RS61885B1 - Novi imunobiološki proizvodi - Google Patents

Description

Opis

[0001] Pronalazak se odnosi na postupak koji obuhvata korak inkubacije hitozana u vodenom rastvoru organske karboksilne kiseline ili njene soli, modifikovanog hitozana koji se može dobiti postupkom iz ovog pronalaska, hidrokoloida, jedinjenje formule [X]n, sastav koji sadrži modifikovani hitozan, hidrokoloid ili jedinjenje prema ovom pronalasku, modifikovani hitozan, hidrokoloid, jedinjenje ili sastav prema ovom pronalasku za upotrebu u humanoj i/ili veterinarskoj medicini i modifikovani hitozan, hidrokoloid, jedinjenje ili sastav prema ovom pronalasku za upotrebu u postupku lečenja i/ili sprečavanja mastitisa, poželjno latentnog mastitisa i/ili akutnog mastitisa, endometritisa, poželjno hroničnog, akutnog i/ili gnojnokataralnog endometritisa, bolesti kopita i kandži, hramanja, lezija u interdigitalnom prostoru, digitalnog dermatitisa, interdigitalnog dermatitisa, interdigitalne flegmone, trihofitoza, mikrosporoza, mikoza kože, alergija, kao i bolesti komplikovanih alergijama, naročito alergijske opstruktivne bolesti pluća, alergijskih bolesti kože, alergijskog eritema uha, alergijskog rinitisa, alergijskog konjunktivitisa, akutnog alergijskog kontaktnog dermatitisa, hroničnog alergijskog kontaktnog ekcema ili atopijskog ekcema, opstruktivne bolesti pluća, naročito hronične opstruktivne bolesti pluća, kožnih bolesti, naročito dermatitisa, eritema uha, rinitisa, konjunktivitisa, dermatofitoza ili bradavica, naročito obične bradavice kod subjekta i za modulaciju imunološkog odgovora kod subjekta i/ili za poboljšanje efikasnosti reprodukcije, poželjno efikasnosti reprodukcije kod uzgoja životinja.

[0002] Mastitis goveda rasprostranjen je širom sveta i izaziva znatne ekonomske gubitke u poljoprivredi. Šteta koju uzrokuje mastitis nastaje naročito zbog smanjene mlečnosti i smanjenog kvaliteta mleka. Mastitis uzrokuje hipogalaktiju i agalaktiju kod životinja. Gubitak dela sekretornih epitelnih ćelija rezultira regeneracijom vezivnim tkivom i atrofijom zahvaćenog dela vimena.

[0003] Endometritis je zapaljenje sluzokože materice, praćeno više ili manje značajnom promenom endometrijuma i povećanom aktivnošću zdravih ili regenerisanih materičnih žlezda. Uteritis najčešće prati razvoj polimorfne mikroflore. Hronični endometritis je vrlo rasprostranjena ginekološka bolest: registrovan je kod 12-40% infertilnih krava.

[0004] Oko 15-25% krava boluje od klinički očiglednog i skrivenog mastitisa, a ovoj bolesti je najviše izložena stoka sa vrlo visokom proizvodnjom mleka. Smanjenje proizvodnje mleka konvalescentnih krava čini do 20% opšte mlečnosti na farmi. Postojeće metode kontrole i lečenja mastitisa neizbežno dovode do velikih gubitaka životinja i mleka. Postporođajne bolesti krava, među kojima je endometritis najčešća bolest, donose ogromne ekonomske gubitke. Postoje različiti razlozi za endometritis. Lečenje od strane veterinara iziskuje puno vremena i troškova.

[0005] Najčešći oblik mastitisa je skriveni (subklinički) mastitis. Skriveni mastitis krava prati tihi inflamatorni proces uz samo nekoliko ili bez kliničkih znakova mastitisa. Lečenje životinja sa ovim oblikom mastitisa je složeno. Ovaj oblik je vrlo čest na velikim mlečnim jedinicama i obično se dijagnostikuje samo tokom mesečnih pregleda za skriveni oblik mastitisa muznog stada. Tokom mašinske muže, kod oko 15% krava u laktaciji pojavljuje se latentni mastitis. Razlozi razvoja skrivenog mastitisa su višestruki. Skriveni mastitis se uglavnom pojavljuje zbog nepridržavanja veterinarskih zdravstvenih propisa od strane vršilaca mašinske muže, zbog pogrešnog pokretanja i nepridržavanja toka lečenja životinja sa mastitisom. Istovremeno, hronični endometritis je vrlo česta ginekološka bolest: registrovan je kod 12-40% infertilnih krava.

[0006] Objektivni pokazatelj zdravog vimena krave je količina somatskih ćelija u mleku. Somatske ćelije u kravljem mleku predstavljaju leukociti i epitel mlečnih žlezda. U sekreciji mleka zdrave krave dominiraju epitelne ćelije. Epitelne ćelije nastaju u tkivima vimena tokom procesa prirodnog starenja i regeneracije tkiva. Tokom mastitisa se povećava migracija leukocita u područje inflamacije, što konačno dovodi do akutnog povećanja količine somatskih ćelija u mleku. 1 ml mleka klinički zdravih krava sadrži 200 - 250 hiljada somatskih ćelija. Tokom mastitisa njihova količina raste do 900 hiljada i više.

[0007] Mleko krava obolelih od skrivenog oblika mastitisa ima smanjenu kiselost jer sadrži više hlorida, albumina i globulina. Količina ćelijskih elemenata povećava se nekoliko puta, naročito količina leukocita. Istovremeno se smanjuje sadržaj čvrstih supstanci (kazein, laktoza, kalcijum i fosfor). Kada se mleko krava sa skrivenim oblikom mastitisa kombinuje sa mlekom zdravih krava, ukupan kvalitet mleka se smanjuje. Ne može se koristiti za pripremu sira i proizvoda od kiselog mleka i izuzetno negativno deluje na ljudsko zdravlje.

[0008] Trenutno se za lečenje različitih oblika mastitisa i endometritisa koriste antibiotici, preparati sulfanilamida ili njihove smeše. Takođe se koriste ekstrakti biljaka koji sadrže esencijalna ulja sa antimikrobnim dejstvom. Poslednjih godina korišćeni su enzimski preparati i imunobiološki proizvodi koji sadrže probiotike i interferon.

[0009] Postoji mnogo metoda i agenasa za lečenje mastitisa sa kliničkim znacima, ali lečenje skrivenih oblika mastitisa je složeno, a rasprostranjenost ovog oblika mastitisa je mnogo veća od ostalih oblika. Poznate su metode lečenja subkliničkog mastitisa fizikalnom terapijom (primena ozokerita, parafina, zavoja za zagrevanje, kompresionih zavoja, zagrevanje solarnim lampama, infracrveno zračenje vimena), kao i primena laserskih uređaja različitih modifikacija. Tok tretmana sastoji se od 3-4 sesije, pri čemu se dnevno izvodi samo jedna sesija. Efikasnost ovih metoda je između 60 - 85%, ali iziskuju puno vremena i troškova. Poznat je i metod intramuskularne primene antibiotika: Doza od 8-10 ml Tilozina 200 jednom dnevno tokom tri dana, doza od 0,5 ml/10kg telesne težine Bilozina 200 dva puta dnevno (mleko se ne može koristiti u prehrambene svrhe tokom 7 dana), supkutana doza 1 ml/50kg telesne težine Efikura tokom 2-3 dana. Prilikom upotrebe antibiotika, potrebno je prethodno proveriti osetljivost uzročnika iz pogođene četvrtine vimena na antibiotike. Štaviše, mleko i proizvodi klanja tretiranih životinja ne mogu se koristiti nekoliko dana do nedelju dana. Poznata je i metoda intramamarne primene preparata Mastiyet-forte u plastičnom špricu koji sadrži oksitetraciklin, Neomicin, bacitracin i Prednizolon. Preparat je vrlo efikasan, ali mleko i proizvodi klanja tretiranih životinja ne mogu se koristiti nekoliko dana. Poznat je i način lečenja subkliničkog mastitisa prokainskom blokadom vimena prema D. D. Logvinovu. Injekcije 0,5% rastvora prokaina daju se svakih 48 sati. Oporavak uz ovu metodu traje 3-5 dana. Mane ove metode su u tome što je radno intenzivna i što nosi rizik od mikrobiološke kontaminacije injekcijom. Takođe je poznat način lečenja bolesnih krava korišćenjem 1% rastvora kolargola i preparata koji sadrže srebro. Preparati se injektiraju u trbušnu aortu. Ako je potrebno, injekcija se ponavlja nakon 48 sati. Preparati koji sadrže srebro imaju visoku antibakterijsku aktivnost i mogu se koristiti u lečenju mastitisa bilo koje etiologije. Međutim, ova metoda je radno intenzivna. Takođe je poznat metod korišćenja intramamarnog uvođenja parnog mleka koje sadrži velike količine lizozima (dobijenog od zdravih krava) 1-2 puta dnevno tokom 2-3 dana. Metoda nije vrlo efikasna, ali mleko i proizvodi klanja mogu se koristiti nakon ovog tretmana bez ikakvih ograničenja. Takođe je poznat postupak tretiranja subkliničkog mastitisa upotrebom preparata na bazi probiotika koji sadrže kulturu Str. thermophilus i drugih bifidolaktobacila. Ovi lekovi se injektiraju intracisternalno 1-2 puta dnevno. Kod skrivenog mastitisa oporavak započinje nakon 1-2 injekcije tokom 2-3 dana. Nedostaci ove metode su akcidentalna bakterijska kontaminacija mleka, pojava nove iritacije parenhimatoznog tkiva mlečne žlezde i, kao posledica, potencijalno pogoršanje patološkog procesa. Takođe je poznat postupak lečenja mastitisa krava primenom rastvora interferona. Ovi rastvori povećavaju zaštitnu funkciju leukocita koji su u velikoj količini prisutni u mleku životinja sa mastitisom. Rastvori sadrže najmanje 1000 jedinica rekombinantnog goveđeg interferona koji je upakovan u injektore od 10g. Rastvori se koriste intracisternalno dva puta dnevno u intervalu od 8-14 sati tokom 3 dana ili do potpunog oporavka. Vreme oporavka je 4-12 dana. Prednost ove metode je odsustvo bilo kakvih ograničenja za upotrebu mleka i mesa tretiranih životinja, ne dovodi do rezistencije patogenih organizama i nema lokalno nadražujuća i resorptivno-toksična svojstva. Nedostaci ove metode su neophodnost ponovljene pripreme i prisustvo proteinskih komponenata koje mogu izazvati alergijske reakcije.

[0010] DD, ID i IP, koje su najčešće zarazne bolesti kopita i kandži, sporadično su rasprostranjene širom sveta, ali mogu biti endemske, posebno u jedinicama za intenzivnu proizvodnju govedine ili muzne stoke. Incidencija zavisi, između ostalog, od vremena, godišnjeg doba, pašnih perioda i sistema stanovanja. DD obično dovodi do hramanja i do značajnog smanjenja telesne težine, gubitka fertiliteta i smanjenja proizvodnje mleka. Incidenca može biti između 5% i 30%. U prvim epidemijskim slučajevima oko 30% do 80% životinja može pokazati kliničke znakove bolesti. Međutim, IP u proseku čini samo do 15% bolesti kandži.

[0011] Bilo je iznenađujuće da mnogi istraživači sugerišu da su etiološki faktori DD-a, ID-a i IP-a isti mikroorganizmi, kao što su Dichelobacter nodosus, Fusobacterium necroforun i Fusobacterium spp, koji prvo uništavaju epiderm i tako omogućavaju da spirohete iz Treponema spp. kao što je T phagedenis, T. vincentii i T. denticola uđu u dublja tkiva da bi se razvili klinički znakovi DD-a. Ostale bakterijske vrste izolovane iz patološkog materijala iz tkiva zahvaćenih D-om, ID-om i IP-om su Campylobacter spp, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Arcanobacterium pyogenes, i Prevotella spp. Takođe, sugerisano je da u patogenezi bolesti važnu ulogu igra virus.

[0012] Tipična strategija lečenja DD-a, ID-a i IP-a je primena antibiotika, antibakterijskih preparata i obloga za lokalnu primenu sa antibioticima, antisepticima i adstringentnim rastvorima. Sve poznate vakcine često ne uspevaju da izazovu dovoljan imunološki odgovor i zaštite životinje od interdigitalnog dermatitisa i interdigitalne flegmone. Ne postoje efikasne vakcine protiv digitalnog dermatitisa.

[0013] Poznati su mnogi tretmani za alergije, a zavise od kliničke slike alergije. Za lečenje akutnog alergijskog kontaktnog dermatitisa, hroničnog alergijskog kontaktnog ekcema i/ili atopijskog ekcema, obično se koriste lipofilne kreme koje sadrže glukokortikosteroide, antimikrobne supstance, antiinflamatorne lekove i/ili kalcijum. Za lečenje ostalih alergijskih dermatitisa primenjuju se različita jedinjenja lokalno ili parenteralno, na primer steroidni preparati, salicilati, ulja ili peptidi izolovani iz mikroorganizama. Sve gore navedene metode lečile su samo simptome, a ne i uzroke alergije. Takođe su poznata sredstva za lečenje alergije koja sadrže antigeni materijal iz keratinofilnih gljivica i

[0014] kvasaca kako je opisano u WO 97/07232. Antigeni materijal opisan u WO 97/07232 sadrži polisaharide i/ili glikopeptide dobijene od keratinofilnih gljivica i kvasaca. Antigeni preparati se mogu koristiti kao farmaceutski sastavi, kao i vakcine za lečenje životinja i ljudi, posebno za lečenje alergija i moduliranje imunološkog odgovora. Mogu biti od imunološke, ali i farmakološke korisnosti.

[0015] Kuen Y L i sar. (Biomaterials, Elsevier Science Publishers BV., izd.16, br.16, 1. januar 1995, stranice 1211-1216) opisuju derivate hitozana u kojima je hitozan aciliran do različitih stepeni sirćetnim, propionskim, n-buternim, n-valerijanskim i n-heksanskim reagensima. Biokompatibilnost pomenutih derivata testirana je npr. u kombinaciji sa enzimima. Kuen Y L i sar. otkrivaju da stepen deacetilovanja hitozana treba da bude manji od 50% radi sprečavanja geliranja.

[0016] CN 102 727 887 A otkriva imunološki adjuvans u modelu alergijske astme kod miša koji uključuje pripremu acetilovanog derivata hitozana, pripremljenog korišćenjem rastvora hitozan-sirćetne kiseline, neutralisanog sa NaOH. OVA se koristi kao model antigena.

[0017] Seferian P G i sar. (Vaccine, Elsevier Ltd, GB, izd.19, br.6, 8. novembar 2000., stranice 661-668) opisuju smešu antigena hitozana gde je antigen pomešan sa sterilnim 2% rastvorom u 2% rastvoru sirćetne kiseline, nakon čega sledi neutralizacija sa NaOH čime se formira fini želatinozni talog koji je korišćen za vakcinaciju.

[0018] Huadong Wang i sar. (BMC Infectious Diseases, izd.14, br.1, 11. april 2014., stranica 195) objavljuju pripremu vakcine protiv mišjeg citomegalovirusa koja uključuje pripremu antigenog rastvora pomešanog sa 0,2% (w/v) hitozanskog adjuvansa razblaženog u 25 mM rastvora natrijum acetata (pH 5,0). Hitozan je pripremljen: dodavanjem 0,04 g hitozana u 20 ml 0,1 M rastvora glacijalne sirćetne kiseline [koncentracija 0,2% (w/v)], mešanjem oko sat vremena da se otopi i podešavanjem pH sa NaOH.

[0019] WO 2013/033400 detaljno opisuje pripremu vakcine protiv mišjeg citomegalovirusa, koja uključuje pripremu rastvora antigena pomešanog sa hitozanskim adjuvansom 0,2% (w/v), razblaženom u 25 mM rastvoru natrijum acetata (pH 5,0). Hitozan je pripremljen: dodavanjem 0,04 g hitozana u 20 ml 0,1 M rastvora glacijalne sirćetne kiseline [koncentracija 0,2% (w/v)], mešanjem oko sat vremena da se otopi, podešavanjem pH sa NaOH.

[0020] Cilj ovog pronalaska je obezbeđivanje efikasnijeg imunobiološkog proizvoda/preparata. Takođe, cilj ovog pronalaska je da se obezbedi novo sredstvo za upotrebu u veterinarskoj i/ili humanoj medicini. Sledeći cilj ovog pronalaska je obezbeđivanje novih sredstava za lečenje i/ ili sprečavanje mastitisa, poželjno latentnog mastitisa i/ili akutnog mastitisa, endometritisa, poželjno hroničnog, akutnog i/ili gnojno-kataralnog endometritisa, bolesti papaka i kandži, hramanja, lezija u interdigitalnom prostoru, digitalnog dermatitisa, interdigitalnog dermatitisa, interdigitalne flegmone, trihofitoze, mikrosporoze, mikoza kože, alergija, kao i bolesti komplikovanih alergijama, posebno alergijske opstruktivne plućne bolesti, alergijskih bolesti kože, alergijskog eritema uha, alergijskog rinitisa, alergijskog konjunktivitisa, akutnog alergijskog kontaktnog dermatitisa, hroničnih alergijskih kontaktnih ekcema ili atopijskih ekcema, opstruktivne plućne bolesti, naročito hronične opstruktivne bolesti pluća, kožnih bolesti, posebno dermatitisa, eritema uha, rinitisa, konjunktivitisa, dermatofitoze ili bradavica, naročito običnih bradavica kod subjekta i za modulaciju imunološkog odgovora kod subjekta i/ili za povećanje reproduktivne efikasnosti, poželjno efikasnosti reprodukcije kod uzgoja životinja.

[0021] Ovi ciljevi se rešavaju predmetom definisanim u patentnim zahtevima.

[0022] Sledeće slike služe za ilustraciju ovog pronalaska.

Slika 1 ilustruje standardnu krivu za kvantifikaciju 1,3-ß-D-glukana. Prikazana je srednja brzina promene optičke gustine ucrtana u grafikon preko poznatih koncentracija [pg/ml] standardnih rastvora 1,3-ß-D-glukana. Za generisanje standardnih krivi pripremljeni su rastvori 1,3-ß-D-glukana od 100 pg/ml, 50 pg/ml, 25 pg/ml, 12,5 pg/ml i 6,25 pg/ml prema preporukama proizvođača. Izmerena kriva bila je linearna u celom opsegu i zadovoljava kriterijume prihvatanja kontrole kvaliteta (R<2>> 0,980).

Slika 2 ilustruje dinamiku intenziteta kliničkih simptoma alergijskog bronhitisa kod konja nakon primene sastava pripremljenog prema primeru 41 (eksperimentalna grupa) i bez vakcinacije (kontrolna grupa). Sastav je injektiran 3 puta sa razmakom od 4 dana. Skor kliničkih simptoma je sledeći: 0 = bez simptoma; 1 = slabo zviždanje, bez kašlja; 2 = slabo zviždanje, sa kašljem; 3 = izraženo zviždanje; 4 = izraženo zviždanje sa kliničkim simptomima depresije.

Slika 3 ilustruje dinamiku intenziteta kliničkih simptoma hronične opstruktivne bolesti pluća kod konja nakon primene sastava pripremljenog prema primeru 41 (eksperimentalna grupa) i bez vakcinacije (kontrolna grupa). Sastav je injektiran 3 puta sa razmakom od 4 dana. Skor kliničkih simptoma je sledeći: 0 = bez simptoma; 1 = slabo zviždanje, bez kašlja; 2 = slabo zviždanje, sa kašljanjem; 3 = izraženo zviždanje; 4 = izraženo zviždanje sa kliničkim simptomima depresije.

Slika 4 ilustruje dinamiku kliničkih znakova kožnih bolesti kod pasa imunizovanih sastavom prema primeru 42 u dozama od 0,5 ml i 1,0 ml (prikazan je srednji skor kliničkih simptoma u svakoj grupi; n=10). Sastav je injektiran 3 puta sa razmakom od 7 dana. Skor kliničkih simptoma je sledeći: 0 = bez simptoma; 1 = rast dlake, aktivno odbacivanje krasta ili prekomerno ljuštenje; 2 = alopecija, bez rasta dlake, odbacivanje krasta; 3 = deskvamacija, ili oticanje sa krastom, krasta nije odbačena; 4 = deskvamacija ili oticanje, bol pri palpaciji; 5 = inflamatorni odgovor, nekrotična krasta.

Slika 5 ilustruje dinamiku kliničkih znakova kožnih bolesti kod pasa imunizovanih sastavom prema primeru 50 u dozama od 0,5 ml. (Prikazan je srednji skor kliničkih simptoma u svakoj grupi; kod vakcinisanih subjekata n=15 i u kontrolnoj grupi n=15). Sastav je injektiran 3 puta sa razmakom od 3 do 4 dana. Skor kliničkih simptoma je sledeći: 0 = bez simptoma; 1 = rast dlake, aktivno odbacivanje krasta ili prekomerno ljuštenje; 2 = alopecija, bez rasta dlake, odbacivanje krasta; 3 = deskvamacija, ili oticanje sa krastom, krasta nije odbačena; 4 = deskvamacija ili oticanje, bol pri palpaciji; 5 = inflamatorni odgovor, nekrotična krasta.

Slika 6 ilustruje dinamiku kliničkih znakova kožnih bolesti kod pasa imunizovanih sastavom prema primeru 41 i 43 u dozi od 0,5 ml (prikazan je srednji skor kliničkih simptoma u svakoj grupi; n=10). Skor kliničkih simptoma je sledeći: 0 = bez simptoma; 1 = rast dlake, aktivno odbacivanje krasta ili prekomerno ljuštenje; 2 = alopecija, bez rasta dlake, odbacivanje krasta; 3 = deskvamacija, ili oticanje sa krastom, krasta nije odbačena; 4 = deskvamacija ili oticanje, bol pri palpaciji; 5 = inflamatorni odgovor, nekrotična krasta.

Slika 7 ilustruje dinamiku kliničkih znakova rinitisa kod mačaka tretiranih sastavom pripremljenim prema primeru 42. Eksperimentalna grupa mačaka tretirana je sastavom. Prema protokolu studije, obavljene su dve kure, svaki dan 1-2 kapi u nos. Skor simptoma je sledeći: 0 = bez simptoma; 1 = hiperemija i/ili oticanje sluzokože nazalnih prolaza; 2 = blagi sekret iz nosa; 3 = hiperemija i/ili oticanje sluzokože nazalnih prolaza, sekret iz nosa; 4 = otežano disanje, hiperemija i oticanje sluzokože nazalnih prolaza, obilan sekret iz nosa; 5 = smrt životinja.

Slika 8 ilustruje dinamiku kliničkih znakova rinitisa kod pasa tretiranih sastavom pripremljenim prema primeru 43. Eksperimentalna grupa pasa tretirana je sastavom. Prema protokolu studije, obavljene su dve kure, svaki dan 1-2 kapi u nos. Skor simptoma je sledeći: 0 = bez simptoma; 1 = hiperemija i/ili oticanje sluzokože nazalnih prolaza; 2 = blagi sekret iz nosa; 3 = hiperemija i/ili oticanje sluzokože nazalnih prolaza, sekretiz nosa; 4 = otežano disanje, hiperemija i oticanje sluzokože nazalnih prolaza, obilan sekretiz nosa; 5 = smrt životinja

Slika 9 ilustruje dinamiku kliničkih znakova konjunktivitisa kod mačaka tretiranih sastavom pripremljenim prema primeru 54. Eksperimentalna grupa mačaka tretirana je sastavom prema protokolu studije ukapavanjem 1-2 kapi na konjunktivu svaki dan. Skor simptoma je sledeći: 0 = bez simptoma; 1 = hiperemija i/ili oticanje konjunktive; 2 = neznatna lakrimacija; sekretiz očiju; 3 = hiperemija i/ili oticanje konjunktive, sekretiz očiju; 4 = hiperemija i oticanje konjunktive, intenzivan sekretiz očiju; 5 = propadanje očne jabučice.

[0023] Upotreba reči „jedan“ (a/an) kada se koristi zajedno sa terminom „sadrži“ u zahtevima i/ili opisu može značiti „jedan“, ali je takođe u skladu sa značenjem „jedan ili više,“ „najmanje jedan“ i „ jedan ili više njih.“

[0024] Termin „oko“ znači da se razmatra navedena vrednost, plus ili minus 5% od navedene vrednosti, ili standardna greška za merenja date vrednosti.

[0025] Termin „sadrži“, kako se ovde koristi, ne tumači se kao ograničeno na značenje „sastoji se od“ (tj. isključujući prisustvo druge dodatne materije). Umesto toga, „sadrži“ podrazumeva da opciono može biti prisutna dodatna materija. Termin „sadrži“ obuhvata posebno predviđena rešenja koja spadaju u njegov opseg „koji se sastoji od“ (tj. isključujući prisustvo drugih dodatnih materija) i „koji sadrže, ali se ne sastoje od“ (tj. zahtevaju prisustvo drugih dodatnih materija), s tim da je prethodni poželjniji.

[0026] Termin „hitozan“, kako se ovde koristi, odnosi se na kopolimer 2-amino-2-deoksi-D-glukopiranoze i 2-acetamido-2-deoksi-D-glukopiranoze, gde je stepen deacetilovanja veći od 50%, a poželjno veći od 60%, 70%, 80% ili 90%. Hitozan se hemijski može dobiti iz hitina koji je poli-1,4-β-N-acetil-D-glukozamin, tačnije N-acetil-1,4-β-D-glukopiranozamin deacetilovanjem. Tipični preparati hitozana imaju različite molekulske mase u zavisnosti od načina proizvodnje.

[0027] Termin „mastitis“, kako se ovde koristi, odnosi se na inflamaciju tkiva dojke i vimena. Poželjno obuhvata latentni mastitis i/ili akutni mastitis. Latentni mastitis se takođe može nazivati skriveni mastitis i/ili subklinički mastitis. Poželjno je da se latentni mastitis može dijagnostikovati sa 2% rastvorom mastidina, dobro poznatim postupkom u struci. Akutni mastitis takođe može biti fibrinozni, kataralni, gnojno-kataralni, hemoragični mastitis sa tipičnim vizuelnim kliničkim simptomima bolesti.

[0028] Termin "endometritis", kako se ovde koristi, odnosi se na upalu endometrijuma.

Poželjnije, odnosi se na inflamaciju sluzokože materice, koja može biti praćena manje ili više značajnom promenom endometrijuma i povećanom aktivnošću zdravih ili obnovljenih materičnih žlezda. Poželjno je da obuhvata hronični endometritis, subakutni, akutni i subklinički (skriveni) endometritis. Priroda inflamacije je podeljena na kataralnu, kataralnognojnu, gnojnu, fibrinoznu i skrivenu. Endometritis se takođe može nazivati uteritis. Uteritis najčešće prati razvoj polimorfne mikroflore.

[0029] Termin „trihofitoza“, kako se ovde koristi, odnosi se na bolest usled infekcije gljivicama iz roda Trichophyton. Goveda se obično zaraze vrstom Trichophyton verrucosum, dok se ljudi, psi, mačke, konji, krznene i druge životinje obično zaraze vrstom T. mentagrophytes. Ljudi se takođe mogu zaraziti vrstom T.rubrum. Takođe se može nazivati Trichophyton bolest.

[0030] Termini „mikrosporoza“ ili „bolest Microsporum canis“, kako se ovde koriste, odnose se na bolest usled infekcije uzročnicima iz roda Microsporum, poželjnije Microsporum canis. Tipično se ovom bolešću zaraze mačke, psi, konji i druge životinje. Posebno je česta kod svinja, koje se uglavnom zaraze vrstom Microsporum nanum.

[0031] Termin „bradavice“, kako se ovde koristi, odnosi se generalno na mali, grubi izrast koji podseća na karfiol ili na čvrsti mehur. Bradavice obično uzrokuje virusna infekcija. Poželjno se izraz "bradavice" odnosi na obične bradavice, posebno na verrucae vulgares i paronihijalne bradavice.

[0032] Termin „bolest papaka i kandži“, kako se ovde koristi, odnosi se naročito na zarazne bolesti papaka i kandži kod šupljorožaca i/ili svinja. Navedene bolesti naročito su uzrokovane bakterijama, gljivicama i/ili virusima. Izraz „bolesti papaka i kandži“ naročito se odnosi na digitalni dermatitis, interdigitalni dermatitis i interdigitalnu flegmonu.

[0033] Termin „šupljorožac“, kako se ovde koristi, odnosi se naročito na kopitare, sisare preživare uključujući bizone, afričke bivole, vodene bivole, antilope, gazele, ovce, koze, mošusnu govečad i goveda.

[0034] Termin „hramanje“, kako se ovde koristi, odnosi se naročito na hramanje koje je posledica infekcije i oštećenja tkiva. Naročito se termin „hramanje“ odnosi na hramanje zbog bolesti papaka i kandži, posebno zbog digitalnog dermatitisa (DD), interdigitalnog dermatitisa (ID) i interdigitalne flegmone (IP).

[0035] Otkriveno je da sastav koji sadrži hitozan modifikovan organskom karboksilnom kiselinom ili njenom solju stimuliše imunološki odgovor i može se koristiti u postupku lečenja i/ili prevencije brojnih različitih bolesti. Pored toga, otkriveno je da se već poznata aktivna sredstva mogu koristiti u do 50 puta manjoj dozi ako se primenjuju u kombinaciji sa modifikovanim hitozanom predmetnog pronalaska.

[0036] Prema tome, ovaj pronalazak se odnosi na metodu za pripremu hitozana modifikovanog organskom karboksilnom kiselinom ili njenom solju, hidrokoloida, jedinjenjem i sastavom definisanim u zahtevima. Pored toga, ovaj pronalazak se odnosi na hidrokoloid, jedinjenje ili sastav, kako je definisano u zahtevima, za upotrebu kako je definisano u zahtevima. Poželjno je da je modifikovani hitozan prozirni gel sa odsutnim ili slabim mirisom sirćetne kiseline. Modifikovani hitozan pripremljen metodom prema ovom pronalasku poželjno ima molekulsku masu ili prosečnu molekulsku masu od oko 50 Da do oko 700 kDa, naročito od oko 15 kDa do oko 500 kDa, tačnije od oko 15 kDa do oko 150 kDa ili od oko 80 kDa do oko 200 kDa, od oko 150 kDa do oko 300 kDa, od oko 100 kDa do oko 250 kDa ili od oko 300 kDa do oko 700 kDa. Sadržaj mase pepela modifikovanog hitozana prema ovom pronalasku je poželjno oko 0,2 do 2%, poželjnije oko 0,8 do oko 1,2%, a najpoželjnije 0,22%. Modifikovani hitozan prema ovom pronalasku može se takođe nazvati derivat hitozana ili njegova varijanta.

[0037] Poželjno je da modifikovani hitozan ima reaktivne amino grupe u količini od oko 100 do oko 500 na 100 kDa hitozana. Modifikovani hitozan pripremljen metodom prema ovom pronalasku ima stepen deacetilovanja od 62% do 98%, poželjnije od 80 do 95%, poželjnije od oko 89% do oko 93% ili od oko 89% do oko 98%, od oko 93% do oko 98%, od oko 93% do 95% ili od oko 95% do 98%.

[0038] Modifikovani hitozan, derivat hitozana ili varijanta hitozana pripremljena metodom prema ovom pronalasku je poželjno jedinjenje formule [X]n, u kojoj n predstavlja ceo broj od oko 1 do oko 5000, posebno ceo broj od oko 300 do oko 4000, a X ima sledeću formulu (1):

, pri čemu je 2 do 38% ostataka X koji čine pomenuto jedinjenje modifikovano acetilovanjem i gde su svi ili deo ostataka X koji čine pomenuto jedinjenje modifikovani organskom karboksilnom kiselinom ili njenom solju.

[0039] Prema tome, ovaj pronalazak se takođe odnosi na jedinjenje formule [X]n, u kome n predstavlja ceo broj od 1 do 5000, naročito ceo broj od 300 do 4000, a X ima sledeću formulu (1):

, pri čemu je 2% do 38%, još poželjnije 5% do 20% ostataka X koji čine pomenuto jedinjenje modifikovano acetilovanjem i gde su svi ili deo ostataka X koji čine pomenuto jedinjenje modifikovani organskom karboksilnom kiselinom ili njenom solju.

[0040] Formula X se odnosi na deacetilovanu 2-amino-2-deoksi-D-glukoznu jedinicu odnosno D-glukozaminsku jedinicu, koja je monomer 100% deacetilovanog hitozana. Shodno tome, formula X se takođe može odnositi na formulu predstavljenu u uglastim zagradama sledeće formule (2) koja predstavlja strukturnu formulu hitozana sa stepenom deacetilovanja od 100%:

[0041] Kao što je gore navedeno, n predstavlja ceo broj od oko 1 do oko 5000. Unutar te granice n je poželjno najmanje oko 10, oko 50, oko 80, oko 100, oko 200, oko 300, oko 400, oko 500, oko 600, oko 700, oko 800, oko 900 ili oko 1000 i/ili najviše oko 4000, oko 3000, oko 2500, oko 2000 ili oko 1500. U sledećim poželjnim realizacijama ovog pronalaska n predstavlja ceo broj od oko 50 do oko 2500, naročito od oko 50 do oko 1000, ili od oko 300 do oko 1500, od oko 1000 do oko 2000, od oko 400 do oko 1700, od oko 50 do oko 1700 ili od oko 1000 do oko 5000.

[0042] U daljim poželjnim realizacijama ovog pronalaska oko 5% do oko 35 %, poželjnije oko 5% do oko 20%, poželjnije oko 7% do oko 11% ili oko 2% do oko 7%, oko 5% do oko 7% ili oko 2% do oko 5% ostataka X koji čini jedinjenje kako je prethodno definisano, modifikuje se acetilovanjem, što znači da su acetilovani. Modifikacija acetilovanjem odnosi se na uvođenje acetil funkcionalne grupe u ostatak prema formuli (1) što rezultira ostatkom N-acetil-D-glukozamina.

[0043] U poželjnoj realizaciji ovog pronalaska, organska karboksilna kiselina ima pKs od oko 2 do oko 5, poželjnije od oko 2,3 do oko 4,9. Poželjnije je da se organska karboksilna kiselina ili njena so bira iz grupe koju čine valerijanska kiselina, hlorid valerijanske kiseline, paraaminobenzojeva kiselina, glukuronska kiselina i mlečna kiselina. Poželjno je da se modifikacija sa organskom karboksilnom kiselinom ili njenom solju dobije kontaktom ili reakcijom sa pomenutom organskom karboksilnom kiselinom ili njenom solju ili vodenim rastvorom koji sadrži pomenutu organsku karboksilnu kiselinu ili njenu so. Poželjno je da se modifikacija odvija kontaktom sa vodenim rastvorom koji sadrži oko 0,2 M do oko 22,5 M navedene organske karboksilne kiseline ili njene soli, ili u vodenom rastvoru koji sadrži oko 1 mM do oko 100 mM organske karboksilne kiseline ili njene soli, poželjnije oko 1 mM do oko 10 mM.

[0044] Modifikovani hitozan, derivat hitozana ili varijanta hitozana pripremljena metodom prema ovom pronalasku je poželjno poliamino-šećerni koloid, poželjno hidrokoloid. Poželjno je da je modifikovani hitozan, derivat hitozana ili varijanta hitozana hitozan-glukuronska kiselina-hidrokoloid ili hitozan-p-aminobenzojeva kiselina-hidrokoloid ili hitozan-valerijanska kiselina -hidrokoloid. Hitozan-glukuronska kiselina-hidrokoloid poželjno ima hemijsku formulu: (C6H11O4N)x(C8H13O5Ny(C6H10O7)z(H2O)m.. Poželjno je da hitozan-glukuronska kiselina-hidrokoloid ima sledeću molekulsku masu: x*(161)+y*(203)+z*(194,14)+m*(18). Alternativno, hitozan-p-aminobenzojeva kiselina-hidrokoloid ima hemijsku formulu: (C6H11O4N)x(C8H13O5N)y(C7H7O2N)z(H2O)m.. Poželjno je da hitozan-p-aminobenzojeva kiselina-hidrokoloid ima sledeću molekulsku masu: x*(161)+y*(203)+z*(137,14)+m*(18). Alternativno, hitozan-valerijanska kiselina-hidrokoloid ima hemijsku formulu: (C6H11O4N)x(C8H13O5N)y(C5H10O2)z(HCl)z(H2O)m.. Poželjno je da hitozan-valerijanska kiselina-hidrokoloid ima sledeću molekulsku masu: x*(161)+y*(203)+z*(102)+z*(36,5)+m*(18).

[0045] Prema tome, ovaj pronalazak se takođe odnosi na hidrokoloid koji sadrži:

(i) 0,1% do 5% (w/v) hitozana i 0,001 do 5% (w/v) valerijanske kiseline ili njene soli, poželjno hlorid valerijanske kiseline ili

(ii) 0,1% do 5% (w/v) hitozana i 0,001 do 5% (w/v) glukuronske kiseline ili paminobenzojeve kiseline ili njihove soli.

[0046] Poželjna realizacija ovog pronalaska odnosi se na hidrokoloid koji sadrži:

(i) 0,1% do 3% (w/v) hitozana i 0,001 do 2% (w/v) valerijanske kiseline ili njene soli, poželjno hlorid valerijanske kiseline, ili

(ii) 0,1% do 3% (w/v) hitozana i 0,001 do 2% (w/v) glukuronske kiseline ili paminobenzojeve kiseline ili njihove soli.

[0047] Sledeća poželjna realizacija ovog pronalaska odnosi se na hidrokoloid koji sadrži:

(i) 0,1% do 1,2% (w/v) hitozana i 0,001 do 1% (w/v) valerijanske kiseline ili njene soli, poželjno hlorid valerijanske kiseline, ili

(ii) 0,1 do 1,2% (w/v) hitozana i 0,001 do 1% (w/v) glukuronske kiseline ili paminobenzojeve kiseline ili njihove soli.

[0048] Sledeća poželjna realizacija ovog pronalaska odnosi se na hidrokoloid koji sadrži:

(i) 0,1% do 1,2% (w/v) hitozana i

(ii) 0,01 do 0,44% (w/v) valerijanske kiseline ili njene soli, poželjno hlorid valerijanske kiseline.

[0049] Sledeća poželjna realizacija ovog pronalaska odnosi se na hidrokoloid koji sadrži:

(i) 0,1% do 1,2% (w/v) hitozana i

(ii) 0,001 do 0,6% (w/v) glukuronske kiseline ili njene soli.

[0050] Sledeća poželjna realizacija ovog pronalaska odnosi se na hidrokoloid koji sadrži:

(i) 0,1% do 1,2% hitozana i

(ii) 0,006 do 1% (w/v) p-aminobenzojeve kiseline ili njene soli.

[0051] Poželjno je da je hitozan hidrokoloida jedinjenje formule [X]n, u kojoj n predstavlja ceo broj od oko 1 do oko 5000, naročito ceo broj od oko 300 do oko 4000, a X ima sledeću formulu (1):

, pri čemu je oko 2% do oko 38%, poželjnije oko 5% do oko 20% ostataka X koji čine pomenuto jedinjenje modifikovano acetilovanjem i gde su svi ili deo ostataka X koji čine pomenuto jedinjenje modifikovani organskom karboksilnom kiselinom ili njenom solju kako je definisano u nastavku.

[0052] U poželjnoj realizaciji, preostali procenat hidrokoloida prema ovom pronalasku obezbeđen je disperzionim medijumom, poželjno vodom ili vodom i hlorovodonikom (HCl).

[0053] U poželjnoj realizaciji, hidrokoloid prema ovom pronalasku se koristi kao razblaživanje, poželjno u razblaženju od 0 do 10 puta.

[0054] Modifikovani hitozan, derivat hitozana ili varijanta hitozana pripremljena postupkom prema ovom pronalasku poželjno je prirodna bela do žućkasta viskozna tečnost. Poželjno je da modifikovani hitozan, derivat hitozana ili varijanta hitozana imaju tipičan miris karboksilne kiseline, poželjno tipičan miris valerijanske kiseline.

[0055] Modifikovani hitozan, derivat hitozana ili varijanta hitozana sadrži poželjno oko 0,2% pentanoil hlorida ili 0,2% glukuronske kiseline ili 0,2% p-aminobenzojeve kiseline.

[0056] Modifikovani hitozan, derivat hitozana ili varijanta hitozana sadrži poželjno 1% ostatka hitozana od sušenja hitozana.

[0057] Modifikovani hitozan, derivat hitozana ili varijanta hitozana ima poželjno oko 10 do oko 1000 mOsmol, poželjno oko 10 do oko 200 mOsmol, najpoželjnije oko 100 mOsmol.

[0058] Modifikovani hitozan pripremljen postupkom prema ovom pronalasku poželjno je dalje modifikovan mineralnom kiselinom. Navedena modifikacija može nastati kontaktom ili reakcijom sa pomenutom mineralnom kiselinom ili vodenim rastvorom koji sadrži pomenutu mineralnu kiselinu. Pomenuta mineralna kiselina je poželjno HCl ili H2SO4. Poželjno je da se modifikacija odvija inkubacijom modifikovanog hitozana u vodenom rastvoru koji sadrži oko 0,05 M do oko 1 M pomenute mineralne kiseline, poželjno HCl ili H2SO4.

[0059] Predmetni pronalazak takođe se odnosi na sastav koji sadrži modifikovani hitozan, derivat hitozana ili njegovu varijantu ili hidrokoloid prema ovom pronalasku. Poželjno je da je sastav koji sadrži pomenuti modifikovani hitozan prozirni gel sa odsutnim ili slabim mirisom sirćetne kiseline koja je rastvorljiva u vodi i u 1% rastvoru sirćetne kiseline. Sastav poželjno ima molekulsku masu ili prosečnu molekulsku masu od oko 50 Da do oko 700 kDa, naročito od oko 15 kDa do oko 500 kDa, tačnije od oko 15 kDa do oko 150 kDa ili od oko 80 kDa do oko 200 kDa, od oko 150 kDa do oko 300 kDa, od oko 100 kDa do oko 250 kDa ili od oko 300 kDa do oko 700 kDa. Sadržaj mase pepela u sastavu prema predstavljenom pronalasku je 0,1 do 2%, poželjno oko 0,8 do oko 1,2%, poželjnije oko 0,22%.

[0060] Poželjno je da modifikovani hitozan pomenutog sastava ima reaktivne amino grupe u količini od oko 100 do oko 500 na 100 kDa hitozana. Modifikovani hitozan sastava prema ovom pronalasku ima stepen deacetilovanja poželjno od oko 65% do oko 98%, poželjnije od oko 80% do oko 95%, poželjnije od oko 89% do oko 93%, ili oko 89% do oko 98%, od oko 93% do oko 98%, od oko 93% do oko 95% ili od oko 95% do oko 98%.

[0061] U daljoj poželjnoj realizaciji ovog pronalaska, sastav dodatno sadrži mineralnu kiselinu. Pomenuta mineralna kiselina podržava rastvorljivost modifikovanog hitozana i/ili može dalje modifikovati hitozan. Pomenuta mineralna kiselina je poželjno HCl ili H2SO4. Vodeni rastvor sadrži poželjno 0,05 M do oko 1 M mineralne kiseline, poželjno HCl ili H2SO4.

[0062] Predmetni pronalazak se takođe odnosi na metodu za pripremu modifikovanog hitozana, varijante hitozana ili derivata hitozana koji obuhvata korak:

(a) inkubacija hitozana u vodenom rastvoru organske karboksilne kiseline ili njene soli kako je definisano u patentnim zahtevima.

[0063] U poželjnoj realizaciji, hitozan se prvo rastvara pod kiselim vodenim uslovima, a zatim taloži povećavanjem pH vrednosti na pH vrednost od oko 8,0 do oko 8,5 pre nego što se inkubira u vodenom rastvoru organske karboksilne kiseline ili njene soli, kako je prethodno opisano.

[0064] Prema tome, ovo otkriće se takođe odnosi na modifikovani hitozan koji se može dobiti postupkom koji obuhvata

(i) rastvaranje hitozana u vodenom rastvoru kiseline

(ii) povećanje pH vrednosti dok se hitozan ne istaloži

(iii) prikupljanje istaloženog hitozana, i

(a) inkubacija prikupljenog hitozana iz koraka (iii) u vodenom rastvoru organske karboksilne kiseline ili njene soli kako je dalje definisano u nastavku.

[0065] Predmetni pronalazak se takođe odnosi na postupak koji sadrži korake:

(i) rastvaranje hitozana u vodenom rastvoru kiseline

(ii) povećanje pH vrednosti dok se hitozan ne istaloži

(iii) prikupljanje istaloženog hitozana, i

(a) inkubacija prikupljenog hitozana iz koraka (iii) u vodenom rastvoru organske karboksilne kiseline ili njene soli kako je dalje definisano u nastavku.

[0066] Organska karboksilna kiselina ili njena so u koraku (a) ima poželjno pKs od oko 2 do oko 5, poželjnije od oko 2,3 do oko 4,9. Navedena organska karboksilna kiselina je valerijanska kiselina, mlečna kiselina, paraaminobenzojeva kiselina ili glukuronska kiselina ili njihova so, naročito hlorid valerijanske kiseline. Pomenuta karboksilna organska kiselina ili njena so se poželjno koristi u koncentraciji od oko 0,2 M do oko 22,5 M. Inkubacija hitozana odnosno prikupljenog hitozana iz koraka (iii) i vodenog rastvora organske karboksilne kiseline ili njene soli, kako je opisano u koraku (a), rezultira rastvorom hitozana, modifikacijom hitozana i/ili formiranjem gela. Poželjno je da je pH vrednost vodenog rastvora u koraku (a) oko 5 do oko 6 ili oko 5,0; 5,1; 5,2; 5,3; 5,4; 5,5; 5,6; 5,7; 5,8; 5,9 ili 6,0. Poželjno je da se modifikacija hitozana odvija u vodenom rastvoru koji sadrži oko 1 mM do oko 100 mM organske karboksilne kiseline ili njene soli, poželjnije oko 1 mM do oko 10 mM.

[0067] Poželjno, korak (a) se izvodi dok se hitozan ne modifikuje i rastvori. Poželjno se izvodi mešanjem hitozana sa vodenim rastvorom organske karboksilne kiseline ili njene soli ili suspendovanjem hitozana u vodenim uslovima i dodavanjem organske karboksilne kiseline u suspenziju. Poželjno je da se izvodi uz mešanje oko 1 do oko 72 sata, još poželjnije oko 24 do oko 48 sati. Korak (a) može obuhvatati dodavanje sledeće kiseline ili se može izvesti u prisustvu sledeće kiseline. Pomenuta sledeća kiselina je poželjno mineralna kiselina, organska kiselina ili so pomenute mineralne kiseline ili organske kiseline. Poželjno je da je mineralna kiselina HCl ili H2SO4, a organska kiselina glutaminska, paraaminobenzojeva kiselina ili mlečna kiselina. Poželjno je da se mineralna ili organska kiselina dodaje ili je prisutna u količini da se pH vrednost smeše iz koraka (a) podesi na pH vrednost od oko 5 do oko 6 ili oko 5,0; 5,1; 5,2; 5,3; 5,4; 5,5; 5,6; 5,7; 5,8; 5,9 ili 6,0. Dodavanje sledeće kiseline može podržati rastvaranje i/ili modifikaciju hitozana, npr. smanjenjem vremena potrebnog za rastvaranje modifikovanog hitozana.

[0068] Koncentracija hitozana u koraku (a), ili ako postupak sadrži korak (i) za korak (i), je poželjno oko 1 g do oko 20 g hitozana po litri, poželjnije oko 5 g do oko 15 g hitozana po litri, najpoželjnije oko 8 do oko 10 g hitozana po litri.

[0069] Hitozan koji se koristi za korak (a), ili ako metoda sadrži korak (i) za korak (i), može biti komercijalno dostupan hitozan ili hitozan izolovan iz bilo kog prirodnog izvora koji sadrži hitozan, kao što je biomasa koja sadrži hitozan. Alternativno, može se koristiti hitin koji je deacetilovan da bi se dobio hitozan pre koraka (a), ili ako metod sadrži korak (i) pre koraka (i). Navedeni hitin može biti komercijalno dostupan ili može biti izolovan iz prirodnog izvora koji sadrži hitin kao što je biomasa koja sadrži hitin. Biomasa za izolaciju hitina i/ili hitozana je poželjno biomasa gljivica, insekata i/ili ljuskara.

[0070] Deacetilovanje hitina može se izvršiti metodama poznatim u struci kao npr. upotrebom natrijum hidroksida (NaOH) kao reagensa u suvišku i vode kao rastvarača ili enzimskim metodama. Izolacija hitozana i/ili hitina iz prirodnih izvora takođe se može izvesti metodama poznatim u struci i metodama opisanim u primerima ovog pronalaska.

[0071] Hitozan koji se koristi za korak (a), ili ako metoda sadrži korak (i) za korak (i), ima stepen deacetilovanja od 62% do 95%, poželjnije od 80% do 94 %, poželjnije od oko 89% do oko 93 % ili od oko 93% do oko 98%, od oko 93% do 95%, od oko 95% do oko 98%, ili od najmanje 70%, 80%, 90% ili 95%, ili stepen deacetilovanja od oko 80% do oko 95%, još poželjnije od oko 90% do oko 95%, najpoželjnije oko 77% do oko 80%.

[0072] Hitozan koji se koristi za korak (a), ili ako metoda sadrži korak (i) za korak (i), ima poželjno viskoznost od oko 50 do 400 MPas, poželjnije oko 70 do oko 150 MPas ili oko 151 do oko 350 MPas.

[0073] Hitozan koji se koristi za korak (a), ili ako metoda sadrži korak (i) za korak (i), ima poželjno molekulsku masu ili prosečnu molekulsku masu od oko 50 Da do oko 700 kDa, naročito od oko 15 kDa do oko 500 kDa, tačnije od oko 15 kDa do oko 150 kDa, ili od oko 80 kDa do oko 200 kDa, od oko 150 kDa do oko 300 kDa, od oko 100 kDa do oko 250 kDa ili od oko 300 kDa do oko 700 kDa.

[0074] Pre nego što se hitozan upotrebi u koraku (a), ili ako postupak sadrži korak (i) u koraku (i), hitozan se može sterilisati autoklaviranjem. Spomenuta sterilizacija može dovesti do toga da je modifikovani hitozan prema ovom pronalasku manje toksičan, da ga svaki subjekat bolje podnosi i/ili da uzrokuje manje neželjenih nuspojava.

[0075] Poželjno, korak (i) se izvodi upotrebom vodenog rastvora slabe kiseline, poželjno organske kiseline ili njene soli, još poželjnije sirćetne kiseline, valerijanske kiseline, mlečne kiseline, paraaminobenzojeve kiseline ili glukuronske kiseline ili njihovih soli, naročito hlorida valerijanske kiseline. Poželjno je da se kiselina koristi u koncentraciji od oko 0,8% do oko 2%. Korak (i) se poželjno izvodi uz mešanje. Mešanje se može izvoditi oko 2 sata do oko 24 sata. Poželjno, korak (i) se izvodi dok se ne dobije gel ili gel suspenzija. Nerastvorene čestice se mogu ukloniti, npr. filtracijom. Na primer, za takvu filtraciju može se koristiti metalna rešetka sa ćelijom od 200 µm do 300 µm.

[0076] Korak (ii) se poželjno izvodi povećanjem pH vrednosti gela ili gel suspenzije dobijene u koraku (i) dok se ne formira talog. Poželjno je da se izvodi uz mešanje. Poželjnose izvodi tretiranjem hitozana pod vodenim alkalnim uslovima, poželjnije pod vodenim alkalnim uslovima koji sadrže oko 0,1 do oko 25,0% alkalije. U poželjnoj realizaciji, alkalija je NaOH. Poželjno je da se pomenuti korak izvodi na temperaturi od oko 4°C do oko 55°C. Poželjno je da se tretman izvodi oko 20 min do oko 2 sata, poželjnije oko 30 min do oko 70 min, ali takođe može trajati i do oko 24 h. Poželjno je da se vrednost pH povećava dodavanjem alkalije gelu ili gel suspenziji iz koraka (i). Poželjno je da se vrednost pH povećava da bi se dobio pH od oko 8,0 do oko 8,5. Korak (ii) može rezultirati daljim deacetilovanjem hitozana. Takođe može rezultirati time da je modifikovani hitozan prema ovom pronalasku manje toksičan, da ga svaki subjekat bolje podnosi i/ili da uzrokuje manje neželjenih nuspojava.

[0077] Korak (iii) se poželjno izvodi centrifugiranjem smeše ili suspenzije dobijene u koraku (ii). Centrifugiranje se poželjno izvodi na oko 4000 do oko 6000 obrtaja/min, poželjnije na oko 5000 obrtaja/min. Centrifugiranje se poželjno izvodi do 60 minuta.

[0078] Metode kojima se može dobiti modifikovani hitozan iz ovog pronalaska i metode iz ovog pronalaska mogu sadržati dodatne korake. Na primer, proizvod dobijen u koraku (ii) može biti homogenizovan. Poželjno je da se korak homogenizacije izvodi u zatvorenom sterilnom homogenizatoru.

[0079] Alternativno ili pored toga, proizvod dobijen u koraku (a) može se dijalizovati. Dijaliza se poželjno izvodi u zatvorenom sistemu za uklanjanje slobodnih jona soli i jedinjenja male molekulske mase. Poželjno je da se dijaliza vrši unakrsnom filtracijom oko 1 do oko 6 sati ili membranskom filtracijom nasuprot destilovanoj vodi oko 24 do oko 48 sati.

[0080] Alternativno ili pored toga, metode kojima se može dobiti modifikovani hitozan iz ovog pronalaska i metode iz ovog pronalaska mogu sadržati dalji korak pripreme konačnog proizvoda. Priprema konačnog proizvoda može obuhvatati razblaživanje dobijenog proizvoda. Poželjno je da se proizvod razblaži dodatkom vode, poželjnije sterilne vode za injekcije. Međutim, proizvod se takođe može razblažiti u bilo kom drugom pogodnom vodenom rastvoru. Alternativno ili kao dodatak, priprema konačnog proizvoda može sadržati dodavanje jednog ili više dodatnih jedinjenja, kao što su razblaživači, konzervansi, antibiotici, dalje aktivne supstance i/ili antigeni materijal iz mikroorganizama i/ili enzimi. Pogodni konzervansi su na primer hlorokrezol, tiomersal i formalin. Pogodni antibiotici su na primer neomicin, penicilin, gentamicin, kloksacilin, cefapirin i cefalosporin. Konačno, konačni proizvod se može sterilisati. Poželjno je da se sterilizacija vrši zagrevanjem, poželjno oko 40 do 50 minuta na temperaturi od oko 65°C do oko 80°C. Poželjno je da se navedena sterilizacija ponovi jedan, dva, tri, četiri ili pet puta.

[0081] Poželjno je da konačni proizvod ima koncentraciju od oko 0,02g do oko 2g modifikovanog hitozana po litri, poželjnije od oko 0,04 do oko 1g modifikovanog hitozana po litri.

[0082] U poželjnoj realizaciji, metode iz ovog pronalaska sadrže korake opisane u zahtevima. Na primer, metode mogu sadržati sledeće korake:

- opciono sterilisanje hitozana npr. autoklaviranjem,

(i) rastvaranje hitozana u vodenom rastvoru kiseline, posebno u prisustvu sirćetne kiseline,

- opciono uklanjanje nerastvorenih čestica npr. filtracijom,

(ii) povećanje pH vrednosti dok se hitozan ne istaloži,

(iii) prikupljanje istaloženog hitozana,

- opciono homogenizacija prikupljenog hitozana pod vodenim uslovima,

(a) inkubacija prikupljenog hitozana iz koraka (iii) ili homogenizovanog prikupljenog hitozana u vodenom rastvoru organske karboksilne kiseline ili njene soli kako je definisano u zahtevima, opciono u prisustvu sledeće mineralne kiseline ili organske kiseline,

- opciono dijalizovanje proizvoda dobijenog u koraku (a),

- opciono dodavanje dodatnih jedinjenja, poput razblaživača, konzervansa, antibiotika, dodatnih aktivnih jedinjenja kao što su hemoterapeutski preparati, i/ili antigeni materijal iz mikroorganizama i/ili enzima i

- opciono sterilisanje finalnog proizvoda npr. grejanjem.

[0083] Poželjno je da redosled koraka kako je prethodno opisano odgovara prethodno navedeom redosledu. Međutim, kako je poznato stručnjaku u ovoj oblasti, redosled pojedinačnih koraka može se menjati sve dok se postižu isti efekti. Na primer, razblaživači kao što je voda mogu se dodati u različitim fazama gore opisanog postupka.

[0084] Ako nisu dati specifični rasponi temperature za korake metoda kao što je gore opisano, poželjno je da se koraci izvode na sobnoj temperaturi i/ili u rasponu od oko 10°C do oko 40°C, poželjnije u rasponu od oko 20°C do oko 30°C.

[0085] U daljoj poželjnoj realizaciji, ovaj pronalazak se odnosi na sastav koji sadrži modifikovani hitozan, derivat hitozana ili njegovu varijantu ili hidrokoloid prema ovom pronalasku.

[0086] Pored toga, sastav ovog pronalaska može sadržati i druge aktivne supstance. Poželjno, sastav ovog pronalaska može dodatno da sadrži hemoterapeutski preparat, naročito ako se koristi za lečenje mastitisa.

[0087] U daljoj poželjnoj realizaciji ovog pronalaska, sastav ovog pronalaska može dodatno sadržati antigeni materijal iz mikroorganizama i/ili enzime, naročito antigeni materijal keratinofilnih gljivica i/ili keratinofilnih gljivica sličnih kvascu i/ili kvascima.

[0088] Antigeni materijal keratinofilnih gljivica ili kvasaca može se dobiti iz bilo kog dela keratinofilnih gljivica ili kvasaca koji sadrže antigene kao što su micelijum, artrospore, mikrokonidije dermatofita, blastospore kvasca ili drugo. Poželjno je da su antigeni polisaharidi i/ili glikopeptidi. Poželjno je da se antigeni materijal keratinofilnih gljivica ili kvasaca bira iz grupe koju čine: homogenizovane inaktivisane mikrokonidije dermatofita, homogenizovane inaktivisane blastospore kvasca, antigeni materijal blastospora kvasca i antigeni materijal mikrokonidija dermatofita. Prema tome, sastav predmetnog pronalaska može dodatno da sadrži homogenizovane inaktivisane mikrokonidije dermatofita i/ili homogenizovane inaktivisane blastopore kvasca i/ili antigeni materijal blastospora kvasca i/ili mikrokonidija dermatofita.

[0089] Antigeni materijal keratinofilnih kvasaca, naročito blastospore kvasca, poželjno pripada rodu Candida, a poželjnije vrsti Candida albicans. Antigeni materijal keratinofilnog dermatofita, naročito mikrokonidije dermatofita, poželjno pripadaju rodovima Trichophyton, Microsporum i/ili Chrisporium. Poželjnije, mikrokonidije dermatofita pripadaju vrstama Trichophyton verrucosum, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton equinum, Trichophyton sarkisovii, Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes, Microsporum canis, Microsporum gypseum i/ili Chrisporium tropicum. Naročito, vrsta Microsporum canis može biti Microsporum canis var. obesum i/ili Microsporum canis var. distortum.

[0090] U poželjnoj realizaciji ovog pronalaska blastospore kvasca i mikrokonidije dermatofita se dobijaju od sojeva prethodno pomenutih vrsta koje su dobijene usmerenom selekcijom na osnovu proizvodnje spora i/ili slabljenja. Veoma je poželjno koristiti soj koji brže raste u hranljivom medijumu, proizvodi više mikrokonidija odnosno blastospora, ima nižu virulenciju i/ili nema neželjenih reakcija nakon njegove intramuskularne primene u poređenju sa bilo kojim epizootskim sojem iz kojeg potiče. Primeri takvih sojeva su sojevi Trichophyton mentagrophytes DSM – 7279, Trichophyton verrucosum DSM – 28406, Trichophyton rubrum DSM – 9469, Trichophyton rubrum DSM – 9470, Trichophyton rubrum DSM – 9471, Trichophyton rubrum DSM – 9472, Candida albicans DSM – 9456, Candida albicans DSM – 9457, Candida albicans DSM – 9458 i Candida albicans DSM – 9459, Chrisporium tropicum DSM-28405 i Microsporum canis BINO 483. Tako se u posebno poželjnim realizacijama ovog pronalaska blastospore kvasca i mikrokonidije dermatofita dobijaju iz sojeva Trichophyton mentagrophytes DSM – 7279, Trichophyton verrucosum DSM – 28406, Trichophyton rubrum DSM – 9469, Trichophyton rubrum DSM – 9470, Trichophyton rubrum DSM – 9471, Trichophyton rubrum DSM – 9472, Candida albicans DSM – 9456, Candida albicans DSM – 9457, Candida albicans DSM – 9458, Candida albicans DSM – 9459, Chrisporium tropicum DSM-28405 i Microsporum canis BINO 483.

[0091] Sojevi Trichophyton rubrum DSM – 9469, Trichophyton rubrum DSM – 9470, Trichophyton rubrum DSM – 9471, Trichophyton rubrum DSM – 9472, Candida albicans DSM – 9456, Candida albicans DSM – 9457, Candida albicans DSM – 9458 i Candida albicans DSM – 9459 su deponovani u skladu sa Budimpeštanskim ugovorom u „Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen“ (DSM), Mascheroder Weg 1B, W-38124 Braunšvajg, Nemačka (čije je trenutno ime i adresa „Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH” (DMSZ), Inhoffenstraße 7B, 38124 Braunšvajg, NEMAČKA), 5. oktobra 1994. godine od strane Basotherm GmbH, Eichendorffveg 5, 88396 Biberach an der Riss. Trenutni deponenti pomenutih sojeva su podnosioci zahteva, imenom dr Igor Poliakov i dr sc. Ljudmila Ivanova, Eberhardtstr. 40, 89073 Ulm.

TRICHOPHYTON RUBRUM, br. DSM-9469

[0092] Soj je deponovan u DSM 05.10.1994. pod serijskim br. DSM-9469. Soj je dobijen usmerenom selekcijom na osnovu stvaranja spora i slabljenja epizootskog soja br.533, koji je identifikovan na koži čoveka 1985. godine. Soj je identifikovan pomoću „Rebell-Taplin” ključa (Rebell, G., Taplin, D.: Dermatophytes, their recognition and identification, 3. izdanje, University of Miami Press. Coral Gables, Florida, SAD, 1978.). Biološka svojstva soja opisana su u Tabeli A. Soj br. DSM-9469 razlikuje se od epidemijskog soja po bržem rastu u hranljivom medijumu, ogromnoj proizvodnji mikrokonidija i nižoj virulenciji.

TABELA A

TRICHOPHYTON RUBRUM, br. DSM- 9470

[0093] Soj je deponovan u DSM 05.10.1994. pod serijskim br. DSM-9470. Soj je dobijen usmerenom selekcijom na osnovu stvaranja spora i slabljenja epizootskog soja br.535, koji je identifikovan na koži čoveka 1990. godine. Soj je identifikovan pomoću „Rebell-Taplin” ključa (Rebell, G., Taplin, D.: Dermatophytes, their recognition and identification, 3. izdanje, University of Miami Press. Coral Gables, Florida, SAD, 1978.). Biološka svojstva soja opisana su u Tabeli B. Soj br. DSM-9470 razlikuje se od epidemijskog soja po bržem rastu u hranljivom medijumu, ogromnoj proizvodnji mikrokonidija i nižoj virulenciji.

TABELA B

TRICHOPHYTON RUBRUM, br. DSM- 9471

[0094] Soj je deponovan u DSM 05.10.1994. pod serijskim br. DSM-9471. Soj je dobijen usmerenom selekcijom na osnovu stvaranja spora i slabljenja epizootskog soja br.620, koji je identifikovan na noktu čoveka 1989. godine. Soj je identifikovan pomoću „Rebell-Taplin” ključa (Rebell, G., Taplin, D.: Dermatophytes, their recognition and identification, 3. izdanje, University of Miami Press. Coral Gables, Florida, SAD, 1978.). Biološka svojstva soja opisana su u tabeli C. Soj br. DSM-9471 razlikuje se od epidemijskog soja po bržem rastu u hranljivom medijumu, ogromnoj proizvodnji mikrokonidija i nižoj virulenciji.

TABELA C

TRICHOPHYTON RUBRUM, br. DSM-9472

[0095] Soj je deponovan u DSM 05.10.1994. pod serijskim br. DSM-9472. Soj je dobijen usmerenom selekcijom na osnovu stvaranja spora i slabljenja epizootskog soja br.754, koji je identifikovan na noktu čoveka 1990. godine. Soj je identifikovan pomoću „Rebell-Taplin” ključa (Rebell, G., Taplin, D.: Dermatophytes, their recognition and identification, 3. izdanje, University of Miami Press. Coral Gables, Florida, SAD, 1978.). Biološka svojstva soja opisana su u tabeli C. Soj br. DSM-9472 razlikuje se od epidemijskog soja po bržem rastu u hranljivom medijumu, ogromnoj proizvodnji mikrokonidija i nižoj virulenciji.

TABELA D

CANDIDA ALBICANS, br. DSM-9456

[0096] Soj je deponovan u DSM 05.10.1994. pod serijskim br. DSM-9456. Soj je dobijen usmerenom selekcijom na osnovu stabilizacije kulturno-morfoloških karakteristika i slabljenja epidemijskog soja br.008-L, koji je identifikovan na čoveku 1990. Soj je identifikovan pomoću Loderovog ključa (Lodder, J: The yeast: A Taxonomic Study. North-Holland Publ. Co., Amsterdam - London (1970). Biološka svojstva soja opisana su u tabeli E. Soj br. DSM-9456 razlikuje se od epidemijskog soja po bržem rastu u hranljivom medijumu, stabilnim biološkim svojstvima, ogromnoj proizvodnji biomase i nižoj virulenciji.

TABELA E

CANDIDA ALBICANS, br. DSM- 9457

[0097] Soj je deponovan u DSM 05.10.1994. pod serijskim br. DSM-9457. Soj je dobijen usmerenom selekcijom na osnovu stabilizacije kulturno-morfoloških karakteristika i slabljenja epidemijskog soja br.012, koji je identifikovan na čoveku 1992. godine. Soj je identifikovan pomoću Loderovog ključa (Lodder, J: The yeast: A Taxonomic Study. North-Holland Publ. Co., Amsterdam - London (1970). Biološka svojstva soja opisana su u tabeli F. Soj br. DSM-9457 razlikuje se od epidemijskog soja po bržem rastu u hranljivom medijumu, stabilnim biološkim svojstvima, ogromnoj proizvodnji biomase i nižoj virulenciji.

TABELA F

CANDIDA ALBICANS, br. DSM-9458

[0098] Soj je deponovan u DSM 05.10.1994. pod serijskim br. DSM-9458. Soj je dobijen usmerenom selekcijom na osnovu stabilizacije kulturno-morfoloških karakteristika i slabljenja epidemiološkog soja br.047, koji je identifikovan na čoveku 1989. godine. Soj je identifikovan pomoću Loderovog ključa (Lodder, J: The yeast: A Taxonomic Study. North-Holland Publ. Co., Amsterdam - London (1970). Biološka svojstva soja opisana su u Tabeli G. Soj br. DSM-9458 razlikuje se od epidemijskog soja po bržem rastu u hranljivom medijumu, stabilnim biološkim svojstvima, ogromnoj proizvodnji biomase i nižoj virulenciji.

TABELA G

CANDIDA ALBICANS, br. DSM-9459

[0099] Soj je deponovan u DSM 05.10.1994. pod serijskim brojem DSM-9459. Soj je dobijen usmerenom selekcijom na osnovu stabilizacije kulturno-morfoloških karakteristika i slabljenja epidemiološkog soja br.158, koji je identifikovan na čoveku 1990. godine. Soj je identifikovan pomoću Loderovog ključa (Lodder, J: The yeast: A Taxonomic Study. North-Holland Publ. Co., Amsterdam - London (1970). Biološka svojstva soja opisana su u Tabeli H. Soj br. DSM-9459 razlikuje se od epidemijskog soja po bržem rastu u hranljivom medijumu, stabilnim biološkim svojstvima, ogromnoj proizvodnji biomase i nižoj virulenciji.

TABELA H

Tabela I

Trichophyton Mentagrophytes br. VKPGF-930/1032, br. DSM-7279

[0100] Soj Trichophyton mentagrophytes DSM-7279 deponovan je prema Ugovoru iz Budimpešte u „Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen“ (DSM), Mascheroder Weg 1B, W-38124 Braunšvajg, Nemačka (čije je trenutno ime i adresa „Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH” (DMSZ), Inhoffenstraße 7B, 38124 Braunšvajg, NEMAČKA) 1. oktobra 1992. godine, od strane Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH, 6507 Ingelheim am Rhein (čija je trenutna adresa Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH, 55216 Ingelheim am Rhein). Trenutni deponenti pomenutog soja su podnosioci zahteva, imenom dr Igor Poljakov i dr sc. Ljudmila Ivanova, Eberhardtstr. 40, 89073 Ulm.

Trichophyton verrucosum, br. DSM-28406

[0101] Soj Trichophyton verrucosum BINO 348 deponovao je Binomed GmbH (Einsteinstraße 59, 89077 Ulm) u skladu sa Ugovorom u Budimpešti pri – Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstraße 7B, 38124 Braunšvajg, Nemačka pod serijskim br. DSM-2840612. februara 2014. godine. Deponent je ovlastio podnosioce zahteva da se pozovu na deponovani biološki materijal u prijavi i dao je bezrezervnu i neopozivu saglasnost da se deponovani materijal učini dostupnim javnosti u skladu sa pravilom 31 EPC. Soj je dobijen usmerenom selekcijom na osnovu stvaranja spora i slabljenja epizootskog soja br. 348, koji je izolovan od goveda 1997. Soj je identifikovan pomoću „Rebell-Taplin” ključa (Rebell, G., Taplin, D.: Dermatophytes, their recognition and identification, 1978) i prema Kashkin, P.N. et.al. (opredelitel patogennykh, toksigenykh vrednykh dlya cheloveka gribov, 1979). Biološka svojstva soja opisana su u Tabeli J. Soj BINO 348-DSM 28406 razlikuje se od epizootskog soja po bržem rastu u hranljivom medijumu, ogromnoj proizvodnji mikrokonidija, nižoj virulenciji i odsustvu bilo kakvih neželjenih reakcija nakon intramuskularne primene antigena.

Tabela J

Chrisporium tropicum, br. DSM-28405

[0102] Soj Chrisporium tropicum BINO 122 deponovao je Binomed GmbH (Einsteinstraße 59, 89077 Ulm) u skladu sa Ugovorom u Budimpešti pri– Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstraße 7B, 38124 Braunšvajg, Nemačka pod serijskim br. DSM-28405 12. februara 2014. godine. Deponent je ovlastio podnosioce zahteva da se pozovu na deponovani biološki materijal u prijavi i dao je bezrezervnu i neopozivu saglasnost da se deponovani materijal učini dostupnim javnosti u skladu sa pravilom 31 EPC. Soj je dobijen usmerenom selekcijom na osnovu stvaranja spora poljskog soja br.122, koji je izolovan iz tla 1993. godine. Soj je identifikovan pomoću „Rebell-Taplin” ključa (Rebell, G., Taplin, D.: Dermatophytes, their recognition and identification, 1978) i prema Carmichael, J.N.: Chrysosporium and some other aleuriosporic hyphomycetes. – Can.J.Bot., 1962, 40, 1137-1173. Biološka svojstva soja opisana su u Tabeli K. Soj BINO 122-DSM 28405 se razlikuje od poljskog soja po bržem rastu u hranljivom medijumu, ogromnoj proizvodnji konidija, slaboj virulenciji i proizvodnji enzima.

Tabela K

Microsporum canis BINO 483

[0103] Soj Microsporum canis BINO 483 je deponovao Binomed GmbH (Einsteinstraße 59, 89077 Ulm) u skladu sa Ugovorom u Budimpešti pri - Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstraße 7B, 38124 Braunšvajg, Nemačka, pod serijskim br. DSM-32271 25. februara 2016. godine. Deponent je ovlastio podnosioce zahteva da se pozovu na deponovani biološki materijal u prijavi i dao je bezrezervnu i neopozivu saglasnost da se deponovani materijal učini dostupnim javnosti u skladu sa pravilom 31 EPC. Soj je dobijen usmerenom selekcijom na osnovu stvaranja spora i slabljenja epizootskog soja br. 483, koji je izolovan od mačke 1990. Soj je identifikovan pomoću „Rebell-Taplin” ključa (Rebell, G., Taplin, D.: Dermatophytes, their recognition and identification, 1978) i prema Kashkin, P.N. et.al. (opredelitel patogennykh, toksigenykh vrednykh dlya cheloveka gribov, 1979). Biološka svojstva soja opisana su u Tabeli L. Soj vakcine 483 razlikuje se od epizootskog soja po bržem rastu u hranljivom medijumu, ogromnoj proizvodnji mikrokonidija, nižoj virulenciji i odsustvu bilo kakvih neželjenih reakcija nakon intramuskularne primene antigena.

Tabela L

[0104] U poželjnoj realizaciji, sastav predmetnog pronalaska sadrži homogenizovane inaktivisane mikrokonidije dermatofita jedne mikrokonidije ili smeše mikrokonidija dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet ili deset od prethodno navedenih sojeva dermatofita. U daljoj poželjnoj realizaciji, sastav sadrži smešu homogenizovanih inaktivisanih mikrokonidija dermatofita jednog, dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet ili deset od prethodno navedenih dermatofita i homogenizovanih inaktivisanih blastospora kvasca jednog, dva, tri ili četiri od prethodno navedenih kvasaca. U daljoj poželjnoj realizaciji, sastav sadrži homogenizovane inaktivisane mikrokonidije dermatofita jednog ili smeše dva, tri ili četiri od prethodnoih naveden kvasaca. Sastavi mogu dodatno sadržati antigeni materijal mikrokonidija dermatofita i/ili antigeni materijal blastospora kvasca.

[0105] U daljoj poželjnoj realizaciji, sastav sadrži antigeni materijal jedne mikrokonidije dermatofita ili smešu antigenog materijala mikrokonidija dermatofita dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet ili deset od prethodno navedenih sojeva dermatofita. U daljoj poželjnoj realizaciji, sastav sadrži smešu antigenog materijala mikrokonidija dermatofita jednog, dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet ili deset od prethodno navedenih dermatofita i antigenog materijala blastospora kvasca jednog, dva, tri ili četiri od prethodno navedenih kvasaca. U daljoj poželjnoj realizaciji, sastav sadrži antigeni materijal blastospora kvasca jednog ili smeše dva, tri ili četiri od prethodno navedenih kvasaca. Sastavi mogu dodatno sadržati homogenizovane inaktivisane mikrokonidije dermatofita jednog, dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet ili deset od prethodno navedenih dermatofita i/ili homogenizovane inaktivisane blastopore kvasca jednog, dva, tri ili četiri od prethodno navedenih kvasaca.

[0106] U poželjnoj realizaciji, sastav za upotrebu prema ovom pronalasku sadrži smešu homogenizovanih inaktivisanih mikrokonidija dermatofita Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton verrucosum, Trichophyton equinum, Trichophyton sarkisovii, Microsporum canis, Microsporum canis var.obesum, Microsporum canis var. distortum i Microsporum gypseum. Na primer, vakcina Polivac-TM (proizvođač: „Vetbiochim“ LLC, Moskva; Distributer: „Prostore“ LLC, Moskva) je u skladu sa ovom realizacijom i može biti sadržana u sastavu ovog pronalaska. Polivac-TM je vakcina namenjena životinjama poput mačaka, pasa, konja i drugih.

[0107] U daljoj poželjnoj realizaciji, sastav ovog pronalaska sadrži smešu homogenizovanih inaktivisanih mikrokonidija dermatofita Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton verrucosum i Trichophyton sarkisovii. Na primer, vakcina Polivac-T (proizvođač: „Vetbiochim“ LLC, Moskva; Distributer: „Prostore“ LLC, Moskva) je u skladu sa ovom realizacijom i može se uključiti u sastav ovog pronalaska. Polivac-T je vakcina specijalno namenjena govedima.

[0108] Ako sastav predmetnog pronalaska sadrži mikrokonidije samo jednog soja dermatofita ili blastospore samo jednog soja kvasca, pomenute mikrokonidije dermatofita ili blastospore kvasca mogu se pripremiti na sledeći način:

(i) gajenjem dermatofita, odnosno kvasca, na odgovarajućem čvrstom medijumu, prikupljanjem i homogenizacijom dermatofita, i

(ii) inaktivisanjem homogenata dobijenog u koraku (i)

[0109] Ako sastav predmetnog pronalaska sadrži smešu mikrokonidija dermatofita i/ili blastospora kvasca, navedena smeša se može pripremiti na sledeći način:

(i) gajenjem jednog soja dermatofita i dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet odnosno deset različitih sojeva dermatofita odvojeno na pogodnom čvrstom medijumu, prikupljanjem svake kulture i homogenizacijom svake kulture zasebno, i

(ii) opciono, uzgajanjem jednog soja kvasca i dva, tri odnosno četiri različita soja kvasca odvojeno na pogodnom čvrstom medijumu, prikupljanjem svake kulture i homogenizacijom svake kulture zasebno, i

(iii) kombinovanjem i inaktivisanjem homogenata dobijenih u koraku (i) i opciono dobijenih u koraku (ii).

[0110] Uzgoj dermatofita gore opisanim postupcima pripreme poželjno se vrši na agaru i sladiovini u bocama za kulturu. Poželjno je da se kultivacija izvodi oko 15 do oko 30 dana. Poželjno je da se uzgajanje izvodi na temperaturi od oko 26°C do oko 28°C. Uzgoj kvasca u prethodno opisanim postupcima pripreme poželjno se vrši na agaru sa ekstraktom slada ili agaru Sabouraud u bocama za kulturu. Poželjno je da se kultivacija izvodi oko 4 do oko 7 dana. Poželjno je da se uzgajanje izvodi na temperaturi od oko 28 do oko 37°C.

[0111] Nakon uzgajanja, dermatofiti, odnosno kvasci, homogenizuju se da bi se dobila fina suspenzija. Poželjno je da se homogenizacija vrši u dejonizovanoj vodi, u vodenom rastvoru koji sadrži oko 0,1 do 0,3% fermentisanog hidrolizovanog proteina mišića ili oko 0,1 do 1% peptona soje ili svinje u kombinaciji sa oko 5 do 6% glukoze i oko 0,1 do 1% ekstrakta kvasca, ili u vodenom rastvoru koji sadrži 0,1-0,9% (w/v) modifikovanog hitozana prema ovom pronalasku.

[0112] Pogodne zapremine za homogenizaciju su oko 100 do 500 ml. Poželjno je da se koncentracija mikrokonidija, odnosno blastospora, podešava na oko 30 do oko 90 miliona mikrokonidija, odnosno blastospora po ml, ili na oko 250 do oko 500 hiljada, poželjnije oko 250 do oko 400 hiljada mikrokonidija odnosno blastospora po ml. Kada se suspenzija može opciono dodatno prilagoditi na oko 40, 50 ili 60 miliona mikrokonidija, odnosno blastopora po ml, ili na oko 250 do oko 500 hiljada, poželjnije na oko 250 do oko 400 hiljada mikrokonidija, odnosno blastopora po ml sa destilovanom vodom, fiziološkim rastvorom soli kao npr. natrijum hlorida ili drugim pogodnim rastvorom. U slučaju pripreme smeše, pojedinačne suspenzije se poželjno podešavaju na istu količinu mikrokonidija, odnosno blastospora po ml, a jednake zapremine svake kulture mešaju se u suspenziju u jednoj posudi.

[0113] Inaktivacija se poželjno izvodi upotrebom tiomersala, formaldehida i/ili 2-propiolaktona. Sredstva za inaktivaciju mogu se dodati direktno u ćelijsku suspenziju. Poželjna je inaktivacija dodavanjem tiomersala u odnosu od oko 1:11000 do oko 1:2500 (w/v). Takođe je poželjna inaktivacija dodavanjem formaldehida da bi se postigla krajnja koncentracija od oko 0,2% do oko 0,4% (w/v). Posle toga, smeša se poželjno inkubira. Inkubacija se može izvoditi oko 1 do 30 dana na temperaturi od oko 20°C do oko 37°C. Poželjna je inkubacija oko 1 do 3 dana na sobnoj temperaturi, oko 5 do 7 dana na 37°C, oko 30 dana na sobnoj temperaturi ili oko 30 dana na oko 26°C do 28 °C.

[0114] U poželjnoj realizaciji, mikrokonidije iz sastava ovog pronalaska su u otečenom stanju i/ili imaju klice zametka. Poželjnije je da je najmanje 50% blastospora i/ili mikrokonidija u otečenom stanju i/ili imaju klice zametka. Otečeno stanje i/ili klice zametka dermatofita mogu se npr. dobiti drugim korakom inkubacije. Pomenuti drugi korak inkubacije poželjno se izvodi nakon homogenizacije i pre inaktivacije kao što je prethodno opisano. Za izvođenje drugog koraka uzgajanja, suspenzija mikrokonidija se stavlja u zaseban sud koji sadrži isti medijum iz prvog koraka inkubacije. Poželjno je da se drugi korak uzgajanja izvodi oko 10 do oko 48 sati. Poželjno je da se drugi korak uzgajanja izvodi na temperaturi od oko 28°C. Poželjno je da se drugi korak kultivacije nastavlja sve dok najmanje 50% mikrokonidija ne pokaže otečeno ili stanje klijanja i ne više od oko 7 do 10% ćelija pokaže drugu micelijsku granu. Prečnik natečenih i mikrokonidija u klijanju se povećava za oko 1,2 ili više u poređenju sa redovnim mikrokonidijama.

[0115] Antigeni materijal blastospora kvasca i/ili mikrokonidija dermatofita poželjno sadrži polisaharide i/ili glikopeptide izolovane iz keratinofilnih gljivica ili kvasaca. Poželjno, pomenuti antigeni materijal može biti antigeni nerastvorljivi materijal (ANMP), antigeni rastvorljivi materijal (ASMP) ili antigeni egzogeni materijal (AEMP). Keratinofilne gljivice su poželjno vrsta Trichophyton ili Microsporum, poželjnije Trichophyton verrucosum, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton equinum, Trichophyton sarkisovii, Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes, Microsporum gypseum, Microsporum canis iChrisporium tropicum, a keratinofilni kvasci su poželjno vrste Candida, poželjnije Candida albicans. Posebno poželjan je antigeni materijal dobijen iz Trichophyton mentagrophytes DSM – 7279, Trichophyton verrucosum DSM – 28406, Trichophyton rubrum DSM – 9469, Trichophyton rubrum DSM – 9470, Trichophyton rubrum DSM – 9471, Trichophyton rubrum DSM – 9472, Chrisporium tropicum DSM-28405, Candida albicans DSM – 9456, Candida albicans DSM – 9457, Candida albicans DSM – 9458, i Candida albicans DSM – 9459. Na primer, antigeni materijal se može dobiti postupkom opisanim u WO 97/07232.

[0116] Generalno se, za dobijanje ANMP, ćelije gljivica koje pripadaju grupi keratinofilnih gljivica ili kvasaca tretiraju pod vodenim alkalnim uslovima, čvrsta i tečna faza sastava se odvajaju, a nakon razdvajanja se čvrsta faza tretira mineralnom ili organskom kiselinom. Poželjno je da se tretman pod vodenim alkalnim uslovima vrši sa oko 0,1 do oko 5% (w/v) KOH ili NaOH na oko 20°C do 150°C do 30 sati. Čvrsta faza se poželjno tretira sa 0,2 do 1,5 M organske kiseline ili 0,05 do 1 M mineralne kiseline i ispere vodenim rastvorom. Preciznije, keratinofilne gljivice ili kvasci poželjno se uzgajaju na agar pločama. Jedan poželjni medijum je, na primer, agar sa ekstraktom slada kompanije Oxsoid. Mogu se koristiti i drugi mediji koji će osigurati rast keratinofilnih gljivica ili kvasca. Nastala gljivična biomasa se uklanja i tretira vodenim rastvorom alkalije. Posle toga se odvajaju čvrsta i tečna faza sastava, na primer centrifugiranjem, filtriranjem ili taloženjem. Poželjno je da se razdvajanje vrši centrifugiranjem, npr. na 3500g, što omogućava dobro odvajanje ostataka gljivičnih ćelija. I tretman u vodenim alkalnim uslovima i korak razdvajanja mogu se ponoviti nekoliko puta. Posle alkalne obrade, nastali supernatant se tretira pod kiselim vodenim uslovima kao što je prethodno opisano. Na primer, mogu se koristiti HCl ili sirćetna kiselina. Poželjno je da se tretman kiselinom izvodi oko 0,5 do oko 3 sata. Poželjno je da je temperatura u rasponu od oko 70 do oko 100°C. Vodeni rastvor za ispiranje je poželjno destilovana voda. Pogodno je da se ispiranje ponovi oko pet puta. Na kraju, čvrsta faza se izdvaja i homogenizuje u vodi za injekcije ili u vodenom rastvoru 0,1-0,9% rastvora modifikovanog hitozana, varijante hitozana ili derivata hitozana prema ovom pronalasku. Poželjno je da se homogenizacija vrši u zapremini od oko 100 do oko 500 ml. Koncentracija čestica se tada poželjno podešava na oko 30 do 90 miliona čestica po ml. Na kraju, preparat koji sadrži antigeni materijal može se liofilizovati i čuvati u suvim uslovima.

[0117] ASMP se generalno može dobiti na sledeći način: Ćelije gljivica keratinofilnih gljivica ili kvasaca tretiraju se pod vodenim alkalnim uslovima, čvrsta i tečna faza preparata se odvajaju, nakon odvajanja supernatant se tretira mineralnom ili organskom kiselinom, a nakon odvajanja ASMP se taloži iz supernatanta. Preciznije, keratinofilne gljivice ili kvasci se uzgajaju na agar pločama, na primer kako je opisano u EP 0564620. Jedan poželjni medijum je, na primer, agar sa ekstraktom slada kompanije Oxsoid. Mogu se koristiti i drugi mediji koji će osigurati rast keratinofilnih gljivica ili kvasca. Nastala gljivična biomasa se izdvaja i tretira vodenim rastvorom alkalija. Poželjni vodeni alkalni rastvori su NaOH ili KOH u poželjnim koncentracijama od 0,1-5% (w/v). Alkalni tretman se poželjno izvodi na oko 20 - 150°C do 30 sati. Posle obrade pod vodenim alkalnim uslovima, čvrsta i tečna faza preparata se odvajaju, na primer, centrifugiranjem, filtriranjem ili taloženjem. Poželjno je da se razdvajanje postiže centrifugiranjem, što obezbeđuje dobro razdvajanje ostataka gljivičnih ćelija, na primer, pri silama od oko 3500g. Tretman pod vodenim alkalnim uslovima, kao i korak razdvajanja, može se ponoviti nekoliko puta. Posle alkalne obrade i razdvajanja, nastali supernatant se tretira pod kiselim vodenim uslovima, npr. s 0,2-1,5M organske kiseline ili 0,05-1M mineralne kiseline. Na primer, HCl ili sirćetna kiselina se mogu koristiti, poželjno pri pH vrednostima od oko pH 2,5 do pH 4,5. Poželjno je da tretman u kiselim vodenim uslovima traje oko 2 do 4 sata na temperaturama od oko 4 do 8°C, gde se odvija razdvajanje čvrstog i tečnog sloja. Tretman pod vodenim kiselim uslovima, kao i korak razdvajanja, može se ponoviti nekoliko puta, poželjno pod prethodno navedenim uslovima. Zatim se supernatant iz koraka razdvajanja podvrgava koraku taloženja. Poželjno je da se taloženje vrši dodavanjem pogodnog organskog rastvarača, npr. alkohola, kao što je niži alkanol, na primer metanol ili etanol. Odnos jedne zapremine supernatanta prema 2-5 zapremina alkohola rezultira dobrim taloženjem antigenog materijala. Takođe se mogu koristiti i drugi, bezalkoholni postupci taloženja, poznati osoblju u struci, na primer, taloženje amonijum sulfatom ili drugim solima. Čvrsta faza se zatim podvrgava daljem koraku razdvajanja, poželjno pod prethodno opisanim uslovima. Dobijena čvrsta faza se prikupi i, po želji, rastvori u vodenom rastvoru, poželjno u destilovanoj vodi, tipično u zapremini od oko 25 do 100 ml. Na kraju, ASMP preparat se može liofilizovati i čuvati duži vremenski period u suvim uslovima.

[0118] AEMP se generalno može dobiti na sledeći način: ćelije gljivica keratinofilnih gljivica ili kvasca uzgajaju se u tečnom medijumu, čvrsta faza i tečne faze sastava se odvajaju, a nakon odvajanja AEMP se taloži iz supernatanta. Preciznije, keratinofilne gljivice ili kvasci mogu se inkubirati u vodenom rastvoru ili uzgajati u tečnom medijumu. Kao i keratinofilne gljivice, mogu se inkubirati u vodenom rastvoru sa keratinom. Uzgajanje može trajati do oko 240 do 250 sati. Zapremina rastvora ili kulture ovde je definisana kao primarna zapremina (PV). Može se koristiti destilovana voda kao i medijumi opisani u EP 0564620. Posle inkubacije ili uzgajanja, ćelije gljivica se odvajaju, na primer, centrifugiranjem, filtriranjem ili taloženjem, poželjno centrifugiranjem pod prethodno opisanim uslovima. Opciono, nastali supernatant se zatim liofilizuje i potom rastvori u vodenom rastvoru, poželjno u vodi. Poželjno je da zapremina vode iznosi oko 0,1 do 0,2 zapremine primarne zapremine (PV). Nastali rastvor ili nastali supernatant dobijeni nakon razdvajanja se zatim podvrgavaju koraku taloženja. Poželjno je da se taloženje vrši dodavanjem pogodnog organskog rastvarača, npr. alkohola, kao što je niži alkanol, na primer metanol ili etanol. Odnos jedne zapremine supernatanta i oko 1 do 5 zapremina alkohola rezultira dobrim taloženjem antigenog materijala. Takođe se mogu koristiti i drugi, bezalkoholni postupci taloženja, poznati osoblju u struci, na primer, taloženje amonijum sulfatom ili drugim solima. Dobijeni talog se prikupi i, po želji, rastvori u vodenom rastvaraču, poželjno u destilovanoj vodi. Poželjno je da se oko 0,5 do 50mg taloga rastvori u 1 ml vodenog rastvarača. Na kraju, rastvor AEMP se može liofilizovati i čuvati duži vremenski period u suvim uslovima, poželjno na oko 2 do 10°C.

[0119] U posebno poželjnoj realizaciji, sastav ovog pronalaska sadrži, pored modifikovanog hitozana ili hidrokoloida ovog pronalaska, inaktivisane mikrokonidije dermatofita Trichophyton mentagrophytes, naročito Trichophyton mentagrophytes DSM - 7279.

[0120] U još jednoj posebno poželjnoj realizacij, sastav ovog pronalaska sadrži, pored modifikovanog hitozana ili hidrokoloida ovog pronalaska, inaktivisane mikrokonidije dermatofita Trichophyton verrucosum, naročito Trichophyton verrucosum DSM - 28406.

[0121] U daljoj posebno poželjnoj realizaciji, sastav ovog pronalaska sadrži, pored modifikovanog hitozana ili hidrokoloida ovog pronalaska, inaktivisane blastospore kvasca Candida albicans, naročito Candida albicans DSM - 9456.

[0122] U daljoj posebno poželjnoj realizaciji, sastav ovog pronalaska sadrži, pored modifikovanog hitozana ili hidrokoloida ovog pronalaska, ANMP od Candida albicans, posebno od Candida albicans DSM - 9456.

[0123] U daljoj posebno poželjnoj realizaciji, sastav ovog pronalaska sadrži, pored modifikovanog hitozana ili hidrokoloida ovog pronalaska, ANMP od Candida albicans, posebno od Candida albicans DSM - 9456.

[0124] U daljoj posebno poželjnoj realizaciji, sastav ovog pronalaska sadrži, pored modifikovanog hitozana ili hidrokoloida ovog pronalaska, smešu homogenizovanih inaktivisanih mikrokonidija dermatofita Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton verrucosum, Trichophyton equinum, Trichophyton sarkisovii, Microsporum canis, Microsporum canis var.obesum, Microsporum canis var. distortum i Microsporum gypseum i opciono ASMP od Candida albicans, naročito od Candida albicans DSM – 9456. Još poželjnije, sastav ovog pronalaska sadrži vakcinu Polivac-TM i opciono ASMP od Candida albicans, posebno od Candida albicans DSM – 9456.

[0125] U daljoj posebno poželjnoj realizaciji, sastav ovog pronalaska sadrži, pored modifikovanog hitozana ili hidrokoloida ovog pronalaska, AEMP od Chrisporium tropicum, posebno Chrisporium tropicum DSM – 28405, ili Microsporum canis BINO 483.

[0126] Koncentracija inaktivisanih mikrokonidija dermatofita i/ili blastospora kvasca u sastavu prema ovom pronalasku je poželjno oko 30 do oko 90, poželjnije oko 45 do oko 80 miliona mikrokonidija, odnosno blastospora, po ml, ili oko 250 do oko 500 hiljada, poželjnije oko 250 do oko 300 hiljada mikrokonidija, odnosno blastospora, po ml. Koncentracija ASMP u sastavu ovog pronalaska je poželjno oko 50 do oko 500 µg/ml, poželjnije oko 100 do oko 400 µg/ml. Koncentracija ANMP u sastavu ovog pronalaska je poželjno oko 30 do oko 90, poželjnije oko 40 do oko 80 miliona po ml. Koncentracija Polivac-TM u sastavu ovog pronalaska je poželjno oko 40 miliona po ml do oko 50 miliona po ml, poželjnije oko 40 miliona po ml do oko 45 miliona po ml. Koncentracija AEMP u sastavu ovog pronalaska je poželjno 0,5 do oko 2 U/ml, još poželjnije oko 1 do oko 1,2 U/ml.

[0127] Sastav predmetnog pronalaska je poželjno farmaceutski sastav koji sadrži farmaceutski prihvatljiv razblaživač, pomoćnu supstancu i/ili nosač. Prema tome, ovaj pronalazak se takođe odnosi na farmaceutski sastav koji sadrži modifikovani hitozan ili hidrokoloid prema ovom pronalasku i farmaceutski prihvatljiv razblaživač, pomoćnu supstancu i/ili nosač.

[0128] Koncentracija modifikovanog hitozana ili hidrokoloida u sastavima ili farmaceutskim sastavima ovog pronalaska je poželjno oko 0,1% do oko 2,0% (w/v), poželjnije oko 0,1% do oko 1,4% (w/v), poželjnije oko 0,1% do oko 1% (w/v), poželjnije oko 0,1% do oko 0,5% (w/v), poželjnije oko 0,1% do oko 0,3% (w/v).

[0129] Sledeći aspekt ovog pronalaska je jedinjenje, modifikovani hitozan, hidrokoloid i/ili sastav ovog pronalaska za upotrebu u humanoj i/ili veterinarskoj medicini. Poželjno je da se jedinjenje, modifikovani hitozan, hidrokoloid ili sastav ovog pronalaska koriste kao vakcina u humanoj i/ili veterinarskoj medicini.

[0130] Predmetni pronalazak se takođe odnosi na jedinjenje, modifikovani hitozan, hidrokoloid i/ili na sastav ovog pronalaska za upotrebu u postupku lečenja i/ili sprečavanja mastitisa, poželjno latentnog mastitisa i/ili akutnog mastitisa, endometritisa, poželjno hroničnog, akutnog i/ili gnojno-kataralnog endometritisa, bolesti papaka i kandži, hramanja, lezija u interdigitalnom prostoru, digitalnog dermatitisa, interdigitalnog dermatitisa, interdigitalne flegmone, trihofitoze, mikrosporoze, mikoza kože, alergija, kao bolesti kompliciranih alergijama, posebno alergijske opstruktivne plućne bolesti, alergijskih bolesti kože, alergijskog eritema uha, alergijskog rinitisa, alergijskog konjunktivitisa, akutnog alergijskog kontaktnog dermatitisa, hroničnih alergijskih kontaktnih ekcema ili atopijskih ekcema, opstruktivne plućne bolesti, naročito hronične opstruktivne bolesti pluća, kožnih bolesti, naročito dermatitisa, eritema uha, rinitisa, konjunktivitisa, dermatofitoza ili bradavica, naročito običnih bradavica kod subjekta.

[0131] Predmetni pronalazak se takođe odnosi na jedinjenje, modifikovani hitozan, hidrokoloid i/ili na sastav ovog pronalaska za upotrebu u postupku modulacije imunološkog odgovora kod subjekta i/ili za povećanje efikasnosti reprodukcije, poželjno efikasnosti reprodukcije u uzgoju životinja.

[0132] Subjekt može biti, na primer, čovek ili životinja, naročito sisar, poželjnije šupljorošci/ili svinje, najpoželjnije goveda, ali takođe i psi, mačke ili druge životinje za uzgoj ili domaće životinje.

[0133] U posebno poželjnoj realizaciji, pronalazak se odnosi na sastav koji sadrži modifikovani hitozan, hidrokoloid ili jedinjenje prema predstavljenom pronalasku i inaktivisane mikrokonidije dermatofita Trichophyton mentagrophytes, naročito Trichophyton mentagrophytes DSM – 7279, za upotrebu u postupku lečenja i/ili sprečavanja interdigitalnog dermatitisa, digitalnog dermatitisa i/ili interdigitalne flegmone kod životinja, naročito kod šupljorožaca i/ili svinja, najpoželjnije kod goveda.

[0134] U daljoj posebno poželjnoj realizaciji, pronalazak se odnosi na sastav koji sadrži modifikovani hitozan ili hidrokoloid ili jedinjenje prema ovom pronalasku i inaktivisane mikrokonidije dermatofita Trichophyton verrucosum, naročito Trichophyton verrucosum DSM – 28406, za upotrebu u postupku tretiranja i/ili sprečavanja interdigitalnog dermatitisa, digitalnog dermatitisa i/ili interdigitalne flegmone i/ili trihofitoze kod životinja, naročito kod šupljorožaca i/ili svinja, najpoželjnije kod goveda.

[0135] U daljoj posebno poželjnoj realizaciji, pronalazak se odnosi na sastav koji sadrži modifikovani hitozan ili hidrokoloid ili jedinjenje prema ovom pronalasku i inaktivisane blastospore kvasca Candida albicans, posebno Candida albicans DSM – 9456, za upotrebu u postupku tretiranja i/ili sprečavanja interdigitalnog dermatitisa, digitalnog dermatitisa i/ili interdigitalne flegmone, na kod šupljorožaca i/ili svinja, najpoželjnije kod goveda.

[0136] U daljoj posebno poželjnoj realizaciji, pronalazak se odnosi na sastav koji sadrži modifikovani hitozan ili hidrokoloid ili jedinjenje prema ovom pronalasku i ASMP od Candida albicans, naročito Candida albicans DSM – 9456, za upotrebu u postupku lečenja i/ili sprečavanje alergija, naročito alergijske opstruktivne plućne bolesti, alergijskih bolesti kože, alergijskog eritema uha, alergijskog rinitisa, alergijskog konjunktivitisa, akutnog alergijskog kontaktnog dermatitisa, hroničnog alergijskog kontaktnog ekcema ili atopijskog ekcema, opstruktivne plućne bolesti, posebno hronične opstruktivne bolesti pluća, kožneihbolesti, eritema uha, rinitisa, konjunktivitisa, dermatofitoze ili bradavica, naročito običnih bradavica, opstruktivne plućne bolesti, naročito hronične opstruktivne bolesti pluća, kožnih bolesti, naročito dermatitisa, eritema uha, rinitisa ili konjunktivitisa kod ljudi i/ili životinja, naročito sisara, poželjnije kod kućnih ljubimaca, najpoželjnije pasa, mačaka i/ili konja, ali takođe i goveda, svinja ili drugih životinja za uzgoj i domaćih životinja.

[0137] U daljoj posebno poželjnoj realizaciji, pronalazak se odnosi na sastav koji sadrži modifikovani hitozan ili hidrokoloid ili jedinjenje prema ovom pronalasku i ASMP od Candida albicans, naročito od Candida albicans DSM – 9456, za upotrebu u postupku lečenja i/ili sprečavanja interdigitalnog dermatitisa, digitalnog dermatitisa i/ili interdigitalne flegmone kod životinja, naročito kod šupljorožaca i/ili svinja, najpoželjnije kod goveda.

[0138] U daljoj posebno poželjnoj realizaciji, pronalazak se odnosi na sastav koji sadrži modifikovani hitozan ili hidrokoloid ili jedinjenje prema ovom pronalasku i smešu homogenizovanih inaktivisanih mikrokonidija dermatofita Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton verrucosum, Trichophyton equinum, Trichophyton sarkisovii, Microsporum canis, Microsporum canis var.obesum, Microsporum canis var. distortum i Microsporum gypseum i opciono ASMP od Candida albicans, naročito Candida albicans DSM – 9456. Poželjnije, sastav predmetnog pronalaska pored modifikovanog hitozana ili hidrokoloida ili jedinjenja predmetnog pronalaska sadrži vakcinu Polivac-TM i opciono ASMP od Candida albicans, naročito Candida albicans DSM – 9456, za upotrebu u postupku lečenja i/ili sprečavanja trihofitoze ili dermatofitoze kod životinja, naročito kod šupljorožaca i/ili svinja, najpoželjnije kod goveda.

[0139] U daljoj posebno poželjnoj realizaciji, pronalazak se odnosi na sastav koji sadrži modifikovani hitozan ili hidrokoloid ili jedinjenje prema ovom pronalasku i AEMP od Chrisporium tropicum, naročito Chrisporium tropicum DSM – 28405 ili Microsporum canis BINO 483, za upotrebu u postupku lečenja i/ili sprečavanja alergija, naročito alergijske opstruktivne plućne bolesti, alergijskih bolesti kože, alergijskog eritema uha, alergijskog rinitisa, alergijskog konjunktivitisa, akutnog alergijskog kontaktnog dermatitisa, hroničnog alergijskog kontaktnog ekcema ili atopijskog ekcema, opstruktivne plućne bolesti, naročito hronične opstruktivne bolesti pluća, kožnih bolesti, eritema uha, rinitisa, konjunktivitisa, dermatofitoze, mikoze kože ili bradavica, naročito običnih bradavica, opstruktivne plućne bolesti, naročito hronične opstruktivne bolesti pluća, kožnih bolesti, naročito dermatitisa, eritema uha, rinitisa ili konjunktivitisa kod ljudi i/ili životinja, naročito sisara, poželjnije kod šupljorožaca i/ili svinja, najpoželjnije goveda ili konja, ali takođe i pasa, mačaka ili drugih životinja za uzgoj ili domaćih životinja.

[0140] Modifikovani hitozan, hidrokoloid, jedinjenje i sastavi ovog pronalaska mogu da moduliraju imunološki sistem, tj. imaju imunostimulaciona svojstva. Mogu se koristiti kao vakcina za sprečavanje bolesti kod subjekta kako je ovde opisano. Alternativno ili kao dodatak, mogu se koristiti za lečenje i izlečenje subjekta od bolesti kako je ovde navedeno. Modifikovani hitozan, hidrokoloid i sastavi mogu se primenjivati poznatim načinima primene, kao npr. oralno, parenteralno, intramuskularnom injekcijom, intrakutanom injekcijom, perkutanom injekcijom, instilacijom, intracisternalno, intrauterino, rektalno, supkutano i/ili lokalno, poželjno kutano, poželjnije intramuskularnom injekcijom i/ili intrakutanom injekcijom i/ili lokalno na kožu i/ili lokalno na sluzokožu. Mogu se primenjivati u odsustvu ili u prisustvu jedne ili više dodatnih imunostimulacionih supstanci. U jednoj realizaciji, pomenuta jedna ili više dodatnih imunostimulacionih supstanci daju se odvojeno od modifikovanog hitozana, jedinjenja ili sastava ovog pronalaska. U drugoj realizaciji, jedna ili više dodatnih imunostimulacionih supstanci su sadržane u sastavima ovog pronalaska ili im dodate.

[0141] Navedena jedna ili više imunostimulacionih supstanci je poželjno adjuvans, poželjno odabran iz grupe koju čine vitamin-E acetat, o/w-emulzija, aluminijum fosfat, aluminijum oksid, aluminijum hidroksid / metil celulozni gel, uljna emulzija, muramil dipeptidi, Freundovi adjuvansi i saponini i/ili najmanje jedan citokin, poželjno odabran iz grupe koju čine IL 2, IL 12 i INF Gamma.

[0142] U poželjnoj realizaciji, sastavi ovog pronalaska su vakcine i/ili se koriste kao vakcine.

[0143] U daljem aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na modifikovani hitozan, hidrokoloidno jedinjenje ili sastav predmetnog pronalaska za upotrebu u postupku lečenja životinjskog i/ili ljudskog tela terapijom. Takav postupak tipično uključuje davanje subjektu efektivne količine modifikovanog hitozana u sastavu, poželjno farmaceutskom sastavu ili hidrokoloidu ovog pronalaska. Subjekt može biti, na primer, čovek ili životinja, naročito sisar, poželjnije šupljorošci/ili svinje, najpoželjnije goveda, ali takođe i psi, mačke ili druge životinje za uzgoj ili domaće životinje. Konkretno, modifikovani hitozan, hidrokoloid ili sastavi, naročito farmaceutski sastavi ovog pronalaska mogu se koristiti u postupcima za lečenje ili sprečavanje bolesti kao što je prethodno opisano. Postupak lečenja može obuhvatati lečenje i/ili prevenciju bakterijskih, mikotičnih i/ili virusnih infekcija kože, uha, pluća, nosa, noge, kopita, kandži, zadnjeg dela stopala i/ili interdigitalnog prostora. Navedene infekcije da budu izazvane uzročnicima Dichelobacter nodosus, Fusobacterium necroforun, Fusobacterium spp, Treponema spp poput T. phagedenis, T. vincentii i T. denticola, Campylobacter spp, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Arcanobacterium pyogenes, Prevotella spp., Trichophyton spp. poput T. verrucosum, T. mentagrophytes, T. sarkisovii, T. equinum, T. schönleinii, T. rubrum,T. tonsurans, T. interdigitale i/ili Microsporum spp. poput M. canis, M. canis var. distortum, M. canis var. obesum, M. gypseum i/ili Malassezia spp. poput M. pachydermatitis, M. furfur, M. dermatitis i/ili HPV - humani papilomavirus iz roda Papillomavirus, porodice Papovaviridae poput HPV-2, HPV-3, HPV-4, HPV-6, HPV-11.

[0144] Doziranje i način primene koji se koriste u postupku lečenja i/ili profilakse prema ovom pronalasku zavise od specifične bolesti / mesta infekcije koje treba lečiti. Način primene može biti, na primer, oralno, parenteralno, intramuskularnom injekcijom, intrakutanom injekcijom, perkutanom injekcijom, instilacijom, intracisternalno, intrauterino, rektalno, potkožno i/ili lokalno, poželjno kutano, poželjnije intramuskularnom injekcijom i/ili intrakutanom injekcijom i/ili lokalno na kožu i/ili lokalno na sluzokožu ili bilo koji drugi način primene.

[0145] Poželjne doze za sastav ovog pronalaska su oko 0,001 do oko 0,5 ml/kg sa koncentracijom od oko 0,1 mg/ml do oko 1,0 mg/ml i/ili oko 30x10<6>do oko 80x10<6>mikrokonidija i/ili blastospora i/ili čestica ANMP-a. Poželjno je da se sastav ovog pronalaska daje oko 1 do oko 5 puta. Interval između primena je poželjno oko 12 sati do oko 21 dan.

[0146] Sledeći primeri objašnjavaju predmetni pronalazak, ali se ne smatraju ograničavajućim.

Primer 1

Prva faza.

Razblaživanje (rastvaranje) hitozana

[0147] 40 g polisaharidnog hitozana sterilisano je autoklaviranjem i dodato uz mešanje u 8 litara sterilne vode za injekcije zakiseljene sa 40 ml 100% sirćetne kiseline da bi se dobila suspenzija. Suspenzija je mešana u sterilnom rezervoaru tokom 24 sata da bi se dobila gel suspenzija. Nerastvorene čestice su uklonjene filtracijom kroz metalnu rešetku sa ćelijom od 200 μm - 300 μm.4 N natrijum hidroksida (NaOH) je dodato kap po kap u gel da bi se dobio konačan pH od 8,0. Potom su se taložile bele pahuljice. Suspenzija je mešana 30 minuta. Dobijeni biološki materijal taloga sadržao je u svojoj strukturi diacetilovani hitozan. Talog je prikupljen centrifugiranjem tokom 50 minuta pri 4500 obrtaja u minuti.

Modifikacija biološkog materijala koji sadrži diacetilovani hitozan

[0148] Dobijeni suspendovani materijal homogenizovan je u zatvorenom sterilnom homogenizatoru u 7 litara sterilne vode za injekcije. 8 mL 98% hlorida valerijanske kiseline (valeril hlorid, pentanoil hlorid) dodavano je kap po kap suspenziji uz stalno mešanje. Posle toga,suspenzija je mešana 24 sata. Da bi se podržalo rastvaranje pahuljica i nerastvorenih čestica dodavan je 4N rastvor hlorovodonične kiseline uz mešanje dok suspenzija nije imala pH od 5,8. Dodata je sterilna voda za injekcije da bi se dobila krajnja zapremina od 8 litara. Nakon toga je za pripremu konačnog proizvoda korišćen modifikovani polisaharid.

[0149] Karakteristike dobijenog biološkog materijala koji sadrži modifikovani hitozan:

[0150] modifikovani hitozan podešene su na zapreminu od 15 litara dodavanjem sterilne vode za injekcije uz mešanje. Zatim je smeši dodato 500 ml rastvora hlorokrezola koji sadrži 30 grama hlorokrezola. Dobijena suspenzija je podešena na zapreminu od 30 litara. Dobijena suspenzija je sterilisana zagrevanjem tokom 40 minuta na 70°C tri puta u intervalima od 24 sata. Dobijeni sterilni proizvod je doziran u bočice pod aseptičnim uslovima.

Primer 2

Razblaživanje (rastvaranje) hitozana

[0151] 4 g polisaharidnog hitozana dodato je uz mešanje u 0,8 litara sterilne vode za injekcije da bi se dobila suspenzija. Dodato je 4 ml 100% sirćetne kiseline i suspenzija je mešana u sterilnoj posudi tokom 24 sata da bi se dobila gel suspenzija. Nerastvorene čestice su uklonjene filtracijom kroz metalnu rešetku sa ćelijom od 200 μm - 300 μm. 4 N natrijum hidroksida (NaOH) je dodato kap po kap u gel da bi se dobio konačan pH od 8,0. Potom su se taložile bele pahuljice. Suspenzija je mešana 40 minuta. Dobijeni biološki materijal taloga sadržao je u svojoj strukturi diacetilovani hitozan. Talog je sakupljen centrifugiranjem tokom 45 minuta pri 4500 obrtaja u minuti.

Modifikacija biološkog materijala koji sadrži diacetilovani hitozan

[0152] Dobijeni suspendovani materijal homogenizovan je u zatvorenom sterilnom homogenizatoru u 4 litara sterilne vode za injekcije.0,8 mL 98% hlorida valerijanske kiseline (valeril hlorid, pentanoil hlorid) dodavano je kap po kap suspenziji uz stalno mešanje. Posle toga,suspenzija je mešana 24 sata. Da bi se podržalo rastvaranje pahuljica i nerastvorenih čestica dodavan je 4N rastvor hlorovodonične kiseline uz mešanje dok suspenzija nije imala pH od 5,5. Nakon toga je za pripremu konačnog proizvoda korišćen modifikovani polisaharid.

[0153] Karakteristike dobijenog biološkog materijala koji sadrži modifikovani hitozan:

[0154] Druga faza. Za dobijanje konačnog proizvoda 200 ml modifikovanog hitozana resuspendovano je u 1,5 litara sterilne vode za injekcije i dodato je 50 ml rastvora hlorokrezola koji sadrži 2g aktivne supstance, uz mešanje. Dobijena suspenzija je podešena na zapreminu od 2 litre. Dobijena suspenzija je sterilisana zagrevanjem tokom 40 minuta na 70 °С tri puta u intervalima od 24 sata. Dobijeni sterilni proizvod je doziran u bočice pod aseptičnim uslovima.

Primer 3

Razblaživanje (rastvaranje) hitozana

[0155] 80 g polisaharidnog hitozana sterilisano je autoklaviranjem i dodato uz mešanje u 16 litara sterilne vode za injekcije zakiseljene sa 80 ml 100% sirćetne kiseline da bi se dobila suspenzija. Suspenzija je mešana u sterilnom rezervoaru tokom 24 sata da bi se dobila gel suspenzija. Nerastvorene čestice su uklonjene filtracijom kroz metalnu rešetku sa ćelijom od 200 μm - 300 μm.4 N natrijum hidroksida (NaOH) je dodato kap po kap u gel da bi se dobio konačan pH od 8,0. Potom su se taložile bele pahuljice. Suspenzija je mešana 50 minuta. Dobijeni biološki materijal taloga sadržao je u svojoj strukturi diacetilovani hitozan. Talog je sakupljen centrifugiranjem tokom 60 minuta pri 5000 obrtaja u minuti.

Modifikacija biološkog materijala koji sadrži diacetilovani hitozan

[0156] Dobijeni suspendovani materijal homogenizovan je u zatvorenom sterilnom homogenizatoru u 4 litara sterilne vode za injekcije.16 mL 98% hlorida valerijanske kiseline (aleril hlorid, pentanoil hlorid) dodavano je kap po kap suspenziji uz stalno mešanje. Štaviše, dodato je 4 litre sterilne vode za injekcije i dodat je 3% rastvor glutaminske kiseline uz mešanje dok suspenzija nije imala pH 5,0. Dodata je sterilna voda za injekcije da bi se dobila krajnja zapremina od 8 litara. Suspenzija je nakon toga mešana 24 sata. Nakon toga je za pripremu konačnog proizvoda korišćen modifikovani polisaharid.

[0157] Karakteristike dobijenog biološkog materijala koji sadrži modifikovani hitozan

[0158] Druga faza. Za dobijanje konačnog proizvoda 4000 ml modifikovanog hitozana resuspendovano je u 30 litara sterilne vode za injekcije i dodato je uz mešanje 50 ml rastvora hlorokrezola koji sadrži 40g aktivne supstance. Dobijena suspenzija je podešena na zapreminu od 40 litara. Dobijena suspenzija je sterilisana zagrevanjem tokom 45 minuta na 72°С tri puta u intervalima od 24 sata. Dobijeni sterilni proizvod je doziran u bočice pod aseptičnim uslovima.

Primer 4

Razblaživanje (rastvaranje) hitozana

[0159] 16 g polisaharida hitozana (deacetilovanja 65% - 72%, viskoznosti 151 - 350 mPas, 80-200 kDa) sterilisano je autoklaviranjem i dodato uz mešanje u 3 litre sterilne vode za injekcije zakiseljene sa 164 ml 100% sirćetne kiseline da bi se dobila suspenzija. Suspenzija je mešana u sterilnom rezervoaru tokom 24 sata da bi se dobila gel suspenzija. Nerastvorene čestice su uklonjene filtracijom kroz metalnu rešetku sa ćelijom od 200 μm - 300 μm. 4 N natrijum hidroksida (NaOH) je dodato kap po kap u gel da bi se dobio konačan pH od 8,5. Potom su se taložile bele pahuljice. Suspenzija je mešana 30 minuta. Dobijeni biološki materijal taloga sadržao je u svojoj strukturi diacetilovani hitozan. Talog je sakupljen centrifugiranjem tokom 50 minuta pri 5000 obrtaja u minuti.

Modifikacija biološkog materijala koji sadrži diacetilovani hitozan

[0160] Dobijeni suspendovani materijal homogenizovan je u zatvorenom sterilnom homogenizatoru u 1 litri sterilne vode za injekcije.0,6 mL 98% hlorida valerijanske kiseline (aleril hlorid, pentanoil hlorid) dodavano je kap po kap suspenziji uz stalno mešanje. Štaviše, dodat je 0,5% rastvor paraaminobenzojeve kiseline uz mešanje dok suspenzija nije imala pH 5,4. Sterilna voda za injekcije dodata je da bi se dobila krajnja zapremina od 1,6 litara. Suspenzija je nakon toga mešana 24 sata. Nakon toga je za pripremu konačnog proizvoda korišćen modifikovani polisaharid.

[0161] Karakteristike dobijenog biološkog materijala koji sadrži modifikovani hitozan

[0162] Druga faza. Za dobijanje konačnog proizvoda, 1000 ml modifikovane frakcije je resuspendovano u 8 litara sterilne vode za injekcije i uz mešanje je dodato 200 ml rastvora hlorokrezola koji sadrži 10 g aktivne supstance. Dobijena suspenzija je podešena na zapreminu od 10 litara. Dobijena suspenzija je sterilisana zagrevanjem tokom 45 minuta na 65°С tri puta u intervalima od 24 sata. Dobijeni sterilni proizvod je doziran u bočice pod aseptičnim uslovima.

Primer 5

[0163] Proizvod je pripremljen od hitozana. Proizvod je pripremljen u dve faze. Prva faza je orijentisana na dobijanje rastvora hitozana; druga faza je orijentisana na dobijanje konačnog proizvoda.

Prva faza.

[0164] 40 g hitozana (deacetilovanja 82% - 87%, viskoznosti 151 - 350 mPas, molekulske težine 150-300 kDa) je sterilisano autoklaviranjem i dodato uz mešanje u 3,5 litre sterilne vode za injekcije. Dobijenoj suspenziji je dodato 40 ml 100% sirćetne kiseline i zapremina je podešena na konačnu zapreminu od 4 litre sa vodom za injekcije. Suspenzija je mešana u sterilnoj posudi 24 sata dok se nije dobila gel suspenzija. Dobijenoj suspenziji se kap po kap dodavao 4N natrijum hidroksid (NaOH) da se dobije konačni pH od 8,0. Potom su se taložile bele pahuljice. Suspenzija je mešana 30 minuta. Dobijeni biološki materijal taloga sadržao je u svojoj strukturi linearni diacetilovani polisaharid N-acetil-1,4-β-D-glukopiranozamin (hitozan). Talog je prikupljen centrifugiranjem tokom 55 minuta pri 4500 obrtaja u minuti.

Modifikacija hitozana

[0165] Talog je suspendovan u 4 litre sterilne vode za injekcije i dodata je 4N hlorovodonična kiselina uz mešanje da bi se dobio pH od 5,4. Suspenzija je mešana 24 sata dok se sve pahuljice nisu rastvorile i dobila se gel suspenzija. Gel suspenzija je korišćena za pripremu konačnog proizvoda.

[0166] Druga faza. Za dobijanje konačnog proizvoda, 3 litre modifikovanog polisaharida podešeno je na zapreminu od 25 litara dodavanjem sterilne vode za injekcije uz mešanje. Zatim je 500 ml rastvora hlorokrezola koji sadrži 30 grama aktivnog sastojka dodato smeši uz mešanje. Dobijena suspenzija je podešena na zapreminu od 30 litara. Dobijeni sterilni proizvod je doziran u bočice pod aseptičnim uslovima.

Primer 6

[0167] Proizvod je pripremljen od hitozana. Proizvod je pripremljen u dve faze. Prva faza je orijentisana na dobijanje rastvora modifikovanog hitozana; druga faza je orijentisana na dobijanje konačnog proizvoda.

[0168] Prva faza. Kao sirovina je korišćen hitozan sa deacetilovanjem od 62% - 67%, viskozitetom od 70-200 mPas i molekulskom masom od 100-250 kD.40 grama polisaharida je sterilisano autoklaviranjem i dodato uz mešanje u 3,5 litre vode za injekcije. Dobijenoj suspenziji je dodato 40 ml 100% sirćetne kiseline. Konačna zapremina je podešena vodom za injekcije na 4 litre. Suspendovani polisaharid je mešan u sterilnoj posudi tokom 24 sata dok se nije dobila gel suspenzija. Nerastvorene čestice su uklonjene filtracijom kroz metalnu mrežu veličine ćelije od 200 μm-300 μm. Dobijenoj suspenziji se kap po kap dodavao 4N natrijum hidroksid (NaOH) da se dobije konačni pH od 8,0. Potom su se taložile bele pahuljice. Suspenzija je mešana 30 minuta. Primljeni biološki materijal sadržao je u svojoj strukturi linearni diacetilovani polisaharid N-acetil-1,4-β-D-glukopiranozamin (hitozan). Talog je sakupljen centrifugiranjem tokom 60 minuta pri 4500 obrtaja u minuti.

Modifikacija hitozana

[0169] U suspenziju je uz neprekidno mešanje dodavano kap po kap 4 mL 98% hlorida valerijanske kiseline. Dobijeni suspendovani materijal je mešan jedan sat. Pahuljice i nerastvorene čestice su resuspendovane u 4 litre sterilne vode za injekcije i dodata je 4N hlorovodonična kiselina uz mešanje da se dobije pH od 5,0. Suspenzija je mešana 28 sati dok se sve pahuljice nisu rastvorile i dobila se gel suspenzija.

[0170] Druga faza. Za dobijanje konačnog proizvoda, 3 litre modifikovanog polisaharida podešeno je na zapreminu od 25 litara dodavanjem sterilne vode za injekcije uz mešanje. Zatim je smeši dodato 500 ml rastvora hlorokrezola koji sadrži 30 grama aktivnog sastojka. Dobijena suspenzija je podešena na zapreminu od 30 litara. Dobijeni sterilni proizvod je doziran u bočice pod sterilnim uslovima.

Primer 7

[0171] Proizvod je pripremljen od hitozana. Proizvod je pripremljen u dve faze. Prva faza je bila orijentisana na dobijanje rastvora modifikovanog hitozana; druga faza bila je orijentisana na dobijanje konačnog proizvoda.

[0172] Prva faza. Kao sirovina je korišćen hitozan sa deacetiliranjem od 77% -82%, viskozitetom od 2700-3300 mPas i molekulskom masom od 300-700 kDa. 40 grama polisaharida je sterilisano autoklaviranjem i dodato uz mešanje u 3,5 litre vode za injekcije. Dobijenoj suspenziji je dodato 40 ml 100% sirćetne kiseline. Konačna zapremina je podešena na 4 litre vodom za injekcije. Suspenzovani polisaharid je mešan u sterilnoj posudi tokom 30 sati dok se nije dobila gel suspenzija. Nerastvorene čestice su uklonjene filtracijom kroz metalnu mrežu sa ćelijom veličine 200 μm - 300 μm. Dobijenoj suspenziji se kap po kap dodavao 4N natrijum hidroksid (NaOH) da se dobije konačni pH od 8,0. Potom su se taložile bele pahuljice. Suspenzija je mešana 30 minuta. Dobijeni biološki materijal sadržao je u svojoj strukturi linearni diacetilovani polisaharid N-acetil-1,4-β-D-glukopiranozamin (hitozan). Talog je prikupljen centrifugiranjem 45 minuta pri 5000 obrtaja u minuti.

Modifikacija biološkog materijala koji sadrži hitozan

[0173] U suspenziju je uz neprestano mešanje dodavano kap po kap 8 mL 90% mlečne kiseline. Dobijeni suspendovani materijal je mešan jedan sat. Pahuljice i nerastvorene čestice su resuspendovane u 4 litre sterilne vode za injekcije i dodata je 4N hlorovodonična kiselina uz mešanje dok se nije dobio pH od 5,6. Suspenzija je mešana 48 sati dok se sve pahuljice nisu rastvorile i dobila se gel suspenzija.

[0174] Druga faza. Za dobijanje konačnog proizvoda, 3 litre modifikovanog polisaharida podešeno je na zapreminu od 25 litara dodavanjem sterilne vode za injekcije uz mešanje. Zatim je smeši dodato 500 ml rastvora hlorokrezola koji sadrži 30 grama aktivnog sastojka. Dobijena suspenzija je podešena na zapreminu od 30 litara. Dobijeni sterilni proizvod je doziran u bočice pod aseptičnim uslovima.

Primer 8

[0175] Proizvod je pripremljen od hitozana. Proizvod je pripremljen u dve faze. Prva faza je bila orijentisana na dobijanje rastvora modifikovanog hitozana, druga faza je bila orijentisana na dobijanje konačnog proizvoda.

[0176] Prva faza. Kao sirovina je korišćen hitozan sa deacetiliranjem od 82%-87%, viskozitetom od 151 - 350 mPas i molekulskom masom od 150-300 kDa.40 grama polisaharida je sterilisano autoklaviranjem i dodato uz mešanje u 3,5 litre vode za injekcije. Dobijenoj suspenziji je dodato 40 ml 100% sirćetne kiseline. Konačna zapremina je podešena na 4 litre vodom za injekcije. Suspendovani polisaharid je mešan u sterilnoj posudi tokom 36 sati dok se nije dobila gel suspenzija. Nerastvorene čestice su uklonjene filtracijom kroz metalnu mrežu sa ćelijom veličine 200 μm - 300 μm. Dobijenoj suspenziji se kap po kap dodavao 4N natrijum hidroksid (NaOH) da se dobije konačni pH od 8,0. Potom su se taložile bele pahuljice. Suspenzija je mešana 30 minuta. Dobijeni biološki materijal sadržao je u svojoj strukturi linearni diacetilovani polisaharid N-acetil-1,4-β-D-glukopiranozamin (hitozan). Talog je sakupljen centrifugiranjem 50 minuta pri 4500 obrtaja u minuti.

Modifikacija biološkog materijala koji sadrži hitozan

[0177] U talog je uz stalno mešanje dodat 0,2% rastvor paraaminobenzojeve kiseline do 4 litre. Dobijeni suspendovani materijal je mešan jedan sat. Pahuljice i nerastvorene čestice su suspendovane u rastvoru paraaminobenzojeve kiseline i dodavana je 4N hlorovodonična kiselina uz mešanje dok se nije dobio pH od 5,6. Suspenzija je mešana 70 sati dok se sve pahuljice nisu rastvorile i dobila se gel suspenzija.

[0178] Druga faza. Za dobijanje konačnog proizvoda, 3 litre modifikovanog polisaharida podešeno je na zapreminu od 25 litara dodavanjem sterilne vode za injekcije uz mešanje. Zatim je smeši dodato 500 ml rastvora hlorokrezola koji sadrži 30 grama aktivnog sastojka. Dobijena suspenzija je podešena na zapreminu od 30 litara. Dobijeni sterilni proizvod je doziran u bočice pod aseptičnim uslovima.

Primer 9

[0179] Proizvod je pripremljen od hitozana. Proizvod je pripremljen u dve faze. Prva faza je bila orijentisana na dobijanje rastvora modifikovanog hitozana; druga faza bila je orijentisana na dobijanje konačnog proizvoda.

[0180] Prva faza. Kao sirovina je korišćen hitozan sa deacetilacijom od 67%-72%, viskozitetom od 151 - 350 mPas i molekulskom masom od 150-300 kDa.40 grama polisaharida je sterilisano autoklaviranjem i dodato uz mešanje u 3,5 litre vode za injekcije. Dobijenoj suspenziji je dodato 40 ml 100% sirćetne kiseline. Konačna zapremina je podešena vodom za injekcije na 4 litre. Suspendovani polisaharid je mešan u sterilnoj posudi tokom 24 sata dok se nije dobila gel suspenzija. Nerastvorene čestice su uklonjene filtracijom kroz metalnu mrežu sa ćelijom veličine 200 μm - 300 μm. Dobijenoj suspenziji se kap po kap dodavao 4N natrijum hidroksid (NaOH) da se dobije konačni pH od 8,0. Potom su se taložile bele pahuljice. Suspenzija je mešana 30 minuta. Dobijeni biološki materijal sadržao je u svojoj strukturi linearni diacetilovani polisaharid N-acetil-1,4-β-D-glukopiranozamin (hitozan). Talog je sakupljen centrifugiranjem tokom 60 minuta pri 4500 obrtaja u minuti.

Modifikacija biološkog materijala koji sadrži hitozan

[0181] U talog je uz stalno mešanje dodat 0,1% rastvor natrijumove soli glukuronske kiseline do 4 litre. Dobijeni suspendovani materijal je mešan jedan sat. Pahuljice i nerastvorene čestice su resuspendovane u rastvoru glukuronske kiseline i dodata je 4N hlorovodonična kiselina uz mešanje dok se nije dobio pH od 5,6. Suspenzija je mešana 72 sata dok se sve pahuljice nisu rastvorile i dobila se gel suspenzija.

[0182] Druga faza. Za dobijanje konačnog proizvoda, 3 litre modifikovanog polisaharida podešeno je na zapreminu od 25 litara dodavanjem sterilne vode za injekcije uz mešanje. Zatim je smeši dodato 500 ml rastvora hlorokrezola koji sadrži 30 grama aktivnog sastojka. Dobijena suspenzija je podešena na zapreminu od 30 litara. Dobijeni sterilni proizvod je doziran u bočice pod aseptičnim uslovima.

Primer 10

[0183] Proizvod je pripremljen od hitozana. Proizvod je pripremljen u dve faze. Prva faza je bila orijentisana na dobijanje rastvora hitozana; druga faza bila je orijentisana na dobijanje konačnog proizvoda.

[0184] Prva faza. Kao sirovina je korišćen hitozan sa deacetilacijom od 67% -72%, viskozitetom od 151 - 350 mPas i molekulskom masom od 150-300 kDa.40 grama polisaharida je sterilisano autoklaviranjem i dodato uz mešanje u 3,5 litre vode za injekcije. 8 ml 98% natrijumove soli valerijanske kiseline dodato je dobijenoj suspenziji. Konačna zapremina je podešena na 4 litre vodom za injekcije. Suspendovani polisaharid je mešan u sterilnoj posudi tokom 48 sati dok se nije dobila gel suspenzija. Nerastvorene čestice su uklonjene filtracijom kroz metalnu mrežu sa ćelijom veličine 200 μm - 300 μm.

[0185] Druga faza. Za dobijanje konačnog proizvoda, 3 litre modifikovanog polisaharida podešeno je na zapreminu od 25 litara dodavanjem sterilne vode za injekcije uz mešanje. Zatim je smeši dodato 500 ml rastvora hlorokrezola koji sadrži 30 grama aktivnog sastojka. Dobijena suspenzija je podešena na zapreminu od 30 litara. Dobijeni sterilni proizvod je doziran u bočice pod aseptičnim uslovima.

Primer 11

[0186] Proizvod je pripremljen od hitozana. Proizvod je pripremljen u dve faze. Prva faza je bila orijentisana na dobijanje rastvora hitozana; druga faza bila je orijentisana na dobijanje konačnog proizvoda.

[0187] Prva faza. Kao sirovina je korišćen hitozan sa deacetilovanjem od 67%-72%, viskozitetom od 151-350 mPas i molekulskom težinom od 150-300 kDa.40 grama polisaharida je sterilisano autoklaviranjem i dodato uz mešanje u 3,9 litara 0,2% paraaminobenzojeve kiseline u vodi za injekcije. Dodat je 4N rastvor hlorovodonične kiseline uz mešanje dok se nije dobio pH od 5,6 i nastala gel suspenzija. Konačna zapremina je podešena na 4 litre vodom za injekcije. Suspendovani polisaharid je mešan u sterilnoj posudi 72 sata dok se nije dobila gel suspenzija. Nerastvorene čestice su uklonjene filtracijom kroz metalnu mrežu sa ćelijom veličine 200 μm - 300 μm.

[0188] Druga faza. Za dobijanje konačnog proizvoda, 3 litre modifikovanog polisaharida podešeno je na zapreminu od 25 litara dodavanjem sterilne vode za injekcije uz mešanje. Zatim je smeši dodato 500 ml rastvora hlorokrezola koji sadrži 30 grama aktivnog sastojka. Dobijena suspenzija je podešena na zapreminu od 30 litara. Dobijeni sterilni proizvod je doziran u bočice pod aseptičnim uslovima.

Primer 12

[0189] Proizvod je pripremljen od hitozana. Proizvod je pripremljen u dve faze. Prva faza je bila orijentisana na dobijanje rastvora hitozana; druga faza bila je orijentisana na dobijanje konačnog proizvoda.

[0190] Prva faza. Kao sirovina je korišćen hitozan sa deacetilacijom od 67%-72%, viskozitetom od 151 - 350 mPas i molekulskom masom od 150-300 kDa.40 grama polisaharida je sterilisano autoklaviranjem i dodato uz mešanje u 3,5 litre 0,1% rastvora natrijumove soli glukuronske kiseline uz mešanje. Da bi se dobila gel suspenzija, dodavan je 4N rastvor hlorovodonične kiseline uz mešanje do dobijanja pH od 5,0. Konačna zapremina je podešena vodom za injekcije na 4 litre. Suspendovani polisaharid je mešan u sterilnoj posudi 78 sati dok se nije dobila gel suspenzija. Nerastvorene čestice su uklonjene filtracijom kroz metalnu mrežu sa ćelijom veličine 200 μm - 300 μm.

[0191] Druga faza. Za dobijanje konačnog proizvoda, 3 litre modifikovanog polisaharida podešeno je na zapreminu od 25 litara dodavanjem sterilne vode za injekcije uz mešanje. Zatim je smeši dodato 500 ml rastvora hlorokrezola koji sadrži 30 grama aktivnog sastojka. Dobijena suspenzija je podešena na zapreminu od 30 litara. Dobijeni sterilni proizvod je doziran u bočice pod aseptičnim uslovima.

Primer 13

[0192] Proizvod je pripremljen od hitozana. Proizvod je pripremljen u dve faze. Prva faza je bila orijentisana na dobijanje rastvora hitozana; druga faza bila je orijentisana na dobijanje konačnog proizvoda.

[0193] Prva faza. Kao sirovina je korišćen hitozan sa deacetilacijom od 67%-72%, viskozitetom od 151 - 350 mPas i molekulskom masom od 150-300 kDa.40 grama polisaharida je sterilisano autoklaviranjem i dodato uz mešanje u 3,5 litre vode za injekcije. 8 ml 90% mlečne kiseline dodato je dobijenoj suspenziji. Za rastvaranje pahuljica i čestica dodat je 4N rastvor hlorovodonične kiseline do dobijanja pH od 5,7. Konačna zapremina je podešena vodom za injekcije na 4 litre. Suspenzovani polisaharid je mešan u sterilnoj posudi 36 sati dok se ne dobije gel suspenzija. Nerastvorene čestice su uklonjene filtracijom kroz metalnu mrežu sa ćelijom veličine 200 μm - 300 μm.

[0194] Druga faza. Za dobijanje konačnog proizvoda, 3 litre modifikovanog polisaharida podešeno je na zapreminu od 25 litara dodavanjem sterilne vode za injekcije uz mešanje. Zatim je smeši dodato 500 ml rastvora hlorokrezola koji sadrži 30 grama aktivnog sastojka. Dobijena suspenzija je podešena na zapreminu od 30 litara. Dobijeni sterilni proizvod je doziran u bočice pod aseptičnim uslovima.

Primer 14

[0195] Proizvod je pripremljen izvođenjem 1. faze primera 1 u zapremini od 2 litre i mešanjem sa 2 litre proizvoda pripremljenog prema primeru 5.

[0196] Druga faza. Za dobijanje konačnog proizvoda, 4 litre modifikovanog polisaharida podešeno je na zapreminu od 35 litara dodavanjem sterilne vode za injekcije uz mešanje. Zatim je smeši dodato 500 mL timerosala koji sadrži 1,6 grama aktivne supstance. Dobijena suspenzija je podešena na zapreminu od 40 litara. Dobijeni sterilni proizvod je doziran u bočice pod aseptičnim uslovima.

Primer 15

[0197] Proizvod je pripremljen izvođenjem prve faze primera 5 u zapremini od 2 litre i mešanjem sa 2 litre proizvoda pripremljenog prema primeru 6.

[0198] Druga faza. Za dobijanje konačnog proizvoda, 4 litre modifikovanog polisaharida podešeno je na zapreminu od 35 litara dodavanjem sterilne vode za injekcije uz mešanje. Zatim je smeši dodato 500 mL timerosala koji sadrži 2 grama aktivne supstance. Dobijena suspenzija je podešena na zapreminu od 40 litara. Dobijeni sterilni proizvod je doziran u bočice pod aseptičnim uslovima.

Primer 16

[0199] Pripremljeni proizvod je pripremljen izvođenjem 1. faze primera 5 u zapremini od 2 litre i mešanjem sa 2 litre proizvoda pripremljenog prema primeru 7.

[0200] Druga faza. Za dobijanje konačnog proizvoda, 4 litre modifikovanog polisaharida podešeno je na zapreminu od 35 litara dodavanjem sterilne vode za injekcije uz mešanje. Zatim je smeši dodato 500 mL timerosala koji sadrži 1,8 grama aktivne supstance. Dobijena suspenzija je podešena na zapreminu od 40 litara. Dobijeni sterilni proizvod je doziran u bočice pod aseptičnim uslovima.

Primer 17

[0201] Proizvod je pripremljen izvođenjem prve faze primera 5 u zapremini od 2 litre i mešanjem sa 2 litre proizvoda pripremljenog prema primeru 8.

[0202] Druga faza. Za dobijanje konačnog proizvoda, 4 litre modifikovanog polisaharida podešeno je na zapreminu od 35 litara dodavanjem sterilne vode za injekcije uz mešanje. Zatim je smeši dodato 500 mL timerosala koji sadrži 1,8 grama aktivne supstance. Dobijena suspenzija je podešena na zapreminu od 40 litara. Dobijeni sterilni proizvod je doziran u bočice pod aseptičnim uslovima.

Primer 18

[0203] Proizvod je pripremljen izvođenjem prve faze primera 5 u zapremini od 2 litre i mešanjem sa 2 litre proizvoda pripremljenog prema primeru 9.

[0204] Druga faza. Za dobijanje konačnog proizvoda, 4 litre modifikovanog polisaharida podešeno je na zapreminu od 35 litara dodavanjem sterilne vode za injekcije uz mešanje. Zatim je smeši dodato 500 mL timerosala koji sadrži 1,6 grama aktivne supstance. Dobijena suspenzija je podešena na zapreminu od 40 litara. Dobijeni sterilni proizvod je doziran u bočice pod aseptičnim uslovima.

Primer 19

[0205] Proizvod je pripremljen izvođenjem 1. faze primera 6 u zapremini od 2 litre i mešanjem sa 2 litre proizvoda pripremljenog prema primeru 9.

[0206] Druga faza. Za dobijanje konačnog proizvoda, 4 litre modifikovanog polisaharida podešeno je na zapreminu od 35 litara dodavanjem sterilne vode za injekcije uz mešanje. Zatim je smeši dodato 500 mL timerosala koji sadrži 1,6 grama aktivne supstance. Dobijena suspenzija je podešena na zapreminu od 40 litara. Dobijeni sterilni proizvod je doziran u bočice pod aseptičnim uslovima.

Primer 20

[0207] Proizvod je pripremljen izvođenjem 1. faze primera 6 u zapremini od 2 litre i mešanjem sa 2 litre proizvoda pripremljenog prema primeru 8.

[0208] Druga faza. Za dobijanje konačnog proizvoda, 4 litre modifikovanog polisaharida podešeno je na zapreminu od 35 litara dodavanjem sterilne vode za injekcije uz mešanje. Zatim je smeši dodato 500 mL timerosala koji sadrži 1,6 grama aktivne supstance. Dobijena suspenzija je podešena na zapreminu od 40 litara. Dobijeni sterilni proizvod je doziran u bočice pod aseptičnim uslovima.

Primer 21

[0209] Proizvod je pripremljen izvođenjem 1. faze primera 6 u zapremini od 2 litre i mešanjem sa 2 litre proizvoda pripremljenog prema primeru 8.

[0210] Druga faza. Za dobijanje konačnog proizvoda, 4 litre modifikovanog polisaharida podešeno je na zapreminu od 35 litara dodavanjem sterilne vode za injekcije uz mešanje. Zatim je smeši dodato 500 mLformalina koji sadrži 80 ml aktivne supstance. Dobijena suspenzija je podešena na zapreminu od 40 litara. Dobijeni sterilni proizvod je doziran u bočice pod aseptičnim uslovima.

Primer 22

[0211] Proizvod je pripremljen izvođenjem 1. faze primera 6 u zapremini od 2 litre i mešanjem sa 2 litre proizvoda pripremljenog prema primeru 9.

[0212] Druga faza. Za dobijanje konačnog proizvoda, 4 litre modifikovanog polisaharida podešeno je na zapreminu od 35 litara dodavanjem sterilne vode za injekcije uz mešanje. Zatim je smeši dodato 500 mL rastvora formalina koji sadrži 85 mL aktivne supstance. Dobijena suspenzija je podešena na zapreminu od 40 litara. Dobijeni sterilni proizvod je doziran u bočice pod aseptičnim uslovima.

Primer 23

[0213] Proizvod je pripremljen prema primeru 5 s tom razlikom što je u drugoj fazi pripreme za dobijanje rezultujućeg proizvoda 3 litre modifikovanog polisaharida podešeno na zapreminu od 10 litara dodavanjem sterilne vode za injekcije uz mešanje. Zatim je smeši dodato 500 ml rastvora hlorokrezola koji sadrži 15 grama aktivne supstance. Dobijena suspenzija je podešena na zapreminu od 15 litara. Dobijeni sterilni proizvod je doziran u bočice pod aseptičnim uslovima.

Primer 24

[0214] Proizvod je pripremljen prema primeru 6 s tom razlikom što je u drugoj fazi pripreme za dobijanje rezultujućeg proizvoda 3 litre modifikovanog polisaharida podešeno na zapreminu od 10 litara dodavanjem sterilne vode za injekcije uz mešanje. Zatim je smeši dodato 500 ml rastvora hlorokrezola koji sadrži 15 grama aktivne supstance. Dobijena suspenzija je podešena na zapreminu od 15 litara. Dobijeni sterilni proizvod je doziran u bočice pod aseptičnim uslovima.

Primer 25

[0215] Proizvod je pripremljen prema primeru 7 s tom razlikom što je u drugoj fazi pripreme za dobijanje rezultujućeg proizvoda 3 litre modifikovanog polisaharida podešeno na zapreminu od 10 litara dodavanjem sterilne vode za injekcije uz mešanje. Zatim je smeši dodato 500 ml timerosala koji sadrži 1,6 grama aktivne supstance. Dobijena suspenzija je podešena na zapreminu od 15 litara. Dobijeni sterilni proizvod je doziran u bočice pod aseptičnim uslovima.

Primer 26

[0216] Proizvod je pripremljen prema primeru 8 s tom razlikom što je u drugoj fazi pripreme za dobijanje rezultujućeg proizvoda 3 litre modifikovanog polisaharida podešeno na zapreminu od 10 litara dodavanjem sterilne vode za injekcije uz mešanje. Zatim je smeši dodato 500 ml rastvora formalina koji sadrži 30 mL aktivne supstance. Dobijena suspenzija je podešena na zapreminu od 15 litara. Dobijeni sterilni proizvod je doziran u bočice pod aseptičnim uslovima.

Primer 27

[0217] Proizvod je pripremljen prema primeru 9 s tom razlikom što je u drugoj fazi pripreme za dobijanje rezultujućeg proizvoda 3 litre modifikovanog polisaharida podešeno na zapreminu od 10 litara dodavanjem sterilne vode za injekcije uz mešanje. Zatim je smeši dodato 500 ml timerosala koji sadrži 0,6 grama aktivne supstance. Dobijena suspenzija je podešena na zapreminu od 15 litara. Dobijeni sterilni proizvod je doziran u bočice pod aseptičnim uslovima.

Primer 28

[0218] Proizvod je pripremljen prema primeru 6 s tom razlikom što je u drugoj fazi pripreme za dobijanje rezultujućeg proizvoda 3 litre modifikovanog polisaharida podešeno na zapreminu od 5 litara dodavanjem sterilne vode za injekcije uz mešanje. Zatim je smeši dodato 500 ml rastvora hlorokrezola koji sadrži 6 grama aktivne supstance. Dobijena suspenzija je podešena na zapreminu od 6 litara. Dobijeni sterilni proizvod je doziran u bočice pod aseptičnim uslovima.

Primer 29

[0219] Proizvod je pripremljen prema primeru 7 s tom razlikom što je u drugoj fazi pripreme za dobijanje rezultujućeg proizvoda 3 litre modifikovanog polisaharida podešeno na zapreminu od 5 litara dodavanjem sterilne vode za injekcije uz mešanje. Zatim je smeši dodato 500 ml timerosala koji sadrži 0,24 grama aktivne supstance. Dobijena suspenzija je podešena na zapreminu od 6 litara. Dobijeni sterilni proizvod je doziran u bočice pod aseptičnim uslovima.

Primer 30

[0220] Proizvod je pripremljen prema primeru 8 s tom razlikom što je u drugoj fazi pripreme za dobijanje rezultujućeg proizvoda 3 litre modifikovanog polisaharida podešeno na zapreminu od 5 litara dodavanjem sterilne vode za injekcije uz mešanje. Zatim je smeši dodato 500 ml rastvora formalina koji sadrži 12 ml aktivne supstance. Dobijena suspenzija je podešena na zapreminu od 6 litara. Dobijeni sterilni proizvod je doziran u bočice pod aseptičnim uslovima.

Primer 31

[0221] Proizvod je pripremljen prema primeru 9 s tom razlikom što je u drugoj fazi pripreme za dobijanje rezultujućeg proizvoda 3 litre modifikovanog polisaharida podešeno na zapreminu od 5 litara dodavanjem sterilne vode za injekcije uz mešanje. Zatim je smeši dodato 500 ml rastvora mertiolata koji sadrži 0,24 grama aktivne supstance. Dobijena suspenzija je podešena na zapreminu od 6 litara. Dobijeni sterilni proizvod je doziran u bočice pod aseptičnim uslovima.

Primer 32

[0222] Proizvod je pripremljen prema primeru 8 s tom razlikom što je u drugoj fazi pripreme za dobijanje rezultujućeg proizvoda 3 litre modifikovanog polisaharida podešeno na zapreminu od 10 litara dodavanjem sterilne vode za injekcije uz mešanje. Zatim je smeši dodato 500 ml rastvora neomicina koji sadrži 150 g aktivne supstance. Dobijena suspenzija je podešena na zapreminu od 15 litara. Dobijeni sterilni proizvod je doziran u bočice pod aseptičnim uslovima.

Primer 33

[0223] Proizvod je pripremljen prema primeru 8 s tom razlikom što je u drugoj fazi pripreme za dobijanje rezultujućeg proizvoda 3 litre modifikovanog polisaharida podešeno na zapreminu od 10 litara dodavanjem sterilne vode za injekcije uz mešanje. Zatim je smeši dodato 500 ml rastvora natrijumove i kalijumove soli penicilina koji sadrži 300 g (300.000.000 UE) aktivne supstance. Dobijena suspenzija je podešena na zapreminu od 15 litara. Dobijeni sterilni proizvod je doziran u bočice pod aseptičnim uslovima.

Primer 34

[0224] Proizvod je pripremljen prema primeru 8 s tom razlikom što je u drugoj fazi pripreme za dobijanje rezultujućeg proizvoda 3 litre modifikovanog polisaharida podešeno na zapreminu od 10 litara dodavanjem sterilne vode za injekcije uz mešanje. Zatim je smeši dodato 500 ml rastvora natrijumove i kalijumove soli penicilina koji sadrži 300 g (300.000.000 UE) aktivne supstance i 500 ml rastvora neomicina koji sadrži 150 g aktivne supstance. Dobijena suspenzija je podešena na zapreminu od 15 litara. Dobijeni sterilni proizvod je doziran u bočice pod aseptičnim uslovima.

Primer 35

[0225] Proizvod je pripremljen izvođenjem 1. faze primera 7 u zapremini od 2 litre i mešanjem sa 2 litre proizvoda pripremljenog prema primeru 8.

[0226] Druga faza. Za dobijanje konačnog proizvoda, 4 litre modifikovanog polisaharida podešeno je na zapreminu od 15 litara dodavanjem sterilne vode za injekcije uz mešanje. Zatim je smeši dodato 500 ml rastvora formalina koji sadrži 30 mL aktivne supstance. Dobijena suspenzija je podešena na zapreminu od 20 litara. Dobijeni sterilni proizvod je doziran u bočice pod aseptičnim uslovima.

Primer 36

[0227] Proizvod je pripremljen izvođenjem 1. faze primera 7 u zapremini od 2 litre i mešanjem sa 2 litre proizvoda pripremljenog prema primeru 6.

[0228] Druga faza. Za dobijanje konačnog proizvoda, 4 litre modifikovanog polisaharida podešeno je na zapreminu od 15 litara dodavanjem sterilne vode za injekcije uz mešanje. Zatim je smeši dodato 500 ml rastvora formalina koji sadrži 30 ml aktivne supstance. Dobijena suspenzija je podešena na zapreminu od 20 litara. Dobijeni sterilni proizvod je doziran u bočice pod aseptičnim uslovima.

Primer 37

[0229] Proizvod je pripremljen izvođenjem 1. faze primera 7 u zapremini od 5 litara.

[0230] Druga faza. Za dobijanje konačnog proizvoda, 4 litre modifikovanog polisaharida podešeno je na zapreminu od 15 litara dodavanjem sterilne vode za injekcije uz mešanje. Zatim je smeši dodato 500 ml rastvora formalina koji sadrži 30 mL aktivne supstance. Dobijena suspenzija je podešena na zapreminu od 20 litara. Dobijeni sterilni proizvod je doziran u bočice pod aseptičnim uslovima.

Primer 38

[0231] Kultura dermatofita vrste Trichophyton mentagrophytes DSM – 7279 uzgajana je na agaru/sladovini, na primer u 3-10 Roux boca. Kultura se uzgajala 15-30 dana na 26-28°C. Gljivične mase dermatofita su izdvojene i homogenizovane u vodenom rastvoru (na primer 100-500 ml) proizvoda dobijenog prema primeru 6, ali sa sledećom razlikom u drugoj fazi: Druga faza. Za dobijanje konačnog proizvoda, 3 litre modifikovanog polisaharida podešeno je na zapreminu od 25 litara dodavanjem sterilne vode za injekcije uz mešanje. Zatim je smeši dodato 500 ml rastvora hlorokrezola koji sadrži 30 grama aktivnog sastojka. Dobijena suspenzija je podešena na zapreminu od 30 litara. Dobijeni sterilni proizvod je dodat gljivičnoj suspenziji da bi se dobila koncentracija od 45-80 miliona mikrokonidija po ml za svaki homogenat. Homogenati su inaktivisani dodavanjem formaldehida direktno u ćelijsku suspenziju tako da ćelijska suspenzija na kraju sadrži 0,2% (w/v) formaldehida. Smeša je inkubirana 5-7 dana na 37°C.

[0232] Vakcina koja se može pripremiti prema ovoj metodi može se npr. koristiti za profilaksu i lečenje interdigitalnog i/ili digitalnog dermatitisa i/ili interdigitalne flegmone kod životinja.

Primer 39

[0233] Kultura dermatofita vrste Trichophyton verrucosum DSM – 2840 uzgajana je na agaru/sladovini, na primer u 3-10 Roux boca. Kultura se uzgajala 15-30 dana na 26-28°C. Gljivične mase dermatofita su izdvojene i homogenizovane u vodenom rastvoru (na primer 100-500 ml) proizvoda pripremljenog prema primeru 8, ali sa sledećom razlikom u drugoj fazi: Druga faza. Za dobijanje konačnog proizvoda, 3 litre modifikovanog polisaharida podešeno je na zapreminu od 25 litara dodavanjem sterilne vode za injekcije uz mešanje. Zatim je smeši dodato 500 ml rastvora hlorokrezola koji sadrži 30 grama aktivnog sastojka. Dobijena suspenzija je podešena na zapreminu od 30 litara. Dobijeni sterilni proizvod je dodat u suspenziju da bi se dobila koncentracija od 45-80 miliona po ml za homogenat. Homogenati su inaktivirani dodavanjem formaldehida direktno u ćelijsku suspenziju tako da ćelijska suspenzija na kraju sadrži 0,4% (w/v) formaldehida. Smeša je inkubirana 5-7 dana na 37°C.

[0234] Vakcina koja se može pripremiti prema ovoj metodi može se npr. koristiti za profilaksu i lečenje interdigitalnog i/ili digitalnog dermatitisa i/ili interdigitalne flegmone i/ili trihofitoze kod životinja.

Primer 40

[0235] Vrsta Candida albicans DSM – 9456 uzgajana je na agaru sa ekstraktom slada ili agaru Sabouraud, na primer u 3-10 Roux boca. Kultura se uzgajala 4-7 dana na 28-37°C. Blastopore su isprane fiziološkim rastvorom natrijum hlorida ili nekim drugim pogodnim rastvorom. Gljivične mase dermatofita su izdvojene i homogenizovane u vodenom rastvoru (na primer 100-500 ml) proizvoda pripremljenog prema primeru 9, ali sa sledećom razlikom u drugoj fazi: Druga faza. Za dobijanje konačnog proizvoda, 3 litre modifikovanog polisaharida podešeno je na zapreminu od 25 litara dodavanjem sterilne vode za injekcije uz mešanje. Zatim je smeši dodato 500 ml rastvora hlorokrezola koji sadrži 30 grama aktivnog sastojka. Dobijena suspenzija je podešena na zapreminu od 30 litara. Dobijeni sterilni proizvod je dodat u suspenziju da bi se dobila koncentracija od 40-90 miliona mikrokonidija po ml za homogenat. Homogenati su inaktivirani dodavanjem formaldehida direktno u ćelijsku suspenziju tako da ćelijska suspenzija na kraju sadrži 0,3% (w/v) formaldehida. Smeša je inkubirana 5-7 dana na 37°C.

[0236] Vakcina koja se može pripremiti prema ovoj metodi može se npr. koristiti za profilaksu i lečenje interdigitalnog i/ili digitalnog dermatitisa i/ili interdigitalne flegmone kod životinja.

Primer 41

[0237] Prvi korak: Vrsta Candida albicans DSM – 9456 uzgajana je na agaru sa ekstraktom slada kompanije Oxoid u 40 Roux boca. Kultura je uzgajana 4-7 dana na 28-37°C kako je opisano u EP 0564620. Dobijena gljivična biomasa je izdvojena i tretirana vodenim rastvorom NaOH sa koncentracijom od 3% (w/v). Pomenuti alkalni tretman je izvođen na 80 °C tokom 6 sati. Posle obrade u alkalnim vodenim uslovima, čvrsta i tečna faza preparata su odvojene centrifugiranjem na 3500 g. Posle alkalne obrade, nastali supernatant je tretiran u kiselim vodenim uslovima, npr.50% sirćetne kiseline pri pH od 4,0 tokom 2 sata na temperaturi od 4° do 8°C, nakon čega je došlo do razdvajanja čvrstog i tečnog sloja. Zatim se supernatant iz koraka razdvajanja podvrgava koraku taloženja. Precipitacija je izvedena dodavanjem etanola. Odnos jedne zapremine supernatanta prema 3 zapremine alkohola rezultirao je dobrim taloženjem antigenog materijala. Konačno, preparat ASMP je liofilizovan. Na kraju je čvrsta faza izdvojena i homogenizovana u proizvodu dobijenom prema primeru 6, ali sa sledećom razlikom u drugoj fazi:

Druga faza. Za dobijanje konačnog proizvoda, 3 litre modifikovanog polisaharida podešeno je na zapreminu od 25 litara dodavanjem sterilne vode za injekcije uz mešanje. Zatim je smeši dodato 500 ml rastvora hlorokrezola koji sadrži 30 grama aktivnog sastojka. Dobijena suspenzija je podešena na zapreminu od 30 litara. Koncentracija ASMP je podešena na 400 µg po ml.

[0238] Vakcina koja se može pripremiti prema ovoj metodi može se npr. koristiti za profilaksu i lečenje alergija.

Primer 42

[0239] Prvi korak: Vrsta Candida albicans DSM – 9456 uzgajana je na ekstraktu sladaagaru iz Okoida u 50 Roux boca. Kultura je uzgajana 4-7 dana na 28-37 °C kako je opisano u EP 0564620. Dobijena gljivična biomasa je izdvojena i tretirana vodenim rastvorom NaOH sa koncentracijom od 3% (w/v). Alkalni tretman je izveden na 80°C tokom 6 sati. Posle obrade u alkalnim vodenim uslovima, čvrsta i tečna faza preparata su odvojene centrifugiranjem na 3500g. Posle alkalne obrade, nastali supernatant je tretiran u kiselim vodenim uslovima, npr. 50% sirćetne kiseline pri pH od 4,0 tokom 2 sata na temperaturi od 4° do 8°C, nakon čega je došlo do razdvajanja čvrstog i tečnog sloja. Zatim se supernatant iz koraka razdvajanja podvrgava koraku taloženja. Precipitacija je izvedena dodavanjem etanola. Odnos jedne zapremine supernatanta prema 3 zapremine alkohola rezultirao je dobrim taloženjem antigenog materijala. Konačno, preparat ASMP je liofilizovan.

[0240] Na kraju je čvrsta faza izdvojena i homogenizovana u proizvodu dobijenom prema primeru 8, ali sa sledećom razlikom u drugoj fazi: Druga faza. Za dobijanje konačnog proizvoda, 3 litre modifikovanog polisaharida podešeno je na zapreminu od 25 litara dodavanjem sterilne vode za injekcije uz mešanje. Zatim je smeši dodato 500 ml rastvora hlorokrezola koji sadrži 30 grama aktivnog sastojka. Dobijena suspenzija je podešena na zapreminu od 30 litara. Koncentracija ASMP je podešena na 200 µg po ml.

[0241] Vakcina koja se može pripremiti prema ovoj metodi može se npr. koristiti za profilaksu i lečenje alergija.

Primer 43

[0242] Prvi korak: Vrsta Candida albicans DSM – 9456 uzgajana je na ekstraktu sladaagaru iz Okoida u 50 Roux boca. Kultura je uzgajana 4-7 dana na 28-37°C kako je opisano u EP 0564620. Dobijena gljivična biomasa je izdvojena i tretirana vodenim rastvorom NaOH sa koncentracijom od 3% (w/v). Alkalni tretman je izveden na 80 °C tokom 6 sati. Posle obrade u alkalnim vodenim uslovima, čvrsta i tečna faza preparata su odvojene centrifugiranjem na 3500 g. Posle alkalne obrade, nastali supernatant je tretiran u kiselim vodenim uslovima, npr.50% sirćetne kiseline pri pH 4,0 tokom 2 sata na temperaturama od 4 do 8°C, nakon čega je došlo do razdvajanja čvrstog i tečnog sloja. Zatim se supernatant iz koraka razdvajanja podvrgava koraku taloženja. Precipitacija je izvedena dodavanjem etanola. Odnos jedne zapremine supernatanta prema 3 zapremine alkohola rezultirao je dobrim taloženjem antigenog materijala. Konačno, preparat ASMP je liofilizovan.

[0243] Na kraju je čvrsta faza izdvojena i homogenizovana u proizvodu dobijenom prema primeru 9, ali sa sledećom razlikom u drugoj fazi: Druga faza. Za dobijanje konačnog proizvoda, 3 litre modifikovanog polisaharida podešeno je na zapreminu od 25 litara dodavanjem sterilne vode za injekcije uz mešanje. Zatim je smeši dodato 500 ml rastvora hlorokrezola koji sadrži 30 grama aktivnog sastojka. Dobijena suspenzija je podešena na zapreminu od 30 litara. Koncentracija ASMP je podešena na 100 µg po ml.

[0244] Vakcina koja se može pripremiti prema ovoj metodi može se npr. koristiti za profilaksu i lečenje alergija.

Primer 44

[0245] Frakcija koja se može pripremiti prema ovom postupku sastoji se od antigenog nerastvorljivog materijala koji sadrži polisaharid i/ili glikopeptide (ANMP) prema PCT/EP96/03535. Vrsta Candida albicans DSM – 9456 uzgajana je na ekstraktu sladaagaru iz Okoida u 50 Roux boca. Kultura je uzgajana 4-7 dana na 28-37°C kako je opisano u EP 0564620. Dobijena gljivična biomasa je izdvojena i tretirana vodenim rastvorom alkalije sa koncentracijom 4% (w/v) NaOH. Tretman je izveden na 80°C do 6 sati. Posle obrade u vodenim alkalnim uslovima, čvrsta i tečna faza preparata su odvojene centrifugiranjem pri silama od oko 3500 g. Posle alkalnog tretmana, čvrsta faza je tretirana sa 50% rastvorom sirćetne kiseline. Posle kiselog tretmana, čvrsta faza je isprana destilovanom vodom pet puta. Na kraju je čvrsta faza izdvojena i homogenizovana u proizvodu dobijenom prema primeru 6, ali sa sledećom razlikom u drugoj fazi: Druga faza. Za dobijanje konačnog proizvoda, 3 litre modifikovanog polisaharida podešeno je na zapreminu od 25 litara dodavanjem sterilne vode za injekcije uz mešanje. Zatim je smeši dodato 500 ml rastvora hlorokrezola koji sadrži 30 grama aktivnog sastojka.. Dobijena suspenzija je podešena na zapreminu od 30 litara. Koncentracija čestica je podešena na 30-90 millona po ml.

[0246] Vakcina koja se može pripremiti prema ovoj metodi može se npr. koristiti za profilaksu i lečenje interdigitalnog i/ili digitalnog dermatitisa i/ili interdigitalne flegmone kod životinja.

Primer 45

[0247] Kultura dermatofita vrste Trichophyton verrucosum DSM – 2840 uzgajana je na agaru/sladovini, na primer u 3-10 Roux boca. Kultura se uzgajala 15-30 dana na 26-28°C. Gljivične mase dermatofita su izdvojene i homogenizovane u vodenom rastvoru (na primer 100-500 ml) proizvoda dobijenog prema primeru 6, ali sa sledećom razlikom u drugoj fazi: Druga faza. Za dobijanje konačnog proizvoda, 3 litre modifikovanog polisaharida podešeno je na zapreminu od 10 litara dodavanjem sterilne vode za injekcije uz mešanje. Zatim je smeši dodato 500 ml rastvora hlorokrezola koji sadrži 30 grama aktivnog sastojka. Dobijena suspenzija je podešena na zapreminu od 15 litara. Dobijeni sterilni proizvod je dodat gljivičnoj suspenziji da bi se dobila koncentracija od 45-60 miliona mikrokonidija po ml za svaki homogenat. Homogenati su inaktivisani dodavanjem formaldehida direktno u ćelijsku suspenziju tako da ćelijska suspenzija na kraju sadrži 0,2% (w/v) formaldehida. Smeša je inkubirana 5-7 dana na 37°C.

[0248] Vakcina koja se može pripremiti prema ovoj metodi može se npr. koristiti za profilaksu i lečenje trihofitoze kod goveda.

Primer 46

[0249] Rastvor biološkog materijala koji u svojoj strukturi sadrži linearni polisaharid N-acetil-1,4-β-D-glukopiranozamin modifikovan sa 0,2% paraaminobenzojeve kiseline dodat je vakcini Polivac-TM protiv dermatofitoze životinja (proizvođač: „Vetbiochim“ LLC, Moskva; Distributer: „Prostore“ LLC, Moskva) da postigne konačnu koncentraciju od 0,3% (w/v). pH rastvora je bio oko 5,6. Koncentracija mikrokonidija bila je 40 miliona po ml.

[0250] Vakcina pripremljena prema ovoj metodi može se koristiti za profilaksu i lečenje dermatofitoze kod životinja.

Primer 47

[0251] Candida albians DSM – 9456 uzgajana je na agar pločama kako je opisano u EP 0564620. Jedan poželjni medijum je bio, na primer, agar sa ekstraktom slada kompanije Oxoid. Dobijena gljivična biomasa je izdvojena i tretirana vodenim rastvorom NaOH sa koncentracijom od 3% (w/v). Alkalni tretman je izveden na 80°C tokom 6 sati. Posle obrade u alkalnim vodenim uslovima, čvrsta i tečna faza preparata su odvojene centrifugiranjem na 3500 g. Posle alkalne obrade, nastali supernatant je tretiran u kiselim vodenim uslovima, npr.

50% sirćetne kiseline pri pH 4,0 tokom 2 sata na temperaturi od 4 do 8°C, nakon čega je došlo do razdvajanja čvrstog i tečnog sloja. Zatim se supernatant iz koraka razdvajanja podvrgava koraku taloženja. Odnos jedne zapremine supernatanta prema 3 zapremine alkohola rezultirao je dobrim taloženjem antigenog materijala. Konačno, preparat ASMP je liofilizovan.

[0252] Rastvor biološkog materijala koji u svojoj strukturi sadrži linearni polisaharid N-acetil-1,4-β-D-glukopiranozamin modifikovan sa 0,5% paraaminobenzojeve kiseline dodat je vakcini Polivac-TM protiv dermatofitoze životinja (proizvođač: „Vetbiochim“ LLC, Moskva; Distributer: „Prostore“ LLC, Moskva) da postigne konačnu koncentraciju od 0,3% (w/v). PH rastvora je bio oko 5,8. Koncentracija mikrokonidija bila je 40 miliona po ml. Na kraju je čvrsta faza ASMP pomešana sa modifikovanom vakcinom Polivac-TM. Koncentracija ASMP je podešena na 400 µg po ml.

[0253] Vakcina koja se može pripremiti prema ovoj metodi može se npr. koristiti za profilaksu i lečenje dermatofitoze kod životinja.

Primer 48

[0254] Keratinase Pure 70 proizvođača PROTEOS Biotech, 4 Almansa Street, 02006 Albacete, Španija je korišćena za pripremu rastvora koji sadrži 2 U/ml. Candida albians DSM – 9456 uzgajana je na agar pločama kako je opisano u EP 0564620. Jedan poželjni medijum je bio, na primer, agar sa ekstraktom slada kompanije Oxoid. Dobijena gljivična biomasa je izdvojena i tretirana vodenim rastvorom NaOH sa koncentracijom od 3% (w/v). Alkalni tretman je izveden na 80 °C tokom 6 sati. Posle obrade u alkalnim vodenim uslovima, čvrsta i tečna faza preparata su odvojene centrifugiranjem na 3500 g. Posle alkalne obrade, nastali supernatant je tretiran u kiselim vodenim uslovima, npr. 50% sirćetne kiseline pri pH 4,0 tokom 2 sata na temperaturama od 4 do 8 °C, nakon čega je došlo do razdvajanja čvrstog i tečnog sloja. Zatim se supernatant iz koraka razdvajanja podvrgava koraku taloženja. Odnos jedne zapremine supernatanta prema 3 zapremine alkohola rezultirao je dobrim taloženjem antigenog materijala. Konačno, preparat ASMP je liofilizovan.

[0255] Rastvor Keratinase Pure 70 umešan je u vodeni rastvor (na primer 100-500 ml) 0,3% rastvora biološkog materijala koji je u svojoj strukturi sadržao linearni polisaharid N-acetil-1,4-β-D-glukopiranozamin modifikovan paraaminobenzojevom kiselinom, pripremljen prema primeru 8 (prva faza). Koncentracija Keratinase Pure 70 je podešena na 1-1,2 U po ml. Formalin je dodat da bi dostigao 0,2% (w/v) u krajnjoj suspenziji. Smeša je inkubirana 5-7 dana na 37 °C. Na kraju se čvrsta faza ASMP izdvojila i homogenizovala u vodenoj suspenziji modifikovanog linearnog polisaharida N-acetil-1,4-β-D-glukopiranozamina. Koncentracija ASMP je podešena na 200 µg po ml.

[0256] Vakcina koja se može pripremiti prema ovoj metodi može se npr. koristiti za profilaksu i lečenje dermatofitoze kod životinja.

Primer 49

[0257] Kultura dermatofita vrste Microsporum canis BINO 483 uzgajana je na agaru/sladovini, na primer u 3-10 Roux boca, 21 dan na 26-28°C. Suspenzija mikrokonidija je kultivisana u medijumu sa keratinom i egzoantigeni dermatofita su dobijeni prema RF patentu br.2219945 kako sledi: Dobijena suspenzija sa koncentracijom mikrokonidija od 40 x 10<6>do 50 x 10<6>uzgajana je 7 dana uz mešanje na temperaturi od 29 °C. Posle toga je dodat formalin da bi se dobila krajnja koncentracija od 0,4%. Tečna faza je odvojena u tri koraka filtracije – kroz metalnu rešetku sa ćelijom od 200 μm - 300 μm, zatim kroz Whatman papirni filter br. 4 (veličine 20 µm do 25 µm) i na kraju kroz najlonski filter za sterilizaciju veličine 0,22 μm, ali je u procesu očuvanja formalina iznenađujuće utvrđeno pojačano antigeno delovanje dobijenih frakcija (AEMP). Egzoantigeni dermatofita AEMP su izdvojeni i homogenizovani u vodenom rastvoru (na primer 100-500 ml) 0,2% rastvora biološkog materijala koji u svojoj strukturi sadrži linearni polisaharid N-acetil-1,4-β-D-glukopiranozamin modifikovan paraaminobenzojevom kiselinom prema primeru 8. Koncentracija AEMP je podešena na 1-1,2 U po ml. Dodat je formalin da dostigne 0,2% (w/v) u krajnjoj suspenziji. Smeša je inkubirana 5-7 dana na 37 °C.

[0258] Vakcina koja se može pripremiti prema ovoj metodi može se npr. koristiti za profilaksu i lečenje dermatofitoze kod životinja.

Primer 50

[0259] Kultura gljiva vrste Chrisporium tropicum DSM-28405 uzgajana je na agaru/sladovini, na primer u 3-10 Roux boca tokom 21 dana na 26-28 °C. Posle toga, dobijena suspenzija mikrokonidija je kultivisana u medijumu sa keratinom i egzoantigeni su pripremljeni u skladu sa RF patentom br.2219945, kako sledi: Dobijena suspenzija sa koncentracijom mikrokonidija od 50 x 10<6>do 60 x 10<6>uzgajana je 7 dana uz mešanje na temperaturi od 30 °C. Zatim je dodat formalin u krajnjoj koncentraciji od 0,4%. Tečna faza je odvojena u tri koraka filtracije – kroz metalnu rešetku sa ćelijom od 200 μm - 300 μm, zatim kroz Whatman papirni filter br. 4 (veličine 20 µm do 25 µm) i na kraju kroz najlonski filter za sterilizaciju veličine 0,22 μm, ali je u procesu očuvanja formalina iznenađujuće utvrđeno pojačano antigeno delovanje dobijenih frakcija (AEMP). Rastvorljivi egzoantigeni gljivica AEMP su izdvojeni i homogenizovani u vodenom rastvoru (na primer 100-500 ml) 0,2% rastvora biološkog materijala koji u svojoj strukturi sadrži linearni polisaharid N-acetil-1,4-β-D-glukopiranozamin modifikovan paraaminobenzojevom kiselinom prema primeru 8. Koncentracija AEMP je podešena na 1-1,2 U po ml. Dodat je formalin da dostigne 0,2% (w/v) u krajnjoj suspenziji. Smeša je inkubirana 5-7 dana na 37 °C.

[0260] Vakcina koja se može pripremiti prema ovoj metodi može se npr. koristiti za lečenje dermatofitoze i alergijskih bolesti kod životinja.

Primer 51

[0261] Kultura dermatofita vrste Trichophyton verrucosum DSM – 2840 uzgajana je na agaru/sladovini, na primer u 3-10 Roux boca. Kultura se uzgajala 15-30 dana na 26-28°C. Gljivične mase dermatofita su izdvojene i homogenizovane u vodenom rastvoru (na primer 100-500 ml) 0,2% rastvora biološkog materijala koji u svojoj strukturi sadrži linearni polisaharid N-acetil-1,4-b-D- glukopiranozamin modifikovan hloridom valerijanske kiseline prema primeru 6. Koncentracija mikrokonidija je podešena na 250-300 hiljada po ml. Homogenati su inaktivisani dodavanjem formaldehida direktno u ćelijsku suspenziju do krajnje vrednosti 0,2% (v/v). Smeša je inkubirana 5-7 dana na 37°C.

[0262] Vakcina koja se može pripremiti prema ovoj metodi može se npr. koristiti za profilaksu i lečenje interdigitalnog i/ili digitalnog dermatitisa i/ili interdigitalne flegmone kod životinja.

Primer 52

[0263] Kultura dermatofita vrste Trichophyton mentagrophytes DSM –7279 uzgajana je na agaru/sladovini, na primer u 3-10 Roux boca. Kultura se uzgajala 15-30 dana na 26-28°C. Gljivične mase dermatofita su izdvojene i homogenizovane u vodenom rastvoru (na primer 100-500 ml) 0,2% rastvora biološkog materijala koji u svojoj strukturi sadrži linearni polisaharid N-acetil-1,4-β-D-glukopiranozamin modifikovan paraaminobenzojevom kiselinom prema primeru 8. Koncentracija mikrokonidija je podešena na 250-300 hiljada po ml. Homogenati su inaktivisani dodavanjem formaldehida do krajnje vrednosti 0,2% (v/v) direktno u ćelijsku suspenziju. Smeša je inkubirana 5-7 dana na 37°C. Vakcina koja se može pripremiti prema ovoj metodi može se npr. koristiti za profilaksu i lečenje interdigitalnog i/ili digitalnog dermatitisa i/ili interdigitalne flegmone kod životinja.

Primer 53

[0264] Kultura dermatofita vrste Trichophyton verrucosum DSM – 2840 uzgajana je na agaru/sladovini, na primer u 3-10 Roux boca. Kultura se uzgajala 15-30 dana na 26-28°C. Gljivične mase dermatofita su izdvojene i homogenizovane u vodenom rastvoru (na primer 100-500 ml) 0,2% rastvora biološkog materijala koji u svojoj strukturi sadrži linearni polisaharid N-acetil-1,4-β-D-glukopiranozamin modifikovan glukuronskom kiselinom prema primeru 9. Koncentracija mikrokonidija je podešena na 250-300 hiljada po ml. Homogenati su inaktivirani dodavanjem formaldehida direktno u ćelijsku suspenziju da bi na kraju dostigli 0,1% (v/v). Smeša je inkubirana 5-7 dana na 37°C.

[0265] Vakcina koja se može pripremiti prema ovoj metodi može se npr. koristiti za profilaksu i lečenje interdigitalnog i/ili digitalnog dermatitisa i/ili interdigitalne flegmone kod životinja.

Primer 54

[0266] Prva faza. Kao sirovina je korišćen hitozan sa deacetilacijom od 67% -72%, viskozitetom od 151 - 350 mPas i molekulskom masom od 150-300 kDa.40 grama polisaharida je sterilisano autoklaviranjem i uz mešanje je dodato 3,9 litara 0,2 % paraaminobenzojeve kiseline u vodi za injekcije. Da bi se dobila gel suspenzija, dodavan je 4N rastvor hlorovodonične kiseline uz mešanje do dobijanja pH od 5,6. Konačna zapremina je podešena vodom za injekcije na 4 litre. Suspendovani polisaharid je mešan u sterilnoj posudi 72 sata dok se nije dobila gel suspenzija. Nerastvorene čestice su uklonjene filtracijom kroz metalnu mrežu sa ćelijom veličine 200 μm - 300 μm. Candida albians DSM – 9456 uzgajana je na agar pločama kako je opisano u EP 0564620. Jedan poželjni medijum je bio, na primer, agar sa ekstraktom slada kompanije Oxoid. Dobijena gljivična biomasa je izdvojena i tretirana vodenim rastvorom NaOH sa koncentracijom od 3% (w/v). Alkalni tretman je izveden na 80°C tokom 6 sati. Posle obrade u alkalnim vodenim uslovima, čvrsta i tečna faza preparata su odvojene centrifugiranjem na 3500 g. Posle alkalne obrade, nastali supernatant je tretiran u kiselim vodenim uslovima, npr.50% sirćetne kiseline pri pH 4,0 tokom 2 sata na temperaturi od 4 do 8°C, nakon čega je došlo do razdvajanja čvrstog i tečnog sloja. Zatim se supernatant iz koraka razdvajanja podvrgava koraku taloženja. Precipitacija je izvedena dodavanjem etanola. Odnos jedne zapremine supernatanta prema 3 zapremine alkohola rezultirao je dobrim taloženjem antigenog materijala. Konačno, preparat ASMP je liofilizovan. Čvrsta faza je izdvojena i homogenizovana u proizvodu dobijenom prema primeru 6, ali sa sledećom razlikom u drugoj fazi: Druga faza. Za dobijanje konačnog proizvoda, 0,3 litre modifikovanog polisaharida podešeno je na zapreminu od 2,5 litara dodavanjem sterilne vode za injekcije uz mešanje. Zatim je smeši dodato 500 ml rastvora tiomersala koji sadrži 0,24 grama aktivnog sastojka. Dobijena suspenzija je podešena na zapreminu od 6 litara. Koncentracija ASMP je podešena na 100 µg po ml.

[0267] Vakcina koja se može pripremiti prema ovoj metodi može se npr. koristiti za profilaksu i lečenje alergija.

Primer 55

[0268] Izvršena je analiza na prisustvo glukana.

Opis testa

[0269] Analiza 1,3-ß-D (Cape Cod, SAD). Test je izveden kako je opisano u uputama proizvođača.S adržaj glukana u uzorcima antigena određen je korišćenjem CE Fungitell® testa za serum. Ukratko, test je kolorimetrijski test zasnovan na proteazi zimogena i koristi se modifikacijom puta limulus amebocitnog lizata (LAL). Fungitelov reagens je modifikovan da eliminiše faktor C i, prema tome, da reaguje samo sa 1,3-ß-D-glukanom. Nepoznati uzorci se pomešaju sa test reagensom i izračunava se srednja brzina promene optičke gustine za sve tačke tokom intervala od 40 minuta. Poredbom sa paralelno generisanom standardnom krivom, može se izračunati količina 1,3-ß-D-glukana u uzorcima.

[0270] Ispitivani rastvori antigena br. 1-13 pripremljeni su u sterilnom ddH20, a zatim su pripremljena dodatna razblaženja u LAL reagenskoj vodi bez pirogena. Na osnovu rezultata ispitivanja endotoksina, najveće razblaženje sa detektabilnim zgrušavanjem gela i jedno razblaženje iznad i ispod testirano je u Fungitell testom. Svaki uzorak je testiran u duplikatu u intervalu od 20 sekundi u ukupno 40 minuta.

Rezultati testa

[0271] Za generisanje standardne krive pripremljeni su rastvori 1,3-ß-D-glukana od 100 pg/ml, 50 pg/ml, 25 pg/ml, 12,5 pg/ml i 6,25 pg/ml prema preporukama proizvođača (Sl.1). Izmerena kriva bila je linearna u celom opsegu i zadovoljava kriterijume prihvatanja kontrole kvaliteta (R<2>> 0,980). Standardna kriva prikazana je na Slici 1.

Tabela 1. Na osnovu prethodno prikazane krive u analiziranim uzorcima ispitivanih rastvora otkriveni su sledeći sadržaji 1,3-ß-D-glukana:

Primer 56

[0272] Izvršena je analiza na prisustvo endotoksina.

[0273] Sadržaj endotoksina u uzorcima antigena određen je metodom gel-ugrušak prema EP 2.6.14.

[0274] Ispitivani rastvori antigena br. 1-7 pripremljeni su u sterilnom H20, a zatim su pripremljena razblaženja od 1:10 do 1:10.000.000 u LAL reagenskoj vodi bez pirogena. Razblaženja su testirana u duplikatima i izračunata je koncentracija endotoksina korišćenjem sledeće formule:

Koncentracija endotoksina = 0,06 lU/ml x faktor razblaženja sa najmanje jednom formacijom gel-ugruška

Polukvantitativni test ima LAL osetljivost od 0,06 lU/ml. Rezultati prikazani u tabeli 4

Rezultati testa

[0275]

Tabela 2

Primer 57

[0276] Izvršena je analiza antimikrobne aktivnosti.

Opis testa

[0277] Antimikrobna aktivnost jedinjenja je analizirana testom za ispitivanje očuvanosti antimikrobne aktivnosti prema sledećem postupku. Za brojanje održivih mikroorganizama u inokulisanim proizvodima korišćen je agar medijum koji je korišćen za inicijalno uzgajanje odgovarajućih mikroorganizama. Svaka posuda iz serije posuda sa proizvodom koji se ispituje inokulisana je sa suspenzijom jednog od ispitivanih organizama da bi se dobio inokulum od 10<5>do 10<6>mikroorganizama po mililitru ili po gramu preparata. Zapremina suspenzije inokuluma nije prelazila 1% zapremine proizvoda. Da bi se osigurala homogena raspodela, temeljno je promešan. Inokulisani proizvod se održava na 20-25°C, zaštićen od svetlosti. Iz svake posude je uzet odgovarajući uzorak, obično 1 mL ili 1 g, u nula sati i u odgovarajućim je intervalima, u zavisnosti od vrste proizvoda, utvrđen broj održivih mikroorganizama brojanjem na ploči ili membranskom filtracijom (2.6.12). Obezbeđeno je da se bilo kakva rezidualna antimikrobna aktivnost proizvoda eliminiše razblaživanjem, filtracijom ili upotrebom određenog inaktivatora. Kada su korišćeni postupci razblaživanja, uzeta je u obzir smanjena osetljivost u prikupljanju malog broja održivih mikroorganizama. Kada je korišćen specifični inaktivator, sposobnost sistema da podrži rast test organizama potvrđena je upotrebom odgovarajućih kontrola. Postupak je validiran kako bi se potvrdila njegova sposobnost da pokaže potrebno smanjenje broja održivih mikroorganizama.

[0278] Ukratko, 4 x 10 ml ispitivanog rastvora (pripremljenog sa ddH20) inokulisano je sa po 0,1 ml (1% w/v) test-mikroorganizama Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Candida albicans i Aspergillus brasiliensis. Izvučeni su uzorci 6 hpi (sati nakon inokulacije), 24 hpi, 7 dpi (dani nakon inokulacije) i 14 dpi i određen je broj održivih mikroorganizama postavljanjem serije razblaženja na agar ploče. Uklanjanje pretpostavljene rezidualne antimikrobne aktivnosti ispitivanih jedinjenja razblaživanjem je dokazano pre izvođenja testa.

Tabela 3

Primer 58

[0279] Lečene su krave sa latentnim (subkliničkim) mastitisom. Dijagnoza je postavljena uobičajenim postupkom sa 2% rastvorom mastidina. Životinje su podeljene u 13 grupa sa po 6 životinja u svakoj grupi. Sve grupe krava lečene su sa 10 ml preparata intracisternalno dva puta sa intervalom od 24 sata. Sve životinje su ponovo testirane sa 2% rastvorom mastidina standardnim postupkom 7. i 14. dana.

[0280] Rezultati su prikazani u Tabeli 4.

Primer 59

[0281] Lečene su krave sa latentnim (subkliničkim) mastitisom. Dijagnoza je postavljena uobičajenim postupkom sa 2% rastvorom mastidina. Životinje su podeljene u 14 grupa sa po 10 životinja u svakoj grupi. Sve grupe krava lečene su sa 10 ml preparata intracisternalno tri puta sa intervalom od 24 sata. Sve životinje su ponovo testirane sa 2% rastvorom mastidina standardnim postupkom 5. dana.

[0282] Rezultati su prikazani u Tabeli 5.

Primer 60

[0283] Lečene su krave sa latentnim (subkliničkim), kliničkim mastitisom i gnojno-kataralnim endometritisom. Dijagnoza je postavljena uobičajenim postupkom sa 5% rastvorom dimastina za mastitis i prema kliničkim simptomima za endometritis. Svim kravama je dato po 10 ml preparata proizvedenog prema primeru 13 intracisternalno ili intrauterino dva ili tri puta sa intervalom od 24 sata. Sve životinje su ponovo testirane sa 5% rastvorom dimastina standardnim postupkom i klinički pregledane 7. dana.

[0284] Rezultati su prikazani u Tabeli 6.

Primer 61

[0285] Lečene su krave sa latentnim (subkliničkim) mastitisom. Dijagnoza je postavljena uobičajenim postupkom sa 5% rastvorom dimastina za mastitis i prema kliničkim simptomima za endometritis. Svim kravama je dato po 10 ml preparata proizvedenog prema primeru 26 intracisternalno ili intrauterino dva ili tri puta u intervalu od 24 sata. Sve životinje su ponovo testirane sa 5% rastvorom dimastina standardnim postupkom i klinički pregledane 7. dana.

[0286] Rezultati su prikazani u Tabeli 7.

[0287] Prema tome, dobijeni imunobiološki preparat omogućava lečenje mastitisa krava i može se široko koristiti u suzbijanju ove rasprostranjene bolesti.

Primer 62

[0288] Lečene su krave sa latentnim (subkliničkim) mastitisom. Dijagnoza je postavljena uobičajenim postupkom sa 5% rastvorom dimastina za mastitis i prema kliničkim simptomima za endometritis. Svim kravama je dato po 10 ml preparata proizvedenog prema primeru 26 intracisternalno ili intrauterino dva ili tri puta u intervalu od 24 sata. Sve životinje su ponovo testirane sa 5% rastvorom dimastina standardnim postupkom i klinički pregledane 7. dana.59% životinja se oporavilo nakon tretmana.

[0289] Rezultati su prikazani u Tabeli 8.

Primer 63

[0290] Krave sa kliničkim dokazima hramanja, lezijama u interdigitalnom prostoru, koje su tipične za DD, ID i IP, lečene su raznim lekovima. Terapijska primena vakcine: 3 puta sa razmakom od 7 dana sa dozom od 5 ml. Vakcina je pripremljena prema primerima 45, 40 i 6.

[0291] Klinička manifestacija bolesti:

Oporavak, ili siva, bez bolova

+ zarastanje, < 2 cm, žuta, lagani bol

++ lezije > 2 cm, žuta, umereni bol

+++ akutna bolest > 2 cm, crvena, značajan bol

[0292] Rezultati su prikazani u Tabeli 9.

Nije primećena uobičajena i lokalna reakcija nakon primene. Efikasnost vakcinacije bila je oko 100%.

Primer 64

[0293] Krave sa kliničkim dokazima hramanja, lezijama u interdigitalnom prostoru, koje su tipične za DD, ID i IP, lečene su raznim lekovima. Terapijska primena vakcine: 3 puta sa razmakom od 10 dana, vakcina pripremljena prema primeru 45.

[0294] Klinička manifestacija bolesti:

Oporavak, ili siva, bez bolova

+ zarastanje, < 2 cm, žuta, lagani bol

++ lezije > 2 cm, žuta, umereni bol

+++ akutna bolest > 2 cm, crvena, značajan bol

[0295] Rezultati su prikazani u Tabeli 10.

Nije primećena uobičajena i lokalna reakcija nakon primene. Efikasnost vakcinacije je bila oko 80 - 100% nakon primene vakcine u dozi od 5 ml.

Primer 65

[0296] Krave sa kliničkim dokazima hramanja, lezijama u interdigitalnom prostoru, koje su tipične za DD, ID i IP, lečene su raznim lekovima. Terapijska primena vakcine: 3 puta sa razmakom od 10 dana, vakcina pripremljena prema primeru 45.

[0297] Klinička manifestacija bolesti:

Oporavak, ili siva, bez bolova

+ zarastanje, < 2 cm, žuta, lagani bol

++ lezije > 2 cm, žuta, umereni bol

+++ akutna bolest > 2 cm, crvena, značajan bol

[0298] Rezultati su prikazani u Tabeli 11.

Nije primećena uobičajena i lokalna reakcija nakon primene. Efikasnost vakcinacije je bila oko 60 - 63% nakon primene vakcine u dozi od 5 ml.

Primer 66

[0299] Krave sa kliničkim dokazima hramanja, lezijama u interdigitalnom prostoru, koje su tipične za DD, ID i IP, lečene su raznim lekovima. Terapijska primena vakcine: 3 puta sa razmakom od 7 dana u dozi od 5 ml. Vakcina je pripremljena prema primerima 38, 39, 40 i 44.

[0300] Klinička manifestacija bolesti:

Oporavak, ili siva, bez bolova

+ zarastanje, < 2 cm, žuta, lagani bol

++ lezije > 2 cm, žuta, umereni bol

+++ akutna bolest > 2 cm, crvena, značajan bol

[0301] Rezultati su prikazani u Tabeli 12.

Nije primećena uobičajena i lokalna reakcija nakon primene. Efikasnost vakcinacije bila je oko 60% do 70% u svim grupama vakcinisanih.

Primer 67

[0302] Krave sa kliničkim dokazima hramanja, lezijama u interdigitalnom prostoru, koje su tipične za DD, ID i IP, lečene su raznim lekovima. Terapijska primena vakcine: 3 puta, 0,4 ml intrakutano sa razmakom od 7 dana. Vakcina je pripremljena prema primerima 51 i 52.

[0303] Klinička manifestacija bolesti:

Oporavak, ili siva, bez bolova

+ zarastanje, < 2 cm, žuta, lagani bol

++ lezije > 2 cm, žuta, umereni bol

+++ akutna bolest > 2 cm, crvena, značajan bol

[0304] Rezultati su prikazani u Tabeli 13.

Nije primećena uobičajena i lokalna reakcija nakon primene. Efikasnost vakcinacije bila je oko 60% do 70% u svim grupama vakcinisanih.

Primer 68

[0305] Studija titracije doze. Obavljena je vakcinacija krava protiv DD, ID i IP. Profilaktička primena vakcine: 2 puta sa razmakom od 10 dana vakcine pripremljene prema primeru 6.

[0306] Ispitivane su kliničke manifestacije bolesti:

Oporavak, ili siva, bez bolova

+ zarastanje, < 2 cm, žuta, lagani bol

++ lezije > 2 cm, žuta, umereni bol

+++ akutna bolest > 2 cm, crvena, značajan bol

[0307] Rezultati su prikazani u Tabeli 14.

Nisu primećene uobičajene i lokalne reakcije nakon primene vakcine. U ovom trenutku efikasnost vakcinacije sa dozama od 1 ml i 2,5 ml bila je oko 93%.45 životinja (oko 21%) iz kontrolne grupe imalo je kliničke simptome DD, ID i IP.

[0308] Rezultati su prikazani u Tabeli 15.

U ovom trenutku efikasnost vakcinacije sa dozama od 1 ml i 2,5 ml bila je oko 87% - 89%.59 životinja (oko 27%) iz kontrolne grupe imalo je kliničke simptome DD, ID i IP.

[0309] Rezultati su prikazani u Tabeli 16.

U ovom trenutku efikasnost vakcinacije sa dozama od 1 ml i 2,5 ml bila je oko 53%. 154 životinje (oko 72%) iz kontrolne grupe imalo je kliničke simptome DD, ID i IP.

[0310] Ovo ispitivanje pokazuje profilaktičku vakcinaciju životinja sa dozom od 1,0 ml. Trajanje imuniteta je bilo oko 5,5 meseci.

Primer 69

[0311] Obavljena je vakcinacija krava protiv DD, ID i IP. Profilaktička primena vakcine: 3 puta intrakutano sa dozom od 0,4 ml u razmaku od 10 dana, vakcina pripremljena prema primeru 51.

Rezime ispitivanja:

Životinje iz grupe 1 su vakcinisane

[0312]

Posmatranje pre vakcinacije

Broj životinja / kliničke manifestacije DD, ID i IP 200/100

Za 160 do 175 dana nakon poslednje vakcinacije

Broj životinja / broj udova zahvaćenih hramanjem 200/20

Broj zdravih životinja 180 Efikasnost vakcinacije 90%

Životinje iz grupe 2 nisu vakcinisane (kontrola)

[0313]

Posmatranje pre vakcinacije

Broj životinja / kliničke manifestacije DD, ID i IP 200/100

Za 160 do 175 dana nakon poslednje primene placeba broj životinja / broj životinja sa manifestacijama od

Klinički simptomi DD, ID i IP 200/132

Količina zdravih životinja 68

Broj obolelih životinja tokom vremena posmatranja 66%

[0314] Sve životinje sa kliničkim simptomom bolesti lečene su lokalnom primenom aseptičnog leka ili antibiotika. U slučaju IP korišćene su intramuskularne injekcije antibiotika.

Primer 70

[0315] Obavljena je vakcinacija krava protiv DD, ID i IP. Profilaktička primena vakcine: 3 puta intrakutano sa dozom od 0,4 ml sa razmakom od 10 dana, vakcina pripremljena prema primeru 52.

Rezime ispitivanja:

Životinje iz grupe 1 su vakcinisane

[0316]

Posmatranje pre vakcinacije

Količina životinja/kliničke manifestacije DD, ID i IP 150/80

Za 160 do 190 dana nakon poslednje vakcinacije

Količina životinja/količina udova sa hromošću 150/15

Količina zdravih životinja 135

Efikasnost vakcinacije 90%

Životinje iz grupe 2 nisu vakcinisane (kontrola)

[0317]

Posmatranje pre vakcinacije

Količina životinja/kliničke manifestacije DD, ID i IP 150/70

Za 160 do 175 dana nakon poslednje primene placeba

broj životinja / broj životinja sa manifestacijama od

Klinički simptomi DD, ID i IP 150/118

Broj zdravih životinja 32

Količina obolelih životinja tokom vremena posmatranja 78,7 %

Sve životinje sa kliničkim simptomom bolesti lečene su lokalnom primenom aseptičnog leka ili antibiotika. U slučaju IP korišćene su intramuskularne injekcije antibiotika.

Primer 71

[0318] Efikasnost vakcinacije nakon izlaganja uzročnicima Trichophyton i Microsporum kod zamorčića (ovaj metod je opisan u WO 98/15284).

[0319] Izlaganje mikrokonidijama uzročnika Trichophyton mentagrophytes i Microsporum canis sastojalo se od primene 100-200 hiljada mikrokonidija po cm<2>(300-600 hiljada mikrokonidija) lokalno na svaku životinju. Izlaganje uzročniku Trichophyton verrucosum sastojalo se od primene 500 hiljada mikrokonidija po cm<2>(1,5 miliona mikrokonidija) lokalno na svaku životinju. Jedna doza od 1,0 ml vakcine primenjena je intramuskularnom injekcijom istog dana kada je životinja izložena, a druga doza nakon 7 dana. Posmatranje je nastavljeno 4 nedelje nakon početnog injektiranja vakcine. Testirane su vakcine pripremljene prema primerima 38, 39, 46, 47, 48, 49, 50 (vidi Tabele 17-30).

[0320] Jedna doza od 1,0 ml vakcine primenjena je intramuskularnom injekcijom istog dana kada je životinja izložena, a druga doza nakon 7 dana. Posmatranje je nastavljeno 4 nedelje nakon početnog injektiranja vakcine.

Suspenzija ćelija soja za izlaganje

[0321] Za infekciju životinja su kao gljivični patogeni korišćeni Trichophyton verrucosum (Tv) Trichophyton mentagrophytes (Tm) i Microsporum canis (Mc). Podaci o ovim sojevima su prikazani u nastavku:

Procena gljivične infekcije

[0322] 7, 15, 22, 29. i 36. dana studije, životinje su pregledane i klinički simptomi su procenjeni na osnovu sledećeg sistema bodovanja:

0 = bez simptoma

1 = hiperemija kože na području gljivične infekcije

2 = pojedinačna mesta perutanja

3 = perutanje kože na području gljivične infekcije

4 = tanke male kraste na području gljivične infekcije

5 = kraste nalik kori na području gljivične infekcije

ŠEMA LEČENJA 1

ŠEMA LEČENJA 2

ŠEMA LEČENJA 3

Tabela 17. Klinički simptomi bolesti uzrokovane uzročnikom Trichophyton verrucosum kod zamorčića

Težina kliničkih simptoma infekcije uzročnikom Trichophyton verrucosum kod izloženih zamorčića prikazana je nakon različitih perioda posmatranja. U poređenju sa vakcinisanim životinjama, nevakcinisane kontrolne životinje imale su teže kliničke simptome 29. i 36. dana.

Tabela 18. Broj zamorčića sa kliničkim simptomima bolesti uzrokovane uzročnikom

U poređenju sa kontrolnom grupom, manje vakcinisane životinje imale su kliničke simptome 29. i 36. dana.

Tabela 19. Klinički simptomi bolesti uzrokovane uzročnikom Trichophyton mentagrophytes kod zamorčića

Težina kliničkih simptoma infekcije uzročnikom Trichophyton mentagrophytes kod izloženih zamorčića prikazana je nakon različitih perioda posmatranja. U poređenju sa vakcinisanim životinjama, nevakcinisane kontrolne životinje imale su teže kliničke simptome 29. i 36. dana.

Tabela 20. Broj zamorčića sa kliničkim simptomima bolesti uzrokovane uzročnikom Trichophyton mentagrophytes

U poređenju sa kontrolnom grupom, manje vakcinisane životinje imale su kliničke simptome 29. i 36. dana.

Tabela 21. Klinički simptomi bolesti uzrokovane uzročnikom Microsporum canis kod zamorčića

Težina kliničkih simptoma infekcije uzročnikom Microsporum canis kod izloženih zamorčića prikazana je nakon različitih perioda posmatranja. U poređenju sa vakcinisanim životinjama, nevakcinisane kontrolne životinje imale su teže kliničke simptome 36. dana.

Tabela 22. Broj zamorčića sa kliničkim simptomima bolesti uzrokovane uzročnikom

U poređenju sa kontrolnom grupom, manje vakcinisane životinje imale su kliničke simptome 36. dana.

Tabela 23. Klinički simptomi bolesti uzrokovane uzročnikom Microsporum canis kod zamorčića

Težina kliničkih simptoma infekcije uzročnikom Microsporum canis kod izloženih zamorčića prikazana je nakon različitih perioda posmatranja. U poređenju sa vakcinisanim životinjama, nevakcinisane kontrolne životinje imale su teže kliničke simptome 29. i 36. dana.

Tabela 24. Broj zamorčića sa kliničkim simptomima bolesti uzrokovane uzročnikom

U poređenju sa kontrolnom grupom, manje vakcinisane životinje imale su kliničke simptome 29. i 36. dana.

Tabela 25. Klinički simptomi bolesti uzrokovane uzročnikom Trichophyton verrucosum kod zamorčića

Težina kliničkih simptoma infekcije uzročnikom Trichophyton verrucosum kod izloženih zamorčića prikazana je nakon različitih perioda posmatranja. U poređenju sa vakcinisanim životinjama, nevakcinisane kontrolne životinje imale su teže kliničke simptome 29. i 36. dana.

Tabela 26. Broj zamorčića sa kliničkim simptomima bolesti uzrokovane uzročnikom

U poređenju sa kontrolnom grupom, manje vakcinisane životinje imale su kliničke simptome 29. i 36. dana.

Tabela 27. Klinički simptomi bolesti uzrokovane uzročnikom Trichophyton mentagrophytes kod zamorčića

Težina kliničkih simptoma infekcije uzročnikom Trichophyton mentagrophytes kod izloženih zamorčića prikazana je nakon različitih perioda posmatranja. U poređenju sa vakcinisanim životinjama, nevakcinisane kontrolne životinje imale su teže kliničke simptome 29. i 36. dana.

Tabela 28. Broj zamorčića sa kliničkim simptomima bolesti uzrokovane uzročnikom

U poređenju sa kontrolnom grupom, manje vakcinisane životinje imale su kliničke simptome 29. i 36. dana.

Tabela 29. Klinički simptomi bolesti uzrokovane uzročnikom Microsporum canis kod zamorčića

Težina kliničkih simptoma infekcije uzročnikom Microsporum canis kod izloženih zamorčića prikazana je nakon različitih perioda posmatranja. U poređenju sa vakcinisanim životinjama, nevakcinisane kontrolne životinje imale su teže kliničke simptome 29. i 36. dana.

Tabela 30. Broj zamorčića sa kliničkim simptomima bolesti uzrokovane uzročnikom

U poređenju sa kontrolnom grupom, manje vakcinisane životinje imale su kliničke simptome 29. i 36. dana.

Primer 72

Efikasnost lečenja alergijskih bolesti

[0323]

Tabela 31. Dinamika intenziteta kliničkih simptoma alergijskog bronhitisa kod konja nakon primene vakcine pripremljene prema primeru 41 (eksperimentalna grupa) i bez vakcinacije (kontrolna grupa). Vakcina je injektirana intramuskularno 3 puta sa razmakom od 4 dana i dozom od 1,0 ml.

[0324] Dinamika intenziteta kliničkih simptoma alergijskog bronhitisa kod konja prikazana je na slici 2.

Tabela 32. Dinamika intenziteta kliničkih simptoma hronične opstruktivne bolesti pluća kod konja nakon primene vakcine pripremljene prema primeru 41 (eksperimentalna grupa) i bez vakcinacije (kontrolna grupa). Vakcina je injektirana intramuskularno 3 puta sa razmakom od 4 dana u dozi od 1,0 ml. Rezultati su takođe prikazani na Slici 3.

Tabela 33. Dinamika kliničkih znakova kožnih bolesti kod pasa imunizovanih vakcinom prema primeru 42 u dozama od 0,5 ml i 1,0 ml (prikazan je srednji skor kliničkih simptoma u svakoj grupi; n=10). Vakcina je injektirana intramuskularno 3 puta sa razmakom od 7 dana i dozom od 1,0 ml. Dinamika je takođe prikazana na Slici 4.

Tabela 34. Dinamika kliničkih znakova kožnih bolesti kod pasa imunizovanih vakcinom prema primeru 50 intramuskularno u dozama od 0,5 ml (prikazan je srednji skor kliničkih simptoma u svakoj grupi; među vakcinisanima n=15 i u kontrolnoj grupi n=15). Vakcina je injektirana 3 puta sa razmakom od 3 do 4 dana. Rezultati su prikazani na Slici 5.

Tabela 35. Test oticanja uha kod miševa.

Tabela 36. Antialergijska aktivnost vakcine pripremljene prema primeru 41.

L

P

H

[0325] Eritem uha utvrđen je vizuelnim pregledom i otkrivanjem prisustva (+) ili odsustva (-) znakova.

[0326] Debljina kontrolnog i eksperimentalnog uha kod svih životinja izmerena je mikrometrom. Merenja učinka sumirana su (Σ) odvojeno u grupama za desno i za levo uho. Procenat oticanja uha i aktivnost serije izračunate su pomoću sledećih formula:

1. % Oticanja uha ∑ Debljina uha nakon provokacije alergenom

(kontrolna = ∑ Debljina uha nakon provokacije × 100

grupa) rastvaračem

∑ Debljina uha nakon provokacije alergenom

2. % Oticanja uha

= ∑ Debljina uha nakon provokacije × 100

(vakcinisani)

rastvaračem

3. Aktivnost vakcine % = % Oticanja uha u kontrolnoj grupi - % Oticanja uha kod vakcinisanih

[0327] U svim fazama eksperimenta primećena je pozitivna dinamika smanjenja inflamatornog odgovora nakon vakcinacije i upotrebe prednizolon-21-acetila nakon provokacije kod miševa. Najizraženija inhibicija reakcije inflamacije bila je 24 sata nakon provokacije. Treba napomenuti da su sve kontrolne životinje reagovale eritemom sa injekcijom sudova (hiperemijom) na desnom uhu (mesto provokacije alergenom). Kod vakcinisanih životinja alergijska reakcija neposrednog tipa nije bila izražena. Intenzivni eritem na uhu nakon primene alergena nije primećen. Intenzitet edema uha bio je značajno veći kod kontrolnih životinja nego kod vakcinisanih miševa i veći od praga od 10%. Takođe, treba napomenuti da je inhibicija provokacija bila jača kod vakcinisanih životinja nego kod onih lečenih prednizolon-21-acetatom. Udeo životinja koje nisu reagovale u kontrolnim i testnim grupama kretao se od 56 do 80%, što je metodom dozvoljeno.

Tabela 37. Test oticanja uha kod miševa.

Tabela 38. Antialergijska aktivnost vakcine pripremljene prema Primeru 41.

[0328] Treba napomenuti da su uprkos maloj razlici u debljini uha između kontrolnih miševa i miševa vakcinisanih dozom od 0,1 ml i 0,5 ml, 2 sata nakon izloženosti sve kontrolne životinje pokazale eritem sa injekcijom sudova (hiperemijom) na desnom uhu (provokacija alergenom). Kod vakcinisanih životinja alergijska reakcija neposrednog tipa nije bila izražena.

Alergijska reakcija nakon 24 i 48 sati primećena je kao rezultat provokacije u kontrolnih i vakcinisanih dozom od 0,1 ml razblažene vakcine i dozom od 1,0 ml nerazblažene vakcine. Reakcija nakon provokacije alergijske reakcije kod miševa vakcinisanih sa dozom od 0,1 ml i 0,5 ml bila je odsutna ili slabo izražena. Intenzitet edema uha bio je značajno veći kod kontrolnih životinja i kod grupa vakcinisanih razblaženom vakcinom i vakcinom u dozi od 1,0 ml, nego kod ostalih vakcinisanih subjekata. Količina životinja koja nije reagovala u kontrolnim i test grupama kretala se od 65 do 81%, što je metodom dozvoljeno.

Tabela 39. Dinamika kliničkih znakova kožnih bolesti kod pasa imunizovanih intramuskularno vakcinom prema primerima 41 i 43 u dozi od 0,5 ml (prikazan je srednji skor kliničkih simptoma u svakoj grupi; n=10). Vakcina je ubrizgana 3 puta sa razmakom od 7 dana.

Tabela 40. Dinamika kliničkih znakova rinitisa kod mačaka lečenih vakcinom pripremljenom prema primeru 42. Životinje su lečene ukapavanjem vakcine u nos tokom pet dana u dozi od 1-2 kapi u svaki nazalni prolaz 1-2 puta dnevno; ostale životinje iz kontrolne grupe su tretirane na isti način, ali fiziološkim rastvorom natrijum hlorida (placebo). Životinje su pregledane uz opis kliničkih manifestacija bolesti pre lečenja i 5., 10., 20. i 30. dana nakon prve primene. U slučaju pogoršanja alergijskog rinitisa, urađena je druga kura lečenja tokom pet dana. Rezultati su prikazani na Slici 7.

Tabela 41. Dinamika kliničkih znakova rinitisa kod pasa tretiranih vakcinom pripremljenom prema primeru 43. Životinje su lečene ukapavanjem vakcine u nos tokom pet dana u dozi od 1-2 kapi u svaki nazalni prolaz 1-2 puta dnevno; ostale životinje iz kontrolne grupe su tretirane na isti način, ali fiziološkim rastvorom natrijum hlorida (placebo). Životinje su pregledane uz opis kliničkih manifestacija bolesti pre lečenja i 5, 10, 20. i 30. dana nakon prve primene. U slučaju pogoršanja alergijskog rinitisa, urađena je druga kura lečenja tokom pet dana. Rezultati su prikazani na Slici 8.

Tabela 42. Dinamika kliničkih znakova konjunktivitisa kod mačaka lečenih vakcinom pripremljenom prema primeru 54. Deset mačaka lečeno je ukapavanjem vakcine tri do pet dana u dozi od 1-2 kapi u svako oko 2-3 puta dnevno. U odsustvu kliničkih znakova lečenje je prekinuto. Preostalih 5 životinja tretirano je fiziološkim rastvorom natrijum hlorida (placebo) kao i eksperimentalne životinje u eksperimentalnoj grupi. Životinje su pregledane uz opis kliničkih manifestacija bolesti pre lečenja i svakog dana tokom lečenja. Zatim su životinje pregledane 10. dana. Rezultati su prikazani na Slici 9.

Primer 73. Efikasnost lečenja običnih bradavica

[0329]

1. slučaj Efikasnost vakcine pripremljene kako je opisano u primeru 38 prikazana je vakcinacijom 16-godišnje devojčice sa običnim bradavicama (Verucae vulgares i paronihijalne bradavice). Vakcina je primenjena pet puta u razmaku od 24 sata lokalno flasterom i kapima pod zahvaćeni nokat, što je rezultiralo značajnim smanjenjem količine bradavica nakon poslednje primene i bradavice su nestale oko dve nedelje nakon poslednjeg tretmana. Nisu primećena ozbiljna neželjena dejstva.

2. slučaj Efikasnost vakcine pripremljene kako je opisano u primeru 39 prikazana je vakcinacijom 12-godišnje devojčice sa običnim bradavicama (Verucae vulgares). Vakcina je primenjena 7 puta u razmaku od 24 sata lokalno flasterom, što je rezultiralo značajnim smanjenjem količine bradavica nakon poslednje primene i bradavice su nestale oko dve nedelje nakon poslednjeg tretmana. Nisu primećena ozbiljna neželjena dejstva.

3. slučaj Efikasnost vakcine pripremljene kako je opisano u primeru 40 prikazana je vakcinacijom 6-godišnjeg dečaka sa običnim bradavicama (Verucae vulgares). Vakcina je primenjena 6 puta u razmaku od 24 sata lokalno flasterom, što je rezultiralo značajnim smanjenjem količine bradavica nakon poslednje primene i bradavice su nestale oko dve nedelje nakon poslednjeg tretmana. Nisu primećena ozbiljna neželjena dejstva.

Primer 74. Hidrokoloidi

[0330] Hemijska nomenklatura: hitozan-valerijanska kiselina-hidrokoloid

Podnaslov: poliamino šećer-valerijanska kiselina-hidrokompleks

Strukturna formula:

Hemijska formula: (C6H11NO4)x(C8H13NO5)y(C5H10O2)z(HCl)z(H2O)mOpšta svojstva

[0331]

Molekulska masa: x*(161)+y*(203)+z*(102)+z*(36,5)+m*(18)

[0332] Izgled: prirodna bela do žućkasta viskozna tečnost tipičnog mirisa Rastvorljivost: rastvorljivo u: Voda

Miris: tipičan, sličan valerijanskoj kiselini

Gustina: 1,002

pH vrednost: 5,5

Skladištenje: Čuvati zaštićeno od svetlosti; čuvati u posudi zaštićenoj od vazduha u frižideru na 4° - 8°C

Stabilnost: 36 meseci u prethodno opisanim uslovima

[0333] Hemijska nomenklatura: hitozan-4-aminobenzojeva kiselina-hidrokoloid Podnaslov: poliamino šećer-aminobenzojeva kiselina-hidrokompleks

Strukturna formula:

Hemijska formula: (C6H11NO4)x(C8H13NO5)y(C7H7NO2)z(H2O)m

Opšta svojstva

[0334]

Molekulska masa: x*(161)+y*(203)+z*(102)+z*(137,14)+m*(18)

Izgled: Viskozna tečnost žućkaste do žute boje

[0335] Hemijska nomenklatura: hitozan-glukuronska kiselina-hidrokoloid

Podnaslov: poliamino šećer-glukuronska kiselina-hidrokompleks

Strukturna formula:

Hemijska formula: (C6H11NO4)x(C8H13NO5)y(C6H10O7)z(H2O)m

Opšta svojstva

[0336]

Molekulska masa: x*(161)+y*(203)+z*(102)+z*(194.14)+m*(18)

Izgled: Viskozna tečnost žućkaste do žute boje

Primer 75. Proizvodnja hitozan-valerijanska kiselina-hidrokoloida

[0337] Prečišćavanje hitozana 80/100 i 80/200, AS-br: 9012-76-4,

Amino-N-acetil-D-glukozamin se steriliše u posebnom sudu i sprovodi se da bi se dobio Hitozan farmaceutskog kvaliteta.

Rastvor reagensa

[0338] Sterilni amino-N-acetil-D-glukozamin se resuspenduje uz mešanje tokom 15 minuta u ovoj sterilnoj vodi. U suspenziju se uz mešanje (24 h) dodaje 400 ml sirćetne kiseline dok se ne dobije bistri rastvor.

Korak prečišćavanja

[0339] Ovom rastvoru dodaje se kap po kap rastvor 4N natrijum hidroksida (pažljivo) da bi se dobio pH 8,0 do 8,5. Dobijeni rastvor se taloži u belu masu. Dobijena suspenzija se meša najmanje 30 minuta. Ostatak se odvoji od tečne faze filtracijom.

Resuspenzija

[0340] Talog se resuspenduje u jednakoj količini prečišćene (sterilne) vode (voda za injekcije (Evropska farmakopeja)) (40 l, početna količina). Izmeri se 80 ml pentanoil hlorida. Suspenziji se, uz mešanje, dodaje kap po kap pentanoil hlorida. Dobijena suspenzija se meša dok se rastvor ne razbistri. Dodaje se 1,6 g tiomersala (40 μg/ml). Bistri rastvor je aktivni sastojak (hidrokoloid). Dobijeni polisaharidni koloid (CVHC) čuva se na temperaturi od 4 °C do 8 °C. Za finalni proizvod se radi vodeni rastvor sa definisanom biološkom aktivnošću.

[0341] Pregled reakcionih koraka proizvodnje

1.Hitozan voda�suspenzija

suspenzija HAc (24 h)� hitozan-HAc-rastvor

2.Korak prečišćavanja

2,1. Hitozan-HAc-rastvor 4N NaOH�(pH 8-8,5)Hitozan NaAc H2O

2,2. Hitozan NaAc+ H2O�H2O NaAc

�Hitozan (čvrsti, prečišćen)

3.Proizvodnja

hitozan (čvrsti) H2O pentanoil hlorid�

hitozan valerijanska kiselina H2O HCl �CVHC (hitozan-valerijanska kiselinahidrokoloid)

[0342] Proizvodnja je kombinacija koraka prečišćavanja osnovnog materijala hitozana i reakcije sa drugim reagensom, pentanoil hloridom.

Prvi kritični korak je taloženje hitozana da bi se dobila ukupna količina prečišćenog hitozana farmaceutskog kvaliteta.

Kontrola procesa: Vreme reakcije i pH vrednost se prate kako bi se dobilo kvantitativno taloženje.

[0343] Ispitivanje farmaceutskog kvaliteta hitozana:

Ispitivanje kvaliteta intermedijera (farmaceutski kvalitet hitozana)

[0344] Rastvorljivost u vodi: Uzorak od oko 250 mg taloga hitozana resuspenduje se u 1 ml prečišćene vode

Cilj: Ne može se dobiti rastvorljivost

Kvalitet: se ispunjava ako se ne može utvrditi smanjenje količine čvrstog materijala.

[0345] Rastvorljivost u jačim kiselinama: Paralelno se ista količina taloga suspenduje u 1 ml HCl (3N)

Cilj: Totalni rastvor

Kvalitet: se ispunjava ako se može utvrditi rastvor ukupne količine čvrstog materijala.

[0346] Drugi kritični korak je postupak rastvaranja aktivnog sastojka. Kontrola se vrši vizuelno: Treba da se rastvori ukupna količina taloga.

Primer 76. Ispitivanje jedinjenja pomoću UV-VIS spektroskopije

[0347] Korišćena je metoda ispitivanja prema EVROPSKOJ FARMAKOPEJI 2.2.25.

Aparat: Spektrofotometar Jasco 7800

Uslovi merenja: Širina trake 2 nm

Raspon 200 - 600 nm

Blanko korekcija sa rastvaračem

Temperatura: 25 °C

UV-ćelija: 12,5 x 45 mm polu-mikro, 10 mm dužina puta silicijum dioksida UV-kvaliteta

Rastvarač: H2O

[0348] Ispitni rastvor: U odgovarajućem rastvoru, rastvoren je odgovarajući uzorak hitozana-HCl, hitozana-HAc, hitozana, hitozan-valerijanska kiselina-hidrokoloida odnosno valerijanske kiseline. Ova smeša je mućkana i zatim sonifikovana u ultrazvučnoj kupki tokom 5 minuta.

[0349] Maksimum apsorpcije u skladu sa opštim osnovama spektroskopije i hemijske strukture sa određenim hromofornim grupama i supstituentima može se očekivati pri: 200 nm za hitozan-HCl, hitozan-HAc, hitozan-valerijanska kiselina-hidrokoloid odnosno valerijansku kiselinu

[0350] Maksimum apsorpcije hitozana nije mogao da se analizira, jer je hitozan čvrsta, u vodi nerastvorljiva supstanca, koja se takođe ne može rastvoriti u tipičnim organskim rastvaračima.

[0351] Poređenje svih spektara ne pokazuje značaj ili strukturne modifikacije poput aromatičnih veza itd. Na osnovu izmerenih spektara i literaturnih podataka o sirovinama, izmereni spektar odgovara očekivanim spektrima. Dakle, prethodno izmereni podaci potvrđuju identitet potencijalne strukture.

Primer 77. IR apsorpciona spektrofotometrija

[0352] Korišćena metoda ispitivanja je prema EUROPEAN PHARMACOPOEIA 2.2.24. Za identifikaciju aktivnog principa hitozan-valerijanska kiselina-hidrokoloida niz IR spektara različitih derivata hitozana upoređen je sa spektrom proizvoda i valerijanske kiseline.

1. Metod i parametri

[0353] Aparat: infracrveni spektrometar FT/IR 410 Jasco

Raspon: 4000 cm<-1>do 600 cm<-1>

Ispitivani uzorak: Smeša od 4,8 mg hitozana ili smeša od 4 mg hitozan-HCl ili smeša od 3,8 mg hitozan acetata i 100 mg KBr pažljivo se melje i pritiska na odgovarajući disk kalijum-bromida ili film hitozan-valerijanska kiselina-hidrokoloida ili NaCl ploča za valerijansku kiselinu Uslovi merenja:

[0354] Korekcija pozadine: stvarna

Temperatura 20 °C

[0355] Izmereni spektar direktno odgovara spektru iz literature iz baze podataka.

Rezultat: Prethodno izmereni podaci potvrđuju identitet testiranih supstanci.

2. Podaci o različitim IR spektrima

[0356]

IR signali valerijske kiseline u aktivnom principu su vrlo mali do nevidljivi.

Poređenje sa podacima iz literature: Na osnovu izmerenih spektara i literaturnih podataka o sirovinama, izmereni spektar CVHC odgovara prospektivnom spektru.

Rezultat: Prethodno navedeni izmereni podaci potvrđuju identitet predložene strukture.

Primer 78.<13>C-NMR spektroskopska analiza

[0357] Korišćena je metoda ispitivanja prema EUROPEAN PHARMACOPOEIA 2.2.33. a)<13>C-NMR spektar hitozana

1. Metod i parametri

[0358] Aparat: Bruker AMX 500 AVANCE

Uslovi merenja

[0359]

Frekvencija skeniranja: 125 MHz za Hitozan, hitozan HCl, hitozan HAc, glukozamin HCl, N-acetilglukozamin, hitozan-valerijanska kiselina-hidrokoloid, valerijansku kiselinu

Temperatura:

300 K za Hitozan, hitozan HCl, hitozan HAc, hitozan-valerijanska kiselina-hidrokoloid, valerijansku kiselinu;

301 K za glukozamin HCl i N-acetilglukozamin

Rastvarač:

D2O za Hitozan, hitozan HCl, hitozan HAc, glukozamin HCl, N-acetilglukozamin; DMSO-D6 za hitozan-valerijanska kiselina-hidrokoloid

CDCl3za valerijansku kiselinu

Koncentracija: – za Hitozan, hitozan HCl, hitozan HAc, hitozan-valerijanska kiselina hidrokoloid;

približno 15 mg/0,5 ml za glukozamin HCl, N-acetilglukozamin i valerijansku kiselinu

Kalibracija: – za Hitozan, hitozan HCl, hitozan HAc, glukozamin HCl, N-acetilglukozamin DMSO-D6 za hitozan-valerijanska kiselina-hidrokoloid

CDCl3za valerijansku kiselinu

1. Rezultati

a)<13>C-NMR analiza spektroskopije hitozana

[0360] Merenje u rastvoru: Obzirom da se ne rastvara u neutralnim rastvaračima merenje u rastvoru nije moguće.

Merenje u čvrstom stanju: Merenje u čvrstom stanju nije bilo moguće. Takođe, nakon dugih uslova merenja (vremena) nisu se pojavili prihvatljivi signali.

Rezultat: NMR identifikacija hitozana nije moguća.

b)<13>C-NMR analiza spektroskopije hitozan HCl

[0361]

[0362] Rezultat: Prethodno navedeni izmereni podaci potvrđuju identitet ispitivane supstance.

c)<13>C-NMR analiza spektroskopije hitozan HAc

[0363]

[0364] Rezultat: Prethodno navedeni izmereni podaci potvrđuju identitet ispitivane supstance. d)<13>C-NMR analiza spektroskopije glukozamin HCl

[0365]

[0366] Poređenje sa podacima iz literature: Izmereni spektar direktno odgovara spektru iz literature iz baze podataka.

[0367] Rezultat: Prethodno navedeni izmereni podaci potvrđuju identitet ispitivane supstance. e)<13>C-NMR analiza spektroskopije N-acetilglukozamina

[0368]

[0369] Rezultat: Prethodno navedeni izmereni podaci potvrđuju identitet ispitivane supstance. f)<13>C-NMR analiza spektroskopije hitozan-valerijanska kiselina-hidrokoloida

[0370]

[0371] Rezultat: Prethodno navedeni izmereni podaci potvrđuju identitet predložene strukture.

g)<13>C-NMR analiza spektroskopije valerijanske kiseline

[0372]

[0373] Poređenje sa podacima iz literature: Izmereni spektar direktno odgovara spektru iz literature iz baze podataka.

[0374] Rezultat: Prethodno navedeni izmereni podaci potvrđuju identitet ispitivane supstance.

3. Poređenje NMR spektara

[0376] Poređenje sa podacima iz literature: Nije dostupno ili na osnovu izmerenih spektara i literaturnih podataka o sirovinama, izmereni spektar direktno odgovara očekivanim spektrima. Rezultat: Prethodno navedeni izmereni podaci potvrđuju identitet predložene strukture.

Primer 79. TLC metoda za analizu hitozana i nečistoća u novom proizvodu hitozanvalerijanska kiselina-hidrokoloid (CVHC)

[0377] Korišćena je metoda ispitivanja prema EUROPEAN PHARMACOPOEIA 2.2.27.

[0378] Ovaj deo predstavlja postupke i podatke tankoslojne hromatografije za identifikaciju CVHC-a, zajedno sa vrednostima Rf-a u korišćenim smešama rastvarača i tačkaste boje kada se detektuju pod UV svetlošću (365 nm i 254 nm), vidljivom svetlošću i sa tipičnim reagensima za vizualizaciju.

[0379] Izvorna bazna sirovina za bilo koju vrstu glukozamina je prirodni materijal hitin od insekata ili rakova. Monomerna struktura ovih biopolimera je N-acetilglukozamin.

Za farmaceutsku i drugu upotrebu u većini slučajeva tipičan je deacetilovani hitin. Ovaj nastali biopolimer je takozvani hitozan, koji se može modifikovati u jonska jedinjenja rastvorljiva u vodi. Monomerna struktura ovog hitozana bi teoretski trebalo da bude glukozamin.

Pošto korak deacetilovanja nije potpun, hitozan ima mešovitu strukturu jedinica N-acetiglukozamina (acetilovanog) i glukozamina (deacetilovanog). Hitozan-valerijanska kiselina-hidrokoloid je novi hidro-kompleks poliamino-šećera valerijanske kiseline. Zbog toga ne bi trebalo da budu mogući pozitivni rezultati analitičkih testova za N-acetilglukozamin i glukozamin. Ako su monomerni fragmenti ugrađeni kao zaostale nečistoće, trebalo bi da bude moguće identifikovati hitozan u obliku njegovih jonskih jedinjenja rastvorljivih u vodi, hitozan HCl i hitozan HAc.

1. Metoda

[0380]

Hromatografski uslovi

Mobilna faza

2. Analiza i rezultati

a) Hitozan

Priprema uzorka

Uzorak: Hitozan suspendovan u vodi

[0381]

1) Aparat: refluksni kondenzator

Uslovi: grejanje tokom oko 30 minuta uz refluks (145 °C)

2) Aparat: Ultrazvučna kupka

Uslovi: Sonifikacija tokom oko 30 minuta na 45 °C

3) Aparat: refluksni kondenzator

Uslovi: grejanje tokom oko 30 minuta uz refluks (145 °C)

4) Filtracija: Filter od 0.45 μm

Bistri filtrat je korišćen za analizu.

Detekcija pomoću UV fluorescencije i VIS-a

Detekcija pomoću reagensa za vizualizaciju

Alternativa: Solubilizacija u organskim rastvaračima pokazuje jednake rezultate zbog nerastvorljivosti hitozana.

Rezultat: Prihvatljivo otapanje hitozana u vodenastim ili organskim rastvaračima poput metanola itd. nije moguće. Odgovarajuća solubilizacija hitozana moguća je samo u jačim kiselinama poput HCl ili HAc uz proizvodnju hitozan HCl ili hitozan HAc.

b) Hitozan HCl

[0382] Za analizu je korišćeno 5 mg hitozan HCl/ml H2O.

Detekcija pomoću UV fluorescencije i VIS-a

Detekcija pomoću reagensa za vizualizaciju

c) Hitozan HAc

[0383] Za analizu je korišćeno 5 mg Hitozan HAc / ml H2O.

Detekcija pomoću UV fluorescencije i VIS-a

Detekcija pomoću reagensa za vizualizaciju

d) Glukozamin HCl

[0384] Za analizu je korišćeno 5 mg glukozamin HCl / ml H2O.

Detekcija pomoću UV fluorescencije i VIS-a

Detekcija pomoću reagensa za vizualizaciju

e) N-acetilglukozamin

[0385] Za analizu je korišćeno 5 mg N-acetilglukozamin / ml H2O Detekcija pomoću UV fluorescencije i VIS-a

Detekcija pomoću reagensa za vizualizaciju

f) Hitozan-valerijanska kiselina-hidrokoloid (CVHC)

[0386] CVHC je jako viskozan vodenasti gel. Za analizu su korišćene dve kapi CVHC.

Detekcija pomoću UV fluorescencije i VIS-a

Detekcija pomoću reagensa za vizualizaciju

g) Valerijanska kiselina

[0387] Za analizu je korišćen 1 µl valerijanska kiseline (čiste).

Detekcija pomoću UV fluorescencije i VIS-a

Detekcija pomoću reagensa za vizualizaciju

3. Poređenje rezultata TLC analize

[0388]

[0389] Prethodno navedeni rezultati TLC-a pokazuju da ne postoje dokazi o monomernoj ili dimernoj strukturi koji bi se mogli otkriti pomoću prethodno testiranih specifičnih derivatnih reagensa. Detekcija i vrednost Rf_a „0“ pokazuje sličnost hitozan-valerijanska kiselinahidrokoloida sa srodnim jedinjenjima hitozan HCl i hitozan HAc. Specifična identifikacija valerijske kiseline sa ovim TLC sistemom nije uspela. Hitozan-valerijanska kiselinahidrokoloid može biti samo poliamino-šećerni-koloid, ali ne i rastvor hitozana ili derivata hitozana sa valerijanskom kiselinom u vodi.

Primer 80. TLC metoda za analitičku detekciju valerijske kiseline u hitozan-valerijanska kiselina-hidrokoloidu

1. Metod i parametri

[0390] Uspostavljen je novi TLC sistem za identifikaciju i ispitivanje čistoće sastojka valerijske kiseline.

Hromatografski uslovi

Mobilna faza

2. Rezultati

a) Valerijanska kiselina (čista)

[0391] Za analizu je korišćeno 2 µl valerijanska kiseline (čiste).

Detekcija pomoću UV fluorescencije i VIS-a

[0392]

Granica detekcije: valerijanske kiseline sa ovim reagensom za vizualizaciju nakon TLC hromatografije: 0,03µg

b) Hitozan-valerijanska kiselina-hidrokoloid (CVHV)

[0393] Za analizu je korišćeno 45 μl hitozan-valerijanska kiselina-hidrokoloida, čistog (ovo je oko 850 puta veća količina valerijanske kiseline u poređenju sa prethodnim testovima).

Detekcija pomoću UV fluorescencije i VIS-a

Detekcija pomoću reagensa za vizualizaciju

Granica detekcije valerijanske kiseline sa ovim reagensom za vizualizaciju nakon TLC hromatografije: 0,03µg

[0394] Čista valerijanska kiselina može se identifikovati sa ovim TLC sistemom. Koloidna integrisana valerijanska kiselina ne može se otkriti u čistom jedinjenju hitozan-valerijanska kiselina-hidrokoloida. Detekcija i vrednost Rf-a „0“ pokazuje sličnost hitozan-valerijanska kiselina-hidrokoloida sa srodnim jedinjenjima hitozana. Hitozan-valerijanska kiselinahidrokoloid može biti samo poliamino-šećerni koloid, ali ne i rastvor hitozana ili derivata hitozana sa valerijanskom kiselinom u vodi. Prethodno navedeni rezultati potvrđuju identitet predložene strukture.

Primer 81. Eliminacija valerijske kiseline iz hitozan-valerijanska kiselina-hidrokoloida visokim vakuumom i višom temperaturom

[0395] Metoda: Procena gubitaka pri sušenju (posebna metoda)

Aparat: Brzi cirkulišući vakuumski koncentrator

Uslovi: 5 mbar

Temperatura: 60°C

Vreme: 1 sedmica

Krajnja tačka: Stalna masa

Izgled: Staklasta masa

[0396] Konačni miris: Nema tipičnog mirisa valerijanske kiseline

Priprema uzorka

Ponovno rastvaranje delimično sa vodom

[0397] Izgled: Jako viskozni gel

TLC analiza

[0398] Aparat: Camag Chromatographic Tank System

TLC ploča: Merck Si 60 F 254 prethodno obložene ploče

Uslovi: Zaštićen od sunčeve svetlosti i sa zasićenjem komore

Temperatura: 20 – 25 °C

Razvoj: Vertikalni razvoj

Hromatografski uslovi

Rastvor uzorka Videti gore

[0399] Primena: 5μl

Sušenje: Min. 2 minuta u vazdušnom toku

Raspon kretanja: 80 mm

Mobilna faza

Detekcija pomoću UV fluorescencije i VIS-a

Detekcija pomoću reagensa za vizualizaciju

[0400] Granica detekcije: valerijanske kiseline sa ovim reagensom za vizualizaciju nakon TLC hromatografije:

0.03μg

Rezultat: Sa visokim vakumom i višom temperaturom dolazi do disproporcije hitozanvalerijanska kiselina-hidrokoloida. Eliminacija valerijanske kiseline može se dokazati apsolutnim odsustvom tipičnog mirisa valerijske kiseline. Eliminacija valerijanske kiseline može se prikazati TLC analizom: nema tipične mrlje na mestu slobodne valerijanske kiseline pri vrednosti Rf-a 0,56. Hitozan ili jedinjenja hitozana mogu se identifikovati pri vredosti Rfa „0”. Hitozan-valerijanska kiselina-hidrokoloid može biti samo poliamino-šećerni-koloid, ali ne i rastvor hitozana ili derivata hitozana sa valerijanskom kiselinom u vodi.

Primer 82. Disproporcija hitozan-valerijanska kiselina-hidrokoloida sa rastvaračima [0401] Struktura hitozan-valerijanska kiselina-hidrokoloida razlaže se u etil acetatu do valerijanske kiseline i jedinjenja hitozana.

Priprema uzorka

[0402] Uređaj: levak za odvajanje, isparivač

Distribucija tečnost-tečnost: 20 ml hitozan-valerijanska kiselina-hidrokoloida i 10 ml etil acetata

Uslovi: Mućka se oko 5 minuta i sačeka razdvajanje faza

Razdvajanje faza: Faza etil acetata se prikupi

Korak koncentrovanja: Otprilike 10 ml je koncentrovano u isparivaču do tečnog ostatka (vodenasto)

Resolubilizacija: u 1 ml metanola

Homogenizacija: Korak centrifugiranja oko 5 minuta na 12000 o/min

Razvajanje faza: Gornja faza: bistri metanolni rastvor

Donja faza: jako viskozni gel

TLC analiza gornje i donje faze (vidi prethodno)

a) Analiza gornje faze (bistri metanolni rastvor)

TLC analiza

[0403] Aparat: Camag Chromatographic Tank System

TLC ploča: Merck Si 60 F 254 prethodno obložene ploče

Uslovi: Zaštićen od sunčeve svetlosti i sa zasićenjem komore

Temperatura: 20 – 25 °C

Razvoj: Vertikalni razvoj

Hromatografski uslovi

[0404] Rastvor uzorka: bistri metanolni rastvor

Primena: 5μl

Sušenje: Min. 2 minuta u vazdušnom toku

Raspon kretanja: 80 mm

Mobilna faza

Detekcija pomoću UV fluorescencije i VIS-a

Detekcija pomoću reagensa za vizualizaciju

[0405] Granica detekcije sa reagensom za vizualizaciju: 0.03μg

Rezultat: Gornja faza je bistri metanolni rastvor. Valerijanska kiselina se može identifikovati pomoću TLC-a nakon razlaganja hidrokoloida u ovom rastvoru. TLC-om se ne može otkriti hitozan ili jedinjenje hitozana.

b) Analiza donje faze (jako viskozni gel)

TLC analiza

[0406] Aparat: Camag Chromatographic Tank System

TLC ploča: Merck Si 60 F 254 prethodno obložene ploče

Uslovi: Zaštićen od sunčeve svetlosti i sa komorom

Temperatura: 20 – 25 °C

Razvoj: Vertikalni razvoj

Hromatografski uslovi

[0407] Rastvor uzorka: jako viskozni gel, potpuno rastvoren u vodi Primena: 30μl

Sušenje: Min.2 minuta u vazdušnom toku

Raspon kretanja: 80 mm

Mobilna faza

Detekcija pomoću UV fluorescencije i VIS-a

Detekcija pomoću reagensa za vizualizaciju

Granica detekcije sa reagensom za vizualizaciju: 0.03μg

[0408] Rezultati: Donja faza je jako viskozni gel, rastvorljiv u vodi. U ovoj fazi se pomoću TLC-a ne može otkriti valerijska kiselina. Hitozan ili jedinjenje hitozana mogu se identifikovati u donjoj fazi (gel) pomoću TLC-a.

Rezime rezultata

[0409] Rezultat: Hitozan-valerijanska kiselina-hidrokoloid može biti samo poliamino-šećerni koloid, ali ne i rastvor hitozana ili derivata hitozana sa valerijanskom kiselinom u vodi. Prethodno navedeni rezultati potvrđuju identitet predložene strukture.

Primer 83. Procena relativne gustine

[0410] Zbog visoke viskoznosti hitozan-valerijanska kiselina-hidrokoloida, procena gustine nije moguća sa bocom/piknometrom za gustinu prema ispitnoj metodi prema EVROPSKOJ FARMAKOPEJI 2.2.5.

1. Metoda ispitivanja vaganjem

[0411] Aparat: Merna boca od 250 ml

Vaga: Sartorius MC 1 LC 2200S

Termometar: Termometar sa gradacijom (min.0,5 °C) i rasponom od najviše 60 °C

Rezultati 1.001 [d20<20>]

[0412] Aktivni princip je hidrogel, pa bi teoretska gustina trebala biti veća od 1,0. Izmereni podaci potvrđuju identitet predložene supstance.

2. Metoda ispitivanja hidrometrom

[0413] Korišćena je metoda ispitivanja prema EUROPEAN PHARMACOPOEIA 2.2.5. Aparat: Merna boca od 250 ml

Hidrometar: Widder 1573°, 20°C-M100-DIN 12791 Klasse H

Termometar: Termometar sa gradacijom (min. 0,5 °C) i rasponom od najviše 60 °C Uslovi merenja: Temperatura 20 /- 0,5 °C sa elektroničkim termostatom

Rezultati 1.002 [d20<20>]

[0414] Aktivni princip je hidrogel, pa bi teoretska gustina trebala biti veća od 1,0. Izmereni podaci potvrđuju identitet predložene supstance.

Primer 84. Sulfatni pepeo

[0415] Korišćena je metoda ispitivanja prema EVROPSKOJ FARMAKOPEJI 2.4.14.

Testiranje

Primer 85. Gubitak tokom sušenja

[0416] Na osnovu ovoga, Phitochem® je uspostavio odgovarajuće metode za određivanje gubitka tokom sušenja.

1. Metoda i parametar za ispitivanje hitozan HCl, hitozana i hitozan HAc

Priprema uzorka

[0417] Prethodni tretman posude: Supstanca se stavlja u odgovarajuću bocu za vaganje, prethodno osušenu pod uslovima korišćenim posle

Punjenje: materijal se puni do najviše 5 milimetara

Prevoz: Boca za vaganje se zatvara odgovarajućim poklopcem

PC metoda: „Pod većim vakuumom“

modifikovana farmakopejska metoda 2.2.32 (EP) „u vakuumu u eksikatoru“

Aparat: eksikator

Vreme sušenja: do konstantne težine

Temperatura sušenja: 25 °C ± 2 °C

Vakuum: trajno 4-8 mbara sa specifičnim pumpama

Reagens za sušenje: Difosfor pentoksid (svež)

2. Procena gubitaka tokom sušenju hitozana u hitozan-valerijanska kiselina-hidrokoloidu (posebna metoda)

[0418] Sadržaj hitozana u hitozan-valerijanska kiselina-hidrokoloidu procenjuje se gravimetrijskim merenjem.

Aparat: Brzi cirkulišući vakuumski koncentrator

Metoda: Procena gubitaka pri sušenju (posebna metoda)

Uslovi merenja

[0419] Pritisak: 5 mbar

Temperatura: 60°C

Vreme: 1 sedmica

Krajnja tačka: Stalna masa

Izgled: Staklasta masa

Merenje: Ispitivani rastvor 4 ml hitozan-valerijanska kiselina-hidrokoloida

Ponavljanje: 10 puta

Konačni miris: Nema tipičnog mirisa valerijanske kiseline

Vaganje

1 40,20 mg 6 40,10 mg

2 39,80 mg 7 39,90 mg

3 40,20 mg 8 39,60mg

4 39,90 mg 9 40,20 mg

5 40,10 mg 10 40,40 mg

Prosečno 40,04 mg

Standardna devijacija 0,236643191

Relativna standardna devijacija 0,591016961

Odstupanje 0,056

Rezultati: Vaganje osušene supstance pokazuje dobru sličnost. Na osnovu ovih merenja, sadržaj hitozana u hitozan-valerijanska kiselina-hidrokoloidu je 1%.

Poređenje rezultata

[0420] Aktivni princip treba da bude hidrokoloidni gel. Izmereni podaci potvrđuju strukturu jedinjenja.

Primer 86. Procena osmolarnosti

[0421] Procena osmolarnosti se može izvršiti indirektno merenjem snižavanja tačke topljenja rastvora.

Aparat: Halbmicro Osmometer Knauer

Uslovi merenja: Spoljni sistem hlađenja

Raspon: 0-1600 mOsmol

Metoda: Zamrzavanje

Postupak ispitivanja

[0422] Kalibracija sa standardnim rastvorom 400 mOsmol/kg: 12,687 g NaCl u 1 l vode na 20 °C

Ponavljanje: 2 puta

Sud: Određena staklena bočica

Uzorak: Hitozan-valerijanska kiselina-hidrokoloid

Ispitni rastvor: 1 bez razblaživanja

2 razblaženje 1: 5

Količina: po 150 μl od svakog

Kalibracija

Uzorak Specifikacija Set tačka Izmerena vrednost

Kalibracija 1 Prečišćena voda 0 mOsmol 0 mOsmol

Kalibracija 2 400 mOsmol/kg 400 mOsmol 400 mOsmol

Merenje

Broj Uzorak Izmerena vrednost

1a Hitozan-valerijanska kiselina-hidrokoloid 100 mOsmol

1b Hitozan-valerijanska kiselina-hidrokoloid 110 mOsmol

2a Hitozan-valerijanska kiselina-hidrokoloid 1:5 20 mOsmol

2b Hitozan-valerijanska kiselina-hidrokoloid 1:5 20 mOsmol

[0423] Rezultati: Merenje osmolarnosti hitozan-valerijska kiselina-hidrokoloida pokazuje relativno nizak sadržaj. Izmereni sadržaj osmolarno reaktivnih komponenti može biti tako nizak samo ako nema rastvora ili suspenzije hitozana i valerijanske kiseline. Jedinjenje sa jako viskoznim geliranjem može biti samo hidrokoloid.

Rezultat: Prethodno navedeni izmereni podaci potvrđuju identitet predložene supstance.

Claims (13)

1. Patentni zahtevi 1. Postupak za pripremu modifikovanog hitozana, varijante hitozana ili derivata hitozana, postupak obuhvata sledeće korake: (a) inkubacija hitozana u vodenom rastvoru organske karboksilne kiseline ili njene soli, pri čemu je organska karboksilna kiselina izabrana iz grupe koja se sastoji od valerijanske kiseline, paraaminobenzojeve kiseline, glukuronske kiseline ili soli bilo koje od pomenutih kiselina, naročito hlorida valerijanske kiseline, pri čemu hitozan ima stepen deacetilovanja od 62% do 98%.
2. 2. Postupak prema patentnom zahtevu 1, u kojem hitozan ima stepen deacetilovanja od 80% do 95 % i/ili ima molekulsku masu ili prosečnu molekulsku masu od 80 kDa do 700 kDa.
3. 3. Postupak prema patentnom zahtevu 1 ili 2, u kojem postupak obuhvata sledeće korake pre koraka (a): (i) rastvaranje hitozana u vodenom rastvoru kiseline, naročito u vodenom rastvoru sirćetne kiseline, (ii) povećanje pH vrednosti, naročito na pH vrednost od 8,0 do 8,5, sve dok se ne istaloži hitozan, i (iii) prikupljanje istaloženog hitozana, pri čemu se prikupljeni hitozan iz koraka (iii) koristi u koraku (a).
4. 4. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, pri čemu korak (a) dodatno obuhvata dodavanje ili prisustvo mineralne kiseline, naročito HCl ili H2SO4, ili organske kiseline, naročito mlečne kiseline, paraaminobenzojeve kiseline ili glukuronske kiseline.
5. 5. Hidrokoloid koji sadrži: (i) 0,1% do 5% (w/v) hitozana i 0,001 do 5% (w/v) valerijanske kiseline ili njene soli, poželjno hlorid valerijanske kiseline, ili (ii) 0,1% do 5% (w/w) hitozana i 0,001 do 5% (w/w) glukuronske kiseline ili paraaminobenzojeve kiseline ili njihovih soli.
6. 6. Jedinjenje formule [X]n, u kojem n predstavlja ceo broj od 1 do 5000, naročito ceo broj od 300 do 4000, a X ima sledeću formulu (1):

   , pri čemu je 2% do 38%, poželjnije 5% do 20% ostataka X koji čine pomenuto jedinjenje modifikovano acetilovanjem i gde su svi ili deo ostataka X koji čine pomenuto jedinjenje modifikovani organskom karboksilnom kiselinom odabranom iz grupe koja se sastoji od valerijanske kiseline, paraaminobenzojeve kiseline, glukuronske kiseline ili soli bilo koje od pomenutih kiselina, naročito hlorida valerijanske kiseline.
7. 7. Kompozicija koja sadrži hidrokoloid prema patentnom zahtevu 5 ili jedinjenje prema patentnom zahtevu 6, naročito pri čemu je kompozicija farmaceutska kompozicija i sadrži farmaceutski prihvatljiv razblaživač, pomoćnu supstancu i/ili nosač.
8. 8. Kompozicija prema patentnom zahtevu 7, pri čemu kompozicija sadrži dodatni antigeni materijal iz mikroorganizama i/ili enzime, naročito antigeni materijal keratinofilnih gljivica i/ili keratinofilnih kvasaca, konzervanse i/ili antibiotike.
9. 9. Kompozicija prema patentnom zahtevu 8, pri čemu antigeni materijal potiče od jedne ili više vrsta Candida, naročito Candida albicans, Trichophyton, naročito Trichophyton verrucosum, Trichophyton mentagrophites, Trichophyton equinum, Trichophyton sarkisovii, Trichophyton rubrum i/ili Trichophyton mentagrophytes, Microsporum, naročito Microsporum canis kao što je Microsporum canis var. obesum i/ili Microsporum canis var. distortum, i/ili Microsporum gypseum, i/ili Chrisporium, naročito Chrisporium tropicum.
10. 10. Kompozicija prema patentnom zahtevu 9, pri čemu je antigeni materijal izveden iz jednog ili više sledećih sojeva: Trichophyton mentagrophytes DSM – 7279, Trichophyton verrucosum DSM – 28406, Trichophyton rubrum DSM – 9469, Trichophyton rubrum DSM – 9470, Trichophyton rubrum DSM – 9471, Trichophyton rubrum DSM – 9472, Candida albicans DSM – 9456, Candida albicans DSM – 9457, Candida albicans DSM – 9458, Candida albicans DSM – 9459, Chrisporium tropicum DSM-28405, i Microsporum canis DSM-32271.
11. 11. Kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 7 do 10, pri čemu je modifikovani hitozan, varijanta hitozana, derivat ili jedinjenje hitozana, prisutan u koncentraciji od 0,1 do 2,0% (w/v), naročito od 0,1 do 1,4% (w/v), tačnije od 0,1% do 0,3% (w/v).
12. 12. Hidrokoloid prema patentnom zahtevu 5, jedinjenje prema patentnom zahtevu 6 ili kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 7 do 11 za upotrebu u humanoj i/ili veterinarskoj medicini, naročito kao vakcina.
13. 13. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 6 ili 12, hidrokoloid prema patentnom zahtevu 5 ili 12 ili kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 7 do 12 za upotrebu u postupku lečenja i/ili prevencije mastitisa, poželjno latentnog mastitisa i/ili akutnog mastitisa, endometritisa, poželjno hroničnog, akutnog i/ili gnojno-kataralnog endometritisa, bolesti papaka i kandži, hramanja, lezija u interdigitalnom prostoru, digitalnog dermatitisa, interdigitalnog dermatitisa, interdigitalne flegmone, trihofitoze, mikrosporoze, mikoze kože, alergija, kao i bolesti komplikovanih alergijama, naročito alergijske opstruktivne plućne bolesti, alergijskih bolesti kože, alergijskog eritema uha, alergijskog rinitisa, alergijskog konjunktivitisa, akutnog alergijskog kontaktnog dermatitisa, hroničnog alergijskog kontaktnog ekcema ili atopijskog ekcema, opstruktivne plućne bolesti, naročito hronične opstruktivne plućne bolesti, kožnih bolesti, naročito dermatitisa, eritema uha, rinitisa, konjunktivitisa, dermatofitoze ili bradavica, naročito običnih bradavica kod subjekta i za modulaciju imunološkog odgovora kod subjekta i/ili za poboljšanje efikasnosti reprodukcije, poželjno efikasnosti reprodukcije kod uzgoja životinja.