RS64497B1 - Onkolitički virus vakcinije - Google Patents

Description

Opis

Oblast pronalaska

[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na terapiju kancera. Pronalazak se posebno odnosi na onkolitički virus vakcinije i virusne vektore za terapiju kancera.

Osnova pronalaska

[0002] Uprkos napretku u minimalno invazivnoj hirurgiji, hiperfrakcionisanoj radioterapiji i novim kombinacijama hemoterapeutskih sredstava, stope preživljavanja pacijenata sa mnogim tipovima solidnih tumora su ostale nepromenjene. Onkolitički virusi su atraktivni terapeutici za lečenje kancera koji su otporni na konvencionalne terapije.

[0003] Onkolitički virusi su virusi koji mogu specifično ciljati i ubiti ćelije kancera. Pored toga, onkolitički virusi takođe mogu da obezbede imunostimulativne signale neophodne za povećanje sopstvenog antikancerogenog odgovora domaćina.

[0004] Virus vakcinije je dvolančani DNK virus sa mnogim karakteristikama koje ga čine atraktivnim kandidatom za onkolitičku terapiju. Pokazuje brzu replikaciju, efikasno širenje na tumore i jaku litičku sposobnost. Pored toga, vakcinija je opširno proučavana i ima dobro definisanu molekularnu biologiju sa velikim kapacitetom kloniranja i nizom komercijalno dostupnih prirodnih i sintetičkih promotora što ga čini idealnim kao vektor za nošenje heterolognih sekvenci nukleinskih kiselina. Vakcinija ima dobro utvrđen bezbednosni profil i tretmani za nekontrolisane infekcije su lako dostupni. Štaviše, hipoksično mikrookruženje koje se obično nalazi u solidnim tumorima štetno je za replikaciju i efikasnost mnogih tipova onkolitičkih virusa, ali ne i za virus vakcinije.

[0005] Objavljeno je nekoliko sojeva onkolitičkih virusa vakcinije, na primer sojevi Western Reserve, Wyeth i Lister. Stvoreni su različiti delecioni mutanti svakog od ovih sojeva. McCart et al (Cancer Res. 2001, 61; 8751-8757) opisuju verziju Western Reserve (WR) soja sa delecijama gena za timidin kinazu (TK) i gena virusnog faktora rasta (VGF). Ovi delecioni mutanti su sposobni za efikasan unakrsni prajming imunog sistema protiv tumorskih antigena. Međutim, studije biodistribucije su pokazale značajne titre virusa u normalnom tkivu jajnika i u manjoj meri u koštanoj srži, povećavajući izglede za neplodnost i mijelosupresiju nakon tretmana virusom vakcinije. Hung et al (Gene Therapy, 2007, 14; 20-29) opisuje soj Lister vakcinije sa deficijencijom TK. Međutim, ovaj soj je takođe pokazao lokalizaciju u normalnom jajniku pored tumora jajnika.

[0006] Insercija heterolognih gena, na primer gena koji kodiraju citokine, u virus može dalje da pokrene imuni odgovor. Međutim, insercija citokina može smanjiti efikasnost virusne replikacije kroz rani virusni klirens. Ovo je zaista primećeno in vivo kod vakcinije naoružane nekim imunomodulatornim genima kao što su IL-2, IL-15, TNF i CD40 ligand.

[0007] U nastavku, Hiley et al. (Gene Therapy, 2010, 17; 281-287) opisuje virus vakcinije Lister soja kao potencijalnog terapeutskog vektora koji cilja hipoksične tumore. Dimier et al. (Journal of Virology. 2011, 85, 10; 5016-5026) opisuje da delecija glavnih neesencijalnih genomskih regiona u soju Lister virusa vakcinije povećava slabljenje bez promene efikasnosti vakcine kod miševa. Bartlett et al. (Journal Of General Virology. 2002, 83, 8; 1965 - 1976) opisuje da je protein N1L virusa vakcinije intracelularni homodimer koji stimuliše virulenciju. Billings et al. (Ann. N.Y. Acad. Sci. 2004, 1030; 297-302) opisuje da nedostatak ekspresije gena N1L dovodi do značajnog smanjenja replikacije virusa vakcinije u mozgu miša. Postigo et al. (Journal of Virology. 2011, 86, 1; 203-213) opisuje da Bcl-2 homolozi kodirani virusom vakcinije ne deluju kao direktni Bak inhibitori. CN 103110939 opisuje sekvencijalnu upotrebu adenovirusa i virusa vakcinije kao vakcine za upotrebu u lečenju kancera. Jahangir et al. (Molecular Therapy. 2014, 22, S1; S248 - S249) opisuje tumor selektivni onkolitički virus vakcinije kome nedostaje N1L gen koji pojačava antitumorski imuni odgovor kada se koristi kao terapeutik protiv kancera.

[0008] Uprkos napretku koji je postignut u oblasti onkolitičkih virusa, nijedan terapeutski proizvod na bazi vakcinije još nije stigao na tržište. Stoga postoji nezadovoljena potreba za efikasnijom onkolitičkom vakcinijom za lečenje kancera.

Suština pronalaska

[0009] U prvom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži virus vakcinije sa deficijencijom TK za upotrebu u lečenju kancera i/ili tumora kod subjekta gde subjekt takođe prima terapiju kancera, pri čemu virus sa nedostatkom TK sadrži inaktivirani N1L gen, pri čemu je N1L gen inaktiviran insercijom sekvence nukleinske kiseline koja kodira heterologni polipeptid, i gde sekvenca nukleinske kiseline sadrži najmanje tri promotora virusa vakcinije, navedeni promotori virusa vakcinije su pozicionirani u istoj orijentaciji koja je suprotna od intaktnog virusa vakcinije ORF L024.

[0010] Heterologni polipeptid može biti citokin.

[0011] Heterologni polipeptid može biti izabran iz grupe koja se sastoji od GM-CSF, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15 i IL-21.

[0012] Terapija kancera može biti hemoterapija, biološka terapija, radioterapija, imunoterapija, hormonska terapija, antivaskularna terapija, krioterapija, terapija toksinima, molekularna terapija kancera, genska terapija i/ili bilo koja njihova kombinacija.

[0013] Genska terapija može biti genska terapija za supresor tumora, genska terapija samoubistva, strategije imunizacije virusnih vektora, anti-angiogena terapija, genska terapija pro-apoptoze ili terapija zamene gena.

[0014] Kancer i/ili tumor mogu biti neresektabilni kancer i/ili tumor pre lečenja.

Detaljan opis pronalaska

[0015] Kao što je ovde opisano, obezbeđena je sekvenca nukleinske kiseline koja sadrži najmanje tri promotora virusa vakcinije, pri čemu su najmanje tri promotora pozicionirana u istoj orijentaciji u sekvenci nukleinske kiseline.

[0016] Linearna DNK ima dve moguće orijentacije - smer od 5' do 3' i smer od 3' do 5'. Na primer, ako je jedan promotor pozicioniran u smeru 5' do 3', i ako je drugi promotor takođe pozicioniran u smeru 5' do 3' unutar istog polinukleotidnog molekula/lanca, tada su dva promotora pozicionirana u istoj orijentaciji.

[0017] Sekvenca nukleinske kiseline može biti prirodna, sintetička ili rekombinantna. To može, na primer, biti cDNK, PCR proizvod ili genomska sekvenca. Može biti izolovana, ili kao deo plazmida, vektora ili ćelije domaćina. Plazmid je kružni ekstrahromozomski molekul DNK sa sposobnošću da se replicira nezavisno od hromozomske DNK.

[0018] Plazmid se može koristiti za uvođenje ekspresione kasete u ćeliju domaćina. Plazmidi se takođe mogu koristiti za ekspresiju polipeptida u ćeliji domaćinu. Na primer, bakterijska ćelija domaćin može biti transfektovana sa plazmidom sposobnim da kodira određeni polipeptid, da bi eksprimirao taj polipeptid. Termin takođe uključuje veštačke hromozome kvasca i veštačke hromozome bakterija koji su sposobni da prime duže delove DNK.

[0019] Promotor je region DNK sa specifičnom sekvencom koja inicira transkripciju određenog gena ili više gena. Promotori koji se koriste za ekspresiju heterolognih gena u vakciniji uključuju promotore koji kontrolišu ranu i kasnu transkripcionu aktivnost, na primer mH5, H5, P7.5 i PE/L. Heterologni gen, kako se ovde koristi, je gen koji se normalno ne nalazi u virusu. Modifikovani promotor H5, mH5, ima pretežno ranu aktivnost i pokazuje veću stabilnost od prirodnog H5. Poželjno, najmanje tri promotora su mH5.

[0020] Kao što je ovde opisano, promotor sadrži nukleotidnu sekvencu koja je suštinski homologna sekvenci datoj na Slici 1. Sekvence nukleinske kiseline sa više od 20% identičnosti (na primer 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ili 99%) se smatraju homolognim sekvencama. Kako se ovde koristi, suštinski homologno se odnosi na sekvence koje pokazuju najmanje 60% ili 70%, poželjno znači najmanje 80%, poželjnije najmanje 90%, a najpoželjnije najmanje 95%, 96%, 97%, 98%, 99 % ili veću identičnost. Kao što je ovde opisano, sekvenca ima najmanje 80% ili više (npr.85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% itd.) homologije sa sekvencom navedenom na Sl.1.

[0021] Kako se ovde koristi, termini homologija i identičnost su zamenljivi.

[0022] Poređenja sekvenci za određivanje homologije mogu se izvesti korišćenjem lako dostupnog softvera za poređenje sekvenci. Primeri uključuju, ali nisu ograničeni na BLAST (videti Ausubel et al., 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed - Chapter 18) i FASTA (Altschul et al., 1990 J. Mol. Biol.403-410). BLAST i FASTA su dostupni za „offline“ i „online“ pretragu (videti Ausubel et al., 1999, Short Protocols in Molecular Biology, pages 7-58 to 7-60).

[0023] Kao što je ovde opisano, sekvenca nukleinske kiseline je prisutna u vektoru. Vektor kako se ovde koristi odnosi se na konstrukt za uvođenje sekvence nukleinske kiseline u ćeliju ili virus za ekspresiju ili replikaciju. Odnosi se na rekombinantni konstrukt, na primer plazmid, virus ili bilo koji drugi konstrukt sposoban za ekspresiju ili replikaciju sekvence nukleinske kiseline nakon uvođenja u ćeliju ili virus.

[0024] Sekvenca nukleinske kiseline kako je ovde opisana može biti deo ekspresione kasete. Ekspresiona kaseta je deo vektora. Ona sadrži promotor, otvoreni okvir čitanja i 3' neprevedeni region.

[0025] Kao što je ovde opisano, vektor virusa vakcinije sadrži nukleotidnu sekvencu koja ima najmanje 80% ili više (npr.85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, itd.) homologije sa sekvencom prikazanom na slici 2.

[0026] Kao što je ovde opisano, sekvenca nukleinske kiseline kodira heterologni polipeptid.

[0027] Polipeptid kako se ovde koristi odnosi se na mnoštvo aminokiselinskih ostataka spojenih zajedno peptidnim vezama. Koristi se naizmenično sa proteinom, peptidom, oligopeptidom i uključuje glikoproteine i njihove derivate. Termin "polipeptid" je takođe namenjen da pokrije analoge i derivate polipeptida koji zadržavaju istu biološku funkciju ili aktivnost kao originalni polipeptid.

[0028] Heterologni polipeptid, kako se ovde koristi, odnosi se na bilo koji polipeptid koji virus normalno ne eksprimira u prirodi. Heterologni polipeptid može biti biološki aktivan. Biološki aktivni polipeptid kako se ovde koristi odnosi se na polipeptid koji ima biološku funkciju ili aktivnost.

[0029] Kao što je ovde opisano, biološki aktivni polipeptid je terapeutski. Terapeutski polipeptid je polipeptid koji je razvijen ili se razvija za terapeutsku upotrebu. Primeri terapeutskog polipeptida uključuju ali nisu ograničeni na citokine, hemokine i faktore rasta.

[0030] Citokin može biti imunomodulatorno sredstvo kao što je interleukin (npr. IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL -10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22 , IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IL-34, IL -35 i IL-36), interferon (INF-α, INF-β, INF-γ i INF-ω), faktor nekroze tumora (TNF) i/ili faktor stimulacije kolonije makrofaga granulocita (GM-CSF).

[0031] Kao što je ovde opisano, polipeptid je interleukin. Kao što je ovde opisano, polipeptid je IL-12. IL-12 se može dobiti od bilo koje životinje, npr. čovek (hIL-12), miš (mlL-12), konj, krava, svinja, itd. Može biti prirodan ili rekombinantan. Poželjno, nukleotidna sekvenca koja kodira IL-12 je IL-12 gen pune dužine. Kao što je ovde opisano, nukleotidna sekvenca kodira 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% ili 99% gen pune dužine. Kao što je ovde opisano, polipeptid je GM-CSF, ili polipeptid može biti IL-21. Sve karakteristike koje se odnose na IL-12 kao što je gore opisano primenjuju se mutatis mutandis na GM-CSF i IL-21.

[0032] Reference na IL-12 ovde uključuju IL-12A (na primer GenBank pristupni broj AF404773.1 GI:15128214) i/ili IL-12B (na primer GenBank pristupni broj AI008847.1 GI:11192034). Zreli protein IL-12 uključuje obe podjedinice. Reference na IL-21 ovde uključuju izoformu 1 (na primer GenBank pristupni broj NP_068575.1 GI:11141875) i/ili izoformu 2 (GenBank pristupni broj NP_001193935.1 GI:333033767). Reference na GM-CSF ovde uključuju pristupni br. AF373868.2 GI:14278709. Generalno, sekvence su humane sekvence.

[0033] Heterologni polipeptid takođe može biti reporterski polipeptid. Reporterski polipeptid, kako se ovde koristi, odnosi se na polipeptid čija ekspresija ukazuje na prisustvo sekvence nukleinske kiseline, ekspresione kasete ili vektora u ćeliji domaćinu ili virusu. Primeri reporterskog polipeptida uključuju, ali nisu ograničeni na fluorescentne polipeptide, hemiluminiscentne polipeptide, bioluminiscentne polipeptide, fosforescentne polipeptide kao i enzime.

[0034] Kao što je ovde opisano, reporterski polipeptid je fluorescentni polipeptid. Fluorescentni polipeptidi uključuju ali nisu ograničeni na zeleni fluorescentni protein, crveni fluorescentni protein, žuti fluorescentni protein, cijan fluorescentni protein i njihove derivate.

[0035] Restrikciona mesta su specifične nukleotidne sekvence koje prepoznaju i cepaju restrikcioni enzimi. Primeri restrikcionih enzima su Sall, Bglll, Hindlll, Smal, BamHI i Mlul. Restrikciono mesto BamHI je restriktivno mesto koje prepoznaje BamHl. Restrikciona mesta za druge enzime imaju sličan naziv.

[0036] Kao što je ovde opisano, sekvenca ili vektor nukleinske kiseline sadrži jedno ili više restrikcionih mesta. Kao što je ovde opisano, je sekvenca nukleinske kiseline ili vektor koji sadrži Sall, Bglll, Hindlll, Smal, BamHI i Mlul restrikciona mesta.

[0037] Kao što je ovde opisano, sekvenca ili vektor nukleinske kiseline su sadržani u virusu vakcinije. Kao što je ovde opisano, sekvenca nukleinske kiseline ima formulu prikazanu na slici 3.

[0038] Vakcinija je razvila brojne strategije za izbegavanje imunološkog sistema domaćina. Na primer, virus luči niz proteina koji inhibiraju citokine i hemokine koji su uključeni u antivirusni odgovor domaćina. Jedan takav protein je proizvod N1 gena, N1L, za koji se veruje da inhibira apoptozu inficiranih ćelija, kao i aktivaciju NF-kB. NF-kB je faktor transkripcije koji kontroliše proizvodnju određenog broja citokina koji učestvuju u uklanjanju virusa. Pokazalo se da delecija N1L gena dovodi do povećanja proinflamatornih antivirusnih citokina kontrolisanih NF-kB kao što su IL1β, TNFα i IFNα/β. Takođe se pokazalo da N1L modulira odgovor ćelije prirodnog ubice (NK). NK ćelije su generalno prva linija odbrane domaćina od virusne infekcije. Pokazalo se da delecija N1L izaziva povećanu lokalnu aktivnost NK ćelija. U skladu sa ovim nalazima, Bartlett et al (J General Virology, 2002, 83:1965-1976) su pokazali da se u poređenju sa VV sojem divljeg tipa, soj vakcinije iz Western Reserve sa delecijom N1L brže uklanja imunološki odgovor domaćina. Kako se ovde koristi, imuni odgovor označava reakciju imunog sistema protiv strane supstance.

[0039] Kao što je ovde opisano, obezbeđen je virus vakcinije koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline ili vektor pri čemu je sekvenca nukleinske kiseline inserirana u gen N1L.

[0040] Insercija sekvence nukleinske kiseline u ciljnu sekvencu može biti olakšana postupcima koji su dobro poznate stručnjaku. Na primer, postupci opisani u Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, by J. Sambrook, E. F. Fritsch and T. Maniatis (2003), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Virology Methods Manual, edited by Brian W J Mahy and Hillar O Kangro (1996) Academic Press and Expression of genes by Vaccinia virus vectors. Current Protocols in Molecular Biology, published by John Wiley and Son (1998), Chapter 16. Kao što je ovde opisano, sekvenca nukleinske kiseline je inserirana u gen N1L homolognom rekombinacijom.

[0041] Kao što je tamo opisano, obezbeđen je virus vakcinije sa deficijencijom TK koji sadrži inaktivirani N1L gen.

[0042] Postoji više sojeva vakcinije sa različitim nivoima virulencije za ljude i životinje. Brojni sojevi virusa korišćeni su širom sveta kao deo programa iskorenjivanja malih boginja 1950-ih. Različiti sojevi su korišćeni u različitim delovima sveta, na primer, soj New York City Board of Health (NYCBOH) i njegov derivat, Wyeth, bili su popularni u Sjedinjenim Državama, dok su sojevi Copenhagen (CPN) i Lister bili dominantni u Evropi. Kao što je ovde opisano, soj vakcinije je Lister.

[0043] Virus vakcinije sa deficijencijom TK, kako se ovde koristi, odnosi se na virus vakcinije koji pokazuje fenotip koji je u skladu sa nedostatkom endogene timidin kinaze (TK). Virus vakcinije sa deficijencijom TK zavisi od timidin kinaze koju proizvodi ćelija domaćin. Timidin kinaza se konstitutivno proizvodi u tumorskim ćelijama, ali ne i u normalnim ćelijama. Virus vakcinije sa deficijencijom TK može selektivno da preživi u tumorskim ćelijama, posebno uz aktivaciju EGFR/Ras/ERK puteva. Ćelija domaćin je svaka ćelija koju virus može da zarazi.

[0044] Kao što je ovde opisano, virus vakcinije sa deficijencijom TK sadrži inaktivirani N1L gen. Inaktivacija kako je ovde opisana odnosi se na utišavanje gena na nivou transkripcije ili posle transkripcije, deleciju gena, mutaciju u genu, poremećaj gena insercijom sekvence nukleinske kiseline ili bilo koji drugi postupak koji čini virus nesposobnim da stvori potpuno funkcionalan genski proizvod. Inaktivacija gena može biti delimična ili potpuna. Kao što je ovde opisano, inaktivacija N1L je insercijom sekvence nukleinske kiseline. Insercija se može olakšati homolognom rekombinacijom.

[0045] Inserirana sekvenca nukleinske kiseline može biti sadržana u vektoru ili ekspresionoj kaseti.

[0046] Kao što je ovde opisano, sekvenca nukleinske kiseline kodira heterologni polipeptid. Heterologni polipeptid može biti biološki aktivan. Kao što je ovde opisano, biološki aktivni polipeptid iz ovog pronalaska je terapeutski.

[0047] Kao što je ovde opisano, sekvenca nukleinske kiseline kodira agens koji indukuje RNAi, RNAi sredstvo, siRNA, shRNA, miRNA, antisens RNK, ribozime, katalitičku DNK i slično. Kao što je ovde opisano, sekvenca nukleinske kiseline kodira senzibilizator radijacije i/ili hemoterapije.

[0048] Kao što je ovde opisano, obezbeđuje kompoziciju koja sadrži virus vakcinije sa deficijencijom TK. Kao što je ovde opisano, kompozicija izborno sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač, razblaživač ili ekscipijens.

[0049] Kompozicija se može prilagoditi za primenu bilo kojim odgovarajućim putem, na primer oralnim (uključujući bukalni ili sublingvalni), topikalnim (uključujući bukalni, sublingvalni ili transdermalni) ili parenteralnim (uključujući subkutani, intramuskularni, intravenski, intraarterijski, intra-tekalni, intrapleuralni, intraoftalmološki, intrakardijalni, intraperitonealni ili intradermalni) put.

[0050] Farmaceutske kompozicije prilagođene za parenteralnu primenu uključuju vodeni i nevodeni sterilni rastvor za injekciju koji može sadržati antioksidante, pufere, bakteriostate i rastvorene supstance koje čine formulaciju suštinski izotoničnom sa krvlju predviđenog primaoca; i vodene i nevodene sterilne suspenzije koje mogu uključivati sredstva za suspendovanje i sredstva za zgušnjavanje.

[0051] Ekscipijensi koji se mogu koristiti za rastvore za injekcije uključuju vodu, alkohole, poliole, glicerin i biljna ulja, na primer. Kompozicije mogu biti predstavljene u kontejnerima sa jediničnim ili višedoznim kontejnerima, na primer u zapečaćenim ampulama i bočicama, i mogu se čuvati u zamrznutom sušenom (liofilizovanom) stanju koje zahteva samo dodavanje sterilne tečnosti koja se nosi, na primer vode za injekcije, odmah pre upotrebe. Rastvori i suspenzije za ekstemporanu injekciju mogu se pripremiti od sterilnih prahova, granula i tableta.

[0052] Farmaceutske kompozicije mogu sadržati konzervanse, solubilizujuća sredstva, stabilizatore, sredstva za vlaženje, emulgatore, zaslađivače, boje, mirise, soli (supstance ovog pronalaska mogu i same biti obezbeđene u obliku farmaceutski prihvatljive soli), pufere, sredstva za oblaganje ili antioksidanse. Oni takođe mogu sadržati terapeutski aktivna sredstva pored supstance iz ovog pronalaska.

[0053] Kao što je ovde opisano, obezbeđuje postupak lečenja kancera koji sadrži primenu na subjekta terapeutski efikasne količine virusa vakcinije sa deficijencijom TK koji sadrži vektor ili sekvencu nukleinske kiseline koja kodira heterologni polipeptid gde navedeni virus dalje sadrži inaktivirani N1L gen.

[0054] Kako se ovde koristi, subjekt se odnosi na životinju, uključujući čoveka. Životinja može uključivati miševe, pacove, živinu kao što su pilići, preživare kao što su krave, koze, jeleni, ovce i druge životinje kao što su svinje, mačke, psi i primati kao što su ljudi, šimpanze, gorile i majmuni.

[0055] Terapeutski efikasna količina je doza dovoljna da izazove onkolizu. Doze za isporuku i primenu mogu se zasnivati na postojećim postojećim protokolima, empirijski utvrđenim, korišćenjem modela bolesti životinja ili izborno u kliničkim ispitivanjima na ljudima. Početne doze za proučavanje mogu se zasnivati na studijama na životinjama koje su ovde izložene, na primer za miša. Doze mogu da variraju i zavise od toga da li je tretman profilaktički ili terapeutski, tipa, početka, progresije, težine, učestalosti, trajanja ili verovatnoće bolesti na koju je lečenje usmereno, željene kliničke krajnje tačke, prethodnih ili istovremenih tretmana, opšteg zdravlja, starosti, pola, rase ili imunološke kompetencije subjekta i drugih faktora koje će kvalifikovani stručnjak razumeti. Količina doze, broj, učestalost ili trajanje mogu biti proporcionalno povećani ili smanjeni, kao što je naznačeno bilo kojim neželjenim efektima, komplikacijama ili drugim faktorima rizika tretmana ili terapije i statusom subjekta. Stručnjak će razumeti faktore koji mogu uticati na dozu i vreme potrebno da se obezbedi količina dovoljna za pružanje terapeutske ili profilaktičke koristi.

[0056] Kao što je ovde opisano, postupak dalje sadrži primenu na subjekta dodatne terapije kancera. Terapija kancera, kako se ovde koristi, odnosi se na lečenje kancera bilo kojim medicinskim ili fizičkim sredstvima. Dodatna terapija kancera može biti hemoterapija, biološka terapija, radioterapija, imunoterapija, hormonska terapija, antivaskularna terapija, krioterapija, terapija toksinima i/ili operacija, uključujući njihove kombinacije.

[0057] Postupci i upotrebe pronalaska kako su ovde otkriveni mogu se praktikovati odmah ili danima, mesecima ili godinama nakon što je identifikovano da subjekt ima bolest ciljanu za lečenje.

[0058] Postupci obuhvataju primenu virusa po različitim rasporedima. Pojedinačna doza virusa može biti primenjena na subjekta ili tumor tokom perioda od 1, 2, 5, 10, 15, 20 ili 24 sata. Virus se može primenjivati tokom 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili više dana ili nedelja. Interval između injekcija može biti 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 dana ili nedelja. Tipično, višestruke doze se primenjuju na isti opšti ciljni region, kao što je blizina tumora ili u slučaju intravenske primene, određena ulazna tačka u krvotok ili limfni sistem subjekta. Vektor virusa vakcinije se može primeniti 2, 3, 4, 5 ili više puta. Vektor virusa vakcinije se može dati pre resekcije tumora u različitim rasporedima i dozama.

[0059] Postupci uključuju primenu virusa u različitim koncentracijama virusa. U određenim aspektima, na subjekta se primenjuje najmanje 5×10<7>, 1×10<8>, 2×10<8>, 5×10<8>, 1×10<9>, 2×10<9>, 5 × 10<9>, 1 × 10<10>, 5 × 10<10>, 1 × 10<11>, 5 × 10<11>, 1 × 10<12>ili više virusnih čestica ili jedinica koje formiraju plak (pfu), uključujući različite vrednosti i opsege između njih. Virusna doza se može primeniti u 0.1 mL, 1 mL, 2 mL, 3 mL, 4 mL, 5 mL, 6 mL, 7 mL, 8 mL, 9 mL, 10 mL ili više, uključujući sve vrednosti i opsege između njih. Doza se može rasporediti tokom vremena ili odvojenom injekcijom.

[0060] Kao što je ovde opisano, subjekat je čovek sa kancerom i/ili tumorom. Kancer može biti gastrointestinalni kancer, kancer respiratornog trakta, kancer genitourinarnog trakta, kancer hematopoeze, sarkom, adenokarcinom, karcinom skvamoznih ćelija ili nemaligni tumor/hiperplazija. Tumor može biti neresektabilan pre lečenja i resektabilan posle tretmana.

Tumor može biti rekurentni, primarni, metastatski i/ili tumor otporan na više lekova. U određenim aspektima tumor se nalazi na ili u pankreasu. U drugim aspektima, tumor može biti neuroendokrini tumor, endokrini tumor, tumor perifernog centralnog nervnog sistema, tumor kancera mozga, tumor glave i vrata, tumor kancera jednjaka, tumor kancera kože, tumor kancera pluća, tumor jetre, tumor timusa, tumor kancera želuca, tumor debelog creva, tumor jajnika, tumor kancera materice, tumor kancera mokraćne bešike, tumor testisa, tumor mokraćne bešike, tumor kancera rektuma, melanom ili tumor kancera dojke.

[0061] Kompozicije i postupci koji su otkriveni mogu se koristiti u različitim tipovima genske terapije, na primer genska terapija za supresor tumora, genska terapija samoubistva, strategije imunizacije virusnih vektora, anti-angiogena terapija, genska terapija pro-apoptoze i terapija zamene gena. "Oncolytic Viruses for Cancer Therapy: Overcoming the Obstacles" (Wong et al. Viruses 2010, 2, 78-106).

[0062] Opisani preparati i postupci mogu se koristiti u kombinaciji sa dodatnim terapeutskim sredstvima ili postupcima u lečenju kancera, na primer hirurgija, hemoterapija, terapija zračenjem, terapija molekularnog kancera ili sledeća genska terapija, koja se može koristiti za primenu gena koji su različiti od ovde opisanih nukleinskih kiselina pronalaska.

Poželjni aspekti drugog i narednih aspekata pronalaska su kao i za prvi aspekt mutatis mutandis

[0063] Ćelijske linije: Sve korišćene ćelijske linije tumora su uskladištene u laboratoriji pronalazača, bilo od ATCC ili Cancer Research UK Cell line Service Unit ili su ljubazno obezbeđene od strane saradnika. Sve humane ćelijske linije kancera su genotipizovane STR testom. Ćelijske linije tumora miševa korišćene u ovoj studiji uključuju: ćelijska linija kolorektalnog kancera CT26 je izvedena iz soja BALB/c, dok CMT93 (kolorektalni), LLC (Lewis-ov kancer pluća) i B16-F10 (metastatski melanom) potiču od C57BL /6 soja. SCC7 je skvamozni karcinom nastao od kancera glave i vrata, od C3H/HeN miševa i ljubazno ga je donirao dr Osam Mazda (Department of Microbiology, Kyoto Prefectural University of Medicine, Japan), MOSEC je ćelijska linija kancera jajnika miša. Panc02 je hemijski indukovana ćelijska linija mišjeg karcinoma pankreasa; DT6606 (karcinom pankreasa) potiče od transgenog miša soja C57BL/6 sa mutacijom u K-Ras uslovljenom pankreasu. Ovo je bio ljubazan poklon profesora Davida Tuveson (CRUK, Cambridge Research Institute, Cambridge, UK). Pored toga, naša grupa je prethodno stabilno transfektovala ćelijsku liniju DT6606 sa plazmidom koji sadrži gen za pileći ovalbumin (DT6606-ova). Konačno, CV1 je „normalna“ ćelijska linija bubrega afričkog zelenog majmuna dobijena od ATCC, VA, SAD i korišćena je kao osnovna ćelijska linija da bi se olakšala masovna proizvodnja virusa, kao i u svim testovima virusne titracije. Ćelijske linije humanog kancera korišćene u ovom pronalasku uključuju: ćelijske linije humanog karcinoma pankreasa SUIT-2, MIAPaCa2, PANC1, PT-45 i Capan-2; ćelijske linije humanog kolorektalnog karcinoma HT29, HCT116 i SW620, adenokarcinoma želuca MKN45 i ćelijske linije humanog karcinoma jajnika A2780.

[0064] Virusi: VVL15 je konstruisan insercijom gena lacZ reportera i gena luciferaze svica u TK region Lister soja virusa vakcinije pod kontrolom sintetičkih ranih/kasnih i p7.5 promotora, respektivno, korišćenjem in vitro tehnike intracelularne rekombinacije prethodno opisane u Timiryasova TM et al. Biotechniques.2001; 31:534, 6, 8-40. VVL15 je deficijentan u TK.

[0065] VRLuc, TK delecija i WRDD, viruse dvostruke delecije (TK i VGF), ljubazno su obezbedili dr Steve Thorne (University of Pittsburgh, USA) i Dr A. McCart (University of Toronto, Canada) respektivno.

[0066] Masovna proizvodnja virusa: Primarna virusna ekspanzija odozgo je brzo dva puta zamrznuta-odmrznuta i razblažena u neophodnu zapreminu od 5% FCS CM potrebnog za inficiranje između 36-40 T175 boca koje sadrže CV1 ćelije (na 80-90% konfluencije).48 sati kasnije, inficirane CV1 ćelije su sakupljene i kroz ponovljene krugove centrifugiranja pri brzini od 2000 rpm tokom 5 minuta (na 4°C), sakupljene u jedan pelet. Pelet je ispran u PBS, ponovo suspendovan u 12 ml 10 mM Tris-HCl (pH 9) pufera i čuvan na -80°C za kasnije prečišćavanje.

[0067] Prečišćavanje virusa: Koncentrovana suspenzija virusnog lizata odozgo je dva puta zamrznuta-odmrznuta i prebačena u homogenizator (Thermofisher) i homogenizovana pomoću 60 poteza. Zatim je podvrgnut ultrazvučnoj obradi 30 sekundi. Nakon centrifugiranja na 2000 rpm na 4°C tokom 5 minuta, supernatant (koji sadrži oslobođene virionske čestice) je sakupljen i razblažen do ukupne zapremine od 30 ml sa 10 mM Tris-HCl pufera. Rastvor je podeljen na četiri alikvote; svaki sloj pažljivo naneti na 17 ml 36% rastvora glukoze u epruvetu za ultracentrifugu Beckman od 36 ml i centrifugirati na 13.500 rpm tokom 80 minuta na 4°C. Dobijeni peleti su ponovo suspendovani do ukupno 16 ml u 10 mM Tris-HCl, ponovo podeljeni na četiri i pažljivo naneti na još četiri gradijenta glukoze, ovog puta stepenovani od 25% tež./m blizu površine do 40% na bazi svake epruvete. Izvršen je drugi krug ultracentrifugiranja. Ovo je bilo neophodno da bi se uklonili dalji ćelijski ostaci čestica, koji bi mogli biti toksični kada se daju intravenski miševima. Konačni peleti su ponovo suspendovani u 1-4 ml virusnog pufera za resuspenziju (PBS; 10% glicerol; 138 mM NaCl; pH 7.4). Uzorak prečišćenog virusa je titriran putem TCID50 testa kao što je opisano u nastavku.

[0068] Replikacija virusa: Ćelije su zasejane na 2 do 4 × 10<5>ćelija po bunarčiću, u zavisnosti od brzine rasta, u tri otvora ploča sa 6 bunarčića u medijumu sa 10% FCS, i inficirana sa 1 PFU/ćeliji virusa vakcinije 16-18 sati kasnije. Uzorci su sakupljeni u tri primerka u intervalima od 24 sata do 72 sata. Replikacija virusa je otkrivena pomoću TCID50 (50% infektivne doze kulture tkiva) kao što je opisano u Wang et al (J Clin Invest, 2009, 119:1604-1615).

[0069] Statistička analiza: Osim ako nije drugačije navedeno, Graphpad Prism 5 je korišćen za uporednu statističku analizu. Dvostruka poređenja uslova su napravljena korišćenjem neparnog studentovog t testa. Za više od jednog stanja ili za dodatnu promenljivu kao što je vreme, izvedena je 1 ili 2-smerna ANOVA. Post hoc testovi (Knewman-Keuls za jednosmernu ANOVA i Bonferroni za 2-smernu ANOVA) upoređivali su specifične parove uslova u okviru eksperimenta. Podaci o preživljavanju su predstavljeni kao Kaplan-Meier dijagram sa analizom log ranga da bi se odredilo da li su razlike između grupa statistički značajne.

[0070] Pronalazak će sada biti dalje opisan putem pozivanja na sledeće Primere koji su prisutni samo u svrhu reference i ne treba ih tumačiti kao ograničavajuće za pronalazak.

[0071] Pozivamo se na određeni broj crteža na kojima:

SLIKA 1 prikazuje sekvencu modifikovanog promotora vakcinije mH5.

SLIKA 2 prikazuje sekvencu ekspresione kasete koja sadrži tri mH5 promotora.

SLIKA 3 prikazuje formulu vektora koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline prema pronalasku. SLIKA 4 prikazuje šematski prikaz VVL15N1L vektora i N1L pShuttle plazmida koji se koristi za kreiranje novih VVL15N1L vektora. Vektori su imenovani kao optuženi. Duga horizontalna traka prikazuje dvolančani DNK genom VV. L024, N1L (L025), L026 i TK se odnose na jedinice transkripcije.

SLIKA 5 prikazuje potvrdu delecije N1L u VVL15N1L vektorima.

SLIKA 6 prikazuje biološku distribuciju vektora VVL15 i VVL15N1L u tumorskom tkivu (Slika 6a) i lokacijama van mesta (Sl.6b i 6c).

SLIKA 7 prikazuje replikaciju VVL15N1L u različitim ćelijskim linijama. Grafikoni sa leve strane predstavljaju krive replikacije VL15 (puna) u poređenju sa VVL15-N1L (isprekidana); dok oni sa desne strane odgovaraju VVL15-RFP (puni) u odnosu na VVL15-N1L (isprekidani). SLIKA 8 prikazuje citotoksičnu potenciju VVL15N1L (šrafirano) u poređenju sa VVL15-RFP (pun) različitim ćelijskim linijama.

SLIKA 9 prikazuje citotoksičnu potenciju VVL15N1L i VVL15N1L naoružanih sa mIL-12 ili mGM-CSF.

SLIKA 10 prikazuje proizvodnju IFN-γ u splenocitima zajedno kultivisanim sa SCC7 ćelijama zaustavljenim u rastu (Sl.10a) i toplotno inaktiviranim VVL15 (Sl.10b) i tretiranim sa VVL15, VVL15N1L ili PBS.

SLIKA 11 prikazuje proizvodnju IFN-γ u splenocitima zajedno kultivisanim sa DT6606-ova ćelijama (Sl. 11a), ovalbumin antigenom (Sl. 11b) i B8R peptidom (Sl. 11c) i tretiranim sa VVL15, VVL15N1L ili PBS.

SLIKA 12 prikazuje proizvodnju IFN-γ u splenocitima zajedno kultivisanim sa LLC ćelijama sa zaustavljenim rastom (Sl. 12a) i B8R peptidom (Sl. 12b) nakon tretmana sa VVL15, VVL15N1L ili PBS.

SLIKA 13 prikazuje efikasnost VL15N1L u modelu kancera pankreasa miša - stopa rasta tumora u DT6606 (Sl.13a) i CMT-93 (Sl.13c) nakon tretmana sa VL15, VVL15N1L ili PBS i stopu preživljavanja u DT6606 i CMT 93 (Sl.13d) modele tumora na boku nakon tretmana sa VVL15, VVL15N1L ili PBS.

SLIKA 14 pokazuje efikasnost VVL15N1L u modelu miša sa ortotopskim kancerom pluća. Slika 14a prikazuje individualne profile težine miševa tretiranih PBS, Sl.14b prikazuje srednju težinu miševa u svakoj grupi kao funkciju vremena, Sl. 14c i 14d, odgovarajuće Kaplan-Meierove krive preživljavanja i dijagrame medijana preživljavanja.

SLIKA 15 prikazuje zapremine tumora u modelu tumora LLC nakon IT primene VVL15RFP, VVL15N1L ili PBS (Sl.15a) i metastaza u svakoj grupi tretmana pri žrtvovanju (Sl.15b). SLIKA 16 prikazuje rast tumora u modelima boka DT6606 nakon tretmana sa VVL15N1L, VVL15N1L-mlL-12, VVL15N1L-mGM-CSF ili PBS (Sl. 16a) i odgovarajućim Kaplan Meir krivama preživljavanja (Sl.16b).

SLIKA 17 prikazuje procenu IL-21 naoružanog VV in vitro.

SLIKA 18 prikazuje anti-tumorsku efikasnost VV-ΔTkΔN1L-mIL-21, VV-ΔTkΔN1L-hIL-21 i kontrolnog virusa VV-ΔTkΔN1L.

SLIKA 19 prikazuje sekvence humanog IL-12A, IL-12B, IL-21 izoforme 1, IL-21 izoforme 2 i GM-CSF.

Primeri

Primer 1: Konstrukcija pUC19-N1L šatl vektora

[0072] Pronalazači su konstruisali pUC19-N1L šatl vektor ilustrovan na Slici 3 koji sadrži specifičnu ekspresionu kasetu okruženu fragmentom koji sadrži L024 kao i 31 bp L025 (leva grana), i fragment koji sadrži 22bp L025 kao i L026 (desna grana). Ekspresiona kaseta ima sledeće karakteristike: (1) postoje tri promotora mH5 virusa vakcinije, a ispod svakog promotora nalazi se mesto restriktivnog enzima za kloniranje za laku inserciju bilo kog gena od interesa; (2) RFP reporter gen pokreće jedan mH5 promotor za pozitivnu selekciju rekombinacionog virusa; (3) Promotor mH5 samo pokreće ekspresiju inseriranog gena s leva na desno. Strategija homologne rekombinacije korišćena u ovom pronalasku je dizajnirana da zameni skoro celu kodirajuću sekvencu L025 (N1L) lokusa. Analiza sekvence na spojevima L024/25 i L025/26 potvrdila je da su ORF ushodno (22bp) i nishodno (31bp) od L025 ostali netaknuti.

[0073] cDNK m-GM-CSF, h-GM-CSF, m-IL12 i h-IL12 je klonirana korišćenjem standardnih tehnika u vektor za ekspresiju pod kontrolom promotora mH5 korišćenjem odgovarajućeg restrikcionog enzima za sintezu pUC19 super šatl vektora.

Primer 2: Konstrukcija VVL15N1L

[0074] Slika 4 prikazuje Lister soj virusa vakcinije i različite konstrukte virusa vakcinije koje su kreirali pronalazači. Svaki pUC19 super-šatl vektor je transfektovan (koristeći protokol zasnovan na Effectene - Qiagen) u CV1 ćelije koje su prethodno inficirane (2 sata ranije) sa VVL15 (0.1 PFU po ćeliji).48 sati kasnije, prisustvo crvene fluorescencije pod fluorescentnim mikroskopom potvrdilo je ekspresiju relevantne kasete, bilo iz citoplazmatičnog plazmida ili iz relativno malog broja virusa u kojima je homologna rekombinacija bila uspešna. Ovi poslednji su izabrani na sledeći način. Ćelije i supernatant su sakupljeni struganjem ćelija sa posude i dva puta zamrzavanjem-odmrzavanjem. 1 µl ovog lizata je upotrebljen da inficira svih 6 bunarčića ploče sa šest bunarčića koja sadrži ćelije CV1 koje su porasle do 80-90% konfluencije. Ovo malo virusno opterećenje bi obezbedilo pojavu dobro odvojenih plakova.

[0075] Posle dodatnih 48 sati, svaki bunarčić je pažljivo pregledan pod fluorescentnim mikroskopom u potrazi za onim plakovima izazvanim virusom koji fluoresciraju crveno. Nakon identifikacije pozitivnih kolonija, njihova lokacija je označena na donjoj površini ploče trajnim markerom sa finim vrhom. Kolonija je pažljivo sakupljena vrhom od 20 µl napunjenim sa 5 ul 5% FCS CM nakon aspiracije medijuma iz bunarčića. Vrh je zatim potopljen u krioepruvetu koja sadrži 250 µl 5% FCS CM. Nakon daljih ciklusa zamrzavanja-odmrzavanja, 5-20 µl ovog rastvora virusa je dodato u svaki bunarčić nove ploče sa 6 bunarčića koja sadrži CV1 ćelije kao i ranije. Ovaj postupak je ponavljan sve dok svaki plak nije fluorescirao crvenom bojom, to jest, sve virusne kolonije nisu bile posledica rekombinantnog virusa. Generalno, bilo je potrebno između 4-8 krugova prečišćavanja plaka da bi se dobila čista serija rekombinantnog virusa. U ovom trenutku, virusni lizat je sakupljen i virusna DNK je ekstrahovana preko sistema zasnovanog na koloni (tj. Blood Mini Kit iz Qiagen). Uzorak supernatanta je takođe testiran na prisustvo relevantnog citokina pomoću ELISA. Čistoća virusa je potvrđena PCR amplifikacijom N1L gena iz ekstrahovane virusne DNK. Njegovo prisustvo bi ukazivalo na kontaminaciju roditeljskim virusom, VVL15.

[0076] Kada su preliminarna istraživanja potvrdila verovatno stvaranje čistog rekombinantnog virusa koji eksprimira relevantni transgen, 50 µl virusnog lizata je dodato u T175 bocu koja sadrži CV1 ćelije, ponovo porasle do 80-90% konfluencije u približno 30 ml 5% FCS CM. Ćelije i medijumi su sakupljeni 48 sati kasnije i čuvani kao "primarna virusna ekspanzija".

Primer 3: Potvrda delecije N1L u rekombinantnim VVL:

[0077] N1L gen je deletiran u svim novim VVL rekombinantima (Sl.5a). Sens i anti-sens N1L genski prajmeri su korišćeni za amplifikaciju putem PCR virusne DNK koja je ekstrahovana iz inficiranih CV1 ćelija. Samo virusi VVL15 sadrže ovaj gen. Očekuje se da će N1L gen koji sadrži segment koji sadrži prajmerski par biti približno 750 bp. Gen A52R je bio prisutan u svim VVL rekombinantima. Sens i anti-sens A52R genski prajmeri su korišćeni za PCR amplifikaciju ovog lokusa iz DNK ekstrahovane iz inficiranih CV1 ćelija. Očekuje se da će segment gena A52R koji obuhvata par prajmera biti približno 880 bp (Sl.5b).

Primer 4: Validacija ekspresije transgena iz rekombinantnih VVL sa delecijom N1L gena:

[0078] Uzorak supernatanta iz finalne runde prečišćavanja plaka svakog rekombinantnog virusa sa transgenom je analiziran korišćenjem relevantnog ELISA kompleta specifičnog za citokine, u skladu sa protokolom proizvođača (ebioscience, Biolegend). Da bi se procenilo da li je svaki transgen citokina eksprimiran relevantnim rekombinantnim virusom nakon infekcije tumorske ćelije, sprovedena je ista eksperimentalna postavka kao što je opisano u prethodnom testu replikacije virusa. 24, 48 i 72 h nakon virusne infekcije, supernatant je sakupljen iz svakog duplikata bunarčića i koncentracija citokina je određena ELISA testom prema uputstvima proizvođača. Kontrolni uzorci su bili supernatanti sakupljeni iz bunarčića zaraženih VVL15-N1L.

Primer 5: Procena virusne biološke distribucije vektora VVL15N1L

[0079] 2×10<6>ćelija CT26 u 100 µl DMEM bez seruma je ubrizgano supkutano u obrijane desne bokove 7-nedeljnih ženki BALB/c miševa. Kada su tumori bili približno 100 mm<3>randomizovani su u dve grupe. IV doza od 1×10<8>PFU ili VVL15 ili VVL15-N1L je ubrizgana preko repne vene. U danima 1, 3, 7 i 10 nakon injekcije virusa, 3 miša iz svake grupe su žrtvovana preko udisanja CO2. Krv je sakupljena srčanom punkcijom u prethodno heparinizovane Ependorfove epruvete od 1.5 ml. Ona zajedno sa prikupljenim tumorom, mozgom, plućima, jetrom, slezinom, bubrezima i jajnicima je odmah zamrznuta na Petrijevoj posudi koja je plutala na prethodno ohlađenom (do -80°C) izopentanu. Kasnije su odmrznuti, izmereni i homogenizovani (ili vorteksovani u slučaju krvi) u DMEM bez seruma. Uzorci su razblaženi sa zapreminom od 5 µl po mg (ili 5 µl po µl krvi). Nakon dodatnog ciklusa zamrzavanja-odmrzavanja, homogenati tkiva su naknadno titrirani za žive virusne PFU pomoću TCID50 testa.

[0080] Eksperiment biološke distribucije je izveden da bi se utvrdilo da li se virus isporučen IV diseminirao na tumor i da bi se odredila replikacija van ciljnog mesta (tj. da bi se odredio stepen selektivnosti tumora, a time i bezbednosti). Model potkožnog CT26 na boku je korišćen za ovaj odeljak kao što je opisano u odeljku Metode. Nakon injekcije u repnu venu, oba virusa mogu se izvući iz tumorskog tkiva do najmanje 10 dana nakon injekcije. Maksimalni titar je između 3 i 7 dana. Neočekivano, izolacija virusa VVL15N1L nije smanjena u tumorskim tkivima u poređenju sa VVL15 (Sl.6a).

[0081] Što se tiče replikacije van ciljnog mesta, sa izuzetkom plućnog tkiva, virus nije pronađen iz bilo kog drugog organa ili krvi u roku od 24 sata nakon injekcije. Posle 24 sata, izolacija virusa VVL15-N1L bila je značajno manja od VVL15 iz tkiva jetre i slezine i potpuno odsutna iz tkiva bubrega. Ni u jednom trenutku u ovom eksperimentu nijedan virus nije pronađen na nivoima koji se mogu detektovati iz mozga, srca, jajnika ili cirkulacije (Sl.6b). Nasuprot tome, virus je opstao u plućima najmanje 3 dana. Čak i u ovom organu, izolacija VVL15-N1L je bila značajno manja u poređenju sa VVL15. Stoga se činilo da novi osnovni lanac VVL15N1L ima još veću selektivnost za tumorsko tkivo nego VL15.

Primer 6: Replikacija VVL15N1L u različitim ćelijskim linijama

[0082] Postoji više mehanizama pomoću kojih tumorska ćelija može biti ubijena virusom vakcinije. To uključuje urođenu odbranu domaćina koja pokreće apoptozu, smrt od virusa posredovanog ćelijskog praska i imunološke odbrambene mehanizme domaćina. Ako je virus prekomerno citotoksičan za ćeliju, možda neće proizvesti dovoljno potomstva da bi se samostalno razmnožavao kroz tumor. Štaviše, može se očekivati da će njegova sposobnost replikacije pozitivno korelirati sa ekspresijom njegovog terapeutskog transgena, jer će biti prisutno više kopija virusa.

[0083] Sve ćelijske linije su bile podložne infekciji sa VVL15 i VVL15N1L. Najpodložnija ćelijska linija tumora bila je SCC7, što je rezultiralo virusnim titrima od preko 1.000 PFU/po ćeliji samo tri dana nakon što je inicijalno inficiran sa 1 PFU/po ćeliji. Ovaj rezultat je u suprotnosti sa onim iz testa ćelijske citotoksičnosti (MTS), u kojem je SCC7 bila najotpornija ćelijska linija. Ćelijska linija najmanje podložna replikaciji bila je CMT93. Virusni titri su se povećali do 3. dana u ćelijskim linijama CMT93 i DT6606. Ovo će verovatno odražavati bolji učinak virusne replikacije u poređenju sa replikacijom neinficiranih ćelija (sa virionima koji efektivno ostaju bez ćelija da bi se inficirali); zajedno sa mogućom virusnom degradacijom iz proteaza oslobođenih iz liziranih ćelija. Statistički značajno slabljenje replikacije VVL15N1L primećeno je samo u CMT-93 (Sl.7).

Primer 7: Citotoksična potencija VVL15N1L

[0084] VVL15-N1L je upoređen sa VVL15-RFP zbog njegove citotoksičnosti u nizu ćelijskih linija kancera miševa in vitro. Ćelije su zasejane u 1 × 10<3>ili 1×10<4>ćelija po bunarčiću, u zavisnosti od brzine rasta, u pločama sa 96 bunarčića, i inficirane virusima 16-18 sati kasnije. Preživljavanje ćelija 6. dana nakon virusne infekcije određeno je MTS testom i EC50 vrednost (virusna doza koja ubija 50% tumorskih ćelija) je izračunata kako je opisano u Wang et al (J Clin Invest, 2009, 119:1604-1615). Svi testovi su obavljeni najmanje tri puta. Na osnovu vrednosti EC50, (tj. PFU koji je potreban da ubije 50% ćelija), nije bilo značajne razlike u citotoksičnosti između dva virusa u CT26 i DT6606 ćelijama. Nasuprot tome, VVL15-N1L je bio značajno potentniji u poređenju sa VL15 u ubijanju ćelija CMT93, LLC i SCC7 (Sl.8).

[0085] Takođe je upoređena citotoksična potencija naoružanog VVL15N1L. EC50 vrednosti su bile značajno veće od VVL15-N1L (tj. bile su manje potentne od VVL15-N1L u ubijanju relevantne ćelijske linije) u svim ćelijskim linijama osim LLC i CMT93. Činilo se da je rekombinant VVL15-N1L-mIL12 potentniji od VVL15-N1L-mGMCSF u svim ćelijskim linijama, što je karakteristika koja je dostigla statistički značaj u ćelijama SCC7 i DT6606 (Sl.

9).

Primer 8: VVL15N1L indukuje viši nivo imunog odgovora domaćina protiv tumorskog antigena

[0086] Korišćena su tri singenička in vivo modela tumora: SCC7 ćelije u C3H/HeN soju miševa; Ćelije DT6606-ova u C57BL/6 soju miševa i ćelije LLC u C57BL/6 soju miševa.

[0087] Modeli potkožnog tumora na boku su uspostavljeni i lečeni jednom dozom virusa ili PBS kao što je navedeno u Tabeli 2. Da bi se obezbedilo blagovremeno stvaranje T ćelija specifičnih za virus i tumor, slezine su sakupljene 14 dana nakon infekcije. Testovi oslobađanja IFN-γ su izvedeni na naknadno generisanim suspenzijama splenocita.

(1) Priprema jednoćelijske suspenzije splenocita iz sakupljenih slezina

[0088] Ustanovljeni su singeni potkožni tumori boka za relevantnu ćelijsku liniju tumora kao što je opisano u nastavku (videti takođe tabelu 2). Kada su tumori bili približno 100 mm<3>u zapremini, miševi su randomizirani u tri grupe.1×10<8>PFU virusa VVL15 ili VVL15-N1L u 50 µl PBS je ubrizgano intratumoralno (IT) korišćenjem insulinskog šprica od 1 ml pričvršćenog na iglu od 29 kalibra. Igla je provučena nekoliko puta u različitim pravcima kroz tumor tokom širenja virusa u cilju široke diseminacije. Trećoj grupi je ubrizgana ekvivalentna zapremina pufera za nosač, tj.50 µl PBS. 14 dana nakon infekcije, životinje su eutanazirane inhalacijom CO2. Slezine su sakupljene u sterilnim uslovima, izgnječene kroz ćelijske cediljke od 70 µm (Becton Dickinson Falcon) korišćenjem ravnog kraja klipa šprica od 2 ml i isprane podlogom za kulturu T ćelija (TCM) (RPMI-1640, 10% FCS, 1 % streptomicina/penicilina, 1% natrijum piruvata) u konične boce od 50 ml. Peletirani splenociti su ponovo suspendovani u 5 ml pufera za lizu RBC (Sigma-Aldrich) nakon centrifugiranja na 1200 rpm i ostavljeni na ledu 5 minuta. Nakon ciklusa ispiranja-centrifugiranja, ponovo su suspendovani sa TCM do konačne koncentracije od 5×10<6>ćelija/ml.

(2) Priprema celih ćelija stimulatora tumora sa zaustavljenim rastom:

[0089] Suspenzija jedne ćelije od 5×10<6>/ ml ćelija stimulatora (tj. relevantne ciljne ili kontrolne tumorske ćelijske linije-SCC7, LLC ili DT6606-ova) u medijumu ćelijske kulture (CM) je pripremljena u konusnoj posudi od 50 ml. U ovu suspenziju je dodat 1 mg/ml rastvor mitomicina C (MMC) (Roche) da bi se postigla konačna koncentracija od 100 µg/ml i inkubiran u vlažnom inkubatoru na 37°C na vazduhu sa 5% CO2za 1 h. Ćelije su zatim isprane dva puta sa 40 ml PBS, ponovo suspendovane u 40 ml CM i inkubirane dok ne budu spremne za zasejavanje (u roku od 30-60 minuta). Stimulatorske ćelije koje su sada zaustavljene u rastu ponovo su suspendovane u TCM da bi se postigla konačna koncentracija od 5×10<5>ćelija/ml.

(3) Test oslobađanja IFN-γ kao surogat markera za aktivaciju T ćelija specifičnu za tumor/antigen:

[0090] Ovaj test se zasniva na oslobađanju IFNγ kada se memorijske T ćelije aktiviraju njihovim srodnim kompleksom epitop-MHC. Pul splenocita treba da sadrži sve tipove ćelija (npr. APC, Th ćelije) neophodne za stimulaciju CD8+ T ćelija. 100 µl svake od suspenzija splenocita iz (1) je zajedno kultivisano sa 100 µl suspenzije ćelija stimulatora ciljanog tumora odozgo u tri primerka bunarčića ploče sa 96 bunarčića sa okruglim dnom (tj.5×10<5>splenocita sa 5×10<4>tumorske ćelije zaustavljene u rastu). Kontrolni bunarčići samo za splenocite sadržali su 5×10<5>splenocita u 200 µl TCM. Tamo gde je prikladno, splenociti su takođe kultivisani sa 100 µl ova-peptida (H-2Kb/SIINFEKL, Proimmune) u TCM (da bi se postigla konačna koncentracija od 5 µg/ml) ili 100 µl TCM koji sadrži 5×10<4>MHC-kompatibilnih, kontrolnih tumorskih ćelija zaustavljenih u rastu (B16-F10 kada je korišćen C56BL/6 model tumora izveden od miša).

[0091] Pored toga, da bi se dokazalo da je virus primenjen i što je važno da je životinja bila sposobna da izazove imuni odgovor per se, splenociti su dodatno kultivisani kao gore sa bilo VVL15 inaktiviranim toplotom (100 PFU po ćeliji, zagrejano na 56°C tokom 2 sata) ili VV B8R peptidom (H-2Kb/ TSYKFESV, Proimmune), snažno antigenskim epitopom virusa vakcine (da bi se postigla konačna koncentracija od 5 µg/ml). Ovaj eksperiment bi takođe poslužio kao pozitivna kontrola za sam test.

[0092] Ploče su inkubirane na 37 °C na vazduhu i 5% CO2tri dana, nakon čega su centrifugirani na 1.200 o/min 5 minuta. Koncentracija IFN-γ u supernatantima uzetim iz svakog od bunarčića je utvrđena korišćenjem mišjeg specifičnog ELISA kompleta IFN-γ (Biolegend). Konačna koncentracija IFN-γ, prosečna u duplikatu udubljenja, određena je nakon oduzimanja odgovarajućih vrednosti dobijenih iz bunarčića koji sadrže samo splenocite.

[0093] SCC model je agresivni model skvamoznog karcinoma glave i vrata miša koji je, kao i njegov pandan kod kancera glave i vrata kod ljudi, slabo imunogen. Kao što je prikazano na Sl.

10a-b, splenociti iz grupe tretirane VVL15-N1L proizveli su značajno više nivoe IFN-γ od grupe VVL15 kao odgovor na ko-kulturu sa SCC7 ćelijama zaustavljenim rastom. Postojao je nizak, ali značajan nivo proizvodnje IFN-γ iz splenocita tretiranih PBS. Ovo je verovatno odražavalo prirodni imuni odgovor domaćina na tumor. Kao što se očekivalo, nije bilo proizvodnje IFN-γ od strane splenocita kao odgovora na ko-kulturu sa toplotno inaktiviranim VVL15 u PBS grupi. Iznenađujuće nije bilo značajne razlike između druge dve grupe u nivoima IFN-γ nakon ko-kulture sa inaktiviranim virusom (Sl.10b). Treba napomenuti da su apsolutni nivoi IFN-γ nakon ko-kulture sa inaktiviranim VVL15 bili niži po veličini u poređenju sa onima nakon ko-kulture sa tumorskim ćelijama sa zaustavljenim rastom. Ovo je verovatno rezultat varijacija u predstavljenim imunogenim tumorima ili virusnim epitopima. U narednim eksperimentima, da bi se obezbedila standardizacija epitopa, korišćen je imunogeni VV B8R epitop umesto inaktiviranog VL15.

[0094] Imunitet domaćina izazvan VV u modelu kancera pankreasa je takođe istražen. Pošto profil antigena povezanog sa tumorom (TAA) ćelijske linije DT6606 nije bio definisan, ćelijska linija DT6606-ova koja je stabilno eksprimirala strani antigen ovalbumin je kreirana kako bi se demonstrirala navodna generacija imunog odgovora specifičnog za antigen (u ovom slučaju anti-ovalbumin odgovor). Ova ćelijska linija je korišćena za kreiranje singenog potkožnog modela na boku kao što je opisano u Tabeli 2.14 dana nakon IT injekcije virusa, grupa tretirana VVL-N1L pokazala je značajno veći IFN-γ odgovor iz sakupljenih splenocita u poređenju sa VVL15 ili grupe za tretman PBS nakon ko-kulture sa ćelijama DT6606-ova zaustavljenim u rastu (Sl.11a). Postojao je relativno visok nivo proizvodnje IFN-γ u grupi koja je primala PBS, što se zaista nije razlikovalo od grupe koja je tretirana VVL15. Ovalbumin je strani antigen, sa sklonošću da stimuliše snažan anti-ova odgovor, tako da ovaj rezultat nije iznenađujući. Grupa za tretman N1L takođe je proizvela najviši nivo IFN-γ kada su splenociti zajedno kultivisani sa antigenom ovalbumina (iako ovo nije dostiglo statistički značaj) (Sl.11b).

[0095] Ponovo, IFN-γ odgovor splenocita između virusnih grupa nije bio statistički različit nakon ko-kulture sa epitopom B8R, iako je veličina odgovora bila skoro 10 puta veća u poređenju sa testovima kokulture tumor/tumorski antigen.

[0096] Strani selekcioni markeri kao što je RFP su verovatno imunogeni i verovatno su mogli da izazovu in vivo rezultate do sada dobijene. Za kontrolu ove mogućnosti, VVL15-RFP je korišćen kao kontrolni virus (umesto VL15) u modelu potkožnog singenog LLC na boku (videti tabelu 2). Eksperimentalna postavka je ponovo bila identična onima u eksperimentima SSCVII i DT6606.

[0097] Prethodni rezultati su ponovljeni u ovom modelu, sa najvećom proizvodnjom IFN-γ demonstriranom od strane splenocita iz grane za tretman VVL15-N1L zajedno sa kultivisanim sa LLC ćelijama sa zaustavljenim rastom (Sl.12a). Ovo je bilo statistički značajno u poređenju sa VVL15-RFP i PBS granama. Nije bilo značajne razlike između grupa za lečenje virusom nakon ko-kulture splenocita sa B8R peptidom (Sl. 12b). Za VVL15-N1L grupu, ko-kultura splenocita sa B16-F10 ćelijama sa zaustavljenim rastom (kao populacija ćelija kontrolnog stimulatora specifične za MHC haplotip) dovela je do nižeg, ali statistički neznačajnog nivoa IFNγ u poređenju sa zajedničkom kulturom sa LLC ćelije zaustavljene u rastu (p=0.0594).

Verovatno je da se određeni broj epitopa tumora deli između ovih i drugih čvrstih tumorskih ćelijskih linija. CTL generisani protiv njih mogli su biti odgovorni za nivoe IFN-γ dobijene u grupi B16-F10.

Primer 9: Efikasnost VVL15N1L u modelu kancera pankreasa

[0098] 5×10<6>CMT93 ćelija ili 3×10<6>DT6606 ćelija je subkutano implantirano u obrijane desne bokove C57BL/6 mužjaka miševa kao što je gore opisano. Kada je zapremina tumora dostigla približno 100 mm<3>, oni su randomizirani u tri grupe i injektirana je doza od 1×10<8>PFU virusa u 50 µl PBS ili 50 µl PBS vehikuluma kontrole pufera prema rasporedu tretmana datim u tabeli 3 (raspored 1 i 2). Zapremine tumora su praćene merenjem kaliperom dva puta nedeljno, a miševi su mereni jednom nedeljno. Rast tumora je praćen dva puta nedeljno i životinje su eutanazirane u skladu sa smernicama Ministarstva unutrašnjih poslova kada se zapremina tumora približila 1000 mm<3>. Došlo je do statistički značajnog smanjenja stope rasta tumora i produženog preživljavanja u korist sredstva VVL15-N1L nakon tretmana DT6606 modela tumora boka (sl. 13a-b), dok u modelu CMT93 nije bilo razlike između stopa rasta tumora nakon IT primene bilo kog virusnog sredstva, iako su oba značajno sporije rasla od PBS grupe (Sl. 13 c-d).

Primer 10: Preživljavanje kod ortotopskog kancera pluća nakon primene VVL15N1L

[0099] Da bi se procenilo da li su virusi bili efikasni kada se primenjuju intravenski, korišćen je ortotopski model kancera pluća.5×10<6>LLC ćelija u 100 µl PBS je ubrizgano u repne vene 7 nedelja starih ženki C57BL/6 miševa.

[0100] CT skeneri pluća bez kontrasta korišćeni su za procenu zapremine pluća pojedinačnih miševa tokom perioda od tri nedelje i svako smanjenje korišćeno za ekstrapolaciju tumorskog opterećenja. U to vreme, određeno početnim prisustvom tumora na CT, primenjene su tri doze IV virusa/PBS kao što je navedeno u Tabeli 3 (raspored 5). Miševi su mereni dva puta nedeljno i žrtvovani su ako su pokazivali znake uznemirenosti ili ako je gubitak težine premašio 20% njihove maksimalne težine.

[0101] Svi miševi su razvili tumore, pri čemu je smrt nastupila između 14 i 21 dana, kada je torakotomija potvrdila ektenzivne tumore pluća. Tumori su u početku bili očigledni na CT između 4 i 7 dana nakon injekcije LLC ćelija, tako da je 5. dan nakon injekcije izabran kao vreme početka terapije.

[0102] Na 21 miša primenjivane su injekcije u repnu venu od 0.5×10<6>LLC ćelija u 100 µl DMEM bez seruma. Oni su nasumično raspoređeni u tri grupe i tretman (videti tabelu 3, raspored 5) je počeo od 5. dana. Svi miševi u grupi tretmana PBS su bili simptomatični 10 dana nakon injekcije LLC ćelija, što je dokazano gubitkom težine i svi su umrli do 21. dana (slika 14). Medijana preživljavanja je produžena za 5 dana sa VVL15 i 6.5 dana sa VVL15-N1L virusnim tretmanima respektivno, u poređenju sa PBS grupom, iako nije bilo statistički značajne razlike u preživljavanju između virusnih grupa.

Primer 11: Metastatska diseminacija u modelu kancera pluća nakon primene VVL15N1L

[0103] LLC je veoma agresivan model tumora sa sklonošću metastazama u pluća nakon potkožnih bočnih injekcija. Zaista je prijavljeno da je hirurška ekscizija subkutano izraslog LLC tumora povećala stopu plućnih metastaza, možda uklanjanjem inhibitora angiogeneze koji luči primarni tumor.

[0104] Da bi se istražilo da li IT injekcija VV rekombinanata može smanjiti ovu stopu metastaza, 1×10<6>LLC ćelija je ubrizgano subkutano u bokove ženki C57BL/6 miševa starih 7 nedelja. Kada su zapremine tumora bile približno 100 mm<3>, oni su randomizovani u tri grupe. Injekcije virusa/PBS su primenjivane IT prema rasporedu tretmana u tabeli 3 (raspored 3). Tumori su praćeni merenjem kaliperom sve dok grupa nije dostigla krajnju tačku u kojoj je bilo potrebno žrtvovanje (približno 17-20 dana nakon implantacije). Sve životinje su eutanazirane u isto vreme, njihova pluća su sakupljena i zabeleženi su svi veliki tumori. Plućni režnjevi su odvojeni, fiksirani u 4% formalinu, ukalupljeni u parafin, obojeni hematoksilinom i eozinom i presečeni kroz najveću dimenziju poprečnog preseka. Za svaki režanj, rezovi su takođe izvedeni iznad i ispod najvećeg poprečnog preseka. Sva tri isečka je pažljivo pregledao patolog koji je bio zaslepljen u pogledu rasporeda lečenja zbog naslaga tumora.

[0105] Nije bilo značajnih razlika između grupa u pogledu zapremine tumora pri žrtvovanju (Sl. 15a). Međutim, procenat miševa sa plućnim metastazama na krajnjoj tački eksperimenta bio je 14, 43 i 57% za grupe N1L, VVL15 i PBS (Sl. 15b). Ove brojke su se statistički razlikovale jedna od druge. Međutim, teško je izvući zaključke sa tako malim brojem miševa po grupi (n=7) i eksperiment bi trebalo ponoviti sa većim uzorcima. Međutim, ovaj rezultat ukazuje na mogućnost da čak i ako VVL15N1L nema uticaja na rast agresivnog primarnog tumora, virusna terapija može minimizirati diseminaciju. Stoga bi se moglo pokazati kao dobra pomoćna terapija.

Primer 12: Efikasnost VV15N1L sa IL-12- i GM-CSF

[0106] Da bi se poboljšala antitumorska efikasnost VVL15N1L, GM-CSF i IL-12 su inserirani u N1L region vektora VVL15N1L. Potentnost svakog od ovih rekombinanata je testirana in vivo na modelu potkožnog singenog DT6606 na boku (videti tabelu 3, raspored 1). Kada je zapremina tumora dostigla u proseku 100 mm3, dnevne doze (ukupno 5) od 1x108 PFU virusa (VVL15-N1L, VVL15-N1L-mGMCSF ili VVL15-N1L-mIL12) ili ekvivalentne zapremine kontrole pufera nosača (50 ul PBS-a) su ubrizgani IT (n=7 po grupi). Rast tumora je praćen merenjem kaliperom dva puta nedeljno (Sl. 16a). Odgovarajuće Kaplan Meir krive preživljavanja (Sl. 16b) zasnovane su na potrebi za humanim žrtvovanjem životinja kada zapremine tumora prelaze 1000 mm3. Slike 16 a-b pokazuju da sam virus sa transgenom GMCSF nije bio značajno bolji od VVL15-N1L, međutim virus sa IL12 pokazao je značajnu potenciju, što je dovelo do izlečenja kod 6/7 miševa i 100% preživljavanja na kraju eksperimenta. Ovi naoružani virusi će biti testirani na drugim modelima kako bi se utvrdila univerzalnost ovog rezultata.

Primeri 13 i 14: IL-21 konstrukti

[0107] Materijali i metode:

Model kancera mišjeg pankreasa: DT6606 subkutani singeni tumori su ustanovljeni kod mužjaka C57BL/6 miševa. Kada su tumori dostigli 5-6 mm u prečniku, PBS, VV-ΔTkΔN1L-mIL-21, VV-ΔTkΔN1L-hIL-21 ili kontrolni virus VV-ΔTkΔN1L je primenjivan intra-tumorski (5×10<7>pfu/injekciji) 1., 3., 7., 9. i 11. dana. Rast tumora je meren dva puta nedeljno i praćeno je preživljavanje životinja. Podaci o preživljavanju su upoređeni pomoću Prism<®>(GraphPad Software, Kalifornija, SAD) i test log ranga (Mantel Cox) korišćen je za određivanje značajnosti razlika u preživljavanju. Značajnost je određena korišćenjem neparnog studentovog T testa (*p<0.05; **p>0.01; ***p<0.001).

[0108] Modeli kancera sirijskog hrčka: Sirijski hrčci koji nose HPD-1NR tumore - 1×10<6>HPD-1 NR ćelija je zasejano subkutanom injekcijom u desni bok sirijskih hrčaka koji nose HPD-1NR tumore. Kada su tumori dostigli 313 mm<3>, PBS, VV-ΔTkΔN1L-mIL-21, VV-ΔTkΔN1L-hIL-21 ili kontrolni virus VV-ΔTkΔN1L je primenjivan intratumorski (5×10<7>pfu/injekciji) 1., 3., 7., 9. i 11. dana. Tumori su mereni dva puta nedeljno i praćeno je preživljavanje životinja. Podaci o preživljavanju su upoređeni pomoću Prism<®>(GraphPad Software, Kalifornija, SAD) i test log ranga (Mantel Cox) korišćen je za određivanje značajnosti razlika u preživljavanju. Značajnost je određena korišćenjem neparnog studentovog T testa (*p<0.05; **p>0.01; ***p<0.001). Model diseminovanog kancera pankreasa u peritonealnoj šupljini sirijskog hrčka - 1×10<7>SHPC6 ćelija je zasejano u donju desnu peritonealnu šupljinu sirijskih hrčaka. Četiri dana kasnije, po 10 hrčaka po grupi je ubrizgano intraperitonealno (IP) sa 500 µl PBS, 2×10<7>PFU različitih VV na dan 4, 6 i 8. Praćene su stope preživljavanja hrčaka. Podaci o preživljavanju su upoređeni pomoću Prism<®>(GraphPad Software, Kalifornija, SAD) i test log ranga (Mantel Cox) korišćen je za određivanje značajnosti razlika u preživljavanju (* p<0.05, ** p<0.01, ***p<0.001).

Primer 13: Generisanje IL-21 naoružanog sa VV i procena antitumorske potencije in vitro

[0109] Humane i mišje IL-21 cDNK sekvence su inserirane u puc19N1L šatl vektor (kao što je prikazan na Sl. 3). Standardne homologne rekombinacije su sprovedene u TK-deletiranom osnovnom lancu virusa vakcinije Lister soja (VVL15) ko-transfekcijom rezultujućeg plazmida pShuttleN1L-mIL-21, ili pShuttleN1L-hIL-21 u CV-1 ćelije (bubreg afričkog zelenog majmuna) koje su pre-inficirane sa VVL15 na 0.05 PFU/ćeliji. Transficirani CV-1 ćelijski lizati su podvrgnuti testu plaka. Izvedeno je pet krugova prečišćavanja plaka da bi se propagirao jedan klonalni virus i modifikacija je ponovo potvrđena PCR-om za deleciju N1Lgena. Dobijeni virusi se nazivaju VV-ΔTkΔN1L-mIL-21 i VV-ΔTkΔN1L-hIL-21. Da bi se testirala potencija ovih virusa, korišćen je test ćelijske smrti (MTS test) za otkrivanje citotoksičnosti tri virusa vakcinije u ćelijskoj liniji kancera pankreasa kod miša (DT6606), koja je izvedena iz modela mutantnog Ras-p53 transgenog kancera pankreasa.

[0110] Slika 17 prikazuje procenu IL-21 naoružane VV in vitro. Sl. 17 A i B prikazuju citotoksičnost različitih onkolitičkih virusa vakcinije u ćelijskoj liniji kancera pankreasa miša. Kulture ćelijske linije mišjeg kancera pankreasa DT6606 izvedene iz miševa sa Ras-p53 transgenim kancerom pankreasa su inficirane različitim virusima, a ubijanje ćelija otkriveno je MTS testom šest dana nakon virusne infekcije. Kriva ćelijske smrti izazvane virusom je prikazana na Sl. 17 A; izračunate su vrednosti EC50 (virusna doza za ubijanje 50% ćelija kancera) (Sl. 17B). Veća vrednost EC50 znači da virus ima manju potenciju. Sl. 17 C & D prikazuju detekciju ekspresije IL-21 i virusne replikacije različitih mutanata nove generacije virusa vakcinije u ćelijama kancera pankreasa in vitro. Kulture ćelijske linije mišjeg kancera pankreasa DT6606 izvedene iz miševa sa Ras-p53 transgenim kancerom pankreasa su inficirane različitim virusima, a ekspresija IL-21 je otkrivena ELISA testom 24 sata nakon virusne infekcije (Sl. 17C). Replikacija virusa je otkrivena TCID50 testom prikazanim na Slici 17D. Eksperimenti su izvedeni u tri ponavljanja.

[0111] Kao što je prikazano na Sl.17A i B, nova generacija onkolitičkog virusa vakcinije (VV-ΔTkΔN1L) je i dalje veoma efikasna u ubijanju ćelija kancera; naoružavanje virusa citokinom IL-21 nije oslabilo virus, već je povećalo citotoksičnost protiv ćelija kancera pomoću (još uvek) nepoznatog mehanizma (p<0.01).

[0112] Da bi se proverilo da li terapeutski gen IL-21 može da se eksprimira u ćelijama kancera zaraženim virusom i na kom nivou, ELISA je korišćena za detekciju ekspresije IL-21 proteina iz VV-ΔTkΔN1L-mIL-21, VV-ΔTkΔN1L-hIL-21 i kontrolnim virusom VV-ΔTkΔN1L-inficiranih ćelija kancera pankreasa (DT6606). Kao što je prikazano na slici 17C, IL-21 je eksprimiran na veoma visokom nivou u ćelijama nakon infekcije VV-ΔTkΔN1L-mIL-21, VV-ΔTkΔN1L-hlL-21, ali kontrolni virus VV-ΔTkΔN1L nije proizveo bilo kakav IL-21 protein. Replikacija naoružanog virusa IL-21 nije oslabljena u poređenju sa virusom osnovnog lanca (Sl. 17D).

Primer 14: Antitumorska efikasnost IL-21 naoružanog VV15N1L

[0113] Da bi se testiralo da li IL21 može da poboljša antitumorsku efikasnost VV-ΔTkΔN1L, potencija svakog od ovih virusa (mišji IL21 ili humani IL21) je testirana in vivo u odnosu na model potkožnog singeničnog DT6606 na boku.

[0114] Slika 18 prikazuje anti-tumorska efikasnost VV-ΔTkΔN1L-mIL-21, VV-ΔTkΔN1L-hlL-21 i kontrolnog virusa VV-ΔTkΔN1L. Model kancera pankreasa kod miševa - Prikazana je kriva rasta tumora (Sl.18A) i preživljavanje (Sl.18B) miševa tretiranih različitim sredstvima (n=7/grupi). Sirijski hrčci koji nose HPD-1NR tumore - Prikazana je kriva rasta tumora (Sl.

18C) i preživljavanje (Sl.18D) miševa tretiranih različitim sredstvima (n=7/grupi). U svakom slučaju, srednja veličina tumora ± SEM je prikazana do smrti prvog hrčka u svakoj grupi i upoređena jednosmernom ANOVA-om sa post-hoc Bonferroni testom. (Sl. 18E) prikazuje antitumorsku efikasnost virusnih sojeva u modelu diseminovanog kancera pankreasa u peritonealnoj šupljini sirijskog hrčka.

[0115] Virus sa IL21 pokazao je značajnu potenciju, usporio rast tumora (Sl. 18A) i izrazito produženo preživljavanje (Sl.18B) miševa koji su nosili kancer pankreasa. S obzirom na to da humani citokini mogu bolje funkcionisati kod sirijskog hrčka nego kod miša, korišćen je model potkožnog kancera pankreasa sirijskog hrčka za procenu antitumorske efikasnosti virusa sa IL21. Zapanjujuće je da je virus sa IL21 pokazao značajnu potenciju, što je dovelo do izlečenja kod 6 od 7 životinja i 86% preživljavanja na kraju eksperimenta (Sl. 18C i D). Na osnovu antitumorske efikasnosti u subkutanom modelu, VV sa IL12 ili IL21 pokazuju obećavajuću efikasnost u poređenju sa kontrolnim virusom.

[0116] Glavna prepreka za poboljšanje preživljavanja pacijenata sa kancerom pankreasa je nedostatak efikasnog terapeutskog sredstva za uznapredovali kancer pankreasa. U tom cilju, dobro okarakterisan model peritonealno diseminovanog kancera pankreasa sirijskog hrčka je korišćen za procenu izvodljivosti, efikasnosti i bezbednosti W sa IL12 i IL21. VVLΔTKΔN1L sa IL-12 pokazao je indukovanu tešku toksičnost nakon sistemske isporuke (Sl. 18E). Zapanjujuće je da VVLΔTKΔN1L-IL21 ima najveći terapeutski indeks za lečenje peritonealno diseminovanog kancera pankreasa, 70% sirijskih hrčaka je izlečeno.

Claims (6)

Patentni zahtevi

1. Kompozicija koja sadrži virus vakcinije sa deficijencijom TK za upotrebu u lečenju kancera i/ili tumora kod subjekta pri čemu subjekt takođe prima terapiju kancera, pri čemu virus sa deficijencijom TK sadrži inaktivirani N1L gen, pri čemu je N1L gen inaktiviran insercijom sekvence nukleinske kiseline koja kodira heterologni polipeptid, i pri čemu sekvenca nukleinske kiseline sadrži najmanje tri promotora virusa vakcinije, pri čemu su navedeni promotori virusa vakcinije pozicionirani u istoj orijentaciji koja je suprotna onoj kod intaktnog virusa vakcinije ORF L024.

2. Kompozicija za upotrebu prema zahtevu 1, naznačena time što heterologni polipeptid je citokin.

3. Kompozicija za upotrebu prema zahtevu 1 ili zahtevu 2, naznačena time što je heterologni polipeptid izabran iz grupe koja se sastoji od GM-CSF, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15 i IL-21.

4. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 3, naznačena time što terapija kancera je hemoterapija, biološka terapija, radioterapija, imunoterapija, hormonska terapija, antivaskularna terapija, krioterapija, terapija toksinima, molekularna terapija kancera, genska terapija i/ili bilo koja njihova kombinacija.

5. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 4, naznačena time što genska terapija je genska terapija supresora tumora, genska terapija samoubistva, strategije imunizacije virusnih vektora, anti-angiogena terapija, genska terapija pro-apoptoze ili terapija zamene gena.

6. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 5, naznačena time što kancer i/ili tumor je neresektabilni kancer i/ili tumor pre tretmana.