RS62023B1 - Humanizovani glodari koji eksprimiraju teške lance koji sadrže vl domene - Google Patents

Humanizovani glodari koji eksprimiraju teške lance koji sadrže vl domene

Info

Publication number
RS62023B1
RS62023B1 RS20210791A RSP20210791A RS62023B1 RS 62023 B1 RS62023 B1 RS 62023B1 RS 20210791 A RS20210791 A RS 20210791A RS P20210791 A RSP20210791 A RS P20210791A RS 62023 B1 RS62023 B1 RS 62023B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
human
mouse
gene
gene segments
sequence
Prior art date
Application number
RS20210791A
Other languages
English (en)
Inventor
Lynn Macdonald
Cagan Gurer
Karolina A Meagher
Sean Stevens
Andrew J Murphy
Original Assignee
Regeneron Pharma
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Regeneron Pharma filed Critical Regeneron Pharma
Publication of RS62023B1 publication Critical patent/RS62023B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/461—Igs containing Ig-regions, -domains or -residues form different species
    • C07K16/462—Igs containing a variable region (Fv) from one specie and a constant region (Fc) from another
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6489—Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/24—Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • C12Y304/24046—Adamalysin (3.4.24.46)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/15—Humanized animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/15—Animals comprising multiple alterations of the genome, by transgenesis or homologous recombination, e.g. obtained by cross-breeding
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/01—Animal expressing industrially exogenous proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/53—Hinge
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2318/00—Antibody mimetics or scaffolds
    • C07K2318/10—Immunoglobulin or domain(s) thereof as scaffolds for inserted non-Ig peptide sequences, e.g. for vaccination purposes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/20—Pseudochromosomes, minichrosomosomes
    • C12N2800/204—Pseudochromosomes, minichrosomosomes of bacterial origin, e.g. BAC
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
  • Central Heating Systems (AREA)
  • Housing For Livestock And Birds (AREA)

Description

Opis
OBLAST PRONALASKA
[0001] Opisane su genetički modifikovane ne-humane fertilne životinje koje eksprimiraju vezujuće proteine slične humanom imunoglobulinu koji sadrže konstanti region teškog lanca imunoglobulina fuzionisan sa varijabilnim domenom lakog lanca imunoglobulina, kao i vezujući proteini koji imaju varijabilni domen lakog lanca imunoglobulina fuzionisan sa konstantnim domenom lakog lanca i varijabilni domen lakog lanca imunoglobulina fuzionisan sa konstantnim domenom teškog lanca. Opisani su genetički modifikovani miševi, ćelije, embrioni, i tkiva koji sadrže sekvencu nukleinske kiseline koja kodira funkcionalni ADAM6, naznačeno time da miševi, ćelije, embrioni, i tkiva sadrže segmente gena lakog lanca humanog imunoglobulina operativno vezane sa jednim ili više konstantnih gena teškog lanca ne-humanog imunoglobulina. Modifikacije uključuju humane i/ili humanizovane imunoglobulinske lokuse. Miševi koji sadrže ADAM6 funkciju su opisani, uključujući miševe koji sadrže ektopičnu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira ADAM6 protein. Genetički modifikovani mužjaci miševa koji sadrže genetičku modifikaciju endogenog lokusa VHregiona imunoglobulina miša, i koji dodatno sadrže ADAM6 aktivnost su opisani, uključuju miševe koji sadrže ektopičnu sekvencu nukleinske kiseline koja obnavlja ili održava fertilitet mužjaka miša. Primer fertilnosti je fertilnost koja se može uporediti sa miševima divljeg tipa.
[0002] Genetički modifikovane ne-humane fertilne životinje koje sadrže deleciju ili modifikaciju endogenog ADAM6 gena ili njegov homolog ili ortolog, i koji sadrže genetičku modifikaciju koja obnavlja funkciju ADAM6 (ili njegov homolog ili ortolog) u celini ili delimično su opisani, naznačeno time da ne-humane životinje eksprimiraju varijabilnu sekvencu lakog lanca humanog imunoglobulina u kontekstu konstantne sekvence teškog lanca. Ćelije koje eksprimiraju takve vezujuće proteine, glodari (npr., miševi) koji ih stvaraju, i povezani postupci i kompozicije su takođe opisani.
[0003] Genetički konstruisane životinje koje eksprimiraju antitela koja sadrže varijabilne regione lakog lanca fuzionisane sa konstantnim regionima teškog lanca, naznačeno time da ne-humanim životinjama nedostaje funkcionalni endogeni ADAM6 gen ali zadržavaju ADAM6 funkciju, su opisane, uključujući glodare (npr., miševe) koji sadrže modifikaciju lokusa varijabilnog regiona teškog lanca (VH) endogenog imunoglobulina koji čini miša nesposobnim da stvara funkcionalni ADAM6 protein i rezultuje u gubitku fertiliteta. Genetički modifikovani miševi sadrže VHlokus imunoglobulina koji se karakteriše sa više humanih VL, JLi izborno segmenata DHgena ili njihovom kombinacijom, i koji dodatno sadrži ADAM6 funkciju su opisani, uključujući miševe koji sadrže ektopične sekvence nukleinske kiseline koje obnavljaju fertilnost mužjaku miša. Genetički modifikovani miševi eksprimiraju antitela kojima nedostaju varijabilni domeni teškog lanca i umesto toga sadrže varijabilne regione koji sadrže rearanžirane segmente gena lakog lanca.
[0004] Genetički modifikovani glodari (npr., miševi), ćelije, embrioni, i tkiva koja sadrže sekvencu nukleinske kiseline koja kodira funkcionalni ADAM6 lokus su opisani, naznačeno time da miševi, ćelije, embrioni, i tkiva eksprimiraju teški lanac imunoglobulina koji sadrži varijabilni domen humanog lakog lanca. Dodatno, miševi, ćelije, embrioni, i tkiva nemaju funkcionalni endogeni ADAM6 gen ali zadržavaju ADAM6 funkciju koja se karakteriše prisustvom ektopične sekvence nukleinske kiseline koja kodira ADAM6 protein. Postupci za stvaranje segmenata antitela kod fertilnih ne-humanih životinja koji su korisni za vezivanje antigena su opisani.
STANJE TEHNIKE
[0005] U poslednje dve decenije, farmaceutske primene antitela pokrenula su mnoga istraživanja u odnosu na stvaranje antitela koja su pogodna za upotrebu kao humani terapeutici. Rani terapeutici antitela, zasnovnai na mišjim antitelima, nisu bili idealni kao humani terapeutici jer je ponovljena primena mišjih antitela na ljude rezultovala u problemima imunogenosti koji mogu otežati dugotrajne režime tretmana. Razvijena su rešenja zasnovana na humanizovanju mišjih antitela da bi učinila više sličnim humanim i manje sličnim mišjim. Sledili su postupci za ekspresiju sekvenci humanog imunoglobulina za upotrebu u antitelima, uglavnom zasnovani na in vitro ekspresiji humanih imunoglobulinskih biblioteka u fagu, bakteriji, ili kvascu. Konačno, načinjeni su pokušaji da se naprave korisna humana antitela od humanih limfocita in vitro, u miševima graftovanim sa humanim hematopoetskim ćelijama, i u transhromozomskim ili transgenim miševima sa onesposobljenim lokusima endogenog imunoglobulina.
[0006] Za stvaranje ovih miševa, bilo je neophodno onesposobiti gene endogenog mišjeg imunoglobulina tako da bi randomizovano integrisani potpuno humani transgeni funkcionisali kao eksprimirani repertoar imunoglobulina u mišu. Takvi miševi mogu stvarati humana antitela pogodna za upotrebu kao humani terapeutici, ali ovi miševi pokazuju značajne probleme sa njihovim imunim sistemom. Ovi problemi dovode do nekoliko eksperimentalnih teškoća, na primer, miševi nisu praktični za stvaranje dovoljno različitih repertoara antitela, zahtevaju upotrebu ekstenzivnih re-konstruktivnih popravki, obezbeđuju suboptimalni proces klonske selekcije verovatno usled nekompatibilnosti između humanih i mišjih elemenata, i nepouzdan izvor velikih i raznovrsnih populacija humanih varijabilnih sekvenci morao je da bude zaista koristan za stvaranje humanih terapeutika.
[0007] Transgeni miševi koji sadrže transgene potpuno humanog antitela sadrže randomizovano ubačene transgene koji sadrže nerearanžirane varijabilne sekvence teškog lanca humanog imunoglobulina (V, D, i J sekvence) vezane za humane konstantne sekvence teškog lanca, i nerearanžirane varijabilne sekvence (V i J) lakog lanca humanog imunoglobulina povezane sa konstantnim sekvencama humanog lakog lanca. Miševi stoga stvaraju rearanžirane gene antitela od lokusa različitih od endogenih lokusa, gde su rearanžirani geni antitela potpuno humani. Generalno, miševi sadrže sekvence humanog teškog lanca i humane sekvence κ lakog lanca, iako miševi sa najmanje nekim humanim λ sekvencama su takođe zabeleženi. Transgeni miševi generalno imaju oštećene i nefunkcionalne lokuse endogenog imunoglobulina, ili nokaute endogenih imunoglobulinskih lokusa, tako da su miševi nesposobni za rearanžman sekvence humanog antitela na lokusu endogenog imunoglobulina. Nepredvidivost takvih transgenih miševa čini ih manje od optimalnih za stvaranje dovoljno raznovrsnog repertoara humanih antitela u miševima, verovatno usled najmanje delimičino zbog suboptimalnog procesa klonske selekcije koji dovodi u kontakt molekule potpuno humanog antitela unutar endogenog selekcionog sisitema i štetnih efekata usled promena endogenog genetičkog sastava takvih miševa.
[0008] U tehnici ostaje potreba za stvaranjem poboljšanih genetički modifikovanih nehumanih životinja koje su korisne za stvaranje imunoglobulinskih sekvenci, uključujući sekvence humanog antitela, i koje su korisne za stvaranje raznovrsnog repertoara imunoglobulin-sličnih molekula koji pokazuju raznovrsnost nezavisno od tradicionalnih molekula antitela, dok istovremeno smanjuju ili eliminišu štetne promene koje mogu biti rezultat genetičkih modifikacija. Takođe ostaje potreba za ne-humanim životinjama koje su sposobne za rearanžiranje imunoglobulinskih genskih segmenata da bi se formirali korisni rearanžirani geni imunoglobulina, uključujući varijabilne domene lakog lanca humanog imunoglobulina u kontekstu konstantnih domena teškog lanca koji su srodni humanim varijabilnim domenima lakog lanca imunoglobulina u kontekstu konstantnih domena lakog lanca, ili koji su sposobni za stvaranje proteina od izmenjenih lokusa imunoglobulina, uključujući lokuse koji sadrže dovoljno različitu kolekciju segmenata varijabilnog gena humanog lakog lanca. Ostaje potreba za ne-humanim životinjama koje mogu stvarati imunoglobulinu-slične vezujuće proteine, naznačeno time da vezujući proteini sadrže varijabilne domene lakog lanca humanog imunoglobulina povezane sa konstantnim domenima teškog lanca.
SUŠTINA PRONALASKA
[0009] Pronalazak obezbeđuje postupak za dobijanje varijabilnog domena humanog lakog lanca koji obuhvata:
imunizaciju miša sa antigenom, pri čemu genom miša sadrži:
(a) inserciju jednog ili više humanih segmenata VLgena i jednog ili više humanih segmenata JLgena ushodno od gena konstantnog regiona lakog lanca imunoglobulina miša, naznačeno time da jedan ili više segmenata humanog VLgena i jedan ili više segmenata humanog JLgena su operativno vezani sa genom konstantnog regiona lakog lanca imunoglobulina miša;
(b) inserciju jednog ili više humanih segmenata VLgena i jednog ili više humanih segmenata JLgena ushodno od gena konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina miša, naznačeno time da jedan ili više segmenata humanog VLgena i jedan ili više segmenata humanog JLgena su operativno vezani sa genom konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina miša; i (c) ektopičnu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira mišji ADAM6a protein ili njegov funkcionalni fragment i ektopičnu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira mišji ADAM6b protein ili njegov funkcionalni fragment, naznačeno time da mišji ADAM6a i ADAM6b proteini ili njihovi funkcionalni fragmenti su eksprimirani od strane ektopične sekvence nukelinske kiseline;
i gde miš eksprimira antitelo koje specifično vezuje antigen koje se sastoji (i) polipeptida koji sadrži humani variijabilni domen lakog lanca vezan sa konstantnim domenom teškog lanca miša, i (ii) polipeptida koji sadrži varijabilni domen humanog lakog lanca vezan sa konstantnim domenom mišjeg lakog lanca,
izolovanje bar jedne ćelije iz miša koja proizvodi antitelo koje specifično vezuje antigen, i
obezbeđivanje varijabilnog domena humanog lakog lanca antitela
[0010] Pronalazak dodatno obezbeđuje upotrebu miša da bi se dobila nukleotidna sekvenca varijabilnog regiona humanog imunoglobulina, gde genom miša sadrži:
(a) inserciju jednog ili više humanih segmenata VLgena i jednog ili više humanih segmenata JLgena ushodno od gena konstantnog regiona lakog lanca imunoglobulina miša, gde jedan ili više segmenata humanog VLgena i jedan ili više segmenata humanog JLgena su operativno vezani sa genom konstantnog regiona lakog lanca imunoglobulina miša;
(b) inserciju jednog ili više humanih segmenata VLgena i jednog ili više humanih segmenata JLgena ushodno od gena konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina miša, gde jedan ili više segmenata humanog VLgena i jedan ili više segmenata humanog JLgena su operativno vezani sa genom konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina miša; i
(c) ektopičnu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira mišji ADAM6a protein ili njegov funkcionalni fragment i ektopičnu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira mišji ADAM6b protein ili njegov funkcionalni fragment, gde mišji ADAM6a i ADAM6b proteini ili njihovi funkcionalni fragmenti su eksprimirani od strane ektopičnih sekvenci nukelinske kiseline;
i gde miš eksprimira antitelo koje specifično vezuje antigen koje se sastoji iz (i) polipeptida koji sadrži humani varijabilni domen lakog lanca vezan sa konstantnim domenom teškog lanca miša; i (ii) polipeptida koji sadrži varijabilni domen humanog lakog lanca vezan sa konstantnim domenom mišjeg lakog lanca.
[0011] Opisane su genetički modifikovane ne-humane životinje koje imaju imunoglobulinske lokuse, naznačeno time da imunoglobulinski lokusi sadrže više segmenata gena humanog varijabilnog lakog lanca (VL) operativno vezanih sa jednim ili više ne-humanih konstantnih regiona, npr., humanim Vκ i Jκ ili humanim Vλ i Jλ, i u različitim aspektima lokusima nedostaje sekvenca koja kodira endogeni funkcionalni ADAM6 protein. Ne-humane životinje uključuju glodare, npr., miševe i pacove.
[0012] Obezbeđeni su lokusi koji su sposobni za rearanžman i formiranje gena koji kodira varijabilni domen lakog lanca koji je izveden iz rearanžmana koji uključuje humani Vκ ili Vλ segment gena lakog lanca i humani Jκ ili Jλ segment gena i u različitim aspektima, dodatno segment DHgena, naznačeno time da u različitim aspektima lokusima nedostaje endogeni funkcionalni ADAM6 gena ili njegov funkcionalni fragment.
[0013] Modifikovani imunoglobulinski lokusi uključuju lokuse kojima nedostaje endogeni funkcionalni ADAM6 gen i sadrže sekvence humanog imunoglobulina su opisane, npr., humani VLsegment operativno vezan sa humanom ili (ili humanom/nehumanom himernom) ne-humanom sekvencom konstantnog imunoglobulina (i u operativnoj vezi sa, npr., V i/ili J segmentom). Opisani su modifikovani lokusi koji sadrže višestruke segmente VLgena i ektopičnu nukleotidnu sekvencu koja kodira ADAM6 protein ili njegov fragment koji je funkcionalan u ne-humanoj životinji. Opisani su modifikovani lokusi koji sadrže višestruke VLgenske segmente, operativno vezane sa jednim ili više DHsegmenata i/ili jednim ili više JLili JHsegmenata, operativno vezanih sa ne-humanim imunoglobulinskom konstantnom sekvencom, npr., glodara (npr., miša ili pacova) ili humanom sekvencom. Ne-humane životinje koje sadrže takve humanizovane lokuse su takođe opisane, naznačeno time da nehumane životinje pokazuju fertilnost divljeg tipa.
[0014] Opisane su ne-humane životinje koje sadrže varijabilni lokus teškog lanca imunoglobulina (npr., na transgenu ili kao insercija ili zamena na endogenom varijabilnom lokusu teškog lanca ne-humane životinje) koji sadrže više humanih segmenata VLgena operativno vezanih sa humanim D i/ili humanim J segmentom gena. U različitim aspektima, više humanih segmenata VLgena su operativno vezani sa jednim ili više humanih D i/ili jednim ili više humanih segmenata J gena na lokusu varijabilnog gena teškog lanca endogenog imunoglobulina ne-humane životinje. U različitim aspektima, ne-humane životinje dodatno sadrže ektopičnu nukleotidnu sekvencu koja kodira ADAM6 protein ili njegov homolog ili ortolog koji je funkcionalan u mužjaku ne-humane životinje koja sadrži lokus modifikovanog teškog lanca. U različitim aspektima, ekstopična nukleotidna sekvenca je susedna sa najmanje jednom humanom VLsegmentom, segmentom DHgena, ili segmentom JLgena. U različitim aspektima, ektopična nukleotidna sekvenca je susedna neimunoglobulinskoj sekvenci u genomu ne-humane životinje. U jednom aspektu, ektopična nukleotidna sekvenca je na istom hromozomu kao i lokus modifkovanog teškog. U jednom aspektu, ektopična nukleotidna sekvenca je na različitom hromozomu kao lokus modifikovanog teškog lanca.
[0015] Opisane su ne-humane životinje koje su modifikovane na svojim lokusima varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina da se deletiraju svi ili skoro svi (npr., svi funkcionalni segmenti, ili skoro svi funkcionalni segmenti) VHsegmenti endogenog imunoglobulina i koje sadrže više segmenata humanog VLgena operativno vezanog sa DHi J segmentom ili segmentom JLgena na lokusu varijabilnog regiona teškog lanca endogenog imunoglobulina ne-humane životinje. Takođe su opisane ne-humane životinje koje sadrže takve lokuse i kojima nedostaje endogeni ADAM6 gen.
[0016] Opisani su postupci za stvaranje humane imunoglobulinske sekvence u ne-humanim životinjama. U različitim aspektima, sekvence humanog imunoglobulina su izvedene iz repertoara sekvenci teškog lanca imunoglobulina koje sadrže segmente humanog VLgena rearanžirane i u operativnoj vezi sa konstantnim regionima teškog lanca imunoglobulina, npr., VL, i jedan ili više DHi J segmenata ili jedan ili više JLsegmenata. Postupci za stvaranje sekvence humanog imunoglobulina u ne-humanim životinjama, tkivima, i ćelijama su opisani, naznačeno time da sekvence humanog imunoglobulina vezuju antigen od interesa.
[0017] U jednom aspektu, konstrukti nukleinske kiseline, ćelije, embrioni, glodari (npr., miševi), i postupci su opisani za stvaranje glodara (npr., miševa) koji sadrže modifikaciju koja rezultuje u nonfunkcionalnom endogenom glodarskom (npr., mišjem) ADAM6 proteinu ili ADAM6 genu (npr., nokaut ili delecija u endogenom ADAM6 genu), naznačeno time da glodari (npr., miševi) sadrže sekvencu nukleinske kiseline koja kodira ADAM6 protein ili ortolog ili homolog ili njegov funkcionalni fragment koji je funkcionaln kod mužjaka glodara iste vrste (npr., miša). U jednom aspektu, miševi sadrže ektopičnu nukelotidnu sekvencu koja kodira glodarski ADAM6 protein ili njegov ortolog ili homolog ili njegov funkcionalni fragment; u specifičnom aspektu, glodarski ADAM6 protein je mišji ADAM6 protein. U jednom aspektu, miševi sadrže ektopičnu nukelotidnu sekvencu koja kodira jedan ili više glodarskih ADAM6 proteina, naznačeno time da jedan ili više proteina sadrži SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 2 ili njen fragment koji je funkcionalan u miševima.
[0018] U različitim aspektima, sekvenca koja kodira ADAM6 aktivnost je susedna humanom sekvencom imunoglobulina. U različitim aspektima, sekvenca koja kodira ADAM6 aktivnost je susedna sekvencom ne-humanog imunoglobulina. U različitim aspektima, sekvenca je prisutna na istom hromozomu kao i lokus teškog lanca endogenog ne-humanog imunoglobulina ne-humane životinje. U različitim aspektima, sekvenca je prisutna na različitom hromozomu od lokusa teškog lanca imunoglobulina ne-humane životinje.
[0019] Opisane su genetički modifikovane ne-humane životinje koje sadrže modifikaciju koja održava aktivnost ADAM6 gena ili njegovog homologa ili ortolog, naznačeno time da modifikacija uključuje inserciju jednog ili više segmenata gena lakog lanca humanog imunoglobulina ushodno od konstantnog regiona teškog lanca ne-humanog imunoglobulina, i ne-humane životinje dodatno sadrže modifikacije koje im omogućavaju da eksprimiraju varijabilne regione lakog lanca humanog imunoglobulina srodne varijabilnim regionima lakog lanca humanog imunoglobulina. U različitim aspektima, varijabilni regioni lakog lanca humanog imunoglobulina su eksprimirani u kontekstu konstantnih regiona lakog i teškog lanca.
[0020] U različitim aspektima, insercija jednog ili više segmenata gena lakog lanca humanog imunoglobulina je izvedena 3’ ili nishodno od ADAM6 gena ne-humane životinje. U različitim aspektima, jednog ili više segmenata gena lakog lanca humanog imunoglobulina je izvedena na takav način da ADAM6 gen(i) ne-humane životinje nisu disruptovani, deletirani i/ili funkcionalno utišani tako da je ADAM6 aktivnost ne-humane životinje na istom ili uporedivom nivou kao u ne-humanoj životinji koja ne sadrži takvu inserciju. Primeri disrupcija, delecija i/ili funkcionalno utišavajućih modifikacija uključuju bilo koju modifikaciju koja rezultuje u smanjenju, eliminaciji i/ili gubitku aktivnosti ADAM6 proteina (ili više njih) kodiranih od strane ADAM6 gena (ili više njih) ne-humane životinje.
[0021] U jednom aspektu, konstrukti nukleinske kiseline, ćelije, embrioni, miševi, i postupci suopisani za stvaranje miševa koji sadrže modifikaciju endogenog imunoglobulinskog lokusa, naznačeno time da miševi sadrže ADAM6 protein ili ortolog ili homolog ili njegov funkcionalni fragment koji je funkcionaln u mužjaku miša. U jednom aspektu, endogeni imunoglobulinski lokus je lokus teškog lanca imunoglobulina, i modifikacija smanjuje ili eliminiše ADAM6 aktivnost ćelije ili tkiva mužjaka miša.
[0022] U jednom aspektu, opisani su miševi koji sadrže ektopičnu nukelotidnu sekvencu koja kodira mišji ADAM6 ili njegov ortolog ili homolog ili njegov funkcionalni fragment; takođe su opisani miševi koji sadrže endogenu nukleotidnu sekvencu koja kodira mišji ADAM6 ili ortolog ili homolog ili njegov funkcionalni fragment, i najmanje jednu genetičku modifikaciju lokusa teškog lanca imunoglobulina. U jednom aspektu, endogena nukleotidnu sekvencu koja kodira mišji ADAM6 ili njegov ortolog ili homolog ili funkcionalni fragment je locirana na ektopičnom položaju u poređenju sa endogenim ADAM6 genom miša divljeg tipa.
[0023] U jednom aspektu, opisani su postupci za stvaranje miševa koji sadrže modifikaciju lokusa endogenog imunoglobulina, naznačeno time da miševi sadrže ADAM6 protein ili ortolog ili homolog ili njegov funkcionalni fragment koji je funkcionaln u mužjaku miša. U različitim aspektima, modifikacija sadrži inserciju jednog ili više segmenata humanog VLgena na lokusu endogenog imunoglobulina.
[0024] U jednom aspektu, opisani su postupci za stvaranje miševa koji sadrže genetičku modifikaciju lokusa teškog lanca imunoglobulina, naznačeno time da primena postupaka rezultuje kod mužjaka miševa koji sadrže modifikovani lokus teškog lanca imunoglobulina (ili njegovu deleciju), i mužjaci miševa su sposobni da stvaraju potomstvo parenjem. U jednom aspektu, mužjaci miševa su sposobni da proizvode spremu koja može preći iz mišjeg uterusa kroz mišji jajovod da bi oplodila jaje miša.
[0025] U jednom aspektu, opisani su postupci za stvaranje miševa koji sadrže genetičku modifikaciju lokusa teškog lanca imunoglobulina i lokusa lakog lanca imunoglobulina, naznačeno time da primena postupaka za modifikovanje lokus teškog lanca rezultuje u mužjacima miševa koji pokazuju smanjenje fertiliteta, i miševi sadrže genetičku modifikaciju koja u potpunosti obnavlja ili delimično smanjenje fertiliteta. U različitim aspektima, smanjenje fertiliteta se karakteriše nesposobnošću sperme mužjaka miševa da migrira iz uterusa miša kroz jajovod miša da oplodi jaje miša. U različitim aspektima, smanjenje fertiliteta se karakteriše spermom koja pokazuje in vivo migracioni defekt. U različitim aspektima, genetička modifikacija koja obnavlja u potpunosti ili delimično smanjenje fertiliteta je sekvenca nukleinske kiseline koja kodira mišji ADAM6 gen ili ortolog ili homolog ili njegov funkcionalni fragment koji je funkcionalan u mužjaku miša.
[0026] U jednom aspektu, genetička modifikacija sadrži zamenu varijabilnih lokusa teškog lanca endogenog imunoglobulina sa varijabilnim lokusima lakog lanca imunoglobulina druge vrste (npr., ne-mišje vrste). U jednom aspektu, genetička modifikacija sadrži inserciju varijabilnih lokusa lakog lanca imunoglobulina druge vrste (npr., ne-mišje vrste) u varijabilne lokuse teškog lanca endogenog imunoglobulina. U specifičnom aspektu, vrsta je čovek. U jednom aspektu, genetička modifikacija sadrži deleciju varijabilnog lokusa teškog lanca endogenog imunoglobulina u celini ili delimično, naznačeno time da delecija rezultuje u gubitku funkcije endogenog ADAM6. U specifičnom aspektu, gubitak funkcije endogenog ADAM6 je povezan sa smanjenjem fertiliteta kod mužjaka miševa.
[0027] U jednom aspektu, genetička modifikacija sadrži inaktivaciju varijabilnog lokusa teškog lanca endogenog ne-humanog imunoglobulina u celini ili delimično, naznačeno time da inaktivacija ne rezultuje u gubitku funkcije endogenog ADAM6. Inaktivacija može uključivati zamenu ili deleciju jednog ili više endogenih ne-humanih segmenata gena rezultujući u endogenom ne-humanom imunoglobulinskom lokusu teškog lanca koji je u značajnom stepenu nesposoban za rearanžman da bi kodirao teški lanac antitela koje sadrži segmente endogenog ne-humanog gena. Inaktivacija može uključivati druge modifikacije koje čine endogeni imunoglobulinski lokus teškog lanca nesposobnim za rearanžman da bi kodirao teški lanac antitela, naznačeno time da modifikacija ne uključuje zamenu ili deleciju segmenata endogenog gena. Primeri modifikacija uključuju hromozomske inverzije i/ili translokacije posredovane molekularnim tehnikama, npr., korišćenjem tačnog postavljanja rekombinacionih mesta specifičnih za mesto (npr., Cre-lox tehnologijaa). Drugi primeri modifikacija uključuju onesposobljavanje operativne veze između segmenata varijabilnog gena ne-humanog imunoglobulina i konstantnih regiona ne-humanog imunoglobulina.
[0028] U jednom aspektu, genetička modifikacija sadrži inserciju u genom ne-humane životinje fragmenta DNK koji sadrži jedan ili više segmenata humanog VLgena i jedan ili više segmenata humanog JLgena, i izborno jedan ili više segmenata humanog DHgena, druge vrste (npr., ne-mišje vrste) operativno vezan sa jednim ili više sekvenci konstantnog regiona (npr., IgM i/ili IgG gen). U jednom aspektu, DNK fragment je sposoban da podlegne rearanžmanu u genomu ne-humane životinje da bi formirao sekvencu koja kodira varijabilni domen lakog
1
lanca operativno vezan sa konstantnim regionom teškog lanca. U jednom aspektu, vrsta je čovek. U jednom aspektu, genetička modifikacija sadrži inserciju jednog ili više segmenata gena lakog lanca humanog imunoglobulina nishodno ili 3’ od endogenog ADAM6 gena nehumane životinje tako da je ADAM6 aktivnost (npr., ekspresija i/ili funkcija kodiranog proteina) ista ili uporediva sa ne-humanom životinjom koja ne sadrži inserciju.
[0029] U jednom aspektu, opisani su postupci za stvaranje miševa koji sadrže genetičku modifikaciju lokusa tehkog lanca imunoglobulina, naznačeno time primena postupaka rezultuje u mužjacima miševa koji sadrže modifikovani lokus teškg lanca imunoglobulina (ili njegovu deleciju), i mužjaci miševa pokazuju smanjenje fertiliteta, i miševi sadrže gnetičku modifikaciju koja obnavlja u potpunosti ili delimično smanjenje fertiliteta. U različitim aspektima, smanjenje fertiliteta se karakteriše nesposobnošću sperme mužjaka miševa da migriraju iz uterusa miša do jajovoda miša da bi oplodili jaje miša. U različitim aspektima, smanjenje fertiliteta se karakteriše spermom koja poakzuje in vivo migracioni defekt. U različitim aspektima, genetička modifikacija koja obnavlja u potpunosti ili delimično smanjenje fertiliteta je sekvenca nukleinske kiseline koja kodira mišji ADAM6 gen ili ortolog ili homolog ili njegov funkcionalni fragment koji je funkcionalan u mužjaku miša.
[0030] U jednom aspektu, genetička modifikacija sadrži zamenu varijabilnih lokusa teškog lanca endogenog imunoglobulina sa varijabilnim lokusima lakog lanca imunoglobulina, npr., jednim ili više segmenata vaijabilnog gena lakog lanca (VL), sa jednim ili segmenata gena za raznovrsnost teškog lanca (DH) i jednim ili više spajajućih (J) segmenata gena, ili jednim ili više segmenata gena koji spajaju laki lanac (JL) druge vrste (npr., ne-mišje vrste). U jednom aspektu, genetička modifikacija sadrži inserciju jednog ortolognog segmenata gena varijabilnih lokusa VLlakog lanca imunoglobulina, najmanje jednog DHsegmenta gena i najmanje jednog J segmenta gena, ili najmanje jednog JLsegmenta gena u varijabilne lokuse teškog lanca endogenog imunoglobulina. U specifičnom aspektu, vrsta je čovek. U jednom aspektu, genetička modifikacija sadrži deleciju varijabilnog lokusa teškog lanca endogenog imunoglobulina u celosti ili delimično, naznačeno time da delecija rezultuje u gubitku funkcije endogenog ADAM6. U specifičnom aspektu, gubitak funkcije endogenog ADAM6 je povezana sa smanjenjem fertiliteta kod mužjaka miševa. U jednom aspektu, genetička modifikacija sadrži inaktivaciju varijabilnog lokusa teškog lanca endogenog imunoglobulina u celosti ili delimično, naznačeno time da delecija ne rezultuje u gubitku funkcije endogenog ADAM6. Inaktivacija može uključivati zamenu ili deleciju jednog ili više endogenih segmenata gena rezultujući u lokusu teškog lanca endogenog imunoglobulina koji je suštinski nesposoban za rearanžman da bi kodirao teški lanac antitela koji sadrži segmente endogenog gena. Inaktivacija može uključivati druge modifikacije koje čine lokus teškog lanca endogenog imunoglobulina nesposobnim za rearanžman da bi kodirao teški lanac antitela, naznačeno time da modifikacija ne uključuje zamenu ili deleciju segmenata endogenog gena. Primeri modifikacija uključuju hromozomske inverzije i/ili izmene koji rezultuju u lokusu teškog lanca koji nije u operativnoj vezi sa jednim ili više endogenih konstanstnih regiona.
[0031] U jednom aspektu, genetička modifikacija sadrži inserciju u genom miša DNK fragmenta koji sadrži jedan ili više segmenata humanog VLgena, jedan ili više segmenata J gena, i izborno jedan ili više segmenata D gena druge vrste (npr., ne-mišje vrste) operativno vezan sa jednom ili više sekvenci konstantnog regiona (npr., IgM i/ili IgG gen). U različitim aspektima, segmenti J gena uključuju segmente JHili JLgena. U jednom aspektu, DNK fragment je sposoban da podleže rearanžmanu da bi formirao sekvencu koja kodira teški lanac antitela, naznačeno time da teški lanac sadrži rearanžirani segment varijabilnog gena humanog lakog lanca fuzionisan sa konstantnim regionom teškog lanca. U jednom aspektu, genetička modifikacija sadrži inserciju od najmanje šest, najmanje 16, najmanje 30, ili najmanje 40 ili više segmenata humanog VLgena, i najmanje jedan ili najmanje 5 segmenata humanog JLgena u genom miša. U specifičnom aspektu, species je human and gene segmenti su human κ lakog lanca gene segmenti. U jednom aspektu, genetička modifikacija sadrži deleciju endogenog varijabilnog lokusa teškog lanca imunoglobulina u celosti ili delimično što čini endogeni lokus teškog lanca imunoglobulina nefunkcionalnim, naznačeno time da delecija dodatno rezultuje u gubitku funkcije endogenog ADAM6 function. U specifičnom aspektu, gubitak funkcije endogenog ADAM6 je povezan sa smanjenjem fertiliteta kod mužjaka miševa.
[0032] U jednom aspektu, opisani su miševi koji sadrže modifikaciju koja smanjuje ili eliminiše ekspresiju mišjeg ADAM6 od strane endogenog ADAM6 alela tako da mužjak miša koji ima modifikaciju pokazuje smanjeni fertilitet (npr., veoma smanjena sposobnost stvaranja potomaka parenjem), ili je suštinski neplodan, usled smanjenja ili eliminacije funkcije endogenog ADAM6, naznačeno time da miševi dodatno sadrže ektopičnu ADAM6 sekvencu ili njen homolog ili ortolog ili funkcionalni fragment. U jednom aspektu, modifikacija koja smanjuje ili eliminiše ADAM6 ekspresiju kod miša je modifikacija (npr., insercija, delecija, zamena, itd.) u mišjem imunoglobulinskom lokusu. U jednom aspektu, imunoglobulinski lokus je lokus teškog lanca imunoglobulina.
[0033] U jednom aspektu, smanjenje ili gubitak ADAM6 funkcije sadrži nesposobnost ili suštinsku nesposobnost miša da proizvede spermu koja može proći kroz uterus miša kroz jajovod miša da oplodi jaje miša. U specifičnom aspektu, najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% ćelija sperme proizvedenih u zapremini ejakulata miša je nesposobno da prođe kroz jajovod in vivo nakon kopulacije i oplodi jaje miša.
[0034] U jednom aspektu, smanjenje ili gubitak ADAM6 funkcije sadrži nesposobnost formiranja ili značajnu nesposobnost formiranja kompleksa ADAM2 i/ili ADAM3 i/ili ADAM6 na površini ćelije sperme miša. U jednom aspektu, gubitak funkcije ADAM6 sadrži značajnu nesposobnost da oplodi jaje miša kopulacijom sa ženkom miša.
[0035] U jednom aspektu, opisan je miš kome nedostaje funkcionalni endogeni ADAM6 gen, i sadrži protein (ili ektopičnu nukelotidnu sekvencu koja kodira protein) koji daje funkcionalanost ADAM6 u mišu. U jednom aspektu, miš je mužjak miša i funkcionalnost sadrži poboljšani fertilitet u poređenju sa mišem kome nedostaje funkcionalni endogeni ADAM6 gen.
[0036] U jednom aspektu, protein je kodiran genomskom sekvencom lociranom unutar imunoglobulinskog lokusa u klicinoj liniji miša. U specifičnom aspektu, imunoglobulinski lokus je lokus teškog lanca. U sledećem specifičnom aspektu, lokus teškog lanca sadrži najmanje jedan humani VH, najmanje jedan humani DHi najmanje jedan humani JHgenski segment. U sledećem specifičnom aspektu, lokus teškog lanca sadrži najmanje jedan humani VLi najmanje jedan humani JLgenski segment. U sledećem specifičnom aspektu, lokus teškog lanca sadrži najmanje jedan humani VL, najmanje jedan humani DH, i najmanje jedan humani JL. U sledećem specifičnom aspektu, lokus teškog lanca sadrži najmanje jedan humani VL, najmanje jedan humani DH, i najmanje jedan humani JHgenski segment. U sledećem specifičnom aspektu, lokus teškog lanca sadrži najmanje jedan humani VLi najmanje jedan humani JLgenski segment. U sledećem specifičnom aspektu, lokus teškog lanca sadrži najmanje jedan humani VLi najmanje jedan humani JHgenski segment. U sledećem specifičnom aspektu, lokus teškog lanca sadrži šest humanih Vκ i pet humanih Jκ genskih segmenata. U sledećem specifičnom aspektu, lokus teškog lanca sadrži 16 humanih Vκ i pet humanih Jκ genskih segmenata. U sledećem specifičnom aspektu, lokus teškog lanca sadrži 30 human Vκ i pet humanih Jκ genskih segmenata. U sledećem specifičnom aspektu, lokus teškog lanca sadrži 40 humanih Vκ i pet humanih Jκ genskih segmenata.
[0037] U jednom aspektu, ektopični protein je kodiran genomskom sekvencom lociranom unutar ne-imunoglobulinskog lokusa u klicinoj liniji miša. U jednom aspektu, neimunoglobulinski lokus je transkripciono aktivan lokus. U specifičnom aspektu, transkripciono aktivan lokus je ROSA lokus. U specifičnom aspektu, transkripciono aktivan lokus je povezan sa tkivno specifičnom ekspresijom. U jednom aspektu, tkivno specifična ekspresija je prisutna u reproduktivnim tkivima. U jednom aspektu, protein je kodiran genomskom sekvencom randomizovano ubačenom u klicinu liniju miša.
[0038] U jednom aspektu, miš sadrži humani ili himerni humani/mišji ili himerni humani/pacovski laki lanac (npr., humani varijabilni, konstantni miša ili pacova) i himerni
1
humani varijabilni/konstantni teški lanac miša ili pacova. U specifičnom aspektu, miš sadrži transgen koji sadrži himerni gen humanog varijabilnog/konstantnog lakog lanca miša ili pacova operativno vezan sa transkripciono aktivnim promotorom, npr., ROSA26 promotorom. U dodatnom specifičnom aspektu, himerni transgen humanog/mišjeg ili pacovskog lakog lanca sadrži rearanžiranu sekvencu varijabilnog regiona humanog lakog lanca u klicinoj liniji miša.
[0039] U jednom aspektu, ektopična nukleotidna sekvenca je locirana unutar imunoglobulinskog lokusa u klicinoj liniji miša. U specifičnom aspektu, imunoglobulinski lokus je lokus teškog lanca. U jednom aspektu, lokus teškog lanca sadrži najmanje jedan humani VLi najmanje jedan humani JLgenski segment. U specifičnom aspektu, lokus teškog lanca sadrži najmanje šest i do 40 humanih Vκ genskih segmenata, i pet humanih Jκ genskih segmenata. U jednom aspektu, ektopična nukleotidna sekvenca je locirana unutar neimunoglobulinskog lokusa u klicinoj liniji miša. U jednom aspektu, ne-imunoglobulinski lokus je transkripciono aktivni lokus. U specifičnom aspektu, transkripciono aktivni lokus je ROSA26 lokus. U jednom aspektu, ektopična nukleotidna sekvenca je pozicionirana randomizovano ubačena u klicinu liniju miša.
[0040] U jednom aspektu, opisan je miš kome nedostaje funkcionalni endogeni ADAM6 gen, naznačeno time da miš sadrži ektopičnu nukleotidnu sekvencu koja dopunjava gubitak ADAM6 funkcije miša. U jednom aspektu, ektopična nukleotidna sekvenca daje mišu sposobnost da proizvodi potomstvo koje se može uporediti sa odgovarajućim mišem divljeg tipa koji sadrži funkcionalni endogeni ADAM6 gen. U jednom aspektu, sekvenca daje mišu sposobnost da formira kompleks ADAM2 i/ili ADAM3 i/ili ADAM6 napovršini ćelije sperme miša. U jednom aspektu, sekvenca daje mišu sposobnost da prođe uterus miša do jajovoda miša do jaja miša da bi oplodio jaje.
[0041] U jednom aspektu, miš kome nedostaje funkcionalni endogeni ADAM6 gen i koji sadrži ektopičnu nukleotidnu sekvencu proizvodi najmanje oko 50%, 60%, 70%, 80%, ili 90% od broja okota miša divljeg tipa iste starosti i soja proizvedenog u periodu od šest meseci.
[0042] U jednom aspektu, miš kome nedostaje funkcionalni endogeni ADAM6 gen i koji sadrži ektopičnu nukleotidnu sekvencu proizvodi najmanje oko 1.5-puta, oko 2-puta, oko 2.5-puta, oko 3-puta, oko 4-puta, oko 6-puta, oko 7-puta, oko 8-puta, ili oko 10-puta ili više potomstva kada je uzgajan tokom perioda od šest meseci od miša iste starosti i istog ili sličnog soja koem nedostaje funkcionalni endogeni ADAM6 gen i kome nedostaje ektopična nukleotidna sekvenca koji je uzgajan tokom suštinski istog vremenskog perioda i pod suštinski istim uslovima.
[0043] U jednom aspektu, miš kome nedostaje funkcionalni endogeni ADAM6 gen i koji sadrži ektopičnu nukleotidnu sekvencu proizvodi u proseku najmanje oko 2-puta, 3-puta, ili 4-puta veći broj mladih po okotu u periodu uzgajanja od ćetiri do šest meseci od miša kome nedostaje funkcionalni endogeni ADAM6 gen i kome nedostaje ektopična nukleotidna sekvenca, i koji je uzgajan isti vremenski period.
[0044] U jednom aspektu, miš kome nedostaje funkcionalni endogeni ADAM6 gen i koji sadrži ektopičnu nukleotidnu sekvencu je mužjak miša, i mužjak miša proizvodi spermu koja kada je uzeta iz jajovoda oko 5-6 časova nakon kopulacije odražava migraciju kroz jajovod koja je najmanje 10-puta, najmanje 20-puta, najmanje 30-puta, najmanje 40-puta, najmanje 50-puta, najmanje 60-puta, najmanje 70-puta, najmanje 80-puta, najmanje 90-puta, 100-puta, 110-puta, ili 120-puta ili veća nego kod miša kome nedostaje funkcionalni endogeni ADAM6 gen i kome nedostaje ektopična nukleotidna sekvenca.
[0045] U jednom aspektu, miš kome nedostaje funkcionalni endogeni ADAM6 gen i koji sadrži ektopičnu nukleotidnu sekvencu kada kopulira sa ženkom miša stvara spermu koja je sposobna da prođe uterus i uđe i prođe jajovod unutar oko šest časova sa efikasnošću koja je približno jednaka spermi iz miša divljeg tipa.
[0046] U jednom aspektu, miš kome nedostaje funkcionalni endogeni ADAM6 gen i koji sadrži ektopičnu nukleotidnu sekvencu proizvodi oko 1.5-puta, oko 2-puta, oko 3-puta, ili oko 4-puta ili više okota u u poredivom vremenskom periodu od miša kome nedostaje funkcionalni ADAM6 gene i kome nedostaje ektopična nukleotidna sekvenca.
[0047] U jednom aspektu, opisan je miš koji u svojoj klicinoj liniji sadrži ne-mišjaju sekvencu nukleinske kiselinekoja kodira imunoglobulinski protein, naznačeno time da ne-mišja imunoglobulinska sekvenca sadrži inserciju mišjeg ADAM6 gena ili njen homolog ili ortolog ili funkcionalni fragment. U jednom aspektu, ne-mišja imunoglobulinska sekvenca sadrži humanu imunoglobulinsku sekvencu. U jednom aspektu, sekvenca sadrži humanu imunoglobulinsku sekvencu teškog lanca. U jednom aspektu, sekvenca sadrži humanu imunoglobulinsku sekvencu lakog lanca. U jednom aspektu, sekvenca sadrži humanu sekvencu teškog lanca susednu humanoj sekvenci lakog lanca. U jednom aspektu, sekvenca sadrži jedan ili više V genskih segmenata, jedan ili više D genskih segmenata, i jedan ili više J genskih segmenata; u jednom aspektu, sekvenca sadrži jedan ili više V genskih segmenata i jedan ili više J genskih segmenata. U jednom aspektu, jedan ili više V, D, i J genskih segmenata, ili jedan ili više V i J genskih segmenata, su nerearanžirani. U jednom aspektu, jedan ili više V, D, i J genskih segmenata, ili jedan ili više V i J genskih segmenata, su rearanžirani. U jednom aspektu, nakon rearanžmana jednog ili više V, D, i J genskih segmenata, ili jednog ili više V i J genskih segmenata, miš sadrži u svom genomu najmanje
1
jednu sekvencu nukelinske kiseline koja kodira mišji ADAM6 gen ili njegov homolog ili ortolog ili funkcionalni fragment. U jednom aspektu, nakon rearanžmana miš sadrži u svom genomu najmanje dve sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju mišji ADAM6 gen ili njegov homolog ili ortolog ili funkcionalni fragment. U jednom aspektu, nakon rearanžmana miš sadrži u svom genomu najmanje jednu sekvencu nukelinske kiseline koja kodira mišji ADAM6 gen ili njegov homolog ili ortolog ili funkcionalni fragment. U jednom aspektu, miš sadrži ADAM6 gen ili njegov homolog ili ortolog ili funkcionalni fragment u B ćeliji. U jednom aspektu, miš sadrži ADAM6 gen ili njegov homolog ili ortolog ili funkcionalni fragment u ne-B ćeliji.
[0048] U jednom aspektu, opisani su miševi koji eksprimiraju varijabilni region teškog lanca humanog imunoglobulina ili njegov funkcionalni fragment sa endogenog imunoglobulinskog lokusa teškog lanca, naznačeno time da miševi sadrže ADAM6 aktivnost koja je funkcionalna u mužjaku miša. U jednom aspektu, lokus teškog lanca sadrži jedan ili više humanih VLgenskih segmenata i jedan ili više JLgenskih segmenata, i izborno jedan ili više DHgenskih segmenata. U jednom aspektu, lokus teškog lanca sadrži najmanje šest humanih Vκ genskih segmenata i pet humanih Jκ genskih segmenata. U jednom aspektu, lokus teškog lanca sadrži najmanje 16 humanih Vκ genskih segmenata i pet humanih Jκ genskih segmenata. U jednom aspektu, lokus teškog lanca sadrži najmanje 30 humanih Vκ genskih segmenata i pet humanih Jκ genskih segmenata. U jednom aspektu, lokus teškog lanca sadrži najmanje 40 humanih Vκ genskih segmenata i pet humanih Jκ genskih segmenata.
[0049] U jednom aspektu, opisani su miševi koji eksprimiraju varijabilni region lakog lanca humanog imunoglobulina ili njegov funkcionalni fragment sa endogenog imunoglobulinskog lokusa teškog lanca, naznačeno time da miševi sadrže ADAM6 aktivnost koja je funkcionalna u mužjaku miša.
[0050] U jednom aspektu, mužjaci miševa sadrže jedan nemodifikovani endogeni ADAM6 alel ili njegov ortolog ili homolog ili njegov funkcionalni fragment na endogenom ADAM6 lokusu.
[0051] U jednom aspektu, mužjaci miševa sadrže ektopičnu mišju ADAM6 sekvencu ili njen homolog ili ortolog ili funkcionalni fragment koja kodira protein koji daje ADAM6 funkciju.
[0052] U jednom aspektu, mužjaci miševa sadrže ADAM6 sekvencu ili njen homolog ili ortolog ili funkcionalni fragment na lokaciji u mišjem genomu koja je približna lokaciji endogenog ADAM6 alela, npr., 3’ od finalne sekvence V genskog segmenta i 5’ od inicijalnog J genskog segmenta.
[0053] U jednom aspektu, mužjaci miševa sadrže ADAM6 sekvencu ili njen homolog ili ortolog ili funkcionalni fragment na lokaciji u mišjem genomu koja je različita od jedan kod
1
endogenog ADAM6 alela, npr., 5’ od najviše 5’ sekvence V genskog segmenta V genskog lokusa.
[0054] U jednom aspektu, mužjaci miševa sadrže ADAM6 sekvencu ili njen homolog ili ortolog ili funkcionalni fragment flankiran ushodno, nishodno, ili ushodno i nishodno (u odnosu na smer transkripcije ADAM6 sekvence) od sekvence nukleinske kiseline koja kodira imunoglobulinski V genski segment i/ili imunoglobulinski J genski segment. U specifičnom aspektu, imunoglobulinski V i J genski segmenti su humani genski segmenti. U jednom aspektu, imunoglobulinski V i J genski segmenati su humani genski segmenti, i sekvenca koja kodira mišji ADAM6 ili njen ortolog ili homolog ili fragment funkcionalan u mišu je između humanih V i J genskih segmenata; u jednom aspektu, miš sadrži dve ili više humanih V genskih segmenata, i sekvenca je na položaju 5’ od najviše 5’ humanog V genskog segmenta; u jednom aspektu, miš sadrži dva ili više humanih V genskih segmenata, i sekvenca je na položaju između finalnog V genskog segmenta i pretposlednjeg V genskog segmenta; u jednom aspektu, miš sadrži više humanih V genskih segmenata, i sekvenca je na položaju ushodno od najviše 5’ humanog V genskog segmenta; u jednom aspektu, miš dodatno sadrži D genski segment, i sekvenca je na položaju nakon najviše 3’- V genskog segmenta i najviše 5’- D genskog segmenta; u jednom aspektu, sekvenca je na položaju između V genskog segmenta i J genskog segmenta.
[0055] U jednom aspektu, humani V genski segmenti su V genski segmenti lakog lanca. U specifičnom aspektu, V genski segmenti lakog lanca su Vκ genski segmenti. U sledećem specifičnom aspektu, V genski segmenti lakog lanca su Vλ genski segmenti. U jednom aspektu, J genski segment su izabrani od JHi JLgenskih segmenata. U specifičnom aspektu, JLgenski segment je Jκ genski segment. U sledećem specifičnom aspektu, JLgenski segment je Jλ genski segment.
[0056] U jednom aspektu, mužjaci miševa sadrže ADAM6 sekvencu ili njen homolog ili ortolog ili funkcionalni fragment koji je lociran na položaju u endogenom imunoglobulinskom lokusu koji je isti ili suštinski isti kao kod mužjaka miša divljeg tipa. U specifičnom aspektu, endogeni lokus nije sposoban da kodira varijabilni region teškog lanca antitela, naznačeno time da varijabilni region sadrži ili je izveden iz endogenog ne-humanog genskog segmenta. U specifičnom aspektu, endogeni lokus je pozicioniran na lokaciji u genomu mužjaka miša što čini genske segmente lokusa teškog lanca nesposobnim da kodiraju varijabilni region teškog lanca antiela. U različitim aspektima, mužjaci miševa sadrže ADAM6 sekvencu lociranu na istom hromozomu kao humani imunoglobulinski genski segmenti i ADAM6 sekvenca kodira funkcionalni ADAM6 protein.
[0057] U jednom aspektu, opisan je mužjak miša koji sadrži nefunkcionalni endogeni
1
ADAM6 gen, ili deleciju endogenog ADAM6 gena, u svojoj klicinoj liniji; naznačeno time da ćelije sperme miša su sposobne da prođu jajovod ženke miša i oplode jaje. U jednom aspektu, miševi sadrže ekstrahromozomsku kopiju mišjeg ADAM6 gena ili njen ortolog ili homolog ili funkcionalni fragment koji je funkcionalan u mužjaku miša. U jednom aspektu, miševi sadrže ektopični mišji ADAM6 gen ili njegov ortolog ili homolog ili funkcionalni fragment koji je funkcionalan u mužjaku miša.
[0058] U jednom aspektu, opisan je mužjak miša koji sadrži funkcionalni endogeni ADAM6 gen i modifikaciju endogenog imunoglobulinskog lokusa teškog lanca. U jednom aspektu, modifikacija je napravljena nishodno, ili 3’ od endogenog ADAM6 gena ili lokusa. U jednom aspektu, modifikacija je zamena jednog ili više endogenih imunoglobulinskih genskih segmenata teškog lanca sa jednim ili više humanih imunoglobulinskih genskih segmenata lakog lanca. U jednom aspektu, modifikacija je insercija jednog ili više humanih imunoglobulinskih genskih segmenata lakog lanca ushodno od endogenog imunoglobulinskog gena konstantnog regiona teškog lanca.
[0059] U jednom aspektu, opisani su miševi koji sadrže genetičku modifikaciju koja smanjuje funkciju endogenog ADAM6, naznačeno time da miš sadrži najmanje nešto ADAM6 funkcionalnosti obezbeđene ili od strane endogenog nemodifikovanog alela koji je funkcionalan u celini ili delimično (npr., heterozigot), ili sa ekspresijom od ektopične sekvence koja kodira ADAM6 ili njen ortolog ili homolog ili funkcionalni fragment koji je funkcionalan u mužjaku miša. U različitim aspektima, ADAM6 ili ortolog ili homolog ili njegov funkcionalni fragment sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira ADAM6 protein dat u SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, ili njihovu kombinaciju.
[0060] U jednom aspektu, miševi sadrže funkciju ADAM6 dovoljnu da omogući mužjacima miševa sposobnost da stvore potomstvo parenjem, u poređenju sa mužjacima miševa kojima nedostaje funkcionalni ADAM6. U jednom aspektu, ADAM6 funkcija je omogućena prisustvom ektopične nukleotidne sekvence koja kodira mišji ADAM6 ili njegov homolog ili ortolog ili funkcionalni fragment. U jednom aspektu, ADAM6 funkcija je omogućena sa endogenim ADAM6 genom prisutnom u endogenom imunoglobulinskom lokusu, naznačeno time da miš je nesposoban da eksprimira antitelo koje sadrži endogeni imunoglobulinski genski segment teškog lanca. ADAM6 homolozi ili ortolozi ili njegovi fragmenti koji su funkcionalni u mužjaku miša uključuju one koje obnavljaju, u celosti ili delimično, gubitak sposobnosti stvaranja potomstva uočenog kod mužjaka miša kome nedostaje dovoljno aktivnosti endogenog ADAM6, npr., gubitak sposobnosti uočen kod ADAM6 nokaut miš. U tom smislu ADAM6 nokaut miševi uključuju miševe koji sadrže endogeni lokus ili njegov fragment, ali koji nije funkcionalan, tj., koji upošte ne eksprimira ADAM6 (ADAM6a i/ili
1
ADAM6b), ili koji eksprimira ADAM6 (ADAM6a i/ili ADAM6b) na nivou koji je nedovoljan koji je nedovoljan da podrži suštinski normalnu sposobnost stvaranja potomstva mužjaka miša divljeg tipa. Gubitak funkcije može biti usled, npr., modifikacije strukturnog gena lokusa (tj., u ADAM6a ili ADAM6b kodirajućem regionu) ili u regulatornom regionu lokusa (npr., u sekvenci 5’ u odnosu na ADAM6a gen, ili 3’ od ADAM6a ili ADAM6b kodirajućeg regiona, naznačeno time da sekvenca kontroliše, u celosti ili delimično, transkripciju ADAM6 gena, ekspresiju ADAM6 RNK, ili ekspresiju ADAM6 proteina). U različitim aspektima, ortolozi ili homolozi ili njihovi fragmenti koji su funkcionalni u mužjaku miša su oni koji omogućavaju spermi mužjaka miša (ili većini ćelija sperme u ejakulatu mužjaka miša) da prođe jajovod miša i oplodi jaje miša.
[0061] U jednom aspektu, mužjaci miševa koji eksprimiraju varijabilni region humanog imunoglobulina ili njegov funkcionalni fragment sadrže dovoljno aktivnosti ADAM6 da omoguće mužjacima miševa sposobnost stvaranja potomstva parenjem sa ženkama miševa i, u jednom aspektu, mužjaci miševa pokazuju sposobnost da stvaraju potomstvo kada se pare sa ženkom miša odnosno u jednom aspektu najmanje 25%, u jednom aspektu, najmanje 30%, u jednom aspektu najmanje 40%, u jednom aspektu najmanje 50%, u jednom aspektu najmanje 60%, u jednom aspektu najmanje 70%, u jednom aspektu najmanje 80%, u jednom aspektu najmanje 90%, i u jednom aspektu približno isto kao miševi sa jednim ili dva endogena nemodifikovana ADAM6 alela.
[0062] U jednom aspektu mužjaci miševa eksprimiraju dovoljno ADAM6 (ili ortolog ili homolog ili njegov funkcionalni fragment) da bi se omogućilo ćeliji sperme mužjaka miševa da pređu jajovod ženke miša i oplode jaje miša.
[0063] U jednom aspektu, ADAM6 funkcionalanost je omogućena sa sekvencom nukelinske kiseline koja je susedna hromozomskoj sekvenci miša (npr., nukleinska kiselina je randomizovano integrisana u hromozom miša; ili postavljena na specifičnu lokaciju, npr., sa targetiranjem nukleinske kiseline na specifičnu lokaciju, npr., sa insercijom specifičnom za mesto posredovanom rekombinazom (npr., Cre-posredovanom) ili homologom rekombinacijom). U jednom aspektu, ADAM6 sekvenca je prisutna u nukleinskoj kiselini koja je različita od hromozoma miša (npr., ADAM6 sekvenca je prisutna na epizomu, tj., ekstrahromozomski, npr., u ekspreisonom konstruktu, vektoru, YAC, trans-hromozomu, itd.).
[0064] U jednom aspektu, opisani su genetički modifikovani miševi i ćelije koji sadrže modifikaciju endogenog imunoglobulinskog lokusa teškog lanca, naznačeno time da miševi eksprimiraju najmanje deo sekvence lakog lanca imunoglobulina, npr., najmanje deo humane sekvence, naznačeno time da miševi sadrže ADAM6 aktivnost koja je funkcionalna u mužjaku miša. U jednom aspektu, modifikacija smanjuje ili uništava aktivnost ADAM6 miša.
1
U jednom aspektu, miš je tako modifikovan da oba alela koji kodiraju ADAM6 aktivnost su ili odsutna ili eksprimiraju ADAM6 koji ne funkcioniše u značajnom stepenu da bi podržao normalno parenje mužjaka miša. U jednom aspektu, miš dodatno sadrži ektopičnu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira mišji ADAM6 ili njegov ortolog ili homolog ili funkcionalni fragment. U jednom aspektu, modifikacija održava ADAM6 aktivnost miša i čini endogeni imunoglobulinski lokus teškog lanca nesposobnim da kodira težak lanac antitela. U specifičnom aspektu, modifikacija uključuje hromozomske inverzije i/ili translokacije koje čine endogeni imunoglobulinski lokus teškog lanca nesposobnim za rearanžiranje da bi kodirao variajbilni region teškog lanca antitela.
[0065] U jednom aspektu, opisani su genetički modifikovani miševi i ćelije koji sadrže modifikaciju of endogenog imunoglobulinskog lokusa teškog lanca, naznačeno time da modifikacija smanjuje ili eliminiše ADAM6 aktivnost eksprimiranu od strane ADAM6 sekvence lokusa, i naznačeno time da miševi sadrže ADAM6 protein ili njegov ortolog ili homolog ili funkcionalni fragment. U različitim aspektima, ADAM6 protein ili njegov fragment je kodiran od strane ektopične ADAM6 sekvence. U različitim aspektima, ADAM6 protein ili njegov fragment je eksprimiran od strane endogenog ADAM6 alela. U različitim aspektima, miš sadrži prvi alel teškog lanca koji sadrži prvu modifikaciju koja smanjuje ili eliminiše ekspresiju funkcionalnog ADAM6 od strane prvog alela teškog lanca, i miš sadrži drugi alel teškog lanca koji sadrži drugu modifikaciju koje ne smanjuje u značajnom stepenu ili ne eliminiše ekspresiju funkcionalnog ADAM6 od strane drugog alela teškog lanca.
[0066] U različitim aspektima, modifikacija je insercija jednog ili više humanih imunoglobulinskih genskih segmenata lakog lanca ushodno, ili 5’, od endogenog imunoglobulinskog gena konstantnog regiona teškog lanca. U različitim aspektima, modifikacija održava endogeni ADAM6 gen lociran na endogenom imunoglobulinskom lokusu teškog lanca.
[0067] U jednom aspektu, druga modifikacija je locirana 3’ (u odnosu na smer transkripcije mišjeg V genskog segmenta) finalnog mišjeg V genskog segmenta i locirana 5’ (u odnosu na smer transkripcije konstantne sekvence) miša (ili himernog humanog/mišjeg) imunoglobulinskog gena konstantnog teškog lanca ili njegovog fragmenta (npr., sekvenca nukleinske kiseline koja kodira humani i/ili mišji: CH1 i/ili zglobni i/ili CH2 i/ili CH3).
[0068] U jednom aspektu, modifikacija je na prvom alelu imunoglobulinskog teškog lanca na prvom lokusu koji kodira prvi ADAM6 alel, i ADAM6 funkcija rezultat je ekspresije endogenog ADAM6 na drugom alelu imunoglobulinskog teškog lanca na drugom lokusu koji kodira funkcionalni ADAM6, naznačeno time da drugi alale imunoglobulinskog teškog lanca sadrži najmanje jednu modifikaciju V, D, i/ili J genskog segmenta. U specifičnom aspektu,
2
najmanje jedna modifikacija V, D, i ili J genskog segmenta je delecija, zamena sa humanim V, D, i/ili J genskim segmentom, zamena sa kamelidnim V, D, i/ili J genskim segmentom, zamena sa humanizovanim ili kamelizovanim V, D, i/ili J genskim segmentom, zamena sekvence teškog lanca sa sekvencom lakog lanca, i njihova kombinacija. U jednom aspektu, najmanje jedna modifikacija je delecija jednog ili više V, D, i/ili J genskih segmenata teškog lanca i zamena sa jednim ili više V i/ili J genskih segmenata lakog lanca (npr., humani V i/ili J genski segment lakog lanca) na lokusu teškog lanca.
[0069] U jednom aspektu, modifikacija je na prvom alelu imunoglobulinskog teškog lanca na prvom lokusu i i drugog alela imunoglobulinskog teškog lanca na drugom lokusu, i ADAM6 funkcija je rezultat ekspresije ektopične ADAM6 na ne-imunoglobulinskom lokusu u klicinoj liniji miša. U specifičnom aspektu, ne-imunoglobulinski lokus je ROSA26 lokus. U specifičnom aspektu, ne-imunoglobulin lokus je transkripciono aktivan u reproduktivnom tkivu.
[0070] U jednom aspektu, modifikacija je na prvom alelu imunoglobulinskog teškog lanca na prvom lokusu i drugom alelu imunoglobulinskog teškog lanca na drugom lokusu, i ADAM6 funkcija je rezultat endogenog ADAM6 gena u klicinoj liniji miša. U specifičnom aspektu, endogeni ADAM6 gen je postavljen uz mišje genske segmente imunoglobulinskog teškog lanca.
[0071] U jednom aspektu, modifikacija je na prvom alelu imunoglobulinskog teškog lanca na prvom lokusu i drugom alelu imunoglobulinskog teškog lanca na drugom lokusu, i ADAM6 funkcija je rezultat ekspresije ektopične ADAM6 sekvence na prvom alelu imunoglobulinskog teškog lanca. U jednom aspektu, modifikacija je na prvom alelu imunoglobulinskog teškog lanca na prvom lokusu i drugom alelu imunoglobulinskog teškog lanca na drugom lokusu, i ADAM6 funkcija ili aktivnost je rezultat ekspresije ektopičnog ADAM6 na drugom alelu imunoglobulinskog teškog lanca.
[0072] U jednom aspektu, opisan je miš koji sadrži heterozigotni ili homozigotni nokaut ADAM6. U jednom aspektu, miš dodatno sadrži modifikovanu imunoglobulinsku sekvencu koja je humana ili humanizovana imunoglobulinska sekvenca, ili kamelidna ili kamelizovana humana ili mišja imunoglobulinska sekvenca. U jednom aspektu, modifikovana imunoglobulinska sekvenca je prisutna na endogenom lokusu imunoglobulinskog teškog lanca. U jednom aspektu, modifikovana imunoglobulinska sekvenca sadrži humanu sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca na endogenom lokusu imunoglobulinskog teškog lanca. U jednom aspektu, humana sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca zamenjuje endogenu varijabilnu sekvencu teškog lanca na endogenom lokusu imunoglobulinskog teškog lanca. U jednom aspektu, modifikovana imunoglobulinska sekvenca sadrži humanu sekvencu varijabilnog regiona κ lakog lanca na endogenom lokusu imunoglobulinskog teškog lanca. U jednom aspektu, modifikovana imunoglobulinska sekvenca sadrži humanu sekvencu varijabilnog regiona λ lakog na endogenom lokusu imunoglobulinskog teškog lanca.
[0073] U jednom aspektu, opisan je miš koji je nesposoban da eksprimira funkcionalni endogeni ADAM6 sa endogenog ADAM6 lokusa. U jednom aspektu, miš sadrži ektopičnu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira ADAM6, ili njegov funkcionalni fragment, koja je funkcionalna u mišu. U specifičnom aspektu, ektopična sekvenca nukleinske kiseline kodira protein koji spasava gubitak sposobnosti stvaranja potomstva koji pokazuje mužjak miša koji je homozigotan za ADAM6 nokaut. U specifičnom aspektu, ektopična sekvenca nukleinske kiseline kodira mišji ADAM6 protein.
[0074] U jednom aspektu, opisan je miš kome nedostaje funkcionalni endogeni ADAM6 lokus, i koji sadrži ektopičnu sekvencu nukelinske kiseline koja daje mišu ADAM6 funkciju. U jednom aspektu, sekvenca nukleinske ksieline sadrži endogenu ADAM6 sekvencu ili njen funkcionalni fragment. U jednom aspektu, endogena ADAM6 sekvenca sadrži ADAM6a- i ADAM6b- koji kodiraju sekvencu lociranu kod miša divljeg tipa između najviše 3’ mišjeg V genskog segmenta (VH) imunoglobulinskog teškog lanca i najviše 5’ mišjeg D genskog segmenta (DH) imunoglobulinskog teškog lanca.
[0075] U jednom aspektu, sekvenca nukleinske kiseline sadrži sekvencu koja kodira mišji ADAM6a ili njegov funkcionalni fragment i/ili sekvencu koja kodira mišji ADAM6b ili njegov funkcionalni fragment, naznačeno time da ADAM6a i/ili ADAM6b ili njegovi funkcionalni fragment(i) je operativno vezan sa promotorom. U jednom aspektu, promotor je humani promotor. U jednom aspektu, promotor je mišji ADAM6 promotor. U specifičnom aspektu, ADAM6 promotor sadrži sekvencu lociranu između prvog kodona prvog ADAM6 gena najbližeg najviše 5’- DHgenskom segmentu i rekombinacione signalne sekvence najviše 5’- DHgenskog segmenta, naznačeno time da 5’ je označen u odnosu na smer transkripcije imunoglobulinskih gena miša. U jednom aspektu, promotor je virusni promotor. U specifičnom aspektu, virusni promotor je promotor citomegalovirusa (CMV) promotor. U jednom aspektu, promotor je ubikvitin promotor.
[0076] U jednom aspektu, promotor je induciblini promotor. U jednom aspektu, inducibilni promotor reguliše ekspresiju u ne-reproduktivnim tkivima. U jednom aspektu, inducibilni promotor reguliše ekspresiju u reproduktivnim tkivima. U specifičnom aspektu, ekspresija mišje ADAM6a i/ili ADAM6b sekvence ili njenog funkcionalnog fragmenta (fragmenata) je razvojno regulisana sa inducibilnim promotorom u reproduktivnim tkivima.
[0077] U jednom aspektu, mišji ADAM6a i/ili ADAM6b su izabrani od ADAM6a od SEQ ID NO: 1 i/ili ADAM6b od sekvence SEQ ID NO: 2.
[0078] U jednom aspektu, mišji ADAM6 promotor je promotor od SEQ ID NO: 3. U specifičnom aspektu, mišji ADAM6 promotor sadrži sekvencu nukleinske kiseline od SEQ ID NO: 3 direktno ushodno (u odnosu na smer transkripcije ADAM6a) od prvog kodona ADAM6a i prostire se do kraja SEQ ID NO: 3 ushodno od ADAM6 kodirajućeg regiona. U sledećem specifičnom aspektu, ADAM6 promotor je fragment koji se prostire od unutar oko 5 do oko 20 nukelotida ushodno od start kodona ADAM6a do oko 0.5kb, 1kb, 2kb, ili 3kb ili ushodnije od start kodona ADAM6a.
[0079] U jednom aspektu, sekvenca nukleinske kiseline sadrži SEQ ID NO: 3 ili njen fragment koji kada je stavljen u miša koji je neplodan ili koji ima niski fertilitet usled nedostatka ADAM6 poboljšava fertilitet ili obnavlja fertilitet približno do fertiliteta divljeg tipa. U jednom aspektu, SEQ ID NO: 3 ili njen fragment daje mužjaku miša sposobnost da proizvede ćeliju sperme koja je sposobna da prođe jajovod ženke miša da bi oplodila jaje miša.
[0080] U jednom aspektu, mišji ADAM6 promotor je promotor od SEQ ID NO: 4. U specifičnom aspektu, mišji ADAM6 promotor sadrži sekvencu nukleinske kiseline od SEQ ID NO: 4 direktno ushodno (u odnosu na smer transkripcije ADAM6a) od prvog kodona ADAM6a i prostire se do kraja SEQ ID NO: 4 ushodno od ADAM6 kodirajućeg regiona. U sledećem specifičnom aspektu, ADAM6 promotor je fragment koji se prostire od unutar oko 5 do oko 20 nukleotida ushodno od start kodona ADAM6a do oko 0.5kb, 1kb, 2kb, ili 3kb ili ushodnije od start kodona ADAM6a.
[0081] U jednom aspektu, sekvenca nukleinske kiseline sadrži SEQ ID NO: 4 ili njen fragment koji kada je stavljen u miša koji je neplodan ili koji ima niski fertilitet usled nedostatka ADAM6 poboljšava fertilitet ili obnavlja fertilitet približno do fertiliteta divljeg tipa. U jednom aspektu, SEQ ID NO: 4 ili njen fragment daje mužjaku miša sposobnost da proizvede ćeliju sperme koja je sposobna da prođe jajovod ženke miša da bi oplodila jaje miša.
[0082] U jednom aspektu, mišji ADAM6 promotor je promotor od SEQ ID NO: 5. U specifičnom aspektu, mišji ADAM6 promotor sadrži sekvencu nukleinske kiseline od SEQ ID NO: 5 direktno ushodno (u odnosu na smer transkripcije ADAM6a) od prvog kodona ADAM6a i prostire se do kraja SEQ ID NO: 5 ushodno od ADAM6 kodirajućeg regiona. U sledećem specifičnom aspektu, ADAM6 promotor je fragment koji se prostire od unutar oko 5 do oko 20 nukleotida ushodno od start kodona ADAM6a do oko 0.5kb, 1kb, 2kb, ili 3kb ili ushodnije od start kodona ADAM6a.
[0083] U jednom aspektu, sekvenca nukleinske kiseline sadrži SEQ ID NO: 5 ili njen fragment koji kada je stavljen u miša koji je neplodan ili koji ima niski fertilitet usled
2
nedostatka ADAM6 poboljšava fertilitet ili obnavlja fertilitet približno do fertiliteta divljeg tipa. U jednom aspektu, SEQ ID NO: 5 ili njen fragment daje mužjaku miša sposobnost da proizvede ćeliju sperme koja je sposobna da prođe jajovod ženke miša da bi oplodila jaje miša.
[0084] U različitim aspektima, sekvenca ektopične nukleinske kiseline koja daje funkciju mišjem ADAM6 kodira jedan ili više ADAM6 proteina, naznačeno time da jedan ili više ADAM6 proteina sadrži SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 ili njihovu kombinaciju.
[0085] U različitim aspektima, sekvenca ektopične nukleinske sekvence sadrži sekvencu izabranu od SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 i SEQ ID NO: 5, naznačeno time da sekvenca ektopične nukleinske kiseline daje funkciju mišjem ADAM6 do jednog ili više ADAM6 proteina kodiranih sa sekvencom ektopične nukleinske kiseline.
[0086] U jednom aspektu, sekvenca nukleinske kiseline je bilo koja sekvenca koja kodira ADAM6 gen ili njegov homolog ili ortolog ili funkcionalni fragment koja kada je stavljena ili održavana u mišu daje nivo fertiliteta koji je isti ili uporediv sa mišem divljeg tipa. Primer fertiliteta može se demonstrirati sposobnošću mužjaka miša da proizvede ćeliju sperme koja je sposobna da prođe jajovod ženke miša da bi oplodio jajae miša.
[0087] U jednom aspektu, opisan je miš koji sadrži deleciju endogene nukleotidne sekvence koja kodira ADAM6 protein, zamenu endogenog VHgenskog segmenta sa humanim VHgenskim segmentom, i ektopičnu nukleotidnu sekvencu koja kodira mišji ADAM6 protein ili ortolog ili homolog ili njegov funkcionalni fragment koji je funkcionalan u mužjaku miša.
[0088] U jednom aspektu, opisan je miš koji sadrži deleciju endogene nukleotidne sekvence koja kodira ADAM6 protein zamenu endogenog VHgenskog segmenta sa humanim VLgenskim segmentom, i ektopičnu nukleotidnu sekvencu koja kodira mišji ADAM6 protein ili ortolog ili homolog ili njegov funkcionalni fragment koji je funkcionalan u mužjaku miša. U jednom aspektu, humani VLgenski segment je Vκ genski segment. U jednom aspektu, VLgenski segment je Vλ genski segment.
[0089] U jednom aspektu, miš dodatno sadrži humani JLgenski segment, i ektopičnu nukleotidnu sekvencu koja kodira mišji ADAM6 protein ili ortolog ili homolog ili njegov funkcionalni fragment koji je funkcionalan u mužjaku miša pozicioniranu između humanog VLgenskog segmenta i humanog JLgenskog segmenta. U jednom aspektu, miš sadrži jedan ili više humanih VLgenskih segmenata i jedan ili više humanih VLgenskih segmenata i ektopičnu nukleotidnu sekvencu koja kodira mišji ADAM6 protein ili ortolog ili homolog ili njegov funkcionalni fragment koji je funkcionalan u mužjaku miša koja je pozicionirana ushodno (ili 5’) od jednog ili više humanih VLgenskih segmenata. U specifičnom aspektu, humani VLi JLgenski segmenti su Vκ i Jκ genski segmenati.
[0090] U jednom aspektu, miš sadrži lokus imunoglobulinskog teškog lanca koji sadrži deleciju nukleotidne sekvence endogenog imunoglobulinskog lokusa koji sadrži endogeni ADAM6 gen, sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira jedan ili više humanih imunoglobulinskih genskih segmenata, i naznačeno time da ektopična nukleotidna sekvenca koja kodira mišji ADAM6 protein je unutar ili direktno susedna nukleotidnoj sekvenci koja kodira jedan ili više humanih imunoglobulinskih genskih segmenata.
[0091] U jednom aspektu, miš sadrži zamenu svih ili suštinski svih endogenih VHgenskih segmenata sa nukleotidnom sekvencom koja kodira jedan ili više humanih VLgenskih segmenata, i ektopična nukleotidna sekvenca koja kodira mišji ADAM6 protein je unutar, ili direktno susedna, nukleotidnoj sekvenci koja kodira jedan ili više humanih VLgenskih segmenata. U jednom aspektu, miš dodatno sadrži zamenu jednog ili više endogenih DLgenskih segmenata sa jednim ili više humanih VLi/ili humanih JLgenskih segmenata na endogenom DHgenskom lokusu. U jednom aspektu, miš dodatno sadrži zamenu jednog ili više endogenih JHgenskih segmenata sa jednim ili više humanih JLgenskih segmenata na endogenom JHgenskom lokusu. U jednom aspektu, miš sadrži zamenu svih ili suštinski svih endogenih VH, DH, i JHgenskih segmenata i zamenu na endogenim VH, DH, i JHgenskim lokusima sa humanim VLi JLgenskim segmentima, naznačeno time da miš sadrži ektopičnu sekvencu koja kodira mišji ADAM6 protein. U jednom aspektu, miš sadrži inserciju jednog ili više humanih VLi JLgenskih segmenata na endogenom lokusu imunoglobulinskog teškog lanca, naznačeno time da miš sadrži ADAM6 gen koji je funkcionalan u mišu. U specifičnom aspektu, humani VLi JLgenski segmenti su Vκ i Jκ genski segmenti. U specifičnom aspektu, ektopična sekvenca koja kodira mišji ADAM6 protein je postavljena između pretposlednjeg najviše 3’- VLgenskog segmenta od prisutnih humanih VLgenskih segmenata, i poslednjeg najviše 5’- JLgenskog segmenta od prisutnih humanih JLgenskih segmenata. U specifičnom aspektu, ektopična sekvenca koja kodira mišji ADAM6 protein je postavljena ushodno (ili 5’) od najviše 5’- VLgenskog segmenta od prisutnih humanih VLgenskih segmenata. U specifičnom aspektu, miš sadrži deleciju svih ili suštinski svih mišjih VHgenskih segmenata, i zamenu sa najmanje 40 humanih VLgenskih segmenata, i ektopična nukleotidna sekvenca koja kodira mišji ADAM6 protein je postavljena nishodno od humanog Vκ4-1 genskog segmenta i ushodno od humanog Jκ1 genskog segmenta. U specifičnom aspektu, miš sadrži deleciju svih ili suštinski svih mišjih VHgenskih segmenata, i zamenu sa najmanje 40 humanih VLgenskih segmenata, i ektopična nukleotidna sekvenca koja kodira mišji ADAM6 protein je postavljena nishodno od humanogVκ2-40 genskog segmenta.
[0092] U specifičnom aspektu, miš sadrži zamenu svih ili suštinski svih endogenih VHgenskih segmenata sa nukleotidnom sekvencom koja kodira jedan ili više humanih VLgenskih
2
segmenata, i ektopična nukleotidna sekvenca koja kodira mišji ADAM6 protein je unutar, ili direktno susedna, nukleotidnoj sekvenci koja kodira jedan ili više humanih VLgenskih segmenata.
[0093] U jednom aspektu, VLgenski segmenti su Vκ genski segmenti. U jednom aspektu, VLgenski segmenti su Vλ genski segmenti.
[0094] U jednom aspektu, ektopična nukleotidna sekvenca koja kodira mišji ADAM6 protein je prisutna u transgenu u genomu miša. U jednom aspektu, ektopična nukleotidna sekvenca koja kodira mišji ADAM6 protein je prisutna ekstrahromozomski u mišu.
[0095] U jednom aspektu, opisan je miš koji sadrži modifikaciju endogenog lokusa imunoglobulinskog teškog lanca, naznačeno time da miš eksprimira B ćeliju koji sadrži rearanžiranu imunoglobulinsku sekvenca operativno vezanu za sekvencu gena konstantnog regiona teškog lanca, i B ćelija sadrži u svom genomu (npr., na hromozomu B ćelije) gen koji kodira ADAM6 ili ortolog ili homolog ili njegov funkcionalni fragment koji je funkcionalan u mužjaku miša. U jednom aspektu, rearanžirana imunoglobulinska sekvenca operativno vezana za sekvencu gena konstantnog regiona teškog lanca sadrži V, J, i izborno D sekvencu gena humanog lakog lanca; V, D, i/ili J sekvencu teškog lanca miša; humanu ili mišju V i/ili J sekvencu lakog lanca. U jednom aspektu, sekvenca gena konstantnog regiona teškog lanca sadrži humanu ili mišju sekvencu teškog lanca izabranu iz grupe koja se sastoji od CH1, zgloba, CH2, CH3, i njihove kombinacije.
[0096] U jednom aspektu, V i/ili J sekvencu humanog lakog lanca je izabrana od humane sekvence Vκ, Vλ, Jκ i Jλ.
[0097] U jednom aspektu, opisan je miš koji sadrži funkcionalno utišani endogenog lokus imunoglobulinskog teškog lanca, naznačeno time da ADAM6 funkcija je održana kod miša, i dodatno sadrži inserciju jednog ili više humanih imunoglobulinskih genskih segmenata, naznačeno time da jedan ili više humanih imunoglobulin genskih segmenata uključuje humane VLi JLgenske segmente, i izborno humane DHgenske segmente. U jednom aspektu, jedan ili više humanih imunoglobulin genskih segmenata uključuje humane Vκ, Vλ, Jκ i Jλ genske segmente.
[0098] U jednom aspektu, opisan je genetički modifikovani miš, naznačeno time da miš sadrži funkcionalno utišan gen imunoglobulinskog lakog lanca, i dodatno sadrži zamenu od jednog ili više endogenih genskih segmenata imunoglobulinskih varijabilnih regiona teškog lanca sa jednim ili više humanih genskih segmenata imunoglobulinskih varijabilnih regiona lakog lanca, naznačeno time da mišu nedostaje funkcionalni endogeni ADAM6 lokus, i naznačeno time da miš sadrži ektopičnu nukleotidnu sekvencu koja eksprimira mišji ADAM6 protein ili ortolog ili homolog ili njegov funkcionalni fragment koji je funkcionalan u
2
mužjaku miša.
[0099] U jednom aspektu, opisan je genetički modifikovani miš, naznačeno time da miš sadrži funkcionalano utišani genski lokus imunoglobulinskog lakog lanca, i dodatno sadrži zamenu jednog ili više endogenih genskih segmenata imunoglobulinskog varijabilnog regiona lakog lanca sa jednim ili više humanih genskih segmenata imunoglobulinskog varijabilnog lakog lanca, naznačeno time da mišu nedostaje funkcionalni endogeni ADAM6 lokus, i naznačeno time da miš sadrži ektopičnu nukleotidnu sekvencu koja kodira mišji ADAM6 protein ili ortolog ili homolog ili njegov funkcionalni fragment koji je funkcionalan u mužjaku miša.
[0100] U jednom aspektu, jedan ili više humanih genskih segmenata imunoglobulinskog varijabilnog lanca je susedan ektopičnoj nukleotidnoj sekvenci.
[0101] U jednom aspektu, opisan je miš kome nedostaje funkcionalni endogeni ADAM6 lokus ili sekvenca i koji sadrži ektopičnu nukleotidna sekvencu koja kodira mišji ADAM6 lokus ili funkcionalni fragment mišjeg ADAM6 lokusa ili sekvence, naznačeno time da miš je sposoban da se pari sa mišem suprotnog pola da bi stvorio potomstvo koje sadrži ektopični ADAM6 lokus ili sekvencu. U jednom aspektu, miš je mužjak. U jednom aspektu, miš je ženka.
[0102] U jednom aspektu, opisan je genetički modifikovan miš, naznačeno time da miš sadrži humani genski segment imunoglobulinskog varijabilnog regiona lakog lanca na endogenom genskom lokusu imunoglobulinskog varijabilnog regiona teškog lanca, mišu nedostaje endogena funkcionalna ADAM6 sekvenca na endogenom genskom lokusu imunoglobulinskog varijabilnog regiona teškog lanca, i naznačeno time da miš sadrži ektopičnu nukleotidnu sekvencu koja eksprimira mišji ADAM6 protein ili ortolog ili homolog ili njegov funkcionalni fragment koji je funkcionalan u mužjaku miša.
[0103] U jednom aspektu, opisan je genetički modifikovan miš, naznačeno time da miš sadrži humani genski segment imunoglobulinskog varijabilnog lakog lanca na endogenom genskom lokusu imunoglobulinskog varijabilnog regiona teškog lanca, mišu nedostaje endogena funkcionalna ADAM6 sekvenca na endogenom genskom lokusu imunoglobulinskog varijabilnog teškog lanca, i naznačeno time da miš sadrži ektopičnu nukleotidnu sekvencu koja eksprimira mišji ADAM6 protein ili ortolog ili homolog ili njegov funkcionalni fragment koji je funkcionalan u mužjaku miša.
[0104] U jednom aspektu, ektopična nukleotidna sekvenca koja eksprimira mišji ADAM6 protein je ekstrahromozomska. U jednom aspektu, ektopična nukleotidna sekvenca koja eksprimira mišji ADAM6 protein je integrisana na jednom ili više lokusa u genomu miša. U specifičnom aspektu, jedan ili više lokusa uključuju imunoglobulinski lokus.
2
[0105] U jednom aspektu, opisan je miš koji eksprimira sekvencu imunoglobulinskog lakog lanca iz modifikovanog endogenog lokusa imunoglobulinskog teškog lanca, naznačeno time da je teški lanac izveden iz humanog VLgenskog segmenta, J genskog segmenta, i izborno DHgenskog segmenta, naznačeno time da miš sadrži ADAM6 aktivnost koja je funkcionalna u mišu. U jednom aspektu, humani VLgenski segment je izabran od humanog Vκ i humanog Vλ genskog segmenta. U različitim aspektima, J genski segment je JH, Jκ ili Jλ genski segment ili njihova kombinacija.
[0106] U jednom aspektu miš sadrži više humanih VLgenskih segmenata i više J genskih segmenata. U specifičnom aspektu, J genski segmenti su JLgenski segmenti.
[0107] U jednom aspektu, opisan je miš koji eksprimira sekvencu imunoglobulinskog lakog lanca iz modifikovanog endogenog lokusa imunoglobulinskog teškog lanca, naznačeno time da je teški lanac izveden iz humanog VLgenskog segmenta i JLgenskog segmenta, naznačeno time da miš sadrži ADAM6 aktivnost koja je funkcionalana u mišu.
[0108] U jednom aspektu, miš sadrži više humanih V genskih segmenata, više J genskih segmenata, i izborno više D genskih segmenata. U jednom aspektu, D genski segmenti su humani D genski segmenti. U jednom aspektu, J genski segmenti su humani J genski segmenti. U jednom aspektu, miš dodatno sadrži humanizovanu sekvencu konstantnog regiona teškog lanca, naznačeno time da humanizacija sadrži zamenu sekvence izabrane od CH1, zgloba, CH2, CH3, i njihove kombinacije. U specifičnom aspektu, teški lanac je izveden iz humanog V genskog segmenta, humanog J genskog segmenta, humane CH1 sekvence, humane ili mišje zglobne sekvence, mišje CH2 sekvence, i mišje CH3 sekvence. U sledećem specifičnom aspektu, miš dodatno sadrži sekvencu humanog lakog lanca. U jednom aspektu, miš sadrži ADAM6 gen koji je 5’ i 3’ flankiran sa endogenim genskim segmentima imunoglobulinskog teškog lanca. U specifičnom aspektu, endogeni genski segmenti imunoglobulinskog varijabilnog regiona teškog lanca su nesposobni da kodiraju varijabilni region teškog lanca antitela. U specifičnom aspektu, ADAM6 gen miša je na položaju koji je isti kao u mišu divljeg tipa i endogeni genski lokusi imunoglobulinskog varijabilnog teškog lanca miša su nesposobni za rearanžman da bi kodirali teški lanac antitela.
[0109] U jednom aspektu, više humanih V genskih segmenata su 5’ flankirani (u odnosu na smer transkripcije V genskih segmenata) sa sekvencom koja kodira ADAM6 aktivnost koja je funkcionalana u mišu. U specifičnom aspektu, više humanih V genskih segmenata uključuju humane Vκ genske segmente Vκ4-1, Vκ5-2, Vκ7-3, Vκ2-4, Vκ1-5, Vκ1-6, Vκ3-7, Vκ1-8, Vκ1-9, Vκ2-10, Vκ3-11, Vκ1-12, Vκ1-13, Vκ2-14, Vκ3-15, Vκ1-16, Vκ1-17, Vκ2-18, Vκ2-19, Vκ3-20, Vκ6-21, Vκ1-22, Vκ1-23, Vκ2-24, Vκ3-25, Vκ2-26, Vκ1-27, Vκ2-28, Vκ2-29, Vκ2-30, Vκ3-31, Vκ1-32, Vκ1-33, Vκ3-34, Vκ1-35, Vκ2-36, Vκ1-37, Vκ2-38, Vκ1-39, i
2
Vκ2-40 i humani Vκ2-40 genski segment je 5’ flankiran (u odnosu na smer transkripcije humanog Vκ2-40 genskog segmenta) sa sekvencom koja kodira ADAM6 aktivnost koja je funkcionalana u mišu. U specifičnom aspektu, sekvenca koja kodira ADAM6 aktivnost koja je funkcionalana u mišu je postavljena u istoj transkripcionoj orijentaciji u odnosu na humane Vκ genske segmente. U specifičnom aspektu, sekvenca koja kodira ADAM6 aktivnost koja je funkcionalana u mišu je postavljena u suprotnoj transkripcionoj orijentaciji u odnosu na humane Vκ genske segmente.
[0110] U jednom aspektu, V genski segment je 3’ flankiran (u odnosu na smer transkripcije V genskog segmenta) sa sekvencom koja kodira ADAM6 aktivnost koja je funkcionalana u mišu.
[0111] U jednom aspektu, D genski segment je 5’ flankiran (u odnosu na smer transkripcije D genskog segmenta) sa sekvencom koja kodira ADAM6 aktivnost koja je funkcionalana u mišu.
[0112] U jednom aspektu, J genski segment je 5’ flankiran (u odnosu na smer transkripcije J genskog segmenta) sa sekvencom koja kodira ADAM6 aktivnost koja je funkcionalana u mišu.
[0113] U jednom aspektu, ADAM6 aktivnost koja je funkcionalana u mišu rezultat je ekspresije nukleotidne sekvence locirane 5’ od najviše 5’ D genskog segmenta i 3’ od najviše 3’ V genskog segmenta (u odnosu na smer transkripcije V genskog segmenta) modifikovanog endogenog lokusa imunoglobulinskog teškog lanca.
[0114] U jednom aspektu, ADAM6 aktivnost koja je funkcionalana u mišu rezultat je ekspresije nukleotidne sekvence locirane 5’ od najviše 5’- J genskog segmenta i 3’ od najviše 3’- V genskog segmenta (u odnosu na smer transkripcije V genskog segmenta) modifikovanog endogenog lokusa imunoglobulinskog teškog lanca.
[0115] U jednom aspektu, ADAM6 aktivnost koja je funkcionalana u mišu rezultat je ekspresije nukleotidne sekvence locirane između dva humana V genska segmenta u modifikovanom endogenom lokusu imunoglobulinskog teškog lanca. U jednom aspektu, dva humana V genska segmenta su humani Vκ5-2 genski segment i Vκ4-1 genski segment.
[0116] U jednom aspektu, ADAM6 aktivnost koja je funkcionalana u mišu rezultat je ekspresije nukleotidne sekvence locirane između humanog V genskog segmenta i humanog J genskog segmenta u modifikovanom endogenom lokusu imunoglobulinskog teškog lanca. U jednom aspektu, humani V genski segment je humani Vκ4-1 genski segment i humani J segment je Jκ1 genski segment.
[0117] U jednom aspektu, nukleotidna sekvenca sadrži sekvencu izabranu od mišje ADAM6b sekvence ili njenog funkcionalnog fragmenta, mišje ADAM6 sekvence ili njenog
2
funkcionalnog fragmenta, i njihove kombinacije.
[0118] U različitim aspektima, sekvenca koja kodira ADAM6 aktivnost koja je funkcionalana u mišu kodira ADAM6b protein dat u SEQ ID NO: 2 i/ili kodira ADAM6a protein dat u SEQ ID NO: 1.
[0119] U jednom aspektu, nukleotidna sekvenca između dva humana V genska segmenta je postavljana u suprotnoj transkripcionoj orijentaciji u odnosu na humane V genske segmente. U specifičnom aspektu, nukleotidna sekvenca kodira, od 5’ do 3’ u odnosu na smer transkripcije ADAM6 gene, ADAM6 sekvencu praćenu sa ADAM6b sekvencom. U jednom aspektu, t
[0120] U jednom aspektu, nukleotidna sekvenca između humanog V genskog segmenta i humanog J genskog segmenta je postavljena u suprotnoj transkripcionoj orijentaciji u odnosu na humane V i J genske segmente. U specifičnom aspektu, nukleotidna sekvenca kodira, od 5’ do 3’ u odnosu na smer transkripcije ADAM6 gene, ADAM6 sekvencu praćenu sa ADAM6b sekvencom.
[0121] U jednom aspektu, miš sadrži hibridnu imunoglobulinsku sekvencu, naznačeno time da hibridna imunoglobulinska sekvenca sadrži sekvencu humanog imunoglobulinskog κ lakog lanca susednu ne-humanoj ADAM6 sekvenci.
[0122] U jednom aspektu, miš sadrži humanu sekvencu susednu mišjoj sekvenci na endogenom lokusu imunoglobulinskog teškog lanca, naznačeno time da susedna sekvenca sadrži najmanje jedan humani VLgenski segment, mišju ADAM6 sekvencu ili ortolog ili homolog ili njegov funkcionalni fragment, i humani JLgenski segment. U specifičnom aspektu, mišja ADAM6 sekvenca ili njen ortolog ili homolog ili funkcionalni fragment je postavljena neposredno susedno najmanje jednom humanom VLgenskom segmentu. U jednom aspektu, humani VLgenski segment je humani Vκ genski segment. U jednom aspektu, mišja ADAM6 sekvenc ili njen ortolog ili homolog ili funkcionalni fragment je postavljena neposredno susedno i 3’ u odnosu na najmanje jedan humani VLgenski segment i neposredno susedno i 5’ u odnosu na humani JLgenski segment. U specifičnom aspektu, humani VLgenski segment je humani Vκ genski segment i humani JLgenski segment je humani Jκ genski segment.
[0123] U jednom aspektu, sekvenca koja kodira ADAM6 aktivnost koja je funkcionalana u mišu je mišja ADAM6 sekvenca ili njen funkcionalni fragment.
[0124] U jednom aspektu, miš sadrži endogeni mišji DFL16.1 genski segment (npr., u mišu heterozigotnom za modifikovani endogeni lokus imunoglobulinskog teškog lanca), ili humani DH1-1 genski segment. U jednom aspektu, D genski segment imunoglobulinskog teškog lanca eksprimiran od strane miša je izveden iz endogenog mišjeg DFL16.1 genskog segmenta ili humanog DH1-1 genskog segmenta.
[0125] U jednom aspektu, opisan je miš koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira mišji ADAM6 (ili njegov homolog ili ortolog ili funkcionalni fragment) u DNK-nosećoj ćeliji ne-rearanžirane B ćelijske linije, ali ne sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira mišji ADAM6 (ili njegov homolog ili ortolog ili funkcionalni fragment) u B ćeliji koja sadrži rearanžirane imunoglobulinske lokuse, naznačeno time da sekvenca nukleinske kiseline koja kodira mišji ADAM6 (ili njegov homolog ili ortolog ili funkcionalni fragment) se javlja u genomu na položaju koji je različit od položaja u kome se pojavljuje mišji ADAM6 gen kod miša divljeg tipa. U jednom aspektu, sekvenca nukleinske kiseline koja kodira mišji ADAM6 (ili njegov homolog ili ortolog ili funkcionalni fragment) je prisutna u svim ili suštinski svim DNK-nosećim ćelijama koje nisu rearanžirane B ćelijska linija; u jednom aspektu, sekvenca nukleinske kiseline je prisutna u klicinoj liniji miša, ali ne u hromozomu rearanžirane B ćelije.
[0126] U jednom aspektu, opisan je miš koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira mišji ADAM6 (ili njegov homolog ili ortolog ili funkcionalni fragment) u svim ili suštinski svim DNK-nosećim ćelijama, uključujući B ćelije koje sadrže rearanžirane imunoglobulinske lokuse, naznačeno time da se sekvenca nukleinske kiseline koja kodira mišji ADAM6 (ili njegov homolog ili ortolog ili funkcionalni fragment) javlja u genomu na položaju koji je različit od položaja u kome se mišji ADAM6 gen pojavljuje kod miša divljeg tipa. U jednom aspektu, sekvenca nukleinske kiseline koja kodira mišji ADAM6 (ili njegov homolog ili ortolog ili funkcionalni fragment) je na nukleinskoj kiselini koja je susedna rearanžiranom imunoglobulinskom lokusu. U jednom aspektu, nukleinska kiselina koja je susedna rearanžiranom imunoglobulinskom lokusu je hromozom. U jednom aspektu, hromozom je hromozom koji se nalazi kod miša divljeg tipa i hromozom sadrži modifikaciju mišjeg imunoglobulinskog lokusa.
[0127] U jednom aspektu, opisan je genetički modifikovan miš, naznačeno time da miš sadrži B ćeliju koja sadrži u svom genomu ADAM6 sekvencu ili njen ortolog ili homolog. U jednom aspektu, ADAM6 sekvenca ili njen ortolog ili homolog je na lokusu imunoglobulinskog teškog lanca. U specifičnom aspektu, lokus teškog lanca sadrži endogene genske segmente imunoglobulinskog teškog lanca koji nisu sposobni za rearanžman da bi kodirali teški lanac antitela. U jednom aspektu, ADAM6 sekvenca ili njen ortolog ili homolog je na lokusu koji nije imunoglobulinski lokus. U jednom aspektu, ADAM6 sekvenca je na transgenu vođenom sa heterolognim promotorom. U specifičnom aspektu, heterologni promotor je neimunoglobulinski promotor. U specifičnom aspektu, B ćelija eksprimira ADAM6 protein ili njegov ortolog ili homolog.
[0128] U jednom aspektu, 90% ili više B ćelija miša sadrže gen koja kodira ADAM6 protein
1
ili njegov ortolog ili njegov homolog ili njegov fragment koji je funkcionalan u mišu. U specifičnom aspektu, miš je mužjak miša.
[0129] U jednom aspektu, genom B ćelije sadrži prvi alel i drugi alela koji sadrži ADAM6 sekvencu ili njen ortolog ili homolog. U jednom aspektu, genom B ćelije sadrži prvi alel ali ne drugi alel koji sadrži ADAM6 sekvencu ili njen ortolog ili homolog.
[0130] U jednom aspektu, opisan je miš koji sadrži modifikaciju na jednom ili više alela endogenog imunoglobulinskog teškog lanca, naznačeno time da modifikacija održava jedan ili više endogenih ADAM6 alela.
[0131] U jednom aspektu, modifikacija čini miša nesposobnim da eksprimira funkcionalni teški lanac koji sadrži endogene rearanžirane genseke segmente teškog lanca od najmanje jednog alela teškog lanca i zadržava endogeni ADAM6 alel lociran unutar najmanje jednog endogenog alela imunoglobulinskog teškog lanca.
[0132] U jednom aspektu, miševi su nesposobni da eksprimiraju funkcionalni teški lanac koji sadrži endogene rearanžirane genske segmente teškog lanca od najmanje jednog endogenog alela imunoglobulinskog teškog lanca, i miševi eksprimiraju i ADAM6 protein iz endogenog ADAM6 alela. U specifičnom aspektu, miševi su nesposobni da eksprimiraju funkcionalni teški lanac koji sadrži endogene rearanžirane genske segmente teškog lanca od dva endogena alela imunoglobulinskog teškog lanca, i miševi eksprimiraju ADAM6 protein od jednog ili više endogenih ADAM6 alela.
[0133] U jednom aspektu, miševi su nesposobni da eksprimiraju funkcionalni teški lanac od svakog endogenog alela teškog lanca, i miševi sadrže funkcionalni ADAM6 alel lociran unutar 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, ili 120 ili više Mbp ushodno (u odnosu na smer transkripcije mišjeg lokusa imunoglobulinskog teškog lanca) sekvence mišjeg imunoglobulinskog konstantog regiona teškog lanca. U specifičnom aspektu, funkcionalni ADAM6 alel je na endogenom lokusu teškog lanca (npr., u intergenskom V-D regionu, između dva V genska segmenta, između V i D genskog segmenta, između D i J genskog segmenta, itd.). U specifičnom aspektu, funkcionalni ADAM6 alel je lociran unutar 90 do 100 kb intragenske sekvence između finalnog mišjeg V genskog segmenta i prvog mišjeg D genskog segmenta. U sledećem specifičnom aspektu, endogena 90 do 100 kb intergenska V-D sekvenca je uklonjena, i ektopična ADAM6 sekvenca je postavljena između finalnog V i prvog D genskog segmenta.
[0134] U jednom aspektu, opisan je miš koji sadrži modifikaciju na jednom ili više endogenih ADAM6 alela.
[0135] U jednom aspektu, modifikacija čini miša nesposobnim da eksprimira funkcionalni ADAM6 protein od najmanje jednog od jednog ili više endogenih ADAM6 alela. U
2
specifičnom aspektu, miš je nesposoban da eksprimira funkcionalni ADAM6 protein od svakog endogenog ADAM6 alela.
[0136] U jednom aspektu, miš je nesposoban da eksprimira funkcionalni ADAM6 protein od svakog endogenog ADAM6 alela, i miševi sadrže ektopičnu ADAM6 sekvencu.
[0137] U jednom aspektu, miš je nesposoban da eksprimira funkcionalni ADAM6 protein od svakog endogenog ADAM6 alela, i miš sadrži ektopičnu ADAM6 sekvencu lociranu unutar 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, ili 120 ili više kb ushodno (u odnosu na smer transkripcije mišjeg lokusa teškog lanca) mišje sekvence imunoglobulinskog konstantnog regiona teškog lanca. U specifičnom aspektu, ektopična ADAM6 sekvenca je na endogenom lokusu imunoglobulinskog teškog lanca (npr., u intragenskom V-D regionu, između dva V genska segmenta, između V i J genskog segmenta, između D i J genska segmenta, itd.). U specifičnom aspektu, ektopična ADAM6 sekvenca je locirana unutar 90 do 100 kb intergenske sekvence između finalnog mišjeg V genskog segmenta i prvog mišjeg D genskog segmenta. U sledećem specifičnom aspektu, endogena 90 do 100 kb intergenska V-D sekvencu je uklonjena, i ektopična ADAM6 sekvenca je postavljena između humanog Vκ genskog segmenta i prvog humanog Jκ genskog segmenta. U sledećem specifičnom aspektu, endogena 90 do 100 kb intergenska V-D sekvenca je uklonjena, i ektopična ADAM6 sekvenca je postavljena 5’ ili ushodno od humanog Vκ genskog segmenta, naznačeno time da humani Vκ genski segment je izabran od humanog Vκ4-1 ili Vκ2-40 genskog segmenta.
[0138] U jednom aspektu, miš je sposoban da eksprimira funkcionalni ADAM6 protein od jednog ili više endogenih ADAM6 alela i modifikacija uključuje inserciju humane sekvence koja kodira imunoglobulinski varijabilni domen. U jednom aspektu, humana sekvenca sadrži nerearanžirane genske segmente imunoglobulina. U specifičnom aspektu, humana sekvenca sadrži V genski segment i J genski segment. U sledećem specifičnom aspektu, humana sekvenca sadrži V genski segment, J genski segment, i D genski segment.
[0139] U jednom aspektu, opisan je neplodni mužjak miša, naznačeno time da miš sadrži deleciju dva ili više endogenih ADAM6 alela. U jednom aspektu, opisana je ženka miša koja je nosilac osobine neplodnosti mužjaka, naznačeno time da ženka miša sadrži u svojoj klicinoj liniji nefunkcionalni ADAM6 alel ili nokaut endogenog ADAM6 alela.
[0140] U jednom aspektu, opisan je miš koji sadrži endogeni V, D, i ili J genski segment imunoglobulinskog teškog lanca koji su nesposobni za rearanžman da bi kodirali teđak lanac antitela, naznačeno time većina B ćelija miša sadrži funkcionalni ADAM6 gen. U različitim aspektima, većina B ćelija dodatno sadrži jedan ili više humanih VLi JLgenskih segmenata ushodno od mišjeg imunoglobulinskog konstantog regiona teškog lanca. U jednom aspektu, humani VLi JLgenski segmenti su Vκ i Jκ genski segmenti.
[0141] U jednom aspektu, miš sadrži intaktne endogene V, D, i J genske segmente imunoglobulinskog teškog lanca koji nisu sposobni za rearanžman da bi kodirali funkcionalni teški lanac antitela. U jednom aspektu, miš sadrži najmanje jedan i do 89 V genskih segmenata, najmanje jedan i do 13 D genskih segmenata, najmanje jedan i do četiri J genska segmenta, i njihovu kombinaciju; naznačeno time da najmanje jedan i do 89 V genskih segmenata, najmanje jedan i do 13 D genskih segmenata, najmanje jedan i do četiri J genska segmenta nisu sposobni za rearanžman da bi kodirali varijabilni region teškog lanca antitela. U specifičnom aspektu, miš sadrži funkcionalni ADAM6 gen lociran unutar intaktnih endogenih V, D, i J genskih segmenata imunoglobulinskog teškog lanca. U jednom aspektu, miš sadrži endogeni lokus teškog lanca koji uključuje endogeni ADAM6 lokus, naznačeno time da endogeni loklus teškog lanca sadrži 89 V genskih segmenata, 13 D genskih segmenata, i četiri J genska segmenta, naznačeno time da endogeni genski segmenti teškog lanca nisu sposobni za rearanžman da bi kodirali varijabilni region teškog lanca antitela i ADAM6 lokus kodira ADAM6 protein koji je funkcionalan u mišu.
[0142] U jednom aspektu, opisan je postupak za stvaranje neplodnog mužjaka miša, koji sadrži stvaranje nefunkcionalnog endogenog ADAM6 alela donor ES ćelije (ili nokaut pomenutog alela), uvođenje donor ES ćelije u embrion domaćin, gestaciju embriona domaćina u surogat majci, i omogućavanje surogat majci da rodi potomstvo izvedeno u celini ili delimično od donor ES ćelije. U jednom aspektu, postupak dodatno sadrži uzgajanje potomstva da bi se dobio neplodni mužjak miša.
[0143] U jednom aspektu, opisan je postupak za stvaranje miša sa genetičkom modifikacijom od interesa, naznačeno time da je miš neplodan, gde postupak sadrži korake (a) stvaranje genetičke modifikacije od interesa u genomu; (b) modifikaciju genoma da bi se izvršio nokaut endogenog ADAM6 alela, ili endogeni ADAM6 alel učinio nefunkcionalnim; i, (c) upotreba genoma u stvaranju miša. U različitim aspektima, genom je od ES ćelije ili korišćen u eksperimentu transfera jedra.
[0144] U jednom aspektu, opisan je miš kome nedostaje endogeni V, D, i J genski segment imunoglobulinskog teškog lanca, naznačeno time većina B ćelija miša sadrži ADAM6 sekvencu ili njen ortolog ili homolog.
[0145] U jednom aspektu, mišu nedostaju endogeni genski segmenti imunoglobulinskog teškog lanca izabrani od dva ili više V genskih segmenata, dva ili više D genskih segmenata, dva ili više J genskih segmenata, i njihove kombinacije. U jednom aspektu, mišu nedostaju genski segmenti imunoglobulinskog teškog lanca izabrani od najmanje jedan i do 89 V genskih segmenata, najmanje jedan i do 13 D genskih segmenata, najmanje jedan i do četiri J genska segmenta, i njihove kombinacije. U jednom aspektu, mišu nedostaje fragment
4
genomske DNK sa hromozoma 12 koji sadrži oko tri megabaze endogenog lokusa imunoglobulinskog teškog lanca. U specifičnom aspektu, mišu nedostaju svi funkcionalni endogeni V, D, i J genski segmenti teškog lanca. U specifičnom aspektu, mišu nedostaje 89 VHgenskih segmenata, 13 DHgenskih segmenata i četiri JHgenska segmenta.
[0146] U jednom aspektu, opisan je miš, naznačeno time da miš ima genom u klicinoj liniji koji sadrži modifikaciju lokusa imunoglobulinskog teškog lanca, naznačeno time da modifikacija lokusa imunoglobulinskog teškog lanca sadrži zamenu jedne ili više mišjih sekvenci imunoglobulinskog varijabilnog regiona sa jednom ili više ne-mišjom sekvencom imunoglobulinskog varijabilnog regiona, i naznačeno time da miš sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira mišji ADAM6 protein. U jednom aspektu, DHi JHsekvence i najmanje 3, najmanje 10, najmanje 20, najmanje 40, najmanje 60, ili najmanje 80 VHsekvence endogenog lokusa imunoglobulinskog teškog lanca su zamenjene sa ne-mišjom sekvencom imunoglobulinskog lakog lanca. U jednom aspektu, DH, JH, i all VHsekvence endogenog lokusa imunoglobulinskog teškog lanca su zamenjeni sa više ne-mišjih imunoglobulinskih sekvenci VLgenskih segmenata, jednom ili više JLgenskih segmenata, i izborno jednom ili više D genskih segmenata. Ne-mišja imunoglobulinska sekvenca može bi nerearanžirana. U jednom aspektu, ne-mišja imunoglobulinska sekvenca sadrži kompletne nerearanžirane VLi JLregione ne-mišje vrste. U jednom aspektu, ne-mišje imunoglobulinske sekvence su sposobne da formiraju kompletni varijabilni region, tj., rearanžirani varijabilni region koji sadrži VLi JLgenske segmente spojene zajedno da formiraju sekvencu koja kodira varijabilni region lakog lanca, ne-mišje vrste, operativno vezanu za jedan ili više endogenih konstantnih regiona. Nemišja vrsta može biti Homo sapiens i ne-mišje imunoglobulinske sekvence mogu biti humane sekvence.
[0147] U jednom aspektu, opisan je genetički modifikovani miš koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira ADAM6 protein ili njegov funkcionalni fragment koji je susedan humanom genskom segmentu imunoglobulinskog varijabilnog lakog lanca.
[0148] U jednom aspektu, mišu nedostaje endogena nemodifikovana ADAM6 genska sekvenca. U jednom aspektu, mišu nedostaje funkcionalna endogena ADAM6 genska sekvenca.
[0149] U jednom aspektu, varijabilni genski segment humanog imunoglobulinskog lakog lanca je genski segment imunoglobulinskog κ lakog lanca. U jednom aspektu, varijabilni genski segment humanog imunoglobulinskog lakog lanca je varijabilni genski segment imunoglobulinskog λ lakog lanca. U jednom aspektu, varijabilni genski segment humanog imunoglobulinskog lakog lanca je operativno vezan za konstantnu gensku sekvencu imunoglobulinskog teškog lanca.
[0150] U jednom aspektu, konstantna genska sekvenca imunoglobulinskog teškog lanca je genska sekvenca mišjeg ili pacovskog ili humanog teškog lanca. U jednom aspektu, konstantna genska sekvenca teškog lanca sadrži CH1 i/ili zglobni region.
[0151] U jednom aspektu, miš sadrži deleciju, ili zamenu, jednog ili više endogenih genskih segvenci imunoglobulinskog teškog lanca.
[0152] U jednom aspektu, miš dodatno sadrži nerearanžirani humani Vκ ili nerearanžirani humani Vλ genski segment operativno vezan za humanu ili mišju ili pacovsku sekvencu konstantnog regiona lakog lanca. U jednom aspektu, miš sadrži više nerearanžiranih humanih Vκ genskih segmenata (npr., dva ili više humanih Vκ segmenata i jedan ili više humanih Jκ segmenata) ili više nerearanžiranih humanih Vλ genskih segmenata (npr., dva ili više humanih Yλ segmenata i jedan ili više humanih Jλ segmenata). U jednom aspektu, nerearanžirani humani Vκ ili nerearanžirani humani Vλ genski segmenti su operativno vezani za sekvencu konstantnog regiona na endogenom lokusu imunoglobulinskog lakog lanca.
[0153] U jednom aspektu, miš dodatno sadrži modifikaciju koja čini endogeni lokus κ lakog lanca i/ili endogeni lokus λ lakog lanca nefunkcionalnim. U jednom aspektu, miš sadrži nokaut ili deleciju lokusa endogenog mišjeg κ i/ili endogenog mišjeg λ lakog lanca.
[0154] U jednom aspektu, opisan je postupak za održavanje mišjeg soja, naznačeno time da mišji soj sadrži zamenu mišje sekvence imunoglobulinskog teškog lanca sa jednom ili više sekvenci humanog imunoglobulinskog lakog lanca. U jednom aspektu, jedna ili više humanih sekvenci imunoglobulin lakog lanca su humani Vκ i/ili JK genski segmenti imunoglobulina.
[0155] U jednom aspektu, mišji soj sadrži deleciju jednog ili više mišjih VH, DH, i/ili JHgenskih segmenata. U jednom aspektu, miš dodatno sadrži jedan ili više humanih VLgenskih segmenata i jedan ili više humanih JLgenskih segmenata. U jednom aspektu, miš sadrži najmanje 6, najmanje 16, najmanje 30, ili najmanje 40 humanih Vκ genskih segmenata i najmanje pet Jκ genskih segmenata. U specifičnom aspektu, humani genski segmenti lakog lanca su operativno vezani za gen konstantnog regiona. U jednom aspektu, gen konstantnog regiona je mišji gen konstantnog regiona. U jednom aspektu, gen konstantnog regiona sadrži mišju sekvencu gena konstantnog regiona izabranu od CH1, zgloba, CH2, CH3, i/ili CH4 ili njihove kombinacije.
[0156] U jednom aspektu, postupak sadrži stvaranje mužjaka miša heterozigotnog u odnosu na zamenu mišje sekvence imunoglobulinskog teškog lanca, i ukrštanje heterozigotnog mužjaka miša sa ženkom miša divljeg tipa ili ženkom miša koja je homozigotna ili heterozigotna u odnosu na sekvencu humanog teškog lanca. U jednom aspektu, postupak sadrži održavanje soja sa ponavljanjem ukrštanja heterozigotnih mužjaka sa ženkama koje su divljeg tipa ili homozigotne ili heterozigotne za sekvencu humanog teškog lanca.
[0157] U jednom aspektu, postupak sadrži dobijanje ćelije od mužjaka ili ženke miševa homozigotnih ili heterozigotnih zu odnosu na sekvencu humanog teškog lanca, i upotrebu tih ćelija kao donor ćelija ili njihovih jedara kao donor jedara, i korišćenje ćelija ili jedara za stvaranje genetički modifikovanih životinja korišćenjem ćelije domaćina i/ili gestacijom ćelije i/ili jedara u surogat majkama.
[0158] U jednom aspektu, samo mužjaci miševa koji su heterozigotni u odnosu na zamenu na lokusu teškog lanca su ukrštani sa ženkom miševa. U specifičnom aspektu, ženke miševa su homozigotne, heterozigotne, ili divljeg tipa u odnosu na zmaenu lokusa teškog lanca.
[0159] U jednom aspektu, miš dodatno sadrži zamenu varijabilne sekvence λ i/ili κ lakog lanca na endogenom lokusu imunoglobulinskog lakog lanca sa heterolognom sekvencom imunoglobulinskog lakog lanca. U jednom aspektu, heterologne sekvence imunoglobulinskog lakog lanca su humane imunoglobulinske varijabilne sekvence λ i/ili κ lakog lanca.
[0160] U jednom aspektu, miš dodatno sadrži transgen na lokusu koji je različit od endogenog imunoglobulinskog lokusa, naznačeno time da transgen sadrži sekvencu koja kodira rearanžiranu ili nerearanžiranu heterolonu sekvencu λ ili κ lakog lanca (npr., nerearanžiranu VLi nerearanžiranu JL, ili rearanžiranu VJ) operativno vezanu (za nerearanžiranu) ili fuzionisanu (za rearanžiranu) sa sekvencom imunoglobulinskog konstantnog regiona lakog lanca. U jednom aspektu, heterologna sekvenca λ ili κ lakog lanca je humana. U jednom aspektu, sekvenca konstantnog regiona je izabrana od glodarske, humane, i nehumanog primata. U jednom aspektu, sekvenca konstantnog regiona je izabrana od miša, pacova, i hrška. U jednom aspektu, transgen sadrži ne-imunoglobulinski promotor koji vodi ekspresiju sekvence lakoglanca. U specifičnom aspektu, promotor je transkripciono aktivni promotor. U specifičnom aspektu, promotor je ROSA26 promotor.
[0161] U jednom aspektu, opisan je fertilni miš koji sadrži modifikaciju endogenog ADAM6 gena, naznačeno time da miš sadrži ektopičnu sekvencu koja daje ADAM6 funkciju mišu, i naznačeno time da miš sadrži u svojoj klicinoj liniji nerearanžirani genski segment humanog imunoglobulinskog lakog lanca operativno vezan sa sekvencom nukelinske kiseline koja kodira sekvencu imunoglobulinskog teškog lanca.
[0162] U jednom aspektu, opisan je fertilni miš koji sadrži modifikaciju endogenog ADAM6 lokusa, naznačeno time da modifikacija čini ADAM6 lokus nefunkcionalnim, i naznačeno time da miš eksprimira imunoglobulinski vezujući protein koji sadrži humani imunoglobulinski varijabilni domen lakog lanca susedan sekvenci konstantnog teškog lanca.
[0163] U jednom aspektu, imunoglobulin binding protein dodatno sadrži cognate humanih imunoglobulinski varijabilni region lakog lanca fuzionisan sa lakog lanca constant sekvencu.
[0164] U jednom aspektu, sekvenca konstantnog teškog lanca sekvenca konstantnog lakog lanca su ne-humane.
[0165] U jednom aspektu, opisan je miš, koji sadrži lokus imunoglobulinskog teškog lanca koji sadrži zamenu jednog ili više genskih segmenata imunoglobulinskih varijabilnih regiona teškog lanca (VH), genskih segmenata raznovrsnosti teškog lanca (DH), i genskih segmenata spajanja teškog lanca (JH) na endogenom lokusu imunoglobulinskog teškog lanca sa jednim ili više genskih segmenata varijabilnog regiona lakog lanca (VL) i jednim ili više genskih segmenata spajajućih regiona lakog lanca (JL), naznačeno time da je miš sposoban da eksprimira ADAM6 protein.
[0166] U jednom aspektu, opisan je miš, koji sadrži lokus imunoglobulinskog teškog lanca koji sadrži zamenu svih ili suštinski svih VH, DH, i JHgenskih segmenata sa jednim ili više VLgenskih segmenata i jednim ili više JLgenskih segmenata da bi formirao sekvencu VLgenskog segmenta na lokusu endogenog teškog lanca (VLH lokus), naznačeno time da VLH lokus je sposoban za rekombinaciju sa endogenim CHgenom da formira rearanžirani gen koji je izveden iz VLgenskog segmenta, JLgenskog segmenta, i endogenog CHgena.
[0167] U jednom aspektu, VLsegmenti su humani VL. U jednom aspektu, JLsegmenti su humani JL. U specifičnom aspektu, VLi JLsegmenti su humani VLi humani JLsegmenti.
[0168] U jednom aspektu, svi ili suštinski svi VH, DH, i JHgenski segmenti su zamenjeni sa najmanje šest humanih Vκ genskih segmenata i najmanje jednim Jκ genskim segmentom. U jednom aspektu, svi ili suštinski svi VH, DH, i JHgenski segmenti su zamenjeni sa najmanje 16 humanih Vκ genskih segmenata (humanih Vκ) i najmanje jednim Jκ genskim segmentom. U jednom aspektu, svi ili suštinski svi VH, DH, i JHgenski segmenti su zamenjeni sa najmanje 30 humanih Vκ genskih segmenata i najmanje jednim Jκ genskim segmentom. U jednom aspektu, svi ili suštinski svi VH, DH, i JHgenski segmenti su zamenjeni sa najmanje 40 humanih Vκ genskih segmenata i najmanje jednim Jκ genskim segmentom. U jednom aspektu, najmanje jedan Jκ genski segment sadrži dva, tri, četiri, ili pet humanih Jκ genskih segmenata.
[0169] U jednom aspektu, VLsegmenti su humani Vκ segmenti. U jednom aspektu, humani Vκ segmenti sadrže 4-1, 5-2, 7-3, 2-4, 1-5, i 1-6. U jednom aspektu, humani Vκ segmenti sadrže 3-7, 1-8, 1-9, 2-10, 3-11, 1-12, 1-13, 2-14, 3-15, i 1-16. U jednom aspektu, humani Vκ segmenti sadrže 1-17, 2-18, 2-19, 3-20, 6-21, 1-22, 1-23, 2-24, 3-25, 2-26, 1-27, 2-28, 2-29, i 2-30. U jednom aspektu, humani Vκ segmenti sadrže 3-31, 1-32, 1-33, 3-34, 1-35, 2-36, 1-37, 2-38, 1-39, i 2-40.
[0170] U jednom aspektu, VLsegmenti su humani Vκ segmenti i sadrže 4-1, 5-2, 7-3, 2-4, 1-5, 1-6, 3-7, 1-8, 1-9, 2-10, 3-11, 1-12, 1-13, 2-14, 3-15, i 1-16. U jednom aspektu, Vκ segmenti dodatno sadrže 1-17, 2-18, 2-19, 3-20, 6-21, 1-22, 1-23, 2-24, 3-25, 2-26, 1-27, 228, 2-29, i 2-30. U jednom aspektu, Vκ segmenti dodatno sadrže 3-31, 1-32, 1-33, 3-34, 1-35, 2-36, 1-37, 2-38, 1-39, i 2-40.
[0171] U jednom aspektu, VLsegmenti su humani Vλ segmenti i sadrže fragment klastera A lokusa humanog λ lakog lanca. U specifičnom aspektu, fragment klastera A lokusa humanog λ lakog lanca prostire se od hVλ3-27 do hVλ3-1.
[0172] U jednom aspektu, VLsegmenti sadrže fragment klastera B lokusa humanog λ lakog lanca. U specifičnom aspektu, fragment klastera B lokusa humanog λ lakog lanca prostire se od hVλ5-52 do hVλ1-40.
[0173] U jednom aspektu, VLsegmenti sadrže sekvencu humanog varijabilnog regiona λ lakog lanca koja sadrži genomski fragment klastera A i genomski fragment klastera B. U jednom aspektu, sekvenca humanog varijabilnog regiona λ lakog lanca sadrži najmanje jedan genski segment klastera A i najmanje jedan genski segment klastera B.
[0174] U jednom aspektu, VLsegmenti sadrže najmanje jedan genski segment klastera B i najmanje jedan genski segment klastera C.
[0175] U jednom aspektu, VLsegmenti sadrže hVλ 3-1, 4-3, 2-8, 3-9, 3-10, 2-11, i 3-12. U specifičnom aspektu, VLsegmenti sadrže neprekidnu sekvencu lokusa humanog λ lakog lanca koji se prostire od Vλ3-12 do Vλ3-1. U jednom aspektu, susedna sekvenca sadrži najmanje 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ili 12 hVλs. U specifičnom aspektu, hVλs uključuje 3-1, 4-3, 2-8, 3-9, 3-10, 2-11, i 3-12. U specifičnom aspektu, hVλs sadrži neprekidnu sekvencu humanog λ lokusa koji se prostire od Vλ3-12 do Vλ3-1.
[0176] U jednom aspektu, hVλs sadrži 13 do 28 ili više hVλs. U specifičnom aspektu, hVλs uključuju 2-14, 3-16, 2-18, 3-19, 3-21, 3-22, 2-23, 3-25, i 3-27. U specifičnom aspektu, hVλs sadrže neprekidnu sekvencu humanog λ lokusa koji se prostire od Yλ3-27 do Vλ3-1.
[0177] U jednom aspektu, VLsegmenti sadrže 29 do 40 hVλs. U specifičnom aspektu, VLsegmenti sadrže neprekidnu sekvencu humanog λ lokusa koji se prostire od Vλ3-29 do Vλ3-1, i neprekidnu sekvencu humanog λ lokusa koji se prostire od Vλ5-52 do Vλ1-40. U specifičnom aspektu, sve ili suštinski sve sekvence između hVλ1-40 i hVλ3-29 u genetički modifikovanom mišu sastoje se suštinski od humane λ sekvence od približno 959 bp koja se nalazi u prirodi (npr., u humanoj populaciji) nishodno od hVλ1-40 genskog segmenta (nishodno od 3’ netranslatiranog dela), mesta restrikcionog enzima (npr., Pl-Scel), praćenog sa humanom λ sekvencom od približno 3,431 bp ushodno od hVλ3-29 genskog segmenta koji se nalazi u prirodi.
[0178] U jednom aspektu, Jκ je human i izabran je iz grupe koja se sastoji od Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4, Jκ5, i njihove kombinacije. U specifičnom aspektu, Jκ sadrži Jκ1 do Jκ5.
[0179] U jednom aspektu, VLsegmenti su humani Vλ segmenti, i Jκ genski segment sadrži RSS koji ima 12-mer spejser, naznačeno time da RSS je suprotan na ushodnom kraju Jκ genskog segmenta. U jednom aspektu, VLgenski segmenti su humani Vλ i VLH lokus sadrži dva ili više Jκ genskih segmenata, pri čemu svaki sadrži RSS sa 12-mer spejserom naznačeno time da RSS je nasuprot na ushodnom kraju svakog Jκ genskog segmenta.
[0180] U specifičnom aspektu, VLsegmenti sadrže neprekidnih humanih κ genskih segmenata koji obuhvataju humani κ lokus od Vκ4-1 do Vκ2-40, i JLsegmenti sadrže neprekidne genske segmente koji obuhvataju humani κ lokus od Jκ1 do Jκ5.
[0181] U jednom aspektu, gde VLsegmenti su Vλ segmenti i nijedan DHsegment nije prisutan između VLsegmenata i J segmenata, VLsegmenti su flankirani nishodno (tj., nasprami na nishodnoj strani) sa 23-mer RSS, i Jκ segmenti ukoliko su prisutni ili Jλ segmenti ukoliko su prisutni flankirani su ushodno (tj., nasprami na ushodnoj strani) sa 12-mer RSS.
[0182] U jednom aspektu, gde V genski segmenti su Vκ genski segmenti i nijedan DHgenski segment nije prisutan između V genskih segmenata i J genskih segmenata, Vκ genski segmenti su svaki nasprami na nishodnoj strani sa 12-mer RSS, i Jκ segmenti ukoliko su prisutni ili Jλ segmenti ukoliko su prisutni su svaki nasprami na ushodnoj strani sa 23-mer RSS.
[0183] U jednom aspektu, miš sadrži rearanžiranu gen koji je izveden iz VLgenskog segmenta, JLgenskog segmenta, i endogenog CHgena. U jednom aspektu, rearanžirani gen je somatski mutiran. U jednom aspektu, rearanžirani gen sadrži 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više N adicija. U jednom aspektu, N adicije i/ili somatske mutacije uočene u rearanžiranom genu izvedenog iz VLsegmenta i JLsegmenta su 1.5-puta, 2- puta, 2.5-puta, 3-puta, 3.5-puta, 4-puta, 4.5-puta, ili najmanje 5-puta više od broja N adicija i/ili somatskih mutacija uočenih u rearanžiranom varijabilnom domenu lakog lanca (izvedenog iz istog VLgenskog segmenta i istog JLgenskog segmenta) koji je rearanžiran na endogenom lokusu lakog lanca. U jednom aspektu, rearanžirani gen je u B ćeliji koja specifično vezuje antigen od interesa, naznačeno time da B ćelija vezuje antigen od interesa sa KD u niskom nanomolarnom opsegu ili niže (npr., KD od 10 nanomola ili niže). U specifičnom aspektu, VLsegment, JLsegment, ili oba, su humani genski segmenti. U specifičnom aspektu, VLi JLsegmenti su humani κ genski segmenti. U jednom aspektu, mišji CHgen je izabran IgM, IgD, IgG, IgA i IgE. U specifičnom aspektu, mišji IgG je izabran od IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG2C i IgG3. U sledećem specifičnom aspektu, mišji IgG je IgG1.
[0184] U jednom aspektu, miš sadrži B ćeliju, naznačeno time da B ćelija eksprimira sa lokusa na hromozomu B ćelije vezojućeg proteina koji se suštinski sastoji do četiri polipeptidna lanca, naznačeno time da se četiri polipeptidna lanca suštinski sastoje od (a) dva identična polipeptida koji sadrže endogeni CHregion fuzionisan sa VL; i, (b) dva identična
4
polipeptida koja sadrže endogeni CLregion fuzionisan sa VLregionom koji je srodan u odnosu na VLregion koji je fuzionisan sa mišjim CHregionom, i, u jednom aspektu, je humani (npr., humani κ) VLregion. U jednom aspektu, VLregion fuzionisan sa endogenim CHregionom je humani VLregion. U specifičnom aspektu, humani VLregion fuzionisan sa mišjim CHregionom je Vκ region. U specifičnom aspektu, humani VLregion fuzionisan sa mišjim CHregionom je identičan sa V regionom kodiranim sa rearanžiranom nukleotidnom sekvencom humane klicine linije lakog lanca. U specifičnom aspektu, humani VLregion fuzionisan sa mišjim CHregionom sadrži dva, tri, četiri, pet, šest, ili više somatskih hipermutacija. U jednom aspektu, humani VLregion fuzionisan sa mišjim CHregionom je kodiran sa rearanžiranim genom koji sadrži 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 ili više N adicija.
[0185] U jednom aspektu, najmanje 50% svih IgG molekula eksprimiranih u mišu sadrže polipeptid koji sadrži CHregion i VLregion IgG iztipa, naznačeno time da dužina pomenutog polipeptida nije veća od 535, 530, 525, 520, ili 515 aminokiselina. U jednom aspektu, najmanje 75% svih IgG molekula sadrži polipeptid naveden u ovom paragrfu. U jednom aspektu, najmanje 80%, 85%, 90%, ili 95% svih IgG molekula sadrži polipeptid naveden u ovom pasusu. U specifičnom aspektu, svi IgG molekuli eksprimirani u mišu sadrže polipeptid koji nije duži od dužine polipeptida n evdenog u ovom pasusu.
[0186] U jednom aspektu, miš eksprimira vezujući protein koji sadrži prvi polipeptid koji sadrži endogeni CHregion fuzionisan sa varijabilnim domenom koji je kodiran sa rearanžiranim humanim V genskim segmentom i J genskim segmentom ali ne DHgenskim segmentom, i drugi polipeptid koji sadrži endogeni CLregion fuzionisan sa V domenom kodiranim sa rearanžiranim humanim V genskim segmentom i J genskim segmentom ali ne DHgenskim segmentom, i vezujući protein specifično vezuje antigen sa afinitetom u mikromolarnom, nanomolarnom, ili pikomolarnom opsegu. U jednom aspektu, J segment je humani J segment (npr., humani κ genski segment). U jednom aspektu, humani V segment je humani Vκ segment. U jednom aspektu, varijabilni domen je fuzionisan sa endogenim CHregionom sadrži veći broj somatskih hipermutacija od varijabilnog regiona koji je fuzionisan sa endogenim CLregionom; u specifičnom aspektu, varijabilni region fuzionisan sa endogenim CHregionom sadrži oko 1.5, 2-, 3-, 4-, ili 5-puta ili više somatskih hipermutacija od V regiona fuzionisanog sa endogenim CLregionom; u specifičnom aspektu, V region fuzionisan sa mišjim CHregionom sadrži najmanje 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, ili 15 ili više somatskih hipermutacija od V regiona fuzionisanog sa mišjim CLregionom. U jednom aspektu, V region fuzionisan sa mišjim CHregionom je kodiran sa rearanžiranim genom koji sadrži 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 ili više N adicija.
[0187] U jednom aspektu, miš eksprimira vezujući protein koji sadrži prvi varijabilni domen lakog lanca (VL1) fuzionisan sa sekvencom imunoglobulinskog konstantnog regiona teškog lanca i drugi varijabilni domen lakog lanca (VL2) fuzionisan sa sekvencom imunoglobulinskog konstantnog regiona lakog lanca, naznačeno time da VL1 sadrži broj somatskih hipermutacija koji je oko 1.5- do oko 5-puta više ili veći od broja somatskih hipermutacija prisutnih VL2. U jednom aspektu, broj somatskih hipermutacija u VL1 je oko 2-do oko 4-puta veći nego u VL2. U jednom aspektu, broj somatskih hipermutacija u VL1 je oko 2- do oko 3-puta veći nego u VL2. U jednom aspektu, VL1 je kodiran sa sekvencom koja sadrži 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 ili više N adicija.
[0188] U jednom aspektu, opisan je genetički modifikovan miš koj eksprimira imunoglobulin koji se suštinski sastoji od sledećih polipeptida: prva dva identična polipeptida pri čemu se svaki suštinski sastoji od CHregiona fuzionisanog sa varijabilnim domenom koji je izveden iz genskih segmenata koji se suštinski sastoje od VLgenskog segmenta i JLgenskog segmenta, i druga dva identična polipeptida pri čemu se svaki suštinski sastoji od CLregiona fuzionisanog sa varijabilnim domenom koji je izveden iz genskih segmenata koi se suštinski sastoje od VLsegmenta i JLsegmenta.
[0189] U specifičnom aspektu, dva identična polipeptida koja imaju CHregion imaju mišji CHregion.
[0190] U specifičnom aspektu, dva identična polipeptida koja imaju CLregion imaju mišji CLregion.
[0191] U jednom aspektu, varijabilni domen fuzionisan sa CLregionom je varijabilni domen koji je srodan sa varijabilnim domenom fuzionisanim sa CHregionom.
[0192] U jednom aspektu, varijabilni domen koji je fuzionisan sa endogenim CHregionom sadrži veći broj somatskih hipermutacija od varijabilnog domena koji je fuzionisan sa endogenim CLregionom; u specifičnom aspektu, varijabilni domen fuzionisan sa endogenim CHregionom sadrži oko 1.5-puta, 2-puta, 2.5-puta, 3-puta, 3.5-puta, 4-puta, 4.5-puta, ili 5-puta ili više somatskih hipermutacija od varijabilnog domena fuzionisanog sa endogenim CLregionom. U jednom aspektu, varijabilni domen fuzionisan sa endogenim CLregionom je kodiran genom koji sadrži 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više N adicija.
[0193] U jednom aspektu, jedan ili više od V segmenata i J segmenata su humani genski segmenti. U specifičnom aspektu, oba V segmenti i J segmenti su humanih κ genski segmenti. U sledećem specifičnom aspektu, oba V segmenti i J segmenti su humani λ genski segmenti. U jednom aspektu, V segmenti i J segmenti su nezavisno izabrani od humanih κ i humanih λ genskih segmenata. U specifičnom aspektu, V segmenti su Vκ segmenti i J segmenti su Jλ segmenti. U sledećem specifičnom aspektu, V segmenti su Vλ segmenti i J segmenti su Jκ segmenti.
[0194] U jednom aspektu, jedan ili više od varijabilnih domena fuzionisanih sa CLregionom i varijabilni domen fuzionisan sa CHregionom su humani varijabilni domeni. U specifičnom aspektu, humani varijabilni domeni su humani Vκ domeni. U sledećem specifičnom aspektu, humani varijabilni domeni su Vλ domeni. U jednom aspektu, humani domeni su nezavisno izabrani od humanih Vκ i humanih Vλ h domena. U specifičnom aspektu, humani varijabilni domen fuzionisan sa CLregionom je humani Vλ domen i humani varijabilni domen fuzionisan sa CHregionom je humani Vκ domen. U sledećem aspektu, humani varijabilni domen fuzionisan sa CLregionom je humani Vκ domen i humani varijabilni domen fuzionisan sa CHje humani Vλ domen.
[0195] U jednom aspektu, VLgenski segment prva dva identična polipeptida je izabran od humanog Vλ segmenta i humanog Vκ segmenta. U jednom aspektu, VLsegment druga dva identična polipeptida je izabran od humanog Vλ segmenta i humanog Vκ segmenta. U specifičnom aspektu, VLsegment prva dva identična polipeptida je humani Vκ segment i VLsegment druga dva identična polipeptida je izabran od humanog Vκ segmenta i humaniog Vλ segmenta. U specifičnom aspektu, VLsegment prva dva identična polipeptida je humani Vλ segment i VLsegment druga dva identična polipeptida je izabran od humanog Vλ segmenta i humanog Vκ segmenta. U specifičnom aspektu, humani VLsegment prva dva identična polipeptida je humani Vκ segment, i humani VLsegment druga dva identična polipeptida je humani Vκ segment.
[0196] U jednom aspektu, IgG miša sadrži vezujući protein stvoren kao odgovor na antigen, naznačeno time da vezujući protein sadrži polipeptid koji se suštinski sastoji od varijabilnog domena i CHregiona, naznačeno time da varijabilni domen je kodiran sa nukleotidnom sekvencom koja se suštinski sastoji od rearanžiranog VLsegmenta i rearanžiranog J segmenta, i naznačeno time da vezujući protein specifično vezuje epitop antigena sa KD u mikromolarnom, nanomolarnom, ili pikomolarnom opsegu.
[0197] U jednom aspektu, opisan je miš, naznačeno time da svi ili suštinski svi IgG stvoreni u mišu kao odgovor na antigen sadrže teški lanac koji sadrži varijabilni domen, naznačeno time da varijabilni domen je kodiran sa rearanžiranim genom izvedenim od genskih segmenata koji se suštinski sastoje od V genskog segmenta i J genskog segmenta. U jednom aspektu, rearanžirani gen sadrži 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 ili više N adicija.
[0198] U jednom aspektu, V segment je V segment lakog lanca. U jednom aspektu, laki lanac je izabran od κ lakog lanca i λ lakog lanca. U specifičnom aspektu, laki lanac je κ laki lanac. U specifičnom aspektu, V segment je humani V segment. U specifičnom aspektu, V segment je humani Vκ segment i J segment je humani Jκ segment.
[0199] U jednom aspektu, J segment je J segment lakog lanca. U jednom aspektu, laki lanac je
4
izabran od κ lakog lanca i λ lakog lanca. U specifičnom aspektu, laki lanac je κ laki lanac. U specifičnom aspektu, J segment je humani J segment. U sledećem aspektu, J segment je J segment teškog lanca (tj., JH). U specifičnom aspektu, teški lanac je mišjeg porekla. U sledećem specifičnom aspektu, teški lanac je humanog porekla.
[0200] U jednom aspektu, varijabilni domen teškog lanca koji je stvoren od ne više od V segmenta i J segmenta je somatski mutirani varijabilni domen.
[0201] U jednom aspektu, varijabilni domen teškog lanca koji je stvoren od ne više od V segmenta i J segmenta je fuzionisan sa mišjim CHregionom.
[0202] U specifičnom aspektu, svi ili suštinski svi IgG stvoreniu mišu kao odgovor na antigen sadrže varijabilni domen koji je izveden od ne više od jednog humanog V segmenta i ne više od jednog humanog J segmenta, i varijabilni domen je fuzionisan sa mišjim IgG konstantnim regionom, i IgG dodatno sadrži laki lanac koji sadrži humani VLdomen fuzionisan sa mišjim CLregionom. U specifičnom aspektu, VLdomen fuzionisan sa mišjim CLregionom je izveden od humanog Vκ segmenta i humanog Jκ segmenta. U specifičnom aspektu, VLdomen fuzionisan sa mišjim CLregionom je izveden od humanog Vλ segmenta i humanog Jλ segmenta.
[0203] U jednom aspektu, opisan je miš koji stvara IgG koji sadrži prvi CDR3 na polipeptidu koji sadrži CHregion i drugi CDR3 na polipeptidu koji sadrži CLregion, naznačeno time da oba i prvi CDR3 i drugi CDR3 su svaki nezavisno izvedeni od ne više od dva genska segmenta, naznačeno time da se dva genska segmenata sastoje suštinski od VLgenskog segmenta i JLgenskog segmenta. U jednom aspektu, CDR3 na polipeptidu sadrži CHregion koji sadrži sekvencu koja je izvedena od CDR3 nukleotidne sekvence koja sadrži 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 ili više N adicija.
[0204] U jednom aspektu, VLsegment i JLsegment su humani genski segmenti. U jednom aspektu, VLsegment i JLsegment su κ genski segmenti. U jednom aspektu, VLsegment i JLsegment su λ genski segmenti.
[0205] U jednom aspektu, opisan je miš koji stvara IgG koji sadrži prvi CDR3 na prvom polipeptidu koji sadrži CHregion i drugi CDR3 na drugom polipeptidu koji sadrži CLregion, naznačeno time da svaki od oba i prvi CDR3 i drugi CDR3 sadrže aminokiselinsku sekvencu naznačeno time da više od 75% aminokiselina je izvedeno od V genskog segmenta. U jednom aspektu, CDR3 na polipeptidu sadrži CHregion koji sadrži sekvencu koja je izvedena od CDR3 nukleotidne sekvence koja sadrži 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 ili više N adicija.
[0206] U jednom aspektu, više od 80%, više od 90%, ili više od 95% aminokiselina prvog CDR3, i više od 80%, više od 90%, ili više od 95% aminokiselina drugog CDR3, su izvedene od V segmenta lakog lanca.
[0207] U jednom aspektu, ne više od dve aminokiseline prvog CDR3 su izvedene iz genskog segmenta različitog od V segmenta lakog lanca. U jednom aspektu, ne više od dve aminokiseline drugog CDR3 su izvedene iz genskog segmenta različitog od V segmenta lakog lanca. U specifičnom aspektu, ne više od dve aminokiseline prvog CDR3 i ne više od dve aminokiseline drugog CDR3 su izvedene iz genskog segmenta različitog od V segmenta lakog lanca. U jednom aspektu, nijedan CDR3 od IgG ne sadrži aminokiselinsku sekvencu izvedenu iz D genskog segmenta. U jednom aspektu, CDR3 prvog polipeptida ne sadrži sekvencu izvedenu iz D segmenta.
[0208] U jednom aspektu, V segment je humani V genski segment. U specifičnom aspektu, V segment je humani Vκ genski segment.
[0209] U jednom aspektu, prvi i/ili drugi CDR3 imaju najmanje jednu, dve, tri, četiri, pet, ili šest somatskih hipermutacija. U jednom aspektu, prvi CDR3 je kodiran sa sekvencom nukleinske kiseline koja sadrži 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 ili više N adicija.
[0210] U jednom aspektu, prvi CDR3 se suštinski sastoji od aminokiselina izvedenih iz humanog V genskog segmenta lakog lanca i humanog J genskog segmenta lakog lanca, i drugi CDR3 se suštinski sastoji od aminokiselina izvedenih iz humanog V genskog segmenta lakog lanca i humanog J genskog segmenta lakog lanca. U jednom aspektu, prvi CDR3 je izveden iz sekvence nukelinske kiseline koja sadrži 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 ili više N adicija. U jednom aspektu, prvi CDR3 je izveden od ne više od dva genska segmenta, naznačeno time da ne više od dva genska segmenta su humani Vκ genski segment i humani Jκ genski segment; i drugi CDR3 je izveden od ne više od dva genska segmenta, naznačeno time da ne više od dva genska segmenta su humani Vκ genski segment i J genski segment izabrn od humanog Jκ segmenta, humanog Jλ segmenta, i humanog JHsegmenta. U jednom aspektu, prvi CDR3 je izveden od ne više od dva genska segmenta, naznačeno time da ne više od dva genska segmenta su humani Vλ segment i J segment izabrani od humanog Jκ segmenta, humanog Jλ segmenta, i humanog JHsegmenta.
[0211] U jednom aspektu, opisan je miš koji stvara IgG koji ne sadrži aminokiselinsku sekvencu izvedenu iz DHgenskog segmenta, naznačeno time da IgG sadrži prvi polipeptid koji ima prvi VLdomen fuzionisan sa mišjim CLregionom i drugi polipeptid koji ima drugi VLdomen fuzionisan sa mišjim CHregionom, naznačeno time da prvi VLdomen i drugi VLdomen nisu identični. U jednom aspektu, prvi i drugi VLdomeni su izvedeni iz različitih V segmenata. U sledećem aspektu, prvi i drugi VLdomeni su izvedeni iz različitih J segmenata. U jednom aspektu, prvi i drugi VLdomeni su izvedeni iz identičnih V i J segmenata, naznačeno time da drugi VLdomen sadrži veći broj somatskih hipermutacija u poređenju sa prvim VLdomenom.
4
[0212] U jednom aspektu, prvi i drugi VLdomen su nezavisno izabrani od humanih i mišjih VLdomena. U jednom aspektu, prvi i drugi VLdomeni su nezavisno izabrani od Vκ i Vλ domena. U specifičnom aspektu, prvi VLdomen je izabran od Vκ domena i Vλ domena, i drugi VLdomen je Vκ domen. U sledećem specifičnom aspektu, Vκ domen je humani Vκ domen.
[0213] U jednom aspektu, opisan je miš, naznačeno time da svi ili suštinski svi IgG stvoreni u mišu se suštinski sastoje od lakog lanca koji ima prvi humani VLdomen fuzionisan sa mišjim CLdomenom, i teškog lanca koji ima drugi humani VLdomen fuzionisan sa mišjim CHdomenom.
[0214] U jednom aspektu, humani VLdomen fuzionisan sa mišjim CHdomenom je humani VK domen.
[0215] U jednom aspektu, prvi i drugi humani VLdomeni nisu identični.
[0216] U jednom aspektu, opisan je miš, naznačeno time da najmanje 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, ili oko 100% imunoglobulina G stvorenih u mišu sastoji se suštinski od dimera (a) prvog polipeptida koji se suštinski sastoji od imunoglobulinskog VLdomena i imunoglobulinskog CLregiona; i, (b) drugog polipeptida dužine od ne više od 535 aminokiselina, naznačeno time da se drugi polipeptid suštinski sastoji od CHregiona i V domena kome nedostaje sekvenca izvedena iz DHgenskog segmenta.
[0217] U jednom aspektu, drugi polipeptid je dužine oko 435-535 aminokiselina. U specifičnom aspektu, drugi polipeptid je dužine oko 435-530 aminokiselina. U specifičnom aspektu, drugi polipeptid je dužine oko 435-525 aminokiselina. U specifičnom aspektu, drugi polipeptid je dužine oko 435-520 aminokiselina. U specifičnom aspektu, drugi polipeptid je dužine oko 435-515 aminokiselina.
[0218] U jednom aspektu, u oko 90% ili više od IgG stvorenog u mišu drugi polipeptid je dužine ne više od oko 535 aminokiselina.
[0219] U jednom aspektu, u oko 50% ili više od IgG stvorenih u mišu drugi polipeptid je dužine ne više od oko 535 aminokiselina. U jednom aspektu, u oko 50% ili više od imunoglobulina G stvorenih u mišu drugi polipeptid je dužine ne više od oko 530, 525, 520, 515, 510, 505, 500, 495, 490, 485, 480, 475, 470, 465, 460, 455, ili 450 aminokiselina. U jednom aspektu, oko 60%, 70%, 80%, 90%, ili 95 % ili više od IgG stvorenih u mišu je navedene dužine. U specifičnom aspektu, svi ili suštinski svi od IgG stvorenih u mišu je navedene dužine.
[0220] U jednom aspektu, V domen drugog polipeptida je VLdomen. U specifičnom aspektu, V domen drugog polipeptida je izabran od Vκ i Vλ domena. U specifičnom aspektu, V domen drugog polipeptida je humani Vκ ili Vλ domen.
4
[0221] U jednom aspektu, opisan je miš koji od nukleotidne sekvence u svojoj klicinoj liniji eksprimira polipeptid koji sadrži variajbilnu sekvencu lakog lanca (npr., V i/ili J sekvencu), DHsekvencu, i konstantni region teškog lanca.
[0222] U jednom aspektu, miš eksprimira polipeptid endogenog lokusa teškog lanca koji sadrži zamenu svih ili suštinski svih funkcionalnih endogenih varijabilnih lokusa genskih segmenata teškog lanca sa više humanih genskih segmenata na endogenom lokusu teškog lanca.
[0223] U jednom aspektu, polipeptid sadrži VLsekvencu izvedenu iz Vλ ili Vκ genskog segmenta, polipeptid sadrži CDR3 izveden iz DHgenskog segmenta, i polipeptid sadrži sekvencu izvedenu iz JHili Jλ ili Jκ genskog segmenta.
[0224] U jednom aspektu, miš sadrži endogeni lokus imunoglobulinskog teškog lanca koji sadrži zamenu svih funkcionalnih VHgenskih segmenata sa jednim ili više humanih Vλ genskih segmenata lakog lanca naznačeno time da svaki od jednog ili više humanih Vλ segmenata ima na nishodnoj strani naspramnu 23-mernu spejsovanu sekvencu rekombinacionog signala (RSS), naznačeno time da Vλ segmenti su operativno vezanu za humani ili mišji DHsegment koji ushodno i nishodno ima naspramnu 12-mer spejsovanu RSS; DHgenski segment je operativno vezan sa J segmentom koji je ushodno naspram sa 23-mer spejsovanom RSS koja je pogodna za rekombinaciju sa 12-mer spejsovanom RSS naspramom DHgenskom segmentu; naznačeno time da V, DH, i J segmenti su operativno vezanu za sekvencu nukleinske kiseline koja kodira konstantni region teškog lanca.
[0225] U jednom aspektu, miš sadrži endogeni lokus imunoglobulinskog teškog lanca koji sadrži zamenu svih funkcionalnih VHgenskih segmenata sa jednim ili više humanih Vκ genskih segmenata pri čemu je svaki supsrotstavljen na nishodnoj strani sa 12-mernom spejsovanom sekvencom rekombinacionog signala (RSS), naznačeno time da su V segmenti operativno vezanu za humani ili miš DHsegment koji je naspram i ushodno i nishodno sa 23-mernom spejsovanom RSS; DHsegment je operativno vezna sa J segmentom naspramim na ushodnoj strani sa 12-mernom spejsovanom RSS koja je pogodna za rekombinaciju sa 23-mernom spejsovanom RSS koja je nasprama DHsegmentu; naznačeno time da V, DH, i genski segmenti su operativno vezani za sekvencu nukleinske kiseline koja kodira konstantni region teškog lanca.
[0226] U jednom aspektu, konstantni region teškog lanca je endogeni konstantni region teškog lanca. U jednom aspektu, sekvenca nukleinske kiseline kodira sekvencu izabranu od CH1, zgloba, CH2, CH3, i njihove kombinacije. U jednom aspektu, jedan ili više od CH1, zgloba, CH2, i CH3 su humani.
[0227] U jednom aspektu, miš sadrži endogeni lokus imunoglobulinskog teškog lanca koji
4
sadrži zamenu svih funkcionalnih VHgenskih segmenata sa više humanih Vλ ili Vκ genskih segmenata pri čemu je svaki naspram nishodno sa 23-mernom spejsovanom RSS, više humanih DHsegmenata naspramih sa i ushodnom i nishodnom 12-mernom spejsovanom RSS, više humanih J segmenata (JHili Jλ ili Jκ) naspramih sa i ushodnom i nishodnom 23-mernom spejsovanom RSS, naznačeno time da lokus sadrži endogenu sekvencu konstantnog regiona izabranu od CH1, zgloba, CH2, CH3, i njihovu kombinaciju. U specifičnom aspektu, miš sadrži sve ili suštinski sve funkcionalne humane Vλ ili Vκ segmente, sve ili suštinski sve funkcionalno humane DHsegmente, i sve ili suštinski sve JHili Jλ ili Jκ segmente.
[0228] U jednom aspektu, miš eksprimira antigen-vezujući protein koji sardrži (a) polipeptid koji sadrži sekvencu humanog lakog lanca vezanu sa sekvencom konstantnog teškog lanca koja sadrži mišju sekvencu; i (b) polipeptid koji sadrži humani varijabilni region lakog lanca vezan sa humaniom ili mišjom sekvencom konstanog lakog lanca. U specifičnom aspektu, sekvenca lakog lanca je humana sekvenca lakog lanca, i nakon izlaganja proteazi koja je sposobna da iseče antitelo na Fc i Fab, potpuno humani Fab je formiran koji sadrži najmanje četiri CDRs lakog lanca, naznačeno time da najmanje četiri CDRs lakog lanca su izabrani od λ sekvence, κ sekvence, i njihove kombinacije. U jednom aspektu, Fab sadrži najmanje pet CDRs lakog lanca. U jednom aspektu, Fab sadrži šest CDRs lakog lanca. U jednom aspektu, najmanje jedan CDR od Fab sadrži sekvencu izvedenu iz Vλ segmenta ili Vκ segmenta, i najmanje jedan CDR dodatno sadrži sekvencu izvedenu iz D segmenta. U jednom aspektu, najmanje jedan CDR je CDR3 i CDR je izveden iz humanog Vκ segmenta, humanog D segmenta, i humanog Jκ segmenta.
[0229] U jednom aspektu, polipeptid sadrži varijabilni region izveden iz humanog Vλ ili Vκ genskog segmenta, humanog DHgenskog segmenta, i humanih JHili Jλ ili Jκ genskih segmenta. U specifičnom aspektu, konstantna sekvenca teškog lanca je izvedena iz humane CH1 i mišje CH2 i mišje CH3 sekvence.
[0230] U jednom aspektu, opisan je miš koji u svojoj klicinoj liniji sadrži nerearanžirani humani Vκ ili Vλ genski segment operativno vezan za humani J genski segment i sekvencu konstantnog regiona teškog lanca, naznačeno time da miš eksprimira VLvezujući protein koji sadrži humani Vκ domen fuzionisan sa konstantnim regionom teškog lanca i humani VLdomen fuzionisan sa konstantnim regionom lakog lanca. U jednom aspektu, humani VLdomen sadrži rearanžirani humani VLgenski segment izabran od humanih Vκ i humanih Vλ genskih segmenata. U specifičnom aspektu, humani VLdomen dodatno sadrži rearanžirani humanih JLgenski segment izabran od humanog Jκ i humanog Jλ genskog segmenta.
[0231] U jednom aspektu, opisan je miš koji eksprimira imunoglobulinski protein od modifikovanog endogenog lokusa teškog lanca u svojoj klicinoj liniji, naznačeno time da
4
modifikovanom lokusu endogenog teškog lanca nedostaje funkcionalni mišji V genski segment teškog lanca i lokus sadrži nerearanžirane V genske segmente lakog lanca i sadrži nerearanžirane J genske segmente, naznačeno time da su nerearanžirani V genski segmenti lakog lanca i nerearanžirani J genski segmenti operativnovezani sa sekvencom konstantnog regiona teškog lanca; naznačeno time da se imunoglobulinski protein suštinski sastoji prvog polipeptida i drugog polipeptida, naznačeno time da prvi polipeptid sadrži sekvencu imunoglobulinskog lakog lanca i sekvencu imunoglobulinskog konstantnog teškog lanca constant sekvencu, i drugi polipeptid sadrži imunoglobulinski varijabilni domen lakog lanca i konstantni region lakog lanca.
[0232] U jednom aspektu, opisan je miš koji eksprimira imunoglobulinski protein, naznačeno time da imunoglobulinom proteinu nedostaje imunoglobulinski varijabilni domen teškog lanca, i imunoglobulinski protein sadrži prvi varijabilni domen izveden iz gena lakog lanca, i drugi varijabilni domen izveden iz gena lakog lanca, naznačeno time da prvi varijabilni domen i drugi varijabilni domen su međusobno srodni, naznačeno time da prvi i drugi varijabilni domeni lakog lanca nisu identični, i naznačeno time da prvi i drugi varijabilni someni lakog lanca se spajaju i kada su spojeni specifično vezuju antigen od interesa.
[0233] U jednom aspektu, opisan je miš koji od nerearanžiranih genskih segmenata u svojoj klicinoj liniji eksprimira imunoglobulinski protein koji sadrži varijabilne regione koji su potpuno izvedeni iz genskih segmenata koji se sastoje suštinski od nerearanžiranih humanih genskih segmenata, naznačeno time da imunoglobulinski protein sadrži imunoglobulinsku sekvencu konstantnog lakog lanca i sekvencu imunoglobulinskog konstantnog teškog lanca izabranu iz grupe koja se sastoji od CH1, zgloba, CH2, CH3, i njihove kombinacije.
[0234] U jednom aspektu, opisan je miš koji od nerearanžiranih genskih segmenata u svojoj klicinoj liniji eksprimira imunoglobulinski protein koji sadrži varijabilne regione, naznačeno time da svi CDR3s svih varijabilnih regiona su u potpunosti stvoreni od V i J genskih segmenata lakog lanca, i izborno jedne ili više somatskih hipermutacija, npr., jedne ili više N adicija.
[0235] U jednom aspektu, opisan je miš koji eksprimira somatski mutirani imunoglobulinski protein izveden iz nerearanžiranih humanih genskih segmenata imunoglobulinskog varijabilnog regiona lakog lanca u klicinoj liniji miša, naznačeno time da imunoglobulinskom proteinu nedostaje CDR koji sadrži sekvencu izvedenu iz D genskog segmenta, naznačeno time da imunoglobulinski protein sadrži prvi CDR3 na varijabilnom domenu lakog lanca fuzionisan sa konstantnim regionom lakog lanca, sadrži drugi CDR3 na varijabilnom domenu lakog lanca fuzionisan sa konstantnim regionom teškog lanca, i naznačeno time da drugi CDR3 je izveden iz rearanžirane sekvence varijabilnog regiona lakog lanca koja sadrži 1, 2, 3,
4
4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 ili više N adicija.
[0236] U jednom aspektu, opisan je miš kao što j eovde opisan, naznačeno time da miš sadrži funkcionalano utišani lokus lako g lanca izabran od λ lokusa, κ lokusa, i njihove kombinacije. U jednom aspektu, miš sadrži deleciju λ i/ili κ lokusa, u celini ili delimično, tako da je λ i/ili κ lokus nonfunkcionaln.
[0237] U jednom aspektu, opisan je embrion miša, koji sadrži ćeliju koja sadrži modifikovani imunoglobulinski lokus kao što je ovde opisano. U jednom aspektu, miš je himeran i najmanje 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ili 95% ćelija embriona sadrži modifikovani imunoglobulinski lokus kao što je ovde opisan. U jednom aspektu, najmanje 96%. 97%, 98%, 99%, ili 99.8% ćelija embriona sadrži modifikovan imunoglobulinski lokus kao što je ovde opisano. U jednom aspektu, embrion sadrži ćeliju domaćina i ćeliju izvedenu iz donor ES ćelije, naznačeno time da ćelija izvedena iz donor ES ćelije sadrži modifikovani imunoglobulinski lokus kao što je opisano ovde. U jednom aspektu, embrion je 2-, 4-, 8, 16-, 32, ili 64-ćelijski stadijum embriona domaćina, ili blastocist, i dodatno sadrži donor ES ćeliju koja sadrži modifikovani imunoglobulinski lokus kao što je ovde opisano.
[0238] U jednom aspektu, opisan je miš ili ćelija stvorena korišćenjem konstrukta nukleinske kiseline kao što je ovde opisano.
[0239] U jednom aspektu, opisan je miš stvoren korišćenjem ćelije kao što je ovde opisano. U jednom aspektu, ćelija je mišja ES ćelija.
[0240] U jednom aspektu, opisani su mišje ćelije i mišji embrioni, uključujući, ali se ne ograničavajući na ES ćelije, pluripotentne ćelije, i indukovane pluripotentne ćelije, koje sadrže genetičke modifikacije kao što je ovde opisano. Opisane su ćelije koje su XX i ćelije koje su XY. Ćelije koje sadrže jedro koje sadrži modifikaciju kao što je ovde opisano su takođe opisane, npr., modifikacije introdukovane u ćeliju pronuklearnom injekcijom. Ćelije, embrioni, i miševi koje sadrže virusno indukovani ADAM6 gen su takođe opisane, npr., ćelije, embrioni, i miševi koje sadrže transdukcioni konstrukt koji sadrži ADAM6 gen koji je funkcionalan u mišu.
[0241] U jednom aspektu, opisana je ćelija ili tkivo izvedeno iz miša kao što je ovde opisano. U jednom aspektu, ćelija ili tkivo je izvedeno iz slezine, limfnog čvora ili kostne srži miša kao što je ovde opisano. U jednom aspektu, ćelija je B ćelija. U jednom aspektu ćelija je embrionalna matična ćelija. U jednom aspektu, ćelija je germinativna ćelija.
[0242] U jednom aspektu, tkivo je izabrano od vezivnog, mišićnog, nervnog i epitelnog tkiva. U specifičnom aspektu, tkivo je reproduktivno tkivo.
[0243] U jednom aspektu, ćelija i/ili tkivo izvedeno iz miša kao što je ovde opisano je izolovana za upotrebu u jednom ili više ex vivo analiza. U različitim aspektima, jedna ili više ex vivo analiza uključuju merenje fizičkih, termalnih, električnih, mehaničkih ili optičkih osobina, hirurške procedure, merenja interakcija različitih tipova tkiva, razvoja tehnika vizuelizacije, ili njihovu kombinaciju.
[0244] U jednom aspektu, opisana je upotreba ćelije ili tkiva izvedenog iz miša kao što je ovde opisano za stvaranje antitela. U jednom aspektu, opisana je upotreba ćelije ili tkiva izvedenog iz miš kao što je ovde opisano da bi se stvorio hibridom ili kvadrom.
[0245] U jednom aspektu, ne-humana ćelija sadrži hromozom ili njegov fragment ne-humane životinje kao što je ovde opisano. U jednom aspektu, ne-humana ćelija sadrži jedro nehumane životinje kao što je ovde opisano. U jednom aspektu, ne-humana ćelija sadrži hromozom ili njegov fragment kao rezultat transfera jedra.
[0246] U jednom aspektu, opisano je jedro izvedeno iz miša kao što je ovde opisano. U jednom aspektu, jedro je od diploidne ćelije koja nije B ćelija.
[0247] U jednom aspektu, opisana je genetički modifikovana mišja ćelija, naznačeno time da je ćelija nesposobna da eksprimira teški lanac koji sadrži rearanžirane genske segmente endogenog imunoglobulinskog teškog lanca, i ćelija sadrži funkcionalni ADAM6 gen koji kodira mišji ADAM6 protein ili njegov funkcionalni fragment. U jednom aspektu, ćelija dodatno sadrži inserciju genskih segmenata humanog imunoglobulinskog lakog lanca. U specifičnom aspektu, genski segmenti humanog imunoglobulinskog lakog lanca su Vκ i/ili Jκ genski segmenti koji su operativno vezani za mišji konstantni regoion teških lanacs tako da nakon rearanžmana kodiraju funkcionalni varijabilni domen lakog lanca fuzionisan sa mišjim konstantnim domenom teškog lanca.
[0248] U jednom aspektu, opisana je ćelija genetički modifikovanog miša; naznačeno time da ćeliji nedostaje funkcionalni endogeni ADAM6 lokus, i ćelija sadrži ektopičnu nukleotidnu sekvencu koja kodira mišji ADAM6. U jednom aspektu, ćelija dodatno sadrži modifikaciju sekvence endogenog imunoglobulinskog varijabilnog regiona teškog lanca. U specifičnom aspektu, modifikacija sekvence endogenog imunoglobulinskog varijabilnog regiona teškog lanca sadrži deleciju izabranu od delecije mišjeg VHgenskog segmenta, delecije mišjeg DHgenskog segmenta, delecije mišjeg JHgenskog segmenta, i njihove kombinacije. U specifičnom aspektu, miš sadrži zamenu jedne ili više mišje imunoglobulinske VH, DH, i/ili JHsekvence sa humanom imunoglobulinskom sekvencom. U specifičnom aspektu, humana imunoglobulinska sekvenca je izabrana od humanog VH, humanog VL, humanog DH, humanog JH, humanog JL, i njihove kombinacije.
[0249] U jednom aspektu, ćelija je totipotentna ćelija, pluripotentna ćelija, ili indukovana pluripotentna ćelija. U specifičnom aspektu, ćelija je mišja ES ćelija.
[0250] U jednom aspektu, opisana je mišja B ćelija, naznačeno time da mišja B ćelija sadrži
1
rearanžirani imunoglobulinski gen, naznačeno time da B ćelija sadrži na hromozomu B ćelije sekvencu nukleinske kiseline koja kodira ADAM6 protein ili ortolog ili homolog ili njegov funkcionalni fragment koji je funkcionalan u mužjaku miša. U jednom aspektu, mišja B ćelija sadrži dva alela sekvence nukleinske kiseline. U jednom aspektu, rearanžirani imunoglobulinski gen sadrži rearanžiranu sekvencu imunoglobulinskog lakog lanca koja se graniči sa konstantnom sekvencom teškog lanca. U jednom aspektu, sekvenca lakog lanca je κ sekvenca; u jednom aspektu, sekvenca lakog lanca je λ sekvenca.
[0251] U jednom aspektu, sekvenca nukleinske kiseline je u molekulu nukleinske kiseline (npr., hromozomu B ćelije) koja se graniči sa rearanžiranim lokusom mišjeg teškog lanca imunoglobulina.
[0252] U jednom aspektu, sekvenca nukleinske kiseline je u molekulu nukleinske kiseline (npr., hromozomu B ćelije) koja je različita od molekula nukelinske kiseline koji sadrži rearanžirani lokus mišjeg teškog lanca imunoglobulina.
[0253] U jednom aspektu, mišja B ćelija sadrži rearanžiranu ne-mišju sekvencu imunoglobulinskog varijabilnog regiona lakog lanca operativno vezanu za mišji ili humani gen imunoglobulinskog konstantnog regiona teškog lanca, naznačeno time da B ćelija sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira ADAM6 protein ili ortolog ili homolog ili njegov funkcionalni fragment koji je funkcionalan u mužjaku miša.
[0254] U jednom aspektu, opisana je somatska mišja ćelija, koja sadrži hromozom koji sadrži modifikovani lokus imunoglobulinskog teškog lanca, i sekvencu nukleinske kiseline koja kodira mišji ADAM6 ili ortolog ili homolog ili njegov funkcionalni fragment koji je funkcionalan u mužjaku miša. U jednom aspektu, sekvenca nukleinske kiseline je na istom hromozomu kao modifikovani lokus imunoglobulinskog teškog lanca. U jednom aspektu, nukleinska kiselina je na različitom hromozomu od modifikovanog lokusa imunoglobulinskog teškog lanca. U jednom aspektu, somatska ćelija sadrži jednu kopiju sekvence nukleinske kiseline. U jednom aspektu, somatska ćelija sadrži najmanje dve kopije sekvence nukleinske kiseline. U specifičnom aspektu, somatska ćelija je B ćelija. U jednom aspektu, modifikovani lokus imunoglobulinskog teškog lanca sadrži nerearanžirani genski segment imunoglobulinskog lakog lanca operativno vezan za sekvencu konstantnog regiona teškog lanca.
[0255] U jednom aspektu, opisana je mišja germinativna ćelija, koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira mišji ADAM6 (ili njegov homolog ili ortolog ili funkcionalni fragment) na hromozomu germinativne ćelije, naznačeno time da sekvenca nukleinske kiseline koja kodira mišji ADAM6 (ili njegov homolog ili ortolog ili funkcionalni fragment) je na položaju u hromozomu koji je različit od položaja u hromozomu germinativne ćelije
2
miša divljeg tipa, naznačeno time da miš dodatno sadrži modifikaciju koja sadrži nerearanžirani genski segment imunoglobulinskog lakog lanca (Vκ i/ili Vλ i/ili Vκ i Jκ i/ili Vλ i JA.) operativno vezan sa sekvencom konstantnog regiona teškog lanca. U jednom aspektu, sekvenca nukleinske kiseline je na lokusu mišjeg imunoglobulina. U jednom aspektu, sekvenca nukleinske kiseline je na istom hromozomu germinativne ćelije kao mišji lokus imunoglobulina. U jednom aspektu, sekvenca nukleinske kiseline je na različitom hromozomu germinativne ćelije od mišjeg lokusa imunoglobulina. U jednom aspektu, mišji lokus imunoglobulina sadrži zamenu najmanje jedne mišje imunoglobulinske sekvence sa najmanje jednom ne-mišjom imunoglobulinskom sekvencom. U specifičnom aspektu, najmanje jedna ne-mišja imunoglobulinska sekvenca je humana imunoglobulinska sekvenca.
[0256] U jednom aspektu, opisana je pluripotentna, indukovana pluripotentna, ili totipotentna ćelija izvedena iz miša kao što je ovde opisano. U specifičnom aspektu, ćelija je mišja embrionalana matična (ES) ćelija.
[0257] U jednom aspektu, opisana je ćelija, koja sadrži modifikovani imunoglobulinski lokus kao što je ovde opisan. U jednom aspektu, ćelija je izabrana od totipotentne ćelije, pluripotentne ćelije, indukovane pluripotentne matične ćelijie (iPS), i ES ćelije. U specifičnom aspektu, ćelija je mišja ćelija, npr., mišja ES ćelija. U jednom aspektu, ćelija je homozigotna za modifikovani imunoglobulinski lokus.
[0258] U jednom aspektu, opisana je ćelija, koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira prvi polipeptid koji sadrži prvu somatski mutiranu humanu Vκ ili Vλ sekvencu fuzionisanu sa humanom sekvencom konstantnog regiona teškog lanca.
[0259] U jednom aspektu, ćelija dodatno sadrži drugi polipeptidni lanac koji sadrži drugu somatski mutiranu humanu Vκ ili Vλ sekvencu fuzionisanu sa sekvencom humanog konstantnog regiona lakog lanca.
[0260] U jednom aspektu, humana Vκ ili Vλ sekvenca prvog polipeptida je srodna humanoj Vκ ili Vλ sekvenci drugog polipeptida.
[0261] U jednom aspektu, Vκ ili Vλ prvog polipeptida i humani Vκ ili Vλ drugog polipeptida kada su spojeni specifično vezuju antigen od interesa. U specifičnom aspektu, prvi polipeptid sadrži varijabilni domen koji se suštinski sastoji od humanog Vκ, i drugi polipeptid sadrži varijabilni domen koji se sastoji od humanog Vκ koji je srodan sa humanim Vκ prvog polipeptida, i sekvenca humanog konstantnog regiona je IgG sekvenca.
[0262] U jednom aspektu, ćelija je izabrana od CHO ćelije, COS ćelije, 293 ćelije, HeLa ćelije, i humane retinalne ćelije koje eksprimiraju virusnu sekvencu nukleinskle kiseline (npr., PERC.6™ ćelija.
[0263] U jednom aspektu, opisana je somatska glodarska (npr., mišja) ćelija, koja sadrži hromozom koji sadrži genetičku modifikaciju kao što je ovde opisano.
[0264] U jednom aspektu, opisana je glodarska (npr., mišja) germinativna ćelija, koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline koji sadrži genetičku modifikaciju kao što je ovde opisano.
[0265] U jednom aspektu, opisana je pluripotentna, indukovana pluripotenta, ili totipotentna ćelija izvedena iz glodara (npr., miša) kao što je ovde opisano. U specifičnom aspektu, ćelija je mišja embrionalna matična (ES) ćelija.
[0266] U jednom aspektu, opisana je upotreba ćelije kao što je opisana ovde za proizvodnju glodarske (npr., mišje), ćelije, ili terapeutskog proteina (npr., antitela ili drugog antigenvezujućeg proteina). U jednom aspektu, opisana je upotreba ćelije kao što je ovde opisano za proizvodnju terapeutskog proteina, naznačeno time da terapeutski protein sadrži humani varijabilni domen. U specifičnom aspektu, humani varijabilni domen sadrži rearanžirane Vκ i Jκ genske segmente.
[0267] U jednom aspektu, opisan je glodar (npr., miš) stvoren korišćenjem targeting vektora, nukleotidnog konstrukta, ili ćelije kao što je ovde opisano.
[0268] U jednom aspektu, opisana je upotreba targeting vektora kao što je ovde opisano za proizvodnju glodara (npr., miša) ili ćelije (npr., mišje ES ćelije, mišjeg fibroblasta, itd.). U jednom aspektu, targeting vektor sadrži humani genomski fragment koji sadrži nerearanžirane imunoglobulinske genske segmente. U specifičnom aspektu, nerearanžirani imunoglobulinski genski segmenti uključuju V i J genske segmente. U specifičnom aspektu, nerearanžirani imunoglobulinski genski segmenti uključuju V, D i J genske segmente.
[0269] U jednom aspektu, opisan je konstrukt nukleinske kiseline, koji sadrži ushodnu homologu ruku i nishodnu homologu ruku, naznačeno time da ushodna homologa ruka sadrži sekvencu koja je identična ili suštinski identična sekvenci humanog imunoglobulinskog varijabilnog regiona teškog lanca, nishodna homologa ruka sadrži sekvencu koja je identična ili suštinski identična humanoj ili mišjoj sekvenci imunoglobulinskog varijabilnog regiona, i između ushodnih i nishodnih homologih ruku postavljena je sekvenca koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira mišji ADAM6 protein. U specifičnom aspektu, sekvenca koja kodira mišji ADAM6 gen je operativno vezana sa mišjim promotorom sa kojim je mišji ADAM6 povezan kod miša divljeg tipa.
[0270] U jednom aspektu, opisan je targeting vektor, koji sadrži (a) nukleotidnu sekvencu koja je identična ili suštinski identična nukelotidnoj sekvenci genskog segmenta humanog varijabilnog regiona; i, (b) nukleotidnu sekvencu koja kodira mišji ADAM6 ili ortolog ili homolog ili njegov funkcionalni fragment koji je funkcionalan u mišu.
[0271] U jednom aspektu, targeting vektor dodatno sadrži promotor operativno vezan za sekvencu koja kodira mišji ADAM6. U specifičnom aspektu, promotor je mišji ADAM6
4
promotor.
[0272] U jednom aspektu, opisan je nukelotidni konstrukt za modifikovanje mišjeg varijabilnog lokusa imunoglobulinskog teškog lanca, naznačeno time da konstrukt sadrži najmanje jedno specifično mesto prepoznavanja rekombinaze i sekvencu koja kodira ADAM6 protein ili ortolog ili homolog ili njegov funkcionalni fragment koji je funkcionalan u mišu.
[0273] U jednom aspektu, opisan je konstrukt nukelinske kiseline koji sadrži humani DHgenski segment naspram ushodno i nishodno sa 23-mernom spejsovanom RSS. U specifičnom aspektu, konstrukt nukleinske kiseline sadrži homologu ruku koja je homologa humanoj genomskoj sekvenci koja sadrži humane Vκ genske segmente. U jednom aspektu, targeting konstrukt sadrži sve ili suštinski sve humane DHgenske segmente pri čemu je svaki naspram ushodne i nishodne 23-merne spejsovane RSS.
[0274] U jednom aspektu, opisan je konstrukt nukleinske kiseline koji sadrži humani Jκ genski segment nasuprot ushodnom 12-mernoj spejsovanoj RSS. U specifičnom aspektu, konstrukt nukleinske kiseline sadrži prvu homologu ruku koja sadrži homologiju sa humanom genomskom sekvencom DHgena koja je nasuprot ushodnoj i nishodnoj 23-mernoj spejsovanoj RSS. U jednom aspektu, konstrukt nukleinske kiseline sadrži drugu homologu ruku koja sadrži homologiju sa humanom genomskom sekvencom J gena ili koja sadrži homologiju sa mišjom sekvencom konstantnog regiona teškog lanca ili koja sadrži homologiju sa J-C inetergenskom sekvencom ushodno od mišje sekvence konstantnog regiona teškog lanca.
[0275] U jednom aspektu, opisan je konstrukt nukleinske kiseline koji sadrži humani Vλ segment nasuprot nishodnoj 23-mernoj spejsovanoj RSS, humani DHsegment nasuprot ushodnoj i nishodnoj 12-mernoj spejsovanoj RSS, i humani J segment izabran od Jκ segmenta nasuprot ushodnoj 23-mernoj spejsovanoj RSS, humani Jλ segment nasuprot ushodnoj 23-mernoj spejsovanoj RSS, i humani JHsegment nasuprot ushodnoj 23- mernoj spejsovanoj RSS. U jednom aspektu, konstrukt sadrži homologu ruku koja sadrži homologiju sa mišjom sekvencom konstantnog regiona, J-C intergensku mišju sekvencu, i/ili humanu Vλ sekvencu.
[0276] U jednom aspektu, konstrukt nukleinske kiseline sadrži sekvencu humanog λ varijabilnog regiona lakog lanca koji sadrži fragment klastera A humanog lokusa λ lakog lanca. U specifičnom aspektu, fragment klastera A humanog lokusa λ lakog lanca se prostire od hVλ3-27 do hVλ3-1.
[0277] U jednom aspektu, konstrukt nukleinske kiseline sadrži sekvencu humanog λ varijabilnog regiona lakog lanca koja sadrži fragment klastera B humanog lokusa λ lakog lanca. U specifičnom aspektu, fragment klastera B humanog lokusa λ lakog lanca prostire se od hVλ5-52 do hVλ1-40.
[0278] U jednom aspektu, konstrukt nukleinske kiseline sadrži sekvencu humanog λ varijabilnog regiona lakog lanca koja sadrži genomski fragment klastera A i genomski fragment klastera B. U jednom aspektu, sekvenca humanog λ varijabilnog regiona lakog lanca sadrži najmanje jedan genski segment klastera A i najmanje jedan genski segment klastera B.
[0279] U jednom aspektu, sekvenca humanog varijabilnog regiona λ lakog lanca sadrži najmanje jedan genski segment klastera B i najmanje jedan genski segment klastera C.
[0280] U jednom aspektu, opisan je konstrukt nukleinske kiseline, koji sadrži humani DHsegment nasuprot ushodnoj i nishodnoj 23-mernoj spejsovanoj RSS koja se noramlno nalazi u prirodi da flankira ili Jκ, JH, Vλ, ili VHsegment. U jednom aspektu, konstrukt nukleinske kiseline sadrži prvu homologu ruku homologu humanom V-J intergenskom regionu ili homologu humanoj genomskoj sekvenci koja sadrži humani V genski segment. U jednom aspektu, konstrukt nukleinske kiseline sadrži drugu homologu ruku koja je homologa humanoj ili mišjoj sekvenci konstantnog regiona teškog lanca. U specifičnom aspektu, humana ili mišja sekvenca konstantnog regiona teškog lanca je izabrana od CH1, zgloba, CH2, CH3, i njihove kombinacije. U jednom aspektu, konstrukt nukleinske kiseline sadrži humani J genski segment flankiran ushodno sa 12-mernom RSS. U jednom aspektu, konstrukt nukleinske kiseline sadrži drugu homologu ruku koja sadrži hmologiju sa J genskim segmentom flankiranim ushodno sa 12-mernom RSS. U jednom aspektu, J genski segment je izabran od humanog Jκ, humanog Jλ, i humanog JH.
[0281] U jednom aspektu, opisan je konstrukt nukleinske kiseline koji sadrži humani DHsegment nasuprot ushodnoj i nishodnoj 23-mernoj spejsovanoj RSS, i sekvencu mesta specifičnog za prepoznavanje sa rekombinazom, npr., sekvencu koju prepoznaje rekombinaza specifična za mesto kao što je Cre, Flp, ili Dre protein.
[0282] U jednom aspektu, opisan je konstrukt nukleinske kiseline koji sadrži humani Vλ ili humani Vκ segment, DHsegment nasuprot ushodnoj i nishodnoj 12-mernoj ili 23-mernoj spejsovanoj RSS, i humani J segment sa 12-mernom ili 23-mernom spejsovanom RSS, naznačeno time da 12-merna ili 23-merna spejsovana RSS je postavljena neposredno 5’ od humanog J segmenta (tj., u odnosu na smer transkripcije). U jednom aspektu, konstrukt sadrži humani Vλ nasuprot 3’ 23-mernoj spejsovanoj RSS, humani DHsegment nasuprot ushodnoj i nishodnoj 12-mernoj spejsovanoj RSS, i humani Jκ segment nasuprot 5’ 23-mernoj spejsovanoj RSS. U jednom aspektu, konstrukt sadrži humani Vκ nasuprot 3’ 12-mernoj spejsovanoj RSS, humani DHsegment nasuprot ushodnoj i nishodnoj 23-mernoj spejsovanoj RSS, i humani Jλ segment nasuprot 5’ 12-mernoj spejsovanoj RSS.
[0283] U jednom aspektu, opisan je targeting vektor, koji sadrži (a) prvu targeting ruku i drugu targeting ruku, naznačeno time da prva i druga targeting ruke su nezavisno izabrane od humanih i mišjih targeting ruku, naznačeno time da targeting ruke usmeravaju vektor do endogenog ili modifikovanog genskog lokusa imunoglobulinskog V regiona; i, (b) neprekidnu sekvencu humanih VLgenskih segmenata ili neprekidnu sekvencu humanih VLgenskih segmenata i najmanje jedan humani Jκ genski segment, naznačeno time da neprekidna sekvenca je izabrana iz grupe koja se sastoji od (i) hVκ4-1 do hVκ1-6 i Jκ1, (ii) hVκ4-1 do hVκ1-6 i Jκ1 do Jκ2, (iii) hVκ4-1 do hVκ1-6 i Jκ1 do Jκ3, (iv) hVκ4-1 do hVκ1-6 i Jκ1 do Jκ4, (v) hVκ4-1 do hVκ1-6 i Jκ1 do Jκ5, (vi) hVκ3-7 do hVκ1-16, (vii) hVκ1-17 do hVκ2-30, (viii) hVκ3-31 do hVκ2-40, i (ix) njihovu kombinaciju.
[0284] U jednom aspektu, targeting ruke koje usmeravaju vektor do endogenog ili modifikovanog imunoglobulinskog lokusa su identične ili suštinski identične sekvenci na endogenom ili modifikovanom imunoglobulinskom lokusu.
[0285] U jednom aspektu, opisan je postupak za stvaranje genetički modifikovanog miša, koji sadrži zamenu jednog ili više genskih segmenata imunoglobulinskog teškog lanca ushodno (u odnosu na transkripciju genskih segmenata imunoglobulinskog teškog lanca) od endogenog ADAM6 lokusa miša sa jednim ili više humanih genskih segmenata imunoglobulinskog lakog lanca i/ili teškog lanca, i zamenu jednog ili više imunoglobulinskih genskih segmenata nishodno (u odnosu na transkripciju genskih segmenata imunoglobulinskog teškog lanca) od ADAM6 lokusa miša sa jednim ili više humanih genskih segmenata imunoglobulinskog teškog lanca ili lakog lanca. U jednom aspektu, jedan ili više humanih imunoglobulin genskih segmenata koji zamenjuju jedan ili više endogeni imunoglobulinski genski segment ushodno od endogenog ADAM6 lokusa miša uključuju V genske segmente. U jednom aspektu, humani imunoglobulinski genski segmenati koji zamenjuju jedan ili više endogenih imunoglobulinskih genskih segmenata ushodno od endogenog ADAM6 lokusa miša uključuju V i D genske segmente. U jednom aspektu, jedan ili više humanih imunoglobulinskih genskih segmenata koji zamenjuju jedan ili više endogenih imunoglobulinskih genskih segmenata nishodno od endogenog ADAM6 lokusa miša uključuju J genske segmente. U jednom aspektu, jedan ili više humanih imunoglobulin genskih segmenata koji zamenjuju jedan ili više endogenih imunoglobulinskih genskih segmenata nishodno od endogenog ADAM6 lokusa miša uključuju D i J genske segmente. U jednom aspektu, jedan ili više humanih imunoglobulinskih genskih segmenata koji zamenjuju jedan ili više endogenih imunoglobulinskih genskih segmenata nishodno od endogenog ADAM6 lokusa miša uključuju V, D i J genske segmente.
[0286] U jednom aspektu, opisan je postupak za stvaranje genetički modifikovanog miša, koji sadrži zamenu jednog ili više genskih segmenata imunoglobulinskog teškog lanca ushodno (u odnosu na transkripciju genskih segmenata imunoglobulinskog teškog lanca) od endogenog ADAM6 lokusa miša sa jednim ili više genskih segmenata humanog imunoglobulinskog lakog lanca, i zamenu jednog ili više imunoglobulinskih genskih segmenata nishodno (u odnosu na transkripciju genskih segmenata imunoglobulinskog teškog lanca) od ADAM6 lokusa miša sa jednim ili više segmenata humanog imunoglobulinskog lakog lanca. U jednom aspektu, jedan ili više humanih imunoglobulinskih genskih segmenata koji zamenjuju jedan ili više endogenih imunoglobulinskih genskih segmenata ushodno od endogenog ADAM6 lokusa miša uključuju V genske segmene. U jednom aspektu, humani imunoglobulinski genski segmenti koji zamenjuju jedan ili više endogenih imunoglobulinskih genskih segmenata ushodno od endogenog ADAM6 lokusa miša uključuju V i J genske segmente. U jednom aspektu, jedan ili više humanih imunoglobulinskih genskih segmenata koji zamenjuju jedan ili više endogenih imunoglobulinskih genskih segmenata nishodno od endogenog ADAM6 lokusa miša uključuju J genske segmente. U jednom aspektu, jedan ili više humanih imunoglobulinskih genskih segmenata koji zamenjuju jedan ili više endogenih imunoglobulinskih genskih segmenata nishodno od endogenog ADAM6 lokusa miša uključuju V i J genske segmente. U jednom aspektu, jedan ili više humanih imunoglobulinskih genskih segmenata koji zamenjuju jedan ili više endogenih imunoglobulinskih genskih segmenata nishodno od endogenog ADAM6 lokusa miša uključuju V genske segmente.
[0287] U specifičnom aspektu, V genski segmenti su VLgenski segmenti. U sledećem specifičnom aspektu, J genski segmenti su JLgenski segmenti.
[0288] U jednom aspektu, jedan ili više genskih segmenata imunoglobulinskog teškog lanca ushodno i/ili nishodno od ADAM6 gena su zamenjeni u pluripotentnoj, indukovanoj pluripotentnoj, ili totipotentnoj ćeliji da formiraju genetički modifikovane progenitor ćelije; genetički modifikovana progenitor ćelija je introdukovana u domaćina; i, domaćin koji sadrži genetički modifikovanu progenitor ćeliju je u gestaciji da bi formirao miša koji sadrži genom izveden iz genetički modifikovane progenitor ćelije. U jednom aspektu, domaćin je embrion. U specifičnom aspektu, domaćin je izabran od mišje pre-morule (npr., 8- ili 4-ćelijskog stadijuma), tetraploidnog embriona, agregata embrionalnih ćelija, ili blastocista.
[0289] U jednom aspektu, opisan je postupak za stvaranje genetički modifikovanog miša, koji sadrži zamenu mišje nukleotidne sekvence koja sadrži mišji imunoglobulinski genski segment i mišju ADAM6 (ili ortolog ili homolog ili njegov funkcionalni fragment funkcionalan u mužjaku miša) nukleotidnu sekvencu sa sekvencom koja sadrži humani imunoglobulinski genski segment da bi se formirao prvi himerni lokus, zatim inserciju sekvence koja sadrži mišji ADAM6- koji kodira sekvencu (ili sekvencu koja kodira njen ortolog ili homolog ili funkcionalni fragment) u sekvencu koja sadrži humani imunoglobulinski genski segment da bi se formirao drugi himerni lokus.
[0290] U jednom aspektu, drugi himerni lokus sadrži humani imunoglobulinski varijabilni genski segment teškog lanca (VH). U jednom aspektu, drugi himerni lokus sadrži humani imunoglobulinski varijabilni genski segment lakog lanca (VL). U specifičnom aspektu, drugi himerni lokus sadrži humanih VHgenski segment ili humani VLgenski segment operativno vezan za humani DHgenski segment i humani JHgenski segment. U specifičnom aspektu, drugi himerni lokus sadrži humani VLgenski segment operativno vezan za humanih JHili humani JLgenski segment. U dodatnom specifičnom aspektu, drugi himerni lokus je operativno vezanu za treći himerni lokus koji sadrži humanu CH1 sekvencu, ili humanu CH1 i humanu zglobnu sekvencu, fuzionisanu sa mišjom CH2 CH3 sekvencom.
[0291] U jednom aspektu, opisan je postupak za modifikaciju mišjeg lokusa imunoglobulinskog teškog lanca, koji sadrži: (a) stvaranje prve modifikacije mišjeg lokusa imunoglobulinskog teškog lanca koja rezultuje u redukciji ili eliminaciji endogene aktivnosti mišjeg ADAM6 u mužjaku miša; i, (b) stvaranje druge modifikacije da bi se dodala sekvenca nukleinske kiseline koja mišu daje ADAM6 aktivnost koja je funkcionalna u mužjaku miša.
[0292] U jednom aspektu, prva modifikacija sadrži adiciju humane imunoglobulinske sekvence ili zamenu mišje imunoglobulinske sekvence sa humanom imunoglobulinskom sekvencom.
[0293] U jednom aspektu, humana imunoglobulinska sekvenca je sekvenca teškog lanca. U jednom aspektu, humana imunoglobulinska sekvenca je sekvenca teškog lanca.
[0294] U jednom aspektu, prva i druga modifikacija su napravljene u jednoj ES ćeliji, i jedna ES ćelija je introdukovana u embrion domaćin da bi se stvorio miš.
[0295] U jednom aspektu, opisano je potomstvo iz parenja miša kao što je opisano ovde sa drugim mišem koji je miš divljeg tipa ili genetički modifikovan.
[0296] U jednom aspektu, opisana je upotreba miša koji sadrži ektopičnu nukleotidnu sekvencu koja sadrži mišji ADAM6 lokus ili sekvencu da se stvori fertilni mužjak miša, naznačeno time da upotreba sadrži parenje miša koji sadrži ektopičnu nukleotidnu sekvencu koja sadrži mišji ADAM6 lokus ili sekvencu sa mišem kome nedostaje funkcionalni endogeni ADAM6 lokus ili sekvenca, i dobijanje potomstva koje je ženka sposobna da stvori potomstvo sa ektopičnim ADAM6 lokusom ili sekvencom ili koje je mužjak koji sadrži ektopični ADAM6 lokus ili sekvencu, i mužjak pokazuje fertilitet koji je približno isti kao fertilitet koij pokazuje mužjak miša divljeg tipa.
[0297] U jednom aspektu, opisana je upotreba miša kao što je ovde opisano za introdukciju ektopične ADAM6 sekvence u miša kome nedostaje funkcionalna endogena ADAM6 sekvenca, naznačeno time da upotreba sadrži parenje miša kao što je opisano ovde sa mišem kome nedostaje funkcionalna endogena ADAM6 sekvenca.
[0298] U jednom aspektu, opisana je upotreba genetičkog materijala od miša kao što je opisano ovde za stvaranje miša koji ima ektopičnu ADAM6 sekvencu. U jednom aspektu, upotreba sadrži transfer jedra korišćenjem jedra ćelije miša kao što je ovde opisano. U jednom aspektu, upotreba sadrži kloniranje ćelije miša kao što je ovde opisano za stvaranje životinje izvedene iz ćelije. U jednom aspektu, upotreba sadrži upotrebu sperme ili jajeta miša kao što je opisano ovde u procesu za stvaranje miša koji sadrži ektopičnu ADAM6 sekvencu.
[0299] U jednom aspektu, opisan je postupak za stvaranje fertilnog mužjaka miša koji sadrži modifikovani lokus imunoglobulinskog teškog lanca, koji sadrži fertilizaciju germinativne ćelije prvog miša koja sadrži modifikaciju endogenog lokusa teškog lanca imunoglobulina sa germinativnom ćelijom drugog miša koja sadrži ADAM6 gen ili ortolog ili homolog ili njegov funkcionalni fragment koji je funkcionalan u mužjaku miša; formiranje oplođene ćelije; omogućavanje oplođenoj ćeliji da se razvije u embrion; i, gestaciju embriona u surogatu da bi se dobio miš.
[0300] U jednom aspektu, fertilizacija je postignuta parenjem mužjaka miša i ženke miša. U jednom aspektu, ženka miša sadrži ADAM6 gen ili ortolog ili homolog ili njegov funkcionalni fragment. U jednom aspektu, mužjak miša sadrži ADAM6 gen ili ortolog ili homolog ili njegov funkcionalni fragment.
[0301] U jednom aspektu, opisana je upotreba sekvence nukleinske kiseline koja kodira mišji ADAM6 protein ili njegov ortolog ili homolog ili funkcionalni fragment odgovarajućeg ADAM6 proteina za obnavljanje ili poboljšanje fertiliteta miša koji ima genom koji sadrži modifikaciju lokusa imunoglobulinskog teškog lanca, naznačeno time da modifikacija smanjuje ili eliminiše funkciju endogenog ADAM6.
[0302] U jednom aspektu, sekvenca nukleinske kiseline je integrisana u genom miša na ektopičnom položaju. U jednom aspektu, sekvenca nukleinske kiseline je integrisana u genom miša na endogeni imunoglobulinski lokus. U specifičnom aspektu, endogeni imunoglobulinski lokus je lokus teškog lanca. U jednom aspektu, sekvenca nukleinske kiseline je integrisana u genom miša na položaju različitom od endogenog imunoglobulinskog lokusa.
[0303] U jednom aspektu, opisan je postupak za stvaranje genetički modifikovanog miša, koji sadrži zamenu na endogenom lokusu teškog lanca jednog ili više genskih segmenata imunoglobulinskog teškog lanca miša sa jednim ili više genskih segmenata humanog imunoglobulinskog lakog lanca. U jednom aspektu, zamena je svih ili suštinski svih funkcionalnih mišjih segmenata mišjeg imunoglobulinskog teškog lanca (tj., VH, DH, i JHsegmenti) sa jednim ili više humanih funkcionalnih segmenata lakog lanca (tj., VLi JLsegmenti). U jednom aspektu, zamena je svih ili suštinski svih funkcionalnih mišjih VH, DH, i JHsegmenata teškog lanca sa svim ili suštinski svim humanim Vλ ili Vκ segmentima i najmanje jednnim Jλ ili Jκ segmentom. U specifičnom aspektu, zamena uključuje sve ili suštinski sve funkcionalne humane Jλ ili Jκ segmente.
[0304] U jednom aspektu, opisan je postupak za stvaranje miša koji eksprimira polipeptid koji sadrži sekvencu izvedenu iz humanog imunoglobulinskog Vλ ili Vκ i/ili Jλ ili Jκ segmenta fuzionisanog sa mišjim konstantnim regionom teškog lanca, koji sadrži zamenu endogenih varijabilnih segmenata teškog lanca imunoglobulina (VH, DH, i JH) sa najmanje jednim humanim Vλ ili Vκ segmentom i najmanje jednim humanim Jλ ili Jκ segmentom, naznačeno time da zamena je u pluripotentnoj, indukovanoj pluripotentnoj, ili totipotentnoj mišjoj ćeliji da bi se stvorio genetički modifikovana progenitor ćelija miša; genetički modifikovana progenitor ćelija miša je introdukovana u miša domaćina; i, miš domaćin koji sadrži genetički modifikovanu progenitor ćeliju gestacijom formira miša koji sadrži genom izveden iz genetički modifikovane progenitor ćelije miša. U jednom aspektu, domaćin je embrion. U specifičnom aspektu, domaćin je izabran od mišje pre-morule (npr., 8- ili 4-ćelijski stadijum), tetraploidnog embriona, agregata embrionalnih ćelija, ili blastocista.
[0305] U jednom aspektu, opisan je postupak za stvaranje genetički modifikovanog miša kao što je ovde opisano, koji sadrži introdukciju preko transfera jedra nukleinske kiseline koja sadrži modifikaciju kao što je ovde opisano u ćeliju, i održavanje ćelije pod odgovarajućim uslovima (npr., uključujući kultivaciju ćelije i gestaciju embriona koji sadrži ćeliju u surogat majci) da be se razvila u miša kao što je ovde opisano.
[0306] U jednom aspektu, opisan je postupak za stvaranje modifikovanog miša, koji sadrži modifikovanje kao što je ovde opisano mišje ES ćelije ili pluripotentne ili totipotentne ili indukovane pluripotentne mišje ćelije da uključuje jedan ili više nerearanžiranih varijabilnih genskih segmenata imunoglobulinskog lakog lanca operativno vezanog za konstantnu sekvencu imunoglobulinskog teškog lanca, kultivisanje ES ćelije, introdukciju kultivisane ES ćelije u embrionu domaćinu da bi se formirao himerni embrion, i introdukciju himernog embriona u pogodnog miša domaćina da bi se razvila u modifikovanog miša. U jednom aspektu, jedan ili više nerearanžiranih genskih segmenata imunoglobulinskog varijabilnog regiona lakog lanca su humani λ ili humani κ genski segment. U jednom aspektu, jedan ili više nerearanžiranih genskih segmenata imunoglobulinskog varijabilnog regiona lakog lanca sadrže humane Yλ ili humane Vκ segmente i jedan ili više Jλ, Jκ, ili JHsegmenata. U jednom aspektu, sekvenca gena konstantnog teškog lanca je humana sekvenca izabrana od CH1, zgloba, CH2, CH3, i njihove kombinacije. U jednom aspektu, jedan ili više nerearanžiranih genskih segmenata imunoglobulinskog varijabilnog regiona lakog lanca zamenjuju sve ili suštinski svi funkcionalne genske segmente endogenog varijabilnog regiona teškog lanca na
1
endogenom lokusu teškog lanca, i konstantna sekvenca teškog lanca je mišja sekvenca koja sadrži CH1, zglob, CH2, i CH3.
[0307] U jednom aspektu, opisani su konstrukti nukleinske kiseline, ćelije, embrioni, miševi, i postupci za stvaranje proteina koji sadrže jednu ili više imunoglobulinskih sekvenci varijabilnog regiona κ i/ili λ lakog lanca i sekvencu imunoglobulinskog konstantnog regiona teškog lanca, uključujući proteine koji sadrže varijabilni domen humanog λ ili κ lakog lanca i humanu ili mišju sekvencu konstantnog regiona teškog lanca.
[0308] U jednom aspektu, nukleotidna opisana je sekvenca koja kodira imunoglobulinski varijabilni region stvoren u mišu kao što je ovde opisano.
[0309] U jednom aspektu, opisana je aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca ili lakog lanca antitela stvorenog u mišu kao što je ovde opisano.
[0310] U jednom aspektu, opisana je nukleotidna sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca ili lakog lanca koja kodira varijabilni region antitela stvorenog u mišu kao što je ovde opisano.
[0311] U jednom aspektu, opisano je antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (npr., Fab, F(ab)2, scFv) stvoren u mišu kao što je ovde opisano.
[0312] U jednom aspektu, opisani su vezujući proteini koji sadrže imunoglobulinske varijabilne domene koji su izvedeni iz lakog lanca (tj., kapa (κ) i/ili lambda (λ)) imunoglobulinski varijabilni domeni, ali ne od imunoglobulinskih varijabilnih domena pune dužine teškog lanca. Takođe su opisani postupci i kompozicije za stvaranje vezujućih proteina, uključujući genetički modifikovane miševe.
[0313] U jednom aspektu, opisan je postupak za stvaranje antigen-vezujućeg proteina koji ne sadrži imunoglobulinski varijabilni domen teškog lanca, koji sadrži korak imunizacije miša kao što je ovde opisano sa antigenom od interesa, i održavanjem miša pod uslovima koji mu omogućuju da stvori antigen-vezujući protein koji specifičnovezuje antigen od interesa.
[0314] U jednom aspektu, opisan je postupak za stvaranje antigen-vezujućeg proteina koji sadrži prvi imunoglobulinski varijabilni domen lakog lanca koji je susedan sekvenci konstantnog regiona teških lanaca, i drugi imunoglobulinski varijabilni domen lakog lanca koji je susedan sekvenci konstantnog lakog lanca, koji sadrži korak imunizacije miša kao što je ovde opisano sa antigenom od interesa, i održavanjem miša pod uslovima koji mu omogućavaju stvaranje antigen-vezujućeg proteina koji specifičnovezuje antigen od interesa.
[0315] U jednom aspektu, opisan je postupak za stvaranje antigen-vezujući protein koji sadrži imunoglobulinski varijabilni region lakog lanca koji je susedan sekvenci konstantnog regiona teških lanaca, naznačeno time da antigen-vezujući protein nema imunoglobulinski laki lanac koji sadrži korak imunizacije miša kao što je ovde opisano koji sadrži nokaut endogenog κ i λ
2
lokusa (ili koji sadrži nefunkcionalni endogeni κ i/ili λ lokus) sa antigenom od interesa, i održavanje miša pod uslovima koji mu omogućavaju da stvori antigen-vezujući protein koji specifično vezuje antigen od interesa.
[0316] U jednom aspektu, opisana je upotreba miša kao što je ovde opisano za stvaranje nukleotidne sekvence imunoglobulinskog variajbilnog regiona. U jednom aspektu, nukleotidna sekvenca varijabilnog regiona sadrži rearanžirane VL, DHi JLgenske segmente. U jednom aspektu, nukleotidna sekvenca varijabilnog regiona sadrži rearanžirane VL, DHi JHgenske segmente. U jednom aspektu, nukleotidna sekvenca varijabilnog regiona sadrži rearanžirane Vκ i Jκ genske segmente. U jednom aspektu, nukleotidna sekvenca varijabilnog regiona sadrži rearanžirane Vλ i Jλ genske segmente.
[0317] U jednom aspektu, opisana je upotreba miša kao što je ovde opisano za stvaranje potpuno humanih Fab ili potpuno humanih F(ab)2. U jednom aspektu, potpuno humani Fab ili potpuno humani F(ab)2 sadrži rearanžirane VL, DHi JLgenske segmente. U jednom aspektu, potpuno humani Fab ili potpuno humani F(ab)2 sadrže rearanžirane VL, DHi JHgenske segmente. U jednom aspektu, potpuno humani Fab ili potpuno humani F(ab)2 sadrže rearanžirane Vκ i Jκ genske segmente. U jednom aspektu, potpuno humani Fab ili potpuno humani F(ab)2 sadrže rearanžirane Vλ i Jλ genske segmente.
[0318] U jednom aspektu, opisana je upotreba miša kao što je ovde opisano za stvaranje potpuno humanih Fab (koji sadrže prvi humani VLfuzionisan sa humanim konstantnim regionom lakog lanca, i drugi humani VLfuzionisan sa sekvencom humanog konstantnog regiona teškog lanca) ili potpuno humani F(ab)2.
[0319] U jednom aspektu, opisana je upotreba miša kao što je ovde opisano za stvaranje imortalizovane ćelijske linije. U jednom aspektu, imortalizovan ćelijska linija sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira humani Vλ ili Vκ domen operativno vezan sekvencu nukleinske kiseline koja sadrži mišju sekvencu nukleinske kiseline konstantnog regiona. U jednom aspektu, imortalizovana ćelijska linija eksprimira antitelo koje sadrži humani varijabilni domen. U specifičnom aspektu, humani varijabilni domen je varijabilni domen lakog lanca.
[0320] U jednom aspektu, opisana je upotreba miša kao što je ovde opisano da bi se storio hibridom ili kvadrom. U jednom aspektu, hibridom ili kvadrom eksprimira polipeptid koji sadrži humani varijabilni domen koji vezuje antigen od interesa.
[0321] U jednom aspektu, opisana je upotreba miša kao što je ovde opisano da bi se stvorila biblioteka faga koja sadrži humane varijabilne regione lakog lanca. U jednom aspektu, varijabilni regioni lakog lanca su humani Vκ regioni.
[0322] U jednom aspektu, opisana je uportreba miša kao što je ovde opisano da bi se stvorila sekvenca varijabilnog regiona za stvaranje humanog antigen-vezujućeg proteina, koja sadrži (a) imunizaciju miša kao što je ovde opisano sa antigenom od interesa, (b) izolaciju limfocita iz imunizovanog miša (a), (c) izlaganje limfocita jednom ili više obeleženih antitela, (d) identifikaciju limfocita koji je sposoban da se veže za antigen od interesa, i (e) umnožavanje jedne ili više sekvence humanog varijabilnog regiona lakog lanca iz limfocita gime se stvara sekvenca varijabilnog regiona.
[0323] U jednom aspektu, limfocit je izveden iz slezine miša. U jednom aspektu, limfocit je izveden iz limfnog čvora miša. U jednom aspektu, limfocit je izveden iz kostne srži miša.
[0324] U jednom aspektu, obeleženo antitelo je fluorofor-konjugovano antitelo. U jednom aspektu, jedan ili više fluorofor-konjugovanih antitela je izabrano od od IgM, IgG, i/ili njihove kombinacije.
[0325] U jednom aspektu, limfocit je B ćelija.
[0326] U jednom aspektu, jedna ili više sekvenci nukleinske kiseline varijabilnog regiona sadrži sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca. U specifičnom aspektu, sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca je imunoglobulinska sekvenca varijabilnog regiona κ lakog lanca. U jednom aspektu, jedna ili više sekvenci nukleinske kiseline varijabilnog regiona je sekvenca varijabilnog regiona λ lakog lanca.
[0327] U jednom aspektu, opisana je upotreba miša kao što je ovde opisano za stvaranje jedne ili više sekvenci varijabilnog regiona κ lakog lanca za stvaranje humanog antigen-vezujućeg proteina, koja sadrži (a) imunizaciju miša kao što je ovde opisano sa antigenom od interesa, (b) izolaciju slezine imunizovanog miša miš iz (a), (c) izlaganje B limfocita slezine jednom ili više obeleženih antitela, (d) identifikaciju B limfocita iz (c) koji je sposoban da se vezuje sa antigenom od interesa, i (e) umnožavanje sekvence nukleinske kiseline varijabilnog regiona κ lakog lanca iz B limfocita čime se stvara sekvenca varijabilnog regiona κ lakog lanca.
[0328] U jednom aspektu, opisana je upotreba miša kao što je ovde opisano za stvaranje sekvence varijabilnog regiona κ lakog lanca za stvaranje humanog antigen-vezujućeg proteina, koja sadrži (a) imunizaciju miša kao što je ovde opisano sa antigenom od interesa, (b) izolaciju jednog ili više limfnih čvorova imunizovanog miša iz (a), (c) izlaganje B limfocita iz jednog ili više limfnih čvorova jednom ili više obeleženih antitela, (d) identifikaciju B limfocita iz (c) koji je sposoban da se vezuje za antigen od interesa, i (e) umnožavanje sekvence nukleinske kiseline varijabilnog regiona κ lakog lanca iz B limfocita čime se stvara sekvenca varijabilnog regiona κ lakog lanca.
[0329] U jednom aspektu, opisana je upotreba miša kao što je ovde opisano za stvaranje sekvence varijabilnog regiona κ lakog lanca za stvaranje humanog antigen-vezujućeg proteina, koja sadrži (a) imunizaciju miša kao što je ovde opisano sa antigenom od interesa,
4
(b) izolovanje kostne srži imunizovanog miša iz (a), (c) izlaganje B limfocita iz kostne srži jednom ili više obeleženih antitela, (d) identifikaciju B limfocita iz (c) koji je sposoban da se vezuje za antigen od interesa, i (e) umnožavanje sekvence nukleinske kiseline varijabilnog regiona κ lakog lanca iz B limfocita čime se stvara sekvenca varijabilnog regiona κ lakog lanca. U različitim aspektima, jedno ili više obeleženih antitela je izabrano od IgM, IgG, i/ili njihove kombinacije.
[0330] U različitim aspektima, opisana je upotreba miša kao što je ovde opisano za stvaranje sekvence varijabilnog regiona κ lakog lanca za stvaranje humanog antigen-vezujućeg proteina, koja dodatno sadrži fuzionisanje amplifikovanje sekvence varijabilnog regiona κ lakog lanca sa sekvencom humanog teškog ili konstantnim regionom lakog lanca ili izborno sekvence humanog varijabilnog regiona teškog lanca, eksprimiranje fuzionisane sekvence u ćeliji, i rekuperaciju eksprimirane sekvence čime se stvara humani antigen-vezujući protein.
[0331] U različitim aspektima, humani konstantni regioni teških lanaca su izabrani od IgM, IgD, IgA, IgE i IgG. U različitim specifičnim aspektima, IgG je izabran od IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. U različitim aspektima, humani konstantni region teškog lanca sadrži CH1, zglob, CH2, CH3, CH4, ili njihovu kombinaciju. U različitim aspektima, konstantni region lakog lanca je imunoglobulinski κ konstantni region. U različitim aspektima, ćelija je izabrana od HeLa ćelije, DU145 ćelije, Lncap ćelije, MCF-7 ćelije, MDA-MB-438 ćelije, PC3 ćelije, T47D ćelije, THP-1 ćelije, U87 ćelije, SHSY5Y (humani neuroblastom) ćelije, Saos-2 ćelije, Vero ćelije, CHO ćelije, GH3 ćelije, PC12 ćelije, humane retinalne ćelije (npr., PER.C6™ ćelije), i MC3T3 ćelije. U specifičnom aspektu, ćelija je CHO ćelija.
[0332] U jednom aspektu, opisan je postupak za stvaranje humanog varijabilnog regiona lakog lanca specifičnog protiv antigena od interesa, koji sadrži korake imunizacije miša kao što je ovde opisano sa antigenom, izolovanje najmanje jedne ćelije iz miša koji proizvodi varijabilni region humanog lakog lanca specifičan protiv antigena, stvarajući najmanje najmanje jednu ćeliju koja proizvodi humani antigen-vezujući protein koji sadrži varijabilni region lakog lanca specifičan prtoiv antigena, i kultivisanje najmanje jedne ćelije koj aproizvodi humanih antigen-vezujući protein, i dobijanje pomenutog humanog antigenvezujućeg proteina. U jednom aspektu, varijabilnog regiona humanog lakog lanca je humani Vκ region.
[0333] U različitim aspektima, najmanje jedna ćelija izolovana iz miša koji stvara humani varijabilni region lakog lanca specifičan protiv antigena je splenocita ili B ćelija.
[0334] U različitim aspektima, antigen-vezujući protein je antitelo.
[0335] U različitim aspektima, imunizacija sa antigenom od interesa je izvedena sa proteinom, DNK, kombinacijom DNK i proteina, ili ćelijom koja eksprimira antigen.
[0336] U jednom aspektu, opisana je upotreba miša kao što je ovde opisano da bi se stvorila sekvenca nukleinske kiseline koja kodira imunoglobulinski varijabilni region ili njegov fragment. U jednom aspektu, sekvenca nukleinske kiseline je upotrebljena za stvaranje humanog antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta. U jednom aspektu, miš je korišćen za stvaranje antigen-vezujućeg proteina izabranog od antitela, multispecifičnog antitela (npr., bispecifično antitelo), scFv, bis-scFv, diatelo, triatelo, tetratelo, V-NAR, VHH, VL, F(ab), F(ab)2, DVD (tj., dvojni varijabilni domen antigen-vezujućeg proteina), SVD (tj., jedan varijabilni domen antigen-vezujućeg proteina), ili bispecifični T-ćelijski engejdžer (BiTE).
[0337] U jednom aspektu, opisana je upotreba miša kao što je ovde opisano za proizvodnju medikamenta (npr., antigen-vezujućeg proteina), ili za proizvodnju sekvence koja kodira varijabilnu sekvencu medikamenta (npr., antigen vezujući protein), za tretman humane bolesti ili poremećaja.
[0338] U jednom aspektu, opisana je upotreba miša kao što je ovde opisano za stvaranje sekvence nukleinske kiseline koja kodira prvu humanu imunoglobulinsku varijabilnu sekvencu lakog lanca (VL1) koja je srodna sa drugom imunoglobulinskom varijabilnom sekvencom humanog lakog lanca (VL2), naznačeno time da VL1 fuzionisan sa humanim imunoglobulinskim konstantnim regionom lakog lanca (polipeptid 1) eksprimira se sa VL2 fuzionisanim sa humanim imunoglobulinskim konstantnim regionom teškog lanca (polipeptid 2), kao dimer polipeptid1/polipeptid 2, da bi se formiralo VL1-VL2 antitelo.
[0339] U jednom aspektu, opisana je upotreba miša kao što je ovde opisano za stvaranje sekvence nukleinske kiseline koja kodira varijabilnu sekvencu humanog imunoglobulinskog lakog lanca koja je fuzionisana sa sa sekvencom humanog imunoglobulinskog teškog lanca, naznačeno time da sekvenca nukleinske kiseline kodira humani VL-CHpolipeptid, naznačeno time da se humani VL-CHpolipeptid eksprimira kao dimer, i naznačeno time da se dimer eksprimira u odsustvu imunoglobulinskog lakog lanca (npr., u odsustvu humanog λ ili humanog κ lakog lanca). U jednom aspektu, VL-CHdimer specifično vezuje antigen od interesa u odsustvu λ lakog lanca i u odsustvu κ lakog lanca.
[0340] U jednom aspektu, opisana je upotreba miša kao što je ovde opisano za stvaranje sekvence nukleinske kiseline koja kodira ceo ili deo imunoglobulinskog varijabilnog domena. U jednom aspektu, imunoglobulinski varijabilni domen je humani Vλ ili humani Vκ domen.
[0341] U jednom aspektu, opisana je upotreba konstrukta nukleinske kiseline kao što je ovde opisano za proizvodnju miša, ćelije, ili terapeutskog proteina (npr., antitela ili drugog antigenvezujućeg proteina).
[0342] U jednom aspektu, upotreba sekvence nukleinske kiseline miša kao što je ovde opisano za stvaranje ćelijske linije za proizvodnju humanog terapeutika. U jednom aspektu, humani terapeutik je vezujući protein koji sadrži varijabilnu sekvencu humanog lakog lanca (npr., izvedenu iz humanog Vλ ili humanog Vκ segmenta) fuzionisanu sa humanomkonstantnom sekvencom teškog lanca. U jednom aspektu, humani terapeutik sadrži prvi polipeptid koji je humani λ ili κ imunoglobulinski laki lanac, i drugi polipeptid koji sadrži humanu Vλ ili humanu Vκ varijabilnu sekvencu fuzionisanu sa konstantnom sekvencom humanog teškog lanca.
[0343] U jednom aspektu, opisan je ekspresioni sistem, koji sadrži ćeliju sisara transficiranu sa DNK konstruktom koji kodira polipeptid koji sadrži somatski mutirani humani VLdomen fuzionisan sa humanim CHdomenom.
[0344] U jednom aspektu, ekspresioni sistem dodatno sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira imunoglobulinski VLdomen fuzionisan sa humanim CLdomenom, naznačeno time da VLdomen fuzionisan sa humanim CLdomenom je srodan lakom lancu sa VLdomenom fuzionisanim sa humanim CHdomenom.
[0345] U jednom aspektu, ćelija sisara je izabrana od CHO ćelije, COS ćelije, Vero ćelije, 293 ćelije, i retinalne ćelije koja eksprimira virusni gen (npr., PER.C6™ ćelija).
[0346] U jednom aspektu, opisan je postupak za stvaranje vezujućeg proteina, koji sadrži dobijanje nukleotidne sekvence koja kodira VLdomen od gena koji kodira VLregion fuzionisanog sa CHregionom iz ćelije miša kao što je ovde opisano, i kloniranje nukleotidne sekvence koja kodira sekvencu VLregiona u okviru sa genom koja kodira humani CHregion da bi se formirala sekvenca humanog vezujućeg proteina, eksprimirajući sekvencu humanog vezujućeg proteina u pogodnoj ćeliji.
[0347] U jednom aspektu, miš je imunizovan sa antigenom od interesa, i VLregion fuzionisan sa CHregionom specifično vezuje (npr., sa KD u mikromolarnom, nanomolarnom, ili pikomolarnom opsegu) epitop antigena od interesa. U jednom aspektu, nukleotidna sekvenca koja kodira VLregion fuzionisana sa CHregionom je somatski mutirana u mišu.
[0348] U jednom aspektu, pogodna ćelija je izabrana od B ćelije, hibridoma, kvadroma, CHO ćelije, COS ćelije, 293 ćelije, HeLa ćelije, i humane retinalne ćelije koja eksprimira virusnu sekvencu nukleinske kiseline (npr., PERC.6™ ćelija).
[0349] U jednom aspektu, CHregion sadrži humani IgG izotip. U specifičnom aspektu, humani IgG je izabran od IgG1, IgG2, i IgG4. U sledećem specifičnom aspektu, humani IgG je IgG1. U sledećem specifičnom aspektu, humani IgG je IgG4. U sledećem specifičnom aspektu, humani IgG4 je modifikovani IgG4. U jednom aspektu, modifikovani IgG4 sadrži supstituciju u regionu zgloba. U specifičnom aspektu, modifikovani IgG4 sadrži supstituciju na aminokiselinskom ostatku 228 u odnosu na humani IgG4 divljeg tipa, numerisan u skladu sa EU indeksom numerisanja od strane Kabat. U specifičnom aspektu, supstitucija na aminokiselinskom ostatku 228 je S228P supstitucija, numerisana u skladu sa EU indeksom numerisanja od strane Kabat.
[0350] U jednom aspektu, ćelija dodatno sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira VLdomen lakog lanca koji je srodan sa VLdomenom fuzionisanim sa CHregionom, i postupak dodatno sadrži ekspresiju nukleotidne sekvence koja kodira srodni VLdomen fuzionisan sa humanim Cκ ili Cλ domenom.
[0351] U jednom aspektu, opisan je postupak za stvaranje bispecifičnog antigen-vezujućeg proteina, koji sadrži izlaganje prvog miša kao što je ovde opisano prvom antigenu od interesa i identifikaciju sekvence prvog humanog VLdomena koji specifično vezuje prvi antigen od interesa; izlaganje drugog miša kao što je ovde opisano drugom antigenu od interesa i identifikaciju sekvence drugog humanog VLdomena koji specifično vezuje drugi antigen od interesa; naznačeno time da prvi humani VLdomen se ne vezuje za drugi antigen od interesa, i drugi humani VLdomen se ne vezuje za prvi antigen od interesa; i fuzionisanje sekvence prvog humanog VLdomena sa prvom konstantnom sekvencom teškog lanca da bi se formirao prvi antigen-vezujući polipeptid, i fuzionisanje sekvence drugog humanog VLdomena sa drugom konstantnom sekvencom teškog lanca da bi se formirao drugi antigen-vezujući polipeptid; i, upotrebu prvog i drugog antigen-vezujućih polipeptida u bispecifičnom vezujućem proteinu.
[0352] U jednom aspektu, antigen-vezujući protein dodatno sadrži prvi imunoglobulinski laki lanac koji sadrži humani κ ili λ varijabilni domen koji je srodan sa prvim humanim VLdomenom, i drugi imunoglobulinski laki lanac koji sadrži humani κ ili λ varijabilni domen koji je srodan sa drugim humanim VLdomenom.
[0353] U jednom aspektu, prva konstantna sekvenca teškog lanca je identična drugoj konstantnoj sekvenci teškog lanca. U jednom aspektu, prva konstantna sekvenca teškog lanca sadrži modifikaciju koja smanjuje ili eliminiše vezivanje prvog konstantnog regiona teškog lanca sa proteinom A, i druga konstantna sekvenca teškog lanca vezuje protein A.
[0354] U jednom aspektu, prvi i drugi humani VLdomeni sadrže sekvencu izvedenu iz humanog Vκ i humanog Jκ genskog segmenta. U jednom aspektu, prvi i drugi humani VLdomeni sadrže sekvencu izvedenu iz humanog Vλ i humanog Jλ genskog segmenta. U jednom aspektu, prvi i drugi humani VLdomeni sadrže sekvencu izvedenu iz humanog DHgenskog segmenta. U jednom aspektu, prvi i drugi humani VLdomeni sadrže sekvencu izvedenu iz humanog JHgenskog segmenta. U specifičnom aspektu, prvi i drugi humani VLdomeni sadrže sekvencu izvedenu iz humanog DHi humanog JHgenskog segmenta. U specifičnom aspektu, prvi i drugi humani VLdomeni sadrže sekvencu izvedenu iz humanog DHi humanog Jκ genskog segmenta.
[0355] U jednom aspektu, prvi humani VLdomen sadrži sekvencu izvedenu iz humanog Vκ i humanog Jκ genskog segmenta i drugi humani VLdomen sadrži sekvencu izvedenu iz humanog Vλ i humanog Jλ genskog segmenta. U jednom aspektu, prvi humani VLdomen sadrži sekvencu izvedenu iz humanog Vλ i humanog Jλ genskog segmenta i drugi humani VLdomen sadrži sekvencu izvedenu iz humanog Vκ i humanog Jκ genskog segmenta.
[0356] U jednom aspektu, opisan je imunoglobulinski varijabilni region (VR) (npr., koji sadrži humanu VLsekvencu fuzionisanu sa humanim JL, ili JH, ili DHi JH, ili DHi JL) stvorenim u mišu kao što je ovde opisano. U specifičnom aspektu, imunoglobulinski VR je izveden iz humanog genskog segmenta klicine linije izabranog od Vκ segmenta i Vλ segmenta, naznačeno time da VR je kodiran od strane rearanžirane sekvence miša naznačeno time da rearanžirana sekvenca je somatski hipermutirana. U jednom aspektu, rearanžirana sekvenca sadrži 1 do 5 somatskih hipermutacija. U jednom aspektu, rearanžirana sekvenca sadrži najmanje 6, 7, 8, 9, ili 10 somatskih hipermutacija. U jednom aspektu, rearanžirana sekvenca sadrži više od 10 somatskih hipermutacija. U jednom aspektu, rearanžirana sekvenca je fuzionisana sa jednom ili više sekvenci humanih ili mišjih konstantnih regiona teškog lanca (npr., izabran od humanih ili mišjih CH1, zgloba, CH2, CH3, i njihove kombinacije).
[0357] U jednom aspektu, opisana je aminokiselinska sekvenca imunoglobulinskog varijabilnog domena vezujućeg proteina stvorenog u mišu kao što je ovde opisano. U jednom aspektu, VR je fuzionisan sa jednom ili više sekvenci humanog ili mišjeg konstantnog regiona teškog lanca sekvence (npr., izabran od humanog ili mišjeg CH1, zgloba, CH2, CH3, i njihove kombinacije).
[0358] U jednom aspektu, opisan je varijabilni domen lakog lanca kodiran je od strane sekvence nukleinske kiseline izvedene iz miša kao što je ovde opisano.
[0359] U jednom aspektu, opisano je antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (npr., Fab, F(ab)2, scFv) stvoren u mišu kao što je ovde opisano, ili izveden iz sekvence stvorene u mišu kao što je ovde opisano.
KRATAK OPIS SLIKA
[0360] SL. 1 ilustruje šemu (ne u razmeri) mišjeg lokusa teškog lanca (gore) i humanog lokusa κ lakog lanca (dole). Mišji lokus teškog lanca je oko 3 Mb dužine i sadrži približno 200 varijabilnih (VH) genskih segmenata teškog lanca, 13 diverzitetnih (DH) genskih segmenata teškog lanca i 4 spajajuća (JH) genska segmenta teškog lanca kao i enhansere (Enh) i konstantne (CH) regione teškog lanca. Lokus humanog κ lakog lanca je dupliciran u ditalni i proksimalni kontig suprotne polarnosti koji obuhvataju oko 440 kb i 600 kb, respektivno. Između dva kontiga je oko 800 kb DNK za koju se veruje da nema Vκ genskih segmenata. Lokus humanog κ lakog lanca sadrži oko 76 Vκ genskih segmenata, 5 Jκ genskih segmenata, intronski enhanser (Enh) i jedan konstantni region (CK).
SL. 2 prikazuje primer targeting strategije za progresivnu inserciju 40 humanih Vκ i pet humanih Jκ genskih segmenata u mišji lokus teškog lanca što rezultuje u modifikovanom mišjem lokusu imunoglobulinskog teškog lanca koji sadrži humane Vκ i Jκ genske segmente operativno vezane za mišji imunoglobulinski konstantni region teškog lanca. Higromicin (hyg) i neomicin (neo) selekcione kasete su prikazane sa mestima prepoznavanja rekombinaze (R1, R2, itd.).
SL. 3 prikazuje primer targeting strategije za progresivnu inserciju više humanih Vλ i jednog humanog Jλ genskog segmenta u mišji lokus teškog lanca. Higromicin (hyg) i neomicin (neo) selekcione kasete su prikazane sa mestima prepoznavanja rekombinaze (R1, R2, itd.).
SL. 4 prikazuje primer targeting strategije za progresivnu inserciju više humanih Vλ i četiri humana Jλ genska segmenta u mišji lokus teškog lanca. Higromicin (hyg) i neomicin (neo) selekcione kasete su prikazane sa mestima prepoznavanja rekombinaze (R1, R2, itd.).
SL. 5 prikazuje primer targeting strategije za progresivnu inserciju humanih Vλ, humanih DHi humanih JHgenskih segmenata u mišji lokus teškog lanca. Higromicin (hyg) i neomicin (neo) selekcione kasete su prikazane sa mestima prepoznavanja rekombinaze (R1, R2, itd.).
SL. 6 prikazuje primer targeting strategije za progresivnu inserciju humanih Vλ, humanih DHi humanih Jκ genskih segmenata u mišji lokus teškog lanca. Higromicin (hyg) i neomicin (neo) selekcione kasete su prikazane sa mestima prepoznavanja rekombinaze (R1, R2, itd.).
SL. 7 prikazuje korake za kloniranje genomskog fragmenta koji kodira mišje ADAM6 gene iz V-D intergenskog regiona mišjeg imunoglobulinskog teškog lanca i korake inženjeringa za modifikaciju genomskog fragmenta za inserciju u modifikovani lokus imunoglobulinskog teškog lanca.
SL. 8 prikazuje targeting strategiju za inserciju ‘genomskog fragmenta koja kodira mišje ADAM6 gene u Vκ- Jκ intergeni region modifikovanog mišjeg lokusa imunoglobulinskog teškog lanca koji sadrži humane Vκ i Jκ genske segmente operativno vezane za mišji imunoglobulinski konstantni region teških lanaca.
SL. 9 prikazuje targeting strategiju za inserciju genomskog fragmenta koji kodira mišje ADAM6 gene ushodno (5’) od humanih Vκ genskih segmenata (tj., hVκ2-40) modifikovanog mišjeg lokusa imunoglobulinskog teškog lanca koji sadrži humane Vκ i Jκ genske segmente operativno vezane za mišji imunoglobulinski konstantni region teškog lanca.
DETALJAN OPIS
[0361] Ovaj pronalazak nije ograničen na određene postupke, i opisane eksperimentalne uslove, jer takvi postupci i uslovi mogu varirati. Takođe se podrazumeva da terminologija korišćena ovde je u svrhu opisa samo određenih aspekata, i nije namera da bude ograničavajuća, jer je obim predmetnog pronalaska definisan patentnim zahtevima.
[0362] Ukoliko nije definisano drugačije, svi termini i izrazi korišćeni ovde uključuju znalenja koja termini i izrazi imaju u tehnici, ukoliko suprotno nije jasno naznačeno ili jasno očigledno u kontekstu u kome je korišćen termin ili izraz. Iako bilo koji postupci i meterijali slični ili ekvivalentni onima opisanim ovde se mogu koristiti u izvođenju ili testiranju predmetnog pronalaska, određeni postupci i materijali su sada opisani.
[0363] Izraz "suštinsko" ili "suštinski" kada je korišćen da označava količinu genskih segmenata genskih segmenata (npr., "suštinski svi" V genski segmenti) uključuje i funkcionalne i ne funkcionalne genske segmente i uključuje, u različitim aspektima, npr., 80% ili više, 85% ili više, 90% ili više, 95% ili više 96% ili više, 97% ili više, 98% ili više, ili 99% ili više od svih genskih segmenata; u različitim aspektima, "suštinski svi" genski segmenti uključuju, npr., najmanje 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% funkcionalnih (tj., ne-pseudogenskih) genskih segmenata.
[0364] Termin "zamena" uključuje naznačeno time da DNK sekvenca je postavljena u genom ćelije na takav način da se zameni sekvenca unutar genoma sa heterolognom sekvencom (npr., humanom sekvencom u mišu), na lokusu genomske sekvence. DNK sekvenca postavljena na taj način uključuje jednu ili više regulatorne sekvence koje su deo izvorne DNK korišćene da se dobije sekvenca tako postavljena (npr., promotori, enhanseri, 5’- ili 3’-netranslatirani regioni, odgovarajuće rekombinacione signalne sekvence, itd.). Na primer, u različitim aspektima, zamena je supstitucija endogene sekvence sa heterolognom sekvencom koja rezultuje u proizvodnji genskog proizvoda od DNK sekvence postavljene tako (koja sadrži heterolognu sekvencu), ali ne ekspresiju endogene sekvence; zamena je endogene genomske sekvence sa DNK sekvencom koja kodira protein koji ima sličnu funkciju kao protein kodiran sa endogenom genomskom sekvencom (npr., endogenom genomskom sekvencom koja kodira imunoglobulinski gen ili domen, i DNK fragment kodira jedan ili više humanih imunoglobulinskih gena ili domena). U različitim aspektima, endogeni gen ili njegov fragment je zamenjen sa odgovarajućim humanim genom ili njegovim fragmentom. Odgovarajući humani gen ili njegov fragment je humani gen ili fragment koji je ortolog, homolog, ili je suštinski identičan ili isti po strukturi i/ili funkciji, kao endogeni gen ili njegov fragment koji je zamenjen.
[0365] Term "susedni" uključuje referencu na pojavu na istom molekulu nukleinske kiseline,
1
npr., dve sekvence nukleinske kiseline su "susedne" ukoliko se pojavljuju na istom molekulu nukleinske kiseline ali su prekinute sa drugom sekvencom nukleinske kiseline. Na primer, rearanžirana V(D)J sekvenca je "susedna" sa sekvencom gena konstantnog regiona, iako finalni kodon V(D)J sekvence ne prati neposredno prvi kodon sekvence konstantnog regiona. U sledećem primeru, dve sekvence V genskog segmenta su "susedne" ukoliko se pojavljuju na istom genomskom fragmentu, iako mogu biti razdvojene sa sekvencom koja ne kodira kodon V regiona, npr., mogu biti razdvojene sa regulatornom sekvencom, npr., promotorom ili drugom nekodirajućom sekvencom. U jednom aspektu, susedne sekvence uključuju genomski fragment koji sadrži genomsku sekvencu uređenu kao što se nalazi u genomu divljeg tipa.
[0366] Izraz "izveden iz" kada je korišćen u odnosu na varijabilni region "izveden iz" navedenog gena ili genskog segmenta uključuje sposobnost da se prati sekvenca natrag do određenog nerearanžiranog genskog segmenta ili genskih segmenata koji su rearanžirani da bi se formirao gen koji eksprimira varijabilni domen (uzimajući u obzir, gde je primenjivo, razlike u splajsovanju i somatske mutacije).
[0367] Izraz "funkcionalni" kada je korišćen u odnosu na genski segment varijabilnog regiona ili spajajući genski segment odnosi se na upotrebu u repertoaru eksprimiranog antitela; npr., u humanim Vλ genskim segmentima 3-1, 4-3, 2-8, itd. su funkcionalni, dok Vλ genski segmenti 3-2, 3-4, 2-5, itd. su nefunkcionalni.
[0368] "Lokus teškog lanca " uključuje lokaciju na hromozomu, npr., mišjem hromozomu, gde se nalaze DNK sekvence kod divljeg tipa mišjeg varijabilnog (VH), diverzitetnog (DH), spajajućeg (JH), i konstantnog (CH) regiona teškog lanca.
[0369] Izraz "bispecifični vezujući protein" uključuje vezujući protein koji je sposoban da selektivno vezuje dva ili više epitopa. Bispecifični vezujući proteini sadrže dva različita polipeptida koji sadrže prvi varijabilni domen (VL1) lakog lanca fuzionisan sa prvim CHregionom i drugi varijabilni domen (VL2) lakog lanca fuzionisan sa drugim CHregionom. Generalno, prvi i drugi CHregioni su identični, ili se razlikuju po jednoj ili više aminoksielinskih supstitucija (npr., kao što je ovde opisano). VL1 i VL2 specifično vezuju različite epitope – ili na dva različita molekula (npr., antigena) ili na istom molekulu (npr., na istom antigenu). Ukoliko bispecifični vezujući protein selektivno vezuje dva različita epitopa (prvi epitop i drugi epitop), afinitet VL1 za prvi epitop će generalno biti najmanje jedan do dva ili tri ili četiri puta niži od afiniteta VL1 za drugi epitop, i obrnuto u odnosu na VL2. Epitopi prepoznati sa bispecifičnim vezujućim proteinom mogu biti na istom ili različitom ciljnom mestu (npr., na istom ili različitom antigenu). Bispecifični vezujući proteini se mogu stvoriti, na primer, kombinovanjem VL1 i VL2 koji prepoznaju različite epitope istog antigena.
2
Na primer, sekvenca nukleinske kiseline koja kodira VLsekvencu koja prepoznaje različite epitope istog antigena može se fuzionisati sa sekvencom nukleinske kiseline koja kodira različite CHregione, i takve sekvence se mogu eksprimirati u ćeliji koja eksprimira imunoglobulinski laki lanac, ili može biti eksprimirana u ćeliji koja ne eksprimira imunoglobulinski laki lanac. Tipični bispecifični vezujući protein ima dva teška lanca pri čemu svaki ima tri CDRs lakog lanca, praćene sa (N-terminalno do C-terminalno) CH1 domenom, zglobom, CH2 domenom, i CH3 domenom, i imunoglobulinskim lakim lancem koji ili ne daje antigen-vezujuću specifičnost, ali koje se mogu povezati sa svakim teškim lancem, ili koji se mogu povezati sa svakim teškim lancem i koje mogu vezati jedan ili više epitopa vezanih sa VL1 i/ili VL2, ili koji se mogu povezati sa svakim teškim lancem i omogućiti vezivanje ili pomoći u vezivanju jednog ili oba teška lanca sa jednim ili oba epitopa.
[0370] Stoga, dva opšta tipa bispecifičnih vezujućih proteina su (1) VL1-CH(dimer), i (2) VL1-CH:laki lanac VL2-CH:laki lanac, naznačeno time da laki lanac je isti ili različit. U bilo kom slučaju, CH(tj., konstantni region teškog lanca) može biti diferencijalno modifikovan (npr., da diferencijalno vezuje protein A, da poveća serumski polu-život, itd.) kao što je ovde opisano, ili može biti isti.
[0371] Termin "ćelija," kada je korišćen u vezi sa eksprimirajućom sekvencom uključuje bilo kkoju ćeliju koja je sposobna da eksprimira rekombinantnu sekvencu nukleinske kiseline. Ćelije uključuju one od prokariota i eukariota (jednoćelijski ili višećelijski), bakterijske ćelije (npr., sojevi E. coli, Bacillus spp., Streptomyces spp., itd.), ćelije mikobakterija, ćelije gljiva, ćelije kvasca (npr., S. cerevisiae, S. pombe, P. pastoris, P. methanolica, itd.), ćelije biljaka, ćelije insekata (npr., SF-9, SF-21, baculovirus-inficirane ćelije insekata, Trichoplusia ni, itd.), ćelije ne-humanih životinja, humane ćelije, B ćelije, ili ćelijske fuzije kao što su, na primer, hibridomi ili kvadromi. U nekim aspektima, ćelija je humana, majmuna, čovekolikog majmuna, hrčka, pacova, ili mišja ćelija. U nekim aspektima, ćelija je eukariotska i izabrana je od sledećih ćelija: CHO (npr., CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS (npr., COS-7), retinalna ćelija, Vero, CV1, bubrega (npr., HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL-60, (npr., BHK21), Jurkat, Daudi, A431 (epidermalna), CV-1, U937, 3T3, L ćelija, C127 ćelija, SP2/0, NS-0, MMT 060562, Sertolijeva ćelija, BRL 3A ćelija, HT1080 ćelija, ćelija mijeloma, ćelija tumora, i ćelijska linija izvedena iz prethodno pomenute ćelije. U nekim aspektima, ćelija sadrži jedan ili više virusnih gena, npr. retinalna ćelija koja eksprimira virusni gen (npr., PER.C6™ ćelija).
[0372] Namera je da termin "srodan," kada je korišćen u smislu "srodan sa," npr., prvi VLdomen koji je "srodan sa" drugim VLdomenom, uključuje referencu na odnos između dva VLdomena istog vezujućeg proteina stvorenog u mišu u skladu sa pronalaskom. Na primer, miš koji je genetički modifikovan u skladu sa aspektom pronalaska, npr., miš koji ima lokus teškog lanca u kom su VH, DH, i JHregioni zamenjeni sa VLi JLregionima, stvara antiteluslične vezujuće proteine koji imaju dva identična polipeptidna lanca stvorena od strane istog mišjeg CHregiona (npr., IgG izotipa) fuzionisanog sa prvim humanim VLdomenom, i dva identična polipeptidna lanca stvorena od strane istog mišjeg CLregiona fuzionisanog sa drugim humanim VLdomenom. Tokom klonske selekcije u mišu, prvi i drugi humani VLdomeni su izabrani procesom klonske selekcije da se pojavljuju zajedno u kontekstu jednog antitelo-sličnog vezujućeg proteina. Stoga, prvi i drugi VLdomeni koji se pojavljuju zajedno, kao rezultat procesa klonske selekcije, u jednom antitelu-sličnom molekulu su označeni kao "srodni." Za razliku od toga, VLdomen koji se pojavljuje u prvom antitelo-sličnom molekulu i VLdomen koji se pojavljuje u drugom antitelo-sličnom molekulu nisu srodni, osim ukoliko prvi i drugi antitelo-slični molekuli imaju identične teške lance (tj., osim ukoliko su VLdomen fuzionisan sa prvim regionom humanog teškog lanca i VLdomen fuzionisan sa drugim regionom humanog teškog lanca region identični).
[0373] Izraz "region koji određuje komplementarnost," ili termin "CDR," uključuje aminokiselinsku sekvencu kodiranu sa sekvencom nukleinske kiseline imunoglobulinskih gena organizma koji se normalno (tj., kod životinje divljeg tipa) pojavljuju između dva okvirna regiona u varijabilnom regionu lakog ili teškog lanca imunoglobulinskog molekula (npr., antitelo ili T ćelijski receptor). CDR može biti kodiran sa, na primer, germinativnom sekvencom ili rearanžiranom ili nerearanžiranom sekvencom, i, na primer, od strane naivne ili zrele B ćelije ili T ćelije. U nekim okolnostima (npr., za CDR3), CDRs mogu biti kodirani od strane dve ili više sekvenci (npr., sekvence klicine linije) koje nisu susedne (npr., u nerearanžiranoj sekvenci nukleinske kiseline) ali su susedni u sekvenci nukleinske kiseline B ćelije, npr., kao rezultat splajs ili vezujuće sekvence (npr., V-D-J rekombinacija kojom se formira CDR3 teškog lanca).
[0374] Izraz "genski segment," ili "segment" uključuje referencu na V (lak ili težak) ili D ili J (laki ili teški) imunoglobulinski genski segment, koji uključuju nerearanžiranu sekvencu na imunoglobulinskim lokusima (kod npr., ljudi i miševa) koji mogu učestvovati u rearanžmanu (posredovanom sa, npr., endogenim rekombinazama) da bi se stvorila rearanžirana V/J ili V/D/J sekvenca. Ukoliko nije naznačeno drugačije, V, D, i J segmenti sadrže rekombinacionu signalnu sekvencu (RSS) koja omogućava V/J rekombinaciju ili V/D/J rekombinaciju prema pravilu 12/23. Ukoliko nije naznačeno drugačije, segmenti dodatno sadrže sekvence sa kojima su povezani u prirodi ili su njihovi funkcionalni ekvivalenti (npr., za V segmente promotor(a) i lider(a)).
4
[0375] Izraz "teški lanac," ili "imunoglobulin teškog lanca" uključuje sekvencu imunoglobulinskog konstantnog regiona teškog lanca bilo kog organizma, i ukoliko nije drugačije naznačeno uključuje varijabilni domen teškog lanca (VH). VHdomeni uključuju tri CDRs teškog lanca i četiri okvirna regiona (FR), osim ukoliko nije drugačije naznačeno. Fragmenti teškog lanca uključuju CDRs, CDRs i FRs, i njihove kombinacije. Tipični teški lanac se suštinski sastoji od, prateći varijabilni domen (N-terminalno do C-terminalno), CH1 domen, zglob, CH2 domen, CH3 domen, i izborno CH4 domen (npr., u slučaju IgM ili IgE) i transmembranskog (M) domena (npr., u slučaju membranski-vezanog imunoglobulina na limfocitima). Konstantni region teškog lanca je region teškog lanca koji se prostire (od N-terminalne strane do C-terminalne strane) od spoljašnjeg FR4 do C-terminusa teškog lanca. Konstantni region teških lanaca sa minornim devijacima, npr., skraćivanjem jedne, dve, tri ili nekoliko aminokiselina sa C-terminusa, bili bi obuhvaćeni izrazom "konstantni region teškog lanca," kao i konstantni region teških lanaca sa modifikacijama sekvence, npr., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 aminokiselinskih supstitucija. Aminokiselinske supstitucije mogu se načiniti na jednom ili više položaja izabranih od, npr. (sa referencom na EU numerisanje imunoglobulinskog konstantnog regiona, npr., humani IgG konstantni region), 228, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 241, 248, 249, 250, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 301, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 315, 318, 320, 322, 324, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 337, 338, 339, 340, 342, 344, 356, 358, 359, 360, 361, 362, 373, 375, 376, 378, 380, 382, 383, 384, 386, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 428, 430, 433, 434, 435, 437, 438, i 439.
[0376] Na primer, i ne kao ograničenje, konstantni region teškog lanca može biti modifikovan da pokazuje poboljšani polu-život u serumu (u poređenju sa istim konstantnim regionom teškog lanca bez navedene modifikacije (modifikacija)) i ima modifikaciju na položaju 250 (npr., E ili Q); 250 i 428 (npr., L ili F); 252 (npr., L/Y/F/W ili T), 254 (npr., S ili T), i 256 (npr., S/R/Q/E/D ili T); ili modifikaciju na 428 i/ili 433 (npr., L/R/SI/P/Q ili K) i/ili 434 (npr., H/F ili Y); ili modifikaciju na 250 i/ili 428; ili modifikaciju na 307 ili 308 (npr., 308F, V308F), i 434. U sledećem primeru, modifikacija može sadržati 428L (npr., M428L) i 434S (npr., N434S) modifikaciju; 428L, 259I (npr., V259I), i 308F (npr., V308F) modifikaciju; 433K (npr., H433K) i 434 (npr., 434Y) modifikaciju; 252, 254, i 256 (npr., 252Y, 254T, i 256E) modifikaciju; 250Q i 428L modifikaciju (npr., T250Q i M428L); 307 i/ili 308 modifikaciju (npr., 308F ili 308P).
[0377] Izraz "laki lanac" uključuje sekvencu konstantnog imunoglobulinskog lakog lanca (CL) bilo kog organizma, i ukoliko nije drugačije naznačeno uključuje humane κ i λ lake lance. Varijabilni domeni (VL) lakog lanca tipično uključuju tri CDRs lakog domena i četiri okvirna regiona (FR), osim ukoliko nije drugačije naznačeno. Generalno, laki lanac pune dužine (VL+ CL) uključuje, od amino terminusa do karboksi terminusa, VLdomen koji uključuje FR1-CDR1-FR2-CDR2- FR3-CDR3-FR4, i CLregion. Laki lanci (VL+ CL) koi se mogu koristiti sa ovim pronalaskom uključuju one, npr., one koji se ne vezuju selektivno sa ili prvim ili drugim (u slučaju bispecifičnih vezujućih proteina) epitopom koji je selektivno vezan sa vezujućim proteinom (npr., epitop(i) slektivno vezani sa VLdomenom fuzionisanim sa CHdomenom). VLdomeni koji se ne vezuju selektivno za epitop(e) vezane od strane VLkoji je fuzionisan sa CHdomenom uključuju one koji se mogu identifikovati skrinigom u odnosu na najčešće korišćene lake lance u postojećim bibliotekama antitela (vlažne biblioteke ili in silico), naznačeno time laki lanci ne utiču značajno na afinitet i/ili selektivnost epitop vezujućih domena vezujućih proteina. Pogodni laki lanci uključuju one koji mogu vezati (sami ili u kombinaciji sa njihovim srodnim VLfuzionisanim sa CHregionom) epitop koji se specifično vezuje sa VLfuzionisanim sa CHregionom.
[0378] Namera je da izraz "mikromolarni opseg" označava 1-999 mikromolarni; namera je da izraz "nanomolarni opseg " označava 1-999 nanomolari; namera je da izraz "pikomolarni opseg" označava 1-999 pikomolarni.
[0379] Namera je da termin "ne-humane životinje" uključuju bilo koje ne-humane životinje kao što su kolouste, košljoribe, ribe sa hrskavičavim skeletom kao što su ajkule i raže, vodozemce, gmizavce, sisare, i ptice. Pogodne ne-humane životinje uključuju sisare. Pogodni sisari uključuju ne-humane primate, koze, ovce, svinje, pse, krave, i glodare. Pogodne nehumane životinje su izabrane iz porodice glodara uključujući pacova i miša. U jednom aspektu, ne-humane životinje su miševi.
[0380] Miš kao genetički model je veoma poboljšan transgenim i nokaut tehnologijama, koje su omogućile studije efekata usmerene prekomerne ekspresije ili delecije specifičnih gena. Uprkos svih njihovih prednosti, miševi i dalje predstavljaju genetičke prepreke koje ih čine nesavršenim modelom za humane bolesti i nesavršenom platformom za testiranje ili pravljenje humanih terapeutika. Prvo, iako oko 99% humanih gena ima mišje homologe (Waterston et al. (2002), Initial sequencing i comparative analysis of mouse genome, Nature 420, 520-562), potencijalni terapeutici često ne uspevaju da unakrsno reaguju, ili neadekvatno unakrsno reaguju, sa mišjim ortolozima nameravanih humanih targeta. Da bi se uklonio ovaj problem, odabrani target geni mogu biti "humanizovani," odnosno, mišji gen se može eliminisati i zameniti sa odgovarajućom humanom ortolognom genskom sekvencom (npr., US 6,586,251, US 6,596,541 i US 7,105,348). Inicijalno, napori da se humanizuju mišji geni sa "nokaut-plus-transgenskom humanizacijom" strategijom povlači za sobom ukrštanje miša koji nosi deleciju (tj., nokaut) endogenog gena sa mišem koji nosi randomizovano integrisani humani transgen (videti, npr., Bril et al. (2006), Tolerance to factor VIII in transgenic mouse expressing humanih factor VIII cDNK carrying Arg(593) to Cys substitution, Thromb Haemost 95:341-347; Homanics et al. (2006), Production i characterization of murine models of classic i intermediate maple syrup urine disease, BMC Med Genet 7:33; Jamsai et al. (2006), A humanizovane BAC transgenic/knockout mouse model for HbE/beta-thalassemia, Genomskus 88(3):309-15; Pan et al. (2006), Different role for mouse and human CD3delta/epsilon heterodimer in preT cell receptor (preTCR) function: human CD3delta/epsilon heterodimer restores defective preTCR function in CD3gamma- i CD3gammadelta-deficient mice, Mol Immunol 43:1741-1750). Ali ti napori su ometeni ograničenjem veličine; konvencionalne nokaut tehnologije nisu bile dovoljne da direktno zamene velike mišje gene sa njihovim velikim humanim genomskim odgovarajućim delovima. Jednostavan pristup direktne homologe zamene, u kojoj je endogeni mišji gen je direktno zamenjen sa humanim odgovarajućim genom na istoj preciznoj genetičkoj lokaciji mišjeg gena (tj., na endogenom mišjem lokusu), je retko pokušavan usled tehničkih teškoća. Do sada, pokušaji direktne zamene uključivali su detaljne i teške za izvođenje procedure, čime se ograničava dužina genetičkog materijala kojim se može upravljati i preciznost sa kojim se može manipulisati.
[0381] Egzogeno introdukovani humani imunoglobulinski transgeni rearanžiraju se u prekursorskim B-ćelijama u miševima (Alt et al. (1985), Imunoglobulin genes in transgenic mice, Trends Genet 1:231-236). Ovaj nalaz je iskorišćen u inženjeringu miševa korišćenjem nokaut-plus-transgenski pristup da bi se eksprimirala humana antitela (Green et al. (1994), Antigen-specific human monoclonal antibodies from mice engineered with human Ig heavy and lakog lanca YACs, Nat Genet 7:13-21; Lonberg, N. (2005), Human antibodies from transgenic animals. Nat Biotechnol 23:1117-1125; Lonberg et al. (1994), Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications, Nature 368:856-859; Jakobovits et al. (2007), From XenoMouse technology to panitumumab, first fully human antibody product of transgenic mice, Nat Biotechnol 25:1134-1143). Endogeni mišji lokusi imunoglobulinskog teškog lanca i κ lakog lanca su inaktivirani u ovim miševima targetiranim delecijama malih ali kritičnih delova svakog endogenog lokusa, praćeno sa introdukcijom genskih lokusa humanih imunoglobulina kao randomizovano integrisanih velikih transgena, kao što je prethodno opisano, ili minihromozoma (Tomizuka et al. (2000), Double trans-chromosomic mice: maintenance of two individual human chomosome fragments containing Ig heavy and kapa loci and expression of fully human antibodies, PNAS USA 97:722-727). Takvi miševi predstavljali su važan napredak u genetičkom inženjeringu; potpuno humana monoklonska antitela izolovana iz njih davala su obećavajući terapeutski potencijal za tretiranje različitih humanih bolesti (Gibson et al. (2006), Randomized phase III trial results of panitumumab, fully human anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibody, in metastatic colorectal cancer, Clin Colorectal Cancer 6:29-31; Jakobovits et al., 2007; Kim et al. (2007), Clinical efficacy of zanolimumab (HuMax-CD4): two Phase II studies in refractory cutaneous T-celllymphoma, Blood 109(11):4655-62; Lonberg, 2005; Maker et al. (2005), Tumor regression and autoimmunity in patients treated with cytotoxic T lymphocyte associated antigen 4 blockade and interleukin 2: phase I/II study, Ann Surg Oncol 12:1005-1016; McClung et al. (2006), Denosumab in postmenopausal women with low bone mineral density, N Engl J Med 354:821-831). Ali, kao što je prethodno razmatrano, ovi miševi pokazuju kompromitovano razviđe B ćelije i imune deficijencije u poređenju sa miševima divljeg tipa. Takvi problemi potencijalno ograničavaju sposobnost miševa da podrže snažan humoralni odgovor i, kao posledica toga, stvaraju potpuno humana antitela protiv nekih antigena. Deficijencije mogu biti usled: (1) neefikasne funkcionalnosti usled randomizovane introdukcije humanih imunoglobulinskih transgena i rezultujuće nekorektne ekspresije usled nedostatka ushodnih i nishodnih kontrolnih elemenata (Garrett et al. (2005), Chromatin architecture near potential 3’ end of Igh lokus involves modular regulation of histone modifications during B-cell development and in vivo occupancy at CTCF sites, Mol Cell Biol 25:1511-1525; Manis et al. (2003), Elucidation of downstream boundary of 3’ IgH regulatory region, Mol Immunol 39:753-760; Pawlitzky et al. (2006), Identification of candidate regulatory element within 5’ flanking region of mouse Igh lokus defined by pro-B cell-specific hypersensitivity associated with binding of PU.1, Pax5, i E2A, J Immunol 17616839-6851); (2) neefikasnih interspecijskih ineterakcija između humanih konstantnih domena i mišjih komponenti B-ćelijskog kompleksa receptorske signalizacije receptora na površini ćelije, koji mogu umanjiti proces signalizacije neophodan za normalno sazrevanje, proliferaciju, i preživljavanje B ćelije (Hombach et al. (1990), Molecular components of B-cell antigen receptor complex of IgM class, Nature 343:760-762); i (3) neefikasnih interspecijskih interakcija između rastvorljivih humanih imunoglobulina i mišjih Fc receptora koji mogu smanj selekciju na osnovu afiniteta (Rao et al. (2002). Differential expression of inhibitory IgG Fc receptor FcgammaRIIB on germinal center cells: implications for selection of highaffinity B cells, J Immunol 169:1859-1868) i koncentracija imunoglobulina u serumu (Brambell et al. (1964), A Theoretical Model of Gamma-Globulin Catabolism, Nature 203:1352-1354; Junghans i Anderson, (1996), protection receptor for IgG catabolism is beta2-microglobulin-containing neonatal intestinal transport receptor, PNAS USA93:5512-5516; Rao et al., 2002; Hjelm et al. (2006), Antitelo-mediated regulation of immune response, Scand J Immunol 64:177-184; Nimmerjahn i Ravetch, (2007), Fc-receptors as regulators of immunity, Adv Immunol 96:179-204). Ove deficijencije se mogu ispraviti sa in situ humanizacijom samo varijabilnih regiona mišjeg lokusa imunoglobulina unutar njihovih prirodnih lokacija na endogenim lokusima teških i lakih lanaca. Ovo bi efikasno rezultovalo u miševima koji stvaraju "reverzna himerna" (tj., humana V: mišja C) antitela koja bi bila sposobna za normalne interakcije i selekciju sa mišjom sredinom zasnovana na zadržavanju mišjih konstantnih regiona. Dodatno takva reverzna himerna antitela mogu se lako preformatirati u potpuno humana antitela za terapeutske svrhe.
[0382] Genetički modifikovane životinje koje sadrže inserciju ili zamenu na endogenm lokusu imunoglobulinskog teškog lanca sa heterolognom (npr., od druge vrste) imunoglobulinskom sekvencom mogu se stvoriti zajedno sa insercijama ili zamenama na endogenim lokusima imunoglobulinskog lakog lanca ili zajedno sa imunoglobulinskim transgenima lakog lanca (npr., himerni rtansgeni imunoglobulinskog lakog gena ili potpuno humani potpuno mišji, itd.). Vrste od kojih su izvedene heterologne imunoglobulinske sekvence mogu veoma varirati. Primeri heterologne imunoglobulinske sekvence uključuju humane sekvence.
[0383] Sekvenca nukleinske kiseline imunoglobulinskog varijabilnog regiona, npr., V, D, i/ili J segmenti, su u različitim aspektima dobijeni od humane ili ne-humane životinje. Ne-humane životinje pogodne za obezbeđivanje V, D, i/ili J segmenata uključuju, na primer košljoribe, ribe sa hrskavičastim skeletom kao što su ajkule i raže, vodozemce, gmizavce, sisare, ptice (npr., kokoške). Ne-humane životinje uključuju, na primer, sisare. Sisari uključuju, na primer, ne-humane primate, koze, ovce, svinje, pse, goveda (npr., krava, bik, bizon), jelena, kamile, feretke i glodare i ne-humane primate (npr., šimpanze, orangutane, gorile, marmozete, rezus majmun babune). Pogodne ne-humane životinje su izabrane iz porodice glodara uključujući pacove, miševe, i hrčke. U jednom aspektu, ne-humane životinje su miševi. Kao što je jasno iz konteksta, različite ne-humane životinje se mogu koristiti kao izvori varijabilnih domena ili genskih segmenata varijabilnog regiona (npr., ajkule, raže, sisari, npr., kamile, glodari kao što su miševi i pacovi).
[0384] U skladu sa kontekstom, ne-humane životinje su takođe korišćene kao izvori sekvence konstantnog regiona koja bi se koristila u vezi sa varijabilnim sekvencama ili segmentima, na primer, konstantne sekvence glodara mogu se koristiti u transgenima operativno vezanim za humane ili ne-humane varijabilne sekvence (npr., humanih ili ne-humanih primata varijabilne sekvence operativno vezane za, npr., glodarske, npr., mišje ili pacova ili hrčka, konstantne sekvence). Stoga, u različitim aspektima, humani V, D, i/ili J segmenti su operativno vezani za glodarsksku (npr., miš ili pacov ili hrčak) gensku sekvencu konstantnog regiona. U nekim aspektima, humani V, D, i/ili J segmenti (ili jedan ili više rearanžiranih VDJ ili VJ gena) su operativno vezani ili fuzionisani sa genskom sekvencom miša, pacova, ili hrčka u, npr., transgenu integrisanom na lokusu koji nije endogeni imunoglobulinski lokus.
[0385] U specifičnom aspektu, opisan je miš koji sadrži zamenu VH, DH, i JHgenskih segmenata na endogenom imunoglobulinskom lokusu teškog lanca sa jednim ili više humanih VLi jednim ili više humanih JLgenskih segmenata, naznačeno time da jedan ili više humanih VLi jedan ili više JLgenskih segmenata su operativno vezani za endogeni gen imunoglobulinskog teškog lanca; naznačeno time da miš sadrži transgen na lokusu različitom od endogenog imunoglobulinskog lokusa, naznačeno time da transgen sadrži nerearanžirani ili rearanžirani humani VLi humani JLgenski segment operativno vezan za mišji ili pacovski ili humani konstantni region. U različitim aspektima, jedan ili više humanih VLgenskih segmenata uključuju humane Vκ ili humane Vλ genske segmente. U jednom aspektu, jedan ili više humanih JLgenskih segmenata uključuju humane Jκ ili humane Jλ genske segmente.
[0386] Opisan je postupak za veliku in situ genetičku zamenu mišjih varijabilnih gena imunoglobulinskog teškog lanca klicine linije sa humanim varijabilnim genima imunoglobulinskog lakog lanca klicine linije uz održavanje sposobnosti miševa da stvore potomstvo. Specifično, opisana je precizna zamena lokusa varijabilnog gena mišjeg teškog lanca sa humanim lokusima varijabilnog gena lakog lanca uz ostavljanje intaktnih mišjih konstantnih regiona. Kao rezultat, stvoreni su miševi koji eksprimiraju vezujuće proteine slične imunoglobulinskim vezujućim proteinima u kontekstu endogenih konstantnih regiona. Varijabilni regioni humanog lakog lanca su povezani sa mišjim konstantnim regionom teških lanaca da bi formirali himerne humane-mišje imunoglobulinske lokuse koji se rearanžiraju i eksprimiraju jedinstvene molekule slične imunoglobulinu. Molekuli slični imunoglobulinu eksprimirani su "reverzne himere," tj., sadrže humane sekvence varijabilnog regiona i mišje sekvence konstantnog regiona.
[0387] Inženjering humanih imunoglobulinskih sekvenci u genomu miša, čak i na tačnim lokacijama, npr., na endogenim mišjim imunoglobulinskim lokusima, mogu predstavljati određene izazove usled divergentne evolucije imunoglobulinskih lokusa između miša i čoveka. Na primer, intergenske sekvence razasute unutar imunoglobulinskih lokusa nisu identične između miševa i ljudi i, u nekim slučajevima, ne moraju biti funkcionalno ekvivalentne. Razlike između miševa i ljudi u njihovim imunoglobulinskim lokusima mogu još uvek rezultovati u abnormalnostima kod humanizovanih miševa, naročito kada se humanizuju ili manipulišu određeni delovi endogenih lokusa mišjeg imunoglobulinskog teškog lanca. Neke modifikacije na lokusima mišjeg imunoglobulinskog teškog lanca su štetne. Štetne modifikacije mogu uključivati, na primer, gubitak sposobnosti modifikovanih miševa da se pare i proizvode potomstvo. U različitim aspektima, inženjering humanih imunoglobulinskih sekvenci u genomu miša uključuju postupke koji održavaju endogene sekvence koje kada su odsutne u modifikovanim sojevima miša su štetne. Primeri štetnih efekata mogu uključivati nesposobnost da se modifikovani sojevi propagiraju, gubitak funkcije esencijalnih gena, nesposobnost da se eksprimiraju polipeptidi, itd. Takvi štetni efekti mogu biti direktno ili indirektno povezani sa inženjeringom postavljenim modifikacijama u genom miša.
[0388] Bez obzira na humoralnu imunu funkciju blisku divljem tipu uočenu kod miševa sa zamenjenim imunoglobulinskim lokusima, postoje druge promene koje se susreću kada se koristi direktna zamena imunoglobulina koja se ne susreće u nekim pristupima koji koriste randomizovano integrisane transgene. Razlike u genetičkom sastavu imunoglobulinskih lokusa između miševa i ljudi doveli su do otkrića sekvenci korisnih za propagaciju miševa sa zamenjenim imunoglobulinskim genskim segmentima. Specifično, mišji ADAM geni locirani unutar endogenog lokusa imunoglobulinskog teškog lanca su optimalno prisutni u miševima sa zamenjenim imunoglobulinskim lokusima, usled njihove uloge u fertilitetu.
[0389] Tačna, in situ zamena šest megabaza imunoglobulinskih lokusa varijabilnih regiona mišjeg teškog lanca (VH-DH-JH) sa humanim varijabilnim genskim lokusima imunoglobulinskog lakog lanca (VL-JL) je izvedena, uz ostavljanje intaktne flankirajuće mišje i funkcionalno unutar hibridnih lokusa, uključujući sve gene mišjeg konstantnog lanca i lokus regiona za kontrolu transkripcije (SL. 2 - SL. 6). Izvedeni su koraci inženjeringa da se održe mišje sekvence koje mišu daju sposobnost da se pari i proizvodi potomstvo na način koji se može uporediti sa mišem divljeg tipa (SL. 7 - SL. 9). Specifično, oko pola megabaze lokusa humanog imunoglobulinskog κ lakog lanca koji sadrži proksimalnu ruku (tj., 40 funkcionalnih humanih Vκ genskih segmenata i pet humanih Jκ genskih segmenata) i mišji ADAM6 geni su introdukovani u himerni BAC targeting vektore u mišje ES ćelije korišćenjem VELOCIGENE® tehnologije genetičkog inženjeringa (videti, npr., SAD Pat. br.
6,586,251 i Valenzuela et al., 2003, High- throughput engineering of mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nat Biotechnol 21:652-659).
Genomska lokacija i funkcija mišjeg ADAM6
[0390] Mužjaci miševa kojima nedostaje sposobnost da eksprimiraju bilo koji funkcionalni ADAM6 protein pokazuju teške defekte u sposobnosti miševa da se pare i generišu potomstvo. Miševi kojima nedostaje sposobnost da eksprimiraju funkcionalni ADAM6 protein putem zamene svih ili suštinski svih varijabilnih genskih segmenata mišjeg imunoglobulinskog teškog lanca sa varijabilnim genskim segmentima humanog lakog lanca. Gubitak ADAM6 funkcije je rezultat jer je ADAM6 lokus lociran unutar regiona endogenog varijabilnog genskoglokusa imunoglobulinskog teškog lanca, proksimalno u odnosu na 3’ kraj
1
lokusa VHgenskog segmenta koji je ushodno od DHgenskih segmenata. Da bi se ukršatali miševi koji su homozigotni u odnosu na zamenu svih ili suštinski svih varijabilnih genskih segmenata endogenog teškog lanca sa humanm varijabilnim genskim segmentima lakog lanca, generalno je nezgodan je pristup da se postave mužjaci i ženke koji su svaki zasebno homozigotni u odnosu na zamenu i očekivati produktivno parenje. Uspešni okoti su relativno retki, i posečna veličina okota je veoma mala. Umesto toga, mužjaci heterozigotni za zamenu su upotrebljeni da se pare sa ženkama homozigotnim za zamenu da bi se stvorilao potomstvo koje je heterozigotno za zamenu, koje daje njihovog homozigotnof miša. Pronalazači su odredili da je verovatan uzrok gubitka fertiliteta kod mužjaka miševa je odsustvo funkcionalnog ADAM6 proteina kod homozigotnih mužjaka miševa.
[0391] U različitim aspektima, mužjaci miševa koji sadrže oštećen (tj., nefunkcionalni ili marginalno funkcionalni) ADAM6 gen pokazuju smanjenje ili eliminaciju fertiliteta. Kako u miševima (i drugim glodarima) ADAM6 gene je lociran u lokusu imunoglobulinskog teškog lanca, pronalazači su odredili da bi se miševi razmnožavali, ili stvorio i održao soj miševa, koji sadrže modifikacije endogenog lokusa imunoglobulinskog teškog lanca, upotrebljene su različite modifikovane šeme ukrštanja ili razmnožavanja. Nizak fertilitet, ili neplodnost, mužjaka miševa homozigotnih za zamenu endogenog varijabilnog genskog lokusa imunoglobulinskog teškog lanca čini teškom održavanje takve modifikacije u soju miša. U različitim aspektima, održavanje soja sadrži izbegavanje problema neplodnosti koji pokazuju mužjaci miševa homozigotni za zamenu.
[0392] U jednom aspektu, opisan je postupak za održavanje soja miša kao što je ovde opisano. Soj miša ne mora da sadrži ektopičnu ADAM6 sekvencu, i u različitim aspektima soj miša je homozigotan ili heterozigotan za nokaut (npr., funkcionalni nokaut) ADAM6.
[0393] Mišji soj sadrži modifikaciju endogenog lokusa imunoglobulinskog teškog lanca koja rezultuje u smanjenju ili gubitku fertliteta mužjaka miša. U jednom aspektu, modifikacija sadrži delecije regulatornog regiona i/ili kodirajućeg regiona ADAM6 gena. U specifičnom aspektu, modifikacija sadrži modifikaciju endogenog ADAM6 gena (regulatornog i/ili kodirajućeg regiona) koja smanjuje ili eliminiše fertilnost mužjaka miša koji sadrži modifikaciju; u specifičnom aspektu, modifikacija smanjuje ili eliminiše fertilnost mužjaka koji je homozigotan za modifikaciju.
[0394] U jednom aspektu, mišji soj je homozigotan ili heterozigotan za nokaut (npr., funkcionalni nokaut) ili deleciju ADAM6 gena.
[0395] U jednom aspektu, mišji soj je održavan izolacijom iz miša koji je homozigotan ili heterozigotan za modifikaciju ćelije, i upotrebu donora ćelije u embrionu domaćinu, i gestaciju embriona domaćina i donorske ćelije u surogat majci, i dobijanje od surogat majke
2
potomstva koje sadrži genetički modifikaciju. U jednom aspektu, donor ćelija je ES ćelija. U jednom aspektu, donor ćelija je pluripotentna ćelija, npr., indukovana pluripotentna ćelija.
[0396] U jednom aspektu, mišji soj je održavan izolacijom iz miša koji je homozigotan ili heterozigotan za modifikaciju sekvence nukleinske kiseline koja sadrži modifikaciju, i introdukcijom sekvence nukleinske kiseline u jedro domaćina, i gestaciju ćelije koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline i jedro domaćina u pogodnoj životinji. U jednom aspektu, sekvenca nukleinske kiseline je introdukovana u embrion koji se razvija iz oocite domaćina.
[0397] U jednom aspektu, mišji soj je održavan izolacijom iz miša koji je homozigotan ili heterozigotan za modifikaciju jedra, i introdukcijom jedra u ćeliju domaćina, i gestaciju jedra i ćelije domaćina u pogodnoj životinji da bi se dobilo potomstvo koje je homozigotno ili heterozigotno za modifikaciju.
[0398] U jednom aspektu, mišji soj je održavan upotrebom in vitro fertilizacije (IVF) ženke miša (divlji tip, homozigotan za modifikaciju, ili heterozigotan za modifikaciju) uportebom mužjaka miša koji sadrži genetičku modifikaciju. U jednom aspektu, mužjak miša je heterozigotan za genetičku modifikaciju. U jednom aspektu, mužjak miša je homozigotan za genetičku modifikaciju.
[0399] U jednom aspektu, mišji soj je održavan ukrštanjem mužjaka miša koji je heterozigotan u odnosu na genetičku modifikaciju sa ženkom miša da bi se dobilo potomstvo koje sadrži genetičku modifikaciju, identifikaciju potomstva mužjaka i ženke koje sadrži genetičku modifikaciju, i upotrebu mužjaka koji je heterozigotan u odnosu na genetičku modifikaciju za ukrštanje sa ženkom koja je divljeg tipa, homozigotna, ili heterozigotna u odnosu na genetičku modifikaciju da bi se dobilo potomstvo koje sadrži genetičku modifikaciju. U jednom aspektu, korak ukrštanja mužjaka heterozigotnog za genetičku modifikaciju sa ženkom divljeg tipa, ženkom heterozigotnom za genetičku modifikaciju, ili ženku homozigotnu za genetičku modifikaciju je ponovljen da bi se održala genetička modifikacija u mišjem soju.
[0400] U jednom aspektu, opisan je postupak za održavanje mišjeg soja koji sadrži zamenu endogenog varijabilnog genskog lokusa imunoglobulinskog teškog lanca sa jednom ili više sekvenci humanog imunoglobulinskog lakog lanca, i izborno jednim ili više humanih DHgenskih segmenata, koji sadrže ukrštanje mišjeg soja tako da se stvore heterozigotni mužjaci miševa, naznačeno time da su heterozigotni mužjaci miševa ukrštani da bi se održala genetička modifikacija u soju. U specifičnom aspektu, soj nije održavan bilo kakvim ukrštanjem homozigotnog mužjaka ženkom divljeg tipa, ili ženkom koja je homozigotna ili heterozigotna u odnosu na genetičku modifikaciju.
[0401] ADAM6 protein je član A Dezintegrin i Metaloproteaza (ADAM) familije proteina, koja je velika familija sa raznovrsnim funkcijama uključujući ćelijsku adheziju. Neki članovi ADAM familije su implicirani u spermatogenezi i fertilizaciji. Na primer, ADAM2 kodira subjedinicu proteina fertilina, koji je uključen u interakcijama spermatozoid-jaje. Izgleda da je ADAM3, ili ciritestin, neophodan za vezivanje spermatozoida za zona pellucida. Odsustvo ili ADAM2 ili ADAM3 rezultuje u neplodnosti. Smatra se da ADAM2, ADAM3, i ADAM6 formiraju kompleks na površini mišjeg spermatozoida.
[0402] Kod ljudi, ADAM6 gen, navodno pseudogen, je lociran između humanih VHgenskih segmenata VH1-2 i VH6-1. U miševima, postoje dva ADAM6 gena-ADAM6a i ADAM6b-koji su locirani u intergenom regionu između mišjih VHi DHgenskih segmenata, i orijentisani su u suprotnoj transkripcionoj orijentaciji u odnosu na onu kod okružujućih imunoglobulinskih genskih segmenata. U miševima, izgleda da je funkcionalni ADAM6 lokus neophodan za normalnu fertilizaciju. Funkcionalni ADAM6 lokus ili sekvenca, se onda, odnosi na ADAM6 lokus ili sekvencu koja može biti komplementarna, ili povratiti, drastično smanjenu fertilizaciju kod mužjaka miševa sa nedostajućim ili oštećenim endogenim ADAM6 lokusima.
[0403] Položaj intergenske sekvence kod miševa koja kodira ADAM6a i ADAM6b čini intergensku sekvencu podložnom modifikaciji kada se modifikuje endogeni teški lanac. Kada su VHgenski segmenti deletirani ili zamenjeni, ili kada su DHgenski segment deletirani ili zamenjeni, postoji velika verovatnoća da će rezultujući miš pokazati teški deficit u fertilitetu. Da bi se kompenzovao deficit, miš je modifikovan da uključuje nukleotidnu sekvencu koja kodira protein koji će komplementirati gubitak ADAM6 aktivnosti usled modifikacije endogenog ADAM6 lokusa. U različitim aspektima, komplementna nukleotidna sekvenca je ona koja kodira mišji ADAM6a, mišji ADAM6b, ili njegov homolog ili ortolog ili funkcionalni fragment koji vraća deficit fertiliteta. U različitim aspektima, komplementirajuća nukleotidna sekvenca kodira mišji ADAM6a protein kao što je dato u SEQ ID NO: 1, i/ili kodira mišji ADAM6b protein kao što je dato u SEQ ID NO: 2. Alternativno, pogodni postupci da se sačuva endogeni ADAM6 lokus mogu se upotrebiti, uz istovremeno stvaranje sekvence endogenog imunoglobulinskog teškog lanca koja flankira mišji ADAM6 lokus nesposoban za rearanžman da bi kodirao funkcionalni endogeni varijabilni region teškog lanca. Primeri alternativnih postupaka uključuju manipulaciju velikih delova mišjih hromozoma koji pozicioniraju endogene lokuse imunoglobulinskog teškog lanca na takav način da su nesposobni za rearanžman da bi kodirali funkcionalni varijabilni region teškog lanca koji je operativno vezanu za endogeni konstantni gen teškog lanca. U različitim aspektima, postupci uključuju inverzije i/ili translokacije mišjih hromozomskih fragmenata koji sadrže endogene genske segmente imunoglobulinskog teškog lanca.
4
[0404] Nukleotidna sekvenca koja vraća fertilnost može se postaviti na bilo koji pogodan položaj. Može se postaviti u intergenski region (npr., između V i J genskih segmenata ili ushodno od V genskih segmenata), ili na bilo koji položaj u genomu (tj., ektopično). U jednom aspektu, nukleotidna sekvenca se može ugraditi u transgen koji se randomizovano integriše u mišji genom. U jednom aspektu, sekvenca se može održavati epizomalno, odnosno, na posebnoj nukleinskoj kiselini pre nego na mišjem hromozomu. Pogodni položaji uključuju položaje koji su transkripciono permisivini ili aktivni, npr., ROSA26 lokus (Zambrowicz et al., 1997, PNAS USA 94:3789-3794), BT-5 lokus (Michael et al., 1999, Mech. Dev. 85:35-47), ili Oct4 lokus (Wallace et al., 2000, Nucleic Acids Res. 28:1455-1464). Targeting nukleotidne sekvence do transkripciono aktivnih lokusa je opisan, npr., u SAD 7,473,557.
[0405] Alternativno, nukleotidna sekvenca koja vraća fertilitet može se kuplovati sa inducibilnim promotorom da bi se olakšala optimalna ekspresija u odgovarajućoj ćelijama i/ili tkivima, npr., reproduktivnim tkivima. Primeri inducibilnih promotora uključuju promotore aktivirane fizičkim (npr., promotor toplotnog šoka) i/ili hemijskim sredstvima (npr., IPTG ili tetraciklin).
[0406] Dodatno, ekspresija nukleotidne sekvence može se povezati sa drugim genima da bi se postigla ekspresiaj na specifičnim stadijumima razvića ili unutar specifičnih tkiva. Takva ekspresija se može postići postavljanjem nukleotidne sekvence u operativnu vezu sa promotorom gena eksprimiranog na specifičnom stadijumu razvića. Na primer, imunoglobulinske sekvence od jedne vrste postavljene inženjeringom u genom vrste domaćina su postavljene u operativnu vezu sa promotorskom sekvencom CD19 gena (gen specifičan za B ćeliju) vrste domaćina. Postignuta je ekspresija specifična za B ćeliju na tačnim razvojnim stadijumima kada su eksprimirani imunoglobulini.
[0407] Sledeći postupak da se postigne robusna ekspresija inserirane nukleotidne sekvence je da se upotrebi konstitutivni promotor. Primeri konstitutivnih promotora uključuju SV40, CMV, UBC, EF1A, PGK i CAGG. Na sličan način, željena nukleotidna sekvenca je postavljena u operativnu vezu sa izabranim konstitutivnim promotorom, koji obezbeđuje visok nivo ekspresije proteina (ili više njih) kodiranih sa nukleotidnom sekvencom.
[0408] Namera je da termin "ektopičan" uključuje premeštanje, ili postavljanje na položaj na kom se ne nalazi noramlno u prirodi (npr., postavljanje sekvence nukleinske kiseline na položaj koji nije isti položaj kao sekvenca nukleinske kiseline koja se nalazi kod miša divljeg tipa). Termin u različitim aspektima je korišćen u smislu da je njegov objekat van njegove normalnog, ili ispravnog, položaja. Na primer, izraz "ektopična nukleotidna sekvenca koja kodira .." odnosi se na nukleotidnu sekvencu koja se pojavljuje na položaju na kojoj se normalno ne nalazi kod miša. Na primer, u slučaju ektopične nukleotidne sekvence koja kodira mišji ADAM6 protein (ili ortolog ili homolog ili njegov funkcionalni fragment koji obezbeđuje istu ili sličnu korist za fertilitet mužjaka miševa), sekvenca može biti postavljena na različit položaj u mišjem genomu nego što se normalno nalazi u mišu divljeg tipa. U takvim slučajevima, spojevi nove sekvence mišje sekvence biće stvoreni postavljanjem sekvence na različit položaj u genomu miša nego u mišu divljeg tipa. Funkcionalni homolog ili ortolog mišje ADAM6 je sekvenca koja vraća fertilitet (npr., gubitak sposobnosti mužjaka miša da stvori potomstvo parenjem) koji je uočen kod ADAM6-/- miša. Funkcionalni homolozi ili ortolozi uključuju proteine koji imaju najmanje oko 89% identičnosti ili više, npr., do 99% identičnosti, sa aminokiselinskom sekvencom ADAM6a i/ili sa aminokiselinskom sekvencom ADAM6b, i koji mogu komplementirati, ili vratiti sposobnost uspeđnog parenja, mišu koji ima genotip koji uključuje deleciju ili nokaut ADAM6a i/ili ADAM6b.
[0409] Ektopični položaj može biti bilo gde (npr., kao randomizovana insercija transgena koja sadrži mišju ADAM6 sekvencu), ili može biti, npr., na položaju koji aproksimira (ali nije potpuno isti kao) njegova lokacija u mišu divljeg tipa (npr., u modifikovanom endogenom imunoglobulinskom lokusu, ali ili ushodno ili nishodno od svog prirodnog položaja, npr., unutar modifikovanog imunoglobulinskog lokusa ali između različitih genskih segmenata, ili na različitom položaju u mišjoj V-D intergenskoj sekvenci). Jedan primer ektopičnog postavljanja je održavanje položaja koji se noramlno nalazi kod miševa divljeg tipa unutar endogenog lokusa imunoglobulinskog teškog lanca lokus uz istovremeno stvaranje okolnih endogenih genskih segmenata teškog lanca nesposobnim za rearanžman da bi kodirali funkcionalni teški lanac koji sadrži endogeni konstantni region teškog lanca. U ovom primeru, ovo se može postići inverzijom hromozomskog fragmenta koji sadrži endogene varijabilne lokuse imunoglobulinskog teškog lanca, npr. korišćenjem inženjeringom dobijenih mesta rekombinacije specifičnih za mesto postavljenih na položaje koji flankiraju lokus varijabilnog regiona. Stoga, nakon rekombinacije lokusi varijabilnog regiona endogenog teškog lanca su postavljeni na većoj udaljenosti od endogenih gena konstantnog regiona teškog lanca čime se sprečava da rearanžman kodira funkcionalni teški lanac koji sadrži endogeni konstantni region teškog lanca. Drugi primeri postupaka da bi se postiglo funkcionalno utišavanje varijabilnog genskog lokusa endogenog imunoglobulinskog teškog lanca uz održavanje funkcionalnog ADAM6 lokusa biđe jasni stručnjacima nakon čitanja ovog opisa i/ili u kombinacijom sa postupcima poznatim u tehnici. Sa takvim postavljanjem lokusa endogenog teškog lanca, endogeni ADAM6 geni su održavani i lokus endogenog imunoglobulinskog teškog lanca je funkcionalano utišan.
[0410] Drugi primer ektopičnog postavljanja je postavljanje unutar lokusa modifikovanog imunoglobulinskog teškog lanca. Na primer, miš koji sadrži zamenu jednog ili više endogenih VHgenskih segmenata sa humanim VLgenskim segmentima, naznačeno time da zamena uklanja endogenu ADAM6 sekvencu, može se dobiti inženjeringom da ima mišju ADAM6 sekvencu lociranu unutar sekvence koja sadrži humane VLgenske segmente. Rezultujuća modifikacija bi generisala (ektopičnu) mišju ADAM6 sekvencu unutar humane genske sekvence, i (ektopično postavljanje) mišje ADAM6 sekvence unutar humane genske sekvence može aproksimirati položaj humanih ADAM6 pseudogena (tj., između dva V segmenta) ili može aproksimirati pložaj mišje ADAM6 sekvence (tj., unutar V-D intergenskog regiona). Spajanja rezultujuće sekvence stvorene spajanjem (ektopične) mišje ADAM6 sekvence unutar ili susedno do humane genske sekvence (npr., genska sekvenca imunoglobulinskog lakog lanca) unutar klicine linije miša bila bi nova u poređenju sa istim ili sličnim položajem u genomu miša divljeg tipa.
[0411] U različitim aspektima, opisane su ne-humane životinje kojima nedostaje ADAM6 ili njegov ortolog ili homolog, naznačeno time nedostatak čini ne-humane životinje neplodnim, ili suštinski smanjuje fertilitet ne-humane životinje. U različitim aspektima, nedostatak ADAM6 ili njegovog ortologa ili homologa je usled modifikacije lokusa endogenog imunoglobulin teškog lanca. Značajno smanjenje fertiliteta je, npr., smanjenje fertiliteta (npr., učestalosti ukrštanja, mladunaca po okotu, okota po godini, itd.) od oko 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ili 95% ili više. U različitim aspektima, nehumanim životinjama su dodati mišji ADAM6 gen ili njegov ortolog ili homolog ili njegov funkcionalni fragment koji je funkcionalan kod mužjaka ne-humane životinje, naznačeno time da dodati ADAM6 gen ili ortolog ili homolog ili njegov funkcionalni fragment vraća smanjenje fertiliteta u celini ili u značajnom delu. Vrađanje fertiliteta u značajnom delu je, npr., obnavljanje fertiliteta tako da ne-humane životinje pokazuju fertilitet koji je najmanje 70%, 80%, ili 90% ili više u poređenju sa nemodifikovanim (tj., životinjama bez modifikacije ADAM6 gena ili njegovog ortologa ili homologa) lokusom teškog lanca.
[0412] Sekvenca koja daje gentički modifikovanim životinjama (tj., životinjama kojima nedostaje funkcionalni ADAM6 ili njegov ortolog ili homolog, usled, npr., modfiikacije lokusa imunoglobulinskog teškog lanca) je, u različitim aspektima, izabran od ADAM6 gena ili njegovog ortologa ili homologa. Na primer, u mišu, gubitak ADAM6 funkcije je vraćen dodavanjem, u jednom aspektu, mišjeg ADAM6 gena. U jednom aspektu, gubitak ADAM6 funkcije u mišu je vraćen dodavanjem ortologa ili homologa blisko srodne vrste u odnosu na miša, npr., glodara, npr., miša različitog soja ili vrste, pacova bilo koje vrste, glodara; naznačeno time dodavanje ortologa ili homologa mišu vraća gubitak fertiliteta usled gubitka ADAM6 funkcije ili gubitka ADAM6 gena. Ortolozi i homolozi drugih vrsta, u različitim aspektima, su izabrani od filogenetički srodnih vrsta i, u različitim aspektima, pokazuju procenat identičnosti sa endogenim ADAM6 (ili ortologom) koji je oko 80% ili više, 85% ili više, 90% ili više, 95% ili više, 96% ili više, ili 97% ili više; i koj vraća ADAM6-povezani ili (u ne-mišjem) ADAM6 srodnom ortologu gubitak fertiliteta. Na primer, u genetički modifikovanom mužjaku pacova kome nedostaje ADAM6 funkcija (npr., pacov sa endogenim varijabilnim regionom imunoglobulinskog teškog lanca zamenjen sa humanim varijabilnim regionom imunoglobulinskog teškog lanca, ili nokaut u regionu imunoglobulinskog teškog lanca pacova), gubitak fertiliteta kod pacova je vraćen dodavanjem ADAM6 pacova ili, u nekim aspektima, ortologa ADAM6 pacova (npr., ADAM6 ortolog drugog soja ili vrste pacova, ili, u jednom aspektu, od miša).
[0413] Stoga, u različitim aspektima, genetički modifikovane životinje koje nisu fertilne ili imaju smanjenu fertilnost usled modifikacija sekvence nukleinske kiseline koja kodira ADAM6 protein (ili njegov ortolog ili homolog) ili regulatorni region operativno vezan sa sekvencom nukleinske kiseline, sadrže sekvencu nukleinske kiseline koja komplementira, ili obnavlja, gubitak fertiliteta gde sekvenca nukleinske kiseline koja komplementira ili obnavlja gubitak fertiliteta je od različitog soja iste vrste ili od filogenetski srodne vrste. U različitim aspektima, komplement sekvence nukleinske kiseline je ADAM6 ortolog ili homolog ili njegov funkcionalni fragment. U različitim aspektima, komlement ADAM6 ortologa ili homolog ili njegov funkcionalni fragment je od ne-humane životinje koja je blisko srodna genetički modifikovanoj životinji koja ima defekt fertiliteta. Na primer, gde je genetički modifikovana životinja miš određenog soja, ADAM6 ortolog ili homolog ili njegov funkcionalni fragment se može dobiti od miša drugog soja, ili miša srodne vrste. U jednom aspektu, gde su genetički modifikovane životinje koje sadrže defekt fertilnosti iz reda Glodaria, ADAM6 ortolog ili homolog ili njegov funkcionalni fragment je od druge životinje reda Glodaria. U jednom aspektu, genetički modifikovana životinja koja sadrži defekt fertiliteta je iz podreda Myomoropha (npr., jerbu, skočimiševi, mišoliki hrčci, hrčci, pacovi i miševi Novog Sveta, vole, pravi miševi i pacovi, gerbili, vrste iz roda Acomys, grivasti pacov, miševi penjači, kengur pacovi, belorepi pacovi, madagaskarski pacovi i miševi, Platacanthomys lasiurus, slepo kuče, bambus pacovi, zokori), i ADAM6 ortolog ili homolog ili njegov funkcionalni fragment je izabran od životinje iz reda Glodaria, ili podreda Myomorpha.
[0414] U jednom aspektu, genetički modifikovana životinja je od superfamilije Dipodoidea, i ADAM6 ortolog ili njegov homolog ili funkcionalni fragment je od superfamilije Muroidea. U jednom aspektu, genetički modifikovane životinje su od superfamilije Muroidea, i ADAM6 ortolog ili njegov homolog ili njegov funkcionalni fragment je od superfamilije Dipodoidea.
[0415] U jednom aspektu, genetički modifikovana životinja je glodar. U jednom aspektu, glodar je izabran od superfamilije Muroidea, i ADAM6 ortolog ili homolog je od različite vrste unutar superfamilije Muroidea. U jednom aspektu, genetički modifikovana životinja je od familije izabrane od Calomyscidae (npr., mišoliki hrčci), Cricetidae (npr., hrčak, pacovi i miševi Novog Sveta, vole), Muridae (pravi miševi i pacovi, gerbili, vrste iz roda Acomys, grivasti pacovi), Nesomyidae (miševi penjači, kengur pacovi, belorepi pacovi, Madagaskarski pacovi i miševi), Platacanthomyidae (npr., Platacanthomys lasiurus), i Spalacidae (npr., slepi kučići, bambus pacovi, i zokori); i ADAM6 ortolog ili homolog je izabran od različitih vrsta iste familije. U specifičnom aspektu, genetički modifikovani pacov je izabran od pravog miša ili pacova (familija Muridae), i ADAM6 ortolog ili homolog je od vrsta izabranih od gerbila, vrste iz roda Acomys, ili grivastog pacova. U jednom aspektu, genetički modifikovani miš je od članova familije Muridae, i ADAM6 ortolog ili homolog je od različite vrste iz familije Muridae. U specifičnom aspektu, genetički modifikovani glodar je miš iz familije Muridae, i ADAM6 ortolog ili homolog je od pacova, gerbila, vrste iz roda Acomys, ili grivastog pacova iz familije Muridae.
[0416] U različitim aspektima, jedan ili više glodarskih ADAM6 ortologa ili homologa ili njihovih funkcionalnih fragmenata od glodara u familiji vraća fertilitet genetički modifikovanom glodaru iz iste familije kome nedostaje ADAM6 ortolog ili homolog (npr., Cricetidae (npr., hrčci, pacovi i miševi Novog Sveta, vole); Muridae (npr., pravi miševi i pacovi, gerbili, vrste iz roda Acomys, grivasti pacovi)).
[0417] U različitim aspektima, ADAM6 ortolozi, homolozi, i njihovi fragmenti su procenjeni u odnosu na funkcionalnost utvrđivanjem da li ortolog, homolog, ili fragment vraća fertilitet genetički modifikovanom mužjaku ne-humane životinje kojoj nedostaje ADAM6 aktivnost (npr., glodar, npr., miš ili pacov, koji sadrži nokaut ADAM6 ili njegov ortolog). U različitim aspektima, funkcionalnost je definisana kao sposobnost spermatozoida genetički modifikovane životinje kojoj nedostaje endogeni ADAM6 ili njegov ortolog ili homolog da migriraju u jajovod i oplode jaje iste vrste genetički modifikovane životinje.
[0418] U različitim aspektima, mogu se stvoriti miševi koji sadrže delecije ili zamene lokusa varijabilnog regiona endogenog teškog lanca ili njegove delove koji sadrže ektopičnu nukleotidnu sekvencu koja kodira protein koji daje slične koristi za fertilitet kao mišji ADAM6 (npr., ortolog ili homolog ili njegov funkcionalni fragment koji je funkcionalan u mužjaku miša). Ektopična nukleotidna sekvenca može uključivati nukleotidnu sekvencu koja kodira protein koji je ADAM6 homolog ili ortolog (ili njegov fragment) različitog mišjeg soja ili različite vrste, npr., različite vrste glodara, i koji donosi korist za fertilitet, npr., povećan broj okota tokom naznačenog vremenskog perioda, i/ili povećani broj mladunaca po okotu, i/ili sposobnost spermatozoidu mužjaka miša do dođe do jajovoda i oplodi jaje miša.
[0419] U jednom aspektu, ADAM6 je homolog ili ortolog koji je najmanje 89% do 99% identičan sa mišjim ADAM6 proteinom (npr., najmanje 89% do 99% identičan sa mišjim ADAM6a ili mišjim ADAM6b). U jednom aspektu, ektopična nukleotidna sekvenca kodira jedan ili više proteina nezavisno izabranih od proteina najmanje 89% identičnih mišjem ADAM6a, protein najmanje 89% identičan mišjem ADAM6b, i njihovu kombinaciju. U jednom aspektu, homolog ili ortolog je protein pacova, hrčka, miša, ili zamorca koji je ili je modifikovan da bude oko 89% ili više identičan sa mišjim ADAM6a i/ili mišjim ADAM6b. U jednom aspektu, homolog ili ortolog je ili je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičan mišjem ADAM6a i/ili mišjem ADAM6b. U specifičnom aspektu, mišji ADAM6a sadrži SEQ ID NO: 1 ili njegov funkcionalni fragment, i mišji ADAM6b sadrži SEQ ID NO: 2 ili njegov funkcionalni fragment.
[0420] U jednom aspektu, opisane su ne-humane životinje, naznačeno time da ne-humane životinje sadrže (a) inserciju jednog ili više humanih VLi JLgenskih segmenata ushodno od ne-humanog imunoglobulinskog konstantnog regiona teškog lanca, (b) inserciju jednog ili više humanih VL, i JLgenskih segmenata ushodno od ne-humanog imunoglobulinskskog konstantnog regiona lakog lanca, i (c) nukleotidnu sekvencu koja kodira ADAM6 protein ili njegov funkcionalni fragment. U jednom aspektu, ne-humani heavy i/ili konstantni region lakih lanaca su glodarski konstantni regiojnin (npr., izabrani od konstantnih regiona miša, pacova ili hrčka). U jednom aspektu, ne-humani konstantni region lakog lanca je glodarski konstantni region. U specifičnom aspektu, konstantni region lakog lanca je mišji Cκ ili Cκ region pacova. U specifičnom aspektu, konstantni region lakog lanca je mišji Cλ ili Cκ region pacova. U jednom aspektu, humani VLi JLgenski segmenti su Vκ i Jκ genski segmenti. U jednom aspektu, humani VLi JLgenski segmenti su Vλ i Jλ genski segmenti. U jednom aspektu, ne-humane životinje dodatno sadrže jedan ili više humanih DHgenskih segmenata prisutnih između humanih VLi JLgenskih segmenata. Pogodne ne-humane životinje uključuju glodare, npr, miševe, pacove i hrčke. U jednom aspektu, glodar je miš ili pacov.
[0421] U jednom aspektu, ne-humana životinja sadrži najmanje šest do najmanje 40 humanih Vκ genskih segmenata i najmanje jedan do najmanje pet humanih Jκ genskih segmenata. U specifičnom aspektu, ne-humana životinja sadrži šest humanih Vκ genskih segmenata i pet humanih Jκ genskih segmenata. U specifičnom aspektu, ne-humana životinja sadrži 16 humanih Vκ genskih segmenata i pet humanih Jκ genskih segmenata. U specifičnom aspektu, ne-humana životinja sadrži 30 humanih Vκ genskih segmenata i pet humanih Jκ genskih segmenata. U specifičnom aspektu, ne-humana životinja sadrži 40 humanih Vκ genskih segmenata i pet humanih Jκ genskih segmenata. U različitim aspektima, humani Jκ genski segmenti su izabrani od Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4, Jκ5, i njihove kombinacije.
[0422] U jednom aspektu, nukleotidna sekvenca koja kodira ADAM6 protein ili njegov funkcionalni fragment je ektopična kod ne-humane životinje. U jednom aspektu, nukleotidna sekvenca koja kodira ADAM6 protein ili njegov funkcionalni fragment (koji je funkcionalan u ne-humanoj životinji) je prisutan na istoj lokaciji u poređenju sa nehumanim ADAM6 lokusom divljeg tipa. U jednom aspektu, ne-humana životinja je miš i nukleotidna sekvenca kodira mišji ADAM6 protein ili njegov funkcionalni fragment i prisutna je na ektopičnoj lokaciji u genomu ne-humane životinje. U jednom aspektu ne-humana životinja je miš i nukleotidna sekvenca kodira mišji ADAM6 protein ili njegov funkcionalni fragment i prisutna je unutar imunoglobulinskih genskih segmenata. U specifičnom aspektu, imunoglobulinski genski segmenti su genski segmenti teškog lanca ne-humane životinje. U specifičnom aspektu, imunoglobulinski genski segmenti su genski segmenti lakog lanca druge vrste. U jednom aspektu, genski segmenti lakog lanca su humani genski segmenti κ lakog lanca. U jednom aspektu, miš sadrži ektopičnu susednu sekvencu koja sadrži jednu ili više nerearanžirane genske segmente teškog lanca, i ADAM6 sekvenca je unutar ektopične susedne sekvence.
[0423] U jednom aspektu, ne-humanoj životinji nedostaje endogeni imunoglobulinski VLi/ili JLgenski segment na lokusu endogenog imunoglobulinskog lakog lanca. U jednom aspektu, ne-humana životinja sadrži endogene imunoglobulinske VLi/ili JLgenske segmente koji nisu sposobni da se rearanžiraju da bi formiralli imunoglobulinski VLdomen u ne-humanoj životinji. U jednom aspektu, svi ili suštinski svi endogeni imunoglobulinski Vκ i Jκ genski segmenti su zamenjeni sa jednim ili više humanih Vκ i Jκ genskih segmenata. U jednom aspektu, svi ili suštinski svi endogeni imunoglobulinski Vλ i Jλ genski segmenti su deletirani u celini ili delimično. U jednom aspektu, svi ili suštinski svi endogeni imunoglobulinski VLi JLgenski segmenti su intaktni u ne-humanoj životinji i ne-humana životinja sadrži jedan ili više humanih Vκ genskih segmenata i jedan ili više humanih Jκ genskih segmenata inseriranih između endogenih imunoglobulinskih VLi/ili JLgenskih segmenata i endogenog imunoglobulinskog konstantnog regiona lakog lanca. U specifičnom aspektu, intaktni endogeni imunoglobulinski VLi JLgenski segmenti su načinjeni nesposobnim za rearanžman da bi formirali VLdomen antitela u ne-humanoj životinji. U jednom aspektu, lokus endogenog imunoglobulinskog lakog lanca ne-humane životinje je lokus imunoglobulinskog κ lakog lanca. U jednom aspektu, endogeni imunoglobulinski VLi JLgenski segmenti su Vκ i Jκ genski segmenti.
[0424] U jednom aspektu, opisane su ćelije i/ili tkiva izvedena iz ne-humanih životinja kao
1
što je ovde opisano, naznačeno time da ćelije i/ili tkiva sadrže (a) inserciju jednog ili više humanih Vκ i Jκ genskih segmenata ushodno of nehumanog imunoglobulinskskog konstantnog regiona lakog lanca, (b) inserciju jednog ili više humanih Vκ i Jκ genskih segmenata ushodno od ne-humanog imunoglobulinskog konstantnog regiona teškog lanca, i (c) nukleotidnu sekvencu koja kodira ADAM6 protein ili njegov funkcionalni fragment. U jednom aspektu, ne-humani konstantni region teških i/ili lakih lanaca su mišji konstantni regioni. U jednom aspektu, ne-humani konstantni region teških i/ili lakih lanaca su konstantni regioni pacova. U jednom aspektu, ne-humani konstantni region teških i/ili lakih lanaca su konstantni regioni hrčka.
[0425] U jednom aspektu, nukleotidna sekvenca koja kodira ADAM6 protein ili njegov funkcionalni fragment je ektopična u ćeliji i/ili tkivu. U jednom aspektu, nukleotidna sekvenca koja kodira ADAM6 protein ili njegov funkcionalni fragment je prisutna na istoj lokaciji u poređenju sa ne-humanim ADAM6 lokusom divljeg tipa. U jednom aspektu nehumana ćelija i/ili tkivo je izvedeno iz miša i nukleotidna sekvenca kodira mišji ADAM6 protein ili njegov funkcionalni fragment i prisutna je na ektopičnoj lokaciji. U jednom aspektu, ne-humana ćelija i/ili tkivo je izvedeno iz miša i nukleotidna sekvenca kodira mišji ADAM6 protein ili njegov funkcionalni fragment i prisutna je unutar imunoglobulinskih genskih segmenata. U specifičnom aspektu, imunoglobulinski genski segmenti su genski segmenti teškog lanca. U specifičnom aspektu, imunoglobulinski genski segmenti su genski segmenti lakog lanca. U jednom aspektu, susedne sekvence genskih segmenata endogenog teškog lanca su postavljene ektopično u nehumanoj životinji, naznačeno time da susedna sekvenca ektopično postavljenih genskih segmenata endogenog teškog lanca sadrži ADAM6 gen koji je funkcionalan u mišu (npr., u mužjaku miša).
[0426] U jednom aspektu, opisana je upotreba ne-humane životinje kao što je ovde opisano za stvaranje antigen-vezujućeg proteina, naznačeno time da ne-humana životinja eksprimira (a) antitelo koje sadrži (i) imunoglobulinski laki lanac koji sadrži humani Vκ domen i ne-humani konstantni region lakog lanca i (ii) imunoglobulinski teški lanac koji sadrži humani Vκ domen i ne-humani konstantni region; i (b) ADAM6 protein ili njegov funkcionalni fragment. U jednom aspektu, antigen vezujući protein je humani. U jednom aspektu, ne-humana životinja je glodar i ne-humani konstantni regioni su glodarski konstantni regioni. U specifičnom aspektu, glodar je miš.
[0427] U jednom aspektu, opisana je ne-humana ćelija ili tkivo izvedeno iz ne-humane životinje kao što je ovde opisano. U jednom aspektu, ne-humana ćelija ili tkivo sadrži jedan ili više humanih imunoglobulinskih Vκ genskih segmenata i najmanje jedan humani imunoglobulinski Jκ genski segment susedan ne-humanom genu konstantnog regiona
2
imunoglobulinskskog lakog lanca i jedan ili više humanih Vκ i jedan ili više humanih Jκ genskih segmenata susednih ne-humanom genu imunoglobulinskog konstantnog regiona teškog lanca, naznačeno time da ćelija ili tkivo eksprimira ADAM6 protein ili njegov funkcionalni fragment. U jednom aspektu, ne-humani gen konstantnog regiona lakog lanca je mišji Cκ.
[0428] U jednom aspektu, nukleotidna sekvenca koja kodira ADAM6 protein ili njegov funkcionalni fragment je ektopična. U jednom aspektu, nukleotidna sekvenca koja kodira ADAM6 protein ili njegov funkcionalni fragment je locirana na položaju koji je isti kao u nehumanoj ćeliji divljeg tipa. U različitim aspektima, ne-humana ćelija je mišja B ćelija. U različitim aspektima, ne-humana ćelija je embrionalna stem ćelija.
[0429] U jednom aspektu, tkivo je izvedeno iz slezine, kostne srži ili limfnog čvora nehumane životinje.
[0430] U jednom aspektu, opisana je upotreba ćelije ili tkiva izvedenog iz ne-humane životinje kao što je ovde opisano da bi se stvorio hibridom ili kvadrom.
[0431] U jednom aspektu, opisana je ne-humana ćelija koja sadrži modifikovani genom kao što je ovde opisano, naznačeno time da ne-humana ćelija je oocita, embrion domaćin, ili fuzija ćelije od ne-humane životinje kao što je ovde opisano i ćelija različite ne-humane životinje.
[0432] U jednom aspektu, opisana je upotreba ćelije ili tkiva izvedenog iz ne-humane životinje kao što je ovde opisano da bi se stvorio humani antigen-vezujući protein. U jednom aspektu, humani antigen-vezujući protein sadrži humani Vκ domen izolovan iz ne-humane životinje kao što je ovde opisano.
[0433] U jednom aspektu, opisan je postupak za stvaranje antigen-vezujućeg proteina koji se vezuje sa antigenom od interesa, naznačeno time da postupak sadrži (a) izlaganje ne-humane životinje kao što je ovde opisano antigenu od interesa, (b) izolovanje jednog ili više B limfocita ne-humane životinje, naznačeno time da jedan ili više B limfocita eksprimira VLvezujući protein koji vezuje antigen od interesa, i (c) identifikaciju sekvence nukleinske kiseline koja kodira VLdomen VLvezujućeg proteina koji vezuje antigen od interesa, naznačeno time da VLvezujući protein sadrži humani Vκ domen i ne-humani konstantni region lakog lanca i humani Vκ domen i ne-humani konstantni domen teškog lanca, i (d) upotrebu sekvence nukleinske kiseline iz (c) sa humanom sekvencom nukleinske kiseline imunoglobulinskog konstantnog regiona da bi se stvorio humani antigen-vezujući protein koji vezuje antigen od interesa.
[0434] U jednom aspektu, ne-humani konstantni region lakog lanca VLvezujućeg proteina je mišji Cκ. U jednom aspektu, ne-humani konstantni domen teškog lanca VLvezujućeg proteina je mišji Cγ. U jednom aspektu, ne-humana životinja je miš.
[0435] U jednom aspektu, opisan je fertilni mužjak miša koji sadrži modifikaciju na lokusu imunoglobulinskog teškog lanca, naznačeno time da fertilni mužjak miša sadrži ektopičnu ADAM6 sekvencu koja je funkcionalna u mužjaku miša.
Ektopični ADAM6 u modifikovanim lokusima imunoglobulinskog teškog lanca
[0436] Razvoj targetinga gena, npr., razvoj veštačkih bakterijskih hromozoma (BACs), sada omogućava rekombinaciju relativno velikih genomskih fragmenata. BAC inženjering je omogućio da se stvaraju velike delecije, i velike insercije, u mišje ES ćelije.
[0437] Miševi koji stvaraju humana antitela (tj., humane varijabilne regione) dostupni su sada već neko vreme. Iako predstavljaju važan napredak u razvoju humanih terapeutskih antitela, ovi miševi pokazuju više značajnih abnormalnosti koje ograničavaju njihovu korisnost. Na primer, oni pokazuju kompomitovano razviće B ćelija. Kompromitovano razviće može biti usled različitih razlika između transgenih miševa i miševa divljeg tipa.
[0438] Humana antitela ne moraju optimalno interagovati sa mišjim pre B ćelijama ili B ćelijskim receptorima na površini mišje ćelije koji signalizuju maturaciju, proliferaciju, ili preživljavanje tokom klonske selekcije. Potpuno humana antitela ne moraju optimalno interagovati sa mišjim Fc receptorskim sistemom; miševi eksprimiraju Fc receptore koji ne prikazuju jedan-prema-jedan podudaranje sa humanim Fc receptorima. Konačno, različiti miševi koji stvaraju potpuno humana antitela ne uključuju sve prave mišje sekvence, npr., nishodne enhanser elemente i druge kontrolne elemente lokusa, koji mogu biti neophodni za razvoj B ćelije divljeg tipa.
[0439] Miševi koji stvaraju potpuno humana antitela generalno sadrže lokuse endogenog imunoglobulina koji su onesposobljeni na neki način, i humane transgene koji sadrže varijabilne i konstantne imunoglobulinske genske segmente su introdukovani u randomizovanu lokaciju u mišjem genomu. Sve dok je endogeni lokus dovoljno onesposobljen tako da ne rearanžira genske segmente da bi formirao funkcionalni imunoglobulinski gene, cilj stvaranja potpuno humanih antitela u takvom mišu može biti postignut iako sa kompromitovanim razvićem B ćelija.
[0440] Iako su prisiljeni da stvore potpuno humana antitela od humang transgenog lokusa, stvaranje humanih antitela u mišu je očigledno nefavorizovan proces. U nekim miševima, proces je toliko nefavorizovan da rezultuje u formiranju himernih humanih varijabilnih/mišjih konstantnih teških lanaca (ali ne lakih lanaca) za mehanizam trans-promene. Ovim mehanizmom, transkripti koji kodiraju potpuno humana antitela podležu promeni izotipa u trans od humanog izotipa u mišji izotip. Proces je u trans, jer je potpuno humani transgen
4
lociran razdvojeno od endogenog lokusa koji zadržava neoštećenu kopiju gena mišjeg konstantnog regiona. Iako je kod tih miševa trans-promena lako uočljiva fenomen je još uvek nedovoljan da bi se spasao razvoj B ćelija, koji ostaje veoma oslabljen. U bilo kom slučaju, trans-promenjena antitela stvorena u takvim miševima zadržavaju potpuno humane lake lance, jer fenomen trans-promene očigledno se ne dešava u odnosu na lake lance; transpromena verovatno se zasniva na promeni sekvence u korišćenim endogenim lokusima (iako različito) u normalni izotip koji se menja u cis. Stoga, čak i kada miševi stvoreni inženjeringom da stvaraju potpuno humana antitela biraju mehanizam trans-promene da stvaraju antitela sa mišjim konstantnim regionima, strategija je i dalje nedovoljna da se vrati normalni razvoj B ćelija.
[0441] Primarni problem za stvaranje antitelo-zasnovanih humanih terapeutika je stvaranje dovoljno velike raznovrsnosti sekvence humanog imunoglobulinskog varijabilnog regiona da bi se identifikovali korisni varijabilni domeni koji specifično prepoznaju određene epitope i vezuju ih sa željenim afinitetom, obično-ali ne uvek-sa visokim afinitetom. Pre razvoja VELOCIMMUNE® miševa (opisanih ovde), nije bilo indikacije da bi miševi koji eksprimiraju humane varijabilne regione sa mišjim konstantnim regionim pokazali bilo kakve značajne razlike u odnosu na miševe koji su stvarali humana antitela od transgena. Ta pretpostavka je, međutim, bila netačna.
[0442] VELOCIMMUNE® miševi, koji sadrže preciznu zamenu mišjih varijabilnih regiona imunoglobulina sa humanim imunoglobulinskim varijabilnim regionima na endogenim lokusima, pokazuju iznenađujuću i izvanrednu sličnost sa miševima divljeg tipa u odnosu na razvoj B ćelija. U iznenađujućem i zapanjujućem razvoju, VELOCIMMUNE® miševi pokazali su suštinski normalni, odgovor divljeg tipa na imunizaciju koji se razlikovao samo u jednom značajnom pogledu od miševa divljeg tipa-varijabilni regioni stvoreni kao odgovor na imunizaciju su potpuno humani.
[0443] VELOCIMMUNE® miševi sadrže precizne, velike zamene varijabilnih regiona klicine linije mišjeg imunoglobulinskog teškog lanca (IgH) i imunoglobulinski laki lanac (npr., κ laki lanac, Igκ) sa odgovarajućim humanim imunoglobulinskim varijabilnim regionima, na endogenim lokusima. Ukupno, oko šest megabaza mišjih lokusa su zamenjeni sa oko 1.5 megabaza humane genomske sekvence. Ova precizna zamena rezultuje u mišu sa hibridnim imunoglobulinskim lokusima koji stvaraju teške i lake lance koji imaju humane varijabilne regione i mišji konstantni region. Precizna zamena mišjih VH-DH-JHi Vκ-Jκ segmenata ostavlja flankirajuće mišje sekvence intaktnim i funkcionalnim na hibridnim imunoglobulinskim lokusima. Humoralni imuni sistem miša funkcioniše kao onaj kod miša divljeg tipa. Razviće B ćelija nije ugrožena ni na koji značajan način i bogati diverzitet humanih varijabilnih regiona je generisan u mišu nakon imunizacije sa antigenom.
[0444] VELOCIMMUNE® miševi su mogući jer imunoglobulinski genski segmenti za teške i κ lake lance se rearanžiraju slično kod ljudi i miševa, što ne znači da su njihovi lokusi isti ili čak blizu toga-jasno je da nisu. Međutim, lokusi su dovoljno slični da se humanizacija lokusa varijabilnog gena teškog lanca može postići zamenom oko tri miliona baznih parova kontig mišje sekvence koja sadrži sve VH, DH, i JHgenske segmente sa oko jedan milion baza kontig humane genomske sekvence koja pokriva praktično ekvivalentnu sekvencu humanog imunoglobulinskog lokusa.
[0445] U nekim aspektima, dodatna zamena određene sekvence mišjeg gena konstantnog regiona sa humanom sekvencom gena (npr., zamena mišje CH1 sekvence sa humanom CH1 sekvencom, i zamena mišje CLsekvence sa humanom CLsekvencom) rezultuje u miševima sa hibridnim imunoglobulinskim lokusima koji stvaraju antitela koja imaju humane varijabilne regione i delimično humane konstantne regione, pogodne za, npr., stvaranje potpuno humanih fragmenata antitela, npr., potpuno humanih Fab’s. Miševi sa hibridnim imunoglobulinskim lokusima pokazuju normalni rearanžman varijabilnog genskog segmenta, normalnu somatsku hipermutaciju, i normalnu promenu klase. Ovi miševi pokazuju humoralni imuni sistem koji se ne može razlikovati od miševa divljeg tipa, i pokazuje normalne populacije ćelija na svim stadijumima razvoja B ćelije i normalne strukture limfoidnog organa-čak i gde miševima nedostaje puni repertoar humanih genskih segmenata varijabilnog regiona. Imunizacija ovih miševa rezultuje u robusnim humoralnim odgovorima koji pokazuju širok diverzitet korišćenja varijabilnog genskog segmenta.
[0446] Precizna zamena mišjih genskih segmenata varijabilnog regiona klicine linije omogućava stvaranje miševa koji imaju delimično humane imunoglobulinske lokuse. Kako se delimično humani imunoglobulinski lokusi rearanžiraju, hipermutiraju, i normalno menjaju klasu, delimično humani imunoglobulinski lokusi stvaraju antitela u mišu koja sadrže humane varijabilne regione. Nukleotidne sekvence koje kodiraju varijabilne regione mogu se identifikovati i klonirati, zatim fuzionisati (npr., u in vitro sistemu) sa bilo kojom sekvencom po izboru, npr., bilo kojim imunoglobulinskim izotipom pogodnim za određenu upotrebu, rezultujući u antitelu ili antigen-vezujućem proteinu izvedenom u potpunosti od humane sekvence.
[0447] Humanizacija u velikom obimu sa postupcima rekombinacije je korišćena da bi se modifikovala mišje embrionalne matične (ES) ćelije da bi se stvorio jedinstveni lokus imunoglobulinskog teškog lanca sa preciznom zamenom do tri megabaze imunoglobulinskog lokusa mišjeg teškog lanca uključujući suštinski sve od mišjih VH, DH, i JHgenskih segmenata sa do segmenta od pola megabaze humanog genoma koji sadrži jedan od dva ponovka koji kodiraju suštinski sve humane Vκ i Jκ genske segmente. Dodatno, segment do pola megabaze humanog genoma koji sadrži jedan od dva ponovka koja kodiraju suštinski sve humane Vκ i Jκ genske segmene je korišćen da se zameni mišji segment od tri megabaze imunoglobulinskog lokusa κ lakog lanca koji sadrži suštinski sve mišje Vκ i Jκ genske segmente. Miševi sa takvim zamenjenim imunoglobulinskim lokusima mogu sadržati disrupciju ili deleciju mišjeg ADAM6 lokusa, koji se normalno nalazi između najviše 3’- VHgenskog segmenta i najviše 5’- DHgenskog segmenta na lokusu mišjeg imunoglobulinskog teškog lanca. Disrupcija u ovom regionun može dovesti do redukcije ili eliminacije funkcionalnosti mišjeg ADAM6 lokusa.
[0448] Opisani su miševi koji sadrže zamenjene lokuse kao što je prethodno opisano, i koij takođe sadrže ektopičnu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira mišji ADAM6, pri čemu miševi pokazuju suštinski noramlnu fertilnost. U jednom aspektu, ektopična sekvenca nukleinske kiseline je postavljena između humanog VLgenskog segmenta i humanog JLgenskog segmenta ili ushodno od najviše 5’- humanog VLgenskog segmenta na modifikovanom endogenom lokusu teškog lanca. Smer transkripcije ADAM6 gena može biti suprotan (SL. 7) ili isti (SL. 8) u odnosu na smer transkripcije okružujućih humanih VLgenskih segmenata. Iako ovde primeri pokazuju obnavljanje fertiliteta postavljanjem ektopične sekvence između naznačenih humanih VLi JLgenskih segmenata ili ushodno od najviše 5’- humanog VLgenskog segmenta, stručnjaci će prepoznati da se može očekivati da postavljanje ektopične sekvence na bilo koji pogodni transkripciono-permisivni lokus u mišjem genomu (ili čak ekstra-hromozomski) slično obnavlja fertilitet kod mužjaka miša. U različitim aspektima, ektopična sekvenca nukleinske kiseline je izabrana od SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 i SEQ ID NO: 5, naznačeno time da ektopična sekvenca kodira jedan ili više ADAM6 proteina, naznačeno time da jedan ili više ADAM6 proteina sadrže SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 ili njihovu kombinaciju.
[0449] Fenomen komplementacije miša kome nedostaje funkcionalni ADAM6 lokus sa ektopičnom sekvencom koja sadrži mišji ADAM6 gen ili ortolog ili homolog ili njegov funkcionalni fragment je generalni postupak koji je primenjiv na spasavanje bilo kog miševa sa nefunkcionalnim ili miniimalno funkcionalnim endogenim ADAM6 lokusima. Stoga, mnogi miševi koji sadrže ADAM6-disruptujuću modifikaciju lokusa imunoglobulinskog teškog lanca mogu se spasiti sa kompozicijama i postupcima opisanim ovde. Shodno tome, predmetno otkriće sadrži miševe sa širokim opsegom modifikacija lokusa imunoglobulinskog teškog lanca koje kompromituju funkciju endogenog ADAM6. Neki (neograničavajući) primeri su obezbeđeni u ovom opisu. Dodatno opisanim miševima, kompoziicje i postupci koji se odnose na ADAM6 mogu se koristiti za mnoge primene, npr., kada se modifikuje lokus teškog lanca na veoma različite načine.
[0450] U jednom aspektu, opisan je miš koji sadrži ektopičnu ADAM6 sekvencu koja kodira funkcionalni ADAM6 protein (ili ortolog ili homolog ili njegov funkcionalni fragment), zamenu svih ili suštinski svih mišjih VHgenskih segmenata sa jednim ili više humanih VLgenskih segmenata, zamenu svih ili suštinski svih mišjih DHgenskih segmenata i JHgenskih segmenata sa humanim JLgenskim segmentima; naznačeno time da mišu nedostaje CH1 i/ili zglobni region. U jednom aspektu, miš stvara vezujući protein sa jednim varijabilnim domenom koji je dimer imunoglobulinskih lanaca izabran od: (a) humanog VL- mišjeg CH1 -mišjeg CH2 - mišjeg CH3; (b) humanog VL-mišjeg zgloba - mišjeg CH2 - mišjeg CH3; i, (c) humanog VL- mišjeg CH2 - mišjeg CH3.
[0451] U jednom aspektu, nukleotidna sekvenca koja obnavlja fertilitet je postavljena unutar sekvence varijabilnog regiona humanog imunoglobulinskog lakog lanca (npr., između humanih Vκ4-1 i Jκ1 genskih segmenata) u mišu koji ima zamenu svih ili suštinski svih mišjih varijabilni genskih segmenata imunoglobulinskog teškog lanca (mVH’s, mDH’s, i mJH’s) sa jednim ili više humanih imunoglobulinskih varijabilnih genskih segmenata κ lakog lanca (hVκ’s i hJκ’s), i miš dodatno sadrži zamenu svih ili suštinski svih mišjih varijabilnih genskih segmenata imunoglobulinskog κ lakog lanca (mVκ’s, mJκ’s) sa jednim ili više humanih imunoglobulinskih varijabilnih genskih segmenata κ lakog lanca (hVκ’s i hJκ’s).
[0452] U jednom aspektu, funkcionalni mišji ADAM6 lokus (ili ortolog ili homolog ili njegov funkcionalni fragment) mogu se postaviti usred humanih VLgenskih segmenata ili ushodno od najviše 5’- humanog VLgenskog segmenta, naznačeno time da humani VLgenski segmenti zamenjuju endogene VHgenske segmente. U jednom aspektu, svi ili suštinski svi mišji VHgenski segmenti su uklonjeni i zamenjeni sa jednim ili više humanih VLgenskih segmenata, i mišji ADAM6 lokus je postavljen neposredno susedno u odnosu na 5’ kraj najviše 5’-humanih VLgenskih segmenata, ili između dva humana VLgenska segmenta. U specifičnom aspektu, mišji ADAM6 lokus je postavljen između dva VLgenska segmenta blizu 3’ terminusa inseriranih humanih VLgenskih segmenata. U specifičnom aspektu, aranžman humanih VLgenskih segmenata je onda sledeći (od ushodno do nishodno u odnosu na smer transkripcije humanih VLgenskih segmenata): humani Vκ5-2-mišji ADAM6 lokus-humani Vκ4-1. U specifičnom aspektu, aranžman humanih VLgenskih segmenata je onda sledeći (od ushodno do nishodno u odnosu na smer transkripcije humanih VLgenskih segmenata): mišji ADAM6 lokus-humani Vκ2-40, naznačeno time da humani Vκ2-40 je najviše 5’- humani VLgenski segment na modifikovanom lokusu imunoglobulinskog teškog lanca. U jednom aspektu, orijentacija jednog ili više mišjih ADAM6a i mišjih ADAM6b mišjeg ADAM6 lokusa je suprotna u odnosu na smer transkripcije u poređenju sa orijentacijom humanih VLgenskih segmenata. U jednom aspektu, orijentacija jednog ili više mišjih ADAM6a i mišjih ADAM6b mišjeg ADAM6 lokusa je ista u odnosu na smer transkripcije u poređenju sa orijentacijom humanih VLgenskih segmenata.
[0453] U jednom aspektu, funkcionalni mišji ADAM6 lokus (ili ortolog ili homolog ili njegov funkcionalni fragment) može se postaviti između humanog VLgenskog segmenta i humanog JLgenskog segmenta (tj., u intergenskom regionu između najviše 3’- humanog VLgenskog segmenta i najviše 5’- JLgenskog segmenta), naznačeno time da humani VLi JLgenski segmenti zamenjuju endogene VHgenske segmente. U jednom aspektu, svi ili suštinski svi mišji VHgenski segment su uklonjeni i zamenjeni sa jedanim ili više humanih VLgenskih segmenata i jednim ili više humanih JLgenskih segmenata, i mišji ADAM6 lokus je postavljen neposredno susedno u odnosu na 3’ kraj najviše 3’- humanog VLgenskog segmenta i neposredno susedno u odnosu na 5’ kraj najviše 5’- humanog JLgenskog segmenta. U specifičnom aspektu, jedan ili više humanih VLgenskih segmenata i jedan ili više humanih JLgenskih segmenata su VK i JK genski segmenti. U specifičnom aspektu, aranžman humanih VLgenskih segmenata je onda sledeći (od ushodno do nishodno u odnosu na smer transkripcije humanih VLgenskih segmenata): humani Vκ4-1-mišji ADAM6 lokus-humani Jκ1. U jednom aspektu, orijentacija jednog ili više mišjih ADAM6a i mišjih ADAM6b mišjeg ADAM6 lokusa je supsrotna u odnosu na smer transkripcije u poređenju sa orijentacijom humanih VLgenskih segmenata. U jednom aspektu, orijentacija jednog ili više mišjih ADAM6a i mišjih ADAM6b mišjeg ADAM6 lokusa je ista u odnosu na smer transkripcije u poređenjusa orijentacijom humanih VLgenskih segmenata.
[0454] Miš modifikovan sa jednim ili više humanih VLgenskih segmenata (npr., Vκ ili Vλ segmentima) koji zamenjuju sve ili suštinski sve endogene VHgenske segmente može se modifikovati tako da ili zadržava endogeni ADAM6 lokus, kao što je opisano prethodno, npr., upotrebom targeting vektora koji ima nishodno homologu ruku koja uključuje mišji ADAM6 lokus ili njegov funkcionalni fragment, ili da zameni oštećeni mišji ADAM6 lokus sa ektopičnom sekvencom postavljenom između dva humana VLgenska segmenta ili između humanih VLgenskih segmenata i DHgenskog segmenta (bilo da su humani ili mišji, npr., Vλ m/hDH), ili J genskog segmenta (bilo da su humani ili mišji, npr., Vκ JH). U jednom aspektu, zamena uključuje dva ili više humanih VLgenskih segmenata, i mišji ADAM6 lokus ili njegov funkcionalni fragment je postavljen između dva najviše 3’- VLgenska segmenta. U specifičnom aspektu, aranžman humanih VLgenskih segmenata je onda sledeći (od ushodno do nishodno u odnosu na smer transkripcije humanih genskih segmenata): humani VL3’-1 -mišji ADAM6 lokus - humani VL3’. U jednom aspektu, orijentacija jednog ili više mišjih ADAM6a i mišjih ADAM6b mišjeg ADAM6 lokusa je suprotna u odnosu na smer transkripcije u poređenju sa orijentacijom humanih VLgenskih segmenata. Alternativno, mišji ADAM6 lokus se može postaviti u intergenski region između najviše 3’- humanog VLgenskog segmenta i najviše 5’- JLgenskog segmenta.
[0455] U jednom aspektu, opisan je miš sa zamenom jednog ili više endogenih VHgenskih segmenata, i koji sadrži najmanje jedan endogeni DHgenski segment. U takvom mišu, modifikacija endogenih VHgenskih segmenata može sadržati modifikaciju jednog ili više od najviše 3’- VHgenskih segmenata, ali ne najviše 5’- DHgenskog segmenta, gde je vođeno računa da takva modifikacija jednog ili više najviše 3’- VHgenskih segmenata ne izazove disrupciju ili učini nefunkcionalnim endogeni ADAM6 lokus. Na primer, u jednom aspektu miš sadrži zamenu svih ili suštinski svih endogenih VHgenskih segmenata sa jednim ili više humanih VLgenskih segmenata, i miš sadrži jedan ili više endogenih DHgenskih segmenata i funkcionalni endogeni ADAM6 lokus.
[0456] U sledećem aspektu, miš sadrži modifikaciju endogenog najviše 3’ VHgenskih segmenata, i modifikaciju jednog ili više endogenih DHgenskih segmenata, i modifikacija je izvedena tako da se održi integritet endogenog ADAM6 lokusa do stepena da endogeni ADAM6 lokus ostaje funkcionalan. U jednom primeru, takva modifikacija je urađena u dva koraka: (1) zamena najviše 3’ endogenih VHgenskih segmenata sa jednim ili više humanih VLgenskih segmenata korišćenjem targeting vektora sa ushodnom homologom rukom i nishodnom homologom rukom naznačeno time da nishodna homologa ruka uključuje ceo ili deo funkcionalnog mišjeg ADAM6 lokusa; (2) zatim zamenu i endogenog DHgenskog segmenta sa targeting vektorom koji ima ushodno homologu ruku koja uključuje ceo ili funkcionalni deo mišjeg ADAM6 lokusa.
[0457] U različitim aspektima, upotreba miševa koji sadrže ektopičnu sekvencu koja kodira mišji ADAM6 protein ili ortolog ili homolog ili njegov funkcionalni homolog su korisni gde modifikacije izazivaju disrupciju funkcije endogenog mišjeg ADAM6. Verovatnoća disrupcije funkcije endogenog mišjeg ADAM6 je visoka kada se prave modifikacije mišjih imunoglobulinskih lokusa, naročito kada se modifikuje mišji varijabilni regioni imunoglobulinskog teškog lanca i okolne sekvence. Stoga, takvi miševi obezbeđuju naročitu korist kada se stvaraju miševi sa lokusima imunoglobulinskog teškog lanca koji su deletirani u celini ili delimično, su humanizovani u celini ili delimično, ili su zamenjeni (npr., sa Vκ ili Vλ sekvencama) u celini ili delimično. Postupci za stvaranje genetičkih modifikacija opisani za miševe opisane u nastavku su pozanti stručnjacima.
[0458] Miševi koji sadrže ektopičnu sekvencu koja kodira mišji ADAM6 protein, ili značajno identičan ili sličan protein koji daje korist u odnosu na fertilitet mišjem ADAM6 proteinu, su naročito korisni zajedno sa modifikacijama mišjeg lokusa varijabilnog gena
1
imunoglobulinskog teškog lanca koje izazivaju disrupciju ili deletiraju endogenu ADAM6 sekvencu. Iako su primarno opisani u vezi sa miševima koji eksprimiraju antitela sa humanim varijabilnim regionima i mišjim konstantnim regionima, takvi miševi su korisni u vezi sa bilo kojim genetičkim modifikacijama koje izazivaju disrupciju endogenih ADAM6 gena. Stručnjak će prepoznati da ovo obuhvata veoma raznovrsne genetički modifikovane miševe koji sadrže modifikacije varijabilnih genskih lokusa mišjeg imunoglobulinskog teškog lanca. Oni uključuju, na primer, miševe sa delecijom ili zamenom celog ili dela mišjih genskih segmenata imunoglobulinskog teškog lanca, bez obzira na druge modifikacije. Neograničavajući primeri su opisani u nastavku.
[0459] U nekim aspektima, opisani su genetički modifikovani miševi koji sadrže ektopični mišji, glodarski, ili drugi ADAM6 gen (ili ortolog ili homolog ili fragment) funkcionalan u mišu, i jedan ili više genskih segmenata humanih imunoglobulinskih varijabilnih i/ili konstantnih regiona. U različitim aspektima, drugi ADAM6 gen ortolozi ili homolozi ili fragmenti funkcionalni u mišu mogu uključivati sekvencegoveda, pasa, primata, zeca ili druge ne-humane sekvence.
[0460] U jednom aspektu, opisan je miš koji sadrži ektopičnu ADAM6 sekvencu koja kodira funkcionalni ADAM6 protein, zamenu svih ili suštinski svih mišjih VHgenskih segmenata sa jednim ili više humanih VLgenskih segmenata; zamenu svih ili suštinski svih mišjih DHi JHgenskih segmenata sa jednim ili više humanih JLgenskih segmenata.
[0461] U jednom aspektu, miš dodatno sadrži zamenu mišje CH1 nukleotidne sekvence sa humanom CH1 nukleotidnom sekvencom. U jednom aspektu, miš dodatno sadrži zamenu mišje zglobne nukleotidne sekvence sa humanom zglobnom nukleotidnom sekvencom. U jednom aspektu, miš dodatno sadrži zamenu varijabilnog lokusa imunoglobulinskog lakog lanca (VLi JL) sa varijabilnim lokusom humanog imunoglobulinskog lakog lanca. U jednom aspektu, miš dodatno sadrži zamenu nukleotidne sekvence konstantnog regiona mišjeg imunoglobulinskog lakog lanca sa nukleotidnom sekvencom konstantnog regiona humanog imunoglobulinskog lakog lanca. U specifičnom aspektu, VL, JL, i CLsu sekvence imunoglobulinskog κ lakog lanca. U specifičnom aspektu, miš sadrži mišju CH2 i mišju CH3 imunoglobulinsku sekvencu konstantnog regiona fuzionisanu sa sekvencom humanog zglobnog regiona i humanog CH1, tako da se mišji imunoglobulinski lokusi rearanžiraju da formiraju gen koji kodira vezujući protein koji sadrži (a) teški lanac koji ima humani varijabilni region, humani CH1 region, humani zglobni region, i mišji CH2 i mišji CH3 region; i (b) gen koji kodira imunoglobulinski laki lanac koji sadrži humani varijabilni domen i humani konstantni region.
[0462] U jednom aspektu, opisan je miš koji sadrži ektopičnu ADAM6 sekvencu koja kodira
1 1
funkcionalni ADAM6 protein, zamenu svih ili suštinski svih mišjih VHgenskih segmenata sa jednim ili više humanih VLgenskih segmenata, i izborno zamenu svih ili suštinski svih DHgenskih segmenata i/ili JHgenskih segmenata sa jednim ili više humanih DHgenskih segmenata i/ili humanih JHgenskih segmenata, ili izborno zamenu svih ili suštinski svih DHgenskih segmenata i JHgenskih segmenata sa jednim ili više humanih JLgenskih segmenata.
[0463] U jednom aspektu, miš sadrži zamenu svih ili suštinski svih mišjih VH, DH, i JHgenskih segmenata sa jednim ili više VL, jednim ili više DH, i jednim ili više J genskih segmenata (npr., Jκ ili Jλ), naznačeno time da genski segmenti su operativno vezani za mišji zglobni region, naznačeno time da miš formira rearanžirani gen imunoglobulinskog lanca koji sadrži, od 5’ do 3’ u smeru transkripcije, humani VL- humani ili mišji DH- humani ili mišji J -mišji zglob - mišji CH2 - miš CH3. U jednom aspektu, J region je humani Jκ region. U jednom aspektu, J region je humani JHregion. U jednom aspektu, J region je humani Jλ region. U jednom aspektu, humani VLregion je izabran od humanog Vλ regiona i humanog Vκ regiona.
[0464] U specifičnim aspektima, miš eksprimira antitelo sa jednim varijabilnim domenom koje ima mišji ili humani konstantni region i varijabilni region izveden iz humanih Vκ, humanih DHi humanih Jκ; humanih Vκ, humanih DH, i humanih JH; humanih Vλ, humanih DH, i humanih Jλ; humanih Vλ, humanih DH, i humanih JH; humanih Vκ, humanih DH, i humanih Jλ; humanih Vλ, humanih DH, i humanih Jκ. U specifičnom aspektu, sekvence za prepoznavanje rekombinacije su modifikovane tako da omoguće odvijanje produktivnih rearanžmana između navedenih V, D, i J genskih segmenata ili između navedenih V i J genskih segmenata.
[0465] U jednom aspektu, opisan je miš koji sadrži ektopičnu ADAM6 sekvencu koja kodira funkcionalni ADAM6 protein (ili ortolog ili homolog ili njegov funkcionalni fragment), zamenu svih ili suštinski svih mišjih VHgenskih segmenata sa jednim ili više humanih VLgenskih segmenata, zamenu svih ili suštinski svih mišjih DHgenskih segmenata i JHgenskih segmenata sa humanim JLgenskim segmentima; naznačeno time da mišu nedostaje CH1 i/ili zglobni region.
[0466] U jednom aspektu, mišu nedostaje sekvenca koja kodira CH1 domen. U jednom aspektu, mišu nedostaje sekvenca koja kodira zglobni region. U jednom aspektu, mišu nedostaje sekvenca koja kodira CH1 domen i zglobni region.
[0467] U specifičnom aspektu, miš eksprimira vezujući protein koji sadrži humani imunoglobulinski varijabilni region lakog lanca (λ ili κ) fuzionisan sa mišjim CH2 domenom koji je vezan sa mišjim CH3 domenom.
[0468] U jednom aspektu, opisan je miš koji sadrži ektopičnu ADAM6 sekvencu koja kodira funkcionalni ADAM6 protein (ili ortolog ili homolog ili njegov funkcionalni fragment),
1 2
zamenu svih ili suštinski svih mišjih VHgenskih segmenata sa jednim ili više humanih VLgenskih segmenata, zamenu svih ili suštinski svih mišjih DHi JHgenskih segmenata sa humanim JLgenskim segmentima.
[0469] U jednom aspektu, miš sadrži delecije sekvence gena konstantnog regiona imunoglobulinskog teškog lanca koja kodira CH1 region, zglobni region, CH1 i zglobni region, ili CH1 region i zglobni region i CH2 region.
[0470] U jednom aspektu, miš stvara vezujući protein sa jednim varijabilnim domenom koji sadrži homodimer izabran od sledećeg: (a) humani VL- mišji CH1 - mišji CH2 - mišji CH3; (b) humani VL- mišji zglob - mišji CH2 - mišji CH3; (c) humani VL- mišji CH2 - mišji CH3.
[0471] U jednom aspektu, ne-humana životinja je opisana, koja sadrži modifikovani lokus imunoglobulinskog teškog lanca, naznačeno time da modifikovani lokus imunoglobulinskog teškog lanca sadrži ne-humanu ADAM6 sekvencu ili njen ortolog ili homolog.
[0472] U jednom aspektu, ne-humana životinja je glodar izabran od miša, pacova i hrčka.
[0473] U jednom aspektu, ne-humani ADAM6 ortolog ili homolog je sekvenca koja je ortologa i/ili homologa mišjoj ADAM6 sekvenci, naznačeno time da ortolog ili homolog je funkcionalan u ne-humanoj životinji.
[0474] U jednom aspektu, ne-humana životinja je izabrana od miša, pacova i hrčka i ADAM6 ortolog ili homolog je od ne-humane životinje izabran od miša, pacova i hrčka. U specifičnom aspektu, ne-humana životinja je miš i ADAM6 ortolog ili homolog je od životinje koja je izabrana od različitih vrsta miša, pacova i hrčka. U specifičnom aspektu, ne-humana životinja je pacov, i ADAM6 ortolog ili homolog je od glodara koji je izabran od različitih vrsta pacova, miša i hrčka. U specifičnom aspektu, ne-humana životinja je hrčak, i ADAM6 ortolog ili homolog je od glodara koji je izabran od različitih vrsta hrčka, miša, i pacova.
[0475] U specifičnom aspektu, ne-humana životinja je iz podreda Myomorpha, i ADAM6 sekvenca je od životinje izabrane od glodara iz superfamilije Dipodoidea i glodara iz superfamilije Muroidea. U specifičnom aspektu, glodar je miš iz superfamilije Muroidea, i ADAM6 ortolog ili homolog je od miša ili pacova ili hrčka iz superfamilije Muroidea.
[0476] U jednom aspektu, modifikovani lokus imunoglobulinskog teškog lanca sadrži jedan ili više humanih VLgenskih segmenata i jedan ili više humanih JLgenskih segmenata. U specifičnom aspektu, jedan ili više humanih VLgenskih segmenata i jedan ili više humanih Jλ genskih segmenata su operativno vezani za jedan ili više humanih, himernih i/ili glodarskih (npr., miš ili pacov) gena konstantnog regiona. U jednom aspektu, geni konstantnog regiona su mišji. U jednom aspektu, geni konstantnog regiona su od pacova. U jednom aspektu, geni konstantnog regiona su od hrčka. U jednom aspektu, geni konstantnog regiona sadrže sekvencu izabranu od zglobne, CH2, CH3, i njihove kombinacije. U specifičnom aspektu, geni
1
konstantnog regiona sadrže zglobnu, CH2, i CH3 sekvencu. U jednom aspektu, humani VLi JLgenski segmenti su humani Vκ i Jκ genski segmenti.
[0477] U jednom aspektu, ne-humana ADAM6 sekvenca je susedna humanojsekvenci imunoglobulinskog lakog lanca. U jednom aspektu, ne-humana ADAM6 sekvenca je postavljena unutar sekvence humanog imunoglobulinskog lakog lanca. U specifičnom aspektu, sekvenca humanog imunoglobulinskog lakog lanca sadrži V i/ili J genski segment.
[0478] U jednom aspektu, ne-humana ADAM6 sekvenca je postavljena uz V genski segment. U jednom aspektu, nehumana ADAM6 sekvenca je postavljena između dva V genska segmenta. U jednom aspektu, ne-humana ADAM6 sekvenca je postavljena između V i J genskog segmenta. U jednom aspektu, mišja ADAM6 sekvenca je postavljena između dva J genska segmenta.
[0479] U jednom aspektu, opisana je genetički modifikovana ne-humana životinja, koja sadrži B ćeliju koja eksprimira humani VLdomen srodan sa humanim VLdomenom imunoglobulinskog lokusa, naznačeno time da ne-humana životinja eksprimira neimunoglobulinski ne-humani protein imunoglobulinskog lokusa. U jednom aspektu, neimunoglobulinski ne-humani protein je ADAM protein. U specifičnom aspektu, ADAM protein je ADAM6 protein ili njegov homolog ili ortolog ili funkcionalni fragment.
[0480] U jednom aspektu ne-humana životinja je glodar (npr., miš ili pacov). U jednom aspektu, glodar je iz familije Muridae. U jednom aspektu, glodar je iz subfamilije Murinae. U specifičnom aspektu, glodar iz subfamilije Murinae je izabran od miša i pacova.
[0481] U jednom aspektu, ne-imunoglobulinski ne-humani protein je glodarski protein. U jednom aspektu, glodar je iz familije Muridae. U jednom aspektu, glodar je iz subfamilije Murinae. U specifičnom aspektu, glodar je izabran od miša, pacova i hrčka.
[0482] U jednom aspektu, humani VLdomeni su vezani direktno ili za linker sa sekvencom imunoglobulinskog konstantnog domena. U specifičnom aspektu, sekvenca konstantnog domena sadrži sekvencu izabranu od zgloba, CH2 CH3, i njihovu kombinaciju. U specifičnom aspektu, humani VLdomen je izabran od Vκ ili Vλ domena.
[0483] U različitim aspektima, humani VLdomeni su humani Vκ domeni.
[0484] U jednom aspektu, opisana je genetički modifikovana ne-humana životinja, koja sadrži u svojoj klicinoj liniji humanu imunoglobulinsku sekvencu, naznačeno time da spermatozoid mužjaka ne-humane životinje je karakterisan in vivo migracionim defektom. U jednom aspektu, in vivo migracioni defekt sadrži nesposobnost spermatozoida mužjaka ne-humane životinje do migrira od uterus do jajovoda ženke ne-humane životinje iste vrste. U jednom aspektu, nehumana životinja nema nukleotidnu sekvencu koja kodira i ADAM6 protein ili njegov funkcionalni fragment. U specifičnom aspektu, ADAM6 protein ili njegov
1 4
funkcionalni fragment uključuju ADAM6a i/ili ADAM6b protein ili njihove funkcionalne fragmente. U jednom aspektu, ne-humana životinja je glodar. U specifičnom aspektu, glodar je izabran od miša, pacova, i hrčka.
[0485] U jednom aspektu, opisana je ne-humana životinja, koja sadrži humanu imunoglobulinsku sekvencu susednu sa ne-humanom sekvencom koja kodira ADAM6 protein ili ortolog ili homolog ili njegov funkcionalni fragment. U jednom aspektu, ne-humana životinja je glodar. U specifičnom aspektu, glodar je izabran od miša, pacova i hrčka.
[0486] U jednom aspektu, humana imunoglobulinska sekvenca je sekvenca imunoglobulinskog lakog lanca. U jednom aspektu, imunoglobulinska sekvenca sadrži jedan ili više VLgenskih segmenata. U jednom aspektu, humana imunoglobulinska sekvenca sadrži jedan ili više JLgenskih segmenata. U jednom aspektu, humana imunoglobulinska sekvenca sadrži jedan ili više VLgenskih segmenata i jedan ili više JLgenskih segmenata. U različitim aspektima, humani VLi JLgenski segmenti su humani Vκ i Jκ genski segmenti.
[0487] U jednom aspektu, opisan je miš sa onesposobljenim lokusom endogenog imunoglobulinskog teškog lanca, koi sadrži onemogućen ili deletirani endogeni ADAM6 lokus, naznačeno time da miš sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja eksprimira humano ili mišje ili humano/mišje ili drugo himerno antitelo. U jednom aspektu, sekvenca nukleinske kiseline je prisutna na integrisanom transgenu koji je randomizovano integrisan u mišji genom. U jednom aspektu, sekvenca nukleinske kiseline je na epizomu (npr., hromozom) koja se ne nalazi u mišu divljeg tipa.
[0488] U jednom aspektu, opisan je miš sa onesposobljenim lokusom endogenog imunoglobulinskog teškog lanca, koji sadrži funkcionalni endogeni ADAM6 lokus, naznačeno time da miš sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja eksprimira humano ili mišje ili humano/mišje ili drugo himerno antitelo. U jednom aspektu, sekvenca nukleinske kiseline je prisutna na lokusu endogenog imunoglobulinskog teškog lanca na položaju ushodno od jednog ili više gena endogenog konstantnog regiona teškog lanca. U jednom aspektu, sekvenca nukleinske kiseline je prisutna na integrisanom transgenu koji je randomizovano integrisan u genom miša. U jednom aspektu, sekvenca nukleinske kiseline je na epizomu (npr., hromozom) koji se ne nalazi kod miša divljeg tipa.
Bispecifični vezujući proteini
[0489] Vezujući proteini opisani ovde, i nukleotidna sekvenca koja ih kodira, mogu se koristiti da se stvore multispecifični vezujući proteini, npr., bispecifični vezujući proteini. U ovom aspektu, prvi polipeptid koji se suštinski sastoji od prvog VLdomena fuzionisanog sa
1
CHregionom može se vezati sa drugim polipeptidom koji se suštinski sastoji do drugog VLdomena fuzionisanog sa CHregionom. Tamo gde prvi VLdomen i drugi VLdomen specifično vezuju različiti epitop, bispecifično vezujući molekul se može stvoriti korišćenjem dva VLdomena. CHregion može biti isti ili različit. U jednom aspektu, npr., jedan od CHregiona može biti modifikovan tako da se eliminiše vezujuća determinanta proteina A, dok drugi konstantni region teškog lanca nije tako modifikovan. Ovaj naročiti aranžman pojednostavljuje izolaciju bispecifičnog vezujućeg proteina iz, npr., smeše homodimera (npr., homodimera prvog ili drugog polipeptida).
[0490] U jednom aspektu, postupci i kompozicije opisani ovde korišćeni su za stvaranje bispecifičnih vezujućih proteina. U ovom aspektu, prvi VLkoji je fuzionisan sa CHregionom i drugi VLkoji je fuzionisan sa CHregionom su svaki nezavisno klonirani u okviru sa humanom IgG sekvencom istog izotipa (npr., humana IgG1, IgG2, IgG3, ili IgG4). Prvi VLspecifično vezuje prvi epitop, i drugi VLspecifično vezuje drugi epitop. Prvi i drugi epitop mogu biti na različitim antigenima, ili na istom antigenu.
[0491] U jednom aspektu, IgG izotip CHregiona fuzionisan sa prvim VLi IgG izotip CHregiona fuzionisan sa drugim VLsu istog izotipa, ali se razlikuju po tome što jedan IgG izotip sadrži najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju. U jednom aspektu, najmanje jedna aminokiselinska supstitucija čini teški lanac koj nosi supstituciju nesposobnim ili suštinski nesposobnim da vezuje protein A u poređenju sa teškim lancem kome nedostaje supstitucija.
[0492] U jednom aspektu, prvi CHregion sadrži prvi CH3 domen humanog IgG izabran od IgG1, IgG2, i IgG4; i drugi CHregion sadrži drugi CH3 domen of humanog IgG izabran od IgG1, IgG2, i IgG4, naznačeno time da drugi CH3 domen sadrži modifikaciju koja smanjuje ili eliminiše vezivanje drugog CH3 domena za protein A.
[0493] U jednom aspektu, drugi CH3 domen sadrži 435R modifikaciju, numerisanu u skladu sa EU indeksom od strane Kabat. U sledećem aspektu, drugi CH3 domen dodatno sadrži 436F modifikaciju, numerisanu u skladu sa EU indeksom od strane Kabat.
[0494] U jednom aspektu, drugi CH3 domen je onaj od humanog IgG1 koji sadrži modifikaciju izabranu iz grupe koja se sastoji od D356E, L358M, N384S, K392N, V397M, i V422I, numerisanu u skladu sa EU indeksom od strane Kabat
[0495] U jednom aspektu, drugi CH3 domen je onaj od humanog IgG2 koji sadrži modifikaciju izabranu iz grupe koja se sastoji od N384S, K392N, i V422I, numerisanu u skladu sa EU indeksom od strane Kabat.
[0496] U jednom aspektu, drugi CH3 domen je onaj od humanog IgG4 koji sadrži modifikaciju izabranu iz grupe koja se sastoji od Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q, i V422I, numerisanu u skladu sa EU indeksom od strane Kabat.
1
[0497] U jednom aspektu, vezujući protein sadrži CHregione koji imaju jednu ili više modifikacija kao što je ovde navedeno, naznačeno time konstantni region vezujućeg proteina je neimunogen ili suštinski neimunogen kod ljudi. U specifičnom aspektu, CHregioni sadrže aminokiselinsku sekvencu koja ne prikazuje imunogeni epitop kod ljudi. U sledećem specifičnom aspektu, vezujući protein sadrži CHregion koji se ne nalazi kod divljeg tipa humanog teškog lanca, i CHregion ne sadrži sekvencu koja generiše T-ćelijski epitop.
PRIMERI
[0498] Sledeći primeri su obezbeđeni da bi se opisalo kako se stvaraju i koriste postupci i kompozicije opisane ovde. Ukoliko nije drugačije naznačeno, temperatura je označena u stepenima Celzijusa, i pritisak je ili blizu atmosferskog.
Primer 1. Introdukovanje genskih segmenata humanog lakog lanca u lokus teškog lanca
[0499] Različiti targeting konstrukti su napravljeni korišćenjem VELOCIGENE® tehnologije genetskog inženjerstva (videti, npr., SAD Pat. br.6,586,251 i Valenzuela et al. (2003), Highdoput engineering of mouse genome coupled with highresolution expression analysis, Nat Biotechnol 21:652-659) da bi se modifkovale mišje genomske biblioteke bakterijskog veštačkog hromozoma (BAC). Mišja BAC DNK je modifikovana sa homologom rekombinacijom da bi se inaktivirao lokus endogenog teškog lanca targetiranom delecijom VH, DHi JHgenskih segmenata da bi se izvela insercija nerearanžirane genske sekvence humane klicine linije κ lakog lanca (npr., videti gornji deo SL.2).
[0500] Ukratko, mišji lokus teškog lanca je deletiran u dva sukcesivna targeting događaja korišćenjem rekombinacije posredovane rekombinazom. Prvi targeting događaj uključivao je targeting na 5’ kraju lokusa mišjeg teškog lanca korišćenjem targeting vektora koji se sastoji od 5’ do 3’ – 5’ mišju homologu ruku, mesto prepoznavanja rekombinaze, neomicin kasetu i 3’ homologu ruku.5’ i 3’ homologe ruke su sadržale sekvencu 5’ mišjeg lokusa teškog lanca. Drugi targeting događaj uključivao je targeting na 3’ kraju lokusa mišjeg teškog lanca u regionu JHgenskih segmenata korišćenjem drugog targeting vektora koji je sadržao od 5’ do 3’ – 5’ mišju homologu ruku, 5’ mesto prepoznavanje rekombinaze, drugo mesto prepoznavanja rekombinaze, higromicin kasetu, treće mesto prepoznavanja rekombinaze, i 3’ mišju homologu ruku. 5’ i 3’ homologe ruke sadržale su sekvencu flankirajućih mišjih JHgenskih segmenata i 5’ od intronskog enhansera i konstantnih regiona. Pozitivne ES ćelije koje su sadržale modifikovani lokus teškog lanca targetiran sa oba targeting vektora (kao što
1
je prethodno opisano) potvrđeni su kariotipizacijom. DNK je zatim izolovana iz dvostruko targetiranih ES ćelija i podvrgnuta tretmanu sa rekombinazom čime se posreduje u deleciji lokusa genomske DNK mišjeg teškog lanca između 5’ mesta prepoznavanja rekombinaze u prvom targeting vektoru i 5’ mesta prepoznavanja rekombinaze u drugom targeting vektoru, ostavljajući pojedinačno mesto prepoznavanja rekombinaze i higromicin kasetu flankiranu sa dva mesta prepoznavanja rekombinaze (gornji deo SL. 2). Tako modifikovani lokus mišjeg teškog lanca koji sadrži intaktne CHgene je stvoren za progresivnu inserciju genskih segmenata humane κ klicine linije na precizan način korišćenjem targeting vektora opisanih u nastavku.
[0501] Četiri zasebna targeting vektora je stvoreno inženjeringom da se progresivno izvrši insercija 40 humanih Vκ genskih segmenata i pet humanih Jκ genskih segmenata u inaktivirani lokus mišjeg teškog lanca (opisanog prethodno) korišćenjem standardnih molekularnih tehnika pozantih u tehnici (SL. 2). Humani κ genski segmenti korišćeni za inženjering četiri targeting konstrukta se prirodno nalaze u proksimalnom kontigu lokusa klicine linije humanog κ lakog lanca (donji deo SL.1 i Tabela 1).
[0502] Humani genomski fragment od ∼110,499 bp koji sadrži prvi šest humanih Vκ genskih segmenata i pet humanih Jκ genskih segmenata je stvoren inženjeringom da sadrži PI-Scel mesto 431 bp nishodno (3’) od humanog Jκ5 genskog segmenta. Drugo PI-Scel mesto je stvoreno inženjeringom na 5’ kraju ∼7,852 bp genomskog fragmenta koji sadrži mišji intronski enhanser teškog lanca, IgM region promene (Sm) i IgM genski lokus mišjeg teškog lanca. Ovaj mišji fragment je korišćen kao 3’ homologa ruka ligacijom sa ∼110.5 kb humanim fragmentom, koji je stvorio 3’ spoj koji sadrži, od 5’ do 3’, ∼110.5 kb genomsku sekvencu lokusa humanog κ lakog lanca koji sadrži prvih šest uzastopnih Vκ genskih segmenata i pet Jκ genskih segmenata, PI-Scel mesto, sekvencu od ∼7,852 bp mišjeg teškog lanca koja sadrži mišji intronski enhanser, 3m i mišji IgM konstantnog gena. Ushodno (5’) od humanog Vκ1-6 genskog segmenta bila je dodatna humana κ sekvenca od 3,710 bp pre starta 5’ mišje homologe ruke, koja je sadržala 19,752 bp mišje genomske DNK koja odgovara lokusu 5’ sekvence mišjeg teškog lanca. Između 5’ homologe ruke i početka humane κ sekvence bila je neomicin kaseta flankirana sa tri mesta prepoznavanja rekombinaze (videti Targeting Vektor 1, SL. 2). Finalni targeting vektor za prvu inserciju humane κ sekvence od 5’ do 3’ uključuju 5’ homologu ruku koja sadrži ∼20 kb mišje genomske sekvence 5’ od lokusa teškog lanca, prvo mesto prepoznavanje rekombinaze (R1), neomicin kasetu, drugo mesto prepoznavanja rekombinaze (R2), treće mesto prepoznavanja rekombinaze (R3), ∼110.5 kb od humane genomske κ sekvence koja sadrži prvih šest uzastopnih humanih Vκ genskih segmenata i pet humanih Jκ genskih segmenata, PI-Scel mesto, i 3’ homologu ruku
1
koja sadrži ∼8 kb mišje genomske sekvence uključujući intronski enhanser, Sm i mišji IgM konstantni gen (SL. 2, Targeting Vektor 1). Homologa rekombinacija sa ovim targeting vektorom stvorila je modifikovani lokus mišjeg teškog lanca koji sadrži šest humanih Vκ genskih segmenata i pet humanih Jκ genskih segmenata operativno vezanih za konstantne gene endogenog teškog lanca koji, nakon rekombinacije, dovodi do formiranja hibridnog teškog lanca (tj., humanog Vκ domena i mišjeg CHregiona).
Tabela 1.
[0503] Introdukcija deset dodatnih humanih Vx genskih segmenata u hibridni lokus teškog lanca. Drugi targeting vektor je konstruisan za introdukciju 10 dodatnih humanih Vκ genskih segmenata u modifikovani lokus mišjeg teškog lanca opisanog prethodno (videti SL.
2, Targeting Vektor 2). Humani genomski fragment od 140,058 bp koji sadrži 12 uzastopnih humanih Vκ genskih segmenata od lokusa humanog κ lakog lanca je konstruisan sa 5’ homologom rukom koja sadrži mišju genomsku sekvencu 5’ lokusa mišjeg teškog lanca i 3’ homologu ruku koja sadrži humanu genomsku κ sekvencu. Ushodno (5’) od humanog Vκ1-16 genskog segmenta bila je dodatna 10,170 bp humana κ sekvenca pre početka 5’ mišje homologe ruke, koja je bila ista 5’ homologa ruka korišćena za konstrukciju Targeting Vektora 1 (SL.2). Između 5’ homologe ruke i početka humane κ sekvence bila je higromicin kaseta flankirana sa mestima prepoznavanja rekombinaze. 3’ homologa ruka uključuje preklapanje 31,165 bp humane genomske κ sekvence koja odgovara ekvivalentnom 5’ kraju ∼110.5 kb fragmenta humane genomske κ sekvence Targeting Vektora 1 (SL. 2). Finalni targeting vektor za inserciju 10 dodatnih humanih Vκ genskih segmenata, od 5’ do 3’,
1
uključuje 5’ homologu ruku koja sadrži ∼20 kb mišje genomske sekvence 5’ od lokusa teškog lanca, prvo mesto prepoznavanja rekombinaze (R1), higromicin kasetu, drugo mesto prepoznavanja rekombinaze (R2) i ∼140 kb humanu genomsku κ sekvencu koja sadrži 12 uzastopnih humanih Vλ, genskih segmenata, ∼31 kb od kojih se preklapa sa 5’ krajem humane κ sekvence Targeting Vektora 1 i služi kao 3’ homologa ruka za ovaj targeting konstrukt. Homologa rekombinacija sa ovim targeting vektorom stvorila je modifikovani lokus mišjeg teškog lanca koji sadrži 16 humanih Vκ genskih segmenata i pet humanih Jκ genskih segmenata operativno vezanih za konstantne gene mišjeg teškog lanca koji, nakon rekombinacije, dovodi do formiranja hibridnog teškog lanca.
[0504] Introdukcija četrnaest dodatnih humanih Vx genskih segmenata u lokus hibridnog teškog lanca. Konstruisan je treći targeting vektor za introdukciju 14 dodatnih humanih Vκ genskih segmenata u modifikovani lokus mišjeg teškog lanca opisan prethodno (SL. 2, Targeting Vektor 3).160,579 bp humani genomski fragment koji sadrži 15 uzastopnih humanih Vκ genskih segmenata je konstruisan sa 5’ homologom rukom koja sadrži mišju genomsku sekvencu 5’ od lokusa mišjeg teškog lanca i 3’ homologu ruku koja sadrži humanu genomsku κ sekvencu. Ushodno (5’) od humanog Vκ2-30 genskog segmenta bilo je dodatnih 14,687 bp humane κ sekvence pre početka 5’ mišje homologe ruke, koja je bila ista 5’ homologija korišćena za prethodna dva targeting vektora (opisani prethodno, videti takođe SL. 2). Između 5’ homologe ruke i početka humane κ sekvence bila je noomicin kaseta flankirana sa mestima prepoznavanja rekombinaze. 3’ homologa ruka uključuje 21,275 bp preklapanje humane genomske κ sekvence koja odgovara ekvivalentnom 5’ kraju ∼140 kb fragmenta humane genomske κ sekvence Targeting Vektora 2 (SL. 20). Finalni targeting vektor za inserciju 14 dodatnih humanih Vκ genskih segmenata, od 5’ do 3’ uključuje 5’ homologu ruku koja sadrži -20 kb mišje genomske sekvence 5’ lokusa mišjeg teškog lanca, prvo mesto prepoznavanja rekombinaze (R1), neomicin kasetu, drugo mesto prepoznavanja rekombinaze (R2) i ∼161 kb humane genomske κ sekvence koja sadrži 15 humanih Vκ genskih segmenata, ∼21 kb od kojih se preklapa sa 5’ krajem humane κ sekvence Targeting Vektora 2 i služi kao 3’ homologa ruka za ovaj targeting konstrukt. Homologa rekombinacija sa ovim targeting vektorom stvorila je modifikovanilokus mišjeg teškog lanca koji sadrži 30 humanih Vκ genskih segmenata i pet humanih Jκ genskih segmenata operativno vezanih za konstantne gene mišjeg teškog lanca koji, nakon rekombinacije, dovodi do formiranja himernog κ teškog lanca.
[0505] Introdukcija deset dodatnih humanih Vκ genskih segmenata u lokus hibridnog teškog lanca. Konstruisan je četvrti targeting vektor za introdukciju 10 dodatnih humanih Vκ genskih segmenata u modifikovani lokus mišjeg teškog lanca opisan prethodno (SL. 2,
11
Targeting Vektor 4).90,398 bp humani genomski fragment koji sadrži 16 uzastopnih humanih Vκ genskih segmenata je konstruisan sa 5’ homologom rukom koja sadrži mišju genomsku sekvencu 5’ od lokusa mišjeg teškog lanca i 3’ homologu ruku koja sadrži humanu genomsku κ sekvencu. Ushodno (5’) od humanog Vκ2-40 genskog segmenta bila je dodatna 8,484 bp humana κ sekvenca pre početka 5’ mišje homologe ruke, koja je bila iste 5’ homologije kao prethodni targeting vektori (opisani prethodno, SL. 2). Između 5’ homologe ruke i početka humane κ sekvence bila je higromicin kaseta flankirana sa mestima prepoznavanja rekombinaze. 3’ homologa ruka uključuje 61,615 bp preklapanje humane genomske κ sekvence koja odgovara ekvivalentnom 5’ kraju ∼160 kb fragmenta humane genomske κ sekvence Targeting Vektora 3 (SL. 2). Finalni targeting vektor za inserciju 10 dodatnih humanih Vκ genskih segmenata, od 5’ do 3’, uključuje 5’ homologu ruku koja sadrži ∼20 kb of mišje genomske sekvence 5’ od lokusa mišjeg teškog lanca lokus, prvo mesto prepoznavanja rekombinaze (R1), higromicin kasetu, drugo mesto prepoznavanja rekombinaze (R2) i ∼90 kb humanu genomsku κ sekvencu koja sadrži 16 humanih Vκ genskih segmenata, ∼62 kb od kojih se preklapa sa 5’ krajem humane κ sekvence Targeting Vektore 3 i služi kao 3’ homologa ruka za ovaj targeting konstrukt. Homologa rekombinacija sa ovim targeting vektorom stvorila je modifikovani lokus mišjeg teškog lanca koji sadrži 40 humanih Vκ genskih segmenata i pet humanih Jκ genskih segmenata operativno vezanih za konstantne gene mišjeg teškog lanca koji, nakon rekombinacije, dovode do formiranja himernog κ teškog lanca (dno na SL.2).
[0506] Korišćenjem sličnog pristupa kao to je prethodno opisano, druge kombinacije varijabilnih domena humanog lakog lanca u kontekstu mišjeg konstantnog regiona teškog lancas su konstruisani. Dodatni varijabilni domeni lakog lanca mogu biti izvedeni iz humanih Vλ, i Jλ, genskih segmenata (SL.3 i SL.4).
[0507] Lokus humanog λ lakog lanca lokus prostire se preko 1,000 kb i sadrži preko 80 gena koji kodiraju varijabilne (V) ili spajajuće (J) segmente. Među 70 Vλ, genskih segmenata lokusa humanog λ lakog lanca, bilo gde od 30-38 izgleda da su funkcionalni genski segmenti prema objavljenim radovima. 70 Vλ, sekvence su raspoređene u tri klastera, pri čemu svi sadrže različite članove distinktnih grupa familije V gena (klasteri A, B i C). Unutar humanog lokusa λ lakog lanca, više od polovine svih uočenih Vλ, domeni su kodirani genskim segmentima 1-40, 1-44, 2-8, 2-14, i 3-21. Postoji sedam Jλ, genskih segmenata, od kojih se samo četiri smatraju generalno funkcionalnim Jλ, genski segmenti ↓Jλ1, Jλ2, Jλ3, i Jλ7. U nekim alelima, peti Jλ,-Cλ, par genskih segmenata je navodno pseudo gen (CPλ6) Inkorporacija više humanih Jλ, genskih segmenata u lokus hibridnog teškog lanca, kao što je ovde opisano, je konstruisan de novo sintezom. Na ovaj način, genomski fragment koji sadrži više humanih Jλ, genskih segmenata u konfiguraciji klicine linije je konstruisan sa više humanih Vλ, genskih segmenata i omogućava normalnu V-J rekombinaciju u kontekstu konstantnog regiona teškog lanca.
[0508] Kuplovanje varijabilnih domena lakog lanca sa konstantnim regionom teških lanaca predstavlja potencijalno bogat izvor diverziteta za stvaranje unikatnih VLvezujućih proteina sa humanim VLregionima u ne-humanim životinjama. Korišćenje ovog diverziteta lokusa humanog λ lakog lanca (ili humanog κ lokusa kao što je prethodno opisano) u miševima rezultuje u konstrukciji unikatnih hibridnih teških lanaca i daje dodatnu dimenziju vezujućim proteinima u imunom repertoaru genetički modifikovanih životinja i nakon toga njihove upotrebe kao platforme sledeće generacije za stvaranje terapeutika.
[0509] Dodatno, humani DHi JH(ili Jκ) genski segmenti mogu se inkorporisati ili sa humanim Vκ ili Vλ genskim segmentima da bi se konstruisali novi hibridni lokusi koji će dati, nakon rekombinacije, nove inženjeringom stvorene varijabilne domene (SL. 5 i 6). U poslednje pomenutom slučaju, konstrukcione kombinacije genskih segmenata koji se normalno ne sadrže u jednom lokusu zahtevale bi posebnu pažnju u odnosu na signalne sekvence rekombinacije (RSS) koje su povezane sa respektivnim genskim segmentima tako da se može postići normalna rekombinacija kada su kombinovani u jedan lokus. Na primer, poznato je da V(D)J rekombinacija vođena konzervativnom nekodirajućom DNK sekvencom, poznatom kao heptamer i nonamer sekvence koje se nalaze susedno u odnosu na svaki genski segment na preciznoj lokaciji na kojoj se odvija rekombinacija. Između ovih nekodirajućih DNK sekvenci su nekonzervativni spejser regioni koji su dužine ili 12 ili 23 baznih parova (bp). Generalno, rekombinacija se dešava samo na genskim segmentima lociranim na istom hromozomu i oni genski segmenti flankirani sa 12-bp spejserom mogu se spojiti sa genskim segmentom flankiranim sa 23-bp spejserom, tj.12/23 pravilo, iako je uočeno spajanje dva od DHgenskih segmenata (svaki flankiran sa 12-bp spejsera) u malom broju antitela. Da bi se omogućila rekombinacija između genskih segmenata koji noramlno nemaju kompatibilne spejsere (npr., Vκ i DHili DHi Jλ), sintetisani su unikatni, kompatibilni spejseri na susednim lokacijama sa željenim genskim segmentima za konstrukciju unikatnih hibridnih teških lanaca koji omogućavaju uspešnu rekombinaciju da bi se formirali unikatni teški lanci koji sadrže varijabilne regione lakog lanca.
[0510] Stoga, korišćenjem prethodno opisane strategije za inkorporaciju humanih genskih segmenata κ lakog lanca u lokus endogenog teškog lanca omogućava upotrebu drugih kombinacija humanih genskih segmenata λ lakog lanca kao i specifičnih humanih genskih segmenata teškog lanca (npr., DHi JH) i njihovih kombinacija.
Primer 2. Identifikacija ciljanih ES ćelija i stvaranje genetički modifikovanih miševa koji nose genske segmente humanog lakog lanca u lokusu endogenog teškog lanca
[0511] Targeting BAC DNK napravljena u prethodnim Primerima je korišćena za elektroporaciju mišjih ES ćelija za stvaranje modifikovane ES ćelija za stvaranje himernih miševa koji eksprimiraju VLvezujeće proteine (tj., genske segmente humanog κ lakog lanca operativno vezane za mišji konstantni region teških lanaca). Targetirane ES ćelije koje sadrže inserciju nerearanžiranih genskih segmenata humanog κ lakog lanca su identifikovani sa kvantitativnom PCR analizom, TAQMAN® (Lie, Y.S., i Petropoulos, C.J. (1998) Advances in quantitative PCR technology: 5’ nuclease assays. Curr Opin Biotechnol 9(1): 43-48). Setovi specifičnih prajmera i proba su dizajnirani da se detektuje insercija humane κ sekvence i povezanih selekcionih kaseta, gubitak sekvence mišjeg teškog lanca i zadržavanje mišje sekvence koja flankira lokus endogenog teškog lanca.
[0512] ES ćelije koje nose genske segmente humanog κ lakog lanca mogu se transfektovati sa konstruktom koji eksprimira rekombinazu da bi se uklonila bilo kakva neželjena selekciona kaseta introdukovana insercijom targeting konstrukta koji sadrži humane κ genske segmente. Izborno, miševi koji nose inženjeringom stvoreni lokus teškog lanca koji sadrži genske segmente humanog κ lakog lanca mogu se uktštati sa FLPe deletor mišjim sojem (videti, npr., Rodriguez, C.I. et al. (2000) Highefficiency deletor mice show that FLPe is alternative to Cre-IoxP. Nature Genetics 25: 139-140; US 6,774,279) da bi uklonila bilo koja Frt’ed kaseta introdukovana targeting vektorom koja nije uklonjena, npr., na stadijumu ES ćelije ili u embrionu. Izborno, selekciona kaseta je zadržana kod miševa.
[0513] Targetirane ES ćelije opisane prethodno su korišćene kao donor ES ćelije i introdukovane u 8-ćelijski stadijum mišjeg embriona sa VELOCIMIŠ® postupkom (supra). Miševi koji nose modifikovani lokus teškog lanca koji nosi humane Vκ i Jκ genske segmente operativno vezane za gene mišjeg imunoglobulinskog konstantnog regiona teškog lanca su identifikovani genotipizacijom korišćenjem modifikacije analize alela (Valenzuela et al., supra) koja je detektovala prisustvo i/ili odsustvo sekvence kasete, humanih Vκ i Jκ genskih segmenata i sekvence endogenog teškog lanca.
[0514] Mladunci su genotipizirani i mladunče heterozigotni za modifikovani lokus teškog lanca koji sadrži genske segmente humanog κ lakog lanca operativno vezane za konstantne gene endogenog mišjeg imunoglobulinskog teškog lanca je izabran za karakterizaciju repertoara imunoglobulinskog teškog lanca.
Primer 3. Propagacija miševa koji eksprimiraju VLvezujuće proteine
11
[0515] Da bi se stvorila nova generacija VLvezujućih proteina, miševi koji nose nerearanžirane humane κ genske segmente mogu se ukrštati sa drugim mišem koji sadrži delecije suprotnog ili neciljanog alela endogenog teškog lanca (tj., mišem heterozigotnim u odnosu na modifikaciju). Na ovaj način, dobijeno potomstvo bi eksprimiralo samo hibridne teške lance kao što je opisano u Primeru 1. Ukrštanje je izvedeno standardnim tehnikama poznatim u tehnici i, alternativno, od strane komercijalnih kompanija, npr., Jackson Laboratory. Izvršen je skrining mišjih sojeva koji nose modifikovani lokus teškog lanca u odnosu na prisustvo unikatnih teških lanaca koji sadrže varijabilne domene humanog lakog lanca.
[0516] Alternativno, miševi koji nose nerearanžirane humane κ genske segmenea na lokusu mišjeg teškog lanca mogu se optimizovati ukrštanjem sa drugim miševima koji sadrže jednu ili više delecija u lokusima mišjeg lakog lanca (κ i λ). Na ovaj način, dobijeno potomstvo bi eksprimiralo antitela samo sa unikatnim humanim κ teškim lancem kao što je opisano u Primeru 1. Ukrštanje je izvedeno na sličan način standardnim tehnikama poznatim u tehnici i, alternativno, od strane komercijalnih kompanija, npr., Jackson Laboratory. Izvršen je skrinig mišjih sojeva koji nose modifikovani lokus teškog lanca i jednu ili više delecija lokusa mišjeg lakog lanca u odnosu na prisustvo unikatnih teških lanaca koji sadrže humane Vκ domene i konstantne domene mišjeg teškog lanca i nemaju endogene lake lance.
[0517] Miševi koji nose modifikovani lokus teškog lanca (opisan prethodno) su takođe ukrštani sa miševima koj sadrže zamenu varijabilnog genskog lokusa endogenog κ lakog lanca sa varijabilnim genskim lokusom humanog κ lakog lanca (videti US 6,596,541, Regeneron Pharmaceuticals, VELOCIMMUNE® Humanized Mouse Technology). VELOCIMMUNE® humanizovani miš uključuje, delimično, to da ima genom koji se sastoji od varijabilnih regiona humanog κ lakog lanca operativno vezanih za lokuse varijabilnog konstantnog regiona endogenog κ lakog lanca takoda miš proizvodi antitela koja sadrže varijabilni domen humanog κ lakog lanca i konstantni domen mišjeg teškog lanca kao odgovor na stimulaciju antigenom. DNK koja kodira varijabilne regione lakih lanaca antitela može biti izolovana i operativno vezana za DNK koja kodira humani konstantni region lakih lanaca. DNK zatim može biti eksprimirana u ćeliji koja je sposobna da eksprimira potpuno humani laki lanac antitela. Nakon pogodnog rasporeda ukrštanja, dobijeni su miševi koji nose zamenu endogenog κ lakog lanca sa lokusom humanog κ lakog lanca i modifikovani lokus teškog lanca prema Primeru 1. Jedinstveni VLvezujući proteini koji sadrže somatski mutirane humane Vκ domene mogu se izolovati po imunizaciji sa antigenom od interesa.
Primer 4. Reinženjering ADAM gena u modifikovani lokus teškog lanca
[0518] Miševi sa modifikovanim lokusima imunoglobulinskog teškog lanca u kojima su endogeni varijabilni region genskih segmenata (tj., VDJ) zamenjeni i/ili deletirani nemaju ekspresiju endogenih ADAM6 genea. Naročito, mužjaci miševa koji sadrže takve modifikacije lokusa imunoglobulinskog teškog lanca pokazuju smanjenje fertiliteta. Ovaj Primer demonstrira dva postupka za reinženjering sposobnosti za ekspresiju ADAM6 u miševima sa modifikovanim lokusima teškog lanca prema Primeru 1, čime se omogućava održavanje modifikovanih mišjih sojeva upotrebom postupaka normalnog ukrštanja.
[0519] Reinženjering ADAM6 gena unutar genskih segmenata hmumanog lakog lanca.
Modifikovani lokus imunoglobulinskog teškog lanca koji sadrži humane Vκ i Jκ genske segmente je reinženjeringom stvoren da sadrži genomski fragment koji kodira mišji ADAM6a i ADAM6b sa homologom rekombinacijom korišćenjem BAC DNK. Ovo je postignuto sa VELOCIGENE® tehnologijom genetičkog inženjerstva (supra) u seriji od šest koraka koji uključuju modifikaciju BAC DNK koja sadrži mišje i humane sekvence koje su dale finalni targeting vektor koji sadrži humane Vκ i Jκ genske segmente susedne sa mišjim ADAM6 genima i mišjim konstantnim regionom teških lanaca.
[0520] Mišji BAC klon (VI149) koji sadrži, od 5’ do 3’, jedinstveno restrikciono mesto (I-Ceul), mišji ADAM6a i Adam6b geni, IGCR1 regulatorni element (Guo et al., 2011), imunoglobulinski DHi JHgenski segmenti, Em enhanser, i gen IgM konstantnog regiona su korišćeni kao početni materijal za reinženjering ADAM6 gena u modifikovani lokus teškog lanca lokus koji sadrži VLi JLgenske segmente (SL.7). VI149 je modifikovan sa bakterijskom homologom rekombinacijom (BHR) da bi se deletirali svi DHi JHgenski segmenti i IgM gen od oko 53 bp 5’ najdistalnijeg D segmenta (DFL16.1) do 3’ kraja BAC. Ovaj region je zamenjen sa kasetom za rezistenciju na spektinomicin (pSVi0029) koja je sadržala jedinstveno Ascl mesto na svom 5’ kraju da bi se dobio BAC klon VI413.
[0521] Načinjene su dodatne modifikacije BHR da bi se stvorile BAC klonovi koji sadrže mišje ADAM6a i Adam6b gene, kao i IGCR1 element. Prvi BAC klon je stvoren zamenom 47199 bp regiona između Adam6a i Adam6b sa Frt’ed kasetom za rezistenciju na neomicin sa jedinstvenim I-Ceul (5’) i Ascl (3’) restrikcionim mestima (pLMa0294). Ova delecija se prostirala u regiono od 4779 bp 3’ Adam6b CDS do 290 bp 5’ Adam6b CDS. Rezultujući BAC klon je nazvan VI421. Drugi BAC klon je stvoren insercijom iste Frt’ed kasete između Adam6a i Adam6b na položaju 4782 bp 3’ Adam6a CDS u VI413 da bi se dobio VI422.
[0522] VI421 BAC klon je sadržao, od 5’ do 3’, jedinstveno I-Ceul mesto, Adam6a
11
uključujući 751 bp 5’ i 4779 bp 3’ CDS, Frt’ed kasetu za rezistenciju na neomicin, Adam6b uključujći 290 bp 5’ i 7320 bp 3’ CDS, IGCR1, i jedinstveno Ascl mesto (SEQ ID NO: 3).
[0523] VI422 BAC klon je sadržao, od 5’ do 3’, jedinstveno I-Ceul mesto, Adam6a uključujući 751 bp 5’ i 4779 bp 3’ CDS, Frt’ed kasetu za rezistenciju na higromicin, Adam6b uključujući 47490 bp 5’ i 7320 bp 3’ CDS, IGCR1, i jedinstveno Ascl mesto (SEQ ID NO: 4).
[0524] Reinženjering ADAM6 gena je postignut insercijom VI421 i VI422 u intergenski region modifikovane verzije Targeting Vektora 1 (SL. 2) kao što je opisano u Primeru 1. Targeting Vektor 1 je modifikovan u dva BHR koraka da bi se izvršila insercija mišjih ADAM6 fragmenata od VI421 i VI422. Prvi BHR korak, neomicin kaseta Targeting Vektora 1 je deletirana sa higromicin kasetom (pLMa0100). Rezultujući BAC klon je nazvan VI425, koji je sadržao, od 5’ do 3’, kasetu za rezistenciju na higromicin, četiri najproksimalnija humana Vκ segmenta, 23,552 bp Vκ-Jκ intergenski region, i svih pet humanih Jκ segmenata, koji su funkcionalnno povezani sa 8 kb 3’ mišjom homologom rukom koja sadrži mišji Em enhanser i gen IgM konstantnog regiona. Za drugi BHR, VI425 je modifikovan da zameni 740 bp unutar Vκ-Jκ intragenskog regiona sa kasetom za rezistenciju na hloramfenikol flankiranu sa jedinstvenim I-Ceul i Ascl restrikcionim mestima (pDBa0049; SL. 8). Lokacija od 740 bp delecije bila je od 16,858 do 17,597 bp 3’ od najproksimalnijeg humanog Vκ genskog segmenta (Vκ4-1). Rezultujući BAC klon oba BHRs je nazvan VI426 (SL.8).
[0525] DNK fragment koji sadrži mišje ADAM6 gene od VI421 i VI422 su nezavisno korišćeni za zamenu hloramfenikol kasete VI426 sa I-Ceul/Ascl digestijom i izbacivanjem kompatibilnih krajeva. SL. 8 pokazuje finalne targeting vektore, nazvane VI429 i VI428, respektivno. Svaki je korišćen za elektroporaciju u ES ćelije prethodno modifikovane sa Targeting Vektorom 4 (kao što je opisano u Primeru 1, videti SL. 2) da bi se omogućila rekombinacija sa jedinstvenim lokusom teškog lanca modifikovanim u skladu sa Primerom 1 i insercija DNK fragmenta koji kodira mišje ADAM6 gen. Pozitivne kolonije su selektovane sa neomicinom.
[0526] Reinženjering ADAM6 gena koji flankiraju genske segmente humanog lakog lanca. Modifikovani lokus imunoglobulinskog teškog lanca koji sadrži humane Vκ i Jκ genske segmente locirane ushodno od svih endogenih konstantnih regiona teških lanaca je reinženjeringom stvoren da sadrži genomski fragment koji kodira mišji ADAM6a i ADAM6b sa homologom rekombinacijom korišćenjem BAC DNK. Ovo je postignuto sa VELOCIGENE® tehnologijom genetičkog inženjerstva (supra) u seriji koraka koji uključuju modifikaciju BAC DNK koja sadrži mišje i humane sekvence koje su dale finalni targeting vektor koji sadrži humane Vκ i Jκ genske segmente susedne sa mišjim ADAM6 genima i mišjim konstantnim regionom teških lanaca.
11
[0527] Targeting Vektor 4 napravljen u skladu sa Primerom 1 (videti SL.2 i gornji deo SL.9) je modifikovan sa BHR da bi zamenio Frt’ed higromicin kasetu sa hloramfenikol kasetom koja sadrži jedinstvena Ascl (5’) i I-Ceul (3’) restrikciona mesta (pLMa0231; SL. 9). Targeting Vektor 4 je sadržao, od 5’ do 3’, ∼20 kb mišju distalnu IgH homologu ruku, Frt’ed kasetu za rezistenciju na higromicin, i humane Vκ2-40 do humanih Vκ3-25 genskih segmenata.
[0528] Sledeće, BAC klon nazvan VI444 je korišćen za inserciju DNK fragmenta koji kodira mišje ADAM6 gene na položaju 5’ od humanih Vκ genskih segmenata VI477 BAC klona sa Ascl/I-Ceul digestijom i izbacivanjem kompatibilnih krajeva. VI444 klon je sadržao, od 5’ do 3’, jedinstveno I-Ceul mesto, Adam6a gen uključujući 751 bp 5’ i 4779 bp 3’ CDS, Frt’ed kasetu za rezistenciju na neomicin, Adam6b gen uključujući 290 bp 5’ i 1633 bp 3’ CDS, i jedinstveno Ascl mesto (SEQ ID NO: 5). Rezultujući BAC klon korišćen kao targeting vektor za inserciju mišjih ADAM6 gena ushodno od humanih Vκ genskih segmenata je nazvan VI478, koji je, za razliku od VI421 i VI422, pozicionirao mišje ADAM6 gene u VI478 u reverznoj orijentaciji (tj., istom transkripcionom smeru u odnosu na humane Vκ genske segmente; SL. 9). Finalni targeting vektor za inserciju mišjih ADAM6 gena na distalnom kraju humanih Vκ genskih segmenata sadržao je, od 5’ do 3’, ∼20 kb mišju distalnu IgH homologu ruku, jedinstveno Ascl mesto, mišji ADAM6b, Frt’ed kasetu za rezistenciju za neomicin, mišji ADAM6a, jedinstveno I-Ceul mesto, i humane Vκ2-40 do humanih Vκ3-25 genskih segmenata. Ovaj targeting vektor je korišćen za elektroporaciju u ES ćelije prethodno modifikovane sa Targeting Vektorom 4 (SL. 2) da bi se omogućila rekombinacija sa jedinstvenim lokusom teškog lanca modifikovanim u skladu sa Primerom 1 i inserciju DNK fragmenta koji kodira mišje ADAM6 gene. Pozitivne kolonije su selktovane sa neomicinom.
[0529] Selekcija i potvrda targetiranih ES ćelija. Svaki od finalnih targeting vektora (opisanih prethodno) je korišćen za elektroporaciju mišjih ES ćelija da bi se stvorile modifikovane ES ćelije koje sadrže mišju genomsku sekvencu ektopično postavljanu koja sadrži mišje ADAM6a i ADAM6b sekvence unutar modifikovanog lokusa teškog lanca koji sadrži humane Vκ i Jκ genske segmente. Pozitivne ES ćelije koje sadrže ektopični mišji genomski fragment unutar modifikovanog lokusa teškog lanca su identifikovani sa kvantitativnom PCR analizom korišćenjem TAQMAN™ proba (Lie i Petropoulos (1998), supra).
[0530] Targetirane ES ćelije opisane prethodno su korišćene kao donor ES ćelije i introdukovane u 8-ćelijski stadijum mišjeg embriona sa VELOCIMIŠ® postupkom za inženjering miša (videti, npr., SAD Pat. br. 7,6598,442; 7,576,259; i 7,294,754). Miševi koji nose modifikovani lokus teškog lanca koji sadrži genske segmente humanog κ lakog lanca i
11
ektopičnu mišju genomsku sekvencu koja sadrži mišje ADAM6a i ADAM6b sekvence su identifikovane genotipizacijom korišćenjem modifikacije analize alela (Valenzuela et al., 2003) koji je detektovao prisustvo mišjih ADAM6a i ADAM6b genea unutar modifikovanog lokusa teškog lanca lokus kao i sekvence humanog κ lakog lanca sekvence.
[0531] Mladumci su genotipizirani i mladunče heterozigotno u odnosu na modifikovani lokus teškog lanca koji sadrži ektopični mišji genomski fragment koji sadrži mišje ADAM6a i ADAM6b sekvence je izabran za karakterizaciju ekspresije i fertiliteta mišjeg ADAM6 gena.
11
11
��
��
��
��
��
��
��
�
11
��
�
��
�
�
�
�
�
��
��
��
��
��
��
��
1
11
��
�
��
�

Claims (14)

Patentni zahtevi
1. Postupak za dobijanje varijabilnog domena humanog lakog lanca, koji obuhvata:
imuniziranje miša sa antigenom, pri čemu genom miša sadrži:
(a) inserciju jednog ili više humanih VLgenskih segmenata i jednog ili više humanih JLgenskih segmenata ushodno od gena mišjeg imunoglobulinskog konstantnog regiona lakog lanca, gde jedan ili više humanih VLgenskih segmenata i jedan ili više humanih JLgenskih segmenata su operativno vezani za gen mišjeg imunoglobulinskog konstantnog regiona lakog lanca;
(b) inserciju jednog ili više humanih VLgenskih segmenata i jednog ili više humanih JLgenskih segmenata ushodno od gena mišjeg imunoglobulinskog konstantnog regiona teškog lanca, gde jedan ili više humanih VLgenskih segmenata i jedan ili više humanih JLgenskih segmenata su operativno vezani za gen mišjeg imunoglobulinskog konstantnog regiona teškog lanca; i
(c) ektopičnu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira mišji ADAM6a protein ili njegov funkcionalni fragment i ektopičnu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira mišji ADAM6b protein ili njegov funkcionalni fragment, gde mišji ADAM6a i ADAM6b proteini ili njihovi funkcionalni fragmenti su eksprimirani od strane ektopičnih sekvenci nukleinske kiseline;
i gde miš eksprimira antitelo koje specifično vezuje antigen koje se sastoji iz (i) polipeptida koji sadrži varijabilni domen humanog lakog lanca povezan sa konstantnim domenom mišjeg teškog lanca; i (ii) polipeptida koji sadrži varijabilni domen humanog lakog lanca povezan sa mišjim konstantnim regionom lakog lanca,
izolovanje bar jedne ćelije iz miša koji proizvodi antitelo koje specifično vezuje antigen i obezbeđivanje varijabilnog domena humanog lakog lanca antitela.
2. Upotreba miša u dobijanju nukleotidne sekvence varijabilnog regiona humanog imunoglobulina, pri čemu mišji genom sadrži:
(a) inserciju jednog ili više humanih VLgenskih segmenata i jednog ili više humanih JLgenskih segmenata ushodno od gena mišjeg imunoglobulinskog konstantnog regiona lakog lanca, gde jedan ili više humanih VLgenskih segmenata i jedan ili više humanih JLgenskih segmenata su operativno vezani za gen mišjeg imunoglobulinskog konstantnog regiona lakog lanca;
(b) inserciju jednog ili više humanih VLgenskih segmenata i jednog ili više humanih JLgenskih segmenata ushodno od gena mišjeg imunoglobulinskog konstantnog regiona teškog lanca, gde jedan ili više humanih VLgenskih segmenata i jedan ili više humanih JLgenskih segmenata su operativno vezani za gen mišjeg imunoglobulinskog konstantnog regiona teškog lanca; i
(c) ektopičnu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira mišji ADAM6a protein ili njegov funkcionalni fragment i ektopičnu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira mišji ADAM6b protein ili njegov funkcionalni fragment, gde mišji ADAM6a i ADAM6b proteini ili njihovi funkcionalni fragmenti su eksprimirani od strane ektopičnih sekvenci nukleinske kiseline;
i gde miš eksprimira antitelo koje specifično vezuje antigen, koje se sastoji iz (i) polipeptida koji sadrži varijabilni domen humanog lakog lanca povezan sa konstantnim domenom mišjeg teškog lanca, i (ii) polipeptida koji sadrži varijabilni domen humanog lakog lanca povezan sa konstantnim domenom mišjeg lakog lanca.
3. Postupak prema zahtevu 1 ili upotreba prema zahtevu 2, gde je gen konstantnog regiona mišjeg lakog lanca imunoglobulina mišji Cκ.
4. Postupak prema zahtevu 1 ili 3 ili upotreba prema zahtevu 2 ili 3, gde jedan ili više humanih VLgenskih segmenata i jedan ili više humanih JLgenskih segmenata ushodno od gena konstantnog regiona lakog lanca mišjeg imunoglobulina su jedan ili više humanih Vκ genskih segmenata i jedan ili više humanih Jκ genskih segmenata.
5. Postupak prema zahtevu 1, 3 ili 4 ili upotreba prema kom od zahteva 2-4, gde jedan ili više humanih VLgenskih segmenata i jedan ili više humanih JLgenskih segmenata ushodno od gena konstantnog regiona teškog lanca mišjeg imunoglobulina su jedan ili više humanih Vκ genskih segmenata i jedan ili više humanih Jκ genskih segmenata.
1
6. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 i 3-5, ili upotreba prema bilo kom od zahteva 2-5, gde se ektopične sekvence nukleinskih kiselina nalaze između dva inserta jednog ili više humanih VLgenskih segmenata i jednog ili više humanih JLgenskih segmenata pod (b).
7. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 i 3-6, ili upotreba prema kom od zahteva 2-6, gde insertovani jedan ili više humanih VLgenskih segmenata i jedan ili više humanih JLgenskih segmenata su genski segmenti humanog κ lakog lanca ili genski segmenti humanog λ lakog lanca.
8. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 i 3-7, ili upotreba prema kom od zahteva 2-7, gde insertovani jedan ili više humanih VLgenskih segmenata obuhvataju Vκ5-2 i Vκ4-1 i ektopične sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju mišje ADAM6a i ADAM6b proteine ili njihove funkcionalne fragmente koji se nalaze između Vκ5-2 i Vκ4-1.
9. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 i 3-8, ili upotreba prema bilo kom od zahteva 2-8, gde insertovani jedan ili više humanih VLgenskih segmenta obuhvata Vκ4-1 i insertovani jedan ili više JLgenskih segmenta obuhvataju Jκ1 i ektopične sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju mišje ADAM6a i ADAM6b proteine ili njihove funkcionalne fragmente koji se nalaze između Vκ4-1 i JK1.
10. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 i 3-9, ili upotreba prema bilo kom od zahteva 2-9, gde miš sadrži jedan ili više endogenih VLi/ili jedan ili više endogenih JLgenskih segmenata koji nisu sposobni za rearanžman da bi se dobila sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca imunoglobulina kod miša.
11. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 i 3-10, ili upotreba prema bilo kom od zahteva 2 do 10, gde miš sadrži deleciju, ili zamenu, jedne ili više endogenih genskih sekvenci teškog lanca imunoglobulina.
12. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 i 3-11, u kome varijabilni domen humanog lakog lanca je humani Vκ domen.
13. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 i 3-12, u kome je bar jedna ćelija izolovana iz miša koji proizvodi varijabilni domen humanog lakog lanca specifična protiv antigena je splenocit ili B ćelija.
1
14. Upotreba prema bilo kom od zahteva 2-11, gde nukleotidna sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca sadrži rearanžirane Vκ i Jκ genske segmente ili rearanžirane Vλ i Jλ genske segmente.
1
RS20210791A 2012-02-01 2013-02-01 Humanizovani glodari koji eksprimiraju teške lance koji sadrže vl domene RS62023B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261593463P 2012-02-01 2012-02-01
US201261677538P 2012-07-31 2012-07-31
EP19191081.9A EP3597038B1 (en) 2012-02-01 2013-02-01 Humanized rodents that express heavy chains containing vl domains

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS62023B1 true RS62023B1 (sr) 2021-07-30

Family

ID=47714588

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20210791A RS62023B1 (sr) 2012-02-01 2013-02-01 Humanizovani glodari koji eksprimiraju teške lance koji sadrže vl domene
RS20191615A RS59699B1 (sr) 2012-02-01 2013-02-01 Humanizovani miševi koji eksprimiraju teške lance koji sadrže vl domene

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20191615A RS59699B1 (sr) 2012-02-01 2013-02-01 Humanizovani miševi koji eksprimiraju teške lance koji sadrže vl domene

Country Status (26)

Country Link
US (3) US20130212719A1 (sr)
EP (3) EP2809150B1 (sr)
JP (6) JP2015505477A (sr)
KR (2) KR20140123983A (sr)
CN (2) CN104202971B (sr)
AU (3) AU2013204758B2 (sr)
BR (1) BR112014018843B1 (sr)
CA (1) CA2863175A1 (sr)
CY (2) CY1122419T1 (sr)
DK (2) DK2809150T3 (sr)
ES (2) ES2753774T3 (sr)
HR (2) HRP20192218T1 (sr)
HU (2) HUE055610T2 (sr)
IL (3) IL233827A0 (sr)
LT (2) LT2809150T (sr)
ME (1) ME03611B (sr)
MX (2) MX2020003491A (sr)
NZ (5) NZ793447A (sr)
PL (2) PL2809150T3 (sr)
PT (2) PT3597038T (sr)
RS (2) RS62023B1 (sr)
RU (2) RU2664185C2 (sr)
SG (3) SG10201913428QA (sr)
SI (2) SI2809150T1 (sr)
SM (2) SMT202100401T1 (sr)
WO (1) WO2013116609A1 (sr)

Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2725169A1 (en) * 2008-05-23 2009-11-26 Aliva Biopharmaceuticals, Inc. Method of generating single vl domain antibodies in transgenic animals
DK3028565T3 (da) 2009-07-08 2017-11-13 Kymab Ltd Dyremodeller og terapeutiske molekyler
US9445581B2 (en) 2012-03-28 2016-09-20 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
EP2947151A1 (en) 2010-08-02 2015-11-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Binding proteins comprising vl domains
HRP20241480T1 (hr) 2011-08-05 2025-01-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanizirani miševi univerzalnog lakog lanca
CN103945689B (zh) 2011-09-19 2016-10-19 科马布有限公司 免疫球蛋白基因多样性的操纵及多抗体治疗剂
EP2761008A1 (en) 2011-09-26 2014-08-06 Kymab Limited Chimaeric surrogate light chains (slc) comprising human vpreb
US9253965B2 (en) 2012-03-28 2016-02-09 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
GB201122047D0 (en) * 2011-12-21 2012-02-01 Kymab Ltd Transgenic animals
SG11201403326VA (en) 2011-12-20 2014-07-30 Regeneron Pharma Humanized light chain mice
NZ793447A (en) * 2012-02-01 2024-05-31 Regeneron Pharma Humanized rodents that express heavy chains containing vl domains
US10251377B2 (en) 2012-03-28 2019-04-09 Kymab Limited Transgenic non-human vertebrate for the expression of class-switched, fully human, antibodies
GB2502127A (en) 2012-05-17 2013-11-20 Kymab Ltd Multivalent antibodies and in vivo methods for their production
DK2858487T3 (da) 2012-06-12 2020-01-20 Regeneron Pharma Humaniserede ikke-humane dyr med begrænsede immunoglobulin-tungkæde-loci
CN109769752A (zh) 2013-02-20 2019-05-21 瑞泽恩制药公司 具有修饰的免疫球蛋白重链序列的非人类动物
US9788534B2 (en) 2013-03-18 2017-10-17 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
US9783618B2 (en) 2013-05-01 2017-10-10 Kymab Limited Manipulation of immunoglobulin gene diversity and multi-antibody therapeutics
US11707056B2 (en) 2013-05-02 2023-07-25 Kymab Limited Animals, repertoires and methods
US9783593B2 (en) 2013-05-02 2017-10-10 Kymab Limited Antibodies, variable domains and chains tailored for human use
SG11201602236SA (en) 2013-10-01 2016-04-28 Kymab Ltd Animal models and therapeutic molecules
RU2016141123A (ru) 2014-03-21 2018-04-23 Регенерон Фармасьютикалз, Инк. Антигенсвязывающие белки vl, проявляющие различные связывающие характеристики
RU2016141307A (ru) 2014-03-21 2018-04-24 Регенерон Фармасьютикалз, Инк. Отличные от человека животные, которые вырабатывают однодоменные связывающие белки
HK1250038A1 (zh) * 2015-03-19 2018-11-23 瑞泽恩制药公司 选择结合抗原的轻链可变区的非人动物
CA2981077A1 (en) * 2015-04-03 2016-10-06 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Composition and methods of genome editing of b-cells
JP2019513415A (ja) * 2016-04-04 2019-05-30 イーティーエッチ チューリッヒ タンパク質産生及びライブラリー生成のための哺乳類細胞株
US20170332610A1 (en) 2016-05-20 2017-11-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for breaking immunological tolerance using multiple guide rnas
CN110719732B (zh) * 2017-03-30 2022-11-18 犹他州立大学 表达蜘蛛丝的转基因蚕
RS63772B1 (sr) * 2017-12-05 2022-12-30 Regeneron Pharma Miševi koji imaju modifikovani lambda laki lanac imunoglobulina i njihove upotrebe
CA3093995A1 (en) * 2018-03-24 2019-10-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified non-human animals for generating therapeutic antibodies against peptide-mhc complexes, methods of making and uses thereof
IL318469A (en) * 2018-06-14 2025-03-01 Regeneron Pharma Non-human animals capable of reorganizing transgenic DH-DH, and their uses
CA3187680A1 (en) 2020-09-11 2022-03-17 Yashu Liu Identification and production of antigen-specific antibodies
AU2021400584A1 (en) 2020-12-16 2023-06-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice expressing humanized fc alpha receptors
CN114645042A (zh) * 2020-12-18 2022-06-21 中国食品药品检定研究院 一种构建具有表达荧光素酶和红色荧光蛋白的重组巨噬细胞的转基因小鼠的方法
CN114196626A (zh) * 2022-02-16 2022-03-18 北京国卫生物科技有限公司 脐带间充质干细胞及其分离培养扩增方法
WO2025145264A1 (zh) * 2024-01-02 2025-07-10 江苏集萃药康生物科技股份有限公司 产生人源化抗体的动物模型及其构建方法
CN121065267A (zh) * 2024-06-04 2025-12-05 赛业（苏州）生物科技有限公司 用于制备四元固定轻链的基因修饰的啮齿动物及其制备方法
WO2026030428A2 (en) 2024-08-01 2026-02-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Prostate-specific antigen peptides and uses thereof
WO2026035843A2 (en) 2024-08-06 2026-02-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals having modified immunoglobulin heavy chain constant region locus and uses thereof

Family Cites Families (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6774279B2 (en) 1997-05-30 2004-08-10 Carnegie Institution Of Washington Use of FLP recombinase in mice
CN1468250A (zh) * 2000-08-03 2004-01-14 ��ķһ����˹��̹ 在转基因动物中产生人源化抗体
US6596541B2 (en) * 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US7105348B2 (en) 2000-10-31 2006-09-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US6586251B2 (en) 2000-10-31 2003-07-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
CN101016543A (zh) * 2000-11-17 2007-08-15 罗切斯特大学 筛选编码抗原特异性免疫球蛋白分子或其抗原特异性片段的多核苷酸的方法
US7473557B2 (en) 2001-06-06 2009-01-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method for targeting transcriptionally active loci
EP1458852B1 (en) * 2001-12-21 2011-03-09 ThromboGenics N.V. Compositions for the in vitro derivation and culture of embryonic stem (es) cell lines with germline transmission capability and for the culture of adult stem cells
US20050246782A1 (en) * 2002-03-22 2005-11-03 Origen Therapeutics Transgenic aves producing human polyclonal antibodies
AU2004257292A1 (en) * 2003-07-15 2005-01-27 Therapeutic Human Polyclonals, Inc. Humanized immunoglobulin loci
AU2005295269B2 (en) 2004-10-19 2010-05-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method for generating an animal homozygous for a genetic modification
WO2006047367A2 (en) * 2004-10-22 2006-05-04 Therapeutic Human Polyclonals, Inc. Suppression of endogenous immunoglubolin expression in non-human transgenic animals
CA2638774C (en) * 2006-03-31 2015-11-24 Medarex, Inc. Transgenic animals expressing chimeric antibodies for use in preparing human antibodies
ATE536374T1 (de) * 2006-09-01 2011-12-15 Therapeutic Human Polyclonals Inc Erhöhte expression von humanem oder humanisiertem immunglobulin bei nicht-humanen transgenen tieren
CA2697448C (en) * 2007-08-30 2019-06-11 The Burnet Institute Dendritic cell marker and uses thereof
SG193868A1 (en) * 2007-09-26 2013-10-30 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Modified antibody constant region
US7659842B2 (en) 2007-10-24 2010-02-09 Infineon Technologies Ag Quantization error reduction in PWM full-MASH converters
CA2725169A1 (en) * 2008-05-23 2009-11-26 Aliva Biopharmaceuticals, Inc. Method of generating single vl domain antibodies in transgenic animals
DK3456192T3 (da) * 2008-06-27 2025-11-24 Merus Nv Anvendelse af antistof-producerende murine pattedyr for at generere antistoffer med høj affinitet
AU2009287165A1 (en) * 2008-08-29 2010-03-04 Symphogen A/S Method for cloning avian-derived antibodies
WO2010091182A2 (en) * 2009-02-04 2010-08-12 Molecular Innovations Methods for screening candidate agents for modulating prorenin and renin, assays for detecting prorenin, and antibodies used therein
DK3028565T3 (da) * 2009-07-08 2017-11-13 Kymab Ltd Dyremodeller og terapeutiske molekyler
RU2425880C2 (ru) * 2009-07-30 2011-08-10 Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН Способ получения трансгенных мышей
AU2011266843C9 (en) * 2010-06-17 2018-03-01 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
EP2947151A1 (en) * 2010-08-02 2015-11-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Binding proteins comprising vl domains
EP2578688B2 (en) * 2011-02-25 2023-02-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. ADAM6 mice
HRP20241480T1 (hr) * 2011-08-05 2025-01-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanizirani miševi univerzalnog lakog lanca
SG11201403326VA (en) * 2011-12-20 2014-07-30 Regeneron Pharma Humanized light chain mice
NZ793447A (en) * 2012-02-01 2024-05-31 Regeneron Pharma Humanized rodents that express heavy chains containing vl domains
DK2858487T3 (da) * 2012-06-12 2020-01-20 Regeneron Pharma Humaniserede ikke-humane dyr med begrænsede immunoglobulin-tungkæde-loci
SG10201913483XA (en) * 2016-11-04 2020-03-30 Regeneron Pharma Non-human animals having an engineered immunoglobulin lambda light chain locus

Also Published As

Publication number Publication date
PL3597038T3 (pl) 2021-11-08
RU2018122695A3 (sr) 2021-10-06
BR112014018843A2 (pt) 2017-07-04
NZ719228A (en) 2022-08-26
HRP20210987T1 (hr) 2021-09-17
HRP20192218T1 (hr) 2020-03-06
HUE055610T2 (hu) 2021-12-28
RS59699B1 (sr) 2020-01-31
RU2018122695A (ru) 2019-03-06
US20210368751A1 (en) 2021-12-02
RU2014133653A (ru) 2016-03-20
RU2770016C2 (ru) 2022-04-14
EP2809150B1 (en) 2019-09-18
EP3597038B1 (en) 2021-04-21
US20170094955A1 (en) 2017-04-06
LT3597038T (lt) 2021-05-25
NZ810648A (en) 2025-11-28
JP6942757B2 (ja) 2021-09-29
NZ793447A (en) 2024-05-31
WO2013116609A1 (en) 2013-08-08
PL2809150T3 (pl) 2020-04-30
IL268675B (en) 2020-11-30
DK3597038T3 (da) 2021-06-28
JP2018075041A (ja) 2018-05-17
JP2021137030A (ja) 2021-09-16
HK1202771A1 (en) 2015-10-09
SG11201404477YA (en) 2014-08-28
SI2809150T1 (sl) 2019-11-29
AU2013204758B2 (en) 2015-07-23
JP2015505477A (ja) 2015-02-23
US20130212719A1 (en) 2013-08-15
JP2023014242A (ja) 2023-01-26
IL261280A (en) 2018-10-31
PT2809150T (pt) 2019-12-09
JP7525579B2 (ja) 2024-07-30
CN104202971B (zh) 2016-07-06
AU2015246154B2 (en) 2017-11-23
KR20140123983A (ko) 2014-10-23
IL261280B (en) 2019-08-29
BR112014018843B1 (pt) 2024-02-20
SMT201900685T1 (it) 2020-01-14
NZ627977A (en) 2016-06-24
EP3597038A1 (en) 2020-01-22
ME03611B (me) 2020-07-20
NZ734504A (en) 2022-10-28
CY1122419T1 (el) 2021-01-27
ES2753774T3 (es) 2020-04-14
MX2019002517A (es) 2019-06-17
CN106117364B (zh) 2021-08-31
HUE046744T2 (hu) 2020-03-30
IL233827A0 (en) 2014-09-30
JP2023168590A (ja) 2023-11-24
AU2017251848B2 (en) 2020-02-20
AU2015246154A1 (en) 2015-11-12
CY1124361T1 (el) 2022-07-22
AU2017251848A1 (en) 2017-11-16
JP2019170395A (ja) 2019-10-10
EP3912465A1 (en) 2021-11-24
CA2863175A1 (en) 2013-08-08
SI3597038T1 (sl) 2021-07-30
IL268675A (en) 2019-10-31
PT3597038T (pt) 2021-05-10
CN104202971A (zh) 2014-12-10
ES2870703T3 (es) 2021-10-27
LT2809150T (lt) 2019-10-25
SG10201913428QA (en) 2020-03-30
SG10201606256TA (en) 2016-09-29
JP7187615B2 (ja) 2022-12-12
RU2664185C2 (ru) 2018-08-15
MX2020003491A (es) 2022-10-25
DK2809150T3 (da) 2019-12-09
BR112014018843A8 (pt) 2019-01-29
KR20190006029A (ko) 2019-01-16
MX373286B (es) 2020-05-20
SMT202100401T1 (it) 2021-09-14
JP6698718B2 (ja) 2020-05-27
AU2013204758A1 (en) 2013-08-15
CN106117364A (zh) 2016-11-16
EP2809150A1 (en) 2014-12-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7525579B2 (ja) Ｖｌドメインを含む重鎖を発現するヒト化齧歯動物
RS55495B1 (sr) Miševi koji stvaraju vezujuće proteine koji sadrže vl domene
RS61946B1 (sr) Humanizovani miševi univerzalnog lakog lakca
EP2858487A1 (en) Humanized non-human animals with restricted immunoglobulin heavy chain loci
HK40064569A (en) Humanized rodents that express heavy chains containing vl domains
HK40020364A (en) Humanized rodents that express heavy chains containing vl domains
HK40020364B (en) Humanized rodents that express heavy chains containing vl domains
HK1202771B (en) Humanized mice that express heavy chains containing vl domains
BR122023011479B1 (pt) Método para produzir uma proteína de ligação ao antígeno humano que se liga a um antígeno de interesse, método para produzir uma célula es animal não humana geneticamente modificada, método para modificar um locus de imunoglobulina de cadeia pesada de uma célula es de camundongo e método para produzir uma sequência de nucleotídeos que codifica uma cadeia leve de imunoglobulina totalmente humana
MX2014009300A (es) Roedores humanizados que expresan cadenas pesadas que contienen dominios vl.
HK1203762B (en) Humanized non-human animals with restricted immunoglobulin heavy chain loci