RS61230B1 - Lečenje neuroloških bolesti - Google Patents

Description

Opis

Tehnička oblast pronalaska

[0001] Aspekti i primeri izvođenja prema predmetnom pronalasku odnose se na lečenje neuroloških poremećaja kao što su, na primer, Alchajmerova bolest i Parkinsonova bolest. Konkretno, neki primeri izvođenja se odnose na peptide koagoniste GIP/GLP-1 za upotrebu u lečenju ova dva neurološka poremećaja. U predmetni pronalazak su takođe uključene, između ostalog, farmaceutske kompozicije koje sadrže peptide koagoniste GIP/GLP-1, zajedno sa postupcima za lečenje tih poremećaja, kao i druge predmetne teme.

Osnov pronalaska

[0002] Alchajmerova bolest (AD) je hronični neurodegenerativni poremećaj za koji trenutno ne postoji lek. Medikamenti koji se trenutno prepisuju samo privremeno olakšavaju neke od simptoma. Glavna obeležja bolesti su dezorijentisanost, gubitak pamćenja, gubitak neurona i sinapsi u mozgu, akumulacija beta-amiloidnog proteina u mozgu (amiloidni plakovi) i unutarćelijska agregacija hiperfosforilisanog tau proteina (klupka) (LaFerla i Oddo, 2005; Blennow et al., 2006).

[0003] Parkinsonova bolest (PD) je takođe hronična neurodegenerativna bolest za koju su trenutno dostupni samo medikamenti koji je odlažu. Glavna obeležja su tremor, ukrućenost i gubitak sposobnosti kretanja, degeneracija neurona u bazi mozga (supstancija nigra) i gubitak oslobađanja neurotransmitera, dopamina (Shen, 2010).

[0004] Dijabetes tipa 2 (T2DM) identifikovan je kao faktor rizika za AD i PD (Holscher, 2014), što ukazuje na to da narušavanje insulinskog signalnog puta može da bude faktor pri inicijaciji i ubrzavanju razvoja AD. Epidemiološke studije su utvrdile jasnu korelaciju između T2DM i rizika od razvoja AD ili drugih neurodegenerativnih poremećaja u nekom kasnijem stadijumu (Luchsinger et al., 2004; Ristow, 2004; Ohara et al., 2011). Takođe je pokazano da je insulinski signalni put u mozgu kod AD pacijenata desenzitizovan. Skorašnje studije su pokazale da je mozak AD pacijenata imao povišene nivoe inaktivisanih fosforilisanih insulinskih receptora i IRS-1 sekundarnih glasnika, što je, i jedno i drugo, indicija za insulinsku desenzitizaciju (Moloney et al., 2010; Bomfim et al., 2012; Talbot et al., 2012). Utvrđeno je da je kod PD insulinski signalni put takođe poremećen i povezan sa progresijom bolesti (Morris et al., 2011; Cereda et al., 2012).

[0005] Glukagonu sličan peptid (GLP-1) je endogeni inkretinski peptidni hormon od 30 amino kiselina (Baggio i Drucker, 2007). Stimulacija GLP-1 receptora pospešuje proliferaciju beta ćelija u pankreasu, tako što aktivira proliferaciju matičnih ćelija, olakšava glukozno-zavisnu sekreciju insulina i snižava glukozu u krvi kod pacijenata sa T2DM (Lovshin i Drucker, 2009). Na tržištu su trenutno prisutna tri GLP-1 analoga za lečenje dijabetesa, eksendin-4 (Byetta®, Bydureon®), liksizenatid (Lyxumia®) i liraglutid (Victoza®) (Campbell i Drucker, 2013; Elkinson i Keating, 2013).

[0006] Glukozno-zavisni insulinotropni peptid (GIP), poznat i kao gastrični inhibitorni polipeptid, je inkretinski peptidni hormon od 42 amino kiseline koji aktivira pankreasna ostrvca kako bi pojačao sekreciju insulina i pomogao da se smanji postprandijalna hiperglikemija, slično kao i GLP-1 (Gault et al., 2003). GIP je član sekretinsko/glukagonske familije neuroregulatornih polipeptida koja takođe uključuje oslobađajući faktor hormona rasta. Eksprimiran je u alfa ćelijama pankreasa, endokrinim ćelijama, a takođe i u neuronima u mozgu (Nyberg et al., 2007; Campbell i Drucker, 2013). Takođe je pokazano da GIP pospešuje rast, diferencijaciju, proliferaciju i ćelijsko preživljavanje beta ćelija pankreasa, što potkrepljuje njegove osobine hormona rasta (Gault et al., 2003). Stoga je u toku istraživanje sa ciljem da se razvije GIP kao terapijsko oruđe za lečenje T2DM (Irwin et al., 2006). Trenutno ne postoje analozi GIP peptida koji su odobreni za lečenje T2DM.

[0007] U toku je razmatranje mogućnosti da se dualni peptidi agonisti koji ciljano deluju na više od jednog receptora koriste za lečenje T2DM. Nekoliko peptida koagonista GIP/GLP-1 trenutno je u fazi razvoja u cilju lečenja T2D. Međutim, trenutno ne postoje dualni agonisti GIP/GLP-1 receptora koji su odobreni za upotrebu u lečenju T2DM.

[0008] Nedavna ispitivanja neuroloških svojstava GLP-1 i GIP ukazala su na to da ovi peptidi možda igraju ulogu u prevenciji obeležja neurodegeneracije u nekoliko mišijih modela Alchajmerove bolesti (AD), a takođe i u životinjskim modelima Parkinsonove bolesti (PD).

[0009] Insulin, kao i inkretini u mozgu, ne samo da imaju svojstva slična svojstvima faktora rasta, već takođe obavljaju i modulaciju sinaptičke aktivnosti (Holscher, 2014). Sinapse predstavljaju kontakte između neurona, i važne su za formiranje pamćenja i obradu informacija u mozgu. Direktno ubrizgavanje GLP-1 ili dugotrajnih analoga GLP-1, u mozak, izrazito je pojačalo dugotrajnu potencijaciju sinaptičke transmisije (LTP) u hipokampusu, oblasti mozga koja je uključena u formiranje pamćenja. Smatra se je LTP ćelijski korelat formiranja pamćenja (Bliss i Collingridge, 1993). Pokazano je da analog GLP- 1, liraglutid pojačava LTP u mozgu pacova (McClean et al., 2010).

[0010] Osim toga, analozi GLP-1 bili su u stanju da spreče narušavanje LTP indukovano betaamiloidnim fragmentima (Gault i Holscher, 2008a; McClean et al., 2011; Gengler et al., 2012; Han et al., 2013). Ovo narušavanje LTP amiloidnim proteinom moglo bi da predstavlja mehanizam putem koga amiloid izaziva gubitak pamćenja (Cleary et al., 2005). Studija u kojoj je testiran liraglutid u APP/PS1 mišijem modelu AD, pokazala je da ovaj lek može da spreči narušavanje formiranja pamćenja i sinaptičke plastičnosti, smanjenje ukupnog broja sinapsi, da normalizuje proliferaciju matičnih ćelija i neurogenezu u dentatnom girusu, redukuje inflamatorni odgovor i dodatno redukuje opterećenje amiloidnih plakova u korteksu i ukupne nivoe amiloida u mozgu (McClean et al., 2011). U drugoj studiji, liraglutid je takođe imao zaštitne i regenerativne efekte kod veoma starih transgenih miševa, čime je pokazano da čak i na uznapredovalom stadijumu progresije bolesti, pamćenje može do izvesnog stepena da se poboljša, a opterećenje plakova da se redukuje (McClean i Holscher, 2014).

[0011] Na osnovu ovih nalaza u životinjskim modelima, sprovedeno je pilot kliničko ispitivanje kod pacijenata sa Alchajmerovom bolešću. Utvrđeno je da analog GLP-1, liraglutid, obezbeđuje zaštitu od bolešću indukovane degeneracije moždane aktivnosti i korišćenja energije. Ovo pokazuje da lek ulazi u mozak i štiti neurone od štetnih efekata Alchajmerove bolesti, dok neuroni u isto vreme ostaju aktivni i funkcionalni (Gejl et al., 2016). Kliničko ispitivanje faze II za liraglutid, otpočelo je kod AD pacijenata (NCT01843075).

[0012] Osim toga, u jednoj prethodnoj studiji iz ove oblasti ispitivani su efekti agonista GLP-1 receptora, eksendina-4, u 6-hidroksidopaminskom modelu PD. Nakon indukcije lezije, pacovi su tretirani eksendinom-4 i posmatrana je protekcija motoričke aktivnosti. Histološka analiza je pokazala da eksendin-4 značajno povećava broj neurona pozitivnih za tirozin hidroksilazu i vezikularni monoaminski transporter 2 u supstanciji nigri (Bertilsson et al., 2008). U drugoj studiji korišćena su dva glodarska modela PD, 6-hidroksidopaminski (6-OHDA) i lipopolisaharidni (LPS), kako bi se testiralo delovanje eksendina-4. Motorička kontrola je bila u velikoj meri poboljšana u grupi tretiranoj lekom, a koncentracije dopamina u tkivu strijatuma bile su izraženo više. Osim toga, eksendin-4 poništio je gubitak vanćelijskog DA u strijatumu (Harkavyi et al., 2008). Prilikom ispitivanja agonista GLP-1 receptora, liraglutida i liksizenatida, u MPTP mišijem modelu Parkinsonove bolesti, utvrđeno je da oba leka pokazuju dobre efekte na prevenciju motoričkog oštećenja, hroničnog zapaljenja u mozgu i gubitka dopaminergičkih neurona indukovanog toksinom MPTP (Liu et al., 2015).

[0013] Na osnovu ovih studija je inicirano kliničko ispitivanje eksendina-4 kod PD pacijenata. U ovoj studiji je nađeno da su pacijenti imali poboljšanje u nekoliko motoričkih procena i u kognitivnom testu, i da su ta poboljšanja opstajala čak i kad je primena leka prekinuta na 12 meseci (Aviles-Olmos et al., 2013; Aviles-Olmos et al., 2014). Kod pacijenata sa Parkinsonovom bolešću je otpočelo kliničko ispitivanje faze II u kome se ispituje lek liraglutid (NCT02953665).

[0014] Takođe su sprovedene studije kako bi se utvrdilo da li GIP ili analozi GIP imaju efekta kod AD. Utvrđeno je da analozi GIP mogu da spreče narušavanje LTP koje beta-amiloidni fragmenti indukuju kod sinaptičke transmisije u mozgu (Gault i Holscher, 2008b). U mišijem soju sa delecijom GIP receptora, LTP je takođe bila narušena, a facilitacija sparenim pulsnim stimulusima je bila smanjena, ukazujući na redukovano oslobađanje sinaptičkih vezikula (Faivre et al., 2011). Dugoživeći analog GIP, D-Ala<2>-GIP, takođe je imao neuroprotektivne efekte u APP/PS1 mišijem modelu AD. Kod miševa starih 12 meseci, sinaptička plastičnost u CA1 oblasti hipokampusa i formiranja prostornog pamćenja bilo je narušeno kod APP/PS1 miševa, ali je ostalo nenarušeno kod APP/PS1 miševa tretiranih sa D-Ala<2>-GIP. Pored toga, opterećenje amiloidnih plakova bilo je u velikoj meri redukovano, pokazujući upadljivo delovanje na redukciju glavnihobeležja AD bolesti (Faivre i Holscher, 2013b).

[0015] Kod ostarelih AD miševa od 19 meseci, lek je i dalje mogao da poništi neke od simptoma AD kao što je gubitak sinapsi (Faivre i Holscher, 2013a). U longitudinalnoj studiji, oksidativni stres i inflamatorni odgovor u mozgu bili su u velikoj meri redukovani kod APP/PS1 miševa (Duffy i Holscher, 2013). Ovo ukazuje na neuroprotektivna svojstva ovih analoga u AD, kao i na to da oni štite sinapse od štetnih efekata beta-amiloida.

[0016] U MPTP mišijem modelu Parkinsonove bolesti, analog GIP, D-Ala<2>-GIP obezbedio je protekciju i sprečavao narušavanje motoričke aktivnosti, gubitak dopaminergičkih neurona, gubitak sinapsi i hronični inflamatorni odgovor koje indukuje MPTP (Li et al., 2015). Prilikom ispitivanja novog dualnog agonista dualnog GLP-1/GIP u ovom mišijem modelu, utvrđeno je da je pokazao dobre protektivne efekte (Ji et al., 2015). Međutim, taj konkretan molekul nije bio efikasan u istoj meri kao analozi GLP-1.

[0017] Potreba da se identifikuju tretmani za neurološke poremećaje kao što su, na primer, neurodegenerativne bolesti, Alchajmerova bolest i Parkinsonova bolest i dalje postoji.

[0018] Cilj nekih primera izvođenja predmetnog pronalaska je da se najmanje delimično ublaže problemi u vezi sa prethodnim stanjem tehnike.

[0019] Cilj nekih primera izvođenja predmetnog pronalaska je da se obezbedi therapeutski peptid za upotrebu u lečenju i/ili prevenciji neurodegenerativnog poremećaja kao što je, na primer, Alchajmerova bolest i/ili Parkinsonova bolest.

[0020] Cilj nekih primera izvođenja predmetnog pronalaska je da se obezbede dualni peptidi agonisti GIP/GLP-1 koji imaju superiornu efikasnost u poređenju sa najboljim u klasi mono agonista GLP-1, liraglutida, za upotrebu u lečenju i/ili prevenciji Alchajmerove ili Parkinsonove bolesti.

[0021] Cilj nekih primera izvođenja predmetnog pronalaska je da se obezbede dualni peptidi agonisti GIP/GLP-1 koji imaju superiorna svojstva u poređenju sa monoagonistima GIP. Primeri superiornih svojstava uključuju, na primer, veće smanjenje opterećenja beta-amiloidnih plakova i/ili redukciju oštećenja motoričkih sposobnosti.

[0022] Cilj nekih primera izvođenja predmetnog pronalaska je da se obezbede novi dualni peptidi agonisti GIP/GLP-1 za upotrebu u lečenju i/ili prevenciji neurodegenerativnog poremećaja kao što je, na primer, Alchajmerova bolest i/ili Parkinsonova bolest.

Kratak opis pronalaska

[0023] Pronalazak je definisan u patentnim zahtevima. U jednom aspektu predmetnog prikaza obezbeđen je peptidni koagonist GIP/GLP-1 ili njegova farmaceutski prihvatljiva so ili solvat, za upotrebu u lečenju i/ili profilaksi neurološkog poremećaja, gde je peptidni koagonist predstavljen opštom formulom 1:

pri čemu je Xaa<24>izabrano od Asn i Cys;

Y1 je izabrano tako da nedostaje ili da predstavlja ekstenziju koja sadrži najmanje osam amino kiselinskih molekula;

Y2 je izabrano od:

Lys-Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ. ID. No 2);

Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ. ID. No.3)

Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Lys-Lys-Arg-Gly-Tyr (SEQ. ID. No 4); i

Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Lys-Lys-Arg-Gly-Tyr (SEQ. ID. No 5); i

R2 je izabrano od -NH2 ili -OH,

ili derivata ili farmaceutski prihvatljive soli ili solvata peptida ili derivata.

[0024] U nekim aspektima prikaza Y2 je Lys-Lys-Lys-Lys-Lys ili Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys. U nekim aspektima prikaza

[0025] U nekim primerima izvođenja prema prikazu

Xaa24 je Cys. U nekim primerima izvođenja, Xaa<24>je Asn.

[0026] U nekim primerima izvođenja prema prikazu

Y1 je ekstenzija koja sadrži najmanje 10 amino kiselina npr. najmanje 11 amino kiselina.

[0027] U nekim primerima izvođenja prema prikazu, Y1 je izabrano od:

Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser (SEQ. ID. No.6);

Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Lys (SEQ. ID No.7);

Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Cys (SEQ. ID. No.8);

Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser (SEQ. ID. No.9);

Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser (SEQ. ID. No.10); i

odsustvovanja.

[0028] Pogodno, Y1 je Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser (SEQ. ID. No. 6). U ovom prikazu Y1 je Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Cys (SEQ. ID. No 8). U alternativnom primeru izvođenja, Y1 je Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Lys (SEQ. ID. No.7).

[0029] U nekim primerima izvođenja, peptid sadrži hidrofilnu komponentu kovalentno vezanu za amino kiselinu. U nekim primerima izvođenja, peptid sadrži hidrofilnu komponentu kovalentno vezanu za amino kiselinu na poziciji 24.

[0030] U nekim primerima izvođenja, peptid sadrži hidrofilnu komponentu kovalentno vezanu za amino kiselinu na poziciji 39 ili 40, kada Y1 predstavlja produžetak koji sadrži najmanje 10 amino kiselina ili najmanje 11 amino kiselina.

[0031] U nekim primerima izvođenja, Xaa<39>ili Xaa<40>je Cys i peptid sadrži hidrofilnu komponentu koja je kovalentno vezana za Cys(39) ili Cys(40).

[0032] U nekim primerima izvođenja, Xaa<24>je Cys i peptid sadrži hidrofilnu komponentu kovalentno vezanu za Cys(24).

[0033] U nekim primerima izvođenja, hidrofilna komponenta je polimer rastvorljiv u vodi.

[0034] U nekim primerima izvođenja, polimer rastvorljiv u vodi je polietilen glikolna komponenta, a izborno je polietilen glikolna komponenta koja ima molekulsku težinu od između oko 20,000 daltona i oko 60,000 daltona. U nekim primerima izvođenja, peptid je konjugovan sa lipofilnim supstituentom.

[0035] U nekim primerima izvođenja, lipofilni supstituent sadrži ugljovodonični lanac koji ima 8 do 24 atoma ugljenika (C). U nekim primerima izvođenja, lipofilni supstituent sadrži acil grupu.

[0036] U nekim primerima izvođenja, lipofilni supstituent je molekul masne kiseline. Pogodno, molekul masne kiseline je izabran od C-8 oktanoil grup, C-10 dekanoil grupe,C-12 lauroil grupe, C-14 miristoil grupe, C-16 palmitoil grupe, C-18 stearoil grupe i C-20 acil grupe. U nekim primerima izvođenja, lipofilni supstituent je vezan za amino kiselinu na karboksilnom terminusu peptida. U nekim primerima izvođenja, lipofilni supstituent je vezan za amino kiselinu na poziciji 40. Pogodno, lipofilni supstituent je kovalentno vezan za bočni lanac amino kiseline peptida.

[0037] U nekim primerima izvođenja, peptid sadrži spejser koji konjuguje lipofilni supstituent sa amino kiselinskim ostatkom. Pogodno, spejser je ostatak amino kiseline koja se javlja ili koja se ne javlja u prirodi, pri čemu spejser sadrži ostatak Gly, Pro, Ala, Val, Leu, Ile, Met, Cys, Phe, Tyr, Trp, His, Lys, Arg, Gln, Asn, α-Glu, γ-Glu, ε-Lys, Asp, Ser, Thr, Gaba, Aib, βaminoheksonil, 7-aminoheptanoil, 8-aminooktanoil, 9-aminononanoil, 10-aminodekanoil ili 8 -amino-3,6- dioksaoktanoil.

[0038] U nekim primerima izvođenja, spejser je γ-Glu. U nekim primerima izvođenja, spejser je dipeptid, pri čemu, izborno, spejser sadrži dve negativno naelektrisane amino kiseline i dodatno izborno, pri čemu je spejser γ-Glu-γ-Glu.

[0039] U nekim primerima izvođenja, peptid sadrži amino kiselinsku sekvencu: YXEGTFTSDYSIYLDKQAAXEFVNWLLAGGPSSGAPPPSKKKKKK-NH2 (SEQ. ID. No.

11)

pri čemu je X = aminoizobuterna kiselina.

[0040] U nekim primerima izvođenja, peptid se u osnovi sastoji od amino kiselinske sekvence: YXEGTFTSDYSIYLDKQAAXEFVNWLLAGGPSSGAPPPSKKKKKK-NH2 (SEQ. ID. No.

11)

pri čemu je X = aminoizobuterna kiselina.

[0041] U nekim primerima izvođenja, peptid sadrži amino kiselinsku sekvencu:

YXEGTFTSDYSIYLDKQAAXEFVNWLLAGGPSSGAPPPSKRRQRRKKRGY-NH2 (SEQ. ID. No.12)

pri čemu je X = aminoizobuterna kiselina.

[0042] Pogodno, peptid se u osnovi sastoji od amino kiselinske sekvence:

YXEGTFTSDYSIYLDKQAAXEFVNWLLAGGPSSGAPPPSKRRQRRKKRGY-NH2 (SEQ. ID. No.12)

pri čemu je X = aminoizobuterna kiselina.

[0043] U dodatnom aspektu predmetnog pronalaska, obezbeđen je peptid kao što je ovde opisan, za upotrebu u lečenju i/ili profilaksi neurološkog poremećaja.

[0044] U dodatnom aspektu predmetnog pronalaska, obezbeđen je peptid kao što je ovde opisan, za upotrebu u lečenju neurološkog poremećaja koji je uzrokovan, ili povezan sa, taloženjem plakova beta-amiloidnog proteina u nekoj oblasti tela pacijenta. U nekim primerima izvođenja, do taloženja plakova beta-amiloidnog proteina dolazi u mozgu pacijenta.

[0045] U dodatnom aspektu predmetnog pronalaska, obezbeđen je peptid, kao što je ovde opisan, za upotrebu u lečenju i/ili profilaksi neurološkog poremećaja koji je uzrokovan, ili povezan sa, disfunkcijom dugotrajne potencijacije sinaptičke transmisije.

[0046] U dodatnom aspektu predmetnog pronalaska, obezbeđen je peptid, kao što je ovde opisan, za upotrebu u lečenju i/ili profilaksi neurološkog poremećaja koji je uzrokovan, ili povezan sa, inflamacijom.

[0047] U dodatnom aspektu predmetnog pronalaska, obezbeđen je peptid, kao što je ovde opisan, za upotrebu u lečenju neurološkog poremećaja povezanog sa motoričkim oštećenjem.

[0048] U dodatnom aspektu predmetnog pronalaska, obezbeđen je peptid kao što je ovde opisan, za upotrebu u lečenju i/ili profilaksi neurološkog poremećaja koji pogađa kognitivnu funkciju, npr. demencije, šizofrenije, i/ili bipolarnog poremećaja.

[0049] U nekim primerima izvođenja, poremećaj je cerebralna ishemija povezana sa moždanim udarom.

[0050] U nekim primerima izvođenja, peptid je za upotrebu u lečenju i/ili profilaksi poremećaja izabranog od posttraumatskog stresnog poremećaja, epilepsije, Turetovog sindroma i halucinacija; kao i disfunkcionalnih kognitivnih procesa, opciono izabranih od pažnje, računanja, pamćenja, procenjivanja, uvida, učenja i rasuđivanja.

[0051] U nekim primerima izvođenja, peptid je za upotrebu u lečenju i/ili profilaksi neurodegenerativnog poremećaja npr. Alchajmerove bolesti, Parkinsonove bolesti, amiotrofične lateralne skleroze, periferne neuropatije, Hantingtonove bolesti i Krojcfeld-Džejkobove bolesti. Pogodno, neurološki poremećaj je multipla skleroza.

[0052] U nekim primerima izvođenja, peptid je za upotrebu u lečenju i/ili profilaksi neurološkog poremećaja izabranog od kliničke ili prekliničke Alchajmerove bolesti, prodromalne Alchajmerove bolesti, i kliničke ili prekliničke amiloidne angiopatije (CAA).

[0053] Pogodno, peptid je za upotrebu u lečenju i/ili profilaksi kliničke Alchajmerove bolesti. U dodatnom aspektu predmetnog pronalaska, obezbeđen je peptid kao što je opisan u ovom dokumentu, za upotrebu u lečenju i/ili profilaksi Parkinsonove bolesti.

[0054] Takođe je obezbeđen postupak lečenja i/ili prevencije neurološkog poremećaja, kao što je ovde opisano, pri čemu postupak obuhvata primenu farmaceutski efikasne količine peptida koagonista GIP/GLP-1, kao što je ovde opisano, kod subjekta kome je to potrebno.

[0055] U dodatnom aspektu predmetnog prikaza, obezbeđen je postupak lečenja i/ili prevencije neurološkog poremećaja, koji obuhvata primenu kod pacijenta kome je to potrebno, farmaceutske kompozicije koja sadrži peptid koagonist GIP/GLP-1, ili derivat ili farmaceutski prihvatljivu so ili solvat peptida ili derivata, gde je navedeni peptid koagonist predstavljen opštom formulom I:

pri čemu je Xaa<24>izabrano od Asn i Cys;

Y1 je ili odsutno ili predstavlja ekstenziju koja sadrži najmanje osam amino kiselinskih molekula;

Y2 je izabrano od:

Lys-Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ. ID. No 2);

Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ. ID. No.3)

Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Lys-Lys-Arg-Gly-Tyr (SEQ. ID. No 4); i

Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Lys-Lys-Arg-Gly-Tyr (SEQ. ID. No 5); i

R2 je izabrano od -NH2 ili -OH,

ili derivata ili farmaceutski prihvatljive soli ili solvata peptida ili derivata.

[0056] Pogodno, peptid je kao što je opisan u ovom dokumentu.

[0057] U nekim primerima izvođenja, neurološki poremećaj je izabran od posttraumatskog stresnog poremećaja, epilepsije, Turetovog sindroma i halucinacija; kao i disfunkcionalnih kognitivnih procesa, opciono izabranih od pažnje, računanja, pamćenja, procenjivanja, uvida, učenja i rasuđivanja.

[0058] U nekim primerima izvođenja, neurološki poremećaj je neurodegenerativni poremećaj. Pogodno, neurodegenerativni poremećaj je izabran od Alchajmerove bolesti, Parkinsonove bolesti, Hantingtonove bolesti, amiotrofične lateralne skleroze, periferne neuropatije i Krojcfeld-Džejkobove bolesti.

[0059] U nekim primerima izvođenja, neurološki poremećaj je neurološki poremećaj izabran od kliničke ili prekliničke Alchajmerove bolesti, prodromalne Alchajmerove bolesti, i kliničke ili prekliničke amiloidne angiopatije (CAA). Pogodno, neurološki poremećaj je klinička Alchajmerova bolest.

[0060] U dodatnom aspektu predmetnog pronalaska, obezbeđen je peptid za upotrebu u lečenju i/ili profilaksi kliničke Alchajmerove bolesti, gde se peptid sastoji od sledeće sekvence:

YXEGTFTSDYSIYLDKQAAXEFVNWLLAGGPSSGAPPPSKKKKKK-NH2 (SEQ. ID. No.

11)

pri čemu je X = aminoizobuterna kiselina.

[0061] U dodatnom aspektu predmetnog pronalaska, obezbeđen je peptid za upotrebu u lečenju i/ili profilaksi kliničke Alchajmerove bolesti, gde se peptid sastoji od sledeće sekvence:

1

YXEGTFTSDYSIYLDKQAAXEFVNWLLAGGPSSGAPPPSKRRQRRKKRGY-NH2 (SEQ. ID. No.12)

pri čemu je X = aminoizobuterna kiselina.

[0062] U jednom primeru izvođenja, peptid sadrži ili se sastoji od sledeće amino kiselinske sekvence:

YXEGTFTSDYSIYLDKQAAXEFVNWLLAGGPSSGAPPPSKKKKKK-NH2 (SEQ. ID. No.

11) X = aminoizobuterna kiselina

[0063] Ovde se ovaj peptid označava kao "DA4" i ima amino kiselinsku sekvencu kao što je izložena u SEQ. ID. No.11.

[0064] U jednom primeru izvođenja, peptid sadrži ili se sastoji od sledeće amino kiselinske sekvence:

YXEGTFTSDYSIYLDKQAAXEFVNWLLAGGPSSGAPPPSKRRQRRKKRGY-NH2 (SEQ. ID. No.12)

X = aminoizobuterna kiselina

[0065] Ovde se ovaj peptid označava kao "DA5" i ima amino kiselinsku sekvencu kao što je izložena u SEQ. ID. No.12.

[0066] Sposobnost prolaska kroz krvno-moždanu barijeru može da ima primenu u lečenju neurodegenerativnih poremećaja. Bez ograničenja u teoriji, smatra se da su peptidi nekih primera izvođenja prema predmetnom pronalasku u stanju da prolaze kroz krvno-moždanu barijeru. Štaviše, peptidi prema nekim primerima izvođenja prolaze kroz krvno-moždanu barijeru u većoj meri od poznatih peptida koagonista GIP/GLP-1.

[0067] Zabeleženo je da u prenosu peptida kroz krvno-moždanu barijeru mogu da postoje brojne teškoće. Razmatran je određen broj mehanizama za poboljšanje pristupa kroz krvno-moždanu barijeru, od kojih je jedan modifikacija peptidnih sekvenci. Međutim, premda je poznato da određen broj peptidnih modifikacija potencijalno asistira pri prolasku kroz krvno-moždanu barijeru, njihovo ponašanje in vivo je teško predvideti. Njihova adicija molekulu peptida ili proteina može da bude neefikasna i može da dovede do inaktivacije peptida ili proteina, npr. procesom degradacije proteina, nepravilnim obrascima savijanja peptida i/ili promenom svojstava vezivanja peptida za receptor.

[0068] Pogodno, peptid je za upotrebu u lečenju i/ili prevenciji Alchajmerove bolesti ili Parkinsonove bolesti.

[0069] Ovde je takođe obezbeđena farmaceutska kompozicija koja sadrži peptide koagoniste GIP/GLP-1 receptora kako su ovde opisani, i farmaceutski prihvatljiv nosač za upotrebu u lečenju i/ili profilaksi neurološkog poremećaja, kao što je ovde opisano. Dodatno je u predmetnom prikazu obezbeđen kit koji uključuje ovakvu farmaceutsku kompoziciju.

Kratak opis crteža

[0070] Dodatni detalji primera izvođenja prema pronalasku, sa referencom na prateće crteže, samo kao primere, obezbeđeni su u daljem tekstu:

Kako se ovde koristi, skraćenica "DA4" odnosi se na koagonist GIP/GLP-1 koji se sastoji od amino kiselinske sekvence prikazane u SEQ ID. No.11.

Kako se ovde koristi, skraćenica "DA5" odnosi se na koagonist GIP/GLP-1 koji se sastoji od amino kiselinske sekvence prikazane u SEQ ID. No.12.

Slika 1 ilustruje imunohistohemijsko merenje opterećenja beta-amiloidnih plakova u korteksu transgenih miševa (model Alchajmerove bolesti). Svi peptidi su smanjili opterećenje plakova. Oba peptida koagonista (DA4 i DA5) prema primerima izvođenja predmetnog pronalaska bila su superiorna u odnosu na pojedinačne analoge GIP ili GLP-1 i primena DA4 i DA5 smanjila je opterećenja beta-amiloidnih plakova kvantifikovano imunohistohemijom za amiloid i određivanjem % površine pozitivne za beta amiloid u poprečnim presecima moždanog korteksa. *=p<0.05, **=p<0.01; ***=p<0.001. N=6 po grupi.

Slika 2 je grafik koji ilustruje činjenicu da DA4 i DA5 peptidi obezbeđuju zaštitu od gubitka sinapsi u korteksu transgenih miševa (model Alchajmerove bolesti) kvantifikovanu imunohistohemijskim merenjem sinaptičkih gustina u korteksu transgenih miševa. Svi peptidi obezbeđuju zaštitu od gubitka sinapsi. Oba peptida koagonista prema primerima izvođenja predmetnog pronalaska bila su superiorna u odnosu na pojedinačne analoge GIP ili GLP-1. *= p<0.05,

**=p<0.01; ***=p<0.001. N=6 po grupi.

Slika 3 je grafik koji ilustruje činjenicu da DA4 i DA5 peptidi obezbeđuju miševima zaštitu od oštećenja motoričkih sposobnosti delovanjem MPTP koje smanjuje nivo dopamina. Rotarod test motoričkih sposobnosti sproveden je kao što je opisano u daljem tekstu. Zabeleženo je vreme zadržavanja svake životinje, i izračunata je prosečna vrednost. Podaci su analizirani upotrebom jednostrane ANOVA sa Bonferonijevim testovima sa naknadnim poređenjem. Oba peptida koagonista prema primerima izvođenja predmetnog pronalaska bila su superiorna u odnosu na pojedinačne analoge GIP ili GLP-1. Kontrola = miš divljeg soja bez MPTP. *= p<0.05, **=p<0.01; ***=p<0.001. N=6 po grupi.

Slika 4 ilustruje MPTP-indukovano smanjenje enzima TH koji sintetiše dopamin u supstanciji nigri, u kompaktnom delu. I DA4 i DA5 obezbedili su zaštitu za dopaminergičke neurone u većoj meri nego pojedinačni analozi GIP i GLP-1. *= p<0.05, **=p<0.01; ***=p<0.001. N=6 po grupi.

Slika 5 ilustruje činjenicu da DA5 peptid ne utiče na lokomotorne i eksploratorne sposobnosti APP/PS1 miševa i miševa divljeg soja. Test u otvorenom polju izveden je kako bi se merilo spontano ponašanje miševa tretiranih fiziološkim rastvorom/DA5. Statističke analize (p=>0.05) nisu pokazale bilo kakvu razliku između grupa tretiranih fiziološkim rastvorom/DA5 (a,b).

Slika 6 ilustruje poboljšanje prostorne radne memorije APP/PS1 miševa u testu sa Y lavirintom, nakon tretmana DA5 peptidom. Procenat desne alternacije APP/PS1 miševa je bio značajno redukovan. *= p<0.05,**=p<0,01; ***=p<0.001 N=8-14 po grupi.

Slika 7 ilustruje činjenicu da poremećaj prostornog pamćenja uočen kod APP/PS1 miševa može da se poboljša putem tretmana DA5 peptidom. Sproveden je klasičan test u Morisovom vodenom lavirintu i prostorno pamćenje miševa ocenjeno je testom pozivanja memorije, kao što je opisano u daljem tekstu. (Slika 7a,7b) Latencija izlaska svake životinje zabeležena je tokom perioda treninga i izračunat je prosek. (Slika 7c, 7d). Probni test je pokazao da su APP/PS1 miševi tretirani sa DA5 mogli da se sete rute za izlazak u većoj meri nego APP/PS1 miševi tretirani fiziološkim rastvorom. *= p<0.05, **=p<0.01; ***=p<0.001. N=8-14 po grupi.

Slika 8 ilustruje činjenicu da DA5 peptid štiti APP/PS1 miševi od smanjene kognitivne fleksibilnosti i ponovo uspostavlja njihovu sposobnost da uče. Reverzni test sa Morisovim vodenim lavirintom izveden je kao što je opisano u daljem tekstu. (Slika 8a, Slika 8b). Latencija izlaska svake životinje zabeležena je tokom produženog perioda obuke i izračunat je prosek (Slika 8c, 8d). Probni test je pokazao da su APP/PS1 miševi tretirani sa DA5 mogli da se sete promene rute za izlaska u većoj meri nego APP/PS1 miševi tretirani fiziološkim rastvorom. *= p<0.05, **=p<0.01; ***=p<0.001. N=8-14 po grupi.

Slika 9 ilustruje činjenicu da DA5 peptid održava sinaptičku snagu kod APP/PS1 miševa (Slika 9a) Prethodnim tretmanom miševa sa DA5 bilo je moguće da se poništi depresija L-LTP koja se uočava kod APP/PS1 transgenih miševa (Slika 9b) Štaviše, APP/PS1 miševi tretirani sa DA5 održavali su visoke nivoe L-LTP post neuronskih stimulusa. *= p<0.05, **=p<0.01; ***=p<0,001. N=6 po grupi.

Slika 10 je grafik koji ilustruje činjenicu da DA5 redukuje neurofibrilarna klupka kod APP/PS1 miševa. Kvantifikacija imunofluorescentnog bojenja p-tau proteina pokazala je redukciju neurofibrilarnih klupkâ kod APP/PS1 miševi tretiranih sa DA5 u poređenju sa APP/PS1 miševa tretiranih fiziološkim rastvorom. *= p<0.05, **=p<0.01; ***=p<0.001. N=4 po grupi.

Slika 11 prikazuje Western blot i grafike koji ilustruju činjenicu da DA5 može da zaštiti oblike kognitivnog ponašanja i poboljša stanje patoloških promena kod AD miševa. Tretman APP/PS1 miševa sa DA5 sprečeva prekomernu aktivaciju GSKp tako što intenzivira P13/AKT signalizaciju (a-g). *= p<0.05, N=6 po grupi.

Slika 12 daje detalje amino kiselinskih sekvenci peptida koji su ovde opisani.

1

Detaljan opis primera izvođenja prema pronalasku

[0071] Praktikovanje primera izvođenja prema predmetnom pronalasku koristiće, ukoliko nije drugačije naznačeno, konvencionalne tehnike molekularne biologije, mikrobiologije, tehnologije rekombinantne DNK i imunologije, koje spadaju u veštine stručnjaka u oblasti.

[0072] Najopštije tehnike molekularne biologije, mikrobiološke rekombinantne DNK i imunologije, mogu se naći u knjizi Sambrook et al, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2001) Cold Harbor-Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. ili Ausubel et al., Current protocols in molecular biology (1990) John Wiley and Sons, N.Y. Ukoliko nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni izrazi koji se ovde koriste imaju isto značenje kao i ono koje za njih podrazumeva prosečno obučen stručnjak u oblasti kojoj pripada ovaj prikaz. Na primer, Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., Academic Press; i Oxford University Press, obezbeđuju za stručnjaka u oblasti opšti rečnik mnogih izraza koji se koriste u ovom prikazu.

[0073] Predmetni prikaz se odnosi na upotrebu peptida koagonista GIP/GLP-1. U oblasti su poznate nativne sekvence humanog GLP-1 peptida i GIP peptida. Izraz „GLP-1“ ili „hGLP-1“, kako se ovde koristi, odnosi se na humani glukagonu sličan peptid-1 (GLP-1 (7-37)), čija je sekvenca ovde uključena kao SEQ ID. No.13.

[0074] Peptid koji ima sekvencu SEQ ID. No 13 može da bude označen i kao „nativni“ GLP-1.

[0075] Sekvenca GLP-1(7-37) vrste Homo sapiens je:

HAEGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLVKGR G-OH (SEQ ID No.13).

[0076] Izraz „GIP „ ili „hGIP“, kako se ovde koristi, odnosi se na humani gastrični inhibitorni peptid (takođe poznat kao glukozno-zavisni insulinotropni peptid), čija je sekvenca u ovaj dokument uključena kao SEQ. ID. No.14. Peptid koji ima sekvencu SEQ. ID. No.14 može da se označava i kao „nativni“ GIP:

YAEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKGKKNDWKHNITQ-OH (SEQ ID. No 14).

[0077] Kako se ovde koristi, predviđeno je da uopštena referenca na „GIP“ ili „GLP-1“, u odsustvu bilo kakve druge oznake, označava nativni GIP ili nativni GLP-1, redom.

[0078] Kako se ovde koristi, izraz „peptid“ obuhvata sekvencu od 3 ili više amino kiselina i tipično manje od 50 amino kiselina, pri čemu amino kiseline predstavljaju amino kiseline koje se pojavljuju u prirodi i one koje se ne pojavljuju u prirodi. Amino kiseline koje se ne pojavljuju u prirodi odnose se na amino kiseline koje se u prirodi ne javljaju in vivo, ali koje, bez obzira na to, mogu da se ugrade u ovde opisane peptidne strukture.

[0079] Kako se ovde koriste, izrazi „polipeptid“ i „protein“ su izrazi koji se naizmenično koriste kako bi se označio polimer amino kiselina, bez obzira na dužinu tog polimera. Uobičajeno, polipeptidi i proteini imaju dužinu polimera koja je veća od dužine „peptida“.

[0080] Kako se ovde koristi, amino kiselinska „modifikacija“ odnosi se na supstituciju, adiciju ili deleciju amino kiseline, i uključuje supstituciju nekom od ili adiciju neke od, 20 amino kiselina koje su uobičajeno prisutne u humanim proteinima, kao i atipičnim amino kiselinama i amino kiselinama koje se ne javljaju u prirodi. Kroz celu ovu patentnu prijavu, sve reference na konkretnu poziciju aminokiseline, putem broja, (npr. pozicija 28), odnose se na amino kiselinu na toj poziciji u dualnom agonistu GIP/GLP-1 iz primera izvođenja prema predmetnom pronalasku.

[0081] Kroz celu ovu specifikaciju, za prirodne amino kiseline se koriste konvencionalni kodovi od jednog i od tri slova, kao i opšteprihvaćeni kodovi od tri slova za druge amino kiseline, kao što je na primer Aib (aminoizobuterna kiselina).

[0082] Dakle, u jednom aspektu predmetnog pronalaska, obezbeđen je peptid koagonist GIP/GLP-1, ili derivat ili farmaceutski prihvatljiva so ili solvat peptida ili derivata, za upotrebu u lečenju i/ili profilaksi neurološkog poremećaja. Pogodno, peptid koagonist ima GLP-1 procentualnu potenciju u okviru od oko 10 GIP procentualnih potencija.

[0083] Kako se ovde koristi, izraz „agonist“ odnosi se na supstancu (ligand) koja aktivira tip receptora o kome se radi. Izrazi „dualni agonist“ i „koagonist“ ovde se koriste naizmenično i odnose se na supstancu (ligand) koja aktivira dva tipa receptora. Pogodno, ovde opisani peptidi koagonisti GIP/GLP-1 imaju uravnoteženu aktivnost pri delovanju na oba receptora, GLP-1R i GIPR. U jednom primeru izvođenja, peptid koagonist ima EC50vrednost na humanom GLP-1 receptoru u okviru od oko 10 EC50vrednosti na humanom GIP receptoru. Aktivnost u in vitro testovima može da se koristi kao mera aktivnosti peptida.

[0084] Pogodno, ovde opisani peptidi sintetišu se putem peptidne sinteze na čvrstoj fazi ili u tečnoj fazi, kao što je, na primer, opisano u WO98/11125. Pogodno, peptidi mogu da se sintetišu kao što je opisano u publikaciji Finan et al. (Sci. Transl. Med.5 209ra151 (2013) str.1 do 16).

[0085] Peptidi prema predmetnom prikazu mogu da budu formulisani kao farmaceutske kompozicije pripremljene za skladištenje ili primenu, za upotrebu u lečenju i/ili prevenciji neurološkog poremećaja, kao što je ovde opisano. Ovakva kompozicija uobičajeno sadrži terapeutski efikasnu količinu peptida koagonista GIP/GLP-1, u pogodnom obliku, u farmaceutski prihvatljivom nosaču.

[0086] Terapeutski efikasna količina peptida koagonista GIP/GLP-1 zavisiće, kao što je ovde opisano, od rute primene, vrste sisara koji se leči, i fizičkih karakteristika konkretnog sisara koji se razmatra. Ovi faktori i njihov odnos sa načinom određivanja ove količine, dobro su poznati

1

obučenim stručnjacima u oblasti medicine. Ova količina i postupak primene mogu da se prilagode tako da se postigne optimalna efikasnost, i mogu da zavise od faktora kao što su težina, način ishrane, medikamenti koji se istovremeno uzimaju, i od drugih faktora koji su dobro poznati obučenim stručnjacima u oblasti medicine. Peptidi prema predmetnom prikazu mogu da budu naročito korisni za lečenje ljudi.

[0087] Protokol za efikasno doziranje i lečenje moguće je odrediti konvencionalnim sredstvima, počevši od niske doze kod laboratorijskih životinja, a zatim povećavajući dozu, uz praćenje efekata i, takođe, uz sistematsko variranje režima doziranja. Kada određuje optimalnu dozu za dati subjekt, klinički lekar može da razmatra brojne faktore. Ova razmatranja su poznata stručnjaku u oblasti.

[0088] Izraz „farmaceutski prihvatljiv nosač“ uključuje bilo koji od standardnih farmaceutskih nosača. Farmaceutski prihvatljivi nosači za terapijsku upotrebu su dobro poznati u oblasti farmacije, i opisani, na primer, u izdanju Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.R.Gennaro edit. 1985). Na primer, mogu da se koriste sterilni fiziološki rastvor i fosfatni puferovani fiziološki rastvor i fosfatni puferovan fiziološki rastvor na blago kiselom ili fiziološkom pH. Sredstva za puferovanje pH mogu da budu fosfat, citrat, acetat, tris/hidroksimetil)aminometan (TRIS), N-Tris(hidroksimetil)metil-3-aminopropansulfonska kiselina (TAPS), amonijum bikarbonat, dietanolamin, histidin, arginin, lizin ili acetat, ili njihove smeše. Izraz dodatno obuhvata bilo koja sredstva za upotrebu kod životinja, uključujući ljude, navedena u SAD Farmakopeji.

[0089] Izraz „farmaceutski prihvatljiva so“ odnosi se na so bilo kog od peptida koagonista GIP/GLP-1 iz primera izvođenja prema pronalasku. Soli uključuju farmaceutski prihvatljive soli kao što su kisele adicione soli i bazne soli. Primeri kiselih adicionih soli uključuju hidrohloridne soli, citratne soli i acetatne soli. Primeri baznih soli uključuju soli kod koji je katjon izabran od alkalnih metala, kao što su natrijum i kalijum, zemnoalkalnih metala, kao što su kalcijum i amonijum joni N(R3) 4

3(R4), gde R3 i R nezavisno označavaju izborno supstituisani C1-6-alkil, izborno supstituisani C2-6-alkenil, izborno supstituisani aril ili izborno supstituisani heteroaril. Drugi primeri farmaceutski prihvatljivih soli su opisani u "Remington’s Pharmaceutical Sciences", 17. izdanje Ed. Alfonoso R. Gennaro (Ed.), Mark Publishing Company, Easton, PA, SAD 1985 i skorijim izdanjima, i u enciklopediji Encyclopaedia of Pharmaceutical Technology.

[0090] Izraz „solvat“ u kontekstu predmetnog prikaza odnosi se na kompleks sa definisanom stehiometrijom koji se obrazuje između rastvorene supstance (npr., peptid ili njegova farmaceutski prihvatljiva so u skladu sa predmetnim prikazom) i rastvarača. U ovoj vezi, rastvarač može da bude voda, etanol ili neka druga farmaceutski prihvatljiva molekulska vrsta

1

kao što je, ali ne i ograničeno na, sirćetna kiselina ili mlečna kiselina. Kada je u pitanju voda kao rastvarač, takav solvat se uobičajeno označava kao hidrat.

[0091] „Lečenje“ je pristup kojim se dobijaju korisni ili željeni klinički rezultati. Za potrebe predmetnog prikaza, korisni ili željeni klinički rezultati uključuju, ali nisu i ograničeni na, ublažavanje simptoma, smanjenje obima bolesti, stabilizaciju (tj. odsustvo pogoršanja) stanje bolesti, odlaganje ili usporavanje napredovanja bolesti, poboljšanje ili ublažavanje stanja bolesti i remisiju (delimičnu ili potpunu), bilo da može ili ne može da se detektuje. „Lečenje“ takođe može da označava produžavanje preživljavanja u poređenju sa očekivanim preživljavanjem kada se lečenje ne sprovodi . „Lečenje“ je intervencija koja se obavlja sa namerom da se spreči razvoj ili izmeni patologija poremećaja. U skladu sa tim, „lečenje“ se odnosi i na terapijski tretman i na profilaktičke ili preventivne mere u nekim primerima izvođenja. Osobe kojima je lečenje potrebno uključuju one osobe koje već imaju poremećaj, kao i one kod kojih je pojavu poremećaja potrebno sprečiti. Pod lečenjem se misli na inhibiciju ili redukciju povećanja patologije ili simptoma u poređenju sa situacijom u kojoj je lečenje odsutno, a ne misli se nužno da se podrazumeva potpuni prestanak relevantnog stanja.

[0092] Farmaceutske kompozicije za upotrebu u lečenju neurološkog poremećaja mogu da budu u obliku jedinične doze. U takvom obliku, kompozicija je podeljena na jedinične doze koje sadrže odgovarajuće količine aktivne komponente. Oblik jedinične doze može da bude upakovana preparacija, pri čemu pakovanje sadrži diskretne količine preparacije, na primer, upakovane tablete, kapsule i praškove u vajlama ili ampulama. Oblik jedinične doze takođe može da bude sama kapsula, kaše ili tableta, ili može da bude odgovarajući broj bilo kog od ovih upakovanih oblika. Može da bude obezbeđena u obliku jedinične doze za ubrizgavanje, na primer u obliku olovke. U nekim primerima izvođenja, upakovani oblici uključuju etiketu ili papir sa uputstvom za upotrebu. Kompozicije mogu da budu formulisane za bilo koju pogodnu rutu ili sredstvo primene. Farmaceutski prihvatljivi nosači ili razblaživači uključuju one koji se koriste u formulacijama pogodnim za oralnu, rektalnu, nazalnu, topikalnu (uključujući bukalnu i sublingvalnu), vaginalnu ili parenteralnu (uključujući potkožnu, intramuskularnu, intravensku, intradermalnu i transdermalnu) primenu. Formulacije mogu pogodno da budu predstavljene u obliku jedinične doze i mogu da se pripremaju bilo kojim od dobro poznatih postupaka iz oblasti farmacije.

[0093] Kako se ovde koristi, „efikasna“ količina ili „terapeutski efikasna količina“ peptida odnosi se na količinu peptida koja nije toksična, ali je dovoljna da obezbedi željeni efekat. Količina koja je „efikasna“ variraće od subjekta do subjekta, u zavisnosti od starosne dobi i opšteg stanja individue, načina primene, i sličnih faktora. Prosečno obučen stručnjak u oblasti

1

može da odredi odgovarajuću „efikasnu“ količinu u svakom pojedinačnom slučaju, koristeći rutinske eksperimente.

[0094] Izrazi „pacijent“, „subjekt“ i „individua“ mogu da se koriste naizmenično i odnose se ili na čoveka ili na sisara koji nije čovek. Pogodno, subjekt je čovek.

[0095] Ovde opisani peptidi mogu da se koriste kako bi se lečio i/ili sprečio neurološki poremećaj npr. neurodegenerativni poremećaj. U jednom primeru izvođenja, peptid je za upotrebu u lečenju i/ili prevenciji Alchajmerove bolesti. Alchajmerova bolest (AD) je neurodegenerativni poremećaj koji dovodi do gubitka kortikalnih neurona, naročito u asocijativnom neokorteksu i hipokampusu, što dalje dovodi do sporog i progresivnog gubitka kognitivnih funkcija, što u krajnjem ishodu dovodi do demencije i smrti. Glavna obeležja bolesti su agregacija i taloženje pogrešno savijenih proteina kao što je agregirani beta-amiloidni peptid u vidu vanćelijskih senilnih ili neuritskih plakova, i hiperfosforilisani tau protein u vidu unutarćelijskih neurofibrilarnih ’klupkâ’ (NFT).

[0096] Genetički, AD se deli na dva oblika: (1) familijalnu AD koja se javlja rano (<60 godina), i (2) sporadičnu AD koja se javlja kasno (>60 godina). Retko je, ali poznato da mutacije koje dovode do bolesti u genima za amiloidni prekursorski protein (APP), presenilin 1 (PSEN1) i presenilin 2 (PSEN2) za razultat imaju familijalnu AD koja se rano javlja, dok je APOE (alel 4) jedini najvažniji faktor rizika za AD koja se kasno javlja.

[0097] Iako se Alchajmerova bolest razvija različito kod svake individue, postoje brojni zajednički simptomi. Za rane simptome se često pogrešno misli da predstavljaju probleme „vezane za starost“ ili manifestacije stresa. U ranim fazama, najčešći simptom su poteškoće u pamćenju skorašnjih događaja. Kada se sumnja na AD, dijagnoza se obično potvrđuje testovima koji procenjuju ponašanje i sposobnosti razmišljanja, a često naknadno i skeniranjem mozga ako je moguće, međutim, za postavljanje definitivne dijagnoze je neophodno pregledanje moždanog tkiva.

[0098] Kako bolest napreduje, simptomi mogu da uključe zbunjenost, razdražljivost, agresivnost, promene raspoloženja, probleme sa jezikom i gubitak dugotrajnog pamćenja. Pošto sposobnosti obolelih osoba opadaju, one se često povlače iz porodice i društva. Postepeno se telesne funkcije gube, što na kraju dovodi do smrti. Budući da je bolest različita za svaku individuu, teško je predvideti kako će uticati na konkretnu osobu. AD se razvija tokom nepoznatog i promenljivog vremenskog perioda pre nego što postane potpuno očigledna, i može da napreduje godinama iako dijagnoza nije postavljena. U proseku, očekivani životni vek nakon postavljanja dijagnoze iznosi približno sedam godina. Manje od tri procenta individua živi duže od četrnaest godina nakon postavljanja dijagnoze.

1

[0099] U jednom primeru izvođenja, peptid koagonist je za upotrebu u lečenju Alchajmerove bolesti. Peptid može da se koristi kako bi se progresija Alchajmerova bolesti kod subjekta usporila i/ili zaustavila. Peptid može da bude za upotrebu u usporavanju i/ili prevenciji progresije do kliničke Alchajmerove bolesti kod sujekta koji pati od prekliničke Alchajmerove bolesti.

[0100] U jednom primeru izvođenja, peptid koagonist je za upotrebu u lečenju i/ili prevenciji Parkinsonove bolesti. Parkinsonova bolest je neurodegenerativni poremećaj koji se karakteriše progresivnim gubitkom neurona, naročito dopaminergičkih neurona supstancije nigre, što dovodi do motoričkih poremećaja kao što su tremor, ukočenost, usporenost pokreta i posturalna nestabilnost. U jednom primeru izvođenja, peptid je za upotrebu u smanjenju i/ili prevenciji motoričkih poremećaja povezanih sa Parkinsonovom bolešću.

[0101] Pored toga, u porastu je broj atipičnih Parkinsonovih sindroma i potklasa Parkinsonove bolesti, koje su povezane sa deficitima učenja i pamćenja. Tipični primeri su Parkinsonova bolest demencije (PDD), demencija sa Levijevim telima (LBD) i multisistemska atrofija (MSA). Peptid može da bude za upotrebu u reverziji ili u poboljšanju procesa učenja ili deficita učenja i/ili u prevenciji, reverziji ili poboljšanju gubitka pamćenja ili oštećenja pamćenja kod subjekta koji pati od Parkinsonove bolesti.

[0102] Kroz ceo opis i patentne zahteve ove specifikacije, reči „sadrži“ i „sadržava“ i njihove varijacije, imaju značenje „uključujući, ali ne i ograničeno na“ i nije predviđeno da one (niti one) isključuju druge komponente, aditive, činioce, cele brojeve ili korake. Kroz ceo opis i patentne zahteve ove specifikacije, jednina obuhvata i množinu, izuzev ako kontekst zahteva drugačije. Konkretno, tamo gde se koristi neodređeni član, potrebno je podrazumevati da se specifikacija odnosi na možinu kao i na jedninu, izuzev ako kontekst zahteva drugačije.

[0103] Skreće se pažnja čitaocu na sve publikacije i dokumente koji su podneti istovremeno sa ovom specifikacijom ili pre nje u vezi sa ovom patentnom prijavom i koji su ovom specifikacijom otvoreni za uvid javnosti.

[0104] Jedinice, prefiksi i simboli, označeni su svojim oblicima koji su prihvaćeni u okviru Internacionalnog sistema jedinica (SI). Numeriči opsezi uključuju brojeve koji definišu opseg. Osim ako nije drugačije naznačeno, amino kiselinske sekvence su napisane sleva na desno, u orijentaciji od amino ka karboksi kraju. Svi amino kiselinski ostaci u peptidima iz primera izvođenja prema pronalasku poželjno su u L-konfiguraciji. Međutim, amino kiseline u D-konfiguraciji takođe mogu da budu prisutne.

Primeri

Molekulske strukture

Sinteza peptida

1

[0105] Peptide je sintetisala kompanija GL Biochem Ltd. (Shanghai). Stepen čistoće peptida analiziran je reverzno-faznom HPLC, a okarakterisani su laserskom, matrično asistiranom desorpsiono/jonizacionom masenom spektrometrijom na bazi vremena prolaska čestica (MALDI-TOF), sa čistoćom > 99%. Peptidi su rekonstituisani u vodi ultrapure® stepena čistoće, do koncentracije od 1 mg/ml, u polipropilenskim epruvetama i zamrznuti u alikvotima kako bi bila moguća priprema svežih doza neophodnih za injeciranje.

[0106] Testiran peptidi su bili:

1. Liraglutid (analog GLP-1) -Liraglutid je peptidni lek koji se obično primenjuje parenteralno. Liraglutid je odobren za lečenje dijabetesa tipa 2. Liraglutid je prikazan u WO98/08871 A1, Primer 37. Amino kiselinska sekvenca liraglutida je prikazana u SEQ ID. No.15.

Masna kiselina vezana za amino kiselinu Lys na poziciji 26. Amino kiselina Lys na poziciji 34 zamenjena je amino kiselinom Arg.

2. DAla2GIP-Lys37-γ-Glu-PAL (analog GIP)

Sekvenca DAla2GIP-Lys37-γ-Glu-PAL je:

Yd-AEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKGKK(γ-E-C16)NDWKHNITQ Liraglutid je monoagonist GLP-1 receptora, dok je DAla2GIP--LyS37- γ-Glu-PAL monoagonist GIP receptora.

3. Peptid koji je ovde označen kao DA4, koji ima sledeću amino kiselinsku sekvencu:

YXEGTFTSDYSIYLDKQAAXEFVNWLLAGGPSSGAPPPSKKKKKK-NH2

X = aminoizobuterna kiselina

Peptid DA4 je dualni agonist GLP-1/GIP.

4. Peptid koji je ovde označen kao DA5, koji ima sledeću amino kiselinsku sekvencu:

YXEGTFTSDYSIYLDKQAAXEFVNWLLAGGPSSGAPPPSKRRQRRKKRGY-NH2

X = aminoizobuterna kiselina

Peptid DA5 je dualni agonist GLP-1/GIP.

Primer 1

Transgeni mišiji model Alchajmerove bolesti

[0107] Životinjski modeli su razvijeni kako bi se testirali novi lekovi. Standardni model za Alchajmerovu bolest predstavljaju transgeni miševi koji eksprimiraju humane mutirane gene za proizvodnju amiloida, za koje se zna da kod ljudi izazivaju Alchajmerovu bolest. Ovi APP/PS1 transgeni miševi reprodukuju neke od simptoma Alchajmerove bolesti, kao što je agregacija amiloida u mozgu, gubitak pamćenja i gubitak sinapsi (Radde et al., 2006).

2

[0108] APP/PS1 miševi eksprimiraju humani švedski mutirani APP i humani mutirani presenilin-1 koji indukuju Alchajmerovu bolest kod ljudi.

[0109] Doza testiranog peptida je iznosila 10nmol/kg telesne težine. Peptidi su primenjivani putem intraperitonealne injekcije, jednom dnevno tokom 8 nedelja. Injekcije fiziološkog rastvora su primenjene kao kontrola. Kod šest životinja po grupi injeciran je peptid ili fiziološki rastvor kao kontrola.

Analiza amiloidnih plakova i broja sinapsi u moždanom tkivu AD miševa

[0110] Na životinjama (6 po grupi) je obavljena transkardijalna perfuzija sa 30 ml ledenog PBS pufera i 30 ml ledenog 4% paraformaldehida, u cilju postfiksiranja mozga. Mozgovi su uklonjeni i stavljeni u svež 30% rastvor saharoze u PBS puferu u cilju krioprotekcije tkiva, i isečeni na kriostatu, na debljinu od 40 µm. Preseci su odabrani na osnovu stereoloških pravila, pri čemu je prvi presek nasumično biran i uziman, kao i svaki 5. presek posle njega. Analizirano je između 7 i 13 preseka po mozgu.

[0111] Za procenu opterećenja neuronskih plakova korišćene su tehnike imunološkog bojenja (anti beta-amiloidno zečije polikonsko antitelo (1:200, zečije poliklonsko-Invitrogen 71-5800) i za sinaptofizin (poliklonsko zečije anti-sinaptofizinsko primarno antitelo, 1:2000, Abcam, Cambridge, Velika Britanija) kako bi se izmerila količina sinapsi u korteksu. Uzorci mozga su najpre izloženi 99% mravljoj kiselini tokom 7 minuta, a zatim ispirani 3 puta po 10 minuta u TBS puferu. Poznato je da pre-tretman 99% mravljom kiselinom drastično povećava detekciju beta-amiloida u uzorcima mozga koji su fiksirani formalinom. Uzorci su zatim inkubirani u 0.3% H2O2(Sigma Aldrich; kat. br.: 516813) u TBS puferu tokom 30 minuta na šejkeru kako bi se smanjila aktivnost endogenih peroksidaza, a nakon toga su ispirani 3 puta po 10 minuta u TBS puferu.

[0112] U cilju povećanja permeabilnosti membrana u moždanom tkivu, uzorci su izloženi 0.3% Triton X-100 reagensu (Sigma Aldrich; kat. br.: 516813) u TBS puferu tokom 10 minuta na šejkeru. Nespecifično vezivanje za proteine u tkivu dovedeno je do zasićenja tako što su uzorci inkubirani sa 5% kozijim serumom (Gibco; kat. br.: 16210-064) u TBS puferu tokom 30 minuta na šejkeru.

[0113] Dodato je primarno antitelo protiv beta-amiloida ili sinaptofizina i inkubirano preko noći na šejkeru na 4°C. Antitelo je bilo poliklonsko i uzgajeno u zecu, protiv sintetičkog betaamiloidnog peptida 1-43. Primarno antitelo je korišćeno u finalnom razblaženju od 1 prema 250 u TBS puferu sa 2% kozijeg seruma i 10% Triton X-100 reagensa. Nakon toga, uzorci su isprani TBS puferom, 3 puta po 10 minuta i sekundarno antitelo je dodato na period od 90 minuta, na šejkeru na 4°C. Sekundarno antitelo je bilo biotinilisano anti-zečije IgG uzgajeno u kozi (Vectastain ABC Kit, Rabbit IgG; Vector Laboratories; kat. br.: PK-6101), i korišćeno je u finalnom razblaženju od 1 do 60 u TBS puferu sa 1% kozijeg seruma i 10% Triton X-100 reagensa.

[0114] Nakon 3 ispiranja u TBS puferu u trajanju od po 10 minuta, uzorci su inkubirani u TBS puferu sa 3% rastvorom avidina (Vectastain ABC Kit, Rabbit IgG; Vector Laboratories; kat. br.: PK-6101) i sa 3% rastvorom biotinilisane peroksidaze iz rena (Vectastain ABC Kit, Rabbit IgG; Vector Laboratories; kat. br.: PK 6101) tokom 90 minuta, na šejkeru na 4°C. Uzorci su zatim isprani 3 puta po 10 minuta u TBS rastvoru, a zatim obojeni tako što je dodat fosfatni puferovani fiziološki rastvor koji je sadržao 3% rastvor boje SG blue (SG Blue Peroxidase Kit; Vector Laboratories; kat. br.: SK-4700) i 3% rastvor H2O2tokom 5 minuta i zatim ponovo isprani 3 puta po 10 minuta fosfatnim puferovanim fiziološkim rastvorom.

[0115] Da bi se bojenje pojačalo, uzorci su inkubirani 5 minuta sa ddH2O koja sadrži 0.5% CuSO4(tež./tež.) tokom 5 minuta. Nakon ispiranja 3 puta po 10 minuta u ddH2O, preseci mozga su pomoću fine četkice smeštani na silanom obložene staklene mikroskopske pločice na kojima su se sušili preko noći. Na kraju su pločice prekrivene pokrovnim staklima pomoću vodenog pokrovnog medijuma (VectaMountAQ Mounting Medium; Vector Laboratories, kat. br.: H-5501). Kao kontrola je služio set uzoraka dobijenih od netransgene životinje iz istog legla, stare 17 meseci, koji su obrađeni zajedno sa eksperimentalnim uzorcima.

[0116] Preseci fotografisani na mikroskopu (Zeiss, Nemačka), randomizovani prema nepristrasnim disektorima, preklapani su sa slikama preseka mozga i analizirani pomoću „Multi threshold plug-in“ funkcije softvera Image J (NIH, SAD). Podaci su analizirani upotrebom jednostrane ANOVA sa Bonferonijevim testovima sa naknadnim poređenjem.

Mišiji model Parkinsonove bolesti

[0117] Standardni model za indukovanje simptoma nalik na simptome Parkinsonove bolesti kod miševa je ubrizgavanje hemikalije (MPTP) (Li et al., 2009). Ova hemikalija oštećuje ili ubija neurone u mozgu koji proizvode dopamin. Miševi razvijaju motorička oštećenja, a broj i funkcija dopaminergičkih neurona u mozgu se smanjuju. Enzim tirozin hidroksilaza (TH) je neophodan da bi se dopamin sintetisao. Gubitak TH znači i gubitak proizvodnje dopamina (Harkavyi et al., 2008).

[0118] Adultnim mužjacima C57BL/6 miševa davan je dopaminergički toksin MPTP (4 doze MPTP od 20 mg/kg u 0.1 mL PBS pufera, i.p. u intervalima od 2 sata; Sigma) ili vehikuluma (PBS) tokom jednog dana. Ovaj tretman selektivno utiče na dopaminergičke neurone i kod miševa indukuje simptome slične simptomima Parkinsonove bolesti. Jedna grupa nije primala MPTP da bi služila kao kontrola bez lezija.

[0119] Doza testiranog peptida je iznosila 10nmol/kg telesne težine. Peptidi su primenjivani putem intraperitonealne injekcije, jednom dnevno tokom 2 nedelje. Injekcije fiziološkog rastvora su primenjene kao kontrola. Kod šest životinja po grupi injeciran je peptid ili fiziološki rastvor kao kontrola.

Rotarod test motoričke kontrole

[0120] Rotarod se sastoji od šipke koja rotira i dobija ubrzanje tokom vemena. Miševi se stavljaju na šipku i motorne veštine se testiraju tako što se rotacija ubrzava. Kako se rotacija ubrzava, životinja gubi kontrolu i pada na jastuče ispod šipke. Miševi su testirani po tri puta sa razmakom od 45 min između testiranja, 2 uzastopna dana za tri nedelje. Vreme zadržavanja svake životinje je beleženo, i izračunavana je prosečna vrednost. Podaci su analizirani upotrebom jednostrane ANOVA sa Bonferonijevim testovima sa naknadnim poređenjem.

Imunohistohemija za TH u delu pars compacta supstancije nigre i u strijatumu

[0121] Ekspresija tirozin hidroksilaze (TH), markera za proizvodnju dopamina, analizirana je kod šest životinja po grupi. Koronalni preseci mozga (20µm) iz stijatuma (bregma 11 do 10.2) i SNpc (bregma 24.80 do 26.04) analizirani su imunohistohemijski, upotrebom antitela koja prepoznaju TH.

[0122] Preseci su isečeni na kriostatu i fiksirani u 4% paraformaldehidu, oprani u PBS rastvoru, tretirani sa 0.3% H2O2u metanolu tokom 20 min, i ponovo isprani. Inkubacija sa TH (1:800) antitelom je sprovedena na 48°C preko noći u PBS puferu sa 0.1 % Tween reagensa i 10% kozijeg seruma. Preseci su inkubirani tokom 1 sata na sobnoj temperaturi sa biotinilisanim sekundarnim antitelom razblaženim u rastvoru 0.1% PBS-Tween. DAB bojenje je sprovedeno u skladu sa uputstvima za kit Vectastain ABC (Vector Laboratories). Za svaku životinju su obojena tri preseka tkiva sa jednog nivoa strijatuma i analizirana je TH-poitivna inervacija vlakana u njima. Kako bi se dobio broj TH ćelija koji je reprezentativan za celu SN, svaka životinja je analizirana na četiri i tri rostrokaudalna nivoa (bregma - 4.80 do - 6.04). Dva preseka tkiva sa svakog nivoa kvantifikovana su pomoću imunohistohemije.

[0123] Podaci su analizirani upotrebom jednostrane ANOVA sa Bonferonijevim testovima sa naknadnim poređenjem. Rezultati su ilustrovani na Slikama 1 do 4.

Zaključak

[0124] Rezultati pokazuju da oba peptida dualna agonista GLP-1/GIP (DA4 i DA5) prikazuju superiornu neuroprotekciju u odnosu na pojedinačne analoge GLP-1 i GIP u životinjskim modelima Alchajmerove i Parkinsonove bolesti. Dakle, podaci iz predmetnih primera pokazuju da oba peptida, i DA4 i DA5, mogu da se smatraju pogodnim za upotrebu u lečenju i/ili prevenciji neurodegenerativnih poremećaja kao što su, na primer, Alchajmerova bolest i/ili Parkinsonova bolest.

Primer 2

2

[0125] Materijali i metode u Primeru 2, isti su kao i u Primeru 1 osim kada su navedeni. Reagensi koji se koriste u Primeru 2 uključuju samo antitela na p-PI3Kp85, PI3Kp85, p-Akt (ser473), Akt, p-GSK3β (Y216) i GSK3β, proizvođača Abcam, Inc. Cambridge, Velika Britanija. Antitelo na p-tau (AT8) je od proizvođača Thermo Scientific SAD. Mišiji anti-β-aktin, anti-zečiji IgG, anti-mišiji IgG, CY3-anti-mišiji IgG, reagensi RIPA Lysate, BCA Protein Assay Kit, rastvor za DAPI bojenje i sredstvo protiv fluorescentnog raspada su od proizvođača Boster (Wuhan, Kina).

Test otvorenog polja za ispitivanje lokomotorne aktivnosti i eksploratornog ponašanja.

[0126] Pre eksperimenta, životinje su u laboratoriji imale adaptaciju od 30 minuta. Otvoreno polje je podeljeno na 16 kvadrata iste veličine sa 4 definišuća kvadrata u sredini kao centralnom oblašću i ostatkom kao perifernom oblašću. Svaki miš je pojedinačno stavljan u aparat (40cm × 40cm × 40cm) počevši od centra, na 5 min i ukupno rastojanje, kao i procenat vremena u centru beleženi su istovremeno pomoću Smart 3.0 softverskog sistema (Panlab, Španija). Aparat je pre svakog testa čišćen pomoću 70% etanola.

Test u Y-lavirintu za merenje radne memorije kod AD miševa

[0127] Prostorna radna memorija je ocenjivana tako što je beleženo ponašanje spontanih alternacija u Y lavirintu. Lavirint je napravljen od tri kraka dugačka 30 cm, visoka 7 cm, i široka 15 cm koji su konvergirali u centralnoj oblasti u obliku jednakostraničnog trougla. Svaki miš je smeštan u centralnu oblast u obliku trougla i omogućeno mu je da se slobodno kreće kroz lavirint tokom sesije od 8 minuta. Ukupan broj i redosled ulazaka u krake zabeležen je pomoću softverskog sistema Smart 3.0. Alternacija je definisana kao ulazak u tri sukcesivna kraka na setovima tripleta koji se preklapaju. Procentualna alternacija je izračunavana kao odnos stvarnih i mogućih alternacija (definisanih kao ukupan broj ulazaka u krake minus 2) pomnožen sa 100. Klasični testovi na Morisovom vodenom lavirintu i testovi reverzije na Morisovom vodenom lavirintu, za merenje prostornog učenja i pamćenja.

[0128] Klasični test na Morisovom vodenom lavirintu (MWM) korišćen je za ispitivanje prostornog referentnog pamćenja miša. Vodeni lavirint pretežno je obuhvatio bazen od nerđajućeg čelika i platformu u bazenu za izlazak. Za zidove vodenog lavirinta bilo je fiksirano nekoliko orijentira. Bazen je napunjen česmenskom vodom na 22±2 °C. Prva faza je bila faza testa akvizicije koja se sastojala od pet dana treninga (dani 1-5) i četiri testa dnevno. Bazen (prečnik, 120 cm; visina, 50 cm) je podeljen na četiri kvadranta i platforma za izlazak (prečnik, 12 cm) skriven 1 cm ispod površine vode, bila je smeštenu u centru prvog kvadranta. Četiri tačke na jednakom rastojanju duž obima bazena služile su kao polazne pozicije, koje su birane nasumično za četiri testa tokom dana. Kada bi se miš popeo na platformu, ili kada bi istekao 1 minut, snimanje je zaustavljano. Latencije izlaska su beležne softverskim sistemom Ethovision 3.0 (Noldus Information Technology, Holandija). Druga faza je bila faza pozivanja memorije. Na dan završetka zadatka akvizicije (dan 6), izvođen je test pozivanja memorije kako bi se ocenilo prostorno pamćenje. Platforma je uklanjana iz bazena, i životinjama je omogućeno da slobodno plivaju tokom 1 minuta. Beleženi su procenat vremena utrošenog za plivanje u ciljnom kvadrantu (prvi kvadrant) i učestalost prelaska platforme. MWM test reverzije je korišćen kako bi se posmatrala sposobnost miševa za ponovno učenje i kognitivna fleksibilnost. Nakon klasičnog MWM testa, platforma je prebačena u kvadrant za reverziju (treći kvadrant), i miševi su stavljani u vodu u cilju sličnog četvorodnevnog testa akvizicije i jednodnevnog testa pozivanja memorije, kao što je pomenuto prethodno u tekstu. Treća faza je bila test sa vidljivom platformom. Platforma je izdignuta 1cm iznad nivoa vode i miševi su stavljani u dva nasumično odabrana kvadranta. Beleženo je vreme plivanja do cilja.

In vivo hipokampalna merenja L-LTP kod AD miševa

[0129] Miševi su anestezirani uretanom (Sigma, UK, 1.5 g/kg, i.p.) i stavljeni u aparat za stereotaksiju (RWD Life Science, Kina) u cilju snimanja L-LTP. Po odsecanju kože glave i izlaganju lobanje, sa jedne strane lobanje su probušene male rupe (2.0 mm posteriorno u odnosu na bregmu i 1.5 mm lateralno u odnosu na srednju liniju).

[0130] Par paralelnih stimulatornih/registujućih elektroda (Sequim, WA, SAD) inseriran je u Šaferovu kolateralu i radijalni strijatum u CA1 regionu hipokampusa. fEPSP potencijali osnovnog nivoa izazvani su testiranim stimulusima u intervalima od 30 sekundi i fEPSP potencijali su snimani tokom 30 minuta kako bi se uočilo da li ima uticaja na transmisiju koja predstavlja njihovu osnovu. Dva sparena testirana stimulusa su primenjena u okviru intervala od 50 ms pre HFS kako bi se indukovala facilitacija sparenim pulsnim stimulusima (PPF). Vidi se da je promena udela PPF, kada se računa deljenjem nagiba drugog fEPSP nagibom prvog fEPSP, povezana sa promenama prilikom oslobađanja neurotransmitera iz presinaptičkih završetaka. L-LTP je indukovan sa tri seta visokofrekventnih stimulacija (HFS) sa intervalom od 5 minuta. Svaki set HFS uključivao je 20 pulseva sa interavima od 5 ms između stimulusa (200 Hz). fEPSPs potencijali su snimani tokom 180 minuta nakon HFS. Svi događaji su zabeleženi sistemom za obradu bioloških signala (Chengdu Instruments Ltd, Kina). Poređena je procentualna promena fEPSP potencijala svake grupe, nakon HFS.

Imunološko bojenje fosforilisanog tau proteina u hipokampusu

[0131] Nakon in vivo snimanja L-LTP u hipokampusu, miševi su anestezirani hloral hidratom (0.007ml/g) putem intraperitonealne injekcije, a zatim je moždano tkivo fiksirano paraformaldehidom u toku 24 sata, nakon čega je tkivo prebačeno u 30% rastvor saharoze radi dehidratacije. Moždano tkivo je sakupljeno, zamrznuto na -80°C, a zatim isečeno na preseke debljine 30 µm, smrznuti preseci su stavljeni u PBS, blokirani normalnim kozijim serumom

2

(Solarbio, Beijing, Kina), nakon čega su dodati primarno antitelo, sekundarno antitelo i DAPI. Fosforilisani tau protein posmatran je pomoću konfokalne laserske skenirajuće mikroskopije. Western blot za procenu nivoa PI3K/AKT/GSK3β u hipokampusu

[0132] Mišiji hipokampusi su disekovani i homogenizovani u reagensu za ekstrakciju proteina iz tkiva, i koncentracija proteina je merena pomoću BCA kita za testiranje proteina. Korišćeno je ukupno 50 µg proteina iz svakog uzorka. Proteini iz uzoraka su razdvojeni na 12% SDS-poliakrilamidnim gelovima. nakon toga, proteini su prebačeni na PVDF membrane i nespecifično vezivanje je blokirano pomoću 5% BSA. Za inkubaciju membrana preko noći na 4°C je korišćeno primarno antitelo, a nakon njega sekundarno antitelo tokom 2 h. Optička gustina ciljne trake (p-PI3K, t-PI3K, p-AKT, t-AKT, p-GSK3β i t-GSK3β) analizirana je upotrebom sistema za obradu snimaka gela.

[0133] Podaci su analizirani upotrebom jednostrane ANOVA sa Bonferonijevim testovima sa naknadnim poređenjem. Rezultati su ilustrovani na Slikama 5 do 11.

Zaključak

[0134] Rezultati predstavljeni u ovoj studiji potvrdili su protektivne efekte dualnog agonista GLP-1/GIP, DA5 peptida, na kognitivnu funkciju i patološke karakteristike kod APP/PS1 transgenih AD miševa. Neuroprotekcija DA5 peptida može da bude u vezi sa poboljšanjem hipokampalne sinaptičke plastičnosti i PI3K/AKT/GSK3β signalnog puta. Navedeni rezultati ukazuju da bi DA5 peptid mogao da bude koristan u lečenju neurodegenerativne bolesti, i da bi konkretno mogao da bude koristan za AD pacijente, naročito one sa T2DM ili hiperglikemijom.

Literatura

[0135]

Aviles-Olmos I, Dickson J, Kefalopoulou Z, Djamshidian A, Ell P, Soderlund T, Whitton P, Wyse R, Isaacs T, Lees A, Limousin P, Foltynie T (2013) Exenatide and the treatment of patients with Parkinson’s disease. The Journal of clinical investigation 123:2730-6.

Aviles-Olmos I, Dickson J, Kefalopoulou Z, Djamshidian A, Kahan J, Fmedsci PE, Whitton P, Wyse R, Isaacs T, Lees A, Limousin P, Foltynie T (2014) Motor and Cognitive Advantages Persist 12 Months After Exenatide Exposure in Parkinson’s Disease. Journal of Parkinson’s disease 4:337-344.

Baggio LL, Drucker DJ (2007) Biology of incretins: GLP-1 and GIP. Gastroenterology 132:2131-2157.

Bertilsson G, Patrone C, Zachrisson O, Andersson A, Dannaeus K, Heidrich J, Kortesmaa J, Mercer A, Nielsen E, Ronnholm H, Wikstrom L (2008) Peptide hormone exendin-4 stimulates

2

subventricular zone neurogenesis in the adult rodent brain and induces recovery in an animal model of Parkinson’s disease. Journal of neuroscience research 86:326-338.

Blennow K, de Leon MJ, Zetterberg H (2006) Alzheimer’s disease. Lancet 368:387-403. Bliss TVP, Collingridge GL (1993) A synaptic model of memory: long-term potentiation in the hippocampus. Nature 361:31-39.

Bomfim TR, Forny-Germano L, Sathler LB, Brito-Moreira J, Houzel JC, Decker H, Silverman MA, Kazi H, Melo HM, McClean PL, Holscher C, Arnold SE, Talbot K, Klein WL, Munoz DP, Ferreira ST,De Felice FG (2012) An antidiabetes agent protects the mouse brain from defective insulin signaling caused by Alzheimer’s disease associated Abeta oligomers. The Journal of clinical investigation 122:1339-53.

Campbell JE, Drucker DJ (2013) Pharmacology, physiology, and mechanisms of incretin hormone action. Cell metabolism 17:819-837.

Cereda E, Barichella M, Cassani E, Caccialanza R, Pezzoli G (2012) Clinical features of Parkinson disease when onset of diabetes came first: A case-control study. Neurology 78:1507-1511.

Christensen M, Knop FK, Holst JJ, Vilsboll T (2009) Lixisenatide, a novel GLP-1 receptor agonist for the treatment of type 2 diabetes mellitus. IDrugs : the investigational drugs journal 12:503-513.

Cleary JP, Walsh DM, Hofmeister JJ, Shankar GM, Kuskowski MA, Selkoe DJ, Ashe KH (2005) Natural oligomers of the amyloid-beta protein specifically disrupt cognitive function. Nature neuroscience 8:79-84.

Duffy AM, Holscher C (2013) The incretin analogue D-Ala(2)GIP reduces plaque load, astrogliosis and oxidative stress in an APP/PS1 mouse model of Alzheimer’s disease. Neuroscience 228:294-300.

Elkinson S, Keating GM (2013) Lixisenatide: first global approval. Drugs 73:383-391.

Faivre E, Holscher C (2013a) D-Ala2GIP facilitated synaptic plasticity and reduces plaque load in aged wild type mice and in an Alzheimer’s disease mouse model. Journal of Alzheimer’s disease : JAD 35:267-283.

Faivre E, Holscher C (2013b) Neuroprotective effects of D-Ala2GIP on Alzheimer’s disease biomarkers in an APP/PS1 mouse model. Alzheimer’s research & therapy 5:20-28.

Faivre E, Gault VA, Thorens B, Holscher C (2011) Glucose-dependent insulinotropic polypeptide receptor knockout mice are impaired in learning, synaptic plasticity, and neurogenesis. J Neurophysiol 105:1574-1580.

Gault V, Holscher C (2008a) GLP-1 agonists facilitate hippocampal LTP and reverse the impairment of LTP induced by beta-amyloid. European journal of pharmacology 587:112-117.

2

Gault VA, Holscher C (2008b) Protease-resistant glucose-dependent insulinotropic polypeptide agonists facilitate hippocampal LTP and reverse the impairment of LTP induced by betaamyloid. J Neurophysiol 99:1590-1595.

Gault VA, Flatt PR, O’Harte FP (2003) Glucose-dependent insulinotropic polypeptide analogues and their therapeutic potential for the treatment of obesity-diabetes. Biochemical and biophysical research communications 308:207-213.

Gejl M, Gjedde A, Egefjord L, Møller A, Hansen SB, Vang K, Rodell AB, Braendgaard H, Gottrup H, Schacht A, Møller N, Brock B, Rungby J (2016) In Alzheimer’s Disease, Six-Month Treatment with GLP-1 Analogue Prevents Decline of Brain Glucose Metabolism: Randomized, Placebo-Controlled, Double-Blind Clinical Trial. Frontiers in aging neuroscience 8:1-10.

Gengler S, McClean P, McCurtin R, Gault V, Holscher C (2012) Val(8)GLP-1 rescues synaptic plasticity and reduces dense core plaques in APP/PS1 mice. Neurobiology of aging 33:265-276. Han B, Hu J, Shen J, Gao Y, Lu Y, Wang T (2013) Neuroprotective effect of hydroxysafflor yellow A on 6-hydroxydopamine- induced Parkinson’s disease in rats. European journal of pharmacology 714:83-88.

Harkavyi A, Abuirmeileh A, Lever R, Kingsbury AE, Biggs CS, Whitton PS (2008) Glucagonlike peptide 1 receptor stimulation reverses key deficits in distinct rodent models of Parkinson’s disease. Journal of neuroinflammation 5:19(11-19).

Holscher C (2014) Insulin, incretins and other growth factors as potential novel treatments for Alzheimer’s and Parkinson’s diseases. Biochemical Society transactions 42:593-599.

Hunter K, Holscher C (2012) Drugs developed to treat diabetes, liraglutide and lixisenatide, cross the blood brain barrier and enhance neurogenesis. BMC neuroscience 13:33-38.

Irwin N, O’Harte F P, Gault VA, Green BD, Greer B, Harriott P, Bailey CJ, Flatt PR (2006) GIP(Lys(16)PAL) and GIP(Lys(37)PAL): Novel Long-Acting Acylated Analogues of Glucose-Dependent Insulinotropic Polypeptide with Improved Antidiabetic Potential. Journal of medicinal chemistry 49:1047-1054.

Ji C, Xue GF, Lijun C, Feng P, Li D, Li L, Li G, Holscher C (2015) A novel dual GLP-1 and GIP receptor agonist is neuroprotective in the MPTP mouse model of Parkinson’s disease by increasing expression of BNDF. Brain research 1634:1-11.

LaFerla FM, Oddo S (2005) Alzheimer’s disease: Abeta, tau and synaptic dysfunction. Trends Mol Med 11:170-176.

Li Y, Liu W, Li L, Holscher C (2015) Neuroprotective effects of a GIP analogue in the MPTP Parkinson’s disease mouse model. Neuropharmacology 101:255-263.

Li Y, Perry T, Kindy MS, Harvey BK, Tweedie D, Holloway HW, Powers K, Shen H, Egan JM, Sambamurti K, Brossi A, Lahiri DK, Mattson MP, Hoffer BJ, Wang Y, Greig NH (2009) GLP-1

2

receptor stimulation preserves primary cortical and dopaminergic neurons in cellular and rodent models of stroke and Parkinsonism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 106:1285-1290.

Liu L, Venkatraman SS, Yang YY, Guo K, Lu J, He B, Moochhala S, Kan L (2008) Polymeric micelles anchored with TAT for delivery of antibiotics across the blood-brain barrier. Biopolymers 90:617-623.

Liu W, Jalewa J, Sharma M, Li G, Li L, Hölscher C (2015) Neuroprotective effects of lixisenatide and liraglutide in the MPTP mouse model of Parkinson’s disease. Neuroscience 303:42-50.

Lovshin JA, Drucker DJ (2009) Incretin-based therapies for type 2 diabetes mellitus. Nature reviews Endocrinology 5:262-269. Luchsinger JA, Tang MX, Shea S, Mayeux R (2004) Hyperinsulinemia and risk of Alzheimer disease. Neurology 63:1187-1192.

McClean P, Holscher C (2014) Liraglutide can reverse memory impairment, synaptic loss and reduce plaque load in aged APP/PS1 mice, a model of Alzheimer’s disease. Neuropharmacol 76:57-67.

McClean P, Parthsarathy V, Faivre E, Hölscher C (2011) The diabetes drug Liraglutide prevents degenerative processes in a mouse model of Alzheimer’s disease. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience 31:6587-6594.

McClean PL, Gault VA, Harriott P, Holscher C (2010) Glucagon-like peptide-1 analogues enhance synaptic plasticity in the brain: A link between diabetes and Alzheimer’s disease. European journal of pharmacology 630:158-162.

Moloney AM, Griffin RJ, Timmons S, O’Connor R, Ravid R, O’Neill C (2010) Defects in IGF-1 receptor, insulin receptor and IRS-1/2 in Alzheimer’s disease indicate possible resistance to IGF-1 and insulin signalling. Neurobiology of aging 31:224-243.

Morris JK, Bomhoff GL, Gorres BK, Davis VA, Kim J, Lee PP, Brooks WM, Gerhardt GA, Geiger PC, Stanford JA (2011) Insulin resistance impairs nigrostriatal dopamine function. Experimental neurology 231:171-180.

Nyberg J, Jacobsson C, Anderson MF, Eriksson PS (2007) Immunohistochemical distribution of glucose-dependent insulinotropic polypeptide in the adult rat brain. Journal of neuroscience research 85:2099-2119.

Ohara T, Doi Y, Ninomiya T, Hirakawa Y, Hata J, Iwaki T, Kanba S, Kiyohara Y (2011) Glucose tolerance status and risk of dementia in the community: The Hisayama Study. Neurology 77:1126-1134. Radde R, Bolmont T, Kaeser SA, Coomaraswamy J, Lindau D, Stoltze L, Calhoun ME, Jaggi F, Wolburg H, Gengler S, Haass C, Ghetti B, Czech C, Holscher

2

C, Mathews PM, Jucker M (2006) Abeta42-driven cerebral amyloidosis in transgenic mice reveals early and robust pathology. EMBO Rep 7:940-647.

Ristow M (2004) Neurodegenerative disorders associated with diabetes mellitus. J Mol Med 82:510-529.

Scherrmann JM (2002) Drug delivery to brain via the blood-brain barrier. Vascul Pharmacol 38:349-354.

Shen J (2010) Impaired neurotransmitter release in Alzheimer’s and Parkinson’s diseases. Neuro-degenerative diseases 7:80-83.

Talbot K, Wang HY, Kazi H, Han LY, Bakshi KP, Stucky A, Fuino RL, Kawaguchi KR, Samoyedny AJ, Wilson RS, Arvanitakis Z, Schneider JA, Wolf BA, Bennett DA, Trojanowski JQ, Arnold SE (2012) Demonstrated brain insulin resistance in Alzheimer’s disease patients is associated with IGF-1 resistance, IRS-1 dysregulation, and cognitive decline. The Journal of clinical investigation 122:1316-38.

Windisch M, Gschanes A, Hutter-Paier B (1998) Neurotrophic activities and therapeutic experience with a brain derived peptide preparation. Journal of neural transmission Supplementum 53:289-298.

Claims (15)

1. Patentni zahtevi 1. Peptidi koagonisti GIP/GLP-1 predstavljeni opštom formulom I:

   pri čemu je Xaa<24>Asn; Y1 je Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Lys (SEQ. ID. No.7); Y2 je izabrano od: Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ. ID. No.3); i Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Lys-Lys-Arg-Gly-Tyr (SEQ. ID. No 4); i R2 je -NH2, ili farmaceutski prihvatljiva so ili solvat peptida.
2. 2. Peptid prema patentnom zahtevu 1, koji se sastoji od amino kiselinske sekvence: YXEGTFTSDYSIYLDKQAAXEFVNWLLAGGPSSGAPPPSKKKKKK-NH2 (SEQ. ID. No. 11) pri čemu je X = aminoizobuterna kiselina.
3. 3. Peptid prema patentnom zahtevu 1, koji se sastoji od amino kiselinske sekvence: YXEGTFTSDYSIYLDKQAAXEFVNWLLAGGPSSGAPPPSKRRQRRKKRGY-N H2 (SEQ. ID. No.12) pri čemu je X = aminoizobuterna kiselina.
4. 4. Peptid prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, koji sadrži hidrofilnu komponentu kovalentno vezanu za amino kiselinu.
5. 5. Peptid prema patentnom zahtevu 4, koji sadrži hidrofilnu komponentu kovalentno vezanu za (i) amino kiselinu na poziciji 24 ili (ii) amino kiselinu na poziciji 39 ili 40.
6. 6. Peptid prema bilo kom od patentnih zahteva 4 do 5, naznačen time što je hidrofilna komponenta polimer rastvorljiv u vodi, pri čemu je polimer rastvorljiv u vodi izborno polietilen glikolna komponenta i izborno predstavlja polietilen glikolnu komponentu koja ima molekulsku težinu od između oko 20,000 daltona i oko 60,000 daltona.
7. 7. Peptid prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu, naznačen time što je peptid konjugovan sa lipofilnim supstituentom.
8. 8. Peptid prema patentnom zahtevu 7, naznačen time što lipofilni supstituent sadrži acil grupu i izborno je molekul masne kiseline i, pri čemu je dodatno molekul masne kiseline izabran od C-8 oktanoil grupe, C-10 dekanoil grupe, C- 12 lauroil grupe, C- 14 miristoil grupe, C- 16 palmitoil grupe, C- 18 stearoil grupe i C-20 acil grupe.
9. 9. Peptid prema patentnom zahtevu 7 ili patentnom zahtevu 8, naznačen time što je lipofilni supstituent vezan za amino kiselinu na karboksilnom terminusu peptida.
10. 10. Peptid prema bilo kom od patentnih zahteva 7 do 9, koji sadrži spejser koji konjuguje lipofilni supstituent sa amino kiselinskim ostatkom.
11. 11. Peptid prema patentnom zahtevu 10, naznačen time što spejser predstavlja ostatak amino kiseline koja se javlja ili ne javlja u prirodi, pri čemu spejser sadrži ostatak Gly, Pro, Ala, Val, Leu, Ile, Met, Cys, Phe, Tyr, Trp, His, Lys, Arg, Gln, Asn, α-Glu, γ-Glu, ε-Lys, Asp, Ser, Thr, Gaba, Aib, β-aminoheksonila, 7-aminoheptanoila, 8-aminooktanoila, 9-aminononanoila, 10-aminodekanoila ili 8-amino-3,6-dioksaoktanoila.
12. 12. Peptid prema patentnom zahtevu 11, naznačen time što je spejser γ-Glu ili gde je spejser dipeptid, izborno gde spejser sadrži dve negativno naelektrisane amino kiseline i dodatno izborno, gde je spejser γ-Glu- γ-Glu.
13. 13. Peptid prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu, koji je za upotrebu u lečenju i/ili profilaksi neurološkog poremećaja, kao što je neurološki poremećaj koji je uzrokovan, ili povezan sa, taloženjem plakova betaamiloidnog proteina u nekoj oblasti tela pacijenta, ili neurološki poremećaj uzrokovan, ili povezan sa: a) disfunkcijom dugotrajne potencijacije sinaptičke transmisije; ili b) inflamacijom.
14. 14. Peptid prema patentnom zahtevu 13, koji je za upotrebu u lečenju i/ili profilaksi neurološkog poremećaja koji pogađa kognitivnu funkciju, npr. demencije, moždanog udara, šizofrenije, i/ili bipolarnog poremećaja, pri čemu izborno poremećaj predstavlja cerebralnu ishemiju povezanu sa moždanim udarom, ili za upotrebu u lečenju i/ili profilaksi poremećaja odabranog od posttraumatskog stresnog poremećaja, epilepsije, Turetovog sindroma i halucinacija; i disfunkcionalnih kognitivnih procesa, izborno izabranih od pažnje, računanja, pamćenja, procenjivanja, uvida, učenja i rasuđivanja, ili za upotrebu u lečenju i/ili profilaksi neurodegenerativnog poremećaja npr. Alchajmerove bolesti, Parkinsonove bolesti, amiotrofične lateralne skleroze, periferne neuropatije, Hantingtonove bolesti i Krojcfeld-Džejkobove bolesti, ili za upotrebu u lečenju i/ili profilaksi neurološkog poremećaja izabranog od kliničke ili prekliničke Alchajmerove bolesti, prodromalne Alchajmerove bolesti, i kliničke ili prekliničke amiloidne angiopatije (CAA).
15. 15. Peptid za upotrebu u lečenju i/ili profilaksi kliničke Alchajmerove bolesti, gde se peptid sastoji od sledeće sekvence: (a) YXEGTFTSDYSIYLDKQAAXEFVNWLLAGGPSSGAPPPSKKKKKK-NH2 (SEQ ID No. 11) pri čemu je X = aminoizobuterna kiselina; ili (b) YXEGTFTSDYSIYLDKQAAXEFVNWLLAGGPSSGAPPPSKRRQRRKKRGY-NH2 (SEQ ID No.12) pri čemu je X = aminoizobuterna kiselina.