RS61190B1

RS61190B1 - Novi peptidi i kombinacija peptida za upotrebu u imunoterapiji protiv raka jajnika i drugih malignih tumora

Info

Publication number: RS61190B1
Application number: RS20201506A
Authority: RS
Inventors: Andrea Mahr; Toni Weinschenk; Helen Hörzer; Oliver Schoor; Jens Fritsche; Harpreet Singh
Original assignee: Immatics Biotechnologies Gmbh
Priority date: 2015-07-01
Filing date: 2016-06-29
Publication date: 2021-01-29
Also published as: AU2021200599B2; CA2990989A1; US20170037111A1; BR112017027459A2; US20170002055A1; US11912748B2; US10472401B2; SG10202001665QA; EA201992664A3; US10494413B2; CN113480604A; DK3317296T3; WO2017001491A3; US10227388B2; SI3317296T1; AU2021200599A1; US10464978B2; US20170037096A1; MX2017017145A; US20180346538A1

Description

Predmetni pronalazak odnosi se na peptide, proteine, nukleinske kiseline i ćelije za upotrebu u imunoterapijskim metodama. Predmetni pronalazak konkretno iznosi imunoterapiju raka. Pored toga, predmetni pronalazak odnosi se na peptidne epitope tumor-asocirane T ćelije, samostalno ili u kombinaciji sa drugim tumorasociranim peptidima koji mogu na primer služiti kao aktivni farmaceutski sastojci smeša za vakcinu koji stimulišu antitumorske imunske odgovore, ili za stimulaciju T ćelija ex vivo i prenos u pacijente. Peptidi vezani za molekule glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC), ili peptidi kao takvi, mogu takođe biti ciljevi antitela, solubilnih T-ćelijskih receptora i drugih molekula koji imaju sposobnost vezivanja.

Predmetni pronalazak odnosi se na peptidnu sekvencu dobijenu iz HLA molekula klase I humanih tumorskih ćelija koje mogu da se koriste u smešama za vakcinu za izazivanje antitumorskih imunskih odgovora, ili kao ciljevi za razvoj farmaceutski/imunološki aktivnih jedinjenja i ćelija.

OSNOVNE INFORMACIJE O PRONALASKU

Rak jajnika

Sa procenjenih 239.000 novih slučajeva u 2012. godini, rak jajnika je sedma najčešća vrsta raka kod žena, koji predstavlja 4% svih vrsta raka kod žena. Stopa smrtnosti od raka jajnika često je prilično visoka u odnosu na druge vrste raka ženskih reproduktivnih organa a letalitet je viši u siromašnijim sredinama. Kao posledica toga, rak jajnika je osmi najčešći uzrok smrti usled raka kod žena, sa 152.000 smrtnih ishoda. 2012. godine skoro 55% svih novih slučajeva otkriveno je u zemljama sa visokim ili veoma visokim nivoom ljudskog razvoja; 37% novih slučajeva i 39% smrti su se dogodile u Evropi i Severnoj Americi. Stope incidencije su najviše u Severnoj i Istočnoj Evropi, Severnoj Americi i Okeaniji a relativno su niske u Africi i većem delu Azije. Stope incidencije opadaju u određenim zemljama sa veoma visokim nivoom ljudskog razvoja, pre svega u Evropi i Severnoj Americi.

Najčešća vrsta raka jajnika su karcinomi jajnika, koji su takođe i među najsmrtonosnijim ginekološkim malignitetima. Prema histopatologiji i molekularnoj genetici, karcinomi jajnika se dele na pet glavnih tipova: serozni visokog gradusa (70%), endometroidni (10%), svetloćelijski (10%), mucinozni (3%) i serozni karcinomi niskog gradusa (< 5%), koji zajedno čine više od 95% slučajeva. Mnogo manje česti su maligni tumori germinativnih ćelija (disgerminomi, tumori žumančane kese i nezreli teratomi) (3% slučajeva raka jajnika) i potencijalni maligni stromalni tumori polne peteljke (1-2%), među kojima su najčešći tumori granuloznih ćelija.

Porodična istorija raka jajnika prisutna je u 10% slučajeva; rizik je povećan 3 puta kada su obolela dva ili više rođaka prvog reda. Žene sa mutacijama germinativne linije na BRCA1 ili BRCA2 imaju 30–70% rizik od razvoja raka jajnika, pre svega seroznih karcinoma visokog gradusa, do 70. godine starosti (Risch et al., 2006).

Hirurška resekcija je primarna terapija u ranom kao i u uznapredovalom stadijumu karcinoma jajnika. Nakon hirurškog odstranjivanja sledi sistemska hemioterapija sa analozima platine, osim za rak jajnika veoma niskog gradusa (stadijum IA, gradus 1), gde postoperativna hemioterapija nije indikovana. U uznapredovalom stadijumu raka jajnika, hemioterapija prve linije se sastoji od kombinacije karboplatine sa paklitakselom, kojima može biti dodat bevacizumab. Standardno lečenje za vrste raka jajnika rezistentne na platinu sastoji se od monoterapije jednim od sledećih hemioterapeutika: pegilovani lipozomalni doksorubicin, topotekan, gemcitabin ili paklitaksel (S3-Leitlinie maligne Ovarialtumore, 2013).

Čini se da je imunoterapija obećavajuća strategija da se poboljša tretman pacijenata sa rakom jajnika, budući da prisustvo proinflamatornih tumor-infiltrišućih limfocita, posebno CD8-pozitivnih T ćelija, korelira sa dobrom prognozom a T ćelije specifične za tumor-asocirane antigene mogu biti izolovane iz tkiva raka.

Stoga, ulaže se dosta naučnog truda u istraživanje različitih imunoterapija kod raka jajnika. Značajan broj pretkliničkih i kliničkih studija je već sproveden i trenutno su u toku dalje studije. Klinički podaci su dostupni za citokinsku terapiju, vakcinaciju, tretman monoklonskim antitelima, adoptivni ćelijski transfer i imunomodulaciju.

Citokinska terapija sa interleukinom-2, interferonom-alfa, interferonom-gama ili faktorom stimulacije kolonije granulocita-makrofaga ima za cilj da podstakne antitumorski imunski odgovor samog pacijenta i ovi tretmani su već pokazali obećavajuće rezultate u malim studijskim kohortama.

Studije vakcinacije faze I i II, koristeći pojedinačne ili multiple peptide, izvedene iz nekoliko tumor-asociranih proteina (Her2/neu, NY-ESO-1, p53, Wilms tumor-1) ili celokupne tumorske antigene, izvedene iz autolognih tumorskih ćelija pokazale su dobre profile bezbednosti i podnošljivosti, ali samo niske do umerene kliničke efekte.

Smatra se da monoklonska antitela koja specifično prepoznaju tumor-asocirane proteine povećavaju ubijanje tumorskih ćelija posredovano imunskim ćelijama. Anti-CA-125 antitela oregovomab i abagovomab kao i anti-EpCAM antitelo katumaksomab postigla su obećavajuće rezultate u studijama faze II i III. Nasuprot tome, anti-MUC1 antitelo HMFG1 nije uspelo da jasno poveća preživljavanje u studiji faze III.

Alternativni pristup koristi monoklonska antitela da cilja i blokira faktor rasta i receptore preživljavanja na tumorskim ćelijama. Dok su davanje trastuzumaba (anti-HER2/neu antitelo) i MOv18 i MORAb-003 (anti-folatni receptor alfa antitela) dali samo ograničenu kliničku korist za pacijente sa rakom jajnika, čini se da dodatak bevacizumaba (anti-VEGF antitelo) standardnoj hemioterapiji u uznapredovalom raku jajnika ima prednosti.

Adoptivni transfer imunskih ćelija postigao je heterogene rezultate u kliničkim ispitivanjima. U pilot ispitivanju je pokazano da je adoptivni transfer autolognih, in vitroekspandiranih tumor infiltrišućih T ćelija obećavajući pristup. Nasuprot tome, transfer T ćelija koje nose himerni antigenski receptor specifičan za folatni receptor alfa nije izazvao značajan klinički odgovor u ispitivanju faze I. Pokazano je da dendritične ćelije pulsirane sa lizatom tumorskih ćelija ili tumor-asociranim proteinima in vitro povećavaju antitumorski T ćelijski odgovor nakon transfera, ali opseg aktivacije T ćelija nije korelisao sa kliničkim efektima. Transfer ćelija prirodnih ubica izazvao je značajne toksičnosti u studiji faze II.

Unutrašnja antitumorska imunost kao i imunoterapija su ograničene imunosupresivnom tumorskom mikrosredinom. Da se prevaziđe ova prepreka, imunomodulatorni lekovi, kao ciklofosfamid, anti-CD25 antitela i pegilovani lipozomalni doksorubicin su testirani u kombinaciji sa imunoterapijom. Najpouzdaniji podaci su trenutno dostupni za ipilimumab, anti-CTLA4 antitelo, koje povećava aktivnost T ćelija. Pokazano je da ipilimumab izaziva značajne antitumorske efekte kod pacijenata sa rakom jajnika (Mantia-Smaldone et al., 2012).

Imajući u vidu teška neželjena dejstva i trošak lečenja raka, postoji potreba da se identifikuju faktori koji mogu da se koriste u lečenju raka uopšte i konkretno raka jajnika. Takođe postoji potreba da se jajnika faktori koji predstavljaju biomarkere za rak uopšte i konkretno za rak jednjaka, koji bi doveli do boljeg dijagnostikovanja raka, bolje procene prognoze i predviđanja uspeha lečenja.

Imunoterapija raka predstavlja mogućnost specifičnog ciljanja ćelija raka uz svođenje neželjenih dejstava na minimum. Imunoterapija raka iskorišćava postojanje tumor-asociranih antigena.

Trenutno važeća klasifikacija tumor-asociranih antigena (TAA) sadrži sledeće velike grupe:

a) Karcinom-testis antigeni: Prvi TAA koji su ikad identifikovani koje mogu da prepoznaju T ćelije pripadaju ovoj klasi, koja je originalno nazvana karcinom-testis (CT) antigeni zbog ekspresije njenih članova u histološki različitim humanim tumorima i, među normalnim tkivima, samo u spermatocitima/spermatogonijama testisa i, povremeno, u placenti. Budući da ćelije testisa ne eksprimiraju HLA molekule klase I i II, ove antigene ne mogu da prepoznaju T ćelije u normalnim tkivima te se stoga mogu smatrati imunološki tumor-specifičnim. Dobro poznati primeri za CT antigene su pripadnici MAGE familije i NY-ESO-1.

b) Antigeni diferencijacije: Ove TAA dele tumori i normalno tkivo iz kojeg je tumor nastao. Većina poznatih antigena diferencijacije nalazi se u melanomima i normalnim melanocitima. Mnogi od ovih proteina povezanih sa melanocitnom linijom uključeni su u biosintezu melanina te stoga nisu tumor-specifični, ali bez obzira na to naširoko se koriste za imunoterapiju raka. Primeri uključuju, ali nisu i ograničeni na, tirozinazu i Melan-A/MART-1 za melanom ili PSA za rak prostate. c) Prekomerno eksprimirani TAA: Geni koji kodiraju naširoko eksprimirane TAA detektovani su u histološki različitim tipovima tumora kao i u mnogim normalnim tkivima, generalno sa nižim nivoima ekspresije. Moguće je da su mnogi od epitopa koje normalna tkiva obrađuju i potencijalno prezentuju ispod nivoa praga za prepoznavanje od strane T ćelija, dok njihova prekomerna ekspresija u ćelijama tumora može da pokrene antitumorski odgovor probijanjem prethodno uspostavljene tolerancije. Istaknuti primeri za ovu klasu TAA su Her-2/neu, survivin, telomeraza ili WT1.

d) Tumor-specifični antigeni: Ovi jedinstveni TAA nastaju iz mutacija normalnih gena (kao što je β-katenin, CDK4, itd.). Neke od ovih molekularnih promena su u vezi sa neoplastičnom transformacijom i/ili progresijom. Tumor-specifični antigeni su generalno u stanju da indukuju jake imunske odgovore a da pritom ne nose rizik od autoimunskih reakcija protiv normalnih tkiva. S druge strane, ovi TAA su u većini slučajeva relevantni samo za određeni tumor na kojem su identifikovani i obično ih ne deli mnogo individualnih tumora. Tumorska specifičnost (ili asociranost) peptida može takođe biti posledica toga što peptid potiče iz tumor- (-asociranog) egzona u slučaju proteina sa tumor-specifičnim (-asociranim) izoformama.

e) TAA koji nastaju iz abnormalnih posttranslacionih modifikacija: Takvi TAA mogu nastati iz proteina koji su niti specifični niti prekomerno eksprimirani u tumorima, ali bez obzira na to postaju tumor-asocirani pomoću posttranslacionih procesa koji su primarno aktivni u tumorima. Primeri za ovu klasu nastaju iz izmenjenih obrazaca glikozilacije koji dovode do novih epitopa u tumorima kao za MUC1 ili događaja poput spajanja proteina u toku degradacije, koji mogu i ne moraju biti tumorspecifični.

f) Onkovirusni proteini: Ovi TAA su virusni proteini koji mogu imati kritičnu ulogu u procesu onkogeneze i, zbog toga što su stranog (a ne humanog) porekla, oni mogu pokrenuti T-ćelijski odgovor. Primeri takvih proteina su proteini humanog papiloma virusa tip 16, E6 i E7, koji se eksprimiraju u karcinomu grlića materice.

Imunoterapija bazirana na T ćelijama cilja peptidne epitope dobijene iz tumorasociranih ili tumor-specifičnih proteina, koje prezentuju molekuli glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC). Antigeni koje prepoznaju tumorspecifični T limfociti, to jest, njihovi epitopi, mogu biti molekuli dobijeni iz svih klasa proteina, kao što su enzimi, receptori, faktori transkripcije, itd. koji se eksprimiraju i, u poređenju sa neizmenjenim ćelijama istog porekla, obično ushodno regulišu u ćelijama datog tumora.

Postoje dve klase MHC molekula, MHC klasa I i MHC klasa II. MHC molekuli klase I su sastavljeni od alfa teškog lanca i beta-2 mikroglobulina, MHC molekuli klase II od alfa i beta lanca. Njihova trodimenzionalna konformacija rezultuje stvaranjem udubljenja za vezivanje, koje se koristi za nekovalentnu interakciju sa peptidima.

MHC molekuli klase I se nalaze na većini ćelija koje sadrže jedro. Oni prezentuju peptide koji nastaju kao posledica proteolitičkog cepanja predominantno endogenih proteina, defektnih proizvoda ribozoma (DRIP-ova) i većih peptida. Međutim na MHC molekulima klase I se često nalaze i peptidi dobijeni iz endozoma ili egzogenih izvora. Ovaj neklasičan način prezentacije klase I se u literaturi naziva unakrsna prezentacija (Brossart and Bevan, 1997; Rock et al., 1990). MHC molekuli klase II predominantno se nalaze na profesionalnim antigen-prezentujućim ćelijama (APĆ), i primarno prezentuju peptide egzogenih ili transmembranskih proteina koje APĆ preuzimaju npr. u toku endocitoze, i nakon toga obrađuju.

Komplekse peptida i MHC klase I prepoznaju CD8-pozitivne T ćelije koje nose odgovarajući T-ćelijski receptor (TCR), dok komplekse peptida i MHC molekula klase II prepoznaju CD4-pozitivne pomoćničke T ćelije koje nose odgovarajući TCR. Dobro je poznato da su TCR, peptid i MHC pritom prisutni u stehiometrijskom odnosu od 1:1:1.

CD4-pozitivne pomoćničke T ćelije imaju važnu ulogu u indukovanju i održavanju efikasnih odgovora od strane CD8-pozitivnih citotoksičnih T ćelija. Identifikacija CD4-pozitivnih T-ćelijskih epitopa dobijenih iz tumor-asociranih antigena (TAA) je od velikog značaja za razvoj farmaceutskih proizvoda za izazivanje antitumorskih imunskih odgovora (Gnjatic et al., 2003). Na mestu tumora, T pomoćničke ćelije podržavaju citokinski milje koji je povoljan za citotoksične T ćelije (CTL) (Mortara et al., 2006) i privlače efektorske ćelije, npr. CTL, ćelije prirodne ubice (NK), makrofage i granulocite (Hwang et al., 2007).

U odsustvu zapaljenja, ekspresija MHC molekula klase II je uglavnom ograničena na ćelije imunskog sistema, naročito profesionalne antigen-prezentujuće ćelije (APĆ), npr. monocite, ćelije izvedene iz monocita, makrofage, dendritične ćelije. Kod pacijenata koji boluju od raka, otkriveno je da ćelije tumora eksprimiraju MHC molekule klase II (Dengjel et al., 2006).

Elongirani (duži) peptidi pronalaska mogu da deluju kao MHC klasa II aktivni epitopi.

T-pomoćničke ćelije, aktivirane od strane MHC klasa II epitopa, imaju važnu ulogu u orkestriranju efektorske funkcije CTL u antitumorskoj imunosti. T-pomoćnički ćelijski epitopi koji izazivaju T-pomoćnički ćelijski odgovor TH1 tipa podržavaju efektorske funkcije CD8-pozitivnih T ćelija ubica, koje obuhvataju citotoksične funkcije usmerene protiv tumorskih ćelija koje prikazuju komplekse tumor-asocirani peptid/MHC na površini ćelije. Na ovaj način tumor-asocirani peptidni epitopi T-pomoćničke ćelije, samostalno ili u kombinaciji sa drugim tumor-asociranim peptidima, mogu da služe kao aktivni farmaceutski sastojci smeša za vakcinu koje stimulišu antitumorske imunske odgovore.

Na životinjskim modelima na sisarima, npr. miševi, dokazano je da su čak i u odsustvu CD8-pozitivnih T limfocita, CD4-pozitivne T ćelije dovoljne za inhibiranje manifestacija tumora putem inhibicije angiogeneze pomoću sekrecije interferonagama (IFNγ) (Beatty and Paterson, 2001; Mumberg et al., 1999). Postoje dokazi da su CD4 T ćelije direktni antitumorski efektori (Braumuller et al., 2013; Tran et al., 2014).

Budući da je konstitutivna ekspresija HLA molekula klase II obično ograničena na imunske ćelije, mogućnost izolovanja peptida klase II direktno iz primarnih tumora ranije se nije smatrala mogućom. Međutim, Dengjel i saradnici su uspešno identifikovali određeni broj epitopa MHC klase II direktno iz tumora (WO 2007/028574, EP 1760 088 B1).

Budući da obe vrste odgovora, CD8 i CD4-zavisan, zajednički i sinergistički doprinose antitumorskom efektu, identifikacija i karakterizacija tumor-asociranih antigena prepoznatih pomoću ili CD8+ T ćelija (ligand: MHC molekul klase I peptidni epitop) ili pomoću CD4-pozitivnih T pomoćničkih ćelija (ligand: MHC molekul klase II peptidni epitop) je važna u razvoju tumorskih vakcina.

Da bi peptid MHC klase I pokrenuo (izazvao) ćelijski imunski odgovor, on takođe mora da se veže za MHC molekul. Ovaj proces zavisi od alela MHC molekula i specifičnih polimorfizama aminokiselinske sekvence peptida. Peptidi koji se vezuju za MHC klasa I su obično dužine 8–12 aminokiselinskih ostataka i obično sadrže dva konzervirana ostatka („sidra“) u svojoj sekvenci koji interaguju sa odgovarajućim udubljenjem za vezivanje MHC molekula. Na ovaj način, svaki MHC alel ima „vezujući motiv“ koji određuje koji peptidi mogu specifično da se vežu za udubljenje za vezivanje.

U MHC klasa I-zavisnoj imunskoj reakciji, peptidi ne samo da moraju da budu sposobni da se vežu za određene MHC molekule klase I koje eksprimiraju tumorske ćelije, već njih takođe moraju da naknadno prepoznaju T ćelije koje nose specifične T-ćelijske receptore (TCR).

Da bi proteini mogli da budu prepoznati od strane T limfocita kao tumor-specifični ili tumor-asocirani antigeni, i da bi mogli da se koriste u terapiji, moraju da budu ispunjeni određeni preduslovi. Antigen bi trebalo da bude uglavnom eksprimiran od strane ćelija tumora a ne ili u uporedivo malim količinama od strane normalnih zdravih tkiva. U poželjnom otelotvorenju, peptid bi trebalo da bude prekomerno prezentovan od strane ćelija tumora u poređenju sa normalnim zdravim tkivima. Nadalje je poželjno da dati antigen ne bude samo prisutan u određenoj vrsti tumora, već takođe i u visokim koncentracijama (tj. broj kopija datog peptida po ćeliji). Tumor-specifični i tumor-asocirani antigeni se često dobijaju od proteina koji su direktno uključeni u transformaciju normalne ćelije u tumorsku ćeliju zbog njihove funkcije npr. u kontroli ćelijskog ciklusa ili supresiji apoptoze. Pored toga, nishodni ciljevi proteina koji su direktno odgovorni za transformaciju mogu biti ushodno regulisani i tako mogu indirektno biti tumor-asocirani. Takvi indirektno tumor-asocirani antigeni mogu takođe biti ciljevi vakcinalnog pristupa (Singh-Jasuja et al., 2004). Esencijalno je da epitopi budu prisutni u aminokiselinskoj sekvenci antigena, kako bi se osiguralo da takav peptid („imunogeni peptid“) koji je dobijen iz tumor-asociranog antigena dovede do in vitro ili in vivo T-ćelijskog odgovora.

U osnovi, svaki peptid koji je u stanju da veže MHC molekul može funkcionisati kao T-ćelijski epitop. Preduslov za indukciju in vitro ili in vivo T-ćelijskog odgovora je prisustvo T ćelije koja ima odgovarajući TCR i odsustvo imunološke tolerancije za ovaj konkretni epitop.

Stoga su TAA početna tačka za razvoj terapije zasnovane na T ćelijama uključujući, bez ograničavanja, tumorske vakcine. Metodi za identifikaciju i karakterizaciju TAA obično su zasnovani na upotrebi T ćelija koje mogu biti izolovane iz pacijenata ili zdravih ispitanika, ili se oni zasnivaju na stvaranju diferencijalnih profila transkripcije ili diferencijalnih obrazaca ekspresije peptida između tumora i normalnih tkiva. Ipak, identifikacija gena koji su prekomerno eksprimirani u tumorskim tkivima ili humanim tumorskim ćelijskim linijama, ili selektivno eksprimirani u takvim tkivima ili ćelijskim linijama, ne obezbeđuje precizne informacije o upotrebi antigena koji se transkribuju iz ovih gena u imunskoj terapiji. Ovo je iz razloga što je samo pojedinačna potpopulacija epitopa ovih antigena prikladna za takvu primenu budući da mora da bude prisutna T ćelija sa odgovarajućim TCR i da imunološka tolerancija za ovaj naročit epitop bude odsutna ili minimalna. U veoma poželjnom otelotvorenju pronalaska je zato važno da se odaberu samo oni prekomerno ili selektivno prezentovani peptidi protiv kojih se može naći funkcionalna i/ili proliferišuća T ćelija. Takva funkcionalna T ćelija je definisana kao T ćelija koja nakon stimulacije sa specifičnim antigenom može klonalno da se proširi i koja je sposobna da izvrši efektorske funkcije („efektorska T ćelija“).

U dokumentu W02006/029176 je predstavljeno 69 aa peptida (ID BR. SEKV: 6) dobijenih iz proteina specifičnog za testis CT45 a koji sadrže ID BR. SEKV: 11 (KIFEMLEGV) predmetnog pronalaska. Dokument W02006/029176 se odnosi na bilo koju vrstu antigenih molekula dobijenih iz CT45 koji se primarno koriste da se stvore antitela ili njegovi fragmenti koji vezuju antigen koji se koriste za terapiju. Dokument W02006/029176 pominje T ćelije koje prepoznaju epitope izolovanog polipeptida prezentovanog od strane MHC molekula, ali nedostaju specifični podaci u tom pogledu.

U slučaju ciljanja kompleksa peptid-MHC pomoću specifičnih TCR-ova (npr. solubilni TCR) i antitela u skladu sa pronalaskom, imunogenost osnovnih peptida je sekundarna. U tim slučajevima presudni faktor je prezentacija.

KRATAK PREGLED PRONALASKA

U prvom aspektu predmetnog pronalaska, predmetni pronalazak odnosi se na peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu u skladu sa ID BR. SEKV: 11, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so.

1

U sledećim tabelama prikazani su ovde predstavljeni peptidi, njihovi odgovarajući ID BR. SEKV i prospektivni izvorni (osnovni) geni za ove peptide. Svi peptidi u tabeli 1 i tabeli 2 vezuju se za HLA-A*02. Peptidi u tabeli 2 objavljeni su ranije, npr. u velikim spiskovima kao rezultati visoko propusnih skrininga sa velikim stopama greške ili su izračunati pomoću algoritama, ali nisu nikada ranije bili povezani sa malignim tumorom. Peptidi u tabeli 3 su dodatni peptidi koji mogu biti korisni u kombinaciji sa drugim ovde predstavljenim peptidimaPeptidi u tabeli 4 su pored toga korisni u dijagnostikovanju i/ili lečenju različitih drugih maligniteta, koji podrazumevaju prekomernu ekspresiju ili prekomernu prezentaciju dotičnog osnovnog polipeptida.

Tabela 1: Predstavljeni peptidi, ID BR. SEKV: 11 je u skladu sa predmetnim pronalaskom. J = fosfoserin.

1

2

Tabela 2: Dodatni predstavljeni peptidi bez prethodno poznate povezanosti sa malignim tumorima. J = fosfoserin.

2

Tabela 3: Peptidi korisni za terapiju raka, npr. personalizovane antitumorske terapije

Predmetni pronalazak se dalje uopšteno odnosi na peptid u skladu sa predmetnim

2

pronalaskom za upotrebu u lečenju proliferativnih bolesti, kao što su, na primer, nesitnoćelijski rak pluća, sitnoćelijski rak pluća, rak bubrega, rak mozga, rak kolona i rektuma, rak želuca, rak jetre, rak pankreasa, rak prostate, leukemija, rak dojke, rak Merkelovih ćelija, melanom, rak jednjaka, rak mokraćne bešike, rak materice, rak žučne kese, rak žučnih puteva.

Predstavljeni su peptidi – samostalni ili u kombinaciji – naznačeni time što je ID BR. SEKV: 11 prema predmetnom pronalasku izabran iz grupe koju čine ID BR. SEKV: 1, 11, 427, 408, 198, 512, 519 i 587 i njihove primene u imunoterapiji raka jajnika, nesitnoćelijskog raka pluća, sitnoćelijskog raka pluća, raka bubrega, raka mozga, raka kolona i rektuma, raka želuca, raka jetre, raka pankreasa, raka prostate, leukemije, raka dojke, raka Merkelovih ćelija, melanoma, raka jednjaka, raka mokraćne bešike, , raka materice, , raka žučne kese, raka žučnih puteva, , a poželjno

raka jajnika.

Kako je prikazano u sledećim tabelama 4A i B, mnogi od predstavljenih peptida se takođe nalaze i na drugim vrstama tumora, te se stoga mogu koristiti i u imunoterapiji drugih indikacija. Takođe pogledajte slike 1 i primer 1.

Tabela 4A: Predstavljeni peptidi, ID BR SEKV: 11 je u skladu sa predmetnim pronalaskom i njihove specifične primene u drugim proliferativnim oboljenjima, posebno u drugim malignim bolestima. U tabeli je prikazano, za izabrane peptide, na kojim dodatnim vrstama tumora su pronađeni i bilo da su prekomerno prezentovani na više od 5% izmerenih uzoraka tumora ili prezentovani na više od 5% izmerenih uzoraka tumora pri čemu je odnos geometrijskih srednjih vrednosti tumora u odnosu na normalna tkiva veći od 3. Prekomerna prezentacija se definiše kao viša prezentacija na uzorku tumora u poređenju sa normalnim uzorkom sa najvišom prezentacijom. Normalna tkiva u odnosu na koja je prekomerna prezentacija testirana bila su: masno tkivo, nadbubrežna žlezda, arterija, kostna srž, mozak, centralni nerv, kolon, duodenum, jednjak, žučna kesa, srce, bubreg, jetra, pluća, limfni čvor, mononuklearne bele krvne ćelije, pankreas, periferni nerv, peritoneum, hipofiza, pleura, rektum, pljuvačna žlezda, skeletni mišić, koža, tanko crevo, slezina, želudac, timus, štitasta žlezda, trahea, ureter, mokraćna bešika, vena. J = fosfoserin

2

1

2

4

NSCLC = nesitnoćelijski rak pluća, SCLC = sitnoćelijski rak pluća, RCC = rak bubrega, CRC = kolorektalni karcinom, GC = rak želuca, HCC = rak jetre, PC = rak pankreasa, PrC = rak prostate, BrCa = rak dojke, MCC = rak Merkelovih ćelija

Tabela 4B: Predstavljeni peptidi, ID BR SEKV: 11 je u skladu sa predmetnim pronaalaskom i njihove specifične primene u drugim proliferativnim oboljenjima, posebno u drugim malignim bolestima (izmena i dopuna tabele 4). U tabeli je prikazano, kao u tabeli 4A, za izabrane peptide, na kojim dodatnim vrstama tumora je pronađeno da pokazuju prekomernu prezentaciju (uključujući specifičnu prezentaciju) na više od 5% izmerenih uzoraka tumora, ili prezentaciju na više od 5% izmerenih uzoraka tumora pri čemu je odnos geometrijskih srednjih vrednosti tumora u odnosu na normalna tkiva veći od 3. Prekomerna prezentacija se definiše kao viša prezentacija na uzorku tumora u poređenju sa normalnim uzorkom sa najvišom prezentacijom. Normalna tkiva u odnosu na koja je prekomerna prezentacija testirana bila su: masno tkivo, nadbubrežna žlezda, arterija, kostna srž, mozak, centralni nerv, kolon, duodenum, jednjak, oko, žučna kesa, srce, bubreg, jetra, pluća, limfni čvor, mononuklearne bele krvne ćelije, pankreas, paraštitasta žlezda, periferni nerv, peritoneum, hipofiza, pleura, rektum, pljuvačna žlezda, skeletni mišić, koža, tanko crevo, slezina, želudac, štitasta žlezda, trahea, ureter, mokraćna bešika, vena.

4

1

2

4

NSCLC = nesitnoćelijski rak pluća, SCLC = sitnoćelijski rak pluća, RCC = rak bubrega, CRC = rak kolona ili rektuma, GC = rak želuca, HCC = rak jetre, PC = rak pankreasa, PrC = rak prostate, BRCA = rak dojke, NHL = non-Hočkin limfom, AML = akutna mijeloidna leukemija, CLL = hronična limfocitna leukemija, HNSCC = skvamocelularni karcinom glave i vrata.

Stoga, predstavljena je upotreba najmanje jednog peptida u skladu sa bilo kojom od ID BR. SEKV 1, 11, 17, 27, 45, 57, 58, 61, 62, 65, 72, 74, 79, 84, 97, 98, 104, 105, 125, 126, 143, 150, 157, 161, 167, 176, 179, 183, 184, 195, 198, 201, 204, 213, 217, 222, 228, 234, 248, 263, 264, 268, 285, 287, 303, 313, 319, 323, 333, 335, 338, 343, 347, 348, 355, 356, 359, 373, 385, 394, 395, 403, 415, 421, 427, 428, 429, 430, 431, 434, 441, 443, 444, 446, 447, 450, 454, 456, 457, 458, 459, 463, 474, 477, 479, 480, 486, 489, 492, 493, 497, 501, 503, 506, 514, 517, 521, 526, 538, 539, 540, 541, 545, 554, 558, 568, 573, 576, 578, 579, 589, 595, 597, 599, 602, 607, 610, 613, 616, 627, 632, 635 i 637 za – u jednom poželjnom otelotvorenju kombinovano – lečenje NSCLC.

Zatim, drugi aspekt predmetnog pronalaska se odnosi na korišćenje peptida u skladu sa predmetnim pronalaskom za - poželjno kombinovano - lečenje proliferativne bolesti odabrane iz grupe karcinoma jajnika, nesitnoćelijskog karcinoma pluća, sitnoćelijskog karcinoma pluća, raka bubrega, raka mozga, raka kolona ili rektuma, raka želuca, raka jetre, raka pankreasa, raka prostate, leukemije, raka dojke, karcinoma Merkelovih ćelija, melanoma, raka jednjaka, raka mokraćne bešike, raka materice, raka žučne kese, raka žučnih puteva.Predmetni pronalazak se dalje odnosi na peptid u skladu sa predmetnim pronalaskom, naznačeno time što navedeni peptid sadrži nepeptidne veze.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na peptid u skladu sa predmetnim pronalaskom, naznačeno time što je navedeni peptid fuzionisan sa N-terminalnim aminokiselinama HLA-DR antigen-asociranog nepromenljivog lanca (Ii).

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na nukleinsku kiselinu koja kodira peptid za upotrebu u skladu sa predmetnim pronalaskom. Predmetni pronalazak se dalje odnosi na nukleinsku kiselinu u skladu sa predmetnim pronalaskom koja je DNK, cDNK, PNK, RNK ili njihova kombinacija.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na vektor ekspresije koji eksprimira nukleinsku kiselinu u skladu sa predmetnim pronalaskom.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na peptid u skladu sa predmetnim pronalaskom, nukleinsku kiselinu u skladu sa predmetnim pronalaskom ili vektor ekspresije u skladu sa predmetnim pronalaskom za upotrebu u lečenju bolesti i medicini, konkretno u lečenju raka.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na antitela koja su specifična protiv kompleksa peptida u skladu sa predmetnim pronalaskom sa MHC i metode za pravljenje istih.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na T-ćelijske receptore (TCR-ove), konkretno solubilne TCR (sTCR) i klonirane TCR ubačene u autologne ili alogene T ćelije, i metode za pravljenje istih, kao i NK ćelije ili druge ćelije koje nose navedeni TCR ili koje unakrsno reaguju sa navedenim TCR-ovima.

Antitela i TCR su dodatna otelotvorenja imunoterapijske upotrebe peptida u skladu sa prikazanim pronalaskom.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na ćeliju domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu u skladu sa predmetnim pronalaskom ili vektor ekspresije kako je ranije opisan. Predmetni pronalazak se dalje odnosi na ćeliju domaćina u skladu sa predmetnim pronalaskom koja je antigen-prezentujuća ćelija, a poželjno dendritična ćelija.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na metod za proizvodnju peptida u skladu sa predmetnim pronalaskom, pri čemu se navedeni metod sastoji od kultivisanja ćelije domaćina u skladu sa predmetnim pronalaskom i izolovanja peptida iz navedene ćelije domaćina ili njenog medijuma za kultivaciju.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na navedeni metod u skladu sa predmetnim pronalaskom, naznačeno time što se antigen postavlja na MHC molekule klase I eksprimirane na površini prikladne antigen-prezentujuće ćelije ili veštačke antigenprezentujuće ćelije tako što se dovoljna količina antigena dovodi u kontakt sa antigen-prezentujućom ćelijom.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na metod u skladu sa predmetnim pronalaskom, naznačeno time što antigen-prezentujuća ćelija sadrži vektor ekspresije koji eksprimira navedeni peptid koji sadrži ID BR. SEKV 11.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na aktivirane T ćelije, proizvedene pomoću metoda u skladu sa predmetnim pronalaskom, naznačeno time što navedena T ćelija selektivno prepoznaje ćeliju koja eksprimira polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu u skladu sa predmetnim pronalaskom.

Predmetni pronalazak dalje predstavlja metod ubijanja ciljnih ćelija kod pacijenta čije ciljne ćelije aberantno eksprimiraju polipeptid koji sadrži bilo koju aminokiselinsku sekvencu u skladu sa predmetnim pronalaskom, pri čemu metod obuhvata davanje pacijentu efikasnog broja T ćelija proizvedenih u skladu sa predmetnim pronalaskom.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na upotrebu bilo kog opisanog peptida, nukleinske kiseline u skladu sa predmetnim pronalaskom, vektora ekspresije u skladu sa predmetnim pronalaskom, ćelije u skladu sa predmetnim pronalaskom, aktiviranog T limfocita, T-ćelijskog receptora ili antitela u skladu sa predmetnim pronalaskom u vidu leka ili u proizvodnji leka. Poželjno, navedeni lek je aktivan protiv raka.

Poželjno, navedeni lek je ćelijska terapija, vakcina ili protein zasnovan na solubilnom TCR ili antitelu.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na upotrebu u skladu sa predmetnim pronalaskom, naznačenu time što su navedene ćelije raka ćelije raka jajnika, nesitnoćelijskog karcinoma pluća, sitnoćelijskog karcinoma pluća, raka bubrega, raka mozga, raka kolona ili rektuma, raka želuca, raka jetre, raka pankreasa, raka prostate, leukemije, raka dojke, karcinoma Merkelovih ćelija, melanoma, raka jednjaka, raka mokraćne bešike, raka materice, raka žučne kese, raka žučnih puteva i poželjno ćelije raka jajnika.

Opciono, antitelo nosi dodatnu efektorsku funkciju kao što je imunostimulišući domen ili toksin.

Pokazano je da su CT45 geni potencijalni prognostički biomarkeri i terapijske mete u epitelijalnom raku jajnika (Zhang et al., 2015l). Pokazano je da je protein CT45A1 koji je obično eksprimiran samo u testikularnim germinativnim ćelijama takođe eksprimiran kod raka pluća, raka dojke i raka jajnika (Chen et al., 2009d). Pokazano je i da je CT45A1 povezan sa lošom prognozom i lošim ishodima kod multiplog mijeloma (Andrade et al., 2009). CT45A1 je opisan kao gen koji ushodno reguliše gene epitelijalno-mezenhimalnog prelaza (EMT) i metastatske gene, promovišući EMT i diseminaciju tumora. Nadalje, CT45A1 je opisan kao uključen u inicijaciju ili održavanje ćelija raka nalik na matične ćelije, promovišući tumorogenezu i malignu progresiju (Yang et al., 2015a). Pokazano je da prekomerna ekspresija CT45A1 u modelu raka dojke dovodi do ushodne regulacije različitih onkogenih i metastatskih gena, konstitutivno aktiviranih ERK i CREB signalnih puteva i povećane tumorogeneze, invazije i metastaze. Pokazano je da utišavanje CT45A1 smanjuje migraciju i invaziju ćelija raka. Stoga, CT45A1 može funkcionisati kao novi protoonkogen i može biti cilj za otkriće i terapiju antitumorskim lekom (Shang et al., 2014).

Pokazano je da je CT45A2 novi spojeni MLL fuzionirani partner kod pedijatrijskog pacijenta sa de novo bifenotipskom akutnom leukemijom i stoga može biti relevantan za leukemogenezu (Cerveira et al., 2010). Pokazano je da je familija karcinom-testis antigena 45 često eksprimirana i u ćelijskim linijama raka i uzorcima raka pluća (Chen et al., 2005). Pokazano je da su CT45 geni potencijalni prognostički biomarkeri i terapijske mete u epitelijalnom raku jajnika (Zhang et al., 2015l).

Pokazano je da je familija karcinom-testis antigena 45 često eksprimirana i u ćelijskim linijama raka i uzorcima raka pluća (Chen et al., 2005). Pokazano je da su CT45 geni potencijalni prognostički biomarkeri i terapijske mete u epitelijalnom raku jajnika (Zhang et al., 2015l).

DETALJAN OPIS PRONALASKA

Stimulacija imunskog odgovora zavisi od prisustva antigena koje imunski sistem domaćina prepoznaje kao strane. Otkriće postojanja tumor-asociranih antigena otvorilo je mogućnost primene imunskog sistema domaćina za intervenciju u rastu tumora. Trenutno se istražuju različiti mehanizmi za iskorišćavanje kako humoralnog tako i ćelijskog dela imunskog sistema za imunoterapiju raka.

Specifični elementi ćelijskog imunskog odgovora su u stanju da specifično prepoznaju i unište ćelije tumora. Izolacija T ćelija iz ćelijskih populacija koje infiltriraju tumor ili iz periferne krvi navodi na to da takve ćelije imaju značajnu ulogu u prirodnoj imunskoj odbrani protiv raka. U ovom odgovoru naročito važnu ulogu imaju CD8-pozitivne T ćelije, koje prepoznaju peptide koji nose molekule klase I glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC) koji obično imaju 8 do 10 aminokiselinskih ostataka i dobijeni su iz proteina ili defektnih proizvoda ribozoma (DRIP-ovi) koji se nalaze u citosolu. MHC molekuli ljudi se takođe nazivaju humani leukocitni antigeni (HLA).

Na način kako su korišćeni u ovom tekstu, i sem ako nije naznačeno drugačije, svi termini su definisani kako je navedeno u nastavku.

Termin „T-ćelijski odgovor“ označava specifičnu proliferaciju i aktivaciju efektorskih funkcija indukovanih peptidom in vitro ili in vivo. Za MHC klasa I restrikovane citotoksične T ćelije, efektorske funkcije mogu biti liza ciljnih ćelija pulsiranih peptidom, pulsiranih prekursorom peptida ili ciljnih ćelija koje prirodno prezentuju peptid, sekrecija citokina, poželjno interferona-gama, TNF-alfa ili IL-2, indukovana peptidom, sekrecija efektorskih molekula, poželjno granzima ili perforina, indukovana peptidom, ili degranulacija.

Termin „peptid“ je korišćen u ovom tekstu da označi seriju aminokiselinskih ostataka, povezanih jedan sa drugim tipično pomoću peptidnih veza između alfaamino i karbonilnih grupa susednih aminokiselina. Peptidi su poželjno dužine 9 aminokiselina, ali mogu biti i kraći sa dužinom od 8 aminokiselina, kao i dužine 10, 11, 12, 13 ili 14 ili duži, a u slučaju peptida MHC klase II (elongirane varijante peptida pronalaska) oni mogu biti dužine od 15, 16, 17, 18, 19 ili 20 ili više aminokiselina.

Pored toga, termin „peptid“ će obuhvatati soli serija aminokiselinskih ostataka, povezanih jedan sa drugim tipično pomoću peptidnih veza između alfa-amino i karbonilnih grupa susednih aminokiselina. Poželjno, soli su farmaceutski prihvatljive soli peptida, kao što su, na primer, hloridne ili acetatne (trifluoroacetat) soli. Neophodno je napomenuti da se soli peptida u skladu sa predmetnim pronalaskom značajno razlikuju od peptida u njihovim stanjima in vivo, zato što peptidi in vivo nisu soli.

Termin „peptid“ će takođe obuhvatati „oligopeptid“. Termin „oligopeptid“ je korišćen u ovom tekstu da označi seriju aminokiselinskih ostataka, povezanih jedan sa drugim tipično pomoću peptidnih veza između alfa-amino i karbonilnih grupa susednih aminokiselina. Dužina oligopeptida nije presudna za pronalazak, sve dok je u njemu zadržan ispravni epitop ili epitopi. Oligopeptidi su tipično dužine manje od oko 30 aminokiselinskih ostataka, a duži od oko 15 aminokiselina.

Termin „polipeptid“ označava seriju aminokiselinskih ostataka, povezanih jedan sa drugim tipično pomoću peptidnih veza između alfa-amino i karbonilnih grupa susednih aminokiselina. Dužina polipeptida nije presudna za pronalazak, sve dok su u njemu zadržani ispravni epitopi. Suprotno terminima peptid ili oligopeptid, termin polipeptid je namenjen da označi molekule koji sadrže više od oko 30 aminokiselinskih ostataka.

Peptid, oligopeptid, protein ili polinukleotidni kod za takav molekul je „imunogen“ (pa je zato „imunogen“ u okviru predmetnog pronalaska), ako je sposoban da indukuje imunski odgovor. U slučaju predmetnog pronalaska, imunogenost je specifičnije definisana kao sposobnost indukovanja T-ćelijskog odgovora. Tako bi „imunogen“ bio molekul koji je u stanju da indukuje imunski odgovor, a u slučaju

1

predmetnog pronalaska, molekul koji je u stanju da indukuje T-ćelijski odgovor. U drugom aspektu, imunogen može biti peptid, kompleks peptida sa MHC, oligopeptid i/ili protein koji se koristi za pokretanje specifičnih antitela ili TCR-ova protiv njega.

T-ćelijski „epitop“ klase I zahteva kratak peptid koji je vezan za MHC receptor klase I, obrazujući trojni kompleks (alfa lanac MHC klase I, beta-2-mikroglobulin i peptid), koji može da prepozna T ćelija koja nosi podudarni T-ćelijski receptor koji se vezuje za kompleks MHC/peptid sa odgovarajućim afinitetom. Peptidi koji se vezuju za MHC molekule klase I su tipično dužine 8-14 aminokiselina, a najčešće su dugački 9 aminokiselina.

Kod ljudi postoje tri različita genska lokusa koji kodiraju MHC molekule klase I (MHC molekuli ljudi se takođe nazivaju humani leukocitni antigeni (HLA)): HLA-A, HLA-B i HLA-C. HLA-A*01, HLA-A*02 i HLA-B*07 su primeri različitih alela MHC klase I koji mogu biti eksprimirani od ovih lokusa.

Tabela 5: Učestalosti ekspresije F HLA-A*02 i HLA-A*24 i najučestaliji serotipovi HLA-DR. Učestalosti su izvedene iz učestalosti haplotipova Gf unutar američke populacije adaptirane iz rada Mori i sar. (Mori et al., 1997) primenom Hardi-Vajnbergove formule F = 1 - (1-Gf)<2>. Kombinacije A*02 ili A*24 sa određenim HLA-DR alelima mogu biti obogaćene ili manje učestale nego što je očekivano u odnosu na njihove pojedinačne učestalosti usled neravnoteže povezivanja. Za detalje pogledajte rad Chanock i sar. (Chanock et al., 2004).

2

Predstavljeni peptidi, poželjno kada su uključeni u vakcinu pronalaska kako je ovde opisana, vezuju se za A*02. Vakcina može takođe da uključuje sve-vezujuće MHC klasa II peptide. Stoga, vakcina pronalaska može da se koristi za lečenje malignog tumora kod pacijenata koji su A*02 pozitivni, pri čemu nije neophodan nikakav izbor za MHC klasa II alotipove zbog sve-vezujuće prirode ovih peptida.

Ako se predstavljeni A*02 peptidi kombinuju sa peptidima koji se vezuju za drugi alel, na primer A*24, veći procenat bilo koje populacije pacijenata može da se leči u poređenju sa tim kada se cilja bilo koji od ova dva MHC klasa I alela sam. Dok u većini populacija pomoću bilo kog od ova dva alela samog može da se targetira manje od 50% pacijenata, vakcina koja sadrži HLA-A*24 i HLA-A*02 epitope može da leči najmanje 60% pacijenata u bilo kojoj relevantnoj populaciji. Konkretno, sledeći procenti pacijenata će biti pozitivni na najmanje jedan od ovih alela u različitim regionima: SAD 61%, Zapadna Evropa 62%, Kina 75%, Južna Koreja 77%, Japan 86% (izračunato sa www.allelefrequencies.net).

U poželjnom otelotvorenju, termin „nukleotidna sekvenca“ odnosi se na heteropolimer dezoksiribonukleotida.

Nukleotidna sekvenca koja kodira određeni peptid, oligopeptid ili polipeptid može biti prirodno postojeća ili mogu biti sintetički napravljene. Uopšteno, DNK segmenti koji kodiraju peptide, polipeptide i proteine ovog pronalaska sastavljaju se iz cDNK fragmenata i kratkih oligonukleotidnih povezivača, ili iz serije oligonukleotida, kako bi se obezbedio sintetički gen koji je u stanju da bude eksprimiran u rekombinantnoj transkripcionoj jedinici koja sadrži regulatorne elemente dobijene iz mikrobnog ili virusnog operona.

Na način kako je korišćen u ovom dokumentu termin „nukleotidni kod za (ili koji kodira) peptid“ odnosi se na nukleotidnu sekvencu koja kodira peptid uključujući veštačke (napravljene od strane ljudi) start i stop kodone kompatibilne za biološki sistem koji će eksprimirati sekvencu, na primer, dendritičnu ćeliju ili drugi ćelijski sistem koristan za proizvodnju TCR-ova.

Na način kako je korišćeno u ovom dokumentu, upućivanje na sekvencu nukleinske kiseline obuhvata i jednolančanu i dvolančanu nukleinsku kiselinu. Tako, na primer za DNK, specifična sekvenca, sem ako kontekst ne ukazuje drugačije, odnosi se na jednolančanu DNK takve sekvence, dupleks takve sekvence sa njenim komplementarnim delom (dvolančana DNK) i komplementarni deo takve sekvence.

4

Termin „kodirajući region“ odnosi se na onaj deo gena koji ili prirodno ili normalno kodira proizvod ekspresije datog gena u njegovoj prirodnoj genomskoj sredini, tj. region koji in vivo kodira proizvod prirodne ekspresije tog gena.

Kodirajući region može biti izveden iz nemutiranog („normalnog“), mutiranog ili izmenjenog gena, ili čak izveden iz DNK sekvence, ili gena, koji su u potpunosti sintetizovani u laboratoriji pomoću metoda koji su dobro poznati stručnjacima iz oblasti sinteze DNK.

Termin „proizvod ekspresije“ označava polipeptid ili protein koji je prirodni proizvod translacije gena i bilo koje sekvence nukleinskih kiselina koja kodira ekvivalente koji nastaju iz degeneracije genetskog koda i tako kodiraju istu aminokiselinu(e).

Termin „fragment“, kada se odnosi na kodirajuću sekvencu, označava deo DNK koji sadrži manje od kompletnog kodirajućeg regiona, čiji proizvod ekspresije esencijalno zadržava istu biološku funkciju ili aktivnost kao i proizvod ekspresije kompletnog kodirajućeg regiona.

Termin „DNK segment“ odnosi se na DNK polimer, u obliku zasebnog fragmenta ili kao komponenta većeg DNK konstrukta, koji je dobijen iz DNK koja je izolovana najmanje jednom u suštinski čistom obliku, tj. ne sadrži kontaminirajuće endogene materijale i u količini ili koncentraciji koja omogućava identifikaciju, manipulaciju i ponovno dobijanje segmenta i njegovih komponentnih nukleotidnih sekvenci pomoću standardnih biohemijskih metoda, na primer upotrebom vektora za kloniranje. Takvi segmenti se obezbeđuju u obliku otvorenog okvira čitanja koji nije prekinut unutrašnjim netranslatornim sekvencama, ili intronima, koji su tipično prisutni u eukariotskim genima. Sekvence netranslatorne DNK mogu biti prisutne nishodno od otvorenog okvira čitanja, gde iste ne ometaju manipulaciju ili ekspresiju kodirajućih regiona.

Termin „prajmer“ označava kratku sekvencu nukleinskih kiselina koja može biti uparena sa jednim lancem DNK i obezbeđuje slobodan 3'-OH kraj na kojem DNK polimeraza započinje sintezu dezoksiribonukleotidnog lanca.

Termin „promoter“ označava region DNK koji je uključen u vezivanje RNK polimeraze kako bi se inicirala transkripcija.

Termin „izolovan“ označava da je materijal uklonjen iz njegove originalne sredine (npr. prirodne sredine ako se on prirodno javlja). Na primer, prirodno postojeći polinukleotid ili polipeptid prisutan u živoj životinji nije izolovan, ali isti polinukleotid ili polipeptid, izdvojen iz nekog ili svih koegzistirajućih materijala u prirodnom sistemu, jeste izolovan. Takvi polinukleotidi mogu biti deo vektora i/ili takvi polinukleotidi ili polipeptidi mogu biti deo smeše, a da i dalje budu izolovani tako što takav vektor ili smeša nije deo njegove prirodne sredine.

Polinukleotidi, i rekombinantni ili imunogeni polipeptidi, predstavljeni u skladu sa predmetnim pronalaskom mogu takođe biti u „prečišćenom“ obliku. Termin „prečišćen“ ne zahteva apsolutnu čistoću; on je pre namenjen kao relativna definicija, i može obuhvatati preparate koji su visoko prečišćeni ili preparate koji su samo delimično prečišćeni, shodno razumevanju tih termina od strane stručnjaka u relevantnoj oblasti. Na primer, pojedinačni klonovi izolovani iz biblioteke cDNK su dogovorno prečišćeni do elektroforetske homogenosti. Prečišćavanje početnog materijala ili prirodnog materijala do najmanje jednog reda veličine, poželjno dva ili tri reda, i još poželjnije četiri ili pet redova veličine se izričito razmatra. Pored toga, polipeptid patentnog zahteva koji ima čistoću od poželjno 99,999%, ili najmanje 99,99% ili 99,9%; i čak poželjno 99% po težini ili veću izričito je obuhvaćen.

Nukleinske kiseline i proizvodi ekspresije polipeptida predstavljeni u skladu sa predmetnim pronalaskom, kao i vektori ekspresije koji sadrže takve nukleinske kiseline i/ili takve polipeptide, mogu biti u „obogaćenom obliku“. Na način kako je korišćen u ovom dokumentu, termin „obogaćen“ znači da je koncentracija materijala najmanje oko 2, 5, 10, 100 ili 1000 puta veća od njegove prirodne koncentracije (na primer), pri čemu prednost ima 0,01% po težini, poželjno najmanje oko 0,1% po težini. Obogaćeni preparati od oko 0,5%, 1%, 5%, 10% i 20% po težini takođe se razmatraju. Sekvence, konstrukti, vektori, klonovi i drugi materijali koji sačinjavaju predmetni pronalazak mogu pogodno biti u obogaćenom ili izolovanom obliku. Termin „aktivni fragment“ označava fragment, obično peptida, polipeptida ili sekvence nukleinske kiseline, koji izaziva imunski odgovor (tj. ima imunogenu aktivnost) kada se primeni, samostalno ili opciono sa prikladnim adjuvansom ili u vektoru, na životinji, kao što je sisar, na primer, zec ili miš, i takođe uključujući ljude, pri čemu takav imunski odgovor po obliku stimuliše T-ćelijski odgovor unutar životinje primaoca, kao što je čovek. Alternativno, „aktivni fragment“ može takođe da se koristi za indukciju T-ćelijskog odgovora in vitro.

Na način kako su korišćeni ovde, termini „deo“, „segment“ i „fragment“, kada se koriste u vezi sa polipeptidima, odnose se na kontinuiranu sekvencu ostataka, kao što su aminokiselinski ostaci, čija sekvenca obrazuje podskup veće sekvence. Na primer, ako je polipeptid bio podvrgnut tretmanu sa bilo kojom od uobičajenih endopeptidaza, kao što su tripsin ili himotripsin, oligopeptidi nastali kao posledica takvog tretmana bi predstavljali delove, segmente ili fragmente početnog polipeptida. Kada se koriste u vezi sa polinukleotidima, ovi termini se odnose na proizvode koji se dobijaju tretiranjem navedenih polinukleotida sa bilo kojom od endonukleaza.

U skladu sa predmetnim pronalaskom, termin „procenat identičnosti“ ili „procentualno identičan“, kada se odnosi na sekvencu, znači da je sekvenca upoređena sa traženom ili opisanom sekvencom nakon poravnanja sekvence koja se upoređuje („upoređena sekvenca“) sa opisanom ili traženom sekvencom („referentna sekvenca“). Procenat identičnosti se zatim utvrđuje prema sledećoj formuli: procenat identičnosti = 100 [1 - (C/R)]

gde je C broj razlika između referentne sekvence i upoređene sekvence u okviru dužine poravnanja između referentne sekvence i upoređene sekvence, naznačeno time što

(i) svaka baza ili aminokiselina u referentnoj sekvenci koja nema odgovarajuću poravnatu bazu ili aminokiselinu u upoređenoj sekvenci, i

(ii) svaka praznina u referentnoj sekvenci, i

(iii) svaka poravnata baza ili aminokiselina u referentnoj sekvenci koja se razlikuje od poravnate baze ili aminokiseline u upoređenoj sekvenci, predstavlja razliku, i (iiii) poravnanje mora da počne na poziciji 1 poravnatih sekvenci;

a R je broj baza ili aminokiselina u referentnoj sekvenci u okviru dužine poravnanja sa upoređenom sekvencom, pri čemu se svaka praznina u referentnoj sekvenci takođe broji kao baza ili aminokiselina.

Ako između upoređene sekvence i referentne sekvence postoji poravnanje za koje je procenat identičnosti izračunat pomoću gore navedene formule skoro jednak ili veći od određenog minimalnog procenta identičnosti, onda upoređena sekvenca ima određeni minimalni procenat identičnosti sa referentom sekvencom iako mogu postojati poravnanja u kojima je ovde naveden i ranije izračunat procenat identičnosti manji od određenog procenta identičnosti.

Kako je ranije navedeno, predmetni pronalazak tako obezbeđuje peptid koji sadrži ID BR. SEKV 11. Peptid pronalaska ima sposobnost da se vezuje za molekul humanog glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I.

U predmetnom pronalasku, termin „homologno“ odnosi se na stepen identiteta (vidite procenat identičnosti ranije) između sekvenci dveju aminokiselinskih sekvenci, tj. peptidnih ili polipeptidnih sekvenci. Gore pomenuta „homologija“ utvrđena je upoređivanjem dve sekvence koje su poravnate pod optimalnim uslovima preko sekvenci koje se upoređuju. Takva homologija sekvence može da se izračuna kreiranjem poravnanja pomoću, na primer, ClustalW algoritma. Opšte dostupni softver za analizu sekvence, specifičnije, Vector NTI, GENETYX ili druge alatke dostupne su u javnim bazama podataka.

Osoba stručna u predmetnoj oblasti će moći da proceni da li će T ćelije koje su indukovane varijantom specifičnog peptida biti sposobne da unakrsno reaguju sa samim peptidom (Appay et al., 2006; Colombetti et al., 2006; Fong et al., 2001; Zaremba et al., 1997).

T ćelije mogu naknadno da unakrsno reaguju sa ćelijama i ubijaju ćelije koje eksprimiraju polipeptid koji sadrži prirodnu aminokiselinsku sekvencu srodnog peptida kako je definisan u aspektima pronalaska. Kako se može izvesti iz naučne literature i baza podataka (Rammensee et al., 1999; Godkin et al., 1997), određene pozicije peptida koji vezuju HLA su tipično sidreni ostaci koji obrazuju jezgrenu sekvencu koja se uklapa u vezujući motiv HLA receptora, koji je definisan polarnim, elektrofizičkim, hidrofobnim i prostornim svojstvima polipeptidnih lanaca koji čine udubljenje za vezivanje.

Naravno, peptid u skladu sa predmetnim pronalaskom će imati sposobnost da se veže za molekul humanog glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I. Vezivanje peptida ili varijante za MHC kompleks može da se testira pomoću metoda poznatih u predmetnoj oblasti.

Poželjno, kada se T ćelije specifične za peptid u skladu sa predmetnim pronalaskom testiraju na supstituisane peptide, koncentracija peptida pri kojoj supstituisani peptidi dostižu polovinu maksimalnog povećanja lize u odnosu na pozadinu nije veća od oko 1 mmol/l, poželjno nije veća od oko 1 µmol/l, poželjnije nije veća od oko 1 nmol/l, a još poželjnije nije veća od oko 100 pM, i najpoželjnije nije veća od oko 10 pM. Takođe je poželjno da supstituisani peptid bude prepoznat od strane T ćelija dobijenih od više od jedne osobe, najmanje dve, a još poželjnije tri osobe.

U naročito poželjnom otelotvorenju pronalaska peptid sadrži aminokiselinsku sekvencu u skladu sa ID BR SEKV: 11.

predmetnog pronalaska, peptid je fuzionisan sa 80 N-terminalnih aminokiselina HLA-DR antigen-asociranog nepromenljivog lanca (p33, u nastavku „li“) koji je dobijen od američkog Nacionalnog centra za biotehnološke informacije (NCBI), GenBank pristupni broj X00497.

Pored toga, peptid ili varijanta može biti dodatno modifikovan da se poboljša stabilnost i/ili vezivanje MHC molekula kako bi se izazvao jači imunski odgovor.

Nepeptidna veza je, na primer, -CH2-NH, -CH2S-, -CH2CH2-, -CH=CH-, -COCH2-, -CH(OH)CH2- i -CH2SO-. Patent US 4,897,445 obezbeđuje metod za sintezu nepeptidnih veza (-CH2-NH) u solidnoj fazi u polipeptidnim lancima koji uključuje polipeptide sintetisane pomoću standardnih postupaka i nepeptidnu vezu sintetisanu reakcijom amino-aldehida i aminokiseline u prisustvu NaCNBH3.

Peptidi koji sadrže sekvence opisane ranije mogu biti sintetisani tako da na svojim amino i/ili karboksi krajevima sadrže dodatne hemijske grupe, kako bi se pojačala stabilnost, bioraspoloživost i/ili afinitet peptida. Na primer, na amino krajeve peptida mogu da se dodaju hidrofobne grupe kao što su karbobenzoksil, dansil ili tbutiloksikarbonil grupa. Isto tako, na amino krajeve peptida mogu biti postavljene acetilna grupa ili 9-fluorenilmetoksi-karbonilna grupa. Pored toga, na karboksi krajeve peptida mogu da se dodaju hidrofobna grupa, t-butiloksikarbonil, ili amido grupa.

Peptid ili varijanta, naznačeno time što peptid sadrži nepeptidne veze, poželjno je otelotvorenje pronalaska. Uopšteno, peptidi (najmanje oni koji sadrže peptidne veze između aminokiselinskih ostataka) mogu da se sintetišu pomoću Fmocpoliamid režima sinteze peptida u solidnoj fazi kako je izloženo u radu Lukas et al. (Lukas et al., 1981) i referencama koje su tamo citirane. Privremenu zaštitu N-amino grupe obezbeđuje 9-fluorenilmetiloksikarbonil (Fmoc) grupa. Ponovljeno cepanje ove zaštitne grupe koja je veoma labilna u bazama vrši se pomoću 20% piperidina u N,N-dimetilformamidu. Funkcionalnosti bočnog lanca mogu da se zaštite u obliku njihovih butil etara (u slučaju serina, treonina i tirozina), butil estara (u slučaju glutaminske kiseline i asparaginske kiseline), butiloksikarbonil derivata (u slučaju lizina i histidina), tritil derivata (u slučaju cisteina) i 4-metoksi-2,3,6-trimetilbenzensulfonil derivata (u slučaju arginina). Kada su glutamin ili asparagin C-terminalni ostaci, za zaštitu amido funkcionalnosti bočnog lanca koristi se 4,4'-dimetoksibenzhidril grupa. Potpora solidne faze zasniva se na polidimetil-akrilamid polimeru koji se sastoji od tri monomera dimetilakrilamida (monomer kostura), bisakriloiletilen diamina (unakrsni povezivač) i akriloilsarkozin metil estra (agens za funkcionalizaciju). Peptid-smola odvojivi vezani agens koji se koristi je derivat 4-hidroksimetil-fenoksisirćetne kiseline koji je labilan u kiselinama. Svi derivati aminokiselina se dodaju u obliku njihovih prethodno formiranih simetričnih anhidridnih derivata, sa izuzetkom asparagina i glutamina, koji se dodaju pomoću procedure reverznog kuplovanja posredstvom N, N-dicikloheksil-karbodiimida/1 hidroksibenzotriazola. Sve reakcije spajanja i deprotekcije se prate pomoću ninhidrin, trinitrobenzen sulfonska kiselina ili izotin test procedura. Nakon završetka sinteze, peptidi se odvajaju od potpore od smole sa istovremenim uklanjanjem zaštitnih grupa bočnog lanca tretiranjem sa 95% trifluorosirćetnom kiselinom koja sadrži 50% smešu čistača. Čistači koji se uobičajeno koriste obuhvataju etanditiol, fenol, anizol i vodu, pri čemu tačan izbor zavisi od konstituentnih aminokiselina peptida koji se sintetizuje. Takođe je moguća kombinacija metodologija za solidnu fazu i fazu rastvora za sintezu peptida (pogledajte, na primer, (rad Bruckdorfer et al., 2004) i reference koje su tamo citirane).

Trifluorosirćetna kiselina se uklanja evaporacijom in vacuo, sa naknadnom trituracijom sa dietil etrom što obezbeđuje sirovi peptid. Svi prisutni čistači se uklanjaju jednostavnim postupkom ekstrakcije koji po liofilizaciji vodene faze obezbeđuje sirovi peptid bez čistača. Reagensi za sintezu peptida su generalno dostupni kod npr. kompanije Calbiochem-Novabiochem (Nottingham, UK).

Prečišćavanje može da se vrši pomoću bilo koje tehnike, ili kombinacije tehnika kao što su rekristalizacija, ekskluziona hromatografija, jonoizmenjivačka hromatografija, hidrofobna hromatografija i (obično) reverzno-fazna tečna hromatografija visokih performansi upotrebom npr. acetonitril/voda gradijenta separacije.

Analiza peptida može da se sprovede upotrebom hromatografije na tankom sloju, elektroforeze, konkretno kapilarne elektroforeze, ekstrakcije iz čvrste faze (CSPE), reverzno-fazne tečne hromatografije visokih performansi, analizom aminokiselina nakon kisele hidrolize i pomoću maseno spektrometrijske analize korišćenjem bombardovanja brzim atomima (FAB), kao i MALDI i ESI-Q-TOF maseno spektrometrijske analize.

Da bi se izabrali prekomerno prezentovani peptidi, izračunava se profil prezentacije koji pokazuje srednju prezentaciju uzorka kao i varijaciju replikata. Profil postavlja jedno uz drugo uzorke tumora od interesovanja sa polaznim vrednostima uzoraka normalnog tkiva. Svaki od ovih profila može zatim da se konsoliduje u rezultat prekomerne prezentacije pomoću izračunavanja p-vrednosti modela linearnih mešovitih efekata (Pinheiro et al., 2015) uz prilagođavanje za višestruko testiranje pomoću stope lažnog otkrivanja (Benjamini and Hochberg, 1995) (uporedite primer 1).

Radi identifikacije i relativne kvantifikacije HLA liganada pomoću masene spektrometrije, HLA molekuli iz uzoraka tkiva zamrznutih brzim zamrzavanjem su prečišćeni a HLA-asocirani peptidi su izolovani. Izolovani peptidi su razdvojeni a sekvence su identifikovane pomoću onlajn eksperimenata nano-elektrosprejjonizacije (nanoESI) tečne hromatografije-masene spektrometrije (LC-MS). Tako dobijene peptidne sekvence su potvrđene poređenjem obrasca fragmentacije prirodnih tumor-asociranih peptida (TUMAP) zabeleženih iz uzoraka raka jajnika (N = 20 A*02-pozitivnih uzoraka) sa obrascima fragmentacije odgovarajućih sintetičkih referentnih peptida identičnih sekvenci. Budući da su peptidi direktno identifikovani kao ligandi HLA molekula primarnih tumora, ovi rezultati daju direktan dokaz za prirodnu obradu i prezentaciju identifikovanih peptida na tkivu primarnog karcinoma dobijenog od 20 pacijentkinja sa rakom jajnika.

Linija korišćena u otkriću XPRESIDENT® v2.1 (vidite na primer US 2013-0096016) omogućava identifikaciju i selekciju relevantnih prekomerno prezentovanih peptida kandidata za vakcinu na osnovu direktne relativne kvantifikacije nivoa HLA-restrikovanog peptida na malignim tkivima u poređenju sa nekoliko različitih nemalignih tkiva i organa. Ovo je postignuto razvojem diferencijalne kvantifikacije bez obeležavanja primenom podataka dobijenih pomoću LC-MS koji su obrađeni vlasničkom linijom za analizu podataka, kombinovanjem algoritama za identifikaciju

1

sekvence, grupisanje spektra, brojanje jona, poravnanje vremena zadržavanja, slabljenje naelektrisanog stanja i normalizaciju.

Ustanovljeni su nivoi prezentacije uključujući procene greške za svaki peptid i uzorak. Identifikovani su peptidi koji su isključivo prezentovani na tumorskom tkivu i peptidi koji su prekomerno prezentovani u tumorskim u poređenju sa nemalignim tkivima i organima.

Kompleksi HLA-peptid iz uzoraka tkiva raka jajnika su prečišćeni, a HLA-asocirani peptidi su izolovani i analizirani pomoću LC-MS (vidite primere). Svi TUMAP koji su sadržani u predmetnoj aplikaciji ovim pristupom su identifikovani na uzorcima primarnog raka jajnika, čime je potvrđena njihova prezentacija na primarnom raku jajnika.

TUMAP identifikovani na multiplim tkivima raka jajnika i normalnim tkivima kvantifikovani su pomoću brojanja jona LC-MS podataka bez obeležavanja. Metod pretpostavlja da oblasti LC-MS signala peptida koreliraju sa njegovom obilnošću u uzorku. Svi kvantitativni signali peptida u raznim LC-MS eksperimentima su normalizovani na osnovu centralne tendencije, uprosečene po uzorku i sjedinjeni u stubičasti dijagram, koji se naziva profil prezentacije. Profil prezentacije objedinjuje različite metode analize kao što su pretraživanje baze podataka proteina, grupisanje spektra, slabljenje naelektrisanog stanja (gubitak naelektrisanja) i poravnanje vremena zadržavanja i normalizaciju.

Pored toga, linija korišćena u otkriću XPRESIDENT® v2.x omogućava direktnu apsolutnu kvantifikaciju nivoa MHC-, poželjno HLA-restrikovanog, peptida na malignim ili drugim inficiranim tkivima. Ukratko, ukupan broj ćelija je izračunat iz ukupnog sadržaja DNK analiziranog uzorka tkiva. Ukupna količina peptida za TUMAP u uzorku tkiva izmerena je pomoću nanoLC-MS/MS kao odnos prirodnih TUMAP i poznate količine verzije TUMAP obeležene izotopom, takozvanog unutrašnjeg standarda. Efikasnost izolacije TUMAP utvrđena je pomoću dodavanja kompleksa peptid:MHC svih izabranih TUMAP u lizat tkiva u najranijoj mogućoj tački procedure izolacije TUMAP i njihove detekcije pomoću nanoLC-MS/MS nakon završetka procedure izolacije peptida. Ukupan broj ćelija i ukupna količina peptida izračunati su iz merenja u triplikatu po uzorku tkiva. Efikasnosti izolacije specifičnog peptida izračunate su kao prosek iz 10 eksperimenata sa dodavanjem a svaki je meren u triplikatu (vidite primer 6 i tabelu 11).

2

Pored prekomerne prezentacije peptida, analizirana je i iRNK ekspresija osnovnog gena. Podaci iRNK dobijeni su putem RNKSeq analiza normalnih tkiva i tkiva raka (vidite Primer 2). Dodatni izvor podataka normalnog tkiva je bila baza podataka javno dostupnih podataka ekspresije RNK od oko 3000 uzoraka normalnog tkiva (Lonsdale, 2013). Peptidi dobijeni iz proteina koji pokazuju visoko eksprimiranu kodirajuću iRNK u tkivu raka, ali vrlo nisku ili odsutnu u vitalnim zdravim (normalnim) tkivima, su uključeni kao poželjni u predmetni pronalazak.

Predmetni pronalazak obezbeđuje peptid koji je koristan u lečenju raka/tumora, poželjno raka jajnika koji prekomerno ili isključivo prezentuje peptid pronalaska. Za peptid je pokazano masenom spektrometrijom da ga prirodno prezentuju HLA molekuli na primarnim humanim uzorcima raka jajnika.

Dokazano je da su mnogi izvorni geni/proteini (koji se takođe nazivaju „proteini kompletne dužine“ ili „osnovni proteini“) iz kojih su dobijeni peptidi visoko prekomerno eksprimirani u malignom tumoru u poređenju sa normalnim tkivima – „normalna tkiva“ u pogledu ovog pronalaska će označavati ili zdrave ćelije jajnika ili druga normalna tkiva, što pokazuje visok stepen tumorske asocijacije izvornih gena (vidite primer 2). Štaviše, sami peptidi su snažno prekomerno prezentovani na tumorskom tkivu – „tumorsko tkivo“ u pogledu ovog pronalaska će označavati uzorak od pacijentkinje koja boluje od raka jajnika, ali ne na normalnim tkivima (vidite primer 1).

HLA-vezani peptidi mogu da budu prepoznati od strane imunskog sistema, specifično T limfocita. T ćelije mogu da unište ćelije koje prezentuju prepoznati kompleks HLA/peptid, npr. ćelije raka jajnika koje prezentuju dobijene peptide.

Za peptid predmetnog pronalaska je dokazano da je sposoban da stimuliše T-ćelijske odgovore i/ili da je prekomerno prezentovan i da samim tim može da se koristi za proizvodnju antitela i/ili TCR-ova, kao što su solubilini TCR-ovi, u skladu sa predmetnim pronalaskom (vidite primer 3 i primer 4). Pored toga, peptid, kada je u kompleksu sa odgovarajućim MHC, može takođe da se koristi za proizvodnju antitela i/ili TCR-ova, konkretno sTCR-ova, u skladu sa predmetnim pronalaskom. Odgovarajući metodi dobro su poznati osobi stručnoj u ovoj oblasti i mogu se naći i u odgovarajućoj literaturi. Tako je peptid predmetnog pronalaska koristan za generisanje imunskog odgovora kod pacijenta pomoću kojeg mogu da se unište tumorske ćelije. Imunski odgovor kod pacijenta može da se indukuje direktnim davanjem opisanih peptida ili prikladnih prekursorskih supstanci (npr. produženi peptidi, proteini, ili nukleinske kiseline koje kodiraju ove peptide) pacijentu, idealno u kombinaciji sa agensom koji pojačava imunogenost (tj. adjuvansom). Može se očekivati da imunski odgovor koji potiče od takve terapeutske vakcinacije bude visoko specifičan protiv tumorskih ćelija zato što ciljni peptid predmetnog pronalaska nije prezentovan na normalnim tkivima u uporedivom broju kopija, čime se sprečava rizik od neželjenih autoimunskih reakcija protiv normalnih ćelija kod pacijenta.

Predmetni opis se dalje odnosi na T-ćelijske receptore (TCR-ove) koji sadrže alfa lanac i beta lanac („alfa/beta TCR-ovi“). Predmetni opis se takođe odnosi na nukleinske kiseline, vektore i ćelije domaćine za eksprimiranje TCR-ova i peptida predmetnog opisa; i metode za primenu istih.

Termin „T-ćelijski receptor“ (skraćeno TCR) odnosi se na heterodimerni molekul koji sadrži alfa polipeptidni lanac (alfa lanac) i beta polipeptidni lanac (beta lanac), naznačeno time što je heterodimerni receptor sposoban da se vezuje za peptidni antigen koji prezentuje HLA molekul. Termin takođe obuhvata takozvane gama/delta TCR-ove.

U jednom otelotvorenju opis obezbeđuje metod proizvodnje TCR-a kakav je opisan u ovom dokumentu, a metod se sastoji od uzgajanja ćelije domaćina koja je sposobna da eksprimira TCR u uslovima pogodnim za promociju ekspresije TCR-a.

U drugom aspektu opis se odnosi na metode u skladu sa opisom, naznačeno time što se antigen postavlja na MHC molekule klase I eksprimirane na površini prikladne antigen-prezentujuće ćelije ili veštačke antigen-prezentujuće ćelije tako što se dovoljna količina antigena dovodi u kontakt sa antigen-prezentujućom ćelijom ili se antigen postavlja na MHC tetramere klase I tetramerizacijom monomera kompleksa antigen/MHC klase I.

Alfa i beta lanci alfa/beta TCR-ova i gama i delta lanci gama/delta TCR-ova se uopšteno smatraju kao da svaki ima dva „domena“, naime varijabilni i konstantni domen. Varijabilni domen sastoji se od spoja varijabilnog regiona (V) i spojnog regiona (J). Varijabilni domen može da sadrži i vodeći region (L). Beta i delta lanci mogu takođe da uključuju region diverziteta (D). Alfa i beta konstantni domeni mogu takođe da sadrže C-terminalne transmembranske (TM) domene koji

4

usidravaju alfa i beta lance za ćelijsku membranu.

U pogledu gama/delta TCR-ova, termin „TCR gama varijabilni domen“ na način kako je korišćen u ovom dokumentu odnosi se na spoj TCR gama V (TRGV) regiona bez vodećeg regiona (L) i TCR gama J (TRGJ) regiona, a termin „TCR gama konstantni domen“ odnosi se na vanćelijski TRGC region, ili na C-terminalno skraćenu TRGC sekvencu. Isto tako, termin „TCR delta varijabilni domen“ odnosi se na spoj TCR delta V (TRDV) regiona bez vodećeg regiona (L) i TCR delta D/J (TRDD/TRDJ) regiona, a termin „TCR delta konstantni domen“ odnosi se na vanćelijski TRDC region, ili na C-terminalno skraćenu TRDC sekvencu.

TCR-ovi predmetnog opisa se poželjno vezuju za kompleks peptid-HLA molekul sa afinitetom vezivanja (KD) od oko 100 µmol/l ili manje, oko 50 µmol/l ili manje, oko 25 µmol/l ili manje, ili oko 10 µmol/l ili manje. Još poželjniji su TCR-ovi visokog afiniteta koji imaju afinitete vezivanja od oko 1 µmol/l ili manje, oko 100 nmol/l ili manje, oko 50 nmol/l ili manje, oko 25 nmol/l ili manje. Neograničavajući primeri poželjnih opsega afiniteta vezivanja za TCR-ove predmetnog pronalaska obuhvataju oko 1 nmol/l do oko 10 nmol/l; oko 10 nmol/l do oko 20 nmol/l; oko 20 nmol/l do oko 30 nmol/l; oko 30 nmol/l do oko 40 nmol/l; oko 40 nmol/l do oko 50 nmol/l; oko 50 nmol/l do oko 60 nmol/l; oko 60 nmol/l do oko 70 nmol/l; oko 70 nmol/l do oko 80 nmol/l; oko 80 nmol/l do oko 90 nmol/l; i oko 90 nmol/l do oko 100 nmol/l.

Na način kako je korišćen u ovom dokumentu u vezi sa TCR predmetnog opisa, termin „specifično vezivanje“ i njegove gramatičke varijante koriste se da označe TCR koji ima afinitet vezivanja (KD) za kompleks peptid-HLA molekul od 100 µmol/l ili manje.

Alfa/beta heterodimerni TCR-ovi predmetnog opisa mogu da imaju uvedenu disulfidnu vezu između njihovih konstantnih domena. Poželjni TCR-ovi ovog tipa obuhvataju one koji imaju TRAC sekvencu konstantnog domena i TRBC1 ili TRBC2 sekvencu konstantnog domena osim što su Thr 48 TRAC-a i Ser 57 TRBC1-a ili TRBC2-a zamenjeni cisteinskim ostacima, navedeni cisteini obrazuju disulfidnu vezu između TRAC sekvence konstantnog domena i TRBC1 ili TRBC2 sekvence konstantnog domena TCR-a.

Sa ili bez uvedene veze između lanaca navedene iznad, alfa/beta heterodimerni TCR-ovi predmetnog opisa mogu imati TRAC sekvencu konstantnog domena i TRBC1 ili TRBC2 sekvencu konstantnog domena, a TRAC sekvenca konstantnog domena i TRBC1 ili TRBC2 sekvenca konstantnog domena TCR mogu biti povezane prirodnom disulfidnom vezom između Cys4 egzona 2 TRAC i Cys2 egzona 2 TRBC1 ili TRBC2.

TRC-ovi predmetnog opisa mogu sadržati detektabilnu oznaku izabranu iz grupe koju čine radionuklid, fluorofor i biotin. TRC-ovi predmetnog opisa mogu biti konjugovani za terapeutski aktivan agens, kao što je radionuklid, hemioterapijski agens ili toksin.

U jednom otelotvorenju, TCR predmetnog opisa koji ima najmanje jednu mutaciju u alfa lancu i/ili ima najmanje jednu mutaciju u beta lancu ima modifikovanu glikozilaciju u poređenju sa nemutiranim TCR.

U jednom otelotvorenju, TCR koji sadrži najmanje jednu mutaciju u alfa lancu TCR i/ili beta lancu TCR ima afinitet vezivanja za, i/ili poluživot vezivanja za, kompleks peptid-HLA molekul, koji je najmanje dvostruk od afiniteta vezivanja TCR koji sadrži nemutirani alfa lanac TCR i/ili nemutirani beta lanac TCR. Pojačanje afiniteta tumor-specifičnih TCR, i njegovo iskorišćavanje, oslanja se na postojanju prozora za optimalne TCR afinitete. Postojanje takvog prozora zasnovano je na opažanjima da TCR-ovi specifični za HLA-A2-restrikovane patogene imaju KD vrednosti koje su uopšteno oko 10 puta manje u poređenju sa TCR-ovima specifičnim za HLA-A2-restrikovane tumor-asocirane autoantigene. Sada je poznato da će imunski sistem, iako tumorski antigeni imaju potencijal da budu imunogeni, zato što tumori nastaju iz sopstvenih ćelija pojedinca, videti samo mutirane proteine ili proteine sa izmenjenom translacionom obradom kao strane. Antigeni koji su ushodno regulisani ili prekomerno eksprimirani (takozvani autoantigeni) neće nužno indukovati funkcionalni imunski odgovor protiv tumora: T ćelije koje eksprimiraju TCR-ove koji su visoko reaktivni na ove antigene bile su negativno selektovane u timusu tokom procesa koji se zove centralna tolerancija, što znači da ostaju samo T ćelije sa TCR-ovima niskog afiniteta za autoantigene. Stoga, afinitet TCR-ova ili varijanti predmetnog opisa za HAVCR1-001 može da se pojača pomoću metoda koje su dobro poznate u predmetnoj oblasti.

Predmetni opis dalje se odnosi na metod identifikacije i izolacije TCR-a u skladu sa predmetnim opisom, pri čemu se navedeni metod sastoji od inkubacije mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC) od HLA-A*02-negativnih zdravih donora sa monomerima A2/peptidni monomeri, inkubacije PBMC sa tetramerfikoeritrinom (PE) i izolacije visoko-aviditetnih T ćelija pomoću analize sortiranja ćelija aktiviranog fluorescencijom (FACS)-Calibur.

Predmetni opis dalje se odnosi na metod identifikacije i izolacije TCR-a u skladu sa predmetnim opisom, pri čemu se navedeni metod sastoji od dobijanja transgenskog miša sa čitavim humanim TCRαꞵ genskim lokusima (1,1 i 0,7 Mb), čije T ćelije eksprimiraju raznolik repertoar humanih TCR koji kompenzuje za TCR deficijenciju miša, imunizacije miša sa peptidom, inkubacije PBMC dobijenih od transgenskih miševa sa tetramer-fikoeritrinom (PE) i izolacije visoko-aviditetnih T ćelija pomoću analize sortiranja ćelija aktiviranog fluorescencijom (FACS)–Calibur.

U jednom aspektu, radi dobijanja T ćelija koje eksprimiraju TCR-ove predmetnog opisa, nukleinske kiseline koje kodiraju TCR-alfa i/ili TCR-beta lance predmetnog opisa se kloniraju u vektore ekspresije, kao što su gama retrovirus ili lentivirus. Rekombinantni virusi se stvaraju a zatim testiraju za funkcionalnost, kao što je antigena specifičnost i funkcionalni aviditet. Zatim se alikvot konačnog proizvoda koristi za transdukciju ciljne T-ćelijske populacije (generalno prečišćene iz pacijentovih PBMC), koja se ekspandira pre infuzije pacijentu.

U drugom aspektu, radi dobijanja T ćelija koje eksprimiraju TCR-ove predmetnog opisa, pomoću tehnika poznatih u predmetnoj oblasti sintetišu se TCR RNK, npr. u in vitro transkripcionim sistemima. In vitro sintetisane TCR RNK se zatim uvode u primarne CD8+ T ćelije dobijene od zdravih donora elektroporacijom u cilju ponovnog eksprimiranja tumor-specifičnih TCR-alfa i/ili TCR-beta lanaca.

Radi povećanja ekspresije, nukleinske kiseline koje kodiraju TCR-ove predmetnog opisa mogu biti operabilno povezane sa snažnim promoterima, kao što su retrovirusni dugi terminalni ponovci (LTRs), citomegalovirus (CMV), mišji virus matičnih ćelija (MSCV) U3, fosfoglicerat kinaza (PGK),ꞵ-aktin, ubikvitin, i simijan virus 40 (SV40)/CD43 kompozitni promoter, faktor elongacije (EF)-1a i promoter virusa formiranja fokusa u slezini (SFFV). U jednom poželjnom otelotvorenju, promoter je heterologan za nukleinsku kiselinu koja se eksprimira.

Pored snažnih promotera, kasete TCR ekspresije predmetnog opisa mogu da sadrže dodatne elemente koji mogu da pojačaju transgensku ekspresiju, uključujući centralni polipurinski trakt (cPPT), koji promoviše nukleusnu translokaciju lentivirusnih konstrukata (Follenzi et al., 2000), i posttranskripcioni regulatorni element hepatitis virusa mrmota (wPRE), koji povećava nivo transgenske ekspresije povećanjem stabilnosti RNK (Zufferey et al., 1999).

Alfa i beta lanci TCR-a predmetnog pronalaska mogu da budu kodirani nukleinskim kiselinama koje se nalaze u zasebnim vektorima, ili mogu da budu kodirani polinukleotidima koji se nalaze u istom vektoru.

Postizanje površinske ekspresije TCR-a visokog stepena iziskuje da i TCR-alfa i TCR-beta lanci uvedenog TCR-a budu transkribovani u visokim nivoima. Da bi se to izvelo, TCR-alfa i TCR-beta lanci predmetnog opisa mogu da budu klonirani u bicistronske konstrukte u jednom vektoru, za koji je dokazano da je u stanju da prevaziđe ovu prepreku. Upotreba virusnog mesta vezivanja ribozoma (IRES) između TCR-alfa i TCR-beta lanaca rezultuje koordinisanom ekspresijom oba lanca, zato što se TCR-alfa i TCR-beta lanci stvaraju iz jednog transkripta koji se cepa na dva proteina tokom translacije, čime se osigurava da se proizvodi podjednak molarni odnos TCR-alfa i TCR-beta lanaca. (Schmitt et al.2009).

Nukleinske kiseline koje kodiraju TCR-ove predmetnog opisa mogu biti kodonski optimizovane da bi se povećala ekspresija iz ćelije domaćina. Obilnost genetskog koda omogućava da neke aminokiseline budu kodirane pomoću više od jednog kodona, ali određeni kodoni su manje „optimalni“ od drugih zbog relativne raspoloživosti podudarnih tRNK kao i drugih faktora (Gustafsson et al., 2004). Pokazano je da modifikacija TCR-alfa i TCR-beta genskih sekvenci tako da svaka aminokiselina bude kodirana optimalnim kodonom za ekspresiju sisarskih gena, kao i eliminacija motiva nestabilnosti iRNK ili mesta kriptičkog cepanja, značajno pojačava ekspresiju TCR-alfa i TCR-beta gena (Scholten et al., 2006).

Pored toga, pogrešno uparivanje uvedenih i endogenih TCR lanaca može rezultovati dobijanjem specifičnosti koje predstavljaju značajan rizik za autoimunost. Na primer, obrazovanje mešovitih TCR dimera može smanjiti broj CD3 molekula dostupnih za obrazovanje pravilno uparenih TCR kompleksa, te stoga može značajno smanjiti funkcionalni aviditet ćelija koje eksprimiraju uvedeni TCR (Kuball et al., 2007).

Da bi se smanjilo pogrešno uparivanje, C-terminalni domen uvedenih TCR lanaca predmetnog opisa može da se modifikuje da bi se promovisao međulančani afinitet, uz smanjenje sposobnosti uvedenih lanaca da se sparuju sa endogenim TCR. Ove strategije mogu da uključuju zamenu humanih TCR-alfa i TCR-beta C-terminalnih domena sa njihovim mišjim antipodima (murinizovani C-terminalni domen); stvaranje druge međulančane disulfidne veze u C-terminalnom domenu uvođenjem drugog ostatka cisteina i u TCR-alfa i u TCR-beta lanac uvedenog TCR (cisteinska modifikacija); zamenjivanje interagujućih ostataka u C-terminalnim domenima TCR-alfa i TCR-beta lanca („knob-in-hole“); i fuziju varijabilnih domena TCR-alfa i TCR-beta lanaca direktno na CD3ζ (CD3ζ fuzija). (Schmitt et al.2009).

U jednom otelotvorenju, ćelija domaćin se projektuje da eksprimira TCR predmetnog opisa. U poželjnim otelotvorenjima, ćelija domaćin je humana T ćelija ili progenitorska T ćelija. U nekim otelotvorenjima T ćelija ili progenitorska T ćelija se dobija od pacijenta obolelog od raka. U drugim otelotvorenjima T ćelija ili progenitorska T ćelija se dobija od zdravog donora. Ćelije domaćini predmetnog opisa mogu da budu alogene ili autologne u odnosu na pacijenta koji će se lečiti. U jednom otelotvorenju, domaćin je gama/delta T ćelija transformisana da eksprimira alfa/beta TCR.

„Farmaceutska smeša“ je smeša koja je pogodna za davanje ljudskom biću u medicinskim okolnostima. Poželjno, farmaceutska smeša je sterilna i proizvedena u skladu sa smernicama Dobre proizvođačke prakse (DPP).

Farmaceutske smeše sadrže peptide ili u slobodnom obliku ili u obliku farmaceutski prihvatljive soli (pogledajte ranije u tekstu). Na način kako je korišćen u ovom tekstu, termin „farmaceutski prihvatljiva so“ odnosi se na derivat opisanih peptida, naznačeno time što je peptid modifikovan pravljenjem kiselih ili baznih soli agensa. Na primer, kisele soli se dobijaju od slobodne baze (tipično naznačeno time što neutralni oblik leka ima neutralnu –NH2 grupu) što uključuje reakciju sa pogodnom kiselinom. Pogodne kiseline za dobijanje kiselih soli uključuju i organske kiseline, npr. sirćetna kiselina, propionska kiselina, glikolna kiselina, piruvična kiselina, oksalna kiselina, jabučna kiselina, malonska kiselina, ćilibarna kiselina, maleinska kiselina, fumarna kiselina, vinska kiselina, limunska kiselina, benzoeva kiselina, cimetna kiselina, bademova kiselina, metansulfonska kiselina, etansulfonska kiselina, p-toluensulfonska kiselina, salicilna kiselina i slične, kao i neorganske kiseline, npr. hlorovodonična kiselina, bromovodonična kiselina, sumporna kiselina, azotna kiselina, fosforna kiselina i slične. Obratno, preparati baznih soli iz kiselih delova koji mogu biti prisutni na peptidu dobijaju se upotrebom farmaceutski prihvatljive baze kao što je natrijum hidroksid, kalijum hidroksid, amonijum hidroksid, kalcijum hidroksid, trimetilamin ili slične.

U jednom posebno poželjnom otelotvorenju, farmaceutske smeše sadrže peptide u vidu soli sirćetne kiseline (acetati), trifluoro acetata ili hlorovodonične kiseline (hloridi).

Poželjno, lek predmetnog pronalaska je imunoterapeutik, kao što je vakcina. On se može dati direktno pacijentu, primeniti u zahvaćeni organ ili sistemski i.d., i.m., s.c., i.p. i i.v., ili primeniti ex vivo u ćelije dobijene od pacijenta ili humane ćelijske linije koje se nakon toga daju pacijentu, ili koristiti in vitro za odabir subpopulacije imunskih ćelija dobijenih od pacijenta, koje se zatim ponovo daju pacijentu. Ako se nukleinska kiselina primenjuje u ćelije in vitro, može biti od koristi da ćelije budu transficirane tako da koeksprimiraju imunostimulišuće citokine, kao što je interleukin-2. Peptid može biti značajno prečišćen, ili kombinovan sa imunostimulišućim adjuvansom (pogledajte u nastavku), ili da se koristi u kombinaciji sa imunostimulatornim citokinima, ili da se primenjuje sa pogodnim dostavnim sistemom, kao na primer lipozomima. Peptid može takođe da bude konjugovan sa prikladnim nosačem kao što je hemocijanin iz puža Megathura crenulata (eng. keyhole limpet haemocyanin – KLH) ili manan (pogledajte WO 95/18145 i (Longenecker et al., 1993)). Peptid takođe može biti obeležen, može biti fuzioni protein, ili može biti hibridni molekul. Od peptida čija je sekvenca data u predmetnom pronalasku se očekuje da stimulišu CD4 ili CD8 T ćelije. Ipak, stimulacija CD8 T ćelija je efikasnija u prisustvu pomoći koju pružaju CD4 T-pomoćničke ćelije. Tako, za epitope MHC klase I koji stimulišu CD8 T ćelije, fuzioni partner ili delovi hibridnog molekula prikladno obezbeđuju epitope koji stimulišu CD4-pozitivne T ćelije. CD4- i CD8-stimulišući epitopi su dobro poznati u predmetnoj oblasti, i uključuju one identifikovane u predmetnom pronalasku.

U jednom aspektu, vakcina sadrži najmanje jedan peptid koji ima aminokiselinsku sekvencu iznetu u ID BR. SEKV 11 i najmanje jedan dodatni peptid kako je predstavljen, poželjno dva do 50, poželjnije dva do 25, još poželjnije dva do 20 i najpoželjnije dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset, jedanaest, dvanaest, trinaest, četrnaest, petnaest, šesnaest, sedamnaest ili osamnaest peptida. Peptid(i) može biti dobijen od jednog ili više specifičnih TAA i može se vezivati za MHC molekule klase I.

Dalji aspekt pronalaska obezbeđuje nukleinsku kiselinu (na primer polinukleotid) koja kodira peptid pronalaska. Polinukleotid može biti, na primer, DNK, cDNK, PNK, RNK ili njihove kombinacije, bilo jedno- i/ili dvolančana, ili nativni ili stabilizovani oblici polinukleotida, kao što su, na primer, polinukleotidi sa fosforotioatnim kosturom i oni mogu i ne moraju sadržati introne sve dok kodiraju peptid. Naravno, polinukleotid može da kodira isključivo peptide koji sadrže prirodno postojeće aminokiselinske ostatke spojene prirodnim peptidnim vezama. Još jedan aspekt pronalaska obezbeđuje vektor ekspresije koji eksprimira polipeptid u skladu sa pronalaskom.

Razvijeni su raznovrsni metodi za povezivanje polinukleotida, naročito DNK, sa vektorima, na primer, preko komplementarnih kohezivnih terminusa. Na primer, komplementarni homopolimerni traktovi mogu da se dodaju na DNK segment koji se umeće u vektorsku DNK. Vektor i DNK segment se zatim spajaju vodoničnom vezom između komplementarnih homopolimernih repova kako bi se obrazovali molekuli rekombinantne DNK.

Sintetički povezivači koji sadrže jedno ili više restrikcionih mesta obezbeđuju alternativni metod za spajanje DNK segmenta sa vektorima. Sintetički povezivači koji sadrže raznovrsna restrikciona endonukleazna mesta komercijalno su dostupni iz velikog broja izvora, uključujući International Biotechnologies Inc., New Haven, CN, SAD.

Poželjan metod modifikovanja DNK koja kodira polipeptid pronalaska koristi lančanu reakciju polimeraze koja je izneta od strane Saiki RK i sar. (Saiki et al., 1988). Ovaj metod može da se koristi za uvođenje DNK u pogodan vektor, na primer, ugradnjom u prikladna restrikciona mesta, ili se može koristiti za modifikaciju DNK na druge korisne načine koji su poznati u predmetnoj oblasti. Ako se koriste virusni vektori, poželjni su poks- ili adenovirus vektori.

DNK (ili u slučaju retrovirusnih vektora, RNK) može zatim da se eksprimira u prikladnom domaćinu kako bi proizvodio polipeptid koji sadrži peptid ili varijantu pronalaska. Tako, DNK koja kodira peptid ili varijantu pronalaska može da se koristi

1

u skladu sa poznatim tehnikama, odgovarajuće modifikovanih u smislu ovde sadržanih učenja, radi konstruisanja vektora ekspresije, koji se zatim koristi da se odgovarajuća ćelija domaćin transformiše za ekspresiju i proizvodnju polipeptida pronalaska. Takve tehnike uključuju one izložene u, na primer, patentima US 4,440,859, 4,530,901, 4,582,800, 4,677,063, 4,678,751, 4,704,362, 4,710,463, 4,757,006, 4,766,075 i 4,810,648.

DNK (ili u slučaju retrovirusnih vektora, RNK) koja kodira polipeptid koji čini jedinjenje pronalaska može da se spoji sa širokim spektrom drugih DNK sekvenci za uvođenje u odgovarajućeg domaćina. Pridružena DNK će zavisiti od prirode domaćina, načina uvođenja DNK u domaćina, i od toga da li se želi epizomalno održavanje ili integracija.

Uopšteno, DNK se umeće u vektor ekspresije, kao što je plazmid, u pravilnoj orijentaciji i pravom okviru čitanja za ekspresiju. Ako je neophodno, DNK može da se poveže sa odgovarajućim regulatornim kontrolnim nukleotidnim sekvencama za transkripciju i translaciju koje prepoznaje željeni domaćin, iako su takve kontrole generalno dostupne u vektoru ekspresije. Vektor se zatim standardnim tehnikama uvodi u domaćina. Uopšteno, vektor neće transformisati sve domaćine. Zato će biti neophodno da se izaberu transformisane ćelije domaćini. Jedna tehnika selekcije obuhvata inkorporiranje DNK sekvence u vektor ekspresije, sa svim neophodnim kontrolnim elementima, koja kodira osobinu po izboru u transformisanoj ćeliji, kao što je otpornost na antibiotike.

Alternativno, gen za takvu osobinu po izboru može biti na drugom vektoru, koji se koristi za kotransformaciju željene ćelije domaćina.

Ćelije domaćini koje su transformisane pomoću rekombinantne DNK pronalaska se zatim kultiviraju dovoljno dugo i u odgovarajućim uslovima koji su poznati osobama stručnim u predmetnoj oblasti, uzimajući u obzir učenja izneta u ovom dokumentu, kako bi se omogućila ekspresija polipeptida, koji nakon toga može da se prikupi.

Poznati su mnogi sistemi za ekspresiju, uključujući bakterije (na primer E. coli i Bacillus subtilis), kvasnice (na primer Saccharomyces cerevisiae), filamentozne gljivice (na primer Aspergillus spec.), biljne ćelije, životinjske ćelije i ćelije insekata. Poželjno, sistem mogu biti ćelije sisara kao što su CHO ćelije dostupne iz ATCC kolekcije biologije ćelija.

2

Tipični plazmidni vektor ćelije sisara za konstitutivnu ekspresiju sadrži CMV ili SV40 promoter sa prikladnim poli A repom i markerom rezistencije, kao što je neomicin. Jedan primer je pSVL koji je dostupan kod kompanije Pharmacia, Piscataway, NJ, SAD. Primer inducibilnog sisarskog vektora ekspresije je pMSG, koji je takođe dostupan kod kompanije Pharmacia. Korisni kvasnički plazmidni vektori su pRS403-406 i pRS413-416 koji su generalno dostupni kod kompanije Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, SAD. Plazmidi pRS403, pRS404, pRS405 i pRS406 su integrišući plazmidi kvasnice (YIps) i inkorporiraju selektivne markere kvasnica HIS3, TRP1, LEU2 i URA3. Plazmidi pRS413-416 su centromerni plazmidi kvasnice (Ycps). Vektori zasnovani na CMV promoteru (na primer, kompanije Sigma-Aldrich) obezbeđuju prolaznu ili stabilnu ekspresiju, citoplazmatsku ekspresiju ili sekreciju, i N-terminalno ili C-terminalno označavanje u različitim kombinacijama FLAG, 3xFLAG, c-myc ili MAT. Ovi fuzioni proteini omogućavaju detekciju, prečišćavanje i analizu rekombinantnog proteina. Dvostruko označene fuzije obezbeđuju fleksibilnost prilikom detekcije.

Snažni regulatorni region, humani citomegalovirus (CMV) promoter dovodi nivoe ekspresije konstitutivnog proteina čak i do 1 mg/l u COS ćelijama. Za manje potentne ćelijske linije, nivoi proteina su tipično ~0,1 mg/l. Prisustvo izvora SV40 replikacije će rezultovati visokim nivoima DNK replikacije u COS ćelijama koje dozvoljavaju replikaciju SV40. CMV vektori, na primer, mogu sadržati izvor pMB1 (derivat pBR322) za replikaciju u bakterijskim ćelijama, gen za b-laktamazu za izbor rezistencije na ampicilin u bakterijama, hGH poliA i izvor f1. Vektori koji sadrže prepro-tripsin (PPT) vodeću sekvencu mogu usmeriti sekreciju FLAG fuzionih proteina u medijum za kultivaciju za prečišćavanje pomoću ANTI-FLAG antitela, smola i pločica. Drugi vektori i sistemi za ekspresiju su dobro poznati u predmetnoj oblasti za upotrebu sa raznim ćelijama domaćinima.

U drugom otelotvorenju dva ili više predstavljenih peptida su kodirani i samim tim eksprimirani po sukcesivnom redosledu (slično konstruktima „brojanica“). Pritom, peptidi mogu biti povezani ili spojeni zajedno pomoću regija povezujućih aminokiselina, kao što je na primer LLLLLL, ili mogu biti povezani bez bilo kakvih dodatnih peptida između njih. Ovi konstrukti mogu takođe da se koriste za antitumorsku terapiju i mogu indukovati imunske odgovore koji uključuju i MHC I i MHC II.

Predmetni pronalazak se takođe odnosi na ćeliju domaćina koja je transformisana sa konstruktom vektora polinukleotida predmetnog pronalaska. Ćelija domaćin može biti prokariotska ili eukariotska. Bakterijske ćelije mogu biti preferirane prokariotske ćelije domaćini u nekim okolnostima i tipično su soj E. coli kao što su, na primer, sojevi E. coli DH5 dostupni kod kompanije Bethesda Research Laboratories Inc., Bethesda, MD, SAD, i RR1 dostupan kod organizacije American Type Culture Collection (ATCC) iz mesta Rockville, MD, SAD (br. ATCC 31343). Preferirane eukariotske ćelije domaćini obuhvataju ćelije kvasnica, insekata i sisara, poželjno ćelije kičmenjaka kao što su ćelije miševa, pacova, majmuna ili humane fibroblastne ćelijske linije i ćelijske linije kolona. Ćelije domaćini kvasnica uključuju YPH499, YPH500 i YPH501, koje su generalno dostupne kod kompanije Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, SAD. Preferirane ćelije domaćini sisara uključuju ovarijalne ćelije kineskog hrčka (CHO) dostupne kod organizacije ATCC kao CCL61, NIH embrionske ćelije švajcarskog miša NIH/3T3 dostupne kod organizacije ATCC kao CRL 1658, COS-1 ćelije dobijene iz bubrega majmuna dostupne kod organizacije ATCC kao CRL 1650 i 293 ćelije koje su humane embrionske ćelije bubrega. Preferirane ćelije insekata su Sf9 ćelije koje mogu da se transfektuju sa bakulovirusnim vektorima ekspresije. Kratak pregled izbora pogodnih ćelija domaćina za ekspresiju može se naći u, na primer, udžbeniku autora Paulina Balbás i Argelia Lorence „Methods in Molecular Biology Recombinant Gene Expression, Reviews and Protocols“, deo jedan, drugo izdanje, ISBN 978-1-58829-262-9, i drugoj literaturi poznatoj stručnoj osobi.

Transformacija odgovarajućih ćelija domaćina sa DNK konstruktom predmetnog pronalaska postiže se dobro poznatim metodama koje tipično zavise od vrste korišćenog vektora. U pogledu transformacije prokariotskih ćelija domaćina, pogledajte, na primer, rad Cohen et al. (Cohen et al., 1972) i (Green and Sambrook, 2012). Transformacija ćelija kvasnica opisana je u radu Sherman et al. (Sherman et al., 1986). Metod koji je izložio Beggs (Beggs, 1978) takođe je koristan. U pogledu ćelija kičmenjaka, reagensi koji su korisni za transfekciju takvih ćelija, na primer kalcijum fosfat i DEAE-dekstran ili formulacije lipozoma, dostupni su kod kompanije Stratagene Cloning Systems ili Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD 20877, SAD. Elektroporacija je takođe korisna za transformaciju i/ili transfekciju ćelija i dobro je poznata u predmetnoj oblasti za transformaciju ćelija

4

kvasnica, bakterijskih ćelija, ćelija insekata i ćelija kičmenjaka.

Uspešno transformirane ćelije, tj. ćelije koje sadrže DNK konstrukt predmetnog pronalaska, mogu da se identifikuju pomoću dobro poznatih tehnika kao što je PCR. Alternativno, prisustvo proteina u supernatantu može da se detektuje pomoću antitela.

Podrazumeva se da su određene ćelije domaćini pronalaska korisne za pripremanje peptida pronalaska, na primer, bakterijske, ćelije kvasnica i insekata. Međutim, u određenim terapeutskim metodama mogu biti korisne druge ćelije domaćini. Na primer, antigen-prezentujuće ćelije, kao što su dendritične ćelije, mogu korisno da se upotrebe za ekspresiju peptida pronalaska tako da oni mogu da se ubace u odgovarajuće MHC molekule. Tako, prikazani pronalazak obezbeđuje ćeliju domaćina koja se sastoji od nukleinske kiseline ili vektora ekspresije u skladu sa pronalaskom.

U jednom poželjnom otelotvorenju ćelija domaćin je antigen-prezentujuća ćelija, konkretno dendritična ćelija ili antigen-prezentujuća ćelija. APĆ u koje je postavljen rekombinantni fuzioni protein koje sadrže prostatičnu kiselu fosfatazu (PAP) odobrene su od strane američke Uprave za hranu i lekove (FDA) 29. aprila 2010. godine za lečenje asimptomatskog ili minimalno simptomatskog metastatskog raka prostate refraktornog na hormone – HRPC (Sipuleucel-T) (Rini et al., 2006; Small et al., 2006).

Dalji aspekt pronalaska obezbeđuje metod za proizvodnju peptida za upotrebu, pri čemu metod obuhvata kultivisanje ćelije domaćina i izolaciju peptida iz ćelije domaćina ili njenog medijuma za kultivaciju.

U drugom otelotvorenju, peptid, nukleinska kiselina ili vektor ekspresije pronalaska koriste se u medicini. Na primer, peptid može biti pripremljen za intravensku (i.v.) injekciju, potkožnu (s.c.) injekciju, intradermalnu (i.d.) injekciju, intraperitonealnu (i.p.) injekciju, intramuskularnu (i.m.) injekciju. Poželjni načini primene injekcije peptida obuhvataju s.c., i.d., i.p., i.m. i i.v. Poželjni načini primene injekcije DNK obuhvataju i.d., i.m., s.c., i.p. i i.v. Mogu se dati doze od npr. između 50 µg i 1,5 mg, poželjno 125 µg do 500 µg, peptida ili DNK i one će zavisiti od datog peptida ili DNK. Doze u ovom opsegu su uspešno korišćene u ranijim ispitivanjima (Walter et al., 2012).

Polinukleotid koji se koristi za aktivnu vakcinaciju može biti značajno prečišćen ili sadržan u pogodnom vektoru ili sistemu za dostavljanje. Nukleinska kiselina može biti DNK, cDNK, PNK, RNK ili njihova kombinacija. Metodi za dizajniranje i uvođenje takve nukleinske kiseline su dobro poznati u predmetnoj oblasti. Kratak pregled je dat od strane npr. Teufel i sar. (Teufel et al., 2005). Polinukleotidne vakcine se lako pripremaju, ali način delovanja ovih vektora u indukovanju imunskog odgovora nije u potpunosti jasan. Prikladni vektori i sistemi za dostavljanje uključuju virusnu DNK i/ili RNK, kao što su sistemi zasnovani na adenovirusu, virusu vakcinije, retrovirusima, herpes virusu, adeno-asociranom virusu ili hibridima koji sadrže elemente više od jednog virusa. Nevirusni sistemi za dostavljanje uključuju katjonske lipide i katjonske polimere i dobro su poznati u oblasti dostavljanja DNK. Fizičko dostavljanje, kao što je preko „genskog pištolja“, može takođe da se koristi. Peptid ili peptidi koje kodira nukleinska kiselina mogu biti fuzioni protein, na primer sa epitopom koji stimuliše T ćelije za dati suprotni CDR kako je navedeno ranije.

Lek pronalaska može takođe da sadrži jedan ili više adjuvanasa. Adjuvansi su supstance koje nespecifično pojačavaju ili potenciraju imunski odgovor (npr. imunske odgovore posredovane CD8-pozitivnim T ćelijama i pomoćničkim T (TH) ćelijama na antigen, i na taj način se smatraju korisnim u leku predmetnog pronalaska. Pogodni adjuvansi uključuju, ali nisu i ograničeni na, 1018 ISS, soli aluminijuma, AMPLIVAX®, AS15, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA, dSLIM, flagelin ili TLR5 ligande dobijene od flagelina, FLT3 ligand, GM-CSF, IC30, IC31, imikvimod (ALDARA®), rezikvimod, ImuFact IMP321, interleukine poput IL-2, IL-13, IL-21, interferon-alfa ili -beta, ili njihove pegilovane derivate, IS Patch, ISS, ISCOMATRIX, ISCOMs, JuvImmune®, LipoVac, MALP2, MF59, monofosforil lipid A, Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, emulzije voda u ulju i ulje u vodi, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, OspA, PepTel® vektorski sistem, poli(laktid ko-glikolid) [PLG]-zasnovane i mikročestice dekstrana, talaktoferin, SRL172, virozome i druge virusu slične partikule, YF-17D, VEGF klopku, R848, beta-glukan, Pam3Cys, QS21 stimulon kompanije Aquila, koji je dobijen od saponina, mikobakterijske ekstrakte i sintetičke mimetike bakterijskog ćelijskog zida i druge zaštićene adjuvanse kao što su Ribi-jev Detox, Quil ili Superfos. Preferirani su adjuvansi kao što je Freund-ov ili GM-CSF.

Nekoliko imunoloških adjuvanasa (npr. MF59) specifičnih za dendritične ćelije i njihova priprema su opisani ranije (Allison i Krummel, 1995). Takođe, mogu se koristiti citokini. Nekoliko citokina je direktno dovedeno u vezu sa uticajem na migraciju dendritičnih ćelija u limfna tkiva (npr. TNF-), ubrzavanjem sazrevanja dendritičnih ćelija u efikasne antigen-prezentujuće ćelije za T limfocite (npr. GM-CSF, IL-1 i IL-4) (patent registrovan u SAD pod brojem 5,849,589) i delovanjem kao imunoadjuvansi (npr. IL-12, IL-15, IL-23, IL-7, IFN-alfa, IFN-beta) (Gabrilovich et al., 1996).

Takođe, objavljeno je da CpG imunostimulatorni oligonukleotidi poboljšavaju efekte adjuvanasa u sastavu vakcine. Bez ograničavanja postojećom teorijom, CpG oligonukleotidi deluju aktiviranjem urođenog (neadaptivnog) imunskog sistema preko Toll-like receptora (TLR), uglavnom TLR9. Aktivacija TLR9 pokrenuta CpG-om pojačava antigen-specifične humoralne i ćelijske odgovore na širok spektar antigena, uključujući peptidne ili proteinske antigene, žive ili mrtve viruse, vakcine dendritičnim ćelijama, autologne ćelijske vakcine i polisaharidne konjugate kako u profilaktičkim tako i terapijskim vakcinama. Što je važnije, on poboljšava sazrevanje i diferencijaciju dendritičnih ćelija, što dovodi do pojačane aktivacije TH1 ćelija i snažnog stvaranja citotoksičnih T limfocita (CTL), čak i u odsustvu pomoći CD4 T ćelija. Predominacija TH1 indukovana pomoću TLR9 stimulacije se održava čak i u prisustvu adjuvanasa u vakcini kao što je aluminijum ili nekompletni Freund-ov adjuvans (IFA) koji normalno promovišu predominaciju TH2. CpG oligonukleotidi pokazuju još veću adjuvansnu aktivnost kada se formulišu ili istovremeno primenjuju sa drugim adjuvansima ili u formulacijama kao što su mikročestice, nanočestice, lipidne emulzije ili slične formulacije, koje su naročito neophodne za indukovanje snažnog odgovora kada je antigen relativno slab. Oni takođe ubrzavaju imunski odgovor i omogućavaju da se doze antigena smanje za približno dva reda veličine, sa uporedivim odgovorima antitelima na punu dozu vakcine bez CpG u pojedinim eksperimentima (Krieg, 2006). Patent US 6,406,705 B1 opisuje kombinovanu upotrebu CpG oligonukleotida, adjuvanasa u obliku nenukleinskih kiselina i antigena za indukovanje antigen-specifičnog imunskog odgovora. Antagonist CpG TLR9 je dSLIM (double Stem Loop Immunomodulator) kompanije Mologen (Berlin, Nemačka) koji je preferirana komponenta farmaceutske smeše predmetnog pronalaska. Takođe, mogu se koristiti i drugi molekuli koji vezuju TLR kao što su RNK koja vezuje TLR 7, TLR 8 i/ili TLR 9.

Drugi primeri korisnih adjuvanasa uključuju, ali nisu i ograničeni na, hemijski modifikovane CpG-jeve (npr. CpR, Idera), analoge dsRNK kao što su Poly(I:C) i njegovi derivati (npr. AmpliGen®, Hiltonol®, poli-(ICLC), poli(IC-R), poli(I:C12U), ne-CpG bakterijska DNK ili RNK kao i imunoaktivne male molekule i antitela poput ciklofosfamida, sunitiniba, Bevacizumab®-a, celebrex-a, NCX-4016, sildenafila, tadalafila, vardenafila, sorafeniba, temozolomida, temsirolimusa, XL-999, CP-547632, pazopaniba, VEGF klopke, ZD2171, AZD2171, anti-CTLA4, druga antitela koja ciljaju ključne strukture imunskog sistema (npr. anti-CD40, anti-TGFbeta, anti-TNFalfa receptor) i SC58175, koji mogu delovati terapijski i/ili kao adjuvans. Količine i koncentracije adjuvanasa i aditiva korisnih u kontekstu predmetnog pronalaska, stručnjak iz ove oblasti može lako da utvrdi bez izvođenja suvišnih eksperimenata.

Poželjni adjuvansi su anti-CD40, imikvimod, rezikvimod, GM-CSF, ciklofosfamid, sunitinib, bevacizumab, interferon-alfa, CpG oligonukleotidi i derivati, poli-(I:C) i derivati, RNK, sildenafil i formulacije čestica sa PLG ili virozomima.

U poželjnom otelotvorenju, farmaceutskoj smeši u skladu sa pronalaskom adjuvans je izabran iz grupe koja se sastoji od faktora stimulacije kolonija, kao što je faktor stimulacije granulocitno-makrofagne kolonije (GM-CSF, sargramostim), ciklofosfamida, imikvimoda, rezikvimoda i interferona alfa.

U poželjnom otelotvorenju, farmaceutskoj smeši u skladu sa pronalaskom adjuvans je izabran iz grupe koja se sastoji od faktora stimulacije kolonija, kao što je faktor stimulacije granulocitno-makrofagne kolonije (GM-CSF, sargramostim), ciklofosfamida, imikvimoda i rezikvimoda. U poželjnom otelotvorenju farmaceutske smeše u skladu sa pronalaskom, adjuvans je ciklofosfamid, imikvimod ili rezikvimod. Još poželjniji adjuvansi su Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, poli-ICLC (Hiltonol®) i anti-CD40 mAT ili njihove kombinacije.

Ova smeša se koristi za parenteralnu primenu, kao što je supkutana, intradermalna, intramuskularna ili oralnu primenu. Za navedeno, peptidi i opciono drugi molekuli se rastvaraju ili suspenduju u farmaceutski prihvatljivom, poželjno, vodenom nosaču. Pored toga, smeša može sadržati pomoćne materije, poput pufera, vezujućih agenasa, raspršivača, rastvarača, aroma, lubrikanata itd. Peptidi takođe mogu biti primenjeni zajedno sa imunostimulišućim supstancama kao što su citokini. Opsežna lista pomoćnih materija koje se mogu koristiti u navedenom sastavu može, na primer, biti preuzeta iz A. Kibbe, Handbook of Pharmaceutical Excipients (Kibbe, 2000). Smeša se može koristiti za prevenciju, profilaksu i/ili terapiju adenomatoznih ili malignih oboljenja. Primerne formulacije se mogu naći u, na primer, patentu EP2112253.

Važno je da se razume da imunski odgovor izazvan vakcinom u skladu sa pronalaskom napada maligni tumor u različitim ćelijskim fazama i različitim stadijumima razvoja. Pored toga napadaju se i različiti signalni putevi povezani sa malignim tumorom. Ovo je prednost u odnosu na vakcine koje ciljaju samo jedan ili nekoliko ciljeva, što može dovesti do toga da se tumor lako adaptira na napad (izbegavanje tumora). Pored toga, ne eksprimiraju svi pojedinačni tumori isti obrazac antigena. Zbog toga, kombinacija nekoliko tumor-asociranih peptida osigurava da svaki pojedinačan tumor nosi najmanje neki od ciljeva. Smeša je dizajnirana na takav način da se očekuje da svaki tumor eksprimira nekoliko antigena i pokriva nekoliko nezavisnih puteva neophodnih za rast i održavanje tumora. Tako, vakcina se lako može koristiti „iz zaliha“ za veću populaciju pacijenata. Ovo znači da prethodna selekcija pacijenata koji će biti lečeni vakcinom može da se ograniči na HLA tipizaciju, ne zahteva bilo kakve dodatne procene biomarkera za ekspresiju antigena, ali se i dalje osigurava da nekoliko ciljeva bude napadnuto istovremeno od strane indukovanog imunskog odgovora, što je važno za efikasnost (Banchereau et al., 2001; Walter et al., 2012).

Peptid predmetnog pronalaska može da se koristi za stvaranje i razvoj specifičnih antitela protiv kompleksa MHC/peptid. Ona se mogu koristiti za terapiju, tako što će ciljno dovoditi toksine ili radioaktivne supstance u obolelo tkivo. Druga primena ovih antitela može biti ciljno dovođenje radionuklida u obolelo tkivo u svrhe imidžinga kao što je PET. Ova primena može pomoći da se detektuju male metastaze ili utvrdi veličina i precizna lokacija obolelih tkiva.

Zato, dalji aspekt pronalaska je obezbeđivanje metoda za proizvodnju rekombinantnog antitela koje se specifično vezuje za humani glavni kompleks gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I koji je u kompleksu sa HLA-restrikovanim antigenom, pri čemu se metod sastoji od: imunizacije genetičkim inžinjeringom napravljenog nehumanog sisara koji sadrži ćelije koje eksprimiraju navedeni humani glavni kompleks gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I sa solubilnim oblikom MHC molekula klase I koji je u kompleksu sa navedenim HLA-restrikovanim antigenom; izolacije molekula iRNK iz ćelija navedenog sisara koji nije čovek koje proizvode antitela; proizvodnje biblioteke prikaza faga koja prikazuje molekule proteina kodiranih navedenim molekulima iRNK; i izolacije najmanje jednog faga iz navedene biblioteke prikaza faga, pri čemu taj navedeni najmanje jedan fag prikazuje navedeno antitelo koje se specifično vezuje za navedeni humani glavni kompleks gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I koji je u kompleksu sa navedenim HLA-restrikovanim antigenom.

Dalji je aspekt pronalaska da se obezbedi antitelo koje se specifično vezuje za humani glavni kompleks gena tkivne podudarnosti (MHC) klase I koji je u kompleksu sa HLA-restrikovanim antigenom, naznačeno time što je antitelo poželjno poliklonalno antitelo, monoklonalno antitelo, bispecifično antitelo i/ili himerno antitelo.

Odgovarajući metodi za proizvodnju takvih antitela i jednolančanih glavnih kompleksa gena tkivne podudarnosti klase I, kao i ostali alati za proizvodnju ovih antitela izneti su u patentima WO 03/068201, WO 2004/084798, WO 01/72768, WO 03/070752, kao i publikacijama (Cohen et al., 2003a; Cohen et al., 2003b; Denkberg et al., 2003).

Poželjno, antitelo se vezuje za kompleks sa afinitetom vezivanja manjim od 20 nanomol/l, poželjno ispod 10 nanomol/l, što se u kontekstu predmetnog pronalaska takođe smatra „specifičnim“.

Predmetni pronalazak odnosi se na peptid koji sadrži ID BR. SEKV: 11.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na peptid u skladu sa pronalaskom koji ima sposobnost da se veže za molekul klase I humanog glavnog kompleksa gena tkivne podudarnosti (MHC).

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na peptide u skladu sa pronalaskom, naznačen time što peptid sadrži nepeptidne veze.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na peptide u skladu sa pronalaskom, naznačene time što je peptid deo fuzionog proteinasa N-terminalnim aminokiselinama HLA-DR antigen-asociranog nepromenjivog lanca (Ii).

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na nukleinsku kiselinu koja kodira peptid u skladu sa pronalaskom.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na nukleinsku kiselinu u skladu sa pronalaskom koja je DNK, cDNK, PNK, RNK ili njihova kombinacija.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na peptid u skladu sa predmetnim pronalaskom, nukleinsku kiselinu u skladu sa predmetnim pronalaskom ili vektor ekspresije u skladu sa predmetnim pronalaskom za upotrebu u medicini, konkretno u lečenju raka jajnika.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na ćeliju domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu u skladu sa pronalaskom ili vektor ekspresije u skladu sa pronalaskom.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na ćeliju domaćina u skladu sa predmetnim pronalaskom koja je antigen-prezentujuća ćelija, a poželjno dendritična ćelija.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na metod u skladu sa predmetnim pronalaskom, naznačeno time što se antigen postavlja na MHC molekule klase I eksprimirane na površini prikladne antigen-prezentujuće ćelije tako što se dovoljna količina antigena dovodi u kontakt sa antigen-prezentujućom ćelijom.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na metod u skladu sa pronalaskom, naznačeno time što antigen-prezentujuća ćelija sadrži vektor ekspresije koji eksprimira navedeni peptid koji sadrži ID BR. SEKV: 11.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na aktivirane T ćelije, proizvedene pomoću metoda u skladu sa predmetnim pronalaskom, naznačeno time što navedena T ćelija selektivno prepoznaje ćeliju koja aberantno eksprimira polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu u skladu sa predmetnim pronalaskom.

1

Predstavljen je metod ubijanja ciljnih ćelija kod pacijenta čije ciljne ćelije aberantno eksprimiraju polipeptid koji sadrži bilo koju aminokiselinsku sekvencu u skladu sa predmetnim pronalaskom, pri čemu metod obuhvata davanje pacijentu efikasnog broja T ćelija u skladu sa predmetnim pronalaskom.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na upotrebu peptida u skladu sa predmetnim pronalaskom, nukleinske kiseline u skladu sa predmetnim pronalaskom, vektora ekspresije u skladu sa predmetnim pronalaskom, ćelije u skladu sa predmetnim pronalaskom, ili aktiviranog citotoksičnog T limfocita u skladu sa predmetnim pronalaskom u vidu leka ili u proizvodnji leka. Predmetni pronalazak se dalje odnosi na upotrebu u skladu sa predmetnim pronalaskom, naznačenu time što je lek aktivan protiv malignog tumora.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na upotrebu u skladu sa pronalaskom, naznačenu time što je lek vakcina. Predmetni pronalazak se dalje odnosi na upotrebu u skladu sa pronalaskom, naznačenu time što je lek aktivan protiv malignog tumora.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na upotrebu u skladu sa pronalaskom, naznačenu time što su navedene ćelije raka ćelije raka jajnika ili ćelije drugog solidnog ili hematološkog tumora kao nesitnoćelijskog raka pluća, sitnoćelijskog raka pluća, raka bubrega, raka mozga, raka kolona ili rektuma, raka želuca, raka jetre, raka pankreasa, raka prostate, leukemije, raka dojke, raka Merkelovih ćelija, melanoma, raka jednjaka, raka mokraćne bešike, raka materice, raka žučne kese, raka žučnih puteva.

Termin „antitelo“ ili „antitela“ je u ovom dokumentu korišćen u širokom smislu i uključuje kako poliklonalna tako i monoklonalna antitela. Pored intaktnih ili „kompletnih“ molekula imunoglobulina, pod terminom „antitela“ su takođe obuhvaćeni i fragmenti (npr. CDR-ovi, Fv, Fab i Fc fragmenti) ili polimeri tih molekula imunoglobulina i humanizovane verzije molekula imunoglobulina, ukoliko oni ispoljavaju bilo koje od željenih svojstava (npr. specifično vezivanje markerskog (poli)peptida raka jajnika, isporučivanje toksina ćeliji raka jajnika koja eksprimira markerski gen za karcinom u povećanom stepenu, i/ili inhibicija aktivnosti markerskog polipeptida raka jajnika) u skladu sa pronalaskom.

Kad god je to moguće, antitela pronalaska mogu da se nabave iz komercijalnih

2

izvora. Antitela pronalaska mogu takođe biti napravljena pomoću dobro poznatih metoda. Osobi stručnoj u predmetnoj oblasti će biti poznato da za stvaranje antitela pronalaska mogu da se koriste ili markerski polipeptidi za rak jajnika kompletne dužine ili njihovi fragmenti. Polipeptid koji će se koristiti za stvaranje antitela pronalaska može biti parcijalno ili kompletno prečišćen iz prirodnog izvora, ili može biti proizveden pomoću tehnika rekombinantne DNK.

Na primer, cDNK koja kodira peptid u skladu sa predmetnim pronalaskom, kao što je peptid u skladu sa ID BR. SEKV: 11, može biti eksprimirana u prokariotskim ćelijama (npr. bakterije) ili eukariotskim ćelijama (npr. kvasnice, insekti ili ćelije sisara), nakon čega rekombinantni protein može da se prečisti i koristi za stvaranje preparata monoklonalnog ili poliklonalnog antitela koje se specifično vezuje za markerski polipeptid za rak jajnika koji se koristi za stvaranje antitela u skladu sa pronalaskom.

Osoba stručna u predmetnoj oblasti će shvatiti da stvaranje dva ili više različitih skupova monoklonalnih ili poliklonalnih antitela maksimizira verovatnoću dobijanja antitela sa specifičnošću i afinitetom neophodnim za njegovu namenu (npr. ELISA, imunohistohemija, in vivo imidžing, terapija imunotoksinima). Antitela se testiraju za njihovu željenu aktivnost pomoću poznatih metoda, u skladu sa svrhom za koju će se antitela koristiti (npr. ELISA, imunohistohemija, imunoterapija, itd; za dalje smernice o stvaranju i testiranju antitela pogledajte, npr. rad Greenfield, 2014 (Greenfield, 2014)). Na primer, antitela mogu da se testiraju u ELISA testovima, ili Western blot testovima, imunohistohemijskim bojenjem uzoraka malignog tumora fiksiranih u formalinu ili zamrznutih isečaka tkiva. Nakon njihove inicijalne in vitro karakterizacije, antitela namenjena za terapeutsku ili in vivo dijagnostičku upotrebu testiraju se u skladu sa poznatim metodama kliničkog testiranja.

Termin „monoklonalno antitelo“ na način na koji je korišćen u ovom dokumentu odnosi se na antitelo dobijeno iz značajno homogene populacije antitela, to jest, pojedinačna antitela koja sačinjavaju populaciju su identična izuzev za moguće prirodno javljajuće mutacije koje mogu biti prisutne u manjim količinama. Monoklonalna antitela opisana u ovom dokumentu specifično obuhvataju „himerna“ antitela u kojima je deo teškog i/ili lakog lanca identičan sa ili homologan sa korespondentnim sekvencama u antitelima dobijenim iz određenih vrsta ili koja pripadaju određenoj klasi ili potklasi antitela, dok je preostali deo lanca (lanaca) identičan sa ili homologan sa korespondentnim sekvencama u antitelima dobijenim iz drugih vrsta ili koja pripadaju drugoj klasi ili potklasi antitela, kao i fragmente takvih antitela, sve dok oni ispoljavaju željenu antagonističku aktivnost (US 4,816,567).

Monoklonalna antitela pronalaska mogu da se pripreme pomoću metoda hibridoma. U metodu hibridoma, miš ili druga odgovarajuća životinja domaćin se obično imunizuje sa sredstvom za imunizaciju kako bi se izazvali limfociti koji proizvode ili su u stanju da proizvode antitela koja će specifično da se vezuju za sredstvo za imunizaciju. Alternativno, imunizacija limfocita može da se izvrši in vitro.

Monoklonalna antitela mogu takođe da se naprave pomoću metoda rekombinantne DNK, kao što su one koje su opisane u patentu US 4,816,567. DNK koja kodira monoklonalna antitela pronalaska može lako da se izoluje i sekvencionira pomoću konvencionalnih procedura (npr. primenom oligonukleotidnih proba koje su sposobne da se specifično vežu za gene koji kodiraju teške i lake lance mišjih antitela).

Za pripremanje monovalentnih antitela takođe su pogodne i in vitro metode. Digestija antitela u cilju proizvodnje njihovih fragmenata, konkretno Fab fragmenata, može da se izvrši pomoću rutinskih tehnika poznatih u predmetnoj oblasti. Na primer, digestija može da se izvrši pomoću papaina. Primeri papainske digestije opisani su u patentima WO 94/29348 i US 4,342,566. Papainska digestija antitela tipično proizvodi dva identična fragmenta koja vezuju antigen, koji se nazivaju Fab fragmenti, i svaki sadrži jedno mesto za vezivanje antigena i rezidualni Fc fragment. Tretiranje pepsinom proizvodi F(ab')2 fragment i pFc' fragment.

Fragmenti antitela, bilo da su povezani sa drugim sekvencama ili ne, mogu takođe uključivati insercije, delecije, supstitucije, ili druge izabrane modifikacije konkretnih regiona ili specifičnih aminokiselinskih ostataka, pod uslovom da aktivnost fragmenta nije značajno izmenjena ili narušena u poređenju sa nemodifikovanim antitelom ili fragmentom antitela. Ove modifikacije mogu obezbediti neka dodatna svojstva, kao što je uklanjanje/dodavanje aminokiselina sposobnih za disuflidno vezivanje, povećanje njegove biološke dugovečnosti, menjanje njegovih sekretornih karakteristika itd. U svakom slučaju, fragment antitela mora da poseduje bioaktivno svojstvo, kao što je aktivnost vezivanja, regulacija vezivanja na domenu za

4

vezivanje, itd. Funkcionalni ili aktivni regioni antitela mogu biti identifikovani pomoću mutageneze specifičnog regiona proteina, nakon čega sledi ekspresija i testiranje eksprimiranog polipeptida. Takvi metodi su očigledni osobi stručnoj u predmetnoj oblasti i mogu uključivati mutagenezu specifičnu za mesto nukleinske kiseline koja kodira fragment antitela.

Antitela pronalaska mogu dalje da sadrže humanizovana antitela ili humana antitela. Humanizovani oblici nehumanih (npr. mišjih) antitela su himerni imunoglobulini, imunoglobulinski lanci ili njihovi fragmenti (poput Fv, Fab, Fab' ili druge podsekvence antitela koje vezuju antigen) koji sadrže najmanju sekvencu dobijenu iz nehumanog imunoglobulina. Humanizovana antitela uključuju humane imunoglobuline (recipijentno antitelo) u kojim su ostaci iz komplementarnog determinišućeg regiona (CDR) recipijenta zamenjeni ostacima iz CDR-a nehumanih vrsta (donorsko antitelo) kao što je miš, pacov ili zec koji imaju željenu specifičnost, afinitet i kapacitet. U nekim slučajevima, ostaci okvira Fv (FR) humanog imunoglobulina se zamenjuju odgovarajućim nehumanim ostacima. Humanizovana antitela mogu takođe da sadrže ostatke koji se ne nalaze niti u recipijentnom antitelu niti u uvezenim sekvencama CDR-a ili okvira. Uopšteno, humanizovano antitelo će u značajnoj meri da sadrži sve od najmanje jednog, i tipično dva, varijabilna domena, u kojem svi ili značajno svi CDR regioni odgovaraju regionima nehumanog imunoglobulina i svi ili značajno svi FR regioni su regioni konsenzus sekvence humanog imunoglobulina. Humanizovano antitelo će takođe optimalno sadržati najmanje deo konstantnog regiona imunoglobulina (Fc), tipično iz humanog imunoglobulina.

Metodi humanizacije nehumanih antitela dobro su poznati u predmetnoj oblasti. Uopšteno, humanizovano antitelo ima jedan ili više aminokiselinskih ostataka uvedenih u njega iz izvora koji nije ljudski. Ovi nehumani aminokiselinski ostaci se često nazivaju „uvozni“ ostaci, koji se tipično uzimaju iz „uvoznog“ varijabilnog domena. Humanizacija se u suštini može izvršiti supstitucijom glodarskih CDR-ova ili CDR sekvenci za korespondentne sekvence humanog antitela. Saglasno tome, takva „humanizovana“ antitela su himerna antitela (US 4,816,567), naznačena time što je značajno manje od intaktnog humanog varijabilnog domena supstituisano odgovarajućim sekvencama iz nehumanih vrsta. U praksi, humanizovana antitela su tipično humana antitela u kojima su neki CDR ostaci, a moguće i neki FR ostaci, supstituisani ostacima sa analognih mesta u antitelima glodara.

U ovu svrhu mogu da se upotrebe transgenske životinje (npr. miševi) koji su sposobni da nakon imunizacije proizvedu kompletan repertoar humanih antitela u odsustvu endogene proizvodnje imunoglobulina. Na primer, opisano je da homozigotna delecija gena koji kodira spojni region teškog lanca antitela kod miševa sa himernom i gametskom mutacijom rezultuje kompletnom inhibicijom endogene proizvodnje antitela. Transfer humanog gametskog niza gena za imunoglobuline u takve miševe sa gametskom mutacijom rezultovaće proizvodnjom humanih antitela nakon izazivanja od strane antigena. Humana antitela mogu takođe da se proizvedu u bibliotekama prikaza faga.

Antitela pronalaska se poželjno daju ispitaniku u farmaceutski prihvatljivom nosaču. Tipično, koristi se odgovarajuća količina farmaceutski prihvatljive soli za pravljenje formulacije kako bi se napravila izotona formulacija. Primeri farmaceutski prihvatljivog nosača uključuju fiziološki rastvor, Ringerov rastvor i rastvor dekstroze. pH rastvora je poželjno od oko 5 do oko 8, još poželjnije od oko 7 do oko 7,5. Dalji nosači obuhvataju preparate sa održivim oslobađanjem, kao što su polupropustljive matrice solidnih hidrofobnih polimera koji sadrže antitelo, pri čemu su matrice u obliku oblikovanih proizvoda, npr. filmovi, lipozomi ili mikročestice. Osobama stručnim u predmetnoj oblasti će biti očigledno da određeni nosači mogu biti poželjniji u zavisnosti od, na primer, načina primene i koncentracije antitela koje se primenjuje.

Antitela se mogu dati ispitaniku, pacijentu ili ćeliji pomoću injekcije (npr. intravenska, intraperitonealna, potkožna, intramuskularna) ili pomoću drugih metoda kao što je infuzija, koje osiguravaju isporučivanje u cirkulaciju u efikasnom obliku. Antitela mogu takođe da se primene intratumorskim ili peritumorskim putevima, kako bi ispoljila lokalne kao i sistemske terapijske efekte. Preferira se lokalna ili intravenska injekcija.

Efikasne doze i režimi primene antitela mogu da se utvrde empirijski a takva određivanja spadaju u okvir veštine predmetne oblasti. Osobe stručne u predmetnoj oblasti će razumeti da će doza antitela, koja mora da se primeni, zavisiti od, na primer, ispitanika koji će dobiti antitelo, načina primene, konkretne vrste korišćenog antitela i drugih lekova koji se primenjuju. Tipična dnevna doza antitela koje se koristi samostalno može se kretati od oko 1 µg/kg do 100 mg/kg telesne težine ili više dnevno, u zavisnosti od gorepomenutih faktora. Nakon primene antitela, poželjno za tretiranje raka jajnika, efikasnost terapijskog antitela može da se proceni na različite načine koji su dobro poznati osobi stručnoj u predmetnoj oblasti. Na primer, veličina, broj i/ili distribucija malignog tumora kod ispitanika koji prima terapiju, može da se prati pomoću standardnih tehnika za imidžing tumora. Antitelo koje se primenjuje u terapijske svrhe, koje zaustavlja rast tumora, rezultuje smanjivanjem veličine tumora i/ili sprečava nastanak novih tumora u poređenju sa tokom bolesti koji bi nastao u odsustvu primene antitela, jeste efikasno antitelo za lečenje malignog tumora.

Dalji je aspekt pronalaska da se obezbedi metod za proizvodnju rastvorljivog T-ćelijskog receptora (sTCR) koji prepoznaje specifični kompleks peptid-MHC. Takvi rastvorljivi T-ćelijski receptori mogu da se naprave od specifičnih T-ćelijskih klonova, a njihov afinitet može da se poveća pomoću mutageneze koja cilja komplementarne determinišuće regione. U svrhu odabira T-ćelijskog receptora, može se koristiti prikaz faga (US 2010/0113300, (Liddy et al., 2012)). U svrhu stabilizacije T-ćelijskih receptora u toku prikaza faga i u slučaju praktične primene u vidu leka, alfa i beta lanac mogu da se povežu, npr. neprirodnim disulfidnim vezama, drugim kovalentnim vezama (jednolančani T-ćelijski receptor) ili pomoću domena dimerizacije (Boulter et al., 2003; Card et al., 2004; Willcox et al., 1999). T-ćelijski receptor može biti povezan sa toksinima, lekovima, citokinima (vidite, na primer, patent US 2013/0115191), domenima koji regrutuju efektorske ćelije kao što je anti-CD3 domen, itd. kako bi se izvršile određene funkcije na ciljnim ćelijama. Pored toga, on može biti eksprimiran u T ćelijama koje se koriste za adoptivni transfer. Dalje informacije se mogu naći u patentima WO 2004/033685A1 i WO 2004/074322A1. Kombinacija sTCR opisana je u WO 2012/056407A1. Dalji metodi za proizvodnju izneti su u WO 2013/057586A1.

Drugi aspekt predmetnog pronalaska uključuje in vitro metod za proizvodnju aktiviranih T ćelija, pri čemu se metod sastoji od dovođenja u kontakt in vitro T ćelija sa humanim MHC molekulima sa ubačenim antigenom eksprimiranim na površini prikladne antigen-prezentujuće ćelije u toku vremenskog perioda koji je dovoljan da se T ćelija aktivira na antigen-specifičan način, naznačeno time što je antigen peptid u skladu sa pronalaskom. Poželjno, sa antigen-prezentujućom ćelijom se koristi dovoljna količina antigena.

Poželjno, ćelija sisara ne poseduje ili ima smanjen nivo ili funkciju TAP peptidnog transportera. Pogodne ćelije kojima nedostaje TAP peptidni transporter obuhvataju T2, RMA-S i ćelije vinske mušice. TAP je transporter koji je u vezi sa obradom antigena.

Ćelijska linija T2 koja je deficijentna za ubacivanje humanih peptida dostupna je kod organizacije American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, SAD pod kataloškim brojem CRL 1992; ćelijska linija vinske mušice Schneider 2 dostupna je kod organizacije ATCC pod kataloškim brojem CRL 19863; mišja RMA-S ćelijska linija opisana je u radu Ljunggren et al. (Ljunggren and Karre, 1985).

Poželjno, pre transfekcije ćelija domaćin značajno ne eksprimira MHC molekule klase I. Takođe je poželjno da stimulatorna ćelija eksprimira molekul koji je važan za obezbeđivanje kostimulatornog signala za T ćelije kao što su bilo koji od B7.1, B7.2, ICAM-1 i LFA 3. Sekvence nukleinskih kiselina brojnih MHC molekula klase I i kostimulatornih molekula javno su dostupne iz GenBank i EMBL baza podataka.

U slučaju epitopa MHC klase I koji se koristi kao antigen, T ćelije su CD8-pozitivne T ćelije.

Ako se antigen-prezentujuća ćelija transficira da eksprimira takav epitop, ćelija se poželjno sastoji od vektora ekspresije koji eksprimira peptid koji sadrži ID BR. SEKV: 11.

Brojne druge metode mogu da se koriste za generisanje T ćelija in vitro. Na primer, za generisanje CTL mogu da se koriste autologni tumor-infiltrišući limfociti. Piebanski i sar. (Piebanski et al., 1995) upotrebili su autologne limfocite iz periferne krvi (PLB) za pripremanje T ćelija. Pored toga, moguća je proizvodnja autolognih T ćelija pulsiranjem dendritičnih ćelija sa peptidom ili polipeptidom, ili putem infekcije sa rekombinantnim virusom. Takođe, za proizvodnju autolognih T ćelija mogu da se koriste B ćelije. Pored toga, makrofagi pulsirani sa peptidom ili polipeptidom, ili inficirani sa rekombinantnim virusom, mogu da se koriste za pripremu autolognih T ćelija. S. Walter i sar. (Walter et al., 2003) opisuju in vitro prajming T ćelija upotrebom veštačkih antigen-prezentujućih ćelija (aAPĆ), što je takođe prikladan način za generisanje T ćelija protiv peptida izbora. U predmetnom pronalasku, aAPĆ su generisane spajanjem preformiranih kompleksa MHC:peptid za površinu polistirenskih čestica (mikroperle) pomoću biohemije biotin:streptavidin. Ovaj sistem dozvoljava egzaktnu kontrolu gustine MHC na aAPĆ, što omogućava da se selektivno izazovu visoko- ili nisko-aviditetni antigen-specifični T-ćelijski odgovori sa visokom efikasnošću iz uzoraka krvi. Pored ovih kompleksa MHC:peptid, aAPĆ bi trebalo da nose druge proteine sa kostimulatornom aktivnošću poput anti-CD28 antitela spojenih za njihovu površinu. Osim toga takvi sistemi zasnovani na aAPĆ često iziskuju dodavanje odgovarajućih solubilnih faktora, npr. citokina, kao što je interleukin-12.

Alogene ćelije mogu takođe da se koriste u pripremanju T ćelija a metod je detaljno opisan u patentu WO 97/26328. Na primer, pored ćelija vinske mušice i T2 ćelija, mogu da se koriste druge ćelije za prezentovanje antigena kao što su CHO ćelije, ćelije insekata inficirane bakulovirusom, bakterije, kvasnice, ciljne ćelije inficirane vakcinijom. Pored toga, mogu se koristiti biljni virusi (vidite, na primer, rad Porta i sar. (Porta et al., 1994) koji opisuje razvoj mozaičkog virusa kravljeg graška kao sistem sa visokim prinosom za prezentaciju stranih peptida.

Aktivirane T ćelije koje su usmerene protiv peptida pronalaska korisne su u terapiji. Tako, dalji aspekt pronalaska obezbeđuje aktivirane T ćelije koje se mogu dobiti prethodno navedenim metodima pronalaska.

Aktivirane T ćelije, koje su proizvedene pomoću gore navedenog metoda, selektivno će prepoznati ćeliju koja aberantno eksprimira polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu sa ID BR. SEKV: 11.

Poželjno, T ćelija prepoznaje ćeliju pomoću interakcije kroz njen TCR sa kompleksom HLA/peptid (na primer, vezivanje). T ćelije su korisne u metodu ubijanja ciljnih ćelija kod pacijenta čije ciljne ćelije aberantno eksprimiraju polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu pronalaska, naznačeno time što se pacijentu daje efikasan broj aktiviranih T ćelija. T ćelije koje se daju pacijentu mogu biti dobijene od pacijenta i aktivirane na način opisan ranije (tj. one su autologne T ćelije). Alternativno, T ćelije nisu od dotičnog pacijenta već od druge osobe. Naravno da je poželjno da osoba bude zdrava osoba. Pod „zdravom osobom“ pronalazači podrazumevaju da osoba bude uopšteno dobrog zdravlja, poželjno da ima kompetentan imunski sistem i, još poželjnije, da ne boluje ni od jedne bolesti za koju se mogu izvršiti testovi i koja se može detektovati.

In vivo, ciljne ćelije za CD8-pozitivne T ćelije u skladu sa predmetnim pronalaskom mogu biti ćelije tumora (koje ponekad eksprimiraju MHC klase II) i/ili ćelije strome koje okružuju tumor (tumorske ćelije) (koje ponekad takođe eksprimiraju MHC klase II; (Dengjel et al., 2006)).

T ćelije predmetnog pronalaska mogu da se koriste kao aktivni sastojci terapeutske smeše. Stoga, pronalazak takođe obezbeđuje metod ubijanja ciljnih ćelija kod pacijenta čije ciljne ćelije aberantno eksprimiraju polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu pronalaska, pri čemu metod obuhvata davanje efikasnog broja T ćelija pacijentu kao što je definisano ranije.

Pod pojmom „aberantno eksprimiran“ pronalazači takođe podrazumevaju da je polipeptid prekomerno eksprimiran u poređenju sa normalnim nivoima ekspresije ili da je gen neaktivan u normalnim (zdravim) tkivima. Pod pojmom „prekomerno eksprimiran’’ pronalazači podrazumevaju da je polipeptid prisutan u nivou koji je najmanje 1,2 puta veći od nivoa prisutnog u normalnom tkivu; poželjno je najmanje 2 puta veći, a još poželjnije najmanje 5 puta ili 10 puta veći od nivoa prisutnog u normalnom tkivu.

T ćelije mogu da se dobiju pomoću metoda poznatih u predmetnoj oblasti, npr. ranije opisanih.

Protokoli za ovaj takozvani adoptivni transfer T ćelija dobro su poznati u predmetnoj oblasti. Pregledi se mogu naći u: Gattioni et al. i Morgan et al. (Gattinoni et al., 2006; Morgan et al., 2006).

Drugi aspekt predmetnog pronalaska obuhvata upotrebu peptida koji su u kompleksu sa MHC za stvaranje T-ćelijskog receptora čija nukleinska kiselina je klonirana i uvedena u ćeliju domaćina, poželjno T ćeliju. Ova stvorena T ćelija može zatim da se prenese u pacijenta radi lečenja raka.

Svaki molekul pronalaska, tj. peptid, nukleinska kiselina, antitelo, vektor ekspresije, ćelija, aktivirana T ćelija, T-ćelijski receptor ili nukleinska kiselina koja ga kodira koristan je za lečenje poremećaja, koji karakterišu ćelije koje izbegavaju imunski odgovor. Zato, svaki molekul predmetnog pronalaska može da se koristi kao lek ili u proizvodnji leka. Molekul može da se koristi samostalno ili u kombinaciji sa drugim molekulom(ima) pronalaska ili poznatim molekulom(ima).

Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje lek koji je koristan u lečenju raka, posebno

1

raka jajnika i drugih maligniteta.

Predmetni pronalazak je dalje usmeren na komplet koji se sastoji od:

(a) posude koja sadrži farmaceutsku smešu kako je opisana iznad, u obliku rastvora ili u liofiliziranom obliku;

(b) opciono druge posude koja sadrži razblaživač ili rastvor za rekonstituciju za liofiliziranu formulaciju; i

(c) opciono, najmanje još jednog peptida odabranog iz grupe koja se sastoji od ID BR. SEKV 1 do 10 i 12 do 640, i

(d) opciono, uputstva za (i) upotrebu rastvora ili (ii) rekonstituciju i/ili upotrebu liofilizirane formulacije.

Komplet dalje može da se sastoji od jednog ili više od navedenih (iii) pufer, (iv) rastvarač, (v) filter, (vi) igla ili (v) brizgalica. Posuda je preferirano boca, bočica, brizgalica ili epruveta; i ona može biti višekratna posuda. Farmaceutska smeša je preferirano liofilizirana.

Kompleti predmetnog pronalaska se poželjno sastoje od liofilizirane formulacije predmetnog pronalaska u pogodnoj posudi i uputstava za njenu rekonstituciju i/ili upotrebu. Pogodne posude uključuju, na primer, boce, bočice (npr. bočice sa dve šupljine), brizgalice (kao što su brizgalice sa dve šupljine) i epruvete. Posuda može biti izrađena od različitih materijala kao što su staklo ili plastika. Poželjno, komplet i/ili posuda sadrži/e uputstva o ili u vezi sa posudom koja navode uputstva za rekonstituciju i/ili upotrebu. Na primer, na nalepnici može biti navedeno da liofilizirana formulacija treba da se rekonstituiše do koncentracija peptida kako je opisano ranije. Na nalepnici može dalje da bude naznačeno da je formulacija korisna ili namenjena za potkožnu primenu.

Posuda u kojoj se nalazi formulacija može da bude višekratna bočica, što omogućava ponavljane primene (npr. 2-6 primena) rekonstituisane formulacije. Komplet može dalje da sadrži i drugu posudu u kojoj se nalazi pogodni razblaživač (npr. rastvor natrijum bikarbonata).

Nakon mešanja razblaživača i liofilizirane formulacije, konačna koncentracija peptida u rekonstituisanoj formulaciji je poželjno najmanje 0,15 mg/ml/peptida (=75 µg) a poželjno ne više od 3 mg/ml/peptida (=1500 µg). Komplet može dalje da uključuje druge materijale poželjne sa komercijalne i korisničke tačke gledišta,

1 1

uključujući druge pufere, rablaživače, filtere, igle, brizgalice i uputstva za upotrebu uz pakovanje.

Kompleti predmetnog pronalaska mogu da imaju jednu posudu koja sadrži formulaciju farmaceutskih smeša u skladu sa predmetnim pronalaskom sa ili bez drugih komponenti (npr. druga jedinjenja ili farmaceutske smeše ovih drugih jedinjenja) ili mogu da imaju zasebnu posudu za svaku komponentu.

Poželjno, kompleti pronalaska obuhvataju formulaciju pronalaska upakovanu za upotrebu u kombinaciji sa istovremenom primenom drugog jedinjenja (kao što su adjuvansi (npr. GM-CSF), hemioterapijski agens, prirodni proizvod, hormon ili antagonist, antiangiogeni agens ili inhibitor, agens koji indukuje apoptozu ili helirajući agens) ili njegove farmaceutske smeše. Komponente kompleta mogu biti u vidu prethodno napravljenog kompleksa ili svaka komponenta može biti u odvojenoj zasebnoj posudi pre primene kod pacijenta. Komponente kompleta mogu biti obezbeđene u jednom ili više tečnih rastvora, poželjno, vodenom rastvoru, poželjnije sterilnom vodenom rastvoru. Komponente kompleta mogu takođe biti obezbeđene kao čvrste materije, koje se mogu pretvoriti u tečnosti dodavanjem pogodnih rastvarača, koji su preferirano obezbeđeni u drugoj zasebnoj posudi.

Posuda terapeutskog kompleta može biti bočica, epruveta, pljosnata boca, boca, brizgalica ili neka druga posuda za čuvanje čvrstih supstanci ili tečnosti. Obično, kada postoji više od jedne komponente, komplet će sadržati drugu bočicu ili drugu posudu, koja omogućava zasebno doziranje. Komplet takođe može sadržati drugu posudu za farmaceutski prihvatljivu tečnost. Poželjno, terapeutski komplet će sadržati pribor (npr. jednu ili više igala, brizgalice, kapaljke, pipete itd) koji omogućava primenu agenasa pronalaska koji su komponente predmetnog kompleta.

Predmetna formulacija je jedna koja je pogodna za primenu peptida na bilo koji prihvatljiv način primene kao što je oralni (enteralni), nazalni, očni, supkutani, intradermalni, intramuskularni, intravenski ili transdermalni. Poželjno, primena je s.c., a najpoželjnije i.d. primena može biti pomoću infuzione pumpe.

Budući da su peptidi pronalaska izolovani iz raka jajnika, lek pronalaska se poželjno koristi za lečenje raka jajnika.

Predmetni pronalazak će sada biti opisan u sledećim primerima koji opisuju

1 2

njegova poželjna otelotvorenja, i uz upućivanje na pridružene slike, ali to neće biti ograničeno na ovde navedeno.

SLIKE

Slike 1A do 1AE pokazuju prekomernu prezentaciju različitih peptida u normalnim tkivima (beli stupci) i raku jajnika (crni stupci). Slika 1A) simbol gena: CLSR2, peptid: VLVSDGVHSV (ID BR. SEKV.: 6); tkiva s leva u desno: 1 masna tkiva, 3 nadbubrežne žlezde, 6 arterija, 5 kostne srži, 7 mozgova, 3 dojke, 1 centralni nerv, 13 kolona, 1 duodenum, 8 jednjaka, 2 žučne kese, 5 srca, 16 bubrega, 2 limfna čvora, 21 jetra, 46 pluća, 1 metastaza u limfni čvor, 4 uzoraka leukocita, 7 pankreasa, 4 periferna nerva, 1 peritoneum, 3 hipofize, 2 placente, 3 pleure, 3 prostate, 6 rektuma, 7 pljuvačnih žlezdi, 3 skeletna mišića, 5 koža, 2 tanka creva, 4 slezine, 7 želudaca, 4 testisa, 3 timusa, 4 štitaste žlezde, 7 traheja, 3 uretera, 6 mokraćnih bešika, 2 materice, 2 vene, 3 jajnika, 20 OC. Peptid je dodatno detektovan na 1/6 rakova dojke, 1/2 karcinoma Merkelovih ćelija, 3/17 rakova jednjaka, 3/91 rakova pluća, 10/29 rakova mozga, 1/22 rakova bubrega i 1/15 sitnoćelijskih rakova pluća (nije prikazano). Slika 1B) simbol gena: CCNA1, peptid: SLMEPPAVLLL (ID BR. SEKV.: 1); tkiva s leva u desno: 1 masna tkiva, 3 nadbubrežne žlezde, 6 arterija, 5 kostne srži, 7 mozgova, 3 dojke, 1 centralni nerv, 13 kolona, 1 duodenum, 8 jednjaka, 2 žučne kese, 5 srca, 16 bubrega, 2 limfna čvora, 21 jetra, 46 pluća, 1 metastaza u limfni čvor, 4 uzoraka leukocita, 7 pankreasa, 4 periferna nerva, 1 peritoneum, 3 hipofize, 2 placente, 3 pleure, 3 prostate, 6 rektuma, 7 pljuvačnih žlezdi, 3 skeletna mišića, 5 koža, 2 tanka creva, 4 slezine, 7 želudaca, 4 testisa, 3 timusa, 4 štitaste žlezde, 7 traheja, 3 uretera, 6 mokraćnih bešika, 2 materice, 2 vene, 3 jajnika, 20 OC. Peptid je dodatno detektovan na 1/2 AML, 1/28 kolorektalnih rakova, 2/17 rakova jednjaka, 7/91 rakova pluća, 1/29 rakova mozga, 1/22 rakova bubrega i 2/15 sitnoćelijskih rakova pluća (nije prikazano). Slika 1C) simbol gena: VTCN1, peptid: ALLPLSPYL (ID BR. SEKV.: 427); tkiva s leva u desno: 1 masna tkiva, 3 nadbubrežne žlezde, 6 arterija, 5 kostne srži, 7 mozgova, 3 dojke, 1 centralni nerv, 13 kolona, 1 duodenum, 8 jednjaka, 2 žučne kese, 5 srca, 16 bubrega, 2 limfna čvora, 21 jetra, 46 pluća, 1 metastaza u limfni čvor, 4 uzoraka leukocita, 7 pankreasa, 4 periferna nerva, 1 peritoneum, 3 hipofize, 2 placente, 3 pleure, 3 prostate, 6 rektuma, 7 pljuvačnih žlezdi, 3 skeletna mišića, 5 koža, 2 tanka creva, 4 slezine, 7 želudaca, 4 testisa, 3

1

timusa, 4 štitaste žlezde, 7 traheja, 3 uretera, 6 mokraćnih bešika, 2 materice, 2 vene, 3 jajnika, 20 OC. Peptid je dodatno detektovan na 4/43 rakova prostate, 3/6 rakova dojke, 4/16 rakova jetre, 1/17 rakova jednjaka, 4/19 rakova pankreasa, 19/91 rakova pluća, 1/15 sitnoćelijskih rakova pluća, 1/4 rakova mokraćne bešike i 3/4 rakova materice (nije prikazano). Slika 1D) simbol gena: AP1B1, peptid: FLDTLKDLI ID BR. SEKV.: 514); tkiva s leva u desno: 6 ćelijskih linija (1 limfocitna, 1 bubreg, 1 pankreasna, 2 PBMC, K562-A2), 4 normalna tkiva (2 kostne srži, 2 slezine), 49 tkiva raka (1 rak dojke, 3 raka kolona, 2 raka jednjaka, 1 rak žučne kese, 2 leukemije, 3 raka jetre, 21 rak pluća, 7 rakova jajnika, 23 raka rektuma, 1 rak kože, 4 raka želuca, 1 rak testisa, 1 rak mokraćne bešike). Panel normalnog tkiva i linija ćelija raka i testiranih ksenografta su bili isti kao na Slici 1A-C, koji se sastoje od 1 masnog tkiva, 3 nadbubrežne žlezde, 6 arterija, 5 kostnih srži, 7 mozgova, 3 dojke, 1 centralnog nerva, 13 kolona, 1 duodenuma, 8 jednjaka, 2 žučne kese, 5 srca, 16 bubrega, 2 limfna čvora, 21 jetre, 46 pluća, 1 metastaze u limfni čvor, 4 uzoraka leukocita, 7 pankreasa, 4 periferna nerva, 1 peritoneum, 3 hipofize, 2 placente, 3 pleure, 3 prostate, 6 rektuma, 7 pljuvačnih žlezdi, 3 skeletna mišića, 5 koža, 2 tanka creva, 4 slezine, 7 želudaca, 4 testisa, 3 timusa, 4 štitaste žlezde, 7 traheja, 3 uretera, 6 mokraćnih bešika, 2 materice, 2 vene, 3 jajnika, 20 OC. Peptid je dodatno detektovan na 2/12 hronične limfocitne leukemije, 5/28 kolorektalnih rakova, 2/16 rakova jetre, 1/2 melanoma, 2/17 rakova jednjaka, 17/91 rakova pluća, 4/46 rakova želuca, 4/15 sitnoćelijskih rakova pluća i 1/4 rakova mokraćne bešike. Odstupanja u pogledu liste tipova tumora između slike 1D i tabele 4 mogu biti usled strožijih kriterijuma za izbor primenjenih u tabeli 4 (za detalje pogledajte tabelu 4). Slika 1D prikazuje sve uzorke sa detektabilnom prezentacijom peptida Y, bez obzira na parametre prekomerne prezentacije i proveru kvaliteta tehničkog uzorka. Slika 1E) simbol(i) gena: CELSR2, peptid: VLVSDGVHSV (ID BR. SEKV.: 6). Tkiva s leva u desno: 6 masnih tkiva, 8 nadbubrežnih žlezda, 24 ćelije krvi, 15 krvnih sudova, 10 kostnih srži, 13 mozgova, 7 dojki, 9 jednjaka, 2 očiju, 3 žučnih kesa, 16 srca, 17 bubrega, 25 debelih creva, 24 jetri, 49 pluća, 7 limfnih čvorova, 12 nerava, 3 jajnika, 13 pankreasa, 6 paraštitastih žlezda, 1 peritoneum, 6 hipofiza, 7 placenta, 1 pleura, 4 prostate, 7 pljuvačnih žlezda, 9 skeletnih mišića, 11 koža, 9 tankih creva, 12 slezina, 8 želudaca, 5 testisa, 3 timusa, 5 štitastih žlezda, 16 traheja, 7 uretera, 8 mokraćnih bešika, 6 materica, 20 uzoraka raka jajnika. Peptid je dodatno pronađen na 15/34

1 4

rakova mozga, 3/18 rakova dojke, 3/18 rakova jednjaka, 4/12 rakova glave i vrata, 1/23 rakova bubrega, 6/107 rakova pluća, 5/18 rakova kože, 5/15 rakova mokraćne bešike, 3/16 rakova materice. Slika 1F) simbol(i) gena: SUCO, peptid: LLLDITPEI (ID BR. SEKV.: 143). Tkiva s leva u desno: 6 masnih tkiva, 8 nadbubrežnih žlezda, 24 ćelije krvi, 15 krvnih sudova, 10 kostnih srži, 13 mozgova, 7 dojki, 9 jednjaka, 2 očiju, 3 žučnih kesa, 16 srca, 17 bubrega, 25 debelih creva, 24 jetri, 49 pluća, 7 limfnih čvorova, 12 nerava, 3 jajnika, 13 pankreasa, 6 paraštitastih žlezda, 1 peritoneum, 6 hipofiza, 7 placenta, 1 pleura, 4 prostate, 7 pljuvačnih žlezda, 9 skeletnih mišića, 11 koža, 9 tankih creva, 12 slezina, 8 želudaca, 5 testisa, 3 timusa, 5 štitastih žlezda, 16 traheja, 7 uretera, 8 mokraćnih bešika, 6 materica, 20 uzoraka raka jajnika. Peptid je dodatno pronađen na 2/34 rakova mozga, 4/18 rakova dojke, 2/18 rakova jednjaka, 1/12 rakova glave i vrata, 2/21 rakova jetre, 6/107 rakova pluća, 2/18 rakova kože, 1/45 rakova želuca, 2/15 rakova mokraćne bešike. Slika 1G) simbol(i) gena: PLAUR, peptid: RLWEEGEELEL (ID BR. SEKV.: 150). Tkiva s leva u desno: 6 masnih tkiva, 8 nadbubrežnih žlezda, 24 ćelije krvi, 15 krvnih sudova, 10 kostnih srži, 13 mozgova, 7 dojki, 9 jednjaka, 2 očiju, 3 žučnih kesa, 16 srca, 17 bubrega, 25 debelih creva, 24 jetri, 49 pluća, 7 limfnih čvorova, 12 nerava, 3 jajnika, 13 pankreasa, 6 paraštitastih žlezda, 1 peritoneum, 6 hipofiza, 7 placenta, 1 pleura, 4 prostate, 7 pljuvačnih žlezda, 9 skeletnih mišića, 11 koža, 9 tankih creva, 12 slezina, 8 želudaca, 5 testisa, 3 timusa, 5 štitastih žlezda, 16 traheja, 7 uretera, 8 mokraćnih bešika, 6 materica, 20 uzoraka raka jajnika. Peptid je dodatno pronađen na 4/17 rakova žučne kese i žučnih puteva, 1/18 rakova dojke, 1/29 rakova kolona, 2/18 rakova jednjaka, 1/12 rakova glave i vrata, 10/107 rakova pluća, 2/18 rakova kože, 1/16 rakova materice. Slika 1H) simbol(i) gena: HEATR2, peptid: SLNDEVPEV (ID BR. SEKV.: 157). Tkiva s leva u desno: 6 masnih tkiva, 8 nadbubrežnih žlezda, 24 ćelije krvi, 15 krvnih sudova, 10 kostnih srži, 13 mozgova, 7 dojki, 9 jednjaka, 2 očiju, 3 žučnih kesa, 16 srca, 17 bubrega, 25 debelih creva, 24 jetri, 49 pluća, 7 limfnih čvorova, 12 nerava, 3 jajnika, 13 pankreasa, 6 paraštitastih žlezda, 1 peritoneum, 6 hipofiza, 7 placenta, 1 pleura, 4 prostate, 7 pljuvačnih žlezda, 9 skeletnih mišića, 11 koža, 9 tankih creva, 12 slezina, 8 želudaca, 5 testisa, 3 timusa, 5 štitastih žlezda, 16 traheja, 7 uretera, 8 mokraćnih bešika, 6 materica, 20 uzoraka raka jajnika. Peptid je dodatno pronađen na 1/17 rakova žučnih puteva, 5/34 rakova mozga, 1/18 rakova dojke, 1/29 rakova kolona, 2/18 rakova jednjaka, 1/12 rakova glave i vrata, 2/23 rakova bubrega, 1/21

1

rakova jetre, 4/107 rakova pluća, 2/20 rakova limfnog čvora, 1/18 rakova kože, 1/15 rakova mokraćne bešike, 1/16 rakova materice. Slika 1I) simbol(i) gena: VTCN1, peptid: ALLPLSPYL (ID BR. SEKV.: 427). Tkiva s leva u desno: 6 masnih tkiva, 8 nadbubrežnih žlezda, 24 ćelije krvi, 15 krvnih sudova, 10 kostnih srži, 13 mozgova, 7 dojki, 9 jednjaka, 2 očiju, 3 žučnih kesa, 16 srca, 17 bubrega, 25 debelih creva, 24 jetri, 49 pluća, 7 limfnih čvorova, 12 nerava, 3 jajnika, 13 pankreasa, 6 paraštitastih žlezda, 1 peritoneum, 6 hipofiza, 7 placenta, 1 pleura, 4 prostate, 7 pljuvačnih žlezda, 9 skeletnih mišića, 11 koža, 9 tankih creva, 12 slezina, 8 želudaca, 5 testisa, 3 timusa, 5 štitastih žlezda, 16 traheja, 7 uretera, 8 mokraćnih bešika, 6 materica, 20 uzoraka raka jajnika. Peptid je dodatno pronađen na 7/17 rakova žučne kese i žučnih puteva, 9/18 rakova dojke, 2/18 rakova jednjaka, 1/12 rakova glave i vrata, 7/21 rakova jetre, 22/107 rakova pluća, 4/19 rakova pankreasa, 4/87 rakova prostate, 2/15 rakova mokraćne bešike, 11/16 rakova materice. Slika 1J) simbol(i) gena: DDX11, DDX12P, LOC642846, peptid: GLLRDEALAEV (ID BR. SEKV.: 444). Tkiva s leva u desno: 6 masnih tkiva, 8 nadbubrežnih žlezda, 24 ćelije krvi, 15 krvnih sudova, 10 kostnih srži, 13 mozgova, 7 dojki, 9 jednjaka, 2 očiju, 3 žučnih kesa, 16 srca, 17 bubrega, 25 debelih creva, 24 jetri, 49 pluća, 7 limfnih čvorova, 12 nerava, 3 jajnika, 13 pankreasa, 6 paraštitastih žlezda, 1 peritoneum, 6 hipofiza, 7 placenta, 1 pleura, 4 prostate, 7 pljuvačnih žlezda, 9 skeletnih mišića, 11 koža, 9 tankih creva, 12 slezina, 8 želudaca, 5 testisa, 3 timusa, 5 štitastih žlezda, 16 traheja, 7 uretera, 8 mokraćnih bešika, 6 materica, 20 uzoraka raka jajnika. Peptid je dodatno pronađen na 2/18 rakova dojke, 3/29 rakova kolona ili rektuma, 1/18 rakova jednjaka, 1/12 rakova glave i vrata, 1/23 rakova bubrega, 2/17 rakova leukocitne leukemije, 9/107 rakova pluća, 6/20 rakova limfnog čvora, 1/18 raka mijeloidnih ćelija, 2/18 rakova kože, 2/15 rakova mokraćne bešike, 1/16 rakova materice. Slika 1K) simbol(i) gena: KDM1B, peptid: KLAEGLDIQL (ID BR. SEKV.: 449). Tkiva s leva u desno: 6 masnih tkiva, 8 nadbubrežnih žlezda, 24 ćelije krvi, 15 krvnih sudova, 10 kostnih srži, 13 mozgova, 7 dojki, 9 jednjaka, 2 očiju, 3 žučnih kesa, 16 srca, 17 bubrega, 25 debelih creva, 24 jetri, 49 pluća, 7 limfnih čvorova, 12 nerava, 3 jajnika, 13 pankreasa, 6 paraštitastih žlezda, 1 peritoneum, 6 hipofiza, 7 placenta, 1 pleura, 4 prostate, 7 pljuvačnih žlezda, 9 skeletnih mišića, 11 koža, 9 tankih creva, 12 slezina, 8 želudaca, 5 testisa, 3 timusa, 5 štitastih žlezda, 16 traheja, 7 uretera, 8 mokraćnih bešika, 6 materica, 20 uzoraka raka jajnika. Peptid je dodatno nađen na

1

3/29 rakova kolona ili rektuma, 6/107 rakova pluća, 1/20 rakova limfnog čvora. Slika 1L) simbol(i) gena: CCNA1, peptid: SLMEPPAVLLL (ID BR. SEKV.: 1). Tkiva s leva u desno: 1 ćelijska linija raka, 1 normalno tkivo (1 limfni čvor), 45 tkiva raka (3 raka kostne srži, 1 rak mozga, 1 rak dojke, 2 raka jednjaka, 1 rak glave i vrata, 1 rak bubrega, 3 raka leukocitne leukemije, 12 rakova pluća, 1 rak mijeloidnih ćelija, 11 rakova jajnika, 2 raka mokraćne bešike, 7 rakova materice. Testirani panel normalnog tkiva je bio isti kao na slici 1E-K. Slika 1M) simbol(i) gena: CT45A5, LOC101060208, CT45A3, CT45A1, LOC101060211, CT45A6, CT45A4, LOC101060210, CT45A2, peptid: KIFEMLEGV (ID BR. SEKV.: 11). Tkiva s leva u desno: 3 normalna tkiva (1 mozak, 1 pluće, 1 ureter), 21 tkiva raka (1 rak žučnih puteva, 1 rak jednjaka, 1 rak jetre, 10 rakova pluća, 1 rak limfnog čvora, 5 rakova jajnika, 2 raka materice). Testirani panel normalnog tkiva je bio isti kao na slici 1E-K. Slika 1N) simbol(i) gena: FGFR1OP, peptid: KLDDLTQDLTV (ID BR. SEKV.: 32). Tkiva s leva u desno: 1 ćelijska linija, 1 normalno tkivo (1 jetra), 29 tkiva raka (2 raka žučnih puteva, 1 rak jednjaka, 2 raka glave i vrata, 4 raka jetre, 4 raka pluća, 3 raka limfnog čvora, 8 rakova jajnika, 1 rak prostate, 1 rak rektuma, 2 raka mokraćne bešike, 1 rak materice). Testirani panel normalnog tkiva je bio isti kao na slici 1E-K. Slika 1O) simbol(i) gena: TSEN15, peptid: FLLEDDIHVS (ID BR. SEKV.: 38). Tkiva s leva u desno: 1 primarna kultura, 1 normalno tkivo (1 traheja), 28 tkiva raka (2 raka dojke, 1 rak glave i vrata, 4 raka leukocitne leukemije, 5 rakova pluća, 6 rakova limfnog čvora, 1 rak mijeloidne ćelije, 2 raka jajnika, 1 rak rektuma, 3 raka kože, 2 raka mokraćne bešike, 1 rak materice). Testirani panel normalnog tkiva je bio isti kao na slici 1E-K. Slika 1P) simbol(i) gena: ZNF527, ZNF829, ZNF383, ZNF850, ZNF583, peptid: SLLEQGKEPWMV (ID BR. SEKV.: 54). Tkiva s leva u desno: 1 ćelijska linija, 18 tkiva raka (2 raka mozga, 1 rak dojke, 1 rak žučne kese, 1 rak leukocitne leukemije, 2 raka jetre, 7 rakova pluća, 1 rak limfnog čvora, 2 raka jajnika, 1 rak mokraćne bešike). Testirani panel normalnog tkiva je bio isti kao na slici 1E-K. Slika 1Q) simbol(i) gena: CAMSAP1, peptid: TLAELQPPVQL (ID BR. SEKV.: 57). Tkiva s leva u desno: 4 ćelijske linije i primarne kulture, 32 tkiva raka (1 rak žučnih puteva, 1 rak mozga, 2 raka jednjaka, 3 raka glave i vrata, 2 raka limfocitne leukemije, 1 rak jetre, 9 rakova pluća, 4 raka limfnog čvora, 5 rakova jajnika, 2 raka kože, 1 rak mokraćne bešike, 1 rak materice). Testirani panel normalnog tkiva je bio isti kao na slici 1E-K. Slika 1R) simbol(i) gena: STK38L, peptid: ILVEADGAWVV (ID BR. SEKV.: 77). Tkiva s leva u desno: 4 ćelijske linije,

1

19 malignih tkiva (1 rak mozga, 2 raka dojke, 1 rak kolona, 1 rak leukocitne leukemije, 4 raka pluća, 3 raka limfnog čvora, 3 raka jajnika, 1 rak prostate, 1 rak kože, 1 rak mokraćne bešike, 1 raka materice). Testirani panel normalnog tkiva je bio isti kao na slici 1E-K. Slika 1S) simbol(i) gena: PIGA, peptid: ALNPEIVSV (ID BR. SEKV.: 148). Tkiva s leva u desno: 3 ćelijske linije, 20 malignih tkiva (1 rak jednjaka, 2 raka glave i vrata, 1 rak leukocitne leukemije, 5 rakova pluća, 3 raka limfnog čvora, 2 raka jajnika, 2 raka kože, 4 raka mokraćne bešike). Testirani panel normalnog tkiva je bio isti kao na slici 1E-K. Slika 1T) simbol(i) gena: NPLOC4, peptid: YLNHLEPPV (ID BR. SEKV.: 166). Tkiva s leva u desno: 2 ćelijske linije, 20 tkiva raka (3 raka mozga, 1 rak dojke, 1 rak jednjaka, 3 raka leukocitne leukemije, 2 raka jetre, 4 raka pluća, 2 raka limfnog čvora, 1 rak mijeloidnih ćelija, 3 raka jajnika). Testirani panel normalnog tkiva je bio isti kao na slici 1E-K. Slika 1U) simbol(i) gena: RNF213, peptid: YLMDINGKMWL (ID BR. SEKV.: 184). Tkiva s leva u desno: 1 ćelijska linija, 19 malignih tkiva (1 rak dojke, 1 rak žučne kese, 1 rak leukocitne leukemije, 6 rakova pluća, 2 raka limfnog čvora, 5 rakova jajnika, 2 raka kože, 1 rak materice). Testirani panel normalnog tkiva je bio isti kao na slici 1E-K. Slika 1V) simbol(i) gena: SKIL, peptid: KTINKVPTV (ID BR. SEKV.: 198). Tkiva s leva u desno: 2 ćelijske linije i primarne kulture, 1 normalno tkivo (1 pluće), 36 tkiva raka (3 raka mozga, 2 raka dojke, 2 raka kolona, 1 rak glave i vrata, 1 rak jetre, 14 rakova pluća, 1 rak limfnog čvora, 8 rakova jajnika, 1 rak rektuma, 2 raka mokraćne bešike, 1 rak materice). Testirani panel normalnog tkiva je bio isti kao na slici 1E-K. Slika 1W) simbol(i) gena: SEC24C, peptid: FLFPNQYVDV (ID BR. SEKV.: 248). Tkiva s leva u desno: 3 ćelijske linije i primarne kulture, 1 normalno tkivo (1 slezina), 24 tkiva raka (1 rak žučnih puteva, 2 raka dojke, 2 raka leukocitne leukemije, 1 rak jetre, 9 rakova pluća, 2 raka limfnog čvora, 3 raka jajnika, 1 rak prostate, 2 raka kože, 1 rak materice). Testirani panel normalnog tkiva je bio isti kao na slici 1E-K. Slika 1X) simbol(i) gena: PDIK1L, STK35, peptid: ALLENPKMEL (ID BR. SEKV.: 441). Tkiva s leva u desno: 5 ćelijskih linija i primarnih kultura, 1 normalno tkivo (1 nadbubrežna žlezda), 26 tkiva raka (1 rak dojke, 1 rak kolona, 1 rak jednjaka, 1 rak glave i vrata, 2 raka jetre, 10 rakova pluća, 5 rakova jajnika, 1 rak prostate, 1 rak rektuma, 2 raka mokraćne bešike, 1 rak materice). Testirani panel normalnog tkiva je bio isti kao na slici 1E-K. Slika 1Y) simbol(i) gena: EMC10, peptid: SLVESHLSDQLTL (ID BR. SEKV.: 463). Tkiva s leva u desno: 1 primarna kultura, 32 tkiva raka (1 rak žučnih puteva, 2 raka mozga, 2 raka dojke, 2 raka

1

glave i vrata, 3 raka leukocitne leukemije, 1 rak jetre, 8 rakova pluća, 3 raka limfnog čvora, 5 rakova jajnika, 2 raka kože, 2 raka mokraćne bešike, 1 rak materice). Testirani panel normalnog tkiva je bio isti kao na slici 1E-K. Slika 1Z) simbol(i) gena: ZYG11A, peptid: VLIANLEKL (ID BR. SEKV.: 466). Tkiva s leva u desno: 5 ćelijskih linija, 17 tkiva raka (3 raka dojke, 2 raka jednjaka, 1 rak jetre, 2 raka pluća, 5 rakova limfnog čvora, 3 raka jajnika, 1 rak mokraćne bešike). Testirani panel normalnog tkiva je bio isti kao na slici 1E-K. Slika 1AA) simbol(i) gena: CEP192, peptid: SLFGNSGILENV (ID BR. SEKV.: 479). Tkiva s leva u desno: 7 ćelijskih linija, 1 normalno tkivo (1 slezina), 33 tkiva raka (1 rak dojke, 1 rak kolona, 1 rak jednjaka, 1 rak glave i vrata, 1 rak leukocitne leukemije, 3 raka jetre, 10 rakova pluća, 1 rak limfnog čvora, 1 raka mijeloidnih ćelija, 7 rakova jajnika, 2 raka kože, 3 raka mokraćne bešike, 1 rak materice). Testirani panel normalnog tkiva je bio isti kao na slici 1E-K. Slika 1AB) simbol(i) gena: CCNA1, peptid: SLSEIVPCL (ID BR. SEKV.: 512). Tkiva s leva u desno: 9 malignih tkiva (1 rak glave i vrata, 2 raka pluća, 1 rak mijeloidnih ćelija, 3 raka jajnika, 2 raka materice). Testirani panel normalnog tkiva je bio isti kao na slici 1E-K. Slika 1AC) simbol(i) gena: GNB1, peptid: ALWDIETGQQTTT (ID BR. SEKV.: 560), tkiva s leva u desno: 5 ćelijskih linija i primarnih kultura, 26 tkiva raka (1 rak mozga, 1 rak jednjaka, 1 rak jednjaka i želuca, 1 rak žučne kese, 2 raka glave i vrata, 1 rak leukocitne leukemije, 1 rak jetre, 5 rakova pluća, 6 rakova limfnog čvora, 3 raka jajnika, 1 rak prostate, 1 rak kože, 1 rak mokraćne bešike, 1 rak materice). Testirani panel normalnog tkiva je bio isti kao na slici 1E-K. Slika 1AD) simbol(i) gena: KLHL14, peptid: VMNDRLYAI (ID BR. SEKV.: 587), tkiva s leva u desno: 5 normalnih tkiva (1 pankreas, 3 slezine, 1 štitasta žlezda), 38 tkiva raka (14 rakova leukocitne leukemije, 10 rakova limfnog čvora, 9 rakova jajnika, 1 rak prostate, 4 rakova materice). Testirani panel normalnog tkiva je bio isti kao na slici 1E-K. Slika 1AE) simbol(i) gena: URB1, peptid: KLLNKIYEA (ID BR. SEKV.: 620), tkiva s leva u desno: 3 ćelijske linije i primarne kulture, 2 normalna tkiva (1 pluće, 1 materica), 27 tkiva raka (5 rakova mozga, 2 raka dojke, 2 raka jednjaka, 5 rakova pluća, 1 rak limfnog čvora, 1 rak mijeloidnih ćelija, 5 rakova jajnika, 3 raka prostate, 1 rak rektuma, 1 rak mokraćne bešike, 1 rak materice). Testirani panel normalnog tkiva je bio isti kao na slici 1E-K.

Na slikama 2A do 2D prikazani su primerni profili ekspresije ovde predstavljenih izvornih gena koji su visoko prekomerno eksprimirani ili ekskluzivno eksprimirani u

1

raku jajnika u panelu normalnih tkiva (beli stupci) i 20 uzoraka raka jajnika (crni stupci). Tkiva s leva u desno: 7 arterija, 1 mozak, 1 srce, 2 jetre, 2 pluća, 2 vene, 1 masno tkivo, 1 nadbubrežna žlezda, 4 kostne srži, 1 kolon, 2 jednjaka, 2 žučne kese, 1 bubreg, 6 limfnih čvorova, 1 pankreas, 1 hipofiza, 1 rektum, 1 skeletni mišić, 1 koža, 1 tanko crevo, 1 slezina, 1 želudac, 1 timus, 1 štitasta žlezda, 5 traheja, 1 mokraćna bešika, 1 dojka, 3 jajnika, 3 placente, 1 prostata, 1 testis, 1 materica. Slika 2A) CT45A1, CT45A3, CT45A5, CT45A6, CT45A2, RP11-342L5.1, Slika 2B) CLDN16; Slika 2C) ESR1; Slika 2D) IDO1.

Na slici 3A do F prikazani su primerni podaci imunogenosti: rezultati protočne citometrije nakon bojenja peptid-specifičnog multimera. CD8+ T ćelije pripremljene su primenom veštačkih APĆ obloženih sa anti-CD28 mAt i HLA-A*02 u kompleksu sa peptidom ID br. sekv. 662 (A, levi panel), peptidom ID br. sekv. 663 (B, levi panel), peptidom ID br. sekv. 11 (C, levi panel), peptidom ID br. sekv. 198 (D, levi panel), peptidom ID br. sekv.587 (E, levi panel) odnosno peptidom ID br. sekv.427 (F, levi panel). Nakon tri ciklusa stimulacije, detekcija ćelija koje reaguju na peptid izvršena je bojenjem 2D multimera sa A*02/ID br. sekv. 662 (A), A*02/ID br. sekv.

663 (B) A*02/ID br. sekv. 11 (C), A*02/ID br. sekv. 198 (D), A*02/ID br. sekv. 587 (E) ili A*02/ID br. sekv.427 (F). Desni paneli (A, B, C, D, E i F) prikazuju kontrolno bojenje ćelija stimulisanih sa irelevantnim kompleksima A*02/peptid. Održive singlet ćelije su gejtovane za CD8+ limfocite. Logički gejtovi su pomogli da se isključe lažno-pozitivni događaji detektovani pomoću multimera specifičnih za različite peptide. Naznačene su učestalosti specifičnih multimer+ ćelija među CD8+ limfocitima.

PRIMERI

PRIMER 1

Identifikacija i kvantifikacija tumor-asociranih peptida prezentovanih na površini ćelije

Uzorci tkiva

Tkiva tumora pacijenata dobijena su od Asterand (Detroit, SAD i Royston, Herts, UK); Univerzitetske bolnice Val d’Hebron (Barselona); ProteoGenex Inc., (Culver

11

City, CA, SAD); Stanford centra za rak (Stanford, CA, SAD); Univerzitetske bolnice u Tibingenu. Normalna (zdrava) tkiva dobijena su od Asterand (Detroit, SAD i Royston, Herts, UK); Bio-Options Inc., CA, SAD; BioServe, Beltsville, MD, SAD; Capital BioScience Inc., Rockville, MD, SAD; Geneticist Inc., Glendale, CA, SAD; Univerzitetske bolnice u Ženevi; Univerzitetske bolnice u Hajdelbergu; Univerzitetske bolnice u Minhenu; ProteoGenex Inc., Culver City, CA, SAD; Univerzitetske bolnice u Tibingenu; Prefekturalnog medicinskog univerziteta u Kjotou (KPUM). Pre operacije ili autopsije, od svih pacijenata je pribavljen pisani informisani pristanak. Tkiva su zamrznuta brzim zamrzavanjem neposredno nakon ekscizije i uskladištena na -70 °C ili manje do izolacije TUMAP.

Izolacija HLA peptida iz uzoraka tkiva

Pulovi HLA peptida iz uzoraka tkiva zamrznutih brzim zamrzavanjem dobijeni su imunskom precipitacijom iz čvrstih tkiva u skladu sa blago modifikovanim protokolom (Falk et al., 1991; Seeger et al., 1999) primenom HLA-A*02-specifičnog antitela BB7.2, HLA-A, -B, -C-specifičnog antitela W6/32, CNBr-aktivirane sefaroze, tretiranja kiselinom i ultrafiltracije.

Analize masenom spektrometrijom

Dobijeni pulovi HLA peptida su odvojeni prema njihovoj hidrofobnosti pomoću reverzno-fazne hromatografije (nanoAcquity UPLC sistem, Waters) a eluirani peptidi su analizirani u LTQ-velos i fuzionim hibridnim masenim spektrometrima (ThermoElectron) opremljenim ESI izvorom. Pulovi peptida su direktno postavljeni na analitičku mikrokapilarnu kolonu od fuzirane silike (75 µm i.d. x 250 mm) upakovanu sa 1,7 µm C18 reverzno-faznim materijalom (Waters) uz primenu brzine protoka od 400 nl u minutu. Nakon toga, peptidi su izdvojeni primenom dvostepenog 180-minutnog binarnog gradijenta iz 10% do 33% B pri brzini protoka od 300 nl u minutu. Gradijent su činili rastvarač A (0,1% mravlja kiselina u vodi) i rastvarač B (0,1% mravlja kiselina u acetonitrilu). Staklena kapilara obložena zlatom (PicoTip, New Objective) je korišćena za uvođenje u nanoESI izvor. LTQ-Orbitrap maseni spektrometri su radili u režimu zavisnom od podataka primenom strategije TOP5 (5 najvećih). Ukratko, iniciran je ciklus skeniranja sa kompletnim skeniranjem visoke masene preciznosti u Orbitrap (R = 30000), što je bilo praćeno MS/MS skeniranjima takođe u Orbitrap (R = 7500) na 5 najzastupljenijih prekursorskih jona sa dinamičkim isključivanjem prethodno odabranih jona.

Tandem maseni spektri su interpretirani pomoću SEQUEST i dodatnom ručnom kontrolom. Identifikovana peptidna sekvenca je potvrđena poređenjem generisanog obrasca fragmentacije prirodnog peptida sa obrascem fragmentacije sintetičkog referentnog peptida identične sekvence.

Relativna LC-MS kvantifikacija bez obeležavanja izvršena je pomoću brojanja jona tj. ekstrakcijom i analizom LC-MS karakteristika (Mueller et al., 2007). Metod pretpostavlja da oblast LC-MS signala peptida korelira sa njegovom obilnošću u uzorku. Ekstrahovane karakteristike su dalje obrađene pomoću dekonvolucije naelektrisanog stanja i poravnanja vremena zadržavanja ((Mueller et al., 2008; Sturm et al., 2008). Na kraju, sve LC-MS karakteristike su referencirane sa rezultatima identifikacije sekvence kako bi se kvantitativni podaci od različitih uzoraka i tkiva kombinovali u profile prezentacije peptida. Kvantitativni podaci su normalizovani na dvostepeni način u skladu sa centralnom tendencijom kako bi se uračunala varijacija u okviru tehničkih i bioloških replikata. Tako svaki identifikovani peptid može biti povezan sa kvantitativnim podacima što omogućava relativnu kvantifikaciju između uzoraka i tkiva. Pored toga, svi kvantitativni podaci dobijeni za peptidne kandidate su ručno pregledani kako bi se osigurala doslednost podataka i potvrdila tačnost automatizovane analize. Za svaki peptid je izračunat profil prezentacije koji pokazuje srednju prezentaciju uzorka kao i varijacije replikata. Profili postavljaju jedno uz drugo uzorke malignog tumora jajnika sa polaznim vrednostima uzoraka normalnog tkiva.

Profili prezentacije primernih prekomerno prezentovanih peptida prikazani su na slici 1. Rezultati prezentacije za primerne peptide prikazani su u tabeli 8.

Tabela 8: Rezultati prezentacije. U tabeli su navedeni peptidi koji su veoma visoko prekomerno prezentovani na tumorima u poređenju sa panelom normalnih tkiva (+++), visoko prekomerno prezentovani na tumorima u poređenju sa panelom normalnih tkiva (++) ili prekomerno prezentovani na tumorima u poređenju sa panelom normalnih tkiva (+). Panel normalnih tkiva se sastojao od: masnog tkiva, nadbubrežne žlezde, arterije, vene, kostne srži, mozga, centralnog i perifernog nerva, kolona, rektuma, tankog creva uklj. duodenum, jednjaka, žučne kese, srca, bubrega, jetre, pluća, limfnog čvora, mononuklearnih belih krvnih ćelija, pankreasa, peritoneuma, hipofize, pleure, pljuvačne žlezde, skeletnog mišića, kože, slezine, želuca, timusa, štitaste žlezde, traheje, uretera, mokraćne bešike.

11

12

PRIMER 2

12 Profiliranje ekspresije gena koji kodiraju ovde predstavljene peptide

Prekomerna prezentacija ili specifična prezentacija peptida na tumorskim ćelijama u poređenju sa normalnim ćelijama je dovoljna za njihovu korisnost u imunoterapiji, a neki peptidi su tumor-specifični iako se njihov izvorni protein takođe javlja u normalnim tkivima. Ipak, profiliranje ekspresije iRNK dodaje dodatni nivo bezbednosti u izboru peptidnih ciljeva za imunoterapije. Naročito za terapijske opcije sa visokim rizicima u pogledu bezbednosti, kao što su afinitetno sazreli TCR-ovi, idealni ciljni peptid će biti dobijen od proteina koji je jedinstven za tumor i ne nalazi se na normalnim tkivima.

RNK izvori i priprema

Hirurški odstranjeni uzorci tkiva obezbeđeni su kako je navedeno ranije (pogledajte primer 1) nakon što je od svakog pacijenta pribavljen pisani informisani pristanak. Uzorci tumorskog tkiva su zamrznuti brzim zamrzavanjem neposredno nakon operacije i kasnije homogenizovani avanom i tučkom u prisustvu tečnog azota. Ukupna RNK je pripremljena iz ovih uzoraka pomoću TRI reagensa (Ambion, Darmstadt, Nemačka) nakon čega je sledilo čišćenje sa RNeasy (QIAGEN, Hilden, Nemačka); oba metoda su izvedena u skladu sa protokolom proizvođača.

Ukupna RNK iz zdravih humanih tkiva za RNASeq eksperimente dobijena je od: Asterand, Detroit, SAD i Royston, Herts, UK; ProteoGenex Inc. Culver City, CA, SAD; Geneticist Inc. Glendale, CA, SAD; Istituto Nazionale Tumori „Pascale“, Molecular Biology and Viral Oncology Unit (Jedinica za molekularnu biologiju i virusnu onkologiju) (IRCCS) (Napulj, Italija); Univerzitetske bolnice u Hajdelbergu, Nemačka; BioCat GmbH, Hajdelberg, Nemačka.Kvalitet i kvantitet svih uzoraka RNK procenjen je na Agilent 2100 bioanalizatoru (Agilent, Waldbronn, Nemačka) upotrebom RNA 6000 Pico LabChip kompleta (Agilent).

RNAseq eksperimenti

Analiza genske ekspresije uzoraka RNK iz tumorskih i normalnih tkiva izvršena je pomoću sekvenciranja naredne generacije (RNAseq) kompanije CeGaT (Tibingen, Nemačka). Ukratko, biblioteke za sekvenciranje pripremljene su pomoću Illumina HiSeq v4 kompleta reagenasa u skladu sa protokolom dobavljača (Illumina Inc, San Diego, CA, SAD), koji uključuje fragmentaciju RNK, konverziju cDNK i dodavanje adaptora za sekvenciranje. Biblioteke izvedene iz višestrukih uzoraka mešaju se ekvimolarno i sekvenciraju na aparatu za sekvenciranje Illumina HiSeq 2500 prema uputstvima proizvođača, generišući jednostruka krajnja očitavanja od 50 bp. Obrađena očitavanja se mapiraju na humanom genomu (GRCh38) pomoću STAR softvera. Podaci o ekspresiji se obezbeđuju na nivou transkripta kao RPKM (očitavanja po kilobazi na milion mapiranih očitavanja, koja generiše softver Cufflinks) i na nivou egzona (ukupna očitavanja, koja generiše softver Bedtools), na osnovu beleški Ensembl baze podataka o sekvencama (Ensembl77). Egzon očitavanja se normalizuju za dužinu egzona i veličinu poravnanja da bi se dobile RPKM vrednosti.

Primerni profili ekspresije ovde predstavljenih izvornih gena koji su visoko prekomerno eksprimirani ili isključivo eksprimirani u raku jajnika prikazani su na slikama 2A do 2D. Rezultati ekspresije za dalje primerne gene prikazani su u tabeli 9.

Tabela 9: Rezultati ekspresije. U tabeli su navedeni peptidi iz gena koji su veoma visoko prekomerno eksprimirani u tumorima u poređenju sa panelom normalnih tkiva (+++), visoko prekomerno eksprimirani u tumorima u poređenju sa panelom normalnih tkiva (++) ili prekomerno eksprimirani u tumorima u poređenju sa panelom normalnih tkiva (+). Početna vrednost za ovaj skor izračunata je iz merenja sledećih normalnih tkiva: masno tkivo, nadbubrežna žlezda, arterija, kostna srž, mozak, kolon, jednjak, žučna kesa, srce, bubreg, jetra, pluće, limfni čvor, pankreas, hipofiza, rektum, skeletni mišić, koža, tanko crevo, slezina, želudac, timus, štitasta žlezda, traheja, mokraćna bešika, vena.

12

PRIMER 3

In vitro imunogenost za MHC klasa I-prezentovane peptide

12

Da bi se dobile informacije u pogledu imunogenosti predstavljenih TUMAP, pronalazači su sproveli ispitivanja pomoću eseja za in vitro prajming T ćelija zasnovanog na ponovljenim stimulacijama CD8+ T ćelija sa veštačkim antigenprezentujućim ćelijama (aAPĆ) napunjenim kompleksima peptid/MHC i anti-CD28 antitelom. Na ovaj način istraživači su mogli da pokažu imunogenost za 22 HLA-A*0201-restrikovana TUMAP predstavljena do sada, dokazujući da su ovi peptidi T-ćelijski epitopi protiv kojih kod ljudi postoje CD8+ prekursorske T ćelije (tabela 10).

In vitro priprema CD8+ T ćelija

Da bi izvršili in vitro stimulacije pomoću veštačkih antigen-prezentujućih ćelija napunjenih kompleksom peptid-MHC (pMHC) i anti-CD28 antitelom, pronalazači su prvo izolovali CD8+ T ćelije iz svežih proizvoda leukafereze HLA-A*02 putem pozitivne selekcije primenom CD8 mikroperli (Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, Nemačka) zdravih donora dobijenih iz Univerzitetskih klinika u Manhajmu, Nemačka, nakon pribavljanja informisanog pristanka.

PBMC i izolovani CD8+ limfociti su inkubirani do primene u T-ćelijskom medijumu (TCM) koji je sadržao RPMI-Glutamax (Invitrogen, Karlsruhe, Nemačka) u koji je dodat 10% humani toplotom inaktiviran AB serum (PAN-Biotech, Aidenbach, Nemačka), 100 U/ml penicilina / 100 µg/ml streptomicina (Cambrex, Cologne, Nemačka), 1 mmol/l natrijum piruvata (CC Pro, Oberdorla, Nemačka), 20 µg/ml gentamicina (Cambrex). U ovom koraku, u TCM je takođe dodato 2,5 ng/ml IL-7 (PromoCell, Heidelberg, Nemačka) i 10 U/ml IL-2 (Novartis Pharma, Nurnberg, Nemačka).

Stvaranje perli obloženih sa pMHC/anti-CD28, stimulacije T ćelija i očitavanje su izvršeni u visoko definisanom in vitro sistemu primenom četiri različita pMHC molekula po uslovu stimulacije i 8 različitih pMHC molekula po uslovu očitavanja.

Prečišćeno kostimulatorno mišje IgG2a anti-humano CD28 At 9.3 (Jung et al., 1987) bilo je hemijski biotinilirano pomoću sulfo-N-hidroksisukcinimidobiotina kako je preporučeno od strane proizvođača (Perbio, Bonn, Nemačka). Korišćene perle bile su polistirenske čestice obložene streptavidinom prečnika 5,6 µm (Bangs Laboratories, Illinois, SAD).

pMHC korišćeni za stimulacije pozitivne i negativne kontrole bili su A*0201/MLA-

12

001 (peptid ELAGIGILTV (ID BR. SEKV: 664) iz modifikovanog Melan-A/MART-1) odnosno A*0201/DDX5-001 (YLLPAIVHI iz DDX5, ID BR. SEKV. 665).

800.000 perliI200 µl je bilo obloženo u pločicama sa 96 mesta u prisustvu 4 x 12,5 ng različitih biotin-pMHC, isprano i naknadno je dodato 600 ng biotin anti-CD28 u zapremini od 200 µl. Stimulacije su bile pokrenute u pločicama sa 96 mesta istovremenim inkubiranjem 1x10<6>CD8+ T ćelija sa 2x10<5>ispranih obloženih perli u 200 µl TCM u koji je dodato 5 ng/ml IL-12 (PromoCell) u toku 3 dana na 37 °C. Polovina medijuma je zatim zamenjena sa svežim TCM u koji je dodato 80 U/ml IL-2 i inkubacija je nastavljena u toku 4 dana na 37 °C. Ovaj ciklus stimulacije je izvršen ukupno tri puta. Za očitavanje pMHC multimera pomoću 8 različitih pMHC molekula po uslovu, korišćen je pristup dvodimenzionalnog kombinatornog kodiranja kako je ranije opisano (Andersen et al., 2012) sa manjim modifikacijama koje obuhvataju spajanje sa 5 različitih fluorohroma. Na kraju, analize multimera su izvršene bojenjem ćelija sa bojom Live/dead near IR dye (Invitrogen, Karlsruhe, Nemačka), klonom CD8-FITC antitela SK1 (BD, Heidelberg, Nemačka) i fluorescentnim pMHC multimerima. Za analizu je korišćen BD LSRII SORP citometar opremljen odgovarajućim laserima i filterima. Peptid-specifične ćelije izračunate su kao procenat ukupnih CD8+ ćelija. Evaluacija analize multimera izvršena je primenom FlowJo softvera (Tree Star, Oregon, SAD). In vitro prajming specifičnih multimer+ CD8+ limfocita detektovan je upoređivanjem sa stimulacijama negativne kontrole. Imunogenost datog antigena detektovana je ako je pronađeno da najmanje jedno procenjivo in vitro stimulisano mesto jednog zdravog donora sadrži specifičnu CD8+ T-ćelijsku liniju nakon in vitro stimulacije (tj. ovo mesto je sadržalo najmanje 1% specifičnih multimer+ među CD8+ T ćelijama a procenat specifičnih multimer+ ćelija je bio najmanje 10x veći od srednje vrednosti stimulacija negativne kontrole).

In vitro imunogenost za peptide raka jajnika

Za testirane HLA klasa I peptide, in vitro imunogenost je mogla da se pokaže stvaranjem peptid-specifičnih T-ćelijskih linija. Primerni rezultati protočne citometrije nakon bojenja TUMAP-specifičnog multimera za dva ovde predstavljena peptida prikazani su na slici 3 zajedno sa odgovarajućim negativnim kontrolama. Rezultati za šest predstavljenih peptida sumirani su u tabeli 10A i B.

12

Tabela 10A: in vitro imunogenost predstavljenih HLA klasa I peptida

Primerni rezultati in vitro eksperimenata imunogenosti izvršenih od strane podnosioca za ovde predstavljene peptide. <20% = ; 20%–49% = +; 50%–69% = ++; >= 70% = +++

Tabela 10B: In vitro imunogenost predstavljenih dodatnih HLA klasa I peptida

Primerni rezultati in vitro eksperimenata imunogenosti izvršenih od strane podnosioca za ovde predstavljene HLA-A*02 restrikovane peptide. Rezultati in vitro eksperimenata imunogenosti su naznačeni. Procenat pozitivnih mesta i donora (među procenjivim) su sumirani kako je naznačeno <20 % = ; 20%-49% = +; 50%-69% = ++; >= 70% = +++

1

PRIMER 4

Sinteza peptida

Svi peptidi su sintetisani pomoću standardne i dobro ustanovljene sinteze peptida u

1 1

čvrstoj fazi primenom strategije Fmoc. Identitet i prečišćenost svakog pojedinačnog peptida utvrđeni su masenom spektrometrijom i analitičkom RP-HPLC. Peptidi su dobijeni u vidu belih do krem liofilizata (trifluoro-acetatne soli) u čistoćama >50%. Svi TUMAP se poželjno primenjuju u obliku trifluoro-acetatnih soli ili acetatnih soli, mogući su i drugi oblici soli.

PRIMER 5

Testovi vezivanja MHC

Peptidi kandidati za terapije zasnovane na T ćelijama kako su predstavljeni su dalje testirani u pogledu njihovog kapaciteta vezivanja MHC (afinitet). Pojedinačni kompleksi peptid-MHC su proizvedeni pomoću izmene liganada pod UV, gde je peptid osetljiv na UV odvojen odmah nakon UV zračenja i zamenjen peptidom od interesa prema analizi. Samo peptidi kandidati koji mogu efikasno da vežu i stabilizuju peptid-receptivne MHC molekule sprečavaju disocijaciju MHC kompleksa. Da bi se utvrdio prinos reakcije zamene, sprovedena je ELISA zasnovana na detekciji lakog lanca (β2m) stabilizovanih MHC kompleksa. Esej je sproveden kako je uopšteno opisano u radu Rodenko et al. (Rodenko et al., 2006).

MAXISorp pločice sa 96 mesta (NUNC) obložene su preko noći sa 2ug/ml streptavidina u PBS-u na sobnoj temperaturi, isprane 4 puta i blokirane tokom 1 h na 37 °C u 2% BSA koji sadrži pufer za blokiranje. Ponovo presavijeni HLA-A*02:01/MLA-001 monomeri služili su kao standardi, pokrivajući opseg od 15–500 ng/ml. Monomeri peptid-MHC iz UV-izmenjivačke reakcije razblaženi su 100 puta u puferu za blokiranje. Uzorci su inkubirani tokom 1 h na 37 °C, isprani četiri puta, inkubirani sa 2ug/ml HRP konjugovanog anti-β2m tokom 1 h na 37 °C, isprani ponovo i detektovani sa rastvorom TMB koji je zaustavljen sa NH2SO4. Apsorpcija je izmerena na 450 nm. Peptidi kandidati koji pokazuju visok prinos izmene (poželjno veći od 50%, najpoželjnije veći od 75%) se generalno preferiraju za generisanje i proizvodnju antitela ili njihovih fragmenata, i/ili T-ćelijskih receptora ili njihovih fragmenata, jer oni pokazuju dovoljan aviditet prema MHC molekulima i sprečavaju disocijaciju MHC kompleksa.

Tabela 11: Rezultati vezivanja MHC klase I.

Vezivanje HLA klasa I-restrikovanih peptida za HLA-A*02:01 rangirano je pomoću

1 2

prinosa izmene peptida: ≥10% = ; ≥20% = +; ≥50 = ++; ≥ 75% = +++

1

14

1

14

PRIMER 6

Apsolutna kvantifikacija tumor-asociranih peptida prezentovanih na površini ćelije

Stvaranje vezivača, kao što su antitela i/ili TCR-ovi, je težak proces, koji se može sprovesti samo za određeni broj izabranih ciljeva. U slučaju tumor-asociranih i tumor-specifičnih peptida, kriterijumi za odabir obuhvataju, bez ograničavanja, ekskluzivnost prezentacije i gustinu peptida prezentovanog na površini ćelije. Pored izolacije i relativne kvantifikacije peptida opisanih u PRIMERU 1, pronalazači su analizirali apsolutni broj kopija peptida po ćeliji kako je opisano u aplikaciji za registraciju patenta PCT/EP2015/79873. Kvantifikacija kopija TUMAP po ćeliji u uzorcima solidnog tumora iziskuje apsolutnu kvantifikaciju izolovanog TUMAP, efikasnost izolacije TUMAP i broj ćelija u analiziranom uzorku tkiva. Eksperimentalni koraci opisani su u nastavku.

Kvantifikacija peptida pomoću nanoLC-MS/MS

Za preciznu kvantifikaciju peptida pomoću masene spektrometrije, za svaki peptid je generisana kalibraciona kriva primenom internog standardnog metoda. Interni

1

standard je dvostruko izotopom obeležena varijanta svakog peptida, tj. u sintezu TUMAP su uključene dve aminokiseline obeležene izotopom. On se od tumorasociranog peptida razlikuje samo po svojoj masi ali ne pokazuje razliku u drugim fizičko-hemijskim svojstvima (Anderson et al., 2012). Interni standard je dodat u svaki MS uzorak a svi MS signali su normalizovani prema MS signalu internog standarda kako bi se izjednačila potencijalna tehnička odstupanja između MS eksperimenata.

Kalibracione krive su pripremljene u najmanje tri različite matrice, tj. eluati HLA peptida iz prirodnih uzoraka slični rutinskim MS uzorcima, a svaki preparat je izmeren u MS ciklusima u duplikatu. Za evaluaciju, MS signali su normalizovani prema signalu internog standarda a kalibraciona kriva je izračunata logističkom regresijom.

Za kvantifikaciju tumor-asociranih peptida iz uzoraka tkiva, u odgovarajuće uzorke je takođe dodat interni standard; MS signali su normalizovani prema internom standardu i kvantifikovani pomoću kalibracione krive peptida.

Efikasnost izolacije peptid/MHC

Kao i za svaki postupak prečišćavanja proteina, izolacija proteina iz uzoraka tkiva povezana je sa određenim gubitkom proteina od interesovanja. Da bi se utvrdila efikasnost izolacije TUMAP, kompleksi peptid/MHC su stvoreni za sve TUMAP-ove izabrane za apsolutnu kvantifikaciju. Da bi mogli da se razlikuju spajkovani od prirodnih kompleksa peptid/MHC korišćene su jednostruko izotopom obeležene verzije TUMAP-ova, tj. u sintezu TUMAP je uključena jedna aminokiselina obeležena izotopom. Ovi kompleksi su dodati u sveže pripremljene lizate tkiva, tj. u najranijoj mogućoj tački procedure izolacije TUMAP, a zatim uhvaćeni kao prirodni kompleksi peptid/MHC u narednom afinitetnom prečišćavanju. Merenje dobijanja jednostruko obeleženih TUMAP-ova stoga omogućava donošenje zaključaka u pogledu efikasnosti izolacije pojedinačnih prirodnih TUMAP-ova.

Efikasnost izolacije je analizirana na malom broju uzoraka i bila je uporediva među ovim uzorcima tkiva. Suprotno tome, efikasnost izolacije se razlikuje između pojedinačnih peptida. Ovo sugeriše da efikasnost izolacije, iako određena u samo ograničenom broju uzoraka tkiva, može da se ekstrapolira na bilo koji drugi preparat tkiva. Ipak, neophodno je da se svaki TUMAP pojedinačno analizira zato što efikasnost izolacije ne može da se ekstrapolira sa jednog peptida na druge.

1 1

Utvrđivanje broja ćelija u solidnom, zamrznutom tkivu

Da bi se utvrdio broj ćelija uzoraka tkiva podvrgnutih apsolutnoj kvantifikaciji peptida, pronalazači su primenili analizu sadržaja DNK. Ovaj metod je primenjiv za širok spektar uzoraka različitog porekla i, što je najvažnije, zamrznute uzorke (Alcoser et al., 2011; Forsey and Chaudhuri, 2009; Silva et al., 2013). U toku protokola izolacije peptida, uzorak tkiva se obrađuje do homogenog lizata, iz kojeg se uzima mali alikvot lizata. Alikvot se deli na tri dela, iz kojih se izoluje DNK (QiaAmp DNA Mini Kit, Qiagen, Hilden, Nemačka). Ukupan sadržaj DNK iz svake izolacije DNK se kvantifikuje pomoću eseja kvantifikacije DNK zasnovanog na fluorescenciji (komplet eseja Qubit dsDNA HS Assay Kit, Life Technologies, Darmstadt, Nemačka) u najmanje dva replikata.

Da bi se izračunao broj ćelija, stvorena je standardna kriva DNK iz alikvota pojedinačnih zdravih ćelija krvi, sa rasponom definisanih brojeva ćelija. Standardna kriva se koristi za izračunavanje ukupnog sadržaja ćelija iz ukupnog sadržaja DNK iz svake izolacije DNK. Srednja vrednost ukupnog broja ćelija uzorka tkiva korišćenog za izolaciju peptida se ekstrapolira uzimajući u obzir poznatu zapreminu alikvota lizata i ukupnu zapreminu lizata.

Kopije peptida po ćeliji

Uz pomoć podataka iz gore navedenih eksperimenata pronalazači su izračunali broj kopija TUMAP po ćeliji deljenjem ukupne količine peptida sa ukupnim brojem ćelija uzorka, nakon čega je sledilo deljenje kroz efikasnost izolacije. Broj kopija po ćeliji za izabrane peptide prikazani su u tabeli 12.

Tabela 12: Apsolutni brojevi kopija. U tabeli su navedeni rezultati apsolutne kvantifikacije peptida u NSCLC uzorcima tumora. Srednji broj kopija po ćelija naznačen je za svaki peptid: <100 = ; >=100 = +; >=1,000 ++; >=10,000 = +++. Naznačen je broj uzoraka, u kojima su dostupni procenjivi, visoko kvalitetni MS podaci.

1 2

587 VMNDRLYAI + 18

Lista referenci

Nature 511 (2014): 543-550

Abba, M. C. et al., Mol.Cancer Res 5 (2007): 881-890 Abdelmalak, C. A. et al., Clin Lab 60 (2014): 55-61

Abele, R. et al., Essays Biochem.50 (2011): 249-264 Abetamann, V. et al., Clin Cancer Res 2 (1996): 1607-1618 Abuhusain, H. J. et al., J Biol Chem 288 (2013): 37355-37364 Adam, A. P. et al., Cancer Res 69 (2009): 5664-5672 Addou-Klouche, L. et al., Mol.Cancer 9 (2010): 213 Adelaide, J. et al., Cancer Res 67 (2007): 11565-11575 Adelman, C. A. et al., Nature 502 (2013): 381-384 Adhikary, S. et al., Cell 123 (2005): 409-421

Agarwal, A. K. et al., J Lipid Res 51 (2010): 2143-2152 Agarwal, N. et al., Oncogene 32 (2013): 462-470

Agesen, T. H. et al., Gut 61 (2012): 1560-1567

Ahangari, F. et al., Med.Oncol 31 (2014): 173

Ahsan, S. et al., Acta Neuropathol.Commun. 2 (2014): 59 Aissani, B. et al., Genes Immun.15 (2014): 424-429 Aissani, B. et al., Fertil.Steril.103 (2015): 528-534

Ajiro, M. et al., Int.J Oncol 35 (2009): 673-681

Ajiro, M. et al., Int.J Oncol 37 (2010): 1085-1093

Akao, Y. et al., Cancer Res 55 (1995): 3444-3449

Akino, K. et al., Cancer Sci.98 (2007): 88-95

Akisawa, Y. et al., Virchows Arch.442 (2003): 66-70

Al-haidari, A. A. et al., Int.J Colorectal Dis.28 (2013): 1479-1487 Albulescu, R., Biomark.Med.7 (2013): 203

Alimirah, F. et al., Mol.Cancer Res 5 (2007): 251-259 Allen, T. et al., Cancer Res 66 (2006): 1294-1301

Allera-Moreau, C. et al., Oncogenesis. 1 (2012): e30 Allison, J. P. et al., Science 270 (1995): 932-933

1

Alpizar-Alpizar, W. et al., Int.J Cancer 131 (2012): E329-E336 Alvarez, J. V. et al., Cancer Cell 24 (2013): 30-44

Aly, R. M. et al., Blood Cells Mol.Dis.53 (2014): 185-188 Amini, S. et al., Anat.Cell Biol 47 (2014): 1-11

Amos, C. I. et al., Hum.Mol.Genet.20 (2011): 5012-5023

An, C. H. et al., Pathol.Oncol Res 21 (2015): 181-185

Anchi, T. et al., Oncol Lett.3 (2012): 264-268

Andersen, C. L. et al., Br.J Cancer 100 (2009): 511-523 Andersen, J. B. et al., Br.J Cancer 94 (2006): 1465-1471 Andersen, J. N. et al., Sci.Transl.Med. 2 (2010): 43ra55 Andersen, R. S. et al., Nat.Protoc. 7 (2012): 891-902 Anderson, K. S. et al., J Proteome.Res 10 (2011): 85-96 Andrade, V. C. et al., Exp.Hematol. 37 (2009): 446-449 Andrew, A. S. et al., Hum.Genet.125 (2009): 527-539

Angele, S. et al., Br.J Cancer 91 (2004): 783-787

Ansari, D. et al., J Cancer Res Clin Oncol 141 (2015): 369-380 Antony-Debre, I. et al., Cancer Cell 27 (2015): 609-611

Appay, V. et al., Eur.J Immunol.36 (2006): 1805-1814

Arai, A. et al., Cancer Res 71 (2011): 4598-4607

Arai, E. et al., Int.J Cancer 135 (2014): 1330-1342

Arbabian, A. et al., FEBS J 280 (2013): 5408-5418

Arbitrio, M. et al., Cancer Chemother.Pharmacol. 77 (2016): 205-209 Argani, P. et al., Clin Cancer Res 7 (2001): 3862-3868

Arlt, A. et al., Oncogene 28 (2009): 3983-3996

Arsenic, R. et al., BMC.Cancer 15 (2015): 784

Asahara, S. et al., J Transl.Med. 11 (2013): 291

Asmarinah, A. et al., Int.J Oncol 45 (2014): 1489-1496

Asou, N. et al., Blood 109 (2007): 4023-4027

Aviles, Velastegui J. et al., Minerva Chir 46 (1991): 533-537 Ayala, F. et al., Breast Cancer Res Treat.80 (2003): 145-154 Aylon, Y. et al., Mol.Oncol 5 (2011): 315-323

Azimi, A. et al., Br.J Cancer 110 (2014): 2489-2495

Azzimonti, B. et al., Histopathology 45 (2004): 560-572 Babron, M. C. et al., Carcinogenesis 35 (2014): 1523-1527 Bachmann, S. B. et al., Mol Cancer 13 (2014): 125

1 4

Bacsi, K. et al., BMC.Cancer 8 (2008): 317

Bagheri, F. et al., Mol.Biol Rep. 41 (2014): 7387-7394

Balakrishnan, A. et al., Hum.Mutat.30 (2009): 1167-1174

Baldini, E. et al., Andrologia 42 (2010): 260-267

Balgkouranidou, I. et al., Clin Chem Lab Med.51 (2013): 1505-1510

Ball, A. R., Jr. et al., Mol.Cell Biol 22 (2002): 5769-5781

Banat, G. A. et al., PLoS.One. 10 (2015): e0139073

Banchereau, J. et al., Cell 106 (2001): 271-274

Band, A. M. et al., J Mammary.Gland.Biol Neoplasia.16 (2011): 109-115 Bandoh, N. et al., Oncol Rep. 23 (2010): 933-939

Bandres, E. et al., Oncol Rep. 12 (2004): 287-292

Banerjee, R. et al., Nat Commun.5 (2014): 4527

Bao, B. Y. et al., Clin Cancer Res.17 (2011): 928-936

Bar-Peled, L. et al., Science 340 (2013): 1100-1106

Barbarulo, A. et al., Oncogene 32 (2013): 4231-4242

Bargou, R. C. et al., Nat Med. 3 (1997): 447-450

Bartlett, J. M. et al., Br.J Cancer 113 (2015): 722-728

Bauer, M. et al., Oncol Rep. 11 (2004): 677-680

Bazzaro, M. et al., Am.J Pathol.171 (2007): 1640-1649

Beales, P. L. et al., Nephrol.Dial.Transplant. 15 (2000): 1977-1985

Beard, R. E. et al., Clin Cancer Res 19 (2013): 4941-4950

Beatty, G. et al., J Immunol 166 (2001): 2276-2282

Bednarska, K. et al., Immunobiology 221 (2016): 323-332

Beggs, J. D., Nature 275 (1978): 104-109

Behrens, P. et al., Anticancer Res 21 (2001): 2413-2417

Behrens, P. et al., Apoptosis. 8 (2003): 39-44

Bekker-Jensen, S. et al., Nat Cell Biol 12 (2010): 80-86

Benada, J. et al., Biomolecules. 5 (2015): 1912-1937

Bender, C. et al., Int.J Cancer 131 (2012): E45-E55

Benjamini, Y. et al., Journal of the Royal Statistical Society.Series B (Methodological), Vol.57 (1995): 289-300

Bennett, C. B. et al., PLoS.One.3 (2008): e1448

Berger, C. et al., Curr.Mol.Med.13 (2013): 1229-1240

Bertherat, J. et al., Cancer Res 63 (2003): 5308-5319

Bessho, Y. et al., Oncol Rep. 21 (2009): 263-268

1

Bhan, S. et al., Oncol Rep. 28 (2012): 1498-1502

Bhattacharya, C. et al., Mol Cancer 11 (2012): 82

Bi, Q. et al., Clin Exp.Metastasis 32 (2015): 301-311

Bi, W. et al., Oncol Rep.29 (2013): 1533-1539

Bianchi, E. et al., Cancer Res 54 (1994): 861-866

Bidkhori, G. et al., PLoS.One.8 (2013): e67552

Bieche, I. et al., Int.J Cancer 133 (2013): 2791-2800

Bieniek, J. et al., Prostate 74 (2014): 999-1011

Bierkens, M. et al., Genes Chromosomes.Cancer 52 (2013): 56-68 Bilbao-Aldaiturriaga, N. et al., Pediatr.Blood Cancer 62 (2015): 766-769 Bin Amer, S. M. et al., Saudi.Med.J 29 (2008): 507-513

Bisgrove, D. A. et al., J Biol Chem 275 (2000): 30668-30676 Bish, R. et al., Mol.Cells 37 (2014): 357-364

Bisikirska, B. C. et al., Oncogene 32 (2013): 5283-5291

Blanco, I. et al., PLoS.One. 10 (2015): e0120020

Blenk, S. et al., Cancer Inform.3 (2007): 399-420

Blenk, S. et al., BMC.Cancer 8 (2008): 106

Bloch, D. B. et al., J Biol Chem 271 (1996): 29198-29204

Bock, A. J. et al., Hum.Pathol.43 (2012): 669-674

Bode, P. K. et al., Mod.Pathol. 27 (2014): 899-905

Boehrer, S. et al., Hematol.J 2 (2001): 103-107

Boehringer, J. et al., Biochem.J 448 (2012): 55-65

Bogush, T. A. et al., Antibiot.Khimioter. 54 (2009): 41-49

Boland, A. et al., Nat Struct.Mol.Biol 20 (2013): 1289-1297 Bombardieri, R. et al., Endocr.Pract. 19 (2013): e124-e128

Borel, F. et al., Hepatology 55 (2012): 821-832

Bossi, D. et al., Mol.Oncol 8 (2014): 221-231

Boulter, J. M. et al., Protein Eng 16 (2003): 707-711

Bourdon, V. et al., Cancer Res 62 (2002): 6218-6223 Bourguignon, L. Y. et al., J Biol Chem 287 (2012): 32800-32824 Brandacher, G. et al., Clin Cancer Res 12 (2006): 1144-1151 Brandenberger, R. et al., Nat Biotechnol.22 (2004): 707-716 Braulke, T. et al., Arch.Biochem.Biophys. 298 (1992): 176-181 Braumuller, H. et al., Nature (2013)

Brendle, A. et al., Carcinogenesis 29 (2008): 1394-1399

1

Brocke, K. S. et al., Cancer Biol Ther.9 (2010): 455-468

Broderick, P. et al., BMC.Cancer 6 (2006): 243

Brody, J. R. et al., Cell Cycle 8 (2009): 1930-1934

Brossart, P. et al., Blood 90 (1997): 1594-1599

Brouland, J. P. et al., Am.J Pathol. 167 (2005): 233-242

Brown, C. O. et al., Leuk.Res 37 (2013): 963-969

Bruckdorfer, T. et al., Curr.Pharm.Biotechnol.5 (2004): 29-43

Brule, H. et al., Biochemistry 43 (2004): 9243-9255

Brynczka, C. et al., BMC.Genomics 8 (2007): 139

Bubnov, V. et al., Exp.Oncol 34 (2012): 370-372

Buch, S. C. et al., Mol Carcinog.51 Suppl 1 (2012): E11-E20

Budowle, B. et al., Cancer Genet.Cytogenet.5 (1982): 247-251

Bueno, R. C. et al., Ann.Oncol 25 (2014): 69-75

Bugide, S. et al., Oncogene 34 (2015): 4601-4612

Bujo, H., Rinsho Byori 60 (2012): 469-476

Bull, J. H. et al., Br.J Cancer 84 (2001): 1512-1519

Burger, H. et al., Leukemia 8 (1994): 990-997

Burkhart, R. A. et al., Mol.Cancer Res 11 (2013): 901-911

Burleigh, A. et al., Breast Cancer Res 17 (2015): 4

Burton, J. D. et al., Clin Cancer Res 10 (2004): 6606-6611

Butz, H. et al., Clin Chem 60 (2014): 1314-1326

Caballero, O. L. et al., PLoS.One. 5 (2010)

Caceres-Gorriti, K. Y. et al., PLoS.One. 9 (2014): e91000

Cahan, P. et al., BMC.Genomics 11 (2010): 638

Cai, H. et al., PLoS.One.8 (2013a): e57081

Cai, H. et al., Cell Commun.Signal. 11 (2013): 31

Cai, K. et al., Lin.Chung Er.Bi Yan.Hou Tou.Jing.Wai Ke.Za Zhi.26 (2012): 425-428 Cai, W. et al., Cancer 119 (2013b): 1486-1494

Caldarelli, A. et al., Leukemia 27 (2013): 2301-2310

Calin, G. A. et al., Oncogene 19 (2000): 1191-1195

Callahan, M. J. et al., Clin Cancer Res 14 (2008): 7667-7673

Camgoz, A. et al., Leuk.Lymphoma 54 (2013): 1279-1287

Campone, M. et al., Breast Cancer Res Treat.109 (2008): 491-501

Cantara, S. et al., J Clin Endocrinol.Metab 97 (2012): 4253-4259

Cao, J. X. et al., Cell Death.Dis. 5 (2014): e1426

1

Cao, L. et al., Biochem.Biophys.Res Commun.333 (2005): 1050-1059 Cappellari, M. et al., Oncogene 33 (2014): 3794-3802

Card, K. F. et al., Cancer Immunol Immunother.53 (2004): 345-357 Caren, H. et al., BMC.Cancer 11 (2011): 66

Carrascosa, C. et al., Oncogene 31 (2012): 1521-1532

Carton, J. M. et al., J Histochem.Cytochem. 51 (2003): 715-726 Cascon, A. et al., J Natl.Cancer Inst.107 (2015)

Castano-Rodriguez, N. et al., Front Immunol.5 (2014): 336 Castle, J. C. et al., BMC.Genomics 15 (2014): 190

Castro, M. et al., J Transl.Med.8 (2010): 86

Ceol, C. J. et al., Nature 471 (2011): 513-517

Cerhan, J. R. et al., Blood 110 (2007): 4455-4463

Cerna, D. et al., J Biol Chem 287 (2012): 22408-22417 Cerveira, N. et al., BMC.Cancer 10 (2010): 518

Chae, S. W. et al., Yonsei Med.J 52 (2011): 445-453

Chaigne-Delalande, B. et al., Science 341 (2013): 186-191 Chan, A. O. et al., Gut 48 (2001): 808-811

Chan, S. H. et al., Int.J Cancer 129 (2011): 565-573 Chandramouli, A. et al., Carcinogenesis 28 (2007): 2028-2035 Chang, C. C. et al., World J Gastroenterol. 20 (2014a): 6826-6831 Chang, C. M. et al., Carcinogenesis 34 (2013): 2512-2520 Chang, G. T. et al., Endocr.Relat Cancer 11 (2004): 815-822 Chang, H. et al., Breast Cancer Res Treat.125 (2011): 55-63 Chang, K. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 93 (1996): 136-140 Chang, L. C. et al., Anticancer Drugs 25 (2014b): 456-461 Chang, Y. C. et al., J Biol Chem 287 (2012): 4376-4385

Chang, Y. T. et al., World J Gastroenterol. 20 (2014c): 14463-14471 Chanock, S. J. et al., Hum.Immunol.65 (2004): 1211-1223 Chatterjee, M. et al., Haematologica 98 (2013): 1132-1141 Chatterjee, M. et al., Blood 111 (2008): 3714-3722

Chelli, B. et al., Chembiochem. 6 (2005): 1082-1088

Chen, C. H. et al., Mol.Cancer 14 (2015a): 83

Chen, C. H. et al., Oncogene 28 (2009a): 2723-2737

Chen, C. H. et al., Oncotarget.5 (2014a): 6300-6311

Chen, C. H. et al., J Transl.Med.10 (2012a): 93

1

Chen, C. H. et al., Gynecol.Oncol 128 (2013a): 560-567

Chen, H. et al., J Surg.Res 189 (2014b): 81-88

Chen, H. J. et al., World J Gastroenterol.19 (2013b): 3130-3133 Chen, H. S. et al., Zhonghua Gan Zang.Bing.Za Zhi. 11 (2003): 145-148 Chen, J. et al., Int.J Cancer 122 (2008): 2249-2254

Chen, J. et al., Oncotarget.6 (2015b): 355-367

Chen, J. Q. et al., Horm.Cancer 1 (2010): 21-33

Chen, K. et al., Nat Commun.5 (2014c): 4682

Chen, K. G. et al., Pigment Cell Melanoma Res 22 (2009b): 740-749 Chen, L. et al., Oncol Rep.34 (2015c): 447-454

Chen, L. et al., Cell Mol.Biol (Noisy.-le-grand) 60 (2014d): 1-5

Chen, L. et al., Cancer Res 65 (2005): 5599-5606

Chen, L. C. et al., Mod.Pathol.24 (2011): 175-184

Chen, Q. et al., PLoS.One.9 (2014e): e88386

Chen, R. et al., Cancer Res 61 (2001): 654-658

Chen, W. T. et al., Elife.4 (2015d)

Chen, X. et al., Pathol.Res Pract. 208 (2012b): 437-443

Chen, X. et al., Med.Oncol 31 (2014f): 865

Chen, X. P. et al., Asian Pac.J Cancer Prev. 15 (2014g): 7741-7746 Chen, Y. et al., J Cell Biochem.100 (2007): 1337-1345

Chen, Y. et al., Am.J Physiol Lung Cell Mol.Physiol 306 (2014h): L797-L807 Chen, Y. et al., Int.J Cancer 91 (2001): 41-45

Chen, Y. et al., J Hematol.Oncol 2 (2009c): 37

Chen, Y. et al., Oncogene 32 (2013c): 4941-4949

Chen, Y. et al., Onco.Targets.Ther. 7 (2014i): 1465-1472

Chen, Y. T. et al., Int.J Cancer 124 (2009d): 2893-2898

Chen, Y. T. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 102 (2005): 7940-7945 Chen, Z. T. et al., Int.J Mol.Sci.16 (2015e): 15497-15530

Cheng, A. N. et al., Cancer Lett.337 (2013a): 218-225

Cheng, A. S. et al., Gastroenterology 144 (2013b): 122-133

Cheng, L. et al., Gynecol.Oncol 117 (2010): 159-169

Cheng, S. et al., Int.J Clin Exp.Pathol. 7 (2014): 8118-8126

Cheng, Y. et al., Cancer Genet. 204 (2011): 375-381

Cheng, Y. et al., Clin Transl.Sci.8 (2015a): 320-325

Cheng, Z. et al., J Exp.Clin Cancer Res 34 (2015b): 27

1

Chernikova, S. B. et al., Cancer Res 72 (2012): 2111-2119

Chevillard, G. et al., Blood 117 (2011): 2005-2008

Chi, L. M. et al., Mol.Cell Proteomics.8 (2009): 1453-1474

Chin, S. F. et al., Genome Biol 8 (2007): R215

Chittasupho, C. et al., Mol.Pharm.7 (2010): 146-155

Cho, H. J. et al., DNA Cell Biol 35 (2016): 71-80

Cho, S. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 108 (2011): 20778-20783

Choi, Y. L. et al., J Thorac.Oncol 9 (2014): 563-566

Choi, Y. W. et al., Int.J Gynecol.Cancer 17 (2007): 687-696

Choschzick, M. et al., Hum.Pathol.41 (2010): 358-365

Chou, J. L. et al., Clin Epigenetics. 7 (2015): 1

Chowdhury, S. K. et al., Biochem.Biophys.Res Commun.333 (2005): 1139-1145 Chowdhury, S. K. et al., Free Radic.Res 41 (2007): 1116-1124

Chu, X. et al., Biochem.Biophys.Res Commun.447 (2014): 158-164 Chuang, J. Y. et al., Oncogene 31 (2012): 4946-4959

Chung, F. Y. et al., J Surg.Oncol 102 (2010): 148-153

Chung, K. Y. et al., Hepatology 54 (2011): 307-318

Cicek, M. S. et al., Hum.Mol.Genet.22 (2013): 3038-3047

Cieply, B. et al., Cancer Res 72 (2012): 2440-2453

Ciruelos Gil, E. M., Cancer Treat.Rev 40 (2014): 862-871

Clarke, L. E. et al., J Cutan.Pathol.36 (2009): 433-438

Claudio, J. O. et al., Oncogene 20 (2001): 5373-5377

Coe, H. et al., Int.J Biochem.Cell Biol 42 (2010): 796-799

Cohen, C. J. et al., J Mol Recognit. 16 (2003a): 324-332

Cohen, C. J. et al., J Immunol 170 (2003b): 4349-4361

Cohen, S. N. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 69 (1972): 2110-2114 Cohen, Y. et al., Hematology. 19 (2014): 286-292

Colak, D. et al., PLoS.One. 8 (2013): e63204

Colas, E. et al., Int.J Cancer 129 (2011): 2435-2444

Colbert, L. E. et al., Cancer Res 74 (2014): 2677-2687

Cole, S. P. et al., Science 258 (1992): 1650-1654

Coligan, J. E. et al., Current Protocols in Protein Science (1995)

Colis, L. et al., J Med.Chem 57 (2014): 4950-4961

Colombetti, S. et al., J Immunol.176 (2006): 2730-2738

Colombo, J. et al., Oncol Rep. 21 (2009): 649-663

1

Condomines, M. et al., J Immunol.178 (2007): 3307-3315 Confalonieri, S. et al., Oncogene 28 (2009): 2959-2968 Cong, X. et al., Hum.Pathol.45 (2014): 1370-1378

Cook, J. et al., Oncogene 18 (1999): 1205-1208

Coppola, D. et al., J Geriatr.Oncol 5 (2014): 389-399 Coradeghini, R. et al., Oncol Rep.15 (2006): 609-613 Corcoran, C. A. et al., Mol.Cancer Res 6 (2008): 795-807 Cornelissen, M. et al., BMC.Cancer 3 (2003): 7

Couch, F. J. et al., Cancer Res 65 (2005): 383-386 Coupienne, I. et al., Lasers Surg.Med. 43 (2011): 557-564 Creancier, L. et al., Cancer Lett.365 (2015): 107-111 Cubillos-Rojas, M. et al., J Biol Chem 289 (2014): 14782-14795 Cuevas, I. C. et al., Cancer Res 65 (2005): 5070-5075 Cuevas, R. et al., Cancer Res 73 (2013): 1400-1410

Cui, D. X. et al., World J Gastroenterol.11 (2005): 1273-1282 Cui, F. et al., Proteomics.6 (2006): 498-504

Cui, L. H. et al., Med.Oncol 29 (2012): 1837-1842

Cui, X. et al., Oncogene 26 (2007): 4253-4260

Cunliffe, H. E. et al., Am.J Cancer Res 2 (2012): 478-491 Cunningham, J. D. et al., Am.J Surg.173 (1997): 521-522 Cunningham, J. M. et al., Br.J Cancer 101 (2009): 1461-1468 Curry, J. M. et al., Laryngoscope (2015)

Cvekl, A., Jr. et al., Eur.J Cancer 40 (2004): 2525-2532 Dadkhah, E. et al., Arch.Iran Med. 16 (2013): 463-470 Dahlman, K. B. et al., PLoS.One.7 (2012): e34414

Dajon, M. et al., Oncoimmunology 4 (2015): e991615 Dalamaga, M., Med.Hypotheses 79 (2012): 617-621

Daly, R. J. et al., Oncogene 21 (2002): 5175-5181 Dannenmann, S. R. et al., Cancer Immunol.Res.1 (2013): 288-295 Danussi, C. et al., Cancer Res 73 (2013): 5140-5150

Das, A. et al., J Cell Sci.127 (2014): 686-699

Das, M. et al., PLoS.One.8 (2013a): e69607

Das, T. K. et al., Oncogene 32 (2013b): 3184-3197

Dasari, V. K. et al., J Urol.165 (2001): 1335-1341

Dasgupta, S. et al., Int.J Oncol 41 (2012): 1405-1410

1 1

Datta, M. W. et al., Appl.Immunohistochem.Mol.Morphol.8 (2000): 210-215 Davalieva, K. et al., Prostate 75 (2015): 1586-1600

David-Watine, B., PLoS.One.6 (2011): e22423

Davidson, B. et al., J Cell Mol.Med.15 (2011): 535-544

Davydova, E. et al., J Biol Chem 289 (2014): 30499-30510

De Angelis, P. M. et al., Mol.Cancer 5 (2006): 20

de Leon, F. C. et al., Childs Nerv.Syst. 31 (2015): 141-146

De, Paoli L. et al., Leuk.Lymphoma 54 (2013): 1087-1090

De, S. et al., Cancer Res 69 (2009): 8035-8042

Debauve, G. et al., Cell Mol Life Sci.65 (2008): 591-604

Deighton, R. F. et al., Brain Pathol. 20 (2010): 691-703

DelBove, J. et al., Epigenetics.6 (2011): 1444-1453

Demelash, A. et al., Mol.Biol Cell 23 (2012): 2856-2866

Demokan, S. et al., Int.J Cancer 127 (2010): 2351-2359

Deng, S. et al., Breast Cancer Res Treat.104 (2007): 21-30

Deng, Y. C. et al., Ai.Zheng.24 (2005): 680-684

Dengjel, J. et al., Clin Cancer Res 12 (2006): 4163-4170

Denkberg, G. et al., J Immunol 171 (2003): 2197-2207

Desai, S. D. et al., Exp.Biol Med.(Maywood.) 237 (2012): 38-49

Diao, C. Y. et al., Asian Pac.J Cancer Prev.15 (2014): 1817-1822 Diefenbacher, M. E. et al., J Clin Invest 124 (2014): 3407-3418 Diggle, C. P. et al., PLoS.Genet. 10 (2014): e1004577

DiSepio, D. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 95 (1998): 14811-14815 Dobashi, Y. et al., Int.J Cancer 110 (2004): 532-541

Dohn, L. H. et al., Urol.Oncol 33 (2015): 165-24

Doldan, A. et al., Mol.Carcinog 47 (2008a): 235-244

Doldan, A. et al., Mol.Carcinog 47 (2008b): 806-813

Domanitskaya, N. et al., Br.J Cancer 111 (2014): 696-707

Dominguez-Sanchez, M. S. et al., BMC.Cancer 11 (2011): 77

Donati, G. et al., J Cell Sci.124 (2011): 3017-3028

Dong, P. et al., Cancer Lett. 243 (2006): 120-127

Dong, Q. et al., Biomed.Res Int.2015 (2015): 156432

Dong, W. et al., Tumour.Biol (2015)

Donnellan, R. et al., FASEB J 13 (1999): 773-780

Dorman, S. N. et al., Mol.Oncol (2015)

1 2

Dormeyer, W. et al., J Proteome.Res 7 (2008): 2936-2951 Douet-Guilbert, N. et al., Leuk.Res 38 (2014): 1316-1319

Downie, D. et al., Clin Cancer Res. 11 (2005): 7369-7375 Drazkowska, K. et al., Nucleic Acids Res 41 (2013): 3845-3858

Du, C. et al., Gastric.Cancer 18 (2015a): 516-525

Du, L. et al., Tumori 101 (2015b): 384-389

Du, Y. et al., Int.J Mol.Sci.15 (2014a): 17065-17076

Du, Y. F. et al., Int.J Clin Exp.Pathol. 7 (2014b): 923-931

Duan, X. L. et al., Zhongguo Shi Yan.Xue.Ye.Xue.Za Zhi.21 (2013): 7-11 Duarte-Pereira, S. et al., Sci.Rep. 4 (2014): 6311

Duex, J. E. et al., Exp.Cell Res 316 (2010): 2136-2151

Dun, B. et al., Am.J Transl.Res 6 (2013a): 28-42

Dun, B. et al., Int.J Clin Exp.Pathol. 6 (2013b): 2880-2886

Dunn, G. P. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 111 (2014): 1102-1107 Dunphy, E. J. et al., J Immunother.28 (2005): 268-275 Dunzendorfer, U. et al., Eur.Urol.6 (1980): 232-236

Durgan, J. et al., J Biol Chem 286 (2011): 12461-12474

Dusseau, C. et al., Int.J Oncol 18 (2001): 393-399

Duursma, A. et al., Mol.Cell Biol 25 (2005): 6937-6947

Duvic, M. et al., Clin Cancer Res 6 (2000): 3249-3259

Duvic, M. et al., J Invest Dermatol. 121 (2003): 902-909

Dyrskjot, L. et al., Br.J Cancer 107 (2012): 116-122

Dzikiewicz-Krawczyk, A. et al., J Hematol.Oncol 7 (2014): 43 Eggers, J. P. et al., Clin Cancer Res 17 (2011): 6140-6150

Eldai, H. et al., PLoS.One. 8 (2013): e76251

Elgohary, N. et al., Int.J Oncol 46 (2015): 597-606

Elias, D. et al., Oncogene 34 (2015): 1919-1927

Ellison-Zelski, S. J. et al., Mol.Cancer 9 (2010): 263

Emdad, L. et al., Neuro.Oncol 17 (2015): 419-429

Emmanuel, C. et al., PLoS.One.6 (2011): e17617

Endoh, H. et al., J Clin Oncol 22 (2004): 811-819

Enesa, K. et al., Adv.Exp.Med.Biol. 809 (2014): 33-48

Eng, K. H. et al., Genes Cancer 6 (2015): 399-407

Enomoto, A. et al., Eur.J Cancer 49 (2013): 3547-3558

Epping, M. T. et al., Mol.Cancer Res 7 (2009): 1861-1870

1

Er, T. K. et al., J Mol.Med.(Berl) (2016)

Erb, H. H. et al., Endocr.Relat Cancer 20 (2013): 677-689 Erdogan, E. et al., Clin Cancer Res 15 (2009): 1527-1533 Erenpreisa, J. et al., Exp.Cell Res 315 (2009): 2593-2603 Escobar-Hoyos, L. F. et al., Mod.Pathol.27 (2014): 621-630 Esseghir, S. et al., J Pathol. 210 (2006): 420-430

Estrella, J. S. et al., Pancreas 43 (2014): 996-1002

Ettahar, A. et al., Cell Rep. 4 (2013): 530-541

Evans, T. J. et al., PLoS.One. 9 (2014): e110255

Exertier, P. et al., Oncotarget.4 (2013): 2302-2316 Ezponda, T. et al., Oncogene 32 (2013): 2882-2890

Fackler, M. et al., FEBS J 281 (2014): 2123-2135

Fagin, J. A., Mol.Endocrinol.16 (2002): 903-911

Fairfield, K. M. et al., Int.J Cancer 110 (2004): 271-277

Falk, K. et al., Nature 351 (1991): 290-296

Falvella, F. S. et al., Oncogene 27 (2008): 3761-3764

Fan, J. et al., Clin Cancer Res 17 (2011): 2908-2918

Fan, M. et al., Int.J Clin Exp.Pathol. 7 (2014): 6768-6775 Fang, H. Y. et al., Hum.Pathol.43 (2012): 105-114

Fang, K. P. et al., Asian Pac.J Cancer Prev.15 (2014): 2655-2661 Fang, Z. et al., J Biol Chem 288 (2013): 7918-7929

Faried, L. S. et al., Mol.Carcinog 47 (2008): 446-457

Faried, L. S. et al., Oncol Rep. 16 (2006): 57-63

Faronato, M. et al., Oncotarget. (2015)

Fasso, M. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 105 (2008): 3509-3514 Feldmann, G. et al., Cancer Res 70 (2010): 4460-4469 Feng, H. et al., J Clin Invest 124 (2014a): 3741-3756

Feng, M. et al., J Clin Invest 124 (2014b): 5291-5304

Feng, X. et al., Neoplasma 62 (2015a): 592-601

Feng, Y. et al., Sci.Rep. 5 (2015b): 9429

Fernandez-Calotti, P. X. et al., Haematologica 97 (2012): 943-951 Fernandez-Nogueira, P. et al., Oncotarget.7 (2016): 5313-5326 Ferreira-da-Silva, A. et al., PLoS.One.10 (2015): e0122308 Ferrero, S. et al., Histol.Histopathol. 30 (2015): 473-478 Fevre-Montange, M. et al., Int.J Oncol 35 (2009): 1395-1407

1 4

Fevre-Montange, M. et al., J Neuropathol.Exp.Neurol.65 (2006): 675-684 Fitzgerald, J. et al., FEBS Lett.517 (2002): 61-66

Fluge, O. et al., Thyroid 16 (2006): 161-175

Fokas, E. et al., Cell Death.Dis. 3 (2012): e441

Folgiero, V. et al., Oncotarget. 5 (2014): 2052-2064

Fong, L. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 98 (2001): 8809-8814

Fortschegger, K. et al., Mol.Cancer Res 12 (2014): 595-606

Fraga, M. F. et al., Cancer Res 68 (2008): 4116-4122

Frasor, J. et al., Mol.Cell Endocrinol. 418 Pt 3 (2015): 235-239

Frias, C. et al., Lung Cancer 60 (2008): 416-425

Fry, A. M. et al., J Cell Sci.125 (2012): 4423-4433

Fu, A. et al., Mol.Carcinog 51 (2012): 923-929

Fu, D. Y. et al., Tumour.Biol (2015)

Fu, J. et al., Cancer Sci.104 (2013a): 508-515

Fu, M. et al., Int.J Clin Exp.Pathol.6 (2013b): 2185-2191

Fu, M. et al., Int.J Clin Exp.Pathol.6 (2013c): 2515-2522

Fu, Z. et al., Breast Cancer Res Treat. 127 (2011): 265-271

Fujimura, K. et al., Clin Chim.Acta 430 (2014): 48-54

Fujitomo, T. et al., Cancer Res 72 (2012): 4110-4118

Fujiuchi, N. et al., J Biol Chem 279 (2004): 20339-20344

Fukasawa, M. et al., J Hum.Genet.51 (2006): 368-374

Fukushima, Y. et al., Eur.J Cancer 35 (1999): 935-938

Fuqua, S. A. et al., Breast Cancer Res Treat.144 (2014): 11-19

Furukawa, T. et al., Sci.Rep.1 (2011): 161

Furuta, J. et al., Cancer Res 66 (2006): 6080-6086

Gaba, R. C. et al., J Vasc.Interv.Radiol. 26 (2015): 723-732

Gabrilovich, D. I. et al., Nat Med.2 (1996): 1096-1103

Galamb, O. et al., Cell Oncol 31 (2009): 19-29

Gallmeier, E. et al., Gastroenterology 130 (2006): 2145-2154

Gantsev, S. K. et al., Biomed.Pharmacother. 67 (2013): 363-366

Gao, F. et al., Biochem.Biophys.Res Commun.431 (2013): 610-616

Gao, J. et al., Acta Oncol 47 (2008): 372-378

Gao, W. et al., BMC.Cancer 15 (2015): 367

Gao, Y. B. et al., Nat Genet. 46 (2014): 1097-1102

Gao, Z. et al., Biochem.Biophys.Res Commun.407 (2011): 271-276

1

Garcia-Baquero, R. et al., Tumour.Biol.35 (2014): 5777-5786 Garritano, S. et al., Oncogenesis. 2 (2013): e54

Gattinoni, L. et al., Nat Rev.Immunol 6 (2006): 383-393

Gatza, M. L. et al., Nat Genet.46 (2014): 1051-1059

Gaudineau, B. et al., J Cell Sci. 125 (2012): 4475-4486

Ge, G. et al., Tumour.Biol (2015)

Geiger, T. R. et al., PLoS.One. 9 (2014): e111813

Gelebart, P. et al., J Biol Chem 277 (2002): 26310-26320

Gelsi-Boyer, V. et al., Br.J Haematol. 145 (2009): 788-800

Gentile, M. et al., Oncogene 20 (2001): 7753-7760

Geoffroy-Perez, B. et al., Int.J Cancer 93 (2001): 288-293

Georgiou, G. K. et al., World J Surg.Oncol 11 (2013): 213

Ghosh, S. et al., Int.J Cancer 123 (2008): 2594-2604

Gibbs, D. C. et al., Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev.24 (2015): 992-997 Gil-Henn, H. et al., Oncogene 32 (2013): 2622-2630

Gilling, C. E. et al., Br.J Haematol. 158 (2012): 216-231

Giuliano, C. J. et al., Biochim.Biophys.Acta 1731 (2005): 48-56 Glaser, R. et al., PLoS.One.6 (2011): e25160

Gnjatic, S. et al., Proc Natl.Acad.Sci.U.S.A 100 (2003): 8862-8867 Godkin, A. et al., Int.Immunol 9 (1997): 905-911

Going, J. J. et al., Gut 50 (2002): 373-377

Gold, D. V. et al., Int.J Clin Exp.Pathol. 4 (2010): 1-12

Goldenson, B. et al., Oncogene 34 (2015): 537-545

Gong, X. et al., PLoS.One.7 (2012): e37137

Gonzalez, M. A. et al., J Clin Oncol 21 (2003): 4306-4313

Goodman, S. L. et al., Biol Open.1 (2012): 329-340

Goswami, A. et al., Mol.Cell 20 (2005): 33-44

Goto, Y. et al., J Invest Dermatol. 130 (2010): 221-229

Gou, W. F. et al., Oncol Rep.31 (2014): 232-240

Govindaraj, V. et al., Horm.Mol.Biol Clin Investig.9 (2012): 173-178 Goyal, P. et al., PLoS.One. 6 (2011): e16249

Grady, W. M., Cancer Metastasis Rev 23 (2004): 11-27

Graff, L. et al., Cancer Res 61 (2001): 2138-2144

Grant, R. C. et al., Hum.Genomics 7 (2013): 11

Green, M. R. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual 4th (2012)

1

Greenfield, E. A., Antibodies: A Laboratory Manual 2nd (2014) Greif, P. A. et al., Leukemia 25 (2011): 821-827

Greuber, E. K. et al., Nat Rev Cancer 13 (2013): 559-571 Grieb, B. C. et al., Mol.Cancer Res 12 (2014): 1216-1224 Grimm, M. et al., BMC.Cancer 13 (2013): 569

Grimmig, T. et al., Int.J Oncol 47 (2015): 857-866

Grinberg-Rashi, H. et al., Clin Cancer Res 15 (2009): 1755-1761 Gronnier, C. et al., Biochim.Biophys.Acta 1843 (2014): 2432-2437 Groth-Pedersen, L. et al., PLoS.One. 7 (2012): e45381 Gruel, N. et al., Breast Cancer Res 16 (2014): R46

Grumati, P. et al., Cancer Discov 4 (2014): 394-396

Gu, X. H. et al., Zhonghua Fu Chan Ke.Za Zhi.44 (2009): 754-759 Gu, Y. et al., Mol.Carcinog 55 (2016): 292-299

Guan, G. et al., Arch.Biochem.Biophys. 417 (2003): 251-259 Guan, X. et al., Carcinogenesis 34 (2013): 812-817 Gueddari, N. et al., Biochimie 75 (1993): 811-819

Guerreiro, A. S. et al., Mol.Cancer Res 9 (2011): 925-935 Guerrero, J. A. et al., Blood 124 (2014): 3624-3635

Guerrero-Preston, R. et al., Oncol Rep. 32 (2014): 505-512 Guin, S. et al., J Natl.Cancer Inst.106 (2014)

Guirado, M. et al., Hum.Immunol.73 (2012): 668-672 Gultekin, Y. et al., J Innate.Immun.7 (2015): 25-36

Guo, F. et al., Mol.Biol Rep. 37 (2010): 3819-3825

Guo, G. et al., Tumour.Biol 35 (2014): 4017-4022

Guo, J. T. et al., Zhonghua Zhong.Liu Za Zhi.31 (2009): 528-531 Guo, S. et al., Drug Des Devel.Ther. 7 (2013): 1259-1271 Guo, W. et al., J Mol.Biol 412 (2011): 365-378

Guo, X. et al., Tumour.Biol 36 (2015): 1711-1720

Gust, K. M. et al., Neoplasia. 11 (2009): 956-963

Gutierrez, M. L. et al., PLoS.One.6 (2011): e22315

Gutierrez-Camino, A. et al., Pediatr.Res 75 (2014): 767-773 Guyonnet, Duperat, V et al., Biochem.J 305 ( Pt 1) (1995): 211-219 Gylfe, A. E. et al., Int.J Cancer 127 (2010): 2974-2980 Hagenbuchner, J. et al., Front Physiol 4 (2013): 147

Haidar, A. et al., Am.J Case.Rep. 16 (2015): 87-94

1

Halama, N. et al., Int.J Oncol 31 (2007): 205-210

Hall, C. L. et al., J Neurooncol.26 (1995): 221-229

Hall, C. L. et al., Cell 82 (1995): 19-26

Halldorsdottir, A. M. et al., Am.J Hematol. 87 (2012): 361-367 Hammam, O. et al., J Egypt.Soc.Parasitol. 44 (2014): 733-740 Han, J. C. et al., World J Surg.Oncol 13 (2015a): 5

Han, L. L. et al., Oncol Rep.31 (2014): 2569-2578

Han, Y. et al., Cancer 119 (2013): 3436-3445

Han, Z. et al., Oncotarget.6 (2015b): 13149-13163

Hansen-Petrik, M. B. et al., Cancer Lett.175 (2002): 157-163 Hao, J. et al., Oncol Lett.9 (2015): 2525-2533

Haque, M. A. et al., J Exp.Med. 195 (2002): 1267-1277

Haridas, D. et al., FASEB J 28 (2014): 4183-4199

Harken, Jensen C. et al., Tumour.Biol 20 (1999): 256-262 Hartmann, T. B. et al., Int.J Cancer 114 (2005): 88-93

Hasegawa, H. et al., Arch.Pathol.Lab Med.122 (1998): 551-554 Hashimoto, T. et al., FEBS J 277 (2010): 4888-4900

Hast, B. E. et al., Cancer Res 73 (2013): 2199-2210

Hatfield, K. J. et al., Expert.Opin.Ther.Targets. 18 (2014): 1237-1251 Hayama, S. et al., Cancer Res 67 (2007): 4113-4122

Hayashi, H. et al., Int.J Cancer 126 (2010): 2563-2574

Hayashi, J. et al., Int.J Oncol 21 (2002): 847-850

Hayashi, S. I. et al., Endocr.Relat Cancer 10 (2003): 193-202 Hayatsu, N. et al., Biochem.Biophys.Res Commun.368 (2008): 217-222 Hazelett, C. C. et al., PLoS.One. 7 (2012): e39602

He, D. et al., Biomed.Pharmacother. 74 (2015): 164-168

He, H. et al., J Clin Endocrinol.Metab 98 (2013): E973-E980

He, J. et al., Cancer Biol Ther. 6 (2007): 76-82

He, Y. et al., Mol Carcinog. (2014)

Hedrick, E. D. et al., J Mol.Signal. 8 (2013): 10

Heeboll, S. et al., Histol.Histopathol.23 (2008): 1069-1076

Hegyi, K. et al., Pathobiology 79 (2012): 314-322

Heidenblad, M. et al., BMC.Med.Genomics 1 (2008): 3

Heim, S. et al., In Vivo 19 (2005): 583-590

Heimerl, S. et al., Melanoma Res 17 (2007): 265-273

1

Hellerbrand, C. et al., Carcinogenesis 27 (2006): 64-72 Hellwinkel, O. J. et al., Prostate Cancer Prostatic.Dis.14 (2011): 38-45 Hemminger, J. A. et al., Mod.Pathol. 27 (2014): 1238-1245 Hennard, C. et al., J Pathol. 209 (2006): 430-435

Hennig, E. E. et al., J Mol.Med.(Berl) 90 (2012): 447-456 Hickinson, D. M. et al., Clin Transl.Sci.2 (2009): 183-192

Hider, J. L. et al., BMC.Evol.Biol. 13 (2013): 150

Hinrichsen, I. et al., PLoS.One.9 (2014): e84453

Hirota, Y. et al., Nucleic Acids Res 28 (2000): 917-924

Hlavac, V. et al., Pharmacogenomics. 14 (2013): 515-529 Hlavata, I. et al., Mutagenesis 27 (2012): 187-196

Ho, M. et al., Clin Cancer Res 13 (2007): 1571-1575

Hodi, F. S. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 99 (2002): 6919-6924 Hodson, I. et al., Int.J Oncol 23 (2003): 991-999

Hoei-Hansen, C. E. et al., Clin Cancer Res 10 (2004): 8521-8530 Hoellein, A. et al., J Cancer Res Clin Oncol 136 (2010): 403-410 Hoff, A. M. et al., Oncotarget. (2015)

Holla, V. R. et al., J Biol Chem 281 (2006): 2676-2682 Holleman, A. et al., Blood 107 (2006): 769-776

Holm, C. et al., Leuk.Res 30 (2006): 254-261

Holzmann, K. et al., Cancer Res 64 (2004): 4428-4433

Hong, J. et al., Biomed.Res Int.2013 (2013): 454085

Honore, B. et al., Oncogene 21 (2002): 1123-1129

Hoque, M. O. et al., Cancer Res 68 (2008): 2661-2670

Horani, A. et al., Am J Hum.Genet.91 (2012): 685-693

Horejsi, Z. et al., Mol.Cell 39 (2010): 839-850

Horst, B. et al., Am.J Pathol.174 (2009): 1524-1533

Hosseini, M., Pol.J Pathol.64 (2013): 191-195

Hosseini, S. et al., Clin Lab 61 (2015): 475-480

Hou, G. et al., Cancer Lett.253 (2007): 236-248

Hou, J. et al., Mol.Oncol 9 (2015): 1312-1323

Hou, X. et al., Ann.Surg.Oncol 21 (2014): 3891-3899

Hou, Y. et al., Med.Oncol 29 (2012): 3498-3503

Hour, T. C. et al., Int.J Biol Markers 24 (2009): 171-178 Hovnanian, A., Subcell.Biochem. 45 (2007): 337-363

1

Hsu, P. K. et al., J Gastroenterol.49 (2014): 1231-1240

Hsu, W. H. et al., PLoS.One.10 (2015): e0121298

Hu, H. et al., Oncol Lett.10 (2015): 268-272

Hu, J. et al., Exp.Biol Med.(Maywood.) 239 (2014): 423-429

Hu, S. et al., Pediatr.Hematol.Oncol 28 (2011): 140-146

Hua, C. et al., BMC.Cancer 14 (2014): 526

Huang, C. et al., Cell Biol Int.32 (2008): 1081-1090

Huang, H. et al., Clin Cancer Res 11 (2005a): 4357-4364

Huang, H. et al., Beijing Da.Xue.Xue.Bao. 46 (2014a): 183-189

Huang, H. et al., Int.J Oncol 38 (2011): 1557-1564

Huang, L. N. et al., Clin Chim.Acta 413 (2012): 663-668

Huang, X. et al., APMIS 122 (2014b): 1070-1079

Huang, Y. et al., Int.J Mol.Sci.15 (2014c): 18148-18161

Huang, Y. et al., Oncogene 24 (2005b): 3819-3829

Huang, Y. et al., Oncotarget. 5 (2014d): 6734-6745

Hudlebusch, H. R. et al., Clin Cancer Res 17 (2011): 2919-2933 Hudson, J. et al., Exp.Mol.Pathol. 95 (2013): 62-67

Hui, L. et al., Oncol Rep.34 (2015): 2627-2635

Hummerich, L. et al., Oncogene 25 (2006): 111-121

Hunecke, D. et al., J Pathol.228 (2012): 520-533

Hungermann, D. et al., J Pathol.224 (2011): 517-528

Hunter, S. M. et al., Oncotarget.6 (2015): 37663-37677

Hussein, Y. M. et al., Med.Oncol 29 (2012): 3055-3062

Huynh, H. et al., Mol.Cancer Ther.14 (2015): 1224-1235

Hwang, C. F. et al., PLoS.One.8 (2013): e84218

Hwang, J. M. et al., Mol.Cell Biochem. 327 (2009): 135-144

Hwang, M. L. et al., J Immunol.179 (2007): 5829-5838

Iacovazzi, P. A. et al., Immunopharmacol.Immunotoxicol.32 (2010): 160-164 Iakovlev, V. et al., Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev. 21 (2012): 1135-1142 Ibragimova, I. et al., Cancer Prev.Res (Phila) 3 (2010): 1084-1092

Ida-Yonemochi, H. et al., Mod.Pathol. 25 (2012): 784-794

Idbaih, A. et al., J Neurooncol. 90 (2008): 133-140

Ide, H. et al., Biochem.Biophys.Res Commun.369 (2008): 292-296

Ii, M. et al., Exp.Biol.Med.(Maywood.) 231 (2006): 20-27

Iio, A. et al., Biochim.Biophys.Acta 1829 (2013): 1102-1110

1

Ijichi, N. et al., J Steroid Biochem.Mol.Biol 123 (2011): 1-7

Ikeda, R. et al., Int.J Oncol 38 (2011): 513-519

Ikonomov, O. C. et al., Biochem.Biophys.Res Commun.440 (2013): 342-347 Ilboudo, A. et al., BMC.Cancer 14 (2014): 7

Illemann, M. et al., Cancer Med.3 (2014): 855-864

Imai, K. et al., Br.J Cancer 104 (2011): 300-307

Imoto, I. et al., Biochem.Biophys.Res Commun.286 (2001): 559-565 Inamoto, T. et al., Mol.Cancer Ther. 7 (2008): 3825-3833

Ino, K. et al., Clin Cancer Res 14 (2008): 2310-2317

Inoda, S. et al., Am.J Pathol. 178 (2011a): 1805-1813

Inoda, S. et al., J Immunother.32 (2009): 474-485

Inoda, S. et al., Exp.Mol.Pathol. 90 (2011b): 55-60

Ioachim, H. L. et al., Am.J Surg.Pathol.20 (1996): 64-71

Iscan, M. et al., Breast Cancer Res Treat. 70 (2001): 47-54

Ishida, T. et al., Leukemia 20 (2006): 2162-2168

Ishigami, S. et al., Cancer Lett.168 (2001): 87-91

Ishigami, S. et al., BMC.Cancer 11 (2011): 106

Ishikawa, S. et al., J Exp.Clin Cancer Res 22 (2003): 299-306

Issaq, S. H. et al., Mol.Cancer Res 8 (2010): 223-231

Ito, K. et al., Protein Cell 2 (2011): 755-763

Ito, M. et al., Jpn.J Clin Oncol 36 (2006): 116-120

Ito, Y. et al., Oncology 59 (2000): 68-74

Itoh, G. et al., Cancer Sci.104 (2013): 871-879

Ivyna Bong, P. N. et al., Mol.Cytogenet.7 (2014): 24

Iwakuma, T. et al., Cancer Metastasis Rev 31 (2012): 633-640 Iwanaga, K. et al., Cancer Lett.202 (2003): 71-79

Izykowska, K. et al., Eur.J Haematol.93 (2014): 143-149

Jaaskelainen, T. et al., Mol.Cell Endocrinol.350 (2012): 87-98 Jackson, R. S. et al., Cell Cycle 6 (2007): 95-103

Jacob, F. et al., BMC.Mol.Biol 15 (2014): 24

Jacques, C. et al., J Clin Endocrinol.Metab 90 (2005): 2314-2320 Jager, D. et al., Cancer Res 60 (2000): 3584-3591

Jaggi, M. et al., Prostate 66 (2006): 193-199

Jais, J. P. et al., Leukemia 22 (2008): 1917-1924

Jakobsson, J. et al., Pharmacogenomics.J 4 (2004): 245-250

1 1

Jalava, S. E. et al., Int.J Cancer 124 (2009): 95-102

Jang, S. G. et al., BMC.Cancer 7 (2007): 16

Januchowski, R. et al., Biomed.Pharmacother. 67 (2013): 240-245 Janus, J. R. et al., Laryngoscope 121 (2011): 2598-2603

Jayaram, H. N. et al., Curr.Med.Chem 6 (1999): 561-574

Jayarama, S. et al., J Cell Biochem.115 (2014): 261-270

Jeffery, J. et al., FASEB J 29 (2015a): 1999-2009

Jeffery, J. et al., Oncogene (2015b)

Jensen, C. H. et al., Eur.J Biochem.225 (1994): 83-92

Jensen, S. A. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 111 (2014): 5682-5687 Jessie, K. et al., Electrophoresis 34 (2013): 2495-2502

Ji, P. et al., Oncogene 24 (2005): 2739-2744

Jia, D. et al., Hepatology 54 (2011): 1227-1236

Jiang, J. H. et al., Ai.Zheng.23 (2004): 672-677

Jiang, J. H. et al., Hepatology 59 (2014a): 2216-2227

Jiang, N. et al., J Biol Chem 278 (2003): 21678-21684

Jiang, P. et al., Mol.Med.Rep. 9 (2014b): 2347-2351

Jiang, Q. et al., Histopathology 64 (2014c): 722-730

Jiao, X. et al., Genes Chromosomes.Cancer 51 (2012): 480-489

Jin, J. K. et al., Oncogene 34 (2015): 1811-1821

Jinawath, N. et al., Oncogene 28 (2009): 1941-1948

Jing, Z. et al., J Immunol.185 (2010): 6719-6727

Jinushi, M. et al., Cancer Res 68 (2008): 8889-8898

Johansson, P. et al., J Biol Chem 289 (2014): 18514-18525

Johnson, D. P. et al., Oncotarget. 6 (2015): 4863-4887

Joosse, S. A. et al., Clin Cancer Res 18 (2012): 993-1003

Jose-Eneriz, E. S. et al., Br.J Haematol. 142 (2008): 571-582

Joshi, A. D. et al., Clin Cancer Res 13 (2007): 5295-5304

Joshi, S. et al., BMC.Cancer 15 (2015): 546

Judson, H. et al., Hum.Genet.106 (2000): 406-413

Junes-Gill, K. S. et al., J Neurooncol.102 (2011): 197-211

Junes-Gill, K. S. et al., BMC.Cancer 14 (2014): 920

Jung, G. et al., Proc Natl Acad Sci U S A 84 (1987): 4611-4615

Jung, H. C. et al., Life Sci.77 (2005): 1249-1262

Jung, W. Y. et al., Appl.Immunohistochem.Mol.Morphol.22 (2014): 652-657

1 2

Juszczynski, P. et al., Mol.Cell Biol 26 (2006): 5348-5359

Kabbage, M. et al., J Biomed.Biotechnol.2008 (2008): 564127 Kaizuka, T. et al., J Biol Chem 285 (2010): 20109-20116

Kalin, T. V. et al., Cancer Res 66 (2006): 1712-1720

Kalinichenko, V. V. et al., Genes Dev.18 (2004): 830-850

Kalinina, T. et al., BMC.Cancer 10 (2010): 295

Kalogeropoulou, M. et al., Mol.Cancer Res 8 (2010): 554-568 Kamatani, N. et al., Cancer Res 40 (1980): 4178-4182

Kamino, H. et al., Cancer Genet. 204 (2011): 382-391

Kamiyama, S. et al., Glycobiology 21 (2011): 235-246

Kanda, A. et al., Oncogene 24 (2005): 7266-7272

Kandoth, C. et al., Nature 497 (2013): 67-73

Kang, B. W. et al., PLoS.One.10 (2015a): e0119649

Kang, G. et al., PLoS.One.8 (2013): e82770

Kang, J. K. et al., Int.J Oncol 16 (2000): 1159-1163

Kang, J. M. et al., Cancer Res 75 (2015b): 3087-3097

Kang, J. U. et al., Int.J Oncol 37 (2010): 327-335

Kang, J. U. et al., Cancer Genet.Cytogenet. 182 (2008a): 1-11

Kang, M. J. et al., Prostate 72 (2012): 1351-1358

Kang, S. K. et al., Am.J Pathol. 173 (2008b): 518-525

Kang, X. et al., Oncogene 28 (2009): 565-574

Kapoor, A. et al., Nature 468 (2010): 1105-1109

Karahatay, S. et al., Cancer Lett.256 (2007): 101-111

Karbowniczek, M. et al., J Invest Dermatol.128 (2008): 980-987 Karess, R. E. et al., Int.Rev Cell Mol.Biol 306 (2013): 223-273

Karim, H. et al., Biochem.Biophys.Res Commun.411 (2011): 156-161 Karlsson, E. et al., Breast Cancer Res Treat.153 (2015): 31-40 Karytinos, A. et al., J Biol Chem 284 (2009): 17775-17782

Kashuba, V. et al., Int.J Mol.Sci.13 (2012): 13352-13377

Kashyap, V. et al., Mol Oncol 7 (2013): 555-566

Kassambara, A. et al., Biochem.Biophys.Res Commun.379 (2009): 840-845 Kato, I. et al., Pathol.Int.59 (2009): 38-43

Kato, S. et al., Int.J Oncol 29 (2006): 33-40

Katoh, M. et al., Int.J Oncol 25 (2004): 1495-1500

Katoh, Y. et al., Int.J Mol.Med.18 (2006): 523-528

1

Katz, T. A. et al., Breast Cancer Res Treat.146 (2014): 99-108 Kaufmann, M. et al., Curr.Top.Microbiol.Immunol.384 (2015): 167-188 Kaur, H. et al., PLoS.One.7 (2012): e50249

Kawagoe, H. et al., Cancer Res 64 (2004): 6091-6100 Kawahara, R. et al., Proteomics. 16 (2016): 159-173

Kawakami, K. et al., Int.J Oncol (2015)

Kawakami, M. et al., Cancer Sci. 104 (2013): 1447-1454

Kaynar, H. et al., Cancer Lett. 227 (2005): 133-139

Kazma, R. et al., Carcinogenesis 33 (2012): 1059-1064

Ke, J. Y. et al., J Zhejiang.Univ Sci.B 15 (2014a): 1032-1038

Ke, R. H. et al., J Neurooncol. 118 (2014b): 369-376

Kearns, P. R. et al., Br.J Haematol. 120 (2003): 80-88

Keng, V. W. et al., Nat Biotechnol.27 (2009): 264-274

Kerley-Hamilton, J. S. et al., Oncogene 24 (2005): 6090-6100 Kesari, M. V. et al., Indian J Gastroenterol. 34 (2015): 63-67 Khan, J. et al., PLoS.One.6 (2011): e26512

Khodarev, N. N. et al., Cancer Res 69 (2009): 2833-2837

Kibbe, A. H., Handbook of Pharmaceutical Excipients rd (2000) Kiessling, A. et al., Oncogene 28 (2009): 2606-2620

Kikuchi, Y. et al., Front Genet.4 (2013): 271

Killian, A. et al., Genes Chromosomes.Cancer 45 (2006): 874-881 Kim, B. H. et al., Ann.Surg.Oncol 21 (2014a): 2020-2027

Kim, D. H., Yonsei Med.J 48 (2007): 694-700

Kim, D. S. et al., J Proteome.Res 9 (2010): 3710-3719

Kim, H. E. et al., PLoS.One.7 (2012a): e43223

Kim, H. J. et al., J Proteome.Res 8 (2009a): 1368-1379

Kim, H. N. et al., Am.J Hematol.82 (2007): 798-801

Kim, I. M. et al., Cancer Res 66 (2006): 2153-2161

Kim, J. et al., Genes Chromosomes.Cancer 54 (2015a): 681-691 Kim, J. C. et al., Int.J Radiat.Oncol Biol Phys. 86 (2013a): 350-357 Kim, J. C. et al., World J Gastroenterol.14 (2008a): 6662-6672 Kim, J. H. et al., Cancer 85 (1999): 546-553

Kim, J. H. et al., BMB.Rep.44 (2011a): 523-528

Kim, J. W. et al., Int.J Oncol 35 (2009b): 129-137

Kim, K. et al., Mol.Cell 52 (2013b): 459-467

1 4

Kim, M. et al., Mol Cancer Res 6 (2008b): 222-230

Kim, M. S. et al., Oncogene 27 (2008c): 3624-3634

Kim, M. S. et al., Histopathology 58 (2011b): 660-668

Kim, R. et al., PLoS.One.10 (2015b): e0126670

Kim, S. H. et al., Investig.Clin Urol.57 (2016): 63-72

Kim, S. J. et al., Acta Haematol. 120 (2008d): 211-216

Kim, S. J. et al., Mol.Carcinog 54 (2015c): 1748-1757

Kim, S. M. et al., Int.J Cancer 134 (2014b): 114-124

Kim, S. W. et al., OMICS.15 (2011c): 281-292

Kim, S. W. et al., Blood 111 (2008e): 1644-1653

Kim, Y. D. et al., Int.J Mol.Med.29 (2012b): 656-662

Kim, Y. W. et al., PLoS.One.7 (2012c): e40960

Kindt, N. et al., J Cancer Res Clin Oncol 140 (2014): 937-947 Kinoshita, Y. et al., Am.J Pathol. 180 (2012): 375-389

Kitange, G. J. et al., J Neurooncol. 100 (2010): 177-186

Klatka, J. et al., Eur.Arch.Otorhinolaryngol. 270 (2013): 2683-2693 Kleppe, M. et al., Nat Genet.42 (2010): 530-535

Kleppe, M. et al., Blood 117 (2011a): 7090-7098

Kleppe, M. et al., Haematologica 96 (2011b): 1723-1727

Kleylein-Sohn, J. et al., J Cell Sci.125 (2012): 5391-5402

Knapp, P. et al., Prostaglandins Other Lipid Mediat.92 (2010): 62-66 Ko, H. W. et al., Dev.Cell 18 (2010): 237-247

Kobayashi, H. et al., Biochem.Biophys.Res Commun.467 (2015a): 121-127 Kobayashi, M. et al., Lung Cancer 90 (2015b): 342-345

Kobayashi, Y. et al., Placenta 34 (2013): 110-118

Kocer, B. et al., Pathol.Int.52 (2002): 470-477

Kogo, R. et al., Int.J Oncol 39 (2011): 155-159

Kohno, T. et al., Nat Med. 18 (2012): 375-377

Kohrt, D. et al., Cell Cycle 13 (2014): 62-71

Koike, K., Recent Results Cancer Res 193 (2014): 97-111

Kokoglu, E. et al., Cancer Lett.50 (1990): 179-181

Kolb, T. M. et al., Toxicol.Sci. 88 (2005): 331-339

Kollmann, K. et al., Cancer Cell 24 (2013): 167-181

Kong, L. et al., Shanghai Kou Qiang.Yi.Xue.24 (2015): 89-93

Koo, G. B. et al., Cell Res 25 (2015a): 707-725

1

Koo, S. et al., Anticancer Res 35 (2015b): 3209-3215

Koochekpour, S. et al., Asian J Androl 7 (2005a): 147-158 Koochekpour, S. et al., Genes Chromosomes.Cancer 44 (2005b): 351-364 Kordi Tamandani, D. M. et al., J Assist.Reprod.Genet.26 (2009): 173-178 Korosec, B. et al., Cancer Genet.Cytogenet.171 (2006): 105-111 Korotayev, K. et al., Cell Signal.20 (2008): 1221-1226

Kortum, K. M. et al., Ann.Hematol.94 (2015): 1205-1211 Koshikawa, K. et al., Oncogene 21 (2002): 2822-2828

Kozlowski, L. et al., Arch.Dermatol.Res 292 (2000): 68-71

Kraemer, N. et al., Cell Mol Life Sci. 68 (2011): 1719-1736

Kramer, M. et al., Biomed.Res Int.2015 (2015): 208017

Krieg, A. M., Nat Rev.Drug Discov. 5 (2006): 471-484

Krona, C. et al., Oncogene 22 (2003): 2343-2351

Kuang, S. Q. et al., Leukemia 22 (2008): 1529-1538

Kuasne, H. et al., Clin Epigenetics. 7 (2015): 46

Kubota, H. et al., Cell Stress.Chaperones. 15 (2010): 1003-1011 Kudo, Y. et al., J Hepatol. 55 (2011): 1400-1408

Kuhn, E. et al., Mod.Pathol.27 (2014): 1014-1019

Kulkarni, A. A. et al., Clin Cancer Res 15 (2009): 2417-2425

Kumar, S. et al., Cell Death.Dis.6 (2015): e1758 Kumarakulasingham, M. et al., Clin Cancer Res 11 (2005): 3758-3765 Kuo, I. Y. et al., Int.J Cancer 135 (2014): 563-573

Kuo, S. J. et al., Oncol Rep. 24 (2010): 759-766

Kuphal, S. et al., Oncogene 25 (2006): 103-110

Kuppers, R. et al., J Clin Invest 111 (2003): 529-537

Kuramitsu, Y. et al., Anticancer Res 31 (2011): 3331-3336

Kurtovic-Kozaric, A. et al., Leukemia 29 (2015): 126-136

Kuruma, H. et al., Am.J Pathol.174 (2009): 2044-2050

Kutikhin, A. G., Hum.Immunol.72 (2011): 955-968

Kuznetsova, E. B. et al., Mol.Biol.(Mosk) 41 (2007): 624-633

Kwon, J. et al., Int J Oncol 43 (2013): 1523-1530

La, Vecchia C., Eur.J Cancer Prev. 10 (2001): 125-129

Labhart, P. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 102 (2005): 1339-1344 Laetsch, T. W. et al., Cell Death.Dis.5 (2014): e1072

Lage, H. et al., FEBS Lett.494 (2001): 54-59

1

Lagorce-Pages, C. et al., Virchows Arch.444 (2004): 426-435 Lai, J. M. et al., Methods Mol.Biol 623 (2010): 231-242

Lai, M. T. et al., J Pathol.224 (2011): 367-376

Lake, S. L. et al., Invest Ophthalmol.Vis.Sci. 52 (2011): 5598-5604 Lan, H. et al., Int.J Clin Exp.Med. 7 (2014): 665-672

Lan, Q. et al., Eur.J Haematol.85 (2010): 492-495

Lane, J. et al., Int.J Mol.Med.12 (2003): 253-257

Langemeijer, S. M. et al., Cell Cycle 8 (2009): 4044-4048 Lapointe, J. et al., Am.J Surg.Pathol. 32 (2008): 205-209 Lapouge, G. et al., Cell Mol.Life Sci.62 (2005): 53-64

Lara, P. C. et al., Radiat.Oncol 6 (2011): 148

Larkin, S. E. et al., Br.J Cancer 106 (2012): 157-165

Laske, K. et al., Cancer Immunol.Res 1 (2013): 190-200

Lau, L. F., Cell Mol.Life Sci.68 (2011): 3149-3163

Lau, Y. F. et al., Mol.Carcinog 27 (2000): 308-321

Lauring, J. et al., Blood 111 (2008): 856-864

Lazova, R. et al., Am.J Dermatopathol.31 (2009): 177-181

Leal, J. F. et al., Carcinogenesis 29 (2008): 2089-2095

Ledet, E. M. et al., Prostate 73 (2013): 614-623

Lee, B. H. et al., Cancer Res 73 (2013a): 1211-1218

Lee, E. J. et al., Oncol Res 18 (2010): 401-408

Lee, E. K. et al., Mol.Cell Biol 33 (2013b): 4422-4433

Lee, J. H. et al., Ann.Surg.249 (2009): 933-941

Lee, M. J. et al., J Proteome.Res 13 (2014a): 4878-4888

Lee, S. Y. et al., Eur.J Cancer 50 (2014b): 698-705

Lee, T. J. et al., Mol.Cancer 3 (2004): 31

Lee, Y. S. et al., Oncotarget. 6 (2015): 16449-16460

Leong, H. S. et al., Cancer Res 73 (2013): 1591-1599

Leong, S. R. et al., Mol.Pharm.12 (2015): 1717-1729

Levi, E. et al., Cancer Chemother.Pharmacol. 67 (2011): 1401-1413 Levy, P. et al., Clin Cancer Res 13 (2007): 398-407

Li, B. H. et al., Biochem.Biophys.Res Commun.369 (2008a): 554-560 Li, B. S. et al., Oncogene 34 (2015a): 2556-2565

Li, C. F. et al., Oncotarget.5 (2014a): 11428-11441

Li, C. F. et al., BMC.Genomics 8 (2007): 92

1

Li, C. M. et al., Am.J Pathol.160 (2002): 2181-2190

Li, H. et al., Neoplasia. 8 (2006): 568-577

Li, J. et al., Zhonghua Bing.Li Xue.Za Zhi.43 (2014b): 546-550

Li, J. F. et al., Zhonghua Wei Chang Wai Ke.Za Zhi.15 (2012a): 388-391 Li, J. Y. et al., Chin Med.J (Engl.) 125 (2012b): 3526-3531

Li, L. et al., Clin Cancer Res 19 (2013a): 4651-4661

Li, L. et al., Pharmacogenet.Genomics 22 (2012c): 105-116

Li, L. C. et al., Am.J Obstet.Gynecol.205 (2011a): 362-25

Li, M. et al., Clin Cancer Res 11 (2005): 1809-1814

Li, N. et al., Biochem.Biophys.Res Commun.455 (2014): 358-362 Li, Q. et al., Mol.Biol Rep.41 (2014c): 2409-2417

Li, S. et al., J Huazhong.Univ Sci.Technolog.Med.Sci. 28 (2008b): 93-96 Li, S. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 111 (2014d): 6970-6975

Li, T. et al., J Thorac.Oncol 7 (2012d): 448-452

Li, W. et al., Cancer Cell Int.15 (2015b): 17

Li, W. et al., Med.Oncol 31 (2014e): 208

Li, W. Q. et al., Carcinogenesis 34 (2013b): 1536-1542

Li, X. et al., Curr.Protein Pept.Sci.16 (2015c): 301-309

Li, X. et al., Pancreas 40 (2011b): 753-761

Li, X. et al., BMC.Cancer 15 (2015d): 342

Li, X. et al., Cancer Res (2016)

Li, Y. et al., Cancer Genet.Cytogenet. 198 (2010): 97-106

Li, Y. et al., Cancer Biol Ther. 16 (2015e): 1316-1322

Li, Y. et al., Clin Cancer Res 17 (2011c): 3830-3840

Li, Y. et al., Lung Cancer 80 (2013c): 91-98

Li, Z. et al., Diagn.Pathol.10 (2015f): 167

Li, Z. et al., Nan.Fang Yi.Ke.Da.Xue.Xue.Bao. 33 (2013d): 1483-1488 Lian, Z. et al., Cancer Biol Ther.16 (2015): 750-755

Liang, B. et al., Zhonghua Yi.Xue.Za Zhi.95 (2015a): 408-411 Liang, B. et al., Dig.Dis.Sci.60 (2015b): 2360-2372

Liang, H. et al., Genome Res 22 (2012a): 2120-2129

Liang, Q. et al., Sci.Rep. 3 (2013): 2932

Liang, X. S. et al., Int.J Cancer 130 (2012b): 2062-2066

Liang, X. T. et al., J Gastroenterol.Hepatol. 26 (2011): 544-549 Liang, Y. et al., BMC.Cancer 6 (2006): 97

1

Liang, Y. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 102 (2005): 5814-5819 Liao, C. F. et al., J Exp.Clin Cancer Res 27 (2008): 15

Liao, F. et al., Med.Oncol 27 (2010): 1219-1226

Liao, Y. et al., BMC.Cancer 14 (2014a): 487

Liao, Y. et al., PLoS.One. 9 (2014b): e99907

Liddy, N. et al., Nat Med. 18 (2012): 980-987

Lignitto, L. et al., Nat Commun.4 (2013): 1822

Lim, B. et al., Carcinogenesis 35 (2014): 1020-1027

Lim, S. O. et al., Biochem.Biophys.Res Commun.291 (2002): 1031-1037 Lin, D. C. et al., Nat Genet.46 (2014): 467-473

Lin, F. et al., Cancer Biol Ther.7 (2008a): 1669-1676

Lin, H. S. et al., Arch.Otolaryngol.Head Neck Surg.130 (2004): 311-316 Lin, P. et al., Mol.Biol Rep. 38 (2011): 1741-1747

Lin, P. H. et al., J Biomed.Sci.22 (2015a): 44

Lin, S. et al., RNA.Biol 12 (2015): 792-800

Lin, W. Y. et al., Hum.Mol.Genet.24 (2015b): 285-298

Lin, Y. L. et al., Int.J Clin Exp.Pathol. 8 (2015c): 14257-14269

Lin, Y. M. et al., Mol.Carcinog 47 (2008b): 925-933

Lin, Y. W. et al., Oral Oncol 48 (2012): 629-635

Lindberg, D. et al., Neuroendocrinology 86 (2007): 112-118

Linder, N. et al., Gynecol.Oncol 124 (2012): 311-318

Linder, N. et al., Clin Cancer Res 11 (2005): 4372-4381

Ling, Z. Q. et al., Eur.J Surg.Oncol 38 (2012): 326-332

Linge, A. et al., Invest Ophthalmol.Vis.Sci. 53 (2012): 4634-4643 Lips, E. H. et al., BMC.Cancer 8 (2008): 314

Lipson, D. et al., Nat Med.18 (2012): 382-384

Litvinov, I. V. et al., Clin.Cancer Res. 20 (2014a): 3799-3808 Litvinov, I. V. et al., Oncoimmunology 3 (2014b): e970025

Liu, B. et al., Biochem.Biophys.Res Commun.293 (2002a): 1396-1404 Liu, C. et al., Int.J Clin Exp.Pathol. 7 (2014a): 690-698

Liu, D. et al., Oncotarget.6 (2015a): 39211-39224

Liu, D. Q. et al., Sci.Rep.5 (2015b): 11955

Liu, F. et al., Tumour.Biol 35 (2014b): 8685-8690

Liu, J. et al., PLoS.One.9 (2014c): e89340

Liu, J. et al., Biochem.Biophys.Res Commun.463 (2015c): 1230-1236

1

Liu, J. F. et al., Cancer Cell Int.13 (2013a): 41

Liu, L. X. et al., World J Gastroenterol.8 (2002b): 631-637 Liu, L. X. et al., Oncol Rep.10 (2003): 1771-1775

Liu, L. Z. et al., Cancer Res 67 (2007): 6325-6332

Liu, M. et al., Cancer Res 66 (2006): 3593-3602

Liu, P. et al., J Natl.Cancer Inst.100 (2008a): 1326-1330 Liu, Q. et al., Prostate 73 (2013b): 1028-1037

Liu, Q. et al., Med.Oncol 31 (2014d): 882

Liu, R. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 105 (2008b): 7570-7575 Liu, R. et al., Oncotarget.6 (2015d): 33456-33469

Liu, S. Y. et al., Zhonghua Wai Ke.Za Zhi.47 (2009a): 1732-1735 Liu, W. et al., Ann.Surg.Oncol 21 Suppl 4 (2014e): S575-S583 Liu, W. et al., J Biol.Chem.279 (2004): 10167-10175

Liu, W. et al., Mol.Clin Oncol 2 (2014f): 219-225

Liu, X. et al., PLoS.One.8 (2013c): e77367

Liu, X. et al., Pathol.Res Pract.210 (2014g): 256-263

Liu, X. et al., Zhonghua Yi.Xue.Za Zhi.94 (2014h): 2008-2012 Liu, X. et al., Med.Oncol 30 (2013d): 735

Liu, Y. et al., Cancer Res 69 (2009b): 7844-7850

Liu, Y. et al., Asian Pac.J Cancer Prev. 16 (2015e): 2659-2664 Liu, Y. et al., Int.J Clin Exp.Pathol. 7 (2014i): 5750-5761

Liu, Y. X. et al., Oncol Lett.4 (2012): 847-851

Liu, Z. et al., Oncol Rep.33 (2015f): 1908-1914

Liu, Z. et al., BMC.Cancer 14 (2014j): 274

Liu, Z. et al., Carcinogenesis 32 (2011): 1668-1674 Ljunggren, H. G. et al., J Exp.Med. 162 (1985): 1745-1759 Llopis, S. et al., BMC.Cancer 13 (2013): 139

Lo, Y. W. et al., J Cell Mol.Med.19 (2015): 744-759

Long, Z. W. et al., Tumour.Biol.35 (2014): 11415-11426 Longenecker, B. M. et al., Ann N.Y.Acad.Sci. 690 (1993): 276-291 Lonsdale, J., Nat.Genet. 45 (2013): 580-585

Lopez-Cortes, A. et al., Am.J Med.Sci.346 (2013): 447-454 Lou, T. F. et al., Cancer Prev.Res (Phila) 9 (2016): 43-52 Lozupone, F. et al., Oncogene (2015)

Lu, C. et al., Mol.Cell Biochem.312 (2008): 71-80

1

Lu, C. et al., Dig.Dis.Sci.58 (2013): 2713-2720

Lu, J. et al., Oncol Rep.32 (2014a): 2571-2579

Lu, J. J. et al., Chin J Nat Med.13 (2015): 673-679

Lu, P. et al., PLoS.One.9 (2014b): e88918

Lu, X. et al., Mol.Cancer Ther.3 (2004): 861-872

Lu, X. et al., Clin Cancer Res 15 (2009): 3287-3296

Lucas, S. et al., Int.J Cancer 87 (2000): 55-60

Lucito, R. et al., Cancer Biol Ther. 6 (2007): 1592-1599

Ludwig, A. et al., Anticancer Res 22 (2002): 3213-3221

Lukas, T. J. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 78 (1981): 2791-2795 Luker, K. E. et al., Cancer Res 61 (2001): 6540-6547

Luksch, H. et al., Anticancer Res 31 (2011): 3181-3192

Lum, D. F. et al., Int.J Cancer 83 (1999): 162-166

Lundblad, R. L., Chemical Reagents for Protein Modification 3rd (2004) Luo, X. et al., J Clin Endocrinol.Metab 94 (2009): 4533-4539

Lv, T. et al., PLoS.One.7 (2012): e35065

Lyng, H. et al., BMC.Genomics 7 (2006): 268

Ma, G. F. et al., Eur.Rev.Med.Pharmacol.Sci. 19 (2015): 578-585

Ma, Q. et al., Biochem.Biophys.Res Commun.454 (2014): 157-161 MacDonald, G. et al., Sci.Signal. 7 (2014): ra56

MacDonald, T. J. et al., Methods Mol.Biol 377 (2007): 203-222

Mackay, C. et al., Cancer Res 74 (2014): 2246-2257

Madden, S. F. et al., Mol.Cancer 13 (2014): 241

Madhavan, S. et al., J Exp.Clin Cancer Res 34 (2015): 45

Magold, A. I. et al., PLoS.One. 4 (2009): e6952

Mahmood, S. F. et al., Carcinogenesis 35 (2014): 670-682

Makkinje, A. et al., Cell Signal. 21 (2009): 1423-1435

Malta-Vacas, J. et al., Clin Chem Lab Med.47 (2009): 427-431 Malumbres, M. et al., Curr.Opin.Genet.Dev.17 (2007): 60-65

Man, T. K. et al., BMC.Cancer 4 (2004): 45

Mang, J. et al., Transl.Oncol 8 (2015): 487-496

Mangs, A. H. et al., Int.J Biochem.Cell Biol 40 (2008): 2353-2357

Mano, Y. et al., Cancer Sci.98 (2007): 1902-1913

Mantia-Smaldone, G. M. et al., Hum.Vaccin.Immunother.8 (2012): 1179-1191 Mao, J. et al., Cancer Sci.99 (2008): 2120-2127

1 1

Mao, P. et al., J Biol Chem 286 (2011): 19381-19391 Mao, P. et al., PLoS.One.8 (2013a): e81803

Mao, Y. et al., BMC.Cancer 13 (2013b): 498

Marechal, R. et al., Clin Cancer Res 15 (2009): 2913-2919 Marian, C. et al., Eur.J Clin Nutr.65 (2011): 683-689

Marini, F. et al., J Biol Chem 277 (2002): 8716-8723

Markt, S. C. et al., Cancer Causes Control 26 (2015): 25-33 Marlow, L. A. et al., J Cell Sci.125 (2012): 4253-4263

Marmey, B. et al., Hum.Pathol.37 (2006): 68-77

Marques Filho, M. F. et al., Braz.J Otorhinolaryngol. 72 (2006): 25-30 Martens-de Kemp, S. R. et al., Clin Cancer Res 19 (2013): 1994-2003 Martin, L. et al., Oncogene 31 (2012): 4076-4084

Martin, T. A. et al., J Cell Biochem.105 (2008): 41-52

Martin, T. A. et al., Methods Mol.Biol 762 (2011): 383-407 Martin, T. D. et al., Mol.Cell 53 (2014): 209-220

Martinez-Trillos, A. et al., Blood 123 (2014): 3790-3796 Masuda, K. et al., Oncol Rep. 28 (2012): 1146-1152

Masuda, T. A. et al., Clin Cancer Res 9 (2003): 5693-5698 Masugi, Y. et al., Lab Invest 95 (2015): 308-319

Matejcic, M. et al., PLoS.One.6 (2011): e29366

Mathew, M. et al., Apoptosis. 18 (2013): 882-895

Matovina, M. et al., Gynecol.Oncol 113 (2009): 120-127 Matsumoto, K. et al., Genes Cells 6 (2001): 1101-1111 Matsumoto, N. et al., Leukemia 14 (2000): 1757-1765 Matsuyama, A. et al., Virchows Arch.459 (2011): 539-545 Matsuyama, A. et al., Virchows Arch.457 (2010): 577-583 Matsuyama, R. et al., Cancer Sci.107 (2016): 28-35

Maurizio, E. et al., Mol.Cell Proteomics. 15 (2016): 109-123 Maxwell, C. A. et al., J Cell Sci.121 (2008): 925-932

Mayne, M. et al., Eur.J Immunol.34 (2004): 1217-1227

Mazan-Mamczarz, K. et al., PLoS.Genet.10 (2014): e1004105 Mazzoccoli, G. et al., Chronobiol.Int.28 (2011): 841-851 McCabe, K. E. et al., Cell Death.Dis. 5 (2014): e1496

McClung, J. K. et al., Exp.Gerontol. 30 (1995): 99-124 McDonald, J. M. et al., Mol.Cancer 4 (2005): 35

1 2

Mechtcheriakova, D. et al., Cell Signal.19 (2007): 748-760 Mehta, A. et al., Breast 23 (2014): 2-9

Mehta, J. et al., PLoS.One.10 (2015): e0120622

Meier, C. et al., J Pathol.234 (2014): 351-364

Meijer, D. et al., Breast Cancer Res Treat.113 (2009): 253-260 Meissner, M. et al., Clin Cancer Res 11 (2005): 2552-2560 Men, W. et al., Cancer Genomics Proteomics.12 (2015): 1-8 Meng, F. et al., Int J Oncol 43 (2013): 495-502

Meng, J. et al., Acta Biochim.Biophys.Sin.(Shanghai) 42 (2010): 52-57 Mertens-Walker, I. et al., BMC.Cancer 15 (2015): 164

Messai, Y. et al., Cancer Res 74 (2014): 6820-6832

Metwally, N. S. et al., Cancer Cell Int.11 (2011): 8

Meziere, C. et al., J Immunol 159 (1997): 3230-3237

Michel, S. et al., Int.J Cancer 127 (2010): 889-898

Midorikawa, Y. et al., Jpn.J Cancer Res 93 (2002): 636-643 Mikami, T. et al., Oral Oncol 47 (2011): 497-503

Mikami, T. et al., Virchows Arch.466 (2015): 559-569 Milanovich, S. et al., Exp.Hematol. 43 (2015): 53-64

Miller, R. K. et al., J Am.Soc.Nephrol. 22 (2011): 1654-1664 Milne, R. L. et al., Hum.Mol.Genet.23 (2014): 6096-6111

Min, K. W. et al., Int.J Gynecol.Pathol.32 (2013): 3-14

Mino, K. et al., Biosci.Biotechnol.Biochem. 78 (2014): 1010-1017 Mirmalek-Sani, S. H. et al., J Cell Mol.Med. 13 (2009): 3541-3555 Mishra, L. et al., Cancer Biol Ther.4 (2005a): 694-699

Mishra, S. et al., FEBS J 277 (2010): 3937-3946

Mishra, S. et al., Trends Mol.Med. 11 (2005b): 192-197

Mitchell, R. J. et al., Hum.Hered.38 (1988): 144-150

Mitra, R. et al., Clin Cancer Res 17 (2011): 2934-2946 Mitsuhashi, K. et al., Int.J Hematol.100 (2014): 88-95

Mittal, R. D. et al., Indian J Cancer 41 (2004): 115-119

Miwa, H. et al., Leukemia 6 (1992): 405-409

Miwa, T. et al., Cancer Med. 4 (2015): 1091-1100

Miyaji, K. et al., J Viral Hepat. 10 (2003): 241-248

Miyoshi, Y. et al., Med.Mol.Morphol. 43 (2010): 193-196

Mo, L. et al., Anticancer Res 30 (2010): 3413-3420

1

Mohamed, F. E. et al., Liver Int.35 (2015): 1063-1076

Mohelnikova-Duchonova, B. et al., Cancer Chemother.Pharmacol. 72 (2013a): 669-682

Mohelnikova-Duchonova, B. et al., Pancreas 42 (2013b): 707-716

Moldovan, G. L. et al., Mol.Cell Biol 30 (2010): 1088-1096

Molinolo, A. A. et al., Clin Cancer Res 13 (2007): 4964-4973

Moniz, L. S. et al., Mol.Cell Biol 31 (2011): 30-42

Monji, M. et al., Clin Cancer Res 10 (2004): 6047-6057

Morgan, R. A. et al., Science 314 (2006): 126-129

Mori, M. et al., Transplantation 64 (1997): 1017-1027

Mori, Y. et al., Endocr.Relat Cancer 18 (2011): 465-478

Moritake, H. et al., Am.J Hematol. 86 (2011): 75-78

Moriya, Y. et al., J Hum.Genet.57 (2012): 38-45

Mortara, L. et al., Clin Cancer Res.12 (2006): 3435-3443

Moss, S. F. et al., Gut 45 (1999): 723-729

Mossink, M. H. et al., Oncogene 22 (2003): 7458-7467

Mostafa, W. Z. et al., J Cutan.Pathol.37 (2010): 68-74

Motaghed, M. et al., Int.J Mol.Med. 33 (2014): 8-16

Mouradov, D. et al., Cancer Res 74 (2014): 3238-3247

Mueller, L. N. et al., J Proteome.Res 7 (2008): 51-61

Mueller, L. N. et al., Proteomics.7 (2007): 3470-3480

Muir, K. et al., Cancer Res 73 (2013): 4722-4731

Mulligan, A. M. et al., Breast Cancer Res 13 (2011): R110

Mumberg, D. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 96 (1999): 8633-8638

Munoz, I. M. et al., Mol.Cell 35 (2009): 116-127

Murphy, N. C. et al., Int.J Cancer 126 (2010): 1445-1453

Murray, G. I. et al., Histopathology 57 (2010): 202-211

Murrin, L. C. et al., J Neuroimmune.Pharmacol.2 (2007): 290-295

Murugan, A. K. et al., Oncol Lett.6 (2013): 437-441

Muto, Y. et al., Cell Cycle 7 (2008): 2738-2748

Mydlikova, Z. et al., Neoplasma 57 (2010): 287-290

Naba, A. et al., Elife.3 (2014): e01308

Nadal-Serrano, M. et al., J Cell Biochem.113 (2012): 3178-3185

Nagai, M. et al., Cancer Res 51 (1991): 3886-3890

Nagai, M. A. et al., Int.J Oncol 37 (2010): 41-49

1 4

Nagakura, S. et al., Blood 100 (2002): 1031-1037

Nagamachi, A. et al., Cancer Cell 24 (2013): 305-317

Nagashio, R. et al., Sci.Rep. 5 (2015): 8649

Nagata, M. et al., BMC.Cancer 13 (2013): 410

Nagendra, D. C. et al., Mol.Carcinog 51 (2012): 826-831

Nagi, C. et al., Breast Cancer Res Treat.94 (2005): 225-235 Nagpal, J. K. et al., Mod.Pathol.21 (2008): 979-991

Nakagawa, Y. et al., Br.J Cancer 80 (1999): 914-917

Nakaya, H. I. et al., Biochem.Biophys.Res Commun.364 (2007): 918-923 Nakayama, K. et al., Cancer Res 67 (2007): 8058-8064

Nallar, S. C. et al., PLoS.One. 6 (2011): e24082

Nam, S. H. et al., Oncotarget.6 (2015): 21655-21674

Nam, S. W. et al., Int.J Oncol 45 (2014): 1450-1456

Nam-Cha, S. H. et al., Mod.Pathol. 22 (2009): 1006-1015

Nantajit, D. et al., PLoS.One. 5 (2010): e12341

Narita, T. et al., Mol Cell Biol. 23 (2003): 1863-1873

Navarro, A. et al., J Clin Endocrinol.Metab 99 (2014): E2437-E2445 Naylor, D. J. et al., J Biol Chem 273 (1998): 21169-21177

Near, R. I. et al., J Cell Physiol 212 (2007): 655-665

Nebral, K. et al., Leukemia 23 (2009): 134-143

Neidert, M. C. et al., J Neurooncol. 111 (2013): 285-294

Nelson, C. R. et al., J Cell Biol 211 (2015): 503-516

Nelson, M. A. et al., Cancer Genet.Cytogenet. 108 (1999): 91-99 Neumann, M. et al., Blood 121 (2013): 4749-4752

Neveling, K. et al., Cytogenet.Genome Res 118 (2007): 166-176 Ng, Y. et al., J Biol Chem 279 (2004): 34156-34164

Ngeow, J. et al., Cancer Discov. 4 (2014): 762-763

Nguyen, T. B. et al., J Biol Chem 277 (2002): 41960-41969

Ni, I. B. et al., Hematol.Rep. 4 (2012): e19

Ni, Y. H. et al., Histopathology (2015)

Ni, Z. et al., J Urol.167 (2002): 1859-1862

Niavarani, A. et al., Ann.Hematol. (2015)

Niimi, R. et al., BMC.Cancer 13 (2013): 309

Nikonova, A. S. et al., Cell Mol.Life Sci.70 (2013): 661-687 Nikpour, P. et al., Med.Oncol 31 (2014): 955

1

Nilsson, R. et al., Nat Commun.5 (2014): 3128

Nishi, T. et al., Pathol.Int.62 (2012): 802-810

Nishikata, M. et al., Mol.Carcinog 46 (2007): 208-214

Niu, N. et al., Genome Res 20 (2010): 1482-1492

Niu, N. et al., BMC.Cancer 12 (2012): 422

Nobori, T. et al., Cancer Res 51 (1991): 3193-3197

Nobori, T. et al., Cancer Res 53 (1993): 1098-1101

Noll, J. E. et al., Neoplasia. 16 (2014): 572-585

Nooter, K. et al., Br.J Cancer 76 (1997): 486-493

Nord, H. et al., Neuro.Oncol 11 (2009): 803-818

Norris, M. D. et al., N.Engl.J Med.334 (1996): 231-238 Noske, A. et al., Exp.Mol.Pathol. 98 (2015): 47-54

Novikov, L. et al., Mol.Cell Biol 31 (2011): 4244-4255 Nowarski, R. et al., Blood 120 (2012): 366-375

Nymoen, D. A. et al., Gynecol.Oncol 139 (2015): 30-39 O'Connor, K. W. et al., Cancer Res 73 (2013): 2529-2539 O'Gorman, D. B. et al., Endocrinology 143 (2002): 4287-4294 O'Malley, S. et al., Int.J Cancer 125 (2009): 1805-1813 O'Reilly, J. A. et al., PLoS.One. 10 (2015): e0123469 Oberg, E. A. et al., J Biol Chem 287 (2012): 43378-43389 Obuchowska, I. et al., Klin.Oczna 101 (1999): 167-168 Odvody, J. et al., Oncogene 29 (2010): 3287-3296

Oehler, V. G. et al., Blood 114 (2009): 3292-3298

Ogawa, C. et al., J Biol Chem 278 (2003): 1268-1272 Ogawa, R. et al., Dis.Esophagus. 21 (2008): 288-297

Oguri, T. et al., Mol.Cancer Ther.7 (2008): 1150-1155 Ohba, K. et al., J Urol.174 (2005): 461-465

Ohnishi, K. et al., Cancer Sci.104 (2013): 1237-1244 Ohshima, K. et al., Mol Biol.Evol. 27 (2010): 2522-2533 Oishi, Y. et al., Tumour.Biol 33 (2012): 383-393

Okada, M. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 105 (2008): 8649-8654 Okada, S. et al., J Oral Pathol.Med. 44 (2015): 115-125 Okosun, J. et al., Nat Genet.48 (2016): 183-188

Olayioye, M. A. et al., J Biol Chem 280 (2005): 27436-27442 Oleksowicz, L. et al., Cancer J Sci.Am.4 (1998): 247-253

1

Olesen, U. H. et al., APMIS 119 (2011): 296-303

Olkhanud, P. B. et al., Cancer Res 69 (2009): 5996-6004

Olsson, L. et al., Leukemia 28 (2014): 302-310

Olsson, M. et al., Prostate 67 (2007): 1439-1446

Ooe, A. et al., Breast Cancer Res Treat.101 (2007): 305-315 Orchel, J. et al., Int.J Gynecol.Cancer 22 (2012): 937-944

Ostrow, K. L. et al., Clin Cancer Res 16 (2010): 3463-3472

Ota, T. et al., Cancer Res 62 (2002): 5168-5177

Ottaviani, S. et al., Cancer Immunol.Immunother.55 (2006): 867-872 Ou, C. Y. et al., J Biol Chem 284 (2009): 20629-20637

Ozaki, Y. et al., Oncol Rep. 12 (2004): 1071-1077

Ozawa, H. et al., Ann.Surg.Oncol 17 (2010): 2341-2348

Ozbas-Gerceker, F. et al., Asian Pac.J Cancer Prev.14 (2013): 5213-5217 Ozgur, S. et al., RNA.Biol 10 (2013): 528-539

Palma, M. et al., BMC.Clin Pathol.12 (2012): 2

Pan, B. et al., Mol.Biol Rep. 40 (2013): 27-33

Pan, W. A. et al., RNA.Biol 12 (2015): 255-267

Pandey, R. N. et al., Oncogene 29 (2010): 3715-3722

Pankratz, V. S. et al., J Thorac.Oncol 6 (2011): 1488-1495

Pannu, V. et al., Oncotarget.6 (2015): 6076-6091

Papadakis, M. et al., Fam.Cancer 14 (2015): 599-602

Papp, B. et al., Biomolecules. 2 (2012): 165-186

Parihar, A. et al., Life Sci.82 (2008a): 1077-1082

Parihar, M. S. et al., Biochim.Biophys.Acta 1780 (2008b): 921-926 Parikh, R. A. et al., Genes Chromosomes.Cancer 53 (2014): 25-37 Park, E. et al., Mol.Cell 50 (2013): 908-918

Park, H. J. et al., J Proteome.Res 7 (2008): 1138-1150

Park, S. H. et al., Clin Cancer Res.13 (2007): 858-867

Park, S. J. et al., Oncogene 35 (2016): 1292-1301

Park, Y. et al., Oncogene 34 (2015): 5037-5045

Park, Y. M. et al., Gene 551 (2014): 236-242

Patil, A. A. et al., Oncotarget. 5 (2014): 6414-6424

Patrick, A. N. et al., Nat Struct.Mol.Biol 20 (2013): 447-453 Patrikainen, L. et al., Eur.J Clin Invest 37 (2007): 126-133

Paulo, P. et al., Neoplasia. 14 (2012): 600-611

1

Pavelec, D. M. et al., Genetics 183 (2009): 1283-1295

Pawar, H. et al., Cancer Biol Ther.12 (2011): 510-522

Pawar, S. et al., J Ovarian.Res 7 (2014): 53

Peddaboina, C. et al., BMC.Cancer 12 (2012): 541

Peeters, M. C. et al., Cell Signal. 27 (2015): 2579-2588

Peltonen, K. et al., Cancer Cell 25 (2014): 77-90

Pelttari, L. M. et al., Fam.Cancer (2015)

Pender-Cudlip, M. C. et al., Cancer Sci.104 (2013): 760-764

Peng, D. F. et al., Gut 58 (2009): 5-15

Peng, H. X. et al., Biomed.Res Int.2015 (2015a): 326981

Peng, J. et al., Sichuan.Da.Xue.Xue.Bao.Yi.Xue.Ban. 46 (2015b): 413-416 Peng, Y. et al., Cancer Res 75 (2015c): 378-386

Perdigao, P. F. et al., Genes Chromosomes.Cancer 44 (2005): 204-211 Pereira, J. S. et al., Endocrine. 49 (2015): 204-214

Pereira, P. M. et al., Org.Biomol.Chem. 12 (2014): 1804-1811

Perez, A. et al., Cancers (Basel) 6 (2014): 179-192

Perez-Tomas, R., Curr.Med.Chem 13 (2006): 1859-1876

Perrais, M. et al., J Biol Chem 276 (2001): 15386-15396

Perrotti, D. et al., Lancet Oncol 14 (2013): e229-e238

Personnic, N. et al., FEBS J 281 (2014): 2977-2989

Perugorria, M. J. et al., Cancer Res 69 (2009): 1358-1367

Pestov, D. G. et al., Mol.Cell Biol 21 (2001): 4246-4255

Peters, D. G. et al., Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev.14 (2005): 1717-1723 Peyrard, M. et al., Hum.Mol.Genet. 3 (1994): 1393-1399

Peyre, M. et al., PLoS.One. 5 (2010): e12932

Phipps-Yonas, H. et al., Front Immunol.4 (2013): 425

Phongpradist, R. et al., Curr.Pharm.Des 16 (2010): 2321-2330

Piccolo, S. et al., Cancer Res 73 (2013): 4978-4981

Piepoli, A. et al., Exp.Biol Med.(Maywood.) 237 (2012): 1123-1128

Pils, D. et al., BMC.Cancer 13 (2013): 178

Pinheiro, J. et al., nlme: Linear and Nonlinear Mixed Effects Models (http://CRAN.R-project.org/packe=nlme) (2015)

Pio, R. et al., Cancer Res 64 (2004): 4171-4179

Pissimissis, N. et al., Anticancer Res 29 (2009): 371-377

Pizzatti, L. et al., Biochim.Biophys.Acta 1764 (2006): 929-942

1

Placke, T. et al., Blood 124 (2014): 13-23

Pleasance, E. D. et al., Nature 463 (2010): 184-190 Plebanski, M. et al., Eur.J Immunol 25 (1995): 1783-1787 Pohl, A. et al., Pharmacogenomics.J 11 (2011): 93-99 Poligone, B. et al., J Invest Dermatol.135 (2015): 869-876 Polisetty, R. V. et al., J Proteomics. 74 (2011): 1918-1925 Pongor, L. et al., Genome Med.7 (2015): 104

Poomsawat, S. et al., J Oral Pathol.Med.39 (2010): 793-799 Poortinga, G. et al., Nucleic Acids Res 39 (2011): 3267-3281 Popov, N. et al., Nat Cell Biol 9 (2007): 765-774

Porkka, K. P. et al., Genes Chromosomes.Cancer 39 (2004): 1-10 Porta, C. et al., Virology 202 (1994): 949-955

Possuelo, L. G. et al., Rev Bras.Ginecol.Obstet. 35 (2013): 569-574 Pozo, K. et al., Cancer Cell 24 (2013): 499-511

Pradhan, M. P. et al., BMC.Syst.Biol 7 (2013): 141

Prasad, M. L. et al., Head Neck 26 (2004): 1053-1057 Prasad, N. K. et al., Carcinogenesis 29 (2008a): 25-34 Prasad, N. K. et al., Tumour.Biol 29 (2008b): 330-341 Prunier, C. et al., Cell Rep. (2015)

Pu, H. et al., World J Surg.Oncol 13 (2015): 323

Puig-Butille, J. A. et al., Oncotarget. 5 (2014): 1439-1451 Puls, F. et al., Am.J Surg.Pathol.38 (2014): 1307-1318 Pulukuri, S. M. et al., Mol.Cancer Res 7 (2009): 1285-1293 Pulvino, M. et al., Blood 120 (2012): 1668-1677

Purrington, K. S. et al., Carcinogenesis 35 (2014): 1012-1019 Qi, J. et al., Gut (2015)

Qi, L. et al., Cancer Res 74 (2014): 1301-1306

Qi, Y. et al., Proteomics.5 (2005): 2960-2971

Qian, Y. et al., Mol.Cancer 13 (2014): 176

Qian, Z. et al., J Exp.Clin Cancer Res 29 (2010): 111

Qin, Y. et al., Chin Med.J (Engl.) 127 (2014): 1666-1671 Quan, J. J. et al., Tumour.Biol 36 (2015a): 8617-8624

Quan, Y. et al., J Cancer 6 (2015b): 342-350

Quayle, S. N. et al., Neuro Oncol 14 (2012): 1325-1331 Quek, H. H. et al., DNA Cell Biol. 16 (1997): 275-280

1

Quidville, V. et al., Cancer Res 73 (2013): 2247-2258

Rahman, M. et al., Anticancer Res 33 (2013): 113-118

Raja, S. B. et al., J Cell Sci. 125 (2012): 703-713

Rajalingam, K. et al., Cell Cycle 4 (2005): 1503-1505

Rajasagi, M. et al., Blood 124 (2014): 453-462

Rajkumar, T. et al., BMC.Cancer 11 (2011): 80

Ramachandran, C., Curr.Pharm.Biotechnol. 8 (2007): 99-104

Rammensee, H. G. et al., Immunogenetics 50 (1999): 213-219

Ran, Q. et al., PLoS.One.9 (2014): e85328

Rangel, L. B. et al., Oncogene 22 (2003): 7225-7232

Rao, C. V. et al., Carcinogenesis 30 (2009): 1469-1474

Rao, F. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 112 (2015): 1773-1778

Rappa, G. et al., Mol.Cancer Res 12 (2014): 1840-1850

Rasinpera, H. et al., Gut 54 (2005): 643-647

Rastetter, R. H. et al., BMC.Cancer 15 (2015): 638

Rausch, M. P. et al., Mol.Immunol.68 (2015): 124-128

Rauscher, G. H. et al., BMC.Cancer 15 (2015): 816

Rawluszko-Wieczorek, A. A. et al., J Cancer Res Clin Oncol 141 (2015): 1379-1392 RefSeq, The NCBI handbook [Internet], Chapter 18, (2002), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21091/

Rekhi, B. et al., Indian J Med.Res 136 (2012): 766-775

Remmelink, M. et al., Int.J Oncol 26 (2005): 247-258

Ren, G. et al., OMICS.18 (2014): 615-624

Ren, S. et al., Cell Res 22 (2012): 806-821

Resende, C. et al., Helicobacter. 15 Suppl 1 (2010): 34-39

Restifo, N. P. et al., J Exp.Med. 177 (1993): 265-272

Reuschenbach, M. et al., Fam.Cancer 9 (2010): 173-179

Rey, O. et al., Oncogene 18 (1999): 827-831

Ribeiro, J. R. et al., Front Oncol 4 (2014): 45

Rieger-Christ, K. M. et al., Hum.Pathol.32 (2001): 18-23

Ries, J. et al., Int.J Oncol 26 (2005): 817-824

Rimkus, C. et al., Clin Gastroenterol.Hepatol. 6 (2008): 53-61

Rini, B. I. et al., Cancer 107 (2006): 67-74

Risch, H. A. et al., J Natl.Cancer Inst.98 (2006): 1694-1706

Ritterson, Lew C. et al., Nat Rev Urol.12 (2015): 383-391

1

Roberts, N. J. et al., Cancer Discov 2 (2012): 41-46

Robin, T. P. et al., Mol.Cancer Res 10 (2012): 1098-1108

Robles, L. D. et al., J Biol Chem 277 (2002): 25431-25438

Rock, K. L. et al., Science 249 (1990): 918-921

Rocken, C., Pathologe 34 (2013): 403-412

Rodins, K. et al., Clin Cancer Res 8 (2002): 1075-1081

Rodriguez-Paredes, M. et al., Oncogene 33 (2014): 2807-2813

Rohrbeck, A. et al., PLoS.One. 4 (2009): e7315

Rohrmoser, M. et al., Mol.Cell Biol 27 (2007): 3682-3694

Roll, J. D. et al., Mol.Cancer 7 (2008): 15

Romero, O. A. et al., Cancer Discov 4 (2014): 292-303

Rondeau, S. et al., Br.J Cancer 112 (2015): 1059-1066

Rosado, I. V. et al., RNA. 10 (2004): 1073-1083

Ross, H. M. et al., Mod.Pathol. 24 (2011): 390-395

Rothe, M. et al., Am.J Pathol.157 (2000): 1597-1604

Rudland, P. S. et al., Am.J Pathol. 176 (2010): 2935-2947

Ruebel, K. H. et al., Endocrine. 29 (2006): 435-444

Rumiato, E. et al., Cancer Chemother.Pharmacol. 72 (2013): 483-488 Ruminy, P. et al., Leukemia 25 (2011): 681-688

Russell, R. et al., Nat Commun.6 (2015): 7677

Ryu, B. et al., PLoS.One.2 (2007): e594

Ryu, H. S. et al., Thyroid 24 (2014): 1232-1240

Ryu, S. J. et al., Expert.Opin.Ther.Targets. 13 (2009): 479-484

S3-Leitlinie maligne Ovarialtumore, 032-035OL, (2013)

Saddoughi, S. A. et al., Adv.Cancer Res.117 (2013): 37-58

Saeki, N. et al., Genes Chromosomes.Cancer 48 (2009): 261-271

Saelee, P. et al., Asian Pac.J Cancer Prev.10 (2009): 501-506

Safadi, R. A. et al., Oral Surg.Oral Med.Oral Pathol.Oral Radiol. 121 (2016): 402-411

Safarinejad, M. R. et al., Urol.Oncol 31 (2013): 1193-1203

Sahab, Z. J. et al., J Cancer 1 (2010): 14-22

Saiki, R. K. et al., Science 239 (1988): 487-491

Saito, Y. et al., J Cancer Res Clin Oncol 139 (2013): 585-594

Saito, Y. et al., Cancer Immunol.Res 3 (2015): 1356-1363

Sajadian, S. O. et al., Clin Epigenetics. 7 (2015): 98

1 1

Sakai, S. et al., Clin Chim.Acta 413 (2012): 1542-1548

Sakamoto, S. et al., Cancer Res 70 (2010): 1885-1895

Sakurikar, N. et al., J Biol Chem 287 (2012): 39193-39204

Salon, C. et al., J Pathol. 213 (2007): 303-310

Saloura, V. et al., Mol.Cancer Res 13 (2015): 293-304

Samimi, G. et al., Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev.21 (2012): 273-279 Sand, M. et al., Cell Tissue Res 350 (2012): 119-126

Sang, Y. et al., Oncotarget. (2015)

Sankar, S. et al., Mol.Cell Biol 33 (2013): 4448-4460

Sankaran, D. et al., J Biol Chem 287 (2012): 5483-5491 Santandreu, F. M. et al., Cell Physiol Biochem.24 (2009): 379-390 Santhekadur, P. K. et al., FEBS Open.Bio 4 (2014): 353-361 Saraon, P. et al., Mol.Cell Proteomics.12 (2013): 1589-1601 Sarbia, M. et al., Am.J Clin Pathol. 128 (2007): 255-259

Sarto, C. et al., Electrophoresis 18 (1997): 599-604

Sastre-Serra, J. et al., Free Radic.Biol Med.61 (2013): 11-17

Sato, F. et al., Int.J Mol.Med.30 (2012a): 495-501

Sato, T. et al., PLoS.One. 8 (2013): e59444

Sato, T. et al., J Cell Sci. 125 (2012b): 1544-1555

Satoh, A. et al., Oncogene 23 (2004): 8876-8886

Sattler, M. et al., Cancer Cell 1 (2002): 479-492

Savoy, R. M. et al., Endocr.Relat Cancer 20 (2013): R341-R356 Sawicka-Gutaj, N. et al., Tumour.Biol 36 (2015): 7859-7863 Sayagues, J. M. et al., Med.Clin (Barc.) 128 (2007): 226-232 Scagliotti, G. V. et al., Ann.Oncol 10 Suppl 5 (1999): S83-S86 Scanlan, M. J. et al., Cancer Immun.1 (2001): 4

Scanlan, M. J. et al., Cancer Res 62 (2002): 4041-4047

Schaner, M. E. et al., Mol.Biol Cell 14 (2003): 4376-4386 Scharadin, T. M. et al., PLoS.One. 6 (2011): e23230

Scheffer, G. L. et al., Curr.Opin.Oncol 12 (2000): 550-556 Schiffmann, S. et al., Carcinogenesis 30 (2009): 745-752 Schimanski, C. C. et al., Oncogene 24 (2005): 3100-3109 Schleiermacher, G. et al., Oncogene 24 (2005): 3377-3384 Schlumbrecht, M. P. et al., Mod.Pathol. 24 (2011): 453-462 Schmidt, S. V. et al., Oncotarget. 6 (2015): 8635-8647

1 2

Schoppmann, S. F. et al., Clin Cancer Res 19 (2013): 5329-5339 Schraders, M. et al., Br.J Haematol. 143 (2008): 210-221

Schramm, A. et al., Nat Genet.47 (2015): 872-877

Schrier, S. A. et al., Curr.Opin.Ophthalmol.22 (2011): 325-331

Schuetz, J. M. et al., Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev.21 (2012): 2272-2274 Schulte, I. et al., BMC.Genomics 13 (2012): 719

Scott, A. F. et al., Genes (Basel) 5 (2014): 366-384

Scotto, L. et al., Genes Chromosomes.Cancer 47 (2008): 755-765

Sears, D. et al., Cell Death.Dis. 1 (2010): e93

Sedoris, K. C. et al., BMC.Cancer 10 (2010): 157

Seeger, F. H. et al., Immunogenetics 49 (1999): 571-576

Seeling, J. M. et al., Science 283 (1999): 2089-2091

Seetoo, D. Q. et al., J Surg.Oncol 82 (2003): 184-193

Seidel, C. et al., Mol.Carcinog 46 (2007): 865-871

Seidl, C. et al., Invest New Drugs 28 (2010): 49-60

Sekine, I. et al., Jpn.J Clin Oncol 37 (2007): 329-336

Selamat, S. A. et al., PLoS.One. 6 (2011): e21443

Seliger, B., Methods Mol.Biol 1102 (2014): 367-380

Seliger, B. et al., Proteomics. 5 (2005): 2631-2640

Seo, S. W. et al., J Orthop.Res 29 (2011): 1131-1136

Seol, H. S. et al., Cancer Lett. 353 (2014): 232-241

Seriramalu, R. et al., Electrophoresis 31 (2010): 2388-2395

Servais, E. L. et al., Clin Cancer Res 18 (2012): 2478-2489

Seshagiri, S. et al., Nature 488 (2012): 660-664

Shackelford, R. E. et al., Int.J Clin Exp.Pathol. 3 (2010): 522-527 Shadeo, A. et al., BMC.Genomics 9 (2008): 64

Shah, S. P. et al., Nature 461 (2009): 809-813

Shah, T. M. et al., Oral Oncol 49 (2013): 604-610

Shames, D. S. et al., Clin Cancer Res 19 (2013): 6912-6923

Shan, T. et al., Oncol Rep. 32 (2014): 1564-1570

Shang, B. et al., Cell Death.Dis. 5 (2014): e1285

Shao, J. et al., PLoS.One.9 (2014): e97085

Sharma, A. et al., Tumour.Biol 34 (2013): 3249-3257

Shaughnessy, J. D., Jr. et al., Blood 118 (2011): 3512-3524

Shaw, E. J. et al., Cell Oncol (Dordr.) 34 (2011): 355-367

1

Shen, C. et al., Cancer Res 73 (2013): 3393-3401

Shen, Y. et al., Oncotarget.6 (2015a): 20396-20403

Shen, Y. et al., Cancer Cell Microenviron. 2 (2015b)

Sheng, S. H. et al., Clin Transl.Oncol 16 (2014): 153-157

Sherman, F. et al., Laboratory Course Manual for Methods in Yeast Genetics (1986)

Shi, D. et al., Biochem.Biophys.Res Commun.450 (2014a): 1241-1246

Shi, H. et al., World J Surg.Oncol 12 (2014b): 188

Shi, J. et al., Oncogene 25 (2006): 4923-4936

Shi, J. et al., Am.J Cancer Res 2 (2012): 116-129

Shi, J. L. et al., Oncotarget.6 (2015): 5299-5309

Shields, B. J. et al., Mol.Cell Biol 33 (2013): 557-570

Shih, IeM et al., Am.J Pathol.178 (2011): 1442-1447

Shin, E. M. et al., J Clin Invest 124 (2014): 3807-3824

Shiraishi, T. et al., J Transl.Med.9 (2011): 153

Shishkin, S. S. et al., Biochemistry (Mosc.) 78 (2013): 1415-1430

Shruthi, D. K. et al., J Oral Maxillofac.Pathol. 18 (2014): 365-371

Shtutman, M. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 108 (2011): 12449-12454

Shu, G. S. et al., Cancer Biomark.11 (2012): 107-114

Shu, J. et al., Cancer Res.66 (2006): 5077-5084

Sidhar, S. K. et al., Hum.Mol.Genet.5 (1996): 1333-1338

Siligan, C. et al., Oncogene 24 (2005): 2512-2524

Silva, J. M. et al., Cell 137 (2009): 1047-1061

Silveira, S. M. et al., PLoS.One. 8 (2013): e67643

Simaga, S. et al., Eur.J Cancer 34 (1998): 399-405

Simaga, S. et al., Gynecol.Oncol 91 (2003): 194-200

Simonova, O. A. et al., Mol.Biol (Mosk) 49 (2015): 667-677

Simons, A. L. et al., Lab Invest 93 (2013): 711-719

Singh, G., Pharmaceuticals.(Basel) 7 (2014): 192-206

Singh, H. et al., Am.J Obstet.Gynecol. 198 (2008): 303-306

Singh, P. K. et al., Immunobiology 220 (2015): 103-108

Singh, R. et al., FEBS J 281 (2014): 1629-1641

Singh-Jasuja, H. et al., Cancer Immunol.Immunother.53 (2004): 187-195 Sinha, S. et al., Mol.Oncol 5 (2011): 454-464

Skandalis, S. S. et al., Matrix Biol 35 (2014): 182-193

1 4

Slattery, M. L. et al., Carcinogenesis 31 (2010): 1604-1611

Slattery, M. L. et al., Mol.Carcinog 52 (2013): 155-166

Slipicevic, A. et al., BMC.Cancer 8 (2008): 276

Smaaland, R. et al., Breast Cancer Res Treat.9 (1987): 53-59

Small, E. J. et al., J Clin Oncol.24 (2006): 3089-3094

Smetsers, S. et al., Fam.Cancer 11 (2012): 661-665

Smith, B. et al., Cell Rep.2 (2012): 580-590

Smith, J. B. et al., Gynecol.Oncol 134 (2014): 181-189

Sohr, S. et al., Cell Cycle 7 (2008): 3448-3460

Soman, N. R. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 88 (1991): 4892-4896 Soman, N. R. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 87 (1990): 738-742

Song, B. et al., Mol.Cancer Ther. 12 (2013a): 58-68

Song, J. et al., World J Gastroenterol. 19 (2013b): 4127-4136

Song, L. J. et al., J Mol.Med.(Berl) 90 (2012): 707-718

Song, N. et al., J Zhejiang.Univ Sci.B 14 (2013c): 451-459

Song, T. et al., Oncol Lett.9 (2015a): 2799-2804

Song, X. et al., Monoclon.Antib.Immunodiagn.Immunother. 33 (2014a): 246-253 Song, X. C. et al., Mol.Cell Proteomics. 7 (2008): 163-169

Song, Y. et al., Nature 509 (2014b): 91-95

Song, Y. et al., Int.J Clin Exp.Pathol. 8 (2015b): 11314-11322

Song, Y. et al., Biochem.J 406 (2007): 427-436

Sonora, C. et al., J Histochem.Cytochem. 54 (2006): 289-299

Soupene, E. et al., J Lipid Res.49 (2008): 1103-1112

Sousa, S. F. et al., Endocr.Relat Cancer 22 (2015): 399-408

Sowalsky, A. G. et al., Cancer Res 71 (2011): 758-767

Sowalsky, A. G. et al., Mol.Cancer Res.13 (2015): 98-106

Sporn, J. C. et al., Am.J Pathol.180 (2012): 2516-2526

Spyropoulou, A. et al., Neuromolecular.Med.16 (2014): 70-82

Srinivasan, D. et al., Cancer Res 66 (2006): 5648-5655

Srinivasan, D. et al., Oncogene 27 (2008): 1095-1105

St-Denis, N. et al., Mol.Cell Proteomics. 14 (2015): 946-960

Stacey, S. N. et al., Nat Commun.6 (2015): 6825

Stadler, W. M. et al., Cancer Res 54 (1994): 2060-2063

Stangel, D. et al., J Surg.Res 197 (2015): 91-100

Stary, S. et al., Genes Chromosomes.Cancer 52 (2013): 33-43

1

Stawerski, P. et al., Pol.J Pathol. 61 (2010): 219-223

Stefanska, B. et al., Clin Cancer Res 20 (2014): 3118-3132

Steffen, J. S. et al., Virchows Arch.461 (2012): 355-365

Steinbach, D. et al., Clin Cancer Res 12 (2006): 4357-4363 Steinestel, K. et al., Mol.Cancer 13 (2014): 145

Steinestel, K. et al., Pathologe 34 Suppl 2 (2013): 189-194 Steinmann, K. et al., Oncol Rep. 22 (2009): 1519-1526

Stirewalt, D. L. et al., Genes Chromosomes.Cancer 47 (2008): 8-20 Stirpe, F. et al., Am.J Gastroenterol. 97 (2002): 2079-2085

Stoiber, D. et al., J Clin Invest 114 (2004): 1650-1658

Stone, B. et al., Gene 267 (2001): 173-182

Stransky, N. et al., Nat Commun.5 (2014): 4846

Strock, C. J. et al., Cancer Res 66 (2006): 7509-7515

Strojnik, T. et al., Anticancer Res 26 (2006): 2887-2900

Strojnik, T. et al., Anticancer Res 29 (2009): 3269-3279

Stubbs, A. P. et al., Am.J Pathol. 154 (1999): 1335-1343

Sturm, M. et al., BMC.Bioinformatics.9 (2008): 163

Su, M. T. et al., Gynecol.Oncol 103 (2006): 357-360

Su, Y. F. et al., J Biomed.Sci.21 (2014): 67

Subramanian, M. et al., J Clin Endocrinol.Metab 94 (2009): 1467-1471 Suchy, J. et al., BMC.Cancer 8 (2008): 112

Sud, N. et al., Int.J Cancer 112 (2004): 905-907

Sudo, H. et al., Genomics 95 (2010): 210-216

Sueoka, S. et al., Ann.Surg.Oncol (2015)

Sugano, G. et al., Oncogene 30 (2011): 642-653

Sugimoto, K. J. et al., Int.J Clin Exp.Pathol. 7 (2014): 8980-8987 Sugimoto, T. et al., Genes Chromosomes.Cancer 48 (2009): 132-142 Suh, J. H. et al., Mol.Endocrinol.22 (2008): 33-46

Sukocheva, O. A. et al., World J Gastroenterol. 21 (2015): 6146-6156 Sullivan, G. F. et al., J Clin Invest 105 (2000): 1261-1267

Sun, A. et al., Prostate (2015a)

Sun, D. W. et al., Cancer Epidemiol. (2015b)

Sun, H. et al., J BUON.20 (2015c): 296-308

Sun, J. Y. et al., Zhonghua Kou Qiang.Yi.Xue.Za Zhi.39 (2004a): 114-117 Sun, K. et al., Tumour.Biol 36 (2015d): 1549-1559

1

Sun, N. K. et al., Oncotarget.6 (2015e): 27065-27082

Sun, Q. Y. et al., J Pathol.235 (2015f): 559-570

Sun, S. et al., Gene 584 (2016): 90-96

Sun, S. et al., J Proteome.Res 9 (2010): 70-78

Sun, W. et al., Cancer Lett.212 (2004b): 83-93

Sun, X. et al., Int.J Oncol 44 (2014a): 1678-1684

Sun, Y. et al., Oncogene 34 (2015g): 2527-2537

Sun, Y. et al., Carcinogenesis 35 (2014b): 1941-1950

Sun, Y. et al., Eur.J Cancer Prev.23 (2014c): 418-424

Sun, Y. et al., Asian J Androl 16 (2014d): 319-324

Sung, W. W. et al., BMC.Cancer 14 (2014): 951

Surmann, E. M. et al., Cancer Immunol.Immunother.64 (2015): 357-366 Suzuki, H. et al., Lung Cancer 59 (2008): 24-31

Svendsen, J. M. et al., Cell 138 (2009): 63-77

Svojgr, K. et al., Immunol.Lett.122 (2009): 185-192

Svojgr, K. et al., Exp.Hematol. 40 (2012): 379-385

Swanson, K. D. et al., Genes Chromosomes.Cancer 47 (2008): 253-259 Swift, M. et al., N.Engl.J Med.316 (1987): 1289-1294

Symes, A. J. et al., PLoS.One. 8 (2013): e84295

Szabo, P. M. et al., Virchows Arch. 455 (2009): 133-142 Szaflarski, W. et al., Postepy Biochem. 57 (2011): 266-273 Szczepanski, M. J. et al., Oral Oncol 49 (2013): 144-151 Szczepanski, M. J. et al., Biomark.Med.7 (2013): 575-578

Szuhai, K. et al., Clin Cancer Res 15 (2009): 2259-2268

Tagawa, H., Nihon Rinsho 72 (2014): 1052-1057

Tahara, H. et al., Prostate Cancer Prostatic.Dis.18 (2015): 56-62 Tahara, K. et al., Cancer 85 (1999): 1234-1240

Tahara, T. et al., Gastroenterology 146 (2014): 530-538

Tai, C. J. et al., Int.J Biol Markers 27 (2012): e280-e284

Tai, W. et al., Mol.Pharm.10 (2013): 477-487

Takahashi, K. et al., Int.J Oncol 28 (2006): 321-328

Takahashi, Y. et al., Ann.Oncol 26 (2015): 935-942

Takao, M. et al., Oncol Rep. 17 (2007): 1333-1339

Takaoka, N. et al., BMC.Mol.Biol 12 (2011): 31

Takashima, S. et al., Tumour.Biol. 35 (2014): 4257-4265

1

Takata, A. et al., Hepatology 57 (2013a): 162-170

Takata, K. et al., Nat Commun.4 (2013b): 2338

Takayanagi, S. et al., J Exp.Ther.Oncol 4 (2004): 239-246

Takeda, S. et al., J Toxicol.Sci.39 (2014): 711-716

Takemoto, H. et al., Int.J Cancer 91 (2001): 783-788

Takenokuchi, M. et al., Anticancer Res 35 (2015): 3307-3316 Takeyama, K. et al., J Biol Chem 278 (2003): 21930-21937

Talieri, M. et al., Thromb.Haemost. 91 (2004): 180-186

Tamir, A. et al., J Ovarian.Res 7 (2014): 109

Tan, J. A. et al., Mol.Cell Endocrinol. 382 (2014): 302-313

Tan, P. et al., Biochem.Biophys.Res Commun.419 (2012): 801-808 Tan, X. et al., Int.J Cancer 123 (2008): 1080-1088

Tanahashi, N. et al., Biochem.Biophys.Res Commun.243 (1998): 229-232 Tanaka, M. et al., Cancer Sci. 99 (2008a): 979-985

Tanaka, Y. et al., J Hepatol. 49 (2008b): 746-757

Tang, C. Y. et al., Clin Chem Lab Med. 52 (2014a): 1843-1850

Tang, H. et al., Int.J Mol.Med.32 (2013): 381-388

Tang, N. et al., Sheng Li Xue.Bao. 62 (2010): 196-202

Tang, S. et al., Xi.Bao.Yu Fen.Zi.Mian.Yi.Xue.Za Zhi.30 (2014b): 411-413 Taniuchi, K. et al., Cancer Res 65 (2005): 105-112

Tanner, M. M. et al., Clin Cancer Res 1 (1995): 1455-1461

Tano, K. et al., FEBS Lett.584 (2010): 4575-4580

Tao, F. et al., World J Gastroenterol. 20 (2014a): 9564-9569

Tao, J. et al., Tumour.Biol 35 (2014b): 4389-4399

Tao, T. et al., Cell Res 23 (2013): 620-634

Taouji, S. et al., J Biol Chem 288 (2013): 17190-17201

Tarcic, O. et al., Cell Rep. 14 (2016): 1462-1476

Tatidis, L. et al., J Lipid Res 38 (1997): 2436-2445

Tatsuka, M. et al., Cancer Res 58 (1998): 4811-4816

Taube, E. T. et al., Gynecol.Oncol 140 (2016): 494-502

Tedeschi, P. M. et al., Mol.Cancer Res (2015)

Teh, M. T. et al., Cancer Res 62 (2002): 4773-4780

Terada, T., Int.J Clin Exp.Pathol. 5 (2012): 596-600

Teufel, R. et al., Cell Mol Life Sci.62 (2005): 1755-1762

Thakkar, A. D. et al., Biomark.Cancer 2 (2010): 1-15

1

Thang, N. D. et al., Oncotarget. 6 (2015): 14290-14299

Theiss, A. L. et al., Biochim.Biophys.Acta 1813 (2011): 1137-1143 Thomas, A. et al., Cancer Med. 2 (2013): 836-848

Thome, C. H. et al., Mol.Cell Proteomics. 11 (2012): 1898-1912 Thompson, D. A. et al., Eur.J Biochem. 252 (1998): 169-177

Thorell, K. et al., BMC.Med.Genomics 2 (2009): 53

Tian, X. et al., Oncol Rep. 34 (2015): 707-714

Tibaldi, L. et al., PLoS.One. 8 (2013): e72708

Timofeeva, O. A. et al., Int.J Oncol 35 (2009): 751-760

Tomiyama, L. et al., Oncogene 34 (2015): 1141-1149

Tomonaga, M. et al., Int.J Oncol 40 (2012): 409-417

Tong, W. G. et al., Epigenetics. 5 (2010): 499-508

Toogeh, G. et al., Clin Lymphoma Myeloma.Leuk.16 (2016): e21-e26 Torres-Reyes, L. A. et al., Int.J Clin Exp.Pathol.7 (2014): 7409-7418 Tozbikian, G. et al., PLoS.One.9 (2014): e114900

Tran, E. et al., Science 344 (2014): 641-645

Travis, R. C. et al., Int.J Cancer 132 (2013): 1901-1910

Trehoux, S. et al., Biochem.Biophys.Res Commun.456 (2015): 757-762 Trifonov, V. et al., BMC.Syst.Biol 7 (2013): 25

Tripodi, D. et al., BMC.Med.Genomics 2 (2009): 65

Trotta, C. R. et al., Nature 441 (2006): 375-377

Tsai, F. M. et al., Cell Signal.18 (2006): 349-358

Tsao, D. A. et al., DNA Cell Biol 29 (2010): 285-293

Tsao, T. Y. et al., Mol.Cell Biochem.327 (2009): 163-170

Tsou, J. H. et al., J Pathol.225 (2011): 243-254

Tsujikawa, T. et al., Int.J Cancer 132 (2013): 2755-2766

Tsukamoto, Y. et al., J Pathol. 216 (2008): 471-482

Tsuruga, T. et al., Oncol Res 16 (2007): 431-435

Tu, L. C. et al., Mol.Cell Proteomics. 6 (2007): 575-588

Tucci, M. et al., Curr.Top.Med.Chem 9 (2009): 218-224

Tummala, R. et al., Cancer Chemother.Pharmacol. 64 (2009): 1187-1194 Tung, M. C. et al., Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev.18 (2009): 1570-1577 Tung, P. Y. et al., Stem Cells 31 (2013): 2330-2342

Turner, A. et al., PLoS.One.8 (2013): e56817

Turner, B. C. et al., Cancer Res 58 (1998): 5466-5472

1

Turtoi, A. et al., J Proteome.Res 10 (2011): 4302-4313

Twa, D. D. et al., J Pathol.236 (2015): 136-141

Uchikado, Y. et al., Int.J Oncol 29 (2006): 1337-1347

Uchiyama, K. et al., J Cell Biol. 159 (2002): 855-866

Uemura, M. et al., Cancer 97 (2003): 2474-2479

Ulloa, F. et al., PLoS.One.10 (2015): e0119707

Unger, K. et al., Endocr.Relat Cancer 17 (2010): 87-98

Urbanucci, A. et al., Oncogene 31 (2012): 2153-2163

Uyama, H. et al., Clin Cancer Res 12 (2006): 6043-6048

Vahedi, S. et al., Oncol Rep. 34 (2015): 43-50

Vainio, P. et al., PLoS.One. 7 (2012): e39801

Vairaktaris, E. et al., Anticancer Res 27 (2007): 4121-4125

Vaites, L. P. et al., Mol.Cell Biol 31 (2011): 4513-4523

Vakana, E. et al., PLoS.One. 8 (2013): e78780

Valles, I. et al., PLoS.One. 7 (2012): e42086

Valque, H. et al., PLoS.One. 7 (2012): e46699

van de Rijn, M. et al., Am.J Pathol. 161 (2002): 1991-1996

van den Heuvel-Eibrink MM et al., Int.J Clin Pharmacol.Ther.38 (2000): 94-110 van der Zwan, Y. G. et al., Eur.Urol. 67 (2015): 692-701

van Dijk, J. R. et al., Biochem.J 459 (2014): 27-36

Van Ginkel, P. R. et al., Biochim.Biophys.Acta 1448 (1998): 290-297

van Vuurden, D. G. et al., Neuro.Oncol 16 (2014): 946-959

van, Agthoven T. et al., J Clin Oncol 27 (2009): 542-549

van, Dam S. et al., BMC.Genomics 13 (2012): 535

Van, Seuningen, I et al., Biochem.J 348 Pt 3 (2000): 675-686

Vanaja, D. K. et al., Clin Cancer Res 12 (2006): 1128-1136

Vanderstraeten, A. et al., Cancer Immunol.Immunother.63 (2014): 545-557 Vanharanta, S. et al., Elife.3 (2014)

Vanneste, D. et al., Curr.Biol.19 (2009): 1712-1717

Vasca, V. et al., Oncol Lett.8 (2014): 2501-2504

Vater, I. et al., Leukemia 29 (2015): 677-685

Vavougios, G. D. et al., Am.J Physiol Lung Cell Mol.Physiol 309 (2015): L677-L686 Veigaard, C. et al., Cancer Genet.204 (2011): 516-521

Vekony, H. et al., Oral Oncol 45 (2009): 259-265

Venere, M. et al., Sci.Transl.Med. 7 (2015): 304ra143

2

Verheugd, P. et al., Nat Commun.4 (2013): 1683

Vermeulen, C. F. et al., Gynecol.Oncol 105 (2007): 593-599 Vey, N. et al., Oncogene 23 (2004): 9381-9391

Vincent, A. et al., Oncotarget. 5 (2014): 2575-2587

Vincent-Chong, V. K. et al., Oral Dis.18 (2012): 469-476 Viswanathan, M. et al., Clin Cancer Res 9 (2003): 1057-1062 Vitale, M. et al., Cancer Res 58 (1998): 737-742

Vlaykova, T. et al., J BUON.16 (2011): 265-273

Vogetseder, A. et al., Int.J Cancer 133 (2013): 2362-2371 Volkmer, J. P. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 109 (2012): 2078-2083 Vrabel, D. et al., Klin.Onkol. 27 (2014): 340-346

Walker, F. et al., Biol Chem 395 (2014): 1075-1086

Walsh, M. D. et al., Mod.Pathol.26 (2013): 1642-1656

Walter, S. et al., J Immunol 171 (2003): 4974-4978

Walter, S. et al., Nat Med.18 (2012): 1254-1261

Wang, B. S. et al., Clin Sci.(Lond) 124 (2013a): 203-214

Wang, B. S. et al., Cell Stress.Chaperones. 18 (2013b): 359-366 Wang, C. et al., Mol.Cancer Res 5 (2007a): 1031-1039

Wang, C. et al., Nucleic Acids Res 43 (2015a): 4893-4908 Wang, C. et al., Clin Cancer Res 4 (1998): 567-576

Wang, C. J. et al., Mol.Biol Rep.40 (2013c): 6525-6531

Wang, C. X. et al., Asian Pac.J Cancer Prev. 15 (2014a): 355-362 Wang, D. et al., J Biol.Chem.277 (2002): 36216-36222

Wang, E. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 110 (2013d): 3901-3906 Wang, F. et al., Oncol Rep.30 (2013e): 260-268

Wang, G. et al., Biochem.J 446 (2012a): 415-425

Wang, G. R. et al., Acta Pharmacol.Sin.30 (2009a): 1436-1442 Wang, H. et al., J Biol.Chem 289 (2014b): 4009-4017

Wang, H. et al., J Biol Chem 289 (2014c): 23123-23131

Wang, H. et al., Chin Med.J (Engl.) 116 (2003): 1074-1077 Wang, H. et al., J Cancer Res Ther.11 Suppl 1 (2015b): C74-C79 Wang, J. et al., Oncotarget.6 (2015c): 16527-16542

Wang, J. et al., Asian Pac.J Cancer Prev. 14 (2013f): 2805-2809 Wang, J. W. et al., Oncogene 23 (2004): 4089-4097

Wang, K. et al., J Biol Chem 289 (2014d): 23928-23937

2 1

Wang, L. et al., Acta Med.Okayama 65 (2011): 315-323

Wang, L. et al., Int.J Cancer 124 (2009b): 1526-1534

Wang, L. et al., Cancer Cell 25 (2014e): 21-36

Wang, M. et al., Int.J Mol.Med.33 (2014f): 1019-1026

Wang, N. et al., Mol.Biol Rep.39 (2012b): 10497-10504

Wang, P. et al., Zhongguo Fei.Ai.Za Zhi.12 (2009c): 875-878

Wang, Q. et al., Cell 138 (2009d): 245-256

Wang, Q. et al., Mol.Med.Rep.12 (2015d): 475-481

Wang, S. S. et al., PLoS.One.5 (2010): e8667

Wang, S. Y. et al., Oncotarget.7 (2016a): 2878-2888

Wang, T. et al., Clin Transl.Oncol 17 (2015e): 564-569

Wang, V. W. et al., Head Neck 35 (2013g): 831-835

Wang, W. W. et al., Int.J Clin Exp.Med.8 (2015f): 3063-3071

Wang, W. X. et al., Sichuan.Da.Xue.Xue.Bao.Yi.Xue.Ban. 40 (2009e): 857-860 Wang, X. et al., Int.J Clin Exp.Med. 8 (2015g): 1780-1791

Wang, X. et al., Hum.Pathol.44 (2013h): 2020-2027

Wang, X. et al., Am.J Cancer Res 5 (2015h): 2590-2604

Wang, X. et al., J Biol Chem 290 (2015i): 3925-3935

Wang, X. et al., Oncotarget.7 (2016b): 8029-8042

Wang, X. et al., Hum.Immunol.75 (2014g): 1203-1209

Wang, X. et al., Biochim.Biophys.Acta 1783 (2008): 1220-1228

Wang, X. et al., Int.J Biol Markers 29 (2014h): e150-e159

Wang, X. X. et al., Hepatobiliary.Pancreat.Dis.Int. 12 (2013i): 540-545 Wang, X. X. et al., PLoS.One.9 (2014i): e96501

Wang, Y. et al., J Thorac.Dis.7 (2015j): 672-679

Wang, Y. et al., Oncogene 31 (2012c): 2512-2520

Wang, Y. et al., J Biomed.Sci.22 (2015k): 52

Wang, Y. et al., Pathol.Oncol Res.20 (2014): 611-618

Wang, Y. F. et al., Tumour.Biol 34 (2013j): 1685-1689

Wang, Z. et al., Cancer Res 67 (2007b): 8293-8300

Warfel, N. A. et al., Cell Cycle 12 (2013): 3689-3701

Waseem, A. et al., Oral Oncol 46 (2010): 536-542

Watanabe, M. et al., Proteomics.Clin Appl.2 (2008): 925-935 Watanabe, T. et al., Clin Colorectal Cancer 10 (2011): 134-141

Waters, M. G. et al., Nature 349 (1991): 248-251

2 2

Watson, P. J. et al., Traffic.5 (2004): 79-88

Watts, C. A. et al., Chem Biol 20 (2013): 1399-1410

Wazir, U. et al., Cancer Genomics Proteomics. 10 (2013): 69-73 Wazir, U. et al., Oncol Rep.33 (2015a): 1450-1458

Wazir, U. et al., Oncol Rep.33 (2015b): 2575-2582

Weber, A. M. et al., Pharmacol.Ther (2014)

Weeks, L. D. et al., Mol.Cancer Ther.12 (2013): 2248-2260

Wegiel, B. et al., J Natl.Cancer Inst.100 (2008): 1022-1036

Wei, P. et al., J Transl.Med.11 (2013): 313

Wei, X. et al., Nat Genet.43 (2011): 442-446

Wei, Y. P. et al., Xi.Bao.Yu Fen.Zi.Mian.Yi.Xue.Za Zhi.28 (2012): 354-357 Weidle, U. H. et al., Clin Exp.Metastasis 32 (2015): 623-635 Weigert, O. et al., Cancer Discov 2 (2012): 47-55

Wen, J. L. et al., PLoS.One.10 (2015): e0115622

Wenzel, J. et al., Int.J Cancer 123 (2008): 2605-2615

Werner, S. et al., J Biol Chem 288 (2013): 22993-23008

Weterman, M. A. et al., Cytogenet.Cell Genet.92 (2001): 326-332 Weterman, M. A. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 93 (1996): 15294-15298 Wharton, S. B. et al., Neuropathol.Appl.Neurobiol. 27 (2001): 305-313 Wheler, J. J. et al., BMC.Cancer 15 (2015): 442

Whitaker-Menezes, D. et al., Cell Cycle 10 (2011): 4047-4064 White, C. D. et al., BMC.Gastroenterol.10 (2010): 125

Wijdeven, R. H. et al., Cancer Res 75 (2015): 4176-4187

Wikman, H. et al., Genes Chromosomes.Cancer 42 (2005): 193-199 Willcox, B. E. et al., Protein Sci. 8 (1999): 2418-2423

Williams, K. A. et al., PLoS.Genet.10 (2014): e1004809

Wilson, I. M. et al., Oncogene 33 (2014): 4464-4473

Wilting, S. M. et al., Genes Chromosomes.Cancer 47 (2008): 890-905 Wirtenberger, M. et al., Carcinogenesis 27 (2006): 1655-1660 Wissing, M. D. et al., Oncotarget.5 (2014): 7357-7367

Wong, N. et al., J Hepatol.38 (2003): 298-306

Wong, S. Q. et al., Oncotarget.6 (2015): 1115-1127

Woo, J. et al., Biochem.Biophys.Res Commun.367 (2008): 291-298 Wood, L. M. et al., Cancer Immunol.Immunother.61 (2012): 689-700 Wright, D. G. et al., Anticancer Res 16 (1996): 3349-3351

2

Wrzeszczynski, K. O. et al., PLoS.One. 6 (2011): e28503 Wu, C. et al., BMC.Bioinformatics.13 (2012a): 182

Wu, C. C. et al., Proteomics.Clin Appl.2 (2008): 1586-1595 Wu, C. C. et al., Biochim.Biophys.Acta 1823 (2012b): 2227-2236 Wu, C. Y. et al., J Biomed.Sci.18 (2011a): 1

Wu, H. et al., Nat Med.17 (2011b): 347-355

Wu, H. C. et al., Nat Commun.5 (2014a): 3214

Wu, J. et al., Oncogene 31 (2012c): 333-341

Wu, J. et al., ACS Chem Biol 8 (2013a): 2201-2208

Wu, M. Z. et al., Cancer Res 75 (2015): 3912-3924

Wu, T. et al., Hepatology 36 (2002): 363-373

Wu, T. T. et al., Chin J Physiol 49 (2006): 192-198

Wu, W. et al., Cancer Res 67 (2007): 951-958

Wu, X. et al., Hum.Mol.Genet.21 (2012d): 456-462

Wu, Y. et al., Biomed.Res 33 (2012e): 75-82

Wu, Y. et al., Cancer Sci.103 (2012f): 1820-1825

Wu, Y. et al., Cell Rep.5 (2013b): 224-236

Wu, Y. et al., J Surg.Oncol 105 (2012g): 724-730

Wu, Z. et al., Neoplasia.11 (2009): 66-76

Wu, Z. et al., Breast Cancer Res 16 (2014b): R75

Wu, Z. B. et al., J Immunol.Res 2014 (2014c): 131494 Wu, Z. Y. et al., Scand.J Immunol.74 (2011c): 561-567 Wurdak, H. et al., Cell Stem Cell 6 (2010): 37-47

Xia, Luo et al., Reprod.Sci. 17 (2010): 791-797

Xia, Q. S. et al., Zhonghua Yi.Xue.Za Zhi.91 (2011): 554-559 Xiang, X. et al., PLoS.One. 7 (2012): e50781

Xiang, Y. J. et al., PLoS.One. 9 (2014): e109449

Xiao, F. et al., Hum.Genet.133 (2014): 559-574

Xiao, J. et al., J Biol.Chem. 276 (2001): 6105-6111

Xiao, W. et al., Nucleic Acids Res 26 (1998): 3908-3914 Xiao, X. et al., J Transl.Med. 11 (2013): 151

Xin, B. et al., Oncogene 24 (2005): 724-731

Xin, H. et al., Oncogene 22 (2003): 4831-4840

Xin, Z. et al., Virchows Arch.465 (2014): 35-47

Xing, Q. T. et al., Onco.Targets.Ther. 7 (2014): 881-885

2 4

Xu, C. et al., Biomarkers 20 (2015a): 271-274

Xu, C. Z. et al., Int.J Clin Exp.Pathol. 6 (2013a): 2745-2756 Xu, H. et al., J Clin Oncol 30 (2012): 751-757

Xu, J. et al., Oncol Rep.34 (2015b): 1424-1430

Xu, L. et al., Zhongguo Fei.Ai.Za Zhi.14 (2011): 727-732

Xu, W. et al., Med.Oncol 32 (2015c): 96

Xu, X. et al., IUBMB.Life 65 (2013b): 873-882

Xu, X. et al., Zhonghua Bing.Li Xue.Za Zhi.43 (2014a): 177-183 Xu, Y. et al., PLoS.One.9 (2014b): e100127

Xu, Y. et al., PLoS.One.8 (2013c): e64973

Xu, Y. et al., Oncol Lett.7 (2014c): 1474-1478

Xu, Y. F. et al., BMC.Cancer 15 (2015d): 332

Xu, Z. et al., Leuk.Res 33 (2009): 891-897

Xu, Z. et al., Anat.Rec.(Hoboken.) 295 (2012): 1446-1454 Xue, L. Y. et al., Zhonghua Zhong.Liu Za Zhi.32 (2010): 838-844 Yakimchuk, K. et al., Mol.Cell Endocrinol. 375 (2013): 121-129 Yamada, H. et al., Genes Chromosomes.Cancer 47 (2008): 810-818 Yamada, H. Y. et al., Oncogene 25 (2006): 1330-1339 Yamada, R. et al., Tissue Antigens 81 (2013): 428-434 Yamada, Y. et al., Jpn.J Cancer Res 90 (1999): 987-992 Yamamoto, S. et al., Ann.Surg.Oncol 14 (2007): 2141-2149 Yamashita, J. et al., Acta Derm.Venereol. 92 (2012): 593-597 Yamauchi, T. et al., Environ.Health Prev.Med.19 (2014): 265-270 Yamazaki, M. et al., Lab Invest 94 (2014): 1260-1272 Yamazoe, S. et al., J Exp.Clin Cancer Res 29 (2010): 53

Yan, C. et al., J Ovarian.Res 7 (2014a): 78

Yan, H. X. et al., J Biol Chem 281 (2006): 15423-15433

Yan, L. et al., Tumour.Biol 34 (2013a): 4089-4100

Yan, Q. et al., Mol.Cell Biol 33 (2013b): 845-857

Yan, X. et al., Int.J Clin Exp.Pathol. 7 (2014b): 8715-8723 Yan, X. B. et al., Mol.Med.Rep. 10 (2014c): 2720-2728

Yan, Y. et al., PLoS.One.8 (2013c): e81905

Yang, H. et al., Cancer Res 68 (2008a): 2530-2537

Yang, H. Y. et al., J Proteomics. 75 (2012a): 3639-3653

Yang, J. et al., Neurosurg.Clin N.Am.23 (2012b): 451-458

2

Yang, J. et al., Cell Biochem.Biophys. 70 (2014a): 1943-1949 Yang, J. J. et al., Blood 120 (2012c): 4197-4204

Yang, J. L. et al., Int.J Cancer 89 (2000): 431-439

Yang, P. et al., Mol.Cell Biol 32 (2012d): 3121-3131

Yang, P. et al., Curr.Pharm.Des 21 (2015a): 1292-1300

Yang, P. et al., Zhonghua Yi.Xue.Za Zhi.93 (2013): 5-7

Yang, T. et al., Tumour.Biol 35 (2014b): 11199-11207

Yang, T. et al., J Biol Chem 278 (2003): 15291-15296

Yang, W. et al., Mol.Med.Rep. 10 (2014c): 1205-1214

Yang, X. et al., Pathol.Oncol Res 20 (2014d): 641-648

Yang, Y. et al., Biochem.Biophys.Res Commun.332 (2005): 181-187 Yang, Y. et al., Biochem.Biophys.Res Commun.450 (2014e): 899-905 Yang, Y. et al., Cancer Discov 4 (2014f): 480-493

Yang, Y. et al., Exp.Oncol 30 (2008b): 81-87

Yang, Y. et al., Mol.Cell 58 (2015b): 47-59

Yang, Y. L. et al., Leuk.Res 34 (2010): 18-23

Yang, Y. M. et al., Cancer Sci.102 (2011): 1264-1271

Yang, Z. et al., Int.J Med.Sci.12 (2015c): 256-263

Yao, J. et al., Cancer Immunol.Res. 2 (2014a): 371-379

Yao, X. et al., Biochem.Biophys.Res Commun.455 (2014b): 277-284 Yao, Y. S. et al., Clin Transl.Sci. 8 (2015): 137-142

Yasen, M. et al., Clin Cancer Res 11 (2005): 7354-7361

Yasen, M. et al., Int.J Oncol 40 (2012): 789-797

Ye, C. et al., J Neurochem.133 (2015): 273-283

Ye, Z. et al., Int.J Clin Exp.Med. 8 (2015): 3707-3715

Yeates, L. C. et al., Biochem.Biophys.Res Commun.238 (1997): 66-70 Yeh, I. et al., Am.J Surg.Pathol.39 (2015): 581-591

Yeh, S. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 97 (2000): 11256-11261 Yen, L. C. et al., Clin Cancer Res 15 (2009): 4508-4513

Yi, C. H. et al., Cancer Lett.284 (2009): 149-156

Yildiz, M. et al., Blood 125 (2015): 668-679

Yin, B. W. et al., Cancer Immun.8 (2008): 3

Yin, J. et al., Med.Oncol 31 (2014): 272

Yiu, G. K. et al., J Biol Chem 281 (2006): 12210-12217

Yokota, T. et al., Acta Neuropathol.111 (2006): 29-38

2

Yonezawa, S. et al., Pathol.Int.49 (1999): 45-54

Yongjun Zhang, M. M. et al., J Cancer Res Ther. 9 (2013): 660-663

Yoo, K. H. et al., Oncol Lett.8 (2014): 2135-2139

Yoon, D. H. et al., Eur.J Haematol. 88 (2012): 292-305

Yoon, S. Y. et al., Biochem.Biophys.Res Commun.326 (2005): 7-17

Yoshida, A. et al., Am.J Surg.Pathol. 38 (2014): 552-559

Yoshida, K. et al., Cancer Sci.104 (2013): 171-177

Yoshida, Y. et al., Genes Dev.17 (2003): 1201-1206

Yoshizawa, A. et al., Clin Cancer Res 16 (2010): 240-248

Young, A. N. et al., Am.J Pathol.158 (2001): 1639-1651

Yu, C. J. et al., Int.J Cancer 69 (1996): 457-465

Yu, J. et al., Cancer 88 (2000): 1801-1806

Yu, L. et al., Cancer Res 75 (2015a): 1275-1286

Yu, M. et al., Oncogene 24 (2005): 1982-1993

Yu, W. et al., Carcinogenesis 29 (2008): 1717-1724

Yu, X. et al., Tumour.Biol 36 (2015b): 967-972

Yu, X. F. et al., World J Gastroenterol.17 (2011): 4711-4717

Yu, Z. et al., Mol.Med.Rep.10 (2014): 1583-1589

Yuan, B. et al., Cancer Sci.106 (2015): 819-824

Yuan, J. Y. et al., Oncol Lett.1 (2010): 649-655

Yuan, Y. et al., Am.J Surg.Pathol.33 (2009): 1673-1682

Zage, P. E. et al., Cancer 119 (2013): 915-923

Zagryazhskaya, A. et al., Oncotarget.6 (2015): 12156-12173

Zamkova, M. et al., Cell Cycle 12 (2013): 826-836

Zang, H. et al., Zhonghua Shi Yan.He.Lin.Chuang.Bing.Du Xue.Za Zhi. 26 (2012): 285-287

Zapatero, A. et al., Urol.Oncol 32 (2014): 1327-1332

Zaravinos, A. et al., Tumour.Biol 35 (2014): 4987-5005

Zaremba, S. et al., Cancer Res. 57 (1997): 4570-4577

Zarubin, T. et al., Cell Res 15 (2005): 439-446

Zekri, A. et al., Oncol Res 20 (2012): 241-250

Zekri, A. R. et al., Asian Pac.J Cancer Prev. 16 (2015): 3543-3549

Zeng, X. et al., Ai.Zheng.26 (2007): 1080-1084

Zhai, W. et al., Eur.Rev Med.Pharmacol.Sci.18 (2014): 1354-1360

Zhan, X. et al., Anal.Biochem.354 (2006): 279-289

2

Zhang, B. et al., J Huazhong.Univ Sci.Technolog.Med.Sci. 30 (2010a): 322-325 Zhang, C. et al., J Surg.Res 197 (2015a): 301-306

Zhang, C. et al., BMC.Gastroenterol. 15 (2015b): 49

Zhang, C. Y. et al., Asian J Androl 17 (2015c): 106-110

Zhang, F. et al., J Viral Hepat. 21 (2014a): 241-250

Zhang, F. et al., Cancer Res 63 (2003): 5005-5010

Zhang, G. et al., Oncol Rep.33 (2015d): 1147-1154

Zhang, H. et al., Tumour.Biol 36 (2015e): 997-1002

Zhang, H. et al., Nat Genet.42 (2010b): 755-758

Zhang, H. H. et al., Int.J Clin Exp.Pathol. 6 (2013a): 1734-1746

Zhang, J. et al., Hum.Pathol.46 (2015f): 1331-1340

Zhang, J. et al., Tumour.Biol 36 (2015g): 2163-2168

Zhang, J. et al., PLoS.One.9 (2014b): e109318

Zhang, K. et al., Tumour.Biol 35 (2014c): 4031-4040

Zhang, L. et al., Med.Oncol 32 (2015h): 454

Zhang, L. et al., Mol.Cancer Ther.6 (2007): 1661-1672

Zhang, L. et al., J Cell Mol.Med.19 (2015i): 799-805

Zhang, L. et al., Cancer Res 65 (2005a): 925-932

Zhang, M. et al., J Exp.Clin Cancer Res 34 (2015j): 60

Zhang, M. et al., Cancer Lett.243 (2006): 38-46

Zhang, N. et al., Oncotarget. (2016a)

Zhang, P. et al., Genome 57 (2014d): 253-257

Zhang, S. Q. et al., Mol.Med.Rep. 12 (2015k): 1177-1182

Zhang, W. et al., Epigenetics.10 (2015l): 736-748

Zhang, W. et al., Acta Haematol.130 (2013b): 297-304

Zhang, W. et al., Tumour.Biol (2015m)

Zhang, W. et al., J Biol Chem 286 (2011): 35899-35905

Zhang, W. et al., Biochem.J (2016b)

Zhang, X. et al., Oncotarget. 5 (2014e): 6178-6190

Zhang, X. et al., PLoS.One.8 (2013c): e72458

Zhang, X. et al., Leuk.Res 39 (2015n): 1448-1454

Zhang, Y. et al., Clin Lung Cancer 14 (2013d): 45-49

Zhang, Y. et al., PLoS.One.9 (2014f): e90154

Zhang, Y. J. et al., Cancer Lett.275 (2009): 277-284

Zhang, Y. X. et al., Biomed.Pharmacother. 67 (2013e): 97-102

2

Zhang, Z. et al., Gynecol.Oncol 135 (2014g): 69-73

Zhang, Z. et al., Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev.14 (2005b): 1188-1193 Zhang, Z. et al., J Biol Chem 290 (2015o): 19558-19568

Zhao, C. et al., Neoplasia. 9 (2007): 1-7

Zhao, C. et al., Endocrine.36 (2009): 224-232

Zhao, H. et al., Cancer Gene Ther. 21 (2014a): 448-455

Zhao, H. et al., Cell Tissue Res (2015a)

Zhao, H. et al., Zhonghua Gan Zang.Bing.Za Zhi.10 (2002): 100-102

Zhao, Q. et al., Exp.Ther.Med. 5 (2013a): 942-946

Zhao, X. et al., Cancer Res 65 (2005): 2125-2129

Zhao, X. et al., Onco.Targets.Ther. 7 (2014b): 343-351

Zhao, X. et al., Lab Invest 93 (2013b): 8-19

Zhao, Y. et al., Onco.Targets.Ther. 8 (2015b): 421-425

Zhao, Y. et al., Hum.Pathol.44 (2013c): 365-373

Zhao, Z. et al., Eur.J Surg.Oncol 40 (2014c): 1361-1368

Zhao, Z. et al., RNA.Biol 12 (2015c): 538-554

Zhao, Z. K. et al., Tumour.Biol.34 (2013d): 173-180

Zheng, C. X. et al., Int.J Oncol 43 (2013): 755-764

Zheng, M. et al., Ai.Zheng.23 (2004): 771-776

Zhou, B. et al., Cancer Biol.Ther 13 (2012a): 871-879

Zhou, D. et al., Cancer Cell 16 (2009): 425-438

Zhou, D. et al., PLoS.One.8 (2013a): e53310

Zhou, J. et al., Lung Cancer 14 (1996): 85-97

Zhou, J. et al., J Biol Chem 285 (2010): 40342-40350

Zhou, J. et al., J Surg.Res 188 (2014a): 129-136

Zhou, J. B. et al., Mol.Med.Rep. 7 (2013b): 591-597

Zhou, J. R. et al., Zhonghua Er.Bi Yan.Hou Tou.Jing.Wai Ke.Za Zhi. 42 (2007): 934-938

Zhou, L. et al., Clin Transl.Oncol 16 (2014b): 906-913

Zhou, T. B. et al., J Recept.Signal.Transduct.Res 33 (2013): 28-36

Zhou, X. et al., Arch.Med.Res 42 (2011): 589-595

Zhou, X. et al., Oncotarget.6 (2015a): 41077-41091

Zhou, Y. et al., Am.J Clin Pathol.138 (2012b): 744-750

Zhou, Z. et al., Exp.Cell Res 331 (2015b): 399-407

Zhu, F. et al., Zhongguo Shi Yan.Xue.Ye.Xue.Za Zhi.21 (2013a): 396-398

2

Zhu, J. et al., Asian Pac.J Cancer Prev. 14 (2013b): 3011-3015 Zhu, J. et al., Oncogene (2015)

Zhu, M. et al., Nucleic Acids Res 42 (2014a): 13074-13081 Zhu, Q. et al., Mol.Cell Biol 27 (2007): 324-339

Zhu, S. et al., FEBS Lett.588 (2014b): 981-989

Zhu, X. et al., Gynecol.Oncol 112 (2009): 248-256

Zhu, Z. et al., Carcinogenesis 35 (2014c): 1901-1910

Zi, Y. et al., Int.J Clin Exp.Pathol. 8 (2015): 1312-1320 Ziebarth, J. D. et al., PLoS.One.7 (2012): e47137 Zighelboim, I. et al., Clin Cancer Res 13 (2007): 2882-2889 Zighelboim, I. et al., J Clin Oncol 27 (2009): 3091-3096 Zins, K. et al., Int.J Mol.Sci.16 (2015): 29643-29653 Zohrabian, V. M. et al., Oncol Rep. 18 (2007): 321-328 Zou, C. et al., Cancer 118 (2012): 1845-1855

Zou, J. X. et al., Mol.Cancer Res 12 (2014a): 539-549 Zou, S. et al., Nat Commun.5 (2014b): 5696

Zou, T. T. et al., Oncogene 21 (2002): 4855-4862

Zou, W. et al., Cancer Sci.101 (2010): 2156-2162

Zou, Y. et al., Biomed.Rep. 3 (2015): 33-37

Zubor, P. et al., Mol.Biol.Rep. 42 (2015): 977-988

Zuo, G. W. et al., Histol.Histopathol.25 (2010): 795-806

21

22

2

21

22

2

24

2

24

2

21

22

2

24

2

21

22

2

24

2

21

22

2

24

2

21

22

2

24

2

21

22

2

24

2

1

2

4

1

11

12

1

14

1

2

21

22

2

24

2

1

2

4

Claims

Patentni zahtevi

1. Peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu u skladu sa ID BR. SEKV. 11; ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

2. Peptid u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačen time što navedeni peptid sadrži nepeptidne veze.

3. Peptid u skladu sa patentnim zahtevom 1 ili 2, naznačeno time što je navedeni peptid fuzioniran sa N-terminalnim aminokiselinama HLA-DR antigen-asociranog nepromenljivog lanca (Ii).

4. T-ćelijski receptor, poželjno rekombinantni, rastvorljivi ili T-ćelijski receptor vezan za membranu koji je specifično reaktivan sa HLA ligandom, naznačeno time što se navedeni ligand sastoji od aminokiselinske sekvence ID BR. SEKV.11.

5. Antitelo, konkretno solubilno ili antitelo vezano za membranu, koje specifično prepoznaje peptid u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 ili 2 kada je vezan za MHC molekul.

6. Nukleinska kiselina koja kodira peptid u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 3 ili TCR u skladu sa patentnim zahtevom 4 ili antitelo u skladu sa patentnim zahtevom 5, opciono povezana sa heterolognom promoterskom sekvencom, ili vektor ekspresije koji eksprimira navedenu nukleinsku kiselinu.

7. Rekombinantna ćelija domaćin koja sadrži peptid u skladu sa patentnim zahtevom 1 do 3, ili nukleinska kiselina ili vektor ekspresije u skladu sa patentnim zahtevom 6, naznačeno time što je navedena ćelija domaćin poželjno antigenprezentujuća ćelija kao što je dendritična ćelija ili naznačeno time što je ćelija domaćin poželjno T ćelija ili NK ćelija.

8. Metod za proizvodnju peptida u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 3, ili za proizvodnju T ćelijskog receptora u skladu sa patentnim zahtevom 4 ili antitelo u skladu sa patentnim zahtevom 5, pri čemu se metod sastoji od kultivisanja ćelije domaćina u skladu sa patentnim zahtevom 7 koja prezentuje peptid u skladu sa patentnim zahtevom 1 do 3 ili eksprimira nukleinsku kiselinu ili vektor ekspresije u skladu sa patentnim zahtevom 6 i izolovanja peptida ili TCR-a ili antitela iz ćelije domaćina ili njenog medijuma za kultivaciju.

9. In vitro metod za proizvodnju aktiviranih T limfocita, pri čemu se metod sastoji od dovođenja u kontakt in vitro T ćelija sa humanim MHC molekulima klase I sa ubačenim antigenom eksprimiranim na površini prikladne antigen-prezentujuće ćelije ili veštačkog konstrukta koji imitira antigen-prezentujuću ćeliju u toku vremenskog perioda koji je dovoljan da se navedene T ćelije aktiviraju na antigenspecifičan način, naznačeno time što je navedeni antigen peptid u skladu sa patentnim zahtevom 1.

10. Aktivirani T limfocit, proizveden pomoću metoda u skladu sa patentnim zahtevom 9, koji selektivno prepoznaje ćeliju koja prezentuje peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u patentnom zahtevu 1.

11. Farmaceutska smeša koja sadrži najmanje jedan aktivan sastojak izabran iz grupe koju čine peptid u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 3, nukleinska kiselina ili vektor ekspresije u skladu sa patentnim zahtevom 4, ćelija u skladu sa patentnim zahtevom 7, aktivirani T limfocit u skladu sa patentnim zahtevom 10 ili antitelo u skladu sa patentnim zahtevom 5 ili T-ćelijski receptor u skladu sa patentnim zahtevom 4, i farmaceutski prihvatljiv nosač, i opciono, dodatne farmaceutski prihvatljive pomoćne materije i/ili stabilizatore.

12. Peptid u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 3, nukleinska kiselina ili vektor ekspresije u skladu sa patentnim zahtevom 4, ćelija u skladu sa patentnim zahtevom 7, aktivirani T limfocit u skladu sa patentnim zahtevom 10 ili antitelo u skladu sa patentnim zahtevom 5 ili T-ćelijski receptor u skladu sa patentnim zahtevom 4 za upotrebu u medicini, poželjno za upotrebu u dijagnostikovanju i/ili lečenju raka, ili za upotrebu u proizvodnji leka protiv raka.

13. Peptid u skladu sa bilo kojim patentnim zahtevom 1 do 3, nukleinska kiselina ili vektor ekspresije u skladu sa patentnim zahtevom 4, ćelija u skladu sa patentnim zahtevom 7, aktivirani T limfocit u skladu sa patentnim zahtevom 10 ili antitelo u skladu sa patentnim zahtevom 5 ili T-ćelijski receptor u skladu sa patentnim zahtevom 4 za upotrebu za dijagnostikovanje i/ili lečenje raka ili za upotrebu u proizvodnji leka protiv raka u skladu sa patentnim zahtevom 13, naznačenog time što je navedeni rak izabran iz grupe koju čine rak jajnika, nesitnoćelijski rak pluća, sitnoćelijski rak pluća, rak bubrega, rak mozga, rak kolona ili rektuma, rak želuca, rak jetre, rak pankreasa, rak prostate, leukemija, rak dojke, karcinom Merkelovih ćelija, melanom, rak jednjaka, rak mokraćne bešike, rak materice, rak žučne kese, rak žučnih puteva i drugi tumori koji pokazuju prekomernu ekspresiju proteina iz kojeg je dobijen peptid u skladu sa ID BR. SEKV 11.

14. Komplet koji se sastoji od:

a) posude koja sadrži farmaceutsku smešu koja sadrži peptid u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 3, nukleinsku kiselinu ili vektor ekspresije u skladu sa patentnim zahtevom 4, ćeliju u skladu sa patentnim zahtevom 7, aktivirani T limfocit u skladu sa patentnim zahtevom 10 ili antitelo u skladu sa patentnim zahtevom 5 ili T-ćelijski receptor u skladu sa patentnim zahtevom 4, u rastvoru ili u liofiliziranom obliku;

b) opciono, druge posude koja sadrži razblaživač ili rastvor za rekonstituciju za liofiliziranu formulaciju;

c) opciono, najmanje još jednog peptida odabranog iz grupe koja se sastoji od ID BR. SEKV 1 do 10 i 12 do 640, i

d) opciono, uputstva za (i) upotrebu rastvora ili (ii) rekonstituciju i/ili upotrebu liofilizirane formulacije, i

e) opciono dalje sadrži jedan ili više od navedenih (iii) pufer, (iv) razblaživač, (v) filter, (vi) igla ili (v) brizgalica.

4