RS62077B1 - Novi genetski modifikovan virus vakcinije - Google Patents

Novi genetski modifikovan virus vakcinije

Info

Publication number
RS62077B1
RS62077B1 RS20210847A RSP20210847A RS62077B1 RS 62077 B1 RS62077 B1 RS 62077B1 RS 20210847 A RS20210847 A RS 20210847A RS P20210847 A RSP20210847 A RS P20210847A RS 62077 B1 RS62077 B1 RS 62077B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
cancer
vaccinia virus
polynucleotide encoding
virus
vgf
Prior art date
Application number
RS20210847A
Other languages
English (en)
Inventor
Shinsuke Nakao
Tatsuya Kawase
Takafumi Nakamura
Original Assignee
Astellas Pharma Inc
Nat Univ Corp Tottori Univ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=60477559&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS62077(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Astellas Pharma Inc, Nat Univ Corp Tottori Univ filed Critical Astellas Pharma Inc
Publication of RS62077B1 publication Critical patent/RS62077B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • A61K35/768—Oncolytic viruses not provided for in groups A61K35/761 - A61K35/766
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2046—IL-7
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/208—IL-12
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5418—IL-7
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5434—IL-12
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24132—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24161—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2710/24162—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24171—Demonstrated in vivo effect

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

Opis
POZADINA OVOG PRONALASKA
Oblast ovog pronalaska
[0001] Ovaj pronalazak se odnosi, inter alia, na virus vakcinije koji obuhvata polinukleotid koji kodira interleukin-7 i polinukleotid koji kodira interleukin-12, i na farmaceutsku kompoziciju koja obuhvata virus vakcinije koji obuhvata polinukleotid koji kodira IL-7 i virus vakcinije koji obuhvata polinukleotid koji kodira IL-12.
Opis stanja tehnike
[0002] U novije vreme razvijene su razne tehnike za upotrebu virusa za lečenje kancera. Virus vakcinije je jedan od tih virusa koji se koriste u lečenju kancera. Virus vakcinije je izučavan za lečenje kancera kao vektor za isporučivanje terapijskih gena u kancerske ćelije, kao onkolitički virus koji se proliferiše u kancerskim ćelijama i uništava kancerske ćelije, ili kao vakcina protiv kancera koja eksprimira tumorske antigene ili imunomodulatorne molekule (Expert Opinion on Biological Therapy, 2011, vol.11, p.595-608).
[0003] Virusi vakcinije konstruisani tako da imaju jedan N1L gen inaktivisan umetanjem stranog gena koji kodira interleukin-12 (IL-12) ili interleukin-21 (IL-21) i da je deficijentan u genu timidinske kinaze (TK) umetanjem lacZ gena reportera i gena luciferaze svica su prijavljeni da suzbijaju rast tumora ili da poboljšavaju stopu preživljavanja kod miševa sa kancerom (patentna literatura 1).
[0004] Prijavljena je tehnika za upošljavanje, za lečenje kancera, rekombinantnih virusa vakcinije koji su deficijentni u funkciji faktora rasta virusa vakcinije virusnih proteina (VGF) i O1L i proliferišu se specifično u kancerskim ćelijama i uništavaju te kancerske ćelije. Iako je navedeno da strani gen kao što je marker gen ili terapeutski gen koji kodira proizvod sa citotoksičnošću ili imunopotencirajućim efektom može da se uvede u gen koji nije suštinski za životni ciklus virusa vakcinije, uvođenje gena specifično ispitano u primerima je ono od marker gena, fuzionog gena luciferaze-zelenog fluorescentnog proteina (GFP) ili ekspresione kasete DsRed. Za uvođenje nije ispitan nijedan terapijski gen. Nije davan predlog za kombinovanje više terapijskih gena (patentna literatura 2).
[0005] U međuvremenu, prijavljeno je da, tokom ispitivanja efekata rekombinantnih proteina na izolovane CD8<+>T ćelije, rekombinantni humani interleukin-7 (IL-7) protein sam ne izaziva nivoe proizvodnje interferona gama (IFN-γ) koji mogu da se detektuju putem CD8<+>T ćelija, ali kombinacija rekombinantnog humanog IL-7 proteina i rekombinantnog humanog IL-12 proteina sinergistički pojačava proizvodnju IFN-γ (The Journal of Immunology, 1995, vol.154, p.5093-5102). Prijavljeno je da onkolitički virus vakcinije koji eksprimira imuno-stimulišući molekul može brzo biti očišćen jakim imunim odgovorima. Takođe je navedeno da jak imuni odgovor može da služi ili kao neprijatelj ili kao saveznik u terapiji kancera posredovanoj virusom vakcinije (Molecular Therapy, 2005, vol.11, No.2, p.180-195).
[0006] Dalje, CA 2387855 A1 opisuje vakcinu protiv melanoma i postupke za pravljenje i upotrebu iste. US 2013/071430 A1 opisuje mikroRNK-kontrolisani rekombinantni virus vakcinije i njegovu upotrebu. WO 2012/151272 A2 opisuje vakcinaciju T-ćelijama sa virusnim vektorima putem mehaničkog epidermalnog prekida. JP 2013527753 A opisuje vektore koji kondicionalno eksprimiraju terapijske proteine, ćelije domaćina koji obuhvataju te vektore, i njihove upotrebe.
Spisak navoda
Patentne literature
[0007]
Patentna literatura 1: WO2015/150809
Patentna literatura 2: WO2015/076422
KRATAK SADRŽAJ OVOG PRONALASKA
Tehnički problem
[0008] Predmet ovog pronalaska je da obezbedi rekombinantni virus vakcinije (određenije, onkolitički virus vakcinije), farmaceutsku kompoziciju i kombinovani komplet, za tretiranje ili sprečavanje kancera.
Rešenje problema
[0009] Kao rezultat značajnog ponovljenog razmišljanja i ispitivanja vezano za generisanje virusa vakcinije, pronalazači su generisali viruse vakcinije koji obuhvataju polinukleotid koji kodira IL-7 ili viruse vakcinije koji obuhvataju polinukleotid koji kodira IL-12, i viruse vakcinije koji obuhvataju dva polinukleotida, polinukleotid koji kodira IL-7 i polinukleotid koji kodira IL-12 (primer 2); i pronađeno je da 1) virus vakcinije koji obuhvata dva polinukleotida, polinukleotid koji kodira IL-7 i polinukleotid koji kodira IL-12 i 2) mešavina dva virusa vakcinije, virus vakcinije koji obuhvata polinukleotid koji kodira IL-7 i virus vakcinije koji obuhvata polinukleotid koji kodira IL-12 ispoljavaju citolitički efekat na razne humane kancerske ćelije (primer 3), čime se ovaj pronalazak upotpunjuje: 1) virus vakcinije koji obuhvata dva polinukleotida, polinukleotid koji kodira IL-7 i polinukleotid koji kodira IL-12 bi mogao da ispolji efekat regresije tumora kod humanizovanih mišjih modela koji imaju kancer (primer 6), bi mogao da postigne potpunu remisiju (primer 7), i mogao bi da izazove stečen imunitet za održavanje antitumorskog efekta (primer 8) kod singenih modela miševa sa kancerom. Štaviše, 2) mešavina dva virusa vakcinije, virusa vakcinije koji obuhvata polinukleotid koji kodira IL-7 i virusa vakcinije koji obuhvata polinukleotid koji kodira IL-12 bi mogla da postigne potpunu remisiju (primer 7), i mogla bi da izazove stečeni imunitet kako bi se održao antitumorski efekat (primer 8) kod singenih modela miševa sa kancerom.
[0010] Ovaj pronalazak je definisan priloženim setom patentnih zahteva.
Poželjni efekti ovog pronalaska
[0011] Virus vakcinije prema ovom pronalasku i virusi vakcinije sadržani u farmaceutskoj kompoziciji i kombinovanom kompletu prema ovom pronalasku ispoljavaju onkolitičko dejstvo, eksprimiraju IL-12 i IL-7 polipeptide koje kodiraju polinukleotidi koje nose virusi u kancerskim ćelijama, i izazivaju potpunu remisiju i stečeni imunitet. Virus vakcinije, farmaceutska kompozicija, i kombinovani komplet prema ovom pronalasku mogu da se koriste za sprečavanje ili tretiranje kancera.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0012]
FIG.1 predstavlja crtež koji ilustruje primer DNK plazmida prenosnog vektora koje se koriste u ovom pronalasku, na kojem gornja mapa ilustruje primer u kojem je BFP gen operativno povezan sa promoterom inkorporisan u VGF gen a donja mapa ilustruje primer u kojem je BFP gene operativno povezan sa promoterom inkorporisan u O1L gen;
FIG.2 predstavlja šematski izgled strukture genoma rekombinantnih virusa vakcinije (LC16mO ΔSCR VGF-p7.5-DsRed/O1L-SP-LacZ i virusa konstruisanih u postupku stvaranja vektora virusa);
FIG.3 predstavlja šematski izgled strukture genoma rekombinantnih virusa vakcinije (LC16mO ΔSCR VGF-SP-IL12/O1L-SP-LacZ, LC16mO ΔSCR VGF-SP-IL7/O1L-SP-LacZ);
FIG.4 predstavlja šematski izgled strukture genoma rekombinantnog virusa vakcinije (LC16mO ΔSCR VGF-SP-IL12/O1L-SP-IL7) ;
FIG.5-1 predstavlja grafikon koji ilustruje onkolitička svojstva rekombinantnog virusa vakcinije (LC16mO ΔSCR VGF-SP-IL12/O1L-SP-IL7), u kojem prava predstavlja stopu preživljavanja (%) kancerskih ćelija, a stupci greške predstavljaju standardnu devijaciju;
FIG.5-2 predstavlja grafikon koji ilustruje onkolitička svojstva rekombinantnog virusa vakcinije (LC16mO ΔSCR VGF-SP-IL12/O1L-SP-IL7), u kojem prava predstavlja stopu preživljavanja kancerskih ćelija (%), a stupci greške predstavljaju standardnu devijacija, pri čemu su FIG.5-1 i FIG.5-2 grafikoni dobijeni u istim eksperimentalnim uslovim izuzev što su izmereni tipovi ćelija bili različiti; FIG.5-3 predstavlja grafikon koji ilustruje onkolitička svojstva mešavine 2 rekombinantna virusa vakcinije (mešavina LC16mO ΔSCR VGF-SP-IL12/O1L-SP-LacZ i LC16mO ΔSCR VGF-SP-IL7/O1L-SP-LacZ), na kojem prava predstavlja kancerske ćelije stopa preživljavanja (%), a stupci greške predstavljaju standardnu devijaciju;
FIG.5-4 predstavlja grafikon koji ilustruje onkolitička svojstva mešavine 2 rekombinantna virusa vakcinije (mešavina LC16mO ΔSCR VGF-SP-IL12/O1L-SP-LacZ i LC16mO ΔSCR VGF-SP-IL7/O1L-SP-LacZ), na kojem prava predstavlja kancerske ćelije stopa preživljavanja (%), a stupci greške predstavljaju standardnu devijaciju, pri čemu su FIG.5-3 i FIG.5-4 grafikoni dobijeni u istim eksperimentalnim uslovima izuzev što su izmereni tipovi ćelija bili različiti.
DETALJAN OPIS POŽELJNIH NAČINA OSTVARIVANJA
[0013] Ovaj pronalazak je detaljno opisan u nastavku.
<Virus vakcinije, farmaceutska kompozicija koja će se primeniti u kombinaciji i kombinovani komplet prema ovom pronalasku>
[0014] Ovaj pronalazak obezbeđuje virus vakcinije koji obuhvata sledeće (1) i (2):
(1) polinukleotid koji kodira IL-7; i
(2) polinukleotid koji kodira IL-12.
(Kako se ovde upotrebljava, virus vakcinije je takođe označen i kao "virus vakcinije prema ovom pronalasku".)
[0015] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja obuhvata sledeće viruse vakcinije (1) i (2):
(1) virus vakcinije koji obuhvata polinukleotid koji kodira IL- 7; i
(2) virus vakcinije koji obuhvata polinukleotid koji kodira IL-12.
(Kako se ovde upotrebljava, farmaceutska kompozicija je takođe označena i kao "farmaceutska kompozicija koja će se primeniti u kombinaciji prema ovom pronalasku" i virus vakcinije koji obuhvata polinukleotid koji kodira IL-7 ili virus vakcinije koji obuhvata polinukleotid koji kodira IL-12 sadržan u farmaceutskoj kompoziciji koji će se primeniti u kombinaciji prema ovom pronalasku opisanoj u (1) ili (2) iznad je takođe označen i kao "virus vakcinije koji će se primeniti u kombinaciji".)
[0016] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje kombinovani komplet koji obuhvata sledeće viruse vakcinije (1) i (2) :
(1) virus vakcinije koji obuhvata polinukleotid koji kodira IL-7; i
(2) virus vakcinije koji obuhvata polinukleotid koji kodira IL-12.
(Kako se ovde upotrebljava, kombinovani komplet je takođe označen i kao "kombinovani komplet prema ovom pronalasku", a virusi vakcinije sadržani u kombinovanom kompletu prema ovom pronalasku su takođe označeni kao "virusi vakcinije za kombinovani komplet".)
[0017] Kombinovani komplet prema ovom pronalasku označava jednu ili više farmaceutskih kompozicija koje se koriste kako bi se primenila dva virusa vakcinije: (1) virus vakcinije koji obuhvata polinukleotid koji kodira IL-7 i (2) virus vakcinije koji obuhvata polinukleotid koji kodira IL-12. Kada se oba ova virusa vakcinije daju istovremeno, kombinovani komplet može da sadrži ta dva virusa vakcinije za kombinovani komplet zajedno u pojedinačnoj farmaceutskoj kompoziciji kao što je prašak ili odvojeno u više farmaceutskih kompozicija. Kombinovani komplet prema ovom pronalasku obuhvata farmaceutsku kompoziciju koja obuhvata dva virusa vakcinije: virus vakcinije koji obuhvata polinukleotid koji kodira IL-7 i virus vakcinije koji obuhvata polinukleotid koji kodira IL-12. Kada se oba virusa vakcinije za kombinovani komplet ne daju istovremeno, kombinovani komplet sadrži ta dva virusa vakcinije za kombinovani komplet u odvojenim farmaceutskim kompozicijama. Na primer, kombinovani komplet obuhvata ta dva virusa vakcinije za kombinovani komplet u odvojenim farmaceutskim kompozicijama u pojedinačnom pakovanju ili u odvojenim farmaceutskim kompozicijama u odvojenim pakovanjima. Kombinovani komplet prema ovom pronalasku može da obuhvata farmaceutski prihvatljiv ekscipijens.
[0018] Virus vakcinije koji se koristi za virus vakcinije prema ovom pronalasku, virus vakcinije koji će se primeniti u kombinaciji, i virusi vakcinije za kombinovani komplet predstavljaju virus iz roda Orthopoxvirus, familije Poxviridae. Sojevi virusa vakcinije koji se koriste u ovom pronalasku uključuju, ali bez ograničenja na, sojeve Lister, New York City Board of Health (NYBH), Wyeth, Copenhagen, Western Reserve (WR), Modified Vaccinia Ankara (MVA), EM63, Ikeda, Dalian, Tian Tan, i njima slične. Sojevi Lister i MVA su dostupni iz Američke tipske kolekcije kultura (ATCC VR-1549 i ATCC VR-1508, tim redom). Dalje, sojevi virusa vakcinije zasnovani na ovim sojevima mogu da se koriste u ovom pronalasku. Na primer, sojevi LC16, LC16m8, i LC16mO zasnovani na soju Lister mogu da se koriste u ovom pronalasku. Soj LC16mO predstavlja soj koji je nastao od soja LC16 subkultivisanjem Lister soja kao matičnog soja na niskoj temperaturi. LC16m8 soj je soj generisan daljim subkultivisanjem soja LC16mO na niskoj temperaturi, sa frejmšift mutacijom u B5R genu, genu koji kodira virusni membranski protein, i atenuisan gubljenjem ekspresije i funkcije ovog proteina (Tanpakushitsu kakusan koso (Protein, Nucleic acid, Enzyme), 2003, vol.48, p.1693-1700). Sekvence celog genoma sojeva Lister, LC16m8, i LC16mO su poznati kao, na primer, pristupni br.AY678276.1, pristupni br.AY678275.1, i pristupni br.AY678277.1, tim redom. Stoga, sojevi LC16m8 i LC16mO mogu biti napravljeni od soja Lister poznatom tehnikom, kao što je homologna rekombinacija ili mutageneza usmerena na mesto.
[0019] U jednom načinu ostvarivanja, virus vakcinije korišćen u ovom pronalasku je soj Lc16mO.
[0020] Virus vakcinije koji se koristi u ovom pronalasku može da uključuje atenuisane i/ili tumorskiselektivne viruse vakcinije. Kako se ovde upotrebljava, "atenuisan" označava nisku toksišnost (na primer, citolitičko svojstvo) za normalne ćelije (na primer, netumorske ćelije). Kako se ovde upotrebljava, "tumorski selektivne" označava toksičnost za tumorske ćelije (na primer, onkolitički) više od normalnih ćelija (na primer, netumorskih ćelije). U ovom pronalasku mogu da se koriste virusi vakcinije genetski modifikovani kako bi bili deficijentni u funkciji konkretnog proteina ili kako bi se suzbila ekspresija konkretnog gena ili proteina (Expert Opinion on Biological Therapy, 2011, vol.11, p.
595-608). Na primer, da bi se povećala selektivnost tumora virusa vakcinije, mogu da se koriste: virus vakcinije koji je deficijentan u funkciji TK (Cancer Gene Therapy, 1999, vol.6, p.409-422), virus vakcinije koji je deficijentan u funkciji VGF (Cancer Research, 2001, vol.61, p.8751-8757), virus vakcinije sa modifikovanim TK genom, modifikovanim genom hemaglutinina (HA), i modifikovanim F3 genom ili isprekidanim F3 lokusom (WO 2005/047458), virus vakcinije koji je deficijentan u funkciji VGF i O1L (WO 2015/076422), virus vakcinije u kojem ciljna sekvenca mikroRNK čija ekspresija je smanjena u kancerskim ćelijama je umetnuta u 3' nekodirajući region B5R gena (WO 2011/125469), virus vakcinije koji je deficijentan u funkciji VGF i TK (Cancer Research, 2001, vol.61, p.8751-8757), virus vakcinije koji je deficijentan u funkciji TK, HA, i F14.5L (Cancer Research, 2007, vol.67, p.10038-10046), virus vakcinije koji je deficijentan u funkciji TK i B18R (PLoS Medicine, 2007, vol.4, p. e353), virus vakcinije koji je deficijentan u funkciji TK i ribonukleotidnoj reduktazi (PLoS Pathogens, 2010, vol.6, p. e1000984), virus vakcinije koji je deficijentan u funkciji SPI-1 i SPI-2 (Cancer Research, 2005, vol.65, p.9991-9998), virus vakcinije koji je deficijentan u funkciji SPI-1, SPI-2, i TK (Gene Therapy, 2007, vol.14, p.638-647), ili virus vakcinije sa mutacijama u E3L i K3L regionima (WO 2005/007824). Štaviše, može da se koristi virus vakcinije koji je deficijentan u funkciji O1L (Journal of Virology, 2012, vol.86, p.2323-2336). Štaviše, u nadi da je čišćenje virusa efektom neutralizacije antitela antivirusne vakcinije smanjeno u živom telu, može da se koristi virus vakcinije koji je deficijentan u ekstracelularnom regionu B5R (Virology, 2004, vol.325, p.425-431) ili virus vakcinije koji je deficijentan u A34R regionu (Molecular Therapy, 2013, vol.
21, p.1024-1033). Štaviše, u nadi da će virus vakcinije aktivirati imune ćelije,može da se koristi virus vakcinije koji je deficijentan u receptoru interleukina-lb (IL-1b) (WO 2005/030971). Takvo umetanje stranog gena ili delecija ili mutacija gena može da se napravi, na primer, poznatom homolognom rekombinacijom ili mutagenezom usmerenom na mesto. Štaviše, virus vakcinije sa kombinacijom takvih genetskih modifikacija može da se koristi u ovom pronalasku. Kako se ovde upotrebljava, "kojem nedostaje" označava da region gena naznačen ovim pojmom nema funkciju i koristi se u značenju uključujući deleciju regiona gena naznačenog ovim pojmom. Na primer, "kojem nedostaje" može da bude rezultat delecije u regionu koji se sastoji od naznačenog regiona gena ili delecije u susednom regionu gena koji obuhvata naznačeni region gena.
[0021] U jednom načinu ostvarivanja, virus vakcinije prema ovom pronalasku, virus vakcinije koji će se primeniti u kombinaciji, ili virusi vakcinije za kombinovani komplet je (su) deficijentan u funkciji VGF. U jednom načinu ostvarivanja, virus vakcinije prema ovom pronalasku, virus vakcinije koji će se primeniti u kombinaciji, ili virusi vakcinije za kombinovani komplet je (su) deficijentan u funkciji O1L. U jednom načinu ostvarivanja, virus vakcinije prema ovom pronalasku, virus vakcinije koji će se primeniti u kombinaciji ili virusi vakcinije za kombinovani komplet je (su) deficijentan u funkcijama VGF i O1L.
Funkciji VGF i/ili O1L može da nedostaje virus vakcinije na osnovu postupka opisanog u WO 2015/076422.
[0022] VGF je protein koji ima visoku homologiju aminokiselinske sekvence sa epidermalnim faktorom rasta (EGF), se vezuje za receptor epidermalnog faktora rasta kao EGF, i aktivira signalnu kaskadu od Ras, Raf, Mitogen-aktivisane proteinske kinaze (MAPK)/ekstracelularne signalno-regulisane kinaze (ERK) kinaze (MAPK/ERK kinaze, MEK), i za sledeći ERK kako bi se promovisala ćelijska deoba.
[0023] O1L održava aktivaciju ERK i doprinosi ćelijskoj deobi zajedno sa VGF.
[0024] Deficijentnost u funkciji VGF i/ili O1L virusa vakcinije se odnosi na gubitak ekspresije gena koji kodira VGF i/ili gena koji kodira O1L ili normalne funkcije VGF i/ili O1L kada je eksprimiran.
Deficijentnost u funkciji VGF i/ili O1L virusa vakcinije može biti uzrokovana delecijom svih ili dela gena koji kodira VGF i/ili gena koji kodira O1L. Štaviše, geni mogu biti mutirani nukleotidnom supstitucijom, delecijom, umetanjem, ili dodavanjem kako bi se sprečila ekspresija normalnog VGF i/ili O1L. Štaviše, strani gen može biti umetnut u gen koji kodira VGF i/ili gen koji kodira O1L. U ovom pronalasku, za gen se navodi da je deficijentan kada normalni proizvod gena nije eksprimiran mutacijom kao što je genetska supstitucija, delecija, umetanje, ili dodavanje.
[0025] Bilo da se radi o virusu vakcinije prema ovom pronalasku ili ne, virus vakcinije koji će se primeniti u kombinaciji, ili virusi vakcinije za kombinovani komplet su (je) deficijentni u funkciji VGF i/ili O1L, može biti određen poznatim postupkom, na primer, procenom funkcije VGF i/ili O1L, ispitivanjem prisustva VGF ili O1L imunohemijskom tehnikom upotrebom antitela protiv VGF ili antitela protiv O1L, ili određivanjem prisustva gena koji kodira VGF ili gena koji kodira O1L lančanom reakcijom polimeraze (PCR).
[0026] B5R (pristupni br.AAA48316.1) je membranski protein tipa 1 koji se nalazi u omotaču virusa vakcinije, i služi da se poveća efikasnost infekcije kada virus inficira i prenese se na susedne ćelije ili druga mesta u domaćinu. Ekstracelularni region B5R sadrži 4 strukturna domena nazvana SCR domeni (Journal of Virology, 1998, vol.72, p.294-302). U jednom načinu ostvarivanja, virus vakcinije prema ovom pronalasku, virus vakcinije koji će se primeniti u kombinaciji, ili virusi vakcinije za kombinovani komplet ima (imaju) delecija u SCR domenima u ekstracelularnom regionu B5R.
[0027] Delecija u SCR domenima u B5R ekstracelularnom regionu virusa vakcinije obuhvata deleciju dela ili sva 4 SCR domena u B5R ekstracelularnom regionu i odnosi se na nedostatak ekspresije genskog regiona koji kodira deo ili sva 4 SCR domena u B5R ekstracelularnom regionu ili nedostatak dela ili sva 4 SCR domena u ekstracelularnom regionu u eksprimiranom B5R proteinu. U jednom načinu ostvarivanja, virus vakcinije prema ovom pronalasku, virus vakcinije koji će se primeniti u kombinaciji, ili virusi vakcinije za kombinovani komplet ima (imaju) deleciju sva 4 SCR domena. U jednom načinu ostvarivanja, 4 SCR domeni izbrisani u virusu vakcinije prema ovom pronalasku, virusu vakcinije koji će se primeniti u kombinaciji, i virusima vakcinije za kombinovani komplet odgovaraju regionu iz aminokisleine 22 do aminokiseline 237 u prethodno opisanoj aminokiselinskoj sekvenci pristupnog br. AAA48316.1.
[0028] Bilo da se radi o virusu vakcinije prema ovom pronalasku ili ne, virus vakcinije koji će se primeniti u kombinaciji, ili virusi vakcinije za kombinovani komplet ima (imaju) deleciju u SCR domenima u B5R ekstracelularnom regionu mogu biti određeni poznatim postupkom, na primer, ispitivanjem prisustva SCR domena imunohemijskom tehnikom upotrebom antitela protiv SCR domena ili određivanjem prisustva ili veličine gena koji kodira SCR domene putem PCR.
[0029] U jednom načinu ostvarivanja, virus vakcinije prema ovom pronalasku, virus vakcinije koji će se primeniti u kombinaciji, ili virusi vakcinije za kombinovani komplet je (su) virus vakcinije koji je deficijentan u funkcijama VGF i O1L i sa delecijom u SCR domenima u B5R ekstracelularnom regionu.
[0030] U jednom načinu ostvarivanja, virus vakcinije prema ovom pronalasku, virus vakcinije koji će se primeniti u kombinaciji, ili virusi vakcinije za kombinovani komplet je (su) virus vakcinije soja LC16mO koji je deficijentan u funkcijama VGF i O1L i sa delecijom u SCR domenima u B5R ekstracelularnom regionu.
[0031] U jednom načinu ostvarivanja, virus vakcinije prema ovom pronalasku predstavlja virus vakcinije koji obuhvata polinukleotid koji kodira IL-7 i polinukleotid koji kodira IL-12 i koji je deficijentan u funkcijama VGF i O1L.
[0032] U jednom načinu ostvarivanja, virus vakcinije prema ovom pronalasku predstavlja virus vakcinije soja LC16mO koji obuhvata polinukleotid koji kodira IL-7 i polinukleotid koji kodira IL-12 i koji je deficijentan u funkcijama VGF i O1L.
[0033] U jednom načinu ostvarivanja, virus vakcinije prema ovom pronalasku predstavlja virus vakcinije koji obuhvata polinukleotid koji kodira IL-7 i polinukleotid koji kodira IL-12, koji je deficijentan u funkcijama VGF i O1L, i sa delecijom u SCR domenima u B5R ekstracelularnom regionu.
[0034] U jednom načinu ostvarivanja, virus vakcinije prema ovom pronalasku predstavlja virus vakcinije soja LC16mO koji obuhvata polinukleotid koji kodira IL-7 i polinukleotid koji kodira IL-12, koji je deficijentan u funkcijama VGF i O1L, i sa delecijom u SCR domenima u B5R ekstracelularnom regionu.
[0035] U jednom načinu ostvarivanja, virus vakcinije koji će se primeniti u kombinaciji ili virusi vakcinije za kombinovani komplet je (su) virus vakcinije koji obuhvata polinukleotid koji kodira IL-7 i koji je deficijentan u funkcijama VGF i O1L ili virus vakcinije koji obuhvata polinukleotid koji kodira IL-12 i koji je deficijentan u funkcijama VGF i O1L.
[0036] U jednom načinu ostvarivanja, virus vakcinije koji će se primeniti u kombinaciji ili virusi vakcinije za kombinovani komplet je (su) virus vakcinije soja LC16mO koji obuhvata polinukleotid koji kodira IL-7 i koji je deficijentan u funkcijama VGF i O1L ili virus vakcinije soja LC16mO koji obuhvata polinukleotid koji kodira IL-12 i koji je deficijentan u funkcijama VGF i O1L.
[0037] U jednom načinu ostvarivanja, virus vakcinije koji će se primeniti u kombinaciji ili virusi vakcinije za kombinovani komplet je (su) virus vakcinije koji obuhvata polinukleotid koji kodira IL-7, koji je deficijentan u funkcijama VGF i O1L, i sa delecijom u SCR domenima u B5R ekstracelularnom regionu ili virus vakcinije koji obuhvata polinukleotid koji kodira IL-12, koji je deficijentan u funkcijama VGF i O1L, i sa delecijom u SCR domenima u B5R ekstracelularnom regionu.
[0038] U jednom načinu ostvarivanja, virus vakcinije koji će se primeniti u kombinaciji ili virusi vakcinije za kombinovani komplet je (su) virus vakcinije soja LC16mO koji obuhvata polinukleotid koji kodira IL-7, koji je deficijentan u funkcijama VGF i O1L i sa delecijom u SCR domenu u B5R ekstracelularnom regionu ili virus vakcinije soja LC16mO koji obuhvata polinukleotid koji kodira IL-12, koji je deficijentan u funkcijama VGF i O1L, i sa delecijom u SCR domenima u B5R ekstracelularnom regionu.
[0039] IL-7 je sekretorni protein koji funkcioniše kao agonist za IL-7 receptor. Prijavljeno je da IL-7 doprinosi preživljavanju, proliferaciji, i diferencijaciji T ćelija, B ćelija, ili njima sličnih (Current Drug Targets, 2006, vol.7, p.1571-1582). U ovom pronalasku, IL-7 obuhvata IL-7 koji se javlja prirodno i modifikovane oblike koji imaju njegovu funkciju. U jednom načinu ostvarivanja, IL-7 je humani IL-7. U ovom pronalasku, humani IL-7 obuhvata humani IL-7 koji se javlja prirodno i modifikovane oblike koji imaju njegovu funkciju. U jednom načinu ostvarivanja, humani IL-7 je odabran iz grupe koju čine sledeći (1) do (3):
(1) polipeptid koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu definisanu pod pristupnim br.
NP_000871.1 i koji ima funkciju humanog IL-7;
(2) polipeptid koji se sastoji od aminokiselinske sekvence iz koje je izbrisano 1 do 10 aminokiselina, supstituisano, umetnuto u, i/ili dodato aminokiselinskoj sekvenci definisanoj pod pristupnim br. NP_000871.1 i koji ima funkciju humanog IL-7; i
(3) polipeptid koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja je 90% ili više identična sa aminokiselinskom sekvencom definisanom pod pristupnim br. NP_000871.1 i koji ima funkciju humanog IL-7.
[0040] U vezi sa ovim, funkcija humanog IL-7 se odnosi na efekat na preživljavanje, proliferaciju, i diferencijaciju humanih imunih ćelija.
[0041] Humani IL-7 korišćen u ovom pronalasku je poželjno polipeptid koji se sastoji od aminokiselinske sekvence definisane pod pristupnim br. NP_000871.1.
[0042] IL-12 predstavlja heterodimer IL-12 podjedinice p40 i IL-12 podjedinice α. IL-12 je prijavljen da ima funkciju aktiviranja i izazivanja diferencijacije T ćelija i NK ćelija (Cancer Immunology Immunotherapy, 2014, vol.63, p.419-435). U ovom pronalasku, IL-12 obuhvata IL-12 koji se javlja prirodno i modifikovane oblike koji imaju njegovu funkciju. U jednom načinu ostvarivanja, IL-12 predstavlja humani IL-12. U ovom pronalasku, humani IL-12 obuhvata humani IL-12 koji se javlja prirodno i modifikovane oblike koji imaju njegovu funkciju. U jednom načinu ostvarivanja, humani IL-12 je izabran, kao kombinacija humane IL-12 podjedinice p40 i humane IL-12 podjedinice α, iz grupe koju čine sledeće (1) do (3):
(1) polipeptidi koji obuhvataju (1-a) polipeptid koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu definisanu pod pristupnim br. NP_002178.2, (1-b) polipeptid koji se sastoji od aminokiselinske sekvence iz koje je izbrisano 1 do 10 aminokiselina, supstituisano, umetnuto u, i/ili dodato aminokiselinskoj sekvenci definisanoj pod pristupnim br. NP_002178.2, ili (1-c) polipeptid koji obuhvata aminokiselinsku
1
sekvencu koja je 90% ili više identična sa aminokiselinskom sekvencom definisanom pod pristupnim br. NP_002178.2; i
(2-a) polipeptid koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu definisanu pod pristupnim br.
NP_000873.2, (2-b) polipeptid koji se sastoji od aminokiselinske sekvence iz koje je izbrisano 1 do 10 aminokiselina, supstituisano, umetnuto u, i/ili dodato aminokiselinskoj sekvenci definisanoj pod pristupnim br. NP_000873.2, ili (2-c) polipeptid koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja je 90% ili više identična sa aminokiselinskom sekvencom definisanom pod pristupnim br. NP_000873.2, i koji ima funkciju humanog IL-12;
(2) polipeptidi koji obuhvataju (1-a) polipeptid koji se sastoji od aminokiselinske sekvence definisane pod pristupnim br. NP_002178.2, i
(2-a) polipeptid koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu definisanu pod pristupnim br.
NP_000873.2, (2-b) polipeptid koji se sastoji od aminokiselinske sekvence iz koje je izbrisano 1 do 10 aminokiselina, supstituisano, umetnuto u, i/ili dodato aminokiselinskoj sekvenci definisanoj pod pristupnim br. NP_000873.2, ili (2-c) polipeptid koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja je 90% ili više identična sa aminokiselinskom sekvencom definisanom pod pristupnim br. NP_000873.2, i koji ima funkciju humanog IL-12; i
(3) polipeptid koji obuhvata (1-a) polipeptid koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu definisanu pod pristupnim br. NP_002178.2, (1-b) polipeptid koji se sastoji od aminokiselinske sekvence iz koje je izbrisano 1 do 10 aminokiselina, supstituisano, umetnuto u, i/ili dodato aminokiselinskoj sekvenci definisanoj pod pristupnim br. NP_002178.2, ili (1-c) polipeptid koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja je 90% ili više identična sa aminokiselinskom sekvencom definisanom pod pristupnim br. NP_002178.2, i
(2-a) polipeptid koji se sastoji od aminokiselinske sekvence definisane pod pristupnim br.
NP_000873.2, i koji ima funkciju humanog IL-12.
[0043] U vezi sa ovim, funkcija humanog IL-12 se odnosi na efekte aktiviranje i/ili diferenciranja na T ćelije ili NK ćelije. IL-12 podjedinica p40 i IL-12 podjedinica α mogu da obrazuju IL-12 direktnim vezivanjem. Štaviše, IL-12 podjedinica p40 i IL-12 podjedinica α mogu da se konjuguju putem veznika.
[0044] Humani IL-12 korišćen u ovom pronalasku je poželjno polipeptid koji obuhvata polipeptid koji se sastoji od aminokiselinske sekvence definisane pod pristupnim br. NP_002178.2 i polipeptid koji se sastoji od aminokiselinske sekvence definisane pod pristupnim br. NP_000873.2.
[0045] Kako se ovde upotrebljava, "identitet" označava identitet vrednosti dobijen pretragom upotrebom NEEDLE programa (Journal of Molecular Biology, 1970, vol.48, p.443-453) sa fabričkim parametrima. Parametri su sledeći.
Vrednost praznine = 10
Vrednost proširenja = 0,5
Matrica = EBLOSUM62
[0046] Virus vakcinije prema ovom pronalasku, virus vakcinije koji će se primeniti u kombinaciji, ili virusi vakcinije za kombinovani komplet ima (imaju) onkolitičko dejstvo. Primeri postupaka za procenjivanje da li ili ne ispitivani virus ima onkolitičko dejstvo uključuju postupak za procenjivanje smanjuju stopu preživljavanja kancerskih ćelija dodavanjem virusa. Primeri kancerskih ćelija koji se koriste za procenu uključuju ćeliju malignog melanoma RPMI-7951 (na primer, ATCC HTB-66), adenokarcinom pluća HCC4006 (na primer, ATCC CRL-2871), karcinom pluća A549 (na primer, ATCC CCL-185), ćeliju mikrocelularnog kancera pluća DMS 53 (na primer, ATCC CRL-2062), skvamozni karcinom ćelija pluća NCI-H226 (na primer, ATCC CRL-5826), ćeliju kancera bubrega Caki-1 (na primer, ATCC HTB-46), ćeliju kancera bešike 647-V (na primer, DSMZ ACC 414), ćeliju kancera glave i vrata Detroit 562 (na primer, ATCC CCL-138), ćeliju kancera dojke JIMT-1 (na primer, DSMZ ACC 589), ćeliju kancera dojke MDA-MB-231 (na primer, ATCC HTB-26), ćeliju kancera jednjaka OE33 (na primer, ECACC 96070808), glioblastom U-87MG (na primer, ECACC 89081402), neuroblastom GOTO (na primer, JCRB JCRB0612), mijelom RPMI 8226 (na primer, ATCC CCL-155), ćeliju kancera jajnika SK-OV-3 (na primer, ATCC HTB-77), ćeliju kancera jajnika OVMANA (na primer, JCRB JCRB1045), kancerske ćelije debelog creva RKO (na primer, ATCC CRL-2577), kolorektalni karcinom HCT 116 (na primer, ATCC CCL-247), ćeliju kancera pankreasa BxPC-3 (na primer, ATCC CRL-1687), ćeliju kancera prostate LNCaP klon FGC (na primer, ATCC CRL-1740), hepatocelularni karcinom JHH-4 (na primer, JCRB JCRB0435), mezoteliom NCI-H28 (na primer, ATCC CRL-5820), ćeliju kancera grlića materice SiHa (na primer, ATCC HTB-35), i ćeliju kancera želuca Kato III (na primer, RIKEN BRC RCB2088). Konkretni primeri postupaka za procenu koji mogu da se koriste uključuju postupak opisan u primeru 3 u nastavku.
[0047] Virus vakcinije prema ovom pronalasku, virus vakcinije koji će se primeniti u kombinaciji, ili virusi vakcinije za kombinovani komplet proizvode(i) IL-7 i/ili IL-12 polipeptid(e). Upotreba virusa vakcinije prema ovom pronalasku, virusa vakcinije koji će se primeniti u kombinaciji, ili virusa vakcinije za kombinovani komplet značajno povećava antitumorski efekat proizvodnjom IL-7 i IL-12 polipeptida. Proizvodnja IL-7 i IL-12 može biti potvrđena upotrebom postupka poznatog u oblasti, na primer, nakon kultivisanja, kancerskim ćelijama, virusom vakcinije u kojem su polinukleotidi koji kodiraju IL-7 i IL-12 polipeptide uvedeni nakon merenja IL-7 i IL-12 koncentracija u supernatantu kulture, imunobojenjem ćelija, izvođenjem Western blot analize ćelijskog lizata, ili merenjem koncentracija IL-7 i IL-12 u ćelijskom lizatu. Koncentracije IL-7 i IL-12 mogu biti izmerene upotrebom, na primer, humanog IL-7 ELISA kompleta (RayBiotech, Inc.) i humanog IL-12 p70 DuoSet ELISA (R&D Systems, Inc.), tim redom. Konkretni primeri postupaka za procenjivanje polipeptidnih koncentracija u supernatantu kulture ili ćelijskog lizata koji mogu da se koriste uključuju postupak opisan u primeru 4 u nastavku. Imunobojenje ćelija ili Western blot analiza ćelijskog lizata može biti izvedena upotrebom komercijalno dostupnih antitela protiv IL-7 i IL-12.
[0048] Polinukleotidi koji kodiraju IL-7 i IL-12 mogu biti sintetisani na osnovu javno dostupnih podataka o sekvencama upotrebom postupka polinukleotidne sinteze poznatog u ovoj oblasti. Štaviše, jednom kada su polinukleotidi odbijeni, modifikovani oblici koji imaju funkciju svakog polipeptida onda mogu biti generisani uvođenjem mutacije u prethodno određeno mesto upotrebom postupka poznatog stručnjacima, kao što je mutageneza usmerena na mesto (Current Protocols in Molecular Biology edition, 1987, John Wiley & Sons Sections 8.1-8.5).
[0049] Svaki od polinukleotida koji kodira IL-7 i IL-12 može biti uveden u virus vakcinije poznatom tehnikom, kao što je homologna rekombinacija ili mutageneza usmerena na mesto. Na primer, plazmid (takođe označen kao DNK plazmida prenosnog vektora) u kojem polinukleotid(i) je (su) uveden u nukleotidnu sekvencu na mestu na kojem je poželjno da bude uveden, može biti napravljen i uveden u ćelije inficirane virusom vakcinije. Taj region u kojem su polinukleotidi, od kojih svaki koji kodira IL-7 i IL-12, strani geni, uvedeni, je poželjno genski region koji je nebitan za životni ciklus virusa vakcinije. Na primer, u određenom aspektu, region u kojem IL-7 i/ili IL-12 je (su) uveden može biti region unutar VGF gena u virusu vakcinije koji je deficijentan u VGF funkciji, region unutar O1L gena u virusu vakcinije koji je deficijentan u O1 funkciji, ili region ili regioni unutar ili jednog ili oba gena VGF i O1L u virusu vakcinije koji je deficijentan u obe funkcije VGF i O1. U gore navedenom, strani gen(i) može biti uvedene tako da bude transkribovan u istom smeru kao ili suprotno od gena VGF i O1L.
[0050] Postupci za uvođenje DNK plazmida prenosnog vektora u ćelije nisu naročito ograničeni, ali primeri postupaka koji mogu da se koriste uključuju postupak sa kalcijumfosfatom i elektroporaciju.
[0051] Prilikom uvođenja polinukleotida od kojih svaki kodira IL-7 i IL-12, koji su strani geni, pogodan promoter(i) može biti operativno povezan u ushodnom delu stranog(ih) gena. Na ovaj način, strani gen(i) u virusu vakcinije prema ovom pronalasku, virusu vakcinije koji će se primeniti u kombinaciji, ili virusima vakcinije za kombinovani komplet mogu biti povezani sa promoterom koji promoviše ekspresiju u tumorskim ćelijama. Primeri takvog promotera uključuju PSFJ1-10, PSFJ2-16, p7.5K promoter, p11K promoter, T7.10 promoter, CPX promoter, HF promoter, H6 promoter, i T7 hibridni promoter.
[0052] U jednom načinu ostvarivanja, virus vakcinije prema ovom pronalasku, virus vakcinije koji će se primeniti u kombinaciji, ili virusi vakcinije za kombinovani komplet nema (nemaju) marker gen za odabir leka.
[0053] Virus vakcinije prema ovom pronalasku, virus vakcinije koji će se primeniti u kombinaciji, ili virusi vakcinije za kombinovani komplet mogu biti eksprimirani i/ili proliferisani inficiranjem ćelija domaćina virusom(ima) vakcinije i kultivisanjem inficiranih ćelija domaćina. Virus vakcinije može biti eksprimiran i/ili proliferisan postupkom poznatim u oblasti. Ćelije domaćina koje se koriste da eksprimiraju ili
1
proliferišu virus vakcinije prema ovom pronalasku, virus vakcinije koji će se primeniti u kombinaciji, ili virusi vakcinije za kombinovani komplet nisu naročito ograničene, sve dok virus vakcinije prema ovom pronalasku, virus vakcinije koji će se primeniti u kombinaciji, ili virusi vakcinije za kombinovani komplet moež biti eksprimiran i proliferisan. Primeri takvih ćelija domaćina uključuju životinjske ćelije kao što su BS-C-1, A549, RK13, HTK-143, Hep-2, MDCK, Vero, HeLa, CV-1, COS, BHK-21, i primarne bubrežne ćelije zeca. BS-C-1 (ATCC CCL-26), A549 (ATCC CCL-185), CV-1 (ATCC CCL-70), ili RK13 (ATCC CCL-37) poželjno mogu da se koriste. Uslovi kulture za ćelije domaćina, na primer, temperatura, pH podloge, i vreme kulture, su odabrani prema potrebi.
[0054] Postupci za proizvodnju virusa vakcinije prema ovom pronalasku, virusa vakcinije koji će se primeniti u kombinaciji, i virusa vakcinije za kombinovani komplet mogu da obuhvataju faze: inficiranje ćelija domaćina virusom vakcinije prema ovom pronalasku, virusom vakcinije koji će se primeniti u kombinaciji, ili virusima vakcinije za kombinovani komplet; kultivisanje inficiranih ćelija domaćina; i eksprimiranje virusa vakcinije prema ovom pronalasku, virusa vakcinije koji će se primeniti u kombinaciji, ili virusa vakcinije za kombinovani komplet; i opciono sakupljanja i poželjno prečišćavanja virusa vakcinije prema ovom pronalasku, virusa vakcinije koji će se primeniti u kombinaciji, ili virusa vakcinije za kombinovani komplet. Postupci koji mogu da se koriste za prečišćavanje uključuju digestiju DNK sa Benzonase-om, centrifugiranje gradijenta saharoze, centrifugiranje gradijenta gustine lodiksanola, ultrafiltraciju, i dijafiltraciju.
<Farmaceutska kompozicija prema ovom pronalasku>
[0055] Farmaceutske kompozicije prema ovom pronalasku uključuju farmaceutsku kompoziciju koja obuhvata virus vakcinije prema ovom pronalasku i farmaceutski prihvatljiv ekscipijens. Farmaceutske kompozicije prema ovom pronalasku takođe uključuju farmaceutsku kompoziciju koja će se primeniti u kombinaciji prema ovom pronalasku. U jednom načinu ostvarivanja, farmaceutska kompozicija koji će se primeniti u kombinaciji prema ovom pronalasku obuhvata farmaceutski prihvatljiv ekscipijens.
[0056] Farmaceutske kompozicije prema ovom pronalasku mogu biti pripremljene postupkom koji se obično koristi u ovoj oblasti, upotrebom ekscipijensa koji se uobičajeno koristi u ovoj oblasti, odnosno, farmaceutskog ekscipijensa, farmaceutskog nosača, ili njima sličnih. Primeri doznog oblika takvih farmaceutskih kompozicija uključuju parenteralne formulacije kao što su injekcije i infuzije i one mogu da se daju intravenski, supkutano, intratumorski, ili na njima slične načine. U formulaciji, ekscipijensi, nosači, ili aditivi pogodni za ovaj dozni oblik mogu da se koriste sve dok su farmaceutski prihvatljivi.
[0057] Efektivna doza varira prema ozbiljnosti simptoma ili uzrasta pacijenta, doznog oblika formulacije koji se koristi, ili titra virusa, ali, na primer, približno 10<2>-10<10>jedinica koje formiraju plak (PFU) može da se koristi kao efektivna doza pojedinačnog virusa, kao kombinovana efektivna doza od 2 virusa u kombinovanom kompletu, ili kao kombinovana efektivna doza 2 virusa koja se daju u kombinaciji. Dva virusa u kombinovanom kompletu mogu da se koriste, na primer, u doznom odnosu od približno 1:10 do 10:1, približno 1:5 do 5:1, približno 1:3 do 3:1, približno 1:2 do 2:1, ili oko 1:1.
<Primena za sprečavanje ili tretiranje kancera>
[0058] Farmaceutske kompozicije prema ovom pronalasku mogu da se koriste kao profilaktički ili terapeutski agens za kancer, na primer, kancer odabran iz grupe koju čine maligni melanom, adenokarcinom pluća, kancer pluća, mikrocelularni kancer pluća, skvamozni karcinom pluća, kancer bubrega, kancer bešike, kancer glave i vrata, kancer dojke, kancer jednjaka, glioblastom, neuroblastom, mijelom, kancer jajnika, kolorektalni kancer, kancer pankreasa, kancer prostate, hepatocelularni karcinom, mezoteliom, kancer grlića materice i kancer želuca.
[0059] Ovaj pronalazak uključuje farmaceutsku kompoziciju za sprečavanje ili tretiranje kancera, na primer, kancera odabranog iz grupe koju čine maligni melanom, adenokarcinom pluća, kancer pluća, mikrocelularni kancer pluća, skvamozni karcinom pluća, kancer bubrega, kancer bešike, kancer glave i vrata, kancer dojke, kancer jednjaka, glioblastom, neuroblastom, mijelom, kancer jajnika, kolorektalni kancer, kancer pankreasa, kancer prostate, hepatocelularni karcinom, mezoteliom, kancer grlića materice i kancer želuca, kompoziciju koja obuhvata virus vakcinije prema ovom pronalasku ili virus vakcinije koji će se primeniti u kombinaciji.
[0060] Ovaj pronalazak uključuje kombinovani komplet za sprečavanje ili tretiranje kancera, na primer, kancera odabranog iz grupe koju čine maligni melanom, adenokarcinom pluća, kancer pluća, mikrocelularni kancer pluća, skvamozni karcinom pluća, kancer bubrega, kancer bešike, kancer glave i vrata, kancer dojke, kancer jednjaka, glioblastom, neuroblastom, mijelom, kancer jajnika, kolorektalni kancer, kancer pankreasa, kancer prostate, hepatocelularni karcinom, mezoteliom, kancer grlića materice i kancer želuca, kombinovani komplet koji obuhvata svaki od virusa vakcinije za kombinovani komplet.
[0061] Štaviše, ovaj pronalazak uključuje virus vakcinije prema ovom pronalasku za upotrebu u postupku za sprečavanje ili tretiranje kancera, na primer, kancera odabranog iz grupe koju čine maligni melanom, adenokarcinom pluća, kancer pluća, mikrocelularni kancer pluća, skvamozni karcinom pluća, kancer bubrega, kancer bešike, kancer glave i vrata, kancer dojke, kancer jednjaka, glioblastom, neuroblastom, mijelom, kancer jajnika, kolorektalni kancer, kancer pankreasa, kancer prostate, hepatocelularni karcinom, mezoteliom, kancer grlića materice i kancer želuca, pri čemu taj postupak obuhvata fazu davanja virusa vakcinije prema ovom pronalasku subjektu (na primer, pacijentu) kome je potrebna prevencija ili tretman kancera.
[0062] Štaviše, ovaj pronalazak uključuje virus vakcinije koji obuhvata polinukleotid koji kodira IL-7 i virus vakcinije koji obuhvata polinukleotid koji kodira IL-12 za upotrebu u postupku za sprečavanje ili tretiranje kancera, na primer, kancera odabranog iz grupe koju čine maligni melanom, adenokarcinom
1
pluća, kancer pluća, mikrocelularni kancer pluća, skvamozni karcinom pluća, kancer bubrega, kancer bešike, kancer glave i vrata, kancer dojke, kancer jednjaka, glioblastom, neuroblastom, mijelom, kancer jajnika, kolorektalni kancer, kancer pankreasa, kancer prostate, hepatocelularni karcinom, mezoteliom, kancer grlića materice i kancer želuca, pri čemu taj postupak obuhvata fazu davanja sledećih (1) i (2) subjektu (na primer, pacijentu) kome je potrebna prevencija ili tretman kancera:
(1) virus vakcinije koji obuhvata polinukleotid koji kodira IL-7; i
(2) virus vakcinije koji obuhvata polinukleotid koji kodira IL-12.
[0063] Ta dva virusa vakcinije mogu da se daju subjektu istovremeno, odvojeno, kontinuirano, ili u intervalima.
[0064] Štaviše, ovaj pronalazak uključuje virus vakcinije prema ovom pronalasku, za sprečavanje ili tretiranje kancera, na primer, kancera odabranog iz grupe koju čine maligni melanom, adenokarcinom pluća, kancer pluća, mikrocelularni kancer pluća, skvamozni karcinom pluća, kancer bubrega, kancer bešike, kancer glave i vrata, kancer dojke, kancer jednjaka, glioblastom, neuroblastom, mijelom, kancer jajnika, kolorektalni kancer, kancer pankreasa, kancer prostate, hepatocelularni karcinom, mezoteliom, kancer grlića materice i kancer želuca.
[0065] Ovaj pronalazak uključuje virus vakcinije odabran od sledećih (1) ili (2), za sprečavanje ili tretiranje kancera, na primer, kancera odabranog iz grupe koju čine maligni melanom, adenokarcinom pluća, kancer pluća, mikrocelularni kancer pluća, skvamozni karcinom pluća, kancer bubrega, kancer bešike, kancer glave i vrata, kancer dojke, kancer jednjaka, glioblastom, neuroblastom, mijelom, kancer jajnika, kolorektalni kancer, kancer pankreasa, kancer prostate, hepatocelularni karcinom, mezoteliom, kancer grlića materice i kancer želuca:
(1) virus vakcinije koji obuhvata polinukleotid koji kodira IL-7, za sprečavanje ili tretiranje kancera u kombinaciji sa farmaceutskom kompozicijom koja obuhvata virus vakcinije koji obuhvata polinukleotid koji kodira IL-12; ili
(2) virus vakcinije koji obuhvata polinukleotid koji kodira IL-12, za sprečavanje ili tretiranje kancera u kombinaciji sa farmaceutskom kompozicijom koja obuhvata virus vakcinije koji obuhvata polinukleotid koji kodira IL-7.
[0066] Takođe je otkrivena upotreba virusa vakcinije prema ovom pronalasku, za proizvodnju farmaceutske kompozicije za sprečavanje ili tretiranje kancera, na primer, kancera odabranog iz grupe koju čine maligni melanom, adenokarcinom pluća, kancer pluća, mikrocelularni kancer pluća, skvamozni karcinom pluća, kancer bubrega, kancer bešike, kancer glave i vrata, kancer dojke, kancer jednjaka, glioblastom, neuroblastom, mijelom, kancer jajnika, kolorektalni kancer, kancer pankreasa, kancer prostate, hepatocelularni karcinom, mezoteliom, kancer grlića materice i kancer želuca.
[0067] Takođe je otkrivena upotreba virusa vakcinije odabrana od sledećih (1) ili (2), za proizvodnju farmaceutske kompozicije za sprečavanje ili tretiranje kancera, na primer, kancera odabranog iz grupe
1
koju čine maligni melanom, adenokarcinom pluća, kancer pluća, mikrocelularni kancer pluća, skvamozni karcinom pluća, kancer bubrega, kancer bešike, kancer glave i vrata, kancer dojke, kancer jednjaka, glioblastom, neuroblastom, mijelom, kancer jajnika, kolorektalni kancer, kancer pankreasa, kancer prostate, hepatocelularni karcinom, mezoteliom, kancer grlića materice i kancer želuca:
(1) upotreba virusa vakcinije koji obuhvata polinukleotid koji kodira IL-7, za proizvodnju farmaceutske kompozicije za sprečavanje ili tretiranje kancera koja se koristi u kombinaciji sa farmaceutskom kompozicijom koja obuhvata virus vakcinije koji obuhvata polinukleotid koji kodira IL-12; ili
(2) upotreba virusa vakcinije koji obuhvata polinukleotid koji kodira IL-12, za proizvodnju farmaceutske kompozicije za sprečavanje ili tretiranje kancera koja se koristi u kombinaciji sa farmaceutskom kompozicijom koja obuhvata virus vakcinije koji obuhvata polinukleotid koji kodira IL-7.
[0068] Takođe je otkrivena upotreba virusa vakcinije koji obuhvata polinukleotid koji kodira IL-7 i virus vakcinije koji obuhvata polinukleotid koji kodira IL-12, za proizvodnju kombinovanog kompleta za sprečavanje ili tretiranje kancera, na primer, kancera odabranog iz grupe koju čine maligni melanom, adenokarcinom pluća, kancer pluća, mikrocelularni kancer pluća, skvamozni karcinom pluća, kancer bubrega, kancer bešike, kancer glave i vrata, kancer dojke, kancer jednjaka, glioblastom, neuroblastom, mijelom, kancer jajnika, kolorektalni kancer, kancer pankreasa, kancer prostate, hepatocelularni karcinom, mezoteliom, kancer grlića materice i kancer želuca.
[0069] Kako se ovde upotrebljava, "za sprečavanje" se koristi kao sinonim za "za upotrebu u sprečavanju", a "za tretiranje" se koristi kao sinonim za "za upotrebu u tretiranju".
[0070] Farmaceutske kompozicije ili kombinovani komplet prema ovom pronalasku može da se koristi u kombinaciji sa raznim terapeutskim agensima koji su efikasni za kancer na primer, kancer odabran iz grupe koju čine maligni melanom, adenokarcinom pluća, kancer pluća, mikrocelularni kancer pluća, skvamozni karcinom pluća, kancer bubrega, kancer bešike, kancer glave i vrata, kancer dojke, kancer jednjaka, glioblastom, neuroblastom, mijelom, kancer jajnika, kolorektalni kancer, kancer pankreasa, kancer prostate, hepatocelularni karcinom, mezoteliom, kancer grlića materice i kancer želuca.
Kombinovana upotreba može da se izvede istovremenim davanjem, ili odvojenim davanjem kontinuirano ili u željenim intervalima. Kada se primenjuju istovremeno, farmaceutske kompozicije prema ovom pronalasku mogu da se daju kao kombinovani lek ili kao odvojeno formulisane formulacije.
[0071] Kanceri na koje se virus vakcinije prema ovom pronalasku, farmaceutske kompozicije prema ovom pronalasku, kombinovani komplet prema ovom pronalasku, postupak za sprečavanje ili tretiranje kancera prema ovom pronalasku, ili upotreba prema ovom pronalasku je (su) primenjuje uključuju metastatske kancere na organu, na primer, limfnom čvoru, jetri, ili njima sličnim, pored primarne lezije.
[0072] Ovaj pronalazak je uopšteno opisan, ali su u nastavku dati i konkretni primeri kao referenca da bi
1
se bolje razumeo ovaj pronalazak. Ovi primeri su dati samo radi ilustracije, i nisu predviđeni da ograniče ovaj pronalazak.
Primeri
[0073] Eksperimenti sa komercijalno dostupnim kompletom ili reagensom su izvedeni prema priloženim protokolima ukoliko nije drugačije naznačeno.
(Primer 1: Konstrukcija DNK plazmida prenosnog vektora)
[0074] DNK plazmida prenosnog vektora koje se koriste za generisanje rekombinantnih virusa vakcinije homolognom rekombinacijom, su pripremljene na sledeći način.
(1) Konstrukcija pTN-VGF-P-DsRed DNK plazmida prenosnog vektora
[0075] pUC19-VGF vektor je pripremljen prema WO 2015/076422. Konkretnije, genomska DNK (pristupni br.AY678277.1) soja LC16mO je korišćena kao templat, a pUC19 vektor (kod proizvoda:
54357) od Invitrogen-a je korišćen za pripremu pUC19-VGF vektora. Pripremljeni pUC19-VGF vektor je digestiran restrikcionim enzimom AccI, a zatim su krajevi zasićeni. DNK plazmida prenosnog vektora je konstruisana umetanjem fragmenta DNK (SEQ ID NO: 22) koji sadrži p7.5k promoter i DsRed fragment na mestu cepanja. Konstruisana DNK plazmida je nazvana pTN-VGF-P-DsRed.
(2) Konstrukcija pTN-VGF-SP-IL12 i pTN-VGF-SP-IL7 DNK plazmida prenosnog vektora
[0076] Region BFP gena je amplifikovan sa dva prajmera (SEQ ID NO: 1 i SEQ ID NO: 2) upotrebom DNK pTagBFP-N vektora (FP172, Evrogen) kao templata. PCR proizvod je digestiran restrikcionim enzimima SfiI i EcoRI i kloniran u ista mesta restrikcionih enzima u pTK-SP-LG vektoru (WO 2015/076422 pod uslovom da je genomska DNK (pristupni br.AY678277.1) soja LC16mO korišćena kao templat, korišćen je pUC19 vektor (kod proizvoda: 54357) od Invitrogena; a, za pVNC110-Luc/IRES/EGFP plazmid, korišćen je pVNC110-Luc/IRES/EGFP opisan u WO 2011/125469.) da bi se konstruisao TK-SP-BFP u kojem je BFP povezan sa sintetičkim promoterom virusa vakcinije (Journal of Virological Methods, 1997, vol.66, p. 135-138). Sledeće, pTK-SP-BFP je digestiran restrikcionim enzimima SphI i EcoRI a krajevi su zasićeni. Dobijeni fragment DNK je kloniran u pUC19-VGF vektor na mestu generisanom digestiranjem plazmida sa restrikcionim enzimom AccI i zasićivanjem krajeva kako bi se konstruisao pTN-VGF-SP-BFP (FIG.1). Sledeće, polinukleotid koji kodira humani IL-12 (polinukleotid koji sadrži humani IL-12 podjedinica p40, interno ribozomalno ulazno mesto, i humani IL-12 podjedinica α; SEQ ID NO: 7) i polinukleotid (SEQ ID NO: 8) koji kodira humani IL-7 (svaki polinukleotid sadrži mesto restrikcionog enzima accggtcgccacc (SEQ ID NO: 16) na 5' mestu i mestu restrikcionog enzima gctagcgaattc (SEQ ID NO: 17) na 3 'mestu.) su digestirani restrikcionim enzimima AgeI i NheI. Svaki od polinukleotidnih fragmenata je kloniran u isto mesto restrikcionog enzima u pTN-VGF-SP-BFP kako bi se konstruisala DNK plazmida prenosnog vektora. DNK konstruisanog plazmida su nazvane kao pTN-VGF-SP-IL12 i pTN-VGF-SP-IL7, tim redom.
1
(3) Konstrukcija pTN-O1L-SP-BFP, pTN-O1L-SP-LacZ, pTN-O1L-SP-IL12, i pTN-O1L-SP-IL7 DNK plazmida prenosnog vektora
[0077] Na isti način kao (2) prethodni, pTK-SP-BFP je digestiran restrikcionim enzimima SphI i EcoRI, a fragment DNK dobijen zasićivanjem krajeva je kloniran u pUC19-O1L vektor (WO 2015/076422 pod uslovom da, kao priprema pUC19-VGF vektora, genomska DNK (pristupni br.AY678277.1) soja LC16mO je korišćena kao templat, a pUC19 vektor (kod proizvoda: 54357) od Invitrogen-a je korišćen; i O1L genski region je umetnut u XbaI mesto u pUC19 vektoru.) na mestu generisanom digestiranjem plazmida sa restrikcionim enzimom XbaI i zasićivanjem krajeva da bi se konstruisala DNK plazmida prenosnog vektora (FIG.1). Pripremljena DNK plazmida je nazvana pTN-O1L-SP-BFP. Sledeće, polinukleotid (SEQ ID NO: 9) koji sadrži Escherichia coli LacZ gen sa kodonima optimizovanim za humani, polinukleotid (SEQ ID NO: 7) koji kodira humani IL-12, i polinukleotid (SEQ ID NO: 8) koji kodira humani IL-7 su digestirani restrikcionim enzimima AgeI i NheI. Svaki od fragmenata polinukleotida koji kodira LacZ, IL-12, ili IL-7 je kloniran u ista mesta restrikcionih enzima (AgeI i NheI mesta) u pTN-O1L-SP-BFP vektor da bi se konstruisao DNK plazmida prenosnog vektora. DNK konstruisanog plazmida su nazvane kao pTN-O1L-SP-LacZ, pTN-O1L-SP-IL12, i pTN-O1L-SP-IL7, tim redom.
(4) Konstrukcija pTN-DsRed (B5R-) i pTN-B5RΔ1-4 DNK plazmida prenosnog vektora
[0078] B4R genski region je amplifikovan sa dva prajmera (SEQ ID NO: 3 i SEQ ID NO: 4) upotrebom DNK pB5R (WO 2011/125469, pod uslovom da je genomska DNK (pristupni br.AY678277.1) soja LC16mO korišćena kao templat) kao templat. Štaviše, DsRed genski region je amplifikovan sa dva prajmera (SEQ ID NO: 5 i SEQ ID NO: 6) upotrebom DNK pDsRed-Express-N1 (Clontech Laboratories, Inc.) kao templatom. Prethodni PCR proizvod je digestiran restrikcionim enzimima NotI i FspI a potonji PCR proizvod je digestiran restrikcionim enzimima FspI i MfeI. Ova dva DNK fragmenta su klonirana u pB5R digestiran restrikcionim enzimima NotI i MfeI da bi se konstruisala DNK plazmida prenosnog vektora. Pripremljena DNK plazmida je nazvana pTN-DsRed (B5R-). U međuvremenu, pB5R je digestiran restrikcionim enzimima NotI i NspI ili restrikcionim enzimima NspI i SacI. Ova dva fragmenta DNK su klonirana u pB5R digestiran restrikcionim enzimima NotI i SacI da bi se konstruisala DNK plazmida prenosnog vektora. Pripremljena DNK plazmida je nazvana pTN-B5RΔ1-4. pTN-B5RΔ1-4 kodira B5R protein sa delecijom četiri SCR domena. Njihova aminokiselinska sekvenca je sekvenca definisana u SEQ ID NO: 18.
(Primer 2: Konstrukcija genetski konstruisanog virusa vakcinije)
[0079] Rekombinantni virus vakcinije (označen kao LC16mO VGF-SP-LucGFP/O1L-p7.5-DsPed) koji je deficijentan u funkcijama VGF i O1L je pripremljen od soja virusa vakcinije LC16mO. Ovaj rekombinantni virus vakcinije je sekvencioniran sekvencom sledeće generacije PacBio RSII (Pacific Biosciences of California, Inc.), a virusni genom je rekonstituisan iz informacija dobijene sekvence upotrebom Sprai
1
[BMC GENOMICS.2014 AUG 21, 15:699.] softvera da bi se odredila nukleotidna sekvenca, koja predstavlja nukleotidnu sekvencu definisanu u SEQ ID NO: 21. Štaviše, sekvence petlje su dodate na oba kraja nukleotidne sekvence i sekvence petlje na oba kraja su bile nukleotidne sekvence definisane u SEQ ID NO: 19 ili 20,
(1) Sakupljeni su rekombinantni virusi vakcinije sa virusnim genomom ilustrovanim na FIG.2.
Postupak sakupljanja virusa je konkretno opisan u nastavku. CV1 ćelije (ATCC CCL-70) ili RK13 ćelije (ATCC CCL-37) kultivisane do 80% konfluentne u sudovima sa 6 bunarčića su inficirane sa LC16mO VGF-SP-LucGFP/O1L-p7.5-DsPed pri multiplicitetu infekcije (MOI) = 0,02-0,1 i virusu je omogućeno da bude apsorbovan na sobnoj temperaturi tokom 1 sata. pTN-O1L-SP-BFP konstruisan u primeru 1 (3) je pomešan sa FuGENE® HD transfekcionim reagensom (Roche), dodat ćelijama prema uputstvu kako bi se inkorporirao u ćelijama i ćelije su kultivisane na 5% CO2i 37°C tokom 2-5 dana. Ćelije su zamrznute-otopljene, sonikovane, i razblažene sa Opti-MEM (Invitrogen) kako bi se dobili pojedinačni plakovi sledećim postupkom.100 µL dobijene razblažene tečnosti je dodato da bi se inokulisale BS-C-1 ćelije (ATCC CCL-26) ili RK13 ćelije kultivisane do sub-konfluenta u sudovima sa 6 bunarčića.2 mL Eagle MEM podloge (NISSUI, 05900) koji sadrže 0,8% metilceluloze (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 136-02155), 5% fetalni goveđi serum, 0,225% natrijumbikarbonat (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 195-16411), i GlutaMAX (TM) Supplement I (GIBCO, 35050-061) je dodat i ćelije su kultivisane na 5% CO2i 37°C tokom 2-5 dana. Podloga je uklonjena, a plakovi, kako je naznačeno ekspresijom BFP, su sastrugani pri čemu je zašiljeni vrh suspendovan u Opti-MEM. Ova operacija je ponovljena tri puta ili više sa BS-C-1 ili RK13 ćelijama kako bi se prečistili plakovi i sakupili plakovi virusa (u ovom primeru, postupak do ove tačke je u daljem tekstu označen kao "sakupljanje".). Plakovi su suspendovani u Opti-MEM i sonikovani. Genomska DNK je ekstrahovana iz 200 µL sonikovanog rastvora upotrebom kompleta High Pure Viral Nucleic Acid Kit (Roche) prema uputstvu i pregledana PCR-om. PCR je izveden za VGF sa dva prajmera (SEQ ID NO: 10 i SEQ ID NO; 11), za O1L sa ta dva prajmera (SEQ ID NO: 12 i SEQ ID NO: 13), i za B5R sa ta dva prajmera (SEQ ID NO: 14 i SEQ ID: NO 15). Među klonovima iz kojih je očekivana veličina PCR proizvoda detektovana, klon virusa za koji je tačna nukleotidna sekvenca PCR proizvoda potvrđena direktnim sekvencioniranjem (označen kao LC16mO VGF-SP-LucGFP/O1L-SP-BFP. FIG.2) je izabran i proliferisan sa A549 (ATCC CCL-185) ili RK13 ćelijama, a zatim je titar virusa izmeren sa RK13 ćelijama. Upotrebom LC16mO VGF-SP-LucGFP/O1L-SP-BFP i pTN-DsRed (B5R-) pripremljenih u primeru 1 (4), rekombinantni virus, kako je naznačeno DsRed ekspresijom umesto BFP ekspresije, je sakupljen na isti način kako je prethodno opisano. Virus je nazvan LC16mO Δ-DsRed VGF-SP-LucGFP/O1L-SP-BFP (FIG.2).
2
(2) Sakupljen je rekombinantni virus sa delecijom 4SCR domena u B5R proteinu. Konkretno, upotrebom LC16mO Δ-DsRed VGF-SP-LucGFP/O1L-SP-BFP pripremljenog u primeru 2 (1) i pTN-B5RΔ1-4 konstruisanog u primeru 1 (4), rekombinantni virus, kako je naznačeno nestajanjem DsRed ekspresije umesto BFP ekspresije, je sakupljen na isti način kao u primeru 2 (1). Virus je nazvan LC16mO ΔSCR VGF-SP-LucGFP/O1L-SP-BFP (FIG.2). Štaviše, upotrebom pripremljenog LC16mO ΔSCR VGF-SP-LucGFP/O1L-SP-BFP i pTN-VGF-P-DsRed konstruisanog u primeru 1 (1), rekombinantni virus, kako je naznačeno DsRed ekspresijom umesto BFP ekspresijom, je sakupljen na isti način kao u primeru 2 (1). Virus je nazvan LC16mO ΔSCR VGF-p7.5-DsPed/O1L-SP-BFP (FIG.2). Sledeće, upotrebom dobijenih LC16mO ΔSCR VGF-p7.5-DsRed/O1L-SP-BFP i pTN-O1L-SP-LacZ konstruisanih u primeru 1 (3), rekombinantni virus, kako je naznačeno nestajanjem BFP ekspresije umesto BFP ekspresije, je sakupljen na isti način kao u primeru 2 (1). Virus je nazvan LC16mO ΔSCR VGF-p7.5-DsRed/O1L-SP-LacZ (FIG.2).
(3) Sakupljeni su rekombinantni virusi vakcinije izbrisani iz SCR regiona sa virusnim genomom ilustrovanim na FIG.3 i koji eksprimiraju terapeutski gen i marker gen. Konkretno, upotrebom svakog od LC16mO ΔSCR VGF-p7.5-DsRed/O1L-SP-LacZ pripremljenog u primeru 2 (2) i DNK plazmida prenosnog vektora (pTN-VGF-SP-IL12 i pTN-VGF-SP-IL7) konstruisanog u primeru 1 (2), svakog od rekombinantnih virusa, kako je naznačeno nestajanjem DsRed ekspresija umesto BFP ekspresija, je sakupljen na isti način kao u primeru 2 (1). Virusi su nazvani LC16mO ΔSCR VGF-SP-IL12/O1L-SP-LacZ (u daljem tekstu, označen kao "hIL12-koji nosi virus vakcinije".) i LC16mO ΔSCR VGF-SP-IL7/O1L-SP-LacZ (u daljem tekstu, označen kao "hIL7-koji nosi virus vakcinije".) (FIG.3). Za prečišćavanje, A549 ili RK13 ćelije su inficirane svakim od rekombinantnih virusa. Ćelije su kultivisane na 5% CO2i 37°C tokom 2-5 dana, a zatim su inficirane ćelije sakupljene. Ćelije su zamrznute-otopljene i sonikovane. Virusi su prečišćeni centrigufiranjem gradijenta gustine upotrebom OptiPrep (Axis-Shield Diagnostics Ltd.). Titar virusa je izmeren sa RK13 ćelijama.
(4) Sakupljen je rekombinantni virus vakcinije izbrisan iz SCR domena sa virusnim genomom ilustrovanim na FIG.4 i koji eksprimira polinukleotid koji kodira humani IL-7 i polinukleotid koji kodira humani IL-12.
(4-1) Konkretno, upotrebom LC16mO ΔSCR VGF-p7.5-DsRed/O1L-SP-BFP pripremljenog u primeru 2 (2) i DNK plazmida prenosnog vektora pTN-VGF-SP-IL12 konstruisanog u primeru 1 (2), svaki od rekombinantnih virusa, kako je naznačeno nestajanjem DsRed ekspresije umesto BFP ekspresije, je sakupljen na isti način kao u primeru 2 (1). Virus je nazvan LC16mO ΔSCR VGF-SP-IL12/O1L-SP-BFP.
(4-2) Sledeće, upotrebom LC16mO ΔSCR VGF-SP-IL12/O1L-SP-BFP pripremljenog u primeru 2 (4-1) i DNK plazmida prenosnog vektora pTN-O1L-SP-IL7 konstruisane u primeru 1 (3), sakupljen je svaki od rekombinantnih virusa, kako je naznačeno nestajanjem BFP ekspresije umesto BFP ekspresije, na isti način kao u primeru 2 (1). Virus je nazvan LC16mO ΔSCR VGF-SP-IL12/O1L-SP-IL7 (u daljem tekstu, u primerima u nastavku, takođe označen kao "hIL12 i hIL7-koji nosi virus vakcinije".) (FIG.4). Svaki rekombinantni virus je prečišćen postupkom u primeru 2 (3) i zatim je titar virusa svakog virusa izmeren RK13 ćelijama.
(Primer 3: Onkolitičko svojstvo genetski konstruisanog virusa vakcinije)
[0080] Procenjena je mogućnost hIL12 i hIL7-koji nose virus vakcinije pripremljenih u primeru 2 da liziraju razne humane kancerske ćelije (mogućnost da ubijaju ćelije). Štaviše, slično je procenjena mogućnost kombinovane mešavine 2 virusa, hIL12-koji nosi virus vakcinije i hIL7-koji nosi virus vakcinije pripremljene u primeru 2, da lizira razne humane kancerske ćelije.
[0081] Konkretno, 100 µL svake od ćelija suspendovanih na 1 × 10<4>ćelija/mL u podlozi (podlozi opisanoj u nastavku koja sadrži 10% fetalni goveđi serum (GE Healthcare) i 1% penicilin-streptomicin (Life Technologies)) je prvo dodato u ploče sa 96 bunarčića (AGC TECHNO GLASS CO., LTD.). Nakon kultivisanja preko noći, 1) hIL12 i hIL7-koji nose virus vakcinije i 2) svaka od mešavina koja kombinuje koncentracije hIL12-koji nosi virus vakcinije i hIL7-koji nosi virus vakcinije u odnosu 1:1 (u daljem tekstu, označen kao "mešavina hIL12-koji nosi virus vakcinije i hIL7-koji nosi virus vakcinije") je razblaženo sa Opti-MEM (Life Technologies) na 5 × 10<4>PFU/mL, 5 × 10<5>PFU/mL, i 5 × 10<6>PFU/mL, tim redom.20 µL svakog od rastvora sa virusom je dodato u svaki bunarčić da bi se inficirale ćelije na MOI = 1,0, 10, ili 100, Kao kontrola, pripremljeni su bunarčići bez ćelija i bunarčići u koje je dodat Opti-MEM umesto virusa (MOI = 0). Ćelije su zatim kultivisane tokom 5 dana u inkubatoru sa koncentracijom
CO2podešenom od 5% i na 37°C. Stopa preživljavanja ćelija 5. dana je izmerena sa CellTitar-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega KK.). Konkretno, prema protokolu kompleta za ispitivanje, 100 µL svakog CellTitar-Glo Reagent je dodato u svaki bunarčić i ostavljeno je da odstoji 30 minuta, zatim je ukupna količina prenesena u crne ploče sa 96 bunarčića (Corning Incorporated), i izmerena je jačina luminiscencije u svakom bunarčiću sa EnSpire (PerkinElmer Inc.). Za izračunavanje stope preživljavanja ćelija u svakom bunarčiću, vrednost bunarčića u kojima nisu posejane ćelije je definisana kao 0% preživljavanja, a vrednost bunarčića u kojima su ćelije posejane a virus nije dodat je definisana kao 100% preživljavanja.
[0082] Procenjene su maligne ćelije melanoma RPMI-7951 (ATCC HTB-66), adenokarcinoma pluća HCC4006 (ATCC CRL-2871), karcinoma pluća A549 (ATCC CCL-185), ćelija mikrocelularnog kancera pluća DMS 53, karcinoma skvamoznih ćelija pluća NCI-H226 (ATCC CRL-5826), ćelija kancera bubrega Caki-1 (ATCC HTB-46), ćelija kancera bešike 647-V (DSMZ ACC 414), ćelija kancera glave i vrata Detroit 562 (ATCC CCL-138), ćelija kancera dojke JIMT-1 (DSMZ ACC 589), ćelija kancera dojke MDA-MB-231 (ATCC HTB-26), ćelija kancera jednjaka OE33 (ECACC 96070808), glioblastoma U-87MG (ECACC 89081402), neuroblastoma GOTO (JCRB JCRB0612), mijeloma RPMI 8226 (ATCC CCL-155), ćelija kancera jajnika SK-OV-3 (ATCC HTB-77), ćelija kancera jajnika OVMANA (JCRB JCRB1045), kancerske ćelije debelog creva RKO (ATCC CRL-2577), kolorektalni karcinom HCT 116, ćelija kancera pankreasa BxPC-3 (ATCC CRL-1687), ćelija kancera prostate LNCaP klon FGC (ATCC CRL-1740), hepatocelularnog karcinoma JHH-4 (JCRB JCRB0435), mezotelioma NCI-H28 (ATCC CRL-5820), ćelija kancera grlića materice SiHa (ATCC HTB-35) i ćelija kancera želuca Kato III (RIKEN BRC RCB2088).
[0083] Podloge koje su korišćene su RPMI1640 podloga (Sigma-Aldrich Co. LLC., R8758) za RPMI-7951, HCC4006, DMS 53, NCI-H226, Caki-1, 647-V, Detroit 562, JIMT-1, OE33, U-87MG, GOTO, RPMI8226, SK-OV-3, OVMANA, RKO, HCT 116, BxPC-3, LNCaP klon FGC, JHH-4, NCI-H28, i Kato III, DMEM podloga (Sigma-Aldrich Co. LLC., D6429) za A549 i MDA-MB-231, i EMEM podloga (ATCC 30-2003) za SiHa.
Rezultati su kao što su ilustrovani na FIG.5-1 do 5-4. U vezi sa ovim, efekti hIL12 i hIL7-koji nose virus vakcinije su ilustrovani odvojeno na FIG.5-1 i 5-2, a efekti mešavine hIL12-koji nosi virus vakcinije i hIL7-koji nosi virus vakcinije su odvojeno ilustrovani na FIG.5-3 i 5-4.
[0084] Kao rezultat, hIL12 i hIL7-koji nosi virus vakcinije je prikazan tako da ima mogućnost da ubija ćelije u svim ispitivanim humanom kancerskim ćelijama (FIGS.5-1 i 5-2). Štaviše, mešavina hIL12-koji nosi virus vakcinije i hIL7-koji nosi virus vakcinije je takođe prikazana tako da ima mogućnost da ubija ćelije u svim ispitanim humanim kancerskim ćelijama (FIG.5-3 i 5-4). Na FIG.5-1 do 5-4, onkolitička svojstva na MOI = 0, 1, 10, i 100 su prikazana s leva po ovom redosledu za svaku ćelijsku liniju.
(Primer 4: Proizvodnja proteina iz kancerskih ćelija inficiranih genetski konstruisanim virusom vakcinije)
[0085] Kada su kancerske ćelije inficirane sa hIL12 i hIL7-koji nosi virus vakcinije, izmerene su koncentracije humanog IL-7 proteina i humanog IL-12 proteina koje proizvode kancerske ćelije. Dalje, slično su izmerene koncentracije humanog IL-7 proteina i humanog IL-12 proteina koje proizvode kancerske ćelije kada su kancerske ćelije inficirane mešavinom hIL12-koji nosi virus vakcinije i hIL7-koji nosi virus vakcinije.
[0086] Merenje humanog IL-7 proteina je izvedeno na sledeći način. Konkretno, prvo, 100 µL od SK-OV-3 kancerskih ćelija jajnika suspendovano na 1 × 10<4>ćelija/mL u RPMI1640 podlozi koja sadrži 10% fetalni goveđi serum i 1% penicilin-streptomicin je posejano u ploče sa 96 bunarčića. Nakon kultivisanja preko noći, 1) hIL12 i hIL7-koji nose virus vakcinije ili 2) mešavina hIL12-koji nosi virus vakcinije i hIL7-koji nosi virus vakcinije je pripremljena u Opti-MEM i po 20 µL je dodato kako bi se inficirale ćelije na MOI = 1,0, Ćelije su zatim kultivisane tokom 24 sata u inkubatoru koncentracije CO2podešene od 5% i na 37°C i supernatant kulture je sakupljen. Koncentracija proteina sadržanih u supernatantu kulture je izmerena ELISA kompletom navedenim u tabeli 1 i EnSpire.
[0087] Merenje humanog IL-12 proteina je izvedeno na sledeći način. Konkretno, prvo, 100 µL SK-OV-3
2
kancerskih ćelija jajnika suspendovano na 1 × 10<5>ćelija/mL u RPMI1640 podlozi koja sadrži 10% fetalni goveđi serum i 1% penicilin-streptomicin je posejano u ploče sa 96 bunarčića. Nakon kultivisanja preko noći, 1) hIL12 i hIL7-koji nose virus vakcinije ili 2) mešavina hIL12-koji nosi virus vakcinije i hIL7-koji nosi virus vakcinije je pripremljena u Opti-MEM i 20 µL je dodato kako bi se inficirale ćelije na MOI = 1,0, Te ćelije su zatim kultivisane tokom 48 sata u inkubatoru sa podešenom koncentracijom CO2od 5% i na 37°C i sakupljen je supernatant kulture. Koncentracija proteina sadržanih u supernatantu kulture je izmerena ELISA kompletom navedenim u tabeli 1 i EnSpire.
[0088] Tabela 1: ELISA komplet koji se upotrebljava u primeru 4.
[Tabela 1]
[0089] Kao rezultat, pokazano je da su humani IL-12 protein i humani IL-7 protein proizvedeni od ćelija kojima se dodaje hIL12 i hIL7-koji nosi virus vakcinije i ćelija kojima se dodaje mešavina hIL12-koji nosi virus vakcinije i hIL7-koji nosi virus vakcinije (Table 2-1 i 2-2).
[0090] Tabela 2-1: Koncentracija humanog IL-12 proteina u supernatantu kulture
[Tabela 2-1]
[0091] Tabela 2-2: Koncentracija humanog IL-7 proteina u supernatantu kulture
[Tabela 2-2]
(Primer 5: Konstrukcija DNK plazmida prenosnog vektora koja nosi polinukleotid koji kodira mišji IL-12 i konstrukcija rekombinantnog virusa vakcinije koji nosi polinukleotid koji kodira mišji IL-12)
[0092]
(1) DNK plazmida prenosnog vektora pTN-VGF-SP-mIL12 je konstruisana prema postupku opisanom u primeru 1 (2). Umesto polinukleotida (SEQ ID NO: 7) koji kodira humani IL-12 u postupku opisanom u primeru 1 (2), polinukleotid koji kodira mišji IL-12 (polinukleotid koji sadrži mišji IL-12 podjedinica p40, interno ribozomalno ulazno mesto, i mišji IL-12 podjedinica α. SEQ ID NO: 23) je korišćen i ovaj fragment polinukleotida je kloniran u pTN-VGF-SP-BFP.
(2) DNK plazmida prenosnog vektora pTN-O1L-SP-Luc2 je konstruisana prema postupku opisanom u primeru 1 (3). Umesto polinukleotida (SEQ ID NO: 9) koji sadrži Escherichia coli LacZ gen u postupku opisanom u primeru 1 (3), polinukleotid (100-1752 pod pristupnim br.DQ188840) koji kodira Luc2 gen luciferaze je korišćen i ovaj fragment polinukleotida je kloniran u pTN-O1L-SP-BFP.
(3) Rekombinantni virus je sakupljen prema postupku u primeru 2 (2). U postupku u primeru 2 (2), korišćeni su LC16mO ΔSCR VGF-p7.5-DsRed/O1L-SP-BFP i pTN-O1L-SP-Luc2 pripremljen u primeru 5 (2) umesto pTN-O1L-SP-LacZ. Taj Virus je nazvan LC16mO ΔSCR VGF-p7.5-DsRed/O1L-SP-Luc2 (u daljem tekstu, ovaj virus je takođe označen i kao "kontrolni virius vakcinije".).
(4) Rekombinantni virus je sakupljen prema postupku u primeru 2 (3). Umesto LC16mO ΔSCR VGF-p7.5-DsRed/O1L-SP-LacZ i pTN-VGF-SP-IL12 u postupku u primeru 2 (3), redom su korišćeni, LC16mO ΔSCR VGF-p7.5-DsRed/O1L-SP-Luc2 pripremljen u primeru 5 (3) i pTN-VGF-SP-mIL12 pripremljen u primeru 5 (1). Virus je nazvan LC16mO ΔSCR VGF-SP-mIL12/O1L-SP-Luc2 (u daljem tekstu, takođe označen kao "mIL12-koji nosi virus vakcinije".).
(5) Rekombinantni virus je sakupljen prema postupku u primeru 2 (4-1). Korišćeni su LC16mO ΔSCR VGF-p7.5-DsRed/O1L-SP-BFP i pTN-VGF-SP-mIL12 pripremljen u primeru 5 (1) umesto pTN-VGF-SP-IL12 u postupku u primeru 2 (4-1). Taj Virus je nazvan LC16mO ΔSCR VGF-SP-mIL12/O1L-SP-BFP.
[0093] Dalje, rekombinantni virus je sakupljen prema postupku u primeru 2 (4-2). Umesto LC16mO ΔSCR VGF-SP-IL12/O1L-SP-BFP u postupku u primeru 2 (4-2), korišćeni su LC16mO ΔSCR VGF-SP-mIL12/O1L-SP-BFP pripremljen kako je prethodno opisano, i pTN-O1L-SP-IL7. Taj Virus je nazvan LC16mO ΔSCR VGF-SP-mIL12/O1L-SP-IL7 (u daljem tekstu, takođe označen kao "mIL12 i hIL7-koji nose virus vakcinije".).
(Primer 6: Antitumorski efekat genetski konstruisanog virusa vakcinije u humanizovanom mišu sa kancerom)
[0094] In vivo antitumorski efekat hIL12 i hIL7-koji nosi virus vakcinije je procenjen upotrebom humanizovanih miševa (miševa kod kojih je imuni sistem zamenjen humanim imunim ćelijama
2
uvođenjem humanih hematopoietičnih matičnih ćelija kod ozbiljno imunodeficijentnog miša) kod kojih su humane kancerske ćelije transplantovane.
[0095] Konkretno, da bi se generisali humanizovani miševi, 3 × 10<4>hematopoietične matične ćelije (Lonza) dobijene iz krvi pupčane vrpce su prvo uvedene ubrizgavanjem u venu repa kod NOG miševa (NOD/Shi-scidIL-2RγKO Jic, ženke, starosti 6 nedelja, CLEA Japan, Inc.) ozračene X-zracima jačine 2,0 greja upotrebom aparata za zračenje X-zracima.13 nedelja nakon uvođenja, 100 µL humanih ćelija kancera pluća NCI-H1373 (ATCC CRL-5866) suspendovanih na 3 × 10<7>ćelija/mL u PBS je transplantovano ubrizgavanjem ćelija supkutano u desni zadnji deo miševa. Prečnik tumora je izmeren kaliperom nakon transplantacije kancerskih ćelija i miševi su podeljeni u grupe tako da srednje zapremine tumora grupa (manja osa mm × manja osa mm × veća osa mm × 0,52) postaju 37 mm<3>do 47 mm<3>. Istog dana, 20 µL hIL12 i hIL7-koji nosi virus vakcinije razblaženo do koncentracije od 1,0 × 10<8>PFU/mL u PBS je ubrizgano u tumor (označen kao "grupa tretirana hIL12 i hIL7-koji nosi VV" u tabeli).20 µL PBS je primenjeno na tumor u grupi, koja je označena kao grupa tretirana nosačem (PBS). Prečnik tumora svakog miša je meren kaliperom svaka 2-4 dana, pri čemu je zapremina tumora računata po gornjoj formuli, a promena procenta (%) zapremine tumora 14. dana nakon davanja virusa je izračunata po sledećoj formuli za svakog pojedinca (n = 7 - 8):
Promena procenta (%) zapremine tumora 14. dana nakon primene virusa = 100 (%) x zapremina tumora (mm<3>) 14. dana nakon primene virusa/zapremina tumora (mm<3>) na dan primene virusa.
[0096] Efekat regresije tumora je određen kao pozitivan kada je srednja promena procenta (%) zapremine tumora 14. dana nakon primene virusa svake grupe manja od 100, a značajna razlika je primećena (značajna razlika je definisana kada je p vrednost < 0,05) između zapremine tumora 14. dana nakon primene virusa i zapremine tumora na dan primene virusa u svakoj grupi kada se ispituje uparenim t-testom.
[0097] U ovom primeru, kontrolni virus vakcinije (2 × 10<6>PFU/pojedinac), hIL12-koji nosi virus vakcinije (2 × 10<6>PFU/pojedinac), ili hIL7-koji nosi virus vakcinije (2 × 10<6>PFU/pojedinac) (označen kao "kontrolna VV tretirana grupa", "hIL12-koji nosi VV tretirana grupa", i "hIL7-koji nosi VV tretirana grupa" u tabeli.) su korišćeni sa istom zapreminom injekcije (20 µL) i istim rastvorom za razblaženje (PBS) kao virus u poređenju sa hIL12 i hIL7-koji nosi virus vakcinije (2 × 10<6>PFU/pojedinac)
[0098] Kao rezultat, grupa tretirana hIL12 i hIL7-koji nosi virus vakcinije je pokazala srednju promenu procenta zapremine tumora 14. dana nakon primene virusa manju od 100%. Dalje, postoji značajna razlika primećena između zapremine tumora 14. dana nakon primene virusa i zapremine tumora na dan primene tumora koja je ispitana uparenim t-testom i samim tim je određeno da je efekat regresije tumora pozitivan (tabela 3). Stoga se za primenu hIL12 i hIL7-koji nosi virus vakcinije pokazalo da ima efekat regresije tumora. Sa druge strane, efekat regresije tumora nije potvrđen u grupi koja je primala ili hIL12-koji nosi virus vakcinije ili hIL7-koji nosi virus vakcinije (tabela 3).
2
[0099] Tabela 3: promena procenta (%) zapremine tumora kod humanizovanog miša koji ima kancer sa hIL12 i hIL7-koji nosi virus vakcinije
[Tabela 3]
(Primer 7: Efekat koji izaziva potpuna remisija genetski konstruisanog virusa vakcinije kod mišjih modela sa singenim kancerom)
(1) Efekat mIL12 i hIL7-koji nose virus vakcinije
[0100] Efekat koji izaziva potpuna remisija mIL12 i hIL7-koji nose virus vakcinije in vivo je procenjen upotrebom miševa kojima je supkutano transplantovana singena mišja kancerska ćelijska linija (miševi koji nose singeni kancer). Budući da je humani IL-12 poznat da nema efekat na mišje imune ćelije, korišćen je genetski konstruisan virus vakcinije koji nosi polinukleotid koji kodira mišji IL-12 umesto polinukleotida koji kodira humani IL-12 (pripremljen u primeru 5).
[0101] Konkretno, 50 µL mišje kancerske ćelije pluća LL/2 (LLC1) (ATCC CRL-1642) (u daljem tekstu označen kao LLC1) pripremljene na 4 × 10<6>ćelija/mL u PBS je prvo supkutano transplantovano u desni bok C57BL/6J miševa (mužjaka, starih 5-7 nedelja, CHARLES RIVER LABORATORIES JAPAN, INC.).
Zapremina tumora je izračunata na isti način kao u primeru 6 i miševi su podeljeni u grupe tako da srednja zapremina tumora svake grupe postaje 50 mm<3>do 60 mm<3>. Sledećeg dana, 30 µL mIL12 i hIL7-
2
koji nose virus vakcinije razblaženo do koncentracije od 6.7 × 10<8>PFU/mL u PBS je intratumorski ubrizgano u 12 miševa (2 × 10<7>PFU, označen kao "mIL12 i grupa tretirana hIL7-koji nosi VV" u tabeli.). Slična intratumorska injekcija virusa je davana 2 dana i 4 dana nakon prvog davanja.30 µL PBS umesto virusa je intratumorski dato u ovoj grupi, koja je označena kao grupa tretirana nosačem (PBS).
[0102] Prečnik tumora je meren kaliperom dva puta nedeljno i izračunata je zapremina tumora.
Odsustvo tumora primećenog palpitacijom 27. dana nakon prve primene virusa je definisano kao potpuna remisija i prebrojani su pojedinci koji su postigli potpunu remisiju. Grupe koje su postigle srednju zapreminu tumora iznad 1,700 mm<3>tokom ispitivanog perioda su eutanazirane sa gledišta životinjske etike. U ovom primeru, kontrolni virus vakcinije, mIL12-koji nosi virus vakcinije, ili hIL7-koji nosi virus vakcinije (svaki 2 × 10<7>PFU/doza, tri doze) (tim redom označen kao "kontrolna grupa tretirana VV", "mIL12-koji nosi Grupu tretiranu VV", i "grupa tretirana hIL7-koji nosi VV" u tabeli.) je korišćen sa istom zapreminom injekcije (30 µL po dozi) i istim rastvorom za razblaženje (PBS) kao virus u poređenju sa mIL12 i hIL7-koji nose virus vakcinije (2 × 10<7>PFU/doza, tri doze).
[0103] Kao rezultat, tri pojedinca su konačno postigla potpunu remisiju u grupama tretiranim mIL12 i hIL7-koji nose virus vakcinije. Sa druge strane, nijedan pojedinac nije postigao potpunu remisiju u grupi koja je primala poredbeni virus (tabela 4-1). Stoga, primena mIL12 i hIL7-koji nose virus vakcinije se pokazala da ima veći efekat koji izaziva potpuna remisija u poređenju sa hIL7-koji nosi virus vakcinije ili mIL12-koji nosi virus vakcinije kod modela miševa sa singenim kancerom.
[0104] Tabela 4-1: Broj mišjih pojedinaca koji su postigli potpunu remisiju primenom mIL12 i hIL7-koji nose virus vakcinije
[Tabela 4-1]
2
(2) mešavina mIL12-koji nosi virus vakcinije i hIL7-koji nosi virus vakcinije
[0105] Efekat koji izaziva potpuna remisija mešavine mIL12-koji nosi virus vakcinije i hIL7-koji nosi virus vakcinije u odnosu 1:1 (u daljem tekstu, označena kao "mešavina mIL12-koji nosi virus vakcinije i hIL7-koji nosi virus vakcinije") in vivo je procenjen upotrebom miševa koji imaju singeni kancer.
[0106] Eksperiment je izveden na isti način kao (1), pod uslovom da je mišja kancerska ćelija pluća LLC1 suspendovana na 8 × 10<6>ćelija/mL transplantovana. Dalje, umesto 30 µL (2 × 10<7>PFU) mIL12 i hIL7-koji nose virus vakcinije razblaženih do koncentracije od 6.7 × 10<8>PFU/mL, 30 µL (svaki 2 × 10<7>PFU/doza, tri doze) mešavine mIL12-koji nosi virus vakcinije i hIL7-koji nosi virus vakcinije (svaki virus je razblažen do 6.7 × 10<8>PFU/mL u PBS) (označen kao " grupa tretirana mešavinom mIL12-koji nosi VV i hIL7-koji nosi VV" u tabeli.) je korišćen. Korišćeno je sedam miševa (n = 7). Kontrolni virus vakcinije (4 × 10<7>PFU/doza, tri doze), mešavina mIL12-koji nosi virus vakcinije i kontrolnog viriusa vakcinije u odnosu 1:1 (svaki 2 × 10<7>PFU/doza, tri doze), ili mešavina hIL7-koji nosi virus vakcinije i kontrolnog virusa vakcinije u odnosu 1:1 (svaki 2 × 10<7>PFU/doza, tri doze) (tim redom, označen kao "kontrolna grupa tretirana VV", " grupa tretirana mešavinom mIL12-koji nosi VV i kontrolnog VV", i " grupa tretirana mešavinom hIL7-koji nosi VV i kontrolnim VV" u tabeli.) je korišćena sa zapreminom injekcije od 30 µL za svaki kao poredbeni virus.
[0107] Kao rezultat, četiri pojedinca u grupi koja su primala mešavinu od mIL12-koji nosi virus vakcinije i hIL7-koji nosi virus vakcinije su postigla potpunu remisiju. Samo jedan pojedinac je postigao potpunu remisiju u grupi koja je primala mešavinu mIL12-koji nosi virus vakcinije i kontrolnog virusa vakcinije, dok nijedan pojedinac nije postigao potpunu remisiju u grupama koje su primale druge poredbene viruse (tabela 4-2). Stoga, mešavina mIL12-koji nosi virus vakcinije i hIL7-koji nosi virus vakcinije se pokazalo da ima veći efekat koji izaziva potpuna remisija u poređenju sa mešavinama koje sadrže ili hIL7-koji nosi virus vakcinije ili mIL12-koji nosi virus vakcinije u mišjem modelu sa singenim kancerom.
[0108] Tabela 4-2: Broj pojedinačnih miševa koji su postigli potpunu remisiju primenom mešavine mIL12-koji nosi virus vakcinije i hIL7-koji nosi virus vakcinije
[Tabela 4-2]
2
(Primer 8: Efekat stečenog imuniteta genetski konstruisanog virusa vakcinije kod singenih mišjih modela sa kancerom (efekat odbacivanja tumora od strane stečenog imuniteta))
(1) mIL12 i hIL7-koji nose virus vakcinije:
[0109] Na miševima koji su postigli potpunu remisiju kao rezultat tretiranja sa mIL12 i hIL7-koji nose virus vakcinije, eksperiment ponovnog uvođenja istih kancerskih ćelija je izveden kako bi se procenio efekat stečenog imuniteta na virus.
[0110] Konkretno, miševi sa LLC1 kancerom su prvo generisani prema primeru 7, a mIL12 i hIL7-koji nose virus vakcinije je primenjen intratumorski kod miševa (pod uslovom da je intratumorska injekcija virusa takođe davana 1. i 3. dana nakon prve primene pored 2. i 4. dana (ukupno 5 puta); označen kao "mIL12 i grupa tretirana hIL7-koji nosi VV" u tabeli.). Potpuna remisija je potvrđena 23. dana nakon poslednje primene virusa. U pojedincima koji još uvek održavaju stanje potpune remisije 51. dana nakon poslednje primene i kod miševa koji odgovaraju po starosti koji nisu inokulisani virusom (kontrolna grupa), 50 µL LLC1 kancerskih ćelija suspendovano na 8 × 10<6>/mL u PBS je supkutano transplantovano. Zapremina tumora je izračunata prema primeru 6 i prebrojan je broj pojedinaca koji su prepoznati da imaju formaciju tumora vizuelnim praćenjem i palpitacijom 14. dana nakon LLC1 transplantacije kako bi se odredio odnos broja pojedinačnih miševa sa nakalemljenim tumorom / broja pojedinačnih miševa kojem su transplantovane kancerske ćelije. U ovom primeru, kontrolna grupa i grupa tretirana virusom su ispitane Fišerovim egzaktnim testom, a efekat stečenog imuniteta je procenjen kao pozitivan kada postoji značajna razlika (manje od 5%).
[0111] Kao rezultat, formiran je supkutani tumor u svim slučajevima od 10 pojedinaca, ukupno 10 pojedinaca u kontrolnoj grupi, ali 6 pojedinaca od ukupno njih 10 u grupi tretiranoj sa mIL12 i hIL7-koji nose virus nije imalo formaciju tumora nakon ponovnog uvođenja LLC1 kancerskih ćelija pronađenih prilikom vizuelnog praćenja i palpitacije (Tabela5-1) (P < 0,05, Fišerov egzaktni test). Samim tim je u ovom primeru potvrđen efekat stečenog imuniteta primene mIL12 i hIL7-koji nose virus vakcinije.
[0112] Tabela 5-1: Rezultat test ponovnog uvođenja leka kod miševa koji su postigli potpunu remisiju [Tabela 5-1]
(2) Mešavina mIL12-koji nosi virus vakcinije i hIL7-koji nosi virus vakcinije:
[0113] Na miševima koji su postigli potpunu remisiju kao rezultat tretiranja mešavinom mIL12-koji nosi virus vakcinije i hIL7-koji nosi virus vakcinije, eksperiment ponovnog uvođenja leka istih kancerskih ćelija je izveden kako bi se procenio efekat stečenog imuniteta na virus.
[0114] Konkretno, eksperiment je izveden na isti način kao u (1). Međutim, umesto miševa koji su postigli potpunu remisiju primenom mIL12 i hIL7-koji nose virus vakcinije, miševi koji su postigli potpunu remisiju primenom mešavine mIL12-koji nosi virus vakcinije i hIL7-koji nosi virus vakcinije prema primeru 7 (2) (1., 3. i 5. dana nakon podele u grupe, ukupno 3 puta) su korišćeni (označeni kao "tretirana grupa mešavine mIL12-koji nosi VV i hIL7-koji nosi VV" u tabeli.). Dalje transplantacija kancerskih ćelija je izvedena 74. dana nakon poslednje primene virusa (određivanje potpune remisije je izvedeno 24. dana nakon poslednje primene).
[0115] Kao rezultat, supkutani tumor je formiran kod svih pojedinaca od ukupno 8 njih u kontrolnoj grupi 14. dana nakon dalje transplantacije kancerskih ćelija, ali osam pojedinaca od ukupno 10 njih u grupi tretiranoj mešavinom mIL12-koji nosi virus vakcinije i hIL7-koji nosi virus vakcinije nije imalo formaciju tumora nakon ponovnog uvođenja LLC1 kancerskih ćelija pronađenih prilikom vizuelnog praćenja i palpitacijom (tabela 5-2) (P < 0,05, Fišerov egzaktni test).
[0116] Stoga, efekat stečenog imuniteta davanja mešavine mIL12-koji nosi virus vakcinije i hIL7-koji nosi virus vakcinije je potvrđen u ovom primeru.
[0117] Tabela 5-2: Rezultat ponovnog uvođenja kancerskih ćelija kod miševa koji su postigli potpunu remisiju
[Tabela 5-2]
1
Industrijska dostupnost
[0118] Virus vakcinije, farmaceutska kompozicija, i kombinovani komplet prema ovom pronalasku su korisni za sprečavanje ili tretiranje raznih kancera.
Slobodan tekst liste sekvenci
[0119] Opis "veštačka sekvenca" je naveden pod numeričkim identifikatorom <223> liste sekvenci.
[0120] Nukleotidne sekvence definisane u SEQ ID NO: 1-6 i 10-15 predstavljaju prajmere.
[0121] Nukleotidne sekvence definisane u SEQ ID NO: 7, 8, i 9 predstavljaju polinukleotid koji sadrži humani IL-12 gen, polinukleotid koji sadrži humani IL-7 gen, i polinukleotid koji sadrži Escherichia coli LacZ gen, tim redom. U SEQ ID NO: 7, nukleotidna sekvenca 14-1000 odgovara regionu koji kodira p40 podjedinicu IL-12, a nukleotidna sekvenca 1606-2367 odgovara regionu koji kodira podjedinicu α IL-12.
[0122] Nukleotidne sekvence definisane u SEQ ID NO: 16 i 17 predstavljaju mesta restrikcionih enzima povezana sa svakim genom koji kodira regione iz SEQ ID NO: 7-9.
[0123] Aminokiselinska sekvenca definisana u SEQ ID NO: 18 predstavlja B5R protein sa delecijom 4SCR domena.
[0124] Nukleotidne sekvence definisane u SEQ ID NO: 19 i 20 predstavljaju sekvence iz sekvenci petlje na oba kraja u LC16mO VGF-SP-LucGFP/O1L-p7.5-DsRed.
[0125] Nukleotidna sekvenca definisana u SEQ ID NO: 21 predstavlja sekvencu izuzev sekvenci petlje na oba kraja u LC16mO VGF-SP-LucGFP/O1L-p7.5-DsRed.
[0126] Nukleotidna sekvenca definisana u SEQ ID NO: 22 predstavlja fragment DNK koji sadrži p7.5k promoter i DsRed fragment.
[0127] Nukleotidna sekvenca definisana u SEQ ID NO: 23 predstavlja polinukleotid koji sadrži mišji IL-12 gen.
2
4
4
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
11
��
�
��
�
�
�
�
�
11
11
11
11
11
11
11
��
��
��
��
��
��
��
�
11
��
�
��
�
�
�
�
�
��
��
��
��
��
��
14
1
11

Claims (21)

Patentni zahtevi
1. Virus vakcinije koji obuhvata sledeće (1) i (2) :
(1) polinukleotid koji kodira interleukin-7 (IL-7); i
(2) polinukleotid koji kodira interleukin-12 (IL-12).
2. Farmaceutska kompozicija koja obuhvata sledeće viruse vakcinije (1) i (2):
(1) virus vakcinije koji obuhvata polinukleotid koji kodira IL-7; i
(2) virus vakcinije koji obuhvata polinukleotid koji kodira IL-12.
3. Kombinovani komplet koji obuhvata sledeće viruse vakcinije (1) i (2):
(1) virus vakcinije koji obuhvata polinukleotid koji kodira IL-7; i
(2) virus vakcinije koji obuhvata polinukleotid koji kodira IL-12.
4. Virus vakcinije prema zahtevu 1, pri čemu je virus vakcinije deficijentan u funkciji faktora rasta virusa vakcinije (VGF) i/ili
pri čemu je virus vakcinije deficijentan u funkciji O1L.
5. Virus vakcinije prema zahtevu 1, pri čemu virus vakcinije ima deleciju u domenima kratkog ponavljanja koncenzusa (SCR) u B5R ekstracelularnom regionu.
6. Virus vakcinije prema zahtevu 1, pri čemu je virus vakcinije deficijentan u funkcijama VGF i O1L i ima deleciju u SCR domenima u B5R ekstracelularnom regionu.
7. Virus vakcinije prema bilo kom od zahteva 1 i 4-6, pri čemu virus vakcinije predstavlja LC16mO soj.
8. Farmaceutska kompozicija koja obuhvata virus vakcinije prema bilo kom od zahteva 1 i 4-7 i farmaceutski prihvatljiv ekscipijens.
9. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 2 ili komplet prema zahtevu 3, pri čemu je virus vakcinije deficijentan u funkciji VGF i/ili
pri čemu je virus vakcinije deficijentan u funkciji O1L.
10. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 2 ili komplet prema zahtevu 3, pri čemu virus vakcinije ima deleciju u SCR domenima u B5R ekstracelularnom regionu.
11. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 2 ili komplet prema zahtevu 3, pri čemu je virus vakcinije deficijentan u funkcijama VGF i O1L i ima deleciju u SCR domenima u B5R ekstracelularnom regionu.
12. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od zahteva 2 i 9-11 ili komplet prema bilo kom od zahteva 3 i 9-11, pri čemu virus vakcinije predstavlja LC16mO soj.
13. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od zahteva 2 i 9-12 ili komplet prema bilo kom od zahteva 3 i 9-12, koja dalje obuhvata farmaceutski prihvatljiv ekscipijens.
14. Farmaceutska kompozicija ili komplet prema bilo kom od zahteva 8-13, za upotrebu u postupku za sprečavanje ili tretiranje kancera.
15. Farmaceutska kompozicija ili komplet za upotrebu prema zahtevu 14, pri čemu kancer predstavlja maligni melanom, adenokarcinom pluća, kancer pluća, mikrocelularni kancer pluća, skvamozni karcinom pluća, kancer bubrega, kancer bešike, kancer glave i vrata, kancer dojke, kancer jednjaka, glioblastom, neuroblastom, mijelom, kancer jajnika, kolorektalni kancer, kancer pankreasa, kancer prostate, hepatocelularni karcinom, mezoteliom, kancer grlića materice ili kancer želuca.
16. Virus vakcinije prema bilo kom od zahteva 1 i 4-7, za upotrebu u postupku za sprečavanje ili tretiranje kancera.
17. Virus vakcinije za upotrebu prema zahtevu 16, pri čemu kancer predstavlja maligni melanom, adenokarcinom pluća, kancer pluća, mikrocelularni kancer pluća, skvamozni karcinom pluća, kancer bubrega, kancer bešike, kancer glave i vrata, kancer dojke, kancer jednjaka, glioblastom, neuroblastom, mijelom, kancer jajnika, kolorektalni kancer, kancer pankreasa, kancer prostate, hepatocelularni karcinom, mezoteliom, kancer grlića materice ili kancer želuca.
18. Virus vakcinije koji obuhvata polinukleotid koji kodira IL-7 i virus vakcinije koji obuhvata polinukleotid koji kodira IL-12 za upotrebu u postupku za sprečavanje ili tretiranje kancera, pri čemu taj postupak obuhvata fazu davanja virusa vakcinije subjektu kome je potrebna prevencija ili tretman za kancer.
1
19. Virus vakcinije za upotrebu prema zahtevu 18, pri čemu kancer predstavlja maligni melanom, adenokarcinom pluća, kancer pluća, mikrocelularni kancer pluća, skvamozni karcinom pluća, kancer bubrega, kancer bešike, kancer glave i vrata, kancer dojke, kancer jednjaka, glioblastom, neuroblastom, mijelom, kancer jajnika, kolorektalni kancer, kancer pankreasa, kancer prostate, hepatocelularni karcinom, mezoteliom, kancer grlića materice ili kancer želuca.
20. Virus vakcinije odabran od sledećih (1) ili (2) :
(1) virus vakcinije koji obuhvata polinukleotid koji kodira IL-7, za upotrebu u postupku za sprečavanje ili tretiranje kancera u kombinaciji sa farmaceutskom kompozicijom koja obuhvata virus vakcinije koji obuhvata polinukleotid koji kodira IL-12; ili
(2) virus vakcinije koji obuhvata polinukleotid koji kodira IL-12, za upotrebu u postupku za sprečavanje ili tretiranje kancera u kombinaciji sa farmaceutskom kompozicijom koja obuhvata virus vakcinije koji obuhvata polinukleotid koji kodira IL-7.
21. Virus vakcinije za upotrebu prema zahtevu 20, pri čemu kancer predstavlja maligni melanom, adenokarcinom pluća, kancer pluća, mikrocelularni kancer pluća, skvamozni karcinom pluća, kancer bubrega, kancer bešike, kancer glave i vrata, kancer dojke, kancer jednjaka, glioblastom, neuroblastom, mijelom, kancer jajnika, kolorektalni kancer, kancer pankreasa, kancer prostate, hepatocelularni karcinom, mezoteliom, kancer grlića materice ili kancer želuca.
1 4
RS20210847A 2016-05-30 2017-05-29 Novi genetski modifikovan virus vakcinije RS62077B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2016107481 2016-05-30
PCT/JP2017/019921 WO2017209053A1 (ja) 2016-05-30 2017-05-29 新規な遺伝子組換えワクシニアウイルス
EP17806608.0A EP3480307B1 (en) 2016-05-30 2017-05-29 New genetically-modified vaccinia virus

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS62077B1 true RS62077B1 (sr) 2021-07-30

Family

ID=60477559

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20210847A RS62077B1 (sr) 2016-05-30 2017-05-29 Novi genetski modifikovan virus vakcinije

Country Status (28)

Country Link
EP (1) EP3480307B1 (sr)
JP (1) JP6794442B2 (sr)
KR (1) KR102357051B1 (sr)
CN (1) CN109477089B (sr)
AR (1) AR108630A1 (sr)
AU (1) AU2017272721B2 (sr)
BR (1) BR112018074881A2 (sr)
CA (1) CA3026025A1 (sr)
CO (1) CO2018013738A2 (sr)
CY (1) CY1124314T1 (sr)
DK (1) DK3480307T3 (sr)
ES (1) ES2882538T3 (sr)
HR (1) HRP20211145T1 (sr)
HU (1) HUE054967T2 (sr)
IL (1) IL263373B2 (sr)
LT (1) LT3480307T (sr)
MX (1) MX382907B (sr)
MY (1) MY191091A (sr)
PH (1) PH12018502548B1 (sr)
PL (1) PL3480307T3 (sr)
PT (1) PT3480307T (sr)
RS (1) RS62077B1 (sr)
RU (1) RU2757933C2 (sr)
SG (1) SG11201810612TA (sr)
SI (1) SI3480307T1 (sr)
TW (1) TWI763673B (sr)
UA (1) UA126380C2 (sr)
WO (1) WO2017209053A1 (sr)

Families Citing this family (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108686202A (zh) * 2017-04-06 2018-10-23 张晋宇 肿瘤免疫疗法
EP3661960A1 (en) 2017-08-04 2020-06-10 Genmab A/S Binding agents binding to pd-l1 and cd137 and use thereof
JP7274138B2 (ja) * 2017-11-30 2023-05-16 アステラス製薬株式会社 Ｓｃｒ欠失ワクシニアウイルス
WO2019134048A1 (en) 2018-01-05 2019-07-11 Bell John C Modified orthopoxvirus vectors
WO2020067085A1 (ja) * 2018-09-26 2020-04-02 アステラス製薬株式会社 腫瘍溶解性ワクシニアウイルスと免疫チェックポイント阻害剤との併用によるがん療法並びにこれに用いるための医薬組成物及び組合せ医薬
CN110205307A (zh) * 2019-01-07 2019-09-06 西安彤盛生物科技有限公司 去除vgf基因的重组天坛株溶瘤痘苗病毒及制备和应用
CN113840914B (zh) * 2019-05-14 2024-11-05 国立大学法人鸟取大学 诱导细胞融合的痘苗病毒及其应用
CN114144196B (zh) * 2019-07-12 2024-03-08 深圳市华药康明生物药业有限责任公司 工程痘苗病毒
WO2021024020A1 (en) 2019-08-06 2021-02-11 Astellas Pharma Inc. Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 and immune checkpoint inhibitors for treatment of cancer
PH12022550240A1 (en) * 2019-08-29 2022-12-19 Astellas Pharma Inc Genetically engineered oncolytic vaccinia viruses and methods of uses thereof
EP4108246A4 (en) * 2020-02-18 2023-11-22 Vacdiagn Biotechnology Co., Ltd. RECOMBINANT VIRAL VECTOR, IMMUNOGENIC COMPOSITION COMPRISING IT AND USES
US20250262293A1 (en) 2020-07-07 2025-08-21 BioNTech SE Therapeutic rna for hpv-positive cancer
WO2022135667A1 (en) 2020-12-21 2022-06-30 BioNTech SE Therapeutic rna for treating cancer
TW202245808A (zh) 2020-12-21 2022-12-01 德商拜恩迪克公司 用於治療癌症之治療性ｒｎａ
WO2022135666A1 (en) 2020-12-21 2022-06-30 BioNTech SE Treatment schedule for cytokine proteins
TW202304506A (zh) 2021-03-25 2023-02-01 日商安斯泰來製藥公司 涉及抗claudin 18.2抗體的組合治療以治療癌症
IL309831A (en) 2021-07-13 2024-02-01 BioNTech SE Multispecific binding agents against CD40 and CD137 in combined cancer therapy
US20250002600A1 (en) 2021-10-06 2025-01-02 Genmab A/S Multispecific binding agents against pd-l1 and cd137 in combination therapy
WO2023057535A1 (en) 2021-10-06 2023-04-13 Genmab A/S Multispecific binding agents against pd-l1 and cd137 in combination with anti pd-1 antibodies for treating cancers
TW202333802A (zh) 2021-10-11 2023-09-01 德商拜恩迪克公司 用於肺癌之治療性rna(二)
WO2023083439A1 (en) 2021-11-09 2023-05-19 BioNTech SE Tlr7 agonist and combinations for cancer treatment
WO2023106839A1 (ko) * 2021-12-07 2023-06-15 재단법인 아산사회복지재단 Il-12를 발현하는 재조합 백시니아 바이러스 및 이의 용도
CN120302979A (zh) 2022-12-01 2025-07-11 生物技术公司 针对CD40和CD137的多特异性抗体与抗PD1 Ab和化学治疗的组合治疗
CN120418289A (zh) 2022-12-14 2025-08-01 安斯泰来制药欧洲有限公司 结合cldn18.2和cd3的双特异性结合剂与免疫检查点抑制剂的联合疗法
EP4674421A1 (en) * 2023-03-01 2026-01-07 Biocomo Incorporation Anticancer agent, pharmaceutical composition for cancer treatment, kit, and activator
EP4688160A1 (en) 2023-04-06 2026-02-11 Genmab A/S Multispecific binding agents against pd-l1 and cd137 for treating cancer
WO2025120867A1 (en) 2023-12-08 2025-06-12 Astellas Pharma Inc. Combination therapy involving bispecific binding agents binding to cldn18.2 and cd3 and anti-vegfr2 antibodies
WO2026033885A1 (en) 2024-08-08 2026-02-12 Astellas Pharma Inc. Combination therapy involving bispecific binding agents binding to cldn18.2 and cd3 and agents stabilizing or increasing expression of cldn18.2
AR134560A1 (es) 2023-12-08 2026-01-28 Astellas Pharma Inc Terapia de combinación que implica agentes de unión biespecíficos que se unen a cldn18.2 y cd3 y agentes que estabilizan o aumentan la expresión de cldn18.2
WO2025120866A1 (en) 2023-12-08 2025-06-12 Astellas Pharma Inc. Combination therapy involving bispecific binding agents binding to cldn18.2 and cd3 and agents stabilizing or increasing expression of cldn18.2
WO2025242827A1 (en) 2024-05-22 2025-11-27 Genmab A/S Bispecific antibody against pd-l1 and cd137 in combination therapy

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6379674B1 (en) * 1997-08-12 2002-04-30 Georgetown University Use of herpes vectors for tumor therapy
DE60033955T2 (de) * 1999-10-18 2007-12-06 St. Vincent's Hospital And Medical Center Of New York Melanoma-impfstoff und seine herstellung und verwendung
ATE545699T1 (de) 2003-06-18 2012-03-15 Genelux Corp Modifizierte, rekombinante vacciniaviren und deren verwendungen
WO2005007824A2 (en) 2003-07-08 2005-01-27 Arizona Board Of Regents Mutants of vaccinia virus as oncolytic agents
EP1518932A1 (en) 2003-09-29 2005-03-30 GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit GmbH Modified vaccinia virus Ankara (MVA) mutant and use thereof
EP2150618B1 (en) * 2007-05-04 2017-10-11 University Health Network Il-12 immunotherapy for cancer
AU2011232435B2 (en) * 2010-03-23 2016-01-28 Intrexon Corporation Vectors conditionally expressing therapeutic proteins, host cells comprising the vectors, and uses thereof
JP5652830B2 (ja) * 2010-04-09 2015-01-14 国立大学法人 東京大学 マイクロｒｎａ制御組換えワクシニアウイルス及びその使用
WO2012151272A2 (en) * 2011-05-02 2012-11-08 Tremrx, Inc. T-cell vaccination with viral vectors via mechanical epidermal disruption
CA2758246C (en) * 2011-11-16 2013-02-12 Westport Power Inc. Method and apparatus for pumping fuel to a fuel injection system
EP3072966B1 (en) * 2013-11-21 2020-01-08 National University Corporation Tottori University Mitogen-activated protein kinase-dependent recombinant vaccinia virus (md-rvv) and use thereof
GB201405834D0 (en) * 2014-04-01 2014-05-14 Univ London Queen Mary Oncolytic virus

Also Published As

Publication number Publication date
MX2018014779A (es) 2019-08-29
RU2018146490A3 (sr) 2020-11-17
PH12018502548B1 (en) 2023-08-30
EP3480307A1 (en) 2019-05-08
CN109477089B (zh) 2022-05-24
PL3480307T3 (pl) 2021-11-08
EP3480307B1 (en) 2021-06-23
HRP20211145T1 (hr) 2021-12-24
HUE054967T2 (hu) 2021-10-28
CA3026025A1 (en) 2017-12-07
KR102357051B1 (ko) 2022-02-03
BR112018074881A2 (pt) 2019-03-26
RU2757933C2 (ru) 2021-10-25
AR108630A1 (es) 2018-09-12
LT3480307T (lt) 2021-09-27
WO2017209053A1 (ja) 2017-12-07
CN109477089A (zh) 2019-03-15
IL263373B1 (en) 2023-06-01
ES2882538T3 (es) 2021-12-02
CY1124314T1 (el) 2022-07-22
KR20190014534A (ko) 2019-02-12
MY191091A (en) 2022-05-30
DK3480307T3 (da) 2021-07-12
JPWO2017209053A1 (ja) 2019-03-28
AU2017272721A1 (en) 2018-12-13
TW201809270A (zh) 2018-03-16
PH12018502548A1 (en) 2019-04-08
TWI763673B (zh) 2022-05-11
UA126380C2 (uk) 2022-09-28
MX382907B (es) 2025-03-13
PT3480307T (pt) 2021-07-26
SG11201810612TA (en) 2018-12-28
EP3480307A4 (en) 2020-01-01
AU2017272721B2 (en) 2023-03-30
CO2018013738A2 (es) 2018-12-28
RU2018146490A (ru) 2020-07-10
IL263373A (en) 2018-12-31
IL263373B2 (en) 2023-10-01
SI3480307T1 (sl) 2021-09-30
JP6794442B2 (ja) 2020-12-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RS62077B1 (sr) Novi genetski modifikovan virus vakcinije
US20200338149A1 (en) Novel genetically engineered vaccinia viruses
CN105765062B (zh) 丝裂原活化蛋白激酶依赖性重组痘苗病毒(md-rvv)及其应用
RS64497B1 (sr) Onkolitički virus vakcinije
US11344589B2 (en) Genetically engineered vaccinia viruses
JP7737141B2 (ja) 細胞融合を誘導するワクシニアウイルス及びその利用
WO2024038175A1 (en) Chimeric poxviruses
US11932879B2 (en) Mumps virus as a potential oncolytic agent
WO2020011754A1 (en) Chimeric vaccinia viruses
JP2025188115A (ja) 新規遺伝子組換えワクシニアウイルス及びその利用
KR102937548B1 (ko) 암 치료를 위한 변형된 b5r 유전자를 갖는 종양용해 백시니아 바이러스
CA2943871A1 (en) Poxviral oncolytic vectors
JP7274138B2 (ja) Ｓｃｒ欠失ワクシニアウイルス
EP4031165A1 (en) Il-36 cytokine expressing oncolytic viruses for treating cancer