RS61646B1 - Antitela specifična za hiperfosforilisan tau i postupci njihove primene - Google Patents

Antitela specifična za hiperfosforilisan tau i postupci njihove primene

Info

Publication number
RS61646B1
RS61646B1 RS20210397A RSP20210397A RS61646B1 RS 61646 B1 RS61646 B1 RS 61646B1 RS 20210397 A RS20210397 A RS 20210397A RS P20210397 A RSP20210397 A RS P20210397A RS 61646 B1 RS61646 B1 RS 61646B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
seq
antibody
amino acid
acid sequence
tau
Prior art date
Application number
RS20210397A
Other languages
English (en)
Inventor
Jan Torleif Pedersen
Kristian Kjaergaard
Lars Østergaard Pedersen
Ayodeji Abdur-Rasheed Asuni
Nina Helen Rosenqvist
Justus Claus Alfred Daechsel
Karsten Juhl
Lena Tagmose
Mauro Marigo
Thomas Jensen
Søren Christensen
Laurent David
Christiane Volbracht
Lone Helbo
Original Assignee
H Lundbeck As
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by H Lundbeck As filed Critical H Lundbeck As
Publication of RS61646B1 publication Critical patent/RS61646B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G01N2800/2821—Alzheimer

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Cardiology (AREA)

Description

Opis
OBLAST OVOG PRONALASKA
[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na novu klasu monoklonalnih antitela koja specifično vezuju fosforilisan serinski 396 ostatak na patološkom hiperfosforilisanom (PHF) tau (pS396), kao i na postupke korišćenja ovih molekula i njihove tau vezujuće fragmente u lečenju Alchajmerove bolesti i tauopatija.
POZADINA OVOG PRONALASKA
[0002] Neurodegenerativne bolesti povezane sa uzrastom kao što su Alchajmerova bolest (AB) i demencija predstavljaju jedan od najvećih društvenih izazova današnjice. Svetska zdravstvena organizacija ocenjuje da će troškovi za brigu o starima nastaviti da rastu i da se će se broj slučajeva demencije utrostručiti do 2050. godine (Svetska zdravstvena organizacija i međunarodni statusni izveštaj o Alchajmerovoj bolesti (2012) DEMENCIJA: Javno zdravstveni prioritet, SZO). Prve terapije za AB su predstavljali neurotransmiterski modulatori kao što su inhibitori acetilholinske esteraze i NMDA modulatori. Ove terapije su postale dostupne početkom ovog milenijuma i dalje predstavljaju kamen temeljac za simptomatsko ublažavanje nedostataka pamćenja povezanih sa demencijom i AB. Međutim, ovi lekovi ne ciljaju osnovne uzroke AB: akumulacija amijloidnog-β (Aβ) peptida i agregata tau proteina i povezanog gubitka neuronskih sinapsi i vremenom neurona.
[0003] Longitudinalna ispitivanja starih rasprostranjena u društvu (Weiner, M.W. et al. (2014) ADNI online: http://www.adni-info.org/; Breteler, M.M. et al. (1992) Neuroepidemiology 11 Suppl 1, 23-28; Launer, L.J. (1992) Neuroepidemiology 11 Suppl 1, 2-13) zajedno sa velikim ispitivanjima povezanosti genoma (Lambert, J.C. et al. (2013) Nat. Genet.45, 1452-1458) su pokazala da AB predstavlja heterogenu mešavinu demencija pri čemu do 10 procenata pacijenata sa naprednom AB nedostaje amiloidna patologija (Crary, J.F. et al. (2014) Acta Neuropathol.128, 755-766). Dalje, uticajna patološka ispitivanja od strane Braak & Braak (Braak, H. and Braak, E. (1996) Acta Neurol. Scand. Suppl 165, 3-12) su pokazala jasnu korelaciju između stepena patologije neurofibrilarnog klupka i kognitivnog stanja pre autopsije. Ova opažanja su pojačana od strane nekoliko istraživača (Nelson, P.T. et al. (2012) J.
Neuropathol. Exp. Neurol.71, 362-381), i u novijom longitudinalnim ispitivanjima biomarkera, koja ukazuju da se nivoi cerebrospinalne tečnosti (CSF) tau i hiperfosforilisanog tau povećavaju tokom ranih i kasnijih faza bolesti (Jack, C.R., Jr. et al. (2013) Lancet Neurol.12, 207-216).
[0004] Kako je gore naznačeno, protein povezan mikrotubulom, tau, i njegova hiperfosforilisana verzija, čine glavni konstituent intracelularne neurofibrilarne klubadi, koja predstavljaju jedan od glavnih obeležja AB. Dalje, specifične genetske tau varijante su povezane sa srodnim oblicima frontotemporalne demencije (FTD). Izgled tau patologije kod AB se javlja u različitom prostornom modelu, počevši od entorinalnog korteksa, praćenog hipokampalnim i kortikalnim oblastima (Braak, H. i Braak, E. (1996) Acta Neurol. Scand. Suppl 165, 3-12). Konkretna faza tau patologije je takođe povezana dobro sa kognitivnim mogućnostima (Nelson, P.T. et al. (2012) J. Neuropathol. Exp. Neurol.71, 362-381; Braak, E. et al. (1999) Eur. Arch. Psychiatry Clin. Neurosci.249 Suppl 3, 14-22). Uzeti zajedno, ovaj dokaz predstavlja osnovu hipoteze bazirane na tau za AB. Ona podrazumeva da intracelularna akumulacija tau dovodi do mikrotbularne degradacije i spinalnog kolapsa. Kao rezultat, javlja se komunikacija između nefunkcionisanja neurona i ćelijske smrti. U novije vreme, takođe je pokazano da sam tau može da obrazuje endo-patogene vrste koje mogu da prenesu neurodegeneraciju sa jedne ćelije na sledeću (Clavaguera, F. et al. (2009) Nat. Cell Biol.11, 909-913).
I. Tau kao endo-patogen
[0005] Clavaguera i kolege su pokazali da sam tau može da dejstvuje kao endo-patogen (Clavaguera, F. et al. (2009) Nat. Cell Biol.11, 909-913). Ekstrakti mozga sa malim okretanjem su izolovani iz P301S tau transgenih miševa (Allen, B. et al. (2002) J. Neurosci.22, 9340-9351), razblaženi i ubrizgani u hipokampus i kortikalne oblasti mladih ALZ17 miševa. ALZ17 miš predstavlja tau transgenu mišju liniju koja samo razvija kasnu patologiju (Probst, A. et al. (2000) Acta Neuropathol.99, 469-481). Ubrizgani ALZ17 miševi su brzo razvili čvrstu filamentoznu patologiju, a davanje tau imuno-deplecionih moždanih ekstrakata P301S miševa ili ekstrakata miševa divljeg tipa nije indukovalo tau patologiju. Frakcionacija moždanih ekstrakta u rastvorljivom (S1) i tau nerastvorljivom u sarkozilu (P3) (Sahara, N. et al. (2013) J. Alzheimer's. Dis.33, 249-263) i ubrizgavanje ova dva u ALZ17 miševe je pokazalo da je P3 frakcija najkompetentnija prilikom indukovanja patologije. Sadrži najviše intracelularniog hiperfosforilisanog filamntoznog tau. Većina patologije bi takođe mogla biti indukovana kada se ubrizgavaju P301S ekstrakti u mozgove miševa divljeg tipa, ali nije došlo do stvaranja NFT-ova. U naknadnim ispitivanjima, Clavaguera et al. su pokazali da humani tau ekstrahovan iz post-mortem moždanog tkiva drugih tauopatija (bolest argirofilnih zrnaca (AGD), progresivna supranuklearna palsija (PSP), i kortikobazalna degeneracija (CBD)) takođe mogu da indukuje tau patologiju u ALZ17 modelu (Clavaguera, F. et al. (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.110, 9535-9540). Od predstavljanja ovih podataka, prijavljeno je nekoliko drugih modela tau zasejavanja i širenja (Ahmed, Z. et al. (2014) Acta Neuropathol.127, 667-683; Walker, L.C. et al. (2013) JAMA Neurol.70, 304-310). Glavni zaključak iz ovih ispitivanja ukazuje da mehanizam prema kojem patogeni tau u intracelularnim inkluzijama je izlučen iz ćelije u periplazmatski prostor. Patološki tau materijal je zatim prenesen zajedno sa vezikularnim omotačem i u anterogradnom i retrogradnom smeru i naknadno su ga sakupile susedne ćelije pomoću rasute endocitoze. Ovaj mehanizam objašnjava zašto širenje patologije primećeno u humanoj bolesti prati različiti anatomski model. Zanimljivo, periferno davanje patološkog tau može da ubrza stvaranje tau patologije kod ALZ17 miševa (Clavaguera, F. et al. (2014) Acta Neuropathol.127, 299-301). Ovaj mehanizam širenja može da objasni napredovanje bolesti u drugim proteinopatijama (Goedert, M. et al. (2010) Trends Neurosci.33, 317-325; Sigurdsson, E.M. et al. (2002) Trends Mol. Med.8, 411-413).
II. Tau vrste
[0006] Otkriće da tau protein može da dejstvuje kao endo-patogen je izazvalo potragu za "patogenim vrstama" koje mogu da budu ciljane u potencijalnim interventnim terapijama.
[0007] Gen tau proteina povezan sa mikrotubulom (MAPT) je lociran na hromozomu 17 humanog genoma i eksprimira šest izoforma tau proteina u mozgu odraslog čoveka. Ovi izoformi proističu iz alternativnog splajsovanja eksona 2, 3 i 10 od 16 eksona unutar MAPT gena. Eksoni 2 i 3 eksprimiraju 29-aminokiselinsko ponavljanje a ekson 10 eksprimira dodatni mikrotubularni vezujući domen. Kao rezultat, tau izoformi će sadržati 0, 1 ili 2 N-terminalnih ponavljanja i 3 ili 4 C-terminalnih mikrotubularnih vezujućih domena (3R ili 4R tau). Uobičajenih šest izoforma tau su eksprimirani. Najduži (2N4R) i najkraći (ON3R) izoformi se sastoje od 441 i 352 aminokiselina, redom (Kolarova, M. et al. (2012) Int. J. Alzheimers. Dis.2012, 731526). Domen projekcija N-terminala iz tau (2N4R) se sastoji od 44-aminokiselinska repa bogata glicinom a ostaci 45-102 obuhvataju izuzetno kisele regione (N1, N2-domene). Dva regiona bogata prolinom mogu da se pronađu u ostacima 151-243 (P1, P2 domeni ). Ostatak proteina je sačinjen od četiri mikrotubularna vezujuća domena (R1-R4), praćena kratkim C-terminalnim regionom.
[0008] Tau je rastvorljiv i protein koji izuzetno podložan fosforilaciji. Približno 20 procenata ili 85 aminokiselinskih ostataka u najdužem izoformu tau predstavljaju potencijalna (Ser, Thr ili Tyr) mesta za fosforilaciju. Za približno polovinu ovih je primećeno da su eksperimentalno fosforilisani (Hanger, D.P. et al. (2009) Trends Mol. Med.15, 112-119; Hasegawa, M. et al. (1992) J. Biol. Chem.267, 17047-17054),a mesta za fosforilaciju su grozdasto nakupljena oko terminalnih ostataka mikrotubularnih vezujućih domena. Tau je dinamički fosforilisan i de-fosforilisan tokom ćelijskog ciklusa. Mora da se razdvoji od mikrotubula kako bi se omogućila mitoza. Njegova glavna uloga u postmitotičnim ćelijama (diferenciran neuron) je da dejstvuje kao mikrotubularni stabilizator, čime se omogućava optimalni aksonalni transport. Jedino može da se poveže sa mikrotubulama u svom uglavnom defosforilisanom obliku, čime fosforilacija dejstvuje kao direktna sklopka mikrotubularne asocijacije/disocijacije unutar neurona. U normalnim uslovima, citosolni tau sadrži u proseku dva fosforilisana mesta. U uparenom spiralnom vlaknastom materijalu, fosforilisano je najmanje 7-8 mesta (Hanger, D.P. et al. (2009) Trends Mol. Med.
15, 112-119; Hasegawa, M. et al. (1992) J. Biol. Chem.267, 17047-17054). Hiperfosforilisani, upareni spiralni filamentozni tau predstavlja ključno obeležje Alchajmerove bolesti (Kosik et. al. (1986) PNAS, 86, 4044-4048), pri čemu je uočen izraziti pomak pokretljivosti hiperfosforilisanog tau u imunocitohemijskoj analizi moždanog materijala čoveka sa AB.
[0009] Bilo je teško izučavati tau protein pomoću tradicionalnih strukturnih tehnika kao što je kristalografija X-zracima ili NMR spektroskopija, čime se odražava meta-stabilna struktura. Takva ispitivanja su uglavnom sprovedena na fragmentima domena nefosforilisanog tau proteina. Jedino strukturno ispitivanje do danas na tau pune dužine (2N4R), NMR spektroskopijom, otkriva da taj protein sadrži samo retke ogrebotine stabilne sekundarne strukture (Mukrasch, M.D. et al. (2009) PLoS. Biol.7, e34). Ova analiza ukazuje da sekundarna struktura okosnice peptida ima veliku sklonost ka podešavanju strukture β-listova. Prvih 200 ostataka okosnice su značajno bolje uređene od C-terminusa koji obuhvata mikrotubularne vezujuće domene. Prisustvo mnogih specifičnih veliko-opsežnih interakcija unutar proteina u rastvoru ukazuje da postoji u uglavnom neuređenom rastopljenom globularnom stanju (Ohgushi, M. and Wada, A. (1983) FEBS Lett.164, 21-24).
[0010] Proizvodi proteaze tau koje generišu naročito kaspaza i kalpain (Asp13, Glu391 i Asp421) su identifikovani u materijalu klupka (Gamblin, T.C. et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.100, 10032-10037). Određenije, skraćivanje na Asp421 je ispitano do detalja pomoću tau C3 antitela, koje se vezuje za slobodan Asp421 terminus. Ovo odsecanje je uzeto kao polazište za rani događaj u patogenezi AB povezanoj sa indukcijom apoptoze (deCalignon A. et al. (2010) Nature 464, 1201-1204). Cepanje N-terminala na Asp13 i cepanje C-terminala na Glu391 se smatra kasnim događajima u patogenezi (deCalignon A. et al. (2010) Nature 464, 1201-1204; Delobel, P. et al. (2008) Am. J. Pathol.172, 123-131). U novije vreme, dodatni fragment N-terminala (ostaci 1-224) je identifikovan u CSF od pacijenata koji imaju AB i PSP, i hipotetički je uzet kao rani marker bolesti i naročito patogen (US14/092539; Bright, J. et al. (2014) Neurobiol. Ageing, 1-17). Sličan fragment otcepljen od kalpaina je prijavljen u drugim grupama (Ferreira, A. i Bigio, E.H. (2011) Mol. Med.17, 676-685; Reinecke, J.B. et al. (2011) PLoS. One.
6, e23865).
[0011] Pored hiperfosforilacije i tau fragmentacije, post-translaciona acetilacija (Cohen, T.J. et al. (2011) Nat. Commun.2, 252; Min, S.W. et al. (2010) Neuron 67, 953-966) i O-GIcNAcilacija (Zhu, Y. et al. (2014) J. Biol. Chem.) su predložene da budu postupci za definisanje patologije u stvaranju patologije klupka povezane sa AB.
III. Tau Imunoterapije
[0012] Imunoterapije su tradicionalno podeljena na pasivni i aktivni pristup vakcini. U aktivnom pristupu vakcinom patogeni agens ili njegov neaktivisani patogeni oblik, je ubrizgan u pacijenta i imuni sistem izaziva imunološki odgovor. Ovo pokreće sazrevanje B-ćelija koje stvaraju antitela visokog afiniteta ili celularni odgovor na dati antigen. U pasivnom vakcinalnom pristupu, pokretanje imunog sistema se zaobilazi infuzijom specifičnog antitela protiv antigena. Inherentni sistem za klirens zatim uklanja ligand vezan za antitelo.
[0013] AC Immune prati mišje monoklonalno antitelo protiv fosfoserinskog 409 iz tau. Antitela su profilisana protiv humane AB i kontrolnog moždanog tkiva i izabrana su na osnovu mogućnosti da se prepozna patologija klupka. Humanizovana verzija dva antitela, hACI-36-2B6-Ab1 i hACI-36-3A8-Ab1, pri čemu se oba vezuju za tau epitop unutar aminokiselina 401-418 (WO 2013/151762).
[0014] Grupa Rodžera Niča je izolovala tau auto-antitela iz starijih pojedinaca bez znaka degenerativne tauopatije. Izolovano je dosta antitela upotrebom rekombinantnog humanog tau pune dužine (2N4R) kako bise pronašla tau specifična antitela. Ova antitela su zatim pregledana zbog njihove mogućnosti da diskriminišu tau izolate iz bolesti i zdravih pojedinaca. Tri vodeća antitela, 4E4, 4A3 i 24B2, su opisana u patentnoj literaturi (WO2012049570; US2012087861). Njihovo mapiranje epitopa ukazuje da svi prepoznaju aminokiseline unutra i na C-terminalnom mikrotubularnom vezujućem regionu, od položaja V339 do K369. Ova antitela ne ispoljavaju bilo kakvu fosfo-specifičnost.
[0015] C2N Diagnostics se uglavnom fokusira na razvijanju dijagnostičkih alata za ranu detekciju neurodegenerativne bolesti. Antitela su generisana protiv humanog i mišjeg tau proteina pune dužine. Osam i pet antitela je identifikovano, koja prepoznaju humani i mišji tau, tim redom (Yanamandra, K. et al. (2013) Neuron 80, 402-414). Tri antitela različite vezujuće kinetike su izabrana zbog in vivo procene. Naime, HJ9.3, HJ9.4 i HJ8.5, koji prepoznaju ostatke tau 306-320, 7-13 i 25-30, tim redom, uz poslednji (HJ8.5) koji je specifičan za humani tau. Antitela su takođe izabrana na osnovu njihove mogućnosti da se spreči prenos patologije u genijalnom mehanicističkom reporterskom ispitivanju transcelularnog umnožavanja tau (Sanders, D.W. et al. (2014) Neuron 82, 1271-1288; Kfour, N. et al. (2012) J. Biol. Chem.287, 19440-19451). Njihova procena u ispitivanjima hronične i.c.v. injekcije kod P301S transgenih miševa je pokazala njihovu sposobnost da smanje nivoe hiperfosforilisanog tau proteina kako je određeno imunohistohemijskom analizom tretiranih miševa.
[0016] Antitela Piter Dejvisa su razvijena originalno kao alati za dijagnostiku koji mogu da naprave razliku između patološkog i normalnog tau u AB i kontrolnom moždanom materijalu (Greenberg, S.G. i Davies, P. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.87, 5827-5831). Procena terapijske iskoristivosti PHF1 i MC1 antitela je potvrđena u P301S i JPNL3 (P301L) (Boutajangout, A. et al. (2011) J. Neurochem.118, 658-667; Chai, X. et al. (2011) J. Biol. Chem.286, 34457-34467; D'Abramo, C. et al. (2013) PLoS. One.8, e62402 miševi). PHF1 prepoznaje linearni fosfo-tau epitop (pS396, pS404) dok MC1 predstavlja antitelo koje je zavisno od konformacije koje prepoznaje strukturni tau epitop koji zahteva dva izrazita dela linearne sekvence, epitop unutar ostataka 46-202 i C-terminalni epitop između ostataka 312-342 (Jicha, G.A. et al. (1997) J. Neurosci. Res.48, 128-132). Ubrizgavanje ova dva antitela u ispitivanjima hronične 12-13-nedeljne imunizacije je za rezultat imalo suštinsko smanjenje kičmene moždine i patologije moždanog stabla između ostalih drugih regija mozga, koja su prevedena u atenuaciju motoričkog nedostatka koji je primećen kod ovih miševa. (D'Abramo, C. et al. (2013) PLoS. One.8, e62402).
[0017] iPerian / Bristol Meyers Squibb je razvio tau antitela protiv pretpostavljene patološki tau vrste, koja se sastoji od tau fragmenta N-terminala (etau: ostaci 1-224), koja je promovisala hiperaktivnost kod indukovanih pluripotentnih matičnih ćelija baziranih na neuronskim kulturama. Portfolio antitela je razvijen, ali karakterizacija je fokusirana na antitela IPN001 i IPN002 koja prepoznaju N-terminalni epitop unutar ostataka 9-18. S tim u vezi, ova antitela detektuju povišene tau nivoe u CSF od pacijenata sa AB i PSP koji su u nekoj fazi koji mogu biti rani znak bolesti. In vivo ubrizgavanja antitela u JPNL3 (P301L) miševe su dovela do delimičnog poništenja progresivnih motoričkih nedostataka (US14/092539).
[0018] Ejnar Sigurdson je prijavio prvi program kako bi se pokazala efikasnost imunoterpaije bazirane na tau. Aktivna vakcina tau paptida 379-408[pS396, pS404] zajedno sa Adju-Phos adjuvansom je korišćena kako bi se imunizovali JPNL3 (P301L) miševi. U ovom ispitivanju značajno smanjenje tau patologije je primećeno kod miševa tretiranih vakcinom u poređenju sa kontrolnim životinjama. Atenuacija motoričkog fenotipa povezanog sa tauopatijom je takođe detektovana. Njena efikasnost je potvrđena u različitom mišjem modelu (htau/PS1) kojim ne upravlja mutantni tau (Boutajangout, A. et al. (2011) AAIC 2011 (7, issue 4, Supplement edn) p. s480-s431; Congdon, E.E. et al. (2013) J. Biol. Chem.288, 35452-35465; Gu, J. et al. (2013) J. Biol. Chem.288, 33081-33095).
[0019] Prothena je procenjivala tri tau antitela kod K369I (K3) transgenog tau miša i kod modela P301L miša. Antitela sa različitim svojstvima su izabrana zbog in-vivo procene. Dva pS404-specifična antitela različitih izotipova (IgG1/k i IgG2a/k) ili ukupna (pan) anti-tau antitela (IgG1/k) su ubrizgana u hroničnu paradigmu. K369I miševi su tretirani nedeljnim ubrizgavanjima tokom 21 nedelje počevši od starosti od 3 nedelje, a P301L miševi su tretirani tokom 7 meseci nedeljnim ubrizgavanjima počevši od 4 meseca starosti. Smanjenje tau-pozitivnih neurofibrilarnih inkluzija je primećeno kod K3 miševa sa IgG2a/k pS404 antitelom. Oba pS404-specifična antitela su mogla da smanje nivo pS422-pozitivnog tau, dok nije primećeno smanjenje kod miševa tretiranih pan tau antitelom. Ova ispitivanja ukazuju da: 1) tau klirens može da zavisi od izotipa antitela, i; 2) da može biti važno da se cilja tau vrsta koja je relevantna za bolest, jer ukupno anti-tau antitelo nije moglo da smanji hiperfosforilisani tau (PCT/US2014/025044).
[0020] Komercijalno mišje anti-Fosfo-Tau 396 antitelo je otkriveno u katalogu Invitrogen-e br.35-5300, od 1. oktobra 2008. godine (2008-10-01).
[0021] Komercijalno antitelo Anti-Tau (fosfo S396) je otkriveno u katalogu proizvoda Abcam-a, od 1. januara 2014. godine (2014-01-01).
[0022] WO 2012/045882 otkriva pS396 specifična antitela A4-2A1 -18, A4-2A1-40, A4-4A6-18, A6-1 D2-12.
[0023] WO 2013/050567 otkriva anti-Tau specifična antitela koja se vezuju za pS396: ACI-35-2A1-Ab1 ; ACI-35-2A1 -Ab2, ACI-35-4A6-Ab1, ACI-35-1 D2-Ab1,ACI-35-2G5-Ab2; ACI-35-2G5-Ab3 i ACI-35-205-Ab1.
[0024] ROSSEELS ET AL., J. Bio Chem, vol.290, no.7, 24 December 2014 (2014-12-24), pages 4059-4074, otkriva komercijalno dostupna anti-Ser(P)396 specifična Ab P-S396.
[0025] Pronalazači ovog pronalaska su iznenađujuće pronašli da su antitela specifična za fosforilisani serinski ostatak 396 (pS396) efikasna kod modela bolesti; ovo je u suprotnosti sa stanjem tehnike antitela koja prepoznaje prevashodno tau proteine fosforilisane i na 396 i 404 ostacima, fosforilisane na 404 ostatku samo ili na drugim ostacima na tau.
[0026] Pronalazači su razvili antitela koja dalje imaju značajnu specifičnost i selektivnost za humani patološki tau. Ovde otkrivena antitela pokazuju mnogo veći stepen specifičnosti i selektivnosti prema humanom patološkom tau u poređenju sa antitelima iz WO2013/050567 (videti Fig.1 od WO2013/050567). Antitela iz WO2012/045882 za koja je prijavljeno da imaju specifično vezivanje, su dobijena od 6 do 9 ostatka aminokiselinske sekvence tau aminokiselina 393-401, 396-401, 394-400 i 393-400. Ovi kontrasti iz antitela otkrivenih ovde koji su izazvani protiv patogenog hiperfosforilisanog tau koje obuhvata dužu aminokiselinsku sekvencu kako je ovde opisano.
[0027] Dalje, antitela i njihovi epitop-vezujući fragmenti, otkriveni ovde pokazuju mnogo poželjnije karakteristike kao što je mogućnost da se pravi razlika između patološkog i nepatološkog humanog tau proteina, i određenije da se vezuje tau povezan sa Alchajmerovom (AB) patologijom. U elektrofiziološkim ispitivanjima, antitela, i njihovi fragmenti vezujućih epitopa, ovde otkriveni su mogli preokrenuti smanjeno upareno olakšavanje pulsa i spontanu minijaturnu uzbudnu sinaptičku struju (mEPSC).
KRATAK SADRŽAJ OVOG PRONALASKA
[0028] Ovaj pronalazak je definisan zahtevima. Otkrivanje koje obuhvata pronalazak se odnosi na monoklonalna antitela, i njihove epitop-vezujuće fragmente, koji mogu da se specifično vezuju za fosforilisani serinski ostatak 396 humanog (2N4R izoform) tau (SEQ ID NO:1). Antitela su dalje karakterisana njihovom mogućnošću da prave razliku između fosforilisanih ostataka 396 i 404 tako da se suštinski ne vezuju za fosforilisani 404 ostatak.
[0029] Antitela ovog otkrivanja su selektivna za patološki tau u prisustvu nepatološkog a opet fosforilisanog tau. Antitela ovog otkrivanja mogu selektivno da iscrpe tau klubad patološkog tau u prisustvu normalnog tau. Nevezujući se za neku određenu teoriju, veruje se da depleciona tau klubad koja obuhvataju tau protein koji je fosforilisan na tau položaju 396 sprečavaju zasejavanje patološkog tau u tau klubad. Shodno tome, jedan aspekt ovog otkrivanja se odnosi na antitelo koje može selektivno da se vezuje za 396-fosforilisani tau čak i kada su takvi molekuli u prisustvu tau proteina koji je fosforilisan na tau položaju 404. Povezani aspekt ovog otkrivanja se odnosi na antitelo koje može selektivno da se vezuje za 396-fosforilisani tau čak i kada su takvi molekuli u prisustvu nepatogenog tau. Dalje definisano, ovo otkrivanje se odnosi na antitelo selektivno za patološki tau pri čemu je pomenuti patološki tau hiperfosforilisan tau koji se prikazuje kao 64 kDa traka (Vestern Blot analizom) kod transgenih miševa koji prekomerno eksprimiraju humani 2N4R izoform tau.
[0030] Jedan aspekt ovog otkrivanja je usmeren na anti-tau antitelo koje, kada se koristi sa imunodeplecionim rTg4510 ekstraktima od transgenih miševa, specifično smanjuje hiperfosforilisan tau 64 kDa i 70 kDa trake za najmanje 90%, pri čemu se smanjuje 55 kDa tau traka za najviše 10%. Dalji aspekt ovog otkrivanja je usmeren na anti-tau antitelo koje specifično smanjuje hiperfosforilisan tau 64 i 70kDa trake za najmanje 90%, pri čemu se smanjuje 55 kDa tau traka za najviše 10%; ili sposobnost, kada se koristi kako je ovde opisano sa ekstraktima iz mozga pojedinaca sa AB post-mortem, da specifično smanji pS396 hiperfosforilisane tau trake za najmanje 90%, pri čemu se ne smanjuju nehiperfosforilisane tau trake za više od 10%.
[0031] Drugi aspekt ovog otkrivanja je usmeren na postupak lečenja pacijenta sa taupatijom, kao što je Alchajmerova bolest, koje obuhvata depleciju klupka ili atenuisanje progresije pomenutog klupka, pri čemu pomenuto klupko obuhvata hiperfosforilisani Tau, pri čemu pomenuti postupak obuhvata stupanje u kontakt hiperfosforilisanog Tau sa antitelom ovog otkrivanja tako da je klupko iscrpljeno, sadržaj hiperfosforilisanog tau mu je smanjen ili je progresija stvaranja klupka atenuisana.
[0032] Alternativno definisano, ovo otkrivanje se odnosi na postupak lečenja pacijenta sa taupatijom, kao što je Alchajmerova bolest, pri čemu pomenuti postupak obuhvata stupanje u kontakt klubadi sa antitelom selektivnim za tau koji ima ostatak 396 fosforilisan tako da je klupko istrošeno od strane hiperfosforilisanog Tau.
[0033] Ovde je opisano monoklonalno antitelo na hiperfosforilisanom humanom tau, ili njegov epitopvezujući fragment, koje obuhvata:
(a) CDR1 lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine SEQ ID
NO:3, SEQ ID NO:31; SEQ ID NO:32; SEQ ID NO:33; SEQ ID NO:34; SEQ ID NO:35; SEQ ID
NO:36; SEQ ID NO:37; SEQ ID NO:38; SEQ ID NO:40; i SEQ ID NO:46;
(b) CDR2 lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:4; SEQ ID NO:41; i SEQ ID NO:47;
(c) CDR3 lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:5; SEQ ID NO:42; i SEQ ID NO:48;
(d) CDR1 teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:6; SEQ ID NO:43; SEQ ID NO:49; SEQ ID NO:52; i SEQ ID NO:55;
(e) CDR2 teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO:7; SEQ ID NO:28; SEQ ID NO:29; SEQ ID NO:30; SEQ ID NO:44; SEQ ID NO:50; SEQ ID NO:53; i SEQ ID NO:56; i
(f) CDR3 teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:39; SEQ ID NO:45; SEQ ID NO:51; SEQ ID NO:54; i SEQ ID NO:57.
[0034] Ovde je opisano monoklonalno antitelo na hiperfosforilisanom humanom tau, ili njegov epitopvezujući fragment, koje obuhvata:
(a) laki lanac odabran iz grupe koju čine SEQ ID NO:12; SEQ ID NO:16; SEQ ID NO:17; SEQ ID NO:18; SEQ ID NO:19; SEQ ID NO:20; SEQ ID NO:21; SEQ ID NO:22 i SEQ ID NO:23; i
(b) teški lanac odabran iz grupe koju čine SEQ ID NO:11; SEQ ID NO:13; SEQ ID NO:14; SEQ ID NO:15; SEQ ID NO:24; SEQ ID NO:25; SEQ ID NO:26; i SEQ ID NO:27.
[0035] Dalje ovde je opisano monoklonalno antitelo na hiperfosforilisanom humanom tau, ili njegov epitop vezujući fragment, koje obuhvata
(a) CDR1 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:3;
(b) CDR2 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:4;
(c) CDR3 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:5;
(d) CDR1 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:6;
(e) CDR2 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:7; i
(f) CDR3 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:8.
[0036] Ovde je opisano monoklonalno antitelo na hiperfosforilisanom humanom tau, ili njegov epitop vezujući fragment, koje obuhvata:
(a) CDR1 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:31;
(b) CDR2 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:4; i
(c) CDR3 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:5;
i dalje koje obuhvata najmanje jedan od
(d) CDR1 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:6;
(e) CDR2 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:7; i
(f) CDR3 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:8.
[0037] Ovde je opisano monoklonalno antitelo na hiperfosforilisanom humanom tau, ili njegov epitop vezujući fragment, koje obuhvata:
(a) CDR1 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:31; i
(f) CDR3 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:39;
i dalje koje obuhvata najmanje jedan od
(b) CDR2 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:4; i
(c) CDR3 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:5;
i dalje koje obuhvata najmanje jedan od
(d) CDR1 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:6; i
(e) CDR2 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:7.
[0038] Antitela, njihovi epitop-vezujući fragmenti, ovog otkrivanja mogu da se koriste u lečenju tauopatije kao što je Alchajmerova bolest (AB), bolest argirofilnih zrnaca (AGD), progresivna
1
supranuklearna palsija (PSP), kortikobazalna degeneracija (CBD), TBI (traumatska povreda mozga, blaga, akutna ili hronična), i hronična traumatska encefalopatija (CTE).
[0039] Antitela i njihovi epitop-vezujući fragmenti ovog otkrivanja su dalje predviđeni za upotrebu u lečenju psihoza, određenije psihoza usled AB ili psihoza kod pacijenata sa AB, i apatija usled AB ili apatija kod pacijenata sa AB.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0040]
Fig.1. Ispitivanje inhibicije tečne faze za hvatanje AD-P3 pomoću humanizovanog C10-2 i varijanti (C10-2_N32S i C10-2_N32S_A101T). Kako je opisano u primeru 3A, inhibicija AD-P3 hvatanja koja zavisi od koncentracije od strane P396-specifičnih antitela hC10-2 (kvadrati), hC10-2_N32S (crni krugovi) i hC10-2_N332_A101T (otvoreni krugovi) je istražena. AD-P3 frakcija je inkubirana 60 min. na sobnoj temperaturi (r/t) rastućim koncentracijama antitela (0-1000 nM) pre inkubacije sa 200 ng/ml mišjeg C10-2 antitela imobilisanog na pločama sa 96 bunarčića. Hvatanje AD-P3 antigena je detektovano sulfo obeleženim anti - ukupnim tau antitelom (MSD).
IC50 od hC10-2_N32S (crni krugovi) i hC10-2_N332_A101T (otvoreni krugovi) antitela je izračunata da iznosi 44 nM i 14 nM, tim redom. Ovo predstavlja značajno poboljšanje u odnosu na hC10-2, što može da se vidi kada se uporede krive sa Fig.1. S tim u vezi, u jednom aspektu ovog pronalaska, antitela inhibiraju AD-P3 u ispitivanju ovde opisane inhibicije tečne faze, tako da je signal smanjen za 50% pri koncentraciji od 100 nM ili manje antitela bazirano na ispitivanju inhibicije tečne faze za AD-P3 hvatanje.
Fig.2. Ispitivanje inhibicije peptida koje ilustruje očigledan afinitet hC10-2 i povezane varijante. Kako je opisano u primeru 3B, inhibicija vezivanja antitela koja zavisi od koncentracije u rastcoru tečne faze za Ptau 386-408 (pS396) peptid je istražena sa antitelom hC10-2 (kvadrati), hC10-2_N32S (crni krugovi) i hC10-2_N32_A101T (otvoreni krugovi). Antitela su prethodno inkubirana na 1 ng/ml tokom 60 min. na sobnoj temperaturi uz rastuće koncentracije (0-10000 nM) Ptau 386-408 (pS396) pre inkubacije u bunarčićima koji su obloženi sa 100 ng/ml Ptau 386-408 (pS396/pS404). Dobro vezano antitelo je detektovano sa sulfo-obeleženim anti-humanim IgG antitelom (MSD).
Kao što može da se vidi sa Fig.2, antitelo hC-10.2 (IC50 = 24 nM), antitelo hC10.2_N32S (IC50 = 50 nM) i antitelo hC10.2_N32S, A101T (IC50 = 34 nM) imaju IC50 manje od 100 nM, i čak manje od 60 nM, na osnovu očiglednih ispitivanja afiniteta pomoću rastvora tečne faze sa Ptau (P396) 386-408.
Fig.3 (paneli A-Z i AA-AG). Imunohistohemijska detekcija patološkog tau u post mortem mozgovima od davalaca sa AB i u rTg4510 mišjem mozgu. Kako je opisano u primeru 4, u prefrontalnom korteksu od 3 različita davaoca sa AB, hC10-2, hC10-2_N32S i hC10-2_N32S_A101T obeležena neurofibrilarna klubad, neuropilna vlakna i distrofijski neuriti. Najjači intenziteti bojenja su detektovani pri najvećim koncentracijama antitelo. Kontrolni delovi mozga nisu imunoreaktivni. Sva 3 antitela su obeležila fosforilisani tau u rTg4510 mozgu pomoću napredne patologije.
Bojenje se povećalo od hC10-2 do hC10-2_N32S i do hC10-2_N32S_A101T. Najjači intenziteti bojenja su detektovani sa hC10-2_N32S_A101T, zatim hC10-2_N32S, zatim hC10-2. Pri koncentracijama niskim kao što je 100 ng/mL hC10-2_N32S_A101T i hC10-2_N32S, postojala je imunohistohemijska detekcija patološkog tau u mozgovima sa Alchajmerom.
Fig.4 (paneli A-F). Dekoracija tau struktura kod rTg4510 miševa tretiranih sa hC10-2. hC10.2 je dato i.v. (Paneli A, C, E i F predstavljaju rTg4510; Paneli B i D predstavljaju tTA) Miševi su primili pojedinačnu injekciju zapremine od 150 µL hC10-2 antitela pri koncentraciji od 80 mg/kg. Režnjevi mozga su uzeti nakon 3 dana prema postupku opisanom u primeru 5. hC10-2 specifično obeležava ciljane strukture in vivo u hipokampusu i korteksu u rTg4510 mozgovi, ali ne u kontrolnim tTA mozgovi. Uparene slike za AlexaFluor488 i Hoechst signal su prikazane u delovima hipokampusa.
Fig.5 (paneli A-F). Dekoracija tau struktura kod rTg4510 miševa tretiranih sa hC10-2_N32S. (paneli A, C i E predstavljaju rTg4510; paneli B, D i F predstavljaju tTA) Miševi su primili pojedinačnu injekciju zapremine od 150 µL od hC10-2_N32S antitela pri koncentraciji od 80 mg/kg. Režnjevi mozga su uzeti nakon 3 dana prema postupku opisanom u primeru 5. hC10-2_N32S specifično obeležava ciljane strukture in vivo u hipokampusu i korteksu u rTg4510 mozgovima, ali ne u kontrolnim tTA mozgovima. Uparene slike za AlexaFluor488 i Hoechst signal su prikazane u delovima hipokampusa.
Fig.6 (paneli A-F). Dekoracija tau struktura kod rTg4510 miševa nakon i.v. injekcije hC10-2_N32S_A101T (paneli A, C i E predstavljaju rTg4510; paneli B, D i F predstavljaju tTA) Miševi su primili pojedinačnu injekciju zapremine od 150 µL hC10-2_N32S_A101T antitela pri koncentraciji od 80 mg/kg. Režnjevi mozga su uzeti nakon 3 dana prema postupku opisanom u primeru 5. hC10-2_N32S_A101T specifično obeležava ciljane strukture in vivo u hipokampusu i korteksu u rTg4510 mozgovima, ali ne u kontrolnim tTA mozgovima. Uparene slike za AlexaFluor488 i Hoechst signal su prikazane u delovima hipokampusa.
Poređenje Fig.4-6 ukazuje da hC10.2, hC10-2_N32S i hC10-2_N32S_A101T prelaze krvno-moždanu barijeru nakon intravenske injekcije. Crteži dalje ukazuju da hC10-2_N32S i hC10-2_N32S_A101T označavaju tau strukture (imunoreaktivne na tau klubad) hipokampus i korteks sa poboljšanim rezultatima u poređenju sa hC10-2.
Fig.7 (paneli A-D). Tau vrste koje prepoznaju pS396 specifična antitela u mozgu Alchajmerove bolesti (AB). Kako je opisano u primeru 6, u delovima AB mozga, tau klubad su ili zajedničko obeleženi sa E1 i p396 antitela ili pozitivna na pS396 antitela sama (sterlice). Delovi su analizirani fluorescentnom mikroskopijom. Neki broj tau klubadi su samo obeleženi ili sa hC10-2 i hC102_N32S_A101T antitelima (sterlicama). Imajući u vidu da duh klubad nisu obojena N-terminalnim tau antitelima, tau vrste označene sa hC10-2 ili hC10-2_N32S_A101T antitelima samim verovatno predstavljaju ekstracelularnu duh klubad.
Fig.8A-8C. Detekcija patološkog tau Vestern blot metodom. Kako je opisano u odeljku primera 6 "Detekcija patološkog tau Vestern blot metodom", patološki tau sa hC10.2, hC10-2_N32S, hC10-2_N32S_A101T detektovanom Vestern blot metodom. Prednji mozak sakupljen od tri rTg4510 miša i netransgena (non-tg) kontrolna legla eutanazirana na 32 nedelja starosti i uzet kortikalni uzorak od četiri miša sa AB i četiri zdrava kontrolna (HC) davaoca, tim redom su frakcionisani u rastvorljivu (S1), TBS-rastvorljivu granulu (S1p) i frakcije nerastvorljive u sarkozilu (P3) i analizirani Vestern blot metodom za fosforilisani tau na pS396 epitopu sa 1 µg/ml hC10.2 (A), hC10-2_N32S (B), hC10-2_N32S_A101T (C). U rTg4510, normalnom humanom 4R0N tau je prikazan na 55 kDa, dok su hiperfosforilisane tau vrste prikazane na 64 kDa i 70 kDa. Kod AB, hiperfosforilisane tau vrste su prikazane kao četiri trake 54, 64, 69 kDa, i 74 kDa, sa različitom količinom uobičajenog razmaza za AB.
Svaki od hC10-2, hC10-2_N32S i hC10-2_N32S_A101T su selektivni za tau proteine rTg4510 miševa u odnosu na netransgene miševe za AD davaoce u odnosu na zdrave kontrolne davaoce. Štaviše, u rastvorljivoj (S1), TBS-rastvorljivoj granuli (S1p) i frakcijama (P3) nerastvorljivim u sarkozilu, pri čemu je svaki od hC10-2, hC10-2_N32S i hC10-2_N32S_A101T selektivan do patogenog tau 64 kDa proteina rTg4510 miševa u odnosu na normalni tau 55 kDa proteina rTg4510 miševa.
Fig.9. Imunoprecipitacija tau iz AB mozgova. Kako je opisano u odeljku primera 6 "Imunoprecipitacija patološkog tau" imunoprecipitacija tau sa 10 µg hC10.2, hC10-2_N32S, hC10-2_N32S_A101T, upotrebom kontrole humanog IgG1 (hlgG1) iz 500 µg prethodno očišćenih lizata kortikalnih moždanih homogenata udruženih od četiri davaoca sa AB i zdravog kontrolnog (HC) davaoca je analizirana Vestern blot metodom sa poliklonalnim zečjim anti-pS396 tau (pS396 tau) antitelom. Kod AB, hiperfosforilisane tau vrste su prikazane kao četiri trake 54, 64, 69 kDa, i 74 kDa, sa varijabilnom količinom uobičajenog razmaza za AB.
Fig.10 A-C Kvantifikacija tau agregacije Cisbio ispitivanjem. Materijal za zasejavanje (WW) divljeg tipa (Wt) nije pokazao da su zasejavanje i pozadinski signal oduzeti od svih zasejanih uzoraka. Tg4510 homogenati su zasejani efikasno i na efekat zasejavanja nije uticalo tretiranje sa B12, ali je izvedeno u različitoj meri tretiranjem u ispitivanjima zasejavanja koja su pri koncentraciji od 20 µg/mL sa tau antitelima ovog pronalaska (hC10-2_N32S_A101T> hC10-2_N32S > hC10-2). Grafikoni predstavljaju rezultate četiri nezavisna skupa eksperimenata i grafički su prikazani kao relativna tau agregacija (signal umnoška u odnosu na pozadinski normalizovan do ukupnih proteina) a relativni nerastvorljivi p396 tau je kvantifikovan densitometrijom vestern blotova triton-X nerastvorljivih frakcija (signal umnoška u odnosu na pozadinski normalizovan). Svi uzorci su normalizovani do
1
kontrolnog antitela izotipa B12. Fig.10 B-C predstavlja kvantifikaciju tau agregacije putem Cisbio ispitivanja. Zasejane pcDNK HEK293 ćelije nisu pokazale signal, čime je potvrđeno odsustvo detekcije za unos materijala za zasejavanje. Materijal za zasejavanje (WW) Wt (divljeg tipa) nije pokazao zasejavanja, ali nasuprot rTg4510 efikasno zasejanih homogenata (CC), u odnosu na nezasejane. Na ovaj efekat zasejavanja nije uticalo tretiranje sa HEL, već je delimično obrnuto tretiranjem tau antitelima (C10-2>D1.2>hACI36-2B6-Ab1). Grafikoni predstavljaju tri nezavisna skupa uzoraka i grafički su predstavljeni kao relativna tau agregacija (signal umnoška u odnosu na pozadinski normalizovan do ukupnih proteina). Primer 6, odeljak "Ispitivanje ćelija i agregacije", opisuje protokol koji sledi.
Fig.11. Kvantifikacija Tau5 vestern blot signala nakon imunodeplecije ekstrakata AB mozga pomoću različitih količina hC10-2 i 2.10.3 antitela. Kako je opisano u primeru 7, oba antitela su uklonila malu frakciju ukupnog tau iz ekstrakata mozga sa Alchajmerom.
Fig.12. Kvantifikacija P-S422 Tau vestern blot signala nakon imunodeplecije ekstrakata AB mozga upotrebom različitih količina hC10-2 (dijamanti) i 2.10.3 (trouglovi) antitela. Crtež prikazuje rezultate iz primera 7. Tau fosforilisan na serinu 422 može biti efikasno uklonjen iz ekstrakata AB mozga imunodeplecijom ili pomoću hC10-2 ili 2.10.3. Oba antitela su uklonila više od 90% P-S422 tau, iako je bilo potrebno više od 2.10.3 antitela da bi se postigao isti efekat.
Fig.13. Kvantifikacija pS396 Tau vestern blot signala nakon imunodeplecije ekstrakata AB mozga upotrebom različitih količina hC10-2 i 2.10.3 antitela. Crtež prikazuje rezultate iz primera 7. hC10-2 imunodeplecija je uklonila 88% tau fosforilisanog na serinu 396, dok je 2.10.3 uklonio samo 55% pS396 Tau iz ekstrakata AB mozga.
Fig.14. Kvantifikacija P-S199/202 tau vestern blot signala nakon imunodeplecije ekstrakata AB mozga upotrebom različitih količina hC10-2 i 2.10.3 antitela. Crtež prikazuje rezultate iz primera 7. hC10-2 imunodeplecija je očistila 69% tau koji je fosforilisan na serinu 199/202.2.10.3 antitelo nije dalo isto smanjenje zavisno od doze.
Fig.15. Ekstrakti mozga obolelog od Alchajmerove bolesti na vestern blotu pre i nakon imunodeplecije. Crtež prikazuje rezultate iz primera 7. Postoji 25kDa Tau fragment fosforilisan na serinu 396. Imunodeplecija pomoću hC10-2 je dovela do smanjenja 25 kDa Tau trake.2 druga fosfospecifična antitela 2.10.3 i AT8 nisu uklonila ovu 25 kDa vrstu.
Fig.16. Kvantifikacija pS396 tau vestern blot signala nakon imunodeplecije ekstrakata AB mozga upotrebom različitih količina hC10-2 varijante N32S, N32Q, N32S_A101T, N32Q_A101T, N32Q_D55E i N32S_ D55E. Kao što može da se zaključi iz primera 8, mogućnost antitela ovog pronalaska da ukloni tau fosforilisan na serinu 396 iz homogenata mozga sa AB je bila suštinska. Na manje od 0.1 µg antitela (tačka podataka na 75 ng), varijante su dovele do smanjenja u pS396 signalu za najmanje 28% (izuzev za N32Q,D55E koji je bio 16%) dok je C10.2 doveo do smanjenja u pS396 signalu od manje od 6%.
Fig.17 (Paneli A-D). Zasejavanje hipokampusa tau klubadima, uzrokovano ubrizgavanjem ekstrakata AB mozga. Kako je izvedeno u primeru 8a, pri dozi od 15 mg/kg, tretiranje mC10-2 je značajno smanjilo patologiju klupka u zasejanom hipokampusu za 57% (P<0,05). Postojao je jasan trend koji je ukazivao da je hC10-2 takođe smanjio patologiju. Poređenja radi, 2.10.3 nije dalo efekta, pri istoj dozi.
Fig.18. Ostatak P-Ser396 i Tyr394 je u centru antigen vezujućeg mesta
Prikazana je struktura Ile(392)-Val(393)-Tyr(394)-Lys(395)-pSer(396)-Pro(397)-Val(398). Glavna interakcija sa antitelom ovog pronalaska uključuje hidrofobni džep, pSer396 i Y394 tau peptida. Postoji velika oformljena mreža vezivanja vodonika i naelektrisanje/polarne interakcije između the Y(394) bočnog lanca i okosnice sa fosfonatom pSer396. HC CDR1 antitela ovog pronalaska obuhvataju palindromski motiv od 8 ostataka POLAR AA-HYRDROPHOBIC AA - POLAR AA -CHARGED AA - CHARGED AA- POLAR AA-HYRDROPHOBIC AA - POLAR AA (Thr- Phe- Thr-Asp-Arg-Thr-Ile-His). Naelektrisani ostaci stupaju u interakciju sa širokom mrežom vezivanja oformljenom putem vezivanja vodonikom, naelektrisanje/naelektrisanje i naelektrisanje/polarne interakcije između antitela i tau.
Fig.19. Efikasnost antitela u paradigmi tretiranja
Kako je izvedeno u primeru 8b, HEK293 ćelije koje eksprimiraju hTau-P301L su posejane sa Tg4510 homogenatima koji su prethodno inkubirani sa označenim antitelima, tripsinizirane i ponovo zasejane nakon 24 sata (ponovno dodavanje antitela) i sakupljene 48h nakon zasejavanja. Ukupni ćelijski homogenati su ispitivani zbog agregatnog tau pomoću Cisbio tau agregacije. Podaci predstavljaju podatke prikupljene od 4 nezavisne biološke replike /- S.E.M., normalizovane do CC+B12 (tg4510).
P301L-htau eksprimirajuće ćelije su zasejane sa 40 µg Tg4510 moždanog homogenata (ukupni proteini) koji je prethodno inkubiran tokom noći na 4°C sa antitelima (20 µg/ml ≈ 133 nM) na 6 bunarčića. Zasejavanje sa CC+B12 je dalo veliki odgovor na zasejavanje. hC10.2 je imalo uticaj na agregaciju približno 40%. Sva druga antitela su pokazala najmanje uporediv efekat sa onim od hC10.2. Određenije, N32S i N32S_A101T varijante hC10.2 su pokazala jače efekte 45% i 62% smanjenja kod agregacije tau. N32S_A101T varijanta je pokazala značajno jači efekat na agregaciju u poređenju sa hC10.2. Crtež pokazuje da je humanizovano C10.2 efikasno u angažovanju kod zasejavanja koje je indukovao tau, ali dodavanje N32S i određenije N32S i A101T dvostruke mutacije povećava neutrališuće dejstvo mAb.
Fig.20. Ispitivanja deamidacije varijanti u uslovima stresa Kako je izvedeno u primeru 8c, deamidacija Asn ostataka na položaju 32 ili 34 VL lanca je praćena analiziranjem triptičnog peptida
1
LC:T2
[VTMTCQASQDTSIXLNWFQQKPGK; SEQ ID NO:58]putem LC-MS. X predstavlja ili Asn, Gln ili Ser u odgovarajućim varijantama naznačenim na Fig.20. MS analiza omogućava izračunavanje relativnog sadržaja deamidisanog do nedeamidisanog peptida. Kod WT, A101T i D55E varijanti primećena je velika deamidacija na LC:T2 peptidu. Takođe je jasno da promena Asn32 ili u Gln ili Ser u potpunosti sprečava deamidaciju peptida na drugim Asn34 ostacima. Takođe mi ne detektujemo bilo koju deamidaciju Gln32 varijanti. Slični rezultati su primećeni sa varijantama Asn34.
Fig.21 Smanjenje tau zasejavanja i agregacije u kortikalnim neuronima od strane antitela Tau zasejavanje i agregacija u kortikalnim neuronskim kulturama iz mišjih embriona rTg4510 su indukovani 0.2 ng patološkog tau iz P3 ili S1p frakcija od rTg4510 miševa starih 40 nedelja i izmereni ispitivanjem Cisbio tau agregacije. Tokom 7 dana u kulturi (DIV) neuroni su tretirani mešavinom P3 ili S1p i 10 µg antitela ili fosfatom puferisanim slanim rastvorom (PBS). Potpuna promena podloge je izvedena na DIV11 kako bi se uklonili preostala P3 i S1p zasejavanja i antitela. Tau zasejavanje je omogućeno dodatna 4 dana a neuroni su lizirani na DIV15 kako bi se izmerilo tau zasejavanje i agregacija. PBS i humano kontrolno IgG antitelo (IgG con ab) nisu uticali na tau zasejavanje i agregaciju. Tau zasejavanje i agregacija su delimično bili obrnuti tretiranjem tau antitelima (hC10.2_A101T_N32S > hC10.2_N32S > hC10.2). Nakon što je izmereno smanjenje tau tau zasejavanja i agregacije: 23% sa hC10.2, 41-53% sa hC10.2_N32S, i 48-60% sa hC10.2_A101T_N32S. Grafikoni sa stupcima predstavljaju podatke iz dva nezavisna eksperimenta tau agregacije normalizovane do no neuronskog proteina kao srednja vrednost ± SD. Jednosmerno ANOVA Newman-Keuls ispitivanje višestrukog poređenja (PBS/IgG con ab nasuprot hC10.2, hC10.2_N32S, hC10.2_A101T_N32S ***p<0.001; hC10.2 nasuprot hC10.2_N32S, hC10.2_A101T_N32S ###p<0.001).
Fig.22 Dekoracija koja zavisi od doze tau struktura kod rTg4510 miševa nakon i.v. injekcije hC10-2_N32S.
hC10-2_N32S specifično obeležava ciljane strukture in vivo u hipokampusu i korteksu u rTg4510 mozgova. Prikazane su slike cingularnog korteksa. Najjači signali na 20 i 80 mg/kg, slabi signali na 8 mg/kg, bez vidljivog signala na 0.8 mg/kg.
Fig.23 Zasejana tau patologija u hipokampusu
Broj ćelija sa bojenjem Gallyas klupka u zasejanom hipokampusu je smanjen za hC10-2 (50%), hC10-2_N32S (48%) i hC10-2_N32S_A101T (47%) tretiranjem. Kvantifikacija je urađena u svakom 6. delu koji pokriva dorzalni hipokampus, pri čemu je po životinji korišćeno ukupno 8 delova. Broj ćelija odražava zbir pozitivnih ćelija u svim podregijama hipokampusa identifikovanih u tih 8 delova. Jednosmerna anova i ispitivanje Danetovim višestrukim poređenjima su korišćeni za analizu podataka.
1
SEKVENCE INKORPORISANE PO REFERENCI
[0041]
SEQ ID NO:1 Humani tau (2N4R)
SEQ ID NO:2 ostaci tau 386-408 (pS396, pS404)
SEQ ID NO:3 C10-2 CDR1 lakog lanca
SEQ ID NO:4 C10-2 CDR2 lakog lanca
SEQ ID NO:5 C10-2 CDR3 lakog lanca
SEQ ID NO:6 C10-2 CDR1 teškog lanca
SEQ ID NO:7 C10-2 CDR2 teškog lanca
SEQ ID NO:8 C10-2 CDR3 teškog lanca
SEQ ID NO:9 Mišji C10-2 laki lanac
SEQ ID NO:10 Mišji C10-2 teški lanac
SEQ ID NO:11 humanizovani C10-2 teški lanac
SEQ ID NO:12 humanizovani C10-2 laki lanac
SEQ ID NO:13 humanizovani C10-2 varijanta teškog lanca D55E SEQ ID NO:14 humanizovani C10-2 varijanta teškog lanca D55Q SEQ ID NO:15 humanizovani C10-2 varijanta teškog lanca D55S SEQ ID NO:16 humanizovani C10-2 varijanta lakog lanca N32S SEQ ID NO:17 humanizovani C10-2 varijanta lakog lanca N32Q SEQ ID NO:18 humanizovani C10-2 varijanta lakog lanca N34S SEQ ID NO:19 humanizovani C10-2 varijanta lakog lanca N34Q SEQ ID NO:20 humanizovani C10-2 varijanta lakog lanca N32S, N34S SEQ ID NO:21 humanizovani C10-2 varijanta lakog lanca N32Q, N34S SEQ ID NO:22 humanizovani C10-2 varijanta lakog lanca N32Q, N34Q SEQ ID NO:23 humanizovani C10-2 varijanta lakog lanca N32S, N34Q SEQ ID NO:24 humanizovani C10-2 varijanta teškog lanca A101T SEQ ID NO:25 humanizovani C10-2 varijanta teškog lanca D55E, A101T SEQ ID NO:26 humanizovani C10-2 varijanta teškog lanca D55Q, A101T SEQ ID NO:27 humanizovani C10-2 varijanta teškog lanca D55S, A101T SEQ ID NO:28 humanizovano C10-2 CDR2 teškog lanca Varijanta D55E SEQ ID NO:29 humanizovano C10-2 CDR2 teškog lanca Varijanta D55Q SEQ ID NO:30 humanizovano C10-2 CDR2 teškog lanca Varijanta D55S SEQ ID NO:31 humanizovano C10-2 CDR1 lakog lanca Varijanta N32S SEQ ID NO:32 humanizovano C10-2 CDR1 lakog lanca Varijanta N32Q SEQ ID NO:33 humanizovano C10-2 CDR1 lakog lanca Varijanta N34S
1
SEQ ID NO:34 humanizovano C10-2 CDR1 lakog lanca Varijanta N34Q
SEQ ID NO:35 humanizovano C10-2 CDR1 lakog lanca Varijanta N32S, N34S
SEQ ID NO:36 humanizovano C10-2 CDR1 lakog lanca Varijanta N32Q, N34S
SEQ ID NO:37 humanizovano C10-2 CDR1 lakog lanca Varijanta N32Q, N34Q
SEQ ID NO:38 humanizovano C10-2 CDR1 lakog lanca Varijanta N32S, N34Q
SEQ ID NO:39 humanizovano C10-2 CDR3 teškog lanca Varijanta A101T
SEQ ID NO:40 IMGT numerisanje CDR1 lakog lanca humanizovanog C10-2
SEQ ID NO:41 IMGT numerisanje CDR2 lakog lanca humanizovanog C10-2
SEQ ID NO:42 IMGT numerisanje CDR3 lakog lanca humanizovanog C10-2
SEQ ID NO:43 IMGT numerisanje CDR1 teškog lanca humanizovanog C10-2
SEQ ID NO:44 IMGT numerisanje CDR2 teškog lanca humanizovanog C10-2
SEQ ID NO:45 IMGT numerisanje CDR3 teškog lanca humanizovanog C10-2
SEQ ID NO:46 IMGT numerisanje CDR1 lakog lanca humanizovanog C10-2 Varijanta N32S
SEQ ID NO:47 IMGT numerisanje CDR2 lakog lanca humanizovanog C10-2 Varijanta N32S
SEQ ID NO:48 IMGT numerisanje CDR3 lakog lanca humanizovanog C10-2 Varijanta N32S
SEQ ID NO:49 IMGT numerisanje CDR1 teškog lanca humanizovanog C10-2 Varijanta A101T SEQ ID NO:50 IMGT numerisanje CDR2 teškog lanca humanizovanog C10-2 Varijanta A101T SEQ ID NO:51 IMGT numerisanje CDR3 teškog lanca humanizovanog C10-2 Varijanta A101T SEQ ID NO:52 Chotia numerisanje CDR1 teškog lanca humanizovanog C10-2
SEQ ID NO:53 Chotia numerisanje CDR2 teškog lanca humanizovanog C10-2
SEQ ID NO:54 Chotia numerisanje CDR3 teškog lanca humanizovanog C10-2
SEQ ID NO:55 Chotia numerisanje CDR1 teškog lanca humanizovanog C10-2 Varijanta A101T SEQ ID NO:56 Chotia numerisanje CDR2 teškog lanca humanizovanog C10-2 Varijanta A101T SEQ ID NO:57 Chotia numerisanje CDR3 teškog lanca humanizovanog C10-2 Varijanta A101T
DETALJAN OPIS OVOG PRONALASKA
[0042] Kako se ovde upotrebljava, pojam "tau" je sinonim sa "tau protein" i odnosi se na bilo koji od izoforma tau proteina (identifikovanih u, na primer, UniProt kao P10636, 1-9). Numerisanje aminokiselina iz tau koje se ovde koristi je dato u odnosu na izoform 2 (SEQ ID NO:1) kako je pokazano u
1
nastavku, sa metioninom (M) koji predstavlja aminokiselinski ostatak 1:
[0043] Ovaj pronalazak je definisan zahtevima. Ovo otkrivanje koje obuhvata ovaj pronalazak se odnosi na antitela i njihove epitop-vezujuće fragmente koji mogu specifično da se vezuju za tau, a naročito za humani tau, i u jednom načinu ostvarivanja ispoljavaju mogućnost da se specifično vezuju za fosforilisan S396 ostatak (pS396) humanog tau. Antitela i njihove epitop-vezujuće fragmente ovog otkrivanja, dalje karakteriše nemogućnost ili suštinska nemogućnost specifičnog vezivanja za fosforilisan serinski 404 (pS404) ostatak na humanom tau, na primer u uslovima ograničenim antitelom ili nezasićenim uslovima. Dalje, fosforilacija na pS404 međusobno se ne meša sa specifičnim vezivanjem za pS396 koji sadrži epitop. Kako se ovde upotrebljavaju, oznake "pS" i "<{p}>S" označavaju aminokiselinski ostatak fosfoserina a brojevi uz iste identifikuju položaj ostatka u odnosu na sekvencu iz SEQ ID NO:1). Kako se ovde upotrebljava, antitelo "suštinski" ne može da se vezuje za epitop ukoliko je u odnosu na drugi epitop takvo vezivanje manje od 20%, manje od 10%, manje od 5%, manje od 2%, i poželjnije, manje od 1% vezivanja primećenog sa takvim drugim epitopom.
[0044] Pojam "antitelo" (Ab) u kontekstu ovog otkrivanja se odnosi na molekul imunoglobulina ili fragment molekula imunoglobulina koij može specifično da se vezuje za epitop molekula ("antigen"). Antitela koja se prirodno javljaju obično obuhvataju tetramer koji se obično sastoji od najmanje dva teška lanca (HC) i najmanje dva laka lanca (LC). Svaki teški lanac se sastoji od varijabilnog domena teškog lanca (ovde skraćeno kao VH) i konstantnog domena teškog lanca, koji obično obuhvata tri domena (CH1, CH2 i CH3). Humani teški lanci mogu da budu od bilo kog izotipa, uključujući IgG (IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4 podtipove). Svaki laki lanac se sastoji od varijabilnog domena lakog lanca (ovde skraćeno kao VL) i konstantnog domena lakog lanca (CL). Humani laki lanci uključuju kapa lance i lambda lance. Varijabilni domen teškog i lakog lanca je obično odgovoran za prepoznavanje antigena, dok konstantni domen teškog i lakog lanca može da posreduje vezivanje imunoglobulina za tkiva ili faktore domaćina, uključujući razne ćelije imunog (npr., ćelije efektora) i prvu komponentu (C1q) klasičnog komplementnog sistema. VH i VL domeni mogu dalje da budu pod-podeljeni u domene hipervarijabilnosti, označene kao "regioni koji određuju komplementarnost," koji su prošarani sa
1
domenima konzerviranije sekvence, označene kao "okvirni regioni" (FR). Svaki VH i VL se sastoji od tri CDR domena i četiri FR domena koji su raspoređeni od amino-terminusa do karboksi-terminusa po sledećem redosledu: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. Varijabilni domeni teških i lakih lanaca sadrže vezujući domen koji stupa u interakciju sa antigenom. Od posebne relevantnosti je to da su antitela i njihovi epitop-vezujući fragmenti koji su " izolovani " tako da postoje u fizičkoj okolini različitoj od one u kojoj mogu da se jave u prirodi ili koja su modifikovana tako da se razlikuju od antitela koje se prirodno javlja ili njegovih epitop-vezujućih fragmenata u aminokiselinskoj sekvenci.
[0045] Pojam "epitop" označava antigensku determinantu koja može specifično da se vezuje za antitelo. Epitopi se obično sastoje od površinskih grupa molekula kao što su aminokiseline ili šećerni bočni lanci i obično imaju specifične trodimenzioonalne strukturne karakteristike, kao i specifične karakteristike naeletrisanja. Konformacioni i pravi epitopi se razlikuju se po tome što se vezivanje za prve, ali ne i za druge, uvek gubi u prisustvu denaturisanih rastvora. Epitop može da obuhvati aminokiselinske ostatke direktno uključene u vezivanje i druge aminokiselinske ostatke, koji nisu direktno uključeni u vezivanje, kao što su aminokiselinski ostaci koje efikasno blokira specifično epitop-vezujući peptid (drugim rečima, aminokiselinski ostatak je unutar ostatka specifično epitop-vezujućeg peptida).
[0046] Kako se ovde upotrebljava, pojam "epitop-vezujući fragment antitela" označava fragment, deo, region ili domen antitela (bez obzira na to kako je proizvedeno (npr., putem cepanja, rekombinantno, sintetički, itd.) koji može specifično da se vezuje za epitop. Epitop-vezujući fragment može da sadrži bilo koji od 1, 2, 3, 4, 5 ili svih 6 domena CDR takvog antitela i, iako može da se specifično vezuje za takav epitop, može da ispolji specifičnost, afinitet ili selektivnost prema takvom epitopu koji se razlikuje od takvog antitela. Poželjno je međutim da epitop-vezujući fragment sadrži svih 6 domena CDR takvog antitela. Epitop-vezujući fragment antitela može biti deo, ili može obuhvatati, pojedinačni polipeptidni lanac (npr., scFv), ili može biti deo, ili obuhvatati, dva ili više polipeptidnih lanaca, pri čemu je svaki sa amino-terminusom i karboksilnim terminusom (npr., dijatelo, Fab fragment, Fab2fragment, itd.).
Fragmenti antitela koji pokazuju epitop-vezujuću mogućnost mogu da se dobiju, na primer, proteaznim cepanjem netaktnih antitela. Poželjnije, iako su ta dva domena Fv fragmenta, VL i VH, prirodno kodirana od strane odvojenih gena, ili polinukleotida koji kodiraju takve genske sekvence (npr., njihove kodirajuće cDNK) mogu biti spojene, pomoću rekombinantnih postupaka, fleksibilnim veznikom koji im omogućava da budu napravljene kao pojedinačan proteinski lanac u kojem se VL i VH regioni združuju kako bi se obrazovali monovalentni epitop-vezujući molekuli (poznati kao Fv (scFv) pojedinačnog lanca; videti npr., Bird et al. , (1988) Science 242:423-426; i Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85:5879-5883). Alternativno, upošljavanjem fleksibilnog veznika koji je prekratak (npr., manji od oko 9 ostataka) kako bi bilo omogućeno VL i VH domenima pojedinačnog polipeptidnog lanca da se spoje zajedno, pri čemu jedan obrazuje bispecifično antitelo, dijatelo, ili sličan molekul (u kojem se dva takva
2
polipeptidna lanca spajaju zajedno kako bi se obrazovao bivalentni epitop-vezujući molekul) (videti na primer PNAS USA 90(14), 6444-8 (1993) radi opisa dijatela).
[0047] Primeri epitop-vezujućih fragmenata uključuju (i) Fab' ili Fab fragment, monovalentni fragment koji se sastoji od VL, VH, CL i CH1 domena, ili monovalentno antitelo kako je opisano u WO2007059782; (ii) F(ab')2 fragmente, bivalentne fragmente koje obuhvataju dva Fab fragmenta povezana disulfidnim mostom na zglobnom domenu; (iii) Fd fragment koji se suštinski sastoji od VH i CH1 domena; (iv) Fv fragment koji se suštinski sastoji od VL i VH domena, (v) dAb fragmenta (Ward et al., Nature 341, 544-546 (1989)), koji se suštinski sastoji od VH domena i takođe se naziva domen antitela (Holt et al; Trends Biotechnol.2003 Nov;2i(II) :484-90); (vi) kamelid ili nanotela (Revets et al; Expert Opin Biol Ther.2005 Jan;5 (I): I II-24) i (vii) izolovani region za određivanje komplementarnosti (CDR). Dalje, iako su dva domena Fv fragmenta, VL i VH, kodirani odvojenim genima, mogu da se spoje, pomoću rekombinantnih postupaka, sintetičkim veznikom koja im omogućava da budu napravljeni kao pojedinačan proteinski lanac u kojem se VL i VH domeni sparuju kako bi obrazovali monovalentne molekule (poznate kao antitela pojedinačnog lanca ili Fv sisngle lanca (scFv), videti na primer Bird et al., Science 242, 423-426 (1988) i Huston et al., PNAS USA 85, 5879-5883 (1988)). O ovim i drugim korisnim fragmentima antitela će biti reči u nastavku. Takođe bi trebalo imati u vidu da pojam antitelo, ukoliko nije naznačeno drugačije, takođe uključuje polipeptidine poput antitela, kao što su himerna antitela i humanizovana antitela, i fragmente antitela koji se odnose na mogućnost specifičnog vezivanja za antigen (epitopvezujuće fragmente) obezbeđene bilo kojom poznatom tehnikom, kao što je enzimatsko cepanje, peptidna sinteza, i rekombinantne tehnike. Antitelo kako je stvoreno može da poseduje bilo koji izotip. Kako se ovde upotrebljava, "izotip" se odnosi na imunoglobulinsku klasu (na primer IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4) koju kodiraju geni konstantnog domena teškog lanca. Takvi fragmenti antitela su dobijeni pomoću konvencionalnih tehnika poznatih stručnjaku; pogodni fragmenti koji mogu da se vezuju za željeni epitop mogu brzo da budu detaljno pregledani zbog iskoristivosti na isti način kao netaktno antitelo. U jednom načinu ostvarivanja, Fc region obuhvata mutaciju koja modulira funkcije efektora.
[0048] Pojam "bispecifično antitelo" odnosi se na antitelo koje sadrži dva nezavisna epitop-vezujuća fragmenta od koji svaki cilja nezavisne ciljeve. Ovi ciljevi mogu biti epitopi prisutni na različitim proteinima ili različiti epitopi prisutni na istom cilju. Molekuli bispecifičnog antitela mogu biti napravljeni pomoću kompenzacionih aminokiselinskih promena u konstantnim domenima HC molekula matičnog monospecifičnog bivalentnog antitela. Dobijeno heterodimerno antitelo sadrži jedan Fabs koji je dobijen od dva različita matična monospecifična antitela. Aminokiselinske promene u Fc domenu vode do povećane stabilnosti heterodimernog antitela bispecifičnosti koja je stabilna tokom vremena. (Ridgway et al., Protein Engineering 9, 617-621 (1996), Gunasekaran et al., JBC 285, 19637-1(2010), Moore et al., MAbs 3:6546-557 (2011), Strop et al., JMB 420, 204-219 (2012), Metz et al., Protein Engineering 25:10 571-580 (2012), Labrijn et al., PNAS 110:113, 5145 -5150 (2013), Spreter Von Kreudenstein et al., MAbs 5:5646-654 (2013)). Bispecifična antitela takođe mogu da uključuju molekule koji se stvaraju pomoću ScFv spajanja. Dva monospecifična scfv su zatim nezavisno spojena do Fc domena koji mogu da obrazuju stabilne heterodimere kako bi se napravio pojedinačna bispecifični molekul (Mabry et al., PEDS 23:3 115-127 (2010). Bispecifični molekuli imaju sposobnosti dvostrukog vezivanja.
[0049] Pojmovi "C10-2", "humani C10-2", "hC10-2", "HC10-2", "hC10.2", "humanizovano C10-2" i "humanizovano C10-2" kako se ovde upotrebljavaju na crtežima su predviđeni da predstavljaju sinonime i definisani su kao antitelo C10-2. Pojam je predviđen da označava antitelo ili njegov epitop-vezujući fragment koji obuhvata, ili se sastoji od, varijabilnog domena lakog lanca antitela koji ima:
(a) CDR1 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:3;
(b) CDR2 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:4; i
(c) CDR3 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:5;
i varijabilnog domena teškog lanca antitela koji ima:
(d) CDR1 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:6;
(e) CDR2 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:7; i
(f) CDR3 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:8.
[0050] Antitelo C10-2 je humanizovano antitelo koje može da bude definisano kao ono koje obuhvata teški lanac iz SEQ ID NO:11, laki lanac iz SEQ ID NO:12., ili oba. Jedan način ostvarivanja ovog otkrivanja je usmeren na antitelo ili njegov epitop-vezujući fragment koji obuhvata antitelo teškog lanca iz SEQ ID NO:11 i laki lanac iz SEQ ID NO:12.
[0051] Pojam "mC10-2" kako se ovde upotrebljava i na crtežima je predviđen da označi mišje antitelo C10-2 i definisan je SEQ ID. NO.9 i 10. Mišje antitelo C10.2 se upotrebljava kao kontrolno antitelo i nije deo ovog pronalaska.
[0052] Pojmovi "hC10-2_N32S" i "C10-2_N32S" kako se ovde upotrebljavaju i na crtežima su predviđeni da budu sinonimi i predstavljaju varijante antitela C10-2 pri čemu je laki lanac mutirao tako da najmanje obuhvati mutaciju aminokiselinskog ostatka 32 od N do S i definisan je kao antitelo N32S. Pojmovi "hC10-2_N32Q" i "C10-2_N32Q" kako se ovde upotrebljavaju i na crtežima su predviđeni da budu sinonimi i predstavljaju varijante antitela C10-2 pri čemu je laki lanac mutirao tako da najmanje obuhvata mutaciju aminokiselinskog ostatka 32 od N do Q i definisan je kao antitelo N32Q.
[0053] Pojmovi "hC10-2_N34S" i "C10-2_N34S" kako se ovde upotrebljavaju i na crtežima su predviđeni da budu sinonimi i predstavljaju varijante antitela C10-2 pri čemu je laki lanac mutirao tako da obuhvata najmanje mutaciju aminokiselinskog ostatka 34 od N do S i definisan je kao antitelo N34S. Pojmovi "hC10-2_N34Q" i "C10-2_N34Q" kako se ovde upotrebljava i na crtežima su predviđeni da budu sinonimi i predstavljaju varijante antitela C10-2 pri čemu je laki lanac mutirao tako da obuhvata najmanje mutaciju aminokiselinskog ostatka 34 od N do Q i definisan je kao antitelo N34Q.
[0054] Pojmovi "hC10-2_N32S_N34S" i "C10-2_N32S_N34S" kako se ovde upotrebljavaju i na crtežima su predviđeni da budu sinonimi i predstavljaju varijante antitela C10-2 pri čemu je laki lanac mutirao tako da najmanje obuhvata mutacije aminokiselinskih ostataka 32 i 34 od N do S i definisan je kao antitelo N32S, N34S. Pojmovi "hC10-2_N32Q_N34S" i "C10-2_N32Q_N34S" kako se ovde upotrebljavaju i na crtežima su predviđeni da budu sinonimi i predstavljaju varijante antitela C10-2 pri čemu je laki lanac mutirao tako da najmanje obuhvata mutacije aminokiselinskih ostataka 32 i 34 od N do Q i do N do S, tim redom i definisan je kao antitelo N32Q, N34S. Pojmovi "hC10-2_N32Q_N34Q" i "C10-2_N32Q_N34Q" kako se ovde upotrebljava i na crtežima su predviđeni da budu sinonimi i predstavljaju varijante antitela C10-2 pri čemu je laki lanac mutirao tako da najmanje obuhvata mutacije aminokiselinskih ostataka 32 i 34 od N do Q i definisan je kao antitelo N32Q, N34Q. Pojmovi "hC10-2_N32S_N34Q" i "C10-2_N32S_N34Q" kako se ovde upotrebljava i na crtežima su predviđeni da budu sinonimi i predstavljaju varijante antitela C10-2 pri čemu je laki lanac mutirao tako da najmanje obuhvata mutacije aminokiselinskih ostataka 32 i 34 od N do S i do N do Q, tim redom i definisan je kao antitelo N32S, N34Q.
[0055] Pojmovi "hC10-2_ D55E" i "C10-2_ D55E" kako se ovde upotrebljava i na crtežima su predviđeni da budu sinonimi i predstavljaju varijante antitela C10-2 pri čemu je teški lanac mutirao da najmanje obuhvata mutaciju aminokiselinskog ostatka 55 od D do E i definisan je kao antitelo D55E. Pojam "hC10-2_ D55Q", "C10-2_ D55Q" kako se ovde upotrebljava i na crtežima je predviđeni da budu sinonimi i predstavljaju varijante antitela C10-2 pri čemu je teški lanac mutirao da najmanje obuhvata mutaciju aminokiselinskog ostatka 55 od D do Q i definisan je kao antitelo D55Q. Pojam "hC10-2_ D55S", "C10-2_ D55S" kako se ovde upotrebljava i na crtežima su predviđeni da budu sinonimi i predstavljaju varijante antitela C10-2 pri čemu je teški lanac mutirao da najmanje obuhvata mutaciju aminokiselinskog ostatka 55 od D do S i definisan je kao antitelo D55S.
[0056] Pojmovi "hC10-2_ A101T" i "C10-2_ A101T" kako se ovde upotrebljavaju i na crtežima su predviđeni da budu sinonimi i predstavljaju varijante antitela C10-2 pri čemu je teški lanac mutirao da najmanje obuhvata mutaciju aminokiselinskog ostatka 101 od A do T i definisan je kao antitelo A101T [0057] Pojam "hC10-2_N32S_A101T", "C10-2_N32S_A101T", hC10-2_A101T _N32S" i "C10-2_A101T_N32S kako se ovde upotrebljava i na crtežima su predviđeni da budu sinonimi i predstavljaju varijante antitela C10-2 pri čemu je teški lanac mutirao da najmanje obuhvata mutaciju aminokiselinskog ostatka 101 od A do T i pri čemu je laki lanac mutirao tako da obuhvata najmanje mutaciju aminokiselinskog ostatka 32 od N do S i definisan je kao antitelo N32S, A101T.
[0058] Pojam "hC10-2_N32Q_A101T", "C10-2_N32Q_A101T", hC10-2_A101T _N32Q" i "C10-2_A101T_N32Q kako se ovde upotrebljava i na crtežima su predviđeni da budu sinonimi i predstavljaju varijante antitela C10-2 pri čemu je teški lanac mutirao da najmanje obuhvata mutaciju
2
aminokiselinskog ostatka 101 od A do T i pri čemu je laki lanac mutirao tako da obuhvata najmanje mutaciju aminokiselinskog ostatka 32 od N do Q i definisan je kao antitelo N32Q, A101T.
[0059] Pojmovi "monoklonalno antitelo" ili "kompozicija monoklonalnog antitela" kako se ovde upotrebljavaju se odnose na pripremu molekula antitela pojedinačne molekulske kompozicije.
Konvencionalna kompozicija monoklonalnog antitela prikazuje specifičnost i afinitet ka pojedinačnom vezivanju za određeni epitop. U određenim načinima ostvarivanja monoklonalno antitelo, može da se sastoji od više od jednog Fab domena čime se povećava specifičnost za više od jednog cilja. Pojmovi "monoklonalna antitelo" ili "kompozicija monoklonalnog antitela" nisu predviđeni da budu ograničeni bilo kojim određenim postupkom proizvodnje (npr., rekombinantnim, transgenim, hibridom, itd.).
[0060] Antitela ovog otkrivanja i njihovi epitop-vezujući fragmenti će poželjno biti "humanizovani," naročito ako se koriste u terapijske svrhe. Pojam "humanizovani" se odnosi na molekul, koji se generalno priprema upotrebom rekombinantnih tehnika, sa epitop-vezujućim mestom dobijenim od imunoglobulina od nehumanih vrsta preostale imunoglobulinske strukture bazirane na strukturi i / ili sekvenci humanog imunoglobulina. Epitop-vezujuće mesto može da obuhvata ili varijabilne domena potpunog nehumanog antitela spojene u humane konstantne domene, ili samo regione koji određuju komplementarnost (CDR-ovi), ili njihove delove, takvih varijabilnih domena nakalemljenih na odgovarajuće humane okvirne regione humanih varijabilnih domena. Ostaci okvira takvih humanizovanih molekula mogu biti divljeg tipa (npr., u potpunosti humani) ili mogu biti modifikovani da sadrže jednu ili više aminokiselinskih supstitucija koje nisu pronađene u humanom antitelu čija sekvenca služi kao osnova za humanizaciju. Humanizacija smanjuje ili eliminiše verovatnoću da će konstantni domen tog molekula dejstvovati kao imunogen kod humanih pojedinaca, ali mogućnost imunološkog odgovora na strani varijabilni domen ostaje (LoBuglio, A.F. et al. (1989) "Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics and Immune Response," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224). Drugi pristup se fokusira ne samo na obezbeđivanje konstantnih domena dobijenih od ljud, već modifikovanje varijabilnih domena kao i na to da ih preoblikuje što je približnije moguće u humani oblik. Poznato je da varijabilni domeni i teških i lakih lanaca sadrže tri regiona za određivanje komplementarnosti (CDR-ovi) koji variraju u odgovoru na specifične antigene i određuju sposobnost vezivanja, flankovanu sa četiri okvirna regiona (FR-ovi) koji su relativno konzervisani u datim vrstama i koji navodno obezbeđuju skele za CDR-ove. Kada se nehumana antitela pripreme vezano za određeni antigen, varijabilni domeni mogu biti "preoblikovani" ili "humanizovani" kalemljenjem CDR-ova dobijenih od nehumanog antitela na FR-ovima prisutnim u humanom antitelu koje bi trebalo modifikovati. Primena ovog pristupa na razna antitela je prijavljena od strane Sato, K. et al. (1993) Cancer Res 53:851-856. Riechmann, L. et al. (1988) "Reshaping Human Antibodies for Therapy", Nature 332:323-327; Verhoeyen, M. et al. (1988) "Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity," Science 239:1534-1536; Kettleborough, C. A. et al. (1991) "Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR-Grafting: The Importance Of Framework Residues On Loop Conformation," Protein Engineering 4:773-3783; Maeda, H. et al. (1991) "Construction Of Reshaped Human Antibodies With HIV-Neutralizing Activity", Human Antibodies Hybridoma 2:124-134; Gorman, S. D. et al. (1991) "Reshaping A Therapeutic CD4 Antibody, " Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:4181-4185; Tempest, P.R. et al. (1991) "Reshaping A Human Monoclonal Antibody To Inhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection in vivo", Bio/Technology 9:266-271; Co, M. S. et al. (1991) "Humanized Antibodies For Antiviral Therapy", Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:2869-2873; Carter, P. et al. (1992) "Humanization Of An Anti-p 185her2 Antibody For Human Cancer Therapy," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 89:4285-4289; and Co, M.S. et al. (1992) "Chimeric And Humanized Antibodies With Specificity For The CD33 Antigen," J. Immunol.148:1149-1154. U nekim načinima ostvarivanja, humanizovana antitela čuvaju sve CDR sekvence (na primer, humanizovano mišje antitelo koje sadrži svih šest CDR-ova od mišjih antitela). U drugim načinima ostvarivanja, humanizovana antitela imaju jedan ili više CDR-ova (jedan, dva, tri, četiri, pet, šest) koji se menjaju u odnosu na originalno antitelo, koji su takođe nazvani jedan ili više CDR-ova "dobijenih od" jednog ili više CDR-ova od originalnog antitela. Mogućnost da se humanizuje antitelo je dobro poznata (videti, npr., US Patent br.
5,225,539; 5,530,101; 5,585,089; 5,859,205; 6,407,213; 6,881,557).
[0061] Pojam "antitelo "XX" je predviđen da označava antitelo ili njegov epitop-vezujući fragment (na primer antitelo "C10-2"), koji obuhvata ili se sastoji od: (a) lakog lanca i ili teškog lanca, varijabilnog domena teškog lanca, ili CDR1-3 varijabilnog domena teškog lanca kako je definisano njegovom odgovarajućom SEQ ID NO, ili (b) varijabilnog domena lakog lanca i ili varijabilnog domena teškog lanca, ili CDR1-3 varijabilnog domena teškog lanca kako je definisano njegovom odgovarajućom SEQ ID NO, ili (c) CDR1-3varijabilnog domena lakog lanca, kako je definisano njegovom odgovarajućom SEQ ID NO, i ili varijabilnog domena teškog lanca, ili CDR1-3 varijabilnog domena teškog lanca kako je definisano njegovom odgovarajućom SEQ ID NO. U određenim načinima ostvarivanja antitelo ili njegov epitopvezujući fragment su definisani njihovim čitavim varijabilnim domenom teškog lanca koji obuhvata kako je definisano njihovom SEQ ID NO i njihovim varijabilnim domenom lakog lanca kako je definisano njihovom SEQ ID NO.
[0062] Ukoliko ovde nije drugačije naznačeno, numerisanje aminokiselinskih ostataka u FC regionu ili konstantnom domenu antitela je u skladu sa EU sistemom numerisanja, koji se takođe zove i EU indeks, kako je opisano u Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.
[0063] U nekim antitelima, samo deo CDR, naime podskup ostataka CDR potrebnih za vezivanje, označenih kao SDR-ovi, su potrebni da bi se zadržao vezivanje u humanizovanom antitelu. CDR ostaci koji ne stupaju u kontakt sa relevantnim epitopom a ne u SDR-ovima mogu biti identifikovani na osnovu ispitivanja. Na primer, ostaci Tyr Ser Gln Lys Phe Gln, koji odgovaraju ostacima 60-65 HC iz SEQ ID NO.
2
11 često nisu potrebni iz regiona Kabat CDR-ova (ovi su takođe pronađeni u HC CDR2 (SEQ.ID. NO.7), koji se nalaze izvan Chothia hipervarijabilnih petlji (videti, Kabat et al. (1992) SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, National Institutes of Health Publication No.91-3242; Chothia, C. et al. (1987) "Canonical Structures For The Hypervariable Regions Of Immunoglobulins," J. Mol. Biol.196:901-917), molekulskim modelovanjem i/ili empirijski, ili kako je opisano u Gonzales, N.R. et al. (2004) " SDR Grafting Of A Murine Antibody Using Multiple Human Germline Templates To Minimize Its Immunogenicity," Mol. Immunol.41:863-872. U takvim humanizovanim antitelima na položajima u kojima jedan ili više davalaca CDR ostataka nije prisutan ili u kojima je čitav davalac CDR ostataka izostavljen, pri čemu aminokiselina koja zauzima položaj može biti aminokiselina koja može da zauzme odgovarajući položaj (Kabat numerisanjem) u sekvenci antitela primaoca. Broj takvih supstitucija za aminokiseline primaoca za davaoca u CDR-ovima koji bi trebalo uključiti odražava ravnotežu kompetitivnih razmatranja. Takve supstitucije su potencijalno poželjne u smanjivanju broja mišjih aminokiselina u humanizovanom antitelu i posledično smanjivanju potencijalne imunogenosti.
Međutim, supstitucije takođe mogu da uzrokuju promene afiniteta, a značajna smanjenja afiniteta se poželjno izbegavaju. Položaji za supstituciju unutar CDR-ova i aminokiselina koje bi trebalo supstituisati su izabrane empirijski.
[0064] Antitela su takođe okarakterisana prema IMGT sistemu numerisanja, koji je dobro definisan u ovom polju. Dužina (u broju aminokiselina, koji predstavlja broj zauzetih položaja) je ključna i originalni koncept IMGT-ONTOLOGY (http://www.imgt.org). CDR-IMGT dužine karakterišu IG i TR V-REGIONi gena zametnih stanica i V-Domeni preraspodeljenih gena, cDNK i proteina.
[0065] Antitela mogu biti okarakterisana na primer prema šemi Chothia
numerisanja http://www.bioinf.org.uk/abs/. Šema Chothia numerisanja je identična Kabat šemi, ali se umetanja izvode u CDR-L1 i CDR-H1 na strukturno definisanim položajima. Šema Chothia numerisanja je bazirana na mestu regiona strukturne petlje. Ovo znači da topološki ekvivalentni ostaci u ovim petljama dobijaju istu etiketu (za razliku od Kabat šeme).
[0066] Činjenica da pojedinačna aminokiselinska izmena CDR ostatka može da dovede do gubitka funkcionalnog vezivanja >Rudikoff, S. itd. (1982) " Single Amino Acid Substitution Altering Antigen-Binding Specificity," Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79(6):1979-1983)) obezbeđuje sredstva za sistematsko identifikovanje alternativnih funkcionalnih CDR sekvenci. U jednom poželjnom postupku za dobijanje CDR-ova takve varijante, polinukleotidno kodiranje CDR je mutagenizvoano (na primer putem nasumične mutageneze ili putem postupka usmerenog na mesto (npr., amplifikacija polimeraze posredovana lancem sa primerima koji kodiraju mutirani lokus) da bi se proizveo CDR sa supstituisanim aminokiselinskim ostatkom. Poređenjem identiteta relevantnog ostatka u originalnoj (funkcionalnoj) CDR sekvenci sa identitetom supstituisane (nefunkcionalne) varijante CDR sekvence, BLOSUM62.iij rezultat supstitucije za tu supstutuciju može biti definisan. BLOSUM sistem obezbeđuje matricu
2
aminokiselinskih supstitucije kreiranih analiziranjem baze podataka sekvenci za pouzdana poravnanja (Eddy, S.R. (2004) "Where Did The BLOSUM62 Alignment Score Matrix Come From?," Nature Biotech.
22(8):1035-1036; Henikoff, J.G. (1992) "Amin acid substitution matrices from protein blocks, " Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89:10915-10919; Karlin, S. et al. (1990) " Methods For Assessing The Statistical Significance Of Molecular Sequence Features By Using General Scoring Schemes," Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 87:2264-2268; Altschul, S.F. (1991) "Amino acid Substitution Matrices From An Information Theoretic Perspective," J. Mol. Biol.219, 555-565. Trenutno, najnaprednija baza podataka BLOSUM je BLOSUM62 baza podataka (BLOSUM62.iij). Tabela 1 predstavlja BLOSUM62.iij rezultate supstitucije (što je veći rezultat konzervativnija je supstitucija i samim tim verovatnije je da prva supstitucija neće uticati na funkciju). Ako se epitop-vezujući fragment koji obuhvata dobijeni CDR ne vezuje za tau, na primer, onda se BLOSUM62.iij rezultat supstitucije smatra da je nedovoljno konzervativan, a novi kandidat za supstituciju je izabran i proizveden sa većim supstitucionim rezultatom. Stoga, na primer, ako je originalni ostatak glutamat (E), a nefunkcionalni ostatak supstituta je histidin (H), onda će BLOSUM62.iij rezultat supstitucije biti 0, i poželjne su konzervativnije promene (kao što je u aspartat, asparagin,
2
glutamin ili lizin).
[0067] Ovo otkrivanje samim tim razmatra upotrebu nasumične mutageneze radi identifikacije poboljšanih CDR-ova. Konzervativne supstitucije mogu biti definisane supstitucije unutar klasa aminokiselina prikazanih u jednoj ili više tabla 2, 3, ili 4:
Klase aminokiselinskih ostataka za konzervativne supstitucije:
2
Nepolarni nenaelektrisani ostaci Cys (C), Met (M), i Pro (P)
Aromatični ostaci Phe (F), Tyr (Y), i Trp (W)
Alternativne klase supstitucija konzervativnih aminokiselinskih ostataka:
Alternativne fizičke i funkcionalne klasifikacije aminokiselinskih ostataka:
[0068] Grupisanja konzervativnijih supstitucija uključuju: valin-leucin-izoleucin, fenilalanin-tirozin, lizinarginin, alanin-valin, i asparagin-glutamin.
2
[0069] Dodatne grupe aminokiselina takođe mogu biti formulisane pomoću principa opisanih u, npr., Creighton (1984) Proteins: Structure and Molecular Properties (2d Ed.1993), W. H. Freeman and Company.
[0070] Tehnologija prikaza faga alternativno može da se koristi da se poveća (ili smanji) afinitet CDR. Ova tehnologija, označena kao sazrevanje afiniteta, upošljava mutagenezu ili " šetajući CDR " i re-izbor koristi ciljni antigen ili njegov antigenski epitop-vezujući fragment kako bi se identifikovala antitela sa CDR-ovima koji se vezuju sa višim afinitetom (ili nižim) afinitetom za antigen kada se uporedi sa početnim ili matičnim antitelom (videti, npr. Glaser et al. (1992) J. Immunology 149:3903).
Mutagenizovanje čitavih kodona pre nego pojedinačnog nukleotida dovodi do polu-randomizovanog repertoara aminokiselinskih mutacija. Biblioteke mogu biti konstruisane koje se sastoje od grupe klonova varijanti od kojih se svaki razlikuje u pojedinačnoj aminokiselnskoj izmeni u pojedinačnom CDR i koji sadrži varijante od kojih svaka predstavlja svaku moguću aminokiselinsku supstituciju az svaki ostatak CDR. Mutanti sa povećanim (ili smanjenim) afinitetom za vezivanje za antigen mogu biti detaljno pregledani stupanjem u kontakt sa imobilisanim mutantima sa obeleženim antigenom. Bilo koji postupak skrininga poznat u tehnici takođe može da se koristi kako bi se identifikovala mutantna antitela povećanog ili smanjenog afiniteta za antigen (npr., ELISA) (videti Wu et al.1998, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 95:6037; Yelton et al., 1995, J. Immunology 155:1994). Šetanje CDR koje randomizuje laki lanac takođe može da se koristi (videti, Schier et al., 1996, J. Mol. Bio.263:551).
[0071] Postupci za postizanje takve zrelosti afiniteta su opisani na primeru: Krause, J.C. et al. (2011) "An Insertion Mutation That Distorts Antibody Binding Site Architecture Enhances Function Of A Human Antibody," MBio.2(1) pii: e00345-10. doi: 10.1128/mBio.00345-10; Kuan, C.T. et al. (2010) "Affinity-Matured Anti-Glycoprotein NMB Recombinant Immunotoxins Targeting Malignant Gliomas And Melanomas," Int. J. Cancer 10.1002/ijc.25645; Hackel, B.J. et al. (2010) "Stability And CDR Composition Biases Enrich Binder Functionality Landscapes," J. Mol. Biol.401(1):84-96; Montgomery, D.L. et al. (2009) "Affinity Maturation And Characterization Of A Human Monoclonal Antibody Against HIV-1 gp41, " MAbs 1(5):462-474; Gustchina, E. et al. (2009) "Affinity Maturation By Targeted Diversification Of The CDR-H2 Loop Of A Monoclonal Fab Derived From A Synthetic Naïve Human Antibody Library And Directed Against The Internal Trimeric Coiled-Coil Of Gp41 Yields A Set Of Fabs With Improved HIV-1 Neutralization Potency And Breadth, " Virology 393(1):112-119; Finlay, W.J. et al. (2009) "Affinity Maturation Of A Humanized Rat Antibody For Anti-RAGE Therapy: Comprehensive Mutagenesis Reveals A High Level Of Mutational Plasticity Both Inside And Outside The Complementarity-Determining Regions," J. Mol. Biol.388(3):541-558; Bostrom, J. et al. (2009) "Improving Antibody Binding Affinity And Specificity For Therapeutic Development," Methods Mol. Biol.525:353-376; Steidl, S. et al. (2008) "In Vitro Affinity Maturation Of Human GM-CSF Antibodies By Targeted CDR-Diversification," Mol.
Immunol.46(1):135-144; and Barderas, R. et al. (2008) "Affinity Maturation Of Antibodies Assisted By In Silico Modeling," Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 105(26):9029-9034.
[0072] Samim tim, sekvenca CDR varijanti obuhvaćenih antitela ili njihovih epitop-vezujućih fragmenata može da se razlikuje od sekvence CDR matičnog antitela, C10-2 i C10.2 Varijante, kroz supstitucije; na primer supstituisana 4 aminokiselinska ostatka, 3 aminokiselinska ostatka, 2 aminokiselinska ostatka ili 1 od aminokiselinskih ostataka. Dalje je predviđeno da aminokiseline u CDR regionima mogu biti supstituisane konzervativnim supstitucijama, kako je definisano u 3 tabele gore iznad. Na primer, kiseli ostatak Asp može biti suptustuisan sa Glu bez suštinskog uticaja na vezivanje karakterističnih antitela.
[0073] Kako se ovde upotrebljava, za antitelo ili njegov epitop-vezujući fragment se kaže da "specifično" vezuje region drugog molekula (tj., epitopa) ukoliko reaguje ili se združuje češće, brže, uz duže trajanje i/ili sa višim afinitetom ili aviditetom sa epitopom koji se odnosti na alternativne epitop. Čitanjem ovde definicije se takođe podrazumeva, na primer, da antitelo ili njegov epitop-vezujući fragment koji se specifično vezuje za prvi cilj možda neće ili možda neće specifično da se vezuje za drugi cilj. Kako se ovde upotrebljava, pojam "vezivanje" u kontekstu vezivanja antitela za prethodno određen antigen se uglavnom odnosi na vezivanje uz afinitet koji odgovara KD od oko 10<-7>M ili manje, kao što je oko 10<-8>M ili manje, kao što je oko 10<-9>M ili manje kada se određuje na primer tehnologijom površinske rezonance plazmona (SPR) u BIAcore® 3000 instrumentu pomoću antigena kao liganda i antitela kao analita, i vezuje se za prethodno određeni antigen sa afinitetom koji odgovara KD odnosno najmanje dese puta nižem, kao što je najmanje 100 puta nižem, na primer najmanje 1,000 puta nižem, kao što je najmanje 10,000 puta nižem, na primer najmanje 100,000 puta nižem od njegovog afiniteta za vezivanje za nespecifični antigen (npr., BSA, kasein) a da to nije prethodno određeni antigen ili bliko povezani antigen. Količina sa kojom je afinitet niži je zavisna od KD antitela, tako da kada su KD antitela veoma niska (odnosno, antitelo je izuzetno specifično), onda ta količina sa kojom je afinitet za antigenom niži od afiniteta za nespecifičnim antigenom može iznositi najmanje 10,000 umnožaka.
[0074] Pojam "kd" (sec -1 ili 1/s), kako se ovde upotrebljava, odnosi se na konstantu brzine disocijacije određene antitelo-antigen interakcije. Pomenuta vrednost se takođe odnosi na kof vrednost.
[0075] Pojam "ka" (M-1 x sec-1 ili 1/Msec), kako se ovde upotrebljava, se odnosi na konstantu brzineasocijacije određene antitelo-antigen interakcije.
[0076] Pojam "KD" (M), kako se ovde upotrebljava, odnosi se na ravnotežnu konstantu disocijacije određene antitelo-antigen interakcije i dobija se kada se kd podeli sa ka.
[0077] Pojam "KA" (M-1 ili 1/M), kako se ovde upotrebljava, odnosi se na ravnotežnu konstantu asocijacije određene antitelo-antigen interakcije i dobija se kada se kad podeli sa kd.
[0078] U jednom načinu ostvarivanja, ovo otkrivanje se odnosi na anti-tau antitelo, ili njegov epitopvezujući fragment, koji ispoljava jedno ili više od sledećih svojstava:
(i) suštinska nemogućnost vezivanja za nefosforilisani tau;
1
(ii) suštinska nemogućnost za vezivanje za tau koji je fosforilisan na S404 a nije fosforilisan na S396; (iii) mogućnost vezivanja za tau fosforilisan na S396;
(iv) mogućnost vezivanja za tau fosforilisan i na S396 i na S404;
(v) mogućnost da se selektivno diskriminiše između fosforilisanih tau ostataka S396 i S404 tako da je suštinski nemoguće vezivanje za fosforilisan 404 ostatak (pS404);
(vi) mogućnost vezivanja za hiperfosforilisani tau iz mozgova ljudi sa Alchajmerovom bolešću; (vii) mogućnost da se diskriminiše između pataloškog i nepatološkog humanog tau proteina; i/or (viii) sposobnost, kada se koristi sa ovde opisanim imunodeplecionim rTg4510 ekstraktima od transgenih miševa, da se specifično smanji hiperfosforilisane tau 64kDa i 70kDa trake za najmanje 90%, pri čemu se tau traka 55 kDa ne smanjuje za više od 10%; ili sposobnost, kada se upotrebljava kao ovde opisani ekstrakti iz humanih AB mozgova post-mortem da se specifično smanjuju S396 fosforilisane hiperfosforilisane tau trake za najmanje 90%, pri čemu se nefosforilisane tau trake ne smanjuju za više od 10%.
[0079] Ovo otkrivanje se dalje odnosi na postupak za dobijanje antitela izuzetne specifičnosti, pri čemu taj postupak obuhvata faze:
(A) ubrizgavanje imunogena u sisara, kako bi se time sisar imunizovao;
(B) ponavljanja pomenute imunizacije pomenutog sisara dva ili više puta;
(C) skrining uzorka seruma od pomenutog ponovno imunizovanog sisara zbog prisutnosti željene velike specifičnosti, visokog afiniteta antitela ali koji je suštinski manje sposoban da se vezuje za drugi protein; i
(D) oporavljanja pomenute antitela velike specifičnosti, visokog afiniteta .
[0080] Ovo otkrivanje se samim tim odnosi na antitelo velike specifičnosti, visokog afiniteta specifično za patogeni hiperfosforilisan tau koji obuhvata ostatak fosforilisani S396. Takva antitela mogu da nastanu prilagođavanjem gore naznačenog postupka za stvaranje velike specifičnosti, visokog afiniteta antitela putem:
(A) ubrizgavanja imunogena u sisara,pri čemu pomenuti imunogen obuhvata bi-fosforilisani peptid koji obuhvata 18-40, kao što je na 18-30, kao što je 20-30 uzastopnih aminokiselinskih ostataka koji obuhvataju TDHGAEIVYK<{p}>SPVVSGDT<{p}>SPRHL (SEQ ID NO:2) ostatke koji pokrivaju 386-410 od 2N4R tau, kako bi se time sisar imunizovao;
(B) ponavljanja pomenute imunizacije pomenutog sisara dva ili više puta;
(C) skrininga uzorka seruma od pomenutog ponovno imunizovanog sisara zbog prisutnosti velike specifičnosti, visokog afiniteta antitela koje može da se vezuje za patogeni hiperfosforilisani tau koji obuhvata ostatak fosforilisan S396, ali koji je suštinski manje sposoban da se vezuje za nepatogeni tau; i
(D) oporavljanja pomenutih antitela velike specifičnosti, visokog afiniteta .
2
[0081] Kako se ovde upotrebljava, "suštinska nemogućnost" vezivanja za tau molekul označava više od 20% razlike, više od 40% razlike, više od 60% razlike, više odn 80% razlike, više od 100% razlike, više od 150% razlike, više od 2-struke razlike, više od 4-struke razlike, više od 5-struke razlike, ili više od 10-struke razlike u funkcionalnosti, u odnosu na vezivanje koje može da se detektuje posredovano referentnim antitelom.
[0082] Pojam "selektivan" i "imunoselektivan" kada se odnosi na sposobnosti vezivanja anti-tau antitela u odnosu na dva epitopa je predviđeno da označi da primećeno vezivanje u uslovi zasićenosti ispoljava najmanje 80% razlike, najmanje 95% razlike, i najpoželjnije 100% razlike (tj., bez vezivanja za epitop koje može da se detektuje). Pojam "selektivan" i "imunoselektivan" kada se odnosi na tau antitelo je dalje predviđen da označava da se antitelo vezuje za hiperfosforilisani tau iz humanih mozgova sa Alchajmerovom bolešću i da može da diskriminiše patološki i nepatološki humani tau protein.
[0083] Pojmovi TBS-ekstraktabilan (S1), visoko slani/sarkozil-ekstraktabilan (S3), i frakcije nerastvorljive u sarkozilu (P3) su frakcije dobijene tau biohemijskom ovde opisanom frakcionacijom.
[0084] Pojam "normalni tau" se odnosi na normalni tau u mozgu koji sadrži 2-3 molova fosfata po molu proteina.
[0085] Pojam "hiperfosforilisani tau" se odnosi na poli-fosforilisanu vrstu taua koje su konzistentne sa pomeranjem pokretljivosti u Vestern Blotu indukovane polianjonskim vrstama ili tau vrstu koja ima više od pet, šest ili sedam serinskih, treoninskih ili tirozinskih fosforilisanih mesta.
[0086] Pojam "tau sa fosforilisanim ostatkom 396" se odnosi na hiperfosforilisani tau pri čemu je serinski ostatak 396 fosforilisan.
[0087] Pojam "transgena nehumana životinja" se odnosi na nehumanu životinju sa genomom koji obuhvata jedan ili više humanih transgena teškog i/ili lakog lanca ili transhromozome (bilo integrisane ili neintegrisane u životinjsku prirodnu genomsku DNK) i koja može da eksprimira u potpunosti humana antitela. Na primer, transgeni miš može da ima humani transgen lakog lanca i bilo humani transgen teškog lanca ili humani transhromozom teškog lanca, takav da miš proizvodi humano anti-tau antitelo kada se imunizuje sa tau antigenom i/ili ćelije koje eksprimiraju tau. Transgen humanog teškog lanca može biti integrisan u hromozomsku DNK tog miša, kao u slučaju transgenih miševa, na primer HuMAb miševa, kao što su HCo7 ili HCol2 miševi, ili transgen humanog teškog lanca može da se održava ekstrahromozomalno, kao u slučaju transhromozomalnih KM miševa kako je opisano u WO02/43478. Takvi transgeni i transhromozomalni miševi (ovde zbirno označeni kao "transgeni miševi") mogu da proizvode višestruke izotipove humanih monoklonalnih antitela za dati antigen (kao što je IgG, IgA, IgM, IgD i/ili IgE) podvrgavanjem V-D-J rekombinaciji i zamenjivanju izotipova.
[0088] Transgena, nehumana životinja takođe može da se koristi za proizvodnju antitela protiv specifičnog antigena uvođenjem gena koji kodiraju takvo specifično antitelo, na primer operativno povezujući gene sa genom koji je eksprimiran u mleku te životinje.
[0089] Pojam "lečenje" ili "koji leči" kako se ovde upotrebljava označava poboljšavanje, usporavanje, atenuisanje, ili obrtanje napretka ili ozbiljnosti bolesti ili poremećaja, ili poboljšanje, usporavanjem atenuisanje, ili menjanja smera jednog ili više simptoma ili neželjenih efekata takve bolesti li poremećaja. U svrhe ovog pronalaska, "lečenje" ili "koji leči" dalje označava pristup za dobijanje korisnih ili željenih kliničkih rezultata, pri čemu "korisni ili željeni klinički rezultati" uključuju, bez ograničenja, ublažavanje simptoma, umanjivanje opsega poremećaja ili bolesti, stabilizovanu (tj., koja se ne pogoršava) bolest ili stanje poremećaja, odlaganje ili usporavanje napredovanja bolesti ili stanja poremećaja, poboljšavanje ili ublažavanje bolesti ili stanja poremećaja, i remisiju bolesti ili poremećaja, bili delimično bilo u celosti.
[0090] "Efikasna količina," kada se odnosi na antitelo ili njegov epitop-vezujući fragment ovog pronalaska, odnosi se na količinu koja je dovoljna, u dozama i tokom vremsnkih perioda neophodnih, da se postigne predviđeni biološki efekat ili željeni terapeutski rezultat uključujući, bez ograničenja, kliničke rezultate. Fraza "terapijski efikasna količina," kada se odnosi na antitelo ili na njegov epitop-vezujući fragment, je predviđena da označava količinu antitela, ili njegov epitop-vezujući fragment, koja je dovoljna da se olakša, ublaži, stabilizuje, obrne, uspori ili atenuiše ili odloži napredak poremećaja ili stanja bolesti, ili simptoma poremećaja ili bolesti. U jednom načinu ostvarivanja, ovo otkrivanje obezbeđuje za davanje antitela, ili njegov epitop-vezujući fragment, u kombinaciji sa drugim jedinjenjima. U takvim slučajevima, "efikasna količina" predstavlja količinu kombinacije dovoljne da uzrokuje predviđeni biološki efekat.
[0091] Terapijski efikasna količina anti-tau antitela ili njegovog epitop-vezujućeg fragmenta može da varira u skladu sa faktorima kao što su stanje bolesti, uzrast, pol i masa pojedinca, i mogućnost anti-tau antitela, ili njegovog epitop-vezujućeg fragmenta, da izazove željeni odgovor kod pojedinca. Terapijski efikasna količina je takođe ona u kojoj bilo koji toksični ili štetni efekti antitela ili dela antitela prevazilaze terapijski korisne efekte.
[0092] Kako je gore naznačeno, ovo otkrivanje se naročito odnosi na monoklonalna antitela, ili njihove epitop-vezujuće fragmente, na potpuno nov postupak za proizvodnju takvih molekula (i samim tim takvih njihovih epitop-vezujućih fragmenata). Ova mogućnost novog postupka da se izoluju monoklonalna antitela je podaci ovde primera radi njegovom upotrebom da se izoluju koja mogu specifično da se vezuju za fosforilisani serinski ostatak 396 (P-S396, pS396,<{p}>S396) humanog tau (SEQ ID NO:1). Ova antitela su dalje okarakterisana njihovom sposobnošću da diskriminišu između fosforilisanih serinskih ostataka 396 i serina 404 (P-S404, pS404) tako da se ne vezuju za tau protein sa fosforilisanim serinom 404 ukoliko tau nije fosforilisan takođe na ostatku 396.
[0093] Antitela ovog otkrivanja, ili njegov epitop-vezujući fragment, su napravljeni i izolovani upotrebom novog postupka koji daje prednost odabiru pS396 specifičnih antitela. Dalje, primenom ovog veoma strogog postupka odabira klona antitela, dobijena su antitela koja nisu samo izuzetno specifična prema
4
S396, već su takođe izuzetno selektivna prema fosforilisanom pS396 epitopu. Ova antitela jedinstveno prepoznaju tau iz mozgova sa Alchajmerovom bolešću. Postupak skrininga obezbeđuje identifikaciju antitela koja ima funkcionalnu i terapijsku iskoristivost.
[0094] Antitela su podignuta protiv bi-fosforilisanog peptida: TDHGAEIVYK{p}SPVVSGDT{p}SPRHL (SEQ ID NO:2) koij pokriva ostatke 386-408 od 2N4R tau. Miševi su imunizovani fosfopeptidom. Kada je dobijeno dovoljno titara antitela, miše su žrtvovani i stvoreni su hibridomi. Hibridomi su detaljno pregledani pomoću dot-blot i MSD ELISA sa imobilisanim humanim patološkim i nepatološkim tau. Mogućnost da se diskriminiše između patološkog i nepatološkog humanog tau proteina u dot-blot i Vestern blot je korišćena za odabir hibridoma. Šesnaest klonova je izabrano, od kojih su četiri klona oporavljena koja su proizvodila antitela koja su ispoljavala neobične sposobnosti za vezivanje za humani patološki tau materijal.
[0095] Specifično vezivanje za patološki i nepatološki tau je takođe određeno izolacijom tau iz bolesnih i zdravih humanih mozgova sa AB i imobilizacijom ovog materijala na MSD ELISA pločama (Primer 4).
[0096] Dalje je ovde otkriveno monoklonalno antitelo ili njegov epitop-vezujući fragment dobijen protiv bi-fosforilisanog peptida koje obuhvata najmanje 18, kao što je najmanje 20 uzastopnih aminokiselinskih ostataka unutar TDHGAEIVYK<{p}>SPVVSGDT<{p}>SPRHL (SEQ ID NO:2) koja pokriva ostatke 386-410 od 2N4R tau. U ovom aspektu, monoklonalno antitelo ili njegov epitop-vezujući fragment se obično dobija protiv bi-fosforilisanog peptida koji obuhvata 18-40, kao što je na 18-30, kao što je 20-30 uzastopnih aminokiselinskih ostataka koji obuhvataju TDHGAEIVYK<{p}>SPVVSGDT<{p}>SPRHL (SEQ ID NO:2) koja pokriva ostatke 386-410 od 2N4R tau.
[0097] Dalje je ovde otkriveno monoklonalno antitelo ili njegov epitop-vezujući fragment, sa specifičnošću za fosfoTau (pTau) od pacijenata koji boluju od AB u odnosu na zdrave kontrole istog godišta, tako da pomenuto monoklonalno antitelo ili njegov epitop-vezujući fragment ima razliku specifičnosti za fosfoTau (pTau) od pacijenata koji boluju od AB u odnosu na tau od zdravih kontrola istog godišta od više od 50-strukog, kao što je više od 100-strukog povećanja specifičnosti za materijal AB bolesti u odnosu na zdrav kontrolni materijal u ispitivanju baziranom na ELISA-i za detekciju fosfoTau (pTau) u moždanim homogenatima od subjekata sa AB i od zdravih kontrolnih subjekata, pomoću fosfoi multimer-specifične Setup 1 ELISA ili MSD kako je ovde opisano.
[0098] Ovde je takođe otkriveno monoklonalno antitelo ili njegov epitop-vezujući fragment sa specifičnošću za tau kod obolelih od AB tako da pomenuto monoklonalno antitelo ili njegov epitopvezujući fragment ima razlike u specifičnosti za AB u poređenju sa zdravim kontrolama istih godišta od više od 50-strukog, kao što je više od 100-strukog povećanja specifičnosti za materijal AB bolesti u odnosu na zdrav kontrolni materijal u ispitivanju baziranom na ELISA ili MSD za detekciju fosfoTau (pTau) u moždanim homogenatima od subjekata sa AB i od zdravih kontrolnih subjekata, upotrebom fosfo- i multimer-specifične Setup 1 ELISA.
[0099] Setup 1 ELISA ili MSD postupak obuhvata faze A) hvatanja patoloških humanih tau antigena iz mozgova sa AB upotrebomC10-2 obloženih ploča; B) inkubacije Tau antigena sa rastućim koncentracijama od pS396 specifičnih antitela; i C) detekcije preostalih slobodnih tau antigena uhvaćenih imobilisanim C10.2 upotrebom sulfo-obeleženih anti humanih (ukupno) Tau antitela iz MSD.
[0100] Konkretnije, faza A obuhvata: oblaganje MSD ploča (obično tokom noći na 4 stepena C) C10-2 antitelom, oblično 0,5 µg/ml (antitelo za hvatanje) u puferu za oblaganje, blokiranje (obično 1 sat na sobnoj temperaturi) i pranje, obično 3 puta. Faza B obuhvata: mešanje uzorakaP3 lizata (obično razblaženih 1:1000 = 2-4 µg/ml ukupnih proteina) i/ili S1(p) (obično razblaženi 1:300=20-40 ng/ml ukupnih proteina) od AB (grupisane od 3 pacijenta) sa graduisanim koncentracijama specifičnog antitela pS396 peptidnog epitopa i inkubiranje (obično 1 sat na sobnoj temperaturi). Reakcije su naknadno inkubirane tokom 2 sata na pločama pripremljenim u fazi A. Faza C obuhvata detektovanje C10-2 uhvaćenog Tau je koristila antitelo sulfo-obeleženog humanog tau (obično 1:50) od MSD u skladu sa uputstvima proizvođača. Ploče su analizirane na MSD SECTOR® S600. AD P3 i AD S1(p) su ispitivani u sličnim okolnostima.
[0101] Dalji način ostvarivanja je usmeren na antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment, koji može specifično da se vezuje za fosforilisani serinski ostatak 396 humanog tau (SEQ ID NO:1), koji je proizveden ili izrađen u ćelijskoj liniji kao što je humana ćelijska linija, nehumana ćelijska linija sisara, insekta, kvasca ili bakterijska ćelijska linija.
[0102] Antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, koji može specifično da se vezuje za fosforilisani ostatak 396 humanog tau (SEQ ID NO:1), proizveden u CHO ćelijskoj liniji, HEK ćelijskoj liniji, BHK-21 ćelijskoj liniji, mišjoj ćelijskoj liniji (kao što je mijelomska ćelijska linija), fibrosarkomskoj ćelijskoj liniji, PER. C6 ćelijskoj liniji, HKB-11 ćelijskoj liniji, CAP ćelijskoj liniji i HuH-7 humanoj ćelijskoj liniji.
[0103] Specifični afiniteti i svojstva vezivanja varijanti C10-2 i C10.2 su okarakterisana pomoću tau 386-410 (2R4N) peptida koji su ili fosforilisani ili nefosforilisani na položaju 396 ili 404. Upotreba protokola specifične imunizacije i skrininga opisanog u ovoj prijavi će proizvesti izuzetno fosfor-serinska-396 (pS396) specifična antitela.
[0104] Kako bi se pokazalo da su antitela specifična prema patološkom tau, C10-2 antitela su takođe okarakterisana imunohistohemijskim analizama. Antitela pokazuju izuzetno specifično vezivanje za neurofibrilarnu klubad u mozgovima sa Alchajmerovom bolešću (tau klubad) i u delovima od Tg4510 tau transgenih miševa koji eksprimiraju humani (P301L) mutantni tau. Nije primećeno vezivanje za tkivo humanih kontrolnih mozgova i netransgenih mišjih mozgova, čime se pokazuje da se antitela specifično vezuju za humani tau a naročito za tau povezan sa patologijom Alchajmerove bolesti.
Antitelo C10-2
[0105] Ovde je otkriveno monoklonalno antitelo, ili njegov epitop vezujući fragment, koje obuhvata (a) CDR1 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:3;
(b) CDR2 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:4;
(c) CDR3 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:5;
(d) CDR1 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:6;
(e) CDR2 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:7; i
(f) CDR3 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:8.
[0106] Dalje je ovde otkriveno monoklonalno antitelo, ili njegov epitop vezujući fragment, koje obuhvata
(a) laki lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:12; i
(b) teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:11.
[0107] Alternativno definisano, upotrebom IMGT definicije, ovde je otkriveno monoklonalno antitelo, ili njegov epitop vezujući fragment, koje obuhvata
(a) CDR1 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:40;
(b) CDR2 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:41;
(c) CDR3 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:42;
(d) CDR1 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:43;
(e) CDR2 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:44; i
(f) CDR3 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:45.
[0108] Alternativno definisano, upotrebom Chotia definicije, ovde je otkriveno monoklonalno antitelo, ili njegov epitop vezujući fragment, koje obuhvata
(a) CDR1 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:3;
(b) CDR2 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:4;
(c) CDR3 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:5;
(d) CDR1 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:52;
(e) CDR2 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:53; i
(f) CDR3 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:54.
[0109] Pokazana je jedinstvena sposobnost antitela ovog otkrivanja da prepozna tau povezan sa patologijom bolesti. Vezivanje patološkog nasuprot nepatološkog tau je upoređeno. Poređenje je sa pet objavljenih tau antitela: hACI-2B6, IPN002, HJ8.5, 2.10.3, i 4E4.2.10.3 antitelo je komercijalno dostupno rekombinantno monoklonalno antitelo koje se specifično vezuje za Tau koji je fosforilisan na serinu 422 (pS422). HJ8.5 je komercijalno dostupno monoklonalno antitelo koje prepoznaje samo humani tau na N-terminalnom regionu (epitop na ostacima 25-30 aa). Antitelo je od IgG2b izotipa. Anti-Tau terapijsko antitelo NI-105-4E4i je komercijalno dostupno antitelo. Tabela pokazuje da izolovana antitela ispoljavaju visok stepen specifičnosti i selektivnosti prema humanom patološkom tau. Ova selektivnost je superiornija u odnosu na bilo koja uporedna antitela prikazana u tabeli 5.
[0110] Pri saturaciji, antitelo C10-2 pokazuje 100-struko veću selektivnost prema P3 tau izolovanom iz humanih mozgova sa AB.
[0111] Kako bi se pokazalo da izabrana antitela imaju funkcionalnu i terapijsku korist, antitela su ispitana pute ispitivanja tau-agregacije in-vitro i u ćelijama (primer 8). Ova ispitivanja su funkcionalna ispitivanja koja pokazuju da ta antitela mogu da se mešaju sa postupkom patološke agregacije tau. HEK293 ćelije su prolazno transfektovane sa humanim tau-P301L-FLAG (4R0N). Posle toga ćelije su izložene tau ekstraktima iz humanih mozgova sa AB ili iz mozgova transgenih Tg4510. Ovo izlaganje patološkom tau pospešuje unos tau u ćelije i intracelularnu agregaciju. I imunodeplecija tau preparata koji koriste antitelo C10-2, i direktno tretiranje ćelija ovim antitelima može dramatično da smanji stvaranje agregata.
[0112] Terapijska iskoristivost antitela C10-2 je procenjena kod humanog tau/PS1 miša. Ovaj mišji model je relevantniji životinjski model za AB bolest koji samo stvara patologiju AB kasnije u životu (12-18 meseci starosti). Međutim, miševi ispoljavaju tau hiperfosforilaciju pre javljanja patologije čvrstog klupka. Miševima je hronično ubrizgavana tokom 13 nedelja, dva puta nedeljno doza od 15 mg/kg. miševi koji su tretirani antitelom ispoljavaju dramatično smanjenje fosforilisanog tau, što ukazuje da će hronično lečenje sa C10-2 smanjiti patologiju klupka a samim tim i neurodegeneraciju in vivo koja se naknadno javlja.
[0113] Antitela ovog otkrivanja specifično uklanjaju hiperfosforilisan tau iz ekstrakata mišjih mozgovaTg4510 postupcima imunodeplecije. Štaviše, antitela ovog otkrivanja ne uklanjaju normalni tau iz homogenata, pri čemu to čini komercijalno dostupno tau5 antitelo. Nasuprot komercijalnih antitela koja se vezuju za tau proteine pri čemu je fosforilacija na ostatku 404 ili na oba ostatka 404 i 396, antitela ovog otkrivanja specifično uklanjaju hiperfosforilisan tau za 95% koji je fosforilisan na serinu 396. Eksperimenti (primer 7) pokazuju da antitelo ovog otkrivanja, uprkos samo uklanjanju veoma male frakcije ukupnog tau u mozgu homogenata (8%), antitela međutim specifično uklanjaju hiperfosforilisani tau (za 90%).
S tim u vezi, jedan aspekt ovog otkrivanja je usmeren na monoklonalno antitelo, ili na njegov epitopvezujući fragment, koji može specifično da se vezuje za patogeni hiperfosforilisan tau. Dalje, u eksperimentima u kojima je hiperfosforilisan tau uklonjen upotrebom antitela ovog otkrivanja dejstvo zasejavanja je poništeno. Uklanjanjem hiperfosforilisanog tau iz homogenata, homogenati više ne izazivaju zasejavanje Tau patologije. Predloženo je da smanjenje zasejavanja smanjuje razvoj stvaranja klupka i napredovanje tauopatije, uključujući Alchajmerovu bolest. Shodno tome, dalji aspekt ovog pronalaska je usmeren na antitelo ovog pronalaska za upotrebu smanjenju napretka AB ili kod simptoma AB.
Antitelo D55E
[0114] Ovde je otkrivena varijanta antitela antitela C10-2, antitelo D55E. Ovaj aspekt ovog otkrivanja je usmeren na monoklonalno antitelo, ili njegov epitop vezujući fragment, koje obuhvata
(a) CDR1 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:3;
(b) CDR2 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:4;
(c) CDR3 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:5;
(d) CDR1 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:6;
(e) CDR2 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:28 i
(f) CDR3 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:8.
[0115] Dalji način ostvarivanja aspekta ovog otkrivanja usmeren na antitelo D55E se odnosi na monoklonalno antitelo, ili njegov epitop vezujući fragment, koje obuhvata
(a) laki lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:12:
(b) teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:13.
[0116] Alternativno definisano, dalji način ostvarivanja aspekta ovog otkrivanja usmeren na antitelo D55E se odnosi na monoklonalno antitelo, ili njegov epitop vezujući fragment, najmanje jedan od (a) CDR1 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:3;
(b) CDR2 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:4; i
(c) CDR3 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:5;
i koje dalje obuhvata
(d) CDR1 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:6;
(e) CDR2 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:28 i
(f) CDR3 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:8.
Antitelo D55Q
[0117] Ovde je otkrivena varijanta antitela antitela C10-2, antitelo D55Q. Ovaj aspekt ovog otkrivanja je usmeren na monoklonalno antitelo, ili njegov epitop vezujući fragment, koje obuhvata
(a) CDR1 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:3;
(b) CDR2 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:4;
(c) CDR3 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:5;
(d) CDR1 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:6;
(e) CDR2 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:29; i
(f) CDR3 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:8.
[0118] Dalji način ostvarivanja aspekta ovog otkrivanja usmeren na antitelo D55Q se odnosi na monoklonalno antitelo, ili njegov epitop vezujući fragment, koje obuhvata
(a) laki lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:12; i
(b) teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:14.
[0119] Alternativno definisano, dalji način ostvarivanja aspekta ovog otkrivanja usmeren na antitelo D55Q se odnosi na monoklonalno antitelo, ili njegov epitop vezujući fragment, najmanje jedan od (a) CDR1 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:3;
(b) CDR2 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:4; i
(c) CDR3 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:5;
i koje dalje obuhvata
(d) CDR1 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:6;
(e) CDR2 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:29; i
(f) CDR3 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:8.
Antitelo D55S
[0120] Ovde je otkrivena varijanta antitela antitela C10-2, antitelo D55S. Ovaj aspekt ovog otkrivanja je usmeren na monoklonalno antitelo, ili njegov epitop vezujući fragment, koje obuhvata
(a) CDR1 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:3;
(b) CDR2 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:4;
(c) CDR3 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:5;
(d) CDR1 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:6;
(e) CDR2 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:30; i
(f) CDR3 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:8.
[0121] Dalji način ostvarivanja aspekta ovog otkrivanja usmeren na antitelo D55S se odnosi na monoklonalno antitelo, ili njegov epitop vezujući fragment, koje obuhvata
(a) laki lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:12 i
(b) teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:15.
4
[0122] Alternativno definisano, dalji način ostvarivanja aspekta ovog otkrivanja usmeren na antitelo D55S se odnosi na monoklonalno antitelo, ili njegov epitop vezujući fragment, najmanje jedan od (a) CDR1 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:3;
(b) CDR2 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:4; i
(c) CDR3 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:5;
i koje dalje obuhvata
(d) CDR1 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:6;
(e) CDR2 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:30; i
(f) CDR3 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:8.
Ispitivanja upotrebom antitela D55S, antitela D55Q, antitela D55E ukazuje da mutacija ovog ostatka dovodi do antitela sa izmenjenim svojstvima vezivanja u odnosu na pomenuta antitela pre i posle tretiranja niskim pH tokom produženog vremenskog perioda na sobnoj temperaturi, što ukazuje da ne dolazi do izomerizacije pri niskoj pH niti da bilo koji izomerizovan protein ima nepromenjena svojstva vezivanja u poređenju sa prethodnim tretiranjem.
Antitelo N32S
[0123] Ovaj pronalazak se odnosi na varijantu antitela antitela C10-2, antitelo N32S. Ovo monoklonalno antitelo obuhvata
(a) CDR1 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:31;
(b) CDR2 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:4;
(c) CDR3 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:5;
(d) CDR1 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:6;
(e) CDR2 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:7; i
(f) CDR3 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:8; i obuhvata
(a) laki lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:16; i
(b) teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:11.
[0124] Alternativna definicija antitela N32S, upotrebom IMGT definicije, predstavlja monoklonalno antitelo, koje obuhvata
(a) CDR1 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:46;
(b) CDR2 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:47;
(c) CDR3 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:48;
(d) CDR1 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:43;
(e) CDR2 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:44; i
(f) CDR3 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:45; i koje obuhvata
(a) laki lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:16; i
(b) teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:11.
[0125] Dalja alternativna definicija antitela N32S, upotrebom Chotia definicije, predstavlja monoklonalno, koje obuhvata
(a) CDR1 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:31;
(b) CDR2 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:4;
(c) CDR3 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:5;
(d) CDR1 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:52;
(e) CDR2 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:53; i
(f) CDR3 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:54; i koje obuhvata (a) laki lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:16; i (b) teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:11.
[0126] Kao što može da se vidi sa Fig.1, IC50 antitela N32S (crni krugovi) je smanjena u poređenju sa antitelom C10-2: IC50 od N32S je izračunata da iznosi 44 nM. Ovo primetno poboljšanje u odnosu na C10-2 nije bilo očekivano. Uz priloženi Fig.1, jedan aspekt ovog pronalaska je usmeren na antitelo koje inhibira AD-P3 u ovde opisanom ispitivanju inhibicije tečne faze, tako da je signal smanjen za 50% pri koncentraciji od 100 nM ili manje antitela. U jednom načinu ostvarivanja, antitelo ovog pronalaska ima IC50 od 0,1 nM do 100 nM, kao što je pri koncentraciji od 50 nM ili manje, kao što je od 0,1 nM do 50 nM, na osnovu ispitivanja inhibicije tečne faze za AD-P3 hvatanje.
[0127] Podaci napravljeni upotrebom antitela N32S ukazuju da mutacija na položaju 32 lakog lanca iz antitela C10-2, ili iz LC CDR1 antitela C10-2 u serin dovodi do povećanog očiglednog afiniteta (IC50) u ispitivanjima inhibicije peptida. Štaviše, mutacija na položaju 32 u serin ili glutamin (antitelo N32S i antitelo N32Q) poništava deamidaciju na oba položaja 32 i 34 kako je prikazano na Fig.20. Potentnost, kako je određeno u smislu ispitivanja in-vitro zasejavanja i agregacije, se održava i u N32S i N32Q varijantama.
[0128] Potencijalna deamidacija potencijalno identifikovana u C 10-2 na položaju koja bi mogla da dovede do heterogenosti proteinskih šarži. C 10-2 je pokazao heterogeno vezivanje za AD-P3 antigene sa manjom frakcijom očiglednog visokog afiniteta (2-5 nM) i predominantnog vezivanja uz očigledan nizak afinitet (200-1000 nM) (Fig.1). Heterogeno vezivanje bi moglo da se odrazi na različite podpopulacije deamidisanog i nedeamidisanog C 10-2. Varijanta je napravljena supstitucijom (N32S) koja je sprečavala deamidaciju. Kako je pokazano poboljšano vezivanje prema dejstvu kako je generalno naznačeno je smanjilo IC50 (očigledni jači afinitet) u poređenju sa C 10-2. Dodatna supstitucija A101T je uvedena što je dovelo do homogenog vezivanja tipa očiglednog višeg afiniteta. Poboljšano dejstvo vezivanja kod oba N32S i N32S-A101T ukazuje da su stabilnija i homogenija antitela postignuta gore opisanim mutacijama.
Antitelo N32Q
[0129] Ovde je otkrivena varijanta antitela antitela C10-2, antitelo N32Q. Ovaj aspekt ovog otkrivanja je usmeren na monoklonalno antitelo, ili njegov epitop vezujući fragment, koje obuhvata
(a) CDR1 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:32;
(b) CDR2 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:4;
(c) CDR3 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:5;
(d) CDR1 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:6;
(e) CDR2 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:7; i
(f) CDR3 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:8.
[0130] Dalji način ostvarivanja aspekta ovog otkrivanja usmeren na antitelo N32Q se odnosi na monoklonalno antitelo, ili njegov epitop vezujući fragment, koje obuhvata
(a) laki lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:17; i
(b) teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:11.
[0131] Alternativno definisano, dalji način ostvarivanja aspekta ovog otkrivanja usmeren na antitelo N32Q se odnosi na monoklonalno antitelo, ili njegov epitop vezujući fragment, koje obuhvata
(a) CDR1 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:32;
(b) CDR2 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:4; i
(c) CDR3 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:5;
i dalje koje obuhvata najmanje jedan od
(d) CDR1 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:6;
(e) CDR2 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:7; i
(f) CDR3 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:8.
[0132] Kako je navedeno, podaci napravljeni upotrebom antitela N32S ukazuju da mutacija na položaju 32 lakog lanca iz antitela C10-2, ili iz LC CDR1 antitela C10-2 u serin dovodi do povećanog očiglednog afiniteta (IC50), pri čemu mutacija u glutamin (antitelo N32Q) dovodi do nepromenjenog dejstva vezivanja. Međutim, mutacija na položaju 32 u serin ili glutamin (antitelo N32S i antitelo N32Q) poništava deamidaciju na oba položaja 32 i 34 kako je prikazano na Fig.20. Shodno tome, postoje prednosti i antitela N32S i antitela N32Q. Potentnost, kako je određena u smislu ispitivanja in-vitro zasejavanja i agregacije, se održava i kod N32S i N32Q varijante.
Antitelo N34S
[0133] Ovde je otkrivena varijanta antitela antitela C10-2, antitelo N34S. Ovaj aspekt ovog otkrivanja je usmeren na monoklonalno antitelo, ili njegov epitop vezujući fragment, koje obuhvata
(a) CDR1 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:33;
(b) CDR2 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:4;
4
(c) CDR3 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:5;
(d) CDR1 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:6;
(e) CDR2 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:7; i
(f) CDR3 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:8.
[0134] Dalji način ostvarivanja aspekta ovog otkrivanja usmeren na antitelo N34S se odnosi na monoklonalno antitelo, ili njegov epitop vezujući fragment, koje obuhvata
(a) laki lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:18; i
(b) teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:11.
[0135] Alternativno definisano, dalji način ostvarivanja aspekta ovog otkrivanja usmeren na antitelo N34S se odnosi na monoklonalno antitelo, ili njegov epitop vezujući fragment, koje obuhvata
(a) CDR1 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:33;
(b) CDR2 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:4; i
(c) CDR3 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:5;
i dalje koje obuhvata najmanje jedan od
(d) CDR1 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:6;
(e) CDR2 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:7; i
(f) CDR3 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:8.
Antitelo N34Q
[0136] Ovde je otkrivena varijanta antitela antitela C10-2, antitelo N34Q. Ovaj aspekt ovog otkrivanja je usmeren na monoklonalno antitelo, ili njegov epitop vezujući fragment, koje obuhvata
(a) CDR1 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:34;
(b) CDR2 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:4;
(c) CDR3 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:5;
(d) CDR1 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:6;
(e) CDR2 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:7; i
(f) CDR3 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:8.
[0137] Dalji način ostvarivanja aspekta ovog otkrivanja usmeren na Antitelo N34Q se odnosi na monoklonalno antitelo, ili njegov epitop vezujući fragment, koje obuhvata
(a) laki lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:19; i
(b) teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:11.
[0138] Alternativno definisano, dalji način ostvarivanja aspekta ovog otkrivanja usmeren na antitelo N34Q se odnosi na monoklonalno antitelo, ili njegov epitop vezujući fragment, koje obuhvata
(a) CDR1 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:34;
(b) CDR2 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:4; i
(c) CDR3 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:5;
i dalje koje obuhvata najmanje jedan od
(d) CDR1 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:6;
(e) CDR2 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:7; i
(f) CDR3 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:8.
Antitelo N32S, N34S
[0139] Ovde je otkrivena varijanta antitela antitela C10-2, antitelo N32S, N34S. Ovaj aspekt ovog otkrivanja je usmeren na monoklonalno antitelo, ili njegov epitop vezujući fragment, koje obuhvata (a) CDR1 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:35;
(b) CDR2 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:4;
(c) CDR3 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:5;
(d) CDR1 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:6;
(e) CDR2 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:7; i
(f) CDR3 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:8.
[0140] Alternativno definisano, dalji način ostvarivanja aspekta ovog otkrivanja usmeren na antitelo N32S, N34S se odnosi na monoklonalno antitelo, ili njegov epitop vezujući fragment, koje obuhvata (a) laki lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:20; i
(b) teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:11.
[0141] Alternativno definisano, dalji način ostvarivanja aspekta ovog otkrivanja usmeren na antitelo N32S, N34S se odnosi na monoklonalno antitelo, ili njegov epitop vezujući fragment, koje obuhvata (a) CDR1 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:35;
(b) CDR2 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:4; i
(c) CDR3 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:5;
i dalje koje obuhvata najmanje jedan od
(d) CDR1 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:6;
(e) CDR2 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:7; i
(f) CDR3 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:8.
Antitelo N32Q, N34S
[0142] Ovde je otkrivena varijanta antitela antitela C10-2, antitelo N32Q, N34S. Ovaj aspekt ovog otkrivanja je usmeren na monoklonalno antitelo, ili njegov epitop vezujući fragment, koje obuhvata (a) CDR1 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:36;
(b) CDR2 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:4;
(c) CDR3 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:5;
4
(d) CDR1 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:6;
(e) CDR2 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:7; i
(f) CDR3 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:8.
[0143] Alternativno definisano, dalji način ostvarivanja aspekta ovog otkrivanja usmeren na antitelo N32Q, N34S se odnosi na monoklonalno antitelo, ili njegov epitop vezujući fragment, koje obuhvata (a) laki lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:21;
(b) teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:11.
[0144] Alternativno definisano, dalji način ostvarivanja aspekta ovog otkrivanja usmeren na antitelo N32Q, N34S se odnosi na monoklonalno antitelo, ili njegov epitop vezujući fragment, koje obuhvata (a) CDR1 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:36;
(b) CDR2 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:4; i
(c) CDR3 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:5;
i dalje koje obuhvata najmanje jedan od
(d) CDR1 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:6;
(e) CDR2 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:7; i
(f) CDR3 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:8.
Antitelo N32Q, N34Q
[0145] Ovde je otkrivena varijanta antitela antitela C10-2, antitelo N32Q, N34Q. Ovaj aspekt ovog otkrivanja je usmeren na monoklonalno antitelo, ili njegov epitop vezujući fragment, koje obuhvata (a) CDR1 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:37;
(b) CDR2 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:4;
(c) CDR3 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:5;
(d) CDR1 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:6;
(e) CDR2 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:7; i
(f) CDR3 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:8;
[0146] Alternativno definisano, dalji način ostvarivanja aspekta ovog otkrivanja usmeren na antitelo N32Q, N34Q se odnosi na monoklonalno antitelo, ili njegov epitop vezujući fragment, koje obuhvata (a) laki lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:22; i
(b) teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:11.
[0147] Alternativno definisano, dalji način ostvarivanja aspekta ovog otkrivanja usmeren na antitelo N32Q, N34Q se odnosi na monoklonalno antitelo, ili njegov epitop vezujući fragment, koje obuhvata (a) CDR1 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:37;
(b) CDR2 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:4; i
(c) CDR3 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:5;
i dalje koje obuhvata najmanje jedan od
4
(d) CDR1 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:6;
(e) CDR2 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:7; i
(f) CDR3 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:8.
Antitelo N32S, N34Q
[0148] Ovde je otkrivena varijanta antitela antitela C10-2, antitelo N32S, N34Q. Ovaj aspekt ovog otkrivanja je usmeren na monoklonalno antitelo, ili njegov epitop vezujući fragment, koje obuhvata (a) CDR1 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:38;
(b) CDR2 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:4;
(c) CDR3 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:5;
(d) CDR1 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:6;
(e) CDR2 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:7; i
(f) CDR3 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:8.
[0149] Alternativno definisano, dalji način ostvarivanja aspekta ovog otkrivanja usmeren na antitelo N32S, N34Q se odnosi na monoklonalno antitelo, ili njegov epitop vezujući fragment, koje obuhvata (a) laki lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:23; i
(b) teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:11.
[0150] Alternativno definisano, dalji način ostvarivanja aspekta ovog otkrivanja usmeren na antitelo N32S, N34Q se odnosi na monoklonalno antitelo, ili njegov epitop vezujući fragment, koje obuhvata (a) CDR1 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:38;
(b) CDR2 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:4; i
(c) CDR3 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:5;
i dalje koje obuhvata najmanje jedan od
(d) CDR1 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:6;
(e) CDR2 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:7; i
(f) CDR3 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:8.
Antitelo A101T
[0151] Ovde je otkrivena varijanta antitela antitela C10-2, antitelo A101T. Ovaj aspekt ovog otkrivanja je usmeren na monoklonalno antitelo, ili njegov epitop vezujući fragment, koje obuhvata
(a) CDR1 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:3;
(b) CDR2 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:4;
(c) CDR3 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:5;
(d) CDR1 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:6;
(e) CDR2 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:7; i
4
(f) CDR3 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:39.
[0152] Alternativno definisano, dalji način ostvarivanja aspekta ovog otkrivanja usmeren na antitelo A101T se odnosi na monoklonalno antitelo, ili njegov epitop vezujući fragment, koje obuhvata
(a) laki lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:12; i
(b) teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:24.
[0153] Alternativno definisano, dalji način ostvarivanja aspekta ovog otkrivanja usmeren na antitelo A101T se odnosi na monoklonalno antitelo, ili njegov epitop vezujući fragment, najmanje jedan od (a) CDR1 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:3;
(b) CDR2 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:4; i
(c) CDR3 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:5;
i koje dalje obuhvata
(d) CDR1 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:6;
(e) CDR2 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:7; i
(f) CDR3 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:39.
[0154] Podaci napravljeni upotrebom antitela A101T ukazuju da mutacija teškog lanca antitela C10-2 ili teškog lanca CR3 antitela C10-2 dovodi do dvostruko povećanog peptidnog vezivanja i 10-20 struko povećanog vezivanja za P3 materijal. Dalje, varijante koje obuhvataju A101T mutaciju su povećale potentnost ispitivanja in-vitro zasejavanja.
Antitelo N32S, A101T
[0155] Ovaj pronalazak se odnosi na varijantu antitela antitela C10-2, antitelo N32S, A101T. Ovo monoklonalna antitelo obuhvata
(a) CDR1 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:31;
(b) CDR2 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:4;
(c) CDR3 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:5;
(d) CDR1 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:6;
(e) CDR2 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:7; i
(f) CDR3 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:39; i obuhvata (a) laki lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:16; i (b) teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:24.
[0156] Upotrebom IMGT definicije, antitelo N32S, A101T je monoklonalno antitelo, koje obuhvata (a) CDR1 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:46;
(b) CDR2 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:47;
(c) CDR3 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:48;
(d) CDR1 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:49;
4
(e) CDR2 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:50; i
(f) CDR3 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:51; i koje obuhvata (a) laki lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:16; i (b) teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:24.
[0157] Upotrebom Chotia definicije, antitelo N32S, A101T je monoklonalno antitelo, koje obuhvata (a) CDR1 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:31;
(b) CDR2 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:4;
(c) CDR3 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:5;
(d) CDR1 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:55;
(e) CDR2 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:56; i
(f) CDR3 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:57; i koje obuhvata (a) laki lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:16; i (b) teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:24.
[0158] Kao što može da se vidi sa Fig.1, IC50 antitela N32S, A101T (beli krugovi) je dramatično snižena u odnosu na antitelo C10-2: IC50 od N32S A101T je izračunata da iznosi 14 nM. Ovo primetno poboljšanje u odnosu na C10-2 nije bilo očekivano. Na osnovu Fig.1, jedan aspekt ovog pronalaska je usmeren na antitelo koje inhibira AD-P3 u ovde opisanom ispitivanju inhibicije tečne faze, tako da je signal smanjen za 50% pri koncentraciji od 100 nM ili manje antitela, kao što je od 10 nM do 100 nM antitela, kao što je pri koncentraciji od 50 nM ili manje, kao što je od 10 nM do 50 nM antitela. Kao što je prikazano na Fig. 20, Antitelo N32S, A101 je veoma stabilno protiv deamidacije. Kao što je prikazano na Fig.19, antitelo N32S, A101T je pokazalo jače smanjenje u agregaciji.
Antitelo N32Q, A101T
[0159] Ovde je otkrivena varijanta antitela antitela C10-2, antitelo N32Q, A101T. Ovaj aspekt ovog otkrivanja je usmeren na monoklonalno antitelo, ili njegov epitop vezujući fragment, koje obuhvata (a) CDR1 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:32;
(b) CDR2 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:4;
(c) CDR3 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:5;
(d) CDR1 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:6;
(e) CDR2 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:7; i
(f) CDR3 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:39.
[0160] Alternativno definisano, dalji način ostvarivanja aspekta ovog otkrivanja usmeren na antitelo N32Q, A101T se odnosi na monoklonalno antitelo, ili njegov epitop vezujući fragment, koje obuhvata (a) laki lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:17; i
(b) teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:24.
4
[0161] Alternativno definisano, dalji način ostvarivanja aspekta ovog otkrivanja usmeren na Antitelo N32Q, A101T se odnosi na monoklonalno antitelo, ili njegov epitop vezujući fragment, koje obuhvata (a) CDR1 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:32; i
(f) CDR3 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:39;
i dalje koje obuhvata najmanje jedan od
(b) CDR2 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:4; i
(c) CDR3 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:5;
i dalje koje obuhvata najmanje jedan od
(d) CDR1 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:6; i
(e) CDR2 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:7.
Antitelo N32S, D55E
[0162] Ovde je otkrivena varijanta antitela antitela C10-2, antitelo N32S, D55E. Ovaj aspekt ovog otkrivanja je usmeren na monoklonalno antitelo, ili njegov epitop vezujući fragment, koje obuhvata (a) CDR1 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:31;
(b) CDR2 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:4;
(c) CDR3 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:5;
(d) CDR1 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:6;
(e) CDR2 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:28; i
(f) CDR3 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:8.
[0163] Alternativno definisano, dalji način ostvarivanja aspekta ovog otkrivanja usmeren na antitelo N32S, D55E se odnosi na monoklonalno antitelo, ili njegov epitop vezujući fragment, koje obuhvata (a) laki lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:16;
(b) teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:13.
[0164] Alternativno definisano, dalji način ostvarivanja aspekta ovog otkrivanja usmeren na antitelo N32S, D55E se odnosi na monoklonalno antitelo, ili njegov epitop vezujući fragment, koje obuhvata (a) CDR1 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:31; i
(e) CDR2 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:28;
i dalje koje obuhvata najmanje jedan od
(b) CDR2 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:4; i
(c) CDR3 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:5;
i dalje koje obuhvata najmanje jedan od
(d) CDR1 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:6; i
(f) CDR3 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:8.
Antitelo N32Q, D55E
[0165] Ovde je otkrivena varijanta antitela antitela C10-2, antitelo N32Q, D55E. Ovaj aspekt ovog otkrivanja je usmeren na monoklonalno antitelo, ili njegov epitop vezujući fragment, koje obuhvata (a) CDR1 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:32;
(b) CDR2 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:4;
(c) CDR3 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:5;
(d) CDR1 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:6;
(e) CDR2 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:28; i
(f) CDR3 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:8.
[0166] Alternativno definisano, dalji način ostvarivanja aspekta ovog otkrivanja usmeren na antitelo N32Q, D55E se odnosi na monoklonalno antitelo, ili njegov epitop vezujući fragment, koje obuhvata (a) laki lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:17;
(b) teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:13.
[0167] Alternativno definisano, dalji način ostvarivanja aspekta ovog otkrivanja usmeren na antitelo N32Q, D55E se odnosi na monoklonalno antitelo, ili njegov epitop vezujući fragment, koje obuhvata (a) CDR1 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:32; i
(e) CDR2 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:28;
i dalje koje obuhvata najmanje jedan od
(b) CDR2 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:4; i
(c) CDR3 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:5;
i dalje koje obuhvata najmanje jedan od
(d) CDR1 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:6; i
(f) CDR3 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:8.
Antitelo N34S, A101T
[0168] Ovde je otkrivena varijanta antitela antitela C10-2, antitelo N34S, A101T. Ovaj aspekt ovog otkrivanja je usmeren na monoklonalno antitelo, ili njegov epitop vezujući fragment, koje obuhvata (a) CDR1 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:33;
(b) CDR2 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:4;
(c) CDR3 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:5;
(d) CDR1 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:6;
(e) CDR2 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:7; i
(f) CDR3 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:39.
[0169] Alternativno definisano, dalji način ostvarivanja aspekta ovog otkrivanja usmeren na antitelo N34S, A101T se odnosi na monoklonalno antitelo, ili njegov epitop vezujući fragment, koje obuhvata
1
(a) laki lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:18; i
(b) teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:24.
[0170] Alternativno definisano, dalji način ostvarivanja aspekta ovog otkrivanja usmeren na antitelo N34S, A101T se odnosi na monoklonalno antitelo, ili njegov epitop vezujući fragment, koje obuhvata (a) CDR1 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:33; i
(f) CDR3 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:39;
i dalje koje obuhvata najmanje jedan od
(b) CDR2 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:4; i
(c) CDR3 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:5;
i dalje koje obuhvata najmanje jedan od
(d) CDR1 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:6; i
(e) CDR2 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:7.
Antitelo N34Q, A101T
[0171] Ovde je otkrivena varijanta antitela antitela C10-2, antitelo N34Q, A101T. Ovaj aspekt ovog otkrivanja je usmeren na monoklonalno antitelo, ili njegov epitop vezujući fragment, koje obuhvata (a) CDR1 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:34;
(b) CDR2 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:4;
(c) CDR3 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:5;
(d) CDR1 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:6;
(e) CDR2 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:7; i
(f) CDR3 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:39.
[0172] Alternativno definisano, dalji način ostvarivanja aspekta ovog otkrivanja usmeren na antitelo N34Q, A101T se odnosi na monoklonalno antitelo, ili njegov epitop vezujući fragment, koje obuhvata (a) laki lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:19; i
(b) teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:24.
[0173] Alternativno definisano, dalji način ostvarivanja aspekta ovog otkrivanja usmeren na antitelo N34Q, A101T se odnosi na monoklonalno antitelo, ili njegov epitop vezujući fragment, koje obuhvata (a) CDR1 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:34; i
(f) CDR3 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:39;
i dalje koje obuhvata najmanje jedan od
(b) CDR2 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:4; i
(c) CDR3 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:5;
i dalje koje obuhvata najmanje jedan od
(d) CDR1 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:6;
2
(e) CDR2 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:7.
Antitelo D55E, A101T
[0174] Ovde je otkrivena varijanta antitela antitela C10-2, antitelo D55E, A101T. Ovaj aspekt ovog otkrivanja je usmeren na monoklonalno antitelo, ili njegov epitop vezujući fragment, koje obuhvata (a) CDR1 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:3;
(b) CDR2 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:4;
(c) CDR3 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:5;
(d) CDR1 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:6;
(e) CDR2 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:28; i
(f) CDR3 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:39.
[0175] Alternativno definisano, dalji način ostvarivanja aspekta ovog otkrivanja usmeren na antitelo D55E, A101T se odnosi na monoklonalno antitelo, ili njegov epitop vezujući fragment, koje obuhvata (a) laki lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:12; i
(b) teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:25.
[0176] Alternativno definisano, dalji način ostvarivanja aspekta ovog otkrivanja usmeren na antitelo D55E, A101T se odnosi na monoklonalno antitelo, ili njegov epitop vezujući fragment, najmanje jedan od
(a) CDR1 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:3;
(b) CDR2 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:4; i
(c) CDR3 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:5;
i koje dalje obuhvata
(d) CDR1 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:6;
(e) CDR2 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:28; i
(f) CDR3 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:39.
Antitelo D55Q, A101T
[0177] Ovde je otkrivena varijanta antitela antitela C10-2, antitelo D55Q, A101T. Ovaj aspekt ovog otkrivanja je usmeren na monoklonalno antitelo, ili njegov epitop vezujući fragment, koje obuhvata (a) CDR1 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:3;
(b) CDR2 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:4;
(c) CDR3 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:5;
(d) CDR1 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:6;
(e) CDR2 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:29; i
(f) CDR3 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:39.
[0178] Alternativno definisano, dalji način ostvarivanja aspekta ovog otkrivanja usmeren na antitelo D55Q, A101T se odnosi na monoklonalno antitelo, ili njegov epitop vezujući fragment, koje obuhvata (a) laki lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:12; i
(b) teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:26.
[0179] Alternativno definisano, dalji način ostvarivanja aspekta ovog otkrivanja usmeren na antitelo D55Q, A101T se odnosi na monoklonalno antitelo, ili njegov epitop vezujući fragment, najmanje jedan od
(a) CDR1 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:3;
(b) CDR2 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:4; i
(c) CDR3 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:5;
i koje dalje obuhvata
(d) CDR1 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:6;
(e) CDR2 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:29; i
(f) CDR3 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:39.
Antitelo D55S, A101T
[0180] Ovde je otkrivena varijanta antitela Antitela C10-2, Antitelo D55S, A101T. Ovaj aspekt ovog otkrivanja je usmeren na monoklonalno antitelo, ili njegov epitop vezujući fragment, koje obuhvata (a) CDR1 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:3;
(b) CDR2 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:4;
(c) CDR3 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:5;
(d) CDR1 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:6;
(e) CDR2 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:30; i
(f) CDR3 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:39.
[0181] Alternativno definisano, dalji način ostvarivanja aspekta ovog otkrivanja usmeren na antitelo D55S, A101T se odnosi na monoklonalno antitelo, ili njegov epitop vezujući fragment, koje obuhvata (a) laki lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:12; i
(b) teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:27.
[0182] Alternativno definisano, dalji način ostvarivanja aspekta ovog otkrivanja usmeren na antitelo D55S, A101T se odnosi na monoklonalno antitelo, ili njegov epitop vezujući fragment, najmanje jedan od
(a) CDR1 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:3;
(b) CDR2 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:4; i
(c) CDR3 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:5;
i koje dalje obuhvata
4
(d) CDR1 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:6;
(e) CDR2 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:30; i
(f) CDR3 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:39.
[0183] Kombinacije varijanti teških lanaca i varijanti lakih lanaca su očekivane, kao što su višestruke varijante unutar lakog lanca i/ili višestruke varijante unutar teškog lanca su očekivane, kombinacija pojedinačne varijante unutar lakog lanca sa pojedinačnom ili višestrukom varijantom unutar teškog lanca, kombinacije višestrukih varijanti unutar lakog lanca sa višestrukim varijantama unutar teškog lanca. Antitelo poželjno obuhvata laki lanac odabran iz grupe koju čine SEQ ID NO:12 (laki lanac C10-2); SEQ ID NO:16 (varijanta lakog lanca N32S); SEQ ID NO:17 (varijanta lakog lanca N32Q); SEQ ID NO:18 (varijanta lakog lanca N34S); SEQ ID NO:19 varijanta lakog lanca N34Q); SEQ ID NO:20 (varijanta lakog lanca N32S, N34S); SEQ ID NO:21 (varijanta lakog lanca N32Q, N34S); SEQ ID NO:22 (varijanta lakog lanca N32Q, N34Q); i SEQ ID NO:23 (varijanta lakog lanca N32S, N34Q); i
teški lanac odabran iz grupe koju čine
SEQ ID NO:11 (teški lanac C10-2); SEQ ID NO:13 (varijanta teškog lanca D55E); SEQ ID NO:14 (varijanta teškog lanca D55Q); SEQ ID NO:15 (varijanta teškog lanca D55S); SEQ ID NO:24 (varijanta teškog lanca A101T); SEQ ID NO:25 (varijanta teškog lanca D55E, A101T); SEQ ID NO:26 (varijanta teškog lanca D55Q, A101T), i SEQ ID NO:27 (varijanta teškog lanca D55S, A101T).
[0184] U jednom načinu ostvarivanja, kada je laki lanac SEQ ID NO:12, teški lanac je odabran iz grupe koju čine SEQ ID NO:13 (varijanta teškog lanca D55E); SEQ ID NO:14 (varijanta teškog lanca D55Q); SEQ ID NO:15 (varijanta teškog lanca D55S); SEQ ID NO:24 (varijanta teškog lanca A101T); SEQ ID NO:25 (varijanta teškog lanca D55E, A101T); SEQ ID NO:26 (varijanta teškog lanca D55Q, A101T), i SEQ ID NO:27 (varijanta teškog lanca D55S, A101T). U alternativnom način ostvarivanja, kada je teški lanac SEQ ID NO:11, laki lanac je odabran iz grupe koju čine SEQ ID NO:16 (varijanta lakog lanca N32S); SEQ ID NO:17 (varijanta lakog lanca N32Q); SEQ ID NO:18 (varijanta lakog lanca N34S); SEQ ID NO:19 varijanta lakog lanca N34Q); SEQ ID NO:20 (varijanta lakog lanca N32S, N34S); SEQ ID NO:21 (varijanta lakog lanca N32Q, N34S); SEQ ID NO:22 (varijanta lakog lanca N32Q, N34Q); i SEQ ID NO:23 (varijanta lakog lanca N32S, N34Q).
[0185] Monoklonalno antitelo, ili njegov epitop-vezujući fragment, pogodno obuhvata
(a) CDR1 lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu odabrane iz grupe koju čine SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:31; SEQ ID NO:32; SEQ ID NO:33; SEQ ID NO:34; SEQ ID NO:35; SEQ ID NO:36; SEQ ID NO:37; i SEQ ID NO:38; (b) CDR2 lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:4; (c) CDR3 lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:5; (d) CDR1 teškog lanca koje obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:6; (e) CDR2 teškog lanca koje obuhvata aminokiselinsku sekvencu odabrane iz grupe koju čine SEQ ID NO:7; SEQ ID NO:28; SEQ ID NO:29; i SEQ ID NO:30; i (f) CDR3 teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu odabrane iz grupe koju čine SEQ ID NO:8, i SEQ ID NO:39.
[0186] Zanimljivi načini ostvarivanja kombinacija varijanti uključuju pri čemu su antitela odabrana iz grupe koju čine antitelo N32S, A101T; antitelo N32Q, A101T; antitelo N32S, D55E; i antitelo N32Q, D55E, poželjno antitelo N32S, A101T. Kao što može da se vidi iz primera, antitelo N32S i antitelo N32S, A101T predstavljaju poželjne načine ostvarivanja.
[0187] Sve zajedno, primeri pokazuju da se antitela ovog otkrivanja, uključujući C10-2, efikasno vezuju za MSD ploče obložene AD-P3 antigenima. Poređenja radi, komercijalna antitela kao što je PHF-13, imaju nisko dejstvo vezivanja. Dalje PHF-13 je pokazao suštinski veći stepen nespecifičnog vezivanja u odnosu na antitela ovog otkrivanja C10-2 inhibicija tečne faze Ptau hvatanja antigena u C10-2 obloženim pločama je efikasno (IC50= 10-20 nM) dok je PHF-13 je neefikasan (IC50 = 500-1000 nM).
[0188] Ovde je otkriveno antitelo koje obuhvata
(a) CDR1 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:3;
(b) CDR2 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:4;
(c) CDR3 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:5; i
(d) teški lanac odabrane iz grupe koju čine SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, i SEQ ID NO:27.
[0189] Ovde je otkriveno antitelo koje obuhvata
(a) CDR1 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:6;
(b) CDR2 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:7;
(c) CDR3 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:8; i
(d) laki lanac odabrane iz grupe koju čine SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, i SEQ ID NO:23.
[0190] Monoklonalno antitelo, ili njegov epitop-vezujući fragment, obično inhibiraju AD-P3 u ispitivanju inhibicije tečne faze tako da je signal smanjen za 50% pri koncentraciji od 100 nM ili manje antitela, kao što je od 10 nM do 100 nM antitela, kao što je pri koncentraciji od 50 nM ili manje, kao što je od 10 nM do 50 nM antitela. Monoklonalno antitelo, ili njegov epitop-vezujući fragment, obično, prema Vestern Blot signalu pS396 tau nakon ispitivanja imunodeplecije na ekstraktima iz mozgova zaraženih Alchajmerovom bolešću, može da ukloni najmanje 15% tau fosforilisanog na serinu 396 iz homogenata mozgova zaraženih sa AB na oko 75 ng antitela.
[0191] Antitelo ili njegov epitop-vezujući fragment je poželjno humano ili humanizovano antitelo.
[0192] Antitela i njihovi gore pomenuti epitop-vezujući fragmenti mogu, prema jednom načinu ostvarivanja, dalje da obuhvataju varijantu takvog lakog i/ili CDR1 teškog lanca, CDR2 ili CDR3 (sa najviše 4 aminokiselinske razlike, ili najviše 3 aminokiselinske razlike, ili najviše 2 aminokiselinske razlike, ili najviše 1 aminokiselinskom razlikom.
[0193] Kao što može da se vidi sa Fig.18, HC CDR1, HC CDR2, HC CDR3 i LC CDR3 su, u najmanje jednom načinu ostvarivanja, važni, za vezivanje za 392-398 region tau. Otkriveno je antitelo ili negovi epitopvezujući fragmenti, koje pravi hidrofobni džep putem L3:H3, L3:F8*, H1:H13, H2:Y1, H2:Y3 sa Y394 tau peptida. Otkriveno je antitelo koje stupa u kompeticiju sa antitelom koje je dalje ovde opisano za stvaranje vodonik vezujuće mreže između solvatisanih<{p}>S396 i L3:T4, H1:R10, H1:T11, H3:R1, H3:T3; (*) L3:F8 predstavlja ostatak okvira flankirajućeg C-terminala iz CDR L3 (videti Fig.11).
[0194] Kao što može da se vidi iz kristalne strukture x-zraka, antitelo ovog otkrivanja se vezuje sa dva nivoa selektivnosti. Prvi nivo selektivnosti je selektivnost za hiperfosforilisani patološki, tau a drugi nivo selektivnosti je selektivnost za fosforilisani serinski ostatak pri čemu fosfat pomenutog fosforilisanog serina predstavlja vodonik koji je vezan za bočni lanac tirozinskog ostatka razdvojen jednim ostacima iz pomenutog fosforilisanog serina. Shodno tome, zanimljiv aspekt ovog otkrivanja je usmeren na monoklonalno antitelo, ili njegov epitop-vezujući fragment, selektivno za aminokiselinski motiv hiperfosforilisanog tau čiji motiv obuhvata fosforilisani serinski ostatak i tirozinski ostatak razdvojen pojedinačnim ostatkom.. Obično, aminokiselinski motiv ima sekvencu:
Y - X - S(fosforilisan) - P -u kojoj Y predstavlja tirozin, X je aminokiselina koja se prirodno javlja, P predstavlja prolin a S(fosforilisan) predstavlja serin sa fosforilisanim hidroksilnim bočnim lancem.
[0195] Slično, otkriveno je antitelo ili njegov epitop-vezujući fragment koji se vezuje za fosforilisani tau, poželjno hiperfosforilisani tau, pri čemu je pomenuto antitelo ili njegov epitop-vezujući fragment selektivan za motiv aminokiselinskog ostatka IA, pri čemu R predstavlja bočni lanac aminokiseline koja se prirodno javlja.
[0196] Nevezujući se za neku određenu teoriju, veruje se da je antitelo selektivno za aminokiselinski motiv IA kada je pomenuti motiv u konformaciji usvojenoj od strane patološkog tau. Shodno tome, aminokiselinski motiv IA je obično sekvenca selektivno reorganizovana od strane antitela. Shodno tome, otkriveno je antitelo ili njegov epitop-vezujući fragment koji se vezuje za fosforilisani tau, poželjno hiperfosforilisani tau, pri čemu je pomenuto antitelo ili njegov epitop-vezujući fragment selektivan za motiv IA aminokiselinskog ostatka, pri čemu R predstavlja bočni lanac asminokiseline koja prirodno javlja.
[0197] U uobičajenom načinu ostvarivanja ovog aspekta ovog otkrivanja, ovo otkrivanje je usmereno na antitelo ili njegov epitop-vezujući fragment koji se vezuje za fosforilisani tau, poželjno hiperfosforilisani tau, pri čemu je pomenuto antitelo ili njegov epitop-vezujući fragment selektivno za motiv IB aminokiselinskog ostatka, pri čemu R predstavlja bočni lanac aminokiseline koja se prirodno javlja kao što je, ali bez ograničenja na IC ili ID.
[0198] Jedan aspekt ovog otkrivanja, HC CDR1 region antitela, Asp Arg Thr Ile His (SEQ. ID. NO.7) stupa u interakciju sa motivima IA-ID hiperfosforilisanog tau.
[0199] Kao što može da se vidi sa Fig.18, u ovom aspektu, prisustvo dva uzastopna naelektrisana ostatka, naime aspartinske kiseline i arginina, u HC CDR1 igraju ulogu u vezivanju vodonikom sa motivom unutar ciljanog tau epitopa pri čemu je to antitelo selektivno za aminokiselnski motiv hiperfosforilisanog tau čiji motiv obuhvata fosforilisani serinski ostatak i tirozinski ostatak razdvojen pojedinačnim ostatkom. Shodno tome, jedan aspekt ovog otkrivanja je usmeren na antitelo ili njegov epitop-vezujući fragment koji se vezuje za fosforilisani tau, poželjno hiperfosforilisan tau, pri čemu je pomenuto antitelo ili njegov epitop-vezujući fragment selektivno za motiv IA-ID aminokiselinskog ostatka pri čemu to antitelo obuhvata HC CDR1 region koji obuhvata dva uzastopna naelektrisana aminokiselinska ostatka, kao što su aspartinska kiselina i arginin. U daljoj alternativi ovog aspekta ovog otkrivanja, antitelo ili njegov epitop-vezujući fragment se vezuje za hiperfosforilisani tau, pri čemu pomenuto antitelo ili njegov epitop-vezujući fragment predstavlja selektivan epitop koji obuhvata serin 396 i tirozin 394, pri čemu PO4 grupa stvara kovalentnu vezu sa jednim od pomenutih serina 396 i zirozina 394 i vodoničnu vezu sa drugim serinom 396 i tirozinim 394 pri čemu to antitelo obuhvata HC CDR1 regione koji obuhvataju dva uzastopna naelektrisana ostatka, kao što su aspartinska kiselina i arginin. Naelektrisani aminokiselinski ostaci iz HC CDR1 regiona mogu biti odabrani iz grupe koju čine arginin, lizin, aspartinska kiselina i glutaminska kiselina pri čemu najmanje jedan od pomenutih ostataka predstavlja aspartinska kiselina ili arginin, poželjno pri čemu jedan naelketrisani ostatak predstavlja arginin a drugi predstavlja aspartinsku kiselinu.
[0200] U daljem načinu ostvarivanja ovog aspekta ovog otkrivanja, jedan ili oba uzastopna naelektrisana aminokiselinska ostatka su flankirana polarnim aminokiselinskim ostatkom, poželjno izabrana od treonina i tirozina. Dalje, jedan ili oba od jednog ili oba uzastopna naelektrisana aminokiselinska ostatka su flankirani motivom 3-aminokiselinska ostatka polarnog ostatka polarnog ostatka-hidrofobnog ostatka-polarnog ostatka.
[0201] U jednom načinu ostvarivanja, HC CDR1 obuhvata motiv od 5 ostataka POLARNI AA -HIDROFOBNI AA - POLARNI AA - NAELEKTRISANI AA - NAELEKTRISANI AA, pri čemu najmanje jedan od pomenutih ostataka predstavlja aspartinsku kiselinu ili arginin, poželjno pri čemu jedan naelektrisani ostatak predstavlja arginin a drugi predstavlja aspartinsku kiselinu. Poželjno, motiv od 5 ostataka ima motiv POLARNI AA - HIDROFOBNI AA - POLARNI AA- Asp-Arg. Poželjnije, motiv od 5 ostataka iz HC CDR1 ima sekvencu Thr-Phe-Thr-Asp-Arg.
[0202] Zanimljivo je da se ima u vidu da HC CDR1 antitela obuhvataju motiv POLARNI-HIRDROFOBNI-POLARNI-NAELEKTRISANI na obe strane dva uzastopna naelektrisana aminokiselinska ostatka koja su uključena u vodonično vezivanje sa fosfatnom grupom koji su uključeni u elektrostatičku interakciju S396 i Y394. Shodno tome, u poželjnom načinu ostvarivanja, HC CDR1 obuhvata motiv od palindromskih 8 ostataka POLARNI AA-HIDROFOBNI AA - POLARNI AA - NAELEKTRISANI AA - NAELEKTRISANI AA-POLARNI AA-HIDROFOBNI AA - POLARNI AA. Poželjno, motiv od 8 ostataka iz HC CDR1 obuhvata motiv Thr-Phe-Thr-Asp-Arg-POLAR AA - HIDROFOBNI AA - POLARNI AA. Poželjnije, motiv od 8 ostataka iz HC CDR1 obuhvata motiv Thr- Phe- Thr-Asp-Arg- Thr-Ile-His.
[0203] U jednom načinu ostvarivanja, antitelo prepoznaje epitop unutar ostatka 392-398 hiperfosforilisanog tau koji obuhvata serin 396 i tirozin 394 pri čemu je serin 396 fosforilisan i pri čemu to antitelo obuhvata HC CDR1 region koji obuhvata dva uzastopna naelektrisana aminokiselinska ostatka. U poželjnom načinu ostvarivanja, antitelo prepoznaje epitop unutar ostatka 392-398 hiperfosforilisanog tau koji obuhvata serin 396 i tirozin 394 pri čemu serin 396 predstavlja fosforilisan i pri čemu antitelo obuhvata HC CDR1 region koji obuhvata motiv od 5 ostataka POLARNI AA -HIDROFOBNI AA - POLARNI AA - NAELEKTRISANI AA - NAELEKTRISANI AA. U poželjnijem načinu ostvarivanja, antitelo prepoznaje epitop unutar ostatka 392-398 hiperfosforilisanog tau koji obuhvata serin 396 i tirozin 394 pri čemu serin 396 predstavlja fosforilisan i pri čemu antitelo obuhvata HC CDR1 region koji obuhvata motiv POLARNI AA- HIDROFOBNI AA - POLARNI AA - NAELEKTRISANI AA -NAELEKTRISANI AA- POLAR AA- HIDROFOBNI AA -POLAR AA.
[0204] U daljem poželjnom načinu ostvarivanja, antitelo obuhvata HC CDR1 region kako je ovde definisano i HC CDR3 region koji obuhvata motiv od 6 ostataka koji obuhvata najmanje dva naelektrisana ostatka.
[0205] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje postupak smanjenja stvaranja tau klupka kod pacijenta, koji obuhvata davanje pacijentu kom je to potrebno takve terapije, terapijski efikasne količine antitela ovog pronalaska, ili njihovih epitop-vezujućih fragmenata.
[0206] Jedan aspekt ovog pronalaska je usmeren na postupak lečenja taupatije upotrebom antitela ovog pronalaska. Obično, taupatija je odabrana iz grupe koju čine Alchajmerova bolest, bolest argirofilnih zrnaca (AGD), psihoza, određenije psihoza usled AB ili psihoza kod pacijenata sa AB, psihijatrijski simptomi pacijenata sa demencijom sa levijevim telima,p supranuklearna palsija (PSP), frontotemporalna demencija (FTD ili njene varijante), TBI (traumatska povreda mozga, akutna ili hronična), kortikobazalna degeneracija (CBD), pikova bolest, primarna tauopatija povezana sa uzrastom (PART), senilna demencija sa predominantnim neurofibrilarnim klupkom, demencija puglistika, hronična traumatska encefalopatija, moždani udar, oporavak od moždanog udara, neurodegeneracija povezana sa Parkinsonovom bolešću, parkinsonizam povezan sa hromozomom, Lytico-Bodigova bolest (Parkinsondemencija kompleks sa Gvama), gangliogliom i gangliocitom, meningioangiomatoza, postencefalopatski parkinsonizam, subakutni sklerozirajući panencefalitis, Hantingtonova bolest, olovna encefalopatija, tuberozna skleroza, Hallervorden-Spatzova bolest i lipofuscinoza. Još uobičajenije, taupatija je odabrana iz grupe koju čine Alchajmerova bolest, bolest argirofilnih zrnaca (AGD), psihoza, određenije psihoza usled AB ili psihoza kod pacijenata sa AB, psihijatrijski simptomi pacijenata sa demencijom sa levijevim telima, progresivna supranuklearna palsija (PSP), frontotemporalna demencija (FTD ili njene varijante), TBI (traumatska povreda mozga, akutna ili hronična), kortikobazalna degeneracija (CBD), i Pikova bolest. Određenije, tauopatije mogu biti odabrane iz grupe koju čine Alchajmerova bolest, bolest argirofilnih zrnaca (AGD), psihoza usled AB ili psihoza kod pacijenata sa AB, i psihijatrijski simptomi pacijenata sa demencijom sa levijevim telima.
[0207] Shodno tome, dalji aspekt ovog pronalaska je usmeren na antitelo ovog pronalaska, za upotrebu u lečenju taupatije. Obično je taupatija odabrana iz grupe koju čine Alchajmerova bolest, bolest argirofilnih zrnaca (AGD), Psihoza, određenije psihoza usled AB ili psihoza kod pacijenata sa AB, psihijatrijski simptomi pacijenata sa demencijom sa levijevim telima, progresivna supranuklearna palsija (PSP), frontotemporalna demencija (FTD ili njene varijante), TBI (traumatska povreda mozga, akutna ili hronična), kortikobazalna degeneracija (CBD), Pikova bolest, primarna tauopatija povezana sa uzrastom (PART), senilna demencija sa predominantnim neurofibrilarnim klupkom, demencija puglistika, hronična traumatska encefalopatija, moždani udar, oporavak od moždanog udara, neurodegeneracija povezana sa Parkinsonovom bolešću, parkinsonizam povezan sa hromozomom, Lytico-Bodigova bolest (Parkinsondemencija kompleks sa Gvama), gangliogliom i gangliocitom, meningioangiomatoza, postencefalopatski parkinsonizam, subakutni sklerozirajući panencefalitis, Hantingtonova bolest, olovna encefalopatija, tuberozna skleroza, Hallervorden-Spatzova bolest i lipofuscinoza. Uobičajenije, taupatija je odabrana iz grupe koju čine Alchajmerova bolest, bolest argirofilnih zrnaca (AGD), psihoza, određenije psihoza usled AB ili psihoza kod pacijenata sa AB, apatija usled AB ili apatija kod pacijenata sa AB, psihijatrijski simptomi pacijenata sa demencijom sa levijevim telima, progresivna supranuklearna palsija (PSP), frontotemporalna demencija (FTD ili njene varijante), TBI (traumatska povreda mozga, akutna ili hronična),kortikobazalna degeneracija (CBD), i Pikova bolest. Određenije, tauopatije mogu biti odabrane iz grupe koju čine Alchajmerova bolest, bolest argirofilnih zrnaca (AGD), psihoza usled AB ili psihoza kod pacijenata sa AB, apatija usled AB ili apatija kod pacijenata sa AB, i psihijatrijski simptomi pacijenata sa demencijom sa levijevim telima.
[0208] Ovde je otkrivena terapija koja obuhvata davanje i) Tau antitela i ii) jedinjenja odabranog iz grupe koju čine
a) BACE inhibitor;
b) jedinjenje koje je korisno u aktivnoj ili pasivnoj Tau imunoterapiji;
c) jedinjenje koje je korisno u aktivnoj ili pasivnoj Aβ peptidnoj imunoterapiji ;
d) antagonisti NMDA receptora;
e) inhibitor dalje agregacije Tau proteina;
e) inhibitor acetilholinske esteraze;
f) antiepileptik;
g) anti-inflamatorni lek; i
1
h) SSRI.
[0209] Ovde je dalje otkrivena kompozicija koja obuhvata i) Tau antitelo i ii) jedinjenje odabrano iz grupe koju čine
a) BACE inhibitor;
b) jedinjenje koje je korisno u aktivnoj ili pasivnoj Tau imunoterapiji;
c) jedinjenje koje je korisno u aktivnoj ili pasivnoj Aβ peptidnoj imunoterapiji ;
d) antagonisti NMDA receptora;
e) inhibitor dalje agregacije Tau proteina;
e) inhibitor acetilholinske esteraze;
f) antiepileptik;
g) anti-inflamatorni lek; i
h) SSRI.
[0210] Dalje je otkriven komplet koji obuhvata i) kompoziciju koje obuhvata tau antitelo i ii) kompoziciju jedinjenje odabrano iz grupe koju čine
a) BACE inhibitor;
b) jedinjenje koje je korisno u aktivnoj ili pasivnoj Tau imunoterapiji;
c) jedinjenje koje je korisno u aktivnoj ili pasivnoj Aβ peptidnoj imunoterapiji ;
d) antagonisti NMDA receptora;
e) inhibitor dalje agregacije tau proteina;
f) inhibitor acetilholinske esteraze;
g) antiepileptik;
h) anti-inflamatorni lek; i
i) antidepresiv.
a) Tau antitelo kombinovano sa BACE 1 inhibitorom
[0211] U terapiji, kompoziciji ili kompletu, tau antitelo može biti kombinovano sa BACE 1 inhibitorom. BACE1 inhibitor može biti mali molekul BACE i inhibitor kao što su LY2886721, MK-8931, AZD3293, ili E2609.
[0212] U daljem načinu ostvarivanja, BACE 1 inhibitor je prema formuli I
u kojoj je Ar odabrano iz grupe koju čine fenil, piridil, pirimidil, pirazinil, imidazolil, pirazolil, tiazolil,
2
oksazolil, izoksazolil, i pri čemu je Ar opciono supstituisano sa jednim ili više supstituenata odabranih iz grupe koju čine halogen, CN, C1-C6 alkil, C2-C6 alkenil, C2-C6 alkinil, C1-C6 fluoroalkil ili C1-C6 alkoksi; a R1 predstavlja jedan ili više vodonika, halogena, C1-C3 fluoroalkila ili C1-C3 alkila; a R2 predstavlja vodonik ili fluoro.
Primeri jedinjenja formule I uključuju
[0213]
orofenil)-3-fluoro-3-(fluorometil)-6-metilpiperidin-2-tion
orofenil)-3-fluoro-3-(fluorometil)-6-metilpiperidin-2-tion
ifluorofenil)-3-fluoro-3-(fluorometil)-6-metilpiperidin-2-tion
ifluorofenil)-3-fluoro-3-(fluorometil)-6-metilpiperidin-2-tion
(6S)-6-(5-amino-2-fluorofenil)-3-fluoro-3,6-bis(fluorometil)piperidin-2-tion
[0214] Dalje, pogodan BACE 1 inhibitor može biti prema formuli II
u kojoj je Ar odabrano iz grupe koju čine fenil, piridil, pirimidil, pirazinil, imidazolil, pirazolil, 1,2,4-triazolil, tiofenil, tiazolil, oksazolil, izoksazolil, 1,3,4-tiadiazolil, isotiazolil, 1,3,4-oksadiazolil, 1,2,4-oksadiazolil, furanzil i 1,2,4-tiadiazolil i u kojoj je Ar opciono supstituisano jednim ili više halogena, CN, C1-C6alkilom, C2-C6alkenilom, C2-C6alkinilom, C1-C6fluoroalkilom ili C1-C6alkoksijem; R<1>predstavlja C1-C3alkil ili C1-C3fluoroalkil; R<2>predstavlja vodonik, halogen, C1-C3fluoroalkil ili C1-C3alkil; i R<3>predstavlja C1-C3alkil.
[0215] Primeri jedinjenja BACE 1 inhibitora formule II uključuju jedinjenja odabrane iz grupe koju čine: N-(3-((2R,5S)-6-amino-3,3,5-trifluoro-2,5-dimetil-2,3,4,5-tetrahidropiridin-2-il)-4 fluorofenil)-5-fluoropikolinamid; N-(3-((2R,5S)-6-amino-3,3,5-trifluoro-2,5-dimetil-2,3,4,5-tetrahidropiridin-2-il)-4fluorofenil)-5-metoksipirazin-2-karboksamid; N-(3-((2R,5S)-6-amino-3,3,5-trifluoro-2,5-dimetil-2,3,4,5-tetrahidropiridin-2-il)-4-fluorofenil)-5-metoksipikolinamid; N-(3-((2R,5S)-6-amino-3,3,5-trifluoro-2,5-dimetil-2,3,4,5-tetrahidropiridin-2-il)-4fluorofenil)-5-cijano-3-metilpikolinamid; i N-(3-((2R,5R)-6-amino-3,3,5-trifluoro-2,5-dimetil-2,3,4,5-tetrahidropiridin-2-il)-4 fluorofenil)-5-(difluorometil)pirazin-2-karboksamid.
[0216] Drugi BACE inhibitori mogu biti odabrani od formule u nastavku
u kojoj je Ar odabrano iz grupe koju čine fenil, piridil, pirimidil, pirazinil, imidazolil, pirazolil, tiazolil, oksazolil, isoksazolil, i u kojoj je Ar opsiono supstituisano jednim ili više supstituenata odabranih od halogena, CN, C1-C6alkila, C2-C6alkenila, C2-C6alkinila, C1-C6fluoroalkila ili C1-C6alkoksija; i
R<1>predstavlja jedan ili više vodonika, halogena, C1-C3fluoroalkila ili C1-C3alkila;
R<2>predstavlja vodonik ili fluoro;
ili njihove farmaceutski prihvatljive soli.
[0217] Na primer jedinjenja kao što su
4
N-(3-((2S,5S)-6-amino-5-fluoro-5-(fluorometil)-2-metil-2,3,4,5-tetrahidropiridin-2-il)-4-fluorofenil)-5-metoksipikolinamid;
N-(3-((2S,5S)-6-amino-5-fluoro-5-(fluorometil)-2-metil-2,3,4,5-tetrahidropiridin-2-il)-4-fluorofenil)-5-(metoksi-d3)pikolinamid;
N-(3-((2S,5S)-6-amino-5-fluoro-5-(fluorometil)-2-metil-2,3,4,5-tetrahidropiridin-2-il)-4-fluorofenil)-5-cijano-3-metilpikolinamid;
N-(3-((2S,5S)-6-amino-5-fluoro-5-(fluorometil)-2-metil-2,3,4,5-tetrahidropiridin-2-il)-4-fluorofenil)-5-hloropikolinamid;
N-(3-((2S,5S)-6-amino-5-fluoro-5-(fluorometil)-2-metil-2,3,4,5-tetrahidropiridin-2-il)-4-fluorofenil)-5-metoksipirazin-2-karboksamid;
N-(3-((2S,5S)-6-amino-5-fluoro-5-(fluorometil)-2-metil-2,3,4,5-tetrahidropiridin-2-il)-4-fluorofenil)-2-metiloksazol-4-karboksamid;
N-(3-((2S,5S)-6-amino-5-fluoro-5-(fluorometil)-2-metil-2,3,4,5-tetrahidropiridin-2-il)-4-fluorofenil)-4-bromo-1-metil-1 H-imidazol-2-karboksamid;
N-(3-((2S,5S)-6-amino-5-fluoro-5-(fluorometil)-2-metil-2,3,4,5-tetrahidropiridin-2-il)-4-fluorofenil)-4-metiltiazol-2-karboksamid;
N-(3-((2S,5S)-6-amino-5-fluoro-5-(fluorometil)-2-metil-2,3,4,5-tetrahidropiridin-2-il)-4-fluorofenil)-2-(difluorometil)oksazol-4-karboksamid;
N-(3-((2S,5S)-6-amino-5-fluoro-5-(fluorometil)-2-metil-2,3,4,5-tetrahidropiridin-2-il)-4-fluorofenil)-1-(difluorometil)-1 H-pirazol-3-karboksamid;
N-(3-((2S,5S)-6-amino-5-fluoro-5-(fluorometil)-2-metil-2,3,4,5-tetrahidropiridin-2-il)-4-fluorofenil)-5-(difluorometil)pirazin-2-karboksamid;
N-(3-((2S,5S)-6-amino-5-fluoro-5-(fluorometil)-2-metil-2,3,4,5-tetrahidropiridin-2-il)-4-fluorofenil)-4-hlorobenzamid;
N-(3-((2S,5S)-6-amino-5-fluoro-5-(fluorometil)-2-metil-2,3,4,5-tetrahidropiridin-2-il)-4-fluorofenil)-5-fluoropikolinamid;
N-(3-((2S,5R)-6-amino-5-fluoro-5-(fluorometil)-2-metil-2,3,4,5-tetrahidropiridin-2-il)-4-fluorofenil)-5-metoksipikolinamid;
N-[3-[(2S,5S)-6-amino-5-fluoro-5-(fluorometil)-2-metil-3,4-dihidropiridin-2-il]-4,5-difluoro-fenil]-5-fluoro-piridin-2-karboksamid;
N-[3-[(2S,5S)-6-amino-5-fluoro-5-(fluorometil)-2-metil-3,4-dihidropiridin-2-il]-4,5-difluoro-fenil]-5-metoksi-piridin-2-karboksamid;
N-[3-[(2S,5S)-6-amino-5-fluoro-5-(fluorometil)-2-metil-3,4-dihidropiridin-2-il]-4,5-difluoro-fenil]-5-metoksi-pirazin-2-karboksamid;
N-[3-[(2S,5R)-6-amino-5-fluoro-5-(fluorometil)-2-metil-3,4-dihidropiridin-2-il]-4,5-difluoro-fenil]-5-fluoro-piridin-2-karboksamid;
N-[3-[(2S,5R)-6-amino-5-fluoro-5-(fluorometil)-2-metil-3,4-dihidropiridin-2-il]-4,5-difluoro-fenil]-5-metoksi-piridin-2-karboksamid;
N-[3-[(2S,5R)-6-amino-5-fluoro-5-(fluorometil)-2-metil-3,4-dihidropiridin-2-il]-4,5-difluoro-fenil]-5-metoksi-pirazin-2-karboksamid;
N-[3-[(2S,5S)-6-amino-5-fluoro-2,5-bis(fluorometil)-3,4-dihidropiridin-2-il]-4-fluorofenil]-5-fluoropiridin-2-karboksamid;
N-[3-[(2S,5S)-6-amino-5-fluoro-2,5-bis(fluorometil)-3,4-dihid ropiridin-2-il]-4-fluorofenil]-5-metoksipiridin-2-karboksamid;
N-[3-[(2S,5S)-6-amino-5-fluoro-2,5-bis(fluorometil)-3,4-dihid ropiridin-2-il]-4-fluorofenil]-5-metoksipirazin-2-karboksamid;
N-[3-[(2S,5R)-6-amino-5-fluoro-2,5-bis(fluorometil)-3,4-dihidropiridin-2-il]-4-fluorofenil]-5-fluoropiridin-2-karboksamid;
N-[3-[(2S,5R)-6-amino-5-fluoro-2,5-bis(fluorometil)-3,4-dihidropiridin-2-il]-4-fluorofenil]-5-metoksipiridin-2-karboksamid and
N-[3-[(2S,5R)-6-amino-5-fluoro-2,5-bis(fluorometil)-3,4-dihidropiridin-2-il]-4-fluorofenil]-5-metoksipirazin-2-karboksamid;
Ili farmaceutski prihvatljiva so pomenutog jedinjenja.
[0218] Drugi BACE inhibitori mogu biti u skladu sa formulom u nastavku
u kojoj je Ar odabrano iz grupe koju čine fenil, piridil, pirimidil, pirazinil, imidazolil, pirazolil, oksazolil, tiazolil i isoksazolil, i u kojoj je Ar opciono supstituisano jednim ili više halogena, CN, C1-C6 alkila, C2-C6 alkenila, C2-C6 alkinila, C1-C6 fluoroalkila ili C1-C6 alkoksija; i
R1 i R2 su nezavisno odabrani od vodonika, halogena, C1-C3 fluoroalkila ili C1-C3 alkila;
ili njihova farmaceutski prihvatljiva so.
[0219] Na primer jedinjenja kao što su
(S)-N-(3-(6-amino-3,3-difluoro-2-(fluorometil)-2,3,4,5-tetrahidropiridin-2-il)-4-fluorofenil)-5-hloropikolinamid
(S)-N-(3-(6-amino-3,3-difluoro-2-(fluorometil)-2,3,4,5-tetrahidropiridin-2-il)-4-fluorofenil)-5-fluoropikolinamid
(S)-N-(3-(6-amino-3,3-difluoro-2-(fluorometil)-2,3,4,5-tetrahidropiridin-2-il)-4-fluorofenil)-5-metoksipirazin-2-karboksamid
(S)-N-(3-(6-amino-3,3-difluoro-2-(fluorometil)-2,3,4,5-tetrahidropiridin-2-il)-4-fluorofenil)-1-(difluorometil)-1H-pirazol-3-karboksamid
(S)-N-(3-(6-amino-3,3-difluoro-2-(fluorometil)-2,3,4,5-tetrahidropiridin-2-il)-4-fluorofenil)-2-(difluorometil)oksazol-4-karboksamid
(S)-N-(3-(6-amino-3,3-difluoro-2-(fluorometil)-2,3,4,5-tetrahidropiridin-2-il)-4-fluorofenil)-5-cijanopikolinamid
(S)-N-(3-(6-amino-3,3-difluoro-2-(fluorometil)-2,3,4,5-tetrahidropiridin-2-il)-4-fluorofenil)-2-metiloksazol-4-karboksamid
(S)-N-(3-(6-amino-3,3-difluoro-2-(fluorometil)-2,3,4,5-tetrahidropiridin-2-il)-4-fluorofenil)-5-metoksipirimidin-2-karboksamid
(S)-N-(3-(6-amino-3,3-difluoro-2-(fluorometil)-2,3,4,5-tetrahidropiridin-2-il)-4-fluorofenil)-5-(difluorometil)pirazin-2-karboksamid
(S)-N-(3-(6-amino-3,3-difluoro-2-(fluorometil)-2,3,4,5-tetrahidropiridin-2-il)-4,5-difluorofenil)-2-metiloksazol-4-karboksamid
(S)-N-(3-(6-amino-3,3-difluoro-2-(fluorometil)-2,3,4,5-tetrahidropiridin-2-il)-4,5-difluorofenil)-5-metoksipirazin-2-karboksamid
(S)-N-(3-(6-amino-3,3-difluoro-2-(fluorometil)-2,3,4,5-tetrahidropiridin-2-il)-4,5-difluorofenil)-5-fluoropikolinamid
(S)-N-(3-(6-amino-3,3-difluoro-2-(fluorometil)-2,3,4,5-tetrahidropiridin-2-il)-4,5-difluorofenil)-5-hloropikolinamid
(S)-N-(3-(6-amino-3,3-difluoro-2-(fluorometil)-2,3,4,5-tetrahidropiridin-2-il)-4,5-difluorofenil)-5-cijanopikolinamid
(S)-N-(3-(6-amino-3,3-difluoro-2-(fluorometil)-2,3,4,5-tetrahidropiridin-2-il)-4,5-difluorofenil)-5-metoksipikolinamid
(S)-N-(3-(6-amino-3,3-difluoro-2-(fluorometil)-2,3,4,5-tetrahidropiridin-2-il)-4,5-difluorofenil)-5-(metoksi-d3)pikolinamid
(S)-N-(3-(6-amino-3,3-difluoro-2-(fluorometil)-2,3,4,5-tetrahidropiridin-2-il)-4,5-difluorofenil)-5-cijano-3-metilpikolinamid
(S)-N-(3-(6-amino-3,3-difluoro-2-(fluorometil)-2,3,4,5-tetrahidropiridin-2-il)-4-fluorofenil)-5-(metoksi-d3)pikolinamid(S)-N-(3-(6-amino-3,3-difluoro-2-(fluorometil)-2,3,4,5-tetrahidropiridin-2-il)-4-fluorofenil)-5-bromopikolinamid
(S)-N-(3-(6-amino-3,3-difluoro-2-(fluorometil)-2,3,4,5-tetrahidropiridin-2-il)-4-fluorofenil)-5-bromopikolinamid
Ili farmaceutski prihvatljiva so pomenutog jedinjenja.
[0220] Druga BACE jedinjenja mogu imati formulu u nastavku
u kojoj je Ar odabrano iz grupe koju čine fenil, piridil, pirimidil, pirazinil, imidazolil, pirazolil, tiazolil, oksazolil, isoksazolil, i u kojoj je Ar opciono supstituisano jednim ili više supstituenata odabranih od halogena, CN, C1-C6 alkila, C2-C6 alkenila, C2-C6 alkinila, C1-C6 fluoroalkila ili C1-C6 alkoksija; i R1 predstavlja vodonik, halogen, C1-C3 fluoroalkil ili C1-C3 alkil;
ili njihova farmaceutski prihvatljiva so.
[0221] Ta jedinjenja mogu biti
(S)-N-(3-(6-amino-2-(difluorometil)-3,3-difluoro-2,3,4,5-tetrahidropiridin-2-il)-4-fluorofenil)-5-hloropikolinamid,
(S)-N-(3-(6-amino-2-(difluorometil)-3,3-difluoro-2,3,4,5-tetrahidropiridin-2-il)-4-fluorofenil)-5-fluoropikolinamid,
(S)-N-(3-(6-amino-2-(difluorometil)-3,3-difluoro-2,3,4,5-tetrahidropiridin-2-il)-4-fluorofenil)-5-metoksipirazin-2-karboksamid,
(S)-N-(3-(6-amino-2-(difluorometil)-3,3-difluoro-2,3,4,5-tetrahidropiridin-2-il)-4-fluorofenil)-2-metiloksazol-4-karboksamid,
(S)-N-(3-(6-amino-2-(difluorometil)-3,3-difluoro-2,3,4,5-tetrahidropiridin-2-il)-4-fluorofenil)-5-metoksipikolinamid,
(S)-N-(3-(6-amino-2-(difluorometil)-3,3-difluoro-2,3,4,5-tetrahidropiridin-2-il)-4-fluorofenil)-5-(difluorometil)pirazin-2-karboksamid,
(S)-N-(3-(6-amino-2-(difluorometil)-3,3-difluoro-2,3,4,5-tetrahidropiridin-2-il)-4-fluorofenil)-5-cijanopikolinamid,
(S)-N-(3-(6-amino-2-(difluorometil)-3,3-difluoro-2,3,4,5-tetrahidropiridin-2-il)-4-fluorofenil)-4-metiltiazol-2-karboksamid,
(S)-N-(3-(6-amino-2-(difluorometil)-3,3-difluoro-2,3,4,5-tetrahidropiridin-2-il)-4-fluorofenil)-5-metoksipirimidin-2-karboksamid,
(S)-N-(3-(6-amino-2-(difluorometil)-3,3-difluoro-2,3,4,5-tetrahidropiridin-2-il)-4-fluorofenil)-5-metoksi-3-metilpirazin-2-karboksamid,
(S)-N-(3-(6-amino-2-(difluorometil)-3,3-difluoro-2,3,4,5-tetrahidropiridin-2-il)-4-fluorofenil)-5-cijano-3-metilpikolinamid,
(S)-N-(3-(6-amino-2-(difluorometil)-3,3-difluoro-2,3,4,5-tetrahidropiridin-2-il)-4-fluorofenil)-5-bromopikolinamid,
(S)-N-(3-(6-amino-2-(difluorometil)-3,3-difluoro-2,3,4,5-tetrahidropiridin-2-il)-4-fluorofenil)-5-(metoksi-d3)pikolinamid and
(S)-N-(3-(6-amino-2-(difluorometil)-3,3-difluoro-2,3,4,5-tetrahidropiridin-2-il)-4-fluorofenil)-5-(metoksi-d3)pirazin-2-karboksamid;
ili farmaceutski prihvatljive soli pomenutih jedinjenja.
[0222] Drugi BACE inhibitori mogu biti prema formuli u nastavku
u kojoj je Ar odabrano iz grupe koju čine fenil, piridil, pirimidil, pirazinil, imidazolil, pirazolil, tiazolil, oksazolil, isoksazolil, i u kojoj je Ar opciono supstituisan jednim ili više supstituenata odabranih od halogena, CN, C1-C6 alkila, C2-C6 alkenila, C2-C6 alkinila, C1-C6 fluoroalkila ili C1-C6 alkoksija; i R1 predstavlja jedan ili više vodonika, halogena, C1-C3 fluoroalkila ili C1-C3 alkila;
ili njihova farmaceutski prihvatljiva so.
[0223] To jedinjenje može biti:
N-(3-((2R,3S,5S)-6-amino-3,5-difluoro-2,5-dimetil-2,3,4,5-tetrahidropiridin-2-il)-4-fluorofenil)-5-fluoropikolinamid,
N-(3-((2R,3S,5S)-6-amino-3,5-difluoro-2,5-dimetil-2,3,4,5-tetrahidropiridin-2-il)-4-fluorofenil)-5-metoksipirazin-2-karboksamid,
N-(3-((2R,3S,5S)-6-amino-3,5-difluoro-2,5-dimetil-2,3,4,5-tetrahidropiridin-2-il)-4-fluorofenil)-5-metoksipikolinamid,
N-(3-((2R,3S,5R)-6-amino-3,5-difluoro-2,5-dimetil-2,3,4,5-tetrahidropiridin-2-il)-4-fluorofenil)-5-fluoropikolinamid,
N-(3-((2R,3S,5R)-6-amino-3,5-difluoro-2,5-dimetil-2,3,4,5-tetrahidropiridin-2-il)-4-fluorofenil)-5-metoksipirazin-2-karboksamid,
N-(3-((2R,3S,5R)-6-amino-3,5-difluoro-2,5-dimetil-2,3,4,5-tetrahidropiridin-2-il)-4-fluorofenil)-2-metiloksazol-4-karboksamid,
N-(3-((2R,3S,5R)-6-amino-3,5-difluoro-2,5-dimetil-2,3,4,5-tetrahidropiridin-2-il)-4-fluorofenil)-5-metoksipikolinamid,
N-(3-((2R,3S,5R)-6-amino-3,5-difluoro-2,5-dimetil-2,3,4,5-tetrahidropiridin-2-il)-4-fluorofenil)-5-(metoksi-d3)pikolinamid,
N-(3-((2R,3S,5R)-6-amino-3,5-difluoro-2,5-dimetil-2,3,4,5-tetrahidropiridin-2-il)-4-fluorofenil)-5-hloropikolinamid,
N-(3-((2R,3S,5R)-6-amino-3,5-difluoro-2,5-dimetil-2,3,4,5-tetrahidropiridin-2-il)-4-fluorofenil)-1-metil-1H-imidazol-2-karboksamid,
N-(3-((2R,3S,5R)-6-amino-3,5-difluoro-2,5-dimetil-2,3,4,5-tetrahidropiridin-2-il)-4-fluorofenil)-5-(trifluorometil)pirazin-2-karboksamid,
N-(3-((2R,3S,5R)-6-amino-3,5-difluoro-2,5-dimetil-2,3,4,5-tetrahidropiridin-2-il)-4-fluorofenil)-4-metiltiazol-2 -karboksamid,
N-(3-((2R,3S,5R)-6-amino-3,5-difluoro-2,5-dimetil-2,3,4,5-tetrahidropiridin-2-il)-4-fluorofenil)-2-(difluorometil)oksazol-4-karboksamid,
N-(3-((2R,3S,5R)-6-amino-3,5-difluoro-2,5-dimetil-2,3,4,5-tetrahidropiridin-2-il)-4-fluorofenil)-1-(difluorometil)-1H-pirazol-3-karboksamid,
N-(3-((2R,3S,5R)-6-amino-3,5-difluoro-2,5-dimetil-2,3,4,5-tetrahidropiridin-2-il)-4-fluorofenil)-5-(difluorometil)pirazin-2-karboksamid,
N-(3-((2R,3S,5R)-6-amino-3,5-difluoro-2,5-dimetil-2,3,4,5-tetrahidropiridin-2-il)-4-fluorofenil)-4-hlorobenzamid,
N-(3-((2R,3S,5R)-6-amino-3,5-difluoro-2,5-dimetil-2,3,4,5-tetrahidropiridin-2-il)-4-fluorofenil)-5-cijanopikolinamid,
N-(3-((2R,3S,5R)-6-amino-3,5-difluoro-2,5-dimetil-2,3,4,5-tetrahidropiridin-2-il)-4,5-difluorofenil)-5-(metoksi-d3)pikolinamid,
N-(3-((2R,3S,5S)-6-amino-3,5-difluoro-2,5-dimetil-2,3,4,5-tetrahidropiridin-2-il)-4-fluorofenil)-5-(metoksi-d3)pikolinamid,
N-(3-((2R,3S,5S)-6-amino-3,5-difluoro-2,5-dimetil-2,3,4,5-tetrahidropiridin-2-il)-4-fluorofenil)-5-(metoksi-d3)pirazin-2-karboksamid,
N-(3-((2R,3S,5S)-6-amino-3,5-difluoro-2,5-dimetil-2,3,4,5-tetrahidropiridin-2-il)-4-fluorofenil)-5-cijano-3-metilpikolinamid,
N-(3-((2R,3S,5S)-6-amino-3,5-difluoro-2,5-dimetil-2,3,4,5-tetrahidropiridin-2-il)-4,5-difluorofenil)-5-(metoksi-d3)pikolinamid,
N-(3-((2R,3R,5S)-6-amino-3,5-difluoro-2,5-dimetil-2,3,4,5-tetrahidropiridin-2-il)-4-fluorofenil)-5-(metoksi-d3)pikolinamid,
N-(3-((2R,3S,5S)-6-amino-3,5-difluoro-2,5-dimetil-2,3,4,5-tetrahidropiridin-2-il)-4-fluorofenil)-5-bromopikolinamid
ili farmaceutski prihvatljive soli pomenutih jedinjenja.
b) Tau antitelo kombinovano sa N3PGLU ABETA antitelom
[0224] U terapiji, kompoziciji ili kompletu, tau antitelo može biti kombinovano sa N3PGLU ABETA antitelom.
c) Tau antitelo kombinovano sa jedinjenjem koje je korisno u aktivnoj ili pasivnoj Aβ peptidnoj imunoterapiji
[0225] U terapiji, kompoziciji ili kompletu, tau antitelo može biti kombinovano sa jedinjenjem koje je korisno u aktivnoj ili pasivnoj Aβ peptidnoj imunoterapiji
d) Tau antitelo kombinovano sa antagonistom NMDA receptora
[0226] U terapiji, kompoziciji ili kompletu, tau antitelo može biti kombinovano s antagonistima NMDA receptora. Antagonist NMDA receptora može biti odabran iz grupe koju čine, memantin, namenda, Namzaric (memantin /donepezil), i njegovi generički oblici. Antagonist NMDA receptora može biti odabran od antipsihotika. Presinaptički neuroni zabranjuju prekomerno otpuštanje glutamata putem negativnih mehanizama povratnih informacija, ali takvi mehanizmi će biti postignuti u uslovima celularnog stresa, kao što je AB. Prekomerni glutamat u sinaptičkom rascepu uzrokuje da se postsinaptički kanali kalcijuma kontinuirano otvaraju, što dovodi do povećanih nivoa intracelularnog kalcijuma unutar neurona, čime se uzrokuje ozbiljno neuronsko oštećenje i/ili smrt. Antagoniziranjem NMDA receptora u uslovima prekomernog priliva kalcijuma, antipsihotik smanjuje prekomerni priliv kalcijuma u neurone, čime se smanjuje celularno oštećenje i čime se poboljšava normalno signaliziranje neurona a time i kognitivna funkcija.
e) Tau antitelo kombinovan sa inhibitorom dalje agregacije tau proteina;
[0227] U terapiji, kompoziciji ili kompletu, tau antitelo može biti kombinovano sa inhibitorom agregacije tau proteina.
f) Tau antitelo kombinovano sa inhibitorom acetilholinske esteraze
[0228] U terapiji, kompoziciji ili kompletu, tau antitelo može biti kombinovano sa inhibitorom acetilholinske esteraze (AChEI). AChEl se često koriste kao terapija prvog reda za kognitivne simptome kod blage do umerene AB. AChEl se često upotrebljavaju u širem smislu za lečenje umerene do ozbiljne AB, uključujući donepezil koji je odobren za ovu subpopulaciju. AChEl ublažavaju holinergijski deficit
1
primećen kod pacijenata sa AB, i poboljšavaju mogućnost pacijenta da izvodi dnevne aktivnosti. Ovde je otkrivena terapija koja obuhvata tau antitelo kako je ovde definisano, i inhibitor acetilholinske esteraze.
[0229] U jednom načinu ostvarivanja, AChEI je odabran iz grupe koju čine donepezil, galantamin i rivastigmin. AChEI može biti tableta za oralnu upotrebu, želatin, sirup ili drugi oblik formulacije oralnog rastvora. AChEI takođe može biti i flaster za transdermalnu primenu.
g) Tau antitelo kombinovano sa antiepileptikom;
[0230] U terapiji, kompoziciji ili kompletu, tau antitelo može biti kombinovano sa antiepileptikom.
h) Tau antitelo kombinovano santi-inflamatornim lekom;
[0231] U terapiji, kompoziciji ili kompletu, tau antitelo može biti kombinovano sa anti-inflamatornim lekom.
i) Tau antitelo kombinovano san antidepresivom
[0232] U terapiji, kompoziciji ili kompletu, tau antitelo može biti kombinovano sa antidepresivom.
[0233] Depresija je uobičajeni rani komorbidni simptom demencije sa AB. Triciklični antidepresivi su nekada bilo poželjni u lečenju depresivnih simptoma kod AB, ali SSRI su u velikoj meri zamenili ove agense. U jednom načinu ostvarivanja, Escitalopram je antidepresiv budući da se često prepisuje za AB zbog svog povoljnog profila neželjenih dejstava i minimalnih interakcija sa drugim lekovima. U daljem načinu ostvarivanja, citalopram ili sertralin je antidepresiv budući da se takođe često upotrebljava. U daljem načinu ostvarivanja, vortioksetin je antidepresiv budući da je povezan sa poboljšanjem u kognitivnoj funkciji i snimanjem dokaza neuronske efikasnosti kod pacijenata koji pate od MDD.
Antidepresiv može biti odabran iz grupe koju čine escitalopram, sertralin, citalopram, paroksetin, fluoksetin, venlafaksin, trazodon, mirtazapin, vortioksetin i njihovi generički oblici.
[0234] Dalje je otkriveno antitelo ili njihovi epitop-vezujući fragmenti, u kompoziciji zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem, razblaživačem, adjuvansom i/ili stabilizatorom. Antitela, ili njihovi epitop-vezujući fragmenti, mogu biti korišćeni u terapiji za lečenje taupatije. Obično, taupatija je odabrana iz grupe koju čine Alchajmerova bolest, bolest argirofilnih zrnaca (AGD), psihoza, određenije psihoza usled AB ili psihoza kod pacijenata sa AB, apatija usled AB ili apatija kod pacijenata sa AB, psihijatrijski simptomi pacijenata sa demencijom sa levijevim telima, progresivna supranuklearna palsija (PSP), frontotemporalna demencija (FTD ili njene varijante), TBI (traumatska povreda mozga, akutna ili hronična), kortikobazalna degeneracija (CBD), Pikova bolest, primarna tauopatija povezana sa uzrastom (PART), senilna demencija sa predominantnim neurofibrilarnim klupkom, demencija puglistika, Hronična traumatska encefalopatija, moždani udar, oporavak od moždanog udara, neurodegeneracija povezana sa Parkinsonovom bolešću, parkinsonizam povezan sa hromozomom, Lytico-Bodigova bolest (Parkinson-
2
demencija kompleks sa Gvama), gangliogliom i gangliocitom, meningioangiomatoza, postencefalopatski parkinsonizam, subakutni sklerozirajući panencefalitis, Hantingtonova bolest, olovna encefalopatija, tuberozna skleroza, Hallervorden-Spatzova bolest i lipofuscinoza. Uobičajenije, taupatija je odabrana iz grupe koju čine Alchajmerova bolest, bolest argirofilnih zrnaca (AGD), psihoza, određenije psihoza usled AB ili psihoza kod pacijenata sa AB, apatija usled AB ili apatija kod pacijenata sa AB, psihijatrijski simptomi pacijenata sa demencijom sa levijevim telima, progresivna supranuklearna palsija (PSP), frontotemporalna demencija (FTD ili njene varijante), TBI (traumatska povreda mozga, akutna ili hronična), kortikobazalna degeneracija (CBD), i Pikova bolest. Određenije, te tauopatije mogu biti odabrane iz grupe koju čine Alchajmerova bolest, bolest argirofilnih zrnaca (AGD), psihoza usled AB ili psihoza kod pacijenata sa AB, apatija usled AB ili apatija kod pacijenata sa AB, i psihijatrijski simptomi pacijenata sa demencijom sa levijevim telima.
[0235] Predviđeno lečenje može biti hronično a pacijent može biti lečen najmanje 2 nedelje, kao što je najmanje 1 mesec, 6, meseci, 1 godina ili više.
[0236] Antitela mogu, na primer, biti monoklonalna antitela proizvedena postupkom hibridoma koji su prvo opisali Kohler et al., Nature 256, 495 (1975), ili mogu biti monoklonalna antitela proizvedena rekombinantnom DNK ili drugim postupcima, ili poželjnije mogu biti proizvedena otkrivenim novim postupkom. Monoklonalna antitela takođe mogu biti izolovana iz biblioteka prikaza faga antitela pomoću tehnika opisanih u, na primer, Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991) i Marks et al., J. Mol. Biol.222, 581-597 (1991). Monoklonalna antitela mogu biti dobijena iz bilo kog pogodnog izvora. Samim tim, na primer, monoklonalna antitela mogu biti dobijena iz hibridoma pripremljenih od mišjih B limfocitnih ćelija slezine dobijenih od miševa imunizovanih antigenom od značaja, na primer, u obliku ćelija koje eksprimiraju antigen na površini, ili nukleinske kiseline koja kodira antigen od značaja.
Monoklonalna antitela takođe mogu da budu dobijena iz hibridoma dobijenih od antiteloeksprimirajućih ćelija imunizovanih ljudi ili od nehumanih sisara kao što su pacovi, zečevi, psi, ovce, koze, primati, itd.
[0237] U jednom načinu ostvarivanja, antitelo je humano antitelo. Humana monoklonalna antitela usmerena protiv tau mogu biti napravljena upotrebom transgenih ili transhromozomalnih miševa koji nose delove humanog imunog sistema pre nego mišjeg sistema. Takvi transgeni i transhromozomni miševi uključuju miševe ovde označene sa HuMAb (humano monoklonalno antitelo) miševi i KM miševi, tim redom, a zbirno su označeni kao "transgeni miševi".
[0238] HuMAb miš sadrži humani mini lokus imunoglobulinskog gena koji kodira imunoglobulinske sekvence neraspoređene humane varijable i konstante teškog (µ i Y) i varijable i konstante lakog (κ) lanca, zajedno sa ciljanim mutacijama koje deaktiviraju endogeni µ i lokuse K lanca (Lonberg, N. et al., Nature 368, 856-859 (1994)). Shodno tome, miševi ispoljavaju smanjenu ekspresiju mišjeg IgM ili K i kao odgovor na imunizaciju, uvedeni transgeni humanog teškog i lakog lanca, se podvrgavaju zameni klasa i somatskoj mutaciji kako bi se napravilo humano IgG visokog afiniteta, κ monoklonalna antitela (Lonberg, N. et al. (1994), supra; pregledano u Lonberg, N., Handbook of Experimental Pharmacology 113, 49-101 (1994), Lonberg, N. and Huszar, D., Intern. Rev. Immunol. Vol.1365-93 (1995) and Harding, F. and Lonberg, N., Ann. N. Y. Acad. Sci 764536-546 (1995)). Priprema HuMAb miševa je detaljno opisana u Taylor, L. et al., Nukleinska kiselinas Research 20, 6287-6295 (1992), Chen, J. et al., International Immunology 5, 647-656 (1993), Tuaillon et al., J. Immunol.152, 2912-2920 (1994), Taylor, L. et al., International Immunology 6, 579-591 (1994), Fishwild, D. et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996). Videti takođe US 5,545,806, US 5,569,825, US 5,625,126, US 5,633,425, US 5,789,650, US 5,877,397, US 5,661,016, US 5,814,318, US 5,874,299, US 5,770,429, US 5,545,807, WO 98/24884, WO 94/25585, WO 93/1227, WO 92/22645, WO 92/03918 i WO 01/09187.
[0239] HCo7, HCo12, HCo17 i HCo20 miševi imaju JKD prekid u njihovim endogenim genima (kappa) lakog lanca (kako je opisano u Chen et al., EMBO J.12, 811-820 (1993)), CMD prekid u njihovim endogenim genima teškog lanca (kako je opisano u primeru 1 iz WO 01/14424), i KCo5 humani kappa transgen lakog lanca (kako je opisano u Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996)). Pored toga, HCo7 miševi imaju transgen HCo7 humanog teškog lanca (kako je opisano u US 5,770,429), HCo12 miševi imaju transgen HCo12 humanog teškog lanca (kako je opisano u primeru 2 iz WO 01/14424), HCo17 miševi imaju transgen HCo17 humanog teškog lanca (kako je opisano u primeru 2 iz WO 01/09187) a HCo20 miševi imaju transgen HCo20 humanog teškog lanca. Dobijeni miševi eksprimiraju humane transgene imunoglobulinskog teškog i kappa lakog lanca u pozadini homozigotnoj za prekid endogenih lokusa mišjeg teškog i kappa lakog lanca.
[0240] Kod KM mišje vrste, endogeni gen mišjeg kappa lakog lanca je homozigotno prekinut kako je opisano u Chen et al., EMBO J.12, 811-820 (1993) a endogeni gen mišjeg teškog lanca je homozigotno prekinut kako je opisano u primeru 1 iz WO 01/09187. Ova mišja vrsta nosi humani transgen kappa lakog lanca, KCo5, kako je opisano u Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996). Ova mišja vrsta takođe nosi transhromozom humanog teškog lanca koji se sastoji od 14 fragmenta hromozoma hCF (SC20) kako je opisano u WO 02/43478. HCo12-Balb/c, HCo17-Balb/c i HCo20-Balb/c miševi mogu biti generisani prelaženjem HCo12, HCo17 i HCo20 do KCo5[J/K](Balb) kako je opisano u WO 09/097006.
[0241] rTg4510 miš je poznat model tauopatije koji obezbeđuje vremensku i prostornu kontrolu nad ekspresijom mutantnog tau transgena. Kod KM mišje vrste, endogeni gen mišjeg kappa lakog lanca je homozigotno prekinut kako je opisano u Chen et al., EMBO J.12, 811-820 (1993) i endogeni gen mišjeg teškog lanca je homozigotno prekinut kako je opisano u primeru 1 iz WO 01/09187. Ova mišja vrsta nosi humani transgen kappa lakog lanca, KCo5, kako je opisano u Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996). Ova mišja vrsta takođe nosi humani teški lanac trans-hromozoma koji se sastoji od hromozomskog 14 epitop-vezujućeg fragmenta hCF (SC20) kako je opisano u WO 02/43478.
4
[0242] Splenociti od ovih transgenih miševa mogu biti korišćeni kako bi se napravili hibridomi koji izlučuju humana monoklonalna antitela u skladu sa dobro poznatim tehnikama. Humana monoklonalna ili poliklonalna antitela, ili antitela koja potiču od drugih vrsta takođe mogu da budu napravljena transgenikalno putem stvaranja drugog ne-humanog sisara ili biljke koja je transgena za sekvence imunoglobulinskog gena od značaja teškog i lakog lanca i proizvodnje antitela u obliku koji može da se obnavlja. U vezi sa transgenom proizvodnjom kod sisara, antitela mogu biti proizvedena u, obnovljenom obliku, kozjem mleku, kravljem, ili od drugih sisara (videti na primer US 5,827,690; US 5,756,687; US 5,750,172 i US 5,741,957).
[0243] Antitelo može biti od bilo kog izotipa. Izbor izotipa će obično biti vođen željenim funkcijama efektora, kao što je ADCC funkcija. Primerni izotipovi su IgG1, IgG2, IgG3, i IgG4. Može se koristiti jedan od konstantnih domena lakog lanca, kappa ili lambda. Po želji, klasa anti-tau antitela može biti zamenjena poznatim postupcima. Na primer, antitelo koje je originalno bilo IgM može biti klasa zamenjena sa IgG antitelom. Dalje, tehnike zamene klase mogu biti korišćene da se konvertuje jedna IgG podklasa u drugu, na primer iz IgG1 u IgG2. Samim tim, funkcija efektora antitela može biti zamenjena zamenom izotipa npr., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE, ili IgM antitelom za razne terapijske upotrebe. U jednom načinu ostvarivanja antitelo predstavlja IgG1 antitelo, na primer IgG1, κ. Za antitelo se kaže da je od određenog izotipa ukoliko je njegova aminokiselinska sekvenca najhomolognija sa tim izotipom, u odnosu na druge izotipove.
[0244] U jednom načinu ostvarivanja, antitelo predstavlja antitelo pune dužine poželjno IgG antitelo, određenije IgG1, κ antitelo. U drugom načinu ostvarivanja, to antitelo predstavlja epitop-vezujući fragment antitela ili jednolančano antitelo.
[0245] Antitela i njihovi epitop-vezujući fragmenti mogu npr. da se dobiju epitop-vezujućom fragmentacijom pomoću konvencionalnih tehnika, a epitop-vezujući fragmenti detaljno pregledani radi iskoristivosti na isti načni kako je ovde opisano za cela antitela. Na primer, F(ab')2epitop-vezujući fragmenti mogu biti napravljeni tretiranjem antitela pepsinom. Dobijeni F(ab')2epitop-vezujući fragment može biti tretiran tako da se smanje disulfidni mostovi kako bi se proizveli Fab' epitop-vezujući fragmenti. Fab epitop-vezujući fragmenti mogu biti dobijeni tretiranjem IgG antitela papainom; Fab' epitop-vezujući fragmenti mogu biti dobijeni digestijom pepsina antitela IgG. F(ab') epitop-vezujući fragment takođe može da bude proizveden vezivanjem Fab'-opisanog u nastavku putem tioetarske veze ili disulfidne veze. Fab' epitop-vezujući fragment predstavlja epitop-vezujući fragment antitela dobijen rezanjem disulfidne veze zglobnog domena F(ab')2. Fab'- epitop-vezujući fragment može biti dobijen tretiranjem F(ab')2 epitop-vezujućeg fragmenta agensom za smanjenje, kao što je ditiotreitol. Epitopvezujući fragment antitela takođe može biti napravljen ekspresijom nukleinskih kiselina koje kodiraju takve epitop-vezujuće fragmente u rekombinantnim ćelijama (videti na primer Evans et al., J. Immunol. Meth. 184, 123-38 (1995)). Na primer, himerni gen koji kodira deo F(ab')2 epitop-vezujućeg fragmenta bi mogao da uključuje sekvence DNK koje kodiraju CH1 domen i zglobni domen H lanca, nakon čega sledi translacioni zaustavni kodon da bi se dobio takav okrnjeni molekul epitop-vezujućeg fragmenta antitela.
[0246] U jednom načinu ostvarivanja, anti-tau antitelo je monovalentno antitelo, poželjno monovalentno antitelo kako je opisano u WO2007059782 sa delecijom zglobnog regiona. Shodno tome, u jednom načinu ostvarivanja, antitelo je monovalentno antitelo, pri čemu je pomenuto anti-tau antitelo konstruisano postupkom koji obuhvata : i) obezbeđivanje konstrukta nukleinske kiseline koja kodira laki lanac iz pomenutog monovalentnog antitela, pri čemu pomenuti konstrukt obuhvata nukleotidnu sekvencu koja kodira VL region odabranog antigenskog antitela specifičnog anti-tau a nukleotidna sekvenca koja kodira konstantni CL region Ig, pri čemu pomenuta nukleotidna sekvenca koja kodira VL region odabranog antigen specifičnog antitela i pomenuta nukleotidna sekvenca koja kodira CL region jednog Ig su operativno povezane zajedno, i pri čemu je, u slučaju jednog podtipa IgG1,nukleotidna sekvenca koja kodira CL region modifikovana tako da CL region ne sadrži bilo koje aminokiseline koje mogu da obrazuju disulfidne veze ili kovalentne veze sa drugim peptidima koji obuhvataju identičnu aminokiselinsku sekvencu CL regiona u prisustvu poliklonalnog humanog IgG ili kada se daje životinji ili čoveku; ii) obezbeđivanje konstrukta nukleinske kiseline koji kodiraju teški lanac pomenutog monovalentnog antitela, pri čemu pomenuti konstrukt obuhvata nukleotidnu sekvencu koja kodira VH region odabranog antigen specifičnog antitela a nukleotidna sekvenca koja kodira konstantni CH region humanog Ig, pri čemu ta nukleotidna sekvenca koja kodira CH region je modifikovana tako da region koji odgovara zglobnom regionu i, koji je potreban za Ig podtip, drugi regioni CH regiona, kao što je CH3 region, ne obuhvata bilo koje aminokiselinske ostatke koji ostaju u formulaciji disulfidnih veza ili kovalentnih ili stabilnih nekovalentnih veza unutar teškog lanca sa drugim peptidima koji obuhvataju identičnu aminokiselinsku sekvencu CH regiona humanog Ig u prisustvu poliklonalnog humanog IgG ili kada se daje životinji ili čoveku, pri čemu pomenuta nukleotidna sekvenca koja kodira VH region odabranog antigen specifičnog antitela i pomenuta nukleotidna sekvenca koja kodira CH region pomenutog Ig su operativno povezane zajedno; iii) obezbeđivanje sistema za ekspresiju ćelija za proizvodnju pomenutog monovalentnog antitela; iv) proizvodnju pomenutog monovalentnog antitela zajedničkom ekspresijom konstrukata nukleinske kiseline pod (i) i (ii) u ćelijama sistema za ekspresiju ćelija pod (iii).
[0247] Slično, u jednom načinu ostvarivanja, anti-tau antitelo predstavlja monovalentno antitelo, koje obuhvata:
(i) varijabilni domen antitela ovog pronalaska kako je ovde opisan ili epitop-vezujući deo pomenutog domena, i
(ii) CH domen imunoglobulina ili njegov domen koji obuhvata CH2 i CH3 domene, pri čemu su CH domen ili njegov domen modifikovani tako da domen koji odgovara zglobnom domenu i, ako imunoglobulin ne predstavlja IgG4 podtip, drugi domeni CH domena, kao što je CH3 domen, ne obuhvata bilo koje aminokiselinske ostatke, koji mogu da formiraju disulfidne veze sa identičnim CH domenom ili drugim kovalentnim ili stabilnim nekovalentnim vezama unutar teškog lanca sa identičnim CH domenom u prisustvu poliklonalnog humanog IgG.
[0248] U daljem načinu ostvarivanja, teški lanac monovalentnog antitela je modifikovan tako da je ceo zglobni region izbrisan.
[0249] Dalje u drugom načinu ostvarivanja, sekvenca monovalentnog antitela je modifikovana tako da ne obuhvata bilo koja mesta primaoca za N-povezanu glikosilaciju.
[0250] Ovo otkrivanje takođe uključuje "bispecifična antitela," pri čemu anti-tau vezujući region (npr., tau-vezujući region anti-tau monoklonalnog antitela) predstavlja deo bivalentnog ili polivalentnog bispecifičnog nosača koja cilja više od jednog epitopa, (na primer drugi epitop bi mogao da obuhvata epitop aktivnog receptora prenosioca, tako da bi bispecifično antitelo moglo da pokaže poboljšanu transcitozu preko biološke barijere, kao što je krvno-moždana barijera). Samim tim, dalje u drugom načinu ostvarivanja, monovalentna Fab anti-tau antitela mogu biti spojena sa dodatnim Fab ili scfv koji ciljaju različit protein da bi se napravilo bispecifično antitelo. Bispecifično antitelo može da ima dvostruku funkciju, na primer terapijsku funkciju dodeljenu anti-tau vezujućim domenom i transportnom funkcijom koja može da se vezuje za molekul receptora kako bi se pojača prenos preko biološke barijere, kao što je krvno-moždana barijera.
[0251] Antitela i njihovi epitop-vezujući fragmenti, takođe uključuju antitela pojedinačnog lanca.
Antitela pojedinačnog lanca su peptidi u kojima su povezani Fv domeni teškog i lakog lanca. U jednom načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak obezbeđuje jednolančani Fv (scFv) pri čemu teški i laki lanci u Fv anti-tau antitela ovog pronalaska su spojene fleksibilnim peptidnim veznikom (obično od oko 10, 12, 15 ili više aminokiselinskih ostataka) u pojedinačnom peptidnom lancu. Postupci proizvodnje takvih antitela su opisani u na primer US 4,946,778, Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp.269-315 (1994), Bird et al., Science 242, 423-426 (1988), Huston et al., PNAS USA 85, 5879-5883 (1988) and McCafferty et al., Nature 348, 552-554 (1990). Antitelo pojedinačnog lanca može biti monovalentno, ukoliko se koriste samo pojedinačni VH i VL, bivalentno, ukoliko se samo dva VH i VL koriste, ili polivalentno, ukoliko se koriste više od dva VH i VL.
[0252] Antitela i njihovi epitop-vezujući fragmenti ovde opisani mogu biti modifikovani inkluzijom bilo kog pogodnog broja modifikovanih aminokiselina i/ili asocijacija sa tako konjugovanim supstituentima. Pogodnost u ovom kontekstu je generalno određena mogućnošću da najmanje suštinski zadrži tau selektivnost i/ili tau specifičnost povezanu sa nederivatizovanim matičnim anti-tau antitelo. Inkluzija jedne ili više modifikovanih aminokiselina može biti poželjna kod, na primer, povećavanja polipeptidnog poluživota u serumu, smanjivanja polipeptidne antigenosti, ili povećavanja stabilnosti čuvanja polipeptida. Aminokiselina(e) su modifikovane, na primer, kotranslaciono ili post-translaciono tokom rekombinantne proizvodnje (npr., N-povezanom glikosilacijom na N-X-S/T motivima tokom ekspresije u ćelijama sisara) ili su modifikovane sintetičkim sredstvima. Neograničavajući primeri modifikovane aminokiseline uključuju glikosilisanu aminokiselinu, sulfonovanu aminokiselinu, prenilisanu (npr., farnesilisanu, geranil-geranisilisanu) aminokiselinu, acetilisanu aminokiselinu, acilisanu aminokiselinu, PEGilisanu aminokiselinu, biotinilisanu aminokiselinu, karboksilisanu aminokiselinu, fosforilisanu aminokiselinu, i njima slične. Literatura je prepuna referenci koje su adekvatne kao vodič za stručnjaka u modifikovanju aminokiselina. Primeri protokola se nalaze u Walker (1998) Protein Protocols On CD-Rom, Humana Press, Totowa, NJ. Modifikovana aminokiselina može, na primer, biti izabrana iz grupe koju čine glikosilisana aminokiselina, PEGilisana aminokiselina, farnesilisana aminokiselina, acetilisana aminokiselina, biotinilisana aminokiselina, aminokiselina konjugovana na lipidnoj grupi, ili aminokiselina konjugovana na orgnski derivatizujućiem agensu.
[0253] Antitela i njihovi epitop-vezujući fragmenti, takođe mogu biti hemijski modifikovani kovalentnom konjugacijom na polimeru koji na primer povećava njihov cirkulišući poluživot. Primeri polimera, i postupci koji ih vezuju za peptide, su ilustrovani u na primer US 4,766,106; US 4,179,337; US 4,495,285 i US 4,609,546. Dodatni ilustrativni polimeri uključuju polioksietilisane polije i polietilenglikol (PEG) (npr., PEG molekulske mase od između oko 1,000 i oko 40,000, kao što je između oko 2,000 i oko 20,000, npr., oko 3,000-12,000 g/mol).
[0254] Antitela i njihovi epitop-vezujući fragmenti dalje mogu da se koriste u dijagnostičkom postupku ili kao ligand dijagnostičkog snimka.
[0255] U jednom načinu ostvarivanja, obezbeđena su antitela i epitop-vezujući fragmenti koji obuhvataju jednu ili više radioobeleženih aminokiselina. Radioobeleženo anti-tau antitelo može biti korišćeno i u dijagnostičke i u terapijske svrhe (konjugacija na radioobeleženim molekulima je druga moguća karakteristika). Neograničavajući primeri takvih oznaka uključuju, ali bez ograničenja na bizmut (<213>Bi), ugljenik (<11>C,<13>C,<14>C), hrom (<51>Cr), kobalt (<57>Co,<60>Co),bakar (<64>Cu), disprozijum (<165>Dy), erbijum (<169>Er), fluor (<13>F), gadolinijum (<153>Gd,<159>Gd), galijum (<68>Ga,<67>Ga), germanijum (<68>Ge), zlato (<198>Au), holmijum (<166>Ho), vodonik (<3>H), indijum (<111>In,<112>In,<113>In,<115>In), jod (<121>I,<123>I,<125>I,<131>I), iridijum (<192>Ir), železo (<59>Fe), kripton (<81m>Kr), lantanijum (<140>La), lutelijum (<177>Lu), mangan (<54>Mn), molibden (<99>Mo), azot (<13>N,<15>N), kiseonik (<15>O), paladijum (<103>Pd), fosfor (<32>P), kalijum (<42>K), praseodimijum (<142>Pr), prometijum (<149>Pm), renijum (<186>Re,<188>Re), rodijum (<105>Rh), rubidijum (<81>Rb,<82>Rb), rutenijum (<82>Ru,<97>Ru), samarijum (<153>Sm), skandijum (<47>Sc), selen (<75>Se), natrijum (<24>Na), stroncijum (<85>Sr,<89>Sr,<92>Sr), sumpor (<35>S), tehnecijum (<99>Tc), talijum (<201>TI), kalaj (<113>Sn,<117>Sn), ksenon (<133>Xe), iterbijum (<169>Yb,<175>Yb,<177>Yb), itrijum (<90>Y), cink (<65>Zn) i cirkonijum (<89>Zr). Cirkonijum (<89>Zr) je naročito zanimljiv. Postupci za pripremu radioobeleženih aminokiselina i povezanih peptidnih derivata su poznati u tehnici (videti na primer Junghans et al., in Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655-686 (2nd edition, Chafner i Longo, eds., Lippincott Raven (1996)) i US 4,681,581; US 4,735,210; US 5,101,827; US 5,102,990 (US RE35,500), US 5,648,471 i US 5,697,902. Na primer, radioizotop može biti konjugovan postupkom za hloramin T (Lindegren, S. et al. (1998) "Chloramine-T In High-Specific-Activity Radioiodination Of Antibodies Using N-Succinimidyl-3-(Trimethylstannyl)Benzoate As An Intermediate," Nucl. Med. Biol. 25(7):659-665; Kurth, M. et al. (1993) "Site-Specific Conjugation Of A Radioiodinated Phenethylamine Derivative To A Monoclonal Antibody Results In Increased Radioactivity Localization In Tumor," J. Med. Chem.36(9):1255-1261; Rea, D.W. et al. (1990) "Site-specifically radioiodinated
antibody for targeting tumors," Cancer Res.50(3 Suppl):857s-861s).
[0256] Ovo otkrivanje takođe obezbeđuje anti-tau antitela i njihove epitop-vezujuće fragmente koji su obeleženi na način koji može da se detektuje pomoću fluorescentne oznake (kao što je redak zemljani helat (npr., europijumhelat)), oznake fluoresentnog tipa (npr., fluorescein, fluoresceinizotiocijanat, 5-karboksifluorescein, 6-karboksifluorescein, dihlorotriazinilaminfluorescein), oznake rodaminskog tipa (npr., ALEXA FLUOR® 568 (Invitrogen), TAMRA® ili danzilhlorid), VIVOTAG 680 XL FLUOROCHROME™ (Perkin Elmer), fikoeritin; umbeliferon, lisamin; cijanin; fikoeritrin, Texas Red, BODIPY FL-SE® (Invitrogen) ili njegov analog, od kojih su svi pogodni za optičku detekciju. Hemiluminescentne oznake mogu biti upošljena (npr., luminol, luciferaza, luciferin, i aekvorin). Takva dijagnoza i detekcija takođe mogu da se postignu kuplovanjem dijagnostičkog molekula sa supstancama koje mogu da se detektuju uključujući, ali bez ograničenja na, razne enzime, enzime uključujući, ali bez ograničenja na, peroksidazu rena, alkalnu fosfatazu, beta-galktosidazu, ili acetilholinesterazu, ili na komplekse prostetičke grupe, kao što su, ali bez ograničenja na, streptavidin/biotin i avidin/biotin.
[0257] Hemiluminescentne oznake mogu biti upošljene (npr., luminol, luciferaza, luciferin, i aekvorin). Takve dijagnoza i detekcija takođe mogu da se postignu kuplovanjem dijagnostičkog molekula sa supstancama koje mogu da se detektuju uključujući, ali bez ograničenja na, razne enzime, enzime uključujući, ali bez ograničenja na, peroksidazu rena, alalkalnu fosfatazu, beta-galaktozidazu, ili acetilholinesterazu, ili za komplekse prostetičke grupe kao što su, ali bez ograničenja na, streptavidin/biotin i avidin/biotin. Paramagnetne oznake takođe mogu biti upošljene, i poželjno se detektuju upotrebom pozitronske emisione tomografije (PET) ili jednofotonske emisione kompjuterske tomografije (SPECT). Takve paramagnetne oznake uključuju, ali bez ograničenja na jedinjenja koja sadrže paramagnetne jone aluminijuma (Al), barijuma (Ba), kalcijuma (Ca), cerijuma (Ce), fisprozijum (Dy), erbijuma (Er), europijuma (Eu), gandolinijuma (Gd), holmijuma (Ho), iridijuma (Ir), litijuma (Li), magnezijuma (Mg), mangana (Mn), molibdenuma (M), neodimijuma (Nd), osmijuma (Os), kiseonika (O), paladijuma (Pd), platine (Pt), rodijuma (Rh), rutenijuma (Ru), samarijuma (Sm), sodijuma (Na), stroncijuma (Sr), terbijuma (Tb), tulijuma (Tm), kalaja (Sn), titanijuma (Ti), tungstena (W), i cirkonijuma (Zi), i određenije, Co<+2>, CR<+2>, Cr<+3>, Cu<+2>, Fe<+2>, Fe<+3>, Ga<+3>, Mn<+3>, Ni<+2>, Ti<+3>, V<+3>, i V<+4>, pozitron emitujućih metala upotrebom raznih pozitronskih emisionih tomografija, i neradioaktivnih praramagnetnih metalnih jona.
[0258] Tako u jednom načinu ostvarivanja anti-tau antitelo ili njegov tau-vezujući fragment mogu biti obeleženi sa fluorescentnom oznakom, hemiluminescentom oznakom, paramagnetnom oznakom, rasdioizotopnom oznakom ili oznakom enzima. Označeno antitelo ili fragment mogu biti korišćeni za detektovanje ili merenje prisustva ili količine pomenutog tau u mozgu subjekta. Ovaj postupak može da obuhvati detekciju ili merenje in vivo snimanja anti-tau antitela ili tau-vezujućeg fragmenta vezanog za takav tau.
[0259] Ovde je dalje otkriven ekspresioni vektor koji kodira jedan ili više polipeptidnih lanaca antitela ovog otkrivanja ili njegov tau-vezujući fragment. Takvi ekspresioni vektori mogu biti korišćeni za rekombinantnu proizvodnju antitela ili njihovih epitop-vezujućih fragmenata.
[0260] Ekspresioni vektor može biti bilo koji pogodan DNK ili RNK vektor, uključujući hromozomalne, nehromozomalne, i sintetičke vektore nukleinske kiseline (sekvenca nukleinske kiseline koja obuhvata pogodan skup ekspresionih kontrolnih elemenata). Primeri takvih vektora uključuju derivate SV40, bakterijske plazmide, fag DNK, bakulovirus, plazmide kvasaca, vektore dobijene od kombinacija plazmida i faga DNK, i virusnih vektora nukleinske kiseline (RNK ili DNK). U jednom načinu ostvarivanja, anti-tau antitelo-koje kodira nukleinsku kiselinu je obuhvaćeno u golom DNK ili RNK vektoru, uključujući, na primer, element linearne ekspresije (kako je opisano u, na primer, Sykes i Johnston, Nat Biotech 12, 355-59 (1997)), kompaktni vektor nukleinske kiseline (kako je opisano u na primer US 6,077,835 i/ili WO 00/70087), plazmidni vektor kao što je pBR322, pUC 19/18, ili pUC 118/119, "muva" vektor nukleinske kiseline minimalne veličine (kako je opisano u, na primer, Schakowski et al., Mol Ther 3, 793-800 (2001)), ili kao nataloženi konstrukt vektora nukleinske kiseline, kao što jeCaPO4-nataloženi konstrukt (kako je opisano u, na primer, WO 00/46147, Benvenisty and Reshef, PNAS USA 83, 9551-55 (1986), Wigler et al., Cell 14, 725 (1978), and Coraro and Pearson, Somatic Cell Genetics 2, 603 (1981)). Takvi vektori nukleinske kiseline i njihova upotreba su dobro poznati u tehnici (videti na primer US 5,589,466 i US 5,973,972).
[0261] U jednom načinu ostvarivanja, taj vektor je pogodan za ekspresiju anti-tau antitela ili njihovih epitop-vezujućih fragmenata u bakterijskoj ćeliji. Primeri takvih vektora uključuju ekspresione vektore kao što je BlueScript (Stratagene), pIN vektore (Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem.264, 5503-5509 (1989), pET vektore (Novagen, Madison, WI), i njima slične.
[0262] Ekspresioni vektor takođe može ili alternativno biti vektor pogodan za ekspresiju u sistemu kvasaca. Bilo koji vektor pogodan za ekspresiju u sistemu kvasaca može biti upošljen. Pogodni vektori uključuju, na primer, vektore koji obuhvataju konstitutivne ili inducibilne promotere kao što je alfa faktor, alkoholna oksidaza i PGH (pregledano u: F. Ausubel et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley InterScience New York (1987), Grant et al., Methods in Enzymol 153, 516-544 (1987), Mattanovich, D. et al. Methods Mol. Biol.824, 329-358 (2012), Celik, E. et al. Biotechnol. Adv.30(5), 1108-1118 (2012), Li, P. et al. Appl. Biochem. Biotechnol.142(2), 105-124 (2007), Boer, E. et al. Appl. Microbiol. Biotechnol.77(3), 513-523 (2007), van der Vaart, J.M. Methods Mol. Biol.
178, 359-366 (2002), i Holliger, P. Methods Mol. Biol.178, 349-357 (2002)).
[0263] U ekspresionom vektoru, anti-tau antitelo-koje kodira nukleinske kiseline može da obuhvata ili da bude povezano sa bilo kojim pogodnim promoterom, pojačivačem, i drugim elementima za olakšavanje ekspresije. Primeri takvih elemenata uključuju jake promotere ekspresije (npr., humani CMV IE promoter/pojačivač kao i RSV, SV40, SL3-3, MMTV, i HIV LTR promotere), efikasne poli (A) terminacione sekvence, poreklo replikacije za plazmidni proizvod u E. coli, gen rezistentan na antibiotik kao marker selekcije, i/ili prikladno mesto za kloniranje (npr., poliveznik). Nukleinske kiseline takođe mogu da obuhvataju inducibilan promoter nasuprot konstitutivnog promotera kao što je CMV IE (stručnjak će reorganizovati da ti pojmovi zapravo opisuju stepen ekspresije gena u određenim uslovima).
[0264] Ovde je dalje otkrivena rekombinantna eukariotična ili prokariotična ćelija domaćina, kao što je transfektom, koji proizvodi antitelo ili njegov epitop-vezujući fragment kako je ovde definisano ili bispecifičan molekul kako je ovde definisano. Primeri ćelija domaćina uključuju kvasce, bakterije, ćelije sisara, kao što su CHO ili HEK ćelije. Na primer, u jednom načinu ostvarivanja, ovo otkrivanje obezbeđuje ćeliju koja obuhvata nukleinsku kiselinu stabilno integrisanu u celularni genom koji obuhvata sekvencu koja kodira za ekspresiju anti-tau antitela ili njegovog epitop-vezujućeg fragmenta. U drugom načinu ostvarivanja, ovo otkrivanje obezbeđuje ćeliju koja obuhvata neintegrisanu nukleinsku kiselinu, kao što je plazmid, kozmid, fagmid, ili linearni ekspresioni element, koji obuhvata sekvencu koja kodira za ekspresiju anti-tau antitela ili njegovog epitop-vezujućeg fragmenta.
[0265] Ovde je dalje otkriven postupak za proizvodnju anti-tau antitela, pri čemu pomenuti postupak obuhvata faze a) kultivisanja hibridoma ili ćelije domaćina kako je ovde prethodno opisano, i b) prečišćavanja antitela iz podloga za kulturu.
[0266] Ovde je otkriven preparat koji obuhvata anti-tau antitelo kako je ovde definisano, i koje suštinski ne sadrži antitela koja se prirodno javljaju koja ne mogu ni da se vezuju za tau niti da materijalno izmene anti-tau funkcionalnost preparata. Samim tim takav preparat ne obuhvata serum koji se prirodno javlja, ili prečišćen derivat takvog seruma, koji obuhvata mešavinu anti-tau antitela i drugog antitela koje ne menja funkcionalnost anti-tau antitela tog preparata, pri čemu je takva funkcionalnost:
(i) suštinska nemogućnost vezivanja za nefosforilisani tau;
(ii) suštinska nemogućnost za vezivanje za tau koji je fosforilisan na S404 a nije fosforilisan na S396; (iii) mogućnost vezivanja za tau fosforilisan na S396;
(iv) mogućnost vezivanja za tau fosforilisan i na S396 i na S404;
1
(v) mogućnost da se selektivno diskriminiše između fosforilisanih tau ostataka S396 i S404 tako da je suštinski nemoguće vezivanje za fosforilisan 404 ostatak;
(vi) mogućnost vezivanja za hiperfosforilisani tau iz mozgova ljudi sa Alchajmerovom bolešću; (vii) mogućnost da se diskriminiše između pataloškog i nepatološkog humanog tau proteina; i/ili (viii) sposobnost, kada se koristi sa ovde opisanim imunodeplecionim rTg4510 ekstraktima od transgenih miševa, da se specifično smanje hiperfosforilisane tau 64kDa i 70kDa trake za najmanje 90%, pri čemu se tau traka 55 kDa ne smanjuje za više od 10% ili sposobnost, kada se koriste kako je ovde opisano sa ekstraktima iz ljudskih post-mortem mozgova sa AB, da specifično smanje S396 fosforilisane hiperfosforilisane tau trake za najmanje 90%, pri čemu se nefosforilisane tau trake ne smanjuju za više od 10%.
[0267] Ovo otkrivanje se određenije odnosi na preparate takvog anti-tau antitela sa strukturnom promenom u svojoj aminokiselinskoj sekvenci (u bilo kojem od svojih CDR-ova, varijabilnih domena, ostataka okvira i/ili konstantnih domena) koja se odnosi na strukturu anti-tau antitela koje se prirodno javlja, pri čemu pomenuta strukturna promena uzrokuje anti-tau antitelo koje ispoljava značajno izmenjenu funkcionalnost (tj., više od 20% razlike, više od 40% razlike, više od 60% razlike, više od 80% razlike, više od 100% razlike, više od 150% razlike, više od 2-struke razlike, više od 4-struke razlike, više od 5-struke razlike, ili više od 10-struke razlike u funkcionalnosti) u odnosu na funkcionalnost koju ispoljava pomenuto anti-tau antitelo koje se prirodno javlja; pri čemu je takva funkcionalnost:
(i) suštinska nemogućnost vezivanja za nefosforilisani tau;
(ii) suštinska nemogućnost za vezivanje za tau koji je fosforilisan na S404 a nije fosforilisan na S396; (iii) mogućnost vezivanja za tau fosforilisan na S396;
(iv) mogućnost vezivanja za tau fosforilisan i na S396 i na S404;
(v) mogućnost da se selektivno diskriminiše između fosforilisanih tau ostataka S396 i S404 tako da je suštinski nemoguće vezivanje za fosforilisan 404 ostatak;
(vi) mogućnost vezivanja za hiperfosforilisani tau iz mozgova ljudi sa Alchajmerovom bolešću; (vii) mogućnost da se diskriminiše između pataloškog i nepatološkog humanog tau proteina; i/or (viii) sposobnost, kada se koristi sa ovde opisanim imunodeplecionim rTg4510 ekstraktima od transgenih miševa, da se specifično smanji hiperfosforilisani tau 64kDa i 70kDa trake za najmanje 90%, pri čemu se tau traka 55 kDa ne smanjuje za više od 10%; ili sposobnost, kada se upotrebljava kao ovde opisani ekstrakti iz humanih AB mozgova post-mortem da specifično smanjuje S396 fosforilisane hiperfosforilisane tau trake za najmanje 90%, pri čemu se nefosforilisane tau trake ne smanjuju za više od 10%.
[0268] Pojam "suštinski ne sadrži" antitela koja se prirodno javljaju se odnosi na potpuno odsustvo takvih antitela koja se prirodno javljaju u takvim preparatima, ili inkluziju koncentracije takvih antitela koja se prirodno javljaju u takvim preparatima koja materijalno ne utiču na tau-vezujuća svojstva
2
preparata. Za antitelo se kaže da je "izolovano" ukoliko nema svoj par koji se prirodno javlja ili je odvojeno ili prečišćeno od komponenata koje ga prirodno prate.
[0269] Pojam "antitela koja se prirodno javljaju," kako se odnosi na takve preparate, se odnosi na antitela (uključujući autoantitela koja se prirodno javljaju) dobijena unutar živih ljudi ili drugih životinja, kao prirodna posledica funkcionisanja njihovih imunih sistema.
[0270] Samim tim, preparati ne isključuju, i zaista izričito obuhvataju, takve preparate koji sadrže antitau antitelo i s namerom dodato dodatno antitelo koje može da se vezuje za epitop koji tau ne poseduje. Takvi preparati naročito uključuju njihove načine ostvarivanja pri čemu taj preparat ispoljava pojačanu efikasnost u tretiranju Alchajmerove bolesti (AB), bolesti argirofilnih zrnaca (AGD), progresivne supranuklearne palsije (PSP), i kortikobazalne degeneracije (CBD). Dalje, ovo otkrivanje je usmereno na preparate koji sadrže anti-tau antitelo antitela, ili njihove epitop-vezujuće fragmente, predviđene za upotrebu u lečenju psihoze, određenije psihoze usled AB ili psihoze kod pacijenata sa AB, apatije usled AB ili apatije kod pacijenata sa AB, i psihijatrijske simptome pacijenata sa demencijom sa levijevim telima. Dalje, preparati sadrže anti-tau antitelo antitela, ili njihove epitop-vezujuće fragmente, koji mogu da se koriste u lečenju moždanog udara, oporavka od moždanog udara, neurodegeneracije povezane sa Parkinsonovom bolešću.
[0271] Čak u daljem aspektu, ovo otkrivanje se odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja obuhvata:
(i) tau antitelo, ili njegov epitop-vezujući fragment, i kako je ovde definisan, ili preparat, budući da je pojam ovde definisan, kao takav koji obuhvata takvo jedno anti-tau antitelo ili njegov epitopvezujući fragment; i
(ii) farmaceutski prihvatljiv nosač.
[0272] Farmaceutske kompozicije mogu biti formulisane sa farmaceutski prihvatljivim nosačima ili razblaživačima kao i bilo kojim drugim poznatim adjuvansima i ekscipijensima u skladu sa konvencionalnim tehnikama kao što su one koje su otkrivene u Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22nd Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 2013.
[0273] Farmaceutski prihvatljivi nosači ili razblaživači kao i bilo koji drug poznati adjuvansi i ekscipijensi bi trebalo da budu pogodni za odabrano jedinjenje i odabran način davanja. Pogodnost za nosače i druge komponente farmaceutskih kompozicija je određena na osnovu nedostatka značajnog negativnog uticaja na željena biološka svojstva odabranog jedinjenje ili farmaceutske kompozicije (npr., manje od suštinskog uticaja (10% ili manje relativne inhibicije, 5% ili manje relativne inhibicije, itd.)) na vezivanje epitopa.
[0274] Farmaceutska kompozicija takođe može da uključuje razblaživače punioce, soli, pufere, deterdžente (npr., nejonski deterdžent, kao što je Tween-20 ili Tween-80), stabilizatore (npr., šećere ili aminokiseline koje ne sadrže proteine), konzervanse, fiksatore tkiva, solubilizatore, i/ili druge materijale pogodne za uključivanje u farmaceutsku kompoziciju. Razblaživač je odabran tako da ne utiče na biološko dejstvo kombinacije. Primeri takvih razblaživača su destilovana voda, fiziološki fosfatom puferisan slani rastvor, Ringerovi rastvori, rastvor dekstroze, i Hankov rastvor. Pored toga, farmaceutska kompozicija ili formulacija takođe može da uključuje druge nosače, ili netoksične, neterapijske, neimunogene stabilizatore i njima slične. Kompozicije takođe mogu da uključuju velike, makromolekule koji se polako metabolizuju, kao što su proteini, polisaharidi kao što je hitozan, polilaktične kiseline, poliglikolne kiseline i kopolimeri (npr., lateksom funkcionisana sefaroza, agaroza, celuloza, i njima slične), polimerne aminokiseline, aminokiselinski kopolimeri, i lipidni agregati (npr., uljane kapljice ili lipozomi).
[0275] Nivoi stvarnog doziranja aktivnih sastojaka u farmaceutskim kompozicijama mogu da se razlikuju kako bi se dobila količina aktivnog sastojka koja je efikasna da bi se postigao željeni terapijski odgovor za određenog pacijenta, kompoziciju, i način davanja. Odabrani dozni nivo će zavisiti od raznih farmakokinetičkih faktora uključujući dejstvo određenih upošljenih kompozicija ovog pronalaska, ili njihovog amida, načina davanja, vremena davanja, brzine izlučivanja određenog jedinjenja koje je upošljeno, trajanja lečenja, drugih lekova, jedinjenja i/ili materijala korišćenih u kombinaciji sa određenim upošljenim kompozicijama, uzrasta, pola, mase, stanja, opšteg zdravlja i prethodne medicinske istorije pacijenta koji se leči, i sličnih faktora dobro poznatih u medicinskim naukama.
[0276] Farmaceutska kompozicija može da se daje bilo kojim pogodnim putem i načinom davanja, uključujući: parenteralna, topikalna, oralna ili intranazalna sredstva profilaktičkog i/ili terapijskog lečenja. U jednom načinu ostvarivanja, farmaceutska kompozicija se daje parenteralno. Fraze "parenteralno davanje" i "dat parenteralno" kako se ovde upotrebljavaju označavaju načine davanja a da različite od enteralnog i topikalnog davanja, obično ubrizgavanjem, i uključuju epidermalnu, intravensku, intramuskularnu, intraarterijalnu, intratekalnu, intrakapsularnu, intraorbitalnu, intrakardijalnu, intradermalnu, intraperitonealnu, intratendinoznu, transtrahealnu, subkutanu, subkutikularnu, intraartikularnu, subkapsularnu, subarahnoidnu, intraspinalnu, intrakranijalnu, intratorkalnu, epiduralnu i intrasternalnu injekciju i infuziju.
[0277] Dodatni pogodni načini davanja jedinjenja in vivo i in vitro su dobro poznati u tehnici i stručnjaci mogu da ih prepoznaju.
[0278] U jednom načinu ostvarivanja farmaceutska kompozicija se daje intravenskom ili subkutanom injekcijom ili infuzijom.
[0279] Farmaceutski prihvatljivi nosači uključuju bilo koji i sve pogodne rastvarače, podloge za disperziju, omotače, antibakterijske i antifungalne agense, izotonične agense, antioksidanse i agense za odlaganje apsorpcije, i njima slične koji su fiziološki kompatibilni sa jedinjenjem ovog pronalaska.
[0280] Primeri pogodnih vodenih i nevodenih nosača koji mogu da se koriste u farmaceutskim kompozicijama uključuju vodu, slani rastvor, fosfatom puferisan slani rastvor, etanol, dekstrozu, poliole (kao što je glicerol, propilenglikol, polietilenglikol, i njima slične), i njihove pogodne mešavine , biljna
4
ulja, kao što je maslinovo ulje, kukuruzno ulje, ulje kikirikija, ulje semena pamuka, i ulje od susama,, rastvore koloidalne karboksimetilceluloze, tragakant gumu i organske estre koji mogu da se ubrizgaju, kao što su etiloleat, i/ili razni puferi. Drugi nosači su dobro poznati u farmaceutskoj oblasti.
[0281] Farmaceutski prihvatljivi nosači uključuju strerilne vodene rastvore ili disperzije i sterilne praškove za improvizovanu pripremu sterilnih injektabilnih rastvora ili disperzije. Upotreba takvih podloga i agenasa za farmaceutski aktivne supstance je poznata u tehnici. Osim u slučaju da je bilo koja dosadašnja podloga ili agens nekompatibilan sa aktivnim jedinjenje, razmatra se njegova upotreba u farmaceutskim kompozicijama.
[0282] Pravilna fluidnost može biti održavana, na primer, upotrebom materijala za oblaganje, kao što je lecitin, održavanjem tražene veličine čestica u slučaju disperzija, i upotrebom surfaktanata.
[0283] Farmaceutske kompozicije takođe mogu da obuhvataju farmaceutski prihvatljive antioksidanse na primer (1) antioksidanse rastvorljive u vodi, kao što je askorbinska kiselina, cisteinhidrohlorid, natrijumbisulfat, natrijum-metabisulfit, natrijumsulfit, i njima slični; (2) antioksidansi rastvorljivi u ulju, kao što je askorbilpalmitat, butilisanihidroksianizol (BHA), butilisanihidroksitoluen (BHT), lecitin, propilgalat, alfa-tokoferol, i njima slični; i (3) metalni helatni agensi, kao što je limunska kiselina, etilenediamin tetra-sirćetna kiselina (EDTA), sorbitol, tartarinska kiselina, fosforna kiselina, i njima slične.
[0284] Farmaceutske kompozicije takođe mogu da obuhvataju agense za izotoničnost, kao što su šećeri, polialkoholi, kao što su manitol, sorbitol, glicerol ili natrijumhlorid u kompoticijama.
[0285] Farmaceutske kompozicije takođe mogu da sadrže jedan ili više adjuvanasa odgovarajućih za izabran način davanja kao što su konzervansi, sredstva za vlaženje, sredstva za emulgaciju, sredstva za dispergovanje, konzervansi ili puferi, koji mogu da pojačaju rok trajanja ili efikasnost farmaceutske kompozicije. Ta jedinjenja mogu biti pripremljena sa nosačima koji će zaštiti jedinjenje od brzog otpuštanja, kao što je formulacija sa kontrolisanim otpuštanjem, uključujući implante, transdermalne flastere, i mikrokapsulirane sisteme isporuke. Takvi nosači mogu da uključuju želatin, glicerilmonostearat, glicerildistearat, biorazgradive, biokompatibilne polimere kao što je etilenvinilacetat, polianhidriri, poliglikolna kiselina, kolagen, poliortoestri, i polilaktična kiselina sama ili sa voskom, ili druge materijale poznate u tehnici. Postupci za pripremu takvih formulacija su generalno poznati stručnjaku. Videti, npr., Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.
[0286] U jednom načinu ostvarivanja, jedinjenja mogu biti formulisana tako da osiguraju pravilnu raspodelu in vivo. Farmaceutski prihvatljiv nosači za parenteralno davanje uključuju strerilne vodene rastvore ili disperzije i sterilne praškove za improvizovanu pripremu sterilnijih injektabilnih rastvora ili disperzije. Upotreba takvih podloga i agenasa za farmaceutski aktivne supstance je poznata u tehnici. Osim u slučaju da je bilo koja dosadašnja podloga ili agens nekompatibilan sa aktivnim jedinjenje, razmatra se njegova upotreba u farmaceutskim kompozicijama. Dodatna aktivna jedinjenja takođe mogu da budu inkorporirana u kompozicije.
[0287] Farmaceutska kompozicije za ubrizgavanje obično moraju da budu sterilne i stabilne u uslovima proizvodnje i čuvanja. Kompozicija može biti formulisana sa rastvorom, mikro-emulzijon, lipozomom, ili drugim uređenom strukturom pogodnom za visoku koncentraciju leka. Nosač može biti vodeni ili nevodeni rastvarač ili podloga za disperziju koja sadrži na primer vodu, etanol, polije (kao što je glicerol, propilenglikol, polietilenglikol, i njima slični), i njihove pogodne mešavine, biljna ulja, kao što je maslinovo ulje, injektabilni organski estri, kao što je etiloleat. Ispravna fluidnost može da se održava, na primer, upotrebom omotača kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzije upotrebom surfaktanata. U mnogim slučajevima, biće poželjno da uključuju izotonične agense, na primer, šećere, polialkohole, kao što je glicerol, manitol, sorbitol, ili natrijumhlorid u kompoziciji.
Produžena apsorpcija injektabilnih kompozicija može biti postignuta uključivanjem u kompoziciju agensa koji odlaže apsorpciju antitela, na primer, monostearatnih soli i želatina. Sterilni injektabilni rastvori mogu biti pripremljeni inkorporisanjem aktivnog jedinjenje u traženu količinu u odgovarajućem rastvaraču sa jednim ili kombinacijom sastojaka npr. kako je prethodno numerisano, po potrebi, nakon čega sledi mikrofiltracija. Generalno, disperzije su pripremljene inkorporisanjem aktivnog jedinjenja u sterilni nosilac koji sadrži podlogu bazne disperzije i druge potrebne sastojke npr. od gore numerisanih. U slučaju sterilnih praškova za pripremu sterilnih injektabilnih rastvora, primeri postupaka pripreme su sušenje u vakuumu i sušenje zamrzavanjem (liofilizacija) koji obezbeđuju prašak aktivnog sastojka plus bilo koji željeni sastojak iz njegovog prethodno sterilno filtriranog rastvora.
[0288] Sterilni injektabilni rastvori mogu biti pripremljeni inkorporisanjem aktivnog jedinjenja u potrebnu količinu u odgovarajućem rastvaraču sa jednim ili kombinacijom gore numerisanih sastojaka, po potrebi, nakon čega je usledila mikrofiltracija sterilizacije. Generalno, disperzije su pripremljene inkorporisanjem aktivnog jedinjenja u sterilni nosilac koji sadrži podlogu bazne disperzije i potrebne druge sastojke od gore numerisanih. U slučaju sterilnih praškova za pripremu sterilnih injektabilnih rastvora, primeri postupaka pripreme su sušenje vakuumon i sušenje zamrzavanjem (liofilizacija) koji obezbeđuju prašak aktivnog sastojka plus bilo koji dodatni željeni sastojak iz njegovog prethodno sterilno filtriranog rastvora.
[0289] Režimi doziranja u gore pomenutim postupcima lečenja i ovde opisane upotrebe su podešeni tako da obezbede optimalni željeni odgovor (npr., terapijski odgovor). Na primer, pojedinačni bolus može da se daje, nekoliko podeljenih doza mogu da se daju tokom vremena ili ta doza može proporcionalno da se smanji ili poveća u skladu sa potrebama terapijske situacije. Parenteralne kompozicije mogu biti formulisane u obliku dozne jedinice za olakšavanje davanja i uniformnosti doziranja. Oblik dozne jedinice kako se ovde upotrebljava odnosi se na fizički diskretne jedinice pogodne za jedinična doziranja za subjekata kojeg je potrebno lečiti; svaka jedinica sadrži prethodno određenu količinu aktivnog jedinjenja izračunatu tako da se proizvede željeni terapijski efekat u vezi sa potrebnim farmaceutskim nosačem. Specifikacija za dozne jedinične oblike je određena i direktno zavisi od (a) jedinstvenih karakteristika aktivnog jedinjenja i određenog terapijskog efekta koji je potrebno da bude postignut, i (b) ograničenja svojstvenih pravljenju jedinjenja kao što je aktivno jedinjenje za lečenje osetljivosti kod pojedinaca.
[0290] Efikasne doze i dozni režimi za antitela ili njihove epitop-vezujuće fragmente zavise od bolesti ili stanja koje se leči i mogu da ih odrede stručnjaci. Bilo kog dana kada je doza podaci, ta doza može da se razlikuje od oko 0.0001 do oko 100 mg/kg, i uobičajenije od oko 0.01 do oko 5 mg/kg, telesne mase domaćina. Na primer, doze mogu biti 1 mg/kg telesne mase ili 10 mg/kg telesne mase ili u opsegu od 1-10 mg/kg telesne mase. Primeri doza samim tim uključuju: od oko 0.1 do oko 10 mg/kg/telesne mase, od oko 0.1 do oko 5 mg/kg/telesne mase, od oko 0.1 do oko 2 mg/kg/telesne mase, od oko 0.1 do oko 1 mg/kg/telesne mase, na primer oko 0.15 mg/kg/telesne mase, oko 0.2 mg/kg/telesne mase, oko 0.5 mg/kg/telesne mase, oko 1 mg/kg/telesne mase, oko 1.5 mg/kg/telesne mase, oko 2 mg/kg/telesne mase, oko 5 mg/kg/telesne mase, ili oko 10 mg/kg/telesne mase.
[0291] Lekar koji je stručnjak iz oblasti može brzo da odredi i prepiše efikasnu količinu potrebne farmaceutske kompozicije. Na primer, lekar bi mogao da započne davanje doza antitela ili njegovog epitop-vezujućeg fragmenta upošljenog u farmaceutskoj kompoziciji na nivoima koji su niži od potrebnog kako bi se postigao željeni terapijski efekat a vremenom povećala doza do postizanja željenog efekta. Generalno, pogodna dnevna doza kompozicije će biti ona količina jedinjenja koja predstavlja najnižu efikasnu dozu za proizvodnju terapijskog efekta. Takva efikasna doza će generalno zavisiti od prethodno opisanih faktora. Davanje na primer može biti intravensko, intramuskularno, intraperitonealno, ili subkutano. Po želji, efikasna dnevna doza farmaceutske kompozicije može da se daje u dve, tri, četiri, pet, šest ili više pod-doza koje se daju odvojeno u odgovarajućim intervalima tokom dana, opciono, u jediničnim doznim oblicima. Dok je za jedinjenje moguće da se daje samo, poželjno je da se to jedinjenje daje u obliku gore opisane farmaceutske kompozicije.
[0292] Označena antitela ili njihovi epitop-vezujući fragmenti mogu da se koriste u dijagnostičke svrhe da bi se detektovale, dijagnostikovale, ili pratile bolesti ili poremećaji. Ovo otkrivanje obezbeđuje za detekciju ili dijagnozu neurodegenerativne ili kognitivne bolesti ili poremećaja, uključujući ali bez ograničenja na Alchajmerovu, bolest argirofilnih zrnaca (AGD), progresivnu supranuklearnu palsiju (PSP), i kortikobazalnu degeneraciju (CBD), koja obuhvata: (a) ispitivanje postojanja piroglutamirinih Aβ fragmenata u ćelijama ili uzorcima tkiva subjekta upotrebom jednog ili više antitela koja se specifično vezuju za tau; i (b) poređenje nivoa antigena sa kontrolnim nivoom, npr. nivoima u uzorcima normalnih tkiva, pri čemu je povećanje ispitivanog nivoa antigena u odnosu na kontrolni nivo antigena pokazatelj bolesti ili poremećaja, ili je pokazatelj ozbiljnosti bolesti ili poremećaja.
[0293] Antitela ili njihovi epitop-vezujući fragmenti mogu da se koriste kako bi se ispitao tau ili fragmenti tau u biološkom uzorku upotrebom imunohistohemijskih postupaka koji su dobro poznati u tehnici. Drugi postupci bazirani na antitelima koji su korisni za detektovanje proteina uključuju imunološka ispitivanja kao što imunološko ispitivanje povezano sa enzimom (ELISA) i radioimunološko ispitivanje (RIA) i ispitivanje bazirano na platformi za otkrivanje mezoskala (MSD). Odgovarajuće oznake antitela mogu da se koriste u takvim kompletima i postupcima, a oznake poznate u tehnici uključuju oznake enzima, kao što je alkalna fosfataza i oksidaza glukoze; oznake radioizotopa, kao što su jod (<125>I,<131>I), ugljenik (<14>C), sumpor (<35>S), tricijum (<3>H), indijum (<121>In), i tehnecijum (<99m>Tc); i luminescentne oznake, kao što su luminol i luciferaza; i fluorescentne oznake, kao što su fluorescein i rodamin.
[0294] Prisustvo označenih anti-tau antitela ili njihovih tau-vezujućih fragmenata može biti detektovano in vivo radi dijagnostike. U jednom načinu ostvarivanja, dijagnoza obuhvata: a) davanje subjektu efikasne količine označenog molekula; b) čekanje vremenskog intervala nakon davanja kako bi se omogućilo da se označeni molekul koncentriše na mestima (ukoliko postoje) Aβ deponovanja i kako bi se omogućilo nevezanom označenom molekulu da bude očišćen do pozadinskog nivoa; c) određivanje pozadinskog nivoa; i d) detektovanje označenog molekula u subjektu, tako da detekcija označenog molekula iznad pozadinskog nivoa predstavlja pokazatelj da je subjekat ima bolest ili poremećaj, ili predstavlja pokazatelj ozbiljnosti bolesti ili poremećaja. U skladu sa takvim načinom ostvarivanja, molekul je označen sa grupom za snimanje koja je pogodna za detekciju pomoću određenog sistema za snimanje koji je poznat stručnjaku. Pozadinski nivoi mogu biti određeni raznim postupcima u poznatim u tehnici, uključujući poređenje količine označenog antitela detektovanog do standardne vrednosti koja je prethodno određena za određeni sistem snimanja. Postupci i sistemi koji mogu da se koriste u dijagnostičkim postupcima uključuju, ali bez ograničenja na, kompjuterizovanu tomografiju (CT), detaljan pregled celog tela kao što je pozitronska emisiona tomografija (PET), snimanje magnetne rezonance (MRI), i sonografija.
[0295] U daljem aspektu, ovo otkrivanje obezbeđuje monoklonalno antitelo, ili njegov epitop-vezujući fragment, kako je ovde definisano za upotrebu u terapiji.
[0296] U daljem aspektu, ovo otkrivanje obezbeđuje monoklonalno antitelo, ili njegov epitop-vezujući fragment, kako je ovde definisano za upotrebu u tretiranju, dijagnostikovanju ili snimanju tauopatija.
[0297] U daljem aspektu, ovo otkrivanje obezbeđuje monoklonalno antitelo, ili njegov epitop-vezujući fragment, kako je ovde definisano za upotrebu u tretiranju Alchajmerove bolesti, bolesti argirofilnih zrnaca (AGD), progresivne supranuklearne palsije (PSP), i kortikobazalne degeneracije (CBD).
[0298] U daljem aspektu, ovo otkrivanje obezbeđuje monoklonalno antitelo, ili njegov epitop-vezujući fragment, kako je ovde definisano za upotrebu u proizvodnji medikamenta za lečenje, dijagnostikovanje ili snimanje tauopatije.
[0299] Poželjno, medikament je za lečenje Alchajmerove bolesti (AB), bolesti argirofilnih zrnaca (AGD), progresivne supranuklearne palsije (PSP), i kortikobazalne degeneracije (CBD) najpoželjnije Alchajmerove bolesti (AB). Ovaj medikament je takođe poželjan za lečenje psihoze, određenije psihoze usled AB ili psihoze kod pacijenata sa AB, apatije usled AB ili apatije kod pacijenata sa AB, i psihijatrijskih simptoma pacijenata sa demencijom sa levijevim telima.
[0300] U daljem aspektu, ovo otkrivanje obezbeđuje postupak lečenja, dijagnostikovanja ili snimanja Alchajmerove bolesti ili drugih tauopatija kod subjekta, pri čemu pomenuti postupak obuhvata davanje monoklonalnog antitela medikamenta ili njegovog epitop-vezujućeg fragmenta kako je ovde definisano, pomenutom subjektu u efikasnoj količini.
[0301] U poželjnom načinu ostvarivanja, lečenje je hronično, poželjno najmanje 2 nedelje, kao što je najmanje 1 mesec, 6, meseci, 1 godinu ili više.
[0302] U daljem aspektu, ovo otkrivanje obezbeđuje komplet koji obuhvata antitelo, ili njegov fragment, kako je ovde definisano za upotrebu u terapiji.
PRIMERI
Primer 1: Imunizacija miševa sa tau fosfopeptidima 396/404
[0303] C56/BL6 i FVB miševi su imunizovani sa 10 µg P30 kojnugovanog fosforilisanog tau peptida 386-408 (pS396/pS404) (SEQ ID NO:2) formulisanog u TiterMax adjuvansu.
[0304] Miševi (C56/BL6 i FVB vrste, ženke i mužjaci. Miševi starosti 2-do 3-meseca su imunizovani peptidnim epitopom P30 konjugovanim fosforilisanim tau 386-408.
[0305] Imunogeni P30 konjugovani fosforilisani tau 386-408 (pS396/pS404) peptid je formulisan u TiterMax (400 µg/ml peptid pomešan u odnosu 1:1 vol:vol) u skladu sa protokolom TiterMax/prodavca i miševima je subkutano ubrizgano 20 µg peptida (100 µl) antigena. Kontrolnim miševima je samo ubrizgan adjuvans. Svi miševi imunizovani peptidom su pojačani sa 0.5 µg peptida/Titermax (10 µg/ml peptida formulisanog kako je prethodno opisano i podaci im je injekcija) na mesečnom nivou. Ti miševi su konačno pojačani sa P30 konjugovanog fosforilisanog tau 386-408 (pS396/pS404) bez Titermax 3 dana pre sakupljanja splenocita nakon čega je usledila fuzija splenocita sa SP-2 ćelijama. Generisani primarni hibridomi su odabrani za ponovno kloniranje nakon ispoljavanja pozitivnog vezivanja za fosforilisani tau 386-408 (pS396/pS404) kako je detektovano ELISA-om, i ispoljavanja poželjnog dejstva veziivanja za S1 i P3 antigene iz AB i TG4510 moždanog lizata (opisanog u nastavku u primeru 2B). Takvo vezivanje je upoređeno sa dejstvom vezivanja takvih antitela za moždani lizat od kontrola, pomoću dot blotova i ELISA ili MSD ploča obloženih moždanim lizatom.
Primer 2A: Stvaranje hibridoma
[0306] Miševi su pojačani sa P30 konjugovanim fosforilisanim tau 386-408 (pS396/pS404) bez Titermax 3 dana pre sakupljanja iz slezina odgovarajućih miševa nakon čega je usledilo mešanje splenocita sa SP-2 ćelijama. Hibridomi su odabrani za cikluse ponovnog kloniranja nakon pozitivnog vezivanja za fosforilisanim tau 386-408 (pS396/pS404) detektovan ELISA-om, i poželjnog dejstva vezivanja za S1 i P3 antigene iz AB i TG4510 lizata mozga u odnosu na lizat mozga od kontrola koje koriste dot blotove i ELISA i MSD ploče obložene lizatom mozga.
Primer 2B: Vestern blot i dot-blot analiza specifičnih antitela
Tau biohemijska frakcionacija
[0307] Tkiva iz mozga ljudi ili rTg4510 miševa koja prekomerno eksprimiraju mutaciju humanog tau P301L su homogenizovana u 10 zapremina Tris-puferisanog slanog rastvora koji sadrži proteazu i inhibitore kao što sledi: 50 mM Tris/HCI (pH 7.4); 274 mM NaCl; 5 mM KCI; 1% mešavina inhibitora proteaze (Roche); 1% koktel inhibitora fosfotaze I & II (Sigma); i 1 mM fenilmetilsulfonilfluorid (PMSF; Sigma). Homogenati su centrifugirani na 27,000 x g tokom 20 minuta na 4°C kako bi se dobio supernatant (S1) i frakcije rotula. Rotule su ponovo homogenizovane u 5 zapremina izuzetne soli/saharoznog šećera (0.8 M NaCl, 10% saharoza, 10 mM Tris/HCI, [pH 7.4], 1 mM EGTA, 1 mM PMSF) i centrifugirani kako je prethodno navedeno. Supernatanti su sakupljeni i inkubirani sarkozilom (1% konačne koncentracije; Sigma) tokom jednog sata na 37°C, nakon čega je usledila centrifugacija na 150,000 x g tokom jednog sata na 4°C kako bi se dobile rotule nerastvorljive u sarkozilu, ovde označene kao P3 frakcija. P3 rotula je ponovo suspendovana u TE puferu (10 mM Tris/HCI [pH 8.0], 1 mM EDTA) do zapremine koja je ekvivalentna polovini originalne zapremine koja se koristi za homogenate mozga.
Vestern i dot blotovi
[0308] Frakcionisani ekstrakti tkiva S1 i P3 su rastvoreni u puferu SDS-uzorka koji sadrži 0.1 M DTT. Uzorci tretirani toplotom (95°C tokom 10 minuta) su razdvojeni elektroforezom na 4-12% Bis-Tris SDS-PAGE gelovima (Invitrogen) i preneti na PVDF membrane (BioRad Laboratories, Hercules, CA). Uzorci dot blota su naneti direktno na nitrocelulozne membrane (Amersham, Pittsburgh, PA) pri poznatim koncentracijama među uzorcima. I Vestern i dot blot membrane su blokirane u 5% nemasnom suvom mleku u TBS-Tween (0.5%) pH 7.4, nakon čega je usledila inkubacija u 1 µg/ml od C10-2 tokom noći na 4 °C. Membrane su oprane i inkubirane peroksidazom-konjugovanim anti-mišjim IgG (1:5000; Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA). Vezana antitela su detektovana upotrebom pojačanog hemiluminescentnog sistema (ECL PLUS komplet; PerkinElmer). Kvantifikacija i vizuelna analiza Vestern i dot blot imunoreaktivnosti je izvedena sa kompjuterski-povezanim sistemom LAS-4000 Biolmaging Analyzer (Fujifilm, Tokio, Japan) i Multi Gauge v3.1 softver (Fujifilm). Uvođenje proteina je podešeno zapreminom originalnih frakcija i može biti pretvoreno u vlažnu masu originalnog tkiva.
Primer 3. Ispitivanje inhibicije fluidne faze za hvatanje AD-P3
[0309] Primer 3A cilj: Da bi se kvantifikovala inhibicija humanog C10-2 i mutirane varijante vezivanja za pS396 tau antigene u materijalu AD-P3 mozga za mišji C10.2. MSD ploče obložene mišjim C10-2 pre inkubacije sa AD-P3 ili AD-P3 prethodno inkubirani sa C10.2 varijantama od značaja. Stepen inhibicije je prikazano kao IC50 vrednosti koje odražavaju očigledan afinitet vezivanja antitela tečne faze za antigene. IC50 vrednosti su dobijene uklapanjem modela vezivanja u jedan ili dva mesta upotrebom Graph Pad Prism softvera. Negativno kontrolno antitelo (miš C10-1) reaktivno sa P (404) Tau je dodato zbog poređenja (podaci nisu prikazani).
[0310] Postupak: MSD ploče su bile obložene hvatanjem antitela (750 ng/ml mišji C10-2 u karbonatnom puferu pH 8.5) tokom noći na sobnoj temperaturi nakon čega je usledilo blokiranje (30 min. u PBS, 3% BSA, 0.1 % NP40) i pranje 5 puta (PBS, 0.1 % BSA, 0.1% NP40). Graduisana koncentracija (0-1000 nM) antitela je inkubirana 60 min. sa AD-P3 materijalom na sobnoj temperaturi i naknadno inkubirana 1 sat na sobnoj temperaturi u MSD pločama obloženim mišjim C10-2 kako je prethodno opisano. Ploče su oprane 5 puta u (PBS, 0.1 % BSA, 0-.1% NP40) i anti-humani ukupni Tau (MSD sulfo označenom 1:50) je dodat kako bi se detektovao uhvaćeni tau koji odražava neinhibirane slobodne tau antigene.
[0311] Rezultati: Podaci su pokazali inhibiciju hvatanja tau zavisnu od doze upotrebom humanog C10-2 i varijanti (Fig.1). Varijante C10-2_N32S i C10-2_N32S:A101T inhibiraju jaču (IC50 = 44 i 14 nM tim redom, uklopljenu na modele vezivanja za jedno mesto) dok je C10-2 pokazao heterogenu inhibiciju koja je prikazana najboljim uklapanjem na model vezivanja za dva mesta (IC5014 nM/ 630 nM). Nizak afinitet vezivanja (IC50=630) je bio zastupljeniji budući da je jak afinitet vezivanja antitela (IC50 =14 nM) obuhvatao manje od 25% ukupnog vezivanja. Rezultati su prikazani na Fig.1.
[0312] Primer 3B Svrha: Da bi se kvantifikovala inhibicija humanog C10-2 i vezivanje mutirane varijante zapS396 tau 386-408 peptida u ispitivanje inhibicije tečne faze. Stepen inhibicije je prikazano kao IC50 vrednosti koja odražava očigledan afinitet vezivanja antitela. IC50 vrednosti su dobijene uklapanjem modela vezivanja u jedan ili dva mesta upotrebom Graph Pad Prism softvera. Antitelo negativne kontrole (mišje C10-1) reaktivno sa P (404) Tau je dodato zbog poređenja (podaci nisu prikazani).
[0313] Postupak: MSD ploče su bile obložene sa pS396 Tau 386-408 peptidom u puferu karbonata pH 9,5, tokom noći na sobnoj temperaturi nakon čega je usledilo blokiranje (30 minuta u PBS, 3% BSA, 0.1 % NP40) i pranje 5 puta (PBS, 0.1 % BSA, 0.1% NP40). Graduisana koncentracija (0-1000 nM) pS396 tau 386-408 je inkubirana 60 min. sa 1 ng/ml antitela na sobnoj temperaturi i naknadno je inkubirana 1 sat na sobnoj temperaturi u MSD pločama obloženim sa pS396 Tau 386-408 kako je prethodno opisano. Ploče su oprane 5 puta u (PBS, 0.1 % BSA, 0.1% NP40) a ukupni anti-humani Tau (MSD sulfo obeleženi 1:50) je dodat kako bi se detektovalo vezano antitelo koje odražava neinhibirano slobodno antitelo. Rezultati su prikazani na Fig.2.
1
Primer 4. Imunohistohemijska profilisanje antitela
Tkiva
[0314] Miš: Tkiva iz mozgova miševa su sakupljena od rTg4510 miševa starih 8 meseci. Ovi transgeni miševi eksprimiraju mutirani Tau (P301L 0N4R) pod reaktivnim elementom bez prisustva tetraciklina u CamK2 pozitivnim neuronima i pokazuju izraženu hiperfosforilaciju tau i stvaranje klupka od uzrasta od 6 meseci pa na dalje. Netransgena legla su služila kao kontrole. Mozgovi miševa su fiksirani uranjanjem u 4% paraformaldehid i usađeni su u parafin. Čovek: Uzorci humanog mozga sa fiksirani u formalinu i usađeni u parafin prednjeg korteksa su dobijeni od Tissue Solutions (Glazgov, UK). Tkiva od 3 davaoca sa dijagnostikovanim krajnjim stadijumom Alchajmerove bolesti (AB; Braak faza V-VI) su upoređeni sa kontrolnim davaocem koji odgovara po uzrastu i koji nema demenciju.
Imunohistohemija:
[0315] Preseci debeli četiri µm miševa i humanih tkiva su izrezani na mikrotomu, deparafinisani i podvrgnuti pronalaženju antigena izlaganjem preseka mikrotalasima u 10 mM citratnog pufera, pH 6, tokom 10 minuta. Endogena peroksidaza je blokirana sa 1% vodonikperoksidom nakon čega je usledio 5% normalni svinjski serum u PBS, 1%BSA, 0.3%Triton X-100 (PBS-BT). Preseci su inkubirani tokom noći na 4 stepena C sa hC10-2, hC10-2_N32S i hC 10-2_N32S_A101T antitelima razblaženim u PBS-BT u opsegu koncentracija koje su naznačene na Fig.1. Preseci su oprani u PBS, 0.25% BSA, 0.1% Triton X-100, pre nego što su inkubirani biotinilisanim sekundarnim svinjskim anti-humanim antitelom (#B1140; Sigma-Aldrich) na 1:200 tokom1 sata. Nakon dodatnog pranja, komplet za kompleks StreptAvidin-Biotin (Vector Laboratories, Burlingam, CA) je primenjen i konačno, imunoreaktivnost je vizualizovana sa 0.05% diaminobenzidinom. Preseci su kontraobojeni hematoksilinom kako bi se otkrila sama lokacija jezgara.
Rezultati
[0316] hC10-2, hC10-2_N32S i hC10-2_N32S_A101T označene strukture konzistentne sa patološkim tau kod 3 AB mozga (tj. klubad, neuropilna vlakna, distrofijski neuriti). Intenzitet imunoreaktivnosti je zavisio od koncentracije. Nije detektovano očigledno obeležavanje npr. glijalnih ćelija ili sudova. Nije detektovana imunoreaktivnost u presecima kod kontrolnog mozga. Slično tome, sva 3 antitela su dovela do očekivanog modela za fosforilisani tau i u hipokampusu i korteksu rTg4510 mozgova. U presecima mozga netransgenih miševa nije detektovana imunoreaktivnost.
Primer 5. Dekoracija tau struktura kod rTg4510 miševa nakon i.v. injekcije
Postupak
2
[0317] Miševi rTg4510 stari deset meseci. Ovi transgeni miševi eksprimiraju humani mutirani Tau (P301L 0N4R) pod reaktivnim elementom bez prisustva tetraciklina u CamK2 pozitivnim neuronima i pokazuju izrazitu tau hiperfosforilaciju i stvaranje klupka od 6 meseci starosti pa na dalje. Pored toga, neurodegeneracija je prisutna kod rTg4510 miševa starih 10 meseci u regijama sa jakom patologijom. Pojedinačna transgena tTA legla su služila kao kontrole. Miševi su primili pojedinačnu injekciju u venu repa ili sa hC10-2, hC10-2_N32S ili hC10-2_N32S_A101T antitelima pri koncentraciji od 80 mg/kg.
Zapremina od 150 µL je ubrizgana po mišu. Tri dana nakon injekcije, miševi su perfuzirani tokom 2 minuta sa PBS-om nakon čega je usledila 10 minutna perfuzija sa 4% paraformaldehidom. Mozgovi su bili kriozaštićeni u 30% saharozi i izrezani na 40 mikrona koji ne sadrže plutajuće kriopreseke. Ti delovi su inkubirani sa 5% normalnim svinjskim serumom u PBS/1%BSA/0.3%Triton X-100 tokom 20 min, oprani u PBS i konačno inkubirani sa AlexaFluor488-konjugovanim sekundarnim anti-humanim IgG na 1:200 (#709-545-149; Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, USA). Hoechst je korišćen za nuklearno bojenje. Preseci su oprani u PBS, postavljeni i ispitani fluorescentnom mikroskopijom.
Rezultati
[0318] I.v. injekcija hC10-2, hC10-2_N32S i hC10-2_N32S_A101T je dovela do in vivo vezivanja za ciljane strukture u hipokampusu i korteksu starijih rTg4510 mozgova miševa (Fig.4-7). Broj primećenih pozitivnih struktura je varirao između pojedinačnih rTg4510 životinja. Kod tTA kontrolnih miševa, nisu detektovani specifični fluorescentni signali nakon ubrizgavanja bilo kog od tri antitela (Fig.4-7). Budući da je koristila kao negativna kontrola, injekcija kontrolnog humanog IgG nije dala rezultat kod signala kod rTg4510 miševa (podaci nisu prikazani). Pozitivni signali u rTg4510 mozgovima se nisu odmah pojavili kao intracelularno bojenje i mogu da predstavljaju ekstracelularni tau materijal otpušten tokom postupka neurodegeneracije. Zbirno, ovi podaci ukazuju da hC10-2, hC10-2_N32S i hC10-2_N32S_A101T antitela mogu da prodru u parenhim mozga i specifično dekorišu ciljeve kod rTg4510 miševa in vivo.
Primer 6. Karakterizacija tau imunoreaktivnosti kod mozgova obolelih od Alchajmerove bolesti
Tkiva:
[0319] Uzorci humanog mozga sa umetnutim parafinom prednjeg korteksa su dobijeni od Tissue Solutions (Glazgov, UK). Uključena su bila tkiva davalaca sa dijagnostikovanim krajnjim stadijumom Alchajmerove bolesti (AD; Braak faza V-VI).
Imunohistohemija
[0320] Preseci debeli četiri µm humanih tkiva su izrezani na mikrotomu, deparafinisani i podvrgnuti pronalaženju antigena izlaganjem mikrotalasima preseka u 10 mM citratnom puferu, pH 6, tokom 10 minuta. Preseci su inkubirani sa 5% normalnim svinjskim serumom u PBS, 1%BSA, 0.3%Triton X-100 (PBS-BT) nakon čega je usledila inkubacija tokom noći na 4°C sa hC10-2 ili hC10-2_N32S_A101T antitelima razblaženim u PBS-BT. Preseci su oprani u PBS, 0.25% BSA, 0.1% Triton X-100.
Imunoreaktivnost je vizualizovana AlexaFluor488-konjugovanim sekundarnim anti-humanim IgG (1:200; #709-545-149, Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, USA). Radi dvostruke imunofluorescencije, preseci su zajedno inkubirani sa AT8 (1:500; #MN1020, ThermoFisher, Waltham USA) ili E1 ukupnim humanim tau antitelom, prilagođenim zečjim antitelom podignutim nasuprot N-terminalnog tau 19-33 (Crowe et al, 1991). AT8 i E1 imunoreaktivnosti su vizualizovane sa anti-mišjim AlexaFluor568 (1:400; #A10037, ThermoFisher) i anti-zečjim AlexaFluor568 (1:400; #A10042, ThermoFisher), tim redom. Preseci su analizirani fluorescentnom mikroskopijom.
Rezultati
[0321] U AB presecima dvostruko obojenim za N-terminalni ukupni tau i pS396 tau populacija neurona koja nosi klupko je označena i sa E1 kao i sa ili hC10-2 i hC10-2_N32S_A101T antitelima (Fig.7). Broj tau klubadi je bio obeležen ili samo hC10-2 i hC10-2_N32S_A101T antitelima (Fig.7, strelice). Za ekstracelularni tau (klubad duha) je prethodno utvrđeno da nije obojen N-terminalnim tau antitelima (npr. Bondareff et al, 1990; Braak et al, 1994; Flores-Rodrigues et al, 2015). Samim tim, tau vrste označene sa hC10-2 ili hC10-2_N32S_A101T antitelima same vrlo verovatno predstavljaju ekstracelularnu duh klubad.
Vestern blotovi i imunoprecipitacija
Eksperimentalni postupak i eksperimentalni opis
[0322] Korišćeni su transgeni rTg4510 miševi: humani tau cDNK sa P301L mutacijom (4R0N TauP301 L) je postavljen nizvodno od konstrukta odgovora operona na tetraciklin (TRE). Da bi se transgen aktivirao, odgovor mora da bude zajedno eksprimiran sa konstruktom aktivatora, koji se sastoji od sistema za ekspresiju tetraciklinskog kondicionog gena (tTA). Sistem aktivatora tTA je postavljen nizvodno od CaMKIIα promotera čime se ograničava ekspresija TRE uglavnom na strukturu prednjeg mozga. Tau transgenski odgovor je eksprimiran u FVB/N (Taconic) mišjoj vrsti, a tTA sistem aktivatora je održavan na 129S6 (Taconic) mišjoj vrsti. Njihovo F1 potomstvo je nosilo transgeni odgovor i aktivator (rTg4510) zajedno sa netransgenim (ne-tg) i pojedinačnim transgenim miševima iz legla- svi miševi su uzgajani u Taconic, Danska i genotipovani su analizom DNK repa upotrebom para prajmera 5'-GATTAACAGCGCATTAGAGCTG-3' & 5'-GCATATGATCAATTCAAGGCCGATAAG-3' za tTA transgen aktivatora i 5'-TGAACCAGGATGGCTGAGCC-3' & 5'-TTGTCATCGCTTCCAGTCCCCG-3' za transgen odgovora mutantnog tau. Miševi su bili smešteni po grupama i dobijali su vodu i hranu (Brogaarden, Danska) ad libitum kao i materijale za obogaćenje. Ciklus svetlo/tama je trajao 12 h; sobna temperatura je bila 21 ±
4
2 °C a relativna vlažnost je iznosila 55% ± 5%. Eksperimenti su izvedeni u skladu sa danskim zakonodavstvom o eksperimentima nad životinjama (br. licence 2014-15-0201-00339).
[0323] Miševi su eutanazirani dislokacijom vrata materice kako bi se očuvalo metaboličko okruženje mozga i kako bi se sprečili artifakti koji bi mogli da izmene biohemijske profile tau. Mozgovi miševa su prepolovljeni sagitalno po srednjoj liniji kako bi se dobile dve hemisfere. Cerebralni korteks i hipokampus desne hemisfere svake životinje su brzo zamrznuti na suvom ledu i čuvani na -80 °C do upotrebe. Smrznuti ljudski korteksi od pacijenata obolelih od Alchajmerove bolesti (AB) i starijih kontrolnih (HC) davalaca su nabavljeni od Tissue Solution (Glazgov, UK). Uzorci humanog mozga su imali slično postmortem vreme obrade < 6 h, i okarakterisani su zbog amiloidne tau patologije a odabrani AB uzorci su klasifikovani kao Braak faza V-VI.
[0324] Za imunoprecipitat tau proteina iz lizata mozga je korišćen komplet Crosslink Immunoprecipitation (Thermo Fisher Pierce 26147) prema uputstvima proizvođača. Ukratko, antitelo je bilo vezano za protein A/G plus agarozu nakon čega je usledilo umrežavanje vezanog antitela sa DSS (disukcinimidilsuberat). Homogenat mozga je pripremljen u Tris puferu (25 mM Tris/HCI pH 7.6, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, i potpunoj mešavini inhibitora fosfataze i proteaze) i prethodno očišćen tokom noći na 4 °C uz kontrolnu agaroznu smolu. Prethodno očišćeni lizat je inkubiran sa smolom -umreženom sa antitelom tokom noći na 4 °C nakon čega je usledila elucija antigena sa 50 µl elucionog pufera (pH 2.8) i neposredno je centrifugiran u epruvete za sakupljanje koje sadrže 5 µl 1 M Tris, pH 9.5. Imunoprecipitirani tau je rastvoren u puferu SDS-uzorka koji sadrži ditiotreitol (DTT, 100 mM), tretiran toplotom (95 °C tokom 10 min) i podvrgnut Vestern blotovanju kako je opisano u nastavku.
[0325] Humane tau koncentracije su izmerene u homogenatima mozga i prethodno očišćenim lizatima ELISA-om zbog ukupnog humanog tau u skladu sa uputstvima proizvođača (Invitrogen).
[0326] Tkiva su homogenizovana u 10 zapremina Tris-puferisanog slanog rastvora (TBS) koji sadrži inhibitore proteaze i fosfataze kao što sledi: 50 mM Tris/HCI (pH 7.4); 274 mM NaCl; 5 mM KCI; 1% mešavina inhibitora proteaze (Roche); 1% koktel inhibitora fosfataze I & II (Sigma); i 1 mM fenilmetilsulfonilfluorida (PMSF). Homogenati su centrifugirani na 27,000 x g tokom 20 min. na 4 °C kako bi se dobio supernatant (S1) i frakcije rotule. Rotule su ponovo homogenizovane u 5 zapremina jake soli/saharoznog šećera (0.8 M NaCl, 10% saharoza, 10 mM Tris/HCI, [pH 7.4], 1 mM EGTA, 1 mM PMSF) i centrifugirane kako je prethodno navedeno. Supernatanti su sakupljeni i inkubirani sarkozilom (1% konačne koncentracije; Sigma) tokom jednog sata na 37 °C, nakon čega je usledila centrifugacija na 150,000 x g tokom jednog sata na 4 °C da bi se dobila so i sarkozil-ekstraktabilne (S3) i frakcije nerastvorljive u sarkozilu (P3). P3 rotula je ponovo suspendovana u TE puferu (10 mM Tris/HCI [pH 8.0], 1 mM EDTA) do zapremine koja je ekvivalentna polovini originalne zapremine koja se koristi za homogenate mozga. Kako bi se obogatile S1 frakcije za vrste hiperfosforilisanog tau deo S1 frakcije je daljom centrifugacijom razdvojen na 150,000 x g tokom 20 minuta na supernatant (S1s) i frakcije taloga (S1p). S1p rotula je ponovo suspendovana u TBS puferu do zapremine koja je ekvivalenta jednoj petini originalne S1 zapremine koja se koristi. Frakcionisani ekstrakti tkiva S1, S1p i P3 su rastvoreni u puferu SDS-uzorka koji sadrži DTT (100 mM). Uzorci tretirani toplotom (95 °C tokom 10 min.) su razdvojeni elektroforezom na 4-12% Bis-Tris SDS-PAGE gelovima (Invitrogen) i preneti na PVDF membrane (BioRad Laboratories, Hercules, CA). Nakon blokiranja rastvorom za blokiranje koji sadrži 5% nemasno mleko i 0.1% Triton-X100 u TBS, membrane su inkubirane sa 1 µg/ml hC10.2, hC10-2_N32S, hC10-2_N32S_A101T ili žečjeg-anti-pS396 tau (Invitrogen). Membrane su oprane, i inkubirane peroksidazomkonjugovanim anti-humanim IgG ili anti-zečjim antitelima (1:5000; Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA). Vezana antitela su detektovana upotrebom pojačanog sistema hemiluminescencije (ECL PLUS kit; Perkin Elmer). Kvantifikacija i vizuelna analiza Vestern blot imunoreaktivnosti je izvedena sa kompjuterski-povezanim sistemom LAS-4000 Biolmaging Analyzer (Fujifilm, Tokio, Japan) i Multi Gauge v3.1 softverom (Fujifilm). Da bi se detektovao tau protein, približno 2 µg S1 iz miša je napunjeno, 20 µg S1 iz humanih mozgova i jednakih zapremina različitih frakcija (S1, S1p, i P3) do SDS PAGE.
Detekcija patološkog tau Vestern blot metodom
[0327] Homogenati prednjeg mozga su uzeti iz tri kontrolna legla rTg4510 miševa starih 32 nedelje i netransgenih (ne-tg) kontrolnih legala i sakupljeni kortikalni uzorak od četiri AB zdrava davaoca su izolovani u rastvorljivoj (S1), rotuli rastvorljivoj u TBS (S1p) i frakcijama nerastvorljivim u sarkozilu (P3). hC10.2, hC10-2_N32S, hC10-2_N32S_A101T su korišćeni na 1 µg/ml na vestern blotu i detektovani patološki tau od rTg4510 miševa i AB. Primetili smo detekciju 55 i 64 kDa tau u S1 i 64 i 70 kDa tau u P3 i S1p frakcijama od rTg4510 miševa starih 32 nedelje. Pored toga, uočene su tri krnje tau trake < 50 kDa u P3 frakciji. Nije detektovan signal u S1p i P3 iz ne-tg kontrolnog legla koji ne eksprimira humani transgenski tau. Slab signal oko 50 kDa je detektovan u S1 frakciji od ne-tg miševa, najverovatnije koji predstavlja endogeni mišji tau fosforilisan na S396 ostatku (Fig.8A-8C). Rezimirano je da su hC10.2, hC10-2_N32S, hC10-2_N32S_A101T detektovali pS396 tau, i kod normalnih fosforilisanih 55 kDa i hiperfosforilisanih 64 kDa tau vrsta kod rTg4510 miševa. Najjači signal je primećen sa hC10-2_N32S_A101T.
[0328] U S1, S1p i P3 frakcijama od davalaca AB hC10.2, hC10-2_N32S, hC10-2_N32S_A101T su detektovali uobičajeni AB tau razmaz i patološka četiri modela tau trake (54, 64, 69 i 74 kDa tau). Kako je i očekivano, hiperfosforilisane tau vrste nerastvorljive u sarkoziluizolovane iz P3 frakcije su bile najizraženije, nakon čega su usledile rastvorljive hiperfosforilisane tau vrste obogaćene S1p frakcijom. Nije detektovan signal u P3 frakcija ma od zdravih kontrola (HC). U S1 i S1p frakcijama od HC detektovan je slab signal oko 55 kDa, koji verovatno predstavlja normalan fosforilisan tau na S396 ostatku (Fig.8A-8C). Rezimirano je da su hC10.2, hC10-2_N32S, hC10-2_N32S_A101T detektovali uobičajeni tau razmaz karakterističan za AB i patološke modele tau trake koji predstavljaju hiperfosforilisan tau. Najjači signal je primećen sa hC10-2_N32S_A101T.
Imunoprecipitacija patološkog tau
[0329] Da bi se odredila mogućnost hC10.2, hC10-2_N32S, hC10-2_N32S_A101T da se vezuju za tau u nedenaturisanim uslovima, utvrđen je protokol tau imunopercipitacije (IP) po kojem su tau antitela konvencionalno umrežena na smoli proteina A/G i samim tim obezbeđuju se IP koji ne sadrže kontaminacije od antitela. Za tau analizu SDS-PAGE prisustvo teških lanaca antitela koji se koriste za IP može da ometa signale budući da se oba proteina detektuju oko 50 kDa. Istražena je efikasnost hC10.2, hC10-2_N32S, hC10-2_N32S_A101T da ukloni patološki tau iz mozga. Kao antigen, 500 µg prethodno očišćenog lizata iz homogenata ljudskog mozga je korišćeno od četiri grupisana AD i HC davaoca koji sadrže 0.1 µg i 0.15 µg humanog tau (određeno ELISA-om za humani tau), tim redom. hC10.2, hC10-2_N32S, hC10-2_N32S_A101T (10 µg) su uklonili 54, 64, 69 i 74 kDa tau vrste (četiri patološki tau trake) i AD razmaz iz prethodno očišćenih AB homogenata (odnos antigen/antitelo 1:100) vizualizovan poliklonalnim zečjim anti-pS396 tau antitelom (Fig.9). Poređenje intenziteta tau traka it mozgova sa AB uklonjenih sa hC10.2, hC10-2_N32S, hC10-2_N32S_A101T sa kontrolnim humanim IgG antitelom i sa HC mozgom, može se rezimirati da su hC10.2, hC10-2_N32S, hC10-2_N32S_A101T imunoprecipitirani hiperfosforilisani tau na pS396 mestu isključivo iz AB mozgova bili efikasni u odnosu antigen/antitelo od 1:100.
Ispitivanje ćelija i agregacije
[0330] HEK293 ćelije su prolazno transfektovane sa humanim tau-P301L-FLAG u pločama sa 6 bunarčića tokom 24 sata nakon postavljanja u ploče, nakon čega je 24 sata kasnije usledila inkubacija homogenatimi uz mozga tokom 24 h, nakon čega je usledilo deljenje i ponovno postavljanje ćelija u ploče i sakupljanje nakon dodatna 24 sata. Ćelije su lizirane i sonikovane u PBS, dopunjene sa 1% tritonom X, Phos-stop i potpunim puferom inhibitora fosfataze i proteaze (Roche) i ultracentrifugirane na 100,000 x g tokom 30 min. Rotula je ponovo suspendovana u SDS, sonikovana i ultracentrifugirana tokom 30 min. na 100,000 x g. Supernatanti su analizirani Vestern blot metodom. Ćelije koje eksprimiraju humani tau-P301L su pokazale nerastvorljiv (SDS frakcija, E1/FLAG detekcija), hiperfosforilisan (pS396 detekcija) tau nakon zasejavanja sa ukupnim homogenatima iz mozga od rTg4510 tau transgenih miševa.
[0331] Ćelije tretirane kontrolnim homogenatom iz mozga tTA miševa pokazale su odsustvo agregacije hiperfosforilisanog humanog tau. Pored toga, ukupni ćelijski lizati HEK293 ćelija su analizirani pomoću ispitivanja tau agregacije od Cisbio. Ovo ispitivanje je zasnovano na vremenski razloženoj fluorescenciji pomoću istog antitela i za davaoca (Tb3+ konjugovan) i za primaoca (d2 konjugovan) Ab u FRET. Uzorak od 10 µl je pomešan sa 10 µl mešavine antitela i inkubiran tokom 20 sati. Ploča je očitana na Pherastar čitaču ploče da bise ocenila vremenski razložena fluorescencija (FRET izmeren signal/integrisan nakon svetla za uzbubu). Ispitivanje meri agregatni tau i u materijalu za humanu autopsiju, rTg4510 miševa i u zasejanim HEK ćelijama velike specifičnosti i osetljivosti. Rezultati su prikazani na Fig.10.
Primer 7. Imunodeplecija tau
[0332] Ekstrakti iz mozga sa Alchajmerom su napravljeni od zamrznutog post mortem prednjeg korteksa u 10x zapremine sterilnog hladnog PBS. Ovo tkivo je homogenizovano pomoću homogenizatora noža nakon čega je usledila sonikacija, 5 x 0.9 drugih pulseva na izlazu 2 (Branson sonifikator). Homogenat je zatim centrifugiran na 3000 g tokom 5 minuta na 4C. Supernatanti su alikvotirani, brzo zamrznuti i čuvani na -80 stepeni C do upotrebe.
[0333] 25 µg antitela (humanizovano C10-2 varijante i 2.10.3, miš AT8, Thermo Scientific mn 1020) su imobilisana do 125 µl suspenzije magnetnih dinaperli (Immunoprecipitation Kit Dynabeads Protein G Novex, kat. br.10007D). Nakon detaljnog pranja obložene perle su pomešane sa različitim količinama neobloženih, opranih perli. Počevši od 100% Ab obloženih perli, koje odgovaraju 5 µg antitela, dole do 100% neobloženih perli. Ukupna količina perli je bila ista u svim uzorcima. Perle su pomešane sa 20 µl AB ekstrakta i inkubirane na sobnoj temperaturi tokom 10 min. Magnetne perle su odvojene od ekstrakta i ekstrakti su alikvotirani, brzinski zamrznuti i čuvani na -80 stepeni C do upotrebe.
Analiza deplecije upotrebom vestern blot metode
[0334] Uzorci su prokuvani u 1x SDS puferu za punjenje i 100 mM DTT. Zapremina koja odgovara 3 µl ekstrakata su napunjeni na 4-12% Bis-Tris NuPAGE Gel (LifeTech Novex). Nakon elektroforeze, proteini su blotovani preko Immobilon-FL PVDF membrane (0,45µm, IPFL10100, Millipore). Membrana je blokirana sa SEA puferom za blokiranje (Prod#37527, Thermo). Tau i P-tau nivoi su ocenjeni u uzorcima upotrebom Tau5 (Tau5 je komercijalno dostupno anti-tau antitelo čiji epitop je opisan kao sredina Tau aminokiselina 210-241. To je mišji monoklonalni Tau. Abcam ab80579, 1:2000) mišji C10-2 (1 µg/ml), P-S199/202 (Invitrogen 44768 G, 1:1000), P-S422 (Abcam ab79415, 1:750), humani IPN (1µg/ml). Gapdh i aktin su korišćeni kontrole za punjenje (Abcam ab9484, 1:2000, Sigma A5441, 1:20000). Sekundarna fluoroforna konjugovana IgG antitela su korišćena (IRDye 800CW kozje anti-humano, IRDye 800CW, kozje anti-zečje, IRDye 680 kozje anti-mišje, LI-COR biosciences) i signal je kvantifikovan upotrebom Odyssey CLx i Image studio softvera (LI-COR biosciences). Kvantifikacija pojedinačnih traka kao i signala u svim trakama je izvedena a iz toga su ucrtane krive doza-odgovor i kada je moguće procenjeni su maksimalni efekat i EC50 vrednosti.
Rezultati
[0335] Oba 2.10.3 i C10-2 antitela uklanjaju malu frakciju tau iz preparata mozga sa Alchajmerovom bolešću. Ovo pokazuje selektivnost za podskup tau unutar ukupnog sadržaja tau proteina.2.10.3, dizajnirano da ima specifičnost za pS422 tau uklanja do 24% ukupne tau količine, dok C10-2 uklanja do 15% ukupnog tau (videti Fig.11). Ovo se može protumačiti da pS396 podskup predstavlja manji podskup tau, pri čemu su svi ostali faktori jednaki. Alternativno, ti podaci mogu da se tumače da su C10-2 antitela selektivnija za pS396 nego što je 2.10.3 antitelo selektivno za pS422.
[0336] 2.10.3 i C10-2 oba uklanjaju više od 90% tau fosforilisanog na serinu 422, iako količina antitela potrebna da se ukloni 50% pS422 tau se razlikuje, za 2.10.3, 0,42 µg antitela i za C10-2, 0.27 µg je bilo potrebno za isti efekat (videti Fig.12). U jednom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, antitelo je specifično za epitop unutar 386-404 pri čemu je serinski ostatak 396 humanog tau fosforilisan i pri čemu 80% pS422 tau je uklonjeno (priliko ispitivanja imunodeplecije Vestern blot analizom) upotrebom manje od 1 µg antitela.
[0337] C10-2 efikasno uklanja tau koji je fosforilisan na serinu 396 (maksimalan efekat: 88% i polovina efekta se postiže upotrebom 0.30 µg antitela).2.10.3 uklanja manju frakciju tau koja je fosforilisana na serinu 396 (maksimalan efekat: 60% a pola tog efekta se postiže kada se koristi 0.63 µg antitela)(videti Fig.13). Ovo ukazuje da sav Tau koji je fosforilisan na serinu 422, takođe je fosforilisan na serinu 396, ali postoji deo hiperfosforilisanog tau koji je fosforilisan na serinu 396 kada fosforilisani serin na položaju 422 nije prisutan. U jednom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, antitelo je specifično za epitop unutar 386-404 pri čemu je ostatak 396 humanog tau fosforilisan i pri čemu 80% pS396 tau je uklonjeno (u ispitivanjima imunodeplecije Vestern blot analizom) pomoću manje od 1 µg antitela
[0338] Veliki deo tau, koji je uklonjen putem C10-2, je takođe fosforilisan na serinu 199/202, budući da 69% tau na čiju je fosforilaciju uticala imunodeplecija (50% efekta prilikom upotrebe 0.34 µg antitela).
2.10.3 imunodeplecija ne obezbeđuje sigmoidalni odgovor na dozu pS199/202 tau, iako kap u signalu je primećena sa rastućom količinom antitela (maks 52% smanjenja kada se koristi maksimalna količina antitela (5 µg) (videti Fig.14). U jednom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, antitelo je specifično za epitop unutar 386-404 pri čemu je serinski ostatak 396 humanog tau fosforilisan i pri čemu 80% P-S199/202 tau je uklonjeno (u ispitivanju imunodeplecije Vestern blot analizom) upotrebom manje od 1 µg antitela.
[0339] Ovi rezultati ukazuju da C10-2 antitelo koje cilja fosforilisani serin 396 vezuje veću grupu hiperfosforilisanog tau od 2.10.3 antitela koje cilja fosforilisani serin na položaju 422.
[0340] Prilikom istraživanja pojedinačnih traka na vestern blotu nakon imunodeplecije 25 kDa traka je identifikovana kao fosforilisana na serinu 396. Ovaj fragment prolazi imunodepleciju od strane C10-2, ali 2.10.3 i AT8 ne crpe imunološki ovaj fragment (videti Fig.15). Samim tim, C10-2 ima jedinstvenu karakteristiku uklanjanja ovog krnjeg oblika tau iz ekstrakata mozga sa Alchajmerovom bolešću.
Primer 8. Poređenje C10-2 varijanti
[0341] Sve C10-2 varijante su imale istu efikasnost u ispitivanju imunodeplecije (videti Fig.16). Ovi rezultati pokazuju da uvedene mutacije nisu promenile funkcionalno vezivanje za Tau specifičan za mozak sa Alchajmerom.
8a. Tretiranje antitelom kod zasejanih rTg4510 miševa
[0342] Korišćeni su transgeni miševi koji eksprimiraju humani mutirani Tau (P301L 0N4R) pod reaktivnim elementom bez prisustva tetraciklina u CamK2 pozitivnim neuronima (rTg4510). Ovaj model normalno počinje da razvija Tau patologiju u uzrastu od 3 meseca, ali hranjenjem majki doksiciklinom tokom trudnoće i tokom prve 3 nedelje života mladunca, patologija se razvija u kasnijem stadijumu (počevši nakon 6 meseci starosti). Miševi koji su prethodno tretirani doksiciklinom su hronično tretirani sa mC10-2, hC10-2, 2.10.3 ili kontrolnim antitelom, 15 mg/kg/nedeljno počevši od 2 meseca života. Sa 2.5 meseca, ekstrakt mozga sa Alchajemrom je infuziran u hipokampus. Miševi su 20 anestezirani udisanjem izoflourana fiksirani u stereostatičkom okviru. Lobanja je izložena i podešena dok su bregma i lambda bili na nivou. Rupa je napravljena u lobanji 2 mm lateralno (desno) i 2.4 mm iza bregma. Korišćen je špric od 10 µl sa zakrivljenim vrhom (SGE) kako bi se ubrizgao materijal za zasejavanje 1.4 mm ventralno od površine mozga na gorepomenutim koordinatama.2 µl ekstrakata, opisano u primeru 7, su polako infuzirana na mestu (1 µl/minut) i špric je ostavljen 5 minuta pre uklanjanja. Rana je zašivena i miševi su zagrevani do buđenja. Miševi su bili smešteni tokom 3 meseca a zatim su žrtvovani i fiksirani perfuzijom sa 4%. Miševi su tretirani antitelom do žrtvovanja, 3 meseca nakon zasejavanja.
Imunohistohemija
[0343] Fiksirani mozgovi su izrezani na 35 µm koronalne preseke na NSA 30 i svaki 6. presek je obojen za tau klubad (Gallyas srebrna boja). Pozitivno obojeni neuroni (soma) su prebrojani u ipsi i kontralateralnim stranama hipokampusa svih mozgova. Uključeni su svi podregioni hipokampusa. Osam preseka je prebrojano po mozgu. Rezultati odražavaju zbir pozitivnih neurona od 8 preseka.
[0344] Statistička analiza: varijansa je značajno različita prilikom poređenja grupa. Samim tim korišćeni su neparametarski, Kruskal-Wallis test i Danov test višestrukog poređenja.
[0345] Rezultati: ekstrakti su uzrokovali zasejavanje patologije klupka u ipsilateralnom hipokampusu. mC10-2 tretiranje je značajno umanjilo patologiju klupka kod zasejanog hipokampusa za 57% (P<0,05). Postoji jasan trend koji ukazuje da hC10-2 je umanjilo patologiju.2.10.3 nije pokazao efekat (videti Fig. 17).
Primer 8b. Efekti anti-zasejavanja C10.2 varijanti
Cilj ispitivanja
1
[0346] Za transcelularno umnožavanje tau agregata je sugerisano da doprinosi patološkom razvoju i topološkom širenju Alchajmerove bolesti unutar CNS-a. In vitro modeli zasejavanja su utvrđeni u kojima humani tau eksprimiran u HEK293 ćelijama je zasejan sa ekstracelularno primenjenim patološkim tau agregatima. Svrha ovog ispitivanja je bila da se proceni i uporedi terapijski efekat monoklonalnog humanog C10.2 i varijanti nakon zasejavanje u paradigmi lečenja. Zasejavanje je predviđeno da označava uvođenje količine hiperfosforilisanog tau (semena) koja započinje hiperfosforilaciju / pogrešno uvijanje celularnog eksprimiranog tau.
Pozadina koja utvrđuje relevantnost ovog ispitivanja
[0347] Deponovanja ekstracelularnih plakova Aβ i intra-neuronski uparenih spiralnih vlakana tau su glavna obeležja Alchajmerove bolesti. Intra-neuronske inkluzije su prevashodno napravljene od nerastvorljivog deterdženta, hiperfosforilisanog, amiloidnih oblika tau i deponovane su kod AB pacijenata u prostorno vremenskom modelu što ukazuje na širenje agregata unutar CNS. Za tau agregate se eksperimentalno pokazalo da se razmnožavaju od ćelija u ćelije i in vivo i in vitro u mehanizmu poput priona. Ovo prisustvo ekstracelularnog širenja koje utiče na razmnožavanje bolesti se otvara za imunoterapiju antitelima koja prodiru u CNS.
[0348] Za primenu tau agregata/semena se pokazalo da dovodi do agregacije celularnog tau in vitro (Frost et al., 2009, Guo i Lee 2011, Yanamandra et al., 2013). Ustanovili smo model in vitro zasejavanja, pir čemu sirovi homogenati mozga od Tg4510 miševa (koji sadrže agregatni humani tau) se koriste za zasejavanje humanog 0N4R tau sa P301L mutacijom prolazno eksprimiranom u HEK293 ćelijama. Ono što je važno je da se nisu mogli detektovati ostaci tau agregata (semena)u zasejanim pcDNK kontrolnim ćelijama, tako da sva očitavanja detektuju pretvaranje celularnog tau i ne detektuju bilo koji signal iz egzogenog materijala za zasejavanje. U ovom ispitivanju određeni su efekti anti-zasejavanja različitih varijanti hC10.2.
Varijante
[0349]
Antitelo C10-2 (hC10.2)
Antitelo N32S (hC10.2 N32S)
Antitelo N32Q (hC10.2 N32Q)
Antitelo N32S,D55E (hC10.2 N32S D55E)
Antitelo N32Q,D55E (hC10.2 N32Q D55E)
Antitelo N32S,A101T (hC10.2 N32S A101T)
Referentne stavk(a)e
1 1
[0350] Kontrolno hIgG1 (B12)
Sistem ispitivanja / Životinje
[0351] HEK293 ćelije prolazno transfektovane sa hTau-P301L (0N4R).
Eksperimentalni dizajn
[0352] Materijal za zasejavanje: Tg4510 homogenata (i kontrola) od miševa starih 12 meseci je homogenizovano kao 10% homogenata u TBS bez inhibitora homogenizacijom perli i sonikovano.
Homogenati su se vrteli na 21000 x g tokom 15 min. a za zasejavanje je korišćena rastvorljiva frakcija.
[0353] Ispitivanje HEK293 zasejavanja: u ovom ispitivanju 600,000 HEK293 ćelija je postavljeno u ploče po bunarčiću u ploči sa 6 bunarčića 0.dana.1.dana, ćelije su transfektovane sa 4 µg plazmidne DNK upotrebom 10 µl lipofektamina 2000 prema protokolu proizvođača. Podloga je promenjena nakon 4 h.
2. dana ćelije su posejane sa sirovim homogenatom iz mozga 12 meseci starih Tg4510 ili tTa miševa. Homogenati koji sadrže 40 µg ukupnog proteina (približno 65 ng ukupnog humanog tau za tg4510 homogenate) se primenjuju na podlogu svakog bunarčića. Za tretiranje antitelom eksperimenti homogenata su prethodno inkubiarni sa ili bez antitela preko noći na 4 stepena.6h posle-zasejavanja podloga je promenjena u podlogu sa niskim serumom kako bi se smanjila proliferacija ćelija i antitela su ponovo primenjena.
[0354] 3. dana (24h nakon zasejavanja), ćelije su tripsinizovane tokom 3 minuta kako bi se degradirala ekstracelularna semena i ponovo postavila u ploče na; 800,000 ćelija po bunarčiću u pločama sa 6 bunarčića radi eksperimenata frakcionacije, 20,000 ćelija po 96 bunarčića za ispitivanje Cisbio tau agregacije i na 10,000 ćelija po 96 bunarčića za procenu unosa antitela procenom snimanja visokog sadržaja. Antitela se ponovo primenjuju na svaki bunarčić.
[0355] Celularna frakcionacija: 48h nakon zasejavanja, ćelije za frakcionaciju su sakupljene struganjem u hladnom PBS, pretvorene u rotule i lizirane u TBS sa 1% triton-X sa inhibitorima fosfatazae i proteaze i sonikovani. Nakon ultracentrifugacije (100,000 x g tookm 30 min. na 4°C) rotula je ponovo suspendovana u 1% SDS, sonikovana i ultracentrifugirana još jednom. Triton-X i SDS-rastvorljive frakcije su analizirane Vestern blot metodom zbog ukupnog tau (E1) i fosforilacije tau na S396 (D1.2). D1.2 signal je kvantifikovan imunoflourescencijom na Odyssey imagingmachine.
[0356] Cisbio tau ispitivanje agregacije: 48h nakon zasejavanja, ćelije za ispitivanje Cisbio agregacije su oprane u ledeno hladnom PBS i osušene su zamrzavanjem. Ćelije su lizirane u 1% triton-X inhibitorima fosfataze/proteaze i benzonazom (RNkza i DNkza) i inkubirane na rotacionoj mućkalici, na 650 obrtaja u minutu tokom 40 minuta na 4 stepena C. Ukupni ćelijski lizat je analiziran za tau agregate ispitivanjem Cisbio tau agregacije, pri čemu ispitivanje bazirano na upotrebi istog antitela kuplovano sa davaocem i primaocem za FRET merenja upotrebom homogene vremenski razložene fluorescencije (HTRF®, Cisbio).
1 2
Monomerni tau može samo da se vezuje ili za primaoca ili za davaoca antitela, budući da su ta dva u kompeticiji za isti vezujući epitop = bez FRET. Nasuprot njemu, oligomerni tau može da se vezuje i za davaoca i za primaoca = FRET signal. Ukupni proteini su određeni za sve uzorke putem BCA a odnos signala i buke uzorka je normalizovan do proteina i prikazan na grafikonu kao relativna agregacija tau upotrebom 8 tehničkih kopija.
[0357] Unos antitela: 48h nakon-zasejavanja, ploče za unos antitela su bile fiksirane u 4% paraformaldehida i 4% saharoze i obojene anti-humanim sekundarnim antitelom. Unos antitela je potvrđen pomoću Cellomics.
Analiza podataka / Statistika
[0358] Podaci su predstavljeni kao grupisani podaci četiri nezavisne biološke replike izvedene i analizirane tokom dve različite nedelje /- S.E.M. Podaci su analizirani upotrebom jednosmernog ANOVA sa Takijevim testom višestrukog poređenja, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.
Rezultati
[0359] hC10.2 je imalo uticaj umanjenja na zasejavanje i nerastvorljivi hiperfosforilisani tau za približno 40% u poređenju sa kontrolom. Sva druga antitela su pokazala sličan ili superioran efekat u odnosu na hC10.2. Određenije, N32S i N32S_A101T varijante hC10.2 su pokazale jače efekte 45% i 62% smanjenja kod agregatnog tau. N32S_A101T varijanta je pokazala značajno jači efekat na agregaciju u poređenju sa hC10.2.
Primer 8C: Ispitivanja stabilnosti na hC10.2 i varijante ovog pronalaska
Cilj ispitivanja
[0360] Ovo ispitivanje je izvedeno kako bi se procenili osnovni problemi stabilnosti sa antitelima ovog pronalaska, koja se fokusiraju na uslove stresa kako bi se otkrile bilo kakve potencijalne razlike u varijantama.
Dizajn ispitivanja
[0361] Svi uzorci su početno pripremljeni u identičnim početnim uslovima (pufer, koncentracija i nivo agregata). Ovo bi eliminisalo razlike početnih svojstava koja potencijalno mogu da utiču na naknadni razvoj ponašanja uzorka. Kontrola je čuvana na -80°C i analizirana paralelno sa uzorcima koji su u uslovima stresa (40°C). Uzorci su uklonjeni sa 40°C u različitoj vremenskoj tački i analizirani simultano na kraju putem SEC-uplc, mapiranjem peptida masenom spektrometrijom tečne hromatografije (LCMS) i diferencijalnom skenirajućom fluorimetrijom (DSF).
1
Varijante
[0362]
Antitelo C10-2 (hC10.2)
Antitelo N32S (hC10.2 N32S)
Antitelo N32Q (hC10.2 N32Q)
Antitelo N32S,D55E (hC10.2 N32S D55E)
Antitelo N32Q,D55E (hC10.2 N32Q D55E)
Antitelo N32S,A101 (hC10.2 N32S A101T)
Antitelo A101T (hC10.2 A101T)
Antitelo D55E (hC10.2 D55E)
Antitelo N32Q, A101T (hC10.2 N32Q A101T)
Referentna stavka
[0363] Uzorci antitela čuvani na -80°C tokom trajanja ispitivanja su korišćeni kao referenca.
Pozadinski podaci
[0364] Aspekti stabilnosti monoklonalnog antitela su važni za oba aspekta proizvodnje, konačno čuvanje i formulaciju aktivnog sastojka leka. U ovom ispitivanju, stresirali smo antitela ciklusima zamrzavanjaotapanja, visokom temperaturom i niskom pH kako bi se otkrilo da li su problemi očigledni u bilo kom od ovih kandidata.
Materijali i postupci
[0365] Za ispitivanja deamidacije, uzorci se stavljaju u bočice za uzorke od 1 ml i inkubirani su na 40°C. u prethodno definisanim vremenskim tačkama uzorak se pomera na -80°C i čuva do analize.
Ispitivanja deamidacije
[0366] Deamidacija Asn ostataka je izučavana na peptidnom nivou kako bise dobile detaljne informacije o stvarnim ostacima u pitanju. mAb je samim tim svareno sa svinjskim tripsinom nakon smanjenja i alkilacije (jodosirćetna kiselina) pomoću standardnih protokola. Peptidi su razdvojeni na CSHT130 C18 1.7 µm koloni i uvedeni u XEVO QTOF (Waters) MS instrument koji funkcioniše u MSe režimu rada. Identični parametri su korišćeni kroz tu seriju. Peptidne mape sa svih vremenskih tačaka su analizirane u BiopharmaLynx i kvantifikovane uz sledeća ograničenja: samo pozitivno identifikovani deadmidisani peptidi su uključeni, fragmenti izvora nisu uključeni. % deamidacije svakog identifikovanog peptida se prati tokom vremena.
1 4
Opšti izgled SEC postupka
[0367] Agregacija je određena SEC hromatografijom na ACQUITY UPLC® BEH200 SEC 1.7 µm 4.6x150 mm koloni u Acquity UPLC sa TUV detektorom (waters). Uzorci 20 µl podešeni na 100 µg/ml (razblaženi u tekućem puferu: Gibco PBS - Invitrogen #14190-094 0.1 M NaCl) se primenjuju na kolonu na 0.4 ml/min i razdvojeni su tokom 6 minuta izokratskom elucijom.
[0368] Podaci su analizirani MassLynx a AUC se koristi za kvantifikovanje nivoa agregacije.
Eksperiment niske pH
[0369] hC10.2 je primenjeno na proteinsku G kolonu i eluirano pri pH 2.8 upotrebom standardnih uslova. Uzorak je čuvan pri pH 2.8 a alikvoti su uklonjeni u vreme 0, 15, 30, 60, 120 i 180 min. i neutralizovani pre odstranjivanja soli u PBS. Uzorci su analizirani zbog afiniteta za vezivanje, agregacije i deamidacije.
Karakterizacija hC10.2 u uslovima stresa: deamidacija na 40°C i 28 dana
[0370] Deamidacija Asn je primećena na nekoliko manjih i tri veća mesta pokrivena peptidima LC:T2, HC:T36 i HC:T25. Kod njih deamidacija raste tokom vremena, pri čemu se završava na 75%, 38% i 28% tim redom. Nasuprot peptidu HC:T36 i T25, Asn ostaci (LC N32 i N34) u LC:T2 peptidu se ne očekuju, bazirano na in silico analizi (sekvencioni motiv), da su skloni deamidaciji, ali iznenađujuće u stvarnom eksperimentu oni jasno prave razliku od drugih Asn ostataka kod hC10.2. Povećana deamidacija ovog peptida je u međusobnoj vezi sadejstvom smanjenja protiv dvostrukog fosforilisanog peptida i ukazuje na mehanističku vezu između deamidacije i IC50. Ovo zapažanje takođe ukazuje da promena Asn ostataka 32 i/ili 34 u hC10.2 LC bi moga oda smanji deamidaciju na ovim mestima.
[0371] U analizi varijanti, jasno je da jednostavno modifikovanje Asn32 ili u Ser ili u Gln u potpunosti sprečava reakciju deamidacije na Asn34 (Fig.20). Takođe ne detektujemo bilo koju deamidaciju Gln32 u varijantama sa ovom mutacijom.
Deamidacija pri niskoj pH
[0372] U ovom ispitivanju, analizirali samo hC10.2 na isti način kako je prethodno opisano za 40°C ispitivanja stabilnosti. Samo u ovom slučaju mešavina tripsina i Lys-C je korišćena (Promega proizvod) da bi se optimizovalo cepanje lizinskih ostataka. Nisu primećena dodatna mesta ili stepen deamidacije i ponovo su najizrazitiji peptidi su bili LC-T2, HC-T25 i HC-T36. Pored toga, nije primećena promena u IC50 kod tretiranih uzoraka pri niskoj pH.
SEC analiza
1
[0373] Nivo agregacije je bio ispod 3% u svim preparatima i nije primećena promena u stepenu agregacije tokom 28 dana na 40°C.
Primer 9
Izolacija tau semena od rTg4510 miševa
[0374] rTg4510 miševi su dvostruko transgeni međusobno eksprimirajući 4R0N tau sa P301L mutacijom u humanom MAPT genu nizvodno od odgovora operona na tetraciklin (TRE) i konstrukta aktivatora, koji se sastoji od tetracikličnog sistema za ekspresiju kondicionog gena (tTA). P301L mutacija je dominantna mutacija koja dovodi do frontotemporalne demencije sa parkinsonizmom povezanim sa hromozomom 17 (FTDP-17). Kod rTg4510 miševa, ekspresija P301L hTau izaziva tau patologiju uključujući obrazovanje predklupka i neurofibrilarnog klupka (NFT), neuronski gubitak i abnormalnosti u ponašanju na način koji zavisi od uzrasta. NFT predstavljaju intraneuronske agregate napravljene od uparenih spiralnih vlakana (PHF), uvrnutih veza, ili ravnih vlakana, i nerastvorljivi su u deterdžentu i prevashodno sadrže hiperfosforilisan tau. Hiperfosforilacija znači da je tau fosforilisan na više mesta nego tau iz mozga odrasle zdrave osobe i da je za dato mesto viši od normalnog procenta tau molekula fosforilisan (>8 fosfo mol/tau mol). Anatomska raspodela NFT-ova predstavlja postmortem histopatološko obeležje koje je u vezi sa kognitivnim padom kod Alchajmerove bolesti (AB) i sa gubitkom pamćenja kod normalnog starenja i blagog kognitivnog oštećenja. Model raspodele NFT u mozgu pacijenata sa AB je izuzetno hijerarhijski i podeljen je na šest faza. Postepena invazija NFT promena na mozak je potvrđena biohemijski i klasifikovana je u deset faza prema zahvaćenoj regiji. Biohemijska karakterizacija različitih tau vrsta iz mozgova sa AB je originalno bazirana na protokolu frakcionacije upotrebom 1% sarkozila za izolaciju nerastvorljivog tau. Na osnovu ovog postupka, hiperfosforilisane tau vrste nerastvorljie u sarkozilu izolovane u frakciji rotule koja je nerastvorljiva u sarkozilu (P3) su definisane kao PHF-tau i na njih se gleda kao na biohemijski NFT ekvivalent. Hiperfosforilisane tau vrste rastvorljive u puferu izolovane u rastvorljivoj frakciji (S1) su definisane kao nefibrilne oligomerne tau vrste i one se posmatraju kao biohemijski tau ekvivalent predklupka. Kod rTg4510 miševa, normalni monomerni fosforilisani i nefosforilisani humani 4R0N transgeni tau je prisutan u rastvorljivoj frakciji (S1) i vizualizovan kao 55 kDa tau vrste na SDS strani. Hiperfosforilisan 4R0N tau sa P301L mutacijom je prikazan u obliku mobilnosti koja je pomerena sa tau 64 kDa i 70 kDa u rastvorljv (S1), i isključivo u rastvorljiv ostatak (S1p) Tris-puferisanog slanog rastvora (TBS) i frakciji rotule nerastvorljive u sarkozilu(P3). Tau vrste nerastvorljive u sarkozilu 64 kDa i 70 kDa tau vrste izolovane u P3 predstavljaju tau vlakna (PHF-tau) i biohemijski NFT ekvivalent. Tau vrste rastvorljive u puferu 64 kDa i 70 kDa u S1 i obogaćene frakcijama TBS-rastvorljivog ostatka (S1p) su oligomerni tau i biohemijski pred-klupko tau ekvivalent.70 kDa tau vrste su specifične za P301L mutant i takođe mogu da se pronađu mozgovima FTDP-17 pacijenata. Moždano tkivo miševa rTg4510 starih 40 nedelja je homogenizovano u 10
1
zapremina TBS koji sadrži 50 mM Tris/HCI (pH 7.4), 274 mM NaCl, i 5 mM KCI. Homogenati su centrifugirani na 27,000 x g tokom 20 min na 4°C kako bi se dobile frakcije supernatanta (S1) i rotula (P1). TBS-ekstraktabilna S1 frakcija je odvojena centrifugiranjem na 150,000 x g tokom jednog sata na 4°C u frakcije supernatanta (S1s) i ostatka (S1p). S1p rotula je ponovo suspendovana u 10 mM Tris/HCI [pH 8.0] do zapremine ekvivalentne petini originalne S1 zapremine. P1 rotula je ponovo homogenizovana u 5 zapremina izuzetno slanog/saharoznog šećera (0.8 M NaCl, 10% saharoza, 10 mM Tris/HCI, [pH 7.4]) i centrifugirana na 27,000 x g tokom 20 min na 4°C. Supernatanti su sakupljeni i inkubirani sarkozilom (1% konačne koncentracije; Sigma) tokom jednog sata na 37°C, nakon čega je usledila centrifugacija na 150,000 x g tokom jednog sata na 4°C da bi se dobile rotule nerastvorljive u sarkozilu, označene kao P3 frakcija. P3 rotula je ponovo suspendovana u 10 mM Tris/HCI [pH 8.0] do zapremine koja je ekvivalentna polovini originalne zapremine koja se koristi za homogenate mozga. Patološki tau iz mozga rTg4510 miša okarakterisan kao hiperfosforilisan tau 64 i 70 kDa na SDS-strani je isključivo prisutan u S1p i P3 frakcijama u obliku TBS rastvorljivog oligomera i tau vlakana nerastvorljivih u sarkozilu, tim redom. S1s frakcije sadrže normalan ne- i fosforilisan tau prikazan kao 55 kDa tau na SDS-strani. Patološki tau, rastvorljivo oligomerni i nerastvorljivo vlakno izolovano u S1p i P3 frakcijama tim redom, je korišćeno kao semenje hiperfosforilisanog tau kako bi se izabrao endogeni monomerni humani tau u inkluzije agregatnog tau i da bi se indukovalo tau zasejavanje kod primarnih kortikalnih kultura izolovanih iz rTg4510 miševa.
[0375] Ispitivanje zasejavanja u primarnoj neuronskoj kulturi izolovanoj iz rTg4510 miševa
Mišji kortikalni neuroni (CTX) su izolovani iz embriona dana E14-16 rTg4510 miševa. Pojedinačni transgeni miševi koji aktiviraju tTA vremenski su povezani s pojedinačnim transgenim mutiranim miševima tau odgovora. Trudne ženke eutanazirane su 14-16 dana nakon začeća, a embrioni su genotipizovani moždanom DNK pomoću para prajmera s 5' - GATTAACAGCGCATTAGAGCTG-3' i 5' -GCATATGATCAATTCAAGGCCGATAAG-3 za tTA aktivator transgena i 5' -TGAACCAGGATGGCTGAGCC-3' i 5' - TTGTCATCGCTTCCAGTCCCCG-3' za mutirani transgen odgovora tau, dok su izolirani embrionalni korteksi držani u hibernatu E bez kalcijumhlorida (BrainBits LLC) na 4°C. Korteksi od embriona rTg4510 miševa su izabrani i disocirani neuroni postavljeni u ploče na sudovima od 100 µg/ml obloženim poli-L-lizinom pri gustini od 0.13 x 106 ćelija/cm2 (420,000 ćelije/ml, 100 µl/bunarčić, ploča sa 96 bunarčića) i kultivisani u kondicioniranoj neurobazalnoj podlozi glijalnim ćelijama dopunjenoj sa 2% B-27 suplementom sa antioksidansima, 0.5 mM L-glutamin, 100 U/ml penicilin, 0.1 mg/ml streptomicin (svi rastvori od Gibco-BRL Invitrogen). Neurobazlna podloga kondicionirana glijalnim ćelijama je generisana konfluentskim i neproliferišućim primarnim mišjim astrocitnim kulturama nakon 24 h inkubacije.
Neuroni su uvedeni 4 dana nakon in vitro (DIV) zamenom polovine podloge svežom neruronskom podlogom kondicioniranom gilijalnim ćelijama i posle toga uvođenje je izvođeno svakih sedam dana. Na DIV4 nakon hranjenja neuronske kulture tretirana je 1 µM citozinarabinozida kako bi se zaustavilo
1
proliferisanje ćelija. Odnos glijalnih ćelija u kulturama bio je manji od 10%, kako je ocenjeno antitelom protiv glijalno-fibrilarnog-kiselog proteina (GFAP) na DIV15. CTX iz rTg4510 miševa eksprimira endogeni mišji tau i transgeni humani tau 4R0N. CTX iz rTg4510 miševa sadrži samo normalan humani monomerni ne- i fosforilisani tau prikazan kao 55 kDa tau trake na SDS-strani; nehiperfosforilisane tau vrste (64 i 70 kDa) su prisutne kod naivnih CTX iz rTg4510 miševa. Na DIV7 tau zasejavanje je izazvano inkubiranjem CTX sa patološkim tau semenjem, ili rastvorljivim oligomernim ili nerastvorljivim vlaknom hiperfosforilisanim tau izolovanim u S1p i P3 frakcijama tim redom. Potpuna promena podloge je uvedena naDIV11 kako bi se sprečio unos patološkog tau semenja i tau zasejavanja u CTX je izmereno na DIV15. Tau zasejavanje je okarakterisano izborom monomernog rastvorljivog humanog tau u inkluzije agregatnog i hiperfosforilisanog tau prikazanog kao tau trake pomeren mobilnosti pri višoj molekulskoj masi od 64, 70 i 140 kDa na SDS strani. Oba hiperfosforilisana tau semena, rastvorljivo oligomerno ili nerastvorljivo vlakno iz S1p i P3 frakcije, tim redom, je izazvalo tau zasejavanje jednako u CTX. Da bi se ispitao efekat tau antitela na tau zasejavanje, CTX su tretirani mešavinom 0.1 µl P3 ili 0.2 µl S1p frakcija (koja sadrži 0.2 ng ukupnog humanog tau) izolovanog od miševa rTg4510 starih 40 nedelja i 10 µg antitelo (hC10.2, hC10.2_N32S, hC10.2_A101T_N32S, humana IgG kontrola) ili fosfatom-puferisanog slanog rastvora (PBS). Mešavina tau semena i antitela je prethodno inkubirana tokom 2 h na 4°C pre dodavanja u CTX. Na izvedena je DIV11 potpuna promena podloge u svežu neurobazalnu podlogu kondicioniranu glijalnim ćelijama. Na DIV15 neuroni su lizirani u liznom puferu ledeno hladnog tritona (1% triton X-100 u 50 mM Tris, 150 mM NaCl (pH 7.6) sa 1% mešavinom inhibitora proteaze (Roche), 1% koktelom inhibitora fosfataze I & II (Sigma), i 0.2% benzonaze (Sigma) u uslovima mućkanja na 200 obrtaja u minutu tokom 45 min na 4°C i lizati su korišćeni u Cisbio in vitro ispitivanju agregacije a sadržaj proteina je određen ispitivanjem agregacije a sadržaj proteina je određen ispitivanjem bicinhoninske kiseline (BCA) prema uputstvima proizvođača. Ispitivanje tau agregacije iz Cisbio je bazirano na vremenski razloženom fluorescencijom pomoću istog antitela i za davaoca (Tb3+ konjugovan) i primaoca (d2 konjugovan) antitela u fluorescentni rezonantni prenos energije (FRET) i izveden je prema uputstvima proizvođača. Ukratko, uzorak od 9 µl je pomešan sa 9 µl mešavine antitela i inkubiran je tokom 20 h. Ploča je očitana na čitaču ploče Pherastar kako bi se ocenila vremenski razložena fluorescencija (FRET signal izmerene/integrisan nakon zamene svetla za uzbunu). Ispitivanje meri tau agregaciju, i tau oligomera i vlakana, u moždanom materijalu od rTg4510 miševa i u neuronskim lizatima od tau posejanih CTX izolovanih iz rTg4510 embriona velike specifičnosti i osetljivosti. Rezultati mogu da se vide na Fig.21. Inkubacija P3 ili S1p semenja sa humanim IgG kontrolnim antitelom je dovela do sličnog signala tau agregacije od zasejanih CTX kao inkubacija P3 ili S1p semena sa PBS. Urađen je prosek signala od PBS i humanog IgG kontrolnog antitela i podešeni kao 100% tau agregacije. Tau antitela hC10.2, hC10.2N32S i hC10.2A101T-N32S su značajno smanjila signale tau agregacije i od P3 i od S1p indukovanog tau zasejavanja na DIV15. Rezultati 2 pojedinačna eksperimenta su rezimirani. hC10.2
1
antitelo je smanjilo P3 i S1p indukovano tau zasejavanje za 23%. Varijante hC10.2N32S i hC10.2A101T-N32S su smanjile P3 i S1p indukovano tau zasejavanje za 41-53% i 48-60%, tim redom. Varijante hC10.2N32S i hC10.2A101T-N32S su bile superiornije u odnosu na hC10.2 kod sve manjeg zasejavnaja u CTX od rTg4510 indukovanog hiperfosforilisanim tau semenjem od S1p ili P3 se sastoji od oligomera ili tau vlakna, tim redom.
Primer 10
[0376] Dekoracija koja zavisi od doze tau struktura kod rTg4510 miševa nakon i.v. injekcije hC10-2_N32S_A101T
Postupak:
[0377] rTg4510 miševi stari dvanaest meseci. Ovi transgeni miševi eksprimiraju humani mutirani tau (P301L 0N4R) pod reaktivnim elementom bez prisustva tetraciklina u CamK2 pozitivnim neuronima i pokazuju izraženu tau tau hiperfosforilaciju i stvaranje klupka od 6 meseci starosti pa na dalje. Pored toga, neurodegeneracija je prisutna u dobi od 12 meseci kod rTg4510 miševa u regionima sa jakom patologijom. Miševi su primili pojedinačnu i.v. injekciju u venu repa sa hC10-2_N32S antitelima u dozama od 80 mg/kg, 20 mg/kg, 8 mg/kg i 0.8 mg/kg. Zapremina od 100 mikroL je ubrizgavana po mišu. Tri dana nakon injekcije, miševi su perfuzirani tokom 2 minuta sa PBS nakon čega je usledila 10-minutna perfuzija 4% paraformaldehidom. Mozgovi su kriozaštićeni u 30% saharozi i izrezani na 40 plutajućih kriosekcija koje ne sadrže mikrone. Preseci su inkubirani sa 5% normalnim svinjskim serumom u PBS/1%BSA/0.3%Triton X-100 tokom 20 min, oprane u PBS i konačno inkubirane sa AlexaFluor488-konjugovanim sekundarnim anti-humanim IgG na 1:200 (#709-545-149; Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, USA). Preseci su oprani u PBS, postavljeni i ispitivani fluorescentnom mikroskopijom.
Rezultati:
[0378] I.v. injekcija hC10-2_N32S je dovela do in vivo vezivanja koje cilja strukture uglavnom u hipokampusu i korteksu kod starijih rTg4510 mišjih mozgova (Fig.1). Broj primećenih pozitivnih struktura je varirao među pojedinačnim rTg4510 životinjama. Pozitivni signali u rTg4510 mozgovima se nisu brzo pojavili kao intracelularno bojenje i mogu da predstavljaju ekstracelularni tau materijal koji je otpušten tokom postupka neurodegeneracije. Polukvantitativnim rezultatom, najjači signali (intenzitet fluorescencije i broj pozitivnih struktura) su detektovana kod svih miševa doziranih sa 20 i 80 mg/kg (tabela 6). Obeležene strukture su bile prisutne na 8 mg/kg kod 3 od 4 miša, ali na očigledno nižem nivou od 20 i 80 mg/kg. Intravenska injekcija od 0.8 mg/kg nije dovela do signala iznad pozadine uz primenjen postupak vizualizacije. Zbirno, ovi podaci ukazuju da hC10-2_N32S antitela na dozno zavistan
1
način mogu da prodru u parenhim mozga u specifično dekoriše ciljeve kod rTg4510 miševa in vivo. Fig. 22
Tabela 6
Stariji Tg4510 hC10-2_N32S i.v. Fluorescentni Intenzitet (u odnosu na 80
[0379] Fluorescencijom obeležene tau strukture detektovane u delovima mozga nakon i.v. injekcije hC10-2_N32S. Polukvantitativni rezultat: ++ jak; + umeren; slab; 0 nije detektovan.
Primer 11 Patologija semena tau u tau
Priprema semena
[0380] Uzorci zamrznutog kortikalnog tkiva od davalaca sa AB su dobijeni od Tissue Solutions (Glazgov, UK). Tkivo mozga je izmereno i homogenizovano pomoću homogenizatora noža u sterilnom hladnom PBS (zapremine 10 puta veće od uzorka mozga). Homogenat je zatim sonikovan pulsevima 5 x 0.9 sekundi na Bransonovom setu za sonifikaciju na izlazu 2. Homogenat je centrifugiran na 3000 g tokom 5 minuta na 4°C a supernatant je alikvotiran, brzinski zamrznut na ledu i čuvan na -80°C do upotrebe.
Životinje korišćene u ispitivanju
[0381] Korišćeni su transgeni miševi koji eksprimiraju humani mutirani tau (P301L 0N4R) u elementu transaktivatora kontrolisanom tetraciklinom u CamKII-pozitivnim neuronima (rtg4510). Ovaj model normalno počinje da razvija tau patologiju u uzrastu od 3-4 meseca. Hranjenjem majki doksiciklinom tokom trudnoće i tokom prve 3 nedelje života mladunca, patologija se razvija u kasnijoj fazi (posle uzrasta od 6 meseci). Miševi koji su prethodno tretirani doksiciklinom koji su korišćeni u ispitivanjima su bili 2,5 meseca stari u vreme zasejavanja.
Lečenje antitelima
[0382] Antitela su pripremljena u koncentraciji od 1,5 mg/ml u sterilnom PBS i od njih su napravljeni alikvoti sa dovoljno antitela za vremensku tačku jednog doziranja. Alikvoti su čuvani na 4°C dok nisu bili iskorišćeni. Od 2 meseca starosti do žrtvovanja sa 5,5 meseci miševi su primali nedeljnu IP dozu antitela
11
(15 mg/kg jednako 10 ml/kg). Korišćena antitela: kontrolna humana B12-IgGI, hC10-2, hC10-2_N32S i hC10-2_N32S_A101T.
Stereostatička injekcija
[0383] Neposredno nakon primanja 3. doze antitela, miševi su anestezirani udisanjem izoflourana i fiksirani u stereostatičkom okviru. Lobanja je izložena a pozicioniranje prilagođeno do nivoa bregma i lamda. Izbušena je rupa u lobanji 2 mm lateralno (desno) i 2.4 mm ispred bregma. Špric od 10 µl sa opsegom 26, sa zakrivljenim vrhom (SGE) je korišćen za ubrizgavanje materijala za zasejavanje 1.4 mm ventralno od površine mozga.
[0384] Dva µl materijala su blago infuzirana na mestu i špric je nakon toga ostavljen tokom dodatnih 5 minuta pre uvlačenja. Rana je zatvorena i zašivena a miševi su imali termičku potporu tokom oporavka od anestezije. Miševi su zatim čuvani tokom 3 meseca pre fiksiranja perfuzijom sa 4% paraformaldehidom.
Histologija
[0385] Fiksirani mozgovi su obrađeni u Neuroscience Associates (Knoxville, TN) upotrebom MultiBrain® tehnologije. Do 25 mišjih mozgova je zajedno umetnuto po bloku i zamrznuto postupkom smrznutog preseka na 35 µm u kontrolnoj koronalnoj ravni kroz ceo mozak. Svaki 6. presek je obojen Gallyas srebrnom bojom kako bi se otkrila neurofibrilarna klubad. Sekcije su postavljene, prekrivene pokrovnim staklom i prebrojani su neuroni koji su pozitivni na Gallyas srebrnu boju (soma) u ubrizganoj strani hipokampusa svih mozgova koji su bili uključeni. Osam preseka je prebrojano po mozgu. Rezultati odražavaju zbir pozitivnih neurona iz 8 sekcija.
Rezultat
[0386] hC10-2, hC10-2_N32S i hC10-2_N32S_A101T su svi značjano smanjili zasejavanje tau klubadi u ubrizganom hipokampusu (jednosmerna anova i Takijev test višestrukim poređenjem). hC10-2: 50%, hC10-2_N32S: 47% i hC10-2_N32S_A101T: 60% u odnosu na miševe tretirane kontrolom. Fig.23.
11
11
11
11
11
11
12
12
12
��
12
12
12
1
11
12
1
14
1
1
1
�
1
��
14
14
14
14
14
14
1

Claims (5)

  1. Patentni zahtevi 1. Monoklonalno antitelo koje obuhvata (a) laki lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:16; i (b) teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:11, ili (a) laki lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:16; i (b) teški lanac koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:24.
  2. 2. Monoklonalno antitelo prema zahtevu 1, koje obuhvata (a) laki lanac sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:16; i (b) teški lanac sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:11.
  3. 3. Monoklonalno antitelo prema zahtevu 1, koje obuhvata (a) laki lanac sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:16; i (b) teški lanac sa aminokiselinskom sekvencom iz SEQ ID NO:24.
  4. 4. Monoklonalno antitelo prema zahtevima 1-3 za upotrebu u lečenju tauopatije odabrane iz grupe koju čine Alchajmerova bolest, bolest argirofilnih zrnaca (AGD), psihoza, određenije psihoza usled AB ili psihoza kod pacijenata sa AB, apatija usled AB ili apatija kod pacijenata sa AB, psihijatrijski simptomi pacijenata sa demencijom sa Levijevim telima, progresivna supranuklearna palsija (PSP), frontotemporalna demencija (FTD ili njene varijante), TBI (traumatska povreda mozga, akutna ili hronična), kortikobazalna degeneracija (CBD), Pikova bolest, primarna tauopatija povezana sa uzrastom (PART), senilna demencija sa predominantnim neurofibrilarnim klupkom, demencija puglistika, hronična traumatska encefalopatija, moždani udar, oporavak od moždanog udara, neurodegeneracija povezana sa Parkinsonovom bolešću, Parkinsonizam povezan sa hromozomom, Lytico-Bodigova bolest (Parkinsondemencija kompleks sa Gvama), gangliogliom i gangliocitom, meningioangiomatoza, postencefalopatski parkinsonizam, subakutni sklerozirajući panencefalitis, Hantingtonova bolest, olovna encefalopatija, tuberozna skleroza, Hallervorden-Spatzova bolest i lipofuscinoza.
  5. 5. Monoklonalno antitelo za upotrebu prema zahtevu 4 za lečenje Alchajmerove bolesti.
RS20210397A 2016-07-12 2017-07-07 Antitela specifična za hiperfosforilisan tau i postupci njihove primene RS61646B1 (sr)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DKPA201600416 2016-07-12
DKPA201700008 2017-01-04
DKPA201700005 2017-01-04
DKPA201700179 2017-03-14
PCT/EP2017/067067 WO2018011073A1 (en) 2016-07-12 2017-07-07 Antibodies specific for hyperphosphorylated tau and methods of use thereof
EP17739940.9A EP3484916B1 (en) 2016-07-12 2017-07-07 Antibodies specific for hyperphosphorylated tau and methods of use thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS61646B1 true RS61646B1 (sr) 2021-04-29

Family

ID=60941665

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20210397A RS61646B1 (sr) 2016-07-12 2017-07-07 Antitela specifična za hiperfosforilisan tau i postupci njihove primene

Country Status (41)

Country Link
US (6) US10472415B2 (sr)
EP (2) EP3878864A1 (sr)
JP (2) JP7029415B2 (sr)
KR (1) KR102551971B1 (sr)
CN (2) CN109618556B (sr)
AU (2) AU2017295608B2 (sr)
BR (1) BR112018004916A2 (sr)
CA (1) CA3027561A1 (sr)
CL (1) CL2019000082A1 (sr)
CO (1) CO2018014325A2 (sr)
CY (1) CY1123995T1 (sr)
DK (1) DK3484916T3 (sr)
DO (1) DOP2018000281A (sr)
EC (1) ECSP19005417A (sr)
ES (1) ES2862427T3 (sr)
GE (1) GEP20217222B (sr)
HR (1) HRP20210522T1 (sr)
HU (1) HUE053679T2 (sr)
IL (1) IL263530B2 (sr)
JO (1) JOP20180117B1 (sr)
LT (1) LT3484916T (sr)
MA (2) MA56165A (sr)
MX (1) MX2019000476A (sr)
MY (1) MY197836A (sr)
NI (1) NI201900003A (sr)
NZ (1) NZ748983A (sr)
PE (1) PE20190227A1 (sr)
PH (1) PH12018502613B1 (sr)
PL (1) PL3484916T3 (sr)
PT (1) PT3484916T (sr)
RS (1) RS61646B1 (sr)
RU (1) RU2760875C1 (sr)
SG (1) SG11201811015RA (sr)
SI (1) SI3484916T1 (sr)
SM (1) SMT202100194T1 (sr)
SV (1) SV2019005807A (sr)
TN (1) TN2018000419A1 (sr)
TW (1) TWI747922B (sr)
UA (1) UA124104C2 (sr)
WO (1) WO2018011073A1 (sr)
ZA (1) ZA201808329B (sr)

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK2767532T3 (en) 2012-12-21 2016-09-12 Nat Inst For Quantum And Radiological Science And Tech New connection for reproduction of tau protein heavy in the brain.
NZ775762A (en) 2015-06-05 2025-02-28 Genentech Inc Anti-tau antibodies and methods of use
JO3711B1 (ar) 2015-07-13 2021-01-31 H Lundbeck As أجسام مضادة محددة لبروتين تاو وطرق استعمالها
PH12018502613B1 (en) 2016-07-12 2023-02-01 H Lundbeck As Antibodies specific for hyperphosphorylated tau and methods of use thereof
UA128383C2 (uk) 2016-12-07 2024-07-03 Дженентек, Інк. Антитіло до тау-білка та спосіб його застосування
MX2019006330A (es) 2016-12-07 2019-09-26 Genentech Inc Anticuerpos anti-tau y metodos de uso.
CN110267985B (zh) * 2017-01-04 2023-05-23 H.隆德贝克有限公司 用于治疗眼科疾病的特异性针对过度磷酸化τ蛋白的抗体
SG11201907422RA (en) 2017-02-17 2019-09-27 Denali Therapeutics Inc Anti-tau antibodies and methods of use thereof
CN111201030B (zh) 2017-07-25 2024-11-01 真和制药有限公司 通过阻断tim-3和其配体的相互作用治疗癌症
AU2018352308B2 (en) 2017-10-16 2025-06-05 Eisai R&D Management Co., Ltd. Anti-tau antibodies and uses thereof
WO2019149798A1 (en) * 2018-02-01 2019-08-08 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Binding molecules that specifically bind to tau
CA3093200A1 (en) * 2018-03-05 2019-09-12 Janssen Pharmaceutica Nv Anti-phf-tau antibodies and uses thereof
TW201946624A (zh) 2018-05-09 2019-12-16 新旭生技股份有限公司 雜芳基化合物及其用途
US20210393621A1 (en) 2018-10-26 2021-12-23 The Research Foundation For The State University Of New York Combination serotonin specific reuptake inhibitor and serotonin 1a receptor partial agonist for reducing l-dopa-induced dyskinesia
US12365724B2 (en) 2018-12-10 2025-07-22 New York University Antibodies binding to phospho-tau comprising phosphorylated Ser396 and Ser404 and methods of detecting thereof
WO2020160156A2 (en) 2019-01-30 2020-08-06 Immutics, Inc. Anti-gal3 antibodies and uses thereof
CN113748343A (zh) 2019-03-28 2021-12-03 H.隆德贝克有限公司 pS396测定用于诊断TAU蛋白病的用途
JP7181438B2 (ja) 2019-08-06 2022-11-30 アプリノイア セラピューティクス リミテッド 病理学的タウ種に結合する抗体及びその使用
CN114728071B (zh) 2019-11-13 2024-12-06 新旭生技股份有限公司 用于降解tau蛋白聚集体的化合物及其用途
EP4157338A4 (en) 2020-05-26 2024-11-13 TrueBinding, Inc. METHOD FOR TREATING INFLAMMATORY DISEASES BY GALECTIN-3 BLOCKING
US20250258180A1 (en) 2021-07-27 2025-08-14 Stand Therapeutics Co., Ltd. Peptide tag and nucleic acid encoding same
US12129302B2 (en) * 2021-08-25 2024-10-29 Ibio, Inc. Anti-CD-25 antibody
WO2025090817A1 (en) * 2023-10-24 2025-05-01 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Tau active functional assays

Family Cites Families (72)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
JPS5896026A (ja) 1981-10-30 1983-06-07 Nippon Chemiphar Co Ltd 新規ウロキナ−ゼ誘導体およびその製造法ならびにそれを含有する血栓溶解剤
DE3380726D1 (en) 1982-06-24 1989-11-23 Japan Chem Res Long-acting composition
US4681581A (en) 1983-12-05 1987-07-21 Coates Fredrica V Adjustable size diaper and folding method therefor
US4766106A (en) 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4735210A (en) 1985-07-05 1988-04-05 Immunomedics, Inc. Lymphographic and organ imaging method and kit
US5101827A (en) 1985-07-05 1992-04-07 Immunomedics, Inc. Lymphographic and organ imaging method and kit
US5776093A (en) 1985-07-05 1998-07-07 Immunomedics, Inc. Method for imaging and treating organs and tissues
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US4861581A (en) 1986-12-05 1989-08-29 Cancer Biologics, Inc. Detection of necrotic malignant tissue and associated therapy
US5750172A (en) 1987-06-23 1998-05-12 Pharming B.V. Transgenic non human mammal milk
US5648471A (en) 1987-12-03 1997-07-15 Centocor, Inc. One vial method for labeling antibodies with Technetium-99m
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
DK0486622T3 (da) 1989-08-09 1999-07-19 Rhomed Inc Direkte radiomærkning af antistoffer og andre proteiner med technetium eller rhenium
US5633076A (en) 1989-12-01 1997-05-27 Pharming Bv Method of producing a transgenic bovine or transgenic bovine embryo
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
WO1993012227A1 (en) 1991-12-17 1993-06-24 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
ATE158021T1 (de) 1990-08-29 1997-09-15 Genpharm Int Produktion und nützung nicht-menschliche transgentiere zur produktion heterologe antikörper
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
WO1992022645A1 (en) 1991-06-14 1992-12-23 Genpharm International, Inc. Transgenic immunodeficient non-human animals
EP1400536A1 (en) 1991-06-14 2004-03-24 Genentech Inc. Method for making humanized antibodies
CA2113113A1 (en) 1991-07-08 1993-01-21 Simon W. Kantor Thermotropic liquid crystal segmented block copolymer
DK0618968T3 (da) 1991-12-06 2000-04-10 Max Planck Gesellschaft Midler til diagnostisering og behandling af Alzheimer's sygdom
WO1994019935A1 (en) 1993-03-09 1994-09-15 Genzyme Corporation Isolation of components of interest from milk
JPH08509612A (ja) 1993-04-26 1996-10-15 ジェンファーム インターナショナル インコーポレイテッド 異種抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
US6077835A (en) 1994-03-23 2000-06-20 Case Western Reserve University Delivery of compacted nucleic acid to cells
KR970029803A (ko) 1995-11-03 1997-06-26 김광호 반도체 메모리장치의 프리차지 회로
WO2000046147A2 (en) 1999-02-03 2000-08-10 Biosante Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic calcium phosphate particles and methods of manufacture and use
US6281005B1 (en) 1999-05-14 2001-08-28 Copernicus Therapeutics, Inc. Automated nucleic acid compaction device
MXPA02000962A (es) 1999-07-29 2002-07-02 Medarex Inc Anticuerpos monoclonales humanos para her2/neu.
EP1212422B1 (en) 1999-08-24 2007-02-21 Medarex, Inc. Human ctla-4 antibodies and their uses
US20030162230A1 (en) 2000-09-27 2003-08-28 Reagan Kevin J. Method for quantifying phosphokinase activity on proteins
CA2430013C (en) 2000-11-30 2011-11-22 Medarex, Inc. Transgenic transchromosomal rodents for making human antibodies
AT500379B8 (de) * 2001-02-02 2009-08-15 Axon Neuroscience Tau-proteine
MXPA05000511A (es) 2001-07-12 2005-09-30 Jefferson Foote Anticuepros super humanizados.
US8003108B2 (en) 2005-05-03 2011-08-23 Amgen Inc. Sclerostin epitopes
WO2007019273A2 (en) 2005-08-04 2007-02-15 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Phosphorylation of tau by abl
CA2631184A1 (en) 2005-11-28 2007-05-31 Genmab A/S Recombinant monovalent antibodies and methods for production thereof
JP5588866B2 (ja) 2007-08-10 2014-09-10 メダレックス エル．エル．シー． Ｈｃｏ３２およびｈｃｏ２７、ならびに関連実施例
EP2527369A3 (en) * 2007-09-13 2012-12-19 University Of Zurich Prorektorat Forschung Monoclonal amyloid beta (abeta)-specific antibody and uses thereof
CN106390107B (zh) 2009-06-10 2019-12-31 纽约大学 病理tau蛋白的免疫靶向
US8609097B2 (en) 2009-06-10 2013-12-17 Hoffmann-La Roche Inc. Use of an anti-Tau pS422 antibody for the treatment of brain diseases
MY164376A (en) 2010-10-07 2017-12-15 Univ Leuven Kath Phosphospecific antibodies recognizing tau
CA2813493C (en) 2010-10-11 2019-07-09 University Of Zurich Human anti-tau antibodies
JP6457263B2 (ja) * 2011-05-20 2019-01-23 オリゴメリックス インコーポレイテッド タウプロテアーゼ組成物および使用方法
KR101981351B1 (ko) * 2011-10-07 2019-09-02 에이씨 이뮨 에스.에이. 타우를 인식하는 포스포특이적 항체
RU2644242C2 (ru) 2012-04-05 2018-02-08 Ац Иммуне С.А. Гуманизированное тау-антитело
SG10201708959WA (en) 2012-07-03 2017-11-29 Univ Washington Antibodies to tau
NZ630542A (en) 2012-08-16 2017-06-30 Ipierian Inc Methods of treating a tauopathy
US10501531B2 (en) 2013-03-13 2019-12-10 Prothena Biosciences Limited Tau immunotherapy
WO2014170549A1 (en) 2013-04-16 2014-10-23 Glykos Finland Oy A method for generating induced pluripotent stem cells
GB201312226D0 (en) * 2013-07-08 2013-08-21 Adx Neurosciences Improved antibodies
US10472514B2 (en) 2014-01-23 2019-11-12 Asahi Kasei Kabushiki Kaisha Block copolymer composition and adhesive composition
CN107073297B (zh) 2014-07-08 2021-09-14 纽约大学 Tau显像配体和其在Tau蛋白病的诊断和治疗中的用途
JO3711B1 (ar) * 2015-07-13 2021-01-31 H Lundbeck As أجسام مضادة محددة لبروتين تاو وطرق استعمالها
PH12018502613B1 (en) 2016-07-12 2023-02-01 H Lundbeck As Antibodies specific for hyperphosphorylated tau and methods of use thereof
US10364286B2 (en) 2016-12-22 2019-07-30 H. Lundbeck A/S Monoclonal anti-alpha-synuclein antibodies for preventing tau aggregation
CN110267985B (zh) 2017-01-04 2023-05-23 H.隆德贝克有限公司 用于治疗眼科疾病的特异性针对过度磷酸化τ蛋白的抗体
US10934438B2 (en) 2017-04-27 2021-03-02 Axalta Coating Systems Ip Co., Llc Coatings and methods for using and producing the same

Also Published As

Publication number Publication date
NZ748983A (en) 2022-12-23
MX2019000476A (es) 2019-06-10
PT3484916T (pt) 2021-03-31
UA124104C2 (uk) 2021-07-21
MA45655A (fr) 2019-05-22
SMT202100194T1 (it) 2021-05-07
EP3878864A1 (en) 2021-09-15
TW201809004A (zh) 2018-03-16
GEP20217222B (en) 2021-02-10
MA45655B1 (fr) 2021-04-30
BR112018004916A2 (en) 2018-12-11
RU2760875C1 (ru) 2021-12-01
JP2022023096A (ja) 2022-02-07
ZA201808329B (en) 2020-02-26
PE20190227A1 (es) 2019-02-13
IL263530B (en) 2022-10-01
US11111290B2 (en) 2021-09-07
US20190284265A1 (en) 2019-09-19
CL2019000082A1 (es) 2019-04-05
ES2862427T3 (es) 2021-10-07
ECSP19005417A (es) 2019-01-31
SG11201811015RA (en) 2019-01-30
PH12018502613A1 (en) 2019-09-30
US10472415B2 (en) 2019-11-12
JP7029415B2 (ja) 2022-03-03
IL263530B2 (en) 2023-02-01
HUE053679T2 (hu) 2021-07-28
JP2019529336A (ja) 2019-10-17
AU2017295608B2 (en) 2024-01-04
US20220177557A1 (en) 2022-06-09
WO2018011073A1 (en) 2018-01-18
NI201900003A (es) 2020-04-27
PL3484916T3 (pl) 2021-07-19
US20200109192A1 (en) 2020-04-09
EP3484916A1 (en) 2019-05-22
LT3484916T (lt) 2021-04-26
MA56165A (fr) 2022-04-20
JOP20180117B1 (ar) 2022-03-15
TN2018000419A1 (en) 2020-06-15
JOP20180117A1 (ar) 2019-01-30
MY197836A (en) 2023-07-20
PH12018502613B1 (en) 2023-02-01
AU2024201450A1 (en) 2024-03-28
US20250257124A1 (en) 2025-08-14
AU2017295608A1 (en) 2018-12-20
SI3484916T1 (sl) 2021-08-31
US10647762B2 (en) 2020-05-12
KR20190028436A (ko) 2019-03-18
TWI747922B (zh) 2021-12-01
US20190284266A1 (en) 2019-09-19
US12129289B2 (en) 2024-10-29
KR102551971B1 (ko) 2023-07-07
CN109618556A (zh) 2019-04-12
CN109618556B (zh) 2022-10-21
IL263530A (en) 2019-01-31
JP7244600B2 (ja) 2023-03-22
EP3484916B1 (en) 2021-03-03
HRP20210522T1 (hr) 2021-05-14
US10487142B2 (en) 2019-11-26
SV2019005807A (es) 2019-02-13
CO2018014325A2 (es) 2019-01-18
CN116041504A (zh) 2023-05-02
DK3484916T3 (da) 2021-04-06
US20180016330A1 (en) 2018-01-18
CY1123995T1 (el) 2022-05-27
CA3027561A1 (en) 2018-01-18
DOP2018000281A (es) 2019-02-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12129289B2 (en) Antibodies specific for hyperphosphorylated tau and methods of use thereof
US11739140B2 (en) Antibodies specific for hyperphosphorylated tau and methods of use thereof
US10995137B2 (en) Antibodies specific for hyperphosphorlated tau for the treatment of ocular diseases
HK40059227A (en) Antibodies specific for hyperphosphorylated tau and methods of use thereof
CA2990555C (en) Antibodies specific for hyperphosphorylated tau and methods of use thereof
HK40007700B (en) Antibodies specific for hyperphosphorylated tau and methods of use thereof
HK40007700A (en) Antibodies specific for hyperphosphorylated tau and methods of use thereof
EA039569B1 (ru) Антитела, специфичные к гиперфосфорилированному тау-белку, и способы их применения