RS61807B1 - Antigenski čip - Google Patents

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na antigenske čipove, kao i na postupke detekcije u biološkom uzorku imunoglobulina koji ispoljavaju specifičnost prema nekom od antigena na čipu. Konkretno, predmetni pronalazak se odnosi na antigenske čipove koji sadrže različite kombinacije sfera obloženih antigenom, a koje su pričvršćene za čvrstu podlogu. Pronalazak takođe obuhvata uloške, komplete i aparate koje sadrže antigenske čipove, kao i postupke njihove primene.

STANJE TEHNIKE

[0002] Alergije i slične bolesti, kao što je bronhijalna astma, pogađaju jednu četvrtinu populacije u industrijskim zemljama. Svetska zdravstvena organizacija (SZO) proglasila je alergije ozbiljnim zdravstvenim problemom 21. veka. U ovom trenutku, alergije tipa 1 pogađaju gotovo jednu trećinu populacije u industrijskim zemljama. Iako su često bezopasne, učestalost i težina alergija se vremenom povećavaju, usled čega se povećavaju direktna i indirektna finansijska odvajanja. Načelno, iako u teoriji jednostavno, dijagnostikovanje alergija još uvek predstavlja izazov za industriju dijagnostičkih sredstava i pružalaca zdravstvenih usluga. Značajan procenat pacijenata ne dobija odgovarajuću dijagnozu i terapiju. Posledice toga su smanjeni kvalitet života, smrtni ishodi koji su se mogli izbeći, i načelno veći troškovi lečenja. Da bi se tretman mogao prilagoditi pojedinačnom pacijentu, dijagnoza ne može da se završi otkrivanjem izvora alergena (na primer, polen, životinja, hrana), već je potrebno dijagnostikovati profil molekulske senzitizacije. Neophodno je precizno identifikovati konkretne alergene koji iniciraju osetljivost, jer su upravo oni odgovorni za: unakrsnu reaktivnost između izvora alergena, klasifikaciju rizika (snažne reakcije ili blaže forme), tip simptoma (kijanje, astma, itd.), izbor terapije i prognozu toka bolesti. Da bi se povećala preciznost dijagnostičkog postupka, potrebno je rutinski testirati veći broj parametara, za šta trenutno ne postoje potrebni finansijski uslovi, niti potrebne tehničke mogućnosti rutinske dijagnostičke instrumentacije.

[0003] Detekcija specifičnih imunskih reakcija u formi proizvodnje specifičnih antitela usmerenih prema biološkim i nebiološkim antigenima ključna je u dijagnostikovanju alergija tipa I, kao ostalih imunoloških stanja, kao što su autoimunske bolesti i infektivne bolesti.

[0004] Osnovno stanje u navedenim bolestima može biti uzrokovano brojnim antigenima, koji mogu biti ili markeri tih bolesti, ili mogu poslužiti kao surogat markeri stanja ili kursa bolesti, kao što je to slučaj sa autoimunskim bolestima.

[0005] Termin antigen odnosi se na svaku supstancu koje može da podstakne imunski sistem da proizvodi antitela usmerena protiv te supstance, i može da inicira biološku reakciju kada se antitelo veže za tu supstancu u odgovarajućim in vivo uslovima.

[0006] U teoriji, detaljna anamneza tokom prvog koraka, omogućila bi sužavanje broja parametara na razumnu meru u drugom koraku in vitro testiranja. Zbog mnoštva praktičnih ograničenja, ovo nije uvek izvodljivo, zbog čega primena multi-parametarskog dijagnostičkog testiranja u mnogim bolestima deluje veoma privlačno. Ovo se naročito odnosi na stanja u kojima je ista klasa antitela odgovorna za imunski odgovor na više različitih antigena (na primer, IgE, IgG, IgA), pa stoga praćenje multi-antigenskog odgovora antitela poboljšava zdravstvenu negu pojedinačnih pacijenata. Primena bioinformatike u identifikaciji antigenskih profila, obrazaca ili prediktivnih algoritama umnogome olakšava određivanje dijagnoze i izbor terapije, i omogućava individualizovan pristup lekara pacijentima.

[0007] In vitro testovi za detekciju antigen-specifičnih imunoglobulina u najvećoj meri se zasnivaju na principu ELISA testa, u kojem se antigen, imobilisan na čvrstoj fazi, inkubira sa uzorkom, a nakon ispiranja viška ne-vezanog uzorka i ne-specifično vezanih antitela, ona antitela koja su vezana specifično detektuju se pomoću sekundarnog antitela ili afinitetnog veznika, koji razvija detektabilni signal, na način koji je poznat u stanju tehnike (boja, fotoni, itd.).

[0008] Termin imobilizacija, u navedenom kontekstu, odnosi se na vezivanje antigena hemijskim vezom ili na nekovalentnim vezivanjem za čvrstu fazu, na primer, za plastičnu površinu ili neki čvrst nosač čije fizičke i hemijske osobine pogoduju vezivanju antigena.

[0009] Čest problem kod razvijanja multi-parametarskog imunološkog in vitro testa jeste heterogena priroda antigena, budući da se u jednom formatu testa, svi antigeni imobilizuju i testiraju u istim ili sličnim uslovima. Zbog toga se mora postići kompromis između broja antigena koji se mogu uključiti u test i tehničkog učinka testa, što je poznato u stanju tehnike.

[0010] Najveći broj relevantnih antigena iz bioloških izvora, kao što su hrana, biljke, bakterije ili virusi su po hemijskoj prirodi protein, a isto važi i za antigene proizveden u organizmu, kod autoimunskih bolesti. Proteini su – u poređenju sa DNK u genetičkim testovima – veoma raznovrsni i istovremeno veoma heterogeni (naelektrisanje, struktura, stabilnost, površinska svojstva, itd), pa je neophodno uzeti u obzir fizičko-hemijska svojstva svakog proteina tokom postupaka primene i proizvodnje testa. Još je važnije da se očuva biološka aktivnost, na primer, održavanjem sekundarne i tercijarne strukture biomolekula, od kojih zavise aktuelni epitopi i vezujuća mesta za antitela. U suprotnom slučaju poremećene strukture, ne može se dobiti funkcionalan test sa potrebnom kliničkom senzitivnošću.

[0011] Neki klinički relevantni antigeni u alergijama, infektivnim i autoimunskim bolestima nisu slobodni ili solubilni proteini, pa je za njihovu solubilizaciju potrebno primeniti relativno jake hemijske rastvarače, usled čega konvencionalno vezivanje proteina ili postupanje tokom proizvodnje in vitro testova može biti zametno. Primeri obuhvataju proteine orašastih plodova ili semena, ćelijske antigene prisutne u ćelijskoj membrani ili u sastavu tkiva.

[0012] U oblasti in vitro dijagnostike alergija, dodatnu komplikaciju predstavlja to što su biološki izvori u kojima se nalaze uzročni antigeni veoma heterogeni, kako između tako i unutar izvora. Najčešće se koriste ekstrakti antigena za in vivo i in vitro dijagnoze. Ekstrakt antigena je vodeni ekstrakt proteina prisutnih u nekom biološkom izvoru, kao što su hrana, životinje, biljke, biljni polen itd. Složena i promenljiva smeša alergena i ne-alergijskih sastojaka u ekstraktu alergena testira se izlaganjem na koži pacijenta, u uzorku krvi pacijenta, u kojima se mogu naći IgE antitela.

[0013] Unutar takve složene smeše proteina, lipida i ugljenih hidrata i drugih hemijskih jedinjenja, samo relativno mali broj proteina ili porodica proteina ima svojstva alergena, odnosno, mogu da izazovu imunski sistem da proizvede na njih specifična antitela.

[0014] Udeo relevantnih antigena u sastavu dominantno nealergenskog materijala otežava vezivanje za čvrsti materijal, pa često nije moguće dobiti dovoljno osetljiv i specifičan IgE test za dijagnostikovanje alergija, koji se bazira na jednostavnoj čvrstoj podlozi kao što je mikrotitar ploča, bez dodatnog koncentrovanja frakcije alergena ili uklanjanja nealergenskih materijala.

[0015] U protekle tri decenije, identifikovani su brojni molekulski antigeni relevantni u dijagnozu alergija, bilo da su prečišćeni iz prirodnog izvora ili da su proizvedeni tehnologijom rekombinantne DNK. Primena molekularnih antigena ima mnoge prednosti, od standardizacije do boljeg razumevanja i predikcije unakrsne reaktivnosti, do klasifikacije rizika pacijenata i odgovarajuće terapije. Međutim, ogroman nedostatak mnogih rutinskih testiranja je najpre, to što zahtevaju znatnu stručnu ekspertizu lekara u selekciji parametara koje treba testirati. I drugo, to što povećava troškove po pacijentu, kada se sprovode konvencionalna testiranja pojedinačnih parametara, a to je 99% komercijalnog tržišta. Takođe, količina krvi koju je potrebno uzorkovati linearno se povećava sa svakim probom u konvencionalnom testu, što uobičajeno iznosi 50 do 100 mikrolitara po probi.

[0016] Nekoliko istraživačkih grupa razvilo je i obelodanilo multi-parametarski sistem testiranja (označen i kao multipleks), koji se zasniva na nekoliko osnovnih tehnologija, od konvencionalnog ELISA testa na minijaturizovanoj mikrotitar ploči (MTP), do čipa suspendovanih sfera ili mikrosfera primenjenih na različite načine.

[0017] Primera radi, WO2004/104586A1 opisuje postupak i uređaj za detektovanje specifičnih antitela, zasnovan na vezivanju tih antitela specifičnim vezujućim reagensom (na primer, Protein A, Protein G ili neko antitelo koje specifično vezuje imunoglobuline), koji je pričvršćen za biočip sa reaktivnom površinom. Vezani kompleks alergen-specifično antitelo dovodi se u kontakt sa odgovarajućim alergenom, koje se detektuje pomoću obeleženog alergen-specifičnog antitela.

[0018] Patent US2005/079592A1 obelodanjuje uređaj za proizvodnju multipleks čipa, u kojem se sfere sa biološkom supstancom, na primer sa proteinom pričvršćenim za njihovu površinu, nalaze na specifičnom mestu na čvrstoj fazi.

[0019] Test za analizu velikog broja analita u uzorku opisan je i u US6268222B1. Ovaj test se bazira na jezgru, odnosno, česticama nosačima, na čijoj se površini nalaze različite manje i fluorescentno obeležene polimerne čestice ili nanočestice.

[0020] Patent US2002/0015666A1 obezbeđuje sistem i postupak čuvanja i primene različitih izabranih reagenasa za čuvanje i masovno skladištenje, a rad autora Tai i sar. (Tai et al., Analytical Biochemistry, vol. 391, no. 2, August 2009, p. 98-105), opisuje mikorfluidne uloške i sistem za multipleks imunoeseje.

[0021] Iako testovi koji se zasnivaju na rastvorenim sferama mogu da posluže i za multipleks analize u maloj zapremini uzorka, praktična primena ovih testova ograničena je na testiranje ne više od 20 parametara. Njihova primena u rutinskim laboratorijskim testovima otežana je zbog razlika u biološkom materijalu, kao što su serum ili plazma, koji u laboratorije često stižu u hemolitičkoj, lipemičnoj ili ikteričnoj formi. Visok kapacitet vezivanja u postupcima koji zahtevaju visoku senzitivnost, kao što je, na primer, detekcija IgE, moguć je samo ako se radi sa prečišćenim antigenima, a ne i sa sirovim ekstraktima alergena. Osim toga, potrebna instrumentacija se često zasniva na FACS tehnologiji (sortiranje fluorescentno aktiviranih ćelija) ili na primeni drugih skupih postupaka detekcije i merenja, koji zahtevaju više laserskih kanala ili preciznost koju može da obezbedi konfokalna laser skenirajuća mikroskopija.

[0022] Konvencionalni mikročipovi na staklenim pločicama ili na mikrotitar pločama mogu da prevaziđu ograničenja koja postoje kod primene testova na bazi suspendovanih sfera, ukoliko se žrtvuju fleksibilnost testiranja po potrebi pojedinačnog uzorka pacijenta, kao i optimizacija pojedinačnih parametara. Kada se antigeni proteini vezuju za ravnu ili homogenu aktivnu površinu, to značajno umanjuje krajnji učinak testa. Takođe, proizvodnju poskupljuje i usložnjava primena pikolitarskih zapremina koje treba naneti na reproducibilan i ponovljiv način. Postojeći proizvođači na tržištu ne nude odgovarajući visokopropusnu instrumentaciju za proizvodnju miliona visoko kvalitetnih dijagnostičkih mikročipova godišnje. Broj serija je uobičajeno mali (manje od nekoliko stotina), dok je koeficijent varijabilnosti (CVs) visok u poređenju sa stanjem tehnike u automatizovanim imunološkim analizama. Slično tehnologiji sfera u suspenziji, mikročipovi najčešće zahtevaju fluorescentno ili luminescentno očitavanje i stoga zahtevaju skupu instrumentaciju. Zbog minijaturnog formata testa, automatizacija nije jednostavna i zahteva sofisticiranu opremu, i/ili mikrofluidni dizajn, što opet može predstavljati problem sa rutinskim laboratorijskim uzorcima.

[0023] Prednost drugih multi-parametarskih testova, kao što je testovi bočnog protoka, jesu niski troškovi testiranja po parametru, ali im sa druge strane, nedostaje osetljivost, reproducibilnost, retko su automatizovani i ne mogu istovremeno da testiraju više od 5-20 parametara po test traci.

[0024] Stoga, u ovom segmentu tržišta kliničke hemije trenutno nema dostupne tehnologije koja može ispuni sve navedene potrebe, konkretno: niske troškove, multipleks nivo (> 200), reproducibilnost, i dobar tehnički ishod testa (CV, senzitivnost, specifičnost, merni opseg, kvantifikacija, itd).

[0025] Stoga je predmet ovog pronalaska antigenski čip sa značajno poboljšanom reproducibilnošću i odličnim tehničkim performansama, koji ima mogućnost uključivanja velikog broja test parametara, što ovaj test čini veoma ekonomičnim.

SAŽETAK PRONALASKA

[0026] Cilj pronalaska je sažet predmetom zahteva.

[0027] Primenjeni su pronalasci u molekularnim istraživanja i multipleks imuno-esej tehnologijama, kako bi se dobio široko primenljivi proizvod za in vitro testiranje, konkretno grupa antigenskih čipova koji sadrže sfere obložene antigenom, i imobilisane na čvrstu podlogu. Ovaj novi format čipa i postupci proizvodnje i primene razvijeni su na osnovu napretka u stanju tehnike na polju razvoja postupaka parametarskih testova, pre svega tehničkog napretka koji je omogućio značajno uvećanje broja test parametara, uz optimizaciju vezivanja svakog pojedinačnog antigena, bez smanjenja ostalih aspekata testa u odnosu na alternativne postupke, konkretno, u pogledu cene, prilagodljivosti proizvodnje, ili količine uzorka seruma po probi. S obzirom na to da testovi minijaturnog formata, kao što su mikročipovi, obično ne omogućavaju ekonomično testiranje visokog kvaliteta, ovde opisani antigenski čip može smatrati in vitro makročipom, koji se sastoji od imobilizovanih nano- i mikročestica, koje formiraju posebne entitete za svaku populaciju sfera obloženih antigenom, ali značajno većih dimenzija od konvencionalnih mikročipova.

[0028] Ova nova tehnologija obezbeđuje podešavanje uslova vezivanja svakog pojedinačnog antigena za čvrstu podlogu, na primer, detekcionog antigena, kao što je alergen, čime se postiže senzitivnost, uz robustan dizajn testa, a bez umanjenja ekonomičnosti i učinka pojedinačnih proba. Antigenski čipovi i postupci koji su ovde obezbeđeni povećavaju senzitivnost, posebno kada se radi sa heterogenim uzorcima, tako da dvofazno vezivanje – prvo za čestice i drugo za čvrstu fazu ili poroznu i 3D strukturni čvrstu fazu – omogućava višestruko povećanje antigen-prezentujuće površine za koju mogu da se vežu antitela tokom faze inkubacije. Napredne reagense upotpunjuju automatizacija i softverska rešenja koja predstavljaju poslednju reč tehnologije.

[0029] Dobar odabir panela antigena, uz robusnost, senzitivnost i specifičnost testa, kao i lakoću primene, obezbeđuju bolju kliničku interpretaciju rezultata, predviđanje unakrsne reaktivnosti, a time i efikasniju selekciju terapije.

[0030] Dakle, čip i postupci koji su ovde opisani obezbeđuju originalan test koji može da promeni dosadašnju dijagnostiku alergija, i drugih imunoloških stanja, kao što su infektivne i autoimunske bolesti, zahvaljujući specifičnom i pouzdanom testiranju antitela. Konkretno, kada je reč o dijagnostikovanju alergija, sadašnji in vitro testovi sprovode se u okviru drugog ili trećeg koraka dijagnostičkog postupka, a obuhvatni testovi velike rezolucije i senzitivnosti, kao što je ovde opisan test, mogli bi da obezbede sredstvo za dijagnostiku u prvom koraku, koji bio potvrđen uzimanjem anamneze, kožnim testom ili testom provokacije. Ovakvi testovi mogu biti od koristi celom procesu lečenja, a najviše koristi bi osetio sam pacijent koji patio od nekog imunološkog poremećaja.

[0031] Jedan aspekt pronalaska obezbeđuje antigenski čip, koji sadrži različite grupe sfera obloženih antigenom, koje su pričvršćene za čvrsti nosač, naznačeno time da svaka grupa sfera sadrži

(i) različite tipove sfera obložene jednim detekcionim antigenom, ili

(ii) različite tipove sfera obložene setom detekcionih antigena, poželjno, naznačeno time da je čvrsti nosač panel ili ploča, da je detekcioni antigen neki alergen, infektivni agens ili autoantigen, naznačeno time da je detekcioni antigen ili set detekcionih antigena povezan sa različitim grupama sfera, posredstvom različitih hemijskih veza.

[0032] U nekim primerima izvođenja, detekcioni antigen je alergen.

[0033] U nekim primerima izvođenja, detekcioni antigen je infektivni marker.

[0034] U nekim primerima izvođenja, detekcioni antigen je autoantigen.

[0035] U nekim primerima izvođenja, detekcioni antigen je neki antigen dobijem postupkom rekombinantne DNK tehnologije ili je izolovan i prečišćen iz biološkog materijala.

[0036] U nekim primerima izvođenja, kada su navedene sfere obložene setom detekcionih antigena, navedeni set detekcionih antigena dobijen je iz ekstrakta ili lizata biološkog materijala koji sadrži jedan ili više antigena, ili je dobijen iz prečišćene frakcije takvog ekstrakta ili lizata ili prečišćene frakcije materijala dobijenog iz ćelijske kulture.

[0037] U nekim primerima izvođenja, detekcioni antigen sadrži jedan epitop, jedan makromolekul sa više epitopa za vezivanje antitela, ili smešu različitih proteina sa različitim antigenima koji sadrže brojne epitope.

[0038] U nekim primerima izvođenja, sfere su mikro- ili nanosfere. Konkretno, veličina sfera je između 5 i 500 nm u prečniku, poželjno između 200 i 500 nm u prečniku.

[0039] U nekim primerima izvođenja, sfere su od lateksa, biokompatibilnih polimera, ili su staklene sfere, poželjno sfere od silicijum dioksida. Konkretno, površina sfera je porozna ili neporozna.

[0040] U nekim primerima izvođenja, detekcioni antigen je kovalentno ili je nekovalentno vezan za sfere. Konkretno, detekcioni antigen je nekovalentno vezan za sfere pasivnom adsorpcijom, poželjno, hidrofobnim i/ili elektrostatičkim vezivanjem.

[0041] U nekim primerima izvođenja, detekcioni antigen je vezan preko odstojnika, tako da uspostavlja pogodnu orijentaciju u pogledu površinske prezentacije epitopa.

[0042] U nekim primerima izvođenja, čvrsti nosač je panel ili ploča od poroznog ili neporoznog materijala, poželjno panel od nitroceluloze, još poželjnije slojeviti panel od nitroceluloze.

[0043] U nekim primerima izvođenja, čip se sastoji od najmanje 25 različitih grupa. Konkretno, sfere u čipu ili u jednoj grupi pripadaju različitom tipu. U nekim primerima izvođenja, grupe sfera obložene antigenom, pričvršćene su za čvrstu podlogu pomoću kontaktnih postupaka, poželjno primenom solenoid dispenzionog sistema. Konkretno, svaka grupa sfera pričvršćena je kao element sa definisanom pozicijom u četvorougaonom čipu, poželjno u gustini od jednog elementa po mm<2>.

[0044] Sfere opisanog antigenskog čipa su različitog tipa. Konkretno, sfere u različitim grupama razlikuju se prema tipu (na primer, grupa 1 sadrži sfere od polistirena, grupa 2 sadrži sfere od stakla). Takođe, i sfere unutar jedne grupe se razlikuju prema tipu.

[0045] U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje antigenski čip, koji sadrži različite grupe sfera obloženih alergenom, fiksirane za čvrsti nosač, naznačeno time da svaka grupa sadrži

(i) različite tipove sfera obložene jednim alergenom, ili

(ii) različite tipove sfera obložene setom alergena, poželjno ekstrakta alergena, poželjno naznačeno time da je čvrsti nosač panel ili ploča, naznačeno time da je alergen ili set alergena vezan za različite grupe sfera posredstvom različitih tipova hemijskih veza.

[0046] U narednom aspektu obezbeđeni su postupci detekcije imunoglobulina koji specifično vezuje antigen ili set detekcionih antigena, naznačeno time da je detekcioni antigen ili set detekcionih antigena neki alergen, infektivni agens ili autoantigen, pri čemu se postupak sastoji od

(i) obezbeđivanja antigenskog čipa, prema nekom od opisanih antigenskih čipova,

(ii) inkubiranja čipa i uzorka,

(iii) inkubiranja čipa sa detekcionim reagensom,

(iv) opciono, inkubiranja čipa sa reagensom za razvijanje signala, i

(v) merenja detektabilnog signala.

[0047] U nekim primerima izvođenja, navedeni imunoglobulin je IgE antitelo povezano sa alergijom.

[0048] U nekim primerima izvođenja, navedeni imunoglobulin je IgG antitelo povezano sa infekcijom ili autoimunskom bolešću.

[0049] Dalje su obezbeđeni postupci detekcije IgE antitela povezanog sa alergijom, koji obuhvataju (i) obezbeđivanje alergenskog čipa, kao što je opisano,

(ii) inkubiranje čipa sa uzorkom,

(iii) inkubiranja čipa sa detekcionim reagensom, poželjno sa IgE-specifičnim antitelom ili IgE-specifičnim aptamerom,

(iv) opciono, inkubiranja čipa sa reagensom za razvijanje signala, i

(v) merenja detektabilnog signala.

[0050] U nekim primerima izvođenja, uzorak je biološki fluid, poželjno serum, ukupna ili prerađena krv, nazalni fluid ili urin, ćelijski lizat ili homogenat dobijen od ispitanika ili grupe ispitanika.

[0051] U nekim primerima izvođenja, detekcioni reagens je afinitentni veznik koji specifično vezuje imunoglobulin, poželjno, neko antitelo (na primer, anti-IgE ili anti-IgG antitelo), neki aptamer (na primer, IgE-specifični aptamer ili IgG-specifični aptamer) ili afitelo. Konkretno, detekcioni reagens je (i) direktno obeležen, poželjno obojenim ili fluorescentnim jedinjenjem ili zlatnim nanočesticama ili obojenim lateks nanočesticama; ili (ii) konjugovan sa enzimom (na primer, anti-IgE ili anti-IgG antitelo koje je obeleženo ili konjugovano sa enzimom).

[0052] U nekim primerima izvođenja, postupci takođe obuhvataju inkubiranje čipa u prisustvu reagensa za razvijanje signala, prema koraku (iv) opisanog postupka, naznačeno time da je detekcioni reagens konjugovan sa enzimom, dok reagens za razvijanje signala sadrži supstrat navedenog enzima.

[0053] U nekim primerima izvođenja, postupak dalje obuhvata inkubiranje opisanog antigenskog čipa, sa rastvorom za zaustavljanje reakcije prema opisanom koraku (v) postupka, to jest, dodavanje rastvora za zaustavljanje reakcije nakon inkubiranja antigenskog čipa sa reagensom za detekciju signala, što dovodi do prekida emitovanja signala.

[0054] Naredni aspekt obuhvata uložak sa komorom u kojoj se nalazi neki od opisanih antigenskih čipova, rezervoar za tečni otpad i opciono, bar-kod. Uložak može dalje da sadrži rezervoare ili integrisane bočice za jedan ili više detekcionih reagenasa, reagenasa za razvijanje signala, rastvor za zaustavljanje reakcije, jedan ili više pufera ili jedan ili više kontrolnih uzoraka.

[0055] Dalje je obezbeđen komplet koji sadrži neki od opisanih antigenskih čipova, detekcioni reagens, jedan ili više pufera, jedan ili više kontrolnih uzoraka, uputstvo za korišćenje kompleta za neki od ovde opisanih postupaka i, opciono, reagens za razvijanje signala. U sastav kompleta može ući i rastvor za zaustavljanje reakcije.

[0056] U narednom aspektu, pronalazak obezbeđuje aparaturu sa komorom za jedan ili više uložaka, kao što je opisano, pipetor i uređaj za detekciju signala.

SLIKE

[0057]

Slika 1A i B: Crno/bela reprezentacija merenja specifičnih IgE antitela na 245 različitih alergena, i pet IgE standarda u rastućim koncentracijama (gornji desni ugao), nakon izvođenja standardnog testa na prikupljenim humanim serumima alergičnih osoba (1A) ili negativnih kontrola (1B) i odslikavanje visoke rezolucije na ravnom skeneru. Originalni snimci su u 16-bit crno/beli snimci u TIFF formatu.

Slika 1C: Šematski prikaz prostornog rasporeda alergena koji su testirani i prikazani na Slikama 1A i B. Veličina polja za svaki alergen je oko 600 mikrona u prečniku, razmak između polja je 1 mm u svakom pravcu.

Slika 2: Procena testiranja na osnovu poređenja sa standardnim postupkom.

Slika 3: Poređenje čipa koji sadrži molekulske alergene direktno imobilisane na čvrstu podlogu i čipa sa nanočesticama obloženim istim molekulskim alergenima i imobilisanih na isti tip čvrste podloge. Grafička predstava rezultata prikazanih u Tabeli 4.

Slika 4: Merenje specifičnih IgE na Pru p 3 antigen koji je najsnažniji alergen breskve, u 8 različitih pozitivnih i jednom negativnom uzorku ispitanika.

Slika 5: Tehničke specifikacije i poređenje dostupnih multi-parametarskih testova za merenje specifičnih IgE antitela. (*) merenje specifičnih IgE antitela je po pravilu, semi-kvantitativno, budući da nisu dostupni međunarodne referentne vrednosti za individualne alergene. (*) Prosečna linearna korelacija za testiranje >100 uzoraka i poređenje alergenskih komponenti i alergenskih ekstrakata primenom ImmunoCAP i ImmunoCAP ISAC testova.

Slika 6: Poređenje IgE merenja za uzorke testirane na dan 0 i na dan 330, primenom istog preparata sfera obloženih alergenima.

DETALJAN OPIS PRONALSKA

[0058] Specifični termini korišćeni u ovoj specifikaciji, imaju sledeća značenja.

[0059] Termin "antigen", u značenju koje je ovde primenjeno, označava supstancu koja može da izazove reakciju imunskog sistema u vidu proizvodnje antitela usmerenih prema toj supstanci, i da u odgovarajućim in vivo uslovima, potencijalno aktivira biološku reakciju kada se antitelo veže za supstancu. Termin antigen, u značenju koje je ovde primenjeno obuhvata celokupan ciljni molekul ili fragment tog molekula, koji će biti prepoznat od antigen-vezujućeg mesta. Konkretno, deo strukture nekog antigena, na primer, polipeptidna ili ugljeno-hidratna potkomponenta označavaju se terminom "epitop", a epitopi su imunološki relevantni, jer predstavljaju mete prepoznate od strane antigen-vezujućeg mesta.

[0060] Izrazi "detekcioni antigen", "antigen koji će biti detektovan" ili "detektabilni antigen", odnose se na antigen koji određuje antigen-specifičnu reakciju. Termin "antigen", "detekcioni antigen", "antigen koji će biti detektovan" i "detektabilni antigen" koriste se kao međusobno zamenljivi sinonimi.

[0061] Izraz "set detekcionih antigena" odnosi se na jedan ili više antigena koji određuju reakciju specifičnu za dato stanje. Stanje može biti bolest ili poremećaj ili dispozicija, kao što je alergija ili autoimunska bolest; izraz takođe obuhvata stanja koja ne ispoljavaju fizičke i/ili kliničke simptome. Reakcija specifična za stanje može biti neka reakcija posredovana kompleksom antigen-antitelo, i to najmanje jednim antitelom koje je karakteristično ili povezano sa tim stanjem i stanje koje može biti detektovano takvom reakcijom; na primer, IgE antitelo specifično za alergen, ukoliko je stanje alergija. Izraz "set antigena", u značenju koje je ovde primenjeno odnosi se na jedan ili više antigena iz istog biološkog izvora, na primer, dobijen iz ćelijskog lizata, ćelija ili tkivnog homogenata ili njihovih prečišćenih frakcija.

[0062] Termin "epitop" odnosi se na deo antigena koji određuje njegovu imunološku specifičnost. Termin epitop, u značenju koje je ovde primenjeno, odnosi se posebno na molekulsku strukturu koja može kompletno da obezbedi specifičnog vezujućeg partnera ili da bude deo specifičnog vezujućeg partnera za vezujuće mesto za antitelo. Epitop može biti ugljeni hidrat, peptid, masna kiselina, neka organska, biohemijska ili neorganska supstanca ili njihov derivat ili kombinacija.

[0063] Epitopi mogu biti linearni ili konformacioni epitopi. Linearni epitop je sačinjen od jednog segmenta primarne sekvence lanca polipeptida ili ugljenih hidrata. Linearni epitopi mogu biti susedni ili preklapajući. Konformacioni epitopi sačinjeni su od amino kiselina ili ugljenih hidrata koji su u međusobnu vezu dovedeni zadobijanjem tercijarne strukture proteina, pri čemu amino kiseline u okviru takvog epitopa ne moraju biti susedne amino kiseline u primarnoj linearnoj sekvenci. Konkretno, i u vezi sa polipeptidnim antigenima, konformacioni ili diskontinualni epitopi odlikuju se prisustvom dve ili više diskretne amino kiseline, koje se ne nalaze jedna pored druge u primarnoj sekvenci polipeptida, ali koji se povezuju u stabilnu strukturu na površini molekula, kada protein/antigen zadobije konačnu nativnu konformaciju.

[0064] Uobičajeno, epitop je polipeptid ili polisaharid unutar prirodno postojećeg antigena. Normalno, epitop B ćelija sastoji se od najmanje 5 amino kiselina, ali može da se sastoji od 3-4 amino kiselina. Epitopi predstavljaju molekulske oblike prepoznate od strane imunskih B i T ćelija, a mogu biti takođe reprezentovani ne-antigenim peptidima, i drugim molekulima koji poseduju isti oblik epitopa koji je prisutan u nativnom antigenu. Primer elementa sa oblikom epitopa je aptamer. Aptamer je molekul koji poseduje molekulski oblik imitira imunološki epitop. Delovi molekula, kao što su peptidi ili molekula koji predstavljaju njihove post-translacione modifikacije, ugljeni hidrati, lipidi i drugi molekuli mogu se koristiti da predstave pojedinačne epitope.

[0065] Termin "čip" odnosi se na kolekciju grupa sfera obloženih antigenom, u kojoj svaka grupa predstavlja prostorno razdvojeni element sa definisanom pozicijom. Takvi elementi ili molekulski entiteti mogu da imaju prostorno definisanu poziciju, kao što su nizovi bunarčića na mikrotitar ploči, ili da budu imobilizovani na planarnim površinama na kojima je svaki element pozicioniran na specifičnoj X/Y koordinati. U ovakvoj prostornoj organizaciji, koja je poznata pod nazivom kodiranje, pozicija svakog molekula je nepromenljiva i ona određuje identitet molekula, odnosno identifikaciju specifičnosti antitela u sastavu uzorka koji se testira na čipu. Ovakav tip prostornog niza može se sintetisati ili naneti na ravnu površinu, te se na taj način proizvodi veliki broj različitih elemenata gusto postavljenih na maloj površini.

[0066] Ukoliko nije drugačije naznačeno, termini "čestice", "nanočestice", "sfere", "mikrosfere" i "zrnca" koriste se kao uzajamno zamenljivi sinonimi, a odnose se na sitne, inertne podloge kružnog, ovalnog ili sferičnog oblika, koje se mogu obložiti antigenom (detekcionim antigenom) ili setom antigena (set detekcionih antigena).

[0067] Termin "grupa sfera", u značenju koje je ovde primenjeno, odnosi se na populaciju sfera vezanih ili obloženih (dva termina koja se koriste u istom značenju) specifičnim detekcionim antigenom, koji se može identifikovati antitelom koje je specifično za taj antigen u reakciji antigenantitelo, ili se odnosi na populaciju sfera obloženih setom detekcionih antigena, koji se može identifikovati najmanje jednim antitelom specifičnim za jedan detekcioni antigen u tom setu.

[0068] Termin "tip sfere" odnosi se na svojstva sfera, definisana njihovom veličinom, materijalom, molekulskim svojstvima obložene površine, hidrofobnošću, naelektrisanjem, površinskim svojstvima (porozna ili neporozna površina), uspostavljanjem hemijskih veza ili veznik/odstojnik hemijom. Sfere istog tipa imaju istu veličinu, površinska svojstva i istu hemiju vezivanja antigena. Sfere različitog tipa predstavljaju sfere koje se razlikuju u najmanje jednom od navedenih svojstava.

[0069] U značenju koje je ovde primenjeno, "podloga", "čvrsta podloga", "nosač", "čvrsti nosač" ili "čvrsta faza" odnose se na bilo koju čvrstu podlogu na koju se u pravilnom prostornom rasporedu mogu naneti elementi/molekulski entiteti (sfere obložene antigenom) i imobilisati za dalje sprovođenje testa i reakcija.

[0070] Termini "imobilisan" ili "fiksiran", koriste se kao međusobno zamenljivi sinonimi, i označavaju materijal ili česticu, a konkretno se odnose na sferu obloženu antigenom, vezanu kovalentno ili nekovalentno, za čvrstu podlogu. Termin se odnosi na materijal ili česticu koja je relativno stacionarna i koja se ne oslobađa tokom inkubacije ili ne ispira tokom faza ispiranja čvrste podloge.

[0071] Termin "imunoglobulin (Ig)" označava deo globulinskog molekula iz seruma koji je odgovoran za imunsku reakciju, a obuhvata i druge glikoproteine koji imaju slična funkcionalna svojstva. Oni se obično sastoje od četiri polipeptidna lanca – dva identična laka lanca i dva identična teška lanca povezana disulfidnim vezama.

[0072] Termin "IgG" odnosi se na Ig izotip antitela u serumu kojem pripada antitelo razvijeno u odgovoru na antigen, a može biti jedan od četiri podtipa IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4.

[0073] Termin "IgE" odnosi se na jedan Ig izotip antitela u serumu, koje se čvrsto vezuje za mastocite i bazofilne ćelije, i kada dodatno veže antigen, izaziva oslobađanje histamina i drugih medijatora hipersenzitivnosti. Ovaj izotip Ig igra primarnu ulogu u najčešćim alergijskim reakcijama tipa I, kao što su polenska groznica, astma i anafilaksa.

[0074] Termin "antitelo", u značenju koje je ovde primenjeno, odnosi se na polipeptide ili proteine koji se sastoje ili sadrže molekulske domene karakteristične za antitela, konkretno, konstantni i/ili varijabilni domen teških i/ili lakih lanaca imunoglobulina, sa ili bez vezne sekvence. Smatra se da polipeptid poseduje domen karakterističan za antitelo ukoliko ima strukturu beta-ploče, sa najmanje dva beta-lanca povezana sekvencom petlje. Domeni antitela mogu biti nativne strukture ili modifikovani mutagenezom ili derivatizacijom, na primer, modifikovanjem antigen-vezujućih svojstava ili bilo kog drugog svojstva, kao što je stabilnost ili funkcija, na primer, vezivanje za Fc receptore FcRn i/ili Fcgama receptor. Termin "antitelo" odnosi se na antitela životinja, uključujući čoveka, sisare, uključujući čoveka, glodara, zeca, pacova, kozu, lamu, kravu i konja, ili ptice, uključujući kokošku, a ovaj termin posebno se odnosi na rekombinantno dobijena antitela prema sekvenci antitela životinjskog porekla.

[0075] Antitela mogu postojati kao intaktni imunoglobulini, ili kao njihove različite modifikacije, uključujući na primer, Fv fragment koji sadrži samo varijabilne regione lakog i teškog lanca, Fab ili (Fab)’2 fragment koji sadrži varijabilne regione ili delove konstantnih regiona, jednolančano antitelo, i slično. Antitelo može biti životinjsko (naročito, mišje, kozje, zečje ili pacovsko) ili može biti poreklom iz čoveka ili može biti himerno. U značenju koje je ovde primenjeno termin “antitelo” obuhvata sve ove forme koje se mogu proizvesti modifikacijom celog antitela i/ili se mogu sintetisati de novo, primenom rekombinantne DNK tehnologije. “Monoklonsko” antitelo odnosi se na individualna antitela ili populaciju individualnih antitela u kojoj su antitela identična u pogledu specifičnosti i afiniteta, sa izuzetkom prirodno postojeće mutacije, koja može biti prisutna u minornim količinama.

[0076] Termin "beleg", u značenju koje je ovde primenjeno, označava neko jedinjenje koje se može detektovati ili kompoziciju koja je konjugovana direktno ili indirektno za antitelo ili fragment antitela, tako da se dobije “obeleženo” antitelo/fragment antitela ili "detekciono antitelo". Beleg može biti detektabilan po sebi, na primer, može biti radioizotopski beleg, boja ili fluorescentni beleg, zlatna nanočestica ili obojena lateks nanopartikula ili, u slučaju enzimskih belega, može katalizovati hemijsku izmenu supstrata ili kompozicije koja se detektuje.

[0077] Termin "ekstrakt", u značenju koje je ovde primenjeno, odnosi se na jednu ili više supstanci, najčešće u koncentrovanoj formi, dobijenih tretiranjem materijala iz kojeg je ekstrakt izolovan, rastvaračem, nakon čega se rastvarač uklanja. Termin "ekstrakt" dalje obuhvata jednu ili više supstanci koje su dobijene primenom daljih postupaka prečišćavanja primarnog ekstrakta, poznatih u stanju tehnike. Načelno, ekstrakt obuhvata smešu proteina i drugih molekula.

[0078] Ekstrakt alergena se uobičajeno priprema izdvajanjem alergena iz biološkog materijala. Biološki materijal je najčešće višećelijski ili ne-ćelijski materijal iz višećelijskog organizma gljiva, biljaka ili životinja, ili može biti bakterijskog porekla. Ekstrakti alergena dobijaju se vodenom ekstrakcijom hidrosolublnih komponenti, primenom postupaka mehaničke homogenizacije (na primer, snažnog mešanja), nakon čega sledi faza prečišćavanja, kao što je filtracija ili frakcionisanje, kako bi se dobio rastvor, to jest, ekstrakt. Ekstrakti se mogu dalje prečišćavati i/ili obrađivati, na primer, sušenjem/smrzavanjem, kojim se uklanja sva voda. Načelno, ekstrakt alergena sadrži smešu proteina i drugih molekula.

[0079] U ovom kontekstu, termin "alergen" odnosi se na bilo koji prirodni protein, njegove izoforme, modifikovani protein, rekombinantni protein, rekombinantni mutirani protein, ili neki njegov fragment, ili na smešu proteina koja je sposobna da indukuje alergijske, odnosno, IgE-posredovane reakcije, nakon ponovljenog eksponiranja pacijenta. Termin "set alergena", u značenju koje je ovde primenjeno, odnosi se na jedan ili više alergena dobijenih iz istog biološkog izvora alergena, na primer, dobijenog iz ekstrakta alergena nekog biološkog materijala.

[0080] Izrazi "biološki izvor" ili "biološki materijal" odnose se na svaki materijal koji potiče iz živog organizma. Izraz podrazumeva i izdvojene ćelije, delove tkiva, bakterije, viruse, kvasce i subfrakcije (kao što su izdvojena jedra i citoplazma) prethodno pomenutih izvora (koje sadrže jedan ili više antigena).

[0081] Izraz "biološki izvor alergena", u značenju koje je ovde primenjeno, odnosi se na svaki biološki materijal koji sadrži jedan ili više alergena. Primeri ovakvih materijala su PMB grinja (Prečišćeno telo grinje) ili WMC (ukupna kultura grinje), odmašćeni ili neodmašćeni polen trava, biljaka, korova i drveća, između ostalih, ili životinjska dlaka i perut, krzno, gljive, micelijum i spore, insekti, otrov ili pljuvačka i hrana.

[0082] Termin "autoimunska bolest" obuhvata svaku bolest koja je povezana sa patogenim autoantitelima, bolesti koje su najverovatnije posredovane T limfocitima i bolesti za koje postoje samo direktni dokazi patogenog procesa. Navedene bolesti mogu biti, bez ograničenja, idiopatska trombocitopenija, autoimunska hemolitička anemija, autoimunska neutropenija, autoimunska eritroblastopenija, miastenija gravis, Žilijan-Barov sindrom, hronična inflamatorna demijelinizujuća polineuropatija, multipla skleroza, monoklonska gamopatija sa anti-mag aktivnošću, adrenoleukodistrofija, Grejvova bolest, sistemski lupus eritematosus, anti-kardiolipinska antitela i višestruki pobačaji, refraktorni poliomiozitis, juvenilni reumatoidni artritis, reumatoidni artritis, Feltijev sindrom, ulcerativni kolitis, Kronova bolest, neki glomerulonefrititisi, ANCA-pozitivan sistemski vaskulitis, Kawasakijeva bolest, autoimunska bolest posredovana antitelima na faktor VIII i ptičja retinopatija.

[0083] Termini "kovalentna veza" ili "kovalentna interakcija" odnose se na veze ili interakcije koje nastaju deobom parova elektrona između atoma. Kovalentne veze/interakcije obuhvataju, bez ograničenja, atomske veze, homopolarne veze, σ-σ-interakcije, σ-π-interakcije, dvoelektronskocentar veza, jednogube, dvogube veze i trogube veze, kao i kombinacije ovih interakcija/veza. Pomenute interakcije/veze mogu biti polarne, ili mogu biti nepolarne.

[0084] "Nekovalentno” se odnosi na vezu između atoma i molekula kao što su jonske interakcije (na primer, dipol-dipol interakcije, jonsko sparivanje i formiranje soli), vodoničnu vezi, nepolarne interakcije, inkluzione komplekse, klatration, van der Valsove interakcije (na primer, pi-pi slaganje) i njihove kombinacije.

[0085] Termin "pasivna adsorpcija", "adsorpcija" ili "apsorpcija" odnosi se na adheziju atoma, jona ili molekula iz gasa, tečnosti ili rastvorene čvrste supstance, na neku površinu. Mehanizam adsorpcije zasniva se primarno na hidrofobnim privlačnim silama (Van der Valsovim interakcijama, London tip) između hidrofobnih delova adsorbovanog molekula i površine. Izrazito hidrofobni molekuli adheriraju za površinu pasivnom adsorpcijom. U slučaju manje hidrofobnih molekula (ili hidrofilnijih površina, kao što su –COOH ili NH2modifikovane površine), vezivanje se dešava posredstvom jonskih i hidrofobnih interakcija.

[0086] Termin "elektrostatičke interakcije" ili "elektrostatičko vezivanje", u značenju koje je ovde primenjeno, odnosi se na interakcije između naelektrisanih komponenti, molekula ili jona, usled privlačnih sila koje se javljaju između komponenti koje nose suprotno naelektrisanje. Primeri obuhvataju, bez ograničenja, jonske interakcije, kovalentne interakcije, interakcije između jona i dipola (jonskih i polarnih molekula), interakcije između dva dipola (parcijalna naelektrisanja polarnih molekula), vodonične veze i London disperzione veze (indukovani dipoli polarizabilnih molekula).

[0087] "Detektabilni signal" označava fizički ili hemijski signal, koji se može meriti vizuelno ili primenom instrumentalnih postupaka, a obuhvata kolorimetrijske, fluorescentne, električne i hemiluminescentne signale.

[0088] "Kontrolna vrednost" ili "kontrolni signal" odnosi se na referentnu vrednost koja služi kao osnov za poređenje signala koji je izmeren u jednom uzorku ili u prikupljenim uzorcima subjekata. Negativna kontrola je signal koji se dobija, na primer, (i) sa uzorkom koji ne sadrži imunoglobulin(e), (ii) sa sferama koje nisu obložene antigenom, odnosno, to su neobložene sfere imobilisane na čvrstu podlogu, (iii) materijal čvrste podloge bez fiksiranih sfera, ili (iv) sa uzorkom zdrave osobe ili grupe zdravih osoba. “Pozitivna kontrola” može se dobiti, na primer, pomoću komercijalnog referentnog uzorka, koji sadrži naznačenu količinu analita (odnosno, ukupnog imunoglobulina ili definisanog imunoglobulina specifičnog prema određenom antigen/alergenu), uzorak koji je validiran ili testiran pozitivno u standardnom testu ili sa sferama obloženim specifičnom količinom detektovanog imunoglobulina fiksiranog za čvrstu podlogu.

[0089] Termin "uzorak" odnosi se na praktično svaki tečni uzorak. Uzorak se može dobiti iz bilo kog željenog izvora, kao što je fiziološki fluid, na primer, krv, pljuvačka, tečnost očnog sočiva, cerebrospinalna tečnost, znoj, urin, mleko, ascitna tečnost, sluz, sinovijalna tečnost, peritonealna tečnost, amnionska tečnost, i slično. Uzorak testirane tečnosti može se tretirati pre upotrebe, na primer, izolovanjem seruma ili plazme iz krvi, razblaživanjem viskoznih tečnosti, i slično; postupci tretiranja mogu obuhvatati separaciju, filtraciju, destilaciju, koncentrovanje, inaktivaciju interferirajućih komponenti i dodavanje reagensa. Moguće je koristiti čvrst materijal dobijen modifikacijom tečnog medijuma. Termin se odnosi na svaku telesnu tečnost koji se može primeniti u testu in vitro.

[0090] Termin "ispitanik" ili "pacijent", u značenju koje je ovde primenjeno, označava toplokrvnog sisara, i posebno se odnosi na čoveka ili drugu životinju.

[0091] Termin "biomolekul" odnosi se na svaki organski molekul koji je deo živog organizma. Biomolekul, između ostalog, obuhvata nukleotid, polinukleotid, oligonukleotid, peptid, protein, ugljeni hidrat, glikozilovani molekul, lipid. Termin se takođe koristi u značenju organskog molekula koji imitira strukturu i vezujuća svojstva biomolekula, na primer, aptamer, koji će stoga, kao biomolekul, biti prepoznat od strane istog antitela.

[0092] "Rekombinantna DNK tehnologija" odnosi se na molekularno-biološke postupke pripreme sekvenci rekombinantnih nukleinskih kiselina, kao što su postupci opisani u Laboratory Manuals, urednik Weigel and Glazebrook, 2002 Cold Spring Harbor Lab Press; and Sambrook et al., 1989 Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

[0093] Termin "odstojnik antigena" odnosi se na hemijski veznik koji se može primeniti tako da se uvede intermedijarni sloj, koji uspostavlja definisanu udaljenost između čvrste supstance i vezanog antigena, kao i definisana hemijska svojstva naznačenog intermedijarnog sloja, na primer, u: Bioconjugate Techniques, Greg T. Hermanson, Academic Press, 25.07.2013.

[0094] Cilj predmetnog pronalaska je da obezbedi antigenski čip, koji sadrži sfere obložene antigenom i fiksirane za čvrst nosač. U nekim primerima izvođenja, sfere obložene antigenom su sfere obložene jednim antigenom (na primer, antigen proizveden tehnologijom rekombinantne DNK ili izolovan i prečišćen antigen iz nekog biološkog izvora). U nekim primerima izvođenja, sfere obložene antigenom su obložene setom antigena (na primer, antigeni dobijeni iz ekstrakta, kao što je ekstrakt alergena, antigeni dobijeni iz lizata, kao što je bakterijski lizat, antigeni dobijeni iz ćelijskog ili tkivnog homogenata ili njihove prečišćene frakcije).

[0095] Prva grupa sfera, na primer, vezana je za neki (prvi) detekcioni antigen, proizveden tehnologijom rekombinantne DNK, druga grupa sfera je vezana za različiti (drugi) detekcioni antigen, prečišćen iz biološkog materijala, treća grupa je vezana za set detekcionih antigena koji se razlikuju od prvog i drugog detekcionog antigena, a koji je dobijen iz ćelijskog lizata, četvrta grupa sfera sa sledećim različitim detekcionim antigenima, dobijenim iz ekstrakta, i tako dalje. Dakle, različite grupe sfera obloženih antigenom (populacije sfera) na antigenskom čipu razlikuju se međusobno po antigenu (na primer, detekcionom antigenu ili setu detekcionih antigena) za koji su vezani.

[0096] Grupe sfera koje nose različite detekcione antigene ili set detekcionih antigena mogu se proizvesti iz različitih izvora (na primer, lizata, ekstrakta, rekombinantno) detekcionog antigena, sa različitim tipom sfera (sfere različitih veličina i/ili materijala) i/ili različitim vezanih različitim hemijskim vezama (nekovalentno ili kovalentno vezani antigeni).

[0097] Ovde opisan antigenski čip sadrži najmanje 25 različitih grupa sfera. U nekim primerima izvođenja, opisani antigenski čip sadrži najmanje 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200 ili 250 grupa sfera. U nekim primerima izvođenja, antigenski čip sadrži do 300, 400, 500 ili 1000 grupa sfera. U nekim primerima izvođenja, antigenski čip sadrži između 200 do 500 grupa sfera, poželjno između 250 i 350 grupa sfera.

[0098] U nekim primerima izvođenja, grupe sfera u sastavu antigenskog čipa sadrže sfere koje ne pripadaju samo jednom tipu (na primer, samo od polistirena, samo od 200-500 nm veličine, itd). Grupe sfera u sastavu antigenskog čipa sadrže grupe sa različitim tipovima sfera (na primer, od polistirena dijametra 350 nm, od lateksa dijametra 300-500 nm i staklene sfere dijametra 5-500 nm). Tip hemijske veze se razlikuje kod različitih grupa sfera (na primer, prvi detekcioni antigen/set detekcionih antigena vezan je za prvu grupu sfera pasivnom adsorpcijom, dok je drugi detekcioni antigen/set detekcionih antigena vezan za drugu grupu sfera pomoću kovalentnog veznika. Konkretno, antigenski čip može sadržati prvu grupu sfera sačinjenu od mikrosfera od polistirena, poluprečnika oko 200 nm, gde je prvi detekcioni antigen vezan za površinu pasivnom adsorpcijom, druga grupa sfera koja sadrži mikrosfere od polistirena prečnika oko 500 nm i NH2-površinsku oblogu, gde je drugi detekcioni antigen vezan za površinu preko EGS (etiln-glikol bis(sukcinimidil sukcinat)-unakrsnog veznika, čime se uvodi 12-atomski odstojnik, treća grupa sfera sadrži mikrosfere od polistirena od oko 200 nm u prečniku i COOH-površinsku oblogu, gde je treći detekcioni antigen vezan za površinu sfere preko EDC karbo-dimidnog vezivanja nulte razdaljine.

[0099] U nekim primerima izvođenja, sfere unutar jedne grupe sfera (na primer, populacija sfera obloženih istim detekcionim antigenom ili populacija sfera obložena istim setom detekcionih antigena), obuhvata sfere istog tipa. U nekim primerima izvođenja, sfere unutar jedne grupe sfera (na primer, populacija sfera obloženih istim detekcionim antigenom ili populacija sfera obloženih istim setom detekcionih antigena) obuhvata sfere različitog tipa. Na primer, unutar jedne grupe sfera, neke sfere (prva subpopulacija/tip sfera) imaju prečnik od oko 200 nm, dok neke druge sfere (druga subpopulacija/tip sfera) imaju prečnik od oko 350 nm. U nekim primerima izvođenja, sfere prečnika oko 200 nm preferencijalno su obložene prvim detekcionim antigenom, mešanjem ekstrakta ili lizata (na primer, smeše proteina i drugih molekula) za naznačene sfere od 200 nm, dok su sfere prečnika 350 nm preferencijalno obložene drugim detekcionim antigenom, mešanjem sfera sa istim ekstraktom, prikupljanjem dva tipa sfera obloženih različitim detekcionim antigenima dobijenim iz istog ekstrakta ili lizata, čime se dobija grupa sfera različitih tipova obložena setom detekcionih antigena.

[0100] U nekim primerima izvođenja, opisani antigenski čip je čip alergena, koji se sastoji najmanje od 25, 50, 75 100, 125, 150, 175, 200, ili 250 grupa sfera obloženih detekcionim alergenom (na primer, alergenom koji je proizveden tehnologijom rekombinantne DNK ili prečišćavanjem prirodnog alergena) ili je obložen setom detekcionih alergena (na primer, sfere obložene ekstraktom alergena). U nekim primerima izvođenja, alergenski čip sadrži najmanje 300, 400, 500 ili 1000 grupa sfera. U nekim primerima izvođenja, alergenski čip sadrži od 200 do 500 grupa sfera, poželjno između 250 i 350 grupa sfera.

[0101] U nekim primerima izvođenja, čip alergena sadrži jednu ili više grupa sfera obloženih molekularno/rekombinantno proizvedenim alergenom. Jednu ili više grupa sfera obloženih ekstraktom alergena i/ili jednu ili više grupa sfera obloženih jednim ili više alergena izolovanih i prečišćenih iz biološkog izvora.

[0102] U nekim primerima izvođenja, opisani antigenski ili alergenski čip, sadrži najmanje 200 grupa sfera (na primer, između 200 i 300 grupa sfera), pričvršćenih na čvrstu ploču ili panel (na primer, nitrocelulozna membrana), naznačeno time da čip sadrži (i) grupe sfera (grupa A sfera), svaka grupa (u grupi A sfera) obložena je različitim detekcionim antigenom/alergenom (na primer, grupa 1 obložena je rekombinantno proizvedenim prvim antigenom/alergenom, grupa 2 obložena je drugim antigenom/alergenom prečišćenim iz ekstrakta ili lizata, grupa 3 obložena je rekombinantno dobijenim trećim antigenom/alergenom, itd.) i (ii) grupe sfera (grupa B sfera), gde je svaka grupa (u grupi B sfera) obložena različitim setom detekcionih antigena/setom alergena (na primer, grupa I obložena prvim ekstraktom antigena/alergena dobijenim iz prvog biološkog materijala, grupe II obložene drugim ekstraktom antigena/Alergena dobijenim iz drugog biološkog materijala) i naznačeno time da su grupe sfera (iz grupe A i grupe B) (na primer, sfere od polistirena) veličine od oko 200 do 500 nm (na primer, prečnik od oko 350 nm), dok su detekcioni antigeni/alergeni ili set detekcionih antigena/alergena povezani sa sferama kovalentno i nekovalentno, preko različitih hemijskih veza. U nekim primerima izvođenja, različiti detekcioni antigeni/alergeni ili setovi detekcionih antigena, vezani za sfere pomoću pasivne adsorpcije. U nekim primerima izvođenja, deo detekcionih antigena/alergena ili njihovi setovi vezani su kovalentno, na primer, preko EGS veznika ili EDC vezom.

[0103] U nekim primerima izvođenja, grupa sfera aranžirana je u opisanim antigenskim ili alergenskim čipovima u pravilnom pravougaonom rasporedu redova i kolona. U nekim primerima izvođenja, opisani antigenski i alergenski čipovi dalje sadrže nanete pozitivne i/ili negativne kontrole na određenim mestima na čipu (na primer, marker mesta), koje se onda koriste za lociranje i identifikaciju sfera obloženih antigenom na čipu.

ANTIGENI

[0104] Antigeni su supstance koje su sposobne da izazovu produkciju antitela od strane imunskog sistema. Antigeni su najčešće makromolekuli ili molekuli, kao što su proteini, peptidi, antitela, polisaharidi, RNK, DNK, lipidi, glikozilovani molekuli, ugljeni hidrati, organska i neorganska hemijska jedinjenja, prirodno postojeće modifikacije ovih molekula, aptameri koji su strani domaćinu. Antigeni sadrže jedan ili više imunskih epitopa.

[0105] Ovde opisani antigeni su detekcioni antigeni, odnosno, antigeni koji uslovljavaju reakciju specifičnu za antigen. U nekim primerima izvođenja, detekcioni antigeni su alergeni, infektivni markeri i/ili autoantigeni.

[0106] Alergeni su antigeni koji imaju sposobnost da indukuju reakciju hipersenzitivnosti tipa I kod atopičnih osoba, posredovanu imunoglobulinima E (IgE). Alergeni su derivati ili su sastavni delovi hrane, na primer, mlečni proizvodi (kao što je kravlje mleko), jaja, celer, susam, pšenica, soja, riba, školjke, šećeri (na primer, šećeri prisutni u mesu, kao što je alfa-galaktoza), kikiriki, mahunarke (na primer, pasulj, grašak, soja), koštunjavo voće. Osim toga, alergeni mogu biti sastojci ili derivati nehranljivih životinjskih proizvoda, na primer, prah grinja, krzno i perut, vuna; polen, kao što je polen drveća (na primer, polen breze, polen kedra, polen hrasta, polen jove, polen grabe, polen divljeg kestena, polen vrbe, polen bele topole, polen platana, polen lipe, polen masline, polen kleke, polen đavoljeg drveta), korova (ambrozija, bokvica, kopriva, divlji pelin, pepeljuga, kiseljak), trava (raž, mačji repak); otrov insekata (na primer, otrov pčela, osa, komaraca, žutih mrava itd.), buđ, lateks, metali (na primer, nikl), hemijska sredstva za pranje, deterdženti, lekovi, kozmetička sredstva (na primer, parfemi i drugo), lekovi (na primer, penicillin, sulfonamid, salicilati, itd), terapeutska monoklonska antitela (na primer, cetukimab)

[0107] U nekim primerima izvođenja, alergen je unakrsno-reaktivni alergen. Unakrsno-reaktivni alergeni su alergeni koji potiču iz jednog izvora (na primer, iz breze), a koji su strukturno slični alergenima iz drugog izvora (na primer, iz jabuke). Kada pacijent ispoljava alergiju na neki alergen iz prvoga izvora, onda postoji značajna verovatnoća da će on/on razviti alergiju na drugi izvor. U nekim primerima izvođenja, alergen je marker-alergen. Marker alergen je dominantan alergen specifičnog izvora. U nekim primerima izvođenja, alergen je pan-alergen. Pan-alergeni (na primer, profilini) su prisutni u brojnim izvorima. U nekim primerima izvođenja, alergen je glavni alergen, koji indukuje dominantan Ig odgovor u u populaciji alergijskih pacijenata, dok u drugom primeru izvođenja alergen može biti manjinski alergen, na koji reaguje mali broj alergičnih pacijenata. U nekim primerima izvođenja, alergen je alergen koji ne ispoljava unakrsnu reakciju ni sa jednim drugim alergenom.

Tabela 1. Lista aler ena

[0108] Infekcioni markeri su supstance, kompozicije ili čestice ukazuju na prisustvo infektivnog agensa, kao što su paraziti, bakterije, prioni i gljive.

[0109] Infektivni markeri obuhvataju, bez ograničenja, glikoproteine (na primer, površinske proteine ili proteine bakterijskog zida ili virusnog omotača), smeše proteina (na primer, bakterijski ćelijski lizat), druga detektabilna jedinjenja povezana sa infektivnim agensima ili česticama (na primer, virusima-slične partikule ili proteini viralnog kapsida, bakterijski površinski agensi, itd.).

[0110] Autoantigeni su molekuli koji nastaju u organizmu, na primer, čoveka, a na koje organizam reaguje razvijajući imunski odgovor, koji se sastoji u proizvodnji antitela na autoantigen, odnosno, autoantitela. Primeri autoantigena obuhvataju organ-specifične antigene, kao što su tireoglobulini i rasprostranjene ćelijske antigene, kao što je DNK, histoni, ribonukleoproteinske čestice. Primeri autoantigena koji mogu biti obuhvaćeni antigenskim čipom prikazani su u Tabeli 2.

Tabela 2. Autoantigeni

[0111] Navedeni antigeni, odnosno, detekcioni antigeni opisanog antigenskog čipa, mogu biti antigeni proizvedeni tehnologijom rekombinantne DNK, ili antigeni prečišćeni i izolovani iz biološkog materijala (na primer, antigeni iz biološkog materijala koji ne sadrži druge antigene, koji se mogu izolovati iz istog biološkog materijala postupcima poznatim u stanju tehnike (uporediti Ian R. Mackay & Noel R. Rose, The Autoimmune Diseases, Fifth Edition, Academic Press 2014). U nekim primerima izvođenja, sfere su obložene rekombinantno dobijenim antigenima. U nekim primerima izvođenja, sfere su obložene antigenima koji su izolovani i prečišćeni iz biološkog izvora.

[0112] U nekim primerima izvođenja, antigenski čip sadrži grupu sfera sa setom detekcionih antigena (na primer, najmanje jedan, dva ili više detekcionih antigena). Na primer, set detekcionih antigena može se dobiti iz ekstrakta (na primer, ekstrakta alergena) ili lizata (na primer, bakterijskog lizata ili drugog ćelijskog lizata) biološkog izvora. U nekim primerima izvođenja, sfere su obložene ekstraktom ili lizatom biološkog izvora, čime se dobijaju antigenom obložene sfere sa setom detekcionih antigena.

[0113] U nekim primerima izvođenja, sfere su obložene molekulskim antigenom koji je dobijen tehnologijom rekombinantne DNK. U nekim primerima izvođenja, sfere su obložene alergenom koji je izolovan i prečišćen iz biološkog izvora. U nekim primerima izvođenja sfere su obložene ekstraktom alergena (na primer, setom alergena, kao što je najmanje jedan, dva ili više alergena iz biološkog materijala). Ekstrakt alergena može sadržati sirov ekstrakt; koncentrovani ekstrakt; nekoliko alergena prečišćenih iz ekstrakta alergena). Alergeni su prirodni alergeni. Ekstrakt alergena može sadržati jednu ili više izoformi istog alergena. Ekstrakt alergena takođe može sadržati smešu najmanje dva ekstrakta alergena iz različitih bioloških izvora, na primer, iz dve različite, ali srodne vrste sličnog porekla, koje se obično označavaju kao spp.

Vezivanje antigena pomoću mikro- i nanočestica

[0114] Antigenski čip koji je ovde opisan zasniva se na principu individualno optimizovanih strategija vezivanja heterogenih i složenih bioloških antigena (odnosno, detekcionih antigena). U multipleks imunološkom testu detekcije antitela, ovo je preduslov za postizanje optimalnog učinka za svaki pojedinačni parametar.

[0115] Vezivanje antigena odvija se u dva koraka. U prvom koraku, svaki antigen se vezuje za mikrometarski ili nanometarski suspendovane čestice, odnosno, za mikrosfere ili nanosfere.

[0116] U jednom primeru izvođenja, ove čestice su sferične čestice koje se čuvaju u vodenom rastvoru pufera, kao što su puferi koji se uobičajeno koriste za proteine ili za čuvanje biomolekula. Čestice mogu biti čestice od lateksa ili polistirena, plastične polimerne čestice ili čestice od stakla (silika), čestice sa poroznom ili neporoznom površinom, ili čestice načinjene od biokompatibilnih polimera. Veličina ovih čestica može varirati od nekoliko nanometara do jednog mikrona, pri čemu je poželjna veličina čestica između 5 i 500 nm u prečniku, poželjnije između 200 i 500 nm, još poželjnije između 200 i 350 nm (na primer, oko 350 nm) u prečniku. U nekim primerima izvođenja, sfere su od nanočestice načinjene od polistirena.

[0117] Vezivanje antigena (proteina, peptida, antitela, DNK i drugih biomolekula sačinjenih od nukleinskih kiselina, amino kiselina ili organskih i neorganskih hemijskih jedinjenja, koji mogu biti antigeni), može se obaviti primenom različitih strategija vezivanja.

[0118] U najjednostavnijem primeru izvođenja, antigeni molekul ili makromolekul se vezuje za česticu (sferu) pasivnom adsorpcijom, na primer, hidrofobnim i/ili elektrostatičkim vezivanjem. Vezivanje se može olakšati izborom odgovarajućeg pufera koji obezbeđuje uslove koji pogoduju maksimalnom vezivanju, na primer, izborom odgovarajućeg puferskog sistema čiji je pH sličan izoelektričnoj tački antigena, čime se neutrališe površinsko naelektrisanje.

[0119] U složenijem obliku, antigen koji se vezuje sastoji se ili od različitih molekula koji nose antigene, ili od jednog makromolekula koji na sebi ima nekoliko epitopa za vezivanje antitela ili od složene smeše različitih proteina sa pojedinačno različitim antigenima koji sadrže različite epitope (na primer, ekstrakt ili lizat biološkog materijala koji sadrži set detekcionih antigena), koji mogu zahtevati različite uslove kako bi se postiglo optimalno biološko vezivanje (afinitet) putem adsorpcije. Tada se antigen ili smeša antigena mogu podeliti u nekoliko alikvota, i svaki alikvot se može vezati pod posebnim uslovima, na primer, u puferima različitog pH ili jonske jačine ili u prisustvu različitih puferskih aditiva, kao što su soli, deterdženti, puferske supstance itd. U različitim uslovima se pojedinačni antigen vezuju u poželjnoj konfiguraciji koja je optimalna za održavanje biološke aktivnosti, ili se deo antigena može ili ne može lakše vezati od druge subpopulacije, pod izabranim uslovima. U narednom koraku, razdvojeni alikvoti se ponovo spajaju, čime se dobija populacija mikro- i nanočestica koje nose različite antigene iz iste polazne složene smeše, ili isti antigen u različitim strukturnim konfiguracijama. Na ovaj, na česticama će biti vezan ceo repertoar postojećih očuvanih epitopa iz biološkog uzorka, umesto vezivanja samo ograničenog broja očuvanih originalnih epitopa ili vezivanja samo određenog broja antigenih nosača iz složene smeše.

[0120] Izborom nekoliko različitih uslova vezivanja i optimizovanjem smeša različito vezanih kombinacija čestica-antigen, dobijeni rastvor čestica obloženih antigenima sakupiće pun repertoar epitopa početne smeše, ili će biti obogaćeni poželjni nosači antigena u rastvoru, uz očuvanje pune složenosti epitopa.

[0121] U još složenijem primeru izvođenja, antigeni se mogu vezati različitim hemijskim vezama koje su poznate u stanju tehnike. Antigeni se za čestice mogu vezati kovalentno, a moguće je selektivno vezati antigene za određene hemijske grupe prisutne na površini antigena, na primer, za neku amino ili karboksilnu ili sulfhidrilnu grupu ili ostatak aromatične amino kiseline, itd.

[0122] Takođe je moguće primeniti pogodne odstojnike antigena, kako bi se poboljšala prezentacija antigena, posebno u slučaju rada sa malim antigenima, kao što su peptidi ili hemijska jedinjenja.

[0123] Primenom hemijskog površinskog inženjerstva, površine čestica je moguće dodatno poboljšati vezivanjem sfera za površinu čvrstog nosača, smanjiti nespecifično vezivanje ili pojačati vezivanje antitela.

[0124] U nekim primerima izvođenja, detekcioni antigen ili set detekcionih antigena je kovalentno vezan za sfere (na primer, preko EGS veznika za NH2grupe na površini sfera, preko EDC veznika za COOH grupe na površini sfera). U nekim primerima izvođenja, detekcioni antigen ili set detekcionih antigena je ne-kovalentno vezan za sfere. Na primer, sfere mogu biti obložene antigenom ili setom detekcionih antigena, postupkom pasivne adsorpcije.

[0125] Moguće je prilagoditi veličinu čestica potrebama procesa proizvodnje. Čestice treba da budu lake za rukovanje i održavanje u rastvoru, a u isto vreme je potrebno da se vežu specifično ili nespecifično kada se nanesu na čvrstu podlogu. Nakon vezivanja antigena za čestice, obložene čestice mogu se razdvojiti od preostalog rastvora nevezanih antigena centrifugiranjem, magnetnim razdvajanjem, u električnom polju ili ekskluzionom hromatografijom. Ova separacija omogućava da se razdvoji frakcija pogodno vezanih antigena, a da se ostatak, potencijalno ne-antigenih frakcija iz originalne smeše antigena, odbaci.

[0126] Čestice obložene antigenom je moguće funkcionalno testirati, i tako dobijene rezultate uporediti sa rezultatima standardnih testova in vitro dijagnostičkih postupaka, ili sa referentnim kliničkim podacima ili dostupnim standardnim preparatima. S obzirom na to da postoje prihvaćeni laboratorijski standardi za samo nekoliko antigen-specifičnih IgE antitela, jedan dostupan referentni sistem predstavljaju Biorad Lyphocheck® uzorci za kontrolu kvaliteta, koji se najčešće koristi za testiranje IgE antitela na glavne alergene u tri najčešće korišćene instrumentacije za automatske imunoeseje (www.bio-rad.com).

[0127] Stepen vezivanja antigena može se proveriti različitim postupcima poznatim u stanju tehnike. Na primer, supernatant dobijen nakon reakcije vezivanja antigena za čestice može se analizirati ELISA testom, takođe se može meriti ukupan sadržaj preostalih proteina, ili se supernatant može testirati 1D- ili 2D-gel elektroforezom, čime se proverava kako ukupan sadržaj nevezanih antigena u supernatantu, tako i priroda nevezanih i vezanih nosača (to jest, onih koji nisu prisutni na gelu, na osnovu veličine/pozicije proteinskih pikova ili tačaka). Supernatant se može analizirati masenom spektrometrijom, po potrebi.

[0128] Na sličan način se može testirati stabilnost vezivanja. Na primer, vezivanjem antigena za čestice i testiranjem dobijenog supernatanta (rastvora bez čestica) u definisanim vremenskim tačkama, može se utvrditi da li antigeni ostaju trajno vezani za čestice ili, se nakon određenog vremena ili određenih uslova u kojima se čuvaju, pufera ili deterdženata, vraćaju natrag u rastvor.

Čuvanje sfera obloženih antigenom i postupanje nakon proizvodnje

[0129] Obložene sfere mogu se skladištiti pod uslovima koji pogoduju stabilizaciji proteinskih veza u česticama, i održavati najmanje nekoliko meseci do nekoliko godina nakon inicijalnog vezivanja, sa dva osnovna cilja, od kojih je prvi da se održe vezani antigeni za čestice, i drugo i važnije, da im se očuva biološka aktivnost i da se zaštite od degradacije, kao što je degradacija proteolitičkom digestijom. S obzirom na to da se sfere moraju čuvati u rastvoru, potrebno je sprečiti njihovo taloženje, jer bi ono dovelo do formiranja nerastvorljivih agregata i blokiranja ili smanjenja ukupnog repertoara epitopa prisutnih u originalnom rastvoru antigena, bez korišćenja oštrih i za antigene potencijalno štetnih postupaka (grejanje, smicanje, sonikacija, vorteksovanje, itd.)

[0130] Navedeni postupak predstavlja značajno poboljšanje postupka proizvodnje imunoeseja, s obzirom na to da se -80°C, reagensi mogu skladištiti tokom dužeg vremena ili neograničeno. Postojanje stabilnog seta primarnih reagenasa veoma je važno za proces proizvodnje, jer dobar reagens, stabilan tokom dužeg vremena znatno umanjuje napore u vezi sa kontrolom kvaliteta celog procesa. S druge strane, kada se vezivanje odvija neposredno pre upotrebe, u kratkim intervalima, nakon svakog procesa vezivanja je potrebno izvršiti kontrolu kvaliteta i popuniti odgovarajuću dokumentaciju. I nakon toga opet postoji izvesna mogućnost postojanja varijacija u procesu vezivanja ili prethodnog oštećenja rastvora antigena, koje je teže čuvati tokom dužeg vremena nego što je to slučaj sa antigenima koji su adsorbovani na površinu čestica. Poznato je u stanju tehnike da se proteini ne mogu trajno čuvati u običnim rastvorima, čak ni kada se čuvaju na niskoj temperature, zato što ponovljeno mržnjenje i odmrzavanje mogu štete konformaciji proteina, koji se uz to mogu staložiti ili agregirati. Suprotno tome, stabilnost površinski vezanih proteina značajno je veća, čak i kada se čuvaju pod manje povoljnim uslovima.

[0131] Uslovi od kojih zavisi rok trajanja vezanih proteina obuhvataju temperaturni opseg, uobičajeno ili -20°C ili opseg 2-8°C, poželjno 2-4 °C.

[0132] Puferi koji mogu biti korisni za čuvanje opisanih sfera obloženih antigenom obuhvataju, bez ograničenja, običan rastvor NaCl, fosfatne pufere, Tris pufer, MES pufer, citratni pufer, HEPES pufer, itd.

[0133] Uslovi pH obično su u fiziološkom opsegu, između pH 7- 8, ali takođe mogu biti u opsegu pH 6 - 9 ili čak u opsegu pH 2- 14.

[0134] Aditivi koji produžavaju trajanje obuhvataju, bez ograničenja: ne-jonske deterdžente, kao što su Tween-20, SDS, Triton i druge.

[0135] Rast bakterija i gljivica u preparatu tokom skladištenja može se sprečiti primenom natrijum azida, katjona ili drugih prezervativa.

[0136] Za stabilizaciju čestica u rastvoru i proteina na česticama, mogu se primeniti glicerol, polivinil alkohol i drugo.

[0137] Za dodatnu stabilizaciju proteina od strukturne degradacije mogu se primeniti polisaharidi, kao što je trehaloza, saharoza i dr.

[0138] Za dodatnu stabilizaciju proteina nakon vezivanja čestica za čvrstu fazu, moguće je primeniti šećere.

Nanošenje sfera obloženih antigenom na površinu čipa

[0139] Transfer sfera iz rastvora na čvrstu fazu može se sprovesti primenom nekoliko postupaka poznatih u stanju tehnike. Cilj ovih postupaka je da se rastvor sa grupom čestica obloženih antigenom (grupe sfera) poređa u uređeni niz prostorno organizovanih elemenata (različiti molekulski entiteti na definisanim mestima na čipu), tako da se nakon inkubacije sa biološkim uzorkom koji sadrži antigen, na primer, sa serumom pacijenta, i odgovarajuće detekcije vezivanja, detektovani signal može povezati sa odgovarajućim antigenim izvorom.

[0140] Glavni postupci nanošenja tečnosti iz rastvora na čvrstu podlogu su kontaktni ili nekontaktni postupci. Kod kontaktnih postupaka obično se koriste pečat ili igla koji se više puta uranjaju u tečnost, a prikupljeni materijal koji se apsorbovao na pečat ili iglu nanosi se na čvrstu podlogu. Ovaj postupak, iako je jednostavniji, ima značajne nedostatke, koji se odnose na prilagodljivost i reproducibilnost, jer kvalitet postupka zavisi od prirode pečata i tečnosti, od vlažnosti čvrste faze, viskoznosti, sastava tečnosti i dr.

[0141] Stoga se, u mnogim savremenijim primenama koriste nekontaktni postupci. Za opisane čipove može se koristiti sistem nanošenja solenoidom, u kojem špric generiše pritisak tečnosti koja sadrži rastvor sa antigenom, a vremenski precizno otvaranje solenoidnog ventila omogućava tačno oslobađanje ujednačenih kapljica kroz keramički vrh. Kapljica se izbacuje kroz keramički vrh i nakon slobodnog pada kroz vazduh, vezuju se za čvrstu fazu. Ako se čvrsta faza ispod statičnog keramičkog vrha polako kreće (ili obrnuto, ako se vrh kreće iznad čvrste faze, duž motorizovane osovine motorizovane ose), moguće je formirati pravilan niz postepeno nanetih rastvora. Kapljice je takođe, moguće naneti pomoću piezo-elementa, pri čemu je osnovna razlika u odnosu na prethodno opisani postupak to što se pritisak ne povećava u špricu, već zahvaljujući električnom pulsu primenjenom na piezo kristal, i to što se na ovaj način nanosi znatno manja zapremina, koja se kreće u pikolitarskom opsegu, dok nanošenje pomoću solenoida pogoduje nanolitarskom opsegu zapremine kapljica.

[0142] Poželjno je da su formirane kapljice prečnika oko 1 mm, i da imaju kružni oblik na čvrstoj podlozi (razdvojeni molekulski entiteti kao elementi sa definisanim pozicijama) od približno 1 mm u prečniku. Držeći se ovih veličina, moguće je kreirati nizove 10×10 (ukupno 100) različitih antigenih površina po kvadratnom centimetru. Količina tečnosti naneta na ovaj način na čvrstu podlogu iznosi oko 30 nl po kapljici, ali ona može varirati od 1 do 200 nanolitara, ili može biti i veća. Tačke koje sadrže specifičnu grupu sfera obloženih antigenom identifikuju se na osnovu lokacije/pozicije (prostorno definisane pozicije) i mogu se urediti u niz pravougaonog oblika, odnosno, u mrežu. Opisani čipovi imaju 1 do 9 prostorno definisanih elemenata po mm<2>, na primer, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ili 9 prostorno definisanih elemenata po mm2.

[0143] Na kvalitet nanetih tačkica (homogenost, oblik, tolerancija pozicije, itd.) i na kvantitativnu reproducibilnost izraženu kroz koeficijent varijacija merenja utiču sledeći faktori: udaljenost od cilja, pritisak u kanalu; trajanje otvorenosti ventila; zapremina kapljice, brzina kretanja klipa; vreme između dva nanošenja; keramički vrh tokom postupka i između postupka čišćenja i održavanja; postupci koji prethode nanošenju kapljica; zapremina aspiracije i brzina aspiracije; geometrija mikrotitarske ploče. Tokom procesa nanošenja neophodno je da se čestice sa antigenom nalaze u rastvoru sve dok su unutar sprave za nanošenje tečnosti i da se izbegne kontaminacija tokom nanošenja različitih sfera, temeljnim čišćenjem kanala za tečnost između dva ciklusa usisavanja i nanošenja.

[0144] Da bi se postigao nivo nulte greške u postupku nanošenja, važno je da se greške nanošenja lako uočavaju, na primer, dodavanjem privremene boje u rastvor sa česticama, koja bi omogućila detekciju uspešnog nanošenja tečnosti na čvrstu fazu, a zatim bi se isprala tokom postupka testiranja. Dodavanjem boje u rastvor moguće je detektovati prazno mesto, koje će biti dopunjeno nakon završene prve runde nanošenja, što bi uslovilo 100% nanošenjem predviđene serije.

Čvrsta podloga

[0145] Čestice se nanose na veće panele ili ploče od čvrstog materijala, tako da se svaki niz sastoji od nekoliko stotina do nekoliko hiljada identičnih nizova. Ovaj neprekidni postupak se postiže postrojavanjem u istoj liniji velikog broja kanala za nanošenje tečnosti i pomeranjem kontrolisanim pomeranjem čvrste podloge ili pomoću sistema namotavanja ispod vrhova za nanošenje i vremenskog usaglašavanja pozicije podloge i nanošenja čestica, tako da se dobije pravilan raspored tačkica na čvrstoj podlozi.

[0146] Nakon nanošenja, čvrsta podloga se iseca na potrebnu veličinu, kako bi se dalje povezala i skladištila. Alternativno, čvrsta podloga se pre nanošenja sfera obloženih antigenom može prvo iseći na manje delove potrebne veličine, pri čemu veličina delova odgovara broju grupa čestica koje će biti nanete na podlogu i gustine nanošenja pojedinačnih grupa. U poželjnom primeru izvođenja, jedinična čvrsta podloga je pravougaonog oblika, veličine između 5×5 mm i 200×200 mm ili veće, poželjno između 10×10 mm i 20×30 mm.

[0147] Čvrsta podloga može biti načinjena od nitroceluloze, laminirane nitroceluloze ili diazopapira ili organskih polimera, kao što su polistiren, polietilen, polipropilen, polifluoreoetilen, polietilenoksi, polivinilidin difluorid (PVDF), poliakrilamin, polikarbonat, polialomer, polivinil, najlon, kao i kopolimera i njihovih graftova, ili druge funkcionalizovane plastike. Čvrsta podloga može takođe biti od neorganskog materijala, kao što su staklo, silicijum dioksid, staklo sa kontrolisanom veličinom pora, ili reverzno-fazna silika. Konfiguracija čvrste podloge može biti u obliku membrane ili površine, koja je ravna, suštinski ravna ili nije ravna. Čvrste podloge mogu biti porozne ili ne-porozne, i mogu imati sposobnost da bubre ili da ne bubre.

[0148] Čvrsta podloga može biti porozna ili neporozna, sa sposobnošću da zadrži čestice obložene proteinskim antigenima. Na primer, paneli od nitroceluloze ili laminirane nitroceluloze mogu se koristiti kao čvrsta faza, pri čemu veličina pora i tačan sastav nitroceluloze mogu značajno uticati na učinak testa. Čak i hemijska aktivacija nitroceluloze sa ciljem kovalentnog vezivanja biomolekula, može imati značajan pozitivan uticaj na rezultate testa. Kao čvrsta podloga mogu da se koriste različite nitrocelulozne membrane, koje se razlikuju prema veličini pora, brzini protoka i osnovnom gradivnom materijalu. Poželjno je da je veličina pora na čvrstoj podlozi u opsegu veličine čestica, tako da pore mogu da zadrže čestice na površini, ali da se u isto vreme, ne utope u strukturu čvrste podloge, što bi otežalo vezivanje antitela za površinu čestica.

[0149] Čvrsta faza treba da bude izdržljiva i da bude kompatibilna sa ELISA testom, koji podrazumeva nekoliko sati inkubacije i ispiranja vodenim rastvorima. Poželjno je da je bazalni nivo ne-specifičnog vezivanja za čvrstu podlogu mali, ili da se to ne-specifično vezivanje može blokirati, kako bi se postigao potreban odnos intenziteta signala i šuma (signal podeljen standardnom devijacijom šuma).

Čuvanje testova i montiranje uloška

[0150] Čestice se stabilizuju nakon nanošenja na čvrstu podlogu, čuvanjem podloge na odgovarajućoj temperaturi, poželjno u opsegu 2-8°C. Stabilizujući efekat je dodatno moguće postići dodavanjem šećere ili drugih supstanci sa stabilizujućim efektom u vidu premaza u spreju. Očekivani standard stabilnosti iznosi najmanje jednu godinu nakon proizvodnje, poželjno najmanje 30 meseci nakon proizvodnje, a to ostavlja prostor od 6 meseci nakon proizvodnje za isporuku krajnjem korisniku i ostatak od 24 meseca roka upotrebe u posedu krajnjeg korisnika.

[0151] U smislu praktične primene, čuvanja i transporta, kao i samog pakovanja, isečene trake čvrste podloge sklapaju se u uložak, koji će biti detaljnije opisan. Uložak pruža fizičku zaštitu čvrste podloge mikročipa, a takođe ima ulogu funkcionalnog kontejnera koji omogućava automatsku obradu testova, lakše rukovanje tečnom fazom i uklanjanje potencijalno kontaminiranog materijala.

Postupak testiranja

[0152] Sledi opis in vitro postupaka detekcije imunoglobulina specifičnih za detekcioni antigen ili set detekcionih antigena, primenom opisanog antigenskom čipa. Konkretno, postupak obuhvata (i) Obezbeđivanje opisanog antigenskog čipa,

(ii) Inkubaciju čipa sa uzorkom,

(iii) Inkubaciju čipa sa detekcionim reagensom,

(iv) Opciono, inkubaciju čipa sa reagensom za razvijanje signala, i

(v) Merenje detektabilnog signala.

[0153] Intenzitet detekcionog signala koji je veći od intenziteta negativne kontrole ukazuje na prisustvo imunoglobulina u uzorku, dok odsustvo razlike između merenog signala i negativne kontrole ukazuje na odsustvo imunoglobulina u uzorku.

[0154] U nekim primerima izvođenja, detektabilan signal je kolorimetrijski, fluorescentni, električni ili hemiluminescentni signal.

[0155] Opisani biološki esej može se primeniti u detekciji specifičnih imunoglobulina razvijenih prema mnoštvu antigena, tokom jednog analitičkog postupka, koji se u osnovi zasniva na principu funkcionisanja ELISA testa i obično se sastoji od sledećih osnovnih koraka:

1) Ispiranje

2) Blokiranje

3) Inkubacija sa uzorkom

4) Ispiranje

5) Inkubacija sa detekcionim reagensom

6) Ispiranje

7) Opciono: Inkubacija sa reagensom za razvijanje signala

8) Opciono: Zaustavljanje produkcije signala

9) Detekcija i merenje

[0156] U nekim primerima izvođenja, postupci za detekciju imunoglobulina koji su specifični prema antigenu ili setu detekcionih antigena (na primer, jedan alergen ili set alergena) primenom opisanog antigenskog čipa, obuhvata

(i) Obezbeđivanje opisanog antigenskog čipa (na primer, čipa alergena),

(ii) Inkubiranje čipa sa uzorkom (na primer, serumom ili ukupnom ili prerađenom krvlju), (iii) Inkubiranje čipa se detekcionim reagensom (na primer, anti-IgE ili anti-IgG antitelo ili neki IgE-specifičan ili IgG-specifičan aptamer direktno obeležen nekim detektabilnim signalom, anti-IgE ili IgG antitelo ili neki IgE-specifičan ili IgG-specifičan aptamer konjugovan sa enzimom)

(iv) Opciono, inkubiranje čipa sa reagensom za razvijanje signala (na primer, supstrat enzimske reakcije),

(v) Opciono, dodavanje rastvora za zaustavljanje reakcije, i

(vi) Merenje detektabilnog signala.

[0157] U ovom kontekstu, uzorak može biti serum ispitanika, ukupna ili prerađena krv, nazalna tečnost, urin, ostale telesne tečnosti ili ćelijski lizati ili homogenati izolovani iz tkiva, itd. Uzorak može biti uzet od jednog ispitanika ili od grupe ispitanika (na primer, skup uzoraka od 10, 20, 30 ispitanika, u slučaju skrininga veće populacije ispitanika). U nekim primerima izvođenja, uzorak je krv ili derivat (na primer, serum). U nekim primerima izvođenja količina uzorka varira između 1 μl -2000 μl, na primer, 1 μl do 10 μl, 10 μl do 50 μl, 50 μl do 100 μl, 100 μl do 500 μl, 500 μl do 2000 μl. U nekim primerima izvođenja, količina uzorka može biti 1 μl, 2 μl, 3 μl, 4 μl, 5 μl, 10 μl, 20 μl, 50 μl, 100 μl, 250 μl, 500 μl ili 1000 μl ili 2000 μl. U nekim primerima izvođenja, uzorak je nerazblažen. U nekim primerima izvođenja, uzorak je razblažen. U nekim primerima izvođenja, razblaženje uzorka je od 1:1 do 1:10, 1:10 do 1:100, između 1:100 i 1:1000 ili između 1:1000 i 1:10000. U nekim primerima izvođenja, razblaženje uzorka je 1:10, 1: 100, 1:1000 ili 1:10 000. Količina uzorka zavisi od stepena razblaženja uzorka koji se koristi u reakciji inkubacije.

[0158] Priroda biološkog uzorka ne bi trebalo značajnije da utiče na učinak testa, čak i onda kada uzorak nije u savršenom stanju, a to se često dešava tokom sa rutinski dobijenim laboratorijskim uzorcima krvi. Najčešći problem su lipemični, hemolitički ili iterički uzorci, zatim uzorci sa visokim sadržajem proteina ili uzorci sa visokim sadržajem antitela (IgG, IgE, ostala antitela).

[0159] Detekcioni reagens je reagens biološkog porekla koji ispoljava visok afinitet vezivanja, poželjno, na primer, antitelo (na primer, detekciono antitelo), dobijeno imunizacijom ili veštačkom selekcijom nasumičnih biblioteka. Afinitetni veznici mogu biti veštački selektovani proteini ili nukleinske kiseline, kao što su aptameri i afitela.

[0160] Korak prethodnog ispiranja (i) treba da ukloni sve čestice koje su prolazno vezane za čvrstu fazu, a koje bi mogle biti u kompeticiji za vezivanje antigena vezanih za čvrstu fazu i solubilnih antigena tokom naredne faze inkubacije sa uzorkom.

[0161] Načelno, korak ispiranja nije jedan korak, već se najčešće ponavlja više puta, kako bi se celokupan višak reagensa uklonio ispod nivoa detekcije. Konkretno, ispiranje se može ponoviti 3-5 puta, pri čemu treba voditi računa da se izlivanjem uloška i dodavanjem novog svežeg rastvora za ispiranje, zapremina razblažuje do 30 puta, tako da je nakon tri runde ispiranja razblaženje oko 1 u 27 000, a svaki dodatni korak ispiranja povećava razblaženje za faktor 30.

[0162] Cilj blokiranja je da se umanji nespecifično vezivanje, kako komponenti prisutnih u uzorku, kao što su antitela koja nisu specifična za imobilisani antigen, tako i nespecifično vezivanje detekcionog reagensa.

[0163] Blokiranje se može obaviti pre inkubacije sa uzorkom, ili se može ponoviti pre svakog sledećeg koraka, ili se sredstvo za blokiranje može dodati u razblaženi uzorak ili detekcioni reagens (na primer, detekciono antitelo, aptamer ili afitelo), koji mogu sadržati sredstvo za blokiranje.

[0164] Sredstvo za blokiranje je bilo koja supstanca biološkog ili drugog porekla, koja otežava neželjeno ili nespecifično vezivanje, koje se obično dešava sa složenim biološkim uzorcima, kao što su krv ili serum i brojnih antigena na čvrstoj podlozi. Sredstvo za blokiranje poželjno ne sadrži antigene proteine, koji bi inače mogli da povećaju nespecifično vezivanje i smanje odnosa intenziteta specifičnog signala prema šumu.

[0165] Primera radi, albumin goveđeg seruma (BSA), koji se često koristi u rutinskom ELISA testu, za stabilizaciju ili blokiranje, nije pogodan za detekciju kada su u pitanju humani IgE i IgG, s obzirom na to da je BSA potencijalni alergen iz hrane i čest induktor ne-relevantnih IgG antitela kod ljudi koji često konzumiraju mlečne proizvode i juneće meso. Stoga, svako vezujuće mesto blokirano BSA molekulima može da ima veće nespecifično vezivanje nego inače, ukoliko se u uzorcima nalaze anti-BSA antitela detektovane potklase. Iz sličnih razloga nije moguća upotreba ekonomičnih i dostupnih sredstava za blokiranje, koji se uobičajeno koriste u drugim oblastima.

[0166] Stoga, kada se koriste blokatori proteina, oni ne bi trebalo da budu imunogeni za ljude, a jedan primer je albumin čovečjeg seruma, za koji se ne vezuje za humana antitela.

[0167] Alternativni postupci blokiranja obuhvataju deterdžente, šećere, polialkohole ili neka druga jedinjenja koja mogu da destabilizuju slabe veze između vezujućih partnera, koje nisu ni jake ni specifične, kao što je to antigen-antitelo vezujući kompleks (sa konstantnom afiniteta koja uobičajeno iznosi 10<-9>M ili manje).

[0168] Korak inkubacije sa uzorkom ili detekcionim reagensom (na primer, detekcionim antitelom) najčešće odnosi najveći deo vremena tokom postupka testiranja, pri čemu vreme inkubacije obično iznosi od nekoliko minuta do nekoliko sati. Poželjno, inkubacija sa uzorkom traje manje od dva sata, dok inkubacija sa detekcionim reagensom traje manje od 30 minuta. U slučaju kada detekcioni reagens već nosi beleg, korak razvijanja signala se može preskočiti. Inače, naročito onda kada se koristi enzimsko razvijanje signala, vreme potrebno za razvijanje signala je kraće od 5 minuta.

[0169] Sadašnji dizajn uloška omogućava snažno mešanje tečnosti tokom inkubacije, čime se uzorak meša i povećava se protok mase afinitetnog reagensa prema odgovarajućim antigenima. Poželjno je da se mešanje odvija duž duže strane uloška, koja je strma da ne dozvoli prelivanje tečnosti preko graničnika, i dovoljna čvrsta da poveća kinetiku reakcije u odnosu na inkubiraju bez mešanja.

[0170] Alternativno, odvijanje testa se može pospešiti ili kontrolisati promenom temperature ili elektromagnetskim talasima koji efikasnije mešaju tečnost.

Detekcija i merenje

[0171] Detektabilni signal se može dobiti na više načina, koji su poznati u stanju tehnike. U najjednostavnijoj formi, obeležen je detekcioni reagens koji se vezuje za antigena mesta sa specifično vezanim imunoglobulinom, a beleg je boja ili ekscitabilno jedinjenje, kao što je fluorescentna boja ili zlatna nanočestica ili obojena lateks nanočestica ili slično. U takvim slučajevima, postupak detekcije ne zahteva dodatne korake u cilju razvijanja signala, a signal se može očitati direktno nakon ispiranja nevezanog detekcionog reagensa.

[0172] U poželjnom primeru izvođenja, primeniće se enzimsko razvijanje signala, uz pomoć detekcionog agensa koji je konjugovan sa enzimom, koji pretvara supstrat, koji se nalazi u sastavu reagensa za razvijanje signala, u detektabilni signal.

[0173] Enzimi konjugovani za detekcioni reagens obuhvataju, bez ograničenja, alkalnu fosfatazu (AP), peroksidazu rena (HRP) ili beta-galaktozidazu (GAL). Ovi enzimi, razlaganjem supstrata (kao što je NCIB/NBT, formiraju obojene precipitate ili mogu da formiraju fotone konverzijom luminofore (na primer, Lumingen APS-5), ili mogu da konvertuju supstrat tako da se promeni koeficijent ekstinkcije na određenim talasnim dužinama, na primer, o-nitrofenil-beta-D-galaktopiranozidaza.

[0174] Kada je neophodno, enzimska reakcija se može odmah zaustaviti, dodavanjem supstance koja snažno interferira sa enzimskom aktivnošću, pomoću takozvanog rastvora za zaustavljanje reakcije (na primer, destilovana voda, EDTA, NaOH, HCl i drugo).

[0175] U nekim primerima izvođenja, detekcioni reagens je anti-humano IgE antitelo direktno vezano za obojeno jedinjenje, zlatne nanočestice ili obojene lateks nanočestice ili vezano sa nekim ekscitabilnim jedinjenjem. U nekim primerima izvođenja, detekcioni reagens je anti-humano IgG antitelo, direktno vezano sa bojom, zlatnom nanočesticom, obojenom lateks nanočesticom ili sa nekim ekscitabilnim jedinjenjem. U nekim primerima izvođenja, detekcioni reagens je aptamer ili afitelo koje specifično prepoznaje humana IgE ili IgG antitela, pri čemu je aptamer ili afitelo direktno obeleženo bojom, zlatnom nanočesticom, obojenom lateks nanočesticom ili ekscitabilnim jedinjenjem. U nekim primerima izvođenja, detekcioni reagens je anti-humano IgE ili IgG antitelo konjugovano s enzimom (na primer, AP, HRP ili GAL), i postupak uključuje inkubaciju čipa sa reagensom za razvijanje signala (na primer, supstrat enzimske reakcije), saglasno koraku (iv) prethodno opisanog postupka, i opciono, dodavanje rastvora za zaustavljanje (na primer, ddH2O, EDTA, NaOH, hlorovodonična kiselina, sumporna kiselina ili neki reagens koji ometa enzimsku reakciju, bilo da potpuno sprečava odvijanje reakcije promenom pH neophodne za katalitičku reakciju, bilo degradacijom ili hemijskom promenom supstrata, bilo blokiranjem aktivnog mesta enzima, ili usporavanjem reakcije na beznačajan nivo, na primer, prema koraku (iv).

[0176] U nekim primerima izvođenja, detekcioni reagens sadrži dve komponente: (i) prva komponenta sadrži anti-IgE ili anti-IgG antitelo; i (ii) druga komponenta sadrži reagens koji prepoznaje anti-IgE ili anti-IgG antitelo, pri čemu je drugi reagens direktno obeležen bojom ili ekscitabilnim jedinjenjem, ili je konjugovan s enzimom i, naznačeno time, antigenski čip se inkubira sa (i) i zatim sa (ii), prema koraku (iii) opisanog postupka (uz korake ispiranja između). Na primer, prva komponenta može biti neko anti-IgE ili anti-IgG antitelo specifičnog tipa, kao što su antitela dobijena iz organizama, na primer, pacova, miša, zeca, itd i druga komponenta može biti antitelo koje se vezuje za navedeno antitelo, na primer, anti-pacovsko, anti-mišje, anti-zečje antitelo, itd.

[0177] Posebno je obezbeđen in vitro postupak detekcije IgE antitela, povezanih sa alergijama koji se sastoji od,

(i) Obezbeđivanja opisanog antigenskog čipa,

(ii) Inkubacije čipa sa uzorkom (na primer, serum ili ukupna krv ili prerađena krv),

(iii) Inkubiranja čipa sa anti-IgE antitelom ili anti-IgE aptamerom direktno obeleženim detekcionim signalom ili anti-IgE ili anti-IgE aptamerom konjugovanim sa enzimom (na primer, konjugovani sa AP, HRP ili GAL),

(iv) Opciono, inkubiranja čipa sa reagensom za razvijanje signala (na primer, supstrat enzimske reakcije),

(v) Opciono, dodavanja rastvora za zaustavljanje, kako bi se prekinulo razvijanje signala (na primer, ddH2O, EDTA, NaOH, hlorovodonična kiselina, sumporna kiselina ili neki drugi reagens koji ometa enzimsku reakciju), i

(vi) Merenja detektabilnog signala. Obojeni signal se može detektovati običnom CCD kamerom, CMOS kamerom, skernirajućim laserom, kao što je konvencionalni položeni skener, ili bilo kojom spravom koja može da meri intenzitetsku razliku između najčešće bele ili transparentne podloge i obojenih reakcionih mesta, na kojima se detektuje reakcija vezivanja. U slučaju detekcije i merenja fotona, potrebna je kamera dovoljne osetljivosti ili uređaj sa fotomultiplikacijom, kako bi se merili pojedinačni događaji.

[0178] Za potrebe kvantifikacije merenja, najpre je potrebno identifikovati tačkice na kojima se nalaze pojedinačni imobilisani antigeni. Proces identifikacije može biti olakšan postojanjem šablona pozitivnih kontrolnih tačaka koje uvek daju pozitivan signal, a takva se nazivaju marker tačke. Na primer, tačka pozitivne kontrole može biti grupa sfera povezana sa prečišćenim humanim IgE antitelom. Na osnovu pozicije i orijentacije ovih marker tačaka, moguće je odrediti relativnu poziciju svih ostalih tačaka na čvrstoj podlozi, kao i njihovu veličinu, a takođe i njihovu poziciju na slici ili u nizu podataka merenja.

[0179] Za svaku, najčešće okruglu površinu na kojoj su imobilisane sfere obložene antigenom, intenzitet signala se integriše sabiranjem svih piksela koji se nalazi na očekivanoj površini probe i ukupnog signala, dok se pikseli van očekivane površine pripisuju pozadini. Takođe je moguće izračunati srednju vrednost, medijanu i standardnu devijaciju, kako za intenzitet signala, tako i pozadine. Sva izračunavanja obavljala bi se obradom slike pomoću analitičkih softverskih paketa poznatih u stanju tehnike, kao što je ImageJ, razvijen u Nacionalnom institutu za zdravlje (NIH).

[0180] U opisanim postupcima poželjno je merenje intenziteta pozadine, koje se izvodi sabiranjem svih piksela na površini koja je određena prečnikom koji je 3 puta veći od prečnika tačke, i ne preklapa se sa površinom bilo kog drugog antigena.

[0181] Konačno, potrebno je primeniti mere statističke kontrole za procenu kvaliteta ili pouzdanosti signala, kao što su srednja varijacija medijane, varijacija signala, varijacija šuma i detekcija ekstremnih vrednosti.

[0182] Sirovi podaci merenja filtriraju se definisanjem praga, kako u pogledu ukupnog merenog signala – pozadina, ili u pogledu odnosa signala i šuma. Poželjno, pozitivni signali su oni koji imaju vrednost najmanje dva puta veću od pozadinskog šuma (na primer, detektabilni signal).

Normalizacija i kalibracija rezultata

[0183] Nakon prikupljanja sirovih rezultata merenja, postoje dva neophodna koraka koja omogućavaju konverziju sirovih analitičkih podataka u klinički relevantne jedinice.

[0184] U opisanim postupcima primenjuju se dva postupka, jedan u cilju normalizacije, a drugi u cilju kalibracije rezultata.

[0185] U predmetnom kontekstu, normalizacija je postupak normiranja ukupnih varijacija signala iz različitih merenja, obavljenih različitih dana, ili iz različitih pakovanja reagenasa ili od strane različitih operatora, na isti prosečan nivo. Tako se mogu do izvesne mere kompenzovati varijacije do kojih dolazi usled malih varijacija vremena inkubacije, razlika ambijentalne temperature, varijacija biološkog uzorka, itd.

[0186] Normalizacija se postiže konstruisanjem standardne krive za specifičnu potklasu antitela koja će biti detektovana testom. Rastuća koncentracija prečišćenog antitela, na primer, humanog IgE, imobiliše se na susednim tačkama na mikročipu. Prema ovom postupku, najvećoj koncentraciji na standardnoj krivoj pripisuje se vrednost 100% signala, a svakom poznatom razblaženju pripisuje se proporcionalno manji % koncentracije. Na osnovu svih tačaka konstruiše se standardna kriva, čija se jednačina primenjuje na sirove podatke, za preračunavanje arbitrarnih intenzitetskih jedinica u relativne jedinice signala.

[0187] Ovaj postupak koji omogućava normalizaciju prosečnog intenziteta signala dobijenih u različitim merenjima, ne može da kompenzuje pojedinačne fluktuacije svakog pojedinačnog parametra u određenoj seriji. Postoji izvestan stepen varijacija u proizvodnji svake serije, a često su ove varijacije sistemske u tom smislu da parametar 1 može biti 10% veći nego što je njegova srednja vrednost tokom dužeg perioda, a parametar 2 može biti 5% manji od svog dugoročnog proseka, dok parametar 3 može biti unutar opsega uobičajenih varijacija. Da bi se ove razlike svele na minimum, sistemske varijacije u odnosu na dugoročne srednje vrednosti moguće je detektovati primenom dobro definisanih kontrolnih uzoraka koji se nabavljaju od odeljenja kontrole kvaliteta proizvođača. Kada se jednom definišu sistemske varijacije, moguće je preneti informacije o njima krajnjim korisnicima, u formi tabele ili poželjno, automatskog kodnog formata, kao što je 2D bar-kod odštampan na svakoj seriji. Čitanjem i interpretiranjem ovih bar-kodova, krajnji korisnik može – koristeći softversku opremu - da automatski podesi vrednosti merenja prema utvrđenim varijacijama tokom QC postupka sprovedenog od strane proizvođača, i u primeru koji je prethodno dat, podesi merenja parametra 1 smanjujući ga za 10%, podesi parametar 2 povećavajući ga za 5% i ostavi parametar 3 nepromenjen. Posledično, biće moguće smanjiti ukupnu varijaciju imunoeseja u poređenju sa onim bez konfiguracije i statističke potvrde rezultata merenja.

[0188] U poslednjem koraku, potrebno kalibrisati rezultate merenja. Kalibracija je postupak pretvaranja podešenih relativnih jedinica imunskog odgovora u apsolutne jedinice. Apsolutne jedinice treba da omoguće poređenje rezultata sa sistemima drugih proizvođača, između grupa ili dobijenih u različitim periodima vremena, čak i nakon značajnih promena sistema za merenje.

[0189] Kalibracija se može izvršiti prema međunarodno priznatim standardnim preparatima, kada oni postoje. Za mnoge bolesti moguće je nabaviti kvantitativne standarde i primeniti ih u kalibraciji. Međutim, u multi-parametarskim formatima nije moguća primena uobičajenih postupaka kalibracije, jednostavno zato što bi bilo potrebno neuporedivo više napora i troškova za kalibraciju nego za merenja.

[0190] Standardan pristup kalibraciji u jedno-parametarskom eseju je homologna kalibracija, pri čemu se rezultat merenja jedne konkretne interakcije antigen-antitelo u uzorku nepoznate koncentracije, meri i upoređuje sa rezultatima merenja definisanih uzoraka sa definisanim koncentracijama imunoglobulina specifičnih za određeni antigen, pa se primenom ove referentne krive sirovi rezultati merenja konvertuju u apsolutne rezultate merenja.

[0191] Ovo je moguće kod merenja relativno malog broja standardnih preparata potrebnih za kalibraciju u odnosu na relativno veliki broj nepoznatih uzoraka.

[0192] Kada se meri nekoliko stotina parametara u svakoj reakciji, gde je svaki parametar vezivanje iste potklase antitela za različite antigene, homologa kalibracija pojedinačnih antigena nije lako izvodljiva, a najverovatnije bi unela dodatnu varijaciju. Stoga se u takvim slučajevima primenjuje heterologna kalibracija. Kalibraciona kriva se ne formira za jednu interakciju antigen-antitelo, sa različitim koncentracijama odgovarajućih antitela merenih u različitim uzorcima, već sa jednim uzorkom koji sadrži opseg antitela različitih koncentracija prema različitim imobilisanim antigenima. Ovaj postupak se zasniva na činjenici da kada se detektuje vezivanje jednog imunoglobulina za različite antigene, nije neophodno kalibrisati odgovor antitela na svaki pojedinačni ciljni antigen, već formirati preciznu kalibracionu krivu za svaku klasu imunoglobulina koji se detektuje.

Interpretacija rezultata primenom softverskog paketa

[0193] Primena opisanih multi-parametarskih imunoloških merenja proizvešće značajno više rezultata od uobičajenog jedno-parametarskog pristupa kliničke izrade profila senzitizacije pacijenta.

[0194] Shodno tome, primena bioinformatičkog oruđa olakšava interpretaciju i vizuelizaciju rezultat i prevođenje u format koji dozvoljava lekaru lakši pregled podataka i donošenje najboljih dijagnostičkih zaključaka. Potrebno je razmotriti sledeće faktore u vezi sa softverski podržanom prezentacijom i smernicama:

1) Opšta klasifikacija medicinskog stanja, na primer, da li je na osnovu profila verovatno da pacijent boluje od navede bolesti za koju je zatražen test.

2) Detaljna klasifikacija bolesti, na primer, relevantni parametri ili obrasci parametara koji ukazuju na status bolesti ili uzrok bolesti.

3) Klasifikacija rizika pacijenta, na primer, utvrđivanjem kod pacijenta, nivoa antitela razvijenih na određene izazivače, ili obrazaca antitela razvijenih prema kombinacijama izazivača, ili odsustvo protektivnih antitela razvijenih prema nekim izazivačima ili udeo različitih potklasa antitela prema različitim izazivačima.

4) Posledice tretmana pacijenta, na primer, izborom odgovarajućeg medikamenta, davanjem odgovarajućih preporuka za izbegavanje ili potpunim izbegavanjem najverovatnijeg uzročnika.

Kompletni paneli za kliničku interpretaciju

[0195] Najvažnija odlika multipleks imunoeseja jeste mogućnost da se u okviru jednog testa uključi mnogo kliničkih parametara, čime se smanjuje napor lekara da izabere pojedinačne setove testova za svakog pacijenta, a da se dobije kompletna klinička slika u samo jednom analitičkom testu.

Dizajniranje uloška i prednosti u vezi sa automatizacijom

[0196] Pronalazak dalje obezbeđuje uložak, koji sadrži test komoru sa antigenskim čipom, rezervoar za tečni otpad, i opciono, bar-kod za podešavanje merenja i kalibraciju. Uložak može dodatno da sadrži, rezervoar ili integrisane bočice za jedan ili više detekcionih reagenasa (na primer, za obeležena antitela, obeleženi aptamer ili obeleženo afitelo), reagens za razvijanje signala (na primer, enzimski supstrat) i rastvor za zaustavljanje reakcije (na primer, destilovana voda, EDTA, NaOH, HCl i dr.). U nekim primerima izvođenja, uložak sadrži rezervoar ili integrisanu bočicu sa jednim ili više kontrolnih uzoraka (na primer, pozitivna i/ili negativna kontrola), i/ili jedan ili više pufera za potrebe testa (na primer, puferi za ispiranje, puferi za blokiranje, puferi za razblaživanje). U nekim primerima izvođenja, pozitivna kontrola je komercijalno dostupan standard, sa definisanom količinom imunoglobulina (na primer, ukupni IgG ili IgE i/ili definisani IgG ili IgG specifični za određeni antigen/alergen). U nekim primerima izvođenja, kao pozitivna kontrola koristi se uzorak koji je u standardnom testu validiran kao pozitivan na odgovarajući imunoglobulin. U nekim primerima izvođenja, uzorak negativne kontrole je komercijalno dostupan uzorak koji ne sadrži imunoglobuline ili uzorak koji je validiran ili pokazao negativan rezultat na prisustvo određenog imunoglobulina u standardnom testu. Moguće je da uložak može da obezbedi postepeno i kontrolisano pomeranje čipa unutar test-komore ili cele test komore sa antigenskim čipom koji se u njoj nalazi, kako bi se obezbedila jednaka distribucija uzorka i pufera na čipu tokom inkubacionog perioda, kao i temeljno ispiranje čipa. Dimenzije uloška zavise od veličine čipa i tipa i broja korišćenih reagenasa. Poželjno je da je veličina od 1 cm × 1cm × 5 cm do 2 cm × 5 cm × 15 cm.

[0197] Pričvršćivanje antigenskog čipa u ulošku može se postići na više načina, uključujući mehaničko pričvršćivanje, preciznim isecanjem definisanih dimenzija, mehanička fiksacija ivica traka, ili pričvršćivanje pomoću biokompatibilnih adheziva, koji su otporni na faze ispiranja i inkubiranja. Važan aspekt fiksiranja je da se spreči formiranje pukotina, prostora ili praznina u ulošku, ili između uloška i čvrste faze, u kojima bi, tokom faze inkubacije, došlo do nespecifičnog vezivanja, koje se ne može ukloniti ispiranjem, što bi značajno povećalo ukupan nespecifičan signal tokom detekcije, i što bi smanjilo odnos jačine signala prema šumu, pa time i ukupan ishod testa.

[0198] Takođe je važno, da se obezbede uslovi da pozicija probe na čipu nema uticaj na inkubaciju i razvijanje signala, što je poznato u stanju tehnike. U stanju tehnike je poznat takozvani "efekat ivice", usled kojeg su merenja na reakcionim mestima (tačkama) koja se nalaze blizu ivice čipa ili spoljašnjeg zida uloška ili bočice, značajno i reproducibilno drugačiji od vrednosti očitavanja od tačaka (proba) u sredini čipa. Ove razlike mogu biti uzrokovane ponašanjem agitacijom i mešanjem, nakupljanjem antitela na specifičnim mestima, površinskom tenzijom ili kinetičkim razlikama reakcionih mesta koja se nalaze u blizini čvrstih ivica i time uslovljenog smanjenja slobodne difuzije, u odnosu na tačke koje se nalaze u središtu ili na mestima koja su pod manjim uticajem periferije ili zida uloška. I prostorne razlike temperature mogu biti od značaja u nastanku ovih razlika, kao i greška merenja usled specifične geometrije suda. Primer bi bio mikročip postavljen na kružnu mikrotitar ploču, na kojoj bi se tačke u centru ploče razlikovale od tačaka u blizini zidova ploče. Iako se neki proizvođači trude da prevaziđu ova ograničenja "kružnih čipova" ili obrazaca, ovakav trend značajno umanjuje korisnu površinu i broj uzoraka po jedinici površine, što nije pogodno za multi-parametarske testove sa nekoliko stotina različitih proba.

[0199] Dizajn uloška prema predmetnom pronalasku nosi izvesne prednosti. Uložak se može smatrati kompletom po sebi, jer sadrži sve tečnosti i reagense potrebne za postupak testiranja, u odgovarajućim posudama. Uložak može imati i bar-kod za identifikaciju serije, kao i za korekciju kalibracije, i druge informacije koje bi se mogle čuvati unutar bar-koda.

[0200] Slično tome, komplet može sadržati i paket nastavaka za jednokratnu upotrebu, koji bi se direktno nabadali na pipetor i vraćali u uložak nakon primene. Ovakav dizajn omogućava da oprema (na primer, potrebna za nanošenje tečnih uzoraka) ne dolazi u kontakt sa tečnostima koje su potencijalno biološki opasne, jer se sve tečnosti prikupljaju unutar uloška koji je dizajniran tako da bude i posuda za otpad. Stoga, nema potrebe ni za dodatnim specijalnim postupcima čišćenja ili dezinfekcije.

[0201] Budući da uložak može da obuhvati ili sadrži sve tečnosti potrebne za testiranje, ovakav dizajn uloška omogućava automatizaciju eseja, tako da se isključivo faza nanošenja odvija pomoću tipičnog pipetora, koji zbog korišćenja nastavaka za jednokratnu upotrebu, ne mora da se održava, a nije potrebna ni zamena ventila ili tuba tokom uobičajenog roka trajanja instrumenta. Ukupni troškovi razvoja, kao i troškovi vlasništva ovakvog instrumenta koji praktično ne zahteva održavanje, značajno su manji od uobičajenih troškova održavanja automatizovanih imunskih analizatora, koji sadrže mnoge pokretne delove, ventile i tube, koje je periodično potrebno menjati.

[0202] Tokom faza ispiranja, uložak se jednostavno iskrene na jednu stranu, tako da tečnost unutar uloška može da iscuri u rezervoar unutar uloška, gde se zadržava do odlaganja.

[0203] Takođe su obezbeđeni kompleti koji sadrže opisani antigenski čip ili uložak, detekcioni reagens, kontrolne uzorke (na primer, pozitivne ili negativne kontrole), pufere koji se koriste tokom testa i uputstvo za upotrebu. Komplet takođe može da sadrži reagens za detekciju signala (na primer, supstrat enzima) i opciono, rastvor za zaustavljanje (na primer, destilovanu vodu EDTA, NaOH, HCI, itd). U nekim primerima izvođenja, komplet obuhvata antigenski čip (na primer, alergenski čip), detekcioni reagens specifičan za IgE ili IgG (na primer, anti-IgE ili anti IgG antitelo, aptamer ili afitelo specifično za IgE ili IgG, bilo da je direktno obeleženo ili konjugovano sa enzimom), pufere (na primer, pufer za ispiranje, pufere za blokiranje, dilucione pufere), i opciono, reagens za razvijanje signala (na primer, enzimski supstrat). U nekim primerima izvođenja, komplet dalje sadrži rastvor za zaustavljanje (na primer, destilovanu vodu, EDTA, NaOH, HCI, itd.).

[0204] Dalje je obezbeđen aparat koji sadrži komoru za jedan ili više opisanih uložaka, pipetor i uređaj za detekciju signala (na primer, CCD kamera, CMOS kamera, skenirajući laser).

PRIMERI

[0205] Slede primeri koji treba da ilustruju predmetni pronalazak, a nikako da ga ograniče. Različiti primeri izvođenja predmetnog pronalaska opisani su prema predmetnom pronalasku.

Primer 1:

Materijali i postupci

Izvor alergena

[0206] Alergeni su nabavljeni od različitih dobavljača ili su proizvedeni u lokalnoj instituciji. Alergeni su u formi ekstrakta alergena, prečišćenih prirodnih alergena, ili rekombinantnih alergena. U vezi sa korišćenim puferima i uslovima skladištenja, alergeni su tretirani prema preporukama dobavljača ili na osnovu prethodnog iskustva. Izbegavano je ponovljeno smrzavanje/topljenje. Alergeni koji su isporučeni u liofilizovanoj formi, rekonstituisani su prema uputstvu proizvođača.

Vezivanje alergena za nanočestice

[0207] Nanočestice od polistirena nabavljene su od kompanije Polysciences Europe GmbH. Vezivanje materijala sa alergenom za čestice obavljeno je prema preporukama proizvođača, ali je finalni postupak optimizovan prema pojedinačnim preparatima alergena. Primenjeno je više različitih postupaka da bi se dobila optimalna efikasnost vezivanja i biološka aktivnost. Neki alergeni se vezuju sa zadovoljavajućim rezultatom primenom pasivne adsorpcije, dok mnogi alergeni zahtevaju posebne uslove vezivanja ili kovalentno vezivanje. U tom smislu, korišćene su čestice od polistirena sa NH2ili COOH površinskim modifikacija, kao i homo- ili heterobifunkcionalni unakrsni veznici. Nekoliko preparata alergena bilo je potrebno tretirati tako da se najpre razdele na posebne alikvote, koji su zatim tretirani u različitim uslovima, a zatim ponovo spojeni u isti preparat, kako bi se dobio pun repertoar alergena tokom funkcionalnog testiranja.

Vezivanje pasivnom adsorpcijom (standardni protokol)

[0208] Nanočestice su pripremljene prema instrukcijama proizvođača. Alergeni ili ekstrakti alergena su razblaženi do koncentracije primenjive za vezivanje, uobičajeno manje od 0.5 mg/ml, u puferima čija pH odgovara izolelektričnoj tački alergena. Čestice (1% čvrste materija) i alergeni inkubirani su tokom 3 h na sobnoj temperature uz stalno mešanje. Inkubacija je nastavljena bez mešanja tokom noći, na 2-8°C. Konačno, čestice su staložene centrifugiranjem na 10000 rpm, 4°C tokom 15 minuta, supernatanti su prikupljeni, a sfere suspendovane u odgovarajućim puferima sa prezervativima za produženo skladištenje.

Vezivanje pasivnom adsorpcijom (napredni protokol)

[0209] Protokol je sličan standardnom protokolu, ali se pojedinačno primenjuju najmanje 3 različita pH opsega, najčešće u neutralnom, kiselom i baznom opsegu. Nakon izvođenja protokola vezivanja, čestice se vezuju za sfere na neutralnom pH.

Hemijsko vezivanje na čestice sa površinskim COOH grupama

[0210] Nanočestice su razblažene do odgovarajuće koncentracije, uobičajeno, 1% čvrste materije, zatim se ispiraju 3 puta u aktivacionom puferu (na primer, MES pufer sa pH opsegom između pH 5 i pH 7.5), talože i suspenduju, uz ispiranje između faza. Za aktivaciju čestica koje sadrže površinske COOH grupe koristi se aktivacija vodenim rastvorom karbodiimida, kao što je 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) karbodiimid, tokom 15 - 30 minuta. Nakon aktivacije, čestice se dva puta ispiraju aktivacionim puferom. Protein je razblažen u puferu za vezivanje koji ne sadrži slobodne NH2grupe, do koncentracije koja se tipično optimizuje titracijom. Aktivirane čestice i rastvor proteina inkubiraju se najmanje 3 sata na sobnoj temperaturi ili tokom noći, na 2-8°C. Konačno, čestice se talože centrifugiranjem, kao što je opisano i suspenduju se u puferu za čuvanje koji sadrži prezervative, sve do korišćenja.

Hemijsko vezivanja na čestice sa površinskim NH2grupama

[0211] Protokol je sličan prethodno opisanom protokolu, uz razliku da je za aktiviranje NH2grupa na nanočesticama korišćen amino-reaktivni reagens, na primer, glutaraldehid, ili sukcinimid, kao što je EGS unakrsni veznik. Saglasno tome, izabrani su puferi i pH vrednosti koje su podešene tako da se dobiju optimalni uslovi vezivanja u svakom pojedinačnom slučaju. Treba napomenuti da teoretski optimalna pH ne daje u svim slučajevima poželjnu efikasnost vezivanja, već su optimalne neke vrednosti pH, koje ne bi bile izabrane da su se birale samo prema svojstvima proteina.

Procena efikasnosti vezivanja

[0212] Efikasnost vezivanja je merena primenom direktnih i indirektnih postupaka. Pre i nakon vezivanja, izmerena je koncentracija proteina u rastvoru. Stepen smanjenja nivoa proteina u rastvoru ukazuje na efikasnost vezivanja proteina, ali ne i njegovu biološke aktivnosti. Takođe, obložene sfere su lišene proteina, na osnovu postupka proizvođača, kako bi se dobile sfere bez proteina. Ovi preparati okarakterisani su u pogledu koncentracije, kao i denaturišućom SDS gel-elektroforezom i bojenjem komazi-plavom bojom.

[0213] Za konačnu procenu biološke aktivnosti vezanih alergena, primenjena je funkcionalna analiza, odnosno, standardni test i postupak analize (videti kasnije), testiranja specifičnih pozitivnih seruma za svaki preparat alergena. Parametri korišćeni u testiranju su: 15 min blokiranja, 2 sata inkubacije seruma sa 1:5 razblaženim uzorcima seruma, 30 min detekcije inkubacije antigena.

Nanošenje čestica alergena na čvrstu fazu

[0214] Nitrocelulozne membrane su nabavljene od kompanije GE Healthcare and Pall Europe. Procenjeni su brojni tipovi membrana, različitih svojstava koja se odnose sa veličinu pora, brzinu protoka ili osnovnog materijala.

[0215] Nanošenje je obavljeno pomoću Biodot AD1520 instrumenta, koji je podešen u vezi sa pomeranjem, usisavanjem uzoraka, nanošenjem, i ciklusom ispiranja. Svaki preparat alergena je nanet na čvrstu fazu u zapremini od najmanje 20 nanolitara, uz međusoban razmak od 1 mm između centara susednih tačaka. Konačni čip se organizuje u geometriji od 10 kolona 25 redova.

[0216] Nakon nanošenja, paneli od NC su zatvoreni i čuvani na 2-8°C do daljeg korišćenja. Pre izvođenja testa, NC paneli su isečeni na odgovarajuće veličine i male vinjete sa čipom su postavljene u kasete.

Standardni test postupak

[0217] Obezbeđen je čip sa 250 različitih proba koje su prethodno blokirane od nespecifičnog vezivanja, puferom visoke koncentracije nealergenskih proteina.

[0218] Za ispiranje je korišćen slani Tris-pufer pH 7.4 i 0.2 % Tween-20, kao deterdžent (TBS-T).

[0219] Nakon blokiranja, čipovi su inkubirani sa serumima ili plazmom pacijenata, pod konstantnim uslovima blagog mešanja tokom 15 minuta. Serum je odbačen i čip je ispran TBST-om nekoliko puta, uz blago mešanje.

[0220] Nakon nekoliko ciklusa ispiranja, čipovi su inkubirani sa razblaženim anti-humanim IgE antitelima, koja su obeležena alkalnom fosfatazom (AP). Antitelo je odbačeno, a preostalo nevezano antitelo je isprano nekoliko puta TBST-om.

[0221] Konačno, čipovi su inkubirani sa rastvorom BCIP/NBT, supstratom za razvijanje boje (5-bromo-4-hloro-3-indolil-fosfat/nitro plavi tetrazolijum), tokom nekoliko minuta, sve dok se ne postigne dovoljna senzitivnost, i reakcija zaustavi, a preostali supstrat ispere.

[0222] Čipovi su, pre skeniranja ili slikanja, osušeni. Slike su načinjene u formatu 24-bit kolor fotografija i konvertovane u 16-bit crno/bele.

Analiza

[0223] Svaka kružna proba je kvantifikovana izračunavanjem srednjeg intenziteta i oduzimanjem okolne pozadine. Odnos signala prema šumu koji je bio > 2 smatran je pozitivnim signalom.

[0224] Čipovi su normalizovani standardnom krivom imobilisanih humanih IgE, koji su naneti zajedno sa preparatima alergena. Uz to, normalizovane vrednosti su kalibrisane primenom heterologih kalibracija, nasuprot referentnog uzorka sa više pozitivnih test rezultata.

Primer 2:

[0225] Antigenski čip sa 245 grupa sfera obloženih antigenom dobijen je primenom materijala i postupaka opisanih u Primeru 1. Prikazani su samo podaci za antigene koji su naneseni pasivnom adsopcijom. Specifična IgE merenja za 245 alergena i 5 IgE standarda, u skupljenim uzorcima seruma nekoliko alergijskih pacijenata, prikazana su na Slici 1A. Aktivnost negativnog uzorka bez značajnog nivoa specifičnih IgE prikazan je Slici 1B. Raspored antigenih grupa je prikazan na Slici 1C. Razmak između antigenih grupa je 1 mm na x- i y-pravcu.

Primer 3a:

Evaluacija testa standardnim postupkom

[0226] Ukupno 137 uzoraka pacijenata (broj pacijenata je izlistan u Tabeli 3), testirano je postupcima opisanim u Primeru 1. Za potrebe testiranja, uzorci pacijenata su razblaženi 1:5 i primenjen je test postupak. Za poređenje dobijenih rezultata korišćene su dostupne referentne vrednosti dobijene primenom nekoliko verzija ImmunoCAP ISAC testa (Thermo Fisher, Uppsala, Sweden). Uzorci pacijenata koji su testirani pozitivno ili negativno u referentnom eseju prikazani su u Tabeli 3, sa oznakama "poz" ili "neg". Podaci su obrađeni u Medcal Version 16.1, kako bi se uradila ROC statistika (Response Operator Curve). U ove svrhe, svi rezultati specifičnih antigena, koji su veći od nivoa koji je definisao proizvođač ImmunoCAP ISAC testa, smatrani su pozitivnom (=1), ili negativnim (=0). Rezultat statističke evaluacije bio je: Površina ispod krive AUC (perfektna korelacija = 1, bez korelacije = 0), analitička senzitivnost, analitička specifičnost. Ukupno, 3619 rezultata merenja, od kojih je uzeto u obzir 692 pozitivna rezultata i 2927 negativnih rezultata. Rezultati su sumarno prikazani u Tabeli 3. Prikazani su prosečna senzitivnost i specifičnost, u nivou od 99 %, odnosno, 95%, pri čemu se smanjena specifičnost može objasniti većom senzitivnošću novog postupka, koji će proizvesti više pozitivnih rezultata merenja u odnosu na standardni postupak.

Tabela 3. ROC analiza sa referentnim podacima iz ImmunoCAP ISAC

Primer 3b:

Evaluacija testa u odnosu na referentni postupak

[0227] Uzorci 220 pacijenata testirani su postupkom, koji je opisan u Primeru 1. Alergeni su pasivno adsorbovani ili su hemijski vezani, posredstvom različitih hemijskih veznika. Uzorci pacijenata razblaženi su 1:5 za potrebe testiranja, a zatim se testirani standardnim testom. Dobijeni podaci su upoređeni sa dostupnim referentnim podacima, koji su dobijeni primenom različitih verzija ImmunoCAP ISAC testa (Thermo Fisher, Uppsala, Sweden). Senzitivnost, specifičnost i r<2>faktor korelacije za izabrane alergene prikazani su na Slici 2. Senzitivnost i specifičnost su procenjeni u MedCalc softveru, poređenjem sa referentnim podacima, primenom protokola predloženog od strane proizvođača i uz primenu praga detekcije od 0.3 ISU. Linearna regresiona analiza rezultata merenja izvedena je u Microsoft Excel softverskom paketu. Ukupno je u obzir uzeto 779 pozitivnih 2772 negativnih rezultata.

Primer 4:

Pojačavanje signala

[0228] Dvanaest ekstrakata alergena i molekulskih alergena izolovanih iz mleka i jaja imobilisano je za čvrstu podlogu (nitroceluloza Protran, 0.2 um, GE Healthcare) u dva seta različitih uslova. U prvom slučaju u alergeni su direktno vezani za čvrstu podlogu, prema uputstvu proizvođača za tok postupka western blota. U drugom slučaju, 12 alergena je najpre povezano sa polistirolskim nanočesticama od 350 nm, pasivnom adsorpcijom pod neutralnim pH, bez dodatne optimizacije uslova vezivanja, kao što je opisano u odeljku Materijal i metode u Primeru 1.

[0229] Nakon toga, serumi su uzeti od 20 pacijenata koji imaju alergiju na mleko i jaja, i testirani su u odnosu na prisustvo IgE antitela specifičnih na 12 proteina. Dobijeni signali specifični za alergene direktno imobilisanih proteinskih preparata ili za svaki pojedinačni antigen vezan za sferu (sirovi podaci za svih 20 seruma su prikazani u Tabeli 5), i obrađeni su i određena je srednja vrednost za svih 20 seruma, dve sumarne vrednosti po alergenu su upoređene i izračunat je faktor razlike. Rezultati su prikazani u Tabeli 4 i na Slici 3.

Tabela 4: Zbirni rezultati za 12 alergena koji su direktno imobilisani ili su imobilisani za sfere. Prikazani su sirovi rezultati merenja, nekalibrisani. Prosečna vrednost amplifikacije signala bila je oko 8-puta veća, kada su alergeni vezani za čestice i odnosu na alergene koji nisu vezani za čestice, a faktor amplifikacije kretao se od 2 - 17. Isti rezultati su grafički prikazani na Slici 3.

Alergen Direktn n za česti aktor (x) Bos d [Mlek 226308 685342 3,03

Bos d 4 29706 98222 3,31

Bos d 5 50009 278392 5,57

Bos d 6 7291 127222 17,45

Bos d 8 151474 606300 4,00

Bos d LF 80338 342786 4,27

Gal d [Belan 40472 77736 1,92

Gal d [Žuman 29165 75288 2,58

Gal d 1 14947 179650 12,02

Gal d 2 2702 28958 10,72

Gal d 3 5169 82668 15,99

Gal d 4 5533 61884 11,18

Tabela 5. Sirovi podaci merenja iz primera amplifikacije signala

Ċ

Primer 5:

[0230] Uticaj različitih uslova vezivanja na odgovor specifičnih IgE antitela u funkcionalnom testu [0231] Izvršena su merenja specifičnih IgE antitela u 8 različitih uzoraka pozitivnih na Pru p 3, koji je glavni alergen breskve (Slika 4). Jedan uzorak sa negativnim rezultatom korišćen je kao negativna kontrola. Pru p 3 je vezan primenom tri tipa različitih postupaka kovalentnog vezivanja (uslovi 1-3). Pasivna adosorpcija proteina nije dala nikakve rezultate (rezultati nisu prikazani). Na osnovu analize efikasnosti vezivanja, nije uočena značajna razlika kod različitih pristupa kovalentnog vezivanja. Međutim, funkcionalni test je ukazao na velike razlike u pogledu biološke aktivnosti vezanih alergena u testiranju različitih seruma, kada se rezultati uporede sa standardnim postupkom (ImmunoCAP 100 kompanije Thermofisher, Uppsala, Sweden).

[0232] Zavisno od seruma, uočene su značajne razlike kada se porede rezultati dobijenih na alergenima vezanim primenom različitih postupaka. Razlog za to je što odgovor IgE seruma zavisi od postupaka vezivanja alergena ili funkcionalnog testiranja, koji u manjoj ili većoj meri prezentuju aktivnu konformaciju datog epitopa.

[0233] Ove vrednosti ne mogu se direktno upoređivati, jer su rezultati u pojedinačnim postupcima izraženi različitim jedinicama, koje se interno kalibrišu kako bi mogle porediti.

Primer 6:

Studija slučaja pacijenta kod kojeg se ispoljila dodatna senzitizacija

[0234] Pacijent je primljen u lokalnoj klinici za alergije, nakon dva napada astme tokom noći provedene kod prijatelja, koji ima mačku. Pacijent je imao prethodno dijagnostikovane alergije na travu i brezu, koje nisu izazivale probleme sa disanjem. Rezultati dobijeni na alergološkoj klinici primenom Immuno CAP postupka, prikazani u Tabeli 6 (Referenca IC), upoređeni su u postupku koji je ovde opisan (pod oznakom "FABER" u Tabeli 6). Tabela 6 dodatno ukazuje na rezultate kožnog ubodnog testa (SPT), kao i na uočene simptome kod pacijenta za izabrane alergene.

[0235] Postoji načelno visok stepen korelacije (pozitivne ili negativne) in vitro rezultata dobijenih opisanim postupkom i standardnim postupkom ImmunoCAP eseja. Može se pretpostaviti da neki od komercijalno dobijenih alergenskih ekstrakata (na primer Bet v, Amb a) ne sadrže dovoljne količine alergena, jer su dobijene vrednosti bile niže od onih dobijenih standardnom metodom. Međutim, kada su upoređeni rezultati molekulskog testiranja, dobijeni su veoma slični rezultati primenom opisanog postupka (Bet v 1.0101 Bet v 2.0101) i ImmunoCAP eseja.

[0236] Ubodni test kožne osetljivosti (SPT) kod pacijenta bio je negativan na alergene iz mačke. Kožni test, kao i IVD test na ImmunoCAP sistemu sprovedeni su sa ekstraktom alergena mačke. Oba testa dala su slabe rezultate, odnosno negativan rezultat SPT testa i slabo pozitivan rezultat na ImmunoCAP testu. Načelan problem sa ekstraktima alergena je nejasna priroda alergena prisutnih u mešavini, kao i degradacija alergena, do koje dolazi tokom ekstrakcije ili skladištenja. Naš format testa pokazao je slično niske vrednosti na komercijalno dobijenom ekstraktu, ali i veoma pozitivan rezultat na rekombinantnim čistom mačjem alergenu Fel d 1. Malo je verovatno da bi lekar, na osnovu negativnog rezultat SPT testa, mogao da nasluti ovako visoko pozitivan rezultat in vitro testa.

[0237] Utvrđene su i neke dodatne alergijske osetljivosti koje nisu uslovljene unakrsnom reaktivnošću prema različitim alergenima, pa se stoga mogu smatrati potencijalno značajnim, na primer, osetljivost na račiće i bubašvabe. Na primer, uočena je pozitivna reakcija na visoko srodni PR10 tip alergena (homologija Bet v 1), uključujući alergene: Bet v 1.0101, Mal d 1.0108, Cor a 1.0103; u okviru veoma konzervirane porodice proteina profilina, utvrđena je pozitivna reakcija sa: Ara h 8.0101, Bet v 2.0101, Hev b 8, Mer a 1; takođe, pozitivna reakcija na proteine životinjskog epitela, proteine iz mleka životinja ili proteine iz mesa, koja se može objasniti unakrsnom reaktivnošću na proteine iz drugih životinjskih vrsta.

[0238] S druge strane, osetljivost na alergene, kao što su Bla g 1 iz bubašvabe ili Pen m 1 iz račića, nije uočena primenom standardnog testa, i ona se može smatrati pravom osetljivošću koja nije uslovljena unakrsnom reaktivnošću sa drugim pozitivnim rezultatima testa. Dakle, osetljivost na ove proteini bi trebalo dalje da se prati sa izvesnim kliničkim značajem.

Tabela 6: Pacijent A ispitan FABER dijagnostičkim sistemom

Ċ

Primer 7:

Poređenje testa sa standardnim postupkom

[0239] Primenom opisanog antigenskog čipa i ImmunoCAP ISAC testa (Thermo Fisher Uppsala, Sweden) kao referentnog postupka, testirano je 83 uzorka (videti Primere 1 i 2). Tehničke specifikacije dva testa uporedno su prikazane na Slici 5.

[0240] Testiranje je izvršeno na 245 alergena u opisanom antigenskom čipu, prema Primerima 1 i 2, dok je standardnim postupkom testirano 112 alergena, od kojih se 70 alergena preklapalo između dva testa. Rezultati za ove alergene koji su mogli direktno da se porede (identični alergeni) ispoljili su dobru korelaciju, od 76% prema Pearsonu. Za ove preklapajuće antigene dobijeno je 1057 pozitivnih rezultata u standardnom postupku, dok je 1159 pozitivnih rezultata dobijeno opisanim postupkom, što odgovara povećanju od oko 10% (9.65%), i ukazuje na povećanu osetljivost opisanog postupka.

[0241] Dalje, primenom standardnog postupka dobijeno je 2508 pozitivnih rezultata, dok je ukupno 4740 pozitivnih rezultata dobijeno ubrzanom metodom. Na osnovu testiranja donesen je zaključak da opisani antigenski čip identifikuje veći broj reakcija senzitivnosti, to jest, povećanje od 89%, što dalje ukazuje na povećanu senzitivnost brzog antigenskog čipa/postupka u odnosu na standardni čip/postupak. Rezultati su sumarno prikazani u Tabeli 7.

Tabela 7: Sažetak testiranja

Primer 8:

Stabilnost sfera obloženih antigenom

[0242] Sfere obložene antigenom su pripremljene kao što je prikazano u Primeru 1, a antigenski čip je proizveden na dan 0. Nekoliko desetina antigenskih čipova (oko 40) proizvedeno je tokom perioda od 330 dana, korišćenjem istog preparata sfera obloženih antigenom. Sfere obložene antigenom su skladištene tokom naznačenog perioda na temperaturi 2-8°C, osim kada su korišćene za proizvodnju antigenog čipa, na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta.

[0243] Isti uzorak testiran je na dan 0 na alergenskom čipu proizvedenom na dan 0, i zatim je testiran na dan 330, na čipu koji je proizveden na dan 330. Rezultati dva testa i koeficijent varijacije (CV) prikazani su u Tabeli 8. Slika 5 grafički prikazuje rezultate dobijene na dan 0 i na dan 330.

[0244] Podaci ukazuju na visoku stabilnost testiranja sfera obloženih antigenom i na reproducibilnost postupka.

Tabela 8. Poređenje rezultata testa na dan 0 i dan 330

Primer 9:

Optimizacija ekstrakta za dobijanje sfera obloženih antigenom

[0245] Polen breze nabavljen je komercijalno, a ekstrakt alergena je pripremljen postupkom poznatim u stanju tehnike, koji se zasniva na mešanju pod definisanim uslovima i trajanju u fiziološkom puferu. Ekstrakt polena breze vezan je za nanočestice, pasivnim vezivanjem u 4 pufera različite pH i jonske jačine. Kao što rezultati ukazuju (Tabela 9), na osnovu molekulskog profila pacijenta (na primer, na koje molekulske alergene pacijent ima razvijena antitela u serumu), različiti pH uslovi daju različite rezultate IgE merenja. Ovo ukazuje da kombinovanje različitih uslova pH doprinosi čuvanju punog repertoara molekulskih epitopa u ekstraktu i doprinosi tačnijem i senzitivnijem merenju.

[0246] Takođe, ekstrakt polena breze je dalje obrađen ekskluzionom hromatografijom (SEC). Pojedinačne frakcije koje predstavljaju definisane molekulske težine u originalnom ekstraktu prikupljene su i vezane za nanočestice, u jednom setu uslova. Kao što se očekivalo, zavisno od molekulskog obrasca prepoznavanja, dobijeni su još izraženiji rezultati prema obrascu senzitizacije pacijenta. Na primer, uzorak 1 ispoljio je uporedive nivoe specifičnih IgE u svim frakcijama, dok je uzorak 2 pokazao niže nivoe IgE prema frakciji 1, ali viši nivo prema frakciji 3, a uzorak 3 je imao najviši nivo IgE prema frakciji 1. Kombinovanjem pojedinačnih frakcija i daljim optimizovanjem pH uslova vezivanja postigla bi se veća analitička osetljivost u odnosu na referentni postupak.

Tabela 9:

Claims (19)

Patentni zahtevi

1. Antigenski čip koji sadrži različite grupe sfera obloženih antigenom, koje su fiksirane na čvrsti nosač, naznačen time, što svaka grupa sadrži

(i) različite tipove sfera obloženih jednim detekcionim antigenom, ili

(ii) različite tipove sfera obloženih setom detekcionih antigena, i gde je čvrsti nosač panel ili ploča, a detekcioni antigen je alergen, infektivni marker ili autoantigen, pri čemu su detekcioni antigen ili set detekcionih antigena vezani za navedene različite grupe sfera, posredstvom različitih hemijskih veza.

2. Antigenski čip, prema zahtevu 1, naznačen time, što je detekcioni antigen proizveden tehnologijom rekombinantne DNK ili je antigen izolovan i prečišćen iz biološkog materijala.

3. Antigenski čip prema zahtevu 1, naznačen time, što je set detekcionih antigena dobijen iz ekstrakta ili lizata biološkog izvornog materijala koji sadrži više od jednog antigena.

4. Antigenski čip, prema bilo kom od zahteva 1 do 3, naznačen time, što su sfere mikro- ili nanosfere, pri čemu je poželjno veličina sfera između 5 i 500 nm u prečniku, poželjno između 200 i 500 nm u prečniku.

5. Antigenski čip, prema bilo kom od zahteva 1 do 4, naznačen time, što su sfere, lateks sfere, polimerne plastičke sfere, poželjno polistirenske sfere, sfere načinjene od biokompatibilnih polimera, ili staklene sfere poželjno, sfere od silicijum dioksida.

6. Antigenski čip prema bilo kom od zahteva 1 do 5, naznačen time, što je detekcioni antigen kovalentno ili nekovalentno vezan, poželjno pasivnom adsorpcijom.

7. Antigenski čip, prema bilo kom od zahteva 1 do 6, naznačen time, što je čvrsta podloga panel ili ploča od poroznog ili neporoznog materijala, poželjno nitrocelulozni panel, poželjnije laminirani nitrocelulozni panel.

8. Antigenski čip, prema bilo kom od zahteva 1 do 7, naznačen time, što čip sadrži najmanje 25 različitih grupa, pri čemu je poželjno svaka grupa pričvršćena kao element sa definisanom pozicijom u pravougaonom čipu, opciono pri gustini od 1 elementa sa definisanom pozicijom na mm<2>.

9. Antigenski čip prema bilo kom od zahteva 1 do 8, naznačen time, što su sfere obložene antigenom sfere obložene alergenom, i svaka grupa sfera obloženih alergenom sadrži:

(i) različite tipove sfera obloženih alergenom, ili

(ii) različite tipove sfera obloženih setom alergena, poželjno ekstraktom alergena, pri čemu su alergen ili set alergena vezani za navedene različite grupe sfera, posredstvom različitih hemijskih veza.

10. Postupak za detekciju imunoglobulina specifičnog prema detekcionom antigenu ili prema setu detekcionih antigena, koji sadrži:

(i) obezbeđivanje antigenskog čipa prema bilo kom od zahteva 1 do 9,

(ii) inkubiranje čipa sa uzorkom,

(iii) inkubiranje čipa sa detekcionim reagensom,

(iv) opciono inkubiranje čipa sa reagensom za razvijanje signala, i

(v) merenje detektabilnog signala.

11. Postupak prema zahtevu 10, naznačen time, što je imunoglobulin IgE antitelo, povezano sa alergijom ili IgG antitelo, povezano sa infekcijom ili autoimunskom bolešću.

12. Postupak prema bilo kom od zahteva 10 ili 11, naznačen time, što je uzorak biološki fluid, poželjno serum, ukupna ili prerađena krv, nazalni fluid ili urin, ćelijski lizat ili tkivni homogenat ispitanika ili grupe ispitanika.

13. Postupak prema bilo kom od zahteva 10 do 12, naznačen time, što je detekcioni reagens neki afinitetni veznik specifičan za imunoglobulin, poželjno antitelo, aptamer, ili afitelo, opciono, gde je detekcioni reagens (i) direktno obeležen, poželjno obojenim ili fluorescentnim jedinjenjem ili zlatnim nanočesticama ili obojenim lateks nanočesticama; ili (ii) konjugovan sa enzimom.

14. Postupak prema bilo kom od zahteva 10 do 13, koji dodatno obuhvata inkubiranje antigenskog čipa sa reagensom za razvijanje signala, saglasno koraku (iv) zahteva 10, pri čemu je detekcioni reagens konjugovan sa enzimom, a reagens za razvijanje signala sadrži supstrat pomenutog enzima.

15. Postupak prema bilo kom od zahteva 10 do 14, koji dodatno obuhvata inkubiranje antigenskog čipa sa rastvorom za zaustavljanje reakcije, nakon koraka (iv) zahteva 10.

16. Postupak prema bilo kom od zahteva 10 do 15, naznačen time, što je imunoglobulin IgE antitelo povezano sa alergijom, pri čemu postupak obuhvata

(i) obezbeđivanje antigenskog čipa, prema zahtevu 9,

(ii) inkubiranje čipa sa uzorkom,

(iii) inkubiranje čipa sa detekcionim reagensom, poželjno IgE-specifičnim antitelom ili IgE-specifičnim aptamerom,

(iv) opciono, inkubiranje čipa sa reagensom za razvijanje signala, i

(v) merenje detektabilnog signala.

17. Uložak koji sadrži komoru za testiranje, koja sadrži antigenski čip prema bilo kom od zahteva 1 do 9, rezervoar za tečni otpad i opciono, bar-kod.

18. Komplet koji sadrži antigenski čip prema bilo kom od zahteva 1 do 9, detekcioni reagens, jedan ili više pufera, jedan ili više kontrolnih uzoraka i uputstvo za korišćenje kompleta u postupku prema bilo kom od zahteva 10 do 16, i opciono, reagens za razvijanje signala.

19. Aparat koji sadrži komoru sa jednim ili više uložaka, prema zahtevu 17, pipetor i uređaj za detekciju signala.