RS61083B1 - Antitela koja se vezuju za humani ligand programirane smrti (pd-l1) - Google Patents

Description

OBLAST PRONALASKA

[0001] Predmetni pronalazak odnosi se na antitela sa specifičnim sekvencama, koja se vezuju za humani ligand programirane smrti (programmed death ligand 1, PD-L1) i koja su korisna za detektovanje ekspresije PD-L1 u uzorcima humanih tkiva, korišćenjem imunohistohemijske (immunohistochemical, IHC) analize. Pronalazak se odnosi i na specifične IHC testove u kojima se koriste ova antihumana PD-L1 antitela.

OSNOV PRONALASKA

[0002] PD-L1 je ćelijski površinski glikoprotein koji je jedan od dva poznata liganda za receptor programirane smrti 1 (PD-1), koji se prepoznaje kao važan učesnik u imunskoj regulaciji i održavanju periferne tolerancije. Ekspresija PD-L1 zapažena je na površini različitih imunskih ćelija, uključujući naivne limfocite i aktivirane B i T ćelije, monocite i dendritske ćelije (isto). Pored toga, PD-L1 iRNK se eksprimira u nelimfoidnim tkivima, uključujući vaskularne endotelske ćelije, epitelne ćelije, mišićne ćelije, kao i u krajnicima i tkivu placente. Vidi, npr., Keir, M.E. et al., Annu Rev Immunol. 26:677-704 (2008); Sharp A.H. et al., Nature Immunol. 8:239-245 (2007); Okazaki T and Honjo T, Internat. immunol.

19:813-824 (2007).

[0003] Ekspresija PD-L1 zapažena je u različitim kancerima kod ljudi, a interakcija PD-L1 eksprimiranog od strane tumorskih ćelija sa PD-1 može indukovati inhibiciju ili apoptozu tumor-specifičnih T ćelija. U veliki setovima uzoraka npr. kancera ovarijuma, bubrega, kolorektalnog kancera, kancera pankreasa, jetre i melanoma, pokazano je da je ekspresija PD-L1 u korelaciji sa lošom prognozom i smanjenim ukupnim preživljavanjem, bez obzira na preduzeto lečenje. Pokazano je da anti-PD-1 monoklonska antitela koja blokiraju vezivanje PD-L1 za PD-1 imaju antitumorsku aktivnost protiv različitih tipova tumora, pri čemu rani klinički podaci dobijeni u studijama kod ljudi sugerišu da će na anti-PD-1 terapiju verovatnije odgovoriti pacijenti čiji tumori eksprimiraju PD-L1. Vidi, npr., Iwai et al., PNAS 99:12293-12297 (2002); Ohigashi et al., Clin Cancer Res 11:2947-2953 (2005); Ghebeh et al., Neoplasia 8:190-198 (2006); Hamanishi, J et al., PNAS 104:3360-3365 (2007); Yang et al., Invest Ophthalmol Vis Sci. 49(6):2518-2525 (2008); Gao et al., Clin Cancer Res 15:971-979 (2009); Brahmer J.R. et al., J Clin Oncol.28:3167-3175 (2010).

[0004] U novijim saopštenjima opisuje se upoređivanje 15 antihumanih PD-L1 antitela u pogledu korisnosti u detektovanju ekspresije hPD-L1 u uzorcima humanog melanoma koji su fiksirani u formalinu i ukalupljeni u parafinu (formalin-fixed paraffin-embedded, FFPE) (Gadiot, J., et al., Cancer 117(10):2192-2201 (2011)). Kriterijumi korisnosti procenjivani u ovom upoređivanju bili su: (1) sposobnost bojenja tkiva ukalupljenog u parafin, (2) davanje manjeg pozadinskog bojenja i (3) blokiranje vezivanja za PD-L1 preinkubacijom sa PD-L1 fuzionim proteinom. Autori su zajključili da je Ab #4059, zečje antihumano poliklonsko antitelo (dobijeno od ProSci, Poway, CA USA), bilo jedino antihumano PD-L1 antitelo, od 15 testiranih, koje je u prihvatljivoj meri zadovoljilo sve kriterijume (isto, 2195, 2. kolona).

KRATAK OPIS PRONALASKA

[0005] Predmetni pronalazak odnosi se na antihumana PD-L1 monoklonska antitela koja daju obrazac IHC bojenja FFPE tkiva krajnika za koji pronalazači u ovom tekstu veruju da je imunološki relevantniji od obrasca koji daje ProSci Ab #4059. Kako je opisano u Primerima, kasnije u ovom tekstu, pronalazači su otkrili da ovo ProSci antitelo (PRS4059, Sigma-Aldrich partija 40590604) jednakim intenzitetom boji sve hematopoetske linije u krajnicima, dok dva antitela predmetnog pronalaska, 22C3 i 20C3, selektivno boje epitel kripti krajnika i folikularne CD68+ mijeloidne ćelije koje su morfološki konzistentne sa makrofagima. Pored toga, 22C3 i 20C3 pokazuju doslednu razliku u intenzitetu bojenja dveju različitih populacija ćelija, pri čemu je intenzitet bojenja epitela kripti mnogo veći nego bojenja folikularnih makrofaga. Sva tri antitela (PRS4059, 22C3 i 20C3) neutrališu se preinkubacijom sa PD-L1 antigenom, što ukazuje da je reaktivnost posredovana antigen-vezujućim domenom (CDR). Prema tome, pronalazak se odnosi i na upotrebu antitela predmetnog pronalaska za detekciju PD-L1 ekspresije na površini humanih ćelija, uključujući IHC testove za detektovanje PD-L1 na presecima FFPE tkiva.

[0006] U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo, ili njegov antigenvezujući fragment, koji se specifično vezuju za humani PD-L1, pri čemu (a) varijabilni region lakog lanca je SEQ ID NO:13 i varijabilni region teškog lanca je SEQ ID NO:20; ili (b) varijabilni region lakog lanca je SEQ ID NO:25 i varijabilni region teškog lanca je SEQ ID NO:32, pri čemu je X u SEQ ID NO:32 Q ili pE.

[0007] U jednom poželjnom antitelu ili njegovom antigen-vezujućem fragmentu pronalaska, varijabilni region lakog lanca je SEQ ID NO:13 i varijabilni region teškog lanca je SEQ ID NO:20.

[0008] U još jednom primeru izvođenja, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment pronalaska uključuju varijabilni regiona lakog lanca SEQ ID NO:25 i varijabilni region teškog lanca SEQ ID NO:32, pri čemu je X u SEQ ID NO:32 pE.

[0009] U još jednom primeru izvođenja, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment pronalaska uključuju varijabilni regiona lakog lanca SEQ ID NO:25 i varijabilni region teškog lanca SEQ ID NO:32, pri čemu je X u SEQ ID NO:32 Q.

[0010] Antitelo je IgG1. U jednom primeru izvođenja, antitelo uključuje konstantni region mišjeg IgG1.

[0011] Antitela predmetnog pronalaska su monoklonska antitela 20C3 i 22C3, koja su IgG1 antitela eksprimirana hibridomima MEB037.20C3, odnosno MEB037.22C3.

[0012] U ovom tekstu opisani su izolovano monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, koji se specifično vezuju za humani PD-L1 i blokiraju vezivanje 20C3 ili 22C3 za humani PD-L1, ili referentno antitelo koje sadrži SEQ ID NO:25 i SEQ ID NO:32. U ovom tekstu opisani su antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment pronalaska, koji blokiraju vezivanje za humani PD-L1 svakog od 20C3 i 22C3, ili svakog od (a) referentnog antitela koje sadrži SEQ ID NO:13 i SEQ ID NO:20 i (b) referentnog antitela koje sadrži SEQ ID NO:25 i SEQ ID NO:32.

[0013] U ovom tekstu opisana je kompozicija antitela, koja uključuje bilo koje od gore opisanih antitela ili fragmenata antitela, u formulaciji. Jedna pogodna formulacija uključuje 20 mM natrijum acetat i 9% saharozu na pH 5.0. Kompozicija može uključivati mešavinu molekula antitela gde većina (tj., više od 60%, 65%, 70%, 80%, 85%, 90% ili 95%) molekula antitela u toj mešavini sadrži SEQ ID NO:25 i SEQ ID NO:32, pri čemu je X u SEQ ID NO:32 pE, a ostali molekuli antitela u mešavini sadrže SEQ ID NO:25 i SEQ ID NO:32, pri čemu je X u SEQ ID NO:32 Q.

[0014] U bilo kojem od gornjih primera izvođenja, antigen-vezujući fragment je Fab fragment, Fab' fragment, (Fab')2fragment.

[0015] U bilo kojem od gornjih primera izvođenja, antitelo ili antigen-vezujući fragment mogu uključivati još i detektabilni obeleživač.

[0016] Pronalazak obezbeđuje i izolovanu nukleinsku kiselinu koja kodira bilo koji od gore objavljenih varijabilnih regiona antitela. U svakom od ovih primera izvođenja, izolovana nukleinska kiselina je poželjno ekspresioni vektor.

[0017] Pronalazak se odnosi i na ćeliju-domaćina koja sadrži ekspresioni vektor koji kodira bilo koji od gore objavljenih varijabilnih regiona antitela.

[0018] Pronalazak obezbeđuje i metod testiranja uzorka humanog tkiva dobijenog od čoveka, na ekspresiju PD-L1. Metod testiranja uključuje dovođenje u kontakt uzorka tkiva sa PD-L1-vezujućim reagensom pod uslovima koji dopuštaju specifično vezivanje PD-L1-vezujućeg reagensa sa humanim PD-L1, uklanjanje nevezanog PD-L1 vezujućeg reagensa i detektovanje prisustva ili odsustva vezanog PD-L1-vezujućeg sredstva. U jednom poželjnom primeru izvođenja, metod uključuje još i kvantifikovanje količine vezanog vezujućeg reagensa. Vezujući reagens je bilo koje od gore opisanih monoklonskih antitela ili antigen-vezujućih fragmenata. Vezujući reagens je antitelo koje sadrži SEQ ID NO:13 i SEQ ID NO:20, ili koje sadrži SEQ ID NO:25 i SEQ ID NO:32, pri čemu je X u SEQ ID NO:32 Q ili pE. U jednom poželjnom primeru izvođenja, vezujući reagens je kompozicija antitela, koja uključuje mešavinu molekula antitela koja sadrže SEQ ID NO:25 i SEQ ID NO:32, pri čemu većina molekula (tj., više od 60%, 65%, 70%, 80%, 85%, 90% ili 95%) ima pE na poziciji X u SEQ ID NO:32 i ostali molekuli imaju imaju Q na poziciji X u SEQ ID NO:32.

[0019] U sledećem aspektu, pronalazak obezbeđuje kit za testiranje uzorka humanog tkiva u na ekspresiju PD-L1. Kit uključuje PD-L1-vezujuće sredstvo i set reagenasa za detektovanje kompleksa koji sadrži vezujuće sredstvo vezano za humani PD-L1. PD-L1-vezujuće sredstvo je neko od monoklonskih antitela ili antigen-vezujućih fragmenata opisanih gore, koji se specifično vezuju za humani PD-L1. Antitelo ili vezujući fragment sadrže SEQ ID NO:13 i SEQ ID NO:20, ili sadrže SEQ ID NO:25 i SEQ ID NO:32, pri čemu je X u SEQ ID NO:32 Q ili pE. U jednom poželjnom primeru izvođenja, vezujući reagens je kompozicija antitela, koja uključuje mešavinu molekula antitela koja sadrže SEQ ID NO:25 i SEQ ID NO:32, pri čemu većina molekula (tj., više od 60%, 65%, 70%, 80%, 85%, 90% ili 95%) ima pE na poziciji X u SEQ ID NO:32, a ostali molekuli imaju Q na poziciji X u SEQ ID NO:32.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0020]

Slika 1 prikazuje nukleotidne sekvence cDNK varijabilnih domena lakog i teškog lanca antitela, pripremljene od ukupne RNK izolovane iz hibridoma MEB037.20C3 i predviđene njima kodirane aminokiselinske sekvence (zadebljani font), pri čemu zagrade označavaju nukleotidne i aminokiselinske sekvence liderskog peptida, a podvučeno označava CDR sekvence.

Slika 2 prikazuje nukleotidne sekvence cDNK varijabilnih domena lakog i teškog lanca antitela, pripremljene od ukupne RNK izolovane iz hibridoma MEB037.22C3 i predviđene njima kodirane aminokiselinske sekvence (zadebljani font), pri čemu zagrade označavaju nukleotidne i aminokiselinske sekvence liderskog peptida, a podvučeno označava CDR sekvence.

Slika 3 prikazuje poravnate aminokiselinske sekvence zrelih varijabilnih regiona lakih i teških lanaca antitela 20C3 i 22C3, pri čemu zadebljani font označava pozicije variranja sekvenci, podvučeno označava CDR sekvenci, kako je definisano Kabatovim sistemom numerisanja, a zagrade označavaju CDR1 teškog lanca, kako je definisano Chothia sistemom numerisanja.

Slika 4 prikazuje bojenje preseka krajnika dobijeno imunohistohemijskim testom, uz korišćenje komercijalno dostupnog antitela PRS4059 (Sl. 4A) ili 22C3 antitela pronalaska (Sl. 4B), pri čemu preseci na desnoj strani Sl. 4A i 4B prikazuju rezultate posle preinkubiranja sa PD-L1-IgG1 fuzionim proteinom (R&D Systems) koji kompetira sa antihumanim PD-L1 antitelima za vezivanje sa humanim PD-L1.

Slika 5 prikazuje fotografije susednih preseka FFPE tkiva normalnog krajnika, na kojima su ispitivane ekspresija humanog PD-L1 proteina i iRNK, pomoću IHC testa, korišćenjem antitela 22C33 (Sl. 5A), odnosno in situ hibridizacije (ISH) (Sl. 5B) i na kojima je prikazana razlika u bojenju dveju jedinstvenih populacija ćelija: epitela kripti (Sl. 5A, levo, uvećano i sl. 5B, gore) i folikularnih makrofaga (Sl. 5A, desno, uvećano i Sl.5B, dole).

Slika 6 ilustruje rezultate protočno-citometrijske procene vezivanja različitih antihumanih PD-L1 antitela i izotipskog kontrolnog antitela za HT144 ćelije, za koje je poznato da su negativne u pogledu ekspresije hPD-L1, prema analizi iRNK (qPCR) (Sl. 6A) i LOX melanoma ćelije, za koje je poznato da eksprimiraju visoke nivoe hPD-L1 iRNK (qPCR) (Sl.6B).

Slika 7 prikazuje IHC bojenje dobijeno antitelom 22C3 na FFPE ćelijskim peletima inženjerisanih CHO ćelijskih linija (Sl. 7A) i humanih ćelijskih linija (Sl. 7B, gornja tabla), i demonstrira da je intenzitet bojenja u dobroj korelaciji sa nivoima ekspresije hPD-L1 iRNK, merenim na istim humanim ćelijskim linijama (Sl.7B, donja tabla).

Slika 8 ilustruje selektivno vezivanje i relativni afinitet antitela 22C3 i 20C3 za hPD-L1, pri čemu grafikoni prikazuju rezultate ćelijskog ELISA eksperimenta u kojem su ćelije koje ne eksprimiraju hPD-L1 (Sl. 8A), eksprimiraju hPDL-1 (Sl. 8B i 8C), ili eksprimiraju humani PD-L2 (Sl. 8D) inkubirane sa naznačenim primarnim antitelom u navedenim koncentracijama, a zatim je vezivanje primarnog antitela detektovano pomoću sekundarnog kozjeg antihumanog IgG antitela, kako je opisano u Primerima.

Slika 9 prikazuje rezultate kompetitivnih testova vezivanja antitela, koji pokazuju da se antitela 22C3 i 20C3 vezuju sa neidentičnim, ali preklapajućim epitopima.

Slika 10 ilustruje rezultate semikvantitativnog "gestalt" ocenjivanja intenziteta 22C3 ICH bojenja FFPE uzoraka navedenih tipova tumora, pri čemu obim bojenja raste sa porastom brojčane vrednosti ocene.

Slika 11 ilustruje da ekspresija humanog PD-L1, detektovana antitelom 22C3 u IHC testu, korelira sa odgovorom pacijenata obolelih od melanoma na terapiju antihumanim PD-1 antitelom (MK-3475), prikazujući, na Sl. 11A, reprezentativne snimke posle 22C3-IHC bojenja koji su interpretirani kao pozitivni, negativni ili dvosmisleni za ekspresiju hPD-L1, dok je na Sl. 11B prikazan broj pacijenata sa pozitivnim ili negativnim odgovorom ocenjeni IHC testom kao pozitivni ili negativni (uključeni pacijenti ocenjeni kao dvosmisleni) na ekspresiju hPD-L1.

DETALJAN OPIS

[0021] Skraćenice. U detaljnom opisu i primerima pronalaska koristiće se sledeće skraćenice:

ADCC Antibody-dependent cellular cytotoxicity, ćelijska citotoksičnost zavisna od antitela

CDC Complement-dependent cytotoxicity, citotoksičnost zavisna od komplementa CDR Complementarity determining region, region koji određuje komplementarnost u varijabilnim regionima imunoglobulina, definisan korišćenjem Kabatovog sistema numerisanja, ukoliko nije drugačije navedeno

CHO Chinese hamster ovary, ovarijum kineskog hrčka

Clothia Sistem numerisanja antitela opisan u Al-Lazikani et al., JMB 273:927-948 (1997)

EC50 koncentracija koja rezultuje efikasnošću ili vezivanjem od 50%

ELISA Enzyme-linked immunosorbant assay, enzimski imunotest

FFPE formalin-fixed, paraffin-embedded, fiksiran u formalinu, ukalupljen u parafinu FR Antibody framework region, region okvira antitela: imunoglobulinski varijabilni regioni koji isključuju CDR regione.

HRP Horseradish peroxidase, peroksidaza rena

IFN interferon

IC50 koncentracija koja rezultuje inhibicijom od 50%

IgG Imunoglobulin G

Kabat Sistem poravnavanja i numerisanja imunoglobulina koji je uveo Elvin A. Kabat ((1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.)

mAb ili Mab ili MAb Monoclonal antibody, monoklonsko antitelo

MES 2-(N-morfolino)etansulfonska kiselina

MOA Mechanism of action, mehanizam dejstva

NHS Normal human serum, normalni humani serum

PCR Polymerase chain reaction, lančana reakcija polimeraze

pE Piroglutamat

PK Pharmacokinetics, farmakokinetika

SEB Staphylococcus Enterotoxin B, stafilokokni enterotoksin B

TT Tetanus toxoid, tetanusni toksoid

V region Segment IgG lanaca čija sekvenca varira kod različitih antitela. Pruža se do Kabatove rezidue 109 u lakom lancu i 113 u teškom lancu.

VH Immunoglobulin heavy chain variable region, varijabilni region teškog lanca imunoglobulina

VK Immunoglobulin kappa light chain variable region, varijabilni region kapa lakog lanca imunoglobulina

DEFINICIJE

[0022] Da bi se pronalazak lakše razumeo, određeni tehnički i naučni izrazi posebno su definisani u nastavku ovog teksta. Ukoliko nije konkretno definisano na drugim mestima u ovom dokumentu, svi drugi ovde upotrebljeni tehnički i naučni izrazi imaju značenje koje obično razume osoba prosečno obučena u oblasti kojoj ovaj pronalazak pripada.

Kako se koristi u ovom tekstu, uključujući priložene patentne zahteve, izrazi u jednini podrazumevaju odgovarajuće oblike u množini, ukoliko kontekst jasno ne nalaže drugačije.

"Aktivacija", kada se odnosi na ćelije ili receptore, označava aktivaciju ili tretman ćelije ili receptora ligandom, ukoliko kontekstom ili eksplicitno nije ukazano drugačije. "Ligand" obuhvata prirodne i sintetske ligande, npr., citokine, varijante citokina, analoge, muteine i vezujuća jedinjenja izvedena iz antitela. "Ligand" obuhvata i male molekule, npr., peptidne mimetike citokina i peptidne mimetike antitela. "Aktivacija" može da se odnosi na aktivaciju ćelije regulisanu unutrašnjim mehanizmima, kao i spoljašnjim ili sredinskim faktorima.

"Aktivnost" molekula može opisivati ili se odnositi na vezivanje molekula sa ligandom ili receptorom, na katalitičku aktivnost; na sposobnost stimulisanja genske ekspresije ili ćelijske signalizacije, diferencijacije, ili maturacije; na antigensku aktivnost, na modulaciju aktivnosti drugih molekula, i slično. "Aktivnost" molekula može se odnositi i na aktivnost u modulisanju ili održavanju međućelijskih interakcija, npr., adhezije, ili aktivnost u održavanju strukture ćelije, npr., ćelijskih membrana ili citoskeleta. "Aktivnost" može označavati i specifičnu aktivnost, npr., [katalitičku aktivnost]/[mg proteina], ili [imunološku aktivnost]/[mg proteina], koncentraciju u biološkom kompartmentu, ili slično. "Aktivnost" može označavati modulaciju komponenti urođenog ili adaptivnog imunskog sistema.

"Primena" i "tretman", kada se odnose na životinju, čoveka, subjekta u eksperimentu, ćeliju, tkivo, organ ili biološku tečnost, označavaju kontakt egzogenog farmaceutskog, terapijskog, dijagnostičkog sredstva ili kompozicije sa životinjom, čovekom, subjektom, ćelijom, tkivom, organom, ili biološkom tečnošću. Tretman ćelije obuhvata kontakt reagensa sa ćelijom, kao i kontakt reagensa sa tečnošću, pri čemu je tečnost u kontaktu sa ćelijom. "Primena" i "tretman" označavaju i in vitro i ex vivo tretmane, npr., ćelije, reagensom, dijagnostičkim, vezujućim jedinjenjem ili drugom ćelijom. Izraz "subjekt" obuhvata svaki organizam, poželjno životinju, poželjnije sisara (npr., pacov, miš, pas, mačka, zec) i najpoželjnije čoveka.

"Lečiti" ili "lečenje" znači primeniti terapijsko sredstvo kao što je kompozicija koja sadrži neko od antitela ili antigen-vezujućih fragmenata predmetnog pronalaska, interno ili eksterno, kod subjekta ili pacijenta koji ima jedan ili više simptoma bolesti, ili za kojeg se misli da ima bolest prema kojoj sredstvo ispoljava terapijsko dejstvo. Tipično, sredstvo se primenjuje u količini efikasnoj za ublažavanje jednog ili više simptoma bolesti kod lečenog subjekta ili populacije, indukovanjem regresije ili inhibiranjem progresije tog/tih simptoma u bilo kojem klinički merljivom stepenu.

1

Količina terapijskog sredstva efikasna za ublažavanje nekog određenog simptoma bolesti (označena i kao "terapijski efikasna količina") može varirati sa variranjem faktora kao što su stanje bolesti, starost i težina pacijenta i sposobnost leka da izazove željeni odgovor kod subjekta. Da li je simptom bolesti ublažen, može se proceniti bilo kojim kliničkim merenjem koje lekari ili drugi davaoci zdravstvene nege tipično koriste za procenu jačine ili stanja progresije tog simptoma. Iako primer izvođenja predmetne objave (npr., metod tretmana ili artikl izrade) ne mora biti efikasan u ublažavanju simptoma ciljne bolesti kod svakog subjekta, trebalo bi da olakša simptom/simptome ciljne bolesti kod statistički značajnog broja subjekata kada se određivanje vrši nekim statističkim testom poznatim u struci, na primer Studentovim ttestom, hi2-testom, U-testom prema Mannu i Whitneyju, Kruskal-Wallisovim testom (H-test), Jonckheere-Terpstra-testom i Wilcoxonovim testom.

"Tretman/lečenje", kada se odnosi na čoveka, veterinarski subjekt ili subjekt u istraživanju, označava terapijski tretman, kao i istraživačku i dijagnostičku primenu. "Tretman/lečenje", kada se odnosi na čoveka, veterinarski subjekt ili subjekt u istraživanju, ili na ćeliju, tkivo ili organ, podrazumeva kontakt antitela ili antigenvezujućih fragmenata predmetnog pronalaska sa humanim ili životinjskim subjektom, ćelijom, tkivom, fiziološkim kompartmentom ili fiziološkom tečnošću.

Anti-PD-L1 antitela

[0023] Antitelo 20C3 je antitelo koje je proizveo hibridoma subklon MEB037.20C3.116.

[0024] Antitelo 22C3 je antitelo koje je proizveo hibridoma subklon MEB037.22C3.138, i odgovara alotipu S414R mišjeg IgG1. N-terminalna rezidua zrelog teškog lanca 22C3 je ili glutamin ili piro-glutamat (pE), što je uobičajena posttranslaciona modifikacija koja se često zapaža u monoklonskim antitelima kada genska sekvenca kodira N-terminalni glutamin u zrelom teškom ili lakom lancu.

[0025] Antitela ili antigen-vezujući fragmenti predmetnog pronalaska vezuju se za zrelu formu humanog PD-L1 (ne sadrži presekretornu lidersku sekvencu, označenu i kao liderski peptid) koja se eksprimira na površini određenih humanih ćelija. Izrazi "PD-L1" i "zreli PDL1" koriste se naizmenično u ovom tekstu i treba razumeti da označavaju isti molekul, ako nije drugačije navedeno ili lako vidljivo iz konteksta. Zreli humani PD-L1 molekul sastoji se od amino-kiselina 19-290 sledeće sekvence (SEQ ID NO:37):

[0026] Vanćelijski domen zrelog humanog PD-L1 sastoji se od sledeće sekvence (SEQ ID NO:38):

[0027] Kako se koristi u ovom tekstu, antihumano PD-L1 antitelo ili anti-hPD-Ll antitelo odnosi se na antitelo koje se specifično vezuje za humani PD-L1. Antitelo koje se "specifično vezuje za humani PD-L1" ili antitelo koje se "specifično vezuje za polipeptid koji uključuje aminokiselinsku sekvencu humanog PD-L1" je antitelo koje se preferencijalno vezuje za humani PD-L1, u odnosu na druge antigene, ali ova specifičnost ne zahteva apsolutnu specifičnost vezivanja. Smatra se da je anti-hPD-L1 antitelo "specifično" za humani PD-L1 ako njegovo prisustvo određuje prisustvo humanog PD-L1 u uzorku, npr. bez davanja neželjenih rezultata u IHC dijagnostičkom testu kao što su lažno pozitivni rezultati. Stepen specifičnosti koje je potrebno da ima anti-hPD-L1 antitelo pronalaska može zavisiti od nameravane upotrebe antitela i, u svakom slučaju, definiše se pogodnošću za upotrebu u predviđene svrhe. Antitelo, ili njegov vezujući fragment pronalaska vezuju se za humani PD-L1 sa afinitetom koji je najmanje dva puta veći, poželjno najmanje deset puta veći, poželjnije najmanje 20 puta veći i najpoželjnije najmanje 100 puta veći od afiniteta za bilo koji protein koji nije PD-L1. U ovom tekstu, kaže se da se antitelo vezuje specifično za polipeptid koji sadrži datu sekvencu, npr. zreli humani PD-L1 (u ovom slučaju amino-kiseline 19-290 SEQ ID NO:37), ako se vezuje za polipeptide koji sadrže tu sekvencu, ali se ne vezuje za proteine koji nemaju tu sekvencu. Na primer, antitelo koje se specifično vezuje za polipeptid koji sadrži 19-290 SEQ ID NO:37 može da se vezuje za FLAG®-markiranu formu 19-290 SEQ ID NO:37, ali se neće vezati za druge FLAG®-markirane proteine.

[0028] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "antitelo" odnosi se na bilo koju formu antitela koja ispoljava željenu biološku aktivnost. Prema tome, upotrebljava se u najširem smislu i specifično pokriva, ali se ne ograničava na monoklonska antitela (uključujući monoklonska antitela pune dužine), poliklonska antitela, multispecifična antitela (npr., bispecifična antitela), humanizovana, potpuno humana antitela, himerna antitela i kamelizovana jednodomenska antitela. "Roditeljska antitela" su antitela dobijena izlaganjem imunskog sistema antigenu i zatim modifikacijom antitela za predviđenu upotrebu, na primer, humanizacija antitela da bi se upotrebilo kao humano terapijsko antitelo.

[0029] Kako se koristi u ovom tekstu, ukoliko nije drugačije navedeno, "fragment antitela" ili "antigen-vezujući fragment" odnosi se na antigen-vezujuće fragmente antitela, tj. fragmente antitela koji zadržavaju sposobnost specifičnog vezivanja za antigen za koji se vezuje antitelo pune dužine, npr. fragmenti koji zadržavaju jedan ili više CDR regiona. Primeri vezujućih fragmenata antitela uključuju, ali se ne ograničavaju na Fab, Fab', F(ab')2i Fv fragmente; dijatela; linearna antitela; jednolančane molekule antitela, npr., sc-Fv; nanotela i multispecifična antitela formirana od fragmenata antitela.

[0030] "Fab fragment" se sastoji od jednog lakog lanca i CH1 i varijabilnih regiona jednog teškog lanca. Teški lanac Fab molekula ne može formirati disulfidnu vezu sa drugim molekulom teškog lanca. "Fab fragment" može biti proizvod sečenja antitela papainom.

[0031] "Fc" region sadrži dva fragmenta teškog lanca koji uključuju CH1 i CH2 domen antitela. Dva fragmenta teškog lanca drže se zajedno preko dve ili više disulfidnih veza i preko hidrofobnih interakcija CH3 domena.

[0032] "Fab' fragment" sadrži jedan laki lanac i deo ili fragment jednog teškog lanca koji sadrži VHdomen i CH1 domen i takođe region između CH1 i CH2 domena, tako da može da se formira međulančana disulfidna veza između dva teška lanca dva Fab' fragmenta da bi se formirao F(ab')2molekul.

1

[0033] "F(ab')2fragment" sadrži dva laka lanca i dva teška lanca koji sadrže deo konstantnog regiona između CH1 i CH2 domena, tako da se međulančana disulfidna veza formira između dva teška lanca. F(ab')2fragment je, dakle, sačinjen od dva Fab' fragmenta koji se drže zajedno disulfidnom vezom između dva teška lanca. "F(ab')2fragment" može biti proizvod sečenja antitela pepsinom.

[0034] "Fv region" uključuje varijabilne regione lakih i teških lanaca, ali ne sadrži konstantne regione.

[0035] Izraz "jednolančani Fv" ili "scFv" antitelo odnosi se na fragmente antitela koji uključuju VHi VLdomene antitela, pri čemu su ovi domeni prisutni u jednom polipeptidnom lancu. Uopšteno, Fv polipeptid uključuje još i polipeptidni linker između VHi VLdomena, koji omogućava da scFv formira željenu strukturu za vezivanje antigena. Za pregled scFv, vidi Pluckthun (1994) THE PHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES, vol.

113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, str. 269-315. Vidi i Objavljenu međunarodnu prijavu patenta br. WO 88/01649 i U.S. pat. br.4,946, 778 i 5,260,203.

[0036] "Domensko antitelo" je imunološki funkcionalan imunoglobulinski fragment koji sadrži samo varijabilni region teškog lanca ili varijabilni region lakog lanca. U nekim slučajevima, dva ili više VHregiona kovalentno je spojeno peptidnim linkerom dajući bivalentno domensko antitelo. Dva VHregiona bivalentnog domenskog antitela mogu ciljati iste ili različite antigene.

[0037] "Bivalentno antitelo" sadrži dva antigen-vezujuća mesta. U nekim slučajevima, dva vezujuća mesta imaju istu antigensku specifičnost. Međutim, bivalentna antitela mogu biti bispecifična (vidi kasnije).

[0038] Monoklonska antitela opisana u ovom tekstu uključuju i kamelizovana jednodomenska antitela. Vidi, npr., Muyldermans et al. (2001) Trends Biochem. Sci.26:230; Reichmann et al. (1999) J. Immunol. Methods 231:25; WO 94/04678; WO 94/25591; U.S. pat. br. 6,005,079). Predmetna objava obezbeđuje jednodomenska antitela koja sadrže dva VHdomena sa modifikacijama, tako da se formiraju jednodomenska antitela.

[0039] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "dijatela" odnosi se na male fragmente antitela sa dva antigen-vezujuća mesta, fragmenti uključuju varijabilni domen teškog lanca (VH) spojen sa varijabilnim domenom lakog lanca (VL) u istom polipeptidnom lancu (VH-VLili VL-VH). Korišćenjem linkera koji je suviše kratak da bi omogućio sparivanje između dva domena na istom lancu, domeni su prinuđeni da se sparuju sa komplementarnim domenima drugog lanca i stvore dva antigen-vezujuća mesta. Dijatela su opisana potpunije u, npr., EP 404,097; WO 93/11161; i Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448. Za pregled inženjerisanih varijanti antitela uopšte, vidi Holliger and Hudson (2005) Nat. Biotechnol.

23:1126-1136.

[0040] Tipično, antitelo ili antigen-vezujući fragment pronalaska zadržavaju najmanje 10% svoje aktivnosti vezivanja za humani PD-L1 (u poređenju sa roditeljskim antitelom) kada se ta aktivnost izražava na molarnoj osnovi. Poželjno, antitelo ili antigen-vezujući fragment pronalaska zadržavaju najmanje 20%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% ili 100% ili više afiniteta vezivanja za humani PD-L1 u odnosu na roditeljsko antitelo. Predviđeno je takođe da antitelo ili antigen-vezujući fragment, opisani u ovom tekstu, mogu uključiti konzevativne ili nekonzervativne aminokiselinske supstitucije (ovde označene kao "konzervativne varijante" ili "funkcionalno konzervirane varijante" antitela) koje suštinski ne menjaju njegovu biološku aktivnost.

[0041] "Izolovano antitelo" označava stanje prečišćenosti i u tom kontekstu označava molekul koji suštinski ne sadrži druge biološke molekule kao što su nukleinske kiseline, proteini, lipidi, ugljeni hidrati, ili drugi materijal kao što su ćelijski detritus ili medijum za rast. Uopšteno, izraz "izolovan" ne označava potpuno odsustvo takvog materijala ili odsustvo vode, pufera, ili soli, osim ako su oni prisutni u količinama koje bitno interferiraju sa eksperimentalnom ili terapijskom upotrebom vezujućeg jedinjenja opisanog u ovom tekstu.

[0042] Izraz "monoklonsko antitelo", kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se na populaciju suštinski homogenih antitela, tj., molekuli antitela koji čine populaciju identični su po aminokiselinskoj sekvenci, osim u pogledu mogućih prirodnih mutacija koje mogu biti prisutne u malom broju. Nasuprot tome, preparati konvencionalnih (poliklonskih) antitela tipično uključuju mnoštvo različitih antitela koja imaju različite aminokiselinske sekvence u svojim varijabilnim domenima, posebno svojim CDR, koji su često specifični za različite epitope. Modifikator "monoklonski" označava karakter antitela dobijenog iz suštinski homogene populacije antitela i ne treba ga vezivati za proizvodnju antitela nekim posebnim metodom. Na primer, monoklonska antitela koja će se upotrebiti u skladu sa predmetnim pronalaskom mogu biti napravljena metodom hibridoma koji su prvi opisali Kohler et al. (1975) Nature 256: 495, ili se može napraviti metodima rekombinantne DNK (vidi, npr., U.S.

1

pat. br. 4,816,567). "Monoklonska antitela" mogu se izolovati i iz biblioteka antitela na fagima, korišćenjem tehnika opisanih u Clackson et al. (1991) Nature 352: 624-628 i Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222: 581-597, na primer. Vidi i Presta (2005) J. Allergy Clin. Immunol. 116:731.

[0043] Uopšteno, osnovna strukturna jedinica antitela uključuje tetramer. Svaki tetramer sadrži dva identična para polipeptidnih lanaca, svaki par ima jedan "laki" (oko 25 kDa) i jedan "teški" lanac (oko 50-70 kDa). Aminoterminalni deo svakog lanca sadrži varijabilni region od oko 100 do 110 ili više amino-kiselina, prvenstveno odgovornih za prepoznavanje antigena. Karboksi-terminalni deo teškog lanca može definisati konstantni region prvenstveno odgovoran za efektorsku funkciju. Tipično, humani laki lanci klasifikuju se kao kapa i lambda laki lanci. Pored toga, humani teški lanci se tipično klasifikuju kao mi, delta, gama, alfa, ili epsilon, i definišu izotip antitela kao IgM, IgD, IgG, IgA, odnosno IgE. U okviru lakih i teških lanaca, varijabilni i konstantni regioni spojeni su "J" regionom od oko 12 ili više aminokiselina, s tim što teški lanac uključuje i "D" region od oko još 10 aminokiselina. Vidi, uopšteno, Fundamental Immunology Ch.7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989).

[0044] Varijabilni regioni svakog para lakog i teškog lanca formiraju vezujuće mesto antitela. Prema tome, uopšteno, intaktno antitelo ima dva vezujuća mesta. Osim u bifunkcionalnim ili bispecifičnim antitelima, dva vezujuća mesta su uglavnom ista.

[0045] Tipično, varijabilni domeni teškog i lakog lanca uključuju tri hipervarijabilna regiona, nazvana i regioni koji određuju komplementarnost (complementarity determining regions, CDR), locirana u relativno konzerviranim regionima okvira (framework regions, FR). CDR se obično poravnavaju regionima okvira, što omogućava vezivanje za specifični epitop. Uopšteno, od N-terminusa do C-terminusa, varijabilni domeni lakog i teškog lanca uključuju FR1, CDR1, FR2 , CDR2, FR3, CDR3 i FR4. Pripisivanje amino-kiselina svakom domenu obično je u skladu sa definicijama Sequences of Proteins of Immunological Interest, Kabat, et al.; National Institutes of Health, Bethesda, Md.; 5th ed.; NIH publ. br.91-3242 (1991); Kabat (1978) Adv. Prot. Chem. 32:1-75; Kabat, et al., (1977) J. Biol. Chem. 252:6609-6616; Chothia, et al., (1987) J Mol. Biol. 196:901-917 ili Chothia, et al., (1989) Nature 342:878-883.

[0046] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "hipervarijabilni region" odnosi se na aminokiselinske rezidue antitela koje su odgovorne za vezivanje sa antigenom.

1

Hipervarijabilni region uključuje aminokiselinske rezidue iz "regiona koji određuje komplementarnost" ili "CDR" (tj. CDRL1, CDRL2 i CDRL3 u varijabilnom domenu lakog lanca i CDRH1, CDRH2 i CDRH3 u varijabilnom domenu teškog lanca). Vidi Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (definiše CDR regione antitela po sekvenci); vidi i Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917 (definiše CDR regione antitela po strukturi). Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "okvirne" ili "FR" rezidue odnosi se na rezidue varijabilnog domena različite od rezidua hipervarijabilnog regiona definisanih ovde kao CDR rezidue.

[0047] "Homologni" označava sekvencionu sličnost između dve sekvence polinukleotida ili između dve sekvence polipeptida, kada se optimalno poravnaju. Kada se na poziciji u obe poravnate sekvence nalazi ista bazna ili aminokiselinska monomerna subjedinica, npr., ako se na poziciji u svakom od dva molekula DNK nalazi adenin, onda su molekuli homologni za tu poziciju. Procenat homologije je broj homolognih pozicija za dve sekvence podeljen ukupnim brojem upoređivanih pozicija × 100. Na primer, ako se 8 od 10 pozicija u dve sekvence poklapa ili su homologne kada se sekvence optimalno poravnaju, onda homologija sekvenci iznosi 80%. Upoređivanje se obično vrši kada su dve skevence poravnate da bi dale maksimalan procenat homologije. Na primer, upoređivanje se može vršiti BLAST algoritmom, pri čemu se parametri algoritma biraju tako da daju najveće poklapanje između respektivnih sekvenci čitavom dužinom respektivnih referentnih sekvenci.

[0048] "Izolovani molekul nukleinske kiseline" označava DNK ili RNK genomskog, iRNK, cDNK ili sintetskog porekla, ili neke njihove kombinacije, koje nisu udružene sa svim ili delom polinukleotida u kojem se izolovani polinukleotid nalazi u prirodi, ili su povezane sa polinukleotidom sa kojim nisu prirodno povezane. Za potrebe ove objave, treba razumeti da "molekul nukleinske kiseline koji uključuje" određenu nukleotidnu sekvencu ne obuhvata intaktne hromozome. Izolovani molekuli nukleinske kiseline "koji uključuju" specifikovane sekvence nukleinske kiseline mogu sadržati, pored specifikovanih sekvenci, kodirajuće sekvence za najviše deset ili čak za najviše dvadeset ili više drugih proteina ili njihovih delova ili fragmenata, ili mogu sadržati operabilno povezane regulatorne sekvence koje kontrolišu ekspresiju kodirajućeg regiona navedenih sekvenci nukleinske kiseline, i/ili mogu sadržati vektorske sekvence.

1

[0049] Izraz "kontrolne sekvence" odnosi se na DNK sekvence neophodne za ekspresiju operabilno povezane kodirajuće sekvence u određenom organizmu-domaćinu. Kontrolne sekvence pogodne za prokariote, na primer, uključuju promotor, opciono operatorsku sekvencu i mesto za vezivanje ribozoma. Poznato je da eukariotske ćelije koriste promotore, poliadenilacione signale i enhensere.

[0050] Nukleinska kiselina je "operabilno povezana" kada se nalazi u funkcionalnom odnosu sa drugom sekvencom nukleinske kiseline. Na primer, DNK za presekvencu ili sekretorni lider, operabilno je povezana sa DNK za polipeptid ako se eksprimira kao preprotein koji učestvuje u sekreciji polipeptida; promotor ili enhenser je operabilno povezan sa kodirajućom sekvencom ako utiče na transkripciju sekvence; ili mesto za vezivanje ribozoma operabilno je povezano sa kodirajućom sekvencom ako je smešteno tako da olakšava translaciju. Obično, "operabilno povezan" označava da su povezane DNK sekvence u kontinuitetu i, u slučaju sekretornog lidera, u kontinuitetu i u fazi čitanja. Međutim, enhenser ne mora biti postavljen u kontinuitetu. Povezivanje se obavlja ligacijom na pogodnim restrikcionim mestima. Ako takva mesta ne postoje, sintetski oligonukleotidni adaptori ili linkeri koriste se u skladu sa uobičajenom praksom.

[0051] Kako se koristi u ovom tekstu, izrazi "ćelija", "ćelijska linija" i "ćelijska kultura" koriste se naizmenično, a sva takva imenovanja uključuju i potomstvo. Prema tome, reči "transformanti" i "transformisane ćelije" obuhvataju primarnu subjekatsku ćeliju i iz nje izvedene kulture, bez obzira na broj transfera. Isto tako, podrazumeva se da, zbog namernih ili nehotičnih mutacija, svo potomstvo neće imati potpuno identičan sadržaj DNK. Obuhvaćeno je i mutantno potomstvo koje ima istu funkciju ili biološku aktivnost prema kojima je odabrana originalna transformisana ćelija. Ako postoji potreba za različitim imenovanjima, razumeće se iz konteksta.

[0052] Kako se koristi u ovom tekstu, "lančana reakcija polimeraze" ili "PCR" odnosi se na postupak ili tehniku u kojoj se specifične sekvence nukleinske kiseline, RNK i/ili DNK, amplifikuju kako je opisano npr., u U.S. pat. br. 4,683,195. Uopšteno, informacije o sekvenci sa krajeva regiona od interesa ili dalje od toga, koriste se za dizajniranje oligonukleotidnih prajmera. Ovi prajmeri će biti identični ili slični po sekvenci sa naspramnim lancima templata koji će se amplifikovati.5' terminalni nukleotidi dva prajmera mogu koincidirat sa krajevima amplifikovanog materijala. PCR se može koristiti za amplifikovanje specifičnih RNK

1

sekvenci, specifičnih DNK sekvenci iz ukupne genomske DNK i cDNK transkribovane sa ukupne ćelijske RNK, bakterifagnih ili plazmidnih sekvenci, itd. Vidi uopšteno Mullis et al. (1987) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263; Erlich, ed., (1989) PCR TECHNOLOGY (Stockton Press, N.Y.) Kako se koristi u ovom tekstu, PCR se smatra za jedan, ali ne jedini primer metoda reakcije polimeraze nukleinskih kiselina za amplifikovanje testnog uzorka nukleinske kiseline, koji uključuje upotrebu poznate nukleinske kiseline kao prajmera i polimeraze nukleinske kiseline, za amplifikovanje ili generisanje specifičnog dela nukleinske kiseline.

[0053] Kako se koristi u ovom tekstu, "sekvenca germinativne linije" odnosi se na sekvencu nerearanžiranih imunoglobulinskih DNK sekvenci. Može se koristiti svaki pogodan izvor nerearanžiranih imunoglobulinskih sekvenci. Humane sekvence germinativne linije mogu se dobiti, na primer, iz JOINSOLVER® baze podataka germinativne linije na veb-stranici Nacionalnog instituta za artritis i mišićno-skeletna i kožna oboljenja Nacionalnih instituta za zdravlje Sjedinjenih Američkih Država. Mišje sekvence germinativne linije mogu se dobiti, na primer, kao što je opisano u Giudicelli et al. (2005) Nucleic Acids Res.33:D256-D261.

Fizičke i funkcionalne osobine primera anti-PD-L1 antitela

[0054] Predmetni pronalazak obezbeđuje izolovana anti-PD-L1 antitela i metode upotrebe antitela ili njihovih antigen-vezujućih fragmenata u detekciji ekspresije PD-L1 na površini ćelija. Primeri anti-PD-L1 antitela pronalaska su: antitela 20C3 i 22C3 (vidi Slike 1 i 2). Antitela 20C3 i 22C3 se vezuju za neidentične, ali susedne epitope (vidi Primer 2 i Slika 9), što ukazuje da se CDR ova dva antitela mogu pomešati da bi se izvela dodatna antitela, kao što je opisano u ovom tekstu, koja se specifično vezuju za PD-L1 na jednom ili oba ova epitopa. Prema tome, kao što je opisano u ovom tekstu, izolovano antitelo ili njegov antigenvezujući fragment, koji se vezuju za humani PD-L1 mogu uključivati tri regiona koji određuju komplementarnost (CDR) lakog lanca i tri CDR teškog lanca, prikazana u Tabelama 1 do 3 u nastavku ovog teksta.

1

Teški lanac

2

Tabela 2. Karakteristike monoklonskog antitela MEB037.22C3

2

[0055] "Konzervativno modifikovane varijante" ili "konzervativna supstitucija", odnose se na supstitucije amino-kiselina u proteinu drugim aminokiselinama koje imaju slične karakteristike (npr. naelektrisanje, veličinu bočnog lanca, hidrofobnost/hidrofilnost, konformaciju i rigidnost osovine, itd.), tako da se promene često mogu praviti a da se ne promeni biološka aktivnost proteina. Stručnjaci u oblasti će prepoznati da, obično, pojedinačne aminokiselinske supstitucije u neesencijalnim regionima polipeptida suštinski ne menjaju biološku aktivnost (vidi, npr., Watson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (4th Ed.)). Pored toga, manje je verovatno da će supstitucije strukturno ili funkcionalno sličnih amino-kiselina remetiti biološku aktivnost. Primeri konzervativnih supstitucija predmetne objave navedeni su u Tabeli 4.

TABELA 4. Primeri konzervativnih aminokiselinskih supstitucija

[0056] U predmetnom pronalasku razmatraju se i funkcionalno-konzervativne varijante antitela objave. "Funkcionalno-konzervativne varijante", kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se na antitela ili fragmente u kojima su jedna ili više aminokiselinskih rezidua izmenjene bez menjanja željene osobine, na primer afiniteta i/ili specifičnosti prema antigenu. Takve varijante uključuju, ali se ne ograničavaju na zamenu amino-kiseline onom koja ima slične osobine, kao što su konzervativne aminokiselinske supstitucije iz Tabele 4.

[0057] U sledećem primeru izvođenja, pronalazak uključuje antitelo ili njegov antigenvezujući fragment koji se specifično vezuju za PD-L1 i imaju VLdomene i VHdomene i dele 100% sekvencione homologije sa lakim i teškim lancem zrelih varijabilnih regiona iz Tabela 1 ili 2.

Nukleinske kiseline

[0058] Predmetni pronalazak obezbeđuje i nukleinske kiseline koje kodiraju imunoglobulinske lance anti-PD-L1 antitela i antigen-vezujuće fragmente objavljene u ovom tekstu. Predmetni pronalazak uključuje nukleinske kiseline koje kodiraju amino-kiseline zrelih varijabilnih regiona lakog i teškog lanca iz Tabela 1 ili 2, pri čemu je X u SEQ ID NO:32 Q.

[0059] Uopšteno, nukleinske kiseline se hibridizuju pod uslovima niske, umerene ili visoke stringencije i kodiraju antitela koja zadržavaju sposobnost specifičnog vezivanja za PD-L1.

2

Jedan molekul nukleinske kiseline "može da se hibridizuje" sa drugim molekulom nukleinske kiseline kada jednolančana forma prvog molekula nukleinske kiseline može da se spoji sa drugim molekulom nukleinske kiseline pod odgovarajućim uslovima temperature i jonske snage rastvora (vidi Sambrook, et al., gore). Uslovi temperature i jonske snage određuju "stringentnost" hibridizacije. Tipični hibridizacioni uslovi niske stringencije uključuju 55 °C, 5X SSC, 0.1% SDS, u odsustvu formamida; ili 30% formamid, 5X SSC, 0.5% SDS na 42 °C. Tipični hibridizacioni uslovi umerene stringencije su 40% formamid, sa 5X ili 6X SSC i 0.1% SDS na 42 °C. Hibridizacioni uslovi visoke stringencije su 50% formamid, 5X ili 6X SSC na 42 °C ili, opciono, na višoj temperaturi (npr., 57 °C, 59 °C, 60 °C, 62 °C, 63 °C, 65 °C ili 68°C). Uopšteno, SSC je 0.15 M NaCl i 0.015 M Na-citrat. Hibridizacija zahteva da dve nukleinske kiseline sadrže komplementarne sekvence, mada su, zavisno od stringencije hibridizacije, pogrešna sparivanja baza moguća. Odgovarajuća stringencija za hibridizaciju nukleinskih kiselina zavisi od dužine nukleinskih kiselina i stepena komplementacije, varijabli dobro poznatih u struci. Što je veći stepen sličnosti ili homologije dveju nukleotidnih sekvenci, viša je stringencija pod kojom nukleinske kiseline mogu da se hibridizuju. Za hibride duže od 100 nukleotida, izvedene su jednačine za izračunavanje temperature topljenja (vidie Sambrook, et al., gore, 9.50-9.51). Za hibridizaciju sa kraćim nukleinskim kiselinama, npr., oligonukleotidima, pozicija pogrešnog sparivanja postaje važnija, a dužina oligonukleotida određuje njegovu specifičnost (vidi Sambrook, et al., gore, 11.7-11.8).

[0060] Reference koje slede u vezi su sa BLAST algoritmima koji se često koriste u analizi sekvence: BLAST ALGORITHMS: Altschul, S.F., et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410; Gish, W., et al., (1993) Nature Genet. 3:266-272; Madden, T.L., et al., (1996) Meth. Enzymol.

266:131-141; Altschul, S.F., et al., (1997) Nucleic Acids Res.25:3389-3402; Zhang, J., et al., (1997) Genome Res. 7:649-656; Wootton, J.C., et al., (1993) Comput. Chem. 17:149-163; Hancock, J.M. et al., (1994) Comput. Appl. Biosci. 10:67-70; ALIGNMENT SCORING SYSTEMS: Dayhoff, M.O., et al., "A model of evolutionary change in proteins." u Atlas of Protein Sequence and Structure, (1978) vol. 5, dodatak 3. M.O. Dayhoff (ed.), str. 345-352, Natl. Biomed. Res. Found., Washington, DC; Schwartz, R.M., et al., "Matrices for detecting distant relationships" u Atlas of Protein Sequence and Structure, (1978) vol. 5, dodatak 3". M.O. Dayhoff (ed.), str.353-358, Natl. Biomed. Res. Found. Washington, DC; Altschul, S.F., (1991) J. Mol. Biol.219:555-565; States, D.J., et al., (1991) Methods 3:66-70; Henikoff, S., et

2

al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919; Altschul, S.F., et al., (1993) J. Mol. Evol. 36:290-300; ALIGNMENT STATISTICS: Karlin, S., et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268; Karlin, S., et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877; Dembo, A., et al., (1994) Ann. Prob.22:2022-2039; i Altschul, S.F. "Evaluating the statistical significance of multiple distinct local alignments." u Theoretical and Computational Methods in Genome Research (S. Suhai, ed.), (1997) str.1-14, Plenum, New York.

[0061] U nekim primerima izvođenja, pronalazak obezbeđuje izolovanu nukleinsku kiselinu koja kodira laki lanac i teški lanac, pro zahtevu, na jednom molekulu nukle in inske kiseline, a u drugom primeru izvođenja laki i teški lanac se kodiraju na odvojenim molekulima nukleinske kiseline. U sledećem primeru izvođenja nukleinske kiseline kodiraju još i signalnu sekvencu.

[0062] Predmetni pronalazak obezbeđuje i ekspresione vektore koji uključuju izolovane nukleinske kiseline pronalaska, pri čemu je nukleinska kiselina operabilno povezana sa kontrolnim sekvencama koje ćelija-domaćin prepoznaje kada bude transfektovana vektorom. Obezbeđene su i ćelije-domaćini koje sadrže ekspresioni vektor predmetnog pronalaska. U ovom tekstu opisani su i metodi proizvodnje antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta opisani u ovom tekstu, koji uključuju kultivisanje ćelije-domaćina koja nosi ekspresioni vektor kodirajući za antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment u kultivacionom medijumu i izolovanje antigena ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta iz ćelije-domaćina ili kultivacionog medijuma.

Vezivanje epitopa

[0063] U ovom tekstu opisana su antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti koji blokiraju vezivanje antitela 20C3 ili 22C3 za humani PD-L1, vezujući se za isti epitop kao 20C3, odnosno 22C3. Takva antitela i njihovi vezujući fragmenti mogu se identifikovati korišćenjem bilo koje unakrsno-blokirajuće ili kompeticione analize poznate u struci, uključujući Octet kompeticione analize opisane u Primeru 2, praćene identifikovanjem epitopa na humanom PD-L1 za koji se vezuje unakrsno blokirajuće antitelo. Smatra se da jedno antitelo unakrsno blokira vezivanje drugog antitela ako prethodno vezivanje prvog antitela za cilj, do zasićenja, povećava koncentraciju drugog antitela potrebnu za dostizanje polovine maksimalnog

2

vezivanja za cilj za 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 100, 200 puta ili više. Vezujući epitop za unakrsno blokirajuće antitelo može se identifikovati korišćenjem tehnika dobro poznatih u struci.

[0064] Jedna takva tehnika mapiranja epitopa je razmena vodonik/deuterijum, povezana sa proteolizom i masenom spektrometrijom (hydrogen/deuterium exchange coupled with proteolysis and mass spectrometry, HDX-MS). Ovaj metod se zasniva na pouzdanom merenju i upoređivanju stepena inkorporacije deuterijuma u antigen kada se on inkubira u teškoj vodi (D2O) sam i u prisustvu svog antitela, tokom različitih vremenskih intervaa. Deuterijum se razmenjuje sa vodonikom na amidnoj osovini proteina u izloženim područjima, dok će regioni antigena vezani za antitelo biti zaštićeni i analizom proteolitičkih fragmenata tečnom hromatografijom-tandemskom masenom spektrometrijom liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS) pokazaće se manja razmena ili odsustvo razmene.

[0065] Na osnovu mapiranja epitopa putem HDX-MS, opisanog u Primeru 3, pretpostavljeni epitop na zrelom humanom PD-L1 za antitelo 22C3 uključuje rezidue u dva diskontinuirana aminokiselinska segmenta u vanćelijskom domenu (SEQ ID NO:38): 156 do 178 i 196 do 206. Dodatne rezidue epitopa su verovatno prisutne u sledećim segmentima vanćelijskog domena (SEQ ID NO:38): 3 do 9; 10 do 13; 88 do 93 i 135 do 147.

[0066] Prema tome, kao što je opisano u ovom tekstu, antitelo koje blokira vezivanje antitela 22C3 za humani PD-L1 time što se vezuje za isti epitop kao 22C3, vezuje se za rezidue u prvom aminokiselinskom segmentu, od 156 do 178 SEQ ID NO:38, i za rezidue u drugom aminokiselinskom segmentu, od 196 do 206 SEQ ID NO:38, a vezuje se i za rezidue u bilo kojem jednom, dva, tri ili sva četiri sledeća segmenta SEQ ID NO:38: amino-kiseline 3 do 9; amino-kiseline 10 do 13; amino-kiseline 88 do 93 i amino-kiseline 135 do 147.

Metodi spravljanja antitela i njihovih antigen-vezujućih fragmenata

[0067] Ćelije hibridoma, koje proizvode roditeljska (npr. glodarska) monoklonska anti-X antitela mogu se proizvesti metodima opštepoznatim u struci. Ovi metodi uključuju, ali se ne ograničavaju na tehnike hibridoma koje su originalno razvili Kohler, et al., (1975) (Nature 256:495-497), kao i tehnike trioma (Hering, et al., (1988) Biomed. Biochim. Acta. 47:211-216 i Hagiwara, et al., (1993) Hum. Antibod. Hybridomas 4:15), tehnike hibridoma humanih B-ćelija (Kozbor, et al., (1983) Immunology Today 4:72 i Cote, et al., (1983) Proc. Natl.

2

Acad. Sci. U.S.A 80:2026-2030), tehnike EBV-hibridoma (Cole, et al., u: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., str.77-96, 1985), i elektrofuziju baziranu na električnom polju uz korišćenje Cyto Pulse fuzionog elektroporatora sa velikom komorom (Cyto Pulse Sciences, Inc., Glen Burnie, MD). Poželjno, mišji splenociti se izoluju i fuzionišu pomoću PEG ili elektrofuzije, sa ćelijskom linijom mišjeg mijeloma, u skladu sa standardnim protokolima.

[0068] Dobijeni hibridomi mogu zatim da se pretraže u pogledu proizvodnje antigenspecifičnih antitela. Na primer, suspenzije pojedinačnih ćelija slezinskih limfocita iz imunizovanih miševa mogu se spojiti sa jednom šestinom broja P3X63-Ag8.653 nesekretujućih mijeloma ćelija miša (ATCC, CRL 1580) uz 50% PEG. Ćelije mogu da se zaseju pri gustini od približno 2 x 10<5>ćelija/mL, na ploči za mikrotitraciju sa ravnim dnom, posle čega sledi inkubacija u trajanju od dve nedelje, u selektivnom medijumu koji sadrži 20% fetalni Clone serum, 18% "653" kondicionirani medijum, 5% origen (IGEN), 4 mM L-glutamin, 1 mM L-glutamin, 1 mM natrijum piruvat, 5 mM HEPES, 0.055 mM 2-merkaptoetanol, 50 jedinica/ml penicilina, 50 mg/ml streptomicina, 50 mg/ml gentamicina i 1X HAT (Sigma; HAT se dodaje 24 sata posle spajanja). Posle dve nedelje, ćelije mogu da se kultivišu u medijumu koji umesto HAT sadrži HT. Pojedinačni bunarčići mogu da se pretražuju pomoću ELISA na anti-X monoklonska IgG antitela. Kada dođe do ekstenzivnog rasta hibridoma, medijum se zapaža obično posle 10-14 dana. Hibridomi koji sekretuju antitelo mogu se ponovo zasejati, ponovo pretražiti i, ako su i dalje pozitivni na humana IgG anti-X monoklonska antitela, mogu se subklonirati najmanje dva puta, ograničavanjem razblaženja.

[0069] Stabilni subklonovi mogu se zatim kultivisati in vitro da bi dali male količine antitela u medijumu za kulturu tkiva, za karakterizaciju. Na primer, iz ćelijske linije hibridoma miša MEB037.22C3.138 može se proizvesti i prečistiti oko 1 gram 22C3 antitela, korišćenjem sledećeg postupka. Zamrznute MEB037.22C3.138 ćelije se odmrznu i adaptiraju u flakonu za mućkanje, uz korišćenje medijuma za hibridom koji ne sadrži serum, u prisustvu 2 mM dodatnog L-glutamina, sa ili bez 0.18% Pluronic F-68. Prisustvo Pluronic F-68 može poboljšati vijabilnost kulture u flakonu za mućkanje. Posle potpune adaptacije ćelija u flakonu za mućkanje, dvadesetlitarska proizvodna kultura se izvede u medijumu bez seruma, u WAVE bioreaktoru (GE Healthcare Life Sciences) uz dodavanje 10% CHO CD efikasnog

2

hranljivog medijuma B (Invitrogen, Catalogue#A10240-01). Za ekspanziju ćelija, u maloj WAVE kesi se inicira jednolitarska kultura, a zatim se 1 L WAVE kulture ekspandira u dvadesetlitarsku kulturu u WAVE bioreaktoru. Dvadesetlitarska kultura može se inicirati pri gustini od 0.5 x 106 vijabilnih ćelija/mL, hranjenih korišćenjem 10% CHO CD efikasnog hranljivog medijuma B na Dan 1 i na pH koji se dnevno podešava pomoću 1 N Na2CO3. Ćelije se sakupljaju posle četiri dana. Mali uzorci mogu da se sakupljaju dnevno za NOVA analizu.

[0070] Anti-hPD-Ll antitela mogu da se prečiste iz kulture hibridoma sledećim postupkom. Kultura hibridoma se izbistri dubinskom filtracijom uz korišćenje 1.2 mikrometarskog staklenog vlakna i 0.2 mikrometarskog celuloza-acetatnog filtera. Jednaka zapremina 2X ProSepA pufera (100 mM borna kiselina, 5 M NaCl, pH 8.5) doda se izbistrenom sakupljenom materijalu i razblaženi sakupljeni materijal se nanese na kolonu sa proteinom-A sa zapreminom ležišta od 170 mL. Kolona se ispere sa 5 zapremina kolone (column volumes, CV) 1X ProSepA pufera (50 mM borna kiselina, 2.5 M NaCl, pH 8.5), zatim se ispere sa 2 CV 1X PBS i anti-hPD-L1 antitelo se eluira sa 5 CV elucionog pufera (0.1 M glicin, pH 3.0). Eluirane frakcije koje sadrže IgG se kombinuju i pH se neutrališe dodavanjem 1/10 zapremine 1.0 M Tris, pH pufera. Neutralisana kompozicija antitela se zatim sterilno filtrira korišćenjem 10 kDa TFF kasete za jednokratnu upotrebu. Antitelo može da se formuliše za skladištenje dijafiltracijom naspram 10 litara formulacionog pufera (20 mM natrijum acetat, 9% saharoza, pH 5.0) i korišćenjem izmena u količini od 20 zapremina. Korišćenjem ovog protokola, može se pripremiti antitelo 22C3 u koncentraciji od oko 5.0 mg/ml koje ima čistoću od najmanje 98%, prema SDS-PAGE, SEC HPLC i C8 RP-HPLC merenjima, sa nivoom endotoksina manjim od 0.1 EU/ml i manjim od 0.02 EU/mg.

[0071] Anti-PD-Ll antitela objavljena u ovom tekstu mogu se proizvesti i rekombinantno (npr., u E. coli/T7 ekspresionom sistemu, kako je rečeno gore). U ovom primeru izvođenja, nukleinske kiseline koje kodiraju molekule antitela pronalaska (npr., VHili VL) mogu se insertovati u pET-bazirani plazmid i eksprimirati u E. coli/T7 sistemu. Postoji nekoliko u struci poznatih metoda kojima se proizvode rekombinantna antitela. Jedan primer metoda rekombinantne proizvodnje antitela objavljen je u U.S. patentu br.4,816,567. Transformacija može da se izvrši bilo kojim poznatim metodom introdukcije polinukleotida u ćelijudomaćina. Metodi introdukcije heterolognih polinukleotida u sisarske ćelije dobro su poznati u struci i uključuju transfekciju posredovanu dekstranom, precipitaciju kalcijum-fosfatom, transfekciju posredovanu polibrenom, fuziju protoplasta, elektroporaciju, inkapsulaciju polinukleotida u lipozome, biolističko injektiranje i direktno mikroinjektiranje DNK u nukleus. Pored toga, molekuli nukleinske kiseline mogu da se introdukuju u sisarske ćelije virusnim vektorima. Metodi transformisanja ćelija dobro su poznati u struci. Vidi, na primer, U.S. patente br.4,399,216; 4,912,040; 4,740,461 i 4,959,455.

[0072] Anti-PD-L1 antitela mogu da se sintetišu i bilo kojim od metoda navedenih u U.S. patentu br.6,331,415.

[0073] Sisarske ćelijske linije raspoložive kao domaćini za ekspresiju antitela ili fragmenata objavljenih u ovom tekstu, dobro su poznati u struci i uključuju mnoge imortalisane ćelijske linije koje se mogu nabaviti od American Type Culture Collection (ATCC). One uključuju, između ostalih, ćelije ovarijuma kineskog hrčka (CHO), NSO, SP2 ćelije, HeLa ćelije, ćelije bubrega novorođenog hrčka (baby hamster kidney, BHK), ćelije bubrega majmuna (monkey kidney cells, COS), ćelije humanog hepatocelularnog karcinoma (npr., Hep G2), A549 ćelije, 3T3 ćelije, HEK-293 ćelije i brojne druge ćelijske linije. Sisarske ćelije-domaćini uključuju ćelije čoveka, miša, pacova, psa, majmuna, svinje, koze, goveda, konja i hrčka. Posebno poželjne ćelijske linije biraju se određivanjem koja ćelijska linija ima visoke nivoe ekspresije. Druge ćelijske linije koje mogu da se koriste su ćelijske linije insekata, na primer Sf9 ćelije, ćelije vodozemaca, bakterijske ćelije, biljne ćelije i ćelije gljiva. Kada se rekombinantni ekspresioni vektori koji kodiraju teški lanac ili njegov antigen-vezujući deo ili fragment, laki lanac i/ili njegov antigen-vezujući fragment, introdukuju u sisarske ćelije-domaćine, antitela se proizvode kultivisanjem ćelija-domaćina tokom vremenskog perioda dovoljno dugog da se omogući ekspresija antitela u ćelijama-domaćinima ili, poželjnije, sekrecija antitela u medijum za kulturu u kojem se ćelije-domaćini gaje.

[0074] Antitela mogu da se izoluju iz kultivacionog medijuma koriščenjem standardnih metoda prečišćavanja proteina. Pored toga, ekspresija antitela pronalaska (ili drugih izvedenih komponenti) u proizvodnim ćelijskim linijama može se pojačati korišćenjem brojnih poznatih tehnika. Na primer, glutamin-sintetaza genski ekspresioni sistem (GS sistem) je čest pristup za pojačavanje ekspresije pod određenim uslovima. O GS sistemu govori se u celini ili delom u vezi sa Evropskim patentnima br.0 216 846, 0256 055 i 0323 997 i Evropskom patentnom prijavomi br.89303964.4.

1

[0075] Poliklonsko antitelo je antitelo proizvedeno pored ili u prisustvu jednog ili više drugih, neidentičnih antitela. Uopšteno, poliklonska antitela se proizvode kolekcijama različitih B-limfocita, npr. B-limfocita životinje tretirane imunogenom od interesa, koji proizvode populaciju različitih antitela koja su sva usmerena ka imunogenu. Obično, poliklonska antitela se dobijaju direktno iz imunizovane životinje, npr. iz slezine, seruma ili ascitne tečnosti.

[0076] Predmetni pronalazak uključuje i fragmente anti-PD-L1 antitela objavljenih u ovom tekstu. Fragmenti antitela uključuju F(ab)2fragmente koji se mogu proizvesti enzimskim sečenjem IgG uz korišćenje, na primer, pepsina. Fab fragmenti se mogu proizvesti, na primer, redukcijom F(ab)2ditiotreitolom ili merkaptoetilaminom. Fab fragment je VL-CLlanac dodat VH-CH1lancu pomoću disulfidnog mosta. F(ab)2fragment predstavlja dva Fab fragmenta povezana preko dva disulfidna mosta. Fab deo F(ab)2molekula sadrži deo Fcregiona gde s enalaze disulfidni mostovi. Fv fragment je VLili VHregion.

[0077] Imunoglobulini se mogu svrstati u različite klase u zavisnosti od amino-kiselinskih sekvenci konstantnog domena njihovih teških lanaca. Postoji najmanje pet velikih klasa imunoglobulina: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, a nekoliko njih se može dodatno podeliti u potklase (izotipove), npr. IgG-1, IgG-2, IgG-3 i IgG-4; IgA-1 i IgA-2. Pronalazak uključuje antitela i antigen-vezujuće fragmente IgG.

[0078] U jednom primeru izvođenja, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže konstantni region teškog lanca, npr. humani konstantni region, kao što su γ1, γ2, γ3, ili γ4 konstantni regioni humanog teškog lanca ili njihove varijante. U sledećem primeru izvođenja, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrže konstantni region lakog lanca, npr. humani konstantni region lakog lanca, kao što su lambda ili kapa regioni humanog lakog lanca ili njihove varijante. Kao primer, a ne kao ograničenje, konstantni region humanog teškog lanca može biti γ1, a konstantni region humanog lakog lanca može biti kapa. U alternativnom primeru izvođenja, Fc region antitela je γ4 sa Ser228Pro mutacijom (Schuurman, J et. al., Mol. Immunol.38: 1-8, 2001).

[0079] U nekim primerima izvođenja, različiti konstantni domeni mogu se dodati humanizovanim VLi VHregionima, po potrebi. Na primer, ako određena upotreba kojoj je namenjeno antitelo (ili fragment) predmetnog pronalaska zahtevala izmenjene efektorske funkcije, može se koristiti konstantni domen teškog lanca različitog od humanog IgG1, ili se može koristiti hibrid IgG1/IgG4.

2

Inženjerisanje antitela

[0080] Kao što je opisano u ovom tekstu, poželjno je izmeniti određene amino-kiseline sa izloženim bočnim lancima, drugim aminokiselinskim reziduama, da bi se obezbedila veća hemijska stabilnost finalnog antitela, na sledeći način. Do deamidacije asparagina može doći na N-G ili D-G sekvenci i njen rezultat je stvaranje izoasparaginske kiselinske rezidue koja uvodi petlju u polipeptidni lanac i smanjuje njegovu stabilnost (efekat izoasparaginske kiseline). Kako je opisano u ovom tekstu, antitela predmetne objave ne sadrže mesta asparaginskog izomerizma.

[0081] Na primer, asparaginska (Asn) rezidua može se promeniti u Gln ili Ala, da bi se smanjila mogućnost formiranja izoaspartata u nekoj od Asn-Gly sekvenci, naročito u okviru CDR. Sličan problem može nastati u sekvenci Asp-Gly. Reissner and Aswad (2003) Cell. Mol. Life Sci.60:1281. Formiranje izoaspartata može oslabiti ili potpuno prekinuti vezivanje antitela za njegov ciljni antigen. Vidi, Presta (2005) J. Allergy Clin. Immunol. 116:731 na 734. Kako je opisano u ovom tekstu, asparagin je promenjen u glutamin (Gln). Poželjna može biti i promena amino-kiseline koja se nalazi pored asparaginske (Asn) ili glutaminske (Gln) rezidue, da bi se smanjila verovatnoća deamidacije koja je češća kada se male amino-kiseline nađu pored asparagina ili glutamina. Vidi, Bischoff & Kolbe (1994) J. Chromatog. 662:261. Pored toga, svaka metioninska rezidua (tipično Met izložen rastvaraču) u CDR može biti promenjena u Lys, Leu, Ala, ili Phe, da bi se smanjila mogućnost oksidacije sumpora u metioninu, što bi moglo da smanji antigen-vezujući afinitet i doprinese molekulskoj heterogenosti u konačnom preparatu antitela. (Ista referenca). Kako je opisano u ovom tekstu, metionin je promenjen u alanin (Ala). Pored toga, da bi se sprečilo ili na najmanju meru svelo moguće raskidanje Asn-Pro peptidnih veza, može biti poželjno da se promeni bilo koja Asn-Pro kombinacija prisutna u CDR, u Gln-Pro, Ala-Pro, ili Asn-Ala. Antitela sa takvim supstitucijama će se potom pretraživati da bi se obezbedilo da supstitucije neće smanjiti afinitet ili specifičnost antitela prema humanom PD-L1, ili drugu željenu biološku aktivnost, do neprihvatljivih nivoa.

TABELA 5 Primeri stabilišućih CDR varijanti objave

Konjugati antitela

[0082] Molekuli anti-PD-L1 antitela objavljeni u ovom tekstu mogu se konjugovati i sa hemijskom komponentom kao što je radionuklid ili drugi detektabilni obeleživač. Radionuklidi uključuju<99>Tc,<90>Y,<111>In,<32>P,<14>C,<125>I,<3>H,<131>I,<11>C,<15>O,<13>N,<18>F,<35>S,<51>Cr, 57To, 226Ra, 60Co, 59Fe, 57Se, 152Eu, 67CU, 217Ci, 211At, 212Pb, 47Sc, 109Pd, 234Th, i 40K, 157Gd, 55Mn, 52Tr, i 56Fe. Fluorescentni ili hemiluminiscentni obeleživači uključuju fluorofore kao što su retki zemni helati, fluorescein i njegovi derivati, rodamin i njegovi derivati, izotiocijanat, fikoeritrin, fikocijanin, alofikocijanin, o-ftalaldehid, fluorescamin, 152Eu, dansil, umbeliferon, luciferin, luminalni obeleživač, izoluminalni obeleživač, aromatični akridinijumestraski obeleživač, imidazolski obeleživač, akridinijumski slani obeleživač, oksalatni estarski obeleživač, ekvorinski obeleživač, 2,3-dihidroftalazindioni, biotin/avidin, spin-obeleživači i stabilni slobodni radikali.

[0083] Za konjugovanje molekula antitela sa različitim komponentama može se upotrebiti bilo koji metod poznat u struci, uključujući metode koje su opisali Hunter, et al., (1962) Nature 144:945; David, et al., (1974) Biochemistry 13:1014; Pain, et al., (1981) J. Immunol. Meth. 40:219; i Nygren, J., (1982) Histochem. and Cytochem. 30:407. Metodi konjugovanja antitela su konvencionalni i veoma dobro poznati u struci.

Eksperimentalna i dijagnostička upotreba

[0084] Anti-PD-L1 antitela i fragmenti antitela objavljeni u ovom tekstu mogu se koristiti za specifično detektovanje humanog PD-L1 eksprimiranog na površini ćelije. Ćelija se može nalaziti u uzorku tkiva ili seruma, dobijenim od čoveka, a detekcija ekspresije PD-L1 obavlja se korišćenjem nekog od različitih in vitro testnih metoda poznatih u struci.

4

[0085] Na primer, određeni primeri izvođenja podrazumevaju ELISA testove (enzimski imunotest), koji tipično uključuje sledeće korake:

(a) obložiti supstrat (npr., površinu bunarčića mikrotitarske ploče, npr., plastične ploče) anti-PD-L1 antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom;

(b) na supstrat naneti uzorak koji treba da se testira na prisustvo humanog PD-L1; (c) isprati ploču, tako da se ukloni nevezani materijal u uzorku;

(d) naneti detektabilno obeležena antitela (npr., antitela povezana sa enzimom) koja su takođe specifična za humani PD-L1;

(e) isprati supstrat, tako da se uklone nevezana, obeležena antitela;

(f) ako su obeležena antitela vezana za enzim, naneti hemijsko sredstvo koje se konvertuje enzimom u fluorescentni signal; i

(g) detektovati prisustvo obeleženog antitela.

[0086] U sledećem primeru izvođenja, obeleženo antitelo obeleženo je peroksidazom koja reaguje sa ABTS (npr., 2,2'-azino-bis(3-etilbenztiazolin-6-sulfonska kiselina)) ili 3,3',5,5'-tetrametilbenzidinom, da bi se proizvela promena boje koja se može detektovati. Alternativno, obeleženo antitelo obeleženo je detektabilnim radioizotopom (npr.,<3>H) koji se može detektovati scintilacionim brojačem u prisustvu scintilanta.

[0087] Anti-PD-L1 antitela i njihovi antigen-vezujući fragmenti pronalaska mogu se koristiti u postupcima Western blota ili imunoproteinskog blota. Takvi postupci predstavljaju deo predmetnog pronalaska i uključuju npr:

(1) dovođenje u kontakt membrane ili drugog čvrstog supstrata koji će se testirati na prisustvo humanog PD-L1, sa antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom pronalaska. Takva membrana može biti u vidu nitrocelulozne ili na vinilu bazirane (npr., poliviniliden fluorid (polyvinylidene fluoride, PVDF)) membrane na koju su preneti proteini koji treba da se testiraju na prisustvo X u nedenaturišućem PAGE (poliakrilamid-gel elektroforeza) gelu ili SDS-PAGE (natrijum dodecil sulfat poliakrilamid-gel elektroforeza) gelu (npr., posle elektroforetske separacije u gelu). Pre kontakta membrane sa anti-PD-L1 antitelom ili fragmentom, membrana se opciono blokira, npr., obranim mlekom u prahu ili slično, tako da se zauzmu nespecifična protein-vezujuća mesta na membrani

(2) ispiranje membrane jednom ili više puta da bi se uklonili nevezano anti-PD-L1 antitelo ili fragment i druge nevezane supstance; i

(3) detektovanje vezanog anti-PD-L1 antitela ili fragmenta.

Vezano antitelo ili fragment mogu se detektovati inkubiranjem vezanog antitela ili fragmenta sa sekundarnim antitelom (antiimunoglobulinskim antitelom) koje je detektabilno obeleženo i zatim detektovanjem prisustva sekundarnog antitela.

[0088] Anti-PD-L1 antitela i njihovi antigen-vezujući fragmenti objavljeni u ovom tekstu mogu da se koriste i u imunohistohemijskim (IHC) testovima koji se mogu izvoditi korišćenjem različitih IHC formata poznatih u struci, i čine primer izvođenja pronalaska. U tipičnom IHC testu koristi se FFPE presek tkiva od oko 3-4 milimetara, i poželjno debljjine 4 mikrometara, montiran i osušen na mikroskopskoj pločici, a test uključuje, npr., (1) deparafinisanje i hidrataciju preseka tkiva, dovođenje u kontakt rehidriranog preseka tkiva sa anti-PD-L1 antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom pronalaska; i (2) detektovanje anti-PD-L1 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta na površini jedne ili više ćelija u tkivu. Ako su antitelo ili fragment sami detektabilno obeleženi, mogu se detektovati direktno. Alternativno, antitelo ili fragment mogu se vezati za detektabilno obeleženo sekundarno antitelo koje se zatim detektuje.

[0089] U poželjnom IHC testu koristi se komercijalno dostupni Dako EnVision™ FLEX detekcioni sistem namenjen upotrebi sa Dako Autostainer instrumentom (Dako, Agilent Technologies Company, Glostrup, Denmark). Kada se ovaj sistem koristi sa 22C3 antitelom, ili antitelom koje sadrži varijabilne regione teškog i lakog lanca 22C3 antitela, IHC test može da se izvede na sledeći način. Četiri mikrona debeli FFPE preseci tkiva, montirani na pločice, suše se na vazduhu preko noći, stave u termostat na 60 °C 45 minuta, deparafinišu i rehidriraju. Posle deparafinisanja, FFPE pločice se izlažu otkrivanju epitopa toplotom, korišćenjem EnVision™ FLEX High pH rastvora za otkrivanje cilja, na 97 °C, posle čega sledi držanje na sobnoj temperaturi, 20 minuta. Pločice se zatim isperu, boje korišćenjem 22C3 u koncentraciji 2 µg/mL u trajanju od 60 minuta, a zatim se vrši detektovanja korišćenjem Dako EnVision™ FLEX reagensa na sledeći način: EnVision™ FLEX+ MS Linker (15 minuta), EnVision™ FLEX/HRP (20 minuta), EnVision™ FLEX DAB (10 minuta), i DAB pojačivač (7 minuta), uz korake ispiranja između.

[0090] Kako je ovde opisano, određena anti-PD-L1 antitela i njihovi antigen-vezujući fragmenti objavljeni u ovom tekstu, mogu se koristiti i za in vivo dobijanje slike tumora. Takav metod može uključivati injektiranje radioobeleženog anti-PD-L1 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta u telo pacijenta - čoveka koji se testira na prisustvo sa tumorom udružene ekspresije PD-L1, praćeno nuklearnim dobijanjem slike tela pacijenta da bi se detektovalo prisustvo obeleženog antitela ili fragmenta npr., na mestima koja sadrže visoku koncentraciju antitela ili fragmenta koji su vezani za tumor.

[0091] Tehnike dobijanja slike uključuju SPECT dobijanje slike (single photon emission computed tomography, jednofotonska emisiona kompjuterizovana tomografija) ili PET dobijanje slike (positron emission tomography, pozitron-emisiona tomografija). Obeleživači uključuju npr., jod-123 (<123>I) i tehnicijum-99m (<99m>Tc), npr., za SPECT dobijanje slike ili<11>C, 13N, 15O ili 18F, npr., za PET dobijanje slike ili indijum-111 (vidi npr., Gordon et al., (2005) International Rev. Neurobiol. 67:385-440).

Detekcioni kitovi i terapijski kitovi

[0092] Iz praktičnih razloga, antitelo ili specifično vezujuće sredstvo, objavljeni u ovom tekstu, mogu se obezbediti kao kit, tj., pakovanje kombinacije reagenasa u unapred određenim količinama, sa uputstvima za izvođenje dijagnostičkog ili detekcionog testa. Kada je antitelo obeleženo enzimom, kit će sadržati supstrate i kofaktore koje enzim zahteva (npr., prekursor supstrata koji obezbeđuje detektabilnu hromoforu ili fluoroforu). Pored toga, mogu biti prisutni i drugi aditivi kao što su stabilizeri, puferi (npr., blokirajući pufer ili litički pufer) i slično. Relativne količine različitih reagenasa mogu široko varirati, kako bi se obezbedile koncentracije reagenasa koje suštinski optimizuju senzitivnost testa. Posebno, reagensi se mogu obezbediti u vidu suvih, obično liofilizovanih, praškova koji uključuju ekscipijente, koji će posle rastvaranja dati rastvor reagensa odgovarajuće koncentracije.

[0093] Obezbeđeni su i dijagnostički ili detekcioni reagensi i kitovi koji sadrže jedan ili više takvih reagenasa za upotrebu u različitim detekcionim testovima uključujući, na primer, imunotestove kao što je ELISA (sendvič-tip ili kompetetivni format). Komponente kita mogu biti unapred prikačene za čvrstu podlogu, ili se mogu naneti na površinu čvrste podloge prilikom korišćenja kita. U nekim primerima izvođenja, sredstvo koje proizvodi signal može biti unapred udruženo sa antitelom pronalaska ili može zahtevati kombinovanje sa jednom ili više komponenti, npr., puferima, konjugatima antitelo-enzim, enzimskim supstratima, ili slično, pre upotrebe. Kitovi mogu uključivati i dodatne reagense, npr., blokirajuće reagense za smanjenje nespecifičnog vezivanja za površinu čvrste faze, reagense za ispiranje, supstrate enzima i slično. Površina čvrste faze može biti u vidu epruvete, perlice, mikrotitarske ploče, mikrosfere ili drugih materijala pogodnih za imobilisanje proteina, peptida, ili polipeptida. U posebnim aspektima, enzim koji katališe formiranje hemiluminiscentnog ili hromogenog proizvoda ili redukciju hemiluminiscentnog ili hromogenog supstrata komponenta je sredstva za stvaranje signala. Takvi enzimi dobro su poznati u struci. Kitovi mogu uključivati neko od imobilišućih sredstava i detekcionih reagenasa opisanih u ovom tekstu. Opciono, kit može sadržati i uputstva za izvođenje metoda pronalaska.

[0094] Mogu se pripremiti i detekcioni kitovi objavljeni u ovom tekstu, koji uključuju najmanje jedno antitelo ili antigen-vezujući fragment, objavljene u ovom tekstu, i uputstva za upotrebu kompozicije kao detekcionog reagensa. Kontejneri za upotrebu u takvim kitovima mogu tipično uključivati najmanje jednu fiolu, testnu epruvetu, flakon, bocu, špric ili drugi pogodan kontejner, u koji se jedna ili više detekcionih kompozicija mogu staviti i poželjno alikvotirati. Kitovi objavljeni u ovom tekstu tipično će uključivati fiolu/fiole u zatvorenom pakovanju za komercijalnu prodaju, kao što su, npr., injekcije ili plastični kontejneri modelovani duvanjem, sa željenom fiolom/fiolama. Kada kit sadrži radioobeleženi, hromogeni, fluorogeni, ili drugi tip detektabilnog obeleživača ili detektujućeg sredstva, obeležavajuće sredstvo može biti dato u istom kontejneru kao i sama detekciona kompozicija, ili se alternativno može staviti u drugi zasebni kontejner u koji se može staviti i pogodno alikvotirati ova druga kompozicija. Alternativno, detekcioni reagens može se pripremiti u jednom kontejneru, a u većini slučajeva, kit će uključivati i sredstvo za držanje fiole/fiola u zatvorenom pakovanju za komercijalnu prodaju i/ili odgovarajuće pakovanje i dostavu.

[0095] Uređaj ili aparat za izvođenje detekcije ili praćenje metoda opisanih u ovom tekstu takođe je ovde opisan. Takav aparat može uključiti komoru ili epruvetu u koju se može staviti uzorak, sistem za rad sa tečnošću opciono uključuje ventile ili pumpe za usmeravanje proticanja uzorka kroz uređaj, opciono filtere za razdvajanje plazme ili seruma iz krvi, komore za mešanje za dodavanje imobilizacionih sredstava ili detekcionih reagenasa i, opciono, detekcioni uređaj za detektovanje količine detektabilnog obeleživača vezanog za imobilizaciono sredstvo-imunokompleks. Protok uzorka može biti pasivan (npr., kapilarnim, hidrostatičkim ili drugim silama koje ne zahtevaju dodatno upravljanje uređajem kada se uzorak unese u njega) ili aktivno (npr., primenom sile generisane mehaničkim pumpama, elektroosmotskim pumpama, centrifugalnom silom, ili povećanim vazdušnim pritiskom), ili kombinacijom aktivnih i pasivnih sila.

[0096] U ovom tekstu obezbeđen je i procesor, kompjuterski čitljiva memorija, i rutinski uskladištena na kompjuteru čitljiva memorija i prilagođena da se implementira na procesoru, za obavljanje nekog od metoda opisanih u ovom tekstu. Primeri pogodnih kompjuterskih sistema, okruženja i/ili konfiguracija uključuju personalne kompjutere, servere, ručne uređaje ili laptop uređaje, multiprocesorske sisteme, sisteme bazirane na mikroprocesorima, set top boksove, programabilnu potrošačku elektroniku, mrežne PC, minikompjutere, mejnfrejm kompjutere, distributivna kompjuterska okruženja koja uključuju bilo koji od gornjih sistema ili uređaja, ili bilo koji drugi sistem poznat u struci.

OPŠTI METODI

[0097] Standardni metodi u molekularnoj biologiji opisani su u Sambrook, Fritsch and Maniatis (1982 & 1989 2nd Edition, 2001 3rd Edition) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Wu (1993) Recombinant DNA, Vol. 217, Academic Press, San Diego, CA). Standardni metodi takođe se pojavljuju u Ausbel, et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vols.1-4, John Wiley and Sons, Inc. New York, NY, gde se opisuju kloniranje u bakterijskim ćelijama i DNK mutageneza (Vol. 1), kloniranje u sisarskim ćelijama i kvascu (Vol.2), glikokonjugati i ekspresija proteina (Vol.3), i bioinformatika (Vol.

4).

[0098] Metodi prečišćavanja proteina koji uključuju imunoprecipitaciju, hromatografiju, elektroforezu, centrifugiranje i kristalizaciju opisani su u (Coligan, et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., New York). Opisane su hemijska analiza, hemijska modifikacija, posttranslaciona modifikacija, proizvodnja fuzionih proteina, glikozilacija proteina (vidi, npr., Coligan, et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 2, John Wiley and Sons, Inc., New York; Ausubel, et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 3, John Wiley and Sons, Inc., NY, NY, pp. 16.0.5-16.22.17; Sigma-Aldrich, Co. (2001) Products for Life Science Research, St. Louis, MO; str.

45-89; Amersham Pharmacia Biotech (2001) BioDirectory, Piscataway, N.J., str. 384-391). Opisani su proizvodnja, prečišćavanje i fragmentacija poliklonskih i monoklonskih antitela (Coligan, et al. (2001) Current Protocols in Immunology, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., New York; Harlow and Lane (1999) Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Harlow and Lane, gore). Dostupne su standardne tehnike karakterizacije interakcija ligand/receptor (vidi, npr., Coligan, et al. (2001) Current Protocols in Immunology, Vol.4, John Wiley, Inc., New York).

[0099] Mogu se pripremiti monoklonska, poliklonska i humanizovana antitela (vidi, npr., Sheperd and Dean (eds.) (2000) Monoclonal Antibodies, Oxford Univ. Press, New York, NY; Kontermann and Dubel (eds.) (2001) Antibody Engineering, Springer-Verlag, New York; Harlow and Lane (1988) Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, str. 139-243; Carpenter, et al. (2000) J. Immunol. 165:6205; He, et al. (1998) J. Immunol. 160:1029; Tang et al. (1999) J. Biol. Chem. 274:27371-27378; Baca et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:10678-10684; Chothia et al. (1989) Nature 342:877-883; Foote and Winter (1992) J. Mol. Biol.224:487-499; U.S. pat. br.6,329,511).

[0100] Alternativa humanizaciji je upotreba biblioteka humanih antitela prikazanih na fagima ili biblioteka humanih antitela u transgenim miševima (Vaughan et al. (1996) Nature Biotechnol. 14:309-314; Barbas (1995) Nature Medicine 1:837-839; Mendez et al. (1997) Nature Genetics 15:146-156; Hoogenboom and Chames (2000) Immunol. Today 21:371-377; Barbas et al. (2001) Phage Display: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Kay et al. (1996) Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, Academic Press, San Diego, CA; de Bruin et al. (1999) Nature Biotechnol.17:397-399).

[0101] Prečišćavanje antigena nije neophodno za generisanje antitela. Životinje se mogu imunizovati ćelijama koje nose antigen od interesa. Splenociti se zatim mogu izolovati iz imunizovanih životinja i fuzionisati sa ćelijskom linijom mijeloma da bi se proizveo hibridom

4

(vidi, npr., Meyaard et al. (1997) Immunity 7:283-290; Wright et al. (2000) Immunity 13:233-242; Preston et al., gore; Kaithamana et al. (1999) J. Immunol. 163:5157-5164).

[0102] Antitela se mogu konjugovati, npr., sa lekovima sa malim molekulima, enzimima, lipozomima, polietilen glikolom (polyethylene glycol, PEG). Antitela su korisna za upotrebu u terapiji, dijagnostici, kitovima ili za druge namene, i obuhvataju antitela kuplovana, npr., za boje, radioizotope, enzime, ili metale, npr., koloidno zlato (vidi, npr., Le Doussal et al. (1991) J. Immunol. 146:169-175; Gibellini et al. (1998) J. Immunol. 160:3891-3898; Hsing and Bishop (1999) J. Immunol. 162:2804-2811; Everts et al. (2002) J. Immunol. 168:883-889).

[0103] Na raspolaganju su metodi protočne citometrije, koji uključuju sortiranje ćelija aktiviranih fluorescencijom (fluorescence activated cell sorting, FACS) (vidi, npr., Owens, et al. (1994) Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ; Givan (2001) Flow Cytometry, 2nd ed.; Wiley-Liss, Hoboken, NJ; Shapiro (2003) Practical Flow Cytometry, John Wiley and Sons, Hoboken, NJ). Na raspolaganju su fluorescenti reagensi pogodni za modifikovanje nukleinskih kiselina, uključujući nukleinskokiselinske prajmere i probe, polipeptide i antitela, za upotrebu, npr., u vidu dijagnostičkih reagenasa, (Molecular Probes (2003) Catalogue, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR; Sigma-Aldrich (2003) Catalogue, St. Louis, MO).

[0104] Opisani su standardni metodi histologije imunskog sistema (vidi, npr., Muller-Harmelink (ed.) (1986) Human Thymus: Histopathology and Pathology, Springer Verlag, New York, NY; Hiatt, et al. (2000) Color Atlas of Histology, Lippincott, Williams, and Wilkins, Phila, PA; Louis, et al. (2002) Basic Histology: Text and Atlas, McGraw-Hill, New York, NY).

[0105] Na raspolaganju su softverski paketi i baze podataka za određivanje, npr., antigenskih fragmenata, liderskih sekvenci, nabiranja proteina, funkcionalnih domena, mesta glikozilacije i poravnavanja sekvenci (vidi, npr., GenBank, Vector NTI® Suite (Informax, Inc, Bethesda, MD); GCG Wisconsin Package (Accelrys, Inc., San Diego, CA); DeCypher® (TimeLogic Corp., Crystal Bay, Nevada); Menne, et al. (2000) Bioinformatics 16: 741-742; Menne, et al. (2000) Bioinformatics Applications Note 16:741-742; Wren, et al. (2002) Comput. Methods Programs Biomed. 68:177-181; von Heijne (1983) Eur. J. Biochem. 133:17-21; von Heijne (1986) Nucleic Acids Res. 14:4683-4690).

PRIMERI

Primer 1. Generisanje i skrining anti-PD-L1 hibridoma

[0106] Balb/C miševi imunizovani su humanim PD-L1-Fc fuzionim proteinom (R&D Systems® kataloški br. 156-B7-100) u adjuvansu. Ovaj fuzioni protein sadrži vanćelijski domen PD-L1 (Phe19-Thr239) fuzionisan sa humanim IgG1 fragmentom (Pro100-Lys 300). Posle 12 imunizacija, izoluju se limfni čvorovi iz dva miša sa visokim titrima na humani PD-L1 i izvede se elektrofuzija da bi se generisale dve serije hibridoma koji su dobili laboratorijske oznake MEB033 i MEB037.

[0107] Supernatanti MEB033 i MEB037 hibridomskih serija pretraženi su da bi se identifikovali hibridomi koji proizvode antitela na humani PD-L1. U pretraživanju je korišćen proeinski ELISA test za vezivanje sa humanim hPD-L1-Fc proteinom; i ćelijski ELISA testovi za vezivanje sa humanim PD-L1-CHO, humanim PD-L1-CHO stabilnim transformantima i roditeljskim CHO ćelijama kao negativnom kontrolom. Supernatanti 88 klonova MEB037 i 23 klona MEB033 hibridoma testiranih pozitivno za prisustvo anti-PD-L1 antitela (podaci nisu prikazani) i njihovi uzorci, testirani su u pogledu IHC reaktivnosti, na FFPE presecima tkiva normalnih humanih krajnika (podaci nisu prikazani).

[0108] Od 88 klonova, samo 11 klonova iz MEB037 serije proizvelo je obrazac bojenja dovoljnog intenziteta i vidljive specifičnosti kojima bi se opravdala dalja evaluacija, na osnovu upoređivanja sa obrascima bojenja dobijenim korišćenjem komercijalno raspoloživih anti-PD-L1 antitela navedenih u Tabeli u nastavku teksta:

TABELA 6 Komercijalno raspoloživa antihumana PD-L1 antitela

[0109] Kada su pronalazači upoređivali različite obrasce bojenja dobijene eksperimentalnim antitelima sa obrascima dobijenim sa ovim komercijalno raspoloživim antihumanim PD-L1 antitelima, zapazili su značajne razlike između obrazaca bojenja, koje su uključivale lokalizaciju boje i tipove obojenih ćelija. U pokušaju da objasne ove razlike, pronalazači su sproveli brojne dodatne eksperimente i otkrili su da nijedno od ovih komercijalno raspoloživih antitela nije obezbedilo kombinaciju atributa potrebnih za korišćenje u IHC PD-L1 ekspresije na FFPE presecima: (1) senzitivnost - sposobnost detektovanja normalne fiziološke ekspresije u pozitivnim kontrolnim tkivima (npr., humani krajnici) kao i ekspresije u tumorskim tkivima (npr., uzorcima humanog melanoma); (2) specifičnost - obrazac bojenja koji treba da je u korelaciji sa poznatom anatomskom/ćelijskom distribucijom PD-L1 i koji može da se neutrališe; i (3) robusnost - malo ili nimalo varijacije u obrascima bojenja prilikom korišćenja za testiranje "duplikata" preseka tkiva.

[0110] Na primer, izumitelji su pronašli da Sigma/ProSco PRS4059 antitelo pokazuje više traka na lizatima krajnika, od kojih ni za jednu nije moglo da se potvrdi da predstavlja PD-L1, ne boji ćelijske linije LOX melanoma za koje je protočnom citometrijom bilo pokazano da su PD-L1 pozitivne, i ne pravi razliku između pozitivnih i negativnih ćelijskih linija u IHC.

[0111] Neki od ovih podataka prikazani su na Slici 4, na kojoj imunohistohemijsko bojenje preseka krajnika identifikuje 22C3 i 20C3 kao dva antitela sa neobičnim i korisnim imunohistohemijskim osobinama na FFPE tkivu, u poređenju sa PRS4059 antitelom koje su Gadiot et al (gore) identifikovali kao jedinog pogodnog kandidata među 15 antihumanih PD-L1 antitela za detektovanje ekspresije PD-L1 na FFPE presecima tkiva. U eksperimentima koje su izveli izumitelji, Prosci antitelo (PRS4059, partija 40590604, korišćeno pri 0.4 mg/ml kao primarno, što je praćeno zečjim polimernim detekcionim sistemom (DAKO Envision)) obojilo je sve hematopoetske linije u krajnicima jednakim intenzitetom (Sl. 4A) dok je 22C3 antitelo selektivno obojilo epitel kripti krajnika i folikularne CD68+ mijeloidne ćelije, koje su morfološki konzistentne sa makrofagima (Sl. 4B). Suštinski isti obrazac bojenja bio je zapažen sa antitelom 20C3 (podaci nisu prikazani). Štaviše, 22C3 i 20C3 pokazali su konzistentnu razliku u intenzitetu bojenja između ove dve različite populacije ćelija, sa mnogo jačim intenzitetom bojenja epitela kripti nego folikularnih makrofaga. Sva tri antitela mogla su da se neutrališu preinkubacijom sa PD-L1 antigenom, što je ukazalo da je reaktivnost posredovana antigen-vezujućim domenom (CDR).

4

Primer 2. Procena kvaliteta 20C3 i 22C3 anti-PD-L1 antitela

[0112] Ovaj primer opisuje dodatne eksperimente koji su izvedeni da bi se procenila korisnost 20C3 i 22C3 antitela za upotrebu u IHC testovima FFPE preseka tkiva.

[0113] U jednom eksperimentu procenjivana je sposobnost ovih dvaju antitela da detektuju opseg proteinske ekspresije humanog PD-L1 (hPD-L1) u IHC testu normalnih humanih FFPE preseka krajnika, i reprezentativne slike za 22C3 prikazane su na Slici 5A. Imunohistohemijsko bojenje pomoću 22C3 snažno obeležava epitel kripti krajnika i pokazuje slabo do umereno bojenje CD68+ folikularne mijeloidne populacije (pretpostavljeni makrofagi). Oba antitela (20C3 podaci nisu prikazani) obeležavaju oba ova dva tipa ćelija po dobro definisanom obrascu membrana/površina ćelije. Podesnost hPD-L1 ekspresije u krajnicima (tj. restrikcija IHC bojenja na dve ćelijske populacije (epitel kripti i folikularni makrofagi) bila je potvrđena nezavisnom metodologijom (in-situ hibridizacija [ISH] za hPD-L1 iRNK) na susednim FFPE presecima tkiva krajnika. Pored toga, diferencijalna ekspresija hPD-L1 proteina procenjivana pomoću IHC (epitel kripti >> folikularni makrofagi) korespondira sa relativnom zastupljenošću hPD-L1 iRNK zapaženom pomoću ISH.

[0114] U sledećem eksperimentu procenjuje se vezujuća specifičnost 20C3 i 22C3 za ćelije koje eksprimiraju hPD-L1. HT144 ćelije, za koje se prema iRNK analizi (qPCR) zna da su negativne u pogledu ekspresije hPD-L1, i LOX melanoma ćelije za koje se zna da eksprimiraju visoke nivoe hPD-L1 iRNK (qPCR) obojene su sa 1 mikrogramom/ml prečišćenog mišjeg IgG iz sedam hibridoma stvorenih u eksperimentima opisanim u Primeru 1, ranije u ovom tekstu. Irelevantno izotipsko kontrolno mišje antitelo takođe je korišćeno, u identičnoj koncentraciji. Fluorescentno obeleženo antimišje sekundarno antitelo upotrebljeno je za detektovanje primarnih mišjih antitela. Posle bojenja i ponovljenog ispiranja, ćelije su analizirane protočnom citometrijom, sa medijanom intenziteta fluorescencije izračunatom za populaciju (>10,000 sakupljenih događaja). Rezultati su prikazani na Slici 6.

[0115] 20C3 i 22C3 kao i druga hPD-L1 antitela upotrebljena su kao reagensi u protočnoj citometriji, za detektovanje hPD-L1 na površini ćelija. Značajno pomeranje udesno krivih na histogramima za 20C3 i za 22C3 (Slika 6A) u poređenju sa krivama izotipskih kontrolnih antitela, odražava selektivnu detekciju hPD-L1 na hPD-L1-pozitivnoj LOX melanoma ćelijskoj liniji. Medijana intenziteta fluorescencije udružene sa ovim histogramima i drugih iz ove analize prikazane su na Slici 6B. Selektivnost vezivanja 20C3 i 22C3 dodatno je potkrepljena odsustvom značajnog vezivanja (tj. MFI 22C3 i 20C3 komparabilno sa izotipom) za negativnu ćelijsku liniju, HT144. Nasuprot tome, podaci na Sl. 6B pokazuju da 20C3 i 22C3 proizvode najmanje desetostruki porast MFI u poređenju sa izotipom, kod hPD-L1 pozitivne LOX melanoma ćelijske linije. Prema tome, 20C3 i 22C3 (pored klonova 5F9, 7C8, 13D2 i 31D3) pokazuju selektivno vezivanje za hPD-L1-eksprimirajuće ćelije, prema proceni protočnom citometrijom.

[0116] U sledećem eksperimentu evaluirana je sposobnost 22C3 antitela da detektuje ekspresiju hPD-L1 na inženjerisanim humanim ćelijskim linijama. Ćelijske linije ovarijuma kineskog hrčka (CHO), negativne na hPD-L1, transfektuju se ekspresionim vektorom koji kodira humani PD-L1 da bi se stvorila inženjerisana pozitivna kontrolna ćelijska linija. Kako je prikazano na Sl. 7B, imunohistohemijsko bojenje korišćenjem 22C3 u formalinu fiksiranih i u parafin ukalupljenih (FFPE) ćelijskih peleta roditeljske CHO ćelijske linije (negativna kontrola) i transfektovane CHO ćelijske linije (pozitivna kontrola) pokazuje odgovarajuće pozitivno i negativno bojenje.

[0117] Dodatni peleti FFPE humanih ćelijskih linija (A375, HS578T i LOX melanoma) obojeni su korišćenjem 22C3 i pokazali su raspon obrazaca i intenziteta bojenja, kao što je pokazano na Slici 7B.22C3 bojenje bilo je jako i uniformno na Lox melanoma ćelijama, ali je pokazalo samo retke, pojedinačne pozitivne ćelije na peletima A375 i HS578T ćelija. Slično bojenje bilo je zapaženo sa 20C3 antitelom (podaci nisu prikazani). Nivoi ekspresije hPD-L1 detektovani u ove 3 ćelijske linije korišćenjem 22C3 u IHC testu, u dobroj su korelaciji sa nivoima PD-L1 iRNK u ovim ćelijskim linijama, kako je procenjeno korišćenjem qPCR, uz korišćenje iRNK za ubikvitin kao bazalne vrednosti.

[0118] Selektivno vezivanje i relativni afinitet 22C3 za hPD-L1-eksprimirajuće ćelije evaluirani su u ćelijskom ELISA eksperimentu. Nekoliko ćelijskih linija (hPDL1-CHOK1 ćelije, roditeljske CHOK1 ćelije, hPDL2-CHOK1 ćelije i LOX ćelije) zasejane su u pojedinačnim bunarčićima ploča sa 96 bunarčića, obloženim kolagenom i rasle su do konfluencije. Medijum se ukloni i umesto njega doda sveži CHOK1 medijum (DMEM/F12 koji sadrži 10% BCS) koji sadrži primarno antitelo u rastućim koncentracijama, između 1.4 i 3000 ng/ml. Korišćena su sledeća primarna antitela: dve različite partije proizvoda svakog od 20C3 i 22C3 antitela, sa mišjim IgG1 izotipskim anti-PD-L1 antitelom (BioLegend), i anti-

4

PD-L2 antitelom, kao kontrolama. Primarno antitelo inkubirano je 1 h na 37 °C, vršeno je ispiranje 3X pomoću PBS/0.01% Tween 20 i dodato je sekundarno antitelo, kozji antihumani IgG, Fc specifični-HRP (Southern Biotech, Cat#1030-05) konjugat u razblaženju 1:2000, u CHOK1 medijumu. Sekundarno antitelo je inkubirano 1 h na 37 °C i isprano 5X kao gore. ELISA se razvija korišćenjem TMB, zaustavi 0.1 N fosfornom kiselinom i apsorpcija se očitava na 450 nm uz oduzimanje pozadinskog signala na 650 nm. Rezultati prikazani na Slici 8 pokazuju selektivno vezivanje 22C3 i 20C3 za ćelije koje eksprimiraju hPD-L1, pri čemu je afinitet vezivanja 22C3 za hPD-L1 CHOK1 inženjerisane ćelije i LOX ćelije bio veći od afiniteta 20C3.

[0119] Sličan ELISA eksperiment izveden je da bi se procenilo da li se antitela 20C3 ili 22C3 vezuju za mišji PD-L1. Nije zapaženo značajno vezivanje nijednog antitela za mišji PD-L1 (podaci nisu prikazani).

[0120] Izvedeni su kompeticioni testovi vezivanja antitela ("unakrsno blokiranje") između različitih parova anti-hPD-Ll antitela identifikovanih u eksperimentima opisanim u Primeru 1. U testovima se koristi ForteBio® Octet® platforma bazirana na interferometriji u biosloju. Ukratko, ovom tehnikom se meri vezivanje inicijalnog antitela (mAb1) za površinu vrh biosenzora, kao pomak talasne dužine (Δλ) zbog vezanog antitela, što povećava optičku gustinu (Y-osa) na vrhu biosenzora tokom vremena (X-osa). Vrh se sastoji od anti-huIgG senzora na koji je vezan hPD-L1-Fc. Promena optičke gustine posle vezivanja anti-PD-L1 antitela reflektuje se naviše nagnutom krivom koja počinje na prvoj, vertikalnoj isprekidanoj crvenoj liniji (vidi grafikone na Sl. 9A, 9B i 9C), koja označava dodavanje zasićujuće koncentracije mAb1 (10 mikrograma/ml) u rastvor. Posle uravnotežavanja (∼1000 sekundi), drugo antitelo se injektira u testni rastvor (naznačeno drugom, vertikalnom crvenom isprekidanom linijom na Sl. 9A, 9B i 9C). Vezivanje drugog mAb2, naznačeno dodatnim odstupanjem krive, sugeriše da se dva antitela vezuju za nepreklapajuće epitope, dok malo ili nimalo odstupanja krive sugeriše da se dva antitela vezuju za preklapajuće ili identične epitope.

[0121] Ukratko, rezultati pokazuju da vezivanje 22C3 kompetira sa dodatnim vezivanjem svih drugih anti-hPDL-1 klonova testiranih kao mAb2, izuzev sa 5H9 (Sl.9A). Slično tome, 20C3 takođe ne kompetira sa vezivanjem 5H9, ali pokazuje intermedijarni stepen dodatnog

4

vezivanja sa 22C3 kao i 4B7 (Sl. B). Sve zajedno, ovi podaci pokazuju da se 20C3 i 22C3 vezuju za preklapajuće epitope.

[0122] Sposobnost 22C3 antitela da detektuje raspon ekspresije hPD-L1 u različitim tipovima tumora, procenjena je izvođenjem IHC analize na FFPE presecima pripremljenim od sledećih tumora: mokraćne bešike, ezofagusa, glave i vrata, bubrega, HCC, dojke, pluća, ovarijuma i želuca. Preliminarni pregled reaktivnosti 22C3 na presecima ovih tumorskih tkiva izveden je korišćenjem semikvantitativne "gestalt" interpretacije obima bojenja. Kao što je prikazano na Slici 10, 22C3 može da detektuje raspon ekspresije PD-L1, od suštinski potpunog izostanka bojenja (ocena = 0) do primetne, jake ekspresije (ocena = 4), što demonstrira korisnost IHC testa uz korišćenje 22C3 za buduće vođenje tipova tumora koji mogu odgovarati na ukidanje imunosupresivnih PD-1/PD-L1 interakcija.

[0123] Korisnost 22C3 antitela za stratifikovanje pacijenata koji će verovatnije odgovoriti na terapiju kojom se blokira interakcija PD-1 i PD-L1, procenjivana je u studijama u kojima je 22C3 korišćen za imunohistohemijsku procenu arhivskih uzoraka dobijenih od 18 pacijenata sa melanomom, uključenih u fazu 1 (P001) ispitivanja sa MK-3475, anti-PDl terapijskim antitelom koje su razvili Merck and Co., Inc. Slučajeve su evaluirala dva patologa nezavisno i određivani su kao "pozitivni", "negativni" ili "dvosmisleni", a reprezentativne slike koje prikazuju ove tri kategorije date su na Sl. 11A. Saglasnost među patolozima na ovom setu uzoraka (n=18) bila je 100%.

[0124] Klinički odgovori procenjivani su korišćenjem kriterijuma evaluacije tumorskog odgovora na imunoterapiju (immune related response criteria, irRC) i korelisani sa IHC rezultatima. Za analizu, "dvosmisleni" slučajevi smatrani su kao negativni, što je rezultovalo senzitivnošću testa od 72% i specifičnošću od 86%. Rezultati, koji su prikazani na Sl. 11B, sugerišu da će 22C3 imunohistohemijsko bojenje FFPE tkiva biti korisno kao biomarker za selektovanje pacijenata.

[0125] Na osnovu rezultata gore opisanih eksperimenata, pronalazači su odredili da antitela koja su proizvela dva od 88 eksperimentalnih hibridoma - MEB037.20C3.138 i MEB037.20C3.116 - poseduju potrebnu kombinaciju senzitivnosti, specifičnosti i robusnosti da bi se razmatralo njihovo razvijanje kao kandidata za FFPE-reaktivne IHC dijagnostičke reagense.

Primer 3. Mapiranje epitopa na humanom PD-L1 za 22C3 anti-PD-L1 antitelo

4

[0126] HDX-MS mapiranje epitopa izvedeno je korišćenjem antitela 22C3 i PD-L1-His proteina sa vanćelijskim domenom zrelog humanog PD-L1 (SEQ ID NO:38) fuzionisanim sa 11-merni histidinskim markerom. Segmenti 156 do 178 i 196 do 206 na vanćelijskom domenu humanog PD-L1 (SEQ ID NO:38) pokazali su snažnu zaštitu (prosečna razlika nivoa deuterizacije > 10%) posle vezivanja za antitelo 22C3. Pored toga, segmenti 3 do 9, 10 do 13, 88 do 93, i 135 do 147 pokazali su marginalnu, ali značajnu zaštitu (prosečna razlika nivoa deuterizacije 5% do 10%).

[0127] Navođenje referenci u ovom tekstu ne znači priznavanje da referenca predstavlja značajno stanje tehnike niti čini bilo kakvo priznavanje u vezi sa sadržajima ili datumima ovih publikacija ili dokumenata.

[0128] Predmetni pronalazak u svom obimu nije ograničen specifičnim primerima izvođenja opisanim u ovom tekstu. Zaista, različite modifikacije pronalaska, pored onih koje su opisane u ovom tekstu, biće vidljive stručnjacima u oblasti na osnovu prethodno iznetog opisa i pridruženih slika. Takve modifikacije obuhvaćene su obimom priloženih patentnih zahteva.

[0129] Smatra se da je prethodno izneta pisana specifikacija dovoljna da omogući stručnjaku u oblasti da primeni pronalazak. Različite modifikacije pronalaska, pored onih koje su prikazane i opisane u ovom tekstu, biće vidljive stručnjacima u oblasti na osnovu prethodno iznetog opisa i obuhvaćene su obimom priloženih patentnih zahteva.

4

4

1

2

4

1

2

4

Claims (9)

PATENTNI ZAHTEVI

1. Izolovano antitelo ili antigen-vezujući fragment koji se specifično vezuju za PD-L1, naznačeni time, što:

(a) varijabilni region lakog lanca je SEQ ID NO:13 i varijabilni region teškog lanca je SEQ ID NO:20; ili

(b) varijabilni region lakog lanca je SEQ ID NO:25 i varijabilni region teškog lanca je SEQ ID NO:32, pri čemu je X u SEQ ID NO:32 Q ili pE.

2. Izolovano antitelo ili antigen-vezujući fragment iz patentnog zahteva 1, naznačeni time, što je X u SEQ ID NO:32 Q.

3. Izolovana nukleinska kiselina koja kodira varijabilne regione antitela ili antigenvezujućeg fragmenta iz patentnog zahteva 1, naznačena time, što je X u SEQ ID NO:32 Q.

4. Izolovana nukleinska kiselina iz patentnog zahteva 3, naznačena time, što je ekspresioni vektor.

5. Ćelija-domaćin, naznačena time, što sadrži ekspresioni vektor iz patentnog zahteva 4.

6. Metod testiranja uzorka tkiva uzetog od čoveka da bi se testirala ekspresija PD-L1, naznačen time, što metod uključuje:

(a) dovođenje u kontakt uzorka tkiva sa PD-L1-vezujućim reagensom pod uslovima koji dopuštaju specifično vezivanje PD-L1-vezujućeg reagensa za humani PD-L1, pri čemu vezujući reagens sadrži antitelo ili antigen-vezujući fragment iz bilo kojeg od patentnih zahteva 1 do 2,

(b) uklanjanje nevezanog PD-L1-vezujućeg reagensa i

(c) detektovanje prisustva ili odsustva vezanog PD-L1-vezujućeg sredstva.

7. Metod iz patentnog zahteva 6, naznačen time, što uključuje još i kvantifikovanje količine vezanog vezujućeg reagensa.

8. Kit, naznačen time, što sadrži izolovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment iz bilo kojeg od patentnih zahteva 1 ili 2 i set reagenasa za detektovanje kompleksa antitela ili antigen-vezujućeg fragmenta, vezanih za humani PD-L1.

9. Kit iz patentnog zahteva 8, naznačen time, što antitelo ili antigen-vezujući fragment uključuju SEQ ID NO:13 i SEQ ID NO:20, ili uključuju SEQ ID NO:25 i SEQ ID NO:32, pri čemu je X u SEQ ID NO:32 Q.