter (hAAT) i njegovi aktivni fragmenti, ljudski albumin minimalni promoter i albumin promoter miša. Pojačivači dobijeni iz mesta vezivanja transkripcionog faktora specifičnog za jetru su takođe razmatrani, kao što su EBP, DBP, HNF1, HNF3, HNF4, HNF6, sa Enh1..
[0013] Ovde je opisan AAV vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira funkcionalno aktivni FVIII koji ima B domen zamenjen sa SQ sekvencom sa 14 amino kiselina, tj., koji kodira FVIII SQ. SQ sekvenca je obelodanjena u Ward i dr., Blood, 117:798-807, 2011, iMcIntosh i dr., Blood 121:3335-3344, 2013. FVIII sekvenca regiona kodiranja je sekvenca koja je optimizovana za kodon (videti Nathwani i dr., obj. pat. prij. SAD br.
2013/0024960A1, koja je objavljena 24. Januara, 2013. i McIntosh i dr., Blood 121:3335-3344, 2013). Ova sekvenca se ovde naziva kao „UCL SQ FVIII“.
[0014] U prvom aspektu, AAV vektor prema pronalasku obuhvata Proto 1, koji je šematski prikazan na Slici 2A i obuhvata sekvencu nukleinske kiseline iznetu u SEQ ID NO:1, gde je vektor kraći od 5,0 kb.
[0015] U drugom aspektu, AAV vektor prema pronalasku obuhvata Proto 1S, koji je prikazan šematski na Slici 2B, i obuhvata sekvencu nukleinske kiseline iznetu u SEQ ID NO:2, gde je vektor kraći od 5,0 kb.
[0016] U trećem aspektu, AAV vektor prema pronalasku obuhvata Proto 2S, koji je šematski prikazan na Slici 2C i obuhvata sekvencu nukleinske kiseline iznetu u SEQ ID NO:3, gde je vektor kraći od 5,0 kb.
[0017] U četvrtom aspektu, AAV vektor prema pronalasku obuhvata Proto 3S, koji je prikazan šematski na Slici 2D, i obuhvata sekvencu nukleinske kiseline iznetu u SEQ ID NO:4, gde je vektor kraći od 5,0 kb.
[0018] Takođe je ovde opisan AAV vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira FVIII koja nema ceo B domen, uključujući SQ sekvencu i a3 domen, koji se nalazi odmah N-terminalno lakom lancu ili C domenu. FVIII sekvenca regiona kodiranja je sekvenca koja je optimizovana za kodon (videti Nathwani i dr., obj. pat. prij. SAD br.2013/0024960A1, koja je objavljena 24. Januara, 2013. i McIntosh i dr., Blood 121:3335-3344, 2013).
[0019] Takođe je ovde opisan AAV vektor koji sadrži Proto 4, koji je prikazan šematski na Slici 3A i koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline iznetu u SEQ ID NO: 5.
[0020] Takođe je ovde opisan AAV vektor koji sadrži Proto 5, koji je prikazan šematski na Slici 3B i koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline iznetu u SEQ ID NO: 6.
[0021] Takođe je ovde opisan AAV vektor koji sadrži Proto 6, koji je prikazan šematski na Slici 3C i koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline iznetu u SEQ ID NO: 7.
[0022] Takođe je ovde opisan AAV vektor koji sadrži Proto 7, koji je prikazan šematski na Slici 3D i koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline iznetu u SEQ ID NO: 8.
[0023] AAV vektor koji je ovde opisan može sadržati nukleinsku kiselinu koja sadrži AAV2 5' inverzno terminalno ponavljanje (ITR), transkripcioni regulatorni region specifičan za jetru, funkcionalno aktivni FVIII region kodiranja optimizovan za kodon, opciono jedan ili više introna, sekvencu poliadenilacije i AAV23' ITR. Transkripcioni regulatorni region specifičan za jetru može sadržati skraćenu ApoE pojačivačku sekvencu, ljudski alfa anti-tripsin (hAAT) proksimalni promoter sa 186 baza, uključujući 42 baze 5' netransliranog regiona (TR) i jedan ili više pojačivača koji su izabrani iz grupe koju čine (i) ApoE/C1 pojačivač od 34 baza, (ii) AAT promoter distalni X region sa 32 baze i (iii) 80 dodatnih baza distalnog elementa ljudskog AAT proksimalnog promotera; i funkcionalno aktivne FVIII regione kodiranja koji su optimizovani za kodon koji kodiraju FVIII SQ varijantu. Transkripcioni regulatorni region specifičan za jetru koji je ovde opisan može sadržati a1 mikro-globulin pojačivačku sekvencu i alfa anti-tripsin (AAT) proksimalni promoter od 186 baza.
[0024] Takođe je ovde opisan AAV vektor koji sadrži konstrukt 100ATG koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline iznetu u SEQ ID NO: 9.
[0025] Takođe je ovde opisan AAV vektor koji sadrži konstrukt 100ATG bGH poli A koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline iznetu u SEQ ID NO: 10.
[0026] Takođe je ovde opisan AAV vektor koji sadrži kratku bGH poliA sekvencu konstrukta 100ATG iznetu u SEQ ID NO: 11.
[0027] Takođe je ovde opisan AAV vektor koji sadrži konstrukt 103ATG koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline iznetu u SEQ ID NO: 12.
[0028] Takođe je ovde opisan AAV vektor koji sadrži konstrukt 103ATG kratki bGH poli A koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline iznetu u SEQ ID NO: 13.
[0029] Takođe je ovde opisan AAV vektor koji sadrži konstrukt 105ATG bGH poli A koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline iznetu u SEQ ID NO: 14.
[0030] Takođe je ovde opisan AAV vektor koji sadrži konstrukt DC172ATG FVIII koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline iznetu u SEQ ID NO: 15.
[0031] Takođe je ovde opisan AAV vektor koji sadrži konstrukt DC172ATG FVIII hAAT koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline iznetu u SEQ ID NO: 16.
[0032] Takođe je ovde opisan AAV vektor koji sadrži konstrukt DC172ATG 2xHCR ATG FVIII koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline iznetu u SEQ ID NO: 17.
[0033] Takođe je ovde opisan AAV vektor koji sadrži konstrukt DC1722xHCR ATG FVIII hAAT koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline iznetu u SEQ ID NO: 18.
[0034] Takođe je ovde opisan AAV vektor koji sadrži konstrukt 2x SerpinA hAAT ATG FVIII koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline iznetu u SEQ ID NO: 19.
[0035] Takođe je ovde opisan AAV vektor koji sadrži konstrukt 2x SerpinA hAAT ATG FVIII 2x µ-globulin pojačivač koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline iznetu u SEQ ID NO: 20.
[0036] Takođe je ovde opisan AAV vektor koji sadrži konstrukt 100ATG kratki bGH poliA 2x µ-globulin pojačivač koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline iznetu u SEQ ID NO: 21.
[0037] Takođe je ovde opisan AAV vektor koji sadrži konstrukt faktor FVIII-BMN001 koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline iznetu u SEQ ID NO: 22.
[0038] Takođe je ovde opisan AAV vektor koji sadrži konstrukt faktor VIII-BMN002 sekvencu iznetu u SEQ ID NO: 23.
[0039] Takođe je ovde opisan AAV vektor koji sadrži konstrukt 99 koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline iznetu u SEQ ID NO: 24.
[0040] Takođe je ovde opisan AAV vektor koji sadrži konstrukt 100 koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline iznetu u SEQ ID NO: 25.
[0041] Takođe je ovde opisan AAV vektor koji sadrži konstrukt 100 reverzne orijentacije koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline iznetu u SEQ ID NO: 26.
[0042] Takođe je ovde opisan AAV vektor koji sadrži konstrukt 100AT koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline iznetu u SEQ ID NO: 27.
[0043] Takođe je ovde opisan AAV vektor koji sadrži konstrukt 100AT 2x MG koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline iznetu u SEQ ID NO: 28.
[0044] Takođe je ovde opisan AAV vektor koji sadrži konstrukt 100AT 2x MG bGH poliA koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline iznetu u SEQ ID NO: 29.
[0045] Takođe je ovde opisan AAV vektor koji sadrži konstrukt 100AT 2x MG (reverzni) bGH koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline iznetu u SEQ ID NO: 30.
[0046] Takođe je ovde opisan AAV vektor koji sadrži konstrukt 100 bGH poliA koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline iznetu u SEQ ID NO: 31.
[0047] Takođe je ovde opisan AAV vektor koji sadrži konstrukt 100-400 koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline iznetu u SEQ ID NO: 32.
[0048] Takođe je ovde opisan AAV vektor koji sadrži konstrukt 101 koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline iznetu u SEQ ID NO: 33.
[0049] Takođe je ovde opisan AAV vektor koji sadrži konstrukt 102 koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline iznetu u SEQ ID NO: 34.
[0050] Takođe je ovde opisan AAV vektor koji sadrži konstrukt 103 koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline iznetu u SEQ ID NO: 35.
[0051] Takođe je ovde opisan AAV vektor koji sadrži konstrukt 103 reverzne orijentacije koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline iznetu u SEQ ID NO: 36.
[0052] Takođe je ovde opisan AAV vektor koji sadrži konstrukt 103AT koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline iznetu u SEQ ID NO: 37.
[0053] Takođe je ovde opisan AAV vektor koji sadrži konstrukt 103AT 2xMG koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline iznetu u SEQ ID NO: 38.
[0054] Takođe je ovde opisan AAV vektor koji sadrži konstrukt 100AT 2xMG bGH poliA koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline iznetu u SEQ ID NO: 39.
[0055] Takođe je ovde opisan AAV vektor koji sadrži konstrukt 103 bGH poliA koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline iznetu u SEQ ID NO: 40.
[0056] Takođe je ovde opisan AAV vektor koji sadrži konstrukt 104 koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline iznetu u SEQ ID NO: 41.
[0057] Takođe je ovde opisan AAV vektor koji sadrži konstrukt 105 koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline iznetu u SEQ ID NO: 42.
[0058] Takođe je ovde opisan AAV vektor koji sadrži konstrukt 106 koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline iznetu u SEQ ID NO: 43.
[0059] Takođe je ovde opisan AAV vektor koji sadrži konstrukt 106AT koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline iznetu u SEQ ID NO: 44.
[0060] Takođe je ovde opisan AAV vektor koji sadrži konstrukt 2x SerpinA hAAT koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline iznetu u SEQ ID NO: 45.
[0061] Predmetno obelodanjivanje se takođe odnosi na vektorske konstrukte koji kodiraju funkcionalni Faktor FVIII polipeptid, gde navedeni konstrukti obuhvataju jedan ili više pojedinačnih elemenata jednog ili više iznad opisanih konstrukata i njihove kombinacije, u jednoj ili više različitih orijentacija. Predmetno obelodanjivanje je takođe usmereno na iznad opisane konstrukte u suprotnoj orijentaciji.
[0062] U drugom otelotvorenju, pronalazak pruža metodu za proizvodnju rekombinantne čestice adeno-asociranog virusa (AAV) koja sadrži bilo koji od AAV vektora prema pronalasku. Metode obuhvataju korake kultivisanja ćelije koje su transfektovane sa bilo kojim od AAV vektora pronalaska i dobijanje rekombinantnog AAV iz supernatanta transfektovane ćelije.
[0063] Ćelije pronalaska su bilo koji tip ćelija pogodan za bakulovirusnu infekciju, uključujući ćelije insekata kao što su High Five, Sf9, Se301, SeIZD2109, SeUCR1, Sf9, Sf900+, Sf21, BTI-TN-5B1-4, MG-1, Tn368, HzAm1, BM-N, Ha2302, Hz2E5 i Ao38.
Poželjne ćelije sisara koje se mogu koristiti mogu biti HEK293, HeLa, CHO, NS0, SP2/0, PER.C6, Vero, RD, BHK, HT 1080, A549, Cos-7, ARPE-19 i MRC-5 ćelije i uključujući ćelije sisara kao što su HEK293, HeLa, CHO, NS0, SP2/0, PER.C6, Vero, RD, BHK, HT 1080, A549, Cos-7, ARPE-19 i MRC-5 ćelije.
[0064] Pronalazak takođe pruža virusne čestice koje sadrže bilo koji od AAV vektora pronalaska.
[0065] „AAV virion“ ili „AAV virusna čestica“ ili „AAV vektorska čestica“ se odnosi na
1
virusne čestice sastavljene od bar jednog AAV kapsid proteina i zatvorenog polinukleotid AAV vektora. Ukoliko čestica sadrži heterologni polinukleotid (tj., polinukleotid koji nije AAV genom divljeg tipa kao što je transgen za isporuku u ćeliju sisara), obično se naziva kao „AAV vektorska čestica“ ili kraće „AAV vektor“. Zbog toga, proizvodnja AAV vektorske čestice obavezno obuhvata proizvodnju AAV vektora, tako da se vektor nalazi u AAV vektorskoj čestici.
[0066] Pronalazak takođe pruža ćelije koje sadrže bilo koji od AAV vektora pronalaska.
[0067] U drugom otelotvorenju, pronalazak pruža metode za tretiranje pacijenta koji boluje od hemofilije A koje obuhvataju davanje pacijentu delotvorne količine bilo kog od AAV vektora pronalaska ili virusne čestice pronalaska.
[0068] U drugom otelotvorenju, pronalazak pruža sastav koji sadrži bilo koji od AAV vektora pronalaska za tretiranje hemofilije A.
OPIS SLIKA
[0069]
Slika 1 pruža šematski prikaz UCL SQ vektora. S leva na desno, UCL SQ vektor obuhvata AAV2 5' ITR AAV2 virusnu sekvencu divljeg tipa, ljudski ApoE/C1 pojačivač sa 34 baze, ljudski AAT promoter distalni X region sa 32 baze, ljudski AAT promoter sa 186 baza uključujući 42 baze od 5' UTR sekvence, ljudsku FVIII SQ sekvencu optimizovanu za kodon (videti Nathwani i dr., obj. pat. prij. SAD. br.
2013/0024960A1, koja je objavljena 24. januara 2013 iMcIntosh i dr., Blood 121:3335-3344, 2013), sekvencu sintetičke poliadenilacije sa 49 baza, AAV2 virusnu sekvencu divljeg tipa i AAV23'ITR. UCL SQ vektor je dužine od 5081 baza.
Slika 2 pruža šematske prikaze i sekvence Proto 1, Proto 1S, Proto 2S i Proto 3S vektora. (A) Šematski prikaz Proto 1 vektora. Počevši od UCL SQ vektora (videti Sliku 1), strane AAV2 virusne sekvence divljeg tipa su izbrisane a sekvence koje odgovaraju mestima restrikcije između ljudskog AAT 5' UTR i ljudskog FVIII regiona kodiranja, i između ljudskog FVIII terminacionog kodona i sekvence sintetske poliadenilacije, su uklonjeni. (B) Šematski prikaz Proto 1S vektora. Počevši od Proto 1 vektora, 10 baza na 3' kraju AAV25'ITR i 10 baza na 5' kraju 3' ITR je izbrisano. (C) Šematski prikaz Proto 2S vektora. Počevši od Proto 1S vektora, ljudski ApoE/C1 pojačivač i ljudski AAT promoter distalni X region su pomereni u sintetički intron od 100 baza koji je uveden između egzona 1 i 2 ljudske FVIII sekvence. Kao što je ukazano strelicama, orijentacija ljudskog ApoE/C1 pojačivača i ljudskog AAT promoter distalnog X regiona je pomerena u odnosu na njihovu orijentaciju u Proto 1S. (D) Šematski prikaz Proto 3S vektora. Počevši od Proto 2S, ljudski AAT promoter distalni X region je zamenjen sa drugom kopijom ljudskog ApoE/C1 pojačivača u reverznoj orijentaciji.
Slika 3 pruža šematske prikaze Proto 4, Proto 5, Proto 6 i Proto 7 vektora. (A) Šematski prikaz Proto 4 vektora. Počevši od Proto 1 vektora, SQ sekvenca i a3 domen su izbrisani. (B) Šematski prikaz Proto 5 vektora. Počevši od Proto 4 vektora, FVIII intron od 129 baza je unet između egzona 1 i 2 i sekvence ljudskog Faktora VIII. (C) Šematski prikaz Proto 6 vektora. Počevši od Proto 5 vektora, druga kopija ljudskog ApoE/C1 pojačivač je uveden u prednjoj orijentaciji u FVIII intron. (D) Šematski prikaz proto 7 vektora. Počevši od Proto 5 vektora, druga kopija ljudskog ApoE/C1 pojačivač je uveden u reverznoj orijentaciji u FVIII intron.
Slika 4A - Slika 4KK pruža šematske prikaze AAV FVIII vektora sa poboljšanim promoter/pojačivač sekvencama. (A) Šematski prikaz konstrukta 100ATG. (B) Šematski prikaz konstrukta 100ATG bGH poliA. (C) Šematski prikaz konstrukta 100ATG kratkog bGH poli A. (D) Šematski prikaz konstrukta 103ATG. (E) Šematski prikaz konstrukta 103ATG kratkog bGH poli A. (F) Šematski prikaz konstrukta 105ATG bGH poliA. (G) Šematski prikaz konstrukta DC172ATG FVIII. (H) Šematski prikaz konstrukta DC172ATG FVIII hAAT. (I) Šematski prikaz konstrukta DC172 2xHCR ATG FVIII. (J) Šematski prikaz konstrukta DC1722xHCR ATG FVIII hAAT. (K) Šematski prikaz konstrukta 2x SerpinA hAAT ATG FVIII. (L) Šematski prikaz konstrukta 2x SerpinA hAAT ATG FVIII 2x µ-globulin pojačivača. (M) Šematski prikaz konstrukta 100ATG kratkog bGH poli A 2x µ-globulin pojačivača. (N) Šematski prikaz konstrukta Faktor VIII-BMN001. (O) Šematski prikaz konstrukta FVIII-BMN002. (P) Šematski prikaz konstrukta 99. (Q) Šematski prikaz konstrukta 100. (R) Šematski prikaz konstrukta 100 u reverznoj orijentaciji. (S) Šematski prikaz konstrukta 100AT. (T) Šematski prikaz konstrukta 100AT 2x MG. (U) Šematski prikaz konstrukta 100AT 2x MG bGH poliA. (V) Šematski prikaz konstrukta 100AT 2x MG (reverzno) bGH poli A. (W) Konstrukt 100 bGH poli A. (X) Šematski prikaz konstrukta 100-400. (Y) Šematski prikaz konstrukta 101. (Z) Šematski prikaz konstrukta 102. (AA) Šematski prikaz konstrukta 103. (BB) Šematski prikaz konstrukta 103 u reverznoj orijentaciji. (CC) Šematski prikaz konstrukta 103AT. (DD) Šematski prikaz konstrukta 103AT 2x MG. (EE) Šematski prikaz konstrukta 103AT 2x MG bGH poli A. (FF) Šematski prikaz 103 bGH poli A. (GG) Šematski prikaz konstrukta 104. (HH) Šematski prikaz konstrukta 105. (II) Šematski prikaz konstrukta 106. (JJ) Šematski prikaz konstrukta 106AT. (KK) Šematski prikaz konstrukta 2x SerpinA hAAT.
Slika 5 pruža rezultate procene Proto konstrukata kod Rag2 miševa i pokazuje da Proto 1 transdukuje FVIII na sličan način kao divlji tip.
Slike 6 i 7 pokazuju da Proto 1, Proto 1S, Proto 2S i Proto 3S ispoljavaju VP1, VP2 i VP3 protein (Slika 5) i VP1, VP2 i VP3 DNK (Slika 6).
Slike 8-10 pokazuju da poboljšani promoter konstrukti imaju povećano ispoljavanje FVIII.
DETALJNI OPIS
[0070] Preveliki AAV vektori su nasumično skraćeni na 5' krajevima i nedostaje im 5' AAV ITR. Zbog toga što je AAV jednolančani DNK virus, i pakuje ili smisao ili antismisao lanac, smisao lanac u prevelikim AAV vektorima nema 5' AAV ITR i moguće delove 5' kraja ciljanog gena koji kodira protein a antismisao lanac u prevelikim AAV vektorima nema 3' ITR i moguće delove 3' kraja ciljanog gena koji kodira protein. Funkcionalni transgen se proizvodi u ćelijama inficiranim prevelikim AAV vektorima prekaljivanjem smisao i antismisao skraćenih genoma u ciljanoj ćeliji.
[0071] Pronalazak pruža AAV vektore koji kodiraju funkcionalno aktivni FVIII., tj., potpuno upakovane AAV FVIII vektore ili AAV FVIII vektore sa visokom aktivnošću ispoljavanja. AAV FVIII vektori pronalaska imaju poboljšano ispoljavanje/čestice, kao i poboljšani prinos proizvodnje AAV virusa i pojednostavljeno prečišćavanje. Uvođenje jednog ili više introna u FVIII region kodiranja proteina poboljšava ispoljavanje. Rekonfiguracija broja i pozicioniranja pojačivača takođe poboljšava ispoljavanje.
UCL SQ Vektor
[0072] UCL SQ vektor, koji je detaljno opisan u Nathwani i dr., obj. pat. prij. SAD br.
2013/0024960A1, objavljenoj 24. januara 2013. i McIntosh i dr., Blood 121:3335-3344, 2013, je preveliki, npr., veći od 5,0 kb, AAV vektor. Kao što je pokazano na Slici 1, UCL SQ vektor sadrži, s leva na desno, AAV serotip 2 (AAV2) 5' ITR, divljeg tipa AAV2 virusnu sekvencu,
1
ljudski apolipoprotein E (ApoE)/C1 pojačivač od 34 baze, ljudski alfa anti-tripsin (AAT) promoter distalni X region od 32 baze, ljudski AAT promoter od 186 baza, uključujući 42 baze sekvence 5' netransliranog regiona (UTR), ljudsku FVIII sekvencu optimizovanu za kodon gde je B domen zamenjen sa 14 aminokiselinskih SQ sekvenci, sekvencu sintetičke poliadenilacije od 49 baza, virusnu sekvencu AAV2 divljeg tipa i AAV23'ITR. UCL SQ vektor je dužine od 5081 baza.
[0073] Kao što je pokazano u Nathwani i dr., obj. pat. prij. SAD br.2013/0024960A1, koja je objavljena 24. januara 2013., i McIntosh i dr., Blood 121:3335-3344, 2013, UCL SQ vektor ispoljava funkcionalno aktivni FVIII in vitro i in vivo.
Proto 1, Proto 1S, Proto 2S i Proto 3S vektori
[0074] Za izbegavanje problema prevelikih AAV vektora i/ili za pojačavanje ispoljavanja AAV vektora, pronalazak pruža potpuno upakovane, manje, tj., manje od 5,0 kb, AAV vektore koji kodiraju FVIII SQ varijantu.4970 bp nukleotidna sekvenca sekvence Proto 1 je izneta u SEQ ID NO: 1.
[0075] Za stvaranje AAV vektora Proto 1, sekvence koje deluju da su neophodne za proizvodnju funkcionalno aktivnog FVIII su izbrisane u poređenju sa UCL SQ vektorom. Kao što je pokazano u Primeru 1, 110 baza strane DNK je uklonjeno, uključujući 53 baza AAV2 virusne sekvence 3' do AAV25' ITR, 46 baza AAV2 virusne sekvence 5' do AAV23' ITR i 11 baza susedno FVIII SQ regionu kodiranja koji je optimizovan za kodon. Dobijeni Proto 1 vektor je dužine 4970 baza. Kada je dizajniran, nije bilo poznato da li bi Proto 1 vektor bio u stanju da ispoljava funkcionalni FVIII polipeptid, ili in vitro ili in vivo.
[0076] Za stvaranje AAV vektora Proto 1S, 10 baza na 3' kraju AAV25' ITR i 10 baza na 5' kraju AAV323' ITR, je uklonjeno iz Proto 1 vektora. Dobijeni Proto 1S vektor je dužine 4950 baza. Nukleotidna sekvenca sekvence Proto 1S je izneta u SEQ ID NO: 2.
[0077] Za stvaranje AAV vektora Proto 2S, sintetički intron od 100 baza je uveden između egzona 1 i 2 i FVIII SQ sekvence optimizovane za kodon u Proto 1S vektoru. Apo3/C1 pojačivač od 34 baze i ljudski AAT promoter distalni X region od 32 baze su uklonjeni uzvodno od ljudskog AAT promotera i uvedeni u sintetički intron u reverznoj orijentaciji (u poređenju sa orijentacijom kada su ovi elementi locirani uzvodno u odnosu na ljudski AAT promoter). Dobijeni Proto 2S vektor je dužine 4983 baza. Nukleotidna sekvenca sekvence Proto 2S je izneta u SEQ ID NO: 3.
[0078] Za stvaranje AAV vektora Proto 3S, ljudski AAT promoter distalni X region je uklonjen iz Proto 2S vektora i zamenjen sa drugom kopijom ApoE/C1 pojačivača sa 34 baza u reverznoj orijentaciji. Dobijeni Proto 3S vektor je dužine 4984 baza. Nukleotidna sekvenca sekvence Proto 3S je izneta u SEQ ID NO: 4.
Proto 4, Proto S, Proto 6 i Proto 7 vektori
[0079] Kako bi se smanjila veličina AAV vektora i/ili povećalo ispoljavanje AAV vektora, pronalazak takođe pruža potpuno upakovane, manje, tj., manje od 5,0 kb, AAV vektore koji kodiraju B domen i a3 domen izbrisani FVIII.
[0080] Kako bi se stvorio AAV vektor Proto 4, SQ sekvenca od 14 amino kiselina i a3 domen koji se nalazi susedno C domenu je uklonjen iz Proto 1 vektora. Ukupna količina FVIII sekvence koja je izbrisana je 55 amino kiselina ili 165 baza. Dobijeni Proto 4S vektor je dužine 4805 baza. Nukleotidna sekvenca sekvence Proto 4S je izneta u SEQ ID NO: 5.
[0081] Za stvaranje AAV vektora Proto 5, skraćeni FVIII intron od 129 baza je uveden između egzona 1 i 2 FVIII sekvence optimizovane za kodon u Proto 4 vektoru. Dobijeni Proto 5 vektor je dužine 4934 baza. Nukleotidna sekvenca sekvence Proto 5 je izneta u SEQ ID NO: 6.
[0082] Za stvaranje AAV Proto 6 vektora, 34 baze FVIII introna su zamenjene sa drugom kopijom ljudskog ApoE/C1 pojačivača od 34 baze u prednjoj orijentaciji u Proto 5 vektoru. Dobijeni Proto 6 vektor je dužine 4934 baza. Nukleotidna sekvenca sekvence Proto 6 je izneta u SEQ ID NO: 7.
[0083] Za stvaranje AAV Proto 7 vektora, 34 baze FVIII introna su zamenjene sa drugom kopijom ljudskog ApoE/C1 pojačivača od 34 baze u reverznoj orijentaciji u Proto 5 vektoru. Dobijeni Proto 7 vektor je dužine 4934 baza. Nukleotidna sekvenca sekvence Proto 7 je izneta u SEQ ID NO: 8.
Dodatni AAV FVIII vektori sa poboljšanim promoter/pojačivač sekvencama
1
[0084] Preveliki AAV vektori sa jakim promoterima su stvoreni kako bi se povećalo ispoljavanje FVIII sa izbrisanim B domenom i a3 domenom i ovi konstrukti su stvoreni sa modifikovanim pojačivač i/ili promoter sekvencama. U nekim otelotvorenjima, AAV FVIII vektori ispoljavaju skraćeni funkcionalni FVIII. Ovi konstrukti sadrže jednu ili više promoter ili pojačivač sekvencu kao što su ApoE HCR ili njegovi fragmenti, µ-globulin pojačivač ili njegovi fragmenti, ljudski alfa 1 antitripsin promoter (hAAT) ili njegovi fragmenti, Serpin A pojačivač ili njegovi fragmenti, LP1 promoter pojačivač ili njegovi fragmenti ili makroglobulin pojačivač ili njegovi fragmenti. Ovi konstrukti sadrže sekvencu poliadenilacije kao što je bGH poli A sekvenca ili sintetička β-globin poli A sekvenca zeca. U nekim otelotvorenjima, konstrukti sadrže intron ili fragmente introna kao to su hAAT intron ili ljudski β-globin intron.
[0085] Konstrukt 100ATG je dužine 5511 baza. Ovaj konstrukt je iznet u SEQ ID NO: 9 gde su baze 1-1455'AAV2 ITR, baze 160-502 ApoE HCR, baze 509-726 hAAT promoter, baze 727-910 modifikovani ljudski β-globin 2. intron, baze 923-5296 SQ FVIII optimizovan za kodon, baze 5305-5352 sintetički β-globin poli A zeca i baze 5367-55113' AAV2 ITR.
[0086] Konstrukt 100ATG bGH poli A je dužine 5688 baza. Ovaj konstrukt je iznet u SEQ ID NO: 10 gde su baze 1-1455'AAV2 ITR, baze 160-502 ApoE HCR, baze 509-726 hAAT promoter, baze 727-910 modifikovani ljudski β-globin 2. intron, baze 923-5296 SQ FVIII optimizovan za kodon, baze 5305-5529 bGH poli A i baze 5544-56883'AAV2 ITR.
[0086] Konstrukt 100ATG bGH poli A je dužine 5613 baza. Ovaj konstrukt je iznet u SEQ ID NO: 11 gde su baze 1-1455'AAV2 ITR, baze 160-502 ApoE HCR, baze 509-726 hAAT promoter, baze 727-910 modifikovani ljudski β-globin 2. intron, baze 923-5296 SQ FVIII optimizovan za kodon, baze 5305-5454 su kratke bGH poli A i baze 5469-5613 3'AAV2 ITR.
[0088] Konstrukt 103ATG je dužine 5362 baza. Ovaj konstrukt je iznet u SEQ ID NO: 12 gde su baze 1-1455'AAV2 ITR, baze 169-344 su četiri kopije (4x) 44bp ApoE ponavljanja, baze 360-577 hAAT promoter, baze 578-761 modifikovani ljudski β-globin 2. intron, baze 774-5147 SQ FVIII optimizovan za kodon, baze 5156-5203 sintetički β-globin poli A zeca i baze 5218-5362 3' AAV2 ITR.
[0089] Konstrukt 103ATG bGH poli A je dužine 5464 baza. Ovaj konstrukt je iznet u SEQ ID
1
NO: 14 gde su baze 1-1455'AAV2 ITR, baze 169-344 su četiri kopije (4x) 44bp ApoE ponavljanja, baze 360-577 hAAT promoter, baze 578-761 modifikovani ljudski β-globin 2. intron, baze 774-5147 SQ FVIII optimizovan za kodon, baze 5156-5305 bGH poli A i baze 5320-5464 3'AAV2 ITR.
[0090] Konstrukt 105ATG bGH poli A je dužine 6354 baza. Ovaj konstrukt je iznet u SEQ ID NO: 14 gde su baze 1-1455'AAV2 ITR, baze 173-512 su dve kopije (2x) 170 bp mikroglobulin pojačivač, baze 519-736 hAAT promoter, baze 737-920 modifikovani ljudski β-globin 2. intron, baze 933-5306 SQ FVIII optimizovan za kodon, baze 5315-5539 bGH poli A, baze 5546-6195 su dve kopije (2x) 325 bp ApoE HCR i baze 6210-63543'AAV2 ITR.
[0091] Konstrukt DC172ATG FVIII je dužine 6308 baza. Ovaj konstrukt je iznet u SEQ ID NO: 15 gde su baze 1-1455' AAV2 ITR, baze 160-449 dve kopije (2x) 145 bp makroglobulin pojačivač, baze 450-1347898 hAAT promoter, baze 1348-1531 modifikovani ljudski βglobin 2. intron, baze 1544.5917 SQ FVIII optimizovan za kodon, baze 5926-6149 bGH poli A i baze 6164-63083' AAV2 ITR.
[0092] Konstrukt DC172ATG FVIII hAAT dužine 5635 baza, Ovaj konstrukt je iznet u SEQ ID NO: 16, gde su baze 1-145 5' AAV2 ITR, baze 160-449 dve kopije (2x) 145 bp makroglobulin pojačivač, baze 457-674 hAAT promoter, baze 675-858 modifikovani ljudski β-globin 2. intron, baze 871-5244 SQ FVIII optimizovan za kodon, baze 5253-5476 bGH poli A i baze 5490-56353' AAV2 ITR.
[0093] Konstrukt DC172 2xHCR ATG FVIII je dužine 6962 baza. Konstrukt je iznet u SEQ ID NO: 17, gde su baze 1-145 5' AAV ITR, baze 160-807 dve kopije (2x) 321 bp ApoE HCR, baze 814-1103 dve kopije (2x) 145 bp makroglobulin pojačivač, baze 1104-2001 bp hAAT promoter, baze 2002-2185 modifikovani ljudski β-globin 2. intron, baze 2198-6571 SQ FVIII optimizovan za kodon, baze 6580-6803 bGH poli A i baze 6818-69623' AAV2 ITR.
[0094] Konstrukt DC172 2xHCR ATG FVIII hAAT je dužine 6289 baza. Konstrukt je iznet u SEQ ID NO: 18, gde su baze 1-1455' AAV ITR, baze 160-807 dve kopije (2x) 321 bp ApoE HCR, baze 814-1103 dve kopije (2x) 145 bp makroglobulin pojačivač, baze 1111-1328 hAAT promoter, baze 1329-1512 modifikovani ljudski β-globin 2. intron, baze 1525-5898 SQ FVIII optimizovan za kodon, baze 5907-6130 bGH poli A i baze 6245-62893' AAV2 ITR.
1
[0095] Konstrukt 2x SerpinA hAAT ATG FVIII je dužine 5430 baza. Ovaj konstrukt je iznet u SEQ ID NO: 19 gde su baze 1-1455' AAV2 ITR, baze 160-309 dve kopije (2x) 71 bp SerpinA pojačivač, baze 326-543 hAAT promoter, baze 544-727 modifikovani ljudski βglobin 2. intron, baze 740-5113 SQ FVIII optimizovan za kodon, baze 5122-5271 kratki bGH poli A i baze 5122-54303' AAV2 ITR.
[0096] Konstrukt 2x SerpinA hAAT ATG FVIII 2x µ-globulin pojačivač je dužine 5779 baza. Ovaj konstrukt je iznet u SEQ ID NO: 20 gde su baze 1-1455' AAV2 ITR, baze 168-309 su dve kopije (2x) 71 bp SerpinA pojačivač, baze 326-543 hAAT promoter, baze 544-727 modifikovani ljudski β-globin 2. intron, baze 740-5113 SQ FVIII optimizovan za kodon, baze 5122-5271 kratki bGH poli A, baze 5279-5618 dve kopije (2x) 170 bp µ-globulin pojačivač i baze 5635-57793'AAV2 ITR.
[0097] Konstrukt 100ATG kratki bGH poli A 2x µ-globulin pojačivač je dužine 5962 baza. Ovaj konstrukt je iznet u SEQ ID NO: 21 gde su baze 1-1455' AAV2 ITR, baze 160-502 ApoE HCR, baze 509-726 hAAT promoter, baze 727-910 modifikovani ljudski β-globin 2. intron, baze 923-5296 SQ FVIII optimizovan za kodon, baze 5305-5454 su kratki bGH poli A i baze 5462-5801 dve kopije (2x) 170 bp mikroglobulin pojačivač i baze 5818-59623'AAV2 ITR.
[0098] Konstrukt faktor VIII-BMN001 je dužine 5919 baza. Ovaj konstrukt je iznet u SEQ ID NO: 22 gde su baze 1-1455' AAV2 ITR, baze 160-480 ApoE HCR, baze 487-884398 bp hAAT promoter, baze 885-1145 skraćeni hAAT intron, baze 1155-5528 SQ FVIII optimizovan za kodon, baze 5537-5760 bGH poli A i baze 5775-59193' AAV2 ITR.
[0099] Konstrukt FVIII-BMN002 je dužine 5306 baza. Ovaj konstrukt je iznet u SEQ ID NO: 23, gde su baze 1-1455' AAV2 ITR, baze 175-705 LP1 promoter/pojačivač, baze 718-5091 SQ FVIII optimizovan za kodon, baze 5100-5147 sintetički β-globin poli A zeca i baze 5162-5306 3' AAV2 ITR.
[0100] Konstrukt 99 je dužine 5461 baza. Ovaj konstrukt je iznet u SEQ ID NO: 24, gde su baze 1-1455' AAV2 ITR, baze 169-627 ApoE HCR/MAR, baze 634-866 hAAT promoter, baze 873-5246 SQ FVIII optimizovan za kodon, baze 5255-5302 sintetički β-globin poli A
1
zeca i baze 5317-54613' AAV2 ITR.
[0101] Konstrukt 100 je dužine 5327 baza. Ovaj konstrukt je iznet u SEQ ID NO: 25, gde su baze 1-1455' AAV2 ITR, baze 169-493 ApoE HCR, baze 509-726 hAAT promoter, baze 739-5112 SQ FVIII optimizovan za kodon, baze 5121-5168 sintetički β-globin poli A zeca i baze 5183-53273' AAV2 ITR.
[0102] Konstrukt 100 reverzne orijentacije je dužine 5309 baza. Ovaj konstrukt je iznet u SEQ ID NO: 26, gde su baze 1-1455' AAV2 ITR, baze 160-484 ApoE HCR u reverznoj orijentaciji, baze 491-708 hAAT promoter, baze 721-5094 SQ FVIII optimizovan za kodon, baze 5103-5150 sintetički β-globin poli A zeca i baze 5165-53093' AAV2 ITR.
[0103] Konstrukt 100AT je dužine 5532 baza. Ovaj konstrukt je iznet u SEQ ID NO: 27, gde su baze 1-1455' AAV2 ITR, baze 169-493 ApoE HCR, baze 509-726 hAAT promoter, baze 739-931 hAATb intron, baze 944-5317 SQ FVIII optimizovan za kodon, baze 5326-5373 sintetički β-globin poli A zeca i baze 5388-55323' AAV2 ITR.
[0104] Konstrukt 100AT 2x MG je dužine 5877 baza. Ovaj konstrukt je iznet u SEQ ID NO: 28, gde su baze 1-1455' AAV2 ITR, baze 169-493 ApoE HCR, baze 508-847 dve kopije (2x) 170 bp µ-globulin pojačivač, baze 854-1071 hAAT promoter, baze 1072-1276 hAAT intron, baze 1289-5662 SQ FVIII optimizovan za kodon, baze 5671-5718 sintetički β-globin poli A zeca i baze 5733-58773' AAV ITR.
[0105] Konstrukt 100AT 2x MG bGH poli A je dužine 6054 baza. Ovaj konstrukt je iznet u SEQ ID NO: 29, gde su baze 1-1455' AAV2 ITR, baze 169-493 ApoE HCR, baze 508-847 dve kopije (2x) 170 bp µ-globulin pojačivač, baze 854-1071 hAAT promoter, baze 1072-1276 hAAT intron, baze 1289-5662 SQ FVIII optimizovan za kodon, baze 5671-5895 bGH poli A i baze 5910-60543' AAV ITR.
[0106] Konstrukt 100AT 2x MG (reverse) bGH poli A je dužine 6054 baza. Ovaj konstrukt je iznet u SEQ ID NO: 30, gde su baze 1-1455' AAV2 ITR, baze 169-493 ApoE HCR, baze 508-847 dve kopije (2x) 170 bp µ-globulin pojačivač u reverznoj orijentaciji, baze 854-1071 hAAT promoter, baze 1072-1276 hAAT intron, baze 1289-5662 SQ FVIII optimizovan za kodon, baze 5671-5895 bGH poli A i baze 5910-6054 3' AAV ITR.
1
[0107] Konstrukt 100 bGH poli A je dužine 5504 baza. Ovaj konstrukt je iznet u SEQ ID NO: 31, gde su baze 1-1455' AAV2 ITR, baze 169-493 ApoE HCR, baze 509-726 hAAT promoter, baze 739-5112 SQ FVIII optimizovan za kodon, bazni parovi 5121-5345 bGH poli A i baze 5360-55043' AAV2 ITR.
[0108] Konstrukt 100-400 je dužine 5507 baza. Ovaj konstrukt je iznet u SEQ ID NO: 32, gde su baze 1-1455' AAV2 ITR, baze 169-493 ApoE HCR, baze 512-906398 bp hAAT promoter, baze 919-5292 SQ FVIII optimizovan za kodon, baze 5301-5348 sintetički β-globin poli A zeca i baze 5363-55073' AAV2 ITR.
[0109] Konstrukt 101 je dužine 5311 baza. Ovaj konstrukt je iznet u SEQ ID NO: 33, gde su baze 1-1455' AAV2 ITR, baze 170-477 dve kopije (2x) 154 bp ApoE HCR, baze 493-710 hAAT promoter, baze 723-5096 SQ FVIII optimizovan za kodon, baze 5105-5152 sintetički β-globin poli A zeca i baze 5167-53113' AAV2 ITR.
[0110] Konstrukt 102 je dužine 5156 baza. Ovaj konstrukt je iznet u SEQ ID NO: 34, gde su baze 1-1455' AAV2 ITR, baze 169-322154 bp ApoE HCR, baze 338-555 hAAT promoter, baze 568-4941 SQ FVIII optimizovan za kodon, baze 4950-4997 sintetički β-globin poli A zeca i baze 5012-51563' AAV2 ITR.
[0111] Konstrukt 103 je dužine 5178 baza. Ovaj konstrukt je iznet u SEQ ID NO: 35, gde su baze 1-1455' AAV2 ITR, baze 169-344 četiri kopije (4x) 44 bp ApoE HCR, baze 360-577 hAAT promoter, baze 590-4963 SQ FVIII optimizovan za kodon, baze 4972-5019 sintetički β-globin poli A zeca i baze 5034-51783' AAV2 ITR.
[0112] Konstrukt 103 reverzne orijentacije je dužine 5160 baza. Ovaj konstrukt je iznet u SEQ ID NO: 36, gde su baze 1-1455' AAV2 ITR, baze 160-335 četiri kopije (4x) 44 bp ApoE HCR u reverznoj orijentaciji, baze 342-559 hAAT promoter, baze 572-4945 SQ FVIII optimizovan za kodon, baze 4954-5001 sintetički β-globin poli A zeca i baze 5016-51603' AAV2 ITR.
[0113] Konstrukt 103AT je dužine 5383 baza. Ovaj konstrukt je iznet u SEQ ID NO: 37, gde su baze 1-1455' AAV2 ITR, baze 169-344 četiri kopije (4x) 44 bp ApoE HCR, baze 360-577
2
hAAT promoter, baze 578-782 hAAT intron, baze 795-4374 SQ FVIII optimizovan za kodon, baze 5177-5224 sintetički β-globin poli A zeca i baze 5239-53833' AAV2 ITR.
[0114] Konstrukt 103AT 2x MG je dužine 5728 baza. Ovaj konstrukt je iznet u SEQ ID NO: 38, gde su baze 1-1455' AAV2 ITR, baze 169-344 četiri kopije (4x) 44 bp ApoE HCR, baze 359-698 dve kopije (2x) 170 bp µ-globulin pojačivač, baze 705-922 hAAT promoter, baze 923-1127 hAAT intron, baze 1140-5513 SQ FVIII optimizovan za kodon, baze 5522-5569 sintetički β-globin poli A zeca i baze 5584-57283' AAV ITR.
[0115] Konstrukt 103AT 2x MG bGH poli A je dužine 5905 baza. Ovaj konstrukt je iznet u SEQ ID NO: 39, gde su baze 1-1455' AAV2 ITR, baze 169-344 četiri kopije (4x) 44 bp ApoE HCR, baze 359-698 dve kopije (2x) 170 bp µ-globulin pojačivač, baze 705-9222 hAAT promoter, baze 923-1127 hAAT intron, baze 1140-5513 SQ FVIII optimizovan za kodon, baze 5522-5746 sintetički β-globin poli A zeca i baze 5761-59055' AAV2 ITR.
[0116] Konstrukt 103 bGH poli A je dužine 5355 baza. Ovaj konstrukt je iznet u SEQ ID NO: 40 gde su baze 1-1455'AAV2 ITR, baze 169-344 su četiri kopije (4x) 44 bp ApoE HCR, baze 360-577 hAAT promoter, baze 590-4963 SQ FVIII optimizovan za kodon, baze 4972-5196 sintetički β-globin poli A zeca i baze 5211-53553' AAV2 ITR.
[0117] Konstrukt 104 je dužine 5618 baza. Ovaj konstrukt je iznet u SEQ ID NO: 41 gde su baze 1-1455'AAV2 ITR, baze 169-784 četiri kopije (4x) 154 bp ApoE HCR, baze 800-1017 hAAT promoter, baze 1030-5403 SQ FVIII optimizovan za kodon, baze 5412-5459 sintetički β-globin poli A zeca i baze 5474-56183' AAV2 ITR.
[0118] Konstrukt 105 je dužine 5993 baza. Ovaj konstrukt je iznet u SEQ ID NO: 42, gde su baze 1-1455' AAV2 ITR, baze 173-512 dve kopije (2x) 170 bp µ-globulin pojačivač, baze 519-736 hAAT promoter, baze 749-5122 SQ FVIII optimizovan za kodon, baze 5131-5178 sintetički β-globin poli A zeca, baze 5185-5834 dve kopije (2x) ApoE HCR i baze 5849-5993 3' AAV2 ITR.
[0119] Konstrukt 106 je dužine 5337 baza. Ovaj konstrukt je iznet u SEQ ID NO: 43, gde su baze 1-1455' AAV2 ITR, baze 173-512 dve kopije (2x) 170 bp µ-globulin pojačivač, baze 519-736 hAAT promoter, baze 749-5122 SQ FVIII optimizovan za kodon, baze 5131-5178 sintetički β-globin poli A zeca, baze 5193-5337 AAV2 ITR.
[0120] Konstrukt 106AT je dužine 5542 baza. Ovaj konstrukt je iznet u SEQ ID NO: 44, gde su baze 1-1455' AAV2 ITR, baze 173-512 dve kopije (2x) 170 bp µ-globulin pojačivač, baze 519-736 hAAT promoter, baze 737-941 hAAT promoter, baze 954-5327 SQ FVIII optimizovan za kodon, baze 5336-5383 sintetički β-globin poli A zeca, baze 5398-55423' AAV2 ITR.
[0121] Konstrukt 2x SerpinA hAAT je dužine 5126 baza. Ovaj konstrukt je iznet u SEQ ID NO: 45, gde su baze 1-1455' AAV2 ITR, baze 160-301 ApoE HCR, baze 308-525 hAAT promoter, baze 538-4911 SQ FVIII optimizovan za kodon, baze 4920-4967 sintetički β-globin poli A zeca i baze 4982-51263' AAV2 ITR.
AAV vektori
[0122] Kako se ovde koristi, termin „AAV“ je standardna skraćenica za adeno-asocirani virus. Adeno-asocirani virus je jednolančani DNK parvovirus koji raste samo u ćelijama u kojima su pružene određene funkcije od strane pomoćnog virusa koji vrši ko-infekciju.
Trenutno postoji trinaest serotipova AAV koji su okarakterisani, kao što je pokazano ispod na Tabeli 1. Opšte informacije i razmatranje o AAV se može pronaći, na primer, u, Carter, 1989, Handbook of Parvoviruses, tom 1, str.169-228, i Berns, 1990, Virology, str.1743-1764, Raven Press, (New York). Međutim, potpuno je očekivano da će ovi isti principi biti primenljivi na dodatne AAV serotipove kako je dobro poznato da su različiti serotipovi veoma blisko povezani, i strukturno i funkcionalno, čak i na genetskom nivou. (Videti, na primer, Blacklowe, 1988, str.165-174 of Parvoviruses and Human Disease, J. R. Pattison, ured.; i Rose, Comprehensive Virology 3:1-61 (1974)). Na primer, svi AAV serotipovi pokazuju veoma slična svojstva replikacije posredovane homolognim rep genima; i svi imaju tri povezana kapsid proteina kao što su oni koji se ispoljavaju u AAV 6. Stepen povezanosti je dalje predložen heterodupleks analizom koja otkriva prekomernu unakrsnu hibridizaciju između serotipova po dužini genoma; i prisustvo analognih samostalno prekaljenih segmenata na terminusima koji odgovaraju „sekvencama inverznog terminalnog ponavljanja“ (ITR). Slični šablon infektivnosti takođe predlažu da su funkcije replikacije u svakom serotipu pod sličnom regulatornom kontrolom.
[0123] „AAV vektor” kako se ovde koristi se odnosi na vektor koji sadrži jedan ili više polinukleotida od interesa (ili transgene) koji su izbočeni od strane AAV sekvenci terminalnog ponavljanja (ITR). Takvi AAV vektori se mogu replikovati i upakovati u infektivne virusne čestice kada su prisutne u ćeliji domaćina koja je transfektovana sa vektorom koji kodira i ispoljava rep i cap genske proizvode
[0124] „AAV virion“ ili „AAV virusna čestica“ ili „AAV vektorska čestica“ se odnosi na virusne čestice sastavljene od bar jednog AAV kapsid proteina i zatvorenog polinukleotid AAV vektora. Ukoliko čestica sadrži heterologni polinukleotid (tj., polinukleotid koji nije AAV genom divljeg tipa kao što je transgen za isporuku u ćeliju sisara), obično se naziva kao „AAV vektorska čestica“ ili kraće „AAV vektor“. Zbog toga, proizvodnja AAV vektorske čestice obavezno obuhvata proizvodnju AAV vektora, tako da se vektor nalazi u AAV vektorskoj čestici.
[0125] AAV „rep“ i „cap“ geni su geni koji kodiraju replikaciju i enkapsidaciju proteina, respektivno. AAV rep i cap geni se mogu pronaći u svim AAV serotipovima koji su istraženi do danas, i koji su ovde opisani i citirani referencama. Kod AAV divljeg tipa, rep i cap geni su uopšteno međusobno susedni u virusnom genomu (tj., spojeni su kao susedne ili preklapajuće transkripcione jedinice), i uopšteno su konzervirane među AAV serotipovima. AAV rep i cap geni se takođe pojedinačno i kolektivno nazivaju kao „AAV geni za pakovanje”. AAV cap gen u skladu sa predmetnim pronalaskom kodira Cap protein koji može upakovati AAV vektor u prisustvu rep i adeno pomoćne funkcije i može vezati ciljane ćelijske receptore. U nekim otelotvorenjima, AAV cap gen kodira kapsid protein koji ima aminokiselinsku sekvencu dobijenu iz naročitog AAV serotipa, na primer, serotipova prikazanih na Tabeli 1.
Tabela 1. AAV serotipovi
2
[0126] Korišćena AAV sekvenca za proizvodnju se može dobiti od genoma bilo kog AAV serotipa. Uopšteno, AAV serotipovi imaju genomsku sekvencu sa značajnom homologijom pri nivoima amino kiselina i nukleinskih kiselina, pružaju sličan niz genetskih funkcija, proizvode virone koji su suštinski fizički i funkcionalno ekvivalentni i vrše replikaciju i čine praktično identične mehanizme. Za genomsku sekvencu AAV serotipova i diskusiju genomskih sličnosti videti, na primer, GenBank Pristupni broj U89790; GenBank Pristupni broj J01901; GenBank Pristupni broj AF043303; GenBank Pristupni broj AF085716; Chlorini i dr., J. Vir.71: 6823-33(1997); Srivastava i dr., J. Vir.45:555-64 (1983); Chlorini i dr., J. Vir. 73:1309-1319 (1999); Rutledge i dr., J. Vir.72:309-319 (1998); i Wu i dr., J. Vir.74: 8635-47 (2000).
[0127] Genomska organizacija svih poznatih AAV serotipova je veoma slična. Genom AAC je prav, jednolančani DNK molekul koji je kraći od oko 5.000 nukleotida (nt). Inverzna terminalna ponavljanja (ITR) oblikuje jedinstvene sekvence nukleotida za kodiranje za proteine nestrukturne replikacije (Rep) i strukturne (VP) proteine. VP proteini formiraju kapsid. Terminalnih 145 nt su samostalno komplementarni i organizovani su tako da energetski stabilni unutarmolekulski dupleks koji formira T-oblikovanu petlju ukosnicu može biti formiran. Ove strukture petlje ukosnice funkcionišu kao početak za virusnu DNK replikaciju, kao prajmeri za ćelijski DNK polimeraza kompleks. Rep geni kodiraju Rep proteine, Rep78, Rep68, Rep52 i Rep40. Rep78 i Rep68 su transkribovani iz p5 promotera, a Rep 52 i Rep40 su transkribovani iz p19 promotera. Cap geni kodiraju VP proteine, VP1, VP2 i Vp3. Cap geni su transkribovani iz p40 promotera.
[0128] U nekim otelotvorenjima, sekvenca nukleinske kiseline koja kodira AAV kapsid protein je operativno povezana sa sekvencama za kontrolisanje ispoljavanja za ispoljavanje specifičnog ćelijskog tipa, kao što su Sf9 ili HEK ćelije. Tehnike poznate stručnjaku u oblasti za ispoljavanje stranih gena u ćelijama insekata koje su domaćin ili ćelijama sisara koje su domaćin se mogu koristiti za praktikovanje pronalaska. Metodologija za molekularni inženjering i ispoljavanje polipeptida u ćelijama insekata je opisana, na primer, u Summers i Smith. 1986. A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Culture Procedures, Texas Agricultural Experimental Station Bull. No.7555, College Station, Tex.; Luckow. 1991. U Prokop i dr., Cloning and Expression of Heterologous Genes in Insect Cells with Baculovirus Vectors' Recombinant DNA Technology and Applications, 97-152; King, L. A. i R. D. Possee, 1992, The baculovirus expression system, Chapman and Hall, United Kingdom; O'Reilly, D. R., L. K. Miller, V. A. Luckow, 1992, Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, New York; W.H. Freeman i Richardson, C. D., 1995, Baculovirus Expression Protocols, Methods in Molecular Biology, volume 39; pat. SAD br.
4,745,051; US2003148506; i WO 03/074714. Naročito pogodni promoter za transkripciju nukleotidne sekvence koja kodira AAV kapsid protein je npr., polihedron promoter. Međutim, drugi promoteri koji su aktivni u ćelijama insekata su poznati u struci, npr., p10, p35 ili IE-1 promoteri i drugi promoteri opisani u referencama od iznad su takođe razmatrani.
[0129] Upotreba ćelija insekata za ispoljavanje heterolognih proteina je dobro dokumentovana, kao i metode za uvođenje nukleinskih kiselina, kao što su vektori, npr., vektori kompatibilni sa ćelijama insekata, u takve ćelije i metode za održavanje takvih ćelija u kulturi. Videti, na primer, METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, ured. Richard, Humana Press, NJ (1995); O'Reilly i dr., BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS, A LABORATORY MANUAL, Oxford Univ. Press (1994); Samulski i dr., J. Vir.63:3822-8 (1989); Kajigaya i dr., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 88: 4646-50 (1991); Ruffing i dr., J. Vir.
66:6922-30 (1992); Kirnbauer i dr., Vir.219:37-44 (1996); Zhao i dr., Vir.272:382-93 (2000); i Samulski i dr., pat. SAD br.6,204,059. U nekim otelotvorenjima, konstrukt nukleinske kiseline koji kodira AAV u ćelijama insekata je vektor koji je kompatibilan sa ćelijom insekata. „Vektor kompatibilan sa ćelijom insekata“ ili „vektor“ kako se ovde koristi se odnosi na molekul nukleinske kiseline koji može produktivno transformisati ili transfektovati insekt ili ćelijsku insekta. Primeri bioloških vektora obuhvataju plazmide, prave molekule nukleinske kiseline i rekombinantne viruse. Bilo koji vektor se može koristiti sve dok je kompatibilan sa ćelijom insekata. Vektor se može integrisati u genom ćelija insekta ali prisustvo vektora u ćeliji insekta ne mora biti permanentno i prolazni episomalni vektori su
2
takođe obuhvaćeni. Vektori se mogu uvesti na bilo koji poznati način, na primer, hemijskim tretiranjem ćelija, elektroporacijom ili infekcijom. U nekim otelotvorenjima, vektor je bakulovirus, virusni vektor ili plazmid. U poželjnijem otelotvorenju, vektor je bakulovirus, tj., konstrukt je bakulovirusni vektor. Bakulovirusni vektori i metode za njihovu upotrebu su opisani u iznad citiranim referencama o molekularnom inženjeringu ćelija insekata.
[0130] Bakulovirusi su obuhvaćeni DNK virusi člankonožaca, čija su dva člana dobro poznati ekspresioni vektori za proizvodnju rekombinantnih proteina u ćelijskim kulturama.
Bakulovirusi imaju kružne dvolančane genome (80-200 kbp) koji se mogu dizajnirati da omogućavaju isporuku velikog genomskog sadržaja u specifične ćelije. Virusi koji se koriste kao vektori su uopšteno Autographa californica multikapsid nukleopolihedrovirus (AcMNPV) ili Bombyx mori (Bm)NPV) (Kato i dr., 2010).
[0131] Bakulovirusi se obično koriste za inficiranje ćelije insekata za ispoljavanje rekombinantnih proteina. Naročito, ispoljavanje heterolognih gena kod insekata se može uspostaviti kao što je opisano, na primer, u pat. SAD br.4,745,051; Friesen i dr (1986); EP 127,839; EP 155,476; Vlak i dr (1988); Miller i dr (1988); Carbonell i dr (1988); Maeda i dr (1985); Lebacq-Verheyden i dr (1988); Smith i dr (1985); Miyajima i dr (1987); i Martin i dr (1988). Brojni bakulovirusni sojevi i varijante i odgovarajuće popustljive ćelije insekata koje su domaćini se mogu koristiti za proteinsku proizvodnju su opisani u Luckow i dr (1988), Miller i dr (1986); Maeda i dr (1985) i McKenna (1989).
Metode za proizvodnju rekombinantnih AAV
[0132] Predmetno obelodanjivanje pruža materijale i metode za proizvodnju rekombinantnih AAV kod insekata ili ćelija sisara. Virusni konstrukti mogu dalje obuhvatati promoter i mesto restrikcije nizvodno od promotera kako bi se omogućilo uvođenje polinukleotida koji kodira jedan ili više proteina od interesa, gde se promoter i mesto restrikcije nalaze nizvodno od 5' AAV ITR i uzvodno od 3' AAV ITR. Virusni konstrukt može dalje sadržati posttranskripcioni regulatorni element nizvodno od mesta restrikcije i uzvodno od 3' AAV ITR. Virusni konstrukt može dalje sadržati polinukleotid uveden na mestu restrikcije i biti operativno povezan sa promoterom, gde polinukleotid sadrži region kodiranja proteina od interesa. Kao što je stručnjak uvažiti, bilo koji od AAV vektora obelodanjenih u predmetnoj prijavi se može koristiti u metodi kao virusni konstrukt za proizvodnju rekombinantnog AAV.
2
[0133] Pomoćne funkcije se mogu pružiti jednim ili više pomoćnih plazmida ili pomoćnih virusa koji sadrže adenovirusne ili bakulovirusne pomoćne gene. Neograničavajući primeri adenovirusnih ili bakulovirusnih pomoćnih gena obuhvataju, ali nisu ograničeni na, E1A, E1B, E2A, E4 i VA, koji mogu pružiti pomoćne funkcije za AAV pakovanje.
[0134] Pomoćni virusi AAV su poznati u struci i obuhvataju, na primer, viruse iz familije Adenoviridae i familije Herpesviridae. Primeri pomoćnih virusa AAV obuhvataju, ali nisu ograničeni na, SAdv-13 pomoćni virus i SAdV-13-nalik pomoćni virus opisan u patentnoj objavi SAD br.20110201088, pomoćne vektore pHELP (Applied Viromics). Stručnjak u ovoj oblasti će uvažiti da se bilo koji pomoćni virus ili pomoćni plazmid AAV koji može pružiti adekvatnu pomoćnu funkciju AAV može ovde koristiti.
[0135] AAV cap geni mogu biti prisutni u plazmidu. Plazmid može dalje sadržati AAV rep gen. Cap geni i/ili rep gen iz bilo AAV serotipa (uključujući, ali bez ograničenja AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13 i bilo koje njihove varijacije) se mogu ovde koristiti za proizvodnju rekombinantnog AAV. AAV cap geni mogu kodirati kapsid iz serotipa 1, serotipa 2, serotipa 4, serotipa 5, serotipa 6, serotipa 7, serotipa 8, serotipa 9, serotipa 10, serotipa 11, serotipa 12, serotipa 13 ili njihovih varijanti.
[0136] Ćelija insekta ili sisara se može transfektovati sa pomoćnim plazmidom ili pomoćnim virusom, virusnim konstruktom i plazmidom koji kodira AAV cap gene; i rekombinantni AAV virus se može sakupiti pri različitim vremenskim tačkama nakon ko-transfekcije. Na primer, rekombinantni AAV virus se može sakupiti nakon oko 12 sati, oko 24 sata oko 36 sati, oko 48 sati, oko 72 sata, oko 96 sati, oko 120 sati ili u bilo koje vreme između ove dve vremenske tačke nakon ko-transfekcije.
[0137] Rekombinantni AAV se takođe može proizvesti bilo kojom konvencionalnom metodom poznatom u struci koja je pogodna za proizvodnju infektivnog rekombinantnog AAV. U nekim primerima, rekombinantni AAV se može proizvesti upotrebom ćelije insekta ili sisara koja stabilno ispoljava neke od neophodnih komponenti za proizvodnju AAV čestice. Na primer, plazmid (ili više plazmida) koji sadrže AAV rep i cap gene i selektabilni marker, kao što je gen otpornosti na neomicin, se mogu integrisati u genom ćelije. Ćelija insekta ili sisara se zatim može ko-inficirati sa pomoćnim virusom (npr., adenovirusom ili
2
bakulovirusom koji pruža pomoćne funkcije) i virusnim vektorom koji sadrži 3' i 3' AAV ITR (i nukleotidnu sekvencu koja kodira heterologni protein, po želji). Prednosti ove metode su u tome da su ćelije selektabilne i pogodne za proizvodnju rekombinantnog AAV u velikoj razmeri. Kao drugi neograničavajući primer, adenovirus ili bakulovirus koji nije plazmid se može koristiti za uvođenje rep i cap gena u ćelije za pakovanje. Kao još jedan neograničavajući primer i virusni vektor koji sadrži 5' i 3' AAV LTR i rep-cap gene se može stabilno integrisati u DNK proizvođačke ćelije i pomoćne funkcije se mogu pružiti adenovirusom divljeg tipa kako bi se proizveo rekombinantni AAV.
Ćelijski tipovi korišćena za proizvodnju AAV
[0138] Virusne čestice koje sadrže AAV vektore pronalaska se mogu obnoviti upotrebom bilo kog ćelijskog tipa beskičmenjaka što omogućava proizvodnju AAV ili bioloških proizvoda koji se mogu održavati u kulturi. Na primer, korišćene inficirane ćelijske linije mogu biti od Spodoptera frugiperda, kao što su SF9, SF21, SF900+, drosofila ćelijske linije, ćelijske linije komaraca, npr., Aedes albopictus dobijene ćelije, ćelijske linije domaće svilene bube, npr. Bombyxmori ćelijske linije, Trichoplusia ni ćelijske linije kao što su High Five ćelije ili Lepidoptera ćelijske linije kao što su Ascalapha odorata ćelijske linije. Poželjne ćelije insekata su ćelije iz vrsta insekata koje su pogodne za bakulovirusnu infekciju, uključujući High Five, Sf9, Se301, SeIZD2109, SeUCR1, Sf9, Sf900+, Sf21, BTI-TN-5B1-4, MG-1, Tn368, HzAm1, BM-N, Ha2302, Hz2E5 i Ao38.
[0139] Bakulovirusi su obuhvaćeni DNK virusi člankonožaca, čija su dva člana dobro poznati ekspresioni vektori za proizvodnju rekombinantnih proteina u ćelijskim kulturama.
Bakulovirusi imaju kružne dvolančane genome (80-200 kbp) koji se mogu dizajnirati da omogućavaju isporuku velikog genomskog sadržaja u specifične ćelije. Virusi koji se koriste kao vektori su uopšteno Autographa californica multikapsid nukleopolihedrovirus (AcMNPV) ili Bombyx mori (Bm)NPV) (Kato i dr., 2010).
[0140] Bakulovirusi se obično koriste za inficiranje ćelije insekata za ispoljavanje rekombinantnih proteina. Naročito, ispoljavanje heterolognih gena kod insekata se može uspostaviti kao što je opisano, na primer, u pat. SAD Br.4,745,051; Friesen i dr (1986); EP 127,839; EP 155,476; Vlak i dr (1988); Miller i dr (1988); Carbonell i dr (1988); Maeda i dr (1985); Lebacq-Verheyden i dr (1988); Smith i dr (1985); Miyajima i dr (1987); i Martin i dr (1988). Brojni bakulovirusni sojevi i varijante i odgovarajuće popustljive ćelije insekata koje
2
su domaćini se mogu koristiti za proteinsku proizvodnju su opisani u Luckow i dr (1988), Miller i dr (1986); Maeda i dr (1985) i McKenna (1989).
[0141] U drugom aspektu pronalaska, metode pronalaska su takođe izvršene na bilo kom tipu ćelije sisara koji omogućava replikaciju AAV ili proizvodnju bioloških proizvoda i koji se može održavati u kulturi. Poželjne ćelije sisara koje se mogu koristiti su HEK293, HeLa, CHO, NS0, SP2/0, PER.C6, Vero, RD, BHK, HT 1080, A549, Cos-7, ARPE-19 i MRC-5 ćelije.
Testiranje AAV FVIII vektora
[0142] Analize za testiranje potpuno upakovanih AAV FVIII vektora prema pronalasku obuhvataju, na primer (1) prolaznu transfekciju dvolančanih DNK plazmida koji sadrže nukleinske kiseline AAV vektora u HepG2 ćelijama, ćelijska linija dobijena iz ljudske jetre za proveravanje ispoljavanja i splajsovanja iRNK specifično za jetru, i FVIII proizvodnju i lučenje FVIII proteina in vitro; (2) proizvodnju AAV virona koji sadrže AAV FVIII vektore u 293 ćelija i bakulovirusno inficiranih ćelija insekata; (3) procenu nukleinskih kiselina AAV vektora analizom alkalnog gela i analize replikacije; i (4) procenu ispoljavanja FVIII, FVIII aktivnosti i FVIII specifične aktivnosti kod Rag2 miševa. Ove analize su detaljnije opisane u Primerima.
[0143] Potpuno upakovani AAV FVIII vektori pronalaska pokazuju bar isto ispoljavanje i/ili aktivnost kao UCL SQ vektor, i poželjno 1,5-put, 2-puta, 3-puta, 4-puta ili 5 puta veće ispoljavanje i/ili aktivnost u poređenju sa UCL SQ vektorom.
[0144] Potpuno upakovani AAV FVIII vektori pronalaska imaju visok prinos vektora sa malo ili bez fragmentarnog genomskog zagađenja, i poželjno 1,5-put, 2-puta, 3-puta, 4-puta ili 5 puta veći prinos vektora u poređenju sa UCL SQ vektorom.
[0145] Drugi aspekti i prednosti predmetnog pronalaska će se prihvatiti nakon razmatranja sledećih ilustrativnih primera.
PRIMERI
Primer 1
2
Stvaranje Proto 1, Proto 1S, Proto 2S i Proto 3S vektora
[0146] UCL SQ vektor, koji je detaljno opisan u Nathwani i dr., obj. pat. prij. SAD br.
2013/0024960A1, koja je objavljena 24. januara 2013,, koja je ovde obuhvaćena referencom u svojoj potpunosti, i McIntosh i dr., Blood 121:3335-3344, 2013, je preveliki, tj., veći od 5,0 kb, AAV vektor. Kao što je pokazano na Slici 1, UCL SQ vektor sadrži, s leva na desno, AAV serotip 2 (AAV2) 5' ITR, divljeg tipa AAV2 virusnu sekvencu, ljudski apolipoprotein E (ApoE)/C1 pojačivač od 34 baze, ljudski alfa anti-tripsin (AAT) promoter distalni X region od 32 baze, ljudski AAT promoter od 186 baza, uključujući 42 baze sekvence 5' netransliranog regiona (UTR), ljudsku FVIII sekvencu optimizovanu za kodon gde je B domen zamenjen sa 14 aminokiselinskih SQ sekvenci, sekvencu sintetičke poliadenilacije od 49 baza, virusnu sekvencu AAV2 divljeg tipa i AAV23'ITR. UCL SQ vektor je dužine od 5081 baza.
[0147] Za dobijanje vektora koji je manji od UCL SQ vektora, DNK sekvence za koje pronalazači veruju da su nepotrebne za FVIII ispoljavanje i/ili aktivnost, ili AAV proizvodnju virona, su uklonjene iz UCL SQ vektorske sekvence. Strana DNK sekvenca je uklonjena, uključujući 53 baze AAV2 virusne sekvence 3' do AAV25' ITR, 46 baza AAV2 virusne sekvence 5' do AAV23' ITR i 11 baza susedno FVIII SQ regionu kodiranja koji je optimizovan za kodon. Dobijeni Proto 1 vektor, koji je dužine 4970 baza je prikazan u šematskom obliku na Slici 2A a sekvenca je izneta u SEQ ID NO: 1. Proto 1 je proizveo infektivni virus i kodirao je funkcionalni Faktor VIII polipeptid.
[0148] Sekvence susedne petlji ukosnici u AAV2 ITR se takođe mogu potrošiti u rekombinantnim AAV vektorima (videti Srivastava i dr., pat. SAD br.6,521,225; Wang i dr., J. Virol.70:1668-1677, 1996; i Wang i dr., J. Virol.71:3077-3082, 1997). Za dalje smanjivanje veličine Proto 1 vektora, 10 baza AAV2 sekvence je uklonjeno direktno 3' petlji ukosnici u AAV25'ITR i 10 baza AAV2 sekvence je uklonjeno direktno 5' petlji ukosnici u AAV2 3'ITR. Dobijeni Proto 1 vektor, koji je dužine 4950 baza je prikazan u šematskom obliku na Slici 2B a sekvenca je izneta u SEQ ID NO: 2.
[0149] U cilju povećanja ispoljavanja FVIII SQ varijante u Proto 1S vektoru, sintetički intron od 100 baza je uveden između egzona 1 i 2 u FVIII sekvenci optimizovanoj za kodon.
Poznato je da uvođenje introna može za rezultat dati povećani nivo iRNK ispoljavanja u suprotno genima sa manje introna, kao što su, na primer, interferon geni.
[0150] Pojačivači su definisani tako da rade na način nezavistan od rastojanja i orijentacije. ApoE/C1 pojačivač od 34 baze radi na način nezavistan od rastojanja i orijentacije u odnosu na FVIII ispoljavanje, kao što je pokazano svojom pretpostavljenom aktivnošću pojačivača u Gray i dr., pat. SAD br.8,030,065 (FIX ispoljavanje) i u Nathwani i dr., obj. pat. prij. SAD br.
2013/0024960 (FVIII ispoljavanje), gde su obe obuhvaćene ovde referencom u svojoj potpunosti. Ljudski AAT promoter distalni X region od 32 baze, opisan u Di Simone i dr., EMBO J.6:2759-2766, 1987, se nalazi u regulatornom domenu koja pojačava ispoljavanje heterolognog promotera.
[0151] U drugom pokušaju da se dalje poveća ispoljavanje FVIII SQ varijanti u Proto 1S vektoru, sintetička intronska sekvenca je obuhvatala ljudski ApoE/C1 pojačivač od 34 baze i ljudski AAT promoter distalni X region od 32 baze, koja je pomerena od svoje lokacije uzvodno od ljudskog AAT promotera. Ova dva regulatorna elementa su uvedena u reverznoj orijentaciji u odnosu na njihovu orijentaciju u Proto 1S. Dobijeni Proto 2S vektor, koji je dužine 4983 baza je prikazan u šematskom obliku na Slici 2C a sekvenca je izneta u SEQ ID NO: 3.
[0152] Kako prethodno nije pokazano da ljudski AAT promoter distalni X region funkcioniše nizvodno od mesta početka transkripcije u intronu, ovaj regulatorni element u Proto 2S vektoru je zamenjen sa drugom kopijom ljudskog ApoE/C1 pojačivača od 34 baze u istoj orijentaciji kao prva kopija pojačivača u intronu. Dobijeni Proto 3S vektor, koji je dužine 4985 baza je prikazan u šematskom obliku na Slici 2D a sekvenca je izneta u SEQ ID NO: 4.
[0153] Nukleinske kiseline Proto 1, Proto 2S i Proto 3S vektora su klonirane u pUC19 bakterijski ekspresioni plazmid, čime se stvaraju dvolančani oblici AAV FVIII vektora.
Primer 2
Stvaranje Proto 4, Proto 5, Proto 6 i Proto 7 vektora
[0154] Za dalje redukovanje Proto 1 vektora i/ili povećanje ispoljavanja FVIII u poređenju sa Proto 1 vektorom, a3 domen koji se nalazi susedno lakom lancu ili C domenu, je izbrisan. A3 domen je uključen u von Willenbrand faktor, ali može biti potrošen za funkcionalno aktivni FVIII in vivo.
1
[0155] Počevši od Proto 1 vektora, SQ sekvenca od 14 amino kiselina i a3 domen od 41 amino kiseline (odgovara amino kiselinama 1649-1689 FVIII divljeg tipa) su izbrisani.
Dobijeni Proto 4 vektor, koji je dužine 4805 baza je prikazan u šematskom obliku na Slici 3A a sekvenca je izneta u SEQ ID NO: 5.
[0156] U pokušaju da se poveća ispoljavanje FVIII sa izbrisanim B domenom i a3 domenom, skraćeni FVIII intron od 129 baza je uveden između egzona 1 i 2 u FVIII sekvenci optimizovanoj za kodon u Proto 4 vektoru. Dobijeni Proto 5 vektor, koji je dužine 4934 baza je prikazan u šematskom obliku na Slici 3B a sekvenca je izneta u SEQ ID NO: 6.
[0157] U pokušaju da se poveća ispoljavanje FVIII sa izbrisanim B domenom i a3 domenom, druga kopija ljudskog ApoE/C1 pojačivača od 34 baze je uvedena ili u prednjoj ili reverznoj orijentaciji u Proto 5 vektoru. Dobijeni Proto 6 vektor, koji je dužine 4934 baza i ima intronski ApoE/C1 pojačivač u prednjoj orijentaciji je prikazan u šematskom obliku na Slici 3C a sekvenca je izneta u SEQ ID NO: 7.
[0158] Dobijeni Proto 7 vektor, koji je dužine 4934 baza i ima intronski ApoE/C1 pojačivač u reverznoj orijentaciji je prikazan u šematskom obliku na Slici 3D a sekvenca je izneta u SEQ ID NO: 8.
[0159] Nukleinske kiseline Proto 4, Proto 5 i Proto 6 i Proto 7 vektora su klonirane u pUC19 bakterijski ekspresioni plazmid, čime se stvaraju dvolančani oblici AAV FVIII vektora.
Primer 3
Analize za testiranje ispoljavanja i aktivnosti AAV FVIII vektora
[0160] Analize za testiranje potpuno upakovanih AAV FVIII vektora prema pronalasku obuhvataju, na primer (1) prolaznu transfekciju dvolančanih DNK plazmida koji sadrže nukleinske kiseline AAV vektora u HepG2 ćelijama, ćelijska linija dobijena iz ljudske jetre za proveravanje ispoljavanja i splajsovanja iRNk specifično za jetru, i FVIII proizvodnju i lučenje FVIII proteina in vitro; (2) proizvodnju AAV virona koji sadrže AAV FVIII vektore u 293 ćelija i bakulovirusno inficiranih ćelija insekata; (3) procenu nukleinskih kiselina AAV vektora analizom alkalnog gela i analize replikacije; i (4) procenu ispoljavanja FVIII, FVIII aktivnosti i FVIII specifične aktivnosti kod Rag2 miševa.
2
Analize prolazne transfekcije.
[0161] Preliminarna in vitro analiza je izvršena za poređenje FVIII ispoljavanja i oblika aktivnosti AAV FVIII vektora predmetnog pronalaska sa tim oblikom UCL SQ vektora. Dvolančani oblici AAV FVIII vektora predmetnog pronalaska su prolazno transfektovani u ljudsku ćelijsku liniju jetre, HepG2. Nakon transfekcije, na primer, 24 ili 48 sati kasnije, FVIII antigen i aktivnost u supernatantima kulture su mereni.
[0162] Primenom ove analize, FVIII aktivnost u HepG2 ćelijama se prolazno transfektovani sa Proto 1, Proto 1S i Proto 2S vektori su bili slični sa FVIII aktivnošću dobijenom primenom UCL SQ vektora, što pokazuje da Proto 1, Proto 1S i Proto 2S vektori mogu ispoljavati funkcionalni Faktor VIII protein.
Proizvodnja AAV virona u 293 ćelijama i bakulovirusno inficiranim ćelijama insekata.
[0163] Za demonstriranje da AAV FVIII vektori predmetnog pronalaska takođe pakuju nukleinske kiseline koje kodiraju FVIII, dvolančani oblici AAV FVIII vektora stvoreni kao što je opisano u Primerima 1 i 2 su uvedeni u ćelije koje mogu proizvoditi AAV virone. U prvom sistemu za proizvodnju AAV virusa, plazmidi koji sadrže nukleinske kiseline AAV FVIII vektora u dvolančanom obliku su ko-transfektovani u 293 ćelije zajedno sa plazmidom koji ispoljava AAV Cap i Rep proteine i plazmidom koji ispoljava adenovirusne pomoćne funkcije potrebne za proizvodnju AAV virona. U drugom sistemu za proizvodnju AAV virusa, bakulovirusni konstrukti koji ispoljavaju nukleinske kiseline AAV FVIII vektora i AAV Cap i Rep proteine su stvoreni i zatim ko-inficirani u Sf9 ćelije insekata. Dobijeni AAV vironi proizvedeni u prolazno transfektovanim 293 ćelijama ili bakulovirusno inficiranim Sf9 ćelijama su prečišćeni i analizirani standardnim metodama poznatim u struci.
Procena alkalnim gelom i analizom replikacije
[0164] Analiza elektroforeze alkalnog gela je korišćena za određivanje veličine upakovane nukleinske kiseline. Centralna analiza replikacije je korišćena za određivanje AAV FVIII vektora upakovanih u nepromenjenom obliku sa obe metode pakovanja.
[0165] Analiza proširenja prajmera je korišćena za kvantifikovanje količine nukleinskih kiselina AAV FVIII vektora koji imaju kompletne krajeve, tj., koji se završavaju na 5' kraju petlje ukosnice u AAV25' ITR (smisao lanac) ili 3' ITR (antismisao lanac).
[0166] Alternativno, PCR analiza je korišćena za određivanje da li nukleinske kiseline AAV FVIII vektora imaju kompletne krajeve, tj., da li se završavaju na 5' kraju petlje ukosnice u AAV2 5' ITR (smisao lanac) ili 3' ITR (antismisao lanac).
Procena kod Rag2 miševa
[0167] AAV vironi proizvedeni u prolazno transfektovanim vektorima upakovanim sa 293 ćelijama ili bakulovirusnim inficiranim Sf9 ćelijama su testirani za FVIII ispoljavanje i aktivnost kod Rag2 miševa kod 2e11, 2e12 i 2e13 virusnih genoma (vg)/kg, dato intravenski. Rag2 miševi su korišćeni u ovoj analizi zato što FVIII ispoljavanje i/ili aktivnost nije zakomplikovana prisustvom imunog odgovora domaćina u AAV virusu ili ljudskom FVIII proteinu.
[0168] FVIII antigen je određen ELISA baziranom analizom. FVIII aktivnost je određena analizom FXa aktivacije i/ili analizom koagulacije. Upotrebom analiza FVIII antigena i aktivnosti, određena je FVIII specifična aktivnost.
[0169] Stručnjacima je očekivano da se jave brojne modifikacije i varijacije u praksi pronalaska nakon razmatranja predmetno poželjnih otelotvorenja. Kao posledica, jedina ograničenja koja treba da se stave u okvir pronalaska su ona koja su navedena u priloženim patentnim zahtevima.
Primer 4
Stvaranje konstrukata sa poboljšanim promoter/pojačivač sekvencama
[0170] Za stvaranje dodatnih AAV vektora sa jakim promoterima koji povećavaju ispoljavanje funkcionalnog FVIII, stvoreni su konstrukti sa modifikovanim pojačivač i/ili promoter sekvencama. U nekim otelotvorenjima, konstrukti su sadržali skraćene verzije ApoE ili µ-globulin pojačivača. Ovi konstrukti su stvoreni primenom standardnih tehnika DNK kloniranja i njihove sekvence su prikazane u SEQ ID NO: 9-45.
Primer 5
Stvaranje AAV virusnih čestica
Stvaranje rekombinantnog Bacmid
[0171] DH10 Bac kompetentne ćelije su odmrznute na ledu. Rekombinantni plazmid za prebacivanje (npr., pFB-GFP) je dodat i blago mešan sa kompetentnim ćelijama i inkubiran na
4
ledu u trajanju od 30 minuta. Kompetentne ćelije su zatim izložene toploti pri temperaturi od približno 42 °C u trajanju od 30 sekundi i zatim su ohlađene na ledu u trajanju od 2 minuta. Kompetentne ćelije su šokirane toplotom u trajanju od 30 sekundi pri 42 °C i ohlađene na ledu u trajanju od 2 min. SOC je dodat i ćelije su ostavljene da se inkubiraju pri 37 °C uz mešanje u trajanju od 4 sata kako bi se omogućilo nastupanje rekombinacije. Za vreme trajanja perioda inkubacije, X-gal je postavljen na dve LB-ploče (koje su dodatno sadržale različite antibiotike (npr., kanamicin, gentamicin i tetraciklin) za transformaciju, što je praćeno sa IPTG.
[0172] Količina smeše za inkubaciju je dobijena, razblažena i zatim postavljena na dve LB-ploče i inkubirana pri 37 °C u trajanju od približno 30-48 sati. Nekoliko belih kolonija je izabrano iz svake ploče i kultivisano preko noći u LB medijumu koji je sadržao istu kombinaciju antibiotika kao što je dato u LB-pločama. Zatim, Bacmid DNK i glicerol su pripremljeni i čuvani na - 80 °C.
Prečišćavanje rekombinantne Bacmid DNK
[0173] Količina Bacmid glicerola je uklonjena i inokulisana u LB medijumu koji je sadržao istu kombinaciju antibiotika datog u LB-pločama koja je opisana u Primeru 1. Kulture su ostavljene da rastu preko noću pri 37 °C uz drmanje. Zatim, količina kulture je obrtana u microfuge pri punoj brzini u trajanju od približno 30 sekundi.
[0174] Pelet je resuspendovan u resuspenzionom puferu upotrebom pipete što je praćeno puferom za lizu i epruveta je obrtana nekoliko puta kako bi se pufer pomešao i zatim je inkubiran na sobnoj temperaturi u trajanju od približno 5 minuta. Primerni resuspenzioni pufer sadrži 50 mM Tris-CL, pH 8,0, 10 mM EDTA i 100 ug/mL RNaza A. Primerni pufer za lizu sadrži 200 mM NaOH i 1% SDS. Količina pufera za talog (npr., pufer koji sadrži 3,0 M kalijum acetat, pH 5,5) je polako dodata i epruveta je obrtana nekoliko puta kako bi se pufer pomešao i zatim je inkubiran na ledu u trajanju od približno 10 minuta. Epruveta je centrifugirana u trajanju od približno 10 minuta pri punoj brzini i supernatant je sipan u epruvetu koja je sadržala izopropanol. Epruveta je obrtana nekoliko puta kako bi se rastvor pomešao.
[0175] Zatim, rastvor je centrifugiran pri punoj brzini u trajanju od približno 15 minuta na sobnoj temperaturi i supernatant je uklonjen odmah nakon centrifugiranja sa pipetom.
[0176] Količina od 70% etanola je dodata kako bi se isprao pelet i opet je obrtana pri punoj brzini u trajanju od 1 minuta. Etanol je zatim uklonjen i rastvor je obrtan opet kako bi se uklonili tragovi etanola. Količina TE/EB pufera je dodata u svaku epruvetu i pelet je pažljivo rastvoren pipetom. Rastvor je čuvan na -20 °C ukoliko nije odmah korišćen.
Proizvodnja P0 količina rekombinantnog bakulovirusa
[0177] Sf9 ćelije su zasejane pri približno 1 x 10<6>ćelija/udubljenju u ploči sa 6 udubljenja (ili 6 x 10<6>ćelija u 10-cm ploči ili 1,7 x 10<7>ćelija u 15-cm sudu) i ćelije su ostavljene da se povežu bar 1 sat pre transfekcije.
[0178] Transfekcioni rastvori A i B su pripremljeni kao što sledi: Rastvor A: količina Bacmida je rastvorena u količini medijuma bez seruma i antibiotika u epruveti od 15-mL. Rastvor B: količina CellFectin je rastvorena u količini medijuma bez seruma i antibiotika u epruveti od 15 mL. Rastvor B je dodat u Rastvor A i blago je mešan pipetom približno 3 puta i inkubiran na sobnoj temperaturi u trajanju od 30 ∼ 45 minuta. Zatim, medijum iz ploča je aspirisan i količina medijuma bez seruma i antibiotika je dodata za ispiranje ćelija. Količina SF900II bez antibiotika je dodata u svaku epruvetu koja je sadržala lipid-DNK smeše.
[0179] Medijum iz kojeg su ćelije aspirisane, transfekcioni rastvor je dodat u ćelije i ćelije su inkubirane u trajanju od približno 5 sati pri 28 °C. Transfekcioni rastvor je uklonjen i količina medijuma bez seruma antibiotici je dodata i inkubiran je približno 4 dana pri 28 °C.
Medijum koji je sadržao rekombinantni bakulovirus je sakupljen i obrtan u trajanju od približno 5 minuta pri 1000 rpm kako bi se uklonio ćelijski talog. Bakulovirus je čuvan pri 4 °C u mraku.
Pojačavanje bakulovirusa (PI)
[0180] Sf9 ćelije su gajene do približno 4 x 10<6>ćelija/mL i razblažene su do približno 2 x 10<6>ćelija/mL sa svežim medijumom u bocama za drmanje. Količina Sf9 ćelija je inficirana sa količinom P0 bakulovirusa. Multiplicitet infekcije (MOI) je bio približno 0,1.
[0181] Sf9 ćelije su inkubirane u trajanju od približno 3 dana i bakulovirus je sakupljen. Ćelije su obrtane pri 2.000 rpb u trajanju od 5 minuta kako bi se stvorio ćelijski pelet i supernatant je sakupljen i čuvan pri 4 °C u mraku. Titar bakulovirusa je određen u skladu sa Clontech protokolom za brzi titarski komplet.
Proizvodnja AAV upotrebom P1 rekombinantnih bakulovirusa
[0182] Sf9 ćelije su gajene do oko 1 x 10<7>ćelija/mL i razblažene do oko 5 x 10<6>ćelija/mL. Količina razblaženih Sf9 ćelija je inficirana sa Bac-vektorom (5Moi) i Bac-pomoćnikom (15Moi) u trajanju od 3 dana. Ćelijska održivost je procenjena trećeg dana (primećeno je približno 50% ∼ 70% mrtvih ćelija).
[0183] Ćelijski pelet je sakupljen centrifugiranjem pri 3000 rpm u trajanju od 10 minuta. Medijum je uklonjen i ćelije su lizirane (ili je ćelijski pelet čuvan na - 20 °C ukoliko nije korišćen odmah).
Liza i protokol vezivanja
[0184] Količina Sf9 pufera za lizu plus benzonata je dodata u svaki ćelijski pelet i mešana kako bi se ćelije resuspendovale. Resuspendovane Sf9 ćelije su inkubirane na ledu u trajanju od približno 10 min. kako bi se lizat ohladio. Lizat je sonifikovan u trajanju od približno 20 sekundi kako bi se ćelije dobro lizirale i zatim je inkubiran pri 37 °C u trajanju od približno 30 minuta.
[0185] Količina od 5M NaCl je dodata i smeša je mešana i zatim inkubirana dodatnih 30 minuta pri 37 °C. Količina NaCl je dodata kako bi se koncentracija soli dovela do 500 nM, mešana i centrifugirana pri 8.000 rpm u trajanju od 20 minuta pri 15 °C kako bi se proizveo očišćeni lizat.
[0186] Očišćeni lizat je podvrgnut koracima ultracentrifugiranja. CsCl gradijent je pripremljen dodavanjem prečišćenog lizata prvo, zatim količine od 1,32 g/cc i količine od 1,55 g/cc CsCl rastvora kroz špric sa dugom iglom. Površina između CsCl rastvora je obeležena. PBS je dodat do vrha epruveta za centrifugiranje i epruvete su pažljivo uravnotežene i zatvorene.
[0187] Epruvete su centrifugirane pri 55.000 rpm u trajanju od približno 20 sati pri 15 °C. Rupa je probušena na vrhu svake epruvete i AAV traka koja se nalazila malo iznad oznake za površinu dva CsCl rastvora je označena.
[0188] Drugo CsCl centrifugiranje je sprovedeno prenošenjem AAV rastvora u epruvetu za centrifugiranje 70,1 Ti rotor i količina CsCl rastvora skoro do vrha epruvete je dodata.
Epruvete su uravnotežene i zatvorene. Epruvete su centrifugirane pri 65.000 u trajanju od približno 20 sati i AAV traka (donja traka, gornja traka su prazni kapsidi) je sakupljena.
Primer 5
Procena konstrukata kod Rag2 miševa
[0189] AAV genomi koja sadrže SQ FVIII kodirajuću gensku sekvencu optimizovanu za kodon su stvoreni bakulovirusom i 293 ćelijama upotrebom UCL SQ, Proto 1, Proto S1, Proto S2 i Proto S3 konstrukata. Granice pakovanja su bile 4800 bp za bakulovirus i 4950 za 293 ćelije.
[0190] Kao što je prikazano na Slici 5, Proto 1 sa skraćenim ili genomima koji nisu skraćeni vrši transdukciju FVIII slično kao UCL SQ konstrukt. AAV5.2 proizveden iz bakulovirusa i 293T ćelijskih lizata kao što je mereno na 4-12% Bis-Tris gelu. Svaki uzorak je ispoljio VP1, VP2 i VP3 proteina, kao što je prikazano na Slici 6. Genomska DNK iz AAV uzoraka je puštena na 0,8% alkalnim agaroza gelovima, kao što je prikazano na Slici 7.
[0191] Transdukcija Proto 1 je bila slična UCL SQ konstruktima kada su ovi AAV napravljeni bakulovirusnim sistemom. Obuhvatanje introna koji je sadržao Proto 2S i 3S nije vršilo bolju transdukciju od Proto 1. UCL SQ vektor koji je sadržao AAV oblikujuće sekvence napravljene u 293 ćelijama je bio potentniji od UCL SQ koji nije imao AAV sekvence napravljene u bakulovirusu. Kao rezultat, dodatni pojačivači su dodati u Proto 1, npr., konstrukt 101, 102, 102 i 104, u pokušaju da se poveća potentnost.
Primer 6
Ispoljavanje i aktivnost AAV FVIII vektora sa poboljšanim promoter/pojačivač sekvencama
[0192] Ispoljavanje i aktivnost AAV vektora koji sadrže konstrukte od 99 do 106 su testirani protokolom hidrodinamičke injekcije. Hidrodinamička isporuka je brza metoda za prikaz promotera u jetri in vivo. AAV plazmidna DNK je stvorena metodama opisanim u Primeru 5 i zatim je razblažena u TransIT-QR hidrodinamičkom rastvoru za isporuku. Plazmidna DNK je injektirana u repnu venu C57B1/6 miševa koji su bili stari 5-6 nedelja (18-25 g) pri zapremini određenog sa (masa miša (g)/10) = 0,1 ml rastvor za isporuku). Vreme injektiranja je bilo manje od 5 sekundi. Plazma iz svakog miša je sakupljena 48 sati nakon injektiranja i količina ispoljenog FVIII antigena je izmerena ELISA analizom.
[0193] Povećane doze Proto 1 plazmida (2,5, 5, 12,5 i 50 µg) su injektirane u repne vene miševa. Količina FVIII u plazmi injektiranih miševa je izmerena ELISA testom i rekombinantni FVIII (Xyntha SQ ekvivalenti) i korišćena kao standard za poređenje.
[0194] Za ispitivanje ispoljavanja poboljšanih promoter/pojačivač elemenata konstrukta p100-400, konstrukta 100(p100), konstrukta FVIII-BMN001 (pFVIII-BMN001), Proto 1, konstrukta 100AT (p100-AT), konstrukta 100 bGH poli A (p100-bGHPA), konstrukta 101 (p101) i konstrukta 104 (p104). Kao što je prikazano na Slici 8, svi konstrukti su proizveli funkcionalni FVIII pri različitim nivoima efikasnosti.
[0195] Slike 9 i 10 pružaju podatke za injekciju od 1 µg plazmida različitih konstrukata. Kao što je prikazano na Slici 8, injektiranje konstrukta FVIII-BMN001, konstrukta FVIII-BMN002, konstrukta 102 (p102), konstrukta 103 (p103) i konstrukta 104 (p104) je rezultat dalo ispoljavanje bar 20 ng FVIII kod 5 od 10 miševa. Kao što je prikazano na Slici 9, injektiranje konstrukta FVIII-BMN001, konstrukta 103 (p103), konstrukta 103-AT (p103-AT; 398 bp hAAT promoter), konstrukta 100 (p100), konstrukta 100AT (p100-AT; 398 bp hAAT promoter) je rezultat dalo ispoljavanje bar 100 ng/ml FVIII kod 5 od 10 miševa.
4
4
�
4
�
�
4
�
2
4
�
�
�
�
2
�
1
�
�
�
2
�
�
11
��
�
��
1
�
�
1
�
11
11
11
11
11
11
11
12
12
��
12
��
��
12
�
11
��
1
��
�
1
�
�
1
��
��
14
��
14
��
��
1
11
��
1
��
�
1
�
�
�
1
11
��
1
��
�
1
�
�
1
�
11
12
�
��
1
�
�
�

Claims (10)

Patentni zahtevi
1. Adeno-asocirani virus (AAV) Faktor VIII (FVIII) vektor koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 ili SEQ ID NO: 4, gde je navedeni AAV FVIII vektor kraći od 5,0 kb.
2. Metoda za proizvodnju rekombinantne adeno-asocirane virusne (AAV) čestice koja obuhvata
A) kultivisanje ćelije koja je transfektovana sa AAV FVIII vektorom prema patentnom zahtevu 1; i
B) dobijanje rekombinantne AAV čestice iz supernatanta transfektovane ćelije.
3. Metoda prema patentnom zahtevu 2, gde je navedena ćelija ćelija insekta.
4. Metoda prema patentnom zahtevu 3, gde je ćelija insekta SF9 ćelija.
5. Metoda prema bilo kom od patentnih zahteva 2-4, gde se transfekcija navedene ćelija koja je transfektovana sa AAV FVIII vektorom uspostavlja inficiranjem navedene ćelije bakulovirusom koji sadrži navedeni AAV FVIII vektor.
6. Metoda prema bilo kom od patentnih zahteva 2-5, gde je transfekcija navedene ćelije koja je transfektovana sa AAV FVIII vektorom ko-transfekcija sa drugim vektorom koji sadrži AAV i cap gene.
7. AAV virusna čestica koja sadrži AAV FVIII vektor prema patentnom zahtevu 1.
8. AAV virusna čestica prema patentnom zahtevu 7, gde AAV virusna čestica sadrži AAV-5 kapsid protein.
9. Izolovana ćelija koja sadrži AAV FVIII vektor prema patentnom zahtevu 1.
10. Sastav koji sadrži AAV FVIII vektor prema patentnom zahtevu 1 ili AAV virusna čestica prema patentnom zahtevu 7 ili 8 za upotrebu pri tretiranju hemofilije A.
RS20201018A 2013-09-12 2014-09-10 Aav vektori koji sadrže gen koji kodira faktor viii RS61039B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361877042P 2013-09-12 2013-09-12
EP14771729.2A EP3044231B1 (en) 2013-09-12 2014-09-10 Aav vectors comprising a gene encoding factor viii
PCT/US2014/054960 WO2015038625A1 (en) 2013-09-12 2014-09-10 Adeno-associated virus factor viii vectors

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS61039B1 true RS61039B1 (sr) 2020-12-31

Family

ID=51585244

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20201018A RS61039B1 (sr) 2013-09-12 2014-09-10 Aav vektori koji sadrže gen koji kodira faktor viii

Country Status (34)

Country Link
US (6) US9504762B2 (sr)
EP (2) EP3044231B1 (sr)
JP (5) JP6735672B2 (sr)
KR (2) KR102484396B1 (sr)
CN (2) CN112538501A (sr)
AR (1) AR097657A1 (sr)
AU (1) AU2014318890B2 (sr)
CA (2) CA3178384A1 (sr)
CL (1) CL2016000502A1 (sr)
CY (2) CY1124213T1 (sr)
DK (1) DK3044231T3 (sr)
ES (1) ES2813698T3 (sr)
FI (1) FIC20230007I1 (sr)
FR (1) FR23C1007I2 (sr)
HR (1) HRP20201324T1 (sr)
HU (2) HUE050484T2 (sr)
IL (2) IL244404B (sr)
LT (2) LT3044231T (sr)
LU (1) LUC00298I2 (sr)
MX (2) MX386802B (sr)
NL (1) NL301222I2 (sr)
NO (1) NO2023003I1 (sr)
NZ (1) NZ716549A (sr)
PE (1) PE20160769A1 (sr)
PH (1) PH12016500328A1 (sr)
PL (1) PL3044231T3 (sr)
PT (1) PT3044231T (sr)
RS (1) RS61039B1 (sr)
RU (1) RU2710307C2 (sr)
SG (1) SG11201601932UA (sr)
SI (1) SI3044231T1 (sr)
SM (1) SMT202000458T1 (sr)
TW (1) TWI632239B (sr)
WO (1) WO2015038625A1 (sr)

Families Citing this family (61)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201210357D0 (en) 2012-06-12 2012-07-25 Ucl Business Plc Factor VIII sequences
RS61039B1 (sr) 2013-09-12 2020-12-31 Biomarin Pharm Inc Aav vektori koji sadrže gen koji kodira faktor viii
EP3160478A4 (en) 2014-06-30 2018-05-16 Bioverativ Therapeutics Inc. Optimized factor ix gene
SG11201703148TA (en) 2014-11-05 2017-05-30 Voyager Therapeutics Inc Aadc polynucleotides for the treatment of parkinson's disease
GB201420139D0 (en) 2014-11-12 2014-12-24 Ucl Business Plc Factor IX gene therapy
EP3270944B1 (en) * 2015-03-17 2019-10-23 Vrije Universiteit Brussel Optimized liver-specific expression systems for fviii and fix
TWI707951B (zh) * 2015-04-08 2020-10-21 美商健臻公司 過大腺相關載體之製造
CN115074366A (zh) * 2015-04-16 2022-09-20 埃默里大学 用于肝脏中蛋白质表达的重组启动子和载体及其用途
RU2742352C2 (ru) 2015-09-24 2021-02-05 Байомарин Фармасьютикал Инк. Векторы фактора fviii на основе аденоассоциированных вирусов, соответствующие вирусные частицы и содержащие их терапевтические композиции
CA3002524A1 (en) * 2015-10-28 2017-05-04 Sangamo Therapeutics, Inc. Liver-specific constructs, factor viii expression cassettes and methods of use thereof
PE20231949A1 (es) * 2015-10-30 2023-12-05 Spark Therapeutics Inc VARIANTES DEL FACTOR VIII REDUCIDO CON CpG, COMPOSICIONES Y METODOS Y USOS PARA EL TRATAMIENTO DE TRASTORNOS DE LA HEMOSTASIA
EA202092049A1 (ru) * 2015-11-13 2020-11-10 Баксалта Инкорпорейтед Вирусные векторы, кодирующие рекомбинантные варианты fviii с повышенной экспрессией для генной терапии гемофилии a
EP3374387A1 (en) 2015-11-13 2018-09-19 Baxalta Incorporated Viral vectors encoding recombinant fviii variants with increased expression for gene therapy of hemophilia a
KR102450833B1 (ko) * 2016-04-15 2022-10-05 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실베니아 혈우병 a 치료용 유전자 요법
AU2017269371B2 (en) 2016-05-25 2021-08-05 Lonza Houston Inc. Methods for isolating adeno-associated virus using a polydiallyldialkylammonium salt
PE20190401A1 (es) 2016-07-26 2019-03-13 Biomarin Pharm Inc Novedosas proteinas de la capside del virus adenoasociado
JOP20190269A1 (ar) 2017-06-15 2019-11-20 Voyager Therapeutics Inc بولي نوكليوتيدات aadc لعلاج مرض باركنسون
AU2018312565A1 (en) * 2017-08-01 2020-02-27 Spark Therapeutics, Inc. Factor VIII (FVIII) gene therapy methods
BR112020022722A8 (pt) 2018-05-09 2022-01-18 Biomarin Pharm Inc Genoma e seu uso, vetor, partícula, molécula de ácido nucleico isolada, ácido nucleico, composição, tratamento, método
US20200069819A1 (en) 2018-05-14 2020-03-05 Biomarin Pharmaceutical Inc. Stable expression of aav vectors in juvenile subjects
TW202005978A (zh) 2018-05-14 2020-02-01 美商拜奧馬林製藥公司 新穎肝靶向腺相關病毒載體
SG11202011296VA (en) 2018-05-15 2020-12-30 Voyager Therapeutics Inc Compositions and methods for the treatment of parkinson's disease
EP3823985A1 (en) 2018-07-16 2021-05-26 Baxalta Incorporated Gene therapy of hemophilia a using viral vectors encoding recombinant fviii variants with increased expression
EP3799569A1 (en) * 2018-07-27 2021-04-07 Zentrum für Forschungsförderung in der Pädiatrie GmbH Improved concepts for the treatment of genetic disorders with high-capacity plal-generated gold nanoparticles
WO2020028830A1 (en) 2018-08-03 2020-02-06 Sangamo Therapeutics, Inc. Improved clinical parameters by expression of factor viii
WO2020033863A1 (en) 2018-08-09 2020-02-13 Bioverativ Therapeutics Inc. Nucleic acid molecules and uses thereof for non-viral gene therapy
GB201813528D0 (en) 2018-08-20 2018-10-03 Ucl Business Plc Factor IX encoding nucleotides
US10842885B2 (en) 2018-08-20 2020-11-24 Ucl Business Ltd Factor IX encoding nucleotides
US12281321B2 (en) 2018-09-28 2025-04-22 Voyager Therapeutics, Inc. Frataxin expression constructs having engineered promoters and methods of use thereof
EP4461814A3 (en) * 2018-10-12 2025-02-26 Genzyme Corporation Generation of improved human pah for treatment of severe pku by liver-directed gene replacement therapy
TWI851647B (zh) 2019-01-16 2024-08-11 日商武田藥品工業股份有限公司 用於a型血友病基因治療之編碼表現增加之重組fviii變異體的病毒載體
US11529427B2 (en) 2019-02-15 2022-12-20 Crispr Therapeutics Ag Gene editing for hemophilia A with improved factor VIII expression
WO2020186207A2 (en) 2019-03-13 2020-09-17 Generation Bio Co. Non-viral dna vectors and uses thereof for expressing fviii therapeutics
JP7803014B2 (ja) 2019-09-30 2026-01-21 バイオベラティブ セラピューティクス インコーポレイテッド レンチウイルスベクター製剤
JP6831943B1 (ja) 2019-10-24 2021-02-17 三ツ星ベルト株式会社 摩擦伝動ベルトおよびその製造方法
EP4051704A2 (en) * 2019-11-01 2022-09-07 Freeline Therapeutics Limited Factor viii construct
CN114829391A (zh) * 2019-11-14 2022-07-29 生物马林药物股份有限公司 用肝特异性基因疗法载体治疗遗传性血管性水肿
WO2021113800A1 (en) * 2019-12-06 2021-06-10 The Children's Hospital Of Philadelphia Compositions and methods for modulating factor viii function
EP4073106A2 (en) 2019-12-12 2022-10-19 Takeda Pharmaceutical Company Limited Gene therapy of hemophilia a using viral vectors encoding recombinant fviii variants with increased expression
WO2021236908A2 (en) 2020-05-20 2021-11-25 Biomarin Pharmaceutical Inc. Use of regulatory proteins for the production of adeno-associated virus
US12173307B2 (en) 2020-06-24 2024-12-24 Bioverativ Therapeutics Inc. Methods for the purification of viral vectors
US20230407328A1 (en) 2020-11-02 2023-12-21 Biomarin Pharmaceutical Inc. Process for enriching adeno-associated virus
IL303317A (en) * 2020-12-01 2023-07-01 Akouos Inc ANTI-NATURAL ANTIBODY STRUCTURES AND RELATED METHODS FOR THE TREATMENT OF SYMPTOMS ASSOCIATED WITH VESTIBULAR SWANNOMA
US20240066146A1 (en) * 2020-12-18 2024-02-29 Sangamo Therapeutics, Inc. Improved pharmaceutical compositions containing adeno-associated viral vector
EP4355768A1 (en) 2021-06-14 2024-04-24 Takeda Pharmaceutical Company Limited Gene therapy of hemophilia a using viral vectors encoding recombinant fviii variants with increased expression
MX2023015329A (es) * 2021-06-22 2024-01-23 Pfizer Produccion de vector de virus adeno-asociado en celulas de insecto.
CA3227296A1 (en) * 2021-07-28 2023-02-02 Tomas Cinek Large scale adeno-associated virus production systems
CA3229323A1 (en) * 2021-08-23 2023-03-02 Ajay MAGHODIA Optimized factor viii genes
WO2023036054A2 (en) * 2021-09-08 2023-03-16 Inspirar Limited Composition and method for treating hemophilia
JP2025504404A (ja) 2022-01-14 2025-02-12 アンジャリウム バイオサイエンシズ エージー Ｖｉｉｉ因子をコードするｄｎａ分子の組成物、それを作製する方法、及びその使用方法
US20230374546A1 (en) * 2022-03-11 2023-11-23 Homology Medicines, Inc. Bidirectional dual promoter expression vectors and uses thereof
WO2023205300A2 (en) * 2022-04-20 2023-10-26 Asklepios Biopharmaceutical, Inc. Therapeutic adeno-associated virus using codon optimized nucleic acid encoding factor viii
KR20250108100A (ko) 2022-09-22 2025-07-15 디나코 아게 Aav 유전자 치료법 벡터를 이용한 심근병증의 치료
UY40442A (es) 2022-09-22 2024-02-15 Biomarin Pharm Inc Tratamiento de la miocardiopatía arritmogénica con vectores de genoterapia con aav
CN115948408A (zh) * 2022-09-23 2023-04-11 上海信致医药科技有限公司 改进的人凝血因子viii基因表达盒及其应用
JP2025534900A (ja) * 2022-10-08 2025-10-21 リンイ バイオテック カンパニー リミテッド 遺伝子発現を増強するためのコンストラクト
CN116555266B (zh) * 2023-06-09 2024-11-12 呈诺再生医学科技(北京)有限公司 肝脏特异性表达的重组启动子和载体及其在肝脏相关疾病治疗中的应用
TW202517669A (zh) 2023-07-05 2025-05-01 日商武田藥品工業股份有限公司 用於Ａ型血友病之基因療法的編碼表現增加之重組ＦＶｌｌｌ變異體的病毒載體
WO2025214477A1 (en) 2024-04-12 2025-10-16 Skyline Therapeutics (Shanghai) Co., Ltd. Treatment of genetic cardiomyopathies with aav gene therapy vectors
CN118064436B (zh) * 2024-04-18 2024-07-26 上海凌医生物科技有限公司 一种增强基因表达的嵌合启动子
WO2025239324A1 (ja) * 2024-05-13 2025-11-20 中外製薬株式会社 遺伝子改変非ヒト動物

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4745051A (en) 1983-05-27 1988-05-17 The Texas A&M University System Method for producing a recombinant baculovirus expression vector
IE58011B1 (en) 1983-05-27 1993-06-16 Texas A & M Univ Sys Method for producing a recombinant baculovirus expression vector
ZA848495B (en) 1984-01-31 1985-09-25 Idaho Res Found Production of polypeptides in insect cells
BR9405507A (pt) * 1993-07-13 1999-05-25 Rhone Poulenc Rorer Sa Adenovirus recombinante defeituoso linhagem celular e composição farmaceutica
US6204059B1 (en) 1994-06-30 2001-03-20 University Of Pittsburgh AAV capsid vehicles for molecular transfer
US6521225B1 (en) 1996-09-06 2003-02-18 Chiron Corporation AAV vectors
US6383794B1 (en) * 1998-08-24 2002-05-07 Uab Research Foundation Methods of producing high titer recombinant adeno-associated virus
US6221349B1 (en) 1998-10-20 2001-04-24 Avigen, Inc. Adeno-associated vectors for expression of factor VIII by target cells
US6200560B1 (en) 1998-10-20 2001-03-13 Avigen, Inc. Adeno-associated virus vectors for expression of factor VIII by target cells
US6723551B2 (en) 2001-11-09 2004-04-20 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of adeno-associated virus in insect cells
WO2003074714A1 (en) 2002-03-05 2003-09-12 Stichting Voor De Technische Wetenschappen Baculovirus expression system
EP1804839B1 (en) 2004-09-22 2012-03-14 St. Jude Children's Research Hospital Improved expression of factor ix in gene therapy vectors
CN1286981C (zh) * 2004-11-30 2006-11-29 华中科技大学同济医学院附属同济医院 表达人类cyp2j2反义基因的重组腺相关病毒及其制备方法
EP1739179A1 (en) * 2005-06-30 2007-01-03 Octapharma AG Serum-free stable transfection and production of recombinant human proteins in human cell lines
US7943374B2 (en) 2005-08-21 2011-05-17 Markus Hildinger Super-size adeno-associated viral vector harboring a recombinant genome larger than 5.7 kb
US7943379B2 (en) 2008-04-30 2011-05-17 Nationwide Children's Hospital, Inc. Production of rAAV in vero cells using particular adenovirus helpers
GB0911870D0 (en) 2009-07-08 2009-08-19 Ucl Business Plc Optimised coding sequence and promoter
CA2851057A1 (en) * 2011-10-18 2013-04-25 Csl Behring Gmbh Combined use of a sulfated glycosaminoglycan and a hyaluronidase for improving the bioavailability of factor viii
CN103215308B (zh) * 2013-02-01 2015-12-23 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 表达重组人fviii的整合质粒、细胞株及其构建方法和应用
RS61039B1 (sr) * 2013-09-12 2020-12-31 Biomarin Pharm Inc Aav vektori koji sadrže gen koji kodira faktor viii

Also Published As

Publication number Publication date
PH12016500328A1 (en) 2016-05-02
NL301222I2 (nl) 2023-10-19
KR102484396B1 (ko) 2023-01-04
IL244404B (en) 2021-10-31
CY2023006I1 (el) 2023-06-09
MX386802B (es) 2025-03-19
WO2015038625A1 (en) 2015-03-19
KR20230006058A (ko) 2023-01-10
US20200101140A1 (en) 2020-04-02
SI3044231T1 (sl) 2020-12-31
ES2813698T3 (es) 2021-03-24
MX2021012014A (es) 2021-10-22
HRP20201324T1 (hr) 2020-11-27
FR23C1007I2 (fr) 2024-06-14
JP2023133597A (ja) 2023-09-22
EP3770169A1 (en) 2021-01-27
BR112016005576A2 (pt) 2017-09-12
US20220339262A1 (en) 2022-10-27
MX2016003262A (es) 2016-09-29
CY2023006I2 (el) 2023-11-15
RU2019141647A (ru) 2020-01-27
HUS2300003I1 (hu) 2023-01-28
ES2813698T8 (es) 2022-01-26
DK3044231T3 (da) 2020-09-07
CA3178384A1 (en) 2015-03-19
US20170095538A1 (en) 2017-04-06
EP3044231B1 (en) 2020-08-05
US10463718B2 (en) 2019-11-05
NL301222I1 (sr) 2023-03-01
CA2921232A1 (en) 2015-03-19
CL2016000502A1 (es) 2016-10-21
JP2025113388A (ja) 2025-08-01
PT3044231T (pt) 2020-08-27
TW201546285A (zh) 2015-12-16
SG11201601932UA (en) 2016-04-28
RU2016113702A (ru) 2017-10-17
CY1124213T1 (el) 2022-03-24
KR20160049015A (ko) 2016-05-04
PE20160769A1 (es) 2016-08-12
IL244404A0 (en) 2016-04-21
AR097657A1 (es) 2016-04-06
JP2021072871A (ja) 2021-05-13
JP7523211B2 (ja) 2024-07-26
US12239692B2 (en) 2025-03-04
LTPA2023508I1 (sr) 2023-04-11
CN105636981A (zh) 2016-06-01
EP3044231A1 (en) 2016-07-20
AU2014318890A1 (en) 2016-02-25
FR23C1007I1 (fr) 2023-03-24
LTC3044231I2 (sr) 2025-04-10
US20250332224A1 (en) 2025-10-30
US20180161403A1 (en) 2018-06-14
CA3178379A1 (en) 2015-03-19
PL3044231T3 (pl) 2021-01-11
RU2019141647A3 (sr) 2020-05-18
HK1226416A1 (en) 2017-09-29
US11406690B2 (en) 2022-08-09
JP2016534739A (ja) 2016-11-10
LT3044231T (lt) 2020-11-10
NO2023003I1 (no) 2023-01-12
FIC20230007I1 (fi) 2023-02-08
AU2014318890B2 (en) 2019-03-07
IL286859A (en) 2021-10-31
US9504762B2 (en) 2016-11-29
TWI632239B (zh) 2018-08-11
HUE050484T2 (hu) 2020-12-28
CA2921232C (en) 2023-03-14
JP2019193675A (ja) 2019-11-07
SMT202000458T1 (it) 2020-11-10
BR112016005576A8 (pt) 2022-10-18
CN105636981B (zh) 2020-11-06
NZ716549A (en) 2022-10-28
CN112538501A (zh) 2021-03-23
US20150071883A1 (en) 2015-03-12
RU2710307C2 (ru) 2019-12-26
JP6735672B2 (ja) 2020-08-05
LUC00298I2 (sr) 2025-09-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12239692B2 (en) Adeno-associated virus factor VIII vectors
US20240058423A1 (en) Adeno-Associated Virus Factor VIII Vectors, Associated Viral Particles and Therapeutic Formulations Comprising the Same
AU2017301600B2 (en) Novel adeno-associated virus capsid proteins
CN112424217A (zh) 肝脏靶向的腺病毒相关病毒载体
JP2010538675A (ja) タンパク質産生の改善のためのａａｖ複製機構の使用
WO2022187473A2 (en) Controlled expression of viral proteins
CA3247763A1 (en) OPTIMIZED RECOMINATING MECP2 CASSETTES AND TREATMENT METHODS FOR RET SYNDROME AND RELATED DISORDERS
CA3178379C (en) Adeno-associated virus factor viii vectors
HK40043433A (en) Adeno-associated virus factor viii vectors
HK1226416B (en) Aav vectors comprising a gene encoding factor viii
BR112016005576B1 (pt) Vetor de fator viii de vírus adeno-associado, partícula de vírus adeno-associado recombinante, partícula viral, uso do referido vetor ou da referida partícula viral para o tratamento de hemofilia a e método para produzir uma partícula de vírus adeno-associado