DE69428764T2 - Immunokonjugate - Google Patents

Immunokonjugate

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Description

  • Die Erfindung betrifft neue Fusionsproteine, die aus einem tumorassoziierten Zielsteuerungselement, vorzugsweise einem monoklonalen Antikörper oder einem seiner Fragmente, der bzw. das ein Molekül erkennt, welches bevorzugt an menschlichen "Timer"-Zellen, wie dem menschlichen Epidermiswachstumsfaktorrezeptor (EGFR), exprimiert wird, sowie TNFα, bestehen. Das so erhaltene Fusionsprotein kann zur Abgabe des biologisch aktiven Liganden an eine spezifische Zielzelle bzw. ein spezifisches Zielgewebe verwendet werden. Die neuen Immunkonjugate lassen sich in der Tumortherapie verwenden.
    • Hintergrund der Erfindung
  • Zur Behandlung von Krebspatienten sind viele unterschiedliche therapeutische Konzepte verwendet worden. In den letzten Jahren wurden klinische Versuche mit monoklonalen Antikörpern durchgeführt, die spezifisch oder bevorzugt Zelloberflächenmoleküle erkennen, welche an malignen Zellen exprimiert werden. Ziel dieses Ansatzes ist die Induktion einer antikörperabhängigen Cytotoxizität der Zelle (antibodydependent cellular cytotoxicity (ADCC)) oder einer komplementvermittelten Cytotoxizität (complementmediated cytotoxicity (CDC)) zur Ausschaltung von Tumorzellen. Ein zweiter Ansatz besteht in der cytokinvermittelten Aktivierung einer Immunreaktion. Die cytokininduzierte Antitumorwirkung kann folgendermaßen vermittelt werden:
  • 1) durch eine direkte cytotoxische/cytostatische Wirkung des Cytokins auf das Tumorwachstum,
  • 2) durch Mechanismen, die nicht für das Tumorantigen spezifisch sind, wie z. B. LAK-Aktivität oder monozyten/makrophagenvermittelte Cytotoxizität,
  • 3) durch von CD4- und CD8-positiven T-Zellen vermittelte Immunreaktionen, die für das Tumorantigen spezifisch sind. In dieser Situation wurde im Tiermodell eine systemische Immunität gegen den Tumor beobachtet.
  • Leider wird die systemische Anwendung von Cytokinen wie IL-2 oder TNFα dadurch erschwert, daß diese toxisch sind (Rubin, Cancer Invest. 11: 460-472, 1990; Balkwill, Nature 361: 206-207, 1993). Um eine ausreichende Cytokinkonzentration am Tumorort sicher zu stellen, müssen ziemlich hohe Dosen verabreicht werden, und die Maximaldosis, die verträglich ist, liegt unter der Wirkdosis. Die negativen Wirkungen der Cytokine beruhen daher in erster Linie darauf, daß sie systemisch verabreicht werden. An ihrer klinischen Bedeutung für die Tumortherapie besteht jedoch kein Zweifel. In Tiermodellen wurde nachgewiesen, daß die Gegenwart des Cytokins in situ, entweder durch intratumorale Injektion oder durch Sekretion transfizierter Tumorzellen, zu einer Tumorregression (Hock et al. PNAS 90: 2774-2778, 1993; Colombo et al. Cancer Res. 52: 4853- 4857, 1992; McBride et al., Cancer Res. 52: 3931-3937, 1992; Tepper et al., Science 257: 548-551, 1992; Mullen et al., Cancer Res. 52: 6020-6024, 1992; Blankenstein et al., J. Exp. Med 173: 1047-1052, 1991; Gansbacher et al., J. Exp. Med. 172: 1217-1224, 1990) führen kann. In diesen Systemen hindern die Cytokine zwar nicht die Tumorproliferation, können jedoch eine rasche und wirksame Antitumorreaktion aktivieren. Die physische Kombination eines Effektormoleküls und eines Zielsteuerungselements stellt daher ein Mittel zur Verringerung des peripheren Vorliegens des biologisch aktiven Liganden und zur Verbesserung seiner intratumoralen Verfügbarkeit dar. Außerdem kann man diese Moleküle auch auf einzelne Tumorzellen oder Mikrometastasen dirigieren.
  • Der biologisch aktive Ligand für eine auf einen Antikörper gerichtete Zielsteuerung sollte die Zerstörung der Zielzelle entweder direkt oder durch Schaffung einer für die Zielzelle letalen Umwelt induzieren. Bei dem biologisch aktiven Liganden kann es sich um ein Cytokin wie Il-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-13, IFNs, TNFα oder CSFs handeln. Diese Cytokine haben nachweislich Antitumorwirkungen hervorgerufen, und zwar entweder direkt oder durch Aktivierung von wirtseigenen Abwehrmechanismen (Mire- Sluis, TIBTECH 11: 74-77, 1993; Colombo et al. Cancer Res. 52: 4853-4857, 1992; Thomas & Balkwill, Pharmac. Ther. 52: 307-330, 1991).
  • Ein gentechnisch hergestelltes Fusionsprotein aus Human-IL-2 und Maus-Human-Hybrid-mAb225 gegen Human- EGFR wurde bei Naramura et al., Immunol. Lett. 39: 91- 99, beschrieben. Dieses Fusionsprotein fördert die von frisch abgetrennten PBMC, isolierten natürlichen Killerzellen und aktivierten T-Zellen vermittelte Cytotoxizität der Zelle gegen Melanomzellinien.
  • TNFα hat eine breite Anwendung in der Tumortherapie gefunden, und zwar in erster Linie aufgrund seiner direkten Cytotoxizität für bestimmte Tumorzellen und der Induktion einer hämorrhagischen Tumorregression. Außerdem vervielfacht TNFα die Immunreaktion: er ist ein Costimulans der T-Zellenproliferation, induziert die Expression der MHC-Antigene der Klasse I und II sowie TNFα-, IFN- und IL-1-Sekretion durch Makrophagen.
  • Beim Epidermiswachstumsfaktor (EGF) handelt es sich um ein Polypeptidhormon, das für Epidermis- und Epithelzellen mitogen wirkt. Bei Interaktion von EGF mit anfälligen Zellen bindet er an Membranrezeptoren (EGFR). Der EGFR ist ein Transmembranglycoprotein mit einer Größe von ungefähr 170 kD und ein Genprodukt des c-erb-B-Protoonkogens.
  • Es wurde gefunden, daß der gegen die Humankarzinomzellinie A431 (ATCC CRL 1555) erzeugte monoklonale Maus-Antikörper MAb 425 an ein Polypeptidepitop an der äußeren Domäne des EGFR bindet. Es wurde gefunden, daß er die Bindung von EGF hemmt, Tumorcytotoxizität in vitro vermittelt und Tumorzellwachstum bei von Epidermis- und Colorectalkarzinom abgeleiteten Zellinien in vitro supprimiert (Rodeck et al., 1987, Cancer Res. 47, 3692). Humanisierte Versionen und Hybridversionen von MAb 425 sind aus WO 92/15683 bekannt.
  • Antikörper-Cytokin-Immunkonjugate in verschiedenen Kombinationen für die direkte Abgabe wirksamer Proteine sind bereits beschrieben worden. 11-2 wurde mit dem humankarzinomspezifischen Antikörper L6 (Fell et al., 1991, J. Immunol. 146: 2446-2452, EP-OS-0439095) oder mit einem Antigangliosid-GD2-Antikörper (Gillies et al., 1992, PNAS 89: 1428-1432, WO 92/08495) kombiniert. Immunkonjugate aus einem Anti-Dansyl-Antikörper und IGF1 wurden für die zielgerichtete Abgabe von Hormonen geschaffen (Shin & Morrison, 1990, PNAS 87: 5322-5326, WO 91/14438).
  • Ziel der Erfindung war daher die Schaffung von Antikörpern oder ihren Fragmenten mit (1) einem gegen ein EGFR-Antigen an der Oberfläche einer Tumorzelle gerichtetes Epitop sowie (2) einem biologisch aktivem Liganden mit einer ausgeprägten Fähigkeit, Cytotoxizität zu induzieren und so die Antitumorwirkung in situ zu intensivieren.
    • Zusammenfassung
  • Die Erfindung betrifft Immunkonjugate, bei denen ein Teil eines monoklonalen Antikörpers oder ein vollständiger monoklonaler Antikörper mit TNFα kombiniert ist. Die für diese Immunkonjugate codierenden Konstrukte werden DNA- rekombinationstechnisch hergestellt. Die Immunkonjugate enthalten die variable Region der schweren Kette des Antikörpers und die CH1- und CH2-Domäne der konstanten Region (Antikörper-CH2-Konjugat) oder die CH1-, CH2- und CH3-Domäne der konstanten Region (Antikörper-CH3- Konjugat) in Fusion mit dem biologisch aktiven Liganden. Durch Zugabe der entsprechenden leichten Kette gelangt man zu Immunkonjugaten, die an antigentragende Zellen addressiert sind und einen wirksamen Liganden an einen bestimmten Ort im Körper abgeben (Fig. 1a-c).
  • Mit den erfindungsgemäßen Konjugaten können Tumore wie Melanom, Gliom und Karzinom erfolgreich nachgewiesen und behandelt werden.
  • Ein Ziel der vorliegenden Erfindung besteht daher in der Bereitstellung eines Immunkonjugats mit (1) einem monoklonalen Antikörper oder einem seiner Fragmente, der bzw. das gegen eine Tumorzelle gerichtet ist, die ein Antigen-Epitop des Epidermiswachstumsfaktorrezeptors (EGFR) trägt, sowie (2) TNFα, der mit diesem Antikörper oder Antikörperfragment fusioniert ist, wobei dieses Immunkonjugat eine cytotoxische Fähigkeit, die Tumorzelle spezifisch in situ zu lösen oder eine tumorspezifische Immunreaktion auszulösen, aufweist.
  • In einer weiteren bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform stammt der Antikörper bzw. das Antikörperfragment von dem Maus-, humanisierten oder Hybrid-MAb 425.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung stammt das Immunkonjugat aus der Gruppe MAb 425-CH2-TNFα, MAb 425-CH3-TNFα.
  • Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung eines Immunkonjugats wie oben und in den Ansprüchen definiert mittels eines Wirtsorganismus, und zwar dadurch, daß man die für den Antikörper bzw. das Antikörperfragment codierenden DNA-Sequenzen mit dem biologisch aktiven Liganden fusioniert, das so erhaltene Konstrukt in einen Expressionsvektor, der in diesen Wirtsorganismus transformiert wird, einführt, die Wirtszellen in einer Nährlösung kultiviert und das Fusionsprotein exprimiert.
  • In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsfarm wird eine Technik verwendet, bei der die für den Antikörper bzw. die Antkörperfragmente codierenden DNA- Sequenzen mit dem biologisch aktiven Liganden auf einer Einzelstrang-DNA mittels eines Oligonukleotids, das zu der gewünschten DNA-Sequenzfusion komplementär ist, fusioniert werden.
  • Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht in der Bereitstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung mit mindestens einem wie oben und in den Ansprüchen definierten Immunkonjugat sowie einem physiologisch unbedenklichen Träger.
  • Schließlich besteht ein Ziel der Erfindung in der Verwendung der wie oben und in den Ansprüchen definierten Immunkonjugate zur Herstellung eines gegen Tumore gerichteten Arzneistoffs.
  • Es wurde gefunden, daß insbesondere bei den Antikörper- CH2- und Antikörper-CH3-Konjugaten, wie zum Beispiel MAb 425-CH-2-TNFα und MAb 425-CH3-TNFα, die Induktion der Cytotoxizität der Zelle dem nichtgekoppelten TNFα überlegen war. Dies läßt sich vermutlich auf die Kombination in bezug auf die Bindungseigenschaften und Induktion von ADCC durch die konstanten Regionen des monoklonalen Antikörpers und die Cytokinwirkungen zurückführen.
  • Die erfindungsgemäßen Immunkonjugate weisen außerdem im Vergleich zu dem monoklonalen Antikörper, vorzugsweise MAb 425, als solchem oder seinen Fragmenten gute Bindungs- und Proliferationseigenschaften auf.
  • In den folgenden Beispielen und den Figuren dazu wird nür auf Konstrukte, die nicht in den Schutzumfang der Ansprüche fallen, z. B. IL-2 oder IL-4-Konstrukte, Bezug genommen.
    • Material und Methoden Monoklonale Antikörper
  • Bei MAb 425 handelt es sich um einen monoklonalen Maus- IgG1-Antikörper gegen die Humankarzinomzellinie A431 (ATCC CRL 1555). MAb 425 bindet an ein Polypeptidepitop der externen Domäne des menschlichen EGF-Rezeptors und konkurriert mit der Bindung von EGF. Es wurde gefunden, daß MAb 425 eine Tumorcytotoxizität in vitro vermittelt und das Tumorzellenwachstum bei von Epidermis- und Colorectalkarzinom abgeleiteten Zellinien in vitro supprimiert (Roedeck et al., 1987, Cancer Res. 47 : 3692). Humanisierte Versionen und Hybridversionen von MAb425 sind aus WO 92/15683 bekannt.
    • Cytokine
  • Für cytokincodierende cDNAs wurden entweder von British Biotechnology Limited (Herrmann Biermann GMBH, Bad Nauheim BRD: human IL-2 BBG30, human TL-4 BBG15, human IL-7 BBG43, human TNFα BBG18) bezogen. Den im Handel erhältlichen cDNAs fehlt die für die Exkretion von Proteinen erforderliche Signalsequenz. Für cytokincodierende cDNAs lassen sich aus von cytokinproduzierenden Zellen isolierter mRNA schaffen.
    • Vektoren
  • pUC19 zählt zu einer Reihe von verwandten E. coli- Plasmidcloniervektoren mit hoher Kopienzahl und enthält Teile von pBR322 und M13mp19. pUC19 enthält den induzierbaren bakteriellen lac-Promoter-Operator und im Anschluß daran eine multiple Klonierstelle (Yanisch- Perron et al., Gene 33: 103-109, 1985). pUC-Vektoren sind im Handel erhältlich (z. B. New England Biolabs). Die Phagemid-Vektoren pBluescript KS/SK&spplus; und KS/SK&supmin; leiten sich von pUC19 ab. Die Vektoren sind im Handel erhältlich (Stratagene).
  • Der eukaryontische Expressionsvektor pHCMV (Gillies et al., 1983, Cell 33 : 717) enthält den Replikationsursprung vom Simian Virus 40 (SV40) und die Promotor- und Enhancer-Region des menschlichen Cytomegalievirus. An die Promotor/Enhancer-Region schließt sich eine multiple Klonierstelle (mcs) für die Einführung der zu exprimierenden Gene an. Bei diesem Vektor wurden die Hybridform der variablen Region der schweren Kette von mAB425 und die ΔSacII cγ1-Region in Fusion mit dem Effektormolekül am Ende der CH1-, CH2- bzw. CH3-Domäne kombiniert, wodurch man ein Fusionsprotein der schweren Kette von MAb 425 erhielt. Die Ig-Kette der Fusion kann dadurch in das Immunkonjugat assembliert werden, daß man sie mit der entsprechenden leichten Kette unter Bildung einer monovalenten Antigenbindungsregion kombiniert, die dann unter Bildung eines divalenten Immunkonjugats, das für das Zielantigen spezifisch ist, assoziiert werden kann (Fig. 1). Die Konstrukte der schweren und der leichten Kette können in denselben oder in separate Vektoren eingebracht werden.
  • Der prokaryontische Expressionsvektor beruht auf dem Vektor pSW1 (Ward et al., Nature 341: 544-546, 1989), der sich vom Vektor pUC19 ableitet. pSW1 enthält eine für das Leader-Peptid des bakteriellen pe1B-Gens aus Erwinia carotovora codierende Sequenz (Lei et al., J. Bact. 169: 4379-4383, 1987). Um die Proteinexpression in das Periplasma zu dirigieren, können Fremd-DNAs. leserastergerecht hinter die pelB-Leader-Sequenz eingebracht werden.
    • Kurzbeschreibung der Figuren und Tabellen Tabelle I: PCR-Primer für die Herstellung von MAb425-Cytokin-Fusionsproteinen (eukaryontische Expression)
  • * Rückwärts-Primer, der mit den (im Handel erhältlichen) Stratagen- pBluescript-Vektoren Sk+/- und KS+/- hybridisiert;
  • ** Dieser Primer hybridisiert mit der konstanten Region von Cg1, darunter auch der singulären SacII-Stelle;
  • *** Rückwärts-Primer, der mit (im Handel erhältlichen) Derivaten des Vektors M13 hybridisiert.
    • Tabelle II: PCR-Primer zur Herstellung von MAb425- Cytokin-Fusionsproteinen (prokaryontische Expression) Fig. 1: Modell von Antikörper-Cytokin- Immunkonjugaten.
  • C = Cytokin, VH = variable Region der schweren Kette, VL = variable Region der leichten Kette, CH = konstante Region der schweren Kette, CL = konstante Region der leichten Kette.
  • (a) Antikörper-CH1-Konjugat, (b) Antikörper-CH2-Konjugat, (c) Antikörper-CH3- Konjugat.
    • Fig. 2: Bindung von Immunkonjugaten an EGF-R in einem für EGF-R spezifischen ELISA.
  • Die Überstände transient transfizierter COS-7-Zellen wurden auf einen Gehalt an Immunkonjugat geprüft. Ordinate:
  • % Extinktion bei 490 nm, Abszisse:
  • Verdünnung des Überstands (log2).
  • MAb425CH1-TNFα (volle Kreise),
  • MAb425CH2-TNFα (volle Quadrate),
  • MAb425CH3-TNFα (volle Dreiecke),
  • MAb425-Kontrolle (volle Rhomben),
  • MAb425FAb-Kontrolle (volles Dreieck, umgekehrt), MAb425F(ab')&sub2;, neugeformt (gereinigtes Protein) (volles Sechseck).
    • Fig. 3A: IL-2 = Aktivität des in COS-7-Zellen exprimierten MAb425-CH1-IL-2-Immunkonjugats.
  • Als Indikatorzellinie wurden CTLL-2- Zellen verwendet. Die Proliferationsaktivität von reihenverdünntem, MAb425- CH1-IL-2-haltigem COS-Überstand ist in der Tafel links dargestellt (volle Kreise). MAb425Fab-Kontrolle-haltiger COS-Überstand wurde als Kontrolle verwendet (leere Kreise). Volles Dreieck: Mediumkontrolle. Proliferationsreaktion der CTLL.2-Zellen bei Aktivierung mit rekombinantem kommerziellem IL-2-Protein oder ohne IL-2(KO) ist aus der Tafel rechts ersichtlich.
  • Tafel links: Abszisse = reziproke Verdünnung, Ordinate: Radioaktivität (ccpm) Tafel rechts: Abszisse = IL-2 (U/lml), Ordinate: Radioaktivität (ccpm)
    • Fig. 3B: IL-2-Aktivität des in E.coli exprimierten MAb425-CH1-IL-2-Immunkonjugats.
  • Als Indikatorzellinie wurden CTLL-2- Zellen verwendet. Tafel links: Die Proliferationsaktivität von reihenverdünntem MAb425-CH1-IL-2, das in E. coli exprimiert und über eine Anti-MAb425- Idiotyp-Säule affinitätsgereinigt wurde, ist in der Tafel links dargestellt (volle Dreiecke). Als Kontrolle wurde MAb425-CH1-IL-2-haltiger COS-Überstand verwendet (volle Kreise). Dialysepuffer. Um sicher zu gehen, daß der Puffer die IL-2-Aktivität nicht beeinträchtigte, wurde der Dialysepuffer in Gegenwart einer gleichbleibenden IL-2-Konzentration (1U/ml) titriert (volle umgekehrte Dreiecke). Tafel rechts: Proliferationsreaktion von CTLL.2-Zellen bei Aktivierung mit rekombinantem kommerziellem -IL-2-Protein (volle Kreise) oder ohne IL-2(KO) (volles Dreieck).
  • Tafel links: Abszisse = reziproke Verdünnung, Ordinate: Radioaktivität (ccpm) Tafel rechts: Abszisse = IL-2 (U/lml), Ordinate: Radioaktivität (ccpm)
    • Fig. 3C: Induktion der TIL-Proliferation durch MAb425-CH1-IL-2-Immunkonjugat.
  • Melanomtumorinfiltrierende Lymphozyten wurden ohne (KO) bzw. in der Gegenwart von reihenverdünnten COS-Überständen, die das 425-CH1-IL-2-Immunkonjugat enthielten, kultiviert (Tafel links). Die TIL-Proliferationsreaktion bei Aktivierung mit rekombinantem kommerziellem IL-2 ist in der Tafel rechts dargestellt.
  • Tafel links: Abszisse = reziproke Verdünnung, Ordinate: Radioaktivität (ccpm) Tafel rechts: Abszisse = IL-2 (U/ml), Ordinate: Radioaktivität (ccpm)
    • Fig. 4: Induktion der HPBL-Proliferation durch MAb425-IL-4-Immunkonjugate (menschliche periphere Blutlymphozyten)
  • Mit PHA aktivierte HPBLs wurden in Gegenwart von reihenverdünnten COS-Überständen, die MAb425-CH&sub2;-IL-4- (volle Kreise) bzw. MAb425-CH&sub3;-IL-4- (volle Dreiecke) Fusionsproteine enthielten, kultiviert. Überstände, die MAb425 (volles Quadrat), IL-4 (voller Rhombus) und Vektorkontrolle (volles umgekehrtes Dreieck) enthielten, wurden als Kontrolle verwendet. Die Proliferationsreaktion der HPBLs bei Aktivierung mit rekombinantem kommerziellem IL-4 sowie ohne Wachstumsfaktor (K0) ist in der Tafel rechts dargestellt. Tafel oben: Abszisse = IL-4 (U/ml), Tafel unten: Abszisse = Verdünnung, Ordinate: Radioaktivität (ccpm)
    • Fig. 5: Cytotoxizität von MAb425-TNFα- Immunkonjugat auf WEHI 164-Zellen.
  • Die gegen TNFα empfindliche Maus- Fibrosarcomzellinie WEHI 164 wurde 48 Stunden in Gegenwart von reihenverdünnten COS-Überständen (Tafel links), die 425-CH1-TNFα-Immunkonjugat (volle Quadrate), 425-CH2-TNFα- Immunkonjugat (volle Dreiecke) oder MAb425Fab-Kontrolle (volle Kreise) enthielten, kultiviert. Die durch kommerziellen rekombinanten Human-TNFα induzierte Wachstumshemmung der Indikatorzellen geht aus der Tafel rechts hervor. Abszisse: Verdünnung (Tafel oben), TNFα (U/ml) (Tafel unten).
    • Fig. 6: Durch MAb425-TNFα-Immunkonjugat vermittelte Tumorcytolyse durch PBMC.
  • Nichtaktivierte menschliche periphere Blutlymphozyten (PBMCs) wurden als Effektorzellen verwendet; sie wurden mit allogenen EGF-R-positiven &sup5;¹Cr-markierten C8161-Zielzellen in einem Effektor/Zielzellenverhältnis von 30 : 1 cokultiviert. Angegeben ist die spezifische Lyse in Prozent nach 18stündiger Cokultur ohne bzw. in Gegenwart von reihenverdünntem COS-Überstand, der MAb 425CH3-TNFα- Immunkonjugat enthielt (schraffierte Balken). Rekombinanter TNFα (Genzyme) wurde als 36 kDa-Dimer in E. coli exprimiert (punktierte Balken). Ordinate: spezifische Lyse in %.
    • Genaue Beschreibung der Erfindung Allgemeines:
  • Die anderen Mikroorganismen, Zellinien, Plasmiden, Promoter, Resistenzmarker, Replikationsursprünge, Restriktionsstellen oder anderen Fragmente von Vektoren, die in der Anmeldung erwähnt sind, sind entweder als Handelsware oder anderweitig allgemein verfügbar. Falls nicht anders angegeben, dienen sie nur als Beispiele und sind nicht wesentlich für die Erfindung; sie können durch andere geeignete Mittel bzw. biologische Materialien ersetzt werden.
  • Die Techniken, die erfindungswesentlich sind, sind unten detailliert beschrieben. Andere Techniken, die nicht detailliert beschrieben sind, entsprechen bekannten Standardverfahren, die einem Fachmann gut bekannt sind, oder sie sind detaillierter in den Literaturangaben, Patentanmeldungen und der einschlägigen Literatur beschrieben (z. B. "Antibodies, A Laboratory Manual", Harlow, Lane, Cold Spring Harbor, 1988).
    • Expression von Fusionsproteinen in eukaryontischen Zellen Konstruktion der eukaryontischen Expressionsvektoren für die Expression von Fab425-Cytokin-Fusionsprotein Fusion von MAb425 und Cytokinen mit der "Loop-Out"- Technik: 25 Herstellung von TNFα-Konstrukten:
  • Das SacII/XbaI-Fragment des ΔSacII cγ1-Klones wurde in ein Bluescript SK+, das die Cytokin-Codiersequenzen, wie die TNFα-cDNA, enthielt, insertiert. Die TNFα-cDNA 30 wurde zwischen die SmaI- und EcoRI-Stelle eingebracht. Das so erhaltene Konstrukt wurde durch Zugabe von geeignetem Helfer-Phagen als Einzelstrang-DNA hergestellt. Die CH2- bzw. CH3-Domäne wurde leserastergerecht mit dem 5'-Ende der TNFα- Codiersequenz fusioniert. Die Oligonucleotide
  • sind zu dem 3'-Ende der CH2-Domäne bzw. CH3-Domäne sowie dem 5'-Ende der TNFα-Codiersequenz homolog. Die Einzelstrang-DNA-Sequenzen werden durch die Oligonucleotide zusammengehalten, und die unerwünschten Sequenzen dazwischen werden aus dem Konstrukt entfernt. Die Oligonucleotide sind entgegengesetzt orientiert, da der obere Strang als Einzelstrang-DNA hergestellt wurde.
  • Die DNA wurde zur Bildung der doppelstrangigen Form durch Sequenase-Polymerase aufgefüllt. Im Gegensatz zur Amplitaq-DNA-Polymerase neigt dieses Enzym nicht zu Fehlern und es wurde daher nur die DNA-Sequenz an der Verbindungsstelle von isolierten Klonen bestimmt. Klone mit der korrekten Sequenz wurden mit den Sequenzen vereinigt, die zur Herstellung eines vollständigen mAb425-Fusionsproteins erforderlich sind, und zur Expression in Eukaryontenzellen in pHCMV-Vektor kloniert.
    • Herstellung von IL-4-Konstrukten:
  • Für diese Konstrukte wurde der vollständige ΔSacII cγ1- Klon als KpnI/SalI-Fragment in Bluescript KS+ insertiert. IL-4 wurde in den gleichen Vektor als HindIII/EcoRI-Fragment kloniert. Die Fusion wurde wie für die TNFQ-Konstrukte durchgeführt, und zwar mit den Oligonucleotiden
  • zur Fusion mit der CH2- bzw. CH3-Domäne.
  • Klone mit der korrekten Sequenz wurden mit den Sequenzen vereinigt, die zur Herstellung eines vollständigen mAb425-Fusionsproteins erforderlich sind, und zur Expression in Eukaryontenzellen in pHCMV-Vektor kloniert.
    • Fusion von MAb425 und Cytokinen mittels PCR-Technik
  • Die Amplitaq-DNA-Polymerase neigt zu Fehlern, und um sicher zu gehen, daß keine Fehler eingebaut wurden, wurden die Sequenzen der mittels PCR-Technik amplifizierten Segmente bestimmt. Die bei diesen Versuchen verwendeten Primer sind in Tabelle 1 zusammengefaßt.
    • Erzeugung von CH1-Fusionsproteinen
  • Das Plasmid pUH5 enthält die Sequenzen für das Fab425- Fragment für die schwere Kette zur prokaryontischen Expression mit der N-terminalen pelB-Leader-Sequenz von Erwinia carotovora (Lei et al., J. Bact. 169: 4379-4383, 1987), um die Sekretion des Proteins sicherzustellen. Das HindIII/NotI-Fragment wurde in den Vektor bluescript KS+ umkloniert. Die Cytokine IL-4 und IL-7 wurden durch PCR-Technik amplifiziert und eine 5'-NcoI- bzw. eine 3'-BamHI-Restriktionsstelle wurde so eingeführt. IL-2 und TNFα enthalten bereits die 5'-NcoI- und 3'-BamHI-Restriktionsstellen. Alle Cytokine wurden in Form von NcoI/BamHI-Fragmenten hinter die CH1-Domäne kloniert. In diesen Konstrukten waren die Cytokinsequenzen nicht leserastergerecht. Deshalb wurde zwischen die SalI- und NcoI-Restriktionsstellen ein Adaptor (5'TCGACAAGAAAG3') eingebracht. In den so erhaltenen Konstrukten werden die schwere Kette und das Cytokin als Fusionsprotein mit nur einer zusätzlichen, durch die Adaptorsequenz eingeführten Aminosäure (Ala) exprimiert. Die DraIII/BamHI-Fragmente wurden in den Expressionsvektor pHCMV, der den vollständigen MAb425-schwere-Kette-cDNA-Klon enthielt, kloniert. In diesem Konstrukt wurde die pelB-Leader- Sequenz gegen die Leader-Sequenz der MAb425-schwere- Kette-cDNA ausgetauscht.
    • Herstellung von CH2- und CH3-Fusionsproteinen
  • Die ΔSacII cγ1-DNA wurde mittels PCR-Technik amplifiziert, und zwar in zwei getrennten Reaktionen unter Verwendung von CH2-3'-Ende-Primern, die leserastergerecht mit dem 5'-Ende des entsprechenden Cytokins, wie IL-2 und IL-7, überlappen. Die IL-2- und IL-7-cDNA-Klone wurden ebenfalls mittels PCR amplifiziert. Am 3'-Ende wurden singuläre NotI- und SalI-Stellen in das IL-2-Konstrukt sowie eine singuläre XbaI-Stelle in das IL-7-Konstrukt eingebaut, um die Subklonierung in den SK+-Vektor und anschließend in den Expressionsvektor pHCMV zu erleichtern. Die Fusion der IL-2- und IL-7-PCR-Produkte mit der vollständigen ΔSacII cγ1-Region erfolgte durch PCR-Rekombination. Das so erhaltene BamHI/NotI ΔSacII cγ1 CH2-IL-2-Fragment wurde in SK+, das die variable Region der schweren Kette von YIAb425 enthielt, subkloniert. Das SacII/XbaI tSacII cγ1 CH-2 IL-7-Fragment wurde in den SK+-Vektor subkloniert, der die variable Region der schweren Kette mAb425 sowie die ΔSacII cγ1-Region bis zur SacII-Stelle enthielt. Auf diese Weise erzeugte man die vollständigen mAb425-CH2 IL-2- bzw. IL7-Fusionsgene.
  • Das vollständige mAb425-CH3 IL-2-Fusionsgen wurde entsprechend hergestellt, nur daß das ΔSacII cγ1 von der singulären SacII-Stelle als 5'-Ende amplifiziert wurde. Das SacII/PstI-Fragment vom mAb425-CH2 IL-2 in SK+ mit der CH2-IL-2-Fusion wurde dann gegen das SacII/PstI- Fragment mit der CH3-IL-2-Fusion ausgetauscht. Die vollständigen mAb425-Fusionsgene wurden dann zur Expression in Eukaryontenzellen in den Vektor pHCMV kloniert.
    • Expression von Immunkonjugaten
  • Vektorkonstrukte für die Expression eines monovalenten Immunkonjugats mit nur der CH1-Domäne bzw. von divalenten Immunkonjugaten mit der CH2- sowie CH2- und CH3-Domäne können in Wirtszellen durch Elektroporation, DEAE-Dextran, Calciumphosphat, Lipofectin oder Protoplastenfusion eingebracht werden. Es können jetzt Wirtszellen beliebiger Art verwendet werden, solange die rekombinanten DNA-Sequenzen, die für das Immunkonjugat codieren und die entsprechende leichte Kette in diesen Zelltyp korrekt in mRNA transkribiert werden. Bei den Wirtszellen kann es sich um Maus- Myelomzellen handeln, die kein Immunglobulin produzieren, wie zum Beispiel Sp2/0-AG14 (ATCC CRL 1581), P3 · 63Ag8.653 (ATCC CRL 1580) oder um Hamsterzellen wie CHO-K1 (ATCC CCL 61), oder CHO/dhFr- (ATCC CRL 9096) oder BHK-21 (ATCC CCL 10). Zur transienten Expression eignen sich COS-1 (ATCC CRL 1650) oder COS-7 (ATCC CRL 1651).
    • Transiente Expression von Immunkonjugaten
  • Der Expressionsvektor pHCMV enthält den Replikationsursprung des Simian Virus 40 (SV40). Die Zellinie COS-7 leitet sich von der Simian-Zellinie CV-1 ab, die mit einem für den Ursprung defektiven SV40-Virus transformiert worden war. Plasmide, die den SV40-Replikationsursprung enthalten, werden daher amplifiziert und die Produktion von Immunkonjugaten wird verbessert sein. Die Überstände wurden nach 72 Stunden geerntet und auf EGF-Rezeptorbindung sowie Cytokinkonzentration untersucht.
    • Permanente Expression von Immunkonjugaten
  • Vektor mit rekombinanten Konstrukten zur Expression von Immunkonjugaten werden in geeignete Wirtszellen eingebracht. Die Konstrukte mit der schweren und der leichten Kette können in denselben oder in separate Vektoren eingebracht werden: im letztgenannten Fall können die beiden Vektoren identische Selektionsmarker, wie Neomycinresistenz oder dhFr, oder zwei unterschiedliche Selektionsmarker tragen, um auf das Vorhandensein beider Vektoren zu selektieren. Die Selektion auf den dhFr-Marker kann nur in dhFr-Negativzellinien wie CHO/dhFr- durchgeführt werden. Die Klone werden mittels EGF-Rezeptorspezifischem ELISA-Assay auf die Expression von Immunkonjugaten analysiert. Die ausgewählten Klone werden dann durch Grenzverdünnungsklonierung weiter aufgereinigt.
    • Konstruktion der prokaryontischen Expressionsvektoren für die Expression von MAb425-CH1-Cytokin-Fusionsprotein
  • Die DNA-Sequenzen, die für die leichte Kette von MAb425 und das Fd-Fragment der schweren Kette codieren, wurden in die multiple Klonierstelle des Vektors pSW1 eingebracht. Die Codiersequenz für die reife leichte Kette und die Codiersequenz für die reife schwere Kette stehen hinter dem Leader-Peptid des bakteriellen pelB-Gens. Die Codiersequenz der schweren Kette enthält eine 3' gelegene NcoI-Stelle. Die für Cytokin codierenden cDNAs wurden mittels PCR so modifiziert, daß die NcoI-Restriktionsstelle (am 5'-Ende) und die NotI-Restriktionsstelle (am 3'-Ende) eingeführt wurden.
  • Die Cytokin-Gene wurden leserastegerecht direkt mit der CH1-Domäne der schweren Kette fusioniert. Die bei diesen Versuchen verwendeten Primer sind in Tabelle II zusammengefaßt. Tabelle I. Zur Herstellung von MAb425-Cytokin- Fusionsproteinen verwendete PCR-Primer Tabelle II. Zur Herstellung von FAb425-Cytokin- Fusionsproteinen verwendete PCR-Primer (prokaryontische Expression)
  • Diese Vektoren ermöglichen die wirksame Expression von funktionellen Fab-Cytokin-Fusionsproteinen in E. coli. Das Leichte-Kette- und Schwere-Kette-Cytokin-Fusionsprotein befindet sich auf einer Messenger-RNA mit zwei Cistrons unter der Kontrolle des induzierbaren lac- Promotors (Skerra und Plückthun, Science 242: 1038-104, 1988). Die Expression des Fab-Fusionsproteins kann daher entsprechend den Anforderungen für die Kulturbedingungen induziert werden. Die Translation der beiden Proteine von einer Messenger-RNA mit zwei Cistrons begünstigt die Synthese gleicher Mengen von Fd-IL-2-Fusionsproteinen und leichter Kette und erhöht so die Wahrscheinlichkeit, daß diese korrekt zu funktionellem Fab-Fusionsprotein assembliert werden. Die beiden Polypeptide werden in das Periplasma von E. coli sezerniert, wo die Faltung, Ausbildung von Disulfidbrücken und Assemblierung zu einem funktionellen FAb425CH1-Fusionsprotein stattfindet. Bei längerer Kultur der Bakterien werden die Proteine in das Kulturmedium ausgeschieden.
    • Expression des MAb425-CH1-IL-2-Fusionsproteins in E. coli und Aufreinigung
  • Zur Proteinexpression geeignete E. coli-Stämme wurden mit den Expressionsplasmiden transformiert. Die Zellen wurden bis zu einer OD&sub5;&sub8;&sub0; von 0,5 gezüchtet und mit IPTG (1mM) induziert. Die Zellen wurden über Nacht gezüchtet, und die Überstände und Zellen wurden geerntet. Der Überstand wurde auf eine AntiMAb425-Anti- Idiotyp-Säule aufgetragen. Die Säule wurde mit phosphatgepufferter 0,5 M NaCl-Lösung gespült, und gebundene Proteine wurden mit 100 mM Glycin 0,5 M NaCl, pH 2,5, eluiert. Das Eluat wurde sofort mit Tris 2,5 M pH8 neutralisiert. Fraktionen, die MAb425-CH1-IL-2 enthielten, wurden gepoolt, eingeengt und gegen PBS dialysiert.
    • Bindungseigenschaften der MAb425-Immunkonjugate
  • Die Bindungseigenschaften der MAb425-Immunkonjugate wurden in einem EGF-Rezeptor-spezifischen ELISA-Assay bestimmt. Kurz gesagt wurden Mikrotiterplatten über Nacht bei 4ºC mit gereinigtem EGF-Rezeptor beschichtet und dann gewaschen, um nicht gebundenes Protein zu entfernen. Die Platten wurden mit fusionsproteinhaltigen Überständen bzw. Überständen, die nichtkonjugierte MAb- oder Fab-Fragmente oder die Proteine in gereinigter Form enthielten, inkubiert. Die Platten wurden gewaschen und mit Ziege-Anti-Mensch-IgG und -IgM (schwere und leichte Kette), die mit Peroxidase konjugiert waren, inkubiert. Es wurde Substrat zugegeben, und die Menge an gebundenem EGF- Rezeptorspezifischem Protein wurde durch Messen bei 450 nm bestimmt (Fig. 2). Die Cytokinkonzentration wurde durch kommerziell erhältliche ELISAs, die für jedes Cytokin spezifisch waren, gemäß den Anweisungen des Herstellers bestimmt (Werte nicht gezeigt).
    • Leukozytenproliferation Tumorspezifische Effektorzellen
  • Mononukleare periphere Blutleukozyten und tumorinfiltrierende Lymphozyten (TILs), die von Melanompatienten isoliert worden waren, wurden mit bestrahlten (30Gy) autologen Tumorzellen in Medium (RPMI 1640, 1% Penicillin/Streptomycin, 1% Glutamin, 20mM Hepes, 50 mM β Mercaptoethanol, 10% fötales Kälberserum, 20 U/ml IL-2, 20 U/ml IL-4) cokultiviert. Die Responder-Zellen würden jede Woche mit autologen Tumorzellen stimuliert.
    • Bestimmung der Proliferation
  • Die cytokinvermittelte Proliferation läßt sich folgendermaßen bestimmen:
  • a) mit geeigneten Indikatorzellinien. Im Fall von IL-2 kann die IL-2-abhängige Maus-Zellinie CTLL-2 (ATCC TIB 241) (Fig. 3A) oder eine andere IL-2-abhängige Zellinie verwendet werden.
  • b) mit in vitro expandierten tumorinfiltrierenden Lymphozyten (Fig. 3B)
  • c) mit frisch isolierten mononukleären Blutzellen, die mit PHA-M (Sigma) vorbehandelt wurden. In diesem Fall wurde der Versuch mit MAb425-IL4- Fusionsproteinen durchgeführt (Fig. 4).
  • Frisch präparierte menschliche periphere Blutleukozyten von gesunden Blutspendern bzw. Melanompatienten oder von Melanompatienten isolierte TILs wurden in vitro vermehrt (siehe oben)y. Für den Assay der Fusionsproteine wurden die Lymphozyten in 96-Well- Flachbodenmikrotiterplatten bei einer Dichte von 1 · 10&sup5; Zellen pro Well in einem Endvolumen von 200 ul kultiviert. Die Zellen wurden mit fusionsproteinhaltigen Überständen oder mit Überständen, die nichtkonjugierten MAb enthielten, oder mit Überständen, die nichtkonjugierte Cytokine enthielten, oder mit den Proteinen in gereinigter Form inkubiert. Nach 72 Stunden wurden die Zellen mit 18.5 kBq (0,5 uCi) 3H-Thymidin gepulst. Der Einbau der Radioaktivität wurde nach Inkubation über Nacht mit β-Flüssigkeitsszintillation-Plattenzählung bestimmt. Die Ergebnisse werden als durchschnittliche cpm ausgedrückt.
    • Bestimmung der Cytotoxizität der MAb425-TNFα- Immunkonjugate Bestimmung der durch TNFα vermittelten Cytotoxizität
  • Es wurde beschrieben, daß TNFα für gewisse Zellen, darunter verschiedene Tumorzellen, direkt cytotoxisch ist. Das direkt-cytotoxische Potential von TNFα läßt sich mit Maus-L929-Fibroblasten (ATCC CCL 1) oder WEHI 164 (ATCC CRL 1751) oder anderen gegenüber TNFα empfindlichen Zellinien wie beschrieben bestimmen (Flick & Gifford, 1984, J. Immunol. Meth. 68 : 167). Fig. 4 zeigt das cytotoxische Potential von MAb425CH1-TNFα und MAb425CH2-TNFα auf WEHI164-Zellen als Indikatorzellinie.
    • Bestimmung der durch TNFα induzierten Cytotoxizität
  • EGF-Rezeptor-positive Zellinien wie die stark invasive und spontan metastasierende EGF-Rezeptor-positive Zellinie C8161 (Welch et al., 1991, Int. J. Cancer 47 : 227, sowie darin genannte Literaturstellen) lassen sich als Zielzellen für die Cytolyse durch allogene tumorinfiltrierende Lymphozyten oder frisch isolierte menschliche periphere Blutlymphozyten von Melanompatienten bzw. gesunden Spendern verwenden. Die Kulturbedingungen für Tumorzellen und TILs sind bereits beschrieben worden (Shimizu et al., 1991, Cancer Res. 51 : 6153).
  • In-vitro-Cytotoxizitätsassays wurden mit &sup5;¹Cr-markierten Tumorzielzellen durchgeführt. Die Zielzellen wurden bei 3700 kBq/10&sup7; Zellen (100 uCi/10&sup7; Zellen) 1 Stunde lang mit &sup5;¹C markiert und anschließend dreimal gewaschen, um überschüssiges &sup5;¹Cr zu entfernen. 2 · 103 Zielzellen pro Well wurden mit Effektorzellen in 96-Well- Mikrotiterplatten in Gegenwart von fusionsproteinhaltigen Überständen oder Überständen, die nichtkonjugierten MAb enthielten, oder Überständen, die nichtkonjugierte Cytokine (Kontrollen) enthielten, oder den Proteinen in gereinigter Form coinkubiert. Die Überstände oder gereinigten Proteine wurden einer Reihendünnung im Kulturmedium unterzogen und in dreifacher Wiederholung im Assay geprüft. Die Platten wurden 4 Stunden bei 37ºC in einer Atmosphäre mit 10% CO&sub2; inkubiert. Anschließend wurden die Zellen abzentrifugiert und die Radioaktivität in den Überständen wurde in einem γ-Zähler bestimmt. Die spezifische &sup5;¹Cr-Freisetzung in Prozent wurde gemäß der folgenden Formel berechnet:
    • Therapeutische Verwendung der Immunkonjugate
  • Die erfindungsgemäßen Immunkonjugate lassen sich an menschliche Patienten für Therapiezwecke verabreichen. Ein Ziel der Erfindung besteht daher in der Bereitstellung eines pharmazeutischen Präparats mit mindestens einem wie oben und in den Ansprüchen definierten Fusionsprotein als Wirkstoff in Assoziation mit einem oder mehreren pharmazeutisch unbedenklichen Trägern, Exzipientien oder Streckmitteln für diesen Wirkstoff.
  • Die erfindungsgemäßen Immunkonjugate werden typischerweise intravenös oder parenteral injiziert. Im allgemeinen sind die Dosierbereiche für die Verabreichung der Immunkonjugate weit genug, um die erwünschte tumorsupprimierende und tumorlysierende Wirkung hervorzurufen. Die Dosierung hängt vom Alter, Zustand, Geschlecht und Schwere der Krankheit des Patienten ab und kann zwischen 0,1 mg/kg und 200 mg/kg, bevorzugt zwischen 0,1 mg/kg und 100 mg/kg pro Dosis in einer oder mehreren Verabreichungen pro Tag über einen oder mehrere Tage liegen.
  • Zu den Präparaten zur parenteralen Verabreichung zählen sterile wäßrige oder nichtwäßrige Lösungen, Suspensionen und Emulsionen. Nichtwäßrige Lösungsmittel sind zum Beispiel Propylenglycol, Polyethylenglycol, pflanzliche Öle wie Olivenöl, sowie injizierbare organische Ester wie Ölsäureethylester und andere fachbekannte Lösungsmittel, die sich für diese Zwecke eignen. Die erfindungsgemäßen Immunkonjugate können in einer Zusammensetzung mit einem physiologisch unbedenklichen Träger verwendet werden. Zu solchen geeigneten Trägern zählen Kochsalzlösung, PBS, Ringersche Lösung oder Ringerlaktatlösung. Konservierungsstoffe und andere Zusatzstoffe wie Antibiotika, Antioxidantien sowie Cheliermittel können ebenfalls in den pharmazeutischen Präparaten vorliegen.
  • Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Präparate eignen sich zur Behandlung von Tumoren verschiedenster Art, darunter Melanomen, Gliomen und Karzinomen, sowie festen Tumoren.

Claims (9)

1. Fusionsprotein mit einem monoklonalen Antikörper oder einem seiner Fragmente, der bzw. das gegen eine Tumorzelle gerichtet ist, die ein Antigenepitop des Epidermis-Wachstumsfaktorrezeptors (EGF-R) trägt, und einem biologisch aktiven Cytokin, das mit diesem Antikörper oder Antikörperfragment fusioniert ist und eine cytotoxische Fähigkeit aufweist, die Tumorzelle spezifisch zu lysieren, wobei es sich bei dem Cytokin um TNFα handelt und wobei der Antikörper im wesentlichen aus der variablen Region der schweren Kette des Antikörpers, der CH1-, CH2- und CH3-Domäne der konstanten Region und der entsprechenden leichten Kette besteht (Antikörper-CH3-Fusionsprotein) oder wobei das Antikörperfragment im wesentlichen aus der variablen Region der schweren Kette des Antikörpers, der CH1- und CH2-Domäne der konstanten Region und der entsprechenden leichten Kette besteht (Antikörper-CH2-Fusionsprotein).
2. Fusionsprotein nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem monoklonalen Antikörper um Maus-, Hybrid- oder humanisierten MAb 425 handelt.
3. Fusionsprotein nach Anspruch 1 oder 2, ausgewählt aus der Gruppe MAb 425-CH2-TNFα oder MAb 425-CH3- TNFα.
4. Verfahren zur Herstellung eines Fusionsproteins nach einem der Ansprüche 1 bis 3 durch Fusionieren der DNA-Sequenzen, die für den Antikörper bzw. das Antikörperfragment codieren, mit dem biologisch aktiven TNFα, Einführen des entstandenen Konstrukts in einen Expressionsvektor, der in den Wirtsorganismus transformiert wird, Kultivieren der Wirtszellen in einer Nährlösung und Exprimieren und Isolieren des Fusionsproteins.
5. Verfahren nach Anspruch 4, durch Fusionieren der DNA-Sequenzen, die für den Antikörper bzw. die Antikörperfragmente codieren, mit dem biologisch aktiven TNFα auf einer Einzelstrang-DNA mittels eines Oligonucleotids, das zu der gewünschten DNA- Fusionssequenz komplementär ist.
6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, wobei die verwendeten DNA-Sequenzen für ein wie in Anspruch 1 oder 2 definiertes Antikörper-CH3-Fusionsprotein codieren.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6, wobei es sich bei dem Wirtsorganismus um E. coli handelt.
8. Pharmazeutische Zusammensetzung mit mindestens einem der Fusionsproteine nach einem der Ansprüche 1 bis 3 sowie einem physiologisch unbedenklichen Träger.
9. Verwendung eines Fusionsproteins nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Herstellung eines gegen Tumore gerichteten Arzneimittels.
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