RS61604B1 - Stabilna tečna formulacija gonadotropina - Google Patents

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Predmetni pronalazak se generalno odnosi na oblast stabilizacije formulacija gonadotropina, naročito tečnih formulacija gonadotropina. Stabilizacija se postiže određenom kombinacijom ekscipijenasa, po mogućnosti arginina i metionina. U poželjnom otelotvorenju, formulacija ne sadrži pufer.

POZADINA

[0002] Gonadotropini su porodica hormona koji su u osnovi i uglavnom uključeni u ciklus plodnosti kod žena i muškaraca. Gonadotropini se mogu dobiti iz urina, kako u istraživačke svrhe, tako i u svrhu lečenja; međutim, nekoliko gonadotropina poput, npr., hCG, LH i FSH, takođe se može proizvesti rekombinantno.

[0003] Gonadotropini se naročito mogu koristiti u lečenju neplodnosti.

[0004] Sva četiri glavna gonadotropina pripadaju istoj porodici glikoproteina. To su folikulostimulišući hormon (FSH), tireostimulišući hormon (TSH), luteinizujući hormon (LH) i (humani) horionski gonadotropin (hCG). Svi ovi gonadotropini su heterodimerni, i sastoje se od alfa i beta podjedinice; alfa podjedinica je zajednička svima, tj. ista za sva četiri prethodno navedena gonadotropina, dok se beta podjedinica razlikuje. Delovanje FSH je posredovano posebnim FSH receptorom. Beta lanci LH i hCG dele 82% homologije sekvence proteina i vrše svoje delovanje kroz isti LH receptor.

[0005] Anteriorna hipofiza prirodno luči FSH, koji funkcioniše kao potpora folikularnom razvoju i ovulaciji. FSH sadrži alfa podjedinicu od 92 aminokiseline, takođe zajedničku sa ostalim glikoproteinskim hormonima, npr. LH i hCG, i beta podjedinicu od 111 aminokiselina, koja je jedinstvena za FSH i daje hormonu biološku specifičnost (Pierce i Parsons, 1981, Glycoprotein hormones: structure and function, Ann Rev Biochem., 50: 465-495). Zrela beta podjedinica hCG sastoji se od 145 aminokiselina. Svaka podjedinica u FSH i hCG je posttranslaciono modifikovana dodavanjem složenih ostataka ugljenih hidrata. Kod FSH, obe podjedinice nose dva mesta za vezivanje N-vezanog glikana, alfa podjedinica na aminokiselinama 52 i 78, a beta podjedinica na aminokiselinskim ostacima 7 i 24 (Rathnam i Saxena, (1975) Primary amino acid sequence of follicle stimulating hormone from human pituitary glands. I. alpha subunit, J Biol Chem.250 (17):6735-6746; Saxena i Rathnam, (1976) Amino acid sequence of the beta subunit of follicle-stimulating hormone from human pituitary glands, J Biol Chem. 251(4): 993-1005)). FSH je tako glikozilovan na oko 30 mas.% (Dias i Van Roey, (2001) Structural biology of human follitropin and its receptor. Arch Med Res.

32(6): 510-519; Fox i sar. (2001) Three-dimensional structure of human follicle-stimulating hormone. Mol Endocrinol.15(3), 379-89). Beta podjedinica hCG sadrži i N- i O-glikozilaciju (N-13, N-30, 0-121, 0-127, 0-132 i 0-138). Dodatna glikozilacija u beta podjedinici hCG čini je hidrofilnijom od one u FSH. β-podjedinice pružaju specifičnost za interakciju receptora.

[0006] Gonadotropini dobijeni iz mokraće klinički se koriste više od 40 godina, i njihova bezbednost je dobro utvrđena. Vremenom su uvedene nove generacije visoko prečišćenog (highly purified, HP) gonadotropina dobijenog iz urina u poređenju sa prvom generacijom. Povećana čistoća se postiže ubacivanjem dodatnih koraka prečišćavanja, kao što su koraci izmene anjona i hromatografije hidrofobne interakcije za uklanjanje urinarnih proteina bez bioaktivnosti FSH i/ili LH. Značajno povećana čistoća preparata gonadotropina nove generacije olakšava sveobuhvatnije studije karakterizacije koje pružaju dodatne informacije o kompoziciji.

[0007] Prečišćeni urinarni FSH i humani menopauzalni menotropini (hMG), oba izolovana iz urina žena u menopauzi, već se dugi niz godina koriste u lečenju neplodnosti radi indukovanja (mono) ovulacije ili stimulacije više folikula kod pacijentkinja koje su podvrgnute kontrolisanoj stimulaciji jajnika (controlled ovarian stimulation, COS) pre tehnologija asistirane reprodukcije (assisted reproduction technologies, ART). Dve rekombinantne verzije FSH, Gonal-F® (folitropin alfa, Merck Serono) i Puregon®/Follistim® (folitropin beta, Merck) postale su dostupne sredinom devedesetih godina 20. veka. Oba proizvoda su eksprimirana u ćelijskim linijama jajnika kineskog hrčka (CHO) (Howles, C.M. (1996), genetic engineering of human FSH (Gonal-f), Hum Reprod. Update, 2: 172-191).

[0008] CHO ćelije se obično koriste za proizvodnju farmaceutskih rekombinantnih proteina. Strukturnom analizom je utvrđeno da je sijalinska kiselina vezana isključivo α2,3-vezom. Mnogi ljudski glikoproteini sadrže mešavinu i α2,3- i α2,6-veza za ostatke sijalinske kiseline. Stoga će se rekombinantni proteini eksprimirani pomoću CHO sistema razlikovati od svojih prirodnih parnjaka po vrsti terminalnih veza sijalinske kiseline.

NEPLODNOST

[0009] U predmetnom kontekstu, „neplodnost“ će se definisati kao smanjena mogućnost ili nemogućnost začeća i rađanja potomstva. Za žene koje mogu da zatrudne, ali nakon toga imaju ponovljene spontane pobačaje, takođe se kaže da su neplodne. Neplodnost se takođe konkretno definiše kao neuspeh začeća nakon godinu dana redovnog odnosa bez kontracepcije. Neplodnost može imati mnoge uzroke. Studije su pokazale da je nešto više od polovine slučajeva neplodnosti posledica ženskih stanja. Preostali slučajevi su uzrokovani poremećajima sperme i neobjašnjenim faktorima. Trenutno postoji nekoliko mogućnosti za lečenje neplodnosti.

[0010] Te mogućnosti su vremenski planirani odnos, upotreba tehnologija asistirane reprodukcije (ART), medicinsko lečenje endometrioze, indukcije ovulacije (OI), fibroida i seksualne disfunkcije kod žena (FSD), i operacija za uklanjanje abnormalnosti.

[0011] Kod tehnologije asistirane reprodukcije i OI, koriste se lekovi za stimulaciju ovulacije. Pored FSH, koji je prvenstveno odgovoran za stimulaciju jajnika, preparati gonadotropina mogu da sadrže LH i/ili hCG.

[0012] Nekoliko različitih lekova koji sadrže hormone gonadotropina koji potiču iz mokraće trudnica ili žena u postmenopauzi trenutno se koristi u kliničkoj praksi za lečenje neplodnosti, poput preparata HMG (humani menopauzalni gonadotropin) koji sadrže FSH i LH sa odnosom bioaktivnosti od 1:1 (vidite npr. Američku farmakopeju (USP), verzija 35, monografija za menotropine), kao i preparata koji imaju samo bioaktivnost FSH. Od 1995. nadalje, gonadotropinski proizvodi, proizvedeni tehnologijom rekombinantne DNK, postali su dostupni.

[0013] Stoga je važno obezbediti stabilizovane formulacije takvih jedinjenja gonadotropina, bilo samostalno ili u smeši.

[0014] Stoga je cilj predmetnog pronalaska da obezbedi formulacije, naročito tečne formulacije, jednog ili više gonadotropina, naročito kompoziciju koja sadrži hCG, po izboru u kombinaciji sa FSH, koje su stabilne. Dalji cilj predmetnog pronalaska je da obezbedi postupak za stabilizaciju takvih formulacija. Još jedan cilj je da obezbedi takvu formulaciju koja je stabilna tokom 12 meseci, poželjno 24 meseca, još poželjnije tokom 24 meseca pri uslovima čuvanja plus 1 mesec „tokom upotrebe“, tj. na sobnoj temperaturi.

SAŽETAK PRONALASKA

[0015] Predmetni pronalazak se odnosi na stabilne tečne formulacije gonadotropina. U poželjnom otelotvorenju, te formulacije sadrže hCG. U još jednom poželjnom otelotvorenju, ova formulacija sadrži i FSH i hCG. Gonadotropini u formulacijama iz pronalaska su poželjno dobijeni iz urina ili iz plazme, ali u alternativnom otelotvorenju mogu da se proizvedu rekombinantno.

[0016] U nastavku će se termin „hMG“ koristiti naizmenično sa terminom „gonadotropini iz urina“. Gonadotropini iz urina će uglavnom biti iz ljudskog urina.

[0017] Humani horionski gonadotropin (hCG) doprinosi aktivnosti LH (luteinizujućeg hormona), koji je odgovoran za trenutno odobrene farmaceutske indikacije. To je dobro poznata činjenica, i opisana je kao deo Sažetaka karakteristika leka (SmPC) hMG preparata poput proizvoda Menopur®, odobrenih za iste indikacije kao što je ovde navedeno. Menopur® – u ovim SmPC – obuhvata aktivnost FSH i LH, ali dodatno potvrđuje da je hCG odgovoran za barem deo aktivnosti LH. Prema tome, svako pozivanje na hCG u kontekstu predmetnog pronalaska obuhvata formulacije koje uključuju aktivnost LH koja se može pripisati hCG.

[0018] Poželjna otelotvorenja uključuju sledeće:

ečna farmaceutska formulacija gonadotropina, koja sadrži gonadotropin, arginin u količini od 50 do 160 mM, i metionin u količini od 0,05 do 1,5 mg/ml, naznačeno time što formulacija ne sadrži dodatni pufer, i naznačeno time što je pH formulacije između 6,0 i 7,5.

armaceutska formulacija iz stavke 1, naznačena time što gonadotropin sadrži hCG (humani horionski gonadotropin), i opciono FSH i/ili LH.

armaceutska formulacija iz stavke 1 ili 2, naznačena time što gonadotropin sadrži hMG (humani menopauzalni gonadotropin).

armaceutska formulacija iz bilo koje od stavki 1 do 3, naznačena time što je gonadotropin (kao što je FSH, LH i/ili hCG) ljudskog porekla i dobijen iz urina. armaceutska formulacija iz bilo koje od stavki 1 do 3, naznačena time što je gonadotropin (kao što je FSH, LH i/ili hCG) rekombinantan.

armaceutska formulacija iz bilo koje od prethodnih stavki, koja dodatno sadrži konzervans, poželjno fenol.

armaceutska formulacija iz bilo koje od prethodnih stavki, koja dodatno sadrži površinski aktivni agens, poželjno polisorbat, još poželjnije polisorbat 20. armaceutska formulacija iz stavke 6 ili 7, naznačena time što je konzervans, poželjno fenol, prisutan u količini od 4–6 mg/ml, poželjno u količini od 5 mg/ml. armaceutska formulacija iz stavke 7 ili 8, naznačena time što je površinski aktivni agens, poželjno polisorbat 20, prisutan u količini od 0,001–0,05 mg/ml, poželjno u količini od 0,005 mg/ml.

Farmaceutska formulacija iz bilo koje od prethodnih stavki, naznačena time što je arginin poželjno L-arginin HCl.

Farmaceutska formulacija iz bilo koje od prethodnih stavki, naznačena time što je hMG prisutan u količini od 300–900, poželjnije 500–700, još poželjnije 600–650, veoma poželjno 625 i.j./ml.

Farmaceutska formulacija iz bilo koje od prethodnih stavki, koja se sastoji od

o 625 i.j./ml hMG

o 0,15 mg/ml metionina

o 150 mM arginina

o 5 mg/ml fenola

o 0,005 mg/ml polisorbata 20

o vode za injekciju (water for injection, WFI), i

o naznačeno time što formulacija ima pH 6,8 /- 0,3.

13. Tečna farmaceutska formulacija kako je opisana u bilo kojoj od prethodnih stavki, za upotrebu u postupku za lečenje neplodnosti.

14. Farmaceutska formulacija za upotrebu iz stavke 13, naznačena time što lečenje je lečenje indukovanjem ovulacije (OI), tehnikama asistirane reprodukcije (ART) i/ili hipogonadotropnog hipogonadizma kod muškaraca.

15. Postupak za stabilizaciju tečne farmaceutske formulacije koja sadrži hMG, koji uključuje korak

o obezbeđivanja uzorka urina žene,

o ekstrakcije hMG,

o mešanja navedenog ekstrakta sa argininom i metioninom, u količini definisanoj u bilo kojoj od prethodnih stavki,

o opcionog daljeg dodavanja fenola i polisorbata u količini definisanoj u bilo kojoj od prethodnih stavki,

o prilagođavanja pH kako bi se dobila formulacija sa pH između 6,0 i 7,5, o naznačeno time što se ne dodaje dodatni pufer.

[0019] Kao što je prethodno opisano, gonadotropini, npr. FSH i hCG, kao i LH, pogodni su za lečenje neplodnosti. U tom pogledu, postalo je jasno da tečne formulacije ovih gonadotropina mogu biti nestabilne. To je tačno čak i za one gonadotropine koji su namenjeni za jednokratnu upotrebu. Nestabilnost može biti još izraženija ako tečne formulacije sadrže konzervans, koji je, npr., propisan za sve višedozne formulacije.

[0020] Predmetne formulacije mogu biti namenjene za jednokratnu, odnosno višekratnu upotrebu.

[0021] FSH formulisan u predmetnim formulacijama može biti urinarni FSH ili iz FSH dobijen iz plazme, ili rekombinantni FSH (rFSH). U poželjnom otelotvorenju, FSH je urinarni ili rFSH; posebno poželjan je urinarni FSH.

[0022] Kao što je prethodno navedeno, sada je moguće rekombinantno proizvoditi gonadotropine, poput FSH, LH ili hCG. Prema tome, pominjanje gonadotropina u ovom tekstu generalno uvek uključuje i gonadotropin dobijen iz urina ili iz plazme, kao i rekombinantni (r) gonadotropin, ako nije drugačije naznačeno. Tako, npr. pominjanje „FSH“ takođe obuhvata rFSH. Proizvodnja i aminokiselinske sekvence, kao i sekvence nukleinskih kiselina FSH, hCG i LH, dobro su poznate stručnjacima.

[0023] Sekvence koje mogu da se koriste u kontekstu predmetnog pronalaska su sledeće: Alfa podjedinica FSH, LH i hCG (SEQ ID NO:1)

[0024] (vidite takođe Fiddes, J.C. i Goodman, H.M. The gene encoding the common alpha subunit of the four human glycoprotein hormones J. Mol. Appl. Genet.1 (1), 3-18 (1981))

(podvučeni deo je vodeći peptid)

Beta podjedinica FSH (SEQ ID NO:2)

[0025] (vidite takođe Saxena,B.B. i Rathnam,P. Amino acid sequence of the beta subunit of follicle-stimulating hormone from human pituitary glands J. Biol. Chem. 251 (4), 993-1005

peptid)

Beta podjedinica hCG (SEQ ID NO:3)

[0026] (vidite takođe Fiddes, JC, Goodman HM. The cDNA for the beta-subunit of human chorionic gonadotropin suggests evolution of a gene by readthrough into the 3'-untranslated region Nature.1980 Aug 14; 286(5774):684-7)

(podvučeni deo je vodeći peptid)

Beta podjedinica LH (SEQ ID NO:4)

[0027] (vidite takođe Sairam, M.R. i Li, C.H. Human pituitary lutropin. Isolation, properties, and the complete amino acid sequence of the beta-subunit Biochim. Biophys. Acta 412 (1), 70-81 (1975))

(podvučeni deo je vodeći peptid)

[0028] U alternativnom otelotvorenju, rFSH ili rhCG iz svih otelotvorenja je rFSH, odnosno rhCG sa dugotrajnim delovanjem. Takve, npr., FSH formulacije sa dugotrajnim delovanjem mogu da se dobiju kako je poznato stručnjaku, npr. modifikacijom molekula FSH ili modifikacijom formulacije.

[0029] „FSH“, kako se ovde koristi, tako obuhvata sve moguće oblike dobijene iz urina ili rekombinantne oblike prethodno navedenog FSH, kao i sve moguće kombinacije oblika FSH. Takođe je obuhvaćena formulacija za jednokratnu upotrebu, i jedna ili više dodatnih formulacija (istog ili različitog gonadotropina) za višedoznu upotrebu.

[0030] Jedan mogući proizvod može biti formulacija koja uključuje FSH (u poželjnom otelotvorenju uključuje i hCG i/ili opciono LH, aktivnost LH itd.), sve u različitoj ambalaži. Aktivnost LH, ako je prisutna, može poticati od LH ili hCG. LH može da se zameni ekvivalentnom dozom hCG, i obrnuto, „ekvivalentna doza“ u tom kontekstu može da se izračuna kako je dobro poznato u struci.

[0031] Naročito poželjna kombinacija gonadotropina je kombinacija FSH i hCG, poželjno kao hMG formulacija u jednoj ambalaži, ali opciono takođe npr. u različitoj ambalaži, poput, npr., bočica ili patrona.

[0032] Moguće kombinacije, koje se mogu obezbediti i u različitoj ambalaži, takođe uključuju: urinarni (u)FSH i uhCG ili uFSH i uLH; dalje (rhCG ili rLH ili rFSH) i (uhCG ili uLH ili rhCG ili rLH), i sve njihove moguće permutacije. U veoma poželjnom otelotvorenju, formulacija iz pronalaska sadrži FSH i hCG. U drugom jednako poželjnom otelotvorenju, formulacija iz pronalaska sadrži hCG.

[0033] Formulacije gonadotropina iz predmetnog pronalaska su tečne formulacije. Formulacija poželjno može da se injektuje. Formulacije mogu da se isporuče kao proizvod koji ima jednu, dve ili više farmaceutskih kompozicija, uključujući FSH ili FSH/hCG i/ili LH, za odvojenu ili zajedničku primenu. Ako se primenjuju odvojeno, primena može biti redna. Proizvod može da se isporuči u bilo kom odgovarajućem pakovanju. Na primer, proizvod može da sadrži više fabrički napunjenih špriceva, od kojih svaki sadrži FSH (FSH kompozicija), ili dodatno hCG (hCG kompozicija), npr. naznačeno time što špricevi mogu biti upakovani u blister pakovanje ili druga sredstva za održavanje sterilnosti. Proizvod opciono može da sadrži uputstvo za upotrebu formulacija gonadotropina.

[0034] Prema daljem aspektu, formulacija gonadotropina iz pronalaska je obezbeđena kao višedozni preparat. Predmetni pronalazak, međutim, izričito je usmeren na formulacije namenjene za jednokratnu upotrebu. Predmetni pronalazak se takođe odnosi na stabilizaciju formulacija u okviru kompleta. Takav komplet će da sadrži najmanje jednu ambalažu koja sadrži jednu ili više dnevnih doza gonadotropina, npr. FSH, ili npr. dve ambalaže (npr. bočica), od kojih svaka sadrži različiti gonadotropin poput hCG i npr. dodatno uputstvo (npr. za primenu) i npr. dodatno sredstvo za injektovanje. U poželjnom otelotvorenju, koristi se injekciona olovka za više injekcija, pri čemu je rastvor gonadotropina napunjen u odgovarajuće patrone. Aktivni sastojci mogu biti u različitim patronama, ali, naravno, mogu da se ubrizgavaju istovremeno ili redom, kao što je dobro poznato stručnjaku. Takođe, dva ili više aktivnih sastojaka može biti unutar jedne iste patrone.

[0035] U veoma poželjnom otelotvorenju, predmetna formulacija je za parenteralnu primenu, još poželjnije za supkutanu injekciju.

[0036] U poželjnom otelotvorenju, hMG je prisutan u formulaciji u količini od 35–850 i.j./ml, poželjno 50–800 i.j./ml, još poželjnije 100–700 i.j./ml, najpoželjnije 625 i.j./ml, obično u višedoznoj formulaciji.

[0037] Naročito poželjna formulacija ekscipijenasa za višedoznu formulaciju koja sadrži hMG kao u prethodnom slučaju, i/ili sadrži hMG i/ili hCG, i/ili sve druge gonadotropine za koje je navedeno da su obuhvaćeni predmetnim pronalaskom, ima sledeću kompoziciju:

50–160 mM arginin HCI, poželjno 150 mM, arginin HCI

0,05 do 1,5 mg/ml, poželjno 0,15 mg/ml, L-metionina

0,001–0,05 mg/ml, poželjno 0,005 mg/ml, polisorbata 20

4,0 do 6,0 mg/ml, poželjno 5,0 mg/ml, fenola

pH 6,0 do 7,5, poželjno pH 6,8 /- 0,3, (pH se odnosi na pH celog rastvora.) WFI.

[0038] Uobičajene koncentracije aktivnog sastojka za formulacije koje sadrže rekombinantni hCG i/ili FSH su sledeće, iako koncentracija aktivnog sastojka nema nikakav uticaj na performanse predmetnog pronalaska:

Za rFSH: 30–150 µg/ml

Za rhCG: 5–200 µg/ml

1

[0039] Poželjni ekscipijensi za takve rekombinantne formulacije su isti kao što je prethodno opisano za višedoznu formulaciju hMG. Uobičajene formulacije sa jednom dozom su takođe obuhvaćene ovim pronalaskom, i bile bi iste kao prethodno opisane, osim što ne sadrže konzervans, poput fenola.

[0040] Injektabilni depo oblici mogu da se načine formiranjem mikrokapsuliranih matrica gonadotropina (i drugih agenasa, ako su prisutni) u biorazgradivim polimerima. Depo oblici na bazi polimera/sistemi sa produženim otpuštanjem mogu biti, zavisno od njihove hemijske prirode, na primer, mikro- ili nanočestice, hidrogelovi, micele, emulzije ili implanti. U zavisnosti od odnosa gonadotropina i polimera i prirode konkretnog polimera koji se koristi, može da se kontroliše brzina otpuštanja gonadotropina. Primeri biorazgradivih polimera uključuju kopolimerne sisteme polilaktid/poliglikolid, polivinilpirolidon, poli(ortoestre), poli(anhidride), poli(etilen glikol), poli aminokiseline, polisaharide, npr., natrijum hijaluronat (NaHA) ili druge njegove soli, želatin, hitozan, itd. Svi navedeni polimeri mogu da se derivatizuju ili modifikuju kako bi se optimizovala isporuka proteinskog leka ili njegova stabilnost. Depo injektabilne formulacije se takođe pripremaju hvatanjem gonadotropina u lipidnim sistemima ili polimerno lipidnim smešama kao što su micele, lipozomi ili mikroemulzije, koje su kompatibilne sa telesnim tkivima.

[0041] Formulacije za injekcije mogu da se sterilišu, na primer, filtriranjem kroz filter koji zadržava bakterije i/ili uključivanjem agenasa za sterilizaciju. Moguće je formirati sterilne čvrste kompozicije koje mogu da se rastvore ili disperguju u sterilnoj vodi ili drugom sterilnom injektabilnom medijumu neposredno pre upotrebe. Injektabilne formulacije mogu da se isporučuju u bilo kojoj odgovarajućoj ambalaži, npr. bočici, fabrički napunjenom špricu, patroni za injekciju, i slično, kako je prethodno opisano.

[0042] pH i tačna koncentracija različitih komponenata formulacije za upotrebu u vidu farmaceutske kompozicije, kako je ovde opisano, uglavnom se prilagođavaju u skladu sa rutinskom praksom u ovoj oblasti, vidite npr. The textbook of Pharmaceutical Medicine, peto izdanje, urednici John P. Griffin i John O'Grady. U poželjnom otelotvorenju, kompozicije iz pronalaska se isporučuju kao kompozicije za parenteralnu primenu. Opšti postupci za pripremu parenteralnih formulacija su poznati u struci, i opisani su u REMINGTON; THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY, gore, na stranama 780–820. Parenteralne kompozicije mogu da se isporuče u tečnoj formulaciji, ili kao čvrsta supstanca koja će se pomešati sa sterilnim injektabilnim medijumom neposredno pre pripreme. U naročito poželjnom otelotvorenju, parenteralne kompozicije se isporučuju u jediničnom doznom obliku radi lakše primene i jednoobraznosti doze.

[0043] FSH, hCG i/ili LH koji mogu da se formulišu u skladu sa predmetnim pronalaskom mogu da se dobiju uobičajenim putem iz urina, kao što je dobro poznato u struci, ili se mogu proizvesti rekombinantno. Za moguće postupke proizvodnje dalje vidite npr. WO 2009/127826.

[0044] Jedno poželjno otelotvorenje pronalaska je predmetno opisana formulacija koja sadrži hCG.

[0045] hCG može da se dobije na bilo koji način poznat u struci. hCG, kako se ovde koristi, uključuje hCG dobijen iz urina i rekombinantni hCG. Posebno je poželjna formulacija koja sadrži hCG dobijen iz urina. Takođe je obuhvaćena formulacija koja ima aktivnost LH koja je, barem delimično, izvedena iz hCG (drugim rečima: hCG je molekul koji je odgovoran za ovu aktivnost LH). hCG ljudskog porekla može da se prečistiti iz bilo kog odgovarajućeg izvora (npr. urina i/ili posteljice) bilo kojim postupkom poznatim u struci. Postupci ekspresije i prečišćavanja rekombinantnog hCG dobro su poznati u struci.

[0046] LH može da se dobije na bilo koji način poznat u struci. LH, kako se ovde koristi, uključuje LH dobijen od čoveka i rekombinantni LH. LH ljudskog porekla može da se prečistiti iz bilo kog odgovarajućeg izvora (npr. urina) bilo kojim postupkom poznatim u struci. Postupci ekspresije i prečišćavanja rekombinantnog LH su poznati u struci.

[0047] Termin „farmaceutska kompozicija“ ovde se koristi naizmenično sa „farmaceutskom formulacijom“.

[0048] Stabilna farmaceutska kompozicija iz predmetnog pronalaska može da se koristi za lečenje neplodnosti. „Lečenje neplodnosti“, u kontekstu ovog pronalaska, uključuje lečenje neplodnosti kontrolisanom (hiper)stimulacijom jajnika (COS) ili postupcima koji uključuju korak ili fazu kontrolisane stimulacije jajnika, na primer, intrauterina inseminacija (IUI), in vitro oplodnja (IVF) ili intracitoplazmatska injekcija sperme (ICSI). Termin takođe uključuje indukciju ovulacije (OI) ili postupke koji uključuju korak ili fazu indukcije ovulacije. Pojam takođe uključuje lečenje neplodnosti kod ispitanika koji ima tubalnu ili neobjašnjivu neplodnost, uključujući lečenje neplodnosti kod ispitanika koji ima endometriozu, na primer, endometriozu stadijuma I ili stadijuma II (kako je definisano sistemom za klasifikaciju različitih stadijuma endometrioze Američkog društva za reproduktivnu medicinu (American Society for Reproductive Medicine, ASRM), Revised American Society for Reproductive Medicine classification of endometriosis: 1996, Fertil Steril 1997; 67, 817-821) i/ili kod ispitanika čiji partner pati od muškog faktora neplodnosti. Termin poželjno uključuje upotrebu, npr., tehnika asistirane reprodukcije (ART), indukcije ovulacije (OI) ili intrauterine inseminacije (IUI). Farmaceutska kompozicija može da se koristi, na primer, u medicinskim indikacijama kada se koriste poznati preparati FSH ili preparati FSH i hCG. U uobičajenom otelotvorenju, predmetna formulacija se koristi za iste zdravstvene indikacije kao što su indikacije odobrene za Menopur®, u Evropi, u nastavku, u slučaju koji služi za primer:

Lečenje neplodnosti žena i muškaraca:

[0049]

• Anovulatorne žene: MENOPUR može da se koristiti za stimulisanje razvoja folikula kod pacijentkinja sa amenorejom. Klomifen (ili slično sredstvo za indukciju ovulacije koje utiče na mehanizme povratnih reakcija steroida) predstavlja poželjno lečenje za žene sa različitim poremećajima menstrualnog ciklusa, uključujući insuficijenciju lutealne faze sa anovulatornim ciklusima i sa normalnim prolaktinom, kao i pacijentkinje sa amenorejom, sa dokazima o endogenoj proizvodnji estrogena, ali sa normalnim nivoima prolaktina i gonadotropina. Pacijentkinje bez odgovora zatim mogu da se izaberu za terapiju menotrofinom.

• Žene koje prolaze superovulaciju u okviru programa medicinski asistirane oplodnje:

MENOPUR može da se koristi za indukciju višestrukog folikularnog razvoja kod pacijentkinja koje su podvrgnute tehnici asistiranog začeća, poput in vitro oplodnje (IVF).

• Hipogonadotropni hipogonadizam kod muškaraca: MENOPUR se može davati u kombinaciji sa humanim horionskim gonadotropinom (npr. Choragon) za stimulaciju spermatogeneze.

ili indikacije odobrene za Menopur® u SAD, u nastavku:

Razvoj višestrukih folikula i trudnoće kod ovulatornih žena u okviru ciklusa tehnologije asistirane reprodukcije (ART).

1

[0050] Alternativno, opcije lečenja lekom Menopur® mogu se opisati na sledeći način:

MENOPUR je indikovan za lečenje neplodnosti u sledećim kliničkim situacijama: Anovulacija, uključujući bolest policističnih jajnika (PCOD), kod žena koje nisu reagovale na lečenje klomifen citratom.

[0051] Kontrolisana hiperstimulacija jajnika radi indukcije razvoja višestrukih folikula za tehnologije asistirane reprodukcije (ART) (npr. in vitro oplodnja/prenos embriona (IVF/ET), prenos gameta unutar jajovoda (GIFT) i intracitoplazmatska injekcija sperme (ICSI)).

[0052] Stimulacija folikularnog razvoja kod žena sa hipogonadotropnim hipogonadizmom.

[0053] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje upotrebu ovde opisanih stabilizovanih formulacija gonadotropina (prema aspektima pronalaska) za lečenje, ili u proizvodnji leka za lečenje neplodnosti.

[0054] U poželjnom otelotvorenju, formulacija iz predmetnog pronalaska se koristi za indukovanje ovulacije, tehnike asistirane reprodukcije (ART) i/ili za hipogonadotropni hipogonadizam kod muškaraca.

[0055] Farmaceutske kompozicije mogu dalje da se formulišu u dobro poznate kompozicije za bilo koji način primene leka, npr. oralno, rektalno, parenteralno, transdermalno (npr. tehnologija flastera), intravenski, intramuskularno, supkutano, intracisternalno, intravaginalno, intraperitonealno, lokalno (praškovi, masti ili kapi) ili u obliku bukalnog ili nazalnog spreja. Uobičajena kompozicija sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač, kao što je vodeni rastvor, netoksične ekscipijense, uključujući soli i konzervanse, pufere i slično, kako je opisano, između ostalog u Remington's Pharmaceutical Sciences, petnaesto izdanje (Matt Publishing Company, 1975), strane 1405 do 1412 i 1461 do 87; i USP-NF, The National Formulary XIV, četrnaesto izdanje (American Pharmaceutical Association, 1975). Predmetni pronalazak je u nekim otelotvorenjima usmeren na specifičnu odredbu o formulaciji koja ispoljava i iznenađujuće veliku stabilnost i druge prednosti, poput nepostojanja neprihvatljivog obojenja, nepostojanja neprihvatljive zamućenosti, smanjenja ili izostanka bola prilikom injekcije, i smanjenja ili izostanka iritacije kože prilikom injekcije. To je postalo moguće tek sa otkrićima iz predmetnog pronalaska koja pokazuju da određene komponente omogućavaju pogodne performanse i veliku stabilnost ovde opisanih tečnih formulacija gonadotropina.

[0056] Iako su formulacije gonadotropina već nekoliko decenija na tržištu, naučnik koji se bavi formulacijom zna da je formulacija ovih proteina povezana sa nizom poteškoća. Te poteškoće postoje i variraju na osnovu mnogih faktora, poput

• činjenice da je protein formulisan (proteine kao takve je teško formulisati u svakom slučaju)

• činjenice da je protein specifično glikozilovan (na glikozilaciju može da utiče specifičan odabir proizvodnje i ekscipijenasa)

• specifičnih proteina koji su formulisani (hemija formulacije značajno se razlikuje u zavisnosti od samog proteina: pokazalo se, npr., da se čak i blisko povezani proteini, poput FSH i hCG, različito ponašaju u istoj formulaciji, vidite npr. WO 2012/013742) • toga da li je protein dobijen iz prirode, npr. urina, ili je rekombinantno proizveden • toga da li je potreban konzervans (neki konzervansi ispunjavaju svoj predviđeni cilj zaštite od rasta mikroba, ali negativno utiču na stabilnost finalne formulacije. To je tačno za m-krezol, fenol i benzil alkohol (sa benzalkonijum hloridom ili bez njega), koji su trenutno jedini konzervansi odobreni za upotrebu sa gonadotropinima; osim toga, konzervansi mogu imati negativno dejstvo na boju, u zavisnosti od ostalih ekscipijenasa i aktivnog sastojka sadržanih u formulaciji)

• specifičnog površinski aktivnog agensa koji se koristi (oni mogu u nekim slučajevima dovesti do zamućenosti, ponovo u zavisnosti od dodatnih ekscipijenasa sadržanih u datoj formulaciji)

• specifičnog pufera koji se koristi (npr. citratni pufer često dovodi do bolova i iritacije kože nakon injekcije)

• specifičnog ekscipijensa koji se koristi za stabilizaciju, koji će stabilizovati različite kompozicije na nepredvidljiv način

• u zavisnosti od ekscipijensa koji se koristi za stabilizaciju, koji će stabilizovati različite kompozicije na nepredvidljiv način.

[0057] Dakle, naučnik koji se bavi formulacijom suočen je sa skupom više problema sa jedne strane, i skupom više mogućih ekscipijenasa sa druge strane, što dovodi do složenog problema za obezbeđenje, s jedne strane, dobre stabilnosti formulacije, a, s druge strane, izostanka obojenja ili zamućenosti ili bola nakon injekcije.

1

[0058] Stoga je bilo prilično iznenađujuće da predmetna kombinacija arginina i metionina, bez dodavanja pufera rešava te konkretne probleme, u datom rasponu pH.

[0059] U tom pogledu, „bez (dodatka/dodatnog) pufera“ i „ne sadrži pufer“ se u ovoj prijavi koriste kao sinonimi. Ovaj izraz će značiti da nijedno dodatno jedinjenje za koje može da se smatra da ima puferski kapacitet nije dodato u formulaciju/prisutno u njoj. Za rastvor se kaže da je puferovan ako se opire promeni aktivnosti jona nakon dodatka supstanci za koje se očekuje da će promeniti aktivnost tog jona. Puferi su supstance ili kombinacije supstanci koje daju ovu otpornost rastvoru. Puferovani rastvori su sistemi u kojima je jon u ravnoteži sa supstancama koje su sposobne da uklone ili otpuste jon. Odnosi se na količinu supstance koja se može dodati rastvoru bez uzrokovanja značajne promene u aktivnosti jona. Definiše se kao odnos dodate kiseline ili baze (u gram-ekvivalentima/l) prema promeni u pH jedinicama. Kapacitet puferovanog rastvora je prilagođen uslovima upotrebe, obično putem prilagođavanja koncentracija puferskih supstanci (USP NF). Puferski kapacitet se obično izražava kao broj ekvivalenata (ekv.) jake kiseline (npr. HCl) ili baze (npr. NaOH) koji dovodi do toga da jedan litar predmetnog rastvora doživi promenu od jedne pH jedinice (poželjno na jednoj atmosferi i 21 °C) (Skoog West i Holler, Fundamentals of Analytical Chemistry, peto izdanje). Jedan ekvivalent HCI jednak je jednom molu HCI, a jedan ekvivalent NaOH je jednak jednom molu NaOH. U predmetnom pronalasku, puferski kapacitet će biti izražen kao broj ekvivalenata (ekv.) jake kiseline (npr. HCl) ili baze (npr. NaOH) zbog kojih se u jednom litru rastvora izvrši promena pH od jedne jedinice. Dakle, u skladu sa predmetnim pronalaskom, formulacija neće sadržati dodatni pufer koji doprinosi sa ≥0,5 mekv./(litar*pH)(poželjno na 1 atm, 21 °C) u opsegu pH kako je prikazano u formulacijama predmetnog pronalaska.

Postupak za određivanje i izračunavanje puferskog kapaciteta

[0060] Puferski kapacitet može da se odredi i izračuna na sledeći način.

[0061] Određena zapremina rastvora koji se testira se titriše kiselinom, npr. HCl ili bazom, npr. NaOH. Treba načiniti odgovarajuće koncentracije kiseline i baze, npr. 0,2 N radi dovoljno precizne titracije.

[0062] Titracija se obavlja dodatkom malih alikvota HCI ili NaOH u ispitivani rastvor. Prilikom svakog dodavanja, dokumentuje se dodata zapremina i odgovarajući pH.

1

[0063] Akumulirana zapremina kiseline i baze se iscrtava u odnosu na izmereni pH, vidite npr. sliku 1. Obavlja se linearna regresija najmanjih kvadrata za relevantnu oblast pH i R<2>se izračunava kako bi se potvrdila validnost iscrtane linije.

[0064] Puferski kapacitet izražen u mekv./(litar×jedinica pH) izračunava se linearnom regresijom.

pri čemu;

x

= puferski kapacitet [μl 0,2 N HCl/NaOH radi pomeranja pH za 1 pH jedinicu] Y-b

= 1 pH jedinica

a

= nagib

and

[0065] Pri čemu. mekv. su miliekvivalenti kiseline ili baze dati iz koncentracije npr. 0,2 N HCl/NaOH što je jednako 0,2 ekvivalenta/l HCl/NaOH, što je jednako 200 mEkv./l HCl/NaOH.

x = puferski kapacitet [mekv./litar×pH jedinica]

Y-b = 1 pH jedinica

C = koncentracija kiseline ili baze, npr. za

V = zapremina dotičnog rastvora

10<6>faktor korekcije iz µl u litar

[0066] Primer izračunavanja koristeći Jednačinu 2 i seriju C-01pH raspon 6,564-6,947, iz tabele 9:

1,32 mekv/(litar x pH jedinica)

1

[0067] Da bi se utvrdilo da li će komponenta doprineti sa ≥0,5 mekv./(litar×jedinica pH) puferskom kapacitetu, puferski kapacitet se određuje kako je gore opisano za rastvor sa komponentom i za isti rastvor bez komponente. Razlika u utvrđenom puferskom kapacitetu za dva rastvora daje doprinos date komponente puferskom kapacitetu.

[0068] Termini „bez (dodatka/dodatnog) pufera“ i „ne sadrži pufer“ takođe znače da formulacija iz predmetnog pronalaska ne sadrži bilo koji od sledećih pufera (koji su puferi odobreni od strane američke Uprave za hranu i lekove (FDA) za parenteralnu upotrebu u rasponu pH 6,0–7,5):

histidin

fosfat

citrat

trometamin (Tris)

hidroksietilpiperazin etan sulfonska kiselina (HEPES)

karbonat

[0069] Pored toga, termini takođe znače da nije uključen nijedan od drugih FDA odobrenih pufera za parenteralnu primenu, naročito

acetat

adipinska kiselina

amonijum sulfat

sukcinat

asparagin

asparaginska kiselina

glutamat (glutaminska kiselina)

glicin

laktat

lizin

maleat (maleinska kiselina)

fumarat (fumarna kiselina)

malat

meglumin

propionat

alanin

1

fenilalanin

cistein

izoleucin

leucin

prolin

serin

tartrat

treonin

triptofan

tirozin

valin

[0070] Bez dodavanja pufera obično se pretpostavlja da pH finalnog rastvora može lako da se održava u željenom rasponu (i da će biti teško da se specifični ciljani pH dostigne tokom podešavanja) (u predmetnom pronalasku, pH treba da bude između 6,0 i 7,5, poželjnije između 6,5 i 7,4, poželjno oko 6,8), ali se ozbiljno koleba.

[0071] Izuzetno je važno održavati odgovarajući pH za farmaceutski proizvod. pH definiše parametre poput stabilnosti, aktivnosti i veka trajanja. Farmaceutske formulacije se iz tog razloga obično formulišu sa puferom. Dostupni su različiti puferujući agensi, i oni se biraju da budu delotvorni pri željenom pH. Primeri pufera koji se redovno koriste u praktično svim postojećim formulacijama gonadotropina su fosfatni pufer i citratni pufer. Pufer treba da formulaciji obezbedi postojani pH u različitim uslovima kojima formulacija može biti izložena prilikom formulisanja, i naročito tokom njenog čuvanja. Često je prilično teško pronaći takav pogodan pufer, a u nekim slučajevima delotvorni pufer pruža formulaciji neželjena dejstva, poput bola prilikom injekcije sa citratnim puferima. Svim puferima je svojstven nedostatak da su dodatni sastojak u formulaciji koji komplikuje proces formulisanja, nosi rizik štetnog delovanja na druge sastojke, stabilnost, vek trajanja i prihvatljivost za krajnjeg korisnika.

[0072] Predmetni pronalazači su, međutim, neočekivano obezbedili formulacije u kojima nije prisutan pufer, pri čemu formulacije ne trpe neprihvatljive fluktuacije pH. Formulacije sadrže arginin kao stabilizujuće jedinjenje. Arginin bi imao očekivani kapacitet puferovanja od /-1 pH jedinice oko svog pKa, koji je na 2,17, na 12,5 i na 9,04. Stoga nije očekivan puferski kapacitet u poželjnom opsegu pH ovog pronalaska (npr. između 6,0 i 7,5, poželjnije između

1

6,5 i 7,4, poželjno na ili oko 6,8). Ipak, iznenađujuće je otkriveno da arginin ima snažno stabilizaciono dejstvo na pH u određenim formulacijama koje su ovde opisane. Takvo dejstvo arginina nije nigde opisano u prethodnom stanju tehnike.

[0073] Povoljno je što ova formulacija bez pufera, kako je ovde definisana, takođe pruža formulaciju sa smanjenim ili nikakvim bolom prilikom injekcije i smanjenom ili nikakvom iritacijom kože prilikom injekcije. To je suprotno formulacijama koje, npr., koriste citratni pufer za koji je pokazano da dovodi do iritacije kože i bola prilikom injekcije.

[0074] Arginin iz ovog pronalaska može biti arginin, ili može biti arginin HCI, ili, još poželjnije, L-arginin (HCI). Količina arginina je poželjno u rasponu od 50 do 160 mM, poželjnije 80–160 mM, još poželjnije oko 150 mM.

[0075] Kao što se može videti iz primera u nastavku, arginin ima izraženo dejstvo na oksidaciju FSH i hCG. Međutim, pronalazači su pokazali posebno visoko stabilizaciono dejstvo. Iznenađujuće, tada su mogli da obezbede tečnu formulaciju gonadotropina koja je bila stabilna i pokazala je samo minimalnu oksidaciju (u prihvatljivim nivoima, vidite odeljak sa primerima u nastavku), ako je gonadotropin kombinovan sa velikom stabilizujućom količinom arginina (npr. 150 mM).

[0076] To je bilo posebno iznenađujuće jer je dejstvo ostvareno u rasponu pH koji je daleko od pKa vrednosti arginina, naime u rasponu pH od 6,0 do 7,5. To je poželjni raspon pH za predmetni pronalazak. U posebno poželjnom otelotvorenju, pH je u rasponu od 6,5 do 7,4. Još poželjniji je raspon pH između 6,5 i 7,2. Najpoželjniji je pH od 6,8 /- 0,3.

[0077] Iznenađujuće, mala antioksidantska količina metionina, po mogućnosti L-metionina, bila je u stanju da spreči neželjene događaje oksidacije. Ova mala količina može biti i do 0,05 mg/ml, ali može dostići i do 2,5 mg/ml. U poželjnom otelotvorenju, količina metionina je od 0,1 do 1,5 mg/ml. U još poželjnijem otelotvorenju, količina metionina je od 0,1 do 1 mg/ml. U još poželjnijem otelotvorenju, količina metionina je od 0,1 do 0,5 mg/ml. Najpoželjnije otelotvorenje je metionin u količini od 0,15 mg/ml. Uopšte se nije moglo predvideti da velika oksidaciona moć arginina može da se poništi i nadjača tako malom količinom metionina.

2

[0078] Još veće iznenađenje je bilo otkriće da arginin ima mnogo izraženije stabilizujuće dejstvo od ostalih poznatih stabilizujućih agenasa, npr. saharoze, koja je stabilizator koji se veoma često dodaje i dobro je poznat.

[0079] Formulacije mogu da sadrže odgovarajuće vodene i nevodene farmaceutske nosače, razblaživače, rastvarače i/ili vehikulume. Primeri odgovarajućih vodenih i nevodenih farmaceutskih nosača, razblaživača, rastvarača ili vehikuluma uključuju vodu, etanol, poliole (kao što je glicerol, propilen glikol, polietilen glikol, i slično), karboksimetil celulozu i njene odgovarajuće smeše, biljna ulja (kao što je maslinovo ulje) i injektabilne organske estre, kao što je etil oleat.

[0080] U predmetnom pronalasku je dalje poželjno dodavanje konzervansa, posebno za višedozne formulacije. Veoma je poželjno da je ovaj konzervans fenol. U daljem poželjnom otelotvorenju, fenol se dodaje u koncentraciji od 4,0 do 6,0 mg/ml, poželjno 5,0 mg/ml fenola. Iznenađujuće, fenol je takođe koristan u kontekstu specifične predmetne formulacije, u poređenju sa drugim poznatim konzervansima, jer ne dovodi do obojenja i vrlo je stabilan, čak i tokom dužeg vremenskog perioda, uprkos prisustvu ovog konzervansa, kako je prikazano u odeljku sa primerima.

[0081] U predmetnom pronalasku je dalje poželjno dodavanje površinski aktivnog agensa. Veoma je poželjno da je ovaj surfaktant polisorbat, još poželjnije polisorbat 20. U daljem poželjnom otelotvorenju, polisorbat 20 se dodaje u koncentraciji od 0,001–0,05 mg/ml, poželjno 0,005 mg/ml polisorbata 20. Pogodno, formulacija iz ovog pronalaska, pomešana sa polisorbatom 20, ne dovodi do zamućenosti i veoma je stabilna, čak i u dužem vremenskom periodu, uprkos prisustvu ovog konzervansa, kako je prikazano u odeljku sa primerima.

[0082] Kompozicije takođe mogu da sadrže dodatne aditive pored onih koji su već prethodno navedeni, kao što su, bez ograničenja (dodatni) konzervansi, kvašljivci, emulgatori i disperagujući agensi. Mogu da se uključe antibakterijski i antifungalni agensi radi sprečavanja rasta mikroba i oni uključuju, na primer, parabene, hlorbutanol, fenole, sorbinsku kiselinu, i slično. Nadalje, možda će biti poželjno uključiti sredstva za pojačavanje toničnosti. Formulacija iz predmetnog pronalaska, međutim, ne sadrži

dodatni pufer.

[0083] U nekim slučajevima, radi produženog delovanja, poželjno je usporiti apsorpciju gonadotrofina kao što je FSH (i drugih aktivnih sastojaka, ako su prisutni) iz supkutane ili intramuskularne injekcije. To se može postići upotrebom tečne suspenzije kristalne ili amorfne supstance slabe rastvorljivosti u vodi. Brzina apsorpcije tada zavisi od brzine disolucije koja, zauzvrat, može da zavisi od veličine kristala i kristalnog oblika. Alternativno, odložena apsorpcija parenteralno primenjenog kombinovanog oblika FSH se postiže rastvaranjem ili suspendovanjem kombinacije FSH u uljanom vehikulumu.

[0084] Prema predmetnom pronalasku, pronalazači su uložili napor da istraže dejstvo određenih jedinjenja na stabilnost tečne formulacije gonadotropina; ovde je istraženo stabilizujuće i destabilizujuće dejstvo nekoliko jedinjenja. Pored toga, pronalazači su nastojali da unaprede nastalu formulaciju u pogledu njene bistrine, stepena obojenosti i bola prilikom injekcije.

[0085] Termin „stabilnost“ može da se odnosi na hemijsku stabilnost, uključujući kovalentnu modifikaciju u aminokiselinskoj sekvenci, ali u kontekstu stabilnosti proteina takođe može da se odnosi na fizičku stabilnost, koja uključuje promene savijenog stanja proteina (tj. nativnog stanja) ne uključujući cepanje kovalentne veze.

U predmetnom pronalasku, termin „stabilnost“ se odnosi na biološku stabilnost formulacija gonadotropina, naročito FSH i hCG. Fizička nestabilnost formulacije proteina može biti uzrokovana agregacijom molekula proteina radi stvaranja agregata višeg reda, disocijacijom heterodimera u monomere, ili bilo kojom drugom konformacionom promenom koja smanjuje barem jednu biološku aktivnost npr. FSH proteina (i drugih aktivnih sastojaka, ako su prisutni) uključenih u predmetni pronalazak.

[0086] „Stabilni“ rastvor ili formulacija je onaj u kome je stepen agregacije, disocijacije, konformacionih modifikacija, gubitka biološke aktivnosti i slično, u njegovim proteinima kontrolisan na prihvatljiv način, i ne dolazi do njegovog neprihvatljivog povećanja tokom vremena. Stabilnost se može proceniti postupcima koji su dobro poznati u struci, uključujući merenje rasipanja svetlosti uzorka, vizuelni pregled bistrine i/ili obojenosti, apsorbancu ili optičku gustinu, utvrđivanje molekulske veličine (npr. hromatografijom na molekulskim sitima ili frakcionisanjem protoka u polju), in vitro ili in vivo biološku aktivnost i/ili diferencijalnu skenirajuću kalorimetriju (DSC).

[0087] Predmetna formulacija je stabilna tokom 12 meseci u uslovima čuvanja, poželjno 16 meseci u uslovima čuvanja, još poželjnije tokom 24 meseca, još poželjnije tokom 24 meseca u uslovima čuvanja plus 1 mesec „u upotrebi“, tj. na sobnoj temperaturi. Stabilnost u „uslovima čuvanja“ odnosi se na čuvanje formulacije u ohlađenom okruženju, npr. na 5 °C ± 3 °C. „Sobna temperatura“ u predmetnom kontekstu treba da se odnosi na 30 °C ili manje, poželjno 15– 25 °C, poželjno 18–25 °C, najpoželjnije 25 ± 2 °C.

[0088] Da bi se utvrdila stabilnost u kontekstu predmetne formulacije, korišćeni su dobro poznati (imunološki) testovi za FSH i hCG, koji su dobro poznati stručnjaku, i ovde su posledično opisani samo u opštim terminima na sledeći način:

RP-HPLC za oksidaciju

[0089] Oksidacija proteina je određena pomoću RP-HPLC, gradijentnom elucijom na C4 koloni i UV detekcijom na 210 nm.

Test enzimski povezane fluorescencije (ELFA)

[0090] Imunoaktivnost FSH i hCG određena je u sendvič imunološkom testu obavljenom pomoću automatskog instrumenta za analizu VIDAS® (BioMérieux, Francuska) sa VIDAS® kompletima koji odgovaraju FSH, odnosno hCG.

Hromatografija na molekulskim sitima (SEC)

[0091] Čistoća rFSH je utvrđena hromatografijom na molekulskim sitima (SEC) na SEC koloni u rasponu proteina 3–70 kDa i UV detekcijom na 210 nm.

Hromatografija sa hidrofobnom interakcijom (HIC)

[0092] Čistoća rhCG je utvrđena hromatografijom sa hidrofobnom interakcijom (HIC) gradijentnom elucijom na koloni sa alkil amidnim grupama i UV detekcijom na 220 nm. Biološki test FSH i LH

[0093] Potentnost FSH i LH je određena koristeći biološke in vivo testove; Stilman-Polijev test (FSH), odnosno test povećanja težine semenih vezikula (LH).

[0094] Ostali postupci za procenu stabilnosti su dobro poznati u struci, i takođe se mogu koristiti u skladu sa predmetnim pronalaskom.

2

[0095] Testovi aktivnosti FSH i LH su standardizovani koristeći Četvrti međunarodni standard za urinarni FSH i urinarni LH, iz novembra 2000, Stručnog komiteta za biološku standardizaciju Svetske zdravstvene organizacije (WHO ECBS), i dobro su poznati stručnjaku.

[0096] Bilo je poznato da neki konzervansi imaju izraženo destabilizujuće dejstvo na formulacije gonadotropina, i ovde je iznenađujuće otkriveno da su opisane formulacije iz pronalaska, naročito koje sadrže arginin i metionin, ali ne i pufer, bile posebno stabilne, čak i u dužem vremenskom periodu, i čak i u prisustvu fenola.

[0097] Kombinacija arginina i metionina iz predmetnog zahteva ima stabilizujuće dejstvo na tečnu formulaciju hMG, koje je na pogodan i iznenađujući način izraženije nego stabilizujuće dejstvo poznatih stabilizatora, poput, npr. saharoze. Poboljšano stabilizujuće dejstvo u poređenju sa poznatim stabilizatorima poput saharoze je posebno iznenađujuće. Dalje, sasvim neočekivano, stabilizujuće dejstvo kombinacije iz pronalaska je bilo izraženo uprkos odsustvu pufera.

[0098] Iz prethodnog stanja tehnike je poznato da dolazi do razgradnje FSH koja se javlja u farmaceutskim formulacijama FSH, i to je potvrđeno primerima koji su dati u WO 2012/013742. FSH će se razgraditi i u funkciji vremena i u funkciji temperature.

[0099] Čini se da je konformaciono odvijanje tercijarnih i sekundarnih struktura FSH, koje se javlja prilikom zagrevanja, tranzicija u dva stanja (kada je agregacija proteina ograničena). Ovo odvijanje može biti nezavisno od disocijacije podjedinice (promene u kvarternernoj strukturi).

[0100] Nadalje, iz prethodnog stanja tehnike je jasno da uključivanje konzervansa poput benzil alkohola ili fenola, kada su takvi konzervansi neophodni, na primer, kao antimikrobni agensi u tečnim formulacijama FSH, očito utiče na stabilnost višedoznih formulacija FSH na negativan način. U tom slučaju je smanjena dugoročna stabilnost FSH, temperatura denaturacije FSH je niža, a već denaturisani oblici imaju manji nivo sekundarnih struktura nego formulacije FSH koje ne sadrže konzervanse.

[0101] Predmetni pronalazak takođe obuhvata postupak za stabilizaciju tečne formulacije gonadotropina, naznačeno time što postupak obuhvata korak dodavanja arginina i metionina navedenoj formulaciji, koja ne sadrži pufer.

SPISAK SLIKA

[0102]

Slika 1: Kriva titracije. Nagib krive prikazuje puferski kapacitet, npr. strmi nagib pokazuje mali puferski kapacitet.

Slika 2: Optimizator odgovora zasnovan na rezultatima na 25 °C. Vertikalne linije prikazuju nivo L-arginina i L-metionina i odgovore u imunološkom testu FSH i hCG kao Y (u i.j./ml). R<2>HCG: 92,15% i R2F5H: 67,31%.

[0103] Sve studije su potvrđene dodatno dobijenim podacima u realnom vremenu.

PRIMERI

Primer 1

1 Pozadina i uvod

[0104] Nekoliko različitih lekova koji sadrže hormone gonadotropina dobijene iz urina postmenopauzalnih ili trudnih žena se koristi u lečenju neplodnosti, poput preparata hMG (humani menopauzalni gonadotropin). hMG ima aktivnost folikulostimulišućeg hormona (FSH) i luteinizujućeg hormona (LH) u odnosu jedan prema jedan.

[0105] FSH, LH i humani horionski gonadotropin (hCG) pripadaju gonadotropinskoj porodici složenih glikoproteinskih hormona. Oni su heterodimeri sastavljeni od α- i β-podjedinice. αpodjedinica od 92 aminokiseline je zajednička za ova tri gonadotropina, β-podjedinice su jedinstvene, dajući im različite biološke karakteristike (Wolfenson C. i sar. 2005, Batch-tobatch consistency of human-derived gonadotropin preparations compared with recombinant preparations. Reproductive BioMedicine. sveska 10 br.4:442-454; Shen, S. T., Cheng, Y. S., Shen, T. Y. i Yu, J. Y. 2006, Molecular cloning of follicle-stimulating hormone (FSH)-beta subunit cDNA from duck pituitary. Gen. Comp Endocrinol.148:388-394; Fox, K. M., Dias, J.

2

A. i Van, R. P.2001, Three-dimensional structure of human follicle-stimulating hormone. Mol. Endocrinol. 15:378-389; Burova, T., Lecompte, F., Galet, C., Monsallier, F., Delpech, S., Haertle, T. i Combarnous, Y.2001, Conformational stability and in vitro bioactivity of porcine luteinizing hormone. Mol. Cell Endocrinol. 176:129-134. Svi glikoproteinski hormoni gube svoju biološku aktivnost nakon disocijacije nekovalentno vezanih podjedinica (Alevizaki, M. i Huhtaniemi, I.2002, Structure-function relationships of glycoprotein hormones; lessons from mutations and polymorphisms of the thyrotrophin and gonadotropin subunit genes. Hormones. (Athens.) 1:224-232).

[0106] LH i hCG se vezuju za isti receptor i stoga oba imaju aktivnost LH. Aktivnost LH u hMG uglavnom potiče iz hCG.

[0107] Cilj predmetnog pronalaska je razvoj formulacije gonadotropina kao tečne formulacije za supkutanu injekciju. Za višedozne injekcije, obično je neophodno dodavanje konzervansa (Meyer, B. K., Ni, A., Hu, B. i Shi, L. 2007, Antimicrobial preservative use in parenteral products: past and present. J. Pharm. Sci.96:3155-3167; Chang, B. S. i Hershenson, S. Practical Approaches to Protein Formulation Development. In Rational Design of Stable Protein Formulations. J. F. Carpenter i M. C. Manning, urednici.2002, Plenum Publ., New York.1-25; Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins. 2000, CRC Press, Boca Raton).

[0108] Kao i obično, nativna (biološki aktivna) struktura proteina je veoma osetljiva na okruženje, npr. kompoziciju formulacije, ambalažu/sisteme za zatvaranje, pH i temperaturu; teško je odrediti odgovarajuću tečnu formulaciju za gonadotropine, ispitani su različiti ekscipijensi. U predmetnom radu, ispitan je puferski kapacitet i stabilnost u realnom vremenu različitih formulacija hMG koristeći imunološki test FSH, imunološki test hCG, biotest, RP-HPLC za utvrđivanje oksidovanih proteina, titracija i pH, kako je u nastavku detaljno opisano.

2 Proizvod koji se ispituje

2.1 Materijali

2.1.1 Supstanca leka (drug substance, DS)

2

[0109] Supstancu leka (DS) hMG-HP proizveo je Instituto Massone S.A. Argentina. DS hMG-HP je dobijen kao prašak od kompanije Ferring Pharmaceuticals A/S, Kopenhagen, Danska.

[0110] Utvrđivanje biološke aktivnosti FSH i LH u supstanci leka je obavljeno u skladu sa trenutnom verzijom Britanske farmakopeje (BP). Takođe je moguće, po želji, obaviti ovo utvrđivanje prema verziji USP 35. Biološka aktivnost FSH:LH u hMG je 1:1, i zato se prosečna utvrđena biološka aktivnost FSH i LH koristi prilikom pravljenja leka. Dakle, kada je koncentracija hMG data kao npr.625 i.j./ml, to je jednako biološkoj aktivnosti od 625 i.j./ml FSH i 625 i.j./ml LH.

2.1.2 Ekscipijensi

[0111] Spisak ekscipijenasa korišćenih u ovom radu je opisan u tabeli 1.

Tabela 1 Spisak ekscipijenasa

2

2.1.3 Sistem za zatvaranja ambalaže

[0112] Za studije stabilnosti, primarni materijali za pakovanje bile su staklene bočice sa gumenim zapušačima i alu/plastičnim zatvaračima, ili staklene patrone sa gumenim poklopcem i kapicom za krimpovanje.

3 Postupak proizvodnje

3.1 Pravljenje jedinjenja

[0113] Sve formulacije se proizvode u laboratorijskom obimu.

[0114] Za dobijanje rastvora lekovitog proizvoda (drug product, DP), osnovni rastvori svakog ekscipijensa i supstance leka (DS) su redom pomešani. Pre dodavanja hMG i konačnog

2

razblaženja do zapremine, pH svake formulacije je podešavan, kada je to potrebno. Osnovni rastvori svih ekscipijenasa i hMG su pripremljeni u Milli-Q vodi.

3.2 Sterilna filtracija i aseptično punjenje

[0115] Formulacije za stabilnost su sterilno filtrirane sa Millipore PVDF filterom od 0,22 µm. Sterilna filtracija je obavljana na LAF klupi koristeći autoklavirane supstance.

[0116] Punjenje je vršeno nakon filtracije. Ambalaža je napunjena rastvorom uzorka. Sve bočice i patrone su punjene u aseptičnim uslovima na LAF klupi, i smesta su zatvorene gumenim poklopcem i kapicom za krimpovanje. Izvan LAF klupe, napunjene bočice su zaptivene aluminijumskim preklopnim zatvaračem.

4 Uslovi čuvanja

4.1 Uslovi čuvanja

[0117] Ambalaža koja sadrži formulacije leka čuva se u ubrzanim uslovima do 3 meseca na 30 ± 2 °C/65 ± 5% RV i/ili tokom najmanje 6 meseci na 25 ± 2 °C/60 ± 5% RV. Na svakoj temperaturi čuvanja, ambalaža se skladišti u vertikalnom položaju. Patrone se čuvaju horizontalno. Sva ambalaža je zaštićena od svetlosti.

5 Analitički postupci

[0118] Analitički postupci koji se koriste u studijama opisani su u nastavku.

5.1 Postupak titracije

[0119] Prema USP-NF, kako je prethodno opisano, za rastvor se kaže da je puferovan ako se opire promeni aktivnosti jona nakon dodatka supstanci za koje se očekuje da će promeniti aktivnost tog jona. Puferi su supstance ili kombinacije supstanci koje daju ovu otpornost rastvoru. Puferovani rastvori su sistemi u kojima je jon u ravnoteži sa supstancama koje su sposobne da uklone ili otpuste jon. Puferski kapacitet se odnosi na količinu supstance koja se može dodati rastvoru bez uzrokovanja značajne promene aktivnosti jona. Definiše se kao odnos

2

dodate kiseline ili baze (u gram-ekvivalentima/l) prema promeni u pH jedinicama. Kapacitet puferovanog rastvora je prilagođen uslovima upotrebe, obično putem podešavanja koncentracija puferskih supstanci.

Puferski kapacitet se obično izražava kao broj ekvivalenata (ekv.) jake kiseline ili baze koji dovodi do toga da jedan litar datog rastvora promeni pH za jednu jedinicu, uzimajući jedinicu mekv./(litar×pH) koja je korišćena za određivanje puferskog kapaciteta u predmetnom pronalasku.

To znači da je puferski kapacitet definisan kao broj molova (ekvivalenata) H<+>/OH<->potreban za promenu pH jednog litra puferskog rastvora za jednu jedinicu.

[0120] Puferski kapacitet je utvrđen koristeći placebo (placebo ovde označava formulaciju bez aktivnog sastojka) formulacije podešene na ciljni pH kao početnu tačku. Za titraciju pH naviše ili naniže korišćen je 0,2 N NaOH/HCl. pH je izmeren nakon svakog dodavanja 0,2 N NaOH/HCl i dokumentovana je zapremina 0,2 N NaOH/HCl. Količina 0,2 N NaOH/HCl prikazana je kao X-vrednost, a pH kao Y-vrednost. Postavljena linearna regresija je obavljena oko pH 6,8 za hMG placebo (ciljni pH) i oko pH 6,5 za referentni placebo (ciljni pH). Puferski kapacitet može da se izračuna kao µl 0,2 N HCl/NaOH za pomeranje pH za 0,01 pH jedinicu/l DP i kao miliekvivalenti (mekv.) kiseline ili baze/(litar×jedinica pH), kako je prethodno opisano u definiciji.

5.2 Imunološki test FSH i hCG

[0121] Imunološki test FSH i hCG je određen pomoću sendvič ELFA.

5.3 Oksidovani proteini

[0122] Oksidacija proteina je određena pomoću RP-HPLC.

5.4 pH

[0123] pH je izmeren prema Ph. Eur.

6 Rezultati

[0124] Rezultati studija stabilnosti, procena puferskog agensa u studiji puferskog kapaciteta, kao i rezultati stabilnosti iz studije Dizajna eksperimenta (DoE) predstavljeni su u nastavku.

Tabela 2 Kompozicija tečnih formulacija hMG (600 i.j./ml)

1

6.1 Stabilnost tečne formulacije hMG/3 meseca

[0125] Molekuli proteina mogu da se stabilizuju dodavanjem ekscipijenasa u rastvor, npr. soli, ugljenih hidrata ili aminokiselina, ali stepen stabilizacije nakon dodavanja različitih ugljenih hidrata, soli i aminokiselina u velikoj meri varira između različitih formulacija. Ovde su obavljene početne studije stabilnosti radi ispitivanja različitih stabilizatora u kombinaciji sa konzervansima i puferima u tečnoj formulaciji hMG. Iznenađujuće, rezultati pokazuju

2

poboljšano stabilizujuće dejstvo L-arginina, kako je prikazano u tabeli 3 i 6 za imunološki test hCG, i tabeli 4 i 7 za imunološki test FSH.

[0126] Formulacija E-09 pokazuje poboljšanu stabilnost u poređenju sa svim ostalim formulacijama. Formulacija E-09 je jedina formulacija koja sadrži L-arginin (vidite tabelu 2). Formulacije K-01, K-03 i K-04, kao i K-09, pokazuju poboljšanu stabilnost u poređenju sa svim ostalim formulacijama (vidite tabelu 6). Ove formulacije ponovo sadrže L-arginin (vidite tabelu 5). U tabeli 4, formulacija E-09 ističe se najboljom stabilnošću u poređenju sa svim ostalim formulacijama, takođe u imunološkom testu FSH, a tabela 7 potvrđuje da formulacija K-09 pokazuje najbolji rezultat imunološkog testa FSH u poređenju sa svim ostalim formulacijama.

Tabela 3Imunološki test za hCG tokom 1 meseca čuvanja na 30 ± 2 °C/65 ± 5% RV.

Formulacija E-09 pokazuje bolju stabilnost u poređenju sa svim drugim

formulacijama. Formulacija E-09 sadrži L-arginin, videti tabelu 2.

(Formulacije E-04, E-14 i E-15 isključene iz ispitivanja usled obojenja)

Tabela 4Imunološki test za FSH nakon 3 meseca čuvanja na 30 ± 2 °C/65 ± 5% RV.

Formulacija E-09 pokazuje najbolju stabilnost u poređenju sa svim drugim formulacijama. Formulacija E-09 sadrži L-arginin, videti tabelu 2.

(Formulacije E-04, E-14 i E-15 isključene iz ispitivanja usled obojenja)

6.2 Stabilnost tečne formulacije hMG – 3 meseca

[0127] Od početnog ispitivanja, ispitane su dodatne formulacije sa argininom.

Tabela 5 Studija stabilnosti kompozicije za tečni hMG 600 i.j./ml – pregled formulacija

4

Tabela 6Imunološki test za hCG tokom 3 meseca čuvanja na 25 ± 2 °C/65 ± 5% RV. Formulacije K-01, K-03, K-04 i K-09 pokazuju bolju stabilnost u poređenju sa svim drugim

formulacijama. Formulacije K-01, K-03, K-04 i K-09 sadrže L-arginin, videti tabelu 5.

[0128] Veoma je očigledno da su formulacije koje sadrže L-arginin mnogo stabilnije od onih koje sadrže različite stabilizatore. Uporedite npr. formulacije K-02 i K-03 nakon tri meseca.

Tabela 7 Imunološki test za FSH tokom 3 meseca čuvanja na 25 ± 2 °C/65 ± 5% RV. Formulacija K-09 pokazuje najveći rezultat imunološkog testa za FSH u poređenju sa svim drugim formulacijama. Formulacija K-09 sadrži L-arginin, videti tabelu 5.

[0129] Rezultati za hCG su potvrđeni i za FSH – uporedite npr. formulacije K-02 i K-03 nakon tri meseca.

6.3 Studija puferskog kapaciteta

[0130] Puferski agensi, npr. natrijum fosfat i natrijum citrat, jesu puferi koji se fiziološki tolerišu, i veoma često se dodaju radi održavanja pH u željenom opsegu. Trinatrijum citrat dihidrat i dinatrijum hidrogen fosfat dodekahidrat se ispituju kao puferujući agensi putem puferskog kapaciteta. Puferski kapacitet se izračunava kao količina kiseline ili baze potrebna za pomeranje pH za prethodno definisani pomak, tj. količina µl 0,2 N HCl/NaOH potrebna za pomeranje pH za 1 pH jedinicu/l DP izračunata kao mekv. kiseline ili baze/(litar×jedinica pH), kako je prethodno objašnjeno.

Tabela 8 Studija puferskog kapaciteta kompozicije – pregled formulacija

[0131] Rezultat titracije obavljene radi određivanja puferskog kapaciteta prikazan je na slici 1. Nagib krive prikazuje puferski kapacitet, npr. strmi nagib predstavlja mali puferski kapacitet. Na slici 1 može se uočiti da šarža C-04 (referentna formulacija) ima najmanji puferski kapacitet. U oblasti odgovarajućeg pH 6,8 ± 0,3 za hMG, sve hMG formulacije C-01 (nema pufera), C-02 (5 mM trinatrijum citrat dihidrat) i C-03 (10 mM trinatrijum citrat dihidrat) imaju sličan puferski kapacitet i veći puferski kapacitet od referentne formulacije koja sadrži 1 mM dinatrijum hidrogen fosfat dodekahidrat. Ciljni pH za referentnu formulaciju je 6,5. Formulacije C-01, C-02 i -03 su upoređene sa referencom za koju se zna da ima stabilan pH. Obavljene su brojne studije stabilnosti referentne formulacije C-04 bez uočenih kolebanja pH.

[0132] Sledeća tabela 9 prikazuje rezultate studije puferskog kapaciteta:

Tabela 9 Studija puferskog kapaciteta. U oblasti pH 6,8 relevantnoj za formulaciju za hMG, sve formulacije hMG imaju veći puferski kapacitet od referentne placebo formulacije.

[0133] Iznenađujuće, puferski kapacitet formulacije hMG bez pufera (C-01) veći je nego kod referentne formulacije C-04. Glavna komponenta ekscipijenta u formulaciji hMG je L-arginin u koncentraciji od 120 mM. Vrednosti pKa za L-arginin su pKa1= 2,17; pKa2= 9,04 i pKa3= 12,5 (Handbook of Pharmaceutical Excipients. 2015, Pharmaceutical Press, London). Veoma je neočekivano da arginin pokazuje dovoljno pufersko ponašanje daleko od vrednosti pKa.

6.4 Studije oksidacije

[0134] Nakon 3 meseca čuvanja na 30 ± 2 °C/65 ± 5% RV, formulacija E-09 koja sadrži L-arginin (vidite tabelu 5) ima povećani nivo oksidisanih proteina za 241% od početne vrednosti (vidite tabelu 10 ispod). To je veoma velika količina, a postoje slučajevi kada tako velike količine oksidacije nisu poželjne.

[0135] Stoga su obavljene dalje studije kako bi se istražilo da li se ovaj problem može prevazići.

[0136] Postoji nekoliko izbora antioksidanasa koji se mogu koristiti u formulacijama proteina. Metionin se može dodati da bi se sprečila oksidacija, predloženim mehanizmom takmičenja sa oksidacijom ostataka metionina u proteinima. Rezultat dodavanja metionina formulaciji koja sadrži arginin prikazan je u tabeli 10. Formulacije K-01, K-03, K-04 i K-09 sadrže arginin i metionin, a nivo oksidisanih proteina je očigledno i povoljno smanjen. Formulacija K-01 (sa metioninom) je ista formulacija kao formulacija E-09 (bez metionina). Poredeći ove dve šarže, može se videti da je nivo oksidisanih proteina izuzetno smanjen metioninom.

Tabela 10 Povećanje % oksidisanih proteina od inicijalne vrednosti tokom 3 meseca čuvanja na 30

± 2 °C/65 ± 5% RV. Formulacija E-09 sadrži arginin, ali ne i metionin. Formulacije K-01, K-03, K-04 i K-09 sadrže arginin i metionin, videti tabelu 5.

Oksidovani proteini [% porasta od inicijalne vrednosti]

Formulacija 3 meseca

(Formulacije E-04, E-14 i E-15 isključene usled obojenja)

[0137] Da zaključimo, ove dve studije pokazuju izuzetno stabilizujuće dejstvo arginina i antioksidaciono dejstvo čak i malih količina metionina u formulacijama gonadotropina.

6.5 Studija stabilnosti DoE

4

[0138] Kombinujući rezultate iz prethodnih studija, i studije puferskog kapaciteta, obavljena je DoE studija kako bi se ispitale interakcije između arginina i metionina, i kako bi se utvrdile optimalne koncentracije ova dva ekscipijensa.

Tabela 11 Kompozicije za DoE studiju stabilnosti za tečni hMG 600 i.j./ml – pregled formulacija

6.5.1 Imunološki test FSH

[0139] Rezultati stabilnosti imunološkog testa FSH tokom 3 meseca čuvanja na 25 ± 2 °C/60 ± 5% RV dati su u tabeli 12.

Tabela 12 Rezultati imunološkog testa FSH tokom čuvanja na 25 ± 2 °C/60 ± 5% RV. Kompletan opis svih formulacija dat je u tabeli 11.

[0140] Obavljen je statistički proračun za aktivnost FSH [i.j./ml] kako bi se procenio uticaj i interakcija arginina i metionina. Rezultat statističke procene potvrđuje da L-arginin ima statistički značajan uticaj na rezultate stabilnosti imunološkog testa FSH. Metionin nema statistički značajan uticaj na rezultate stabilnosti imunološkog testa FSH. Ne postoji statistički značajna interakcija između arginina i metionina za ovaj parametar odgovora.

6.5.2 Imunološki test hCG

[0141] Rezultati stabilnosti imunološkog testa hCG tokom 3 meseca čuvanja na 25 ± 2 °C/60 ± 5% RV dati su u tabeli 13.

Tabela 13 Rezultati imunološkog testa hCG tokom čuvanja na 25 ± 2 °C/60 ± 5% RV. Kompletan opis svih formulacija dat je u tabeli 11.

[0142] Obavljen je statistički proračun aktivnosti hCG [i.j./ml] kako bi se procenio uticaj i interakcija arginina i metionina. Rezultat statističke procene potvrđuje da arginin ima statistički značajan uticaj na rezultate stabilnosti imunološkog testa za hCG. Sadržaj metionina ima mali uticaj na 25 °C na rezultate stabilnosti imunološkog testa hCG. Postaje jasno da se pri niskoj (0,1 mg/ml) koncentraciji metionina ne može otkriti dalje povećanje stabilnosti povećanjem

4

koncentracije čak i do 1,5 mg/ml. Ne postoji statistički značajna interakcija između arginina i metionina za ovaj parametar odgovora.

6.5.3 Oksidovani proteini

[0143] U prethodnim studijama stabilnosti iznenađujuće je uočeno da prisustvo arginina ima izuzetno stabilizujuće dejstvo. Međutim, dodavanje arginina dovelo je do povećanog nivoa oksidovanih proteina. Radi sprečavanja ove oksidacije može se dodati metionin, a ova studija istražuje ravnotežu koncentracije između arginina kao stabilizatora i metionina kao antioksidansa.

[0144] Rezultati stabilnosti količine oksidovanih proteina [% porasta od početne] tokom čuvanja tokom 6 meseci na 25 ± 2 °C/60 ± 5% RV i 3 meseca na 30 ± 2 °C/65 ± 5% RV za formulacije sa argininom i metioninom (u rasponu koncentracija 0,1–1,5 mg/ml) dati su u nastavku. Radi poređenja, formulacija E-09 sa argininom i bez metionina takođe je uključena u tabelu 14.

Tabela 14 Rezultati oksidovanih proteina tokom čuvanja na 25 ± 2 °C/60 ± 5% RV i 30 ± 2 °C/65 ± 5% RV. Kompletan opis svih formulacija dat je u tabeli 11.

[0145] Iz tabele 14 iznenađujuće se vidi da su i male količine metionina dovoljne da spreče oksidaciju u čitavom rasponu koncentracija arginina.

6.5.4 Sažetak DoE

[0146] Da bi se zaključili i sumirali rezultati DoE, primenjen je optimizator odgovora u softveru Minitab, vidite sliku 2. Alat za optimizaciju odgovora Minitab pokazuje kako različita podešavanja eksperimentalnih faktora, npr. koncentracije arginina i metionina, utiču na očekivane odgovore, npr. imunološki test za FSH [i.j./ml] i imunološki test za hCG [i.j./ml] za dizajn faktora. Grafikon optimizacije prikazuje dejstvo svakog faktora (kolone) na odgovore (redovi). Vertikalne podebljane linije na grafikonu predstavljaju trenutna podešavanja faktora. Brojevi prikazani na vrhu kolone prikazuju trenutne postavke nivoa faktora (u uglastim zagradama). Vodoravne isprekidane linije i odgovarajući brojevi predstavljaju odgovore za trenutni nivo faktora. Optimizator odgovora će biti zasnovan na rezultatima sa 25 ºC. Rezultat primene optimizatora odgovora prikazan je na slici 2. Najbolja stabilnost (kompozitna poželjnost) postiže se pri visokim koncentracijama arginina i niskim koncentracijama metionina.

6.6 Studija pH

[0147] U studiji puferskog kapaciteta pokazano je da puferujući agens nije neophodan u formulaciji hMG, koristeći samo arginin za stabilizaciju pH u željenom rasponu pH.

4

[0148] Da bi se potvrdilo da se pH održava tokom čuvanja, meren je tokom 6 meseci čuvanja na 25 ± 2 °C/60 ± 5% RV i 3 meseca na 30 ± 2 °C/65 ± 5% RV. Rezultati su navedeni u tabeli 15.

[0149] Ciljni pH za sve formulacije bio je pH 6,8, i pH svih formulacija je bio 6,8 u početnom terminu. pH je bio prilično stabilan, ali je blago porastao na oko 6,9 nakon 2 meseca, i pH od oko 6,9 je održan do 6 meseci čuvanja. Rezultati čuvanja do 6 meseci potvrđuju stabilnost pH u ispitivanom rasponu koncentracija arginina.

Tabela 15 Rezultati studije pH

7 Zaključak

[0150] Veoma iznenađujuće, puferski kapacitet formulacije hMG bez pufera je veći nego kod reference sa 1 mM dinatrijum hidrogen fosfat dodekahidratom. Glavna komponenta ekscipijenta u formulaciji hMG je arginin. Vrednosti pKa za arginin su pKa1= 2,17; pKa2= 9,04 i pKa3= 12,5. Neočekivano je da arginin pokazuje dovoljno pufersko ponašanje daleko od svojih pKa vrednosti. Međutim, rezultati jasno pokazuju da u formulaciji hMG u trenutnom rasponu pH nije potreban dodatni puferujući agens. Samo arginin je dovoljan za održavanje pH u željenom rasponu pH. Stabilnost pH je potvrđena u DoE studiji ispitivanjem raspona

4

koncentracije arginina tokom 6 meseci čuvanja na 25 ± 2 °C/60 ± 5% RV i 3 meseca čuvanja na 30 ± 2 °C/65 ± 5% RV, što je potvrdilo zapažanja iz studije kapaciteta pufera.

[0151] Pokazalo se da dodavanje arginina u tečnu formulaciju hMG iz pronalaska ima izuzetno stabilizujuće dejstvo na tečne formulacije hMG. Međutim, takođe je otkriveno da arginin dovodi do visokog nivoa oksidovanih proteina. Pokazalo se da dodavanje metionina sprečava oksidaciju u poređenju sa formulacijom bez metionina.

[0152] Tokom 6 meseci čuvanja na 25 ± 2 °C/60 ± 5% RV i 3 meseca čuvanja na 30 ± 2 °C/65 ± 5% RV, pokazalo se da čak i mala koncentracija metionina sprečava oksidaciju.

[0153] Zaključujući rezultate ovih studija, jasno se vidi da je dodavanje arginina dovoljno za održavanje pH na željenom nivou pH. Dodatak arginina izuzetno stabilizuje testiranu formulaciju gonadotropina u tečnoj formulaciji. Nijedna druga testirana aminokiselina, šećer ili so nisu pokazali slično stabilizujuće dejstvo. Nivo oksidovanih proteina se značajno povećava dodatkom arginina, međutim, dodatak čak i malih količina metionina sprečava oksidaciju proteina. Iznenađujuće je da su čak i male količine metionina dovoljne da spreče oksidaciju nezavisno od koncentracije arginina.

Primer 2

[0154] Predmetni pronalazači su dalje potvrdili da je pogodna predmetna formulacija iz pronalaska takođe pogodna za stabilizaciju odgovarajuće rekombinantne formulacije gonadotropina.

[0155] U tu svrhu, rekombinantni FSH i rekombinantni hCG (sa sekvencama kako su gore opisane) pripremljeni su u skladu sa dobro poznatim postupcima.

[0156] Obavljena je ubrzana studija stabilnosti za dve formulacije, koja obuhvata rhCG, odnosno rFSH, kako je opisano u nastavku.

[0157] Uočeno iznenađujuće stabilizujuće dejstvo arginina je takođe potvrđeno u rekombinantnim proteinima. I rFSH i rhCG su formulisani u 5 mg/ml fenola, 0,15 mg/ml L-

4

metionina, 150 mM arginin HCI, 0,005 mg/ml polisorbata 20, pH 6,8. Da bi se pojednostavila analiza stabilnosti proteina, rFSH i rhCG su formulisani u različitim sudovima.

Tabela 16:

[0158] Ovo u potpunosti potvrđuje da je predmetna formulacija iz pronalaska sa argininom, ali bez dodatnog pufera, i sa malom količinom metionina pogodna i za stabilizovane rekombinantne gonadotropine.

Primer 3

4

[0159] Obavljena su dalje ispitivanja, naznačeno time što je ispitana sledeća kompozicija:

Tabela 17 Kompozicija tečne formulacije hMG 625 i.j./ml

Stabilnost ciljne formulacije

[0160] Kombinujući sve prethodne rezultate, dobra stabilnost je potvrđena za prethodne formulacije, na sledeći način:

Tabela 18 Imunološki test FSH

±

i

Tabela 19 Imunološki test hCG

4

[0161] Rezultati potvrđuju stabilnost utvrđenu imunološkim testom hCG.

Tabela 20 Oksidovani proteini

pH

[0162] Rezultati stabilnosti pH tokom čuvanja 3 meseca na 25 ± 2 °C/60 ± 5% RV i 12 meseci na 5 ± 3 °C pokazuju stabilan pH.

Tabela 21 Rezultati za pH tokom čuvanja na 25 ± 2 °C/60 ± 5% RV i 12 meseci na 5 ± 3 °C.

Primer 4

[0163] Pored prethodno navedenog, predmetni pronalazači su takođe izveli studiju biološkog testa (6 meseci čuvanja na 25 °C za šarže DoE).

Biološki test FSH (Stilman-Polijev)

[0164] Rezultati stabilnosti biološkog testa FSH tokom 6 meseci čuvanja na 25 ± 2 °C/60 ± 5% RV navedeni su u tabeli 22.

Tabela 22 Rezultati biološkog testa FSH tokom čuvanja na 25 ± 2 °C/60 ± 5% RV. Kompletan opis svih formulacija dat je u tabeli 11.

[0165] Rezultati potvrđuju stabilnost, kako je utvrđeno biološkim testom FSH.

Biološki test LH (povećanje težine semenih vezikula)

[0166] Rezultati stabilnosti biološkog testa LH tokom 6 meseci čuvanja na 25 ± 2 °C/60 ± 5% RV navedeni su u tabeli 23.

Tabela 23 Rezultati biološkog testa LH tokom čuvanja na 25 ± 2 °C/60 ± 5% RV. Kompletan opis svih formulacija dat je u tabeli 11.

1

[0167] Rezultati potvrđuju stabilnost, kako je utvrđeno biološkim testom LH.

[0168] Nadalje, kompozicija iz Primera 3 je takođe ispitana u biološkom testu FSH i LH, dajući sledeće rezultate:

Rezultati stabilnosti biološkog testa FSH tokom čuvanja 3 meseca na 25 ± 2 °C/60 ± 5% RV i 12 meseci na 5 ± 3 °C navedeni su u tabeli 24:

Tabela 24: Rezultati biološkog testa FSH tokom čuvanja na 25 ± 2 °C/60 ± 5% RV i 12 meseci na 5 ± 3 °C.

[0169] Rezultati potvrđuju stabilnost utvrđenu biološkim testom FSH.

[0170] Rezultati stabilnosti biološkog testa LH tokom čuvanja 3 meseca na 25 ± 2 °C/60 ± 5% RV i 12 meseci na 5 ± 3 °C navedeni su u tabeli 25.

2

Tabela 25 Rezultati biološkog testa LH tokom čuvanja na 25 ± 2 °C/60 ± 5% RV i 12 meseci na 5 ± 3 °C.

[0171] Rezultati potvrđuju stabilnost utvrđenu biološkim testom LH.

8 Skraćenice i definicije

[0172]

BP Britanska farmakopeja

DoE Dizajn eksperimenta

DS Supstanca leka

FSH Folikulostimulišući hormon

hCG Humani horionski gonadotropin

hMG Humani menopauzalni gonadotropin

hMG-HP Humani menopauzalni gonadotropin – veoma prečišćen

JP Japanska farmakopeja

LH Luteinizujući hormon

MD Višedozni

NF Nacionalni registar odobrenih lekova

Ph Eur Evropska farmakopeja

PS 20 Polisorbat 20

USP Farmakopeja SAD

WFI Voda za injekciju

4

Claims (15)

Patentni zahtevi

1. Tečna farmaceutska formulacija gonadotropina, koja sadrži gonadotropin, arginin u količini od 50 do 160 mM, i metionin u količini od 0,05 do 1,5 mg/ml, naznačeno time što formulacija ne sadrži dodatni pufer, i naznačeno time što je pH formulacije između 6,0 i 7,5.

2. Farmaceutska formulacija iz zahteva 1, naznačena time što gonadotropin sadrži hCG (humani horionski gonadotropin), i opciono FSH i/ili LH.

3. Farmaceutska formulacija iz zahteva 1 ili 2, naznačena time što gonadotropin sadrži hMG (humani menopauzalni gonadotropin).

4. Farmaceutska formulacija iz bilo kog od zahteva 1 do 3, naznačena time što gonadotropin sadrži FSH, LH i/ili hCG ljudskog porekla dobijen iz urina.

5. Farmaceutska formulacija iz bilo kog od zahteva 1 do 3, naznačena time što gonadotropin sadrži rekombinantni FSH, LH i/ili hCG.

6. Farmaceutska formulacija iz bilo kog od prethodnih zahteva, koja dodatno sadrži konzervans, poželjno fenol.

7. Farmaceutska formulacija iz bilo kog od prethodnih zahteva, koja dodatno sadrži površinski aktivni agens, poželjno polisorbat, još poželjnije polisorbat 20.

8. Farmaceutska formulacija iz zahteva 6 ili 7, naznačena time što je konzervans, poželjno fenol, sadržan u količini od 4–6 mg/ml, poželjno u količini od 5 mg/ml.

9. Farmaceutska formulacija iz zahteva 7 ili 8, naznačena time što je površinski aktivan agens, poželjno polisorbat 20, sadržan u količini od 0,001–0,05 mg/ml, poželjno u količini od 0,005 mg/ml.

10. Farmaceutska formulacija iz bilo kog od prethodnih zahteva, naznačena time što je arginin poželjno L-arginin HCl.

11. Farmaceutska formulacija iz bilo kog od prethodnih zahteva, naznačena time što je hMG sadržan u količini od 300–900, poželjno 500–700, i.j./ml.

12. Farmaceutska formulacija iz bilo kog od prethodnih zahteva, koja se sastoji od

- 625 i.j./ml hMG

- 0,15 mg/ml metionina

- 150 mM arginina

- 5 mg/ml fenola

- 0,005 mg/ml polisorbata 20

- vode za injekciju (WFI), i

- naznačeno time što formulacija ima pH 6,8 /- 0,3.

13. Tečna farmaceutska formulacija kako je opisana u bilo kom od prethodnih zahteva, za upotrebu u postupku za lečenje neplodnosti.

14. Farmaceutska formulacija za upotrebu iz zahteva 13, naznačena time što lečenje je lečenje indukovanjem ovulacije (OI), tehnikama asistirane reprodukcije (ART) i/ili hipogonadotropnog hipogonadizma kod muškaraca.

15. Postupak za stabilizaciju tečne farmaceutske formulacije koja sadrži hMG, koji uključuje korak

- obezbeđivanja uzorka urina žene,

- ekstrahovanja hMG iz uzorka,

- mešanja navedenog ekstrakta sa argininom i metioninom, u količinama koje su definisane u bilo kom od prethodnih zahteva,

- opcionog daljeg dodavanja fenola i polisorbata u količinama koje su definisane u bilo kom od prethodnih zahteva,

- podešavanja pH formulacije između 6,0 i 7,5,

- naznačeno time što se ne dodaje dodatni pufer.