RS62029B1 - Derivati mono- ili di-supstituisanog indola kao inhibitori replikacije denga virusa - Google Patents

Description

Opis

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na mono- ili di-supstituisana jedinjenja indola i takođe se odnosi na navedena jedinjenja za upotrebu kao lek, poželjnije za upotrebu kao lek za tretman ili prevenciju infekcija denga virusa. Predmetni pronalazak se dalje odnosi na farmaceutske sastave ili kombinovane preparate jedinjenja, na sastave ili preparate za upotrebu kao lek, poželjnije za prevenciju ili tretman infekcija denga virusa. Pronalazak se takođe odnosi na postupke za pripremu jedinjenja.

STANJE TEHNIKE

[0002] Flavivirusi, koje prenose komarci ili krpelji, izazivaju kod ljudi infekcije opasne po život, poput encefalitisa i hemoragične groznice. Poznata su četiri različita, ali blisko povezana serotipa denga flavivirusa, takozvani DENV-1, -2, -3 i -4. Denga je endemska u većini tropskih i suptropskih regiona širom sveta, pretežno u urbanim i poluurbanim oblastima.

[0003] Prema Svetskoj zdravstvenoj organizaciji (SZO), 2,5 milijarde ljudi, od kojih je milijarda dece, pod rizikom su od DENV infekcije (SZO, 2002). Procenjuje se da se 50 do 100 miliona slučajeva denga groznice [DG], pola miliona slučajeva teške denga groznice (tj. hemoragijska denga groznica [HDG] i sindroma denga šoka [SDŠ]), i više od 20.000 smrtnih slučajeva dogodi širom sveta svake godine. HDG je postala vodeći uzrok hospitalizacije i smrti među decom u endemskim regionima. Sve u svemu, denga je najčešći uzrok arbovirusne bolesti. Zbog nedavnih velikih epidemija u zemljama smeštenim u Latinskoj Americi, jugoistočnoj Aziji i zapadnom Pacifiku (uključujući Brazil, Portoriko, Venecuelu, Kambodžu, Indoneziju, Vijetnam, Tajland), broj slučajeva denga groznice dramatično je porastao tokom poslednjih godina. Ne samo da se broj slučajeva denga groznice povećava kako se bolest širi na nova područja, već su epidemije teže.

[0004] Kako bi se sprečile i/ili suzbile bolesti povezane sa infekcijom denga virusa, trenutno su dostupni samo postupci iskorenjivanja komaraca kako bi se kontrolisao vektor. Iako se napreduje u razvoju vakcina protiv denga groznice, nailazi se na mnoge poteškoće. One uključuju postojanje fenomena koji se naziva pojačanje zavisno od antitela (ADE). Oporavak od infekcije jednim serotipom pruža doživotni imunitet protiv tog serotipa, ali pruža samo delimičnu i prolaznu zaštitu od naknadne infekcije jednim od preostala tri serotipa. Nakon infekcije drugim serotipom, postojeća hetarologna antitela formiraju komplekse sa novoinfektivnim serotipom denga virusa, ali ne neutrališu patogen. Umesto toga, veruje se da je olakšan ulazak virusa u ćelije, što rezultuje nekontrolisanom replikacijom virusa i višim vršnim titrima virusa. I kod primarnih i kod sekundarnih infekcija, viši virusni titri povezani su sa težom denga groznice. S obzirom da se majčina antitela lako mogu preneti na decu dojenjem, ovo bi mogao biti jedan od razloga što su deca više pogođena teškom denga groznicom nego odrasli.

[0005] Na lokacijama sa dva ili više serotipova koji cirkulišu istovremeno, koji se nazivaju i hiper endemskim regionima, rizik od ozbiljne denga groznice je znatno veći usled povećanog rizika od sekundarne, teže infekcije. Štaviše, u situaciji hiper-endemičnosti povećana je verovatnoća pojave virulentnijih sojeva, što zauzvrat povećava verovatnoću hemoragijske denga groznice (HDG) ili sindroma denga šoka.

[0006] Komarci koji prenose dengu, uključujući Aedes aegypti i Aedes albopictus (tigrasti komarac), kreću se sve severnije na zemaljskoj kugli. Prema američkom (SAD) Centrima za kontrolu i prevenciju bolesti (Centers for Disease Control and Prevention - CDC), oba komarca su trenutno sveprisutna u južnom Teksasu. Širenje komaraca koji prenose dengu nije ograničeno na SAD, već je primećeno i u Evropi.

[0007] WO2013/045516 (Katholieke Universiteit Leuven) opisuje niz derivata indola za upotrebu u prevenciji ili tretmanu virusnih infekcija, posebno infekcija Denga virusom.

[0008] Nedavno (decembra 2015), vakcina protiv denga groznice koju je proizveo Sanofi Pasteur prvi put je odobrena u Meksiku. Vakcina je takođe odobrena u Brazilu, na Filipinima i u El Salvadoru. Procesi regulatornog nadzora nastavljaju se u drugim zemljama u kojima je denga prioritet javnog zdravlja. Ipak, vakcina ostavlja značajan prostor za poboljšanje usled ograničene efikasnosti, posebno protiv DENV-1 i -2, niske efikasnosti kod bave flavivirusnaivnih pacijenata i dugotrajnog rasporeda doziranja.

[0009] Uprkos ovim nedostacima, vakcina ima veliki značaj endemskim okruženjima, jer će pružiti zaštitu velikom delu populacije, ali verovatno ne i vrlo maloj deci, koja nose najveći teret denge. Pored toga, raspored doziranja i vrlo ograničena efikasnost kod flavivirus-naivnih pacijenata čine ga neprimerenim i verovatno neisplativim za putnike iz ne-endemskih područja u endemska područja denge. Gore navedeni nedostaci vakcina protiv denga su razlog zašto postoji potreba za profilatičkim antivirusnim sredstvom protiv denga groznice pre nego što je pacijent izložen.

[0010] Dalje, danas nisu dostupni specifični antivirusni lekovi za tretman ili prevenciju infekcije denga virusom groznice. Jasno je da i dalje postoji velika nezadovoljena medicinska potreba za terapijskim sredstvima za prevenciju ili tretman virusnih infekcija kod životinja, naročito kod ljudi, a posebno za virusne infekcije izazvane flavivirusima, naročito denga virusom. Jedinjenja sa dobrom antivirusnom potencijom, bez ili sa niskim nivoom neželjenih efekata, širokim spektrom aktivnosti protiv višestrukih serotipova denga virusa, niskom toksičnošću i/ili dobrim farmakokinetičkim ili -dinamičkim svojstvima su izuzetno potrebna.

[0011] Predmetni pronalazak sada pruža jedinjenja, derivate mono- ili di-supstituisanog indola, koja pokazuju visoko potentnu aktivnost protiv sva četiri (4) serotipa Denga virusa. Takođe jedinjenja prema pronalasku poseduju dobar farmakokinetički profil i iznenađujuće ova specifična jedinjenja pokazuju poboljšanu hiralnu stabilnost.

SAŽETAK PRONALASKA

[0012] Predmetni pronalazak zasnovan je na neočekivanom otkriću da se bar jedan od gore navedenih problema može rešiti trenutnim jedinjenjima pronalaska.

[0013] Predmetni pronalazak pruža jedinjenja za koja je pokazano da poseduju snažno antivirusno delovanje protiv sva četiri (4) trenutno poznata serotipa. Predmetni pronalazak dalje pokazuje da ova jedinjenja efikasno inhibiraju proliferaciju denga virusa (DENV). Prema tome, ova jedinjenja čine korisnu klasu moćnih jedinjenja koja se mogu koristiti u tretmanu i/ili prevenciji virusnih infekcija kod životinja, sisara i ljudi, tačnije za upotrebu u tretmanu i/ili prevenciji infekcija Denga virusima.

[0014] Predmetni pronalazak se dalje odnosi na jedinjenja kao lekove i na njihovu upotrebu za proizvodnju lekova za tretman i/ili prevenciju virusnih infekcija, posebno sa virusima koji pripadaju porodici denga virusa groznice kod životinja ili sisara, naročito kod ljudi.

Pronalazak se takođe odnosi na postupke za pripremu svih takvih jedinjenja i na farmaceutske sastave koje ih sadrže u efikasnoj količini.

[0015] Predmetni pronalazak se takođe odnosi na jedinjenja koja se koriste u tretmanu ili prevenciji infekcija denga virusa kod ljudi primenom efikasne količine jednog ili više takvih jedinjenja, ili njihove farmaceutski prihvatljive soli, opciono u kombinaciji sa jednim ili više drugih lekova, poput drugog antivirusnog agensa ili vakcine protiv denga groznice ili oboje, pacijentu koji ima potrebu za tim.

[0016] Jedan aspekt pronalaska je pružanje jedinjenja formule (I)

njegovog stereo-izomernog oblika, farmaceutski prihvatljive soli ili solvata; gde:

R1je OCF3, R2je H i R3je H.

[0017] Ovde su opisana jedinjenja formule (I)

njihov stereo-izomerni oblik, farmaceutski prihvatljiva so, solvat ili polimorf koja obuhvataju mono- ili di-supstituisanu indol grupu; gde je navedeno jedinjenje izabrano iz grupe gde: R1je H, R2je F i R3je H ili CH3,

R1je H, CH3ili F, R2je OCH3i R3je H,

R1je H, R2je OCH3i R3je CH3,

R1je CH3, R2je F i R3je H,

R1je CF3, R2je H i R3je H,

R1je OCF3, R2je OCH3i R3je H i

R1je OCF3, R2je H i R3je CH3.

[0018] Određeno jedinjenje pronalaska ili njegov stereo-izomerni oblik, farmaceutski prihvatljiva so ili solvat je:

[0019] Ovde su posebno opisana jedinjenja ili njihov stereo-izomerni oblik, farmaceutski prihvatljiva so ili solvat izabrani iz grupe:

[0020] Drugi aspekt pronalaska je jedinjenje predstavljeno narednom strukturnom formulom (I)

njegov stereo-izomerni oblik, farmaceutski prihvatljiva so ili solvat; gde:

R1je OCF3, R2je H i R3je H,

za primenu pri inhibiciji replikacije denga virusa u biološkom uzorku ili kod pacijenta.

[0021] Drugi aspekt opisa je jedinjenje predstavljeno narednom strukturnom formulom (I)

njegov stereo-izomerni oblik, farmaceutski prihvatljiva so ili solvat; gde je navedeno jedinjenje izabrano iz grupe gde:

R1je H, R2je F i R3je H ili CH3,

R1je H, CH3ili F, R2je OCH3i R3je H i

R1je H, R2je OCH3i R3je CH3,

R1je CH3, R2je F i R3je H,

R1je CF3, R2je H i R3je H,

R1je OCF3, R2je OCH3i R3je H i

R1je OCF3, R2je H i R3je CH3

za primenu pri inhibiciji replikacije denga virusa u biološkom uzorku ili kod pacijenta.

[0022] Deo predmetnog pronalaska je takođe farmaceutski sastav koji sadrži jedinjenje formule (I) ili njegov stereoizomerni oblik, farmaceutski prihvatljivu so ili solvat, zajedno sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijensa, razblaživača ili nosača.

[0023] Farmaceutski prihvatljive soli jedinjenja formule (I) uključuju njihove kisele adicione i bazne soli. Pogodne kisele adicione soli nastaju od kiselina koje formiraju netoksične soli. Pogodne bazne soli nastaju od baza koje formiraju netoksične soli.

[0024] Jedinjenja pronalaska mogu takođe da postoje u nesolvatiranim i solvatiranim oblicima. Izraz „solvat“ se ovde koristi za opisivanje molekularnog kompleksa koji sadrži jedinjenje pronalaska i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih molekula rastvarača, na primer, etanol.

[0025] Izraz „polimorf“ odnosi se na sposobnost jedinjenja pronalaska da postoji u više oblika ili kristalnih struktura.

[0026] Jedinjenja predmetnog pronalaska mogu se primenjivati kao kristalni ili amorfni proizvodi. Mogu se dobiti, na primer, u obliku čvrstih čepova, prahova ili filmova postupcima kao što su taloženje, kristalizacija, sušenje smrzavanjem, sušenje raspršivanjem ili isparavanje. Mogu se primenjivati sami ili u kombinaciji sa jednim ili više drugih jedinjenja pronalaska ili u kombinaciji sa jednim ili više drugih lekova. Generalno, oni će se primenjivati u obliku formulacije zajedno sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenasa. Izraz „ekscipijens“ ovde se koristi za opis bilo kog sastojka osim jedinjenja pronalaska. Izbor ekscipijensa u velikoj meri zavisi od faktora kao što su određeni način primene, efekat ekscipijensa na rastvorljivost i stabilnost i prirodu doznog oblika.

[0027] Jedinjenja predmetnog pronalaska ili bilo koja njihova podgrupa mogu se formulisati u različite farmaceutske oblike za svrhe primene. Kao odgovarajuće smeše mogu se navesti sve smeše koje se obično koriste za sistemsku primenu lekova. Kako bi se pripremile farmaceutske smeše predmetnog pronalaska, efikasna količina određenog jedinjenja, opciono u obliku soli, kao aktivni sastojak kombinuje se u intimnoj smeši sa farmaceutski prihvatljivim nosačem, gde nosač može imati široku paletu oblika u zavisnosti od oblika pripreme poželjnog za primenu. Poželjno je da su ove farmaceutske smeše u jedinstvenom doznom obliku, pogodnom, na primer, za oralnu ili rektalnu primenu. Na primer, u pripremi sastava u oralnom doznom obliku, može se koristiti bilo koji od uobičajenih farmaceutskih medijuma, kao što su, na primer, voda, glikoli, ulja, alkoholi i slično u slučaju oralnih tečnih preparata kao što su suspenzije, sirupi, eliksiri, emulzije i rastvori; ili čvrsti nosači kao što su skrobovi, šećeri, kaolin, razblaživači, lubrikant, veznici, agensi za raspadanje i slično u slučaju praha, pilula, kapsula i tableta. Usled njihove jednostavnosti u primeni, tablete i kapsule predstavljaju najpovoljnije oralne jedinične oblike doziranja, u kom slučaju se očigledno koriste čvrsti farmaceutski nosači. Uključeni su i preparati u čvrstom obliku koji se mogu neposredno pre upotrebe pretvoriti u tečne oblike.

[0028] Naročito je korisno formulisati gore navedene farmaceutske sastave u jediničnom doznom obliku radi lakše primene i ujednačenosti doziranja. Jedinični oblik doziranja, kako se ovde koristi, odnosi se na fizički odvojene jedinice pogodne kao jedinstvene doze, gde svaka jedinica sadrži unapred određenu količinu aktivnog sastojka izračunatu da proizvede željeni terapeutski efekat u vezi sa potrebnim farmaceutskim nosačem. Primeri takvih jediničnih oblika doziranja su tablete (uključujući usečene ili obložene tablete), kapsule, pillule, pakete praška, vafere, supozitorijume, rastvore ili suspenzije za injekcije i slično, i njihove odvojene višestruke sastojke.

[0029] Stručnjaci u tretmanu zaraznih bolesti moći će da utvrde efikasnu količinu na osnovu rezultata ispitivanja predstavljenih u daljem tekstu. Generalno se smatra da bi efikasna dnevna količina bila od 0,01 mg/kg do 50 mg/kg telesne težine, još poželjnije od 0,1 mg/kg do 10 mg/kg telesne težine. Može biti prikladno primenjivati potrebnu dozu u obliku dve, tri, četiri ili više pod-doza u odgovarajućim intervalima tokom dana. Navedene pod-doze mogu se formulisati kao jedinični oblici doziranja, na primer, koji sadrže 1 do 1000 mg, i posebno 5 do 200 mg aktivnog sastojka po jediničnom doznom obliku.

[0030] Tačna doza i učestalost primene zavise od određenog jedinjenja formule (I) koje se koristi, određenog stanja koje se tretira, težine stanja koje se tretira, uzrasta, težine i opšteg fizičkog stanja određenog pacijenta, kao i drugih lekova pojedinac može uzimati, kao što je dobro poznato stručnjacima. Dalje, očigledno je da se efektivna količina može smanjiti ili povećati u zavisnosti od odgovora tretiranog pacijenta i/ili u zavisnosti od procene lekara koji prepisuje jedinjenja predmetnog pronalaska. Gore navedeni efikasni rasponi količina su stoga samo smernice i nisu namenjeni ograničavanju obima ili upotrebe pronalaska u bilo kojoj meri.

[0031] Predmetno obelodanjenje takođe treba da obuhvati bilo koje izotope atoma prisutnih u jedinjenjima pronalaska. Na primer, izotopi vodonika uključuju tricijum i deuterijum, a izotopi ugljenika uključuju C-13 i C-14.

1

Predmetna jedinjenja koja se koriste u predmetnom pronalasku mogu takođe postojati u svom stereohemijski izomernom obliku, definišući sva moguća jedinjenja koja se sastoje od istih atoma povezanih istim nizom veza, ali koja imaju različite trodimenzionalne strukture, koje nisu zamenjive. Ako nije drugačije pomenuto ili naznačeno, hemijska oznaka jedinjenja obuhvata smešu svih mogućih stereohemijski izomernih oblika, koja navedena jedinjenja mogu da poseduju.

[0032] Navedena smeša može sadržati sve dija-stereomere i/ili enantiomere osnovne molekularne strukture navedenog jedinjenja. Svi stereo-hemijski izomerni oblici jedinjenja koja se koriste u predmetnom pronalasku, bilo u čistom obliku ili u mešavini jedni sa drugima, namenjeni su da budu obuhvaćena od strane predmetnog pronalaska, uključujući bilo koje racemske smeše ili racemate.

[0033] Čisti stereoizomerni oblici jedinjenja i intermedijeri, kako su ovde navedeni, definisani su kao izomeri suštinski bez drugih enantiomernih ili dijastereomernih oblika iste osnovne molekularne strukture navedenih jedinjenja ili intermedijera. Konkretno, izraz „stereoizomerno čist“ odnosi se na jedinjenja ili intermedijere koji imaju stereoizomerni višak od najmanje 80% (tj. najmanje 90% jednog izomera i maksimalno 10% ostalih mogućih izomera) do stereoizomernog viška od 100% (tj.100% jednog izomera, i nijedan drugi), tačnije, jedinjenja ili intermedijeri koji imaju stereoizomerni višak od 90% do 100%, još preciznije sa stereoizomernim viškom od 94% do 100%, i posebno sa stereoizomernim viškom od 97% do 100%. Izraze „enantiomerno čist“ i „dijastereomerno čist“ treba shvatiti na sličan način, ali onda uzimajući u obzir enantiomerni višak, odnosno dijastereomerni višak smeše o kojoj je reč.

[0034] Čisti stereoizomerni oblici jedinjenja i intermedijeri koji se koriste u predmetnom pronalasku mogu se dobiti primenom postupaka poznatih u struci. Na primer, enantiomeri se mogu odvojiti jedni od drugih selektivnom kristalizacijom njihovih dijastereomernih soli sa optički aktivnim kiselinama ili bazama. Primeri za njih su vinska kiselina, dibenzoilvinska kiselina, ditoluoilvinska kiselina i kamfosulfonska kiselina. Alternativno, enantiomeri se mogu razdvojiti hromatografskim tehnikama koristeći hiralne stacionarne faze. Navedeni čisti stereohemijski izomerni oblici takođe mogu biti izvedeni iz odgovarajućih čistih stereohemijski izomernih oblika odgovarajućih polaznih materijala, pod uslovom da se reakcija odvija stereospecifično. Poželjno, ako je želja kako bi se dobio određeni

stereoizomer, navedeno jedinjenje će se sintetisati stereospecifičnim postupcima pripreme. Ovi postupci će povoljno koristiti enantiomerno čiste početne materijale.

Opšti pristupi sinteze

[0035] Sinteza jedinjenja opšte formule I može se izvesti kako je opisano u Šemi 1.2-(4-hloro-2-metoksifenil)sirćetna kiselina (II) može se pretvoriti u odgovarajući 2-(4-hloro-2-metoksifenil)acetil hlorid (III) sa hlorisanjem reagensom kao što je na primer tionil hlorid. Fridel-Kraftsova reakcija kiselog hlorida III sa supstituisanim indolom opšte formule IV može se izvesti upotrebom reagensa Luisove kiseline kao što su na primer Et2AlCl ili TiCl4u pogodnom rastvaraču kao što su na primer CH2Cl2ili 1,2-dihloroetan, i pod pogodnim reakcionim uslovima koji tipično (ali ne isključivo) uključuju hlađenje, kako bi se dobio 3-acilovani indol opšte formule V. Uvođenje anilinskog dela u alfa položaju u karbonilni deo jedinjenja opšte formule V može se postići reakcionom sekvencom koja uključuje, na primer, bromiranje V sa reagensom kao što je na primer feniltrimetilamonijum tribromid u pogodnom rastvaraču kao što je na primer THF, dajući jedinjenja opšte formule VI, i naknadnom reakcijom jedinjenja opšte formule VI sa 3-metoksi-5-(metilsulfonil) anilinom (VII) u pogodnom rastvaraču kao na primer CH3CN, i obično koristeći bazu kao što su na primer TEA ili DIPEA, kako bi se dobila jedinjenja opšte formule I kao racemske smeše. Hiralno razdvajanje jedinjenja opšte formule I može se izvesti na primer hiralnom hromatografijom kako bi se dobili enantiomeri A i B opšte formule I.

[0036] U nekim slučajevima sinteza intermedijera opšte formule V putem Fridel-Kraftsovog pristupa sintezi, ima koristi od prisustva zaštitne grupe (PG) na indolu-N tokom koraka Fridel-Kraftsove reakcije, kako je prikazano u Šemi 2. U tu svrhu supstituisani indol opšte formule IV može se prvo pretvoriti u N-zaštićeni intermedijer opšte formule VIII, kao što je na primer N-tozilovani intermedijer opšte formule VIII (PG = Ts), koristeći reagens kao što je na primer tozil hlorid, u prisustvu baze kao što je na primer natrijum hidrid. Fridel-Kraftsova reakcija supstituisanog indola opšte formule IV kiselim hloridom III može se izvesti upotrebom reagensa Luisove kiseline kao što su na primer Et2AlCl ili TiCl4u pogodnom rastvaraču kao što su na primer CH2Cl2ili 1,2-dihloroetan, i pod pogodnim reakcionim uslovima koji tipično (ali ne isključivo) uključuju hlađenje, kako bi se dobio 3-acilovani N-zaštićeni indol opšte formule IX. Uklanjanje indol-N zaštitne grupe PG intermedijera opšte formule IX može se postići reagensom kao što je na primer LiOH (za PG = Ts) u smeši rastvarača kao što je na primer THF/voda i na pogodnoj reakcionoj temperaturi, kako bi se dobio 3-acilovani indol opšte formule V.

[0037] Kao alternativni pristup, intermedijer opšte formule V se takođe može pripremiti kako je navedeno u Šemi 3: N-Boc-zaštićeni supstituisani indol-3-karbaldehid opšte formule X može se pretvoriti u odgovarajući Streckerov intermedijer opšte formule XI reakcijom sa morfolinom u prisustvu reagenasa kao štosu na primer natrijum cijanid i natrijum bisulfit, i u pogodnom rastvaraču, na primer smeši vode i organskom rastvaraču koji se može mešati sa vodom, na primer dioksanu. Alkilacija jedinjenja opšte formule XI sa 4-hloro-2-metoksibenzil-hloridom može se postići u prisustvu baze kao što je na primer kalijum heksametildisilazan i u pogodnom rastvaraču kao što je na primer DMF kako bi se dobilo jedinjenje opšte formule XII. Podvrgavanje jedinjenja opšte formule XII pogodnim vodeno kiselo hidrolitičkim uslovima, na primer, tretiranjem vodenim rastvorom hlorovodonične kiseline na povišenoj temperaturi, daje intermedijer opšte formule V.

1

Primeri

LC/MS postupci

[0038] Merenje tečne hromatografije visokih performansi (HPLC) izvršeno je upotrebom LC pumpe, diodnog niza (DAD) ili UV detektora i kolone kako je određeno u odgovarajućim postupcima. Ako je potrebno, uključeni su i dodatni detektori (pogledati tabelu postupaka u nastavku).

[0039] Protok iz kolone je doveden do masenog spektrometra (MS) koji je konfigurisan sa izvorom jona atmosferskog pritiska. Stručnjaku je poznato da podesi parametre (npr. raspon skeniranja, vreme zadržavanja...) kako bi se dobili joni koji omogućavaju identifikaciju nominalne monoizotopne molekulske težine jedinjenja (MW). Prikupljanje podataka izvršeno je odgovarajućim softverom.

[0040] Jedinjenja su opisana njihovim eksperimentalnim vremenima zadržavanja (R.t) i jonima. Ako nije drugačije naznačeno u tabeli podataka, prijavljeni molekularni jon odgovara [M+H]<+>(protonirani molekul) i/ili [M-H]<->(deprotonirani molekul). U slučaju da jedinjenje nije direktno jonizujuće, navedena je vrsta adukta (tj. [M+NH4]<+>, [M+HCOO]-, itd...). Za molekule sa višestrukim izotopskim obrascima (Br, CI), prijavljena vrednost je ona dobijena za najmanju izotopsku masu. Svi rezultati su dobijeni sa eksperimentalnim nesigurnostima koje su obično povezane sa postupkom koji se koristi.

[0041] U daljem tekstu, „SQD“ označava pojedinačni kvadrupolni detektor, „MSD“ maseni selektivni detektor, „RT“ sobnu temperaturu, „BEH“ premošćen etilsiloksan/silicijum dioksid hibrid , „DAD“ detektor niza dioda, „HSS“ silicijum dioksid visoke snage.

[0042] Kodovi LCMS postupka (protok izražen u ml/min; kolona temperature (T) u °C; vreme rada u minutima)

1

SFC-MS postupci

[0043] SFC merenje izvedeno je korišćenjem analitičkog sistema nadkritične fluidne hromatografije (SFC) koji je sastavljen od binarne pumpe za dovod ugljen-dioksida (CO2) i modifikatora, automatskog uzorka, kolonske peći, detektora niza dioda opremljenog protočnom ćelijom visokog pritiska do 400 bara. Ako je konfigurisan sa masenim spektrometrom (MS), protok iz kolone je doveden do (MS). Stručnjaku je poznato da podesi parametre (npr. raspon skeniranja, vreme zadržavanja...) kako bi se dobili joni koji omogućavaju identifikaciju nominalne monoizotopne molekulske težine jedinjenja (MW). Prikupljanje podataka izvršeno je odgovarajućim softverom.

[0044] Analitički SFC-MS postupci (protok izražen u ml/min; temperatura kolone (T) u °C; vreme rada u minutima, povratni pritisak (BPR) u barima.

1

Tačke topljenja

[0045] Vrednosti su ili vršne vrednosti ili rasponi topljenja, i dobijaju se sa eksperimentalnim nesigurnostima koje su obično povezane sa ovom analitičkom postupkom.

DSC823e (označen kao DSC)

1

[0046] Za niz jedinjenja, tačke topljenja su određene sa DSC823e (Mettler-Toledo). Tačke topljenja su izmerene sa gradijentom temperature od 10°C/minut. Maksimalna temperatura je iznosila 300°C.

Optičke rotacije:

[0047] Optičke rotacije su izmerene na Perkin-Elmer 341 polarimetru sa natrijumovom lampom i prijavljene na naredni način: [a]°(λ, c g/100 ml, rastvarač, T°C).

[α]λ<T>= (100α)/(l x c): gde l jeste dužina putanje u dm, dok je c koncentracija u g/100 ml za uzorak na temperaturi T (°C) i talasnoj dužini λ (u nm). Ako je upotrebljena talasna dužina svetlosti 589 nm (natrijumova D linija), tada se umesto nje može koristiti simbol D. Znak rotacije (+ ili -) uvek treba da bude dat. Kada se koristi ova jednačina, koncentracija i rastvarač su uvek navedeni u zagradama nakon rotacije. Rotacija se izveštava pomoću stepeni i ne daju se jedinice koncentracije (pretpostavlja se da je g/100 ml).

Primer 1: Sinteza 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(6-fluoro-1H-indol-3-il)-2-((3-metoksi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)etanona (Jedinjenje 1) i hiralno razdvajanje na Enantiomere 1A i 1B.

[0048]

Sinteza intermedijera 1a:

[0049] 2-(4-hloro-2-metoksifenil)sirćetna kiselina [CAS 170737-95-8] (5,8 g, 28,9 mmol) je dodat iz malih delova tionil hloridu (50 mL) i rezultujući rastvor je mešan preko noći na 60°C. Rastvarač je koncentrovan pod redukovanim pritiskom i ko-isparen sa toulenom kako

1

bi se dobio 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-acetil hlorid 1a (6,5 g) kao uljani ostatak koji je u narednom koraku korišćen bez daljeg prečišćavanja.

Sinteza intermedijera 1b:

[0050] Dietilaluminijum hlorid 1M u heksanu (37,1 mL, 37,1 mmol) je dodat kapanjem na 0°C rastvoru 6-fluoro-1H-indola [CAS 399-51-9] (3,34 g, 24,76 mmol) u CH2Cl2(100 mL). Nakon 30 minuta na 0°C, rastvor 2-(4-hloro-2-metoksifenil)acetil hlorida 1a (6,3 g, 28,76 mmol) u CH2Cl2(100 mL) je dodat polako na 0°C. Reakcija je mešana na 0°C tokom 3 sata. Ledena voda je dodata i talog je filtriran, opran sa vodom i malom količinom CH2Cl2. Čvrsta materija je osušena pod vakuumom na 70°C preko noći kako bi se dobio 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(6-fluoro-1H-indol-3-il)etanon 1b (4,9 g).

Sinteza intermedijera 1c:

[0051] Na 0°C, rastvor feniltrimetilamonijum tribromida [CAS 4207-56-1] (5,8 g, 15,4 mmol) u THF (65 mL) je dodat kapanjem smeši 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(6-fluoro-1H-indol-3-il)etanona 1b (4,9 g, 15,4 mmol) u THF (60 mL). Smeša je mešana na 0°C tokom 1 sata i sobnoj temperaturi tokom 2,5 sata. Talog je filtriran i opran sa EtOAc. Kombinovani filtrati su koncentrovani pod redukovanim pritiskom. Ostatak je uzet sa EtOAr i opran sa vodom. Talog koji se pojavio u organskom sloju i je filtriran i osušen kako bi se dobila prva serija 2-bromo-2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(6-fluoro-1H-indol-3-il)etanona 1c (4,6 g). Organski sloj je razdvojen, osušen preko MgSO4, filtriran i rastvarač je isparen pod redukovanim pritiskom. Ostatak je kristalisan od EtOAc, talog je filtriran, opran sa Et2O i osušen pod vakuumom kako bi se dobio drugi fragment 2-bromo-2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(6-fluoro-1H-indol-3-il)etanona 1c (1,6 g).

Sinteza Jedinjenja 1 i hiralno razdvajanje Enantiomera 1A i 1B:

[0052] Smeša 2-bromo-2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(6-fluoro-1H-indol-3-il)-etanona 1c (3 g, 7,56 mmol), 3-metoksi-5-(metilsulfonil)anilina [CAS 62606-02-4] (2,28 g, 11,35 mmol) i diizopropiletilamina (1,95 mL, 11,35 mmol) u CH3CN (60 mL) i THF (30 mL) je mešana na 70°C tokom 24 sata. Reakcija je razređena sa EtOAc. Organski sloj je opran sa 1N HCl (dvaput) i vodom, osušen preko MgSO4, filtriran i rastvarač je koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom na silika gelu (15-40 µm, 80 g, Mobilna faza: CH2Cl2/MeOH 99,5/0,5). Drugo prečišćavanje je sprovedeno fleš hromatografijom na silika gelu (15-40 µm, 80 g, Mobilna faza: CH2Cl2/MeOH 99,7/0,3). Čisti

1

fragmenti su kombinovani i koncentrovani pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(6-fluoro-1H-indol-3-il)-2-((3-metoksi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)etanon (Jedinjenje 1, 2 g) kao racemska smeša.

[0053] Enantiomeri Jedinjenja 1 su razdvojene putem hiralne SFC (Stacionarna faza:

Chiralpak® AD-H 5 µm 20 x 250 mm, Mobilna faza: 50% CO2, 50% MeOH) čime je kao prinos dobijeno 740 mg prvog eluiranog enantiomera i 720 mg drugog eluiranog enantiomera. Prvi eluirani enantiomer je kristalisan od CH3CN/Et2O. Talog je filtriran i osušen kako bi se dobio Enantiomer 1A (645 mg). Drugi eluirani enantiomer je kristalisan od CH3CN/Et2O. Talog je filtriran i osušen kako bi se dobio Enantiomer 1B (632 mg).

Jedinjenje 1:

[0054]<1>H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm 3,09 (s, 3 H) 3,72 (s, 3 H) 4,00 (s, 3 H) 6,24 (d, J=7,9 Hz, 1 H) 6,58 (s, 2 H) 6,91 (s, 1 H) 6,97 (dd, J=8,7, 1,9 Hz, 1 H) 7,02 - 7,09 (m, 2 H) 7,12 (d, J=1,9 Hz, 1 H) 7,27 (dd, J=9,5, 1,9 Hz, 1 H) 7,35 (d, J=8,5 Hz, 1 H) 8,14 (dd, J=8,7, 5,5 Hz, 1 H) 8,44 (s, 1 H) 12,10 (br. S., 1 H) LC/MS (postupak LC-C): Rt3,08 min, MH<+>517 Tačka topljenja: 174°C

Enantiomer 1A:

[0055]<1>H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm 3,09 (s, 3 H) 3,72 (s, 3 H) 4,00 (s, 3 H) 6,24 (d, J=7,9 Hz, 1 H) 6,59 (s, 2 H) 6,91 (s, 1 H) 6,97 (dd, J=8,8, 2,2 Hz, 1 H) 7,02 - 7,10 (m, 2 H) 7,12 (d, J=2,2 Hz, 1 H) 7,27 (dd, J=9,6, 2,2 Hz, 1 H) 7,35 (d, J=8,2 Hz, 1 H) 8,14 (dd, J=8,8, 5,7 Hz, 1 H) 8,44 (s, 1 H) 12,10 (br. S., 1 H)

LC/MS (postupak LC-C): Rt3,09 min, MH<+>517

[α]D<20>: 130,3° (c 0,277, DMF)

Hiralna SFC (postupak SFC-D): Rt3,41 min, MH<+>517, hiralna čistoća 100%.

Tačka topljenja: 220°C

Enantiomer 1B:

[0056]<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 3,09 (s, 3 H) 3,72 (s, 3 H) 4,00 (s, 3 H) 6,24 (d, J=7,6 Hz, 1 H) 6,53 - 6,65 (m, 2 H) 6,91 (s, 1 H) 6,97 (dd, J=8,6, 2,0 Hz, 1 H) 7,01 - 7,09 (m, 2 H) 7,12 (d, J=2,0 Hz, 1 H) 7,27 (dd, J=9,6, 2,0 Hz, 1 H) 7,35 (d, J=8,1 Hz, 1 H) 8,14 (dd, J=8,6, 5,6 Hz, 1 H) 8,43 (s, 1 H) 12,09 (br. S., 1 H) LC/MS (postupak LC-C): Rt3,09 min, MH<+>517

[α]D<20>: -135,3° (c 0,283, DMF)

2

Hiralna SFC (postupak SFC-D): Rt4,89 min, MH<+>517, hiralna čistoća 99,35%.

Tačka topljenja: 218°C

Primer 1.1: Hiralna stabilnost Enantiomera 1A na pH 7,4

[0057] Hiralna stabilnost Enantiomera 1A (R = OMe) je procenjena određivanjem entantiomernog viška (ee%) nakon inkubacije tokom 24 sata i 48 sati u puferisanom rastvoru na pH 7,4 na 40°C i 60°C. Kako bi se procenio uticaj metoksi-supstituenta Enantiomera 1A (R = OMe) na stabilnost protiv racemizacije, hiralna stabilnost Enantiomera 1'A (R = H) je testirana pod istim uslovima. Sa tim ciljem, 5 µM puferisanih (pH = 7,4) rastvora 1A i 1'A je pripremljeno mešanjem 25 µL od 100 µM rastvora 1A ili 1'A u DMSO sa 475 µL vodenog pufera pH 7,4. Uzorci su uzeti 24 sata i 48 sati nakon inkubacije na 40°C i 60°C. Analitički uzorci su analiziranim hiralnom SFC (MS detektovanje) i hiralna čistoća je izražena kao enantiomerni višak (ee% = %enantiomera A - %enantiomera B). Oba Enantiomera 1A i 1'A su imala hiralnu čistoću od 100% pre svoje inkubacije.

Primer 2: sinteza 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(6-fluoro-7-metil-1H-indol-3-il)-2-((3-metoksi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)etanona (Jedinjenje 2) i hiralno razdvajanje na Enantiomere 2A i 2B.

[0058]

Sinteza intermedijera 2a:

[0059] Dietilaluminijum hlorid 1M u heksanu (20 mL, 20,0 mmol) je dodat kapanjem na 0°C rastvoru 6-fluoro-7-metil-1H-indola [CAS 57817-10-4] (1,50 g, 10,1 mmol) u CH2Cl2(45 mL). Nakon 30 minuta na 0°C, rastvor 2-(4-hloro-2-metoksifenil)acetil hlorida (3,30 g, 15,1 mmol, sinteza: pogledati Primer 1) u dihlorometanu (30 mL) je dodat polako. Reakciona smeša je mešana na 0°C tokom 3 sata.1M rastvora Rošelove soli (50 mL) je dodat i reakciona smeša je mešana sobnoj temperaturi tokom 1 sata. Čvrsta materija je filtrirana i podeljena između EtOAc i 1N HCl. Faze su razdvojene. Vodena faza je ekstrahovana sa EtOAc.

Organske faze su kombinovane, oprane sa rasolom, osušene preko MgSO4, filtrirane i koncentrovane pod redukovanim pritiskom. Ostatak je trituriran sa EtOAc i heptanom. Talog je filtriran kako bi se dobio 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(6-fluoro-7-metil-1H-indol-3-il)etanon 2a (2,00 g).

Sinteza intermedijera 2b:

[0060] Rastvor feniltrimetilamonijum tribromida [CAS 4207-56-1] (2,49 g, 6,6 mmol) u THF (45 mL) je dodat kapanjem na 0°C rastvoru 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(6-fluoro-7-metil-1H-indol-3-il)etanona 2a (2,00 g, 6,0 mmol) u THF (65 mL). Smeša je mešana sobnoj temperaturi preko noći. Talog je filtriran i opran sa EtOAc. Kombinovani filtrati su koncentrovani pod redukovanim pritiskom. Ostatak je uzet sa minimumom acetonitrila. Talog je filtriran, opran sa acetonitrilom i osušen pod vakuumom kako bi se dobila prva serija 2-bromo-2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(6-fluoro-7-metil-1H-indol-3-il)etanona 2b (1,51 g).

Filtrat je koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Ostatak je uzet sa minimumom acetonitrila. Talog je filtriran, opran sa acetonitrilom i osušen pod vakuumom kako bi se dobio drugi fragment 2-bromo-2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(6-fluoro-7-metil-1H-indol-3-il)etanona 2b (0,70 g).

Sinteza Jedinjenja 2 i hiralno razdvajanje Enantiomera 2A i 2B:

[0061] Smeša 2-bromo-2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(6-fluoro-7-metil-1H-indol-3-il)etanona 2b (1,8 g, 4,36 mmol) i 3-metoksi-5-(metilsulfonil)anilina [CAS 62606-02-4] (2,6 g, 13,0 mmol) u THF (9 mL) i CH3CN (9 mL) je zagrejana na 100°C pod mikrotalasnim zračenjem tokom 50 minuta. Reakciona smeša je razređena sa EtOAc i oprana sa 1N HCl. Faze su razdvojene. Organska faza je oprana sa vodenim zasićenim rastvorom NaHCO3i rasolom, osušena preko MgSO4, filtrirana i koncentrovana pod redukovanim pritiskom. Ostatak je uzet sa minimumom acetonitrila. Talog je filtriran, opran sa acetonitrilom i osušen pod vakuumom kako bi se dobio 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(6-fluoro-7-metil-1H-indol-3-il)-2-((3-metoksi-5-(metilsulfonil)-fenil)amino)etanon (Jedinjenje 2, 1,7 g) kao racemska smeša.

[0062] Hiralno razdvajanje enantiomera Jedinjenja 2 (1,59 g) je izvršeno putem preparativne SFC (Stacionarna faza: (S,S)-Whelk-O1 5 µm 250 x 21,1 mm, Mobilna faza: 50% CO2, 50% MeOH). Fragmenti proizvoda su kombinovani i ispareni pod redukovanim pritiskom. Prvi eluirani enantiomer (746 mg) je dalje prečišćen kolonom hromatografije na silika gelu (15-40 µm, 24 g, Mobilna faza: CH2Cl2/MeOH 99,5/0,5). Čisti fragmenti su kombinovani i ispareni pod redukovanim pritiskom (560 mg). Ostatak je učvršćen trituracijom sa smešom Et2O i nekoliko kapi CH3CN. Čvrsta materija je filtrirana i osušena pod vakuumom kako bi se dobio Enantiomer 2A (473 mg). Drugi eluirani enantiomer (732 mg) je dalje prečišćen kolonom hromatografije preko silika gela (15-40 µm, 24 g, Mobilna faza: CH2Cl2/MeOH 99,5/0,5). Čisti fragmenti su kombinovani i ispareni pod redukovanim pritiskom (550 mg). Ostatak je učvršćen trituracijom sa smešom Et2O i nekoliko kapi CH3CN. Čvrsta materija je filtrirana i osušena pod vakuumom kako bi se dobio Enantiomer 2B (457 mg).

Jedinjenje 2:

[0063]<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2,38 (d, J=1,5 Hz, 3 H) 3,10 (s, 3 H) 3,73 (s, 3 H) 4,01 (s, 3 H) 6,27 (d, J=7,9 Hz, 1 H) 6,55 - 6,63 (m, 2 H) 6,93 (m, 1 H) 6,94 - 7,09 (m, 3 H) 7,13 (d, J=1,9 Hz, 1 H) 7,35 (d, J=8,3 Hz, 1 H) 7,97 (dd, J=8,7, 5,3 Hz, 1 H) 8,45 (s, 1H) 12,23 (br. S, 1 H)

LC/MS (postupak LC-D): Rt1,68 min, MH<+>531

2

Enantiomer 2A:

[0064]<1>H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2,37 - 2,39 (m, 3 H) 3,09 (s, 3 H) 3,72 (s, 3 H) 4,01 (s, 3 H) 6,26 (d, J=7,9 Hz, 1 H) 6,54 - 6,63 (m, 2 H) 6,92 (s, 1 H) 6,97 (dd, J=8,4, 1,9 Hz, 1 H) 7,02 (dd, J=9,9, 9,0 Hz, 1 H) 7,07 (d, J=7,9 Hz, 1 H) 7,13 (d, J=1,9 Hz, 1 H) 7,35 (d, J=8,4 Hz, 1 H) 7,96 (dd, J=8,5, 5,4 Hz, 1 H) 8,45 (s, 1 H) 12,24 (br. S., 1 H)

LC/MS (postupak LC-C): Rt3,20 min, MH<+>531

[α]D<20>: 104,5° (c 0,2545, DMF)

Hiralna SFC (postupak SFC-A): Rt4,22 min, MH<+>531, hiralna čistoća 100%.

Enantiomer 2B:

[0065]<1>H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2,36 - 2,41 (m, 3 H) 3,09 (s, 3 H) 3,72 (s, 3 H) 4,01 (s, 3 H) 6,26 (d, J=7,9 Hz, 1 H) 6,57 - 6,64 (m, 2 H) 6,92 (s, 1 H) 6,97 (dd, J=8,2, 1,9 Hz, 1 H) 6,99 - 7,04 (m, 1 H) 7,07 (d, J=7,9 Hz, 1 H) 7,13 (d, J=1,9 Hz, 1 H) 7,35 (d, J=8,2 Hz, 1 H) 7,96 (dd, J=8,7, 5,2 Hz, 1 H) 8,45 (s, 1 H) 12,24 (br. S., 1 H)

LC/MS (postupak LC-C): Rt3,20 min, MH<+>531

[α]D<20>: -104,1° (c 0,2536, DMF)

Hiralna SFC (postupak SFC-A): Rt5,12 min, MH<+>531, hiralna čistoća 99,53%.

Primer 3: sinteza 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(6-metoksi-1H-indol-3-il)-2-((3-metoksi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)etanona (Jedinjenje 3) i hiralno razdvajanje na Enantiomere 3A i 3B.

[0066]

Sinteza intermedijera 3a:

[0067] Rastvor NaHSO3(5,7 g, 54,5 mmol) u vodi (45 mL) je dodat mešanom rastvoru trecbutil 3-formil-6-metoksi-1H-indol-1-karboksilata [CAS 847448-73-1] (10 g, 36,3 mmol) u dioksanu (45 mL). Nakon 15 minuta, morfolin (4,8 mL, 54,5 mmol) je dodat i 35 minuta kasnije, natrijum cijanid (NaCN) (1,96 g, 40 mmol) je dodat. Rezultujuća suspenzija je mešana sobnoj temperaturi tokom 3 dana, do završetka reakcije. Proizvod je filtriran i opran sa 1/1 smešom dioksana/vode (3x 35 mL), i potom sa vodom (3x 45 mL) i osušen pod vakuumom na 60°C. Čvrsta materija je mešana u Et2O (125 mL), filtrirana, oprana sa Et2O (3x) i osušena pod vakuumom na 50°C kako bi se dobilo trec-butil 3-(cijano(morfolino)metil)-6-metoksi-1H-indol-1-karboksilat 3a (12,3 g).

Sinteza intermedijera 3b:

[0068] Smeša trec-butil 3-(cijano(morfolino)metil)-6-metoksi-1H-indol-1-karboksilata 3a (6,0 g, 16,2 mmol) u suvom DMF (80 mL) je mešan pod N2-atmosferom uz hlađenje na ledenoj kadi. Rastvor KHMDS 0,5 M u toluenu (35,5 mL, 17,8 mmol) je dodat kapanjem tokom 10 minuta. Nakon mešanja tokom dodatnih 10 minuta, 4-hloro-1-(hlorometil)-2-metoksibenzen [CAS 101079-84-9] (3,09 g, 16,2 mmol) je dodat i rezultujuća smeša je

2

mešana sobnoj temperaturi tokom 20 sati. Reakciona smeša je sipana u hladnu vodu (400 mL) i proizvod je ekstrahovan sa Et2O (2x). Kombinovani organski slojevi su oprani sa rasolom, osušeni preko MgSO4, filtrirani, ispareni pod redukovanim pritiskom i ko-ispareni sa ksilenom. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom (Stacionarna faza: Grace Reveleris® silicijum dioksid 120 g, Mobilna faza: heptan/EtOAc gradijent 100/0 do 20/80). Željeni fragmenti su kombinovani, ispareni pod redukovanim pritiskom i ko-ispareni sa dioksanom kako bi se dobio trec-butil 3-(2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-cijano-1-morfolinoetil)-6-metoksi-1H-indol-1-karboksilat 3b (7,75 g).

Sinteza intermedijera 3c:

[0069] Mešanoj suspenziji trec-butil 3-(2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-cijano-1-morfolinoetil)-6-metoksi-1H-indol-1-karboksilata 3b (7,75 g, 14,7 mmol) u dioksanu (40 mL) i vodi (20 mL) je dodat rastvor HCl 6 M u izopropanolu (36,8 mL, 220 mmol). Rezultujuća smeša je mešana na 60°C tokom 4 sata i potom na 80°C tokom 1 sata. Nakon hlađenja do sobne temperature, smeša je ostavljena tokom 20 sati kako bi se omogućila kristalizacija proizvoda reakcije. Proizvod je filtriran, opran sa 1/1/1 smešom iPrOH/H2O/dioksana (2x 15 mL) i osušen pod vakuumom na 50°C kako bi se dobio 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(6-metoksi-1H-indol-3-il)etanon 3c (3,67 g).

Sinteza Jedinjenja 3 i hiralno razdvajanje Enantiomera 3A i 3B:

[0070] Mešana smeša 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(6-metoksi-1H-indol-3-il)-etanona 3c (2 g, 6,07 mmol) u THF (80 mL) je ohlađena na ledenoj kadi pod N2-atmosferom.

Feniltrimetilamonijum tribromid [CAS 4207-56-1] (2,39 g, 6,37 mmol) je dodat i reakciona smeša je mešana na 0°C tokom 1 sata i potom na sobnoj temperaturi tokom 1,5 sata.3-metoksi-5-(metilsulfonil)anilin [CAS 62606-02-4] (3,66 g, 18,2 mmol) je dodat i rastvarač je isparen pod redukovanim pritiskom. Ostatak je rastvoren u CH3CN (100 mL).

Diizopropiletilamin (2,09 mL, 12,1 mmol) je dodat i reakciona smeša je zagrejana na 55°C tokom 27 sati. Reakcionoj smeši je omogućeno da se ohladi do sobne temperature i sipana je u mešanu vodu (400 mL). Proizvod je ekstrahovan sa 2-MetF (2x). Kombinovani organski slojevi su oprani sa rasolom, osušeni preko MgSO4, filtrirani i ispareni pod redukovanim pritiskom. Ostatak (8 g) je prečišćen fleš hromatografijom (Stacionarna faza: Grace Reveleris® silicijum dioksid 120 g, Mobilna faza: heptan/EtOAc gradijent od 100/0 do 0/100). Željeni fragmenti su kombinovani i ispareni pod redukovanim pritiskom. Ostatak (5,4 g) je dalje prečišćen preparativnom HPLC (Stacionarna faza: RP XBridge® Prep C18 OBD -10 µm, 50 x 150 mm, Mobilna faza: 0,25% NH4HCO3rastvor u voda, CH3CN). Fragmenti

2

proizvoda su kombinovani i ispareni pod redukovanim pritiskom i potom ko-ispareni sa MeOH. Ostatak je kristalisan od smeše EtOAc (15 mL), CH3CN (2 mL) i MeOH (2 mL). Čvrsta materija je filtrirana, oprana sa EtOAc (3x) i osušena pod vakuumom na 50°C kako bi se dobio 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(6-metoksi-1H-indol-3-il)-2-((3-metoksi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)etanon (Jedinjenje 3, 681 mg) kao racemska smeša.

[0071] Hiralno razdvajanje enantiomera Jedinjenja 3 (0,63 g) je izvršeno putem hiralnog razdvajanja normalne faze (Stacionarna faza: AS 20 µM, Mobilna faza: 100% metanol). Fragmenti proizvoda su kombinovani i ispareni pod redukovanim pritiskom. Prvi eluirani enantiomer je prečišćen fleš hromatografijom (Stacionarna faza: Grace Reveleris® silicijum dioksid 12 g, Mobilna faza: heptan/EtOAc/EtOH gradijent od 100/0/0 do 40/45/15). Željeni fragmenti su kombinovani i ispareni, i ko-ispareni sa EtOAc. Preostalo ulje je učvršćeno mešanjem u H2O (4 mL) i sporim dodavanjem MeOH (1,6 mL). Nakon mešanja tokom 20 minuta, proizvod je filtriran, opran (3x) sa 1/2 smešom MeOH/H2O i osušen pod vakuumom na 50°C kako bi se dobio Enantiomer 3A (168 mg) kao amorfna čvrsta supstanca. Drugi eluirani enantiomer je prečišćen fleš hromatografijom (Stacionarna faza: Grace Reveleris® silicijum dioksid 12 g, Mobilna faza: heptan/EtOAc/EtOH gradijent od 100/0/0 do 40/45/15). Željeni fragmenti su kombinovani, ispareni pod redukovanim pritiskom i ko-ispareni sa EtOAc. Preostala pena je učvršćena mešanjem u H2O (4 mL) i sporim dodavanjem MeOH (2 mL). Nakon mešanja tokom 15 minuta, proizvod je filtriran, opran (3x) sa 1/2 smešom MeOH/H2O i osušen na 50°C pod vakuumom kako bi se dobio Enantiomer 3B (146 mg) kao amorfna čvrsta supstanca.

Jedinjenje 3:

[0072]<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 3,09 (s, 3 H) 3,72 (s, 3 H) 3,77 (s, 3 H) 4,01 (s, 3 H) 6,21 (d, J=7,9 Hz, 1 H) 6,54 - 6,64 (m, 2 H) 6,83 (dd, J=8,7, 2,3 Hz, 1 H) 6,91 (t, J=1,4 Hz, 1 H) 6,94 - 6,99 (m, 2 H) 7,04 (d, J=7,7 Hz, 1 H) 7,12 (d, J=2,0 Hz, 1 H) 7,35 (d, J=8,1 Hz, 1 H) 8,02 (d, J=8,8 Hz, 1 H) 8,30 (s, 1 H) 11,84 (s, 1 H) LC/MS (postupak LC-A): Rt1,20 minuta, MH<+>529

Enantiomer 3A:

[0073]<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ ppm 3,09 (s, 3 H) 3,72 (s, 3 H) 3,77 (s, 3 H) 4,01 (s, 3 H) 6,22 (d, J=8,1 Hz, 1 H) 6,55 - 6,61 (m, 2 H) 6,84 (dd, J=8,8, 2,2 Hz, 1 H) 6,91 (t, J=1,8 Hz, 1 H) 6,94 - 7,00 (m, 2 H) 7,07 (d, J=7,0 Hz, 1 H) 7,13 (d, J=1,8 Hz, 1 H) 7,35 (d, J=8,4

2

Hz, 1 H) 8,02 (d, J=8,8 Hz, 1 H) 8,32 (d, J=2,9 Hz, 1 H) 11,87 (d, J=2,6 Hz, 1 H) LC/MS (postupak LC-A): Rt1,08 minuta, MH<+>529

[α]D<20>: 134,9° (c 0,545, DMF)

Hiralna SFC (postupak SFC-E): Rt4,31 minuta, MH<+>529, hiralna čistoća 100%.

Enantiomer 3B:

[0074]<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ ppm 3,09 (s, 3 H) 3,72 (s, 3 H) 3,77 (s, 3 H) 4,01 (s, 3 H) 6,21 (d, J=8,1 Hz, 1 H) 6,54 - 6,62 (m, 2 H) 6,83 (dd, J=8,6, 2,4 Hz, 1 H) 6,91 (t, J=1,5 Hz, 1 H) 6,94 - 6,99 (m, 2 H) 7,07 (d, J=7,0 Hz, 1 H) 7,13 (d, J=1,8 Hz, 1 H) 7,35 (d, J=8,1 Hz, 1 H) 8,02 (d, J=8,8 Hz, 1 H) 8,32 (d, J=2,9 Hz, 1 H) 11,87 (br d, J=2,2 Hz, 1 H) LC/MS (postupak LC-A): Rt1,08 minuta, MH<+>529

[α]D<20>: -116,7° (c 0,51, DMF)

Hiralna SFC (postupak SFC-E): Rt4,63 minuta, MH<+>529, hiralna čistoća 94,7%.

Primer 4: Sinteza 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-2-((3-metoksi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)-1-(6-metoksi-5-metil-1H-indol-3-il)etanona (Jedinjenje 4) i hiralno razdvajanje na Enantiomere 4A i 4B.

[0075]

Sinteza intermedijera 4a:

[0076] Dietilaluminijum hlorid 1M u heksanu (13,5 mL, 13,5 mmol) je dodat kapanjem na 0°C rastvoru 6-metoksi-5-metil-1H-indola [CAS 1071973-95-9] (1,45 g, 9 mmol) u CH2Cl2

2

(45 mL). Nakon 30 minuta na 0°C, rastvor 2-(4-hloro-2-metoksifenil)acetil hlorida 1a (2,4 g, 10,9 mmol) u CH2Cl2(45 mL) je dodat polako na 0°C. Reakcija je mešana na 0°C tokom 3 sata. Ledena voda je dodata i talog je filtriran i opran sa vodom. Čvrsta materija je osušena pod vakuumom kako bi se dobio 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(6-metoksi-5-metil-1H-indol-3-il)etanon 4a (2,1 g).

Sinteza intermedijera 4b:

[0077] Na 0°C, rastvor feniltrimetilamonijum tribromida [CAS 4207-56-1] (2,4 g, 6,4 mmol) u THF (65 mL) je dodat kapanjem smeši 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(6-metoksi-5-metil-1H-indol-3-il)etanona 4a (2,1 g, 6,1 mmol) u THF (60 mL). Smeša je mešana na 0°C tokom 1 sata i na sobnoj temperaturi tokom 2,5 sata. Talog je filtriran i opran sa EtOAc. Filtrat je koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Ostatak je uzet sa minimumom diizopropiletra. Talog je filtriran i osušen pod vakuumom kako bi se dobio 2-bromo-2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(6-metoksi-5-metil-1H-indol-3-il)etanon 4b (2,36 g).

Sinteza Jedinjenja 4 i hiralno razdvajanje Enantiomera 4A i 4B:

[0078] Smeša 2-bromo-2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(6-metoksi-5-metil-1H-indol-3-il)etanona 4b (4,0 g, 9,46 mmol), 3-metoksi-5-(metilsulfonil)anilina [CAS 62606-02-4] (2,86 g, 14,2 mmol) i diizopropiletilamina (2,44 mL, 14,2 mmol) u CH3CN/THF (1/1) (100 mL) je mešana na 45°C tokom 72 sata. Rastvarači su uklonjeni pod redukovanim pritiskom. Ostatak je rastvoren u EtOAc. Organski sloj je opran dvaput sa 1N HCl, opran sa vodom, osušen preko MgSO4, filtriran i koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Jedinjenje je kristalisano od CH3CN/diizopropiletra kako bi se dobio 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-2-((3-metoksi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)-1-(6-metoksi-5-metil-1H-indol-3-il)etanon (Jedinjenje 4, 1,1 g) kao racemska smeša. Hiralno razdvajanje enantiomera Jedinjenja 4 je izvršeno putem preparativne hiralne SFC (Stacionarna faza: (S,S)-Whelk-O15 µm 250 x 21,1 mm, Mobilna faza: 45% CO2, 55% MeOH) čime je kao prinos dobijeno 500 mg prvog eluiranog enantiomera i 531 mg drugog eluiranog enantiomera. Prvi eluirani enantiomer je kristalisan od CH3CN/Et2O kako bi se dobio Enantiomer 4A (401 mg). Drugi eluirani je kristalisan od CH3CN/Et2O kako bi se dobio Enantiomer 4B (396 mg).

Jedinjenje 4:

[0079]<1>H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2,21 (s, 3 H) 3,09 (s, 3 H) 3,72 (s, 3 H) 3,79 (s, 3 H) 4,01 (s, 3 H) 6,20 (d, J=7,9 Hz, 1 H) 6,58 (s, 2 H) 6,88 - 6,93 (m, 2 H) 6,96 (dd, J=8,5,

2

1,9 Hz, 1 H) 7,02 (d, J=7,9 Hz, 1 H) 7,12 (d, J=1,9 Hz, 1 H) 7,34 (d, J=8,5 Hz, 1 H) 7,89 (s, 1 H) 8,24 (s, 1 H) 11,78 (br. S., 1 H)

LC/MS (postupak LC-C): Rt3,16 minuta, MH<+>543

Tačka topljenja: 208°C

Enantiomer 4A:

[0080]<1>H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2,21 (s, 3 H) 3,09 (s, 3 H) 3,72 (s, 3 H) 3,79 (s, 3 H) 4,01 (s, 3 H) 6,20 (d, J=7,6 Hz, 1 H) 6,58 (d, J=1,6 Hz, 2 H) 6,87 - 6,93 (m, 2 H) 6,96 (dd, J=8,2, 1,9 Hz, 1 H) 7,02 (d, J=7,6 Hz, 1 H) 7,12 (d, J=1,9 Hz, 1 H) 7,34 (d, J=8,2 Hz, 1 H) 7,89 (s, 1 H) 8,25 (s, 1 H) 11,78 (br. S., 1 H)

LC/MS (postupak LC-C): Rt3,15 minuta, MH<+>543

[α]D<20>: 141,8° (c 0,3936, DMF)

Hiralna SFC (postupak SFC-C): Rt4,95 minuta, MH<+>543, hiralna čistoća 100%.

Tačka topljenja: 173°C

Enantiomer 4B:

[0081]<1>H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2,21 (s, 3 H) 3,09 (s, 3 H) 3,72 (s, 3 H) 3,79 (s, 3 H) 4,01 (s, 3 H) 6,20 (d, J=7,9 Hz, 1 H) 6,58 (s, 2 H) 6,88 - 6,93 (m, 2 H) 6,96 (dd, J=8,2, 1,9 Hz, 1 H) 7,02 (d, J=7,9 Hz, 1 H) 7,12 (d, J=1,9 Hz, 1 H) 7,34 (d, J=8,2 Hz, 1 H) 7,90 (s, 1 H) 8,25 (s, 1 H) 11,79 (br. S., 1 H)

LC/MS (postupak LC-C): Rt3,15 minuta, MH<+>543

[α]D<20>: -142,2° (c 0,3909, DMF)

Hiralna SFC (postupak SFC-C): Rt6,84 minuta, MH<+>543, hiralna čistoća 100%.

Tačka topljenja: 174°C

Primer 5: Sinteza 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(5-fluoro-6-metoksi-1H-indol-3-il)-2-((3-metoksi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)etanona (Jedinjenje 5) i hiralno razdvajanje na Enantiomere 5A i 5B.

[0082]

Sinteza intermedijera 5a:

[0083] Dietilaluminijum hlorid 1M u heksanu (15,7 mL, 15,7 mmol) je dodat kapanjem na 0°C rastvoru 5-fluoro-6-metoksi-1H-indola [CAS 1211595-72-0] (2 g, 12,1 mmol) u CH2Cl2(50 mL). Nakon 30 minuta na 0°C, rastvor 2-(4-hloro-2-metoksifenil)acetil hlorida 1a (3,2 g, 14,6 mmol) u CH2Cl2(50 mL) je dodat polako na 0°C. Reakcija je mešana na 0°C tokom 3 sata. Ledena voda je dodata i talog je filtriran, opran sa vodom i minimumom CH2Cl2. Čvrsta materija je osušena pod vakuumom kako bi se dobio 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(5-fluoro-6-metoksi-1H-indol-3-il)etanon 5a (2,82 g).

Sinteza intermedijera 5b:

[0084] Na 0°C, rastvor feniltrimetilamonijum tribromida [CAS 4207-56-1] (3,5 g, 8,1 mmol) u THF (20 mL) je dodat kapanjem rastvoru 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(5-fluoro-6-metoksi-1H-indol-3-il)etanona 5a (2,82 g, 8,1 mmol) u THF (46 mL). Smeša je mešana na 0°C tokom 1 sata i na sobnoj temperaturi tokom 4 sata. Talog je filtriran i opran sa EtOAc. Filtrat je koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Ostatak je rastvoren u EtOAc i opran sa vodom. Organska faza je osušena preko MgSO4, filtrirana i rastvarač je isparen pod redukovanim pritiskom. Ostatak je uzet sa minimumom od EtOAc. Talog je filtriran i osušen pod vakuumom kako bi se dobio 2-bromo-2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(5-fluoro-6-metoksi-1H-indol-3-il)etanon 5b (2,5 g).

Sinteza Jedinjenja 5 i hiralno razdvajanje Enantiomera 5A i 5B:

1

[0085] Smeša 2-bromo-2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(5-fluoro-6-metoksi-1H-indol-3-il)etanona 5b (2,5 g, 5,86 mmol), 3-metoksi-5-(metilsulfonil)anilina [CAS 62606-02-4] (1,415 g, 7,03 mmol) i diizopropiletilamina (1,515 mL, 8,79 mmol) u CH3CN (55 mL) i THF (100 mL) je mešana na 50°C tokom 10 dana. Rastvarači su uklonjeni pod redukovanim pritiskom. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom na silika gelu (15-40 µm, 80 g, Mobilna faza: CH2Cl2/CH3OH 99,25/0,75). Čisti fragmenti su kombinovani i ispareni. Jedinjenje je rastvoreno u EtOAc i mešano sa HCl 1N tokom 15 minuta. Talog koji se pojavio je filtriran i osušen pod vakuumom kako bi se dobio 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(5-fluoro-6-metoksi-1H-indol-3-il)-2-((3-metoksi-5-(metilsulfonil)fenil)-amino)etanon (Jedinjenje 5, 1,3 g) kao racemska smeša.

[0086] Hiralno razdvajanje enantiomera Jedinjenja 5 je izvršeno putem preparativne hiralne SFC (Stacionarna faza: Chiralpak® IC 5 µm 250 x 20 mm, Mobilna faza: 55% CO2, 45% MeOH). Fragmenti proizvoda su kombinovani i ispareni. Prvi eluirani enantiomer je učvršćen trituracijom sa heptanom/diizopropiletrom. Čvrsta materija je filtrirana i osušena pod vakuumom kako bi se dobio Enantiomer 5A (502 mg) kao amorfni beli prašak. Drugi eluirani enantiomer je učvršćen trituracijom sa heptanom/diizopropiletrom. Čvrsta materija je filtrirana i osušena pod vakuumom kako bi se dobio Enantiomer 5B (490 mg) kao amorfni beli prašak.

Jedinjenje 5:

[0087]<1>H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm 3,09 (s, 3 H) 3,72 (s, 3 H) 3,85 (s, 3 H) 4,00 (s, 3 H) 6,21 (d, J=7,9 Hz, 1 H) 6,58 (d, J=1,3 Hz, 2 H) 6,90 (s, 1 H) 6,97 (dd, J=8,2, 1,9 Hz, 1 H) 7,06 (d, J=7,9 Hz, 1 H) 7,10 - 7,18 (m, 2 H) 7,34 (d, J=8,2 Hz, 1 H) 7,82 (d, J=12,0 Hz, 1 H) 8,35 (s, 1 H) 11,98 (br. S., 1 H)

LC/MS (postupak LC-C): Rt3,01 minuta, MH<+>547

Tačka topljenja: 182°C

Enantiomer 5A:

[0088]<1>H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm 3,09 (s, 3 H) 3,72 (s, 3 H) 3,85 (s, 3 H) 4,00 (s, 3 H) 6,21 (d, J=7,9 Hz, 1 H) 6,58 (d, J=1,3 Hz, 2 H) 6,90 (s, 1 H) 6,97 (dd, J=8,2, 2,0 Hz, 1 H) 7,07 (d, J=7,9 Hz, 1 H) 7,11 - 7,17 (m, 2 H) 7,34 (d, J=8,2 Hz, 1 H) 7,82 (d, J=11,7 Hz, 1 H) 8,35 (s, 1 H) 11,98 (br. S., 1 H)

LC/MS (postupak LC-C): Rt3,00 minuta, MH<+>547

2

[α]D<20>: 136,4° (c 0,28, DMF)

Hiralna SFC (postupak SFC-B): Rt3,43 minuta, MH<+>547, hiralna čistoća 100%.

Enantiomer 5B:

[0089]<1>H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm 3,09 (s, 3 H) 3,72 (s, 3 H) 3,85 (s, 3 H) 4,00 (s, 3 H) 6,21 (d, J=7,9 Hz, 1 H) 6,58 (d, J=1,3 Hz, 2 H) 6,90 (s, 1 H) 6,97 (dd, J=8,2, 2,0 Hz, 1 H) 7,07 (d, J=7,9 Hz, 1 H) 7,11 - 7,19 (m, 2 H) 7,34 (d, J=8,2 Hz, 1 H) 7,82 (d, J=11,7 Hz, 1 H) 8,35 (s, 1 H) 11,95 (br. S., 1 H)

LC/MS (postupak LC-C): Rt3,00 minuta, MH<+>547

[α]D<20>: -126,3° (c 0,2755, DMF)

Hiralna SFC (postupak SFC-B): Rt4,80 minuta, MH<+>547, hiralna čistoća 98,06%.

Primer 6: Sinteza 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-2-((3-metoksi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)-1-(6-metoksi-7-metil-1H-indol-3-il)etanona (Jedinjenje 6) i hiralno razdvajanje na Enantiomere 6A i 6B.

[0090]

Sinteza intermedijera 6a:

[0091] Dietilaluminijum hlorid 1M u heksanu (32,8 mL, 32,8 mmol) je dodat kapanjem ohlađenom (-30°C) rastvoru 6-metoksi-7-metil-1H-indola [CAS 19500-05-1] (3,53 g, 21,9 mmol) u CH2Cl2(150 mL). Nakon mešanja tokom 15 minuta na -30°C, rastvor 2-(4-hloro-2-metoksifenil)acetil hlorida 1a (6,71 g, 30,6 mmol) u CH2Cl2(150 mL) je dodat polako na 30°C. Reakcija je mešana na -30°C tokom 1 sata i omogućeno joj je da se zagreje do sobne temperature uz mešanje tokom 2 sata. Reakciona smeša je sipana u ledenu vodu/Rošelovu so. Smeša je filtrirana preko kratke ploče od dicalite® i filter kolač je ispran nekoliko puta sa THF. Slojevi su razdvojeni. Vodeni sloj je ekstrahovan sa THF. Kombinovani organski slojevi su oprani sa rasolom, vodom, osušeni preko MgSO4, filtrirani, i ispareni pod redukovanim pritiskom. Čvrsti ostatak je suspendovan u CH2Cl2(50 mL) i čvrsta materija je filtrirana i oprana sa malom količinom CH2Cl2i osušena pod vakuumom na 50°C kako bi se dobio 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(6-metoksi-7-metil-1H-indol-3-il)etanon 6a (6,85 g) kao beličasta čvrsta supstanca.

Sinteza intermedijera 6b:

[0092] Na 0°C, rastvor feniltrimetilamonijum tribromida [CAS 4207-56-1] (8,2 g, 21,8 mmol) u THF (150 mL) je dodat kapanjem rastvoru 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(6-metoksi-7-metil-1H-indol-3-il)etanona 6a (6,8 g, 19,8 mmol) u THF (250 mL). Smeša je mešana sobnoj temperaturi tokom 2 sata.

[0093] Talog je filtriran i opran sa THF. Filtrat je koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Ostatak je kristalisan od CH2Cl2. Talog je filtriran, opran sa CH2Cl2(2x) i osušen pod vakuumom na 50°C kako bi se dobio 2-bromo-2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(6-metoksi-7-metil-1H-indol-3-il)etanon 6b (5,38 g).

Sinteza Jedinjenja 6 i hiralno razdvajanje Enantiomera 6A i 6B:

[0094] Smeša 2-bromo-2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(6-metoksi-7-metil-1H-indol-3-il)etanona 6b (1,96 g, 4,65 mmol), 3-metoksi-5-(metilsulfonil)anilina [CAS 62606-02-4] (1,40 g, 6,97 mmol) i diizopropiletilamina (1,20 mL, 6,97 mmol) u CH3CN (50 mL) je zagrejana preko noći pod refluksom. Rastvarači su uklonjeni pod redukovanim pritiskom. Ostatak je rastvoren u CH2Cl2i opran sa 0,5N HCl i vodom, osušen preko MgSO4, filtriran i isparen pod redukovanim pritiskom. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom na silika gelu (Stacionarna faza: Biotage® SNAP Ultra 100 g, Mobilna faza: EtOAc:EtOH(3:1)/heptan gradijent 0/100 do 50/50). Čisti fragmenti su kombinovani i ispareni pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-2-((3-metoksi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)-1-(6-metoksi-7-metil-1H-indol-3-il)etanon (Jedinjenje 6, 1,0 g) kao racemska smeša.

4

[0095] Hiralno razdvajanje enantiomera Jedinjenja 6 (1,0 g) je izvršeno putem preparativne hiralne SFC (Stacionarna faza: Chiralcel® Diacel OD 20 x 250 mm, Mobilna faza: CO2, EtOH containing 0,2% iPrNH2). Fragmenti proizvoda su kombinovani i ispareni. Prvi eluirani enantiomer je učvršćen trituracijom sa smešom MeOH/vode (1/1). Čvrsta materija je filtrirana i osušena pod vakuumom na 50°C kako bi se dobio Enantiomer 6A (368 mg) kao amorfni beli prašak. Drugi eluirani enantiomer je učvršćen trituracijom sa MeOH/voda (1/1) smeša. Čvrsta materija je filtrirana i osušena pod vakuumom na 50°C kako bi se dobio Enantiomer 6B (303 mg) kao amorfni beli prašak.

Enantiomer 6A:

[0096]<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2,29 (s, 3 H) 3,10 (s, 3 H) 3,72 (s, 3 H) 3,80 (s, 3 H) 4,02 (s, 3 H) 6,24 (d, J=7,7 Hz, 1 H) 6,56 - 6,59 (m, 1 H) 6,59 - 6,62 (m, 1 H) 6,92 (t, J=1,6 Hz, 1 H) 6,93 - 6,99 (m, 2 H) 7,06 (d, J=7,7 Hz, 1 H) 7,13 (d, J=1,8 Hz, 1 H) 7,35 (d, J=8,4 Hz, 1 H) 7,94 (d, J=8,4 Hz, 1 H) 8,35 (s, 1 H) 11,91 (br s, 1 H)

LC/MS (postupak LC-A): Rt1,18 minuta, MH<+>543

[α]D<20>: 122,9° (c 0,48, DMF)

Hiralna SFC (postupak SFC-E): Rt4,15 minuta MH<+>543, hiralna čistoća 100%.

Enantiomer 6B:

[0097]<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2,29 (s, 3 H) 3,10 (s, 3 H) 3,72 (s, 3 H) 3,80 (s, 3 H) 4,02 (s, 3 H) 6,24 (d, J=7,7 Hz, 1 H) 6,57 - 6,59 (m, 1 H) 6,59 - 6,62 (m, 1 H) 6,92 (t, J=1,8 Hz, 1 H) 6,93 - 7,00 (m, 2 H) 7,06 (d, J=7,7 Hz, 1 H) 7,13 (d, J=1,8 Hz, 1 H) 7,35 (d, J=8,1 Hz, 1 H) 7,94 (d, J=8,8 Hz, 1 H) 8,35 (d, J=2,2 Hz, 1 H) 11,91 (br s, 1 H)

LC/MS (postupak LC-A): Rt1,22 minuta, MH<+>543

[α]D<20>: -120,6° (c 0,2755, DMF)

Hiralna SFC (postupak SFC-E): Rt4,50 minuta, MH<+>543, hiralna čistoća 99,35%.

Primer 7: Sinteza 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(6-fluoro-5-metil-1H-indol-3-il)-2-((3-metoksi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)etanona (Jedinjenje 7) i hiralno razdvajanje na Enantiomere 7A i 7B.

[0098]

Sinteza intermedijera 7a:

[0099] Rastvor 6-fluoro-5-metil-1H-indol [CAS 162100-95-0] (1,7 g, 11,4 mmol) u CH2Cl2(100 mL) je ohlađen do 0°C pod N2-atmosferom. Rastvor dietilaluminijum hlorida 1M u heksanu (17,1 mL, 17,1 mmol) je dodat kapanjem i rezultujuća smeša je držana na 0°C tokom 15 minuta. Rastvor 2-(4-hloro-2-metoksifenil)acetil hlorida 1a (3,50 g, 16 mmol) u CH2Cl2(50 mL) je dodat kapanjem. Mešanje je nastavljeno na 0°C tokom 1 sata i na sobnoj temperaturi tokom 2 sata. Reakciona smeša je sipana u mešan rastvor leda/Rošelove soli.

[0100] Nakon što se led otopio, smeša je filtrirana preko dicalite® i filter kolač je opran nekoliko puta sa THF. Filtrati su kombinovani. Slojevi su razdvojeni i organski sloj je opran sa rasolom, osušen preko MgSO4, filtriran i isparen pod redukovanim pritiskom. Čvrsti ostatak je suspendovan u CH2Cl2(30 mL), talog je filtriran i osušen pod vakuumom na 50°C kako bi se dobio 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(6-fluoro-5-metil-1H-indol-3-il)etanon 7a (2,76 g).

Sinteza intermedijera 7b:

[0101] Mešani rastvor 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(6-fluoro-5-metil-1H-indol-3-il)etanona 7a (2,76 g, 8,32 mmol) u THF (350 mL) je ohlađen do 0°C. Rastvor feniltrimetilamonijum tribromida [CAS 4207-56-1] (3,44 g, 9,15 mmol) u THF (50 mL) je dodat kapanjem.

Reakciona smeša je mešana na 0°C tokom 2 sata i na sobnoj temperaturi tokom 2 sata. Čvrsta materija je uklonjena filtracijom i oprana sa THF. Kombinovani filtrati su ispareni pod redukovanim pritiskom. Ostatak je pomešan sa EtOAc (50 mL). Čvrsta materija je izolovana filtracijom, oprana sa malom količinom EtOAc i osušena pod vakuumom na 50°C kako bi se dobio 2-bromo-2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(6-fluoro-5-metil-1H-indol-3-il)etanon 7b (3,21 g) kao bela čvrsta supstanca, koja je u narednom koraku korišćena bez daljeg prečišćavanja.

Sinteza Jedinjenja 7 i hiralno razdvajanje Enantiomera 7A i 7B:

[0102] Smeša 2-bromo-2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(6-fluoro-5-metil-1H-indol-3-il)etanona 7b (1,6 g, 3,90 mmol), 3-metoksi-5-(metilsulfonil)anilina [CAS 62606-02-4] (1,18 g, 5,84 mmol) i diizopropiletilamina (671 µL, 3,90 mmol) u CH3CN (100 mL) je mešana preko noći na 85°C. Reakciona smeša je koncentrovana pod redukovanim pritiskom. Ostatak je rastvoren u CH2Cl2(100 mL), opran sa 1N HCl (100 mL) i vodom (100 mL), osušen preko MgSO4, filtriran i isparen pod redukovanim pritiskom. Ostatak je prečišćen kolonom hromatografije (Stacionarna faza: Grace Reveleris® silicijum dioksid 120 g, Mobilna faza:

EtOAc:EtOH(3:1)/heptan gradijent 0/100 do 50/50). Željeni fragmenti su kombinovani i ispareni pod redukovanim pritiskom. Ostatak je taložen od CH2Cl2/heptan. Čvrsta materija je izolovana filtracijom i opran sa CH2Cl2/heptan (1/1). Sirov proizvod je dalje prečišćen preparativnom HPLC (Stacionarna faza: Uptisphere® C18 ODB - 10 µm, 200 g, 5 cm, Mobilna faza: 0,25% NH4HCO3rastvor u voda, CH3CN). Fragmenti proizvoda su kombinovani i ispareni pod redukovanim pritiskom. Čvrsti ostatak je pomešan sa EtOAc (20 mL) i čvrsta materija je izolovana filtracijom i oprana sa malom količinom EtOAc kako bi se dobio 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(6-fluoro-5-metil-1H-indol-3-il)-2-((3-metoksi-5-(metilsulfonil)-fenil)amino)etanon (Jedinjenje 7, 341 mg) kao racemska smeša. Filtrat je isparen pod redukovanim pritiskom i ostatak je uzet sa MeOH. Nakon mešanja tokom 30 minuta, čvrsta materija je izolovana filtracijom kako bi se dobila druga serija Jedinjenja 7 (92 mg).

[0103] Hiralno razdvajanje enantiomera Jedinjenja 7 (402 mg) je izvršeno putem hiralnog razdvajanja normalne faze (Stacionarna faza: (S,S)-Whelk-O1, Mobilna faza: 100% metanol). Fragmenti proizvoda su kombinovani i ispareni kako bi se dobio Enantiomer 7A kao prvi eluirani proizvod i Enantiomer 7B kao drugi eluirani proizvod. Enantiomer 7A je dalje prečišćen fleš hromatografijom na silika gelu (Stacionarna faza: Grace Reveleris® silicijum dioksid 12 g, Mobilna faza: heptan/EtOAc/EtOH 100/0/0 do 40/45/15). Željeni fragmenti su kombinovani i ispareni pod redukovanim pritiskom. Ostatak je trituriran sa H2O (1,75 mL) i MeOH (0,75 mL). Čvrsta materija je filtrirana, oprana (2x) sa H2O/MeOH 7/3, i osušena pod vakuumom na 50°C kako bi se dobio Enantiomer 7A (48 mg). Enantiomer 7B je dalje prečišćen fleš hromatografijom na silika gelu (Stacionarna faza: Grace Reveleris® silicijum dioksid 12 g, Mobilna faza: heptan/EtOAc/EtOH 100/0/0 do 40/45/15). Željeni fragmenti su kombinovani i ispareni pod redukovanim pritiskom. Ostatak je trituriran sa H2O (1,75 mL) i MeOH (0,75 mL). Čvrsta materija je filtrirana, oprana (2x) sa H2O/MeOH 7/3, i osušena pod vakuumom na 50°C kako bi se dobio Enantiomer 7B (43 mg).

Jedinjenje 7:

[0104]<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2,30 (d, J=0,9 Hz, 3 H) 3,09 (s, 3 H) 3,72 (s, 3 H) 4,00 (s, 3 H) 6,22 (d, J=7,7 Hz, 1 H) 6,54 - 6,63 (m, 2 H) 6,92 (t, J=1,5 Hz, 1 H) 6,97 (dd, J=8,3, 1,9 Hz, 1 H) 7,01 (d, J=7,7 Hz, 1 H) 7,12 (d, J=1,8 Hz, 1 H) 7,22 (d, J=10,2 Hz, 1 H) 7,35 (d, J=8,4 Hz, 1 H) 8,02 (d, J=7,7 Hz, 1 H) 8,37 (s, 1 H) 11,97 (br s, 1 H)

LC/MS (postupak LC-A): Rt1,19 minuta, MH<+>531

Enantiomer 7A:

[0105]<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2,30 (d, J=1,5 Hz, 3 H) 3,09 (s, 3 H) 3,72 (s, 3 H) 4,00 (s, 3 H) 6,22 (d, J=7,9 Hz, 1 H) 6,56 - 6,60 (m, 2 H) 6,91 (t, J=1,7 Hz, 1 H) 6,97 (dd, J=8,3, 2,1 Hz, 1 H) 7,01 (d, J=7,7 Hz, 1 H) 7,12 (d, J=2,0 Hz, 1 H) 7,22 (d, J=10,1 Hz, 1 H) 7,34 (d, J=8,1 Hz, 1 H) 8,02 (d, J=7,7 Hz, 1 H) 8,37 (s, 1 H) 11,96 (s, 1 H)

LC/MS (postupak LC-A): Rt1,15 minuta, MH<+>531

[α]D20: -163,2° (c 0,435, DMF)

Hiralna SFC (postupak SFC-E): Rt4,26 minuta, MH<+>531, hiralna čistoća 100%.

Enantiomer 7B:

[0106]<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2,30 (d, J=1,5 Hz, 3 H) 3,09 (s, 3 H) 3,72 (s, 3 H) 4,00 (s, 3 H) 6,22 (d, J=7,7 Hz, 1 H) 6,57 - 6,61 (m, 2 H) 6,92 (t, J=1,8 Hz, 1 H) 6,97 (dd, J=8,1, 2,0 Hz, 1 H) 7,01 (d, J=7,7 Hz, 1 H) 7,12 (d, J=2,0 Hz, 1 H) 7,22 (d, J=10,0 Hz, 1 H) 7,35 (d, J=8,4 Hz, 1 H) 8,02 (d, J=7,9 Hz, 1 H) 8,37 (d, J=2,4 Hz, 1 H) 11,97 (s, 1 H) LC/MS (postupak LC-A): Rt1,15 minuta, MH<+>531

[α]D<20>: 166,6° (c 0,5, DMF)

Hiralna SFC (postupak SFC-E): Rt3,78 minuta, MH<+>531, hiralna čistoća 100%.

Primer 8: sinteza 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-2-((3-metoksi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)-1-(5-(trifluorometil)-1H-indol-3-il)etanona (Jedinjenje 8) i hiralno razdvajanje na Enantiomere 8A i 8B.

Sinteza intermedijera 8a:

[0108] Na 0°C, pod N2-protokom, natrijum hidrid (2,48 g, 64,8 mmol) je dodat iz delova smeši 5-(trifluorometil)-1H-indola [CAS 100846-24-0] (10 g, 54,0 mmol) u DMF (150 mL) i reakciona smeša je mešana na 0°C tokom 30 minuta. Rastvor tosil hlorida (11,3 g, 59,4 mmol) u DMF (50 mL) je dodat kapanjem i rezultujuća smeša je mešana sobnoj temperaturi tokom 3 sata. Na 0°C, smeša je ugašena dodavanjem vode. Talog je filtriran i osušen preko noći pod vakuumom na 70°C kako bi se dobio 1-tosil-5-(trifluorometil)-1H-indol 8a (18,4 g).

Sinteza intermedijera 8b:

[0109] Titanijum(IV) hlorid (2,4 mL, 21,9 mmol) je dodat kapanjem sobnoj temperaturi rastvoru 1-tosil-5-(trifluorometil)-1H-indola 8a (3,7 g, 10,95 mmol) i 2-(4-hloro-2-metoksifenil)acetil hlorida 1a (4,8 g, 21,9 mmol, sinteza: pogledati Primer 1) u 1,2-dihloroetane (120 mL). Reakcija je mešana sobnoj temperaturi tokom 2 sata. Ledena voda je dodata. Reakciona smeša je ekstrahovana sa EtOAc. Organski sloj je osušen preko MgSO4, filtriran, i rastvarač je koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Ostatak je prečišćen kolonom hromatografije na silika gelu (15-40 µm, 80 g, Mobilna faza: CH2Cl2/MeOH 99,5/0,5). Fragmenti koji sadrže Jedinjenje 8b su kombinovani i rastvarač je isparen pod redukovanim pritiskom. Jedinjenje je uzeto sa CH3CN/diizopropiletrom. Talog je filtriran i osušen kako bi se dobio 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(1-tosil-5-(trifluorometil)-1H-indol-3-il)etanon 8b (2,8 g).

Sinteza intermedijera 8c:

[0110] Litijum hidroksid (0,64 g, 15,3 mmol) je dodat rastvoru 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(1-tosil-5-(trifluorometil)-1H-indol-3-il)etanona 8b (3,2 g, 6,13 mmol) u THF (18 mL) i vodi (6 mL). Smeša je mešana na 30°C tokom 1 sata. Voda i EtOAc su dodati. Organski sloj je razdvojen, osušen preko MgSO4, filtriran, i rastvarač je isparen pod redukovanim pritiskom. Čvrsta materija je uzeta sa diizopropiletrom. Talog je filtriran i osušen kako bi se dobio 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(5-(trifluorometil)-1H-indol-3-il)etanon 8c (2,1 g).

Sinteza intermedijera 8d:

[0111] Na 0°C, rastvor feniltrimetilamonijum tribromida [CAS 4207-56-1] (2,1 g, 5,7 mmol) u THF (60 mL) je dodat kapanjem smeši 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(5-(trifluorometil)-1H-indol-3-il)etanona 8c (2,15 g, 5,7 mmol) u THF (60 mL). Smeša je mešana na 0°C tokom 1 sata i na sobnoj temperaturi tokom 4 sata. Talog je filtriran i opran sa EtOAc. Kombinovani filtrati su koncentrovani pod redukovanim pritiskom. Ostatak je rastvoren u EtOAc. Organski sloj je opran sa vodom, osušen preko MgSO4, filtriran i rastvarač je isparen pod redukovanim pritiskom. Ostatak je uzet sa diizopropiletrom. Talog je filtriran i osušen kako bi se dobio 2-bromo-2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(5-(trifluorometil)-1H-indol-3-il)-etanon 8d (2,5 g).

Sinteza Jedinjenja 8 i hiralno razdvajanje na Enantiomere 8A i 8B:

[0112] Smeša 2-bromo-2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(5-(trifluorometil)-1H-indol-3-il)etanona 8d (1 g, 2,24 mmol), 3-metoksi-5-(metilsulfonil)anilina [CAS 62606-02-4] (496 mg, 2,46 mmol) i diizopropiletilamina (0,38 mL, 2,24 mmol) u CH3CN (50 mL) i THF (25 mL) je mešana na 70°C tokom 24 sata. Rastvor je koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Ostatak je rastvoren u EtOAc i rastvor je opran sa 1N HCl. Organski sloj je razdvojen, osušen preko MgSO4, filtriran i rastvarač je isparen pod redukovanim pritiskom. Jedinjenje je kristalisano od diizopropiletra/CH3CN kako bi se dobio 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-2-((3-metoksi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)-1-(5-(trifluorometil)-1H-indol-3-il)etanon (Jedinjenje 8, 310 mg) kao racemska smeša. Enantiomeri Jedinjenja 8 su razdvojeni putem preparativne hiralne SFC (Stacionarna faza: Chiralpak® AD-H 5 µm 250 x 20 mm, Mobilna faza: 70% CO2, 30%

4

iPrOH 0,3% iPrNH2) kako bi se dobilo, nakon kristalizacije u petrolej etru/diizopropiletru, 122 mg prvog eluiranog enantiomera 8A i 128 mg drugog eluiranog enantiomera 8B.

Jedinjenje 8:

[0113]<1>H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm 3,10 (s, 3 H) 3,72 (s, 3 H) 3,99 (s, 3 H) 6,29 (d, J=7,9 Hz, 1 H) 6,56 - 6,62 (m, 2 H) 6,92 (s, 1 H) 6,98 (dd, J=8,4, 2,0 Hz, 1 H) 7,09 (d, J=7,9 Hz, 1 H) 7,13 (d, J=1,9 Hz, 1 H) 7,36 (d, J=8,5 Hz, 1 H) 7,54 (dd, J=8,5, 1,6 Hz, 1 H) 7,69 (d, J=8,5 Hz, 1 H) 8,48 (s, 1 H) 8,61 (s, 1 H) 12,45 (br s, 1 H)

LC/MS (postupak LC-C): Rt3,19 minuta, MH<+>567

Tačka topljenja: 168°C

Enantiomer 8A:

[0114]<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 3,09 (s, 3 H) 3,73 (s, 3 H) 3,99 (s, 3 H) 6,29 (d, J=7,6 Hz, 1 H) 6,60 (br s, 2 H) 6,92 (s, 1 H) 6,98 (dd, J=8,3, 1,8 Hz, 1 H) 7,07 (d, J=8,1 Hz, 1 H) 7,13 (d, J=1,5 Hz, 1 H) 7,36 (d, J=8,1 Hz, 1 H) 7,54 (d, J=8,1 Hz, 1 H) 7,69 (d, J=8,6 Hz, 1 H) 8,49 (s, 1 H) 8,60 (s, 1 H) 12,41 (br s, 1 H)

LC/MS (postupak LC-C): Rt3,25 minuta, MH<+>567

[α]D<20>: -119,2° (c 0,2727, DMF)

Hiralna SFC (postupak SFC-F): Rt2,64 minuta, MH<+>567, hiralna čistoća 100%.

Enantiomer 8B:

[0115]<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 3,09 (s, 3 H) 3,73 (s, 3 H) 3,99 (s, 3 H) 6,29 (d, J=8,1 Hz, 1 H) 6,60 (s, 2 H) 6,92 (s, 1 H) 6,98 (dd, J=8,6, 2,0 Hz, 1 H) 7,07 (d, J=8,1 Hz, 1 H) 7,13 (d, J=2,0 Hz, 1 H) 7,36 (d, J=8,6 Hz, 1 H) 7,54 (dd, J=8,6, 1,5 Hz, 1 H) 7,69 (d, J=8,6 Hz, 1 H) 8,49 (s, 1 H) 8,60 (s, 1 H) 12,40 (br s, 1 H)

LC/MS (postupak LC-C): Rt3,25 minuta, MH<+>567

[α]D<20>: 125,1° (c 0,2455, DMF)

Hiralna SFC (postupak SFC-F): Rt3,44 minuta, MH<+>567, hiralna čistoća 100%.

Primer 9: Sinteza 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-2-((3-metoksi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)-1-(5-(trifluorometoksi)-1H-indol-3-il)etanona (Jedinjenje 9) i hiralno razdvajanje na Enantiomere 9A i 9B.

[0116]

Sinteza intermedijera 9a:

[0117] Rastvor 5-(trifluorometoksi)-1H-indola [CAS 262593-63-5] (3 g, 14,9 mmol) u CH2Cl2(150 mL) je ohlađen do 0°C pod N2-atmosferom. Rastvor dietilaluminijum hlorida 1M u heksanu (22,4 mL, 22,4 mmol) je dodat kapanjem i rezultujuća smeša je držana na 0°C tokom 15 minuta. Rastvor 2-(4-hloro-2-metoksifenil)acetil hlorida 1a (4,57 g, 20,9 mmol) u CH2Cl2(100 mL) je dodat kapanjem. Mešanje je nastavljeno na 0°C tokom 1 sata i reakciona smeša je potom mešana na sobnoj temperaturi tokom 4 sata. Reakciona smeša je sipana u mešan rastvor leda/Rošelove soli. Nakon što se led otopio, smeša je filtrirana preko dicalite® i filter kolač je opran nekoliko puta sa THF. Filtrati su kombinovani. Slojevi su razdvojeni i organski sloj je opran sa rasolom, osušen preko MgSO4, filtriran i isparen pod redukovanim pritiskom. Ostatak je trituriran sa CH2Cl2(50 mL). Rezultujući talog je filtriran i osušen pod vakuumom na 50°C kako bi se dobio 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(5-(trifluorometoksi)-1H-indol-3-il)etanon 9a (4,39 g).

Sinteza intermedijera 9b:

[0118] Mešani rastvor 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(5-(trifluorometoksi)-1H-indol-3-il)etanona 9a (4,39 g, 11,4 mmol) u THF (200 mL) je ohlađen do 0°C. Rastvor feniltrimetilamonijum tribromida [CAS 4207-56-1] (4,73 g, 12,6 mmol) u THF (100 mL) je dodat kapanjem. Rezultujuća suspenzija je mešana sobnoj temperaturi tokom 2 sata. Čvrsta materija je uklonjena filtracijom i oprana sa THF. Kombinovani filtrati su ispareni pod redukovanim pritiskom. Ostatak je pomešan sa EtOAc (30 mL). Čvrsta materija je izolovana filtracijom, oprana sa malom količinom EtOAc i osušena pod vakuumom na 50°C kako bi se dobio 2-bromo-2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(5-(trifluorometoksi)-1H-indol-3-il)etanon 9b (5,0 g) kao bela čvrsta supstanca, koja je u narednom koraku korišćena bez daljeg prečišćavanja.

Sinteza Jedinjenja 9 i hiralno razdvajanje Enantiomera 9A i 9B:

[0119] Smeša 2-bromo-2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(5-(trifluorometoksi)-1H-indol-3-il)etanona 9b (2,5 g, 5,40 mmol), 3-metoksi-5-(metilsulfonil)anilina [CAS 62606-02-4] (1,49 g, 7,38 mmol) i diizopropiletilamina (931 µL, 5,40 mmol) u CH3CN (100 mL) je mešana preko noći na 90°C. Reakciona smeša je koncentrovana pod redukovanim pritiskom. Ostatak je rastvoren u CH2Cl2(100 mL), opran sa 1N HCl (100 mL) i vodom (100 mL), osušen preko MgSO4, filtriran i isparen pod redukovanim pritiskom. Ostatak je prečišćen kolonom hromatografije (Stacionarna faza: Grace Reveleris® silicijum dioksid 120 g, Mobilna faza: EtOAc:EtOH(3:1)/heptan gradijent 0/100 do 50/50). Željeni fragmenti su kombinovani i ispareni pod redukovanim pritiskom. Ostatak je taložen od EtOAc (10 mL) uz mešanje. Čvrsta materija je izolovana filtracijom i oprana sa malom količinom EtOAc kako bi se dobio 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-2-((3-metoksi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)-1-(5-(trifluorometoksi)-1H-indol-3-il)etanon (Jedinjenje 9, 477 mg) kao racemska smeša. Filtrat je isparen pod redukovanim pritiskom i ostatak je uzet sa EtOAc (5 mL). Nakon mešanja preko noći, čvrsta materija je izolovana filtracijom i oprana sa EtOAc kako bi se dobila druga serija Jedinjenja 9 (216 mg). Hiralno razdvajanje enantiomera Jedinjenja 9 (663 mg) je izvršeno putem hiralnog razdvajanja normalne faze (Stacionarna faza: AS 20 µm, Mobilna faza: 100% metanol). Fragmenti proizvoda su kombinovani i ispareni kako bi se dobio Enantiomer 9A kao prvi eluirani proizvod i Enantiomer 9B kao drugi eluirani proizvod. Enantiomer 9A je mešan u H2O (2 mL) i MeOH (3 mL) na 40°C. Čvrsta materija je filtrirana, oprana (3x) sa H2O/MeOH 1/1, i osušena pod vakuumom na 45°C kako bi se dobio Enantiomer 9A (151 mg). Enantiomer 9B je dalje prečišćen fleš hromatografijom na silika gelu (Stacionarna faza: Grace Reveleris® silicijum dioksid 12 g, Mobilna faza: heptan/EtOAc/EtOH 100/0/0 do 40/45/15). Željeni fragmenti su kombinovani, ispareni pod redukovanim pritiskom i koispareni sa EtOAc. Ostatak je mešan u MeOH (5 mL) i taložen sporim dodavanjem H2O (4 mL). Čvrsta materija je filtrirana, oprana (3x) sa H2O/MeOH 1/1, i osušena pod vakuumom na 50°C kako bi se dobio Enantiomer 9B (132 mg).

Jedinjenje 9:

4

[0120]<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 3,09 (s, 3 H) 3,73 (s, 3 H) 3,99 (s, 3 H) 6,26 (d, J=7,9 Hz, 1 H) 6,57 - 6,62 (m, 2 H) 6,91 (t, J=1,9 Hz, 1 H) 6,98 (dd, J=8,4, 2,0 Hz, 1 H) 7,07 (d, J=7,9 Hz, 1 H) 7,13 (d, J=2,0 Hz, 1 H) 7,22 (dd, J=8,6, 2,2 Hz, 1 H) 7,36 (d, J=8,4 Hz, 1 H) 7,59 (d, J=8,8 Hz, 1 H) 8,06 (d, J=0,9 Hz, 1 H) 8,55 (s, 1 H) 12,28 (br s, 1 H) LC/MS (postupak LC-A): Rt1,31 minuta, MH<+>583

Enantiomer 9A:

[0121]<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 3,09 (s, 3 H) 3,73 (s, 3 H) 3,99 (s, 3 H) 6,26 (d, J=7,9 Hz, 1 H) 6,55 - 6,62 (m, 2 H) 6,91 (t, J=1,5 Hz, 1 H) 6,98 (dd, J=8,4, 2,0 Hz, 1 H) 7,07 (d, J=7,9 Hz, 1 H) 7,13 (d, J=2,0 Hz, 1 H) 7,21 (dd, J=8,8, 1,8 Hz, 1 H) 7,36 (d, J=8,4 Hz, 1 H) 7,59 (d, J=8,8 Hz, 1 H) 8,07 (d, J=0,9 Hz, 1 H) 8,55 (s, 1 H) 12,29 (br s, 1 H)

LC/MS (postupak LC-A): Rt1,20 minuta, MH<+>583

[α]D<20>: 130,3° (c 0,555, DMF)

Hiralna SFC (postupak SFC-E): Rt3,10 minuta, MH<+>583, hiralna čistoća 100%.

Enantiomer 9B:

[0122]<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 3,09 (s, 3 H) 3,73 (s, 3 H) 3,99 (s, 3 H) 6,26 (d, J=7,9 Hz, 1 H) 6,56 - 6,62 (m, 2 H) 6,92 (t, J=2,0 Hz, 1 H) 6,98 (dd, J=8,1, 2,0 Hz, 1 H) 7,07 (d, J=7,9 Hz, 1 H) 7,13 (d, J=2,0 Hz, 1 H) 7,22 (dd, J=8,8, 1,8 Hz, 1 H) 7,36 (d, J=8,4 Hz, 1 H) 7,59 (d, J=8,8 Hz, 1 H) 8,07 (d, J=0,9 Hz, 1 H) 8,55 (s, 1 H) 12,30 (br s, 1 H) LC/MS (postupak LC-A): Rt1,20 minuta, MH<+>583

[α]D<20>: -133,2° (c 0,5, DMF)

Hiralna SFC (postupak SFC-E): Rt3,50 minuta, MH<+>583, hiralna čistoća 100%.

Primer 10: Sinteza 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-2-((3-metoksi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)-1-(6-metoksi-5-(trifluorometoksi)-1H-indol-3-il)-etanona (Jedinjenje 10) i hiralno razdvajanje na Enantiomere 10A i 10B.

[0123]

Sinteza intermedijera 10a:

[0124] Ohlađenom (-15°C) rastvoru 3-metoksi-4-(trifluorometoksi)benzaldehida [CAS 853771-90-1] (50 g, 230 mmol) i etil azidoacetata (89 g, 690 mmol) u EtOH (400 mL) je kapanjem dodat, tokom perioda od 2 sata, rastvor NaOEt (0,69 mol, pripremljen od 15,9 g od Na i 700 mL od EtOH). Reakciona smeša je mešana sobnoj temperaturi preko noći. Nakon hlađenja na ledenoj kadi, reakcija je ugašena sa zasićenim NH4Cl rastvorom (1,2 L), i mešana tokom 10 minuta. Talog je filtriran, opran sa vodom, i osušen kako bi se dobio (Z)-etil 2-azido-3-(3-metoksi-4-(trifluorometoksi)fenil)akrilat 10a (32 g) kao žućkasta čvrsta supstanca.

Sinteza intermedijera 10b:

[0125] Rastvor (Z)-etil 2-azido-3-(3-metoksi-4-(trifluorometoksi)fenil)akrilat 10a (3 g, 10 mmol) u ksilenu (40 mL) je zagrejan pod refluksom preko noći. Nakon hlađenja do sobne temperature, rastvarač je isparen do suvoće. Ostatak je trituriran sa heksanom (50 mL) i talog je filtriran kako bi se dobio metil 6-metoksi-5-(trifluorometoksi)-1H-indol-2-karboksilat 10b (yield: 1,4-1,6 g) kao žuta čvrsta supstanca.

Sinteza intermedijera 10c:

[0126] Smeši metil 6-metoksi-5-(trifluorometoksi)-1H-indol-2-karboksilata 10b (25 g, 87 mmol) u MeOH/H2O (2/1, 300 mL) je dodat NaOH (7 g, 175 mmol) i smeša je zagrejana pod refluksom dok nije dobijen bistar rastvor. Nakon hlađenja do sobne temperature, većina

4

metanola je uklonjena pod redukovanim pritiskom i preostali vodeni rastvor je acidifikovan sa koncentrisanim HCl do pH 3-4. Proizvod je ekstrahovan sa EtOAc (2x 250 mL).

Kombinovani organski slojevi su oprani sa rasolom, osušeni, i ispareni pod redukovanim pritiskom kako bi se dobila 6-metoksi-5-(trifluorometoksi)-1H-indol-2-karboksilna kiselina 10c (22,7 g) kao siva čvrsta supstanca.

Sinteza intermedijera 10d:

[0127] Suspenzija 6-metoksi-5-(trifluorometoksi)-1H-indol-2-karboksilne kiseline 10c (7,5 g, 27 mmol) i Cu (1,22 g, 0,7 equiv.) u hinolinu (150 mL) je zagrejana do 220-230°C pod inertnom atmosferom tokom 12 sati. Nakon hlađenja do sobne temperature, smeša je razređena sa metil trec-butil etrom (MTBE, 400 mL) i oprana sa zasićenim vodenim NaHSO4rastvorom (2x 500 mL). Organski sloj je osušen preko MgSO4, filtriran kroz kratke ploče od silika gela, i isparen pod redukovanim pritiskom. Ostatak je prečišćen kolonom hromatografije kako bi se dobio 6-metoksi-5-(trifluorometoksi)-1H-indol 10d (3,75 g) kao žuta čvrsta supstanca.

Sinteza intermedijera 10e:

[0128] Rastvor 6-metoksi-5-(trifluorometoksi)-1H-indola 10d (1,61 g, 6,96 mmol) u CH2Cl2(150 mL) je ohlađen do 0°C pod N2-atmosferom. Rastvor dietilaluminijum hlorida 1M u heksanu (10,4 mL, 10,4 mmol) je dodat kapanjem i rezultujuća smeša je držana na 0°C tokom 30 minuta. Rastvor 2-(4-hloro-2-metoksifenil)acetil hlorida 1a (2,28 g, 10,4 mmol) u CH2Cl2(75 mL) je dodat kapanjem. Mešanje je nastavljeno na 0°C tokom 1 sata i na sobnoj temperaturi tokom 1 sata. Reakciona smeša je ohlađena do 0°C i rastvor kalijum natrijum tartrat tetrahidrata (Rošelova so, 3,93 g, 13,9 mmol) u vodi (6 mL) je dodat kapanjem.

Reakciona smeša je mešana tokom 30 minuta na 0°C. THF (200 mL) je dodat i reakciona smeša je mešana sobnoj temperaturi tokom 20 minuta. Na2SO4(25g) je dodat, smeša je mešana preko noći, filtrirana preko dicalite® i filter kolač je opran nekoliko puta sa THF (4x 150 mL). Filtrati su kombinovani i ispareni pod redukovanim pritiskom. Čvrsti ostatak je mešan u smeši diizopropil etra (25 mL) i EtOAc (2 mL). Čvrsta materija je filtrirana, oprana sa DIPE (3x) i osušena pod vakuumom na 50°C kako bi se dobio 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(6-metoksi-5-(trifluorometoksi)-1H-indol-3-il)etanon 10e (3,6 g).

Sinteza intermedijera 10f:

[0129] Mešani rastvor 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(6-metoksi-5-(trifluoro-metoksi)-1H-

4

indol-3-il)etanona 10e (3,6 g, 6,53 mmol) u THF (130 mL) je ohlađen do 0°C, pod N2-atmosferom. Feniltrimetilamonijum tribromid [CAS 4207-56-1] (2,58 g, 6,85 mmol) je dodat i reakciona smeša je mešana na 0°C tokom 45 minuta i sobnoj temperaturi tokom 1,5 sata. Čvrsta materija je uklonjena filtracijom i oprana sa THF (2x). Kombinovani filtrati su ispareni pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio 2-bromo-2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(6-metoksi-5-(trifluorometoksi)-1H-indol-3-il)etanon 10f (4,16 g), koja je u narednom koraku korišćena bez daljeg prečišćavanja.

Sinteza Jedinjenja 10 i hiralno razdvajanje Enantiomera 10A i 10B:

[0130] Smeša 2-bromo-2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(6-metoksi-5-(trifluoro-metoksi)-1H-indol-3-il)etanona 10f (4,16 g, 6,50 mmol), 3-metoksi-5-(metilsulfonil)anilina [CAS 62606-02-4] (2,62 g, 13,0 mmol) i diizopropiletilamina (2,24 mL, 13,0 mmol) u CH3CN je mešana na sobnoj temperaturi tokom 2 dana pod N2-atmosferom. Voda (250 mL) je dodata i proizvod je ekstrahovan sa Et2O (2x). Kombinovani organski slojevi su osušeni preko MgSO4, filtrirani i ispareni pod redukovanim pritiskom. Ostatak je prečišćen kolonom hromatografije (Stacionarna faza: Grace Reveleris® silicijum dioksid 100 g, Mobilna faza: heptan/EtOAc/EtOH gradijent 100/0/0 do 40/45/15). Željeni fragmenti su kombinovani i ispareni pod redukovanim pritiskom. Ostatak je dalje prečišćen putem preparativne HPLC (Stacionarna faza: RP XBridge® Prep C18 OBD - 10 µm, 50 x 150 mm, Mobilna faza: 0,25% NH4HCO3rastvor u voda, CH3CN). Željeni fragmenti su kombinovani i ispareni pod redukovanim pritiskom. Ostatak, koji sadrži racemski 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-2-((3-metoksi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)-1-(6-metoksi-5-(trifluorometoksi)-1H-indol-3-il)etanon (Jedinjenje 10, 380 mg) je podvrgnut hiralnom razdvajanju preparativnom SFC (Stacionarna faza: Chiralpak® Diacel AS 20 x 250 mm, Mobilna faza: CO2, EtOH 0,4% iPrNH2).

Fragmenti proizvoda su kombinovani, ispareni pod redukovanim pritiskom i ko-ispareni sa MeOH kako bi se dobio Enantiomer 10A kao prvi eluirani proizvod i Enantiomer 10B kao drugi eluirani proizvod. Oba enantiomera su taložena od rastvarač smeše MeOH i vode, filtrirana i osušena na 50 °C pod vakuumom kako bi se dobili Enantiomer 10A (135 mg) i Enantiomer 10B (144 mg).

Enantiomer 10A:

[0131]<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ ppm 3,09 (s, 3 H) 3,72 (s, 3 H) 3,87 (s, 3 H) 3,99 (s, 3 H) 6,22 (d, J=7,7 Hz, 1 H) 6,55 - 6,59 (m, 2 H) 6,88 - 6,91 (m, 1 H) 6,98 (dd, J=8,1, 1,8 Hz, 1 H) 7,08 (d, J=7,7 Hz, 1 H) 7,13 (d, J=2,2 Hz, 1 H) 7,21 (s, 1 H) 7,34 (d, J=8,1 Hz, 1 H) 8,02

4

(d, J=1,5 Hz, 1 H) 8,41 (s, 1 H) 12,05 (br s, 1 H)

LC/MS (postupak postupak LC-A): Rt1,20 minuta, MH<+>613

[α]D<20>: 81,4° (c 0,29, DMF)

Hiralna SFC (postupak SFC-E): Rt3,34 minuta, MH<+>613, hiralna čistoća 100%.

Enantiomer 10B:

[0132]<1>H NMR (360 MHz, DMSO-d6) δ ppm 3,09 (s, 3 H) 3,72 (s, 3 H) 3,87 (s, 3 H) 3,99 (s, 3 H) 6,22 (d, J=7,7 Hz, 1 H) 6,55 - 6,60 (m, 2 H) 6,90 (t, J=1,6 Hz, 1 H) 6,98 (dd, J=8,2, 2,0 Hz, 1 H) 7,08 (d, J=7,8 Hz, 1 H) 7,13 (d, J=2,2 Hz, 1 H) 7,21 (s, 1 H) 7,34 (d, J=8,4 Hz, 1 H) 8,01 (d, J=1,1 Hz, 1 H) 8,41 (s, 1 H) 12,08 (br s, 1 H)

LC/MS (postupak postupak LC-A): Rt1,20 minuta, MH<+>613

[α]D<20>: -99,6° (c 0,261, DMF)

Hiralna SFC (postupak SFC-E): Rt3,69 minuta, MH<+>613, hiralna čistoća 100%.

Primer 11: Sinteza 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-2-((3-metoksi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)-1-(7-metil-5-(trifluorometoksi)-1H-indol-3-il)etanona (Jedinjenje 11) i hiralno razdvajanje na Enantiomere 11A i 11B.

[0133]

Sinteza intermedijera 11a:

4

[0134] Smeša bor(III) hlorida 1M u CH2Cl2(25,5 mL, 25,5 mmol) i aluminijum(III) hlorida (3,40 g, 25,5 mmol) je razređena sa CH2Cl2(20 mL) i ohlađena na ledenoj kadi pod N2-atmosferom. Rastvor 2-metil-4-(trifluoro-metoksi)anilina [CAS 86256-59-9] (4,88 g, 25,5 mmol) i hloroacetonitrila (3,24 mL, 51,0 mmol) u CH2Cl2(7,5 mL) je dodat kapanjem. Nakon dodavanja, ledena kada je uklonjena i smeša je zagrejana pod refluksom tokom 8 sati. Smeša je ohlađena ponovo do 0°C koristeći ledenu kadu.2N HCl (75 mL) je dodat kapanjem, što je izazvalo prilično taloženja. Rezultujuća suspenzija je zagrejana pod refluksom tokom 90 minuta, i ohlađena do sobne temperature. Čvrsta materija je uklonjena filtracijom. Filter kolač je opran sa CH2Cl2(4x). Filtrati su kombinovani i faze su razdvojene. Organski sloj je izolovan, opran sa vodenim rastvorom NaHCO3, osušen preko MgSO4, filtriran i isparen pod redukovanim pritiskom. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom (Stacionarna faza:

Biotage® SNAP Ultra Silica 100 g, Mobilna faza: heptan/CH2Cl2gradijent 100/0 do 0/100). Željeni fragmenti su kombinovani i koncentrovani do rezidualne zapremine od 30 mL. Talog je filtriran, opran sa heptanom i CH2Cl2, i osušen pod vakuumom na 50°C kako bi se dobio 1-(2-amino-3-metil-5-(trifluorometoksi)fenil)-2-hloroetanon 11a (1,37 g). Filtrat je koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Čvrsti ostatak je mešan u smeši heptana (20 mL) i diizopropil etra (3 mL), filtriran, opran sa heptanom (3x) i osušen pod vakuumom na 50°C kako bi se dobio drugi fragment 11a (0,24 g).

Sinteza intermedijera 11b:

[0135] Natrijum borohidrid (326 mg, 8,61 mmol) je dodat mešanom rastvoru 1-(2-amino-3-metil-5-(trifluorometoksi)fenil)-2-hloroetanona 11a (1,92 g, 7,17 mmol) u trec-butanolu (50 mL) i vodi (5 mL). Reakciona smeša je mešana sobnoj temperaturi tokom 30 minuta i na 90°C tokom 2,5 sata. Voda (50 mL) je dodata i proizvod je ekstrahovan sa dietil etrom (2x). Kombinovani organski slojevi su oprani sa rasolom, osušeni preko MgSO4, filtrirani i ispareni pod redukovanim pritiskom. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom (Stacionarna faza: Biotage® SNAP Ultra Silica 25 g, Mobilna faza: heptan/EtOAc gradijent 100/0 do 20/80). Željeni fragmenti su kombinovani, koncentrovani pod redukovanim pritiskom, ko-ispareni sa heptanom i osušeni pod vakuumom na 50°C kako bi se dobio 7-metil-5-(trifluorometoksi)-1H-indol 11b (1,2 g).

Sinteza intermedijera 11c:

[0136] Mehanički mešan rastvor 7-metil-5-(trifluorometoksi)-1H-indola 11b (1,5 g, 6,97 mmol) u CH2Cl2(100 mL) je ohlađen do 0°C pod N2-atmosferom. Rastvor dietilaluminijum

4

hlorida 1M u heksanu (10,5 mL, 10,5 mmol) je dodat kapanjem i rezultujuća smeša je držana na 0°C tokom 25 minuta. Rastvor 2-(4-hloro-2-metoksifenil)acetil hlorida 1a (2,29 g, 10,5 mmol) u CH2Cl2(40 mL) je dodat kapanjem uz održavanje temperature reakcije ispod 6°C. Mešanje je nastavljeno na 0°C tokom 1 sata i reakciona smeša je potom mešana na sobnoj temperaturi tokom 1 sata. Reakciona smeša je ohlađena do 0°C i rastvor Rošelove soli [CAS 6100-16-9] (3,94 g, 13,9 mmol) u vodi (4 mL) je dodat kapanjem. Nakon mešanja tokom 1 sata, reakciona smeša je filtrirana preko dicalite® i filter kolač je opran sa THF (5x 100 mL). Kombinovani filtrati su ispareni pod redukovanim pritiskom. Ostatak učvršćen nakon mirovanja preko noći. Čvrsta materija je mešana u CH3CN (5 mL), filtrirana, oprana sa CH3CN (3x 1,5 mL) i osušena pod vakuumom na 50°C kako bi se dobio 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(7-metil-5-(trifluorometoksi)-1H-indol-3-il)-etanon 11c (1,9 g).

Sinteza intermedijera 11d:

[0137] Mešani rastvor 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(7-metil-5-(trifluorometoksi)-1H-indol-3-il)etanona 11c (2,13 g, 5,35 mmol) u THF (80 mL) je ohlađena do 0°C, pod N2-atmosferom. Feniltrimetilamonijum tribromid [CAS 4207-56-1] (2,11 g, 5,62 mmol) je dodat i reakciona smeša je mešana na 0°C tokom 40 minuta i na sobnoj temperaturi tokom 2 sata. Čvrsta materija je uklonjena filtracijom i oprana sa THF (2x). Kombinovani filtrati su ispareni pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio 2-bromo-2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(7-metil-5-(trifluorometoksi)-1H-indol-3-il)etanon 11d (3,45 g), koji je u narednom koraku korišćen bez daljeg prečišćavanja.

Sinteza Jedinjenja 11 i hiralno razdvajanje Enantiomera 11A i 11B:

[0138] Smeša 2-bromo-2-(4-hloro-2-metoksifenil)-1-(7-metil-5-(trifluoro-metoksi)-1H-indol-3-il)etanona 11d (3,45 g, 6,87 mmol), 3-metoksi-5-(metilsulfonil)anilina [CAS 62606-02-4] (2,76 g, 13,7 mmol) i diizopropiletilamina (2,37 mL, 13,7 mmol) u CH3CN (60 mL) je mešana na sobnoj temperaturi tokom 2 dana pod N2-atmosferom. Voda (125 mL) je dodata i proizvod je ekstrahovan sa Et2O (2x). Kombinovani organski slojevi su oprani sa rasolom, osušeni preko MgSO4, filtrirani i ispareni pod redukovanim pritiskom. Ostatak je prečišćen putem preparativne HPLC (Stacionarna faza: RP XBridge® Prep C18 OBD - 10 µm, 50 x 150 mm, Mobilna faza: 0,25% NH4HCO3rastvor u voda, CH3CN). Fragmenti koji sadrže proizvod su kombinovani i ispareni pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio racemski 2-(4-hloro-2-metoksifenil)-2-((3-metoksi-5-(metilsulfonil)fenil)amino)-1-(7-metil-5-(trifluorometoksi)-1H-indol-3-il)etanon (Jedinjenje 11, 1,74 g). Hiralno razdvajanje enantiomera Jedinjenja 11 (1,74 g) je izvršeno putem preparativne SFC (Stacionarna faza: Chiralpak® Diacel AS 20 x 250 mm, Mobilna faza: CO2, EtOH 0,4% iPrNH2). Fragmenti proizvoda su kombinovani i ispareni pod redukovanim pritiskom kako bi se dobio Enantiomer 11A kao prvi eluirani proizvod i Enantiomer 11B kao drugi eluirani proizvod. Oba enantiomera su taložen od rastvarač smeše MeOH i vode, filtrirana i osušena na 50°C pod vakuumom kako bi se dobili Enantiomer 11A (777 mg) i Enantiomer 11B (712 mg).

Enantiomer 11A:

[0139]<1>H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2,50 (s, 3 H) 3,09 (s, 3 H) 3,72 (s, 3 H) 4,00 (s, 3 H) 6,28 (d, J=7,8 Hz, 1 H) 6,56 - 6,63 (m, 2 H) 6,92 (br s, 1 H) 6,97 (dd, J=8,4, 1,9 Hz, 1 H) 7,05 (br s, 1 H) 7,07 (d, J=7,9 Hz, 1 H) 7,13 (d, J=1,9 Hz, 1 H) 7,35 (d, J=8,4 Hz, 1 H) 7,90 (br s, 1 H) 8,53 (s, 1 H) 12,41 (br s, 1 H)

LC/MS (postupak postupak LC-A): Rt1,26 minuta, MH<+>597

[α]D<20>: 81,3° (c 0,3455, DMF)

Hiralna SFC (postupak SFC-E): Rt2,96 minuta, MH<+>597, hiralna čistoća 100%.

Enantiomer 11B:

[0140]<1>H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2,51 (s, 3 H) 3,09 (s, 3 H) 3,72 (s, 3 H) 4,00 (s, 3 H) 6,28 (d, J=7,9 Hz, 1 H) 6,58 - 6,60 (m, 2 H) 6,92 (t, J=1,8 Hz, 1 H) 6,97 (dd, J=8,4, 1,9 Hz, 1 H)7,05(br s, 1 H) 7,06 (d, J=7,9 Hz, 1 H) 7,13 (d, J=2,1 Hz, 1 H) 7,35 (d, J=8,2 Hz, 1 H) 7,89 (br s, 1 H) 8,53 (s, 1 H) 12,37 (br s, 1 H)

LC/MS (postupak LC-A): Rt1,26 minuta, MH<+>597

[α]D<20>: -87,4° (c 0,342, DMF)

Hiralna SFC (postupak SFC-E): Rt3,44 minuta, MH<+>597, hiralna čistoća 100%.

ANTIVIRUSNA AKTIVNOST JEDINJENJA PRONALASKA

DENV-2 antivirusni test

[0141] Antivirusna aktivnost svih jedinjenja pronalaska testirana je protiv DENV-2 16681 soja koji je obeležen pojačanim zelenim fluorescentnim proteinom (eGPF; Tabela 1).

Medijum za kulturu sastoji se od minimalnog esencijalnog medijuma dopunjenog sa 2% toplotno inaktiviranog fetalnog telećeg seruma, 0,04% gentamicina (50 mg/ml) i 2 mm L-glutamina. Vero ćelije, dobijene iz ECACC, suspendovane su u medijumu za kulturu i 25 µL je dodato pločama sa 384 komorice (2500 ćelija po komorici), koje već sadrže antivirusna jedinjenja. Tipično, ove ploče sadrže petostruko serijsko razređivanje od 9 koraka

1

razblaživanja test jedinjenja u 200 puta većoj od krajnje koncentracije u 100% DMSO (200 nL). Pored toga, svaka koncentracija jedinjenja se ispituje u četvorostrukom uzorku (raspon konačne koncentracije: 25µM - 0,000064µM ili 2,5µM - 0,0000064µM za najaktivnija jedinjenja). Konačno, svaka ploča sadrži komorice koje su dodeljene kao kontrole virusa (sadrže ćelije i virus u odsustvu jedinjenja), kontrole ćelija (sadrže ćelije u odsustvu virusa i jedinjenja) i kontrole medijuma (sadrže medijum u odsustvu ćelija, virusa i jedinjenja). U komorice dodeljene kao kontrola medijuma, umesto Vero ćelija dodato je 25 µL medijuma za kulturu. Jednom kada su ćelije dodate pločama, ploče su inkubirane 30 minuta na sobnoj temperaturi kako bi se omogućilo da se ćelije ravnomerno rasporede u komoricama. Zatim su ploče inkubirane u potpuno ovlaženom inkubatoru (37°C, 5%CO2) do narednog dana. Zatim je dodat DENV-216681 soj, obeležen sa eGFP, sa mnoštvom infekcije (MOI) od 0,5. Zbog toga je 15 µL suspenzije virusa dodato u sve komorice koje sadrže test jedinjenje i u komorice dodeljene kao kontrola virusa. Paralelno, u kontrolu medijuma i kontrolu ćelija je dodato 15 µL medijuma za kulturu. Zatim su ploče inkubirane 3 dana u potpuno ovlaženom inkubatoru (37°C, 5%CO2). Na dan očitavanja, eGFP fluorescencija je izmerena korišćenjem automatizovanog fluorescentnog mikroskopa na 488 nm (plavi laser). Koristeći interni LIMS sistem, izračunate su krive odgovora doze inhibicije za svako jedinjenje i polovina maksimalne efektivne koncentracije (EC50) je određena. Stoga se procenat inhibicije (I) za svaku test koncentraciju izračunava pomoću naredne formule: I = 100*(ST-SCC)/(SVC-SCC); ST, SCCi Svc su količina eGFP signala u komoricama sa test jedinjenjem, kontrolom ćelija i kontrolom virusa, respektivno. EC50predstavlja koncentraciju jedinjenja pri kojoj je replikacija virusa inhibirana sa 50%, mereno 50% smanjenjem intenziteta eGFP fluorescencije u poređenju sa kontrolom virusa. EC50izračunava se pomoću linearne interpolacije.

[0142] Paralelno, toksičnost jedinjenja procenjena je na istim pločama. Jednom kada je završeno očitavanje eGFP signala, u sve komorice ploča sa 384 komorice dodato je 40 µL ATPlite, boje za održivost ćelija. ATP je prisutan u svim metabolički aktivnim ćelijama i koncentracija vrlo brzo opada kada ćelije prolaze kroz nekrozu ili apoptozu. Sistem za ispitivanje ATPLite zasnovan je na proizvodnji svetlosti izazvanoj reakcijom ATP sa dodatkom luciferaze i D-luciferina. Ploče su inkubirane tokom 10 minuta na sobnoj temperaturi. Dalje, ploče su izmerene na ViewLux. Polovina maksimalne citotoksične koncentracije (CC50) je takođe određena, definisana kao koncentracija potrebna za smanjenje luminiscentnog signala za 50% u poređenju sa koncentracijom u komoricama sa kontrolom

2

ćelija. Na kraju, određen je indeks selektivnosti (SI) za jedinjenja, koji je izračunat na naredni način: SI = CC50/EC50.

Tabela 1: EC50, CC50, i SI za jedinjenja pronalaska u DENV-2 antivirusnom testu

Tetravalentna reverzna transkriptaza kvantitativna PCR (RT-qPCR) analiza: Protokol A.

[0143] Antivirusna aktivnost jedinjenja pronalaska testirana je protiv DENV-1 soja TC974#666 (NCPV; Tabela 6), DENV-2 soja 16681 (Tabela 7), DENV-3 soja H87 (NCPV; Tabela 8) i DENV- 4 soja H241 (NCPV; Tabela 9A) i SG/06K2270DK1/2005 (Eden; Tabela 9B) u RT-qPCR testu. Prema tome, Vero ćelije su zaražene bilo sa DENV-1, ili -2, ili -3, ili -4 u prisustvu ili odsustvu test jedinjenja. Na dan 3 nakon infekcije, ćelije su lizirane i ćelijski lizati su korišćeni za pripremu cDNK i virusne mete (3'UTR od DENV; Tabela 2) i ćelijskog referentnog gena (β-aktin, Tabela 2). Potom je izveden dupleks PCR u realnom vremenu na Lightcycler480 instrumentu. Stvorena Cp vrednost je obrnuto proporcionalna količini eksprimiranja RNK ovih meta. Inhibicija replikacije DENV test jedinjenjem dovodi do pomeranja Cp za 3'UTR gen. S druge strane, ako je test jedinjenje toksično za ćelije, primetiće se sličan efekat na eksprimiranje β-aktina. Za izračunavanje EC50koristi se uporedni ΔΔCp postupak, koji se zasniva na relativnom eksprimiranju gena ciljnog gena (3'UTR) normalizovanom sa ćelijskim genom za održavanje (β-aktin).

Tabela 2: Prajmeri i sonde koji se koriste za kvantitativni RT-PCR u realnom vremenu.

4

[0144] Medijum za kulturu sastojao se od minimalnog esencijalnog medijuma dopunjenog sa 2% toplotno inaktiviranog fetalnog telećeg seruma, 0,04% gentamicina (50 mg/ml) i 2 mm L-glutamina. Vero ćelije, dobijene iz ECACC, suspendovane su u medijumu za kulturu i dodato je 75 µL/komorici u ploče sa 96 komorica (10000 ćelija/komorica), koje već sadrže antivirusna jedinjenja. Tipično ove ploče sadrže petostruko serijsko razblaživanje od 9 koraka razblaživanja test jedinjenja pri 200 puta krajnjoj koncentraciji u 100% DMSO (500 nL; raspon konačne koncentracije: 25 µM - 0,000064 µM ili 2,5 µM - 0,0000064 µM za najaktivnija jedinjenja). Pored toga, svaka ploča sadrži komorice koje su dodeljene kao kontrole virusa (sadrže ćelije i virus u odsustvu jedinjenja) i kontrole ćelija (sadrže ćelije u odsustvu virusa i jedinjenja). Jednom kada su ćelije dodate u ploče, ploče su inkubirane u potpuno ovlaženom inkubatoru (37°C, 5% CO2) do narednog dana. Virusi denga groznice serotip-1,2, 3 i 4 razblaženi su kako bi se dobio Cp od -22-24 u testu. Zbog toga je 25 µL suspenzije virusa dodato u sve komorice koje sadrže test jedinjenje i u komorice dodeljene kao kontrola virusa. Paralelno, 25 µL medijuma za kulturu je dodato u kontrole ćelija. Zatim su ploče inkubirane 3 dana u potpuno ovlaženom inkubatoru (37°C, 5% CO2). Posle 3 dana, supernatant je uklonjen iz komorica i ćelije su isprane dva puta ledeno hladnim PBS (-100 µL). Pelet ćelija unutar ploča sa 96 komorica čuvan je na -80°C najmanje 1 dan. Dalje, RNK je ekstrahovana pomoću Cells-to-CT™ kompleta za lizu, prema smernicama proizvođača (Life Technologies). Ćelijski lizati se mogu čuvati na -80°C ili odmah koristiti u koraku obrnute transkripcije.

[0145] U pripremi koraka obrnute transkripcije, pripremljena je smeša A (Tabela 3A) i dodato je 7,57 µL/komorica u ploču sa 96 komorica. Nakon dodavanja 5 µL ćelijskih lizata, izveden je petominutni korak denaturacije na 75°C (Tabela 3B). Posle toga je dodato 7,43 µL smeše B (Tabela 3C) i pokrenut je korak obrnute transkripcije (Tabela 3D) kako bi se generisala cDNK.

[0146] Na kraju je pripremljena RT-qPCR smeša, smeša C (Tabela 4A), i 22,02 µL/komorica je dodato u LightCycler qPCR ploče sa 96 komorica u koje je dodato 3 μL cDNK i qPCR je izveden prema uslovima u Tabeli 4B na LightCycler 480.

[0147] Korišćenjem LightCycler softvera i sopstvenog LIMS sistema izračunate su krive odgovora na dozu za svako jedinjenje i utvrđene su polovina maksimalne efektivne koncentracije (EC50) i polovina maksimalne citotoksične koncentracije (CC50).

Tetravalentna kvantitativna reverzna transkriptaza-PCR (RT-qPCR) test: Protokol B.

[0148] Antivirusna aktivnost jedinjenja pronalaska testirana je protiv DENV-1 soja Džibuti (D1/H/IMTSSA/98/606; Tabela 6), DENV-2 soja NGC (Tabela 7), DENV-3 soja H87 (Tabela 8) i DENV-4 soj SG/06K2270DK1/2005 (Tabela 9B) u RT-qPCR testu. Vero-B ili Vero-M ćelije (5 × 10<4>) su posejane u ploče sa 96 komorica. Jedan dan kasnije, podloga za kulturu zamenjena je sa 100 µL test podloge koja sadrži 2x, 3× ili 5× serijsko razblaženje jedinjenja (raspon koncentracije: 50 µg/ml - 0,00038 µg/ml, 50 µg/ml - 0,0076 µg/ml, i 50 µg/ml - 0,00013 µg/ml, respektivno) i 100 µL inokuluma denga virusa (DENV). Nakon perioda inkubacije od 2 sata, ćelijski monosloj je ispran 3 puta sa test medijumom kako bi se uklonio zaostali, neadsorbovani virus i kulture su dalje inkubirane bilo 4 dana (DENV-2 NGC) ili 7 dana (DENV-1 soj Džibuti D1/H/IMTSSA/98/606, DENV-3 soj H87 prototip, DENV-4 soj H241 i DENV-4 soj EDEN) u prisustvu inhibitora. Sakupljen je supernatant i opterećenje virusne RNK je određeno kvantitativnim RT-PCR u realnom vremenu. Efikasna koncentracija od 50% (EC50), koja je definisana kao koncentracija jedinjenja koja je potrebna da inhibira replikaciju virusne RNK za 50%, određena je pomoću logaritamske interpolacije. RNK je izolovana iz 100 µL (ili u nekim okolnostima 150 µL) supernatanta pomoću NucleoSpin 96 Virus kompleta (Filter Service, Duren, Nemačka) kako je opisao proizvođač. Sekvence TaqMan prajmera (DENV-For, DENV-Rev; Tabela 5) i TaqMan sondi (DENV-sonda Tabela 5) odabrane su iz nestrukturnog gena 3 (NS3) ili NS5, odgovarajućih flavivirusa pomoću Primer Express softvera (verzija 2.0; Applied Biosystems, Lennik, Belgija). TaqMan sonda je na 5 'kraju fluorescentno obeležena sa 6-karboksifluoresceinom (FAM) kao reporter boja i sa veznikom sa malim žlebovima (MGB) na 3' kraju kao agens za gašenje (Tabela 5). Kvantitativni RT-PCR u jednom koraku je izveden u ukupnoj zapremini od 25 µL, koja sadrži 13,9375 µL H2O, 6,25 µL master smeše (Eurogentec, Seraing, Belgija), 0,375 µL prajmera, 0,375 µL reverznog prajmera, 1 µL sonde, 0,0625 µL reverzne transkriptaze (Eurogentec) i 3 µL uzorka. RT-PCR je izveden korišćenjem ABI 7500 brzog PCR sistema u realnom vremenu (Applied Biosystems, Branchburg, Nju Džerzi, SAD) pod narednim uslovima: 30 minuta na 48°C i 10 minuta na 95°C, praćeno sa 40 ciklusa od 15 sekundi na 95°C i 1 minuta na 60°C. Podaci su analizirani pomoću ABI PRISM 7500 SDS softvera (verzija 1.3.1; Applied Biosystems). Za apsolutnu kvantifikaciju, generisane su standardne krive primenom 10-ostrukog razblaživanja šablonskih preparata poznatih koncentracija.

Tabela 5: Prajmeri i sonde koji se koriste za kvantitativni RT-PCR u realnom vremenu.

Citotoksični test

[0149] Potencijalni citotoksični efekti jedinjenja procenjeni su u neinficiranim mirnim ćelijama Vero-B ili Vero-M. Ćelije su posejane na 5 × 10<4>ćelije/komorica u ploči sa 96 komorica u prisustvu dvostrukih, trostrukih ili petostrukih serijskih razblaženja (u rasponu od 50 µg/mL - 0,0038 µg/mL, 50 µg/mL - 0,0076 µg/mL, i 50 µg/mL - 0,00013 µg/mL, respektivno) jedinjenja i inkubirano 4 do 7 dana. Medijum za kulturu je odbačen i 100 µL 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-karboksi-metoksifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolijum/fenazinmetosulfat (MTS/PMS; Promega, Leiden, Holandija) u PBS je dodat u svaku komoricu. Posle 2-časovnog perioda inkubacije na 37°C, optička gustina je određena na 498 nm. Citotoksična aktivnost je izračunata korišćenjem naredne formule: % održivosti ćelija = 100 × (ODJedinjenje/ODCC), gde ODJedinjenjei ODCCodgovaraju optičkoj gustini na 498 nm neinficiranih ćelijskih kultura tretiranih jedinjenjem, odnosno neinficiranih, netretiranih ćelijskih kultura. Citotoksična koncentracija od 50% (tj. koncentracija koja smanjuje ukupan broj ćelija za 50%; CC50) izračunata je pomoću linearne interpolacije.

Tabela 6: EC50, CC50, i SI za jedinjenja protiv serotipa 1 u RT-qPCR testovima

1

Tabela 7: EC50, CC50, i SI za jedinjenja protiv serotipa 2 u RT-qPCR testovima

2

Tabela 8: EC50, CC50, i SI za jedinjenja protiv serotipa 3 u RT-qPCR testovima

Tabela 9: EC50, CC50, i SI za jedinjenja protiv serotipa 4 u RT-qPCR testovima

4

Claims (11)

1. Patentni zahtevi 1. Jedinjenje ili njegov stereo-izomerni oblik, farmaceutski prihvatljiva so ili solvat, gde je navedeno jedinjenje
2. 2. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1, gde je navedeno jedinjenje: Enantiomer 9A, gde <1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 3,09 (s, 3 H) 3,73 (s, 3 H) 3,99 (s, 3 H) 6,26 (d, J=7,9 Hz, 1 H) 6,55 - 6,62 (m, 2 H) 6,91 (t, J=1,5 Hz, 1 H) 6,98 (dd, J=8,4, 2,0 Hz, 1 H) 7,07 (d, J=7,9 Hz, 1 H) 7,13 (d, J=2,0 Hz, 1 H) 7,21 (dd, J=8,8, 1,8 Hz, 1 H) 7,36 (d, J=8,4 Hz, 1 H) 7,59 (d, J=8,8 Hz, 1 H) 8,07 (d, J=0,9 Hz, 1 H) 8,55 (s, 1 H) 12,29 (br s, 1 H) LC/MS (postupak LC-A): Rt1,20 minuta, MH<+>583 [α]D<20>: 130,3° (c 0,555, DMF) Hiralna SFC (postupak SFC-E): Rt3,10 minuta, MH<+>583, hiralna čistoća 100%.
3. 3. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1, gde je navedeno jedinjenje: Enantiomer 9B, gde <1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 3,09 (s, 3 H) 3,73 (s, 3 H) 3,99 (s, 3 H) 6,26 (d, J=7,9 Hz, 1 H) 6,56 - 6,62 (m, 2 H) 6,92 (t, J=2,0 Hz, 1 H) 6,98 (dd, J=8,1, 2,0 Hz, 1 H) 7,07 (d, J=7,9 Hz, 1 H) 7,13 (d, J=2,0 Hz, 1 H) 7,22 (dd, J=8,8, 1,8 Hz, 1 H) 7,36 (d, J=8,4 Hz, 1 H) 7,59 (d, J=8,8 Hz, 1 H) 8,07 (d, J=0,9 Hz, 1 H) 8,55 (s, 1 H) 12,30 (br s, 1 H) LC/MS (postupak LC-A): Rt1,20 minuta, MH<+>583 [α]D<20>: -133,2° (c 0,5, DMF) Hiralna SFC (postupak SFC-E): Rt3,50 minuta, MH<+>583, hiralna čistoća 100%.
4. 4. Farmaceutski sastav koji sadrži jedinjenje prema bilo kom patentnom zahtevu 1-3 ili njegov stereoizomerni oblik, farmaceutski prihvatljivu so ili solvat zajedno sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijensa, razblaživača ili nosača.
5. 5. Jedinjenje prema bilo kom patentnom zahtevu 1-3 ili njegov stereoizomerni oblik, farmaceutski prihvatljiva so ili njegov solvat ili farmaceutski sastav prema patentnom zahtevu 4 za upotrebu kao lek.
6. 6. Jedinjenje prema bilo kom patentnom zahtevu 1-3 ili njegov stereoizomerni oblik, farmaceutski prihvatljiva so ili njegov solvat ili farmaceutski preparat prema patentnom zahtevu 4 za upotrebu u tretmanu denga groznice.
7. 7. Jedinjenje prema zahtevu 6, gde se jedinjenje primenjuje kao kristalni ili amorfni proizvod.
8. 8. Jedinjenje predstavljeno narednom strukturnom formulom (I)

   njegov stereo-izomerni oblik, farmaceutski prihvatljiva so ili solvat; gde: R1je OCF3, R2je H i R3je H, za primenu pri inhibiciji replikacije denga virusa u biološkom uzorku ili kod pacijenta.
9. 9. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 8, koje dalje obuhvata zajedničku primenu dodatnog terapeutskog agensa.
10. 10. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 9, gde je navedeni dodatni terapeutski agens odabrano između antivirusnog agensa ili vakcine protiv denga groznice, ili oboje.
11. 11. Postupak za sintezu jedinjenja prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 3 koji obuhvata korake: a) pretvaranje 2-(4-hloro-2-metoksifenil)sirćetne kiseline (II) u odgovarajući 2-(4-hloro-2-metoksifenil)acetil hlorid (III) sa reagensom za hlorinaciju; b) Fridel-Kraftsova reakcija kiselog hlorida (III) sa supstituisan indolom opšte formule (IV) izvršena upotrebom reagensa Luisove kiseline u odgovarajućem rastvaraču i pod 1 odgovarajućim uslovima reakcije, kako bi se dobio 3-acilovani indol opšte formule (V), gde R1je OCF3, R2je H i R3je H; c) brominacija (V) sa reagensom u odgovarajućem rastvaraču, kako bi se dobila jedinjenja opšte formule (VI); d) reakcija jedinjenja opšte formule (VI) sa 3-metoksi-5-(metilsulfonil)-anilinom (VII) u odgovarajućem rastvaraču i upotreba baze kako bi se dobila jedinjenja opšte formule I kao racemske smeše; e) hiralno razdvajanje jedinjenja opšte formule I kako bi se dobili Enantiomeri A i B opšte formule I, gde R1je OCF3, R2je H i R3je H.

    Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5 2