RS61128B1 - Postupak pegilacije - Google Patents

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na postupak za PEGilovanje interferona beta.

POZADINA PRONALASKA

[0002] Kovalentno vezivanje hidrofilnih polimera, kao što su polialkilen glikol polimeri, takođe poznati kao polialkilen oksidi, za biološki aktivne molekule i površine je od interesa za biotehnologiju i medicinu. Posebno, mnogo istraživanja fokusirano je na upotrebu poli(etilen glikol) (PEG), koji je takođe poznat kao ili poli(etilen oksid) (PEO), konjugata za poboljšanje rastvorljivosti i stabilnosti i za produženje poluživota u cirkulaciji krvi i izlaganje bioloških molekula, uključujući na primer, interferon beta.

[0003] U svom najčešćem obliku, PEG je linearni polimer završen na svakom kraju hidroksilnim grupama: HO-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH. Ovaj polimer, alfa-, omegadihidroksilpoli(etilen glikol), takođe može biti predstavljen kao HO-PEG-OH, gde se podrazumeva da simbol -PEG- predstavlja sledeću strukturnu jedinicu: CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2- gde se n tipično nalazi u opsegu od oko 4 do oko 10.000. PEG se uobičajeno upotrebljava kao metoksi-PEG-OH, ili mPEG, u kom jedan terminus sadrži relativno inertnu metoksi grupu, dok je drugi terminus hidroksilna grupa koja je podložna brzoj hemijskoj modifikaciji. Pored toga, nasumični ili blok kopolimeri različitih alkilen oksida (npr. etilen oksid i propilen oksid) koji su usko povezani sa PEG u svojoj hemiji mogu biti supstituisani za PEG u mnogim svojim primenama.

[0004] Da bi se PEG kuplovao sa molekulom od interesa, često je potrebno aktivirati PEG pripremom derivata PEG koji ima reaktivnu funkcionalnu grupu na najmanje jednom terminusu. Funkcionalna grupa se bira na osnovu tipa dostupne reaktivne grupe na molekulu koji će biti kuplovan sa PEG.

[0005] PEG je polimer koji ima svojstva rastvorljivosti u vodi i u mnogim organskim rastvaračima, nedostatak toksičnosti, i nedostatak imunogenosti. Jedna upotreba PEG je kovalentno vezivanje polimera za nerastvorljive molekule kako bi se rezultujući PEG-molekul "konjugat" učinio rastvorljivim. Na primer, pokazano je da u vodi nerastvorljivi lek paklitaksel, kada je kuplovan sa PEG, postaje rastvorljiv u vodi. Greenwald et al., 1995, J Org Chem 60:331-336.

[0006] Jedan faktor koji ograničava korisnost proteinskih supstanci za primenu u medicinskom lečenju je taj, da kada se daju parenteralno, eliminišu se iz tela u kratkom vremenu. Ova eliminacija može nastati kao rezultat degradacije od strane proteaza ili klirensom upotrebom normalnih puteva za eliminaciju proteina kao što je filtracija u bubrezima. Oralna primena ovih supstanci je još problematičnija zato što, pored proteolize u želucu, visoka kiselost želuca uništava ove supstance pre nego što dođu do ciljnog tkiva kom su namenjene. Problemi povezani sa ovim putevima primene proteina dobro su poznati u farmaceutskoj industriji, i koriste se različite strategije u pokušajima njihovog rešavanja. Veliki deo posla koji se bavi stabilizacijom proteina je objavljen. Poznati su različiti načini konjugovanja proteina sa polimernim materijalima, uključujući upotrebu dekstrana, polivinil pirolidona, glikopeptida, polietilen glikola, i poliamino kiselina. Saopšteno je da rezultujući konjugovani polipeptidi zadržavaju svoje biološke aktivnosti i rastvorljivost u vodi za parenteralne primene.

[0007] Od posebnog interesa je održavanje biološke aktivnosti interferona uz istovremeno smanjenje toksičnosti povezane sa upotrebom ovih proteina za lečenje humanih pacijenata. Interferoni su porodica malih proteina i glikoproteina koji se javljaju u prirodi koje proizvodi i sekretuje većina ćelija sa nukleusom kao odgovor na virusnu infekciju kao i na druge antigene stimuluse. Interferoni čine ćelije rezistentnim na virusnu infekciju i pokazuju širok spektar delovanja na ćelije. Oni vrše svoje ćelijske aktivnosti vezivanjem za specifične membranske receptore na ćelijskoj površini. Jednom vezani za ćelijsku membranu, interferoni iniciraju složenu sekvencu unutarćelijskih događaja. In vitro studije su demonstrirale da oni uključuju indukciju određenih enzima; supresiju ćelijske proliferacije, aktivnosti imunomodulacije kao što je poboljšanje fagocitne aktivnost makrofaga; povećanje specifične citotoksičnosti limfocita za ciljne ćelije; i inhibiciju replikacije virusa u ćelijama zaraženim virusom.

[0008] Interferoni su testirani u lečenju različitih kliničkih stanja bolesti. Upotreba humanog interferona beta uspostavljena je u lečenju multiple skleroze. Dva oblika rekombinantnog interferona beta (IFN β) nedavno su licencirana u Evropi i SAD za lečenje ove bolesti: interferon-beta-1a (IFN β-1a) (AVONEX<®>, Biogen, Inc., Kembridž, Masačusets i REBIF<®>, Serono, Ženeva, Švajcarska) i interferon-beta-1b (IFN β - 1a) (BETASERON<®>, Berlex, Ričmond, Kalifornija). AVONEX<®>i REBIF<®>se proizvode u ćelijama sisara upotrebom prirodne humane genske sekvence i glikozilovani su, dok se BETASERON<®>proizvodi u E. coli bakterijama upotrebom modifikovane humane genske sekvence koja sadrži genetički projektovanu cistein-u-serin supstituciju na amino-kiselinskoj poziciji 17 i nije glikozilovan.

[0009] Poznato je da ne-imunski interferoni, koji uključuju i alfa i beta interferone, suprimiraju virus humane imunodeficijencije (HIV) i u akutno i u hronično inficiranim ćelijama. Videti Poli i Fauci, 1992, AIDS Research and Human Retroviruses 8(2):191-197. Usled svoje antivirusne aktivnosti, interferoni, posebno alfa interferoni, dobili su značajnu pažnju kao terapijski agensi u lečenju bolesti povezanih sa hepatitis C virusom (HCV). Videti Hoofnagle et al., u: Viral Hepatitis 1981 International Symposium, 1982, Philadelphia, Franklin Institute Press; Hoofnagle et al., 1986, New Eng J Med 315:1575-1578; Thomson, 1987, Lancet 1:539-541 Kiyosawa et al., 1983, u: Zuckerman, ed., Viral Hepatitis and Liver Disease, Allen K. Liss, New York pp.895-897; Hoofnagle et al., 1985, Sem Liv Dis, 9:259-263.

[0010] Interferon-polimer konjugati, uključujući konjugate sa PEG, opisani su u, na primer, SAD patentu br.4,766,106, SAD patentu br.4,917,888, SAD patentu br.8,017,733, evropskom patentu br. 0 236 987, evropskom patentu br. 0510 356 i međunarodnoj prijavnoj publikaciji br. WO 95/13090.

[0011] Hronični hepatitis C je podmukla i sporo progresivna bolest koja ima značajan uticaj na kvalitet života. Uprkos poboljšanju kvaliteta pula davalaca krvi i nedavnoj implementaciji testiranja donirane krvi na HCV, procenjena incidenca akutne infekcije među osobama koje primaju transfuzije je 5 do 10%. Videti Alter et al., u: Zuckerman, ed., Viral Hepatitis and Liver Disease, Allen K. Liss, New York. 1988, pp. 537-542. Stoga, od približno 3 miliona osoba koje primaju transfuziju u Sjedinjenim Državama svake godine, akutni hepatitis C će se razviti kod oko 150000. Dok će mnogi pacijenti koji obole od hepatitisa C imati subkliničku ili blagu bolest, kod približno 50% će se razviti u stanje hronične bolesti koju karakterišu fluktuirajuće abnormalnosti serumskih transaminaza i inflamatorne lezije na biopsiji jetre. Procenjuje se da će se ciroza razviti u do oko 20% ove grupe. Videti Koretz et al., 1985, Gastroenterology 88: 1251-1254.

[0012] Poznato je da interferoni utiču na različite ćelijske funkcije, uključujući replikaciju DNK, i sintezu RNK i proteina, i u normalnim i u abnormalnim ćelijama. Stoga, citotoksični efekti interferona nisu ograničeni na ćelije inficirane tumorom ili virusom već se manifestuju i u normalnim, zdravim ćelijama. Kao rezultat, mogu da se pojave neželjeni sporedni efekti tokom terapije interferonom, posebno kada su neophodne visoke doze. Primena interferona može dovesti do mijelosupresije, što rezultira smanjenim brojem crvenih krvnih zrnaca, i smanjenim nivoima belih krvnih zrnaca i krvnih pločica. Interferoni uobičajeno dovode do simptoma sličnih gripu (npr. groznica, umor, glavobolja i jeza), gastrointestinalnih poremećaja (npr. anoreksija, mučnina i dijareja), vrtoglavice i kašlja. Često, trajni odgovor pacijenata sa HCV na lečenje ne-PEGilovanim interferonom je nizak i lečenje može da indukuje teške sporedne efekte, uključujući, ali ne ograničavajući se na, retinopatiju, tiroiditis, akutni pankreatitis, i depresiju.

[0013] SAD patent br. 8,017,733 opisuje sintezu aktiviranih polialkilen glikola, uključujući mPEG-O-2-metilpropionaldehid od 20 kDa, i njihovu upotrebu u pravljenju konjugata sa interferonom, uključujući PEGilovani IFN β-1a. U jednom primeru, humani IFN β-1a bio je PEGilovan na svom N-terminusu sa mPEG-O-2-metilpropionaldehidom od 20 kDa. Početni materijal u ovom postupku bio je neformulisani AVONEX<®>, tj. IFN β-1a rinfuzni intermedijer koji je bio klinička serija rinfuznog leka koji je prošao sve testove za upotrebu na ljudima. Proizvod hemije reduktivne alkilacije upotrebljen da inkorporira PEG na IFN β-1a okosnicu rezultovao je formiranjem aminske veze koja je izuzetno stabilna na degradaciju. Pokazano je da ovaj proizvod ima poboljšane farmakokinetičke parametre i in vivo efikasnost u modelu angiogeneze u melanomu. Videti Baker et al., 2006, Bioconjug Chem 17(1): 179-188.

[0014] Relapsno-remitentni oblik multipla skleroze (RRMS) karakterišu jasno definisani napadi pogoršanja neurološke funkcije. Ovi napadi - koji se često nazivaju relapsi, rasplamsavanja ili pogoršanja - praćeni su periodima delimičnog ili potpunog oporavka (remisije), tokom kojih se simptomi poboljšavaju delimično ili u potpunosti, i nema očiglednog napredovanja bolesti. RRMS je najčešći tok bolesti u vreme postavljanja dijagnoze. Kod približno 85 procenata ljudi inicijalno se dijagnostikuje RRMS, u poređenju sa 10-15 procenata sa progresivnim oblicima bolesti. PEGilovani interferon β-1a (PLEGRIDY™) je odobren u Sjedinjenim Državama i Evropi za lečenje relapsno-remitentnog oblika multipla skleroze.

[0015] Poželjno je razviti i koristiti reakciju PEGilacije (ovde se takođe označava kao reakcija PEG-kuplovanja) koja se može integrisati u biofarmaceutski postupak ili u serijski postupak zarad lakše proizvodnje, poboljšanog protoka i poboljšanog rukovanja reakcionim reagensima i proizvodima.

SAŽETAK PRONALASKA

[0016] Predmetni pronalazak je iznet u patentnim zahtevima.

[0017] Predmetni pronalazak se odnosi na postupak za PEGilovanje interferona beta (IFN β). U jednom primeru izvođenja, IFN β je IFN β -1a. U još jednom primeru izvođenja, IFN β je IFN β -1b.

[0018] Stoga, jedan aspekt predmetnog pronalaska obezbeđuje postupak za kuplovanje PEG sa IFN. U jednom primeru izvođenja, postupak za kuplovanje PEG sa IFN β sadrži sledeće korake: (a) dodavanje aktiviranog PEG u rastvor prečišćenog IFN β u reakcionoj posudi kako bi se formirala smeša aktiviranog PEG i IFN β, pri čemu rastvor prečišćenog IFN β ima koncentraciju IFN β od 1,75 mg/ml do 3,3 mg/ml i temperaturu od 2° C do 30° C, pri čemu je količina dodatog aktiviranog PEG dovoljna da obezbedi molarni odnos aktiviranog PEG prema IFN β u reakcionoj smeši PEG kuplovanja od 1:1 do 20:1 i pri čemu je pH smeše od 4,0 do 6,0;

(b) opciono dodavanje katalizatora Luisove kiseline u smešu, pri čemu je količina katalizatora Luisove kiseline kada se dodaje dovoljna da obezbedi koncentraciju katalizatora Luisove kiseline u reakcionoj smeši PEG kuplovanja od 0,1 mM do 2,2 mM; (c) dodavanje NaCNBH3u smešu kako bi se formirala reakciona smeša PEG kuplovanja uz mešanje tokom perioda od 5 minuta do 600 minuta, pri čemu je količina dodatog NaCNBH3dovoljna da obezbedi koncentraciju NaCNBH3u reakcionoj smeši PEG kuplovanja od 15 mM do 25 mM; i

(d) inkubiranje reakcione smeše PEG kuplovanja tokom 10 minuta do 24 sata kako bi se proizveo prvenstveno mono-PEG IFN β, posle koraka (c).

[0019] U jednom primeru izvođenja, katalizator Luisova kiselina dodaje se u reakcionu smešu. U još jednom primeru izvođenja, katalizator Luisova kiselina je cink katjon. U dodatnom primeru izvođenja, postupak dodatno sadrži gašenje reakcije PEG kuplovanja kako bi se zaustavila reakcija. U jednom primeru izvođenja, reakcija PEG kuplovanja gasi se dodavanjem arginina. U još jednom primeru izvođenja, količina arginina u ugašenoj reakcionoj smeši je od oko 25 mM do oko 250 mM.

[0020] U jednom primeru izvođenja, rastvor prečišćenog IFN β dovodi se na željenu temperaturu pre nego što se doda u reakcionu posudu. U još jednom primeru izvođenja, rastvor prečišćenog IFN β dodaje se u reakcionu posudu i dovodi na željenu temperaturu pre nego što se doda aktivirani PEG. U dodatnom primeru izvođenja, različite smeše u reakcionoj posudi prekrivaju se inertnim gasom. U jednom primeru izvođenja, inertni gas je argon. U još jednom primeru izvođenja, inertni gas je azot. U jednom primeru izvođenja, IFN β je IFN β-1a. U još jednom primeru izvođenja, IFN β je IFN β-1b. U jednom primeru izvođenja, PEG je mPEG. U jednom primeru izvođenja, aktivirani PEG je PEG-O-2-metilpropionaldehid. U još jednom primeru izvođenja, aktivirani PEG je mPEG-O-2-metilpropionaldehid. U jednom primeru izvođenja, PEG ima molekulsku masu od oko 20 kDa.

[0021] PEG IFN β se prečišćava upotrebom konvencionalnih tehnika. Stoga, u jednom primeru izvođenja, predmetna objava takođe obezbeđuje PEG IFN β prečišćen iz reakcije PEG kuplovanja ili ugašene reakcije PEG kuplovanja dobijene u skladu sa postupkom ovog primera izvođenja.

[0022] U još jednom primeru izvođenja, postupak za kuplovanje PEG sa IFN β sadrži sledeće korake:

(a) dodavanje aktiviranog PEG u rastvor prečišćenog IFN β u reakcionoj posudi kako bi se formirala smeša aktiviranog PEG i IFN β, pri čemu rastvor prečišćenog IFN β ima koncentraciju IFN β od oko 1,75 mg/ml do oko 3,3 mg/ml i temperaturu od oko 19° C do oko 27° C, pri čemu je količina dodatog aktiviranog PEG dovoljna da obezbedi molarni odnos PEG prema IFN β od oko 1:1 do oko 5:1 i pri čemu je pH od oko 4,8 do oko 5,2; (b) opciono dodavanje katalizatora Luisove kiseline u smešu, pri čemu je količina katalizatora Luisove kiseline kada se dodaje dovoljna da obezbedi koncentraciju katalizatora Luisove kiseline u reakcionoj smeši PEG kuplovanja od oko 0,78 mM do oko 1,2 mM;

(c) dodavanje NaCNBH3u smešu kako bi se formirala reakciona smeša PEG kuplovanja uz mešanje tokom perioda od oko 45 minuta do oko 240 minuta, pri čemu je količina dodatog NaCNBH3dovoljna da obezbedi koncentraciju NaCNBH3u reakcionoj smeši PEG kuplovanja od oko 15 mM do oko 25 mM; i

(d) inkubiranje reakcione smeše PEG kuplovanja tokom oko 5 sati do oko 9 sati kako bi se prvenstveno proizveo mono-PEG IFN β.

[0023] U jednom primeru izvođenja, postupak dodatno sadrži gašenje reakcije PEG kuplovanja kako bi se zaustavila reakcija. U još jednom primeru izvođenja, reakcija PEG kuplovanja gasi se dodavanjem arginina. U jednom primeru izvođenja količina arginina koja se dodaje dovoljna je da obezbedi koncentraciju arginina u ugašenoj reakcionoj smeši PEG kuplovanja od oko 50 mM do oko 150 mM. U još jednom primeru izvođenja, količina arginina koja se dodaje dovoljna je da obezbedi koncentraciju arginina u ugašenoj reakcionoj smeši PEG kuplovanja od oko 75 mM do oko 125 mM. U dodatnom primeru izvođenja, količina arginina koja se dodaje dovoljna je da obezbedi koncentraciju arginina u ugašenoj reakcionoj smeši PEG kuplovanja od oko 100 mM. U dodatnom primeru izvođenja, različite smeše u reakcionoj posudi prekrivaju se inertnim gasom. U jednom primeru izvođenja, inertni gas je argon. U još jednom primeru izvođenja, inertni gas je azot.

[0024] U jednom primeru izvođenja, rastvor prečišćenog IFN β dovodi se na željenu temperaturu pre nego što se doda u reakcionu posudu. U još jednom primeru izvođenja, rastvor prečišćenog IFN β dodaje se u reakcionu posudu i dovodi na željenu temperaturu pre nego što se doda aktivirani PEG.

[0025] U jednom primeru izvođenja, koncentracija IFN β u rastvoru prečišćenog IFN β je od oko 1,75 mg/ml do oko 3,3 mg/ml. U još jednom primeru izvođenja, koncentracija IFN β u rastvoru prečišćenog IFN β je od oko 2,0 mg/ml do oko 3,3 mg/ml. U dodatnom primeru izvođenja, koncentracija IFN β u rastvoru prečišćenog IFN β je od oko 2,4 mg/ml do oko 3,3 mg/ml. U dopunskom primeru izvođenja, koncentracija IFN β u rastvoru prečišćenog IFN β je od oko 2,9 mg/ml do oko 3,3 mg/ml. U još jednom primeru izvođenja, koncentracija IFN β u rastvoru prečišćenog IFN β je oko 3,3 mg/ml. U jednom primeru izvođenja, IFN β je IFN β-1a. U još jednom primeru izvođenja, IFN β je IFN β-1b.

[0026] U jednom primeru izvođenja, molarni odnos aktiviranog PEG prema IFN β u reakcionoj smeši PEG kuplovanja je od oko 1,5:1 do oko 5:1. U još jednom primeru izvođenja, molarni odnos aktiviranog PEG prema IFN β u reakcionoj smeši PEG kuplovanja je od oko 1,5:1 do oko 2:1. U dodatnom primeru izvođenja, molarni odnos aktiviranog PEG prema IFN β u reakcionoj smeši PEG kuplovanja je oko 1,5:1. U jednom primeru izvođenja, PEG je mPEG. U jednom primeru izvođenja, aktivirani PEG je PEG-O-2-metilpropionaldehid. U još jednom primeru izvođenja, aktivirani PEG je mPEG-O-2-metilpropionaldehid. U jednom primeru izvođenja, PEG ima molekulsku masu od oko 20 kDa.

[0027] U jednom primeru izvođenja, u reakcionu smešu dodaje se katalizator Luisova kiselina. U još jednom primeru izvođenja, katalizator Luisova kiselina je cink katjon. U jednom primeru izvođenja, koncentracija katalizatora Luisove kiseline ili cink katjona u reakcionoj smeši PEG kuplovanja je od oko 0,78 mM do oko 1,2 mM. U još jednom primeru izvođenja, koncentracija katalizatora Luisove kiseline ili cink katjona u reakcionoj smeši PEG kuplovanja je od oko 0,9 mM do oko 1,1 mM. U dodatnom primeru izvođenja, koncentracija katalizatora Luisove kiseline ili cink katjona u reakcionoj smeši PEG kuplovanja je od oko 0,95 mM do oko 1,05 mM. U dopunskom primeru izvođenja, koncentracija katalizatora Luisove kiseline ili cink katjona u reakcionoj smeši PEG kuplovanja je oko 1,0 mM.

[0028] U jednom primeru izvođenja, koncentracija NaCNBH3u reakcionoj smeši PEG kuplovanja je od oko 15 mM do oko 25 mM. U još jednom primeru izvođenja, koncentracija NaCNBH3u reakcionoj smeši PEG kuplovanja je od oko 18 mM do oko 22 mM. U dodatnom primeru izvođenja, koncentracija NaCNBH3u reakcionoj smeši PEG kuplovanja je oko 20 mM.

[0029] Iako nije kritični ili ključni parametar (kao što je ovde opisano) za reagens PEG kuplovanja, vreme zadržavanja ugašene reakcione smeše PEG kuplovanja je kritično za maksimiziranje količine prečišćenog mono-PEG IFN β izdvojenog iz reakcione smeše PEG kuplovanja. Ugašena reakciona smeša PEG kuplovanja može biti zadržana do 48 sati na oko 2° C do oko 25° C pre iniciranja prečišćavanja mono-PEG IFN β. U jednom primeru izvođenja, temperatura zadržavanja je oko 18° C do oko 25° C, poželjno oko 20° C do oko 23° C. U još jednom primeru izvođenja, temperatura zadržavanja je oko 2° C do oko 8° C. U dodatnom primeru izvođenja, temperatura zadržavanja je oko 8° C do oko 18° C. PEG IFN β se prečišćava upotrebom konvencionalnih tehnika. Stoga, u jednom primeru izvođenja, predmetna objava takođe obezbeđuje PEG IFN β prečišćen iz reakcije PEG kuplovanja ili ugašene reakcije PEG kuplovanja dobijene u skladu sa postupkom ovog primera izvođenja.

[0030] U drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje reakcionu smešu PEG kuplovanja. U jednom primeru izvođenja, reakciona smeša PEG kuplovanja sadrži sledeće elemente:

(a) IFN β u koncentraciji od 1,5 mg/ml do 2,8 mg/ml;

(b) aktivirani PEG u molarnom odnosu aktiviranog PEG prema IFN β od 1:1 do 20:1; i (c) NaCNBH3u koncentraciji od 15 mM do 25 mM, pri čemu je pH reakcione smeše PEG od 4,0 do 6,0.

[0031] U jednom primeru izvođenja, reakciona smeša PEG kuplovanja dodatno sadrži katalizator Luisovu kiselinu u koncentraciji od oko 0,1 mM do oko 2,2 mM. U još jednom primeru izvođenja, katalizator Luisova kiselina je cink katjon. U dodatnom primeru izvođenja, reakciona smeša PEG kuplovanja dodatno sadrži arginin u koncentraciji u reakcionoj smeši od oko 25 mM do oko 250 mM. U jednom primeru izvođenja, reakciona smeša PEG kuplovanja koja dodatno sadrži arginin je ugašena. U dodatnom primeru izvođenja, reakciona smeša PEG kuplovanja u reakcionoj posudi prekriva se inertnim gasom. U jednom primeru izvođenja, inertni gas je argon. U još jednom primeru izvođenja, inertni gas je azot. U jednom primeru izvođenja, IFN β je IFN β-1a. U još jednom primeru izvođenja, IFN β je IFN β-1b. U jednom primeru izvođenja, PEG je mPEG. U jednom primeru izvođenja, aktivirani PEG je PEG-O-2-metilpropionaldehid. U još jednom primeru izvođenja, aktivirani PEG je mPEG-O-2-metilpropionaldehid. U jednom primeru izvođenja, PEG ima molekulsku masu od oko 20 kDa.

[0032] PEG IFN β se prečišćava upotrebom konvencionalnih tehnika. Stoga, u jednom primeru izvođenja, predmetna objava takođe obezbeđuje PEG IFN β prečišćen iz reakcije PEG kuplovanja ili ugašene reakcije PEG kuplovanja dobijene u skladu sa ovim primerom izvođenja.

[0033] U još jednom primeru izvođenja, reakciona smeša PEG kuplovanja sadrži sledeće elemente:

a) IFN β u koncentraciji od oko 1,5 mg/ml do oko 2,8 mg/ml, poželjno od oko 2,0 mg/ml do oko 2,8 mg/ml, poželjnije od oko 2,5 mg/ml do oko 2,8 mg/ml, poželjnije oko 2,8 mg/ml;

(b) aktivirani PEG u molarnom odnosu aktiviranog PEG prema IFN β od oko 1:1 do oko 5:1, poželjno od oko 1,5:1 do oko 5:1, poželjnije od oko 1,5:1 do oko 2:1, još poželjnije oko 1,5:1; i

(c) NaCNBH3u koncentraciji od oko 15 mM do oko 25 mM, poželjno od oko 18 mM do oko 22 mM, poželjnije oko 20 mM, pri čemu je pH reakcione smeše PEG kuplovanja od oko 4,8 do oko 5,2, poželjno od oko 4,9 do oko 5,1, poželjnije oko 5,0.

[0034] U jednom primeru izvođenja, reakcija PEG kuplovanja dodatno sadrži katalizator Luisovu kiselinu u koncentraciji od oko 0,78 mM do oko 1,2 mM, poželjno od oko 0,9 mM do oko 1,1 mM, poželjnije od oko 0,95 mM do oko 1,05 mM, još poželjnije oko 1,0 mM. U još jednom primeru izvođenja, katalizator Luisova kiselina je cink katjon.

[0035] U dodatnom primeru izvođenja, reakciona smeša PEG kuplovanja dodatno sadrži arginin u koncentraciji u reakcionoj smeši od oko 50 mM do oko 150 mM, poželjno od oko 75 mM do oko 125 mM, poželjnije oko 100 mM. U jednom primeru izvođenja, reakciona smeša PEG kuplovanja koja dodatno sadrži arginin je ugašena. U još jednom primeru izvođenja, reakciona smeša PEG kuplovanja je u reakcionoj posudi. U dodatnom primeru izvođenja, reakciona smeša PEG kuplovanja u reakcionoj posudi prekriva se inertnim gasom. U jednom primeru izvođenja, inertni gas je argon. U još jednom primeru izvođenja, inertni gas je azot. U jednom primeru izvođenja, IFN β je IFN β-1a. U još jednom primeru izvođenja, IFN β je IFN β-1b. U jednom primeru izvođenja, PEG je mPEG. U jednom primeru izvođenja, aktivirani PEG je PEG-O-2-metilpropionaldehid. U još jednom primeru izvođenja, aktivirani PEG je mPEG-O-2-metilpropionaldehid. U jednom primeru izvođenja, PEG ima molekulsku masu od oko 20 kDa.

[0036] U jednom primeru izvođenja, IFN β je IFN β-1a. U još jednom primeru izvođenja, IFN β je IFN β-1b. U jednom primeru izvođenja, PEG je mPEG. U jednom primeru izvođenja, aktivirani PEG je PEG-O-2-metilpropionaldehid. U još jednom primeru izvođenja, aktivirani PEG je mPEG-O-2-metilpropionaldehid. U jednom primeru izvođenja, PEG ima molekulsku masu od oko 20 kDa.

[0037] PEG IFN β se prečišćava upotrebom konvencionalnih tehnika. Stoga, u jednom primeru izvođenja, predmetna objava takođe obezbeđuje PEG IFN β prečišćen iz reakcije PEG kuplovanja ili ugašene reakcije PEG kuplovanja dobijene u skladu sa ovim primerom izvođenja.

1

[0038] Ukoliko nije drugačije definisano, svi ovde upotrebljeni tehnički i naučni termini imaju isto značenje kao što ga uobičajeno razume neko ko je prosečno iskusan u struci kojoj ovaj pronalazak pripada. Iako se postupci i materijali slični ili ekvivalentni onima koji su ovde opisani mogu upotrebljavati u praksi ili testiranju predmetnog pronalaska, pogodni postupci i materijali su opisani ispod.

[0039] U slučaju spora, predmetna specifikacija, uključujući definicije, će imati kontrolu. Pored toga, materijali, postupci, i primeri su samo ilustrativni i nisu namenjeni da budu ograničavajući.

[0040] Ostale odlike i prednosti pronalaska biće očigledne iz sledećeg detaljnog opisa, i iz patentnih zahteva.

KRATAK OPIS SLIKE

[0041] Slika ilustruje jedan primer izvođenja ovde opisane reakcije PEG kuplovanja.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0042] Predmetni pronalazak se odnosi na postupak za PEGilovanje interferona beta. U jednom primeru izvođenja, IFN β je IFN β-1a. U još jednom primeru izvođenja, IFN β je IFN β-1b.

[0043] Termin "interferon" ili "IFN" kao što se ovde upotrebljava označava porodicu visoko homolognih species-specifičnih proteina koji inhibiraju replikaciju virusa i ćelijsku proliferaciju i moduliraju imunski odgovor. Humani interferoni su grupisani u dve klase; Tip I, koji uključuje α- i β-interferon, i Tip II, koji je predstavljen samo γ-interferonom. Rekombinantni oblici svake grupe su razvijeni i komercijalno su dostupni. Podtipovi u svakoj grupi su zasnovani na antigenskim/strukturnim karakteristikama.

[0044] Termini "beta interferon", "beta-interferon", "beta IFN", "beta-IFN", "β interferon", "βinterferon", "β IFN", "IFN", "interferon beta", "interferon-beta", "interferon β", "interferon-β", "IFN beta", "IFN-beta", "IFN β", "IFN β", i "interferon humanog fibroblasta" ovde se upotrebljavaju naizmenično da opišu članove grupe interferona beta koji imaju posebne aminokiselinske sekvence kao što je identifikovano izolovanjem i sekvenciranjem DNK koja kodira peptide.

[0045] Pored toga, termini "beta interferon 1a", "beta interferon-1a" "beta-interferon 1a", "betainterferon-1a", "beta IFN 1a", "beta IFN-1a", "beta-IFN 1a", "beta-IFN-1a", "β interferon 1a", "β interferon-1a", "β-interferon 1a", "β-interferon-1a", "β IFN 1a", "β IFN-1a", "β-IFN 1a", "βIFN-1a", "interferon beta 1a, "interferon beta-1a", "interferon-beta 1a", "interferon-beta-1a", "interferon β 1a", "interferon β-1a", "interferon-β 1a", "interferon-β-1a", "IFN beta 1a", "IFN beta-1a", "IFN-beta 1a", "IFN-beta-1a", "IFN β 1a", "IFN β-1a", "IFN β 1a" i, "IFN β-1a" ovde se upotrebljavaju naizmenično da opišu rekombinantno- ili sintetički-proizveden interferon beta koji ima amino-kiselinske sekvence koje se javljaju u prirodi (divlji tip).

[0046] Pored toga, termini "beta interferon 1b", "beta interferon-1b" "beta-interferon 1b", "betainterferon-1b", "beta IFN 1b", "beta IFN-1b", "beta-IFN 1b", "beta-IFN-1b", "β interferon 1b", "β interferon-1b", "β-interferon 1b", "β-interferon-1b", "β IFN 1b", "β IFN-1b", "β-IFN 1b", "β-IFN-1b", "interferon beta 1b", "interferon beta-1b", "interferon-beta 1b", "interferon-beta-1b", "interferon β 1b", "interferon β-1b", "interferon-β 1b", "interferon-β-1b", "IFN beta 1b", "IFN beta-1b", "IFN-beta 1b", "IFN-beta-1b", "IFN β 1b", "IFN β-1b", "IFN β 1b" i, "IFN β-1a" ovde se upotrebljavaju naizmenično da opišu rekombinantno- ili sintetički-proizveden interferon beta koji ima amino-kiselinske sekvence koje se javljaju u prirodi (divlji tip).

[0047] Termini "PEGilovani IFN beta", "PEGilovani IFN-beta", "PEGilovani IFN β", "PEGilovani IFN β", "PEGilovani interferon beta", "PEGilovani interferon-beta", "PEGilovani interferon β", "PEGilovani interferon-β", "PEG IFN beta", "PEG IFN-beta", "PEG IFN β", "PEG IFN β", "PEG interferon beta", "PEG interferon-beta", "PEG interferon β" i "PEG interferon-β" ovde se upotrebljavaju naizmenično da opišu IFN beta koji sadrži PEG ili mPEG ostatak povezan sa amino terminusom interferona.

[0048] Termin "prvenstveno mono-PEG IFN β" ovde se upotrebljava da označi da je više od 50% ovog proizvoda prisutno u ugašenoj reakcionoj smeši. U nekim primerima izvođenja, prinos mono-PEG IFN β je od oko 62% do oko 68% PEGilovanog proizvoda.

[0049] Termin "aktivirani-PEG" se odnosi na PEG koji je aktiviran pripremom derivata PEG koji ima reaktivnu funkcionalnu grupu na najmanje jednom terminusu. Reaktivna funkcionalna grupa je odabrana na osnovu tipa dostupne reaktivne grupe na molekulu koja će biti kuplovana sa PEG. Primeri aktiviranog PEG su dobro poznati u struci, kao što je opisano u SAD patentu br. 8,017,733.

[0050] Pojava tehnologije rekombinantne DNK koja se primenjuje na proizvodnju interferona dozvolila je da se uspešno sintetiše nekoliko humanih interferona, omogućavajući tako fermentaciju u velikoj razmeri, proizvodnju, izolaciju, i prečišćavanje različitih interferona do homogenosti. Rekombinantno proizvedeni interferon zadržava neke - ili veći deo - svojih in vitro i in vivo antivirusnih i imunomodulatornih aktivnosti. Takođe se podrazumeva da bi rekombinantne tehnike takođe mogle uključivati mesto glikozilacije za dodavanje ugljenohidratnog ostatka na rekombinantno-izvedenom polipeptidu.

[0051] Takođe se razmatra konstrukcija rekombinantnih DNK plazmida koji sadrže sekvence koje kodiraju najmanje deo interferona humanog fibroblasta i ekspresija polipeptida koji ima imunološku ili biološku aktivnost interferona humanog fibroblasta. Konstrukcija gena hibridnih beta-interferona koji sadrže kombinacije različitih podtipova sekvenci može se postići tehnikama poznatim iskusnima u struci.

[0052] Kao što je opisano u SAD patentu br.8,017,733, IFN β se može PEGilovati reakcijom rastvora IFN β-1a, koji je dobijen primenom serije IFN β na SF-Sepharose FF kolonu i izdvajanjem IFN β iz kolone, sa mPEG-O-2-metilpropionaldehidom na pH 6,0 u prisustvu natrijum cijanoborohidrida na sobnoj temperaturi tokom 16 h u mraku. PEGilovani IFN β je zatim prečišćen upotrebom SF-Sepharose FF kolone nakon koje sledi Superose 6HR 10/20 FPLC kolona za procenu po veličini.

[0053] Kako bi se razvila reakcija PEGilacije koja bi mogla biti integrisana u biofarmaceutski postupak ili u serijski postupak zarad jednostavnosti izrade, poboljšane propusnosti i poboljšanog rukovanja reakcionim reagensima i proizvodima, ispitivani su parametri reakcija PEGilacije kako bi se identifikovali oni parametri koji su važni za kvalitet PEGilovanog IFN β proizvoda, naime IFN β povezan sa jednim molekulom PEG na N-terminusu. U jednom primeru izvođenja PEG molekul je poželjno PEG molekul koji ima molekulsku masu od 20 kDa. U još jednom primeru izvođenja, PEG je mPEG. Parametri koji su važni za kvalitet proizvoda ovde se ponekad označavaju kao kritični parametri. Parametri koji su važni za prinos ili konzistenciju proizvoda ovde se ponekad označavaju kao ključni parametri. Parametar može biti i kritični parametar i ključni parametar.

[0054] Dobro je poznato da je IFN β, uključujući IFN β-1a i IFN β-1b, pomalo labilan protein sa dobro razumljivim mehanizmima degradacije. Primarni mehanizmi degradacije posle prikupljanja ćelijske kulture su formacija i deamidacija rastvorljivog agregata, naročito na povišenim temperaturama (tj. > 20° C) i pH ≥ 7,5. Shodno tome, postupak prečišćavanja rekombinantno proizvedenog IFN β tipično se izvodi kako bi se minimalizovala degradacija IFN β upotrebom niske temperature, kao što je oko 2° C do oko 8° C.

[0055] Takođe je poznato da PEG IFN β ima slične mehanizme degradacije kao IFN β sa dva dodatna mehanizma degradacije. Potencijal O-2-metilpropionil linkera (ostatak od 3 ugljenika koji, u nekim primerima izvođenja, vezuje mPEG od 20 kDa za N-terminus IFN β) da iseca pokazan je da se dešava na povišenoj temperaturi (tj. 40° C), što rezultira generacijom slobodnog IFN β. Pored toga, mPEG ostatak od 20 kDa može da se podvrgne oksidativnoj degradaciji u prisustvu peroksida, što dovodi do skraćenog lanca rezultujući u povećanoj polidisperznosti (tj. niže molekulske mase). Shodno tome, postupak prečišćavanja PEG IFN β

1

tipično se izvodi kako bi se minimalizovala degradacija PEG IFN β upotrebom temperature okoline, npr. sobne temperature.

[0056] Izvršena je temeljna analiza i proučavanje parametara reakcija PEGilacije u kojima je mPEG-O-2-metilpropionaldehid od 20 kDa upotrebljen kao aktivirani PEG molekul i IFN β-1a je upotrebljen kao IFN β, isključivo u svrhu ove analize. Međutim, podrazumeva se da su IFN β-1b i drugi aktivirani PEG molekuli mogli da se upotrebe za ovu analizu i proučavanje. Na primer, proučavana je temperatura reakcije i utvrđeno je da je reakcija kuplovanja zavisna od temperature. Razvojni podaci su demonstrirali da se može upotrebljavati temperatura između oko 2° C i oko 30° C. Na 2° C, reakcija se odvija polako. Na 30° C, proizvod se agregira brže. U poželjnom primeru izvođenja, utvrđeno je da ukoliko temperatura padne ispod granice delovanja od 19° C, kinetika reakcije će se smanjiti i konverzija mono-PEG IFN β će biti niža od očekivane. U ovom poželjnom primeru izvođenja, utvrđeno je da ukoliko temperatura premaši granicu delovanja od 27° C, mogu se očekivati netačni profili proizvoda (viši od normalnog multi-PEG IFN β, niži od normalnog neizreagovanog IFN β) i proizvod potencijalno može agregati. S obzirom na ovu studiju i posebno u odnosu na poželjan primer izvođenja predmetnog pronalaska, ustanovljeno je da je temperatura reakcije kuplovanja kritični/ključni parametar.

[0057] Takođe je proučavana količina aktiviranog PEG u reakciji PEG kuplovanja. U ovoj studiji, početna ciljna zapremina dodavanja za štok rastvor PEG postavljena je na 1 L (ili 1007 grama /- 50 grama) na osnovu zapremine rastvora IFN β upotrebljene za studiju. Štok rastvor je pripremljen da se postigne molarni odnos PEG prema IFN β od 1:1 do 20:1 u konačnoj reakcionoj smeši (tj. reakcionoj smeši PEG kuplovanja posle dodavanja NaCNBH3), na osnovu prijavljene aktivnosti mPEG lota od dobavljača. Studija je pokazala da postoji fleksibilnost u ukupnoj količini aktiviranog mPEG koja je potrebna da bi se postigla maksimalna mono-PEG konverzija, omogućavajući širu količinu aktiviranog mPEG za molarni odnos mPEG:IFN β između 1:1 i 20:1. U poželjnom primeru izvođenja, utvrđeno je da se opseg koncentracije aktiviranog mPEG od 4,0 - 5,5 mg/ml u konačnoj reakcionoj smeši može upotrebiti bez uticaja na ukupni prinos mono-PEG IFN β. U ovom poželjnom primeru izvođenja, utvrđeno je da ukoliko je količina aktiviranog mPEG ispod 4,0 mg/ml ili iznad 5,5 mg/ml, prinos mono-PEG je smanjen. S obzirom na ovu studiju i posebno u odnosu na poželjan primer izvođenja predmetnog pronalaska, ustanovljeno je da je količina aktiviranog mPEG ključni parametar u reakciji PEG kuplovanja.

[0058] Pokazano je da je dodavanje ZnCl2u reakcionu smešu PEG kuplovanja korisno za poboljšanje mono-PEG konverzije usled njegove poznate uloge kao katalizatora Luisove kiseline u nekoliko redoks reakcija (Kim, S et al., 1985, J Org Chem 50(11):1927-1931). Iako nije neophodan da bi se reakcija PEGilacije nastavila (npr. reakcija se nastavlja ali sa nešto nižim prinosom) i stoga je opcioni reagens u reakciji PEG kuplovanja, proučavana je upotreba katalizatora Luisove kiseline, kao što je ZnCl2, u reakciji PEG kuplovanja. Eksperimenti su potvrdili da je 1 mM ZnCl2u smeši kuplovanja doveo do poboljšanih nivoa mono-PEG IFN za 10% i stabilne reakcije (spora stopa povećanja multi-PEG). U poželjnom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, utvrđeno je da je dodavanje katalizatora Luisove kiseline eliminisalo potrebu za sporim dodavanjem NaCNBH3(prethodno upotrebljavan za poboljšanje mono-PEG konverzije i smanjenje potrebne količine NaCNBH3) zato što je aktivirani aldehid (potencijalno potpomognut cink-modifikovanim NaCNBH3) efikasnije konvertovan u mono-PEG IFN. U nekim primerima izvođenja, umesto ZnCl2mogu se upotrebljavati drugi dobro poznati katalizatori Luisove kiseline u onim primerima izvođenja za koje je poželjan katalizator Luisova kiselina.

[0059] U poželjnom primeru izvođenja, dodatno je proučavana količina ZnCl2u reakcionoj smeši PEG kuplovanja. Studija je pokazala da postoji fleksibilnost u ukupnoj količini katalizatora Luisove kiseline, kao što su cink katjoni, koja se može upotrebljavati u reakciji. Ukoliko se upotrebljava opcioni katalizator Luisova kiselina, upotrebljava se u količini od oko 0,1 mM do 2,2 mM. U poželjnom primeru izvođenja, utvrđeno je da je 1 mM koncentracija katalizatora Luisove kiseline, kao što je cink hlorid, optimalna za postizanje maksimalne mono-PEG IFN konverzije. U ovoj studiji ciljna zapremina dodavanja (1L ili 988 grama /- 50 grama), na osnovu zapremine rastvora IFN β upotrebljene za studiju, 20 mM štoka ZnCl2dizajnirana je da dovede konačnu reakcionu smešu (tj. reakcionu smešu PEG kuplovanja posle dodavanja NaCNBH3) na 1 mM ZnCl2u konačnoj reakcionoj smeši. Dok je 1 mM ZnCl2bio optimalan u ovom poželjnom primeru izvođenja, utvrđeno je da koncentracije između 0,78 mM i 1,2 mM u konačnoj reakcionoj smeši prinose prihvatljive nivoe mono-PEG IFN. U ovom poželjnom primeru izvođenja, utvrđeno je da ukoliko je količina ZnCl2ispod 0,78 mg/ml ili iznad 1,2 mg/ml, prinos mono-PEG bio je smanjen. S obzirom na ovu studiju i posebno u odnosu na ovaj poželjni primer izvođenja predmetnog pronalaska, ustanovljeno je da je količina katalizatora Luisove kiseline, kao što je cink katjon, npr. ZnCl2, ključni parametar u reakciji PEG kuplovanja.

[0060] U početku, radna pH bila je podešena između 4,0 i 6,0. Iako se reakcija PEGilacije dešava širom ovog opsega, utvrđeno je da se pri pH od 4,0 emituje gas cijanid i reakcija je nestabilna. Takođe je utvrđeno da je pri pH 6,0, reakcija sporija i dešava se više sporednih reakcija. Dodatno je utvrđeno da je pri radnoj pH od 5,5 minimalizovano otpuštanje HCN/H2u

1

obliku gasa, ali je rezultirala određenom precipitacijom ZnCl2i IFN β. Stoga, u poželjnom primeru izvođenja proučavana je pH korisna za dodavanje ZnCl2. U ovom poželjnom primeru izvođenja, utvrđeno je da je pH od 4,6 do 5,2 pogodna za sprečavanje precipitacije ZnCl2i IFN β. Ukoliko je pH bila iznad 5,2, utvrđeno je da je prinos mono-PEG bio smanjen. Pored toga, u poželjnom primeru izvođenja utvrđeno je da je pH od 4,8 do 5,2 bila pogodna za dodavanje NaCNBH3. Ukoliko je pH bila ispod 4,8 ili iznad 5,2, utvrđeno je da je prinos mono-PEG bio smanjen. Takođe je utvrđeno da je pH 5,0 bila poželjna za dodavanje svakog reagensa i reakciju kuplovanja. Prema tome, puferi koji se upotrebljavaju tokom čitavog postupka promenjeni su u poželjnom primeru izvođenja kako bi se prilagodila pH reakcije kuplovanja od 5,0. S obzirom na ovu studiju i posebno u odnosu na poželjni primer izvođenja predmetnog pronalaska, ustanovljeno je da je pH reakcione smeše za dodavanje ZnCl2u reakciju PEG kuplovanja ključni parametar. Takođe je ustanovljeno da je pH reakcione smeše za dodavanje NaCNBH3u reakciju PEG kuplovanja ključni parametar u odnosu na poželjni primer izvođenja predmetnog pronalaska.

[0061] Takođe je proučavana količina NaCNBH3u reakciji PEG kuplovanja. U ovoj studiji, ciljna zapremina dodavanja za 400 mM štok rastvor NaCNBH3dizajnirana je da bude 1 L (1025 grama /- 50 grama) za sve serije, na osnovu zapremine rastvora IFN β upotrebljene za studiju. Zapremina štok rastvora NaCNBH3od 1 L zasnovana je na konačnoj koncentraciji NaCNBH3od 5 mM do 100 mM, opseg za koji je utvrđeno da se u njemu dešava reakcija. Utvrđeno je da reakcija nije završena i da je reakcioni proizvod bio nestabilan ispod 5 mM NaCNBH3. Takođe je utvrđeno da je reakcija išla prebrzo sa niskim prinosom iznad 100 mM. U poželjnom primeru izvođenja, konačna koncentracija od 20 mM u reakcionoj smeši (tj. reakciona smeša PEG kuplovanja posle dodavanja NaCNBH3) odabrana je za studiju. Ova studija je ukazala da je poželjan opseg od 15 mM - 25 mM NaCNBH3. Ukoliko je količina NaCNBH3bila ispod 15 mM, utvrđeno je da je prinos mono-PEG bio smanjen. Treba voditi računa da se izbegne prekomerno dodavanje štoka NaCNBH3, za smanjenje nivoa otpuštanja HCN i H2u obliku gasa. S obzirom na ovu studiju i posebno u odnosu na poželjan primer izvođenja predmetnog pronalaska, ustanovljeno je da je količina NaCNBH3ključni parametar u reakciji PEG kuplovanja.

[0062] Takođe je proučavano vreme za dodavanje NaCNBH3u reakciju PEG kuplovanja. U ovoj studiji, vreme za dodavanje NaCNBH3u reakcionu smešu analizirano je za vremena duža od 1 min. Utvrđeno je da je stopa dodavanja NaCNBH3bila beznačajna u prisustvu cink hlorida. Stoga, duži periodi dodavanja NaCNBH3nisu značajno uticali na konverziju proizvoda. Odabrana je donja granica od 5 min. Proizvoljno je odabrana gornja granica od 600 min kako

1

bi se obezbedilo drugačije ograničenje vremena dodavanja. U poželjnom primeru izvođenja, utvrđeno je da je prinos mono-PEG bio smanjen za vreme kraće od 45 min za dodavanje NaCNBH3. Odabrana je gornja granica od 240 min kako bi se obezbedilo razumno vreme za dodavanje NaCNBH3. S obzirom na ovu studiju i posebno u odnosu na poželjan primer izvođenja predmetnog pronalaska, ustanovljeno je da je vreme za dodavanje NaCNBH3ključni parametar u reakciji PEG kuplovanja.

[0063] Takođe je proučavana količina IFN β u reakcionoj smeši. Količina IFN β u reakciji PEG kuplovanja posle dodavanja NaCNBH3proučavana je za efekat na količinu proizvedenog mono-PEG. Utvrđeno je da je postupak radio u opsegu od 0,4 mg/ml do oko 4,0 mg/ml IFN β, što odgovara opsegu od 0,5 mg/ml do oko 4,7 mg/ml u rastvoru prečišćenog IFN β. Pri 4,0 mg/ml i više, reakcija nije uspela zbog precipitacije. U poželjnom primeru izvođenja, utvrđeno je da je koncentracija IFN β veća od 2,8 mg/ml u konačnoj reakciji PEG kuplovanja (tj. reakcionoj smeši PEG kuplovanja posle dodavanja NaCNBH3) rezultirala manjim prinosom izazvanim precipitacijom. Koncentracija IFN β od 2,8 mg/ml u konačnoj reakciji PEG kuplovanja odgovara koncentraciji IFN β od 3,3 mg/ml u početnom rastvoru prečišćenog proteina koji se upotrebljava za reakciju PEGilacionog kuplovanja. Utvrđeno je da koncentracije IFN β niže od 1,5 mg/ml u konačnoj reakciji PEG kuplovanja (što odgovara 1,75 mg/ml IFN β u početnom rastvoru prečišćenog proteina) dovede do povećanog multi-PEG IFN β, od kojih se neki mogu tolerisati ukoliko se uklone u nizvodnom prečišćavanju. Na primer, koncentracija IFN β od 1,36 mg/ml u konačnoj reakciji PEG kuplovanja (što odgovara 1,6 mg/ml IFN β u početnom rastvoru prečišćenog proteina) rezultira u 20% multi-PEG IFN β u poređenju sa 18% pri koncentraciji od 1,5 mg/ml. S obzirom na ovu studiju i posebno, ustanovljeno je da je količina IFN β u reakcionoj smeši ključni parametar.

[0064] Takođe je proučavano vreme zadržavanja nakon dodavanja NaCNBH3(ovde se ponekad označava kao vreme inkubacije ili reakcije). U ovoj studiji reakcija je ugašena u različita vremena posle dodavanja NaCNBH3. Gašenje je postignuto upotrebom arginina. Gašenje na 10 min obezbedilo je manje od 20% prinosa. Razvojni podaci su ukazali na to da reakcija kuplovanja počinje sa platoom rano (~200 minuta) što implicira da bi gašenje posle 200 minuta trebalo da dovede do manje mono-PEG IFN β konverzije. Međutim, prinos mono-PEG IFN β mogao bi se dobiti do vremena reakcije od 24 h. Iako rano gašenje reakcije može dovesti do nepotpune mono-PEG IFN β konverzije (povećan neizreagovan IFN β i stoga smanjen prinos proizvoda i smanjen multi-PEG IFN β), ne bi trebalo da ima uticaj na kvalitet proizvoda. U poželjnom primeru izvođenja, gašenje reakcije posle perioda od 9 sati dovodi do povećanih nivoa multi-PEG IFN β. Poželjno je isključiti mešanje tokom zadržavanja reakcije, kako bi se

1

izbeglo prekomerno smicanje proteina tokom reakcije. Na osnovu analize podataka na tačkama za ovaj poželjan primer izvođenja, zaključeno je da je vreme reakcije manje od 5 h rezultovalo manjim prinosom mono-PEG IFN β i posledično višim nivoima IFN β, dok je vreme reakcije veće od 9 h rezultovalo višim nivoima oblika visoke molekulske mase. S obzirom na ovu studiju i posebno u odnosu na poželjan primer izvođenja predmetnog pronalaska, ustanovljeno je da je vreme zadržavanja nakon dodavanja NaCNBH3kritični/ključni parametar.

[0065] Takođe je proučavano vreme isteka ugašene reakcije kako bi se ustanovila stabilnost ugašene reakcione smeše dok je mono-PEG IFN β bio prečišćen. Utvrđeno je da je ugašena reakcija bila stabilna u reakcionoj posudi do 48 h na oko 2° C do oko 30° C. U poželjnom primeru izvođenja, temperatura zadržavanja je od oko 2° C do oko 30° C. Utvrđeno je da su se proizvodili oblici visoke molekulske mase ukoliko je vreme duže od 48 h. S obzirom na ovu studiju, ustanovljeno je da je vreme isteka ugašene reakcije kritični parametar u odnosu na prečišćavanje mono-PEG IFN β.

[0066] S obzirom na ove studije, parametri za poželjan primer izvođenja predmetnog pronalaska za koje je utvrđeno da su kritični i/ili ključni kao što je ovde definisano za reakciju PEG kuplovanja i prečišćavanje mono-PEG IFN β proizvoda izloženi su u Tabeli 1.

TABELA 1

1

1

[0067] Stoga, u jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje reakciju PEG kuplovanja. U jednom primeru izvođenja, reakcija PEG kuplovanja uzima u obzir eksperimente i podatke opisane iznad. U skladu sa ovim primerom izvođenja predmetnog pronalaska, postupak za kuplovanje PEG sa IFN β sadrži sledeće korake:

(a) dodavanje aktiviranog PEG u rastvor prečišćenog IFN β u reakcionoj posudi kako bi se formirala smeša aktiviranog PEG i IFN β, pri čemu rastvor prečišćenog IFN β ima koncentraciju IFN β od1,75 mg/ml do 3,3 mg/ml i temperaturu od 2° C do 30° C, pri čemu je količina dodatog aktiviranog PEG dovoljna da obezbedi molarni odnos aktiviranog PEG prema IFN β u reakcionoj smeši PEG kuplovanja od 1:1 do 20:1 i pri čemu je pH smeše od 4,0 do 6,0;

2

(b) opciono dodavanje katalizatora Luisove kiseline u smešu, pri čemu je količina katalizatora Luisove kiseline kada se dodaje dovoljna da obezbedi koncentraciju katalizatora Luisove kiseline u reakcionoj smeši PEG kuplovanja od 0,1 mM do 2,2 mM;

(c) dodavanje NaCNBH3u smešu kako bi se formirala reakciona smeša PEG kuplovanja uz mešanje tokom perioda od 5 minuta do 600 minuta, pri čemu je količina dodatog NaCNBH3dovoljna da obezbedi koncentraciju NaCNBH3u reakcionoj smeši PEG kuplovanja od 15 mM do 25 mM; i

(d) inkubiranje reakcione smeše PEG kuplovanja tokom 10 minuta do 24 sata kako bi se proizveo prvenstveno mono-PEG IFN β, posle koraka (c).

[0068] U jednom primeru izvođenja, katalizator Luisova kiselina dodaje se u reakcionu smešu. U još jednom primeru izvođenja, katalizator Luisova kiselina je cink katjon. U dodatnom primeru izvođenja, postupak dodatno sadrži gašenje reakcije PEG kuplovanja kako bi se zaustavila reakcija. U jednom primeru izvođenja, reakcija PEG kuplovanja gasi se dodavanjem arginina. U još jednom primeru izvođenja, količina arginina u ugašenoj reakcionoj smeši je od oko 25 mM do oko 250 mM.

[0069] U jednom primeru izvođenja, različite smeše u reakcionoj posudi prekrivaju se inertnim gasom. U dodatnom primeru izvođenja, inertni gas je argon. U još jednom primeru izvođenja, inertni gas je azot. U jednom primeru izvođenja, IFN β je IFN β-1a. U još jednom primeru izvođenja, IFN β je IFN β-1b. U jednom primeru izvođenja, PEG je mPEG. U jednom primeru izvođenja, aktivirani PEG je PEG-O-2-metilpropionaldehid. U još jednom primeru izvođenja, aktivirani mPEG je mPEG-O-2-metilpropionaldehid. U jednom primeru izvođenja, PEG ima molekulsku masu od oko 20 kDa.

[0070] Reagensi se kupuju komercijalno ili se pripremaju upotrebom konvencionalnih tehnika ili se pripremaju kao što je opisano ovde. Na primer, mPEG-O-2-metil-propionaldehid od 20 kDa se može kupiti od različitih dobavljača, uključujući na primer BioVectra i NOF Corporation, ili se može pripremiti kao što je opisano u SAD patentu br. 8,017,733. IFN β početni materijal se rekombinantno proizvodi, npr. u bioreaktoru, upotrebom konvencionalnih postupaka i tehnika i prečišćava se za upotrebu u reakciji PEG kuplovanja upotrebom konvencionalnih tehnika.

[0071] U jednom primeru izvođenja, rekombinantno proizvedeni IFN β prečišćava se upotrebom konvencionalnih tehnika dobro poznatih u struci upotrebom temperature kako bi se smanjila degradacija IFN β, kao što je od oko 2° C do oko 8° C. Pored toga, puferi upotrebljeni tokom prečišćavanja, kao u poslednjim koracima prečišćavanja odabrani su tako da će rastvor prečišćenog IFN β imati željenu pH. Utvrđuje se količina prečišćenog IFN β u rastvoru. Ukoliko je potrebno rastvor pročišćenog IFN β se razblažuje ili koncentruje kako bi se obezbedio rastvor koji ima željenu koncentraciju IFN β. Prečišćeni IFN β se može skladištiti zamrznut na -70 ° C dok se ne upotrebi. Ukoliko se rastvor prečišćenog IFN β skladišti zamrznut, može se dovesti na željenu temperaturu pre dodavanja u reakcionu posudu. Alternativno, iako manje efikasno, zamrznuti rastvor prečišćenog IFN β može se dodati u reakcionu posudu i dovesti na željenu temperaturu.

[0072] U još jednom primeru izvođenja, rekombinantno proizvedeni IFN β se prečišćava upotrebom konvencionalnih tehnika dobro poznatih u struci upotrebom temperature kako bi se smanjila degradacija IFN β, kao što je od oko 2° C do oko 8° C. U ovom primeru izvođenja, korak ultrafiltracije/dijafiltracije (UF/DF) koristi se kako bi se proizveo rastvor prečišćenog IFN β koji ima konstantnu zapreminu rastvora prečišćenog IFN β iz svake serije rekombinantno proizvedenog IFN β. Konstantna zapremina za rastvor prečišćenog IFN β će takođe imati željenu koncentraciju IFN β. Konstantna zapremina rastvora prečišćenog IFN β omogućava upotrebu konstantnih zapremina reagenasa kako bi se osigurale odgovarajuće koncentracije reagensa u reakciji PEG kuplovanja što olakšava automatizaciju proizvodnje mono-PEG IFN β i integraciju reakcije PEG kuplovanja u postupak u bioreaktoru. Ovi faktori dovode do bolje doslednosti reakcije PEGilacije i bolje doslednosti mono-PEG IFN β proizvedenog u reakciji. Kao što je opisano iznad, u ovom koraku se koristi odgovarajući pufer tako da rezultujući rastvor prečišćenog IFN β ima željenu pH za reakciju PEG kuplovanja. U jednom primeru izvođenja, rastvor prečišćenog IFN β se nakon koraka UF/DF zamrzava i skladišti pre upotrebe u reakciji PEG kuplovanja. Ovaj zamrznuti rastvor se dovodi na željenu temperaturu kao što je opisano iznad. U još jednom primeru izvođenja, rastvor prečišćenog IFN β dodaje se u reakcionu posudu i dovodi na željenu temperaturu. U dodatnom primeru izvođenja, rastvor prečišćenog IFN β dovodi se na željenu temperaturu pre dodavanja u reakcionu posudu.

[0073] PEG IFN β se prečišćava upotrebom konvencionalnih tehnika ili kao što je opisano ovde. Stoga, u jednom primeru izvođenja, predmetna objava takođe obezbeđuje PEG IFN β prečišćen iz reakcije PEG kuplovanja ili ugašene reakcije PEG kuplovanja dobijene u skladu sa postupkom ovog primera izvođenja.

[0074] U drugom primeru izvođenja, reakcija PEG kuplovanja, prikazana na Slici, uzima u obzir kritične i/ili ključne parametre navedene u Tabeli 1. U skladu sa ovim aspektom predmetnog pronalaska, postupak za kuplovanje PEG sa IFN β sadrži sledeće korake:

(a) dodavanje aktiviranog PEG u rastvor prečišćenog IFN β u reakcionoj posudi kako bi se formirala smeša aktiviranog PEG i IFN β, pri čemu rastvor prečišćenog IFN β ima koncentraciju IFN β od oko 1,75 mg/ml do oko 3,3 mg/ml i temperaturu od oko 19° C do oko 27° C, pri čemu je količina dodatog aktiviranog PEG dovoljna da obezbedi molarni odnos PEG prema IFN β od oko 1:1 do oko 5:1 i pri čemu je pH od oko 4,8 do oko 5,2; (b) opciono dodavanje katalizatora Luisove kiseline u smešu, pri čemu je količina katalizatora Luisove kiseline kada se dodaje dovoljna da obezbedi koncentraciju katalizatora Luisove kiseline u reakcionoj smeši PEG kuplovanja od oko 0,78 mM do oko 1,2 mM;

(c) dodavanje NaCNBH3u smešu kako bi se formirala reakciona smeša PEG kuplovanja uz mešanje tokom perioda od oko 45 minuta do oko 240 minuta, pri čemu je količina dodatog NaCNBH3dovoljna da obezbedi koncentraciju NaCNBH3u reakcionoj smeši PEG kuplovanja od oko 15 mM do oko 25 mM; i

(d) inkubiranje reakcione smeše PEG kuplovanja tokom oko 5 sati do oko 9 sati kako bi se prvenstveno proizveo mono-PEG IFN β.

[0075] U jednom primeru izvođenja, postupak dodatno sadrži gašenje reakcije PEG kuplovanja kako bi se zaustavila reakcija. U još jednom primeru izvođenja, reakcija PEG kuplovanja gasi se dodavanjem arginina. U jednom primeru izvođenja količina arginina koja se dodaje dovoljna je da obezbedi koncentraciju arginina u ugašenoj reakcionoj smeši PEG kuplovanja od oko 50 mM do oko 150 mM. U još jednom primeru izvođenja, količina arginina koja se dodaje dovoljna je da obezbedi koncentraciju arginina u ugašenoj reakcionoj smeši PEG kuplovanja od oko 75 mM do oko 125 mM. U dodatnom primeru izvođenja, količina arginina koja se dodaje dovoljna je da obezbedi koncentraciju arginina u ugašenoj reakcionoj smeši PEG kuplovanja od oko 100 mM. U dodatnom primeru izvođenja, različite smeše u reakcionoj posudi prekrivaju se inertnim gasom. U jednom primeru izvođenja, inertni gas je argon. U još jednom primeru izvođenja, inertni gas je azot.

[0076] U jednom primeru izvođenja, rastvor prečišćenog IFN β dovodi se na željenu temperaturu pre nego što se doda u reakcionu posudu. U još jednom primeru izvođenja, rastvor

2

prečišćenog IFN β dodaje se u reakcionu posudu i dovodi na željenu temperaturu pre nego što se doda aktivirani PEG.

[0077] Iako nije kritični parametar za reakciju PEG kuplovanja, vreme zadržavanja ugašene reakcije je kritično za maksimiziranje količine prečišćenog mono-PEG IFN β izdvojenog iz reakcije PEG kuplovanja.

[0078] Reagensi se kupuju komercijalno ili se pripremaju upotrebom konvencionalnih tehnika ili se pripremaju kao što je opisano ovde. Na primer, mPEG-O-2-metil-propionaldehid od 20 kDa se može kupiti od različitih dobavljača, uključujući na primer BioVectra i NOF Corporation, ili se može pripremiti kao što je opisano u SAD patentu br. 8,017,733. IFN β početni materijal se rekombinantno proizvodi, npr. u bioreaktoru, upotrebom konvencionalnih postupaka i tehnika i prečišćava se za upotrebu u reakciji PEG kuplovanja upotrebom konvencionalnih tehnika.

[0079] U jednom primeru izvođenja, rekombinantno proizvedeni IFN β prečišćava se upotrebom konvencionalnih tehnika, dobro poznatih u struci upotrebom temperature kako bi se smanjila degradacija IFN β, kao što je od oko 2° C do oko 8° C. Pored toga, puferi upotrebljeni tokom prečišćavanja, kao u poslednjim koracima prečišćavanja odabrani su tako da će rastvor prečišćenog IFN β imati pH od oko 4,8 do oko 5,2, poželjno od oko 4,9 do oko 5,1, poželjnije oko 5,0. Utvrđena je količina prečišćenog IFN β u rastvoru. Ukoliko je potrebno, rastvor prečišćenog IFN β se razblažuje ili koncentruje kako bi se obezbedio rastvor koji ima željenu koncentraciju IFN β. U jednom primeru izvođenja, koncentracija IFN β u rastvoru prečišćenog IFN β je od oko 1,75 mg/ml do oko 3,3 mg/ml. U još jednom primeru izvođenja, koncentracija IFN β u rastvoru prečišćenog IFN β je od oko 2,0 mg/ml do oko 3,3 mg/ml. U dodatnom primeru izvođenja, koncentracija IFN β u rastvoru prečišćenog IFN β je od oko 2,4 mg/ml do oko 3,3 mg/ml. U dopunskom primeru izvođenja, koncentracija IFN β u rastvoru prečišćenog IFN β je od oko 2,9 mg/ml do oko 3,3 mg/ml. U još jednom primeru izvođenja, koncentracija IFN β u rastvoru prečišćenog IFN β je oko 3,3 mg/ml. Prečišćeni IFN β se može skladištiti zamrznut na -70° C dok se ne upotrebi. Ukoliko se rastvor prečišćenog IFN β skladišti zamrznut, može se dovesti na željenu temperaturu pre dodavanja u reakcionu posudu. Alternativno, iako manje efikasno, zamrznuti rastvor prečišćenog IFN β može se dodati u reakcionu posudu i dovesti na željenu temperaturu. U jednom primeru izvođenja, IFN β je IFN β-1a. U još jednom primeru izvođenja, IFN β je IFN β-1b.

[0080] U još jednom primeru izvođenja, rekombinantno proizvedeni IFN β se prečišćava upotrebom konvencionalnih tehnika dobro poznatih u struci upotrebom temperature kako bi se smanjila degradacija IFN β, kao što je od oko 2° C do oko 8° C. U ovom primeru izvođenja, korak ultrafiltracije/dijafiltracije (UF/DF) koristi se kako bi se proizveo rastvor prečišćenog IFN β koji ima konstantnu zapreminu rastvora prečišćenog IFN β iz svake serije rekombinantno proizvedenog IFN β. Konstantna zapremina za rastvor prečišćenog IFN β će takođe imati željenu koncentraciju IFN β, tj. od oko 1,75 mg/ml do oko 3,3 mg/ml, poželjno od oko 2,4 mg/ml do oko 3,3 mg/ml, poželjnije od oko 2,9 mg/ml do oko 3,3 mg/ml, najpoželjnije oko 3,3 mg/ml. Konstantna zapremina rastvora prečišćenog IFN β omogućava upotrebu konstantnih zapremina reagenasa kako bi se osigurale odgovarajuće koncentracije reagensa u reakciji PEG kuplovanja što olakšava automatizaciju proizvodnje mono-PEG IFN β i integraciju reakcije PEG kuplovanja u postupak u bioreaktoru. Ovi faktori dovode do bolje doslednosti reakcije PEGilacije i bolje doslednosti mono-PEG IFN β proizvedenog u reakciji. Kao što je opisano iznad, u ovom koraku se koristi odgovarajući pufer tako da rezultujući rastvor prečišćenog IFN β ima željenu pH za reakciju PEG kuplovanja. U jednom primeru izvođenja, rastvor prečišćenog IFN β se nakon koraka UF/DF zamrzava i skladišti pre upotrebe u reakciji PEG kuplovanja. Ovaj zamrznuti rastvor se dovodi na željenu temperaturu kao što je opisano iznad. U još jednom primeru izvođenja, rastvor prečišćenog IFN β dodaje se u reakcionu posudu i dovodi na željenu temperaturu. U dodatnom primeru izvođenja, rastvor prečišćenog IFN β dovodi se na željenu temperaturu pre dodavanja u reakcionu posudu. U jednom primeru izvođenja, IFN β je IFN β-1a. U još jednom primeru izvođenja, IFN β je IFN β-1b.

[0081] U svakom od ovih primera izvođenja, rastvor prečišćenog IFN β, iz zamrznutog štoka ili iz rastvora prečišćenog IFN β ili u reakcionoj posudi, dovodi se na temperaturu u opsegu od oko 19° C do oko 27° C, poželjno od oko 21° C do oko 25° C, poželjnije od oko 22° C do oko 24° C, najpoželjnije oko 23° C pre dodavanja aktiviranog PEG.

[0082] U prvom koraku, aktivirani PEG dodaje se u rastvor prečišćenog IFN β u reakcionoj posudi koja je na željenoj temperaturi i pH kako bi se formirala smeša aktiviranog PEG i IFN β. U jednom primeru izvođenja, količina aktiviranog PEG dodata u rastvor prečišćenog IFN β dovoljna je da obezbedi molarni odnos aktiviranog PEG prema IFN β u reakcionoj smeši PEG kuplovanja od oko 1,5:1 do oko 5:1. U još jednom primeru izvođenja, molarni odnos aktiviranog PEG prema IFN β u reakcionoj smeši PEG kuplovanja je od oko 1,5:1 do oko 2:1. U dodatnom primeru izvođenja, molarni odnos aktiviranog PEG prema IFN β u reakcionoj smeši PEG kuplovanja je oko 1,5:1. Kada se dodaje štok rastvor aktiviranog PEG u rastvor prečišćenog IFN β, treba voditi računa kako bi se osiguralo da zapremina štok rastvora aktiviranog PEG koja se dodaje bude samo onolika koliko je potrebno kako bi se osiguralo da će svi preostali reagensi u reakciji PEG kuplovanja dostići potrebne nivoe. Nije utvrđeno da je stopa dodavanja štok rastvora aktiviranog PEG kritična. Stopa agitacije nije kritični parametar

2

u ovom koraku, ali poželjno je postići adekvatno mešanje tokom perioda od 14-16 minuta, kako bi se osigurala adekvatna homogenost reakcione smeše pre dodavanja štoka cink hlorida. Stope mešanja koje rezultuju penjenjem proizvoda verovatno će rezultirati agregacijom proizvoda i treba ih izbegavati. U jednom primeru izvođenja, PEG je mPEG. U jednom primeru izvođenja, aktivirani PEG je PEG-O-2-metilpropionaldehid. U još jednom primeru izvođenja, aktivirani mPEG je mPEG-O-2-metilpropionaldehid. U jednom primeru izvođenja, PEG ima molekulsku masu od oko 20 kDa.

[0083] U jednom primeru izvođenja, katalizator Luisova kiselina dodaje se u smešu smeše aktiviranog PEG i IFN β u drugom koraku kako bi se obezbedila smeša aktiviranog PEG, IFN β i katalizatora Luisove kiseline. U još jednom primeru izvođenja, katalizator Luisova kiselina je cink katjon. U jednom primeru izvođenja, količina katalizatora Luisove kiseline dodata u smešu aktiviranog PEG i IFN β dovoljna je da obezbedi koncentraciju katalizatora Luisove kiseline u reakcionoj smeši PEG kuplovanja od oko 0,78 mM do oko 1,2 mM. U još jednom primeru izvođenja, količina katalizatora Luisove kiseline dodata u smešu aktiviranog PEG i IFN β dovoljna je da obezbedi koncentraciju cink hlorida u reakcionoj smeši PEG kuplovanja od oko 0,9 mM do oko 1,1 mM. U dodatnom primeru izvođenja, količina katalizatora Luisove kiseline dodata u smešu aktiviranog PEG i IFN β dovoljna je da obezbedi koncentraciju katalizatora Luisove kiseline u reakcionoj smeši PEG kuplovanja od oko 0,95 mM do oko 1,05 mM. U dopunskom primeru izvođenja, količina katalizatora Luisove kiseline dodata u smešu aktiviranog PEG i IFN β dovoljna je da obezbedi koncentraciju katalizatora Luisove kiseline u reakcionoj smeši PEG kuplovanja od oko 1,0 mM. Kada se dodaje štok rastvor katalizatora Luisove kiseline u smešu aktiviranog PEG i IFN β, treba voditi računa kako bi se osiguralo da zapremina štok rastvora katalizatora Luisove kiseline koja se dodaje bude samo onolika koliko je potrebno kako bi se osiguralo da će svi preostali reagensi u reakciji PEG kuplovanja dostići potrebne nivoe. Stopa mešanja nije kritična za korak dodavanja katalizatora Luisove kiseline; međutim, poželjno je postići adekvatno mešanje tokom perioda od 14-16 minuta. Stope mešanja koje rezultuju penjenjem proizvoda mogu rezultirati agregacijom proizvoda i treba ih izbegavati.

[0084] U trećem koraku, NaCNBH3se dodaje u smešu aktiviranog PEG, IFN β i opciono katalizatora Luisove kiseline kako bi se formirala reakciona smeša PEG kuplovanja. U jednom primeru izvođenja, količina dodatog NaCNBH3u smešu aktiviranog PEG, IFN β i opciono katalizatora Luisove kiseline dovoljna je da obezbedi koncentraciju NaCNBH3u reakcionoj smeši PEG kuplovanja od oko 15 mM do oko 25 mM. U još jednom primeru izvođenja, količina dodatog NaCNBH3u smešu aktiviranog PEG, IFN β i opciono katalizatora Luisove kiseline

2

dovoljna je da obezbedi koncentraciju NaCNBH3u reakcionoj smeši PEG kuplovanja od oko 18 mM do oko 22 mM. U dodatnom primeru izvođenja, količina dodatog NaCNBH3u smešu aktiviranog PEG, IFN β i opciono katalizatora Luisove kiseline dovoljna je da obezbedi koncentraciju NaCNBH3u reakcionoj smeši PEG kuplovanja od oko 20 mM. NaCNBH3se dodaje aktiviranom PEG, IFN β i opciono katalizatoru Luisovoj kiselini uz mešanje. U jednom primeru izvođenja, NaCNBH3se dodaje tokom vremenskog perioda od oko 45 min do oko 240 min. U još jednom primeru izvođenja, NaCNBH3se dodaje tokom vremenskog perioda od oko 45 min do oko 80 min. U dodatnom primeru izvođenja, NaCNBH3se dodaje tokom vremenskog perioda od oko 60 min. Kada se dodaje štok rastvor NaCNBH3u smešu aktiviranog PEG, IFN β i opciono katalizatora Luisove kiseline, treba voditi računa kako bi se osiguralo da zapremina štok rastvora NaCNBH3koja se dodaje bude samo onolika koliko je potrebno kako bi se osiguralo da će svi preostali reagensi u reakciji PEG kuplovanja dostići potrebne nivoe. Početna agitacija (14-16 min) reakcione smeše je poželjna kako bi se osiguralo pravilno mešanje i uniformna koncentracija NaCNBH3u celoj reakcionoj posudi; nemešane reakcije mogu dovesti do nepotpune mono-PEG IFN konverzije.

[0085] U četvrtom koraku, reakciona smeša PEG kuplovanja inkubira se kako bi se proizveo mono-mPEG IFN β. U jednom primeru izvođenja, inkubacija se izvodi tokom oko 5 sati do oko 9 sati. U još jednom primeru izvođenja, inkubacija se izvodi tokom oko 7 sati do oko 9 sati. U dodatnom primeru izvođenja, inkubacija se izvodi tokom oko 8 sati do oko 8,5 sati. U dopunskom primeru izvođenja, inkubacija se izvodi oko 8,5 sati.

[0086] Kako bi se smanjila degradacija materijala i proizvoda, smanjio rastvoreni kiseonik i razblažili HCN i H2gasovi proizvedeni tokom reakcije, poželjno je da se u reakcionoj posudi koristi prekrivač od inertnog gasa. U jednom primeru izvođenja, poželjno je upotrebljavati stopu prekrivanja inertnim gasom od 3-5 LPM za (a) zagrevanje rastvora prečišćenog IFN β u reakcionoj posudi, (b) dodavanje aktiviranog PEG u reakcionu posudu i (c) dodavanje opcionog katalizatora Luisove kiseline u reakcionu posudu. U još jednom primeru izvođenja, poželjno je upotrebljavati stopu prekrivanja inertnim gasom od 10 LPM za (a) dodavanje NaCNBH3u reakcionu posudu, (b) inkubiranje reakcione smeše PEG kuplovanja i (c) gašenje reakcije PEG kuplovanja. Stopa prekrivanja inertnim gasom povećava se na 10 LPM kako bi se smanjio rastvoreni kiseonik u reakcionoj posudi, ali i razblažili HCN i H2gasovi proizvedeni tokom reakcije. Smanjene stope prekrivanja inertnim gasom mogu dovesti do povećanog rastvorenog kiseonika (potencijalna dimerizacija/agregacija proizvoda), kao i povećanih izmerenih nivoa HCN i H2(moguće nakupljanje toksičnog gasa u posudi), ali zbog toga što se reakcija PEGilacije sprovodi u zatvorenom sistemu, ovo će imati malo uticaja na operatore postupka. U

2

jednom primeru izvođenja, inertni gas je argon. U još jednom primeru izvođenja, inertni gas je azot.

[0087] Iako nije kritični parametar za reagens PEG kuplovanja, vreme zadržavanja ugašene reakcione smeše PEG kuplovanja je kritično za maksimiziranje količine prečišćenog mono-PEG IFN β izdvojenog iz reakcione smeše PEG kuplovanja. Ugašena reakciona smeša PEG kuplovanja može se držati do 48 sati na oko 2° C do oko 25° C pre iniciranja prečišćavanja mono-PEG IFN β. U jednom primeru izvođenja, temperatura zadržavanja je oko 18° C do oko 25° C, poželjno oko 20° C do oko 23° C. U još jednom primeru izvođenja, temperatura zadržavanja je oko 2° C do oko 8° C. U dodatnom primeru izvođenja, temperatura zadržavanja je oko 8° C do oko 18° C. PEG IFN β se prečišćava upotrebom konvencionalnih tehnika. Stoga, u jednom primeru izvođenja, predmetna objava takođe obezbeđuje PEG IFN β prečišćen iz reakcije PEG kuplovanja ili ugašene reakcije PEG kuplovanja dobijene u skladu sa postupkom ovog primera izvođenja.

[0088] U drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje reakcionu smešu PEG kuplovanja. U jednom primeru izvođenja, reakciona smeša PEG kuplovanja sadrži sledeće elemente:

(a) IFN β u koncentraciji od 1,5 mg/ml do 2,8 mg/ml;

(b) aktivirani PEG u molarnom odnosu aktiviranog PEG prema IFN β od 1:1 do 20:1; i (c) NaCNBH3u koncentraciji od 15 mM do 25 mM, pri čemu je pH reakcione smeše PEG od oko 4,0 do oko 6,0.

[0089] U jednom primeru izvođenja, reakciona smeša PEG kuplovanja dodatno sadrži katalizator Luisovu kiselinu u koncentraciji od oko 0,1 mM do oko 2,2 mM. U još jednom primeru izvođenja, katalizator Luisova kiselina je cink katjon. U dodatnom primeru izvođenja, reakciona smeša PEG kuplovanja dodatno sadrži arginin u koncentraciji u reakcionoj smeši od oko 25 mM do oko 250 mM. U jednom primeru izvođenja, reakciona smeša PEG kuplovanja koja dodatno sadrži arginin je ugašena. U dodatnom primeru izvođenja, reakciona smeša PEG kuplovanja u reakcionoj posudi je prekrivena inertnim gasom. U jednom primeru izvođenja, inertni gas je argon. U još jednom primeru izvođenja, inertni gas je azot. U jednom primeru izvođenja, IFN β je IFN β-1a. U još jednom primeru izvođenja, IFN β je IFN β-1b. U jednom primeru izvođenja, PEG je mPEG. U jednom primeru izvođenja, aktivirani PEG je PEG-O-2-metilpropionaldehid. U još jednom primeru izvođenja, aktivirani PEG je mPEG-O-2-metilpropionaldehid. U jednom primeru izvođenja, PEG ima molekulsku masu od oko 20 kDa.

2

[0090] PEG IFN β se prečišćava upotrebom konvencionalnih tehnika. Stoga, u jednom primeru izvođenja, predmetna objava takođe obezbeđuje PEG IFN β prečišćen iz reakcije PEG kuplovanja ili ugašene reakcije PEG kuplovanja dobijene u skladu sa ovim primerom izvođenja.

[0091] U još jednom primeru izvođenja, reakciona smeša PEG kuplovanja sadrži sledeće elemente:

(a) IFN β u koncentraciji od oko 1,5 mg/ml do oko 2,8 mg/ml, poželjno od oko 2,0 mg/ml do oko 2,8 mg/ml, poželjnije od oko 2,5 mg/ml do oko 2,8 mg/ml, poželjnije oko 2,8 mg/ml;

(b) aktivirani PEG u molarnom odnosu aktiviranog PEG prema IFN β od oko 1:1 do oko 5:1, poželjno od oko 1,5:1 do oko 5:1, poželjnije od oko 1,5:1 do oko 2:1, još poželjnije oko 1,5:1; i

(c) NaCNBH3u koncentraciji od oko 15 mM do oko 25 mM, poželjno od oko 18 mM do oko 22 mM, poželjnije oko 20 mM, pri čemu je pH reakcione smeše PEG kuplovanja od oko 4,8 do oko 5,2, poželjno od oko 4,9 do oko 5,1, poželjnije oko 5,0.

[0092] U jednom primeru izvođenja, reakcija PEG kuplovanja dodatno sadrži katalizator Luisovu kiselinu u koncentraciji od oko 0,78 mM do oko 1,2 mM, poželjno od oko 0,9 mM do oko 1,1 mM, poželjnije od oko 0,95 mM do oko 1,05 mM, još poželjnije oko 1,0 mM. U još jednom primeru izvođenja, katalizator Luisova kiselina je cink katjon.

[0093] U dodatnom primeru izvođenja, reakciona smeša PEG kuplovanja dodatno sadrži arginin u koncentraciji u reakcionoj smeši od oko 50 mM do oko 150 mM, poželjno od oko 75 mM do oko 125 mM, poželjnije oko 100 mM. U jednom primeru izvođenja, reakciona smeša PEG kuplovanja koja dodatno sadrži arginin je ugašena. U još jednom primeru izvođenja, reakciona smeša PEG kuplovanja je u reakcionoj posudi. U dodatnom primeru izvođenja, reakciona smeša PEG kuplovanja u reakcionoj posudi prekriva se inertnim gasom. U jednom primeru izvođenja, inertni gas je argon. U još jednom primeru izvođenja, inertni gas je azot.

[0094] U jednom primeru izvođenja, IFN β je IFN β-1a. U još jednom primeru izvođenja, IFN β je IFN β-1b. U jednom primeru izvođenja, PEG je mPEG. U jednom primeru izvođenja, aktivirani PEG je PEG-O-2-metilpropionaldehid. U još jednom primeru izvođenja, aktivirani PEG je mPEG-O-2-metilpropionaldehid. U jednom primeru izvođenja, PEG ima molekulsku masu od oko 20 kDa.

2

[0095] PEG IFN β se prečišćava upotrebom konvencionalnih tehnika. Stoga, u jednom primeru izvođenja, predmetna objava takođe obezbeđuje PEG IFN β prečišćen iz reakcije PEG kuplovanja ili ugašene reakcije PEG kuplovanja dobijene u skladu sa ovim primerom izvođenja.

[0096] PEG IFN β u reakcionoj smeši PEG kuplovanja ili u ugašenoj reakciji PEG kuplovanja prečišćava se upotrebom konvencionalnih tehnika dobro poznatih iskusnom stručnjaku. Takve tehnike prečišćavanja mogu da uključuju upotrebu SP-Sepharose hromatografske kolone i Superose 6 HR 10/30 FLPC kolona za procenu po veličini. Alternativno, tehnika prečišćavanja može uključivati fraktogel EMD SE HiCap katjonsku izmenjivačku kolonu. Ultrafiltracija/dijafiltracija se može upotrebljavati za koncentrovanje prečišćenog mono-PEG IFN β. Prečišćeni mono-PEG IFN β formuliše se za upotrebu i skladišti se na -70° C u Teflon bocama. Stoga, u jednom primeru izvođenja, predmetna objava obezbeđuje mono-PEG IFN β prečišćen iz reakcije PEG kuplovanja ili ugašene reakcije PEG kuplovanja dobijene u skladu sa predmetnim pronalaskom ili iz reakcije PEG kuplovanja ili ugašene reakcije PEG kuplovanja predmetnog pronalaska. U jednom primeru izvođenja, IFN β je IFN β-1a. U još jednom primeru izvođenja, IFN β je IFN β-1b. U dodatnom primeru izvođenja, PEG je mPEG. U još jednom primeru izvođenja, mPEG je mPEG od 20 kDa.

[0097] PEGilovani interferoni proizvedeni prema predmetnom pronalasku mogu se formulisati u farmaceutske kompozicije upotrebom tehnika dobro poznatih iskusnom stručnjaku. PEG IFN β (takođe se ponekad označava kao PEG IFN β konjugat ili konjugat) predmetne objave primenjuje se u farmakološki efikasnoj količini da leči bilo koje od stanja opisanih iznad, i zasniva se na IFN β aktivnosti konjugata. Termin "farmakološki efikasna količina" označava količinu leka ili farmaceutskog agensa koja će izazvati biološki ili medicinski odgovor tkiva, sistema, životinje ili čoveka koji se traži od strane istraživača ili lekara. To je količina koja je dovoljna da značajno utiče na pozitivan klinički odgovor dok istovremeno održava smanjene nivoe sporednih efekata. Količina PGC IFN-beta koja se može primeniti subjektu kome je to potrebno je u opsegu od 0,01-100 μg/kg, ili poželjnije 0,01-10 μg/kg, primenjeno u pojedinačnoj ili podeljenim dozama.

[0098] Primena opisanih doza može biti svaki drugi dan, ali poželjno se dešava jednom nedeljno ili jednom svake druge nedelje. Doze se tipično primenjuju tokom perioda od najmanje 24 nedelje pomoću injekcije.

[0099] Primena doze može biti oralna, topikalna, intravenska, subkutana, intramuskularna, ili bilo koji drugi prihvatljiv sistemski postupak. Na osnovu procene lekara koji leči, količina primenjenog leka i upotrebljeni režim lečenja će, naravno, zavisiti od starosti, pola i istorije bolesti pacijenta koji se leči, broja neutrofila (npr. težine neutropenije), težine specifičnog stanja bolesti i tolerancije pacijenta na lečenje kao što dokazuju lokalna toksičnost i sistemski sporedni efekti.

[0100] U praksi, konjugati objave se primenjuju u količinama koje će biti dovoljne da inhibiraju ili spreče neželjena medicinska stanja ili bolesti kod subjekta, kao što je sisar, i upotrebljavaju se u najpogodnijem obliku za takve svrhe. Kompozicije su poželjno pogodne za unutrašnju upotrebu i uključuju efikasnu količinu farmakološki aktivnog jedinjenja objave, samu ili u kombinaciji sa drugim aktivnim agensima, sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih nosača. Jedinjenja su naročito korisna po tome što imaju veoma malu, ukoliko uopšte imaju, toksičnost.

[0101] Ovde opisani konjugati mogu da formiraju aktivni sastojak farmaceutske kompozicije, i tipično se primenjuju u smeši sa pogodnim farmaceutskim razblaživačima, ekscipijentima ili nosačima (zajednički ovde označeni kao materijali "nosači") pogodno odabranim u odnosu na predviđeni oblik primene, odnosno, oralne tablete, kapsule, eliksire, sirupe i slično. Kompozicije će tipično uključivati efikasnu količinu aktivnog jedinjenja ili njihove farmaceutski prihvatljive soli, i pored toga, i mogu takođe da uključuju bilo koji materijal nosač kao što se uobičajeno upotrebljava u farmaceutskim naukama. U zavisnosti od predviđenog načina primene, kompozicije mogu biti u čvrstom, polučvrstom ili tečnom doznom obliku, kao što su, na primer, injekcije, tablete, supozitorije, pilule, kapsule sa vremenskim otpuštanjem, praškovi, tečnosti, suspenzije, ili slično, poželjno u jediničnim dozama.

[0102] Konvencionalne farmaceutske kompozicije koje sadrže farmakološki efikasnu količinu konjugata, npr. PEG IFN β, zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačima, adjuvansima, razblaživačima, konzervansima i/ili solubilizatorima mogu se upotrebljavati u praksi objave. Farmaceutske kompozicije interferona uključuju razblaživače različitih pufera (npr. arginin, Tris-HCl, acetat, fosfat) koji imaju opseg pH i jonsku snagu, nosače (npr. humani serumski albumin), solubilizatore (npr. tween, polisorbat), i konzervanse (npr. benzil alkohol). Videti, na primer, SAD patent br.4,496,537.

[0103] Primena ovde opisanih aktivnih jedinjenja može biti putem bilo kog od prihvaćenih načina primene za terapijske agense. Ovi postupci uključuju sistemsku ili lokalnu primenu kao što su oralni, nazalni, parenteralni, transdermalni, subkutani, ili topikalni načini primene.

[0104] Na primer, za oralnu primenu u obliku tablete ili kapsule (npr. želatinske kapsule), aktivna komponenta leka može se kombinovati sa oralnim, netoksičnim farmaceutski prihvatljivim inertnim nosačem kao što su etanol, glicerol, voda, i slično. Štaviše, po želji ili potrebi, pogodna veziva, lubrikanti, agensi za dezintegraciju, i agensi za bojenje takođe se mogu inkorporisati u smešu. Pogodna veziva uključuju skrob, magnezijum aluminijum silikat, skrob pastu, želatin, metilcelulozu, natrijum karboksimetilcelulozu i/ili polivinilpirolidon, šećere,

1

kukuruzne zaslađivače, prirodne i sintetičke gume kao što su akacija, tragakant ili natrijum alginat, polietilen glikol, voskove i slično. Lubrikanti koji se upotrebljavaju u ovim doznim oblicima uključuju natrijum oleat, natrijum stearat, magnezijum stearat, natrijum benzoat, natrijum acetat, natrijum hlorid, silicijum dioksid, talk, stearinsku kiselinu, njenu magnezijumovu ili kalcijumovu so, i/ili polietilen glikol i slično. Dezintegratori uključuju, bez ograničenja, skrob, metil celulozu, agar, bentonit, skrobove ksantan gume, agar, alginsku kiselinu ili njenu natrijumovu so, ili šumeće smeše, i slično. Razblaživači uključuju, npr. laktozu, dekstrozu, saharozu, manitol, sorbitol, celulozu i/ili glicin. Konjugati objave se takođe mogu primenjivati u takvim oralnim oblicima doziranja kao što su tablete ili kapsule sa vremenskim i produženim otpuštanjem, pilule, praškovi, granule, elikseri, tinkture, suspenzije, sirupi, i emulzije. Tečne, posebno smeše za injekcije mogu, na primer, biti pripremljene rastvaranjem, dispergovanjem, itd. Aktivno jedinjenje se rastvara u ili se meša sa farmaceutski čistim rastvaračem kao što su na primer, voda, fiziološki rastvor, akvozna dekstroza, glicerol, etanol, i slično, čime se formira rastvor ili suspenzija za injekcije. Pored toga, mogu se formulisati čvrsti oblici pogodni za rastvaranje u tečnosti pre injektiranja. Kompozicije za injekcije su poželjno akvozni izotonični rastvori ili suspenzije. Kompozicije mogu biti sterilisane i/ili sadržati adjuvanse, kao što su agensi za konzervisanje, stabilizovanje, vlaženje ili emulgovanje, promoteri rastvora, soli za regulisanje osmotskog pritiska i/ili puferi. Pored toga, oni mogu sadržati i druge terapijski vredne supstance.

[0105] Konjugati predmetne objave mogu se primenjivati u intravenskom (npr. bolus ili infuzija), intraperitonealnom, subkutanom ili intramuskularnom obliku, i svi oblici koji se upotrebljavaju dobro su poznati onima koji su prosečno iskusni u farmaceutskoj struci. Injekcije se mogu pripremiti u konvencionalnim oblicima, bilo kao tečni rastvori ili suspenzije.

[0106] Parentalna injektabilna primena se generalno upotrebljava za subkutane, intramuskularne ili intravenske injekcije i infuzije. Na primer, kada se upotrebljava subkutana injekcija da isporuči 0,01-100 μg/kg, ili poželjnije 0,01-10 μg/kg PEGilovanog IFN-beta tokom jedne nedelje, dve injekcije od 0,005-50 μg/kg, ili poželjnije 0,005-5 μg/kg, respektivno, može se primeniti na sat 0 i 72. Pored toga, jedan pristup za parenteralnu primenu koristi implantaciju sistema sa sporim ili produženim otpuštanjem, koji osigurava da se održava konstantan nivo doze, u skladu sa SAD patentom br.3,710,795.

[0107] Štaviše, poželjni konjugati za predmetnu objavu mogu se primenjivati u intranazalnom obliku putem topikalne upotrebe pogodnih intranazalnih nosača, ili putem transdermalnih puteva, upotrebljavajući one oblike transdermalnih flastera za kožu dobro poznate onima koji su prosečno iskusni u struci. Za primenjivanje u obliku sistema za transdermalnu isporuku,

2

primena doze će, naravno, biti kontinuirana pre nego isprekidana tokom celog režima doziranja. Drugi poželjni topikalni preparati uključuju kreme, masti, losione, aerosole, sprejeve i gelove, pri čemu bi primenjena količina bila 10-100 puta doze koja se tipično daje parenteralnom primenom.

[0108] Za čvrste kompozicije, ekscipijenti uključuju farmaceutske kvalitete manitola, laktoze, skroba, magnezijuma stearata, natrijum saharina, talka, celuloze, glukoze, saharoze, magnezijum karbonata, i slično se mogu upotrebljavati. Aktivno jedinjenje definisano iznad, takođe se može formulisati kao supozitorije upotrebom na primer, polialkilen glikola, na primer, propilen glikol, kao nosača. U nekim primerima izvođenja, supozitorije se povoljno pripremaju od masnih emulzija ili suspenzija.

[0109] Konjugati predmetne objave takođe se mogu primenjivati u obliku lipozomskih sistema za isporuku, kao što su male jednolamelarne vezikule, velike jednolamelarne vezikule i višelamelarne vezikule. Lipozomi se mogu formirati od različitih fosfolipida, koji sadrže holesterol, stearilamin, ili fosfatidilholine. U nekim primerima izvođenja, film lipidnih komponenti se hidrira akvoznim rastvorom leka kako bi se formirao lipidni sloj koji inkapsulira lek, kao što je opisano u SAD patentu br.5,262,564.

[0110] Konjugati predmetne objave takođe se mogu isporučiti upotrebom fuzija imunoglobulina kao pojedinačnih nosača za koje su kuplovani molekuli jedinjenja. Jedinjenja predmetne objave takođe mogu biti kuplovana sa rastvorljivim polimerima kao nosačima lekova koji mogu da ciljaju. Takvi polimeri mogu da uključuju polivinilpirolidon, piran kopolimer, polihidroksipropil-metakrilamid-fenol, polihidroksietilaspanamidfenol, ili polietilenoksidpolilizin supstituisan palmitoilnim ostacima. Konjugati se takođe mogu kuplovati sa proteinima, kao što su, na primer, receptorski proteini i albumin. Štaviše, jedinjenja predmetne objave mogu biti kuplovana sa klasom biorazgradivih polimera korisnih u postizanju kontrolisanog otpuštanja leka, na primer, polilaktičnom kiselinom, poliepsilon kaprolaktonom, polihidroksi buternom kiselinom, poliortoestrima, poliacetalima, polidihidropiranima, policijanoakrilatima i umreženim ili amfipatičkim blok kopolimerima hidrogelova.

[0111] Po želji, farmaceutska kompozicija za primenu takođe može sadržati manje količine netoksičnih pomoćnih supstanci kao što su agensi za vlaženje ili emulgovanje, agensi za puferovanje pH, i druge supstance kao što su na primer, natrijum acetat, trietanolamin oleat, itd.

[0112] Dozni režim koji koristi konjugate odabran je u skladu sa nizom faktora uključujući tip, vrstu, starost, težinu, pol i zdravstveno stanje pacijenta; težinu stanja koje treba lečiti; put primene; bubrežne funkcije i funkcije jetre pacijenta; i posebno jedinjenje ili njegovu so koja se koristi. Takođe se uzimaju u obzir aktivnost jedinjenja objave i osetljivost pacijenta na sporedne efekte. Prosečno iskusan lekar ili veterinar mogu lako odrediti i propisati efikasnu količinu leka potrebnu za sprečavanje, suprotstavljanje ili zaustavljanje napredovanja stanja.

[0113] Oralne doze predmetne objave, kada se upotrebljavaju za naznačene efekte, kretaće se u opsegu između oko 0,01-100 μg/kg/danu oralno, ili poželjnije 0,01-10 μg/kg/danu oralno. Kompozicije se poželjno obezbeđuju u obliku deljivih tableta sa utisnutom linijom preko sredine koje sadrže 0,5-5000 μg ili poželjnije 0,5-500 μg aktivnog sastojka.

[0114] Za bilo koji put primene mogu se upotrebljavati podeljene ili pojedinačne doze. Na primer, jedinjenja predmetne objave mogu se primenjivati dnevno ili nedeljno, u jednoj dozi, ili se ukupna doza može primenjivati u podeljenim dozama od dve, tri ili četiri.

[0115] Bilo koja od iznad navedenih farmaceutskih kompozicija može sadržati 0,1-99%, 1-70%, ili, poželjno, 1-50% aktivnih jedinjenja objave kao aktivne sastojke.

[0116] Kao što je opisano iznad, tok bolesti i njen odgovor na lečenja lekom mogu biti praćeni kliničkim pregledom i laboratorijskim nalazima. Efikasnost terapije objave utvrđuje se merom u kojoj su prethodno opisani znaci i simptomi stanja, npr. hroničnog hepatitisa, ublaženi i merom do kog su normalni sporedni efekti interferona (tj. simptomi slični gripu kao što su groznica, glavobolja, jeza, mijalgija, umor, itd. i simptomi povezani sa centralnim nervnim sistemom kao što su depresija, parestezija, smanjena koncentracija, itd.) eliminisani ili znatno smanjeni.

[0117] PEGilovani interferoni se mogu upotrebljavati za lečenje stanja koja su podložna lečenju sa interferonom koja su dobro poznata iskusnom stručnjaku upotrebljavajući prihvaćene načine primene. Videti, na primer, SAD patent br.8,017,733 koji opisuje farmaceutske kompozicije, primenu i lečenja upotrebom PEGilovanih interferona. Takva stanja uključuju, ali nisu ograničena na, poremećaje ćelijske proliferacije, posebno multipla sklerozu, kancer (npr. leukemija vlasastih ćelija, Kapošijev (Kaposi’s) sarkom, hronična mijelogena leukemija, multipli mijelom, karcinom bazalnih ćelija i maligni melanom, kancer jajnika, T-ćelijski limfom kože), virusne infekcije ili bolesti, hronični hepatitis C. Virusne infekcije uključuju, ali nisu ograničene na, hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, drugi ne-A/ne-B hepatitis, herpes virus, Epštajn-Bar (Epstein-Barr) virus (EBV), citomegalovirus (CMV), herpes simpleks, humani herpes virus tip 6 (HHV-6), papiloma, poksvirus, pikornavirus, adenovirus, rinovirus, humani T limfotropni virus tip 1 i 2 (HTLV-1/-2), humani rotavirus, besnilo, retroviruse uključujući virus humane imunodeficijencije (HIV), encefalitis, i respiratorne virusne infekcije. Na primer, PEG IFN prečišćen iz reakcione smeše PEG kuplovanja upotrebljava se za lečenje multipla skleroze, posebno relapsno-remitentnog oblika multipla skleroze (RRMS). RRMS karakterišu

4

jasno definisani napadi pogoršanja neurološke funkcije. Ovi napadi - koji se često nazivaju relapsi, rasplamsavanja ili pogoršanja - praćeni su periodima delimičnog ili potpunog oporavka (remisije), tokom kojih se simptomi poboljšavaju delimično ili u potpunosti, i nema očiglednog napredovanja bolesti. RRMS je najčešći tok bolesti u vreme postavljanja dijagnoze. Kod približno 85 procenata ljudi inicijalno se dijagnostikuje RRMS, u poređenju sa 10-15 procenata sa progresivnim oblicima bolesti.

[0118] Sprovedena je faza 3 studije efikasnosti i bezbednosti PEG IFN β-1a za lečenje RRMS. Videti Calabresi et al., 2014, Lancel Neurol 13(7):657-665. U ovoj studiji, istražitelji širom sveta nasumično su raspodelili 1512 ljudi sa relapsnom MS u jednu od tri grupe: placebo, PEG IFN β-1a 125 μg koji se isporučuje subkutano (ispod kože) svake dve nedelje, ili PEG IFN β -1a 125 μg koji se isporučuje subkutano svake četiri nedelje. Primarni cilj studije bio je da utvrdi efekte leka nasuprot placebu na godišnjoj stopi relapsa posle 48 nedelja. Sekundarni ciljevi su uključivali efekte na oštećenje centralnog nervnog sistema, kao što je primećeno na MRI snimcima, i napredovanje bolesti kao što je mereno EDSS skalom invaliditeta. Posle prve godine, učesnici na placebu su ponovo raspodeljeni da primaju PEG IFN β-1a svake dve ili četiri nedelje, i oni koji su već bili na terapiji ostali su u svojim respektivnim grupama.

[0119] Rezultati za prvu godinu studije pokazali su da je godišnja stopa relapsa znatno više smanjena nego placebo, za 35,6% u grupi doziranja na dve nedelje, i za 27,5% u grupi doziranja na četiri nedelje. Nove lezije (područja oštećenja tkiva) na MRI snimcima smanjene su za 67% u grupi doziranja na dve nedelje i za 28% u grupi doziranja na četiri nedelje. Smanjen je rizik od napredovanja invaliditeta (potvrđen tokom 12 nedelja), kao što je mereno EDSS skalom za 38% u obe grupe PEG IFN β-1a.

[0120] Stoga se u jednom primeru izvođenja za lečenje RRMS, PEG IFN β-1a dozira jednom svake 2 nedelje i primenjuje se subkutano sa autoinjektorom ili prethodno napunjenim špricem. Preporučena doza PEG IFN β-1a je 125 μg svakih 14 dana. Preporučuje se da pacijenti treba da započnu lečenje sa 63 μg na dan 1. Na dan 15 doza se povećava na 94 μg, dostižući punu dozu od 125 μg na dan 29.

PRIMERI

[0121] Predmetni pronalazak je opisan pozivanjem na sledeće primere, koji se nude kao ilustracija i nisu namenjeni da ograniče pronalazak na bilo koji način. Korišćene su standardne tehnike dobro poznate u struci ili tehnike specifično opisane ispod.

PRIMER 1

Reakcija PEGilacije

[0122] Prečišćeni, rekombinantno proizvedeni IFN β-1a u ultrafiltracionom pulu prebačen je u zatvorenu, reakcionu posudu od nerđajućeg čelika sa omotačem i temperatura je dovedena na 18° C - 26° C uz konstantno mešanje. Ciljna zapremina je 21L - 22,5L. Štok rastvor mPEG-O-2-metilpropionaldehida od 20 kDa u acetatu, Bis-Tris pufer je pripremljen i dodat u IFN β-1a do ciljne koncentracije od 4,5 mg/ml aktivnog mPEG-O-2-metilpropionaldehida od 20 kDa. Ciljna pH reakcije kuplovanja je pH 5. Pri pH 5, hemija reduktivne aminacije dešava se selektivno na α-amino grupi N-terminalnog amino-kiselinskog ostatka zbog toga što je znatno manje protonovan od α-amino grupe lizinskih ostataka. Nakon mešanja, u reakcionu smešu dodat je štok rastvor katalizatora Luisove kiseline do ciljne koncentracije od 1 mM. Blagi reduktant NaCNBH3je zatim dodat kao štok rastvor (uz stalno mešanje) u reakcionu smešu do krajnje koncentracije od 20 mM tokom perioda od 1 h. Redukcija sa NaCNBH3rezultuje stabilnom kovalentnom C-N vezom između mPEG-O-2-metilpropionaldehida od 20 kDa i proteina. Tokom procedure kuplovanja nanet je prekrivač od argona radi uklanjanja bilo kog vodonika i cijanovodonik gasa koji mogu da nastanu. Reakciona smeša je inkubirana tokom 5 - 9 sati što je praćeno dodavanjem štok rastvora arginina do krajnje koncentracije od 100 mM. Arginin u višku gasi reakciju reagujući sa preostalim aktivnim mPEG-O-2-metilpropionaldehidom od 20 kDa kako bi bio formiran mPEG-O-2-metilpropionilarginin od 20 kDa, koji je kasnije uklonjen SE HiCap katjonskom izmenjivačkom hromatografijom. Ugašeni reakcioni pul je zadržan do 48 sati pre dodatne obrade.

PRIMER 2

Reakcija PEGilacije

[0123] Ponavljen je primer 1, osim što je pul za ultrafiltraciju čuvan zamrznut pre pokretanja reakcije PEG kuplovanja. Boce su odmrznute na temperaturi okoline, pulirane u istu reakcionu posudu i dovedene na temperaturu okoline.

[0124] Upotrebu neodređenih i određenih članova i sličnih referenci u kontekstu opisa pronalaska (naročito u kontekstu sledećih patentnih zahteva) treba tumačiti tako da pokrivaju i jedninu i množinu, osim ukoliko ovde nije drugačije naznačeno ili jasno protivrečno kontekstu.

Termine "koji sadrže", "koji imaju", "koji uključuju", i "sadrže" treba tumačiti kao otvorene termine (tj. što znači "uključujući, ali ne ograničavajući se na"), osim ukoliko nije drugačije naznačeno. Navođenje opsega vrednosti ovde je samo namenjeno da posluži kao stenografski postupak pozivanja pojedinačno na svaku odvojenu vrednost koja spada u opseg, osim ukoliko ovde nije drugačije naznačeno, i svaka odvojena vrednost je inkorporisana u specifikaciju kao da je ovde pojedinačno navedena. Na primer, ukoliko je objavljen opseg 10-15, onda su 11, 12, 13, i 14 takođe objavljeni, kao i bilo koja njihova frakcija. Svi ovde opisani postupci mogu se izvoditi bilo kojim pogodnim redosledom osim ukoliko ovde nije drugačije naznačeno ili ukoliko nije na drugi način jasno protivrečno kontekstu. Upotreba bilo kog i svih primera, ili primernog jezika (npr. "kao što je") koji su ovde obezbeđeni, namenjena je samo da bolje osvetli pronalazak i ne predstavlja ograničenje obima pronalaska, osim ukoliko nije drugačije zahtevano. Jezik u specifikaciji ne treba tumačiti kao da ukazuje da je bilo koji element van patentnih zahteva suštinski važan za praksu pronalaska.

Claims (26)

Patentni zahtevi

1. Postupak za kuplovanje PEG sa IFN β naznačen time što sadrži sledeće korake:

(a) dodavanje aktiviranog PEG u rastvor prečišćenog IFN β u reakcionoj posudi kako bi se formirala smeša aktiviranog PEG i IFN β, pri čemu rastvor prečišćenog IFN β ima koncentraciju IFN β od 1,75 mg/ml do 3,3 mg/ml i temperaturu od 2° C do 30° C, pri čemu je količina dodatog aktiviranog PEG dovoljna da obezbedi molarni odnos aktiviranog PEG prema IFN β u reakcionoj smeši PEG kuplovanja od 1:1 do 20:1 i pri čemu je pH smeše od 4,0 do 6,0;

(b) opciono dodavanje katalizatora Luisove kiseline u smešu, pri čemu je količina katalizatora Luisove kiseline kada se dodaje dovoljna da obezbedi koncentraciju katalizatora Luisove kiseline u reakcionoj smeši PEG kuplovanja od 0,1 mM do 2,2 mM;

(c) dodavanje NaCNBH3u smešu kako bi se formirala reakciona smeša PEG kuplovanja uz mešanje tokom perioda od 5 minuta do 600 minuta, pri čemu je količina dodatog NaCNBH3dovoljna da obezbedi koncentraciju NaCNBH3u reakcionoj smeši PEG kuplovanja od 15 mM do 25 mM; i

(d) posle koraka (c), inkubiranje reakcione smeše PEG kuplovanja tokom 10 minuta do 24 sata kako bi se proizveo prvenstveno mono-PEG IFN β.

2. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što dodatno sadrži gašenje reakcije PEG kuplovanja kako bi se zaustavila reakcija, opciono pri čemu se reakcija PEG kuplovanja gasi dodavanjem arginina, i opciono pri čemu je količina arginina u ugašenoj reakcionoj smeši od 25 mM do 250 mM.

3. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-2, naznačen time što se smeša u koraku gašenja prekriva inertnim gasom, opciono pri čemu je stopa prekrivanja inertnim gasom 10 LPM.

4. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 2-3, naznačen time što se ugašena reakcija PEG kuplovanja zadržava do 48 sati na 2° C do 30° C pre prečišćavanja mono-PEG IFN β.

5. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što:

(a) rastvor prečišćenog IFN β ima koncentraciju IFN β od 1,75 mg/ml do 3,3 mg/ml i temperaturu od 19° C do 27° C, i količina dodatog aktiviranog PEG dovoljna je da obezbedi molarni odnos aktiviranog PEG prema IFN β u reakcionoj smeši PEG kuplovanja od 1:1 do 5:1 i pri čemu je pH smeše od 4,8 do 5,2;

(b) količina katalizatora Luisove kiseline kada se opciono dodaje dovoljna je da obezbedi koncentraciju katalizatora Luisove kiseline u reakcionoj smeši PEG kuplovanja od 0,78 mM do 1,2 mM;

(c) NaCNBH3se dodaje u smešu kako bi se formirala reakciona smeša PEG kuplovanja uz mešanje tokom perioda od 45 minuta do 240 minuta, pri čemu je količina dodatog NaCNBH3dovoljna da obezbedi koncentraciju NaCNBH3u reakcionoj smeši PEG kuplovanja od 15 mM do 25 mM; i

(d) reakciona smeša PEG kuplovanja inkubira se tokom 5 sati do 9 sati kako bi se proizveo prvenstveno mono-PEG IFN β.

6. Postupak prema patentnom zahtevu 5, naznačen time što dodatno sadrži gašenje reakcije PEG kuplovanja kako bi se zaustavila reakcija, opciono pri čemu se reakcija PEG kuplovanja gasi dodavanjem arginina, i opciono pri čemu je količina arginina u ugašenoj reakcionoj smeši od 50 mM do 150 mM, poželjno od 75 mM do 125 mM, poželjnije 100 mM.

7. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 5-6, naznačen time što:

(i) koncentracija IFN β u rastvoru prečišćenog IFN β je od 2,4 mg/ml do 3,3 mg/ml, poželjno 2,9 mg/ml do 3,3 mg/ml, poželjnije 3,3 mg/ml;

(ii) molarni odnos aktiviranog PEG prema IFN β u reakcionoj smeši PEG kuplovanja je od 1,5:1 do 5:1, poželjno od 1,5:1 do 2:1, poželjnije 1,5:1;

(iii) koncentracija cink katjona u reakciji PEG kuplovanja je od 0,9 mM do 1,1 mM, poželjno od 0,95 mM do 1,05 mM, poželjnije 1,0 mM;

(iv) koncentracija NaCNBH3u reakciji PEG kuplovanja je od 18 mM do 22 mM, poželjno 20 mM;

(v) molarni odnos aktiviranog PEG prema IFN β u reakcionoj smeši PEG kuplovanja je od 1,5:1 do 5:1, poželjno od 1,5:1 do 2:1, poželjnije 1,5:1;

(vi) temperatura je od 21° C do 25° C, poželjno od 22° C do 24° C, poželjnije 23° C; i/ili

(vii) pH je od 4,9 do 5,1, poželjno 5,0.

8. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 6-7, naznačen time što se ugašena reakcija PEG kuplovanja zadržava do 48 sati na 2° C do 25° C pre prečišćavanja mono-PEG IFN β.

9. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-8, naznačen time što se katalizator Luisova kiselina dodaje u reakcionu smešu, opciono pri čemu je katalizator Luisova kiselina cink katjon.

10. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-9, naznačen time što je IFN β IFN β-1a.

11. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-10, naznačen time što je PEG mPEG, opciono pri čemu je mPEG mPEG-O-2-metilpropionaldehid.

12. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-11, naznačen time što:

(i) IFN β se dovodi na navedenu temperaturu pre nego što se doda u reakcionu posudu; ili

(ii) IFN β se dodaje u reakcionu posudu i zatim dovodi na navedenu temperaturu.

13. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-12, naznačen time što se smeše u koracima (a) - (d) prekrivaju inertnim gasom, opciono pri čemu je stopa prekrivanja inertnim gasom 3-5 LPM za korake (a) i (b) i 10 LPM za korake (c) i (d).

14. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 5-13, naznačen time što je pH 5,0, temperatura je 23° C, koncentracija IFN β u rastvoru prečišćenog IFN β je 3,3 mg/ml, molarni odnos aktiviranog PEG prema IFN β je 1,5:1 i koncentracija NaCNBH3u reakciji PEG kuplovanja je 20 mM, opciono pri čemu je Luisov katalizator cink katjon u koncentraciji u reakciji PEG kuplovanja od 1,0 mM.

15. Postupak prema patentnom zahtevu 14, naznačen time što se reakcija PEG kuplovanja gasi dodavanjem arginina u reakcionu smešu PEG kuplovanja do koncentracije od 100 mM u ugašenoj reakcionoj smeši.

4

16. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 14-15, naznačen time što se smeše u koracima (a) - (d) prekrivaju inertnim gasom pri stopi prekrivanja inertnim gasom od 3-5 LPM za korake (a) i (b) i 10 LPM za korake (c) i (d).

17. Postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time što se mono-PEG IFN β formuliše u farmaceutsku kompoziciju, opciono pri čemu farmaceutska kompozicija dodatno sadrži farmaceutski prihvatljive nosače, adjuvanse, razblaživače, konzervanse i/ili solubilizatore.

18. Postupak prema patentnom zahtevu 17, naznačen time što je (a) navedeni solubilizator odabran od tween ili polisorbata; i/ili (b) navedeni razblaživač sadrži pufer, opciono odabran od arginina, Tris-HCl, acetata ili fosfata.

19. Reakciona smeša PEG kuplovanja naznačena time što sadrži sledeće elemente:

(a) IFN β u koncentraciji od 1,5 mg/ml do 2,8 mg/ml;

(b) aktivirani PEG u molarnom odnosu aktiviranog PEG prema IFN β od 1:1 do 20:1; i

(c) NaCNBH3u koncentraciji od 15 mM do 25 mM,

pri čemu je pH reakcione smeše PEG od 4,0 do 6,0.

20. Reakciona smeša PEG kuplovanja prema patentnom zahtevu 19, naznačena time što dodatno sadrži katalizator Luisovu kiselinu u koncentraciji od 0,1 mM do 2,2 mM, opciono pri čemu je katalizator Luisova kiselina cink katjon.

21. Reakciona smeša PEG kuplovanja prema bilo kom od patentnih zahteva 19-20, naznačena time što dodatno sadrži arginin u koncentraciji u reakcionoj smeši od 25 mM do 200 mM.

22. Reakciona smeša PEG kuplovanja prema patentnim zahtevima 19-21, naznačena time što se reakciona smeša PEG kuplovanja gasi.

23. Reakciona smeša PEG kuplovanja prema patentnom zahtevu 19, naznačena time što:

(a) IFN β je u koncentraciji od 2,0 mg/ml do 2,8 mg/ml, poželjnije 2,5 mg/ml do 2,8 mg/ml, još poželjnije 2,8 mg/ml;

(b) aktivirani PEG je u molarnom odnosu aktiviranog PEG prema IFN β od 1:1 do 5:1, poželjno od 1,5:1 do 5:1, poželjnije od 1,5:1 do 2:1, još poželjnije 1,5:1; i (d) NaCNBH3je u koncentraciji od 18 mM do 22 mM, poželjnije 20 mM, pri čemu je pH reakcione smeše PEG od 4,8 do 5,2, poželjno od 4,9 do 5,1, poželjnije 5,0.

24. Reakciona smeša PEG kuplovanja prema patentnom zahtevu 23, naznačena time što dodatno sadrži katalizator Luisovu kiselinu u koncentraciji od 0,78 mM do 1,2 mM, poželjno od 0,9 mM do 1,1 mM, poželjnije od 0,95 mM do 1,05 mM, još poželjnije 1,0 mM, opciono pri čemu je katalizator Luisova kiselina cink katjon.

25. Reakciona smeša PEG kuplovanja prema bilo kom od patentnih zahteva 23-24, naznačena time što dodatno sadrži arginin u koncentraciji u reakcionoj smeši od 50 mM do 150 mM, poželjno od 75 mM do 125 mM, poželjnije 100 mM.

26. Reakciona smeša PEG kuplovanja prema bilo kom od patentnih zahteva 23-25, naznačena time što se reakciona smeša PEG kuplovanja gasi.