RS61976B1 - Postupci i kompozicije za određivanje dnk profila - Google Patents

Postupci i kompozicije za određivanje dnk profila

Info

Publication number
RS61976B1
RS61976B1 RS20210751A RSP20210751A RS61976B1 RS 61976 B1 RS61976 B1 RS 61976B1 RS 20210751 A RS20210751 A RS 20210751A RS P20210751 A RSP20210751 A RS P20210751A RS 61976 B1 RS61976 B1 RS 61976B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
primers
nucleic acid
amplification
snp
dna
Prior art date
Application number
RS20210751A
Other languages
English (en)
Inventor
Kathryn M Stephens
Cydne Holt
Carey Davis
Anne Jager
Paulina Walichiewicz
Yonmee Han
David Silva
Min-Jui Richard Shen
Sasan Amini
Frank Steemers
Original Assignee
Illumina Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Illumina Inc filed Critical Illumina Inc
Publication of RS61976B1 publication Critical patent/RS61976B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2522/00—Reaction characterised by the use of non-enzymatic proteins
    • C12Q2522/10—Nucleic acid binding proteins
    • C12Q2522/101—Single or double stranded nucleic acid binding proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
    • C12Q2525/10—Modifications characterised by
    • C12Q2525/155—Modifications characterised by incorporating/generating a new priming site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
    • C12Q2525/10—Modifications characterised by
    • C12Q2525/161—Modifications characterised by incorporating target specific and non-target specific sites
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
    • C12Q2525/10—Modifications characterised by
    • C12Q2525/191—Modifications characterised by incorporating an adaptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
    • C12Q2525/10—Modifications characterised by
    • C12Q2525/204—Modifications characterised by specific length of the oligonucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2527/00—Reactions demanding special reaction conditions
    • C12Q2527/107—Temperature of melting, i.e. Tm
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2537/00—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature
    • C12Q2537/10—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature the purpose or use of
    • C12Q2537/143—Multiplexing, i.e. use of multiple primers or probes in a single reaction, usually for simultaneously analyse of multiple analysis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Description

Opis
OBLAST PRONALASKA
[0001] Primeri izvođenja koji su obezbeđeni u ovom dokumentu odnose se na postupke i kompozicije za određivanje DNK profila. Neki primeri izvođenja se odnose na postupke za amplifikaciju ciljnih sekvenci varirajućih veličina u jednoj reakciji, koji su praćeni naknadnim sekvenciranjem biblioteke.
OSNOV PRONALASKA
[0002] Istorijski gledano, upotreba podgrupe markera u ljudskom genomu korišćena je za određivanje ličnog identiteta pojedinca, ili DNK otiska prsta ili profila. Ovi markeri uključuju lokacije ili lokuse kratkih tandemskih ponovaka (STR ponovci) i srednjih tandemskih ponovaka (ITR ponovci), koje su u kombinaciji korisne za razlikovanje jedne jedinke od druge na genetskom nivou. Analiza ovih markera postala je standardizovana u analizi DNK koja se pronađenalazi na mestima zločina. Na primer, u Sjedinjenim Državama je nekoliko ovih ponovljenih sekvenci kombinovano da bi se stvorio Sistem indeksiranja kombinovane DNK (CODIS), koji služi kao laboratorijski standard za određivanje DNK profila u krivičnim predmetima. Druge zemlje su na sličan način usvojile standardni sistem za određivanje DNK profila. Ovi sistemi se takođe koriste za utvrđivanje očinstva i porodičnih odnosa. Međutim, svi aktuelni sistemi se zasnivaju na razdvajanju ovih ponovljenih lokusa na nekom elektroforetskom sistemu, prema veličini, i zbog toga su ograničeni na neki broj lokusa koji može da se razlikuje u takvom sistemu. Na primer, neki od aktuelnih komercijalnih sistema za određivanje DNK profila u forenzičke svrhe razlikuju samo 16 markera zbog ograničenja metoda elektroforetske detekcije.
[0003] WO2006/004659A1 opisuje postupke za genotipizaciju uzorka koji sadrži nukleinsku kiselinu, pri čemu ti postupci uključuju analizu STR i SNP lokusa. WO2012/155084A1 opisuje postupke za multipleks PCR amplifikaciju STR lokusa koje se mogu koristiti za brzo generisanje specifičnog STR profila na osnovu ciljnih nukleinskih kiselina. Rook et al., Am. J. Pathol., 164(1), 2004, 23-33, opisuje postupak za amplifikaciju celog genoma kojim se amplifikuje DNK iz ćelija kancera koje su dobijene laserskom mikrodisekcijom u cilju brze SNP i STR genotipizacije u kratkom vremenu. Fraige et al., Brazilian Archives of Biology and Technology, 56(2), 2013, 213-221, opisuje analizu sedam humanih STR lokusa za utvrđivanje očinstva upotrebom elektroforeze na mikročipu. Teemu et al., Nature Methods, 9(1), 2012, 72-74, opisuju postupak za kariotipizaciju na nivou genoma kod ljudi i sekvenciranje mRNK na nivou genoma kod Drosophila melanogaster koristeći jedinstvene molekulske identifikatore u cilju razlikovanja svakog molekula u populaciji.
KRATAK OPIS PRONALASKA
[0004] Primeri izvođenja se odnose na postupke koji nisu ograničeni sadržajem i koji objedinjuju različite genetske informacije o jednom pojedincu kako bi se dobio sveobuhvatan, potpuniji DNK profil pojedinca. Predmetni prikaz opisuje postupke i kompozicije koje omogućavaju ovaj profil pojedinca, čime se unapređuju polja lične i forenzičke genomike.
[0005] Za određivanje DNK profila trenutno se koriste odabrani biološki markeri za određivanje identiteta DNK uzorka. Na primer, najčešća analiza za određivanje DNK profila je određivanje profila za niz kratkih tandemskih ponovaka (STR) koji se nalaze u genomu organizma. Analiza se sastoji od amplifikacije definisanih STR ponovaka dužine do 400 bp koji mogu da se razlikuju po veličini na elektroforetskom gelu ili upotrebom kapilarne elektroforeze (CE). Elektroforeza se koristi za detektovanje promena veličine usled razlika u broju ponovljenih STR sekvenci na datom lokusu i, usled toga, dužine PCR amplikona, koja za CE sistem iznosi između 50-500 bp. Da bi se pomoglo u prevazilaženju ograničenja koja nameću metodologije za razlikovanje veličina (tj. STR ponovci kod kojih se veličina amplikona preklapa ne mogu da se razlikuju), u aktuelnim postupcima za određivanje DNK profila koriste se različiti skupovi obeleženih prajmera, tako da se amplikoni koji se preklapaju po veličini mogu obeležiti različitim fluorescentnim bojama, pri čemu se, nakon pobuđivanja, emisioni spektri razlikuju, čime je omogućeno diferenciranje amplikona koji se preklapaju, koristeći razlike u spektru pobuđivanja i emisije boje. Koristeći diferencirano obeležavanje, aktuelni postupci omogućavaju multipleksiranje 24 različita STR lokusa upotrebom 6 različitih boja koje se detektuju u jednom ciklusu određivanja DNK profila.
[0006] Postoje mnoga ograničenja aktuelnih metodologija za određivanje DNK profila. Kao što je prethodno pomenuto, sistemi za diferenciranje po veličini ograničavaju broj lokusa koji mogu posebno da se odrede u datom trenutku. Sledeće ograničenje uspostavljenih metoda za određivanje DNK profila je to što se DNK koja se analizira često degraduje i opseg veličine nekih markera ne obuhvata degradovanu DNK, na primer, amplikoni mogu da budu veći od veličine fragmenata degradovane DNK. Za degradovanu DNK, amplikoni od 400 bp smatraju se veoma dugim i mogu da dovedu do gubitka amplifikacije tih dužih lokusa. Kada DNK analitičari amplifikuju degradovane uzorke DNK kako bi identifikovali njihov STR profil, na primer uzorak pronađen na mestu zločina, često nisu u stanju da detektuju sve lokuse što rezultira delimičnim profilom koji može dovesti do toga da poklapanje osumnjičenog sa mestu zločina sa kriminalističkim uzorkom bude teško ili nemoguće. Po pravilu, sa takvim uzorcima, DNK analitičar nema mnogo izbora i ako bilo koja količina uzorka preostane, neophodno je izvođenje dodatnih testova kako bi se identifikovali drugi markeri koji bi mogli da ukažu na identitet pojedinca, kao što su polimorfizmi pojedinačnih nukleotida (SNP poimorfizmi), mini-STR ponovci ili analiza mitohondrijalne DNK (mtDNK). Međutim, dragoceni uzorak se onda troši u svakom testu bez ikakve sigurnosti da pojedinac na kraju može uspešno da se identifikuje. SL.
1A prikazuje potencijalne različite puteve do identifikacije DNK, od kojih svaki predstavlja zaseban radni tok i zahteva alikvot dragocenog uzorka. Kada je neophodno kombinovanje jednog ili više jednostavnih radnih tokova i potencijalno višekratno ponavljanje, tada rezultujući postupak više nije jednostavan ili upotreba dragocenog uzorka nije efikasna.
[0007] Prikazi u predmetnoj patentnoj prijavi obezbeđuju postupke, kompozicije i sisteme za određivanje DNK profila individue ili organizma putem sekvenciranja naredne generacije (NGS) čime se obezbeđuje rešenje za probleme i ograničenja aktuelnih metodologije za određivanje DNK profila. SL. 1B prikazuje tipičan radni tok postupaka prikazanih u jednom primeru izvođenja. U ovom dokumentu su prikazani postupci i kompozicije za kombinovanje brojnih forenzički relevantnih markera u jedan test, uključujući, ali ne i ograničeno na, kratke tandemske ponovke (STR ponovle), srednje tandemske ponovke (ITR ponovke), polimorfizme pojedinačnih nukleotida koji daju informaciju o identitetu (iSNP ponovci), polimorfizme pojedinačnih nukleotida koji daju informaciju o poreklu (aSNP ponovci), polimorfizme pojedinačnih nukleotida koji daju informaciju o fenotipu (pSNP ponovci).
[0008] Ovo otkriće opisuje testove koji prevazilaze ograničenja trenutnih metodologija za DNK profilisanje. Otkrivena izvođenja pružaju metode za multipleks amplifikaciju, pripremu biblioteke i sekvenciranje kombinovanih STR, ITR, iSNP, aSNP i pSNP iz jednog uzorka nukleinske kiseline u jednoj multipleks reakciji. Otkrivene metode analiziraju mnoštvo markera u jednom eksperimentalnom testu uz minimalno rukovanje uzorkom, koristeći male količine DNK uzorka, uključujući degradiranu DNK. Neke opisane realizacije mogu da se koriste za DNK profile za baze podataka i / ili DNK profile koji se mogu koristiti za krivične postupke. Neki primeri izvođenja pružaju PCR metode i kompozicije razvijene da budu dovoljno osetljive da otkriju pod-nanogramske količine DNK. Dalje, nekonvencionalni parametri dizajna prajmera omogućavaju visoko multipleksirani PCR za identifikaciju STR, YTR i SNP u jednoj multipleksnoj reakciji. Za krivični rad, sadašnje metode i kompozicije uključuju jedinstvene identifikatore molekula (UMI) koji pomažu u uklanjanju, na primer, grešaka u PCR reakciji sekvenciranju, staterima i slično iz rezultata sekvenciranja. Videti Kivioja i sar., Nat. Meth. 9, 72-74 (2012). Takođe, rezultati ovde opisanih metoda i sastava su kompatibilni sa postojećim bazama podataka.
[0009] Prema tome, ovde otkrivena izvođenja pružaju metode za konstruisanje DNK profila koji sadrže: obezbeđivanje uzorka nukleinske kiseline, pojačavanje uzorka nukleinske kiseline sa mnoštvom prajmera koji se specifično hibridizuju u najmanje jednu ciljnu sekvencu koja sadrži jedan nukleotidni polimorfizam (SNP) i najmanje jedna ciljna sekvenca koja sadrži tandemski ponavljač u multipleksnoj reakciji radi generisanja produkata amplifikacije i određivanje genotipova najmanje jednog SNP ponovka i najmanje jednog tandemskog ponavljanja u produktima amplifikacije, čime se konstruiše DNK profil uzorka nukleinske kiseline.
[0010] U nekim primerima izvođenja, metode obuhvataju kreiranje biblioteke nukleinske kiseline od proizvoda amplifikacije. U nekim primerima izvođenja, metode obuhvataju određivanje sekvenci biblioteke nukleinske kiseline. U nekim primerima izvođenja, uzorak nukleinske kiseline je od čoveka. U nekim primerima izvođenja, uzorak nukleinske kiseline je iz uzorka iz okoline, biljke, životinje koja nije čovek, bakterije, arhee, gljive ili virusa. U nekim primerima izvođenja, DNK profil se koristi za jednu ili više dijagnostike ili prognoze bolesti, identifikacije biomarkera raka, identifikacije genetske anomalije ili analize genetske raznolikosti. U nekim primerima izvođenja, DNK profil se koristi za jedno ili više bankarskih podataka, forenzike, krivičnih dela, očinstva ili lične identifikacije. U nekim primerima izvođenja, najmanje jedan SNP ukazuje na poreklo ili fenotipsku karakteristiku izvora uzorka nukleinske kiseline. Svaki od više prajmera ima nisku temperaturu topljenja i ima dužinu od najmanje 24 nukleotida. U nekim primerima izvođenja, svaki od više prajmera ima temperaturu topljenja manju od 60 stepeni C. Svaka od više prajmera ima dužinu od najmanje 24 nukleotida. U nekim primerima izvođenja, svaki od više prajmera ima dužinu od 24 nukleotida do oko 38 nukleotida. U nekim primerima izvođenja, svaki od više prajmera sadrži homopolimernu nukleotidnu sekvencu. U nekim primerima izvođenja, uzorak nukleinske kiseline se pojačava lančanom reakcijom polimeraze (PCR). U nekim primerima izvođenja, uzorak nukleinske kiseline se amplifikuje u puferu za amplifikaciju koji ima koncentraciju soli koja je povećana u poređenju sa koncentracijom soli pufera za amplifikaciju koji se koristi zajedno sa konvencionalno dizajniranim prajmerima. U nekim primerima izvođenja, so sadrži KCl, LiCl, NaCl ili njihovu kombinaciju. U nekim primerima izvođenja, so sadrži KCl. U nekim primerima izvođenja, koncentracija KCI u puferu za amplifikaciju je oko 100 mM do oko 200 mM. U nekim primerima izvođenja, koncentracija KCl u puferu za amplifikaciju je manja od oko 150 mM. U nekim primerima izvođenja, koncentracija KCl u puferu za amplifikaciju je oko 145 mM. U nekim primerima izvođenja, SNP je SNP porekla, fenotipski SNP, identitet SNP ili njihova kombinacija. U nekim primerima izvođenja, mnoštvo prajmera posebno hibridizuje na najmanje 30 SNP. U nekim primerima izvođenja, mnoštvo prajmera posebno hibridizuje na najmanje 50 SNP. U nekim primerima izvođenja, tandemsko ponavljanje je kratko tandemsko ponavljanje (STR), srednje tandemsko ponavljanje (ITR) ili njegova varijanta. U nekim primerima izvođenja, mnoštvo prajmera posebno se hibridizuje u najmanje 24 tandemske sekvence za ponavljanje. U nekim primerima izvođenja, veći broj prajmera se hibridizuje u najmanje 60 tandemskih sekvenci za ponavljanje. U nekim primerima izvođenja, uzorak nukleinske kiseline sadrži oko 10 pg do oko 100 pg DNK. U nekim primerima izvođenja, uzorak nukleinske kiseline sadrži oko 5 pg do oko 10 pg DNK. U nekim primerima izvođenja, uzorak nukleinske kiseline sadrži genomsku DNK. U nekim primerima izvođenja, genomska DNK je iz forenzičkog uzorka. U nekim primerima izvođenja, genomska DNK sadrži degradiranu DNK. U nekim primerima izvođenja utvrđuje se najmanje 50% genotipova najmanje jednog SNP-a i najmanje jednog tandemskog ponavljanja. U nekim primerima izvođenja utvrđuje se najmanje 80% genotipova najmanje jednog SNP polimorfizma i najmanje jednog tandemskog ponavljanja. U nekim primerima izvođenja, određuje se najmanje 90% genotipova najmanje jednog SNP polimorfizma i najmanje jednog tandemskog ponavljanja. U nekim primerima izvođenja, određuje se najmanje 95% genotipova najmanje jednog SNP polimorfizma i najmanje jednog tandemskog ponavljanja. U nekim primerima izvođenja, svaki od više prajmera sadrži jednu ili više sekvenci oznaka. U nekim primerima izvođenja, jedna ili više sekvenci oznaka sadrže osnovnu oznaku, oznaku za hvatanje, oznaku za sekvenciranje, jedinstvenu oznaku molekularnog identifikatora ili njihovu kombinaciju. U nekim primerima izvođenja, jedna ili više sekvenci oznaka sadrže osnovnu oznaku. U nekim primerima izvođenja, jedna ili više sekvenci oznaka sadrže jedinstvenu oznaku molekularnog identifikatora.
[0011] Ova otkrića pružaju metode za izgradnju biblioteke nukleinske kiseline koja obuhvata: obezbeđivanje uzorka nukleinske kiseline i pojačavanje uzorka nukleinske kiseline sa mnoštvom prajmera koji se specifično hibridizuju u najmanje jednu ciljnu sekvencu koja sadrži jedan nukleotidni polimorfizam (SNP) i najmanje jedna ciljna sekvenca koja sadrži tandemsku sekvencu ponavljanja u multipleksnoj reakciji da bi se proizveli proizvodi amplifikacije.
[0012] U nekim primerima izvođenja, uzorak nukleinske kiseline nije fragmentiran pre amplifikacije. U nekim primerima izvođenja, ciljne sekvence nisu obogaćene pre amplifikacije. U nekim primerima izvođenja, najmanje jedan SNP ukazuje na poreklo ili fenotipsku karakteristiku izvora uzorka nukleinske kiseline. U nekim primerima izvođenja, svaki od više prajmera sadrži jednu ili više sekvenci oznaka. U nekim primerima izvođenja, jedna ili više sekvenci oznaka sadrže osnovnu oznaku, oznaku za hvatanje, oznaku za sekvenciranje ili jedinstvenu oznaku molekularnog identifikatora ili njihovu kombinaciju. U nekim primerima izvođenja, postupci uključuju pojačavanje proizvoda amplifikacije sa drugom množinom prajmera. U nekim primerima izvođenja, svaki drugi mnoštvo prajmera sadrži deo koji odgovara oznaci prajmera množine prajmera i jednoj ili više sekvenci oznaka. U nekim primerima izvođenja, jedna ili više sekvenci oznaka drugog mnoštva prajmera sadrže oznaku za hvatanje ili oznaku za sekvenciranje ili njihovu kombinaciju. U nekim primerima izvođenja, metode uključuju dodavanje jednolančano vezujućeg proteina (SSB) proizvodima amplifikacije. U nekim primerima izvođenja, uzorak nukleinske kiseline i/ili proizvodi amplifikacije se pojačavaju lančanom reakcijom polimeraze (PCR). U nekim primerima izvođenja, uzorak nukleinske kiseline i/ili proizvodi amplifikacije se pojačavaju u puferu za amplifikaciju koji ima koncentraciju soli koja je povećana u poređenju sa koncentracijom soli pufera za amplifikaciju koji se koristi zajedno sa konvencionalno dizajniranim prajmerima. U nekim primerima izvođenja, so sadrži KCl, LiCl, NaCl ili njihovu kombinaciju. U nekim primerima izvođenja, so sadrži KCl. U nekim primerima izvođenja, koncentracija KCI u puferu za amplifikaciju je oko 100 mM do oko 200 mM. U nekim primerima izvođenja, koncentracija KCl u puferu za amplifikaciju je manja od oko 150 mM. U nekim primerima izvođenja, koncentracija KCI u puferu za amplifikaciju je oko 145 mM.
[0013] Predmetna otkrića pružaju biblioteku nukleinske kiseline koja sadrži mnoštvo molekula nukleinske kiseline, pri čemu mnoštvo molekula nukleinske kiseline sadrži najmanje jednu tandemsku sekvencu za ponavljanje uz bok prvom paru sekvenci oznaka i najmanje jednu sekvencu nukleotidnog polimorfizma (SNP) uz bok drugim parom sekvenci oznaka. Dalje je data biblioteka nukleinskih kiselina konstruisana korišćenjem ovde opisanih metoda i kompozicija. U nekim primerima izvođenja, najmanje jedan SNP ukazuje na poreklo ili fenotipsku karakteristiku izvora mnoštva molekula nukleinske kiseline.
[0014] Predmetna otkrića daju mnoštvo prajmera koji se specifično hibridizuju u najmanje jednu kratku ciljnu sekvencu i najmanje jednu dugu ciljnu sekvencu u uzorku nukleinske kiseline, pri čemu pojačanje uzorka nukleinske kiseline upotrebom mnoštva prajmera u pojedinačnoj multipleksnoj reakciji rezultira u najmanje jedan produkt kratke amplifikacije i bar jedan produkt duge amplifikacije, pri čemu svaki od više prajmera sadrži jednu ili više označenih sekvenci.
[0015] U nekim primerima izvođenja, kratka ciljna sekvenca sadrži polimorfizam jednog nukleotida (SNP), a dugačka sekvenca cilja sadrži tandem ponavljanje. U nekim primerima izvođenja, jedna ili više sekvenci oznaka sadrže osnovnu oznaku, oznaku za hvatanje, oznaku za sekvenciranje, jedinstvenu oznaku molekularnog identifikatora ili njihovu kombinaciju. Svaki od više prajmera ima nisku temperaturu topljenja manju od 60 stepeni C i ima dužinu od najmanje 24 nukleotida. U nekim primerima izvođenja, svaki od više prajmera ima dužinu od 24 nukleotida do oko 38 nukleotida. U nekim primerima izvođenja, svaki od više prajmera sadrži homopolimernu nukleotidnu sekvencu. U nekim primerima izvođenja, uzorak nukleinske kiseline se pojačava lančanom reakcijom polimeraze (PCR). U nekim primerima izvođenja, SNP je SNP porekla, fenotipski SNP, identitet SNP ili njihova kombinacija. U nekim primerima izvođenja, mnoštvo prajmera posebno se hibridizuje na najmanje 30 SNP. U nekim primerima izvođenja, mnoštvo prajmera posebno se hibridizuje na najmanje 50 SNP. U nekim primerima izvođenja, tandemsko ponavljanje je kratko tandemsko ponavljanje (STR), srednje tandemsko ponavljanje (ITR) ili njegova varijanta. U nekim primerima izvođenja, mnoštvo prajmera posebno se hibridizuje u najmanje 24 tandemske sekvence za ponavljanje. U nekim primerima izvođenja, veći broj prajmera se hibridizuje u najmanje 60 tandemskih sekvenci za ponavljanje.
[0016] Prikazi u ovom dokumentu obezbeđuju kitove koji sadrže najmanje jedno kontejnersko sredstvo, pri čemu najmanje jedno kontejnersko sredstvo sadrži veliki broj ovde prikazanih prajmera.
[0017] U nekim otkrićima, kitovi uključuju reagens za reakciju amplifikacije. U nekim primerima izvođenja, reagens je pufer za amplifikaciju za lančanu reakciju polimeraze (PCR). U nekim primerima izvođenja, pufer za amplifikaciju sadrži koncentraciju soli koja je povećana u poređenju sa koncentracijom soli pufera za amplifikaciju koji se koristi zajedno sa konvencionalno dizajniranim prajmerima. U nekim primerima izvođenja, so sadrži KCl, LiCl, NaCl ili njihovu kombinaciju. U nekim primerima izvođenja, so sadrži KCl. U nekim primerima izvođenja, koncentracija KCI u puferu za amplifikaciju je oko 100 mM do oko 200 mM. U nekim primerima izvođenja, koncentracija KCl u puferu za amplifikaciju je manja od oko 150 mM. U nekim primerima izvođenja, koncentracija KCl u puferu za amplifikaciju je oko 145 mM.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0018]
SL. 1A i SL. 1B pokazuju razlike u A) aktuelnom radnom toku za DNK profilisanje u odnosu na B) radni tok u jednom tipičnom primeru izvođenja prema predmetnom prikazu. SL. 2 prikazuje jedan tipičan primer izvođenja postupka za kreiranje biblioteke korisne za profilisanje DNK.
SL. 3 prikazuje još jedan tipičan primer izvođenja postupka za kreiranje biblioteke korisne za DNK profilisanje.
SL. 4A, SL. 4B, SL. 4C i SL. 4D su linijski grafikoni koji ilustruju rezultate elektroferograma u situaciji u kojoj par prajmera dizajniran tradicionalnim metodama i prateći uspostavljene PCR protokole i ograničenja dizajna prajmera može da dovede do nespecifične amplifikacije genomskih ciljnih sekvenci i spreči detekciju željenih amplikona, kada se kombinuje sa prajmerima dizajniranim prateći postupke predmetnog prikaza; A) 10 parova prajmera dizajniranih metodama prema predmetnom prikazu usmerenih na SNP lokuse, B) i D) 10 prajmera plus dodatni par prajmera dizajniran tradicionalnim metodama koji pokazuju da dodatni par prajmera ometa 10 parova prajmera tokom amplifikacije, i C) 10 parova prajmera plus dodatni par prajmera, pri čemu je dodatni par prajmera takođe dizajniran prateći metode prema predmetnom prikazu što je rezultiralo uspešnom amplifikacijom svih ciljanih SNP. X osa predstavlja veličinu fragmenata biblioteke (bp), a Y osa su fluorescentne jedinice (FU) amplifikacionih pikova amplifikovanih fragmenata. Sl. 5A, SL. 5B, SL. 5C, SL. 5D i SL. 5E su boks-dijagrami koji prikazuju tipične rezultate za eksperiment koji sledi radni tok opisan na SL. 2, koji je korišćen za identifikaciju panela od 56 STR ponovaka i mešavinu 75 SNP ponovaka koji daju informaciju o identitetu (iSNP), SNP ponovaka koji daju informaciju o nasleđu (aSNP) i SNP ponovaka koji daju informaciju o fenotipu (pSNPs) u multipleks reakciji amplifikacije i sekvenciranja iz uzorka. Navedeni su ponovljeni rezultati koji pokazuju uspešnu amplifikaciju i sekvenciranje STR lokusa iz panela; A) boks-dijagram koji prikazuje ravnotežu unutar lokusa za 25 heterozigotnih STR ponovaka iz panela, B) boks-dijagram koji pokazuje niski stater za većinu od 56 STR lokusa, C) boks-dijagram koji prikazuje pokrivenost sekvenciranjem STR lokusa, D) boks-dijagram koji pokazuje pokrivenost sekvence za SNP-ove i E) boks-dijagram koji pokazuje ravnotežu za 22 heterozigotna SNP ponovka iz panela. Donja linija greške označava minimalnu vrednost, gornja linija greške označava maksimalnu vrednost, donji boks prikazuje 25. percentil, a gornji boks 75. percentil, a srednja vrednost je presek donjeg i gornjeg boksa.
SL. 6 prikazuje seriju grafikona sa stubićima koji pokazuju uzorke STR lokusa iz eksperimenta sa SL. 5. Grafikoni pokazuju različita pozivanja alela za STR ponovke u panelu sa Sl.5.
SL. 7A, SL.7B, SL. 7C, SL.7D i SL. 7E su boks-dijagrami koji pokazuju tipične rezultate za eksperiment koji sledi radni tok prikazan na SL. 3, koji je korišćena za identifikaciju panela od 26 STR ponovaka i mešavine od 94 iSNP, aSNP i pSNP u multipleks reakciji amplifikacije i sekvenciranja iz uzorka. Navedeni su ponovljeni rezultati koji pokazuju uspešnu amplifikaciju i sekvenciranje STR ponovaka iz panela; A) boks-dijagram koji pokazuje ravnotežu za 21 heterozigotni STR lokus iz panela, B) boks-dijagram koji pokazuje nizak stater za 26 STR lokusa (39 od 47 alela 26 lokusa nije pokazalo statere), C) boks-dijagram koja prikazuje pokrivenost sekvenciranjem za STR lokuse (očitani brojevi su normalizovani pomoću UMI), D) boks-dijagram koji pokazuje pokrivenost sekvence za SNP ponovke i E) boks-dijagram koji pokazuje ravnotežu za 21 heterozigotni iSNP iz panela. Donja linija greške označava minimalnu vrednost, gornja linija greške označava maksimalnu vrednost, donji boks prikazuje 25. percentil, a gornji boks 75. percentil, a srednja vrednost je presek donjeg i gornjeg boksa.
SL. 8 prikazuje seriju dijagrama sa stubićima koji pokazuju uzorke STR lokusa iz eksperimenta sa SL. 7. Grafikoni pokazuju različita pozivanje alela za STR u panelu sa Sl.
7.
SL. 9 prikazuje trakasti grafikon uzoraka analiziranih bez UMI i sa UMI. Levi panel za svaki set predstavlja uzorke analizirane bez UMI-a, a desni panel za svaki set predstavlja uzorke analizirane pomoću UMI-a. X osa označava ponovljeni broj STR, a Y osa označava broj odbrojavanja određenog alela. Linije grešaka unutar traka razdvajaju grešku sekvenciranja (gornji deo trake) od ispravne sekvence (donji deo trake) unutar STR sekvence.
SL. 10A i SL. 10B pokazuju uzorne rezultate eksperimenta gde je odnos DNK bio 90:10 žensko: muško. A) podskup rezultata poziva STR lokusa za STR lokuse kada se koriste metode profilisanja DNK kapilarne elektroforeze i B) nekoliko STR lokusa poziva rezultate za nekoliko STR lokusa kada se koriste metode iz ove prijave. I CE metode i metode iz ove prijave otkrile su nizak nivo kontaminacije muške DNK.
SL. 11 prikazuje trakasti dijagram koji pokazuje da su STR lokusi specifični za Y hromozom otkriveni u eksperimentu sa SL. 9, dalje demonstrirajući da sadašnja aplikacija može otkriti zagađivanje muške DNK i specifičnih STR lokusa iz te muške DNK, dok bi za to trebalo sprovesti dva eksperimenta sa trenutnom CE metodologijom.
SL. 12 je tabela koja prikazuje tipične rezultate sekvenciranja na visokom nivou iz eksperimenta koji koristi 12 uzoraka pojedinaca i referentnog pojedinca, demonstrirajući doslednost STR i SNP očitavanja u dva ponavljanja.
SL. 13 je tabela koja prikazuje primer statističkih podataka o populaciji iz eksperimenta prikazanog na sl. 12.
SL. 14 je tabela koja prikazuje primerna predviđanja fenotipa zasnovana na genotipu pSNP iz eksperimenta prikazanog na sl.12.
SL. 15 je grafikon koji prikazuje primerno mapiranje predaka na osnovu genotipa aSNP iz eksperimenta prikazanog na sl.12.
SL. 16A, SL.16B, SL.16C, SL.16D i SL.16E su trakasti grafikoni koji pokazuju uzorke STR lokusa iz eksperimenta sa SL.12. SLIKA.17A i SL.17B su trakasti grafikoni koji pokazuju tipične SNP grafikone iz eksperimenta sa SL. 12.
SL. Slike 18A i SL.18B prikazuju okvire koji prikazuju ravnotežu unutar lokusa tipičnih STR i SNP lokusa iz eksperimenta sa Sl.12.
SL. 19A i SL.19B su grafikoni koji pokazuju analizu statera tipičnih STR lokusa iz eksperimenta sa SL.12.
1
SL. 20 je tabela koja prikazuje tipične izometrijske heterozigote u STR lokusima iz eksperimenta sa SL.12
SL. 21 je blok dijagram koji prikazuje primernu shemu nasleđivanja zasnovanu na varijantama u STR D8S1179 iz eksperimenta sa sl.12.
SL. 22 je blok dijagram koji prikazuje primernu shemu nasleđivanja zasnovanu na varijantama u STR D13S317 iz eksperimenta sa sl.12.
SL. 23 je tabela koja pokazuje tipične rezultate genotipizacije pomoću degradovane DNK. SL. 24A i SL.24B pokazuju uzorne rezultate genotipizacije STR i intro-lokus ravnotežu na raznim DNK ulazima.
SL. 25A i SL.25B pokazuju tipične rezultate genotipizacije SNP polimorfizama i ravnotežu unutar lokusa za različite polazne količine DNK.
DETALJAN OPIS
Definicije
[0019] Kako se ovde koristi, oblici jednine na englesnom jeziku „a“, „an“ i „the“ uključuju reference u množini, osim ako nije drugačije naznačeno, izričito ili kontekstom. Na primer, "a" dimer uključuje jedan ili više dimera, osim ako nije drugačije naznačeno, izričito ili kontekstom.
[0020] Kako su ovde korišćeni, izrazi „DNK profil“, „genetski otisak prsta“ i „genotipski profil“ ovde se koriste naizmenično da bi se odnosili na alelne varijacije u kolekciji polimorfnih lokusa, kao što je tandem ponavljanje, polimorfizam jednog nukleotida (SNP ), itd. DNK profil je koristan u forenzikama za identifikaciju pojedinca na osnovu uzorka nukleinske kiseline. DNK profil kako se ovde koristi može se koristiti i za druge primene, kao što su dijagnoza i prognoza bolesti, uključujući rak, identifikacija biomarkera raka, analiza nasledstva, analiza genetske raznolikosti, identifikacija genetske anomalije, bankarstvo podataka, forenzika, rad u krivičnim predmetima, očinstvo, lična identifikacija itd.
[0021] Izrazi "polinukleotid", "oligonukleotid", "nukleinska kiselina" i "molekul nukleinske kiseline" ovde se koriste naizmenično da bi se odnosili na polimerni oblik nukleotida bilo koje dužine i mogu sadržati ribonukleotide, deoksiribonukleotide, njihove analoge ili njihove smeše. Ovaj termin se odnosi samo na primarnu strukturu molekula. Dakle, termin uključuje trostruku, dvo- i jednolančanu deoksiribonukleinsku kiselinu („DNK“), kao i trostruku, dvostruku i jednolančanu ribonukleinsku kiselinu („RNK“).
[0022] Kako se ovde koristi, „identičnost sekvence“ ili „identičnost“ ili „homologija“ u kontekstu dve nukleotidne sekvence uključuje referencu na ostatke u dve sekvence koji su isti kada se poravnaju radi maksimalne korespondencije u određenom prozoru poređenja. Deo nukleotidne sekvence u prozoru za upoređivanje može da sadrži dodavanja ili delecije (tj. praznine) u poređenju sa referentnom sekvencom za optimalno poravnanje dve sekvence. Procenat se izračunava određivanjem broja položaja na kojima se u obe sekvence javlja identični bazni ostatak nukleinske kiseline da bi se dobio broj podudarnih položaja, deleći broj poklapanih položaja sa ukupnim brojem položaja u prozoru poređenja i množenjem rezultat sa 100 da bi se dobio procenat identiteta sekvence.
[0023] Kako se ovde koristi, "u osnovi komplementarne ili u osnovi poklopljene" znači da dve sekvence nukleinske kiseline imaju najmanje 90% identičnosti sekvence. Poželjno, dve sekvence nukleinske kiseline imaju najmanje 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence. Alternativno, "u osnovi komplementarne ili u osnovi poklopljene" znači da dve sekvence nukleinske kiseline mogu da hibridizuju u restriktivnim uslovima hibridizacije.
[0024] Podrazumeva se da aspekti i primeri izvođenja prema pronalasku koji su ovde opisani uključuju "koji se sastoji" i / ili "koje se u osnovi sastoji od" aspekata i primera izvođenja.
[0025] Ostali ciljevi, prednosti i karakteristike ovog pronalaska postaće očigledni iz sledećih specifikacija uzetih zajedno sa priloženim crtežima
Postupci konstruisanja DNK profila
[0026] Utvrđene metodologije za određivanje DNK profila ograničene su na više načina. Na primer, trenutne metode otkrivaju promene veličine amplifikovanih lokusa koje se razlikuju usled promena dužina ponovljenih tandemskih sekvenci pronađenih u uzorku DNK. Da bi se multipleksirali STR amplifikovani lokusi za vizuelizaciju, amplifikovani lokusi moraju biti dizajnirani tako da su različite veličine amplikona unutar veličine granica razdvajanja elektroforetskog sistema, koje je za CE između 50-500 bp. Kao takav, samo ograničeni broj ponovljenih sekvenci se može vizualizovati u jednom testu. Na primer, GLOBALFILER PCR amplifikacioni komplet (APPLIED BIOSYSTEMS) navodno je u stanju da razlikuje 24 STR lokusa pomoću 6 različitih boja. Dalje, takve metode imaju problema kada je DNK uzorka degradovana, što je uobičajeno za uzorke DNK sa mesta zločina, tako da duži proizvodi amplifikacije nisu mogući što rezultira nekompletnim DNK profilom. Trenutne metode takođe često nisu dovoljno osetljive da otkriju male količine kontaminirajuće DNK, tako da mešani uzorak može ostati neotkriven i neprijavljen, što bi moglo biti od suštinske važnosti za krivične postupke. Kao takve, trenutne metode mogu dovesti do nepotpunih rezultata koji dovode do neuverljivih rezultata, što može biti štetno za DNK profilisanje.
[0027] Pored toga, trenutni ciljevi ne uključuju informacije o poreklu uzorka, fenotipskim osobinama kao što je moguća boja očiju i druge individualizovane informacije o uzorku. Neke metodologije sekvenciranja pokušale su da uključe i STR i SNP detekciju. Na primer, pokušana je priprema biblioteke praćena prilagođenim obogaćivanjem za STR i SNP, međutim nisu svi STR-ovi pokriveni u potpunosti, jer metode pripreme biblioteke obično uključuju smicanje uzoraka koje može uništiti ciljnu sekvencu. Dalje, uspostavljene metode i protokoli dizajniranja prajmera mogu da obezbede setove prajmera za amplifikaciju dugih sekvenci (npr. STR) ili kratkih sekvenci (npr. SNP), ali kombinacije obe u jednoj reakciji nisu naišle na uspeh.
[0028] Ovaj prikaz opisuje rešenja problema i ograničenja postojećih sistema za DNK profilisanje. Metode i materijali prikazani u ovom dokumentu omogućavaju kombinaciju STR-ova i SNP-ova u jedan test koristeći PCR za amplifikaciju ciljne sekvence i kreiranje biblioteka za sekvenciranje. Tokom razvoja sadašnjih testova, neočekivano je otkriveno da, na primer, kada se koristi nekonvencionalni i kontraintuitivni dizajn prajmera, i STR-ovi i SNP polimorfizam mogu da se pojačaju u jednoj reakciji koja omogućava određivanje sekvence za sve ciljne lokuse. Iznenađujuće, kada su se dizajnirali prajmeri za amplifikaciju koristeći parametre koji su u suprotnosti sa trenutnom dogmom dizajna prajmera, stvoreni su prajmeri koji su omogućili da se aamplifikuju duži STR regioni i da se kratki SNP regioni aamplifikuju na više ili manje uravnotežen način, omogućavajući tako da se i STR ponovci i SNP polimorfizmi multipleksiraju zajedno.
[0029] Metode i materijali za određivanje DNK profila organizma prikazani u ovom dokumentu mogu da se koriste kad god su poželjni setovi amplikona različitih veličina iz jedne reakcije amplifikacije izvan DNK profilisanja. Na primer, ako targeti od interesa za PCR uključuju i velike genske regije i kratke SNP regione, što može rezultirati amplikonima koji variraju u veličini od stotina do hiljada baznih parova u odnosu na amplikone manje od 100 baznih parova, tada metode i materijali prikazani u ovom dokumentu mogu omogućiti uspešnu istovremenu amplifikaciju ciljnih gena i SNP-ova, što ne bi bilo moguće bez korišćenja prikazanih metoda. Dalje, metode i materijali prikazani u ovom dokumentu mogu se primeniti na bilo koji organizam, na primer na ljude, druge primate, životinje, biljke, viruse, bakterije, gljive i slično. Kao takvi, ovi postupci i materijali su korisni ne samo za određivanje DNK profila (npr. forenzika, utvrđivanje očinstva, individualna identifikacija, itd.) i ljudski genom kao ciljni genom, već se mogu koristiti i za druge ciljne sekvence kao što su markeri raka i bolesti, markeri genetičkih anomalija i/ili kada ciljni genom nije zasnovan na čoveku.
[0030] Prema tome, primeri izvođenja prikazani u ovom dokumentu pružaju metode za konstruisanje DNK profila koje čine: obezbeđivanje uzorka nukleinske kiseline, amplifikacija uzorka nukleinske kiseline sa grupom prajmera koji se specifično hibridizuju sa najmanje jednom ciljnom sekvencom koja sadrži jednonukleotidni polimorfizam (SNP) i najmanje jednu ciljnu sekvencu koja uključuje tandemsko ponavljanje i određivanje genotipova najmanje jednog
1
SNP-a i najmanje jednog tandemskog ponavljanja u produktima amplifikacije, čime se konstruiše DNK profil uzorka nukleinske kiseline.
[0031] Stručnjacima bi bilo korisno da se bilo koja pogodna tehnika može koristiti za određivanje genotipova ciljnih sekvenci, uključujući, ali ne ograničavajući se na hibridizaciju zasnovanu na nizu, sekvenciranje ili slično. Prema tome, u nekim primerima izvođenja, postupci prikazani u ovom dokumentu mogu obuhvatati generisanje biblioteke nukleinskih kiselina, kao što je biblioteka sekvenciranja, od proizvoda amplifikacije i određivanje sekvenci biblioteke nukleinskih kiselina.
[0032] U nekim primerima izvođenja, ovaj prikaz daje uvid u metode i materijale za DNK profilisanje koje obuhvataju istovremenu identifikaciju STR-ova i iSNP-ova, na primer za upotrebu u populaciji ili u bankama ličnih podataka. U takvim bankama podataka lični podaci nisu nužno potrebni jer su pojedinci obično poznati. Međutim, ako se žele dodatne informacije, tada se mogu dodati dodatne ciljne sekvence za istovremenu identifikaciju. Kratki tandemska ponovci dobro su poznati u struci i sastoje se od ponovljenih di- ili trinukleotidnih sekvenci. Intermedijarnim tandemskim ponovcima se obično smatraju ponovljene sekvence između 4 i 7 nukleotidnih sekvenci. SNP polimorfizmi koji se koriste u ovom dokumentu mogu biti u bilo kom obliku koji može da pruži uvid u fizičke karakteristike osobe. U ovom dokumentu su prikazani SNP polimorfizmi koji pružaju uvid u poreklo ili nasleđe (aSNP) i oni koji daju tragove za fenotipske karakteristike (SNP polimorfizmi koji daju informacije o fenotipu). U postupcima prikazanim u ovom dokumentu, analiza DNK profila može da obuhvati bilo koji broj ovih SNP polimorfizama u kombinaciji sa određivanjem STR i ITR lokusa.
[0033] Na primer, ovaj prikaz daje uvid u dodatne metode i materijale gde su, zajedno sa STR ponovcima i iSNPS polimorfizmina, uključene i dodatne ciljne sekvence. Ako se želi više informacija o pojedincu, na primer kada uzorak pripada nepoznatom pojedincu ili grupi pojedinaca, što može biti slučaj u kriminalističkom postupku, ostali markeri informacija mogu se dodati u STR-ove i iSNP-ove, kao što su SNP polimorfizmi koji se odnose na poreklo (aSNP) i SNP polimorfizmi vezani za fenotipske varijante (fenotipsko-informativni SNP polimorfizmi). Dodatne informacije se tada mogu koristiti da pomognu istražiteljima, na primer, pružanjem uvida u nasleđe nepoznate osobe, boju očiju, boju kose i slično. Kao takav, dodavanjem svih kombinovanih informacija može se dobiti potpuniji DNK profil osobe koja nije poznata na osnovu prethodne upotrebe aktuelnih metoda za određivanje DNK profila.
[0034] Metode i materijali prikazani u ovom dokumentu dizajnirani su tako da budu dovoljno osetljivi da otkriju pod-nanogramske količine molekula nukleinske kiseline. Dalje, metode i materijali prikazani u ovom dokumentu mogu biti korisni za amplifikaciju uzorka nukleinske kiseline napravljenog od niskokvalitetnih molekula nukleinske kiseline, poput degradovane i/ili fragmentirane genomske DNK iz forenzičkog uzorka. Uzorak nukleinske kiseline može biti prečišćeni uzorak ili sirova DNK koja sadrži lizat, na primer izveden iz bukalnog brisa, papira, tkanine ili drugog supstrata koji može biti prekriven pljuvačkom, krvlju ili drugim telesnim tečnostima. Kao takav, u nekim primerima izvođenja, uzorak nukleinske kiseline može da sadrži male količine ili fragmentirane delove DNK, poput genomske DNK. Na primer, uzorak nukleinske kiseline može da sadrži količinu nukleinske kiseline (npr. genomske DNK) koja je jednaka, približna, ili je manja od 1 pg, 2 pg, 3 pg, 4 pg, 5 pg, 6 pg, 7 pg, 8 pg, 9 pg, 10 pg, 11 pg, 12 pg, 13 pg, 14 pg, 15 pg, 16 pg, 17 pg, 18 pg, 19 pg, 20 pg, 30 pg, 40 pg, 50 pg, 60 pg, 70 pg, 80 pg, 90 pg, 100 pg, 200 pg, 300 pg, 400 pg, 500 pg, 600 pg, 700 pg, 800 pg, 900 pg, 1 ng, 10 ng, 100 ng, ili opseg definisan sa bilo koje dve od ovih vrednosti, na primer, 10 pg do 100 pg, 10 pg do 1 ng, 100 pg do 1 ng, 1 ng do 10 ng, 10 ng do 100 ng, itd. U nekim primerima izvođenja, uzorak nukleinske kiseline može da sadrži količinu nukleinske kiseline (npr. genomske DNK) koja je od oko 100 pg do oko 1 ng. U nekim primerima izvođenja, uzorak nukleinske kiseline može da sadrži količinu nukleinske kiseline (npr. genomske DNK) koja je veća od oko 62,5 pg. U nekim primerima izvođenja, dodatni koraci fragmentacije, kao što je ultrazvučna obrada ili digestija endonukleazom, nisu obuhvaćeni postupcima fragmentacije.
[0035] U nekim primerima izvođenja, metode i materijali prikazani u ovom dokumentu mogu uspešno da odrede genotipove jedne ili više ciljnih sekvenci, na primer, SNP, STR, itd., čak i u pod-nanogramskim količinama i/ili degradiranim uzorcima nukleinske kiseline. Na primer, metode i materijali prikazani u ovom dokumentu mogu uspešno da odrede genotip koji je približno, jednako, ili je veći od 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% , 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% ili opseg između bilo koje dve od gore navedenih vrednosti ciljnih sekvenci. U nekim primerima izvođenja, metode i materijali prikazani u ovom dokumentu mogu uspešno da odrede genotip više od oko 50%, 80%, 90%, 95%, 98% ili više ciljnih sekvenci. U nekim primerima izvođenja, metode i materijali prikazani u ovom dokumentu mogu postići ravnotežu unutar lokusa veću od oko 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% ili opseg između bilo koje dve od gore navedenih vrednosti ciljnih sekvenci.
[0036] Za forenzičko istraživanje, više prajmera može da sadrži jedinstvene molekulske identifikatore (UMI) koji pomažu u uklanjanju, na primer, grešaka u PCR-u i sekvenciranju, statera i slično iz rezultata sekvenciranja. Videti Kivioja i sar., supra. Kao što je detaljnije diskutovano u drugim delovima ovog prikaza, uključivanje UMI u prajmere takođe omogućava identifikaciju varijanti unutar tandemski ponovljenih lokusa, dalje povećavajući korisnost trenutnih metoda i materijala za DNK profilisanje i druge svrhe kao što je analiza nasledja.
[0037] Shodno tome, u nekim primerima izvođenja, genotipovi tandemski ponovljenih sekvenci
1
koji su prikazani u ovom dokumentu mogu da uključuju varijante sekvenci unutar tandemski ponovljenih lokusa. Prema tome, homozigot za tandemski ponovljenu sekvencu (npr. 13, 13 za D9S1122) korišćenjem tradicionalnih metoda može se identifikovati kao izometrijski heterozigot na osnovu varijanti sekvence unutar tandemskog ponovka. Uzimanje u obzir varijante sekvenci unutar lokusa bi u velikoj meri poboljšalo korisnost metoda prikazanih u ovom dokumentu, na primer, za analizu nasledja.
Postupci za konstrukciju biblioteke nukleinske kiseline
[0038] Primeri izvođenja prikazani u ovom dokumentu pružaju metode za konstrukciju biblioteke nukleinske kiseline koje obuhvataju: obezbeđivanje uzorka nukleinske kiseline i amplifikacija uzorka nukleinske kiseline sa više prajmera koji se specifično hibridizuju sa najmanje jednom ciljnom sekvencom koja sadrži jednonukleotidni polimorfizam (SNP) i najmanje jednom ciljnom sekvencom koja sadrži sekvencu tandemskog ponovka.
[0039] Metode i materijali prikazani u ovom dokumentu dizajnirani su tako da budu dovoljno osetljivi da otkriju pod-nanogramske količine molekula nukleinske kiseline. Dalje, metode i materijali prikazani u ovom dokumentu mogu biti korisni za amplifikaciju uzorka nukleinske kiseline koji se sastoji od nekvalitetnih molekula nukleinske kiseline, kao što je degradirana i/ili fragmentirana genomska DNK iz forenzičkog uzorka. Uzorak nukleinske kiseline može biti prečišćen ili sirovi DNK koji sadrži lizat, na primer izveden iz bukalnog brisa, papira, tkanine ili drugog supstrata koji može biti prekriven pljuvačkom, krvlju ili drugim telesnim tečnostima. Kao takav, u nekim primerima izvođenja, uzorak nukleinske kiseline može da sadrži malu količinu DNK ili fragmentiranu DNK, kao što je genomska DNK. Na primer, uzorak nukleinske kiseline može da sadrži količinu nukleinske kiseline (npr. genomske DNK) koja je jednaka, približna, ili manja od 1 pg, 2 pg, 3 pg, 4 pg, 5 pg, 6 pg, 7 pg, 8 pg, 9 pg, 10 pg, 11 pg, 12 pg, 13 pg, 14 pg, 15 pg, 16 pg, 17 pg, 18 pg, 19 pg, 20 pg, 30 pg, 40 pg, 50 pg, 60 pg, 70 pg, 80 pg, 90 pg, 100 pg, 200 pg, 300 pg, 400 pg, 500 pg, 600 pg, 700 pg, 800 pg, 900 pg, 1 ng, 10 ng, 100 ng, ili opseg definisan sa bilo koje dve od ovih vrednosti, na primer, od 10 pg do 100 pg, od 10 pg do 1 ng, od 100 pg do 1 ng, od 1 ng do 10 ng, od 10 ng do 100 ng, itd. U nekim primerima izvođenja, uzorak nukleinske kiseline može da sadrži količinu nukleinske kiseline (npr. genomske DNK) koja je od oko 100 pg do oko 1 ng. U nekim primerima izvođenja, uzorak nukleinske kiseline može da sadrži količinu nukleinske kiseline (npr. genomske DNK) koja je veća od oko 62,5 pg. U nekim primerima izvođenja, nisu uključeni dodatni koraci fragmentacije, kao što je ultrazvučna obrada ili digestija endonukleazom.
[0040] U nekim primerima izvođenja, metode prikazane u ovom dokumentu uključuju amplifikaciju i pripremu biblioteke pre nizvodnog paralelnog sekvenciranja. Analiza može
1
obuhvatati dva PCR master miksa, dve termostabilne polimeraze, dve mešavine prajmera i adaptere za biblioteku. U nekim primerima izvođenja, uzorak DNK može se umnožavati tokom određenog broja ciklusa upotrebom prvog seta primera za amplifikaciju koji sadrže ciljane specifične regione i neciljane specifične regione oznaka i prvi PCR mastermiks. Region oznake može biti bilo koja sekvenca, kao što je univerzalni region oznake, region oznake za hvatanje, region oznake amplifikacije, region oznake za sekvenciranje, region UMI oznake i slično. Na primer, region oznake može biti obrazac za amplifikacioni prajmer koji se koristi u drugom ili sledećem krugu amplifikacije, na primer za pripremu biblioteke. U nekim primerima izvođenja, metode uključuju dodavanje jednolančano-vezujućeg proteina (SSB) prvim proizvodima amplifikacije. Alikvot prvog amplifikovanog uzorka može se ukloniti i amplifikovati drugi put upotrebom drugog skupa prajmera za amplifikaciju koji su specifični za region oznake, npr. univerzalni region oznake ili region oznake amplifikacije, prvih amplifikacionih prajmera koji mogu sadržati jednu ili više dodatnih sekvenci oznaka, kao što su sekvence oznaka specifične za jedan ili više radnih tokova nizvodnog sekvenciranja, i ista ili druga PCR master smeša. Kao takva, biblioteka originalnog uzorka DNK je spremna za sekvenciranje.
[0041] Alternativna metoda može obuhvatati prvu amplifikaciju koja se izvodi u maloj zapremini (npr. 15 ul) i umesto prenosa alikvota na novu lokaciju za drugi krug amplifikacije, mogu se dodati dodatni reagensi za izvođenje drugog kruga amplifikacije.
[0042] Kada se napravi biblioteka, ona se može prečistiti i kvantifikovati. U nekim primerima, prečišćavanje se može izvršiti provlačenjem uzorka kroz podlogu kao što su AMPURE XP kuglice (Beckman Coulter) koje služe za prečišćavanje fragmenata DNK od reakcionih komponenti. Druga metoda bi mogla biti ugrađivanje ostatka prečišćavanja, kao što je ostatak haptena, u drugi set prajmera za amplifikaciju. Na primer, ako je biotin ugrađen u jedan od prajmera drugog seta za amplifikaciju, onda bi fragmenti biblioteke mogli da se snimaju, na primer, streptavidinskim ostatkom na kuglicama. Koristeći strategiju hvatanja, biblioteke se takođe mogu normalizovati i kvantifikovati koristeći normalizaciju zasnovanu na kuglicama (BBN). Međutim, biblioteke se mogu prečistiti i kvantifikovati ili objediniti i kvantifikovati ako se dešavaju višestruke reakcije, bez upotrebe BBN-a. Na primer, biblioteke takođe mogu biti kvantifikovane gel elektroforetskim metodama, BioAnalizer, qPCR, spekrofotometrijskim metodama, kvantitativnim setovima (npr. PicoGreen, itd.) i slično kao što je već poznato u struci. Nakon kvantifikacije, biblioteka se može sekvencirati paralelnim sekvenciranjem.
[0043] U nekim primerima izvođenja, prvi set prajmera za amplifikaciju koji se koristi za amplifikaciju ciljne DNK obezbeđen je u tako ograničenoj koncentraciji da kada se alikvot prve reakcije amplifikacije doda u novu epruvetu i reagensi iz druge reakcije amplifikacije budu dodati postoji minimalna do nedetektovana prenosna amplifikacija proistekla iz prvog seta
1
amplifikacionog prajmera i korak čišćenja između prve reakcije amplifikacije i druge reakcije amplifikacije nije potreban. U nekim primerima, koncentracija prajmera za amplifikaciju za prvi PCR je jednaka, približna, ili manja od 0,5 nM, 0,6 nM, 0,7 nM, 0,8 nM, 0,9 nM, 1,0 nM, 1,5 nM, 2,0 nM, 3,0 nM , 4,0 nM, 5,0 nM, 6,0 nM, 7,0 nM, 8,0 nM, 9,0 nM, 10,0 nM, 11,0 nM, 12,0 nM, ili opseg između bilo koje od ovih vrednosti, na primer od 0,5 nM do 1,0 nM, od 1,0 nM do 12 nM, od 0,8 nM do 1,5 nM, itd. U nekim primerima izvođenja, koncentracija amplifikacionog prajmera za prvi PCR je od oko 0,9 nM do oko 10 nM.
[0044] Slika 2 prikazuje primer radnog toka metoda prikazanih u ovom dokumentu u jednom primeru izvođenja. Ciljna genomska sekvenca DNK se amplifikuje korišćenjem prvog skupa prajmera koji sadrži region koji se vezije za bočne regione ciljne sekvence i regione oznake amplifikacije (koji mogu biti isti ili različiti) rezultujući amplikonima koji sadrže ciljnu sekvencu i oznake na oba kraja. Alikvot amplikona iz prvog PCR-a se dalje amplifikuje korišćenjem drugog seta prajmera specifičnih za sekvence prve oznake, koji dalje sadrže sekvence prajmera za sekvenciranje (i5 i i7 adapter sekvence), stvarajući tako biblioteku koja sadrži ciljnu sekvencu DNK pored sekvenci koje se koriste za paralelno sekvenciranje, u ovom slučaju se i5 i i7 sekvence koriste u sekvenciranju metodama sinteze koje je popularizovala Illumina, Inc.
[0045] Primer alternativnog radnog toka za određivanje DNK profila iz uzorka opisan je na slici 3. U ovom primeru, ciljna sekvenca DNK se amplifikuje sa prvim parom prajmera koji sadrži sekvence koje se vezuju za bočne regione ciljne sekvence, neciljane sekvence oznaka (iste ili različite) i jedinstvene sekvence molekularnih identifikatora ili UMI, koje sadrže nasumične baze. UMI se mogu koristiti, na primer, za bioinformatičko smanjenje ili uklanjanje grešaka koje se javljaju tokom procesa pripreme biblioteke (npr. PCR artefakti ili pogrešne inkorporacije, itd.). Upotreba UMI može biti važna za DNK profilisanje, ali je od posebnog značaja za pomoć u uklanjanju grešaka kada se uzorci sekvenciraju za krivične postupke. U ovom primeru, prvi krug amplifikacije se izvodi tokom 2 ciklusa, nakon čega sledi dodavanje jednolančano-vezujućeg proteina (SSB) i inkubacija na 37 stepeni C tokom 15 minuta, nakon čega sledi inaktivacija od 95 stepeni C/5 minuta, koja efikasno gasi dalju amplifikaciju prvog seta amplifikacionih prajmera tokom drugog kruga amplifikacije. Iako je mehanizam nepoznat, smatra se da dodavanje SSB nepovratno vezuje jednolančane prajmere prve amplifikacije i sprečava ih da ponovo učestvuju u sledećim reakcijama amplifikacije. Nakon SSB inkubacije, dodaje se drugi set prajmera koji sadrži sekvence oznaki i druga PCR smeša što rezultira bibliotekom sekvenciranja.
Biblioteka nukleinske kiseline
1
[0046] Prikazi iz ovog dokumenta daju uvid u biblioteke nukleinskih kiselina, koje se mogu koristiti za sekvenciranje. U nekim primerima izvođenja, biblioteke nukleinskih kiselina koje su prikazane u ovom dokumentu mogu sadržati mnoštvo molekula nukleinske kiseline, pri čemu mnoštvo molekula nukleinske kiseline sadrži najmanje jednu tandemski ponovljenu sekvencu označenu prvim parom sekvenci oznaka i najmanje jednu sekvencu jednonukleotidnog polimorfizma (SNP) označenu drugim parom sekvenci oznaka.
[0047] Kao što je prikazano u ovom dokumentu, veličina molekula nukleinske kiseline može u velikoj meri da varira koristeći metode i materijale opisane u ovom dokumentu. Stručnjaci u ovoj oblasti bi imali koristi od toga da molekuli nukleinske kiseline amplifikovani iz ciljne sekvence koja sadrži tandemski ponovak (npr. STR) mogu imati veliku veličinu, dok molekuli nukleinske kiseline amplifikovani iz ciljne sekvence koja sadrži SNP mogu imati male veličine. Na primer, molekuli nukleinske kiseline mogu da sadrže od manje od stotinu nukleotida do stotine ili čak hiljade nukleotida. Prema tome, veličina molekula nukleinske kiseline može biti u opsegu između bilo koje dve vrednosti od oko 50 bp, oko 60 bp, oko 70 bp, oko 80 bp, oko 90 bp, oko 100 bp, oko 110 bp, oko 120 bp, oko 130 bp, oko 140 bp, oko 150 bp, oko 200 bp, oko 300 bp, oko 400 bp, oko 500 bp, oko 600 bp, oko 700 bp, oko 800 bp, oko 900 bp, oko 1 kb, ili više. U nekim primerima izvođenja, minimalna veličina molekula nukleinske kiseline može biti dužine koja je jednaka, približna, ili manja od 50 bp, 60 bp, 70 bp, 80 bp, 90 bp ili 100 bp. U nekim primerima izvođenja, maksimalna veličina molekula nukleinske kiseline može biti dužina koja je jednaka, približna ili je veća od 100 bp, 150 bp, 200 bp, 250 bp, 300 bp, 350 bp, 400 bp, 450 bp , 500 bp ili 1 kb.
[0048] Za generisanje klastera, fragmenti biblioteke su imobilisani na podlozi, na primer klizaču, koji sadrži homologne sekvence oligonukleotida za hvatanje i imobilizaciju fragmenata DNK biblioteke. Imobilisani fragmenti DNK biblioteke se amplifikuju korišćenjem klaster metodologija amplifikacije, kao što je prikazano u otkrićima američkih patenata br. 7,985,565 i 7,115,400. Američki patentni brojevi 7,985,565 i 7,115,400 opisuju postupke amplifikacije nukleinske kiseline u čvrstoj fazi koji omogućavaju da se proizvodi amplifikacije imobilišu na čvrstom nosaču kako bi se formirali nizovi koji se sastoje od klastera ili „kolonija“ molekula imobilisanih nukleinskih kiselina. Svaki klaster ili kolonija na takvom nizu formiran je od mnoštva identičnih imobilisanih polinukleotidnih lanaca i od više identičnih imobilisanih komplementarnih polinukleotidnih lanaca. Tako formirani nizovi se obično nazivaju „grupisani nizovi“. Proizvodi reakcija amplifikacije u čvrstoj fazi, kao što su oni opisani u američkim patentima br. 7,985,565 i 7,115,400, su takozvane „premošćene” strukture nastale anilingom parova imobilisanih polinukleotidnih lanaca i imobilisanih komplementarnih lanaca, pri čemu su oba lanca imobilisana na čvrstom nosaču na 5' kraju, poželjno preko kovalentnog dodatka.
1
Metodologije amplifikacije klastera su primeri metoda u kojima se imobilisani šablon nukleinske kiseline koristi za proizvodnju imobilisanih amplikona. Druge pogodne metodologije se takođe mogu koristiti za proizvodnju imobilisanih amplikona od imobilisanih fragmenata DNK proizvedenih prema metodama prikazanih u ovom dokumentu. Na primer, jedan ili više klastera ili kolonija mogu da se formiraju pomoću PCR-a u čvrstoj fazi bez obzira na to da li je jedan ili oba prajmera svakog para amplifikacionih prajmera imobilisan. Međutim, metode prikazane u ovom dokumentu nisu ograničene na bilo koju određenu metodologiju pripreme sekvenciranja ili platformu sekvenciranja i mogu biti prilagođeni drugim metodama pripreme paralelnog sekvenciranja i pridruženim platformama sekvenciranja.
Prajmeri
[0049] Primeri izvođenja prikazani u ovom dokumentu daju uvid u više prajmera koji specifično hibridizuju sa najmanje jednom kratkom ciljnom sekvencom i najmanje jednom dugom ciljnom sekvencom u uzorku nukleinske kiseline, dok amplifikacija uzorka nukleinske kiseline koristeći više prajmera u jednoj multipleks reakciji rezultira najmanje jednim kratkim produktom amplifikacije i najmanje jednim dugim produktom amplifikacije, pri čemu svaki od prajmera sadrži jednu ili više označenih sekvenci. Dalje, u ovom dokumentu je prikazano više prajmera koji imaju sekvence date u tabelama 1-2.
[0050] Za multipleks amplifikaciju velike ciljne sekvence (npr. STR, ITR) i male ciljne sekvence (npr. SNP), dizajnirani su prajmeri koji će omogućiti uravnoteženu amplifikaciju u svim tipovima ciljnih sekvenci. Metode i materijali prikazani u ovom dokumentu mogu da se koriste za amplifikaciju višestrukih tandemski ponovljenih ciljnih sekvenci u jednoj multipleks reakciji. Na primer, više prajmera može specifično hibridizovati sa nizom tandemski ponovljenih sekvenci, koje su jednake, približne ili su veće od 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 24, 30, 40, 50 , 60, 70, 80, 90, 100 ili opseg između bilo koje od dve vrednosti, kao što su 4 do 12, 10 do 24, 30 do 100 itd. U nekim primerima izvođenja, više prajmera može posebno hibridizovati sa najmanje 24 tandemske sekvence ponavljanja. U nekim primerima izvođenja, više prajmera može specifično hibridizovati sa najmanje 60 tandemskih sekvenci za ponavljanje. Metode i materijali prikazani u ovom dokumentu mogu da se koriste za amplifikaciju višestrukih SNP ciljnih sekvenci u jednoj reakciji. Na primer, više prajmera može specifično hibridizovati sa određenim brojem SNP sekvenci, koje su jednake, približne, ili su veće od 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 24, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ili opseg između bilo koje od dve vrednosti, kao što su 4 do 12, 10 do 24, 30 do 100, itd. U nekim primerima izvođenja, više prajmera može specifično hibridizovati sa najmanje 30 SNP sekvenci. U nekim primerima izvođenja, više prajmera može specifično hibridizovati sa najmanje 50 SNP sekvenci.
2
[0051] Tokom eksperimentacije je otkriveno da su kratke SNP ciljne sekvence preferencijalno amplifikovane u odnosu na duže STR ciljne sekvence kada se koriste prajmeri koji su dizajnirani prema utvrđenim kriterijumima za uspešan dizajn prajmera. Dalje, bar u toku rada sinteze, gde se generišu klasteri i sami klasteri se sekvenciraju (na primer, kod sekvenciranja sintezom (SBS, prikazanog na drugom mestu u ovom dokumentu) povezani sa Illumina, Inc. sekvencerima), dešavala se preferencijalna amplifikacija klastera kraćih SNP fragmenata biblioteke. Da bi se prevazišle ove dve pristrasnosti, bila je potrebna nova strategija za dizajn prajmera koja bi omogućila uravnoteženu amplifikaciju između kratkih SNP ciljnih sekvenci i dugih STR ciljnih sekvenci.
[0052] Jedna od strategija je uključivala dizajniranje prajmera za STR amplifikaciju. Kod STR-ova, ponovljeni nizovi su često ugrađeni u veće ponovljene regione; stoga dizajniranje specifičnih prajmera za amplifikaciju STR može biti problematično. Dalje, STR i njihovi bočni regioni često su bogati AT parovima. U jednom slučaju, prajmeri su dizajnirani za problematične regione koristeći strategiju dizajna protivnu konvencionalnim i dobro uspostavljenim PCR kriterijumima za dizajn. Utvrđeni kriterijumi za dizajn PCR prajmera navode da, između ostalih kriterijuma, 1) optimalna dužina prajmera iznosi 18-22 nukleotida, 2) temperatura topljenja treba da bude u opsegu od 55-58 stepeni C, 3) sadržaj GC parova treba da bude oko 40-60%, 4) i ponovljene AT dinukleotidne regione treba izbegavati, sa maksimalno <4 dinukleotidnih AT ponavljanja. Dizajnirani su prajmeri duži od tipičnih PCR prajmera, na primer 23-35 nukleotida umesto 18-22 nukleotida, imali su niske temperature topljenja (Tm), na primer oko 54 stepeni C umesto oko 58 stepeni C, i prajmeri su bili bogati AT parovima, tri parametra koje po konvencionalno uspostavljenim PCR kriterijumima treba izbegavati za optimalni dizajn prajmera. U stvari, dizajnirani su neoptimalni prajmeri. Iznenađujuće, otkriveno je da su ovi dugi prajmeri, bogati AT parovima, sa niskom Tm zapravo multipleksirali STR-ove bolje od kratkih prajmera sa visokom Tm, bogati AT parovima. Bez vezivanja za bilo koju teoriju, smatra se da kraći prajmeri koji su dizajnirani u skladu sa utvrđenim PCR kriterijumima za dizajn mogu da formiraju dimere koji imaju visoke temperature topljenja i tako efikasno formiraju dimere u normalnim PCR uslovima, dok duži prajmeri sa niskom Tm mogu da formiraju dimere pod zaista niskim Tm i stoga ne bi bili stabilni za kreiranje dimera, omogućavajući time veće učešće dužih prajmera sa niskom Tm pod normalnim uslovima amplifikacije u poređenju sa kratkim prajmerima sa visokom Tm (npr.18-22 nukleotida, Tm od 60 stepeni C, 50% GC sadržaja).
[0053] Duži prajmeri za STR amplifikaciju sa niskom Tm, bogati AT parovima su zatim multipleksirani sa konvencionalno dizajniranim kraćim prajmerima sa visokim Tm koji su ciljali SNP-ove. Međutim, reakcije multipleks amplifikacije ponovo su bile neuspešne u pružanju uravnotežene amplifikacije STR-ova i SNP-ova u jednoj multipleks reakciji. Razmišljalo se da bi možda primena nekonvencionalnog dizajna prajmera za amplifikaciju neproblematičnih ciljnih sekvenci, na primer za amplifikaciju SNP ciljnih sekvenci, mogla dati uspešne multipleks amplifikacije. Kao takvi, isti kriterijumi korišćeni za dizajniranje neoptimalnih prajmera za STR primenjeni su i za dizajn prajmera za SNP (dugi, bogati AT parovima, sa niskom Tm). Iznenađujuće, novi dizajnirani prajmeri rezultirali su boljom ravnotežom između amplifikacije STR i SNP u multipleks reakciji.
[0054] SLIKA 4 prikazuje primere međusobnog dejstva konvencionalnih i nekonvencionalnih dizajniranih prajmera u multipleks reakciji. Na sl. 4A, multipleksna reakcija od 10 SNP ciljnih sekvenci pokazuje očekivanu amplifikaciju u željenom opsegu od oko 200-350 bp za biblioteku. Prajmeri koji se koriste za amplifikaciju 10 SNP-ova u multipleksu su dizajnirani da budu duži, imaju niži Tm i budu bogatiji AT parovima, što se savetuje prema utvrđenim kriterijumima za dizajn PCR prajmera. Kada je 11. par prajmera dizajniran korišćenjem utvrđenih PCR kriterijuma, odnosno prajmeri su kratki, imaju visoku Tm i nisu bogati AT parovima, i dodat u prethodnih 10 parova, dobijeni multipleks pokazuje nespecifičnu amplifikaciju ciljne DNK. Kao što se vidi na sl. 4B i 4D, dodavanje 11. konvencionalno dizajniranog para prajmera ometa 10 pleksa nekonvencionalnih parova prajmera i rezultira neuspešnom multipleks amplifikacijom ciljanih SNP-ova. Međutim, dodavanje 11. para prajmera koji je takođe nekonvencionalno dizajniran prateći iste kriterijume kao i 10 pleksa parova prajmera rezultira uspešnom amplifikacijom ciljnih SNP ponovaka (slika 4C).
[0055] Shodno tome, svaki od prajmera ima nisku temperaturu topljenja manju od 60 stepeni C i ima dužinu od najmanje 24 nukleotida, npr. 24 nukleotida do oko 38 nukleotida. U nekim primerima izvođenja, svaki od prajmera sadrži homopolimernu nukleotidnu sekvencu.
[0056] U nekim primerima, nekonvencionalno dizajnirani prajmeri sadrže sekvence koje okružuju ciljane STR-ove i SNP-ove, kao i dodatne sekvence. Dodatne sekvence mogu biti, na primer sekvence oznaka koje su korisne tokom pripreme biblioteke ili metodologija sekvenciranja. Na primer, sekvenca oznake može biti sekvenca za hvatanje kao što je haptenski deo koji može biti uhvaćen imobilizovanim partnerskim delom za prečišćavanje fragmenata biblioteke. Primer haptenskog dela je biotin koji streptavidin može da uhvati, za izolovane fragmente biblioteke iz reakcionih komponenata i slično. Sekvenca oznake takođe može biti amplifikaciona sekvenca, na primer koja je komplementarna prajmeru za amplifikaciju i koristi se u jednoj ili više reakcija amplifikacije. Slike 2 i 3 pokazuju primere sekvenci oznaka koje se koriste u drugom krugu amplifikacije nakon prvog kruga amplifikacije. Sekvenca oznake takođe može biti oznaka sekvence. Slike 2 i 3 takođe pokazuju primere oznaka sekvenci, i5 adapter i i7 adapter se koriste u sekvenciranju za hibridizaciju, generaciju klastera i prajmera za sekvenciranje tokom reakcija sekvenciranja sintezom kako je prikazano u ovom dokumentu. Još jedan primer oznaka sekvenci je jedinstveni molekularni identifikator ili UMI, kao što je prikazano na sl.3.
[0057] UMI sadrži nasumični lanac nukleotida koji se može koristiti tokom sekvenciranja za ispravljanje PCR grešaka i grešaka u sekvenciranju, dodajući tako dodatni sloj korekcije grešaka rezultata sekvenciranja. UMI mogu biti, na primer, dugi 3-10 nukleotida, međutim broj će zavisiti od količine ulazne DNK. Na primer, ako se 1ng DNK koristi za ciljanje oko 250 lokacija, pretpostavlja se da će biti potrebno približno 350 kopija x 250 ciljeva, dakle približno 90 000 različitih UMI-a. Ako se koristi više DNK, na primer 10ng, tada bi moglo biti potrebno približno 1 milion različitih UMI-a. Svi PCR duplikati iz iste PCR reakcije imali bi istu UMI sekvencu, jer se takvi duplikati mogu upoređivati i sve greške u sekvenciranju kao što su supstitucije pojedinačne baze, delecije, insercije (tj. stater u PCR) mogu se isključiti iz rezultata sekvenciranja bioinformatički. Jedinstveni molekularni identifikatori se takođe mogu koristiti u analizi mešovitog uzorka. Mešoviti uzorci, na primer uzorak ženske DNK koji je kontaminiran muškom DNK, mogu se dekonvoluirati kako bi se odredio i ženski i muški DNK udeo koristeći UMI sekvence. Na primer, mogu biti ukupno četiri različita ponovljena broja za dve mešane DNK; međutim, moglo bi ih biti manje od četiri ako mešavina dva uzorka deli alele na određenom lokusu. Ovi zajednički aleli mogu se razlikovati i odrediti približni procenti pomoću UMI za određivanje broja različitih alela u početnoj populaciji molekula DNK. Na primer, početni molekuli mogu da se prebroje i ako je manji učesnik bio prisutan na, na primer 5%, tada bi 5% UMI identifikovalo jedan genotip, a 95% bi identifikovalo drugi genotip. Nakon PCR-a, ako je jedan od alela (ili možda i više) bio pristrasan pri amplifikaciji, taj odnos 5:95 se ne bi video. Međutim, korišćenjem UMI pristrasni odnos bi mogao da se ispravi nakon što se PCR duplikati kondenzuju pomoću UMI detekcije i korekcije. Ovo je važno kada pokušavate da razlikujete stater artefakt od PCR-a i istinskog manjeg udela.
[0058] Prajmer sadašnjih metoda može da sadrži jedan ili više sekvenci oznaka. Sekvence oznaka mogu biti jedna ili više početnih sekvenci koje nisu homologne ciljnoj sekvenci, ali se na primer mogu koristiti kao templejti za jednu ili više reakcija amplifikacije. Sekvenca oznaka može biti sekvenca hvatanja, na primer sekvenca haptena kao što je biotin koja se može koristiti za prečišćavanje amplikona od reakcionih komponenti. Sekvence oznaka mogu biti sekvence kao što su adapterske sekvence koje su korisne za hvatanje amplikona biblioteke na podlozi, na primer za tzv. bridge amplifikaciju pre sekvenciranja pomoću tehnologija sinteze kako je prikazano u ovom dokumentu. Dalje, sekvence oznaka mogu biti jedinstvene oznake molekularnih identifikatora, tipično između, na primer, 3-10 nukleotida koji se sastoje od nasumičnog lanca nukleotida koji se mogu koristiti za korekciju grešaka tokom pripreme biblioteke i/ili metoda sekvenciranja.
2
[0059] Pored toga, korisno je da multipleks PCR reakcija sadrži oligonukleotidne prajmere za suštinski sve ciljne sekvence udružene u jednu smešu. Međutim, kao što je prikazano u ovom dokumentu, oligonukleotidi su neobično duži od prajmera dizajniranih koristeći tradicionalne parametre. Dalje dodavanje sekvenci oznaka prajmerima, kao što je dodavanje UMI koji dodaju sekvencu specifičnu za sekvencu ciljnog gena, kreiraju još duže sekvence prajmera. U nekim primerima izvođenja, glicin betain (približno 1,5 M) može se dodati u smešu prajmera. Na primer, u nekim primerima izvođenja pufer za amplifikacijui koji se koriste u reakcijama amplifikacije sa nekonvencionalnim prajmerima kako je prikazano u ovom dokumentu sadrže koncentraciju betaina koja je jednaka, približna ili veća od 100 mM, 200 mM, 300 mM, 400 mM, 500 mM, 600 mM, 700 mM, 800 mM, 900 mM, 1 M, 1,2 M, 1,3 M, 1,4 M, 1,5 M, 1,6 M, 1,7 M, 1,8 M, 1,9 M, 2 M, 3 M, 4 M, 5 M, 6 M, 7 M, 8 M, 9 M, 10 M ili opseg između bilo koje dve od ovih vrednosti, na primer, od 500 mM do 2 M, od 1 M do 1,5 M itd. Kao takva, mešavina prajmera kako je prikazano u ovom dokumentu, dopunjena sa betainom, na primer na približno 1,5 M, bila bi u prednosti kada se primenjuju metode prikazane u ovom dokumentu. U nekim primerima izvođenja, glicerol se može dodati u smešu prajmera. Na primer, u nekim primerima izvođenja pufer za amplifikacijui korišćeni u reakcijama amplifikacije sa nekonvencionalnim prajmerima prikazanim u ovom dokumentu sadrže koncentraciju glicerola koja je jednaka, približna, ili veća od 100 mM, 200 mM, 300 mM, 400 mM, 500 mM, 600 mM, 700 mM, 800 mM, 900 mM, 1 M, 1,2 M, 1,3 M, 1,4 M, 1,5 M, 1,6 M, 1,7 M, 1,8 M, 1,9 M, 2 M, 3 M, 4 M, 5 M, 6 M, 7 M, 8 M, 9 M, 10 M ili opseg između bilo koje dve od ovih vrednosti, na primer, od 500 mM do 2 M, od 1 M do 1,5 M itd. Kao takva, smeša prajmera kako je prikazano u ovom dokumentu, dopunjena glicerolom, na primer na približno 1,5 M, imala bi prednost kada se primenjuju metode prikazane u ovom dokumentu.
[0060] U nekim primerima izvođenja, puferi povezani sa nekonvencionalnim dizajnom prajmera koji se koriste u postupcima amplifikacije prikazanim u ovom dokumentu takođe mogu biti modifikovani. Na primer, u nekim primerima izvođenja, koncentracije soli, kao što su KCl, LiCl, NaCl ili njihova kombinacija, pufera za amplifikaciju povećavaju se u poređenju sa koncentracijom soli pufera za amplifikaciju koji se koristi zajedno sa konvencionalno dizajniranim prajmerima. U nekim primerima izvođenja, pufer za amplifikacijui koji se koriste u reakcijama amplifikacije sa nekonvencionalnim prajmerima prikazanim u ovom dokumentu sadrže koncentraciju KCl koja je jednaka, približna, ili veća od 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, 100 mM, 110 mM, 120 mM, 130 mM, 140 mM, 150 mM, 160 mM, 170 mM, 180 mM, 190 mM, 200 mM, 250 mM, 300 mM, 400 mM, 500 mM, ili opseg između bilo koje dve od ovih vrednosti, na primer, od 60 mM do 200 mM, od 100 mM do 250 mM itd. U nekim primerima izvođenja, pufer za amplifikacijui koji se koriste u reakcijama amplifikacije sa nekonvencionalnim prajmerima prikazanim u ovom dokumentu sadrže koncentraciju KCl koja iznosi oko 145 mM. U nekim primerima izvođenja, pufer za amplifikacijui koji se koriste u reakcijama amplifikacije sa nekonvencionalnim prajmerima prikazanim u ovom dokumentu sadrže koncentraciju LiCl koja je jednaka, približna, ili je veća od 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, 100 mM, 110 mM, 120 mM, 130 mM, 140 mM, 150 mM, 160 mM, 170 mM, 180 mM, 190 mM, 200 mM, 250 mM, 300 mM, 400 mM, 500 mM, ili opseg između bilo koje dve od ovih vrednosti, na primer, od 60 mM do 200 mM, od 100 mM do 250 mM, ctc. U nekim primerima izvođenja, pufer za amplifikacijui korišćeni u reakcijama amplifikacije sa nekonvencionalnim prajmerima prikazanim u ovom dokumentu sadrže koncentraciju LiCl koja iznosi oko 145 mM. U nekim primerima izvođenja, pufer za amplifikacijui korišćeni u reakcijama amplifikacije sa nekonvencionalnim prajmerima prikazanim u ovom dokumentu sadrže koncentraciju NaCl koja je jednaka, približna, ili je veća od 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, 100 mM, 110 mM, 120 mM, 130 mM, 140 mM, 150 mM, 160 mM, 170 mM, 180 mM, 190 mM, 200 mM, 250 mM, 300 mM, 400 mM, 500 mM, ili opseg između bilo koje dve od ovih vrednosti, na primer, od 60 mM do 200 mM, od 100 mM do 250 mM, itd. U nekim primerima izvođenja, pufer za amplifikacijui koji se koriste u reakcijama amplifikacije sa nekonvencionalnim prajmerima prikazanim u ovom dokumentu sadrže koncentraciju NaCl koja iznosi oko 145 mM.
[0061] U nekim primerima izvođenja, pufer za amplifikacijui koji se koriste u reakcijama amplifikacije sa nekonvencionalnim prajmerima prikazanim u ovom dokumentu mogu sadržati MgSO4, MgCl2ili njihovu kombinaciju.
Kitovi
[0062] Ostvarenja koja su ovde otkrivena obezbeđuju komplete koji sadrže najmanje jedno sredstvo za kontejner, pri čemu najmanje jedno sredstvo za kontejner sadrži mnoštvo prajmera kako su ovde otkriveni. U nekim primerima izvođenja, sredstvo za kontejner može biti cev, bunar, mikrotitarska ploča, itd. U nekim primerima izvođenja, mnoštvo prajmera može posebno da se hibridizuje u niz tandemskih ponavljajućih sekvenci, to jest, je ili je više od , 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 24, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ili opseg između bilo koje od dve vrednosti, kao što su 4 do 12, 10 do 24, 30 do 100 itd. U nekim primerima izvođenja, mnoštvo prajmera može posebno da se hibridizuje u najmanje 24 tandemske sekvence ponavljanja . U nekim primerima izvođenja, mnoštvo prajmera može specifično hibridizovati u najmanje 60 tandemskih sekvenci za ponavljanje. Ovde opisani postupci i kompozicije mogu da se koriste za amplifikaciju višestrukih SNP ciljnih sekvenci u jednoj reakciji. Na primer, mnoštvo prajmera može specifično hibridizovati sa određenim brojem SNP sekvenci koje su, jesu ili su veće ili su veće od 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 24, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ili opseg između bilo koje od dve vrednosti,
2
kao što su 4 do 12, 10 do 24, 30 do 100, itd. U nekim primerima izvođenja, veliki broj prajmera može posebno hibridizuje sa do najmanje 30 SNP sekvenci. U nekim primerima izvođenja, mnoštvo prajmera može specifično hibridizovati sa najmanje 50 SNP sekvenci.
[0063] U nekim primerima izvođenja, najmanje jedno sredstvo za kontejner sadrži pufer za amplifikaciju. U nekim primerima izvođenja, puferi povezani sa nekonvencionalnim dizajnom prajmera koji se koriste u postupcima amplifikacije prema predmetnom prikazu takođe mogu biti modifikovani. Na primer, u nekim primerima izvođenja koncentracije soli, kao što su KCl, LiCl, NaCl ili njihova kombinacija, pufera za amplifikaciju povećavaju se u poređenju sa koncentracijom soli pufera za pojačanje koji se koristi zajedno sa konvencionalno dizajniranim prajmerima. U nekim primerima izvođenja, pufer za amplifikaciju i koji se koriste u reakcijama amplifikacije sa nekonvencionalnim prajmerima kako su ovde prikazani sadrže koncentraciju KCl, NaCl ili LiCl koja je, ili je veća od, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, 100 mM 110 mM, 120 mM, 130 mM, 140 mM, 150 mM, 160 mM, 170 mM, 180 mM, 190 mM, 200 mM, 250 mM, 300 mM, 400 mM, 500 mM ili opseg između bilo koje dve od ovih vrednosti na primer, od 60 mM do 200 mM, od 100 mM do 250 mM, itd. U nekim primerima izvođenja, puferi za amplifikaciju koji se koriste u reakcijama amplifikacije sa nekonvencionalnim prajmerima kako su ovde otkriveni sadrže koncentraciju KCl, NaCl ili LiCl koja je oko 145 mM.
[0064] U nekim primerima izvođenja, puferi za amplifikaciju koji se koriste u reakcijama amplifikacije sa nekonvencionalnim prajmerima kako su ovde otkriveni mogu da sadrže MgSO4, MgCl2ili njihovu kombinaciju.
Metode sekvenciranja
[0065] Predmetni postupci nisu ograničeni na bilo koju određenu platformu za sekvenciranje, ali su ovde ipak dati primeri u vezi sa SBS ili sekvenciranje sintezom, što je tip paralelnog sekvenciranja. Naročito primenljive tehnike su one u kojima su nukleinske kiseline pričvršćene na fiksiranim mestima u nizu tako da se njihovi relativni položaji ne menjaju i pri čemu se niz više puta slika. Primeri u kojima se slike dobijaju u različitim kanalima u boji, na primer, poklapaju se sa različitim obeleživačima koje se koriste za razlikovanje jednog osnovnog tipa nukleotidne baze od drugog.
[0066] SBS tehnike obično uključuju enzimsku ekstenziju nascentnog lanca nukleinske kiseline kroz iterativno dodavanje nukleotida na osnovu matričnog lanca. U tradicionalnim metodama SBS tehnike, ciljni nukleotid može da se dobije jednim nukleotidnim monomerom u prisustvu polimeraze u svakoj isporuci. Međutim, u ovde opisanim postupcima, prilikom isporuke može da se obezbedi više od jedne vrste nukleotidnih monomera za ciljnu nukleinsku kiselinu u prisustvu polimereze.
2
[0067] SBS tehnike mogu da koriste nukleotidne monomere koji imaju komponentu obeleživača ili one koji nemaju komponentu obeleživača. Shodno tome, događaji ugradnje mogu da se detektuju na osnovu karakteristika obeleživača, kao što je fluorescencija obeleživača; karakteristika nukleotidnog monomera kao što je molekulska težina ili naelektrisanje; sporedni proizvod inkorporacije nukleotida, kao što je oslobađanje pirofosfata; ili slično. U nekim primerima gde su dva ili više različitih nukleotida prisutni u reagensu za sekvenciranje, različiti nukleotidi mogu da se razlikuju jedni od drugih, ili alternativno, dva ili više različitih obeleživača ne mogu da se razlikiju u tehnikama detekcije koje se koriste. Na primer, različiti nukleotidi prisutni u reagensu za sekvenciranje mogu da imaju različite obeleživače i mogu da se razlikuju pomoću odgovarajućih optičkih tehnika kao što je prikazano metodama sekvenciranja koje je razvila kompanija Solexa (sada Illumina, Inc.).
[0068] Neki primeri uključuju tehnike pirosekvenciranja. Pirosekvenciranje otkriva oslobađanje neorganskog pirofosfata (PPi) pošto se određeni nukleotidi ugrađuju u novonastalu nit (Ronaghi, M., Karamohamed, S., Pettersson, B., Uhlen, M. and Nyren, P. (1996) "Real time DNA sequencing using detection of pyrophosphate release."Analytical Biochemistry 242(1), 84-9; Ronaghi, M. (2001) "Pyrosequencing sheds light on DNA sequencing." Genome Res. 11(1), 3-11; Ronaghi, M., Uhlen, M. and Nyren, P. (1998) "A sequencing method based on real-time pyrophosphate." Science 281(5375), 363; U.S. Pat. No. 6,210,891; U.S. Pat. No. 6,258,568 and U.S. Pat. No. 6,274,320). U pirosekvenciranju, oslobođeni PPi može da se detektuje tako što se AT sulfurilaza odmah pretvori u adenozin trifosfat (ATP), a nivo generisanog ATP detektuje putem fotona proizvedenih luciferazom. Nukleinske kiseline koje će se sekvencirati mogu se prikačiti za karakteristike niza i niz može da se slika da bi uhvatio hemiluminscentne signale koji se dobijaju ugrađivanjem nukleotida u karakteristike niza. Slika može da se dobije nakon obrade niza određenim tipom nukleotida (npr. A, T, C ili G). Slike dobijene nakon dodavanja svakog tipa nukleotida razlikovaće se u odnosu na to koje su karakteristike u nizu otkrivene. Ove razlike na slici odražavaju različit sadržaj sekvenci karakteristika u nizu. Međutim, relativne lokacije svake od karakteristika ostaće nepromenjene na slikama. Slike se mogu čuvati, obrađivati i analizirati pomoću ovde navedenih metoda. Na primer, slikama dobijenim nakon obrade niza sa svakim različitim tipom nukleotida može se rukovati na isti način kao što je ovde prikazano kao primer sa slikama dobijenim iz različitih kanala detekcije za reverzibilne metode sekvenciranja zasnovane na terminatorima.
[0069] U drugom primeru SBS sekvenciranja, ciklično sekvenciranje se postiže postupnim dodavanjem reverzibilnih terminatorskih nukleotida koji sadrže, na primer, odvojivi ili fotoizbeljivi obojeni obeleživač, kao što je opisano, na primer, u WO 04/018497 i SAD pat. br.
7,057,026. Ovaj pristup na tržište donosi firma Solexa (sada Illumina Inc.), a takođe je opisan u
2
WO 91/06678 i WO 07 / 123,744. Dostupnost fluorescentno obeleženih terminatora u kojima i terminacija može da bude reverzibilna i odvojeni fluorescentni obeleživač omogućava efikasno cikličnu reverzibilnu terminaciju (CRT) sekvenciranja. Polimeraze se takođe mogu koinženjerizirati da bi se efikasno uklopile i proširile iz ovih modifikovanih nukleotida. Dodatni tipični SBS sistemi i postupci koji se mogu koristiti sa ovde opisanim metodama i sistemima opisani su u objavi SAD patentne prijave br. 2007/0166705, objavi SAD patentne prijave br.
2006/0188901, SAD pat. br. 7,057,026, objavi SAD patentne prijave br. 2006/0240439, objavi SAD patentne prijave br. 2006/0281109, PCT objavi br. WO 05/065814, objavi SAD patentne prijave br. 2005/0100900, PCT objavi br. WO 06/064199, PCT objavi br. WO 07/010,251, objavi SAD patentne prijave br.2012/0270305 i objavi SAD patentne prijave br.2013/0260372.
[0070] Neki primeri mogu da koriste detekciju četiri različita nukleotida koristeći manje od četiri različita obeleživača. Na primer, SBS može da se izvodi korišćenjem metoda i sistema opisanih u ugrađenim materijalima u američkoj patentnoj prijavi br.2013/0079232. Kao prvi prajmer, par nukleotidnih tipova može se otkriti na istoj talasnoj dužini, ali se razlikuje na osnovu razlike u intenzitetu jednog člana para u poređenju sa drugim, ili na osnovu promene jednog člana para (npr. putem hemijske modifikacije, fotohemijske modifikacije ili fizičke modifikacije) koja uzrokuje pojavljivanje ili nestajanje očiglednog signala u poređenju sa signalom otkrivenim za drugog člana para. Kao drugi prajmer, tri od četiri različita tipa nukleotida mogu se otkriti pod određenim uslovima, dok četvrtom tipu nukleotida nedostaje obeleživač koji može da se detektuje u tim uslovima ili se u tim uslovima minimalno detektuje (npr. minimalna detekcija zbog fluorescencije u pozadini itd.). Inkorporacija prva tri tipa nukleotida u nukleinsku kiselinu može se odrediti na osnovu prisustva njihovih odgovarajućih signala, a inkorporacija četvrtog tipa nukleotida u nukleinsku kiselinu može se utvrditi na osnovu odsustva ili minimalne detekcije bilo kog signala. Kao treći prajmer, jedan tip nukleotida može da sadrži obeleživače koji se detektuju u dva različita kanala, dok se drugi tipovi nukleotida detektuju u više od jednog kanala. Gore pomenute tri tipične konfiguracije ne smatraju se međusobno isključivim i mogu da se koriste u raznim kombinacijama. Tipični primer izvođenja koji kombinuje sva tri prajmera je SBS metoda zasnovana na fluorescenciji koja koristi prvi tip nukleotida koji se detektuje u prvom kanalu (npr. DATP ima oznaku koja se detektuje u prvom kanalu kada se pobudi prvom talasnom dužinom pobuđivanja) , drugi tip nukleotida koji se detektuje u drugom kanalu (npr. dCTP ima oznaku koja se detektuje u drugom kanalu kada se pobuđuje drugom talasnom dužinom pobuđivanja), treći tip nukleotida koji se detektuje i u prvom i u drugom kanalu ( npr. dTTP koji ima najmanje jednu oznaku koja se detektuje u oba kanala kada se pobuđuje prvom i / ili drugom talasnom dužinom pobuđivanja) i četvrti tip nukleotida kojem nedostaje obeleživač koji nije, ili je minimalno, detektovan ni u jednom kanalu (npr. dGTP koji nema obeleživač).
2
[0071] Dalje, kao što je opisano u SAD patentnoj prijavi br. 2013/0079232, podaci o sekvenciranju mogu se dobiti korišćenjem jednog kanala. U takozvanim pristupima sekvenciranja sa jednom bojom, prvi tip nukleotida je obeležen, ali se obeleživač uklanja nakon generisanja prve slike, a drugi tip nukleotida se obeležava tek nakon generisanja prve slike. Treći tip nukleotida zadržava obeleživač i na prvoj i na drugoj slici, a četvrti tip nukleotida ostaje neobeležen na obe slike.
[0072] Neki primeri mogu koristiti sekvenciranje tehnikama ligacije. Takve tehnike koriste DNK ligazu za inkorporiranje oligonukleotida i identifikuju inkorporacije takvih oligonukleotida. Oligonukleotidi tipično imaju različite obeleživače koi su u korelaciji sa identitetom određenog nukleotida u sekvenci sa kojim oligonukleotidi hibridizuju. Kao i kod ostalih SBS metoda, slike se mogu dobiti nakon obrade niza karakteristika nukleinske kiseline obeleženim reagensima za sekvenciranje. Svaka slika će pokazati karakteristike nukleinske kiseline koje imaju ugrađene oznake određenog tipa. Različite karakteristike će biti prisutne ili odsutne na različitim slikama zbog različitog sekvencijalnog sadržaja svake od njih, ali relativni položaj obeležja ostaće nepromenjen na slikama. Slike dobijene metodama sekvenciranja zasnovane na ligaciji mogu se čuvati, obrađivati i analizirati kako je ovde izloženo. Tipični SBS sistemi i postupci koji se mogu koristiti sa ovde opisanim metodama i sistemima opisani su u SAD 6,969,488, američki patent br. 6,172,218 i američki patent br.6,306,597.
[0073] Neki primeri mogu da koriste sekvenciranje nanopora (Deamer, D. W. & Akeson, M. "Nanopores and nucleic acids: prospects for ultrarapid sequencing." Trends Biotechnol. 18, 147 151 (2000); Deamer, D. and D. Branton, "Characterization of nucleic acids by nanopore analysis". Acc. Chem. Res. 35:817-825 (2002); Li, J., M. Gershow, D. Stein, E. Brandin, and J. A. Golovchenko, "DNA molecules and configurations in a solid-state nanopore microscope" Nat. Mater. 2:611-615 (2003)). U takvim realizacijama, ciljana nukleinska kiselina prolazi kroz nanoporu. Nanopora može biti sintetička pora ili biološki membranski protein, kao što je a hemolizin. Kako ciljana nukleinska kiselina prolazi kroz nanoporu, svaki bazni par može se identifikovati merenjem fluktuacija električne provodljivosti pore. (SAD Pat. No. 7,001,792; Soni, G. V. & Meller, "A. Progress toward ultrafast DNA sequencing using solid state nanopores." Clin. Chem. 53, 1996-2001 (2007); Healy, K. "Nanopore-based single-molecule DNA analysis." Nanomed. 2, 459-481 (2007); Cockroft, S. L., Chu, J., Amorin, M. & Ghadiri, M. R. "A single-molecule nanopore device detects DNA polymerase activity with single nucleotide resolution." J. Am. Chem. Soc.130, 818-820 (2008)). Podaci dobijeni sekvenciranjem nanopora mogu se čuvati, obrađivati i analizirati kako je ovde izloženo. Podaci se posebno mogu tretirati kao slika u skladu sa primerima tretmana optičkih slika i drugih slika koji su ovde izloženi.
2
[0074] U nekim primerima mogu da se koriste postupci koji uključuju praćenje aktivnosti DNK polimeraze u realnom vremenu. Uključivanje nukleotida može se otkriti interakcijama fluorescentnog rezonantnog prenosa energije (FRET) između polimeraze koja nosi fluorofor i nukleotidi obeleženi g fosfatom, kao što je opisano, na primer, u SAD pat. br. 7,329,492 i SAD pat. br. 7,211,414 ili se inkorporacija nukleotida može detektovati talasnim vođicama u nultom modu koje su opisane, na primer, u SAD pat. br. 7,315,019 i upotrebom fluorescentnih nukleotidnih analoga i inženjerisanih polimeraza, kao što je opisano, na primer, u SAD pat. br.
7,405,281 i objavi patentne prijave SAD pat. br 2008/0108082. Osvetljenje se može ograničiti na zapreminu zeptolitra oko površinski vezane polimeraze tako da se ugradnja fluorescentno obeleženih nukleotida može posmatrati sa niskom pozadinom (Levene, M. J. et al. "Zero-mode waveguides for single-molecule analysis at high concentrations." Science 299, 682-686 (2003); Lundquist, P. M. et al. "Parallel confocal detection of single molecules in real time." Opt. Lett.
33, 1026-1028 (2008); Korlach, J. et al. "Selective aluminum passivation for targeted immobilization of single DNA polymerase molecules in zero-mode waveguide nano structures." Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105, 1176-1181 (2008)). Slike dobijene ovim postupcima mogu da se skladište, obrađuju i analiziraju kao što je u ovom dokumentu izloženo.
[0075] Neki primeri izvođenja SBS uključuju detekciju protona koji se oslobađa ugrađivanjem nukleotida u produžni produkt. Na primer, sekvenciranje zasnovano na otkrivanju oslobođenih protona može da koristi električni detektor i povezane tehnike koje su komercijalno dostupne od kompanije Ion Torrent (Guilford, CT, podružnica firme Life Technologies) ili metode i sistemi sekvenciranja opisani u US 2009/0026082 A1; US 2009/0127589 A1; US 2010/0137143 A1; ili SAD 2010/0282617 A1. Ovde navedeni postupci za amplifikaciju ciljanih nukleinskih kiselina pomoću kinetičke ekskluzije mogu se lako primeniti na podloge koje se koriste za otkrivanje protona. Preciznije, ovde izloženi metodi mogu da se koriste za kreiranje klonskih populacija amplikona koji se koriste za otkrivanje protona.
[0076] Gore navedene SBS metode mogu se povoljno izvoditi u multipleks formatima tako da se istovremeno manipuliše sa više različitih ciljnih nukleinskih kiselina. U određenim realizacijama, različite ciljane nukleinske kiseline mogu se tretirati u zajedničkom reakcionom sudu ili na površini određenog supstrata. To omogućava pogodnu isporuku reagensa za sekvenciranje, uklanjanje nereagovanih reagenasa i otkrivanje događaja ugradnje u multipleks anner. U izvođenjima koja koriste površinski vezane ciljane nukleinske kiseline, ciljne nukleinske kiseline mogu biti u formatu niza. U formatu niza, ciljne nukleinske kiseline mogu se tipično vezati za površinu na prostorno prepoznatljiv način. Ciljne nukleinske kiseline mogu se vezati direktnim kovalentnim vezivanjem, vezivanjem za zrno ili drugu česticu ili vezivanjem za polimerazu ili drugi molekul koji je vezan za površinu. Niz može da sadrži po jednu kopiju ciljne nukleinske kiseline na svakom mestu (takođe se naziva i svojstvo) ili više kopija sa istim nizom može biti prisutno na svakom mestu ili obeležju. Višestruke kopije mogu se proizvesti metodama amplifikacije kao što su amplifikacija mosta ili PCR emulzija, kao što je detaljnije opisano u nastavku.
[0077] Metode ovog otkrića koriste tehnologiju Illumina, Inc. za sekvenciranje biblioteka DNK profila stvorenih vežbanjem ovde opisanih metoda. MiSek instrument za sekvenciranje je korišćen za grupisanje i sekvenciranje za primere koji su ovde opisani. Međutim, kao što je prethodno rečeno i kako razume stručnjak, sadašnji postupci nisu ograničeni vrstom platforme za sekvenciranje koja se koristi.
PRIMERI
[0078] Primeri koji slede prikazuju nekoliko postupaka i materijale za određivanje DNK profila. Ovi postupci i materijali mogu da se modifikuju, a da se pri tome zadrži obim pronalaska. Ove modifikacije postaće očigledne stručnjacima u oblasti, na osnovu razmatranja ovog prikaza ili praktikovanja ovde prikazanih postupaka. Usled toga, ne postoji namera da ovi postupci i materijali budu ograničeni na specifične, ovde prikazane primere, već da pokrivaju sve modifikacije i alternative koje spadaju u obim patentnih zahteva.
Primer 1-Dizajniranje nekonvencionalnih prajmera
[0079] Kompjuterski program za dizajniranje DesignStudio kompanije Illumina, Inc. (San Diego, CA), modifikovan je i upotrebljen za dizajniranje prajmera. Stručnjak u oblasti će naravno razumeti da isto tako mogu da se koriste i alternativni programi za dizajniranje prajmera, kao što je Primer3, kao i da predodređeni parametri mogu da se podešavaju kako bi podražavali namenu modifikovanih parametara za dizajniranje prajmera. Podešavanje se uobičajeno modifikuju u okviru config.xml fajla koji dolazi uz softver, međutim ovo može da se razlikuje kada se koristi drugačiji softver i uobičajena praksa je da se pristupa specifičnim materijalima za pristup primarnim parametrima. Sledeći parametri mogu da se podese u softveru za dizajn prajmera:
1) Željena minimalna dužina amplikona podešena na >60<
2) Željena maksimalna dužina amplikona podešena na >120<
3) Mala razdvojenost kandidata podešena >3< (primarno je 30bp)
4) %GC maks probe podešena na >60< da bi se omogućio povećan broj AT bogatih delova sa ponovcima
5) Srednja Tm podešena na >57< (primarno 59C) da bi se snizila srednja Tm
1
6) Maksimalna Tm podešena >60< (primarno 71)
7) Minimalna Tm podešena na >51< (primarno 55)
8) Srednja dužina probe podešena na >28< (primarno 27)
9) Maksimalna dužina probe podešena na >38< (primarno 30)
10) Minimalna dužina probe podešena na >25< (primarno 22)
[0080] Za dizajniranje SNP prajmera, opseg za ciljanje na kraj 3 ’prajmera postavljen je na„ mali “da bi prajmeri bili udaljeni oko 1 bp za ciljani SNP. Jednom kada se svi parametri resetuju, program dizajniranja prajmera može se pokrenuti u nizu da bi se utvrdili kandidati za par prajmera koji spadaju u nove parametre. Na primer, korisnik softvera može da generiše listu ciljeva koja softveru govori gde da traži u genomu za dizajniranje prajmera. U ovom primeru, ciljani regioni su kopirani i zalepljeni u aplikaciju grafičkog korisničkog interfejsa koju je softver DesignStudio koristio za orijentaciju i ciljanje dizajna prajmera. Jednom kada su ciljani regioni uneseni u program, program dircctcd kreira datoteku dizajna za pokretanje alata i izradu dizajna početnih slojeva. U ovom primeru, glavni izlaz je bila datoteka .tkt koja je sadržala početne sekvence i / ili neki od regiona sadržali su kvarove i bili su „neodredivi“, a u tom trenutku ciljane sekvence je trebalo redefinisati i ponovo pokrenuti. Softver korišten u ovom eksperimentu pružio je dizajnirane početnice koje su mapirane u sekvencu koja je navedena kao ciljani region. Nakon parametara resetovanja, dizajnirani su prajmeri koji nisu sledili konvencionalne kriterijume za dizajn prajmera za pojačanje; međutim što je omogućilo multipleksno pojačanje dugih STR ponovaka i kratkih SNP polimorfizama.
[0081] Primeri dizajniranih prajmera usmerenih na STR koji su poželjni u ovde prikazanim postupcima uključuju prajmere navedene u Tabeli 1. Primeri prajmera usmerenih na SNP, koji su poželjni u ovde prikazanim postupcima uključuju prajmere navedene u Tabeli 2.
Tabela 1 – Prajmer bez oznaka, usmeren na STR i veličina amplikona
2
4
Tabela 2 – Prajmeri usmereni na SNP
4
Primer 2-Određivanje DNK profila za baze podataka
[0082] Ovaj primer opisuje eksperiment koji sledi radni tok sa Sl.2. Ovaj primer ne koristi UMI, jer bi se moglo pretpostaviti da su dobijeni uzorci od pojedinaca čiji je identitet već poznat.
[0083] Za ovaj eksperiment, STR ponovci se multipleksiraju sa iSNP polimorfizmima, kako se vidi u Tabeli 3.
Tabela 3- SNP polimorfizmi i STR ponovci koji daju informacije o identitetu
4
[0084] Dodatni SNP polimorfizmi i STR ponovci mogu se naravno dodati na gornju listu. Primeri drugih potencijalnih ciljnih sekvenci uključuju, ali nisu ograničeni na, one markere koji se nalaze u Tabeli 4.
Tabela 4-Primeri dodatnih STR ponovaka i SNP polimorfizama za multipleksiranje
[0085] Prajmeri su dizajnirani tako da sadrže sekvencu PCR prajmera specifičnu za gen na 3’ kraju i sekvencu adapterske oznake na 5’ kraju. U ovom eksperimentu, nizvodni prajmeri sadrže sekvencu oznaka za TruSeq prilagođene Amplicon i5 adaptere, a reverzni prajmeri sadrže sekvencu oznaka za TruSeq Small RNA kit i7 adaptere. Oznake se mogu koristiti kao mesta prajmera za amplifikaciju, kao i mesta za praćenje sekvenciranja.
Sekvenca adapterske oznake i5 5’TACACGACGCTCTTCCGATCT3 (SEQ ID NO:403) ’
Sekvenca adapterske oznake i7 5’CTTGGCACCCGAGAATTCCA3’ (SEQ ID NO:404)
[0086] Da bi se uravnotežila amplifikacija između STR i SNP u multipleksu, parametri dizajna prajmera su modifikovani za SNP, kao što je opisano u Primeru 1. Originalni set SNP prajmera dizajniran pomoću programa Design Studio kompanije Illumina bili su klasični PCR prajmerikratke sekvence sa visokim temperaturama topljenja a malo ili nimalo sekundarne strukture. Design Studio je korišćen za dizajn TruSeq prilagođenih sondi Amplicon i za kreiranje obrnutog komplementa nizvodne sonde da bi se napravio reverzni PCR prajmer. Ovi prajmeri se, međutim, nisu dobro multipleksirali i jedan loš prajmer mogao bi pretvoriti test iz dobrog u loš (npr. Svi dimerovi prajmera i bez proizvoda) (SLIKA 4.) U pokušaju stvaranja boljih prajmera za multipleksiranje, Primer3 (sharevare) ) je korišćen koji sadrži funkciju biblioteke sa pogrešnim štampanjem. Otkriveno je da su Primer3 dizajnirani prajmeri imali još slabije rezultate u multipleks testu od primera Design Studio. Iznenađujuće je da su generisani podaci koji pokazuju da se STR prajmeri dobro multipleksiraju. Primećeno je da loše dizajnirani parovi prajmera usmereni na STR ciljne sekvence nisu uzrokovali multipleksne kvarove kao SNP prajmeri. STR prajmeri su dugi, bogati AT i imaju niske temperature topljenja, suprotno onome što je poznato kao "dobar" prajmer.
[0087] SNP prajmeri su redizajnirani prateći parametre iz Primera 1. Prajmeri su pomešani zajedno za sve ciljne sekvence. U ovom primeru, parovi prajmera za 56 STR su pomešani sa parovima prajmera za 75 iSNP, aSNP i fenotipsko-informativni SNP. Polimere (Hot-start Phusion II u ovom primeru) dodane su u mastermiks svih komponenata potrebnih za PCR i dodani su prajmeri. Smeša je pipetirana u bunarčiće PCR ploče, ali se pojačavanje moglo izvoditi i u epruvetama, itd. DNK je dodata na ploču kao prečišćena DNK u zapremini od 15 mikrolitara, međutim lizovani ekstrakti krvi ili bukalnih uzoraka iz brisa ili ne- tretirani filter papir ili direktno iz uzoraka krvi ili bukala na FTA karticama itd. takođe se mogu koristiti. Za ovaj eksperiment je korišćena prečišćena kontrolna 2800M DNK pri 1 ng i 100 pg. Reakcije su podvrgnute PCR reakciji tokom određenog broja ciklusa (u slučaju primera 25 ciklusa) sledeći protokol:
4
[0088] Nakon PCR reakcije, ploče su uklonjene iz PCR mašine. Reakcija je dovedena na 50 mikrolitara polimerazom (Kapa HiFi, Kapa Biosistems), PCR master smešom koja sadrži sve komponente potrebne za PCR i parom adaptera (jedan i7 i jedan i5 adapter). Izveden je drugi krug PCR reakcije tokom određenog broja ciklusa (10 ciklusa u slučaju primera) za generisanje biblioteka sekvenciranja, sledeći protokol:
98°C - 30sec
98°C - 15 sec
66°C - 30 sec
72°C - 1 min
72°C - 5min
10°C - održ.
[0089] Nakon PCR reakcije, ploča koja sadrži završene biblioteke uklonjena je iz PCR mašine. U ovom trenutku, uzorci se mogu objediniti zapreminom i prečistiti kao jedan uzorak, na primer, pomoću magnetnih zrnaca (SPRI). Uzorci se takođe mogu prečišćavati pojedinačno. Skup ili pojedinačne biblioteke mogu se kvantifikovati korišćenjem metode zasnovane na qPCR metodi, korišćenjem analizatora fragmenata ili BioAnalizer-a ili upotrebom PicoGreen-a i čitača ploča (kao u primeru). Stručnjak u oblasti znaće bezbroj mogućnosti za kvantifikovanje biblioteka. Ako se biblioteke prečišćavaju pojedinačno, mogu se normalizovati na 2 nM svake koncentracije i objediniti po zapremini.
[0090] Grupacije prečišćenih biblioteka su denaturisane, razblažene, grupirani i sekvencirani na MiSeq instrumentu za sekvenciranje sa nizom sekvenciranja od 350 ciklusa i dva indeksa očitavaju. Nakon sekvenciranja, uzorci su demultipleksirani u skladu sa sekvencama adaptera i analizirani kroz cevovod Forensics Genomics (Illumina, Inc.). STR očitavanja su odvojena od SNP očitavanja i analizirana nezavisno. STR su analizirani pomoću algoritma opisanog u prethodnoj patentnoj prijavi (PCT/US2013/30867,). Prijavljeni su brojevi ponavljanja i sve varijacije sekvence zajedno sa pročitanim brojevima. SNP polimorfizmi su analizirani pomoću manifesta i očitavanja su registrovana zajedno sa pročitanim brojevima očitavanja. Relativni bilans između alela (Min/Maks %), balans između lokusa (% CV), stope grešaka i stope statera izračunati su za STR lokuse. Rezultati za STR u početnom multipleksu za baze podataka prikazani su na Sl. 5A-C. Ravnoteža (srednja ravnoteža 80%), stater (∼3%) i stope grešaka
4
(manje od 5%) ispunjavaju zahteve za ulaz dizajna za lokuse obuhvaćene ovim primerom. % CV (~ 142%) izračunat je koristeći svih 56 lokusa. Iako korišćeni prajmeri pokazuju međulokusnu ravnotežu, očekuje se dalja optimizacija prajmera da bi se poboljšala međulokusna ravnoteža. Pozivi za poznati loci podudaraju objavljene rezultate za 2800M. Rezultati za SNP prikazani su na sl. 5D-E. Pokrivenost, pozivi alela, stateri i drugi artefakti za 56 STR lokusa u velikom multipleksu prikazani su na SL. 6. Ovi grafikoni oponašaju elektroferograme generisane CE tehnologijom. Stubići su analogni vrhovima za definisani alel (X osa), a brojanje očitavanja (Y osa) analogno je RFU. Pokrivenost SNP polimorfizama bila je negde od 10-2500Ks u zavisnosti od SNP-a, međutim svaki SNP koji je bio multipleksiran brojao se i pružao je tačne pozive.
Primer 3 – Određivanje DNK profila za kriminalistički slučaj
[0091] Ovaj primer opisuje eksperiment koji sledi radni tok sa Sl.3. Ovaj primer uključuje UMI u prajmere, jer bi se moglo pretpostaviti da su dobijeni uzorci od pojedinaca čiji identitet nije već poznat.
[0092] Za ovaj eksperiment, STR ponovci su multipleksirani sa iSNP polimorfizmima, aSNP polimorfizmima i fenotipski informativnim SNP polimorfizmima, kao što se vidi u Tabeli 5.
Tabela 5 – STR ponovci i SNP polimorfizmi za kriminalističke slučajeve
4
[0093] Ovaj primer uključuje UMI za STR prajmere. Za ove primere samo STR prajmeri sadrže UMI, međutim i STR i SNP prajmeri mogu da sadrže UMI po želji i ta opcija nije isključena iz
4
prakse. U ovom primeru, međutim, samo prajmeri STR uključuju UMI u demonstracijske svrhe. Jedinstveni identifikatori molekula uvedeni su tokom dva ciklusa PCR (slika 3). Prvo, kao u primeru 2, PCR prajmeri sadrže sekvencu PCR prajmera na 3 ’kraju i sekvencu adapterske oznake na 5’ kraju, isto kao i za sekvence oznaka korišćene u primeru 2 za i5 i i7 sekvence. U ovom eksperimentu, UMI se postavljaju između sekvence prajmera specifičnih za gen i sekvence oznaka. U slučaju ovog primera, postojalo je pet nasumičnih baza koje su korišćene za UMI i na uzvodnom i na reverznom prajmeru. Prajmeri su pomešani za sve ciljne sekvence. Smeša prajmera se sastojala od 26 parova prajmera autozomalnih STR ponovaka i 86 parova prajmera SNP polimorfizama (pokriveno 92 SNP polimorfizma). Polimeraza (Hot-start Phusion II u ovom primeru) je dodata u master smešu svih komponenata potrebnih za PCR i dodati su prajmeri. Smeša je pipetirana u bunarčiće PCR ploče. DNK je dodata na ploču kao prečišćena DNK, optimalno 1 ng. Kao u primeru 2, prečišćena DNK iz 2800M kontrole je testirana pri koncentraciji od 1 ng. Multipleks reakciona smeša je prošla kroz dva ciklusa PCR prema protokolu:
[0094] Posle ciklusa, uzorci su uklonjeni iz termičkog ciklera i u reakciju je dodat jednolančani protein koji veže DNK E. SSB (SSB). Smatralo se da SSB smanjuje razine prajmera neiskorišćenim označenim genom specifičnim prajmerima i sprečava bilo kakvo pojačavanje ovih prajmera. SSB je inkubiran sa uzorkom na ledu, alternativno se može koristiti i RT ili 37C inkubacija. Nakon ove inkubacije, polimeraza (Hot-start Phusion II u ovom primeru) je dodata u mastermik svih komponenata potrebnih za PCR, a mastermik je dodat u uzorak sa parom adaptera (i7 i i5 adapteri) i cikliran za određeni broj ciklusa (u ovom eksperimentu 34 ciklusa), sledeći protokol:
[0095] Uzorci su prečišćeni SPRI zrncima, a pojedinačne biblioteke su mogle biti kvantifikovane korišćenjem metode zasnovane na kPCR, korišćenjem analizatora fragmenata (kao u primeru) ili
4
BioAnalizer ili upotrebom PicoGreen i čitača ploča. Biblioteke su normalizovane na 2 nM svake koncentracije i objedinjene zapreminom.
[0096] Grupacije prečišćenih biblioteka su denaturisane, razblažene, grupirane i sekvencirane pomoću MiSeq sa ciklusom sekvenciranja od 350k100 ciklusa i dva indeksa očitavaju. Posle sekvenciranja, podaci su utvrđeni kao što je navedeno u Primeru 2. Međutim, s obzirom da prajmeri sadrže UMI, UMI su korišćeni za sažimanje podataka korišćenjem PCR duplikata za uklanjanje sekvenciranja i PCR grešaka i artefakata. SNP polimorfizam su analizirani pomoću manifesta i pozivi su prijavljeni zajedno sa pročitanim brojevima. Izračunata je relativna ravnoteža između alela (Min/Maks%), ravnoteža između lokusa (% CV), stope grešaka i stope statera (samo STR). Rezultati za početni multipleks slučaja prikazani su na Sl. 7A-E. Pokrivenost, pozivi alela, stater i drugi artefakti za 26 STR lokusa u velikom multipleksu prikazani su na SL. 8. Ovi grafikoni oponašaju elektroferograme koje generiše CE. Trake su analogne vrednostima pikova, a brojanje očitavanja analogno RFU. Pokrivenost SNP-a bila je negde od 10-5500Ks u zavisnosti od SNP-a, međutim svaki SNP koji je multipleksiran je prebrojan i pružio je korisne rezultate.
[0097] Jedan rezultat koji su generisale ove studije je da se pokazalo da je stater PCR artefakt. Mnogi istraživači su ovo pretpostavili (a proklizavanje polimeraze je naznačeno kod karcinoma debelog creva kod ljudi), ali to nije dokazano u forenzičkim testovima. UMI se mogu koristiti da pokažu da je stater zaista PCR artefakt. Proizvodi sa n 1 ili n-1 ponavljanjima imaju iste UMI kao i proizvodi sa tačnim brojem ponavljanja (SLIKA 9). Na sl. 9A svaki lokus prikazuje rezultate bez UMI korekcije u poređenju sa SLIKOM.9B gde se vrši UMI korekcija. Kao što je pokazano, bez UMI korekcije ravnoteža između alela nije tako dobra kao kada se vrši UMI korekcija. Dalje, postoji znatno više statera koje je očigledno bez UMI korekcije. Deo trake iznad linije između stubića predstavlja grešku u sekvenciranju, dok deo ispod linije predstavlja tačan niz unutar STR sekvence. Greška se znatno smanjuje korišćenjem UMI korekcije. Na primer, SE33 lokus ima grešku koja se uklanja pomoću UMI korekcije. Ispravljanje grešaka može biti izuzetno važno za krivični postupak kako bi se obezbedilo najtačnije moguće DNK profilisanje.
Primer 4-Određivanje DNK profila iz uzorka 12 pojedinaca
Metode i materijali
[0098] DNK od 12 jedinki uzoraka (Uzorak #: 1, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 13, 14, 15, 16, 17) i jednog referentnog genoma (2800M) testiran je prateći radni tok sa SL. 3. Ovaj eksperiment uključuje UMI-je u STR početnice kao što je opisano u Primeru 3. Dva replikata svakog uzorka su analizirane pomoću Illumina® ForenSeq DNA Signature Librari Prep Kit na MiSek sekvencer. Za svaku replikaciju korišćena je po jedna ng DNK, koristeći mešavinu Primer Primer B: Mešavina prikupljenih uzoraka, koja sadrži prajmere za 61 STRs plus Amelogenin, 95 informativnih SNP-a o identitetu, 56 SNP-ova o poreklu, 22 fenotipsko-informativna SNP-a (2 SNP-a porekla se takođe koriste za predviđanje fenotipa).
Primarna podešavanja
[0099] STR: analitički prag = 6,5%; interpretacijski prag = 15%. SNP: analitički prag = 3%; interpretacijski prag = 15%.
[0100] Detalja očitavanja sekvenci, kao što su pokrivenost i očitani lokusi, za određivanje DNK profila iz 12 uzoraka pojedinaca prikazani su na SL. 12. Kao što se može videti, svako mesto je pokriveno sa najmanje 100 000 čitanja u oba ponavljanja. Samo dva uzorka dovela su do neuspelog očitavanja STR (1 od 61). Svih 173 SNP polimorfizama je uspešno očitano kod svih pojedinaca u oba ponavljanja. STR očitavanja uzoraka za dva pojedinačna uzorka su prikazana na SL. 16. SNP očitavanja uzoraka za dva pojedinačna uzorka su prikazana na Sl. 17. SL. 13 prikazuje statističke podatke o populaciji, kao što su verovatnoća slučajnog podudaranja (RMP) auto-STR ponovaka Nacionalnog instituta za standarde i tehnologiju (NIST), poverljivost od 95% za učestalost haplotipa NIST Y-STR, RMP za dbSNP iSNP i RMP za STR ponovke iz američke baze podataka za Y-STR.
[0101] Predikcije za fenotipove, kao što su boja očiju i boja kose, za 12 uzoraka pojedinaca i referentne osobe, date su na osnovu genotipa pSNP ponovaka u eksperimentu i upoređivani sa fenotipovima koji su sami prijavili (slika 14). Primećen je visok stepen korelacije između predikcija i utvrđenih fenotipova.
[0102] Predak 12 jedinki uzorka predviđen je korišćenjem genotipa 56 aSNP u eksperimentu. Izračunati su rezultati PCA1 i PCA3 svakog pojedinca u uzorku i ucrtani u odnosu na referentne uzorke na parceli predaka. Kao što je prikazano na sl.15, poreklo pojedinaca iz uzorka može se predvideti na osnovu lokacije na parceli predaka. Četrnaest centroidnih tačaka bilo je uključeno u parcelu predaka (krugovi). Na osnovu najbliže tačke centroida predviđeno je poreklo svakog uzorka pojedinca.
[0103] Eksperiment za DNK profilisanje takođe je pokazao visok nivo ravnoteže unutar lokusa i u STR lokusima i u SNP lokusima, kao što se može videti na SL.18, i nizak nivo statera, kao što se može videti na SL.19.
[0104] Šest od 12 jedinki plus 2800M imaju najmanje jedan izometrični heterozigotni lokus, što je prikazano na SL. 20. Izometrični lokus heterozigota je definisan kao STR koji ima isti broj ponavljanja, dve različite sekvence, koje su podjednako uravnotežene. Koristeći informacije o
1
varijantama u STR D8S1179, 13 alela uzorka 15 pronađeno je do bake, uzorka 17 (slika 21). Slične varijantne informacije u STR D13S317 korišćene su za traženje alela iz uzorka 15. Međutim, u ovom slučaju poreklo bilo kog alela ne može se utvrditi (slika 22).
Primer 5- Određivanje DNK profila za istraživanje, forenzičku upotrebu ili za određivanje očinstva
[0105] Ovaj primer zasnovan je na radnom toku opisanom u publikaciji ForenSeq™ DNA Signature Prep Guide (Illumina, San Diego, CA).
[0106] Za ovaj primer se može koristiti ili prečišćena DNK ili sirovi lizat. Za prečišćenu DNK, svaki uzorak od 1 ng se razblaži vodom do 0,2 ng/ml, vodom bez nukleaze. Za sirovi lizat, svaki uzorak od 2 μl se razblaži sa 3 μl vode bez nukleaze. Master smeša se priprema za osam ili više reakcija. Za svaku reakciju dodaje se 5,4 μl ForenSeq PCR1 reakcione mešavine, 0,4 μl ForenSeq mešavine enzima i 5,8 μl mešavine DNK prajmera (A ili B) u 1,5 ml epruvetu za mikrocentrifugu. 10 μl master smeše se prebacuje u svaki bunarčić PCR ploče i dodaje se DNK ili lizat. Multipleksna reakciona smeša se podvrgava PCR reakciji prema protokolu:
98 stepeni C tokom 3 min.
8 ciklusa po:
96 stepeni C tokom 45 sec.
80 stepeni C tokom 30 sec.
54 stepeni C tokom 2 min., sa definisanim načinom podizanja temperature
68 stepeni C tokom 2 min., sa definisanim načinom podizanja temperature
10 ciklusa po:
96 stepeni C tokom 30 sec.
68 stepeni C tokom 3 min., sa definisanim načinom podizanja temperature
68 stepeni C tokom 10 min.
Zadržavanje na 10 stepeni C.
[0107] Posle PCR reakcije, uzorci su uklonjeni iz PCR mašine. U uzorke je dodat reagens ForenSeq PCR2 Reaction Mix sa parom adaptera (i7 i i5 adapteri) i uzorci su izloženi amplifikaciji tokom 15 ciklusa, prema protokolu:
98 stepeni C tokom 30 sec.
15 ciklusa po:
2
98 stepeni C tokom 20 sec.
66 stepeni C tokom 30 sec.
68 stepeni C tokom 90 sec.
68 stepeni C tokom 10 min.
Održavanje na 10 stepeni C.
[0108] Uzorci se prečišćavaju zrncima za prečišćavanje uzoraka, a biblioteke se normalizuju i objedinjuju po obimu. Biblioteke organizovane u grupacije se razblažuju u puferu za hibridizaciju (HT1), dodaje se reagens Human Sequencing Control (HSC) i denaturišu se toplotom u pripremi za sekvenciranje.
Primer 6-Genotipizacija sa degradovanom DNK
[0109] SL. 23 prikazuje rezultate genotipizacije upotrebom fragmentisane DNK i/ili DNK obrađene pomožu DNaze koja predstavlja degradiranu DNK. Kao što je prikazano, više od 50% STR i SNP lokusa korektno je očitano sa fragmentisanom DNK. Verovatnoća slučajnog podudaranja (RMP) od 10-19 je postignuta sa DNK manjom od 100 bp. Poreklo je takođe tačno predviđeno korišćenjem degradovane DNK.
Primer 7-Senzitivnost genotipizacije
[0110] Slike 24 i 25 pokazuju rezultate osetljivosti na genotipizaciju sa polaznim količinama DNK nižim od nanograma, od 7,82 pg do 1 ng. Kao što je prikazano, 100% alela je uspešno očitano pri početnoj količini DNK od 125 ng, i za STR i za SNP. Više od 50% alela je uspešno očitano sa samo 7,82 pg polazne DNK. Ravnoteža unutar lokusa bila je veća od 70% za većinu lokusa pri polaznoj količini DNK od 1 ng.
[0111] Svaki numerički parametar treba tumačiti u svetlu broja značajnih cifara i uobičajenih pristupa zaokruživanju.
[0112] U meri u kojoj su publikacije i patenti ili patentne prijave pomenute u ovom dokumentu u suprotnosti sa otkrivanjem sadržanim u specifikaciji, namenjeno je tome da ta zamenjuje i/ili ima prednost nad bilo kojim takvim kontradiktornim materijalom.
[0113] Citiranje gorenavedenih publikacija ili dokumenata nije zamišljeno kao priznanje da je bilo šta od navedenog relevantno stanje tehnike, niti predstavlja bilo kakvo priznanje u pogledu sadržaja ili datuma ovih publikacija ili dokumenata.
[0114] Iako je ovaj pronalazak u potpunosti opisan u vezi sa svojim primerima izvođenja, pozivajući se na prateće crteže, treba napomenuti da će različite promene i modifikacije u okviru obima patentnih zahteva postati očigledne stručnjacima u ovoj oblasti. Različite primere izvođenja pronalaska treba shvatiti tako kao da su predstavljena samo kao primer, a ne kao ograničenje. Na sličan način, različiti dijagrami mogu prikazati primer arhitektonske ili druge konfiguracije za pronalazak, što je urađeno da bi se pomoglo razumevanju karakteristika i funkcionalnosti koje mogu biti obuhvaćene pronalaskom. Pronalazak nije ograničen na ilustrovane primere arhitektura ili konfiguracija, ali se može primeniti pomoću različitih alternativnih arhitektura i konfiguracija. Pored toga, iako je pronalazak gore opisan u terminima različitih primera izvođenja i primena, treba razumeti da različite karakteristike i funkcionalnosti opisane u jednom ili više pojedinačnih primena nisu ograničene u svojoj primenljivosti na određeno ostvarenje sa kojim su opisano. Umesto toga, mogu se primeniti, pojedinačno ili u nekoj kombinaciji, na jednu ili više drugih realizacija pronalaska, bez obzira da li su takve realizacije opisane ili ne i da li su takve karakteristike predstavljene kao deo opisane realizacije. Stoga širina i obim pronalaska ne bi trebalo da budu ograničeni bilo kojim od gore opisanih tipičnih izvođenja, već patentnim zahtevima.
[0115] Za izraze i fraze koje se koriste u ovom dokumentu, ili u njegovim primerima izvođenja, potrebno je, osim ako nije eksplicitni drugačije rečeno, smatrati da su otvorenog značenja, za razliku od ograničavajućeg. Kao primeri za prethodno rečeno: za izraz "uključujući" treba da se smatra da znači "uključujući, bez ograničenja" ili slično tome; izraz "primer" koristi se da obezbedi predmet u diskusiji, a ne njegov iscrpan ili ograničavajući spisak; i prideve kao što su „konvencionalni“, „tradicionalni“, „normalni“, „standardni“, „poznati“ i izrazi sličnog značenja ne treba tumačiti kao ograničavanje predmeta opisanog na dati vremenski period ili na raspoloživu stavku kao određeno vreme. Dalje, iako se predmeti, elementi ili komponente pronalaska mogu opisati ili tvrditi u jednini, smatra se da je množina u njenom obimu, osim ako izričito nije navedeno ograničenje u jednini. Na primer, „bar jedan“ može se odnositi na jednu ili množinu i nije ograničen ni na jedno. Prisustvo proširivih reči i fraza kao što su „jedna ili više“, „najmanje“, „ali bez ograničenja na“ ili neke druge slične fraze u nekim slučajevima se neće čitati tako da znači da je uži slučaj namenjen ili potreban u pojedinim slučajevima gde takve fraze za proširivanje mogu biti odsutne.
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
11
11
11
11
11
11
11
12
12

Claims (14)

Patentni zahtevi
1. Postupak za konstruisanje DNK profila koji obuhvata: obezbeđivanje uzorka nukleinske kiseline,
amplifikaciju uzorka nukleinske kiseline pomoću smeše prajmera koja sadrži veliki broj prajmera koji specifično hibridizuju sa najmanje jednom ciljnom sekvencom koja sadrži polimorfizam pojedinačnog nukleotida (SNP) i najmanje jednom ciljnom sekvencom koja sadrži tandemski ponovak, u multipleks reakciji, kako bi se generisao proizvod amplifikacije, pri čemu svaki od velikog broja prajmera ima temperaturu topljenja koja je niža od 60 stepeni C, ima dužinu od najmanje 24 nukleotida koji hibridizuju sa ciljnom sekvencom, i bogat je AT parovima, sa sadržajem AT parova većim od 60%, pri čemu svaki od velikog broja prajmera opciono sadrži homopolimernu nukleotidnu sekvencu; i
od određivanja genotipa za najmanje jedan SNP polimorfizam i najmanje jedan tandemski ponovak u proizvodima amplifikacije, čime se konstruiše DNK profil uzorka nukleinske kiseline.
2. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što postupak obuhvata amplifikaciju proizvoda amplifikacije pomoću drugog velikog broja prajmera.
3. Postupak prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2, koji dodatno obuhvata generisanje biblioteke nukleinskih kiselina od proizvoda amplifikacije, naznačen time što postupak opciono obuhvata određivanje sekvenci biblioteke nukleinskih kiselina.
4. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1 -3, pri čemu uzorak nukleinske kiseline predstavlja uzorak čoveka, uzorak životne sredine, biljke, životinje koja nije čovek, bakterije, arhee, gljive ili virusa.
5. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4, naznačen time što najmanje jedan SNP ukazuje na poreklo ili fenotipske karakteristike izvora iz koga potiče uzorak nukleinske kiseline.
6. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-5, naznačen time što je DNK profil pogodan za upotrebu u jednom ili više postupaka za, dijagnostifikovanje ili prognozu u slučaju bolesti, za identifikaciju biomerkera kod kancera, za identifikaciju genetskih anomalija ili analizu genetičke raznovrsnosti, za rad sa bazama podataka, za forenzičku, kriminalističku identifikaciju, utvrđivanje očinstva ili za ličnu identifikaciju
7. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6, naznačen time što se uzorak nukleinske kiseline amplifikuje lančanom reakcijom polimeraze (PCR).
8. Postupak prema patentnom zahtevu 7, naznačen time što se uzorak nukleinske kiseline amplifikuje u puferu za amplifikaciju, pri čemu pufer za amplifikaciju sadrži KCl u koncentraciji koja je u opsegu 60mM do 500mM, LiCl u koncentraciji koja je u opsegu 60mM do 500mM, NaCl u koncentraciji koja je u opsegu 60mM do 500mM, ili njihovu kombinaciju.
9. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-8, naznačen time što SNP polimorfizam predstavlja SNP nasleđa, SNP fenotipa, SNP identiteta, ili njihovu kombinaciju; i/ili gde veliki broj prajmera specifično hibridizuje sa najmanje 30 SNP polimorfizama ili sa najmanje 50 SNP polimorfizama; i/ili gde tandemski ponovak predstavlja kratak tandemski ponovak (STR), intermedijerni tandemski ponovak (ITR), ili njihovu varijantu; i/ili gde veliki broj prajmera specifično hibridizuje sa najmanje 24 sekvence tandemskih ponovaka ili sa najmanje 60 sekvenci tandemskih ponovaka; i/ili gde uzorak nukleinske kiseline sadrži 100 pg do 100 ng DNK, ili 10 pg do 100 pg DNK, ili 5 pg do 10 pg DNK; i/ili gde uzorak nukleinske kiseline sadrži genomsku DNK; i/ili gde se određuje najmanje 50%, 80%, 90%, ili 95% genotipova najmanje jednog SNP polimorfizma i najmanje jednog tandemskog ponovka.
10. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-9, naznačen time što svaki od velikog broja prajmera sadrži jednu ili više sekvenci za označavanje koje nisu homologe sa ciljnom sekvencom, pri čemu, opciono, jedna ili više sekvenci za označavanje sadrže prajmersku oznaku, oznaku za vezivanje, oznaku za sekvenciranje, oznaku za jedinstvenu molekulsku identifikaciju, ili njihovu kombinaciju.
11. Postupak konstruisanja biblioteke nukleinskih kiselina koji obuhvata:
obezbeđivanje uzorka nukleinske kiseline, i
amplifikaciju uzorka nukleinske kiseline pomoću smeše prajmera koja sadrži veliki broj prajmera koji specifično hibridizuju sa najmanje jednom ciljnom sekvencom koja sadrži polimorfizam pojedinačnog nukleotida (SNP) i najmanje jednom ciljnom sekvencom koja sadrži sekvencu tandemskog ponovka, u multipleks reakciji, kako bi se generisali proizvodi amplifikacije, pri čemu svaki od velikog broja prajmera ima temperaturu topljenja koja je niža od 60 stepeni C, ima dužinu od najmanje 24 nukleotida koji hibridizuju sa ciljnom sekvencom, i bogat je AT parovima, sa sadržajem AT parova većim od 60%, pri čemu svaki od velikog broja prajmera opciono sadrži homopolimernu nukleotidnu sekvencu.
12. Postupak prema patentnom zahtevu 11, naznačen time što uzorak nukleinske kiseline nije fragmentisan pre amplifikacije; i/ili gde ciljne sekvence nisu obogaćene pre amplifikacije; i/ili gde najmanje jedan SNP ukazuje na poreklo ili fenotipske karakteristike izvora iz koga potiče uzorak nukleinske kiseline; i/ili pri čemu svaki od velikog broja prajmera sadrži jednu ili više sekvenci za označavanje koje nisu homologe sa ciljnom sekvencom; i/ili pri čemu postupak dodatno obuhvata amplifikaciju proizvoda amplifikacije pomoću drugog velikog broja prajmera.
13. Postupak prema patentnom zahtevu 11 ili patentnom zahtevu 12, naznačen time što se uzorak nukleinske kiseline i/ili proizvodi amplifikacije amplifikuju lančanom reakcijom polimeraze (PCR).
14. Postupak prema patentnom zahtevu 13, naznačen time što se uzorak nukleinske kiseline i/ili proizvodi amplifikacije amplifikuju u puferu za amplifikaciju, pri čemu pufer za amplifikaciju sadrži KCl u koncentraciji koja je u opsegu 60mM do 500mM, LiCl u koncentraciji koja je u opsegu 60mM do 500mM, NaCl u koncentraciji koja je u opsegu 60mM do 500mM, ili njihovu kombinaciju.
12
RS20210751A 2014-02-18 2015-02-13 Postupci i kompozicije za određivanje dnk profila RS61976B1 (sr)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201461940942P 2014-02-18 2014-02-18
US201462043060P 2014-08-28 2014-08-28
US201562103524P 2015-01-14 2015-01-14
PCT/US2015/015939 WO2015126766A1 (en) 2014-02-18 2015-02-13 Methods and compositions for dna profiling
EP15708379.1A EP3108009B1 (en) 2014-02-18 2015-02-13 Methods and compositions for dna profiling

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS61976B1 true RS61976B1 (sr) 2021-07-30

Family

ID=52629678

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20210751A RS61976B1 (sr) 2014-02-18 2015-02-13 Postupci i kompozicije za određivanje dnk profila

Country Status (22)

Country Link
US (2) US10422002B2 (sr)
EP (2) EP3910069A1 (sr)
JP (3) JP7011392B2 (sr)
CN (1) CN106164298B (sr)
AU (2) AU2015219289B2 (sr)
BR (2) BR122022007092B8 (sr)
CA (1) CA2940048C (sr)
DK (1) DK3108009T3 (sr)
ES (1) ES2866044T3 (sr)
HR (1) HRP20210953T1 (sr)
HU (1) HUE055256T2 (sr)
LT (1) LT3108009T (sr)
MX (1) MX379233B (sr)
MY (2) MY182415A (sr)
NZ (1) NZ723399A (sr)
PL (1) PL3108009T3 (sr)
PT (1) PT3108009T (sr)
RS (1) RS61976B1 (sr)
RU (2) RU2752700C2 (sr)
SA (1) SA516371691B1 (sr)
SI (1) SI3108009T1 (sr)
WO (1) WO2015126766A1 (sr)

Families Citing this family (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20220041957A (ko) * 2013-03-15 2022-04-01 아비에 도이치란트 게엠베하 운트 콤파니 카게 항-egfr 항체 약물 접합체 제형
ES2866044T3 (es) * 2014-02-18 2021-10-19 Illumina Inc Métodos y composiciones para la elaboración de perfiles de ADN
US9618474B2 (en) 2014-12-18 2017-04-11 Edico Genome, Inc. Graphene FET devices, systems, and methods of using the same for sequencing nucleic acids
US10006910B2 (en) 2014-12-18 2018-06-26 Agilome, Inc. Chemically-sensitive field effect transistors, systems, and methods for manufacturing and using the same
US10020300B2 (en) 2014-12-18 2018-07-10 Agilome, Inc. Graphene FET devices, systems, and methods of using the same for sequencing nucleic acids
US9857328B2 (en) 2014-12-18 2018-01-02 Agilome, Inc. Chemically-sensitive field effect transistors, systems and methods for manufacturing and using the same
US10429342B2 (en) 2014-12-18 2019-10-01 Edico Genome Corporation Chemically-sensitive field effect transistor
US9859394B2 (en) 2014-12-18 2018-01-02 Agilome, Inc. Graphene FET devices, systems, and methods of using the same for sequencing nucleic acids
AU2016252998B2 (en) * 2015-04-24 2021-11-04 Atila Biosystems Incorporated Amplification with primers of limited nucleotide composition
CN105755129B (zh) * 2016-03-21 2020-03-31 北京市理化分析测试中心 基于新一代测序的基因座d8s1179的str分型方法
US9963750B2 (en) 2016-05-13 2018-05-08 Colorado State University Research Foundation High throughput method to genotype plants
WO2017201081A1 (en) 2016-05-16 2017-11-23 Agilome, Inc. Graphene fet devices, systems, and methods of using the same for sequencing nucleic acids
US10822647B2 (en) * 2016-07-12 2020-11-03 Biodynamics S.R.L. Methods for using long ssDNA polynucleotides as primers (superprimers) in PCR assays
IL266197B2 (en) 2016-10-24 2024-03-01 Geneinfosec Inc Hiding information contained within nucleic acids
EP4134444B1 (en) * 2017-03-23 2024-10-02 University of Washington Methods for targeted nucleic acid sequence enrichment with applications to error corrected nucleic acid sequencing
CN106835292B (zh) * 2017-04-05 2019-04-09 北京泛生子基因科技有限公司 一步法快速构建扩增子文库的方法
KR20200004335A (ko) 2017-05-05 2020-01-13 스키피오 바이오사이언스 하이드로겔 내의 별개의 생물학적 단위를 트래핑하고 바코딩하는 방법
CN111356795B (zh) * 2017-05-23 2024-04-26 哈佛学院董事及会员团体 核酸的多重末端标记扩增
EP3642362B1 (en) 2017-06-20 2025-10-15 Illumina, Inc. Methods for addressing inefficiencies in amplification reactions
AU2018313286B2 (en) 2017-08-11 2024-09-12 Atila Biosystems Incorporated Digital amplification with primers of limited nucleotide composition
CN107868837B (zh) * 2017-12-12 2019-03-01 苏州普瑞森基因科技有限公司 一种用于分析肠道微生物的引物组合物及其应用
CN109988826A (zh) * 2017-12-30 2019-07-09 安诺优达基因科技(北京)有限公司 一种基于str计算混合样本嵌合比例的方法以及系统
EP3517629A1 (en) * 2018-01-30 2019-07-31 Myway Genetics S.r.L. Use of cfdna fragments as biomarkers in patients after organ transplantation
CN108342469A (zh) * 2018-02-27 2018-07-31 广州中安基因科技有限公司 一种皮肤基因检测的基因芯片
CN112189055B (zh) * 2018-03-22 2024-07-19 哈佛学院院长及董事 用于分子认证的方法和组合物
JP6646120B1 (ja) * 2018-10-01 2020-02-14 日本ソフトウェアマネジメント株式会社 分解されたｄｎａで個体識別可能なｄｎａ鑑定方法
KR102097721B1 (ko) * 2019-01-24 2020-04-06 주식회사 시선바이오머티리얼스 태그서열 snp를 이용한 단일 검출 프로브 기반 다중 표적 검출방법
CN111485024B (zh) * 2019-01-29 2024-04-26 深圳华大法医科技有限公司 用于个体特征确认的引物组合、及其应用
KR102351579B1 (ko) * 2019-06-25 2022-01-17 대한민국 상염색체 str 좌위를 포함한 ngs 패널 및 다중증폭 시스템
EP4028546A1 (en) * 2019-09-11 2022-07-20 Parlanca Limited A multiplex method of preparing a sequencing library
CA3176620A1 (en) * 2020-03-31 2021-10-07 Personal Genome Diagnostics Inc. Compositions and methods for nucleic acid quality determination
CN112592981B (zh) * 2020-12-01 2023-06-20 广州精科医学检验所有限公司 用于dna档案建库的引物组、试剂盒和方法
CN112342303A (zh) * 2020-12-04 2021-02-09 郑州高新生物技术有限公司 一种基于ngs的人类y染色体str和snp遗传标记联合检测体系及检测方法
CN112852970A (zh) * 2020-12-31 2021-05-28 百特元生物科技（北京）有限公司 一种同时扩增人37个y-str基因座的引物组、试剂盒及其应用
JP2024507168A (ja) 2021-02-12 2024-02-16 ベロジェン・インコーポレイテッド Ｄｎａベースの血縁関係解析のための方法および組成物
CN113293205B (zh) * 2021-05-24 2024-11-26 深圳市真迈生物科技有限公司 测序方法
KR102337267B1 (ko) * 2021-06-01 2021-12-08 주식회사 다우진유전자연구소 유전자 감식을 위한 24개의 str 유전자 마커를 이용한 pcr 다중증폭 시스템
CN113930490B (zh) * 2021-09-27 2024-09-10 江汉大学 二代测序平台中利用分子特异性条形码评估str滑脱的方法及其应用
US20240412816A1 (en) * 2021-10-13 2024-12-12 Verogen, Inc. Methods and compositions for improving accuracy of dna based kinship analysis
EP4272764A1 (en) 2022-05-03 2023-11-08 Scipio Bioscience Method of complexing biological units with particles
JP2025530659A (ja) 2022-08-16 2025-09-17 ベロジェン・インコーポレイテッド 行方不明者および災害／紛争犠牲者のための血縁関係評価のための方法およびシステム
EP4599059A4 (en) * 2022-10-21 2026-03-04 Watchmaker Genomics Inc METHODS AND COMPOSITIONS FOR NORMALIZING SEQUALIZATION LIBRARIES
EP4603595A1 (en) * 2024-02-13 2025-08-20 ImmuneDiscover Sweden AB A method for typing the immune genes and the allelic variants thereof

Family Cites Families (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2044616A1 (en) 1989-10-26 1991-04-27 Roger Y. Tsien Dna sequencing
US5846719A (en) 1994-10-13 1998-12-08 Lynx Therapeutics, Inc. Oligonucleotide tags for sorting and identification
US5750341A (en) 1995-04-17 1998-05-12 Lynx Therapeutics, Inc. DNA sequencing by parallel oligonucleotide extensions
GB9620209D0 (en) 1996-09-27 1996-11-13 Cemu Bioteknik Ab Method of sequencing DNA
GB9626815D0 (en) 1996-12-23 1997-02-12 Cemu Bioteknik Ab Method of sequencing DNA
JP2002503954A (ja) 1997-04-01 2002-02-05 グラクソ、グループ、リミテッド 核酸増幅法
US6969488B2 (en) 1998-05-22 2005-11-29 Solexa, Inc. System and apparatus for sequential processing of analytes
AR021833A1 (es) 1998-09-30 2002-08-07 Applied Research Systems Metodos de amplificacion y secuenciacion de acido nucleico
US6274320B1 (en) 1999-09-16 2001-08-14 Curagen Corporation Method of sequencing a nucleic acid
GB9929381D0 (en) * 1999-12-10 2000-02-09 Pyrosequencing Ab A method of assessing the amount of nucleic acid in a sample
US7001792B2 (en) 2000-04-24 2006-02-21 Eagle Research & Development, Llc Ultra-fast nucleic acid sequencing device and a method for making and using the same
WO2002004680A2 (en) 2000-07-07 2002-01-17 Visigen Biotechnologies, Inc. Real-time sequence determination
US7211414B2 (en) 2000-12-01 2007-05-01 Visigen Biotechnologies, Inc. Enzymatic nucleic acid synthesis: compositions and methods for altering monomer incorporation fidelity
US7078168B2 (en) * 2001-02-27 2006-07-18 Biotage Ab Method for determining allele frequencies
JP4210769B2 (ja) * 2001-11-22 2009-01-21 独立行政法人産業技術総合研究所 Ｇａｔｅｗａｙエントリークローンの作製方法
US7057026B2 (en) 2001-12-04 2006-06-06 Solexa Limited Labelled nucleotides
EP3002289B1 (en) 2002-08-23 2018-02-28 Illumina Cambridge Limited Modified nucleotides for polynucleotide sequencing
GB0321306D0 (en) 2003-09-11 2003-10-15 Solexa Ltd Modified polymerases for improved incorporation of nucleotide analogues
EP1701785A1 (en) 2004-01-07 2006-09-20 Solexa Ltd. Modified molecular arrays
WO2006004659A1 (en) * 2004-06-30 2006-01-12 Applera Corporation Methods for analyzing short tandem repeats and single nucleotide polymorphisms
US20060057595A1 (en) * 2004-09-16 2006-03-16 Applera Corporation Compositions, methods, and kits for identifying and quantitating small RNA molecules
US7315019B2 (en) 2004-09-17 2008-01-01 Pacific Biosciences Of California, Inc. Arrays of optical confinements and uses thereof
WO2006064199A1 (en) 2004-12-13 2006-06-22 Solexa Limited Improved method of nucleotide detection
WO2006120433A1 (en) 2005-05-10 2006-11-16 Solexa Limited Improved polymerases
GB0514936D0 (en) 2005-07-20 2005-08-24 Solexa Ltd Preparation of templates for nucleic acid sequencing
US7405281B2 (en) 2005-09-29 2008-07-29 Pacific Biosciences Of California, Inc. Fluorescent nucleotide analogs and uses therefor
EP3722409A1 (en) 2006-03-31 2020-10-14 Illumina, Inc. Systems and devices for sequence by synthesis analysis
US20080090239A1 (en) * 2006-06-14 2008-04-17 Daniel Shoemaker Rare cell analysis using sample splitting and dna tags
US8343746B2 (en) 2006-10-23 2013-01-01 Pacific Biosciences Of California, Inc. Polymerase enzymes and reagents for enhanced nucleic acid sequencing
US8262900B2 (en) 2006-12-14 2012-09-11 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for measuring analytes using large scale FET arrays
US8349167B2 (en) 2006-12-14 2013-01-08 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for detecting molecular interactions using FET arrays
US7948015B2 (en) 2006-12-14 2011-05-24 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for measuring analytes using large scale FET arrays
US9434997B2 (en) * 2007-08-24 2016-09-06 Lawrence Livermore National Security, Llc Methods, compounds and systems for detecting a microorganism in a sample
US20090163366A1 (en) * 2007-12-24 2009-06-25 Helicos Biosciences Corporation Two-primer sequencing for high-throughput expression analysis
CA2717320A1 (en) * 2008-03-11 2009-09-17 Sequenom, Inc. Nucleic acid-based tests for prenatal gender determination
US20100137143A1 (en) 2008-10-22 2010-06-03 Ion Torrent Systems Incorporated Methods and apparatus for measuring analytes
CA2786564A1 (en) 2010-01-19 2011-07-28 Verinata Health, Inc. Identification of polymorphic sequences in mixtures of genomic dna by whole genome sequencing
US8951781B2 (en) 2011-01-10 2015-02-10 Illumina, Inc. Systems, methods, and apparatuses to image a sample for biological or chemical analysis
KR101982627B1 (ko) * 2011-05-12 2019-05-27 에이엔디이 코포레이션 Ｓｔｒ 유전자좌의 신속한 다중 증폭 방법 및 조성법
CA2859660C (en) 2011-09-23 2021-02-09 Illumina, Inc. Methods and compositions for nucleic acid sequencing
EP2834622B1 (en) 2012-04-03 2023-04-12 Illumina, Inc. Integrated optoelectronic read head and fluidic cartridge useful for nucleic acid sequencing
JP6382189B2 (ja) * 2012-06-29 2018-08-29 ゼネラル・エレクトリック・カンパニイ Ｒｎａテンプレートから開始する等温ｄｎａ増幅用のキット
ES2866044T3 (es) * 2014-02-18 2021-10-19 Illumina Inc Métodos y composiciones para la elaboración de perfiles de ADN

Also Published As

Publication number Publication date
JP2017509329A (ja) 2017-04-06
RU2016133987A3 (sr) 2018-12-19
US20150232929A1 (en) 2015-08-20
BR112016019267B8 (pt) 2023-01-10
PL3108009T3 (pl) 2021-10-11
MX2016010717A (es) 2017-04-27
JP7011392B2 (ja) 2022-01-26
NZ723399A (en) 2020-08-28
BR122022007092B1 (pt) 2022-07-19
AU2015219289A1 (en) 2016-09-08
CA2940048C (en) 2023-03-14
RU2708337C2 (ru) 2019-12-05
AU2021203877A1 (en) 2021-07-08
LT3108009T (lt) 2021-07-12
EP3108009B1 (en) 2021-03-24
CN106164298B (zh) 2020-02-21
NZ761724A (en) 2024-04-26
US11530446B2 (en) 2022-12-20
MY182415A (en) 2021-01-25
BR112016019267A2 (pt) 2017-10-10
BR122022007092B8 (pt) 2023-01-31
WO2015126766A1 (en) 2015-08-27
WO2015126766A8 (en) 2016-11-03
RU2019138698A3 (sr) 2020-06-19
SA516371691B1 (ar) 2022-03-20
AU2021203877B2 (en) 2023-11-23
AU2015219289B2 (en) 2021-05-06
DK3108009T3 (da) 2021-06-07
HRP20210953T1 (hr) 2021-09-03
RU2019138698A (ru) 2020-01-27
CN106164298A (zh) 2016-11-23
JP7770437B2 (ja) 2025-11-14
EP3108009A1 (en) 2016-12-28
RU2752700C2 (ru) 2021-07-30
RU2016133987A (ru) 2018-03-27
HUE055256T2 (hu) 2021-11-29
SI3108009T1 (sl) 2021-09-30
US20200224268A1 (en) 2020-07-16
CA2940048A1 (en) 2016-08-27
EP3910069A1 (en) 2021-11-17
MY200537A (en) 2024-01-02
BR112016019267B1 (pt) 2022-06-28
JP2021177777A (ja) 2021-11-18
US10422002B2 (en) 2019-09-24
PT3108009T (pt) 2021-05-10
MX379233B (es) 2025-03-10
ES2866044T3 (es) 2021-10-19
JP2024059651A (ja) 2024-05-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11530446B2 (en) Methods and compositions for DNA profiling
EP4134444A1 (en) Methods for targeted nucleic acid sequence enrichment with applications to error corrected nucleic acid sequencing
EP3152316B1 (en) Sample preparation for nucleic acid amplification
US20180195118A1 (en) Systems and methods for detection of genomic copy number changes
England et al. A review of the method and validation of the MiSeq FGx™ Forensic Genomics Solution
US20230416730A1 (en) Methods and compositions for addressing inefficiencies in amplification reactions
US20230366009A1 (en) Simultaneous amplification of dna and rna from single cells
US20250297243A1 (en) Single cell multiomics
Barbaro Overview of NGS platforms and technological advancements for forensic applications
HK40064512A (en) Methods and composition for dna profiling
WO2024054517A1 (en) Methods and compositions for analyzing nucleic acid
HK1227445B (en) Methods and compositions for dna profiling
Graham Discovery and characterization of tetranucleotide short tandem repeats in North American bears (ursids)
HK1236228B (en) Sample preparation for nucleic acid amplification
HK1236228A1 (en) Sample preparation for nucleic acid amplification