RS61104B1

RS61104B1 - Oligosaharid i postupak njegove pripreme

Info

Publication number: RS61104B1
Application number: RS20201417A
Authority: RS
Inventors: Hans Andreasen
Original assignee: Pharmacosmos Holding As
Priority date: 2009-03-25
Filing date: 2009-03-25
Publication date: 2020-12-31
Also published as: PL2411053T3; JP5426010B2; SI3156075T1; US20140303364A1; BRPI0924653B8; KR101580348B1; EP3156075A1; PL3821910T3; US20140364598A1; EP2411053A1; CY1123651T1; WO2010108493A1; DK2411053T3; EP3156075B1; RS55700B1; BRPI0924653B1; HRP20170230T1; EP3821910C0; BRPI0924653A2; AU2009342799A1

Description

Opis

[0001] Predmetni pronalazak se svojim prvim aspektom odnosi na oligosaharid. Drugim aspektom, pronalazak se odnosi na postupak dobijanja gvožđe-oligosaharidnog jedinjenja, saglasno prvom aspektu pronalaska. Ovde je takođe opisano jedinjenje gvožđa oligosaharida sa poboljšanom stabilnošću i postupak za pripremu jedinjenja gvožđa oligosaharida. Dalje je ovde opisana primena navedenog jedinjenja u pripremi kompozicije za terapiju anemija uzrokovanih nedostatkom gvožđa.

[0002] Zbog svoje velike učestalosti, anemije uzrokovane nedostatkom gvožđa predstavljaju globalnu zdravstvenu temu najvišeg značaja. Ove anemije su jedan od najčešćih patoloških stanja, kako ljudi, tako i domaćih životinja.

[0003] Iako se anemija uslovljena nedostatkom gvožđa može sprečiti ili lečiti oralnom administracijom preparata gvožđa, u mnogim slučajevima poželjno je da se preparati gvožđa primenjuju parenteralnom rutom, kako bi se eliminisale varijacije biološke dostupnosti oralne primene, i kako bi se osigurala efikasna primena.

[0004] Zbog toga su preparati gvožđa za parenteralnu primenu, to jest, potkožnu, intramuskularnu ili intravensku primenu, već duže vreme dostupni u veterinarskoj i humanoj medicini.

[0005] Iako se jedinjenja gvožđa koriste kao komponente preparata za parenteralnu primenu u anemija uslovljenih nedostatkom gvožđa, uobičajeni prihvaćeni preparati su oni koji sadrže gvožđe-oksihidroksid (ili gvožđe hidroksid) zajedno sa nekim saharidom, konkretno, sa dekstranom ili dekstrinom. Dekstran je polimerni ugljeni hidrat proizveden u mikroorganizmu Leuconostoc mesenteroides, dok je dekstrin depolimerizacioni proizvod skroba.

[0006] Postoje i drugi tipovi preparata za tretiranje anemija uslovljenih nedostatkom gvožđa, kao što su jedinjenja gvožđe-saharoza i gvožđe-glukonat. U ovim jedinjenjima gvožđe je slabije vezano, usled čega je veća koncentracija slobodnih Fe<3>+ jona, što kod parenteralne primene povećava toksičnost ovih preparata, a kod oralne primene dovodi do poremećaja varenja.

[0007] Preparati gvožđa za parenteralne injekcije stoga treba da ispune nekoliko zahteva, uključujući laku dostupnost gvožđa za sintezu hemoglobina, odsustvo lokalnih ili opštih sporednih efekata i stabilnost prilikom skladištenja koja omogućava adekvatan rok trajanja na sobnoj temperaturi.

[0008] U nekim slučajevima, poželjna je oralna administracija preparata gvožđa, jer je to najpogodnije za primaoce. Čest nus-efekat oralne primene gvožđa je poremećaj varenja. Dobri preparati gvožđa s jedne strane, treba na kontrolisan način da obezbede dostupnost gvožđa u crevima, kako bi se gvožđe asimilovalo kroz epitel creva i kako ne bi izazvalo štetne efekte na digestiju.

[0009] Gvožđe-saharidni preparati za terapiju anemija već decenijama postoje na tržištu, a predložene su brojne varijacije u postupku proizvodnje i selekcije polaznih materijala, sa ciljem da se poveća stabilnost ovih preparata i da se smanji težina sporednih efekata koji se javljaju prilikom primene.

[0010] Rezultati dobijeni u istraživanjima, testovima i na osnovu praktičnog iskustva ukazuju da su prethodno pomenuti problemi povezani sa distribucijom molekulskih masa primenjenih saharida.

[0011] Poznato je da je upotreba dekstrana velike molekulske mase povezana sa većim rizikom pojave anafilaktičkih reakcija nego upotreba dekstrana male molekulske mase, ali je takođe poznato da prisustvo ugljenih hidrata male molekulske mase, na primer, monosaharida koji nastaju hidrolizom polisaharida, takođe izaziva probleme. Kada reaguju sa gvožđem taloženjem gvožđe-hidroksida u rastvoru saharida široke distribucije molekulskih masa, nisko molekulski ugljeni hidrati vezuju se sa gvožđem formirajući kompleks svojih jedinjenja. Takva jedinjenja su manje stabilna od gvožđe-oligosaharidnih jedinjenja srednje molekulske težine, usled precipitacije gvožđe-hidroksida ili oksihidroksida i/ili reakcije formiranja gela koja će najverovatnije dovesti do potpune solidifikacije rastvora nakon nekoliko dana ili meseci.

[0012] Imajući u vidu značaj ove problematike, velika pažnja je usmerena na razvoj gvožđe-oligosaharidnih jedinjenja, u kojima je oligosaharidna komponenta prisutna u odgovarajućoj distribuciji molekulskih masa.

[0013] GB 1,076,219 opisuje postupak proizvodnje kompleksa koji sadrži gvožđe, niskomolekulski dekstrin ili dekstran i sorbitol, za profilaksu ili tretman anemija uslovljenih nedostatkom gvožđa.

[0014] US 4,927,756 opisuje postupak proizvodnje gvožđe-dekstrana, naznačen time da je molekulska masa dekstrana u opsegu od 2000 - 4000.

[0015] WO 1999/48533 opisuje gvožđe-dekstrane koji se sastoje od dekstrana srednje masene molarne mase od 700 do 1400 i srednje brojne molarne mase od 400 do 1400 Daltona, u stabilnoj vezi sa gvožđeoksidhidroksidom. Opisani gvožđe-dekstranski kompleksi izazivaju manju incidencu anafilaktičkih efekata.

[0016] WO 2003/087164 i opisuje gvožđe-dekstrinska jedinjena koja sadrže dekstrine srednje masene molarne mase od 3000 Daltona ili manje i srednje brojne molarne mase od 400 Daltona ili više, u stabilnoj vezi sa gvožđe oksidhidroksidom. Navedena jedinjenja ispoljavaju manji stepen toksičnosti.

[0017] WO 2000/30657 i US 2003/083310 Opisuju postupak proizvodnje jedinjenja gvožđe dekstrana za upotrebu u parenteralnom lečenju nedostatka gvožđa kod ljudi ili životinja.

[0018] WO 2006/084782 opisuje terapeutsku primenu jedinjenja gvožđe(lll) kompleksa sa karbohidratima ili njihovim derivatima radi dobijanja medikamenata koji podstiču imunsku odbranu i/ili funkciju mozga. U svetlu poznatih postupaka i jedinjenja koja su prethodno navedena, još uvek postoji potreba za poboljšavanjem stabilnosti gvožđe-oligosaharidnih jedinjenja koja se mogu koristiti za dobijanje kompozicija za terapiju ili profilaksu anemija uslovljenih nedostatkom gvožđa, tako da medikamenti ne gube svojstva prilikom skladištenja na sobnoj temperaturi.

[0019] Stoga je cilj predmetnog pronalaska da obezbedi gvožđe-oligosaharidno jedinjenje povećane stabilnosti koje omogućava da se uvrsti u kompozicije za tretman ili profilaksu anemija izazvanih nedostatkom gvožđa. Jedinjenje treba da ispuni uobičajene kriterijume poznate u stanju tehnike, kao što su: 1) visoka dostupnost gvožđa za adsorpciju u crevima, bez izazivanja problema u varenju prilikom oralne administracije; 2) gvožđe u formi koja se lako može apsorbovati u crevima; 3) visoka dostupnost gvožđa bez rizika od toksičnosti uslovljene visokom lokalnom koncentracijom Fe<3>+, u slučaju parenteralne administracije; 4) minimum rizika od anafilaktičke reakcije; 5) visok sadržaj gvožđa, i 6) sposobnost da se formiraju rastvori koji sadrže veliku količinu gvožđa, pri čemu rastvori ispunjavaju osnovne uslove za farmaceutske kompozicije, to jest, mogu se sterilisati, poželjno autoklaviranjem i da su stabilni duži vremenski period prilikom skladištenja na sobnoj temperaturi.

[0020] Ovaj pronalazak se u prvom aspektu odnosi na oligosaharid koji ima prosečnu molekulsku težinu (Mw) manju od 3.000 Daltona, naznačen time što navedeni oligosaharid sadrži funkcionalne aldehidne grupe i ima sadržaj dimernih saharida od 2,9% težinski ili manje, bazirano na osnovu ukupne težine oligosaharida. U drugom aspektu, pronalazak se odnosi na postupak za pripremu oligosaharida prema prvom aspektu pronalaska, koji postupak sadrži korake:

(a) hidroliza polisaharida tako da smanjuje njegovu molekulsku težinu, pri čemu nastali oligosaharid sadrži funkcionalne aldehidne grupe i

(b) frakcionisanje oligosaharida prema molekulskoj težini, tako da prečišćena frakcija ima prosečnu molekulsku težinu jednaku ili manju od 3.000 Daltona,

pri čemu korak (b) obuhvata postupak prečišćavanja jednim ili više membranskih procesa koji imaju graničnu vrednost između 340 i 800 Daltona, koji se nastavlja sve dok se sadržaj dimernog saharida u prečišćenoj frakciji oligosaharida ne smanji na 2,9% težinski ili manje, na osnovu ukupne težine oligosaharida.

[0021] Dalje je ovde opisano jedinjenje gvožđe-oligosaharidna, gde jedinjenje uključuje hidrogenizovani oligosaharid u stabilnoj vezi sa gvožđe-oksidhidroksidom, pri čemu hidrogenarisani oligosaharid ima srednju masenu molarnu masu (MW) od manje od 3000 Daltona, poželjno oko 1000 Daltona, i u kojem je dimerni saharid u hidrogenisanom oligosaharidu čini 2.9 % mase ili manje, u odnosu na ukupnu masu hidrogenisanog oligosaharida.

[0022] Primera radi, polazni materijal za proizvodnju hidrogenisanog oligosaharida koji se koristi saglasno pronalasku, može biti dekstran 1 (Dextran 1), koji zadovoljava uslove Evropske farmakopeje (European Pharmacopoeia), član 01/2009:1506. Prema odredbama Evropske farmakopeje, ovaj polazni materijal ima sledeće specifikacije: srednju masenu molarnu masu (MW): 850 do 1150 Daltona, frakcione jedinice sa jednim ili dva saharida (odnosno, dimer): manje od 15 %, i frakciju sa više od 9 saharidnih jedinica; manje od 20 % težine. Uobičajeno, količina dimernog saharida u Dekstranu I je oko 8 % mase. Uklanjanjem manjih molekula, pomoću membranske filtracije, dobija se željena količina dimernog saharida od 2.9 % mase ili manje.

[0023] U predmetnom kontekstu i nadalje, temiine „srednja masena molarna masa" i "srednja brojna molarna masa” treba shvatiti kao odgovarajuće molarne mase oligosaharida u trenutku formiranja kompleksa, u odnosu na sve oligosaharidne molekule od monomera naviše.

[0024] Neočekivano je uočeno da je ključni faktor stabilnosti finalnog jedinjenja količina dimera u sastavu oligosaharidu koja formira stabilnu vezu sa gvožđe(lll)-oksidhidroksidom i da je ovaj efekat ne-linearan. Gvožđe(lll)-oksidhidroksid najčešće je jedina komponenta koja se koristi u kompozicijama kako je ovde opisano. Međutim, u nekim primenama, kao što su konstrastni agensi sa magnetskim sposobnostima, poželjno je da se koristi smeša gvožđe (II)oksida i gvožđe(lll)-oksidhidroksida. Jedinjenje gvožđe-oligosaharid kako je ovde opisano uključuje jedinjenja dobijena iz ovih smeša.

[0025] Da bi se ispoljila zadovoljavajuća stabilnost jedinjena u skladu sa pronalaskom, sadržaj dimera mora se dovesti na nivo ispod 2.9 % mase. Na taj način, kontrolišući količinu dimera u oligosaharidu pre reakcije sa gvožđem, dobija se stabilno jedinjenje gvožđe-oligosaharid, na efikasan i isplativ način. U slučaju dekstrana ili dekstrina, koji predstavljaju polimere glukoze koji sadrže 1,6-veze i 1,4-veze, dimeri o kojima je reč su izomaltoza (dva monomera glukoze povezana 1,6-vezom) i maltoza (dva monomera glukoze, povezana 1,4-vezom).

[0026] Poželjno je da je sadržaj monomernih saharida u navedenom hidrogenizovanom oligosaharidu manji ili jednak 0.5 % u odnosu na ukupnu masu hidrogenisanog oligosaharida. Tako se smanjuje rizik od toksičnih efekata izazvanih oslobađanjem slobodnih jona gvožđa, naročito kada je reč o preparatima za parenteralnu primenu. U navedenim preparatima za parenteralnu primenu, povećana koncentracija slobodnog monomernog šećera, kao što je glukoza, može po sebi da bude nepoželjna.

[0027] Saglasno jednom obliku izvođenja pronalaska, primenjeni hidrogenisani oligosaharid je hidrogenisani dekstran, srednje masene molarne mase (MW) između 500 i 3000 Daltona, srednje brojne molarne mase (Mn) prek0500 Daltona, naznačeno time da 90 % mase navedenog dekstrana ima molekulsku masu manju od 3500 Daltona, i da je MW 10% masenih procenata frakcije dekstrana sa najvećom molekulskom masom manje od 4500 Daltona. Poželjno je da se dekstran izloži membranskoj filtraciji kroz membrane propusnog opsega od 340 do 800 Daltona. Na ovaj način se smanjuje incidenca pojave neželjenih efekata.

[0028] U alternativnom obliku izvođenja, hidrogenisani oligosaharid je hidrogenisani dekstrin, srednje brojne molarne mase (Mn) veće ili jednake 500 Daltona, naznačeno time da 10% frakcije navedenog hidrogenisanog dekstrina sa najvećom molekulskom masom ima srednju masenu molarnu masu (MW) manju od 4500 Daltona, i da 90 % dekstrina ima molekulsku masu manju od 3500 Daltona. Navedeni dekstrin ima nisku toksičnost i odgovarajuću viskoznost koja omogućava lako i pouzdano rukovanje rastvorima dekstrina.

[0029] Poželjno je da je molekulska masa gvožđe-oligosaharidnog jedinjenja kako je ovde opisano (MP) 120 do 180 kD. Poželjno je daje molekulska masa (MP) između 130 i 160 kD.

[0030] Predviđeno je da se molekulska masa određuje u autoklaviranom vodenom rastvoru, koji je dobijen rastvaranjem u 1000 ml vode, 400 g praška hidrogenisanog oligosaharida u stabilnom rastvoru sa gvožđe oksidhidroksidom, pri čemu gvožđa (Fe) čini 25 % ukupne mase praha. Rastvori koji sadrže jedinjenja kako je ovde opisano, pripremljeni na drugih način ili rastvaranjem drugih koncentracija, mogu usloviti drugačiju molekulsku masu, koja sa ne poklapa sa postupkom saglasno pronalasku.

[0031] Molekulska masa se meri primenom hromatografije sa izdvajanjem po veličini. Kolone su na bazi silicijumski čestica koje sadrže polarne diolne grupe. Kolone se kalibriraju primenom dekstrana i gvožđedekstrana kao standarda i 0.1 % natrijum azida, kao rastvora za ispiranje.

[0032] Količina gvožđa u gvožđe-oligosaharidnom jedinjenju kako je ovde opisano, može varirati zavisno od namene konačne kompozicije, Načelno govoreći, količina gvožđa u gvožđe-oligosaharidnom jedinjenju je 50 % mase ili manje. Poželjno je da je količina gvožđe-oligosaharida veća od IO % mase.

[0033] U jednom obliku izvođenja, sadržaj dimera u hidrogenisanom oligosaharidu je 2.5 % mase ili manje, alternativno, 2.3 % mase ili manje.

[0034] Bez dubljeg teorijskog objašnjenja, pretpostavljeno je da je mala količina dimera dovodi do koordinacije koloidnih čestica koje sadrže kompleks oligosaharida i FeOOH. Kada je sadržaj dimera u oligosaharidu veći od 2.9 %, dimer se očito ponaša kao ”rastvarač” koloidnih čestica, čineći jedinjenje oligosaharida i FeOOH nestabilnim i sklonim sa se tokom vremena pretvori u gel.

[0035] U jednom obliku izvođenja pronalaska, gvožđe-oligosaharidno jedinjenje je jedini ili parcijalni konstituent suvog praha, u kojem je sadržaj gvožđa poželjno 10 - 50 % mase. U alternativnom slučaju, gvožđeoligosaharidno jedinjenje može se rastvoriti ili dispergovati u nekoj vodenom rastvaraču, tako da sadržaj gvožđa u formiranom rastvoru ili disperziji iznosi I 30 % w/v. Kada se koristi u rastvorima za injekcije, poželjnije su tečnosti sa visokim sadržajem gvožđa, jer je tada tokom tretmana potrebno injektovati manju zapreminu tečnosti subjektu, što ima jasnu prednost, kako za subjekta koji se tretira, tako i za osobu koja obavlja tretman.

[0036] Saglasno narednom aspektu pronalaska, obezbeđena je kompozicija koja uključuje farmakološki efikasnu količinu jedinjenja gvožđe oligosaharida, kao i najmanje jedan farmaceutski prihvatljivi nosač. Kompozicija se može primeniti za parenteralnu, oralnu ili neku drugu rutu primene.

[0037] Farmaceutska kompozicija koja uključuje gvožđe-oligosaharidno jedinjenje kako je ovde opisano može se dobiti primenom postupaka poznatih stručnim osobama. Kompozicije za oralnu primenu mogu se formulisati u obliku tablete, kapsule, sirupe, paste i smeše.

[0038] Farmaceutske kompozicije koje uključuju gvožđe-oligosaharidno jedinjenje kako je ovde opisano mogu se formulisati tako da sadrže dodatne hranljive ili farmakološke agense, kao što su vitamini, poželjno hidrosolubilni vitamini, mikronutritijenti, kao što su mikroelementi, na primer, kobalt, bakar, cink ili selen, bakteriostatske agense ili antibiotike, kao što je tilozin. Vitamini koji nisu rastvorljivi u vodu mogu se emulzifikovati u vodenom rastvoru koji sadrži gvožđe-oligosaharidno jedinjenje kako je ovde opisano, primenom pogodnih emulzifikatora.

[0039] Takođe je ovde opisan postupak dobijanja gvožđeoligosaharidnog jedinjenja, naznačen time da se postupak uključuje sledeće korake:

(a) hidrolizu polisaharida, tako da se smanji njegova molekulska masa,

(b) hidrogenizovanje nastalog oligosaharida, tako da se funkcionalne aldehidne grupe prevode u alkoholne grupe,

(c) frakcionisanje hidrogenisanog oligosaharida, prema molekulskoj masi, tako da prečišćena frakcija ima srednju masenu molarnu masu jednaku ili manju od 3000 Daltona,

(d) mešanje nastalog frakcionisanog hidrogenisanog oligosaharida u vidu vodenog rastvora sa najmanje jednom hidrosolubilnom soli gvožđa,

(e) dodavanje baze nastalom vodenom rastvoru, kako bi se formirao rastvor gvožđe-hidroksida, i (f) grejanje dobijenog baznog rastvora kako bi se gvožđe-hidroksid transformisalo u gvožđeoksidhidroksid povezan sa navedenim oligosaharidom;

gde korak (c) uključuje postupak prečišćavanja pomoću jedne ili više membranskih filtracija propusnog opsega od 340 do 800 Daltona, pri čemu se postupci filtriranja sprovode se dok se sadržaj dimernog saharida u prečišćenoj frakciji oligosaharida ne smanje na 2.9 % mase ili manje u odnosu na ukupnu masu hidrogenisanog oligosaharida. Prečišćavanje se alternativno može izvesti primenom drugih pogodnih postupaka frakcionisanja oligosaharida u cilju smanjenja opsega molekulskih masa, na primer, primenom hromatografskih metoda. Poželjno je, međutim, prečišćavanje membranskom filtracijom. U svakom slučaju, predmetni pronalazak ne predviđa primenu tradicionalnih postupaka frakcionisanja, koji se zasnivaju na taloženju, budući da bi tako dobijene oligosaharidne frakcije bile suviše difuzne.

[0040] Poželjno je da se početna hidroliza polisaharida sprovede u prisustvu kiselina, primenom jakih neorganskih kiselina, kao što su sumporna, fosforna ili hlorovodonična kiselina.

[0041] U poželjnom obliku izvođenja, hidrogenaciju nastalog oligosaharida pospešuje dodavanje natrijum borohidrata u vodenom rastvoru.

[0042] Poželjno je da se dobijena veza između gvožđe-oksidhidroksida i oligosaharida stabilizuje dodavanjem najmanje jedne soli organske hidroksi-kiseline, poželjeno neke soli citrata.

[0043] Poželjno je da se pomenuto prečišćavanje pojedinačnim ili višestrukim filtracijama kroz membrane sa propusnim opsegom od 340 i 800 Daltona nastavi sve dok se sadržaj monomera u prečišćenoj frakciji oligosaharida ne smanji na 2.9 % (w/w) ili manje.

[0044] Izraz polisaharid se u predmetnom pronalasku koristi da opiše svaki polimer koji se sastoji od monomernih jedinica glukoze. Saglasno jednom obliku izvođenja, primenjeni polisaharid je dekstran.

[0045] Poželjno je da se dekstran prečišćava u koraku (c), primenom jedne ili više uzastopnih membranskih filtracija kroz filtere propusnog opsega pogodnog da zadrži dekstran molekulskih masa preko 2700 Daltona.

[0046] Kada se u koraku (e) u rezultujući rastvor doda baza, da bi se formiralo gvožđe hidroksid, poželjno je da se PH vrednost navedenog vodenog rastvora podesi na PH preko IO.

[0047] Poželjno je da se postupak grejanja u koraku (f) sprovede na temperaturi od preko 100<0>C, sve dok rastvor ne postane crni ili tamno-braon koloidni rastvor, koji se nakon neutralizacije filtrira i dodaje mu se jedan ili više stabilizatora. Pogodan filter je 0.45 µm filter. Pre dodavanja navedenih stabilizatora, rastvor se dodatno prečišćava i filtrira, greje i izlaže membranskim procesima.

[0048] Konačno, rezultujući bazni rastvor može se u poželjnom obliku izvođenja, osušiti, kako bi se jedinjenje gvožđe-dekstran, u formi stabilnog praška. Alternativno, postupak sušenja se može izostaviti, tako da se od prečišćenog rastvora dobije injekcioni rastvor, bez intermedijarnog koraka sušenja. Poželjno je daje sadržaj gvožđa (Fe) u gvožđe-dekstranskom jedinjenju u sastavu praška oko 50 % mase ili manje.

[0049] Saglasno alternativnom obliku izvođenja, primenjeni polisaharid je skrob ili dekstrin. Dekstrini se najčešće dobijaju depolimerizacijom skroba, primenom sredstava za depolimerizaciju, kao što kiseline, baze ili enzimi. Zavisno od svog porekla, skrob sadrži izvestan broj 1,6-glukozidnih veza na mestima granjanja poliglukoznih lanaca. Stoga, dekstrini mogu sadržati sličan nizak nivo u-1,6-glukozidnih veza. Podešavanjem uslova za depolimerizaciju skroba moguće je favorizovati razgradnju 1,4-glukozidnih veza ili 1,6-glukozidnih veza, tako da se odnos i zastupljenost ova dva tipa veza kod dobijenih dekstrina razlikuje od odnosa ovih veza kroz skroba iz kojeg su dekstrini dobijeni.

[0050] Jedno od karakterističnih svojstava skroba i dekstrina jeste sposobnost da formiraju gel, čak i pri relativno niskim koncentracijama, usled čega je korišćenje ovih jedinjenja otežano.

[0051] Tendencija formiranja gela kod skroba i dekstrina, smanjuje se kada se molekulska masa smanji hidrolizom. Međutim, hidroliza ne bi trebalo da bude suviše ekstenzivna, jer su dekstrini malih molekulskih masa, kao što je prethodno pomenuto, toksični kada formiraju kompleks sa gvožđem. Poželjno je da se Skrob hidrolizuje sve dok ne formira jako obojene komplekse sa jodom. Rastvori skroba koji je hidrolizovan do te mere uključuju velike količine dekstrina poželjnih opsega molekulske mase i ispoljavaju viskoznost koja je dovoljno niska da omogući lako i precizno korišćenje. Za hidrolizu skroba, kao hidrolitičku kiselinu poželjno je koristiti hlorovodoničnu kiselinu.

[0052] Pre mešanja sa gvožđem, potrebno je umanjiti redukcionu sposobnost dekstrina. Ovo se može postići hidrogenacijom terminalnih aldehidnih grupa do alkohola. Ova redukcija se može izvesti primenom poznatih postupaka. Poželjna je hidrogenacija pomoću natrijum borohidrata. Nakon hidrogenacije, redukujuća sposobnost dekstrina, određena postupkom bakarne oksidacije, treba da bude manja od 3.0 %.

[0053] U poželjnom obliku izvođenja, dekstrin iz koraka (c) prečišćava se kako bi se dobila srednja brojna molarna masa (Mn) veća ili jednaka 500 Daltona, naznačeno time da 10 % frakcije navedenog hidrogenisanog dekstrina sa najvećom molarnom masom poseduje srednju masenu molarnu masu (MW) manju od 4 500 Daltona i 90 % dekstrina ima molekulsku masu manju od 3500 Daltona.

[0054] U posebno poželjnom obliku izvođenja, 10% frakcije dekstrina sa najvećom molarnom masom ima srednju masenu molarnu masu manju od 4000 Da, 90 % dekstrina ima molarnu masu manju od 3000 Daltona, i IO % frakcije sa najmanjom molarnom masom, ima srednju masenu molarnu masu od 800 Daltona ili više. Dekstrin sa ovakvom distribucijom molarnih amsa ispoljava odgovarajuću visokoznost, bezbedan je i formira stabilnu asocijaciju sa gvožđem.

[0055] U koraku (d), prečišćeni i hidrogenisani vodeni rastvora dekstrina, meša se sa najmanje jednom hidrosolubilnom solju gvožđa, a poželjno je da se koristi gvožđe-hlorid.

[0056] U koraku (e), u rastvor gvožđe-hidroksida dodaje se baza, kako bi se poželjno postigla vrednost pH preko 8.5.

[0057] Rezultujući bazni rastvor se zagreva u koraku (f), čime se gvožđe-hidroksid transformiše u gvožđeoksidhidroksid povezan sa dekstrinom, a rastvor se poželjno greje na temperaturu iznad 85<0>, sve dok se ne dobiju crni ili tamno-braon kolodni rastvor, koji se nakon neutralizacije filtrira, i dodaje mu se jedan ili više stabilizatora. Pre dodavanja pomenutih stabilizatora rastvor se dodatno prečišćava i stabilizuje primenom filtracije, grejanja i membranskih procesa separacije.

[0058] Konačno, tako dobijen bazni rastvor može da se osuši, kako bi se dobilo stabilno gvožđe-dekstrinsko jedinjenja u vidu praha. Alternativno, sušenje se može izostaviti, tako da se iz prečišćenog rastvora dobije injekciona tečnost, bez intermedijarnog koraka sušenja.

[0059] Takođe je ovde opisana primena jedinjenja gvožđe oligosaharida za proizvodnju terapeutske kompozicije koja se može primeniti parenteralno ili oralno, u profilaksi ili tretmanu anemija uslovljenih nedostatkom gvožđa kod ljudi.

[0060] Saglasno narednom aspektu predmetnog pronalaska, obezbeđen je hidrogenisani oligosaharid srednje masene molarne mase (MW) manje od 3000 Daltona i sadržaja dimernih saharida od 2.9 % mase ili manje, i poželjno, sadržaja monomernih saharida 0.5 % mase ili manje. Navedeni oligosaharid je intermedijarni proizvod u proizvodnji gvožđe-oligosaharidnog jedinjenja kako je ovde opisano.

[0061] Saglasno dodatnom aspektu pronalaska, obezbeđen je postupak za pripremu navedenog intermedijarnog hidrogenisanog oligosaharida saglasno prethodnom aspektu pronalaska, naznačeno time da postupak uključuje sledeće korake:

(a) hidrolizu polisaharida, tako da se umanji njegova molarna masa,

(b) hidrogenisanje nastalog oligosaharida, kako bi se funkcionalne aldehidne grupe konvertovale u alkoholne grupe, i

(c) frakcionisanje hidrogenizovanog oligosaharida prema molarnoj masi, tako da prečišćena frakcija ima srednju masenu molarnu masu jednaku ili veću od 3000 Daltona,

gde korak (c) uključuje postupak prečišćavanja primenom jednog ili više membranskih procesa separacije sa propusnim opsegom između 340 i 800 Daltona, pri čemu se postupak nastavlja sve dok se sadržaj dimernih saharida u prečišćenoj frakciji oligosaharida ne smanje na 2.9 % mase ili manje, u odnosu na ukupnu masu hidrogenisanog oligosaharida. Poželjno je da se prečišćavanje nastavi sve dok se sadržaj monomera u prečišćenom oligosaharidu ne spusti na 0.5 % mase ili manje.

[0062] Saglasno narednom aspektu pronalaska, obezbeđen je postupak proizvodnje injekcionog rastvora koji sadrži jedinjenje gvožđe oligosaharida, u kom postupku se gvožđe-oligosaharidno jedinjenje u vidu suvog praha, rastvara u vodenom medijumu, ako je potrebno podešava se PH, dodaje se stabilizator i tečnost se steriliše filtracijom, pre nego što se sipa u ampule ili vajle, ili se autoklavira nakon punjenja u ampule ili vajle.

[0063] Alternativno, tečnost koja sadrži navedeno jedinjenje se prečišćava, podešava se sadržaj gvožđa i PH, stabilizuje se i steriliše filtracijom, pre nego što se sipa u pomenute ampule ili vajle ili se autoklavira nakon sipanja u ampule ili vajle.

[0064] Gvožđe-oligosaharidna jedinjenja dobijena kako je ovde opisano, veoma su rastvorljiva u vodi, zbog čega je moguće pripremiti injekcione rastvore sa visokim sadržajem gvožđa. Ovde je opisan injekcioni rastvor adaptiran za primenu kod ljudi, koji sadrži 1-20 % (w/v) gvožđa. Takođe je ovde opisan injekcioni rastvor adaptiran za primenu kod životinja, koji sadrži 10-30 % (w/v) gvožđa.

[0065] Rastvori gvožđe-oligosaharidnih jedinjenja kako je ovde opisano mogu se sterilisati autoklaviranjem, koje ne dovodi do značajnih fizičkih promena rastvora. Stoga se rastvori mogu autoklavirati bez značajnih promena molarne mase kompleksa ili viskoznosti rastvora.

[0066] Vodeni rastvori gvožđe-oligosaharidnog jedinjenja mogu se konzervirati primenom poznatih postupaka konzervacije, kao što su autoklaviranje, filtracija kroz 0.2-0.5 mikrometarske filtere u sterilnim uslovima ili dodavanjem konzervanasa. Na primer, kao konzervans je moguće primeniti 0.5% fenol.

[0067] Poželjan postupak konzervacije vodenih rastvora jedinjenja saglasno pronalasku jeste autoklaviranje. Naročito je poželjno autoklaviranje na temperaturama 121-135<0>C tokom perioda od 5-40 minuta.

[0068] Vodeni rastvori gvožđe-oligosaharidnih jedinjenja kako je ovde opisano pokazuju odličnu stabilnost i nisu podložni pogoršavanju tokom vremena skladištenja, kao što su geliranje ili precipitacija.

[0069] Pronalazak će biti ilustrovan narednim neograničavajućim primerima.

PRIMERI

Hidroliza i hidrogenacija dekstrana

[0070] Količina pre-hidrolizovanog dekstrana prikupljenog kao permeat kroz membranu sa propusnom veličinom < 5000 Daltona dalje se hidrolizuje na PH 1.5, na temperaturi od 95<0>C.

[0071] Hidroliza se prati pomoću gel permeacione hromatografije (GPC) i prekida se hlađenjem, kada se proceni da je postignuta molarna masa materijala koji je hidrolizovan u željenoj vrednosti, odnosno, srednja masena molarna masa od 700 — 1400 Daltona.

[0072] Tokom hidrolize, nastaje nisko-molekuski dekstran, ali nastaju i glukoza i izomaltoza. Nakon hidrolize, sadržaj disaharida je oko 7 - 8 % mase.

[0073] Nakon hlađenja i neutralizacije, količina monomera i dimera smanjuje se membranskom separacijom propusnog opsega od 340 - 800 Daltona. Koncentracija monosaharida i disaharida u rastvoru prati se pomoću gel permeacione hromatografije, a frakcionisanje se odvija sve dok se koncentracija dimera ne svede na 2.9<0>0 mase ili manje, odnosno, dok se koncentracija monomera ne smanji na 0.5 % ili manje.

[0074] Nadalje, sadržaj dekstrana se određuje optičkom rotacijom, a količina redukujućeg šećera se određuje pomoću Somodijevog (Somogyi) reagensa. Redukujuća sposobnost se spušta na nivo manji od 3%, dodavanjem natrijum borohidrida rastvoru na baznom PH. Primenjeni odnos natrijum borohidrida : frakcionisanog dekstranaje I : 34.7.

[0075] Rastvor se neutrališe na pH < 7.0, a zatim se dejonizuje. Srednje molarne mase i distribucija molarnih masa određuju se hromatografski. Primena hromatografije ukazuje na ispunjenje željenih uslova, odnosno, da je postignuto da 90 % mase dekstrana ima molarnu masu manju od 2700 Daltona i da je srednja masena molarna masa (MW) 10% masene frakcije dekstrana sa najvećom molarnom masom manja od 3200 Daltona. Finalni prinos dekstrana nakon dejonizacije je oko 50 % inicijalne količine prehidrolizovanog dekstrana. Sinteza gvožđe-dekstrana

[0076] Količina od 120 kg dekstran koji je dobijen na prethodno opisani način, meša se, u formi 18 % rastvora, sa 150 kg FeC13, 61-120. Pomenutoj smeši dodaje se 93 kg Na2C03 u vidu zasićenog vodenog rastvora, nakon čega se pH povećava na vrednost 10.5, pomoću 24 litra koncentrovanog rastvora NaOH (27 % (w/v)).

[0077] Tako dobijena smeša se greje na temperaturu preko 100<0>C, sve dok se ne dobije crni ili tamno-braon koloidni rastvor. Nakon hlađenja, rastvor se neutrališe pomoću 12 litara koncentrovane hlorovodonične kiseline, kako bi se dobio rastvor pH od 5.8. Nakon filtracije, rastvor se prečišćava filtracijom sve dok se sadržaj hlorida u rastvoru ne smanji na nivo manji od 0.55 %, izračunato u odnosu na rastvor koji sadrži 5 % (w/v) gvožđa.

[0078] Ukoliko je sadržaj hlorida u rastvoru manji od potrebnog za dobijanje izotoničnog rastvora, dodaje se natrijum hlorid i pH se konačno podešava na 5.6, a rastvor se zatim filtrira kroz 0.45 prn (ili 0.2 um) membranske filtere.

[0079] Rastvor se suši raspršivanjem, a gvožđe-dekstransko jedinjenje u prahu spremno je za korišćenje ili dalju obradu.

[0080] Umesto sušenja raspršivanjem, ovaj rastvor se može primeniti za dobijanje injekcionih rastvora čiji je sadržaj gvožđa na primer, 10 % (w/v), kao što je već opisano.

[0081] Kada se praškasti gvožđe-dekstran koristi za dobijanje injekcionih rastvora ili infuzionih tečnosti, prah se ponovo rastvara u vodenom medijumu, proverava se ako je potrebno podešava PH i rastvor se puni u ampule ili vajle nakon sterilizacije filtracijom. Alternativno, sterilizacija se može izvesti autoklaviranje, nakon pakovanja tečnosti u ampule ili vajle.

Analiza stabilnosti vožde-oligosaharidnih jedinjenja zavisno od sadržaja dimera

[0082] Kod jednog broja gvožđe-oligosaharidnih jedinjenja sa različitim sadržajem disaharida analizirane su brzina hidrolize i molarna masa, kao parametri koji jasno ukazuju na kvalitet jedinjenja.

[0083] Pretpostavljeno je da brzina hidrolize Fe<3>+ iz jedinjenja FeOOH i oligosaharida u kiselim uslovima (0.24 M HCI; 0,9% NaCl) korelira sa brzinom fiziološkog oslobađanja gvožđa. Stoga je brzina hidrolize, predstavljena kao dužina polu-života (t 1/2) važan parametar ispitivanih jedinjenja.

[0084] Hidroliza Fe<3>+ određena je merenjem apsorbance na 287.3 nm.

[0085] Osim toga, utvrđeno je da termostabilnost gvožđe-oligosaharida zavisi od molekulsne mase (MP) jedinjenja. Stoga su ova jedinjenja nestabilna kada molarna masa značajno prevazilazi vrednost od 160000 Daltona, kada se testira nakon skladištenja na povišenim temperaturama tri meseca.

[0086] Rezultati su prikazani u Tabeli l .

Tabela 1

[0087] Kao što se vidi iz Tabele 1, molarna masa nalazi se u željenom opsegu, konkretno oko 130 kD do oko 160 kD, kada je količina dimera u oligosaharidu manja od 3 %. Isto važi i za brzinu hidrolize, predstavljenu u vidu dužine polu-života. Polu-život (t1/2) se definiše kao vreme tokom kojeg se vrednost apsorbance smanji na polovinu vrednosti očitane na t = 0.

[0088] Rezultati prikazani u Tabeli 1 mogu se prikazati u dve serije. Kada se rezultati predstave grafički u dijagramu t1/2vs. sadržaj dimera, dobija se Slika 1. Dve prave linije fitovane u dve serije imaju odsečak jednak sadržaju dimera od 3.5 % mase i t1/2od 12.6 sati.

Claims

Patentni zahtevi

1. Oligosaharid čija je prosečna molekulska težina (Mw) manja od 3.000 Daltona, naznačen time što navedeni oligosaharid sadrži funkcionalne aldehidne grupe i ima sadržaj dimernih saharida 2.9 % mase ili manje, u odnosu na ukupnu masu hidrogenisanog oligosaharida.

2. Oligosaharid prema patentnom zahtevu l, gde je sadržaj monomernog saharida 0.5 % mase ili manje, u odnosu na ukupnu masu hidrogenisanog oligosaharida.

3. Oligosaharid prema patentnom zahtevu l ili 2, koji ispunjava uslove Evropske Farmakopeje, unos 01/2009:1506.

4. Oligosaharid prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, gde je prosečna težinska molekulska masa (Mw) oligosaharida 850 do 1150 Daltona.

5. Oligosaharid prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, koji je hidrogenirani oligosaharid.

6. Postupak za pripremu oligosaharida prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5, koji postupak obuhvata korake:

(a) hidrolizu polisaharida tako da smanji njegovu molekulsku težinu, gde nastali oligosaharid sadrži funkcionalne aldehidne grupe i

(b) frakcionisanje oligosaharida prema molekulskoj težini, tako da prečišćena frakcija ima prosečnu molekulsku težinu jednaku ili manju od 3000 Daltona,

pri čemu korak (b) obuhvata postupak prečišćavanja jednim ili više membranskih procesa koji imaju graničnu vrednost između 340 i 800 Daltona, koji se nastavlja sve dok se sadržaj dimernog saharida u prečišćenoj frakciji oligosaharida ne smanji na 2.9% mase ili manje, na osnovu ukupne težine oligosaharida.

7. Postupak prema patentnom zahtevu 5, gde se navedeno prečišćavanje odvija sve dok se sadržaj monomernog saharida u prečišćenoj frakciji oligosaharida ne smanji na 0.5 % mase ili manje, u odnosu na ukupnu masu hidrogenisanog oligosaharida.

8. Postupak prema patentnom zahtevu 6 ili 7, koji dalje sadrži korak

(c) hidrogeniranje frakcionisanog oligosaharida za pretvaranje funkcionalnih aldehidnih grupa u alkoholne grupe.

9. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 6 do 8, gde oligosaharid zadovoljava Evropsku Farmakopeju, unos 01/2009: 1506.

10. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 6 do 9, gde je prosečna težinska molekulska težina (Mw) oligosaharida 850 do 1150 Daltona.

11. Oligosaharid koji se može dobiti postupkom prema patentnim zahtevima 6 do 10.