RS61705B1 - Vezujući molekuli koji vezuju pd-l1 i lag-3 - Google Patents

Description

Opis

Povezane prijave

[0001] Predmetni slučaj je povezan sa US 62/352482 koji je podnet 20 juna 2016.

Oblast pronalaska

[0002] Predmetni pronalazak se odnosi na molekule antitela koja se vezuju za ligand-1 programirane ćelijske smrti (PD-L1) i limfocitni aktivacijski gen 3 (LAG-3). Molekuli antitela se sastoje iz mesta za vezivanje antigena zasnovanog na CDR-u za PD-L1, i LAG-3 antigen vezujućeg mesta koje je locirano u dve ili više strukturnih petlji CH3 domena molekula antitela. Molekuli antitela iz pronalaska nalaze primenu, na primer, u terapiji kancera.

Stanje tehnike pronalaska

[0003] Limfocitni aktivacijski gen-3 (LAG-3; CD223) je član supefamilije Ig, i genetički i strukturno je povezan sa CD4 (iako je samo 20% identičan u sekvenci). Kao i CD4, LAG-3 se vezuje za molekule MHC klase II ali sa većim afinitetom u odnosu na CD4 (KD= 60 nM). LAG-3 je eksprimiran na aktiviranim T ćelijama, NK ćelijama, pDC-a, B ćelijama, γδ T ćelijama i učestvuje u imunskoj supresiji, naročito preko istrajne snažne ekspresije u procentu regulatornih T ćelija (eng.Tregs) (Liang et al, 2008).

[0004] LAG-3 gen je lociran na humanom hromozomu 12, u blizini CD4 gena, i prostire se na 8 egzona. Postoji pet alternativnih transkripata, pri čemu dva proizvode proteinske proizvode: transmembranski protein pune dužine i alternativno splajsovani rastvorljivi monomerni oblik. Transkript pune dužine kodira za protein od 525 aminokiselina sa molekulskom masom od 70 kDa i ima funkcionalnu aktivnost, dok se rastvorljivi oblik izgleda ne vezuje za molekule MHC klase II i njegova funkcija nije poznata. Humani protein LAG-3 pune dužine je 93% identičan u sekvenci sa Macaca fascicularis (cinomolgus majmun) LAG-3 i 70% identičan u sekvenci sa Mus musculus (kućni miš) LAG-3.

[0005] LAG-3 je transmembranski protein sa četiri vanćelijska domena slična Ig (D1-D4), i citolazmatskim delom odgovornim za LAG-3 signalizaciju. Citoplazmatski domen ima EP (glutaminska kiselina/prolin) motiv koji se udružuje sa LAG-3-povezanim proteinom (LAP) kao i sa KIEELE motivom za kog se smatra da je neophodan za LAG-3 modulaciju funkcije T ćelije. Izveštaji o ulozi EP motiva ukazuju da može da bude odgovoran za kretanje (eng. trafficking) LAG-3 do površine membrane T ćelije (Bae et al, 2014), ili može da bude direktno odgovoran za modulaciju nishodne signalizacije STAT5 tokom ativacije T ćelije (Durham et al, 2014), ili moguće oba.

[0006] Smatra se da je imuno-suppresivni mehanizam LAG-3 na T ćelijama pokrenut sa unakrsnim vezivanjem LAG-3 na aktiviranim T ćelijama što dovodi do smanjenog fluksa kalcijuma i oslobađanja IL-2 tokom T ćelijske aktivacije (Huard et al, 1997). Na antigen prezentujućim ćelijama (APCs), vezivanje za MHC II molekule sa LAG-3 pozitivnim regulatornim T ćelijama uzrokuje smanjenu sekreciju IL-12 i nishodnu regulaciju CD86 (Liang et al, 2008), aktivaciju "sekunardnog signala", dovodeći do anergije T ćelije zbog neodgovarajuće aktivacije i/ili smanjenog prezentovanja antigena od strane APCs. Modeli miševa sa izbačenim (eng. knock-out) genom za LAG-3 su vijabilni, sa samo blagom limfohiperproliferacijom (Workman et al, 2003), što ukazuje da LAG-3 ima ulogu umerene imunske "kočnice".

[0007] Takođe je predloženo da se ova supresivna interakcija između LAG-3 i MHC klase II događa između Treg-a i CD4 pozitivnih T ćelija (Sega et al, 2014). Treg-e suprimiraju imunski odgovor ili preko oslobađanja supresivnih citokina (kao što su IL-10 i TGFβ), manipulacijom inflamatornog metabolizma (kao što je CD73 katabolisan adenozin), regulacijom sazrevanja APC, ili direktnom interakcijom između regulatornih T ćelija i efektorskih T ćelija. Postoji dokaz kod ljudi da su MHC klasa II pozitivne Treg-e supresivnije u odnosu na MHC klasa II negativne Treg-e (Baecher-Allen et al, 2006) i aktivno suprimiraju imunski odgovor kroz direktnu interakciju između LAG-3 eksprimiranog na efektorskim T ćelijama. Dok LAG-3 negativne Treg-e mogu da suprimiraju podrazumevanu proliferaciju T ćelija, LAG-3 negativne CD4 i CD8 T ćelije su rezistentne na Treg imunsku supresiju. Opisano je da se ovaj postupak dešava između humanih T ćelija kroz postupak koji je poznat pod imenom trogocitoza (Sega et al, 2014) gde Treg-e ne samo da sprečavaju sazrevanje APC već takođe dobijaju MHC klasu II da bi suprimirale prajmovane LAG-3 pozitivne CD4 T ćelije.

[0008] Ekspresija LAG-3 je takođe marker ponovljene antigenske stimulacije. U kanceri, T ćelije obično usvoje "iscrpljeni" fenoip, uključujući ekspresiju imuno-supresora kao što su PD-1, CTLA-4, TIM-3, i LAG-3 (Wherry et al, 2011), u kome ćelije generalno nisu sposobne da ispravno proliferišu i sekretuju hemokine u odgovoru na antigen. Inhibicija ovih imunskih-supresora snižava imunski prag i (ponovo)omogućuje odgovarajući anti-kancerozni odgovor od strane T ćelija. U prekliničkim modelima, ovo je sprovedeno korišćenjem antagonista antitela protiv LAG-3, CTLA-4 i PD-1 gde je uočeno smanjenje u tumorskom opterećenju. Smatra se da LAG-3 inhibicija od strane antagonističkih antitela reaktiviše imunski odgovor u mikrookruženju tumora, pri čemu ekspresija LAG-3 na CD4 pozitivnim T ćelijama i CD8 pozitivnim T ćelijama je povezana sa iscrpljenim fenotipom, i LAG-3 ekspresija na Trega je povezana sa potentnim imuno-supresivnim svojstvima. Antitela koja blokiraju povećanje proiliferacije LAG-3 T efektorske ćelije, proizvodnju citokina, citotoksičnost, i smanjenje Treg supresorske aktivnosti dovodi do smanjenja u tumorskom rastu.

[0009] U humanim tumorima, povećana ekspresija LAG-3 je pronađena na tumor-infiltrirajućim limfocitima (TILs) iz karcinoma humanih ćelija bubrega i drugih tumora, kao što su melanomi i limfomi (Demeure et al, 2001; Wolchock et al, 2013). Što je važno, LAG-3 je takođe bliko povezan sa disfunkcijom T ćelije kod pacijenata sa hroničnom virusnom infekcijom (Workman et al, 2005) i kancerom (Workman et al, 2003). LAG-3 je takođe bio identifikovan kao površinski marker za tumorinfiltrirajuće Treg-e kod raznih humanih kancera (Camisachi et al.2010; Gandhi et al, 2006).

[0010] Monoklonska antitela specifična za humani LAG-3 su u kliničkom razvoju da se ukine imunska supresija i potencijalno pojača prezentovanje antigena u kancerima (čvrsti i hematološki maligniteti).

[0011] LAG-525 i IMP-701 (Novartis AG), su humana antitela specifična za LAG-3 i napredovala su do Faze II i I kliničkih ispitivanja, redom, u kanceru bubrega (kancer bubrežne ćelije); nesitnoćelijski kancer pluća (NSCLC); nazofaringealni kancer; kolorektalni kancer; melanom; kancer želudca i adenokarcinom gastroezofagealne veze.

[0012] Anti-LAG-3 antitelo BMS-986016 (Bristol-Myers Squibb Company), je trenutno u Fazi I kliničkog ispitivanja za kancer ovarijuma; NSCLC; kolorektalni kancer; kancer cerviksa; melanom; kancer želudca; kancer bešike; kancer glave i vrata karcinom skvamoznih ćelija; karcinom bubrežne ćelije i u Fazi II ispitivanja kod NSCLC; Relapsna hronična limfocitna leukemija (CLL); Refraktorna hronična limfocitna leukemija (CLL); Melanom; Ne-Hodčkinov Limfom; Hodčkinov Limfom; Difuzni B-krupnoćelijski limfom; Indolentni Limfom; Limfom mantle ćelija; Refraktorni multipli mijelom; i Relapsni Multipli mijelom ili kao monoterapija ili kao deo kombinovanih terapija.

[0013] Dalje, antitela koja su specifična za LAG-3 takođe se nalaze u prekliničkom razvoju.

[0014] Programirana ćelijska smrt 1 (PD-1) i njegovi ligandi PD-L1 (CD274, B7-H1) i PD-L2 (B7-DC) isporučuju inhibiorne signale koji regulišu ravnotežu između aktivacije T ćelije, tolerance, i imunopatologije. PD-L1 je prolazno eksprimiran na svim imunskim ćelijama i na nekim tumorskim ćeljama.

[0015] PD-L1 je tip I transmembranskog proteina sa dva domena slična Ig u vanćelijskom regionu, transmembranskim domenom i kratkim citoplazmatskim domenom. Citoplazmatski domen nema poznati motiv signalne transdukcije što ukazuje da nema signalizacije od PD-L1 nakon interakcije liganda sa njegovim receptorom. Njegova molekulska masa je 40 kDa (290 aminokiselina) i kodiran je od strane CD274 gena koji se nalazi na mišjem hromozomu 19 i na humanom hromozomu 9, redom. PD-L1 je član B7 proteinske familije i deli približno 20 % identiteta u sekvenci aminokiselina sa B7.1 i B7.2. Humani PD-L1 deli 70 % i 93 % identiteta u aminokiselinama sa mišjim i cinomolgus ortolozima PD-L1, redom.

[0016] PD-L1 se vezuje za njegov receptor PD-1 sa afinitetom (KD) od 770 nM. PD-1 je eksprimiran na aktiviranim T ćelijama, B ćelijama, i mijeloidnim ćelijama, i modulira aktivaciju ili inhibiciju ćelijskih imunskih odgovora. Vezivanje PD-L1 sa PD-1 isporučuje inhibitorni signal, smanjuje proizvodnju citokina i proliferaciju T ćelija. Prema tome, ekspresija PD-L1 od strane ćelija može da posreduje u zaštiti protiv ubijanja citotoksičnim T limfocitom (CTL) i predstavlja regulatorni mehanizam koji čini manje snažim hronične imunske odgovore tokom virusnih infekcija. Kancer, kao hronična i proinflamatorna bolest ruši ovaj imunozaštitni put preko pojačane regulacije ekspresije PD-L1 kako bi se izbegao imunski odgovor domaćina. U kontekstu aktivnog imunskog odgovora, IFNγ takođe pojačano reguliše ekspresiju PD-L1.

[0017] PD-L1 takođe posreduje u imunskog supresiji kroz interakciju sa drugim proteinom, B7.1 (takođe poznatim pod imenom CD80), blokirajući njegovu sposobnost da isporuči jedan od sekundarnih aktivirajućih signala na T ćelijama preko CD28. U terminima ekspresije PD-L1 na tumorskim ćelijama i njegovo angažovanje sa B7.1, značaj ove specifične interakcije u tumoru još uvek nije jasan.

[0018] Ekspresija PD-L1 je takođe pokazana u širokom opsegu čvrstih tumora. Od 654 uzoraka ispitanih u jednoj studiji, koja obuhvata 19 tumora sa različitih mesta, 89 (14%) je bilo pozitivno za PD-L1 (≥5% učestanost). Najveće učestanosti pozitivnih za PD-L1 su uočene u glavi i vratu (17/54; 31%), cervikalni (10/34; 29%), kanceru nepoznatog primarnog nastanka (CUP; 8/29; 28%), glioblastom (glioblastoma multiforme) (GBM; 5/20; 25%), bešike (8/37; 21%), jednjaka (16/80; 20%), tros-negativnog kancera (TN) grudi (6/33; 18%), i hepatokarcinoma (6/41; 15%) (Grosso et al, 2013). Pokazano je sa ekspresija PDL1 povezana sa tumorom pruža imunsku rezistenciju i potencijalno štiti tumorske ćelije od T ćelijski posredovane apoptoze.

[0019] Terapije kojima se cilja PD-L1 su pokazale odlične rezultate u mišjim in vivo ispitivanjima. U B16 mišjem modelu melanoma, tretman sa anti-PD-L1 kombinovan ili sa GVAX ili FVAX vakcinacionim strategijama doveo je do značajnog efekta i na preživljavanje (30 dana za kontrolne u odnosu na 52 dana na PD-L1-tretirane) i procenta životinja bez tumora (5%) po zaključku ispitivanja (Curran et al, 2010). Anti-PD-L1 terapija je takođe korišćena da bi se ispitao mehanizam imunske supresije u P815 modelu mišjeg mastoma. P815 ćelije ubrizgane u miševe normalno pokreću snažan imunski odgovor, koji rezultuje u njihovom odbacivanju. Kada je PD-L1 eksprimiran na P815 ćelijama, ove ćelije izbegavaju imunski napad, koji sa druge strane može da bude poništen kroz davanje anti-PD-L1 antitela (Iwai et al, 2002). Očigledno je da ciljanje PD-1/PD-L1 ose kod imunogenih humanih kancera (Herbst et at, 2014) rezultuje u prednosti u preživljavanju kroz stimulaciju anti-kanceroznog imunskog odgovora (Wolchock et al, 2013; Larkin et al, 2015).

[0020] Atezolizumab (MPDL3280A, RG7466, TECENTRIQ) je humanizovano IgG1 antitelo koje se vezuje za PD-L1. U kliničkim ispitivanjima kao pojedinačno sredstvo i takođe u kombinaciji sa drugim biologicima i/ili terapijama malim molekulima za lčnj čvrstih kancera, uključujući kolorektalni kancer, kancer dojke, ne-sitnoćelijski karcinom pluća, kancer bešike, i karcinom bubrežne ćelije. Tretman sa atezolizumabom rezultovao je u objektivnim stopama odgovora (ORR) od 23% u NSCLC, 36% melanomu, 33% bešici, 14% u RCC, i 13% u kancerima glave i vrata (Herbst et al, 2014; Powles et al, 2014).

[0021] Avelumab (MSB0010718C) je puno humano IgG1 antitelo koje se vezuje za PD-L1 i nalazi se u kliničkom ispitivanju kod brojnih kancera uključujući kancer bešike, kancer želudca, kancer glave i vrata, mezoteliom, nesitnoćelijski karcinom pluća, kancer ovarijumma, kancer bubrega i karcinom Merkelovih ćelija.

[0022] Durvalumab (MEDI4736) je humano IgG1 antitelo koje se vezuje za PD-L1 i ispitano je u kliničkim ispitivanjima zasebno ili u kombinaciji sa tremelimumabom u nesitnoćelijskom kanceru pluća, karcinomu skvamoznih ćelija glave i vrata, kanceru bešike, kanceru pankreasa i sa drugim biologicima i malim molekulima u ispitivanjima za dodatne čvrste kancere kao što su kanceri želudca, melanom i neresektabilni hepatoćelijski karcinom.

[0023] Dalje anti-PD-L1 antiela su ispitivana u klinčkim studijama, uključujući BMS-936559 i druga su u prekliničkom ispitivanju.

[0024] Međutim, nekoliko anti-LAG-3 terapija je trenutno u kliničkom ispitivanju in nijedna nije odobrena za terapiju tako da ostaje potreba za razvojem dodatnih molekula koji ciljaju LAG-3. Iako postoje neki anti-PD-L1 terapeutici u razvoju, trenutni podaci pokazuju da sveukupan tretman sa anti-PD-L1 monoterapijom dovodi do odgovora kod manje od 50% pacijenata sa kancerom. Prema tome, u oblasti tehnike ostaje potreba za dodatnim molekulima koji ciljaju LAG-3 i/ili PD-L1 i koji nalaze primenu u terapiji kancera.

Izjave o pronalasku

[0025] Anti-PD-1 i anti-PD-L1 antitela su predominantno uključena u prekid imunske tolerance i aktivacije anti-tumorskog imunskog odgovora. LAG-3, eksprimiran na T ćelijama nakon aktiviranja, i konstitutivno eksprimiran na iscrpljenim T ćelijama, dalje održava ove ćelije u supresivnom stanju. Takođe je pokazano da blokada LAG-3, kada se koristi u kombinaciji sa drugim uspostavljenim imunskim supresivnim molekulima (tj.: PD-1, PD-L1) obezbeđuje sinergistički unapređen imunski odgovor u modelima tumora kod miševa (Woo et al, 2012). Predmetni pronalazači su ukazali da terapije koje ciljaju oba ova puta istovremeno će direktno uticati na mehanizam koji promoviše i održava iscrpljivanje T ćelija. Dodatno, pronalazači očekuju da ciljanje LAG-3 može da suprimira prezentovanje antigena kroz delovanje regulatornih T ćelija koje eksprimiraju LAG-3 na APC-a i objavljena dokumentacija pretrage nisodne regulacije CD86 (Grosso et al, 2013). Očekuje se da blokiranje ove interakcije da bi se održalo prezentovanje antigena, dok blokiranje signalizacije preko PD-L1 je očekivano da prekine tolerancu, što dovodi do značajnog anti-tumorskog odgovora kada su oba puta istovremeno inibirana.

[0026] Objavljeni podaci o kombinacijama anti-LAG-3 i anti-PD-L1 antitela su ograničeni iako postoje neki rezultati i prekliničkog singenog mišjeg tumora i modela virusnog opterećenja. U mišjem modelu mijeloma, kombinacija anti-PD-L1 i anti-LAG-3 blokirajućih antitela je davana nakon nisko doznog zračenja celog tela i unapređene stope preživljavanja do više od 80% (Jing et al, 2015; WO2015/048312). Nije uočen dokaz postojanja sistemske ili organ-specifične autoimunosti. Miševi sa izbačenim genom za LAG-3 i PD-1 pokazali su značajno povećano preživljavanje od i uklanjanje brojnih transplantabilnih tumora (Woo et al, 2012).

[0027] Predmetni pronalazači su predložili da bispecifična antitela koja se vezuju za oba LAG-3 i PD-L1 bi dala brojne prednosti u odnosu na kombinaciju monoklonskih antitela protiv ovih antigena, uključujući:

1. Usmerenu terapiju

[0028] Aktivirane T ćelije eksprimiraju LAG-3 u limfnim čvorovima. Jedan deo anti-LAG-3/PD-L1 bispecifičnog antitela cilja prajmovane LAG-3-pozitivne T ćelije u limfnom čvoru, koje se nakon toga premeštaju do mesta tumora, transportujući bispecifično antitelo. Jednom kada se nađu u tumorskom mikrookruženju, T ćelije koje nose bispecifično antitelo su sposobne da se trenutno angažuju i blokiraju PD-L1 na tumorskim ćelijama preko anti-PD-L1 dela. Stoga, sve T ćelije koje putuju do tumorskog mesta bi bile rezistentne na signalizaciju preko LAG-3 i PD-L1/PD-1.

2. Premošćavanje

[0029] Prajmovane CD8 pozitivne T ćelije susreću tumorske antigene u tumorskom mikrookruženju, gde one odgovaraju ubijanjem tumorske ćelije u odsustvu supresivnih signala. Očekuje se da su bispecifična antitela superiorna u odnosu na kombinacije individualnih monoklonskih terapija sa održavanjem ili produžavanjem ovog kontakta između T ćelija i tumorskih ćelija. Jačina signala u aktivaciji T ćelija je esencijalna, koja u slučaju prezentivanih antigena u kancerima može da bude ključ (Engels et al, 2013) i očekivano je da prisustvo bispecifičnog anti-LAG-3/PD-L1 antitela vezanog za mete na APC ili kancerozne ćelije poveća vreme u kome T ćelije mogu uspešno da prepoznaju antigen i postanu aktivirane.

3. Lokalizacija

[0030] U oblastima inflamacije i inflamatornih odgovora koji traju, ekspresija PD-L1 je značajno povećana zbog lokalizovanog oslobađanja IFN-γ. Ovo je tačno bilo na ciljanim ćelijama kancera, makrofagima povezanim sa tumorom (TAM), ili ponovljenom stimulacijom T ćelijskih populacija. Očekivano je da bispecifično antitelo koje antagonizuje PD-L1 i LAG-3 lokalizuje i koncentriše se u oblastima najveće ekspresije PD-L1 u tumoru dok omogućava anti-LAG-3 deo da se veže i spreči LAG-3-posredovanu supresiju T ćelija.

[0031] Nakon opsežnog programa skrininga i sazrevanja afiniteta, predmetni pronalazači su mogli da idenifikuju deset specifičnih članova za vezivanje koji se sastoje iz vezujućeg mesta specifičnog za LAG-3 u CH3 domenu molekula. Pokazano je da ovi molekuli imaju visok afinitet za oba humani i LAG-3 cinomolgusa. Očekivano je da visok afinitet za LAG-3 bude prednost u lečenju npr. kancera koji sadrže tumor-infiltrirajuće limfocite (TILs) koji eksprimiraju LAG-3 kod humanih pacijenata, dok je očekivano da visok afinitet za LAG-3 cinomolgusa, koji je uporediv sa afinitetom za humani LAG-3, bude koristan u proceni svojstava specifičnih vezujućih članova u modelima bolesti kod cinomolgus majmuna. Razlog za ovo je u tome što je verovatnije da dobijeni rezultati predviđaju efekte specifičnih vezujućih članova kod humanih pacijenata u odnosu na to kada molekul koji ima veću varijabilnost u njegovom afinitetu za humani i LAG-3 cinomolgusa je ispitan u modelima kod cinomolgus majmuna.

[0032] Takođe je pokazano da specifični vezujući članovi imaju visoku aktivnost u testu T ćelijske aktivacije, što se očekuje da predviđa unapređenu efikasnost kod humanih pacijenata kro pojačanu inhibiciju LAG-3.

[0033] Navedeni pronalazači su dalje kombinovali specifične vezujuće članove koji se sastoje iz mesta vezivanja koje je specifično za LAG-3 u CH3 domenu sa Fab domenom antitela koji se sastoji iz mesta za vezivanje antigena zasnovanog na CDR za PD-L1 da bi se dobili bispecifični molkuli antitela koji se sastoje iz vezujućih mesta za oba LAG-3 i PD-L1, za koje je očekivano da imaju prednosti koje su navedene gore u tekstu. Surogati mišjih verzija ovih molekula antitela koja se vezuju za mišji LAG-3 i mišji PD-L1 su takođe dobijeni od proizvođača i pokazano je da su sposobni značajno da inibiraju tumorski rast u modelima kancera kod singenih miševa. Posebno, upotreba ovih surogata mišjih molekula je pokazala da postoji sinergistički efekat na supresiju tumorskog rasta kada je molekul antitela sastoji iz mesta vezivanja za oba LAG-3 i PD-L1 davan miševima u ispitanim mišjim modelima. Na osnovu sličnog mehanizma delovanja mišjeg i humanog LAG-3 i PD-L1 u tumorskom mikrookruženju, očekuje se da će se ispitivanja na miševima koja su pokazala efikasnost u smanjenju opterećenja tumorom preneti u kliničke terapeutske benefite kod humanih pacijenata sa kancerom. Na osnovu ovi rezultata, prema tome je očekivano da će molekuli antitela iz pronalaska pokazati superiorni efekat u lečenju kancera kod humanih pacijenata, posebno u suprimiranju tumorskog rasta, u odnosu na, na primer, davanje dva različita molekula koji vezuju LAG-3 i PD-L1, redom.

[0034] Prema tome, predmetni pronalazak obezbeđuje molekul antitela koje se vezuje za ligand 1 programirane smrti (PDL1) i limfocitni-aktivacijski gen 3 (LAG-3), gde se molekul antitela sastoji iz:

(i) antigen vezujućeg mesta baziranog na osnovu regiona za određivanje komplementarnosti (CDR) za PD-L1 koji se sastoji iz CDR-a predstavljenih u SEQ ID NOs 86 do 91; i

(ii) mesto za vezivanje antigena LAG-3 locirano u CH3 domenu molekula antitela, pri čemu se mesto za vezivanje LAG-3 sastoji iz aminokiselinskih sekvenci WDEPWGED (SEQ ID NO: 1) i PYDRWVWPDE (SEQ ID NO: 3), i gde je aminokiselinska sekvenca WDEPWGED locirana u AB petlji u CH3 domenu i aminokiselinska sekvenca PYDRWVWPDE je locirana u EF petlji u CH3 domenu.

[0035] Aminokiselinska sekvenca koja je predstavljena u SEQ ID NO: 1 je poželjno locirana na ostacima 11 do 18 u CH3 domenu; i/ili aminokiselinska sekvenca koja je predstavljena u SEQ ID NO: 3 je locirana na ostacima 92 do 101 u domenu CH3; pri čemu je numerisanje aminokiselinskog ostatka u skladu sa ImMunoGeneTics IMGT) šemom za numerisanje.

[0036] LAG-3 antigen-vezujuće mesto molekula antitela može dalje da se sastoji iz jedne od sledećih sekvenci, poželjno u CD petlji u CH3 domenu molekula antitela:

(i) SNGQPENNY (SEQ ID NOS 2, 8 i 18);

(ii) SNGQPEDNY (SEQ ID NO: 13);

(iii) SNGYPEIEF (SEQ ID NO: 23);

(iv) SNGIPEWNY (SEQ ID NO: 28);

(v) SNGYAEYNY (SEQ ID NO: 33);

(vi) SNGYKEENY (SEQ ID NO: 38);

(vii) SNGVPELNV (SEQ ID NO: 43); ili

(viii) SNGYQEDNY (SEQ ID NO: 48).

[0037] Poželjno, LAG-3 antigen-vezujuće mesto molekula antitela dalje sadrži jednu od sledećih sekvenci, poželjno u CD petlji CH3 domena molekula antitela: aminokiselinsku sekvencu koja je predstavljena u SEQ ID NO: 2, 28, ili 38 u CD petlji CH3 domena. Poželjnije, LAG-3 antigen-vezujuće mesto molekula antitela dalje sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je predstavljena u SEQ ID NO: 2 u CD petlji CH3 domena

[0038] Aminokiselinska sekvenca predstavljena u SEQ ID NO: 2, 8, 13, 18, 23, 28, 33, 38, 43, ili 48 je poželjno locirana na ostacima 43 do 78 CH3 domena molekula antitela, pri čemu su ostaci numerisani prema IMGT šemom za numerisanje.

[0039] Sekvenca CH3 domena molekula antitela, koje nisu sekvence LAG-3 antigen-vezujućeg mesta, nije posebno ograničena. Poželjno, CH3 domen je domen humanog imunoglobulina G, kao što je CH3 domen humanog IgG1, IgG2, IgG3, ili IgG4, poželjnije CH3 domen humanog IgG1. Sekvence CH3 domena humanog IgG1, IgG2, IgG3, ili IgG4 su poznate u oblasti tehnike.

[0040] U poželjnom izvođenju, molekul antitela sadrži CH3 domen koji je predstavljen u SEQ ID NO: 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, ili 50, poželjnije CH3 domen koji je predstavljen u SEQ ID NO: 5, 30, ili 40, najpoželjnije CH3 domen koji je predstavljen u SEQ ID NO: 5. Alternativno, molekul antitela može da sadrži CH3 domen sa aminokiselinskom sekvencom koja je najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identična u sekvenci sa SEQ ID NO: 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, ili 50, poželjno SEQ ID NO: 5, 30, ili 40, poželjnije SEQ ID NO: 5.

[0041] Molekul antitela može dalje da sadrži CH2 domen. CH2 domen je poželjno lociran na N kraju CH3 domena, kao što je slučaj u humanom IgG molekulu. CH2 domen molekula antitela je poželjno CH2 domen humanog IgG1, IgG2, IgG3, ili IgG4, poželjnije CH2 domen humanog IgG1. Sekvence domena humanih IgG su poznate u oblasti tehnike. U poželjnom izvođenju, molekul antitela sadrži CH2 domen IgG sa sekvencom koja je predstavljena u SEQ ID NO: 53 ili SEQ ID NO: 54, ili CH2 domen sa aminokiselinskom sekvencom koja je najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najamnje 99% identična u sekvenci sa SEQ ID NO: 53 ili SEQ ID NO: 54.

[0042] U poželjnom izvođenju, molekul antitela sadrži sekvencu koja je predstavljena u SEQ ID NO: 6, 7, 11, 12, 16, 17, 21, 22, 26, 27, 31, 32, 36, 37, 41, 42, 46, 47, 51, ili 52, ili sekvencu koja je najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identična u sekvenci sa sekvencom koja je predstavljena u SEQ ID NO: 6, 7, 11, 12, 16, 17, 21, 22, 26, 27, 31, 32, 36, 37, 41, 42, 46, 47, 51, ili 52. Poželjnije, molekul antitela sadrži sekvencu koja je predstavljena u SEQ ID NO: 6, 7, 31, 32, 41, ili 42, ili sekvencu koja je najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identična u sekvenci sa sekvencom koja je predstavljena u SEQ ID NO: 6, 7, 31, 32, 41, ili 42. Još poželjnije, molekul antitela sadrži sekvencu koja je predstavljena u SEQ ID NO: 6 ili 7, ili sekvenca koja je najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identična u sekvenci sa sekvencom koja je predstavljena u SEQ ID NO: 6 ili 7.

[0043] U poželjnom izvođenju, molekul antitela je molekul humanog imunoglobulina G, kao što je humani IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4 molekul, poželjnije humani IgG1 molekul. Sekvence molekula humanog imunoglobulina G su poznate u oblasti tehnike i uvođenjem sekvence domena CH3 ili domena CH3 kao što je ovde opisano u takav molekul ne bi predstavljalo poteškoću stručnjaku iz oblasti tehnike.

[0044] Molekul antitela se sastoji iz svih šest regiona za određivanje komplementarnosti koji su predstavljeni u SEQ ID Nos 86 do 91. Poželjno, molekul antitela se sastoji iz VH i/ili VL domena koji su predstavljeni u SEQ ID NOs 92 i 93, redom.

[0045] U poželjnom izvođenju, molekul antitela se sastoji iz sekvence teškog lanca koja je predstavljena u bilo kojoj od SEQ ID NOs: 94 do 113, ili teškog lanca sa sekvencom aminokiselina koja je najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identična u sekvenci sa bilo kojom od SEQ ID NOs: 94 do 113, pod uslovom da VH domen sekvence teškog lanca ostaje nepromenjen. Poželjnije, molekul antitela se sastoji iz sekvence teškog lanca koja je predstavljena u bilo kojoj od SEQ ID NOs: 94, 95, 104, 105, 108, i 109, ili teškog lanca sa sekvencom aminokiselina koja je najmanje 70%, najmaje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identična u sekvenci sa bilo kojom od SEQ ID NOs: 94, 95, 104, 105, 108, i 109, pod uslovom da VH domen u sekvenci teškog lanca ostaje nepromenjen.. Poželjnije, molekul antitela se sastoji iz sekvence teškog lanca koja je predstavljena u SEQ ID NO: 94 ili 95, ili teškog lanca sa sekvencom aminokiselina koja je najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identična u sekvenci sa SEQ ID NOs: 94 ili 95, pod uslovom da VH domen u sekvenci teškog lanca ostaje nepromenjen..

[0046] U daljem poželjnom izvođenju, molekul antitela može dodatno, ili alternativno, da se sastoji iz sekvence lakog lanca koja je predstavljena u SEQ ID NO: 116, ili lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom koja je najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identična u sekvenci sa SEQ ID NO: 116, pod uslovom da VL domen sekvence lakog lanca ostane nepromenjen..

[0047] Molekul antitela je poželjno sposoban da se istovremeno veže za PD-L1 i LAG-3. PD-L1 i LAG-3 mogu, na primer, mogu da se nalaze na dve različite ćelije. Bez želje za ograničavanjem teorijom, smatra se da ovo rezultuje u unakrsnom vezivanju između ćelija i internalizacija PD-L1 i/ili LAG-3 ih čini nedostupnim za stimulaciju.

[0048] Navedeni pronalazači su pokazali da molekul antitela koji se sastoji iz (i) CDR-zasnovanog antigen vezujužeg mesta za PD-L1; i (ii) LAG-3 antigen vezujuće mesto locirano u CH3 domenu molekula antitela, u skladu sa predmetnim pronalaskom, FS18-7-9/84G09, iznenađujuće posredovana citotoksičnost koja zavisi od komplementa (CDC) ćelija koje eksprimiraju PD-L1 ali ne ćelija koje eksprimiraju LAG-3, čak i kada su u uzorku prisutne smeše ćelija koje eksprimiraju LAG-3 i PD-L1. Ovo svojstvo je očekivano da bude korisno gde, kao i u slučaju sa FS18-7-9/84G09, i CDRzasnovano vezivanje antigena molekula antitela cilja tumorsku ćeliju i mesto vezivanja locirano u konstantnom domenu molekula antitela cilja imunsku ćeliju, kao što bi imunska ćelija bila zaštićena od CDC posredovane sa vezivanjem molekula antitela, dok bi tumorske ćelije bile podložne CDC.

[0049] Prema tome, takođe je prikazan molekul antitela koji se vezuje za tumorski antigen i antigen imunske ćelje, gde molekul antitela sadrži:

(i) CDR-zasnovano mesto vezivanja antigena za tumorski antigen; i

(ii) antigen vezujuće mesto za antigen imunske ćelije lociran u konstantnom domenu, poželjno CH3 ili CH2 domenu, poželjnije CH3 domenu, molekula antitela,

gde molekul antitela ne posreduje, ili ne posreduje značajno, citotoksičnosti koja zavisi od komplementa imunske ćelije koja se sastoji iz pomenutog antigena imunske ćelije kada je pomenuta imunska ćelija vezana sa molekulom antitela.

[0050] Molekul antitela može dalje da posreduje u citotoksičnosti koja zavisi od komplementa tumorske ćelije koja se sastoji iz pomenutog tumorskog antigena kada je pomenuta tumorska ćelija vezana sa molekulom antitela.

[0051] Postupci za merenje CDC molekula antitela su dobro poznati u oblasti tehnike i ovde su opisane.

[0052] Predmetni pronalazači su dalje pokazali da molekul antitela koji se sastoji iz (i) a CDR-zasnovanog antigen vezujućeg mesta za PD-L1; i (ii) LAG-3 antigen vezujuće mesto locirano u CH3 domenu molekula antitela, u skladu sa predmetnim pronalaskom, FS18-7-9/84G09, iznenađujuće posredovana niska ćelijska citotoksičnost posredovana antitelima (ADCC) ćelija koje eksprimiraju LAG-3 u poređenju sa ADCC ćelija koje eksprimiraju PD-L1. Ovo svojstvo je ponovo očekivano da bude korisno gde, kao i u slučaju FS18-7-9/84G09, vezivanje molekula antitela za antigen bazirano na CDR cilja tumorsku ćeliju i mesto vezivanja locirano u konstantnom domenu molekula antitela cilja imunsku ćeliju, kako bi imunska želijia bila izložena nižoj ADCC u odnosu na tumorsku ćeliju vezanu sa antitelom.

[0053] Kao što je ovde objašnjeno, u oblasti tehnike su poznate mutacije za smanjenje ili ukidanje aktivnosti ADCC ili molekula antitela. Jedna od takvih mutacija je ovde opisana mutacija LALA. Neočekivano je pronađeno da FS18-7-9/84G09 ima nisu ADCC aktivnost prema ćelijama koje eksprimiraju LAG-3. Gde nije neophodno potpuno ukidanje aktivnosti ADCC, ovo može predstavljati prednost.

[0054] Prema tome, takođe je prikazan molekul antitela koji se vezuje za tumorski antigen i antigen imunske ćelije, gde molekul antitela sadrži:

(i) CDR-zasnovano antigen vezujuće mesto za tumorski antigen; i

(ii) antigen vezujuće mesto za antigen imunske ćelije koje je locirano u konstantnom domenu, poželjno CH3 ili CH2 domenu, poželjnije CH3 domenu, molekul antitela,

pri čemu molekul antitela uzrokuje manju ADCC u odnosu na imunske ćelije koje se sastoje iz pomenutog antigena imunske ćelije gde su pomenute imunske ćelije vezane sa molekulom antitela nego tumorske ćelije koje sadrže pomenuti tumorski antigen pri čemu su pomenute tumorske ćelije vezane se molekulom antitela. Molekul antitela može da ne posreduje, ili ne posreduje značajno, ADCC imunske ćelije koja se sastoji iz pomenutog antigena imunske ćelije pri čemu je pomenuta imunska ćelija vezana sa molekulom antitela. Molekul antitela dalje može da ne posreduje, ili ne posreduje značajno, u citotoksičnosti koja zavisi od komplementa imunske ćelije koja se sastoji iz pomenutog antigena imunske ćelije gde je pomenuta imunska ćelija vezana sa molekulom antitela i/ili može da posreduje citotoksičnosti koja zavisi od komplementa tumorske ćelije koja sadrži pomenuti tumorski antigen kada je pomenuta tumorska ćelija vezana sa molekulom antitela.

[0055] Postupci za merenje ADCC molekula antitela su dobro poznati u oblasti tehnike i ovde su opisani.

[0056] Različiti tumorski antigeni i antigeni imunskih ćelija su poznati u oblasti tehnike. Tumorski antigen i antigen imunske ćelije antigeni ćelijske površine. Antigen imunske ćelije može da bude antigen koji se prisutan na tumor infiltrirajućim limfocitima.

[0057] Antigen vezujuće mesto za antigen imunske ćelije može da sadrži jednu ili više one modifikacija u jednoj ili više strukturalnih petlji u konstantnom domenu molekula antitela, kao što je AB, CD, i/ili EF petlja konstantnog domena. Na primer, mesto vezivanja može da bude LAG-3 vezujuće mesto kao što je ovde opisano.

[0058] Molekul antitela iz pronalaska može da bude konjugovan sa modulatorom imunskog sistema, citotoksičnim molekulom. radioizotopom. ili detektabilnim obeleživačem. Modulator imunskog sistema ili citotoksičan molekul može da bude citokin.

1

[0059] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje nukleinsku kiselinu koja kodira molekul antitela iz pronalaska, kao i vektor koji se sastoji iz takve nukleinske kiseline.

[0060] Rekombinantna ćelija domaćina koja se sastoji iz nukleinske kiseline ili vektora iz pronalaska je takođe obezbeđena. Takva rekombinantna ćelija domaćina može da se koristi za proizvodnju molekula antitela. Prema tome, takođe je obezbeđen postupak za proizvodnju molekula antitela iz pronalaska, postupak koji se sastoji iz kultivisanja rekombinantne ćelije domaćina pod uslovima za proizvodnju molekula antitela. Postupak dalje može da sadrži korak izolovanja i/ili prečišćavanja molekula antitela.

[0061] Očekivano je da molekuli antitela iz predmetnog pronalaska nađu primenu u terapeutskim primenama, posebno u terapeutskim primenama kod ljudi, kao što je tretman kancera. Prema tome, takođe je obezbeđena farmaceutska kompozicija koja se sastoji iz molekula antitela prema pronalasku i farmaceutski prihvatljivog ekscipijenta.

[0062] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje molekul antitela iz pronalaska, za upotrebu u postupku lečenja kancera kod pacijenta.

[0063] Dalje je obezbeđena upotreba molekula antitela prema pronalasku u dobijanju leka za lečenje kancera kod pacijenta. Lečenje dalje može da sadrži davanje anti-tumorske vakcine i/ili hemoterapeutskog sredstva pacijentu.

Kratak opis slika

[0064]

Slika 1: A pokazuje poravnanje u sekvenci devet Fcat-a koji su identifikovani nakon drugog sazrevanja afiniteta, FS18-7-32; FS18-7-33; FS18-7-36; FS18-7-58; FS18-7-62; FS18-7-65; FS18-7-78; FS18-7-88; i FS18-7-95, u odnosu na parentalno Fcat, FS18-7-9. B pokazuje procenat u identitetu sekvenci svakog od ovih Fcat-a sa sekvencom parentalnog Fcat, FS18-7-9.

Slika 2 pokazuje rezultate testa T ćelijske aktivacije. Specifično, Slika 2 prikazuje reprezentativne grafike oslobađanja IL-2, što je pokazatelj T ćelijske aktivacije, u panelu ćelijskih linija tretiranih sa mAt<2>FS18-7-9/84G09 (Slika 2A-C), ili FS18-7-62/84G09 ili FS18-7-78/84G09 (Slika 2D-F), i kontolnim antitelom. Slika 2A: Test sa LAG-3 i PD-L1 zahtevanom inhibicijom obe mete (FS18-7-9/84G09LALA, FS18-7-9/4420LALA+84G09, 25F7+84G09LALA or 25F7+S1LALA) da bi se dobila aktivacija. Slika 2B: Test sa LAG-3 zahteva inhibiciju samo LAG-3 za aktivaciju (FS18-7-9/84G09LALA, FS18-7-9/4420LALA+84G09, 25F7+84G09LALA, 25F7+S1LALA, 25F7, FS18-7-9/4420 LALA). Slika 2C:

Test sa PD-L1 zahteva samo inhibiciju PD-L1 za aktivaciju (FS18-7-9/84G09LALA, FS18-7-9/4420LALA+84G09, 25F7+84G09LALA, 25F7+S1LALA, 84G09LALA). Slika 2D: Test sa LAG-3 i PD-L1 zahtevanom inhibicijom obe mete (FS18-7-62/84G09LALA, FS18-7-78/84G09LALA, FS18-7-62/4420LALA+84G09, FS18-7-78/4420LALA+84G09, 25F7+84G09LALA ili 25F7+S1LALA) da se dobije aktivacija. Slika E: Test sa samo LAG-3 zahteva inhibiciju LAG-3 za aktivaciju (FS18-7-62/84G09LALA,

FS18-7-62/4420LALA, FS18-7-78/84G09LALA, FS18-7-78/4420LALA, FS18-7-62/4420LALA+84G09,

FS18-7-78/4420LALA+84G09, 25F7+84G09LALA ili 25F7+S1LALA). Slika 2F: Test sa samo PD-L1 zahteva inhibiciju PD-L1 za aktivaciju (FS18-7-62/84G09LALA, FS18-7-78/84G09LALA, FS18-7-62/4420LALA+84G09, FS18-7-78/4420LALA+84G09, 25F7+84G09LALA ili 25F7+S1LALA).

Slika 3 Pokazuje da je FS18-7-9/84G09 sposoban da indukuje T ćelijsku aktivaciju, kao što je pokazano sa oslobađanjem IL-2, u prisustvu oba cLAG-3 cPD-L1 i cLAG-3 ili samog cPD-L1 koji pokazuje unakrsnu reaktivnost sa cinomolgusom.

Slika 4 pokazuje reprezentativni grafik iz SEB testa. LAG-3/PD-L1 mAt<2>i kombinacija LAG-3/4420 mAt<2>+ 84G09LALA je pokazala veću aktivaciju u odnosu na sam 84G09LALA mAt, gde LAG-3/4420 mAt<2>ili 4420 mAt nije pokazalno značajnu aktivaciju.

Slika 5 pokazuje tumorske mase na kraju u danu 20 u ne-uspostavljenom MC38 singenom modelu tumora. LAG-3/PD-L1 mAt<2>(FS18-29/S1) tretirani miševi su imali tumore na kraju sa značajno manjim masama u odnosu na one koji su tretirani sa kombinacijom reper („benchmark“) mAt-a, C9B7W i S1.

Slika 6 pokazuje krive rasta neuspostavljenog MC38 singenog tumorskog modela. LAG-3/PD-L1 mAt<2>(FS18-29/S1) tretirani miševi su imali manje tumore u odnosu na one koje su tretirane sa kombinacijom reper (benchmark) mAt-a, C9B7W i S1, ili onih koji su tretirani samo sa S1. LAG-3/4420 mAt<2>i reper (benchmark) anti-LAG-3 mAt je imao mali uticaj na tumorski rast.

Slika 7 pokazuje krajnje mase tumora u danu 24 u upostavljenom MC38 singenom tumorskom modelu. LAG-3/PDL1 mAt<2>(FS18-29/S1) je bio jednako efikasan u suprimiranju tumorskog rasta kao kombinacija reper (benchmark) antitela, C9B7W i S1. FS18-29/4420 sam nije imao primetan uticaj na tumorski rast i S1 i C9B7W oba su imala blage efekte na nastali rast tumora.

Slika 8 pokazuje krive tumorskog rasta uspostavljenog MC38 singenog tumorskog modela. LAG-3/PD-L1 mAt<2>(FS18-29/S1) tretirani miševi su imali zapremine slične sa onim koji su tretirani sa kombinacijom reper (benchmark) mAt-a, C9B7W i S1. Miševi koji su tretirani sa S1 ili C9B7W zasebno pokazuju srednje zapremine tumora pri čemu LAG-3/4420 mAt<2>tretman nije imao uticaj na tumorski rast.

Slika 9 pokazuje krajnje mase tumora u danu 20 u neuspostavljenom CT26 singenom modelu tumora. LAG-3/PD-L1 mAt<2>(FS18-29/S1 i FS18-35/S1) su suprimirala tumorski rast u većem obimu u odnosu na kombinaciju reper (benchmark) antitela, C9B7W i S1.

Slika 10 pokazuje krive tumorskog rasta neuspostavljenog CT26 singenog modela tumora. Demonstrirana je statistički značajna razlika u FS18-35/S1 u odnosu na IgG kontrolu u supresiji tumorskog rasta. Takva statistički značajna razlika nije uočena sa kombinacijom reper (benchmark) antitela, u odnosu na IgG kontrolnu grupu.

Slika 11 pokazuje krajnje mase tumora u danu 22 u neuspostavljenom MC38 singenom modelu tumora koji se koristi za poređenje efekta LALA mutacije u mAt<2>na inhibiciji tumorskog rasta. Nije uočena statistički značajna razlika u krajnjoj masi tumora između miševa tretiranih sa mAt<2>sa i bez LALA mutacije.

Slika 12 pokazuje krive tumorskog rasta neuspostavljenog MC38 singenog modela tumora koji je korišćen za poređenje efekta mAt<2>sa i bez LALA mutacije na inhibiciju tumorskog rasta. Nije uočena statistički značajna razlika u krivama tumorskog rasta između miševa koji su tretirani sa mAt<2>sa i bez LALA mutacije, međutim postoji trend prema povećanoj inhibiciji tumorskog rasta od strane molekula koji nose LALA mutaciju.

Slika 13 pokazuje efekat tretmana mAb<2>na LAG-3 ekspresiju kod T ćelija. LAG-3 ekspresija na CD8 (A), CD4 (B) i FoxP3 (C) tumorskim infiltrirajužim limfocitima (TILs) tretiranim sa mAt<2>FS18-29/S1, FS18-29/4420, S1, FS18-29/4420 i S1, ili kontrolnim antitelima 4420 je prikazana u danu 19 i 23 posle inokulacije tumora, što odgovara danima 3 i 7 nakon doziranja poslednjeg mAt<2>/antitela, redom. Ekspresija LAG-3 je smanjena nakon tretmana sa mAt<2>FS18-29/S1 u danu 19 i 23. Životinje kojima je davana kombinacija FS18-29/4420 i S1 su takođe pokazale ekspresiju LAG-3 ali je efekat bio odložen do dana 23, dok FS18-29/4420 ili S1 koji su davani pojedinačno su doveli do malo ili bez povećanja u ekspresiji LAG-3.

Slika 14 pokazuje procenat lize PD-L1 i LAG-3 eksprimiranih od strane Raji ćelija nakon različitih tretmana sa antitelom/mAt<2>korišćenjem CDC testa za merenje oslobađanja lakat dehidrogenaze (LDH). A i B pokazuju CDC-posredovanu lizu Raji ćelija koje eksprimiraju PD-L1 i LAG-3, redom. Ćelije su inkubirane sa anti-LAG-3 antitelom 25F7, anti-PD-L1 antitelom 84G09, anti-PD-L1 antitelom 84G09 koje se sastoji iz LALA mutacije, anti-CD20 antitela Rituksimaba, mAt<2>FS18-7-9/84G09, mAt<2>FS18-7-9/84G09 koje se sastoji iz LALA mutacije, ili Rituksimab koji se sastoji iz LALA mutacije. Oslobađanje LDH je mereno 4 h posle tretmana sa komplementom mladunca zeca i eksprimiran je kao procenat u poređenju sa ukupnom lizom. Koncentracija tretmana antitelo/mAt<2>tretmana je označena na X-osi. Deljena vrednost je podešena na nagibima svih kriva kako bi mogla da se upored kroz krive.

Slika 15 pokazuje procenat mrtvih Raji ćelija koje eksprimiraju PD-L1 i LAG-3 posle različitih tretmana korišćenjem CDC testa zasnovanog na protočnoj citometriji. Smeša diferencijalno fluorescentno obeleženih ćelija koje eksprimiraju PD-L1 i LAG-3 je eksprimirana sa kontrolnim antitelom 4420, anti-CD20 antitelom Rituksimab-om (RIT), kombinacijom anti-LAG-3 antitela 25F7 i anti-PD-L1 antitelom 84G09, ili mAt<2>FS18-7-9/84G09. Ćelije su nakon toga tretirane sa komplementom mladunca zeca i bojene su korišćenjem boje koja boji samo mrtve ćelije. Procenat mrtvih ćelija u dve ćelijske populacije je procenjen kao procenat od ukupnog broja ćelija. Ćelijski tip (koji eksprimira PD-L1 ili eksprimira LAG-3, je identifikova na raličitim diferencijalnim obeleživačima) procenjen nakon svakog tretmana je naznačen na Slici 15 posle imena odgovarajućeg tretmana, videti npr.4420 PDL1, koji se odnosi na procenu vijabilnosti Raji ćelija koje eksprimiraju PD-L1 posle tretmana sa kontrolnim antitelom 4420. Koncentracija tretmana antitelo/mAt<2>je naznačena na X-osi

Slika 16 pokazuje procenat lize (citotoksičnosti) kod Raji ćelija koje eksprimiraju PD-L1 i LAG-3 nakon različitih tretmana korišćenjem ADCC testa oslobađanja laktat dehidrogenaze (LDH). Ćelije su tretirane sa anti-CD20 antitelom Rituksimabom, anti-PD-L1 antitelom 84G09, mAt<2>FS18-7-9/84G09, Rituksimabom koji se sastoji iz LALA mutacije, mAt<2>FS18-7-9/84G09 koji se sastoji iz LALA mutacije, anti-LAG-3 antiela 25F7, anti-PD-L1 antitela 84G09 koji se sastoji iz LALA mutacije, kontrolnog antitela 4420, ili kontrolnog antitela 4420 koje se sastoji iz LALA mutacije. Tretirane ćelije su nakon toga ko-inkubirane sa primarnim NK ćelijama i specifično oslobađanje LDH je mereno kao procenat u poređenju sa ukupnom lizom ciljanih ćelija. Koncentracija tretmana antitelo/mAt<2>je naznačena na X-osi.

Detaljan opis

[0065] Predmetni pronalazak se odnosi na molekule antitela koja se vezuju za oba PD-L1 i LAG-3. Specifično, molekuli antitela iz predmetnog pronalaska se sastoje iz mesta za vezivanje antigena zasnovanog na CDR za PD-L1 i mesta za vezivanje LAG-3 antigena koje je locirano u konstantnom domenu molekula antitela kao što je predstavljeno u patentnim zahtevima. Termini "PD-L1" i "LAG-3" mogu da se odnose na humani PD-L1 i humani LAG-3, mišji PD-L1 i mišji LAG-3, i/ili PDL1 cinomologus majmuna LAG-3 cinomologus majmuna, osim ukoliko kontekst ne zahteva drugačije. Poželjno termini "PD-L1" i "LAG-3" se odnose na humani PD-L1 i humani LAG-3, osim ukoliko kontekst ne zahteva drugačije.

1

[0066] Termin "molekul antitela" opisuje imunoglobulin bilo prirodni ili delom ili ukupno sintetički proizveden. Molekul antitela može biti humani ili humanizovan. Molekul antitela je poželjno molekul monoklonskog antitela. Primeri antitela su i tipovi imunoglobulina, kao što je imunoglobuilin G, i njiove izotipske podklase, kao što su IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4, kao i njihovi fragmenti.

[0067] Termin " molekul antitela ", kao što je ovde korišćen, uključuje prema tome fragmente antitela, pod uslovom da pomenuti fragmenti sadrže mesto za vezivanje antigena koje je zasnovano na CDR za PD-L1 i mesto za vezivanje LAG-3 antigena koje je locirano u konstantnom domenu, kao što je CH1, CH2, ili CH3 domen, poželjno CH3 domen, molekula antitela. Osim ukoliko kontekst ne zahteva drugačije, termin "molekul antitela", kao što je ovde korišćen, je prema tome istovetan sa "molekul antitela ili njegov fragment".

[0068] Moguće je uzeti monoklonska i druga antitela i koristiti postupke tehnologije rekombinantne DNK da bi se proizvela druga antitela ili himerni molekuli koji zadržavaju specifičnost originalnog antitela. Takvi postupci mogu da uključe CDR-e, ili varijabilne regione, i/ili sekvence konstantnog domena pružajući mesto za vezivanje LAG-3 antigena, u različitom imunoglobilinu. Uvođenje CDR-i jednog imunoglobulina u drugi imunoglobulin je opisano na primer u EP-A-184187, GB 2188638A ili EP-A-239400. Slični postupci mogu da budu korišćeni za sekvence relevantnih konstantnih domena. Alternativno, hibridom ili druga ćelija koja proizvodi molekul antitela može da bude predmet za genske mutacije ili druge promene, koje mogu ili ne moraju da menjaju specifičnosti vezivanja proizvedenih antitela.

[0069] Kao što antitela mogu da budu modifikovna na brojne načine, termin "molekul antitela" treba da se konstruiše tako da pokriva fragmente antitela, derivate, funkcionalne ekvivalente i homologe antitela, uključujući bilo koji polipeptid koji se sastoji iz vezujućeg domena imunoglobilina, bilo prirodnog ili u potpunosti ili delom sintetički. Himerni molekuli koji se sastoje iz vezujućeg domena imunoglobulina, ili ekvivalenta, spojeni sa drugim polipeptidom su prema tome uključeni. Kloniranje i ekspresija himerinih antitela su opisani u EP-A- 0120694 i EP-A-0125023.

[0070] Primer fragmenta antitela koje se sastoji iz obe CDR sekvence i CH3 domna je minitelo, koje se sastoji iz scFv spojenim sa CH3 domenom (Hu et al. (1996), Cancer Res., 56(13):3055-61).

[0071] Molekul antitela iz predmetnog pronalaska vezuje PD-L1 i LAG-3. Vezivanje u ovom kontekstu može da se odnosi na specifično vezivanje. Termin "specifično" može da se odnosi na situaciju u kojoj molekul antitela neće pokazati bilo koje značajno vezivanje sa molekulima osim onih koji su njegovi specifični vezujući partner(i), ovde navedeni PD-L1 i LAG-3. Termin "specifično" se takođe može primeniti gde je molekul antitela specifičan za određene epitope, kao što su epitopi na PD-L1 i LAG-3, koji su nošeni od strane brojnih antigena u kom slučaju će molekul antitela biti sposoban da se veže za različite antigene koji nose epitop.

[0072] LAG-3 deli 40% identiteta u sekvenci sa CD4, njegovim najbliže povezanim proteinom. Predmetni pronalazači su ispitali FS18-7-9 Fcat, koje se sastoji iz aminokiselinskih sekvenci koje su predstavljene u SEQ ID NOs 1 do 3, za vezivanje sa CD4. FS18-7-9 Fcat nije pokazalo vezivanje sa CD4, što pokazuje da ovaj molekul vezuje specifično LAG-3. Prema tome, u poželjnom izvođenju, mesto vezivanja za LAG-3 u molekulu antitela iz predmetnog pronalaska ne vezuje, ili ne pokazuje bilo koje značajno vezivanje, sa CD4.

[0073] Molekul antitela iz pronalaska sadrži mesto za vezivanje LAG-3 antigena. Mesto za vezivanje LAG-3 antigena je locirano u CH3 domenu. Mesto za vezivanje LAG-3 sadrži aminokiselinske sekvence WDEPWGED (SEQ ID NO: 1) i PYDRWVWPDE. (SEQ ID NO: 3). Ove sekvence su bile prisutne u svim glavnim klonovima anti-LAG-3 Fcat koji su identifikovani od strane pronalazača nakon opsežnog prongrama skrininga i karakterizacije kao što je opisano u primerima.

[0074] Sekvence aminokiselina predstavljene u SEQ ID NOs 1 i 2 su locirane u strukturnim petljama u CH3 domenu molekula antitela. U vođenje sekvenci u regione strukturne petlje konstantnih domena antitela da se dobiju nova mesta za vezivanje antigena je opisano, na primer, u WO2006/072620 i WO2009/132876.

[0075] Struktune petlje konstantnih domena antitela uključuju AB, CD i EF petlje. U CH3 domenu, AB, CD, i EF petlje su locirane na ostacima 11-18, 43-78 i 92-101 u CH3 domenu, gde je numerisanje aminokiselina prema ImMunoGeneTics (IMGT) šemi numerisanja. Sekvenca aminokiselina koja je predstavljena u SEQ ID NO: 1 je locirana u AB petlji u CH3 domenu. Sekvenca aminokiselina predstavljena u SEQ ID NO: 3 je locirana u EF petlji u CH3 domenu. Poželjnije, sekvenca aminokiselina predstavljena u SEQ ID NO: 1 je locirana na ostacima 11 do 18 u CH3 domenu; i/ili sekvenca aminokiselina predstavljena u SEQ ID NO: 3 je locirana na ostacima 92 do 101 u CH3 domenu, gde je numerisanje aminokiselina prema IMGT šemi numerisanja.

[0076] Dodato, molekul antitela poželjno sadrži sekvencu aminokiselina koja je predstavljena u SEQ ID NO: 2, 8, 13, 18, 23, 28, 33, 38, 43, ili 48, poželjnije SEQ ID NO: 2, 28, ili 38, još poželjnije SEQ ID NO: 2, u strukturnoj petlji CH3 domena u molekulu antitela. Strukturna petlja je poželjno CD petlja. Sekvenca aminokiselina koja je predstavljena u SEQ ID NO: 2, 8, 13, 18, 23, 28, 33, 38, 43, ili 48 je poželjno locirana na ostacima 43 do 78 u CH3 domenu, pri čemu je obeležavanje aminokiselinskih ostataka prema IMGT šemi za obeležavanje.

[0077] Molekul antitela iz pronalaska može dalje da sadrži ostatak glutaminske kiseline (E) na poziciji 36 i/ili ostatak tirozina (Y) na poziciji 85.2 u domenu CH3 (kao što je prikazano na Slici 1A), pri čemu je obeležavanje aminokiselinskih ostataka prema IMGT šemi za numerisanje. Posebno, molekul antitela koji sadrži region CD strukturne petlje predstavljen u SEQ ID NO: 8 poželjno dalje sadrži ostatak glutaminske kiseline (E) na poziciji 36 u CH3 domenu. Slično tome, molekul antitela koji sadrži region CD struturne petlje koji je predstavljen u SEQ ID NO: 18 poželjno dalje sadrži ostatak tirozina (Y) u poziciji 85.2 u CH3 domenu.

[0078] U poželjnom izvođenju, molekul antitela iz pronalaska sadrži CH3 domen koji sadrži, ima, ili se sastoji iz sekvence koja je predstavljena u SEQ ID NO: 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, ili 50, poželjno CH3 domen sa sekvencom koja je predstavljena u SEQ ID NO: 5, 30, ili 40, poželjnije, CH3 domen sa sekvencom koja je predstavljena u SEQ ID NO: 5.

[0079] Molekul antitela iz pronalaska može da sadrži CH3 domen koji sadrži, ima, ili se sastoji iz sekvence koja je predstavljena u SEQ ID NO: 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, ili 50, pri čemu sekvenca CH3 domena dalje sadrži sekvencu lizina (K) u neposrednom C-kraju sekvence koja je prikazana u SEQ ID NO: 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, ili 50. Prema tome, na primer, molekul antitela iz pronalaska može da sadrži CH3 domen koji se sastoji iz, ima, ili sadrži sekvencu koja je predstavljena u SEQ ID NO: 5 sa ostatkom lizina na C-kraju sekvence koja je prikazana u SEQ ID NO: 5. Sekvenca kao što je CH3 domen bi onda bila kao što sledi:

[0080] Dodatno, molekul antitela iz pronalaska može da sadrži CH2 domen molekula imunoglobulina G, kao što je CH2 domen IgG1, IgG2, IgG3, ili IgG4 molekula. Poželjno molekul antitela iz pronalaska

1

sadrži CH2 domen IgG1 molekula. CH2 domen može da ima sekvencu koja je predstavljena u SEQ ID NO: 53.

[0081] CH2 domen molekula antitela može da sadrži mutaciju za smanjenje ili ukidanje vezivanja CH2 domena za jedan ili više Fcγ receptora, kao što su FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIII i/ili za komplement. CH2 domeni humanih IgG domena normalno se vezuju za Fcγ receptore i komplement i pronalazači postuliraju da će smanjeno vezivanje sa Fcγ receptorima smanjiti citotoksičnost posredovanu ćelijama koja zavisi od antitela (ADCC) i smanjeno vezivanje sa komplementom će smanjiti citotoksičnost aktivnosi molekula antitela koja zavisi od komplementa (CDC). Mutacije kojima se smanjuje ili ukida vezivanje CH2 domena sa jednim ili više Fcγ receptora i komplementa su poznate i uključuju "LALA mutaciju" koja je opisana u Bruhns, et al. (2009) i Xu et al. (2000). Prema tome, molekul antitela može da sadrži CH2 domen, pri čemu CH2 domen sadrži ostatke alanina na pozicijama 4 i 5 u CH2 domenu, gde je numerisanje u skladu sa IMGT šemom numerisanja. Na primer, molekul antitela sadrži IgG1 CH2 domen koji se sastoji iz, ima, ili sadrži sekvencu koja je predstavljena u SEQ ID NO: 54.

[0082] Molekul antitela prema pronalasku sadrži mesto za vezivanje antigena zasnovano na CDR za PD-L1, kao što je zasnovano na patentom zahtevu 1. Izraz "mesto za vezivanje antigena zasnovano na CDR" se odnosi na mesto za vezivanje antigena u varijabilnom regionu molekula antitela koji se sastoje iz šest CDR-a. Dobijanje molekula antitela protiv PD-L1, i određivanje CDR sekvenci takvih molekula antitela, je u granicama kapaciteta stručne osobe i mnoge pogodne tehnike su poznate u oblasti tehnike.

[0083] Molekul antitela prema pronalasku sadrži HCDR3 antitela 84G09. Pokazano je da HCDR3 ima ključnu ulogu u određivanju specifičnosti molekula antitela (Segal et al., (1974), PNAS, 71:4298-4302; Amit et al., (1986), Science, 233:747-753; Chothia et al., (1987), J. Mol. Biol., 196:901-917; Chothia et al., (1989), Nature, 342:877-883; Caton et al., (1990), J. Immunol., 144:1965-1968; Sharon et al., (1990a), PNAS, 87:4814-4817; Sharon et al., (1990b), J. Immunol., 144:4863-4869; Kabat et al., (1991b), J. Immunol., 147:1709-1719).

[0084] Molekul antitela dalje sadrži HCDR1, HCDR2, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 antitela 84G09. Stručnjak iz oblasti tehnike neće imati poteškoće u određivanju sekvenci CDRs od sekvenci VH i VL domena antitela 84G09 koje su prikazane u SEQ ID NOs 92 i 93, redom. CDR sekvence mogu, na primer, da se odrede prema Kabat-u (Kabat, E.A. et al., (1991)) ili IMGT šemi za numerisanje.

[0085] Sekvence HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 antitela 84G09, prema IMGT šemi numerisanja, su predstavljene u SEQ ID NOs 86, 87, 88, 89, 90, i 91, redom.

[0086] Sekvence HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 antitela 84G09, prema Kabat-u, su predstavljene u SEQ ID NOs 136, 137, 138, 139, 140, i 141, redom.

[0087] Antitelo može takođe da sadrži VH i/ili VL domen antitela 84G09. Sekvence VH i VL domena antitela 84G09 su prikazane u SEQ ID NOs 92 i 93, redom.

[0088] U poželjnom izvođenju, molekul antitela iz pronalaska sadrži (i) mesto za vezivanje antigena zasnovano na CDR za PD-L1 koje se sastoji iz HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 sekvenci antitela 84G09, i (ii) mesto za vezivanje LAG-3 antigena koje je locirano u CH3 domenu molekula antitela, pri čemu mesto za vezivanje LAG-3 sadrži aminokiselinske sekvence koje su predstavljene u SEQ ID NOs 1 i 3, aminokiselinska sekvenca je izabrana iz grupe koja se sastoji iz: SEQ ID NOs 2, 8, 13, 18, 23, 28, 33, 38, 43, i 48, kao što je predstavljeno u patentnim zahtevima.

[0089] Poželjnije, molekul antitela iz pronalaska sadrži (i) mesto za vezivanje antigena zasnovano na CDR za PDL1 koje se sastoji iz HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 sekvenci antitela 84G09,

1

i (ii) mesto za vezivanje antigena LAG-3 koje je locirano u CH3 domenu molekula antitela, pri čemu mesto za vezivanje LAG-3 sadrži aminokiselinske sekvence koje su predstavljene u SEQ ID NOs 1 i 3, i aminokiselinska sekvenca je izabrana iz grupe koja se sastoji iz: SEQ ID NOs 2, 28, i 38, kao što je predstavljeno u patentnim zahtevima.

[0090] Još poželjnije, molekul antitela iz pronalaska sadrži (i) mesto za vezivanje antigena zasnovano na CDR za PD-L1 koje se sastoji iz HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 sekvenci antitela 84G09, i (ii) mesto za vezivanje LAG-3 antigena koje se nalazi u CH3 domenu molekula antitela, pri čemu mesto za vezivanje LAG-3 sadrži aminokiselinske sekvence koje su predstavljene u SEQ ID NOs 1, 2 i 3, kao što se navodi u patentnim zahtevima.

[0091] U poželjnom izvođenju, molekul antitela iz pronalaska sadrži VH domen i VL domen koji sadrži, ima, ili se sastoji iz sekvence koja se sastoji SEQ ID NOs 92 i 93, redom, i CH3 domen koji sadrži, ima, ili se sastoji iz sekvence koja je predstavljena u SEQ ID NO: 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, ili 50, poželjno CH3 koji sadrži, ima, ili se sastoji iz sekvence koja je predstavljena u SEQ ID NO: 5, 30, ili 40, poželjnije, CH3 domen koji sadrži, ima, ili se sastoji iz sekvence koja je predstavljena u SEQ ID NO: 5.

[0092] U daljem poželjnom izvođenju, molekul antitela se sastoji iz teškog lanca koji se sastoji, ima, ili sadrži sekvencu koja je predstavljena u SEQ ID NOs: 94 do 113 i laki lanac koji se sastoji, ima, ili sadrži sekvencu koja je predstavljena u SEQ ID NO: 116. Poželjnije, molekul antitela sadrži sekvencu teškog lanca, koji sadrži, ima, ili se sastoji iz sekvence koja je predstavljena u SEQ ID NOs: 94, 95, 104, 105, 108, i 109 i laki lanac koji sadrži, ima, ili se sastoji iz sekvence koja je predstavljena u SEQ ID NO: 116. Poželjnije, molekul antitela sadrži teški lanac koji sadrži, ima, ili se sastoji iz sekvence koja je predstavljena u SEQ ID NO: 94 ili 95 i laki lanac koji sadrži, ima, ili se sastoji iz sekvence koja je predstavljena u SEQ ID NO: 116.

[0093] Ovde prikazani molekuli antitela mogu takođe da sadrže varijante strukturne petlje, CH3 domen, CH2 domen, CH2 i CH3 domen, ovde prikazane sekvence lakog lanca i teškog lanca, pod uslovom da sekvence lakog i teškog lanca VL i VH domena, redom, ostaju nepromenjene. Pogodne varijante mogu da se dobiju korišćenjem postupaka izmene sekvenci, ili mutacije, i skrininga. U poželjnom aspektu, molekul antitela koji se sastoji iz jedne ili više varijanti sekvenci zadržava jednu ili više funkcionalnih karakteristika matičnog molekula antitela, kao što je specifičnost vezivanja i/ili afinitet vezivanja za LAG-3 i PD-L1. Na primer, molekul antitela koji se sastoji iz jedne ili više varijanti sekvenci poželjno se vezuje za LAG-3 i/ili PD-L1 sa istim afinitetom, ili većim afinitetom, u odnosu na (matični) molekul antitela. Matični molekul antitela je moleku antitela koji ne sadrži aminokiselinske supstitucija(e), delecija(e), i/ili insercija(e) koje su uključene u varijantu molekula antitela.

[0094] Na primer, molekul antitela može da sadrži strukturnu petlju, CH3 domen, CH2 domen, CH2 i CH3 domen, sekvenca lakog lanca i teškog lanca koja je najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, najmanje 99.1%, najmanje 99.2%, najmanje 99.3%, najmanje 99.4%, najmanje 99.5%, najmanje 99.6%, najmanje 99.7%, najmanje 99.8%, ili najmanje 99.9% identična u sekvenci sa strukturnom petljom, CH3 domenom, CH2 domenom, CH2 i CH3 domenom, ovde prikazanim sekvencama lakog i teškog lanca, pod uslovom da sekvence lakog i teškog lanca VL i VH domena, redom, ostaju nepromenjene.

[0095] Molekul antitela može da sadrži sekvencu CH3 domena koja je najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, najmanje 99.1%, najmanje 99.2%, najmanje 99.3%, najmanje 99.4%, najmanje 99.5%, najmanje 99.6%, najmanje 99.7%, najmanje 99.8%, ili najmanje 99.9% identična u sekvenci sa sekvencom CH3 domena koja je predstavljena u SEQ ID NO: 4, 5, ili 135.

1

[0096] Alternativno, molekul antitela se sastoji iz sekvence CH3 i CH2 domena, koja je najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, najmanje 99.1%, najmanje 99.2%, najmanje 99.3%, najmanje 99.4%, najmanje 99.5%, najmanje 99.6%, najmanje 99.7%, najmanje 99.8%, ili najmanje 99.9% identična u sekvenci sa sekvencom CH2 i CH3 domena koja je predstavljena u SEQ ID NO: 6 ili 7.

[0097] Identičnost u sekvenci je obično definisana u odnosu na algoritam GAP (Wisconsin GCG package, Accelerys Inc, San Diego USA). GAP koristi Needleman i Wunsch algoritam za poravnanje dve kopmpletne sekvence koji maksimizuje broj poklapanja i minimizuje broj „gaps“. Generalno, korišćeni su podešeni parametri, sa „gap creation penalty“ = 12 i „gap extension penalty“ = 4. Upotreba GAP može da bude poželjna ali mogu da se koriste drugi algoritmi, npr. BLAST (koji koristi postupak prema Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 405-410), FASTA (koji koristi postupak prema Pearson and Lipman (1988) PNAS USA 85: 2444-2448), ili Smith-Waterman algoritam (Smith and Waterman (1981) J. Mol Biol. 147: 195-197), ili TBLASTN program, prema Altschul et al. (1990) supra, koji generalno koristi podešene parametre. Posebno, može da se koristi psi-Blast algoritam (Nucl. Acids Res. (1997) 25 3389-3402).

[0098] Molekul antitela takođe može da sadrži strukturnu petlju, CH3 domen, CH2 domen, CH2 i CH3 domen, sekvencu lakog lanca ili teškog lanca koja ima jednu ili više izmena u aminokiselinskoj sekvenci (adicija, delecija, supstitucija i/ili insercija aminokiselinskog ostatka), poželjno 20 izmena ili manje, 15 izmena ili manje, 10 izmena ili manje, 5 izmena ili manje, 4 izmene ili manje, 3 izmene ili manje, 2 izmene ili manje, ili 1 izmenu u poređenju sa strukturnom petljom, CH3 domen, CH2 domen, CH2 i CH3 domen, ovde prikazanu sekvencu lakog lanca ili teškog lanca, pod uslovom da VL i VH domeni sekvenci lakog i teškog lanca, redom, ostaju nepromenjeni. Posebno, izmene mogu da se naprave u jednom ili više regiona okvira u molekulu antitela izvan sekvenci VH i VL domena.

[0099] Na primer, molekul antitela može da se sastoji iz sekvence CH3 domena sa jednom ili više izmena u sekvenci aminokiselina (adicija, delecija, supstitucija i/ili insercija amiokiselinskog ostatka), poželjno 20 izmena ili manje, 15 izmena ili manje, 10 izmena ili manje, 5 izmena ili manje, 4 izmene ili manje, 3 izmene ili manje, 2 izmene ili manje, ili 1 izmena u poređenju sa sekvencom CH3 domena koja je predstavljena u SEQ ID NO: 4, 5, ili 135.

[0100] Alternativno, molekul antitela se sastoji iz sekvence CH3 i CH2 domena, sa jednom ili više izmena u aminokiselinskog sekvenci (adicija, delecija, supstitucija i/ili insercija aminokiselinskog ostatka), poželjno 20 izmena ili manje, 15 izmena ili manje, 10 izmena ili manje, 5 izmena ili manje, 4 izmene ili manje, 3 izmene ili manje, 2 izmene ili manje, ili 1 izmena u poređenju sa sekvencom CH2 i CH3 domena predstavljenom u SEQ ID NO: 6 ili 7.

[0101] Takođe je prikazan molekul antitela koji je u kompeticiji sa molekulom antitela iz pronalaska za vezivanje za LAG-3 i/ili PD-L1, ili koji se vezuje za isti epitop na LAG-3 i/ili PD-L1 kao molekul antitela iz pronalaska, pri čemu molekul antitela sadrži oba mesto za vezivanje antigena zasnovano na CDR za PD-L1 i mesto za vezivanje LAG-3 antigena koje je locirano u CH3 domenu molekula antitela. Postupci za određivanje kompeticije za antigen od strane dva antitela su poznati u oblasti tehnike. Na primer, kompeticija za vezivanje za antigen od strane dva antitela može da se odredi korišćenjem BIAcore. Postupci za mapiranje epitopa vezanog od strane antitela su slično tome poznati u oblasti tehnike.

[0102] Molekul antitela iz pronalaska se poželjno vezuje za LAG-3 sa afinitetom (KD) 1 x 10<-9>M ili afinitetom koji je veći. Na primer, molekul antitela iz pronalaska može da se veže za LAG-3 sa afinitetom (KD) od 8 x 10<-10>M, ili sa afinitetom koji je veći.

[0103] Fcat-a imaju manju površinu za vezivanje u odnosu na monoklonska antitela kako mesta vezivanja Fcat-a obrazuju relativno kompaktan fragment antitela sa dva mesta za vezivanje koja su

1

postavljena u međusobnoj blizini. Suprotno tome, delovi ( „kraci“) Fat uobičajenog mAt su razdvojeni sa fleksibilnim zglobnim regionom. Dva antigen vezujuća mesta Fcat su prostorno takođe bliska jedan sa drugim, u poređenju sa onim kod uobičajenog mAt. Na osnovu ove manje površine za vezivanje i smanjene fleksibilnosti dva vezujuća mesta bilo je iznenađujuće da su anti-LAG-3 Fcat-a bila sposobna da se vežu za i inhibiraju LAG-3 sa sličnim afinitetom i potencijom kao reper (eng. benchmark) monoklonsko antitelo.

[0104] Molekul antitela iz pronalaska se poželjno vezuje za PD-L1 sa afinitetom (KD) od 1 x 10<-9>M ili sa afinitetom koji je veći.

[0105] Afinitet vezivanja molekula antitela sa srodnim antigenom, kao što je LAG-3 ili PD-L1 može da se odredi sa površinskom plazmonskom rezonancijom (SPR), na primer. Afinitet vezivanja molekula antitela sa srodnim antigenom, kao što je LAG-3 ili PD-L1, eksprimiranim na ćelijskoj površini može da se odredi sa protočnom citometrijom.

[0106] Molekul antitela iz predmetnog pronalaska je poželjno sposoban za vezivanje sa LAG-3 i PD-L1 eksprimiranim na površini ćelije. Ćelija je poželjno ćelija kancera.

[0107] Molekul antitela iz predmetnog pronalaska je poželjno sposoban za istovremeno vezivanje sa LAG-3 i PD-L1. U poželjnom izvođenju, molekul antitela iz predmetnog pronalaska je sposoban za istovremeno vezivanje sa LAG-3 i PD-L1, pri čemu su LAG-3 i PD-L1 eksprimirani na površini jedne ćelije, ili na površini dve odvojene ćelije.

[0108] Molekul antitela iz pronalaska može da se veže za humani LAG-3, mišji LAG-3, i/ili LAG-3 cinomologus majmuna. Poželjno, molekul antitela iz pronalaska se vezuje za humani LAG-3. Najpoželjnije, molekul antitela iz pronalaska se vezuje za humani LAG-3 i humani PD-L1.

[0109] Molekul antitela iz pronalaska se sastoji iz (i) mesta za vezivanje antigena koje je zasnovano na CDR za PD-L1; i (ii) mesta za vezivanje LAG-3 antigena koje je locirano u konstantnom domenu molekula antitela kao što je predstavljeno u patentnim zahtevima. Molekuli antitela koji se ne sastoje iz mesta za vezivanje LAG-3 antigena lociranog u konstantnom domenu, kao što je CH3 domen, molekula antitela prema tome ne obrazuju deo predmetnog pronalaska. Slično tome, molekul koji se ne sastoji iz mesta za vezivanje antigena koje je zasnovano na CDR za PD-L1 ne obrazuje deo predmetnog pronalaska.

[0110] Molekul antitela iz predmetnog pronalaska može da bude spojen sa terapeutskim sredstvom ili obeleživačem za detekciju. U ovom slučaju, molekul antitela može da bude naznačen kao konjugat. Na primer, molekul antitela može da bude spojen sa modulatorom imunskog sistema, citotoksičnim molekulom, radioizotopom, ili obeleživačem za detekciju. Modulator imunskog sistema ili citotoksični molekul može da bude citokin. Obeleživač za detekciju može da bude radioizotop, npr. ne-terapeutski radioizotop.

[0111] Molekul antitela može da bude spojen sa terapeutskim sredstvom ili obeleživačem za detekciju, pomoću peptidne veze ili grupe za povezivanje, tj. u polipeptidu za spajanje koji se sastoji iz pomenutog terapeutskog sredstva ili obeleživača za detekciju i molekula antitela ili njegove komponente polipeptidnog lanca. Drugi načini za spajanje uključuju hemijsko spajanje, posebno unakrsnim vezivnjem korišćenjem bifunkcionalnog reagensa (npr. korišćenjem DOUBLE-REAGENTS™ Cross-linking Reagents Selection Guide, Pierce).

[0112] Molekul antitela i terapeutsko sredstvo ili obeleživač za detekciju mogu prema tome međusobno da budu povezani direktno, na primer preko bilo koje pogodne hemijske veze ili preko grupe za vezivanje, na primer peptidna grupa za vezivanje.

1

[0113] Peptidna grupa za vezivanje može da bude kratka (2-20, poželjno 2-15, ostataka aminokiselina koje prostiru). Pogodni primeri sekvenci peptidnih grupa za vezivanje su poznati u oblasti tehnike. Mogu da se koriste jedna ili više različitih grupa za vezivanje. Grupa za vezivanje može da bude dužine 5 aminokiselina.

[0114] Hemijska veza može da bude, na primer, kovalentna ili jonska veza. Primeri kovalentnih veza uključuju peptidne veze (amidne veze) i disulfidne veze. Na primer molekul antitela i terapeutsko i dijagnostičko sredstvo mogu da budu kovalentno spojeni. Na primer pomoću peptidnih veza (amidne veze). Prema tome, molekul antitela i terapeutsko i dijagnostičko sredstvo mogu da budu proizvedeni (sekretovani) kao jednolančani polipeptid.

[0115] Pronalazak takođe obezbeđuje izolovane nukleinske kiseline koje kodiraju za molekule antitela iz pronalaska. Stručnjak iz oblasti tehnike neće imati poteškoća u dobijanju takvih nukleinskih kiselina upotrebom postupaka koji su dobro poznati u oblasti tehnike. Izolovana nukleinska kiselina može da se koristi za eksprimiranje molekula antitela iz pronalaska, na primer, ekspresijom u bakterijskoj, ćeliji kvasca, insekta ili sisarskoj ćeliji domaćina. Poželjna ćelija domaćina je sisarska ćelija kao što je CHO, HEK ili NS0 ćelija. Nukleinska kiselina će generalno biti obezbeđena u obliku rekombinantnog vektora za ekspresiju.

[0116] Izolovana nukleinska kiselina može, na primer, da sadrži sekvencu koja je predstavljena u SEQ ID NO: 142, 4, 9, 14, 19, 24, 29, 34, 39, 44, ili 49, koja kodira CH3 domene FS18-7-9 (nukleotidna sekvenca optimizovana CHO kodonom), FS18-7-9 (HEK293-eksprimirana nukleotidna sekvenca), FS18-7-32, FS18-7-33, FS18-7-36, FS18-7-58, FS18-7-62, FS18-7-65, FS18-7-78, FS18-7-88, i FS18-7-95, redom.

[0117] In vitro ćelije domaćina koje sadrže takve nukleinske kiseline i vektore su deo pronalaska, kao i što je njihova upotreba za eksprimiranje antitela iz pronalaska, koje zatim može da bude prečišćeno iz ćelijske kulture i po potrebi formulisano u farmaceutskoj kompoziciji. Predmetni pronalazak prema tome dalje obezbeđuje postupak za dobijanje molekula antitela iz pronalaska, koji obuhvata kultivisanje rekombinantne ćelije domaćina iz pronalaska u uslovima za proizvodnju molekula antitela. Postupci za kultivaciju pogodnih ćelija domaćina kao što je pomenuto gore u tekstu su dobro poznati u oblasti tehnike. Postupak može dalje da obuhvati izolovanje i/ili prečišćavanje molekula antitela. Postupak može takođe da obuhvati formulisanje molekula antitela u farmaceutsku kompoziciju, po potrebi sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijentom ili drugom supstancom kao što je opisano u tekstu ispod.

[0118] Poznato je da je PD-L1 eksprimiran na mnogim kanceroznim ćelijama, dok je ekspresija LAG-3 na kancerozim ćelijama više ograničena. Oba su eksprimirana na ćelijama imunskog sistema. Posebno, poznato je da je LAG-3 eksprimira na iscrpljenim T ćelijama unutar tumorskog okruženja. Dodatno, predmetni pronalazači su pokazali da upotreba molekula antitela koje se vezuje za oba LAG-3 i PD-L1 je efikasna u suprimiranju tumorskog rasta u modelima kancera kod singenih miševa, i da su takvi molekuli antitela efektivniji u odnosu na davanje dva vezujuća molekula koji se vezuju za LAG-3 i PD-L1, redom.

[0119] Prema tome, molekul antitela iz pronalaska može da se koristi u postupku lečenja kancera kod pacijenta. Pacijent je poželjno humani pacijent.

[0120] Ćelije kancera koje treba tretirati korišćenjem molekula antitela iz pronalaska mogu da eksprimiraju LAG-3, npr. na njihovoj ćelijskoj površini. U jednom izvođenju, ćelije kancera koje treba tretirati su možda određene da eksprimiraju LAG-3, npr. na njihovoj ćelijskoj površini. Na primer, pokazano je da limfomi B ćelija eksprimiraju LAG-3 na njihovoj ćelijskoj površini. Postupci za

2

određivanje ekspresije antigena na ćelijskoj površini su poznati u oblasti tehnike i uključuju, na primer, protočnu citometriju.

[0121] Primer 4 u tekstu ispod pokazuje da molekuli antitela i predmetnog pronalaska mogu da budu korišćeni za lečenje tumora sa visokim nivoima imunskih ćelija koje eksprimiraju LAG-3, kao što su TILs ćelije koje eksprimiraju LAG-3-TILs, kod miševa. Prema tome, dodatno, ili alternativno, tumori kancera koje treba tretirati korišćnjem molekula iz antitela iz pronalaska mogu da sadrže imunske ćelije koje eksprimiraju LAG-3. Imunske ćelije koje eksprimiraju LAG-3, kao što su TILs koji eksprimiraju LAG-3, su prisutni između tumorskih ćelija u mnogim kancerima. U jednom izvođenju, određeno je da tumori kancera koje treba tretirati korišćenjem molekula antitela iz pronalaska sadrže imunske ćelije koje eksprimiraju LAG-3. Postupci za određivanje prisustva imunskih ćelija koje eksprimiraju LAG-3 u tumoru ili u periferiji tumora su poznati u oblasti tehnike.

[0122] Primer 4 u tekstu ispod takođe pokazuje da molekuli antitela iz predmetnog pronalaska može da se koristi za lečenje tumora koji eksprimiraju PD-L1 na njihovoj ćelijskoj površini. Prema tome, dodatno, ili alternativno, ćelije kancera koje treba tretirati korišćenjem molekula antitela iz pronalaska mogu da eksprimiraju PD-L1, npr. na njihovoj ćelijskoj površini. Dodatno, ili alternativno, tumori kancera koje treba tretirati mogu da sadrže imunske ćelije, kao što su TILs, koje eksprimiraju PD-L1. Ćelije kancera koje treba tretirati mogu da budu određene da eksprimiraju PD-L1, npr. na njihovoj ćelijskoj površini. Dodatno, ili alternativno, tumori kancera koje treba tretirati mogu da budu određene da sadrže imunske ćelije, kao što su TILs, koje eksprimiraju PD-L1.

[0123] Ekspresija LAG-3 i PD-L1 na ćelijskoj površini je očekivana da omogući molekulu antitela da se veže za LAG-3 i PD-L1 koji je eksprimiran na površini imunske ćelije i/ili ćelije kancera. Smatra se da ovo dovodi do direktne terapije, premošćavanjem, i lokalizacijom kanceroznih ćelija i imunskih ćelija.

[0124] Ćelije kancera koje treba tretirati korišćenjem antitela iz pronalaska mogu da budu izabrane iz grupe koja se sastoji iz Hodgčkinovog limfoma, ne-Hodčkinovog limfoma (kao što je difuzni krupnoćelijski B limfom, indolentni ne-Hodčkinov limfom, limfom mantle ćelija, kancer jajnika, kancer prostate, kolorektalni kancer, fibrosarkom, karcinom bubrežne ćelije, melanom, kancer pankreasa, kancer dojke, glioblastom (glioblastoma multiforme), kancer pluća (kao što je nesitnoćelijski kancer pluća), kancer glave i vrata (kao što je karcinom skvamoznih ćelija glave i vrata), kancer stomaka (kancer želudca), kancer bešike, cervikalni kancer, kancer uterusa, kancer vulve, kancer testisa, kancer penisa, leukemija (kao što je hronična limfocitna leukemija, mijeloidna leukemija, akutna limfoblastoidna leukemija, ili hronična limfoblastoidna leukemija), multipli mijelom, kancer skvamozne ćelije, kancer testisa, kancer jednjaka (kao što je adenokarcinom gastroezofagealne veze), Kapošijev sarkom, i limfom centralnog nervnog sistema (CNS), hepatoćelijski karcinom, nazofaringealni kancer, karcinom Merkelove ćelije, i mezoteliom. Tumori ovih kancera su poznati, ili je očekivano, da eksprimiraju PD-L1 na njihovoj ćelijskoj površini i/ili sadrže imunske ćelije kao što su TILs, koje eksprimiraju PD-L1 i/ili LAG-3.

[0125] Tretman karcinoma ćelija bubrega, kancera pluća (kao što je nesitnoćelijski kancer pluća), nazofaringealni kancer, kolorektalni kancer, melanom, kancer stomaka (kancer želudca), kancer jednjaka (kao što je adenokarcinom gastroezofagealne veze), kancer jajnika, kancer cerviksa, kancer bešike, kancer glave i vrata (kao što je karcinom skvamozih ćelija glave i vrata), leukemija (kao što je hronična limfocitna leukemija, Hodgčkinov limfom, ne-Hodgčkinov limfom (kao što je difuzni krupnoćelijski B limfom, indolentni ne-Hodčkinov limfom, limfom mantle ćelija), i multipli mijelom korišenjem anti-LAG-3 antitela je ispitan u kliničkim ispitivanjima i pokazani su obećavajući rezultati. Prema tome, kancer koga treba tretirati korišćenjem molekula antitela iz predmetnog pronalaska može da bude kancer ćelija bubrega, kancer pluća (kao što je nesitnoćelijski kancer pluća), nazofaringealni kancer, kolorektalni kancer, melanom, kancer stomaka (kancer želudca), ezofagealni kancer (kao što je adenokarcinom gastroezofagealne veze), kancer jajnika, kancer cerviksa, kancer bešik, kancer glave i vrata (kao što je karcinom skvamoznih ćelija glave i vrata), leukemija (kao što je hronična limfocitna leukemija, Hodgčkinov limfom, ne-Hodgčkinov limfom (kao što je difuzni krupnoćelijski B limfom, indolentni ne-Hodgčkinov limfom, limfom mantle ćelija), ili multipli mijelom.

[0126] Tretman melanoma, kolorektalni kancer, kancer dojke, kancer bešike, karcinom ćelije bubrega, kancer bešike, kancer želudca, kancer glave i vrata (kao što je karcinom skvamozne ćelije glave i vrata), mezoteliom, kancer pluća (kao što je nesitnoćelijski kancer pluća), kancer ovarijuma, karcinom Merkelove ćelije, kancer pankreasa, melanom i hepatoćelijski karcinom korišćenjem anti-PD-L1 antitela je takođe ispitivano u kliničkim ispitivanjima i pokazani su obećavajući rezultati. Prema tome, kancer koga treba tretirati korišćenjem molekula antitela iz predmetnog pronalaska može da bude melanom, kolorektalni kancer, kancer grudi, kancer bešike, karcinom ćelije bubrega, kancer bešike, kancer želudca, kancer glave i vrata (kao što je karcinom skvamoznih ćelija glave i vrata), mezoteliom, kancer pluća (kao što je nesitnoćelijski kancer pluća), kancer jajnika, karcinom Merkel ćelija, ancer pankreasa, melanom, ili hepatoćelijski karcinom.

[0127] Poželjni kancer za tretman korišćenjem molekula antitela iz predmetnog pronalaska su kancer pluća (kao što je nesitnoćelijski kancer pluća), kancer bešike, kancer glave i vrata (karcinom skvamoznih ćelija glave i vrata), difuzni krupnoćelijski B limfom, kancer želudca, kancer pankreasa i hepatoćelijski karcinom. Poznato je da tumori ovih kancera sadrže imunske ćelije koje eksprimiraju LAG-3 i koje eksprimiraju PD-L1 ili na njihovoj ćelijskoj površini ili da sadrže imunske ćelije koje eksprimiraju PD-L1.

[0128] Gde se primena odnosi na određenu vrstu kancera, kao što je kancer grudi, ovo se odnosi na malignu transformaciju relevantnog tkiva, u ovom slučaju tkiva dojke. Kancer koji nastaje od maligne transformacije različitog tkiva, npr. tkiva jajnika, može rezultovati metastatskim lezijama u drugoj lokaciji na telu, kao što je dojka, ali time nije kancer dojke kao što je ovde naznačen već je kancer jajnika.

[0129] Kancer može biti primarni ili sekundarni kancer. Prema tome, molekul antitela iz predmetnog pronalaska može da bude za upotrebu u postupku za lečenje kancera kod pacijenta, pri čemu je kancer primarni tumor i/ili tumorske metastaze.

[0130] Molekuli antitela iz pronalaska su dizajnirani da se koriste u postupcima lečenja pacijenata, posebno humanih pacijenata. Molekuli antitela će obično biti davani u obliku farmaceutske kompozicije, koja može da sadrži bar jednu komponentu pored molekula antitela, kao što je farmaceutski prihvatljiv ekscipijent. Na primer, farmaceutska kompozicija iz predmetnog pronalaska, može da sadrži, pored aktivnog sastojka, farmaceutski aktivan ekscipijent, nosač, pufer, stabilizator ili druge materijale koji su dobro poznati u oblasti tehnike. Takvi materijali trebaju da budu ne-toksični i ne trebaju da interferiraju sa efikasnošću aktivnog sastojka. Precizna priroda nosača ili drugog materijala će zavisiti od načina davanja, što može da bude injekcijom, npr. intravenozno ili subkutanozno. Molekul antitela može da se daje intravenozno, ili subkutanozno.

[0131] Tečne farmaceutske kompozicije generalno sadrže tečni nosač kao što je voda, sirovo ulje, životinjska ili biljna ulja, mineralna ulja ili sintetička ulja. Fiziološki rastvor soli, dekstroza ili drugi rastvori saharida ili glikola kao što je etilen glikol, propilen glikol ili polietilen glikol mogu da budu uključeni.

[0132] Za intravenoznu injekciju, ili injekcija na mestu bola, molekul antitela, ili farmaceutska kompozicija koja se sastoji i molekula antitela, poželjno u obliku parentalno prihvatljivog vodenog rastvora koji je bez pirogena i ima pogodnu pH, izotoničnost i stabilnost. Stručnjaci iz relevantne oblasti tehnike će biti sposobni da pripreme odgovarajuće rastvore korišćenjem, na primer, izotoničnih nosača kao što su injekcija natrijum hlorida, injekcija Ringera, Ringerova injekcija sa laktatom. Mogu da se koriste konzervansi, stabilizatori, puferi, antioksidansi i/ili drugi aditivi, po potrebi. Mnogi postupci za dobijanje farmaceutskih formulacija su poznati stručnjacima iz oblasti tehnike. Videti npr. Robinson ed., Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.

[0133] Kompozicija koja se sastoji iz molekula antitela prema predmetnom pronalasku može da se daje zasebno ili u kombinaciji sa drugim tretmanima, istovremeno ili uzastopno kao kombinovani preparat sa drugim terapeutskim sredstvom ili sredstvima, u zavisnosti od stanja koje se leči. Na primer, molekul antitela iz pronalaska može da se daje u kombinaciji sa postojećim terapeutskim sredstvom za bolest koju treba lečiti, npr. kancer kao što je pomenuto gore u tekstu. Na primer, molekul antitela iz predmetnog pronalaska može da se daje pacijentu u kombinaciji sa drugom anti-kanceroznom terapijom, kao što je hemoterapija anti-tumorska vakcinacija (takođe naznačena kao vakcinacija kancera), terapija zračenjem, imunoterapija, onkolitički virus, T ćelijska terapija himernog receptora antigena (CAR), ili hormonska terapija.

[0134] Očekivano je da molekul antitela iz pronalaska može da deluje kao adjuvans u anti-kanceroznoj terapiji, kao što je hemoterapija, anti-tumorska vakcinacija, ili radio terapija. Bez želje za vezivanjem za teoriju, smatra se da će davanje molekula antitela pacijentu kao dela hemoterapije, anti-tumorske vakcinacije, ili terapije zračenjem biti pokretač za veći imunski odgovor protiv antigena povezanih sa kancerom LAG-3 i PD-L1, nego što je postignuto u hemoterapiji, anti-tumorskoj vakcinaciji, ili samoj terapiji zračenjem. Na primer, anti-LAG-3 terapije su pokazale dobru efikasnost u lečenju patologija kod miševa koje su zasnovane na virusima (Blackburn SD, et al., 2009).

[0135] Postupak za lečenje kancera kod pacijenta može prema tome da obuhvati davanje pacijentu terapeutski efikasne količine molekula antitela prema predmetnom pronalasku u kombinaciji sa hemoteraputskim sredstvom, antitumorskom vakcinom, radionuklidom, imunoterapeutskim sredstvom, onkolitičkim virusima, CAR-T ćelijama, ili sredstvom za hormonsku terapiju. Hemoterapeutsko sredstvo, anti-tumorska vakcina, radionuklid, imunoterapeutsko sredstvo, onkolitički virusi, CAR-T ćelije, ili sredstvo za hormonsku terapiju je poželjno hemoterapeutsko sredstvo, anti-tumorska vakcina, radionuklid, imunoterapeutsko sredstvo, onkolitički virusi, CAR-T ćelije, ili sredstvo za hormonsku terapiju za kancer u pitanju, tj. hemoterapeutsko sredstvo, antitumorska vakicna, radionuklid, imunoterapeutsko sredstvo, onkolitički virusi, CAR-T ćelije, ili sredstvo za hormonsku terapiju za koje je pokazano da je efikasno u lečenju kancera u pitanju. Odabir odgovarajućeg hemoterapeutskog sredstva, anti-tumorske vakcine, radionuklida, imunoterapeutskog sredstva, onkolitičkih virusa, CAR-T ćelija, ili sredstva za hormonsku terapiju za koje je pokazano da su efikasni za kancer u pitanju što je takođe u okviru kapaciteta osobe koja je stručna u praksi.

[0136] Na primer, gde postupak obuhvata davanje pacijentu terapeutski efikasne količine molekula antitela prema predmetnom pronalasku u kombinaciji sa hemoterapeutskim sredstvom, hemoterapeutsko sredstvo iz grupe koja se sastoji iz: taksana, citotoksičnih antibiotika, inhibitora tirozin kinaze, PARP inhibitora, inhibitora B_RAF enzima, sredstava za alkilovanje, analoga platine, nukleozidnih analoga, derivata talidomida, antineoplastičnih hemoterapeutskih sredstava i drugih. Taksani uključuju docetaksel, paklitaksel i nab-paklitaksel; citotoksični antibiotici uključuju aktinomicin, bleomicin, antracikline, doksorubicin i valrubicin; ihibitori tirozin kinaze uključuju erlotinib, gefitinib, aksitinib, PLX3397, imatinib, cobemitinib i trametinib; PARP inhibitori uključuju piraparib; Inhibitori enzima B-Raf uključuju vemurafenib i dabrafenib; sredstva za alkilovanje uključuju dakarbazin, ciklofosfamid, temozolomid; analozi platine uključuju karboplatin, cisplatin i oksaliplatin; nukleozidni analozi uključuju gemcitabin i azacitidin; antineoplastici uključuju fludarabin. Druga hemoterapeutska

2

sredstva koja su pogodna za upotrebu u predmetnom pronalasku uključuju metotreksat, defactinib, entinostat, pemetreksed, kapecitabin, eribulin, irinotekan, fluorouracil, i vinblastin.

[0137] Strategije vakcinacije za lečenje kancera su obe implementirane u kliničkoj i detaljno su razmatrane u naučnoj literaturi (kao što je Rosenberg, S.2000 Development of Cancer Vaccines). Ovo uglavnom uključuje strategije kojima se podstiče imunski sistem da reaguje i odgovori na različite ćelijske markere koji su eksprimirani od strane autolognih ili alogenih kanceroznih ćelija korišćenjem takvih ćelija kao načina za vakcinaciju, oba sa ili bez faktora koji stimuliše kolonije granulocitamakrofaga (GM-CSF). GM-CSF podstiče jak odgovor kod prezentovanja antigena a posebo dobro funkcioniše kada se koristi sa pomenutim strategijama.

[0138] Davanje može da bude u "terapeutski efikasnoj količini", što je dovoljno da pacijentu bude od koristi. Takav benefit može da bude bar ublažavanje najmanje jednog simptoma. Prema tome "tretman" specifične bolesti se odnosi na ublažavanje najmanje jednog simptoma. Stvarno primenjena količina, i brzina i vremenski tok davanja, će zavisiti od prirode i težine stanja koje se leči, posebno pacijenta koji se leči, kliničkog stanja individualnog pacijenta, uzročnika bolesti, mesta isporuke kompozicije, vrste molekula antitela, načina davanja, rasporeda davanja i drugih faktora koji su poznati osobama iz medicinske prakse. Propisivanja lečenja, npr. odluka u vezi sa dozom itd., je obuhvaćeno okvirom lekara opšte prakse i drugih lekara, i može da zavisi od težine simptoma i/ili progresije bolesti koja se leči. Odgovarajuće doze molekula antitela su poznate u oblasti tehnike (Ledermann et al. (1991) Int. J. Cancer 47: 659-664; and Bagshawe et al. (1991) Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4: 915-922). Specifične doze koje su ovde naznačene, ili u Physician’s Desk Reference (2003) kao odgovarajuće za molekul antitela koji se daje, mogu da se koriste. Terapeutski efikasna količina ili odgovarajuća doza molekula antitela može da bude određena poređenjem njegove in vitro aktivnosti i in vivo aktivnosti u životinjskom modelu. Poznati su postupci za ekstrapolaciju efikasnih doza kod miševa i drugih ispitivanih životinja na ljude. Precizna doza će zavisiti od brojnih faktora, ukljčujući da li veličina i položaj oblasti koju treba tretirati, i tačne prirode molekula antitela. Tretmani mogu da se ponavljaju u dnevnim, dva puta nedeljno, nedeljnim ili mesečnim intervalima, po nahođenju lekara tretman može da se daje pre, i/ili posle operacije, i može da se daje ili primeni direktno na anatomskom mestu hirurškog tretmana.

[0139] "i/ili" gde je ovde korišćeno treba uzeti kao specifičan prikaz svake od dve specifične karakteristike ili komponente sa ili bez druge. Na primer "A i/ili B" treba uzeti kao specifičan prikaz svakog od (i) A, (ii) B i (iii) A i B, baš kao da je svaki ovde predstavljen pojedinačno.

[0140] Osim ukoliko kontekst ne ukazuje drugačije, opisi i definicije gore prikazanih karakteristika nisu ograničeni bilo kojim posebnim aspektom ili izvođenjem iz pronalaska, koje je prikazano u zahtevima, i jednako se primenjuje na sve aspekte i izvođenja koja se opisuju.

[0141] Određeni aspekti i izvođenja iz pronalaska će sada biti ilustrovani primerom i sa referencom na Slike koje su opisane u tekstu ispod.

Primeri

Primer 1 – Selekcija i karakterizacija Fcat molekula

1.1 Naivna selekcija i sazrevanje afiniteta anti-humanih LAG-3 Fcat-a

1.1.1 Naivna selekcija

[0142] Biblioteke naivnih faga koji ispoljavaju CH3 domen humanog IgG1 (IMGT numerisanje 1.4-130) sa randomizacijom u okviru AB (ostaci 14-18) i EF (ostaci 92-101) petlji su korišćeni za selekciju sa Fctagovanim humanim LAG-3 (LAG-3 Fc) antigenom (R&D sistemi, 2319-L3-050). Biblioteke su izabrane u tri runde korišćenjem antigena koji je uhvaćen na zrncima Proteina A (Life Technologies, 10002D) ili Proteina G (Life Technologies, 10004D). Ishodi su pretraženi sa ELISA i pozitivno vezani su pod-klonirani i eksprimirani kao rastvorljiva Fcat-a (koji sadrže prekinuti zglobni region) u Pichia pastoris korišćenjem EasySelect Pichia kita za ekspresiju (Life Technologies, K1740-01). Fcat-a su nakon toga pretražena za vezivanje sa rekombinantnim humanim LAG-3 Fc na Biacore 3000 (GE Healthcare). Ukratko, LAG-3 Fc (R&D sistemi, 2319-L3-050) je kuplovan na gustini od 7200 RU za CM5 čip (GE Healthcare, BR-100012) pomoću kuplovanja amina (GE Healthcare, BR-1000-50). Fcat-a su razblažena u HBS-P (GE Healthcare, BR100368) puferu i ubrizgana su na 250 nM, 500 nM i 1000 nM tokom 3 min i zatim je omogućena disocijacija u puferu tokom 5 min. Referentni oduzeti podaci (LAG-3 Fc protočna ćelija 2-blank protočna ćelija) je analizirana korišćenjem BIAevaluation 3.2 softvera za identifikovanje vezivanja. Fcat-a su nakon toga ispitana za vezivanje sa HEK ćelijskim eksprimiranim humanim LAG-3 (LAG-3 je kloniran u pcDNA5FRT vektor [Life Technologies, V6010-20] [Videti odeljak 1.4.5 za metodologiju]). Ukratko, HEK 293 ćelije koje prekomerno eksprimiraju LAG-3 gajene u DMEM (Life Technologies, 61965-026) koje sadrže 10% FBS (Life Technologies, 10270-1-6), 100 µg/ml Higromicin B (Melford Laboratories Ltd, Z2475), 15 µg/ml Blasticidin (Melford Laboratories Ltd, B1105) i 1 µg/ml Doksiciklin (Sigma, D9891) su odvojene od posuda za kulture tkiva korišćenjem pufera za disocijaciju ćelija (Life Technologies, 13151-014) i zasejane su u ploče sa 96 bunarića sa V-dnom u 2x10<5>ćelija/bunariću. Fcat-a su inkubirana sa ćelijama na 5 µM u zapremini 100 µl tokom 1 h na 4 °C. Ploče su isprane sa sekundarnim antitelom (Anti-humano Fc-488, Jackson ImmunoResearch, 109-546-098) koje je razblaženo 1:1000 u PBS i 100 µl je dodato u ćelije i inkubirano u trajanju od 30 min na 4 °C. Ploče su isprane i ćelije su resuspendovane u 100 µl PBS koji sadrži 1 µg/ml DAPI (Biotium, 40043). Ploča je čitana na BD FACSCanto II citometru (BD Biosciences) i podaci su analizirani pomoću FlowJoX. Fcat-asu nakon toga eksprimirana u sisarskim ćelijama transformacijom pomoću lipofektamina (Life Technologies, 11668-019) u FIp-In T-Rex 293 ćelije (Life Technologies, R780-07). LAG-3 vezujuća Fcat-a su ispitana za inhibiciju vezivanja na humane MHC klase II na A375 ćelijama (ATCC, CRL-1619) sa rekombinantnim LAG-3 Fc (korišćenjem metodologije u primeru 1.6).54 jedinstvenih sekvenci Fcat je identifikovano iz tri runde fagne selekcije, i određeno je da se 12 od ovih Fcat-a vezuje za LAG-3 Fc pomoću BIAcore analize i/ili vezuje za HEK ćelije koje eksprimiraju LAG-3. Tri od izabranih Fcat-a je takođe bilo sposobno da inhibira interakciju LAG-3 sa MHC klasom II i izabrani su za afinitetno sazrevanje. Tri Fcat-a su nazvana FS18-3, FS18-7 i FS18-21.

1.1.2 Sazrevanje afiniteta

Prvo sazrevanje afiniteta

[0143] Šest biblioteka fagnog prikaza sazrevanja afiniteta je konstruisano randomizacijom pet ostataka u AB petlji (ostaci 14-18) i ili pet (ostaci 92-94 i 97-98) ili osam (ostaci 92-94 i 97-101) ostataka u EF petlji svakog od tri Fcat-a identifikovanog korišćenjem postupka naivne selekcije koji je opisan u tekstu ispod.

[0144] Biblioteke afinitetnog sazrevanja su izabrane korišćenjem rekombinantnog humanog LAG-3 Fc (R&D systems, 2319-L3-050) i HEK ćelija koje eksprimiraju humani LAG-3 (kao što je opisano gore u tekstu). Ishodi su pretraženi ELISA testom faga, pozitivno vezani su podklonirani i eksprimirani kao Fcata (koji sadrže prekinuti zglobni region) u HEK Expi293 ćelijama (Fcabs kloniran u pTT5 vektor [National Research Council of Canada] transfektovan korišćenjem ExpiFectamine 293 kita za transfekciju [Life Technologies, A14524] u Expi293F ćelije [Life technologies, A14527]). HEK su eksprimirale rastvorljiva Fcat-a nakon čega su pretraženi za vezivanje sa ćelijskim eksprimiranim humanim LAG-3, vezivanje za ćelijski eksprimiran LAG-3 cinomolgusa (metodologija kao u primeru 1.4.3), i sposobnost da blokiraju vezivanje MHC klase II sa rekombinantnim LAG-3 Fc (metodologija kao u primeru 1.6). Blokirajuća Fcat-

2

a su dalje ispitana da bi se odredilo da li su sposobna za reverznu LAG-3 indukovanu inhibiciju sekrecije IL-2 u testu aktivacije T ćelija (metodologija kao u primeru 2.1). 61 jedinstveni anti-LAG-3 Fcat-i su identifikovani sa šest biblioteka afinitetnog sazrevanja korišćenjem ovih postupaka za pretraživanje. Pokazano je da afinitetno zrela Fcat-a iz linije FS18-7 imaju najveći nivo ukrštene reaktivnosti sa LAG-3 cinomolgus majmuna. Tri Fcat-a iz ove linije sa najjačim vezivanjem za LAG-3 Fc cinomolgus majmuna i najvećom aktivnosti u testu aktivacije T ćelija (pod imenom FS18-7-7, FS18-7-9, i FS18-7-11) izabrani su za dalje sazrevanje afiniteta. Takođe je pokazno da ova tri Fcat-a blokiraju interakciju LAG-3 Fc sa ćelijski eksprimiranom MHC klasom II.

Drugo sazrevanje afiniteta

[0145] Količina od tri Fcat-a (FS18-7-7, FS18-7-9, i FS18-7-11) iz prvog afinitetnog sazrevanja je korišćena za dalje dobijanje biblioteka afinitetnog sazrevanja. CD petlja je bila teško randomizirana korišćenjem prajmera za randomizovanje ELLA Biotech. Porcija aminokiselinskih pozicija u CD petlji (ostaci 45.1-78) je randomizirana korišćenjem ekvimolarne distribucije aminokiselina isključujući cisten. PCR sklon razvijanju grešaka je takođe izveden kroz celu sekvencu CH3 domena da bi se indukovale dodatne mutacije koje mogu da pojačaju vezivanje.

[0146] Biblioteke afinitetnog sazrevanja su generisane u fagu i selekcije su izvedene protiv biotinilovanog rekombinantnog LAG-3 avi-Fc (BPS Bioscience, 71147) i HEK hLAG-3 ćelija i pretražene su za vezivanje sa rekombinantnim LAG-3 Fc (R&D sistemi, 2319-L3-050) pomoću fagnog ELISA testa.

86 jedinstvenih Fcat-a (koji sadrže prekinuti region zgloba) su eksprimirani u HEK293F ćelijama. Selektovana Fcat-a su takođe pretražena za aktivnost u testu aktivacije T ćelija kao što je opisano gore u tekstu. Devet Fcat-a je identifikovano tokom drugog sazrevanja afiniteta sa najvećom aktivnosti u testu aktivacije T ćelija (FS18-7-32; FS18-7-33; FS18-7-36; FS18-7-58; FS18-7-62; FS18-7-65; FS18-7-78; FS18-7-88; i FS18-7-95), kao i u matičnom klonu Fcat, FS18-7-9, koji su dalje karakterisani kao što je opisano u tekstu ispod. Poravnanje u sekvenci ovih devet Fcat-a protiv matičnog klona Fcat, FS18-7-9, je prikazano na Slici 1A. Slika 1B prikazuje detalje u procentu identičnosti u sekvenci svakog od devet klonova Fcat prema matičnom klonu Fcat, FS18-7-9. Fcat-a koja nastaju iz sazrevanja afiniteta dva druga matična klona Fcat, FS18-7-7 i FS18-7-11, nisu bili tako obećavajući kandidati kao oni koji nastaju iz afinitetnog sazrevanja FS18-7-9 i prema tome dalje nisu uzeti u razmatranje.

1.2 Selekcija surogata Fcat specifičnog za mišji LAG-3

[0147] Fcat FS18-7, koje je izabrano korišćenjem protokola za naivnu selekciju kao što je opisano gore u tekstu, je korišćeno za dobijanje fagnih biblioteta za odabir protiv mišjeg LAG-3. Izvedene su dve runde afinitetnog sazrevanja, i Fcat klonovi FS18-7-108-29 i FS18-7-108-35, koji su pokazali visok afinitet, specifičnim vezivanjem za mišji LAG-3 su izabrani nakon sazrevanja afiniteta. Potvrđena je sposobnost FS18-7-108-29 i FS18-7-108-35 da inhibiraju mišji LAG-3 u testu aktivacije T ćelija. Mapiranje epitopa korišćenjem Octet (Forteo Bio) je pokazalo da su anti-mišja LAG-3 Fcat-a u kompeticiji sa anti-humanim LAG-3 Fcat-a (izabrani nakon drugog sazrevanja afiniteta kao što je opisano gore u tekstu) za vezivanje sa humanim LAG-3. Postoji između 4 i 8 razlika u ostacima između anti-humanih LAG-3 i anti-mišjih LAG-3 Fcat-a. Prema tome, očekivano je da anti-mišja LAG-3 Fcat-a predstavljaju odgovarajuće surogate za vezivanje i funkciju anti-humanih LAG-3 Fcat-a kod miševa.

1.3 Konstruisanje i ekspresija „mock“ mAt<2>

[0148] "mock" mAt<2>se sastoji iz glavnog anti-humanog LAG-3 i anti-mišjih LAG-3 Fcat-a identifikovanih u 1.1 i 1.2 gore u tekstu su pripremljeni da bi se omogućila karakterizacija Fcat-a u mAt<2>formatu. Ova „mock“ mAt<2>su dobijena iz anti-LAG-3 Fcat-a i varijabilnih regiona anti-FITC antitela 4420 (videti SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, i SEQ ID NO: 85 za detalje) (Bedzyk, W. D., et al.1989 and Bedzyk, W. D., et

2

al. 1989). „mock“ mAt<2>su pripremljeni oba sa (SEQ ID NO: 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, i 81) i bez (SEQ ID NO: 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, i 82) LALA mutacija u CH2 domenu teškog lanca (videti odeljak 1.5 u tekstu ispod za detalje) i dalje se sastoje iz lakog lanca anti-FITC mAt 4420 (SEQ ID NO: 85). „mock“ mAt<2>su proizvedena prolaznom ekspresijom u HEK293-6E ćelijama i prečišćeni upotrebom mAt Select SuRe kolona proteina A.

1.4 Afinitet vezivanja Fcat-a sa LAG-3

1.4.1 Afinitet vezivanja Fcat-a sa humanim LAG-3 kao što je određeno sa površinskom plazmonskom rezonancijom (SPR)

[0149] BIAcore T200 (GE Healthcare) je korišen za merenje afiniteta anti-humanih LAG-3 Fcat-a u „mock“ mAt<2>formatu za humani LAG-3. Protočna ćelija 4 čipa senzora CM5 (GE Healthcare, BR1005-30) je imobilizovana sa humanim LAG-3-Fc (R&D Sistemi, 2319-L3-050), i protočna ćelija 3 je imobilizovana sa puferom za referencu pomoću kita za spajanje amina (GE Healthcare, BR-1000-50). LAG-3-Fc je razblažen do 5 µg/ml u natrijum acetatu pH5 (ForteoBio, 18-1069) i ubrizgan je u brzini protoka od 10µl/min za 12 sekundi nakon čega sledi deaktivacija površine ubrizgavanjem etanolamina tokom 420 sek. Nivo imobilizacije je bio 158 RU. „mock“ mAt<2>(ili kontrolno anti-humanom LAG-3 mAt, 25F7) su razblaženi u HBS-P puferu (GE Healthcare, BR-1003-68) u 2-strukim serijama razblaženja od 4 µg/ml. Kontrolno mAt/“mock“ mAt<2>su ubrizgani sa vremenom povezivanja od 240 sekundi na 30µl/min, i vremenom disocijacije od 300 sekundi na 30µl/min. Površina je regenerisana korišćenjem 25mM NaOH tokom 30 sekundi na 100 µl/min. Podaci su dvostruko referencirani oduzeti i analizirani korišćenjem BIAevaluation 3.2 softvera da bi se izračunale kinetičke konstante. Fcat-a u „mock“ mAt<2>formatu je imao afinitete za humani LAG-3 u opsegu od 0.8 - 1.1 nM (Tabela 1), koji je sličan sa afinitetom reper anti-humanim LAG-3 mAt 25F7. Ovo je bilo iznenađujuće zbog toga što Fcat-a imaju manju površinu vezivanja u odnosu na monoklonska antitela kako mesta vezivanja Fcat-a obrazuju relativno kompaktan fragment antitela sa dva mesta vezivanja smeštena u neposrednoj blizini. Suprotno tome, Fab delovi uobičajenog mAt su razdvojeni sa fleksibilnim regionom zgloba. Na osnovu ove manje površine za vezivanje i povezanom smanjenom fleksibilnosti dva mesta vezivanja u Fc regionu, bilo je neočekivano da će anti-LAG-3 Fcat-a biti sposobna da se vežu za i inhibiraju LAG-3 sa manjim afinitetom i potencijom kao reper antitelo 25F7.

Tabela 1: Afinitet vezivanja LAG-3 specifičnih Fcat-a u „mock“ mAt<2>formatu za humani LAG-3

2

1.4.2 Afinitet vezivanja surogata Fcat specifičnog za mišje LAG-3 prema mišjem LAG-3 kao što je određeno sa SPR

[0150] Biacore 3000 (GE Healthcare) je korišćen za merenje afiniteta surogata Fcat-a specifičnih za mišji LAG-3 prema mišjem LAG-3. Kuplovanje amina (kit za kuplovanje amina, GE Healthcare, BR-1000-50) je korišćen za oblaganje mLAG-3 Fc (R&D Systems, 3328-L3-050) razblaženog u 10 mM natrijum acetatu pH 5.0 (ForteBio, 18-1069) direktno za čip CM5 (GE Healthcare, BR-1000-12). Protočna ćelija 1 je obložena sa Mišjim Fc (SinoBiological, 51094-MNAH), i protočna ćelija 2 je obložena sa mLAG-3 Fc na 950 RU. Fcat-a su razblažena u HBS-P puferu (GE Healthcare, BR-1003-68) i ubrizgana su u različitim koncentracijama (četvorostruka razblaženja od 100 nM) tokom 3 min na 20 µl/min i nakon toga je omogućeno razdvajanje u puferu tokom 12 min. Čip je regenerisan ubrizgavanje 10 mM glicina pH 2.5 u trajanju od 30 s na 30 µl/min. Podaci su dvostruko referentno oduzeti i analizirani su korišćenjem BIAevaluation 3.2 softvera za izračunavanje kinetičkih konstanti. Ispitivana surogat Fcat-a vezana za mišje LAG-3 sa jednocifrenim nanomolarnim afinitetom kao što je predstavljeno u Tabeli 2.

Tabela 2: Afinitet vezivanja (KD) surogata LAG-3 specifičnih Fcat-a prema mišjem LAG-3

1.4.3 Afinitet vezivanja Fcat-a za humani LAG-3 eksoprimiran na ćelijama kao što je određeno sa protočnom citometrijom

Proizvodnja ćelijskih linija koje prekomerno eksprimiraju LAG-3

[0151] Metodologija lentivirusne transdukcije je korišćena za dobijanje DO11.10 ćelija (National Jewish Health) koje prekomerno eksprimiraju humani, cinomolgus ili mišji LAG-3 korišćenjem Lenti-X HTX sistema pakovanja (Clontech, Cat. No 631249). Lenti-X ekspresioni vektor (pLVX) (Clontech, kat. br 631253), se sastoji iz mišje LAG-3 cDNK (SEQ ID NO: 96), humane LAG-3 cDNK (SEQ ID NO: 95) ili cinomolgus LAG-3 cDNK (SEQ ID NO: 97), je ko-transfektovan sa Lenti-X HTX miksom za pakovanje u Lenti-X 293T ćelijsku liniju (Clontech, Cat. No 632180) da bi se dobio virus. DO11.10 ćelijska linija je transdukovana korišćenjem lentivirusnih vektora proizvedenih sa Lenti-X HTX sistemom za pakovanje.

[0152] Afinitet anti-humanih LAG-3 Fcat-a u „mock“ mAt<2>formatu prema ćelijama koje eksprimiraju humani LAG-3 (DO11.10 ćelijska linija transfektovana sa humanim LAG-3) je mereno protočnim citometrom. mAt<2>i razblaženja kontrolnih mAt (2 x finalna koncentracija) su pripremljeni u triplikatu u 1 x DPBS (Gibco, 14190-094). DO11.10:LAG-3 ćelijske suspenzije su pripremljene u PBS+2%BSA (Sigma, A7906) i zasejane su na 4 x 10<-6>ćelija/ml sa 50 µl/bunariću u ploče sa 96 bunarića sa V-dnom (Costar, 3897). Razblaženja 50µl mAt<2>ili kontrolnog mAt (anti humano LAG-3 mAt, 25F7) su dodata u bunariće koji sadrže ćelije (finalna zapremina 100 µl) i inkubirani su na 4°C u trajanju od 1 h. Ploče su isprane i 100µl/bunariću sekundarnog antitela (anti-humano Fc-488 antitelo, Jackson ImmunoResearch, 109-546-098) razblaženo 1:1000 u PBS+2% BSA je nakon toga dodato i inkubirano je 30 minuta na 4°C u mraku. Ploče su isprane i resuspendovane u 100 µl PBS koji se sastoji iz DAPI (Biotium, 40043) u 1 mg/ml. Ploče su očitane korišćenjem Canto II protočnog citometra (BD Bioscience). Mrtve ćelije su isključene i merena je fluorescencija u FITC kanalu (488nm/530/30). Podaci su uklopljeni korišćenjem log (agonist) u odnosu na odgovor u GraphPad Prism Sofveru. Sva ispitivana Fcat-a u „mock“ mAt<2>

2

formatu i reper anti-humano LAG-3 mAt, 25F7, vezuje humani LAG-3 sa sličnim afinitetom (EC50), u opsegu od 1.2 - 2.1 nM kao što je prikazano u Tabeli 3.

Tabela 3: Afinitet vezivanja anti-humanih LAG-3 Fcat-a u „mock“ mAt<2>formatu prema DO11.10 ćelijama koje eksprimiraju humani LAG-3 kao što je određeno sa protočnom citometrijom

1.4.4 Afinitet vezivanja Fcat-a sa cinomolgus LAG-3 eksprimiranom na ćelijama kao što je određeno sa protočnom citometrijom

[0153] Afinitet anti-humanih LAG-3 Fcat-a u „mock“ mAt<2>formatu prema ćelijama koje eksprimiraju LAG-3 cinomolgusa (DO11.10 ćelijska linija transfektovana sa LAG-3 cinomolgusa) je meren korišćenjem protočne citometrije. Razblaženja mAt<2>i kontrolnog mAt (2 x finalna koncentracija) su pripremljeni u triplikatu u 1 x DPBS (Gibco, 14190-094). DO11.10:LAG-3 ćelijske suspenzije su pripremljene u PBS+2%BSA (Sigma, A7906) i zasejane su na 4 x 10<-6>ćelija/ml sa 50 µl/bunariću u pločama sa 96 bunarića sa V-dnom (Costar, 3897). Razblaženja 50µl mAt<2>ili kontrolnog mAt (anti humano LAG-3 mAt, 25F7) su dodata u bunariće koji sadrže ćelije (finalna zapremina 100 µl) i inkubirani su na 4°C u trajanju od 1 h. Ploče su isprane i 100µl/bunariću sekundarnog antitela (anti-human Fc-488 antitelo, Jackson ImmunoResearch, 109-546-098) razblaženo na 1:1000 u PBS+2% BSA je nakon toga dodato i inkubirano je u trajanju od 30 minuta na 4°C u mraku. Ploče su isprane i resuspendovane u 100 µl PBS koji sadrži DAPI (Biotium, 40043) na 1 mg/ml. Ploče su očitavane korišćenjem Canto II protočnog citometra (BD Bioscience). Mrtve ćelije su isključene i fluorescencija je merena u FITC kanalu (488nm/530/30). Podaci su uklopljeni korišćenjem log (agonist) u odnosu na odgovor kod GraphPad Prism softvera. Ispitana Fcat-a u „mock“ mAt<2>formatu se vezuju za LAG-3 cinomolgusa sa 0.5-0.6 nM afinitetom što ukazuje da bi se očekivalo da toksikološke studije kod cinomolgus majmuna predviđaju efekte koji su uočeni kod ljudi (videti Tabela 4). Reper anti-humano LAG-3 mAt, 25F7, vezuje LAG-3 cinomolgusa sa 15-puta nižim afinitetom (EC50) (Tabela 4).

Tabela 4: Afinitet vezivanja anti-LAG-3 Fcat-a sa DO11.10 ćelijama koje eksprimiraju LAG-3 cinomolgusa sa protočnim citometrom

2

1.4.5 Afinitet vezivanja surogata anti-mišjih LAG-3 Fcat-a i anti-humanog LAG-3 Fcat-a sa mišjim LAG-3 eksprimiranim na ćelijama kao što je određeno protočnom citometrijom

Proizvodnja HEK ćelija koje prekomerno eksprimiraju mLAG-3

[0154] Sekvenca mišjeg LAG-3 (SEQ ID NO: 96) je podklonirana u pcDNA5FRT vektor (Life Technologies, V6010-20) korišćenjem Kpnl (NEB, R0142) i Notl (NEB, R0146) restrikcionom digestijom. Vektor je nakon toga transformisan u FIp-In T-REx 293 HEK ćelijsku liniju (Life Technologies, R780-07) korišćenjem Lipofektamina 2000 (Life Technologies, 11668-019). Transformisane FIp-In T-REx 293 ćelije su gajene u DMEM (Life Technologies, 61965-026) koji se sastoji iz 10% FBS (Life Technologies, 10270-1-6), 100 µg/ml Higromicina B (Melford Laboratories Ltd, Z2475), 15 µg/ml Blasticidina (Melford Laboratories Ltd, B1105) u trajanju od 3-4 nedelje dok kolonije stabilno transformisanih ćelija nisu postale očigledne. Ove kolonije su umnožene u prisustvu 1 µg/ml Doksiciklina (Sigma, D9891) i ispitane su za ekpresiju LAG-3 kod miša korišćenjem PE konjugovanog anti-mišjeg LAG-3 (klon C9B7W, BD Biosciences, 552380).

[0155] Afinitet surogata anti-mišjih LAG-3 Fcat-a (koji sadrže prekinuti region zgloba; SEQ ID NO: 58) prema ćelijski eksprimiranom mišjem LAG-3 je određen korišćenjem protočne citometrije. HEK ćelije koje eksprimiraju mLAG-3 gajene su u DMEM (Life Technologies, 61965-026) koji sadrži 10% FBS (Life Technologies, 10270-1-6), 100 µg/ml Higromicin B (Melford Laboratories Ltd, Z2475), 15 µg/ml Blasticidin (Melford Laboratories Ltd, B1105) i 1 µg/ml Doksiciklin (Sigma, D9891) su odvojene od posuda za tkivnu kulturu korišćenjem pufera za disocijaciju ćelija (Life Technologies, 13151-014) i zasejane su u ploče sa 96 bunarića sa V-dnom (Costar, 3897) u 2x10<5>ćelija/bunariću. Ploče su centrifugirane na 1500 oum u trajanju od 3 min na 4°C da se dobije ćelijski pelet. Serije razblaženja Fcat-a (ili kontrolnog mAt) su inkubirane sa ćelijama u 100 µl zapremine u trajanju od 1 h na 4 °C. Ploče su isprane i sekundarno antitelo (Anti-human Fc-488, Jackson ImmunoResearch, 109-546-098 za Fcata ili Anti-Rat IgG (H+L), Alexa Fluor 488 Conjugate, ThermoFisher, A-11006 for C9B7W) je razblaženo u 1:1000 u PBS i 100 µl je dodato u ćelije tokom 30 min na 4 °C (ploče su držane u mraku). Ploče su nakon toga isprane i ćelije su resuspendovane u 100 µl PBS koji sadrži 1 µg/ml DAPI (Biotium, 40043). Ploče su očitane korišćenjem Canto II protočnog citometra (BD Bioscience). Mrtve ćelije su isključene i merena je fluorescencija u FITC kanalu (488nm/530/30). Podaci su uklopljeni korišćenjem log (agonist) u odnosu na odgovor GraphPad Prism softvera. Ispitana Fcat-a su vezala mišji LAG-3 sa sličnim afinitetom (videti Tabela 5). Reper LAG-3 mAt, C9B7W (2B Scientific, BE0174-50MG), vezuje mišje LAG-3 sa 17-puta slabijim afinitetom (EC50) u odnosu na Fcat-a (Tabela 5).

Tabela 5: Afinitet vezivanja surogata anti-mišjih LAG-3 Fcat-a sa HEK ćelijama koje eksprimiraju mišji LAG-3 protočnom citometrijom

[0156] Afinitet anti-humanog LAG-3 Fcat FS18-7-9 u „mock“ mAt<2>formatu prema ćelijski eksprimiranom LAG-3 je određen korišćenjem protočne citometrije. HEK ćelije koje eksprimiraju mLAG-3 gajene u DMEM (Life Technologies, 61965-026) koji sadrži 10% FBS (Life Technologies, 10270-1-6), 100 µg/ml Higromicin B (Melford Laboratories Ltd, Z2475), 15 µg/ml Blasticidin (Melford Laboratories Ltd, B1105) i 1 µg/ml Doksiciklin (Sigma, D9891) su odvojene od posuda za gajenje tkivnih kultura korišćenjem pufera za razdvajanje ćelija (Life Technologies, 13151-014). Ćelije su sakupljene centrifugiranjem na 1500 oum tokom 3 min na 4°C da peleta ćelija i nakon toga su resuspendovani u 1 x DPBS zatim su zasejani u ploče sa 96 bunarića sa V-dnom (Costar, 3897) na 1.2x10<5>ćelija/bunariću u 30 µl.1:1 zapremina serija razblaženja mAt<2>(ili kontrolnog mAt) je dodata i inkubirana sa ćelijama u trajanju od 1 h na 4 °C. Ploče su isprane i sekundarno antitelo (Anti-human Fc-488, Jackson ImmunoResearch, 109-546-098) je razblaženo 1:1000 u PBS i 60 µl je dodato ćelijama tokom 30 min na 4 °C (ploče su držane u mraku). Ploče su nakon toga isprane i ćelije su resuspendovane u 60 µl PBS koji sadrži 1 µg/ml DAPI (Biotium, 40043). Ploče su očitavane korišćenjem Canto II protočnog citometra (BD Bioscience). Mrtve ćelije su isključene i merena je fluorescencija u FITC kanalu (488nm/530/30). Podaci su uklopljeni korišćenjem log (agonist) u odnosu na odgovor kod GraphPad Prism Softvera. Antihumano LAG-3 Fcat FS18-7-9 u „mock“ mAt<2>formatu vezuje se za mišji LAG-3 sa EC50od 19 nM u poređenju sa EC50od 2.6 nM za surogat anti-mišje LAG-3 Fcat FS18-7-9-108 (Tabela 6). Humano mAt, 25F7 ne pokazuje bilo koje detektabilno vezivanje za mišji LAG-3, što ukazuje na to da humano LAG-3 Fcat, FS18-7-9, ima različit epitop vezivanja na LAG-3 u odnosu na ono kod 25F7.

Tabela 6: Afinitet vezivanja humanog anti-LAG-3 Fcat FS18-7-9 sa HEK ćelijama koje eksprimiraju mišji LAG-3 pomoću protočne citometrije

1.5 Afinitet vezivanja Fcat-a sa Fc receptorima

[0157] Poznato je da uvođenje LALA mutacije u CH2 domen humanog IgG1 smanjuje vezivanje za Fcγ (Bruhns, P., et al. (2009); and Xu, D. et al. (2000)). BIAcore je korišćen da bi se potvrdilo da je LALA mutacija smanjila afinitet vezivanja Fcat-a (u „mock“ mAt<2>formatu) prema Fcγ receptorima. Test vezivanja za humani FcγR je sproveden na Biacore T200 instrumentu (GE Healthcare) korišćenjem Fcata u „mock“ mAt<2>formatu. Humani FcγR-i (R&D Systems, 1257-FC, 1330-CD, 1875-CD, 4325-FC) su imobilizovani korišćenjem kuplovanja amina (kit za kuplovanje amina, GE Healthcare, BR-1000-50) na serijama Series S CM5 čipa (GE Healthcare, BR-1005-30) do površinske gustine od 370 RU za FcγRI, 264 RU za FcγRIII (visoko afinitetni humani FcγR-i) i 500 RU za FcγRIIa i FcγRIIb (nisko afinitetni humani FcγR-i). Za svaki imobilizovani čip protočna ćelija je ostavljena kao blank za pozadinsko oduzimanje. FcγR su imobilozovani korišćenjem koncentracije 5 µg/ml u natrijum acetatu pH5 (ForteBio, 18-1069)

1

i ubrizgani su u brzini protoka od 10 µl/min u ciklusima od 15 sekundi dok nije postignut neophodan nivo imobilizacije.

[0158] Za visoko afinitetne FcγRI i FcγRIII, 200 µg/ml mAt-a ili „mock“ mAt<2>su prešli preko čipa tokom 3 min u brzini protoka od 30 µl/min i disocijacija je praćena tokom 5 min. Aktivni pufer je bio HBS-P (0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.005% v/v Surfaktant P20, GE Healthcare, BR-1003-68). Za nisko afinitetne FcγRIIa i FcγRIIb koncentracija „mock“ mAt<2>je povećana do 500 µg/ml.

[0159] Pozitivna kontrola je bila divlji tip mAt izotipa IgG1, koji je upoređen sa kontrolama LALA IgG1 mAt i monoklonskim At-a izotipa IgG2 i IgG4 prema relevantnim metama. Protočne ćelije su regenerisane ubrizgavanjem 10 µM natrijum hidroksida (VWR, 28244.262) na brzini protoka od 100 ml/min tokom 30 sekundi. Podaci analize su sprovedeni sa BiaEvaluation verzijom softvera 3.2 RC1 sa dvostrukim referenciranjem prema blanku protočne ćelije (bez imobilizovanog FcγR) i oduzimanjem ciklusa pufera iz mAt<2>koje se ispituje. Rezultati su prikazani u Tabeli 7.

Tabela 7: Odgovor vezivanja anti-humanih LAG-3 Fcat-a u „mock“ mAt<2>formatu (koji se sastoji iz LALA mutacije kao što je detaljno opisano u teksu ispod) za humane Fcγ receptore sa SPR

[0160] Sva ispitana „mock“ mAt<2>(svi se sastoje iz LALA mutacije kao što je gore predstavljeno) su pokazala značajno smanjeno vezivanje za ispitivane Fcγ receptore u poređenju sa kontrolnim antitelom („mock“ mAt IgG1) bez LALA mutacije, što ukazuje na to da je LALA mutacija smanjila vezivanje Fcγ receptora od strane ovih „mock“ mAt<2>i prema tome, očekivano je da smanji aktivnost ADCC mAt<2>.

1.6 Blokiranje vezivanja MHC klase II sa LAG-3

[0161] Sposobnost Fcat-a (koja sadrže prekinuti zglobni region; SEQ ID NO: 58) da blokiraju interakciju između rekombinantnog humanog ili mišjeg LAG-3 Fc i humane MHC Klase II je ispitivana merenjem vezivanja LAG-3 Fc sa A375 ćelijama, ćelijskom linijom melanoma koja eksprimira humanu MHC Klasu II. A375 (ATCC, CRL-1619) ćelije koje su gajene u DMEM (Life Technologies, 61965-026) sadrže 10% FBS (Life Technologies, 10270-106) su odvojene od posuda za ćelijsku kulturu korišćenjem pufera za disocijaciju ćelija (Life Technologies, 13151-014) i zasejane su u ploče sa 96 bunarića sa V-dnom (Costar, 3897) na 2x10<5>ćelija/bunariću. Ploče su centrifugirane na 1500 oum tokom 3 min na 4 °C do peleta ćelija. Relevantne koncentracije Fcat ili kontrolnog mAt su inkubirane sa 1 µg/ml LAG-3 Fc (humani LAG-3-Fc R&D Systems, 2319-L3-050 ili mišji LAG-3 Fc R&D Systems, 3328-L3-050) u 100 µl DMEM koji se sastoji iz 10% FBS tokom 1 h na 4 °C. LAG-3/Fcat miks je dodat u A375 ćelije i inkubirani su 1 h na 4

2

°C. Ćelije su isprane. Sekundarno antitelo (Alexa Fluor 488 konjugovano kozje anti-humano Fc F(ab’)2, Jackson Immunoresearch, 109-546-098 ili kozje anti-mišje IgG (H+L) 488 konjugat, Life Technologies, A-1101) je razblaženo 1:1000 u PBS i 100 µl je dodato na ćelije tokom 30 min na 4 °C (ploče su držane u mraku). Ćelije su isprane jednom u PBS i resuspendovane su u 100 µl PBS 1 µg/ml DAPI (Biotium, 40043). Ploče su čitane na BD FACSCanto II citometru (BD Biosciences) i podaci su analizirani pomoću FlowJo softvera.

[0162] Oba anti-mišja LAG-3 Fcat-a su bila sposobna da inhibiraju interakciju humane MHC klase II sa mišjim LAG-3, pri čemi kontrolno anti-mišje LAG-3 mAt (C9B7W, 2B Scientific, BE0174-50MG) nije bilo (videti Tabelu 8).

Tabela 8: Surogati anti-mišjih LAG-3 Fcat-a inhibiraju vezivanje mišjeg LAG-3 sa MHC klasom II

[0163] Ispitana anti-humana LAG-3 Fcat-a su takođe bila sposobna da inhibiraju interakciju humane MHC klase II sa humanim LAG-3 sa sličnom potencijom kao kontrolno anti-humano LAG-3 mAt (25F7).

Tabela 9: Anti-humana LAG-3 Fcat-a inhibiraju vezivanje humanog LAG-3 sa MHC klasom II

Primer 2: Priprema i karakterizacija mAt i molekula mAt<2>

2.1 Dobijanje mAt 84G09

2.1.1 Genersanje DNK konstrukta

[0164] DNK inserti koji kodiraju regione varijabilnog teškog i lakog lanca 84G09 su optimizovani kodonom za ekspresiju kod sisara i sintetisani su pomoću DNA2.0 (Menlo Park, CA, USA). Inserti dopunjeni u pJ-Amp-visoko vektorom domaćina su pod-klonirani u ekspresione vektore pFS-hHC2.1-G1m17(z) LALA (IgG težak lanac koji se sastoji iz LALA mutacije) ili pFShHC2.1-G1m17(z) (IgG težak lanac bez LALA mutacije) i pFShK1.0 (IgG kapa laki lanac) preko EcoRI i NheI restrikcione digestije.

[0165] Uspešnost kloniranja je verifikovana PCR-om kolonije i naknadnom analizom sekvenciranja nukleotida od treće strane (GATC Biotech).

2.1.2 Ćelijsko održavanje

[0166] HEK293-6E ćelije (NRCC), su pod-kultivisane u prethodno zagrejanom F17 medijumu (Invitrogen, A13835-01) dopunjenom sa 4mM GlutaMAX-1 (Invitrogen, 35050-038), 0.1% of Pluronic F-68 (Invitrogen A13835-01) i 25 µg/ml geneticina (Invitrogen, 10131-027). Ćelije su inkubirane na 37 °C, 140 oum, 5% CO2i podkultivisane na 0.3x10<6>ćelija/ml u tro a zatim četvorodnevnom režimu.

2.1.3 Prolazna transfekcija

[0167] HEK293-6E ćelije su prolazno transfektovane korišćenjem PEIpro i 1 mg/ml (Polyplus, PPLU115).

24 h pre transfekcije ćelije su zasejane na 0.8x10<6>ćelija/ml u medijumu za kulturu. Za svakih 200 µl ćelijske kulture, smeša DNK je pripremljena mešanjem 10 ml zagrejanog Opti-MEMI (Invitrogen, 11058-021), 100 µg endotoksin-slobodne DNK koja kodira težak lanac i 100 µg endotoksin-slobodne DNK koja kodira laki lanac. PEI smeša je pripremljena mešanjem 10 ml zagrejanog Opti-MEMI i 200 ml PEIpro i voteksovanjem. Smeša DNK je brzo dodata u vorteksovanu PEI smešu, pomešana je pulsnim vorteksom 3 puta tokom 1 s, inkubirana 3 min na sobnoj temperaturi i dodavana je u kapima na ćelije.

48 h nakon transfekcije 20 ml F17 plus suplemenata sa 0.5% Tripton N1 (TekniScience Inc., 19553) je dodato u svaku posudu.

[0168] 6 dana nakon transfekcije ćelije su sakupljene centrifugiranjem na 4500 oum tokom 40 min. Supernatant je nakon toga proceđen sa 0.22 µm polietersulfonskom jedinicom za ceđenje (Millipore, SCGPU01RE, SCGPU02RE, SCGPU05RE, SCGPU11RE) i skladišten je na 4 °C do prečišćavanja.

2.1.4 Hromatografija Proteina A

[0169] Izbistreni supernatanti su prečišćeni korišćenjem pre-pakovanih 5ml HiTrap MabSelect SuRe kolona (GE Healthcare, 11-0034-95) na ÄKTAexplorer ili ÄKTAxpress. Ukratko, kolone su ekvilibrisane sa 50mM Tris-HCl, 250mM NaCl na pH 7.0, nevezani materijal je ispran sa istim puferom na 5 ml/min. Proizvodi su eluirani sa 10mM natrijum formijatom pH 3.0 ma 5 ml/min. Eluirani uzorci su odmah izmenjeni puferom u PBS pH 7.4 korišćenjem PD-10 kolona (GE Healthcare, 17-0851-01) preekvilibrisanih sa PBS pH 7.4 u skladu sa preporukama proizvođača.

2.1.5 Merenje koncentracije proteina spektrometrom

[0170] Apsorbanca na 280 nm svakog prečišćenog proizvoda je merena korišćenjem LabChip DS (PerkinElmer, 133089) sa DropPlate 96 D+ (PerkinElmer, CLS135136). Koncentracija proizvoda je izračunata korišćenjem ekstinkcionog koeficijenta (A280 od 1mg/ml) izračunata je korišćenjem VectorNTI Advance v11.5.4 softvera (Thermofisher Scientific, A13784)

2.1.6 Koncentracija proizvoda

[0171] Gde je neophodno, purečišćene frakcije su koncentrovane korišćenjem Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit 30K (Millipore, UFC803024). Nakon ekvilibrisanja Ultracel regenerisane celulozne membrane sa PBS pH 7.4 centrifugiranjem 10 min na 3000 oum, uzorci su naneti u jedinicu zapremije 4 ml i centrifugirani na 3000 oum dok nije dostignuta željena koncentracija proteina.

2.1.6 Sterilizacija ceđenjem

[0172] Finalni uzorci su proceđeni korišćenjem pre-wet Millex-GV PVDF filtera u špricu (Millipore, SLGV013SL).

2.2 Dobijanje humanog LAG-3/PD-L1 mAt<2>

[0173] Teški lanci molekula mAt<2>FS18-7-9/84G09 (SEQ ID NOs 94 i 95), FS18-7-32/84G09 (SEQ ID NOs 96 i 97), FS18-7-33/84G09 (SEQ ID NOs 98 i 99), FS18-7-36/84G09 (SEQ ID NOs 100 i 101), FS18-7-58/84G09 (SEQ ID NOs 102 i 103), FS18-7-62/84G09 (SEQ ID NOs 104 i 105), FS18-7-65/84G09 (SEQ ID

4

NOs 106 i 107), FS18-7-78/84G09 (SEQ ID NOs 108 i 109), FS18-7-88/84G09 (SEQ ID NOs 110 i 111) i FS18-7-95/84G09 (SEQ ID NOs 112 i 113) su dobijeni zamenom CH3 domena monoklonskih antitela 84G09 (sa i bez LALA mutacije) sa CH3 domenima humanog LAG-3 specifičnih Fcat-a FS18-7-9, FS18-7-32, FS18-7-33, FS18-7-36, FS18-7-58, FS18-7-62, FS18-7-65, FS18-7-78, FS18-7-88 i FS18-7-95 u XhoI i BamHI mestima prisutnim u sekvenci nemodifikovanog CH3 domena humanog IgG1. Teški lanci mAt<2>su ko-transfektovani sa lakim lancem 84G09 (SEQ ID NO: 116) kao što je opisano za mAt 84G09 u odeljku 2.1 gore u tekstu. mAt<2>su nakon toga eksprimirana i prečišćena kao što je opisano za mAt 84G09 u odeljku 2.1 gore u tekstu.

2.3 Dobijanje humanog LAG-3/“mock“ mAt<2>

[0174] Anti-FITC mAt (sa i bez LALA mutacije) je pripremljeno kao što je opisano za mAt 84G09 u odeljku 2.1 gore u tekstu korišćenjem teških lanaca (SEQ ID NOs 83 i 84; sa i bez LALA mutacije) i lakog lanca (SEQ ID NO: 85) mAt 4420.

[0175] Teški lanci molekula mAt<2>FS18-7-9/4420 (SEQ ID NOs 63 and 64), FS18-7-32/4420 (SEQ ID NOs 65 i 66), FS18-7-33/4420 (SEQ ID NOs 67 i 68, FS18-7-36/4420 (SEQ ID NOs 69 i 70), FS18-7-58/4420 (SEQ ID NOs 71 i 72), FS18-7-62/4420 (SEQ ID NOs 73 i 74), FS18-7-65/4420 (SEQ ID NOs 75 i 76), FS18-7-78/4420 (SEQ ID NOs 77 i 78), FS18-7-88/4420 (SEQ ID NOs 79 i 80) i FS18-7-95/4420 (SEQ ID NOs 81 i 82) su dobijeni zamenom CH3 domena monoklonskih antitela 4420 (sa i bez LALA mutacije) sa CH3 domenima humanih LAG-3 specifičnih Fcat-a FS18-7-9, FS18-7-32, FS18-7-33, FS18-7-36, FS18-7-58, FS18-7-62, FS18-7-65, FS18-7-78, FS18-7-88 i FS18-7-95 u XhoI i BamHI mestima prisutnim u sekvenci nemodifikovanog CH3 domena humanog IgG1. Teški lanci mAt<2>su ko-transfektovani sa lakim lancem mAt 4420 kao što je opisano za mAt 84G09 u odeljku 2.1 gore u tekstu. Proteini su nakon toga uzeti i eksprimirani i prečišćeni su kao što je opisano za mAt 84G09 u odeljku 2.1 gore u tekstu.

2.4 Dobijanje mišjeg LAG-3/PD-L1 mAt<2>

[0176] Mišje anti-PD-L1 mAt (sa i bez LALA mutacije) je dobijeno kao što je opisano za mAt 84G09 u odeljku 2.1 gore u tekstu korišćenjem teškog lanca (SEQ ID NOs 122 i 123) i lakog lanca (SEQ ID NO: 119) mAt S1.

[0177] Težak lanac molekula mAt<2>FS18-7-108-29/S1 (SEQ ID NOs 117 i 118) i FS18-7-108-35/S1 (SEQ ID NOs 120 i 121) su pripremljeni zamenom CH3 domena monklonskih antitela S1 (sa i bez LALA mutacije) sa CH3 domenima mišjih LAG-3 specifičnih Fcat-a FS18-7-108-29 i FS18-7-108-35 u XhoI i BamHI mestima prisutnim u sekvenci nemodifikovanog CH3 domena humanog IgG1. Teški lanci mAt<2>su ko-transfektovani sa lakim lancem S1 kao što je opisano za mAt 84G09 u odeljku 2.1 gore u tekstu. Proteini su nakon toga eksprimirani i prečićeni kao što je opisano za mAt 84G09 u odeljku 2.1 gore u tekstu.

2.5 Afiniteti vezivanja i kinetike mAt2 za humani LAG-3 i humani PD-L1

[0178] Protein L (Thermo, 21189) je imobilozovan na protočnim ćelijama 1 i 2 Serija S CM5 čipa (GE Healthcare, BR-1005-30) kuplovanjem amina (GE Healthcare, BR-1000-50) do površinske gustine od 2000 RU u skladu sa instrukcijama proizvođača za BIAcore T200 instrument. Za LAG-3 vezivanje, uzorci mAt<2>(svi sadrže LALA mutaciju) su uhvaćeni samo na protočnoj ćeliji 2 i humanom LAG-3Fc (R&D Systems, 2319-L3) na 4 koncentracije u serijama dvostrukog razblaženja počev od 0.5 nM su protekli kroz obe protočnu ćeliju 1 i 2 na brzini protoka od 30 µl/min. Vreme povezivanja je bilo 3 min i vreme disocijacije je bilo 6 min. Naneti pufer je bio HBS-P (GE Healthcare, BR-1003-68). Obe protočne ćelije su regenerisane ubrizgavanjem 10 mM natrijum hidroksida (NaOH) na brzini protoka od 100 µl/min tokom 20 sekundi. Podaci su analizirani sa dvostrukim referenciranjem u odnosu na blanko protočnu ćeliju.

[0179] Za PD-L1 vezivanje, četiri koncentracije u serijama dvostrukog razblaženja PD-L1 Fc (R&D Systems, 156-B7), počev od 40 nM, su protekla kroz mAt<2>uhvaćenom na istom Protein L čipu. Svi drugi uslovi su bili isti kao za vezivanje LAG-3 (videti gore u tekstu).

[0180] Kinetike vezivanja su uklopljene sa 1:1 Langmuirovim modelom da bi se generisale stope konstanta vezivanja (ka) i disocijacije (kd). Ravnotežne konstante vezivanja (KD) su izračunate deljenjem stope disocijacije sa konstantnom vezivanja za svaki uzorak. Analiza podataka je izvedena sa BiaEvaluation softverskom verzijom 3.2. Rezultati su prikazani u Tabelama 10 i 11.

Tabela 10: Afinitet vezivanja i kinetike mAt<2>prema humanom LAG-3 kao što je određeno sa SPR

Tabela 11: Afinitet vezivanja i kinetike mAt<2>prema humanom PD-L1 kao što je određeno sa SPR

[0181] Afiniteti vezivanja za humani PD-L1 i humani LAG-3 su poredivi za svaki od ispitanih mAt<2>. Afiniteti vezivanja mAt<2>za humani PD-L1 su bili uporedivi sa 84G09, ukazujući da je uvođenje LAG-3 mesta vezivanja u CH3 domenu nije imalo uticaja na vezivanje PD-L1.

2.6 Istovremeno vezivanje mAt<2>za humani LAG-3 i humani PD-L1

[0182] Sposobnost mAt<2>(FS18-7-09/84G09, FS18-7-32/84G09, FS18-7-33/84G09, FS18-7-36/84G09, FS18-7-62/84G09, FS18-7-65/84G09, i FS18-7-78/84G09 svi sa LALA mutacijom) za istovremeno vezivanje za LAG-3 i PD-L1 je ispitano sa SPR. Humani PD-L1 Fc (R&D Sistemi, 156-B7) je imobilizovan na protočnoj ćeliji 2 od Seriija S CM5 čipa (GE Healthcare, BR-1005-30) do površinske gustine od 150 RU u skladu sa upuststvima proizvođača. Protočna ćelija 1 je aktivirana i deaktivirana bez bilo kog imobilizovanog proteina za pozadinsko oduzimanje. Za svaki uzorak, 10 µg/ml mAt<2>je prošlo kroz protočne ćelije 1 i 2, na brzini protoka od 10 µml/min tokom 3 min. Zatim, 40 nM LAG-3Fc (R&D Sistemi, 2319-L3) je proteklo kroz obe protočnu ćeliju 1 i 2 na brzini protoka od 10 µl/min tokom 3 min. Za svaki korak vezivanja praćena je disocijacija tokom 3 min. Senzorski čip je regenerisan nakon svakog ciklusa sa 15 s ubrizgavanja 25 mM NaOH na brzini protoka od 100 µl/min.

[0183] Sva ispitana mAt<2>su bila sposobna za vezivanje sa LAG-3 i PD-L1. Matično anti-PD-L1 mAt, 84G09, se vezuje samo za PD-L1.

2.7. Istovremeno vezivanje surogata mAt<2>za mišji LAG-3 i mišji PD-L1

[0184] Sposobnost dva surogata mišja mAt<2>(FS18-7-108-29/S1 i FS18-7-108-35/S1, oba koja sadrže LALA mutaciju) da se istovremeno vežu za mišji LAG-3 i mišji PD-L1 je ispitana sa SPR na BIAcore 3000 (GE Healthcare). Mišji PD-L1Fc (R&D Sistemi, 1019-B7-100) je imobilizovan na protočnoj ćeliji 4 CM5 čipa do površinske gustine 830 RU prema uputstvima proizvođača. Protočna ćelija 3 je imobilizovana sa 820 RU humanim-Fc (R&D system, 110-HG) za pozadinsko oduzimanje. Za svaki uzorka, 50 nM mAt<2>je prešlo kroz protočne ćelije 1 i 2, u brzini protoka od 20 µl/min tokom 150 sec. Zatim, 50 nM mišjeg LAG-3Fc (R&D Sistemi, 3328-L3-050) je prošlo kroz obe protočne ćelije 3 i 4 na brzini protoka od 20 µl/min tokom 150 sek. Za svaki korak vezivanja praćena je disocijacija tokom 3 min. Senzorski čip je regenerisan posle svakog ciklusa sa 2 x 10 µl 50 mM NaOH. Oba ispitana mAt<2>su bila sposobna za istovremeno vezivanje sa mišjim LAG-3 i mišjim PD-L1 i prema tome su pogodni surogati za humano LAG-3/PD-L1 mAt<2>.

2.8 Vezivanje za humane Fcγ receptore sa mAt<2>koje se sastoji iz LALA mutacije

[0185] Humani Fcγ receptori su imobilizovani sa CM5 čipu do površinske gustine približno 200 RU za Fcγ RI (R&D Sistemi, 1257-FC) i Fcγ RIIIa (R&D Sistemi, 4325-FC) i približno 500 RU za Fcγ RIIa (R&D Sistemi, 1330-CD) i Fcγ RIIb/c (R&D Sistemi, 1875-CD), u skladu sa uputstvima proizvođača za BIAcore3000 instrument. Za Fcγ RI i Fcγ RIIIa, 100µg/ml mAt-a ili mAt<2>je prošlo kroz čip tokom 3 min u brzini protoka 10 µl/min i nakon toga je sledila disocijacija tokom 5 min. Aktivni pufer je bio PBS (Lonza, BE17-516F) 0.05% (v/v) P20 surfaktant (GE Healthcare, BR-1000-54). Pozitivna kontrola je bio divlji tip IgG1 4420-mAt. Monoklonska IgG2 i IgG4 mAt-a prema irelevantnim metama (20H4 i MOR7490) i mišjem IgG1 (Sigma, P5305) bila su uključena kao referentne tačke. Nije bila potrebna regenracija zbog brzih stopa disocijacije vezujućih kompleksa. Za ispitivanje Fcγ RIIa i Fcγ RIIb/c koncentracija mAt<2>je povećana do 500 µg/ml da bi se nadoknadilo slabije vezivanje za ova dva receptora. Rezultati su prikazani u Tabeli 12.

Tabela 12: Odgovor vezivanja anti-LAG-3/PD-L1 mAt<2>za humane Fcγ receptore kao što je određeno sa SPR

[0186] Kao što je očekivano, LALA varijanta koja je uvedena u mAt ili mAt<2>smanjuje sposobnost ovih molekula da se vežu za humane Fcγ receptore.

2.9 Vezivanje mAt<2>sa ćelijama koje eksprimiraju humani i LAG-3 cinomolgusa

[0187] Sekvenca humanog LAG-3 (SEQ ID NO: 126) ili sekvenca LAG-3 cinomolgusa (SEQ ID NO: 128) je podklonirana u pcDNA5FRT vektor (Life Technologies, V6010-20) korišćenjem Kpnl (NEB, R0142) i Notl (NEB, R0146) restrikcione digestije. Vektor je nakon toga transformisan u Flp-In T-REx 293 HEK ćelijsku liniju (Life Technologies, R780-07) upotrebom Lipofektamina 2000 (Life Technologies, 11668-019). Transformisane Flp-In T-REx 293 ćelije su gajene u DMEM (Life Technologies, 61965-026) koji se sastoji iz 10% FBS (Life Technologies, 10270-1-6), 100 µg/ml Higromicina B (Melford Laboratories Ltd, Z2475), 15 µg/ml Blasticidina (Melford Laboratories Ltd, B1105) tokom 3-4 nedelja dok kolonije stabilno transformisanih ćelija nisu postale vidljive. Ove kolonije su umnožene u prisustvu 1 µg/ml Doksiciklina (Sigma, D9891) i ispitane su za ekspresiju LAG-3 koja je potvrđena protočnom citometrijom.

[0188] Afinitet mAt<2>(svi sadrže LALA mutaciju) prema ćelijama koje eksprimiraju humani ili LAG-3 cinomolgusa je određen korišćenjem protočne citometrije. HEK ćelije koje eksprimiraju humani ili LAG-3 cinomolgusa su gajene u DMEM (Life Technologies, 61965-026) koji se sastoji iz 10% FBS (Life Technologies, 10270-1-6), 100 µg/ml Higromicina B (Melford Laboratories Ltd, Z2475), 15 µg/ml Blasticidina (Melford Laboratories Ltd, B1105) i 1 µg/ml Doksiciklina (Sigma, D9891) su odvojene od posuda za tkivnu kulturu korišćenjem pufera za ćelijsku disocijaciju (Life Technologies, 13151-014) i zasejane su u ploče sa 96 bunarića sa V-dnom (Costar, 3897) u 2x10<5>ćelija/bunariću. Ploče su centrifugirane na 1500 oum tokom 3 min na 4 °C do ćelijskog peleta. Serije razblaženja mAt<2>(ili kontrolnog mAt) su inkubirane sa ćelijama u zapremini 100 µl tokom 1 h na 4 °C. Ploče su isprane sa sekundarnim antitelom (Anti-human Fc-488, Jackson ImmunoResearch, 109-546-098) razblaženim 1:1000 u PBS i 100 µl je dodato ćelijama tokom 30 min na 4 °C (ploče su držane u mraku). Ploče su isprane i nakon toga su ćelije resuspendovane u 100 µl PBS koji sadrži 1 µg/ml DAPI (Biotium, 40043). Ploče su čitane korišćenjem Canto II protočnog citometra (BD Bioscience). Mrtve ćelije su isključene i merena je fluorescencija u FITC kanalu (488nm/530/30). Podaci su uklopljeni pomoću log (agonist) u odnosu na odgovor u GraphPad Prism Softveru. Ploče su čitane na BD FACSCanto II citometru (BD Biosciences) i podaci su analizirani korišćenjem FlowJo. Rezultati su prikazani u Tabeli 13.

Tabela 13: Afinitet vezivanja anti-LAG-3/PD-L1 mAt<2>sa HEK ćelijama koje eksprimiraju humani ili LAG-3 cinomolgusa kao što je određeno sa protočnom citometrijom

[0189] Rezultati potvrđuju vezivanje mAt<2>za humani i LAG-3 cinomolgusa koji je eksprimiran na HEK ćelijama. Što se tiče izračunatih EC<2>

50vrednosti, ispitana mAt su pokazala veće ili jednako vezivanje sa humanim LAG-3 i najmanje dva puta bolje vezivanje sa LAG-3 cinomolgusa kada se uporede sa kontrolnim anti-LAG-3 antitelom 25F7. Nije uočena ukrštena reaktivnost sa drugim proteinima eksprimiranim na površini HEK ćelijske linije.

2.10 Vezivanje mAt<2>za ćelije koje eksprimiraju humani i PD-L1 cinomolgusa

[0190] Sekvenca humanog PD-L1 (SEQ ID NO: 129) ili sekvenca PD-L1 cinomolgusa (SEQ ID NO: 131) su podklonirane u pcDNA5FRT vektor (Life Technologies, V6010-20) korišćenjem Kpnl (NEB, R0142) i Notl (NEB, R0146) restrikcione digestije. Vektor je nakon toga transformisan u Flp-In T-REx 293 HEK ćelijsku liniju (Life Technologies, R780-07) korišćenjem Lipofektamina 2000 (Life Technologies, 11668-019). Transformisane Flp-In T-REx 293 ćelije su gajene u DMEM (Life Technologies, 61965-026) koji se sastoji iz 10% FBS (Life Technologies, 10270-1-6), 100 µg/ml Higromicina B (Melford Laboratories Ltd, Z2475), 15 µg/ml Blasticidina (Melford Laboratories Ltd, B1105) tokom 3-4 nedelja dok kolonije stabilno transformisanih ćelija nisu postale vidljive. Ove kolonije su umnožene u prisustvu 1 µg/ml Doksiciklina (Sigma, D9891) i ekspresija LAG-3 je potvrđena protočnim citometrom.

[0191] Afinitet mAt<2>(svi sadrže LALA mutaciju) za vezivanje za ćeliju koja eksprimira humani ili PD-L1 cinomolgusa ili sa matičnim (netransformisanim ćelijama) je određen korišćenjem protočne citometrije. HEK ćelije koje eksprimiraju humani ili PD-L1 cinomolgusa su gajene u DMEM (Life Technologies, 61965-026) koji se sastoji iz 10% FBS (Life Technologies, 10270-1-6), 100 µg/ml Higromicina B (Melford Laboratories Ltd, Z2475), 15 µg/ml Blasticidina (Melford Laboratories Ltd, B1105) i 1 µg/ml Doksiciklina (Sigma, D9891) su odvojene od posuda tkivne kulture korišćenjem pufera za ćelijsku disocijaciju (Life Technologies, 13151-014) i zasejane su na ploče sa 96 bunarića sa V-dnom (Costar, 3897) na 2x10<5>ćelija/bunariću. Ploče su centrifugirane na 1500 oum tokom 3 min na 4 °C do ćelijskog peleta. Serije razblaženja mAt<2>(ili kontrolnog mAt) su inkubirane u zapremini od 100 µl u trajanju od 1 h na 4 °C. Ploče su isprane sa sekundarnim antitelom (Anti-human Fc-488, Jackson ImmunoResearch, 109-546-098) razblaženim 1:1000 u PBS i 100 µl je dodato u ćelije tokom 30 min na 4 °C (ploče su držane u mraku). Ploče su isprane nakon čega su ćelije resuspendovane u 100 µl PBS koji se sastoji iz 1 µg/ml DAPI (Biotium, 40043). Ploče su očitavane korišćenjem Canto II protočnog citometra (BD Bioscience). Mrtve ćelije su isključene i merena je fluorescencija u FITC kanalu (488nm/530/30). Podaci su uklopljeni korišćenjem log (agonist) u odnosu na odgovor GraphPad Prism softvera. Ploče su očitavane na BD FACSCanto II citometrau (BD Biosciences) i podaci su analizirani korišćenjem FlowJo. Rezultati su prikazani u Tabeli 14.

Tabela 14: Afinitet vezivanja anti-LAG-3/PD-L1 mAt<2>sa HEK ćelijama koje eksprimiraju humani ili cinomolgus PD-L1 kao što je mereno sa protočnom citometrijom

[0192] Svaki od ispitanih LAG-3/PD-L1 mAt<2>vezuje se za humani PD-L1 i cino PD-L1 sa EC50blizu onom za 84G09 mAt, pokazujući da afinitet vezivanja za PD-L1 nije pogođen sa uvođenjem LAG-3 vezujućeg mesta u CH3 domenu mAt2.

2.11 Vezivanje surogata mišjeg mAt<2>sa ćelijama koje eksprimiraju mišji LAG-3 ili mišji PD-L1

[0193] Sekvenca mišjeg LAG-3 (SEQ ID NO: 127) ili sekvenca mišjeg PD-L1 (SEQ ID NO: 130) su podklonirane u pcDNA5FRT vektor (Life Technologies, V6010-20) korišćenjem Kpnl (NEB, R0142) i Notl (NEB, R0146) restrikcione digestije. Vektor je zatim transformisan u Flp-In T-REx 293 HEK ćelijsku liniju (Life Technologies, R780-07) korišćenjem Lipofektamina 2000 (Life Technologies, 11668-019). Transformisane Flp-In T-REx 293 ćelije su gajene u DMEM (Life Technologies, 61965-026) koji se sastoji iz 10% FBS (Life Technologies, 10270-1-6), 100 µg/ml Higromicina B (Melford Laboratories Ltd, Z2475), 15 µg/ml Blasticidina (Melford Laboratories Ltd, B1105) tokom 3-4 nedelja dok kolonije stabilno transformisanih ćelija nisu postale vidljive. Ove kolonije su umnožene u prisustvu 1 µg/ml Doksiciklina (Sigma, D9891) i ekspresije LAG-3 ili PD-L1 je potvrđena korišćenjem protočne citometrije.

[0194] Afinitet mAt<2>(svi sadrže LALA mutacije) za vezivanje za ćelije koje eksprimiraju mišji LAG-3 ili mišji PD-L1 je određen korišćenjem protočne citometrije. HEK ćelije koje eksprimiraju mišji LAG-3 ili mišji PD-L1 su gajene u DMEM (Life Technologies, 61965-026) koji se sastoji iz 10% FBS (Life Technologies, 10270-1-6), 100 µg/ml Higromicina B (Melford Laboratories Ltd, Z2475), 15 µg/ml Blasticidina (Melford Laboratories Ltd, B1105) i 1 µg/ml Doksiciklina (Sigma, D9891) su odvojene od posuda tkivne kulture korišćenjem pufera za ćelijsku disocijaciju (Life Technologies, 13151-014) i i

4

zasejane su na ploče sa 96 bunarića sa V-dnom (Costar, 3897) na 2x10<5>ćelija/bunariću. Ploče su centrifugirane na 1500 oum tokom 3 min na 4 °C do ćelijskog peleta. Serije razblaženja mAt<2>(ili kontrolno mAt) su inkubirani sa ćelijama u zapremini od 60 µl tokom 1 h na 4 °C. Ploče su isprane sa sekundarnim antitelom (Anti-humano Fc-488, Jackson ImmunoResearch, 109-546-098 za mAt<2>ili Antipacovsko IgG (H+L), Alexa Fluor 488, ThermoFisher, A-11006 za anti-LAG-3 kontrolu, C9B7W) je razblaženo 1:1000 u PBS i 50 µl je dodato ćelijama tokom 30 min na 4 °C (ploče su držane u mraku). Ploče su isprane nakon čega su ćelije resuspendovane u 50 µl FACS Cell Fix (BD Bioscience, 340181) tokom 15 minuta, zatim isprane i resuspendovane u 100 µl PBS koji se sastoji iz 1 µg/ml DAPI (Biotium, 40043). Ploče su očitavane korišćenjem Canto II protočnog citometra (BD Bioscience). Mrtve ćelije su isključene i merena je fluorescencija u FITC kanalu (488nm/530/30). Podaci su uklopljeni korišćenjem log (agonist) u odnosu na odgovor GraphPad Prism softvera. Ploče su očitavane na BD FACSCanto II citometru (BD Biosciences) i podaci su analizirani korišćenjem FlowJo. Rezultati su prikazani u Tabeli 15.

Tabela 15: Afinitet vezivanja surogata anti-mišjeg LAG-3/PD-L1 mAt<2>sa HEK ćelijama koje eksprimiraju mišji LAG-3 ili mišji PD-L1 sa protočnim citometrom

[0195] Surogati mAt<2>su bili sposobni da se vežu za ćelijski eksprimirani mišji LAG-3 i za ćelijski eksprimirani PD-L1. Afinitet vezivanja surogara mAt<2>prema ćeliji koja eksprimira mišji LAG-3 je bio približno isti kao afinitet anti-humanog LAG-3/PD-L1 mAt<2>prema humanom LAG-3 (2.3-3.8 nM u poređenju sa 2.5-4.2 nM) i afinitet vezivanja surogata mAt<2>prema ćelijski eksprimiranim mišjem PD-L1 je u okviru 3-puta afiniteta anti-humanog LAG-3/PD-L1 mAt<2>prema humanom PD-L1 (11.9-12.3 nM u poređenju sa 3.1-4.0 nM), pokazujući da su ova mAt<2>pogodni surogati za anti-humano LAG-3/PD-L1 mAt<2>za upotrebu u in vivo ispitivanjima kod miševa.

Primer 3: Aktivnost mAt<2>molekula u testovima T ćelijske aktivacije i SEB testu

3.1 Test T ćelijske aktivacije

[0196] Test za merenje oslobađanja IL-2 zasnovan na DO11.10 OVA T-limfocitnim i LK35.2 B-limfocitnim hibridoma ćelijskim linijama je korišćen za funkcionalno pretraživanje mAt2. Oslobađanje IL-2 je marker T ćelijske aktivacije. T ćelije, koje eksprimiraju endogeni mišji PD-1, su transfektovane ili sa praznim vektorom (pLVX) ili konstruktom humanog LAG-3. B-ćelije su transfektovane sa praznim vektorom (pLVX) ili konstruktom PD-L1.

[0197] Tri kombinacije ovih četiri ćelijskih linija su uporedo korišćene za ispitivanje T ćelijske aktivacije 2

sa mAt :

● DO11.10 pLVX LK35.2 hPD-L1 za anti-PD-L1 aktivnost;

● DO11.10 hLAG-3 LK35.2 pLVX za anti-LAG-3 aktivnost;

● DO11.10 hLAG-3 LK35.2 hPD-L1 za istovremenu anti-LAG-3/ anti-PD-L1 aktivnost.

[0198] Sva mAt<2>(svi sadrže LALA mutaciju) su ispitani dva puta u ovom testu T ćelijske aktivacije. Ukrštena reaktivnost sa LAG-3 i PD-L1 cinomolgusa je ispitana u testu funkcionalne T ćelijske aktivacije korišćenjem ćelija koje prekomerno eksprimiraju mete cinomolgusa (cPD-L1 i cLAG-3).

Proizvodnja T ćelijskih linija koje prekomerno eksprimiraju LAG-3

[0199] Metodologija lentivirusne transdukcije je korišćena za dobijanje DO11.10 ćelija (National Jewish Health) koje prekomerno eksprimiraju humani, cinomolgus ili mišji LAG-3 korišćenjem Lenti-X HTX Packaging Sistema (Kat. Br 631249). Lenti-X ekspresioni vektor (pLVX) (Kat. Br 631253), koji sadrži mišju LAG-3 cDNK (SEQ ID NO: 127), humanu LAG-3 cDNK (SEQ ID NO: 126) ili cinomolgus LAG-3 cDNK (SEQ ID NO: 128), je ko-transfektovan sa Lenti-X HTX Packaging Miksom u Lenti-X 293T ćelijsku liniju (Kat. Br 632180) da bi se dobio virus. DO11.10 c ćelijska linija je transdukovana korišćenjem lentivirusnih vektora proizvedenih pomoću Lenti-X HTX Packaging sistema.

Proizvodnja antigen prezentujućih ćelija koje prekomerno eksprimiraju PD-L1

[0200] Metodologija lentivirusne transdukcije je korišćena za dobijanje LK35.2 limfoma B ćelija (ATCC, HB-98) koji prekomerno eksprimiraju humani, cinomolgus ili mišji PD-L1 korišćenjem Lenti-X HTX Packaging System (Kat. Br 631249). Lenti-X ekspresioni vektor (pLVX) (Kat. Br 631253), koji se sastoji iz mišje PD-L1 cDNK (SEQ ID NO: 130), humane PD-L1 cDNK (SEQ ID NO: 129 ili cinomolgus PD-L1 cDNK (SEQ ID NO: 131), je ko-transfektovan sa Lenti-X HTX Packaging Miksom u Lenti-X 293T ćelijsku liniju (Kat. Br 632180) da bi se dobio virus. LK35.2 ćelijska linija je transdukovana korišćenjem lentivirusnih vektora proizvedenih pomoću Lenti-X HTX Packaging sistema.

Medijumi i peptid

[0201] Medijum ćelijske kulture: DMEM (Gibco, 61965-026) 10% FBS (Gibco, 10270-106), 1 mM natrijum piruvat (Gibco, 11360-070), 1 µg/ml puromicin (Gibco, A11138-03) Eksperimentalni medijum: kompletni DO11.10 medijum kulture bez puromicina. OVA peptid (MW= 1773.9 Da): H-ISQAVHAAHAEINEAGR-OH (Pepscan)

[0202] Ćelije:

● DO11.10 hLAG-3: DO11.10 T ćelijski hibridom transdukovan sa lentivirusnim vektorom da bi se prekomerno eksprimirao LAG-3;

● DO11.10 pLVX: DO11.10 T ćelijski hibridom transdukovan sa praznim lentivirusnim vektorom; ● DO11.10 cLAG-3: DO11.10 T ćelijski hibridom transdukovan sa lentivirusnim vektorom da bi se prekomerno eksprimirao cinomolgus LAG-3.

● LK 35.2 hPD-L1: B ćelijski hibridom transdukovan sa lentivirusnim vektorom koji se sastoji iz hPD-L1 da bi se prekomerno eksprimirao PD-L1;

● LK 35.2 PLVX: B ćelijski hibridom transdukovan sa praznim lentivirusnim (pLVX) vektorom; ● LK 35.2 cPD-L1: B ćelijski hibridom transdukovan sa lentivirusnim vektorom da bi se prekomerno eksprimirao cinomolgus PD-L1.

[0203] DO11.10 ćelije (ili DO11.10 pLVX ćelije ili DO11.10 hLAG-3 ćelije) u 0.3 x 10<6>ćelija/ml su pomešane u odnosu 1:1 sa antitelima u 3 x finalnoj koncentraciji. Antitela i DO11.10 ćelije su inkubirane na 37° C, 5% CO2tokom 1 h. LK 35.2 ćelije (obe pLVX i PD-L1-pLVX) su inkubirane ne 3x10<5>ćelija/ml eksperimentalnog medijuma sa OVA peptidom na 1.5 µM tokom 30 min. LK 35.2 ćelije OVA su dodavani u DO11.10 ćelije/tretman miksu u odnosu 1:2 u sledećim kombinacijama:

Humani funkcionalni skrining

DO11.10 pLVX LK35.2 hPD-L1,

DO11.10 hLAG-3 LK35.2 pLVX,

DO11.10 hLAG-3 LK35.2 hPD-L1;

Skrining unakrsne reaktivnosti cinomolgusa

DO11.10 pLVX LK35.2 cPD-L1,

DO11.10 cLAG-3 LK35.2 pLVX,

DO11.10 cLAG-3 LK35.2 cPD-L1;

[0204] Ćelije su inkubirane na 37°C, 5%CO2u trajanju od 24 h. Supernatanti su sakupljeni i ispitivani sa mišjim IL-2 ELISA kitom (eBioscience, 88-7024-88 ili R&D systems, SM2000) u skladu sa instrukcijama proizvođača. Ploče su očitavane na 450 nm korišćenjem čitača za ploče Gen5 Softverom, BioTek. Vrednosti apsorbance od 570 nm su oduzimane od onih na 450 nm (Korekcija). Standardna kriva za izračunavanje koncentracije citokina je zasnovana na uklapanju logističke krive sa četiri parametra (Gen5 Software, BioTek). Predstavljena je koncentracija mIL-2 u odnosu na log koncentracije Fcat ili mAt i dobijene krive su uklopljene korišćenjem log (agonista) u odnosu na jednačinu odgovora u GraphPad Prism. Tabela 16 pokazuje EC50vrednosti i maksimalno oslobađanje IL-2 mAt<2>i kontrolnih mAt-a, izračunato kao procent vakcine (84G09 25F7). Slika 2A-F prikazuje reprezentativne grafike oslobađanja IL-2 od strane panela ćelijskih linija tretiranih sa FS18-7-9/84G09, FS18-7-62/84G09, ili FS18-7-78/84G09, i kontrolama. U testu aktivacije T ćelija sa obe prisutne mete (DO11.10 hLAG-3 LK35.2 hPD-L1), oslobađanje IL-2 je indukovano samo kada su oba LAG-3 i PD-L1 bila inhibirana, na<2>2 primer kada mAt ili je korišćena kombinacija antitela specifičnih za LAG-3 i PD-L1. Prema tome mAt ima benefit u odnosu na samo jedno sredstvo. U testovima sa samo LAG-3 (DO11.10 hLAG-3 LK35.2 pvlx) ili PD-L1 (DO11.10 pvlx LK35.2 PD-L1) mAt<2>je pokazao sličnu aktivnost kao pojedinačna sredstva u inhibiranju ovih meta, pokazujući da je mAt2 samo jedan pojedinačan molekul koji je sposoban da dovede do aktivacije T ćelije u prisustvu LAG-3, PD-L1 ili LAG-3+PD-L1.

Tabela 16: EC50i maksimum oslobađanja IL2 (kao što je izračunato procentom oslobađanja IL2 u 2

poređenju sa kontrolom - 84G09+25F7) za devet mAt

4

[0205] Jedno od mAt<2>(FS18-7-9/84G09 koje sadrži LALA mutaciju) je ispitivano za funkcionalnu ukrštenu reaktivnost cinomolgusa u DO11.1-/LK35.2 testu T ćelijske aktivacije. Slika 3 A-C pokazuje rezultate u panelu tri testa zasnovana na ćelijama. FS18-7-9/84G09 je sposoban da indukuje T ćelijsku 2 aktivaciju u prisustvu oba cLAG-3 cPD-L1 i cLAG-3 ili samo cPD-L1, što ukazuje na to da su mAt funkcionalno ukršteno reaktivna sa cinomolgusom i prema tome su pogodni za upotrebu u ispitivanjima bezbednosti zasnovanim na primatima.

3.2 Stafilokokni Enterotoksin B test

[0206] Tri mAt<2>(svi se sastoje iz LALA mutacija) su ispitana u Stafilokoknom Enterotoksin B testu zasnovanom na humanom-PBMC (SEB test). Stafilokokni Enterotoksin B je superantigen, i vezuje se za molekule MHC klase II na antigen prezentujućim ćelijama (APCs) i vβ lanac T ćelijskog receptora (TCR), uzrokuje ne-specifičnu aktivaciju T ćelija i oslobađanje citokina. Ne postoji potreba da antigen bude prisutan da bi se videla T ćelijska aktivacija. SEB test koristi stimulisane humane ćelije (PBMCs) sa fiziološkim nivoima inhibitora kontrolnih tačaka, i može da bude korišćen da bi se potvrdilo da je T ćelijska aktivacija pojačana sa mAt<2>u humanom sistemu. Tri mAt<2>su ispitana u SEB sistemu sa ćelijama koje su dobijene od četiri različita donora.

Generisanje proširenih T ćelija

[0207] PMBC-e su izolovane iz ostataka leukocita izolovanih od pojedinaca koji daju trombocite aferezom i sastoje se od male zapremine leukocita sa malo crvenih krvnih zrnaca ili trombocita (eng. leukocyte cones) razdvajanjem na gradijentu Ficoll-a. CD4+ T ćelije su izolovane korišćenjem kita za izolovanje humanih CD4+ T ćelija (Miltenyi Biotec Ltd, 130-096-533) u skladu sa uputstvima proizvođača. Humana T-Aktivatorska CD3/CD28 Dynazrnca (Life technologies, 11131D) su resuspendovana vorteksovanjem. Zrnca su preneta u sterilnu epruvetu zapremine 15ml i 10ml RPMI (Life Technologies, 61870044) sa 10% FBS (Life Technologies, 10270106) i 1x Penicilin Streptomicin (Life Technologies, 15140122) je dodavano za ispiranje Dynazrnaca. Supernatant je odbačen. Željena količina CD4+ T ćelija na 1.0 x10<6>ćelija/ml u RPMI sa 10% FBS i 1x Rastvor Penicilina Streptomicina i 50 IU/ml rekombinantnim humanim IL2 (Peprotech, 200-02-50ug ) sa odnosom 3:1 zrnaca prema ćelijama je preneta u T75 bocu (Greiner Bio-one, 690195) i inkubirana je na 37°C 5% CO2. Posle 3 dana ćelije su nežno resuspendovane i izbrojane. Ćelijska gustina je održavana između 0.8-1 x 106 ćelija/ml dodavanjem svežeg medijuma (RPMI-10% FBS Penicilin Streptomicin Rastvor 1X 50IU/ml rhuIL2) koliko je potrebno. U danu 7 ili 8, CD3/28 zrnca su uklonjena i CD4+ T ćelije su ostavljene preko noći u 1 x 10<6>ćelija/ml svežem medijumu RPMI-10% FBS Penicilin Streptomicin Rastvor 1X sa smanjenim 10IU/ml rhuIL2. Ćelije su čuvane zamrznute do ponovne potrebe.

Generisanje MoiDC-a

[0208] Netaknuti monociti su izolovani iz humanih PBMC-a korišćenjem kita za izolovanje humanih Pan Monocita, (Miltenyi Biotec Ltd, 130-096-537) u skladu sa uputstvima proizvođača. Monociti su diferencirani do iDC-a korišćenjem medijuma za diferencijaciju humanih Mo-DC (Miltenyi Biotec Ltd, 130-094-812) u skladu sa uputstvima proizvođača.

SEB test

[0209] Proširene T ćelije su otopljene jedan dan pre eksperimenta, isprane sa AIM medijumom (Gibco, 12055-091) i inkubirane na 37°C, 5% CO<6>

2preko noći na 1x10 ćelija/ml u AIM medijumu. 2 µM koncentracija svakog antitela/smeše je pripremljena u DPBS (Gibco, 14190-169) i razblažena 1:10 u medijumu (30 µl 270 µl) da se dobije 200 nM. U ploči sa 96 bunarića, serijska razblaženja su izvedena na 1:10 (30 µl 270 µl eksperimentalni medijum; 2x finalna konc.). MoiDCs su otopljene, isprane sa AIM medijumom i pomešane su sa T ćelijama iz istog donora u odnosu 1:10 (5 ml iDC-a u 2x10<5>ćelija/ml je kombinovano sa 5ml T ćelija na 2x10<6>ćelija/ml).20 µl SEB (Sigma, S4881) na 0.1 µg/ml je dodato u 10 µl ćelija. U ploču sa okruglim dnom sa 96 bunarića, 100 ml smeše ćelija/SEB je dodato u 100 µl razblaženja antitela, dajući odnos 10<4>iDC ćelija prema 10<5>T ćelija sa 0.1 ng/ml SEB u 200 µl AIM medijumu po bunariću sa finalnim koncentracijama antitela koje iznose 100, 10, 1, 0.1, 0.01, 0.001 nM. Ćelije su inkubirane ne 37°C, 5% CO2u trajanju od 3 dana. Supernatanti su sakupljeni i trenutno su ispitani sa ELISA kitom za humani IFNγ (R&D Systems, PDIF50) ili su smrznuti na -20°C za dalju analizu. Test je izveden u skladu sa uputstvima proizvođača iz kita korišćenjem razblaženja supernatanta 1:30 sa PBA (DPBS, 2% BSA (Sigma, A7906-100G)). Koncentracija humanog IFNγ je prikazana u odnosu na log koncentraciju mAt<2>ili mAt i dobijene krive su uklopljene korišćenjem log (agonist) prema jednačini odgovora u GraphPad Prism softveru. Tabela 17 pokazuje EC50vrednosti i obim oslobađanja IFNγ u SEB testu sa ćelijama iz četiri različita donora (Donori A do D). Slika 4 prikazuje reprezentativni grafik SEB testa sa jednim donorom. Kod svih šest testova LAG-3/PD-L1 mAt<2>i kombinacija LAG-3/FITC mAt<2>+ 84G09LALA pokazala je veću aktivaciju u odnosu na samo 84G09LALA mAt, pri čemu gde su LAG-3/FITC mAt<2>ili 4420 mAy ispitivani nisu pokazali značajnu aktivaciju. Rezultati SEB testa prema tome potvrđuju rezultate DO11.10/LK35.2 testa u više fiziološkom sistemu.

Tabela 17. EC50vrednosti izračunate za šest mAt<2>na osnovu šest SEB testova sa 4 različita ćelijska donora.

4

nastavak

4

Primer 4: In vivo aktivnost mAt<2>molekula kod mišjih modela tumora

4.1 Aktivnost mAt<2>molekula u MC38 ne-uspostavljenom tumorskom modelu

[0210] MC38 singeni tumorski model je korišćen u ovom eksperimentu kao MC38 tumori koji su poznati da eksprimiraju PD- L1 na njihovoj ćelijskoj površini i da su visoko imunogeni pri čemu dolazi do povećane ekpresije LAG-3 na imunskim ćelijama u tumoru i periferiji tumora.

[0211] Surogat mišjeg mAt<2>FS18-7-108-29/S1 koji se sastoji iz LALA mutacije (SEQ ID NO: 117 i 119) koji je označen sa FS18-29/S1 je ispitan za in vivo aktivnost korišćenjem MC38 modela tumorskog rasta kod singenog miša. Sposobnost mAt<2>da inhibira tumorski rast je upoređena sa onom kod LAG-2

3/“mock“ mAt , FS18-7-108-29/4420 koji se sastoji iz LALA mutacije (SEQ ID NO: 132 i 85) naznačene sa FS18-29/4420, reper anti-LAG-3 mAt C9B7W (2B naučni; Broj kataloga BE0174-50MG), reper anti-PD-L1 mAt S1 koje se sastoji iz LALA mutacije (SEQ ID NO: 122 i 119) i kombinacije mAt-a C9B7W i S1.

[0212] C57BL/6 ženke miševi (Charles River) starosti 8-10 nedelja i težine 20-25 g svaka su odmarale jednu nedelju pre početka ispitivanja. Sve životinje su mikro-čipovane i dobile su jedinstven identifikator. Svaka kohorta je imala 10 miševa. MC38 ćelijska linija karcinoma debelog creva (S.

4

Rosenberg, NIH) je prvobitno proširena, skladištena, i nakon toga je izvršen pre-skrining sa IDEXX Bioresearch za patogene korišćenjem IMPACT I protokola i pokazano je da su bez patogena. MC38 ćelije su otopljene sa skladišenja na -150 °C i dodate su u 20 ml DMEM (Gibco, 61965-026) sa 10% FCS (Gibco, 10270-106) u T175 posudu za tkivnu kulturu. Miševi su anestezirani korišćenjem izoflurana (Abbott Laboratories) i svaka životinja je primila 2x10<6>ćelija ubrizganih subkutanozno u levi bok.7-8 dana posle inokulacije tumorskih ćelija, miševi koji nisu imali tumore u ovom vremenu su uklonjeni iz ispitivanja.

[0213] Svaki od mAt<2>molekula i kontrolna_antitela su analizirani tokom 24 h pre ubrizgavanja sa SEC-HPLC profilisanjem i provereni su za nečištoće. Antitela su pripremljena u finalnoj koncentraciji od 10 mg/kg u PBS-u i kombinovana su sa drugim antitelom u kombinovanim ispitivanjima. Molekuli mAt<2>i kontrolna antitela su davani miševima sa intraperitonealnim (IP) ubrizgavanjem u danima 8, 11, i 14 nakon inokulacije tumora. Izvršena su precizna merenja tumora, izvršeno je doziranje bilo kog leka na dan u pitanju, i miševi su izloženi pomnom posmatranju za preostali deo ispitivanja. Merenja zapremine tumora su vršena pomoću kalipera da bi se odredila najduža osa i najkraća osa tumora. Sledeća formula je korišćena za određivanje zapremine tumora:

Gde L = najduža osa; S= najkraća osa

[0214] Ispitivanje je zaustavljeno u danu 20 kada je smatrano da je opterećenje tumorom blizu ograničenjima. Svi miševi su humano žrtvovani i tumori su isečeni i izmereni.

[0215] Rezultati su prikazani na Slikama 5 i 6. Miševi tretirani sa LAG-3/PD-L1 mAt<2>(FS18-29/S1) imali su na kraju tumore sa značajno manjim težinama u odnosu na one koji su tretirani sa kombinacijom reper mAt-a, C9B7W i S1. Specifično, statistička analiza krajnjih težina tumora je izvedena korišćenjem dvosmernog Studentovog t-testa sa GraphPad Prism softverskim paketom koji pokazuje statistički značajnu razliku između davanja FS18-29/S1 i davanja kombinacije reper antitela C9B7W i S1 (p = 0.0125), ukazujući da inhibicija LAG-3 i PD-L1 obezbeđena od strane istog molekula dovodi do sinergističkog efekta na krajnje tumorske mase u poređenju sa inhibicijom LAG-3 i PD-L1 koja je obezbeđena od strane odvojenih molekula.

[0216] Surogat mAt<2>FS18-29/S1 takođe je imao izrazit efekat na tumorski rast sprečavanjem uspostavljanja kod 6 od 8 rastućih MC38 tumora, i usporavanja rasta preostalih 2. Davanje repera anti-LAG-3 i PD-L1 antitela u kombinaciji usporilo je tumorski rast kod 7 životinja sa nijednom životinjom koja je bila bez tumora.

[0217] FS18-29/4420 sam pojedinačno nije imao izrazit efekat na tumorski rast, što ukazuje da za maksimalnu efikasnost, mAt<2>zahteva anti-PD-L1 Fat. Reper anti-mišje LAG-3 antitelo samo je imalo mali ili nije imao efekat na nastali rast tumora dok reper anti-mišje PD-L1 je sprečilo uspostavljanje 1 od 7 tumora u ovoj kohorti, i imao je određeni sveukupni efekat na usporavanje tumorskog rasta.

[0218] Modeli singenih miševa prihvaćeni su kao odgovarajući mišji sistemi za ispitivanje antitumorskog efekta inhibiranja terapeutskih sredstava i široko su korišćeni za validaciju razvoja humanih terapeutika.

4

4.2 Aktivnost mAt<2>molekula u MC38 uspostavljenom tumorskom modelu

[0219] Surogat mišjeg mAt<2>FS18-7-108-29/S1 koji se sastoji iz LALA mutacije, (SEQ ID NO: 117 i 119) koji je nazačen sa FS18-29/S1, je ispitan za in vivo aktivnost u modelu tumorskog rasta kod MC38 singenog miša. Sposobnost mAt<2>da inhibira tumorski rast je upoređena sa onom kod LAG-3/“mock“ 2

mAt , FS18-7-108-29/4420 koji se sastoji iz LALA mutacije (SEQ ID NO: 132 i 85), naznačeno sa FS18-29/4420, reper LAG-3 mAt C9B7W, reper PD-L1 mAt S1 koji se sastoji iz LALA mutacije (SEQ ID NO: 122 i 119) i na kombinaciju C9B7W i S1.

[0220] C57BL/6 ženke miševi (Charles River) starosti 8-10 nedelja i težina 20-25 g svaka su odmarale jednu nedelju pre početka ispitivanja. Sve životinje su mikro-čipovane i dobile su jedinstven identifikator. Svaka kohorta je imala 10 miševa. MC38 ćelijska linija karcinoma debelog creva (S. Rosenberg, NIH) je prvobitno proširena, skladištena, i nakon toga je izvršen pre-skrining sa IDEXX Bioresearch za patogene korišćenjem IMPACT I protokola i pokazano je da su bez patogena. MC38 ćelije (približno 3-5x106) su otopljene sa skladišenja na -150 °C i dodate su u 20 ml DMEM (Gibco, 61965-026) sa 10% FCS (Gibco, 10270-106) u T175 posudu za tkivnu kulturu. Miševi su anestezirani korišćenjem izoflurana (Abbott Laboratories) i 2x10<6>ćelija u 100 µl je ubrizgano subkutanozno u levi bok svakog miša. 7-8 dana posle inokulacije tumorske ćelije, miševi su rutinski praćeni za zdravlje i tumorski rast koji je odgovarajući za početak ispitivanja. Kada je većina miševa ispoljila tumore prečnika od 5-10 mm, sortirani su i nasumično su vraćeni u kohorte za ispitivanje. Bilo koji miševi koji u ovom vremenu nisu imali tumore odgovarajuće veličine su uklonjeni iz ispitivanja.

[0221] Svaki od mAt<2>molekula i kontrolna_antitela su analizirani tokom 24 h pre ubrizgavanja sa SEC-HPLC profilisanjem i provereni su za nečištoće. Antitela su pripremljena u finalnoj koncentraciji od 10 mg/kg u PBS-u i kombinovana su sa drugim antitelom u kombinovanim ispitivanjima. Molekuli mAt<2>i kontrolna antitela su davani miševima u danima 15, 18, i 21 nakon inokulacije tumora sa IP ubrizgavanjem. Životinje su ispitivane za zdravstveno stanje pod anestezijom tri puta nedeljno na slepi način, u vremenu kada su uzimana precizna merenja tumora. Merenja zapremine tumora su uzimana sa kaliperom da bi se odredila najduža osa i najkraća osa tumora. Formula koja je korišćena za izračunavanje zapremine tumora je prikazana u odeljku 4.1 gore u tekstu.

[0222] Ispitivanje je zaustavljeno u danu 24 kada je opterećenje tumorom smatrano blizu ograničenjima. Svi miševi su humano žrtvovani i tumori su isečeni i izmereni. Rezultati su prikazani na Slikama 7 i 8.

[0223] Efikasna kontrola ili supresija tumorskog rasta u singenim tumorskim modelima kod miševa je najbolje postignuta kroz terapeutsku intervenciju u ranim vremenskim tačkama (polazne zapremine 3

tumora manje od 40mm ). Što se intervencija primenjuje kasnije, teže je uočiti pozitivne efekte u odnosu na tumorski rast, iako je ovo možda više slično situaciji u humanom kliničkom okruženju.

[0224] FS18-29/S1 je imao pozitivan efekat kod oba u suprimiranju tumorskog rasta i prevenciji uspostavljanja MC38 karcinoma debelog creva kod imunski kompetentnih miševa kada je davan u ranijim vremenskim tačkama C57BL/6 miševima. Kada su davani u kasnijim vremenskim tačkama (polazne zapremine tumora 50-125mm3), FS18-29/S1 je bio isto tako efikasan u suprimiranju tumorskog rasta kao kombinacija reper antitela. FS18-29/4420 zasebno sam nije imao primetan uticaj na tumorski rast i oba S1 i C9B7W su imala blagi efekat na nastali tumorski rast.

4

4.3 Aktivnost mAt<2>molekula kod CT26 ne-uspostavljenog tumorskog modela

[0225] CT26 singeni model tumora je korišćen u ovom eksperimentu kao što su CT26 tumori poznati da eksprimiraju PD-L1 na njihovoj ćelijskoj površini i da budu visoko imunogeni dovodeći do povećane ekspresije LAG-3 na imunskim ćelijama u tumoru i periferiji.

[0226] Surogat mišjeg mAt<2>FS18-7-108-29/S1 koji se sastoji iz LALA mutacije (SEQ ID NO: 117 i 119), koji je označen sa FS18-29/S1, i FS18-7-108-35/S1 koji se sastoji iz LALA mutacije (SEQ ID NO: 120 i 119), koji je označen sa FS18-35/S1, su ispitani za in vivo aktivnost kod CT26 modela tumorskog rasta kod singenog miša. Sposobnost mAt<2>da inhibira tumorski rast je upoređena sa onom kod LAG-3/“mock“ mAt2 , FS18-7-108-29/4420 koje se sastoji iz LALA mutacije (SEQ ID NO: 132 i 85), naznačene sa FS18-29/4420, i FS18-7-108-35/4420 koji se sastoji iz LALA mutacije (SEQ ID NO: 133 i 85), naznačene sa FS18-35/4420, reper LAG-3 mAt C9B7W, reper PD-L1 mAt S1 koje se sastoji iz LALA mutacije (SEQ ID NO: 122 i 119) i na kombinaciju C9B7W i S1.

[0227] BALB/c ženke miševi (Charles River) starosti 8-10 nedelja i težine 20-25 g svaka su odmarale jednu nedelju pre početka ispitivanja. Sve životinje su mikro-čipovane i dobile su jedinstven identifikator. Svaka kohorta je imala 10 miševa. CT26 ćelijska linija karcinoma debelog creva (ATCC, CRL-2638) je prvobitno proširena, skladištena, i nakon toga je izvršen pre-skrining sa IDEXX Bioresearch za patogene korišćenjem IMPACT I protokola i pokazano je da su bez patogena. CT26 ćelije (približno 3-5x106) su otopljene sa skladišenja na -150 °C i dodate su u 20 ml DMEM (Gibco, 61965-026) sa 10% FCS (Gibco, 10270-106) u T175 posudu za tkivnu kulturu.7-8 dana posle inokulacije tumorske ćelije, miševi su rutinski praćeni za zdravlje i tumorski rast koji je odgovarajući za početak ispitivanja. Kada je većina miševa ispoljila tumore prečnika od 3-5 mm<3>, sortirani su i nasumično su vraćeni u kohorte za ispitivanje. Bilo koji miševi koji u ovom vremenu nisu imali tumore su uklonjeni iz ispitivanja.

[0228] Svaki od mAt<2>molekula i kontrolna_antitela su analizirani tokom 24 h od ubrizgavanja sa SEC-HPLC profilisanjem i provereni su za nečištoće. Antitela su pripremljena u finalnoj koncentraciji od 10 mg/kg u PBS-u i kombinovana su sa drugim antitelom u kombinovanim ispitivanjima. Molekuli mAt<2>i kontrolna antitela su davani miševima u danima 8, 11, i 24 nakon inokulacije tumora. Životinje su ispitivane za zdravstveno stanje u vremenu kada su uzimana precizna merenja tumora. Merenja zapremine tumora su uzimana sa kaliperom da bi se odredila najduža osa i najkraća osa tumora. Formula koja je korišćena za izračunavanje zapremine tumora je prikazana u odeljku 4.1 gore u tekstu: Ispitivanje je zaustavljeno u danu 20 kada je opterećenje tumorom smatrano blizu ograničenjima. Svi miševi su humano žrtvovani i tumori su isečeni i izmereni. Rezultati su prikazani na Slikama 9 i 10.

[0229] Statistička analiza krajnjih težina tumora je sprovedena je korišćenjem dvosmernog Studentovog t-testa sa GraphPad Prism softverskim paketom. Statistička analiza kriva tumorskog rasta je određena korišćenjem funkcije za poređenje kriva rasta iz paketa statističkog modelovanja, statmod (Elso et al., 2004 i Baldwin et al., 2007), dostupno sa R Projekta za statističko računanje.

[0230] Pokazana je statistički značajna razlika između FS18-35/S1 mAt<2>i kontrole IgG (normalan rast) u suprimiranju tumorskog rasta. Takva statistički značajna razlika nije uočena sa bilo kojom kombinacijom reper antitela, ili FS18-29/S1 mAt<2>u odnosu na IgG kontrolnu grupu, ili u odnosu na bilo koju drugu kohortu u ovom ispitivanju.

[0231] CT26 model tumora je agresivni, tumorski model sa brzim rastom, onaj koji je inherentno sklon za miševe koji razvijaju intestinalne metastaze, i kao rezultat ima veoma ograničen terapeutski prozor.

[0232] Iznenađujuće kombinacija reper LAG-3 i PD-L1 antitela nije značajno suprimirala tumorski rast u poređenju sa kohortom IgG kontrole. Međutim, kohorta tretirana sa FS18-35/S1 nije otkrila značajnu supresiju rasta u poređenju sa IgG kontrolom. FS18-29/S1, dok jeste suprimirao tumorski rast kao u poređenju sa IgG kontrolom, nije bilo statistički značajno. Ovo ispitivanje pokazuje drugi tumorski model u kome mišje reaktivno LAG-3/PD-L1 mAt<2>pokazalo pozitivni efekat u usporavanju tumorskog rasta najmanje do istog stepena kao davanje kombinacije repera monoklonskih antitela.

4.4 Efekat LALA mutacije na inhibiciju tumorskog rasta u MC38 ne-uspostavljeni tumorski model

[0233] Dva mAt<2>(FS18-7-108-29/S1 LALA i FS18-7-108-29/S1) su testirana za ispitivanje potencijalnih razlika u anti-tumorskoj aktivnosti ovih mAt<2>sa i bez LALA mutacije u Fc regionu. Surogat mišje mAt2 FS18-7-108-29/S1 naznačeno kao FS18-29/S1 sa (SEQ ID NO: 117 i 119) i bez LALA mutacije (SEQ ID NO: 118 i 119) je ispitano za in vivo aktivnost korišćenjem MC38 singenog mišjeg modela tumorskog<2>2 rasta. Sposobnost mAt da inhibira tumorski rast je upoređena sa onom kod LAG-3/“mock“ mAt , FS18-7-108-29/4420 sa (SEQ ID NO: 132 i 85) i bez LALA mutacije (SEQ ID NO: 134 i 85) naznačeno sa FS18-29/4420LALA i FS18-29/4420 i kombinacijom LAG-3/“mock“ mAt<2>sa i bez LALA mutacije sa reper PD-L1 mAt S1 sa (SEQ ID NO: 122 i 119) i bez LALA mutacije (SEQ ID NO: 123 i 119).

[0234] C57BL/6 ženke miševi (Charles River) starosti 8-10 nedelja i težine 20-25 g svaka su odmarale jednu nedelju pre početka ispitivanja. Sve životinje su mikro-čipovane i dobile su jedinstven identifikator. Svaka kohorta je imala 10 miševa. MC38 ćelijska linija karcinoma debelog creva (S. Rosenberg, NIH) je prvobitno proširena, skladištena, i nakon toga je izvršen pre-skrining sa IDEXX Bioresearch za patogene korišćenjem IMPACT I protokola i pokazano je da su bez patogena. MC38 ćelije (približno 3-5x106) su otopljene sa skladišenja na -150 °C i dodate su u 20 ml DMEM (Gibco, 61965-026) sa 10% FCS (Gibco, 10270-106) u T175 posudu za tkivnu kulturu. Miševi su anestezirani korišćenjem izofluorana (Abbot Laboratories) i 2x10<6>ćelija u 100 µl je subkuranozno ubrizgano u levi bok svakog miša. Miševima je dozvoljeno da se oporave pod opservacijom i datum inokulacije je zabeležen kao Dan 0.7-8 dana posle inokulacije tumorske ćelije, miševi su rutinski praćeni za zdravlje i tumorski rast koji je odgovarajući za početak ispitivanja. Bilo koji miševi koji u ovom vremenu nisu imali tumore su uklonjeni iz ispitivanja.

[0235] Svaki od mAt<2>molekula i kontrolna_antitela su analizirani tokom 24 h od ubrizgavanja sa SEC-HPLC profilisanjem i provereni su za nečištoće. Antitela su pripremljena u finalnoj koncentraciji od 10 mg/kg u PBS-u i kombinovana su sa drugim antitelom u kombinovanim ispitivanjima. Molekuli mAt<2>i kontrolna antitela su davani miševima u danima 8, 11, i 14 nakon inokulacije tumora sa IP ubrizgavanjem. Životinje su ispitivane za zdravstveno stanje pod anestezijom tri puta nedeljno na slep način, u vremenu kada su uzimana precizna merenja tumora. Merenja zapremine tumora su uzimana sa kaliperom da bi se odredila najduža osa i najkraća osa tumora. Formula koja je korišćena za izračunavanje zapremine tumora je prikazana u odeljku 4.1.

[0236] Svi miševi su humano žrtvovani i tumori su isečeni i izmereni. Rezultati su prikazani na Slikama 11 i 12.

[0237] Ovo ispitivanje potvrđuje da prisustvo ili odsustvo LALA mutacije, koje ukida ADCC aktivnost, nema statistički značajan efekat na tumorski rast u MC38 modelu karcinoma debelog creva, međutim 2

ona mAt koja su uključila LALA mutaciju težila su rezultatu povećane supresije tumorskog rasta. Osim toga, oblazloženje za uključivanje mutacije koja potencijalno inhibira ADCC aktivnost protiv T ćelija koje eksprimiraju LAG-3 ili PD-L1 je opravdana time što LALA mutacija nije imala oštećujući efekat na anti-

1

tumorsku aktivnost LAG-3/PD-L1 mAt2. Postoji određeni dokaz koji sugeriše da je uključivanje LALA mutacije bilo kritično samo za PD-L1 antitelo.

[0238] Ovo testiranje je takođe ispitivalo da li LAG-3/PD-L1 mAt<2>može da ima povećanu efikasnost u odnosu na davanje individualnih antitela (LAG-3 LALA PD-L1 LALA). U ovom slučaju nije bilo značajne razlike između dve kohorte. Obe grupe su suprimirale rast u MC38 modelu karcinoma debelog creva.

4.5 Zaključak

[0239] Sveukupno, iz gore navedenih rezultat je jasno da postoji sinergistički efekat na supresiju tumorskog rasta kada mAt<2>molekul sadrži mesta vezivanja za oba LAG-3 i PD-L1 je davan miševima in u ispitivanim mišjim modelima. Na osnovu ovih rezultata, očekivano je da će molekuli antitela iz pronalaska pokazati superiorniji efekat u lečenju kancera kod humanih pacijenata, posebno u suprimiranju tumorskog rasta, u odnosu na davanje sva zasebna molekula koja se redom vezuju za LAG-3 i PD-L1.

Primer 5: Efekat tretmana mAt2 na ekspresiju LAG-3 T ćelija

[0240] Mehanizam pomoću koga surogat mišje mAt<2>FS18-7-108-29/S1 koje se sastoji iz LALA mutacije, (SEQ ID NOs: 117 i 119) naznačeno sa FS18-29/S1 dovodi do smanjenog opterećenja tumorom je ispitivano kod MC38 singenog modela tumorskog rasta kod miša koji eksprimira ovalbumin 2

(MC38.OVA). Efekat FS18-29/S1 je upoređen sa onim kod LAG-3/“mock“ mAt , FS18-7-108-29/4420 koji se sastoji iz LALA mutacije (SEQ ID NOs: 132 i 85), naznačen sa FS18-29/4420, reper PD-L1 mAt S1 koji se sastoji iz LALA mutacije (SEQ ID NOs: 122 i 119) i na kombinaciju FS18-29/4420 i S1.

[0241] U danu implanta, kultivisane MC38.OVA ćelije su sakupljene tokom log faze rasta (Konfluentnost -75%) i resuspendovane su u PBS u koncentraciji od 1 x 10<7>ćelija/mL. Tumori su prvo inicirani anesteziranjem svake životinje sa izofluoranom, zatim subkutanoznim implantiranjem 1 x 106 MC38.OVA ćelija (0.1 mL suspenzije) u levi bok svake ispitivane životinje. Jedanaest dana nakon implantacije tumorskih ćelija životinje su nasumično raspoređene, upotrebom determinističkog postupka nasumičnog raspoređivanja, u pet grupa sa individualnim zapreminama tumora od 32 do 3

62.5 mm . Životinje su dozirane na 10 mg/kg antitela ili mAt<2>u danu 12, 14 i 16 nakon inokulacije tumora, i tumori su sakupljeni iz tri životinje/grupi u danima 19 i 23 nakon inokulacije tumora. GentleMACSTM Dissociator je korišćen za razdvajanje tumora sa ćelijama koje su naknadno prosejane kroz sito od 70 µm za ćelije da se dobije suspenzija pojedinačnih ćelija.1x10<6>ćelija/bunariću u ploči sa 96-bunarića je resuspendovano u FACS puferu sa 1:3000 bojom za vijabilnost i Fc blokirajućim (anti-CD16/32 antitelom). Ćelije za FACS analizu su obojene korišćenjem Master Miksa koji je uključio antitela obeležena protiv CD43, CD8a, CD4, FoxP3, i LAG-3. Za FoxP3 unutarćelijsko bojenje ćelije su fiksirane i permeabilizovane pre bojenja sa antitelom koje je specifično za FoxP3. Uzorci su nanošeni na Canto II protočni citometar sa kompenzacionom matricom i minimumom 500,000 izbrojanih događaja.

[0242] U ovom eksperimentu, TIL-e su ispitivane za ekspresiju LAG-3 nakon davanja treće doze antitela/mAt2 , kada je uočeno razdvajanje u rastu tumora između kontrole i tretmana sa mAt<2>ali pre nego što je bila velika razlika između veličina tumora što bi moglo iskriviti rezultate. U ovoj vremenskoj 2 tački, pronađeno je da je ekspresija LAG-3 na TIL-a značajno smanjena kod životinja tretiranih sa mAt FS18-29/S1 ili sa kombinacijom FS18-29/4420 i S1. Specifično, kao što je prikazano na Slici 13, ekspresija LAG-3 na CD8, CD4 i FoxP3 tumorskim infiltrirajućim limfocitima (TIL-i) je smanjena posle tretmana sa FS18-29/S1 u danu 19 i 23 posle inokulacije tumora, što odgovara 3 i 7 dana redom, nakon

2

poslednjeg doziranja antitela/mAt2. Smanjenje u ekspresiji LAG-3 je bilo više izraženo u danu 23 ali je i dalje bilo očigledno u danu 19. Životinjama kojima je davana kombinacija FS18-29/4420 i S1 su takođe pokazale smanjenje u ekspresiji LAG-3 na TIL-a ali je efekat bio odložen do dana 23, dok je tretman sa FS18-29/4420 ili S1 koji je davan individualno imao malo ili nije imao efekta na ekspresiju LAG-3 na TIL-a.

[0243] Ovi rezultati su pokazali da je neophodna dualna inhibicija LAG-3 i PD-L1 za smanjenje u ekspresiji LAG-3 od strane TIL-a, kako ovaj fenomen nije uočen kod životinja koje su tretirane sa pojedinačnim agensima protiv LAG-3 ili PD-L1. Bez želje za vezivanjem za teoriju, smatra se da dualni anti-LAG-3 i anti-PD-L1 tretman dovodi do smanjenja u ekspresiji LAG-3 na TIL-a, time smanjujući inhibitorni efekat LAG-3 i omogućavajući da TIL-i prevaziđu iscrpljivanje. Jednom kada se TIL-i aktiviraju, postaju sposobni da prepoznaju neo-antigene eksprimirane od strane tumora i pokrenu odgovor protiv njih. Stoga se smatra da je ovo mehanizam pomoću koga tretman sa anti-LAG3/PD-L1 mAt<2>rezultuje u smanjenju opterećenja tumorom.

Primer 6: Ćelijska citotoksičnost zavisna od antitela i aktivnost citotoksičnosti mAt2 koja zavisi od komplementa

[0244] IgG1 antitela obično ispoljavaju efektorske funkcije preko konzervisanih mesta za interakciju u konstantnom regionu molekula. Ona uključuju ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC), kojaje posredovana sa vezivanjem za FcyR eksprimiranim na Monocitima/Makrofagima, dendritičnim ćelijama, NK ćelijama, neutrofilima i drugim granulocitima, i citotoksičnost koja zavisi komplementa (CDC), posredovana indukovanjem kaskade komplementa koja se inicira vezivanjem C1q komponente komplementa. S obzirom na to da je LAG-3 predominantno eksprimiran na aktiviranim T ćelijama i PD-L1 je eksprimiran na njima ali takođe na ćelijama tumora na višim nivoima, ispitivana je sposobnost 2

mAt FS18-7-9/84G09 (SEQ ID NOs 94 i 116) za indukovanje ADCC i CDC.

[0245] Specifično, ispitivano je da li FS18-7-9/84G09 tretman ćelija koje eksprimiraju LAG-3 ili PD-L1, nakon inkubacije sa ili NK ćelijama ili komplementom, indukuje lizu odgovarajuće ciljne ćelije. Dodatno, s obzirom da je FS18-7-9/84G09 bispecifično antitelo, takođe je ispitivano da li ciljno angažovanje na jednoj od specifičnosti utiče na efektorsku funkciju prema ćelijama koje eksprimiraju metu za drugu specifičnost.

[0246] Razumevanje efektorskih funkcija mAt<2>FS18-7-9/84G09 je korisno iz brojnih razloga, uključujući određivanje da li mutacija koja smanjuje efektorske funkcije, kao što je LALA mutacija, treba da bude uključena u molekul da zaštiti efektorske T ćelije koje eksprimiraju LAG-3 koje su angažovane u ubijanju tumora od FS18-7-9/84G09-posredovane ADCC i/ili CDC.

6.1 Dizajn studije

[0247] Raji ćelije koje rekombinantno eksprimiraju LAG-3 ili PD-L1 su korišćene za sve testove, upotrebom njihove endogene ekspresije CD20 kao kontrole za ciljanje sa generičkom verzijom Rituksimaba da bi se pokazala funkcionalna aktivnost dodatog komplementa i preparata NK ćelija nezavisno od rekombinantne ekspresije ciljnih proteina. Cilja ekspresija je potvrđena pre ovih eksperimenata.

[0248] Da bi se odredila osnovna CDC aktivnost prema ćelijama koje eksprimiraju LAG-3 ili PD-L1, ov aktivnost je merena korišćenjem oslobađanja LDH, merenjem konverzije supstrata u fluorescentnu boju (CytoTox-ONETM by Promega). Da bi se izmerilo koje ciljne ćelije u ćelijskoj smeši koja se sastoji iz obe, ćelije koje eksprimiraju LAG-3 i ćelije koje eksprimiraju PD-L1 su lizirane, diferencijalna CDC je izmerena protočnom citometrijom ili diferencijalno fluorescentno obelelženim ciljnim ćelijama posle inkubacije sa mAt2/antitelom, detektovanjem mrtvih ćelija korišćenjem fluorescentne boje koja je isključena iz živih ćelija.

[0249] Da bi se odredila ADCC aktivnost prema ćeljama koje eksprimiraju LAG-3 ili PD-L1, ova aktivnost je merena korišćenjem NK ćelija koje su izolovane iz zamrznutih PBMC i oslobađanje LDH je mereno kolorimetrijski (CytoTox 96 sa Promega). Za sva ova ispitivanja, Rituksimab je u različitim izotipovima i Fc konfiguracijama korišćen kao kontrola. Nije poznat pouzdan postupak za diferencijalno merenje ADCC, prema tome diferencijala ADCC aktivnost nije merena.

[0250] U svim eksperimentima, PD-L1 specifično mAt (84G09) i LAG-3 specifično mAt (25F7) su korišćeni kao kontrole. IgG izotipska kontrola (4420) koja je korišćena ili kao negativna kontrola ili da se generiše pozadina CDC aktivnosti je takođe korišćena. LALA verzije odgovarajućih antitela i mAt2 (isključujući 25F7) su takođe upoređene sa verzijama divljeg tipa IgG1 u CDC i ADCC testovima da bi se odredio efekat ove mutacije na navedene efektorske funkcije.

6.2 Materijali i Postupci

6.2.1 CDC testovi

2

[0251] Sva antitela/mAt , uključujući Rituksimab, su razblažena u 10 tačka 1 u 2 serijska razblaženja. Kontrolni bunarići koji sadrže IgG (4420 LALA) u najvećoj koncentraciji korišćenoj su takođe pripremljeni. Ćelijske suspenzije Raji ćelija koje rekombinantno eksprimiraju LAG-3 ili PD-L1 redom, su pripremljene u medijumu oslobođenom od seruma za test oslobađanja LDH i dodate su u jednaku zapreminu pripremljenih antitela/mAt2.

[0252] Za test Protočne citometrije zasnovan na CDC, ćelijske suspenzije od 5 x 10<7>ćelija su pripremljene i resuspendovane u ili 0.5 µM CellTracker duboko crveno (CellTrackerTM duboko crveno, Thermo Fisher, #C34565) ili 5 µM za CellTracker zeleno (CellTrackerTM zeleno CMFDA (5-hlorometilfluorescein diacetat, Thermo Fisher, # C7025) u medijumu bez seruma. Posle 30 min inkubacije na 37°C, ćelije su isprane u medijumu bez seruma i ili su dodate direktno u pripremljene bunariće koji sadrže antitelo/mAt2 , ili su kombinovane sa drugom diferencijalno obojenom ćelijskom linijom u jednakim zapreminama i nakon toga su dodate u bunariće koji sadrže antitelo/mAt2 kao što je opisano gore u tekstu. Za oba testa, posle 30 min inkubacije pod uslovima u ćelijskoj kulturi, bunarići su dopunjeni sa jednakom zapreminom komplementa mladunca zeca, 10% u medijumu bez seruma (Baby Rabbit Complement,TEBU-bio, #CL3441). Ploče su inkubirane u trajanju od 4 h u uslovima ćelijske kulture. Za CDC test oslobađanja LDH, 100% kontrole lize su generisane dodavanjem Triton X 100 polovini bunarića tretiranih sa 4420 LALA i Cytotox test je izveden prema uspustvima proizvođača (CytotoxOne,Promega, G7891). Nakon dobijanja očitavanja, signal iz 100% liza kontrola je podešen do 100% i signali iz bunarića uzoraka su izračunati kao procenat od tog nivoa.

[0253] Za test Protočne citometrije zasnovan na CDC, na kraju inkubacionog perioda, boja za mrtve ćelije (SYTOX® Blue Dead Cell Stain, Thermo Fisher, #S34857) je razblažena 1 prema 500 u PBS i bunarići su dopunjeni sa jednakom zapreminom. Protočna citometrija je izvedena na Cytoflex protočnom citometru podešavanjem gejtova na intaktnim ćelijskim populacijama zasnovano na FSC i SSC i detekcijom procenta Sytox pozitivnih ćelija (kanal PB450) od oba CellTrackerTM duboko crveno pozitivnih i CellTrackerTM zelenih CMFDA pozitivnih ćelijskih populacija.

4

6.3.2 ADCC test

[0254] ADCC je meren kao što je prethodno opisano (Broussas, Matthieu; Broyer, Lucile; i Goetsch, Liliane. (2013) Evaluation Antibody-Dependent Cell Cytotoxicity Using Lactate Dehydrogenase (LDH) Measurement in Glycosylation Engineering of Biopharmaceuticals: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. New York: Springer Science Business Media. Volume 988, pp 305-317) . Ukratko, ciljane ćelije su prethodno-inkubirane sa antitelima pre dodavanja primarnih NK ćelija izolovanih iz humanih PBMC-a (NK cell isolation kit, Miltenyi Biotec, 130-092-657) u odnosu od 20 prema 1 tokom 4 h. Test citotoksičnosti je sproveden u skladu sa instrukcijama proizvođača (CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay, Promega, G1780). % lize je izračunat na osnovu 100% ciljane lize ćelija, uzimajući u obzir spontanu lizu efektorskih i ciljnih ćelija.

6.3 Rezultati i zaključci

6.3.1 CDC test

[0255] Raji ćelije koje eksprimiraju PD-L1 su ciljane sa anti-CD20 antitelom Rituksimabom, što je za rezultat imalo maksimalnu lizu od <60% kada je mereno CDC sa generičkim oslobađanjem LDH. Anti-PD-L1 antitelo 84G09 (koje se sastoji iz porcije F(at)2od mAt<2>FS18-7-9/84G09), i FS18-7-9/84G09 u IgG1 formatu, je pokazalo veću maksimalnu lizu i takođe veću potenciju za lizu, sa procenjenim polovinama maksimalnih doza od oko polovine doze koja zahteva Rituksimab u IgG1 formatu. Ovo pokazuje da uvođenje mesta vezivanja LAG-3 u 84G09 antitelu nije promenilo njegovu aktivnost ciljanja PD-L1 u odnosu na potenciju ili maksimalni odgovor, kao što su oba veoma slična kada se uporede 84G09 i FS18-7-9/84G09. Uvođenje LALA mutacije je rezultovalo u smanjenom maksimalnom odgovoru za Rituksimab, 84G09 i FS18-7-9/84G09, međutim, potencija je bila smanjena samo za 84G09 i FS18-7-9/84G09. Kao što je očekivano, anti-LAG-3 antitelo 25F7 nije imalo efekta na ćelijsku vijabilnost Raji ćelija koje eksprimiraju PD-L1, s obzirom da ove ćelije nisu eksprimirale humani LAG-3. Ovi rezultati su prikazani na Slici 14A.

[0256] Raji ćelije koje eksprimiraju LAG-3 su ciljane za CDC sa anti-CD20 antitelom Rituksimabom, međutim, LAG- 3 antitelo 25F7 je pokazalo bolju potenciju sa uspostavljenom polovinom maksimalne doze od oko polovine koja je potrebna za Rituksimab. Nijedno od drugih antitela nije pokazalo bilo koju CDC aktivnost protiv Raji ćelija koje eksprimiraju LAG-3, uključujući FS18-7-9/84G09. Uvođenje LALA mutacije je imalo veoma ograničeni efekat na CDC aktivnost Rituksimaba (Slika 14B).

6.3.2 Diferencijalni CDC test

[0257] Diferencijalni CDC test, koji koristi protočnu citometriju, je razvijen od strane pronalazača da bi se napravila razlika koje cilje eksprimirajuće ćelije su lizirane kada su tretirane sa FS18-7-9/84G09 ili kontrolnim antitelima. Ovaj test je korišćen da se potvrde rezultati iz osnovnog gore opisanog CDC testa za oslobađanje LDH. U poređenju sa IgG izotipskim kontrolnim antitelom (4420), koji nije imao efekta na procent živih ćelija, Rituksimab je posredovao u smanjenju živih ćelija i povećanju mrtvih ćelija, ćelija koje eksprimiraju oba PD-L1 i LAG-3. Međutim, FS18-7-9/84G09 nije imao efekta na ćelije koje eksprimiraju LAG-3, ali je veoma efikasno lizirao ćelije koje eksprimiraju PD-L1. Slično tome, smeša LAG-3 specifičnog antitela 25F7 i PD-L1 antitela 84G09 je takođe pokazala dozno zavisno smanjenje u živim ćelijama i recipročno povećanje u mrtvim ćelijama, međutim, maksimalna liza ćelija koje eksprimiraju LAG-3 je bila samo preko 50% ćelija, ali je već dostignta na koncentraciji od 1 nM, najniža doza da bi se postigla maksimalna liza od svih ispitivanih antitela. Ovo potvrđuje prethodni nalaz da mesto vezivanja za LAG-3 u CH3 domenu FS18-7-9/84G09 nije indukovalo CDC posredovanu lizu ciljanih ćelija koje eksprimiraju LAG-3. Dodatno, ovaj eksperiment pokazuje da prisustvo ćelija koje eksprimiraju LAG-3 nije imalo efekta na aktivnost CDC FS18-7-9/84G09 prema ćelijama koje eksprimiraju PD-L1. Rezultati su prikazani na Slici 15.

6.3.3 ADCC test

[0258] Raji ćelije koje eksprimiraju PD-L1 su ciljane za ADCC sa anti-CD20 antitelom Rituksimabom, FS18-7-9/84G09, i 84G09 sa veoma sličnom efikasnosti i potencijom, što za rezultat ima maksimalnu lizu oko 40% ćelija. Rituksimab i 84G09 koji sadrže LALA mutaciju nisu pokazali ADCC-posredovanu lizu FS18-7-9/84G09 koji sadrži LALA mutaciju nije pokazao ili je pokazao veoma nisku ADCC-posredovanu lizu ciljnih ćelija koje eksprimiraju PD-L1. LAG-3 specifično antitelo 25F7 i izotipska kontrola 4420 sa i bez LALA mutacije nije pokazala aktivnost u ovom testu.

[0259] Ovi rezultati su pokazali da uvođenje mesta za vezivanje LAG-3 u antitelo 84G09 nije promenilo njegovu PD- L1 ciljanu ADCC aktivnost u potenciji ili maksimalnom odgovoru, s obzirom na to da su oba veoma slična sa PD-L1 specifičnim antitelom 84G09. Uvođenje LALA mutacije je kao rezultat imalo narušenu aktivnost ADCC (Slika 16A).

[0260] Raji ćelije koje eksprimiraju LAG-3 su ciljane sa Rituksimabom i 25F7 za ADCC-posredovanu lizu, što dovodi do maksimalne lize od oko 40%. FS18-7-9/84G09 je takođe posredovao lizi ćelija koje eksprimiraju LAG-3 sa ADCC, što je bilo u mnogo nižoj potenciji i efikasnosti, dostižući samo ispod 20% lize na koncentraciji od 2.5 nM. Uvođenje LALA mutacije je narušilo svu aktivnost ADCC Rituksimaba i FS18-7-9/84G09.84G09 i izotipska kontrola 4420 sa i bez LALA mutacije nije pokazala aktivnost ADCC u ovom testu kao što je bilo očekivano, kako se ova antitela nisu vezala za LAG-3 (Slika 16B).

Lista sekvenci

Aminokiselinske sekvence regiona petlje Fcat FS18-7-9

[0261]

FS18-7-9 AB petlja - WDEPWGED (SEQ ID NO: 1)

FS18-7-9 CD petlja - SNGQPENNY (SEQ ID NO: 2)

FS18-7-9 EF petlja - PYDRWVWPDE (SEQ ID NO: 3)

Nukleotidna sekvenca domena Fcat FS18-7-9 CH3 (SEQ ID NO: 4)

[0262]

CHO kodonom optimizovana nukleotidna sekvenca domena Fcat FS18-7-9 CH3 (SEQ ID NO: 142)

[0263]

Aminokiselinska sekvenca domena Fcat FS18-7-9 CH3 (SEQ ID NO: 5)

[0264]

Aminokiselinska sekvenca domena Fcat FS18-7-9 CH3 koja se sastoji iz C-terminalnog lizina (SEQ ID NO: 135)

[0265]

Aminokiselinska sekvenca domena Fcat FS18-7-9 CH2 i CH3, koja se sastoji iz LALA mutacije (podvučeno) (SEQ ID NO: 6)

[0266]

Aminokiselinska sekvenca domena Fcat FS18-7-9 CH2 i CH3 bez LALA mutacije (SEQ ID NO: 7)

[0267]

Aminokiselinske sekvence regiona petlje Fcat FS18-7-32

[0268]

FS18-7-32 AB petlja - WDEPWGED (SEQ ID NO: 1)

FS18-7-32 CD petlja - SNGQPENNY (SEQ ID NO: 8)

FS18-7-32 EF petlja - PYDRWVWPDE (SEQ ID NO: 3)

Nukleotidna sekvenca domena Fcat FS18-7-32 CH3 (SEQ ID NO: 9)

[0269]

Aminokiselinska sekvenca domena Fcat FS18-7-32 CH3 (SEQ ID NO: 10)

[0270]

Aminokiselinska sekvenca domena Fcat FS18-7-32 CH2 i CH3, koja se sastoji iz LALA mutacije (podvučeno) (SEQ ID NO: 11)

[0271]

Aminokiselinska sekvenca domena Fcat FS18-7-32 CH2 i CH3 bez LALA mutacije (SEQ ID NO: 12)

[0272]

Aminokiselinske sekvence regiona petlji Fcat FS18-7-33

[0273]

FS18-7-33 AB petlja - WDEPWGED (SEQ ID NO: 1)

FS18-7-33 CD petlja - SNGQPEDNY (SEQ ID NO: 13)

FS18-7-33 EF petlja - PYDRWVWPDE (SEQ ID NO: 3)

Nukleotidna sekvenca domena Fcat FS18-7-33 CH3 (SEQ ID NO: 14)

[0274]

Aminokiselinska sekvenca domena Fcat FS18-7-33 CH3 (SEQ ID NO: 15)

[0275]

Aminokiselinska sekvenca domena Fcat FS18-7-33 CH2 i CH3, koja se sastoji iz LALA mutacije (podvučeno) (SEQ ID NO: 16)

[0276]

Aminokiselinska sekvenca domena Fcat FS18-7-33 CH2 i CH3 bez LALA mutacije (SEQ ID NO: 17)

[0277]

Aminokiselinske sekvence regiona petlje Fcat FS18-7-36

[0278]

FS18-7-36 AB petlja - WDEPWGED (SEQ ID NO: 1)

FS18-7-36 CD petlja - SNGQPENNY (SEQ ID NO: 18)

FS18-7-36 EF petlja - PYDRWVWPDE (SEQ ID NO: 3)

Nukleotidna sekvenca domena Fcat FS18-7-36 CH3 (SEQ ID NO: 19)

[0279]

Aminokiselinska sekvenca domena Fcat FS18-7-36 CH3 (SEQ ID NO: 20)

[0280]

Aminokiselinska sekvenca domena CH2+CH3 Fcat FS18-7-36 CH2 i CH3, koja se sastoji iz LALA mutacije (podvučeno) (SEQ ID NO: 21)

[0281]

Aminokiselinska sekvenca domena Fcat FS18-7-36 CH2 i CH3 bez LALA mutacije (SEQ ID NO: 22)

[0282]

Aminokiselinske sekvence regiona petlje Fcat FS18-7-58

[0283]

FS18-7-58 AB petlja - WDEPWGED (SEQ ID NO: 1)

FS18-7-58 CD petlja - SNGYPEIEF (SEQ ID NO: 23)

FS18-7-58 EF petlja - PYDRWVWPDE (SEQ ID NO: 3)

Nukleotidna sekvenca domena Fcat FS18-7-58 CH3 (SEQ ID NO: 24)

[0284]

Aminokiselinska sekvenca domena Fcat FS18-7-58 CH3 (SEQ ID NO: 25)

[0285]

Aminokiselinska sekvenca domena Fcat FS18-7-58 CH2 i CH3, koji se sastoji iz LALA mutacije (podvučeno) (SEQ ID NO:26)

[0286]

Aminokiselinska sekvenca domena Fcat FS18-7-58 CH2 i CH3 bez LALA mutacije (SEQ ID NO: 27)

[0287]

Aminokiselinske sekvence regiona petlje Fcat FS18-7-62

[0288]

FS18-7-62 AB petlja - WDEPWGED (SEQ ID NO: 1)

FS18-7-62 CD petlja - SNGIPEWNY (SEQ ID NO: 28)

FS18-7-62 EF petlja - PYDRWVWPDE (SEQ ID NO: 3)

Nukleotidna sekvenca domena CH3 Fcab FS18-7-62 (SEQ ID NO: 29)

[0289]

1

Aminokiselinska sekvenca domena CH3 Fcat FS18-7-62 (SEQ ID NO: 30)

[0290]

Aminokiselinska sekvenca domena CH2 i CH3Fcat FS18-7-62, koja se sastoji iz LALA mutacije (podvučeno) (SEQ ID NO: 31)

[0291]

Aminokiselinska sekvenca domena CH2 i CH3 Fcat FS18-7-62 bez LALA mutacije (SEQ ID NO: 32)

[0292]

Aminokiselinske sekvence regiona petlje Fcat FS18-7-65

[0293]

FS18-7-65 AB petlja - WDEPWGED (SEQ ID NO: 1)

FS18-7-65 CD petlja - SNGYAEYNY (SEQ ID NO: 33)

FS18-7-65 EF petlja - PYDRWVWPDE (SEQ ID NO: 3)

Nukleotidna sekvenca domena CH3 Fcat FS18-7-65 (SEQ ID NO: 34)

[0294]

Aminokiselinska sekvenca domena CH3 Fcat FS18-7-65 (SEQ ID NO: 35)

[0295]

2

Aminokiselinska sekvenca domena CH2 i CH3 Fcat FS18-7-65, koja se sastoji iz LALA mutacije (podvučeno) (SEQ ID NO: 36)

[0296]

Aminokiselinska sekvenca domena CH2 i CH3 Fcat FS18-7-65 bez LALA mutacije (SEQ ID NO: 37)

[0297]

Aminokiselinske sekvence regiona petlje Fcat FS18-7-78

[0298]

FS18-7-78 AB petlja - WDEPWGED (SEQ ID NO: 1)

FS18-7-78 CD petlja - SNGYKEENY (SEQ ID NO: 38)

FS18-7-78 EF petlja - PYDRWVWPDE (SEQ ID NO: 3)

Nukleotidna sekvenca domena CH3 Fcat FS18-7-78 (SEQ ID NO: 39)

[0299]

Aminokiselinska sekvenca domena CH3 Fcat FS18-7-78 (SEQ ID NO: 40)

[0300]

Aminokiselinska sekvenca domena CH2 i CH3Fcat FS18-7-78, koja se sastoji iz LALA mutacije (podvučeno) (SEQ ID NO: 41)

Aminokiselinska sekvenca domena Fcat FS18-7-78 CH2 i CH3 bez LALA mutacije (SEQ ID NO: 42)

[0302]

Aminokiselinske sekvence regiona petlje Fcat FS18-7-88

[0303]

FS18-7-88 AB petlja - WDEPWGED (SEQ ID NO: 1)

FS18-7-88 CD petlja - SNGVPELNV (SEQ ID NO: 43)

FS18-7-88 EF petlja - PYDRWVWPDE (SEQ ID NO: 3)

Nukleotidna sekvenca domena Fcat FS18-7-88 CH3 (SEQ ID NO: 44)

[0304]

Aminokiselinska sekvenca domena Fcat FS18-7-88 CH3 (SEQ ID NO: 45)

[0305]

Aminokiselinska sekvenca domena Fcat FS18-7-88 CH2 i CH3, koja se sastoji iz LALA mutacije (podvučeno) (SEQ ID NO: 46)

[0306]

4

Aminokiselinska sekvenca domena Fcat FS18-7-88 CH2 i CH3 bez LALA mutacije (SEQ ID NO: 47)

[0307]

Aminokiselinske sekvence regiona petlje Fcat FS18-7-95

[0308]

FS18-7-95 AB petlja - WDEPWGED (SEQ ID NO: 1)

FS18-7-95 CD petlja - SNGYQEDNY (SEQ ID NO: 48)

FS18-7-95 EF petlja - PYDRWVWPDE (SEQ ID NO: 3)

Nukleotidna sekvenca domena Fcat FS18-7-95 CH3 (SEQ ID NO: 49)

[0309]

Aminokiselinska sekvenca domena Fcat FS18-7-95 CH3 (SEQ ID NO: 50)

[0310]

Aminokiselinska sekvenca domena Fcat FS18-7-95 CH2 i CH3, koja se sastoji iz LALA mutacije (podvučeno) (SEQ ID NO: 51)

[0311]

Aminokiselinska sekvenca domena Fcat FS18-7-95 CH2 i CH3 bez LALA mutacije (SEQ ID NO: 52)

[0312]

Aminokiselinska sekvenca CH2 domena humanog IgG1 divljeg tipa (SEQ ID NO: 53)

[0313]

Aminokiselinska sekvenca CH2 domena humanog IgG1 koja se sastoji iz "LALA mutacije" (podvučeno) (SEQ ID NO: 54)

[0314]

Aminokiselinska sekvenca domena "divljeg tipa" Fcat CH2 i CH3 bez LALA mutacije (SEQ ID NO: 55).

[0315]

Aminokiselinska sekvenca "divljeg tipa" domena CH2 i CH3 Fcat, koja se sastoji iz LALA mutacije (podvučeno) (SEQ ID NO: 56)

[0316]

Aminokiselinska sekvenca regiona zgloba humanog IgG1 (SEQ ID NO: 57)

[0317] EPKSCDKTHTCPPCP

Aminokiselinska sekvenca prekinutog regiona zgloba humanog IgG1 (SEQ ID NO: 58)

[0318] TCPPCP

Aminokiselinska sekvenca anti-mišjeg LAG-3 Fcat FS18-7-108-29, koji se sastoji iz LALA mutacije (podvučeno) (SEQ ID NO: 59)

[0319] CH3 domen je prikazan iskošenim slovima. AB, CD i EF petlje CH3 domena su prikazane tamnim slovima i podvučene su.

Aminokiselinska sekvenca anti-mišjeg LAG-3 Fcat FS18-7-108-29 bez LALA mutacije (SEQ ID NO: 60)

[0320] CH3 domen je prikazan iskošenim slovima. AB, CD i EF petlje CH3 domena su prikazane tamnim slovima i podvučene su.

Aminokiselinska sekvenca anti-mišjeg LAG-3 Fcat FS18-7-108-35, koji se sastoji iz LALA mutacije (podvučeno) (SEQ ID NO: 61)

[0321] CH3 domen je prikazan iskošenim slovima. AB, CD i EF regioni petlje su prikazani tamnim slovima i podvučeni su.

Aminokiselinska sekvenca anti-mišjeg LAG-3 Fcat FS18-7-108-35 bez LALA mutacije (SEQ ID NO: 62)

[0322] CH3 domen je prikazan iskošenim slovima. AB, CD i EF regioni petlje su prikazani tamnim slovima i podvučeni su.

Aminokiselinska sekvenca teškog lanca anti-humanog LAG-3/FITC mAt<2>FS18-7-9/4420 sastoji se iz LALA mutacije (SEQ ID NO: 63)

[0323] Pozicija CDR-a je podvučena, i sekvence petlji AB, CD, i EF su prikazane tamnim slovima i podvučene su. Pozicija LALA mutacije je prikazana masnim slovima.

Aminokiselinska sekvenca teškog lanca anti-humanog LAG-3/FITC mAt<2>FS18-7-9/4420 bez LALA mutacije (SEQ ID NO: 64)

[0324] Pozicija CDR-a je podvučena, i sekvence petlji AB, CD, i EF su prikazane tamnim slovima i podvučene su.

Aminokiselinska sekvenca teškog lanca anti-humanog LAG-3/FITC mAt<2>FS18-7-32/4420 koja se sastoji iz LALA mutacije (SEQ ID NO: 65)

[0325] Pozicija CDR-a je podvučena, i sekvence petlji AB, CD, i EF su prikazane tamnim slovima i podvučene su. Pozicija LALA mutacije je prikazana tamnim slovima.

Aminokiselinska sekvenca teškog lanca anti-humanog LAG-3/FITC mAt<2>FS18-7-32/bez LALA mutacije (SEQ ID NO: 66)

[0326] Pozicija CDR-a je podvučena, i sekvence petlji AB, CD, i EF su prikazane tamnim slovima i podvučene su.

Aminokiselinska sekvenca teškog lanca anti-humanog LAG-3/FITC mAt<2>FS18-7-33/4420 koji se sastoji iz LALA mutacije (SEQ ID NO: 67)

[0327] Pozicija CDR-a je podvučena, i sekvence petlji AB, CD, i EF su prikazane tamnim slovima i podvučene su. Pozicija LALA mutacije je prikazana tamnim slovima.

Aminokiselinska sekvenca teškog lanca anti-humanog LAG-3/FITC mAt<2>FS18-7-33/4420 bez LALA mutacije (SEQ ID NO: 68)

[0328] Pozicija CDR-a je podvučena, i sekvence petlji AB, CD, i EF su prikazane tamnim slovima i podvučene su.

Aminokiselinska sekvenca teškog lanca anti-humanog LAG-3/FITC mAt<2>FS18-7-36/4420 koja se sastoji iz LALA mutacije (SEQ ID NO: 69)

[0329] Pozicija CDR-a je podvučena, i sekvence petlji AB, CD, i EF su prikazane tamnim slovima i podvučene su. Pozicija LALA mutacije je prikazana tamnim slovima.

Aminokiselinska sekvenca teškog lanca anti-humanog LAG-3/FITC mAt<2>FS18-7-36/4420 bez LALA mutacije (SEQ ID NO: 70)

[0330] Pozicija CDR-a je podvučena, i sekvence petlji AB, CD, i EF su prikazane tamnim slovima i podvučene su.

Aminokiselinska sekvenca teškog lanca anti-humanog LAG-3/FITC mAt<2>FS18-7-58/4420 koja se sastoji iz LALA mutacije (SEQ ID NO: 71)

[0331] Pozicija CDR-a je podvučena, i sekvence petlji AB, CD, i EF su prikazane tamnim slovima i podvučene su. Pozicija LALA mutacije je prikazana tamnim slovima.

Aminokiselinska sekvenca teškog lanca anti-humanog LAG-3/FITC mAt<2>FS18-7-58/4420 bez LALA mutacije (SEQ ID NO: 72)

[0332] Pozicija CDR-a je podvučena, i sekvence petlje AB, CD, i EF su prikazane tamnim slovima i podvučene su.

Aminokiselinska sekvenca teškog lanca anti-humanog LAG-3/FITC mAt<2>FS18-7-62/4420 koja se sastoji iz LALA mutacije (SEQ ID NO: 73)

[0333] Pozicija CDR-a je podvučena, i sekvence petlji AB, CD, i EF su prikazane tamnim slovima i podvučene su. Pozicija LALA mutacije je prikazana tamnim slovima.

Aminokiselinska sekvenca teškog lanca anti-humanog LAG-3/FITC mAt<2>FS18-7-62/4420 bez LALA mutacije (SEQ ID NO: 74)

[0334] Pozicija CDR-a je podvučena, i sekvence petlji AB, CD, i EF su prikazane tamnim slovima i podvučene su.

Aminokiselinska sekvenca teškog lanca anti-humanog LAG-3/FITC mAt<2>FS18-7-65/4420 koja se sastoji iz LALA mutacije (SEQ ID NO: 75)

[0335] Pozicija CDR-a je podvučena, i sekvence petlji AB, CD, i EF su prikazane tamnim slovima i podvučene su. Pozicija LALA mutacije je prikazana tamnim slovima.

1

Aminokiselinska sekvenca teškog lanca anti-humanog LAG-3/FITC mAt<2>FS18-7-65/4420 bez LALA mutacije (SEQ ID NO: 76)

[0336] Pozicija CDR-a je podvučena, i sekvence petlji AB, CD, i EF su prikazane tamnim slovima i podvučene su.

Aminokiselinska sekvenca teškog lanca anti-humanog LAG-3/FITC mAt<2>FS18-7-78/4420 koja se sastoji iz LALA mutacije (SEQ ID NO: 77)

[0337] Pozicija CDR-a je podvučena, i sekvence petlji AB, CD, i EF su prikazane tamnim slovima i podvučene su. Pozicija LALA mutacije je prikazana tamnim slovima.

Aminokiselinska sekvenca teškog lanca anti-humanog LAG-3/FITC mAt<2>FS18-7-78/4420 bez LALA mutacije (SEQ ID NO: 78)

[0338] Pozicija CDR-a je podvučena, i sekvence petlji AB, CD, i EF su prikazane tamnim slovima i podvučene su.

2

Aminokiselinska sekvenca teškog lanca anti-humanog LAG-3/FITC mAt<2>FS18-7-88/4420 koja se sastoji iz LALA mutacije (SEQ ID NO: 79)

[0339] Pozicija CDR-a je podvučena, i sekvence petlji AB, CD, i EF su prikazane tamnim slovima i podvučene su. Pozicija LALA mutacije je prikazana tamnim slovima.

Aminokiselinska sekvenca teškog lanca anti-humanog LAG-3/FITC mAt<2>FS18-7-88/4420 bez LALA mutacije (SEQ ID NO: 80)

[0340] Pozicija CDR-a je podvučena, i sekvence petlji AB, CD, i EF su prikazane tamnim slovima i podvučene su.

Aminokiselinska sekvenca teškog lanca anti-humanog LAG-3/FITC mAt<2>FS18-7-95/4420 koja se sastoji iz LALA mutacije (SEQ ID NO: 81)

[0341] Pozicija CDR-a je podvučena, i sekvence petlji AB, CD, i EF su prikazane tamnim slovima i podvučene su. Pozicija LALA mutacije je prikazana tamnim slovima.

Aminokiselinska sekvenca teškog lanca anti-humanog LAG-3/FITC mAt<2>FS18-7-95/4420 bez LALA mutacije (SEQ ID NO: 82)

[0342] Pozicija CDR-a je podvučena, i sekvence petlji AB, CD, i EF su prikazane tamnim slovima i podvučene su.

Aminokiselinska sekvenca teškog lanca anti-FITC mAt 4420 koja se sastoji iz LALA mutacije (SEQ ID NO: 83)

[0343] Pozicija CDR-a je podvučena. Pozicija LALA mutacije je prikazana masnim slovima.

Aminokiselinska sekvenca teškog lanca anti-FITC mAt 4420 bez LALA mutacije (SEQ ID NO: 84)

[0344] Pozicija CDR-a je podvučena.

4

Aminokiselinska sekvenca anti-FITC mAt 4420 laki lanac (SEQ ID NO: 85)

[0345] Pozicija CDR-a je podvučena.

Aminokiselinske sekvence CDR-a anti-PD-L1 antitela 84G09 (prema IMGT)

[0346]

HCDR1 GFTFDDYA (SEQ ID NO: 86)

HCDR2 ISWKSNII (SEQ ID NO: 87)

HCDR3 ARDITGSGSYGWFDP (SEQ ID NO: 88)

LCDR1 QSISSY (SEQ ID NO: 89)

LCDR2 VAS (SEQ ID NO: 90)

LCDR3 QQSYSNPIT (SEQ ID NO: 91)

Aminokiselinske sekvence CDR-a anti-PD-L1 antitela 84G09 (prema Kabat-u)

[0347]

HCDR1 DYAMH (SEQ ID NO: 136)

HCDR2 GISWKSNIIGYADSVKG (SEQ ID NO: 137)

HCDR3 DITGSGSYGWFDP (SEQ ID NO: 138)

LCDR1 RASQSISSYLN (SEQ ID NO: 139)

LCDR2 VASSLQS (SEQ ID NO: 140)

LCDR3 QQSYSNPIT (SEQ ID NO: 141)

Aminokiselinska sekvenca anti-PD-L1 antitela 84G09 VH domen (SEQ ID NO: 92)

[0348]

Aminokiselinska sekvenca anti-PD-L1 antitela 84G09 VL domen (SEQ ID NO: 93)

[0349]

Aminokiselinska sekvenca anti-humanog LAG-3/PD-L1 mAt<2>FS18-7-9/84G09 sa LALA mutacijom teškog lanca (SEQ ID NO: 94)

[0350] Pozicija CDR-a je podvučena, i sekvence petlji AB, CD, i EF su prikazane tamnim slovima i podvučene su. Pozicija LALA mutacije je prikazana tamnim slovima.

Aminokiselinska sekvenca anti-humanog LAG-3/PD-L1 mAt<2>FS18-7-9/84G09 težak lanac (SEQ ID NO: 95)

[0351] Pozicija CDR-a je podvučena, i sekvence petlji AB, CD, i EF su prikazane tamnim slovima i podvučene su.

Aminokiselinska sekvenca anti-humanog LAG-3/PD-L1 mAt<2>FS18-7-32/84G09 sa LALA mutacijom teškog lanca (SEQ ID NO: 96)

[0352] Pozicija CDR-a je podvučena, i sekvence petlji AB, CD, i EF su prikazane tamnim slovima i podvučene su. Pozicija LALA mutacije je prikazana tamnim slovima.

Aminokiselinska sekvenca anti-humanog LAG-3/PD-L1 mAt<2>FS18-7-32/84G09 težak lanac (SEQ ID NO: 97)

[0353] Pozicija CDR-a je podvučena, i sekvence petlji AB, CD, i EF su prikazane tamnim slovima i podvučene su.

Aminokiselinska sekvenca anti-humanog LAG-3/PD-L1 mAt<2>FS18-7-33/84G09 sa LALA mutacijom teškog lanca (SEQ ID NO: 98)

[0354] Pozicija CDR-a je podvučena, i sekvence petlji AB, CD, i EF su prikazane tamnim slovima i podvučene su. Pozicija LALA mutacije je prikazana tamnim slovima.

Aminokiselinska sekvenca anti-humanog LAG-3/PD-L1 mAt<2>FS18-7-33/84G09 težak lanac (SEQ ID NO: 99)

[0355] Pozicija CDR-a je podvučena, i sekvence petlji AB, CD, i EF su prikazane tamnim slovima i podvučene su.

Aminokiselinska sekvenca anti-humanog LAG-3/PD-L1 mAt<2>FS18-7-36/84G09 sa LALA mutacijom teškog lanca (SEQ ID NO: 100)

[0356] Pozicija CDR-a je podvučena, i sekvence petlji AB, CD, i EF su prikazane tamnim slovima i podvučene su. Pozicija LALA mutacije je prikazana tamnim slovima.

Aminokiselinska sekvenca anti-humanog LAG-3/PD-L1 mAt<2>FS18-7-36/84G09 težak lanac (SEQ ID NO: 101)

[0357] Pozicija CDR-a je podvučena, i sekvence petlji AB, CD, i EF su prikazane tamnim slovima i podvučene su.

Aminokiselinska sekvenca anti-humanog LAG-3/PD-L1 mAt<2>FS18-7-58/84G09 sa LALA mutacijom teškog lanca (SEQ ID NO: 102)

[0358] Pozicija CDR-a je podvučena, i sekvence petlji AB, CD, i EF su prikazane tamnim slovima i podvučene su. Pozicija LALA mutacije je prikazana tamnim slovima.

Aminokiselinska sekvenca anti-humanog LAG-3/PD-L1 mAt<2>FS18-7-58/84G09 težak lanac (SEQ ID NO: 103)

[0359] Pozicija CDR-a je podvučena, i sekvence petlji AB, CD, i EF su prikazane tamnim slovima i podvučene su.

Aminokiselinska sekvenca anti-humanog LAG-3/PD-L1 mAt<2>FS18-7-62/84G09 sa LALA mutacijom teškog lanca (SEQ ID NO: 104)

[0360] Pozicija CDR-a je podvučena, i sekvence petlji AB, CD, i EF su prikazane tamnim slovima i podvučene su. Pozicija LALA mutacije je prikazana tamnim slovima.

Aminokiselinska sekvenca anti-humanog LAG-3/PD-L1 mAt<2>FS18-7-62/84G09 težak lanac (SEQ ID NO: 105)

[0361] Pozicija CDR-a je podvučena, i sekvence petlji AB, CD, i EF su prikazane tamnim slovima i podvučene su.

Aminokiselinska sekvenca anti-humanog LAG-3/PD-L1 mAt<2>FS18-7-65/84G09 sa LALA mutacijom teškog lanca (SEQ ID NO: 106)

[0362] Pozicija CDR-a je podvučena, i sekvence petlji AB, CD, i EF su prikazane tamnim slovima i podvučene su. Pozicija LALA mutacije je prikazana tamnim slovima.

Aminokiselinska sekvenca anti-humanog LAG-3/PD-L1 mAt<2>FS18-7-65/84G09 težak lanac (SEQ ID NO: 107)

[0363] Pozicija CDR-a je podvučena, i sekvence petlji AB, CD, i EF su prikazane tamnim slovima i podvučene su.

Aminokiselinska sekvenca anti-humanog LAG-3/PD-L1 mAt<2>FS18-7-78/84G09 sa LALA mutacijom teškog lanca (SEQ ID NO: 108)

[0364] Pozicija CDR-a je podvučena, i sekvence petlji AB, CD, i EF su prikazane tamnim slovima i podvučene su. Pozicija LALA mutacije je prikazana tamnim slovima.

Aminokiselinska sekvenca anti-humanog LAG-3/PD-L1 mAt<2>FS18-7-78/84G09 težak lanac (SEQ ID NO: 109)

[0365] Pozicija CDR-a je podvučena, i sekvence petlji AB, CD, i EF su prikazane tamnim slovima i podvučene su.

Aminokiselinska sekvenca anti-humanog LAG-3/PD-L1 mAt<2>FS18-7-88/84G09 sa LALA mutacijom teškog lanca (SEQ ID NO: 110)

[0366] Pozicija CDR-a je podvučena, sekvence petlji AB, CD, i EF su prikazane tamnim slovima i podvučene su. Pozicija LALA mutacije je prikazana tamnim slovima.

Aminokiselinska sekvenca anti-humanog LAG-3/PD-L1 mAt<2>FS18-7-88/84G09 težak lanac (SEQ ID NO: 111)

[0367] Pozicija CDR-a je podvučena, i sekvence petlji AB, CD, i EF su prikazane tamnim slovima i podvučene su.

Aminokiselinska sekvenca anti-humanog LAG-3/PD-L1 mAt<2>FS18-7-95/84G09 sa LALA mutacijom teškog lanca (SEQ ID NO: 112)

[0368] Pozicija CDR-a je podvučena, i sekvence petlji AB, CD, i EF su prikazane tamnim slovima i podvučene su. Pozicija LALA mutacije je prikazana tamnim slovima.

1

Aminokiselinska sekvenca anti-humanog LAG-3/PD-L1 mAt<2>FS18-7-95/84G09 težak lanac (SEQ ID NO: 113)

[0369] Pozicija CDR-a je podvučena, i sekvence petlji AB, CD, i EF su prikazane tamnim slovima i podvučene su. Pozicija LALA mutacije je prikazana tamnim slovima.

Aminokiselinska sekvenca anti-humanog PD-L1 mAt 84G09 sa LALA teškim lancem (SEQ ID NO: 114)

[0370] Pozicija CDR-a je podvučena. Pozicija LALA mutacije je prikazana tamnim slovima.

Aminokiselinska sekvenca anti-humanog PD-L1 mAt 84G09 težak lanac (SEQ ID NO: 115)

[0371] Pozicija CDR-a je podvučena.

2

Aminokiselinska sekvenca anti-humanog PD-L1 mAt 84G09 laki lanac (SEQ ID NO:116)

[0372] Pozicija CDR-a je podvučena.

Aminokiselinska sekvenca anti-mišjeg LAG-3/PD-L1 mAt<2>FS18-7-108-29/S1 sa LALA mutacijom teškog lanca (SEQ ID NO: 117)

[0373] Pozicija CDR-a je podvučena, i sekvence petlji AB, CD, i EF su prikazane tamnim slovima i podvučene su. Pozicija LALA mutacije je prikazana tamnim slovima.

Aminokiselinska sekvenca anti-mišjeg LAG-3/PD-L1 mAt<2>FS18-7-108-29/S1 težak lanac (SEQ ID NO:118)

[0374] Pozicija CDR-a je podvučena, i sekvence petlji AB, CD, i EF su prikazane tamnim slovima i podvučene su.

Aminokiselinska sekvenca anti-mišjeg PD-L1 mAt S1 laki lanac (SEQ ID NO:119)

[0375] Pozicija CDR-a je podvučena.

Aminokiselinska sekvenca anti-mišjeg LAG-3/PD-L1 mAt<2>FS18-7-108-35/S1 sa LALA mutacijom teškog lanca (SEQ ID NO:120)

[0376] Pozicija CDR-a je podvučena, i sekvence petlji AB, CD, i EF su prikazane tamnim slovima i podvučene su. Pozicija LALA mutacije je prikazana tamnim slovima.

Aminokiselinska sekvenca anti-mišjeg LAG-3/PD-L1 mAt<2>FS18-7-108-35/S1 težak lanac (SEQ ID NO:121)

[0377] Pozicija CDR-a je podvučena, i sekvence petlji AB, CD, i EF su prikazane tamnim slovima i podvučene su.

Aminokiselinska sekvenca kontrolnog PD-L1 mAt S1 sa LALA mutacijom teškog lanca (SEQ ID NO:122)

[0378] Pozicija CDR-a je podvučena. Pozicija LALA mutacije je prikazana tamnim slovima.

Aminokiselinska sekvenca kontrolnog PD-L1 mAt S1 težak lanac (SEQ ID NO:123)

[0379] Pozicija CDR-a je podvučena. Pozicija LALA mutacije je prikazana tamnim slovima.

4

Aminokiselinska sekvenca kontrolnog anti-humanog LAG-3 mAt 25F7 težak lanac (SEQ ID NO:124)

[0380] Pozicija CDR-a je podvučena.

Aminokiselinska sekvenca kontrolnog anti-humanog LAG-3 mAt 25F7 laki lanac (SEQ ID NO:125)

[0381] Pozicija CDR-a je podvučena.

Aminokiselinska sekvenca humanog LAG-3 (SEQ ID NO: 126)

[0382]

Aminokiselinska sekvenca mišjeg LAG-3 (SEQ ID NO: 127)

Aminokiselinska sekvenca LAG-3 cinomolgusa (SEQ ID NO: 128)

[0384]

Aminokiselinska sekvenca humanog PD-L1 (SEQ ID NO: 129)

[0385]

Aminokiselinska sekvenca mišjeg PD-L1 (SEQ ID NO: 130)

[0386]

Aminokiselinska sekvenca PD-L1 cinomolgusa (SEQ ID NO: 131)

[0387]

Aminokiselinska sekvenca teškog lanca anti-mišjeg LAG-3/FITC mAt<2>FS18-7-108-29/4420 koja se sastoji iz LALA mutacije (SEQ ID NO: 132)

[0388] Pozicija CDR-a je podvučena, i sekvence petlji AB, CD, i EF su prikazane tamnim slovima i podvučene su. Pozicija LALA mutacije je prikazana tamnim slovima.

Aminokiselinska sekvenca teškog lanca anti-mišjeg LAG-3/FITC mAt<2>FS18-7-108-35/4420 koja se sastoji iz LALA mutacije (SEQ ID NO: 133)

[0389] Pozicija CDR-a je podvučena, i sekvence petlji AB, CD, i EF su prikazane tamnim slovima i podvučene su. Pozicija LALA mutacije je prikazana tamnim slovima.

Aminokiselinska sekvenca teškog lanca anti-mišjeg LAG-3/FITC mAt<2>FS18-7-108-29/4420 (SEQ ID NO: 134)

[0390] Pozicija CDR-a je podvučena, i sekvence petlji AB, CD, i EF su prikazane tamnim slovima i podvučene su.

Reference

[0391]

Bae J, Lee SJ, Park CG, Lee YS, Chun T. Trafficking of LAG-3 to the surface on activated T cells via its cytoplasmic domain and protein kinase C signaling. J Immunol.193(6),3101-12 (2014).

Baecher-Allan C, Wolf E, Hafler DA. MHC class II expression identifies functionally distinct human regulatory T cells. J Immunol.176(8),4622-31 (2006).

Camisaschi C, Casati C, Rini F, Perego M, De Filippo A, Triebel F, Parmiani G, Belli F, Rivoltini L, Castelli C. LAG- 3 expression defines a subset of CD4(+)CD25(high)Foxp3(+) regulatory T cells that are expanded at tumor sites. J Immunol.184(11),6545-51 (2010).

Curran MA, Montalvo W, Yagita H, Allison JP. PD-1 and CTLA-4 combination blockade expands infiltrating T cells and reduces regulatory T and myeloid cells within B16 melanoma tumors. Proc Natl Acad Sci U S A.107(9),4275-80 (2010).

Demeure, C. E., Wolfers, J., Martin-Garcia, N., Gaulard, P. & Triebel, F. T Lymphocytes infiltrating various tumour types express the MHC class II ligand lymphocyte activation gene-3 (LAG-3): role of LAG-3/MHC class II interactions in cell-cell contacts. European journal of cancer 37, 1709-1718 (2001). Durham NM, Nirschl CJ, Jackson CM, Elias J, Kochel CM, Anders RA, Drake CG. Lymphocyte Activation Gene 3 (LAG-3) modulates the ability of CD4 T cells to be suppressed in vivo. PLoS One.9(11), e109080 (2015).

Engels B, Engelhard VH, Sidney J, Sette A, Binder DC, Liu RB, Kranz DM, Meredith SC, Rowley DA, Schreiber H. Relapse or eradication of cancer is predicted by peptide-major histocompatibility complex affinity. Cancer Cell.23(4),516-26 (2013).

Gandhi MK, Lambley E, Duraiswamy J, Dua U, Smith C, Elliott S, Gill D, Marlton P, Seymour J, Khanna R. Expression of LAG-3 by tumor-infiltrating lymphocytes is coincident with the suppression of latent membrane antigen-specific CD8+ T cell function in Hodgkin lymphoma patients. Blood 108(7),2280-9 (2006).

Grosso J, Inzunza D, Wu Q, et al. Programmed death-ligand 1 (PD-L1) expression in various tumor types. Journal for Immunotherapy of Cancer.1 (Suppl 1):P53. (2013).

Herbst RS, Soria JC, Kowanetz M, Fine GD, Hamid O, Gordon MS, Sosman JA, McDermott DF, Powderly JD, Gettinger SN, Kohrt HE, Horn L, Lawrence DP, Rost S, Leabman M, Xiao Y, Mokatrin A, Koeppen H, Hegde PS, Mellman I, Chen DS, Hodi FS. Predictive correlates of response to the anti-PD-L1 antibody MPDL3280A in cancer patients. Nature 515(7528),563-7 (2014).

Huard B, Mastrangeli R, Prigent P,et al. Characterization of the major histocompatibility complex class II binding site on LAG-3 protein. Proc Natl Acad Sci USA 94,5744-9 (1997).

Iwai Y, Ishida M, Tanaka Y, Okazaki T, Honjo T, Minato N. Involvement of PD-L1 on tumor cells in the escape from host immune system and tumor immunotherapy by PD-L1 blockade. Proc Natl Acad Sci U S A.99(19),12293-7.

Jing W, Gershan JA, Weber J, Tlomak D, McOlash L, Sabatos-Peyton C, Johnson BD1. Combined immune check- point protein blockade and low dose whole body irradiation as immunotherapy for myeloma. J Immunother Cancer.3(1):2 (2015).

Kabat, E.A. et al., In: Sequences of Proteins of Immunological Interest. NIH Publication, 91-3242 (1991). Larkin J, Hodi FS, Wolchok JD. Combined Nivolumab and Ipilimumab or Monotherapy in Untreated Melanoma. N Engl J Med.373(13),1270-1 (2015).

Huard B, Mastrangeli R, Prigent P,et al. Characterization of the major histocompatibility complex class II binding site on LAG-3 protein. Proc Natl Acad Sci USA 94,5744-9 (1997).

Powles T, Eder JP, Fine GD, Braiteh FS, Loriot Y, Cruz C, Bellmunt J, Burris HA, Petrylak DP, Teng SL, Shen X, Boyd Z, Hegde PS,Chen DS, Vogelzang NJ. MPDL3280A (anti-PD-L1) treatment leads to clinical activity in metastatic bladder cancer. Nature.515(7528),558-62 (2014).

Sega EI, Leveson-Gower DB, Florek M, Schneidawind D, Luong RH, Negrin RS. Role of lymphocyte activation gene-3 (Lag-3) in conventional and regulatory T cell function in allogeneic transplantation.PLoS One.9(1), e86551 (2014).

Wolchok J et al; Nivolumab plus ipilimumab in advanced melanoma. N Engl J Med. 369(2),122-33 (2013).

Woo SR, Turnis ME, Goldberg MV, Bankoti J, Selby M, Nirschl CJ, Bettini ML, Gravano DM, Vogel P, Liu CL, Tangsombatvisit S, Grosso JF, Netto G, Smeltzer MP, Chaux A, Utz PJ, Workman CJ, Pardoll DM, Korman AJ, Drake CG, Vignali DA. Immune inhibitory molecules LAG-3 and PD-1 synergistically regulate T cell function to promote tumoral immune escape. Cancer Res.72(4),917-2 (2012).

Workman CJ, Vignali DA. Negative regulation of T cell homeostasis by lymphocyte activation gene-3 (CD223). J Immunol.2005 Jan 15;174(2):688-95.

Workman CJ, Vignali DA. The CD4-related molecule, LAG-3 (CD223), regulates the expansion of activated T cells. Eur J Immunol.2003 Apr;33(4):970-9.

Claims (16)

Patentni zahtevi

1. Molekul antitela koji se vezuje za ligand 1 programirane smrti (PD-L1) i limfocitni aktivirajući gen 3 (LAG-3), pri čemu se molekul antitela sastoji iz:

(i) regiona za određivanje komplementarnosti (CDR)-zasnovanog antigen vezujućeg mesta za PD-L1 koji se sastoji iz CDR-a predstavljenih u SEQ ID NOs 86 do 91; i

(ii) LAG-3 antigen vezujućeg mesta koje se nalazi u CH3 domenu molekula antitela, gde LAG-3 mesto vezivanja sadrži aminokiselinske sekvence WDEPWGED (SEQ ID NO: 1) i PYDRWVWPDE (SEQ ID NO: 3), i gde je aminokiselinska sekvenca WDEPWGED locirana u AB petlji CH3 domena i aminokiselinska sekvenca PYDRWVWPDE je locirana u EF petlji CH3 domena.

2. Molekul antitela prema zahtevu 1, pri čemu LAG-3 antigen vezujuće mesto dalje sadrži jednu od sledećih sekvenci u CD petlji CH3 domena:

(i) SNGQPENNY (SEQ ID NOS 2, 8 i 18);

(ii) SNGQPEDNY (SEQ ID NO: 13);

(iii) SNGYPEIEF (SEQ ID NO: 23);

(iv) SNGIPEWNY (SEQ ID NO: 28);

(v) SNGYAEYNY (SEQ ID NO: 33);

(vi) SNGYKEENY (SEQ ID NO: 38);

(vii) SNGVPELNV (SEQ ID NO: 43); ili

(viii) SNGYQEDNY (SEQ ID NO: 48);

poželjno gde LAG-3 antigen vezujuće mesto sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu u SEQ ID NO: 2, 28, ili 38,

poželjno gde LAG-3 antigen vezujuće mesto sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu u SEQ ID NO: 2.

3. Molekul antitela prema zahtevu 1 ili 2, pri čemu je molekul antitela imunoglobulin G (IgG) molekul, poželjno IgG1, IgG2, IgG3, ili IgG4 molekul, poželjno IgG1 molekul.

4. Molekul antitela prema bilo kom od zahteva 1 do 3, gde molekul antitela sadrži CH3 domen predstavljen u SEQ ID NO: 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, ili 50, poželjno SEQ ID NO: 5, 30, ili 40, poželjno SEQ ID NO: 5.

5. Molekul antitela prema bilo kom od zahteva 1 do 4, gde molekul antitela sadrži CH2 domen i CH2 domen ima sekvencu predstavljenu u SEQ ID NO: 53 ili SEQ ID NO: 54.

6. Molekul antitela prema bilo kom od zahteva 1 do 5, gde molekul antitela sadrži sekvencu predstavljenu u SEQ ID NO: 6, 7, 11, 12, 16, 17, 21, 22, 26, 27, 31, 32, 36, 37, 41, 42, 46, 47, 51, ili 52, poželjno SEQ ID NO: 6, 7, 31, 32, 41, ili 42, poželjno SEQ ID NO: 6 ili 7.

7. Molekul antitela prema bilo kom od zahteva 1 do 6, gde molekul antitela sadrži VH i/ili VL domene predstavljene u SEQ ID NOs 92 i 93.

8. Molekul antitela prema bilo kom od zahteva 1-7, gde molekul antitela sadrži sekvencu teškog lanca predstavljenu u bilo kojoj od SEQ ID NOs: 94 do 113, poželjno SEQ ID NO: 94, 95, 104, 105, 108, ili 109, poželjno SEQ ID NO: 94 ili 95.

9. Molekul antitela prema zahtevu 7 ili 8, gde molekul antitela sadrži sekvencu lakog lanca predstavljenu u SEQ ID NO: 116.

10. Molekul antitela prema zahtevu 9, gde molekul antitela sadrži sekvencu teškog lanca predstavljenu u SEQ ID NO: 94 i sekvencu lakog lanca predstavljenu u SEQ ID NO: 116.

11. Molekul antitela prema bilo kom od zahteva 1 do 10, gde je molekul antitela konjugovan sa modulatorom imunog sistema, citotoksičnim molekulom, radioizotopom, ili detektabilnim obeleživačem, po potrebi gde modulator imunog sistema ili citotoksičan molekul je citokin.

12. Nukleinska kiselina koja kodira molekul antitela prema bilo kom od zahteva 1 do 11, ili vektor koji se sastoji iz nukleinske kiseline koja kodira molekul antitela prema bilo kom od zahteva 1 do 11.

13. Rekombinantna ćelija domaćina koja se sastoji iz nukleinske kiseline ili vektora prema zahtevu 12.

14. Postupak za dobijanje molekula antitela prema bilo kom od zahteva 1 do 11, koji se sastoji iz kultivacije rekombinantne ćelije domaćina prema zahtevu 13 pod uslovima za dobijanje molekula antitela, pri čemu postupak po potrebi dalje sadrži izolovanje i/ili prečišćavanje molekula antitela.

15. Farmaceutska kompozicija koja se sastoji iz molekula antitela prema bilo kom od zahteva 1 do 11 i farmaceutski prihvatljivog ekscipijensa.

16. Molekul antitela prema bilo kom od zahteva 1 do 11, za upotrebu u postupku lečenja kancera kod pacijenta, po potrebi pri čemu postupak dalje obuhvata davanje pacijentu:

(a) anti-tumorske vakcine; ili

(b) hemoterapeutskog sredstva.

1