RS61594B1 - Postupci i kompozicije za inhibiranje patologije povezane sa poliomavirusom - Google Patents

Postupci i kompozicije za inhibiranje patologije povezane sa poliomavirusom

Info

Publication number
RS61594B1
RS61594B1 RS20210207A RSP20210207A RS61594B1 RS 61594 B1 RS61594 B1 RS 61594B1 RS 20210207 A RS20210207 A RS 20210207A RS P20210207 A RSP20210207 A RS P20210207A RS 61594 B1 RS61594 B1 RS 61594B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
bkv
polypeptide
capsid polypeptide
capsid
subject
Prior art date
Application number
RS20210207A
Other languages
English (en)
Inventor
Christopher B Buck
Diana V Pastrana
Original Assignee
The United States Of America As Represented By The Secretary Department Of Health And Human Services
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by The United States Of America As Represented By The Secretary Department Of Health And Human Services filed Critical The United States Of America As Represented By The Secretary Department Of Health And Human Services
Publication of RS61594B1 publication Critical patent/RS61594B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/10—Drugs for disorders of the urinary system of the bladder
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5258—Virus-like particles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/22011—Polyomaviridae, e.g. polyoma, SV40, JC
    • C12N2710/22023—Virus like particles [VLP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/22011—Polyomaviridae, e.g. polyoma, SV40, JC
    • C12N2710/22034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/01—DNA viruses
    • G01N2333/025—Papovaviridae, e.g. papillomavirus, polyomavirus, SV40, BK virus, JC virus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/20—Detection of antibodies in sample from host which are directed against antigens from microorganisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/34—Genitourinary disorders
    • G01N2800/347—Renal failures; Glomerular diseases; Tubulointerstitial diseases, e.g. nephritic syndrome, glomerulonephritis; Renovascular diseases, e.g. renal artery occlusion, nephropathy
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)

Description

Opis pronalaska
OBLAST TEHNIKE NA KOJU SE PRONALAZAK ODNOSI
[0001] Ovaj opis se odnosi na oblast imunologije, preciznije na postupke i kompozicije za stvaranje imunskog odgovora na poliomavirus, posebno BK poliomavirus.
POZNATO STANJE TEHNIKE
[0002] Proces transplantacije organa je revolucionarno napredovao od prve uspešne transplantacije bubrega kod jednojajčanih blizanaca, pre više od pet decenija (Harrison i saradnici, Surg. Forum 6:432-436, 1956; Merrill i saradnici, J. Am Med. Assoc. 160:277-282, 1956). Od tada, upotreba imunosupresiva, poput ciklosporina, poboljšala je ishod transplantacija (Calne, Mt. Sinai J. Med.
54:465-466, 1987), ali je proces još uvek sa mnogim izazovima, kao što su kontrola hroničnog i akutnog odbacivanja, nefrotoksičnost prouzrokovana imunosupresivima i antivirusnim lekovima, kao i izbegavanje reaktivacije infektivnih agenasa (ili nove infekcije) koji mogu ugroziti transplantat. Da bi se uspostavio balans u ovim potrebama, kliničke smernice za transplantaciju bubrega (Kasiske i saradnici, Am. J. Transpl. 9:S1-S155, 2009) obično predlažu upotrebu imunosupresiva i antiproliferativnog agensa u početnim fazama procesa, nakon čega se predlaže smanjenje doze imunosupresiva, ukoliko ne dođe do akutnog odbacivanja. Ipak, pažljivo praćenje funkcije alografta je od ključnog značaja; preporučuju se stoga testovi za detektovanje povećanja proteinurije, povišenih nivoa kreatinina u serumu i za detektovanje virusnih nukleinskih kiselina u plazmi.
[0003] Jedan od problema koji može ugroziti preživljavanje alografta bubrega je razvoj nefropatije prouzrokovane poliomavirusom (PVAN) (Purighalla i saradnici, Am. J. Kidney Dis. 26:671-673, 1995; poznate i kao nefropatija prouzrokovana sa BKV (BKVN)). Ukoliko se ne leči, PVAN može dovesti do gubitka alografta, a što se zapravo može sprečiti postavljanjem rane dijagnoze, praćenjem pacijenata i intervencijama. Kod primalaca transplantata bubrega, trenutne procene zastupljenosti PVAN su oko 1-10% (Ramos i saradnici, Clin. Transpl. 2002:143-153; Hirsch i saradnici, Transplantation 79:1277-1286, 2005), a gubici transplantata su u okviru opsega od 10-100% (Hirsch i Steiger, Lancet Inf. Dis. 3:611-623, 2003), u zavisnosti od sprovedenih režima primene lekova, praćenja i intervencija. Patologije prouzrokovane poliomavirusom, kao što su to PVAN ili progresivna multifokalna leukoencefalopatija (PML), takođe su uzrok značajnog morbiditeta ili čak mortaliteta kod ostalih pacijenata koji primaju imunosupresivnu terapiju (na primer, za autoimune poremećaje).
[0004] Trond Flaegstad i saradnici, J Med Virology, V19, br. 3 str. 287-296, 1986, opisuju test neutralizacije za detektovanje BKV. U stanju tehnike su opisani i postupci lečenja BKV infekcija sa humanim IVIG preparatima, npr. Pogledati Randhawa PS i saradnici: „Polyomavirus BK neutralizing activity in human immunoglobulin preparations“, Transplantation. 27. jun 2010. god.; 89(12): 1462-1465; Sharma AP i saradnici: „Intravenous immunoglobulin as rescue therapy for BK virus nephropathy“, PEDIATRIC TRANSPLANTATION, 02-2009, tom 13, br. 1, strane 123-129; Sener A i saradnici: „Intravenous immunoglobulin as a treatment for BK virus associated nephropathy: oneyear follow-up of renal allograft recipients“, TRANSPLANTATION, 15. januar 2006. god., tom 81, br. 1, strane 117-120; Marfo K i saradnici: „Desensitization protocols and their outcome“, CLINICAL JOURNAL OF THE AMERICAN SOCIETY OF NEPHROLOGY, april 2011. god., tom 6, br. 4, strane 922-936; Dheir H i saradnici: „Intensive Polyoma Virus Nephropathy Treatment as a Preferable Approach for Graft Surveillance“, TRANSPLANTATION PROCEEDINGS, tom 43, br.
3, 10, mart 2011. god. (2011-03-10), strane 867-870.
KRATKO IZLAGANJE SUŠTINE PRONALASKA
[0005] Pronalazak je definisan u patentnim zahtevima.
[0006] Ovde su opisani postupci izazivanja imunskog odgovora na poliomavirus (na primer, BKV serotipa I (BKV-I), BKV serotipa II (BKV-II), BKV serotipa III (BKV-III) i/ili BKV serotipa IV (BKV-IV)) i postupci lečenja ili inhibiranja patologije prouzrokovane poliomavirusom (kao što su PVAN, hemoragični cistitis prouzrokovan sa BKV ili PML prouzrokovana sa JC virusom). Dalje su opisane imunogene kompozicije za upotrebu u opisanim postupcima. U pojedinim primerima izvođenja, imunogena kompozicija sadrži najmanje jedan kapsidni polipeptid (ili nukleinsku kiselinu koja kodira takve polipeptide) iz dva ili više BKV serotipova (npr. imunogena kompozicija je multivalentna).
[0007] Opisani su takođe postupci odabira davaoca transplantata i/ili primaoca transplantata (na primer, davaoca ili primaoca za transplantaciju bubrega), koji obuhvataju i detektovanje da li potencijalni davalac i/ili primalac ima neutrališuća antitela specifična za određeni BKV serotip (kao što su antitela specifična za BKV-IV).
[0008] Prethodne i druge karakteristike opisa će postati jasnije iz detaljnog opisa koji sledi, a koji se nastavlja na pozivanje na pridružene slike.
KRATAK OPIS SLIKA NACRTA
[0009]
SL. 1 je serija grafika koji pokazuju rezultate ELISA postupka i titre neutrališućih antitela kod miševa imunizovanih sa česticama sličnim virusima (VLP), obrazovanim ekspresijom rekombinantnih VP1 kapsidnih proteina izvedenih iz BKV-I izolata KOM-5 (podtipa BKV-Ib1) ili BKV-IV izolata A-66H (podtipa BKV-IVc2). Šest miševa je imunizovano sa VLP iz BKV-I (kružići) ili BKV-IV (kvadratići). Na gornjem panelu, serumi su titrirani upotrebom odvojenih ELISA testova sa VLP poreklom iz BKV-I (x osa) ili BKV-IV (y osa). Podatak za jednu životinju koja je bila relativno nereaktivna, prikazan je sa neobojenim kružićem. Srednji panel prikazuje neutrališuće titre specifične za određene BKV genotipove kod istog skupa miševa. Donji panel pokazuje odnos neutrališućeg titra za BKV genotip primenjen u vidu vakcine, u odnosu na neutrališući titar za heterologni BKV genotip kod pojedinačnih životinja. Životinja koja nije reagovala je isključena iz analize prikazane na donjem panelu. Na gornjem i srednjem panelu, dijagonalna linija pokazuje teorijsku korelaciju između BKV-I i BKV-IV titara od 1:1.
SL. 2 je serija grafika koji pokazuju rezultate BKV-I i BKV-IV ELISA testova u odnosu na neutrališuće titre, kod miševa imunizovanih sa VLP. Prikazani su rezultati ELISA testa (x osa) ili neutrališući titri (y osa) za šest miševa imunizovanih sa VLP poreklom iz BKV-I (kružići) ili BKV-IV (kvadratići). Neutrališući titri za BKV-I pseudovirus su prikazani na levom panelu, dok su anti-BKV-IV titri prikazani na desnom panelu. Podatak za životinju koja je bila relativno nereaktivna (SL.1) je prikazan sa neobojenim kružićem.
SL. 3 je par grafika koji prikazuju BKV-I i BKV-IV serološke titre kod zdravih odraslih osoba. U serumima 48 zdravih odraslih osoba ispitivani su serološki titri specifični za određeni BKV tip. Gornji panel prikazuje BKV-I i BKV-IV titre utvrđene ELISA postupkom. Donji panel prikazuje neutrališuće titre. Dijagonalna linija pokazuje teoretsku korelaciju između BKV-I i BKV-IV titara od 1:1.
SL. 4 je serija grafika koji pokazuju rezultate BKV-I i BKV-IV ELISA testova u odnosu na neutrališuće titre kod zdravih odraslih osoba. Prikazani su rezultati ELISA postupaka (x osa) ili neutrališući titri (y osa) za BKV-I (kružići) ili BKV-IV (kvadratići). Neutrališući titri u odnosu na BKV-I pseudovirus su prikazani na levom panelu, dok su anti-BKV-IV titri prikazani na desnom panelu.
SL. 5 je serija grafika koji pokazuju BKV-I i BKV-IV serološke obrasce u serumima pojedinačnih primalaca transplantata bubrega. Serumi iz primalaca transplantata bubrega su titrirani da bi se utvrdilo prisustvo neutrališućih titara specifičnih za BKV-I (kružići) ili BKV-IV (kvadratići) (y osa). Kategorije neutrališućih titara, prikazane na y osi, definisane su kao: 1) neutralizacija <95% pri razblaženju seruma od 1:100; 2) neutralizacija ≥95% za 1:100; 3) neutralizacija ≥95% za 1:500; 4) neutralizacija ≥95% za 1:5 000; i 5) neutralizacija ≥95% za 1:50 000. Serumi su prikupljani u pet različitih vremenskih tačaka (x osa), otprilike 1, 4, 12, 26 i 52 nedelje nakon transplantacije, a koje su označene sa A-E. Na svakom panelu, oznake u donjem desnom uglu predstavljaju BKV genotip (I ili IV) koji je uočen u urinu pacijenta (eksponent u) ili krvi (eksponent b). Subjekta označenog sa I/IV<u>je karakterisalo izlučivanje BKV-I iz urina u 5. nedelji i izlučivanje BKV-IV u urinu u 16. nedelji. Prikazani su obrasci za 12 reprezentativnih pacijenata.
SL. 6 je serija grafika koji pokazuju serološke profile za BKV-I i BKV-IV kod svih 108 analiziranih pacijenata nakon transplantacije bubrega. Kategorije neutrališućih titara (y-osa) i vremenske tačke (x osa) su kao što je to opisano za SL. 5. Brojevi na vrhu svakog grafika označavaju kvantifikaciju BKV virurije (log10 kopija BKV DNK po ml) u svakoj vremenskoj tački. Crtice ukazuju da BKV DNK nije detektovana u urinu. Simbol „nr“ označava da za datu vremensku tačku nisu dobijeni rezultati. Simbol „utq“ označava da je signal BKV virurije bio previše nizak za tačnu kvantifikaciju. Zvezdicama su označene vremenske tačke u kojima je BKV viremija bila kvantifikovana. Simbol JC+ označava da je detektovana DNK JC virusa.
SL. 7 je par grafika koji prikazuju BKV-I i BKV-IV neutrališuće titre kod primalaca transplantata bubrega na početku i na kraju studije. Serumi 108 primalaca transplantata bubrega su titrirani da bi se utvrdilo prisustvo neutrališućih antitela specifičnih za BKV-I (gornji panel) ili BKV-IV (donji panel). Procenti pacijenata sa određenom graničnom vrednošću titriranja na početku studije (nedelju dana nakon transplantacije) su prikazani neobojenim stubićima, dok su procenti pacijenata sa određenom graničnom vrednošću titriranja na kraju studije (godinu dana nakon transplantacije) prikazani obojenim stubićima.
SL. 8 je prikaz poravnatih sekvenci BKV VP1 polipeptida. Pošto na osnovu VP1 aminokiselinskih sekvenci nije bilo moguće napraviti jasnu razliku između Ia i Ib1 podtipova, BKV-Ia podrazumeva genotipove Ia/Ib1, dok BKV-Ib podrazumeva genotip Ib2. Takođe, na osnovu VP1 aminokiselinskih sekvenci nije bilo moguće napraviti jasnu razliku između BKV-IV podtipova. Prema tome, BKV-IV podrazumeva genotipove IV-b1/IV-c2. Aminokiseline koje su u potpunosti očuvane među svim BKV tipovima su osenčene. Identifikatori sekvenci za aminokiselinske sekvence su obezbeđeni u Tabeli 5 (u nastavku teksta).
SL. 9 je filogenetsko stablo koje prikazuje odnos dodatnih delimičnih BKV VP1 sekvenci sa izabranim VP1 sekvencama za od BKV-I do BKV-IV
SL. 10 je prikaz poravnatih sekvenci delimičnih VP1 polipeptida poreklom iz BKV (SEQ ID NO: 126-158) sa aminokiselinama 31-174 iz BKV-Ia (SEQ ID NO; 52), BKV-Ia (SEQ ID NO: 75), BKV- Ib2 (SEQ ID NO: 75), BKV-Ic (SEQ ID NO: 103), BKV-II (SEQ ID NO: 105), BKV-III (SEQ ID NO: 107), BKV-IVb1 (SEQ ID NO: 125) i BKV-IVc2 (SEQ ID NO:124) polipeptida.
LISTA SEKVENCI
[0010] Bilo koja od sekvenci nukleinskih kiselina i aminokiselina koje su ovde navedene ili koje su navedene u pridruženoj listi sekvenci, prikazana je upotrebom standarnih slovnih skraćenica za nukleinske baze i aminokiseline. U barem pojedinim slučajevima, prikazan je samo jedan lanac svake sekvence nukleinskih kiselina, ali se podrazumeva da je navođenjem prikazanog lanca obuhvaćen i komplementaran lanac.
SEQ ID NO: 1-3 su aminokiselinske sekvence BKV-Ib1 VP1, VP2 i VP3 proteina za primer, tim redom.
SEQ ID NO: 4-6 su aminokiselinske sekvence BKV-IVc2 VP1, VP2 i VP3 proteina za primer, tim redom.
SEQ ID NO: 7-9 su aminokiselinske sekvence BKV-II VP1, VP2 i VP3 proteina za primer, tim redom.
SEQ ID NO: 10-12 su aminokiselinske sekvence BKV-III VP1, VP2 i VP3 proteina za primer, tim redom.
SEQ ID NO: 13 je aminokiselinska sekvenca VP1 iz BKV-la za primer.
SEQ ID NO: 14 je aminokiselinska sekvenca VP1 iz BKV-Ib2 za primer.
SEQ ID NO: 15 je aminokiselinska sekvenca VP1 iz BKV-Ic za primer.
SEQ ID NO: 16 je aminokiselinska sekvenca VP1 iz BKV-IV-b1 za primer.
SEQ ID NO: 17-19 su aminokiselinske sekvence JCV-1A VP1, VP2 i VP3 proteina za primer, tim redom.
SEQ ID NO: 20 je aminokiselinska sekvenca VP1 iz JCV-2A za primer.
SEQ ID NO: 21 je aminokiselinska sekvenca VP1 iz JCV-3B za primer.
SEQ ID NO: 22-23 su JCV konsenzusne VP2 i VP3 aminokiselinske sekvence za primer, tim redom.
SEQ ID NO: 24-26 su sekvence nukleinskih kiselina za primer koje kodiraju BKV-Ib1 VP1, VP2 i VP3, tim redom.
SEQ ID NO: 27-29 su sekvence nukleinskih kiselina za primer koje kodiraju BKV-IVc2 VP1, VP2 i VP3, tim redom.
SEQ ID NO: 30-32 su sekvence nukleinskih kiselina za primer koje kodiraju BKV-II VP1, VP2 i VP3, tim redom.
SEQ ID NO: 33-35 su sekvence nukleinskih kiselina za primer koje kodiraju BKV-III VP1, VP2 i VP3, tim redom.
SEQ ID NO: 36-38 su sekvence nukleinskih kiselina za primer koje kodiraju JCV-1A VP1, VP2 i VP3, tim redom.
SEQ ID NO: 39-41 su sekvence nukleinskih kiselina optimizovanih kodona za primer koje kodiraju BKV-IVc2 VP1, VP2 i VP3 polipeptide, tim redom.
SEQ ID NO: 42 je sekvenca nukleinske kiseline optimizovanih kodona za primer koja kodira BKV-Ia VP1 polipeptid.
SEQ ID NO: 43 je sekvenca nukleinske kiseline optimizovanih kodona za primer koja kodira BKV-Ib2 VP1 polipeptid.
SEQ ID NO: 44 je sekvenca nukleinske kiseline optimizovanih kodona za primer koja kodira BKV-Ic VP1 polipeptid.
SEQ ID NO: 45 i 46 su sekvence nukleinskih kiselina optimizovanih kodona za primer koje kodiraju BKV-II i BKV-III VP1 polipeptide, tim redom.
SEQ ID NO: 47 je sekvenca nukleinske kiseline optimizovanih kodona za primer koja kodira BKV-IVb1 VP1 polipeptid.
SEQ ID NO: 48 je sekvenca nukleinske kiseline optimizovanih kodona za primer koja kodira JCV-2A VP1 polipeptid.
SEQ ID NO: 49 je sekvenca nukleinske kiseline optimizovanih kodona za primer koja kodira JCV-3B VP1 polipeptid.
SEQ ID NO: 50 i 51 su sekvence nukleinskih kiselina optimizovanih kodona za primer koje kodiraju JCV konsenzusne VP2 i VP3 polipeptide, tim redom.
SEQ ID NO: 52-125 su aminokiselinske sekvence BKV VP1 polipeptida za primer.
SEQ ID NO: 126-160 su aminokiselinske sekvence parcijalnog BVK VP1 polipeptida za primer.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
[0011] BKV je sveprisutan DNK virus i do 90% zdravih osoba je seropozitivno. Veruje se da ovaj virus započinje infekciju u urinarnom traktu i da zatim ostaje latentan, bez uznemiravanja svog domaćina, uz njegovu povremenu reaktivaciju koja se manifestuje izlučivanjem niskih nivoa viriona u urin (virurija). Međutim, kod osoba sa oslabljenim imunitetom, BKV (i srodan JC poliomavirus) može prouzrokovati značajan morbiditet ili čak smrt.
[0012] Kod pedijatrijskih transplantacija bubrega, slučajevi sa seronegativnim BKV serološkim testom pre pocedure su povezani sa razvojem PVAN. Kod odraslih primalaca transplantata bubrega, ukazano je na ulogu statusa BKV kod davaoca u razvoju PVAN. Ipak, BKV serologija se obično ne prati pre transplantacije; delom pošto se veruje da su gotovo sve odrasle osobe seropozitivne na BKV, a delom pošto se uglavnom veruje i da je seropozitivnost na BKV povezana sa zaštitom od razvoja PVAN. Štaviše, uloga intravenskog imunoglobulina (IVIG) u lečenju PVAN nije još u potpunosti razjašnjena.
[0013] BKV čine četiri podgrupe (ili tipovi; BKV-I, BKV-II, BKV-III i BKV-IV) koje su izjednačene sa razdvojenim serotipovima i koje imaju ograničenu unakrsnu reaktivnost, koja se meri testovima inhibicije hemaglutinacije (HI) i neutralizacije. Međutim, visoke stope prevalencije BKV kod ljudi, izmerene lančanom reakcijom polimeraze ili BKV seropozitivnošću, uglavnom se odnose samo na serotip I. Incidencija ostalih BKV tipova kod pacijenata pre transplantacije bubrega ili kosne srži, kod belca je procenjena na oko 3% za BKV-II, 6-7% za BKV-IV, dok je za BKV-III incidencija nivoa koji se ne može detektovati. Ipak, pronalazači predmetnog pronalaska su utvrdili da je panel seruma iz 48 zdravih odraslih osoba bio sa znatno višim % od očekivanih za genotipove II, III i IV. U nekoliko slučajeva, pronalazači su pokazali da su se kod pacijenata nakon transplantacije bubrega, a koji su na početku imali samo BKV-I viruriju, kasnije razvili virurija i viremija (prisustvo virusa u krvotoku) za BKV-IV.
[0014] Od 1989. godine, unakrsna reaktivnost anti-BKV antitela među tipovima nije ponovo analizirana; ipak, navedeno može imati važne implikacije u razvoju PVAN kod pacijenata nakon transplantacije, posebno ukoliko je davalac organa pozitivan na ređi BKV tip. Pronalazači predmetnog pronalaska su pokazali da je nakon tranplantacije bubrega, kod 23-43% pacijenata sa nivoima BKV-IV neutrališućih antitela koji se nisu mogli detektovati u vreme transplantacije, došlo do serokonverzije (promene iz negativnog rezultata u pozitivan rezultat serološkog testa) u roku od jedne godine, bez obzira na njihov BKV-I serostatus. Kod svih od malog broja prvobitno BKV-I seronegativnih primalaca transplantata bubrega je došlo do serokonverzije za BKV-I, bez obzira na njihov BKV-IV serostatus.
[0015] Pronalazači su stoga pokazali da prisustvo neutrališućih antitela za jedan BKV serotip ne štiti od infekcije sa drugim BKV serotipovima, kao što se prethodno verovalo. Štaviše, prisustvo neutrališućih antitela za BKV-Ib2 ne obezbeđuje neutralizaciju BKV-Ia, što pokazuje da ne mogu sva BKV-I neutrališuća antitela obezbediti zaštitu od svih BKV-I podtipova. Navedeno ukazuje da vakcinacija pojedinaca (kao što su tu primaoci transplantiranih organa ili druge osobe sa oslabljenim imunitetom), sa vakcinom za jedan BKV serotip ili podtip, možda neće efektivno izazvati imunski odgovor na sve serotipove ili podtipove, kao i da možda neće obezbediti adekvatnu zaštitu od patologija prouzrokovanih poliomavirusom, kao što su to PVAN ili PML. Dodatno, navedeno ukazuje da prevalencija BKV-I u opštoj populaciji ne štiti pojedince koji su sa rizikom od infekcije sa drugim BKV serotipovima (poput BKV-IV).
I. Skraćenice
[0016]
BKV BK poliomavirus
BKV-I BKV serotipa I
BKV-II BKV serotipa II
BKV-III BKV serotipa III
BKV-IV BKV serotipa IV
ELISA imunosorbentni test povezan sa enzimom
IVIG intravenski imunoglobulin
JCV JC poliomavirus
PML progresivna multifokalna leukoencefalopatija
PVAN nefropatija prouzrokovana poliomavirusom
SV40 simian virus 40
VLP čestica slična virusu
II. Termini
[0017] Ukoliko nije drugačije naznačeno, tehnički termini su upotrebljavani u skladu sa konvencionalnom upotrebom. Definicije uobičajenih termina u molekularnoj biologiji se mogu naći u publikaciji autora Benjamin Lewin, Genes VII, objavljenoj od strane Oxford University Press, 2000 (ISBN 019879276X); Kendrew i saradnici (ur.), The Encyclopedia of Molecular Biology, objavljenoj od strane Blackwell Publishers, 1994 (ISBN 0632021829); Robert A. Meyers (ur.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, objavljenoj od strane Wiley, John & Sons, Inc., 1995 (ISBN 0471186341); i George P. Rédei, Encyclopedic Dictionary of Genetics, Genomics, and Proteomics, 2. izdanje, 2003 (ISBN: 0-471-26821-6).
[0018] Objašnjenja pojmova i postupaka koja slede su obezbeđena da bi se bolje opisao predmetni opis i da bi se prosečno iskusni stručnjaci iz oblati tehnike uputuli u praksu predmentog opisa. Jednine pojmova se odnose na jedan ili više od jednog za iste, ukoliko kontekst jasno ne ukazuje drugačije. Na primer, termin „koji sadrži polipeptid“ podrazumeva jedan ili mnoštvo polipeptida i smatra se ekvivalentnim frazi „koji sadrži najmanje jedan polipeptid“. Kako se ovde upotrebljava, „obuhvata“ označava i „uključuje“. Prema tome, „sadrži A ili B“ označava „uključujući A, B ili A i B“, bez isključivanja dodatnih elemenata.
[0019] U slučaju spora, prednost će imati predmetna specifikacija, uključujujći i objašnjenja koja su ovde navedena.
[0020] Iako se postupci i materijali koji su slični ili ekvivalentni onima koji su ovde opisani, mogu upotrebljavati u praksi ili ispitivanjima opisane tehnologije, pogodni postupci i materijali su opisani u nastavku teksta. Materijali, postupci i primeri su isključivo ilustrativne prirode i nije predviđeno da budu ograničavajući.
[0021] Da bi se olakšao pregled raznih primera izvođenja ovog opisa, obezbeđena su sledeća objašnjenja specifičnih pojmova:
Antitelo: Protein (ili proteinski kompleks) koji uključuje jedan ili više polipeptida koji su u osnovi kodirani imunoglobulinskim genima ili fragmentima imunoglobulinskih gena. Prepoznatljivi imunoglobuliski geni obuhvataju gene kapa, lambda, alfa, gama, delta, epsilon i mi konstantnih regiona, kao i bezbroj gena imunoglobulinskih varijabilnih regiona. Laki lanci su klasifikovani bilo kao kapa ili lambda. Teški lanci su klasifikovani kao gama, mi, alfa, delta ili epsilon, što zauzvrat definiše klase imunoglobulina, IgG, IgM, IgA, IgD i IgE, tim redom. Neutrališuće antitelo je antitelo koje u smeši sa homolognim infektivnim agensom (kao što je poliomavirus) smanjuje infektivni titar.
U pojedinim primerima, neutrališuće antitelo je antitelo koje blokira sposobnost njegovog antigena da obavlja fiziološku funkciju.
[0022] Osnovna strukturna jedinica imunoglobulina (antitela) je uglavnom tetramer. Svaki tetramer se sastoji od dva identična para polipeptidnih lanaca, pri čemu svaki par sadrži jedan „laki“ (oko 25 kDa) i jedan „teški“ (oko 50-70 kDa) lanac. N-kraj svakog lanca definiše varijabilni region od oko 100 do 110 ili više aminokiselina, koje su prvenstveno odgovorne za prepoznavanje antigena. Termini „varijabilni laki lanac“ (VL) i „varijabilni teški lanac“ (VH) se odnose na ove lake i teške lance, tim redom.
[0023] Kao što se ovde upotrebljava, termin "antitela" obuhvata intaktne imunoglobuline, kao i brojne dobro okarakterisane fragmente. Na primer, Fabs, Fvs i jednolančani Fvs (SCFvs), koji se vezuju za ciljni protein (ili epitop unutar proteina ili fuzionog proteina), takođe bi predstavljali specifične vezujuće agense za taj protein (ili epitop). Ovakvi fragmenti antitela su definisani na sledeći način: (1) Fab, fragment koji sadrži monovalentan fragment molekula antitela koji vezuje antigen, proizveden digestijom celokupnog antitela sa enzimom papainom, da bi se dobio intaktan laki lanac i deo jednog teškog lanca; (2) Fab', fragment molekula antitela dobijen tretiranjem celokupnog antitela sa pepsinom, nakon čega sledi redukcija, a da bi se dobili intaktan laki lanac i deo teškog lanca; po molekulu antitela se tako dobijaju dva Fab' fragmenta; (3) (Fab’)2<, fragment antitela dobijen>tretiranjem celokupnog antitela enzimom pepsinom, bez naknadne redukcije; (4) F(ab’)2, dimer dva Fab’ fragmenta koji su međusobno povezani sa dve disulfidne veze; (5) Fv, fragment dobijen genetičkim inženjeringom, koji sadrži varijabilni region lakog lanca i varijabilni region teškog lanca koji su eksprimirani u vidu dva lanca; i (6) jednolančano antitelo, molekul dobijen genetičkim inženjeringom koji sadrži varijabilni region lakog lanca i varijabilni region teškog lanca, pri čemu su ovi regioni povezani odgovarajućim polipeptidnim veznikom tako da se obrazuje genetički fuzionisan jednolančani molekul. Postupci pripreme ovakvih fragmenata su rutinski (pogledati, na primer, Harlow i Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, CSHL, New York, 1999).
[0024] BK poliomavirus (BKV): Poliomavirus koji je prvobitno izolovan iz pacijenta B.K., nakon transplantacije bubrega (Gardner i saradnici, Lancet 1:1253-1257, 1971). Poznata su četiri BKV serotipa (serotipovi I-IV; npr. Knowles i saradnici, J. Med. Virol. 28:118-123, 1989). BKV je gotovo sveprisutan i do 90% zdravih osoba je seropozitivno na BKV. Akutna infekcija je uglavnom asimptomatska i nastavlja se u latentnu infekciju, prvenstveno u urogenitalnom traktu. BKV se može reaktivirati kod osoba sa oslabljenim imunitetom i može prouzrokovati značajan morbiditet, posebno kod pacijenata sa transplantiranim bubregom.
[0025] Sekvence nukleinskih kiselina i aminokiselinske sekvence BKV su javno dostupne. Na primer, pristupni brojevi u GenBank bazi podataka označeni kao AB211374, AB263920, AB211386 i AB369093 opisuju sekvence nukleinskih kiselina BKV-I, BKV-II, BKV-III i BKV-IV za primer, tim redom.
1
[0026] Kapsidni polipeptid: Jedan od tri strukturna proteina koji obrazuju poliomavirusni kapsid. Kapsid poliomavirusa nastaje od virusnog proteina 1 (VP1), virusnog proteina 2 (VP2) i virusnog proteina 3 (VP3).
[0027] Optimizovani kodoni: Nukleinska kiselina „optimizovanih kodona“ se odnosi na sekvencu nukleinske kiseline koja je izmenjena tako da su kodoni optimalni za ekspresiju u određenom sistemu (kao što je to određena vrsta ili grupa vrsta). Na primer, sekvenca nukleinske kiseline može biti optimizovana za ekspresiju u sisarskim ćelijama, bakterijama ili kvascu. Optimizacija kodona ne menja aminokiselinsku sekvencu kodiranog proteina.
[0028] Konzervativne varijante: Supstitucija aminokiselinskog ostatka drugim aminokiselinskim ostatkom koji je sličnih biohemijskih osobina. „Konzervativne“ aminokiselinske supstitucije obuhvataju one supstitucije koje suštinski ne utiču na ili koje smanjuju aktivnost ili antigenost polipeptida. Peptid može uključivati jednu ili više aminokiselinskih supstitucija, na primer, 1-10 konzervativnih supstitucija, 2-5 konzervativnih supstitucija, 4-9 konzervativnih supstitucija, a kao što je to 1, 2, 5 ili 10 konzervativnih supstitucija. Specifični, neograničavajući primeri konzervativne supstitucije obuhvataju primere koji slede (Tabela 1).
Tabela 1. Konzervativne aminokiselinske supstitucije za primer
[0029] Termin konzervativna varijacija takođe obuhvata upotrebu supstituisane aminokiseline umesto nesupstituisane matične aminokiseline, pod uslovom da su antitela nastala na supstituisani polipeptid takođe imunoreaktivna sa nesupstituisanim polipeptidom, ili da se imunski odgovor može generisati na supstituisani polipeptid koji je sličan imunskom odgovoru na nesupstituisan polipeptid. Prema tome, u jednom primeru izvođenja, nekonzervativne supstitucije su one koje smanjuju aktivnost ili antigenost.
[0030] Imunski odgovor: Odgovor ćelije imunog sistema, poput B-ćelije, T-ćelije, makrofaga ili polimorfonukleocita, na stimulus kao što je antigen. Imunski odgovor može uključivati bilo koju ćeliju tela koja je uključena u odbrambeni odgovor domaćina, na primer, epitelnu ć eliju koja luči interferon ili citokin. Imunski odgovor obuhvata, ali nije ograničen na, urođeni imunski odgovor ili na upalu.
[0031] Imunokompromitovan/oslabljenog imuniteta: Imunokompromitovan subjekat je subjekat koji nije sposoban da razvije ili je malo verovatno da će razviti snažan imunski odgovor, obično kao rezultat oboljenja, neuhranjenosti ili imunosupresivne terapije. Imunokompromitovani imunski sistem je imunski sistem koji funkcioniše ispod normalnog. Imunokompromitovani subjekti su podložniji oportunističkim infekcijama, na primer, virusnim, gljivičnim, protozoalnim ili bakterijskim infekcijama, prionskim oboljenjama i određenim neoplazmama.
[0032] Oni koji se mogu smatrati imunokompromitovanima obuhvataju, ali nisu ograničeni na, subjekte sa sidom (ili HIV pozitivne), subjekte sa teškom kombinovanom imunodeficijencijom (SCID), dijabetičare, subjekte koji su bili podvrgnuti transplantaciji i koji uzimaju imunosupresive, kao i one koji primaju hemoterapiju za kancer. Imunokompromitovane osobe takođe obuhvataju osobe sa većinom oblika kancera (osim kancera kože), sa anemijom srpastih ć elija, cističnom fibrozom, one koji nemaju slezinu, subjekte u završnoj fazi oboljenja bubrega (na dijalizi), kao i one koji su učestalo uzimali kortikosteroide ili druge imunosupresivne terapije u poslednjih godinu dana.
[0033] Imunosupresivi: Bilo koje jedinjenje koje smanjuje funkciju ili aktivnost jednog ili više aspekata imunog sistema, kao što je to komponenta humoralnog ili ćelijskog imunog sistema ili sistema komplementa. Imunosupresivi se označavaju i kao „imunosupresivni agensi“ ili „imunosupresivne terapije“.
[0034] U pojedinim primerima, imunosupresiv obuhvata, ali nije ograničen na: (1) antimetabolite, poput inhibitora sinteze purina (kao š to su to inhibitori inozin monofosfat dehidrogenaze (IMPDH), npr. azatioprin, mikofenolat i mikofenolat mofetil), inhibitora sinteze pirimidina (npr. leflunomid i teriflunomid) i antifolate (npr. metotreksat); (2) inhibitore kalcineurina, poput takrolimusa, ciklosporina A, pimekrolimusa i voklosporina; (3) inhibitore TNF-α, poput talidomida i lenalidomida; (4) antagoniste IL-1 receptora, poput anakinra; (5) inhibitore sisarskog ciljnog molekula za rapamicin (mTOR), kao što su to rapamicin (sirolimus), deforolimus, everolimus, temzirolimus, zotarolimus i biolimus A9; (6) kortikosteroide, poput prednizona; i (7) antitela na bilo koji od brojnih ćelijskih ili serumskih ciljnih molekula (uključujući anti-limfocitni globulin i anti-timocitni globulin).
[0035] Ćelijski ciljni molekuli i njihova odgovarajuća inhibitorna jedinjenja za primer obuhvataju, ali nisu ograničeni na, komponentu 5 sistema komplementa (npr. ekulizumab); faktore nekroze tumora (TNF-ove) (npr. infliksimab, adalimumab, certolizumab pegol, afelimomab i golimumab); IL-5 (npr. mepolizumab); IgE (npr. omalizumab); BAYX (npr. nerelimomab); interferon (npr. faralimomab); IL-6 (npr. elzilimomab); IL-12 i IL-13 (npr. lebrikizumab i ustekinumab); CD3 (npr. muromonab-CD3, oteliksizumab, teplizumab, vizilizumab); CD4 (npr. klenoliksimab, keliksimab i zanolimumab); CD11a (npr. efalizumab); CD18 (npr. erlizumab); CD20 (npr. rituksimab, afutuzumab, okrelizumab, paskolizumab); CD23 (npr. lumiliksimab); CD40 (npr. teneliksimab, toralizumab); CD52 (npr. alemtuzumab); CD62L/L-selektin (npr. azelizumab); CD80 (npr. galiksimab); CD147/bazigin (npr. gavilimomab); CD154 (npr. ruplizumab); BLyS (npr. belimumab); CTLA-4 (npr. ipilimumab, tremelimumab); CAT (npr. bertilimumab, lerdelimumab, metelimumab); integrin (npr. natalizumab); IL-6 receptor (npr. tocilizumab); LFA-1 (npr. odulimomab); i IL-2 receptor/CD25 (npr. baziliksimab, daklizumab, inolimomab).
[0036] Inhibiranje ili lečenje oboljenja: "Inhibiranje" oboljenja se odnosi na inhibiranje potpunog razvoja oboljenja, na primer, PVAN, PML ili hemoragijskog cistitisa prouzrokovanog sa BKV. Inhibicija oboljenja može obuhvatiti spektar od delimične inhibicije do suštinski potpune inhibicije (npr. uključujući, ali ne ograničavajući se na prevenciju) oboljenja. U pojedinim primerima, termin "inhibiranje" se odnosi na smanjenje ili odlaganje početka ili progresije oboljenja. Subjekat kome se primenjuje terapijski efektivna količina opisanih imunogenih kompozicija može biti identifikovana standardnim dijagnostičkim tehnikama za takav poremećaj, na primer, na osnovu porodične istorije ili faktora rizika za razvoj oboljenja ili poremećaja. "Lečenje" se odnosi na terapijsku intervenciju koja ublažava znak ili simptom oboljenja ili patološkog stanja nakon što je isti počeo da se razvija.
[0037] Izolovan: „Izolovana“ ili „prečišćena“ biološka komponenta (poput nukleinske kiseline, peptida, proteina, proteinskog kompleksa ili čestice slične virusu) je suštinski razdvojena, proizvedena odvojeno od ili prečišćena od ostalih bioloških komponenti u ćeliji organizma u kome se komponenta prirodno javlja, odnosno, od ostale hromozomske i ekstrahromozomske DNK i RNK i od drugih proteina. Nukleinske kiseline, peptidi i proteini koji su „izolovani“ ili „prečišćeni“obuhvataju stoga nukleinske kiseline i proteine koji su prečišćeni standardnim postupcima prečišćavanja. Termin takođe obuhvata nukleinske kiseline, peptide i proteine koji su pripremljeni rekombinantnom ekspresijom u ćeliji domaćinu, kao i hemijski sintetisane nukleinske kiseline ili proteine.
[0038] Termin "izolovan" ili "prečišćen" ne zahteva apsolutnu čistoću; predviđeno je da prevashodno predstavlja relativan pojam. Prema tome, izolovana biološka komponenta je, na primer, ona u kojoj je biološka komponenta više obogaćena u odnosu na zastupljenost biološke komponente u svom prirodnom okruženju unutar ćelije ili unutar neke posude za proizvodnju. Poželjno je da se preparat prečisti tako da biološka komponenta predstavlja najmanje 50%, kao što je najmanje 70%, najmanje 90%, najmanje 95% ili više od ukupnog sadržaja bioloških komponenata u preparatu.
1
[0039] JC poliomavirus (JCV): Poliomavirus prvobitno izolovan iz pacijenta (J.C.) sa progresivnom multifokalnom leukoencefalopatijom (Padgett i saradnici, Lancet 1:1257-1260, 1971). JCV je genetički sličan BKV i simian virusu 40 (SV40). JCV je veoma čest u opštoj populaciji, sa 70-90% individua koje su seropozitivne na JCV. Početno mesto infekcije mogu biti krajnici ili gastrointestinalni trakt. Smatra se da su primarna mesta JC infekcije tubularne epitelne ć elije u bubrezima, ovojnica uretera i bešike i oligodendrociti i astrociti u centralnom nervnom sistemu.
[0040] JCV se može reaktivirati kod osoba sa oslabljenim imunitetom i može prouzrokovati progresivnu multifokalnu leukoencefalopatiju (PML) prouzrokovanu sa JCV, koja je obično fatalna. PML se javlja kod oko 10% pacijenata koji boluju od side indukovane sa HIV-om, a može se javiti i kod drugih pacijenata sa oslabljenim imunitetom, uključujući, ali ne ograničavajući se na, pacijente lečene sa rituksimabom, natalizumabom, alemtuzumabom ili efalizumabom. JCV može takođe prouzrokovati patologiju urinarnog trakta kod pojedinih primalaca transplatiranih organa.
[0041] Sekvence nukleinskih kiselina i aminokiselina JCV su javno dostupne. Na primer, pristupni brojevi u GenBank bazi podataka NC_001699, AB038251 i AF281600 opisuju sekvence nukleinskih kiselina JCV za primer. JCV izolati su klasifikovani u osam jasno različitih genotipova, delom na osnovu aminokiselinskih sekvenci VP1 proteina pojedinačnih izolata (Cubitt i saradnici, J. Neurovirol.7:339-344, 2001).
[0042] Farmaceutski prihvatljiv nosač: Farmaceutski prihvatljivi nosači (medijumi) koji su od značaja za ovaj opis, su konvencionalni. Publikacija Remington: The Science and Practice of Pharmacy, The University of the Sciences in Philadelphia, ur., Lippincott, Williams, & Wilkins, Philadelphia, PA, 21. izdanje (2005), opisuje kompozicije i formulacije koje su pogodne za farmaceutsku isporuku jedne ili više terapijskih kompozicija, kao što su to jedan ili više poliomavirusnih kapsidnih polipeptida, ili njihovi fragmenti, i dodatni farmaceutski agensi.
[0043] U principu, priroda nosača će zavisiti od određenog načina primene koji se koristi. Na primer, parenteralne formulacije obično sadrže tečnosti za injeciranje koje obuhvataju farmaceutski i fiziološki prihvatljive tečnosti poput vode, fiziološkog rastvora, balansiranih rastvora soli, vodene dekstroze, glicerola ili sličnih kao nosača. Za čvrste kompozicije (na primer, za prah, pilulu, tabletu ili kapsulu), uobičajeni netoksični čvrsti nosači mogu obuhvatati, na primer, manitol, laktozu, skrob ili magnezijum stearat farmaceutskog stepena čistoće. Pored biološki neutralnih nosača, farmaceutske kompozicije koje će biti primenjene mogu sadržavati neznatne količine netoksičnih pomoćnih supstanci, kao š to su sredstva za vlaženje ili emulgatori, konzervansi, sredstva za puferisanje pH i slično, na primer, natrijum acetat ili sorbitan monolaurat. Poliomavirus: Rod virusa bez omotača sa ikozaedarnim kapsidom. Genom poliomavirusa obuhvata nestrukturne proteine (veliki T-antigen i mali t-antigen), nekodirajući region koji uključuje mesto početka replikacije i promotore, kao i strukturne proteine (VP1, VP2 i VP3). Poliomavirusi obuhvataju, ali nisu ograničeni na, BK poliomavirus, JC poliomavirus, poliomavirus Merkel ćelija i simijan virus 40 (SV40). U kliničkim uzorcima su nedavno prijavljeni i srodni humani poliomavirusi poput WU virusa (Gaynor i saradnici, PLoS Pathog.3:e64, 2007) i KI virusa (Allander i saradnici, J. Virol.81:4130-4136, 2007).
[0044] Infekcija poliomavirusom je uglavnom asimptomatska kod zdravih subjekata. Ipak, poliomavirusna infekcija se može javiti ili se ponovo aktivirati kod osoba sa oslabljenim imunitetom i može prouzrokovati značajan morbiditet. Nefropatija prouzrokovana poliomavirusom (PVAN; označena i kao nefropatija prouzrokovana sa BK poliomavirusom ili BK virusni nefritis) javlja se kod do 10% primalaca transplantata bubrega i veruje da je prouzrokovana BKV infekcijom ili reaktivacijom latentne BKV infekcije. Infekcija prouzrokuje disfunkciju alograftnog bubrega i može dovesti do gubitka alografta. Hemoragijski cistitis prouzrokovan poliomavirusom karakteriše inflamacija bešike koja dovodi do disurije, hematurije i hemoragije/krvarenja. Može se javiti kod primalaca u transplantaciji kosne srži i kod drugih osoba koje primaju imunosupresive ili druge terapije koje smanjuju funkciju imunog sistema.
[0045] Identičnost sekvenci: Sličnost između dve sekvence nukleinskih kiselina, ili dve aminokiselinske sekvence, izražava se u vidu sličnosti između sekvenci, što se drugačije označava kao identičnost sekvenci. Identičnost sekvenci se često meri kao procenat identičnosti (ili sličnosti ili homologije); što je veći procenat, to su dve sekvence sličnije.
[0046] Postupci poravnavanja sekvenci radi poređenje su dobro poznati u oblasti tehnike. Razni programi i algoritmi poravnavanja su opisani u: Smith i Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482, 1981; Needleman i Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443, 1970; Pearson i Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444, 1988; Higgins i Sharp, Gene, 73: 237-244, 1988; Higgins i Sharp, Comput. Appl. Biosci. 5: 151-153, 1989; Corpet i saradnici, Nucl. Acids Res. 16, 10881-90, 1988; Huang i saradnici, Comput. Appl. Biosci. 8, 155-65, 1992; i Pearson, Methods Mol. Biol. 24:307-331, 1994. Publikacija Altschula i saradnika (J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990) predstavlja detaljno razmatranje postupaka poravnavanja sekvenci i izračunavanja homologije.
[0047] Osnovni alat za pretragu lokalnih poravnanja iz NCBI (BLAST) (Altschul i saradnici, J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990) je dostupan iz nekoliko izvora, uključujući Nacionalni centar za biotehnološke informacije (NCBI, Bethesda, MD) i Internet, a namenjen je za upotrebu zajedno sa programima za analizu sekvenci poput blastp, blastn, blastx, tblastn i tblastx. Kao primer se može navesti da se za poređenje aminokiselinskih sekvenci većih od oko 30 aminokiselina koristi funkcija za sekvence Blast 2, uz upotrebu zadate BLOSUM62 matrice koja je podešena na zadate parametre (ograničenje za postojanje praznine od 11 i ograničenje dužine praznine od 1). Prilikom poravnavanja kratkih peptida (manjih od oko 30 aminokiselina), poravnavanje se vrši upotrebom Blast 2 funkcije za sekvence, korišćenjem PAM30 matrice sa zadatim parametrima (ograničenje za postojanje praznine od a 9, ograničenje dužine praznine od 1).
[0048] Sekvence nukleinskih kiselina koje ne karakteriše visok stepen identičnosti sekvenci mogu ipak kodirati slične aminokiselinske sekvence, zahvaljujući degeneraciji genetičkog koda. Podrazumeva se da se promene u sekvenci nukleinske kiseline mogu izvršiti upotrebom ovakve
1
degeneracije, da bi se proizveli višestruki molekuli nukleinskih kiselina koji u osnovi svi kodiraju isti protein.
[0049] Subjekat: Živi višećelijski organizmi kičmenjaka, kategorija koja obuhvata i čoveka i sisare različite od čoveka (kao što su to miševi, pacovi, zečevi, ovce, konji, krave i primati različiti od čoveka).
[0050] Terapijski efektivna količina: Količina određenog agensa koja je dovoljna da se postigne željeni efekat kod subjekta koji se leči datim agensom. Na primer, to može biti količina poliomavirusnog kapsidnog polipeptida ili nukleinske kiseline (ili njegovog fragmenta) koja je korisna za izazivanje imunskog odgovora kod subjekta i/ili za inhibiranje ili prevenciju infekcije ili patologije prouzrokovane poliomavirusom (kao što je BKV ili JCV). Idealno je, u kontekstu ovog opisa, da je terapijski efektivna količina poliomavirusnog polipeptida ili nukleinske kiseline (ili njegovog fragmenta) količina koja je dovoljna da se poveća rezistencija na, da se spreči, ublaži i/ili leči infekcija prouzrokovana poliomavirusom kod subjekta, a bez prouzrokovanja značajnog citotoksičnog efekta kod subjekta. Efektivna količina poliomavirusnog polipeptida ili nukleinske kiseline (ili njegovog fragmenta) koja je korisna za povećanje rezistencije na, za prevenciju, ublažavanje i/ili lečenje infekcije kod subjekta zavisiće od, na primer, samog subjekta koji se leči, načina primene terapijske kompozicije i drugih faktora.
[0051] Čestice slične virusu (VLP): Virusna struktura koja se ne replikuje, izvedena iz bilo kog od nekoliko virusa. VLP se obično sastoje od jednog ili više virusnih proteina, kao što su, ali bez ograničavanja samo na, oni proteini koji se označavaju kao proteini kapsida, omotača, ljuske, površine i/ili ovojnice, ili polipeptidi koji obrazuju čestice i koji su izvedeni iz ovih proteina. VLP se mogu obrazovati spontano nakon rekombinantne ekspresije proteina u odgovarajućem ekspresionom sistemu. Postupci za proizvodnju određenih VLP su poznati u oblasti tehnike. Prisustvo VLP nakon rekombinantne ekspresije virusnih proteina se može detektovati upotrebom konvencionalnih tehnika koje su poznate u oblasti tehnike, kao što su to elektronska mikroskopija, biofizička karakterizacija i slične. Pogledati, na primer, Baker i saradnici (1991) Biophys. J. 60:1445-1456; Hagensee i saradnici (1994) J. Virol. 68:4503-4505. Na primer, VLP mogu biti izolovani centrifugiranjem na gradijentu gustine i/ili identifikovani karakterističnim izdvajanjem po trakama gustine. Alternativno, može biti urađena krioelektronska mikroskopija na vitrifikovanim vodenim uzorcima VLP preparata koji se ispituje i sa slika koje su snimljene pod odgovarajućim uslovima ekspozicije.
III. Imunski odgovor na poliomavirus
[0052] Ovde su opisani postupci izazivanja imunskog odgovora na poliomavirus (na primer, BKV ili JCV). Opisani postupci koriste jedan ili više kapsidnih polipeptida (ili njihovih fragmenata) poliomavirusa da bi se izazvao imunski odgovor kod subjekta. U pojedinim primerima, postupci se upotrebljavaju za lečenje, inhibiranje ili č ak prevenciju infekcije subjekta sa poliomavirusom ili za
1
lečenje, inhibiciju ili čak prevenciju poremećaja prouzrokovanih sa poliomavirusom (na primer, PVAN, hemoragijskog cistitisa prouzrokovanog sa BKV i/ili PML prouzrokovane sa JCV). U pojedinim primerima izvođenja, postupci obuhvataju primenu najmanje jednog kapsidnog polipeptida (ili njegovog fragmenta) iz svakog od dva ili više BKV serotipova (kao što je multivalentna BKV serotipska imunogena kompozicija) subjektu. U pojedinim primerima, multivalentna imunogena kompozicija sadrži najmanje jedan kapsidni polipeptid (ili njegov fragment) iz dva ili više BKV-I podtipova (kao što su BKV-Ia, BKV-Ib1, BKV-Ib2 i/ili BKV-Ic podtipovi). Postupci mogu dalje obuhvatati primenu najmanje jednog JCV kapsidnog polipeptida (ili njegovog fragmenta) subjektu. Takođe su opisani postupci identifikovanja davaoca transplantata i/ili primaoca transplantata (kao što je davalac ili primalac u transplantaciji bubrega) koji nema antitela za jedan ili više BKV serotipova (na primer, BKV-IV ili BKV-I), kao što je to npr. davalac i/ili primalac kod koga nisu prisutni nivoi antitela koji su u stanju da neutrališu jedan ili više BKV serotipova (na primer, BKV-I ili BKV-IV) koji se mogu detektovati.
A. Postupci izazivanja imunskog odgovora na BKV
[0053] Prema pojedinim aspektima, postupci obuhvataju izazivanje imunskog odgovora na BKV kod subjekta (kao š to je jedan ili više BKV serotipova). Postupci obuhvataju primenu subjektu, kome je potreban pojačan imunitet na BKV, terapijski efektivne količine najmanje jednog izolovanog BKV-I kapsidnog polipeptida (ili njegovog fragmenta) ili nukleinske kiseline koja kodira najmanje jedan BKV-I kapsidni polipeptid (kao što je najmanje jedan BKV-Ia VP1 polipeptid, BKV-Ib1 VP1 polipeptid, BKV-Ib2 VP1 polipeptid i/ili BKV-Ic VP1 polipeptid) i terapijski efektivne količine najmanje jednog izolovanog BKV-IV kapsidnog polipeptida (ili njegovog fragmenta) ili nukleinske kiseline koja kodira najmanje jedan BKV-IV kapsidni polipeptid (kao što je najmanje jedan BKV-IVb1 VP1 polipeptid i/ili BKV-IVc2 VP1 polipeptid). U pojedinim primerima, najmanje jedan BKV-I kapsidni polipeptid (ili njegov fragment) i najmanje jedan BKV-IV kapsidni polipeptid (ili njegov fragment) se međusobno razlikuju. BKV-I i BKV-IV kapsidni polipeptidi obuhvataju jedan ili više od VP1, VP2 i VP3 (kao što su SEQ ID NO: 1-6 i 13-16), a koji se detaljno razmatraju u nastavku teksta, u Poglavlju IV. U posebnim primerima, primena najmanje jednog izolovanog BKV-I kapsidnog polipeptida obuhvata primenu VLP koji uključuju BKV-I kapsidni polipeptid (kapsidne polipeptide) i/ili primena najmanje jednog BKV-IV kapsidnog polipeptida obuhvata primenu VLP koji uključuju BKV-IV kapsidni polipeptid (kapsidne polipeptide). U posebnim primerima, subjekat nema BKV-IV neutrališuća antitela. U drugim primerima, subjekat nema BKV-I neutrališuća antitela.
[0054] U jednom neograničavajućem primeru, postupci obuhvataju primenu subjektu kome je potreban pojačan imunitet na BKV, terapijski efektivne količine najmanje jednog BKV-Ia VP1 polipeptida, najmanje jednog BKV-Ib2 VP1 polipeptida i najmanje jednog BKV-IV VP1 polipeptida (kao što je najmanje jednog od BKV-IVb1 VP1 polipeptida i/ili BKV-IVc2 VP1 polipeptida). U
1
drugim primerima, postupci mogu takođe obuhvatati primenu terapijski efektivne količine najmanje jednog BKV-Ic VP1 polipeptida subjektu kome je potreban pojačan imunitet na BKV. U pojedinim primerima, BKV-Ia/Ib1 VP1 polipeptid sadrži glutaminsku kiselinu na aminokiselinskoj poziciji 73 i/ili glutaminsku kiselinu na aminokiselinskoj poziciji 82 (kao što je to u SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 13). U dodatnim primerima, BKV-Ib2 VP1 polipeptid sadrži ostatak lizina na aminokiselinskoj poziciji 73 i/ili asparaginsku kiselinu na aminokiselinskoj poziciji 82 (kao što je to u SEQ ID NO: 14).
[0055] U pojedinim primerima, postupci dalje obuhvataju primenu subjektu terapijski efektivne količine najmanje jednog izolovanog BKV-II kapsidnog polipeptida (ili njegovog fragmenta) ili nukleinske kiseline koja kodira najmanje jedan BKV-II kapsidni polipeptid i/ili primenu terapijski efektivne količine najmanje jednog BKV-III kapsidnog polipeptida (ili njegovog fragmenta) ili nukleinske kiseline koja kodira najmanje jedan BKV-III kapsidni polipeptid. U pojedinim primerima, BKV-II kapsidni polipeptid (ili njegov fragment) i BKV-III kapsidni polipeptid (ili njegov fragment) se razlikuju jedan u odnosu na drugog i takođe se razlikuju od BKV-I i BKV-IV kapsidnih polipeptida (ili njihovih fragmenata). BKV-II i BKV-III kapsidni polipeptidi obuhvataju jedan ili više od VP1, VP2 i VP3 (kao što su SEQ ID NO: 7-12), a koji se detaljno razmatraju u nastavku teksta, u Poglavlju IV. U posebnim primerima, primena najmanje jednog izolovanog BKV-II kapsidnog polipeptida obuhvata primenu VLP koji uključuju BKV-II kapsidni polipeptid (kapsidne polipeptide) i/ili primena najmanje jednog BKV-III kapsidnog polipeptida obuhvata primenu VLP koji uključuju BKV-III kapsidni polipeptid (kapsidne polipeptide).
[0056] Postupci mogu dodatno obuhvatati odabir subjekta kome je potreban pojačan imunitet na BKV. U pojedinim primerima, subjekat kome je potreban pojačan imunitet na BKV je subjekat sa rizikom od BKV infekcije ili sa rizikom od poremećaja prouzrokovanih sa BKV, kao što su to PVAN ili hemoragijski cistitis prouzrokovan sa BKV. Subjekti kojima je potreban pojačan imunitet na BKV obuhvataju subjekte koji su sa oslabljenim imunitetom, na primer, subjekte zaražene virusom humane imunodeficijencije (HIV), subjekte sa SCID-om, dijabetičare, subjekte koji primaju hemoterapiju za kancer i subjekte koji primaju imunosupresivnu terapiju (poput kortikosteroida, inhibitora kalcineurina, kao što su to takrolimus, ciklosporin ili pimekrolimus, ili drugih terapija koje smanjuju funkciju imunog sistema, poput rituksimaba, natalizumaba, efalizumaba ili alemtuzumaba). U pojedinim primerima, subjekti koji primaju imunosupresivnu terapiju obuhvataju osobe kojima je presađen organ (kao što je to transplantacija bubrega ili druga transplantacija čvrstog organa ili transplantacija kosne srži). U specifičnom primeru, subjekat kome je potreban pojačan imunitet na BKV je primalac u transplantaciji bubrega. U drugom primeru, subjekat kome je potreban pojačan imunitet na BKV je primalac kod transplantacije kosne srži. U ostalim primerima, subjekti kojima je potreban pojačan imunitet na BKV obuhvataju one koji su kandidati za transplantaciju organa ili kosne srži ili one koji su kandidati za imunosupresivnu terapiju. U specifičnom primeru, subjekat je sa bubrežnom insuficijencijom ili je na neki drugi način kandidat za transplantaciju bubrega. U daljim
1
primerima, subjekat kome je potreban pojačan imunitet na BKV može podrazumevati subjekta koji je oboleo ili je sa rizikom da oboli od kancera (na primer, kancera prostate ili karcinoma bešike).
[0057] Postupci mogu dalje obuhvatati primenu subjektu terapijski efektivne količine najmanje jednog JCV kapsidnog polipeptida (ili njegovog fragmenta) ili nukleinske kiseline koja kodira najmanje jedan JCV kapsidni polipeptid. JCV kapsidni polipeptidi obuhvataju jedan ili više od VP1, VP2 i VP3 (na primer, SEQ ID NO: 17-23) koji su detaljno razmotreni u nastavku teksta, u Poglavlju IV. U posebnim primerima, primena najmanje jednog izolovanog JCV kapsidnog polipeptida obuhvata primenu VLP koji uključuju JCV kapsidni polipeptid (kapsidne polipeptide).
[0058] U pojedinim primerima, subjekat kome se primenjuje najmanje jedan JCV kapsidni polipeptid ili nukleinska kiselina koja kodira JCV kapsidni polipeptid je subjekat kome je potreban pojačan imunitet na JCV ili subjekat sa rizikom da oboli od poremećaja prouzrokovanog sa JCV (na primer, od PML prouzrokovane sa JCV). U posebnim primerima, subjekat je subjekat sa oslabljenim imunitetom, na primer, subjekat koji je zaražen HIV-om, subjekat sa SCID-om, dijabetičar, subjekat koji prima hemoterapiju za kancer ili subjekat koji prima imunosupresivnu terapiju (kao što su to npr. kortikosteroidi, inhibitor kalcineurina poput takrolimusa, ciklosporina ili pimekrolimusa, ili druge terapije koje smanjuju funkciju imunog sistema, poput rituksimaba, natalizumaba, efalizumaba ili alemtuzumaba). U pojedinim primerima, subjekat koji prima imunosupresivnu terapiju podrazumeva subjekta kome je presađen organ (kao š to je to transplantacija bubrega ili drugog čvrstog organa ili transplantacija kosne srži). U specifičnom primeru, subjekat kome je potreban pojačan imunitet na JCV je primalac u transplantaciji bubrega ili transplantaciji kosne srži. U drugom primeru, subjekat kome je potreban pojačan imunitet na JCV je subjekat koji prima terapiju rituksimaba (ili je subjekat koji će primati ili je primio terapiju rituksimabom). U ostalim primerima, subjekti kojima je potreban pojačan imunitet na JCV obuhvataju one koji su kandidati za transplantaciju organa ili kosne srži ili one koji su kandidati za imunosupresivnu terapiju.
B. Postupci lečenja ili inhibiranja poremećaja prouzrokovanih poliomavirusom
[0059] Postupci mogu obuhvatati lečenje ili inhibiranje (ili u pojedinim primerima, čak i prevenciju) poremećaja prouzrokovanog sa poliomavirusom, kao što je to PVAN, hemoragijski cistitis prouzrokovan sa BKV ili PML prouzrokovana sa JCV. U pojedinim primerima, postupci obuhvataju primenu subjektu kome je potrebno lečenje ili inhibicija poremećaja prouzrokovanog sa poliomavirusom, terapijski efektivne količine najmanje jednog izolovanog BKV-IV kapsidnog polipeptida (ili njegovog fragmenta) ili nukleinske kiseline koja kodira najmanje jedan BKV-IV kapsidni polipeptid izabranom subjektu (kao što je najmanje jedan BKV-IVb1 VP1 polipeptid i/ili najmanje jedan BKV-IVc2 VP1 polipeptid). U pojedinim primerima, primena jednog ili više BKV-IV kapsidnih polipeptida (kao što su VP1, VP2 ili VP3, na primer, SEQ ID NO: 4-6 i/ili SEQ ID NO: 16) obuhvata primenu VLP koji uključuju kapsidni polipeptid (kapsidne polipeptide).
1
[0060] Postupci mogu dalje obuhvatati odabir subjekta kome je potreban tretman za inhibiranje poremećaja prouzrokovanog sa poliomavirusom. U pojedinim primerima, subjekat kome je potrebno lečenje ili inhibiranje PVAN ili hemoragijskog cistitisa prouzrokovanog sa BK. (kao što je subjekat kome je presađen organ ili kosna srž ili kandidat za transplantaciju organa ili kosne srži). U jednom primeru, subjekat je kandidat za transplantaciju bubrega. U drugim primerima, subjekat je kandidat za transplantaciju kosne srži. U daljim primerima, subjekat je imunokompromitovan (kao što je primalac u transplantaciji, subjekat koji je zaražen HIV-om ili subjekat lečen imunosupresivom) ili je kandidat za lečenje sa imunosupresivom (kao što je to kandidat za transplantaciju organa ili kosne srži). U posebnim primerima, subjekat nema BKV-IV neutrališuća antitela i/ili BKV-I neutrališuća antitela.
[0061] U pojedinim primerima, postupci dodatno obuhvataju primenu subjektu terapijski efektivne količine najmanje jednog izolovanog BKV-I kapsidnog polipeptida (ili njegovog fragmenta) ili nukleinske kiseline koja kodira najmanje jedan BKV-I kapsidni polipeptid, najmanje jednog izolovanog BKV-II kapsidnog polipeptida (ili njegovog fragmenta) ili nukleinske kiseline koja kodira najmanje jedan BKV-II kapsidni polipeptid, najmanje jednog izolovanog BKV-III kapsidnog polipeptida (ili njegovog fragmenta) ili nukleinske kiseline koja kodira najmanje jedan BKV-III kapsidni polipeptid, najmanje jednog izolovanog JCV kapsidnog polipeptida (ili njegovog fragmenta) ili nukleinske kiseline koja kodira najmanje jedan JCV kapsidni polipeptid, ili primenu kombinacije dva ili više od navedenih (na primer, jedne ili više od SEQ ID NO: 1-23). U posebnim neograničavajućim primerima, postupci obuhvataju primenu subjektu terapijski efektivne količine najmanje jednog BKV-Ia VP1 polipeptida i najmanje jednog BKV-Ib2 VP1 polipeptida (kao što su to SEQ ID NO: 1, 14 ili 15). U pojedinim primerima, primena jednog ili više BKV i/ili JCV kapsidnih polipeptida (kao što su VP1, VP2 ili VP3) obuhvata primenu VLP koji uključuju kapsidni polipeptid (kapsidne polipeptide).
[0062] U posebnim primerima, subjekat je kandidat za transplantaciju organa (na primer, za transplantaciju bubrega ili transplantaciju kosne srži) i terapijski efektivna količina BKV-IV kapsidnog polipeptida, ili nukleinske kiseline koja kodira kapsidni polipeptid, primenjuje se subjektu dovoljno dug vremenski period pre transplantacije organa, da bi se proizveo imunski odgovor na BKV-IV kapsidni polipeptid kod subjekta. Stručnjak iz oblasti tehnike može identifikovati vreme potrebno za stvaranje imunskog odgovora kod subjekta, na osnovu faktora kao što su opšte zdravstveno stanje subjekta i robusnost imunskog sistema subjekta. U pojedinim primerima, najmanje jedan izolovani BKV-IV kapsidni polipeptid ili nukleinska kiselina koja kodira BKV-IV kapsidni polipeptid se primenjuje subjektu najmanje oko š est meseci (na primer, najmanje oko 6 meseci, 5 meseci, 4 meseca, 3 meseca, 2 meseca, 6 nedelja, 5 nedelja, 4 nedelje, 3 nedelje, 2 nedelje ili čak 1 nedelju) pre transplantacije organa. U pojedinim primerima, BKV-IV kapsidni polipeptid se primenjuje subjektu najmanje oko 2 nedelje pre transplantacije organa. U drugim primerima, BKV-IV kapsidni polipeptid se primenjuje subjektu najmanje oko 6 nedelja pre transplantacije organa, sa buster dozom oko 2 nedelje pre transplantacije. U pojedinim primerima, BKV-I, BKV-II, BKV-III
2
i/ili JCV kapsidni polipeptid (ili njihov fragment) se dodatno primenjuju subjektu pre transplantacije organa.
[0063] Postupci mogu obuhvatati primenu subjektu terapijski efektivne količine prečišćenog preparata humanog gama globulina, za koga je utvrđeno da sadrži antitela sposobna da neutrališu BKV-I, BKV-II, BKV-III i/ili BKV-IV. Subjekti obuhvataju one koji su prethodno opisani. Postupci identifikovanja seruma koji sadrže BKV-I, BKV-II, BKV-III i/ili BKV-IV neutrališuća antitela su poznati stručnjaku iz oblasti tehnike i obuhvataju postupke koji se razmatraju u nastavku teksta, u Poglavlju VI. U pojedinim primerima, preparati gama globulina koji mogu biti upotrebljeni obuhvataju komercijalno dostupne preparate intaktnog gama globulina i preparate Fc, F(ab’)2fragmenata gama globulina ili njihove kombinacije. Postupci pripreme gama globulina, na primer, za primenu kod subjekta, poznati su prosečno iskusnom stručnjaku iz oblasti tehnike. Pogledati, npr. U.S. Pat. No. 5,177,194; 6,504,012; i 7,879,331.
[0064] Doza gama globulina i postupak primene će varirati u zavisnosti od ozbiljnosti i prirode određenog stanja koje se leči, kao i od trajanja lečenja, upotrebljene pomoćne terapije, starosti i fizičkog stanja subjekta lečenja i sličnih faktora. U pojedinim primerima, doze za intravensko primenu su od 100 mg/kg do 2,5 g/kg (kao što je od oko 400 mg/kg do 2 g/kg ili od 1 g/kg do 2 g/kg). Doza se može menjati na osnovu učestalosti primene, na primer, 400 mg/kg/dan tokom 5 uzastopnih dana mesečno ili 2 g/kg/dan jednom mesečno. U drugom primeru, preparat gama globulina se primenjuje supkutano ili intramuskularno. U pojedinim primerima, doza za supkutanu ili intramuskularnu primenu je od oko 1 mg/kg do 30 mg/kg telesne težine (kao što je od oko 4 mg/kg do 20 mg/kg ili od oko 10 mg/kg do 20 mg/kg).
[0065] Gama globulin se primenjuje kao farmaceutska kompozicija koja sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač. Farmaceutski prihvatljivi nosači za upotrebu u kompozicijama gama globulina obuhvataju one opisane u nastavku teksta, u Poglavlju V.
C. Postupci odabira davaoca i/ili primaoca za transplantaciju bubrega
[0066] U daljim primerima izvođenja, postupci obuhvataju odabir kandidata za davaoca organa za transplantaciju i/ili primaoca organa za transplantaciju. U pojedinim primerima, kandidat za davaoca je kandidat za davaoca u transplantaciji bubrega, a kandidat za primaoca transplantata je kandidat za priamoca u transplantaciji bubrega. Posupci obuhvataju skrining kandidata za davaoca i/ili primaoca na prisustvo antitela specifičnih za BKV serotip (uključujući, ali ne ograničavajući se na, neutrališuća antitela specifična za BKV-IV).
[0067] U pojedinim primerima izvođenja, postupci obuhvataju odabir subjekta kao davaoca za transplantaciju bubrega ukoliko neutrališuća antitela specifična na BKV serotip (poput BKV-IV ili BKV-I) nisu prisutna u subjektu. U pojedinim primerima, postupci dalje obuhvataju odabir subjekta kao primaoca u transplantaciji bubrega ukoliko neutrališuća antitela specifična za BKV serotip (poput BKV-IV ili BKV-I) nisu prisutna kod subjekta koji je kandidat za primaoca transplantata. U pojedinim primerima, postupci obuhvataju detektovanje prisustva BKV-IV neutrališućih antitela kod subjekta (u uzorku iz subjekta) i odabir subjekta kao davaoca ili primaoca transplantata ukoliko BKV-IV neutrališuća antitela nisu prisutna u uzorku. Uzorak može obuhvatati bilo koji odgovarajući biološki uzorak iz subjekta, uključujući uzorak krvi ili uzorak seruma.
[0068] Postupci detektovanja neutrališućih antitela kod subjekta (kao što je u uzorku krvi ili seruma iz subjekta) poznati su prosečno iskusnom stručnjaku iz oblasti tehnike. Takvi postupci se razmatraju u nastavku teksta, u Poglavlju VI.
IV. Poliomavirusni kapsidni polipeptidi
[0069] Sekvence poliomavirusnih nukleinskih kiselina i polipeptida su javno dostupne i mogu biti identifikovane od strane stručnjaka iz oblasti tehnike. Sekvence nukleinskih kiselina BKV genoma za primer obuhvataju, ali nisu ograničene na, sekvence iz GenBank baze podataka sa pristupnim brojevima JF894228, AB211374, DQ989796, AB211377, AB263920, AB211386, AB211390 i [0070] AB369093.
[0071] Ovde je opisano da se nekoliko BKV kapsidnih polipeptida (ili njihovih fragmenata) može upotrebljavati za izazivanje imunskog odgovora na BKV. U nekoliko primera izvođenja, BKV kapsidni polipeptid sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene kao SEQ ID NO: 1-12. Ovde su opisani i dodatni BKV VP1 polipeptidi, na primer, iz dodatnih BKV podtipova. U pojedinim primerima izvođenja, BKV VP1 polipeptid sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene kao SEQ ID NO: 13-16.
[0072] Sekvence nukleinskih kiselina JCV genoma za primer obuhvataju, ali nisu ograničene na, sekvence iz GenBank baze podataka sa pristupnim brojevima NC_001699, AF300945 i AY536541.
[0073] Ovde je takođe opisano da se nekoliko JCV kapsidnih polipeptida (ili njihovih fragmenata) može upotrebljavati za izazivanje imunskog odgovora na JCV, na primer, u kombinaciji sa jednim ili sa više BKV kapsidnih polipeptida. U nekoliko primera izvođenja, JCV kapsidni polipeptid sadrži ili se sastoji od aminokiselinske sekvence navedene kao SEQ ID NO: 17-23. U pojedinim primerima izvođenja, poliomavirusni kapsidni polipeptidi (kao što su BKV ili JCV kapsidni polipeptidi) za upotrebu u postupcima koji su ovde opisani, sa sekvencom su koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99%, kao što je 100%, identična aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u jednoj od SEQ ID NO: 1-23 ili 52-125. U drugim primerima, poliomavirusni kapsidni polipeptidi (kao što su BKV VP1 polipeptidi) sadrže sekvencu koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99%, kao što je 100%, identična aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u jednoj od SEQ ID NO: 126-158. U pojedinim primerima, poznat je BKV podtip ili serotip polipeptida. U ostalim primerima, BKV podtip ili serotip polipeptida nije poznat. Stručnjak iz oblasti tehnike može odrediti BKV podtip ili serotip nepoznatog BKV kapsidnog polipeptida, na primer, analizom sekvence i ELISA ili testovima neutralizacije (poptu onih opisanih u nastavku teksta, u Primerima 1-3). Sekvence za primer mogu biti dobijene upotrebom kompjuterskih programa koji su lako dostupni na internetu, kao i aminokiselinskih sekvenci koje su ovde opisane. U jednom primeru, polipeptid zadržava funkciju poliomavirusnog kapsidnog polipeptida, poput vezivanja za antitelo koje se specifično vezuje za poliomavirusni epitop.
[0074] Rezultat neznatnih modifikacija primarnih aminokiselinskih sekvenci poliomavirusnog kapsidnog polipeptida mogu biti peptidi koji su suštinski sa ekvivalentnom aktivnošću u poređenju sa nemodifikovanim peptidima parnjacima koji su ovde opisani. Takve modifikacije mogu biti namerne, poput mutageneze usmerene na mesto, ili mogu biti spontane. Svi od polipeptida koji su proizvedeni ovakvim modifikacijama su ovde uključeni. Prema tome, specifičan, neograničavajući primer poliomavirusnog kapsidnog polipeptida je konzervativna varijanta poliomavirusnog kapsidnog polipeptida (kao što je jedna konzervativna aminokiselinska supstitucija, na primer, jedna ili više konzervativnih aminokiselinska supstitucija, na primer, 1-10 konzervativnih supstitucije, 2-5 konzervativnih supstitucija, 4-9 konzervativnih supstitucija, kao što je 1, 2, 5 ili 10 konzervativnih supstitucija). Ovde je obezbeđena tabela konzervativnih supstitucija. Supstitucije aminokiselinske sekvence prikazane u SEQ ID NO: 1-23 ili 52-158 mogu biti ostvarene na osnovu ove tabele.
[0075] „Epitop“ ili „antigena determinanta“ se odnosi na mesto na antigenu na koje reaguju B i/ili T ćelije. T ć elije mogu odgovoriti na epitop kada se epitop prezentuje zajedno sa MHC molekulom. Epitopi se mogu obrazovati i iz susednih aminokiselina (linearnih) ili iz aminokiselina koje nisu susedne i pozicioniraju se jedna pored druge tercijarnim uvijanjem antigenog polipeptida (konformaciono). Epitopi obrazovani od susednih aminokiselina se obično ne menjaju pri izlaganju denaturišućim rastvaračima, dok se epitopi obrazovani tercijarnim uvijanjem obično gube nakon tretmana sa denaturišućim rastvaračima. U normalnim uslovima, B-ćelijski epitop će uključivati najmanje oko 5 aminokiselina, ali može biti i tako mali da se sastoji od 3-4 aminokiseline. T-ćelijski epitop, kao što je CTL epitop, uključivaće najmanje oko 7-9 aminokiselina, dok će epitop za T-ćelije pomoćnice biti sa najmanje oko 12-20 aminokiselina. Obično će zapravo epitop sadržavati između oko 5 i 15 aminokiselina, kao što je to 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ili 15 aminokiselina. U pojedinim primerima, imunogene kompozicije koje su ovde opisane uključuju fragment (kao što je imunogeni fragment) ili antigenu determinantu poliomavirusnog kapsidnog proteina. Stručnjak iz oblasti tehnike može lako idetnifikovati predviđene antigene determinante, na primer, upotrebom programa za predikciju vezivanja HLA peptida, kao što je BIMAS (wwwbimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/) ili resurs za IEDB analizu (immuneeptiope.org). U pojedinim primerima, poliomavirusni kapsidni polipeptid obuhvata, suštinski se sastoji ili se sastoji od pet ili više aminokiselina (na primer, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 ili 23 aminokiselina) VP1 BC petlje (npr. to su aminokiseline 61-83 iz BKV VP1 polipeptida; pogledati, npr. Tremolada i saradnici, Virus Res.149:190-196,2010).
2
[0076] Poliomavirusni kapsidni polipeptidi koji su ovde opisani mogu biti hemijski sintetisani standarnim postupcima, ili mogu biti proizvedenih rekombinantno. Proces proizvodnje polipeptida za primer je opisan u Lu i saradnici, FEBS Lett. 429:31-35, 1998. Oni mogu biti izolovani i postupcima koji uključujuju preparativnu hromatografiju i imunološka razdvajanja. Polipeptidi mogu biti proizvedeni i upotrebom molekularno genetičkih tehnika, poput insertovanja nukleinske kiseline koja kodira najmanje jedan poliomavirusni kapsidni polipeptid ili njegov epitop u ekspresioni vektor, nakon čega slede uvođenje ekspresionog vektora u ćeliju domaćina i izolovanja polipeptida. Za eksprimiranje opisanih polipeptida može biti upotrebljena bilo koja pogodna ćelija, uključujući bakterije (npr. E. coli), kvasce, ćelije insekata (npr. Sf9 ćelije) ili sisarske ćelije (npr. 293 ćelije). U pojedinim primerima, polipeptid se spontano udružuje u česticu sličnu virusu (VLP).
[0077] U pojedinim primerima, opisani poliomavirusni kapsidni polipeptidi (ili njihovi fragmenti), na primer, kapsidni polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu iz jedne ili više od SEQ ID NO: 1-23 ili 52-125, deo su VLP, kao što je to BKV-I VLP, BKV-II VLP, BKV-III VLP, BKV-IV VLP ili JCV VLP. Imunogeni su obično predstavljeni multimerno (npr. čini ih oko 72 pentamera ili oko 360 kapsidnih polipeptida po VLP čestici) imunskim ćelijama kao što su to B-ćelije i antigen-prezentujuće ćelije. Rezultat je stoga efektivno indukovanje imunskog odgovora na imunogen, posebno odgovora u vidu proizvodnje antitela. U pojedinim primerima, VLP uključuju jedan ili više od VP1, VP2 i VP3 (kao što su 1, 2 ili sva 3) iz BKV-I (kao što je BKV-Ia, BKV-Ib1, BKV-Ib2 i/ili BKV-Ic), BKV-II, BKV-III, BKV-IV (kao što je BKV-IVb1 i/ili BKV-IVc2) ili JCV.
[0078] Antigen koji je deo opisanih VLP može sadržavati jednu ili više od aminokiselinskih sekvenci koje su navedene kao SEQ ID NO: 1-23 ili 52-158 (ili njihove fragmente) i imati sposobnost spontanog udruživanja u VLP-ove. U pojedinim primerima, VLP uključuje BKV-I VP1 polipeptid (kao što je jedna od SEQ ID NO: 1, 13, 14 ili 15) i BKV-I VP2 polipeptid (kao što je SEQ ID NO: 2) i/ili BKV-I VP3 polipeptid (kao što je SEQ ID NO: 3). U drugim primerima, VLP uključuje BKV-I VP1 polipeptid (kao što je jedna od SEQ ID NO: 1, 13, 14 ili 15) i BKV-IV VP2 polipeptid (kao što je SEQ ID NO: 5) i/ili BKV-IV VP3 polipeptid (kao što je SEQ ID NO: 6). U još drugim primerima, VLP uključuje BKV-II VP1 polipeptid (kao što je SEQ ID NO: 7) i BKV-II VP2 polipeptid (kao što je SEQ ID NO: 8) i/ili BKV-II VP3 polipeptid (kao što je SEQ ID NO: 9). U ostalim primerima, VLP uključuje BKV-II VP1 polipeptid (kao što je SEQ ID NO: 7) i BKV-IV VP2 polipeptid (kao što je SEQ ID NO: 5) i/ili BKV-IV VP3 polipeptid (kao što je SEQ ID NO: 6). U dodatnim primerima, VLP uključuje BKV-III VP1 polipeptid (kao što je SEQ ID NO: 10) i BKV-III VP2 polipeptid (kao što je SEQ ID NO: 11) i/ili BKV-III VP3 polipeptid (kao što je SEQ ID NO: 12). U drugim primerima, VLP uključuje BKV-III VP1 polipeptid (kao što je SEQ ID NO: 10) i BKV-IV VP2 polipeptid (kao što je SEQ ID NO: 5) i/ili BKV-IV VP3 polipeptid (kao što je SEQ ID NO: 6). U još daljim primerima, VLP uključuje BKV-IV VP1 polipeptid (kao što je jedna od SEQ ID NO: 4 i 16) i BKV-IV VP2 polipeptid (kao što je SEQ ID NO: 5) i/ili BKV-IV VP3 polipeptid (kao što je SEQ ID NO: 6). U drugom primeru, VLP uključuje JCV VP1 polipeptid (kao što je jedna od SEQ ID NO: 17, 20 ili 21) i JCV VP2 polipeptid (kao š to je SEQ ID NO: 22) i/ili JCV VP3 polipeptid (kao što je SEQ ID NO: 23).
[0079] U još daljim primerima, fragment opisanog poliomavirusnog kapsidnog polipeptida zadržava sposobnost da se spontano udruži u VLP-ove. Fragmenti (kao što su imunogeni fragmenti) i varijante mogu biti različite dužine. Na primer, fragment se može sastojati od šest ili više, 25 ili više, 50 ili više, 75 ili više, 100 ili više, ili 200 ili više aminokiselinskih ostataka iz aminokiselinske sekvence poliomavirusnog kapsida. Navedeno uključuje, na primer, bilo koji polipeptid dužine od šest ili više aminokiselinskih ostataka, koji je u stanju da se spontano udruži u VLP-ove. Postupci ispitivanja obrazovanja VLP-ova i izolacije VLP-ova su dobro poznati u oblasti tehnike (pogledati, na primer, Pastrana i saradnici, PLoS Pathogens 5(9):e1000578, 2009).
[0080] Polinukleotidi koji kodiraju BKV kapsidne polipeptide koji su ovde opisani, takođe su obezbeđeni. Sekvence nukleinskih kiselina za primer su navedene kao SEQ ID NO: 24-35. Obezbeđeni su i polinukleotidi koji kodiraju JCV kapsidne polipeptide koji su ovde opisani. Sekvence nukleinskih kiselina za primer su navedene kao SEQ ID NO: 36-38.
[0081] Nukleinske kiseline koje kodiraju BKV kapsidne polipeptide mogu biti optimizovanih kodona za ekspresiju u heterolognom sistemu (kao što su to sisarske ćelije, bakterije ili kvasci). Sekvence nukleinskih kiselina optimizovanih kodona za sisarske ćelije za primer su navedeni kao SEQ ID NO: 39-51 (iako sekvence optimizovanih kodona mogu biti eksprimirane i u drugim sistemima, kao što su bakterije).
[0082] Kao što je ovde opisano, sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju poliomavirusne kapsidne polipeptide (poput BKV ili JCV kapsidnih polipeptida) za upotrebu u postupcima koji su ovde opisani, sa sekvencom su koja je najmanje 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99%, kao što je 100%, identična sekvenci nukleinske kiseline koja je navedena kao jedna od SEQ ID NO: 24-51. Sekvence za primer mogu biti dobijene upotrebom kompjuterskih programa koji su lako dostupni na internetu, kao i sekvenci nukleinskih kiselina koje su ovde navedene. U jednom primeru, polipeptid koga kodira sekvenca nukleinske kiseline zadržava funkciju poliomavirusnog kapsidnog polipeptida, poput vezivanja za antitelo koje se specifično vezuje za poliomavirusni epitop.
V. Farmaceutske kompozicije i načini primene
[0083] Poliomavirusni kapsidni polipeptidi (ili njihovi fragmenti) koji su ovde opisani, ili nukleinske kiseline koje kodiraju poliomavirusne kapsidne polipeptide, mogu biti upotrebljeni za izazivanje imunskog odgovora kod subjekta. U nekoliko primera, subjekat je inficiran sa najmanje jednim BKV serotipom ili je prisutan rizik od infekcije sa BKV serotipom (kao što je jedan ili više od BKV-I, BKV-II, BKV-III ili BKV-IV) i/ili JCV. Postupci mogu obuhvatati primenu subjektu terapijski efektivne količine jednog ili više poliomavirusnih kapsidnih polipeptida (ili njihovih fragmenata) koji
2
su ovde opisani (ili polinukleotida koji kodiraju ove polipeptide) u cilju izazivanja imunog odgovora, kao što je, ali bez ograničavanja samo na, protektivan imunski odgovor.
[0084] U opisanim postupcima, kompozicije se primenjuju subjektu u količini koja je dovoljna da se proizvede imunski odgovor na poliomavirus (na primer, na BKV). Opisani BKV polipeptidi, VLP-ovi koji uključuju BKV polipeptide ili polinukleotidi koji kodiraju ovakve polipeptide, za upotrebu su u inhibiranju (ili čak prevenciji) infekcije sa BKV kod subjekta, u inhibiranju (ili čak prevenciji) progresije oboljenja kod subjekta koji je sa latentnom BKV infekcijom ili u inhibiranju ili lečenju poremećaja prouzrokovanih sa BKV (na primer, PVAN ili hemoragijskog cistitisa prouzrokovanog sa BKV) kod subjekta inficiranog sa BKV. U nekoliko primera, primena terapijski efektivne količine kompozicije koja uključuje jedan ili više kapsidnih polipeptida specifičnih za BKV serotip (ili njihove fragmente) koji su ovde opisani (ili polinukleotida koji kodiraju ove polipeptide), indukuje dovoljan imunski odgovor da se smanji simptom oboljenja usled BKV infekcije, da se inhibira razvoj jednog ili više simptoma BKV ili poremećaja prouzrokovanog sa BKV ili da se inhibira infekcija sa BKV (kao što je BKV serotip, na primer, BKV-I, BKV-II, BKV-III i/ili BKV-IV).
[0085] U pojedinim primerima, kompozicije su za upotrebu u inhibiranju ili čak prevenciji buduće infekcije sa BKV. Tako, u pojedinim primerima, terapijski efektivna količina kompozicije se primenjuje subjektu koji je sa rizikom da se zarazi sa BKV (na primer, primenjuje se subjektu sa oslabljenim imunitetom ili subjektu koji je podvrgnut ili je kandidat za transplantaciju organa). Kompozicija inhibira razvoj BKV kod subjekta, kao što je latentna ili aktivna BKV infekcija, nakon naknadnog izlaganja BKV ili nakon gubitka imunske kontrole nad postojećom BKV infekcijom (na primer, nakon reaktivacije latentne infekcije).
[0086] Postupci mogu dalje obuhvatati primenu subjektu terapijski efektivne količine jednog ili više od JCV kapsidnih polipeptida (ili njihovog fragmenta) koji su ovde opisani (ili polinukleotida koji kodiraju ove polipeptide) u cilju izazivanja imuskog odgovora, kao što je, ali bez ograničavanja samo na, protektivni imunski odgovor na JCV. U pojedinim primerima, kompozicije se upotrebljavaju u inhibiranju ili čak prevenciji buduće infekcije sa JCV. Prema tome, u pojedinim primerima, terapijski efektivna količina kompozicije se primenjuje subjektu sa rizikom da se zarazi sa JCV (na primer, primenjuje se subjektu sa oslabljenim imunitetom ili subjektu koji je podvrgnut ili je kandidat za transplantaciju organa). Kompozicija inhibira ili sprečava razvoj JCV, kao što je latentna ili aktivna JCV infekcija, kod subjekta nakon naknadnog izlaganja JCV ili nakon gubitka imunske kontrole nad postojećom JCV infekcijom (na primer, nakon reaktivacije latentne infekcije). U pojedinim primerima, opisani postupci i kompozicije inhibiraju ili leče poremećaje prouzrokovane sa JCV (na primer, PML prouzrokovanu sa JCV) kod subjekta inficiranog sa JCV. U posebnim primerima, subjekat je sa rizikom da razvije PML prouzrokovanu sa JCV, kao š to je to slučaj kod subjekta zaraženog sa HIV-om, subjekta na imunosupresivnoj terapiji (na primer, sa mikofenolatom, fludarabinom, metotreksatom, rituksimabom, natalizumabom, alemtuzumabom ili efalizumabom) ili
2
subjekat koji je podvrgnut ili je kandidat za transplantaciju organa (kao što je transplantacija kosne srži).
[0087] Količina koja je efektivna za ovakve upotrebe zavisiće od ozbiljnosti oboljenja, opšteg zdravstvenog stanja subjekta i robusnosti imunskog sistema subjekta. U jednom primeru, terapijski efektivna količina jedinjenja je ona koja obezbeđuje bilo subjektivno olakšanje simptoma ili objektivno poboljšanje koje kliničar ili drugi kvalifikovani posmatrač može lako identifikovati zapaženjem. U drugim primerima, terapijski efektivna količina je količina dovoljna da se inhibira infekcija BKV (kao što je to BKV-I, BKV-II, BKV-III i/ili BKV-IV) kod subjekta, nakon naknadnog izlaganja subjekta jednom ili više BKV serotipova. U dodatnim primerima, terapijski efektivna količina je količina koja je dovoljna da se inhibira razvoj jednog ili više simptoma kod subjekta inficiranog sa BKV (na primer, usled PVAN ili hemoragijskog cistitisa prouzrokovanog sa BKV).
[0088] U daljim primerima, terapijski efektivna količina je količina dovoljna da se inhibira infekcija sa JCV kod subjekta, nakon naknadnog izlaganja subjekta jednom ili više JCV serotipova, ili da se inhibira pojava postojeće JCV infekcije iz asimptomatske latencije kod subjekta. U dodatnim primerima, terapijski efektivna količina je količina dovoljna da se inhibira razvoj jednog ili više simptoma kod subjekta inficiranog sa JCV (na primer, sa PML prouzrokovanom sa JCV).
[0089] U pojedinim primerima, jedan ili više od poliomavirusnih kapsidnih polipeptida (kao što su BKV ili JCV kapsidni polipeptidi), ili njihovih fragmenata koji su ovde opisani, mogu biti kovalentno povezani sa najmanje jednim drugim imunogenim proteinom, pri čemu konjugat izaziva imunski odgovor na poliomavirusni kapsidni polipeptid kod subjekta. Drugi imunogeni protein (ponekad označen kao protein ”nosač”) idealno je sa osobinama koje su same po sebi imunogene, tako da može biti upotrebljen kod subjekta kada je veličine koja se može lako prečistiti i konjugovati sa najmanje jednim drugim proteinom ili peptidom. Pogodni proteini nosači su poznati stručnjaku iz oblasti tehnike. U posebnim primerima, drugi imunogeni protein (protein nosač) je goveđi serumski albumin (BSA), ovalbumin, tetanusni toksoid, difterijski toksoid, toksin kolere, toksin A iz Clostridium difficile, toksin B iz C. difficile, Šiga toksin ili rekombinantni egzoprotein A iz Pseudomonas aeruginosa.
[0090] Kapsidni polipeptid poliomavirusa može biti primenjen na bilo koji način koji je poznat stručnjaku iz oblasti tehnike (pogledati, Banga A., „Parenteral Controlled Delivery of Therapeutic Peptides and Proteins", u Therapeutic Peptides and Proteins, Technomic Publishing Co., Inc., Lancaster, PA, 1995), bilo lokalno ili sistemski, na primer, intramuskularnim injeciranjem, supkutanim injeciranjem intraperitonealnim injeciranjem, intravenskim injeciranjem, oralnom primenom, nazalnom primenom, transdermalnom primenom ili čak analnom primenom. Primena može biti oralna primena, supkutano injeciranje ili intramuskularno injeciranje.
[0091] U jednom specifičnom, neograničavajućem primeru, poliomavirusni kapsidni polipeptid se primenjuje na način kojim se imunski odgovor usmerava na ćelijski odgovor (to jest, na odgovor T-ćelija pomoćnica ili citotoksičnih T limfocita (CTL)), umesto humoralnog odgovora (antitelima).
2
[0092] Da bi se produžilo vreme tokom kog je peptid ili protein dostupan za podsticanje odgovora, peptid ili protein može biti obezbeđen kao implantat, uljana injekcija ili kao sistem na bazi čestica. Sistem na bazi čestica može biti na bazi mikročestica, mikrokapsula, mikrosfera, nanokapsula ili sličnih čestica (pogledati npr. publikaciju autora Banga, navedenu iznad). Pokazano je tako da nosač na bazi čestica zasnovan na sintetskom polimeru deluje kao adjuvans za pojačavanje imunskog odgovora, pored toga što obezbeđuje kontrolisano oslobađanje. Soli aluminijuma se takođe mogu upotrebljavati kao adjuvansi za proizvodnju imunskog odgovora.
[0093] Po želji, jedan ili više citokina, kao što su to IL-2, IL-6, IL-12, RANTES, GM-CSF, TNF-α ili IFN-γ, jedan ili više od faktora rasta, kao što su GM-CSF ili G-CSF; jedan ili više molekula poput OX-40L ili 4-1 BBL, ili kombinacije ovih molekula, mogu biti upotrebljeni kao biološki adjuvansi (pogledati, na primer, Salgaller i saradnici, 1998, J. Surg. Oncol. 68(2):122–38; Lotze i saradnici, 2000, Cancer J. Sci. Am. 6(Suppl 1):S61-6; Cao i saradnici, 1998, Stem Cells 16(Suppl 1):251-60; Kuiper i saradnici, 2000, Adv. Exp. Med. Biol. 465:381-90). Ovi molekuli mogu biti primenjeni domaćinu sistemski (ili lokalno). U nekoliko primera, primenjuju se IL-2, RANTES, GM-CSF, TNF-α, IFN-γ, G-CSF, LFA-3, CD72, B7-1, B7-2, B7-1 B7-2, OX-40L, 4-1 BBL i/ili ICAM-1.
[0094] Na ovaj način, obezbeđena je farmaceutska kompozicija koja uključuje jedan ili više poliomavirusnih kapsidnih polipeptida. Ovakve kompozicije su za upotrebu u podsticanju imunskog odgovora na poliomavirus, kao što je odgovor specifičan za BKV serotip. U pojedinim primerima, opisane kompozicije obuhvataju BKV-IV kapsidni polipeptid (ili njegov fragment), BKV-I kapsidni polipeptid (ili njegov fragment) i farmaceutski prihvatljiv nosač. U posebnim primerima, kompozicije sadrže VLP koji uključuje najmanje jedan BKV-IV kapsidni polipeptid, VLP koji uključuje najmanje jedan BKV-I kapsidni polipeptid i farmaceutski prihvatljiv nosač. U drugim primerima, kompozicija sadrži VLP koji uključuje najmanje jedan BKV-Ia kapsidni polipeptid, VLP koji uključuje najmanje jedan BKV-Ib2 kapsidni polipeptid, VLP koji uključuje najmanje jedan BKV-IV kapsidni polipeptid i farmaceutski prihvatljiv nosač. U pojedinim primerima, kompozicije dalje sadrže najmanje jedan BKV-II kapsidni polipeptid, najmanje jedan BKV-III kapsidni polipeptid i/ili najmanje jedan JCV kapsidni polipeptid (kao što su jedan ili više VLP, uključujući najmanje jedan BKV-II kapsidni polipeptid, najmanje jedan BKV-III kapsidni polipeptid i/ili najmanje jedan JCV kapsidni polipeptid). U pojedinim primerima izvođenja, kompozicije sadrže jedan ili više adjuvanasa.
[0095] Na primer, poliomavirusni kapsidni polipeptid može biti pomešan sa adjuvansom koji sadrži dva ili više od stabilišućih deterdženta, agenasa za obrazovanje micela i ulje. Pogodni stabilišući deterdženti, agensi za obrazovanje micela i ulja su detaljno opisani u U.S. Patent No. 5,585,103; U.S. Patent No. 5,709,860; U.S. Patent No. 5,270,202; i U.S. Patent No. 5,695,770. Stabilišući deterdžent je bilo koji deterdžent koji omogućava komponentama emulzije da ostanu kao stabilna emulzija. Takvi deterdženti obuhvataju polisorbat, 80 (TWEEN) (sorbitan-mono-9-oktadecenoat-poli(oksi-1,2-etandiil; proizveden od strane kompanije ICI Americas, Wilmington, DE), TWEEN 40™, TWEEN 20™, TWEEN 60™, ZWITTERGENT™ 3-12, TEEPOL HB7™ i SPAN 85™. Ovi deterdženti se
2
obično nabavljaju u količini od približno 0,05 do 0,5%, kao što je oko 0,2%. Agens za obrazovanje micela je agens koji je u stanju da stabilizuje emulziju obrazovanu sa drugim komponentama, tako da se obrazuje struktura slična miceli. Takvi agensi uglavnom prouzrokuju izvesnu iritaciju na mestu injeciranja, da bi se regrutovali makrofagi i time pojačao ć elijski odgovor. Primeri takvih agenasa obuhvataju polimerne surfaktante opisane u publikacijama BASF Wiandotte, npr. Schmolka, J. Am. Oil. Chem. Soc. 54:110, 1977; i Hunter i saradnici, J. Immunol. 127:1244-1250, 1981; na primer, PLURONIC™ L62LF, L101 i L64, PEG1000 i TETRONIC™ 1501, 150R1, 701, 901, 1301 i 130R1. Hemijske strukture ovakvih agenasa su dobro poznate u oblasti tehnike. U jednom primeru izvođenja, agens je izabran tako da je sa hidrofilno-lipofilnom ravnotežom (HLB) između 0 i 2, kao što je to definisano od strane Hunter-a i Bennett-a, J. Immunol. 133:3167-3175, 1984. Agens može biti obezbeđen u efektivnoj količini, na primer, između 0,5 i 10%, ili u količini između 1,25 i 5%.
Ulje uključeno u kompoziciju se bira tako da pospeši zadržavanje antigena u emulziji tipa ulje-u-vodi, kao što je to pri obezbeđivanju nosača za ž eljeni antigen, a poželjno je i da je sa temperaturom topljenja koja je niža od 65°C, tako da se emulzija obrazuje bilo na sobnoj temperaturi (od oko 20°C do 25°C) ili kada se temperatura emulzije spusti na sobnu temperaturu. Primeri takvih ulja obuhvataju skvalen, skvalan, EICOSANE™, tetratetrakontan, glicerol i ulje kikirikija ili druga biljna ulja. U jednom specifičnom, neograničavajućem primeru, ulje se obezbeđuje u količini između 1 i 10% ili između 2,5 i 5%. Ulje bi trebalo da bude i biorazgradivo i biokompatibilno, tako da organizam može razgraditi ulje tokom vremena, ali i tako da štetna dejstva, poput granuloma, ne budu očigledna nakon upotrebe ulja.
[0096] Primer može biti smeša deterdženta za stabilizaciju, agensa za obrazovanje micela i ulja koja je dostupna pod nazivom PROVAX® (IDEC Pharmaceuticals, San Diego, CA). Adjuvans takođe može biti imunostimulatorna nukleinska kiselina, kao što je nukleinska kiselina koja sadrži CpG motiv, ili biološki adjuvans (pogledati iznad).
[0097] Parenteralne formulacije sa kontrolisanim oslobađanjem mogu biti pripremljene kao implantati, uljane injekcije ili kao sistemi na bazi čestica. Za širi pregled sistema za isporuku proteina pogledati Banga, Therapeutic Peptides and Proteins: Formulation, Processing, and Delivery Systems, Technomic Publishing Company, Inc., Lancaster, PA, 1995. Sistemi na bazi čestica obuhvataju one sa mikrosferama, mikročesticama, mikrokapsulama, nanokapsulama, nanosferama i nanočesticama. Mikrokapsule sadrže terapijski protein kao centralno jezgro. U mikrosferama, terapijski agens je dispergovan po celoj čestici. Čestice, mikrosfere i mikrokapsule manje od oko 1 µm se obično označavaju kao nanočestice, nanosfere i nanokapsule, tim redom. Prečnik kapilara je približno 5 µm, tako da se samo nanočestice primenjuju intravenski. Mikročestice su obično prečnika oko 100 µm i primenjuju se supkutano ili intramuskularno (pogledati Kreuter, Colloidal Drug Delivery Systems, J. Kreuter, ur., Marcel Dekker, Inc., New York, NY, str. 219-342, 1994; Tice i Tabibi, Treatise on Controlled Drug Delivery, A. Kydonieus, ur., Marcel Dekker, Inc. New York, NY, str. 315-339, 1992).
2
[0098] Za kontrolisano oslobađanje mogu biti upotrebljeni i polimeri. U oblasti tehnike su poznate razne razgradive i nerazgradive polimerne matrice za upotrebu u kontrolisanoj isporuci lekova (Langer, Accounts Chem. Res. 26:537, 1993). Na primer, blok-kopolimer, polaksamer 407, postoji kao viskozna, ali ipak pokretna tečnost na niskim temperaturama, koja obrazuje polučvrsti gel na telesnoj temperaturi. Pokazano je takođe da je efektivan nosač za obrazovanje i kontinuiranu isporuku rekombinantnog interleukina-2 i ureaze (Johnston i saradnici, Pharm. Res. 9:425, 1992; i Pec, J. Parent. Sci. Tech.44(2):58, 1990). Alternativno, kao mikronosač za kontrolisano oslobađanje proteina je bio upotrebljavan hidroksiapatit (Ijntema i saradnici, Int. J. Pharm. 112:215, 1994). Prema još jednom aspektu, za kontrolisano oslobađanje, kao i za ciljano dejstvo lekova inkapsuliranih u lipide se upotrebljavaju lipozomi (Betageri i saradnici, Liposome Drug Delivery Systems, Technomic Publishing Co., Inc., Lancaster, PA, 1993). Poznati su i brojni dodatni sistemi za kontrolisanu primenu terapijskih proteina (npr. U.S. Patent No. 5,055,303; 5,188,837; 4,235,871; 4,501,728; 4,837,028; 4,957,735; 5,019,369; 5,055,303; 5,514,670; 5,413,797; 5,268,164; 5,004,697; 4,902,505; 5,506,206; 5,271,961; 5,254,342; i 5,534,496).
[0099] Alternativno, farmaceutska kompozicija može sadržavati nukleinsku kiselinu koja kodira poliomavirusni kapsidni polipeptid ili njegov fragment (na primer, BKV ili JCV kapsidni polipeptid ili fragment). Terapijski efektivna količina BKV ili JCV kapsidnog polinukleotida može biti primenjena subjektu da bi se generisao imunski odgovor.
[0100] Jedan od pristupa u primeni nukleinskih kiselina je direktna imunizacija sa plazmidnom DNK, kao što je to slučaj sa sisarskim ekspresionim plazmidom. Na primer, nukleotidna sekvenca koja kodira poliomavirusni kapsidni polipeptid može biti stavljena pod kontrolu promotora, da bi povećala ekspresija molekula.
[0101] Imunizacija konstruktima nukleinskih kiselina je dobro poznata u oblasti tehnike i razmatra se, na primer, u U.S. Patent No. 5,643,578 (koji opisuje postupke imunizacije kičmenjaka uvođenjem DNK koja kodira željeni antigen, da bi se izazvao odgovor posredovan ćelijama ili humoralni odgovor) i U.S. Patent No. 5,593,972 i 5,817,637 (koji opisuju operativno povezivanje sekvence nukleinske kiseline koja kodira antigen, sa regulatornim sekvencama koje omogućavaju ekspresiju). U.S. Patent No. 5,880,103 opisuje nekoliko postupaka isporuke nukleinskih kiselina koje kodiraju imunogene peptide ili druge antigene u organizam. Postupci obuhvataju lipozomsku isporuku nukleinskih kiselina (ili samih sintetskih peptida), kao i imuno-stimulišućih kontrukata, ili ISCOMS™ (negativno naelektrisanih kavezastih struktura veličine 30-40 nm, spontano nastalih mešanjem holesterola i saponina). Protektivan imunitet je bio generisan u raznim eksperimentalnim modelima infekcije, uključujući toksoplazmozu i tumore izazvane Epstein-Barr virusom, upotrebom ISCOMS™ kao nosača za isporuku antigena (Mowat i Donachie, Immunol. Today 12:383, 1991). Utvrđeno je i da doze antigena od samo 1 µg, koje su bile kapsulirane u ISCOMS™, proizvode CTL reakcije posredovane Klasom I (Takahashi i saradnici, Nature 344:873, 1990).
[0102] Po izboru, jedan ili više citokina, kao što su to IL-2, IL-6, IL-12, RANTES, GM-CSF, TNF-α ili IFN-γ, jedan ili više faktora rasta, kao što su GM-CSF ili G- CSF, jedan ili više kostimulatornih molekula, kao što su ICAM-1, LFA-3, CD72, B7-1, B7-2 ili drugi molekuli srodni B7; jedan ili više molekula kao što su OX-40L ili 4-1 BBL, ili kombinacije ovih molekula, mogu biti upotrebljeni kao biološki adjuvansi (pogledati, na primer, Salgaller i saradnici, 1998, J. Surg. Oncol. 68(2):122–38; Lotze i saradnici, 2000, Cancer J. Sci. Am. 6(Suppl 1):S61-6; Cao i saradnici, 1998, Stem Cells 16(Suppl 1):251-60; Kuiper i saradnici, 2000, Adv. Exp. Med. Biol. 465:381-90). Ovi molekuli mogu biti primenjeni domaćinu sistemski. Potrebno je napomenuti da ovakvi molekuli mogu biti istovremeno primenjeni putem insercije nukleinske kiseline koja kodira molekule u vektor, na primer, rekombinantnog pox vektora (pogledati, na primer, U.S. Pat. No. 6,045,802). U raznim primerima izvođenja, nukleinska kiselina koja kodira biološki adjuvans može biti klonirana u isti vektor kao sekvenca koja kodira BKV polipeptid, ili nukleinska kiselina može biti klonirana u jedan ili više odvojenih vektora za istovremenu primenu.
[0103] Alternativno, nukleinska kiselina koja kodira kapsidni polipeptid poliomavirusa može biti direktno uvedena u ćelije. Na primer, nukleinskom kiselinom se mogu ispuniti mikrosfere zlata, standarnim postupcima, a zatim iste mogu biti uvedene u kožu uređajem poput Helios™ genskog pištolja (Bio-Rad, Hercules, CA). Nukleinske kiseline mogu biti „gole“, tako da se sastoje od plazmida pod kontrolom jakog promotora. Uobičajeno je da se DNK injecira u mišić, iako može biti injecirana direktno i na druga mesta. Doze za injeciranje su obično od oko 0,5 µg/kg do oko 50 mg/kg, a uobičajeno je i da su oko 0,005 mg/kg do oko 5 mg/kg (pogledati, na primer, U.S. Patent No.
5,589,466).
[0104] U jednom specifičnom, neograničavajućem primeru, farmaceutska kompozicija za intravensku primenu bi sadržavala oko 0,1 µg do 100 mg imunogenog poliomavirusnog kapsidnog polipeptida (ili njegovog fragmenta) po pacijentu po danu. Mogu biti upotrebljene doze od 0,1 do oko 100 mg po pacijentu dnevno (na primer, od oko 10 mg do 50 mg), posebno ukoliko se agens primenjuje na izdvojenom mestu, a ne u cirkulatorni ili limfni sistem, kao što je to primena u telesnu šupljinu ili u lumen nekog organa. U ostalim neograničavajućim primerima, farmaceutska kompozicija sadrži jedan ili više VLP-ova, uključujući opisane poliomavirusne kapsidne polipeptide, na primer, sadrži od oko 1-200 µg VLP (kao što je od oko 10 µg do 200 µg, oko 20 µg do 100 µg ili oko 20 µg do oko 40 µg).
[0105] U pojedinim primerima, kompozicije uključuju farmaceutski prihvatljive nosače i/ili jedan ili više adjuvanasa. Stvarni postupci za pripremu kompozicija koje se mogu primenjivati će biti poznati ili jasni stručnjacima iz oblasti tehnike i opisani su detaljnije u publikacijama poput Remington: The Science and Practice of Pharmacy, The University of the Sciences in Philadelphia, izdavač, Lippincott, Williams, & Wilkins, Philadelphia, PA, 21. izdanje (2005).
[0106] Primena poliomavirusnih kapsidnih polipeptida (ili njihovih fragmenata), VLP-ova, uključujući polipeptide, ili nukleinskih kiselina koje kodiraju polipeptide, može biti sekvencijalna, simultana (istovremena) ili suštinski istovremena. Sekvencijalna primena može biti razdvojena bilo
1
kojim vremenskim periodom, sve dok se postigne željeni efekat. U pojedinim primerima, BKV-I kapsidni polipeptid ili njegov fragment i BKV-IV kapsidni polipeptid ili njegov fragment se primenjuju subjektu jedan za drugim. U drugim primerima, BKV-I kapsidni polipeptid ili njegov fragment i BKV-IV kapsidni polipeptid ili njegov fragment se primenjuju subjektu istovremeno ili suštinski istovremeno.
[0107] U pojedinim primerima, efektivnost terapijske ili preventivne intervencije se prati putem odgovora u vidu titriranja neutrališućeg potencijala antitela u serumu subjekta za BKV ili JCV tokom vremena. Subjektima za koje se utvrdi da su slabo reagovali na početne terapijske intervencije, kao što su, ali bez ograničavanja samo na, imunizacija sa BKV ili JCV kapsidnim proteinima, daje se jedna ili više buster doza terapijske intervencije.
[0108] Razmatraju se i višestruke primene kompozicija koje su ovde opisane. Koriste se i jednokratna ili višestruka primena kompozicija, u zavisnosti od načina primene doza i učestalosti koje su potrebne subjektu, kao i u zavisnosti od toga šta je subjektu u stanju da podnese. Doza može biti primenjena jednom, u vidu bolusa, ili alternativno može biti primenjivana periodično, dok se ne postigne terapijski rezultat. Doza može biti dovoljnja za lečenje ili ublažavanje simptoma ili znakova BKV i/ili JCV bez stvaranja neprihvatljive toksičnosti za subjekta. Doza može biti dovoljna da se inhibira infekciju sa BKV nakon naknadne izloženosti BKV Doza može biti dovoljna da se inhibira infekcija sa JCV nakon naknadne izloženosti JCV. Doza može biti dovoljna da se inhibira simptom BKV kod subjekta sa latentnom BKV infekcijom. U još jednom primeru izvođenja, doza je dovoljna da inhibira simptom JCV kod subjekta sa latentnom JCV infekcijom. Može biti upotrebljena sistemska ili lokalna primena.
VI. Postupci praćenja imunskog odgovora na poliomavirus
[0109] Ovde su takođe opisani postupci praćenja imunskog odgovora na poliomavirus, na primer, nakon izlaganja (ili potencijalnog izlaganja) poliomavirusu ili nakon imunizacije za poliomavirus. U pojedinim primerima, postupci obuhvataju detektovanje prisustva poliomavirusnih antitela kod subjekta kome je bila primenjena imunogena kompozicija, a koja sadži najmanje jedan izolovan BKV kapsidni polipeptid (ili njegov fragment) ili nukleinsku kiselinu koja kodira BKV kapsidni polipeptid. U drugim primerima, postupci obuhvataju detektovanje prisustva poliomavirusnih antitela kod subjekta kome je bila primenjena imunogena kompozicija koji sadrži najmanje jedan izolovani JCV kapsidni polipeptid (ili njegov fragment) ili nukleinsku kiselinu koja kodira JCV kapsidni polipeptid. U pojedinim primerima, postupak obuhvata detektovanje prisustva poliomavirusnih antitela (kao što su neutrališuća antitela) u uzorku iz subjekta (kao što je uzorak krvi ili uzorak seruma). Poliomavirusna antitela obuhvataju jedno ili više antitela na BKV-I (kao što su antitela na BKV-Ia, antitela na BKV-Ib2 i/ili antitela na BKV-Ic), antitela na BKV-II, antitela na BKV-III, antitela na BKV-IV (kao što su antitela na BKV-IVb1 i/ili antitela na BKV-IVc2) ili antitela na JCV. U
2
pojedinim primerima, antitela su neutrališuća antitela. U pojedinim neograničavajućim primerima, antitela su neutrališuća antitela za BKV-Ia, neutrališuća antitela za BKV-Ib2 ili neutrališuća antitela za BKV-IV. Praćenje imunskog odgovora na poliomavirus može ukazati da li je subjekat razvio imunski odgovor (na primer, protektivan imunski odgovor) na jedan ili više poliomavirusa, na primer, nakon primene imunogene kompozicije (na primer, kao što je prethodno opisano). Praćenje imunskog odgovora na poliomavirus može takođe ukazati da li je kod subjekta došlo do serokonvezije za jedan ili više poliomavirusa (na primer, BKV-I i/ili BKV-IV) nakon transplantacije organa ili imunosupresivne terapije. U pojedinim primerima, višestruki uzorci iz subjekta se analiziraju na prisustvo antitela tokom vremena, na primer, pre i u vremenskim tačkama nakon primene imunogene kompozicije, transplantacije organa ili početka imunosupresivne terapije (kao što su to 1 nedelja, 2 nedelje, 1 mesec, 2 meseca, 3 meseca, 6 meseci, 9 meseci, 1 godina ili više).
[0110] Postupci za detektovanje antitela u uzorku su poznati stručnjaku iz oblasti tehnike. Takvi postupci obuhvataju, ali nisu ograničene na ELISA, imunofluorescentne testove, radioimune testove i testove mikroaglutinacije. U pojedinim primerima, postupci obuhvataju detektovanje prisustva neutrališućih antitela (kao što su neutrališuća antitela specifična za BKV serotip) u uzorku iz subjekta. U pojedinim primerima, testovi za detektovanje neutrališućih antitela obuhvataju test neutralizacije smanjenja plaka, ubijanja ćelija i reporterske testove.
[0111] U specifičnom primeru, neutrališuća antitela se detektuju upotrebom reporterskog testa. Reporterski vektori za BKV ili JCV (poznati i kao pseudovirioni) proizvode se pakovanjem reporterskog plazmida u ćelije (kao što su to 293 ćelije, na primer, 293TT ćelije ili 293FT ćelije za BKV ili SVG ćelije za JCV) koje eksprimiraju BKV (poput BKV-I, BKV-II, BKV-III ili BKV-IV) ili JCV kapsidni polipeptid (na primer, VP1, VP2 i/ili VP3). Reporterske vektorske čestice se zatim izoluju i tretiraju serijskim razblaženjima seruma iz subjekta (kao što su četvorostruka razblaženja od1:100 do 1:2,6 x 10<7>ili serijska desetostruka razblaženja od 1:100 do 1 x 10<7>). Smeša seruma/reporterskih vektora se zatim nanosi na sveže ćelije (na primer, na 293 ćelije za BKV ili SVG ćelije za JCV) tokom određenog vremenskog perioda (kao što je 72 sata). Dalje se u ćelijskoj kuluturi analizira proizvodnja reporterskog proteina kodiranog reporterskim plazmidom koji je upoakovan unutar reporterskog vektora. Smanjenje aktivnosti reporterskog vektora (na primer, u poređenju sa kontrolom, kao što je kontrola bez seruma) ukazuje na prisustvo neutrališućih antitela u uzorku. U jednom primeru, reporterski plazmid nosi mesto početka replikacije iz SV40, koje može posredovati u replikativnom umnožavanja transdukovanog plazmida u ciljnoj ć eliji. U specifičnom primeru, reporterski vekor je phGluc (luciferaza iz Gaussia princeps, pod kontrolom promotora humanog faktora elongacije tipa 1 alfa) i aktivnost se detektuje upotrebom supstrata za Gaussia luciferazu (New England Biolabs). Pogledati, npr. Pastrana i saradnici, PLoS Pathogens 5(9):e1000578, 2009. Prosečno iskusan stručnjak iz oblasti tehnike može odabrati dodatne reportere za upotrebu u testovima za neutrališuća antitela, kao što su to zeleni fluorescentni protein, β-galaktozidaza, alkalna fosfataza i drugi.
[0112] Predmetni opis je dalje ilustrovan neograničavajućim primerima koji slede.
Primer 1
Materijali i postupci
[0113] Miševi: Osam nedelja stare ženke BALB/cAnNCr miševa su imunizovane jednom, supkutano, sa 5 µg BKV-I ili BKV-IV čestica sličnih virusnim (VLP) u kompletnom Frojndovom adjuvansu (CFA, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Serumi su izolovani 4 nedelje nakon imunizacije. Životinje su držane pod uslovima oslobođenim od patogena, u skladu sa institucionalnim smernicama Nacionalnog instituta za kancer.
[0114] Serumi: Upotrebljavani su uzorci iz 108 subjekata kojima je tranplantiran bubreg, u okviru studije „Randomized Prospective Controlled Clinical and Pharmacoeconomic Study of Cyclosporine vs. Tacrolimus in Adult Renal Transplant Recipients“ Univerziteta u Vašingtonu, Medicinskog fakulteta. Pacijenti i klinički protokoli studije su prethodno detaljno opisani (Bohl i saradnici, Am. J. Transplant. 5:2213-2221; Randhawa i saradnici, Clin. Vaccine Immunol. 15:1564-1571, 2008). Pacijentima je davan imunosupresivan režim, koji je prekinut ukoliko je detektovana viremija. Uzorci seruma su prikupljani otprilike 1, 4, 12, 26 i 52 nedelje nakon transplantacije. Nije utvrđeno da bilo koji pacijent boluje od PVAN tokom perioda prikupljanja. Serumi zdravih subjekata koji posećuju Američke centre za doniranje plazme takođe su ranije detaljno opisani (Pastrana i saradnici, PLoS Pathog.5:e1000578, 2009).
[0115] VLP-ovi i reporterski vektori (pseudovirioni): BKV reporterski vektori su generisani kao što je prethodno opisano (Pastrana i saradnici, PLoS Pathog. 5:e1000578, 2009). BKV-I reporterski vektori su proizvedeni upotrebom plazmida pCAG-BKV (Nakanishi i saradnici, Virology 379:110-117, 2008), koji kodira kapsidne proteine BKV izolata KOM-5 (SEQ ID NO: 1-3). KOM-5 je klasifikovan kao BKV genotip tipa I podtipa b-1 (Ib-1) (Nishimoto i saradnici, J. Mol. Evol. 63:341-352, 2006) i transfektovan je u 293TT ćelije (Buck i saradnici, J. Virol. 78:751-757, 2004) upotrebom Lipofektamina 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Zatim, 48 sati nakon transfekcije, ćelije su resuspendovane do >100 miliona ćelija/ml u Dulbekovom fiziološkom rastvoru puferisanom sa fosfatom (DPBS), nakon čega su lizirane dodavanjem 0,5% Triton X-100, 25 mM amonijum sulfata (razblaženog iz 1M osnovnog rastvora podešenog na pH 9) i koktela RNaze A/T1 (Ambion, Austin, TX). Lizat je dalje inkubiran na 37°C preko noći da bi se omogućilo sazrevanje kapsida, nakon čega je isti prečišćen sa dva centrifugiranja od po 10 minuta na 5000 x g, uz lagano mešanje lizata između centrifugiranja. Reporterske vektorske čestice su prečišćene iz izbistrenog supernatanta upotrebom postepenog gradijenta jodiksanola od 27-33-39% (OptiPrep®, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) (Buck i Thompson, Curr. Protoc. Cell Biol. Poglavlje 26, Jedinica 26.21, 2007).
4
[0116] Za BKV-IV čestice, upotrebljena je sekvenca BKV izolata A-66H (podtipa IV-c2; Zhong i saradnici, J. Gen. Virol. 90:144-152, 2009), da bi se kontruisale sintetske vezije modifikovanih kodona za VP1, VP2 i VP3 gene (SEQ ID NO: 39-41). Geni modifikovanih kodona su sintetisani od strane kompanije Blue Heron Biotechnology (Bothell, VA), nakon čega su klonirani u sisarske ekspresione plazmide pGwF(za VP1) ili phGF(za VP2 i VP3) (Invitrogen) adaptirane za upotrebu u Gateway tehnologiji (Buck i saradnici, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:1516-1521, 2006). Dodatni par plazmida, pwB2b i pwB3b, generisani su transferom BKV-IV VP2 ili VP3 gena (tim redom) u pwB ekspresionu kasetu pod kontrolom SV40 promotora. Za proizvodnju BKV-IV reporterskog vektora, ćelije su istovremeno transfektovane sa pwB2b, pwB3b, ph2b, ph3b i phGluc u odnosu 2:2:1:1:1. Delovalo je da su početni koncentrovani rastvori čestica proizvedenih bez ph2b ili ph3b, u smeši za istovremenu transfekciju, ispoljili slabo zauzeće VP2/3 i relativno slabu infektivnost. Transfekcija, prikupljanje i prečišćavanje BKV-IV reporterskih vektora su bili isti kao i za proizvodnju BKV-I reporterskih vektora.
[0117] Za generisanje VLP, 293TT ćelije su transfektovane sa pCAG-BKV (BKV-I) ili smešom pwB2b i pwB3b (BKV-IV) bez bilo kakvog reporter plazmida. Dva dana nakon transfekcije, ćelije su lizirane sa 0,5% Triton X-100 u DPBS-u, u koji su bili dodati 25 mM amonijum sulfat, benzonaza (Sigma-Aldrich), Plasmid Safe reagens (Epicentre, Madison, WI) i 1,2 U/ml neuraminidaze V (Sigma-Aldrich, kataloški br. N2876). Lizati su zatim inkubirani na 37°C preko noći, nakon čega su podešeni na 0,85 M NaCl, razbistreni kao što je prethodno navedeno i podvrgnuti prečišćavanju upotrebom OptiPrep® gradijenata.
[0118] ELISA testovi: Ploče Immulon™ H2B (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) su preko noći obložene sa 15 ng/bunariću VLP-ova u PBS-u. Za blokiranje obloženih ploča je zatim upotrebljen PBS sa 1% nemasnim mlekom u prahu (blotto), tokom 2 sata na sobnoj temperaturi, uz mešanje na orbitalnoj mešalici. Serumi iz miševa i zdravih humanih subjekata su serijski razblaživani u blotto rastvoru, pa su inkubirani u blokiranim pločama tokom jednog sata na sobnoj temperaturi, ponovo uz mešanje na orbitalnoj mešalici. Pranje je vršeno sa PBS-om. Za detektovanje vezanih seruma su upotrebljavani kozji anti-mišji IgG (BioRad) ili magareći anti-humani IgG koji su bili konjugovani sa peroksidazom rena (Jackson ImmunoResearch, Wes Grove, PA) i sa razblaženjem od 1:7500 u blotto rastvoru. Ploče su zatim inkubirane sa ABTS (2,2-azino-di-[3-etilbenztiazoin sulfonatnim) supstratom (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) i očitana je apsorbancija na 405 nm, uz referentno očitavanje na 490 nm. Efektivna koncentracija od 10% (EC10<) izračunata je>upotrebom kompjuterskog programa Prism® (GraphPad Software, La Jolla, CA) da bi se kriva uklopila u OD vrednosti za svaki serijski razblažen uzorak seruma. Vrh svake krive odgovora je bio ograničen shodno prosečnoj vrednosti izračunatog maksimuma platoa (Bmax) za jako reaktivne serume. Vrednost Bmax je obično predstavljala OD vrednost od oko 2,0, tako da se EC10vrednost može smatrati uporedivom sa graničnom vrednošću OD od 0,2.
[0119] Testovi neutralizacije: Testovi neutralizacije su izvođeni kao što je prethodno prijavljeno (Pastrana i saradnici, PLoS Pathog. 5:e1000578, 2009). Ukratko, 293TT ćelije su zasejane u gustini od 3 x 10<4>ćelija po bunariću, nakon čega su ostavljene da se vežu za podlogu tokom 3-5 sati. Serumi iz miševa i humanih subjekata su serijski razblaživani, do su serumi iz pacijenata sa transplantiranim bubregom ispitivani u odovojenim testovima, u 4 različita razblaženja: 1:100, 1:500, 1:5 000 i 1:50 000. Razblaživanja su vršena u medijumu za ćelijsku kulturu (DMEM bez fenol crvene, u koji je su bili dodati 25 mM HEPES, 10% fetalni goveđi serum inaktiviran toplotom, 1% MEM sa neesencijalnim aminokiselinama, 1% Glutamax™ i 1% antibiotik/antimikotik, svi od kompanije Invitrogen). Potom je po 24 µl razblaženih seruma pomešano sa po 96 µl razblaženog osnovnog rastvora reporterskih vektora i sve je prebačeno da se inkubira na 4°C tokom 1 sata. Ćelije su dalje inkubirane sa 100 µl ove smeše tokom 72 sata. Kondicionirani supernatanti (25 µl) su prikupljani u bele luminometrijske ploče sa 96 ležišta (Perkin Elmer, Waltham, MA). Neposredno pre luminometrije, injeciran je supstrat iz Gaussia Luciferase Assay kompleta (50 µl, New England Biolabs, Ipswich, MA), upotrebom BMG Labtech Polarstar Optima luminometra.
[0120] Za miševe i serume iz zdravih osoba, neutrališući titri od 50% (EC50<) su izračunati na osnovu>krivih zavisnosti doze i odgovora, sa gornjim i donjim vrednostima ograničenim na prosečne vrednosti kontrolnih bunarića označenih kao „bez seruma“ i „bez reporterskog vektora“, tim redom. Za pacijente sa transplantatima su usvojeni sledeći kriterijumi za seropozitivnost i seronegativnost: serumi su smatrani negativnim pri ulasku u studiju ukoliko razblaženje od 1:100 nije posredovalo u smanjenju aktivnosti Gaussia luciferaze za najmanje 95% (mereno u relativnim svetlosnim jedinicama, RLU) u odnosu na kontrolne uslove bez seruma (neutralizacija reporterskog vektora >95%). Serokonverzija se odnosi na subjekte koji su bili sa seronegativnim rezultatom u početnoj vremenskoj tački, ali čiji su serumi u bilo kojoj narednoj vremenskoj tački bili >95% neutrališući u razblaženju od 1:500. Stroža definicija serokonverzije, uzimajući u obzir moguću neutralizaciju unakrsnog tipa u niskom nivou, dodala je uslov da se neutrališući titar od 95% za BKV-IV razlikuje od neutrališućeg titra za BKV-I za manje od 1000 puta.
[0121] Analiza sekvenci: VP1 sekvence iz BKV sojeva koji su naznačeni u Tabeli 3 (u nastavku teksta) preuzete su iz GenBank baze podataka (Pastrana i saradnici, PLoS Pathogens 8:e1002650, 2012). Poravnanja u ClustalW programu su urađena sa MacVector kompjuterskim programom verzije 11.1.2, upotrebom serijske matricu tipa Gonnet. Strukturno modeliranje aminokiselinskih varijacija za BKV VP1 je vršeno poravnavanjem sekvenci JCV ili SV40 VP1 sa BKV, nakon čega je sledilo ispitivanje u kontekstu homolognih pozicija od interesa u rendgentskim kristalnim strukturama JCV ili SV40 VP1 (PDB ID pristupni brojevi 3NXD i 1SVA, tim redom). Analiza strukture je vršena upotrebom programa Swiss PDB Viewer.
Primer 2
Unakrsni neutrališući odgovori za BKV u mišjim serumima
[0122] Ovaj primer opisuje serološku unakrsnu reaktivnost kod miševa imunizovanih VLP-ovma iz BKV-I ili BKV-IV serotipova.
[0123] Da bi se utvrdilo da li će reaktivnost na jedan tip BKV generisati unakrsno reaktivna antitela, miševi su imunizovani sa VLP-ovima koji su sadržavali VP1, VP2 i VP3 kapsidne proteine iz dva najčešća serotipa: BKV-I (BKV-Ib1 izolat KOM-5) ili BKV-IV (BKV-IVc2 izolat A-66H). Jedna supkutana doza u prisustuvu Frojndovog adjuvansa dovela je do razvoja odgovora visokog titra. Mereno ELISA testom, svi miševi, osim jednog, odgovorili su titrima na BKV-I raspona od 9000 do 110 000 (SL. 1, gornji panel). Odgovor kod imunizovanih BKV-IV miševa je bio sličan, sa titrima raspona od 13 000 do 130 000. Serume su karakterisali različite količine unakrsne reaktivnosti na nesrodne BKV. Prosečan odnos homolognog i heterolognog titra je iznosio 21 za miševe imunizovane sa BKV-I i 110 za miševe imunizovane sa BKV-IV (SL. 1, donji panel). Za ovaj proračun, eliminisan je miš koji nije reagovao, pošto odrednica nije bio pravi titar, već proizvoljno postavljena vrednost na 25 ili na najnižu ispitivanu koncentraciju.
[0124] Da bi se dobilo više informacija o unakrsnim neutrališućim odgovorima, upotrebljavan je i test neutralizacije zasnovan na reporterskim vektorima. Ovakvi rekombinantni proizvodni sistemi su omogućili stvaranje infektivnih kapsida sastavljenih od VP1/2/3 kapsidnih proteina BKV primarnih izolata genotipova I i IV, koji se inače ne mogu kultivisati. Upotrebom testova zanovanih na reporterima, bila je titrirana neutrališuća potencija seruma iz miševa vakcinisanih na BKV-I ili BKV-IV. Pokazalo se da test neutralizacije BKV-I, u poređenju sa ELISA testovima, ima širi linearni opseg za detektovanje serumskih titra (Pastrana i saradnici, PLoS Pathog. 5:e1000578, 2009), a sličan test neutralizacije je takođe pokazao poboljšanu specifičnost u kontekstu papiloma virusa (Pastrana i saradnici, Virology 321:205-216, 2004). Testovi neutralizacije su ukazali na značajno veći stepen specifičnosti za BKV tip u poređenju sa ELISA testovima. Za BKV-I imunizovane miševe, homologni titri su bili opsega od 1100 do 3000000 (SL. 1, srednji panel). Miš koji nije bio reaktivan u ELISA testu, pokazao je titar od 1100, što je bilo 55 puta niže od sledećeg miša sa nižim BKV-I titrima. Miševi imunizovani sa BKV-IV su bili sa titrima opsega od 17 000 do 600 000. Odnos homolognog i heterolognog titra je iznosio 910 za miševe imunizovane sa BKV-I i 620 za miševe imunizovane sa BKV-IV. Poređenje ELISA vrednosti sa vrednostima testova neutralizacije je prikazano na SL.2.
[0125] Da bi se ispitala mogućnost da buster vakcinacija može izmeniti stepen unakrsne neutralizacije dva tipa BKV, druga doza srodnih VLP-ova je primenjivana miševima (u nekompletnom Frojndovom adjuvansu) mesec dana nakon prajmovanja. Ponovljena serologija je rađena ukupno dva meseca nakon primene početne doze za prajmovanje. Hiperimunski serumi iz životinja koje su primile buster doze, pokazali su neutrališući odnos sličan početnom ispitivanju.
[0126] Dodatno, miševi vakcinisani sa VLP-ovima na bazi BKV-Ib2 bili su sa odgovorima tipa serumskih antitela koja su robusno neutralisala srodne BKV-Ib2 reporterske pseudoviruse, ali nisu uspevala da efektivno neutrališu BKC-Ia pseudovirus (Tabela 2). Ovaj rezultat potvrđuje da su genotipovi BKV-Ia i BKV-Ib2 jasno različiti serotipovi.
Tabela 2. Jednokratna imunizacija miševa sa BKV varijantama
[0127] Uzeti zajedno, podaci ukazuju da test neutralizacije ima veći kvantitativni dinamički opseg od ELISA testa i da je test neutralizacije u proseku oko 10 puta bolji u jasnom razlikovanju titra specifičnih za tip BKV (SL. 1, donji panel). Moguće je i da se u ELISA testu detektuju unakrsno reaktivna antitela na BKV koja nisu neutrališuća, a koja se ne mogu detektovati u testu neutralizacije. Ipak, u kontekstu transplantacije bubrega, relevantnije je detektovanje neutrališućih antitela specifičnih za tip, pošto bi samo neutrališuća antitela inhibirala de novo infekcije sa novim serotipom ili bi supriirala latentne infekcije sa postojećim BKV serotipom.
Primer 3
Titri BKV kod zdravih odraslih osoba
[0128] Serumi iz 48 zdravih odraslih osoba sa medijanom starosti od 52,5 godina, ispitivani su na BKV-I i BKV-IV reaktivnost u ELISA testovima. Seroprevalencija različitih tipova BKV kod ovih osoba je prikazana u Tabeli 3. Od navedenih, 83% je bilo seropozitivno na BKV-I (SL. 3, gornji panel), što je slično grafiku koji je prijavljen u literaturi (Egli i saradnici, J. Infect. Dis. 199:837-846, 2009; Knowles i saradnici, J. Med. Virol. 71:115-123, 2003). Geometrijska sredina titra za anti-BKV-I serume je iznosio 550 i bio je opsega od niskih 60 do visokih 7100. Nasuprot tome, 65% dobrovoljaca je bilo seropozitivno za BKV-IV, ali njihova geometrijska sredina titra je iznosila 150, čak i kada su imali sličan opseg (60 do 17 000). U BKV-IV ELISA testu, samo 18% (9 seruma) je bilo sa titrom većim ili jednakim 500, dok je u BKV-I ELISA 54% (26 seruma) dostiglo ovaj titar.
Bila je prisutna i statistički značajna korelacija između BKV-I i BKV-IV titara (Spearman r = 0,69, p < 0,0001). Ova korelacija, zajedno sa nižim geometrijskim sredinama titara i saznanjima da su prethodne studije utvrdile prevalenciju BKV-IV DNK od samo 6-7% (Krumbholz i saradnici, J. Med. Virol. 78:1588-1598, 2006), ukazuje da se veći deo seropozitivnosti na BKV-IV može pripisati unakrsnoj reaktivnosti u ELISA testu. Serumi su stoga dalje ispitivani u testu neutralizacije.
Tabela 3. Seroprevalencija BKV tipova kod 48 zdravih osoba
[0129] Za testove neutralizacije, uzorci seruma su serijski razblaživani polazeći od 1:100. Ovo je bilo najniže razblaženje naivnog (zečjeg) seruma koje je konzistetno bilo lišeno nespecifične neutrališuće aktivnosti (Pastrana i saradnici, PLoS Pathog. 5:e1000578, 2009). Prema tome, EC50vrednosti ispod ovog razblaženja nisu mogle biti tačno izračunate i bile su proizvoljno određene kao da su sa EC50od 100. Samo 3 dobrovoljca (6%) su bila negativna na BKV-I neutralizaciju. Nasuprot tome, 37 (77%) je bilo negativno na BKV-IV (SL. 3, donji panel). Geometrijska sredina EC50titara za BKV-I je takođe bila značajno veća (5100) od BKV-IV titaa (180). Postojale su i tri osobe sa titrima većim od 60000 za BKV-I koje su bile potpuno negativne za BKV-IV neutrališuće titre. Za razliku od ELISA rezultata, nije postojala statistički značajna korelacija između BKV-I i BKV-IV neutrališućih titara subjekata. Bile su prisutne i dve osobe sa BKV-I neutrališućim titrima >100 000 čiji serumi nisu detekotvani kao oni koji neutrališu BKV-IV pri najnižem ispitivanom razblaženju (1:100). Navedeno ukazuje da ove osobe ispoljavaju odnose specifičnosti BKV tipova od najmanje 1 000. Poređenje ELISA vrednosti sa vrednostima iz testova neutralizacije su prikazani na SL. 4. Sveukupno, rezultati za humane serume potvrđuju zapažanja dobijena upotrebom mišjih seruma, koji ukazuje da testovi neutralizacije nude značajno veći stepen osetljivosti i specifičnosti za serološku analizu izloženosti BKV-I i BKV-IV.
Primer 4
Serokonverzija specifična za BKV tip kod primalaca transplantata bubrega
[0130] Određivani su i anti-BKV-I i BKV-IV titri kod 108 primalaca tranplantata bubrega. Arhivirani set seruma prikupljenih u vremenskim tačkama od otprilike 1, 4, 12, 26 i 52 nedelje nakon transplantacije, ispitivan je u testu neutralizacije. Svaki uzorak je ispitivan u četiri razblaženja: 100, 500, 5000 i 50 000. Usled ovog nedostatka potpunog serijskog razblaživanja, korišćena je stroža granična vrednost neutralizacije od 95% za pojedinačne tačke podataka. Rezultati testa neutralizacije za pojedine subjekte su prikazani na SL. 5 i 6. Prilikom ulaska u studiju, 5 pacijenata (5%) je bilo seronegativno (neutralizacija <95% pri razblaženju seruma od 1:100) u testu neutralizacije BKV-I (Tabela 4). Nasuprot tome, na početku studije je bilo prisutno 53 BKV-IV seronegativnih subjekata (49%). Pacijenti su zatim ispitivani u kontekstu serokonverzije, definisane u vidu promene iz seronegativnosti u prvoj vremenskoj tački do neutralizacije od najmanje 95% pri razblaženju seruma od 1:500 u bilo kojoj narednoj vremenskoj tački. Svih 5 prvobitno seronegativnih BKV-I pacijenata je ispoljilo serokonverziju za BKV-I, a 23 (43%) inicijalno BKV-IV seronegativnih pacijenata su bili sa serokonverzijom za BKV-IV (Tabela 4).
Tabela 4. Serokonverzija primalaca transplantata bubrega
[0131] Prosečan odnos specifičnosti BKV tipa za serume imunizovanih miševa je iznosio 1359 (SL.
1). Dva humana subjekta su slično ispoljila odnose specifičnosti za tip koji su bili >1000 (SL. 3). Da bi se ispitala mogućnost da neutralizacija BKV-IV može biti delimično pripisana unakrsnoj reaktivnosti odgovora antitela sa visokim titrom izazvanim sa BKV-I, primenjena je stroža definicija serokonverzije, u kojoj je odnos BKV-I titra naspram BKV -IV titra (ili obrnuto) morao biti manji od 1000 u najmanje jednoj vremenskoj tački da bi se događaj smatrao jasnom serokonverzijom specifičnom za tip. Čak i sa ovakvim strožim kriterijumima, 12 (23%) BKV-IV negativnih pacijenata je bilo sa serokonvezijom u roku od godinu dana nakon transplantacije (Tabela 2). Na osnovu rezultata prikazanih na SL. 1 i 3, deluje da je pojava odnosa specifičnosti tipa BKV od 10 ili manje vrlo malo verovatna. Pet pacijenata (5%) je bilo sa serokonverzijom specifičnom za BKV-IV kada je uzet u obzir izuzetno strog kriterijum da je odnos BKV-I prema BKV-IV titrima ≤10.
[0132] U proseku, oba neutrališuća BKV-I i BKV-IV titra pacijenata su znatno porasla za godinu dana nakon transplantacije bubrega (SL. 7). U pojedinim slučajevima, povećanje titra se desilo čak i kod pacijenata kod kojih su bili prisutni umereni neutrališući titri antitela na početku studije (SL. 5 i 6).
Primer 5
Analiza proteinskih sekvenci BKV VP1
[0133] Poravnate su neidentične sekvence BKV VP1 peptida pune dužine koje su dostupne u GenBank bazi podataka (SL. 8). Pristupni brojevi iz GenBank baze podataka koji su korišćeni za generisanje poravnanja su obezbeđeni u Tabeli 5. Pošto na osnovu VP1 aminokiselinskih sekvenci nije moguće razlikovati Ia i Ib1 podtipove, BKV-Ia podrazumeva genotipove Ia/Ib1, dok BKV-Ib
4
podrazumeva genotip Ib2. Na osnovu VP1 aminokiselinskih sekvenci takođe nije moguće razlikovati BKV-IV podtipove. Prema tome, BKV-IV podrazumeva genotipove IV-b1/IV-c2.
Tabela 5. Pristupni brojevi u GenBank bazi podataka za poravnate BKV VP1sekvence
[0134] U pogledu BKV-I konsenzusa, izolati BKV-IV su bili sa tendencijom da nose raznovrsne supstitucije: E61N, N62D, F66Y, K69R, S71T, N74T, D75A, S77D, E82D, Q117K, H139N, I178V, F225Y, A284P, R340Q, K353R i L362V. Mapiranje ovih BKV-I/BKV-IV varijantnih ostataka na homolognnim pozicijama u rendgenskim kristalnim strukturama JCV (Neu i saradnici, Cell Host Microbe 8:309-319, 2010) i SV40 (Stehle i saradnici, Structure 4:165-182, 1996) ukazalo je da će, sa izuzetkom pozicija 117, 225, 284 i 340, svaki od ovih BKV-I/BKV-IV varijantnih ostataka verovatno biti izložen na spoljnoj površini kapside. Sa izuzetkom ostataka 353 i 362, koji su bili izloženi duž osnove procepa između kapsomernih jedinica, sve izložene varijacije su mapirale na mestima na apikalnoj površini i apikalnom obodu kapsomernih jedinica. Mnoge od varijacije su susedne sa ostacima za koje je predviđeno da su uključeni u vezivanje ćelijskih glikolipida koji služe kao receptori prilikom ulaska BKV tokom infekcije (Dugan i saradnici, J. Virol. 81:11798-11808, 2007; Low i saradnici, J. Virol. 80:1361-1366,2006). Navedeno je u skladu sa idejom da varijacije BKV-I/BKV-IV mogu izmeniti epitope koje prepoznaju antitela koja neutrališu infektivnost, putem steričke okluzije mesta vezivanja receptora.
[0135] Pored razlika između BKV-I i BKV-IV, nekoliko pozicija se stereotipno razlikovalo među podtipovima BKV-I. Na primer, BKV izolati podtipa Ib-2 su bili sa tendencijom da nose razlike u V42L, E82D, D175E, V210I, R340K i L362V, u odnosu na podtipove Ia i Ib-1. Slično tome, izolati podtipa Ic su često bili sa razlikama u E20D, F225L i R340K. Iako su ove varijacije površine unutar genotipa-I hemijski suptilne, bez vezivanja za teoriju, moguće je da razlike odražavaju selektivni pritisak da se izbegnu neutrališuća antitela.
[0136] Kod ljudskih subjekata, utvrđeno je da 6 od 48 subjekata sa BKV-Ia neutrališućim antitelima nije bilo u stanju da neutrališe BKV-Ib2 izolat (uključujući VP1 polipeptid sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 14). Analizom mutiranih pseudovirusa koji su predstavljali rekombinantne himere tipova Ia i Ib2, identifikovani su ključni aminokiselinski ostaci koji omogućavaju Ib2 izolatu da izbegne odgovor u vidu antitela za neutralizaciju la. Varijacije su bile u VP1 BC petlji i uključivale su E73Q i E82D (varijacije Ia u Ib2). Nekoliko drugih Ib2 varijanti i varijacije petlje kod genotipa Ic BC, bile su delimično rezistentne na Ia-neutrališuće humane serume. Ovakve dodatne varijante su sadržavale E73Q, S77N, E82Q ili kombinacije ovih varijacija. Ovakvi rezultati ukazuju da bi optimalna BKV vakcina trebala da sadrži najmanje BKV-Ia i BKV-Ib2 VP1 polipeptide, a da bi se
4
proizvela antitela sposobna da neutrališu sve BKV-I varijante. Štaviše, validacija vakcina koje su kandidati bi trebala da uključuje skrining serima iz vakcinisanih subjekata radi neutralizacije višestrukih BKV-I podtipova (kao što su barem BKV-Ia i BKV-Ib2 podtipovi).
Primer 6
Dodatni BKV VP1 polipeptidi
[0137] Dodatni BKV serotipovi mogu ostati da tek budu otrkiveni i u potpunosti sekvencirani. Pristupni brojevi u GenBank bazi podataka CCF70703-CCF70735 prijavljuju deo VP1 proteina koji obuhvata BC i EF petlje. Pojedine od ovih sekvenci sadrže prethodno nepoznate varijacije u BC i EF petljama. U pojedinim slučajevima, fragmenti sekvenci se više razlikuju od svih objavljenih BKV VP1 sekvenci u odnosu na razliku BKV-I od BKV-IV (SL. 9). Na osnovu poravnanja ovih dodatnih sekvenci sa BKV-Ia, BKV-Ib, BKV-Ic, BKV-II, BKV-III, BKV-IVbl i BKV-IVc2 VP1 sekvencama (SL. 10), deluje da pristupni brojevi CCF70725 (SEQ ID NO: 154), CCF70727 (SEQ ID NO: 153), CCF70729 (SEQ ID NO: 158) i CCF70730 (SEQ ID NO: 157) predstavljaju delove jasno različitih BKV serotipova. Pristupni brojevi u GenBank bazi podataka koji su korišćeni za generisanje poravnavanja su obezbeđeni u Tabeli 6. Serološka jasna različitost ovih nedavno prijavljenih sekvenci može biti utvrđena, na primer, izolovanjem ostatka ovih VP1 sekvenci i upotrebom postupaka opisanih u Primerima 1 i 2. Polipeptidi koji sadrže ovakve dodatne BKV VP1 polipeptide mogu biti upotrebljeni u opisanim postupcima i kompozicijama. U pojedinim slučajevima, opisani postupci i kompozicije uključuju jednu ili više od SEQ ID NO: 126-158.
Tabela 6. Pristupni brojevi u GenBank bazi podataka za dodatne delimične BKV VP1 sekvence
Primer 7
Postupci izazivanja imunskog odgovora na BKV
[0138] Ovaj primer obezbeđuje postupke za primer za izazivanje imunskog odgovora na jedan ili više BKV serotipova kod subjekta. Ipak, stručnjak iz oblasti tehnike će lako prepoznati da postupci koji odstupaju od ovih specifičnih postupaka takođe mogu biti upotrebljeni za uspešno izazivanje imunskog odgovora na BKV kod subjekta.
[0139] U posebnim primerima, postupak obuhvata odabir subjekta kome je potreban pojačan imunitet na BKV. Subjekti kojima je potreban pojačan imunitet na BKV obuhvataju osobe koje su sa oslabljenim imunitetom i osobe koje su podvrgnute ili su kandidati za transplantaciju organa, na primer, transplantaciju bubrega ili transplantaciju kosne srži. Subjekti kojima je potreban pojačan imunitet na BKV takođe obuhvataju osobe koje su seronegativne za najmanje jedan BKV serotip.
[0140] Subjektima koji su odabrani za lečenje se primenjuje terapijski efektivna količina opisane imunogene kompozicije. U pojedinim primerima, terapijski efektivna količina jednog ili više BKV-I kapsidnih polipeptida (ili njihovih fragmenata) ili jednog ili više polinukleotida koji kodiraju BKV-I
4
kapsidne polipeptide i terapijski efektivna količina jednog ili više BKV-IV kapsidnih polipeptida (ili njihovi fragmenti) ili jednog ili više polinukleotida koji kodiraju BKV-IV kapsidne polipeptide, primenjuju se subjektu u dozama od oko 0,1 µg do 10 mg za svaki BKV kapsidni polipeptid ili polinukleotid koji kodira polipeptid ili u dozama od oko 20-40 µg VLP po tipu za pentamere. Međutim, konkretna doza može biti utvrđena od strane iskusnog kliničara. Opisani BKV kapsidni polipeptidi (ili njihov fragment) ili polinukleotid koji kodira BKV kapsidne polipeptide ili njihov fragment, mogu biti primenjivani u jednoj ili nekoliko doza, na primer, u kontinuitetu, jednom dnevno, nedeljno ili mesečno. Kada se primenjuje jedan za drugim, vreme između primene može biti u sekundama, minutima, satima, danima ili čak nedeljama.
[0141] Način primene može biti bilo koji koji se upotrebljava u oblasti tehnike, ukljčujući, ali ne ograničavajući se na, supkutanu ili intramuskularnu primenu. Količina agensa koji se primenjuje subjektu može biti određena od strane kliničara i ista može zavisiti od samog subjekta koji se leči. Ovde su obezbeđeni specifični primeri količina (ali opis nije ograničen na takve doze).
[0142] Razvoj imunskog odgovora (kao što je razvoj antitela, poput neutrališućih antitela) kod subjekta se prati u vremenskim tačkama nakon primene imunogene kompozicije. Postupci za detektovanje antitela u uzorku (kao što je uzorak krvi ili seruma) obuhvataju one koji su poznati u oblasti tehnike, na primer, ELISA postupke. U pojedinim primerima, prati se razvoj neutrališućih antitela na BKV-Ia i/ili BKV-Ib1 podtip i razvoj neutrališućih antitela na BKV-Ib2 podtip.
Primer 8
Postupci lečenja ili inhibiranja PVAN
[0143] Ovaj primer obzebeđuje primer postupaka za lečenje ili inhibiranje PVAN kod subjekta. Ipak, prosečno iskusni stručnjaci će lako prepoznati da postupci koji odstupaju od ovih specifičnih postupaka takođe mogu biti upotrebljeni za uspešno lečenje ili inhibiranje PVAN kod subjekta.
[0144] U posebnim primerima, postupak obuhvata odabir subjekta koji boluje, smatra se da je oboleo ili je sa rizikom da oboli od PVAN. Subjekti koji boluju ili za koje se smatra da su oboleli od PVAN obuhvataju one sa >10 inkluzija koje nose epitelne ćelije ("ćelije mamci") u uzorku urina na 10 poljavelikog uvećanja, sa >10<7>kopija BKV na 10 ml urina ili kod kojih je na biopsiji bubrega histopatološki identifikovana virusom prouzrokovana promena. Subjekti sa rizikom od PVAN obuhvataju one koji su podvrgnuti ili su kandidati za transplantaciju organa (poput transplantacije bubrega ili transplantacije kosne srži), kao i osobe sa oslabljenim imunitetom. U pojedinim primerima, izabrani su subjekti koji su kandidati za transplantaciju bubrega. Odabrani subjekat može biti subjekat koji nema neutrališuća antitela za BKV-IV.
[0145] Subjektima odabranim za lečenje se primenjuje terapijski efektivna količina opisane imunogene kompozicije. U pojedinim primerima, terapijski efektivna količina jednog ili više BKV-IV
4
kapsidnih polipeptida, ili polinukleotida koji kodiraju BKV-IV kapsidni polipeptid (kapsidne polipeptide), primenjuje se subjektu u dozama od oko 0,1 µg do 10 mg za svaki BKV-IV kapsidni polipeptid ili polinukleotid koji kodira polipeptid ili u dozama od oko 20-40 µg VLP po tipu za pentamere. Ipak, konkretnu dozu može odrediti iskusan kliničar. Opisani BKV-IV kapsidni polipeptidi (ili njihovi fragmenti), ili polinukleotid koji kodira BKV-IV kapsidne polipeptide ili njihove fragmente, mogu biti primenjivani u jednoj ili nekoliko doza, na primer, u kontinuitetu, jednom dnevno, nedeljno ili mesečno, sa najmanje jednom dozom koja se primenjuje najmanje 2 nedelje pre transplantacije. Kada se primenjuju jedan za drugim, vreme razdvojenosti primena može biti u sekundama, minutima, satima, danima ili čak nedeljama.
[0146] Način primene može biti bilo koji koji se upotrebljava u oblasti tehnike, ukljčujući, ali ne ograničavajući se na, supkutanu ili intramuskularnu primenu. Količina agensa koji se primenjuje subjektu može biti određena od strane kliničara i ista može zavisiti od samog subjekta koji se leči. Ovde su obezbeđeni specifični primeri količina (ali opis nije ograničen na takve doze).
[0147] Razvoj imunskog odgovora (kao što je razvoj antitela, poput neutrališućih antitela) kod subjekta se prati u vremenskim tačkama nakon primene imunogene kompozicije. Postupci za detektovanje antitela u uzorku (kao što je uzorak krvi ili seruma) obuhvataju one koji su poznati u oblasti tehnike, na primer, ELISA postupke. Transplantacija bubrega se vrši nakon detektovanja imunskog odgovora. Subjekat se takođe prati u kontekstu razvoja PVAN, na primer, ispitivanjem prisustva virusa u urinu ili u okviru biopsije bubrega.
Primer 9
Postupci identifikovanja davaoca za transplantaciju bubrega
[0148] Ovaj primer obzebeđuje postupke za primer za identifikovanje davaoca za transplantaciju bubrega, kao što je osoba koja nema serumska antitela sposobna da neutrališu jedan ili više BKV tipova. Ipak, prosečno iskusni stručnjaci će lako prepoznati da postupci koji odstupaju od ovih specifičnih postupaka mogu takođe biti upotrebljeni za uspešno identifikovanje davaoca za transplantaciju bubrega.
[0149] Uzorak krvi se uzima iz subjekta koji se smatra mogućim davaocem za transplantaciju bubrega. Iz uzorka se priprema serum i dalje se pripremaju serijska razblaženja seruma (npr. desetčetvorostrukih serijskih razblaženja opsega od 1:100 do 2,6 x 10<7). Razblaženi serum se meša sa>razblaženim BKV reporterskim vektorom sa reporterskim plazmidom koji kodira luciferazu iz Gaussia princeps, pod kontrolom promotora za humani elongacioni faktor tipa 1 alfa, nakon čega se smeša inkubira na ledu ili na 4°C tokom 1 sata. Smeša virusa/seruma se zatim dodaje 293TT ćelijama koje su prethodno zasejane u ploču sa 96 bunarića, u gustini od 3 x 10<4>ćelije/bunariću. Nakon 3 dana, prikuplja se po 25 µl kondicioniranog medijuma i isti se prebacuje na luminometrijsku ploču. Dodaje
4
se zatim supstrat Gaussia luciferaze (50 µl supstrata iz NEB Gaussia luciferase assay kompleta) i luminometrom se detektuje emisija svetlosti. Efektivna koncentracija od 50% (EC50) se izračunava za seriju razblaženja seruma. EC50manja od 100 ukazuje da subjekat nema BKV-IV neutrališuća antitela. Subjekat koji nema BKV-IV neutrališuća antitela se bira kao davalac za transplantaciju bubrega.
[0150] Kandidat za primaoca transplantata bubrega takođe može biti odabran skriningom u kontekstu prisustva BKV-IV neutrališućih antitela, kao što je prethodno opisano. Kandidat za primaoca transplantata bubrega koji je negativan na BKV-IV neutrališuća antitela, smatra se dobrim kandidatom za primanje bubrega od davaoca transplantata bubrega koji je negativan na BKV-IV neutrališuća antitela.
[0151] Sličan skrining može biti sproveden i u kontekstu prisustva drugih neutrališućih antitela specifičnih za BKV kod potencijalnih davalaca i/ili primalaca za transplantaciju bubrega. Potencijalni davalac za transplantaciji bubrega koji nema određena neutrališuća antitela za specifičan tip (poput BKV-I, BKV-II ili BKV-III) identifikuje se i bira kao davalac za transplantaciju bubrega, posebno za primaoca transplantata bubrega koji takođe nema ista neutrališuća antitela specifična za tip.
[0152] U pogledu mnogih mogućih primera izvođenja na koja se mogu primeniti principi predmetnog pronalaska, potrebno je naglastiti da ilustrovani primeri izvođenja predstavljaju samo primere i da ih ne treba smatrati ograničavajućim za obim pronalaska. Umesto toga, obim pronalaska je definisan patentnim zahtevima koji slede. Prema tome, smatramo svojim pronalaskom sve š to je obuhvaćeno obimom ovih patentnih zahteva.
4
4
2
4
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
11
12
1
14
1
1
1
1
11
11
11
11
11
11
11
12
12
12
12
12
12
12
1
11
12
1
14
1
1
1
1
14
14
14
14
14
14
14
1
11
12
1
14
1
1
1
1
11
12
14
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
11
12
14
1
1
1
2
21
22
2
24
2
2
2
2
21
21
21
21
21
21
21
22
22
22
22
22
22
22
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
24
24
24
24
24
24

Claims (19)

Patentni zahtevi
1. Izolovani kapsidni polipeptid BKV serotipa I (BKV-I) ili nukleinska kiselina koja kodira BKV-I kapsidni polipeptid; i
izolovani kapsidni polipeptid BKV serotipa IV (BKV-IV) ili nukleinska kiselina koja kodira BKV-IV kapsidni polipeptid, za upotrebu u postupku izazivanja imunskog odgovora na BK poliomavirus (BKV) kod subjekta, pri čemu postupak obuhvata primenu subjektu kome je potreban pojačan imunitet na BKV:
terapijski efektivne količine najmanje jednog izolovanog kapsidnog polipeptida BKV serotipa I (BKV-I) ili nukleinske kiseline koja kodira najmanje jedan BKV-I kapsidni polipeptid; i terapijski efektivne količine najmanje jednog izolovanog kapsidnog polipeptida BKV serotipa IV (BKV-IV) ili nukleinske kiseline koja kodira najmanje jedan BKV-IV kapsidni polipeptid, radi izazivanja imunskog odgovora BKV,
pri čemu se najmanje jedan BKV-I kapsidni polipeptid i najmanje jedan BKV-IV kapsidni polipeptid primenjuju istovremeno ili jedan za drugim.
2. Kapsidni polipeptidi ili nukleinske kiseline za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, pri čemu primena najmanje jednog izolovanog BKV-I kapsidnog polipeptida obuhvata primenu čestice slične virusu koja sadrži najmanje jedan BKV-I kapsidni polipeptid i/ili pri čemu primena najmanje jednog izolovanog BKV-IV kapsidnog polipeptida obuhvata primenu čestice slične virusu koja sadrži najmanje jedan BKV-IV kapsidni polipeptid.
3. Kapsidni polipeptidi ili nukleinske kiseline za upotrebu prema patentnom zahtevu 1 ili 2, pri čemu najmanje jedan izolovani BKV-I kapsidni polipeptid obuhvata BKV-I VP1, BKV-I VP2, BKV-I VP3 ili kombinaciju dva ili više od navedenih i/ili pri čemu najmanje jedan izolovani BKV-IV kapsidni polipeptid obuhvata BKV-IV VP1, BKV-IV VP2, BKV-IV VP3, ili kombinaciju dva ili više od navedenih, i/ili
pri čemu najmanje jedan izolovani BKV-IV kapsidni polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 4-6, 16 i 110-125 i najmanje jedan izolovani BKV-I kapsidni polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 1-3, 13-15 i 52-103.
4. Kapsidni polipeptidi ili nukleinske kiseline za upotrebu prema patentnom zahtevu 3, pri čemu BKV-I VP1 polipeptid obuhvata jedan ili više od BKV-Ia VP1 polipeptida, BKV-Ib1 VP1 polipeptida, BKV-Ib2 VP1 polipeptida i BKV-Ic VP1 polipeptida i/ili pri čemu BKV-IV VP1 polipeptid obuhvata jedan ili više od BKV-IVb1 VP1 polipeptida i BKV-IVc2 VP1 polipeptida.
24
5. Kapsidni polipeptidi ili nukleinske kiseline za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 4, pri čemu postupak dodatno obuhvata primenu subjektu terapijski efektivne količine:
najmanje jednog izolovanog kapsidnog polipeptida BKV serotipa II (BKV-II) ili nukleinske kiseline koja kodira najmanje jedan BKV-II kapsidni polipeptid; i/ili
najmanje jednog izolovanog kapsidnog polipeptida BKV serotipa III (BKV-III) ili nukleinske kiseline koja kodira najmanje jedan BKV-III kapsidni polipeptid.
6. Kapsidni polipeptidi ili nukleinske kiseline za upotrebu prema patentnom zahtevu 5, pri čemu postupak dalje obuhvata primenu subjektu terapijski efektivne količine:
najmanje jednog kapsidnog polipeptida JC poliomavirusa (JCV) ili nukleinske kiseline koja kodira najmanje jedan JCV kapsidni polipeptid; i/ili
adjuvans.
7. Kapsidni polipeptidi ili nukleinske kiseline za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 6, pri čemu subjekat nema neutrališuća antitela za BKV-I i/ili neutrališuća antitela za BKV-IV.
8. Izolovani kapsidni polipeptid BKV serotipa IV (BKV-IV) ili nukleinska kiselina koja kodira BKV-IV kapsidni polipeptid, za upotrebu u postupku izazivanja imunskog odgovora na BK poliomavirus (BKV) kod subjekta, pri čemu postupak obuhvata primenu subjektu kome je potreban pojačan imunitet na BKV, terapijski efektivne količine najmanje jednog izolovanog BKV-IV kapsidnog polipeptida ili nukleinske kiseline koja kodira najmanje jedan BKV-IV kapsidni polipeptid,
radi izazivanja imunskog odgovora na BKV.
9. Izolovani kapsidni polipeptid BK poliomavirusa serotipa IV (BKV-IV) ili nukleinska kiselina koja kodira BKV-IV kapsidni polipeptid, za upotrebu u postupku lečenja ili inhibiranja nefropatije prouzrokovane sa BK poliomavirusom ili hemoragijskog cistitisa prouzrokovanog sa BK poliomavirusom kod subjekta, pri čemu postupak obuhvata primenu subjektu kome je potrebno lečenje ili inhibicija nefropatije prouzrokovane sa BK poliomavirusom ili hemoragijskog cistitisa prouzrokovanog sa BK poliomavirusom, terapijski efektivne količine najmanje jednog izolovanog kapsidnog polipeptida BKV serotipa IV (BKV-IV) ili nukleinske kiseline koja kodira najmanje jedan BKV-IV kapsidni polipeptid, čime se leči ili inhibira nefropatija prouzrokovana sa BK poliomavirusom ili hemoragijski cistitis prouzrokovan sa BK poliomavirusom.
10. Kapsidni polipeptid ili nukleinska kiselina za upotrebu prema patentnom zahtevu 8 ili 9, koja dalje obuhvata primenu subjektu terapijski efektivne količine:
najmanje jednog izolovanog kapsidnog polipeptida BKV serotipa I (BKV-I) ili nukleinske kiseline koja kodira najmanje jedan BKV-I kapsidni polipeptid;
najmanje jednog izolovanog kapsidnog polipeptida BKV serotipa II (BKV-II) ili nukleinske kiseline koja kodira najmanje jedan BKV-II kapsidni polipeptid;
najmanje jednog izolovanog kapsidnog polipeptida BKV serotipa III (BKV-III) ili nukleinske kiseline koja kodira najmanje jedan BKV-III kapsidni polipeptid;
najmanje jednog izolovanog kapsidnog polipeptida JC poliomavirusa ili nukleinske kiseline koja kodira najmanje jedan JC poliomavirusni kapsidni polipeptid;
ili adjuvansa; ili
kombinaciju dva ili više od navedenih.
11. Kapsidni polipeptid ili nukleinska kiselina za upotrebu prema patentnom zahtevu 9 ili 10, pri čemu je subjekat kandidat za transplantaciju organa, a terapijski efektivna količina najmanje jednog BKV-IV kapsidnog polipeptida ili nukleinske kiseline koja kodira najmanje jedan BKV-IV kapsidni polipeptid se primenjuje subjektu dovoljno vremena pre transplantacije organa, da bi se proizveo imunski odgovor kod subjekta, i/ili pri čemu je subjekat sa oslabljenim imunitetom ili je subjekat koji je lečen sa ili je kandidat za lečenje sa imunosupresivom ili je subjekat koji je primio ili je kandidat za transplantaciju organa ili transplantaciju kosne srži.
12. Multivalentna imunogena kompozicija za BK poliomavirus (BKV) koji sadrži:
česticu sličnu virusu koja sadrži najmanje jedan kapsidni polipeptid BKV serotipa IV; česticu sličnu virusu koja sadrži najmanje jedan kapsidni polipeptid BKV serotipa I; i farmaceutski prihvatljiv nosač.
13. Kompozicija prema patentnom zahtevu 12, pri čemu najmanje jedan izolovani BKV-IV kapsidni polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 4-6, 16 i 110-125 i najmanje jedan izolovani BKV-I kapsidni polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 1-3, 13-15 i 52-103.
14. Imunogena kompozicija prema patentnom zahtevu 12 ili 13, koja dalje sadrži:
česticu sličnu virusu koja sadrži najmanje jedan kapsidni polipeptid BKV serotipa II; i/ili česticu sličnu virusu koja sadrži najmanje jedan kapsidni polipeptid BKV serotipa III.
2 1
15. Imunogena kompozicija prema patentnom zahtevu 14, koja dalje sadrži:
česticu sličnu virusu koja sadrži najmanje jedan JC poliomavirusni (JCV) kapsidni polipeptid; i/ili
adjuvans.
16. Imunogena kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva od 12 do 15, pri čemu polipeptid obuhvata VP1, VP2, VP3 ili kombinaciju dva ili više od navedenih.
17. Imunogena kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva od 12 do 16, pri čemu najmanje jedan kapsidni polipeptid BKV serotipa IV obuhvata jedan ili više od BKV-IVb1 VP1 polipeptida i BKV-IVc2 VP1 polipeptida i/ili pri čemu najmanje jedan kapsidni polipeptid BKV I serotipa obuhvata jedan ili više od BKV-la VP1 polipeptida, BKV-Ib1 VP1 polipeptida, BKV-Ib2 VP1 polipeptida i BKV-Ic VP1 polipeptida.
18. Postupak praćenja razvoja imunskog odgovora na BKV kod subjekta kome je primenjena imunogena kompozicija koja sadrži najmanje jedan izolovani BKV kapsidni polipeptid ili nukleinsku kiselinu koja kodira BKV kapsidni polipeptid, koji obuhvata detektovanje prisustva neutrališućih antitela za specifičan serotip BK poliomavirusa virusa u uzorku dobijenom od subjekta, pri čemu su neutrališuća antitela specifična za serotip ona koja su specifična za BKV-I, specifična za BKV-II, specifična za BKV-III ili specifična za BKV-IV.
19. Čestica slična virusu koja sadrži najmanje jedan kapsidni polipeptid BKV serotipa IV i
čestica slična virusu koja sadrži najmanje jedan kapsidni polipeptid BKV serotipa I, za upotrebu u postupku izazivanja imunskog odgovora na BK poliomavirus (BKV) kod subjekta, pri čemu postupak obuhvata primenu čestica, istovremeno ili jednih za drugima, subjektu kome je potreban pojačan imunitet na BKV.
2 2
RS20210207A 2011-07-18 2012-07-17 Postupci i kompozicije za inhibiranje patologije povezane sa poliomavirusom RS61594B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161508897P 2011-07-18 2011-07-18
PCT/US2012/047069 WO2013012866A1 (en) 2011-07-18 2012-07-17 Methods and compositions for inhibiting polyomavirus-associated pathology
EP12741191.6A EP2734544B1 (en) 2011-07-18 2012-07-17 Methods and compositions for inhibiting polyomavirus-associated pathology

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS61594B1 true RS61594B1 (sr) 2021-04-29

Family

ID=46598982

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20210207A RS61594B1 (sr) 2011-07-18 2012-07-17 Postupci i kompozicije za inhibiranje patologije povezane sa poliomavirusom

Country Status (17)

Country Link
US (3) US9764022B2 (sr)
EP (1) EP2734544B1 (sr)
JP (1) JP6030650B2 (sr)
AU (1) AU2012284122B2 (sr)
CA (1) CA2842180C (sr)
CY (1) CY1123949T1 (sr)
DK (1) DK2734544T3 (sr)
ES (1) ES2855110T3 (sr)
HR (1) HRP20210419T1 (sr)
HU (1) HUE053664T2 (sr)
LT (1) LT2734544T (sr)
PL (1) PL2734544T3 (sr)
PT (1) PT2734544T (sr)
RS (1) RS61594B1 (sr)
SI (1) SI2734544T1 (sr)
SM (1) SMT202100100T1 (sr)
WO (1) WO2013012866A1 (sr)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2362881B1 (en) 2008-11-04 2019-03-13 Janssen Pharmaceutica NV Crhr2 peptide agonists and uses thereof
WO2015095770A1 (en) * 2013-12-20 2015-06-25 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Immunogenic jc polyomavirus compositions and methods of use
CN117209571B (zh) * 2023-08-23 2024-11-29 北京清华长庚医院 检测bkv病毒vp1抗体的vp1抗原、试剂盒和方法

Family Cites Families (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4235871A (en) 1978-02-24 1980-11-25 Papahadjopoulos Demetrios P Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles
US4501728A (en) 1983-01-06 1985-02-26 Technology Unlimited, Inc. Masking of liposomes from RES recognition
US4957735A (en) 1984-06-12 1990-09-18 The University Of Tennessee Research Corporation Target-sensitive immunoliposomes- preparation and characterization
US5019369A (en) 1984-10-22 1991-05-28 Vestar, Inc. Method of targeting tumors in humans
US4902505A (en) 1986-07-30 1990-02-20 Alkermes Chimeric peptides for neuropeptide delivery through the blood-brain barrier
US4837028A (en) 1986-12-24 1989-06-06 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5004697A (en) 1987-08-17 1991-04-02 Univ. Of Ca Cationized antibodies for delivery through the blood-brain barrier
US5055303A (en) 1989-01-31 1991-10-08 Kv Pharmaceutical Company Solid controlled release bioadherent emulsions
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5270202A (en) 1989-11-03 1993-12-14 Syamal Raychaudhuri Anti-idiotypic antibodies to human melanoma-associated proteoglycan antigen
US5271961A (en) 1989-11-06 1993-12-21 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Method for producing protein microspheres
US5188837A (en) 1989-11-13 1993-02-23 Nova Pharmaceutical Corporation Lipsopheres for controlled delivery of substances
US5177194A (en) 1990-02-01 1993-01-05 Baxter International, Inc. Process for purifying immune serum globulins
US5268164A (en) 1990-04-23 1993-12-07 Alkermes, Inc. Increasing blood-brain barrier permeability with permeabilizer peptides
US5213796A (en) 1991-05-06 1993-05-25 Dana Farber Cancer Institute Assay for polyomavirus in humans and uses thereof
US5709860A (en) 1991-07-25 1998-01-20 Idec Pharmaceuticals Corporation Induction of cytotoxic T-lymphocyte responses
IL102639A (en) 1991-07-25 1997-03-18 Idec Pharma Corp Compositions for inducing cytotoxic t lymphocyte responses
US5254342A (en) 1991-09-30 1993-10-19 University Of Southern California Compositions and methods for enhanced transepithelial and transendothelial transport or active agents
US5643578A (en) 1992-03-23 1997-07-01 University Of Massachusetts Medical Center Immunization by inoculation of DNA transcription unit
WO1993017668A1 (en) 1992-03-12 1993-09-16 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Controlled release acth containing microspheres
US5534496A (en) 1992-07-07 1996-07-09 University Of Southern California Methods and compositions to enhance epithelial drug transport
CA2142007C (en) 1992-08-11 2007-10-30 Robert Glen Urban Immunomodulatory peptides
US5593972A (en) 1993-01-26 1997-01-14 The Wistar Institute Genetic immunization
US5514670A (en) 1993-08-13 1996-05-07 Pharmos Corporation Submicron emulsions for delivery of peptides
US6045802A (en) 1994-10-03 2000-04-04 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Enhanced immune response to an antigen by a composition of a recombinant virus expressing the antigen with a recombinant virus expressing an immunostimulatory molecule
DE19543553B4 (de) 1995-11-22 2009-04-09 Deutsches Primatenzentrum Gmbh VP-Antigene des JC-Virus
US6441144B1 (en) 1999-05-20 2002-08-27 Alpha Therapeutic Corporation Method for repairing dual virally inactivated immune globulin for intravenous administration
AU2002339224B2 (en) * 2001-09-14 2008-10-09 Kuros Us Llc Packaging of immunostimulatory substances into virus-like particles: method of preparation and use
US7468186B2 (en) * 2005-07-22 2008-12-23 City Of Hope Polyomavirus cellular epitopes and uses therefor
US20070049732A1 (en) 2005-09-01 2007-03-01 Zurlo Eugene J Ultra-high yield intravenous immune globulin preparation
WO2008091398A2 (en) 2006-08-31 2008-07-31 Baylor Research Institute Jc virus vaccine
WO2009105212A2 (en) 2008-02-20 2009-08-27 Metic Immunogenetic Consultant, Inc Detection of polyomavirus
SG173201A1 (en) 2009-02-05 2011-08-29 Biogen Idec Inc Methods for the detection of jc polyoma virus

Also Published As

Publication number Publication date
SI2734544T1 (sl) 2021-04-30
PT2734544T (pt) 2021-03-16
AU2012284122B2 (en) 2017-06-01
US9764022B2 (en) 2017-09-19
WO2013012866A8 (en) 2014-01-03
HRP20210419T1 (hr) 2021-04-30
ES2855110T3 (es) 2021-09-23
DK2734544T3 (da) 2021-03-15
EP2734544B1 (en) 2020-12-16
PL2734544T3 (pl) 2021-05-31
JP2014525911A (ja) 2014-10-02
CA2842180C (en) 2020-06-23
CA2842180A1 (en) 2013-01-24
WO2013012866A1 (en) 2013-01-24
LT2734544T (lt) 2021-04-26
CY1123949T1 (el) 2022-05-27
US20170368163A1 (en) 2017-12-28
EP2734544A1 (en) 2014-05-28
JP6030650B2 (ja) 2016-11-24
HUE053664T2 (hu) 2021-07-28
US20220395569A1 (en) 2022-12-15
AU2012284122A1 (en) 2014-01-23
US20140154284A1 (en) 2014-06-05
SMT202100100T1 (it) 2021-03-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20220395569A1 (en) Methods and compositions for inhibiting polyomavirus-associated pathology
CN110872351B (zh) 一种特异性结合gpc3蛋白的纳米抗体gn1及其制备方法和应用
ES2842425T3 (es) Métodos para la detección del poliomavirus JC
CN111542534B (zh) 新型支架式hiv-1疫苗免疫原
JP2000500973A (ja) Ｊｃ−ウイルスのｖｐ−抗原
EP3261670A1 (en) Anti-tau antibodies
JP2021514994A (ja) 癌を治療するための治療方法
JP2009515827A (ja) 治療薬
WO2021206638A1 (en) Vaccine and/or antibody for viral infection
EP2548567A1 (en) Polyoma virus JC peptides and proteins in vaccination and diagnostic applications
US20240228549A1 (en) Prefusion-stabilized lassa virus glycoprotein complex and its use
JP2009508517A (ja) Ｔ細胞受容体定常ドメインの免疫原性断片及びそれに由来するペプチド
US20140271694A1 (en) Antigen-specific methods of diagnosing and/or treating myocarditis or inflammatory cardiomyopathy
US9931393B2 (en) Immunogenic JC polyomavirus compositions and methods of use
US20150174239A1 (en) Membrane proximal region of hiv gp41 anchored to the lipid layer of a virus-like particle vaccine
CN114276453A (zh) 可结合cd4的纳米抗体4nb334及其应用
CN109758575B (zh) 充分多样的双亲性mhc ii结合多肽、免疫载体微球及其制备方法和应用
WO2021188818A1 (en) Vaccine constructs and compositions and methods of use thereof
Rahman et al. Loss of HIV candidate vaccine efficacy in male macaques by mucosal nanoparticle immunization rescued by V2-specific response
CN111704661B (zh) 日本血吸虫童虫高表达基因或其编码蛋白的应用
CN113754749A (zh) 一种微小隐孢子虫Gp40/15蛋白表位多肽及其腺病毒载体疫苗
JP7086000B2 (ja) 体液性親和性の加速に関する方法及び組成物
RU2850338C2 (ru) Композиции, содержащие адъюванты sbi, и способы их применения
CN107058353B (zh) Hiv嵌合抗原、制备方法及应用
Dakroub The impact of pre-graft serology on the risk of BKPyV infection reactivation post-renal transplantation