ES2833046T3 - Anticuerpos que se unen al ligando 1 de muerte programada (PD-L1) humano - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo o un fragmento de union a antigeno aislados que se unen especificamente al PD-L1 en donde: (a) la region variable de cadena ligera es el SEQ ID NO: 13 y la region variable de cadena pesada es el SEQ ID NO: 20; o (b) la region variable de cadena ligera es el SEQ ID NO: 25 y la region variable de cadena pesada es el SEQ ID NO: 32, en donde en el SEQ ID NO: 32, X es Q o pE.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos que se unen al ligando 1 de muerte programada (PD-L1) humano

Campo de la invención

La presente invención se refiere a anticuerpos que tienen secuencias específicas que se unen al ligando 1 de muerte programada (PD-L1, por las siglas del inglés Programmed Death Ligand 1) humano y que son útiles para detectar la expresión del PD-L1 en muestras de tejido humano mediante análisis inmunohistoquímico (IHQ). La invención también se refiere a ensayos IHQ específicos que emplean estos Anticuerpos anti-PD-L1 humano.

Antecedentes de la invención

El PD-L1 es una glucoproteína de la superficie celular que es uno de los dos ligandos conocidos de la Muerte Programada 1 (PD-1), que se reconoce como un actor importante en la regulación inmunitaria y el mantenimiento de la tolerancia periférica. La expresión del PD-L1 se ha observado en la superficie de varios células inmunitarias, incluyendo linfocitos vírgenes y células B y T activadas, monocitos y células dendríticas (Id.). Por otro lado, el ARNm del PD-L1 se expresa en tejidos no linfoides, incluidas las células endoteliales vasculares, células epiteliales, células musculares, y en tejido amigdalino y placentario. Véase, por ejemplo, Keir, M.E. et al., Annu Rev Immunol. 26:677-704 (2008); Sharp A.H. et al., Nature Immunol. 8:239-245 (2007); Okazaki T y Honjo T, Internat. immunol. 19:813-824 (2007).

La expresión del PD-L1 también se ha observado en varios cánceres humanos, y la interacción del PD-L1, expresado en células tumorales, con PD-1, puede inducir la inhibición o la apoptosis de células T específicas de tumor. En grandes conjuntos de muestras, por ejemplo, de cánceres de ovario, riñón, colorrectal, páncreas, hígado y melanoma, se demostró que la expresión del PD-L1 se correlacionaba con un mal pronóstico y una reducción de la supervivencia global independientemente del tratamiento posterior. Se ha demostrado que los anticuerpos monoclonales anti-PD-1 que bloquean la unión del PD-L1 con PD-1, tienen actividad antitumoral contra varios tipos de tumores, sugiriendo los datos clínicos tempranos en humanos que los pacientes cuyos tumores expresan PD-L1 tienen más probabilidades de responder a la terapia anti-PD-1. Véase, por ejemplo, Iwai et al., PNAS 99:12293-12297 (2002); Ohigashi et al., Clin Cancer Res 11:2947-2953 (2005); Ghebeh et al., Neoplasia 8:190-198 (2006); Hamanishi, J et al., PNAS 104:3360-3365 (2007); Yang et al., Invest Ophthalmol Vis Sci. 49(6):2518-2525 (2008); Gao et al., Clin Cancer Res 15:971-979 (2009); Brahmer J.R. et al., J Clin Oncol. 28:3167-3175 (2010).

En un informe reciente se describe la comparación de 15 anticuerpos anti-PD-L1 humano por su utilidad en la detección de la expresión del hPD-L1 en muestras de melanoma humano fijadas en formol y embebidas en parafina (FFPE) (Gadiot, J., et al., Cancer 117(10):2192-2201 (2011)). Los criterios de utilidad evaluados en esta comparación fueron: (1) capacidad para teñir tejidos embebidos en parafina, (2) producir una tinción de fondo baja y (3) bloquear la unión con el PD-L1 mediante preincubación con una proteína de fusión PD-L1. Los autores concluyeron que el Ac n.° 4059, un anticuerpo policlonal anti-ser humano de conejo (obtenido en ProSci, Poway, CA Estados Unidos), fue el único anticuerpo anti-PD-L1 humano de los 15 analizados que cumplió aceptablemente con todos estos criterios (Id. en 2195, 2a columna).

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a anticuerpos monoclonales anti-PD-L1 humano, que producen un patrón de tinción IHQ en tejido amigdalino FFPE que los inventores de la presente creen que es más relevante desde el punto de vista inmunológico que el producido por el Ac n.° 4059 de ProSci. Como se describe en los ejemplos más adelante, los inventores descubrieron que este anticuerpo de ProSci (PRS4059, Sigma-Aldrich lote 40590604) teñía todos los linajes hematopoyéticos en la amígdala con la misma intensidad, mientras que dos anticuerpos de la presente invención, 22C3 y 20C3, teñían selectivamente el epitelio críptico amigdalino y las células mieloides CD68+ foliculares, que morfológicamente están en consonancia con los macrófagos. Por otra parte, los anticuerpos 22C3 y 20C3 demuestran una diferencia de intensidad consistente entre estas dos poblaciones de células distintas con una intensidad de tinción en el epitelio críptico mucho mayor que en los macrófagos foliculares. Los tres anticuerpos (PRS4059, 22C3 y 20C3) se neutralizan con preincubación con el antígeno PD-L1, lo que indica que la reactividad está mediada por el dominio de unión a antígeno (las CDR). Por tanto, la invención también se refiere al uso de los anticuerpos de la presente invención en la detección de la expresión del PD-L1 en la superficie de células humanas, incluyendo en ensayos IHQ para detectar el PD-L1 en secciones de tejido FFPE.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente al PD-L1 humano en donde (a) la región variable de cadena ligera es el SEQ ID NO: 13 y la región variable de cadena pesada es el SEQ ID NO: 20; o (b) la región variable de cadena ligera es el SEQ ID NO: 25 y la región variable de cadena pesada es el SEQ ID NO: 32, en donde en el SEQ ID NO: 32, X es Q o pE.

En un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno preferido de la invención, la región variable de cadena ligera es el SEQ ID NO: 13 y la región variable de cadena pesada es el SEQ ID NO: 20.

En otra realización más, el anticuerpo o fragmento de unión de la invención, comprende una región variable de cadena ligera del SEQ ID NO: 25 y una región variable de cadena pesada del SEQ ID n O: 32, en donde en el SEQ ID NO: 32, X es pE.

En otra realización adicional, el anticuerpo o fragmento de unión de la invención, comprende una región variable de cadena ligera del SEQ ID NO: 25 y una región variable de cadena pesada del SEQ ID NO: 32, en donde en el SEQ ID NO: 32, X es Q.

El anticuerpo es una IgGi . En una realización, el anticuerpo comprende una región constante de IgGi de ratón.

Los anticuerpos de la presente invención son los anticuerpos monoclonales 20C3 y 22C3, que son anticuerpos de IgG1 expresados por los hibridomas MEB037.20C3 y MEB037.22C3, respectivamente.

En el presente documento se describe un anticuerpo monoclonal aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente al PD-L1 humano y bloquea la unión de 20C3 o 22C3 con el PD-L1 humano, o de un anticuerpo de referencia que comprendel SEQ ID NO: 25 y el SEQ ID NO: 32. En el presente documento se describe un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la invención que bloquea la unión con el PD-L1 humano de cada uno de 20C3 y 22C3, o de cada uno de (a) un anticuerpo de referencia que comprendel SEQ ID NO: 13 y el SEQ ID NO: 20 y (b) un anticuerpo de referencia que comprendel SEQ ID NO: 25 y el SEQ ID NO: 32.

En el presente documento se describe una composición de anticuerpos, que comprende cualquiera de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos descritos anteriormente en una formulación. Una formulación adecuada comprende acetato de sodio 20 mM y sacarosa al 9 % a un pH de 5,0. La composición puede comprender una mezcla de moléculas de anticuerpo, en la que una mayoría (es decir, más de cualquiera de un 60 %, 65 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 %) de las moléculas de anticuerpo en la mezcla comprendel SEQ ID NO: 25 y el SEQ ID NO: 32, en donde en el SEQ ID NO: 32, X es pE, y las restantes moléculas de anticuerpo en la mezcla comprenden el SEQ ID NO: 25 y el SEQ ID NO: 32, en donde en el SEQ ID NO: 32, X es Q.

En cualquiera de las realizaciones anteriores, el fragmento de unión al antígeno es un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento (Fab')2.

En cualquiera de las realizaciones anteriores, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede comprender además un marcador detectable.

La invención también proporciona un ácido nucleico aislado que codifica cualquiera de las regiones variables del anticuerpo desveladas anteriormente. En cualquiera de estas realizaciones, el ácido nucleico aislado es preferentemente un vector de expresión.

La invención también se refiere a una célula hospedadora que comprende un vector de expresión que codifica cualquiera de las regiones variables del anticuerpo desveladas anteriormente.

La invención también proporciona un método para analizar una muestra de tejido humano que se ha extraído de un ser humano para determinar la expresión del PD-L1. El método de ensayo comprende poner en contacto la muestra de tejido con un reactivo de unión al PD-L1 en condiciones que permitan la unión específica del reactivo de unión al PD-L1 con el PD-L1 humano, eliminar el reactivo de unión al PD-L1 no unido y detectar la presencia o la ausencia del agente de unión al PD-L1 unido. En una realización preferida, el método comprende además cuantificar la cantidad de reactivo de unión que se ha unido. El reactivo de unión es cualquiera de los anticuerpos monoclonales o fragmentos de unión a antígeno descritos anteriormente. El reactivo de unión es un anticuerpo que comprendel SEQ ID NO: 13 y el SEQ ID NO: 20, o comprendel SEQ ID NO: 25 y el SEQ ID NO: 32, en donde en el SEQ ID NO: 32, X es Q o pE. En una realización preferida, el reactivo de unión es una composición de anticuerpo que comprende una mezcla de moléculas de anticuerpo que comprendel SEQ ID NO: 25 y el SEQ ID NO: 32, en donde una mayoría de las moléculas (es decir, más de cualquiera de un 60 %, 65 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 %) tiene pE en la posición X en el SEQ ID NO: 32 y el resto de las moléculas tienen Q en la posición X en SEQ ID NO: 32.

En otro aspecto, la invención proporciona un kit para analizar una muestra de tejido humano para determinar la expresión del PD-L1. El kit comprende un agente de unión al PD-L1 y un conjunto de reactivos para detectar un complejo que comprende el agente de unión unido al PD-L1 humano. El agente de unión al PD-L1 es cualquier anticuerpo monoclonal o fragmento de unión a antígeno descrito anteriormente que se una específicamente al PD-L1 humano. El anticuerpo o fragmento de unión comprendel SEQ ID NO: 13 y el s Eq ID NO: 20, o comprendel SEQ ID NO: 25 y el SEQ ID NO: 32, en donde en el SEQ Id NO: 32, X es Q o pE. En una realización preferida, el reactivo de unión es una composición de anticuerpo que comprende una mezcla de moléculas de anticuerpo que comprendel SEQ ID NO: 25 y el SEQ ID NO: 32, en donde una mayoría de las moléculas (es decir, más de cualquiera de un 60 %, 65 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 %) tiene pE en la posición X en el Se Q ID NO: 32 y el resto de las moléculas tienen Q en la posición X en SEQ ID n O: 32.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra las secuencias de nucleótidos del ADNc de cadena ligera y pesada variable del anticuerpo preparado a partir de ARN total aislado del hibridoma MEB037.20C3 y las secuencias de aminoácidos predichas codificadas por el mismo (en negrita), indicando entre corchetes las secuencias de nucleótidos y aminoácidos del péptido líder y subrayando las secuencias de las CDR (regiones determinantes de complementariedad).

La figura 2 muestra las secuencias de nucleótidos del ADNc de cadena ligera y pesada variable del anticuerpo preparado a partir de ARN total aislado del hibridoma MEB037.22C3 y las secuencias de aminoácidos predichas codificadas por el mismo (en negrita), indicando entre corchetes las secuencias de nucleótidos y aminoácidos del péptido líder y subrayando las secuencias de las CDR (regiones determinantes de complementariedad).

La figura 3 muestra las secuencias de aminoácidos alineadas de las regiones variables maduras de las cadenas ligera y pesada de los anticuerpos 20C3 y 22C3, indicando en negrita las posiciones donde varían las secuencias, subrayándose las secuencias de las CDR, según lo definido por el sistema de numeración de Kabat e indicando entre corchetes la CDR1 de cadena pesada según lo definido por el sistema de numeración de Chothia.

La figura 4 muestra una tinción de secciones de amígdala producida mediante un ensayo inmunohistoquímico usando el anticuerpo PRS4059 disponible en el comercio (figura 4A) o el anticuerpo 22C3 de la invención (figura 4B), mostrando las secciones del lado derecho de las figuras 4A y 4B los resultados después de la preincubación con una proteína de fusión PD-L1-IgG1 (R&D Systems), que compite con los anticuerpos anti-PD-L1 humano por la unión con el PD-L1 humano.

La figura 5 muestra fotografías de secciones de tejido amigdalino FFPE normal adyacente en las que se analizó la proteína PD-L1 humano y la expresión de ARNm por hibridación in situ (HIS) mediante un ensayo IHQ utilizando el anticuerpo 22C33 (figura 5A) e hibridación in situ (HIS) (figura 5B), respectivamente, y que demuestran tinción diferencial entre dos poblaciones de células únicas: epitelio críptico (Fig. 5A, vista ampliada a la izquierda y Fig. 5B, vista superior) y macrófagos foliculares (Fig. 5A, vista ampliada a la derecha y Fig. 5B, vista inferior).

La figura 6 ilustra los resultados de una evaluación mediante citometría de flujo de la unión de varios anticuerpos anti-PD-L1 humano y de un anticuerpo de control de isotipo a células HT144, que se sabía que eran negativas para la expresión del hPD-L1 mediante análisis de ARNm (PCRc) (Fig. 6A) y células de melanoma LOX, que se sabía que expresaban altos niveles de ARNm de hPD-L1 (PCRc) (Fig. 6B).

La figura 7 muestra la tinción IHQ producida por el anticuerpo 22C3 en sedimentos de células FFPE de líneas celulares CHO genomodificadas (figura 7A) y líneas celulares humanas (figura 7B, panel superior), y demuestra que la intensidad de la tinción se correlaciona bien con los niveles de expresión de ARNm de hPD-L1 medidos en las mismas líneas celulares humanas (figura 7B, panel inferior).

La figura 8 ilustra la unión selectiva y la afinidad relativa de los anticuerpos 22C3 y 20C3 por hPD-L1, mostrando los gráficos los resultados de un experimento ELISA basado en células en el que se incubaron células que no expresaban hPD-L1 (figura 8A), que expresaban hPDL-1 (Figuras 8B y 8C) o que expresaban PD-L2 humano (figura 8D) con el anticuerpo primario indicado a las concentraciones indicadas, y después, la unión del anticuerpo primario se detectó con un anticuerpo secundario de cabra anti-IgG humana, como se describe en los Ejemplos.

La figura 9 muestra los resultados de los ensayos de competición de unión de anticuerpos que demuestran que los anticuerpos 22C3 y 20C3 se unen a epítopos no idénticos pero solapantes.

La figura 10 ilustra los resultados de una puntuación de Gestalt semicuantitativa de la intensidad de la tinción IHQ con 22C3 de muestras FFPE de los tipos de tumores indicados, aumentando la extensión de la tinción al aumentar el número de puntuaciones.

La figura 11 ilustra que la expresión del PD-L1 humano detectada con el anticuerpo 22C3 en un ensayo IHQ se correlaciona con la respuesta de los pacientes con melanoma a la terapia con un anticuerpo anti-PD-1 humana (MK-3475), mostrando en la figura 11A imágenes representativas de la tinción IHQ con 22C3 interpretadas como positiva, negativa o ambigua para la expresión de hPD-L1 y mostrando la figura 11B el número de pacientes que tuvieron una respuesta positiva o negativa que se calificaron como positivos o negativos (incluidos los pacientes calificados como ambiguos) para la expresión del hPD-L1 mediante ensayo IHQ.

Descripción detallada

Abreviaturas. A lo largo de la descripción detallada y de los ejemplos de la invención, se utilizarán las siguientes abreviaturas:

ADCC (antibody-dependent cellular cytotoxicity) citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos

CDC (complement-dependent cytotoxicity) citotoxicidad dependiente del complemento

CDR (complementarity determining región) región determinante de complementariedad en las regiones variables de inmunoglobulina, definida mediante el sistema de numeración de Kabat, a menos que se indique lo contrario CHO (chinese hamster ovary) ovario de hámster chino

Clothia, un sistema de numeración de anticuerpos descrito en Al-Lazikani et al., JMB 273:927-948 (1997) Concentración CE50 que da como resultado una eficacia o unión del 50 %

ELISA (enzyme-linked immunosorbant assay) enzimoinmunoanálisis de adsorción

FFPE (formalin-fixed, paraffin-embedded) fijado en formol y embebido en parafina

FR (framework región) región estructural de un anticuerpo: las regiones variables de inmunoglobulina excluyendo las regiones CDR.

HRP (horseradish peroxidase) peroxidasa de rábano picante

IFN interferón

Concentración CI50 que da como resultado una inhibición del 50 % IgG Inmunoglobulina G

Kabat, un sistema de alineación y numeración de inmunoglobulinas liderado por Elvin A. Kabat ((1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.) Acm o acM o AcM, anticuerpo monoclonal

MES ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico

MDA Mecanismo de acción

SHN = suero humano normal

PCR (polymerase chain reaction) reacción en cadena de la polimerasa

pE Piroglutamato

FC Farmacocinética

SEB (Staphylococcus Enterotoxin B) enterotoxina estafilocócica B

TT Toxoide tetánico

Región V El segmento de cadenas de IgG cuya secuencia es variable entre diferentes anticuerpos. Se extiende hasta el resto 109 de Kabat en la cadena ligera y hasta el 113 en la cadena pesada.

VH región variable de cadena pesada de inmunoglobulina

VK región variable de cadena ligera kappa de inmunoglobulina

Definiciones

Para que la invención se entienda más fácilmente, a continuación se definen específicamente algunos términos técnicos y científicos. A menos que se defina específicamente en otra parte del presente documento, todos los demás términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el significado comprendido habitualmente por un experto en la materia a la que pertenece la presente invención.

Como se usa en el presente documento, incluyendo en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares de palabras tales como "un", "uno/a", "el" y "la", incluyen sus referencias plurales correspondientes a menos que el contexto dictamine claramente otra cosa.

"Activación", de la manera en la que se aplica a células o a receptores, se refiere a la activación o al tratamiento de una célula o de un receptor con un ligando, a menos que el contexto indique lo contrario o explícitamente. "Ligando" abarca ligandos naturales y sintéticos, por ejemplo, citocinas, variantes de citocinas, análogos, muteínas y compuestos de unión derivados de anticuerpos. "Ligando" también abarca moléculas pequeñas, por ejemplo, miméticos peptídicos de citocinas y miméticos peptídicos de anticuerpos. "Activación" puede referirse a la activación celular regulada por mecanismos internos así como por factores externos o ambientales.

La "actividad" de una molécula puede describir o referirse a la unión de la molécula con un ligando o con un receptor, a la actividad catalítica; a la capacidad de estimular la expresión génica o la señalización, diferenciación o maduración celular; a la actividad antigénica, a la modulación de las actividades de otras moléculas, y similares. La "actividad" de una molécula también puede referirse a la actividad para modular o conservar interacciones entre células, por ejemplo, adhesión o actividad en la conservación de la estructura de una célula, por ejemplo, membranas celulares o citoesqueleto. "Actividad" también puede significar actividad específica, por ejemplo, [actividad catalítica]/[mg de proteína] o [actividad inmunológica]/[mg de proteína], concentración en un compartimento biológico, o similar. "Actividad" puede referirse a la modulación de componentes de los sistemas inmunitarios innato o adaptativo.

"Administración" y "tratamiento", de la manera en la que se aplica a un sujeto animal, humano, experimental, a una célula, a un tejido, a un órgano o a un líquido biológico, se refiere al contacto de un agente farmacéutico, terapéutico, de diagnóstico exógeno o de una composición con el animal, ser humano, sujeto, célula, tejido, órgano o líquido biológico. El tratamiento de una célula abarca el contacto de un reactivo con la célula, así como el contacto de un reactivo con un líquido, donde el líquido está en contacto con la célula. "Administración" y "tratamiento" también significa tratamientos in vitro y ex vivo, por ejemplo, de una célula, mediante un compuesto reactivo, de diagnóstico, de unión, o mediante otra célula. El término "sujeto" incluye cualquier organismo, preferentemente un animal, más preferentemente un mamífero (por ejemplo, rata, ratón, perro, gato, conejo) y, lo más preferentemente, un ser humano.

"Tratar" o "tratamiento" significa administrar un agente terapéutico, tal como una composición que contiene cualquiera de los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de la presente invención, interna o externamente a un sujeto o paciente que tiene uno o más síntomas de enfermedad, o que se sospecha que tiene una enfermedad, para lo cual el agente tiene actividad terapéutica. Normalmente, para aliviar uno o más síntomas de enfermedad en el sujeto tratado o en la población tratada, el agente se administra en una cantidad eficaz, ya sea induciendo la regresión del avance de dicho(s) síntoma(s) o inhibiendo su avance en cualquier grado clínicamente medible. La cantidad de un agente terapéutico que es eficaz para aliviar cualquier síntoma de enfermedad en particular (también denominada "cantidad terapéuticamente eficaz") puede variar según factores tales como la patología de la enfermedad, la edad y el peso del paciente y la capacidad del fármaco para desencadenar una respuesta deseada en el sujeto. El alivio de un síntoma de la enfermedad puede evaluarse mediante cualquier medida clínica utilizada normalmente por los médicos u otros proveedores de atención médica capacitados para evaluar la gravedad o el estado de avance de ese síntoma. Aunque una realización de la presente divulgación (por ejemplo, un método de tratamiento o un artículo de fabricación) puede que no sea eficaz para aliviar el síntoma o los síntomas de la enfermedad específica en cada sujeto, debería aliviar el síntoma o los síntomas de la enfermedad específica en un número estadísticamente significativo de sujetos según lo determinado por cualquier prueba estadística conocida en la técnica, tal como la prueba de la t de Student, la prueba de chi2, la prueba U de Mann y Whitney, la prueba de Kruskal-Wallis (prueba H), la prueba de Jonckheere-Terpstra y la prueba de Wilcoxon.

"Tratamiento", de la manera en la que se aplica a un sujeto humano, veterinario o de investigación, se refiere a tratamiento terapéutico, así como a aplicaciones de investigación y diagnóstico. "Tratamiento", de la manera en la que se aplica a un sujeto humano, veterinario o de investigación, o a una célula, a un tejido o a un órgano, abarca el contacto de los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de la presente invención, con un sujeto humano o animal, una célula, tejido, compartimento fisiológico o líquido fisiológico.

Anticuerpos anti-PD-LI

El anticuerpo 20C3 es el anticuerpo producido por el subclon de hibridoma MEB037.20C3.116.

El anticuerpo 22C3 es el anticuerpo producido por el subclon de hibridoma MEB037.22C3.138, y corresponde al alotipo S414R de una IgG1 de ratón. El resto N-terminal de la cadena pesada madura de 22C3 es glutamina o piroglutamato (pE), que es una modificación postraduccional común que se observa con frecuencia en los anticuerpos monoclonales cuando la secuencia del gen codifica una glutamina N-terminal en la cadena pesada o ligera madura.

Los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de la presente invención se unen a la forma madura del PD-L1 humano (que carece de la secuencia líder presecretora, también denominada péptido líder) que se expresa en la superficie de ciertas células humanas. Las expresiones "PD-L1" y "PD-L1 maduro" se usan indistintamente en el presente documento y se entenderá que se refieren a la misma molécula a menos que se indique lo contrario o se desprenda fácilmente del contexto. Una molécula del PD-L1 humano maduro consiste en los aminoácidos 19-290 de la siguiente secuencia (SEQ ID NO:37):

MRIFAVFIFMTYWHLLNAFTVTVPKDLYWEYGSNMTIECKFPVEKQLDLAALIYYWE

MEDKNIIQFVHGEEDLKVQHSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMI

S YGGAD YKRITVKVNAP YNKINQRE.WDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWT S SDHQVL

SGKTTTTNSKREEKLFNVTSTLRINTTTNEIFYCTFRRLDPEENHTAELVIPELPLAHPPNE

RTHLVILGAILLCLGVALTFIFRLRKGRMMDVKKCGIQDTNSKKQSDTHLEET.

El dominio extracelular del PD-L1 humano maduro consiste en la siguiente secuencia (SEQ ID NO: 38):

FT VT VPKDL Y W E Y G SNMTIE CKFP VEKQLDLA ALIVY WEMEDKNIIQF VHGEEDLKV Q

HSSYRQRARLLKDQLSLGNAALQITDVKLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNAPYN

KINQRILWDPVTSEHELTCQAEGYPKAEVIWTSSDHQVLSGKTTTTNSKREEKLFNVTS

TLRINTTTNEIF Y CTFRRLDPEENHT AELVIPELPLAHPPNERT.

Como se usa en el presente documento, un anticuerpo anti-PD-L1 humano o un anticuerpo anti-hPD-L1 se refiere a un anticuerpo que se une específicamente al PD-L1 humano. Un anticuerpo que "se une específicamente al PD-L1 humano", o un anticuerpo que "se une específicamente a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos del PD-L1 humano", es un anticuerpo que presenta unión preferencial con el PD-L1 humano en comparación con otros antígenos, pero esta especificidad no requiere especificidad de unión absoluta. Un anticuerpo anti-hPD-L1 se considera "específico" para el PD-L1 humano si su unión es determinante de la presencia del PD-L1 humano en una muestra, por ejemplo, sin producir resultados no deseados, tales como positivos falsos en un ensayo de diagnóstico IHQ. El grado de especificidad necesario para un anticuerpo anti-hPD-L1 de la invención puede depender del uso pretendido del anticuerpo y, en cualquier caso, se define por su idoneidad para su uso para un propósito pretendido. El anticuerpo, o fragmento de unión del mismo, de la invención, se une al PD-L1 humano con una afinidad que es al menos dos veces mayor, preferentemente al menos diez veces mayor, más preferentemente al menos 20 veces mayor y, lo más preferentemente, al menos 100 veces mayor, que la afinidad con cualquier proteína no PD-L1. Como se usa en el presente documento, se dice que un anticuerpo se une específicamente a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos dada, por ejemplo, el PD-L1 humano maduro (en este caso los aminoácidos 19-290 del SEQ ID NO: 37), si se une a polipéptidos que comprenden esa secuencia pero no se une a proteínas que carecen de esa secuencia. Por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido que comprende los aminoácidos 19-290 del s Eq ID NO: 37 puede unirse a una forma etiquetada con FLAG® de los aminoácidos 19-290 del SEQ ID NO: 37 pero no se unirá a otras proteínas etiquetadas con FLAG®.

Como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo" se refiere a cualquier forma de anticuerpo que presente la actividad biológica deseada. Por tanto, se utiliza en el sentido más amplio y cubre específicamente, aunque no de forma limitativa, anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), anticuerpos humanizados, completamente humanos, anticuerpos quiméricos y anticuerpos camelizados de dominio único. Los "anticuerpos precursores" son anticuerpos obtenidos mediante la exposición de un sistema inmunitario a un antígeno antes de la modificación de los anticuerpos para un uso previsto, tal como la humanización de un anticuerpo para su uso como anticuerpo terapéutico humano.

Como se usa en el presente documento, a menos que se indique lo contrario, "fragmento de anticuerpo" o "fragmento de unión a antígeno" se refiere a fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos, es decir, fragmentos de anticuerpos que conservan la capacidad de unirse específicamente al antígeno unido por el anticuerpo de longitud completa, por ejemplo, fragmentos que conservan una o más regiones CDR. Los ejemplos de fragmentos de unión de anticuerpo incluyen, aunque sin limitación, fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo monocatenario, por ejemplo, sc-Fv; nanocuerpos y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.

Un "fragmento Fab" comprende una cadena ligera y las regiones C^h 1 y variable de una cadena pesada. La cadena pesada de una molécula Fab no puede formar un enlace disulfuro con otra molécula de cadena pesada. Un "fragmento Fab" puede ser el producto de la escisión con papaína de un anticuerpo.

Una región "Fc" comprende dos fragmentos de cadena pesada que comprenden los dominios C^h 1 y C^h2 de un anticuerpo. Los dos fragmentos de la cadena pesada se mantienen unidos mediante dos o más enlaces disulfuro y mediante interacciones hidrófobas de los dominios C^h3.

Un "fragmento Fab'" contiene una cadena ligera y una parte o un fragmento de una cadena pesada que contiene el dominio V^h y el dominio C^h 1 y también la región entre los dominios C^h 1 y C^h2, de tal forma que puede formarse un enlace disulfuro intercadena entre las dos cadenas pesadas de dos fragmentos Fab' para formar una molécula de F(ab')2.

Un "fragmento F(ab')2" contiene dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas que contienen una parte de la región constante entre los dominios C^h 1 y C^h2, de tal forma que se forma un enlace disulfuro intercadena entre las dos cadenas pesadas. Por tanto, un fragmento F(ab')2 está compuesto por dos fragmentos Fab' que se mantienen unidos mediante un enlace disulfuro entre las dos cadenas pesadas. Un "fragmento F(ab')2" puede ser el producto de la escisión con pepsina de un anticuerpo.

La "región Fv" comprende las regiones variables de las cadenas tanto pesada como ligera, pero carece de las regiones constantes.

La expresión anticuerpo "Fv monocatenario" o "scFv", se refiere a fragmentos de anticuerpo que comprenden los dominios V^h y V ^l de un anticuerpo, en donde estos dominios están presentes en una única cadena polipeptídica. En general, el polipéptido Fv comprende además un enlazador polipeptídico entre los dominios V^h y V ^l lo que permite que el scFv forme la estructura deseada para la unión con el antígeno. Para una revisión de scFv, véase Pluckthun (1994) THE PHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES, vol. 113, Rosenburg y Moore eds. Springer-Verlag, Nueva York, págs. 269-315. Véase también, la publicación de solicitud de patente internacional N.° WO 88/01649 y las patentes de Estados Unidos N.° 4.946, 778, 5.260.203.

Un "anticuerpo de dominio" es un fragmento de inmunoglobulina inmunológicamente funcional que contiene únicamente la región variable de una cadena pesada o la región variable de una cadena ligera. En algunos casos, dos o más regiones V ^h se unen covalentemente con un enlazador peptídico para crear un anticuerpo de dominio bivalente. Las dos regiones V^h de un anticuerpo de dominio bivalente pueden dirigirse al mismo antígeno o a antígenos diferentes.

Un "anticuerpo bivalente" comprende dos sitios de unión a antígeno. En algunos casos, los dos sitios de unión tienen las mismas especificidades antigénicas. Sin embargo, los anticuerpos bivalentes pueden ser biespecíficos (véase más adelante).

Los anticuerpos monoclonales descritos en el presente documento también incluyen anticuerpos camelizados de dominio único. Véase, por ejemplo, Muyldermans et al. (2001) Trends Biochem. Sci. 26:230; Reichmann et al. (1999) J. Immunol. Methods 231:25; los documentos WO 94/04678 y WO 94/25591; y la patente de Estados Unidos N.° 6.005.079. La presente divulgación proporciona anticuerpos de dominio único que comprenden dos dominios V ^h con modificaciones tales que se forman anticuerpos de dominio único.

Como se usa en el presente documento, el término "diacuerpos" se refiere a fragmentos de anticuerpos pequeños con dos sitios de unión a antígeno, comprendiendo dichos fragmentos un dominio variable de cadena pesada (V^h) conectado con un dominio variable de cadena ligera (V^l) en la misma cadena polipeptídica (V^h-V^l o V^l-V^h). Usando un enlazador que sea demasiado corto como para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, se obliga a los dominios a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión al antígeno. En los documentos EP 404097 y WO 93/11161 y en Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448, se describen diacuerpos de manera más completa. Para una revisión de variantes de anticuerpos genomodificadas véase, en general, Holliger y Hudson (2005) Nat. Biotechnol. 23:1126-1136.

Normalmente, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la invención conserva al menos un 10 % de su actividad de unión al PD-L1 humano (cuando se compara con el anticuerpo precursor) cuando esa actividad se expresa sobre una base molar. Preferentemente, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la invención conserva al menos un 20 %, 50 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 100 % o más de la afinidad de unión al PD-L1 humano como el anticuerpo precursor. También se pretende que un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno como se describe en el presente documento pueda incluir sustituciones de aminoácidos conservativas o no conservativas (denominadas "variantes conservativas o "variantes conservadas en función" del anticuerpo) que no alteren sustancialmente su actividad biológica.

"Anticuerpo aislado" se refiere al estado de purificación y en dicho contexto significa que la molécula carece sustancialmente de otras moléculas biológicas tales como ácidos nucleicos, proteínas, lípidos, carbohidratos u otros materiales, tales como restos celulares y medios de crecimiento. En general, el término "aislado" no pretende referirse a una ausencia total de dicho material o una ausencia de agua, tampones o sales, a menos que estén presentes en cantidades que interfieran sustancialmente con el uso experimental o terapéutico del compuesto de unión como se describe en el presente documento.

La expresión "anticuerpo monoclonal", como se usa en el presente documento, se refiere a una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, las moléculas de anticuerpo que comprenden la población son idénticas en cuanto a la secuencia de aminoácidos excepto por posibles mutaciones de origen natural que puede haber en cantidades minoritarias. En cambio, las preparaciones de anticuerpos (policlonales) convencionales incluyen normalmente una multitud de anticuerpos diferentes que tienen diferentes secuencias de aminoácidos en sus dominios variables, particularmente en sus CDR, que a menudo son específicos para diferentes epítopos. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea y no debe interpretarse como que requiere la producción del anticuerpo por ningún método concreto. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales para su uso de acuerdo con la presente invención, pueden prepararse mediante el método del hibridoma descrito por primera vez en Kohler et al. (1975) Nature 256: 495 o pueden prepararse mediante métodos de ADN recombinante (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N.° 4.816.567. Los "anticuerpos monoclonales" también pueden aislarse de fagotecas de anticuerpos utilizando las técnicas descritas en Clackson et al. (1991) Nature 352: 624-628 y en Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222: 581-597, por ejemplo. Véase también Presta (2005) J. Allergy Clin. Immunol. 116:731.

En general, la unidad estructural básica del anticuerpo comprende un tetrámero. Cada tetrámero incluye dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, teniendo cada par una cadena "ligera" (de aproximadamente 25 kDa) y una "pesada" (de aproximadamente 50-70 kDa). La parte amino-terminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos, que son principalmente responsables del reconocimiento del antígeno. La parte carboxi-terminal de la cadena pesada puede definir una región constante que es principalmente responsable de la función efectora. Normalmente, las cadenas ligeras humanas se clasifican como cadenas ligeras kappa y lambda. Por otro lado, las cadenas pesadas humanas se clasifican normalmente como mu, delta, gamma, alfa o épsilon y definen el isotipo del anticuerpo, tal como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. Dentro de cadenas ligeras y pesadas, las regiones variable y constante están unidas por una región "J" de aproximadamente 12 o más aminoácidos, incluyendo también la cadena pesada una región "D" de aproximadamente 10 aminoácidos más. Véase, en general, Fundamental Immunology Cap. 7 (Paul, W., ed., 2a ed. Raven Press, N.Y. (1989).

Las regiones variables de cada par de cadena ligera/pesada forman el sitio de unión del anticuerpo. Por tanto, en general, un anticuerpo intacto tiene dos sitios de unión. Excepto en anticuerpos bifuncionales o biespecíficos, los dos sitios de unión son, en general, iguales.

Normalmente, los dominios variables de las cadenas pesada y ligera comprenden tres regiones hipervariables, también denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDr ), localizadas dentro de regiones estructurales (FR, del inglés framework regions) relativamente conservadas. Las CDR están normalmente alineadas mediante las regiones estructurales, lo que permite la unión a un epítopo específico. En general, del N-terminal al C-terminal, los dominios variables de las cadenas tanto ligera como pesada comprenden FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. Generalmente, la asignación de aminoácidos a cada dominio se realiza según las definiciones de Sequences of Proteins of Immunological Interest, Kabat, et al.; National Institutes of Health, Bethesda, Md.; 5a ed.; NIH Publ. N.° 91-3242 (1991); Kabat (1978) Adv. Prot. Chem. 32:1-75; Kabat, et al., (1977) J. Biol. Chem. 252:6609-6616; Chothia, et al., (1987) J Mol. Biol. 196:901-917 o Chothia, et al., (1989) Nature 342:878-883.

Como se usa en el presente documento, la expresión "región hipervariable" se refiere a los restos de aminoácidos de un anticuerpo que son responsables de la unión al antígeno. La región hipervariable comprende restos de aminoácidos de una "región determinante de complementariedad" o "CDR" (es decir, CDRL1, CDRL2 y CDRL3 en el dominio variable de cadena ligera y CDRH1, CDRH2 y CDRH3 en el dominio variable de cadena pesada). Véase Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, ⁵ a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (que definen las regiones CDR de un anticuerpo por secuencia); véase también Chothia y Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917 (que definen las regiones CDR de un anticuerpo por estructura). Como se usa en el presente documento, la expresión restos "estructurales" o "FR" se refiere a los restos de dominio variable distintos de los restos de la región hipervariable definidos en el presente documento como restos de CDR.

"Homología" se refiere a la similitud de secuencia entre dos secuencias de polinucleótidos o entre dos secuencias de polipéptidos cuando están alineadas de manera óptima. Cuando en las dos secuencias comparadas, una posición está ocupada por la misma base o subunidad monomérica de aminoácidos, por ejemplo, si en cada una de las dos moléculas de ADN, una posición está ocupada por adenina, entonces las moléculas son homólogas en dicha posición. El porcentaje de homología es el número de posiciones homólogas compartidas por las dos secuencias dividido entre el número total de posiciones comparadas x 100. Por ejemplo, si en dos secuencias, 8 de 10 de las posiciones coinciden o son homólogas cuando las secuencias están alineadas de manera óptima, entonces las dos secuencias son 80 % homólogas. En general, la comparación se hace cuando dos secuencias se alinean para proporcionar el máximo porcentaje de homología. Por ejemplo, la comparación se puede realizar mediante un algoritmo BLAST en el que los parámetros del algoritmo se seleccionan para dar la mayor coincidencia entre las secuencias respectivas en toda la longitud de las secuencias de referencia respectivas.

Por "molécula de ácido nucleico aislada" se entiende un ADN o ARN de origen genómico, ARNm, ADNc o sintético o alguna combinación de los mismos, que no está asociado a la totalidad o una parte de un polinucleótido en el que el polinucleótido aislado se encuentra en la naturaleza, o está unido a un polinucleótido al que no está unido en la naturaleza. A efectos de la presente divulgación, ha de entenderse que "una molécula de ácido nucleico que comprende" una secuencia de nucleótidos particular, no abarca cromosomas intactos. Las moléculas de ácido nucleico aisladas "que comprenden" secuencias específicas de ácido nucleico pueden incluir, además de las secuencias específicas, secuencias codificantes para hasta diez o incluso hasta veinte o más proteínas distintas o partes o fragmentos de las mismas, o pueden incluir secuencias reguladoras unidas operativamente que controlan la expresión de la región codificante de las secuencias de ácido nucleico citadas y/o pueden incluir secuencias de vector.

La expresión "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante unida operativamente en un organismo hospedador particular. Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas, incluyen, por ejemplo, un promotor, opcionalmente una secuencia operadora y un sitio de unión al ribosoma. Se sabe que las células eucariotas usan promotores, señales de poliadenilación y potenciadores.

Un ácido nucleico está "unido operativamente" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN de una presecuencia o líder de secreción está unido operativamente con ADN de un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está unido operativamente con una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión al ribosoma está unido operativamente con una secuencia codificante si se coloca de manera que facilite la traducción. En general, "unido operativamente" significa que las secuencias de ADN que se unen son contiguas y, en el caso de un líder de secreción, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, no es necesario que los potenciadores sean contiguos. La unión se realiza mediante ligamiento en sitios de restricción convenientes. Si no existen dichos sitios, se usan adaptadores o enlazadores oligonucleotídicos sintéticos de acuerdo con la práctica convencional.

Como se usa en el presente documento, las expresiones "célula", "línea celular", y "cultivo celular", se pueden utilizar indistintamente y todas estas denominaciones incluyen la descendencia. Por tanto, las palabras "transformantes" y "células transformadas" incluyen la célula objeto primaria y cultivos procedentes de la misma sin tener en cuenta el número de transferencias. También se entiende que no toda la descendencia tendrá un contenido de ADN exactamente idéntico, debido a mutaciones deliberadas o involuntarias. Se incluye descendencia mutante que tiene la misma función o actividad biológica que la explorada en la célula transformada originalmente. Cuando se pretenda hacer denominaciones distintas, estas quedaran claras a partir del contexto.

Como se usa en el presente documento, "reacción en cadena de la polimerasa" o "PCR" se refiere a un procedimiento o a una técnica donde se amplifican secuencias específicas de ácidos nucleicos, ARN y/o ADN, como se describe, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos N.° 4.683.195. En general, la información de secuencia de los extremos de la región de interés o más allá, se utiliza para diseñar cebadores de oligonucleótidos. Estos cebadores tendrán una secuencia idéntica o similar a las cadenas opuestas del molde que se va a amplificar. Los nucleótidos 5' terminales de los dos cebadores pueden coincidir con los extremos del material amplificado. La PCR se puede usar para amplificar secuencias de ARN específicas, secuencias de ADN específicas a partir de ADN genómico total y ADNc transcrito a partir de ARN celular total, secuencias de bacteriófago o plásmido, etc. Véase, en general, Mullis et al. (1987) Cold Spring Harbor Symp. Cuant. Biol. 51:263; Erlich, ed., (1989) PCR TECHNOLOGY (Stockton Press, N.Y.) Como se usa en el presente documento, se considera que la PCR es un ejemplo, aunque no el único, de un método de reacción de la polimerasa de ácido nucleico para amplificar una muestra de ensayo de ácido nucleico que comprende el uso de un ácido nucleico conocido como cebador y una polimerasa de ácido nucleico para amplificar o generar un trozo específico de ácido nucleico.

Como se usa en el presente documento, la expresión "secuencia de línea germinal" se refiere a una secuencia de secuencias de ADN de inmunoglobulina no reordenadas. Se puede usar cualquier fuente adecuada de secuencias de inmunoglobulina no reordenadas. Se pueden obtener secuencias de la línea germinal humana, por ejemplo, de las bases de datos de la línea germinal JOINSOLVER® en el sitio web del National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases de los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos. Se pueden obtener secuencias de la línea germinal de ratón, por ejemplo, como se describe en Giudicelli et al. (2005) Nucleic Acids Res. 33:D256-D261.

Propiedades físicas y funcionales de los anticuerpos anti-PD-LI ilustrativos

La presente invención proporciona anticuerpos anti-PD-L1 aislados y métodos de uso de los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos en la detección de la expresión del PD-L1 en la superficie de las células. Son ejemplos de anticuerpos anti-PD-L1 de la invención: los anticuerpos 20C3 y 22C3 (véanse las figuras 1 y 2). Los anticuerpos 20C3 y 22C3 se unen a epítopos no idénticos pero adyacentes (véase el ejemplo 2 y la figura 9), lo que indica que las CDR de estos dos anticuerpos pueden mezclarse para obtener anticuerpos adicionales, como se describe en el presente documento, que se unen específicamente al PD-L1 en uno o ambos de estos epítopos. Por tanto, como se describe en el presente documento, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo aislado que se une al PD-L1 humano puede comprender tres de las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de cadena ligera y tres de las CDR de cadena pesada mostradas a continuación en las Tablas 1 a 3.

(continuación)

(continuación)

(continuación)

"Variantes modificadas de manera conservativa" o "sustitución conservativa" se refiere a sustituciones de aminoácidos en una proteína por otros aminoácidos que tienen características similares (por ejemplo, carga, tamaño de la cadena lateral, hidrofobicidad/hidrofilicidad, conformación y rigidez de la cadena principal, etc.), de tal manera que pueden realizarse cambios con frecuencia sin alterar la actividad biológica de la proteína. Los expertos en esta técnica reconocen que, en general, las sustituciones de aminoácidos individuales en regiones no esenciales de un polipéptido no alteran sustancialmente la actividad biológica (véase, por ejemplo, Watson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., pág. 224 (4a Ed.)). Además, las sustituciones de aminoácidos estructural o funcionalmente similares tienen menos probabilidades de alterar la actividad biológica. Las sustituciones conservativas ilustrativas de la presente divulgación se exponen en la Tabla 4.

TABLA 4. Sustituciones conservativas de aminoácidos ilustrativas

continuación

En la presente divulgación también se contemplan variantes de función conservativa de los anticuerpos de la divulgación. "Variantes de función conservativa", como se usa en el presente documento, se refiere a anticuerpos o a fragmentos en los que se han cambiado uno o más restos de aminoácidos sin alterar una propiedad deseada, tal como una afinidad y/o especificidad del antígeno. Dichas variantes incluyen, aunque sin limitación, el remplazo de un aminoácido por uno que tiene propiedades similares, tal como las sustituciones de aminoácidos conservativas de la Tabla 4.

En otra realización, la invención incluye un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente al PD-L1 y que tiene dominios V^l y dominios V^h y que comparte una homología de secuencia del 100 % con las regiones variables maduras de cadena ligera y pesada de las Tablas 1 o 2.

Ácidos nucleicos

La presente invención también proporciona ácidos nucleicos que codifican las cadenas de inmunoglobulina de los anticuerpos anti-PD-L1 y fragmentos de unión a antígeno desvelados en el presente documento. La presente invención incluye ácidos nucleicos que codifican los aminoácidos de las regiones variables maduras de cadena ligera y pesada de las Tablas 1 o 2, en donde en el SEQ ID NO: 32, X es Q.

En general, los ácidos nucleicos se hibridan en condiciones de rigurosidad baja, moderada o alta, y codifican anticuerpos que conservan la capacidad de unirse específicamente al PD-L1. Una primera molécula de ácido nucleico "puede "hibridarse" con una segunda molécula de ácido nucleico cuando una forma monocatenaria de la primera molécula de ácido nucleico puede aparearse con la segunda molécula de ácido nucleico en las condiciones adecuadas de temperatura y fuerza iónica de la solución (véase Sambrook, et al., citado anteriormente). Las condiciones de temperatura y fuerza iónica determinan la "rigurosidad" de la hibridación. Las condiciones normales de hibridación de rigurosidad baja incluyen 55 °C, SSC 5X, SDS al 0,1% y sin formamida; o con formamida al 30 %, SSC 5X, SDS al 0,5 % a 42 °C. Las condiciones normales de hibridación de rigurosidad moderada son formamida al 40 %, con SSC 5X o 6X y SDS al 0,1 % a 42 °C. Las condiciones de hibridación de rigurosidad alta son formamida al 50 %, SSC 5X o 6X a 42 °C u, opcionalmente, a una temperatura más alta (por ejemplo, 57 °C, 59 °C, 60 °C, 62 °C, 63 °C, 65°°C o 68°°C). En general, el SSC es NaCl 0,15 M y citrato de Na 0,015 M. La hibridación requiere que los dos ácidos nucleicos contengan secuencias complementarias, aunque, dependiendo de la rigurosidad de la hibridación, son posibles emparejamientos erróneos entre bases. La rigurosidad apropiada para hibridar ácidos nucleicos depende de la longitud de los ácidos nucleicos y del grado de complementación, variables bien conocidas en la técnica. Cuanto mayor sea el grado de similitud u homología entre dos secuencias de nucleótidos, mayor será la rigurosidad con la que pueden hibridarse los ácidos nucleicos. Para híbridos de más de 100 nucleótidos de longitud, se han obtenido ecuaciones para calcular la temperatura de fusión (véase Sambrook, et al., citado anteriormente, 9.50-9.51). Para la hibridación con ácidos nucleicos más cortos, por ejemplo, oligonucleótidos, la posición de los emparejamientos erróneos se vuelve más importante y la longitud del oligonucleótido determina su especificidad (véase Sambrook, et al., citado anteriormente, 11.7-11.8).

Las siguientes referencias se refieren a algoritmos BLAST que se utilizan a menudo para el análisis de secuencias: ALGORITMOS BLAST: Altschul, S.F., et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410; Gish, W., et al., (1993) Nature Genet.

3:266-272; Madden, T.L., et al., (1996) Meth. Enzymol. 266:131-141; Altschul, S.F., et al., (1997) Nucleic Acids Res.

25:3389-3402; Zhang, J., et al., (1997) Genome Res. 7:649-656; Wootton, J.C., et al., (1993) Comput. Chem. 17:149-163; Hancock, J.M. et al., (1994) Comput. Appl. Biosci. 10:67-70; SISTEMAS DE PUNTUACIÓN DE ALINEACIÓN: Dayhoff, M.O., et al., "A model of evolutionary change in proteins" in Atlas of Protein Sequence and Structure, (1978) vol. 5, suppl. 3. M.O. Dayhoff (ed.), págs. 345-352, Natl Biomed. Res. Found., Washington, DC; Schwartz, R.M., et al., "Matrices for detecting distant relationships" in Atlas of Protein Sequence and Structure, (1978) vol. 5, suppl. 3". M.O. Dayhoff (ed.), págs. 353-358, Natl Biomed. Res. Found., Washington, DC; Altschul, S.F., (1991) J. Mol. Biol. 219:555-565; States, D.J., et al., (1991) Methods 3:66-70; Henikoff, S., et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919; Altschul, S.F., et al., (1993) J. Mol. Evol. 36:290-300; DATOS ESTADÍSTICOS DE ALINEACIÓN: Karlin, S., et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268; Karlin, S., et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877; Dembo, A., et al., (1994) Ann. Prob. 22:2022-2039; y Altschul, S.F. "Evaluating the statistical significance of multiple distinct local alignments." en Theoretical and Computational Methods in Genome Research (S. Suhai, ed.), (1997) págS. 1-14, Plenum, Nueva York.

En algunas realizaciones, la invención proporciona un ácido nucleico aislado que codifica tanto una cadena ligera como una cadena pesada como se reivindica en una única molécula de ácido nucleico, y en otras realizaciones las cadenas ligera y pesada están codificadas en moléculas de ácido nucleico distintas. En otra realización, los ácidos nucleicos codifican además una secuencia señal.

La presente invención también proporciona vectores de expresión que comprenden los ácidos nucleicos aislados de la invención, en donde el ácido nucleico está unido operativamente a secuencias de control que son reconocidas por una célula hospedadora cuando la célula hospedadora se transfecta con el vector. También se proporcionan células hospedadoras que comprenden un vector de expresión de la presente invención. En el presente documento se describen métodos para producir el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se desvelan en el presente documento que comprenden cultivar en un medio de cultivo una célula hospedadora que lleva un vector de expresión que codifica el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno y aislar el antígeno o fragmento de unión a antígeno del mismo de la célula hospedadora o del medio de cultivo.

Unión epitópica

En el presente documento se describen anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que bloquean la unión del anticuerpo 20C3 o 22C3 con el PD-L1 humano uniéndose al mismo epítopo que 20C3 o 22C3, respectivamente. Dichos anticuerpos y fragmentos de unión pueden identificarse usando cualquier análisis de bloqueo cruzado o de competencia conocido en la técnica, incluyendo los análisis de competencia Octet descritos en el Ejemplo 2, seguido de la identificación del epítopo en el PD-L1 humano al que se une el anticuerpo de bloqueo cruzado. Se considera que un primer anticuerpo bloquea de forma cruzada la unión de un segundo anticuerpo si la unión previa de la diana con el primer anticuerpo a la saturación aumenta la concentración del segundo anticuerpo necesaria para lograr la unión media máxima de la diana en 2-, 3-, 4-, 5-, 10-, 20-, 50-, 100-, 200 veces o más. El epítopo de unión de un anticuerpo de bloqueo cruzado puede identificarse usando técnicas bien conocidas en la materia.

Una de dichas técnicas de mapeo epitópico es el intercambio de hidrógeno/deuterio acoplado con proteólisis y espectrometría de masas (HDX-MS). Este método se basa en la medición precisa y la comparación del grado de incorporación de deuterio por un antígeno cuando se incuba en agua pesada (D2O) por sí solo y en presencia de su anticuerpo en varios intervalos de tiempo. El deuterio se intercambia por hidrógeno en la cadena principal amida de las proteínas en las áreas expuestas, mientras que las regiones del antígeno unidas al anticuerpo estarán protegidas y mostrarán menos o ningún intercambio después del análisis por cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) de fragmentos proteolíticos.

Basándose en el mapeo epitópico HDX-MS descrito en el Ejemplo 3, el epítopo propuesto en el PD-L1 humano maduro para el anticuerpo 22C3 comprende restos en dos segmentos de aminoácidos discontinuos en el dominio extracelular (SEQ ID NO: 38): 156 a 178 y 196 a 206. Es probable que haya restos epitópicos adicionales en los siguientes segmentos del dominio extracelular (SEQ ID NO: 38): 3 a 9; 10 a 13; 88 a 93 y 135 a 147.

Por tanto, como se describe en el presente documento, un anticuerpo que bloquea la unión del anticuerpo 22C3 con el PD-L1 humano al unirse al mismo epítopo que 22C3 se une a los restos en un primer segmento de los aminoácidos 156 a 178 del SEQ ID NO: 38 y a los restos en un segundo segmento de los aminoácidos 196 a 206 del SEQ ID NO: 38, y también se une a los restos en cualquiera de uno, dos, o tres, o en los cuatro, de los siguientes segmentos del SEQ ID NO: 38: aminoácidos 3 a 9; aminoácidos 10 a 13; aminoácidos 88 a 93 y aminoácidos 135 a 147.

Métodos de fabricación de anticuerpos y de fragmentos de unión a antígeno de los mismos

Las células de hibridoma que producen anticuerpos anti-X monoclonales precursores (por ejemplo, roedores) pueden producirse mediante métodos conocidos comúnmente en la materia. Estos métodos incluyen, aunque sin limitación, la técnica del hibridoma desarrollada originalmente por Kohler, et al., (1975) (Nature 256:495-497), así como la técnica del trioma (Hering, et al., (1988) Biomed. Biochim. Acta. 47:211-216 y Hagiwara, et al., (1993) Hum. Antibod. Hybridomas 4:15), la técnica del hibridoma de células B humanas (Kozbor, et al., (1983) Immunology Today 4:72 y Cote, et al., (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2026-2030), la técnica del hibridoma con el VEB (virus de Epstein Barr) (Cole, et al., en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., págs. 77-96, 1985), y electrofusión basada en campo eléctrico usando un electroporador de fusión selectiva de cámara grande Cyto Pulse (Cyto Pulse Sciences, Inc., Glen Burnie, MD). Preferentemente, esplenocitos de ratón se aíslan y se fusionan con PEG o mediante electrofusión con una línea celular de mieloma de ratón basándose en protocolos estándar.

A continuación, los hibridomas resultantes pueden explorarse con respecto a la producción de anticuerpos específicos de antígeno. Por ejemplo, suspensiones unicelulares de linfocitos esplénicos de ratones inmunizados pueden fusionarse a una sexta parte del número de células de mieloma de ratón no secretoras P3X63-Ag8.653 (ATCC, CRL 1580) con PEG al 50 %. Las células pueden sembrarse en placas a aproximadamente 2 x 105 células/ml en una placa de microtitulación de fondo plano, seguido de dos semanas de incubación en medio selectivo que contiene suero de clon fetal al 20 %, medios acondicionados "653" al 18 %, origen (IGEN) al 5 %, L-glutamina 4 mM, L-glutamina 1 mM, piruvato sódico 1 mM, HEPES 5 mM, 2-mercaptoetanol 0,055 mM, penicilina 50 unidades/ml, estreptomicina 50 mg/ml, gentamicina 50 mg/ml y HAT 1X (Sigma; el HAT se añade 24 horas después de la fusión). Después de dos semanas, las células pueden cultivarse en medio en el que el HAT está reemplazado por HT. A continuación, los pocillos individuales pueden explorarse mediante ELISA para detectar anticuerpos de IgG monoclonales anti-X. Una vez que se produce el crecimiento extenso del hibridoma, el medio puede observarse normalmente después de 10-14 días. Los hibridomas secretores de anticuerpo pueden resembrarse en placas, explorarse de nuevo y si siguen siendo positivos a la IgG humana, los anticuerpos monoclonales anti-X, pueden subclonarse al menos dos veces mediante dilución limitante.

A continuación, para su caracterización, los subclones estables pueden cultivarse in vitro para generar pequeñas cantidades de anticuerpo en medio de cultivo tisular. Por ejemplo, usando el siguiente procedimiento, a partir de la línea celular de hibridoma de ratón MEB037.22C3.138, puede producirse y purificarse aproximadamente 1 gramo del anticuerpo 22C3. Las células de MEB037.22C3.138 congeladas se descongelan y se adaptan en un matraz de agitación usando medio sin suero de hibridoma con L-glutamina adicional 2 mM con o sin Pluronic F-68 al 0,18 %. La presencia de Pluronic F-68 puede mejorar la viabilidad del cultivo en el matraz de agitación. Una vez que las células se han adaptado completamente en el matraz de agitación, se realiza un cultivo de producción de 20 litros en medio sin suero en un biorreactor WAVE (GE Healthcare Life Sciences) con la adición de suministro B eficiente de CHO CD al 10 % (Invitrogen, n.° de catálogo A10240-01). Para la expansión celular, se inicia un cultivo de 1 litro en una pequeña bolsa WAVE, y después el cultivo WAVE de 1 l se expande a un cultivo de 20 l en el biorreactor WAVE. El cultivo de 20 litros puede iniciarse a una densidad celular de 0,5 x 106 células viables/ml, alimentarse con suministro B eficiente de CHO CD al 10 % el día 1 y el pH puede ajustarse diariamente con Na2CO3 1 N. Las células se recogen después de cuatro días. Para el análisis NOVA pueden recogerse pequeñas muestras diariamente.

Los anticuerpos anti-hPD-L1 de la invención pueden purificarse de un cultivo de hibridoma mediante el siguiente proceso. El cultivo de hibridoma se aclara mediante filtración profunda utilizando fibra de vidrio de 1,2 micrómetros y un filtro de acetato de celulosa de 0,2 micrómetros. Al aclarado recogido se le añade un mismo volumen de tampón ProSepA 2X (ácido bórico 100 mM, NaCl 5 M, pH 8,5) y el diluido recogido se carga en una columna de proteína A con un volumen de lecho de 170 ml. La columna se lava con 5 volúmenes de columna (VC) de tampón ProSepA 1X (ácido bórico 50 mM, NaCl 2,5 M, pH 8,5), después se lava con 2VC de PBS 1X y el anticuerpo anti-hPD-L1 se eluye con 5VC de tampón de elución (glicina 0,1M, pH 3,0). Las fracciones de elución que contienen IgG se combinan y el pH se neutraliza añadiendo un volumen de 1/10 de Tris 1,0 M, tampón de pH. La composición de anticuerpo neutralizado se esteriliza después por filtración usando un casete de TFF desechable de 10 kDa. Para su conservación, el anticuerpo puede formularse mediante diafiltración frente a 10 litros de tampón de formulación (acetato de sodio 20 mM, sacarosa al 9 %, pH 5,0) y usando 20 cambios de volumen. Usando este protocolo, el anticuerpo 22C3 puede prepararse a una concentración de aproximadamente 5,0 mg/ml y con una pureza de al menos el 98 % mediante SDS-Pa Ge , Mediciones por SEC HPLC y C8 RP-HPLC, con niveles de endotoxina inferiores a 0,1 UE/ml y menos de 0,02 UE/mg.

Los anticuerpos anti-PD-L1 desvelados en el presente documento también pueden producirse de manera recombinante (por ejemplo, en un sistema de expresión de E. coli/T7, como se indicó anteriormente). En esta realización, ácidos nucleicos que codifican las moléculas de anticuerpo de la invención (por ejemplo, V^h o V ^l) pueden insertarse en un plásmido basado en pET y expresarse en el sistema de E. coli/T7. Existen varios métodos conocidos en la materia para producir anticuerpos recombinantes. En la Patente de Estados Unidos N° 4.816.567 se desvela un ejemplo de un método de producción recombinante de anticuerpos. La transformación puede ser mediante cualquier método conocido de introducción de polinucleótidos en una célula hospedadora. En la materia se conocen bien métodos para introducir polinucleótidos heterólogos en células de mamífero e incluyen transfección mediada por dextrano, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplastos, electroporación, encapsulación del polinucleótido (o de los polinucleótidos en liposomas, inyección biolística y microinyección directa del ADN en los núcleos. Además, las moléculas de ácido nucleico pueden introducirse en células de mamíferos mediante vectores víricos. En la materia se conocen bien métodos de transformación de células. Véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos N.° 4.399.216; 4.912.040; 4.740.461 y 4.959.455.

Los anticuerpos anti-PD-L1 también pueden sintetizarse mediante cualquiera de los métodos expuestos en la patente de Estados Unidos N.° 6.331.415.

En la materia se conocen bien líneas celulares de mamífero disponibles como hospedadores para la expresión de los anticuerpos o fragmentos desvelados en el presente documento e incluyen muchas líneas celulares inmortalizadas disponibles en la colección americana de cultivos tipo (American Type Culture Collection, ATCC). Estas incluyen, entre otras, células de ovario de hámster chino (CHO), NSO, células SP2, células HeLa, células de riñón de cría de hámster (BHK, baby hámster kidney), células de riñón de mono (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2), células A549, células 3T3, células h EK-293 y diversas líneas celulares distintas. Las células hospedadoras de mamífero incluyen seres humanos, ratón, rata, perro, mono, cerdo, cabra, bovinos, células de caballo y hámster. Las líneas celulares de preferencia particular se seleccionan determinando qué líneas celulares tienen altos niveles de expresión. Otras líneas celulares que pueden utilizarse son líneas celulares de insecto, tales como células Sf9, células de anfibios, células bacterianas, células vegetales y células fúngicas. Cuando los vectores de expresión recombinante codifican la cadena pesada o la parte de unión al antígeno o un fragmento de la misma, la cadena ligera y/o el fragmento de unión a antígeno de la misma se introducen en células hospedadoras de mamífero, los anticuerpos se producen cultivando las células hospedadoras durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células hospedadoras o, más preferentemente, la secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en el que crecen las células hospedadoras.

Los anticuerpos pueden recuperarse del medio de cultivo usando métodos de purificación de proteínas convencionales. Adicionalmente, usando diversas de técnicas conocidas, puede potenciarse la expresión de los anticuerpos de la invención (u otras fracciones de los mismos) a partir de líneas celulares de producción. Por ejemplo, el sistema de expresión del gen de la glutamina sintetasa (el sistema GS) es una estrategia habitual para mejorar la expresión en determinadas condiciones. El sistema GS se analiza, total o parcialmente, en relación con las patentes europeas N.° 0216846, 0256055 y 0323997 y con la solicitud de patente europea N.° 89303964.4.

Un anticuerpo policlonal es un anticuerpo que se produce entre o en presencia de uno o más, anticuerpos distintos, no idénticos. En general, los anticuerpos policlonales se producen a partir de colecciones de linfocitos B diferentes, por ejemplo, el linfocito B de un animal tratado con un inmunógeno de interés, que produce una población de anticuerpos diferentes que están todos dirigidos al inmunógeno. Habitualmente, los anticuerpos policlonales se obtienen directamente de un animal inmunizado, por ejemplo, de bazo, suero o líquido ascítico.

La presente invención incluye además fragmentos de anticuerpo de los anticuerpos anti-PD-LI desvelados en el presente documento. Los fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos F(ab)2, que pueden producirse por escisión enzimática de una IgG mediante, por ejemplo, pepsina. Los fragmentos Fab pueden producirse, por ejemplo, mediante reducción de F(ab)2 con ditiotreitol o mercaptoetilamina. Un fragmento Fab es una cadena V^l-C^l unida a una cadena V^h-C^hi mediante un puente disulfuro. Un fragmento F(ab)2 está constituido por dos fragmentos Fab que, a su vez, están unidos por dos puentes disulfuro. La parte Fab de una molécula F(ab)2 incluye una parte de la región Fc entre la que se encuentran los puentes disulfuro. Un fragmento Fv es una región V ^l o V ^h .

Las inmunoglobulinas pueden asignarse a diferentes clases dependiendo de las secuencias de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas. Hay al menos cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de éstas pueden dividirse además en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG-1, IgG-2, IgG-3 e IgG-4; IgA-1 e IgA-2. La invención comprende anticuerpos y fragmentos de IgG de unión a antígeno.

En una realización, el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno comprende una región constante de cadena pesada, por ejemplo, una región constante humana, tal como la región constante humana de cadena pesada humana Yl, y2, y3 o y4 o una de sus variantes. En otra realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende una región constante de cadena ligera, por ejemplo, una región constante de cadena ligera humana, tal como la región de cadena ligera humana lambda o kappa o una de sus variantes. Como ejemplo, y sin limitación, la región constante de cadena pesada humana puede ser y1 y la región constante de cadena ligera humana puede ser kappa. En una realización alternativa, la región Fc del anticuerpo es y4 con una mutación Ser228Pro (Schuurman, J et al., Mol. Immunol. 38: 1-8, 2001).

En algunas realizaciones, se pueden añadir diferentes dominios constantes a las regiones V ^l y V^h humanizadas reivindicadas. Por ejemplo, si un uso particular previsto de un anticuerpo (o fragmento) de la presente invención requiriera la alteración de las funciones efectoras, podría utilizarse un dominio constante de cadena pesada distinto de la IgG1 humana, o podría utilizarse un híbrido de IgG1/IgG4.

Genomodificación de anticuerpos

Como se describe en el presente documento, para proporcionar una mayor estabilidad química del anticuerpo final, sería deseable cambiar ciertos aminoácidos que contienen cadenas laterales expuestas por otro resto de aminoácido, como se expone a continuación. La desaminación de la asparagina puede producirse en secuencias N-G o D-G y puede dar como resultado la creación de un resto de ácido isoaspártico que puede introducir un pliegue en la cadena polipeptídica y puede disminuir su estabilidad (efecto de ácido isoaspártico). Como se describe en el presente documento, los anticuerpos de la presente divulgación no contienen sitios de isomería de asparagina.

Por ejemplo, un resto de asparagina (Asn) se puede cambiar por Gln o Ala para reducir el potencial de formación de isoaspartato en cualquier secuencia Asn-Gly, particularmente dentro de una CDR. Puede producirse un problema similar en una secuencia de Asp-Gly. Reissner y Aswad (2003) Cell. Mol. Life Sci. 60:1281. La formación de isoaspartato puede debilitar o anular completamente la unión de un anticuerpo con su antígeno diana. Véase, Presta (2005) J. Allergy Clin. Immunol. 116:731 en 734. Como se describe en el presente documento, la asparagina se cambia a glutamina (Gln). También puede ser deseable alterar un aminoácido adyacente a un resto de asparagina (Asn) o glutamina (Gln) para reducir la probabilidad de desamidación, que ocurre a mayor velocidad cuando los aminoácidos pequeños se encuentran adyacentes a la asparagina o la glutamina. Véase, Bischoff y Kolbe (1994) J. Chromatog.

662:261. Además, en las CDR, cualquier resto de metionina (normalmente Met expuesta a disolvente) puede cambiarse a Lys, Leu, Ala o Phe para reducir la posibilidad de que se oxide el azufre de metionina, lo que podría reducir la afinidad de unión al antígeno y también contribuir a la heterogeneidad molecular en la preparación final de anticuerpos. Id. Como se describe en el presente documento, la metionina se cambia a alanina (Ala). Adicionalmente, para prevenir o minimizar posibles enlaces peptídicos Asn-Pro escindibles, puede ser deseable alterar cualquier combinación de Asn-Pro encontrada en una CDR a Gln-Pro, Ala-Pro o Asn-Ala. Los anticuerpos con dichas sustituciones se exploran posteriormente para garantizar que las sustituciones no disminuyan la afinidad o especificidad del anticuerpo por el PD-L1 humano u otra actividad biológica deseada a niveles inaceptables.

TABLA 5 Variantes de CDR estabilizadoras ilustrativas de la divul ación

Conjugados de anticuerpos

Las moléculas de anticuerpo anti-PD-L1 desveladas en el presente documento también pueden conjugarse con una fracción química tal como un radionúclido u otro marcador detectable. Los radionúclidos incluyen 99Tc, 90Y, 111In, 32P, 14C, 125I, 3H, 131I, 11C, 15O, 13N, 18F, 35S ,51 Cr, 57To, 226Ra, 60Co, 59Fe, 57Se, 152Eu, 67CU, 217Ci, 211At, 212Pb, 47Sc, 109Pd, 234Th y 40K, 157Gd, 55Mn, 52Tr y 56Fe. Los marcadores fluorescentes o quimioluminiscentes incluyen fluoróforos, tales como quelatos de tierras raras, fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, isotiocianato, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaladehído, fluorescamina, 152Eu, dansilo, umbeliferona, luciferina, marcador luminal, marcador isoluminal, un marcador de éster de acridinio aromático, un marcador de imidazol, un marcador de sal de acridinio, un marcador de éster de oxalato, un marcador de aecuorina, 2,3-dihidroftalacinadionas, biotina/avidina, marcadores de espín y radicales libres estables.

Se puede emplear cualquier método conocido en la materia para conjugar las moléculas de anticuerpo con las diversas fracciones, incluyendo los métodos descritos por Hunter, et al., (1962) Nature 144:945; David, et al., (1974) Biochemistry 13:1014; Pain, et al., (1981) J. Immunol. Meth. 40:219; y Nygren, J., (1982) Histochem. and Cytochem.

30:407. Los métodos para conjugar anticuerpos son convencionales y muy conocidos en la materia.

Usos experimentales y de diagnóstico

Los anticuerpos anti-PD-L1 y los fragmentos de anticuerpos desvelados en el presente documento pueden usarse para detectar específicamente el PD-L1 humano expresado en la superficie de una célula. La célula puede estar presente en una muestra de tejido o suero obtenida de un individuo humano y la detección de la expresión del PD-L1 se realiza utilizando cualquiera de varios métodos de ensayo in vitro conocidos en la materia.

Por ejemplo, realizaciones particulares incluyen ensayos ELISA (enzimoinmunoanálisis de adsorción), que normalmente comprenden las siguientes etapas:

(a) recubrir un sustrato (p. ej., la superficie de un pocillo de una placa de microtitulación, por ejemplo, una placa de plástico) con un fragmento de unión al antígeno del anticuerpo anti-PD-L1 del mismo;

(b) aplicar al sustrato una muestra para analizar la presencia del PD-L1 humano;

(c) lavar la placa, de modo que se elimine el material no unido en la muestra;

(d) aplicar anticuerpos marcados de manera detectable (por ejemplo, anticuerpos ligados a enzimas) que también son específicos del PD-L1 humano;

(e) lavar el sustrato, para eliminar los anticuerpos marcados no unidos;

(f) si los anticuerpos marcados están ligados a enzimas, aplicar una sustancia química que la enzima convierta en una señal fluorescente; y

(g) detectar la presencia del anticuerpo marcado.

En una realización adicional, el anticuerpo marcado está marcado con peroxidasa que reacciona con ABTS (por ejemplo, ácido 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico)) o 3,3',5,5'-tetrametilbencidina, para producir un cambio de color que sea detectable. Como alternativa, el anticuerpo marcado está marcado con un radioisótopo detectable (por ejemplo, 3H) que puede detectarse mediante un contador de centelleo en presencia de un centelleante.

Los anticuerpos anti-PD-LI y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la invención pueden usarse en un procedimiento de transferencia Western o inmunoproteína. Dicho procedimiento forma parte de la presente invención e incluye, por ejemplo:

(1) poner en contacto una membrana u otro sustrato sólido para analizar la presencia del PD-L1 humano del mismo con un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención. Dicha membrana puede adoptar la forma de una membrana de nitrocelulosa o basada en vinilo (por ejemplo, una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF)) en la que se han transferido proteínas para analizar la presencia de X en un gel PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis, electroforesis en gel de poliacrilamida) no desnaturalizante o gel SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio) (por ejemplo, después de la separación electroforética en el gel). Antes del contacto de la membrana con el anticuerpo o fragmento anti-PD-L1, la membrana está opcionalmente bloqueada, por ejemplo, con leche en polvo desnatada o similar para unir sitios de unión a proteínas inespecíficos en la membrana (2) lavar la membrana una o más veces para eliminar el anticuerpo o fragmento anti-PD-L1 no unido y otras sustancias no unidas; y

(3) detectar el anticuerpo o fragmento anti-PD-L1 unido.

El anticuerpo o fragmento unido puede detectarse incubando el anticuerpo o fragmento unido con un anticuerpo secundario (un anticuerpo anti-inmunoglobulina) que está marcado de manera detectable y, a continuación, detectando la presencia del anticuerpo secundario.

Los anticuerpos anti-PD-L1 y los fragmentos de unión a antígeno de los mismos desvelados en el presente documento también pueden usarse en ensayos de inmunohistoquímica (IHQ), que pueden realizarse usando varios formatos IHQ conocidos en la materia y que constituyen realizaciones de la invención. En un ensayo IHQ normal se usa una sección de tejido FFPE de aproximadamente 3-4 milímetros, y preferentemente de 4 micrómetros, montada y secada en un portaobjetos de microscopio y que comprende, por ejemplo, (1) someter la sección de tejido a desparafinización e hidratación, poner en contacto la sección de tejido rehidratado con un anticuerpo anti-PD-L1 o un fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención; y (2) detectar el anticuerpo anti-PD-L1 o su fragmento de unión a antígeno en la superficie de una o más células en el tejido. Si el anticuerpo o el propio fragmento está marcado de manera detectable, este puede detectarse directamente. Como alternativa, el anticuerpo o fragmento que se detecta puede unirse mediante un anticuerpo secundario marcado de manera detectable.

En un ensayo IHQ preferido se emplea el sistema de detección FLEX de Dako EnVision ™ disponible en el comercio, que está diseñado para su uso junto con un instrumento Dako Autostainer (Dako, una empresa de tecnologías Agilent, Glostrup, Dinamarca). Cuando se emplea este sistema con el anticuerpo 22C3, o con un anticuerpo que comprende las regiones variables de cadena pesada y ligera del anticuerpo 22C3, el ensayo IHQ puede realizarse de la siguiente manera. Secciones de tejido FFPE de cuatro micras de espesor, montadas en un portaobjetos, se secan al aire durante la noche, se cuecen a 60°°C durante 45 minutos, se desparafinan y se rehidratan. Después de la desparafinación, los portaobjetos FFPE se someten a una recuperación de epítopos inducida por calor utilizando la solución de recuperación diana de pH alto FLEX de EnVision™ a 97°°C seguido de 20 minutos a temperatura ambiente. Después, los portaobjetos se lavan, se tiñen durante 60 minutos con 22C3 a 2 |jg/ml y a continuación se detectan usando reactivos FLEX de Dako EnVision™ de la siguiente manera: Enlazador FLEX+ MS de EnVision™ (15 minutos), FLEX/HRP de EnVision™ (20 minutos), FLEX DAB de EnVision™ (10 minutos) y potenciador DAB (7 minutos) con etapas de lavado intermedias.

Como se describe en el presente documento, determinados anticuerpos anti-PD-L1 y fragmentos de unión a antígeno de los mismos desvelados en el presente documento, también pueden usarse para la formación de imágenes tumorales in vivo. Dicho método puede incluir la inyección de un anticuerpo anti-PD-L1 o de un fragmento de unión a antígeno del mismo radiomarcado en el cuerpo de un paciente humano para analizar la presencia de un tumor asociado a la expresión del PD-L1 seguido de la formación de imágenes nucleares del cuerpo del paciente para detectar la presencia del anticuerpo o fragmento marcado, por ejemplo, en lugares que comprenden una alta concentración del anticuerpo o fragmento que se une al tumor.

Las técnicas de obtención de imágenes incluyen imágenes SPECT (single-photon emission computed tomography, tomografía de emisión monofotónica) o imágenes PET (positron emission tomography, tomografía de emisión positrónica). Los marcadores incluyen, por ejemplo, yodo 123 (123I) y tecnecio 99m (99mTc), por ejemplo, junto con obtención de imágenes SPECT o 11C, 13N, 15O o 18F, por ejemplo, junto con obtención de imágenes PET o indio 111 (Véase, por ejemplo, Gordon et al., (2005) International Rev. Neurobiol. 67:385-440).

Kits de detección y kits terapéuticos

Por cuestiones de conveniencia, un anticuerpo o agente de unión específico desvelado en el presente documento se puede proporcionar en un kit, es decir, una combinación envasada de reactivos en cantidades predeterminadas con instrucciones para realizar el ensayo de diagnóstico o detección. Cuando el anticuerpo está marcado con una enzima, el kit incluirá sustratos y cofactores requeridos por la enzima (por ejemplo, un precursor de sustrato que proporciona el cromóforo o fluoróforo detectable). Además, pueden incluirse otros aditivos tales como estabilizadores, tampones (por ejemplo, un tampón de bloqueo o tampón de lisis) y similares. Las cantidades relativas de los diversos reactivos pueden variarse ampliamente para proporcionar unas concentraciones en solución de los reactivos que optimicen sustancialmente la sensibilidad del ensayo. En particular, los reactivos pueden proporcionarse en forma de polvos secos, habitualmente liofilizados, incluyendo excipientes que, en disolución, proporcionarán una solución de reactivo que tiene la concentración apropiada.

También se proporcionan reactivos y kits de diagnóstico o detección que comprenden uno o más de dichos reactivos para su uso en varios ensayos de detección, incluyendo, por ejemplo, inmunoanálisis tales como ELISA (de tipo sándwich o con formato competitivo). Los componentes del kit se pueden unir previamente a un soporte sólido o se pueden aplicar a la superficie de un soporte sólido cuando se utiliza el kit. En algunas realizaciones, los medios de generación de señales pueden venir previamente asociados a un anticuerpo de la invención o pueden requerir la combinación con uno o más componentes, por ejemplo, tampones, conjugados de anticuerpo y enzima, sustratos de enzimas, o similares, antes de su uso. Los kits también pueden incluir reactivos adicionales, por ejemplo, reactivos de bloqueo para reducir la unión inespecífica a la superficie de la fase sólida, reactivos de lavado, sustratos de enzimas y similares. La superficie de la fase sólida puede tener forma de tubo, de perla, de una placa de microtitulación, una microesfera u otros materiales adecuados para inmovilizar proteínas, péptidos o polipéptidos. En aspectos particulares, una enzima que cataliza la formación de un producto quimioluminiscente o cromogénico o la reducción de un sustrato quimioluminiscente o cromogénico es un componente de los medios de generación de señales. Dichas enzimas se conocen bien en la materia. Los kits pueden comprender cualquiera de los agentes de captura y reactivos de detección descritos en el presente documento. Opcionalmente, el kit también puede comprender instrucciones para llevar a cabo los métodos de la invención.

Los kits de detección desvelados en el presente documento también pueden prepararse para que comprendan al menos uno del anticuerpo o fragmento de unión al antígeno desvelado en el presente documento e instrucciones para usar la composición como un reactivo de detección. Los recipientes para usar en dichos kits pueden comprender normalmente al menos un vial, un tubo de ensayo, un matraz, un frasco, una jeringa u otro recipiente adecuado, en el que pueden colocarse una o más de las composiciones de detección, y preferentemente, dividirse convenientemente en alícuotas. Los kits desvelados en el presente documento también incluirán normalmente un medio para contener el vial o los viales en confinamiento cerrado para la venta comercial, tal como, por ejemplo, recipientes de plástico inyectables o moldeados por soplado en los que se guarda el vial o los viales deseados. Cuando en el kit se incluye un radiomarcador, un marcador cromogénico, fluorigénico u otro tipo de marcador detectable o medio de detección, el agente marcador puede proporcionarse en el mismo recipiente que el de la propia composición de detección, o de manera alternativa puede colocarse en un segundo medio de recipiente distinto en el que esta segunda composición puede colocarse y dividirse convenientemente en alícuotas. Como alternativa, el reactivo de detección puede prepararse en un solo medio de recipiente, y en la mayoría de los casos, el kit también incluirá normalmente un medio para contener el vial o los viales en confinamiento cerrado para la venta comercial y/o el envasado y suministro convenientes.

En el presente documento también se proporciona un dispositivo o aparato para llevar a cabo los métodos de detección o monitorización descritos en el presente documento. Dicho aparato puede incluir una cámara o un tubo en el que se puede introducir la muestra, un sistema de manipulación de líquidos que incluye opcionalmente válvulas o bombas para dirigir el flujo de la muestra a través del dispositivo, opcionalmente filtros para separar el plasma o el suero de la sangre, cámaras de mezclado para la adición de agentes de captura o reactivos de detección y, opcionalmente, un dispositivo de detección para detectar la cantidad de marcador detectable unido al inmunocomplejo del agente de captura. El flujo de muestra puede ser pasivo (por ejemplo, mediante fuerza capilar, hidrostática u otras fuerzas que no requieren una manipulación adicional del dispositivo una vez aplicada la muestra) o activo (por ejemplo, mediante la aplicación de una fuerza generada mediante bombas mecánicas, bombas electroosmóticas, fuerza centrífuga o aumento de la presión del aire), o mediante una combinación de fuerzas activas y pasivas.

En el presente documento también se proporciona un procesador, una memoria legible por ordenador y una rutina almacenada en la memoria legible por ordenador y adaptada para ejecutarse en el procesador para realizar cualquiera de los métodos descritos en el presente documento. Como ejemplos de sistemas informáticos, entornos y/o configuraciones adecuados se incluyen ordenadores personales, ordenadores servidores, dispositivos manuales o portátiles, sistema multiprocesadores, sistemas basados en microprocesadores, decodificadores, electrónica de consumo programable, PC de red, miniordenadores, ordenadores centrales, entornos informáticos distribuidos que incluyen cualquiera de los sistemas o dispositivos anteriores, o cualquier otro sistema conocido en la materia.

MÉTODOS GENERALES

Se describen métodos convencionales en biología molecular en Sambrook, Fritsch y Maniatis (1982 y 19892a edición, 2001 ³ a Edición) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Sambrook y Russell (2001) Molecular Cloning, ³ a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Wu (1993) Recombinant DNA, Vol. 217, Academic Press, San Diego, CA). También aparecen métodos estándar en Ausbel, et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vols.1-4, John Wiley y Sons, Inc. Nueva York, NY, que describen la clonación en células bacterianas y la mutagénesis de ADN (vol. 1), la clonación en células de mamífero y levadura (vol. 2), glucoconjugados y expresión de proteínas (vol. 3) y bioinformática (vol. 4).

Métodos de purificación de proteínas, incluida la inmunoprecipitación, cromatografía, electroforesis, centrifugación y cristalización, se describen en Coligan et al. (2000) Current Protocols en Protein Science, Vol. 1, John Wiley y Sons, Inc., Nueva York). Se describe el análisis químico, la modificación química, la modificación postraduccional, la producción de proteínas de fusión, la glucosilación de proteínas (véase, por ejemplo, Coligan, et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 2, John Wiley y Sons, Inc., Nueva York; Ausubel, et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 3, John Wiley y Sons, Inc., NY, NY, págs. 16.0.5-16.22.17; Sigma-Aldrich, Co. (2001) Products for Life Science Research, St. Louis, MO; págs.45-89; Amersham Pharmacia Biotech (2001) BioDirectory, Piscataway, N.J., págs. 384-391). Se describe la producción, purificación y fragmentación de anticuerpos policlonales y monoclonales (Coligan, et al. (2001)Current Protcols in Immunology, Vol. 1, John Wiley y Sons, Inc., Nueva York; Harlow y Lane (1999) Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Harlow y Lane, citado anteriormente). Se dispone de técnicas convencionales para caracterizar interacciones entre ligando/receptor véase, por ejemplo, Coligan, et al. (2001) Current Protocols in Immunology, Vol. 4, John Wiley, Inc., Nueva York).

Pueden prepararse anticuerpos monoclonales, policlonales y humanizados (véase, por ejemplo, Sheperd y Dean (eds.) (2000) Monoclonal Antibodies, Oxford Univ. Press, Nueva York, NY; Kontermann y Dubel (eds.) (2001) Antibody Engineering, Springer-Verlag, Nueva York; Harlow y Lane (1988) Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, págs. 139-243; Carpenter, et al. (2000) J. Immunol. 165:6205; He, et al. (1998) J. Immunol. 160:1029; Tang et al. (1999) J. Biol. Chem. 274:27371-27378; Baca et al. (1997) J. Biol. Chem.

272:10678-10684; Chothia et al. (1989) Nature 342:877-883; Foote y Winter (1992) J. Mol. Biol. 224:487-499; la patente de Estados Unidos N.° 6.329.511.

Una alternativa a la humanización es utilizar bibliotecas de anticuerpos humanos presentadas en fagotecas o bibliotecas de anticuerpos humanos en ratones transgénicos (Vaughan et al. (1996) Nature Biotechnol. 14:309-314; Barbas (1995) Nature Medicine 1:837-839; Mendez et al. (1997) Nature Genetics 15:146-156; Hoogenboom y Chames (2000) Immunol. Today 21:371-377; Barbas et al. (2001) Phage Display: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York; Kay et al. (1996) Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, Academic Press, San Diego, CA; de Bruin et al. (1999) Nature Biotechnol. 17:397-399).

La purificación del antígeno no es necesaria para la generación de anticuerpos. Los animales pueden inmunizarse con células que llevan el antígeno de interés. Los esplenocitos pueden aislarse después de los animales inmunizados y los esplenocitos pueden fusionarse con una línea celular de mieloma para producir un hibridoma (véase, por ejemplo, Meyaard et al. (1997) Immunity 7:283-290; Wright et al. (2000) Immunity 13:233-242; Preston et al., citados anteriormente; Kaithamana et al. (1999) J. Immunol. 163:5157-5164).

Los anticuerpos se pueden conjugar, por ejemplo, con pequeñas moléculas de fármaco, enzimas, liposomas, polietilenglicol (PEG). Los anticuerpos son útiles para fines terapéuticos, de diagnóstico, kits u otros propósitos, e incluyen anticuerpos acoplados, por ejemplo, a colorantes, radioisótopos, enzimas o metales, por ejemplo, oro coloidal (véase, por ejemplo, Le Doussal et al. (1991) J. Immunol. 146:169-175; Gibellini et al. (1998) J. Immunol. 160:3891-3898; Hsing y Bishop (1999) J. Immunol. 162:2804-2811; Everts et al. (2002) J. Immunol. 168:883-889).

Se dispone de métodos de citometría de flujo, incluida la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS, fluorescence activated cell sorting) (véase, por ejemplo, Owens, et al. (1994) Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice, John Wiley y Sons, Hoboken, NJ; Givan (2001) Flow Cytometry, 2a ed.; Wiley-Liss, Hoboken, NJ; Shapiro (2003) Practical Flow Cytometry, John Wiley y Sons, Hoboken, Nueva Jersey). Se dispone de reactivos fluorescentes adecuados para modificar ácidos nucleicos, incluyendo cebadores y sondas de ácido nucleico, polipéptidos y anticuerpos, para su uso, por ejemplo, como reactivos de diagnóstico (Molecular Probes (2003) Catalogue, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR; Sigma-Aldrich (2003) Catalogue, St. Louis, MO).

Se describen métodos convencionales de histología del sistema inmunitario (véase, por ejemplo, Muller-Harmelink (ed.) (1986) Human Thymus: Histopathology and Pathology, Springer Verlag, Nueva York, NY; Hiatt, et al. (2000) Color Atlas of Histology, Lippincott, Williams y Wilkins, Phila, PA; Louis, et al. (2002) Basic Histology: Text and Atlas, McGraw-Hill, Nueva York, NY).

Se dispone de paquetes informáticos y de bases de datos para determinar, por ejemplo, fragmentos antigénicos, secuencias líder, plegamiento de proteínas, dominios funcionales, sitios de glucosilación y alineaciones de secuencias (véase, por ejemplo, GenBank, Vector NTI® Suite (Informax, Inc, Bethesda, MD); GCG Wisconsin Package (Accelrys, Inc., San Diego, CA); DeCypher® (TimeLogic Corp., Crystal Bay, Nevada); Menne, et al. (2000) Bioinformatics 16: 741-742; Menne, et al. (2000) Bioinformatics Applications Note 16:741-742; Wren, et al. (2002) Comput. Methods Programs Biomed. 68:177-181; von Heijne (1983) Eur. J. Biochem. 133:17-21; von Heijne (1986) Nucleic Acids Res.

14:4683-4690).

Ejemplos

Ejemplo 1. Generación y exploración de hibridomas anti-PD-LI

Ratones Balb/C se inmunizaron con una proteína de fusión PD-L1 humano-Fc (R&D Systems® Catálogo N.° 156-B7-100) en adyuvante. Esta proteína de fusión contiene el dominio extracelular de PD-L1 (Phe19-Thr239) fusionado a un fragmento de IgG1 humana (Pro100-Lys 300). Después de 12 inmunizaciones, se extrajeron los ganglios linfáticos de dos ratones con títulos altos de PD-L1 humano y se realizó una electrofusión para generar dos lotes de hibridomas, que recibieron los nombres de laboratorio MEB033 y MEB037.

Se exploraron los sobrenadantes de los lotes de hibridomas MEB033 y MEB037 para identificar hibridomas que producen anticuerpos contra el PD-L1 humano. La exploración empleó un ensayo ELISA basado en proteínas para la unión a la proteína hPD-L1 humano-Fc; y ensayos ELISA basados en células para detectar la unión a transformantes estables PD-L1 humano-CHO PD-L1 humano-CHO y células CHO precursoras como control negativo. Los sobrenadantes de 88 clones del hibridoma MEB037 y de 23 clones del hibridoma MEB033 dieron positivo a la presencia de anticuerpo anti-PD-L1 (datos no mostrados) y sus muestras se analizaron para determinar la reactividad IHQ en secciones de tejido FFPE de amígdalas humanas normales (datos no mostrados).

De los 88 clones, solo 11 clones del lote MEB037 produjeron patrones de tinción de suficiente intensidad y especificidad aparente como para justificar una evaluación adicional, basándose en la comparación con los patrones de tinción obtenidos con los anticuerpos anti-PD-L1 disponibles en el comercio que se enumeran en la siguiente tabla:

TABLA 6 Anticuer os anti-PD-L1 humano dis onibles en el comercio

Cuando los inventores compararon los diversos patrones de tinción obtenidos con los anticuerpos experimentales con los patrones obtenidos con estos anticuerpos anti-PD-L1 humano disponibles en el comercio, observaron diferencias significativas entre los patrones de tinción, incluida la localización de la tinción y los tipos de células teñidas. En un intento para explicar estas diferencias, los inventores llevaron a cabo diversos experimentos adicionales y descubrieron que ninguno de estos anticuerpos disponibles en el comercio proporcionaba la combinación de atributos requeridos para su uso en IHQ de la expresión de PD-L1 en secciones de f Fp E: (1) sensibilidad - la capacidad de detectar la expresión fisiológica normal en tejidos de control positivo (por ejemplo, amígdalas humanas) así como la expresión en tejido tumoral (por ejemplo, muestras de melanoma humano); (2) especificidad - el patrón de tinción debe correlacionarse con la distribución anatómica/celular conocida de PD-L1 y debe ser neutralizable; y (3) contundente -poca o ninguna variación en los patrones de tinción cuando se usa para analizar secciones de tejido "duplicadas".

Por ejemplo, los inventores descubrieron que el anticuerpo PRS4059 de Sigma/ProSco mostraba múltiples bandas en lisados de amígdalas, ninguno de los cuales pudo ser confirmado para representar al PD-L1, no pudo teñir líneas celulares de melanoma LOX que habían demostrado ser positivas a PD-L1 mediante citometría de flujo y no pudo diferenciar entre líneas celulares positivas y negativas mediante IHQ.

Algunos de estos datos se muestran en la figura 4, en la que la tinción inmunohistoquímica de las secciones de amígdalas identificó los anticuerpos 22C3 y 20C3 como dos anticuerpos con propiedades inmunohistoquímicas inusuales y útiles en tejido FFPE en comparación con el anticuerpo PRS4059 identificado por Gadiot et al (citado anteriormente) como el único candidato adecuado entre 15 anticuerpos anti-PD-L1 humano para detectar la expresión del PD-L1 en secciones de tejido FFPE. En experimentos realizados por los inventores, el anticuerpo Prosci (PRS4059, lote 40590604, utilizado principalmente a 0,4 mg/ml, seguido por el sistema de detección de polímero de conejo (DAKO Envision) tiñó todos los linajes hematopoyéticos en la amígdala con la misma intensidad (figura 4A) mientras que el anticuerpo 22C3 tiñó selectivamente el epitelio críptico amigdalino y las células mieloides CD68+ foliculares, que son morfológicamente compatibles con los macrófagos (figura 4B). Se observó sustancialmente el mismo patrón de tinción con el anticuerpo 20C3 (datos no mostrados). Por otra parte, los anticuerpos 22C3 y 20C3 demuestran una diferencia de intensidad de tinción constante entre estas dos poblaciones de células distintas con epitelio críptico mucho mayor que los macrófagos foliculares. Los tres anticuerpos podrían neutralizarse mediante preincubación con el antígeno PD-L1, lo que indica que la reactividad está mediada por el dominio de unión a antígeno (las CDR).

Ejemplo 2. Evaluación de la calidad de los anticuerpos 20C3 y 22C3 anti-PD-LI

Este ejemplo describe experimentos adicionales que se llevaron a cabo para evaluar la utilidad de los anticuerpos 20C3 y 22C3 para su uso en ensayos IHQ de secciones de tejido FFPE.

Un experimento evaluó la capacidad de estos dos anticuerpos para detectar un intervalo de expresión de la proteína PD-L1 humano (hPD-L1) en el ensayo IHQ de secciones de amígdalas FFPE humanas normales, y en la figura 5A se muestran imágenes representativas de 22C3. La tinción inmunohistoquímica con 22C3 marca fuertemente el epitelio críptico amigdalino y también demuestra una tinción de débil a moderada de una población mieloide folicular CD68+ (presuntos macrófagos). Ambos anticuerpos (los datos del anticuerpo 20C3 no se muestran) marcan las células en un patrón de superficie membranosa/celular bien definido en estos dos tipos de células. La idoneidad de la expresión de hPD-L1 en la amígdala (es decir, la restricción de la tinción IHQ a las dos poblaciones celulares (epitelio críptico y macrófagos foliculares) se corroboró mediante una metodología independiente (hibridación in situ [HIS] para el ARNm de hPD-L1) en secciones de tejido amigdalino FFPE adyacentes. Además, la expresión diferencial de la proteína hPD-L1 evaluada por IHQ (epitelio críptico >> macrófagos foliculares) se corresponde con la abundancia relativa de ARNm de hPD-L1 observado con HIS.

En otro experimento se evaluó la especificidad de unión de 20C3 y 22C3 en células que expresan hPD-L1. Células HT144, que se sabía que eran negativas para la expresión de hPD-L1 mediante análisis de ARNm (PCRc) y células de melanoma LOX, que se sabía que expresaban altos niveles de ARNm de hPD-L1 (PCRc), se tiñeron con 1 microgramo/ml de IgG de ratón purificada de siete hibridomas generados en los experimentos descritos en el Ejemplo 1 anterior. También se utilizó un anticuerpo de ratón de control de isotipo irrelevante a la misma concentración. Para detectar los anticuerpos primarios de ratón se usó un anticuerpo secundario anti-ratón marcado con fluorescencia. Después de teñir y lavar repetidamente, las células se analizaron mediante citometría de flujo, con intensidades fluorescentes medianas calculadas para la población (> 10.000 acontecimientos recogidos). Los resultados se muestran en la figura 6.

Como reactivos de citometría de flujo se emplearon los anticuerpos 20C3 y 22C3, así como otros anticuerpos contra hPD-L1, para detectar el hPD-L1 en la superficie celular. El desplazamiento significativo a la derecha de las curvas del histograma de 20C3 y 22C3 (figura 6A) en comparación con la curva del anticuerpo de control de isotipo refleja la detección selectiva de hPD-L1 en la línea celular de melanoma LOX positiva a hPD-L1. En la figura 6B se muestran las intensidades de fluorescencia media asociadas a estos histogramas y a otros de este análisis. La selectividad de la unión de 20C3 y 22C3 se corrobora adicionalmente por la ausencia de unión significativa (es decir, IFM (intensidad de fluorescencia media) de 22C3 y 20C3 comparable a la del isotipo) en la línea celular negativa, HT144. En cambio, los datos de la figura 6B muestran que tanto 20C3 como 22C3 producen un aumento en la IFM de al menos 10 veces en comparación con el isotipo en la línea celular de melanoma LOX positiva a hPD-L1. Por tanto, tanto 20C3 como 22C3 (además de los clones 5F9, 7C8, 13D2 y 31D3) demuestran una unión selectiva a células que expresan hPD-L1 mediante evaluación por citometría de flujo.

Otro experimento evaluó la capacidad del anticuerpo 22C3 para detectar la expresión de hPD-L1 en líneas celulares genomodificadas y humanas. Una línea celular de ovario de hámster chino (CHO), que era negativa para hPD-L1, se transfectó con un vector de expresión que codificaba el PD-L1 humano para crear una línea celular de control positiva genomodificada. Como se muestra en la figura 7B, la tinción inmunohistoquímica con 22C3 de sedimentos de células fijadas en formol y embebidas en parafina (FFPE) de la línea celular CHO precursora (control negativo) y la línea celular CHO transfectada (control positivo) demuestra tinción positiva y negativa apropiada.

Se tiñeron sedimentos de líneas celulares humanas FFPE adicionales (A375, HS578T y melanoma LOX) con 22C3 y se demostró un intervalo de patrones e intensidades de tinción, como se muestra en la figura 7B. La tinción con 22C3 fue fuerte y uniforme en las células del melanoma Lox, aunque en los sedimentos celulares A375 y HS578T solo se mostraron células positivas, poco frecuentes e individuales. Se observó una tinción similar con el anticuerpo 20C3 (datos no mostrados). Los niveles de expresión del hPD-L1 detectados en estas 3 líneas celulares por 22C3 en el ensayo IHQ, se correlacionaron bien con los niveles de ARNm de PD-L1 en estas líneas celulares, evaluados usando PCRc con ARNm de ubiquitina como valor de referencia.

La unión selectiva y la afinidad relativa de 22C3 por células que expresan el hPD-L1 se evaluaron en un experimento ELISA basado en células. Varias líneas celulares (células CHOK1 hPDL1, células CHOK1 precursoras, células CHOK1 hPDL2 y células LOX) se sembraron en placas en pocillos individuales de placas de 96 pocillos revestidas con colágeno y se cultivaron hasta la confluencia. El medio se eliminó y se reemplazó con medio CHOK1 reciente (DMEM/F12 que contiene BCS al 10 %) que contiene un anticuerpo primario a concentraciones crecientes de entre 1,4 y 3000 ng/ml. Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios: dos lotes de producción diferentes de cada uno de los anticuerpos 20C3 y 22C3, con un isotipo de IgG1 de ratón, un anticuerpo anti-PD-L1 (BioLegend) y un anticuerpo anti-PD-L2 que sirven como controles. El anticuerpo primario se incubó durante 1 hora a 37°°C, se lavó 3X con PBS/Tween 20 al 0,01 % y el anticuerpo secundario, anti-IgG humana de cabra, conjugado con HRP específico de Fc (Southern Biotech, n° de cat. 1030-05) se añadió a una dilución de 1:2000 en medio CHOK1. El anticuerpo secundario se incubó durante 1 hora a 37°°C y se lavó 5X como se ha indicado anteriormente. El ELISA se reveló utilizando TMB, se detuvo con ácido fosfórico 0,1 N, y la absorbancia se leyó a 450 nm con sustracción de fondo a 650 nm. Los resultados, mostrados en la figura 8, demuestran unión selectiva de 22C3 y 20C3 con células que expresan el hPD-L1, siendo la afinidad de unión de 22C3 mayor que la de 20C3 tanto para las células genomodificadas CHOK1 hPD-L1 como para las células LOX.

Se realizó un experimento ELISA similar para evaluar si alguno de los anticuerpos 20C3 o 22C3 se unía al PD-L1 de ratón. No se observó unión significativa de ninguno de los anticuerpos con el PD-L1 de ratón (datos no mostrados).

Se realizaron ensayos de competición de unión de anticuerpos ("bloqueo cruzado") entre diferentes pares de anticuerpos anti-hPD-L1 identificados en los experimentos descritos en el Ejemplo 1. Los ensayos emplean la plataforma ForteBio® Octet®, que se basa en la interferometría de biocapa. En resumen, esta técnica mide la unión de un anticuerpo inicial (Acm1) con la superficie de la punta del biodetector como un cambio de longitud de onda (AA) debido a que el anticuerpo unido aumenta el espesor óptico (eje Y) en la punta del biodetector a lo largo del tiempo (eje X). La punta consta de un detector anti-huIgG al que se une hPD-L1-Fc. El cambio del espesor óptico después de la unión del anticuerpo anti-PD-LI se refleja en la curva de pendiente ascendente que comienza en la primera línea roja de puntos vertical (véanse los gráficos en las figuras 9A, 9B y 9C), que representa la adición de una concentración saturante de Acm1 (10 microgramos/ml) en la solución. Después de permitir el equilibrio (-1 000 segundos), se inyecta un segundo anticuerpo en la solución de ensayo (indicado por la segunda línea de puntos roja vertical en las figuras 9A, 9B y 9C). La unión del segundo Acm2, indicada por una variación adicional de la curva, sugiere que los dos anticuerpos se unen a epítopos no solapantes, mientras que poca o ninguna variación de la curva sugiere que los dos anticuerpos se unen a epítopos solapantes o idénticos.

Resumiendo, los resultados demuestran que la unión de 22C3 compite con la unión adicional de todos los demás clones anti-hPDL-1 analizados como Acm2, excepto para 5H9 (figura 9A). De manera similar, 20C3 tampoco compite con la unión a 5H9, pero muestra un grado intermedio de unión adicional con 22C3 así como con 4B7 (figura B). Considerados en conjunto, estos datos indican que 20C3 y 22C3 se unen a epítopos solapantes.

La capacidad del anticuerpo 22C3 para detectar un intervalo de expresión de hPD-L1 en diferentes tipos de tumores se evaluó realizando análisis IHQ en secciones FFPE preparadas a partir de los siguientes tumores: vejiga, esofágico, cabeza y cuello, renal, HCC, mama, pulmón, ovárico y gástrico. Se realizó una exploración preliminar de la reactividad de 22C3 con estas secciones de tejido tumoral usando una interpretación "gestalt" semicuantitativa del grado de tinción. Como se muestra en la figura 10, el anticuerpo 22C3 es capaz de detectar un intervalo de expresión de PD-L1 desde esencialmente ninguna tinción (Puntuación = 0) hasta una expresión prominente y fuerte (Puntuación = 4), lo que demuestra la utilidad del ensayo IHQ con 22C3 para guiar futuros tipos de tumores que pueden responder a la interdicción de las interacciones inmunosupresoras de PD-1/PD-L1.

La utilidad del anticuerpo 22C3 para estratificar pacientes que tienen más probabilidades de responder a la terapia que bloquea la interacción de p D-1 y PD-L1, se evaluó en estudios que utilizaban la evaluación inmunohistoquímica con 22C3 de muestras de archivo obtenidas de 18 pacientes con melanoma inscritos en un ensayo clínico en fase 1 (P001) con MK-3475, un anticuerpo terapéutico anti-PDl desarrollado por Merck and Co., Inc. Los casos se evaluaron de manera independiente por dos patólogos y se asignaron como "positivos", "negativos" o "ambiguos" y en la figura 11A se muestran imágenes representativas de estas tres categorías. La concordancia interpatológica en este conjunto de muestras (n = 18) fue del 100 %.

Las respuestas clínicas se evaluaron utilizando criterios de respuesta relacionados con la inmunidad (irRC, immune related response entena) y se correlacionaron con los resultados IHQ. Para este análisis, los casos "ambiguos" se consideraron como negativos, dando como resultado una sensibilidad de ensayo del 72 % y una especificidad del 86 %. Los resultados, mostrados en la figura 11B, sugieren que la tinción inmunohistoquímica con 22C3 en tejido FFPE tendrá utilidad como un biomarcador de selección de pacientes.

Basándose en los resultados de los experimentos descritos anteriormente, los inventores del presente documento determinaron que los anticuerpos producidos por dos de los 88 hibridomas experimentales, MEB037.20C3.138 y MEB037.20C3.116, tenían la combinación necesaria de sensibilidad, especificidad y robusted para ser considerados para el desarrollo como reactivos de diagnóstico IHQ reactivos a FFPE candidatos.

Ejemplo 3. Mapeo del epítopo en el PD-L1 humano para el anticuerpo 22C3 anti-PD-LI

El mapeo epitópico HDX-MS se realizó utilizando el anticuerpo 22C3 y una proteína PD-L1-His, que contenía el dominio extracelular del PD-L1 humano maduro (SEQ ID NO: 38) fusionado a una etiqueta de histidina de 11 unidades monoméricas. Los segmentos 156 a 178 y 196 a 206 en el dominio extracelular del PD-L1 humano (SEQ ID NO: 38) mostraron fuerte protección (una diferencia promedio del nivel de deuteración de > 10 %) al unirse al anticuerpo 22C3. Además, los segmentos 3 a 9, 10 a 13, 88 a 93 y 135 a 147, mostraron protección marginal aunque significativa (una diferencia promedio del nivel de deuteración del 5 % al 10 %).

La mención de las referencias del presente documento no pretende ser una admisión de que la referencia sea una técnica anterior pertinente, ni constituye una admisión en cuanto al contenido o la fecha de estas publicaciones o documentos.

El alcance de la presente invención no debe limitarse a las realizaciones específicas que se describen en el presente documento. De hecho, a partir de la descripción anterior y de las figuras adjuntas, diversas modificaciones de la invención, además de las que se describen en el presente documento, serán obvias para los expertos en la materia. Se pretende incluir dichas modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

La memoria descriptiva escrita anteriormente se considera que es suficiente como para permitir a un experto en la materia poner en práctica la invención. Varias modificaciones de la invención, además de las mostradas y descritas en el presente documento, serán obvias para los expertos en la materia a partir de la descripción anterior y se incluirán

Claims (9)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno aislados que se unen específicamente al PD-L1 en donde: (a) la región variable de cadena ligera es el SEQ ID NO: 13 y la región variable de cadena pesada es el SEQ ID NO: 20; o

(b) la región variable de cadena ligera es el SEQ ID NO: 25 y la región variable de cadena pesada es el SEQ ID n O: 32, en donde en el SEQ ID NO: 32, X es Q o pE.

2. El anticuerpo o el fragmento antigénico aislados de la reivindicación 1, en donde en el SEQ ID NO: 32, X es Q.

3. Un ácido nucleico aislado que codifica las regiones variables del anticuerpo o del fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 1, en donde en el SEQ ID NO: 32, X es Q.

4. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 3, que es un vector de expresión.

5. Una célula hospedadora que comprende el vector de expresión de la reivindicación 4.

6. Un método para analizar una muestra de tejido extraída de un ser humano para determinar la expresión del PD-L1, comprendiendo el método:

(a) poner en contacto la muestra de tejido con un reactivo de unión al PD-L1 en condiciones que permitan la unión específica del reactivo de unión al PD-L1 con el PD-L1 humano, en donde el reactivo de unión comprende el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2,

(b) eliminar el reactivo de unión al PD-L1 no unido, y

(c) detectar la presencia o la ausencia del agente de unión al PD-L1 unido.

7. El método de la reivindicación 6, que comprende además cuantificar la cantidad de reactivo de unión que se ha unido.

8. Un kit que comprende el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo aislados de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 y un conjunto de reactivos para detectar un complejo del anticuerpo o del fragmento de unión a antígeno unido al PD-L1 humano.

9. El kit de la reivindicación 8, en donde el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno comprenden el SEQ ID NO: 13 y el SEQ ID NO: 20, o comprende el SEQ ID NO: 25 y el SEQ ID NO: 32, en donde en el SEQ ID NO: 32, X es Q.