JP2000500973A - Ｊｃ−ウイルスのｖｐ−抗原 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ＪＣウイルスのＶＰ１タンパク質からなる新規のウイルス様粒子、その製造方法及び分析方法、診断方法、及び治療方法におけるその使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 ＪＣ−ウイルスのＶＰ−抗原 本発明は、新規のウイルス様粒子（Virus like particle）及び分析法、診断 法及び治療法におけるその使用に関する。 ＪＣ−ウイルス（ＪＣＶ）はヒトのポリオーマウイルスのグループに属する。 ＪＣＶは、ミエリン形成する乏突起膠細胞の溶解感染により及び星状膠細胞の不 完全感染により脳の亜急性脱随性疾患を引き起こすことがある。この感染は臨床 的には進行性多巣性白質脳病（ＰＭＬ）として表され、この感染は小脳内及び脳 幹での脱随病巣の発生を引き起こし、通常数ヶ月内で死亡する。 ＰＭＬの場合に、ＪＣＶに対する明らかな体液性又は細胞性の免疫応答が生じ ず、それにより疾病の診断が困難となっている。ＪＣＶが成人の人口のほぼ８０ ％において存在しているように思われるが、ＰＭＬは一般に免疫系の衰弱との関 係で発症するにすぎない。免疫抑制剤の使用が増加し、ＨＩＶ感染患者の数が増 加することにより、ここ数年来ＰＭＬ−疾患が著しく増加している。現在の調査 によると、ＰＭＬはＡＩＤＳ患者の約２〜５％に発症している。 ＰＭＬ疾患の検出のための公知の診断法は、主に、 例えばＣＴ（コンピュータトモグラフィー）及びＭＲＩ（磁気共鳴イメージング ）のような映像法、並びに生検もしくは死検による免疫細胞化学的な方法である 。ここ数年においてＰＣＲ−検出法が次第に重要となってきており、この方法の 場合、髄液（ＣＳＦ）からのウイルス−ＤＮＡ−増幅が信頼性のある特異的な結 果を提供する（Weber et al.,J. Infect. Dis.（1994），1138−1141及びMc Gui re et al.，Annal s of Neurology 37（1995），395−399）。 先行技術から公知の診断法の欠点は、この方法を実施するのに著しく費用がか かり、従って信頼性のある日常の診断にとっては不適当であることにある。この ことはＰＣＲ法にも通用し、この場合、汚染の危険性が高くなり、それにより結 果の変造が生じることがある。従って、ＰＭＬの信頼性のある診断を簡単な方法 で行うことができる方法及び試薬を提供することが望ましい。さらに、ＰＭＬ疾 患の場合に治療的な処置のために使用することができる手段が必要とされる。 従って、本発明の根底をなす課題は上記の目的を達成することができ、かつ先 行技術の欠点を少なくとも部分的に回避できるような方法並びに試薬を提供する ことであった。 意外にも、ＪＣウイルスのウイルスタンパク質１（ＶＰ１）はＪＣＶの免疫化 学的検出のための優れた手段であることが確認された。さらに、ＶＰ１が組換体 ＤＮＡ技術によりウイルス様粒子（ＶＬＰ）の形で高い収率で製造可能であるこ とが見出された。 従って、本発明の対象はウイルスタンパク質１（ＶＰ１）の複数の分子、ＪＣ −ウイルスの主構造タンパク質から構成されているウイルス様粒子（ＶＬＰ）で ある。このＶＬＰは特に免疫学的にアンチ−ＪＣＶ−抗血清と反応する構造を有 し、かつＪＣＶと会合した核酸を有していないことにより特に優れている。 意外にも、ＪＶＣの組換体ＶＰ１は精製の後に会合して、ウイルス様粒子（Ｖ ＬＰ）になることができることが見出された。この種のＶＬＰは約５０ｎｍの直 径を有する正二十面体構造を示す。個々のＶＰ１タンパク質と比べてＶＬＰの利 点は特に、天然ウイルスの特性又は／及び作用を正確にシュミレートし、かつ広 範囲な利用分野が開かれるという点にある。天然のウイルスと比較して、他の利 点は特に高められた作業安全性にあり、意外にもＶＬＰは精製された全ウイルス と比較してより高い免疫原性を示すことが確認された。 ＪＶＣのＶＰ１は、例えば野生種株からのＪＣＶの又はＪＣＶの突然変異株か らのキャプシド殻の主構造タンパク質である。特別な実施態様において、ＶＬＰ は組換により製造されたＶＰ１から構成されている。この場合、ＶＰ１の概念は 、野生種のＶＰ１とは突然変異、例えば置換、挿入又は／及び欠失により異なる タンパク質をも包含する。組換体ＶＰ１の製造のために、SEQ ID N0．１に示さ れた配列、遺伝的コードの同義性の範囲内でこの配列に相当する配列又はストリ ンジェントな条件下でこれとハイブリダイズする配列を包含する核酸を使用する のが有利であり、この場合、この核酸配列又はこの配列を含有する組換体べクタ ーを適当な宿主細胞中へ導入し、この宿主細胞を、核酸配列の発現が行われる条 件下でインキュベートし、このタンパク質を細胞又は細胞上澄液から単離する。 ストリンジェントでハイブリダイズする条件とは有利にSambrook et al.(1989) Molecular Cloninｇ A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory pressにより定義されており、６８℃で０．１×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ中で３０分の洗浄工程を包含する。 本発明によるＶＬＰはさらに１以上の付加的な異種タンパク質をキャプシド構 造中に有することができる。これは異種タンパク質がキャプシド構造中に固定さ れており、この場合有利にこのタンパク質の少なくとも１部が外部からアクセス 可能であると解釈される。異種タンパク質としてこのために原則的に、キャプシ ド構造中へ組み込むことが可能でありかつＶＬＰの自己集合に悪影響を及ぼさな い全てのタンパク質が適している。例えば、ＶＬＰに異種タンパク質を用いて、 特異的な抗体によって検出可能な抗原決定基を備え付 けることができる。他方では、異種タンパク質は細胞表面レセプターにとっての 結合相手であることができ、それによりＶＬＰと、相応するレセプターを有する 細胞の特異的クラス又はサブクラスとの相互作用が可能である。この種の相互作 用は、例えばレセプターとの結合の後で特定の信号の放出又はＶＬＰのインター ナリゼーションである。 タンパク質の起源は特定の生物に制限されず、特別な適用形態に依存して真核 性のタンパク質、特にヒトのタンパク質又は原核性の又はウイルス性のタンパク 質をＶＬＰ中へ組み込むこともできる。適当なタンパク質の例は、表面タンパク 質もしくは膜タンパク質及びヒト細胞表面レセプターについての例示であるＣＤ ４及びウイルス性の表面タンパク質について免疫欠乏ウイルスの殻タンパク質、 例えばＨＩＶ−ｇｐ １２０が挙げられる。異種タンパク質は場合により、特に 天然のタンパク質がＶＬＰ中に組み込むことができないか又は自己集合に悪影響 を与える場合に組換方法の使用下で変更される、例えば短縮されることができる と解釈される。 もう一つの特別な実施態様において、ＶＬＰはキャプシド構造の内部において １以上の作用物質を含有することができる。作用物質とは、本願明細書において 、自己集合の際に使用される媒体中で通常存在しない各分子であると解釈される 。このような作用物質は、 例えば核酸のような巨大分子、例えばＲＮＡ、ＤＮＡ又は人為的に変性された核 酸、並びにタンパク質及び他の生理学的に活性の物質を包含し、これらは天然、 合成又は組換の種類であってもよい。この種の生理学的に活性の物質の例は、例 えば脂質、リン脂質、ぺプチド、医薬、トキシン等である。 本発明のもう一つの対象は、ＶＰ１タンパク質をコードし、かつ （ａ） SEQ ID N0．１で示されたヌクレオチド配列、 （ｂ） 遺伝的コードの同義性の範囲内で（ａ）からなる配列に相当するヌクレ オチド配列又は／及び （ｃ） ストリンジェントな条件下で（ａ）又は／及び（ｂ）からなる配列の一 つとハイブリダイズするヌクレオチド配列を含めた核酸である。 本発明による核酸は、有利に組換体べクターに上で、特に発現信号の制御下で 局在化されている。適当なべクターの例は、Sambrook et al.，Supra，Kapitel １，２，３，４，１６，and １７に記載されている。本発明は本発明によるべク ターでトランスフォーメーションされた細胞にも関する。 もう一つの観点において、本発明はＶＬＰの製造方法にも関しており、この場 合、ＶＰ１を精製し、複数のＶＰ１分子が会合して１つのＶＬＰになるような形 態に転換される。会合のための適当な条件は、例えばスクロース及びメトリザミ ドを介する分別クッション遠心分離（differentielle Kissenzentrifugation） による細胞培養上澄液からのＶＰ１の精製の際に存在する。 ＶＬＰを組換法で製造するのが有利であり、この場合、ＶＰ１タンパク質をコ ードする核酸を細胞内へ導入し、このトランスフォーメーションされた細胞を媒 体中で、核酸の発現が行われる条件下でインキュベートし、発現生成物を細胞又 は媒体から獲得する。組換体ＶＰ１の単離は、使用した宿主／べクター系に依存 して、宿主細胞又は／及び細胞上澄液から直接行われる。 この組換方法の利点は、特に簡単な方法でＶＬＰを高純度でかつ大量に獲得で きる点にある。発現系として、実際にバキュロウイルスの使用が、昆虫細胞、例 えば昆虫細胞系Ｓｆ １５８との関連で有利である。 キャプシド構造中に異種タンパク質が組み込まれたＶＬＰもしくはキャプシド 構造の内部に作用物質を含有するＶＬＰの製造のために、上記の製造方法は、適 当な時点で、つまりＶＬＰの会合の前に異種タンパク質又は／及び作用物質を所 望の量もしくは所望の濃度で添加し、引き続き会合を行うように変更される。こ の方法で、キャプシド殻に異種タンパク質を組み込まれた又は／及び内部に、封 入された作用物質、例えば 核酸を含有するＶＬＰが製造できる。キャプシド殻内への異種ポリペプチドの組 込は、例えばそれぞれのポリペプチド、例えばＶＰ１ポリペプチド及び異種ポリ ペプチドを、適当な宿主細胞、例えば真核細胞中で組換体同時発現させることに より行われる。キャプシド殻の内部への作用物質の組込は、例えばキャプシド殻 の解離、及び引き続く作用物質の存在での再会合、又は作用物質の存在でのＶＬ Ｐの浸透圧ショックにより行われる。 もう一つの観点において、本発明は試料中のＪＣＶに対する特異的抗体の免疫 学的測定方法に関しており、この場合、抗体はＰＶ１から構成された１つのＶＬ Ｐ又はその１成分と結合することにより定性的並びに定量的に検出される。簡単 な取り扱い性の理由から、組換体ＶＰ１分子から構成されたＶＬＰの使用が有利 である。 この種の免疫学的測定方法のための試験形態は、当業者には多数のものが公知 であり、従って詳細に述べる必要がない。一般に、この種の方法はＶＬＰもしく はその成分を試料と適当な条件下で接触させて、ＪＣ−ウィルスに対する特異的 な抗体とＶＬＰもしくはその成分との結合を行わせ、形成された免疫複合体を他 の試料成分から分離し、抗体の存在を検出することにより行われる。このために 、例えば、吸着により、共有結合により又は適当な結合相手を介して固相と結合 されたＶＬＰを使用することができる。 液体試料と一緒にインキュベートした後にウイルスタンパク質と結合した検出 すべき抗体は、引き続き検出すべき抗体に対して特異的に結合するレセプター、 例えば検出抗体、タンパク質Ａ又はこの抗体と結合可能な抗原、例えばＶＬＰに より検出される。このレセプターの正確な種類は重要ではなく、例えば多クロー ン性又は単クローン性の検出−抗体を使用することができ、例えば多様な動物種 、例えばウサギ、マウス又はヤギからなるアンチ−ヒト−抗体、免疫グロブリン 又は免疫グロブリンクラスのＦｃ−部分に対して特異的に結合する抗体を使用す ることができる。 検出すべき抗体と結合可能なレセプターは、さらに、検出を行う手段、例えば 標識を有していてもよく、この標識は例えば特異的な結合ぺア、例えばビオチン ／アビジンを用いて直接的又は間接的にレセプターと会合されている。この種の 標識は当業者には同様に公知であり、放射能、酵素、発光標識又は蛍光標識を包 含する。特に有利な試験形態はＥＬＩＳＡであり、この場合、レセプターは酵素 標識を組み込まれる。 上記の免疫学的測定方法は、試料として髄液（ＣＳＦ）を使用した場合、進行 性多巣性白質脳病（ＰＭＬ）の診断のために使用することができる。有利な実施 態様において、ＰＭＬの診断のために平行測定を実施され、この場合、試料とし て同じ個体からのＣＳＦ並 びに血清が使用され、その際、この両方の試料は特に有利に平行して取り出され る。意味深い結果を得るために、測定された値を全免疫グロブリン濃度に関して 校正するのが特に有利である。適当な標準サイズはいわゆる抗体特異インデック ス（ＡＳＩ）であり、このインデックスはＣＳＦ及び血清中のＪＣＶに対する特 異的抗体の力価の割合をＣＳＦ及び血清中のＩｇ−全濃度の割合で割った値とし て定義される。≧１．５のＡＳＩ−値がＰＭＬの陽性の診断について信頼性のあ る結果を生じることが明らかになった。 従って、本発明のもう一つの対象は、ＪＣＶに対する特異的抗体を測定するた めのテストキットであり、このテストキットは空間的に別々に配置してＪＣＶの ＶＬＰ又はその成分、抗体を検出するための薬剤（手段）及び場合により通常の 緩衝剤及び補助物質を包含する。有利にこのテストキットはヒト抗体を検出する ために適している。抗体を検出するための薬剤は、特に検出すべき抗体と特異的 に結合可能なレセプターであり、このレセプターは検出可能な標識を直接的又は 間接的に備えている。このテストキットは同様に必要な支持体もしくは検出物質 を含むことができる。 本発明によるＶＬＰは治療的にも、例えばＰＭＬの治療のためにも使用するこ とができる。本発明によるＶＬＰは、ＪＶＣによる感染に対して使用することが できる治療的又は／及び予防的ワクチンの製造のため に適している。これに関して、特にキャプシド構造の異種タンパク質を組み込ま れているのでもなく、内部に作用物質が封入されているのでもないＶＬＰを使用 するようにする。それにより、一方で乏突起膠細胞の表面上のレセプターは飽和 され、さらなる感染を少なくとも延長させ、他方でＪＣＶに対する体液性の免疫 応答が刺激される。同様に、抗原特異的Ｔ細胞の増殖により検出することができ る細胞性の免疫応答も、組換体ＶＰ１を投与することにより刺激することができ る。しかしながら、また別に、有利にキャプシド構造中に相応する目標細胞、つ まり乏突起膠細胞の表面レセプターに対する結合相手を組込かつ内部にウイルス の増殖又は蔓延を阻害する少なくとも１種の作用物質を封入された、変性された ＶＬＰを使用することもできる。この場合、作用物質は有利にウイルス抑制剤、 例えばシトシンアラビノシドである。 もう一つの実施態様において、ＶＬＰを輸送媒介物として使用することができ る。この種のＶＬＰはその内部に適当な作用物質を封入して含有しており、かつ 有利に異種の、キャプシド構造中へ組み込まれたタンパク質を含有しており、こ のタンパク質は意図した目標細胞の特異的表面レセプターと結合可能である。こ のように、意図された目標細胞との相互作用の特異性を保障することができ、適 用に応じて多数の細胞種に適合させることができる。この種の使用の例は、多発 性硬化症の場合にＴＮＦ−αアンチセンス−核酸を乏突起膠細胞に目標に指向的 に輸送することである、それというのもこの疾患の場合ＴＮＦ−α発現がいっぺ んに脱髄現象を引き起こすのが公知であるためである。他の例は、遺伝子治療に おける核酸のためのトランスポーターシステムとしてのＶＬＰの使用である。 本発明のもう一つの対象は、従って、ＶＬＰ、並びに場合により常用の緩衝剤 、助剤、添加剤又は／及び希釈剤を含有する調剤学的組成物である。この場合、 ＶＬＰは未変性のＶＬＰであるか、又はキャプシド構造中に異種タンパク質が組 み込まれた又は／及び内部に作用物質が封入されたＶＬＰであることができる。 本発明を次の実施例並びに添付した図面而及び配列表によりさらに詳説する。 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１はＪＣＶから単離された、ＶＰ１をコードするＤＮＡ配 列の核酸配列を表し； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２は対応するアミノ酸配列を表し； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３はＶＰ１をコードする配列を単離するために使用された 増幅プライマーを表し； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４はもう一つの増幅プライマーを表し及び 図１は組換体ＶＰ１の製造のための作業工程の略図を示し； 図２はＶＰ１−ＶＬＰ中の異種ＤＮＡのパッケージン グを示し； 図３はアンチ−ＶＰ１−ＶＬＰ−免疫血清の免疫活性を示し及び 図４はアンチ−ＶＰ１−ＶＬＰ−免疫血清によるＪＣＶの中和を示す。実施例 例１ ＪＣＶ−ＶＰ１の組換方法 ＪＣＶ−ＤＮＡ（菌株Ｍａｄ−４）をＳＶＧ−細胞から単離し、ＶＰ１−遺伝 子のコードする配列をＰＣＲを用いて増幅した。ＰＣＲのために次に記載するプ ライマーを使用し、このプライマーは引き続くクローニングのためにＢａｍＨＩ もしくはＨｉｎｄＩＩＩ制限切断部位を備えている。 プライマ−１（SEQ ID No．3)： ５′-GTA CGG GAC TGC AGC ACC TGC TCT TGA AG-３′ プライマ−２（SEQ ID No．4)： ５′-TAC AAT AAA AGC TTT TGA TTA CAG CAT TT-３′ ＰＣＲ反応において、５０μｌの反応容量中でそれぞれプライマー１００ｐｍ ｏｌを使用した。このＤＮＡは５０μｌの混合物中で、９５℃で４５ｓの変性、 ５５℃で４５ｓのアニーリング及び７０℃で４５ｓの伸張からなる２０回の増幅 サイクルにより予備増幅された。最初のサイクルで変性は５分間に延長した。引 き続く各伸張はｌｓだけ延長し、最後のサイクルは５分に延長した。この反応か ら１０μｌをプライマー及 び２．０Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（pharmacia，Freiburg，Deutschland ）と混合し、ＰＣＲを上記の条件下で合計で２５サイクル行った。 このＰＣＲ生成物を、アガロースゲル電気泳動により精製し、ＢａｍＨＩ及び ＨｉｎｄＩＩＩで分割し、ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで切断されたｐ−Ｂｌｕ ｅＢａｃ−ＩＩＩ−べクター（Invitrogen，Niederlande）のクローニング箇所 内へ連結し、その際、ＶＰ１−遺伝子を有するべクターのｐＢｌｕｅＢａｃ−Ｖ Ｐが得られた。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞をｐＢｌｕｅＢａｃ−ＶＰでトランスフォーメ ーションし、ポジティブなクローンを同定し、組換体プラスミドを単離し、野生 種のバキュロウイルスＤＮＡと一緒にＳｆ １５８昆虫細胞中ヘトランスフェク ションした。ＳＦ １５８細胞上の上澄液を２回パッサージした後に組換体バキ ュロウイルスを精製した（図１参照）。 組換体ＶＰ１はＳＦ １５８宿主細胞中で発現し、１ｍｌあたりタンパク質０ ．９ｍｇの濃度で細胞上澄液中に分泌される。発現の検出は、ウサギ−アンチ− ＳＶ４０−高度免疫血清を使用して細胞培養上澄液のウェスタンブロットにより 行った。 細胞培養上澄液から、ＶＰ１を、スクロース及びメトリザミドを介する分別ク ッション遠心分離を用いて均一になるまで精製することができた。 電子顕微鏡による調査により、ＶＰ１がＶＬＰと会 合し、これが約５０ｎｍの直径及び正二十面体構造を有し、かつＣｓＣｌ勾配に おいて約１．３１ｇ／ｍｌの密度を有することが示された。トリプシン消化後の 質量分析器を用いたＶＬＰ中に含有するＶＰ１タンパク質生化学的調査は、期待 されたフラグメント材料を示した。組換体ＶＬＰはウサギの免疫により高いイム ノゲンであることが証明された。例２ 血清及びＣＳＦ中のＪＣウイルスに対する特異的抗体の免疫学的測定 組換体ＶＰ１をウサギからのＳＶ４０に対する高度免疫血清に対して及びＰＭ Ｌ患者の抗血清に対して滴定した。最適抗原濃度は分別クッション遠心分離によ り得られた生成物のタンパク質２００ｎｇ（これはくぼみ当たりＶＰ１約７０ｎ ｇに相当）を用いて算出された。ＣＳＦ全タンパク質はトリクロロ酢酸析出を用 いて測定された。血清及びＣＳＦ中の免疫グロブリンＧ及びアルブミンは免疫化 学的にネフェロメトリーにより測定した。鞘内の抗体合成はライバー及びランゲ （Reiber und Lange，Clin．Chem．37（1991），1153 - 1160）及びウェバーほ か（Weber et al.,J. Immunol.Methods 136（1991），133 - 137）の方法に 従って分析された。ＶＰ１−特異的抗体の鞘内合成は、少なくとも１．５のＣＳ Ｆ及び血清（ＡＳＩ）中の抗体力価の割合として定義される。 測定の実施のために、９６個のくぼみを有する微量滴定プレート（Grainer Fr ickenhaus, Deutsch1and）のくぼみ１つあたりｐＢｌｕｅＢａｃ−ＩＩＩ−ＶＰ １で感染したＳｆ１５８−細胞の細胞培養上澄液２００ｎｇを４℃で１２〜１４ 時間載せた。非特異的結合がくぼみ１つあたり５％Ｂｌｏｔｔｏ２００μｌと共 に１時間の間３７℃でインキュベーションすることにより飽和させた。血清を、 Ｌｏｇ２−ステップにおいて１：５００から出発してＢｌｏｔｔｏ中で希釈し、 その際、使用した最大希釈は１：８００００であった。ＣＳＦを、Ｌｏｇ２−ス テップにおいて１：５から出発してＢｌｏｔｔｏ中で希釈し、その際、使用した 最大希釈は１：４００００であった。３７℃で３時間の間の１次抗体の結合の後 、このプレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を有するＰＢＳ１５０ｍＭで７回洗 浄した。結合した抗体を、ウサギ（Jackson Laboratories Dianoｗa, Hamburg, Deutsch1and）からのペルオキシダーゼー接合アンチ−ヒト−ＩｇＧ−抗血清と 共に３７℃で２時間インキュベーションすることにより検出した。ＰＢＳで７回 の洗浄の後に、ペルオキシダーゼー接合抗体を、ｏ−フェニレンジアンを使用し て可視化した。１５分後に、この反応を１．３Ｎ硫酸で停止し、Titertec MC340 MKII-ELISA-読み取り機中で４９５／６２０ｎｍで光学密度（ＯＤ）を測定した 。ＣＳＦ及び血清中の抗体力価はＥ 選択された場合に、鞘内の免疫応答のウェスタンブロット分析を実施した。１ ２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ−ゲル中で１トラックあたりＶＰ１ １μｇを電気泳動に より分離した後、抗原を電気泳動的にＨｉＢｏｎｄ−ＰＶＤＦ−膜（Amersham B uch1er KG, Deutschland）上に移した。非特異的抗体結合を、５％Ｂｌｏｔｔｏ を用いて３７℃で１時間飽和させた。血清抗体又はＣＳＦ抗体を１０ｍｇ／ｌの ＩｇＧ濃度で各トラックに添加し、３７℃で３時間インキュベートした。ＰＢＳ 中で３回洗浄した後、この膜をウサギからのペルオキシダーゼ−接合アンチ−ヒ ト−ＩｇＧ−抗血清（Jackson Laboratories Dianova,Hamburg）と共にインキュ ベーションした。結合した検出抗体をＥＣＬ−キット（Amersham Buch1er KG, D eutschland）を使用して、製造元の記載に従ってハイパーフィルム−ＥＣＬ上に 可視化した。例３ ＰＭＬの診断的測定 １８９人の患者の平行ＣＳＦ／血清試料を検査のために採った。ＰＭＬ患者の ２８／３４（８２％）においてＡＳＩ≧１．５でアンチ−ＶＰ１抗体の鞘内合成 が確認され、ＡＳＩ≧１．５は５／１５５の対照患者において見られただけであ った。ＶＰ１に対する血清抗体は全ＰＭＬ患者において、並びに多発性硬化症患 者の２８／３７（７６％）において、対照グループ４３／５０（８６％）、血液 髄液交差機能障害の患者の２９／３３（８８％）及びＨＩＶ陽性患者の３１／３ ５（８９％）において確認された。 個々の場合に、ウェスタンブロット分析によりアンチ−ＶＰ１−抗体の鞘内合 成を検査した。ＶＰ１ ＡＳＩ＜１．５を有するＰＭＬ患者の場合、ＣＳＦ及び 血清においてほぼ同じ強度が得られるが、１２〜１０７の範囲内のＡＳＩを有す る患者の４つの血清は著しく弱い血清バンドを示し、かつ明らかに強いＣＳＦバ ンドを示した。 抗体特異インデックス（ＡＳＩ）の統計学的評価を５つの異なる患者グループ において実施した。標準グループにおいて平均ＶＰ１ ＡＳＩは０．９２（±０ ．１６，範囲０．６５〜１．２６）であり、多発性硬化症のグループにおいて０ ．９１（±０．３８，範囲０．３４〜２．４９）、血液髄液交差機能障害のグル ープにおいて０．９２（±０．２２，範囲０．５２〜１．３６）、ＨＩＶ陽性グ ループにおいて４．３５（±１２．７、範囲０．３５〜６７．２）及びＰＭＬグ ループにおいて１２．５９（±２４．４２，範囲０．３８〜１０７）であった。 Kruska1-wallisテストの使用の際に、５つのグループ（Ｐ＜０．０００１）の間 の明らかな差異が生じた。Mann-whitneyテストの使用の際に、ＰＭＬグループと 対照グループの間で、 血液髄液交差機能障害のグループと多発性硬化症のグループ（Ｐ＜０．０００１ ）との間で、並びにＰＭＬグループとＨＩＶ陽性グループ（Ｐ＜０．００１）と の間で明らかな差異が生じた。他の６つのグループペアの間の差異は明らかでは なかった。 上記の結果はＪＣＶ−ＶＰ１に対して結合する抗体の鞘内の合成の調査がＰＭ Ｌの診断のための適当なテストであることを示している。実施された調査におい て、≧１． ５の統計学的に明らかなＶＰ１−ＡＳＩの使用下で８２％の感度及 び９６％の特異性が確認された。従って、このＥＬＩＳＡアッセイがネスト状プ ライマーを有するＰＣＲアッセイ（９３％）よりも僅かな感度を示しているが、 ＥＬＩＳＡアッセイは、費用が安価で、より簡単に実施でき、汚染により誤った 陽性の結果になりにくい合目的な補正がある試験方法である。重要な適用は、多 数の試料を用いるスクリーニング及び検査、明らかに陽性の試料の迅速な決定、 並びに明らかに陰性の試料の選択を包含する、それというのも、今まで存在する 結果により血清中の陰性の抗体テストはＰＭＬの診断を排除するためである。例４ 組換体ＶＰ１に対する細胞性の免疫応答の検出 健康な被験者及びＰＭＬ患者において、組換体ＪＣＶ−ＶＰ１に対する細胞性 免疫応答を検出することができた。抗原−特異的増殖は投与量に依存した。抗原 １〜１０μｇの最終濃度の場合、抗原−特異的なＴ細胞の増殖が検出され、この 増殖は６日目に最大値を達成した。この試験は健康な被験者及びＰＭＬ患者が、 ＪＣＶに対して、特にＶＰ１−タンパク質に対して体液性だけでなく細胞性の免 疫応答を有することを示唆した。例５ ＪＣＶの主構造タンパク質ＶＰ１のＶＬＰ中の外来タンパク質及び外因性ＤＮＡ のパッケージング ５．１． ウイルスの殻糖タンパク質のパッケージング 外来タンパク質のパッケージングのためにモデル試験においてＶＰ１及びサル の免疫不全ウイルスＳＩＶｍａｃ３２Ｈの殻糖タンパク質ｇｐ１６０を同時発現 した。両方の場合に発現のためのベースのべクターとして例１に記載されたベク ターｐＢｌｕｅＢａｃを使用した。 さらに、Ｓｆ１５８細胞を、ＶＰ１についての組換体バキュロウイルスを用い て５の多重度（細胞あたり感染単位数）で、及び０．２、０．５及び２のｇｐｌ ６０対ＶＰ１多重度比で感染させた。同時感染の５日後に、細胞及び細胞培養上 澄液をウェスタンブロット−分析によりｇｐ１６０及びＶＰ１の存在に関して調 査した。この場合、ｇｐ１６０及びＶＰ１に対して結合する抗体混合物を有する ｇｐ１６０及びＶＰ１の 効率的な同時発現が検出された。ｇｐ１６０及びＶＰ１は同様に別々に検出可能 である。この場合、２の多重度比が最良の同時発現結果を生じる。ｇｐ１６０と ＶＰ１−ＶＬＰとの会合は、４０％のスクロースクッションによる細胞培養上澄 液のぺレット化により実証することができた。生じたぺレット中でｇｐ１６０は 、同様にｇｐｑ６０及びＶＰ１と別々に抗体混合物を用いて検出可能である。 ５．２． 外因性ＤＮＡのパッケージング ＶＰ１−ＶＬＰ中に外因性ＤＮＡをパッケージングできるかどうか、遺伝子治 療のための効率的なトランスファーシステムの開発の範囲内で試験した。このた め３つのバッチを追跡した。精製したＶＰ１−ＶＬＰを、ＴＢＳ／Ｃａ（トリス −ＨＣｌ １０ｍＭ ｐＨ：７．５、ＮａＣｌ １５０ｍＭ、ＣａＣｌ₂ ０． ０１ｍＭ）、Ｈ₂Ｏbidest又は解離緩衝液（ＥＧＴＡ１０ｍＭ及びＤＴＴ５ｍＭ を有するＴＢＳ ｐＨ：８．５）中に懸濁させた。外因性ＤＮＡをｐＵＣ１８誘 導体（これはＨＩＶ−１ｈａｎ２の殻糖タンパク質に対するｅｎｖ−遺伝子の１ ．２ｋＢの長さのＶ１／Ｖ２領域を有し、この配列はSauermann et al.(AIDS Re search and Human Retroviruses 6 (1990)，813-823)に記載されている（全べク ターは約４．１ｋＢ））の形で、１：１０及び１：２０のＤＮＡ対ＶＰ１−ＶＬ Ｐの重量比で添加した。インキュベーショ ンを３７℃で６０分間行った。ＴＢＳ／Ｃａ中で実施されたバッチを、次いで浸 透圧ショックにかけ、さらに３７℃で３０分間インキュベーションした。全試料 を一晩中再会合緩衝液（ＣａＣｌ₂ １ｍＭを有するＴＢＳ ｐＨ：７．５）に 対して透析した。引き続き全ての試料を集中的にＤＮａｓｅ Ｉを用いて消化し 、ＴＢＳ／Ｃａで希釈し、一晩中４０％のスクロースクッションにより超遠心分 離した。この粒子を再懸濁させた後にＤＮＡを抽出し、Ｖ１／Ｖ２−領域（約１ ．８ｋＢ）を特異的プライマーでＰＣＲを用いて増幅し、増幅物をアガロースゲ ル中で分離した。その際、全ての３つの方法を用いて（トレース１〜６）外因性 ＤＮＡはＶＰ１−ＶＬＰ中にパッケージングできたことが判明した（図２）。外 来性ＤＮＡはパッケージングによりＤＮａｓｅ Ｉによる消化に対して効率的に 保護されていた。最良のパッケージング効率はｌ：２０のＤＮＡ対ＶＰ１−ＶＬ Ｐの割合の場合で、解離及び再会合の進行の後に達成される（トレース６）。陽 性対照から出発した評価により、精製されたＶＰ１−ＶＬＰ８０ｇ中で外来性Ｄ ＮＡ約３〜４ｇがパッケージングされた。例６ 主構造タンパク質ＶＰ１のＶＬＰをベースとするヒトポリオーマウイルスＪＣ Ｖに対する治療的ワクチンの開発 ヒトのポリオウイルスＪＣＶに対する治療的ワクチンの製造のために、主構造 タンパク質ＶＰ１を組換体バキュロウイルスを用いて昆虫細胞中で発現させた（ 例１）。発現後にＶＰ１は典型的なウイルス様粒子（ＶＬＰ）を形成した。この ＶＬＰは約５０〜６０ｎｍの直径を有する「空の」又は「充填された」粒子から なる混合物を表す。ＶＰ１−ＶＬＰは均質化するまで精製され、ＣｓＣｌ勾配中 での１．３２ｇ／ｍｌ（空の粒子）及び１．３４ｇ／ｍｌ（充填された粒子）の 浮遊密度（Schwimmdichte）を示した。 ＶＰ１−ＶＬＰの免疫原性 免疫原性の調査のために、精製されたＶＰ１−ＶＬＰ １００μｇを鍵穴螺旋 のへモシアニン３００μｇと混合し、完全フロイントアジュバント中に懸濁し、 ウサギに筋肉内で免疫接種した。補充免疫接種を不完全フロイントアジュバント を用いて４週間後に行った。図３Ａ中では、ウサギの最後の免疫接種後の多様な 検査データのＥＬＩＳＡでのアンチ−ＶＰ１抗血清の力価の分析を示した。調査 のために、精製したＶＰ１−ＶＬＰ５０ｎｇをＥＬＩＳＡプレート（Greiner, −ＶＰ１抗血清（＋：７週；＊：１３週；□：１５週；×：２０週；◇：２５週 ）を記載された希釈で滴定した。最終力価は、反応性が免疫前血清（−）の反応 性と一致する希釈として定義した。図３Ａに示した ように、免疫血清は最後の免疫接種の６週間後に約１０⁵の最終力価に達した。 アンチ−ＶＰ１抗血清の特異性はウェスタンブロット（ＷＢ）で調査した。こ れについてトレースあたり精製された抗原約２０ｎｇをＳＤＳポリアクリルアミ ドゲル電気泳動を用いて分離し、ニトロセルロース膜上に移した。図３Ｂ中では 、抗原としてＶＰＳ１−ＶＬＰを使用し、異なる検査データ（トレース２：７週 ；トレース３：１３週；トレース４：１５週；トレース５：２０週；トレース６ ：２５週）のアンチ−ＶＰ１抗血清の反応性を、免疫前血清（トレース１）の反 応性及びアンチ−ＳＶ４０高度免疫血清（トレース７）と比較した。図３Ｃ中で も同様に精製されたＶＰ１−ＶＬＰを使用し、図３Ｂでは精製された天然のＪＣ Ｖ粒子が及び図３Ｅでは精製された天然のＳＶ４０粒子が抗原として見られる。 図Ｃ〜ＥにおいてそれぞれトレースＰが免疫前血清を表し、それぞれトレース１ がアンチ−ＳＶ４０免疫血清、それぞれトレース２がアンチ−ＶＰＳ抗血清を表 す。 抗血清の特異性は期待値に相当した。ウェスタンブロット分析に示したように 、単にＶＰ１−ＶＬＰ特異的タンパク質が認識され、最後の免疫接種の後で出血 時点に依存して反応性の明らかな上昇を観察することができた（図３Ｂ、トレー ス２〜６）。この反応性はアンチ−ＳＶ４０高度免疫血清（トレース７）と比較 可能である。アンチ−ＶＰ１−ＶＬＰ免疫血清の免疫反応性は、同様に多様な抗 原に対して試験した。高度免疫血清は組換体ＶＰ１（図３Ｃ、トレース１）に対 してさらにＳＶ４０のＶＰ１（図３Ｄ、トレース１）及び天然ＪＣＶのＶＰ１（ 図３Ｅ、トレース１）が認識された。他方で、この反応性はアンチ−ＳＶ４０免 疫血清の反応性と比較可能である（図３Ｃ〜Ｅ、それぞれトレース２）。 ＶＰ１−ＶＬＰのＳＶＧ細胞との結合及び結合阻害 この試験のために、ＶＰ１−ＶＬＰは¹²⁵Ｉを用いて放射性標識した。まず、^{1 25} Ｉ−ＶＰ１−ＶＬＰ及びＳＶＧの比を測定し、これはヒト胎児グリア細胞に複 製開始点に欠陥のあるＳＶ４０突然変異体をトランスフェクションすることによ り得られた（Major etal．， Proc． Natl． Acad． Sci USA 82 (1985)， 1257 -1261）。¹²⁵Ｉ−ＶＰ１−ＶＬＰ２×１０⁶ｃｐｍ及び１０⁵ＳＶＧ細胞を用いて 飽和結合を達成した。この試験条件下で、アンチ−ＶＰ１−ＶＬＰ免疫血清の結 合阻害を試験した。１：５及び１：１０の血清希釈で、¹²⁵Ｉ−ＶＰ１−ＶＬＰ 結合は９５％まで抑制され、１：２０の血清希釈では、なお約７５％の結合阻害 が観察された。１：４０の血清希釈の場合にはなお２０％の結合阻害が測定でき たが、１：８０の血清希釈の場合には結合阻害は達成されなかった。 ＪＣＶの中和 ＶＰ１−ＶＬＰ高度免疫血清の中和能力の検査のために、新規の試験を開発し た。この試験はＳＶＧ細胞のＪＣＶによる感染後のＶＰ１の細胞内の検出に基づ く。図４から明らかなように、１：１６０のＪＣＶ感染系統の希釈の場合でかつ １：２４の血清希釈の場合にＪＣＶの完全な中和を達成することができた、それ というのもＶＰ１は検出されなかったためである。１：４０の血清希釈の場合に ＶＰ１が確認されたが、減少した形であり、これは部分的ＪＣＶ中和を示唆する 。これは１：８０の血清希釈にも当てはまるが、１：１６０の血清希釈の場合で は対照との比較において中和作用は達成されなかった。同様の結果が１：８０の ＪＣＶ感染系統の希釈の場合でも達成された。 この結果は、ＶＰ１−ＶＬＰが、効果能力を有するワクチンにより期待するこ とができる免疫応答を誘導することを示す。中和する及び結合阻害する抗体が誘 導される。さらに、ＶＰ１−ＶＬＰはＪＣＶ陽性であるが健康な個体の末梢血リ ンパ球中での増殖性Ｔ細胞活性を誘導することができる（例２〜４）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 48/00 Ｃ０７Ｋ 14/025 Ｃ０７Ｋ 14/025 14/16 14/16 Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/53 33/569 Ｌ 33/569 Ａ６１Ｋ 37/02 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:92） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ゲルハルト フンスマン ドイツ連邦共和国 ゲッチンゲン ケルナ ーヴェーク ４ ドイチェス プリマーテ ンツェントルム ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング内 (72)発明者 トーマス ヴェーバー ドイツ連邦共和国 ハンブルク アルフレ ートシュトラーセ ９ マリーエンクラン ケンハウス内

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． ＪＣ−ウイルスのウイルスタンパク質（ＶＰ１）の複数の分子から構成さ れているウイルス様粒子。 ２． 組換体ＶＰ１から構成されている、請求項１記載の粒子。 ３． ＶＰ１が、 （ａ） SEQ ID N0.１で示されたヌクレオチド配列、 （ｂ） 遺伝的コードの同義性の範囲内で（ａ）からなる配列に一致するヌク レオチド配列又は／及び （ｃ） ストリンジェントな条件下で（ａ）又は／及び（ｂ）からなる配列の 一つとハイブリダイズするヌクレオチド配列を含める核酸によりコードされる、 請求項１又は２記載の粒子。 ４． さらに少なくとも１つの付加的異種タンパク質をキャプシド構造中に組み 込んで有している、請求項１から３までのいずれか１項記載の粒子。 ５． 前記付加的タンパク質が細胞表面レセプター又は細胞表面レセプターの結 合相手である、請求項４記載の粒子。 ６． 前記付加的タンパク質がウイルス表面タンパク質である、請求項５記載の 粒子。 ７． 前記付加的タンパク質がＨＩＶのｇｐ１２０である、請求項５又は６記載 の粒子。 ８． キャプシド構造の内部に少なくとも１種の作用物質を含有する、請求項１ から７までのいずれか１項記載の粒子。 ９． 作用物質が、核酸、タンパク質及び生理学的活性物質から選択されている 、請求項８記載の粒子。 １０． 作用物質が核酸である、請求項９記載の粒子。 １１． ＶＰ１を精製し、複数のＶＰ１分子が集合してＶＬＰになる形に移行さ せることを特徴とする、請求項１から１０までのいずれか１項記載のＶＬＰの製 造方法。 １２． ＶＰ１タンパク質をコードする核酸を細胞中に導入し、トランスフォー メーションした細胞を媒体中で、核酸の発現が行われる条件下でインキュべート し、発現生成物を細胞又は媒体から獲得する、請求項１１記載の方法。 １３． ＶＰ１タンパク質をコードする核酸が、 （ａ） SEQ ID NO.１で示されたヌクレオチド配列、 （ｂ） 遺伝的コードの同義性の範囲内で（ａ）からなる配列に一致するヌク レオチド配列又は／及び （ｃ） ストリンジェントな条件下で（ａ）又は／及び（ｂ）からなる配列の 一つとハイブリダイズす るヌクレオチド配列である、請求項１２記載の方法。 １４． ＶＰ１タンパク質をコードする核酸が少なくとも１つのコピーの形で、 特に発現信号の制御下で、組換体べクター上に局在している、請求項１２又は１ ３記載の方法。 １５． 昆虫細胞を使用する、請求項１２から１４までのいずれか１項記載の方 法。 １６． 集合を少なくとも１つの他のタンパク質の存在で実施し、その際、この タンパク質がキャプシド殻中へ組み込まれる、請求項１１から１５までのいずれ か１項記載の方法。 １７． 集合を少なくとも１つの物質の存在で実施し、その際、この物質がキャ プシド殻の内部へ封入される、請求項１１から１６までのいずれか１項記載の方 法。 １８． 集合を核酸の存在で実施する請求項１７記載の方法。 １９． 抗体を、請求項１から９までのいずれか１項記載のＶＬＰ又はその成分 と結合させることにより定性的又は／及び定量的に検出することを特徴とする、 試料中でＪＣＶに対する特異的抗体を免疫学的に測定する方法。 ２０． 組換体ＶＰ１分子から構成されたＶＬＰを使用する、請求項１９記載の 方法。 ２１． ＶＬＰ又はその成分を試料と適当な条件下で接触させて、ＪＣウイルス に対する特異的抗体とＶＬＰもしくはその成分とを結合させ、形成された免疫複 合体を他の試料成分から分離し、抗体の存在を検出する、請求項１９又は２０記 載の方法。 ２２． 試料として、同じ患者からの髄液及び血清を使用することを特徴とする 、進行性多巣性白質脳病（ＰＭＬ）の診断のための請求項１９から２１までのい ずれか１項記載の方法。 ２３． 空間的に別々な配置で、請求項１から１０までのいずれか１項記載のＶ ＬＰ又はその成分、抗体の検出のための薬剤、及び場合により常用の緩衝液及び 補助物質を有するＪＣ−ウイルスに対する特異的抗体の測定のための試験キット 。 ２４． 抗体を検出するための薬剤が、検出すべき抗体と特異的に結合可能なレ セプター及び適当な検出剤を有する、請求項２３の試験キット。 ２５． 患者に、請求項１から１０までのいずれか１項記載のＶＰＬを投与する ことを特徴とする、治療方法。 ２６． ＰＭＬの治療のための、請求項１から１０までのＶＬＰの使用。 ２７． ＪＶＣ感染に対する治療用又は／及び予防用のワクチンを製造するため の、請求項１から１０までのＶＬＰの使用。 ２８． 輸送媒介物としての、請求項８又は９記載のＶＬＰの使用。 ２９． 遺伝子治療のためのトランスポーターシステムとしての、請求項２８記 載の使用。 ３０． キャプシド殻中に封入された物質がアンチセンス−核酸である、請求項 ２８記載の使用。 ３１． アンチセンス−核酸がＴＮＦ−α−アンチセンス−核酸である、請求項 ３０記載の使用。 ３２． 請求項１から１０までのいずれか１項記載のＶＬＰ並びに場合により常 用の緩衝剤、助剤、添加剤又は／及び希釈剤を含有する、調剤学的組成物。