RS61124B1

RS61124B1 - Anti-aktivin a antitela i njihove upotrebe

Info

Publication number: RS61124B1
Application number: RS20201414A
Authority: RS
Inventors: Jesper Gromada; Esther Latres; Andrew J Murphy; George D Yancopoulos; Lori C Morton
Original assignee: Regeneron Pharma
Priority date: 2013-07-30
Filing date: 2014-07-30
Publication date: 2020-12-31
Also published as: DK3027209T3; HRP20201729T1; AU2014296243B2; US20230312699A1; JP7589200B2; AU2014296243A1; JP2025024066A; JP2016528232A; SMT202000643T1; EP4062937A1; JP2020011965A; US20180155416A1; ZA201601294B; CA2920071C; SG11201600731WA; NZ716854A; JP2022160619A; IL243822A0; EP3027209B1; WO2015017576A1

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Ovaj se pronalazak odnosi na antitela, i njihove fragmente koji vezuju antigen, koji su specifični za aktivin A, i postupke za njegovu upotrebu, uključujući postupke upotrebe antitela specifičnih za aktivin A u vezi sa inhibitorom miostatina.

STANJE TEHNIKE

[0002] Aktivini pripadaju supefamiliji koja transformiše beta faktor rasta (TGF- β) i ispoljava širok opseg bioloških dejstava na proliferaciju, diferencijaciju, i apoptozu ćelije. Aktivini su homodimeri ili heterodimeri od Inhibina βA, Inhibina βB, Inhibina βC i Inhibina βE, čije različite kombinacije stvaraju različite elemente grupe proteina aktivina. Na primer, Aktivin A je homodimer Inhibina βA i Aktivin B je homodimer Inhibina βB, pri čemu je Aktivin AB heterodimer Inhibina βA i Inhibin βB i Aktivin AC je heterodimer Inhibina βA i Inhibina βC (Tsuchida, K. et al., Cell Commun Signal 7:15 (2009)).

[0003] Aktivin A se vezuje na i aktivira komplekse receptora na površini ćelija poznate kao receptori aktivina tipa II (Tip IIA i Tip IIB, takođe poznati kao ActRIIA i ActRIIB, prema opisanom redosledu). Aktivacija ovih receptora dovodi do fosforilacije receptora aktivina tipa I T(npr., Alk4 ili 7), što zauzvrat dovodi do fosforilacije SMAD 2 i 3 proteina, formiranja SMAD kompleksa (sa SMAD4), i translokacije SMAD kompleksa u nukleus ćelije, pri čemu funkcija SMAD2 i SMAD3 da reguliše transkripciju različitih gena (Sozzani, S. and Musso, T., Blood 117(19):5013-5015 (2011)).

[0004] Brojni drugi ligandi se vezuju na i aktiviraju ActRIIB, uključujući GDF8 (miostatin), aktivin B, aktivin AB, inhibin A, inhibin B, GDF3, GDF11, nodal, BMP2, BMP4, BMP7, BMP9, i BMP10. Blokiranje interakcija ActRIIB sa njegovim ligandima može dovesti do korisnih fizioloških efekata. Na primer, GDF8 igra centralnu ulogu u razvoju i održavanju mišića skeleta, koji deluju kao negativni regulator mase mišića (McPherron AC et al. (1997). Nature 387(6628):83-90). Isporuka ActRIIB-Fc (t.j., vanćelijskog dela receptora tipa IIB, ActRIIB, je stabilizovano fuzijom na IgG Fc domen) što dovodi do značajnih povećanja u masi mišića skeleta i poboljšava težinu mišića i merenja jačine mišića kod miševa (Lee SJ, et al. (2005) Proc Natl Acad Sci U S A 102(50):18117-18122). Efikasnost ActRIIB-Fc je oslabljena ali nije eliminisana kod Mstn (miostatin) nultih miševa, što pokazuje da drugi ActRIIB ligand(i) pored miostatina mogu da funkcionišu kao negativni regulatori rasta mišića. Dakle, postoji potreba za dodatnim inhibitorima ActRIIB signaliziranja koji mogu obezbediti klinička poboljšanja.

[0005] WO 2013/074557 i WO 2008/031061 opisuju anti-aktivin A antitela.

KRATAK OPIS PRONALASKA

[0006] Ovaj pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji specifično vezuje aktivin A sa konstantom ravnoteže razdruživanja vezivanja (KD) čija je vrednost manja od 5 pM, opciono sa KD čija je vrednost manja od 4 pM, kako je izmereno u ogledu rezonance površinskog plazmona na 25 °C, pri čemu antitelo ili fragment koji vezuje antigen obuhvata: HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 domene, sa sekvencama aminokiseline iz SEK ID BR: 164-166-168-148-150-152, prema opisanom redosledu. Antitela iz ovog pronalaska su korisna, inter alia, za inhibiranje signaliziranja posredovanog aktivinom A, proizvodnju korisnih kliničkih ishoda kroz inhibiciju signaliziranja posredovanog aktivinom A, npr. za lečenje bolesti i poremećaja prouzrokovanih ili povezanih sa aktivnošću aktivina A i/ili signaliziranjem aktivina A. Antitela iz ovog pronalaska takođe su korisna za upotrebu u vezi sa inhibitorima drugih liganada od receptora ActRIIA i ActRIIB, kao što su GDF8 inhibitori.

[0007] Antitela iz ovog pronalaska mogu biti pune dužine (na primer, IgG1 ili IgG4 antitelo) ili mogu obuhvatiti samo deo koji vezuje antigen (na primer, Fab, F(ab’)2 ili scFv fragment), i mogu biti modifikovani da bi uticali na funkcionalnost, npr., da se eliminišu rezidualne funkcije efektora (Reddy et al., J Immunol 164:1925-1933 (2000)).

[0008] Izolovana antitela, ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen, specifično vezuju aktivin A sa konstantom ravnoteže udruživanja vezivanja (Ka) od manje od 500 nM i konstantom ravnoteže razdruživanja (KD) od manje od 5 pM kao što je izmereno u ogledu sa rezonancom površinskog plazmona na 25 °C. U nekim izvođenjima ovog pronalaska, izolovana antitela, ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen, specifično vezuju aktivin A sa KD od manje od oko 4 pM kako je izmereno u ogledu rezonance površinskog plazmona na 25°C. U nekim izvođenjima ovog pronalaska, izolovana antitela, ili njegovi fragmenti koji vezuju antigen, specifično vezuju aktivin A sa konstantom ravnoteže udruživanja vezivanja (Ka) od manje od oko 500 nM.

[0009] Ovaj opis obezbeđuje izolovana antitela, ili njegove fragmente koji vezuju antigen, koji specifično vezuju aktivin A i blokiraju vezivanje najmanje jednog receptora aktivina A na aktivin A. U nekim slučajevima, izolovana antitela, ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen, blokiraju vezivanje aktivina A na receptor aktivina A sa IC50 vrednošću manjom od oko 80 pM kako je izmereno u in vivo bioogledu vezivanja receptora/liganda na 25 °C. U nekim slučajevima, izolovana antitela, ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen, blokiraju vezivanje aktivina A na receptor aktivina A sa IC50 vrednošću od manje od oko 60 pM kako je izmereno u in vivo bioogledu vezivanja receptora/liganda na 25°C. Ovaj opis takođe obezbeđuje izolovana antitela, ili njihove fragmente koji vezuju antigen, koji specifično vezuju aktivin A i blokiraju aktivaciju najmanje jednog receptora aktivina A pomoću aktivina A. U nekim slučajevima, izolovana antitela, ili njegovi fragmenti koji vezuju antigen, ne blokiraju u većoj meri vezivanje aktivina A na receptor aktivina tip II. U nekim slučajevima, izolovana antitela, ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen, inhibiraju vezivanje aktivina A na receptor aktivna A izabran iz grupe koja obuhvata receptor aktivina tip IIA (ActRIIA), receptor aktivina tip IIB (ActRIIB) i receptor aktivina tip I. U nekim slučajevima, izolovana antitela, ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen, inhibiraju aktivinom A posredovanu aktivaciju signaliziranja SMAD kompleksa.

[0010] Ovde su opisana antitela, ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen koji obuhvataju promenljivi region teškog lanca (HCVR) sa sekvencom aminokiseline izabranom iz grupe koja obuhvata SEK ID BR: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 106, 114, 122, 130, 138, 154, 162, 170, 178, 186, 194, i 202, ili njoj pretežno sličnu sekvencu koja ima barem 90%, barem 95%, barem 98% ili barem 99% identičnost sekvence.

[0011] Ovde je takođe opisano antitelo ili fragment koji vezuje antigen nekog antitela koji obuhvata promenljivi region lakog lanca (LCVR) sa sekvencom aminokiseline izabranom iz grupe koja obuhvata SEK ID BR: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 146, i 210, ili njima pretežno sličnoj sekvenci koja ima najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identičnost sekvence.

[0012] Ovde je opisano antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji obuhvata HCVR i LCVR (HCVR/LCVR) par sekvence izabran iz grupe koja obuhvata SEK ID BR: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/90, 106/90, 114/90, 122/90, 130/90, 138/146, 154/146, 162/146, 170/146, 178/146, 186/146, 194/146, i 202/210.

[0013] Ovde je takođe opisano antitelo ili fragment koji vezuje antigen antitela koji obuhvata CDR3 domen teškog lanca (HCDR3) sa sekvencom aminokiseline izabranom iz grupe koja obuhvata SEK ID BR: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 112, 120, 128, 136, 144, 160, 168, 176, 184, 192, 200, i 208, ili njenu pretežno sličnu sekvencu koja ima identičnost sekvence od najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99%; i CDR3 domen lakog lanca (LCDR3) sa sekvencom aminokiseline izabranom iz grupe koja obuhvata SEK ID BR: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 152, i 216, ili njima pretežno sličnoj sekvenci koja ima najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identičnost sekvence.

[0014] U izvesnim slučajevima, antitelo ili deo antitela koji vezuje antigen obuhvata HCDR3/LCDR3 par sekvence aminokiseline izabran iz grupe koja obuhvata SEK ID BR: 8/16, 24/32, 40/48, 56/64, 72/80, 88/96, 104/96, 112/96, 120/96, 128/96, 136/96, 144/152, 160/152, 168/152, 176/152, 184/152, 192/152, 200/152, i 208/216.

[0015] Ovde je opisano antitelo ili njegov fragment koji još obuhvata CDR1 domen teškog lanca (HCDR1) koji ima sekvencu aminokiseline izabranu iz grupe koja obuhvata SEK ID BR: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 108, 116, 124, 132, 140, 156, 164, 172, 180, 188, 196, i 204, ili njenu pretežno sličnu sekvencu koja ima identičnost sekvence od najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99%; CDR2 domen teškog lanca (HCDR2) sa sekvencom aminokiseline izabranom iz grupe koja obuhvata SEK ID BR: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 110, 118, 126, 134, 142, 158, 166, 174, 182, 190, 198, i 206, ili njenu pretežno sličnu sekvencu koja ima identičnost sekvence od najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99%; CDR1 domen lakog lanca (LCDR1) sa sekvencom aminokiseline izabranom iz grupe koja obuhvata SEK ID BR: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 148, i 212, njenu pretežno sličnu sekvencu sa barem 90%, barem 95%, barem 98% ili barem 99% identičnosti sekvence; i CDR2 domen lakog lanca (LCDR2) sa sekvencom aminokiseline izabranom iz grupe koja obuhvata SEK ID BR: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 150, i 214, ili njima pretežno sličnoj sekvenci koja ima najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identičnost sekvence.

[0016] Izvesna antitela i fragmenti koji su dati neograničavajuće, samo radi primera obuhvataju HCDR1-HCDR2-HCDR3- LCDR1-LCDR2-LCDR3 domene, prema opisanom redosledu, sa sekvencama aminokiseline izabranim iz grupe koja obuhvata: SEK ID BR: 4-6-8-12-14-16 (npr. H4H10423P); 20-22-24-28-30-32 (npr. H4H10424P); 36-38-40-44-46-48 (npr. H4H10426P); 52-54-56-60-62-64 (npr. H4H10429P); 68-70-72-76-78-80 (npr. H4H10430P); 84-86-88-92-94-96 (npr. H4H10432P2; 100-102-104-92-94-96 (npr. H4H10433P2); 108-110-112-92-94-96 (npr. H4H10436P2); 116-118-120-92-94-96 (npr. H4H10437P2); 124-126-128-92-94-96 (npr. H4H10438P2); 132-134-136-92-94-96 (npr. H4H10440P2); 140-142-144-148-150-152 (npr. H4H10442P2); 156-158-160-148-150-152 (H4H10445P2); 164-166-168-148-150-152 (H4H10446P2); 172-174-176-148-150-152 (H4H10447P2); 180-182-184-148-150-152 (H4H10448P2); 188-190-192-148-150-152 (H4H10452P2); 196-198-200-148-150-152 (H4H10468P2); i 204-206-208-212-214-216 (H2aM10965N). Antitela i njihov fragment koji vezuje antigen iz ovog pronalaska obuhvataju: HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 domene, sa sekvencama aminokiseline iz SEK ID BR: 164-166-168-148-150-152, prema opisanom redosledu.

[0017] Ovde je opisano antitelo ili fragment koji vezuje antigen nekog antitela koje specifično veže aktivin A, pri čemu to antitelo ili fragment obuhvata CDR domene teškog i lakog lanca sadržane unutar sekvenci promenljivog regiona teškog i lakog lanca (HCVR/LCVR) izabranih iz grupa koje obuhvataju SEK ID BR: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/90, 106/90, 114/90, 122/90, 130/90, 138/146, 154/146, 162/146, 170/146, 178/146, 186/146, 194/146, i 202/210. Metode i tehnike za identifikovanje CDR unutar HCVR i LCVR sekvenci aminokiseline su dobro poznate u ovoj oblasti moguće ih je koristiti da bi se identifikovali CDR unutar navedenih HCVR i/ili LCVR sekvenci aminokiseline opisanih ovde. Primeri konvencija koje je moguće koristiti da se odrede granice CDR obuhvataju, npr. Kabat definiciju, Hotija definiciju, i AbM definiciju. Uopšteno gledano, Kabat definicija se bazira na promenljivosti sekvence, Hotija definicija je bazirana na lokaciji regiona strukturne petlje, i AbM definicija je kompromis između pristupa Kabat i Hotija. Videti, npr. Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikani et al., J Mol Biol 273:927-948 (1997); and Martin et al., PNAS (USA) 86:9268-9272 (1989). Javno dostupne baze podataka su takođe na raspolaganju za identifikovanje CDR sekvenci unutar nekog antitela.

[0018] Ovde su takođe opisani molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju anti-aktivin A antitela ili njihove delove. Na primer, molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju bilo koju od HCVR sekvenci aminokiseline navedenih u Tabeli 1; u izvesnim slučajevima molekul nukleinske kiseline obuhvata sekvencu polinukleotida izabranu iz bilo koje od HCVR sekvenci nukleinske kiseline navedenih u Tabeli 2, ili njoj pretežno sličnoj sekvenci koja ima sa njom identičnost sekvence najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99%.

[0019] Ovde su takođe opisani molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju bilo koju od LCVR sekvenci aminokiseline navedenih u Tabeli 1; u izvesnim slučajevima molekul nukleinske kiseline obuhvata sekvencu polinukleotida izabranu iz bilo koje od LCVR sekvenci nukleinske kiseline navedenoj u Tabeli 2, ili njoj pretežno sličnoj sekvenci koja ima sa njom identičnost sekvence najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99%.

[0020] Ovde su takođe opisani molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju bilo koju od HCDR1 sekvenci aminokiseline navedenih u Tabeli 1; u izvesnim slučajevima molekul nukleinske kiseline obuhvata sekvencu polinukleotida izabranu iz bilo koje od HCDR1 sekvenci nukleinske kiseline navedenoj u Tabeli 2, ili njoj pretežno sličnoj sekvenci koja ima sa njom identičnost sekvence najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99%.

[0021] Ovde su takođe opisani molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju bilo koju od HCDR2 sekvenci aminokiseline navedenih u Tabeli 1; u izvesnim slučajevima molekul nukleinske kiseline obuhvata sekvencu polinukleotida izabranu iz bilo koje od HCDR2 sekvenci nukleinske kiseline navedenoj u Tabeli 2, ili njoj pretežno sličnoj sekvenci koja ima sa njom identičnost sekvence najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99%.

[0022] Ovde su takođe opisani molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju bilo koju od HCDR3 sekvenci aminokiseline navedenih u Tabeli 1; u izvesnim slučajevima molekul nukleinske kiseline obuhvata sekvencu polinukleotida izabranu iz bilo koje od HCDR3 sekvenci nukleinske kiseline navedenoj u Tabeli 2, ili njoj pretežno sličnoj sekvenci koja ima sa njom identičnost sekvence najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99%.

[0023] Ovde su takođe opisani molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju bilo koju od LCDR1 sekvenci aminokiseline navedenih u Tabeli 1; u izvesnim slučajevima molekul nukleinske kiseline obuhvata sekvencu polinukleotida izabranu iz bilo koje od LCDR1 sekvenci nukleinske kiseline navedenoj u Tabeli 2, ili njoj pretežno sličnoj sekvenci koja ima sa njom identičnost sekvence najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99%.

[0024] Ovde su takođe opisani molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju bilo koju od LCDR2 sekvenci aminokiseline navedenih u Tabeli 1; u izvesnim slučajevima molekul nukleinske kiseline obuhvata sekvencu polinukleotida izabranu iz bilo koje od LCDR2 sekvenci nukleinske kiseline navedenoj u Tabeli 2, ili njoj pretežno sličnoj sekvenci koja ima sa njom identičnost sekvence najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99%.

[0025] Ovde su takođe opisani molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju bilo koju od LCDR3 sekvenci aminokiseline navedenih u Tabeli 1; u izvesnim slučajevima molekul nukleinske kiseline obuhvata sekvencu polinukleotida izabranu iz bilo koje od LCDR3 sekvenci nukleinske kiseline navedenoj u Tabeli 2, ili njoj pretežno sličnoj sekvenci koja ima sa njom identičnost sekvence najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99%.

[0026] Ovde su takođe opisani molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju HCVR, pri čemu HCVR obuhvata niz od tri CDRs (tj., HCDR1-HCDR2-HCDR3), pri čemu HCDR1-HCDR2HCDR3 komplet sekvence aminokiseline jeste kao što je definisan bilo kojim od za primer uzetih anti-aktivin A antitela navedenih u Tabeli 1.

[0027] Ovde su takođe opisani molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju LCVR, pri čemu LCVR obuhvata niz od tri CDR (tj., LCDR1-LCDR2-LCDR3), pri čemu LCDR1-LCDR2-LCDR3 komplet sekvence aminokiseline jeste kao što je definisan bilo kojim za primer uzetim anti-aktivin A antitelom navedenim u Tabeli 1.

[0028] Ovde su takođe opisani molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju i HCVR i LCVR, pri čemu HCVR obuhvata sekvencu aminokiseline od bilo koje od HCVR sekvenci aminokiseline navedenih u Tabeli 1, i pri čemu LCVR obuhvata sekvencu aminokiseline od LCVR sekvenci aminokiseline navedenih u Tabeli 1. U izvesnim slučajevma, molekul nukleinske kiseline obuhvata sekvencu polinukleotida izabranu iz bilo koje od HCVR sekvenci nukleinske kiseline datih u Tabeli 2, ili njenoj pretežno sličnoj sekvenci koja ima sa njom identičnost sekvence od najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99%, i sekvencu polinukleotida izabranu iz bilo koje od LCVR sekvenci nukleinske kiseline navedenih u Tabeli 2, ili njima pretežno sličnoj sekvenci koja sa njom ima identičnost sekvence od najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99%. U izvesnim slučajevima prema ovom varijantnom rešenju pronalaska, molekul nukleinske kiseline kodira HCVR i LCVR, pri čemu HCVR i LCVR jesu oba izvedena iz istog anti-aktivin A antitela navedenih u 1.

[0029] Ovde su takođe opisani rekombinantni vektori ekspresije koji su sposobni za ekspresiju polipeptida koji obuhvata promenljivi region teškog ili lakog lanca anti-aktivin A antitela. Na primer, rekombinantni vektori ekspresije obuhvataju bilo koje gore u tekstu pomenute molekule nukleinske kiseline, tj. molekule nukleinske kiseline koji kodiraju bilo koju od HCVR, LCVR, i/ili CDR sekvenci kao što je izneto u Tabeli 1. Takođe su obuhvaćene ovim opisom ćelije domaćini u koje se takvi vektori uvode, kao i postupci proizvodnje antitela ili njihovih delova kultivisanjem ćelija domaćina pod uslovima koji dozvoljavaju proizvodnju antitela ili fragmenata antitela, i oporavljanje antitela i fragmenata antitela tako proizvedenih.

[0030] Ovaj pronalazak uključuje anti-aktivin A antitela koja imaju modifikovani sadržaj karbohidrata. U nekim primenama, može biti korisna modifikacija da se uklone neželjena mesta glikosilacije. U nekim primenama, može biti korisna modifikacija da se promene obrasci glikosilacije, npr. modifikovanje antitela na nedostatak fukoznog dela prisutnog na lancu oligosaharida, na primer, da bi se povećala funkcija ćelijske citotoksičnosti zavisna od antitela (ADCC) (videti Shield et al. J Biol Chem 277:26733 (2002)). Kod još nekih drugih primena, modifikaciju galaktosilacije moguće je izvesti da bi se modifikovala citotoksičnost zavisna od komplementa (CDC). U nekim primenama, antitela mogu imati modifikovane obrasce glikosilacije da bi se svela na minimum funkcija efektora. Na primer, antitela mogu biti modifikovana da bi se dobila dodatno glikosilisana ili sijalilisana antitela.

[0031] U jednom drugom varijantnom rešenju, ovaj pronalazak obezbeđuje farmaceutsku supstancu koja obuhvata rekombinantno humano antitelo ili njegov fragment iz ovog pronalaska, koji specifično vezuje aktivin A i njegov farmaceutski prihvatljiv nosač. U sličnom varijantnom rešenju, pronalazak karakteriše supstanca koja je kombinacija antiaktivin A antitela i drugog terapijskog agensa. U jednom izvođenju, drugi terapijski agens je bilo koji agens koji se pogodno kombinuje sa anti-aktivin A antitelom,. Primeri agenasa koji mogu biti pogodno kombinovani sa anti-aktivin A antitelom uključuju, bez ograničenja, druge agense koji inhibiraju aktivnost aktivina A (uključujući druga antitela ili njihove fragmente za vezivanje antigena, inhibitore peptida, antagoniste malog molekula, itd.) i/ili agense koji ne vezuju direktno aktivin A već ometaju, blokiraju ili oslabljuju aktivinom A posredovano signaliziranje. U jednom izvođenju, sekundarni terapijski agens suzbija, ometa, blokira i/ili oslabljuje aktivnost drugog liganda receptora ActRIIA i/ili ActRIIB (npr., GDF8, aktivin B, aktivin AB, inhibin A, inhibin B, GDF3, GDF11, nodal, BMP2, BMP4, i/ili BMP7). U jednom izvođenju, sekundarni terapijski agens je anti-GDF8 antagonist (npr., humano anti-GDF8 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen). Primeri anti-GDF8 agenasa za upotrebu sa anti-aktivin A antitelima iz ovog pronalaska uključuju humano anti-GDF8 antitelo (npr., anti-GDF8 antitelo obuhvata bilo koju od sekvenci HCVR/LCVR ili CDR aminokiseline kao što je izneto u US 2011-0293630 A1 (npr., H4H1657N2, što je anti-GDF8 antitelo sa regionima određivanja komplementarnosti teškog lanca (HCDR) od HCVR koji obuhvataju SEK ID BR:217 (npr., CDR1, CDR2, i CDR3 sekvence iznete u SEK ID BR:218, 219, i 220, prema opisanom redosledu), i regioni određivanja komplementarnosti lakog lanca (LCDR) od LCVR obuhvataju SEK ID BR:221 (npr., CDR1, CDR2, i CDR3 sekvence iznete u SEK ID BR:222, 223, i 224)). Dodatne kombinovane terapije i koformulacije koje uključuju anti-aktivin A antitela iz ovog pronalaska su opisane ovde u tekstu.

[0032] U dodatnom varijantnom rešenju iz ovog opisa, daje se molekul koji vezuje antigen koji obuhvata za aktivin A specifičan domen vezivanja i za GDF8-specifičan domen vezivanja. U jednom izvođenju ovog pronalaska, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen je bispecifično antitelo koje obuhvata prvi promenljivi domen koji specifično vezuje aktivin A i drugi promenljivi domen koji specifično vezuje GDF8.

[0033] U još jednom varijantnom rešenju, ovaj pronalazak obezbeđuje antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen iz ovog pronalaska za upotrebu u terapijskim postupcima koji obuhvataju isporuku terapijski delotvorne količine farmaceutske supstance koja obuhvata antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen antitela iz ovog pronalaska. Lečeni poremećaj je bilo koja bolest ili stanje koje je poboljšano, obrađivano, inhibirano ili sprečeno uklanjanjem, inhibicijom ili smanjenjem aktivnosti ili signaliziranja aktivina A. Antiaktivin A antitela ili fragmenti antitela iz ovog opisa mogu da funkcionišu da blokiraju interakciju između aktivina A i receptora aktivina tip II (npr., receptor aktivina tip IIA i/ili receptor aktivina tip IIB); između aktivina A i receptora aktivina tip I; između aktivna A i oba receptora i tipa II i receptora tip I; ili drugačije inhibira aktivnost signaliziranja aktivina A.

[0034] Ovde je takođe opisana upotreba anti-aktivin A antitela ili antigen vezujućeg dela antitela iz ovog pronalaska u proizvodnji leka za lečenje bolesti ili poremećaja povezanih sa ili prouzrokovanih aktivnošću aktivina A kod pacijenta. Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen iz ovog pronalaska za upotrebu u postupcima za povećanje mišićne mase ili jačine kod subjekta isporučivanjem subjektu aktivin A antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen. Takođe su ovde opisani postupci za povećanje mišićne mase ili jačine kod subjekta isporukom subjektu za aktivin A specifičan protein vezivanja i za GDF8 specifičan protein vezivanja, ili isporučivanjem subjektu molekula koji vezuje antigen koji obuhvata za aktivin A specifičan domen vezivanja i za GDF8 specifičan domen vezivanja.

[0035] Ovaj pronalazak uključuje antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen iz ovog pronalaska za upotrebu u postupcima za lečenje, sprečavanje i/ili poboljšanje bolesti ili poremećaja koje karakteriše smanjena mišićna masa ili jačina isporučivanjem subjektu kom je potrebno anti-aktivin A antitela ili njegovog fragmenta. Ovde su takođe opisani postupci za lečenje, sprečavanje i/ili poboljšanje bolesti ili poremećaja koje karakteriše smanjena mišićna masa ili jačina isporučivanjem subjektu kom je potrebno za aktivin A specifičnog proteina vezivanja i za GDF8 specifičnog proteina vezivanja (npr. anti-aktivin A antitelo i anti GDF8 antitelo). Takođe su ovde opisani postupci lečenja, sprečavanja i/ili poboljšanja bolesti ili poremećaja naznačenog smanjenom mišićnom masom ili jačinom isporučivanjem subjektu kom je potrebno molekula koji vezuje antigen koji obuhvata za aktivin A specifičan domen vezivanja i za GDF8 specifičan domen vezivanja. Bolesti ili poremećaji naznačeni smanjenom mišićnom masom ili jačinom koju je moguće lečiti, sprečavati i/ili poboljšati korišćenjem ovde opisanih postupaka uključuju sarkopeniju, kaheksiju (npr. idiopatsku kaheksiju ili kaheksiju sekundarnu drugom stanju (npr. kancer, hronična bubrežna insuficijencija, ili hronična opstruktivna bolest pluća)), povreda mišića, gubljenje mišića i/ili atrofija mišića (npr. prouzrokovana ili povezana sa zloupotrebom, imobilizacijom, ležanjem u krevetu, povredom, medicinskim lečenjem, hirurškom

1

intervencijom (npr., prelom kuka, zamena kuka, i zamena kolena) i neophodnošću mehaničkog disanja), kancer, gojaznost, dijabetes, artritis, multipla skleroza, distrofija mišića, amiotropna lateralna skleroza, Parkinsonova bolest, osteoporoza, osteoartritis, osteopenija, i metabolički sindromi (npr. jedna ili više bolesti iz grupe dijabetesa, gojaznosti, poremećaja u ishrani, atrofije organa, hronične opstruktivne bolesti pluća, i anoreksije).

[0036] Ovde su takođe opisani postupci za lečenje, sprečavanje i/ili poboljšanje bolesti ili poremećaja prouzrokovanih, pospešenih, pogoršanih, ili otežanih aktivnošću molekula koji obuhvata inhibin βA (npr. dimeri koji obuhvataju inhibin βA, npr., aktivin A, aktivin AB, itd.) isporučivanjem subjektu kom je potrebno vezujućeg proteina specifičnog za aktivin A (tj., inhibin βA dimer), npr. anti-aktivin A antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen. Ovde su opisani postupci za lečenje, sprečavanje i/ili poboljšanje renalne fibroze isporučivanjem subjektu kom je potrebno anti-aktivin A antitela. Ovde su opisani postupci lečenja, sprečavanja, i/ili poboljšavanja renalne fibroze prouzrokovane hroničnim oboljenjem bubrega (npr. kao posledica hipertenzije, dijabetesa, glomerulonefritisa, nasleđenih bolesti (kao što je policistična bolest bubrega), deformacije bubrega, autoimuno oboljenje (npr. lupus), ili opstrukcije (npr. kamenje u bubregu, tumori, uvećanje žlezde prostate), ili ponovljene urinarne infekcije) isporučivanjem subjektu kom je potrebno anti-aktivin A antitela. Takođe su ovde opisani postupci lečenja, sprečavanja, i/ili poboljšanja sepse, hronične srčane insuficijencije, hronične opstruktivne bolesti pluća, benignog ili malignog feohromocitoma, fibroida/leiomiomata (benignih tumora glatkom mišićnog tkiva) materice, preeklampsije, keloida, hipertrofnih ožiljaka, ili pulmonarne arterijske hipertenzije isporučivanjem subjektu kom je potrebno anti-aktivin A antitela. Ovde su takođe opisani postupci za lečenje, sprečavanje, i/ili poboljšanje kaheksije prouzrokovane, pospešene, pogoršanih, ili otežanih aktivnošću aktivina A, isporučivanjem subjektu kom je potrebno anti-aktivin A antitela. Ovde su takođe opisani postupci za lečenje, sprečavanje, i/ili poboljšanje gubitka težine prouzrokovanog, pospešenog, pogoršanog, ili otežanog aktivnošću aktivina A, isporučivanjem subjektu kom je potrebno anti-aktivin A antitela.

[0037] Druga izvođenja će postati očigledna iz pregleda koji obezbeđuje detaljan opis.

KRATAK OPIS SLIKA NACRTA

[0038]

Slika 1 je matrica koja pokazuje rezultate ogleda unakrsnog takmičenja antitela u kom je prvo anti-aktivin A antitelo ("uzorak antitela") naneto na anti-humani FC-om obložen tip senzora, posle čega je usledilo potapanje u rastvor drugog anti-aktivin A antitela (1 µM) prethodno vezanog na aktivin A. Odgovori vezivanja (numeričke vrednosti 0,22 do 1,84) za svaku testiranu kombinaciju antitela su prikazani. Odgovori vezivanja predstavljeni u belim kućištima sa crnim tipom ukazuju da nije bilo konkurencije za vezivanje aktivina A, što nagoveštava distinktivne regione vezivanja.

Slika 2: Panel A pokazuje dejstva 21 dana terapije anti-GDF8 antitelom (H4H1657N2, 10 mg/kg ili 30 mg/kg) na prosečno vreme maksimalne tetaničke sile u poređenju sa izotipnim kontrolnim antitelom. Podaci su analizirani korišćenjem jednosmerne analize odstupanja (ANOVA) a posle je usledio Takijev (Tukey’s) test upoređenja. *p<0,05 značaja nad izotipnom kontrolom (n=6, neupareni studentski t test); n.s. = nije statistički značajno u poređenju sa izotipom 30 mg/kg. Panel B pokazuje povećanje maksimalne vrednosti tetaničke sile za prednji tibijalis (mišić tetive) (TA) kod H4H1657N2-om lečenih miševa (10 mg/kg) u odnosu na miševe lečene izotipnim kontrolnim antitelima tokom tri nedelje (n=6), kada su stimulisani električnom strujom u opsegu frekvencija od (40 do 100 Hz). Podaci su izraženi kao srednja vrednost prosečne maksimalne jačine ± SEM.

Slika 3: Panel A pokazuje konstrukciju eksperimenta da bi se procenila dejstva H4H1657N2 tokom faze oporavka od suspenzijom indukovane atrofije mišića zadnjeg dela uda. Panel B pokazuje procenat promene težine prednjeg mišića tetive (TA) i težine mišića Gastroknemijus (trbušasti mišić lista) (GA) za H4H1657N2-om lečene i izotipnom kontrolnim antitelom lečene miševe u periodu posle oporavka posle 7 dana od suspenzije zadnjeg uda (HLS+7Rec) u odnosu na miševe bez perioda oporavka posle 7 dana suspenzije zadnjeg uda (HLS) i kontrolni miševe (ne-HLS kontrola). Vrednosti su izražene kao srednji procenat promene u odnosu na kontrolne ne-HLS vrednosti ± SEM. Podaci su analizirani korišćenjem jednosmerne analize odstupanja (ANOVA) a posle je usledio Takijev (Tukey’s) test upoređenja. * = p<0,05 značaj u odnosu na ne-HLS grupu. # = p<0,05 značaj u odnosu na HLS grupu.

Slika 4: Panel A pokazuje dejstva isporuke anti-aktivin A antitela H4H10446P2 na telesnu težinu miševa sa prekomernim eksprimovanjem aktivina A (naspram izotipne kontrole). Podaci su analizirani korišćenjem dvosmerne analize odstupanja (ponovljene mere ANOVA Bonferonijev (Bonferroni) test višestrukog poređenja) posle kog je usledio Takijev (Tukey’s) test. * = p<0,05 naspram izotipne kontrole; #= p<0,05 naspram aktivina A izotipna kontrola. Panel B pokazuje dejstva anti-aktivin A antitela H4H10446P2 na težine mišića prednje tetive (tibialis) (TA) i trbušastog mišića lista (gastroknemijus) (GA) kod miševa sa prekomernim eksprimovanjem aktivina A (naspram izotipne kontrole). Podaci su analizirani korišćenjem jednosmerne analize odstupanja (ANOVA) a posle je usledio Takijev (Tukey’s) test upoređenja. *= p<0,05 nad vektor izotipnom kontrolnim sredstvom; #= p<0,05 nad aktivin A izotipnim kontrolnim sredstvom.

DETALJAN OPIS

[0039] Pre nego što se opiše ovaj pronalazak, treba razumeti da ovaj pronalazak nije ograničen na opisane specifične postupke i eksperimentalne uslove, jer takvi postupci i uslovi mogu da variraju. Takođe, treba razumeti da je ovde korišćena terminologija samo u svrhu opisa određenih izvođenja, i nije predviđena da bude ograničavajuća, jer će obim ovog pronalaska biti ograničen samo pomoću priloženih patentnih zahteva.

[0040] Osim ako nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni pojmovi korišćeni vode imaju isto značenje kako to obično razume prosečan stručnjak u ovoj oblasti u koju ovaj pronalazak spada. Kako se ovde koristi, pojam "oko," kada se koristi kao referenca na specifičnu navedenu brojčanu vrednost, znači da ta vrednost može da varira od navedene vrednosti za ne više od 1%. Na primer, kako se ovde koristi, izraz "oko 100" obuhvata 99 i 101 i sve vrednosti između (npr., 99,1, 99,2, 99,3, 99,4, itd.).

[0041] Iako je postupke i materijale slične ili identične onima koji su opisani ovde moguće koristiti u praksi ili testiranje ovog pronalaska, sada se opisuju preporučeni postupci i materijali.

Proteini vezivanja specifični za antigen

[0042] Ovaj se pronalazak odnosi na supstance koje obuhvataju proteine vezivanja specifične za antigen. Preciznije, ovaj pronalazak obezbeđuje supstancu koja obuhvata protein vezivanja specifičan za aktivin A.

[0043] Kako je ovde korišćeno, izraz "protein vezivanja specifičan za antigen znači protein koji obuhvata najmanje jedan domen koji specifično veže naročiti antigen. Primeri kategorija proteina vezivanja specifičnih za antigen uključuju antitela, antigen-vezujuće delove antitela, peptida koji su u specifičnoj interakciji sa naročitim antigenom (npr. peptitela), molekule receptora koji specifično reaguju međusobno sa naročitim antigenom, i proteine koji obuhvataju ligand-vezujući deo receptora koji specifično vezuje naročiti antigen.

1

[0044] Ovaj pronalazak uključuje proteine vezivanja specifične za antigen koji specifično vezuju aktivin A, tj., "proteine vezivanja specifične za aktivin A". Aktivini su homodimerni i heterodimerni molekuli koji obuhvataju beta podjedinice, tj. inhibin βA, inhibin βB, inhibin βC, i/ili inhibin βE. Podjedinica βA ima sekvencu aminokiseline od SEK ID BR:226 i βB podjedinica ima sekvencu aminokiseline SEK ID BR:228. Aktivin A je homodimer dve βA podjedinice; aktivin B je homodimer dve βB podjedinice; aktivin AB je heterodimer jedne βA podjedinice i jedne βB podjedinice; i aktivin AC je heterodimer jedne βA podjedinice i jedne βC podjedinice. Protein vezivanja specifičan za aktivin A može biti protein vezivanja specifičan za antigen koji specifično veže βA podjedinicu. Pošto se βA podjedinica nalazi u molekulima aktivina A, aktivina AB, i aktivina AC, "protein vezivanja specifičan za aktivin A" može biti protein vezivanja specifičan za antigen koji specifično veže aktivin A kao i aktivin AB i aktivin AC (interakcijom sa βA podjedinicom). Samim tim, prema jednom izvođenju ovog pronalaska, protein vezivanja specifičan za aktivin aktivin A specifično veže aktivin A; ili aktivin A i aktivin AB; ili aktivin A i aktivin AC; ili aktivin A, aktivin AB i aktivin AC, ali ne veže druge ActRIIB ligande kao što je aktivin B, GDF3, GDF8, BMP2, BMP4, BMP7, BMP9, BMP10, GDF11, nodal, itd. Dakle, u jednom izvođenju ovog pronalaska, protein vezivanja specifičan za aktivin A se specifično veže na aktivin A ali se ne veže značajno na aktivin B ili aktivin C. U drugom izvođenju, protein vezivanja specifičan za aktivin A može da se veže na aktivin B (zahvaljujući unakrsnoj reakciji sa βB podjedinicom, tj., inhibin βB). U jednom drugom izvođenju, protein vezivanja specifičan za aktivin A je vezujući protein koji se veže specifično na aktivin A ali se ne veže ni na koji drugi ligand ActRIIB. U drugom izvođenju, protein vezivanja specifičan za aktivin A je vezujući protein koji se veže specifično na aktivin A i ne vezuje se ni na koji drugi morfogenetski protein kosti (BMP) (npr., BMP2, BMP4, BMP6, BMP9, BMP10). U još jednom izvođenju, protein vezivanja specifičan za aktivin A je vezujući protein koji se veže specifično na aktivin A ali se ne veže ni na koji drugi element superfamilije transformacionog faktora rasta (TGF β).

[0045] Ovde su takođe opisani proteini vezivanja specifični za antigen koji specifično vežu GDF8, t.j., "proteine vezivanja specifične za GDF8". Pojam "GDF8" (se takođe pominje kao "faktor 8 rasta i diferencijacije" i "miostatin") znači da protein ima sekvencu aminokiseline iz SEK ID BR:225 (zreli protein). Proteini vezivanja specifični za GDF8 specifično vežu GDF8 ali ne vežu druge ActRIIB ligande kao što je GDF3, BMP2, BMP4, BMP7, BMP9, BMP10, GDF11, aktivin A, aktivin B, aktivin AB, nodal, itd.

[0046] U kontekstu ovog pronalaska, molekuli kao što je ActRIIB-Fc (npr., "ACE-031"), koji obuhvataju deo koji vezuje ligand od ActRIIB receptora, se ne smatraju "proteinima vezivanja specifičnim za aktivin A" ili "proteinima vezivanja specifičnim za GDF8" jer takvi molekuli vezuju više liganda pored GDF8, aktivina A i aktivina AB.

[0047] Svako pominjanje proteina, polipeptida i proteinskih fragmenata ovde u tekstu je predviđeno da se odnosi na humanu verziju odgovarajućeg proteina, polipeptida ili proteinskog fragmenta osim ako nije izričito precizirano da pripadaju nehumanim vrstama.

Molekuli koji vezuju antigen sa dva različita domena vezivanja specifična za antigen

[0048] Ovaj opis takođe uključuje molekule koji vezuju antigen koji obuhvataju dva različita domena vezivanja specifična za antigen. Preciznije, ovaj opis uključuje molekule koji vezuju antigen koji obuhvataju domen vezivanja specifičan za aktivin A i domen vezivanja specifičan za GDF8. Pojam "domen vezivanja specifičan za antigen," kako je ovde korišćeno, uključuje polipeptide koji obuhvataju ili se sastoje od: (i) fragmenta za vezivanje antigena nekog molekula antitela, (ii) peptid koji specifično reaguje međusobno sa određenim antigenom (npr. peptitelo), i/ili (iii) deo za vezivanje liganda nekog receptora koji specifično veže naročiti antigen. Na primer, ovaj pronalazak uključuje bispecifična antitela sa jednim krakom koji obuhvata prvi promenljivi region teškog lanca/promenljivi region lakog lanca (HCVR/LCVR) par koji specifično veže aktivin A i drugi krak koji obuhvata drugi HCVR/LCVR par koji specifično veže GDF8.

Specifično vezivanje

[0049] Pojam "specifično veže" ili sličan, kako je ovde korišćeno, znači da protein vezivanja specifičan za antigen, ili domen vezivanja specifičan za antigen, formira kompleks sa naročitim antigenom koji karakteriše konstanta razdruživanja (KD) od 500 pM ili manje, i ne veže druge nesrodne antigene pod redovnim uslovima ispitivanja. "Nesrodni antigeni" su proteini, peptidi ili polipeptidi koji imaju identičnost aminokiseline od manje od 95% jedan prema drugom. Postupci za određivanje da li se dva molekula specifično vezuju jedan drugi su dobro poznati u ovoj oblasti i obuhvataju, na primer dijalizu ravnoteže, površinsku rezonancu plazmona, i slično. Na primer, protein vezivanja specifičan za antigen ili domen vezivanja specifičan za antigen, kako je korišćeno u kontekstu ovog pronalaska, uključuje molekule koji vezuju specifičan antigen (npr., aktivin A i/ili AB, ili GDF8) ili njegov deo sa KD manjom od oko 500 pM, manjom od oko 400 pM, manjom od oko 300 pM, manjom od oko 200 pM, manjom od oko 100 pM, manjom od oko 90 pM,

1

manjom od oko 80 pM, manjom od oko 70 pM, manjom od oko 60 pM, manjom od oko 50 pM, manjom od oko 40 pM, manjom od oko 30 pM, manjom od oko 20 pM, manjom od oko 10 pM, manjom od oko 5 pM, manjom od oko 4 pM, manjom od oko 2 pM, manjom od oko 1 pM, manjom od oko 0,5 pM, manjom od oko 0,2 pM, manjom od oko 0,1 pM, ili manjom od oko 0,05 pM, kako je izmereno ogledom rezonance površinskog plazmona.

[0050] Kako je ovde korišćeno, protein vezivanja specifičan za antigen ili domen vezivanja specifičan za antigen "ne veže" na precizirani molekul (npr. "ne veže GDF11", "ne veže BMP9", "ne veže BMP10", itd.) ako protein ili domen vezivanja, kada je testiran za vezivanje na molekul na 25°C u ogledu rezonance površinskog plazmona, ispoljava KD veću od 50,0 nM, ili ne izloži nikakvo vezivanje u takvom ogledu ili njegovom ekvivalentu.

[0051] Pojam "rezonanca površinskog plazmona", kako je ovde korišćeno, se odnosi na optički fenomen koji omogućava analizu interakcija u stvarnom vremenu detektovanjem promena u koncentracijama proteina unutar matrice biosenzora, na primer korišćenjem sistema BIAcore™ (Biacore Life Sciences division of GE Healthcare, Piscataway, NJ).

[0052] Pojam "KD", kako je ovde korišćeno, znači ravnotežna konstanta razdruživanja specifične interakcije protein-protein (npr. interakcija antitelo-antigen). Osim ako nije drugačije naznačeno, ovde opisane KD vrednosti se odnose na KD vrednosti određene ogledom rezonance površinskog plazmona na 25°C.

Antitela i fragmenti vezivanja antigena antitela

[0053] Kako je ovde naznačeno, protein vezivanja specifičan za antigen može obuhvatiti ili sastojati se od antitela ili fragmenta vezivanja antigena nekog antitela. Pored toga, u slučaju da molekuli vezivanja antigena obuhvataju dva različita domena vezivanja specifična za antigen, jedan ili oba domena vezivanja specifična za antigen mogu obuhvatiti ili sastojati se od fragmenta vezivanja antigena nekog antitela.

[0054] Kako je ovde korišćeno, "antitelo koje vezuje aktivin" ili "anti-aktivin A antitelo" uključuje antitela, i njihove fragmente vezivanja antigena, koji vezuju rastvorljivi fragment proteina aktivina A i mogu takođe da se vežu na heterodimer aktivina koji sadrži podjedinicu aktivin βA.

[0055] Pojam "antitelo", kako je ovde korišćen, označava bilo koji molekul koji vezuje antigen ili kompleks molekula koji obuhvata barem jedan region za određivanje komplementarnosti (CDR) koji se specifično veže na ili reaguje sa nekim specifičnim antigenom (npr., aktivin A). Pojam "antitelo" obuhvata molekule imunoglobulina koji

1

obuhvataju četiri lanca polipeptida, dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca koji su međusobno povezani disulfidnim vezama, kao i njihove multimere (npr. IgM). Svaki teški lanac obuhvata promenljivi region teškog lanca (ovde skraćeno kao HCVR ili VH) i konstantni region teškog lanca. Konstantni region teškog lanca obuhvata tri domena, CH1, CH2 i CH3. Svaki laki lanac obuhvata promenljivi region lakog lanca (ovde skraćen kao LCVR ili VL) i konstantni region lakog lanca. Konstantni region lakog lanca obuhvata jedan domen (CL1). Regione promenljivog teškog (VH) i promenljivog lakog (VL) lanca moguće je podpodeliti u regione hiperpromenljivosti, poznate kao regione određivanja komplementarnosti (CDR), koji su ispreplitani sa regionima koji su očuvaniji (stabilniji), pod naslovom okvirni regioni (FR). Svaki promenljivi teški (VH) i promenljivi laki (VL) se sastoji od tri regiona za određivanje komplementarnosti (CDR) i četiri okvirna regiona (FR), raspoređena od amino-terminusa na karboksi terminus u sledećem redosledu: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. U različitim izvođenjima, FR anti-aktivin A antitela (ili njihov deo koji vezuje antigen) mogu biti identični sa humanim sekvencama klicine linije, ili mogu da budu prirodno ili veštački modifikovani. Konsenzus sekvenca aminokiseline može da bude definisana na osnovu uporedne analize dva ili više CDR.

[0056] Pojam "antitelo", kako se ovde koristi, takođe obuhvata fragmente koji vezuju antigen punih molekula antitela. Pojmovi "deo koji vezuje antigen" nekog antitela, "fragment koji vezuje antigen" nekog antitela, i slični, kao se ovde koriste, obuhvataju bilo prirodno nastao, enzimski dobijen, sintetisan, ili genetski projektovan polipeptid ili glikoprotein koji se specifično veže na antigen da bi se formirao kompleks. Fragmenti koji vezuju antigen mogu da budu izvedeni, npr., iz molekula celog antitela koji koriste bilo koje pogodne standardne tehnike kao što je proteolitska razgradnja ili tehnike rekombinantnog genetskog inženjeringa koje obuhvataju manipulaciju i ekspresiju DNK koja kodira promenljive i opciono konstantne domene antitela. Takva DNK je poznata i/ili je lako dostupna iz, npr. komercijalnih izvora, DNK biblioteka (uključujući, npr., biblioteke antitela prikaza faga), ili ih je moguće sintetisati. Tu DNK je moguće sekvencionirati i manipulisati hemijski ili korišćenjem tehnika molekularne biologije, na primer, da se rasporedi jedan ili više promenljivih i/ili konstantnih domena u pogodnu konfiguraciju, ili da se uvedu kodoni, stvore ostaci cisteina, modifikuju, dodaju ili obrišu aminokiseline, itd.

[0057] Neograničavajući primeri fragmenata koji vezuju antigen obuhvataju: (i) Fab fragmenti; (ii) F(ab’)2 fragmenti; (iii) Fd fragmenti; (iv) Fv fragmenti; (v) molekuli jednolančanog Fv (scFv); (vi) dAb fragmenti; i (vii) minimalne jedinice prepoznavanja koje obuhvataju ostatke aminokiseline koji oponašaju hiperpromenljivi region antitela (npr. izolovan region određivanja komplementarnosti (CDR) kao što je CDR3 peptid), ili

1

ograničen FR3-CDR3-FR4 peptid. Drugi projektovani molekuli kao što su za domen specifična antitela specifična, antitela pojedinačnog domena, antitela izbrisanog domena, himerna antitela, CDR kalemljena antitela, diatela, triatela, tetratela, minitela, nanotela (npr. monovalentna nanotela, bivalentna nanotela, itd.), mali modularni imunolekovi (SMIP), i promenljivi IgNAR domeni ajkule, su takođe obuhvaćeni izrazom "fragment koji vezuje antigen," kako se ovde koristi.

[0058] Fragment koji vezuje antigen od nekog antitela će uobičajeno obuhvatiti barem jedan promenljiv domen. Promenljivi domen može da bude bilo koje veličine ili sastava aminokiseline i generalno će obuhvatiti barem jedan CDR koji je susedan ili u okviru sa jednom ili više okvirnih sekvenci. Kod fragmenata koji vezuju antigen sa VH domenom povezanim sa VL domenom, VH i VL domeni mogu biti smešteni u odnosu jedan prema drugom u bilo kom pogodnom rasporedu. Na primer, promenljivi region moguće biti dimerni i sadržati VH-VH, VH-VL ili VL-VL dimere. Alternativno, fragment koji vezuje antigen nekog antitela može obuhvatiti monomerni VH ili VL domen.

[0059] Fragment koji vezuje antigen nekog antitela može obuhvatiti barem jedan promenljivi domen kovalentno povezan na barem jedan konstantni domen. Neograničavajući, primeri konfiguracija promenljivih konstantnih domena koje je moguće naći unutar fragmenta vezivanja antigena nekog antitela uključuju: (i) VH-CH1; (ii) VH-CH2; (iii) VH-CH3; (iv) VH-CH1-CH2; (v) VH-CH1-CH2-CH3; (vi) VH-CH2-CH3; (vii) VH-CL; (viii) VL-CH1; (ix) VL-CH2; (x) VL-CH3; (xi) VL-CH1-CH2; (xii) VL-CH1-CH2-CH3; (xiii) VL-CH2-CH3; i (xiv) VL-CL. U bilo kojoj konfiguraciji i konstantnim domenima, uključujući bilo koju od konfiguracija navedenih gore uzetih kao primer, promenljivi i konstantni domeni mogu biti bilo direktno povezani jedan na drugi ili mogu biti povezani putem potpunog ili delimičnog zglobnog (hinge) regiona ili vezujućeg (linker) regiona. Zglobni region može obuhvatiti barem 2 (npr.5, 10, 15, 20, 40, 60 ili više) aminokiselina koje daju kao rezultat fleksibilnu ili polufleksibilnu vezu između susednih promenljivih i/ili konstantnih domena u pojedinačnom molekulu polipeptida. Pored toga, fragment vezivanja antigena nekog antitela može obuhvatiti homodimer ili heterodimer (ili drugi multimer) iz bilo koje od konfiguracija promenljivog i konstantnog domena je naveden gore u tekstu u nekovalentnom udruživanju jednog sa drugim i/ili sa jednim ili više monomernih promenljivih teških (VH) domena ili promenljivih lakih (VL) domena (npr. disulfidnom vezom(a)).

[0060] Kako kod celih molekula antitela, fragmenti koji vezuju antigen mogu biti monospecifični ili multispecifični (npr. bispecifični). Višestruko specifičan fragment antitela koji vezuje antigen će obično obuhvatiti barem dva različita promenljiva domena, pri čemu je svaki promenljivi domen sposoban da se specifično vezuje na odvojeni antigen ili na

1

drugačiji epitop istog antigena. Bilo koji višespecifičan format antitela, uključujući primere bispecifičnih ovde opisanih formata antitela, moguće je prilagoditi za upotrebu u kontekstu fragmenta koji vezuje antigen antitela iz ovog pronalaska korišćenjem rutinskih tehnika dostupnih u ovoj oblasti.

[0061] Antitela iz ovog pronalaska mogu da funkcionišu kroz citotoksičnost zavisnu od komplementa (CDC) ili od antitela zavisnu ćelijski posredovanu citotoksičnost (ADCC). "Citotoksičnost zavisna od komplementa" (CDC) se odnosi na lizu ćelija sa ekspresijom antigena putem antitela iz ovog pronalaska u prisustvu komplementa. "Citotoksičnost posredovana ćelijom zavisna od antitela" (ADCC) se odnosi na reakciju posredovanu ćelijom u kojoj nespecifične citotoksične ćelije sa ekspresijom Fc receptora (FcRs) (npr. ćelije prirodne ubice (NK), neutrofili, i makrofagi) prepoznaju vezano antitelo na ciljnoj ćeliji i time dovode do lize ciljne ćelije. CDC i ADCC mogu biti izmereni upotrebom ogleda koji su dobro poznati i dostupni u ovoj oblasti. (Videti, npr., U.S. brojeve patenata 5,500,362 i 5,821,337, i rad Klajnsa i saradnika (Clynes et al., PNAS USA 95:652-656 (1998))). Konstantni region antitela je važan u sposobnosti antitela da fiksira komplement i posreduje citotoksičnost zavisnu od ćelije. Dakle, izotip antitela moguće je izabrati na bazi toga da li je, da bi posredovao citotoksičnost, poželjan za to antitelo.

[0062] U izvesnim izvođenjima ovog pronalaska, antitela anti-aktivina A iz ovog pronalaska su humana antitela. Pojam "humano antitelo", kako se ovde koristi, je predviđeno da obuhvata antitela koja imaju promenljive i konstantne regione izvedene iz humanih sekvenci imunoglobulina klicine linije. Humana antitela iz ovog pronalaska mogu obuhvatiti ostatke aminokiseline koji nisu kodirani sekvencama imunoglobulina humane klicine linije (npr. mutacije uvedene nasumičnom ili za mesto specifičnom mutagenezom in vitro ili somatskom mutacijom in vivo), na primer u CDR i posebno CDR3. Međutim, pojam "humano antitelo", kako se ovde koristi, nije predviđen da obuhvati antitela u kojima su CDR sekvence izvedene iz klicine linije ili drugih vrsta sisara, kao što je miš, su nakalemljene na humane okvirne sekvence čoveka.

[0063] Antitela iz ovog pronalaska mogu, u nekim izvođenjima, da budu rekombinantna humana antitela. Pojam "rekombinantno humano antitelo", kako je ovde korišćeno, je predviđen da uključi sva humana antitela koja se pripremaju, eksprimuju, stvaraju ili izoluju pomoću rekombinantnih sredstava, kao što su antitela eksprimovana korišćenjem rekombinantnih vektora ekspresije transfektovanih u ćeliju domaćina (kako je opisano detaljnije dole u tekstu), antitela su izolovana iz rekombinantne, kombinatorne biblioteke humanih antitela (detaljnije opisano dole u tekstu), antitela su izolovana iz životinje (npr., miša) koji je transgenski za humane gene imunoglobulina (videti npr. rad Tejlora i

1

saradnika (Taylor et al., Nucl Acids Res 20:6287-6295 (1992))) ili antitela pripremljenih, eksprimovanih, stvorenih ili izolovanih bilo kojim drugim načinima koja uključuju splajsovanje humanih sekvenci gena imunoglobulina na druge DNK sekvence. Takva rekombinantna humana antitela imaju promenljive i konstantne regione izvedene iz humanih sekvenci imunoglobulina klicine linije. U izvesnim izvođenjima, međutim, takva rekombinantna humana antitela se izlažu in vitro mutagenezi (ili, kada se koristi životinja transgenska za humane Ig sekvence, in vivo somatska mutageneza) i samim tim sekvence aminokiseline promenljivih teških (VH) i promenljivih lakih (VL) regiona rekombinantnih antitela su sekvence koje, iako su izvedene iz i srodne su humanim promenljivih teškim (VH) i promenljivim lakim (VL) sekvencama klicine linije, ne moraju prirodno da postoje unutar humanog repertoara klicine linije antitela in vivo.

[0064] Humana antitela mogu da postoje u dva oblika koji se povezuju sa heterogenošću zgloba. U jednom obliku, molekul imunoglobulina obuhvata stabilni konstrukt četiri lanca od približno 150-160 kDa u kom se dimeri drže zajedno putem međulančane disulfidne veze teškog lanca. U drugom obliku, dimeri koji nisu povezani preko međulančanih disulfidnih veza i molekul od oko 75-80 kDa se formira sastavljen od kovalentno spojenog lakog i teškog lanca (poluantitelo). Ove oblike nije previše teško odvojiti, čak ni posle afinitetnog prečišćavanja.

[0065] Usled strukturnih razlika povezanih sa izotipom regiona zgloba od tog antitela se javlja učestalost pojave drugog oblika u različitim nedirnutim IgG izotipima, ali bez ograničenja. Supstitucija pojedinačne aminokiseline u zglobnom regionu humanog IgG4 zgloba može značajno da smanji izgled drugog oblika (Angal et al. Molecular Immunology 30:105 1993)) do nivoa koji se najčešće primećuju korišćenjem humanog IgG1 zgloba. Ovaj pronalazak obuhvata antitela koja imaju jednu ili više mutacija u zglobu, CH2 ili CH3 region koji može biti poželjan, na primer, za proizvodnju, da bi se poboljšao prinos željenog oblika antitela.

[0066] Antitela iz ovog pronalaska su izolovana antitela. Kako se ovde koristi, "izolovano antitelo" znači antitelo koje je identifikovano i odvojeno i/ili oporavljeno iz barem jedne komponente svog prirodnog okruženja. Na primer, antitelo koje je odvojeno ili uklonjeno iz barem jedne komponente organizma, ili iz tkiva ili ćelije u kom to antitelo prirodno postoji ili je prirodno proizvedeno, je "izolovano antitelo" za potrebe ovog pronalaska. Izolovano antitelo takođe obuhvata antitelo in situ unutar rekombinantne ćelije. Izolovana antitela su antitela koja su podvrgnuta barem jednom koraku prečišćavanja ili izolacije. Prema izvesnim izvođenjima, izolovano antitelo može biti pretežno bez drugog ćelijskog materijala i/ili hemikalija.

2

[0067] Ovaj pronalazak uključuje neutrališuća i/ili blokirajuća anti-aktivin A antitela. "neutrališuće" ili "blokirajuće" antitelo, kako je ovde korišćeno, je predviđeno da se odnosi na antitelo čije vezivanje na aktivin A: (i) ometa interakciju između aktivina A i receptora aktivina A (npr. receptor aktivina tip IIA, receptor aktivina tip IIB, receptor aktivina tip I, itd.); (ii) ometa formiranje kompleksa receptora aktivin-aktivin; i/ili (iii) daje kao rezultat inhibiranje najmanje jedne biološke funkcije aktivina A. Inhibicija prouzrokovana neutrališućim ili blokirajućim antitelom atkivina A ne mora da se završi dokle god je moguće detektovati korišćenje odgovarajućeg ogleda. Primeri ogleda za detektovanje inhibicije aktivina A su opisani ovde u tekstu u Primerima razrade.

[0068] Ovde opisana antitela anti-aktivina A mogu da obuhvate jednu ili više supstitucija aminokiseline, umetaka i/ili delecija u okviru i/ili CDR regionima promenljivih domena teškog i lakog lanca kada se uporedi sa odgovarajućim sekvencama klicine linije iz koje su antitela izvedena. Takve mutacije mogu biti lako ustanovljene upoređivanjem sekvenci aminokiseline opisanih ovde sa sekvencama linije klice koje su dostupne iz, na primer, javno dostupnih baza podataka sekvenci antitela. Ovaj opis uključuje antitela, i njihove fragmente koji vezuju antigen, koji su izvedeni iz bilo koje od ovde opisanih sekvenci aminokiseline, pri čemu jedna ili više aminokiselina unutar jednog ili više okvira i/ili CDR regiona mutira u odgovarajući ostatak sekvence klicine linije iz koje je to antitelo izvedeno, ili na odgovarajućem ostatku druge humane sekvence klicine linije, ili na konzervativnoj supstituciji aminokiseline odgovarajućih ostataka klicine linije (takve promene sekvence se pominju ovde kolektivno kao "mutacije klicine linije"). Prosečan stručnjak u ovoj oblasti, počevši od ovde opisanih sekvenci promenljivog regiona teškog i lakog lanca, može lako da proizvede brojna antitela i fragmente koji vežu antigen koji obuhvataju jednu ili više pojedinačnih mutacija klicine linije ili njihove kombinacije. U izvesnim izvođenjima, svi od okvirnih i/ili CDR ostataka unutar domena VH i/ili VL mutiraju nazad u ostatke pronađene u originalnoj sekvenci linije klice iz koje je to antitelo izvedeno. U drugim izvođenjima, samo izvesni ostaci su mutirali povratno u originalnu sekvencu klicine linije, npr., samo mutirani ostaci pronađeni unutar prvih 8 aminokiselina FR1 ili unutar poslednjih 8 aminokiselina FR4, ili samo mutirani ostaci pronađeni unutar CDR1, CDR2 ili CDR3. U drugim izvođenjima, jedan ili više od okvira i/ili CDR ostataka mutira u odgovarajuće ostatke različite sekvence linije klice (tj. sekvencu linije klice koja je drugačija od sekvence linije klice iz koje je antitelo originalno izvedeno). Pored toga, ta antitela iz ovog opisa mogu da obuhvate bilo koju kombinaciju od dve ili više mutacija linije klice unutar okvira i/ili CDR regiona, npr., pri čemu su izvesni pojedinačni ostaci mutirani u odgovarajući ostatak specifične sekvence linije klice pri čemu se zadržavaju izvesni drugi ostaci koji se razlikuju od originalne sekvence linije klice ili se mutiraju u odgovarajući ostatak drugačije sekvence linije klice. Pošto se dobiju, antitela, i fragmente koji vezuju antigen koji obuhvataju jednu ili više mutacija linije klice moguće je lako ispitati na jedno ili više željeno svojstvo kao što je, poboljšana specifičnost vezivanja, povećan afinitet vezivanja, poboljšana ili pospešena antagonistička biološka svojstva (kao što može biti slučaj), smanjenu imunogenost, itd. antitela i fragmenti vezivanja antigena dobijeni na ovaj opšti način su obuhvaćeni ovim ovde opisom.

[0069] Ovaj opis takođe obuhvata antitela anti- Aktivin A koja obuhvataju varijante ovde opisanih HCVR, LCVR, i/ili CDR sekvenci aminokiseline koji imaju jednu ili više konzervativnih supstitucija. Na primer, ovaj opis obuhvata anti-aktivin A antitela koja imaju HCVR, LCVR, i/ili CDR sekvence aminokiseline sa, npr., 10 ili manje, 8 ili manje, 6 ili manje, 4 ili manje, itd. konzervativnih supstitucija aminokiseline u odnosu na bilo koju od ovde opisanih sekvenci aminokiseline HCVR, LCVR, i/ili CDR.

[0070] Pojam "epitop" se odnosi na antigeni determinant koji je u interakciji sa specifičnim mestom za vezivanje antigena u promenljivom regionu molekula antitela poznatom kao paratop. Pojedinačni antigen može imati više od jednog epitopa. Dakle, različita antitela mogu da se vezuju na različita područja na antigen i mogu imati različita biološka dejstva. Epitopi mogu biti bilo konformacioni ili linearni. Konformacioni epitop je proizveden pomoću prostorno suprotstavljenih aminokiselina iz različitih segmenata linearno polipeptidnog lanca. Linearni epitop je proizveden putem susednih ostataka aminokiseline u polipeptidnom lancu. U izvesnim okolonostima, epitop može obuhvatiti delove saharida, fosforili grupa, ili sulfonil grupa antigena.

[0071] Pojam "značajna identičnost" ili "značajno identično," kada se odnosi na nukleinsku kiselinu ili njen fragment, označava da, kada se optimalno poravna sa odgovarajućim umecima ili delecijama nukleotida sa drugom nukleinskom kiselinom (ili njenim komplementarnim lancem), postoji identičnost sekvence nukleotida u barem oko 95%, ili poželjnije barem oko 96%, 97%, 98% ili 99% baza nukleotida, mereno poznatim algoritmom identičnosti sekvence kao što je FASTA, BLAST ili Gap, kako je razmatrano dole u tekstu. Molekul nukleinske kiseline koji ima pretežnu identičnost sa referentnim molekulom nukleinske kiseline može, u izvesnim primerima, da kodira polipetid koji ima istu ili pretežno sličnu sekvencu aminokiseline kao što je polipeptid kodiran referentnim molekulom nukleinske kiseline.

[0072] Kada se primenjuje na polipeptide, pojam "pretežna sličnost" ili "pretežno slično " znači da dve sekvence peptida, kada su optimalno poravnate, kao što je putem programa GAP ili BESTFIT korišćenjem težina zadatih praznina, dele barem 95% identičnost sekvence, i još poželjnije barem 98% ili 99% identičnost sekvence. Preporučljivo, pozicije ostataka koje nisu identične se razlikuju konzervativnim supstitucijama aminokiseline. "Konzervativna supstitucija aminoksieline" je ona kod koje je ostatak aminokiseline supstituisan drugim ostatkom aminokiseline sa bočnim lancem (R grupa) sa veoma sličnim hemijskim svojstvima (npr. naelektrisanje ili hidrofobnost). Generalno, konzervativna supstitucija aminokiseline neće u znatnoj meri promeniti funkcionalna svojstva nekog proteina. U slučajevima gde se dve ili više sekvenci aminoksieline razlikuju jedna od druge konzervativnim supstitucijama, procentom ili stepenom identičnosti sekvence može biti podešen prema gore da bi se izvršila korekcija zbog konzervativne prirode supstitucije. Načini da se ova podešavanja izvedu su dobro poznati stručnjaku u ovoj oblasti. Videti, npr. Pearson, W.R., Methods Mol Biol 24: 307-331 (1994). Primeri grupa aminokiselina koje imaju bočne lance sa sličnim hemijskim svojstvima obuhvataju 1) alifatne bočne lance: glicin, alanin, valin, leucin i izoleucin; 2) alifatne hidroksilne bočne lance: serin i treonin; 3) bočne lance koji sadrže amid; 4) aromatične bočne lance: fenilalanin, tirozin, i triptofan; 5) bazne bočne lance: lizin, arginin, i histidin; 6) kiselinske bočne lance: aspartat i glutamat, i 7) bočne lance koji obuhvataju sumpor: cistein i metionin. Preporučene konzervativne supstitucione grupe aminokiseline su: valin-leucin-izoleucin, fenilalanintirozin, lizin-arginin, alanin-valin, glutamat-aspartat, i asparagin-glutamin. Alternativno, konzervativna zamena je bilo koja promena koja ima pozitivnu vrednost u PAM250 log matrici verovatnoće što su opisali Gonnet et al. Science 256: 1443-1445 (1992). "Umereno konzervativna" zamena je bilo koja promena koja ima ne-negativnu vrednost u PAM250 log matrici verovatnoće.

[0073] Sličnost sekvence za polipeptide, koja se takođe pominje kao identičnost sekvence, se obično meri korišćenjem softvera za analizu sekvence. Softver za analizu proteina odgovara sličnim sekvencama korišćenjem merenja sličnosti dodeljeno različitim supstitucijama, brisanjima i drugim modifikacijama, uključujući konzervativne supstitucije aminokiseline. Na primer, GCG softver koji sadrži programe kao što je Gap i Bestfit koje je moguće koristiti sa zadatim parametrima da bi se utvrdila homologija sekvence ili identičnost sekvence između blisko srodnih polipeptida, kao što su homologni polipeptidi iz različitih vrsta ili organizama ili između proteina divljeg tipa njegovog muteina. Videti, npr. GCG Version 6.1. Sekvencu polipeptida je takođe moguće uporediti korišćenjem FASTA sa zadatim ili preporučenim parametrima, programom u GCG verziji 6.1. FASTA (npr., FASTA2 i FASTA3) obezbeđuje poravnanja i procenat identičnosti sekvence regiona najboljeg preklapanja između sekvenci upita i pretraživanja (videti, npr. Pearson, W.R., Methods Mol Biol 132: 185-219 (2000)). Još jedan preporučeni algoritam kada se uporedi sekvenca iz ovog opisa sa bazom podataka koja obuhvata veliki broj sekvenci iz različitih

2

organizama je računarski program BLAST, posebno BLASTP ili TBLASTN, korišćenjem zadatih parametara. Videti, npr., rad Altšula i saradnika (Altschul et al., J Mol Biol 215:403-410 (1990)) i rad Altšula i saradnika (Altschul et al., Nucleic Acids Res 25:3389-402 (1997)).

Biološke karakteristike antitela

[0074] Ovaj opis uključuje anti-aktivin A antitela i njihove fragmente koji vezuju antigen koji vezuju aktivin A sa visokim afinitetom. Na primer, ovaj opis uključuje antitela i fragmente vezivanja antigena antitela koja vezuju aktivin A (npr., na 25°C ili 37°C) sa KD od manje od oko 30 nM kako je izmereno rezonancom površinskog plazmona, npr., korišćenjem formata ogleda kako je definisano ovde u Primeru 3. U izvesnim izvođenjima, antitela ili fragmenti vezivanja antigena iz ovog opisa vezuju aktivin A sa KD od manje od oko 25 nM, manje od oko 20 nM, manje od oko 15 nM, manje od oko 10 nM, manje od oko 5 nM, manje od oko 2 nM, manje od oko 1 nM, manje od oko 500 pM, manje od oko 250 pM, manje od oko 240 pM, manje od oko 230 pM, manje od oko 220 pM, manje od oko 210 pM, manje od oko 200 pM, manje od oko 190 pM, manje od oko 180 pM, manje od oko 170 pM, manje od oko 160 pM, manje od oko 150 pM, manje od oko 140 pM, manje od oko 130 pM, manje od oko 120 pM, manje od oko 110 pM, manje od oko 100 pM, manje od oko 95 pM, manje od oko 90 pM, manje od oko 85 pM, manje od oko 80 pM, manje od oko 75 pM, manje od oko 70 pM, manje od oko 65 pM, manje od oko 60 pM, manje od oko 55 pM, manje od oko 50 pM, manje od oko 45 pM, manje od oko 40 pM, manje od oko 35 pM, manje od oko 30 pM, manje od oko 25 pM, manje od oko 20 pM, manje od oko 15 pM, manje od oko 10 pM, manje od oko 9 pM, manje od oko 8 pM, manje od oko 7 pM, manje od oko 6 pM, manje od oko 5 pM, manje od oko 4 pM, ili manje od oko 3 pM, kako je izmereno rezonancom površinskog plazmona, npr. korišćenjem formata ogleda kako je definisano u Primeru 3 ovde u tekstu ili pretežno sličnom ogledu.

[0075] Ovaj pronalazak takođe uključuje anti-aktivin A antitela i njihove fragmente vezivanja antigena koji inhibiraju aktivinom A posredovano ćelijsko signaliziranje. Na primer, ovaj pronalazak uključuje anti-aktivin A antitela koja inhibiraju aktivaciju SMAD kompleksa putanje prenosa signala preko vezivanja aktivina A na receptore aktivina tip I ili II sa IC50 vrednošću manjom od oko 4 nM, kako je izmereno u bioogledu blokiranja zasnovanom na ćeliji, npr., korišćenjem formata ogleda kako je definisano u Primeru 6 ovde u tekstu, ili u pretežno sličnom ogledu. U izvesnim izvođenjima, antitela ili fragmenti vezivanja antigena iz ovog pronalaska inhibiraju aktivaciju SMAD kompleksa putanje prenosa signala preko vezivanja aktivina A na receptore aktivina tip I ili II sa IC50 vrednošću od manje od oko 3nM, manje od oko 2 nM, manje od oko 1 nm, manje od oko 500 pM, manje od oko 250 pM, manje od oko 240 pM, manje od oko 230 pM, manje od oko 220 pM, manje od oko 210 pM, manje od oko 200 pM, manje od oko 190 pM, manje od oko 180 pM, manje od oko 170 pM, manje od oko 160 pM, manje od oko 150 pM, manje od oko 140 pM, manje od oko 130 pM, manje od oko 120 pM, manje od oko 110 pM, manje od oko 100 pM, manje od oko 95 pM, manje od oko 90 pM, manje od oko 85 pM, manje od oko 80 pM, manje od oko 75 pM, manje od oko 70 pM, manje od oko 65 pM, manje od oko 60 pM, manje od oko 55 pM, manje od oko 50 pM, manje od oko 49 pM, manje od oko 48 pM, manje od oko 47 pM, manje od oko 46 pM, manje od oko 45 pM, manje od oko 44 pM, manje od oko 43 pM, manje od oko 42 pM, manje od oko 41 pM, manje od oko 40 pM, ili manje od oko 39 pM, kako je izmereno u bioogledu blokiranja na bazi ćelije, npr., korišćenjem formata ogleda kako je definisano ovde u Primeru 6, ili pretežno sličnom ogledu. U izvesnim izvođenjima, antitela ili fragmenti vezivanja antigena iz ovog pronalaska inhibiraju aktiviranje signaliziranja aktivina B ometanjem sa vezivanjem aktivina B na receptore aktivina tipa I ili II sa IC50 vrednošću manjom od oko 50 nM, manjom od oko 20 nM, manjom od oko 10 nm, manje od oko 5 nM, ili manjom od oko 1 nM, kao što je izmereno u bioogledu blokiranja na bazi ćelije, npr., korišćenjem formata ogleda kao što je definisano u Primeru 6 ovde, ili pretežno sličnom ogledu. U izvesnim izvođenjima, antitela ili fragmenti vezivanja antigena iz ovog pronalaska inhibiraju aktivaciju SMAD kompleksa putanje prenosa signala preko vezivanja aktivina AB na receptora aktivina tip I ili II sa IC50 vrednošću od manje od oko 500 pM, manje od oko 450 pM, manje od oko 440 pM, manje od oko 430 pM, manje od oko 420 pM, manje od oko 410 pM, manje od oko 400 pM, manje od oko 390 pM, manje od oko 380 pM, manje od oko 370 pM, manje od oko 360 pM, manje od oko 350 pM, manje od oko 340 pM, manje od oko 320 pM, manje od oko 310 pM, manje od oko 300 pM, manje od oko 290 pM, manje od oko 280 pM, manje od oko 270 pM, manje od oko 260 pM, manje od oko 250 pM, manje od oko 240 pM, manje od oko 230 pM, manje od oko 220 pM, manje od oko 210 pM, manje od oko 200 pM, manje od oko 190 pM, manje od oko 180 pM, manje od oko 170 pM, manje od oko 160 pM, manje od oko 150 pM, ili manje od oko 140 pM, kao što je izmereno u bioogledu blokiranja zasnovanom na ćeliji, npr. korišćenjem formata ogleda kako je definisano u Primeru 6 ovde u tekstu, ili pretežno sličnom ogledu. U izvesnim izvođenjima, antitela ili fragmenti vezivanja antigena iz ovog pronalaska inhibiraju aktivaciju SMAD kompleksa putanje prenosa signala preko vezivanja aktivina AC na receptore aktivina tip I ili II sa IC50 vrednošću od manje od oko 1 nM, manje od oko 900 pM, manje od oko 800 pM, manje od oko 750 pM, manje od oko 700 pM, manje od oko 650 pM, manje

2

od oko 600 pM, ili manje od oko 580 pM, kao što je izmereno u bioogledu blokiranja zasnovanom na ćeliji, npr. korišćenjem formata ogleda kao što je definisano u Primeru 6 ovde u tekstu, ili pretežno sličnom ogledu.

[0076] Antitela iz ovog opisa mogu da poseduju jednu ili više od gore pomenutih bioloških karakteristika, ili bilo koju kombinaciju tih karakteristika. Druge biološke karakteristike antitela iz ovog pronalaska će biti očigledne prosečnom stručnjaku u ovoj oblasti iz prikaza ovog opisa uključujući i ovde date Primere razrade.

Anti-aktivin A antitela koja obuhvataju Fc varijante

[0077] Prema izvesnim izvođenjima ovog pronalaska, obezbeđuju se anti-aktivin A antitela koja obuhvataju Fc domen koji obuhvata jednu ili više mutacija koje pospešuju ili smanjuju vezivanje antitela na FcRn receptor, npr. pri pH vrednosti na nivou kiseline u poređenju sa neutralnom pH. Na primer, ovaj pronalazak obuhvata anti-aktivin A antitela koja obuhvataju mutaciju u CH2 ili CH3 regionu Fc domena, pri čemu ta mutacija(e) povećava afinitet Fc domena na FcRn u okruženju koje ima pH vrednost kiseline (npr. u endozomu pri čemu su pH opsezi od oko 5,5 do oko 6,0). Takve mutacije mogu kao rezultat da daju povećanje poluveka trajanja u serumu kada se isporuče životinji. Neograničavajući primeri takvih Fc modifikacija obuhvataju, npr. modifikaciju na poziciji 250 (npr., E ili Q); 250 i 428 (npr., L ili F); 252 (npr., L/Y/F/W ili T), 254 (npr., S ili T), i 256 (npr., S/R/Q/E/D ili T); ili modifikaciju na poziciji 428 i/ili 433 (npr., H/L/R/S/P/Q ili K) i/ili 434 (npr., A, W, H, F ili Y [N434A, N434W, N434H, N434F ili N434Y]); ili modifikaciju na poziciji 250 i/ili 428; ili modifikaciju na poziciji 307 ili 308 (npr. 308F, V308F), i 434. U jednom izvođenju, modifikacija obuhvata 428L (npr. M428L) i 434S (npr. N434S) modifikaciju; 428L, 259I (npr. V259I), i 308F (npr. V308F) modifikaciju; 433K (npr. H433K) i 434 (npr. 434Y) modifikaciju; 252, 254, i256 (npr. 252Y, 254T, i256E) modifikaciju; 250Q i 428L modifikaciju (npr. T250Q i M428L); i 307 i/ili 308 modifikaciju (npr. 308F ili 308P). U još jednom izvođenju, modifikacija obuhvata 265A (npr. D265A) i/ili 297A (npr. N297A) modifikaciju.

[0078] Na primer, ovaj pronalazak uključuje anti-aktivin A antitela koja obuhvataju Fc domen koji obuhvata jedan ili više parova ili grupa mutacija izabranih iz grupe koja obuhvata: 250Q i 248L (npr. T250Q i M248L); 252Y, 254T i 256E (npr. M252Y, S254T i T256E); 428L i 434S (npr. M428L i N434S); 2571 i 3111 (npr. P257I i Q3111); 2571 i 434H (npr. P257I i N434H); 376V i 434H (npr. D376V i N434H); 307A, 380A i 434A (npr. T307A, E380A i N434A); i 433K i 434F (npr. H433K i N434F). Sve moguće kombinacije gore

2

navedenih mutacija Fc domena, i druge mutacije unutar ovde opisanih promenljivih domena antitela, se smatraju obuhvaćene obimom ovog pronalaska.

[0079] Ovaj pronalazak takođe uključuje anti-aktivin A antitela koja obuhvataju himerni konstantni region teškog lanca (CH), pri čemu himerni region teškog lanca (CH) obuhvata segmente izvedene iz regiona teškog lanca (CH) od više od jednog izotipa imunoglobulina. Na primer, antitela iz ovog pronalaska mogu obuhvatiti himerni region teškog lanca (CH) koji obuhvata deo ili sve što je od domena teškog lanca 2 (CH2) izvedeno iz humanog IgG1, human IgG2 ili humanog IgG4 molekula, kombinovano sa delom ili svim što je od domena teškog lanca 3 (CH3) izvedeno iz humanog IgG1, humanog IgG2 ili humanog IgG4 molekula. Prema izvesnim izvođenjima, antitela iz ovog pronalaska obuhvataju himerni region teškog lanca (CH) koji ima himerni region zgloba. Na primer, himerni zglob može obuhvatiti "gornji zglob" sekvence aminokiseline (ostaci aminokiseline iz pozicija 216 do 227 prema EU numeraciji) izvedeni iz humanog IgG1, humanog IgG2 ili humanog IgG4 regiona zgloba, kombinovano sa sekvencom "donjeg zgloba" (ostaci aminokiseline iz pozicija 228 do 236 prema EU numeraciji) izvedeni iz humanog IgG1, humanog IgG2 ili humanog human IgG4 regiona zgloba. Prema izvesnim izvođenjima, himerni region zgloba obuhvata ostatke aminokiseline izvedene iz humanog IgG1 ili humanog IgG4 gornjeg zgloba i ostatke aminokiseline izvedene iz humanog IgG2 donjeg zgloba. Antitelo koje obuhvata himerni CH region kao što je ovde opisano može, u izvesnim izvođenjima, da ispolji modifikovane funkcije Fc efektora a da ne utiče neželjeno na terapijska ili farmakokinetička svojstva tog antitela. (Videti, npr., U.S. privremenu prijavu. br.

61/759,578, podnetu 1. februara 2013.).

Mapiranje epitopa i srodne tehnologije

[0080] Ovaj opis uključuje anti-aktivin A antitela koja reaguju međusobno sa jednom ili više aminokiselina pronađenih unutar aktivina A (npr. unutar mesta vezivanja receptora aktivina tip II). Epitop na koji se antitela vezuju može obuhvatiti jednu dodirnu sekvencu od 3 ili više (npr., 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ili više) aminokiselina smeštenih unutar podjedinice aktivina βA. Alternativno, epitop može da se sastoji od više nedodirnih aminokiselina (ili sekvenci aminokiselina) smeštenih unutar dimera aktivina A.

[0081] Različite tehnike poznate osobama prosečne stručnosti u ovoj oblasti moguće je koristiti da bi se odredilo da li je neko antitelo "u interakciji sa jednom ili više aminokiselina"

2

unutar polipeptida ili proteina. Primeri tehnika obuhvataju, npr., rutinski ogled unakrsnog blokiranja kao što je to opisano u Antitela, Harlo i Lein (Antibodies, Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY)), alanin analizi za skeniranje mutacije, analize blotova peptida (Reineke (Rajneke), Methods Mol Biol 248:443-463 (2004)), i analiza cepanja peptida. Pored toga, mogu biti korišćeni postupci kao što je ekscizija epitopa, ekstrakcija epitopa i hemijska modifikacija antigena (Tomer, Protein Science 9: 487-496 (2000)). Drugi postupak koji je moguće koristiti da bi se identifikovale aminokiseline unutar polipeptida sa kojima antitelo reaguje međusobno je izmena vodonika/deuterijuma koja je detektovana masenom spektrometrijom. U opštem smislu, izmena vodonika/deuterijuma obuhvata označavanje deuterijumom proteina od interesa, posle čega sledi vezivanje antitela na protein označen deuterijumom. Dalje, kompleks protein/antitelo se prenosi na vodu da bi se omogućilo da dođe do izmene vodonikadeuterijuma na svim ostacima izuzev za ostatke zaštićene antitelom (koji preostanu označeni kao deuterijum). Posle razdruživanja antitela, ciljni protein se podvrgava cepanju proteazom i analizi masenom spektrometrijom, pri čemu se otkriva da ostaci označeni deutrijumom koji odgovaraju specifičnim aminokiselinama sa kojima antitelo međusobno reaguje. Videti, npr. Ehring Analytical Biochemistry 267(2):252-259 (1999); Engen and Smith (2001) Anal. Chem.73:256A-265A (2001).

[0082] Ovaj pronalazak obuhvata još i anti-aktivin A antitela koja se vezuju na isti epitop kao bilo koja od ovde opisanih specifičnih za primer uzetih antitela (npr., H4H10423P, H4H10424P, H4H10426P, H4H10429P, H4H10430P, H4H10432P2, H4H10433P2, H4H10436P2, H4H10437P2, H4H10438P2, H4H10440P2, H4H10442P2, H4H10445P2, H4H10446P2, H4H10447P2, H4H10448P2, H4H10452P2, H4H10468P2, H2aM10965N, itd.). Takođe, ovaj opis takođe uključuje anti-aktivin A antitela koja se takmiče za vezivanje na aktivin A sa bilo kojim od ovde opisanih specifičnih za primer uzetih antitela (npr. H4H10423P, H4H10424P, H4H10426P, H4H10429P, H4H10430P, H4H10432P2, H4H10433P2, H4H10436P2, H4H10437P2, H4H10438P2, H4H10440P2, H4H10442P2, H4H10445P2, H4H10446P2, H4H10447P2, H4H10448P2, H4H10452P2, H4H10468P2, H2aM10965N, itd.). Na primer, ovaj opis uključuje anti-aktivin A antitela koja se međusobno takmiče za vezivanje na aktivin A sa jednim ili više antitela iz "Bin 1" kao što je definisano u Primeru 5 ovde (npr. H4H10423P, H4H10446P2, H4H10468P2 i H4H10442P2). Ovaj opis još uključuje anti-aktivin A antitela koja se međusobno takmiče za vezivanje na aktivin A sa jednim ili više antitela iz "Bin 2" kao što je definisano u Primeru 5 ovde (npr. H4H10429, H4H10430P, H4H10432P2, H4H10436P2, i H4H10440P2).

[0083] Stručnjak može lako da utvrdi da li se antitelo vezuje na isti epitop, ili se takmiči za

2

vezivanje sa, referentnim anti-aktivin A antitelom upotrebom rutinskih metoda poznatih u ovoj oblasti i datih ovde kao primer. Na primer, da bi se odredilo da li se antitelo koje se testira vezuje na isti epitop kao referenca na anti-aktivin A antitelo iz ovog pronalaska, referentnom antitelu je omogućeno da se veže na aktivin A (ili βA heterodimer koji sadrži podjedinicu). Dalje, procenjivana je sposobnost antitiela koje se testira da se veže na aktivin A molekul. Ako antitelo koje se testira može da se veže na Aktivin A posle vezivanja saturacijom sa referencom na anti-aktivin A antitelo, može se zaključiti da se to testirano antitelo veže na drugačiji epitop nego što je referentno anti-aktivin A antitelo. Sa druge strane, ako antitelo koje se testira nije u mogućnosti da se veže na aktivin A posle saturacionog vezivanja sa referentnim anti-aktivin A antitelom, onda antitelo koje se testira može da se veže na isti epitop kao što je epitop vezan referentnim anti-aktivin A antitelom iz ovog pronalaska. Dodatno rutinsko eksperimentisanje (npr., analize mutacije peptida i vezivanja) mogu zatim da budu izvedeni da bi se potvrdilo da li će primećen nedostatak vezivanja testiranog antitela zapravo da bude usled vezivanja na isti epitop kao referentno antitelo ili da li je sterno blokiranje (ili drugi fenomen) odgovoran za izostanak primećenog vezivanja. Eksperimente ove vrste je moguće izvesti korišćenjem ELISA, RIA, Biacore, protočne citometrije ili bilo kog drugog kvantitativnog ili kvalitativnog ogleda koji veže antitelo dostupno u ovoj oblasti. U skladu sa izvesnim izvođenjima ovog opisa, dva antitela se vezuju na isti (ili preklapajući) epitop ako, npr., 1-, 5-, 10-, 20- ili 100-struko prekoračenje jednog antitela inhibira vezivanje drugog putem barem 50% ali preporučljivo 75%, 90% ili čak 99% kako se meri u ogledu konkurentnog vezivanja (videti, npr. Junghans et al., Cancer Res.50:1495-1502 (1990)). Alternativno, smatra se da se dva antitela vezuju na isti epitop ako su suštini sve mutacije aminokiseline u antigenu koje smanjuju ili eliminišu vezivanje jednog antitela smanjuju ili eliminišu vezivanje drugog. Smatra se da dva antitela imaju "preklapanje epitopa" ako samo podskup mutacija aminokiseline koji smanjuju ili eliminišu vezivanje jednog antitela smanjuju ili eliminišu vezivanje drugog.

[0084] Da bi se odredilo da li se neko antitelo takmiči za vezivanje (ili se takmiči sa drugima za vezivanje) sa referentnim anti-aktivin A antitelom, gore opisana metodologija vezivanja se izvodi u dve orijentacije: U prvoj orijentaciji, referentno antitelo ima mogućnost da se veže na protein aktivina A (ili βA heterodimer koji sadrži podjedinicu) pod uslovima saturacije posle čega sledi procena vezivanja antitela koje se testira na molekul aktivina A. U drugoj orijentaciji, antitelu koje se testira je dozvoljeno da se veže na aktivin A pod uslovima saturacije posle kojih sledi procena vezivanja referentnog antitela na aktivin A. Ako, u obe orijentacije, samo prvo (saturaciono) antitelo može da se veže na aktivin A,

2

onda se zaključuje da se antitelo koje se testira i referentno antitelo takmiče za vezivanje na aktivin A (videti, npr. format ogleda opisan u Primeru 4 ovde u tekstu, u kom je antitelo aktivina A koje se testira registrovano na vrhovima senzora koji su zatim uronjeni u rastvor koji sadrži referentno antitelo aktivina A prethodno vezano sa aktivinom A). Kao što će uvideti prosečan stručnjak u ovoj oblasti, antitelo koje se takmiči za vezivanje sa referentnim antitelom ne mora neophodno da se veže na isti epitop kao to referentno antitelo, ali može sterno da blokira vezivanje referentnog antitela vezivanjem preklapanja ili susednog epitopa.

[0085] Anti-aktivin A antitela mogu da se vežu na epitop na aktivin A koji je u okviru ili blizu mesta vezivanja za receptor aktivina tip II, direktno blokiraju interakciju između aktivina A i receptora aktivina tip II, i indirektno blokiraju interakciju između aktivina A i receptora aktivina tip I. Anti-aktivin A antitela mogu da se vežu na eptiop na aktivinu A koji je unutar ili blizu mesta vezivanja za receptor aktivina tip I i direktno blokiraju interakciju između aktivina A i receptora aktivina tip I. U jednom slučaju, anti-aktivin A antitelo koje se veže na aktivin A na ili blizu mesta vezivanja receptora aktivina tip I ne blokira interakciju između aktivina A i receptora aktivina A tip II.

Dobijanje humanih antitela

[0086] Metode za generisanje monoklonalnih antitela, obuhvataju potpuno humana monoklonalna antitela su poznate u ovoj oblasti. Sve takve poznate metode moguće je koristiti u kontekstu ovog pronalaska da bi se napravila humana antitela koja se specifično vezuju na aktivin A.

[0087] Korišćenje VELOCIMMUNE™ tehnologije, na primer, ili bilo kog drugog poznatog postupka za generisanje potpuno humanih monoklonalnih antitela, himerna antitela visokog afiniteta na humani aktivin A su prvo izolovana sa humanim promenljivim regionom i mišjim konstantnim regionom. Kao što je u eksperimentalnom odeljku dole u tekstu, antitela se karakterišu i biraju za poželjne karakteristike, uključujući afinitet, selektivnost, epitop, itd. Ako je neophodno, mišji konstantni regioni se zamene sa željenim humanim konstantnim regionom, na primer divlji tip ili modifikovani IgG1 ili IgG4, da bi se generisalo potpuno humano anti-aktivin A antitelo. Kako izabrani konstantni region može varirati prema specifičnoj upotrebi, karakteristike specifičnosti vezivanja antigena visokog afiniteta i ciljne specifičnosti se nalaze u promenljivom regionu. U izvesnim slučajevima, potpuno humana anti-aktivin A antitela se izoluju direktno iz na antigen pozitivnih B ćelija.

Bioekvivalenti

[0088] Anti-aktivin A antitela i fragmenti antitela iz ovog pronalaska obuhvataju proteine koji imaju sekvence aminokiseline koji variraju od onih kod opisanih antitela ali koji zadržavaju sposobnost da se vežu na humani aktivin A. Takva varijantna antitela i fragmenti antitela obuhvataju jedno ili više dodataka, delecija, ili supstitucija aminokiselina kada se uporede sa roditeljskom sekvencom, ali ispoljavaju biološku aktivnost koja je u suštini ekvivalentna biološkoj aktivnosti koju imaju opisana antitela. Takođe, anti-aktivin A antitelo koje kodira DNK sekvence iz ovog pronalaska obuhvata sekvence koje obuhvataju jednu ili više adicija (dodavanja), delecija, ili supstitucija nukleotida kada se uporede sa opisanom sekvencom, ali koje kodiraju anti-aktivin A antitelo ili fragment antitela koji je u suštini bioekvivalentan anti-aktivin A antitelu ili fragmentu antitela iz ovog pronalaska. Primeri takvih varijanti sekvenci aminokiseline i sekvenci DNK se razmatraju gore u tekstu.

[0089] Dva proteina, ili antitela koja vezuju antigen, se smatraju bioekvivalentnim ako su, na primer, farmaceutski ekvivalenti ili farmaceutske alternative čija brzina i nivo apsorpcije ne pokazuju značajnu razliku kada se isporuče u istoj molarnoj dozi pod sličnim eksperimentalnim uslovima, bilo kao jedna doza ili kao više doza. Neka antitela će se smatrati ekvivalentima ili farmaceutskim alternativama ako su ekvivalentna u meri njihove apsorpcije ali ne u brzini njihove apsorpcije i ipak se mogu smatrati bioekvivalentom zbog toga što su takve razlike u brzini apsorpcije namerne i odražavaju se u označavanju, nisu ključne za dobijanje delotvornih koncentracija leka za organizam pri, npr., hroničnoj upotrebi, i smatraju se medicinski beznačajnim za specifični proučavani proizvod u obliku leka.

[0090] U jednom izvođenju, dva proteina koja vezuju antigen su bioekvivalenti ako ne postoje klinički značajne razlike za njihovu bezbednost, čistoću i jačinu.

[0091] U jednom izvođenju, dva proteina koja vezuju antigen su bioekvivalentni ako pacijent može da se prebaci jednom ili više puta između referentnog proizvoda i biološkog proizvoda a da se ne očekuje povećanje u riziku od neželjenih dejstava, uključujući klinički značajnu promenu imunogenosti, ili smanjenu delotvornost, u poređenju sa neprekidnom terapijom bez takvog prebacivanja.

[0092] U jednom izvođenju, dva proteina koja vezuju antigen su bioekvivalentni ako oba deluju putem zajedničkog mehanizma ili mehanizama delovanja za stanje ili stanja upotrebe, do mere da su takvi mehanizmi poznati.

[0093] Bioekvivalenti mogu biti prikazani putem in vivo i in vitro metoda. Merenje bioekvivalentnosti obuhvata, npr.

1

(a) Merenje bioekvivalentnosti obuhvata, npr. (a) in vivo test na ljudima ili drugim sisarima, kod kojih se koncentracija antitela ili njegovih metabolita meri u krvi, plazmi, serumu, ili drugom biološkom fluidu kao funkcija vremena; (b) in vitro test koji je doveden u vezu sa i koji je opravdano predvidiv za humane in vivo podatke biodostupnosti; (c) in vivo test kod ljudi i drugih sisara kod kojih se odgovarajuće akutno farmakološko dejstvo tog antitela (ili njegovog cilja) meri kao funkcija vremena; i (d) u dobro kontrolisanom kliničkom ispitivanju koje uspostavlja bezbednost, efikasnost, ili biodostupnost ili bioekvivalentnost nekog antitela.

[0094] Bioekvivalentne varijante anti-aktivin A antitela iz ovog opisa moguće je konstruisati putem, na primer, pravljenja različitih supstitucija ostataka ili sekvenci ili brisanja terminalnih ili unutrašnjih ostataka ili sekvenci koje nisu potrebne za biološku aktivnost. Na primer, ostatke cisteina koji nisu ključni za biološku aktivnost moguće je izbrisati ili zameniti sa drugim aminokiselinama da bi se sprečilo formiranje bespotrebnih ili pogrešnih intramolekularnih disulfidnih mostova posle renaturacije. U drugim kontekstima, bioekvivalentna antitela mogu obuhvatiti varijante anti-aktivin A antitela koje sadrže promene aminokiseline koje modifikuju karakteristike glikosilacije tih antitela, npr., mutacije koje eliminišu ili uklanjaju glikosilaciju.

Selektivnost vrsta i unakrsna reaktivnost vrsta

[0095] Ovaj pronalazak, prema izvesnim izvođenjima, obezbeđuje anti-aktivin A antitela koja se vežu na humani aktivin A ali ne na aktivin A iz drugih vrsta. Ovaj pronalazak takođe uključuje anti-aktivin A antitela koja se vežu na humani aktivin A i na aktivin A od jedne ili više nehumanih vrsta. Na primer, anti-aktivin A antitela iz ovog pronalaska mogu da se vežu na humani aktivin A i mogu da se vežu ili da se ne vežu, kao što može biti slučaj, na jedan ili više aktivina A od miša, pacova, morskog praseta, hrčka, skočimiša, svinje, mačke, psa, zeca, koze, ovce, krave, konja, kamile, makaki, marmoseta, rezusa ili šimpanze. Prema izvesnim izvođenjima ovog pronalaska datim kao primer, obezbeđuju se anti-aktivin A antitela obezbeđena koja specifično vezuju humani aktivin A (npr. aktivin A ili βA heterodimer koji sadrži podjedinicu) i makaki majmuna (npr. Macaca fascicularis) aktivin A.

Imunokonjugati

2

[0096] Ovaj pronalazak obuhvata anti-aktivin A monoklonalna antitela konjugovana u terapijski deo ("imunokonjugat"), kao što je citotoksin, hemoterapijski lek, imunosupresant ili radioizotop. Citotoksični agensi obuhvataju bilo koji agens koji je štetan za ćelije. Primeri pogodnih agenasa citotoksina i hemoterapijskih agenasa za formiranje imunokonjugata su poznati u ovoj oblasti, (videti na primer, WO 05/103081).

Višestruko specifična antitela

[0097] Antitela iz ovog pronalaska mogu biti monospecifična, bispecifična, ili višestruko specifična antitela. Višestruko specifična antitela mogu biti specifična za različite epitope jednog ciljnog polipeptida ili mogu obuhvatiti domene koji vezuju antigen specifične za više od jednog ciljnog polipeptida. Videti, npr. Tutt et al., J Immunol 147:60-69 (1991); Kufer et al., Trends Biotechnol 22:238-244 (2004). Anti-aktivin A antitela iz ovog pronalaska moguće je povezati na ili izraziti zajedno sa drugim funkcionalnim molekulom, npr., još jedan peptid ili protein. Na primer, antitelo ili njegov fragment može biti funkcionalno povezano (npr., hemijskim spajanjem, genetskom fuzijom, nekovalentnom vezom ili drugačije) na jedan ili više drugih molekularnih entiteta, kao što je drugo antitelo ili fragment antitela da bi se proizvelo bispecifično ili višestruko specifično antitelo sa drugom specifičnošću vezivanja. Na primer, ovaj pronalazak obuhvata bispecifična antitela pri čemu je jedan krak imunoglobulina specifičan za humani aktivin A ili njegov fragment, i drugi krak imunoglobulina je specifičan za drugi terapijski cilj ili konjugovan na terapijski deo. Jedno izvođenje ovog pronalaska uključuje bispecifična antitela pri čemu je jedan krak imunoglobulina specifičan za humani aktivin A ili njegov fragment, i drugi krak imunoglobulina je specifičan za GDF8.

[0098] Primer formata bi-specifičnog antitela koji je moguće koristiti u kontekstu ovog pronalaska uključuje upotrebu prvog domena teškog lanca 3 (CH3) imunoglobulina (Ig) i drugog domena teškog lanca 3 (CH3) imunoglobulina (Ig), pri čemu se prvi i drugi domeni teškog lanca 3 (CH3) imunoglobulina (Ig) razlikuju jedan od drugog za najmanje jednu aminokiselinu, i pri čemu najmanje jedna razlika aminokiseline smanjuje vezivanje bispecifičnog antitela na Protein A u poređenju sa bi-specifičnim antitelom kom nedostaje razlika aminokiseline (videti, npr., US patent br. 8,586,713). U jednom izvođenju, prvi domen Ig CH3 vezuje Protein A i drugi domen Ig CH3 obuhvata mutaciju koja smanjuje ili poništava vezivanje Proteina A kao što je H95R modifikacija (prema IMGT numeraciji eksona; H435R prema EU numeraciji). Drugi CH3 može još da obuhvati Y96F modifikaciju (prema IMGT; Y436F prema EU). Dalje modifikacije koje je moguće naći unutar drugog CH3 obuhvataju: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M, i V82I (prema IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M, i V422I prema EU) u slučaju IgG1 antitela; N44S, K52N, i V82I (IMGT; N384S, K392N, i V422I prema EU) u slučaju IgG2 antitela; i Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q, V82I, i L105P (prema IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q, V422I, i L445P prema EU) u slučaju IgG4 antitela. Varijacije na gore opisanom formatu bispecifičnog antitela su obuhvaćene obimom ovog pronalaska.

[0099] Drugi primeri bispecifičnih formata koje je moguće koristiti u kontekstu ovog pronalaska uključuju, bez ograničenja, npr., na scFv-zasnovane formate ili formate bispecifične za diatelo, IgG-scFv fuzije, dualni promenljivi domen (DVD)-Ig, Kvadroma (Quadroma), struktura proteinskog savijanja tzv. knobs-into-holes, struktura proteinskog savijanja tzv. knobs-into-holes, zajednički laki lanac (npr. zajednički laki lanac sa strukturama proteinskog savijanja tzv. knobs-into-holes, itd.), CrossMab, CrossFab, (SEED) telo, leucinski patentni zatvarač, duotelo (Duobody), IgG1/IgG2, dualno delujući Fab (DAF)-IgG, i Mab2 bispecifične formate (videti, npr. Klein i saradnici., mAbs 4:6, 1-11 (2012), i ovde citirane reference, za prikaz gore navedenih formata). Bispecifična antitela mogu takođe da budu konstruisana korišćenjem konjugacije peptida/nukleinske kiseline, npr., pri čemu se neprirodne aminokiseline sa ortogonalnom hemijskom reaktivnošću koriste da generišu za mesto specifične konjugate antitela-oligonukleotida koji se zatim samomontiraju u višestruke komplekse sa definisanim sastavom, valencom i geometrijom. (Videti, npr. Kazane et al., J Am Chem Soc.135(1):340-346 (2013)).

Terapijska formulacija i isporuka

[0100] Ovaj pronalazak obezbeđuje terapijske supstance koje obuhvataju anti-aktivin A antitela ili njihove fragmente koji vezuju antigen iz ovog pronalaska. Farmaceutske supstance iz ovog pronalaska se formulišu sa pogodnim nosačima, ekscipijentima, i drugim agensima koji obezbeđuju poboljšani transfer, isporuku, tolerantnost, i slično. Više odgovarajućih formulacija moguće je naći u formularu (spisku medicinskih supstanci i lekova) poznatom svim farmaceutskim hemičarima: Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Ove formulacije obuhvataju, na primer, prahove, paste, masti, gelove, voskove, ulja, lipide, mehuriće koji sadrže lipid (katjonski ili anjonski) (kao što je LIPOFECTIN™, Life Technologies, Carlsbad, CA), konjugate DNK, anhidrovane apsorpcione paste, karbovaks emulzije (polietilen glikoli različitih molekularnih težina), polučvrsti gelovi, i polučvrste mešavine koje sadrže rastvor polietilen glikola poznat i pod nazivom karbovaks. Videti takođe i Priručnik sa ekscipijentima za parenteralne formulacije

4

koji su priredili Pauel i saradnici (Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA, J Pharm Sci Technol 52:238-311 (1998).

[0101] Ta doza antitela može da se isporuči pacijentu tako što će se varirati zavisno od starosti i veličine pacijenta, ciljnoj bolesti, stanja, rute isporuke, i sličnog. Preporučena doza je obično izračunata prema telesnoj težini ili području površine tela. Kada se antitelo iz ovog pronalaska koristi za lečenje stanja ili bolesti povezanih sa aktivnošću aktivina A kod odraslog pacijenta, može biti prednost da se intravenozno isporuči antitelo iz ovog pronalaska normalno u pojedinačnoj dozi od oko 0,01 do oko 20 mg/kg telesne težine, još poželjnije oko 0,02 do oko 7, oko 0,03 do oko 5, ili oko 0,05 do oko 3 mg/kg telesne težine. Zavisno od ozbiljnosti stanja, učestalost i trajanje terapije je moguće podesiti. Delotvorne doze i rasporedi isporuke anti-aktivin A antitela moguće je odrediti empirijski; na primer, napredak pacijenta je moguće nadgledati periodičnim procenama, i dozu prilagoditi sa tim u skladu. Pored toga, određivanje razmere doza između vrsta moguće je izvesti upotrebom dobro poznatih postupaka u ovoj oblasti (npr. Mordenti et al., Pharmaceut Res 8:1351 (1991)).

[0102] Različiti sistemi isporuke su poznati i moguće ih je koristiti za isporuku farmaceutske supstance iz ovog pronalaska, npr. enkapsulacija lipozoma, mikročestica, mikrokapsula, rekombinantne ćelije koje su sposobne da eksprimuju antitelo ili drugi terapijski protein iz ovog pronalaska, receptorom posredovanu endocitozu (videti, npr., Wu et al., J Biol Chem 262:4429-4432 (1987)). Antitela i druge terapijski aktivne komponente iz ovog pronalaska moguće je takođe isporučiti tehnikama genske terapije. Metode uvođenja obuhvataju, ali se ne ograničavaju na, intradermalnu, intramuskularnu, intraperitonealnu, intravenoznu, potkožnu, intranazalnu, epiduralnu, i druge rute. Supstancu je moguće isporučiti bilo kojom prikladnom rutom, na primer infuzijom ili bolusnom injekcijom, apsorpcijom kroz obloge epitela ili sluzokože (npr., oralna sluzokoža, sluzokoža rektuma i sluzokoža creva, itd.) i moguće ih je isporučiti zajedno sa drugim biološki aktivnim agensima. Isporuka može biti sistemska ili lokalna.

[0103] Farmaceutsku supstancu iz ovog pronalaska moguće je isporučiti potkožno ili intravenozno sa standardnom iglom i špricem. Pored toga, u vezi sa potkožnom isporukom, uređaj za isporuku u vidu olovke lako ima primene za isporuku farmaceutske supstance iz ovog pronalaska. Takav uređaj za isporuku u vidu olovke može biti ponovo korišćen ili za jednokratnu upotrebu. Uređaj za isporuku u vidu olovke za ponovnu upotrebu generalno koristi zamenjivu patronu koja sadrži farmaceutsku supstancu. Pošto se cela farmaceutska supstanca u patroni isporuči i patrona se isprazni, prazna patrona može lako da se baci i zameni novom patronom koja sadrži tu farmaceutsku supstancu.

Uređaj za isporuku u vidu olovke moguće je ponovo koristiti. Kod uređaja za isporuku u vidu olovke za jednokratnu upotrebu, ne postoji patrona koju je moguće zameniti. Pored toga, uređaj za isporuku u vidu olovke za jednokratnu upotrebu se isporučuje prethodno napunjen sa farmaceutskom supstancom držanom u rezervoaru sa uređajem. Pošto se iz rezervoara isprazni farmaceutska supstanca, ceo uređaj se odloži u smeće.

[0104] Brojni uređaji za isporuku leka sa ponovnom upotrebom u vidu olovke ili kao autoinjektori imaju primene u potkožnoj isporuci farmaceutske supstance iz ovog pronalaska. Primeri obuhvataju, ali se ne ograničavaju na AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Woodstock, UK), DISETRONIC™ olovka (Disetronic Medical Systems, Bergdorf, Switzerland), HUMALOG MIX 75/25™ olovka, HUMA- LOG™ olovka, HUMALIN 70/30™ olovka (Eli Lilly and Co., Indianapolis, IN), NOVOPEN™ I, II i III (Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), BD™ olovka (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™, olovka OPTICLIK™ (sanofi-aventis, Frankfurt, Germany) da pomenemo samo neke. Primeri uređaja za jednokratnu isporuku kao što su olovke ili koji imaju primenu u potkožnoj isporuci farmaceutske supstance iz ovog pronalaska obuhvataju, ali se ne ograničavaju na SOLOSTAR™ olovku (sanofi-aventis), FLEXPEN™ (Novo Nordisk), i KWIKPEN™ (Eli Lilly), SURECLICK™ Autoinjector (Amgen, Thousand Oaks, CA), PENLET™ (Haselmeier, Stuttgart, Germany), EPIPEN (Dey, L.P.), i HUMIRA™ Pen (Abbott Labs, Abbott Park, IL) da pomenemo samo neke.

[0105] U izvesnim situacijama, farmaceutsku supstancu moguće je isporučiti u sistem sa kontrolisanim ispuštanjem. U jednom izvođenju, moguće je koristiti pumpu (videti Langer, supra; Sefton (CRC Crit. Ref. Biomed. Eng.14:201 (1987)). U drugom izvođenju, moguće je koristiti polimerne materijale; videti Medical Applications of Controlled Release (Medicinske primene kontrolisanog otpuštanja), Langer and Wise (eds.), 1974, CRC Pres., Boca Raton, Florida. U još jednom izvođenju, sistem sa kontrolisanim otpuštanjem moguće je postaviti u blizinu cilja te supstance, čime se zahteva samo frakcija sistemske doze (videti, npr. Goodson, 1984, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138). Drugi sistemi sa kontrolisanim otpuštanjem u pregledu koji je dao Langer (Langer, Science 249:1527-1533 (1990)).

[0106] Preparati koje je moguće ubrizgati mogu obuhvatiti oblike doze za intravenozne, potkožne, intrakutane i intramuskularne injekcije, infuzije kap po kap, itd. Ove preparate koji se ubrizgavaju je moguće dobiti opšte poznatim metodama. Na primer, preparate koje je moguće ubrizgati moguće je pripremiti, npr. rastvaranjem, suspendovanjem ili emulzifikovanjem antitela ili njegove soli opisane gore u sterilnoj vodenoj podlozi ili u uljnoj podlozi koja se uobičajeno koristi za injekcije. Kao podloga vodenog rastvora za injekcije, postoje, na primer, fiziološki slani rastvor, izotonični rastvor koji sadrži glukozu i druge pomoćne agense, itd., koje je moguće koristiti u kombinaciji sa odgovarajućim agensom za rastvaranje kao što je alkohol (npr. etanol), polialkohol (npr. propilen glikol, polietilen glikol), nejonski surfaktant [npr. polisorbat 80, HCO-50 (polioksietilen (50 mol) adukt hidrogenisanog ricinusovog ulja)], itd. Kao uljna podloga, koriste se, npr., susamovo ulje, ulje zrna soje, itd., koje je moguće koristiti u kombinaciji sa agensom rastvaranja kao što je benzil benzoat, benzil alkohol, itd. Injekcija se dakle priprema poželjno napunjena u odgovarajućoj ampuli.

[0107] Kao pogodnost, farmaceutske supstance za oralnu i parenteralnu upotrebu opisane gore u tekstu se dobijaju u doziranim oblicima u jediničnoj dozi pogodnoj da odgovara dozi aktivnih sastojaka. Takvi oblici doze u jediničnoj dozi obuhvataju, na primer, tablete, pilule, kapsule, injekcije (ampule), supozitorije, itd. Količina sadržanog gore pomenutog antitela je generalno oko 5 do oko 500 mg po obliku doze u jediničnoj dozi; posebno u obliku injekcije, gore pomenuto antitelo je sadržano u oko 1 do oko 100 mg, u oko 10 do 250 mg druge oblike doze.

Terapijske upotrebe antitela

[0108] Antitela iz ovog opisa su korisna, inter alia, za lečenje, sprečavanje i/ili poboljšanje bilo koje bolesti ili poremećaja povezanog sa ili posredovanog ekspresijom aktivina A, signaliziranje, ili aktivnošću, ili je moguće lečiti blokiranjem interakcije između aktivina A i receptora aktivina A (npr. ActRIIA, ActRIIB, receptor aktivina tip I, itd.) ili drugačijim inhibiranjem aktivnosti aktivina A i/ili signaliziranja. Na primer, ovaj opis obezbeđuje postupke za lečenje stanja ili tegoba koje je moguće lečiti, ublažiti ili poboljšati povećanjem jačine/snage mišića i/ili mišićne mase i/ili funkcije mišića kod pojedinca, ili preporučljivim menjanjem metabolizma (preradom karbohidrata, lipida i proteina) specifičnim vezivanjem aktivina A i nevezivanjem drugih ActRIIB liganda, ili specifičnim vezivanjem aktivina A i GDF8 i nevezivanjem drugih ActRIIB liganda. Na primer, postupci za povećanje jačine/snage mišića i/ili mase mišića i/ili funkcije mišića kod subjekta, ili za lečenje bolesti ili poremećaja koji karakteriše smanjena masa mišića ili jačina kod subjekta, isporukom subjektu za aktivin A specifičnog vezujućeg proteina. Takođe, postupci za povećanje jačine/snage mišića i/ili mase mišića i/ili funkcije mišića kod subjekta, ili za lečenje bolesti ili poremećaja koji karakteriše smanjena masa mišića ili jačina kod subjekta, isporukom subjektu za aktivin A specifičnog vezujućeg proteina i za GDF8 specifičnog vezujućeg proteina. Bilo koji od za aktivin A specifičnih vezujućih proteina i/ili za GDF8 specifičnih vezujućih proteina opisanih ovde ili na koje se ovde upućuje može biti korišćen u kontekstu ovih varijantnih rešenja iz ovog opisa. Na primer, terapijski postupci uključuju isporuku subjektu anti-aktivin A antitela i/ili anti-GDF8 antitela.

[0109] Dakle, u kontekstu postupaka ovde opisanog lečenja, anti-aktivin A antitelo moguće je isporučiti kao monoterapiju (tj. kao jedini terapijski agens) ili u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih terapijskih agenasa (npr., anti-GDF8 antitelo), čiji su dodatni primeri opisani ovde na drugom mestu.

[0110] U postupcima koji obuhvataju isporuku proteina vezivanja specifičnog za aktivin A i proteina vezivanja specifičnog za GDF8 nekom subjektu, protein vezivanja specifičan za aktivin A i protein vezivanja specifičan za GDF8 mogu biti isporučeni subjektu u isto ili pretežno isto vreme, npr. u jednoj terapijskoj dozi, ili u dve terapijske doze koje se isporučuju istovremeno ili u razmaku od manje od oko 5 minuta jedna od druge. Alternativno, protein vezivanja specifičan za aktivin A i protein vezivanja specifičan za GDF8 mogu biti isporučeni subjektu jedan za drugim, npr. u odvojenim terapijskim dozama odvojenim vremenski jedna od druge za više od oko 5 minuta.

[0111] Ovaj pronalazak uključuje postupke za povećanje snage/jačine mišića i/ili mase mišića i/ili funkcije mišića kod subjekta, ili za lečenje bolesti ili poremećaja koje karakteriše smanjena masa mišića ili snaga kod subjekta, isporukom subjektu molekula koji vezuje antigen koji obuhvata domen vezivanja specifičan za aktivin A i domen vezivanja specifičan za GDF8. Bilo koji od ovde opisanih ili pomenutih molekula koji vezuju antigen je moguće koristiti. Na primer, terapijski postupci uključuju isporuku subjektu bispecifičnog antitela koje obuhvata prvi promenljivi domen koji obuhvata HCVR/LCVR par koji specifično vezuje aktivin A i drugi promenljivi domen koji obuhvata HCVR/LCVR par koji specifično vezuje GDF8.

[0112] Supstance iz ovog pronalaska moguće je isporučiti subjektu zajedno sa jednim ili više dodatnih terapijskih agenasa, uključujući, npr. inhibitore faktora rasta, imunosupresante, agense protiv upala, metaboličke inhibitore, inhibitore enzima, i citotoksične/citostatičke agense. Dodatni terapijski agensi mogu biti isporučeni pre, istovremeno sa, ili posle isporuke proteina vezivanja specifičnih za aktivin A i za GDF8 iz ovog pronalaska.

[0113] Primeri bolesti, poremećaja i stanja koje je moguće lečiti sa supstancama iz ovog pronalaska uključuju, ali se ne ograničavaju na, sarkopeniju, kaheksiju (bilo idiopatsku ili sekundarnu drugim stanjima, npr., kanceru, hroničnog bolesti bubrega, ili hroničnoj opstruktivnoj bolesti pluća), povredi mišića, traumi mišića, gubljenju mišića i atrofiji mišića, npr., atrofija ili gubljenje mišića prouzrokovani ili povezani sa zloupotrebom, npr., imobilizacijom mišića, vezanošću za krevet, povredom, medicinskim lečenjem ili hirurškom intervencijom mišića (npr. prelom kuka, zamena kuka, zamena kolena, i drugog zgloba, tetive, ili povredama ligamenta kao što su cepanja u prednjem krstastom ligamentu (ACL) i/ili medicinski kolateralni ligament (MCL), itd.), distrofija mišića (npr. miotonična, Dušenova (Duchenne), Bekerova (Becker), pojasna mišićna distrofija, fascioskapulohumeralna mišićna distrofija (FSHD, poznata i kao Landuzi-Deherinova (Landouzy-Dejerine) bolest), urođene, okulofaringealne, distalne, Emeri-Drajfusove (Emery-Dreifuss), itd.), glukokortikoidom indukovana miopatija, rehabilitacija posle moždanog udara (npr., rehabilitacija delimične paralize (hemipareze) posle moždanog udara) ili neophodnošću mehaničkog disanja. Supstance iz ovog pronalaska moguće je koristiti i za lečenje, sprečavanje ili poboljšanje bolesti kao što je kancer, gojaznost, dijabetes, artritis, multipla skleroza, mišićna distrofija, amiotropna lateralna skleroza, Parkinsonova bolest, osteoporoza, osteoartritis, osteopenija, i metabolički sindromi (uključujući, ali bez ograničenja na dijabetes, gojaznost, nutritivne poremećaje, atrofiju organa, hroničnu opstruktivnu bolest pluća i anoreksiju). Dodatne bolesti, poremećaje, i stanja koje je moguće sprečiti, lečiti i/ili poboljšati korišćenjem supstanci iz ovog pronalaska uključuju sepsu, hroninčno zatajenje srca, benigni i maligni feohromocitom, fibroide/leiomiomate materice, preeklampsiju, keloidne i hipertropne ožiljke, i plućnu arterijsku hipertenziju.

Poboljšana specifičnost vezivanja i aktivnost

[0114] Ovaj opis uključuje postupke za povećanje jačine/snage mišića i/ili mase mišića i/ili funkcije mišića kod subjekta, ili za lečenje bolesti ili poremećaja koje karakteriše smanjena masa ili jačina mišića kod subjekta, ili za lečenje bolesti ili poremećaja prouzrokovanih, pospešenih, ili pogoršanih aktivnošću aktivina A, a da se ne prouzrokuju neželjena dejstva povezana sa isporukom molekula koji vezuju više (npr., 3 ili više) ActRIIB liganda. Drugim rečima, postupci korišćenja anti-aktivin A antitela ili njihovih proteina koji vezuju antigen (npr. pri čemu se anti-aktivin A antitelo samo značajno vezuje na aktivin A) mogu lečiti bolest ili poremećaj a da ne prouzrokuju neželjena ili suprotna dejstva koja se javljaju sa molekulima koji vezuju više ActRIIB liganda. Na primer, klinički molekul koji se pominje kao ACE-031 (Acceleron Pharma, Inc., Cambridge, MA) je multimer koji obuhvata vanćelijski deo ActRIIB fuzionisan na IgG Fc domen (ovaj molekul se takođe pominje kao "ActRIIB-Fc"). ActRIIB-Fc vezuje aktivin A kao i druge ActRIIB ligande kao što je, npr.

aktivin B, GDF8, GDF11, BMP9, BMP10, i TGF β, i poznato je da prouzrokuje različita neželjena dejstva kada se isporuči humanim pacijentima. Značajno, ovi pronalazači su neočekivano utvrdili da specifično inhibiranje aktivina A i GDF8 (npr. isporukom anti-aktivin A antitela i anti-GDF8 antitelo), a da ne inhibira druge ActRIIB ligande kao što je aktivin B, GDF11, BMP9, BMP10, i TGF β, daje kao rezultate povećanje mase mišića koje je barem ekvivalentno onome što je primećeno isporučivanjem ActRIIB-Fc, a da ne prouzrokuje neželjena dejstva povezana sa vezujućim agensima kao što je ActRIIB-Fc.

Kombinovane terapije i formulacije

[0115] Ovaj opis uključuje supstance i terapijske formulacije koje obuhvataju bilo koja od anti-aktivin A antitela opisana ovde u kombinaciji sa jednom ili više dodatnih terapijskih aktivnih komponenata, i postupaka lečenja koji obuhvataju isporuku takvih kombinacija subjektima kojima su potrebni. Ovaj opis uključuje i supstance i terapijske formulacije koje obuhvataju bilo koja od anti-aktivin A antitela opisana ovde u kombinaciji sa jednom ili više dodatnih terapijskih aktivnih komponenata, i postupaka lečenja koji obuhvataju isporuku takvih kombinacija subjektima kojima su potrebni. Na primer, anti-aktivin A antitela iz ovog pronalaska mogu takođe da budu isporučena i/ili koformulisana u kombinaciji sa antiviroticima, antibioticima, analgeticima, kortikosteroidima, steroidima, kiseonik, antioksidansi, helatori metala, IFN-gama, i/ili NSAID. Anti-aktivin A antitela iz ovog pronalaska mogu biti isporučena i kao deo režima lečenja koji takođe uključuje terapiju zračenjem i/ili uobičajenu hemoterapiju (npr. u kontekstu postupaka za lečenje kancera ili inhibiranje rasta tumora). Bilo koje od gore pomenutih dodatnih terapijski aktivnih komponenata moguće je isporučiti u kombinaciji sa bilo kojim od anti-aktivin A antitela iz ovog pronalaska za lečenje bilo koje bolesti ili poremećaja kod koje je korisno isporučivanje anti-aktivin A antitela, uključujući, npr. sarkopeniju, kaheksiju, povredu mišića, gubljenje mišića i atrofiju mišića. Bilo koja od gorepomenutih dodatnih terapijskih aktivnih komponenata moguće je takođe isporučiti u kombinaciji sa bilo kojim od anti-aktivin A antitela iz ovog pronalaska zajedno sa GDF8 inhibitorom (npr. anti-GDF8 antitelo).

[0116] Dodatne terapijski aktivne komponente moguće je isporučiti subjektu pre isporuke anti-aktivin A antitela iz ovog pronalaska. Na primer, prvu komponentu je moguće smatrati isporučenom "pre" druge komponente ako je prva komponenta isporučena 1 nedelju pre, 72 sata pre, 60 sati pre, 48 sati pre, 36 sati pre, 24 sata pre, 12 sati pre, 6 sati pre, 5 sati pre, 4 sata pre, 3 sata pre, 2 sata pre, 1 sat pre, 30 minuta pre, 15 minuta pre, 10 minuta

4

pre, 5 minuta pre, ili manje od 1 minut pre isporuke druge komponente. U drugim izvođenjima, dodatne terapijski aktivne komponente moguće je isporučiti subjektu posle isporuke anti-aktivin A antitela iz ovog pronalaska. Na primer, prvu komponentu je moguće smatrati isporučenom "posle" druge komponente ako je prva komponenta isporučena 1 minut posle, 5 minuta posle, 10 minuta posle, 15 minuta posle, 30 minuta posle, 1 sat posle, 2 sata posle, 3 sata posle, 4 sata posle, 5 sati posle, 6 sati posle, 12 sati posle, 24 sata posle, 36 sati posle, 48 sati posle, 60 sati posle, 72 sata posle isporuke druge komponente. U još nekim drugim izvođenjima, dodatne terapijski aktivne komponente moguće je isporučiti subjektu istovremeno sa isporukom anti-aktivin A antitela iz ovog pronalaska. "Istovremena" isporuka, u svrhe ovog pronalaska, uključuje, npr. isporuku anti-aktivin A antitela i dodatnu terapijski aktivnu komponentu subjektu u jednom obliku doze, ili u odvojenim oblicima doze isporučenu subjektu u roku od oko 30 minuta ili manje jednu od druge. Ako je isporučena u odvojenim oblicima doze, svaki oblik doze moguće je isporučiti preko iste rute (npr. i anti-aktivin A antitelo i dodatna terapijski aktivna komponenta mogu biti isporučeni intravenozno, potkožno, intravitrealno, itd.); alternativno, svaki oblik doze moguće je isporučiti preko različite rute (npr., anti-aktivin A antitelo moguće je isporučiti lokalno (npr. intravitrealno) i dodatnu terapijski aktivnu komponentu je moguće isporučiti sistemski). U svakom slučaju, isporuka komponenata u jednom doznom obliku, u odvojenim oblicima doze istom rutom, ili u odvojenim oblicima doze odvojenim rutama se takođe razmatraju '' istovremena isporuka,'' u svrhu ovog opisa. U svrhe ovog opisa, isporuke antiaktivin A antitela "pre", "istovremeno," ili "posle" (kao što su ti uslovi definisani prethodno u ovom tekstu) isporuka dodatne terapijske aktivne komponente se smatra isporukom antiaktivin A antitela "u kombinaciji sa" dodatnom terapijski aktivnom komponentom).

[0117] Ovaj pronalazak obuhvata farmaceutske supstance u kojima je anti-aktivin A antitelo iz ovog pronalaska koformulisano sa jednom ili više dodatnih aktivnih komponenata kako je opisano ovde na drugom mestu.

Doziranje

[0118] Količina aktivnog sastojka (npr. anti-aktivin A antitela, anti-GDF8 antitela datih u kombinaciji sa anti-aktivin A antitelima, ili bispecifičnim antitelima koji specifično vezuju aktivin A i GDF8) koja je moguće isporučiti subjektu jeste, generalno, terapijski delotvorna količina. Kako je ovde korišćeno, fraza "terapijski delotvorna količina" znači dozu proteina vezivanja specifično za antigen i/ili molekula koji se vezuju za antigen koja daje kao rezultat detektibilno povećanje jednog ili više sledećih parametara: telesna težina, mišićna masa (npr. mase mišića prednje tetive, tzv. tibialis anterior [TA], mase mišića trbušastog mišića lista, tzv. gastroknemijus [GA], mase mišića četvoroglavog mišića stražnjice, tzv. kvadriceps [Quad], itd.), jačine/snage mišića, i/ili funkcije mišića. Na primer, "terapijski delotvorna količina" proteina vezivanja specifičnog za aktivin A i/ili proteina vezivanja specifičnog za GDF8 uključuje, npr. količinu proteina vezivanja specifičnog za aktivin A i/ili proteina vezivanja specifičnog za GDF8, kada se isporuči subjektu koji se testira, prouzrokuje povećanje mase mišića prednje tetive, tzv. tibialis anterior [TA], mase mišića trbušastog mišića lista, tzv. gastroknemijus [GA], za najmanje 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60% ili više, u poređenju sa kontrolom tretiranim subjektima, npr., kao što je prikazano na Primeru 7, ovde u tekstu.

[0119] U slučaju antitela iz ovog pronalaska (npr. anti-aktivin A antitela ili bispecifična antitela koja specifično vezuju aktivin A i GDF8), terapijski delotvorna količina može da bude od oko 0,05 mg do oko 600 mg; npr. oko 0,05 mg, oko 0,1 mg, oko 1,0 mg, oko 1,5 mg, oko 2,0 mg, oko 10 mg, oko 20 mg, oko 30 mg, oko 40 mg, oko 50 mg, oko 60 mg, oko 70 mg, oko 80 mg, oko 90 mg, oko 100 mg, oko 110 mg, oko 120 mg, oko 130 mg, oko 140 mg, oko 150 mg, oko 160 mg, oko 170 mg, oko 180 mg, oko 190 mg, oko 200 mg, oko 210 mg, oko 220 mg, oko 230 mg, oko 240 mg, oko 250 mg, oko 260 mg, oko 270 mg, oko 280 mg, oko 290 mg, oko 300 mg, oko 310 mg, oko 320 mg, oko 330 mg, oko 340 mg, oko 350 mg, oko 360 mg, oko 370 mg, oko 380 mg, oko 390 mg, oko 400 mg, oko 410 mg, oko 420 mg, oko 430 mg, oko 440 mg, oko 450 mg, oko 460 mg, oko 470 mg, oko 480 mg, oko 490 mg, oko 500 mg, oko 510 mg, oko 520 mg, oko 530 mg, oko 540 mg, oko 550 mg, oko 560 mg, oko 570 mg, oko 580 mg, oko 590 mg, oko 600 mg, oko 610 mg, oko 620 mg, oko 630 mg, oko 640 mg, oko 650 mg, oko 660 mg, oko 670 mg, oko 680 mg, oko 690 mg, oko 700 mg, oko 710 mg, oko 720 mg, oko 730 mg, oko 740 mg, oko 750 mg, oko 760 mg, oko 770 mg, oko 780 mg, oko 790 mg, oko 800 mg, oko 810 mg, oko 820 mg, oko 830 mg, oko 840 mg, oko 850 mg, oko 860 mg, oko 870 mg, oko 880 mg, oko 890 mg, oko 900 mg, oko 910 mg, oko 920 mg, oko 930 mg, oko 940 mg, oko 950 mg, oko 960 mg, oko 970 mg, oko 980 mg, oko 990 mg, ili oko 1000 mg, odgovarajućeg antitela.

[0120] Količina antitela iz ovog pronalaska (npr., anti-aktivin A antitela ili bispecifičnih antitela koja specifično vezuju aktivin A i GDF8) sadržanih unutar pojedinačnih doza može biti izražena u vidu miligrama antitela po kilogramu telesne težine pacijenta (tj. mg/kg). Na primer, anti-aktivin A i/ili anti-aktivin A/anti-GDF8 bispecifična antitela iz ovog pronalaska moguće je isporučiti pacijentu u dozi od oko 0,0001 do oko 50 mg/kg telesne težine pacijenta (npr. 0,1 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1,0 mg/kg, 1,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 2,5 mg/kg, 3,0 mg/kg, 3,5 mg/kg, 4,0 mg/kg, 4,5 mg/kg, 5,0 mg/kg, 5,5 mg/kg, 6,0 mg/kg, 6,5 mg/kg, 7,0 mg/kg, 7,5 mg/kg, 8,0 mg/kg, 8,5 mg/kg, 9,0 mg/kg, 9,5 mg/kg, 10,0 mg/kg, 10,5 mg/kg, 11,0 mg/kg, 11,5 mg/kg, 12,0 mg/kg, 12,5 mg/kg, 13,0 mg/kg, 13,5 mg/kg, 14,0 mg/kg, 14,5 mg/kg, 15,0 mg/kg, 15,5 mg/kg, 16,0 mg/kg, 16,5 mg/kg, 17,0 mg/kg, 17,5 mg/kg, 18,0 mg/kg, 18,5 mg/kg, 19,0 mg/kg, 19,5 mg/kg, 20,0 mg/kg, itd.).

[0121] Supstance iz ovog pronalaska mogu obuhvatiti jednake količine proteina vezivanja specifičnog za aktivin A i proteina vezivanja specifičnog za GDF8. Alternativno, količina proteina vezivanja specifičnog za aktivin A u supstanci može biti manja od ili veća od količine proteina vezivanja specifičnog za GDF8. Prosečan stručnjak u ovoj oblasti, korišćenjem rutinskih eksperimenata, će biti u mogućnosti da utvrdi odgovarajuće količine pojedinačnih komponenata u supstancama iz ovog pronalaska neophodnim da se proizvede željeno terapijsko dejstvo.

Režimi isporuke

[0122] Prema izvesnim izvođenjima iz ovog pronalaska, više doza aktivnog sastojka (npr., anti- aktivin A antitela, anti-GDF8 antitela isporučenog u kombinaciji sa anti-aktivin A antitelom, farmaceutska supstanca koja obuhvata kombinaciju anti-aktivin A antitela i bilo kog dodatnog terapijski aktivnog sastojka pomenutog ovde u tekstu, uključujući, npr., anti-GDF8 antitelo, ili bispecifično antitelo koje specifično veže aktivin A i GDF8) može biti isporučeno subjektu tokom definisanog vremenskog perioda. Postupci prema ovom varijantnom rešenju iz ovog pronalaska obuhvataju isporuku subjektu više doza aktivnog sastojka iz ovog pronalaska u sledu. Kako se ovde koristi, "isporuka u sledu" znači da je svaka doza aktivnog sastojka isporučena u sledu ispitaniku u različitim vremenskim trenucima, npr., različitim danima odvojenim unapred određenim vremenskim intervalom (npr. sati, dani, nedelja ili meseci). Postupci mogu obuhvatiti isporuku u sledu pacijentu pojedinačne početne doze aktivnog sastojka, posle čega sledi jedna ili više sekundarnih doza aktivnog sastojka, i opciono sledi jedna ili više tercijarnih doza aktivnog sastojka.

[0123] Pojmovi "početna doza, "sekundarne doze," i "tercijarne doze," se odnose na vremenski sled isporuke aktivnog sastojka, npr. anti-aktivin A antitelo iz ovog pronalaska ili kombinacija terapije iz ovog pronalaska, npr. anti-aktivin A antitelo i anti-GDF8 antitelo. Dakle, "početna doza" je doza koja se isporučuje na početku režima terapije (takođe se pominje kao "polazna doza"); ili "sekundarne doze" su doze koje se isporučuju posle početne doze; i "tercijarne doze" su doze koje se isporučuju posle sekundarnih doza. Početna, sekundarne, i tercijarne doze mogu sve da sadrže istu količinu aktivnog sastojka,

4

npr., anti- aktivin A antitelo, ali se generalno mogu razlikovati jedna od druge u smislu učestalosti isporuke. U izvesnim izvođenjima, međutim, količina aktivnog sastojka, npr. antiaktivin A antitelo, sadržano u početnoj, sekundarnoj i/ili tercijarnim dozama se razlikuje jedno od drugog (npr. podešeno naviše ili naniže kako je pogodno) tokom toka lečenja. U izvesnim izvođenjima, dve ili više (npr.2, 3, 4, ili 5) doza se isporučuje na početku režima lečenja kao "udarne doze" posle čega slede naknadne doze koje se isporučuju nešto slabijom učestalošću (npr. "doze održavanja").

[0124] U izvesnim slučajevima datim kao primer, svaka sekundarna i/ili tercijarna doza se isporučuje 1 do 26 (npr. 1, 11⁄2, 2, 21⁄2, 3, 31⁄2, 4, 41⁄2, 5, 51⁄2, 6, 61⁄2, 7, 71⁄2, 8, 81⁄2, 9, 91⁄2, 10, 101⁄2, 11, 111⁄2, 12, 121⁄2, 13, 131⁄2, 14, 141⁄2, 15, 151⁄2, 16, 161⁄2, 17, 171⁄2, 18, 181⁄2, 19, 191⁄2, 20, 201⁄2, 21, 211⁄2, 22, 221⁄2, 23, 231⁄2, 24, 241⁄2, 25, 251⁄2, 26, 261⁄2, ili više nedelja posle neposredno prethodne doze. Fraza," neposredno prethodna doza,'' kako se ovde koristi, znači, u nizu više isporuka, npr. anti-aktivin A antitela, koja se isporučuje pacijentu pre isporuke prve sledeće doze po redosledu bez interventnih doza.

[0125] Postupci mogu uključiti isporuku pacijentu bilo kog broja sekundarnih i/ili tercijarnih doza aktivnog sastojka iz ovog pronalaska, npr., anti-aktivin A antitela. Na primer, u izvesnim slučajevima, pacijentu se isporučuje samo jedna sekundarna doza. U drugim slučajevima, dve ili više (npr. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ili više) sekundarnih doza se isporučuje pacijentu. Slično, u izvesnim slučajevima, samo jedna tercijarna doza se isporučuje pacijentu. U drugim slučajevima, dve ili više (npr.2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ili više) tercijarnih doza se isporučuje pacijentu.

[0126] U slučajevima koji obuhvataju sekundarnih doza, svaku sekundarnu dozu moguće je isporučiti istom učestalošću kao druge sekundarne doze. Na primer, svaku sekundarnu dozu moguće je isporučiti pacijentu 1 do 2 nedelje ili 1 do 2 meseca posle neposredno prethodne doze. Slično, u slučajevima koji obuhvataju tercijarne doze, svaku tercijarnu dozu moguće je isporučiti istom učestalošću kao druge tercijarne doze. Na primer, svaku tercijarnu dozu moguće je isporučiti pacijentu 2 do 12 nedelje posle neposredno prethodne doze. U izvesnim slučajevima, učestalost kojom se sekundarne i/ili tercijarne doze isporučuju pacijentu mogu varirati tokom režima terapije. Učestalost isporuke, može da podesi lekar tokom terapije, zavisno od individualnih potreba pacijenta posle kliničkog ispitivanja.

[0127] Ovaj opis uključuje režime isporuke leka pacijentu kod kojih se 2 do 6 početnih doza isporučuje pacijentu pri prvoj učestalosti isporuke leka (npr. jednom nedeljno, jednom svake dve nedelje, jednom svake tri nedelje, jednom mesečno, jednom svaka dva meseca, itd.), posle čega sledi isporuka dve ili više doza za održavanje pacijentu na bazi manje učestalosti. Na primer, ako se udarne doze isporuče učestalošću jednom mesečno, onda doze održavanja mogu biti isporučene pacijentu jednom svakih šest nedelja, jednom svaka dva meseca, jednom svaka tri meseca, itd.).

Dijagnostičke upotrebe antitela

[0128] Anti-aktivin A antitela iz ovog pronalaska moguće je takođe koristiti da bi se detektovale i/ili izmerile ćelije koje eksprimuju aktivin A, ili ćelije koje eksprimuju aktivin A u nekom uzorku, npr. u dijagnostičke svrhe. Na primer, anti-aktivin A antitelo, ili njegov fragment, moguće je koristiti da se dijagnostikuje stanje ili bolest naznačeno nenormalnom ekspresijom (npr. prekomernom ekspresijom, nedovoljnom ekspresijom, odsustvom ekspresije, itd.) aktivina A. Primeri dijagnostičkih ogleda za aktivin A mogu obuhvatiti, npr. dovođenje u kontakt uzorka, dobijenog od pacijenta, sa anti-aktivin A antitelom iz ovog pronalaska, pri čemu anti-aktivin A antitelo jeste označeno detektibilnom oznakom ili molekulom reporterom. Alternativno, neoznačeno anti-aktivin A antitelo je moguće koristiti u dijagnostičkim primenama u kombinaciji sa sekundarnim antitelom koje je samo detektibilno označeno. Detektibilna oznaka ili molekul reporter može biti radioizotop, kao što je<3>H,<14>C,<32>P,<35>S, ili<125>I; fluorescentni ili hemiluminescentni deo, kao što je fluorescein izotiocijanat, ili rodamin; ili enzim kao što je alkalna fosfataza, beta-galaktozidaza, peroksidaza rena, ili luciferaza. Specifični ogledi uzeti kao primer koje je moguće koristiti da bi se detektovao ili izmerio aktivin A u uzorku obuhvataju sa enzimom povezan ogled imunosorbensa (ELISA), radioimunotest (RIA), razvrstavanje ćelija aktiviranih fluorescencijom (FACS).

[0129] Uzorci koje je moguće koristiti u ogledima za dijagnostikovanje aktivina A kako je ovde opisano obuhvataju bilo koji uzorak tkiva ili fluida koji je moguće dobiti od pacijenta koji sadrži detektibilne količine proteina aktivina A, ili njegove fragmente, pod normalnim ili patološkim uslovima. Generalno, nivoi aktivina A u specifičnom uzorku dobijenom od zdravog pacijenta (npr. pacijent nije pogođen bolešću ili stanjem povezanim sa nenormalnim nivoima ili aktivnošću aktivina A) će biti izmereni na početku da se uspostavi polazna vrednost, ili standard, nivo aktivina A. Ovaj nivo polazne vrednosti aktivina A moguće je zatim uporediti sa nivoima aktivina A izmerenim u uzorcima dobijenim od pojedinaca za koje se sumnja da imaju bolest ili stanje povezano sa aktivinom A.

PRIMERI

4

[0130] Primeri u nastavku su izneti da bi se prosečnom stručnjaku u ovoj oblasti dao potpuno objašnjenje i opis kako da pravi i koristi postupke i supstance iz ovog pronalaska, i nisu predviđeni da ograniče obim predmeta koji ovi pronalazači smatraju svojim pronalaskom. Nastojalo se da se postigne preciznost u pogledu korišćenih brojeva (npr. količina, temperature, itd.) ali neke eksperimetnalne greške i odstupanja treba uzeti u obzir. Osim ako nije drugačije navedeno, delovi su delovi prema težini, molekularna težina je prosečna molekularna težina, temperatura se smatra da je u stepenima Celzijusove skale, i pritisak je na ili blizu atmosferskog.

Primer 1. Generisanje humanih antitela prema aktivinu A

[0131] Imunogen koji obuhvata protein aktivina A ( dimer inhibin- βA) je isporučen direktno, sa adjuvansom da bi se stimulisao odgovor imunog sistema, VELOCIMMUNE® mišu sa DNK koja kodira humane promenljive regione teškog i lakog lanca imunoglobulina. Imuni odgovor antitela je nadgledan imunoogledom specifičnim za aktivin A. Kada se postigne željeni odgovor imunog sistema, splenociti su pokupljeni i spojeni sa mišjim ćelijama mijeloma da bi se očuvala njihova održivost i formirale linije ćelije hibridoma. Linije ćelije hibridoma se pregledaju i odabiraju da bi se identifikovale linije ćelije koje proizvode aktivin A specifična antitela. Korišćenjem ove tehnike dobijeno je nekoliko anti- aktivin A himernih antitela (tj. antitela koja imaju humane promenljive domene i mišje konstante domene). Primer antitela dobijenog na ovaj način je H2aM10965N. Humani domeni promenljivog lanca iz himernih antitela su naknadno klonirani na humane konstantne domene da bi napravili potpuno humana anti-aktivin A antitela kao što je ovde opisano.

[0132] Anti-aktivin A antitela su takođe izolovana direktno iz antigen pozitivnih B ćelija bez fuzije na ćelije mijeloma, kao što je opisano u U.S. 2007/0280945A1. Upotrebom ovog postupka, dobijeno je nekoliko potpuno humanih anti-aktivin A antitela (tj. antitela koja poseduju humane promenljive domene i humane konstantne domene); primeri antitela generisanih na ovaj način su navedeni kao u nastavku: H4H10423P, H4H10429P, H4H10430P, H4H10432P2, H4H10440P2, H4H10442P2, H4H10436P2, i H4H10446P2.

[0133] Izvesna biološka svojstva anti-aktivin A antitela uzetih za primer generisanih u skladu sa metodama iz ovog Primera su opisana detaljno u Primerima iznetim dole.

Primer 2. Sekvence aminokiseline promenljivog regiona teškog i lakog lanca

4

[0134] Tabela 1 iznosi parove sekvenci aminokiseline promenljivog regiona teškog i lakog lanca od izabranih anti-aktivin A antitela i njihove odgovarajuće identifikatore antitela. Odgovarajući identifikatori sekvence nukleinske kiseline su izneti u Tabeli 2.

Tabela 1: Identifikatori sekvence aminokiseline

4

Tabela 2: Identifikatori sekvence nukleinske kiseline

[0135] Antitela se obično pominju ovde prema sledećoj nomenklaturi: Fc prefiks (npr. "H1M," "H2aM," "H4H"), posle čega sledi brojčani identifikator (npr. "10423," "10424," ili "10426" kao što je poznato u Tabelama 1 i 2), posle čega sledi "P," "P2" ili "N" sufiks. Dakle, prema ovoj nomenklaturi, antitelo je moguće ovde pomenuti kao, npr., " H4H10423P,"" H4H10432P2," "H2aM10965N," itd. H1M, H2M i H4H prefiksi na oznakama antitela korišćeni ovde označavaju specifični izotip Fc regiona tog antitela. Na primer, "H2aM" antitelo ima mišji IgG2a Fc, pri čemu "H4H" antitelo ima humani IgG4 Fc. Kao što je jasno prosečnom stručnjaku u ovoj oblasti, antitelo koje ima specifični Fc izotip može biti konvertovano u antitelo sa različitim Fc izotipom (npr., antitelo sa mišjim IgG2a Fc moguće je pretvoriti u antitelo sa humanim IgG4, itd.), ali u svakom slučaju, promenljivi domeni (uključujući CDR) - koji su naznačeni brojčanim indikatorima prikazanim u Tabeli 1 - će ostati isti, i očekuje se da svojstva vezivanja budu identična ili pretežno slična bez obzira na prirodu Fc domena.

Kontrolni konstrukti korišćeni u primerima u nastavku

4

[0136] Anti-aktivin A kontrolni molekuli su uključeni u sledeće Primere radi poređenja. Kontrolno antitelo naznačeno ovde kao Kontrola 1 je humano anti-aktivin A antitelo sa sekvencama promenljivog domena teškog i lakog lanca od "A1" kao što je izneto u US 8,309,082. Kontrola 2 je anti-humano antitelo receptora aktivina tipa II B (anti- ActR2B mAb) opisano kao MOR8159 u U.S. prijavi patenta br. 2012/0237521 A1. Kontrola 3 je mišje anti-aktivin A monoklonalno antitelo iz kompanije R&D Systems, Minneapolis, MN (kataloški broj MAB3381). Kontrolno 4 je fuzioni molekul receptora Fc aktivina tip IIB (rastvorljivi vanćelijski domen receptora aktivina RIIB proizveden sa Fc fuzionim proteinom humanog IgG1 C-terminusa (E23-P133 od NP_001097 posle kog sledi Gly-Ser linker (vezujući) region posle kog sledi Fc fuzija humanog IgG1 C-terminusa), čija je sekvenca obezbeđena kao SEK ID BR:227.

Primer 3. Vezivanje antitela na humani aktivin A kako je utvrđeno rezonancom površinskog plazmona

[0137] Afiniteti vezivanja i kinetičke konstante za vezivanje antigena na izabrana prečišćena anti-humana monoklonalna antitela aktivina A su utvrđeni korišćenjem biosenzora rezonance površinskog plazmona u stvarnom vremenu (Biacore T200 or Biacore 4000, GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ) ogled na 25 °C i 37 °C. Antitela, izražena kao bilo mišja Fc (prefiks H2aM) ili humana Fc (prefiks H4H), su registrovana na njihovim odgovarajućim anti-Fc senzornim površinama (mAb format slike). Anti-aktivin A antitela su registrovana na površini bilo kozjeg anti-mišjeg IgG poliklonalnog antitela (GE Healthcare, # #BR- 1008-388) ili mišjeg anti-humanog IgG monoklonalnog antitela (GE Healthcare, #BR-1008-39) stvoreno kroz direktno spajanje amina na Biacore CM5 senzor čip. Kinetički eksperimenti su izvedeni korišćenjem bilo HBS-EP (10mM HEPES, 150mM NaCl, 3mM EDTA, 0,05% surfaktanta P20, na pH vrednosti od 7,4) ili PBS-P (10mM natrijum fosfat, 2,7mM KCI, 137mM NaCl, 0,02% NaN3, 0,05% surfaktant P20, pH vrednost 7,4), kao radno pufersko sredstvo i kao pufersko sredstvo uzorka. Brzine udruživanja antigen-antitelo su izmerene ubrizgavanjem različitih koncentracija (4-struka razblaženja u opsegu od 50 do 0,2 nM) bilo aktivina A (R&D Systems, # 338-AC-050/CF), aktivina B (R&D Systems, # 659-AB-025/CF), aktivina AB (R&D Systems, # 1006-AB-005), aktivina AC (R&D Systems, # 4879-AC/CF), ili inhibina E (Novus Biologicals, #H00083729- P01) na površini na kojoj je registrovano antitelo. Udruživanje antitelo-antigen je nadgledano tokom 240 sekunde dok je razdruživanje u puferu nadgledano tokom 600 sekundi. Konstante brzina kinetičkog udruživanja i razdruživanja su određene preradom i fitovanjem podataka korišćenjem

4

Scrubber softvera, verzija 2.0c. Konstante ravnoteže razdruživanja vezivanja (KD) i razdružene polovine (t1/2) su zatim izračunate iz konstanti kinetičke brzine kao: KD (M) = kd / ka i t1⁄2 (min) = [ln2/(60*kd)]. Parametri kinetičkog vezivanja za različita anti-aktivin A monoklonalna antitela su prikazani u Tabelama 3 do 10. (NB = nikakvo vezivanje nije primećeno pri korišćenim uslovima; NT = nije testirano).

Tabela 3: Karakteristike vezivanja anti-aktivin A antitela na aktivin A na 25°C

Tabela 4: Karakteristike vezivanja anti-aktivin A antitela na aktivin A na 37°C

(nastavak)

1

[0138] Za kd vrednosti koje su ispisane kurzivom, nikakav analit razdruživanja nije primećen pod ovim eksperimentalnim uslovima, i vrednost kd je samim tim fiksirana na 5.0E-05 s<-1>

Tabela 5: Karakteristike vezivanja anti-aktivin A antitela na aktivin B na 25°C

2

Tabela 6: Karakteristike vezivanja anti-aktivin A antitela na aktivin B na 37°C

Tabela 7: Karakteristike vezivanja anti-aktivin A antitela na aktivin AB na 25°C

Tabela 8: Karakteristike vezivanja anti-aktivin A antitela na aktivin AB na 37°C

Tabela 9: Karakteristike vezivanja anti-aktivin A antitela na aktivin AC na 25°C

4

Tabela 10: Karakteristike vezivanja anti-aktivin A antitela na aktivin AC na 37°C

[0139] Kao što je prikazano u Tabelama 3 i 4, anti-aktivin A antitela vezana na aktivin A sa KD vrednostima koje se kreću u opsegu od manje od 3.18pM (tj. ≤ 3.18E-12) do 745pM (tj. 7.45E-10) na 25 °C i sa KD vrednostima u opsezima od manje od 2.18pM (tj. ≤ 2.18E-12) do 1.77nM (1.77E-09) na 37 °C. Kao što je prikazano u Tabelama 5 i 6, nekoliko antiaktivin A antitela (tj. H4H10432P2, H4H10442P2, H4H10430P2, H4H10446P2, i H4H10468P2) je pokazalo da nema merljivo vezivanje na aktivin B na 25 °C ili 37 °C. Neka od antitela su pokazala merljivo vezivanje na aktivin AB sa KD vrednostima u opsezima od približno 18.5pM (tj. 1.85E-11) do 33.1 nM (tj.3.31E-08) na 25 °C (Tabela 7) i od približno 44.3pM (tj.4.43E-11) do 24.2nM (tj.2.42E-08) na 37 °C (Tabela 8). Neka od antitela su pokazala merljivo vezivanje na aktivin AC sa KD vrednostima u opsezima od približno 99.7pM (tj. 9.97E-11) do 11.8 nM (tj. 1.18E-08) na 25 °C (Tabela 9) i od približno 462pM (tj. , 4.62E-10) do 22.5nM (tj. 2.25E-08) na 37 °C (Tabela 10). Pored toga, nijedno od testiranih anti-aktivin A antitela nije pokazalo merljivo vezivanje na inhibin E (podaci nisu prikazani).

Primer 4. Vezivanje antitela na članove familije TGF-beta kako je utvrđeno rezonancom površinskog plazmona

[0140] Aktivin A mAb su testirana za vezivanje sa međusobnom reaktivnošću na panel članova TGF-beta familije. Za eksperiment vezivanja je korišćen instrument Biacore 4000. Antitela H4H10429P, H4H10430P, H4H10436P2, H4H10442P2, H4H10446P2; Kontrola 4 (ActR2B protein rastvorljivog ekto domena proizveden sa C terminusom humanog IgG1 Fc oznaka (ActR2B-hFc; SEK ID BR:227)); i izotipno kontrolno antitelo su registrovani na Biacore CM4 biosenzorsnom čipu koji je prvo derivatizovan kuplungom amina sa monoklonalnim mišjim anti-humanim Fc antitelom (GE, Catalog# BR- 1008-39). Sve Biacore studije vezivanja su izvedene u HBS-T radnom puferskom sredstvu (0.01 M HEPES pH 7,4, 0,5 M NaCl, 3 mM EDTA, 0,5 mg/ml albumina goveđeg seruma, 0,05% v/v Surfaktant P20). Humani ligandi koji su članovi TGF-beta familije su kupljeni od kompanije R&D systems (aktivin A, #338-AC; aktivin B, #659-AB; aktivin AB, #1066-AB; aktivin AC, #4879-AC; BPM2, #355-BM; hBMP4, #314-BP; hBMP6, #507-BP; hBMP7, #354-BP; hBMP9, #3209-BP; hBMP10, #2926-BP; hGDF8, #788-G8; hGDF11, #1958-GD). Sve merenja vezivanja su izvedena na 37 °C. Nivoi snimanja koji se kreću u opsezima od 60 - 200 jedinica rezonance (RUs) su dobijeni za svako od ovih antitela ili rastvorljivi receptor. Na površinu registrovanog antitela su ubrizgani ligandi TGF-beta familije u koncentracijama u opsegu od 3.1nM d 200nM. Vrednosti vezivanja za injekcije 200nM analita su prikazane u Tabeli 11.

Tabela 11: Vezivanje anti-aktvin A monoklonalnih antitela

na ligandima humane TGF-β familije na 37 ° C

[0141] Primećeni odgovori vezivanja registrovanih aktivin A antitela na ubrizgane ligande TGF-beta familije na 200nM bi mogli biti upoređeni sa odgovorima vezivanja negativnog kontrolnog antitela (izotipno kontrolno mAb), koje obezbeđuje meru nespecifičnog vezivanja na pozadinskom nivou, i na reakciju na vezivanje od ActR2B-hFc, koji je primećen da vezuje ceo panel elemenata TGF-beta familije testiranih i samim tim služi kao pozitivni kontrolni protein vezivanja liganda (Tabela 11). Iz ovog poređenja, utvrđeno je da se nekoliko antitela (npr. H4H10430, H4H10442, H4H20446) vezalo na aktivin A, aktivin AB, aktivin AC ali ne poželjno na aktivin B ili na BMP ili GDF ligande. Takođe je utvrđeno da su se neka antitela vezala sa širom unakrsnom reaktivnošću na dodatne ligande TGF-beta familije. Na primer, H4H10429P vezao se poželjno na aktivin A, aktivin B, aktivin AB, aktivin AC i takođe na BMP9 i BMP10. H4H10436P2 je pokazao primetno vezivanje na aktivin A, aktivin B, aktivin AB, aktivin AC, BMP2, BMP4, BMP7, BMP9, i BMP10. Iz ovih podataka je pokazano da je antitela sa različitim specifičnostima vezivanja na ligande TGF-beta familije moguće dobiti posle imunizacije miševa sa aktivin A ligandom.

Primer 5. Analiza međusobnog takmičenja anti-aktivin A antitela

[0142] Ogled međusobnog takmičenja je sproveden da se proceni sposobnost panela od 9 antitela (H4H10446P2, H4H10468P2, H4H10442P2, H4H10423P, H4H10430P, H4H10429P, H4H10432P2, H4H10436P2 i H4H10440P2) da se takmiče jedno sa drugim za vezivanje na humani aktivin A. Dva izotipna kontrolna antitela i dva kontrolna aktivin A antitela, kontrola 1 (humano anti-aktivin A antitelo sa sekvencama promenljivog domena teškog i lakog lanca od "A1" kao što je izneto u US 8,309,082) i Kontrola 3 (MAB3381, dostupni od kompanije R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN) su takođe uključeni u ove oglede. Svi ogledi su izvedeni na 25 °C sa brzinom vibracije mikrotitarske ploče od 1000 ob./min u Octet HBST puferskom sredstvu (0.01 M HEPES pH7,4, 0.15M NaCl, 3 mM EDTA, 0,05% v/v Surfaktant P20, 0,1mg/mL BSA) prema instrukcijama proizvođača (ForteBio Corp., Menlo Park, CA). Ukratko, količina anti-aktivin A antitela koja daje reakciju na vezivanje od približno 1,8nm je registrovana na anti-humanom Fc antitelom obloženim Octet senzorskim vrhovima (Fortebio, # 18-0015) uranjanjem vrhova tokom 5 minuta u 10 µg/mL rastvora svakog anti-aktivin A antitela. Sva preostala anti-hFc mesta vezivanja na vrhovima su blokirana inkubiranjem vrhova u 50ug/mL rastvora irelevantnog antitela tokom 5 minuta. Vrhovi senzora su uronjeni u pregrade ploče sa rastvorom od 50nM aktivina A (R&D Systems, # 338-AC/CF) koji su prethodno vezani sa 1µM drugog anti-aktivin A antitela. Vezivanje drugog aktivin A antitela / aktivin A rastvora na aktivin A antitelom obložen vrh senzora je posmatran tokom 5 minuta na 1000 ob./min. Reakcija vezivanja kompleksa mAb/aktivin A na vrh senzora obložen anti-aktivinom A je upoređen i konkurentno/nekonkurentno ponašanje različitih anti-aktivin A monoklonalnih antitela je određeno. Rezultati su prikazani na Slici 1.

[0143] Na Slici 1, odgovori konkurentnog vezivanja su prikazani u crnim ili svetlo sivim senkama i označavaju da se odgovarajući parovi antitela takmiče međusobno za vezivanje na aktivin A. Svetlo siva kućišta sa crnim fontom predstavljaju reakcije vezivanja za samokonkurenciju između istih antitela. Crna kućišta sa belim fontom predstavljaju antitela koja se takmiče za vezivanje aktivna A u oba smera, nezavisno od redosleda vezivanja. Tamnosiva kućišta sa crnim fontom predstavljaju očitavanja za izotipna kontrolna (tj. nevezujuća) antitela, ukazujući na nedostatak vezivanja izotipnih kontrolnih antitela na antiaktivin A antitelo-aktivin A komplekse (kada se izotipna kontrolna antitela vežu na vrh senzora Octet) ili izostanak vezivanja izotipnih kontrolnih antitela na aktivin A (kada se izotipna kontrolna antitela koriste kao drugo antitelo u pregradama sa aktivinom A). Bela kućišta sa crnim fontom predstavljaju da između antitela nema konkurencije, što nagoveštava da antitela imaju distinktivne epitope vezivanja na aktivin A.

[0144] Četiri antitela, H4H10446P2, H4H10468P2, H4H10442P2, i H4H10423P, se dvosmerno takmiče međusobno za vezivanje na aktivin A. Dodatno, ova četiri antitela se ne takmiče sa kontrolom 1 ili kontrolom 3 za vezivanje. Tri od ova četiri aktivin A antitela, H4H10446P2, H4H10468P2, i H4H10442P2, se ne takmiče unakrsno sa bilo kojim drugim aktivin A antitelima. Jedno od četiri antitela (H4H10423P) se takođe dvosmerno takmiči sa H4H10430P za vezivanje na aktivin A. Pet antitela, H4H10430P, H4H10429, H4H10432P2, H4H10436P2, i H4H10440P2, se dvosmerno takmiče jedno sa drugim za vezivanje na aktivin A, kao i sa kontrolom 1 i kontrolom 3. Četiri od pet antitela (tj. H4H10429, H4H10432P2, H4H10436P2, i H4H10440P2) se ne takmiči unakrsno sa bilo kojim drugim aktivin A antitelima, pri čemu H4H10423P se takođe unakrsno takmiči sa H4H10430P, kao što je napomenuto gore u tekstu.

[0145] Rezultati iz ovog Primera ukazuju da je anti-aktivin A antitela moguće grupisati u dva različita profila, tzv. "bina" na osnovu karakteristika vezivanja epitopa: Bin 1 uključuje H4H10423P, H4H10446P2, H4H10468P2 i H4H10442P2. Bin 2 uključuje H4H10429, H4H10430P, H4H10432P2, H4H10436P2, i H4H10440P2. Pored toga, jedno antitelo iz svakog bina, tj. H4H10423P i H4H10430P, se unakrsno takmiči sa drugim. Rezultati iz ovog Primera ukazuju na to da se antitela iz Bina 1 vezuju na distinktivne regione na aktivnu A nego antitela iz bina 2.

Primer 6. Inhibicija aktivacije receptora posredovane aktivinom A i signaliziranja SMAD kompleksa sa anti-aktivin A antitelima

[0146] Da bi se detaljnije karakterisala anti-aktivin A antitela, razvijen je bioogled za detektovanje aktivacije receptora aktivina tip IIA i IIB (ActRIIA i ActRIIB, prema opisanom redosledu) i naknadna fosforilacije i aktivacije receptora aktivina tip I. Interakcija između ActRIIA i ActRIIB i aktivina dovodi do uvođenja raznovrsnih ćelijskih procesa uključujući regulaciju rasta, metastazu ćelija kancera i diferencijaciju embrionskih matičnih ćelija (Tsuchida, K. et al., Cell Commun Signal 7:15 (2009)). Fosforilacija i aktivacija receptora tipa I dovodi do fosforilacije SMAD 2 i 3 proteina koji formiraju aktivne SMAD komplekse koji dovode do transkripcione regulacije gena.

[0147] Da bi se detektovala aktivacija SMAD kompleksa putanje prenosa signala preko vezivanja aktivina na receptore aktivina tip II, humana A204 linija ćelije rabdomiosarkoma (ATCC, # HTB-82) je transfektovana sa plazmidom reporterom Smad 2/3-luciferaze (CAGAx12-Luc; Dennler, 1998) da bi se stvorila A204/CAGAx12-Luc linija ćelije. A204/CAGAx12-Luc ćelije su održavane u MekKojevom (McCoy’s) 5A (Irvine Scientific, # 9090) suplementiranom sa 10% seruma goveđeg fetusa (FBS), penicilin/streptomicin/glutamin i 250 µg/mL od G418. Za bioogled, A204/CAGAx12-Luc ćelije su zasejane na ogledne ploče sa 96 pregrada sa 10.000 ćelija/pregradi u podlozi sa malo seruma, 0,5% FBS i OPTIMEM (Invitrogen, #31985-070), i inkubirane na 37 °C i 5% CO2 tokom noći. Da bi se utvrdila reakcija na dozu liganda, aktivin A (R&D Systems, #338-AC), aktivin B (R&D Systems, #659-AB), aktivin AB (R&D Systems, #1066-AB) i aktivin AC (R&D Systems, #4879-AC/CF) su serijski razblaženi u odnosu 1:3 od 100 do 0,002nM i je dodat u ćelije počevši zajedno sa kontrolom koja nije sadržala aktivin. Za aktivin A, aktivin B, aktivin AB, i aktivin AC je primećeno da aktiviraju A204/CAGAx12-Luc liniju ćelije sa EC50 vrednostima 99 pM, 47 pM, 19 pM, i 4.4 nM, prema opisanom redosledu. Da bi se izmerila inhibicija, antitela su serijski razblažena u odnosu 1:3 počevši od 100 do 0,002nM, 1000 do 0,02nM, ili 300 do 0,005nM uključujući kontrolne uzorke koji obuhvataju bilo odgovarajuće izotipno kontrolno antitelo ili nijedno antitelo i dodato u ćelije sa konstantnom koncentracijom 100 pM aktivina A, 50 pM aktivina B, 30 pM aktivina AB ili 4nM aktivina AC. Takođe je korišćeno kao pozitivno blokirajuća kontrola 4 (ActRIIB-hFc; SEK ID BR:227). Posle 5,5 sati od inkubacije na 37 °C i 5% CO2, OneGlo supstrat (Promega, # E6051) je dodat i zatim je detektovana aktivnost luciferaze korišćenjem Victor X (Perkin Elmer) instrumenta. Rezultati su analizirani korišćenjem nelinearne regresije (4-parametarne logistike) sa softverom Prism 5 (GraphPad).

[0148] Kao što je prikazano u Tabeli 12, anti-aktivin A antitela su blokirala 100 pM aktivina A sa IC50 vrednostima u opsegu od 39 pM do 3.5 nM, dok je kontrola 1 blokirana sa IC50 vrednošću od 83 pM. Podskup anti-aktivin A antitela su testirana za blokiranje aktivina B, AB, i AC. Četiri od 9 antitela testiranih je blokiralo 50 pM aktivina B sa IC50 vrednostima u opsezima od 130 pM do 100 nM. Pet antitela je testirano za blokadu aktivina B samo je blokirano pri visokim koncentracijama antitela, dok kontrola 1 nije pokazala nikakvu merljivu blokadu aktivina B. Osam testiranih antitela je blokiralo 30 pM aktivina AB sa IC50 vrednostima u opsezima od 100 pM do 8.2 nM, dok je kontrola 4 blokirana sa IC50 vrednošću od 540 pM. Jedno antitelo, H4H10423P, je samo pokazalo slabu blokadu aktivina AB. Sedam od 8 antitela testiranih je blokiralo 4nM aktivina AC sa IC50 vrednostima u opsezima od 580 pM do 6.5 nM, dok je kontrola 4 blokirana sa IC50 vrednošću od 1,1 nM. Jedno antitelo, H4H10423P, nije pokazalo nikakvu blokadu aktivina AC. Oba mišja IgG (mlgG izotip kontrola) i humani IgG (hlgG izotip kontrola) negativne kontrole nisu blokirale aktivaciju liganda tih receptora.

Tabela 12: Inhibicija aktivina A, aktivina B, aktivina AB i aktivina AC pomoću anti-aktivin A antitela (IC50 [M])

[0149] . Bioogled korišćenja A204/CAGAx12-Luc ćelija bi mogao biti stimulisan i pomoću GDF8 (R&D Systems, kat # 788- G8/CF) i GDF11 (R&D Systems, kat # 1958-GD-010/CF). Da bi se testirala funkcionalna inhibicija ovih liganada sa antitelima aktivina A, ogled je izveden korišćenjem uslova opisanih gore u tekstu ali supstituisanje GDF8 ili GDF11 za aktivacioni ligand, što je kao rezultat dalo EC50 vrednosti od 188 pM i 84 pM, prema opisanom redosledu. U ovom ogledu, aktivacija konstantnom koncentracijom 0,50 nM GDF8 ili 0,40 nM GDF11 je potpuno blokirana Kontrolom 4 sa IC50 vrednostima od 298 pM i 214 pM, prema opisanom redosledu. Korišćenje ovih istih konstantnih

1

koncentracija liganda, bez inhibicije bilo GDF8 ili GDF11 je primećeno pomoću aktivin A antitela, H4H10446P2 i H4H10430P, kada je testirano na najviše do 100 nM antitela. Nekog specifičnog dana, aktivin A antitela H4H10429P i H4H10436P2 su testirana za inhibiciju u ovom ogledu u prisustvu konstantnih koncentracija 250 pM GDF8 ili 250 pM GDF11, i nije primećena nikakva inhibicija posle inkubacije ćelija sa najviše do 150 nM testiranih aktivin A antitela; GDF8 i GDF11 sam u ovom ogledu su ispoljili EC50 vrednosti od 124pM i 166pM, prema opisanom redosledu. Ovi podaci su pokazali da aktivin A antitela H4H10446P2, H4H10430P, H4H10429P i H4H10436P2 ne inhibiraju funkcionalno GDF8 ili GDF11.

Primer 7. Stimulacija hipertrofije mišića skeleta korišćenjem aktivin A antitela

[0150] Hipertrofija mišića skeleta indukovana isporukom antagonista specifičnog za miostatin, anti-GDF8 antitelo H4H1657N2 (videti US 2011-0293630 A1), ili kombinaciju H4H1657N2 i različitih anti-aktivin A antitela, je procenjena kod CB17 SCID miševa. Nivo hipertrofije je izmeren u odnosu na lečenje sa izotip-odgovarajućim kontrolnim antitelom. Takođe je uključeno u ove studije lečenje sa vanćelijskim domenom humanog ActRIIB, proizvedenog sa Fc domenom humanog IgG1 C terminusa (Kontrola 4, SEK ID BR: 227). Kontrola 4 je prethodno pokazala da indukuje hipertrofiju mišića in vivo i takođe da se veže i blokira aktivnost više liganada članova TGF-beta familije (Souza, TA et al. Mol Endocrinol 22:2689-702 (2008); Lee, SJ et al. Proc Natl Acad Sci U.S.A.102(50):18117-22 (2005)).

[0151] Ukupno osam anti-aktivin A antitela i kontrola 1 su testirani u kombinaciji sa H4H1657N2 ili sami u osam studija, u poređenju sa izotipnom kontrolom, kontrolom 4, H4H1657N2 samim, ili kontrola 2 (anti-aktivin RIIB antitelo sa VH/VL tog antitela MOR08159 opisanim u US 2010/0272734 A1) terapijskim grupama. Za studije, mužjaci CB17 SCID miševa (Taconic, #CB17SC-M) sa otprilike 10 nedelja starosti su podeljeni ravnopravno prema telesnoj težini u 6 grupa od po 5 miševa. Grupe miševa su lečene u svakoj studiji kao što je opisano u Tabeli 13.

2

Tabela 13: Antitela i kontrole testirani u in vivo studijama hipertrofije mišića

(nastavak)

4 (nastavak)

(nastavak)

[0152] Za studije 1-5, 7, i 8, antitela i Kontrola 4 su isporučeni potkožno u dozi od 10 mg/kg svakog proteina dva puta tokom prve nedelje eksperimenta (0. i 3. dana) i jednom u dozi od 10 mg/kg svakog proteina tokom druge nedelje (7. dana). U krajnjoj dozi antitela ili Kontrole 4 tokom treće nedelje (14. dana) je isporučeno potkožno u 8mg/kg za studije #1 i #2 ili u 10mg/kg za studije #3 - #8 (Tabela 13). 21. dana, miševi su eutanazirani i ukupna telesna težina za svakog miša je izmerena. Za studiju 6, antitela su isporučena za prethodne studije 1-5 ali lečenje je produženo do 28. dana sa dodatnom injekcijom 21. dana. Mišići prednje tetive (tibialis anterior) (TA) i trbušasti mišić list (gastroknemijus) (GA) svakog miša su disektirani i izmereni. Težine tkiva su normalizovane do početne telesne težine, i izračunat je srednji procenat promene u težini tokom srednje težine izotipne kontrolne grupe terapijskog antitela. Rezultati sažeto prikazani u Tabelama 14-21 su izraženi kao srednje procentualno povećanje u odnosu na izotipnu kontrolu ± standardna greška srednje vrednosti.

Tabela 14: Procenat promene težine organizma i težine mišića u poređenju sa terapijom izotipnom kontrolom, Studija 1

[0153] Kao što je prikazano u Tabeli 14, u prvoj studiji, Kontrola 4 je indukovala značajnu hipertrofiju kod svih ispitanih mišića, sa povećanjima od 45,80 ± 1,47% kod TA, i 31,91 ± 1,4% za GA težine kada se uporedi sa izotipnom kontrolom lečenih miševa. Lečenje samo sa H4H1657N2 je takođe indukovalo hipertrofiju kod TA (19,54 ± 2,67% povećanja) i GA (26,46 ± 3,63% povećanja) težine mišića, ali je bilo manje efikasno od Kontrole 4. Kombinacija H4H1657N2 H4H10442P2 je uvela slična povećanja u prosečnim TA (40,76 ± 2,59%) i GA (30,62 ± 2,32%) težinama mišića u poređenju sa miševima lečenim Kontrolom 4. Kombinovane terapije H4H1657N2/H4H10423P i H4H1657N2/H4H10432P2 nisu indukovale povećanja u pogledu prosečnih TA težina toliko velikim kao one koje su indukovane putem H4H16757N2/H4H10442P ili lečenjima Kontrolom 4.

Tabela 15: Procenat promene težine organizma i težine mišića u poređenju sa terapijom izotipnom kontrolom, Studija 2

[0154] Kao što je prikazano u Tabeli 15, u drugoj studiji, Kontrola 4 je indukovala hipertrofiju kod svih ispitanih mišića, sa povećanjima od 43,47 ± 2,37% za prosečnu težinu TA, i 29,24 ± 2,22% za prosečnu težinu GA mišića u poređenju sa izotipnom kontrolom lečenih miševa. U ovoj studiji, lečenje samo sa H4H1657N2 je takođe indukovalo povećanja prosečnih težina mišića TA i GA (16,7 ± 2,73% i 18,54 ± 3,48%, prema opisanom redosledu u poređenju sa miševima lečenim izotipnom kontrolom, ali su ova prosečna povećanja bila manja od onih primećenih za terapijsku grupu koja je dobijala Kontrolu 4. Kombinovane terapije H4H1657N2/H4H10429P i H4H1657N2/H4H10436P2 su indukovale povećanja u prosečnim TA (34,14 ± 2,55% i 29,31 ± 1,59%, prema opisanom redosledu) i prosečni GA (26,24 ± 3,11% i 26,55 ± 2,41%, prema opisanom redosledu), povećanja koja su bila između povećanja primećenih za bilo H4H1657N2 ili za samo Kontrolu 4. Kombinacija H4H1657N2/H4H10440P2 nije indukovala povećanja u prosečnim težinama TA ili GA toliko velika kao povećanja indukovana drugim dvema kombinacijama u ovoj studiji ili pomoću Kontrole 4 korišćene za lečenje.

Tabela 16: Procenat promene težine organizma i težine mišića u poređenju sa terapijom izotipnom kontrolom, Studija 3

[0155] Kao što je prikazano u Tabeli 16, u trećoj studiji, Kontrola 4 je indukovala hipertrofiju kod svih ispitanih mišića, sa povećanjima od 39,90 ± 3,58% za prosečnu težinu TA, i 34,01 ± 2,87% za prosečnu težinu mišića GA u poređenju sa izotipnom kontrolom lečenih miševa. Lečenje samo sa H4H1657N2 je takođe indukovalo povećanja kod TA (14,19 ± 3,19%) i GA prosečne težine mišića (15,73 ± 0,58%) u poređenju sa izotipnom kontrolom lečenim miševima, ali ova prosečna povećanja su bila manja od onih primećenih za terapijsku grupu sa Kontrolom 4. Kombinovano lečenje H4H1657N2/H4H10446P2 je uvelo slična povećanja kod TA (40,01 ± 3,67%) i GA (31,29 ± 2,60%) prosečnim težinama mišića kao u slučaju miševa lečenih Kontrolom 4. Kombinovana terapija sa H4H1657N2/H4H10430P je indukovala povećanja kod TA (28,30 ±_3,27%) i GA (21,55 ± 2,30%) prosečne težine mišića koje su bile između onih koje su primećene za H4H1657N2 sam, i za H4H1657N2/H4H10446P2 kombinovanu terapiju.

Tabela 17: Procenat promene težine organizma i težine mišića u poređenju sa terapijom izotipnom kontrolom, Studija 4

[0156] Kao što je prikazano u Tabeli 17, u četvrtoj studiji, H4H1657N2 je indukovala hipertrofiju kod svih ispitanih mišića, sa povećanjima od 21,05 ± 2,64% za prosečnu težinu TA, i 22,85 ± 2,28% za prosečnu težinu mišića GA u poređenju sa izotipnom kontrolom lečenih miševa. U ovoj studiji, lečenje samo sa H4H10430P je blago povećalo težine mišića u poređenju sa težinama miševa lečenih izotipnom kontrolom ali vrednosti nisu bile statistički značajne. Kombinovana terapija H4H1657N2 i H4H10430P na 10mg/kg i 2mg/kg, prema opisanom redosledu, je indukovala povećanja u TA (39,02 ± 3,55%) i GA (27,57 ± 1,26%) prosečne težine mišića su bile veće za mišiće TA od onih koje su primećene za H4H1657N2 ili H4H10430P samostalno uzet. Kombinovana terapija H4H1657N2 i H4H10430P na 10 mg/kg i 10 mg/kg, prema opisanom redosledu, je indukovala povećanja u TA (40,20 ± 2,48%) i GA (22,46 ± 5,03%) prosečne težine mišića su bile veće za TA mišić od onih koje su primećene za H4H1657N2 ili H4H10430P samostalno uzet. Kombinovana terapija H4H1657N2 i H4H10430P na 10 mg/kg i 25 mg/kg, prema opisanom redosledu, je indukovala povećanja i TA (44,92 ± 5,70%) i GA (30,22 ± 2,97%) prosečne težine mišića su bile veće za TA mišić od onih koje su primećene za H4H1657N2 ili H4H10430P samostalno uzet.

Tabela 18: Procenat promene težine organizma i težine mišića u poređenju sa terapijom izotipnom kontrolom, Studija 5

[0157] Kao što je prikazano u Tabeli 18, u petoj studiji, H4H1657N2 je indukovala hipertrofiju kod svih ispitanih mišića, sa povećanjima od 25,4 ± 1,35% za prosečnu težinu TA, i 22,82 ± 1,97% za prosečnu težinu mišića GA u poređenju sa izotipnom kontrolom lečenih miševa. U ovoj studiji, lečenje samo sa H4H10446P2 je indukovalo nizak nivo hipertrofije mišića sa povećanjem 3,70 ± 1,67% za prosečnu težinu TA mišića i 2,70 ± 1,06% za prosečnu težinu GA mišića u poređenju sa miševima lečenim izotipnom kontrolom. Kombinovana terapija H4H1657N2 i H4H10446P2 na 10mg/kg i 2mg/kg, prema opisanom redosledu, je indukovala povećanja u TA (51,29 ± 4,20%) i GA (39,24 ± 3,08%) prosečne težine mišića su bile veće od onih koje su primećene za H4H1657N2 ili H4H10446P2 samostalno uzet. Kombinovana terapija H4H1657N2 i H4H10446P2, svaki u dozi od 10 mg/kg, je indukovala povećanja prosečnih težina mišića za TA (49,64 ± 4,08%) i GA (35,56 ± 3,39%) prosečne težine mišića su bile veće od onih koje su primećene za H4H1657N2 ili H4H10446P2 samostalno uzet. Kombinovana terapija H4H1657N2 i H4H10446P2 na 10 mg/kg i 25 mg/kg, prema opisanom redosledu, je indukovala povećanja u TA (49,79 ± 5,46%) i GA (35,14 ± 3,49%) prosečne težine mišića su bile veće od onih koje su primećene za H4H1657N2 ili H4H10446P2 samostalno uzet.

Tabela 19: Procenat promene težine organizma i težine mišića u poređenju sa terapijom izotipnom kontrolom, Studija 6

[0158] Kao što je prikazano u Tabeli 19, u šestoj studiji, Kontrola 4 je indukovala hipertrofiju kod svih ispitanih mišića, sa povećanjima od 47,34 ± 2,63% za prosečnu težinu TA, i 32,17 ± 3,81% za prosečnu težinu GA mišića u poređenju sa izotipnom kontrolom lečenih miševa. U ovoj studiji, lečenje samo sa H4H1657N2 je takođe indukovalo povećanja prosečnih težina mišića TA i GA (17,21 ± 2,97% i 21,57 ± 1,90%, prema opisanom redosledu u poređenju sa miševima lečenim izotipnom kontrolom, ali su ova prosečna povećanja bila manja od onih primećenih za terapijsku grupu koja je dobijala Kontrolu 4. U ovoj studiji, lečenje samo sa Kontrolom 1 je indukovalo nizak nivo hipertrofije mišića sa povećanjem 4,54 ± 2,25% za prosečnu težinu TA mišića i 2,72 ± 1,30% povećanja za prosečnu težinu GA mišića u poređenju sa miševima lečenim izotipnom kontrolom. Kombinovana terapija H4H1657N2 i Kontrola 1 na 10 mg/kg i 10 mg/kg, prema opisanom redosledu, je indukovala povećanja u TA (30,06 ± 5,51%) i GA (30,72 ± 3,64%) prosečne težine mišića su bile veće od onih koje su primećene za H4H1657N2 ili Kontrolu 1 samostalno uzetu.

1

Tabela 20: Procenat promene težine organizma i težine mišića u poređenju sa terapijom izotipnom kontrolom, Studija 7

[0159] Kao što je prikazano u Tabeli 20, u sedmoj studiji, Kontrola 4 je indukovala hipertrofiju kod svih ispitanih mišića, sa povećanjima od 34,43 ± 5,92% za prosečnu težinu TA, i 14,86 ± 3,65% za prosečnu težinu GA mišića u poređenju sa prosečnom težinom GA mišića miševa lečenih izotipnom kontrolom. U ovoj studiji, lečenje samo sa Kontrolom 2 je indukovalo hipertrofiju ispitanih mišića, sa povećanjima od 36,75 ± 3,88% u proseku težina TA i 26,41 ± 3,16% za prosečnu težinu mišića ga je upoređena sa izotipnom kontrolom lečenih mišića. Kombinovano lečenje H4H1657N2 i H4H10430P sa 10 mg/kg i 10 mg/kg, prema opisanom redosledu, je indukovalo povećanja, kod TA (33,13 ± 2,02%) i GA (22,82 ± 1,34%) prosečne težine mišića između dva povećanja primećena za ActRIIB-Fc samo i za Kontrolu 2 samu. Kombinovano lečenje H4H1657N2 i H4H10446P2 korišćenjem doze od 10 mg/kg i 10 mg/kg, prema opisanom redosledu, je indukovalo povećanje za TA (41,28 ± 2,76%) i GA (29,21 ± 2,62%) prosečnih težina mišića.

Tabela 21: Procenat promene težine organizma i težine mišića u poređenju sa terapijom izotipnom kontrolom, Studija 8

2

[0160] Kao što je prikazano u Tabeli 21, u osmoj studiji, Kontrola 4 je indukovala hipertrofiju kod svih ispitanih mišića, sa povećanjima od 53,74 ± 5,31% za prosečnu težinu TA, i 39,39 ± 4,56% za prosečnu težinu GA mišića u poređenju sa prosečnom težinom GA mišića miševa lečenih izotipnom kontrolom. U ovoj studiji, lečenje samo sa H4H1657N2 je takođe indukovalo povećanja prosečnih težina mišića na TA i GA (18,44 ± 2,30% i 21,17 ± 1,72%, prema opisanom redosledu u poređenju sa miševima lečenim izotipnom kontrolom, ali su ova prosečna povećanja bila manja od onih primećenih za terapijsku grupu koja je dobijala Kontrolu 4. U ovoj studiji, lečenje samo sa Kontrolom 2 je indukovalo hipertrofiju ispitanih mišića, sa povećanjima od 39,90 ± 1,69% u proseku težina TA i 25,87 ± 2,72% za prosečnu težinu mišića GA je upoređena sa izotipnom kontrolom lečenih mišića. Kombinovano lečenje H4H1657N2 i H4H10423P sa 10 mg/kg i 25 mg/kg, prema opisanom redosledu, je indukovalo povećanja na TA (36,33 ± 3,67%) i GA (28,18 ± 3,11%) prosečnih težina mišića u poređenju sa izotipnom kontrolom lečenih miševa. Kombinovano lečenje H4H1657N2 i H4H10430P sa 10 mg/kg i 25 mg/kg, prema opisanom redosledu, je indukovalo povećanja, kod TA (43,83 ± 1,56%) i GA (31,24 ± 1,90%) prosečne težine mišića između dva povećanja primećena za Kontrolu 4 i za Kontrolu 2 samu.

[0161] Ove studije pokazuju da isporuka anti-aktivin A antitela sa inhibitorom miostatina može dodatno da poveća hipertrofiju mišića skeleta do značajno višeg stepena nego što je terapija sa samo inhibitorom miostatina kada je reč o testiranim dozama i učestalostima injekcija.

Primer 8. Blokiranje vezivanja aktivina A korišćenjem aktivin A antitela

[0162] Sposobnost izabranih anti-aktivin A antitela da blokiraju interakciju aktivina A sa njegovim receptorima, ActRIIB i ActRIIA, kao i njegov endogeni antagonist, folistatin, je određena korišćenjem Biacore 3000 instrumenta. Za ovaj eksperiment, Kontrola 4 (humano ActRIIB je izražen sa humanom Fc oznakom na C terminusu (SEK ID:227)), humano ActRIIA izraženo sa humanom Fc oznakom na C terminusu (hActRIIA-Fc; R&D Systems, # 340-R2-100), ili Follistatin-288 (R&D Systems, #5836-FS-025) su spojeni sa aminom na Biacore CM5 površini senzora. Aktivin A (R&D Systems, #338-AC) pri fiksnoj koncentraciji 5 nM bilo samog ili pomešanog sa aktivin A antitelima, hActRIIA-Fc, hActRIIB-Fc, ili izotip kontrolnim antitelom u finalnoj koncentraciji od 60 nM (12-struki molarni višak nad aktivinom A) je inkubiran na sobnoj temperaturi tokom 1 sat. Mešavine antitelo-aktivin A su zatim ubrizgane preko sa aminom spojene Kontrole 4, hActRIIA-Fc, ili Follistatin- 288 površina pri brzini protoka od 20 µL/min. Signal vezivanja (RU) je izmeren na 150 sekundi posle početka injekcije, i ovaj signal je oduzet izmerenom RU vrednošću za referentnu površinu za negativnu kontrolu da bi se odredio specifičan signal vezivanja. Procenat slobodnog vezivanja aktivina A preko površina receptora ili antagonista u prisustvu svakog anti-aktivin A antitela je izračunat kao odnos primećenog specifičnog signala vezivanja podeljenog sa specifičnim signalom vezivanja od 5nM aktivina A u prisustva ijednog antitela.

Tabela 22: Blokiranje vezivanja aktivina A na folistatin pomoću anti-aktivin A antitela

mAb/protein concentration (nM)- mAb/koncentracija proteina (nM); Kontrola 4; izotipna (-) kontrola

[0163] Kao što je prikazano u Tabeli 22, testirano je 6 od 7 anti-aktivin A antitela i oba kontrolna antitela, kontrolno 1 i kontrolno 3, su blokirala vezivanje aktivina A na Follistatin-288. Jedno antitelo, H4H10423P, nije sprečilo vezivanje aktivina A na folistatin-288. Kontrola 4 i hActRIIA-Fc su blokirali vezivanje aktivina A na folistatin-288 pri višim koncentracijama.

4

Tabela 23: Blokiranje vezivanja aktivina A na hActRIIA-Fc pomoću anti-aktivin A antitela

[0164] Kao što je prikazano u Tabeli 23, 4 od 7 anti-aktivin A antitela je testirano i oba kontrolna, kontrolno 1 i kontrolno 3, su blokirala vezivanje hActRIIA-Fc na aktivin A. Ova antitela, H4H10442P2, H4H10446P2, i H4H10423P, nisu sprečila vezivanje aktivina A na hActRIIA-Fc. Kontrola 4 i hActRIIA-Fc su blokirali vezivanje aktivina A na hActRIIA-Fc.

Tabela 24: Blokiranje vezivanja aktivina A na hActRIIA-Fc pomoću anti-aktivin A

[0165] Kao što je prikazano u Tabeli 24, testirano je 4 od 7 anti-aktivin A antitela i oba kontrolna antitela, kontrolno 1 i kontrolno 3, su blokirala vezivanje aktivina A na hActRIIB-Fc. Dva antitela, H4H10442P2 i H4H10446P2, nisu sprečila vezivanje aktivina A na hActRIIB-Fc. Jedno antitelo, H4H10423P, je pokazalo sposobnost da delimično blokira vezivanje aktivina A na hActRIIB-Fc pri višim koncentracijama testiranog antitela. Oba, i hActRIIB-Fc i hActRIIA-Fc, su blokirala vezivanje aktivina A na hActRIIB-Fc.

Primer 9. Dejstva H4H1657N2 na mišićnu masu i učinak vežbanja

[0166] Dejstva anti-GDF8 antitela H4H1657N2 na mišićnu masu i učinak vežbanja je procenjen kod starih mužjaka C57BL/6 miševa (starih 19 meseci).

[0167] Miševi su nasumično podeljeni u četiri grupe (n=6-8/grupa), sedeća i vežbajuća grupa su primile potkožno doze H4H1657N2 ili izotipno kontrolno antitelo (10 mg/kg) dvaput nedeljno tokom 21 dan (6 injekcija). Miševi u vežbajućoj grupi su postavljeni na režim vežbanja koji je uključivao jednu sesiju treninga dnevno, koja je uključivala 20 minuta na Exer 6M stazi za trčanje u prostoriji (Columbus Instruments, Columbus, OH) na 10 m/min sa 5° nagiba, pet dana nedeljno tokom tri uzastopne nedelje. Na kraju tri nedelje terapije, izmerena je izdržljivost u sve četiri grupe korišćenjem testa iscrpljivanja staze za trčanje u prostoriji. Podaci su analizirani sa dvosmernim ANOVA posle čega je usledio Takijev (Tukey) HSD test. Težine mišića su prijavljene kao normalizovane težine (tj. težine mišića su normalizovane prema telesnim težinama izmerenim na početku eksperimenta). Rezultati za četvoroglavi mišić su prikazani u Tabeli 25 kao prosečna promena u % za svaku grupu (± standardna greška srednje vrednosti) upoređeni sa grupom sa izotip kontrolnim antitelom.

Tabela 25: Promena težine kvadracept (četvoroglavog) mišića

[0168] Kao što se vidi u Tabeli 25, H4H1657N2 terapija je dala kao rezultat značajna povećanja mase kvadriceps (četvoroglavih) mišića (p<0,01 značaj u odnosu na izotip kontrolu za obe H4H1657N2 grupe). Povećanja težina grupa mišića zadnje strane ekstremiteta (TA, GA,) su utvrđena kod miševa koji su vežbali (17,4%, 12,5%, prema opisanom redosledu) i kod starih miševa koji su uglavnom sedeli (14,1%, 11,6%, prema opisanom redosledu), u poređenju sa izotipnim kontrolnim antitelom. Blago povećanje težine miševa je primećeno između miševa koji su vežbali i starih koji su sedeli koji su primili izotipno kontrolno antitelo, ali nije bilo statistički značajno (Tabela 25).

[0169] Dejstva H4H1657N2 terapije na izdržljivost vežbanja je takođe ispitana kod mužjaka miševa starosti 19 meseci C57BL/6 (Tabela 26).

Tabela 26: Testiranje izdržljivosti

[0170] Kod starih miševa koji su vežbali, H4H1657N2 su takođe indukovana povećanja izdržljivosti, kao što je izmereno pomoću vremena provedenog u trčanju na traci za trčanje (73,2 min naspram 50,2 min) i rastojanje (1,33 km naspram 0,93 km), u poređenju sa izotipnom kontrolnom grupom (Tabela 26). Međutim, kod miševa sa sedećim načinom života, H4H1657N2 nije značajno povećao izdržljivost u poređenju sa izotip kontrolnom grupom.

[0171] Kao što je slučaj sa studijom merenja težine mišića, H4H1657N2 je indukovao značajno povećanje izdržljivosti, kako je izmereno pomoću vremena trčanja i rastojanja na traci za trčanje, samo kod miševa koji su vežbali, ali ne i kod miševa sa sedećom svakodnevicom. Ovi rezultati pokazuju da H4H1657N2 povećava rezultate fizičkog učinka kada su kombinovani sa fizičkim vežbanjem.

Primer 10. Dejstva H4H1657N2 na masu mišića skeleta i izometrijsku silu kod miševa

[0172] Sposobnost H4H1657N2 da se indukuje hipertrofija mišića skeleta je ocenjena in vivo kod 9 nedelja starih C57BL/6 miševa.

[0173] Ponovljene potkožne doze H4H1657N2 ili izotipno kontrolno antitelo, sa bilo 10 ili 30 mg/kg, su isporučeni dva puta nedeljno tokom 3 nedelje (n=6). H4H1657N2 terapija tokom 21 dan je proizvela povećanja telesne težine od 4,7 ± 2,3% (n.s.) i 7,1 ± 1,5% (n.s.), prema opisanom redosledu, u poređenju sa miševima koji su primali izotipnu kontrolu isporučenu u jednakim dozama. Pojedinačne težine mišića su povećane kao u nastavku u poređenju sa izotipnom kontrolom (10 mg/kg i 30 mg/kg): Tibialis anterior (mišići prednje tetive) (TA) (19,4 ± 4,9%** i 20,6 ± 1,5%**), Gastroknemijus (trbušasti mišić lista) (GA): (14,9 ± 2,9%** i 25,3 ± 1.9%***), i kvadriceps (četvoroglavi mišić) (17,7 ± 3,6%* i 26,2 ± 3,8%**). (Svi statistički podaci dobijeni pomoću One Way ANOVA sa Takijevim (Tukey) post hoc testom [* p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001; n.s. = nije statistički drugačije].)

[0174] Povećanje mišićne mase kod Tibialis anterior (mišić prednje tetive) (TA) je praćeno povećanjem ex vivo izometrijske sile, što je ukazalo na sposobnost da se održi i funkcija mišića i masa. Miševi su prethodno lečeni ponovljenim potkožnim dozama H4H1657N2 ili izotipnim kontrolnim antitelom (sa 10 mg/kg isporučenih dva puta nedeljno tokom 3 nedelje, n = 6 po grupi) su pojedinačno anestezirani i održavani pod gasom izofuranom dok je Tibialis anterior (mišić prednje tetive) (TA) izvađen, postavljen u oksigeniranu laktatnu ringerovu kupku koja je neprekidno održavana na 25 °C. Superiorni kraj TA je čvrsto vezan na uronjeni podupirač u kupki dok je distalna tetiva vezana na 305C krak poluge (Cambridge Systems). Optimalna dužina je određena blagim ispravljanjem Tibialis anterior (mišić prednje tetive) (TA) i zatim je testirana jačina proizvedena 1Hz stimulacijom na minimalnom naponu. Tibialis anterior (mišić prednje tetive) (TA) mišići su više puta istezani i stimulisani sve dok nije došlo do smanjenja sile i zatim su opušteni u prethodni položaj. Napon je zatim postupno povećan u serijama od 1HZ stimulacija da bi se postigao maksimalni učinak sile. Jednom kada se odrede optimalna dužina i sila, mišići Tibialis anterior (mišić prednje tetive) (TA), su stimulisani tokom 400 milisekundi pri povećanim frekvencijama (40-100Hz) da bi se odredila maksimalna sila tetanske kontrakcije mišića. Tibialis anterior (mišić prednje tetive) (TA) mišići su dobili 2 minuta odmora između svake stimulacije tetanske konstrakcije.

[0175] Tibialis anterior (mišić prednje tetive) (TA) mišići miševa lečenih izotipnim kontrolnim antitelom na 10 mg/kg i 30 mg/kg dozi tokom 21 dan su generisali prosečnu vršnu vrednost sile tetanske kontrakcije od 892,6 ± 37 i 906,1 ± 37,8, prema opisanom redosledu. Tibialis anterior (mišić prednje tetive) (TA) mišići miševa lečenih sa H4H1657N2 su generisali u proseku vršnu silu tetanske kontrakcije od 1041,3 ± 31,7 i 1003,3 ± 35,7 mN, prema opisanom redosledu. Ove vrednosti sile predstavljaju povećanje od 16,7%* (10 mg/kg) i 10,7%n.s (30 mg/kg) u prosečnoj vršnoj vrednosti sile tetanske kontrakcije u poređenju sa izotipnom kontrolom (Slika 2A). Celokupno dejstvo lečenja sa H4H1657N2 na vršnu silu tetanske kontrakcije je bilo statistički različito od izotipne kontrole za obe doze, i za dozu od 10mg/kg i za dozu od 30mg/kg (10mg/kg doza je prikazana na Slici 2B). (Slika 2A: statistička analiza pomoću One Way ANOVA sa Takijevim (Tukey’s) post hoc testom [* p<0,05; n.s. = nije statistički drugačije]. Slika 2B: statistička analiza pomoću Two way ANOVA i Sidaks post hoc testa [p>0,0001].)

Primer 11. H4H1657N2 poboljšava oporavak od atrofije indukovane suspenzijom zadnjeg dela ekstremiteta (HLS)

[0176] Dejstvo H4H1657N2 na masu mišića skeleta tokom faze oporavka od atrofije indukovane 7-dnevnom suspenzijom zadnjeg dela ekstremiteta (HLS) je procenjena kod miševa muškog pola starih godinu dana vrste C57BL/6.

[0177] Na dan 0, osamnaest miševa je okačeno za rep tako da obe zadnje noge ne dodiruju tlo tokom 7 dana. Miševi su smešteni u specijalne kaveze sa besplatnim pristupom hrani i vodi. Istovremeno, jedna dodatna grupa od šest miševa je ostavljena u normalnom kavezu i korišćena kao kontrola (ne-HLS kontrola).7. dana, okačeni miševi su spušteni i nasumično podeljeni po procentu telesne težine izgubljene tokom HLS u tri grupe (n=6 u svakoj grupi).7. dana, težine mišića od ne-HLS kontrolne grupe i jedna HLS grupa (HLS grupa) su uzete da bi se procenio procenat atrofije kao odgovor na HLS. Dve preostale HLS grupe (n=6 u svakoj) su ostavljene da se oporave tokom 8 dana (tj. dan 7 sve do dana 15 ovog eksperimenta) u normalnim kavezima i tretirane su potkožno sa 10 mg/kg doza bilo H4H1657N2 ili izotipne kontrole 7. i 10. dana (tj. posle nula dana i 3 dana od oporavka) (HLS+7Rec+H4H1657N2 i HLS+7rec+izotip kontrola, prema opisanom redosledu). 15. dana (tj. posle 8 dana od oporavka), težine mišića su uzete da bi se procenio procenat oporavka posle atrofije indukovane HLS-om.

[0178] Kao što se vidi na Slici 3B, sedam dana HLS je dalo kao rezultat značajan gubitak mase i kod mišića tibialis anterior (mišić prednje tetive) (TA) i gastroknemijus mišića (trbušasti mišića lista) (GA) (HLS grupa), u poređenju sa ne-HLS kontrolnom grupom (-13,7%* i -14,8%* prema opisanom redosledu). Posle 8 dana od oporavka, HLS+7rec+izotipna kontrolna grupa je zadržala gubitke mišićne mase i mišića tibialis anterior (mišić prednje tetive) (TA) i gastroknemijus (trbušasti mišić lista) (GA) (-6,3% i -7,5%) u poređenju sa ne-HLS kontrolnom grupom, pri čemu je HLS+7Rec+H4H1657N2 grupa pokazala povećanje mase (4,7% i 5%) u poređenju sa ne-HLS grupom čiji zadnji ekstremiteti nisu visili (ne-HLS).

[0179] Kada se uporede dve grupe oporavka (tj. HLS+7Rec+H4H1657N2 naspram HLS+7rec+izotip kontrola), dejstva H4H1657N2 na masu mišića tibialis anterior (mišić prednje tetive) (TA) i gastroknemijus (trbušasti mišića lista) (GA) nisu bila statistički drugačija od dejstava viđenih u grupi koja je primala izotipno kontrolno antitelo. Međutim, dok masa mišića grupe sa HLS+7rec+izotipnom kontrolom nije bila statistički drugačija od grupe čiji zadnji ekstremiteti jesu visili ili kontrolne grupe čiji zadnji ekstremiteti nisu visili (ne-HLS), HLS+7Rec+H4H1657N2 grupa je imala statistički veću masu mišića tibialis anterior (mišić prednje tetive) (TA) i gastroknemijus (trbušastog mišića lista) (GA) kada je upoređena sa grupom čiji zadnji ekstremiteti jesu visili (HLS). (Svi statistički podaci su dobijeni pomoću One Way ANOVA sa Takijevim (Tukey’s) post hoc testom [* p<0,05 vs. Nije-HLS (grupa čiji zadnji ekstremitet nije visio); ## p<0,01 vs. HLS grupa čiji je zadnji ekstremitet visio).)

Primer 12. Inhibicija aktivacije morfogenetskih proteina kosti (BMP) receptora tip I i II pomoću anti-aktivin A antitela i ActRIIB-Fc

[0180] Morfogenetski proteini kosti (BMP) pripadaju TGF- β superfamiliji i uključeni su u regulaciju brojnih fizioloških procesa aktiviranjem receptorskih kompleksa na površini ćelije koji su sastavljeni od receptora morfogenetskih proteina kosti (BMP) tipa I i II.

Aktivacija receptora dovodi do fosforilacije SMAD proteina i transkripcione aktivacije gena koji reaguju na ligand.

[0181] Bioogled je razvijen da se detektuje regulacija morfogenetskih proteina kosti (BMP) signalizovanja u W-20-17 ćelijama, stromalne ćelijske linije koštane srži miša prethodno pokazano da da odgovor na morfogenetske proteine kosti tipa 2 (BMP2). Ćelije su genetski manipulisane da se stabilno eksprimuje reporter luciferaze (tj. element reakcije morfogenetskog proteina kosti (BRE(2X)-luciferaze-IRES-GFP)), i sortirane za visoko eksprimovanje GFP. Stabilna linija ćelije dobijena kao rezultat se pominje kao W-20-17/BRE-luc i održavana je u 10% FBS, DMEM, Pen/Strep, i 200 µg/ml G418. Ove ćelije su korišćene da izmere aktivaciju morfogenetskog proteina kosti (BMP) i inhibiciju ove aktivacije pomoću anti-aktivin A antitela i ActRIIB-hFc (Kontrola 4, SEK ID Br:227).

[0182] Sposobnost četiri anti-aktivin A antitela i ActRIIB-hFc da inhibira signaliziranje morfogenetskog proteina kosti (BMP) je procenjena korišćenjem W-20-17/BRE-luc linije ćelije. Za bioogled, W-20-17/BRE-luc ćelije su zasejane na ogledne ploče sa 96 pregrada sa 10.000 ćelija/pregradi i inkubirane na 37 °C i 5% CO2 tokom noći. Sledećeg dana, BMP2, BMP4, BMP6, BMP9 ili BMP10 su serijski razblaženi u odnosu 1:3 i dodati u ćelije od 100nM do 0,002nM (uključujući nikakav kontrolni morfogenetski protein kosti (BMP) za odgovore na dozu). Za inhibiciju morfogenetskih proteina kosti (BMP) pomoću anti-aktivin A antitela ili ActRIIB-hFc, antitela ili ActRIIB-hFc su bila serijski razblažena u odnosu od 1:3 od 1000 nM do 0,02 nM (uključujući bez antitela, sa kontrolnim antitelom, ili negativnom kontrolom za ActRIIB-hFc (tj. irelevantni protein označen sa hFc, "Kontrolni protein")) i dodati su u ćelije zajedno sa 100 pM BMP2, 100 pM BMP4, 10 nM BMP6, 800 pM BMP9 ili 4 nM BMP10, kao što je naznačeno. Aktivnost luciferaze je detektovana posle 5,5 sati od inkubacije u 37 °C i 5% CO2 sa Victor X (Perkin Elmer) i rezultati su analizirani korišćenjem nelinearne regresivne (4-parametarske logistike) sa softverom Prism 5 (GraphPad).

[0183] Kao što je prikazano u Tabeli 27 dole u tekstu, H4H10446P2 i H4H10430P ne inhibiraju bilo koji od testiranih morfogenetskih proteina kosti (BMP), pri čemu su druga testirana aktivin A antitela (H4H10429 i H4H10436P2) i ActRIIB-hFc sva pokazala nekakvu inhibiciju neke količine morfogenetskih proteina kosti (BMP). H4H10429P je pokazao inhibiciju BMP9 i BMP10 sa IC50 vrednostima od 8,1 nM i 3,5 nM, prema opisanom redosledu, ali nije inhibirao BMP2, BMP4 i BMP6. H4H10436P2 je pokazao slabu inhibiciju BMP2 i BMP4 pri najvišim koncentracijama antitela i inhibiciju BMP10 sa IC50 vrednost od >100nM, ali nije pokazao nikakvu inhibiciju BMP6 i BMP9. ActRIIB-hFc je pokazao inhibiciju BMP9 i BMP10 sa IC50 vrednostima od 2nM i 1nM ali nije inhibirao BMP2, BMP4, i BMP6. Nijedan od kontrolnih molekula (tj. izotipno kontrolno antitelo (Kontrolno mAb) i irelevantni

1

protein označen sa hFc (Kontrolni protein)), su potvrđeno da inhibiraju bilo koji od morfogenetskih proteina kosti (BMP), pri čemu BMP2, BMP4, BMP6, BMP9, ili BMP10 sam (tj. bez antitela ili hFc-označeni proteini) aktivirane W-20-17/BRE-luc ćelije sa EC50 vrednostima od 34 pM, 63 pM, 4.5 nM, 260 pM, i 2.5 nM, prema opisanom redosledu.

Tabela 27. Inhibicija anti-aktivin A antitelima i ActRllb-hFc od BMP u W-20-17/BRE-luc ćelijama

Primer 13. Lečenje sa anti-aktivin A antitelom H4H10446P2 smanjuje bubrežne fibroze in vivo

[0184] Dejstvo specifičnog anti-aktivin A antitela iz ovog pronalaska, H4H10446P2, na bubrežnu fibrozu je određeno na jednostranoj začepljenosti mokraćovoda (UUO) na modelu miša za bubrežnu fibrozu. UUO model je razvijen potpunom ligacijom levog mokraćovoda dok funkcije desnog bubrega drži nedirnutom. Ukratko, UUO je izvedeno kod miševa pod Ketamin/Ksilazin (Xylazine) anestezijom, pri čemu je levom mokraćovodu pristupljeno preko bočne incizije, i dve ligature su postavljene na proksimalnoj jednoj trećini mokraćovoda korišćenjem 5-0 svilene niti na rastojanju od 5 mm. Urađene su lažne hirurgije na sličan način bez postavljanja bilo kojih ligatura na mokraćovodu. Na ovom modelu, na bubregu se razvija ozbiljna fibroza u roku od 14 dana posle 14 dana posle UUO, što je procenjeno merenjem kolagena u bubregu direktnim merenjem količine hidroksiprolina u uzorku, koji se pominje kao hidroksiprolin postupak. Hidroksiprolin je

2

specifična komponenta kolagena, i predstavlja približno 14,4% aminokiselinske supstance kolagene u većini tkiva sisara (Cochrane et al., J Am Soc Nephrol 16:3623-30 (2005)). Da bi se izmerio sadržaj kolagena preko postupka hidroksiprolina, prvi zamrznuti uzorci bubrega su osušeni tokom noći korišćenjem vakuumske komore. Osušeni uzorci tkiva bubrega su zatim homogenizovani u ledeno hladnom NaCl/NaHCO3 rastvoru i zatim su hidrolizovani korišćenjem 6 M HCI. Uzorci su naknadno osušeni korišćenjem vakuumske centrifuge, i zatim su rehidratisani korišćenjem 0,1 M HCI. Hidroksiprolin u rehidratisanim uzorcima je oksidiran sa 300 mM Chloramine T (Sigma, # 857319) i Erlihovom (Ehrlich’s) reagensu [3.5M p-dimetilaminobenzaldehid (FW: 149.19, Sigma, # 39070) u 60% perhlorne kiseline (Sigma, # 311413)] je zatim dodat da bi se razvila boja. Najzad, korišćenjem spektrofotomerača, apsorpcija uzoraka je izmerena na 558 nm i ovo je upoređeno sa standardima za hidroksiprolin (Sigma, # H5534) poznate koncentracije, da bi se utvrdio sadržaj hidroksiprolina u bubregu. Izmerena vrednost hidroksiprolina je zatim pomnožena faktorom 6,94 da bi se odredila vrednost kolagena. Četrnaest dana posle UUO, suve težine bubrega se smanjuju kao rezultat parenhimalnog oštećenja. Lažne (n = 10) ili UUO (n = 20) hirurške operacije su izvedene na 16 nedelja starim mužjacima miševa C57BL/6 (Taconic farms, Inc.). Miševi, koji su prošli UUO hiruršku operaciju, su zatim podeljeni u dve grupe. Svaka UUO grupa je primila potkožnu injekciju od bilo H4H10446P2 (40 mg/kg, n = 10) ili izotip kontrolnog antitela (40 mg/kg, n = 10), koje se ne vezuje na bilo koji poznat mišji protein, počevši od dana prehirurških operacija, i 1, 3, 6, 8, 10, i 13 dana posle hirurške operacije. Miševi koji su podvrgnuti lažnoj hirurškoj operaciji su primili pomoćno farmaceutsko sredstvo (sterilni PBS) tokom ovog vremena korišćenjem istog rasporeda kao UUO grupa. Svi miševi su žrtvovani 14 dana posle hirurške operacije. Izmerene su težine bubrega, i bubrezi su brzo zamrznuti korišćenjem tečnog azota, i čuvani na -80°C sve dok sadržaj kolagena nije izmeren. Sadržaj kolagena u bubregu je izmeren korišćenjem hidroksiprolin postupka, i zatim je izražen kao bilo ukupan kolagen u bubregu (µg) ili kolagen u bubregu normalizovan na težinu bubrega (µg/mg suve težine). Statistička analiza je urađena korišćenjem One-Way ANOVA sa Takijevim (Turkey’s) testom višestrukog poređenja. Rezultati uključuju sažet ukupan kolagen u bubregu, normalizovani kolagen u bubregu, i suve težine bubrega za svaku terapijsku grupu su izražene kao srednja vrednost<±>SEM u Tabeli 28 dole u tekstu.

Tabela 28. Ukupan kolagen bubrega, normalizovani kolagen bubrega, i težina bubrega na suvo u svakoj grupi (srednje ± SEM)

[0185] Kao što je prikazano u Tabelia 28, i ukupan kolagen u bubregu i kolagen u bubregu normalizovan na težinu bubrega je bio značajno povećan kod miševa u UUO grupi u poređenju sa miševima sa lažnom operacijom. UUO miševi lečeni sa H4H10446P2 su ispoljili značajno smanjenje i za ukupni kolagen u bubregu i kolagen u bubregu normalizovan na težinu bubrega (približno 45% smanjenja u fibroznom kolagenu) u poređenju sa izotipnim kontrolnim antitelom tretiranim UUO miševima, koji ukazuje da anti-aktivin A antitelo dovodi do smanjene fibroze u bubregu. UUO miševi tretirani sa H4H10446P2 ispoljili su povećanje suve težine bubrega u poređenju sa izotipnim kontrolnim antitelom lečenih UUO miševa, što ukazuje na očuvanje parenhima za miševe lečene anti-aktivin A antitelom.

Primer 14. Dejstva H4H10446P2 na telesnoj težini i masa mišića kod miševa prekomerno eksprimovanje aktivina A

[0186] Da bi se procenila efikasnost H4H10446P2 kod neutralizacije povišenih nivoa aktivina A u miševa, aktivina A je prekomerno eksprimovana u C57BL/6 miševe (10 nedelja starosti) u hidrodinamičkoj isporuci (HDD) od DNK konstrukta koji kodira aktivin A punom dužinom. Miševi su randomizovani u tri grupe (n = 5-6/grupa); jednoj je ubrizgana mešavina slanog rastvora/2,5 µg DNK kontrolnog konstrukta u prisustvu izotipnog kontrolnog antitela, i dvema grupama je ubrizgana mešavina slanog rastvora/2,5 µg DNK konstrukta koji obuhvata aktivin A u prisustvu izotipnog kontrolnog antitela ili H4H10446P2. DNK konstrukti su ubrizgani na dan 0, i antitela su isporučena pacijentima 0. i 4. dana pri 2,5 mg/kg (2 injekcije) u toku 7 dana. Težine mišića su prijavljene kao normalizovane težine (tj. težine mišića su normalizovane prema telesnim težinama izmerenim na početku eksperimenta). Rezultati za telesne težine su prikazani kao prosečna promena od početnih telesnih težina. Rezultati za tibialis anterior (mišić prednje tetive) (TA) i gastroknemijus (trbušasti mišić lista) (GA) su prikazani na Slici 4 kao

4

prosečna procentualna promena za svaku grupu (± standardna greška srednje vrednosti) u poređenju sa HDD isporukom grupe sa kontrolom konstrukta izotipnom kontrolnom antitela. Podaci su analizirani sa jednosmernim ili dvosmernim ANOVA posle čega je usledio Takijev (Tukey) HSD test.

[0187] Kao što se vidi na Slici 4, sedam dana posle HDD, isporuka aktivina A kod miševa tretiranih sa izotipnim kontrolnim antitelom je dala kao rezultat značajna smanjenja telesnih težina (-10,81 ± 2,46%) i masom mišića tetive i trbušastog mišića lista (od -13,96 ± 1,85% i od -10,34 ± 1,51%, prema opisanom redosledu) (p<0,01 značaj u odnosu na izotipnu kontrolu). Isporuka aktivina A kod miševa lečenih sa H4H10446P2 je dala kao rezultat značajno ublažavanje telesnih težina (-1,49 ± 1,98%) i masa mišića tetive i trbušastog mišića lista na kraju sedam dana od terapije (od -2,57 ± 1,26% i od -1,77 ± 2,42%, prema opisanom redosledu).

[0188] Obim ovog pronalaska ne treba ograničavati na specifična ovde opisana izvođenja pronalaska. Različite modifikacije ovog pronalaska pored onih koje su ovde opisane svakako će postati očigledne stručnjacima u ovoj oblasti na osnovu gore datog opisa i priloženih slika. Obim ovog pronalaska će biti ograničen samo priloženim patentnim zahtevima.

1

2

4

1

11

12

1

14

1

11

12

1

11

12

1

14

1

14

1

11

12

1

14

1

Claims

Patentni zahtevi

1. Izolovano antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji specifično vezuje aktivin A sa konstantom ravnoteže razdruživanja vezivanja (KD) čija je vrednost manja od 5 pM, opciono sa KD čija je vrednost manja od 4 pM, kako je izmereno u ogledu rezonance površinskog plazmona na 25 °C, pri čemu antitelo ili fragment koji vezuje antigen obuhvata: HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 domene, sa sekvencama aminokiseline iz SEK ID BR: 164-166-168-148-150-152, prema opisanom redosledu.

2. Izolovano antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen prema patentnom zahtevu 1, pri čemu to antitelo ili fragment koji vezuje antigen obuhvata: (a) HCVR sa sekvencom aminokiseline iz SEK ID BR: 162; i (b) LCVR sa sekvencom aminokiseline iz SEK ID BR: 146.

3. Farmaceutska supstanca koja obuhvata to antitelo ili fragment koji vezuje antigen iz patentnih zahteva 1 ili patentnog zahteva 2, i neki farmaceutski prihvatljiv nosač ili razblaživač.

4. Farmaceutska supstanca iz patentnog zahteva 3, još obuhvata GDF8 antagonist, opciono pri čemu je taj GDF8 antagonist izabran iz grupe koja obuhvata GDF8 inhibirajući fuzioni protein, anti- GDF8 antitelo, i fragment koji vezuje antigen od anti-GDF8 antitela.

5. Antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2 ili farmaceutska supstanca prema patentnom zahtevu 3 ili patentnom zahtevu 4 za upotrebu za lečenje, sprečavanje ili poboljšanje bolesti ili poremećaja naznačen time što je smanjena masa ili jačina mištića, pri čemu je bolest ili poremećaj naznačena time što je smanjena masa ili jačina mišića izabrana iz grupe koja obuhvata sarkopeniju, kaheksiju, povredu mišića, gubljenje/atrofiju mišića, kancer, gojaznost, dijabetes, artritis, multipla sklerozu, mišićnu distrofiju, amiotropnu lateralnu sklerozu, Parkinsonovu bolest, osteoporozu, osteoartritis, osteopeniju, i metabolički sindrom.