RS61947B1

RS61947B1 - Davanje selektivnog inhibitora il-6-trans-signalizacije

Info

Publication number: RS61947B1
Application number: RS20210709A
Authority: RS
Inventors: Ian Cottingham; Niclas Axel Petri
Original assignee: Ferring Bv
Priority date: 2014-12-01
Filing date: 2015-12-01
Publication date: 2021-07-30
Also published as: MD3226888T2; KR20240166606A; PL3226888T3; US11198721B2; EP3912636A1; MA41114B1; SI3226888T1; US20170320932A1; EP3912636B1; MX2017007067A; KR20170135819A; HRP20210737T1; MA54761A; CN107223132A; JP6775513B2; JP2017537155A; LT3226888T; EP3226888B1; PT3226888T; ES2875351T3

Description

Opis

UPUĆIVANJE NA POVEZANE PATENTNE PRIJAVE

[0001] Ova patentna prijava polaže pravo na privremenu patentnu prijavu SAD br.

62/086,054, podnesenu 1. decembra, 2014, čiji je sadržaj ovde u celini ovde ugrađen.

POZADINA

[0002] IL-6 je plejotropni citokin koji proizvode hematopoetske i nehematopoetske ćelije, npr. kao odgovor na infekciju i oštećenje tkiva. IL-6 vrši svoje višestruke biološke aktivnosti kroz dva glavna signalna puta, takozvani klasični put za ligand-receptor putem membranski vezanog IL-6R prisutan uglavnom na hepatocitima i određenim leukocitima, i trans-signalni put putem cirkulišućeg sIL-6R poreklom od proteolitičkog deljenja membranski vezanog IL-6R ili od alternativnog spajanja.

[0003] U klasičnom putu, IL-6 se direktno vezuje za IL-6R vezan za membranu na površini ograničenog raspona tipova ćelija. Kompleks IL-6/IL-6R se udružuje sa unapred formiranim dimerom proteina receptora koji pretvara signal, uzrokujući steričke promene u homodimeru gp130 i time pokrećući unutarćelijsku signalnu kaskadu. Klasična signalizacija odgovorna je za akutne inflamatorne odbrambene mehanizme i ključne fiziološke funkcije IL-6, kao što su rast i regenerativni signali za crevne epitelne ćelije.

[0004] Vanćelijski domeni IL-6R i gp130 mogu se generisati bez domena za učvršćivanje membrane prevođenjem alternativno spojenih mRNK, što rezultira u varijantama sIL-6R i sgp130. Pored toga, vanćelijski domen IL-6R može se izliti membranski vezanim proteazama porodice A dezintegrina i metaloproteaze (ADAM) (kod ljudi, ADAM17) da bi se dobio sIL-6R. U procesu trans-signalizacije, sIL-6R se vezuje za IL-6, formirajući agonistički kompleks koji se vezuje za trans-membranske gp130 dimere prisutne na mnoštvu tipova ćelija koji ne izražavaju IL-6R vezan za membranu; Signalizacija IL-6 signalnim pretvaračima i aktivatorima transkripcije (STAT) se zatim indukuje u ćelijama koje obično ne reaguju na IL-6. Aktivnost kompleksa IL-6/sIL-6R obično se kontroliše nivoima sgp130 prisutnim u cirkulaciji koji se efikasno nadmeću sa membranom vezanim gp130. Trans-signalizacija je uglavnom uključena u hronično zapaljenje i pokazano je da sprečava populaciju T-ćelija sluzokože koja promoviše bolest da pređe u apoptozu.

[0005] Bilo bi poželjno da imamo molekul koji imitira prirodni inhibitor trans-signalizacije sgp130, ali sa većim afinitetom vezivanja i, shodno tome, jačom inhibitornom aktivnošću. Štaviše, bilo bi poželjno imati molekul koji se može primeniti na ljude sa minimalnom toksičnošću i imunogenim potencijalom.

SUŠTINA PRONALASKA

[0006] Sada je utvrđeno da se selektivni inhibitor IL-6-trans-signalnog signala može primeniti na ljude bez značajnih štetnih efekata u velikom opsegu doziranja. Štaviše, iznenađujuće je utvrđeno da terminalni polu-raspad inhibitora omogućava doziranje nedeljno, dvotjedno (tj., svake druge nedelje), mesečno ili čak i manje često.

[0007] U određenim otelotvorenjima, pronalazak uključuje inhibitor (npr., polipeptidni dimer kako je ovde obelodanjeno) za lečenje inflamatorne bolesti ili stanja posredovanog IL-6, pri čemu se polipeptid daje u dozi od 0,5 mg do 5 g. Pronalazak takođe uključuje postupak za lečenje inflamatorne bolesti davanjem inhibitora (npr., polipeptidnog dimera, kako je ovde obelodanjeno), gde je doza inhibitora od 0,5 mg do 5 g. Pronalazak dalje uključuje upotrebu takvog inhibitora u proizvodnji leka za lečenje inflamatorne bolesti u naznačenoj dozi.

Poželjno je da se leči čovek.

[0008] U drugim otelotvorenjima, pronalazak uključuje polipeptidni dimer kako je ovde obelodanjeno za lečenje stanja posredovanog IL-6 bez značajnog smanjenja broja neutrofila, broja trombocita i/ili nivoa C-reaktivnog proteina ili bez smanjenja broja neutrofila, broja trombocita i/ili nivoi C-reaktivnog proteina ispod normalnog nivoa kod zdravih ispitanika ili pacijenata koji pate od stanja posredovanog IL-6. Pronalazak takođe uključuje upotrebu polipeptidnog dimera u postupku lečenja stanja posredovanog IL-6 primenom polipeptidnog dimera kako je ovde obelodanjeno, pri čemu postupak ne smanjuje značajno broj neutrofila, broj trombocita i/ili nivo C-reaktivni protein. Pronalazak dalje uključuje upotrebu takvog polipeptidnog dimera u proizvodnji leka za lečenje stanja posredovanog IL-6 bez značajnog smanjenja broja neutrofila, broja trombocita i/ili nivoa C-reaktivnog proteina. Poželjno je da se leči čovek.

KRATAK OPIS SLIKA

[0009]

Sl. 1 prikazuje put trans-signalizacije IL-6. sIL-6R generisan iz alternativno spojenog mRNK ili proteolitičkog deljenja je u stanju da se veže za IL-6 da bi formirao IL-6/sIL-6 kompleks koji se vezuje za gp130 prisutan na velikoj većini tipova telesnih ćelija i indukuje unutarćelijsku signalnu kaskadu.

Sl. 2 pokazuje da polipeptidni dimer koji sadrži dva monomera sa SEQ ID NO: 1 ne ometa IL-6 vezivanje za IL-6R vezano za membranu (klasična signalizacija), ali se selektivno vezuje za kompleks IL-6/sIL-6R i sprečava trans-signalizaciju.

Sl. 3 prikazuje profile nakon i.v. infuzija Peptida 1 (leva ploča) na 0,75 mg, 7,5 mg, 75 mg, 150 mg, 300 mg, 600 mg i 750 mg i s.c. injekcija (desni panel) od 60 mg (2x2mL).

Sl. 4 prikazuje profile nakon intravenskog davanja od 75 mg, 300 mg i 750 mg kod zdravih ispitanika (levi panel) i CD pacijenata u kliničkoj remisiji (desni panel).

Sl. 5 prikazuje profile nakon intravenskog davanja od 75 mg, 300 mg i 750 mg jednom nedeljno tokom 4 nedelje kod zdravih ispitanika.

Sl. 6 prikazuje predviđanja modela pomoću strukturnog PK modela sa 2 odeljenja (puna linija) i posmatrane podatke (krugovi) u ispitivanju 000115.

Sl. 7 prikazuje nukleotidnu i aminokiselinsku sekvencu pojedinačne gp130-Fc podjedinice.

Sl. 8 prikazuje elemente nukleotidne sekvence ekspresijskog plazmida pFER02.

DETALJNI OPIS PRONALASKA

[0010] Poželjni inhibitori pronalaska uključuju dimer dva gp130-Fc fuzijska monomera (npr., dva monomera sa SEQ ID NO:1). U svom aktivnom obliku, polipeptid SEQ ID NO: 1 postoji kao dimer povezan dvema disulfidnim vezama na Cys623 i Cys626 (Sl.2). SEQ ID NO: 2 odgovara aminokiselinskoj sekvenci fuzionog monomera gp130-Fc koji ima endogeni signalni peptid. Signalni peptid se uklanja tokom sinteze proteina, što rezultira proizvodnjom polipeptida SEQ ID NO: 1.

[0011] Ovde opisani dimeri polipeptida selektivno inhibiraju prekomerno trans-signaliziranje (Sl. 1) i indukuje apoptozu štetnih T-ćelija uključenih u višestruke inflamatorne bolesti.

Polipeptidni dimer cilja i neutrališe IL-6/sIL-6R komplekse i zbog toga se očekuje da inhibira samo IL-6 trans-signalizaciju u željenim terapijskim koncentracijama, ostavljajući klasično signaliziranje i njegove brojne fiziološke funkcije, kao i njegove akutne inflamatorne odbrambene mehanizme , netaknut (Sl.2). Veruje se da polipeptidni dimer nije u mogućnosti da ometa klasičnu IL-6 signalizaciju zbog steričke prepreke; deo Fc nije u mogućnosti da se ubaci u ćelijsku membranu, što čini deo gp130 nedostupnim za vezivanje za IL-6/sIL-6R kompleksom vezanim za membranu. Dakle, očekuje se da polipeptidni dimer ima efikasnost sličnu globalnoj blokadi IL-6 (npr., tocilizumab, sirukumab), ali sa manje neželjenih efekata.

[0012] Ovde opisani polipeptidni dimeri poželjno sadrže gp130-Fc monomere koji imaju sekvencu koja odgovara SEQ ID NO:1. U određenim otelotvorenjima, monomeri imaju sekvencu koja odgovara SEQ ID NO:2. U određenim otelotvorenjima, ovde opisani dimeri polipeptida sadrže polipeptide koji imaju najmanje 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ili 99,5% identičnosti sekvence prema SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2. Poželjno je da polipeptid sadrži gp130 D6 domen (naročito aminokiseline TFTTPKFAQGE: aminokiselinske pozicije 585-595 SEQ ID NO:1), AEGA u regionu šarke Fc domena (aminokiselinske pozicije 609-612 SEQ ID NO:1) i ne sadrži veznik između dela gp130 i Fc domena. U poželjnom otelotvorenju, obelodanjivanje daje polipeptidni dimer koji sadrži dva monomera koji imaju aminokiselinsku sekvencu od najmanje 90% identifikovanu sa SEQ ID NO: 1, gde aminokiselinska sekvenca sadrži gp130 D6 domen, AEGA u regionu šarke Fc domena, a ne postoji veznik između dela gp130 i Fc domena. U poželjnom otelotvorenju, obelodanjivanje daje polipeptidni dimer koji sadrži dva monomera koji imaju aminokiselinsku sekvencu od najmanje 90% identifikovanu sa SEQ ID NO: 2, gde aminokiselinska sekvenca sadrži gp130 D6 domen, AEGA u regionu šarke Fc domena, a ne postoji veznik između dela gp130 i Fc domena.

[0013] Poželjno je da polipeptidi u suštini ne sadrže ostatke galaktoze-alfa-1,3-galaktoze, jer su oni povezani sa imunogenim odgovorom. Iznenađujuće je otkriveno da dimeri pronalaska imaju nizak nivo takvih delova. U poželjnim otelotvorenjima, polipeptidni dimer ne sadrži više od 6% galaktoze-alfa-1,3-galaktoze po molu polipeptida. Poželjno je da polipeptidni dimer ne sadrži više od 4 molarnih%, 3 molarnih%, 2 molarnih%, 1 molarnih%, 0,5 molarnih%, 0,2 molarnih%, 0,1 molarnih% ili čak neotkrivenog nivoa galaktoze-alfa-1,3-galaktoze (npr., mereno WAX-HPLC, NP-HPLC ili WAX, poželjno kako je određeno WAX-HPLC). U drugim otelotvorenjima, polipeptidni dimer sadrži manje od 6%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,2% ili čak 0,1% galaktoze-alfa-1,3-galaktoze u odnosu na ukupnu količina glikana, bilo maseno ili molarno.

[0014] Takođe je poželjno da se polipeptid iz pronalaska sijalira. Ovo ima prednost u povećanju polu-raspada polipeptida prema pronalasku. Svaki lanac polipeptidnog dimera sadrži 10 mesta N-glikozilacije; devet mesta N-glikozilacije nalazi se u delu gp130, a jedno mesto N-glikozilacije nalazi se u delu Fc. Stoga polipeptid sadrži ukupno 20 mesta glikozilacije. U određenim otelotvorenjima, srednja vrednost od najmanje 52% ili najmanje 54% glikana na polipeptidu uključuje ostatak sijalne kiseline, kao što je srednja vrednost od 52-65% (na primer, mereno WAX-HPLC, NP-HPLC ili WAX, poželjno kako je određeno WAX-HPLC). Poželjno je da polipeptid pronalaska ima približnu molekulsku masu od 220 kDa; svaki od 93 kDA koji ima dodatnih ∼20 kDa molekularne mase dobijenih iz 10 lanaca N-glikozilacije.

[0015] Dalje je poželjno minimizirati u kojoj meri se polipeptidi agregiraju, što se ovde naziva oligomerizacija koja rezultira oligomernim agregatima. "Oligomerni agregati", kako se ovde koristi, ne odnosi se na aktivni dimerizovani peptid. Umesto toga, termin se odnosi na najmanje dimer aktivnih dimera. Iznenađujuće je otkriveno da peptidni dimeri pronalaska pokazuju nizak nivo agregacije. U određenim otelotvorenjima, manje od 5%, manje od 4%, manje od 3%, manje od 2%, manje od 1,5% ili čak manje od 1,0% polipeptida je prisutno kao oligomer. Sadržaj oligomera može se meriti, na primer, hromatografijom za isključivanje veličine sa višestrukim rasipanjem svetlosti (SEC-MALS) ili SEC-UV.

[0016] Poželjno je da je polipeptidni dimer prisutan u svom obliku u punoj dužini (npr., uključuje dva monomera pune dužine, npr., SEQ ID NO:1). Međutim, ćelijska kultura može da proizvede skraćenu varijantu koja se ovde naziva pojedinačni gp130 oblik (SGF). SGF je kovalentno vezan dvolančani molekul, jedan lanac koji sadrži gpl30-Fc monomer pune dužine (npr. SEQ ID NO:1), a drugi lanac koji sadrži usečeni gp130-Fc monomer (npr., skraćivanje SEQ ID NO:1), koji drugi lanac uključuje Fc domen i nedostaje mu većina ili ceo gp130 domen (npr., završen pre sekvence linkera za Fc region). Dosadašnja ispitivanja pokazuju da SGF nema heterogeni amino-kraj. SGF se može formirati na doslednim nivoima u bioreaktoru i kada se jednom formiraju, nivoi SGF se ne menjaju lako tokom prečišćavanja, prerade ili ubrzanih uslova skladištenja. Nivoi SGF mogu biti teško ukloniti tokom prečišćavanja zbog sličnih fizičko-hemijskih svojstava kao oblik polipeptidnog dimera pune dužine; tako napori da se ukloni SGF mogu rezultirati značajnim smanjenjem prinosa.

Iznenađujuće je otkriveno da su polipeptidni dimeri prema pronalasku gotovo uvek pune dužine. U određenim otelotvorenjima, sastav pronalaska sadrži polipeptidne dimere koji sadrže ne više od 4,0 masenih%, 3,0 masenih%, 2,0 masenih% ili čak 1,5 masenih% polipeptida koji su krnja varijacija polipeptida SEQ ID NO: 1 u odnosu na polipeptide sa SEQ ID NO: 1. U određenim otelotvorenjima, sastav pronalaska koji sadrži ne više od 4,0 masenih%, 3,0 masenih%, 2,0 masenih% ili čak 1,5 masenih% polipeptida koji su krnja varijacija polipeptida SEQ ID NO: 2 u odnosu na polipeptide sa SEQ ID NO: 2.

Doziranje

[0017] Ovde opisane doze predstavljaju opseg doza za koji se veruje da je siguran i podnošljiv, na osnovu podataka iz Faze I. Druga jedinjenja koja ciljaju IL-6R ili IL-6 često su u ranim kliničkim ispitivanjima pokazala smanjenje broja neutrofila i trombocita i niži nivo C-reaktivnog proteina (CRP), kako kod zdravih ispitanika, tako i kod pacijenata sa RA.

Međutim, posmatrani nivoi broja neutrofila i trombocita kod zdravih ispitanika doziranih polipeptidom prema pronalasku i dalje su bili u granicama normale. Iz rezultata iz faze I programa proizlazi da polipeptid pronalaska ne pokazuje iste efekte na biomarkere kao jedinjenja koja ciljaju IL-6R ili IL-6.

[0018] U dva ispitivanja sa dimerom polipeptida koji sadrže monomere sa SEQ ID NO: 1, korišćen je ex vivo test kojim se meri nivo aktivacije STAT 3 stimulisanjem uzoraka cele krvi ispitanika sa hiper IL-6 kao procena aktivnosti leka. Nivoi koncentracije polipeptida koji sadrže monomere sa SEQ ID NO: Veruje se da su 1 iznad 1 µg/mL povezani sa potisnutim signalom na početnu liniju u testu sekundarnog glasnika (STAT3). Nivo koncentracije polipeptidnih dimera koji sadrže monomere sa SEQ ID NO: 1 odgovara najvišim nivoima doze od 7,5 mg. Doza od 75 mg primenjena kao i.v. pokazano je da infuzija ima koncentraciju iznad 1 µg/mL u stanju ravnoteže tokom intervala doziranja od jedne nedelje. Odgovarajuća doza koja se daje svake dve nedelje je 300 mg. Veruje se da se veruje da 60 mg primenjeno u obliku subkutane injekcije rezultira istim stacionarnim stanjem za doziranje svake nedelje.

[0019] U određenim otelotvorenjima, doza je od 0,5 mg do 5 g polipeptidnog dimera. Na primer, doza može biti od 5 mg do 3 g, 10 mg do 2 g, 60 mg do 1 g ili poželjno od 60 mg do 750 mg.

[0020] Polipeptidni dimeri se mogu davati na frekvenciji koja odgovara odgovarajućem stanju. U određenim otelotvorenjima, polipeptidni dimer se dozira jednom u 7-60 dana. Na primer, dimeri polipeptida mogu se dozirati jednom u 7-30 dana ili 7-20 dana. U poželjnim otelotvorenjima, doza se javlja nedeljno (jednom u 7 dana) ili dvonedeljno (jednom u 14 dana). Doze se takođe mogu pojaviti svakodnevno ili dva puta ili tri puta nedeljno. Doza se odnosi na jednu epizodu doziranja, bilo da je doza jedinični oblik doziranja ili više jediničnih oblika doziranja uzeti zajedno (npr., gutanje dve ili više tableta, primanje dve ili više injekcija). Kao što je objašnjeno u nastavku, ova učestalost doze nije mogla da se predvidi iz ispitivanja na životinjama. Klinička ispitivanja na ljudima pronašla su srednji polu-raspad od 4,6 dana do 5,5 dana. Nasuprot tome, majmuni cinomolgus imali su polu-raspad od samo 0,7 dana kada su davali polipeptidne dimere intravenozno i 1,4-1,5 dana subkutano.

[0021] Polipeptidni dimer prema pronalasku se tipično daje parenteralno, kao što je intravenozno ili subkutano. Davanje se može dogoditi u skladu sa jednom od ovde opisanih frekvencija doziranja.

[0022] U određenim otelotvorenjima, polipeptidni dimer se daje intravenozno, dozira se jednom na 7-60 dana, sa dozom od 60 mg do 1 g.

[0023] U takvim određenim otelotvorenjima, polipeptidni dimer se daje intravenozno, dozira se jednom na 7-30 dana, sa dozom od 60 mg do 1 g.

[0024] U primernom otelotvorenju, polipeptidni dimer se daje intravenozno, dozira se nedeljno u dozi od 60 mg do 1 g.

[0025] U drugom primernom otelotvorenju, polipeptidni dimer se daje intravenozno, dozira se dva puta nedeljno u dozi od 60 mg do 1 g.

[0026] U određenim otelotvorenjima, polipeptidni dimer se daje subkutano, dozira se jednom na 7-60 dana, sa dozom od 60 mg do 600g.

[0027] U određenim otelotvorenjima, polipeptidni dimer se daje subkutano, dozira se jednom na 7-30 dana, sa dozom od 60 mg do 600g.

[0028] U primernom otelotvorenju, polipeptidni dimer se daje subkutano, dozira se jednom nedeljno u dozi od 60 mg do 600g.

[0029] U primernom otelotvorenju, polipeptidni dimer se daje subkutano, dozira se dva puta nedeljno u dozi od 60 mg do 600g.

Bezbednost

[0030] Polipeptidni dimer koji sadrži monomere sa SEQ ID NO: 1 je davan do 750 mg kao pojedinačna doza i 600 mg jednom nedeljno tokom 4 nedelje. Sigurnosni profil polipeptida bio je povoljan sa nekoliko neželjenih događaja koji su se javili u svim lečenim grupama, uključujući i placebo grupu, a sve su bile blage ili umerene. Nisu primećeni očigledni trendovi u učestalosti ili učestalosti neželjenih događaja u vezi sa dozom. Nije bilo očiglednih trendova u vezi sa dozom ili promena u lečenju vitalnih znakova, EKG-a ili parametara kliničke hemije. Dogodila su se tri događaja infuzionih reakcija, svi su bili blagi/umereni sa kožnim simptomima poput urtikarije i otoka i brzo su se povukli bez ikakvih posledica.

[0031] Generalno, polipeptidni dimer koji sadrži monomere sa SEQ ID NO: 1 je bio siguran i dobro se podnosio kada se primenjuje i.v. do 600 mg jednom nedeljno tokom 4 nedelje i do 750 mg kao pojedinačna doza.

[0032] Potencijalni rizik od polipeptida koji sadrži monomere sa SEQ ID NO: 1 kod ljudi takođe se može adresirati indirektno analizom kliničkih ispitivanja koje istražuju slična jedinjenja koja ciljaju IL-6R ili IL-6. Do danas ne postoji odobreno jedinjenje koje blokira isti signalni put kao ovaj polipeptidni dimer, tj. ciljanje i neutralizacija IL-6/sIL-6R-kompleksa za inhibiranje trans-signalnog puta, bez ikakve interakcije sa IL-6 ili IL -6R pojedinačno. Međutim, postoje iskustva sa jedinjenjima koja ciljaju IL-6 receptore. Jedno od ovih jedinjenja je tocilizumab, koji je odobren u Evropi i Sjedinjenim Državama.

Tocilizumab se specifično vezuje i za rastvorljive i za membranu vezane receptore IL-6 i pokazano je da inhibira sIL-6R i mIL-6R posredovanu signalizaciju.

[0033] Najčešće prijavljene neželjene reakcije lekova kod pacijenata sa RA lečenih tocilizumabom (javljaju se u ≥5%) bile su infekcije gornjih disajnih puteva, nazofaringitis, glavobolja, hipertenzija i povećani ALT. Najozbiljnije neželjene reakcije na lekove bile su ozbiljne infekcije, komplikacije divertikulita i reakcije preosetljivosti. Nakon tretmana tocilizumabom došlo je do smanjenja broja neutrofila i trombocita. Smanjenje broja neutrofila ispod 10<9>/L dogodilo se kod 3,4% pacijenata koji su uzimali tocilizumab od 8 mg/kg plus antireumatski lekovi koji modifikuju bolest (DMARD). Približno polovina pacijenata koji su razvili ANC <109/L učinila je to u roku od 8 nedelja nakon početka terapije. Smanjenje ispod 5x10<8>/L zabeleženo je kod 0,3% pacijenata koji su primali tocilizumab 8 mg/kg i DMARD. Teška neutropenija može biti povezana sa povećanim rizikom od ozbiljnih infekcija, iako do danas nije postojala jasna povezanost između smanjenja neutrofila i pojave ozbiljnih infekcija u kliničkim ispitivanjima sa tocilizumabom. Događaji zabeleženi tokom infuzije bili su prvenstveno epizode hipertenzije; događaji prijavljeni u roku od 24 sata od završetka infuzije bili su glavobolja i kožne reakcije (osip, urtikarija). Ovi događaji nisu ograničavali lečenje. Klinički značajne reakcije preosetljivosti povezane sa tocilizumabom i koje zahtevaju prekid lečenja zabeležene su kod ukupno 13 od 3778 pacijenata (0,3%) lečenih tocilizumabom tokom kontrolisanih i otvorenih kliničkih ispitivanja. Ove reakcije su generalno primećene tokom druge do pete infuzije tocilizumaba. Gastrointestinalne perforacije, prvenstveno kod pacijenata sa anamnezom divertikulitisa, zabeležene su kao retki događaji, kako u kliničkim ispitivanjima tocilizumaba, tako i nakon stavljanja u promet. Etiologija nije jasna, ali pacijenti sa RA imaju generalno povećani rizik za perforacije i gornjeg i donjeg dela GI trakta (bez obzira na DMARD terapiju); rizik je najveći kod pacijenata sa RA na terapiji glukokortikoidima, NSAIL ili sa divertikulitisom u anamnezi. Zabeležena je fatalna anafilaksija nakon odobrenja za stavljanje leka u promet tokom lečenja tocilizumabom. Treba napomenuti da pacijenti sa RA mogu imati i druge pozadinske bolesti kao zbunjujuće faktore.

[0034] Budući da polipeptidni dimer koji sadrži monomere sa SEQ ID NO: 1 je prvoklasni fuzioni protein, poređenje sa različitim proizvodima monoklonskih antitela sa različitim mehanizmima delovanja je ograničene vrednosti. Za razliku od drugih proizvoda koji u potpunosti blokiraju aktivnost IL-6, veruje se da ovaj polipeptidni dimer ometa samo IL-6/sIL-6R kompleks, ostavljajući membranski vezan IL-6 put dostupan.

[0035] IL-6 ima široko učešće u imunološkim i inflamatornim odgovorima u telu. Kada su rastvorljivi i membranski vezani IL-6R blokirani, postoji potencijalno povećan rizik od infekcija i drugih imuno-zavisnih bolesti, kao i manje izražen inflamatorni odgovor. Iako ne želi da bude vezan teorijom, veruje se da tretman polipeptidnim dimerom koji sadrži monomere sa SEQ ID NO: 1, koji cilja samo na IL-6/sIL-6R kompleks, sprečio bi produžavanje hroničnog zapaljenja creva kod IBD i sačuvao akutni fazni inflamatorni odgovor aktiviran klasičnom signalizacijom IL-6, smanjujući time rizik od oportunističkih

1

infekcija. Međutim, ne može se predvideti da li postoji koncentracija polipeptidnog dimera prema pronalasku iznad koje bi se uticalo na klasičnu IL-6 signalizaciju. Stoga, podaci ovde iznenađujuće pokazuju da je manji uticaj na klasičnu signalizaciju IL-6 u odnosu na druge tretmane koji ciljaju aktivnost IL-6.

[0036] Na osnovu ovde predstavljenih podataka, prednost polipeptidnog dimera prema pronalasku je ta što može imati manji efekat na broj neutrofila, broj trombocita i/ili nivo C-reaktivnog proteina od ostalih jedinjenja koja inhibiraju IL-6. U određenim otelotvorenjima, polipeptidni dimer prema pronalasku ne smanjuje značajno broj neutrofila, broj trombocita i/ili nivo C-reaktivnog proteina ili bez smanjenja broja neutrofila, broja trombocita i/ili nivoa C-reaktivnog proteina ispod normalnog opsega u zdravom ispitaniku ili pacijentu koji patu od stanja posredovanog IL-6. Na primer, davanje polipeptidnog dimera u ovde opisanoj količini doze održava broj neutrofila, broj trombocita i/ili nivo C-reaktivnog proteina u normalnom fiziološkom opsegu. U određenim otelotvorenjima, broj neutrofila, broj trombocita i/ili nivo C-reaktivnog proteina nije veći od 50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 10% ili 5% manje od donje granice normalnog fiziološki opseg. Merenje broja neutrofila, broja trombocita i/ili nivoa C-reaktivnog proteina može se desiti neposredno nakon tretmana, jedan dan nakon nekoliko dana, tri dana nakon lečenja, nedelju dana posle lečenja, dve nedelje nakon lečenja, mesec dana nakon lečenja, tri meseca nakon lečenja, šest meseci nakon lečenja ili godinu dana nakon lečenja.

[0037] Određivanje broja neutrofila, broja trombocita i nivoa C-reaktivnog proteina može se izvršiti bilo kojim brojem testova dobro poznatih u struci. Broj neutrofila, koji se naziva i apsolutni broj neutrofila (ANC), je mera broja neutrofilnih granulocita prisutnih u krvi (videti, npr., Al-Gwaiz LA, Babay HH (2007). "The diagnostic value of absolute neutrophil count, band count and morphologic changes of neutrophils in predicting bacterial infections". Med Princ Pract 16 (5): 344-7). Normalne fiziološke vrednosti za C-reaktivni protein kod odraslih muškaraca i žena su 0-5,00 mg/L (npr., turbidimetrijom). Normalne fiziološke vrednosti neutrofila kod odraslih žena su 1,61-6,45 x 10<9>po L (apsolutna vrednost, npr., laserskom protočnom citometrijom) ili 37,9-70,5% (izračunato); kod odraslih muškaraca odgovarajuće vrednosti su 1,46-5,85 x 10<9>po L i 38,2-71,5%. Normalne fiziološke vrednosti za trombocite kod odraslih žena su 173-369 x 10<9>po L (npr., putem merenja impedance visoke frekvencije); kod odraslih muškaraca odgovarajuće vrednosti su 155-342 x 10<9>po L.

[0038] Polipeptidni dimer prema pronalasku poželjno ne indukuje značajno stvaranje antitela (npr., antitela na polipeptidni dimer) kod ljudi. Još poželjnije, antitela nisu neutralizujuća antitela. U određenim otelotvorenjima, antitela protiv polipeptidnog dimera pronalaska mogu se otkriti u manje od 5%, 2%, 1%, 0,5%, 0,2%, 0,1% ili 0,01% lečenih ispitanika ili pacijenata. Tipično, granica detekcije je približno 9 ng/mL seruma.

Indikacije

[0039] Kod akutne inflamacije, pokazano je da IL-6 indukuje odgovor akutne faze u jetri što dovodi do oslobađanja kaskade proteina akutne faze, naročito CRP. Formiranjem kompleksa sa sIL-6R prolivenim apoptotskim neutrofilima na mestu upale i vezivanjem nastalog transsignalnog kompleksa IL-6/sIL-6R za pretvarač signala gp130 na endotelnim ćelijama, IL-6 indukuje ekspresiju hemokina kao što su kao monocitni hemotaktički protein (MCP)-1 i privlači mononuklearne ćelije. To dovodi do rešavanja akutne inflamacije i do pokretanja adaptivnog imunološkog odgovora. Dakle, kod akutne inflamacije, IL-6 sa sIL-6R kompleksom podržava prelazak između ranog pretežno neutrofilnog stadijuma inflamacije i održivijeg priliva mononuklearnih ćelija, što na kraju takođe dovodi do rešavanja inflamacije.

[0040] Hronična inflamacije, poput Kronove bolesti (CD), ulceroznog kolitisa (UC), reumatoidnog artritisa (RA) ili psorijaze, histološki je povezana sa prisustvom mononuklearnih ćelija, kao što su makrofagi i limfociti, koji perzistiraju u tkivu nakon što su stečeni za rešavanje akutne inflamatorne faze. U modelima hroničnih inflamatornih bolesti, čini se da IL-6 ima štetnu ulogu pogodujući akumulaciji mononuklearnih ćelija na mestu povrede, kroz indukciju kontinuirane sekrecije MCP-1, angio-proliferacije i anti-apoptotičkih funkcija na T-ćelijama.

[0041] Inflamatorna bolest creva (IBD), naime CD ili UC, je hronično zapaljenje koje se javlja u crevima osetljivih osoba i za koje se veruje da su nezavisne od određenog patogena. Promene u epitelnoj sluzničkoj barijeri sa povećanom propustljivošću creva dovode do pojačane izloženosti imunološkog sistema sluzokože luminalnim antigenima, što uzrokuje neodgovarajuću aktivaciju crevnog imunog sistema kod pacijenata. Nekontrolisana aktivacija CD4+ T-limfocita sluznice sa uzastopnim prekomernim oslobađanjem proinflamatornih citokina izaziva patogeno gastrointestinalno zapaljenje i oštećenje tkiva. Postoji konsenzus da su glavne aktivirane imune ćelije uključene u patogenezu IBD crevne T-ćelije i makrofagi.

[0042] Pokazano je da je IL-6 centralni citokin u IBD kod ljudi. Utvrđeno je da pacijenti sa CD i UC proizvode povećani nivo IL-6 u poređenju sa kontrolom, pri čemu su nivoi IL-6 povezani sa kliničkom aktivnošću. Takođe je utvrđeno da CD pacijenti imaju povišene nivoe sIL-6R i, shodno tome, IL-6/sIL-6R kompleks u serumu. Mononuklearne ćelije lamine proprije dobijene iz hirurških uzoraka debelog creva od pacijenata sa CD i UC pokazale su da su i CD4+ T-ćelije i makrofagi proizvodile povećane količine IL-6 u poređenju sa kontrolama. Utvrđeno je da se sIL-6R oslobađa ispuštanjem sa površine makrofaga i mononuklearnih ćelija sa povećanom proizvodnjom povezanom sa povišenim nivoima IL-6. Kod pacijenata sa CD-om, mukozne T-ćelije pokazale su snažne dokaze za IL-6 transsignalizaciju sa aktivacijom STAT3, bcl-2 i bcl-xl. Blokada IL-6 trans-signalizacije izazvala je apoptozu T-ćelija, što ukazuje da sistem IL-6/sIL-6R posreduje u otpornosti T-ćelija na apoptozu u CD.

[0043] Dakle, kod pacijenata sa IBD, stečena akumulacija CD4+ T-ćelija koje promovišu bolest u lamina propria, što dovodi do produženja inflamacije, kritično zavisi od antiapoptotičkog trans-signaliziranja IL-6/sIL-6R. Veruje se da je dejstvom na kompleks IL-6/sIL-6R, ovde otkriveni polipeptidni dimer koristan u lečenju CD-a i drugih inflamatornih bolesti.

[0044] Prema tome, polipeptidni dimer prema pronalasku može da tretira stanja posredovana IL-6. Stanja posredovana IL-6 uključuju inflamatornu bolest ili rak. S tim u vezi, ovde opisani polipeptidi i sastavi mogu se davati ispitaniku koji ima inflamatornu bolest, kao što je juvenilni idiopatski artritis, Kronova bolest, kolitis (npr., kolitis koji nije povezan sa IBD, uključujući radijacioni kolitis, divertikularni kolitis, ishemični kolitis, infektivni kolitis, celiakija, autoimuni kolitis ili kolitis koji su posledica alergija koje pogađaju debelo crevo), dermatitis, psorijaza, uveitis, divertikulitis, hepatitis, sindrom iritabilnog creva (IBS), eritematozni lupus, nefritis, Parkinsonova bolest, ulcerozni kolitis, multipla skleroza (MS), Alchajmerova bolest, artritisa, reumatoidni artritis, astma i raznih kardiovaskularnih bolesti poput ateroskleroze i vaskulitisa. U određenim otelotvorenjima, inflamatorna bolest je izabrana iz grupe koju čine dijabetes, giht, periodični sindrom povezan sa kriopirinom i hronični opstruktivni plućni poremećaj.

[0045] Poželjno je da je inflamatorna bolest ili stanje posredovano IL-6 inflamatorna bolest creva, poželjno kada tretman indukuje remisiju inflamatorne bolesti creva. Poželjno je da je inflamatorna bolest creva Kronova bolest ili ulcerozni kolitis, poželjno pri čemu lečenje

1

održava remisiju inflamatorne bolesti creva. Poželjno je da je inflamatorna bolest ili stanje posredovano IL-6 reumatoidni artritis, psorijaza, uveitis ili ateroskleroza. Poželjno je da je inflamatorna bolest ili stanje posredovano IL-6 kolitis koji nije povezan sa inflamatornom bolešću creva, poželjno gde je kolitis radijacioni kolitis, divertikularni kolitis, ishemijski kolitis, infektivni kolitis, celiakija, autoimuni kolitis ili kolitis koji proističu iz alergija debelog creva.

[0046] Kod inflamatorne bolesti kao što je inflamatorna bolest creva, lečenje može obuhvatati remisiju stanja, održavanje remisije stanja ili oboje.

[0047] Druga otelotvorenja pružaju postupak lečenja, smanjenja ozbiljnosti ili prevencije karcinoma, uključujući, ali ne ograničavajući se na multipli mijelom, leukemiju plazme, karcinom bubrežnih ćelija, Kaposijev sarkom, rak debelog creva, karcinom želuca, melanom, leukemiju, limfom, gliom , multiformni glioblastom, rak pluća (uključujući, ali ne ograničavajući se, na nesitnoćelijski rak pluća (NSCLC; i adenokarcinom i karcinom skvamoznih ćelija)), ne-Hodgkinov limfom, Hodgkinova bolest, plazmacitom, sarkom, timom, rak dojke, rak prostate, hepatocelularni karcinom, rak bešike, rak materice, rak pankreasa, rak jednjaka, mozak, glava i vrat karcinomi, rak jajnika, rak grlića materice, rak testisa, rak želuca, rak jednjaka, hepatom, akutna limfoblastna leukemija (ALL), T-ALL, akutna mijelogena leukemija (AML), hronična mijelogena leukemija (CML) i hronična limfocitna leukemija (CLL), karcinomi pljuvačke ili drugi karcinomi.

[0048] Dalja otelotvorenja predmetnog obelodanjivanja pružaju postupak lečenja, smanjenja ozbiljnosti ili sprečavanja bolesti odabrane iz grupe koja se sastoji od sepse, resorpcije kostiju (osteoporoza), kaheksije, umora povezanog sa rakom, psorijaze, juvenilnog idiopatskog artritisa sa sistemskim početkom, sistemski eritematozni lupus (SLE), mezangijski proliferativni glomerulonefritis, hiper gamaglobulinemija, Kastlemanova bolest, IgM gamopatija, srčani miksom i autoimunski dijabetes zavisan od insulina.

[0049] Kako se ovde koristi, termini "lečenje", "lečiti" i "tretiranje" odnose se na preokretanje, ublažavanje, odlaganje početka ili inhibiranje napredovanja bolesti ili poremećaja, ili jednog ili više njihovih simptoma, kako je ovde opisano. U nekim otelotvorenjima, lečenje se može primeniti nakon što se razviju jedan ili više simptoma. U drugim otelotvorenjima, lečenje se može davati u odsustvu simptoma. Na primer, lečenje se može primeniti na osetljivu osobu pre pojave simptoma (npr., u svetlu istorije simptoma i/ili u svetlu genetskih ili drugih faktora osetljivosti). Lečenje se takođe može nastaviti nakon što simptomi nestanu, na primer da bi se sprečilo ili odgodilo njihovo ponavljanje.

[0050] Polipeptidni dimer prema pronalasku može se davati zajedno sa drugim aktivnim sredstvom. Drugo aktivno sredstvo može biti jedna ili više 5-aminosalicilne kiseline, azatioprina, 5-merkaptopurina i kortikosteroida. Režimi doziranja za primenu 5-aminosalicilne kiseline, azatioprina, 5-merkaptopurina i kortikosteroida dobro su poznati stručnjaku.

[0051] Polipeptidni dimeri se mogu dobiti, na primer, ekspresijom monomera, npr. monomeri koji sadrže SEQ ID NO: 1, u ćelijama. U primernom otelotvorenju, vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:2 se transfektira u ćelije.

Dizajn vektora ekspresije, uključujući odabir regulatornih sekvenci, može zavisiti od faktora kao što su izbor ćelije domaćina koja će se transformisati, nivo ekspresije željenog proteina i tako dalje. Regulatorne sekvence za ekspresiju ćelija domaćina sisara uključuju virusne elemente koji usmeravaju visok nivo ekspresije proteina u ćelijama sisara, poput promotora i/ili pojačivača izvedenih iz retrovirusnih LTR, citomegalovirus (CMV) (kao što je CMV promoter/pojačivač), Simian Virus 40 (SV40) (kao što je SV40 promoter/pojačivač), adenovirus (npr. Glavni kasni promotor adenovirusa (AdMLP)), poliomi i snažni promoteri sisara kao što su nativni promoteri imunoglobulina i aktina. Ćelija domaćin može biti ćelija sisara, insekata, biljaka, bakterija ili kvasca, poželjno je ćelija sisara kao što je CHO ćelija.

[0052] Transficirane ćelije su kultivisane da omoguće ćelijama da ekspresuju željeni protein. Zatim se sakupljaju ćelije i podloga za kulturu, a polipeptidni dimeri se prečišćavaju, na primer, hromatografskim kolonama (npr., MAbSelect Sure, SP Sepharose, Capto Q). Dimer se takođe može koncentrovati i/ili tretirati koracima virusne redukcije/inaktivacije. Dobijeni dimeri se zatim mogu koristiti za pripremu sastava, poželjno farmaceutskih sastava korisnih za terapiju.

POJAŠNJENJE

Primer 1

Ispitivanja životinja

Primer 1a

1

Farmakokinetika miševa

[0053] Četiri grupe sa 54 miša (27 mužjaka i 27 ženki) težine 25 - 38 g dobile su jednu dozu polipeptida sa SEQ ID NO: 1 u svom aktivnom dimerizovanom obliku ("Peptid 1") bilo od i.v. (3 mg/životinja) ili s.c. (0,3, 3 i 30 mg/životinja) injekcija.

[0054] Bioraspoloživost je bila približno 60%, a očigledna linearnost doze je primećena za AUC, AUCt i Cmax. Tmaxod 8-24 sata je bio očekivani za protein. Peptid 1 se polako izbacuje iz sistemske cirkulacije sa klirensom od 142 mL/dan/kg. Količine raspodele procenjene fazom eliminacije (Vz) i krivom prvog trenutka (Vss) bile su 397 mL/kg, odnosno 284 mL/kg, što ukazuje da je Peptid 1 raspoređen van vaskularnog korita. Krajnji polu-raspad bio je u rasponu od 1,3 - 2,3 dana.

Primer 1b

Farmakokinetici pacova

Davanje jedne doze

[0055] PK jedne doze Peptida 1 je ispitivan nakon i.v. i s.c. davanja kod dva različita soja pacova, Sprague Dawley (8 pacova/grupa) i Wistar (24 pacova/grupa), pokazujući donekle različite rezultate. Izgleda da su klirens (57, odnosno 93 ml/kg/dan) i zapreminska raspodela niži kod pacova Sprague Dawley, sa dvostruko većom bioraspoloživošću, 60%, u poređenju sa približno 30% kod pacova Wistar. Tmaxje primećen 0,5 - 1,5 dana nakon s.c. davanja, a terminalni polu-raspad bio je približno 2 dana, u rasponu od 1,7 - 2,7 dana, sa samo malim razlikama između dva načina davanja.

Ponavljanje doze

Intravenozno davanje

[0056] Pacovi (n=18) su primili i.v. bolus doze 10, 30 i 100 mg/kg/jednom dva puta nedeljno tokom 2 nedelje. Povećanje Cmaxi AUC nakon prvog davanja izgledalo je približno linearno. Međutim, čini se da je izloženost bila konstantno veća kod mužjaka nego kod ženki kod svih nivoa doze. Grupa od 100 mg/kg/prilika dostigla je nivo Cmaxod 2100 µg/mL za muške pacove i 1740 µg/mL za ženske pacove. Vrednosti AUCt bile su 942 i 642 dan×µg/mL.

[0057] Posle dve nedelje, sistemska izloženost Peptidu 1 kod pacova smanjila se za dozne grupe od 10 mg/kg i 30 mg/kg. Kako su odgovori na antitela na lekove (ADA) potvrđeni kod

1

svih životinja do 8. nedelje studije, smanjenje očekivane izloženosti tokom vremena može se pripisati klirensu Peptida 1 posredovanom od ADA.

Subkutano davanje

[0058] U 2- i 4-nedeljnoj ponovljenoj dozi s.c. ispitivanja, činilo se da se Cmaxi AUC nakon prvog davanja povećavaju približno linearno. Međutim, pri poslednjoj dozi primećena je znatno manja izloženost leku, verovatno zbog stvaranja antitela; sve testirane životinje su pokazale antitela prema Peptidu 1.

Primer 1c

Farmakokinetika majmuna Cynomolgus

Davanje jedne doze

[0059] PK jednokratno davanje Peptida 1 ispitivan je kod mužjaka i ženki majmuna cynomolgus u dozama od 0,1 - 100 mg/kg s.c. (n=4) i 1,0 mg/kg i.v (n=4). Bioraspoloživost je bila približno 60% nakon s.c. davanja sa tmax6 - 24 sata. Klirens je bio 98 mL/dan/kg, a zapreminska raspodela približno 70-90 mL/kg. Polu-raspad određeno nakon i.v. davanje je bilo 0,68 dana, i približno 1,5 dana nakon s.c. davanja.

Ponavljanje doze

[0060] Majmunima Cynomolgus dozirani su s.c. sa 2 (n=4), 10 (n=4), 50 (n=2) ili 100 (n=2) mg/kg peptida 1 dva puta nedeljno tokom 2 nedelje i sa 10 (n=4), 30 (n=4) ili 100 (n=4) mg/kg peptida 1 dva puta nedeljno tokom 4 nedelje. Izloženost pomoću Cmaxi AUC povećavala se približno dozi linearno, a slična izloženost i maksimalna koncentracija između prve i poslednje doze kod većih doza primećeni su nakon 2 nedelje. Međutim, nakon 4 nedelje, poslednja davana doza pokazala je manju izloženost leku u poređenju sa prvom primenom, verovatno zbog stvaranja antitela. Srednji polu-raspad Peptida 1 kretao se u rasponu od 1,0 - 1,8 dana za prvo davanje u različitim grupama lečenja sa kraćim poluraspadom posle poslednjeg davanja.

Primer 2

Kliničko ispitivanje 000067 (Jedna doza)

Dizajn

[0061] Ovo je bilo jednokratno, placebo kontrolisano, pojedinačno slepo, nasumično u okviru doze, paralelno grupno ispitivanje eskalacije doze. Ispitivanje je sprovedeno u dva dela, gde su 1. deo obuhvatale su zdrave osobe, a 2. deo su bili pacijenti sa CD u kliničkoj remisiji. Cilj je bio ispitati sigurnost i podnošljivost, i ako je moguće, dobiti znakove farmakoloških

1

efekata, nakon pojedinačnih doza Peptida 1.

[0062] U 1. delu su obuhvaćena 64 ispitanika, od kojih je 48 (44 muškarca, 4 žene) dobilo aktivno lečenje, a 16 (svi muškarci) placebo. Istraženo je sedam doza koje su primenjene kao i.v. infuzija tokom 30 minuta (0,75 mg, 7,5 mg, 75 mg) ili 1 sat (150 mg, 300 mg, 600 mg i 750 mg). Pored toga, 6 ispitanika je dobilo s.c. doza od 60 mg Peptid 1 i 2 ispitanici su dobili s.c. doza placeba. Peptid 1 je davan sa 15 mg/ml u 25 mM histidina, 200 mM saharoze i 0,1 mg/ml polisorbata 20.

[0063] U 2. delu obuhvaćena su 24 pacijenta, od kojih je 18 (11 muškaraca, 7 žena) dobilo aktivno lečenje (75 mg, 300 mg i 750 mg), a 6 (4 muškarca, 2 žene) placebo, a svima je davano kroz i.v.

Rezultati

[0064] Procena PK nakon i.v. davanja Peptida 1 pokazale su proporcionalnost doze i za AUC i za Cmaxu opsegu od 0,75 mg do 750 mg, a koncentracije Cmaxu plazmi u rasponu od 0,2 do 170 µg/ml (Sl.3). Klirens je bio približno 0,13 L/h, srednji terminalni polu-raspad oko.4,5 dana, a obim distribucije približno 20 L, a poslednji ukazuje na određenu ekstravaskularnu distribuciju. S.c. davanje 60 mg peptida 1 pokazala je Cmaxod 1,1 µg/mL tokom 2,3 dana i polu-raspad od 5,0 dana. Bioraspoloživost nakon s.c. izračunata je davanja Peptida 1 na približno 50%. Nije bilo indikacija da je dispozicija lekova posredovana ciljano.

[0065] I.v. davanje 75, 300 i 750 mg CD pacijentima u remisiji pokazala je vrlo slične rezultate kao i kod zdravih ispitanika (Sl.4). AUC i Cmaxbili su proporcionalni dozi sa koncentracijama Cmaxod 16, 76 i 186 µg/mL (16, 77 i 161 µg/mL za zdrave osobe). Klirens je bio približno 0,13 L/h, srednji terminalni polu-raspad oko.4,6 dana, a obim distribucije približno 22 L.

[0066] Sigurnosni profil Peptida 1 bio je povoljan sa nekoliko neželjenih događaja koji su se javili u svim lečenim grupama, uključujući i placebo grupu, a sve su bile blage ili umerene. Nisu primećeni očigledni trendovi u učestalosti ili učestalosti neželjenih događaja u vezi sa dozom. Infuzije su prekinute kod dva ispitanika, jednom zbog blagih (1. deo, grupa od 300 mg) i drugih zbog umerenih (2. deo, 75 mg grupa) infuznih reakcija.

[0067] Nije bilo očiglednih trendova vezanih za dozu niti promena u vezi sa lečenjem vitalnih

1

znakova, EKG-a ili parametara kliničke hemije (uključujući broj neutrofila, broj trombocita ili nivo C-reaktivnog proteina).

[0068] Jedan zdrav ispitanik u grupi od 300 mg pokazao je neutralizujuća nastala antitela protiv Peptida 1 tokom naknadne posete 5-6 nedelja nakon davanja.

[0069] Sve u svemu, Peptid 1 je bio siguran i dobro se podnosi kada se daje intravenozno do 750 mg kao pojedinačna i.v. doza, i na 60 mg kao jednokratna s.c. doza.

Primer 3

Kliničko ispitivanje 000115 (Više uzlaznih doza)

Dizajn

[0070] Ovo je bilo placebo kontrolisano, dvostruko slepo, u okviru nasumičnog, paralelnog grupnog ispitivanja sa grupom doza, sa ciljem da se ispita sigurnost, podnošljivost i farmakokinetika više uzlaznih doza Peptida 1. Istražene doze su bile 75, 300 i 600 mg peptida 1, davane jednom nedeljno, tokom 4 nedelje, i.v. infuzija tokom 30 minuta (75 mg) ili 1 sat (300 mg i 600 mg).

[0071] Uključena su dvadeset i četiri (24) zdrava ispitanika, od kojih je 18 (11 muškaraca i 7 žena) dobilo aktivno lečenje, a 6 (2 muškarca i 4 žene) placebo.

Rezultati

[0072] Procena PK pokazala je vrlo bliske karakteristike prvog i poslednjeg dana lečenja, i slične rezultatima u ispitivanju sa jednom dozom. AUC i Cmax bili su proporcionalni dozi nakon prvog i četvrtog doziranja sa koncentracijama Cmax od 19, 78 i 148 µg/mL nakon prve doze i 19, 79 i 142 µg/mL nakon četvrte doze (16, 77, i 161 µg/mL za jednu dozu kod zdravih ispitanika; Sl.5). Odgovarajuće najniže vrednosti bile su 0,66, 2,68, 4,56 µg/mL i 0,98, 3,95 i 7,67 µg/mL za tri nivoa doze. Srednji terminalni polu-raspad izračunat nakon poslednje doze bio je približno.5,5 dana.

[0073] Sigurnosni profil Peptida 1 bio je povoljan sa nekoliko neželjenih događaja koji su se javili u svim lečenim grupama, uključujući i placebo grupu, a sve su bile blage ili umerene. Nisu primećeni očigledni trendovi u učestalosti ili učestalosti neželjenih događaja u vezi sa dozom. Jedan ispitanik (grupa od 600 mg) povučen je zbog blagih reakcija infuzije.

1

[0074] Nije bilo očiglednih trendova vezanih za dozu niti promena u vezi sa lečenjem vitalnih znakova, EKG-a ili parametara kliničke hemije (uključujući broj neutrofila, broj trombocita ili nivo C-reaktivnog proteina).

[0075] Nijedan anti-peptid 1 antitela nije otkriven ni kod jednog od ispitanika.

[0076] Sve u svemu, Peptid 1 je bio siguran i dobro se podnosi kada se daje i.v. do 600 mg jednom nedeljno tokom 4 nedelje.

Primer 4

Modeliranje farmakokinetičkih podataka

[0077] Podaci PK iz ispitivanja 000115 mogu se adekvatno opisati pomoću strukturnog modela sa 2 odeljenja. Predviđeni profili od 75, 300 i 600 mg peptida 1 i posmatrani podaci prikazani su na Sl.6 i procenjeni srednji parametri PK navedeni su u Tabeli 1.

Tabela 1 Procene modela za peptid 1 pomoću strukturnog farmakokinetičkog modela sa 2 odeljka

[0078] Peptid 1 ima afinitet vezivanja za ljude od 130 pM za kompleks IL-6/sIL-6R. U dozama od 75-600 mg, nivo zauzetosti je veći od 90% u procenjenim nivoima stabilnog stanja Peptida 1 koristeći afinitet vezivanja (KD; 130pM) i IL-6/sIL-6R nivoi (Ctarget; 2.0 nM na osnovu sIL-6R).

Primer 5

Pripremanje Peptida 1

Kloniranje i ekspresija peptida 1 u CHO/dhfr - ćelije

[0079] CHO/dhfr<->ćelije su dobijene iz evropske kolekcije ćelijskih kultura (ECACC, br. 9406067). Prilepljenim CHO/dhfr<->ćelijama nedostaje dihidrofolat reduktaza (DHFR), enzim

2

koji katalizuje redukciju folata u dihidrofolat, a zatim u tetrahidrofolat. CHO/dhfr<->ćelije tako pokazuju osetljivost na antifolatni lek, metotreksat (MTX).

[0080] CHO/dhfr<->ćelijska linija je dobro okarakterisana i testirana. Sigurnost CHO/dhfr-roditeljske ćelijske linije kao ćelijskog supstrata za proizvodnju biofarmaka za ljudsku upotrebu potvrdio je ECACC (Porton Down, UK) za sterilnost mikroba, mikoplazmu i adventivne viruse prema 21 CFR.

Izbor i konstrukcija sekvence cDNK

[0081] Sekvenca cDNK monomera Peptida 1 (polipeptidna sekvenca SEQ ID NO: 1) sintetizovao je kao jedan DNK fragment GeneArt AG (Regensburg, Nemačka) koristeći sekvencu za vanćelijski domen gp130 (IL6ST, NCBI Gene ID 3572, varijanta transkripta 1 (NP_002175), aminokiseline 23-617) i Fc domen humanog IgGI (IGHG1, NCBI gen ID 3500, aminokiseline 221-447 prema Kabat EU numerisanju). Sekvenca je optimizovana za optimalnu upotrebu kodona u CHO ćelijama. Tri dobro okarakterisane tačkaste mutacije uvedene su u donji zglobni deo Fc dela.

[0082] Sekvenca cDNK je dalje modifikovana zamenom originalnog gp130 signalnog peptida mišjim IgG teškim lancem signalnog peptida poznate efikasnosti u sistemima za ekspresiju CHO ćelija. Signalni peptid se odvaja tokom sinteze proteina. Prisustvo sekvence IgG1 Cys-Pro-Pro-Cys u Fc regionu rezultira dimerizacijom dve identične gp130-Fc podjedinice preko sulfhidrilnih ostataka na Fc regionu, koji zajedno formiraju Peptid 1.

[0083] Sl.7 prikazuje nukleotidnu i aminokiselinsku sekvencu gp130-Fc podjedinice koja se koristi za formiranje Peptida 1.

Konstrukcija ekspresijskog plazmida za izbor glavne ćelijske banke (MCB)

[0084] Monomerna cDNK je klonirana u pANTVhG1 ekspresijski vektor (Antitope) koji sadrži dhfr gen za transfektantnu selekciju sa MTX kako sledi: Prvo, ekspresijski vektor je digestiran sa MluI i EagI restrikcionim enzimima da bi se omogućilo umetanje Peptid 1 cDNK. Drugo, region kodiranja monomera je PCR amplifikovan upotrebom prajmera OL1425 i OL1426 (Tabela 2) i digestiran sa MluI i EagI restrikcionim enzimima. Treće, svareni fragmenti su prečišćeni gelom i podvezani zajedno da bi se dobio pFER02 ekspresijski vektor. Monomerna cDNK je ubačena pod kontrolu promotora citomegalovirusa (CMV).

[0085] Tabela 3 predstavlja funkciju elemenata izraza pFER02. Sl. Slika 8 predstavlja nukleotidne sekvence ekspresijskih elemenata pFER02.

Tabela 2 Oligonukleotidne sekvence koje se koriste za pojačavanje oblasti kodiranja monomera za kloniranje u pANTVhGl

Proces izbora ćelijske linije koji vodi do konačnog klona koji proizvodi Peptid 1

[0086] Vektor pFER02 linearizovan je restrikcionim enzimom tupog kraja SspI, koji ima jedno mesto prepoznavanja smešteno u genu beta-laktamaze. Linearizovani plazmid je transfektovan u ćelije 5 x 10<6>CHO/dhfr-ćelija primenom transfekcije posredovane lipidima. Dvadeset i četiri sata nakon transfekcije, transfektovane ćelije su odabrane u medijumu sa dodatkom 5% dijalizovanog fetalnog telećeg seruma (FCS) i 100 nM metotreksata (MTX). Transficirane ćelije su razblažene u ovom medijumu pri različitim gustinama i raspodeljene u ploče sa kulturama tkiva sa ravnim dnom sa 96 udubljenja. Ćelije su zatim inkubirane u vlažnoj atmosferi na 5% CO2i 37°C. Svež MTX medijum za odabir je dodat u redovnim intervalima tokom vremena inkubacije kako bi se osiguralo da nivoi MTX i nivoi hranljivih sastojaka ostanu konstantni.

Početni izbor ćelijske linije sa MTKS izborom

[0087] Nekoliko nedelja nakon transfekcije, ploče sa tkivima za kulturu su ispitivane pomoću Genetix CloneSelect® Imager i primećeno je da > 2000 udubljenja imaju aktivno rastuće kolonije. Supernatanti iz ovih jažica su uzorkovani i ispitani na titar Peptida 1 pomoću ELISA. Na osnovu rezultata ovog ispitivanja, ukupno 105 udubljenja sa najboljom ekspresijom prošireno je u ploče sa 48 udubljenja. Ukupno 83 ćelijske linije su odabrane za širenje u ploče sa 6 udubljenja ili u boce T-25; uzorkovan je supernatant iz svake od ćelijskih linija i ispitan je titar peptida 1 (ELISA). Na osnovu ovih rezultata, izabrano je 54 ćelijskih linija koje najbolje izražavaju sa optimalnim karakteristikama rasta za ekspanziju u boce T-75 ili T-175; uzorkovani su supernatanti iz slivnih boca i kvantifikovani su titri Peptida 1 (ELISA). Poređenje nivoa ekspresije između ćelijskih linija omogućilo je identifikaciju 38 najboljih ćelijskih linija koje su odabrane za analizu produktivnosti. Produktivnost je procenjena na sledeći način:

Gde je:

Th je titar žetve [µg/mL]

Ti je početni titar [µg/mL]

Vh je broj održivih ćelija u žetvi [x 10<6>ćelija/mL]

Vi je početni broj održivih ćelija [x 10<6>ćelija/mL]

Vreme je proteklo vreme (dani) između Ti i Th

Na osnovu rezultata produktivnosti (pg/ćelija/dan), odabrano je 13 ćelijskih linija za amplifikaciju gena.

MTX-vođeno pojačavanje gena za izbor ćelijske linije Peptida 1

[0088] 13 izabranih ćelijskih linija izabrano je za prvi krug amplifikacije gena selektivnim pritiskom pod rastućim koncentracijama MTKS (0,1-50 M). Posle 7-10 dana, uzorkovan je supernatant iz svakog udubljenja iz svake od 13 ćelijskih linija i ispitan je titar Peptida 1 (ELISA). Udubljenja iz svake ćelijske linije sa visokim nivoom ekspresije Peptida 1 procenjeni su za produktivnost (pg/ćelija/dan). Pokrenut je drugi krug amplifikacije gena sa

2

ukupno 16 udubljenja iz ćelijskih linija koje su pokazale značajno povećanje produktivnosti.

[0089] Drugi krug amplifikacije gena sproveden je u prisustvu povećanih koncentracija MTX; supernatanti iz svake kulture su analizirani na titar peptida 1 (ELISA). Proširena su odabrana udubljenja iz svake ćelijske linije i procenjena je produktivnost (pg/ćelija/dan); identifikovano je pet ćelijskih linija sa povećanom produktivnošću kao odgovor na povećani MTX selekcioni pritisak. Ovih pet ćelijskih linija napredovalo je do trećeg kruga amplifikacije gena korišćenjem selekcionog pritiska pod povećanom koncentracijom MTX; supernatanti iz svakog udubljenja su analizirani na titar Peptida 1 (ELISA). Proširena su odabrana udubljenja za svaku ćelijsku liniju i procenjena je produktivnost (pg/ćelija/dan); izabrano je pet ćelijskih linija koje pokazuju visoku ekspresiju Peptida 1.

Ograničavanje razblaživanja klonova

[0090] Kloniranje graničnog razblaženja je izvedeno na pet ćelijskih linija koje pokazuju ekspresiju Peptida 1. Nakon nedelju dana inkubacije, ploče su ispitane pomoću Genetix CloneSelect® Imager i identifikovane su pojedinačne kolonije. Zapaženo je da su stope rasta dve ćelijske linije tokom razblaživanja klonirane posebno sporo, pa su ove ćelijske linije prekinute. Ukupno je od tri preostale ćelijske linije odabrano 58 kolonija klonova za ekspanziju, prvo u ploče sa 48 udubljenja, a zatim sukcesivno proširene kroz ploče sa 12 udubljenja, T-25 boce i T-75 boce u odsustvu MTX. Zatim je procenjen svaki od 58 odabranih klonova za produktivnost (pg/ćelija/dan); Izabrano je 16 klonova za adaptaciju suspenzije i prilagođavanje rastu u hemijski definisanom medijumu.

Prilagođavanje ćelijskih linija kulturi suspenzije u hemijski definisanom medijumu [0091] Šesnaest ćelijskih linija prilagođeno je suspenzivnoj kulturi u hemijski definisanom medijumu na sledeći način: odabrane ćelijske linije u kulturi adherenta su prvo prilagođene suspenziji u medijumu za rast CHO suspenzije (DMEM visoka glukoza, uključujući L-glutamin i natrijum piruvat, 5% dijalizovani FCS, 20 mg/L L-prolin, 1 x penicilin/streptomicin, 1 % pluronika F68), a zatim u hemijski definisanom medijumu za rast suspenzije (CD Opti-CHO® kompanije Life Technologies Ltd. (Paisley, UK), 2,5% dijalizovanog FCS, 0,1 x penicilina/streptomicina, 8 mM Glutamax®).

[0092] Jednom prilagođene suspenzijskoj kulturi, ćelijske linije su odvojene u fazama u hemijski definisan medijum za rast suspenzije bez seruma (CD Opti-CHO®, 0,1 x penicilin/streptomicin, 8 mM Glutamax®). MTX je izostavljen iz svih kultura suspenzije. Prilagođene linije su proširene i pripremljene su banke ćelijskih ćelija. Ukratko, ćelije su proširene na 300 mL ukupne zapremine i sakupljene kada je gustina ćelija premašila 0,85 x 10<6>ćelija/mL, a vitalnost je bila > 90%. Sledeće 3 x 10<7>ćelija su zasejane u svežu tikvicu koja sadrži 70 mL medijuma za rast suspenzije radi analize rasta i produktivnosti. Preostale ćelije su sakupljene centrifugiranjem i resuspendovane u odgovarajućoj zapremini medijuma za zamrzavanje da bi se dobila ćelijska suspenzija od 1 x 10<7>ćelija/mL. Bočice su zamrznute do -80°C. Banka ćelija je zatim prebačena u tečni azot radi dugotrajnog skladištenja.

[0093] 16 ćelijskih linija je dalje rafinirano na 5 klonova nakon adaptacije bez seruma. 5 klonova je procenjeno na rast (gustina ćelija i vreme udvostručavanja ćelija) i produktivnost (pg/ćelija/dan), nakon čega su izabrana 3 klona. Jedan klon je izabran da napravi glavnu banku ćelija.

[0094] Izvršena je priprema glavne banke ćelija (MCB) i banke aktivnih ćelija (WCB). Jedna bočica iz zalihe predsemena je korišćena za pripremu MCB od 200 bočica, a jedna bočica MCB je korišćena za pripremu WCB od 200 bočica. U svakom slučaju, bočica je odmrznuta i medijum za krioprezervaciju uklonjen centrifugiranjem. Ćelije su resuspendovane i razmnožene u zapremini u medijumu za rast (CD OptiCHO®/4 mM L-glutamin). Četiri prolaza izvedena su tokom stvaranja MCB, a šest odlomaka tokom stvaranja WCB.

[0095] Kada se dobije dovoljno ćelija, ćelije su alikvotisane u mediju za krioprezervaciju (92,5% CD OptiCHO®/7,5% DMSO) u bočice od polipropilena (svaka sadrži približno 1,5 x 10<7>održivih ćelija) i krioprezervirane smanjenjem temperature na -100 ° C tokom perioda od najmanje 60 minuta u postupnom zamrzavanju. Bočice se čuvaju u ambalaži za automatsko punjenje tečnim azotom u parnoj fazi u GMP kontrolisanom području.

Opis procesa proizvodnje lekovite supstance (DS)

[0096] Kratki opis procesa proizvodnje Peptida 1 DS je sledeći. Ćelije iz bočice sa WCB oživljavaju se i postupno proširuju pomoću medijuma bez proteina pre inokulacije u proizvodni bioreaktor. Po završetku ćelijske kulture, ćelije i ostaci ćelija se uklanjaju filtriranjem kulture.

[0097] Prečišćavanje se sastoji od tri koraka hromatografske kolone (MAbSelect Sure, SP Sepharose, Capto Q ili Sartobind Phenil), koraka koncentracije i dijafiltracije i uključuje dva specifična koraka virusne redukcije/inaktivacije; Treton Triton X-100 (inaktivacija virusa sa ovojnicom) i korak nanofiltracije (uklanjanje virusa sa ovojnicom i bez ovojnice).

2

[0098] Nakon koncentracije i dijafiltracije, dodaju se pomoćni sastojci za formulaciju DS. Formulirani peptid 1 je 0,22 µm filtriran u kontejnere.

Opis i sastav leka (DP)

[0099] DP je sterilni rastvor koji treba davati pomoću i.v. infuzije. DP se sastoji od peptida 1 u koncentraciji od 15 mg/mL u izotoničnom rastvoru koji sadrži 25 mM L-histidina, 200 mM saharoze i 0,1 mg polisorbata 20/ml pri pH 7,6. Bočice su prekrivene azotom radi zaštite od oksidacije. Proizvod je namenjen za jednokratnu upotrebu i skladištenje na -20°C do odmrzavanja za kliničko davanje.

Sastav i serijska formula

[0100] Serijska formula za lek je predstavljena u Tabeli 4.

Tabela 4 Sastav DP serije

2

�

Claims

Patentni zahtevi

1. Polipeptidni dimer koji sadrži dva monomera, od kojih svaki monomer ima najmanje 90% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO:1, gde monomeri sadrže gp130 D6 domen koji odgovara aminokiselinama na pozicijama 585-595 SEQ ID NO:1, Fc domenski zglobni region koji sadrži aminokiseline na položajima 609-612 SEQ ID NO:1, i monomeri ne sadrže vezu između dela gp130 i Fc domena, za upotrebu u lečenju inflamatorne bolesti ili stanja posredovanog IL-6 kod čoveka, pri čemu se polipeptidni dimer daje u dozi od 60 mg do 1 g.

2. Polipeptidni dimer koji sadrži dva monomera, od kojih svaki monomer ima najmanje 90% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO:1, gde monomeri sadrže gp130 D6 domen koji odgovara aminokiselinama na pozicijama 585-595 SEQ ID NO:1, region šarke Fc domena koji sadrži aminokiseline na položajima 609-612 SEQ ID NO:1 i monomeri ne sadrže vezu između dela gp130 i Fc, za upotrebu u lečenju stanja posredovanog IL-6 kod čoveka bez značajnog smanjenja broja neutrofila, broja trombocita i/ili nivoa C-reaktivnog proteina ili bez smanjenja broja neutrofila , broj trombocita i/ili nivo C-reaktivnog proteina ispod normalnog opsega kod zdravih ispitanika ili pacijenata koji pate od stanja posredovanog IL-6, pri čemu se polipeptidni dimer primenjuje svakih 7-20 dana, poželjno gde se daje polipeptidni dimer u dozi od 60 mg do 1 g.

3. Polipeptidni dimer za upotrebu u postupku prema patentnom zahtevu 1 ili 2, gde monomeri imaju SEQ ID NO:1.

4. Polipeptidni dimer za upotrebu u postupku prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3, gde je doza od 60 mg do 600 mg.

5. Polipeptidni dimer za upotrebu u postupku prema patentnom zahtevu 1, gde se polipeptidni dimer daje na svakih 7-60 dana, poželjno na svakih 7-30 dana.

6. Polipeptidni dimer za upotrebu u postupku prema patentnom zahtevu 5, gde se polipeptidni dimer daje svakih 7-20 dana.

7. Polipeptidni dimer za upotrebu u postupku prema patentnom zahtevu 1 ili 2, gde se polipeptidni dimer daje na svakih 7 dana ili na svakih 14 dana.

8. Polipeptidni dimer za upotrebu u postupku prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde se polipeptidni dimer daje parenteralno, poželjno intravenozno ili subkutano.

9. Polipeptidni dimer za upotrebu u postupku prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde je inflamatorna bolest ili stanje posredovano IL-6 inflamatorna bolest creva, poželjno gde je inflamatorna bolest creva Kronova bolest ili ulcerozni kolitis.

10. Polipeptidni dimer za upotrebu u postupku prema patentnom zahtevu 9, gde tretman indukuje ili održava remisiju inflamatornih bolesti creva.

11. Polipeptidni dimer za upotrebu u postupku prema bilo kom od patentnih zahteva 1-8, gde je inflamatorna bolest ili stanje posredovano IL-6 reumatoidni artritis, psorijaza, uveitis ili ateroskleroza.

12. Polipeptidni dimer za upotrebu u postupku prema patentnom zahtevu 9, gde je inflamatorna bolest ili stanje posredovano IL-6 kolitis koji nije povezan sa inflamatornom bolesti creva.

13. Polipeptidni dimer za upotrebu u postupku prema patentnom zahtevu 12, gde je kolitis radijacioni kolitis, divertikularni kolitis, ishemijski kolitis, infektivni kolitis, celijakija, autoimuni kolitis ili kolitis koji su posledica alergija koje pogađaju debelo crevo.

14. Polipeptidni dimer za upotrebu u postupku prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde se broj neutrofila, broj trombocita i/ili nivo C-reaktivnog proteina održava u fiziološki normalnom opsegu nakon davanja polipeptidnog dimera.

15. Polipeptidni dimer za upotrebu u postupku prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde tretman dalje obuhvata davanje drugog aktivnog sredstva, poželjno gde je drugo aktivno sredstvo 5-aminosalicilna kiselina, azatioprin, 5-merkaptopurin ili kortikosteroid.