RS61288B1

RS61288B1 - Farmaceutska kompozicija koja sadrži nikotinsku kiselinu i/ili nikotinamid i/ili triptofan za pozitivan uticaj na crevnu mikrobiotu

Info

Publication number: RS61288B1
Application number: RS20201595A
Authority: RS
Inventors: Georg Waetzig; Dirk Seegert
Original assignee: Conaris Res Institute Ag
Priority date: 2012-06-15
Filing date: 2013-06-14
Publication date: 2021-02-26
Also published as: SMT202100248T1; HK1204972A1; US20150126462A1; PH12014502744A1; IL236205A0; EP2861229A1; ZA201408922B; PL2861229T3; KR20200011619A; JP2015519388A; RU2657797C2; MX2014015217A; AU2013276451A1; TWI624260B; US20200009124A1; NZ702297A; BR112014030835B1; AU2013276451B2; EP2861229B1; HUE053359T2

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na novu farmaceutsku kompoziciju koja sadrži nikotinsku kiselinu i nikotinamid i/ili triptofan za pozitivan uticaj na crevnu mikrobiotu, pri čemu se farmaceutska kompozicija specifično oslobađa (npr. selektivno oslobađa) u tanko i/ili debelo crevo.

POZADINA PRONALASKA

[0002] Mnoge inflamatorne bolesti crevnog zida su uzrokovane ili na njih utiču promene u crevnoj mikrobioti i/ili poremećena interakcija između crevne mikrobiote i creva. Takve crevne upale se javljaju kod ljudi, npr. inflamatorne bolesti creva (IBD), kao što je Kronova bolest ili ulcerozni kolitis, ali i kod drugih sisara (npr. hronični idiopatski kolitis kod pasa). Ove bolesti se zasnivaju na složenim imunološkim procesima koji nisu u potpunosti razumljivi. Međutim, promene i poremećene interakcije crevne mikrobiote takođe mogu biti uzročnici brojnih drugih bolesti. Primeri uključuju atopijske bolesti, kao što su atopijski ekcem, alergijska stanja ili astma (videti npr. Bisgaard et al. 2011, J. Allergy Clin. Immunol. 128:646; Iebba et al. 2011, Dig. Dis.

29:531; Abrahamsson et al. 2012, J. Allergy Clin. Immunol. 129:434; Candela et al. 2012, BMC Microbiol.

12:95; Olszak et al. 2012, Science 336:489), kao i metaboličke bolesti sa inflamatornom komponentom, kao što je arterioskleroza sa rezultujućim koronarnim bolestima srca, gojaznošću ili dijabetesom (Ott et al. 2006, Circulation 113:929; Koren et al. 2011, PNAS 108 Suppl 1:4592; za komentare vidi Caesar et al. 2010, J. Intern. Med. 268:320; i Vrise et al. 2010, Diabetologia 53:606).

[0003] Iako je veza između crevne mikrobiote i različitih bolesti poznata, nije razumljivo kako uticati na mikrobiotu na način koji bi pozitivno uticao na pridružene bolesti.

[0004] Nikotinska kiselina (niacin, vitamin B3), nikotinamid (amid nikotinske kiseline) i/ili L-triptofan se decenijama koriste za terapiju bolesti deficijencije niacina (npr. pelagra). Poznato je da pelagra može biti praćena upalom creva, koja se poboljšava nakon administracije niacina, gde je terapijski princip uklanjanje deficijencije vitamina koja uzrokuje crevnu upalu (Segal et al. 1986, Int. J. Colorectal Dis. 1:238; i Clayton et al. 1991, Eur. J. Pediatr. 150:498).

[0005] Takođe je poznato da nikotinska kiselina ima povoljan uticaj na lipoproteine holesterola u krvi (odnos HDL/LDL i veličinu LDL vezikula; Vahlberg et al. 1990, J. Intern. Med. 228: 151; Seed et al. 1993, Atherosclerosis 101:61; Elam et al. 2000, JAMA 284:1263; McKennei et al., 2001, Am. J. Cardiol. 88:270).

[0006] Međunarodna patentna publikacija WO 97/29760 A1 otkriva formulaciju za smanjenje holesterola koja sadrži hitozan i nikotinsku kiselinu, pri čemu je navedeni hitozan u formulaciji sa nikotinskom kiselinom i može dodatno da sadrži jednu ili više drugih vitaminskih kiselina, kao što su askorbinska kiselina, folna kiselina, pantotenska kiselina ili biotin za oralnu administraciju radi smanjenja holesterola i povećanja lipoproteina visoke gustine u krvnom serumu. Dodatno, takve formulacije smanjuju pH debelog creva što je korisno u etiologiji kolona.

KRATAK PREGLED PRONALASKA

[0007] Cilj ovog pronalaska je da obezbedi nove oblike lečenja za terapiju i/ili profilaksu bolesti kod ljudi i životinja povezanih sa promenama crevne mikrobiote i/ili poremećene interakcije između crevne mikrobiote i creva, kako je definisano u zahtevima.

[0008] Prema pronalasku, gornji problem je rešen farmaceutskom kompozicijom koja sadrži nikotinsku kiselinu, nikotinamid, triptofan ili neko drugo ovde opisano jedinjenje, za koje se veruje da pozitivno utiču na crevnu mikrobiotu.

[0009] Dakle, pronalazak se odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži aktivnu supstancu odabranu od nikotinske kiseline; nikotinamida; triptofana; estara nikotinske kiseline; nikotinamid adenin dinukleotida (NAD); nikotinamid adenin dinukleotid fosfata

[0010] (NADP); intermedijer u biosintezi NAD ili NADP odabran iz grupe koju čine N-formilkinurenin, L-kinurenin, 3-hidroksi-L-kinurenin, 3-hidroksiantranilat, 2-amino-3-karboksimukonat polialdehid, kinolinat i beta-nikotinat D-ribonukleotid; triptofan dipeptid; ili njihovu kombinaciju, pri čemu farmaceutska kompozicija oslobađa aktivnu supstancu za topikalnu efikasnost u terminalnom ileumu, kolonu ili u oba, gde se nalaze crevne mikrobiote koje treba modifikovati.

[0011] U poželjnim realizacijama, nikotinska kiselina i/ili nikotinamid i/ili triptofan se administriraju da lokalno utiču na intestinalnu mukozu i intestinalnu mikrobiotu. Na primer, aktivna supstanca je formulisana za selektivnu primenu u terminalnom ileumu ili kolonu gde se nalaze crevne mikrobiote koje treba modifikovati. Druge aktivne supstance koje se pretvaraju u nikotinsku kiselinu i/ili nikotinamid i/ili triptofan u telu životinje (npr. telu čoveka) takođe su obuhvaćene ovim pronalaskom.

[0012] Shodno tome, obezbeđene su farmaceutske kompozicije koje sadrže nikotinsku kiselinu (niacin, vitamin B3) i/ili nikotinamid i/ili triptofan. Ove tri supstance pojedinačno ili u kombinaciji (kombinacija dve ili tri) jedna sa drugom deluju na protivupalni i/ili koristan način na mikrobiotu u tankom i/ili debelom crevu. Kompozicija je pogodna za oralnu administraciju sa kontrolisanim i/ili odloženim oslobađanjem aktivnih sastojaka za specifičnu specifičnu lokalnu ili topikalnu efikasnost u terminalnom ileumu i/ili kolonu. Primeri lečenih stanja uključuju terapiju ili profilaksu inflamatornih bolesti tankog creva, inflamatornih bolesti debelog creva, profilaksu karcinoma kolona i terapiju ili profilaksu drugih bolesti koje su rezultat promene crevne mikrobiote i/ili poremećene interakcije između intestinalne mikrobiote i creva.

[0013] Pronalazak takođe uključuje postupke za lečenje jedne ili više ovde opisanih bolesti i stanja pomoću ovde opisane farmaceutske kompozicije. Osim toga, pronalazak obezbeđuje upotrebu ovde opisane farmaceutske kompozicije u proizvodnji leka za lečenje jedne ili više ovde opisanih bolesti i stanja.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0014]

Slika 1 prikazuje sprečavanje intenzifikacije DSS kolitisa kod ACE2-deficijentih miševa nikotinamidom ili triptofanom. Gornji red: histopatologija debelog creva (bojenje hematoksilin eozina na dan 10, nakon administracije DSS-a; bar: 100 µm (a)), gubitak težine u procentima (b) i skor dijareje (c) kod DSS-om izazvane ACE2-normalnih (ACE2+/y) i ACE2-deficijentnih (ACE2-/y) miševa kojima je davan nosač ili nikotinamid (NAM) u vodi za piće. Administracija NAM-a je započela 3 dana pre administracije DSS. Donji red: histopatologija kolona (bojenje hematoksilin eozinom na dan 7 nakon DSS izazova; bar: 100 µm (d)), gubitak težine u procentima (e) i oštećenje kripti kolona (f) kod DSS-om izazvanih ACE2-normalnih (ACE2+/y) i ACE2-deficijentnih (ACE2-/y) miševa koji su dobijali normalnu ishranu (kontrola) ili triptofandipeptidnu dijetu (Trp+).

Sve vrednosti su prosečne vrednosti sa standardnom greškom od 3-10 miševa po grupi.

*: P <0.05; ** ili ##: P <0.01.

Slika 2 prikazuje razvoj indeksa aktivnosti Kronove bolesti (CDAI) kod tri pacijenta od nedelje (week) 0 do nedelje 4, dok im je administriran nikotinamid (2 x 600 mg dnevno).

Slika 3 prikazuje histološke rezultate mukoze kolona miševa sa kolitisom izazvanim dekstran natrijum sulfatom (DSS), koji su tretirani ili nikotinamidom (NAM) gavažiranim u vodi ili formulacijom minitablete sa kontrolisanim oslobađanjem NAM pomešanom u hrani ili 5-aminosalicilnom kiselinom gavažiranom kao suspenzija u 0.5% metilcelulozi.

Slika 4 prikazuje podatke o indeksu aktivnosti mišića (DAI) kod miševa sa kolitisom izazvanim dekstran natrijum sulfatom (DSS), koji su tretirani (1) nikotinamidom (NAM) gavažiranim u vodi ili (2) kontrolnim granulama pomešanim u hrani, ili (3) formulacijom granula sa kontrolisanim oslobađanjem NAM pomešanim u hrani u tri doze, ili (4) formulacijom granula sa kontrolisanim oslobađanjem 5-aminosalicilne kiseline (granule 5-ASA) pomešanim sa hranom. *, p<0.05 u odnosu na kontrolne granule; **, p<0.01 u odnosu na kontrolne granule; ***, p<0.001 u odnosu na kontrolne granule; ###, p <0.001 u odnosu na istu dozu NAM u vodi.

Slika 5 prikazuje sadržaj mijeloperoksidaze (MPO) u homogenatima tkiva kolona kod miševa sa kolitisom izazvanim dekstran natrijum sulfatom (DSS) i tretiranih (1) nikotinamidom (NAM) gavažiranim u vodi ili (2) kontrolnim granulama pomešanim u hrani, ili (3) formulacijom granula sa kontrolisanim oslobađanjem NAM pomešanim sa hranom u tri doze, ili (4) formulacijom granula sa kontrolisanim oslobađanjem 5-aminosalicilne kiseline (granule 5-ASA) pomešanim sa hranom. *, p<0.05 u odnosu na kontrolne granule; ***, p<0.001 u odnosu na kontrolne granule.

Slika 6 prikazuje relativnu zastupljenost glavnih bakterijskih vrsta Bacteroidetes i Firmicutes u uzorcima stolice od 5-8 miševa po grupi pre i posle 12 dana dijete deficijentne u triptofanu, nikotinskoj kiselini ili nikotinamidu (dijeta bez Trp/Nia/NAM). Dijeta bez Trp/Nia/NAM sadržala je (1) kontrolne granule bez NAM ili 5-aminosalicilne kiseline (5-ASA), (2) formulaciju granula sa kontrolisanim oslobađanjem NAM pomešanu u hrani u tri doze, ili (3) formulaciju granula sa kontrolisanim oslobađanjem 5-aminosalicilne kiseline (granule 5-ASA) pomešanu u hrani.

Slika 7 prikazuje analize procenta sličnosti (SIMPER) kompozicija mikrobiote u uzorcima stolice od 5-8 miševa po grupi pre i posle 12 dana dijete sa nedostatkom triptofana, nikotinske kiseline ili nikotinamida (dijeta bez Trp/Nia/NAM). Dijeta bez Trp/Nia/NAM sadržala je (1) kontrolne granule bez NAM ili 5-aminosalicilne kiseline (5-ASA), ili (2) formulaciju granula NAM sa kontrolisanim oslobađanjem pomešanu u hrani u tri doze, ili (3) formulaciju granula 5-aminosalicilne kiseline (5-ASA granule) sa kontrolisanim oslobađanjem pomešanu u hrani. Širenje neklasifikovanih Bacteroidales i Bacteroidales roda Paraprevotella je vizualizovana šrafiranim delovima stubaca.

DETALJAN OPIS

[0015] Pronalazak se odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži aktivnu supstancu odabranu od nikotinska kiselina; nikotinamid; triptofan; estri nikotinske kiseline; nikotinamid adenin dinukleotid (NAD); nikotinamid adenin dinukleotid fosfat (NADP); intermedijer u biosintezi NAD ili NADP odabran iz grupe koju čine N-formilkinurenin, L-kinurenin, 3-hidroksi-L-kinurenin, 3-hidroksiantranilat, 2-amino-3-karboksimukonat semialdehid, hinolinat i beta-nikotinat D-ribonukleotid; triptofan dipeptid; ili njihova kombinacija, pri čemu se u farmaceutskoj kompoziciji oslobađa aktivna supstanca za topikalnu efikasnost u terminalnom ileumu, kolonu ili u oba, gde se nalazi intestinalna mikrobiota koju treba modifikovati.

[0016] Suština pomenutog pronalaska je farmaceutska kompozicija koja sadrži jednu, dve ili više aktivnih supstanci izabranih od nikotinske kiseline; nikotinamida; triptofana; jedinjenja koje se u telu životinje (npr. telu čoveka) pretvara u nikotinsku kiselinu, nikotinamid ili triptofan; nikotinamid adenin dinukleotid (NAD); nikotinamid adenin dinukleotid fosfat (NADP); intermedijer u biosintezi NAD ili NADP; i triptofan dipeptid za pozitivan uticaj na crevnu mikrobiotu, pri čemu je farmaceutska kompozicija dizajnirana za odloženo oslobađanje tako da se oslobađa (npr. delimično oslobađa, selektivno oslobađa) u donjem tankom crevu, kolonu ili u oba, gde se nalazi intestinalna mikrobiota koja se modifikuje.

[0017] Pronalazači su prepoznali da nikotinska kiselina i/ili nikotinamid i/ili triptofan imaju antiinflamatorni efekat tako što utiču na crevnu mikrobiotu (svi mikroorganizmi u crevima, naročito bakterije) time što menjaju obrazac sekrecije antimikrobnih peptida u crevima. Izmenjena crevna mikrobiota nakon administracije farmaceutskog preparata prema ovom pronalasku manje promoviše upale ili je antiinflamatorna, što uzrokuje i/ili podržava jasno smanjenje simptoma IBD, kao što je Kronova bolest ili ulcerozni kolitis, kod ljudi ili drugih sisara (npr. hronični idiopatski kolitis kod pasa). Osim toga, ovde je prvi put pokazano da farmaceutske kompozicije koje oslobađaju bar deo svoje aktivne supstance u pogođenom delu gastrointestinalnog trakta imaju znatno bolju efikasnost od farmaceutske kompozicije koja se u velikoj meri apsorbuje pre nego što dospe do pogođenog područja.

[0018] Prema tome, kako se ovde koristi, „pozitivan uticaj na crevnu mikrobiotu“ se odnosi na izazivanje promene u crevnoj mikrobioti koja ima pozitivan uticaj na zdravlje, posebno na jednu ili više ovde opisanih bolesti i stanja. Na primer, pozitivni uticaji su povezani sa smanjenjem broja patogenih bakterija, smanjenjem odnosa patogenih bakterija prema korisnim bakterijama, povec ́anjem raznolikosti mikrobiote, smanjenjem količine upale koju mikrobiota izaziva u crevima i delimičnim ili potpunim vrac ́anjem patološke promene u enterotipu mikrobiote (npr. enterotipovi povezani sa Bacteroides, Prevotella i Ruminococcus). Bakterije koje se generalno smatraju patogenima u upalnim bolestima creva uključuju, na primer, Enterobacteriaceae (npr. Escherichia coli) sa invazivnim svojstvima ili faktorima virulencije, Desulfovibrio spp koji proizvodi sulfid i Fusobacterium spp sa invazivnim svojstvima. Bakterije koje se generalno smatraju korisnim uključuju vrste iz rodova Lactobacillus, Bifidobacterium i Faecalibacterium, kao što su L. casei, L. plantarum i F. prausnitzii. Za nedavni pregled mikrobiote creva kod zapaljenskih bolesti creva, videti Manichanh et al. 2012, Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 9:599.

[0019] Hashimoto et al. (Nature 2012, 487:477), objavljen nakon datuma prioriteta ove prijave, čiji je sadržaj ovde uključen referencom, pruža dodatne dokaze u vezi sa ovde opisanim pronalaskom. Hashimoto sa sar. je pokazao da malapsorpcija triptofana kod miševa dovodi do značajno veće težine kolitisa izazvanog iritantnim dekstran natrijum sulfatom (DSS). Dijetetski suplementi triptofana ili nikotinamida sprečili su ovo pojačanje kolitisa. Hashimoto i sar. su pokazali da je povećana osetljivost na teški kolitis posledica promenjenog mikrobioma creva, koji je prilikom transplantacije drugim miševima takođe povećao težinu kolitisa kod primalaca. Utvrđeno je da su štetne promene u mikrobiomu creva nastale usled jako smanjenih količina određenih antimikrobnih peptida (AMP), posebno alfa-defensina, čija je ekspresija u epitelnim ćelijama terminalnog ileuma u velikoj meri kontrolisana mTOR signalizacijom indukovanom triptofanom ili nikotinamidom.

[0020] Budući da hronična upala creva jako povećava rizik od razvoja karcinoma debelog creva (za pregled videti npr. Ullman & Itzkovitz 2011, Gastroenterology 140:1807), upotreba kompozicije prema ovom pronalasku je takođe profilaksa karcinoma debelog creva u slučaju hroničnog ili rekurentnog zapaljenja creva.

[0021] Pokazalo se da je terapijska intervencija uspostavljanjem ili ponovnim uspostavljanjem normalne crevne mikrobiote ili dodavanjem korisnih bakterija efikasna u različitim modelima bolesti i kod odgovarajućih ljudskih bolesti. Na primer, Olszak sa sar. (Science 2012, 336:489) nedavno je pokazao da se patološka akumulacija invarijantnih prirodnih T ćelijskih ubica u obolelim organima u mišjim modelima IBD ili astme bez mikroba može sprečiti kolonizacijom novorođenih miševa sa normalnom mikrobiotom. U različitim bolestima, studije su pokazale korisne efekte određenih pre-, pro- ili sinbiotika. Na primer, laktobacili mogu smanjiti nivo holesterola u krvi kod gojaznosti, ali mehanizam još uvek nije potpuno jasan (razmotrio Caesar sa sar.

2010, J. Intern. Med. 268:320). Kod inflamatornih bolesti creva, neki probiotici poput VSL#3 (mešavina Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium infantis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus i Streptococcus thermophilus). uspešno su korišćeni u ograničenom broju kliničkih studija. Čini se da je obično potrebna suplementacija sa najmanje nekoliko sojeva bakterija da bi se obezbedila značajna terapijska korist. Nedavni primer spektakularne efikasnosti kompleksne bakterijske intervencije je uspešna upotreba transplantata stolice protiv Clostridium difficile (van Nood et al. 2013, New Engl. J. Med. 368: 407).

[0022] Pošto patološke promene u crevnoj mikrobioti takođe mogu igrati uzročnu ulogu kod brojnih drugih bolesti koje potiču od atopijskih poremećaja, kao i kod metaboličkih bolesti sa zapaljenskom komponentom, terapija i/ili profilaksa takvih bolesti je takođe u okviru ovog pronalaska. Naročito, sledeće bolesti su primeri takvih indikacija:

- koža: alergija, atopijski ekcem, psorijaza;

- pluća: cistična fibroza, astma, COPD;

- sudovi: koronarna bolest srca, arterioskleroza, ateroskleroza;

- endokrini sistem: dijabetes, gojaznost.

[0023] Inventivna, specifična, topikalna upotreba nikotinske kiseline i/ili nikotinamida i/ili triptofana (i srodnih aktivnih supstanci) za lokalni uticaj na intestinalnu sluznicu i crevnu mikrobiotu, crevne upale i direktnu terapiju crevne sluznice proizilaze iz ovde opisanih uvida u ranije nepoznate i neočekivane uloge ovih jedinjenja. Ova upotreba se značajno razlikuje od konvencionalne upotrebe aktivnih supstanci, gde se te supstance apsorbuju i treba da deluju sistemski. Zbog svog novog protivupalnog dejstva i/ili njihovog dejstva koje modifikuje crevnu mikrobiotu, nikotinska kiselina i/ili nikotinamid i/ili triptofan (i ostala ovde opisana jedinjenja) su stoga pogodna kao aktivne supstance za lečenje inflamatornih bolesti tankog i/ili debelog creva. Posebni uslovi uključuju lečenje crevnih upala, profilaksu karcinoma kolona i terapiju ili profilaksu drugih bolesti koje su rezultat promena u crevnoj mikrobioti i/ili poremećene interakcije između crevne mikrobiote i creva. Poželjno je da se ove aktivne supstance koriste u farmakološkoj formulaciji koja štiti najveću moguću količinu aktivne supstance od apsorpcije u telu u gornjem delu tankog creva i umesto toga vrši oslobađanje (npr. kontrolisano oslobađanje i/ili odloženo oslobađanje) u terminalnom ileumu ili kolonu gde se nalaze crevne mikrobiote koje treba modifikovati (npr. aktivna supstanca se selektivno oslobađa u terminalnom ileumu i/ili kolonu).

[0024] Ovde opisane aktivne supstance su naročito pogodne za upotrebu u lekovima sa topikalnim oslobađanjem (npr., kontrolisano i/ili odloženo oslobađanje) za terapiju Kronove bolesti, ulceroznog kolitisa, poučitisa, drugih hroničnih bolesti debelog creva ili upala debelog creva, diverzionog kolitisa, infektivnog enteritisa, sa antibioticima povezane dijareje, poput dijareje povezane sa C. difficile, infektivnog kolitisa, divertikulitisa i upala koje nastaju od zračenja, antibiotika, hemoterapeutskih agensa, farmaceutskih proizvoda ili hemikalija, kao i za profilaksu karcinoma kolona i za terapiju ili profilaksu drugih bolesti koje su rezultat promena u crevnoj mikrobioti i/ili poremec ́ene interakcije između crevne mikrobiote i creva.

[0025] Supstance iz kompozicija koje su predmet patentnih zahteva su podjednako upotrebljive za terapiju ili profilaksu bolesti slične geneze kod ljudi i kod drugih sisara, naročito kod domaćih i korisnih životinja. Primeri takvih životinja su psi, mačke, konji, kamile ili krave bez objektivnih ograničenja.

[0026] Aktivne supstance, tj. nikotinska kiselina i/ili nikotinamid i/ili triptofan se mogu koristiti u bilo kom obliku koji je dostupan na tržištu, npr. proizveden u Merck KgaA. Triptofan se može koristiti kao pojedinačna aminokiselina ili dipeptid, npr. kao Gly-Trp dipeptid.

[0027] Pored nikotinske kiseline, nikotinamida i triptofana, i druga srodna jedinjenja se mogu koristiti u ovde opisanom pronalasku kao aktivne supstance. Na primer, pogodna su jedinjenja koja se pretvaraju u jedno od ovih sredstava (npr. hidrolizom, metabolizmom) u telu čoveka ili životinje, kao što su estri nikotinske kiseline. Pored toga, mogu se koristiti intermedijeri u sintezi nikotinamid adenin dinukleotida (NAD) ili NAD fosfata (NADP), kao š to su N-formilkinurenin, L-kinurenin, 3-hidroksi-L-kinurenin, 3-hidroksiantranilat, 2-amino-3-karboksimukonat polualdehid, kinolinat i beta-nikotinat D-ribonukleotid. Otali primeri uključuju NAD i NADP.

[0028] Farmaceutske kompozicije koje sadrže nikotinsku kiselinu i/ili nikotinamid i/ili triptofan (ili neku od drugih supstanci koje su gore opisane), mogu se administrirati oralno uz usporavanje oslobađanja aktivne supstance. Mesto isporuke aktivne supstance za inhibiranje zapaljenskih procesa je poželjno donji deo tankog creva i/ili debelog creva, i stoga se suštinski razlikuje od načina primene koji - npr. za terapiju pelagre – teži ka maksimalnoj apsorpciji i metabolizmu u organizmu, a time i sistemskom efektu. Pored toga, način primene prema pronalasku i doziranje prema pronalasku minimiziraju verovatnoću pojave neželjenih efekata, npr. kako je opisano u vezi sistemske administracije nikotinske kiseline.

[0029] Kako se ovde koristi, "donje tanko crevo" je druga polovina tankog creva, a "terminalni ileum" je druga polovina ileuma.

[0030] S tim u vezi, ovaj pronalazak takođe uključuje kombinovane preparate, kao što su kombinacije nikotinske kiseline i/ili nikotinamida sa acetilsalicilnom kiselinom i/ili antagonistima prostaglandina D2, kao što je laropiprant, koji smanjuju neželjene efekte tipične za nikotinsku kiselinu. Sastav i doziranje takvih kombinacija su poznati stručnjaku u ovoj oblasti. Pored toga, upotreba nikotinamida umesto nikotinske kiseline, koja je poželjna prema pronalasku, minimizira verovatnoću pojave neželjenih efekata.

[0031] Da bi se proizvele oralno administrirane formulacije aktivne supstance koje imaju antiinflamatorni i/ili modifikujući efekat na crevnu mikrobiotu u terminalnom ileumu i/ili u kolonu, korisno i inovativno je koristiti kontrolisani i/ili odloženi načini oslobađanja. Nasuprot konvencionalnim (u nekim slučajevima i odloženim) načinima oslobađanja za optimalnu suplementaciju, npr. u slučaju pelagre, određene realizacije ovog pronalaska delimično ili suštinski izbegavaju apsorpciju u želucu i gornjim delovima tankog creva.

[0032] Za lečenje Kronove bolesti ili ulceroznog kolitisa, pogodni su oralni načini primene. Ako se za lečenje poučitisa u slučaju ulceroznog kolitisa koristi rektalna aplikacija (npr. kao klistir), ona takođe može biti podržana oralnom primenom gore opisanih oralnih formulacija, npr. preparata sa odloženim oslobađanjem. Za simptomatsku terapiju bilo kog drugog oblika kolitisa, mogu se odabrati oralne i rektalne aplikacije za terapijsku modifikaciju intestinalne mikrobiote. Inventivna oralna aplikacija pronalaska je poželjna za profilaksu karcinoma kolona, posebno u slučaju ulceroznog kolitisa, i za terapiju i/ili profilaksu drugih bolesti koje su delimično ili u znatnoj meri posledica promena u crevnoj mikrobioti i/ili poremećene interakcije između crevne mikrobiote i creva.

[0033] Za oralnu adminiatraciju su posebno pogodni određeni oblici doziranja koji kontrolišu i/ili odlažu oslobađanje aktivne supstance zbog posebnih galenika (takozvani oblici sa kontrolisanim oslobađanjem, usporenim ili odloženim oslobađanjem). Takvi oblici doziranja mogu biti jednostavne tablete a takođe i obložene tablete, npr. film tablete ili dražeje. Tablete su obično okrugle ili bikonveksne. Mogući su i duguljasti oblici tableta koji omogućavaju deljenje tablete. Pored toga, moguće su granule, sferoidi, pelete ili mikrokapsule koje se pune u kesice ili kapsule, kada je to potrebno.

[0034] Termin "odloženo oslobađanje" poželjno se odnosi na farmaceutsku formulaciju koja oslobađa aktivne sastojke nakon određenog perioda odlaganja. U određenim realizacijama, odlaganje je dovoljno da se bar deo aktivnih supstanci u formulaciji oslobodi u donjem tankom crevu (npr. terminalni ileum) i/ili debelom crevu.

[0035] Termin "kontrolisano oslobađanje" odnosi se poželjno na farmaceutsku formulaciju ili njenu komponentu koja oslobađa ili isporučuje jedan ili više aktivnih sastojaka tokom dužeg vremenskog perioda. U određenim realizacijama, vremenski period je dovoljan da se bar deo aktivnih supstanci u formulaciji oslobodi u donjem delu tankog creva (npr. terminalni ileum) i/ili u debelom crevu.

[0036] Retardacija se povoljno postiže, npr. oblogama koje su otporne na želudačni sok i rastvaraju se u zavisnosti od pH, pomoću mikrocelulozne i/ili multi matriksne (MMKS) tehnologije, korišćenjem različitih matriksa kao nosača ili kombinacijom ovih tehnika. Primeri uključuju obloge u vidu filma koje sadrže akrilne i/ili metakrilatne polimere u različitim smešama za kontrolisano i/ili odloženo oslobađanje. Na primer, aktivne supstance mogu biti sadržane u konvencionalnom matriksu mikrokristalne celuloze ili želatina ili sa MMX tehnologijom, koja je obložena materijalom, koji obezbeđuje odloženo oslobađanje aktivne supstance. Poželjno je uvođenje aktivne supstance u kapsule velike zapremine (npr. želatin sa sadržajem 0.68 ml) koje su obložene poznatim postupcima. Pogodni agensi za oblaganje su u vodi nerastvorni voskovi i polimeri, kao što su polimetakrilati (npr. portfolio proizvoda sa trgovačkim imenom Eudragit®, naročito Eudragit® S i Eudragit® L, Evonik Industries AG, Essen, Nemačka) i u vodi nerastvorne celuloze (npr. metil celuloza, etil celuloza). Kada je to prikladno, u materijalu obloge se mogu nalaziti i vodorastvorni polimeri (npr. polivinilpirolidon), vodorastvorne celuloze (npr. hidroksipropilmetil celuloza ili hidroksipropil celuloza), polisorbat 80, polietilen glikol (PEG), laktoza ili manitol.

[0037] Na primer, kombinacija jedinjenja Eudragit® S i L (npr. Eudragit® L/S 100) utiče na kontrolisano oslobađanje aktivnih supstanci prema pronalasku pri pH>6.4, koje se dešava u terminalnom ileumu. Dalja upotreba preparata Eudragit® i njihovih smeša (jedinjenja L, S i R) takođe je moguća za pakovanje aktivne supstance, i prema tome se lokalna upotreba u odabranim delovima čitavog gastrointestinalnog trakta može postići kontrolisanim oslobađanjem pri određenim pH vrednostima.

[0038] Farmaceutska kompozicija takođe može da sadrži i druge farmaceutske ekscipijente, kao što su veziva, punioci, glidanti, maziva i agensi za regulaciju tečljivosti. Jedinjenja prema pronalasku mogu biti formulisana, prema potrebi, zajedno sa drugim aktivnim supstancama i sa ekscipijentima uobičajenim u farmaceutskim kompozicijama, npr. talk, gumi arabika, laktoza, skrob, magnezijum stearat, kakao buter, vodeni i ne-vodeni nosači, lipidne komponente ž ivotinjskog ili biljnog porekla, derivati parafina, glikoli (naročito polietilen glikol), razni plasticizeri, disperzanti, emulgatori i/ili konzervansi.

[0039] Da bi se proizveli klistiri ili supozitorije za gore pomenutu rektalnu aplikaciju, preparacije aktivne supstance se mogu rastvoriti u pogodnom rastvaraču i dalje preraditi u klistire ili supozitorije prema poznatim farmaceutskim metodama.

[0040] Sadržaj aktivne supstance u gotovom doznom obliku je 1 - 3000 mg, poželjno 100 - 1000 mg, u slučaju inventivne oralne administracije; klistir i/ili supozitorije za gore pomenutu rektalnu aplikaciju mogu sadržati količinu od 10 mg do 5000 mg aktivne supstance. U zavisnosti od intenziteta i težine zapaljenske bolesti, oblici doziranja se daju jednom ili nekoliko puta dnevno ili u drugom režimu doziranja koji odabere lekar.

[0041] Kako se ovde koriste, izrazi "tretman", "lečenje" i "lečiti" se odnose na preusmeravanje, ublažavanje, odlaganje početka ili inhibiranje razvoja bolesti ili poremećaja, ili jednog ili više njihovih simptoma, kako je ovde opisano. U nekim realizacijama, lečenje se može primeniti nakon što se razviju jedan ili više simptoma. U drugim realizacijama, lečenje se može primeniti u odsustvu simptoma. Na primer, lečenje se može primeniti na osetljivu osobu pre pojave simptoma (npr. u pogledu istorije simptoma i/ili genetskih ili drugih faktora susceptibilnosti). Lečenje se takođe može nastaviti nakon nestanka simptom, na primer da bi se sprečilo ili odložilo njihovo ponavljanje.

[0042] Kako se ovde koristi, izrazi "profilaksa" i "sprečavanje" se odnose na odlaganje početka ili smanjenje verovatnoće razvoja bolesti ili poremećaja ili jednog ili više njihovih simptoma, u poređenju sa nelečenom kontrolnom populacijom.

[0043] Sledeći aspekt ovde opisanog pronalaska je efikasna upotreba zahtevanih lekova na osnovu genetskih i/ili mikrobioloških podataka i specifičnih potreba pojedinaca koji se leče. Novi uvidi u genetsku predispoziciju pojedinaca za sve vrste bolesti (naročito bolesti kod kojih je poremećena interakcija između crevne mikrobiote i creva) i u farmakogenetiku ukazuju da personalizovana medicina zasnovana na dokazima, uključujući genetske analize relevantnih rizičnih gena, kao i gena koji kodiraju, na primer, receptore na ćelijskoj površini, transportne proteine, metaboličke enzime ili proteine transdukcije signala, koji stupaju u interakciju sa lekom i/ili njegovim metabolitima i/ili njegovim nizvodnim efektorima, mogu doprineti informacijama i poboljšanjima u pogledu vrste upotrebe, načina primene, vremena upotrebe, doze i/ili doznog režima ovde opisanih lekova. Pojedinci koji mogu imati koristi od ovog personalizovanog tretmana uključuju one sa smanjenim serumskim triptofanom, izmenjenom ekspresijom B<0>AT1 (npr. u ćelijama crevnog epitela) i B<0>AT1 polimorfizmima. Ovo se analogno odnosi na analize crevne mikrobiote, posebno kada uzorak stolice ukazuje na promenu mikrobiote. Predmetni pronalazak, prema tome, takođe uključuje upotrebu pogodnih genetskih i/ili mikrobioloških metoda ispitivanja za identifikaciju pojedinaca koji su posebno podobni za lekove prema pronalasku i/ili za prilagođavanje upotrebe lekova prema pronalasku individualnim okolnostima. Ovo takođe izričito uključuje upotrebu različitih supstanci (nikotinska kiselina i/ili nikotinamid i/ili triptofan) u različitim načinima adminiistracije, u zavisnosti od genetskih i mikrobioloških svojstava pojedinca. U ove svrhe moguc ́e je koristiti laboratorijske testove i/ili odgovarajuc ́e komplete za testiranje, kao i merne metode, uređaje i/ili komplete koje c ́e koristiti lekar, korisnik i/ili pacijent, npr. za uzimanje uzoraka stolice ili za analizu odgovarajuc ́ih krvnih parametara u, urinu ili drugim telesnim tečnostima.

OBJAŠNJENJE NA PRIMERIMA

[0044] Postoje različite mogućnosti za povoljan razvoj i dalji razvoj ideja i principa iz ovog pronalaska. U tu svrhu upućuje se na primere u nastavku koji opisuju pronalazak na reprezentativan način.

Primer 1:

[0045] Novi i oni nalazi koji nisu bili objavljeni u vreme podnošenja prioritetne prijave, pošto su objavljeni kao Hashimoto et al. (Nature 2012, 487: 477), podržavaju učenja iz ovog pronalaska i ovde su ukratko opisani u svrhu ilustracije: Poznato je da je ekspresija transportera neutralnih aminokiselina B<0>AT1 (koji transportuje triptofan) na površini epitelnih ćelija creva vezana za prisustvo angiotenzin-konvertujućeg enzima-2 (ACE2) (Kowalczuk et al. 2008, FASEB J. 22:2880; Camargo et al. 2009, Gastroenterology 136:872). Defektan ACE2 dovodi do bolesti deficijencije aminokiselina (takozvana Hartnupova bolest), čiji je model bolesti sličan pelagri i koja se može lečiti povećanom količinom triptofana i nikotinamida. Model miša je sada pokazao da su miševi bez funkcionalnog ACE2 (genotip: Ace2-/y) patili od znatno jačih veštački izazvanih crevnih upala od miševa sa normalnim genotipom (Ace2+/y) kada im je davana supstanca dekstran natrijum sulfat (DSS). Zanimljivo, bilo je moguće smanjiti ovaj efekat profilaktičkom i trajnom administracijom nikotinamida (NAM) ili triptofan dipeptida (koji se preuzimaju preko transportera različitog od B<0>AT1 koji ovde nije dostupan) do vrednosti genetski normalnih miševa. Propratni podaci su sažeti na slici 1 i, s obzirom na sadržaj, podržavaju nalaze i zahteve ovog pronalaska za upotrebu kod čoveka i životinje iz perspektive mišjeg modela.

Primer 2:

[0046] Da bi se analizirala promena crevne mikrobiote kada se daje nikotinamid, izolovana je genomska DNK iz uzoraka stolice u skladu sa stanjem tehnike i kvantifikovana, a varijabilni region bakterijskog 16-S-rRNA gena je amplifikovan, pri č emu su amplikoni snabdeveni odgovarajućim oznakama u svrhu identifikacije. Nakon pirosekvenciranja visoke propusnosti amplikona, sve dobijene sekvence su podvrgnute kontroli kvaliteta i analizirane su višestepenim poređenjem sekvenci sa kuriranim bazama podataka bakterijskih DNK sekvenci. Razlike dobijenih reprezentativnih poprečnih preseka crevne mikrobiote u uzorcima stolice lečenih i nelečenih osoba se koreliraju i procenjuju sa uočenim i izmerenim simptomima bolesti i relevantnim genetskim faktorima pojedinaca.

[0047] Slika 2 prikazuje razvoj indeksa aktivnosti Kronove bolesti (CDAI), tj. aktivnosti bolesti izračunate prema priznatom standardu iz različitih parametara bolesti, kod tri pacijenta koji su patili od Kronove bolesti i lečeni su konvencionalno formulisanim nikotinamidom u visokoj dozi tokom 4 nedelje (2 x 600 mg dnevno). Vrednost CDAI<150 je ekvivalentna remisiji. Sva tri pacijenta koja su patila od Kronove bolesti pokazala su jasan odgovor na primenu nikotinamida, od kojih su dva postigla remisiju u terapijskom periodu.

[0048] Osnovni mehanizam i blagotvorno dejstvo nikotinamida koje su opisali Hashimoto et al. 2012 (Nature 487:477) za model mišjeg kolitisa (videti Primer 1) podudara se sa kliničkim poboljšanjem pacijenata sa humanom Kronovom bolešću kao odgovor na suplementaciju nikotinamidom viđenu u ovom primeru.

Primer 3:

[0049] Iznenađujuće se pokazalo da iako se ekspresija ACE2 u crevnoj sluznici pacijenata koji pate od Kronove bolesti i ulceroznog kolitisa nije značajno razlikovala od vrednosti kod zdravih osoba (podaci nisu prikazani), ekspresija B<0>AT1 u upaljenim delovima mukoze je jako smanjena i to na statistički značajan način (vrednost P<0.05) (videti tabelu 1). Dodatno, kontrolni uzorci pacijenata koji pate od crevnih upala različite geneze (tzv. kontrole specifičnosti bolesti) nisu pokazali značajna odstupanja od hospitalizovanih normalnih osoba (HN). Ovo govori protiv generalne, bolesti nespecifične deficijencije ili deficijencije aminokiselina, i za specifične efekte nikotinske kiseline, nikotinamida i/ili triptofana (i srodnih jedinjenja) u lečenju IBD, čiji efekti su novo zapaženi u ovom pronalasku.

[0050] Deficijencija transportera triptofana kod pacijenata sa IBD, koja je uočena u ovom primeru, odgovara situaciji kod miševa sa pogoršanim kolitisom usled nedostatka transportera triptofana (Hashimoto et al. 2012, Nature 487: 477; videti Primer 1).

Primer 4:

[0051] Da bi se okarakterisala prednost formulacija sa kontrolisanim oslobađanjem za ciljanu isporuku nikotinamida u crevni epitel, sprovedena je studija radi potvrde koncepta (eng. proof-of-concept) na modelu kolitisa izazvanog dekstran natrijum sulfatom (DSS) kod miševa. DSS kolitis je standardizovani model kolitisa za procenu efikasnosti leka kandidata za humane inflamatorne bolesti creva. Kao kontrola lečenja koja je normalno efikasna kod DSS kolitisa, korišćena je 5-aminosalicilna kiselina (5-ASA). 5-ASA je gotovo nerastvoran pri fiziološkom pH i zbog toga je administriran kao suspenzija u 0.5% metilcelulozi.

[0052] Zbog specifičnih razlika u gastrointestinalnom traktu kod pojedinih vrsta u pogledu dužine, vremena prolaska i pH vrednosti, formulacije sa kontrolisanim oslobađanjem su prilagođene organizmu koji je trebalo da bude lečen. Na osnovu parametara gastrointestinalnog trakta miša (Koopman et al. 1978, Lab. Anim.

12:223; McConnell et al. 2008, J. Pharm. Pharmacol. 60:63), proizvedena je specifična formulacija za studiju potvrde koncepta na miševima.

[0053] Mini tabletice sa kontrolisanim oslobađanjem su proizvedene od praha smeše 99% NAM i 1% magnezijum stearata (oba iz Caelo, Hilden, Nemačka) kao lubrikanta. Nakon mešanja, prah je okarakterisan u pogledu tečljivosti (ugao mirovanja; <35 °) i raspodele veličine (laserska difrakcija; glavne frakcije čestica: 100-200 mm) kako bi se osigurala dobra tečljivost praha. Zatim su mini tablete proizvedene u rotacionoj presi i obložene filmom, u vodi nerastvornog, polimera Kollidon SR 30 D (BASF, Ludwigshafen, Nemačka) da bi se kontrolisalo oslobađanje NAM pomoću difuzije NAM kroz film. Formulacija obloge bila je sledeća: Kollicoat SR 20 D (49.9%), glicerol monostearat 60 (0.743%), propilen glikol (0.743%), crveni gvožđe oksid (0.4%), polisorbat 80 (0.314%) i voda do 100%.

[0054] Glicerol monostearat 60 (Caelo) je zagrevan sa polovinom vode na 80 °C i emulgovan pomoću Ultraturrax-a (IKA, Staufen, Nemačka). Posle toga je dodat crveni gvožđe oksid (Caelo) i dispergovan dodatnih 5 minuta (prva posuda). Polisorbat 80 (Caelo), propilen glikol (Caelo) i polimerne disperzije su kombinovani u drugoj posudi i mešani magnetnom mešalicom. Hladna (<30 °C) emulzija iz prve posude je kombinovana sa polimernom disperzijom iz druge posude i dodata je preostala voda. Disperzija je mešana 1 h pre filtriranja (<500 µm). Minitablete su obložene u aparatu sa fluidizovanim slojem (Microlab, Huttlin, Schopfheim, Nemačka) u šarži od 50 g sa brzinom dodavanja tečnosti od oko 1 ml/min i pritiskom nebulizacije od 0.7 bara. Pre nanošenja spreja, tablete su prethodno zagrejane sa zapreminskim protokom od 8 m<3 na 45 °C. Tokom>nanošenja spreja, zapreminski protok je povećan na 16 m<3>na 45 °C. Temperatura proizvoda je bila oko 38 °C. Posle nanošenja spreja, tablete su fluidizovane sa 16 m<3>tokom dodatnih 10 minuta na 45 °C radi očvršćavanja. U završnom koraku procesa, grejanje je isključeno i sloj tableta je ohlađen na <30 °C da bi se izbeglo lepljenje. Tablete su obložene sa 6.2 ± 0.04 mg/cm<2>. Oslobađanje leka je određeno u aparatu sa lopaticama (DT6, Erweka, Heusenstamm, Nemačka) u skladu sa Ph. Eur. pri 50 o/min. Fosfatni pufer (pH 4) je korišćen kao medijum za rastvaranje, pošto se kod miševa očekuje blago kisela gastrointestinalna tečnost otprilike ovog pH (McConnell et al. 2008, J. Pharm. Pharmacol. 60:63-70). Koncentracija leka je određena UV apsorpcijom na 262 nm. Neobložene tablete su pokazale trenutno oslobađanje leka zbog male veličine tableta i velike rastvorljivosti nikotinamida u vodi. Korišćenjem obloge Kollidon SR, oslobađanje leka je optimizovano da pokriva ciljna područja u tankom crevu miševa (najmanje 15 minuta kašnjenja, konstantno oslobađanje leka tokom 3 sata). Mini tablete su homogeno pomešane sa dijetetskim prahom bez Triptofana/niacina, formirane su pelete dužine oko 2 cm i prečnika 1 cm sa minimalnom količinom sterilne vode, zamrznute u alikvotima za jednokratnu upotrebu na -20 °C za skladištenje i svakodnevno sveže odmrzavane za hranjenje miševa.

[0055] Mužjaci miša C57BL/6J (bez specifičnih patogena; Taconic Europe, Ry, Danska) su prebačeni u objekat za ispitivanje sa 6-7 nedelja starosti i aklimatizovani tokom 2 nedelje. Ishrana tokom faze aklimatizacije je bila Altromin 1324, proizvođača Altromin (Lage, Nemačka). Posle 2 nedelje aklimatizacije, ishrana je promenjena u kastomizovanu ishranu bez triptofana ili nikotinske kiseline ili nikotinamida (dijeta bez Trp/Nia/NAM), koju je proizveo Ssniff (Soest, Nemačka). Na dan promene ishrane, režim lečenja je započeo kako je navedeno u nastavku. I dijeta bez Trp/Nia/NAM i tretman su administrirani do terminacije miševa.

Posle 12 dana ishrane bez Trp/Nia/NAM, miševi su izazvani sa 1.5% DSS (MP Biomedicals, Illkirch, Francuska) u vodi za piće tokom 4 dana, a zatim je izazov prekinut.

[0056] Režim tretmana je sproveden sa četiri grupe od po 10 miševa, koji su tretirani na sledeći način:

Grupa 1: svakodnevna oralna gavaža 0.25 ml nosača (sterilna voda).

Grupa 2: svakodnevna oralna gavaža 0.25 ml rastvora nikotinamida (Cat. No. 4488; Caelo) u sterilnoj vodi (6 mg/ml; finalna doza: oko 60 mg/kg telesne težine).

Grupa 3: Mini tablete sa kontrolisanim oslobađanjem, homogeno raspodeljene u hrani (finalna doza: oko 60 mg/kg telesne težine, na bazi unosa hrane od 2.5 g po mišu dnevno).

Grupa 4: svakodnevna oralna gavaža 0.25 ml 5-aminosalicilne kiseline (5-ASA; Cat. No. A3537, Sigma-Aldrich, Brondbi, Danska) suspendovane u 0.5% metilcelulozi (Cat. No. M7140, Sigma-Aldrich) pri koncentraciji od 15 mg/ml (finalna doza: oko 150 mg/kg telesne težine).

Rastvori doza su pripremani sveže od istih matičnih rastvora, dnevno, neposredno pre administracije.

[0057] Neposredno pre promene ishrane, pre indukcije DSS kolitisa i pre terminacije, od svake životinje su prikupljeni sveži uzorci stolice ekvivalentni dvema fekalnim peletima za analize mikrobioma. Uzorci stolice su odmah brzo zamrznuti u tečnom azotu i čuvani na -80 °C. Zamrzavanje je izvršeno da bi se održali odnosi između različitih bakterija sa različitim karakteristikama rasta u ambijentalnim uslovima.

[0058] Odmah nakon terminacije životinja, debelo crevo je isprano sa 0.9% fiziološkim rastvorom i pripremljeni su "Swiss roll" uzorci (Moolenbeek i Ruitenberg 1981: Lab. Anim. 15:57). Ukratko, očišćeno debelo crevo je otvoreno uzdužnim rezom, uvijeno sa resicama okrenutim ka spolja, i dobijeni kolut je fiksiran u formaldehidu i uklopljen u parafin prema standardnim procedurama. "Swiss roll" preparat omogućava longitudinalnu i kvantitativnu histološku procenu kompletne sluznice debelog creva na istom preseku. Preseci su obojeni hematoksilin-eozinom prema standardnim procedurama. Uzorke su na slepo ocenila dva nezavisna istraživača i bodovani su prema sledećem sistemu na osnovu tri parametra:

Jačina upale: 0, retke inflamatorne ćelije u lamini proprija; 1, povećani broj granulocita u lamini proprija, submukozni edem; 2, konfluentnost inflamatornih ćelija koje se protežu u submukozu; 3, transmuralna ekstenzija inflamatornog infiltrata.

Oštećenje kripte: 0, intaktne kripte; 1, gubitak bazalne trećine; 2, gubitak bazalne dve trećine; 3, gubitak cele kripte; 4, promena površine epitela sa erozijom; 5, konfluentna erozija.

Ulceracija: 0, odsustvo ulkusa; 1, 1 ili 2 žarišta ulceracija; 2, 3 ili 4 žarišta ulceracija; 3, konfluentna ili ekstenzivna ulceracija.

[0059] Maksimalni histološki skor je bio 3 5 3 = 11. Slepa histološka ocena kompletne mukoze debelog creva izabrana je kao “čvrsti” pokazatelj za terapeutski efekat zahtevanih NAM formulacija.

[0060] Histološki skorovi četiri grupe su prikazani na Slici 3, izraženi kao srednje vrednosti i standardne devijacije. Korišćeni su samo optimalno konzervisani i pripremljeni uzorci i preseci debelog creva (broj životinja je prikazan u zagradama dalje u tekstu). Skorovi su bili sledeći:

grupa 1 (vodene kontrole): 6.25 ± 1.39 (n = 8);

grupa 2 (NAM u vodi): 5.14 ± 1.07 (n = 7);

grupa 3 (NAM tablete sa kontrolisanim oslobađanjem): 3.38 ± 0.92 (n = 8);

grupa 4 (5-ASA): 6.50 ± 1.60 (n = 8).

[0061] Dok je NAM u vodi za piće indukovao samo tendenciju smanjenja histološkog rezultata upale u poređenju sa vodenom kontrolom (p = 0.1), primećena je veoma značajna razlika između NAM tableta sa kontrolisanim oslobađanjem i grupe vodene kontrole (p < 0.001) i, što je važno, takođe između NAM u vodi i NAM sa kontrolisanim oslobađanjem (p < 0.01). Zanimljivo je da tretman kontrola 5-ASA (koja ublažava normalni DSS kolitis i koja se široko koristi za terapiju inflamatornih bolesti creva kod ljudi) nije uspela da ublaži DSS kolitis u odsustvu triptofana ili niacina (Slika 3). Ova otkric ́a podržavaju koncept ovog pronalaska da blagotvorni uticaji NAM na crevnu mikrobiotu i na kolitis nisu optimalno iskorišc ́eni sistemskom isporukom oralnom gavažom, vec ́ formulacijama sa kontrolisanim oslobađanjem u crevima i da je primarno dejstvo NAM na lokalno okruženje u crevima.

Primer 5:

[0062] Da bi se dalje okarakterisale formulacije sa kontrolisanim oslobađanjem za ciljanu isporuku nikotinamida u crevni epitel, sprovedena je druga studija radi potvrde koncepta na modelu kolitisa dekstran natrijum sulfata (DSS) kod miševa. U ovoj drugoj i većoj studiji radi potvrde koncepta, formulacija granula sa kontrolisanim oslobađanjem za NAM je testirana u tri različite doze. Kao tretman kontrola koja je normalno efikasna kod DSS kolitisa, korišćene su granule sa kontrolisanim oslobađanjem koje sadrže 5-aminosalicilnu kiselinu (granule 5-ASA; PENTASA, Ferring Pharmaceuticals, Saint-Prex, Švajcarska).

[0063] Formulacija sa kontrolisanim oslobađanjem za NAM je granulat od 25% nikotinamida, 70% dvobaznog kalcijum fosfata i 5% Povidona K30. Srednja veličina čestica je bila 234 µm. Granulat je naknadno obložen filmom sa Etilcelulozom 7 da bi se postiglo povećanje težine od 30% i srednja veličina čestica 640 µm. Filtriranjem su uklonjene č estice veličine manje od 355 µm. Kontrolne granule su zamenile NAM ekvivalentnom količinom dvobaznog kalcijum fosfata.

[0064] Muški miševi C57BL/6J (bez specifičnih patogena; Charles River Laboratories, Saint-Germain-surl'Arbresle, Francuska) su preneti u objekat za testiranje sa > 12 nedelja starosti i aklimatizovani tokom 1.5 meseci kako bi se obogatila i stabilizovala njihova mikrobiota. Ishrana tokom faze aklimatizacije je bila hrana A4, proizvođača SAFE (Scientific Animal Food and Engineering, Augy, Francuska). Nakon aklimatizacije, ishrana je promenjena u kastomizovanu ishranu bez triptofana ili nikotinske kiseline ili nikotinamida (dijeta bez Trp/Nia/NAM), koju je proizveo Ssniff (Soest, Nemačka). Dijeta bez Trp/Nia/NAM se isporučivala u prahu, koji se koristio za pripremu hrane u obliku peleta bez granula, kontrolnih granula bez NAM ili granula 5-ASA, NAM ili 5-ASA. Granule su homogeno dispergovane u hrani. Hrana u obliku peleta približne dužine 2 cm i prečnika 1 cm su formirani sa minimalnom količinom sterilne vode, zamrznuti u alikvotima za jednokratnu upotrebu na -20 °C za skladištenje i svakodnevno sveže odmrzavani za hranjenje miševa. Sadržaj granula u peletima je definisan na sledeći način, na bazi kalkulacije od 30 g telesne težine i dnevnog unosa hrane od 3 g.

[0065] 5-ASA granule (ciljna doza 5-ASA: 150 mg/kg telesne težine; sadržaj 5-ASA: 52%): 4.5 mg 5-ASA je potrebno u 3 g hrane; 8.65 mg granula je potrebno u 3 g hrane; Dodato je 2.88 g granula po kg hrane. Fiksne doze za ostale granule izračunate su na analogan način.

[0066] NAM granule (ciljne doze NAM: 30, 60 ili 120 mg/kg telesne težine; sadržaj NAM: 19.1%): za 30 mg/kg NAM, 1.57 g granula po kg hrane; za 60 mg/kg NAM, 3.14 g granula po kg hrane; za 120 mg/kg NAM, 6.28 g granula po kg hrane.

[0067] Kontrolne granule su dodavane u hranu u istom odnosu kao NAM granule iz dozne grupe od 120 mg/kg, tj. 6.28 g granula po kg hrane.

[0068] Na dan kada je ishrana prebačena na dijetu bez Trp/Nia/NAM sa ili bez granula, započet je režim tretmana oralnom gavažom za grupe 1 i 2 kako je dole navedeno. I dijeta bez Trp/Nia/NAM sa ili bez granula i tretman gavažom su administrirani do terminacije miševa. Posle 12 dana dijete bez Trp/Nia/NAM, miševi su izazivani sa 1.5% DSS (TDB Consultancy, Uppsala, Švedska) u vodi za piće tokom pet dana i, nakon još dva dana tokom kojih im je davana normalna voda za piće, izvršena je terminacija.

[0069] Režim tretmana je sproveden sa sedam grupa od po 10 miševa, koji su tretirani na sledeći način:

Grupa 1: svakodnevna oralna gavaža 0.1 ml nosača (sterilna voda).

Grupa 2: svakodnevna oralna gavaža 0,1 ml rastvora NAM (Sigma-Aldrich, Brondbi, Danska) u sterilnoj vodi (18 mg/ml; finalna doza: oko 60 mg / kg telesne težine).

Grupa 3: kontrolne granule u ishrani (sadržaj granula odgovara grupi 6).

Grupa 4: NAM granule u ishrani (finalna doza: 30 mg/kg telesne težine).

Grupa 5: NAM granule u ishrani (finalna doza: 60 mg/kg telesne težine).

Grupa 6: NAM granule u ishrani (finalna doza: 120 mg/kg telesne težine).

Grupa 7: 5-ASA granule u ishrani (finalna doza: 150 mg/kg telesne težine).

[0070] Rastvori doza su pripremani sveže iz istih matičnih rastvora svakog dana neposredno pre administracije.

[0071] Neposredno pre promene dijete, pre indukcije DSS kolitisa i pre terminacije, od svake životinje sakupljani su sveži uzorci stolice ekvivalentni dvema fekalnim peletima za analize mikrobioma. Uzorci stolice su odmah brzo zamrznuti u tečnom azotu i čuvani na -80 °C. Zamrzavanje je izvedeno da bi se održali odnosi između različitih bakterija sa različitim karakteristikama rasta u ambijentalnim uslovima.

[0072] Od početka DSS izazova, miševi su svakodnevno praćeni u pogledu njihovog opšteg zdravstvenog stanja i parametara relevantnih za indeks aktivnosti bolesti (DAI), odnosno dijareje i vidljive fekalne krvi. Nakon terminacije, izvršeno je makroskopsko bodovanje zapaljenja debelog creva. DAI je izračunat prema Melgar et al. 2005. (Am J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 288: G1328), koji ima teorijski maksimum 9. DAI podaci sumirani u Tabeli 2 i na Slici 4 pokazuju da je, slično podacima iz primera 4, NAM u vodi pokazao samo neznatu tendenciju poboljšanja u ovoj eksperimentalnoj postavci, dok je NAM formulacija sa kontrolisanim oslobađanjem (NAM granule) prouzrokovala izuzetno značajno i od doze zavisno smanjenje DAI. Što je bitno, grupa NAM granula koja je primala 60 mg/kg NAM je imala značajno niži DAI od grupe koja je primala 60 mg/kg NAM u vodi (Tabela 2). 5-ASA granule su pokazale neznatan trend terapijske efikasnosti.

Tabela 2: Podaci o indeksu aktivnosti (DAI) i njihova statistička ocena.

[0073] Količina mijeloperoksidaze (MPO), enzima sadržanog u granulama polimorfonuklearnih neutrofilnih granulocita, je kvantitativni tkivni marker za regrutovanje neutrofila i indirektno omogućava kvantifikovanje akutne upale kolona posredovane od neutrofila u DSS kolitisu.

[0074] Za ispitivanje sadržaja MPO u tkivu kolona miša, reprezentativni uzorci tkiva kolona su analizirani pomoću Hicult MPO mišjeg ELISA kompleta (Cat. No. HK210; Hycult Biotech; CliniSciences, Nanterre, Francuska), prema preporukama proizvođača.

[0075] Dok je NAM u vodi pokazao samo neznačajan trend smanjenja MPO, uočen je značajan pad nivoa MPO u grupama miševa koji su dobijali NAM granule u dozama od 60 i 120 mg/kg, ponovo ukazujući na značajan terapeutski efekat NAM samo kada se primenjuje kao formulacija sa kontrolisanim oslobađanjem (Tabela 3, Slika 5).

Tabela 3: Kvantifikacija i statistička analiza nivoa mijeloperoksidaze (MPO) u kolonu.

Primer 6:

[0076] Kako su rezultati obe studije na životinjama opisani u Primerima 4 i 5 sugerisali značajnu terapijsku efikasnost NAM formulacija sa kontrolisanim oslobađanjem, crevni mikrobiom miševa iz studije opisane u Primeru 5 analiziran je potpuno istom metodologijom i mašinerijom (filogenije 16srDNA i 454 tag sekvenciranje) kako su opisali Hashimoto et al. 2012 (Nature 487: 477). Od pet grupa koje su dobile granule sa kontrolisanim oslobađanjem (grupe 3-7), osam životinja je odabrano na slepo pre analize parametara bolesti opisanih u Primeru 5. Poređeni su uzorci stolica svih ovih miševa pre nutricione intervencije (normalna, nekolitogena flora kao referentna tačka) i posle 12 dana dijete bez Trp/Nia/NAM (neposredno pre izazivanja DSS, videti Primer 5).

[0077] Slika 6 prikazuje da je 12 dana dijete bez Trp/Nia/NAM dovelo do dramatičnog prelaska dominantnog filuma sa Bacteroidetes na Firmicutes. To bi moglo delimično i zavisno od doze biti sprečeno NAM granulama sa kontrolisanim oslobađanjem. 5-ASA granule sa kontrolisanim oslobađanjem su pokazale trend u istom smeru (Slika 6). Pored toga, detaljnije analize procenta sličnosti (SIMPER) bakterijskih grupa su pokazale da je NAM kontrolisano oslobađanje indukovalo ekspanziju neklasifikovanih Bacteroidales i Bacteroidales roda Paraprevotella (Slika 7; šrafirani delovi stubaca).

[0078] Korisni simbionti iz reda Bacteroidales pripadaju pretežno zastupljenim rodovima u crevima sisara i važni su za preradu hranljivih sastojaka, jer hidrolizuju dijetarne polisaharide i pretvaraju ih u masne kiseline kratkog lanca (SCFA) koje domaćin može da iskoristi. Takvim proizvođačima SCFA pripadali su najhomologniji genomi pronađeni u grupi Bacteroidales koja se širila pod tretmanom NAM granulama sa kontrolisanim oslobađanjem. Što je od posebnog značaja, prevalencija ovih korisnih simbionata i rezultujući nivoi crevnih SCFA se smanjuju kod humanih inflamatornih bolesti creva (Frank et al. 2007, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104:13780). Širenje takve mikrobiote pre- ili probiotikom, kao i njihovi SCFA produkti su se pokazali terapeutski efikasnim kod DSS kolitisa glodara (Osman et al. 2006, BMC Gastroenterol. 28;6:31; Maslowski et al. 2009, Nature 461:1282). Osim toga, pokazano je da bakteroidali luče imunomodulatorne strukture ugljenih hidrata (polisaharid A) koje mogu potisnuti inflamatorne reakcije (Mazmanian et al. 2008, Nature 453:620).

[0079] Ukratko, kontrolisano oslobađanje NAM u crevima dovodi do dozno zavisnog povećanja korisne mikrobiote i smanjuje kolitis.

Claims

Patentni zahtevi

1. Farmaceutska kompozicija koja sadrži aktivnu supstancu odabranu od nikotinske kiseline;

nikotinamida; triptofana; estara nikotinske kiseline; nikotinamid adenin dinukleotida (NAD); nikotinamid adenin dinukleotid fosfata (NADP); intermedijera u biosintezi NAD ili NADP odabranog iz grupe koju čine N-formilkinuremin, L-kinurenin, 3-hidroksi-L-kinurenin, 3-hidroksiantranilat, 2-amino-3-karboksimukonat semialdehid, hinolinat i beta-nikotinat D-ribonukleotid; triptofan dipeptid; ili njihovu kombinaciju, pri č emu farmaceutska kompozicija oslobađa aktivnu supstancu za lokalnu efikasnost u terminalnom ileumu, kolonu ili u oba, gde se nalazi crevna mikrobiota koju treba modifikovati.

2. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 1, koja sadrži aktivnu supstancu odabranu od nikotinske kiseline, estara nikotinske kiseline, nikotinamida, triptofana, triptofan dipeptida ili njihovu kombinaciju, pri čemu farmaceutska kompozicija oslobađa aktivnu supstancu za lokalnu efikasnost u terminalnom ileumu, kolonu ili u oba, gde se nalazi crevna mikrobiota koju treba modifikovati.

3. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 1 ili 2, formulisana za oralnu administraciju sa odloženim oslobađanjem aktivnog sastojka (sastojaka) za specifičnu lokalnu efikasnost u terminalnom ileumu i/ili kolonu.

4. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 1 ili 2, formulisana za oralnu administraciju sa kontrolisanim oslobađanjem aktivnog sastojka (sastojaka) za specifičnu lokalnu efikasnost u terminalnom ileumu i/ili kolonu.

5. Farmaceutska kompozicija prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 4, koja sadrži nikotinamid.

6. Farmaceutska kompozicija prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 5, formulisana za oralnu administraciju sa odloženim ili kontrolisanim oslobađanjem aktivne supstance

- za upotrebu u terapiji ili profilaksi inflamatornih bolesti tankog creva i/ili bolesti debelog creva i/ili za profilaksu karcinoma kolona i/ili za upotrebu u terapiji ili profilaksi bolesti promenom crevne mikrobiote da manje podstiče upale ili da bude protivupalna, i/ili za upotrebu u lečenju i/ili profilaksi patoloških promena u crevnoj mikrobioti;

- za upotrebu u izazivanju promene crevne mikrobiote koja pozitivno utiče na zdravlje smanjenjem broja patogenih bakterija i/ili smanjenjem odnosa patogenih bakterija prema korisnim bakterijama i/ili povećanjem diverziteta mikrobiote, i/ili smanjenjem količine upale koju mikrobiota indukuje u crevima i/ili delimičnim ili potpunim vraćanjem patoloških promena u enterotipu mikrobiote.

7. Farmaceutska kompozicija prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 6, formulisana za selektivno oslobađanje aktivne supstance za topikalnu efikasnost u terminalnom ileumu, kolonu ili u oba, gde se nalazi crevna mikrobiota koju treba modifikovati.

8. Farmaceutska kompozicija prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 7, naznačena time što je formulisana za oralnu primenu sa sadržajem aktivne supstance od 1-3000 mg po gotovom doznom obliku.

9. Farmaceutska kompozicija prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 8, naznačena time što pored nikotinske kiseline i/ili nikotinamida sadrži acetilsalicilnu kiselinu i/ili prostaglandin D2 antagoniste.

10. Farmaceutska kompozicija prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 9,

(a) za upotrebu u terapiji ili profilaksi inflamatornih bolesti creva,

(b) za upotrebu u terapiji ili profilaksi karcinoma kolona, ili

(c) za upotrebu u terapiji ili profilaksi bolesti koje potiču od atopijskih poremećaja i/ili metaboličkih bolesti sa inflamatornom komponentom i/ili su izabrane iz grupe koju čine kožna alergija, atopijski ekcem, psorijaza, cistična fibroza, astma, HOBP, koronarna bolest srca, arterioskleroza, ateroskleroza, dijabetes i gojaznost.

11. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 10, za upotrebu u terapiji ili profilaksi inflamatorne bolesti creva.

12. Farmaceutska kompozicija prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 11, koja sadrži triptofan dipeptid.

13. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu od 1 do 12, koja se koristi za izazivanje promene crevne mikrobiote koja ima pozitivan uticaj na zdravlje smanjenjem broja patogenih bakterija i/ili smanjenjem odnosa patogenih bakterija i korisnih bakterija, i/ili povećanjem raznolikosti mikrobiote i/ili smanjenjem količine upale koju mikrobiota izaziva u crevima, i/ili delimičnim ili potpunim vraćanjem patoloških promena u enterotipu mikrobiote; i/ili za upotrebu u terapiji ili profilaksi bolesti promenom crevne mikrobiote tako da manje podstiče upale ili da bude antiinflamatorno; i/ili za upotrebu u lečenju i/ili profilaksi patoloških promena u crevnoj mikrobioti.