RS62085B1

RS62085B1 - Sastav koji sadrži antitelo koje se vezuje za domen ii her2 i njegove kiselinske varijante

Info

Publication number: RS62085B1
Application number: RS20210882A
Authority: RS
Inventors: Reed J Harris; Paul A Motchnik
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 2008-01-30
Filing date: 2009-01-28
Publication date: 2021-08-31
Also published as: SG190607A1; AR116860A2; HRP20180666T1; US11414498B2; PE20140579A1; RU2543664C2; US12110341B2; JP2011511780A; US11597776B2; HUE037471T2; ECSP10010433A; CO6231039A2; CR20150625A; IL206931A0; PE20190906A1; KR101223941B1; RU2015101975A; EP3401335A1; EP4119583A1; CN101981056B

Description

Opis

Oblast pronalaska

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na sastav koji sadrži glavnu vrstu HER2 antitela koja se vezuje za domen II HER2 i njegove kiselinske varijante. Pronalazak se takođe odnosi na farmaceutske formulacije koje sadrže sastav i terapeutske primene sastava.

Pozadina pronalaska

HER2 antitela

[0002] HER familija receptora tirozin kinaza je važan posrednik rasta ćelija, diferencijacije i preživljavanja. Familija receptora sadrži četiri različita člana uključujući receptor epidermalnog faktora rasta (EGFR, ErbB1, ili HER1), HER2 (ErbB2 ili p185<neu>), HER3 (ErbB3) i HER4 (ErbB4 ili tyro2).

[0003] EGFR, kodiran genom erbB1, je uzročno uključen u malignitet ljudi. Konkretno, povećana ekspresija EGFR je primećena kod kancera dojke, bešike, pluća, glave, vrata i kancera stomaka kao i glioblastoma. Povećana ekspresija EGFR receptora često je povezana sa povećanom produkcijom EGFR liganda, transformišući faktor rasta alfa (TGF-α), od strane istih tumorskih ćelija što dovodi do aktivacije receptora putem autokrinog stimulativnog puta. Baselga and Mendelsohn Pharmac. Ther. 64:127-154 (1994). Monoklonalna antitela usmerena na EGFR ili njegove ligande, TGF-α i EGF, procenjena su kao terapijska sredstva u lečenju takvih maligniteta. Videti, npr. Baselga and Mendelsohn., supra; Masui i dr. Cancer Research 44:1002-1007 (1984); i Wu i dr. J. Clin. Invest.95:1897-1905 (1995).

[0004] Drugi član familije HER, p185<neu>, prvobitno je identifikovan kao proizvod transformacionog gena kod neuroblastoma hemijski tretiranih pacova. Aktivirani oblik novog protoonkogena rezultat je tačkaste mutacije (valine do glutaminske kiseline) u transmembranskom regionu kodiranog proteina. Amplifikacija humanog homologa neu je primećena kod karcinoma dojke i jajnika i povezana je sa lošom prognozom (Slamon i dr., Science, 235:177-182 (1987); Slamon i dr., Science, 244:707-712 (1989); i patent SAD br.

4,968,603). Do danas nije prijavljena nijedna tačkasta mutacija analogna onoj kod neu protoonkogena za ljudske tumore. Prekomerna ekspresija HER2 (česta ali nejednaka zbog amplifikacije gena) takođe je primećena kod drugih karcinoma uključujući karcinom želuca, endometrijuma, pljuvačne žlezde, pluća, bubrega, debelog creva, štitaste žlezde, pankreasa i bešike. Vidite, između ostalog, King i dr., Science, 229:974 (1985); Yokota i dr., Lancet: 1:765-767 (1986); Fukushige i dr., Mol Cell Biol., 6:955-958 (1986); Guerin i dr., Oncogene Res., 3:21-31 (1988); Cohen i dr., Oncogene, 4:81-88 (1989); Yonemura i dr., Cancer Res., 51:1034 (1991); Borst i dr., Gynecol. Oncol., 38:364 (1990); Weiner i dr., Cancer Res., 50:421-425 (1990); Kern i dr., Cancer Res., 50:5184 (1990); Park i dr., Cancer Res., 49:6605 (1989); Zhau i dr., Mol. Carcinog., 3:254-257 (1990); Aasland i dr. Br. J. Cancer 57:358-363 (1988); Williams i dr. Pathobiology 59:46-52 (1991); i McCann i dr., Cancer, 65:88-92 (1990). HER2 može biti prekomerno eksprimiran kod kancera prostate (Gu i dr. Cancer Lett.99:185-9 (1996); Ross i dr. Hum. Pathol.28:827-33 (1997); Ross i dr. Cancer 79:2162-70 (1997); i Sadasivan i dr. J. Urol.150:126-31 (1993)).

[0005] Opisana su antitela usmerena protiv p185<neu>i ljudskih proteinskih proizvoda HER2. Drebin i njegove kolege uzgojili antitela protiv proizvoda neu gena pacova, p185<neu>Videti, na primer, Drebin i dr., Cell 41:695-706 (1985); Myers i dr., Meth. Enzym. 198:277-290 (1991); i WO94/22478. Drebin i dr. Oncogene 2:273-277 (1988) izveštava da smeše antitela reaktivnih sa dva različita regiona p185<neu>rezultuju sinergijskim anti-tumorskim efektima na neu-transformisane NIH-3T3 ćelije implantirane u gole miševe. Videti takođe patent SAD 5,824,311 izdat 20. oktobra 1998. godine.

[0006] Hudziak i dr., Mol. Cell. Biol. 9(3):1165-1172 (1989) opisuju generisanje panela HER2 antitela koja se karakterišu korišćenjem ćelijske linije ljudskog tumora dojke SK-BR-3. Relativna ćelijska proliferacija SK-BR-3 ćelija nakon izlaganja antitelima određena je kristalno ljubičastim bojenjem mono-slojeva nakon 72 sata. Koristeći ovaj test, maksimalna inhibicija je dobijena sa antitelom zvanim 4D5 koje je inhibiralo proliferaciju ćelija za 56%. Druga antitela u panelu su smanjila ćelijsku proliferaciju u manjoj meri u ovom testu. Dalje je pronađeno da antitelo 4D5 senzitizira HER2 prekomernu ekspresiju ćelijske linije tumora dojke do citotoksičnih efekata TNF-α. Videti takođe patent SAD br.5,677,171 izdat 14. oktobra, 1997. HER2 antitela o kojima se govori u Hudziak i dr. su dalje okarakterisana u Fendly i dr. Cancer Research 50:15501558 (1990); Kotts i dr. In Vitro 26(3):59A (1990); Sarup i dr. Growth Regulation 1:72-82 (1991); Shepard i dr. J. Clin. Immunol. 11(3):117-127 (1991); Kumar i dr. Mol. Cell. Biol. 11(2):979-986 (1991); Lewis i dr. Cancer Immunol. Immunother. 37:255-263 (1993); Pietras i dr. Oncogene 9:1829-1838 (1994); Vitetta i dr. Cancer Research 54:5301-5309 (1994); Sliwkowski i dr. J. Biol. Chem.269(20):14661-14665 (1994); Scott i dr. J. Biol. Chem. 266:14300-5 (1991); D'souza i dr. Proc. Natl. Acad. Sci.91:7202-7206 (1994); Lewis i dr. Cancer Research 56:1457-1465 (1996); i Schaefer i dr. Oncogene 15:1385-1394 (1997).

[0007] Rekombinantna humanizovana verzija mišjeg HER2 antitela 4D5 (huMAb4D5-8, rhuMAb HER2, Trastuzumab ili HERCEPTIN®; patent SAD br. 5,821,337) je klinički aktivna kod pacijenata sa HER2 prekomernom ekspresijom metastatskih karcinoma dojke koji su dobili široku ranu terapiju protiv karcinoma (Baselga i dr., J. Clin., Oncol 14:737-744 (1996)). Trastuzumab je 25. septembra 1998. primio odobrenje marketinga od strane Administracije hrane i lekova za lečenje pacijenata sa metastatskim kancerom dojke čiji tumori prekomerno eksprimiraju HER2 protein.

[0008] Druga HER2 antitela sa različitim svojstvima opisana su u Tagliabue i dr. Int. J. Cancer 47:933-937 (1991); McKenzie i dr. Oncogene 4:543-548 (1989); Maier i dr. Cancer Res. 51:5361-5369 (1991); Bacus i dr. Molecular Carcinogenesis 3:350-362 (1990); Stancovski i dr. PNAS (USA) 88:8691-8695 (1991); Bacus i dr. Cancer Research 52:2580-2589 (1992); Xu i dr. Int. J. Cancer 53:401-408 (1993); WO94/00136; Kasprzyk i dr. Cancer Research 52:2771-2776 (1992); Hancock i dr. Cancer Res. 51:4575-4580 (1991); Shawver i dr. Cancer Res. 54:1367-1373 (1994); Arteaga i dr. Cancer Res.54:3758-3765 (1994); Harwerth i dr. J. Biol. Chem. 267:15160-15167 (1992); patent SAD br. 5,783,186; i Klapper i dr. Oncogene 14:2099-2109 (1997).

[0009] Skrining homologije rezultirao je identifikacijom dva druga člana HER receptora; HER3 (patent SAD br. 5,183,884 i 5,480,968 kao i Kraus i dr. PNAS (USA) 86:9193-9197 (1989)) i HER4 (EP patentna prijava br. 599,274; Plowman i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:1746-1750 (1993); i Plowman i dr., Nature, 366:473-475 (1993)). Oba ova receptora pokazuju povećanu ekspresiju na barem određenim ćelijskim linijama karcinoma dojke.

[0010] HER receptori se uglavnom nalaze u različitim kombinacijama u ćelijama i smatra se da heterodimerizacija povećava raznolikost ćelijskih odgovora na različite HER ligande (Earp i dr. Breast Cancer Research and Treatment 35:115-132 (1995)). EGFR je vezan putem šest različitih liganda; epidermalnog faktora rasta (EGF), transformacionog faktora rasta alfa (TGF-α), amfiregulina, heparinskog vezivnog epidermalnog faktora rasta (HB-EGF), betacelulina i epiregulina (Groenen i dr. Growth Factors 11:235-257 (1994)). Familija proteina heregulina koja proizilazi iz alternativnog spajanja jednog jedinog gena su ligandi za HER3 i HER4. Familija heregulina obuhvata alfa, beta i gama hereguline (Holmes i dr., Science, 256:1205-1210 (1992); patent SAD br.5,641,869; i Schaefer i dr. Oncogene 15:1385-1394 (1997)); neu faktori diferencijacije (NDF), faktori rasta gliala (GGFs); aktivnost indukcije acetilholinskog receptora (ARIA); i faktor senzornog i motornog neurona (SMDF). Za pregled, videti Groenen i dr. Growth Factors 11:235-257 (1994); Lemke, G. Molec. & Cell. Neurosci. 7:247-262 (1996) i Lee i dr. Pharm. Rev. 47:51-85 (1995). Nedavno su identifikovana tri dodatna HER liganda; neuregulin-2 (NRG-2) za koji se navodi da vezuje ili HER3 ili HER4 (Chang i dr., Nature 387 509-512 (1997) i Carraway et al Nature 387:512-516 (1997)); neuregulin-3 koji vezuje HER4 (Zhang i dr. PNAS (USA) 94(18):9562-7 (1997)); i neuregulin-4 koji vezuju HER4 (Harari i dr. Oncogene 18:2681-89 (1999)) HB-EGF, betacelulin i epiregulin se takođe vezuju za HER4.

[0011] Dok EGF i TGF ne vezuju HER2, EGF stimuliše EGFR i HER2 da formiraju heterodimer koji aktivira EGFR i rezultira transfosforilacijom HER2 u heterodimeru. Izgleda da dimerizacija i/ili transfosforilacija aktiviraju HER2 tirozin kinazu. Videti Earp i dr., supra. Isto tako, kada je HER3 koeksprimiran sa HER2, formira se aktivni signalni kompleks i antitela usmerena protiv HER2 mogu da poremete ovaj kompleks (Sliwkowski i dr., J. Biol. Chem., 269(20):14661-14665 (1994)). Pored toga, afinitet HER3 za heregulin (HRG) se povećava do višeg stanja afiniteta kada je ko-eksprimiran sa HER2. Videti takođe, Levi i dr., Journal of Neuroscience 15:1329-1340 (1995); Morrissey i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1431-1435 (1995); and Lewis i dr., Cancer Res., 56:1457-1465 (1996) u odnosu na HER2-HER3 proteinski kompleks. HER4, poput HER3, formira aktivni signalni kompleks sa HER2 (Carraway and Cantley, Cell 78:5-8 (1994)).

[0012] Za ciljanje HER signalnog puta, rhuMAb 2C4 (Pertuzumab) je razvijen kao humanizovano antitelo koje inhibira dimerizaciju HER2 sa drugim HER receptorima, čime se inhibira fosforilacija i aktivacija na ligandu, a aktiviranje nizvodnih aktivacija RAS i AKT puteva. U fazi testiranja Pertuzumaba kao jedinstvenog sredstva za lečenje čvrstih tumora, 3 subjekta sa naprednim kancerom jajnika su tretirani sa pertuzumabom. Jedan je imao izdržljiv delimični odgovor, a drugi subjekt je imao stabilnu bolest u trajanju od 15 nedelja. Agus i dr. Proc Am Soc Clin Oncol 22:192, Abstract 771 (2003).

Sastavi varijanti antitela

[0013] U patentu SAD br. 6,339,142 opisan je sastav HER2 antitela koji sadrži smešu anti-HER2 antitela i jednu ili više njihovih kiselinskih varijanti pri čemu je količina kiselinske varijante(i) manja od oko 25%. Trastuzumab je primerno HER2 antitelo.

[0014] Reid i dr. Poster predstavljen na konferenciji Well Characterized Biotech Pharmaceuticals (januar, 2003.) „Effects of Cell Culture Process Changes on Humanized Antibody Characteristics“ opisuje neimenovani humanizovani sastav IgG1 antitela sa N-terminalnim heterogenostima usled kombinacija VHS signalnog peptida, N-terminalnog glutamina i piroglutaminske kiseline na njegovom teškom lancu.

[0015 Harris i dr. „The Ideal Chromatographic Antibody Characterization Method“ govor predstavljen na konferenciji IBC za proizvodnju antibiotika (februar, 2002.), izveštava o VHS produženju na teškim lancima E25, humanizovanog anti-IgE antitela.

[0016] Rouse i dr. Poster predstavljen na WCBP „Top Down' Glycoprotein Characterization by High Resolution Mass Spectrometry and Its Application to Biopharmaceutical Development“ (januara 6-9, 2004) opisuje sastav monoklonskih antitela sa N-terminalnim heterogenom koja je rezultat iz<-3>AHS ili<-2>HS ostatka signalnog peptida na lakom lancu.

[0017] U prezentaciji na IBC sastanku (septembra 2000.) „Strategic Use of Comparability Studies and Assays for Well Characterized Biologicals“ Jill Porter je razgovarao o formi ZENAPAX™ sa kasnijim eluiranjem sa tri dodatna aminokiselinska ostatka na njegovom teškom lancu.

[0018] US2006/0018899 opisuje sastav koji sadrži glavne vrste antitela pertuzumaba i varijantu produženja amino-terminalnih lidera, kao i druge varijantne forme antitela pertuzumaba.

Rezime pronalaska

[0019] Prema prvom aspektu, pronalazak se tiče sastava prema patentnom zahtevu 1. Poželjno je da kisele varijante uključuju glikovanu varijantu, deamidiranu varijantu, redukovanu disulfidnu varijantu, sijaliliranu varijantu i nereducibilnu varijantu. Poželjno, količina kiselinskih varijanti je manja od oko 25%.

[0020] Pronalazak se takođe tiče farmaceutskih formulacija koje sadrže sastave u farmaceutski prihvatljivom nosaču.

[0021] Dodatno, pronalazak se odnosi na farmaceutsku formulaciju za upotrebu u

metodi za lečenje HER2 pozitivnog kancera kod pacijenta, koja se sastoji iz davanja farmaceutske formulacije pacijentu u količini koja je efektivna za lečenja kancera. U skladu sa takvim metodama, kao što je prikazano u ovdašnjem Primeru, poželjne glavne vrste antitela i kiselinskih varijanti su u suštini isti farmakokinetici.

[0022] U drugom aspektu, pronalazak se odnosi na metodu pravljenja farmaceutskog sastava prema patentnom zahtevu 13.

Kratak opis crteža

[0023]

Crtež 1 prikazuje šemu HER2 proteinske strukture, aminokiselinske sekvence za Domene I-IV(SEQ ID Nos.19-22, respektivno) njihovog vanćelijskog domena.

Crteži 2A i 2B prikazuju poravnanja aminokiselinskih sekvenci varijantnog lakog (VL) (Sl. 2A) i varijantnog teškog (VH) (Sl. 2B) domena mišjeg monoklonskog antitela 2C4 (SEQ ID Br. 1 i 2, respektivno); VLi VHdomeni humanizovane 2C4 verzije 574 (SEQ ID Br. 3 i 4, respektivno), i humani VLi VHkonsenzusni okviri (hum κ1, laka kapa podgrupa I, humIII, teška podgrupa III) (SEK ID Br. 5 i 6, respektivno). Zvezdica identifikuje razlike između humanizovane verzije 2C4 574 i mišjeg monoklonskog antitela 2C4 ili između humanizovane verzije 2C4 574 i humanog okvira. Regioni koji određuju komplementarnost (CDR) su u zagradama.

Slike 3A i 3B prikazuju sekvence aminokiselinskog lakog lanca Pertuzumaba (SEQ ID No. 15) i teškog lanca (SEQ ID No.16). CDR su prikazani podebljano. Ostatak ugljenih hidrata je vezan za Asn 299 teškog lanca.

Slike 4A i 4B pokazuju sekvence aminokiselina lakog lanca Pertuzumaba (SEQ ID No. 17) i teškog lanca (SEQ ID No. 18), od kojih svaka sadrži neotvorenu peptidnu sekvencu amino-terminalnog signala.

Slika 5, šematski, prikazuje vezivanje 2C4 na heterodimernom mestu vezivanja HER2, čime se sprečava heterodimerizacija aktiviranim EGFR ili HER3.

Slika 6 prikazuje vezivanje HER2/HER3 na puteve MAPK i Akt.

Slika 7 poredi aktivnosti Trastuzumaba i Pertuzumaba.

Slike 8A i 8B pokazuju sekvence aminokiselinskog lakog lanca Trastuzumaba (SEQ ID No. 13) i teškog lanca (SEQ ID No.14).

Slike 9A i 9B prikazuju varijantnu sekvencu lakog lanca Pertuzumaba (SEQ ID No. 23) i varijantnu sekvencu teškog lanca Pertuzumaba (SEQ ID No.24).

Slika 10 pokazuje eksperimentalni dizajn za izolaciju MP (glavnog maksimuma) i AV (kiselinske varijante), ćelijske kulture, oporavka i PK (farmakokinetike) evaluacije i analitičkog ispitivanja. Sveži medijum = standardni medijum; potrošeni medijum = standardni medijum nakon 12 dana ćelijske kulture, ćelije su uklonjene centrifugiranjem. Rastvoreni kiseonik, pH i drugi parametri nisu kontrolisani.

Slika 11 prikazuje tipičnu DIONEX PROPAC™ katjonsku razmenu (CEX) hromatograma iz Primera 1.

Slika 12 prikazuje analize početnog materijala pertuzumaba i CEX frakcije. AV= kiselinska varijanta; MP= glavni maksimum; BV= osnovna varijanta.

Slika 13 obelodanjuje CEX glavni maksimum (MP) koji se dostiže u medijumu ćelijske kulture i inkubira 12 dana.

Slika 14 opisuje uslove inkubacije glavnog maksimuma.

Slika 15 rezimira metode karakterizacije kiselinskih varijanti.

Slika 16 pokazuje koncentraciju pertuzumaba u odnosu na vreme u PK studijama Primera 1.

Slika 17 pruža površinu ispod krive (AUC) i geometrijsku sredinu odnosa iz PK studije Primera 1. Detaljan opis poželjnih otelotvorenja

I. Definicije

[0024] Termin „antitelo glavne vrste“ ovde se odnosi na strukturu aminokiseline antitela u sastavu koji je kvantitativno prevladavajući molekul antitela u sastavu. Glavno antitelo je ono koje sadrži laki lanac i sekvence aminokiselinskog teškog lanca u SEQ ID Br.15 i 16 (Pertuzumab).

[0025] Ovdašnje antitelo „varijante aminokiselinske sekvence“ je antitelo sa aminokiselinskom sekvencom koja se razlikuje od glavnog antitela. Obično, varijante aminokiselinskih sekvenci će posedovati najmanje oko 70% homologije sa glavnim antitelima, a poželjno će biti najmanje oko 80%, a poželjnije najmanje oko 90% homologa sa glavnim antitelima. Varijante aminokiselinskih sekvenci imaju zamene, delecije i/ili dodatke na određenim položajima unutar ili pored aminokiselinske sekvence glavnog antitela. Primeri varijanti aminokiselinskih sekvenci u ovom tekstu uključuju kiselinsku varijantu (npr. varijantu deamidiranog antitela), bazičnu varijantu, antitelo sa produžetkom amino-terminalnog prolaza (npr. VHS-) na jednom ili dva laka lanca, antitelo sa C-terminalnim lizinskim ostatkom na jednom ili dva teška lanca, antitelo sa jednim ili više oksidovanih ostataka metionina itd. i uključuje kombinacije varijanti sa aminokiselinskim sekvencama teških i/ili lakih lanaca.

[0026] „Kiselinska varijanta“ je varijanta glavnog antitela vrste koja je kiselija od glavnog antitela. Kiselinska varijanta je dobila negativno punjenje ili izgubila pozitivan naboj u odnosu na glavno antitelo. Takve kiselinske varijante mogu se rešiti primenom metodologije razdvajanja, kao što je jono izmenjivačka hromatografija, koja razdvaja proteine prema punjenju. Kiselinske varijante glavnog antitela eluiraju ranije od glavnog maksimuma po separaciji pomoću katjonsko izmenjivačke hromatografije.

[0027] „Disulfidom redukovana varijanta“ ima još jedan cistein(e) vezan disulfidom koji se hemijski redukuje na slobodni tiolni oblik. Ova varijanta može se pratiti hromatografijom hidrofobne interakcije ili metodom kalibracije, kao što je kapilarna elektroforeza sa natrijum-dodecil-sulfatom (CE-SDS), npr. kao što je opisano u Primeru 1. Ovde je "neredukovana varijanta" varijanta glavnog antitela vrste koja se ne može hemijski redukovati na teški i laki lanac tretiranjem redukcijskog sredstva kao što je ditiotreitol. Takve varijante mogu se proceniti tretiranjem sastava redukcijskim sredstvom i procenom rezultujućeg sastava koristeći metodologiju koja procenjuje veličinu proteina, kao što je kapilarna elektroforeza sa natrijumdodecil-sulfatom (CE-SDS), na primer koristeći tehnike opisane u Primeru 1 ispod .

[0028] „Varijanta glikozilacionog antitela“ ovde je antitelo sa jednim ili više vezanih ugljenih hidrata, koje se razlikuju od jednog ili više karbohidratnih grupa povezanih sa glavnim antitelima. Primeri varijanti glikozilacije ovde obuhvataju antitelo sa G1 ili G2 oligosaharidnom strukturom, umesto G0 oligosaharidnom strukturom, prikačenom na njegov Fc region, antitelo sa jednim ili dva ugljena hidrata koja su povezana sa jednim ili dva laka lanca, antitela bez ugljenih hidrata vezanih za jedan ili dva teška lanca antitela, antitelo koje je salinirano, itd., kao i kombinacije takvih izmena glikozilacije.

[0029] Kada antitelo ima Fc region, struktura oligosaharida, kao što je prikazano na Sl.14, može biti vezana za jedan ili dva teška lanca antitela, npr. na ostatku 299. Za Pertuzumab, G0 je dominantna oligosaharidna struktura, sa ostalim oligosaharidnim strukturama kao što su GO-F, G-1, Man5, Man6, G1-1, G1(1-6), G1(1-3) i G2 se nalazi u manjim količinama u sastavu Pertuzumab.

[0030] Osim ako nije drugačije naglašeno, „G1 oligosaharidna struktura“ ovde uključuje G1(1-6) i G1(1-3) strukture.

[0031] Za ovdašnje svrhe, „salinirana varijanta“ je varijanta glavne vrste antitela koja sadrži jedan ili više saliniranih ugljenih hidrata u vezama sa jednim ili dva teška lanca. Salinirana varijanta može se identifikovati vrednovanjem sastava (na primer pomoću jonoizmenjivačke hromatografije) sa ili bez tretmana salinacije, npr. kao što je opisano u primeru.

[0032] „Glikirana varijanta“ je antitelo na koje je šećer, kao što je glukoza, kovalentno vezan. Ovaj dodatak se može javiti reakcijom glukoze sa ostatkom lizina na proteinu (npr. u medijumima ćelijske kulture). Glikirana varijanta može se identifikovati analizom masenog spektrometra redukovanih antitela procenjujući povećanje mase teških ili lakih lanaca. Glikirana varijanta takođe može biti kvantifikovana pomoću boronatne hromatografije kako je objašnjeno u Primeru 1 u nastavku. Glikirana varijanta se razlikuje od varijante glikozilacije.

[0033] „Deamidirano“ antitelo je ono u kojem je jedan ili više ostataka asparagina derivatizovano, npr. u asparaginsku kiselinu, sukcinimid ili izo-asparaginsku kiselinu. Primer deamidiranog antitela je varijanta pertuzumaba, pri čemu su Asn-386 i/ili Asn-391 na jednom ili dva teška lanca pertuzumaba deamidirani.

[0034] „Proširena varijanta prolaza amino-terminalnog lidera“ ovde se odnosi na glavno antitelo vrste sa jednim ili više aminokiselinskih ostataka amino-terminalne liderske sekvence na amino-terminusu bilo kog jednog ili više teških ili lakih lanaca glavnog antitela. Primerna ekspresija lanca amino-terminalne linije sadrži ili se sastoji od tri aminokiselinska ostatka, VHS, prisutnih na jednom ili oba laka lanca varijante antitela.

[0035] „Homologija“ se definiše kao procenat ostataka u varijanti aminokiselinske sekvence koji su identični nakon poravnanja sekvencija i uvođenja praznina, ukoliko je potrebno, da bi se postigla maksimalna homogenost procenta. Metode i računarski programi za usklađivanje su dobro poznati u struci. Jedan od takvih kompjuterskih programa je "Align 2", autor knjige Genentech, Inc., koji je 10. decembra 1991. godine dostavljen u korisničku dokumentaciju u United States Copyright Office, Washington, DC 20559, 10. decembra, 1991.

[0036] Za ovdašnje potrebe, „analiza razmene katjona“ odnosi se na bilo koji postupak kojim se sastav koji sadrži dva ili više jedinjenja na osnovu razlike u naboju koristeći izmenjivač katjona. Razmenjivač katjona uglavnom sadrži kovalentno vezane, negativno naelektrisane grupe. Poželjno, izmenjivač katjona ovde je slab katjon-izmenjivač i/ili sadrži funkcionalnu grupu karboksilata, kao što je PROPAC WCX-10™ katjonska kolona za razmenu koju je prodala Dionex.

[0037] „HER receptor“ je tirozin-kinaza receptorskog proteina koji pripada porodici HER receptora i uključuje receptore EGFR, HER2, HER3 i HER4 i druge članove ove porodice koji će biti identifikovani u budućnosti. HER receptor će generalno sadržati vanćelijski domen koji može vezati HER ligand; lipofilni transmembranski domen; konzervisan intracelularni domen tirozin-kinaze; i karboksil-terminalni signalizacijski domen koji sadrži nekoliko ostataka tirozina koji mogu biti fosforilovani. Poželjno, HER receptor je prirodni receptor humanog HER receptora.

[0038] Vanćelijski domen HER2 obuhvata četiri domena, domen I (aminokiselinski ostaci od oko 1-195), domen II (aminokiselinski ostaci od oko 196-319), domen III (aminokiselinski ostaci od oko 320-488) i domen IV (aminokiselinski ostaci od oko 489-630) (numerisanje ostatka bez signalnog peptida). Videti Garrett i dr. Mol. Cell.. 11: 495-505 (2003), Cho i dr. Nature 421: 756-760 (2003), Franklin i dr. Cancer Cell 5:317-328 (2004) ili Plowman i dr. Proc. Natl. Acad. Sci.90:1746-1750 (1993). Videti, takođe, Sl.1 ovde.

[0039] Izrazi „ErbB1“, „HER1“, „receptor epidermalnog faktora rasta“ i „EGFR“ koriste se naizmenično ovde i odnose se na EGFR kao što je obelodanjeno, na primer, u Carpenter i dr. Ann. Rev. Biochem.56:881-914 (1987), uključujući prirodne mutantne oblike (npr., mutantni EGFR kao u Humphrey i dr. PNAS (USA) 87:4207-4211 (1990)). erbB1 se odnosi na gen koji kodira EGFR proteinski proizvod.

[0040] Izrazi „ErbB2“ i „HER2“ se ovde koriste izmenjivo i odnose se na humani HER2 protein opisan, na primer, u Semba i dr., PNAS (USA) 82:6497-6501 (1985) i Yamamoto i dr. Nature 319:230-234 (1986) (Genebank pristupni broj X03363).Termin „erbB2“ odnosi se na gen koji kodira humani ErbB2 i „neu“ se odnosi na gen koji kodira pacov p185<neu>. Preferirani HER2 je izvorna sekvenca humanog HER2.

[0041] „ErbB3“ i „HER3“ se odnose na receptor polipeptida kao što je obelodanjeno, na primer, u patentu SAD br.5,183,884 i 5,480,968 kao i u Kraus i dr. PNAS (USA) 86:9193-9197 (1989).

[0042] Termini „ErbB4“ i „HER4“ ovde se odnose na receptorski polipeptid kao što je obelodanjeno, na primer, u patentnoj prijavi EP br. 599.274; Plovman i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:1746-1750 (1993); i Ploughman i dr., Nature, 366:473-475 (1993), uključujući njegove izoforme, na primer, kako je objavljeno u WO99/19488, objavljenom 22. aprila 1999. godine.

[0043] Pod „HER ligandom“ podrazumeva se polipeptid koji se vezuje i/ili aktivira HER receptor. HER ligand od posebnog interesa ovde je prirodna sekvenca humanog HER liganda kao što je epidermalni faktor rasta (EGF) (Savage i dr., J. Biol Chem. 247:7612-7621 (1972)); transformišući faktor rasta alfa (TGF-α) (Marquardt i dr., Science 223:1079-1082 (1984)); amfiregulin poznat i kao švanom ili keratinocitni autokrini faktor rasta (Shoyab i dr. Science 243:1074-1076 (1989); Kimura i dr. Nature 348:257-260 (1990); i Cook i dr. Mol. Cell. Biol.11:2547-2557 (1991)); betacelulin (Shing i dr., Science 259:1604-1607 (1993); i Sasada i dr. Biochem. Biophys. Res. Commun. 190:1173 (1993)); heparinom-vezujući epidermalni faktor rasta (HB-EGF) (Higashiyama i dr., Science 251:936-939 (1991)); epiregulin (Toyoda i dr., J. Biol. Chem. 270:7495-7500 (1995); i Komurasaki i dr. Oncogene 15:2841-2848 (1997)); heregulin (videti ispod); neuregulin-2 (NRG-2) (Carraway i dr., Nature 387:512-516 (1997)); neuregulin-3 (NRG-3) (Zhang i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. 94:9562-9567 (1997)); neuregulin-4 (NRG-4) (Harari i dr. Oncogene 18:2681-89 (1999)) ili kripto (CR-1) (Kannan i dr. J. Biol. Chem. 272(6):3330-3335 (1997)). HER ligandi koji vezuju EGFR uključuju EGF, TGF-α, amfiregulin, betacelulin, HB-EGF i epiregulin. HER ligandi koji vezuju HER3 uključuju hereguline. HER ligandi sposobni za vezivanje HER4 uključuju betacelulin, epiregulin, HB-EGF, NRG-2, NRG-3, NRG-4 i hereguline.

[0044] „Heregulin“ (HRG), kada se ovde koristi, odnosi se na polipeptid koji kodira proizvod heregulinskog gena kao što je opisano u patentu SAD br. 5,641,869 ili Marchionni i dr., Nature, 362:312-318 (1993). Primeri heregulina uključuju heregulin-a, heregulin-β1, heregulin-β2 i heregulin-β3 (Holmes i dr., Science, 256:1205-1210 (1992) i US patent br.5,641,869); faktor difuzije neu (NDF) (Peles i dr. Cell 69:205-216 (1992)); aktivnost koja indukuje acetilholin receptor (ARIA) (Falls i dr. Cell 72:801-815(1993)); faktori rasta gliala (GGFs) (Marchionni i dr., Nature, 362:312-318 (1993)); senzorni i motorni neuronski faktor (SMDF) (Ho et al J. Biol Chem. 270:14523-14532 (1995)) γ-heregulin (Schaefer i dr. Oncogene 15:1385-1394 (1997)). Termin obuhvata biološki aktivne fragmente i/ili varijante aminokiselinske sekvence HRG polipeptida u prirodnoj sekvenci, kao što je domen nalik EGF njegovog fragmenta (npr. HRGβ1177-244).

[0045] „HER dimer“ ovde je nekovalentno povezani dimer koji sadrži najmanje dva različita HER receptora. Takvi kompleksi mogu se formirati kada je ćelija koja eksprimira dva ili više HER receptora izložena HER ligandu i može se izolovati imunoprecipitacijom i analizirati SDS-PAGE kao što je opisano u Sliwkowski i dr., J. Biol. Chem., 269(20):14661-14665 (1994), na primer. Primeri takvih HER dimera uključuju heterodimere EGFR-HER2, HER2-HER3 i HER3-HER4. Štaviše, HER dimer može sadržati dva ili više HER2 receptora u kombinaciji sa različitim HER receptorima, kao što su HER3, HER4 ili EGFR. Ostali proteini, kao što je podjedinica receptora citokina (npr. gp130) može biti povezana sa dimerom.

[0046] „Heterodimerno vezujuće mesto“ na HER2, odnosi se na region u vanćelijskom domenu HER2 koji kontaktira ili se povezuje sa regionom u vanćelijskom domenu EGFR, HER3 ili HER4, nakon formiranja dimera sa njim. Region se nalazi u domenu II HER2. Franklin i dr. Cancer Cell 5:317-328 (2004).

[0047] „Aktivacija HER“ ili „HER2 aktivacija“ se odnosi na aktivaciju ili fosforilaciju bilo kog ili više HER receptora ili HER2 receptora. U principu, aktivacija HER-a rezultira transdukcijom signala (npr. izazvana intracelularnim kinaznim domenom HER receptorskog fosforilacionog ostatka tirozina u HER receptoru ili polipeptidom supstrata). Aktivacija HER može biti posredovana vezivanjem HER liganda za HER dimer koji sadrži HER receptor koji je od interesa. HER vezivanje liganda na HER dimer može aktivirati domen kinaze jednog ili više HER receptora u dimu i na taj način rezultirati fosforilacijom ostataka tirozina u jednom ili više HER receptora i/ili fosforilacije ostataka tirozina u dodatnim polipeptidu(ima) supstrata, kao što su Akt ili MAPK intracelularne kinaze.

[0048] Termin „antitelo“ ovde se koristi u najširem smislu i specifično pokriva netaknuta monoklonalna antitela, poliklonska antitela, multispecifična antitela (npr. bispecifična antitela) formirana iz najmanje dva netaknuta antitela i fragmenata antitela, sve dok pokazuju željenu biološku aktivnost .

[0049] Termin „monoklonsko antitelo“, kako se ovde koristi, odnosi se na antitelo dobijeno iz populacije suštinski homogenih antitela, tj., pojedinačna antitela koja sadrže populaciju su identična i/ili vezuju isti epitop, osim mogućih varijanti koje mogu nastati tokom proizvodnje monoklonskog antitela, kao što su one varijante koje su ovde opisane. Za razliku od preparata poliklonskih antitela koji tipično uključuju različita antitela usmerena protiv različitih determinanti (epitopi), svako monoklonsko antitelo je usmereno protiv jedne determinante antigena. Pored njihove specifičnosti, monoklonalna antitela su povoljna u tome što su nekontaminirana drugim imunoglobulinama. „Monoklonalni“ modifikator označava karakter antitela kao dobijenog od suštinski homogene populacije antitela i ne treba tumačiti kao da zahteva proizvodnju antitela bilo kojom posebnom metodom. Na primer, monoklonalna antitela koja se koriste u skladu sa ovim pronalaskom mogu se napraviti metodom hibridoma koji je prvi opisao Kohler i dr., Nature, 256:495 (1975), ili se može napraviti metodama rekombinantne DNK (videti, npr., patent SAD br. 4,816,567). „Monoklonalna antitela“ takođe mogu biti izolovana iz biblioteka fagnih antitela koristeći tehnike opisane u Clackson i dr., Nature, 352:624-628 (1991) i Marks i dr., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991), na primer.

[0050] Monoklonalna antitela ovde posebno uključuju „himerna“ antitela u kojima deo teškog i/ili lakog lanca je identičan ili homologan odgovarajućim sekvencama u antitelima izvedenim iz određene vrste ili koji pripadaju određenoj klasi ili podklasi antitela, dok ostatak lanca (lanaca) je identičan ili homologan odgovarajućim sekvencama u antitelima izvedenim iz druge vrste ili pripadaju drugoj klasi ili podklasi antitela, kao i fragmentima takvih antitela, sve dok pokazuju željenu biološku aktivnost (patent SAD br.

4,816,567 i Morrison i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). Himerna antitela od interesa ovde uključuju "primatizovana" antitela koja sadrže sekvence vezivanja antigena sa promenljivim domenom izvedenim iz primata koji nije čovek (npr. majmun starog sveta, majmun i sl.) i sekvence ljudskog konstantnog regiona.

[0051] „Frakcije antitela“ sadrže deo netaknutog antitela, poželjno sadrži njegov antigen-vezujući ili varijabilni region. Primeri fragmenata antitela uključuju Fab, Fab', F(ab')2i Fv fragmente; diatela; linearna antitela; molekule antitela sa jednim lancem; i multispecifična antitela formirana iz fragmenta antitela.

[0052] „Netaknuto antitelo“ je ono koje sadrži varijabilni region vezujući za antigen, kao i konstantni domen lakog lanca (CL) i konstantne domene teškog lanca, CH1, CH2 i CH3. Konstantni domeni mogu biti konstantni domeni sekvence (npr. konstantni domeni humane izvorne sekvence) ili njihove varijante aminokiselinske sekvence. Poželjno, netaknuto antitelo ima jednu ili više efektorskih funkcija, i sadrži oligosaharidnu strukturu vezanu za jedan ili dva teška lanca.

[0053] Antitela „efektorske funkcije“ odnose se na one biološke aktivnosti koje se mogu pripisati regionu Fc (Fc regionu sa prirodnom sekvencom ili varijantu Fc regiona aminokiselinske sekvence) antitela. Primeri efektorskih funkcija antitela uključuju C1q vezivanje; komplementarna zavisna citotoksičnost; vezivanje Fc receptora; citotoksičnost posredovana ćelijama zavisnih od antitela (ADCC); fagocitoza; regulacije na površini receptora na površini (npr. B ćelijski receptor; BCR) itd.

[0054] Termin „Fc region“ ovde se koristi za definisanje C-terminala regiona teškog lanca imunoglobulina, uključujući Fc regione izvorne sekvence i varijante Fc regiona. Iako granice Fc regiona teškog lanca imunoglobulina mogu varirati, Fc region teškog lanca IgG obično se definiše da se proteže od aminokiselinskog ostatka na položaju Cys226 ili od Pro230 do karboksil-terminusa. C-terminal lizin (ostatak 447 prema EU sistemu numerisanja) regiona Fc može se ukloniti, na primer, tokom proizvodnje ili prečišćavanja antitela ili rekombinantnim inženjeringom nukleinske kiseline koja kodira teški lanac antitela. Prema tome, sastav netaknutih antitela može sadržati populacije antitela sa uklonjenim ostacima K447, populacije antitela bez uklonjenih ostataka K447 i populacija antitela koja imaju smešu antitela sa i bez ostataka K447.

[0055] Osim ako nije drugačije naznačeno ovde, brojanje ostataka u teškom lancu imunoglobulina je indeks EU, kao u Kabat i dr., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). "EU indeks kao u Kabatu" odnosi se na brojanje ostataka humanog IgG1 EU antitela.

[0056] U zavisnosti od aminokiselinske sekvence konstantnog domena njihovih teških lanaca, netaknuta antitela mogu biti dodeljena različitim „klasama“. Postoji pet glavnih klasa netaknutih antitela: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, a nekoliko od njih mogu se dalje podeliti na „podklase“ (izotipove), npr. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA i IgA2. Konstantni domeni teškog lanca koji odgovaraju različitim klasama antitela nazivaju α, δ, ε, γ, i µ, respektivno. Strukture podjedinica i trodimenzionalne konfiguracije različitih klasa imunoglobulina su dobro poznate.

[0057] „Citotoksičnost zavisna od antitela i ona posredovana ćelijama“ i „ADCC“ odnose se na ćelijsko posredovane reakcije u kojima nespecifične citotoksične ćelije koje eksprimiraju Fc receptore (FcRs) (npr. Natural Killer (NK) ćelije, neutrofili i makrofage) prepoznaje vezana antitela na ciljnu ćeliju i potom uzrokuju lizu ciljne ćelije. Primarne ćelije za posredovanje ADCC, NK ćelija, eksprimiraju samo FcγRIII, dok monociti izražavaju FcyRI, FcyRII i FcyRIII. FcR ekspresija na hematopoietskim ćelijama u rezimeu je Tabela 3 na strani 464 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991). Da bi se procenila aktivnost ADCC molekula od interesa, in vitro ADCC test, kao što je opisano u patentu SAD br. 5,500,362 ili 5,821,337, može se izvršiti. Korisne efektorske ćelije za takve analize uključuju mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) i Natural Killer (NK) ćelije. Alternativno, ili dodatno, aktivnost ADCC molekula od interesa može se proceniti in vivo, npr., u životinjskom modelu kao što je on opisano u Clynes i dr. PNAS (USA) 95:652-656 (1998).

[0058] „Ljudske efektorske ćelije“ su leukociti koji izražavaju jedan ili više FcR i izvršavaju efektorske funkcije. Poželjno, ćelije izražavaju najmanje FcγRIII i izvršavaju ADCC efektorsku funkciju. Primeri ljudskih leukocita koji posreduju ADCC uključuju mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC), ćelije prirodne ubice (NK (natural killer)), monociti, citotoksične T ćelije i neutrofili; sa PBMC i NK ćelijama koje su poželjne. Efektorske ćelije mogu biti izolovane iz njegovog izvornog izvora, npr. iz krvi ili PBMC kako je ovde opisano.

[0059] Izrazi „Fc receptor“ ili „FcR“ se koriste da opišu receptor koji se vezuje za Fc region antitela. Poželjan FcR je prirodni humani FcR. Štaviše, poželjan FcR je onaj koji vezuje IgG antitelo (gama receptor) i uključuje receptore FcγRI, FcγRII i Fcγ RIII podklase, uključujući alelne varijante i alternativno spojene oblike ovih receptora. FcyRII receptori uključuju FcyRIIA („aktivacijski receptor“) i FcyRIIB („inhibitorni receptor“), koji imaju slične aminokiselinske sekvence koje se prvenstveno razlikuju u njihovim citoplazmatskim domenima. Aktiviranje receptora FcyRIIA sadrži imunoreceptorski motiv za aktivaciju na bazi tirozina (ITAM) u svom citoplazemskom domenu. Aktivacioni receptor FcyRIIB sadrži imuninoceptorski motiv za inhibiciju na osnovi tirozina (ITIM) u svom citoplazemskom domenu. (videti pregled M. in Daëron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). FcR su pregledani u Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel i dr., Immunomethods 4:25-34 (1994); and de Haas i dr., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). Ostali FcR, uključujući i one koji će se identifikovati u budućnosti, obuhvaćeni su izrazom „FcR“ ovde. Termin takođe uključuje i neonatalni receptor FcRn koji je odgovoran za prenošenje materinskih IgG na fetus (Guyer i dr., J. Immunol.117:587 (1976) and Kim i dr., J. Immunol.

24:249 (1994)).

[0060] „Komplementarna zavisna citotoksičnost“ ili „CDC“ se odnosi na sposobnost molekula da lizira cilj u prisustvu komplementa. Put aktivacije komplementa inicira se vezivanjem prve komponente sistema komplementa (C1q) u molekul (npr. antitelo) kompleksirano sa srodnim antigenom. Za procenu aktivacije komplementa, CDC test, npr. kao što je opisano u in Gazzano-Santoro i dr., J. Immunol. Methods 202:163 (1996), mogu se izvesti.

[0061] „Izvorna antitela“ su obično heterotetramerični glikoproteini od oko 150.000 daltonova, sastavljeni od dva identična laka (L) lanca i dva identična teška (H) lanca. Svaki laki lanac je povezan sa teškim lancima pomoću jedne kovalentne disulfidne veze, dok se broj disulfidnih veza razlikuje među teškim lancima različitih izotipova imunoglobulina. Svaki teški i lagani lanac ima i redovno razmaknute unutrašnje disulfidne mostove. Svaki teški lanac ima na jednom kraju varijabilni domen (VH), praćen brojnim konstantnim domenima. Svaki laki lanac ima varijabilni domen na jednom kraju (VL) i konstantni domen na drugom kraju. Konstantni domen lakog lanca poravnat je sa prvim konstantnim domenom teškog lanca, a varijabilni domen lakog lanca je poravnat sa varijabilnom domenom teškog lanca. Posebno se smatra da aminokiselinski ostaci formiraju interfejs između varijabilnog domena lakog lanca i teškog lanca.

[0062] Termin „varijabla“ se odnosi na činjenicu da se određeni delovi varijabilnih domena obično razlikuju u nizu među antitelima i koriste se u vezivanju i specifičnosti svakog pojedinačnog antitela za njegov određeni antigen. Međutim, varijabilnost nije ravnomerno raspoređena u varijabilnim domenima antitela. Koncentrisana je u tri segmenta koja se nazivaju hipervarijabilni regioni i u lakom lancu i varijabilnim domenima teškog lanca. Više se konzervisani delovi varijabilnih domena nazivaju okvirni regioni (FRs). Svaki varijabilni domeni izvornih teških i lakih lanaca sadrži po četiri FR, u velikoj meri usvajaju konfiguraciju β-listova, povezana sa tri hipervarijabilna područja, koja formiraju petlje koje povezuju, a u nekim slučajevima i sastavni deo strukture β-listova. Hipervarijabilni regioni u svakom lancu držani su zajedno u neposrednoj blizini od strane FR i, sa hipervarijalnim regionima iz drugog lanca, doprinose stvaranju antigen-vezujućeg mesta antitela (videti Kabat i dr., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Konstantni domeni nisu direktno uključeni u vezivanje antitela antigenu, ali pokazuju različite efektorske funkcije, kao što je učešće antitela u ćelijskoj citotoksičnosti zavisno od antitela (ADCC).

[0063] Izraz „hipervarijabilni region“, kada se ovde koristi, odnosi se na aminokiselinske ostatke antitela koji su odgovorni za vezivanje antigena. Hipervarijabilni region uglavnom sadrži aminokiselinske ostatke iz regiona za određivanje komplementarnosti ili CDR-a (npr. ostatke 24-34 (LI), 50-56 (L2) i 89-97 (L3) u varijabilnom domenu lakog lanca i 31 -35 (HI), 50-65 (H2) i 95-102 (H3) u varijabilnom domenu težeg lanca, Kabat i dr., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) i/ili ostatke iz „hipervarijabilne petlje“ (npr. ostaci 26-32 (L1), 50-52 (L2) i 91-96 (L3) u varijabilnom domenu lakog lanca i 26-32 (HI), 53- 55 (H2) i 96-101 (H3) u varijabilnom domenu teškog lanca; Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Ostatak „okvirnog regiona“ ili „FR“ su ostaci drugih varijabli, različitih od ostataka hipervarijabilnog regiona, kako je ovde definisano.

[0064] Papainom digestijom antitela proizvedu se dva identična fragmenta vezivanja antigena, pod nazivom „Fab“ fragmenti, svaki sa jednim antigen-vezujućim mestom i ostatak fragmenta „Fc“, čije ime odražava njegovu sposobnost lake kristalizacije. Terapija pepsinom daje fragment F(ab')2koji ima dva mesta za vezivanje antigena i još uvek je sposoban za unakrsno povezivanje antigena.

[0065] „Fv“ je minimalni fragment antitela koji sadrži kompletno mesto za prepoznavanje antigena i antigenvezujućeg mesta. Ovaj region se sastoji od dimera jednog teškog lanca i jednog varijabilnog domena lakog lanca u čvrstoj, nekovalentnoj vezi. U ovoj konfiguraciji su tri hipervarijabilna regiona svakog varijabilnog domena u interakciji da definišu antigen-vezujuće mesto na površini VH-VL dimera. Kolektivno, šest hipervarijabilnih regiona daje antigen-vezujuću specifičnost na antitelo. Međutim, čak i jedan varijabilni domen (ili polovina Fv koja sadrži samo tri hipervarijabilna regiona specifična za antigen) ima sposobnost prepoznavanja i vezivanja antigena, iako sa nižim afinitetom od celog mesta vezivanja.

[0066] Fab fragment takođe sadrži konstantni domen lakog lanca i prvi konstantni domen (CH1) teškog lanca. Fab= fragmenti se razlikuju od fragmenata Faba dodavanjem nekoliko ostataka na karboksi-terminusu CH1 domena teškog lanca, uključujući jedan ili više cisteina iz regiona zavisnog antitela. Fab'-SH je oznaka ovde za Fab' u kojem ostaci cisteina konstantnih domena imaju najmanje jednu slobodnu tiolnu grupu. F(ab')2fragmenti antitela prvobitno su proizvedeni kao parovi Fab' fragmenata koji imaju između njih sržne cisteine. Takođe su poznati i drugi hemijski sklopovi fragmenata antitela.

[0067] „Laki lanci“ antitela bilo koje vrste kičmenjaka mogu se dodeliti jednom od dva jasno izražena tipa, koja se zovu kapa (κ) i lambda (λ), zasnovana na aminokiselinskim sekvencama njihovih konstantnih domena.

1

[0068] „Jednolančani Fv“ ili „scFv2 antitela fragmenti sadrže VH i VL domene antitela, pri čemu su ovi domeni prisutni u jednom polipeptidnom lancu. Poželjno, Fv polipeptid dalje sadrži polipeptidni linker između VH i VL domena koji omogućava scFv da formira željenu strukturu za vezivanje antigena. Za pregled scFv videti Plückthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994). HER2 antitelo scFv fragmenata su opisani u WO93/16185; patentu SAD br.5,571,894; i patentu SAD br.5,587,458.

[0069] Termin „diatela“ se odnosi na male fragmente antitela sa dva mesta za vezivanje antigena, koji fragmenti sadrže varijabilni teški domen (VH) povezan sa varijabilnim lakim domenom (VL) u istom polipeptidnom lancu (VH - VL). Korišćenjem prekidača koji je prekratak da bi omogućio uparivanje između dva domena na istom lancu, domeni su prisiljeni da se uparuju sa komplementarnim domenima drugog lanca i kreiraju dva mesta za vezivanje antigena. Diatela su detaljnije opisana u, na primer, EP 404,097; WO 93/11161; i Hollinger i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993).

[0070] „Humanizovani“ oblici ne-humanih (npr., glodara) antitela su himerna antitela koja sadrže minimalnu sekvencu dobijenu od ne-humanog imunoglobulina. Uglavnom, humanizirana antitela su humani imunoglobulini (prijemno antitelo) u kojima su ostaci iz hipervarijabilnog regiona primatelja zamenjeni ostacima iz hipervarijabilnog regiona ne-humane vrste (donatorsko antitelo) kao što su miš, pacov, zec ili nehumani primat koji ima željenu specifičnost, afinitet i kapacitet. U nekim slučajevima, ostaci humanog imunoglobulina okružnog regiona (FR) zamenjuju se odgovarajućim ne-humanim ostacima. Pored toga, humanizovana antitela mogu sadržati ostatke koji nisu pronađeni u prijemnom antitelu ili u antitelu donatora. Ove modifikacije su učinjene kako bi se dalje poboljšale performanse antitela. Generalno, humanizovano antitelo će sadržati u suštini sve od najmanje jednog, a obično dva, promenljiva domena, u kojima sve ili u suštini sve hipervarijabilne petlje odgovaraju onima kod ne-humanog imunoglobulina i svi ili u suštini svi FR su oni humane imunoglobulinske sekvence. Humanizovano antitelo će opciono takođe obuhvatati barem deo konstantnog regiona imunoglobulina (Fc), tipično onog humanog imunoglobulina. Za dodatne detalje vidite Jones i dr., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann i dr., Nature 332:323-329 (1988); i Presta, Curr. Op. Struct. Biol.2:593-596 (1992).

[0071] Humanizovana HER2 antitela uključuju huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 i huMAb4D5-8 ili Trastuzumab (HERCEPTIN®) kao što je opisano u Tabeli 3 patenta SAD 5,821,337; humanizovani 520C9 (WO93/21319) i humanizovana 2C4 antitela kako je ovde opisano.

[0072] U ovdašnje svrhe „Trastuzumab“, „HERCEPTIN®“ i „huMAb4D5-8“ odnose se na antitelo koje sadrži sekvence aminokiselina lakog i teškog lanca u SEQ ID BR.13 i 14, respektivno.

[0073] Ovde se „Pertuzumab“ i „rhuMAb 2C4“ odnose na antitelo koje sadrži varijabilne lake i varijabilne teške aminokiselinske sekvence u SEQ ID NOs 3 i 4, redom. Gde je Pertuzumab netaknuto antitelo, ono sadrži laki lanac i teški lanac aminokiselinske sekvence u SEQ ID NOs 15 i 16, respektivno.

[0074] „Golo antitelo“ je antitelo (kako je ovde definisano) koje nije konjugovano za heterologni molekul, kao što je citotoksični deo ili radio-oznaka.

[0075] „Izolovano“ antitelo je ono koje je identifikovano i odvojeno i/ili se obnavlja iz komponente njegove prirodne sredine. Komponente zagađivača njegovog prirodnog okruženja su materijali koji bi ometali dijagnostičke ili terapeutske upotrebe za antitelo i mogu uključivati enzime, hormone i druge proteinske ili neproteinske supstance. U poželjnim otelotvorenjima, antitelo će biti prečišćeno (1) do većeg od 95% masenog procenta antitela, kako je određeno metodom Lowry, a najpoželjnije više od 99% po težini, (2) do stepena koji je dovoljan da se dobije najmanje 15 ostataka N-terminala ili interne aminokiselinske sekvence pomoću sekvencenatora za vraćanje špricanja ili (3) homogenosti pomoću SDS-PAGE u uslovima redukcije ili nepreduženja korišćenjem Coomassie plave ili, poželjno, srebrne mrlje. Izolovano antitelo obuhvata antitelo in situ u rekombinantnim ćelijama jer barem jedna komponenta prirodnog okruženja antitela neće biti prisutna. Obično, međutim, izolovano antitelo će se pripremiti najmanje jednim korakom prečišćavanja.

[0076] HER2 antitelo koje „efikasnije inhibira HER dimerizaciju od Trastuzumaba“ je ono koje smanjuje ili eliminiše HER dimere efikasnije (na primer, barem oko 2 puta efikasnije) od Trastuzumaba. Poželjno, takvo antitelo inhibira HER2-dimerizaciju barem približno tako efektivno kao antitelo odabrano iz grupe koja se sastoji od netaknutog mišjeg monoklonskog antitela 2C4, Fab fragmenta mišjeg monoklonskog antitela 2C4, netaknutog Pertuzumaba i Fab fragmenta Pertuzumaba. Može se proceniti HER dimerizacijska inhibicija proučavanjem HER dimera direktno, ili procenom HER aktivacije ili nizvodne signalizacije, koja je rezultat HER dimerizacije i/ili procenom mesta vezivanja antitela-HER2 itd. Analize za skrining antitela sa sposobnošću da bi efikasnije inhibirali HER dimerizaciju nego što su Trastuzumab opisani u Agus i dr. Cancer Cell 2:127-137 (2002) i WO01/00245 (Adams i dr.). Kao samo primer, može se analizirati inhibicija HER dimerizacije procenom, na primer, inhibicije formiranja HER dimera (videti, npr., Sl.1A-B Agus i dr. Cancer Cell 2:127-137 (2002); i WO01/00245); smanjenje aktivacije ćelija HER liganda ćelija koje izražavaju HER dimere (WO01/00245 i Sl. 2A-B of Agus i dr. Cancer Cell 2: 127-137 (2002), na primer); blokiranje vezivanja HER liganda na ćelije koje izražavaju HER dimere (WO01/00245, i Sl. 2E Agus i dr. Cancer Cell 2: 127-137 (2002), na primer); (npr., MCF7, MDA-MD-134, ZR-75-1, MD-MB-175, T-47D ćelije) koji izražavaju HER dimere u prisustvu (ili odsustvu) HER liganda (WO01/00245 i Sl. 3A-D Agus i dr. Cancer Cell 2:127-137 (2002), na primer); (npr., inhibicija HRG-zavisne AKT fosforilacije ili inhibicije HRG ili TGFa-zavisne MAPK fosforilacije) (videti WO01/00245 i Sl. 2C-D Agus i dr., Cancer Cell 2:127 -137 (2002), na primer). Takođe se može proceniti da li antitelo inhibira HER dimerizaciju proučavajući mesto vezivanja antitela-HER2, na primer, vrednovanjem strukture ili modela, kao što je kristalna struktura, antitela vezana za HER2 (videti, na primer, Franklin i dr. Cancer Cell 5:317-328 (2004)).

[0077] Antitelo HER2 može „inhibirati HRG-zavisnu AKT fosforilaciju“ i/ili inhibirati „HRG- ili TGFazavisna MAPK fosforilacija“ efikasnije (na primer, najmanje 2 puta efikasnije) od Trastuzumaba (videti Agus i dr. Cancer Cell 2: 127-137 (2002) i WO01/00245, na primer).

[0078] HER2 antitelo može biti ono koje „ne inhibira HER2 ektodomensko cepanje“ (Molina i dr. Cancer Res. 61:4744-4749(2001)).

[0079] HER2 antitelo koje se „vezuje za heterodimerno mesto vezivanja“ HER2, vezuje se za ostatke u domenu II (i opciono se takođe vezuje za ostatke u drugim domenima HER2 vanćelijskog domena, kao što su domeni I i III) i mogu sterički otežavati, makar u izvesnoj meri, formiranje heterodimera HER2-EGFR, HER2-HER3 ili HER2-HER4. Franklin i dr. Cancer Cell 5:317-328 (2004) karakteriše HER2-Pertuzumab kristalna struktura, deponovana sa RCSB Protein Data Bank (ID kod IS78), ilustrujući primerno antitelo koje se vezuje za heterodimerno mesto vezivanja HER2.

[0080] Antitelo koje se „vezuje za domen II“ HER2 vezuje se za ostatke u domenu II i opciono ostatke u drugom domenu HER2, kao što su domeni I i III.

[0081] „Sredstvo za inhibiranje rasta“ kada se ovde koristi, odnosi se na jedinjenje ili sastav koji inhibira rast ćelije, naročito HER ekspresivnu ćeliju kancera bilo in vitro ili in vivo. Prema tome, agens inhibitora rasta može biti jedan koji značajno smanjuje procenat HER ekspresirajućih ćelija u S fazi. Primeri sredstava koja inhibiraju rast uključuju sredstva koja blokiraju progresiju ćelijskog ciklusa (na mestu koje nije S faza), kao što su agensi koji indukuju G1 zaustavljanje i M-fazno zaustavljanje. Klasični blokatori M faze uključuju vinkas (vinkristin i vinblastin), taksane i inhibitore topo II kao što su doksorubicin, epirubicin, daunorubicin, etopozid i bleomicin. Ovi agensi koji zaustavljaju G1 takođe prelaze u zaustavljanje S-faze, na primer, sredstva za alkiliranje DNK, kao što su tamoksifen, prednizon, dakarbazin, mekloretamin, cisplatin, metotreksat, 5-fluorouracil i ara-C. Dodatne informacije mogu se naći u poglavlju The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn i Israel, eds., Chapter 1, pod nazivom „Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs“ od Murakami i dr. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), posebno str.13.

[0082] Primeri antitela „inhibitora rasta“ su ona koji se vezuju za HER2 i inhibiraju rast ćelija karcinoma koji prekomerno izražavaju HER2. Poželjna inhibitorna HER2 antitela inhibiraju rast tumora dojke SK-BR-3 u ćelijskoj kulturi za više od 20% i poželjno veću od 50% (npr. pd oko 50% do oko 100%) pri koncentraciji antitela od oko 0.5 do 30 mg/ml, gde se inhibicija rasta određuje šest dana nakon izlaganja SK-BR-3 ćelija u antitelo (videti patent SAD br. 5,677,171 izdat od 14. oktobra 1997. godine). Test inhibicije rasta ćelija SK-BR-3 je detaljnije opisan u tom patentu i u nastavku. Poželjno antitelo za inhibiranje rasta je humanizovana varijanta mišjeg monoklonskog antitela 4D5, npr., Trastuzumab.

[0083] Antitelo koje „indukuje apoptozu“ je ono koji indukuje programiranu ćelijsku smrt kao što je određeno vezivanjem aneksina V, fragmentacije DNK, smanjivanja ćelija, dilacije endoplazemskog retikuluma, fragmentacije ćelija i/ili formiranja membranskih vezikula (nazvanih apoptotska tela). Ćelija je obično jedna koja prekomerno izražava HER2 receptor. Poželjno, ćelija je tumorska ćelija, npr. dojke, jajnika, želuca, endometrijuma, pljuvačne žlezde, pluća, bubrega, debelog creva, štitne žlezde, pankreasa ili ćelije bešike. In vitro, ćelija može biti SK-BR-3, BT474, Calu 3 ćelija, MDA-MB-453, MDA-MB-361 ili SKOV3 ćelija. Dostupne su različite metode za procenu ćelijskih događaja povezanih sa apoptozom. Na primer, translokacija fosfatidil serina (PS) može se meriti vezivanjem aneksina; fragmentacija DNK može se proceniti kroz lestve DNK; i nuklearna/hromatinska kondenzacija zajedno sa fragmentacijom DNK mogu se proceniti bilo kojim povećanjem hipodipoidnih ćelija. Poželjno, antitelo koje indukuje apoptozu je ono koje rezultira u oko 2 do 50 puta, poželjno oko 5 do 50 puta, a najpoželjnije oko 10 do 50 puta, indukciju vezivanja aneksina u odnosu na neobrađenu ćeliju u aneksinskom vezivnom testu korišćenjem BT474 ćelija (videti dole). Primeri HER2 antitela koja indukuju apoptozu su 7C2 i 7F3.

[0084] „Epitop 2C4“ je region u vanćelijskom domenu HER2 na koji se vezuje antitelo 2C4. Da bi se prikazala antitela koja se vezuju za epitop 2C4, može se izvršiti rutinski test unakrsnog blokiranja, kao što je opisano u Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)-Alternativno, mapiranje epitopa se može izvršiti kako bi se procenilo da li se antitelo vezuje za 2C4 epitop HER2 korišćenjem postupaka poznatih u stanju tehnike i/ili se može proučavati struktura antitela-HER2 (Franklin i dr. Cancer Cell 5:317-328 (2004)) da bi se videlo koji je domen(i) HER2 vezan za antitelo. Epitop 2C4 sadrži ostatke iz domena II u vanćelijskom domenu HER2. 2C4 i Pertuzumab se vezuju za vanćelijski domen HER2 na spoju domena I, II i III. Franklin i dr. Cancer Cell 5:317-328 (2004).

[0085] „Epitop 4D5“ je region u vanćelijskom domenu HER2 na koji se vezuju antitela 4D5 (ATCC CRL 10463) i Trastuzumab. Ovaj epitop je blizu transmembranskog domena HER2 i unutar domena IV HER2. Da bi se prikazala antitela koja se vezuju za epitop 4D5, može se izvršiti rutinski test unakrsnog blokiranja, kao što je opisan u Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988). Alternativno, mapiranje epitopa se može izvršiti kako bi se procenilo da li se antitelo vezuje za 4D5 epitop HER2 (npr., jedan ili više ostataka u regionu od oko 529 do ostatka 625, uključujući, na Sl.1).

[0086] „Epitop 7C2/7F3“ je region na N terminusu, unutar domena I, vanćelijskog domena HER2 na koji se vezuju 7C2 i/ili 7F3 antitela (svako deponovano sa ATCC, videti dole). Da bi se prikazala antitela koja se vezuju za epitop 7C2/7F3, može se izvršiti rutinski test unakrsnog blokiranja, kao što je opisano u Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988). Alternativno, mapiranje epitopa se može izvršiti da bi se utvrdilo da li se antitelo vezuje za 7C2/7F3 epitop na HER2 (npr. bilo koji jedan ili više ostataka u regionu od oko ostatka 22 do otprilike 53 HER2 na Sl.1).

[0087] „Lečenje“ se odnosi na terapeutski tretman i profilaktičke ili preventivne mere. Oni kojima treba lečenje uključuju one koji već imaju bolest, kao i one kod kojih se bolest treba sprečiti. Prema tome, pacijentu koji se ovde može tretirati može se dijagnostifikovati kao da ima bolest ili može biti predisponiran ili podložan bolesti.

[0088] Izrazi „kancer“ i „kancerogeni“ odnose se na fiziološko stanje kod sisara, ili ga opisuju, koji se obično karakteriše neregulisanim rastom ćelija. Primeri kancera uključuju, ali nisu ograničeni na, karcinom, limfom, blastom (uključujući meduloblastom i retinoblastom), sarkom (uključujući liposarkom i sivovijalnu ćelijsku sarkomu), neuroendokrine tumore (uključujući karcinoidne tumore, gastrinom i kancer otočnih ćelija), mezoteliom, švanom (uključujući akustičnu neuromu), meningiom, adenokarcinom, melanom i leukemiju ili limfoidne maligne bolesti. Pojedini primeri takvih karcinoma uključuju kancer skvamoznih ćelija (npr. epitelijalni skvamozni ćelijski kancer), kancer pluća, uključujući pluća malih ćelija pluća, kancer pluća ne-malih ćelija, adenokarcinom pluća i skvamozni karcinom pluća, kancer peritoneuma, hepatoma, kancer debelog creva, kancer debelog creva, rektalni kancer, kolorektalni karcinom, karcinom endometrijuma ili karcinom materice, karcinom pljuvačne žlezde, kancer jetre, gastrointestinalni karcinom, kancer pankreasa, glioblastoma, kancer grlića materice, kancer jajnika, kancer bubrega ili renalni kancer, kancer prostate, kancer vulvi, karcinom tiroidne žlezde, hepatični karcinom, analni karcinom, karcinom penisa, karcinom testisa, kancer jednjaka, tumori bilijarnog trakta, kao i kancer glave i vrata.

[0089] Izraz „efektivna količina“ odnosi se na količinu leka koja je efikasna za lečenje bolesti kod pacijenta. Gde je bolest kancer, efektivna količina leka može smanjiti broj ćelija karcinoma; smanjiti veličinu tumora; inhibirati (tj., u određenoj meri sporo i poželjno prestati) infiltracija ćelija kancera u periferne organe; inhibirati (tj. usporiti do neke mere i poželjno zaustaviti) tumorske metastaze; u određenoj meri inhibira rast tumora; i/ili u određenoj meri osloboditi jedan ili više simptoma povezanih sa kancerom. U meri u kojoj lek može sprečiti rast i/ili ubiti postojeće ćelije kancera, može biti citostatički i/ili citotoksični. Efektivna količina može proširiti preživljavanje bez progresije, rezultirati objektivnim odgovorom (uključujući delimični odgovor, PR ili potpunu izloženost, CR), povećati ukupno preživljavanje i/ili poboljšati jedan ili više simptoma karcinoma.

[0090] „HER2 pozitivan kancer“ je onaj koji sadrži ćelije koji imaju HER2 protein prisutan na njihovoj ćelijski površini.

1

[0091] Kancer koji „previše izražava“ HER receptor je onaj koji ima značajno veće nivoe HER receptora, kao što je HER2, na njegovoj površini ćelija, u poređenju sa nekanceroznom ćelijom istog tipa tkiva. Ovakva prekomerna ekspresija može biti uzrokovana amplifikacijom gena ili povećanom transkripcijom ili translacijom. Prekomerna ekspresija HER receptora može se odrediti u dijagnostičkom ili prognostičkom testiranju procenom povećanih nivoa HER proteina prisutnog na površini ćelije (npr. pomoću imunohistohemijskog testa, IHC). Alternativno, ili dodatno, može se izmeriti nivo HER-kodirajuće nukleinske kiseline u ćeliji, npr. preko fluorescentne in situ hibridizacije (FISH, videti WO98/45479 objavljen oktobra 1998), južno upijanje ili tehnike polimerazne lančane reakcije (PCR), kao što je kvantitativni PCR (RT-PCR) u realnom vremenu. Može se takođe proučavati prekomerna ekspresija HER receptora merenjem prolivenih antigena (npr. vanćelijskog domena HER) u biološkoj tečnosti kao što je serum (videti npr. patent SAD br. 4,933,294 izdat 12. juna 1990. godine, WO91/05264 objavljen 18. aprila 1991; patent SAD br. 5,401,638 objavljen 28. marta 1995. i Sias i dr. J. Immunol. Methods 132: 73-80 (1990)). Osim gore navedenih analiza, razni in vivo testovi su dostupni stručnjaku. Na primer, mogu se izložiti ćelije unutar tela pacijenta u antitelu koje je opciono označeno nalepljivom etiketom, npr. radioaktivni izotop i vezivanje antitela na ćelije kod pacijenta može se proceniti, npr. spoljnim skeniranjem za radioaktivnost ili analizom biopsije uzetih od pacijenta koji je prethodno bio izložen antitelu.

[0092] Nasuprot tome, kancer koji „neprekomerno ekspresimira HER2 receptor“ je onaj koji ne izražava više od normalnih nivoa HER2 receptora u poređenju sa nekanceroznom ćelijom istog tipa tkiva.

[0093] Kancer koji „prekomerno eksprimira“ HER ligand je onaj koji proizvodi znatno viši nivo tog liganda u poređenju sa nekanceroznom ćelijom istog tipa tkiva. Ovakva prekomerna ekspresija može biti uzrokovana amplifikacijom gena ili povećanom transkripcijom ili translacijom. Prekomerna ekspresija HER liganda može se odrediti dijagnostički putem procene nivoa liganda (ili nukleinske kiseline koja je kodira) kod pacijenta, npr. u biopsiji tumora ili različitim dijagnostičkim testovima kao što su IHC, FISH, južno upijanje, PCR ili in vivo testovi opisani iznad.

[0094] Termin „citotoksični agens“ koji se ovde koristi odnosi se na supstancu koja inhibira ili sprečava funkciju ćelija i/ili uzrokuje uništenje ćelija. Izraz je namenjen uključivanju radioaktivnih izotopa (npr. At<211>, I<131>, I<125>, Y<90>, Re<186>, Re<188>, Sm<153>, Bi<212>, P<32>i radioaktivnih izotopa Lu), hemoterapeutskih sredstava i toksina kao što su toksini malih molekula ili enzimatski aktivni toksini bakterija, gljivičnog, biljnog ili životinjskog porekla, uključujući fragmente i/ili njihove varijante.

[0095] „Hemoterapeutski agens“ je hemijsko jedinjenje korisno za lečenje kancera. Primeri hemoterapijskih sredstava uključuju sredstva za alkilaciju kao što su tiotepa i ciklosfosfamid (CYTOXAN®); alkil sulfonat kao što su busulfan, improsulfan i piposulfan; aziridini kao što su benzodopa, karbo kun, meturedopa i uredopa; etilenimin i metilamelamin, uključujući altretamin, trietilenemelamin, trietilenfosforamid, trietilenetiofosforamid i trimetilolomelamin; acetogenini (posebno bulatacin i bulatacinon); delta-9-tetrahidrokanabinol (dronabinol, MARINOL®); beta-lapakon; lapakol; kolhicin; betulinska kiselina; kamptotecin (uključujući sintetički analogni topotekan (HYCAMTIN®), CPT-11 (irinotekan, CAMPTOSAR®), acetilkamptotecin, skopektektin i 9-aminokamptotecin); briostatin; callistatin; CC-1065 (uključujući njegove adezelezine, karzelesine i bizelesine sintetičke analoge); podofilotokin; podofilinična kiselina; tenipozid; kriptofikini (posebno kriptoficin 1 i kriptoficin 8); dolastatin; duokarmicin (uključujući sintetičke analoge, KW-2189 i CB1-TM1); eleuterobin; pankratistatin; sarkodictin; spongistatin; azotni gorčici, kao što su hlorambucil, hlornapazin, holofosfamid, estramustin, ifosfamid, mekloretamin, meklorethamin oksid hidrohlorid, melfalan, novembicin, fenesterin, prednimustin, trofosfamid, uracil senf; nitrosurea kao što su karmustin, hlorozotocin, fotemustin, lomustin, nimustin i ranimnustin; antibiotici kao što su enediinski antibiotici (npr., caliceamicin, posebno caliceamicin gama I i caliceamicin omega I1 (videti, npr., Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); dinemicin, uključujući dinemicin A; esperamicin , kao i neokarzinostatinski hromofor i srodni hromoproteinski endieni antiobiotski hromofori), aklacinomizini, aktinomicin, autramicin, azaserin, bleomicini, kaktinomicin, karabicin, karminicin, karzinofilin, hromomicinis, daktinomicin, daunorubicin, detorubicin, 6-diazo-5-okso-L-norleucin, doksorubicin (uključujući ADRIAMYCIN®, morfolino-doksorubicin, cijanomorpholino-dokorubicin, 2-pirolino-doksorubicin, dokorubicin HCl injekcija liposoma (DOXIL ®), liposomalni doksorubicin TLC D-99 (MYOCET®), peglilovani liposomalni doksorubicin (CAELYX ®) i deoksidoksorubicin), epirubicin, esorubicin, idarubicin, marcelomicin, mitomicini kao mitomicin C, mikofenolna kiselina, nogalamicin, olivomicini, peplomicin, potfiromicin, puromicin, kvelamicin, rodorubicin, stretonigrin, streptozocin, tubercidin, ubenimek, zinostatin, zorubicin; anti-metaboliti kao što su metotreksat, gemcitabin (GEMZAR®), tegafur (UFTORAL®), kapecitabin (XELODA®), epotilon i 5-fluorouracil (5-FU); analoge folne kiseline kao što su denopterin, metotreksat, pteropterin, trimetreksat; analogi purina kao što su fludarabin, 6-merkaptopurin, tiamiprin, tioguanin; analogi pirimidina kao što su ankitabin, azacitidin, 6-azauridin, karmofur, citarabin, dideokuridin, doksifluridin, enocitabin, floksuridin; anti-adrenalin kao što su aminoglutetimid, mitotan, trilostan; popunjavanjivači folne kiseline kao što je frolinska kiselina; aceglatone; aldofosfamidni glikozid; aminolevulinična kiselina; eniluracil; amsacrin; bestrabucil; bisantren; edatrakat; defofamin; demekolcin; diazikon; elfornitin; eliptinijum acetat; etoglucid; galijum nitrat; hidroksiurea; lentinan; lonidainin; majtansinoidi kao što su majtansin i ansamitocini; mitoguazone; mitoksantron; mopidanmol; nitraerin; pentostatin; fenamet; pirarubicin; losoksantron; 2-etilhidrazid; prokarbazin; PSK7 polisaharidni kompleks (JHS Natural Products, Eugene, OR); razoksan; rizizoksin; sizofiran; spirogermanijum; tenuazonska kiselina; triazikuone; 2,2', 2"-trihlorotrietilamin, trihotecen (naročito T-2 toksin, verakurin A, roridin A i anguidin), uretan, dakarbazin, manomustin, mitobronitol, mitolaktol, pipobroman, gacitosin, arabinosid („Ara-C“); tiotepa, taksoid, npr., paklitaksel (TAXOL®), formulacija nano-čestica paklitaksela (ABRAXANE™), i docetaksel (TAXOTERE®); hloranbucil; 6-tiogvanin; merkaptopurin; metotreksat; platinasti agensi kao što su cisplatin, oksaliplatin i karboplatin; vinkas, koji sprečavaju polimerizaciju tubulina od formiranja mikrotubula, uključujući vinblastin (VELBAN®), vinkristin (ONCOVIN®), vindesin (ELDISINE®, FILDESIN®) i vinorelbine (NAVELBINE®); etopozid (VP-16); ifosfamid; mitoksantron; leucovovin; novantron; edatrekat; daunomicin; aminopterin; ibandronat; inhibitor topoizomeraze RFS 2000; difluorometilhortritin (DMFO); retinoidi kao što je retinoinska kiselina, uključujući beksaroten (TARGRETIN®); bifosfonati kao što su klodronat (na primer BONEFOS® ili OSTAC®), etidronat (DIDROCAL®), NE-58095, zoledronska kiselina/zoledronat (ZOMETA®), alendronat (FOSAMAX®), pamidronat (AREDIA®), tiludronat (SKELID®), ili risedronat (ACTONEL®); troksacitabin (1,3-dioksolan nukleozidni analog citozina); antisens oligonukleotidi, posebno oni koji inhibiraju ekspresiju gena u signalnim putevima impliciranim u aberantnoj proliferaciji ćelija, kao što su, na primer, PKC-alfa, Raf, H-Ras i receptor epidermalnog rastnog faktora (EGF-R); vakcine kao što su vakcine THERATOPE® i vakcine protiv gena, na primer, ALLOVECTIN® vakcina, LEUVECTIN® vakcina i VAXID ® vakcina; inhibitor topoizomeraze 1 (npr., LURTOTECAN®); rmRH (npr., ABARELIX®); BAY439006 (sorafenib; Bayer); SU-11248 (Pfizer); perifozin, inhibitor COX-2 (npr., celekoksib ili etorikoksib), inhibitor proteosoma (npr., PS341); bortezomib (VELCADE®); CCI-779; tipifarnib (R11577); orafenib, ABT510; Bcl-2 inhibitor kao što je oblimersen natrijum (GENASENSE®); piksantron; EGFR inhibitori (videti definiciju ispod); inhibitori tirozin kinaze (videti definiciju ispod); i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivati bilo kog od gornjih; kao i kombinacije dva ili više gore navedenih, kao što je CHOP, skraćenica za kombinovanu terapiju ciklofosfamida, doksorubicina, vinkristina i prednizolona, i FOLFOKS, skraćenicu za režim lečenja sa oksaliplatinom (ELOKSATIN™) kombinovanim sa 5- FU i leucovovin.

[0096] U ovu definiciju su uključeni i antihormonalni agensi koji deluju da regulišu ili inhibiraju delovanje hormona na tumorima kao što su antiestrogeneni sa mešovitim agonistom/antagonistskim profilom, uključujući tamoksifen (NOLVADEX®), 4-hidroksitamoksifen, toremifen (FARESTON®), idoksifen, droloksifen, raloksifen (EVISTA®), trioksifen, keoksifen i selektivni modulatori estrogenskih receptora (SERM) kao što je SERM3; čisti anti-estrogeni bez agonističkih svojstava, kao što su fulvestrant (FASLODEX®) i EM800 (takvi agensi mogu blokirati dimerizaciju estrogenskog receptora (ER), inhibirati vezivanje DNK, povećati promet ER i/ili potiskivati ER nivoe); inhibitori aromataze, uključujući inhibitore steroidnih aromataza kao što su formestan i eksemestan (AROMASIN®) i inhibitori nesteroidnih aromataza kao što je anastrazol (ARIMIDEX®), letrozol (FEMARA®) i aminoglutetimid i drugi inhibitori aromataze, uključujući vorozol (RIVISOR®), megestrol acetat (MEGASE®), fadrozol, imidazol; lutenizujući hormon agoniste koji sprovode hormon, uključujući leuprolid (LUPRON® i ELIGARD®), goserelin, buserelin i tripterelin; seksualni steroidi, uključujući progestine kao što su megestrol acetat i medroksiprogesteron acetat, estrogeni kao što su dietilstilbestrol i premarin i androgeni/retinoidi kao što je fluoksimesteron, sve transretionske kiseline i fenretinid; onapristone; anti-progesteron; regulatorni regulatori estrogenih receptora (ERD); anti-androgeni kao što su flutamid, nilutamid i bikalutamid; testolakton; i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivati bilo kog od gornjih; kao i kombinacije dva ili više gore navedenih.

[0097] Kako se ovde koristi, termin „EGFR ciljani lek“ odnosi se na terapeutsko sredstvo koje se vezuje za EGFR i, opciono, inhibira EGFR aktivaciju. Primeri takvih agenasa uključuju antitela i male molekule koji se vezuju za EGFR. Primeri antitela koji se vezuju za EGFR uključuju MAb 579 (ATCC CRL HB 8506), MAb 455 (ATCC CRL HB8507), MAb 225 (ATCC CRL 8508), MAb 528 (ATCC CRL 8509) (videti patent SAD br.4,943, 533, Mendelsohn i dr.) i njihove varijante, kao što su himerizovani 225 (C225 ili Cetuximab; ERBUTIX7) i preoblikovani humani 225 (H225) (videti WO 96/40210, Imclone Systems Inc.); IMC-11F8,

1

potpuno humano, ciljano EGFR antitelo (Imklone); antitela koja vezuju mutant EGFR tipa II (patent SAD br.

5,212,290); humanizovana i himerna antitela koja vezuju EGFR kao što je opisano u patentu SAD br.

5,891,996; i ljudska antitela koja vezuju EGFR, kao što su ABKS-EGF ili Panitumumab (videti WO98/50433, Abgenix/Amgen); EMD 55900 (Stragliotto i dr. Eur. J. Cancer 32A:636-640 (1996)); EMD7200 (matuzumab) humanizovano EGFR antitelo usmereno protiv EGFR-a koji se takmiče sa EGF i TGF-alpha za EGFR vezivanje (EMD/Merck); humano EGFR antitelo, HuMak-EGFR (GenMab); potpuno ljudska antitela poznata pod nazivom E1.1, E2.4, E2.5, E6.2, E6.4, E2.11, E6. 3 i E7.6. 3 i opisan u SAD 6,235,883; MDX-447 (Medarex Inc); i mAb 806 ili humanizovani mAb 806 (Johns i dr., J. Biol Chem. 279 (29): 30375-30384 (2004)). Antitelo protiv EGFR-a može biti konjugovano sa citotoksičnim agensom, stoga stvarajući imunokonjugat (videti, npr., EP659,439A2, Merck Patent GmbH). EGFR antagonisti uključuju male molekule kao što su jedinjenja koja su opisana u US patentima: 5,616,582, 5,457,105, 5,475,001, 5,654,307, 5,679,683, 6,084,095, 6,265,410, 6,455,534, 6,521,620, 6,596,726, 6,713,484, 5,770,599, 6,140,332, 5,866,572, 6,399,602, 6,344,459, 6,602,863, 6,391,874, 6,344,455, 5,760,041, 6,002,008, and 5,747,498, kao i u sledećim PCT objavama: WO98/14451, WO98/50038, WO99/09016, i WO99/24037. Posebno mali molekuli EGFR antagonisti uključuju OSI-774 (CP-358774, erlotinib, TARCEVA<7>Genentech/OSI Pharmaceuticals); PD 183805 (CI 1033, 2-propenamid, N-[4-[(3-hloro-4-fluorofenil)amino]-7-[3-(4-morfolinil)propoksi]-6-kinazolinil]-, dihidrohlorid, Pfizer Inc.); ZD1839, gefitinib (IRESSA7) 4-(3=-hloro-4=-fluoroanilino)-7-metoksi-6-(3-morfolinopropoksi)kinazolin, AstraZeneca); ZM 105180 ((6-amino-4-(3-metilfenilamino)-kinazolin, Zeneca); BIBX-1382 (N8-(3-hloro-4-fluoro-fenil)-N2-(1-metil-piperidin-4-il)-pirimido[5,4-d] pirimidin-2,8-diamin, Boehringer Ingelheim ); PKI-166 ((R)-4-[4-[(1-feniletil)amino]-1 H-pirolo[2,3-d] pirimidin-6-il]-fenol); (R)-hidroksifenil)-4-[(1-feniletil)amino]-7H-pirolo [2,3-d]pirimidin); CL-387785 (N- [4-[(3-bromofenil)amino]-6-kinazolinil]-2-butinamid); EKB-569 (N-[4-[(3-hloro-4-fluorofenil)amino]-3-cijano-7-etoksi-6-hinolinil]-4-(dimetilamino)-2-butenamid) (Wyeth); AG1478 (Sugen); AG1571 (SU 5271; Sugen); dual EGFR/HER2 inhibitora tirozin kinaze kao što su lapatinib (GW 572016 ili N-[3-hloro-4-[(3-fluorofenil)metoksi]fenil] 6 [5-[2-metilsulfonil)etil]amino]metil]-2-furanil]-4-kinazolinamin; Glaxo-SmithKline) ili derivati cijanogvanidin kinazolina i cijanoamidin kinazolamina.

[0098] „Inhibitor tirozin kinaze“ je molekul koji inhibira aktivnost tirozin kinaze tirozin kinaze, kao što je HER receptor. Primeri takvih inhibitora uključuju lekove ciljane na EGFR, navedene u prethodnom paragrafu; mali molekul HER2 inhibitor tirozin kinaze, kao što je TAK165 dostupan od Takeda; CP-724,714, oralni selektivni inhibitor tirozin kinaze ErbB2 receptora (Pfizer i OSI); dual-HER inhibitori kao što je EKB-569 (dostupan od Wyeth-a) koji preferentno vezuju EGFR, ali inhibiraju i ćelije prekomerne ekspresije HER2 i EGFR; lapatinib (GW572016, dostupan od Glako-SmithKline) oralni inhibitor HER2 i EGFR tirozin kinaze; PKI-166 (dostupno iz Novartisa); pan-HER inhibitori kao što je canertinib (CI-1033; Pharmacia); Raf-1 inhibitori kao što je antisens agens ISIS-5132 dostupan od ISIS Pharmaceuticals koji inhibira Raf-1 signalizaciju; ne-HER ciljani TK inhibitori kao što je imatinib mesilat (GLEEVACC) dostupan od Glaxo; MAPK vanćelijski regulisani inhibitor kinaze I CI-1040 (dostupan u Pharmacia); kinazolini, kao što je PD 153035,4- (3-hloroanilino) kinazolin; piridopirimidini; pirimidopirimidine; pirolopirimidini, kao što su CGP 59326, CGP 60261 i CGP 62706; pirazolopirimidini, 4-(fenilamino)-7H-pirolo [2,3-d] pirimidini; kurkumin (diferuloil metan, 4,5-bis (4-fluoroanilino) ftalimid); tirfostini koji sadrže nitrothiofenove grupe; PD-0183805 (Varner-Lamber); antisenzivni molekuli (npr. oni koji se vezuju za HER-kodirajuću nukleinsku kiselinu); kinoksalini (US patent br. 5,804,396); trifostini (US patent br.

5,804,396); ZD6474 (Astra Zeneca); PTK-787 (Novartis/Schering AG); pan-HER inhibitori kao što je CI-1033 (Pfizer); Affinitac (ISIS 3521; Isis/Lilli); Imatinib mesilat (Gleevac, Novartis); PKI 166 (Novartis); GV2016 (Glako SmithKline); CI-1033 (Pfizer); EKB-569 (Vieth); Semakinib (Sugen); ZD6474 (AstraZeneca); PTK-787 (Novartis/Schering AG); INC-1C11 (Imklon); cijanoguanidin kinazolin i derivati cianoamidin hinazolamina; ili kao što je opisano u bilo kojoj od sledećih patentnih objava: Patent SAD br.

5,804,396; WO99/09016 (American Cyanamid); WO98/43960 (American Cyanamid); WO97/38983 (Warner Lambert); WO99/06378 (Warner Lambert); WO99/06396 (Warner Lambert); WO96/30347 (Pfizer, Inc); WO96/33978 (Zeneca); WO96/3397 (Zeneca); WO96/33980 (Zeneca); and US2005/0101617.

[0099] „Anti-angiogenski agens“ se odnosi na jedinjenje koje blokira ili u nekoj meri ometa razvoj krvnih sudova. Anti-angiogenski faktor može, na primer, biti mali molekul ili antitelo koje se vezuje za faktor rasta ili receptor faktora rasta koji je uključen u promovisanje angiogeneze. Poželjni anti-angiogenskii faktor ovde je antitelo koje se vezuje za Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF), kao što je Bevacizumab (AVASTIN7).

[0100] Izraz „citokin“ je generički izraz za proteine koji se oslobađaju od strane jedne ćelijske populacije koja deluje na drugu ćeliju kao intercelularni medijatori. Primeri takvih citokina su limfokini, monokini i

1

tradicionalni polipeptidni hormoni. Uključeni među citokine su hormon rasta, kao što je ljudski hormon rasta, N-metionil ljudski hormon rasta, i hormon rasta goveda; paratiroidni hormon; tiroksin; insulin; proinsulin; relakin; prorelakin; glikoproteinski hormoni kao što je folikle stimulišući hormon (FSH), stimulacioni hormon štitaste žlezde (TSH) i luteinizacijski hormon (LH); faktor rasta jetre; faktor rasta fibroblasta; prolaktin; placentalni laktogen; faktor tumorske nekroze-α i -β supstanca koja inhibira muller; miš gonadotropin-pridruženi peptid; inhibin; aktivin; vaskularni endotelijalni faktor rasta; integrin; trombopoetin (TPO); faktori rasta nerva kao što su NGF-β faktor rasta trombocita; transformišući faktore rasta (TGF) kao što su TGF-α i TGF-β faktor rasta-I i -II nalik insulinu; eritropoetin (EPO); osteoinduktivni faktori; interferoni kao što su interferon-a, -β, i -γ faktori koji stimulišu kolonije (CSF) kao što je makrofag-CSF (M-CSF); granulocit-makrofag-CSF (GM-CSF); i granulocit-CSF (G-CSF); IL-1, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL- IL-11, IL-12; faktor tumorske nekroze, kao što je TNF-α ili TNF-β i druge polipeptidne faktore uključujući LIF i kit ligand (KL). Kao što je ovde korišćeno, termin citokin uključuje proteine iz prirodnih izvora ili iz rekombinantne ćelijske kulture i biološki aktivne ekvivalente citokina sa izvornom sekvencom.

II. Sastavi varijanti HER2 antitela

[0101] Predmetni pronalazak se odnosi na sastav koji sadrži glavnu vrstu HER2 antitela koje sadrži sekvence lakog lanca i teškog lanca aminokiselinske sekvence u SEQ ID Br.15 i 16 respektivno i vezuju se za domen II HER2 i kiselinske varijante tog glavnog antitela, pri čemu je glavna vrsta HER2 antitela struktura aminokiselinske sekvence antitela u sastavu koji je kvantitativno prevladavajući molekul antitela u sastavu, pri čemu kiselinske varijante uključuju redukovanu disulfidnu varijantu.

[0102] Kiselinske varijante u sastavu mogu uključivati jednu ili obe glicirane varijante i neredukovane varijante. Kiselinske varijante u sastavu mogu takođe uključivati glicirane varijante, deamidovane varijante, sijaliliranu varijantu i neredukovanu varijantu. Poželjno, ukupna količina svih kiselinskih varijanti u sastavu je manja od oko 25%. U jednom otelotvorenju, glicirana varijanta, deamidovana varijanta, varijanta redukovana disulfidom, sijalilovana varijanta i neredukovana varijanta čine najmanje oko 75-80% kiselinskih varijanti u sastavu.

[0103] Pronalazak obezbeđuje postupak za izradu farmaceutskog sastava koji sadrži: (1) pripremu sastava koji sadrži glavnu vrstu HER2 antitela koje sadrži sekvence lakog lanca i teškog lanca aminokiselina u SEQ ID Br. 15 i 16 i koji se vezuju za domen II HER2 i kiselinske varijante te glavne vrste HER2 antitela uključujući varijantu redukovanu disulfidom i/ili neredukovanu varijantu, pri čemu je glavna vrsta HER2 antitela struktura aminokiselinske sekvence antitela u sastavu koji je kvantitativno prevladavajući molekul antitela u sastavu, i (2) procenjivanje kiselinskih varijanti u sastavu i potvrđivanje da je njegova količina manja od oko 25 %. Metoda predviđa kombinovanje sastava pre, tokom ili posle koraka (2) sa farmaceutski prihvatljivim nosačem. U jednom otelotvorenju, sastav evaluirana u koraku (2) je u farmaceutski prihvatljivom nosaču.

[0104] U jednom otelotvorenju, najmanje oko 75-80% kiselinskih varijanti (koje sadrže manje od oko 25% sastava) se biraju iz: glicirane varijante, deamidirane varijante, varijante sa smanjenim disulfidom, sijalilovane varijante i neredukovane varijante.

[0105] Kiselinske varijante mogu biti procenjene različitim metodama, ali poželjno takve metode uključuju jednu, dve, tri, četiri ili pet: jonskih naizmeničnih hromatografija (IEC) pri čemu se sastav tretira sijalidazom pre, nakon i/ili tokom IEC (npr. procena sijalilovane varijante), smanjiti CE-SDS (npr. procena varijante redukovane disulfidom), neredukovan CE-SDS (npr. procena neredukovane varijante), boronatnu hromatografiju (npr. procena glicirane varijante) i mapiranje peptida (npr. procena deamidirane varijante).

[0106] U jednom otelotvorenju, ukupne kiselinske varijante se procenjuju pomoću jonske naizmenične hromatografije, na primer koristeći izmenjivač katjona i/ili katjona sa funkcionalnom grupom karboksilata (na primer, pomoću kolone DIONEX PROPAC™ WCX-10 hromatografije). U jednom otelotvorenju takve hromatografije uslovi za hromatografiju uključuju pufer A od 20mM BisTris, pH 6.0; pufer B od 20mM BisTris, 200mM NaCl, pH 6.0; i gradijent od 0.5% pufer B na 1.0mL/min.

[0107] Sastav opciono obuhvata varijantu produženja linije amino-terminalnog lidera. Poželjno, produžetak amino-terminalnog lidera je na lakom lancu varijante antitela (npr. na jednom ili dva laka lanca varijante antitela). Glavna vrsta HER2 antitela ili varijanta antitela može biti netaknuto antitelo ili fragment antitela (npr. Fab of F (ab')2fragmenta), ali poželjno je da su oba netaknuta antitela. Varijanta antitela u ovom tekstu može sadržati produžetak amino-terminala na bilo kom jednom ili više teških ili lakih lanaca. Poželjno,

1

produžetak amino-terminalnog lidera je na jednom ili dva laka lanca antitela. Izduženje amino-terminalnog lidera poželjno sadrži ili se sastoji od VHS-. Prisustvo produžetka amino-terminalnog lidera u sastavu može se otkriti raznim analitičkim tehnikama, uključujući, ali bez ograničenja, analizu N-terminološke sekvence, analizu heterogenosti naplaćivanja (na primer, katjonsku izmenjivačku hromatografiju ili elektroforezu kapilarne zone), masovnu spektrometriju, itd. Količina varijante antitela u sastavu se uglavnom kreće od količine koja čini nižu granicu detekcije bilo kog testa (poželjno je analiza katjonske razmene) koja se koristi za otkrivanje varijante u količini koja je manja od količine glavnog antitela. Generalno, oko 20% ili manje (npr., od oko 1% do oko 15%, na primer od 5% do oko 15%, a poželjno od oko 8% do oko 12%) molekula antitela u sastavu sadrže amino- produžetak vođenja terminala. Ovakve procentualne količine se poželjno određuju korišćenjem analize razmene katjona.

[0108] Razmatrane su dodatne aminokiselinske sekvence glavnog antitela i/ili varijantne vrste, uključujući, ali ne ograničavajući se na antitelo koje sadrži C-terminalni lizinski ostatak na jednom ili oba teška lanca (takva varijanta antitela može biti prisutna u količini od oko 1% do oko 20%), antitelo sa jednim ili više oksidovanih ostataka metionina (na primer, Pertuzumab koji sadrži oksidovane met-254) itd.

[0109] Osim toga, pored sijalilirane varijante koja je gore pomenuta, glavno antitelo ili varijantna vrsta može sadržati dodatne varijacije glikozilacije, neograničavajući primeri od kojih uključuju antitelo koje sadrži G1 ili G2 oligosaharidnu strukturu prikačenu na njegov Fc region, antitelo koje sadrži vezani ugljenih hidrata za njegov laki lanac (npr., jedan ili dva ugljena hidrata, kao što je glukoza ili galaktoza, vezana za jedan ili dva laka lanca antitela, npr. vezana za jedan ili više ostataka lizina), antitelo koje sadrži jedan ili dva neglikozilovana teška lanca, itd.

[0110] Sastav se može dobiti iz genetski modifikovane ćelijske linije, npr. ćelijska linija kineskog hrčka (CHO) koja eksprimira HER2 antitelo, ili može biti pripremljena sintezom peptida.

III. Proizvodnja HER2 antitela

[0111] Sledi opis kao primerne tehnike za proizvodnju antitela korišćenih u skladu sa ovim pronalaskom. HER2 antigen koji se koristi za proizvodnju antitela može biti, na primer, rastvorni oblik vanćelijskog domena HER2 ili njegovog dela, koji sadrži željeni epitop. Alternativno, ćelije koje eksprimiraju HER2 na svojoj ćelijski površini (npr. NIH-3T3 ćelije transformisane da bi prekomerno eksprimirale HER2; ili linije karcinoma kao što su SK-BR-3 ćelije, videti Stancovski i dr. PNAS (USA) 88:8691-8695 (1991)) može se koristiti za stvaranje antitela. Ostali oblici HER2 korisni za stvaranje antitela biće očigledni stručnjacima iz oblasti.

(i) Monoklonska antitela

[0112] Monoklonalna antitela se dobijaju iz populacije suštinski homogenih antitela, tj., pojedinačna antitela koja sadrže populaciju su identična i/ili vezuju isti epitop, osim mogućih varijanti koje mogu nastati tokom proizvodnje monoklonskih antitela, kao što su one varijante koje su ovde opisane. Stoga modifikator "monoklonalni" označava karakter antitela da nije mešavina diskretnih antitela.

[0113] Na primer, monoklonalna antitela mogu se napraviti koristeći hibridom metod koji je prvi opisao Kohler i dr., Nature, 256:495 (1975), ili se može napraviti metodama rekombinantne DNK (patent SAD br.

4,816,567).

[0114] U postupku hibridoma, miš ili druga odgovarajuća domaća životinja, kao što je hrčak, imunizuju se kako je opisano ovde kako bi se izrodili limfociti koji proizvode ili su sposobni da proizvode antitela koja će se specifično vezati za protein koji se koristi za imunizaciju. Alternativno, limfociti mogu biti imunizirani in vitro. Limfociti su onda spojeni sa ćelijama mijeloma korišćenjem pogodnog fuzionog sredstva, kao što je polietilen glikol, kako bi se formirao hibridom ćelija (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)).

[0115] Tako pripremljene ćelije hibridoma se seju i rastu u odgovarajućem medijumu za kulturu, koji poželjno sadrži jednu ili više supstanci koje inhibiraju rast ili preživljavanje nefuzionisanih roditeljskih ćelija mijeloma. Na primer, ako roditeljske mijelomske ćelije nemaju enzim hipoksantin-guan-fosforiboziltransferaze (HGPRT ili HPRT), medijum za kulturu hibridoma tipično će obuhvatiti hipoksantin, aminopterin i timidin (HAT medijum), čije supstance sprečavaju rast HGPRT-deficitiranih ćelija.

[0116] Preferirane ćelije mijeloma su one koje efikasno rastvaraju, podržavaju stabilnu visokokvalitetnu proizvodnju antitela od izabranih ćelija za proizvodnju antitela i osetljive su na medijum kao što je HAT medijum. Među njima, željene mijelomske ćelijske linije su linije mijelomskih linija miša, kao što su one

1

izvedene iz MOPC-21 i MPC-11 tumora miševa dostupnih iz Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA, i SP-2 ili X63-Ag8-653 ćelije dostupne iz American Type Culture Collection, Rockville, Maryland USA. Humani mijelom i ćelijske linije mišića i ljudskih heteromijeloma takođe su opisani za proizvodnju ljudskih monoklonskih antitela (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); and Brodeur i dr., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).

[0117] Kulturni medijum u kome raste hibridom ćelija se analizira za proizvodnju monoklonskih antitela usmerenih protiv antigena. Poželjno, specifičnost vezivanja monoklonskih antitela proizvedenih od ćelija hibridoma se određuje imunoprecipitacijom ili in vitro testom vezivanja, kao što je radioimunski test (RIA) ili enzimom povezani imunoabsorbentni test (ELISA).

[0118] Afinitet vezivanja monoklonskih antitela može, na primer, biti određen pomoću the Scatchard analysis of Munson i dr., Anal. Biochem., 107:220 (1980).

[0119] Nakon što se identifikuju ćelije hibridoma koje proizvode ćelije željene specifičnosti, afiniteta i/ili aktivnosti, klonovi mogu biti podklonirani ograničavajućim procedurama za razblaženje i uzrokovani standardnim metodama (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). Pogodni medijumi za kulturu za ovu svrhu uključuju, na primer, D-MEM ili RPMI-1640 medijum. Pored toga, ćelije hibridoma mogu se uzgajati in vivo kao tumori asciti kod životinja.

[0120] Monoklonska antitela koja se izlučuju od strane podklona su pogodno odvojena od medija kulture, ascitne tečnosti ili seruma konvencionalnim postupcima prečišćavanja antitela kao što su, na primer, protein A-Sepharose, hromatografija hidroksilapatita, elektroforeza gela, dijaliza ili afinitetna hromatografija.

[0121] DNK koja kodira monoklonalna antitela se lako izoluje i sekvencira korišćenjem konvencionalnih procedura (npr., koristeći oligonukleotidne sonde koje su sposobne da se specifično vezuju za gene koji kodiraju teške i lake lance mišjih antitela). Ćelije hibridoma služe kao preferirani izvor takve DNK. Jednom izolovana, DNK se može staviti u vektore ekspresije, koji se onda transfektiraju u ćelije domaćina, kao što su ćelije E. coli, COS simian ćelije, ćelije kineskog hrčka (CHO) ili ćelije mijeloma koje inače ne proizvode proteine antitela, kako bi se postigla sinteza monoklonskih antitela u rekombinantnim ćelijama domaćina. Pogledati članke o rekombinantnoj ekspresiji kod bakterija DNK koji kodiraju antitelo uključuju Skerra i dr., Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993) i Pluckthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992).

[0122] U daljem otelotvorenju, monoklonalna antitela ili fragmenti antitela mogu biti izolovani iz fagalnih biblioteka antitela generisanih korišćenjem tehnika opisanih u McCafferti i dr., Nature, 348: 552-554 (1990). Clackson i dr., Nature, 352: 624-628 (1991) i Marks i dr., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991) opisuju izolaciju muških i ljudskih antitela, koristeći fage biblioteke. Sledeće publikacije opisuju proizvodnju ljudskih antitela sa visokim afinitetom (nM opsega) ljudskim antitelima pomoću lančane mešavine (Marks i dr., Bio/Technologi, 10: 779-783 (1992)), kao i kombinatornu infekciju i in vivo rekombinaciju kao strategija izgradnja veoma velikih faga biblioteka (Vaterhouse i dr., Nuc. Acids Res., 21: 2265-2266 (1993)). Prema tome, ove tehnike su održive alternative alternativama tradicionalnim tehnikama hibridoma monoklonalnih antitela za izolaciju monoklonskih antitela.

[0123] DNK se takođe može modifikovati, na primer, supstitujući sekvencu kodiranja za konstantne domene humanog teškog lanca i lakog lanca umesto homolognih murinskih sekvenci (patent SAD br. 4,816,567 i Morrison, i dr., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)) ili kovalentno spajajući sekvencu kodiranja imunoglobulina sve ili deo kodirajuće sekvence za neimunoglobulinski polipeptid.

[0124] Tipično, takvi neimunoglobulinski polipeptidi zamenjuju konstantne domene antitela ili su zamenjeni varijabilnim domenima jednog antigen-kombinacionog mesta antitela kako bi se stvorilo himerno bivalentno antitelo koje sadrži jedno antigen-kombinaciono mesto koje ima specifičnost za antigen i drugo antigensko kombinovanje, koje ima specifičnost za različiti antigen.

(ii) Humanizovana antitela

[0125] Metode humanizovanja nehumanih antitela opisane su u stanju tehnike. Poželjno, humanizovano antitelo ima jedan ili više aminokiselinskih ostataka uneta u njega iz izvora koji nije čovek. Ovi nehumani ostaci aminokiselina se često nazivaju "uvoznim" ostacima, koji se obično uzimaju iz "uvoznog" varijabilnog domena. Humanizacija se u suštini može izvršiti po metodu Winter i saradnika (Jones i dr., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann i dr., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen i dr., Science, 239:1534-1536 (1988)), zamenom sekvenci hipervarijabilnih regiona za odgovarajuće sekvence humanog antitela. Shodno tome,

1

takva "humanizovana" antitela su himerna antitela (patent SAD br. 4,816,567) gde su značajno manje od netaknutog humanog varijabilnog domena zamenjeni odgovarajućim sekvencom iz neljudske vrste. U praksi, humanizovana antitela su uglavnom humana antitela u kojima su neki ostaci hipervarijalnog regiona i eventualno neki ostaci FR ostali supstrati sa analognih mesta u antitelima glodara.

[0126] Izbor ljudskih varijabilnih domena, i lakih i teških, koji se koriste za izradu humanizovanih antitela, veoma je važno za smanjenje antigeničnosti. Prema tzv. "best-fit" metodi, sekvenca varijabilnog domena antitela za glodare je prikazana prema celoj biblioteci poznatih ljudskih sekvenci varijabilnog domena. Ljudska sekvenca koja je najbliža onoj kod glodara potom se prihvata kao ljudski okvirni region (FR) za humanizovano antitelo (Sims i dr., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia i dr., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). Druga metoda koristi određeni okvirni region izveden iz konsenzusnog sekvenca svih ljudskih antitela određene podgrupe lakih ili teških lanaca. Isti okvir se može koristiti za nekoliko različitih humanizovanih antitela (Carter i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta i dr., J. Immunol., 151:2623 (1993)).

[0127] Dalje je važno da antitela budu humanizovana zadržavanjem visokog afiniteta za antigen i druga povoljna biološka svojstva. Da bi se postigao ovaj cilj, prema poželjnoj metodi, humanizovana antitela se pripremaju procesom analize roditeljskih sekvenci i različitih konceptualnih humanizovanih proizvoda koristeći trodimenzionalne modele roditeljskih i humanizovanih sekvenci. Trodimenzionalni imunoglobulin modeli su često dostupni i poznati su stručnjacima u ovoj oblasti. Na raspolaganju su kompjuterski programi koji ilustruju i prikazuju verovatne trodimenzionalne konformacijske strukture odabranih kandidatskih imunoglobulinskih sekvenci. Pregled ovih prikaza omogućava analizu verovatne uloge ostataka u funkcionisanju kandidatske imunoglobulinske sekvence, tj. analize ostataka koji utiču na sposobnost kandidatskog imunoglobulina da veže svoj antigen. Na ovaj način, FR ostaci mogu biti odabrani i kombinovani od primaoca i uvoznih sekvenci tako da se postigne željena karakteristika antitela, kao što je povećan afinitet za ciljni antigen(e). Generalno, ostaci hipervarijabilnog regiona su direktno i najosetljivije uključeni u uticaj na vezivanje antigena.

[0128] Patent SAD br. 6,949,245 opisuje proizvodnju primera humanizovanih HER2 antitela koja vezuju HER2 i blokiraju aktivaciju liganda HER receptora. Humanizovano antitelo od posebnog interesa ovde blokira EGF, TGF-α i/ili HRG posredovano aktiviranje MAPK-a u suštini efikasno kao netaknuto mišje monoklonsko antitelo 2C4 (ili njen fragment Fab) i/ili vezuje HER2 u suštini efikasno kao netaknuto mišje monoklonsko antitelo 2C4 (ili njegov Fab fragment). Humanizovano antitelo ovde može, na primer, da sadrži nehumane hipervarijabilne regionske ostatke inkorporirane u humani varijabilni teški domen i dalje mogu obuhvatati zamenu okružnog regiona (FR) na poziciji izabranoj iz grupe koju čine 69H, 71H i 73H koristeći varijabilni domen sistema numeracije predviđen u Kabat i dr., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). U jednom otelotvorenju, humanizovano antitelo sadrži supstitucije FR na dva ili svim mestima 69H, 71H i 73H.

[0129] Primerno humanizovano antitelo od interesa ovde obuhvata promenljive teške komplementarnost koje određuju ostatke GFTFTDYTMX, gde je X poželjno D ili S (SEQ ID NO:7); DVNPNSGGSIYNQRFKG (SEQ ID NO: 8); i/ili NLGPSFYFDY (SEQ ID NO:9), opciono obuhvata modifikacije aminokiselina onih CDR ostataka, npr. gde modifikacije u suštini održavaju ili unapređuju afinitet antitela. Na primer, varijanta antitela od interesa može imati od oko jedan do oko sedam ili oko pet aminokiselinskih supstitucija u gornjoj varijabilnoj teškoj CDR sekvenci. Takve varijante antitela mogu se pripremiti afinitetom sazrevanja, npr., kako je opisano u nastavku. Najpoželjnije humanizovano antitelo sadrži varijantu teške aminokiselinske sekvence u SEQ ID NO: 4.

[0130] Humanizovano antitelo može sadržati promenljive komplementarnost za određivanje komplementarnosti KASQDVSIGVA (SEQ ID NO: 10); SASYX<1>X<2>X<3>, gde X<1>je poželjno R ili L, X<2>je poželjno Y ili E, a X<3>je poželjno T ili S (SEQ ID NO: 11); i/ili QQYYIYPYT (SEQ ID NO: 12), npr. pored ovih varijabilnih CDR ostataka teškog domena u prethodnom paragrafu. Takva humanizovana antitela opciono sadrže aminokiselinske modifikacije gore navedenih CDR ostataka, npr. gde modifikacije u suštini održavaju ili unapređuju afinitet antitela. Na primer, varijanta antitela od interesa može imati od oko jedan do oko sedam ili oko pet aminokiselinskih supstitucija u gore navedenim varijabilnim CDR sekvencama. Takve varijante antitela mogu se pripremiti afinitetom sazrevanja, npr., kako je opisano u nastavku. Najpoželjnije humanizovano antitelo sadrži varijantnu lake aminokiselinske sekvence u SEQ ID NO: 3.

2

[0131] Ova aplikacija takođe obuhvata afinitet zrelih antitela koja vezuju HER2 i blokiraju aktivaciju liganda HER receptora. Matično antitelo može biti humano antitelo ili humanizovano antitelo, na primer, ono koje sadrži varijabilnu laku i/ili varijablu tešku sekvencu SEQ ID No. 3 i 4, respektivno (tj. varijanta 574). Antitelo zrelog afiniteta poželjno se vezuje za HER2 receptor sa afinitetom superiornijim od onog kod netaknutog 2C4 miša ili netaknutoj varijanti 574 (npr. od oko dva ili oko četiri puta, do oko 100 puta ili oko 1000 puta poboljšanog afiniteta, npr. procenjen pomoću HER2 - vanćelijskog domena (ECD) ELISA). Primeri varijabilnih teških CDR ostataka za supstituciju uključuju H28, H30, H34, H35, H64, H96, H99 ili kombinacije dva ili više (npr. dva, tri, četiri, pet, šest ili sedam od ovih ostataka). Primeri varijabilnih lakih CDR ostataka za promenu uključuju L28, L50, L53, L56, L91, L92, L93, L94, L96, L97 ili kombinacije od dva ili više (npr. dva do tri, četiri, pet ili do deset ostataka).

[0132] Razmatrani su različiti oblici humanizovanog antitela ili zrelih antitela afiniteta. Na primer, humanizovano antitelo ili antitelo zrelog afiniteta može biti fragment antitela, kao što je Fab, koji je opciono konjugovan sa jednim ili više citotoksičnih sredstava radi generisanja imunokonjugata. Alternativno, humanizovano antitelo ili antitelo zrelog afiniteta može biti netaknuto antitelo, kao što je netaknuto IgG1 antitelo.

(iii) Humana antitela

[0133] Kao alternativa humanizaciji, mogu se generisati humana antitela. Na primer, sada je moguće proizvesti transgene životinje (npr., miševe) koji su sposobni, nakon imunizacije, da proizvedu potpuni repertoar humanih antitela u odsustvu endogene proizvodnje imunoglobulina. Na primer, opisano je da homozigotna brisanja gena za vezivanje regiona teškog lanca (JH) antitela u himernim miševima i mutiranim miševima dovodi do potpune inhibicije proizvodnje endogenih antitela. Prenos humane germne linije imunoglobulinskih gena u takvim mutantnim miševima bi rezultirao stvaranjem ljudskih antitela nakon izazivanja antigena. Vidi, npr., Jakobovits i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits i dr., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann i dr., Year in Immuno., 7:33 (1993); i patenti SAD br.5,591,669, 5,589,369 i 5,545,807.

[0134] Alternativno, tehnologija fagnog prikazivanja (McCafferty i dr., Nature 348:552-553 (1990)) može se koristiti za proizvodnju ljudskih antitela i fragmenata antitela in vitro, od repertoara gena domena promenljivih imunoglobulina (V) od humanih donora. Prema ovoj tehnici, geni domena antitela V su klonirani u ramu ili u većem ili manjem proteinu gena filamentnog bakteriofaga, kao što su M13 ili fd, i prikazani kao funkcionalni fragmenti antitela na površini fagne čestice. Zbog toga što filamentna čestica sadrži jednostruku DNK kopiju gena faga, izbori zasnovani na funkcionalnim svojstvima antitela takođe rezultiraju selekcijom gena koji kodira antitelo koje pokazuje te osobine. Dakle, fag imitira neke od osobina B-ćelije. Prikaz faga se može izvesti u različitim formatima; za njihov pregled vidi, npr., Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993). Za fagni prikaz može se koristiti nekoliko izvora segmenta V-gena. Clackson i dr., Nature, 352:624-628 (1991) izolovao je raznovrsnu masu antioksazolonskih antitela iz male slučajne kombinatorne biblioteke V gena izvedenih iz slezina imuniziranih miševa. Repertoar V gena od neimuniziranih humanih donora mogu se konstruisati i antitela različitim nizom antigena (uključujući i samo-antigene) mogu se izolovati u suštini po tehnikama koje su opisali Marks i dr., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), ili Griffith i dr., EMBO J. 12:725-734 (1993). Videti, takođe, patente SAD br.5,565,332 i 5,573,905.

[0135] Ljudska antitela mogu takođe biti generisana in vitro aktiviranim B-ćelijama (videti patente SAD 5,567,610 i 5,229,275).

[0136] Ljudska HER2 antitela su opisana u patentu SAD br. 5,772,997 objavljenom 30. juna 1998. i WO 97/00271 objavljenom 3. januara 1997. godine.

(iv) Fragmenti antitela

[0137] Razvijene su različite tehnike za proizvodnju fragmenata antitela. Tradicionalno, ovi fragmenti su izvedeni putem proteolitičke digestije netaknutih antitela (videti, npr., Morimoto i dr. , Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992); i Brennan i dr., Science, 229:81 (1985)). Međutim, ovi se fragmenti sada mogu direktno proizvesti rekombinantnim ćelijama domaćina. Na primer, fragmenti antitela mogu biti izolovani iz fagnih biblioteka antitela o kojima se govori iznad. Alternativno, Fab'-SH fragmenti mogu biti direktno obrađeni od E. coli i hemijski spojeni da bi se formirali F(ab')2fragmenti (Carter i dr., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). Prema drugom pristupu, F(ab')2fragmenti mogu biti izolovani direktno od rekombinantne ćelije domaćina. Druge tehnike za proizvodnju fragmenata antitela biće očigledne stručnom licu. U drugim otelotvorenjima, željeno antitelo je FV fragment sa jednim lancem (scFv). Vidi WO 93/16185; patent SAD br. 5,571,894; i patent SAD br.5,587,458. Antitelo fragment takođe može biti „linearno antitelo“, na primer, kako je opisano u patentu SAD br. 5,641,870, na primer. Takvi fragmenti linearnih antitela mogu biti monospecifični ili bispecifični.

(v) Bispecifična antitela

[0138] Bispecifična antitela su antitela koja imaju specifičnosti vezivanja za najmanje dva različita epitopa. Primerna bispecifična antitela mogu se vezati za dva različita epitopa HER2 proteina. Druga takva antitela mogu kombinovati HER2 vezujuće mesto sa vezujućim mestima za EGFR, HER3 i/ili HER4. Alternativno, HER2 ruka može biti kombinovana sa rukom koja se vezuje za pokretački molekul na leukocitu kao što je molekul receptora T-ćelija (npr. CD2 ili CD3) ili Fc receptori za IgG (FciR), kao što je FcyRI (CD64) , FcyRII (CD32) i FcyRIII (CD16), kako bi se ćelijski mehanizmi odbrane fokusirali na HER2-ekspresionu ćeliju. Bispecifična antitela se takođe mogu koristiti za lokalizaciju citotoksičnih sredstava za ćelije koje eksprimiraju HER2. Ova antitela poseduju HER2-vezujuću ruku i ruku koja vezuje citotoksično sredstvo (npr. saporin, anti-interferon-α, vinka alkaloid, ricin A lanac, metotreksat ili radioaktivni izotop hapten). Bispecifična antitela mogu se dobiti kao antitela u punoj dužini ili fragmenti antitela (npr. F(ab')2bispecifična antitela).

[0139] WO 96/16673 opisuje bispecifično HER2/FcγRIII antitelo i patent SAD br. 5,837,234 obelodanjuje bispecifično HER2/FcγRI antitelo IDM1 (Osidem). Bispecifično HER2/Fca antitelo je prikazano u WO98/02463. U patentu SAD br. 5,821,337 predviđeno je bispecifično HER2/CD3 antitelo. MDX-210 je bispecifično HER2- FcγRIII Ab.

[0140] Metode za izradu bispecifičnih antitela poznate su u stanju tehnike. Tradicionalna proizvodnja bispecifičnih antitela pune dužine zasnovana je na koekspresiji dva para imunoglobulina teških lanca-lakih lanaca, gde dva lanca imaju različite specifičnosti (Millstein i dr., Nature, 305:537-539 (1983)). Zbog slučajnog asortimana teških i lakih lanaca imunoglobulina, ovi hibridomi (kvadromi) proizvode potencijalnu mešavinu od 10 različitih molekula antitela, od kojih samo jedna ima tačnu bispecifičnu strukturu. Prečišćavanje tačnog molekula, koji se obično vrši pomoću afinitetnih hromatografskih koraka, prilično je teško, a prinos proizvoda je nizak. Slične procedure su objavljene u WO 93/08829, i u Traunecker i dr., EMBO J., 10:3655-3659 (1991).

[0141] Prema drugačijem pristupu, varijabilni domeni antitela sa željenim karakteristikama vezivanja (mesta za kombinovanje antitela i antigena) su spojeni sa sekvencama konstantnog domena imunoglobulina. Fuzija je poželjna sa konstantnim domenom teškog lanca imunoglobulina, koja sadrži bar deo zavisnog, CH2 i CH3 regiona. Poželjno je imati prvi konstantni region teškog lanca (CH1) koji sadrži mesto neophodno za vezivanje lakog lanca, prisutno u najmanje jednoj od fuzija. DNK koje kodiraju fuzije teških lanaca imunoglobulina i, ako je poželjno, lakog lanca imunoglobulina, ubacuju se u odvojene vektore ekspresije i ko-transfektiraju u odgovarajući organizam domaćina. Ovo obezbeđuje veliku fleksibilnost u prilagođavanju uzajamnih proporcija tri polipeptidna fragmenta u otelotvorenjima kada nejednaki odnosi tri lanca polipeptida koji se koriste u konstrukciji pružaju optimalne prinose. Međutim, moguće je ubaciti kodirajuće sekvence za dva ili sva tri polipeptidna lanca u jednom ekspresionom vektoru, kada ekspresija najmanje dva polipeptidna lanca u jednakim odnosima rezultira visokim prinosima ili kada su odnosi bez posebnog značaja.

[0142] U poželjnom otelotvorenju ovog pristupa, bispecifična antitela su sastavljena od teškog lanca hibridnog imunoglobulina sa prvom vezivnom specifičnošću u jednoj ruci i parom teških lanca imunoglobulina (koji obezbeđuje drugu vezujuću specifičnost) u drugoj ruci. Utvrđeno je da ova asimetrična struktura olakšava odvajanje željenog bispecifičnog jedinjenja od neželjenih kombinacija imunoglobulinskih lanaca, pošto prisustvo lakog lanca imunoglobulina u samo jednoj polovini bispecifičnog molekula omogućava lakši način odvajanja. Ovaj pristup je objavljen u WO 94/04690. Za dalje detalje o generisanju bispecifičnih antitela vidi, na primer, Suresh i dr., Methods in Enzymology, 121:210 (1986).

[0143] Prema drugom pristupu koji je opisan u patentu SAD br. 5,731,168, interfejs između par molekula antitela može se konstruisati da maksimizira procenat heterodimera koji se obnavljaju iz rekombinantne ćelijske kulture. Poželjni interfejs sadrži bar deo CH3 domena konstantnog domena antitela. U ovom postupku, jedan ili više bočnih lanaca male aminokiseline iz interfejsa prvog molekula antitela zamenjuju se sa većim bočnim lancima (npr. tirozinom ili triptofanom). Kompenzirajuće „šupljine“ identične ili slične veličine velikog bočnog lanca(lanaca) stvorene su na interfejsu drugog molekula antitela zamenom velikih lanaca aminokiselina sa manjim (npr. alaninom ili treoninom). Ovo obezbeđuje mehanizam za povećanje prinosa heterodimera u odnosu na druge neželjene krajnje proizvode kao što su homodimeri.

[0144] Bispecifična antitela uključuju unakrsna ili „heterokonjugatna“ antitela. Na primer, jedno od antitela u heterokonjugatu može se spojiti sa avidinom, a drugo sa biotinom. Takva antitela su, na primer, predložena da ciljaju ćelije imunog sistema na neželjene ćelije (patent SAD br. 4,676,980) i za lečenje HIV infekcije (WO 91/00360, WO 92/200373 i EP 03089). Heterokonjugatna antitela mogu se napraviti koristeći bilo koje pogodne metode unakrsnog povezivanja. Pogodni agensi za ukrštanje su dobro poznati u struci i obelodanjeni su u patentu SAD br.4,676,980, zajedno sa nizom tehnika unakrsnog povezivanja.

[0145] Tehnike generisanja bispecifičnih antitela iz fragmenata antitela takođe su opisane u literaturi. Na primer, bispecifična antitela mogu biti pripremljena korišćenjem hemijske veze. Brennan i dr., Science, 229: 81 (1985) opisuju postupak u kome se netaknuta antitela proteolitički odvajaju kako bi se generisali F(ab')2fragmenti. Ovi fragmenti su smanjeni u prisustvu agensa natrijum arsenita za kombinovanje ditiola, koji stabilizuje susedne ditiole i sprečava nastanak intermolekularnih disulfida. Generisani fragmenti Faba pretvaraju se u derivate tionitrobenzoata (TNB). Jedan od Fab'-TNB derivata se zatim pretvara u Fab'-tiol redukcijom sa merkaptoetilaminom i pomeša se sa ekvimolarnom količinom drugog Fab'-TNB derivata da bi se formiralo bispecifično antitelo. Bispecifična antitela proizvedena mogu se koristiti kao sredstva za selektivnu imobilizaciju enzima.

[0146] Nedavni napredak omogućio je direktan oporavak Fab'-SH fragmenata od E. coli, koji se može hemijski spajati i formirati bispecifična antitela. Shalaby i dr., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992) opisuju proizvodnju potpuno humanizovanog bispecifičnog antitela F(ab')2molekula. Svaki Fab' fragment se zasebno izlučio iz E. coli i podvrgnut je usmerenoj hemijskoj sprezi in vitro da bi se formiralo bispecifično antitelo. Tako formirano bispecifično antitelo moglo se vezati za ćelije koje prekomerno eksprimiraju HER2 receptor i normalne humane T ćelije, kao i pokretanje litičke aktivnosti humanih citotoksičnih limfocita protiv ciljanih tumora dojki.

[0147] Takođe su opisane razne tehnike za izradu i izolaciju fragmenata bispecifičnih antitela direktno iz rekombinantne ćelijske kulture. Na primer, bispecifična antitela su proizvedena korišćenjem leucinskih otvarača. Kostelny i dr., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992). Leucinski peptidni otvarači iz proteina Fos i Jun su povezani sa delima Faba dva različita antitela fuzijom gena. Homodimeri antitela su redukovani u regiji šarke da bi se formirali monomeri i zatim ponovo oksidovani da bi se formirali heterodimeri antitela. Ovaj metod se takođe može koristiti za proizvodnju homodimera antitela. Tehnologija „diatela“ koju su opisali Hollinger i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993) obezbedio je alternativni mehanizam za izradu fragmenata bispecifičnih antitela. Fragmenti sadrže varijabilni domen teškog lanca (VH) povezan sa varijabilnim domenom lakog lanca (VL) pomoću linkera koji je prekratak da bi omogućio uparivanje između dva domena na istom lancu. Shodno tome, VH i VL domeni jednog fragmenta prisiljavaju se upariti sa komplementarnim VL i VH domenima drugog fragmenta, čime se formiraju dva mesta za vezivanje antigena. Prijavljena je još jedna strategija za izradu bispecifičnih fragmenata antitela korišćenjem jednolančnih Fv (sFv) dimera. Videti Gruber i dr., J. Immunol., 152:5368 (1994).

[0148] Antitela sa više od dve valencije su razmatrane. Na primer, mogu se pripremiti trispecifična antitela. Tutt i dr. J. Immunol.147: 60 (1991).

(vi) Druge modifikacije aminokiselinskih sekvenci

[0149] Smišljene su modifikacije aminokiselinske sekvence antitela HER2 koja su ovde opisana. Na primer, može biti poželjno poboljšati afinitet vezivanja i/ili druga biološka svojstva antitela. Varijante aminokiselinskih sekvenci antitela HER2 se pripremaju uvođenjem odgovarajućih promena nukleotida u nukleinskoj kiselini antitela HER2 ili sintezom peptida. Takve modifikacije uključuju, na primer, brisanje i/ili umetanje u i/ ili supstituciju ostataka u aminokiselinskim sekvencama HER2 antitela. Bilo koja kombinacija brisanja, ubacivanja i supstitucije napravljena je da stigne do konačnog konstrukta, pod uslovom da konačni konstrukt poseduje željene karakteristike. Promene aminokiselina takođe mogu promeniti posttranslacijske procese HER2 antitela, kao što je promena broja ili položaja mesta glikozilacije.

[0150] Koristan metod za identifikaciju određenih ostataka ili regiona HER2 antitela koji su poželjne lokacije za mutagenezu naziva se "mutageneza skeniranja alanina", kako što je opisano od strane Cunningham and Wells Science, 244:1081-1085 (1989). Ovde se identifikuje ostatak ili grupa ciljanih ostataka (npr. oštećeni ostaci kao što su arg, asp, his, lys i glu) i zamenjuju se neutralnom ili negativno naelektrisanom aminokiselinom (najpoželjnije alaninom ili polialaninom) da utiču na interakciju

2

aminokiselina sa HER2 antigenom. Lokacije tih aminokiselina koje pokazuju funkcionalnu osetljivost na supstitucije zatim se prečišćavaju uvođenjem dodatnih ili drugih varijanti na ili za mesta supstitucije. Tako, iako je mesto za uvođenje varijacije aminokiselinske sekvence unapred određeno, priroda mutacije per se ne mora prethodno odrediti. Na primer, da bi se analizirala performansa mutacije na datom mestu, ala skeniranje ili slučajna mutageneza se sprovodi na ciljnom kodonu ili regionu, a ekspresirane varijante HER2 antitela se prikazuju za željenu aktivnost.

[0151] Uključivanje aminokiselinske sekvence uključuju aminokiseline i/ili karboksil-terminalne fuzije dužine od jednog ostatka do polipeptida koji sadrže stotinu ili više ostataka, kao i intrasekvencijalna ubacivanja pojedinačnih ili višestrukih aminokiselinskih ostataka. Primeri terminalnih ubacivanja uključuju HER2 antitelo sa N-terminalnim metionilnim ostatkom ili antitelo spojeno sa citotoksičnim polipeptidom. Druge varijante ubacivanja molekula antitela HER2 uključuju fuziju na N- ili C-terminus antitela HER2 na enzim (npr. za ADEPT) ili polipeptid koji povećava polu-život antitela u serumu.

[0152] Druga vrsta varijanti je varijanta supstitucije aminokiselina. Ove varijante imaju najmanje jedan aminokiselinski ostatak u molekulu antitela HER2 zamenjen drugačijim ostacima. Lokacije od najvećeg interesa za supstitucionu mutagenezu uključuju hipervarijabilne regione ili CDR-e, ali takođe su zamišljeni i promene FR ili Fc regiona. Konzervativne supstitucije su prikazane u Tabeli 1 pod naslovom „poželjne supstitucije“. Ukoliko takve zamene rezultiraju promenom biološke aktivnosti, onda se mogu uvesti i znatnije promene, naznačene „primerne supstitucije“ u tabeli 1 ili kako je dalje opisano u daljem tekstu u odnosu na klase aminokiselina, a proizvodi pregledani.

Tabela 1

[0153] Značajne modifikacije u biološkim svojstvima antitela ostvaruju se selekcijom supstitucija koje se značajno razlikuju u njihovom uticaju na održavanje(a) strukture polipeptidnog magneta u području supstitucije, na primer, kao lista ili spiralne konformacije, (b) naelektrisanje ili hidrofobičnost molekula na ciljnom mestu, ili (c) najveći deo bočnog lanca. Aminokiseline mogu biti grupisane prema sličnostima u svojstvima njihovih bočnih lanaca (u A. L. Lehninger, in Biochemistry, second ed., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)):

(1) nepolarne: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M)

(2) nenaelektrisane polarne: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q)

(3) kiselinske: Asp (D), Glu (E)

(4) bazične: Lys (K), Arg (R), His (H)

[0154] Alternativno, prirodni ostaci mogu biti podeljeni u grupe na osnovu zajedničkih osobina bočnih lanaca:

(1) hidrofobna: Norleucin, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) neutralna hidrofilna: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) kiselina: Asp, Glu;

(4) bazična: His, Lys, Arg;

(5) ostaci koji utiču na orijentaciju lanca: Gly, Pro;

(6) aromatični: Trp, Tyr, Phe.

[0155] Nekonzervativne supstitucije će podrazumevati razmenu člana jedne od ovih klasa za drugu klasu.

[0156] Svaki ostatak cisteina koji nije uključen u održavanje odgovarajuće konformacije HER2 antitela takođe može biti supstituisan, generalno sa serinom, radi poboljšanja oksidativne stabilnosti molekula i sprečavanja aberantnog unakrsnog povezivanja. Nasuprot tome, cisteinska veza(e) se može dodati antitelu radi poboljšanja njegove stabilnosti (naročito tamo gde je antitelo antitelski fragment kao što je Fv fragment).

[0157] Posebno poželjna vrsta supstitucionih varijanti podrazumeva zamenu jednog ili više hipervarijabilnih regiona ostataka roditeljskog antitela (npr. humanizovano ili humano antitelo). Uopšteno govoreći, rezultujuća varijanta(e) odabrana za dalji razvoj će imati poboljšana biološka svojstva u odnosu na roditeljsko antitelo iz kojeg se generišu. Pogodan način za stvaranje takvih supstitucionih varijanti podrazumeva sazrevanje afiniteta koristeći fagni prikaz. Ukratko, nekoliko hipervarijabilnih područja regiona (npr. 6-7 lokacija) su mutirane da generišu sve moguće amino supstitucije na svakoj lokaciji. Tako proizvedene varijante antitela prikazane su monovalentno od filamentoznih čestica faga kao fuzije do proizvoda gena III M13 pakiranog unutar svake čestice. Prikazane varijante na fagama se zatim prikazuju za njihovu biološku aktivnost (npr. afinitet vezivanja), kako je ovde obelodanjeno. Da bi se identifikovale lokacije hipervarijabilnog regiona za modifikaciju, može se izvršiti mutageneza skeniranja alanina za identifikaciju ostataka hipervarijabilnog regiona koji znatno doprinose vezivanju antigena. Alternativno, ili dodatno, može biti korisno analizirati kristalnu strukturu kompleksa antigena-antitela da bi se identifikovale kontaktne tačke između antitela i huma HER2. Takvi kontaktni ostaci i susedni ostaci su kandidati za supstituciju u skladu sa tehnikama koje su ovde izložene. Kada se takve varijante generišu, panel varijanti je podvrgnut prosejavanju kako je ovde opisano, a antitela sa superiornim osobinama u jednom ili više relevantnih testova mogu biti odabrana za dalji razvoj.

[0158] Drugi tip varijante aminokiselina antitela menja originalni obrazac glikozilacije antitela. Promenom podrazumeva se brisanje jednog ili više ugljenih hidrata u antitelu i/ili dodavanje jednog ili više mesta glikozilacije koji nisu prisutni u antitelu.

[0159] Glikozilacija antitela je tipično N-vezana ili O-povezana. N-vezni odnosi se na vezivanje ugljovodoniče grupe na bočni lanac ostatka asparagina. Tripeptidne sekvence asparagin-X-serin i asparagin-X-treonin, gde je KXs bilo koja aminokiselina osim prolina, su sekvence prepoznavanja za enzimsko vezivanje ugljovodonične grupe na asparaginski bočni lanac. Tako prisustvo bilo koje od ovih tripeptidnih sekvenci u polipeptidu stvara potencijalno mesto glikozilacije. O-povezana glikozilacija se odnosi na vezivanje jednog od šećera N-aceilgalaktozamina, galaktoze ili ksiloze u hidroksiamino kiselinu, najčešće serin ili treonin, iako se može koristiti 5-hidroksiprolin ili 5-hidroksilizin.

[0160] Dodavanje mesta glikozilacije u antitelo se pogodno vrši izmenjivanjem aminokiselinske sekvence tako da sadrži jednu ili više od gore opisanih tripeptidnih sekvenci (za N-povezane glikozilaciona mesta). Promena se takođe može izvršiti dodavanjem ili supstitucijom pomoću jednog ili više ostataka serina ili treonina u sekvenci prvobitnog antitela (za O-vezane glikozilaciona mesta).

[0161] Gde antitelo sadrži Fc region, svaka oligosaharidna struktura koja je prikačena na njega može se izmeniti. Na primer, antitela sa zrelom ugljovodoničnom strukturom koja nema fokozu koja je vezana za Fc region antitela opisana je u patentnoj prijavi SAD br. US 2003/0157108 A1, Presta, L. Videti takođe US 2004/0093621 A1 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Antitela sa bisekcionim N-acetilglukozaminom

2

(GlcNAc) u oligosaharidnoj strukturi vezanoj za Fc region antitela navedeni su u WO03/011878, Jean-Mairet i dr. i US patent 6,602,684, Umana i dr. Antitela sa najmanje jednim ostatkom galaktoze u strukturi oligosaharida prikačenih na Fc region antitela su prijavljeni u WO97/30087, Patel i dr. Videti takođe WO98/58964 (Raju, S.) i WO99/22764 (Raju, S.) koja se odnose na antitela sa izmenjenim ugljenim hidratima vezanim za njihov region Fc. Sastavi antitela koja sadrže glavno antitelo sa takvim ugljovodoničnim strukturama vezanim za jedan ili dva teška lanca regiona Fc su ovde razmatrani.

[0162] Molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju varijante aminokiselinskih sekvenci antitela HER2 su pripremljeni različitim metodama poznatim u tehnici. Ove metode uključuju, ali nisu ograničene na, izolaciju iz prirodnog izvora (u slučaju prirodnih varijanti aminokiselinskih varijanti) ili pripreme putem mutageneze posredovane oligonukleotidom (ili usmerenom na mesto), mutagenezu PCR i kasetnom mutagenezom ranije pripremljene varijante ili ne-varijantna verzija HER2 antitela.

(vii) Skrining antitela sa željenim osobinama

[0163] Tehnike generisanja antitela su opisane iznad. Mogu se dodatno odabrati antitela sa određenim biološkim karakteristikama, po želji.

[0164] Da bi se identifikovalo antitelo koje blokira aktivaciju liganda HER receptora, sposobnost antitela da blokira vezivanje HER liganda na ćelije koje eksprimiraju HER receptor (npr., u konjugaciji sa drugim HER receptorom pomoću koga HER receptor koji je u interesu formira HER hetero-oligomer ) može se odrediti. Na primer, ćelije koje prirodno eksprimiraju ili transfektuju da eksprimiraju HER receptore HER heterolognog oligomera mogu biti inkubirane sa antitelom, a zatim izložene označenom HER ligandu. Potom se može proceniti sposobnost HER2 antitela da blokira vezivanje liganda na HER receptor u HER heterooligomeru.

[0165] Na primer, inhibicija vezivanja HRG na MCF7 ćelijske linije tumora dojke pomoću HER2 antitela može se izvesti korišćenjem jednoslojnih MCF7 kultura na ledu u formatu od ploče sa 24 otvora u suštini kao što je opisano u WO01/00245. HER2 monoklonalna antitela mogu biti dodata u svaki otvor i inkubirana 30 minuta. 125I-označeni rHRGβ1177-224(25 pm) se zatim mogu dodati, a inkubacija se može nastaviti 4 do 16 sati. Krive odgovora na dozu mogu se pripremiti i može se izračunati vrednost IC50za antitelo od interesa. U jednom otelotvorenju antitelo koje blokira aktivaciju liganda HER receptora imaće IC50za inhibiranje HRG vezivanja za MCF7 ćelije u ovom testu od oko 50 nM ili manje, još poželjnije 10 nM ili manje. Kada je antitelo fragment antitela kao što je Fab fragment, IC50za inhibiranje HRG vezivanja za MCF7 ćelije u ovom testu može, na primer, biti oko 100 nM ili manje, još poželjnije 50 nM ili manje.

[0166] Alternativno ili dodatno, može se proceniti sposobnost HER2 antitela da blokira HER ligandstimulisanu tirozinsku fosforilaciju HER receptora prisutnog u HER hetero-oligomeru. Na primer, ćelije koje endogenom eksprimiraju HER receptore ili koje su transfektovane do izražaja mogu biti inkubirane sa antitelom, a zatim se analiziraju za aktivnosti vezane za HER ligand, koji zavise od fosforilacije tirozina koristeći monoklonali anti-fosfotirozin (koji je opciono konjugovan sa detektibilnom etiketom). Test aktivacije receptora kinaze opisan u patentu SAD br. 5,766,863 i takođe je dostupan za određivanje aktivacije HER receptora i blokiranje te aktivnosti antitelom.

[0167] U jednom otelotvorenju, može se prikazati antitelo koje inhibira HRG stimulaciju p180 tirozin fosforilacije u MCF7 ćelijama u suštini kao što je opisano u WO01/00245. Na primer, ćelije MCF7 mogu biti pokrivene pločama sa 24 otvora, a monoklonalna antitela u HER2 mogu se dodati u svaku bazu i inkubirati 30 minuta na sobnoj temperaturi; onda se rHRGβ1177-244može dodati u svaki otvor do krajnje koncentracije od 0.2 nM, a inkubacija se može nastaviti 8 minuta. Mediji mogu biti ispareni iz svakog otvora, a reakcije se mogu zaustaviti dodavanjem 100 µl SDS uzorka pufera (5% SDS, 25 mM DTT i 25 mM Tris-HCl, pH 6.8). Svaki uzorak (25 ml) može biti elektroforeziran na gradijentnom gelu od 4-12% (Novex), a zatim elektroforetski preneti na poliviniliden difluoridnu membranu. Može se razviti antifosfotirozin (na 1 µg/ml) imunobloti, a intenzitet pretežne reaktivne trake na Mr~ 180.000 može biti kvantifikovan pomoću refleksne densitometrije. Odabrano antitelo poželjno će značajno inhibirati HRG stimulaciju p180 tirozin fosforilacije na oko 0-35% kontrole u ovom testu. Kriva krive odgovora za inhibiciju HRG stimulacije p180 tirozin fosforilacije, kao što je određeno refleksivnom densitometrijom, može se pripremiti i IC50za antitelo od interesa može se izračunati. U jednom otelotvorenju antitelo koje blokira aktivaciju liganda HER receptora ima IC50za inhibiranje HRG stimulacije p180 tirozin fosforilacije u ovom testu od oko 50 nM ili manje, još poželjnije 10 nM ili manje. Kada je antitelo fragment antitela kao što je Fab fragment, ICso za inhibiranje HRG stimulacije p180 tirozin fosforilacije u ovom testu može, na primer, biti oko 100nM ili manje, još bolje 50nM ili manje.

2

[0168] Jedan takođe može proceniti inhibitorne efekte antitela na MDA-MB-175 ćelije, npr., u suštini kao što je opisano u Schaefer i dr. Oncogene 15:1385-1394 (1997). Prema ovom testu, MDA-MB-175 ćelije mogu da se tretiraju sa HER2 monoklonskim antitelom (10µg/mL) tokom 4 dana i obojeni kristalnom ljubičastom. Inkubacija sa HER2 antitelom može pokazati inhibitorni efekat rasta na ovoj ćelijskoj liniji slična onoj koju prikazuje monoklonsko antitelo 2C4. U daljem otelotvorenju, egzogeni HRG neće značajno obrnuti ovu inhibiciju. Poželjno, antitelo će moći da inhibira ćelijsku proliferaciju ćelija MDA-MB-175 u većoj meri od monoklonskih antitela 4D5 (i opciono u većoj meri od monoklonskih antitela 7F3), i to u prisustvu i odsustvu egzogenog HRG.

[0169] U jednom otelotvorenju, HER2 antitelo od interesa može blokirati heregulinsko zavisno udruživanje HER2 sa HER3 u ćelijama MCF7 i SK-BR-3, kao što je određeno u eksperimentu ko-imunoprecipitacije, kao što je on opisano u WO01/00245 znatno efikasnije nego monoklonsko antitelo 4D5, a poželjno znatno efikasnije od monoklonskog antitela 7F3.

[0170] Za identifikaciju antitela HER2 inhibitora rasta, mogu se prikazati antitela koja inhibiraju rast ćelija karcinoma koji prekomerno izražavaju HER2. U jednom otelotvorenju, izbor inhibitornog antitela za rast može inhibirati rast SK-BR-3 ćelija u ćelijskoj kulturi za oko 20-100% i poželjno za oko 50-100% pri koncentraciji antitela od oko 0.5 do 30 µg/ml. Za identifikaciju takvih antitela može se izvršiti test SK-BR-3 opisan u patentu SAD br. 5,677,171. Prema ovom testu, ćelije SK-BR-3 se gaje u smeši F12 i DMEM od 1:1 uz dodatak sa 10% fetalnog goveđeg seruma, glutamina i penicilin streptomicina. SK-BR-3 ćelije su pokrivene u 20.000 ćelija u 35-milimetarskoj posudi ćelijske kulture (2mls/35mm posuda). 0.5 do 30 µg/ml HER2 antitela se dodaje po posudi. Posle šest dana, broj ćelija u poređenju sa neobrađenim ćelijama se računa pomoću elektronskog brojača ćelija COULTER™. Ova antitela koja inhibiraju rast SK-BR-3 ćelija za oko 20-100% ili oko 50-100% mogu biti izabrana kao inhibitori antitela za rast. Videti patent SAD br.

5,677,171 za ispitivanja za prosejavanje za inhibitorna inhibitora antitela, kao što su 4D5 i 3E8.

[0171] Da bi se odabrali za antitela koja indukuju apoptozu, dostupan je aneksin vezujući test pomoću BT474 ćelija. BT474 ćelije su kultivisane i zasejane u posudama kao što je navedeno u prethodnom paragrafu. Medijum se zatim uklanja i zamenjuje svežim medijumom ili medijumom koji sadrži 10µg/ml monoklonskog antitela. Posle trodnevnog perioda inkubacije, monoslojevi se ispiraju sa PBS i odvoje tripsinizacijom. Ćelije se zatim centrifugiraju, resuspendiraju u Ca<2+>puferu za vezivanje i alokvotiraju u cevi kao što je već pomenuto za analizu smrti ćelije. Cevi zatim dobijaju označeni aneksin (npr., aneksin V-FTIC) (1µg/ml). Uzorci su možda analizirani pomoću FACSCAN™ protočnog citometra i FACSCONVERT™ CellQuest softvera (Becton Dickinson). Ova antitela koja indukuju statistički značajne nivoe vezivanja aneksina u odnosu na kontrolu su odabrana kao antitela koja indukuju apoptozu. Pored analize vezivanja aneksina, dostupan je test za bojenje DNK pomoću BT474 ćelija. Da bi se izvršio ovaj test, BT474 ćelije koje su tretirane antitelom od interesa kao što je opisano u prethodnim paragrafima, inkubiraju sa 9µg/ml HOECHST33342™ tokom 2 sata na 37°C, a zatim analiziraju na protoku EPICS ELITE ™ citometar (Coulter Corporation) koristeći MODFIT LT™ softver (Verity Software House). Antitela koja indukuju promenu procenta apoptotskih ćelija koje su 2 puta ili veće (i poželjno 3 puta ili više) od neobrađenih ćelija (do 100% apoptotskih ćelija) mogu se izabrati kao pro-apoptotička antitela koristeći ovaj test. Videti WO98/17797 za testove za prosejavanje za antitela koja indukuju apoptozu, kao što su 7C2 i 7F3.

[0172] Da bi se prikazala antitela koja se vezuju za epitop na HER2 vezanom za antitelo od interesa, rutinski unakrsni test blokiranja, kao što je opisan u Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988), može da se izvrši da bi se procenilo da li antitelo unakrsno blokira vezivanje antitela, kao što je 2C4 ili Pertuzumab, na HER2. Alternativno, ili dodatno, mapiranje epitopa može se obaviti metodama poznatim u struci i/ili se može proučiti struktura antitela-HER2 (Franklin i dr. Cancer Cell 5:317-328 (2004)) da bi videlo koji domen(i) HER2 je/su vezao(li) antitelo.

(viii) Imunokonjugati

[0173] Takođe su opisani imunokonjugati koji sadrže antitelo konjugovano sa citotoksičnim agensom kao što je hemoterapeutski agens, toksin (npr. toksin malog molekula ili enzimatski aktivni toksin bakterijskog, gljivičnog, biljnog ili životinjskog porekla, uključujući fragmente i/ili njihove varijante) ili radioaktivni izotop (tj., radiokonjugat).

[0174] Hemoterapeutska sredstva koja su korisna u stvaranju takvih imunokonjugata su opisana iznad. Konjugati antitela i jednog ili više toksina malog molekula, kao što su kaliheamicin, maitansin (patent SAD br. 5,208,020), trikoten i CC1065 takođe su ovde razmatrani.

2

[0175] Antitelo može biti konjugovano sa jednim ili više molekula majtansina (npr. oko 1 do oko 10 maitansin molekula po molekulu antitela). Maitansin se, na primer, može pretvoriti u May-SS-Me, koji se može svesti na May-SH3 i reagovati sa modifikovanim antitelima (Chari i dr. Cancer Research 52: 127-131 (1992)) za generisanje imunokonjugata majtansinoid-antitela .

[0176] Drugi imunokonjugat od interesa sadrži HER2 antitelo konjugovano sa jednim ili više molekula kaliheamicina. Porodica antibiotika kaliheamicina je sposobna da proizvede dvostruke prekide DNK u podpikomolarnim koncentracijama. Strukturni analogi kaliheamicina koji mogu biti korišćeni obuhvataju, ali bez ograničenja, , γ1, α2, α3, N-acetyl-γ1, PSAG i θ1(Hinman i dr. Cancer Research 53: 3336-3342 (1993) i Lode i dr. Cancer Research 58: 2925-2928 (1998)). Videti, takođe, patent SAD br. 5,714,586; 5,712,374; 5,264,586; i 5.773.001.

[0177] Enzimatski aktivni toksini i njegovi fragmenti koji se mogu koristiti mogu uključivati difterijin A lanac, nevezujući aktivni fragmenti difterijskog toksina, lanac egzotoksina A (iz Pseudomonas aeruginosa), ricin A lanac, lanac Abrin A, modecin A lanac, alfa-sarcin, Aleurites fordii proteini , diantin proteini, proteini Phytolaca americana (PAPI, PAPII i PAP-S), inhibitor gorke dinje, curcin, crotin, inhibitor sapaonaria officinalis, gelonin, mitogelin, restocin, fenomein, enomicin i trikothecen. Videti, na primer, WO 93/21232 objavljen 28. oktobra 1993. godine.

[0178] Imunokonjugat se može formirati između antitela i jedinjenja sa nukleolitičkom aktivnošću (npr., ribonukleazom ili DNK endonukleazom, kao što je dezoksiribonukleaza, DNaza).

[0179] Na raspolaganju su različiti radioaktivni izotopi za proizvodnju HER2 antitela radiokonjugiranih. Primeri uključuju At<211>, I<131>, I<125>, Y<90>, Re<186>, Re<188>, Sm<153>, Bi<212>, P<32>i radioaktivne izotope Lu.

[0180] Konjugati antitela i citotoksičnog agensa mogu se izraditi pomoću različitih agensa za vezivanje bifunkcionalnih proteina kao što su N-sukcinimidil-3-(2-piridilditiol)propionat (SPDP), sukcinimidil-4-(N-maleimidometil)cikloheksan-1-karboksilat, iminotiolana (IT), bifunkcionalnih derivata imidoestera (kao što je dimetil adipimidat HCL), aktivnih estara (kao što je disukcinimidil suberat), aldehida (kao što je glutareldehid), bis-azido jedinjenja (kao što je bis(p-azidobenzoil)heksandiamin)derivati bis-diazonijuma (kao što su bis-(p-diazoniumbenzoil)-etilendiamin), diizocijanati (kao tolien 2,6-diizocijanat) i bis-aktivna jedinjenja fluora (kao što je 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzen). Na primer, ricin imunotoksin se može pripremiti kako je opisano u Vitetta i dr. Science 238: 1098 (1987). Karbon-14-označena 1-izotiocianatobenzil-3-metildietilen triaminepentaocetna kiselina (MKS-DTPA) je primerno helatno sredstvo za konjugaciju radionukleotida u antitelo. Videti WO94/11026. Linker može biti „razdvojivi linker“ koji olakšava oslobađanje citotoksičnog leka u ćeliji. Na primer, može se koristiti kiselinski labilni linker, linker vezan za peptidazu, linker sa dimetil linkerom ili disulfid (Chari i dr. Cancer Research 52: 127-131 (1992)).

[0181] Alternativno, fuzioni protein koji sadrži HER2 antitelo i citotoksično sredstvo mogu se napraviti, npr. rekombinantnim tehnikama ili sintezom peptida.

[0182] Antitelo može biti konjugovano sa „receptorom“ (kao što je streptavidin) za upotrebu u prethodnom ciljanju tumora gde se konjugat receptora antitela daje pacijentu, nakon čega sledi uklanjanje nevezanog konjugata iz cirkulacije pomoću sredstva za čišćenje, a zatim davanjem „liganda“ (npr. avidina) koji je konjugovan sa citotoksičnim agensom (npr. radionukleotidom).

(ix) Druge modifikacije antitela

[0183] Druge modifikacije antitela su ovde razmatrane. Na primer, antitelo može biti povezano sa jednim od različitih neproteinastičnih polimera, npr. polietilen glikola, polipropilen glikola, polioksialkilena ili kopolimera polietilen glikola i polipropilen glikola. Antitelo se takođe može uhvatiti u mikrokapsule pripremljene, na primer, tehnikom koacervacije ili međusobnom polimerizacijom (na primer, hidroksimetilcelulozom ili mikrokapsulama želatina i mikrokapsulama iz poli-(metilmetakilata)), u koloidnim sistemima za dostavu lekova (na primer, lipozomi, albumin mikrosfere, mikroemulzije, nanočestice i nanokapsule) ili u makroimulzijama. Takve tehnike su obelodanjene u Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A., Ed., (1980).

[0184] Može biti poželjno modifikovati antitelo u odnosu na efektorsku funkciju, npr. kako bi se poboljšala antigen-zavisna ćelijsko posredovana citotoksičnost (ADCC) i/ili zavisna citotoksičnost (CDC) antitela. Ovo se može postići uvođenjem jedne ili više supstitucija aminokiselina u Fc regionu antitela. Alternativno ili dodatno, ostaci cisteina mogu biti uvedeni u regionu Fc, čime se omogućava formiranje međuproizvoda disulfidnih veza u ovom regionu. Homodimerno antitelo koje je stvoreno na taj način može imati poboljšanu

2

sposobnost za interakciju i/ili povećanu ćelijsko ubistvo posredovano komplementom i ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC). Caron i dr., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) i Shopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992). Homodimerna antitela sa poboljšanom anti-tumorskom aktivnošću mogu se takođe pripremiti koristeći heterobifunkcionalne unakrsne linkere kao što je opisano u Wolff i dr. Cancer Research 53:2560-2565 (1993). Alternativno, antitelo može biti projektovano tako da ima dva Fc regiona i na taj način može imati poboljšanu lizu komplementa i ADCC sposobnosti. Videti Stevenson i dr. Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989).

[0185] WO00/42072 (Presta, L.) opisuje antitela sa poboljšanom ADCC funkcijom u prisustvu humanih efektorskih ćelija, gde antitela sadrže supstitucije aminokiselina u njihovom Fc regionu. Poželjno, antitelo sa poboljšanim ADCC sadrži supstitucije na pozicijama 298, 333 i/ili 334 regiona Fc. Poželjno, izmenjen Fc region je humani IgG1 Fc region koji sadrži ili se sastoji od zamena na jednom, dva ili tri od ovih položaja.

[0186] Antitela sa izmenjenim Clq vezivnom i/ili komplementnom zavisnom citotoksičnošću (CDC) su opisana u WO99/51642, patent SAD br. 6,194,551B1, patent SAD br. 6,242,195B1, patent SAD br.

6,528,624B1 i patent SAD br. 6,538,124 (Idusogie et al). Antitela obuhvataju supstituciju aminokiselina na jednoj ili više pozicija aminokiselina 270, 322, 326, 327, 329, 313, 333 i/ili 334 njihovom Fc regionu.

[0187] Da bi povećali polu-život antitela u serumu, može se inkorporirati epitop vezujući receptor u antitelo (naročito fragment antitela) kao što je opisano u patentu SAD 5,739,277, na primer. Kao što se ovde koristi, termin "receptivni vezivni receptor za spasavanje" odnosi se na epitop Fc regiona IgG molekula (npr. IgG1, IgG2, IgG3, ili IgG4) koji je odgovoran za povećanje polu-života in vivo seruma molekula IgG. Antitela sa supstitucijama u Fc regionu i povećane polu-života seruma opisana su takođe u WO00/42072 (Presta, L.).

[0188] Takođe su predviđena projektovana antitela sa tri ili više (poželjno četiri) funkcionalnih mesta za vezivanje antigena (patentna prijava SAD br. US2002/0004587 A1, Miller i dr.).

[0189] HER2 antitela koja su ovde prikazana mogu takođe biti formulisana kao imunolipozomi. Lipozomi koji sadrže antitelo se dobijaju metodama poznatim u stanju tehnike, kao što je opisano u Epstein i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985); Hwang i dr., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77:4030 (1980); patentn SAD br.4,485,045 i 4,544,545; i WO97/38731 objavljeni 23. oktobra 1997. godine. Lipozomi sa povišenim vremenom cirkulacije su objavljeni u patentu SAD br.5,013,556.

[0190] Posebno korisni lipozomi mogu se generisati postupkom isparavanja reverzne faze sa lipidnim sastavom koji sadrži fosfatidilholin, holesterol i PEG-derivatizovan fosfatidiletanolamin (PEG-PE). Lipozomi se ekstrudiraju kroz filtere definisane veličine pora kako bi se dobili lipozomi sa željenim prečnikom. Fab' fragmenti antitela iz ovog pronalaska mogu biti konjugovani sa lipozomima kao što je opisano u Martin i dr. J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982) putem reakcije disulfidne zamene. Hemoterapeutski agens opciono se nalazi u lipozomima. Videti Gabizon i dr. J. National Cancer Inst.81(19)1484 (1989).

IV. Farmaceutkse formulacije

[0191] Terapeutske formulacije sastava prema predmetnom pronalasku se pripremaju za skladištenje mešanjem sastava sa opcionim farmaceutski prihvatljivim nosačima, ekscipijensima ili stabilizatorima (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), u obliku liofilizovanih formulacija ili vodenim rastvorima. Prihvatljivi nosači, ekscipijensi ili stabilizatori su netoksični za primaoce u primenjenim dozama i koncentracijama i uključuju pufere kao što su fosfat, citrat i druge organske kiseline; antioksidansi uključujući askorbinsku kiselinu i metionin; konzervansi (kao što je oktadecildimetilbenzil amonijum hlorid, heksametonski hlorid, benzalkonijum hlorid, benzetonijum hlorid, fenol, butil ili benzil alkohol, alkil parabeni kao što su metil ili propil paraben, katehol, rezorcinol; cikloheksanol; 3-pentanol; i m-kresol); niske molekulske mase (manje od 10 ostataka) polipeptida; proteini, kao što su serumski albumini, želatin ili imunoglobulini; hidrofilni polimeri kao što je polivinilpirolidon; aminokiseline kao što su glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin ili lizin; monosaharidi, disaharidi i drugi ugljeni hidrati, uključujući glukozu, manozu ili dekstrine; helatirajući agensi kao što su EDTA; šećeri kao što su saharoza, manitol, trehaloza ili sorbitol; kontra-joni koji formiraju soli kao što je natrijum; metalni kompleksi (npr., kompleksi Zn-proteina); i/ili nejonske surfaktante kao što su TWEENJ, PLURONICSJ ili polietilen glikol (PEG). Formulacije liofilizovanih HER2 antitela opisane su u WO 97/04801. Posebno poželjne formulacije za sadašnji sastav opisane su u US20006/088523.

[0192] Formulacija ovde može takođe sadržati više od jednog aktivnog jedinjenja ako je potrebno za određenu indikaciju koja se tretira, poželjno ona sa komplementarnim aktivnostima koje ne negativno utiču

2

jedni na druge. Na primer, može biti poželjno dalje da obezbedi antitela koja se vezuju za EGFR, HER2 (npr. antitelo koje povezuje različiti epitop na HER2), HER3, HER4 ili vaskularni endotelijalni faktor (VEGF) u jednoj formulaciji. Alternativno, ili dodatno, sastav može dalje obuhvatati hemoterapeutsko sredstvo, citotoksično sredstvo, citokin, agens za inhibiranje rasta, antihormonalno sredstvo, EGFR ciljani lek, anti-angiogeni agens, inhibitor tirozin kinaze i/ili kardioprotektant. Takvi molekuli su odgovarajuće prisutni u kombinaciji u količinama koje su efikasne u namenjenu svrhu.

[0193] Aktivni sastojci se takođe mogu uhvatiti u mikrokapsule pripremljene, na primer, tehnikom koacervacije ili međusobnom polimerizacijom, na primer, hidroksimetilcelulozom ili mikrokapsulama želatina i mikrokapsulama iz poli (metilmetakilata), u koloidnim sistemima za davanje lekova (na primer, lipozomi, albumin mikrosfere, mikroemulzije, nano-čestice i nanokapsule) ili u makroemulzijama. Takve tehnike su otkrivene u 16. izdanju Remington's Pharmaceutical Sciences, Osol, A. Ed. (1980).

[0194] Pripreme za održavano oslobađanje mogu se pripremiti. Pogodni primeri preparata sa produženim oslobađanjem uključuju semipermeabilne matrice čvrstih hidrofobnih polimera koje sadrže antitelo, koje su matrice u obliku oblikovanih proizvoda, npr. filmove ili mikrokapsule. Primeri matrica sa trajnim oslobađanjem uključuju poliestere, hidrogele (na primer, poli(2-hidroksietil-metakrilat) ili poli(vinilalkohol)), polilaktidi (patent SAD 3,773,919), kopolimeri L-glutaminske kiseline i γ etil-L-glutamat, ne-razgradivi etilen-vinil acetat, kopolimeri mlečne kiseline i glikolne kiseline koji se mogu razgraditi, kao što su LUPRON DEPOT™ (injektirajuće mikrosfere sastavljene od kopolimera mlečne kiseline i glikolne kiseline i leuprolid acetata) i poli-D-(-)-3-hidroksibutatna kiselina.

[0195] Formulacije koje se koriste za in vivo primenu moraju biti sterilne. Ovo se lako postiže filtracijom kroz sterilne filtracione membrane.

V. Tretman sa sastavom HER2 antitela

[0196] Smatra se da se HER2 antitelo može koristiti za lečenje kancera. Kancer je generalno HER2 pozitivan, tako da se HER2 antitelo ovde može povezati sa ćelijama karcinoma. U jednom otelotvorenju, kancer izražava nizak HER3 (npr. kancer jajnika) ili ima povišeni odnos HER2:HER3 (npr. kancer jajnika). Razni kanceri koji se mogu tretirati sa sastavom navedeni su u odeljku definicija iznad.

[0197] Poželjni kanceri koji se ovde tretiraju uključuju: kancer dojke, uključujući HER2 pozitivan kancer dojke, opciono u kombinaciji sa trastuzumabom i taksoidom kao što je docetaksel, uključujući i neoadjuvansnu terapiju kancera dojke; kancer jajnika (uključujući i platinastu i kancer jajnika osetljiv na platinu) (videti npr. US2006/0013819); kancer pluća (uključujući ne-maloletna ćelijska karcinoma pluća, NSCLC), opciono u kombinaciji sa EGFR inhibitorom (videti npr. SAD 2007/0020261); kolorektalni kancer itd.

[0198] Takođe je predviđeno da se HER2 antitelo može koristiti za lečenje različitih nemalignih bolesti ili poremećaja, kao što je autoimuna bolest (npr. psorijaza); endometrioza; skleroderma; restenoza; polipi kao što su polipi debelog creva, nazalni polipi ili gastrointestinalni polipi; fibroadenoma; respiratorne bolesti; holecistitis; neurofibromatoza; policistička bolest bubrega; inflamatorne bolesti; poremećaji kože uključujući psorijazu i dermatitis; vaskularne bolest; uslovi koji uključuju abnormalnu proliferaciju vaskularnih epitelnih ćelija; gastrointestinalni ulkusi; Menetrijeva bolest, sekretujući sindrom adenoma ili proteinskog gubitka; poremećaji bubrega; angiogeni poremećaji; okularna bolest, kao što je makularna degeneracija starosne dobi, pretpostavljeni sindrom očnog histoplazmoze, neovaskularizacija mrežnjače od proliferativne dijabetičke retinopatije, vaskularizacija retine, dijabetička retinopatija ili makularna degeneracija uzrasta; patologije povezane sa kostima kao što su osteoartritis, rahitis i osteoporoza; oštećenje nakon cerebralnog ishemijskog događaja; fibrotične ili edemijske bolesti, kao što su hepatična ciroza, pluća fibroza, karkoidoza, troiditis, sindrom hiperviskoznosti, Osler Weber-Rendu bolest, hronična okluzivna plućna bolest ili edem nakon opekotina, trauma, zračenje, moždani udar, hipoksija ili ishemija; preosetljivost reakcije kože; dijabetičku retinopatiju i dijabetičku nefropatiju; Guillain-Barre sindrom; bolest grafta protiv bolesnika domaćina ili odbacivanje transplantata; Pagetova bolest; zapaljenje kostiju ili zglobova; fotoaging (npr., uzrokovano UV zračenjem čoveka);benigna hipertrofija prostate; određene mikrobiološke infekcije uključujući mikrobiološke patogene odabrane od adenovirusa, hantavirusa, Borrelia burgdorferi, Iersinia spp. i Bordetella pertussis; trombus izazvan agregacijom trombocita; reproduktivni uslovi kao što su endometrioza, sindrom hiperstimulacije jajnika, preeklampsija, disfunkcionalno krvarenje u materici ili menometrorhagija; sinovitis; ateroma; akutne i hronične nefropatije (uključujući proliferativni glomerulonefritis i bubrežnu bolest izazvanu dijabetesom); ekcem; hipertrofična formacija ožiljaka; endotoksični šok i gljivična infekcija; familijarna polimoza adenomatoze; neurodenergijske bolesti (npr., Alchajmerova bolest, demencija koja se odnosi na AIDS, Parkinsonova bolest, amiotrofična lateralna skleroza, pigmentoza retinitisa, atrofija spinalnog mišića i degeneracija cerebelara); mielodisplastični sindromi; aplastična anemija; ishemijska povreda; fibroza pluća, bubrega ili jetre; T-ćelijska hipersenzitivna bolest posredovana ćelijama; infantilna hipertrofična pilorična stenoza; urinarni opstruktivni sindrom; psoriatični artritis; i Hasimotoov tiroiditis. Poželjne nemaligne indikacije za terapiju ovde uključuju psorijazu, endometriozu, sklerodermu, vaskularnu bolest (npr., restenozu, arterosklerozu, bolest koronarne arterije ili hipertenziju), polipove debelog creva, fibroadenom ili respiratorno oboljenje (npr., astma, hronični bronhitis, bronhijeaktaza ili cistična fibroza) .

[0199] Tretman sa antitelom HER2 rezultiraće poboljšanjem znakova ili simptoma bolesti. Na primer, kada je lečenje oboljenje karcinoma, takva terapija može dovesti do poboljšanja preživljavanja (ukupnog preživljavanja i/ili preživljavanja bez progresije) i/ili može dovesti do objektivnog kliničkog odgovora (delimičnog ili potpunog).

[0200] Poželjno, HER2 antitelo u datom sastavu je golo antitelo. Međutim, primenjeno antitelo HER2 može biti konjugovano sa citotoksičnim agensom. Poželjno, ćelija imunokonjugata i/ili HER2 na koju je vezana je/se internalizuje od strane ćelije, što dovodi do povećane terapeutske efikasnosti imunokonjugata u ubijanju ćelije kancera na koju se vezuje. U poželjnom otelotvorenju, citotoksično sredstvo cilja ili ometa nukleinsku kiselinu u ćeliji karcinoma. Primeri takvih citotoksičnih agenasa uključuju majtanzinoide, kaliheamicin, ribonukleaze i DNA endonukleaze.

[0201] HER2 antitelo se daje ljudskom pacijentu u skladu sa poznatim metodama, kao što je intravenozna primena, npr., kao bolus ili kontinuirana infuzija tokom određenog vremenskog perioda, intramuskularnim, intraperitonealnim, intrakerobrospinalnim, subkutanim, intraartikularnim, intrasinovskim, intratekalni, oralni, lokalni ili putevi udisanja. Poželjno je intravenozno davanje sastava antitela.

[0202] Za sprečavanje ili lečenje bolesti, odgovarajuća doza HER2 antitela zavisiće od vrste bolesti koja se treba tretirati, kao što je prethodno definisano, težine i toka bolesti, bilo da se antitelo HER2 primenjuje u preventivne ili terapeutske svrhe, prethodnoj terapiji, kliničku istoriju pacijenta i odgovor na HER2 antitelo i diskreciju lekara koji prisustvuje. HER2 antitelo se adekvatno primenjuje kod pacijenta jednom ili tokom niza tretmana. U zavisnosti od vrste i ozbiljnosti bolesti, oko 1 µg/kg do 50 mg/kg (npr., 0.1-20 mg/kg) HER2 antitela je inicijalna doza kandidata za primenu kod pacijenta, bilo da je, na primer, jednim ili više odvojenih davanja, ili kontinuiranom infuzijom. U jednom aspektu početno vreme infuzije za antitelo HER2 može biti duže od sledećih vremena infuzije, na primer oko 90 minuta za početnu infuziju i približno 30 minuta za sledeće infuzije (ako se prva infuzija dobro toleriše). Poželjna doza HER2 antitela biće u opsegu od oko 0.05 mg/kg do oko 10 mg/kg. Tako se pacijentu može davati jedna ili više doza od oko 0.5 mg/kg, 2.0mg/kg, 4.0mg/kg ili 10mg/kg (ili bilo koja njihova kombinacija). Takve doze mogu se primenjivati povremeno, npr. svake sedmice ili svake treće nedelje (npr. tako da pacijent prima od oko dva do oko dvadeset, npr. oko šest doza HER2 antitela). Inicijalna veća opterećena doza, praćena jednim ili više nižim dozama može se primenjivati. U jednom otelotvorenju, antitelo HER2 se primenjuje kao opterećenje doze od oko 840 mg, praćeno otprilike 420 mg, primenjeno otprilike na svake 3 nedelje. U još jednom otelotvorenju, antitelo HER2 se primenjuje kao opterećenje doze od oko 1050 mg, praćeno približno 525 mg, dati približno svaka 3 nedelje.

[0203] Ostali terapeutski agensi mogu biti kombinovani sa HER2 antitelom. Takvo kombinovano davanje obuhvata ko-administrativnost ili istovremenu primenu, koristeći odvojene formulacije ili jednu farmaceutsku formulaciju i uzastopnu primenu u bilo kom redosledu, pri čemu poželjno postoji vremenski period dok oba (ili svi) aktivni agensi istovremeno vrše svoje biološke aktivnosti. Prema tome, drugo terapeutsko sredstvo može da se primeni pre ili posle dodavanja antitela HER2. U ovom otelotvorenju, vreme između najmanje jednog davanja drugog terapeutskog agensa i najmanje jednod davanja HER2 antitela je poželjno otprilike 1 mesec ili manje, a najpoželjnije oko 2 sedmice ili manje. Alternativno, drugo terapijsko sredstvo i HER2 antitelo se primenjuju istovremeno sa pacijentom, u jednoj formulaciji ili odvojenim formulacijama.

[0204] Primeri drugih terapeutskih agenasa koji se mogu kombinovati sa HER2 antitelom uključuju bilo koji ili više: hemoterapeutski agens, kao što je anti-metabolit, npr. gemcitabin; drugo, različito HER2 antitelo (na primer, antitelo HER2 antitela za rast, kao što je Trastuzumab ili HER2 antitelo koje indukuje apoptozu HER2-prekomerno ekspresirajuće ćelije, kao što su 7C2, 7F3 ili njegove humanizovane varijante); drugo antitelo usmereno protiv drugog tumora povezanom antigenom, kao što su EGFR, HER3, HER4; antihormonalno jedinjenje, npr. jedinjenje protiv estrogena kao što je tamoksifen ili inhibitor aromataze; kardioprotektant (za sprečavanje ili smanjenje bilo koje disfunkcije miokarda povezane sa terapijom);

1

citokin; lek koji cilja EGFR (kao što su Erlitonib, Gefitinib ili Cetuksimab); anti-angiogeni agens (posebno Bevacizumab koji je prodao Genentech pod zaštitnim znakom AVASTIN7; inhibitor tirozin kinaze; COX inhibitor (na primer inhibitor COX-1 ili COX-2); nesteroidni anti-inflamatorni lek, Celecoxib (CELEBREX®); inhibitor farnesil transferaze (na primer, Tipifarnib/ZARNESTRA® R115777 dostupan od Johnson i Johnson ili Lonafarnib SCH66336 dostupan od Schering-Plough); antitelo koje vezuje onkofetalni protein CA 125 kao što je Oregovomab (MoAb B43.13); HER2 vakcina (kao što je HER2 AutoVac vakcina iz Pharmexia, ili APC8024 proteinska vakcina iz Dendreona, ili HER2 peptidna vakcina iz GSK/Corixa); još jedna terapija za ciljanje (npr. trastuzumab, cetuksimab, gefitinib, erlotinib, CI1033, GV2016 itd.); Raf i/ili ras inhibitor (videti, na primer, WO 2003/86467); Doxil; Topetecan; taksan; GV572016; TLK286; EMD-7200; lek koji tretira mučninu kao što je serotoninski antagonist, steroid ili benzodiazepin; lek koji sprečava ili tretira kožni osip ili standardne terapije akni, uključujući lokalni ili oralni antibiotik; lek za smanjenje telesne temperature, kao što je acetaminophen, difenhidramin ili meperidin; hematopoetski faktor rasta itd.

[0205] Odgovarajuće doze za bilo koji od gorenavedenih agensa koji su uzastopno korišćeni su oni koji se trenutno koriste i mogu se smanjiti zbog kombinovanog dejstva (sinergije) agensa i HER2 antitela. Tretman sa kombinacijom sastava HER2 antitela i drugog terapeutskog agensa može rezultirati sinergističkom ili dodatnom terapijskom korist za pacijenta.

[0206] Ako se primenjuje hemoterapeutsko sredstvo, obično se primenjuje u dozama za koje je poznato, ili opciono spušteno zbog kombinovane akcije lekova ili negativnih neželjenih efekata koji se mogu pripisati primeni hemoterapeutskog sredstva. Priprema i doziranje rasporeda za takve hemoterapeutske agense mogu se koristiti u skladu sa uputstvima proizvođača ili kao što je empirijski određen od strane stručnjaka. Priprema i doziranje rasporeda za takvu hemoterapiju su takođe opisane u Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992).

[0207] Osim gore navedenih terapijskih režima, pacijent može biti podvrgnut hirurškom uklanjanju ćelija karcinoma i/ili radioterapiji.

VII. Depozit materijala

[0208] Sledeće ćelijske linije hibridoma deponovane su u American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USA (ATCC):

[0209] Dodatni detalji o pronalasku ilustrovani su sledećem neograničavajućem primerom.

PRIMER 1

[0210] Ovaj primer opisuje karakterizaciju sastava koji sadrži glavnu vrstu HER2 antitela koja se vezuje za domen II HER2 (pertuzumab) i njegove kiselinske varijante.

[0211] Pertuzumab je rekombinantno humanizirano monoklonsko antitelo, nastalo na osnovu humanog IgG1 (k) okvira. Sastoji se od dva teška lanca (448 ostataka) i dva lakog lanca (214 ostataka). Dva teška lanca povezana su sa dva interlančana disulfida, a svaki lak lanac je vezan za teški lanac kroz jedan interlančani disulfid. U Fc regionu pertuzumaba nalazi se N-povezana glikozilacija na Asn-299 od dva teška lanca. Pertuzumab se razlikuje od HERCEPTIN<7>(Trastuzumab) u područjima vezivanja epitopa lakog lanca (12 aminokiselinskih razlika) i teškog lanca (30 aminokiselinskih razlika). Kao rezultat ovih razlika, pertuzumab se vezuje za potpuno drugačiji epitop na HER2 receptoru. Vezivanje pertuzumaba prema HER2 receptoru na epitelnim ćelijama čoveka sprečava ga da formiraju komplekse sa drugim članovima familije HER receptora (Agus i dr., Cancer Cell 2: 127-137 (2002)). Blokiranjem kompleksnih formacija, pertuzumab sprečava stimulativne efekte rasta liganda za komplekse (npr., EGF i heregulin). In vitro eksperimenti su pokazali da i pertuzumab i pertuzumab-Fab inhibiraju vezivanje heregulina (HRG) na MCF7 ćelije, te da fosforilacija stimulisanog sa HRG-om HER2-HER3 kompleksa može biti inhibirana i pertuzumabom i pertuzumab-Fabom (Agus i dr., Cancer Cell 2:127-137 (2002)). Osim toga, utvrđeno je da in vivo inhibicija rasta tumora

2

pertuzumaba i derivata Fab pertuzumaba derivat polietilen glikola može biti uporediva u modelu ksenografa raka prostate (Agus i dr., Cancer Cell 2: 127-137 (2002)). Ovi podaci ukazuju na to da Fc region antitela nije neophodan za inhibiciju rasta tumora, a osim toga, bivalentnost i Fc-posredovane efektorske funkcije nisu potrebne za in vivo ili in vitro biološku aktivnost.

[0212] U ovom primeru glavni vrh pertuzumaba je sakupljen iz kolone za razmjenu katjona i inkubiran u medijumima za kulturu ćelija ili obrađen korišćenjem standardnih operacija pročišćavanja antitela. Kiselinske varijante formirane nakon inkubacije glavnog vrha sa komponentama medijuma ćelijske kulture. Kiselinske varijante monoklonskih antitela su modifikovani oblici željenog proizvoda koji eluiraju ranije od glavnog vršnjaka nakon separacije pomoću katjonske izmenjivačke hromatografije. Suptilne razlike u količini i/ili raspodeli kiselinskih varijanti često se posmatraju pre i posle procesa i predstavljaju izazov za demonstriranje uporedivosti proizvoda. Operacije prečišćavanja imale su mali uticaj na formiranje kiselinskih varijanti. Varijante identifikovane u kiselinskoj varijantnoj frakciji obuhvatale su glikacionu varijantu, varijantu deamidacije, varijantu redukovanu disulfidom, sijalilovanu varijantu i neredukovanu varijantu. Kolektivno, kiselinske varijante su bile potpuno moćne.

[0213] Između ostalog, svrha ove studije bila je: bolje razumeti uticaj ćelijske kulture i procese oporavka na formiranje kiselinskih varijanti pertuzumaba, karakterizirati preovlađujuće kiselinske varijante pertuzumaba i proceniti uticaj kiselinskih varijanti na farmakokinetiku (PK).

[0214] Rezultati farmakokinetike na podlozi pokazuju da je površina ispod krivine za frakciju kiselinskih varijanti i glavnu frakciju maksimuma ekvivalentna početnom materijalu pertuzumaba (geometrijska srednja vrednost 0.96 i 0.95, respektivno). Ovi rezultati pokazuju da iako su kiselinske varijante hemijski različite od glavnog maksimuma imaju ekvivalentnu farmakokinetiku.

Metode i rezultati

[0215] Slika 10 prikazuje eksperimentalni dizajn za izolaciju katjonske razmene MP (glavni maksimum) i AV (kiselinske varijante), analize ćelijske kulture, oporavka i PK (farmakokinetike) i analitičko testiranje. Sveži mediji = standardni mediji; potrošeni mediji = standardni mediji nakon 12 dana ćelijske kulture, ćelije su uklonjene centrifugiranjem. Rastvoreni kiseonik, pH i drugi parametri nisu kontrolisani.

A. Izolacija maksimalnih vrednosti i kiselinskih varijanti

[0216] Varijante punjenja pertuzumaba su odvojene na koloni DIONEX PROPAC WCX-10 ™ katjonske razmene (CEKS) dimenzija 4.0 k 250 mm koristeći sledeće uslove:

Pufer A: 20mM BisTris, pH 6.0

Pufer B: 20 mM BisTris, 200 mM NaCI, pH 6.0

Gradijent: 0,5% B/min isporučuje se na 1.0 ml / min

Temperatura kolone: 35°C

Detekcija: 280 nm

[0217] Tipičan hromatogram je prikazan na slici 11. Prikupljene su AV (kiselinske varijante) i MP (glavni maksimum) frakcije.

[0218] Sadržaj potencije i monomera bili su slični među početnom materiju pertuzumaba, glavnom maksimumu i kiselinskim varijantama (Slika 12). Čistoća glavnih maksimuma i kiselinskih varijanti CEX frakcija je prihvatljiva za studije farmakokinetike na osnovu kriterijuma čistoće od 90% od CEX-a (Slika 12).

B. Maksimalna vrednost vršnih eksperimenata

[0219] Pertuzumabov glavni vrh, izolovan od strane CEX-a, bio je uperen u sveže ili eksploatisane medijume za kulturu ćelija (bez ćelija) i inkubiran 12 dana na 37NC, kao što je prikazano na slici 10. Uzorke u različitim vremenskim tačkama su direktno analizirane od strane CEKS-a ili nakon izolacije sa proteinima A. Glavni vrh je takođe bio uperen u medijske /- različite medijske komponente kao što su glukoza i pepton. Osim toga, glavni vrh se obrađuje kroz standardne operacije oporavka kao što su protein A hromatografija (ProA), niskog pH tretmana i SP Sepharose Fast Flow (SPFF) za više ciklusa i analizirani od strane CEX-a.

[0220] CEX profili glavnog vrha inkubirani 12 dana u svežim ili potrošenim medijima bili su slični (slike 13 i 14). Glavni vrh se smanjio nakon inkubacije u svežim medijima nego u potrošenim medijima. Uklanjanje različitih medijskih komponenti uticalo je na smanjenje glavnog vrha. Procenat glavnog pika u inkubiranim uzorcima bio je isti sa izolacijom proteina A i bez njega.

Inkubacija u samom medijumskom puferu izazvala je gubitak glavnog vrha.

[0221] Proteina A izolacije glavnog vrha iz medijuma nije uticala na CEX profil koji pokazuje da modifikacije tokom inkubacije ne utiču na vezivanje ili eluciju proteina A. Operacije oporavka imale su mali ili nikakav uticaj na procenat CEX-a.

C. Karakterizacija kiselinskih varijanti

[0222] Pertuzumab kiselinske varijante su izolovane iz CEX iz početnog materijala pertuzumaba ili glavnog vrha inkubiranog u medijumu za kulturu. Izolovane kiselinske varijante su analizirane metodama navedenim na Slici 15. Kiselinske varijante obuhvataju 21% ukupne površine vršnih površina, stoga oko 80% (17% od 21%) kiselinskih varijanti. Deamidirani oblici nisu mogli biti kvantifikovani.

[0223] Formulari koji su identifikovani u kiselinskim varijantama generisani glavnim maksimumom inkubiranim sa medijima bili su isti kao oni identifikovani u početnom materijalu pertuzumab. Detektovani su sledeći oblici: sijalizovana varijanta, disulfidom redukovane varijante, glikatna varijanta, ne-redukovana varijanta i deamidirana varijanta. Formulisani glikozni oblici višeg reda identifikovani su elektrosprejskom jonizacijom-masenom spektrometrijom (ESI-MS) nakon redukcije i tretiranja PNGase.

D. Farmakokinetičke (PK) studije

[0224] Jedna intravenozna (IV) doza od 10 mg/kg, 12 pacova po ruci, 3 ruke (kiselinske varijante, glavni maksimum, pertuzumab početni materijal). Obimno uzimanje PK-a je sprovedeno 35 dana. Geometrijski srednji odnos AUC (Dan 0-14) između kiselinskih, glavnih vrhova i pertuzumab početnog materijala. Geometrijski srednji odnos = GM uzorak/GM IgG1 početni materijal. Koncentracija pertuzumaba u odnosu na vremenski period bila je slična za početni materijal pertuzumaba, kiselinsku varijantu i glavni vrh (slike 16 i 17). Nije primećena značajna razlika u izloženosti između kiselinskih varijanti, glavnog maksimuma i pertuzumab početnog materijala. GMR je bio ~1.0 sa 90% CI između 0.80 – 1.25.

Zaključci

[0225] Faktori višestruke ćelijske kulture doprinose stvaranju kiselinskih varijanti, ali se nije pokazalo da je oporavak efekat kiselinske varijante formiranja. U kiselinskoj frakciji su identifikovane disulfidom redukovane, ne-redukovane, sijalizovane, glikirane i deamidirane varijante. Kiselinska frakcija izolovana iz početnog materijala pertuzumaba i ona koja je generisana inkubacijom glavnog maksimuma CEX sadržavale su iste forme. Kiselinske varijante, glavni maksimum i pertuzumab polazni materijal imali su istu farmakokinetiku.

Spisak sekvenci

[0226]

Sequence Listing

4

�

4

�

Claims

Patenti zahtevi

1. Sastav koji sadrži glavnu vrstu HER2 antitela koja sadrži sekvence aminokiselina lakog lanca i teškog lanca u SEQ ID Br. 15 i 16 respektivno i vezuju se za domen II HER2 i kiselinske varijante tog glavnog antitela, pri čemu je glavna vrsta HER2 antitelo struktura aminokiselinske sekvence antitela u sastavu koji je kvantitativno prevladavajući molekul antitela u sastavu, pri čemu kiselinske varijante uključuju varijantu redukovanu disulfidom.

2. Sastav prema patentnom zahtevu 1, gde kiselinske varijante takođe uključuju glikovanu varijantu, deamidovanu varijantu, sijaliziranu varijantu ili neredukovanu varijantu.

3. Sastav prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2 gde je količina kiselinske varijante manja od 25%.

4. Sastav prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, pri čemu su glavna vrsta HER2 antitela i kisele varijante netaknuta antitela.

5. Sastav prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu sadrži amino-terminalnu varijantu produženja lidera glavne antitela na vrstu.

6. Sastav prema patentnom zahtevu 5 gde se amino-terminalni nastavak lidera sadrži ili sastoji iz VHS-.

7. Farmaceutska formulacija koja sadrži sastav prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva u farmaceutski prihvatljivom nosaču.

8. Farmaceutska formulacija prema patentnom zahtevu 7 za upotrebu u postupku lečenja HER2 pozitivnog karcinoma kod pacijenta, pri čemu u se postupku farmaceutska formulacija prema patentnom zahtevu 7 daje pacijentu u količini koja je efikasna za lečenje kancera.

9. Farmaceutska formulacija za upotrebu prema patentnom zahtevu 8, pri čemu se u postupku farmaceutski sastav daje u kombinaciji sa Trastuzumab-om.

10. Farmaceutska formulacija za upotrebu prema patentnom zahtevu 8 ili 9, gde je kancer izabran iz grupe koju čine kancer dojke, kancer jajnika, kancer pluća i kolorektalni kancer.

11. Farmaceutska formulacija za upotrebu prema patentnom zahtevu 8 ili 9, gde glavno antitelo i kiselinska varijanta imaju u suštini istu farmakokinetiku.

12. Postupak za izradu farmaceutskog sastava koja sadrži: (1) pripremu sastava koji sadrži glavnu vrstu HER2 antitela koja sadrži sekvence lakog i teškog aminokiselinskog lanca u SEQ ID Br.15 i 16 i koji se vezuju za domen II HER2 i kiselinske varijante te glavne vrste HER2 antitela uključujući varijantu redukovanu disulfidom i/ili neredukovanu varijantu, pri čemu je glavna vrsta HER2 antitelo struktura aminokiselinske sekvence antitela u sastavu koji je kvantitativno prevladavajući molekul antitela u sastavu i glavna vrsta HER2 antitela i kiselinske varijante su sve netaknuta antitela (2) procenjivanje kiselinskih varijanti u sastavu i potvrđivanje da je njihova količina manja od oko 25 %.

13. Postupak prema patentnom zahtevu 12, pri čemu su glavna vrsta HER2 antitelo i kisele varijante u sastavu netaknuta antitela.

14. Postupak prema patentnom zahtevu 12 ili zahtevu 13, gde korak (2) obuhvata procenu kiselih varijanti ne-redukovanom kapilarnom elektroforezom sa natrijum dodecil sulfatom (CE-SDS) i otkrivanje varijante redukovane disulfidom.

15. Postupak prema patentnom zahtevu 12 ili zahtevu 13, gde kisele varijante tog glavnog tipa HER2 antitela uključuju glikovanu varijantu, deamidovanu varijantu, redukovanu disulfidnu varijantu, sijalizovanu varijantu i neredukovanu varijantu.

16. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 12 do 15, gde korak (2) obuhvata procenu kiselih varijanti postupkom izabranim iz grupe koja se sastoji od jonoizmenjivačke hromatografije pri čemu se kompozicija tretira sialidazom, smanjenom kapilarnom elektroforezom natrijum dodecil sulfatom CE-SDS), neredukovanim CE-SDS, boronatnom hromatografijom i mapiranjem peptida.

17. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 12 do 16 koji obuhvata kombinovanje sastava posle koraka (2) sa farmaceutski prihvatljivim nosačem.

18. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 12 do 16 gde je sastav evaluiran u koraku (2) u farmaceutski prihvatljivom nosaču.

2