RS61072B1 - Sistemi aditiva za upotrebu u pegilaciji proteina - Google Patents

Sistemi aditiva za upotrebu u pegilaciji proteina

Info

Publication number
RS61072B1
RS61072B1 RS20201382A RSP20201382A RS61072B1 RS 61072 B1 RS61072 B1 RS 61072B1 RS 20201382 A RS20201382 A RS 20201382A RS P20201382 A RSP20201382 A RS P20201382A RS 61072 B1 RS61072 B1 RS 61072B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
peg
reaction
protein
equiv
additive
Prior art date
Application number
RS20201382A
Other languages
English (en)
Inventor
Matthew R Hickey
Antonio Ramirez
Original Assignee
Bristol Myers Squibb Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bristol Myers Squibb Co filed Critical Bristol Myers Squibb Co
Publication of RS61072B1 publication Critical patent/RS61072B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/1072—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups
    • C07K1/1077—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups by covalent attachment of residues other than amino acids or peptide residues, e.g. sugars, polyols, fatty acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/64—Relaxins

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Description

Opis
OBLAST TEHNIKE PRONALASKA
[0001] Predmetno otkriće se odnosi na poboljšani sistem aditiva za upotrebu u reakciji PEGilacije proteina. Konkretno, otkriće identifikuje aditiv za reakciju konjugacije između proteina koji sadrže p-acetilfenilalanin ostatak i aminoksi-PEG jedinjenja.
STANJE TEHNIKE PRONALASKA
[0002] PEGilacija proteina je proces konjugacije koji uključuje vezivanje derivata polietilen glikola za terapijski protein radi poboljšanja njegove stabilnosti i farmakokinetike smanjenjem brzine klirensa i obezbeđivanjem steričkog štita od proteolitičkih enzima i prepoznavanja imunog sistema (Roberts, M.J. et al., Adv. Delivery Rev, 54:459 (2002)). Generalno, tehnologije PEGilacije mogu se klasifikovati u dve vrste, i to nasumične i mesto-specifične konjugacije. Nasumične PEGilacije proizvoljno povezuju PEGilacioni reagens sa reaktivnim aminokiselinama kao što su lizin ili cistein dajući smešu PEGiliranih proizvoda. Suprotno tome, konjugacije specifične za mesto koriste nedvosmislenu reaktivnost nativne funkcionalnosti (npr. N- ili C-terminalne grupe) ili neprirodne aminokiseline (npr. p-acetilfenilalanin -pAcF) za kontrolu položaja i broja PEG ostataka vezanih za protein. Reakcija konjugacije specifična za mesto koja uključuje stvaranje ketoksima između PEGilirajućeg reagensa i pAcF ostatka inkorporisana je u protein supstrata širenjem genetskog koda (Liu, C.C. et al., Annu. Rev. Biochem., 79:413 (2010); Tian, F. et al., "Ubrzivači za modifikaciju ne-prirodnih aminokiselina i polipeptida ne-prirodnih aminokiselina", američki patent br. 7,468,458 (23. decembar 2008)). Uprkos svojoj i demonstriranoj korisnosti, konjugacije zasnovane na stvaranju ketoksima trpe zbog sporosti i nepotpunih konverzija (Crisalli, P. et al., J. Org. Chem., 78: 1184 (2013)). Pokušaji da se poboljša stvaranje ketoksima uključuju upotrebu viška PEGilirajućeg reagensa, visokih temperatura ili visokih koncentracija toksičnih katalizatora. Ova rešenja, međutim, uvode dodatne korake za uklanjanje viška PEGilirajućeg reagensa ili toksičnog katalizatora iz proizvoda i često ugrožavaju stabilnost proteina. Pored toga, stare metode ne koriste aditive, koriste sredstvo za denaturaciju (ureu) i/ili koriste acetilhidrazid (AcNHNH2) kao aditiv. AcNHNH2i srodne strukture definisane su u PCT publikaciji br. WO 2007/056448.
[0003] Ono što je sada potrebno u struci su nove metode za poboljšanje prinosa i brzine PEGilacije proteina (Relaksin i FGF21) koji sadrže pAcF ostatak ispitivanjem mehaničkih principa koji utiču na zastoj i identifikovanjem novih aditiva koji ubrzavaju reakciju i promovišu visoke konverzije pri niskim molarnim odnosima PEG: protein. Metode treba da budu ekonomične, da promovišu veće konverzije sa znatno manjim količinama PEGilacionog reagensa, da promovišu brže reakcije koje zaobilaze potrebu za visokim reakcionim temperaturama i uklanjanje genotoksičnog materijala.
SAŽETAK
[0004] U prvom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na poboljšani sistem aditiva za reakciju PEGilacije proteina, pri čemu navedeni sistem obuhvata hidrazid p-aminobenzoeve kiseline u kombinaciji sa aromatičnim aminom ili amonijumovom soli, pri čemu je navedeni aromatični amin izabran iz grupe koja se sastoji od 3,5-diaminobenzoeve kiseline, o-fenilendiamina, 1-piridin-2-iletilamina, 2-(dimetilamino)etilhidrazina, m-fenilendiamina i 2-pikolilamina, i pri čemu je navedena amonijumova so odabrana iz grupe koja se sastoji od amonijum acetata i amonijum hlorida.
[0005] U drugom aspektu, pronalazak se odnosi na upotrebu poboljšanog sistema aditiva za reakciju PEGilacije proteina stvaranjem ketoksima, pri čemu pomenuti sistem sadrži hidrazid paminobenzoeve kiseline sam ili u kombinaciji sa aromatičnim aminima ili amonijumovim solima.
[0006] U trećem aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na proces za dobijanje PEGiliranog proteina, pri čemu pomenuti proces obuhvata korake: (a) identifikacije proteina, PEG reagensa i aditivnog sistema; (b) solubilizacije proteina praćeno kombinovanjem proteina sa PEG reagensom u prisustvu sistema aditiva, (c) reakcije proteina sa PEG reagensom da bi se dobio PEGilirani protein sa visokim prinosom,
pri čemu navedeni sistem aditiva uključuje hidrazid p-aminobenzoeve kiseline i pri čemu je navedeni PEG reagens odabran iz grupe koja se sastoji od PEG-OA i drugih PEG derivata sa aminoksi grupom.
KRATAK OPIS SLIKA
[0007]
Slika 1: Opšti mehanizam za stvaranje ketoksima.
Slika 2: Hromatogram za PEGilaciju Relaksina (4 mg/ml u vodi) sa PEG-OA reagensom od 20 kDa.
Slika 3: Vremenski tok razgradnje PEG-OA od 20 kDa u vodi kada je izložen neprekidnoj struji vazduha.
Slika 4: Studija stabilnosti acetil hidrazida korišćenjem in situ IR i<1>H NMR spektra. Slika 5: Model reakcija za proveravanje aditiva. Reakcioni uslovi: 1 (3,6 mmol) i 2 (3,6 mmol) u 1,0 mL acetatnog pufera (20 mM, pH 4,0) na sobnoj temperaturi (23 °C).
Slika 6: Relativne brzine (krel) primećene za različite aditive. Hidrazid sirćetne kiseline (krel≈2) je prikazan uokvireno.
Slika 7: Vremenski tok reakcije dipeptida 1 sa O-benzilhidroksilaminom (2) u prisustvu (a) 1 ekviv pirazolamina (crvena); (b) 1 ekviv MCH (plava); (c) 1 ekviv pirazolamina i 1 ekviv MCH (zelena). Profil reakcije dobijen u odsustvu aditiva prikazan je sivom bojom.
Slika 8: Aromatični region<1>H NMR spektra uzoraka koji sadrže dipeptid 1 (a) (plava) sa (b) 1 ekviv MCH (zelena); (c) 1 ekviv MCH i 1 ekviv pirazol-amina (siva); (d) 1 ekviv pirazol-amina (crvena). Sinergistički efekat između MCH i pirazolaminskih aditiva daje smeše sa većom koncentracijom aktivnih intermedijera u odnosu na uzorke koji sadrže samo jedan aditiv.
Slika 9: Levo: PEGilacija dipeptida 1 sa 30 ekviv PABH i 1,2 ekviv PEG-OA od 20 kDa; hidrazonski intermedijer se prati kao zelene tačke. Desno: Reakcija PEGilacije u kojoj je dodato 1,2 ekviv PEGilirajućeg reagensa nakon uravnoteženja dipeptida sa 30 ekviv PABH preko noći.
Slika 10: Levo: Grafikon koncentracije hidrazona u odnosu na ekvivalente PABH za PEGilaciju dipeptida 1; plave tačke označavaju reakcionu smešu u kojoj je izostavljen pirazolamin. Centar: Efekat različitih kombinacija PABH i pirazolamina na brzine reakcije. Desno: Konačna koncentracija dipeptida 1 i njegovog hidrazonskog derivata u reakcionim smešama koje sadrže PABH i pirazolamin.
Slika 11: Grafikon preostalog dipeptida 1 na kraju reakcije, naspram ukupnih ekvivalenata aditiva i odnosa pirazolamin: PABH.
Slika 12: Levo: Vremenski tok reakcije Relaksina sa PEG-OA od 20 kDa (1,5 ekviv) u prisustvu (a) 30 ekviv acetil hidrazida (plava); (b) 30 ekviv MCH (crvena); profil reakcije dobijen u odsustvu aditiva prikazan je sivom bojom. Centar: Vremenski tok reakcije Relaksina sa PEG-OA (1,5 ekviv) u prisustvu (a) 30 ekviv pirazolamina (plava); (b) 30 ekviv MCH (crvena); (c) 10 ekviv MCH (ljubičasta); (d) 30 ekviv pirazolamina i 10 ekviv MCH (zelena); (e) 30 ekviv MCH i 30 ekviv pirazolamina. Desno: Vremenski tok reakcije Relaksina sa PEG-OA (1,5 ekviv) u prisustvu 30 ekviv pirazolamina i 10 ekviv MCH na (a) 40 °C; (b) 10 °C; (c) 25 °C.
Slika 13: Levo: Vremenski tok reakcije Relaksina sa PEG-OA od 20 kDa (1,2 ekviv) u prisustvu (a) 30 ekviv MPCH i 30 ekviv pirazolamina (zelena); (b) 30 ekviv PH i 30 ekviv pirazolamina (plava); i (c) 30 ekviv MCH i 30 ekviv pirazolamina u urei 6M (crvena). Desno: Vremenski tok reakcije Relaksina sa PEG-OA (1,2 ekviv) u prisustvu (a) 30 ekviv PH i 60 ekviv pirazolamina (plavo); (b) 30 ekviv acetil hidrazida i 60 ekviv pirazolamina (zeleno); i (c) 30 ekviv PABH i 60 ekviv pirazolamina (crvena).
Slika 14: HRMS analiza PEGilacije Relaksina ubrzane pomoću MCH na krajnjoj tački. Pik oksima se preklapa sa rezidualnim Relaksinom. Kašnjenje od 0,04 minuta za pik Relaksina nastaje usled efekta reakcionog matriksa na hromatografsko ponašanje, pre nego zbog nečistoće koja kasno eluira.
Slika 15: Levo: Vremenski tok reakcije Relaksina sa PEG-OA od 20 kDa (1,2 ekviv) u prisustvu uree 6M sa (a) 30 ekviv MCH i 30 ekviv pirazolamina (crvena); (b) 30 ekviv MCH, 30 ekviv pirazolamina i 30 ekviv NH2OH (plava). Desno: Vremenski tok za raspadanje Relaksina sa PEG-OA (1,2 ekviv) u prisustvu uree 6M sa 30 ekviv MCH i 30 ekviv pirazolamina (plava); vrh oksima (crvena) raste tokom reakcije, što sugeriše paralelno formiranje hidroksilamina iz razgradnje PEG-OA.
Slika 16: Levo: Vremenski tok reakcije Relaksina sa PEG-OA od 20 kDa (1,2 ekviv) U prisustvu 30 ekviv PABH i (a) 60 ekviv etilendiamina (siva); (b) 60 ekviv 3,5-diaminobenzoeve kiseline (zelena); (c) 60 ekviv m-fenilendiamina (plava); i 60 ekviv pirazolamina (crvena). Desno: Vremenski tok reakcije Relaksina sa PEGOA (1,2 ekviv) U prisustvu (a) 30 ekviv PABH i 60 ekviv 3,5-diaminobenzoeve kiseline (zelena); i (b) 60 ekviv PABH i 120 ekviv NH4Cl (plava).
Slika 17: Shema za preliminarno posmatranje PEGilacije.
Slika 18: Shema za PEGilaciju Relaksina i FGF21 sa različitim aminima.
Slika 19: Rezultati PEGilacije za o- i m- fenilendiamin koji ilustruju zakrivljenost grafikona ukupnog ekviv u odnosu na odnos amin: PABH u odnosu na konačnu koncentraciju FGF21. Levo: o-fenilendiamin. Desno: m-fenilendiamin.
Slika 20: Grafikoni ukupnih ekvivalenata aditiva naspram odnosa amin:PABH i konverzije za PEGilacije primenom PABH i 3,5-diaminobenzoeve kiseline. Levo: FGF21 sa PEG-OA od 30 kDa. Desno: Relaksin sa PEG-OA od 20 kDa.
Slika 21: Levo: Vremenski tok reakcije Relaksina sa PEG-OA od 20 kDa (1,2 ekviv) u prisustvu 120 ekviv Soli i 60 ekviv PABH katalizatora korišćenjem (a) uree 6 M (zelena); (b) NH4CI (siva); i (c) (NH4)2SO4.
Slika 22: Vremenski tok reakcije Relakina sa PEG-OA od 20 kDa (1,2 ekviv) u odsustvu aditiva (plava) i prisustvu: (a) 120 ekviv NH4Cl (crvena), (b) 60 ekviv acetilhidrazida (siva) i (c) 60 ekviv acetilhidrazida i 120 ekviv NH4Cl (zelena).
Slika 23: Levo: UV spektri Relaksina pre i posle dodavanja 120 ekviv NH4CI (plava i crvena, redom). Desno: Aminokiselinska sekvenca Relaksina naglašavajući crvenom bojom aromatične ostatke.
Slika 24: Levo: IC spektri Relaksina pre i posle dodavanja 120 ekviv NH4Cl (plava i ljubičasta, redom). Desno: umetak IR spektra nakon dodavanja 120 ekviv NH4Cl sa okvirnim zadacima za strukturne promene.
Slika 25:<15>N NMR HSQC spektri Relaksina pre i posle dodavanja 120 ekviv NH4Cl (crvena i plava, redom).
Slika 26: Blizu UV CD spektri Relaksina pre (plava) i nakon dodavanja 120 ekviv NH4Cl (plava i zelena, redom).
Slika 27: Strukture potencijalnih nečistoća prisutnih u komercijalnom PABH.
DETALJAN OPIS
[0008] Ako nije drugačije naznačeno bilo gde drugde u zahtevu, ovde se mogu koristiti sledeći izrazi koji će imati sledeća značenja.
Skraćenice
[0009]
PEG: polietilen glikol
PEG-OA: polietilen glikol - oksiamin
mPEG: metoksi polietilen glikol
MCH: morfolin 4-karbohidrazid
MPCH: 4-metilpiperazin-1- karbohidrazid
PH: Hidrazid pivalinske kiseline
PABH: Hidrazid p-amino benzoeve kiseline
PMBH: Hidrazid p-metoksi benzoeve kiseline
[0010] Mora se primetiti da, kao što se ovde koriste, oblici jednine u engleskom jeziku "a", "an" i "the" uključuju reference u množini, osim ako kontekst jasno ne nalaže drugačije. Ukoliko nije drugačije definisano, svi ovde korišćeni tehnički i naučni izrazi imaju isto značenje kao što je uobičajeno za razumevanje stručnjaka u ovoj oblasti. Ako nije drugačije naznačeno, svi ovde opisani opsezi uključuju određene krajnje tačke. Sledeći termini su dati u nastavku.
[0011] Oko: Termin "oko" ovde se koristi da označi približno, odoka, oko ili u oblasti. Kada se termin „oko“ koristi zajedno sa numeričkim opsegom, on modifikuje taj opseg proširujući granice iznad i ispod utvrđenih numeričkih vrednosti. Generalno, termin "oko" se ovde koristi za modifikovanje numeričke vrednosti iznad i ispod navedene vrednosti varijacijom od 5 procenata nagore ili niže (više ili niže).
[0012] Aditivni sistem: Termin "aditivni sistem" ovde se koristi da znači "katalizatorsko jedinjenje", bilo samostalno ili u kombinaciji. Na primer, hidrazid p-aminobenzoeve kiseline sam ili u kombinaciji sa aromatičnim aminima, naime 3,5-diaminobenzoevom kiselinom, O-fenilendiaminom, 1-piridin-2-il-etilaminom, 2- (dimetilamino) etilhidrazinom, mfenilendiaminom i 2- pikolilaminom ili amonijum soli, naime amonijum acetatom i amonijum hloridom. Poželjna katalizatorska jedinjenja uključuju hidrazid p-aminobenzoeve kiseline sa 3,5-diaminobenzoevom kiselinom ili hidrazid p-aminobenzoeve kiseline sa amonijum hloridom.
[0013] Koji sadrži: Termin „koji sadrži“ znači „koji uključuje“, na primer, kompozicija „koja sadrži“ X može se sastojati isključivo od X ili može sadržati nešto dodatno, npr. X Y.
[0014] PEG: Termin "PEG" kada se koristi u kontekstu ovog otkrića odnosi se na polietilen glikol ili derivatizovani polietilen glikol.
[0015] Proces PEGilacije ili pegilacija: Izraz "PEGilacija" ili "proces pegilacije" odnosi se na postupak vezivanja polietilen glikolnih (PEG) polimernih lanaca za drugi molekul, u kontekstu ovog otkrića, na proteine koji sadrže p-acetilfenilalanin (pAcF) ostatak, uključujući, ali ne i ograničeno na, Relaksin i FGF21.
[0016] Konjugacija: Termin "konjugacija", kako se ovde koristi, odnosi se na reakciju konjugacije između proteina koji sadrže p-acetilfenilalanin ostatak i aminoksi-PEG jedinjenja.
[0017] Generalno uključuje aktivaciju PEG-a i sprezanje aktiviranih PEG-intermedijera direktno na ciljne proteine/peptide ili na veznik, koji se zatim aktivira i spaja sa ciljanim proteinima/peptidima (videti Abuchowski, A. et al., J. Biol Chem., 252:3571 (1977) i J. Biol. Chem., 252:3582 (1977), Zalipsky et al., u Hemija Poli (etilen glikola): biotehničke i biomedicinske primene, poglavlja 21 i 22, Harris, J.M. , ed., Plenum Press, NY (1992). Primećeno je da je polipeptid koji sadrži PEG molekul poznat i kao konjugovani ili PEGilirani protein, dok se protein koji nema vezan PEG molekul može nazvati nekonjugovanim ili slobodnim.
[0018] PEG reagens i PEGilirajući reagens: Reagensi koji pomažu u reakciji PEGilacije.
[0019] Podrazumeva se da se svako dato tehničko rešenje uzeto kao primer može kombinovati sa jednim ili više dodatnih tehničkih rešenja uzetih kao primer.
[0020] U prvom aspektu, ovaj predmetni pronalazak se odnosi na poboljšani sistem aditiva za reakciju PEGilacije proteina, pomenuti sistem koji sadrži hidrazid p-aminobenzoeve kiseline u kombinaciji sa aromatičnim aminima ili amonijumovim solima, pri čemu su navedeni aromatični amini izabrani iz grupe koja se sastoji od 3,5- diaminobenzoeve kiseline, o-fenilendiamina, 1-piridin-2-il-etilamina, 2-(dimetilamino)etilhidrazina, m-fenilendiamina i 2-pikolilamina, i pri čemu su pomenute amonijumove soli odabrane iz grupe koju čine amonijum acetat i amonijum hlorid.
[0021] U prvoj tehničkom rešenju prvog aspekta pronalaska, poželjna kombinacija sistema uključuje hidrazid p-aminobenzoeve kiseline sa 3,5-diaminobenzoevom kiselinom ili hidrazid paminobenzoeve kiseline sa amonijum hloridom.
[0022] U drugom tehničkom rešenju prvog aspekta pronalaska, reakcija je reakcija konjugacije između proteina koji sadrže p-acetilfenilalanin ostatak i aminoksi-PEG jedinjenja.
[0023] U trećem tehničkom rešenju prvog aspekta pronalaska, sistem aditiva povećava brzinu reakcije konjugacije, obezbeđuje visok prinos konjugovanog proizvoda i olakšava smanjenje aminoksi-PEG ekvivalenata potrebnih za završetak reakcije konjugacije.
[0024] U drugom aspektu, tehnički pronalazak se odnosi na upotrebu poboljšanog sistema aditiva za reakciju PEGilacije proteina stvaranjem ketoksima, pomenuti sistem koji sadrži hidrazid paminobenzoeve kiseline sam ili u kombinaciji sa aromatičnim aminima ili amonijumovim solima.
[0025] U trećem aspektu, ovaj predmetni pronalazak se odnosi na postupak za dobijanje PEGiliranog proteina, pri čemu pomenuti postupak obuhvata korake: (a) identifikacije proteina, PEG reagensa i aditivnog sistema; (b) solubilizacije proteina, praćene kombinovanjem proteina sa PEG reagensom u prisustvu aditivnog sistema, (c) reakcije proteina sa PEG reagensom da bi se dobio PEGilirani protein sa visokim prinosom, pri čemu navedeni aditivni sistem uključuje hidrazid p-aminobenzoeve kiseline i pri čemu je pomenuti PEG reagens odabran iz grupe koja sadrži PEG-OA i druge derivate PEG sa aminoksi grupom.
[0026] U prvom tehničkom rešenju trećeg aspekta pronalaska, protein je Relaksin ili FGF21 koji sadrži pAcF ostatak.
[0027] U drugom tehničkom rešenju trećeg aspekta pronalaska, solubilizovani protein u kombinaciji sa PEG reagensom u prisustvu aditivnog sistema održava se na pH od oko 4.
[0028] U trećem tehničkom rešenju trećeg aspekta pronalaska, rastvoreni protein kombinovan sa PEG reagensom u prisustvu aditivnog sistema drži se na temperaturi u rasponu od oko 20 °C do oko 25 °C.
[0029] U četvrtom tehničkom rešenju trećeg aspekta pronalaska, sistem aditiva uključuje hidrazid p-aminobenzoeve kiseline sam ili u kombinaciji sa aromatičnim aminima, kao što je 3,5-diaminobenzoeva kiselina, ili amonijumove soli, kao što je amonijum acetat ili amonijum hlorid.
[0030] U petom tehničkom rešenju trećeg aspekta pronalaska, sistem aditiva dalje uključuje kombinaciju visokokvalitetnog hidrazida p-aminobenzoeve kiseline sa amonijum hloridom, poželjnom za upotrebu u proizvodnji PEGiliranih proteina u velikim razmerama.
PRIMERI
[0031] Predmetno otkriće će sada biti opisano u vezi sa određenim tehničkim rešenjima kojima nije cilj da ograniče njegov obim. Suprotno tome, ovo otkriće pokriva sve alternative, modifikacije i ekvivalente koji mogu biti obuhvaćeni obimom patentnih zahteva. Tako će sledeći primeri, koji uključuju specifična tehnička rešenja, ilustrovati jednu praksu ovog otkrića, pri čemu se podrazumeva da su primeri u svrhu ilustracije određenih tehničkih rešenja i predstavljeni su kako bi pružili ono za šta se veruje da je najkorisniji i lako razumljiv opis njegovih postupaka i konceptualnih aspekata.
[0032] Opšti mehanizam reakcije između karbonilne grupe i hidroksilamin derivata dobro je razumljiv za reaktante malih molekula (Jencks, W.P., Prog. Phys. Org. Chem., 2:63 (1964), i tamo citirane reference). Proces je katalizovan kiselinom i sveukupno podrazumeva dehidrataciju kojoj prethodi višestepena ravnoteža. Dok se ketimini formiraju sporijim brzinama od aldimina zbog alilnog 1,3-naprezanja, za jednostavne alkiloksiamine keton-ketimin ravnoteža se uglavnom pomera ka dehidrataciji (slika 1).
Primer 1
Studija za istraživanje raspadanja PEGilirajućeg reagensa kao potencijalnog uzroka zastoja reakcije
[0033] Jedan mogući uzrok zastoja PEGilacije može biti rezultat razgradnje PEGilirajućeg reagensa. Kako PEG reagens nije UV aktivan, potreban je drugačiji metod detekcije da bi se pratila njegova sudbina tokom reakcije. Evaporativno otkrivanje svetlosnog rasipanja uključuje prolazak HPLC mobilne faze kroz raspršivač da bi se uklonio rastvarač. Sve čvrste čestice koje stvaraju vrše difrakciju svetlosti iz laserskog zraka u detektoru, što rezultira signalom. Ova metoda omogućava otkrivanje bilo kog jedinjenja koje stvara čvrstu supstancu koja može da izvrši difrakciju svetlosti. Kako su PEGilacioni reagensi čvrste supstance velike molekulske mase, oni su izvrsni kandidati za HPLC analizu pomoću ELS detekcije. To je vidljivo na 2. slici UV trag je prikazan zelenom bojom, a ELS trag je prikazan crnom bojom. Gornji hromatogram (zeleno) je UV trag na 210 nm, crni hromatogram je ELS trag iste smeše dobijen u seriji sa UV detektorom. Jasno je da donji crni trag pruža više informacija, posebno sa jedinjenjima na bazi PEG-a koja se kasnije eluiraju.
[0034] Poslednji elucioni pik nije UV aktivan i nije bio prisutan na početku reakcije. Ovo sugeriše kompetitivno razlaganje PEGilirajućeg reagensa. Zapravo, ovo jedinjenje je nastalo kada je rastvor PEGilacionog reagensa bio izložen vazduhu (slika 3). Konverzija reagensa PEG-OA od 20 kDa bila je > 97% pri koncentracijama ≈ 4 mg/ml i rezultirala je nusproizvodima koji nisu bili reaktivni u PEGilaciji.
[0035] Kako je ovo razlaganje rezultat reakcije PEGilirajućeg reagensa sa rastvorenim gasom u rastvaraču, trebalo bi da postoji obrnuta korelacija između brzina razlaganja i koncentracija. Ova hipoteza se podudara sa zapažanjem da su uzorci PEG-OA od 20 kDa u koncentracijama relevantnijim za reakciju od 30-40 mg/ml bili prilično stabilni (<5% razlaganja). Iako može postojati neki uticaj na analitički rad za ovaj projekat da bi se osigurala stabilnost uzorka tokom analize, minimalno raspadanje pod uslovima relevantnijim za reakciju dovodi do zaključka da raspadanje PEG-a pomoću vazduha nije snažan uzrok za uočeno zaustavljanje reakcije. Stabilnost PEGilacionog reagensa je takođe proučavana u prisustvu aditiva koji se koriste za ubrzanje PEGilacije. Ovi eksperimenti su izvedeni pri očekivanim koncentracijama reakcije, pretpostavljajući ciljno PEG opterećenje od 1,2 ekviv u odnosu na Relaksin. U svim slučajevima, razlaganje PEGilirajućeg reagensa bilo je minimalno.
[0036] Budući da se zaustavljanje PEGilacije javlja u prisustvu velikog viška acetilhidrazida kao ubrzavajućeg aditiva, stabilnost ovog hidrazida pod reakcionim uslovima testirana je pomoću in situ IR i<1>H NMR spektroskopija. Studije su pokazale da je hidrazid sirćetne kiseline stabilan i sugerišu da je višak potreban za podsticanje reakcije najverovatnije povezan sa postojanjem ravnoteže i umerenim ubrzanjem u odnosu na nekatalizovani pozadinski proces (slika 4).
Primer 2
Studije o proveravanju aditiva pomoću sistema dipeptidnog modela (DMS)
[0037] Početni napori da se pronađu aditivi koji su ubrzali reakciju između pAcF keton ručice u Relaksinu i alkoksiamina podrazumevali su proveravanje komercijalno dostupnih jedinjenja koja su sadržala aktivirane X-NH2segmente sposobne da promovišu stvaranje njihovih odgovarajućih imino derivata dehidratacijom. Minimalni zahtevi za odabir ovih aditiva bili su njihova dovoljna stabilnost i rastvorljivost pod temperaturnim, puferskim i pH uslovima koji se koriste za promociju PEGilacije stvarnog proteina u vodenom medijumu. Da bi se pojednostavili analitički postupci i olakšalo praćenje reakcija pomoću HPLC-UV i NMR spektroskopije, kondenzacija između dipeptida Ala-pAcF (1) i O-fenilhidroksilamina (2, videti sliku 5) izabrana je kao transformacija modela koja može voditi izboru aditiva. U sledećem koraku, aditivi koji su poboljšali reakciju modela bili bi testirani u PEGilaciji Relaksina i FGF21. Na Slici 5 dat je model reakcije za proveravanje aditiva. Reakcioni uslovi: 1 (3,6 mmol) i 2 (3,6 mmol) u 1,0 mL acetatnog pufera (20 mM, pH 4,0) na sobnoj temperaturi (23 °C).
[0038] Brzine reakcija i procenat konverzije procenjeni su za pedeset aditiva klasifikovanih u četiri opšte kategorije, i to: anilini, hidrazini, hidrazidi i hidrazinkarboksamini, u zavisnosti od prirode X supstituenta na X-NH2segmentu. Uočene brzine su normalizovane na brzinu izmerenu u odsustvu aditiva (krel= 1). Hidrazid sirćetne kiseline (krel≈ 2) bio je referentni aditiv za uspostavljanje osnovnih prihvatljivih performansi; za naknadnu primenu i optimizaciju u PEGilaciji Relaksina i FGF21 uzimaju se u obzir samo oni aditivi koji daju krel> 2 i visoke konverzije (> 95%). Rezime rezultata prikazan je na 6. slici. Reakcije su izvedene u HPLC bočicama na sobnoj temperaturi bez mešanja da oponašaju uslove PEGilacije proteina, a HPLC automatski autosampler povremeno je izvlačio alikvote kako bi se izbegla dalja manipulacija uzorkom.
[0039] Hidrazidi (obojeni u plavo) i hidrazinkarboksamidi (zelena) pružili su najbolje rezultate. Generalno, anilini (crvena) su dali potpunu konverziju dipeptida, ali nisu ubrzali reakciju. Štaviše, većina anilina promovisala je visok nivo neželjene epimerizacije. Hidrazini (žuta) su formirali velike količine hidrazona u reakcionim uslovima i odbačeni su za dalje proučavanje. Aromatični hidrazidi i sekundarni hidrazinkarboksamini daju petostruko ubrzanje, kao i visoke konverzije koje zaustavljaju približno 95% potrošnje dipeptida. Konkretno, proveravanje je dovelo do pronalaska morfolin-4-karbohidrazida (MCH, 4) i hidrazida p-aminobenzoeve kiseline (PABH, 7) kao optimalnih reagensa za pospešivanje transformacije. Na osnovu njihovih performansi, rastvorljivosti pri pH 4, komercijalne dostupnosti i cene, PABH i MCH su dalje procenjeni u PEGilaciji Relaksina i FGF21 (vide dole).
[0040] Sa ovim informacijama u rukama, pokušaji zaobilaženja zastoja reakcije usredsređeni su na tri aspekta: (a) dodavanje promenljivih količina aditiva, (b) dejstvo haotropnih sredstava i (c) kombinacija aditiva. U početku su izvedene studije sa modelom dipeptida i acetilhidrazida kako bi se utvrdili suštinski trendovi u reaktivnosti. Praćenje brzina reakcije pri različitim količinama acetilhidrazida otkrilo je kinetiku zasićenja u aditivu, što ukazuje da povećanje brzine dostiže graničnu vrednost pri visokim koncentracijama reagensa (Shema 1).
[0041] Štaviše, rastuće koncentracije acetilhidrazida promovisale su više nivoe zaustavljanja u skladu sa opštim mehanizmom koji uključuje višestepenu sekvencu reverzibilnih reakcija prenosa imina. U prisustvu ubrzavajućeg aditiva, takav mehanizam je ukazivao na mogućnost postizanja boljih konverzija pomeranjem očigledne ravnoteže ka dehidrataciji. Empirijski pokušaji modifikovanja ove ravnoteže kroz promene u reakcionom medijumu nisu bili uspešni. Na primer, dodavanje 6M uree ili NH4CI nije ubrzalo reakciju niti uticalo na prvobitne nivoe konverzije. Provera određenih anilina rezultirala je potpunom konverzijom bez ubrzanja i predvidela je da kombinacija ovih anilina sa ubrzavajućim aditivom može da pomogne u produžavanju konverzije supstrata. Zapravo, upotreba smeše acetilhidrazida i pirazolamina 9 dovela je do bržih reakcionih profila i skoro potpunih konverzija (slika 6).<1>H NMR analiza smeša koje sadrže ekvimolarne količine dipeptida, pirazol-amina, aditiva MCH-a ili smeše MCH-a i pirazol-amina otkrila je sinergijski rast intermedijera imina i hidrazona za uzorke koji sadrže smešu i sugerisala da je pozitivan efekat kombinovanja ubrzavajućeg aditiva i anilina korelira sa pomeranjem ravnoteže na putu do reakcionih intermedijera (slika 8).
[0042] Analogna<1>H NMR spektroskopska ispitivanja koja koriste PABH, aditiv koji sadrži i hidrazid i anilin segmente, pokazuju prevladavajuće stvaranje jednog hidrazonskog intermedijera u skladu sa proračunima DFT-a. U neutralnim uslovima, proračuni na B3LYP/6-31G(d) nivou teorije favorizuju stvaranje hidrazona između pAcF i PABH, pre nego njegovog izostrukturnog imina za ≈ 3 kcal/mol (Shema 2).
[0043] Protoniranje aminokiselinskog -NH2(pKa ≈ 9), podržava stvaranje hidrazona sa ≈ 9 kcal/mol. Dvostruka protonacija (pKa: anilin ≈ 2,5, hidrazid <2) favorizuje stvaranje imina za ≈ 1,0 kcal/mol. Iako se reakcija ne odvija pri tako niskim pH vrednostima, DFT proračuni pokazuju da je dehidratacija veoma osetljiva na varijacije pH i efekte H-vezivanja.
[0044] Hidrazonski intermedijer se mogao pratiti tokom PEGilacije dipeptida 1 sa PABH (slika 9). Kontrolni eksperimenti koji su uravnotežili smeše dipeptida 1 sa PABH preko noći u odsustvu PEGilirajućeg reagensa pokazali su nastajanje hidrazona kao i njegovu brzu potrošnju dodavanjem PEG-OA od 20 kDa da bi se dobio željeni proizvod. Dalje ispitivanje stvaranja hidrazona u prisustvu aminskih aditiva (npr. Pirazolamin, slika 10) sugeriše da je stepen stvaranja hidrazona povezan sa odnosom pirazolamin: PABH koji se koristi u reakciji. Zanimljivo je da obim stvaranja hidrazona ne korelira sa brzinom reakcije ili konverzijama na jednostavan način. U modelu dipeptidnog sistema, odnos pirazolamin: PABH od 1: 1 bio je optimalan za formiranje hidrazona. Međutim, u slučaju brzina reakcije, optimalni uslovi odgovarali su amin: hidrazid odnosu 1:2. Potreba za većim količinama hidrazida u odnosu na amin potkrepljena je preliminarnim skriningom u kome je primećeno da hidrazidi obezbeđuju mnogo veće brzine reakcije od aminskih aditiva. S druge strane, odnos 3:1 amin: hidrazid bio je optimalan za konverziju dipeptida u skladu sa (a) primećivanjem značajnih količina hidrazonskog intermedijera koje su ostale na kraju reakcije pri niskom odnosu amin: hidrazid i (b) preokretom reakcije otkrivenim nakon dodavanja „udarnih punjenja“ (eng. „kicker charges“) hidrazidnog aditiva. U prethodno predstavljenim eksperimentima, ukupni ekvivalenti su zbir PBAH i pirazolamina. Efekat promena ukupnih ekvivalenata aditiva rešen je nizom eksperimenata koji su se odvijali varirajući i odnos amin:hidrazid kao i ukupne ekvivalente kombinovanih aditiva. Rezultati su rezimirani na slici 11. Zakrivljenost na slici sugeriše da je kooperativni efekat između amina i hidrazida složen i da optimizacija reakcionih uslova može zahtevati uzimanje u obzir ne samo ukupnih ekvivalenata aditiva, već i odnosa između dva.
Primer 3
Aditivno ubrzane PEGilacije proteina - Relaksina i FGF21
[0045] Primena lekcija naučenih u model sistemu na PEGilaciju Relaksina i FGF21 imala je za cilj smanjenje broja ekvivalenata PEG-OA od 20 kDa na maksimalnih 1,2 ekviv kao i skraćivanje vremena reakcije na sobnoj temperaturi bez ugrožavanja prinosa reakcije ili kvaliteta proizvoda.
U tom cilju, testirani su aditivi identifikovani u model reakciji sa Relaksinom u reakcionim uslovima inicijalno razvijenim iz površnih ispitivanja. PEGilacija Relaksina (21 mg/Ml u 20 mM AcONa na pH 4,0) sa 1,5 ekviv PEG-OA dala je dobre konverzije (≈ 90%) nakon 24 sata na sobnoj temperaturi u prisustvu 30 ekviv acetilhidrazida ili MCH. U odsustvu katalizatora, pod identičnim uslovima, reakcija je dala znatno niže konverzije (≈ 75%). U skladu sa ispitivanjima model sistema, aditivi su ubrzavali PEGilaciju, a reakcija sa MCH bila je dvostruko brža od reakcije sa acetihidrazidom. Štaviše, ravnoteža predložena na Slici 6 pronašla je podršku u sledećim zapažanjima: (a) katalizovane reakcije zaustavljene pri uporedivim konverzijama, (b) jednom zaustavljene, dodavanje 30 ekviv ekstra aditiva smanjuje nivoe konverzije, i (c) jednom zaustavljene, dodavanje 0,5 ekviv PEG-OA odvelo je reakciju na veću konverziju (≈ 95%). Trendovi primećeni za aniline u model reakciji prevedenoj na PEGilaciju Relaksina: dodavanjem 30 ekviv pirazolamina transformisana je većina Relaksin polaznog materijala bez ubrzanja i, kombinovanjem MCH sa pirazol-aminom dobijena je 95% konverzija za samo 8 sati. Napori na optimizaciji reakcionih uslova otkrili su složenu interakciju između promenljivih i podstakli primenu DoE studija da bi se stekao dublji uvid (Primer 4). Na primer, veće ili manje količine MCH pomešane sa 30 ekviv pirazolamina nisu poboljšale konverziju, a upotreba viših temperatura nije podstakla brže reakcije (slika 12). Smanjenje punjenja PEG-OA na 1,2 ekviv izazvalo je zastoj pri konverziji od ≈ 85-90% pod uslovima optimizovanim za 1,5 ekviv u prisustvu aditiva MCH, MPCH (5) ili PH (6). Međutim, za razliku od njegovog zanemarljivog efekta u model sistemu, upotreba MCH u urei 6M uznapredovala je završetak reakcije do ≈ 95% (slika 12).
[0046] Unapređenje PEGilacije do završetka, međutim, otkrilo je stvaranje nečistoće sa istim vremenom zadržavanja kao Relaksin polazni materijal, ali nereaktivne u prisustvu PEGilirajućeg reagensa. HRMS studije su pokazale da nečistoća odgovara oksimu na N-terminalnom ostatku pAcF, a dodavanje NH2OH potvrdilo je da je nečistoća bila neproduktivna prema PEGilaciji (slika 13). Dve hipoteze su postavljene da objasne izvor NH2OH, i to: (a) njegovo prisustvo kao ulazne nečistoće u PEGilirajućem reagensu i (b) njegovo formiranje tokom reakcije PEGilacije. Pažljiva analiza PEG-OA pokazala je da su nivoi NH2OH u polaznim materijalima <0,05 ppm i opovrgla je prvu hipotezu. U saglasnosti sa razgradnjom PEGilirajućeg reagensa tokom reakcije, praćenje stvaranja oksimske nečistoće pokazalo je njen nedvosmislen rast tokom PEGilacije (slika 14). Sistematska HRMS studija aditiva 4-9 pokazala je da MCH i MPCH promovišu razgradnju PEG-OA, dok hidrazid sirćetne kiseline, PH, PABH, PMBH i pirazolamin nisu. Shodno tome, u optimizaciji PEGilacija posredovanih pomoću PABH, jer PABH daje konverzije uporedive sa onim od MCH (slika 6), a njegov trošak je mnogo niži od potonjeg (1 $/g naspram 60 $/g). Optimizovani uslovi podrazumevali su upotrebu 30 ekviv PABH i 60 ekviv pirazolamina. Ovi rezultati bi naknadno bili potvrđeni DoE studijama.
[0047] Revizija efekta anilina nakon konverzije reakcije uočene tokom provere u model sistemu pokazala je da su, pored pirazolamina, tri amina uspela da unaprede nivoe završetka. To su bili mfenilendiamin, etilendiamin i 3,5-diaminobenzoeva kiselina. Korišćenjem 1,2 ekviv PEG-OA i 30 ekviv PABH, dodavanjem 60 ekviv amina dobijene su konverzije ≈ 95% (slika 19). Stehiometrije nižih aditiva rezultirale su nižim konverzijama u kratkim vremenima (≈ 90%), ali su polako postizale veće konverzije na 24 sata.
Primer 4
DoE studije za procenu interakcija između različitih kombinacija aditiva
[0048] Saradnja između aminskih i hidrazidnih aditiva dalje je istražena za PEGilaciju Relaksina i FGF21 upotrebom DOE pristupa koji je uzeo u obzir četiri promenljive, naime (a) identitet hidrazida, (b) identitet amina, (c) ukupne ekvivalente aditiva i (d) amin:hidrazid odnos upotrebljenih aditiva. Studije su izvedene sa Relaksinom i FGF21 kako bi se ispitao efekat molarnog odnosa amin: hidrazid i opterećenja PEG-OA na brzine i konverzije, i analizirali razni amini prethodno identifikovani u model sistema (slika 6). Rezultati ovih eksperimenata ukazali su na složenu interakciju između amin:hidrazid odnosa i ukazali su da optimizacija reakcije zahteva pažljivo razmatranje vrste amina, kao i proteina supstrata.
[0049] U prvom krugu proveravanja (Tabela 1), koristili smo PABH, hidrazid sirćetne kiseline i hidrazid pivalinske kiseline u kombinaciji sa pirazolaminom za PEGilaciju Relaksina i FGF21 (slika 17). Takođe su razmatrani ekvivalenti PEG-OA i koncentracija uree. Većina aditivnih sistema u ovom praćenju dala je dobre performanse. U saglasnosti sa prethodnim studijama (slike 7 i 12), 2:1 sistem amin: hidrazid bio je među najboljima za podsticanje visoke konverzije. Iako je hidrazid pivalinske kiseline bio odličan hidrazidni aditiv koji je mogao da podstakne visoku konverziju i brze reakcione stope, primećene su nove nečistoće u reakcionim smešama koje nisu bile prisutne kada je korišćen PABH.
Tabela 1
[0050] Ova provera je ponovljena korišćenjem FGF21 sa sličnim rezultatima (Tabela 2). PABH se pokazao kao izvanredan aditiv za ubrzavanje reakcije i, budući da je jedan od ciljeva ove inicijative bio razvijanje opšte metode PEGilacije koja se može primeniti na niz proteinskih sistema u inostranstvu, PABH je odabran za dalje proučavanje. Dodatna podrška za upotrebu PABH kao hidrazidne komponente bila je činjenica da je on negativan u AMES ispitivanju za razliku od acetil hidrazida, koji je poznati snažni mutagen (Bhide, S.V. et al., Cancer Lett., 23:235 (1984)).
Tabela 2
[0051] Odabirom PABH kao hidrazida, on je pregledan u kombinaciji sa širim opsegom amina, koristeći i Relaksin i FGF21 proteine (Shema 3). Za ove eksperimente izvedena su sledeća razmatranja: (a) amini koji su prethodno testirani u model sistemu (slika 5) bi bili pregledani, (b) ukupni ekvivalenti aditiva (suma hidrazida i amina) bi se kretali od 20 do 120 i (c) vremena reakcije bi bila ograničena na 24 h.
[0052] Kako je prvo DOE proveravanje sprovedeno upotrebom PABH i pirazolamina, bilo je od primarnog interesa da se utvrdi koji od amina (ili klase amina) je optimalan za upotrebu u aditivnim sistemima sa PABH. Eksperimentalni rezultati proveravanja sa Relaksinom i FGF21 su sumirani u nastavku (tabele 3 i 4, redom).
Tabela 3
Tabela 4
[0053] Rezultati za PEGilaciju Relaksina konzistentni su između različitih amina, a konverzije su generalno relativno visoke. S druge strane, čini se da je za FGF213,5-diaminobenozoeva kiselina dobar promotor PEGilacije pri i 1,0 i 3,0 amin:PABH odnosima. Držeći konstantim ukupne ekvivalente i odnos, dobijamo bolju sliku uticaja amina na konverzije. Za Relaksin ovi podaci su predstavljeni u tabeli 5.
Tabela 5
[0054] Za Relaksin, uticaj amin aditiva je očigledan, ali obzirom na zapažene visoke ukupne konverzije, ovaj uticaj je ponovo nizak. Za FGF21 je uticaj veći (tabela 6).
Tabela 6
[0055] Iz ovih podataka je jasno da konverzija u velikoj meri zavisi od identiteta amina koji se koristi u kombinaciji sa PABH. Shvatajući da ovi uslovi ne odražavaju nužno optimalne uslove za reakciju PEGilacije, sortirali smo prema konverziji da bismo došli na listu pet najboljih kombinacija aditiva za FGF21 (Tabela 7).
Tabela 7
[0056] Etilendiamin i 3,5-diaminobenzoeva kiselina su bila dva najbolja izvođača za PEGilaciju FGF21 pod prikazanim uslovima. Kako je 3,5-diaminobenzoeva kiselina relativno jeftina i lako dostupna kristalna čvrsta supstanca, smatrana je omiljenim aditivom za kombinaciju amin: PABH. Dalja podrška će doći iz detaljne analize ukupnih ekvivalenata u odnosu na odnose amin: PABH. Kao što je primećeno u model sistemu, efekat saradnje dva aditiva je prilično složen. U stvari, zakrivljenost uočena u model sistemu bila je izraženija za PEGilaciju Relaksina i FGF21. Podaci i trendovi za FGF21 prikazani su na slici 19. Anilini o- i m-fenilendiamin bili su dobri aditivi kada se koriste u PEGilaciji FGF21. Zanimljivo je da je grafikon konačne koncentracije preostalog proteina naspram ukupnih ekvivalenata i odnosa amin:PABH dao potpuno drugačije rezultate. Jedina strukturna razlika između ova dva aditiva je orijentacija amino grupa.
[0057] Kako je z-osa konačna koncentracija za FGF21 u reakcionoj smeši, idealni uslovi će imati najmanju vrednost na z-osi grafikona. Za robustan postupak koji može omogućiti manje razlike u punjenju reagensa, idealan je ravni grafik ili grafik sa dolinom ili bunarom. Jedan aditiv koji je ispunio ovu premisu je 3,5-diaminobenzoeva kiselina (slika 20).
[0058] Kada se koristi u PEGilaciji Relaksina, 3,5-diaminobenzoeva kiselina je takođe proizvela velike konverzije u razumnom vremenu reakcije. Poređenje slika 20 (levo i desno) pokazuje da su povećane konverzije takođe povezane sa identitetom proteina.
Primer 5
Upotreba jednostavnih amonijum soli
[0059] Obzirom na blagotvorno dejstvo dodataka amina pri pH 4, računali smo da jednostavne amonijum soli takođe mogu poboljšati PEGilaciju Relaksina. U tom cilju izvedena je serija eksperimenata sa različitim količinama PABH i NH4OAc ili NH4Cl koji su otkrili superiornost kombinacije 60 ekviv PABH i 120 ekviv NH4Cl da bi se postigla najbolja konverzija koja je primećena za 10 sati (97%, tabela 8). Zanimljivo je da je ponovnim ispitivanjem reakcije modelnog dipeptida u prisustvu NH4Cl dobijen profil koji je identičan profilu primećenom bez NH4Cl, što sugeriše da efekat NH4Cl može biti povezan sa promenama u strukturi Relaksina. Zapravo, dodavanje poznatih haotropnih reagenasa poput uree ili (NH4)2SO4dalo je uporedive rezultate (slika 21). Pozitivan efekat NH4Cl deluje opšte i ponovo se javlja u PEGilaciji Relaksina bez hidrazidnog aditiva ili u prisustvu acetilhidrazida (slika 22).
[0060] Spektroskopske studije u cilju boljeg razumevanja porekla NH4Cl efekta sugerirale su da so modifikuje konformaciju Relaksina u rastvoru. Iako UV spektroskopska analiza nije mogla otkriti varijacije u apsorbanci aromatičnih ostataka (260-290 nm) nakon dodavanja 120 ekviv NH4Cl (slika 23), IR spektroskopija je ukazala na postojanje strukturnih modifikacija na H-vezivanju amidnog II pojasa (slika 24). Pretpostavlja se da neuspeh UV analize u otkrivanju promena na aromatičnim ostacima može da se prati na distalnoj lokaciji aminokiselina Tir(Y), Phe(F) i Trp(W) u Relaksinu, što ostatke u velikoj meri izlaže rastvaraču i nemaju nikakve značajne intramolekularne interakcije.
[0061] Suptilne modifikacije na strukturi Relaksina pronašle su dalju potporu u<15>N NMR HSQC spektroskopskim studijama u skladu sa savijanjem proteina koje idu ka većem procentu slučajne zavojnice nakon dodavanja NH4Cl (slika 25) i UV CD ispitivanjima koja su pokazala male razlike u jedinstvenoj oblasti tercijarne strukture Relaksina moguće usled promena interfejsa dimerizacije (slika 26).
Primer 6
Tipični postupak i rezultati
[0062] Na osnovu studija zabeleženih u ovoj belešci, kombinacija PABH i NH4Cl preporučena je za upotrebu u većim razmerama. Rezultati različitih proteinskih sistema dati su u sledećoj tabeli.
Tabela 9
[0063] Jedno razmatranje kada se koristi PABH u reakcijama PEGilacije je da čistoća komercijalno dostupnih reagenasa nije jednaka kod svih dobavljača. Korišćenje 98% PABH u velikim razmerama rezultiralo je koeluiranjem pika nečistoće sa željenim proizvodom tokom hromatografije. Izolacijom ovih nečistoća potvrđeno je da su njihove strukture hidrazid i amid nečistoće prisutne u PABH (slika 27).
[0064] Zbog visokih ekvivalenata koji se koriste u reakciji, čak i nečistoće niskog nivoa u ovom reagensu mogu imati uticaj. Stoga se preporučuje postizanje najkvalitetnije dostupne PABH. Primer 7
Tipicna procedura proveravanja-skrininga
[0065] Upotreba aditiva je operativno jednostavna. Kao reprezentativni primer data je PEGilacija FGF21 G1 sa PEG-OA od 30 kDa.
Tabela 10
Procedura
[0066] Rastvor FGF21 (1,0 ml, 20,3 mg/mL, 1,04 µmol) u 20 mM NaOAc, 6M uree, sa pH 4, dodat je čvrstom NH4Cl (6,7 mg, 124,8 µmol) u čistoj bočici od 1,5 ml. Smeša je lagano mešana dok se sva čvrsta supstanca nije rastvorila. U odvojenoj bočici kombinovani su MPEG od 30 kDa (39,0 mg, 1,26 µmol) i PABH (4,7 mg, 31,2 µmol). Rastvor proteina iz prve bočice prebačen je u drugu bočicu koja sadrži PEGilirajući reagens i PABH, i smeša je lagano mešana dok se čvrste materije nisu rastvorile (oko 20 min). Izmeren je pH i smeša je podešena na pH 4 koristeći 0,1M HCl ako je potrebno.
[0067] Tipične reakcione smeše su homogeni rastvori, pa je reakcioni rastvor držan na 20-25 °C bez mešanja. Napredak reakcije se prati pomoću HPLC ili ELS ili UV detekcijom na 280 nm. Završetak reakcije procenjuje se HPLC analizom u odnosu na spoljni standard.
Primer 8
Poređenje uslova pegilacije
[0068] Konačni cilj ove inicijative bio je da demonstrira korisnost ovog novog postupka PEGilacije u odnosu na postupke koji su postojali u vreme početka projekta, kao i uslove iz „stanja tehnike“ u literaturi. Ovo je prvenstveno radi kvantifikovanja uštede u skupim reagensima za PEGilaciju koji su dostupni upotrebom preporučenih kombinacija aditiva. Tabela 11 uključuje originalne uslove koji se koriste za Relaksin i FGF21 G1 PEGilacije, kao i PEGilacije posredovane aditivom PABH.
Tabela 11
[0069] Potencijalno smanjenje troškova za jedinjenje Relaksin je isključivo povezano sa količinom korišćenog PEG 20 kDa reagensa, jer su konverzije i prinosi oba procesa uporedivi. Međutim, za PEGilaciju FGF21 prve generacije, ušteda je drastična. Više od 50% smanjenja PEG opterećenja u kombinaciji sa 13% povećanjem prinosa reakcije rezultira ukupnim smanjenjem troškova od 70% povezanim sa njegovom proizvodnjom. Kako su troškovi PABH i NH4Cl izuzetno niski u odnosu na reagense za PEGilaciju, njihova upotreba minimalno doprinosi ukupnom trošku proizvodnje. U sledećoj tabeli upoređujemo PABH uslove sa onima koji koriste hidrazid sirćetne kiseline.
Tabela 12
[0070] Neke od prednosti sistema aditiva u ovom otkriću su navedene u nastavku:
1) Promocija većih konverzija sa znatno nižim količinama PEGilacionog reagensa (1,2 ekviv u odnosu na 1,5-2,5 ekviv), koji je izuzetno skup. Tabela u nastavku daje poređenje koje ističe poboljšanja u odnosu na staru metodu (standardne uslove).
Kombinacija dva aditiva znatno povećava brzinu reakcije i konverzije i omogućava dramatično smanjenje PEG opterećenja u odnosu na prvobitne uslove.
1) Promocija bržih reakcija koje zaobilaze potrebu za visokim reakcionim temperaturama. Izbegavanje visokih temperatura umanjuje povezanu zabrinutost zbog strukturne modifikacije proteina i stabilnosti u reakciji.
2) Zamena acetilhidrazida (Ames pozitivan) sa PABH (Ames negativan u preliminarnim studijama). Eliminiše upotrebu genotoksičnog materijala i povezane kontrole u konačnom proizvodu.
Farmaceutske kompozicije
[0071] PEGilirani proteini pripremljeni u skladu sa predmetnom objavom mogu se dalje učiniti pogodnim za ubrizgavanje u smeši ili kombinaciji sa dodatnim farmaceutski prihvatljivim nosačem ili transporterom postupcima poznatim u tehnici. Među farmaceutski prihvatljivim nosačima za formulisanje proizvoda objave su fiziološki rastvor, humani serumski album, proteini humane plazme itd. Otkriće se takođe odnosi na farmaceutske kompozicije koje sadrže konjugat kao što je gore opisano i farmaceutski prihvatljiv ekscipijens i/ili nosač. Takvi farmaceutski prihvatljivi nosači mogu biti vodeni ili ne-vodeni rastvori, suspenzije i emulzije. Primeri nevodenih rastvarača su propilen glikol, polietilen glikol, biljna ulja kao što je maslinovo ulje i injektabilni organski estri kao što je etil oleat. Vodeni nosači uključuju vodu, alkoholne/vodene rastvore, emulzije ili suspenzije, uključujući fiziološki rastvor i puferovane medijume. Parenteralni nosači uključuju rastvor natrijum hlorida, Ringerovu dekstrozu, dekstrozu i natrijum hlorid, laktatna Ringerova ili fiksna ulja. Intravenski transporteri uključuju sredstva za nadoknadu tečnosti i hranljivih sastojaka, sredstva za nadoknadu elektrolita poput onih na bazi Ringerove dekstroze i slično. Takođe mogu biti prisutni konzervansi i drugi aditivi, kao što su, na primer, antimikrobna sredstva, antioksidansi, helirajući agensi, inertni gasovi i slično. Proteinski konjugati pripremljeni u skladu sa trenutnom objavom mogu se formulisati u farmaceutskim kompozicijama pogodnim za injekcije sa farmaceutski prihvatljivim nosačem ili transporterom postupcima poznatim u struci. Videti, npr. WO 97/09996, WO 97/40850, WO 98/58660 i WO 99/07401.

Claims (17)

Patentni zahtevi
1. Poboljšani sistem aditiva za reakciju PEGilacije proteina, pri čemu pomenuti sistem sadrži hidrazid p-aminobenzoeve kiseline u kombinaciji sa aromatičnim aminom ili amonijumovom soli, gde je navedeni aromatični amin odabran iz grupe koja se sastoji od 3,5-diaminobenzoeve kiseline, o-fenilendiamina, 1-piridin-2-il-etilamina, 2-(dimetilamino)etilhidrazina, m-fenilendiamina i 2-pikolilamina, i gde je navedena amonijumova so odabrana iz grupe koja se sastoji od amonijum acetata i amonijum hlorida.
2. Sistem prema patentnom zahtevu 1, gde kombinacija sistema uključuje hidrazid paminobenzoeve kiseline sa 3,5-diaminobenzoevom kiselinom ili hidrazid p-aminobenzoeve kiseline sa amonijum hloridom.
3. Sistem prema patentnom zahtevu 1, gde navedena reakcija je reakcija konjugacije između proteina koji sadrži p-acetilfenilalanin ostatak i aminoksi-PEG jedinjenja.
4. Sistem prema patentnom zahtevu 3, gde sistem aditiva povećava brzine reakcija konjugacije, obezbeđuje visok prinos konjugovanog proizvoda i olakšava smanjenje aminoksi-PEG ekvivalenata potrebnih za završetak reakcije konjugacije.
5. Primena poboljšanog sistema aditiva za reakciju PEGilacije proteina stvaranjem ketoksima, pri čemu pomenuti sistem sadrži hidrazid p-aminobenzoeve kiseline sam ili u kombinaciji sa aromatičnim aminima ili amonijumovim solima.
6. Primena prema patentnom zahtevu 5, gde je navedeni aromatični amin izabran iz grupe koja se sastoji od 3,5-diaminobenzoeve kiseline, o-fenilendiamina, 1-piridin-2-il-etilamina, 2-(dimetilamino)etilhidrazina, m-fenilendiamina i 2-pikolilamina.
7. Primena prema patentnom zahtevu 5, gde je navedena amonijumova so izabrana iz grupe koja se sastoji od amonijum acetata i amonijum hlorida.
8. Primena prema patentnom zahtevu 5, gde sistem uključuje hidrazid p-aminobenzoeve kiseline sa 3,5-diaminobenzoevom kiselinom ili hidrazid p-aminobenzoeve kiseline sa amonijum hloridom.
9. Primena prema patentnom zahtevu 5, gde navedena reakcija je reakcija konjugacije između proteina koji sadrže p-acetilfenilalanin ostatak i aminoksi-PEG jedinjenja.
10. Primena prema patentnom zahtevu 9, gde sistem aditiva povećava brzine reakcija konjugacije, obezbeđuje visok prinos konjugovanog proizvoda i olakšava smanjenje aminoksi-PEG ekvivalenata potrebnih za završetak reakcije konjugacije.
11. Postupak za dobijanje PEGilovanog proteina, pri čemu pomenuti postupak obuhvata korake:
(a) identifikovanja proteina, PEG reagensa i sistema aditiva;
(b) solubilizacije proteina praćene kombinovanjem proteina sa PEG reagensom u prisustvu sistema aditiva,
(c) reagovanja proteina sa PEG reagensom da bi se dobio PEGilovani protein sa visokim prinosom,
gde navedeni sistem aditiva uključuje hidrazid p-aminobenzoeve kiseline i gde je pomenuti PEG reagens odabran iz grupe koja se sastoji od PEG-oksiamina i drugih derivata PEG-a sa aminoksi grupom.
12. Postupak prema patentnom zahtevu 11, gde navedeni protein nosi p-acetilfenilalaninski ostatak.
13. Postupak prema patentnom zahtevu 11, gde je navedeni protein Relaksin ili FGF21 koji sadrži p-acetilfenilalaninski ostatak.
14. Postupak prema patentnom zahtevu 11, gde se solubilizovani protein kombinovan sa PEG reagensom u prisustvu sistema aditiva održava na pH od oko 4.
15. Postupak prema patentnom zahtevu 11, gde se solubilizovani protein kombinovan sa PEG reagensom u prisustvu sistema aditiva drži na temperaturi u rasponu od oko 20 °C do oko 25 °C.
16. Postupak prema patentnom zahtevu 11, gde navedeni sistem aditiva uključuje hidrazid paminobenzoeve kiseline u kombinaciji sa aromatičnim aminom, kao što je 3,5-diaminobenzoeva kiselina, ili amonijumovom soli, kao što je amonijum acetat ili amonijum hlorid.
17. Postupak prema patentnom zahtevu 11, gde navedeni sistem aditiva dalje uključuje amonijum hlorid.
RS20201382A 2015-11-23 2016-11-22 Sistemi aditiva za upotrebu u pegilaciji proteina RS61072B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562258644P 2015-11-23 2015-11-23
PCT/US2016/063313 WO2017091568A1 (en) 2015-11-23 2016-11-22 Additive systems for use in protein pegylation
EP16816042.2A EP3380487B1 (en) 2015-11-23 2016-11-22 Additive systems for use in protein pegylation

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS61072B1 true RS61072B1 (sr) 2020-12-31

Family

ID=57589163

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20201382A RS61072B1 (sr) 2015-11-23 2016-11-22 Sistemi aditiva za upotrebu u pegilaciji proteina

Country Status (17)

Country Link
US (3) US10617765B2 (sr)
EP (2) EP3380487B1 (sr)
JP (2) JP6921821B2 (sr)
KR (1) KR102688003B1 (sr)
CN (2) CN115819494A (sr)
CY (1) CY1123699T1 (sr)
DK (1) DK3380487T3 (sr)
ES (2) ES2827776T3 (sr)
HR (1) HRP20201832T1 (sr)
HU (1) HUE052634T2 (sr)
LT (1) LT3380487T (sr)
PL (1) PL3380487T3 (sr)
PT (1) PT3380487T (sr)
RS (1) RS61072B1 (sr)
SI (1) SI3380487T1 (sr)
SM (1) SMT202000649T1 (sr)
WO (1) WO2017091568A1 (sr)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SMT202000649T1 (it) * 2015-11-23 2021-01-05 Bristol Myers Squibb Co Sistemi di additivi per l'uso nella pegilazione di proteine
CA3111576A1 (en) * 2018-09-11 2020-03-19 Ambrx, Inc. Interleukin-2 polypeptide conjugates and their uses
CN111484551B (zh) * 2020-03-19 2022-02-11 北京翼方生物科技有限责任公司 一种聚乙二醇修饰的重组人碱性成纤维细胞生长因子

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19535571A1 (de) 1995-09-14 1997-03-20 Boehringer Mannheim Gmbh Pharmazeutische Kombinationspräparate und deren Verwendung zur Behandlung von Hämodialysepatienten
TW518219B (en) 1996-04-26 2003-01-21 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Erythropoietin solution preparation
EP0885613A1 (de) 1997-06-21 1998-12-23 Roche Diagnostics GmbH Verwendung von modifizierten Hämoglobinen zur Behandlung von Anämien und Kombinationspräparate umfassend Erythropoietin und modifiziertes Hämoglobin
DE19734293A1 (de) 1997-08-08 1999-02-11 Boehringer Mannheim Gmbh Verwendung von pharmazeutischen Kombinationspräparaten enthaltend Erythropoietin und Eisenpräparate zur Behandlung von rheumatischen Erkrankungen
KR20120134158A (ko) * 2004-03-17 2012-12-11 안티캔서, 인코포레이티드 폴리에틸렌 글리콜(ｐｅｇ) 단백질 결합을 증가시키기 위한 방법
TW200722521A (en) * 2005-06-01 2007-06-16 Alza Corp Novel bioconjugation reactions for acylating polyethylene glycol reagents
CN101400646A (zh) * 2005-11-08 2009-04-01 Ambrx公司 用于修饰非天然氨基酸和非天然氨基酸多肽的促进剂
CN107501407B (zh) * 2007-03-30 2022-03-18 Ambrx公司 经修饰fgf-21多肽和其用途
EA031930B1 (ru) 2013-01-30 2019-03-29 Авелас Байосайенсиз, Инк. Молекула селективной доставки для визуализации злокачественной ткани
EP2988786A4 (en) 2013-04-22 2016-12-21 Avelas Biosciences Inc COMPOSITIONS FOR SELECTIVE DRUG ADMINISTRATION AND METHOD OF USE
CN114805532A (zh) 2014-10-24 2022-07-29 百时美施贵宝公司 修饰的fgf-21多肽及其用途
SMT202000649T1 (it) * 2015-11-23 2021-01-05 Bristol Myers Squibb Co Sistemi di additivi per l'uso nella pegilazione di proteine

Also Published As

Publication number Publication date
KR102688003B1 (ko) 2024-07-23
PL3380487T3 (pl) 2020-12-28
WO2017091568A8 (en) 2018-01-04
CN108350025A (zh) 2018-07-31
CN115819494A (zh) 2023-03-21
US20200276319A1 (en) 2020-09-03
SMT202000649T1 (it) 2021-01-05
ES2827776T3 (es) 2021-05-24
EP3380487A1 (en) 2018-10-03
WO2017091568A1 (en) 2017-06-01
EP3789395A1 (en) 2021-03-10
JP6921821B2 (ja) 2021-08-18
CY1123699T1 (el) 2022-03-24
EP3380487B1 (en) 2020-09-02
US11213589B2 (en) 2022-01-04
US10617765B2 (en) 2020-04-14
PT3380487T (pt) 2020-10-29
EP3789395B1 (en) 2025-08-27
LT3380487T (lt) 2020-12-28
HRP20201832T1 (hr) 2021-01-08
JP2019503994A (ja) 2019-02-14
JP2021176890A (ja) 2021-11-11
SI3380487T1 (sl) 2020-11-30
JP7257457B2 (ja) 2023-04-13
DK3380487T3 (da) 2020-12-07
US20220160883A1 (en) 2022-05-26
KR20180081610A (ko) 2018-07-16
CN108350025B (zh) 2023-02-21
US20190351065A1 (en) 2019-11-21
HUE052634T2 (hu) 2021-05-28
ES3055983T3 (en) 2026-02-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Koniev et al. Developments and recent advancements in the field of endogenous amino acid selective bond forming reactions for bioconjugation
Menegatti et al. mRNA display selection and solid‐phase synthesis of Fc‐binding cyclic peptide affinity ligands
JP7257457B2 (ja) タンパク質のｐｅｇ化に用いるための添加物系
Hessefort et al. Chemical and enzymatic synthesis of sialylated glycoforms of human erythropoietin
Fukuzumi et al. Chemoselective cyclization of unprotected linear peptides by α-ketoacid–hydroxylamine amide-ligation
AU2021209196B2 (en) Methods of conjugating an agent to a thiol moiety in a protein that contains at least one trisulfide bond
EA039002B1 (ru) Способ получения белка
Arrigoni et al. Morpholine Prevents the Formation of Aspartimide from β-allyl ester aspartic acid during Fmoc Cleavage in SPPS of Stapled Peptides
JP6667856B2 (ja) 糖タンパク質の糖鎖遊離法
Yon et al. Protein folding in vitro and in the cellular environment
Byun et al. Preparation of polymer-bound pyrazolone active esters for combinatorial chemistry
US20180245115A1 (en) Method, kit and device for preparing glycoprotein sugar chain
KR101692992B1 (ko) 고리형 펩타이드의 사전 활성화 합성방법 및 이에 따라 합성된 고리형 펩타이드
US20190369105A1 (en) Method for preparing sugar chain
Nakamura et al. One-pot ligation of multiple peptide segments via N-terminal thiazolidine deprotection chemistry
Neo et al. Allylic amination of Passerini adducts. Application to the selective synthesis of chromone-substituted α-and γ-amino acid peptidic and retropeptidic units
Trunschke Development of New Auxiliaries for the Native Chemical Ligation
im Fach Chemie et al. Development of New Auxiliaries for the Native Chemical Ligation
Qiao Site-Specific Protein Functionalization Using Activated Cysteine Based Chemical Biology Methods
WO2023277186A1 (ja) 液相ペプチド合成用担体結合ペプチドの分析方法
EP3894387A1 (en) Acylation process for preparation of n-substituted peptide
Carbonell mRNA display selection and solid-phase synthesis of Fc-binding cyclic peptide affinity ligands