RS62115B1 - Konjugati antitelo-lek usmereni prema uparap - Google Patents

Konjugati antitelo-lek usmereni prema uparap

Info

Publication number
RS62115B1
RS62115B1 RS20210886A RSP20210886A RS62115B1 RS 62115 B1 RS62115 B1 RS 62115B1 RS 20210886 A RS20210886 A RS 20210886A RS P20210886 A RSP20210886 A RS P20210886A RS 62115 B1 RS62115 B1 RS 62115B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
uparap
seq
drug conjugate
antigen
Prior art date
Application number
RS20210886A
Other languages
English (en)
Inventor
Christoffer Nielsen
Niels Behrendt
Lars Henning Engelholm
Original Assignee
Rigshospitalet
Univ Copenhagen
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Rigshospitalet, Univ Copenhagen filed Critical Rigshospitalet
Publication of RS62115B1 publication Critical patent/RS62115B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/65—Peptidic linkers, binders or spacers, e.g. peptidic enzyme-labile linkers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68031—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being an auristatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68035—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a pyrrolobenzodiazepine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6865—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from skin, nerves or brain cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2851—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the lectin superfamily, e.g. CD23, CD72
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Description

Opis
Tehničko polje pronalaska
[0001] Predmetno otkriće odnosi se na molekulske konjugate koji su usmereni prema uPARAP receptoru, konkretno, odnosi se na konjugate antitelo-lek (ADC), specifično usmerene prema uPARAP, kao i na primenu konjugata za isporuku aktivnog agensa u ćelije koje eksprimiraju uPARAP. Pronalazak se dalje odnosi na primenu navedenih ADC konjugata u terapiji bolesti povezanih sa ćelijama koje eksprimiraju uPARAP, kao što su kancerske ćelije.
Osnov pronalaska
[0002] Protein asociran sa receptorom za aktivator plazminogena urokinaznog tipa (uPARAP), poznat i pod oznakama CD280, Endo180 i receptor manoze C tip 2, jeste član familije makrofagnih receptora za manozu endocitnih transmembranskih proteina. Protein uPARAP je transmembranski protein uključen u održavanje međućelijskog matriksa tokom remodelovanja tkiva, konkretno, u preuzimanje i unutarćelijsku degradaciju kolagena.
[0003] Receptor uPARAP je pojačano eksprimiran u tumorskim ćelijama specifičnih tipova kancera, uključujući sarkome i pozne glioblastome. Uz to, receptor je najčešće ushodno regulisan u stromalnim ćelijama koje okružuju solidne tumore, a neki literaturni podaci ukazuju na visoku ekspresiju uPARAP u koštanim metastazama kancera prostate (Caley et al., 2012, J. Pathol 5: 775-783). Kod zdravih adulta receptor ima veoma ograničenu tkivnu ekspresiju (Melander et al., 2015, Int J Oncol 47: 1177-1188).
[0004] Konjugati antitelo-lek (ADC) čine novu klasu moćnih biofarmaceutskih lekova namenjenih ciljanoj terapiji, konkretno terapiji i lečenju kancera. ADC konjugati su složeni molekuli sačinjeni od antitela (celo mAB ili fragment antitela), povezanog, preko hemijski stabilnog veznika koji poseduje razgradivu vezu, sa biološki aktivnim lekom ili citotoksičnim jedinjenjem. Kombinovanje jedinstvenih usmeravajućih svojstava antitela i lekova koji imaju sposobnost ubijanja ćelija, omogućava preciznu diskriminaciju zdravog i obolelog tkiva, koja se zasniva na ekspresiji antigena za koje je antitelo specifično. Suprotno tradicionalnim hemoteraputskim agensima, konjugati antitelo-lek aktivno se usmeravaju ka kancerskim ćelijama i selektivno ih napadaju, tako da zdrave ćelije koje eksprimiraju malo ili nimalo antigena, bivaju pošteđene.
[0005] Do sada su tri ADC konjugata dobila odobrenje za promet, a nekoliko ADC konjugata je u fazama kliničkih istraživanja.
[0006] WO 2010/111198 obelodanjuje konjugate koji sadrže anti-uPARAP antitelo i predlaže njihovu primenu u isporuci terapeutskih agenasa u ćelije koje eksprimiraju uPARAP.
[0007] WO 2013/098813 obelodanjuje konjugate koji sadrže anti-uPARAP antitelo, veznik i neki aktivni agens i predlaže primenu ovakvih konjugata u terapiji kancera, kao što je glioblastom.
[0008] L. Engelholm et al., Journal of Pathology, 2016, vol. 238, no. 1, p. 120-133, opisuje primenu reprezentativnih uPARAP antitela u lečenju u mišjem modelu sarkoma. Ovaj rad dalje predlaže kombinovanu primenu reprezentativnih antitela i bifosfonata i/ili anti-tumorskog agensa u terapiji sarkoma.
[0009] H.J. Jürgensen et al., Journal of Biological Chemistry, 2014, vol. 289, no. 11, p. 7935-7947, obelodanjuje antitela usmerena prema uPARAP.
[0010] Za najveći broj tipova kancera postoje postupci lečenja. Međutim, u mnogim slučajevima lečenje nema zadovoljavajuću efikasnost ili ima prateće štetne pojave, usled nespecifičnosti tretmana. Dakle, postoji potreba za efikasnijim tretmanima koji imaju veću specifičnost.
Sažetak
[0011] Predmetni pronalazak obezbeđuje konjugate antitelo-lek (ADC), zasnovane na antiuPARAP antitelima koja su sposobna da se vežu za N-terminalni deo uPARAP. Ovde opisani ADC konjugati imaju sposobnost da se usmere prema specifičnim ćelijama i tkivima koja eksprimiraju uPARAP, i ispoljavaju odličnu efikasnost in vitro i in vivo, bez zabeleženih propratnih štetnih dejstava. Pronalazak je definisan patentnim zahtevima. Svi sadržaji koji su izvan obima definisanog patentnim zahtevima dati su samo u informativne svrhe.
[0012] Predmetni pronalazak obezbeđuje konjugat antitelo-lek, usmeren prema uPARAP, koji se sastoji od:
a. Antitela koje se vezuje za amino kiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 32 ili 33 (domen fibronektina tipa II (FN-II) u uPARAP),
b. Aktivnog agensa, naznačenog time da je aktivni agens izabran između terapeutskog agensa, citotoksičnog agensa, radioizotopa i detektabilnog obeleživača, i
c. Veznika, koji vezuje a) za b).
[0013] U narednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje konjugat antitelo-lek, usmeren prema uPARAP, koji se sastoji od:
a. Antitela, koje se vezuje za amino kiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 32 ili 33 (domen fibronektina tipa II (FN-II) u uPARAP),
b. Aktivnog agensa, naznačeno time da je aktivni agens izabran između terapeutskog agensa, citotoksičnog agensa, radioizotopa i detektabilnog obeleživača, i,
c. Veznika koji vezuje a) za b)
za primenu kao medikamenta.
[0014] U narednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži konjugat antitelo-lek, usmeren prema uPARAP, koji se sastoji od:
a. Antitela, koje se vezuje za amino kiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 32 ili 33 (domen fibronektina tipa II (FN-II) u uPARAP),
b. Aktivnog agensa, naznačeno time da je aktivni agens izabran između terapeutskog agensa, citotoksičnog agensa, radioizotopa i detektabilnog obeleživača, i,
c. Veznika, koji vezuje a) za b)
i farmaceutski prihvatljiv pufer, razblaživač, nosač, adjuvans ili eksipijens.
[0015] U narednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje konjugat antitelo-lek usmeren prema uPARAP, koji se sastoji od:
a. Antitela, koje se vezuje za amino kiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 32 ili 33 (domen fibronektina tipa II (FN-II) u uPARAP),
b. Aktivnog agensa, naznačeno time da je aktivni agens izabran između terapeutskog agensa, citotoksičnog agensa, radioizotopa i detektabilnog obeleživača, i,
c. Veznika, koji vezuje a) za b)
ili farmaceutsku kompoziciju koja sadrži navedeni konjugat antitelo-lek, za primenu u postupcima lečenja bolesti koje se odlikuju prisustvom ćelija koje eksprimiraju uPARAP, naznačeno time da su bolesti koje se odlikuju prisustvom ćelija koje eksprimiraju uPARAP izabrane između kancera, bolesti degradacije kostiju, kao što je osteoporoza, fibroza i bolesti povezanih sa makrofagima ili poremećaji, kao što su ateroskleroza ili hronična inflamacija.
[0016] U narednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje komplet koji sadrži konjugat antitelo-lek, usmeren prema uPARAP, koji se sastoji od:
a. Antitela, koje se vezuje za amino kiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 32 ili 33 (domen fibronektina tipa II (FN-II) u uPARAP),
b. Aktivnog agensa, naznačeno time da je aktivni agens izabran između terapeutskog agensa, citotoksičnog agensa, radioizotopa i detektabilnog obeleživača, i,
c. Veznika, koji vezuje a) za b)
ili farmaceutsku kompoziciju koja sadrži navedeni konjugat antitelo-lek, i, opciono, takođe sadrži sredstvo za administraciju konjugata antitelo-lek i/ili uputstvo za upotebu.
Opis crteža
[0017]
Slika 1. Shematski prikaz četiri člana familije receptora za manozu, uključujuću uPARAP. Svi protein imaju isti globalnu domensku strukturu, sa signalnim peptidom na N-kraju molekula, nakon kojeg sledi domen bogat cisteinom, domen fibronektina tipa II (FN-II domen), 8-10 domena sličnih lektinu tipa C (CTLD), transmembranski region i kratku citoplazmatsku petlju (prerađeno iz Melander et al., 2015 Int J Oncology 47: 1177-1188).
Slika 2. Shematski prikaz ADC sa usmereim dejstvom prema uPARAP, koji se sastoji od antitela konjugovanog sa veznikom-toksin kontsruktom, u formi maleimidokaproil-valincitrulin-p-amino-benzoiloksikarbonil-monometil auristatinom E (MC-VC-PAB-MMAE). Usmeravajuće antitelo je specifično prema uPARAP, za koji se zna da se pojačano eksprimira u nekim tipovima kancera. Konstrukcija veznik-toksin pokvezana je premo maleimida za tiolne grupe slobodnih cisteina ili redukovane disulfidne mostove između lanaca (N=1-10 molekula toksina po antitelu). Region veznika, valin-citrulin, povezan peptidnom/amidnom vezom za razdelnik, predstavlja mesto delovanja lizozomskih proteaza, kao što je katepsin B, mada je u vanćelijskoj sredini ovaj region dovoljno stabilan da obezbedi oslobađanje konjugovanog leka tek onda kada je konjugat preuzet u ćelije koje eksprimiraju antigen. Konjugovani lek u sastavu ADC je monometil auristatina E (MMAE), snažan inhibitor tubulina. Kao celina (mAB-vc-MMAE), ovaj ADC konstrukt obezbeđuje ciljanu isporuku leka u ćelije koje eksprimiraju uPARAP antigen, i oslobađanje konjugovanog leka samo unutarćelija.
Slika3: Preuzimanje u ćeliju mAb 2h9 antitela, obeleženog fluoroforom (AlexaFluor 647, AF647), postupkom koji je sličan konjugacionom postupku opisanom u legendi za Sliku 2 (parcijalna redukcija, nakon koje sledi reakcija sa maleimid-AlexaFluor 647 reagensom), u uPARAP-pozitivnim ćelijskim linijama, izmereno protočnom citometrijom. MFI: Prosečni intenzitet fluorescencije. Odnos specifičnosti: Odnos 2h9-AF647/aTNP-AF647 signala, sa aTNP, koji je služio kao ne-usmeravajuće kontrolno mAb. Vrednosti pokazuju specifično preuzimanje 2h9-AF647, i potvrđuju da je mAb 2h9 preuzeto u uPARAP-pozitivne ćelije, nakon ovog konjugacionog postupka.
Slika 4: A. Redukujuća SDS-PAGE elektroforetsko razdvajanje usmeravajućeg antitela (2h9), mAb-vc-MMAE ADC dobijenog u uslovima umerenog molekulskog odnosa lekantitelo (DAR) od ∼4-5, i mAb-vc-MMAE ADC sa DAR vrednošću od ∼8-10. Uočeno je da konjugovana mAbs imaju manju mobilnost na gelu, a da su umereno konjugovane ADC vrste konjugovane preko teških lanaca mAb, dok su ADC sa visokim DAR konjugovane i preko teških i preko lakih lanaca. B. Redukujuća SDS-PAGE elektroforeza, koja pokazuje da inkubacija ADC sa aktiviranim rekombinantnim katepsinom B (+rh katepsin B), vraća mobilnost ADC na gelu na onu koju ima nemodifikovano usmeravajuće antitelo, što ukazuje da se ADC u regionu veznika može iseći lizozomalnim proteazama, kao što je katepsin B. C. Podaci ELISA testa ukazuju na očuvan afinitet mAb 2h9 prema uPARAP-u, nakon redukcije konjugacije, kao i u sastavu ADC. Sve zajedno, ovi podaci pokazuju da se ADC 2h9-vc-MMAE, nakon konjugacije, ponaša očekivano u pogledu mobilnosti na gelu i afinitetu prema ciljnom receptoru.
Slika 5: Test ćelijske vijabilnosti in vitro, nakon izlaganja ćelija različitim razblaženjima ADC-a. Diluciona serija počinje od koncentracije 10 µg/mL ADC (mAb komponenta), i nastavlja se serijskim četvorostrukim razblaženjima ADC. Ćelije su inkubirane 72 sata, pre analize kolorimetrijskim testom vijabilnosti. Test pokazuje specifično smanje je ukupne vijabilnosti nakon inkubacije ćelija sa ADC 2h9-vc-MMAE usmerenim prema uPARAP-u, u odnosu na ADC sa ne-usmerenim antitelom (aTNP-vc-MMAE), u ćetiri ćelijske linije koje eksprimiraju receptor (U937, THP-1, HT1080 and KNS42 cells), dok ćelijska linija koja ne eksprimira receptor (CHO-K1) ostaje netaknuta. Ovo je dokaz receptor-zavisnog smanjenja vijabilnosti uPARAP-pozitivnih ćelijskih linija nakon inkubacije sa ADC 2h9-vc-MMAE.
Slika 6: Distribucija ćelija po fazama ćelijskog ciklusa u četiri ćelijske linije koje eksprimiraju uPARAP (U937, THP-1, HT1080 ili KNS42), nakon 3 dana inkubacije sa 1µg/mL uPARAP-usmerenih ADC 2h9-vc-MMAE, sa kontrolnim ADC aTNP-vc-MMAE, ili sa 50 nM slobodnog MMAE toksina. S obzirom na to da MMAE deluje kao inhibitor tubulina, ovaj lek dovodi do povećanja udela ćelija u Sub-G1 fazi (koja vodi u apoptozu), G2-M fazi (inhibicija segregacije genoma nakon DNK replikacije). Crtice označavaju rezultate ispod nivoa detekcije, usled ćelijske smrti i dezintegracije ćelija. Sve četiri testirane ćelijske linije ispoljile su senzitivnost prema uPARAP-usmerenim ADC 2h9-vc-MMAE (kao i slobodnom MMAE), što se odslikava u većoj zastupljenosti ćelija u Sub-G1 i G2/M fazi.
Slika 7: Kompetitivni test, koji pokazuje U937 ćelije inkubirane 3 dana sa 1µg/mL uPARAP-usmerenih ADC 2h9-vc-MMAE, i istovremeno sa različitim koncentracijama ne-konjugovanog usmeravajućeg antitela (2h9), sa drugim antitelom specifičnim prema uPARAP-u (5f4), ili sa ne-usmerenim kontrolnim antitelom (aTNP). Podaci pokazuju da ne-konjugovano usmeravajuće antitelo 2h9, samo kada je prisutno u molarnom suvišku (1+ µg/mL kompetitivnih mAb), može da spreči efekte usmerevajućeg ADC, spasavanjem ćelija od ADC-om posredovane ćelijske smrti. Dakle, pokazano je da je interakcija između uPARAP i usmeravajućeg antitela 2h9 ključna za utvrđeni citotoksični efekat.
Slika 8: Preinkubacija U937 ćelija u prisustvu inhibitora lizozomalnih proteaza širokog spektra (E64D), dovodi do potpunog ukidanja citotoksičnog efekta uPARAP-usmerenih ADC 2h9-vc-MMAE. Dakle, pokazano je da je za ostvarivanje citotoksičnog efekta konjugovanog leka ključno oslobađanje leka posredstvom lizozoma.
Slika 9: In vivo testiranje efikasnosti uPARAP-usmerenog ADC 2h9-vc-MMAE u borbi protiv uPARAP-pozitivnog potkožnog ksenografta tumora, uspostavljenog injektovanjem U937 ćelijske linije u CB17 SCID miševe. Miševima je u blizini tumora injketovana potkožna (s.c.) injekcija uPARAP-usmerenog ADC 2h9-vc-MMAE (N=10), kontrolni ADC aTNP-vc-MMAE (N=9), nekonjugovano mAb 2h9 (N=5), ili fiziološki rastvor (PBS, N=5). Svi tretmani su sprovedeni u dozama od 3 mg/kg/injekcije mAb komponente, u vidu 4 doze, tokom 4 dana. Dan 0 je dan prve injekcije, odnosno dan kada je tumor palpatorno dostigao veličinu od 50-100 mm<3>, a grafici pokazuju prosečnu veličinu tumora u eksperimentalnim grupama. Uočava se da tretman ADC 2h9-vc-MMAE dovodi do drastičnog smanjenja rasta tumora, dok u svim ostalim grupama tumor dostiže veličinu žrtvovanja, 10-12 dana nakon početnog tretmana. Ovo pokazuje da uPARAP-usmereni ADC 2h9-vc-MMAE efikasno inhibira rast prethodno uspostavljenog uPARAP-pozitivnog tumora in vivo. Dalje, podaci dobijeni od grupe tretirane 2h9-vc-MMAE ukazuju na konstatnu stopu izlečenja od 50% (videti, takođe, Sliku 10).
Slika 10: Detaljniji pregled rasta tumora kod grupe tretirane 2h9-vc-MMAE i opisane na Slici 9, pokazuje da je ova grupa obuhvatila miševe koji nisu imali kompletan tretman i miševe u relapsu, kao i miševe kod kojih se tumor potpuno povukao i koji nisu pokazivali relaps. Od 10 miševa tretiranih 2h9-vc-MMAE, 5 je pokazalo gotovo trenutni relaps rasta tumora nakon tretmana, brzo dostižući tačku žrtvovanja, dok je preostalih 5 izgubilo sve znake tumora, i ostalo bez tumora narednih 90 dana, što daje ukupnu stopu trajnog izlečenja od 50%, za miševe tretirane 2h9-vc-MMAE putem potkožne administracije.
Slika 11: In vivo testiranje efikasnosti uPARAP-usmerenog ADC 2h9-vc-MMAE u borbi protiv uPARAP-pozitivnog, potkožnog ksenografta tumora, uspostavljenog injektovanjem ćelijske linije U937 u CB17 SCID miševe. Miševi su tretirani intravenskom (i.v.) injekcijom u repnu venu, uPARAP-usmerenog ADC 2h9-vc-MMAE (N=10), kontrolnog ADC aTNP-vc-MMAE (N=10), nekonjugovanih mAb 2h9 (N=5), ili fiziološkog rastvora (PBS, N=5). Svi tretmani su izvršeni u dozi od 5 mg/kg/injekcije mAb komponente, ukupno 3 doze, tokom 4 dana. Dan 0 označava dan prve injekcije, koja je data kada je tumor dostigao palpatornu veličinu od 50-100 mm<3>, i grafik pokazuje prosečnu veličinu tumora u različitim grupama tretmana. Pod ovim uslovima, tretman uPARAP-usmerenog ADC 2h9-vc-MMAE doveo je do potpunog uklanjanja tumora kod 10 miševa, što rezultira ukupnom stopom trajnog izlečenja od 100% miševa, nakon intravenske primene ovog ADC, što dalje pokazuje efikasnot ADC 2h9-vc-MMAE u borbi protiv solidnih, uPARAP-pozitivnih tumora.
Slika 12: In vitro esej ćelijske vijabilnosti, koji pokazuje specifično smanjenje ukupne vijabilnosti ćelija nakon inkubacije sa uPARAP-usmerenim ADC 2h9-vc-MMAE ili uPARAP-usmerenim ADC 5f4-vc-MMAE, u poređenju sa neusmerenim ADC (aTNP-vc-MMAE), u U937 ćelijskoj liniji. Podaci ukazuju na ADC-konjugati sa 5f4 ispoljavaju sličnu efikasnost kao ADC –konjugati sa 2h9 antitelima.
Slika 13: Imunohistohemijsko bojenje različitih sarcoma (liposarkom, miksofibrosarkom, dermatofibrosarkom protuberans (DFSP) i leiomiosarkom (LMS). Analiza pokazuje tkivnu ekspresiju uPARAP, kao tamnu crveno-braon bojenje. Ekspresije uPARAP se uočava na presecima malignog kancerskog (tumorskog) tkiva, dok su preseci nekancerskog tkiva slobodni od uPARAP, što ukazuje na povećane nivoe ekspresije uPARAP u sarcomima. Veličina skale: 20µm.
Slika 14: Za efikasnu isporuku leka u ADC formatu mogu se primeniti različita antitela usmerena prema N-kraju uPARAP. ADC, u konfiguraciji mAb-vc-MMAE, pripremljen je kao što je opisano u legendi Slike 2, primenom tri različita antitela usmerena prema epitopima tri N-terminalna domena uPARAP (mAb 2h9, mAb 5f4 id mAb 9b7). Takođe je, radi poređenja, na isti način dobijen ADC sa anti-uPARAP antitelom usmerenim prema epitopu van domena na N-terminusu (mAb 11c9). Test ćelijske vijabilnosti in vitro na U937 ćelijama izveden je kao što je objašnjeno u legendi Slike 5, za svaki od pet primenjih ADC konjugata. Svi ADC su izveli specifično smanjenja ukupne ćelijske vijabilnosti, pri čemu je osetljivost ćelija bila veća prema 2h9-vc-MMAE, 5f4-vc-MMAE i 9b7-vc-MMAE, od senzitivnosti prema 11c9-vc-MMAE.
Slika 15: Za dobijanje ADC konjugata koji je usmeren prema N-terminalnom kraja uPARAP moguće je koristiti različite toksine. Pripremljen je ADC, sa mAb 2h9 kao antitelom, kao što je opisano u legendi Slike 2, ali uz linker –citotoksičnu jednicu, umesto VC-PAB-MMAE: VC-PAB-MMAF (sa MMAF - monometil auristatin F, karboksilvarijanta MMAE) i PEG4-va-PBD (sa PEG4-polietilenglikolni razdelnik, sa valin-alanin i PBD kao dimernog pirolobenzodiazepina). Rezultujući ADC konjugati (označeni sa 2h9-vc-MMAF i 2h9-va-PBD) primenjeni su u in vitro testu ćelijske vijabilnosti, na U937 ćelijama, koji je izveden kao što je opisano u legend Slike 5. U937 ćelije ispoljile su veoma veliku osetljivost na 2h9-vc-MMAF i umerenu osetljivost na 2h9-va-PBD. Slika 16: ADC konjugat, sa mAb 2h9 kao antitelom, pripremljen je kao što je opisano u legendi Slike 2, uz primenu sledeće veznik-citotoksin jedinice, umesto VC-PAB-MMAE: PEG4-vc-Duokarmicin SA (sa PEG4- polietilenglikolski razdelnik i vc - valin-citrulin). Rezultujući ADC (označen sa 2h9-vc-DuocSA) primenjen je u in vitro testu ćelijske vijabilnosti na U937 ćelijama, koji je izveden, kao što je opisano, u legendi Slike 5. U937 ćelije su ispoljile nisku, ali merljivu osetljivost na 2h9-vc-DuocSA.
Slika 17: ADC konjugati, sa mAbs 2h9 ili TNP, kao antitelima, pripremljeni su kao što je opisano u legendi Slike 2. Primenom sledećih veznik-citotoksičnih jedinica: VC-PAB-MMAE ili VC-PAB-MMAF. Rezultujući ADC konjugati (označeni sa 2h9-vc-MMAE, 2h9-vc-MMAF, aTNP-vc-MMAE i aTNP-vc-MMAF), primenjeni su u in vitro testu ćelijske vijabilnosti, na ćelijama eksplanta humanih glioblastoma, a test je izvršen kao što je opisano u legendi Slike 5. Eksplanti glioblastoma su ispoljili visok nivo osetljivosti na uPARAP-usmerene ADC, kako na one koji sadrže MMAE, tako i na one koji sadrže MMAF toksin.
Slika 18: Rekombinantni mAb 2h9 proizvod, označen kao " klonirano 2h9”, proizveden je u CHO ćelijama transfektovanim ekspresionim vektorom koji sadrži DNK sekvence koje kodiraju laki lanac i teški lanac mAb 2h9 ([SEQ ID NO: 1], odnosno, [SEQ ID NO: 5]). Reaktivnost ovog proizvoda analizirana je Western blotom i upoređena je sa mAb 2h9, proizvedenim u hibridoma ćelijskoj kulturi ("originalno 2h9"). Ćelijski lizat korišćen u metodi Western blota, dobijen od uPARAP-pozitivnih MG63 ćelija ostesarkoma, uz korišćenje istih koncentracija “kloniranog 2h9" i "originalnog 2h9" koji su korišćeni kao primarna antitela. Dva antitela su ispoljila identične reakcije i oba su reagovala specifično sa uPARAP proteinom. Reakcija je izostala u odsustvu primarnog antitela (negativna kontrola).
Sekvence
[0018]
SEQ ID NO: 15 mAb 5f4 Amino kiselinska sekvenca varijabilnog regiona
1
80-228
47-361
35-360
aa 46-
41-360
46-228
kvenca
81-361
80-360
ma ma ma ma ma ma a a a
[0019] Sekvenca regiona koji određuju komplementarnost (CDR) predviđena je prema šemi Kabat et al., kao što je opisano u referencama Kabat et al. (1983), Kabat et al. (1991) i Wu and Kabat (2008), u programskom paketu za Kabat-numerisanje, kao što je objavljeno od strane Dunbar-a i Deane-a (2016). Antigen-vezujući regioni (ABR), čija je sekvenca predviđena primenom Paratome algoritma, takođe su predviđeni kao što je opisano u referencama Kunik et al. (2012a i b). ABR domeni su alternativni CDR domeni antitela koja su ovde obelodanjena.
[0020] Sekvence regiona uključenih u prepoznavanje i vezivanje antigena mogu neznatno da se razlikuju od specifikovanih CDR i ABR, a obuhvaćene su sve sekvence, uključujući specifikovane varijabilne regione ili Fab fragmente, kao potencijalni faktori u vezivanju antigena. U identifikaciji potencijalnih regiona za vezivanje i prepoznavanje antigena mogu se primeniti postupke ili algoritme različiti od onih koji su ovde korišćeni. Stoga, uz predviđene i prikazane CDR sekvence, pronalazak obuhvata sve druge amino kiselinske sekvence koje na osnovu predikcije primenom ovih postupaka i algoritama reprezentuju CDR ili ABR u mAbs 2h9, 5f4 i 9b7 na osnovu odgovarajućih Fab regiona i varijabilnih regiona (prema SEQ ID NOs: 9, 10, 11, 15, 20, odnosno, 25). Primeri drugog postupaka i algoritma za predikciju CDR je IMGT sistem (LeFranc et al., (2003))
[0021] Zbog položaja prajmera tokom sekvencioniranja lakih i teških lanaca Fab 9B7, postoji izvesna nepreciznost redosleda amino kiselina na N-terminusu ovih sekvenci. Stoga, prvih 7 amino kiselina u sekvenci SEQ ID NO: 19 ne moraju biti potpuno precizno navedene. Isto važi
1
za prvih osam amino kiselina sekvence SEQ ID NO: 24. Sekvence SEQ ID NO: 20 i 25 odgovaraju sekvencama SEQ ID NO: 19, odnosno, 24, bez neizvesnih pozicija na N-terminusu.
Detaljan opis
[0022] Pronalazak je definisan pridruženih patentnim zahtevima. Svaki oblik izvođenja koji nije obuhvaćem obimom pridruženih zahteva nije deo ovog pronalaska.
[0023] Konjugat antitelo-lek koji je usmeren prema uPARAP-u u predmetnom pronalasku sadrži a) antitelo, koje se vezuje za domen bogat cisteinom (CysR), domen fibronektina tipa II (FN-II) domen i/ili domen 1 sličan lektinu tipa C (CTLD 1) u uPARAP,
b) aktivni agens, i
c) opciono, veznik, koji povezuje a) za b).
[0024] U posebnom aspektu predmetnog pronalaska, konjugat antitelo-lek koji je usmeren prema uPARAP prema predmetnom pronalasku, sadrži
a. antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, sposoban da se veže za:
i. amino kiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 36 ili 37 (CysR-FN-II-CTLD-1 domeni uPARAP),
ii. amino kiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 38 ili 39 (CysR-FN-II domeni uPARAP),
iii. amino kiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 40 ili 41 (FN-II-CTLD-1 domeni uPARAP),
iv. amino kiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 30 ili 31 (domen bogat cisteinom (CysR) u uPARAP)
v. amino kiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 32 ili 33 (domen fibronektina tipa II (FN-II) uPARAP), i/ili
vi. amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 34 ili 35 (domen 1 sličan lektinu tipa-C (CTLD 1) u uPARAP),
b. aktivni agens, i opciono
c. veznik koji povezuje a) za b).
Antitela usmerena prema uPARAP
[0025] Anti-uPARAP antitelo prema predmetnom otkriću, ulazi u ćeliju nakon vezivanja za uPARAP na ćelijskoj membrani, omogućavajući tako unutarćelijsko dejstvo aktivnog agensa u sasatvu ADC kompleksa. Poznato je, na primer, iz WO 2010/111198, da neće sva antitela koja se vezuju za uPARAP, ući u ćeliju istom brzinom i u istoj meri. Zaista, neka anti-uPARAP antitela uopšte ne ulaze u ćeliju, pa stoga nisu pogodna za primenu u sastavu ADC prema pronalasku.
[0026] uPARAP receptor sastoji se od N-terminalnog domena bogatog cisteinom (CysR), domen fibronektina tipa II (FN-II), i osam domena sličnih lektinu tipa-C (CTLD 1-8), videti Sliku 1. Pojedinačni domeni su međusobno povezani kratkim amino kiselinskim sekvencama. Prikazani podaci ukazuju da su anti-uPARAP antitela, usmerena prema tri domena na samom N-terminusu uPARAP veoma delotvorna kada se nađu u sastavu ADC.
[0027] Stoga je prema predmetnom pronalasku poželjno da se anti-uPARAP antitela preferencijalno vezuju za N-terminalni region uPARAP, poželjnije za epitop lokalizovan u jednom od tri domena postavljena na samom N-terminusu uPARAP, konkretno za domen bogat cisteinom, domen fibronektina tipa II i/ili domen 1 sličan lektinu C-tipa, uključujući i vezne sekvence koje povezuju ove domene u uPARAP.
[0028] Stoga je anti-uPARAP antitelo, prema predmetnom otkriću, sposobno da veže peptid, koji sadrži ili se sastoji od domena bogatog cisteinom (CysR) (SEQ ID NO: 30 ili 31), domena fibronektina tip II (FN-II) (SEQ ID NO: 32 ili 33) i/ili domena 1 sličnog lektinu C-tipa (CTLD 1) (SEQ ID NO: 34 i 35) uPARAP.
[0029] Domen bogat cisteinom, domen fibronektina tip II, domen 1 sličan lektinu C-tipa, uključujući i vezne sekvence koje povezuju ove domene, kao što su navedene u bazi podataka NCBI, odgovaraju amino kiselinskoj (aa) sekvenci 46-361 pune dužine humanog uPARAP. Stoga, u jednom obliku izvođenja predmetnog pronalaska, epitop anti-uPARAP antitela lokalizovan je u regionu aa 46-361 prema SEQ ID NO: 29 (puna dužina sekvence humanog uPARAP). U jednom obliku izvođenja predmetnog otkrića, anti-uPARAP antitelo, prema pronalasku, vezuje se za epitop lokalizovan u delu aa 31-365 prema sekvenci SEQ ID NO: 29, poželjnije u delu aa 46-361 sekvence SEQ ID NO: 29, što odgovara amono kiselinskoj sekvenci prema SEQ ID NO: 36. SMART predviđa da sekvenca CYSR-FN-II-CTLD1, uključujući veznike koja povezuje ove domene, odgovata pozicijama 41-360 sekvence prema SEQ ID NO: 29. Stoga, u jednom obliku izvođenja predmetnog otkrića, epitop anti-uPARAP antitela
1
lokalizovan je u region aa 41-360 sekvence prema SEQ ID NO: 29, što odgovara sekvenci SEQ ID NO: 37.
[0030] U jednom obliku izvođenja pronalaska, anti-uPARAP antitela prema pronalasku, vezuju se za CysR domen i/ili CTLD-1 domen.
[0031] U jednom obliku izvođenja predmetnog pronalaska, anti-uPARAP antitelo prema pronalasku, vezuje se za CysR domen, koji se prema predikciji NCBI sastoji od aa 46-161 pune dužine humanog uPARAP, što odgovara sekvenci prema SEQ ID NO: 30, dok prema SMART predikciji obuhvata aa 41-161 pune dužune humanog uPARAP, što odgovara sekvenci prema SEQ ID NO: 31. U jednom obliku izvođenja predmetnog pronalaska, antitelo se vezuje za epitop lokalizovan između aa 46-161 ili 41-161 sekvence prema SEQ ID NO: 29.
[0032] U jednom obliku izvođenja predmetnog otkrića, anti-uPARAP antitelo prema pronalasku, vezuje se za FN-II domen, koji se, prema predikciji NCBI, sastoji od aa 181-228 pune dužine humanog uPARAP, što odgovara sekvenci prema SEQ ID NO: 32, dok se prema SMART predikciji sastoji se od aa 180-228 pune dužine humanog uPARAP, što odgovara sekvenci prema SEQ ID NO: 33. Odnosno, u jednom obliku izvođenja predmetnog pronalaska, antitelo se vezuje za epitop lokalizovan između aa 181-228 ili 180-228 sekvence prema SEQ ID NO: 29.
[0033] U jednom obliku izvođenja predmetnog otkrića, anti-uPARAP antitelo prema pronalasku vezuje se za CTLD-1 domen, koji se, prema predikciji NCBI, sastoji od aa 247-361 pune dužine humanog uPARAP, što odgovara sekvenci prema SEQ ID NO: 34, dok se prema SMART predikciji sastoji od aa 235-360 pune dužione humanog uPARAP, što odgovara sekvenci prema SEQ ID NO: 35. Odnosno, u jednom obliku izvođenja predmetnog otkrića, antitelo se vezuje za epitop lokalizovan između aa 247-361 ili 235-360 sekvence prema SEQ ID NO: 29.
[0034] U jednom obliku izvođenja predmetnog pronalaska, anti-uPARAP antitelo prema pronalasku vezuje se za peptid koji sadrži ili se sastoji od CysR i FN-II domena, uključujući i vezne sekvence koje povezuju ove domene, koji se, prema predikciji NCBI, sastoji od aa 46-228 pune dužine humanog uPARAP, a to odgovara sekvenci prema SEQ ID NO: 38, dok se prema SMART predikciji, sastoji od aa 41-228 pune dužine humanog uPARAP, što odgovara sekvenci prema SEQ ID NO: 39. Odnosno, u jednom obliku izvođenja predmentog pronalaska, antitelo se vezuje za epitop lokalizovan između aa 46-228 ili 41-228 sekvence prema SEQ ID NO: 29.
1
[0035] U jednom obliku izvođenja predmetnog pronalaska, anti-uPARAP antitelo prema pronalasku vezuje se za peptid koji sadrži ili se sastoji od FN-II i CTLD-1 domena, uključujući i vezne sekvence koje povezuju ove domene, odnosno, prema NCBI sadrži aa 181-361 pune dužine humanog uPARAP, što odgovara sekvenci prema SEQ ID NO: 40, dok prema SMART predikciji obuhvata aa 180-360 pune dužine humanog uPARAP, što odgovara sekvenci prema SEQ ID NO: 41. Odnosno, u jednom obliku izvođenja predmetnog pronalaska, antitelo se vezuje za epitop lokalizovan između aa 180-361 ili 181-360 sekvence prema SEQ ID NO: 29.
[0036] U jednom obliku izvođenja predmetnog pronalaska, anti-uPARAP antitelo je mišje monoklonsko IgG1k antitelo klona 2.h.9:F12, komercijalno dostupno kod Merck Millipore (http://www.merckmillipore.com/DK/en/product/Anti-UPAR-Associated-Protein-Antibody%2C-clone-2.h.9%3AF12,MM NF-MAB2613?cid=BI-XX-BRC-P-GOOG-ANTI-B302-1075) ili funkcionalni fragment ili varijanta ovog antitela, kao što je himerno ili humanizovano antitelo. Mišje monoklonsko IgG1k antitelo klona 2.h.9:F12 označeno je ovde sa "2h9" ili "mAb 2h9". Ovo 2h9 antitelo reaguje sa humanim i mišjim uPARAP, pa je stoga podesno za preklinička i klinička istraživanja.
[0037] Prethodne studije ukazuju da je epitop antitela 2h9 lokalizovan u tri N-terminalno postavljena domena uPARAP, konkretno u CysR domenu ili CTLD-1 domenu. Solubilni rekombinantni protein koji se sastoji od tri N-terminalna domena uPARAP (CysR, FN-II i CTLD-1), vezuje se za 2h9 antitela imobilisana na BIAcore-u, što sužava epitop za vezivanje mAb 2h9 na ova tri N-terminalna domena (Jürgensen et al., 2011, JBC 286(37):32736-48). mAb 2h9 se jednako vezuje za rekombinantni protein u kojem je FN-II domen uPARAP zamenjen FN-II domenom nekog drugog člana iste receptorske familije, što ukazuje da se epitop za vezivanje mAb 2h9 antitela verovatno ne nalazi unutar FN-II domena (Jürgensen et al., 2014, JBC 289(11):7935-47). To dalje sužava epitop za vezivanje mAb 2h9 antitela na CysR i/ili CTLD-1 domen.
[0038] Predviđena sekvenca CDR varijabilnog regiona lakog lanca imunoglobulina mAb 2h9 odgovara SEQ ID NO:2-4:, predviđena sekvenca CDR varijabilnog regiona teškog lanca mAb 2h9 odgovara sekvenci prema SEQ ID NO: 6-8.
[0039] U jednom obliku izvođenja predmetnog otkrića, anti-uPARAP antitelo je 2h9 antitelo ili nijegov funkcionalni fragment ili varijanta, i izabrano je iz grupe koja se sastoji od
a. antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta koji se sastoji od
1
i. varijabilnog regiona lakog lanca imunoglobulina koji sadrži ili se sastoji od amino kiselinske sekvence prema SEQ ID NO: 1 ili 9 ili sekvence koja ima najmanje 70% identičnosti sa prethodnom sekvencom, na primer, najmanje 80% identičnosti, na primer, najmanje 90% identičnosti, i/ili
ii. varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina koji sadrži ili se sastoji od amino kiselinske sekvence prema SEQ ID NO: 5 ili 10, ili sekvence koja ima najmanje 70% identičnosti sa prethodnom sekvencom, na primer, najmanje 80% identičnosti, na primer, najmanje 90% identičnosti sekvence,
b. antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, koje se vezuje za isti epitop kao i antitelo pod a),
c. humanizovane verzije antitela pod a) ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta ili humanizovane verzije antitela pod b) ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, d. himerne verzija antitela pod a) ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, ili himerne verzije antitela pod b) ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta,
e. antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, koji sadrži
i. jednu ili više amino kiselinskih sekvenci prema SEQ ID NO: 2, 3, 4, 6, 7 i 8, ili ii. amino kiselinske sekvence prema SEQ ID NO: 2, 3 i 4, i/ili amino kiselinske sekvence prema SEQ ID NO: 6, 7 i 8,
f. antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, koji sadrži,
i. jednu ili više amino kiselinskih sekvenci prema SEQ ID: 42, 43, 44, 45, 46 i 47, ili
ii. amino kiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 42, 43 i 44, i/ili amino kiselinske sekvence prema SEQ ID NO: 45, 46 i 47.
[0040] Da bi se očuvala sposobnost antitela prema predmetnom pronalasku, da prepozna antigen, varijacije sekvenci najčešće nisu locirane unutar CDR ili ABR domena. Stoga, u poželjnom obliku izvođenja pronalaska, sve varijacije sekvenci lokalizovane su van CDR ili ABR domena. Sve ovde obelodanjene varijante antitela i antigen-vezujućih fragmenata imaju očuvanu sposobnost vezivanja za uPARAP.
[0041] Na primer, antitela prema predmetnom pronalsku mogu da sadrže,
a. varijabilni region lakog lanca imunoglobulina, koji sadrži amino kiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 1 ili 9 ili sekvencu koja ima najmanje 70% identičnosti sa prethodnim sekvencama, na primer, najmanje 80% identičnosti, najmanje 90% identičnosti i koja dalje sadrži:
1
i. CDR1, sa sekvencom prema SEQ ID NO: 2,
ii. CDR2, sa sekvencom prema SEQ ID NO: 3,
iii. CDR3, sa sekvencom prema SEQ ID NO: 4, i
b. varijabilni region teškog lanca imunoglobulina, koji sadrži amino kiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 5 ili 10 ili sekvencu koja ima najmanje 70% identičnosti sekvence sa prethodnim sekvencama, na primer, najmanje 80% identičnosti, najmanje 90% identičnosti, i dalje sadrži
i. CDR1, sa aa sekvencom prema SEQ ID NO: 6,
ii. CDR2, sa aa sekvencom prema SEQ ID NO: 7,
iii. CDR3, sa aa sekvencom prema SEQ ID NO: 8,
naznačeno time da su sve varijacije sekvence lokalizovane van CDR domena.
[0042] Alternativno, antitelo prema pronalasku može da sadrži
a. varijabilni region lakog lanca imunoglobulina, koji sadrži amino kiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 1 ili 9 ili sekvencu koja ima najmanje 70% identičnosti sekvence sa prethodnim sekvencama, na primer, najmanje 80% identičnosti, najmanje 90% identičnosti, i dalje sadrži
i. ABR 1, sa aa sekvencom prema SEQ ID NO: 42,
ii. ABR 2, sa aa sekvencom prema SEQ ID NO: 43,
iii. ABR 3, sa aa sekvencom prema SEQ ID NO: 44, i
b. varijabilni region teškog lanca imunoglobulina, koji sadrži amino kiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 5 ili 10 ili sekvencu koja ima najmanje 70% identičnosti sa prethodnim sekvencama, na primer, najmanje 80% identičnosti, najmanje 90% identičnosti, i dalje sadrži
i. ABR 1, sa aa sekvencom prema SEQ ID NO: 45,
ii. ABR 2, sa aa sekvencom prema SEQ ID NO: 46,
iii. ABR 3, sa aa sekvencom prema SEQ ID NO: 47,
naznačeno time da se sve varijacije sekvenci nalaze van ABR domena.
[0043] U jednom obliku izvođenja predmetnog pronalaska, anti-uPARAP antitelo prema pronalasku je mišje monoklonsko antitelo 5f4 ili njegov funkcionalnui fragment ili varijanta. Antitelo 5f4 pripada klasi IgG1κ.
[0044] Istraživanja su pokazala da je epitop 5f4 antitela lokalizovan unutar FN-II domena uPARAP. U radu Jurgensen et al., 2014, pokazano je da je 5f4 antitelo sposobno da se veže za
1
neizrođeni (wild type) oblik uPARAP, kao i za rekombinantne članove familije receptora za manozu, čiji su FN-II domeni zamenjeni FN-II domenom uPARAP. Antitelo 5f4 ne može da se veže za druge članove familije receptora za manozu u njihovoj neizrođenoj formi, niti se vezuje za uPARAP u kojem je neizrođeni FN-II domen zamenjen ekvivalentnim domenima ostalih članova familije receptora za manozu (Jürgensen et al., 2014, JBC 289(11):7935-47).
[0045] U jednom obliku izvođenja predmetnog pronalaska, anti-uPARAP antitelo prema predmetnom pronalasku je 5f4 antitela ili njegov funkcionalni fragment ili varijanta izabrana iz grupe koja se sastoji od
a. antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenat, koji sadrži
i. varijabilni region lakog lanca imunoglobulina, koji sadrži ili se sastoji od amino kiselinske sekvence prema SEQ ID NO: 11 ili sekvence koja ima najmanje 70% identičnosti sa prethodnom sekvencom, na primer, najmanje 80% identičnosti, najmanje 90% identičnosti sekvence i/ili
ii. varijabilni region teškog lanca imunoglobulina, koji sadrži ili se sastoji od amino kiselinske sekvence prema SEQ ID NO: 15 ili sekvence koja ima najmanje 70% identičnosti sekvence sa prethodnom sekvencom, na primer, najmanje 80% identičnosti, najmanje 90% identičnosti,
b. antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, koji vezuje isti epitop kao i antitelo pod a),
c. humanizovane verzije antitela pod a) ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, ili humanizovane verije antitela pod b) ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta,
d. himerne verzije antitela pod a) ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, ili himerne verzije antitela pod b) ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta,
e. antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragment, koji sadrži
i. jednu ili više amino kiselinskih sekvenci prema SEQ ID NO: 12, 13, 14, 16, 17 i 18, ili
ii. amino kiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 12, 13 i 14, i/ili amino kiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 16, 17 i 18.
f. antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta koji sadrži
i. jednu ili više amino kiselinskih sekvenci prema SEQ ID NOs: 48, 49, 50, 51, 52 i 53, ili
ii. amino kiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 48, 49 i 50, i/ili amino kiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 51, 52 i 53.
2
[0046] Da bi se unele varijacije sekvenci izvan CDR domena, antitelo prema predmetnom pronalasku može da sadrži
a. varijabilni region lakog lanca imunoglobulina, koji sadrži amino kiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 11 ili sekvencu koja ima najmanje 70% identičnosti sa prethodnom sekvencom, kao što je najmanje 80% identičnosti, na primer, najmanje 90% identičnosti, i dalje sadrži
i. CDR1, sa aa sekvencom prema SEQ ID NO: 12,
ii. CDR2, sa aa sekvencom prema SEQ ID NO: 13,
iii. CDR3, sa aa sekvencom prema SEQ ID NO: 14, and
b. varijabilni region teškog lanca imunoglobulina, koji sadrži amino kiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 15 ili sekvencu koja ima najmanje 70% identičnosti sa prethodnom sekvencom, kao što je najmanje 80% identičnosti, najmanje 90% identičnosti, i dalje sadrži
i. CDR1, sa aa sekvencom prema SEQ ID NO: 16,
ii. CDR2, sa aa sekvencom prema SEQ ID NO: 17,
iii. CDR3, sa aa sekvencom prema SEQ ID NO: 18,
naznačeno time da su sve varijacije sekvenci lokalizovane van CDR domena.
[0047] Alternativno, antitelo prema predmetnom pronalasku može da sadrži
a. varijabilni region lakog lanca imunoglobulina, koji sadrži amino kiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 11 ili sekvencu koja ima najmanje 70% identičnosti sa prethodnom sekvencom, na primer, najmanje 80% identičnosti, najmanje 90% identičnosti, i dalje sadrži
i. ABR1, sa aa sekvencom prema SEQ ID NO: 48,
ii. ABR2, sa aa sekvencom prema SEQ ID NO: 49,
iii. ABR 3, sa aa sekvencom prema SEQ ID NO: 49, i
b. varijabilni region teškog lanca imunoglobulina, koji sadrži amino kiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 15 ili sekvencu koja ima najmanje 70% identičnosti sa prethodnom sekvencom, na primer, najmanje 80% identičnosti, najmanje 90% identičnosti, i koja dodatno sadrži
i. ABR 1, sa aa sekvencom prema SEQ ID NO: 51,
ii. ABR 2, sa aa sekvencom prema SEQ ID NO: 52,
iii. ABR 3, sa aa sekvencom prema SEQ ID NO: 53,
naznačeno time da se sve varijacije sekvence nalaze van ABR domena.
[0048] U jednom obliku izvođenja predmetnog otkrića, anti-uPARAP antitelo prema pronalasku je mišje monoklonsko antitelo 9b7 (mAb 9b7) ili njegov funkcionalni fragment ili varijanta. Prethodna istraživanja ukazuju da je epitop 9b7 antitela lokalizovan u jednom od tri N-terminalno locirana domena uPARAP. Kada se solubilni rekombinantni protein, koji se sastoji od navedena tri N-terminalna domena uPARAP (CysR, FN-II i CTLD-1), imobiliše na BIAcoreu, antitelo mAb 9b7 se vezuje za ovu konstrukciju.
[0049] U jednom obliku izvođenja predmetnog pronalaska, anti-uPARAP antitelo je izabrano iz grupe koja se sastoji od
a. antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, koje sadrži
i. varijabilni region lakog lanca imunoglobulina, koji sadrži ili se sastoji od amino kiselinske sekvence prema SEQ ID NO: 19 ili 20 ili od sekvence koja ima najmanje 70% identičnosti sa prethodnim sekvencama, kao što je najmanje 80% identičnosti, na primer, najmanje 90% identičnosti, i /ili
ii. varijabilni region teškog lanca imunoglobulina koji sadrži ili se sastoji od amino kiselinske sekvence prema SEQ ID NO: 24 ili 25 ili sekvence koja ima najmanje 70% identičnosti sa prethodnim sekvencama, na primer, najmanje 80% identičnosti, najmanje 90% identičnosti,
b. antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta koji vezuje isti epitop kao antitelo pod a),
c. humanizovane verzije antitela a) ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, ili humanizovane verzije antitela pod b) ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, d. himerne verzije antitela pod a) ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, ili himerne verzije antitela pod b) ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta,
e. antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta koji sadrži
i. jednu ili više amino kiselinskih sekvenci prema SEQ ID NO: 21, 22, 23, 26, 27 i 28, ili
ii. amino kiselinske sekvence prema SEQ ID NO: 21, 22 i 23, i/ili amino kiselinske sekvence prema SEQ ID NO: 26, 27 i 28.
f. antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, koji sadrži
i. jednu ili više amino kiselinskih sekvenci prema SEQ ID NO: 54, 55, 56, 57, 58 i 59, ili
ii. amino kiselinske sekvence prema SEQ ID NO: 54, 55 i 56, i/ili amino kiselinske sekvence prema SEQ ID NO: 57, 58 i 59.
[0050] U jednom obliku izvođenja predmetnog otkrića, antitelo prema pronalasku može da sadrži
a. varijabilni region lakog lanca imunoglobulina, koji sadrži amino kiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 19 ili 20 ili sekvencu koja ima najmanje 70% identičnosti sa navedenim sekvencama, na primer, najmanje 80% identičnosti, najmanje 90% identičnosti, i još sadrži
i. CDR1, sa aa sekvencom prema SEQ ID NO: 21,
ii. CDR2, sa aa sekvencom prema SEQ ID NO: 22,
iii. CDR3, sa aa sekvencom prema SEQ ID NO: 23, i
b. varijabilni region teškog lanca imunoglobulina, koji sadrži amino kiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 24 ili 25 ili sekvencu koja ima najmanje 70% identičnosti sa navedenim sekvencama, na primer, najmanje 80% identičnosti, na primer, najmanje 90% identičnosti, i dodatno sadrži
i. CDR1, sa aa sekvencom prema SEQ ID NO: 26,
ii. CDR2, sa aa sekvencom prema SEQ ID NO: 27,
iii. CDR3, sa aa sekvencom prema SEQ ID NO: 28, naznačeno time da se sve varijacije nalaze van CDR domena.
[0051] Alternativno, antitelo prema predmetnom pronalasku može da sadrži
a. varijabilni region lakog lanca imunoglobulina, koji sadrži amino kiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 19 ili 20 ili sekvencu koja ima najmanje 70% identičnosti sa navedenim sekvencama, na primer, najmanje 80% identičnosti, na primer, najmanje 90% identičnosti, i dodatno sadrži
i. ABR 1, sa aa sekvencom prema SEQ ID NO: 54,
ii. ABR 2, sa aa sekvencom prema SEQ ID NO: 55,
iii. ABR 3, sa aa sekvencom prema SEQ ID NO: 56, i
b. varijabilni region teškog lanca imunoglobulina, koji sadrži amino kiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 24 ili 25 ili sekvencu koja ima najmanje 70% identičnosti sa navedenim sekvencama, na primer, najmanje 80% identičnosti, na primer, najmanje 90% identičnosti, i dodatno sadrži
i. ABR 1, sa aa sekvencom prema SEQ ID NO: 57,
ii. ABR 2, sa aa sekvencom prema SEQ ID NO: 58,
iii. ABR 3, sa aa sekvencom prema SEQ ID NO: 59,
naznačeno time da se sve varijacije sekvence nalaze izvan ABR domena.
2
[0052] Termin "antitelo" podrazumeva suštinski intaktne molekule antitela, himernih antitela, humanizovanih antitela, humanih antitela, jednolančanih antitela, bi-specifičnih antitela, teške lance antitela, lake lance antitela, homodimere i heterodimere teških i/ili lakih lanaca antitela, antigen-vezujući fragment ili derivate svega prethodnog.
[0053] Pod "antigen-vezujućim fragmentom" podrazumevamo funkcionalni fragment antitela, sposoban da se veže za uPARAP.
[0054] U jednom obliku izvođenja predmetnog otrkića, anti-uPARAP antitelo prema pronalasku izabrano je između mišjeg antitela, himernog antitela, humanog antitela, humanizovanog antitela, humanizovanog antigen-vezujućeg fragmenta, Fab fragmenta, Fab' fragmenta, F(ab')2 fragmenta, Fv fragmenta, jednolančanog antitela (SCA), kao što je scFv, njegovog varijabilnog dela teškog i/ili lakog lanca, ili Fab mini-antitela, pri čemu ovi fragmenti ili modifikovana antitela mogu da se dobiju od mišjih, himernih, humanih ili humanizovanih antitela.
[0055] U jednom obliku izvođenja predmetnog otkrića, anti-uPARAP antitelo je humanizovano ili potpuno humano monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment.
[0056] U jednom obliku izvođenja predmetnog pronalaska, anti-uPARAP antitelo prema pronalasku je rekombinantno antitelo.
[0057] Anti-uPARAP antitelo prema pronalasku može pripradati bilo kojoj klasi imunoglobulina IgG, IgM, IgD, IgE, IgA, i njihovim potklasama. Potklase IgG antitela su dobro poznate u oblasti, uključujući humane klase IgGI, IgG2, IgG3 i IgG4. U jednom obliku izvođenja pronalaska, antitelo je IgG monoklonsko antitelo. U jednom obliku izvođenja pronalaska, antitelo je IgG1κ.
[0058] U jednom obliku izvođenja predmetnog pronalaska, anti-uPARAP antitelo je antigenvezujući fragment.
[0059] Postoje mnoge prednosti primene fragmenata antitela, umesto celih antitela. Manja veličina fragmenata može usloviti bolja farmakološka svojstva, na primer, lakši ulazak u ćeliju. Takođe, antigen-vezujući fragmenti mogu se eksprimirati i oslobađati iz E. coli ili drugih nesisarskih ćelija, što olakšava proizvodnju velikih količina naznačenih fragmenata.
[0060] Fab je monovalentni antigen-vezujući fragment antitela, koji nastaje isecanjem antitela enzimom papainom, ili putem specifične proteolize kojom se oslobađa laki lanac ili deo teškog lanca.
[0061] F(ab')2 je fragment antitela koji se dobija tretiranjem celog molekula antitela enzimom pepsinom ili proteolitičkom razgradnjom, čime nastaje bivalentni antigen-vezujući fragment bez naknadne redukcije; F(ab')2 je dimer dva Fab fragmenta, koji su povezani preko dve disulfidne veze.
[0062] Fv je fragment nastao genetičkim inžinjeringom, a sadrži varijabilni region lakog lanca i varijabilni region teškog lanca, eksprimiran u vidu dva lanca.
[0063] Jednolančano antitelo (SCA), kao što je scFv, je molekul nastao genetičkim inžinjeringom, koji sadrži varijabilni region lakog lanca i varijabilni region teškog lanca, genetički fuzionisani u jedinstveni molekul pogodnim polipeptidnim veznikom.
[0064] Postupci proizvodnje fragmenata antitela dobro su poznati u stanju tehnike. Na primer, antitela se mogu proizvesti primenom jednog od nekoliko postupaka koji se zasnivaju na indukciji in vivo proizvodnje antitela, pretraživanju imunoglobulinskih biblioteka, ili stvaranju monoklonskih antitela u ćelijskim linijama. Oni uključuju tehnike hibridoma, humanih hibridoma B-ćelija, i Epštajn Bar virus (EBV)-hibridizacione tehnike.
[0065] Slično prethodnom, fragmenti antitela mogu se dobiti primenom postupaka poznatih u stanju tehnike. Na primer, fragmenti antitela, prema pronalasku, mogu se dobiti proteolitičkom hidrolizom antitela različitim enzimima, ili ekspresijom DNK koja kodira dati fragment u E. coli ili sisarskim ćelijama (na primer, kulturi ćelija ovarijuma kineskog hrčka ili u nekom drugom ekspresionom sistemu). Alternativno, fragmenti antitela mogu se dobiti digestijom celih antitela pepsinom ili papainom, na konvencionalan način.
[0066] Osobe stručne u ovoj oblasti ceniće da je za potrebe humane terapije ili dijagnostike poželjna primena humanih ili humanizovanih antitela. Humanzovane forme ne-humanih antitela (na primer, mišjih) jesu himerna antitela ili fragmenti dobijeni genetičkim inženjeringom, koja poželjno imaju minimalne-delove dobijene od ne-humanih antitela. Humanizovana antitela obuhvataju antitela u kojima su regioni koji određuju komplementarnost (CDR) humanih antitela (antitelo primaoca), zamenjeni amino kiselinskim ostacima regiona koji određuju
2
komplementarnost iz antitela odgovarajuće funkcionalnosti poreklom iz ne-humanih vrsta (donorska antitela), kao što su miš, pacov, ili zec. U nekim slučajevima okvirne aminokiseline Fv domena humanog antitela zamenjuju se amino kiselinama na odgovarajućim pozicijama nehumanih antitela. Humanizovana antitela mogu takođe da sadrže amino kiselinske ostatke koji se ne nalaze niti u antitelu recipijenta, niti u importovanim CDR ili okvirnim sekvencama. Načelno, humanizovana antitela obuhvatiće suštinski sva od najmanje jednog, a najčešće dva varijabilna domena, u kojima svi ili suštinski svi regioni koji determinišu komplementarnost odgovaraju istim regionima u ne-humanim antitelima, i svi ili suštinski svi okvrini regioni odgovaraju istim regionima relevantne humane konsenzusne sekvence. Humanizovana antitela optimalno takođe obuhvataju najmanje deo konstantnog regiona antitela, kao što je Fc region, tipično dobijen od humanog antitela.
[0067] Postupci humanizacije ne-humanih antitela dobro su poznati u stanju tehnike. Načelno, humanizovano antitelo ima jednu ili više uvedenih amino kiselina antitela iz izvora koji nije čovek. Ovi amino kiselinski ostaci, koje potiču iz ne-humanih izvora, često se nazivaju uvezeni ostaci, najčešće se preuzimaju iz importovanih varijabilnih domena. Humanizacija se može u osnovi izvesti kao što je opisano, substitucijom humanih CDR odgovarajućim ne-humanim CDR domenima. Shodno tome, ovako humanizovana antitela su himerna antitela, naznačena time da je suštinski manje od jednog intaktnog humanog varijabilnog domena supstituisano odgovarajućom sekvencom antitela iz neke vrste koja nije čovek. U praksi, humanizovana antitela su tipično humana antitela u kojima su neki amino kiselinski ostaci CDR domena i moguće, neki okvirni amino kiselinski ostaci zamenjeni ostacima sa analognih mesta u ne-humanim antitelima.
[0068] Humana antitela mogu se identifikovati primenom različitih postupaka poznatih u stanju tehnike, uključujući biblioteke fagnih prikaza.
[0069] Kada se dobije pogodno antitelo, ono se može testirati u pogledu antigenske specifičnosti, na primer, pomoću ELISA testa.
Aktivni agens
[0070] Anti-uPARAP ADC konjugat prema predmetnom pronalasku obuhvata aktivni agens, na primer, lek, koji se isporučuje u ćelije koje eksprimiraju uPARAP na svojoj membrani. Aktivni agens može biti terapeutski agens, citotoksični agens, radioizotop, ili detektabilno obeležje. U poželjnom obliku izvođenja predmetnog pronalaska, aktivni agens je terapeutski agens.
2
[0071] U jednom obliku izvođenja predmetnog pronalaska, aktivni agens je hemoterapeutski agens. Klasa hemoterapeutskih agenasa obuhvata alkilirajuće agense, antracikline, antimetabolite, antimikrotubularne/anti-mitotičke agense, inhibitore histonskih deacetilaza, inhibitore kinaza, peptidne antibiotike, anti-neoplastike na bazi platine, inhibitore topoizomeraze i citotoskične antibiotike.
[0072] U jednom poželjnom obliku izvođenja predmetnog pronalaska, aktivni agens je citotoksični agens koji omogućava efikasno ubijanje ćelija koje eksprimiraju uPARAP.
[0073] U jednom obliku izvođenja predmetnog otkrića, aktivni agens je anti-mitotički agens, kao što su monometil auristan E (MMAE), monometil auristan F (MMAF), taksan (na primer Paklitaksel ili docetaksel), vinka alkaloidi (na primer, vinblastin, vinkristin, vindezin ili vinorelbin), kolhicin ili podofilotoksin.
[0074] U jednom obliku izvođenja predmetnog otkrića, citotoksični agens je monometil auristan E (MMAE). Zbog svoje toksičnosti, MMAE koji inhibira deobu ćelija blokiranjem polimerizacije tubulina, ne može se koristiti kao individualni hemoterapeutski lek. Međutim, pokazano je da je MMAE povezan za anti-CD30 monoklonskim antitelom (Brentuksimab Vedotin, trgovačko ime Adcetris™), stabilan u vanćelijskoj tečnosti, te da može da se oslobodi iz konjugata isecanjem pomoću enzima katepsina i da je tako bezbedan za primenu u terapiji.
[0075] U jednom obliku izvođenja predmetnog pronalaska, citotoksični agens je monometil auristan F (MMAF). MMAF je anti-mikrotubularni/anti-mitotički agens i karboksi-varijanta MMAE.
[0076] U jednom obliku izvođenja predmetnog pronalaska, citotoksični agens je agens za DNK umrežavanje, kao što su pirolo-benzodiazepin ili dimerni pirolo-benzodiazepinski derivat.
[0077] U jednom obliku izvođenja predmetnog pronalaska, citotoksični agens je DNK alkilirajući agens, kao što je Duokarmicin SA.
[0078] Primeri drugih alkilirajućih agenasa obuhvataju tiotepa-u i CYTOXAN® ciklofosfamid; alkil-sulfonate, kao što su busulfan, improsulfan i piposulfan; aziridine, kao što je benzodopa, karbokvion, meturdopa, i uredopa; etilen-imine i metilamelamine, uključujući altretamin,
2
trietilenemelamin, trietilen-fosforamid, trietilen-etiofosforamid i trimetilo-melamin; acetogenin (posebno, bulatacin i bulatacinon); delta-9-tetrahidrokanabinol (dronabinol, MARINOL®); betalapačon; lapačol; kolhicin; betulinska kiselina; kamptotecin (uključujući, sintetski analog topotekan (HYCAMTIN®), CPT-II (irinotekan, CAMPTOSAR®), acetil-kamptotecin, skopolektin, i 9-aminokamptotecin); briostatin; kalistatin; CC-1065 (uključujući, njegove sintetske analoge adozelesin, karzelesin i bizelesin); podofilotoksin; podofilinsku kiselinu; teniposid; kriptoficine, (posebno, kriptoficin 1 i kriptoficin 8); dolastatin; duokarmicin (uključujući sintetske analoge KW-2189 i CBI-TMI); eleuterobin; pankratistatin; sarkodiktin; spongistatin; azotni senf, kao što su hlorambucil, hlornafazin, holofosfamid, estramustin, ifosfamid, mehloretamin, mehloretamin oksid hlorovodonik, melfalan, novembihin, fenesterin, prednimustin, trofosfamid, uracil senf; nitrozi-urea, kao što su karmustin, hlorozotocin, fotemustin, lomustin, nimustin, i ranimnustin; antibiotici, kao što je enediinski antibiotici (na primer, kalihamicin, posebno, kalihamicin gama II i kalihamicin omega II; dinemicin, uključujući dinemicin A; esperamicin; kao i neokarzinostatin hromofor i srodne hromoprotein enediinske antibiotske hromofore), aklacinomicine, aktinomicin, autramicin, azaserin, bleomicin, kaktinomicin, karabicin, karminomicin, karzinofilin, hromomicin, daktinomicin, daunorubicin, detorubicin, 6-diazo-5-okso-L-norleucin, doksorubicin (uključujući, ADRIAMYCIN®, morfolino-doksorubicin, cijanomorfolino-doksorubicin, 2-pirolino-doksorubicin, doksorubicin HCl lipozomsku injekciju (DOXIL®) i deoksi doksorubicin), epirubicin, ezorubicin, idarubicin, marcelomicin, mitomicin, kao što je mitomicin C, mikofenolnu kiselinu, nogalamicin, olivomicin, peplomicin, potfiromicin, puromicin, kvuelamicin, rodorubicin, streptonigrin, streptozocin, tubercidin, ubenimeks, zinostatin, zorubicin; anti-metabolite, kao što su metotreksat, gemcitabin (GEMZAR®), tegafur (UFTORAL®), kapecitabin (XELODA®), epotilon, i 5-fluorouracil (5-FU); analoge folne kiseline, kao što je denopterin, metotreksat, pteropterin, trimetreksat; purinske analoge, kao što je fludarabin, 6-merkaptopurin, tiamiprin, tioguanin; pirimidineske analoge, kao što je ancitabin, azacitidin, 6-azauridin, karmofur, citarabin, dideoksiuridin, doksifluridin, enocitabin, floksuridin; androgene, kao što je kalusteron, dromostanolon propionat, epitiostanol, mepitiostan, testolakton; antagoniste adrenalnih hormona, kao što su, aminoglutetimid, mitotan, trilostane; supplement folne kiseline, kao što je frolinična kiselina; aceglaton; aldofosfamid glikozid; amino-levulinska kiselina; eniluracil; amsakrin; bestrabucil; bizantren; edatraksat; defofamin; demekolcin; diazikvion; elfornitin; eliptinium acetat; etoglucid; galijum nitrat; hidroksi-urea; lentinan; lonidainin; majtanzinoide, kao što su majtanzin i anzamitocin; mitoguazon; mitoksantron; mopidanmol; nitraerin; pentostatin; fenamet; pirarubicin; losoksantron; 2-etilhidrazid; prokarbazin; PSK® polisaharidni kompleks; razoksan; rizoksin; sizofiran; spirogermanijum; tenuazonska kiselina; triazikvinon; 2,2',2"-
2
trihlorotrietilamin; trihotecen (posebno, T-2 toksin, verakurin A, roridin A i anguidin); uretan; vindezin (ELDISINE®, FILDESIN®); dakarbazin; manomustin; mitobronitol; mitolaktol; pipobroman; gacitozin; arabinozid ("Ara-C"); tiotepa; taksoidi, na primer, paklitaksel (TAXOL®), formulacija albumin-konstruisanih nanočestica paklitaksela (ABRAXANE.TM.), i doksetaksela (TAXOTERE®); hloranbucil; 6-tioguanin; merkaptopurin; metotreksat; analog platine, kao što je cisplatina karboplatina; vinblastin (VELBAN®); platina; etopozid (VP-16); ifosfamid; mitoksantron; vinkristin (ONCOVIN®); oksaliplatina; leukovovin; vinorelbin (NAVELBINE®); novantron; edatreksat; daunomicin; aminopterin; ibandronat; inhibitor topoizomeraze RFS 2000; difluorometil-ornitin (DMFO); retinoid, kao što je retinoična kiselina; farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivati svih prethodno navedenih; kao i kombinacije dva ili više prethodno navedenih, kao što je CHOP, što je skraćenica za kombinovanu terapiju ciklofosfamidom, doksorubicinom, vinkristinom, i prednisolonom, i FOLFOX, što je skraćenica za terapijski režim oksaliplatinom (ELOXATIN®) kombinovanim sa 5-FU i leukovovinom.
[0079] Dejstvo anti-hormonskih agenasa zasniva se na regulaciji, smanjenju, blokiranju ili inhibiranju efekata hormona, koji mogu da podstaknu rast tumor, i često se primenjuju kao sistemski, telesni tretman. Oni po sebi mogu biti hormoni. Primeri obuhvataju anti-estrogene i selektivne modulatore estrogenskih receptora (SERMs), uključujući, na primer, tamoksifen (uključujući NOLVADEX® tamoksifen), raloksifen (EVISTA®), droloksifen, 4-hidroksitamoksifen, trioksifen, keoksifen, LYI 17018, onapriston, i toremifen (FARESTON®); antiprogesteron; negativne regulatore estrogenskog receptora (ERDs); agense koji suprimiraju ili isključuju funkciju jajnika, na primer, agoniste oslobađajućeg hormona luteinizirajućeg hormona (LHRH) kao što su, leuprolid acetat (LUPRON® i ELIGARD®), goserelin acetat, buzerelin acetat i tripterelin; ostale anti-androgene, kao što su flutamid, nilutamid i bikalutamid; i inhibitore aromataza, kao što su 4(5)-imidazoli, aminoglutetimid, megestrol acetat (MEGASE®), eksemestan (AROMASIN®), formestan, fadrozol, vorozol (RIVISOR®), letrozol (FEMARA®), i anastrozol (ARIMIDEX®). Uz to, bisfosfonati, kao što je hlodronat (na primer, BONEFOS® ili OSTAC®), etidronat (DIDROCAL®), NE-58095, zoledronska kiselina/zoledronat (ZOMETA®), alendronat (FOSAMAX®), pamidronat (AREDIA®), tiludronat (SKELID®), ili rizedronat (ACTONEL®); kao i troksacitabin (analog 1,3-dioksolan nukleozid cisteina); siRNA, ribozom i antisen-oligonukleotidi, konkretno, oni koji inhibiraju ekspresiju gena uključenih u signalne puteve povezane sa aberantnomu proliferacijom ćelija; vakcine, kao što su THERATOPE® vakcina i vakcine za gensku terapiju, na primer, ALLOVECTIN® vakcina, LEUVECTIN® vakcina, i VAXID® vakcina; inhibitor topoizomeraze 1 (na primer, LURTOTECAN®); rmRH (na primer, ABARELIX®); lapatinib ditozilat (mali inhibitor ErbB-2
2
i EGFR dvojne tirozin kinaze, takođe poznat kao GW572016); inhibitori COX-2, kao što su celekoksib (CELEBREX®; 4-(5-(4-metilfenil)-3-(trifluorometil)-IH-pirazol-1-il) benzensulfonamid; i njihove farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivati.
[0080] U jednom obliku izvođenja predmetnog pronalaska, aktivni agens je nukleotid, kao što je oligonukleotid, na primer siRNK ili miRNK.
[0081] Po jednom molekulu antitela može biti jedna ili više jedinica leka. Odnos broja molekula leka prema molekulu antitela označen je kao odnos lek-antitelo (DAR). U jednom obliku izvođenja predmetnog pronalaska, DAR je između 1 i 10, to jest, između 1 i 10 jednica leka po molekulu antitela. U jednom obliku izvođenja predmetnog pronalaska, DAR je između 2 i 8, na primer, između 3 i 6, kao što je 4 ili 5.
Veznik
[0082] Stabilna veza između antitela i aktivnog agensa važan je aspekt tehnologije ADC konjugata. Veznici se mogu zasnivati na hemijskim motivima, kao što su disulfid, hidrazon ili peptid (podložni isecanju), ili tioetri (nisu podložni isecanju), a oni kontrolišu distribuciju i isporuku citotoksičnog agensa u ciljnu ćeliju. U prekliničkim i kliničkim istraživanjima dokazana je bezbedna primena nekoliko razgradivih i nerazgradivih veznika. Na primer, konjugat Brentuksimab Vedotin, koji sadrži sintetski anti-neoplastični agens monometil auristan E (MMAE), koji deluje kao snažan i toskičan antimikrotubularni agens, sadrži veznik koji je podložan enzimskom isecanju.
[0083] Drugi odobreni ADC konjugat, Trastuzumab Emtanzin, sačinjen je od derivata Majtansina, mertanzina (DM-1), koji inhibira formiranje mikrotubula, i od antitela Trastuzumaba (Herceptin™, Genentech/Roche), povezanog sa lekom stabilnim veznikom koji nije podložan isecanju.
[0084] Tip veznika koji je podložan ili nije podložan isecanju, određuje neka svojstva leka u konjugatu. Na primer, veznici koji su podložni isecanju, mogu, na primer, biti isečeni enzimskom aktivnošću u ciljnoj ćeliji, dovodeći do efikasnog unutarćelijskog oslobađanja aktivnog agensa, na primer, citotoksičnog agensa. Suprotno tome, ADC konjugati koje sadrže veznik koji nije podložan isecanju, ne poseduju mehanizam za oslobađanje leka, pa se za oslobađanje leka oslanjaju na druge mehanizme, kao što je degradacija usmeravajućeg antitela.
Takođe je poznato stručnjacima u stanju tehnike, da sastav veznika može da utiče na važne osobine konjugata, kao što su solubilnost i farmako-kinetička svojstva ADC kao celine.
[0085] Za oba tipa veznika, način oslobađanja leka ključan je faktor postizanja ćelijskog efekta. Lekovi koji mogu slobodno da difunduju kroz ćelijsku membranu mogu da izbegnu ciljne ćelije i da u procesu koji se naziva “ubistvo posmatrača”, napadnu susedne ćelije, kao što su kancerske ćelije u blizini ciljnih ćelija koje eksprimiraju uPARAP.
[0086] U poželjnom obliku izvođenja predmetnog otkrića, ADC koje su usmerene prema uPARAP, kao što je obelodanjeno pronalaskom, sadrže veznik koji povezuje anti-uPARAP antitelo sa aktivnim agensom. Veznik može biti podložan isecanju ili nepodložan isecanju. U jednom obliku izvođenja pronalaska, veznik se može iseći i omogućiti oslobađanje aktivnog agensa unutar ćelija koje eksprimiraju uPARAP.
[0087] Grupe koje se isecaju obuhvataju disulfidnu vezu, amidnu vezu, supstituisanu amidnu vezu, u formi peptidne veze, tioamidnu vezu, estarsku vezu, tioestarsku vezu, susednu diolsku vezu, ili hemiacetatnu vezu. Ove i druge veze podložne isecanju mogu da uključe i enzimski razgradive veze, na primer, peptidne veze (koje su podložne isecanju posredstvom peptidaza), fosfatne veze (podložne isecanju posredstvom fosfataza), veze u nukleinskim kiselanama (podložne isecanju posredstvom endonukleaza) i veze u šećerima (podložne isecanju posredstvom glukozidaza).
[0088] Veznik može biti polipeptidni veznik, peptidni veznik ili nukleinski veznik.
[0089] U jednom konkretnom obliku izvođenja predmetnog pronalaska, veznik je peptidni veznik. Izbor peptidne sekvence je kritičan za uspeh konjugata. U nekim oblicima izvođenja pronalaska, veznik je stabilan u odnosu na serumske proteaze, ali podložan razgradnju lizozomskim enzimima u ciljnoj ćeliji. U jednom primeru veznik je peptid, izabran između protamina, fragmenta protamina, (Arg)9, biotin-avidina, biostreptavidina ili antenapedija peptida. Ostali ne-nukleotidni veznici obuhvataju alkil ili aril lance od 5 do 100 atoma. U nekim oblicima izvođenja predmetnog pronalaska, veznik je nukleotidni veznik.
[0090] U jednom obliku izvođenja predmetnog pronalaska, veznik je peptidni veznik podložan enzimskom isecanju, kao što je peptidni veznik podložan isecanju katepsinom. Katepsin može biti jedan od nekoliko tipova katepsina, iz grupe lizozomskih proteaza.
1
[0091] U jednom obliku izvođenja predmetnog pronalaska, veznik obuhvata ili se sastoji od dipeptida, kao što su valin-citrulin (VC) ili valin-alanin (VA), koji se mogu povezati amidnom vezom sa drugim strukturnim elementima konjugata. Veznici na bazi valin-citrulina, u kojem je karboksi grupa citrulina modifikovana u supstituisani amid, mogu se iseći lizomskim katepsinom, dok se veznici na bazi valin-alanina, u kojima je karboksi grupa alanina modifikovana u suptituisani amid, mogu iseći drugim lizozomskim proteazama, uključujući i katepsin.
[0092] U jednom obliku izvođenja predmetnog pronalaska, ADC prema pronalasku sadrži i razdelnik. Razdelnik može, na primer, da povezuje veznik i aktivni agens. U jednom obliku izvođenja predmetnog pronalaska, razdelnik je para-aminobenzojeva kiselina (PAB).
[0093] U jednom obliku izvođenja predmetnog pronalaska, razdelnik jeste ili obuhvata polietilen- glikol, kao što je PEG4 razdelnik.
[0094] U jednom obliku izvođenja predmetnog pronalaska, ADC prema pronalasku sadrži i povezujući deo. Povezujući deo može da povezuje antitelo sa razgradivim veznikom, gde je povezujući deo reakcioni proizvod između bočnog lanca amino kiseline u sastavu antitela i reaktivne grupe u prekursoru veznika. U jednom obliku izvođenja pronalaska, ova reaktivna povezujuća grupa obuhvata ili sadrži maleimidnu ili kaproinsku kiselinu (MC), gde maleimid reaguje sa tiol grupom cisteina tokom vezivanja. U narednom obliku izvođenja predmetnog pronalaska, povezujuća grupa obuhvata ili se sastoji od N-hidroksi-sukcinimida, azida ili alkina.
[0095] U jednom obliku izvođenja predmetnog pronalaska, ADC prema pronalasku obuhvata anti-uPARAP antitelo, kao što je opisano, i Vedotin kao kompleks veznik-lek. Vedotin je kompleks veznika i leka, koji sadrži citotoksični agens MMAE, razdelnik (para-aminobenzojevu kiselinu), veznik podložan razgradnji katepsinom (dipeptid valin-citrulin) i povezujuću grupu koja sadrži kaproinsku kiselinu i maleimid. Vedotin je MC-VC-PAB-MMAE. Brentuksimab Vedotin (trgovačko ime Adcetris™) je primer ADC konjugata koji sadrži Vedotin i odobren je od strane FDA.
[0096] U jednom obliku izvođenja predmetnog pronalaska, ADC sadrži anti-uPARAP antitelo, kao što je opisano i veznik-razdelnik-toksin jedinicu VC-PAB-MMAF.
2
[0097] U jednom obliku izvođenja predmetnog pronalaska, ADC sadrži anti-uPARAP antitelo, kao što je opisano, i veznik-razdelnik-toksin jedinicu PEG4-VA-PBD.
[0098] U jednom obliku izvođenja predmetnog pronalaska, ADC sadrži anti-uPARAP antitelo, kao što je opisano, i veznik-razdelnik-toksin jedinicu PEG4-VC-DuokarmicinSA.
[0099] U jednom obliku izvođenja predmetnog pronalaska, ADC sadrži kompleks veznika i leka, koji je opisan u US 2006/074008.
[0100] Kompleks veznika i leka može biti prikačen za anti-uPARAP antitelo preko veze između maleimida i tiolskih grupa redukovanih disulfidnih mostova koji povezuju različite lance ili delove istog polipeptidnog lanca.
Terapeutska primena
[0101] ADC konjugati usmereni prema uPARAP, kao što je opisano, korisni su u isporuci aktivnih agenasa, na primer, terapeutskih ili citotoksičnih agenasa, u ćelije koje eksprimiraju uPARAP, pa time i u lečenju brojnih bolesti i poremećaja koji se odlikuju ekspresijom uPARAP, naročito povećanom ekspresijom uPARAP.
[0102] U jednom obliku izvođenja, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži efektivnu dozu anti-uPARAP ADC konjugata, kao što je opisano, zajedno sa farmaceutski prihvatljivim puferom, diluentom, nosačem, adjuvansom ili eksipijensom.
[0103] Farmaceutske kompozicije dobijaju se na način poznat u stanju tehnike, tako da su kompozicije dovoljno stabilne i da su pogodne za administraciju kod ljudi i/ili životinja. Na primer, farmaceutske kompozicije mogu se liofilizovati, na primer, postupkom sušenja smrzavanjem, sprej sušenjem, sprej hlađenjem, ili postupkom formiranja superkritičnih čestica.
[0104] Pod "farmaceutski prihvatljivim” podrazumevamo svaki ne-toksični materijal koji ne umanjuje efikasnost anti-uPARAP ADC konjugata. Ovakvi farmaceutski prihvatljivi puferi, nosači ili eksipijensi poznati su u stanju tehnike (videti Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A.R Gennaro, Ed., Mack Publishing Company (1990) i priručnik Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press (2000)).
[0105] Termin "pufer" označava vodeni rastvor koji sadrži smešu baze i kiseline, sa ciljem stabilizacije pH. Farmaceutski prihvatljivi puferi su poznati u stanju tehnike.
[0106] Termin "diluent" označava vodeni ili ne-vodeni rastvor koji ima ulogu razblaživača farmaceutskog preparata.
[0107] Termin "adjuvans" smatra se svakim jedinjenjem koje se dodaje formulaciji sa ciljem da se poveća biološki efekat agensa prema pronalasku. Adjuvans može biti jedna ili više soli cinka, bakra ili srebra sa različitim anjonima, na primer, fluoridnim, hloridnim, bromidnim, jodidnim, tiocijanatnim, sulfitnim, hidroksidnim, fosfatnim, karbonatnim, laktatnim, glikolatnim, citratnim, boratnim, tartaratnim, ili acetatnim različitog acilnog sastava. Adjuvansi mogu biti katjonski polimeri, kao što su katjonski celulozni etri, katjonski celulozni estri, deacilovana hijaluronaska kiselina, kitozan, katjonski dendrimeri, sintetski katjonski polimeri, kao što je poli(vinil imidazol), i katjonski polipeptidi, kao što su polihitidin, polilizin, poliarginin, i peptidi koji sadrže prethodno navedene amino kiseline.
[0108] Eksipijens može biti jedan ili više ugljenih hidrata, polimera, lipida i minerala. Primeri ugljenih hidrata uključuju laktozu, glukozu, saharozu, manitol i ciklodekstrine, koji se dodaju kompoziciji, na primer, kako bi se olakšala liofilizacija. Primeri polimera su skrob, celulozni etri, celukozna karboksimetil-celuloza, hidroksipropilmetil-celuloza, hidroksietil-celuloza, etilhidroksietil-celuloza, alginat, karageni, hijaluronska kiselina i njeni derivati, poliakrilna kiselina, polisulfonat, polietilenglikol/polietilen oksid, polietilenoksid/polipropilen oksidni kopolimeri, polivinil alkohol/polivinila acetat različitog stepena hidrolize i polivinil-pirolidon, različitih molekulskih težina, koji se dodaju u kompoziciju kako bi se kontrolisala viskoznost, za postizanje bioadhezivnosti ili za zaštitu lipida od hemijske ili proteolitičke degradacije. Primeri lipida su masne kiseline, fosfolipidi, mono-, di- i trigliceridi, ceramidi, sfingolipidi i glikolipidi, različite dužine lanca i zasićenosti veza, lecitin jaja, sojin lecitin, hidrogenisani licitin jaja i soje, koji se dodaju u kompoziciju iz sličnih razloga kao i polimeri. Primeri minerala su talk, magnezijum oksid, cink-oksid i titanijum-oksid, koji se dodaju u kompoziciju kako bi se postigle osobine kao što su smanjenje akumulacije tečnosti ili poželjna pigmentna svojstva.
[0109] ADC konjugati prema pronalasku mogu se formulisati u bilo koji tip framaceutske kompozicije poznat u stanju tehnike kao pogodan za administraciju.
4
[0110] ADC konjugati prema pronalasku ili farmaceutske kompozicije koje sadrže ADC conjugate mogu se administrirati na svaki pogodan način poznat stručnjacima u ovoj oblasti. Stoga moguće rute isporuke obuhvataju parenteralnu (intravensku, subkutanu i intramuskularnu), površinsku, okularnu, nazalnu, pulmonalnu, bukalnu, oralnu, vaginalnu i rektalnu. Takođe, moguća je administracija putem implanta.
[0111] U jednom poželjnom obliku izvođenja predmetnog otkrića, farmaceutske kompozicije se administriraju parenteralno, na primer, intravenski, intracerebroventrikularno, intraartikularno, intra-arterijalno, intraperitonealno, intratekalno, intraventrikularno, intrasternalno, intrakranijalno, intramuskularno ili subkutano, ili se mogu administrirati putem infuzije. One se primenjuju u formi sterilnih vodenih rastvora koji mogu da sadrže druge supstance, na primer, dovoljno soli ili glukoze kako bi rastvor bio izotoničan sa krvlju. Vodeni rastvori treba da budu adekvatno puferisani. Priprema odgovarajuće formulacije za parenteralnu primenu pod sterilnim uslovima postiže se primenom standardnih farmaceutskih postupaka koji su poznati stručnim osobama u stanju tehnike.
[0112] Formulacije pogodne za parenteralnui administraciju obuhvataju vodene i ne-vodene sterilne rastvore za injekciju, koji mogu sadržati anti-oksidanse, pufere, bakteriostatine i rastvorke koji čine formulaciju izotoničnom sa krvlju nameravanog recipijenta; i vodene i nevodene sterilne suspenzije, koje mogu da obuhvate suspendujuće agense i agense za zgušnjavanje. Formulacije mogu biti upakovane u jediničnu doznu formu ili u multidoznim kontejnerima, na primer, zaptivenim ampulama i bočicama, i mogu se čuvati u suvoj formi dobijenoj zamrzavanjem (liofilizacijom), koja onda zahteva samo dodavanje sterilnog tečnog nosača, na primer, vode za injekcije, neposredno pre upotrebe. Injekcioni rastvori i suspenzije za naknadnu primenu mogu se pripremiti uz sterilnih praškova, granula, i tableta sličnim onima koje su već opisane.
[0113] U jednom obliku izvođenja predmetnog pronalaska, ADC konjugat prema pronalasku se administrira intravenski.
[0114] U jednom obliku izvođenja predmetnog pronalaska, ADC konjugat prema pronalasku se administrira subkutano.
[0115] U jednom obliku izvođenja predmetnog pronalaska, ADC konjugat prema pronalasku se administrira intrakranijalno ili intracerebralno.
[0116] Farmaceutske kompozicije se administriraju pacijentu u farmaceutski efektivnoj količini. Fraze “terapeutski efektivna količina” ili “efektivna količina” ili “terapeutski efektivan” koriste se da označe količinu koja obezbeđuje terapeutski efekat u konkretnom režimu primene. Ova prethodno definisana količina aktivnog materijala sračunata je da proizvede željeni terapeutski efekat, kada je u kombinaciji sa sa željenim aditivom i diluentom, to jest, nosačem i rastvaračem. Dalje, ona treba da označe količinu koja je dovoljna da smanji, ili poželjno, spreči, klinički značajan deficit aktivnosti, funkcije ili odgovora domaćina. Alternativno, terapeutski efektivna količina je dovoljna da izazove poboljšanje nekog klinički značajnog stanja domaćina. Kao što će ceniti stručnjaci u stanju tehnike, količina jedinjenja može da varira zavisno od specifične aktivnosti. Pogodne dozne količine mogu da sadrže prethodno definisanu količinu aktivne kompozicije izračunatu da proizvede željeni terapijski efekat kada je u kombinaciji sa diluentom. Terapeutski efektivna količina može se odrediti od strane iskusnog medicinskog ili veterinarskog doktora, na osnovu osobina pacijenta, kao što su starost, težina, pol, opšte stanje, komplikacije, druge bolesti, i td, što je poznato u stanju tehnike. Administracija farmaceutski efektivne doze može se izvesti pojedinačnom primenom u formi jedinične doze, ili u vidu nekoliko jediničnih doza, ili višestrukom administracijom podeljene dozne jedinice u specifičnim vremenskim intervalima. Alternativno, doza se može isporučiti u vidu kontinualne infuzije tokom dužeg vremena.
[0117] Stručnjaci u oblasti će ceniti da se opisani ADC konjugati usmereni prema uPARAP mogu administrirati samostalno ili u kombinaciji sa drugim terapeutskim agensima. Na primer, opisani ADC konjugati usmereni prema uPARAP mogu se administrirati u kombinaciji sa brojnim anti-kancerskim agensima, kao što su anti-metaboliti, alkilirajući agensi, antraciklini i drugi citotoksični antibiotici, vinka alkaloidi, anti-mikrotubularni/anti-mitotički agensi, inhibitori deacetilaza histona, inhibitori kinaza, peptidni antibiotici, antineoplastici na bazi platine, etopozidi, taksani, inhibitori topoizomeraze, antiproliferativni imunosupresanti, kortikosteroidi, polni hormoni i antagonisti hormona, citotoksični antibiotici i drugi terapeutski agensi.
[0118] U jednom obliku izvođenja predmetnog otkrića, ADC prema pronalasku se administrira zajedno sa dodatnim reagensima i/ili terapeutucima koji povećavaju funkcionalnu efikasnost ADC konjugata, kao što su postojeći i novi lekovi koji povećavaju permeabilnost membrane lizozoma, čime se olakšava promet molekula iz unutrašnjosti lizozoma u citoplazmu, ili sa lekovima koji povećavaju permeabilnost krvno-moždane barijere.
[0119] U jednom obliku izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje komplet koji sadrži opisani ADC konjugat usmerenu prema uPARAP, ili farmaceutsku kompoziciju u čijem se sastavu konjugat nalazi. Komplet može opciono da sadrži sredstvo za administraciju ADC konjugata pacijentu i uputstvo za upotrebu.
[0120] U jednom obliku izvođenja, pronalazak se odnosi na postupak isporuke aktivnog agensa u ćeliju subjekta koja eksprimira uPARAP, gde se postupak sastoji od administriranja ADC konjugata usmerenog prema uPARAP ili kompozicije koja sadrži ADC konjugat usmeren prema uPARAP, sa ciljem da se aktivni agens isporuči do naznačene ćelije.
[0121] U jednom obliku izvođenja, pronalazak se odnosi ADC konjugat usmeren prema uPARAP ili na kompoziciju koja sadrži navedeni ADC konjugat usmeren prema uPARAP, za primenu u isporuci aktivnog agensa u ćeliju koja eksprimira uPARAP, što se sastoji od administriranja subjektu ADC konjugata usmerenog prema uPARAP ili kompozicije koje sadrži ADC konjugat usmeren prema uPARAP, tako da se aktivni sastojak isporuči do navedene ćelije.
[0122] U jednom obliku izvođenja predmetnog otkrića, pronalazak se odnosi na postupak lečenja bolesti ili poremećaja subjekta, koji se odlikuju prisustvom ćelija koje eksprimiraju uPARAP, gde se postupak sastoji od administriranja subjektu ADC konjugata usmerenog prema uPARAP ili kompozicije koja sadrži ADC konjugat usmeren prema uPARAP, kao što je opisano.
[0123] U jednom obliku izvođenja predmetnog otkrića, pronalazak se odnosi na ADC konjugat usmeren prema uPARAP i kompoziciju koja sadrži navedeni ADC konjugat usmeren prema uPARAP, za primenu u lečenju bolesti ili poremećaja koje se odlikuju prisustvom ćelija koje eksprimiraju uPARAP.
[0124] U jednom obliku izvođenja, pronalazak se odnosi na in vivo ili in vitro inhibiciju rasta ćelija koje eksprimiraju uPARAP, gde se postupak inhibicije sastoji od administriranja ADC konjugata usmerenog prema uPARAP ili kompozicije koja sadrži ADC konjugat usmeren prema uPARAP. Inhibicija rasta označava indukovanje ćelijske smrti ili zasuatvljanje rasta ćelije bez ćelijske smrti.
[0125] U naročito pogodnom obliku izvođenja predmetnog pronalaska, ćelija koja eksprimira uPARAP je tumorska ćelija i/ili tumor-asocirana ćelija, a predmetni pronalazak se odnosi na postupak lečenja kancera kod subjekta, gde se postupak sastoji od administracije ADC konjugata usmerenog prema uPARAP ili kompozicije koja sadrži ADC konjugat usmeren prema uPARAP, kao što je opisano.
[0126] Tumor-asocirane ćelije obuhvataju aktivirane fibroblaste, miofibroblaste, novoformirane krvne sudove, infiltrirajuće ćelije makrofagno-monocitne loze ili druge tipove leukocita, kao što su ćelije stromalnog tkiva koje okružuje tumor.
[0127] U jednom obliku izvođenja, otkriće se odnosi na postupak inhibiranja progresije tumora kod subjekta, gde se postupak sastoji od administriranja subjektu ADC konjugata usmerenog prema uPARAP ili kompozicije koja sadrži ADC konjugat usmeren prema uPARAP. Inhibicija progresije tumora može da obuhvati potpuno ili nepotpuno iskorenjenje tumora, ili može da obuhvati zaustavljanje rasta tumora bez ćelijske smrti.
[0128] U jednom obliku izvođenja, pronalazak se odnosi na postupak inhibiranja, smanjenja ili eliminisanja metastatskog kapaciteta tumora kod subjekta, gde se postupak sastoji od administriranja subjektu ADC konjugata usmerenog prema uPARAP ili kompozicije koja sadrži ADC konjugat usmeren prema uPARAP, kao što je opisano.
[0129] U jednom obliku izvođenja predmetnog otkrića, tumorske ćelije eksprimiraju ili pojačano eksprimiraju uPARAP.
[0130] U jednom obliku izvođenja predmetnog pronalaska, tumor-asocirane ćelije eksprimiraju ili pojačano eksprimiraju uPARAP.
[0131] U jednom obliku izvođenja, pronalazak se odnosi na postupak indukovanja ćelijske smrti i/ili inhibicije rasta i/ili proliferacije ćelija koje eksprimiraju uPARAP, gde se postupak sastoji od koraka administracije efektivne količine ADC konjugata usmerenog prema uPARAP, kao što je opisano, ili farmaceutske kompozicije koja sadrži ADC konjugat usmeren prema uPARAP, kao što je opisano.
[0132] Lečenje poželjno indukuje ćelijsku smrt i/ili inhibira rast i/ili proliferaciju ćelija koje eksprimiraju uPARAP, kao što su tumorske ćelije ili tumor-asocirane ćelije.
[0133] U jednom obliku izvođenja predmetnog pronalaska, lečenje je meliorativno.
[0134] U jednom obliku izvođenja predmetnog pronalaska, lečenje je kurativno.
[0135] U jednom obliku izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje ADC konjugat usmeren prema uPARAP, kao što je opisano, za pripremu medikamenta za indukovanje ćelijske smrti i/ili inhibicije rasta i/ili proliferacije ćelija koje eksprimiraju uPARAP, kao što su tumorske ćelije ili tumor-asocirane ćelije.
[0136] Ekspresija i uloga uPARAP u kanceru izučava se u nekoliko istraživačkih grupa; uporediti, revijski rad Melander-a et al (Melander et al., 2015, Int J Oncol 47: 1177-1188) i članak Engelholm-a et al (Engelholm et al., 2016, J. Pathol. 238, 120-133).
[0137] U jednom obliku izvođenja predmetnog pronalaska, kancer je solidni tumor, naznačen time da tumorske ćelije i/ili tumor-asocirane ćelije eksprimiraju uPARAP.
[0138] U jednom obliku izvođenja predmetnog pronalaska, kancer je solidni tumor, naznačen time da tumorske ćelije eksprimiraju uPARAP.
[0139] Primeri kancera koji se odlikuju pretranom ekspresijom uPARAP obuhvataju sarkom, kao što je osteosarkom (Engelholm et al., 2016, J Pathol 238(1): 120-33), kao i druge sarkome, glioblastom (Huijbers et al., 2010, PLoS One 5(3):e9808), kancer prostate i metastastki kancera prostate u kostima (Kogianni et al., 2009, Eur J Cancer 45(4): 685-93), kancer dojke i posebno kancer dojke “sličan bazalnom” (Wienke et al., 2007, Cancer Res 1;67(21): 10230-40), kancer glave i vrata (Sulek et al., 2007, J HistochemCytochem 55(4): 347-53).
[0140] U jednom obliku izvođenja predmetnog pronalaska, kancer je sarkom, kao što je osteosarkom, liposarkom, miksofibrosarkom, dermato-fibrosarkom protuberans (DFSP) i/ili leiomiosarkom (LMS).
[0141] U jednom obliku izvođenja predmetnog pronalaska, kancer je glioblastom.
[0142] U jednom obliku izvođenja predmetnog pronalaska, kancer je solidni tumor, naznačen time da tumor-asocirane ćelije eksprimiraju uPARAP. Kada se uPARAP eksprimira u tumorasociranim ćelijama, veruje se da je terapeutski efekat posredovan takozvanim efektom "posmatrača" i/ili redukcijom i/ili eliminacijom stimulatornog efekta rasta i diseminacije, koji kod tumora indukuju stromalne ćelije.
[0143] Primeri kancera koji se odlikuju povećanom ekspresijom uPARAP a u tumor-asociranim ćelijama obuhvataju kancer dojke (Schnack et al., 2002, Int J Cancer 10;98(5): 656-64), kancer glave i vrata (Sulek et al., 2007, J HistochemCytochem 55(4): 347-53) i mnoge druge maligne tumore.
[0144] U jednom obliku izvođenja predmetnog pronalaska, kancer nije solidni tumor. Na primer, ADC konjugati prema pronalasku mogu se, primeniti u lečenju leukemija koje eksprimiraju uPARAP, na primer, u ćelijama makrofagno-monocitne loze.
[0145] U nekim oblicima izvođenja predmetnog pronalaska, bolest ili poremećaj koja se odlikuju ćelijama koje eksprimiraju uPARAP nije kancer.
[0146] uPARAP je uključen u rast i homeostazu kostiju (Madsen et al., 2013, PLoS One 5;8(8): e71261). Stoga, u jednom obliku izvođenja pronalaska, ADC konjugat prema pronalasku može se primeniti u lečenju bolesti koja se odlikuje degradacijom kostiju, naznačeno time da je degradacija kostiju posredovana ne-malignim ćelijama, kao što je u osteoporozi, na primer.
[0147] Zbog svoje uloge u akumulaciji kolagena, uPARAP ima ulogu i u fibrozi (Madsen et al., 2012, J Pathol 227(1):94-105). Stoga, u jednom obliku izvođenja predmetnog pronalaska, ADC konjugati prema pronalasku mogu se primeniti u lečenju fibroze, na primer, fibroze bubrega, pluća i jetre.
[0148] U jednom obliku izvođenja predmetnog pronalaska, ADC konjugat prema pronalasku može se primeniti u lečenju bolesti i poremećaja povezanih sa makrofagima, uključujući aterosklerozu i hroničnu inflamaciju.
Reference
[0149]
Kabat, E. A., Wu, T. T., Bilofsky, H., Reid-Miller, M., Perry, H. (1983) Sequence of proteins of immunological interest. Bethesda: National Institute of Health.
Kabat, E. A., Wu, T. T., Perry, H., Gottesman, K. and Foeller, C. (1991) Sequences of proteins of immunological interest. Fifth Edition. NIH Publication No.91-3242.
4
Wu, T.T., Kabat, E. A. (2008) Pillars article: an analysis of the sequences of the variable regions of Bence Jones proteins and myeloma light chains and their implications for antibody complementarity. J. Exp. Med.132, 211-250. J. Immunology 180, 7057-7096. Dunbar, J., Deane, C. M. (2016) ANARCI: antigen receptor numbering and receptor classification. Bioinformatics, 32, 298-300.
Lefranc MP, Pommié C, Ruiz M, Giudicelli V, Foulquier E, Truong L, Thouvenin-Contet V, Lefranc G. (2003) IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains. Dev Comp Immunol.27, 55-77. Kunik V, Ashkenazi S, Ofran Y. (2012a) Paratome: an online tool for systematic identification of antigen-binding regions in antibodies based on sequence or structure. Nucleic Acids Res. 40(Web Server issue):W521-4. doi: 10.1093/nar/gks480. Epub 2012 Jun 6.
Kunik V, Peters B, Ofran Y. (2012b) Structural consensus among antibodies defines the antigen binding site. PLoSComput Biol.8(2):e1002388.
Primer 1: In vitro i in vivo efikasnost ADC konjugata usmerenih prema N-terminalnom regionu uPARAP
Materijali i postupci
Priprema i evaluacija mAb-vc-MMAE ADC konjugata
[0150] Monoklonska antitela (mAbs) usmerena prema uPARAP ili prema trinitrofenilu (TNP) generisana su primenom hibridoma tehnika nakon imunizacije miševa, prema utvrđenim postupcima poznatim u stanju tehnike. U slučaju mAb usmerenih prema uPARAP, imunizovani miš-domaćin bio je deficijentan za gen koji kodira uPARAP, što je uslovilo nastanak uPARAP-reaktivnih antitela, kako prema mišjem, tako i prema humanom antigenu. ADC konjugati su dobijeni primenom ubičajenih postupaka konjugacije, koji su već opisani u stanju tehnike (Doronina et al. 2003 Nature biotechnology 21(7):778-84; Francisco et al., 2003. Blood 102(4):1458-65; Hamblett et al., 2004. Clinical cancer research 10(20):7063-70).
[0151] Antitela su izložena blagoj redukciji, inkubacijom 10 minuta na 37°C, u prisustvu 10 mM DTT u puferu 50 mM natrijum borata, 50 mM NaCl, pH 8.0, u koncentraciji od 5 mg/mL, nakon čega je DTT uklonjen primenom 30 kDa NMWL filtera za centrifugiranje, i zamenjen PBS puferom pH 7.4, koji je sadržao 1 mM EDTA, kojim je koncentracija rastvora podešena na 2 mg/mL. Nakon toga je usledila konjugacija, u 5-10 puta molarnom suvišku maleimidokaproilvalin-citrulin-p-aminobenzoiloksikarbonil-monometil auristatina E (MC-VC-PAB-MMAE, odnosno, Vedotin), rastvorenom u DMSO bez vode, u finalnoj koncentraciji DMSO od 10% v/v, tokom konjugacije od 2 sata na 37°C. Rezultujuće mAb-vc-MMAE ADC konjugati prečišćeni su gel filtracijom na PD-10 desalinizujućim kolonama. Prosečan odnos lek-antitelo (DAR) tako dobijenih ADC konjugata određen je na osnovu odnosa izmerenih apsorbanci prečišćenog uzorka konjugata na talasnim dužinama λ=248 nm i λ=280 nm. Nemodifikovana mAbs antitela ispoljavaju odnos A248nm/A280nmod 0.43, a AMAXna λ=248 nm MMAE dovodi do povećanja A248nm/A280nmodnosa za mAb-vc-MMAE ADC konjugat, što reflektuje DAR vrednost rezultujućih ADC konjugata (Hamblett et al., 2004. Clinical cancer research 10(20):7063-70; Sanderson et al., 2005. Clinical Cancer Research 11:843-852).
Ćelijske linije
[0152] Ćelijske linije U937, THP-1 i HT1080 nabavljene su kod ATCC. KNS42 je poklon Lare Perryman, Biotech Research and Innovation Centre (BRIC), University of Copenhagen. CHO-K1 su nabavljene od Invitrogen-a. Sve ćelije su gajene u odgovarajućem medijumu, obogaćenom 10 % serumom fetusa govečeta i 1% penicilin/streptomicinom, u inkubatoru na 37°C i u atmosferi 5% CO2.
SDS-PAGE analiza konjugovanih vrsta
[0153] Redukujuća SDS-PAGE elektroforeza je izvedena na diskontinualnom 4-12% NuPAGE Bis-Tris SDS-PAGE gelu, na koji je nanaeto po 5 µg ukupnih proteina po traci, gde su protein u uzorku redukovani kuvanjem 3 minuta u puferu za uzorke, u prisustvu 40 mM DTT. Gelovi su obojeni primenom standardne 0.1% komazi-plavo boje. Za esej isecanja veze katepsinom B, uzorci su tretirani rekombinantnim humanim (rh) katepsinom B, prema uputstvu proizvođača, u uslovima delovanja 100 ng aktiviranog rh katepsina B na 20 µg ADC konjugata (mAb komponenta), u 25 mM MES, pH 5.0 puferu, i inkubacijom tokom noći na 37°C.
Analiza vezivanja mAbs za uPARAP pomoću ELISA testa
[0154] Mikrotitar ploče za ELISA test sa 96 bunarića obložene su sa 25 ng/bunariću solubilnog skraćenog uPARAP koji sadrži prva 3 N-terminalna domena humanog uPARAP proteina, sa očuvanim epitopom za mAb 2h9 antitelo. Kao primarna antitela primenjeni su netretirano mAbs (2h9 ili aTNP), isto mAbs podvrgnuto redukciji konjugacije (videti ranije) ili ADC 2h9-vc-MMAE ili aTNP-vc-MMAE, a zatim su primenjena HRP-konjugovana antimišja Ig sekundarna antitela poreklom iz zeca. Na kraju je dodat rastvor supstrata o-fenilen-diamin dihidrohlorida, a razvijanje boje je zaustavljeno dodavanjem 1M H2SO4. Ploče su izmerene u čitaču ploča na talasnoj dužini od 492 nm.
In vitro citotoksičnost ADC konjugata – Test ćelijske vijabilnosti
[0155] Testirane ćelije zasejane su u maloj gustini (20-25% konfluentnosti, oko 5-10 ×10<3>ćelija po bunariću), na mikrotitar pločama sa 96 bunarića, u 90 µL medijuma, i inkubirane su tokom noći. Narednog dana, mAb-vc-MMAE konjugati na bazi mAb 2h9, mAb 5f4 antitela ili neusmerenih kontrolnih antitela mAbaTNP, pripremljani su u serijskim razblaženjima (1:4) u PBS, i dodati su u svaki bunarić u zapremini od 10 µL, sa konačnom najvećom koncentracijom ADC konjugata od 10µg/mL (mAb komponenta). Ćelije su inkubirane 72 sata, pa je dodato 20 µL CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS, Promega), i inkubirane su odgovarajuće vreme do razvijanja boje (oko 1 sat). Ploče su očitane na čitaču mikrotitar ploča na talasnoj dužini od 490 nm, sa oduzimanjem pozadinskog šuma merenjem na talasnoj dužini od 630 nm.
In vitro citotoksičnost ADC konjugata – Analiza ćelijskog ciklusa
[0156] Analiza ćelijskog ciklusa je izvršena na Nucleocounter NC-3000 system (ChemoMetec Denmark), primenom standardnog protokola za analizu distribucije populacije ćelijama po fazama ćelijskog ciklusa, na osnovu DNK sastava svake ćelije. Procenat ćelija u Sub-G1, G1, S, ili G2/M-fazama ćelijskog ciklusa ustanovljen je analizom histograma primenom NucleoView NC-3000 softverskog paketa.
Kompeticija receptora i inhibicija lizozomske proteaze
[0157] Za test kompeticije receptora, test deplecije receptora i test inhibicije lizozomskih proteaza, U937 ćelije su sejane u gustini kao za test vijabilnosti (videti ranije). Za test kompeticije recepetora, u svim bunarićima je održavana konstantna koncentracija 2h9-vc-MMAE na nivou od 1µg/mL mAb komponente, dok je nemodikifovano kompetitivno mAb dodato simultano u dilucionoj seriji (1:2), počev od koncentracije 8 µg/mL kompetitivnog mAb. Ćelije su nakon toga podvrgnute citotoksičnom testu ćelijske vijabilnosti tokom 72 sata (videti
4
ranije). Za test inhibicije lizozomskih proteaza, U937 ćelije su preinkubirane sa 20 µM inhibitora proteaza E64D tokom 2 sata, pre otpočinjanja citotoksičnog testa ćelijske vijabilnosti tokom 72 sata (videti ranije).
Eksperimenti na životinjama
[0158] Svi eksperimenti na životinjama su izvedeni na osnovu dozvole izdate od The Danish Veterinary and Food Administration. Svi reagensi i ćelijske linije korišćene u eksperimentima na životinjama testirani su negativno na prisustvo mišjih virusa, bakterija, mikoplazme i gljivica. Životinje su imale standardnu negu, i žrtvovane su nakon pojave nekog od sledećih simptoma: gubitak telesne mase od više od 10 %, uočljiva patnja ili bolest, poremećen unos hrane ili vode i defekacija, znaci snažne inflamacije u blizini tumora, rast tumora koji prevazilazi zapreminu od 1000 mm<3>ili onemogućeno slobodno kretanje životinja. Rast tumora je meren pomoću elektronskog kalipera, a zapremina tumora je izračunata primenom formule Zapremina = (L×W<2>)/2, gde je L najveća dimenzija tumora, a W širina dimenzije pod uglom od 90°.
Tretman s.c injekcijom subkutanog uPARAP-pozitivnog U937 ksenografta u modelu tumora miša
[0159] Za uspostavljanje modela tumora, koža na boku miševa je obrijana, i miševi su primili subkutanu injekciju 1×10<6>U937 ćelija, a zatim su miševi pažljivo praćeni kako bi se uočio razvoj solidnih tumora. Tretman je započet nakon formiranja palpabilnih tumora zapremine 50-100 mm<3>, u jednoj od četiri režima tretmana: 2h9-vc-MMAE (N = 10), aTNP-vc-MMAE (N = 9), nemodifikovano mAb 2h9 (N = 5) ili PBS kontrola (N = 5). Svi tretmani su datu u vidu 4 subkutane doze od po 3 mg/kg mAb komponente u oblast tumora, sa intervalom od 4 dana između dve sukcesivne doze. Životinje su injektovane pod kratkotrajnom anestezijom izofluranom, kako bi se izbegao rizik za eksperimentatora. Tokom tretmana, tumori su procenjivani svaka dva dana, sve dok nije dostignuta tačka žrtvovanja. Miševi koji su u potpunosti izgubili tumor ispitivani su dva puta nedeljno tokom perioda od 3 meseca nakon završetka tretmana.
Tretman intravenskom injekcijom subkutanog uPARAP-pozitivnog U937 ksenografta u modelu tumora miša
[0160] Za uspostavljanje tumora, koža miševa na boku je obrijana, i miševi su primili subkutanu injekciju 1×10<6>U937 ćelija, a zatim su pažljivo praćeni kako bi se uočio razvoj solidnog tumora. Tretman je započeo nakon formiranja palpabilnog tumora zapremine 50-100 mm<3>, u jednoj od četiri grupe: 2h9-vc-MMAE (N = 10), aTNP-vc-MMAE (N = 10), nemodifikovano mAb 2h9 (N = 5) ili PBS kontrola (N = 5). Svi tretmani su dati u vidu ukupno 3 intravenske doze od po 5 mg/kg mAb komponente u repnu venu miša, sa intervalima između doza od po 4 dana. Tokom tretmana, tumori su procenjivani svaka dva dana, sve dok nije dostignuta tačka žrtvovanja. MIševi koji su potpuno izgubili tumor testirani su dva puta nedeljeno tokom perioda od 3 meseca nakon tretmana.
Statistika
[0161] Svi uzorci su testirani u triplikatu. Odstupanja: Standardna devijacija.
Rezultati i zaključci
[0162] Receptor kolagena uPARAP pozitivno je regulisan u tumorskim ćelijama nekih tipova kancera, uključujući sarkome i pozne glioblastome. Takođe, ovaj receptor je često pozitivno regulisan u stromalnim ćelijama koje okružuju solidne tumore. Kod zdravih odraslih osoba, receptor ispoljava obrazac ograničene ekspresije, što ga čini potencijalnom metom u ADC terapiji.
[0163] U tom smislu, selektovali smo monoklonsko antitelo 2h9 koje smo proizveli imunizacijom miševa sa deficijentnim uPARAP genom, i proizveli smo ADC konjugat usmeren prema uPARAP (2h9-vc-MMAE), primenom dobro poznatih postupaka konjugacije. Pokazalo se da usmeravajuće antitelo 2h9 dobro podnosi postupak konjugacije, uz zanemarujući gubitak aktivnosti. Pokazano je da je rezultujući ADC konjugat veoma specifičan u ubijanju ili prekidu rasta uPARAP-pozitivnih ćelija in vitro, pri čemu su U937 ćelije najosetljivija testirana ćelijska linija. uPARAP je receptor koji se konstitutivno recikluje, i usmerava prema lizozomskom odeljku ćelije. Utvrdili smo da je efikasnost ADC konjugata u visoko-senzitivnim ćelijama, kao što su U937 ćelije, potpuno zavisi od isecanja veznika, s obzirom na to da se citotoksičnost izazvana uPARAP potpuno gubi nakon inhibicije lizozomskog katepsina, primenom E64D. Stoga smo sugerisali da je razlika osetljivosti pojedinih tipova ćelija prem ADC uslovljena različitim kapacitetom lizozoma u tim ćelijama za isecanje veznika, uz sve druge razlike senzitivnostu prema konjugovanom citotoksinu.
4
[0164] Za in vivo istraživanja, primenili smo brzo-rastući model subkutanog ksenografta U937 ćelija kod CB17 SCID miševa. Primenom ovog modela, utvrđeno je da je ADC 2h9-vc-MMAE izuzetno efikasan u eradikaciji solidnog U937 tumora in vivo. Nakon tretmana lokalnom subkutanom aplikacijom, 5 miševa je bilo potpuno bez tumora 90 dana nakon završenog tretmana, što čini stopu izlečenja od 50%. Još važnije, nakon tretmana intravenskom administracijom, uočili smo rezultat od 100% stope izlečenja. Posebno važno, eradikacija tumora je postignuta bez uočljivih sporednih štetnih efekata nakon normalne inspekcije tretiranih miševa. Još važnije, antitelo 2h9 je reaktivno prema humanom i mišjem uPARAP, pri čemu je unakrsna reaktivnost omogućena korišćenjem uPARAP-deficijentnih miševa za imunizaciju i dobijanje antitela. Stoga bi u ovom modelu ksenografta, uz pogodne anti-tumorske efekte, bio uočen svaki potencijalni štetni efekat kod domaćina, a ti neželjeni događaji nisu uočeni.
[0165] Epitop 2h9 antitela nalazi se unutar prva tri N-terminalna domena uPARAP, konkretno, unutar CysR domena ili CTLD-1 domena. Prezentovana in vitro istraživanja ukazuju da je drugi ADC konjugat koji sadrži anti-UPARAP antitelo usmereno prema prva tri N-terminalna domena uPARAP moelkula, konkretno 5f4 antitelo, efikasno usto kao i ADC konjugat koji sadrži 2h9 antitelo. Epitop 5f4 antitela je FN-II domen uPARAP. Stoga smo pretpostavili da su ADC konjugati koji sadrže anti-uPARAP antitela usmerena prema epitopima unutar prva tri N-terminalna domena uPARAP proteina, posebno efikasni kada su u sastavu ADC.
[0166] U zaključku, na osnovu obrasca ekspresije i molekulskih funkcija, prezentovani podaci snažno podupiru hipotezu o uPARAP receptoru kolagena, kao raznovrsnoj meti u ADC-usmerenoj terapiji kancera. Ovi podaci dalje pokazuju da je ADC koja sadrži antitela usmerena prema prva tri N-terminalna domena uPARAP, kao što je ADC 2h9-vc-MMAE, veoma efikasna u napadu na ćelije koje eksprimiraju uPARAP in vitro i in vivo.
Primer 2: In vitro efikasnost ADC konjugata zasnovanih na MMAE
[0167] Uz ADC conjugate predstavljene u Primeru 1, proizvedeni su naredni MMAE ADC: 9b7-vc-MMAE i 11c9-vc-MMAE.
[0168] mAb 2h9, mAb 5f4 i mAb 9b7 su antitela usmerena prema epitopima unutar tri N-terminalna domena uPARAP, dok je mAb 11c9 anti-uPARAP antitelo usmereno prema epitopu koji se nalazi van ova tri N-terminalna domena u uPARAP.
4
[0169] Sprovedeni su in vitro testovi ćelijske vijabilnosti na U937 ćelijama, kao što je opisano u Primeru 1, primenom ovih ADC konjugata. Svi ADC konjugati su doveli do specifične redukcije vijabilnosti ćelija, pri čemu je osetljivost ćelija prema 2h9-vc-MMAE, 5f4-vc-MMAE i 9b7-vc-MMAE bila značajno veća od osetljivosti prema 11c9-vc-MMAE (Slika 14).
[0170] Stoga su pronalazači zaključili da su ADC konjugati koji u svom sastavu imaju antiuPARAP antitela koja vezuju epitope unutar tri N-terminalna domena uPARAP, veoma efikasni.
Primer 3: In vitro efikasnost ADC konjugata koji sadrže različite veznike, razdelnike i toksine
[0171] U opisanom ADC formatu koji je usmeren prema N-terminalnom delu uPARAP mogu se primeniti različiti toksini. ADC konjugati sa mAb 2h9 kao antitelom dobijeni sun a opisani način, uz korišćenje narednih veznik-citotoksin jedinica, umesto VC-PAB-MMAE:
• VC-PAB-MMAF (sa MMAF - monometil auristatin F, karboksi-varijanta MMAE) • PEG4-va-PBD (sa PEG4-polietilenglikolski razdelnik, gde je va valin-alanin i PBD se odnosi na dimerni pirolobenzodiazepin)
• PEG4-vc-Duokarmicin SA (sa PEG4- polietilenglikolski razdelnik i vc, što označava valin-citrulin).
[0172] Tako dobijeni ADC konjugati (označeni sa 2h9-vc-MMAF, 2h9-va-PBD, odnosno, 2h9-vc-DuocSA) testirani su in vitro testovima ćelijske vijabilnosti na U937 ćelijama, kao što je prethodno opisano. U937 ćelije su ispoljile veliku osetljivost prema 2h9-vc-MMAF, umerenu osetljivost prema 2h9-va-PBD i malu, ali merljivu osetljivost prema 2h9-vc-DuocSA. Rezultati su prikazani na slikama 15 i 16.
Primer 4: In vitro efikasnost ADC konjugata u eksplantu ćelija humanog glioblastoma
[0173] ADC konjugati 2h9-vc-MMAE i 2h9-vc-MMAF testirani su in vitro testovima ćelijske vijabilnosti, koji su izvedeni prema protokolu opisanom u Primeru 1, u pogledu kapaciteta da specifično unište eksplante ćelija humanog glioblastoma. Eksplanti ćelija glioblastoma su detaljno opisani kod Staberg et al., 2017, Cell Oncol. 40: 21-32. Ove ćelije ispoljavaju veoma snažnu i specifičnu senzitivnost prema ADC 2h9-vc-MMAE, kao i ADC 2h9-vc-MMAF, što demonstrira visoku efikasnost ovih ADC konjugata u borbi protiv humanog glioblastoma. Rezultati su prikazani na Slici 17.
4
Primer 5: Rekombinantno antitelo
[0174] Proteinski proizvod kodiran sintetskom DNK, koja sadrži sekvencu prema [SEQ ID NO: 1] (laki lanac monoklonskog antitela 2h9 usmeren prema uPARAP) i sekvencu [SEQ ID NO: 5] (teški lanac istog antitela), eksprimiran je u CHO ćelijama. Rezultujuće rekombinantno antitelo je prečišćeno, i postupkom Western blota je pokazano da specifično prepoznaje uPARAP, na sličan način kao i monoklonsko antitelo 2h9, proizvedeno u ćelijskoj kulturi hibridoma (Slika18).
4
4
�
2
4
1
2
�
1
�
4
1

Claims (20)

Patentni zahtevi
1. Konjugat antitelo-lek usmeren prema uPARAP, koji sadrži:
a) antitelo, koje se vezuje za amino kiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 32 ili 33 (domen fibronektina tipa II (FN-II) uPARAP),
b) aktivni agens, naznačen time da je aktivni agens izabran između terapeutskog agensa, citotoksičnog agensa, radioizotopa i detektabilnog obeležja, i
c) veznik, koji povezuje a) za b).
2. Konjugat antitelo-lek prema zahtevu 1, naznačen time da je antitelo izabrano iz grupe koja se sastoji od:
a) antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, koji sadrže
i. varijabilni region lakog lanca imunoglobulina, koji sadrži ili se sastoji od amino kiselinske sekvence prema SEQ ID NO: 11 ili sekvence koja ima 90 % identičnosti sa prethodnom sekvencom, i
ii. varijabilni region teškog lanca imunoglobulina, koji sadrži ili se sastoji od amino kiselinske sekvence prema SEQ ID NO: 15 ili sekvence koja ima 90% identičnosti sa prethodnom sekvencom,
pri čemu se sve varijacije sekvence nalaze van regiona koji određuju komplementarnost,
b) humanizovane verzije antitela pod a) ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, c) himerne verzije antitela pod a) ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta,
d) antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, koji sadrže
i. varijabilni region lakog lanca imunoglobulina, koji sadrži amino kiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 12, 13 i 14, i
ii. varijabilni region teškog lanca imunoglobulina, koji sadrži amino kiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 16, 17 i 18,
e) antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, koji sadrže
i. varijabilni region lakog lanca imunoglobulina, koji sadrži sekvencu prema SEQ ID NO: 48, 49 i 50, i
ii. varijabilni region teškog lanca imunoglobulina, koji sadrži amino kiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 51, 52 i 53
f) humanizovane verzije antitela pod d) ili e) ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta.
2
3. Konjugat antitelo-lek, prema zahtevu 1, naznačen time da je antitelo izabrano iz grupe koja se sastoji od:
a) antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, koji se sastoje od
i. varijabilnog regiona lakog lanca imunoglobulina koji sadrži ili se sastoji od amino kiselinske sekvence prema SEQ ID NO: 19 ili 20, ili od sekvence koja ima 90% identičnosti sa prethodnom sekvencom, i
ii. varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina, koji sadrži ili se sastoji od amino kiselinske sekvence prema SEQ ID NO: 24 ili 25 ili sekvence koja ima najmanje 90% identičnosti sa tim sekvencama,
naznačeno time da se sve varijacije sekvenci nalaze van regiona koji određuju komplementarnost,
b) humanizovane verzije antitela pod a) ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, c) himerne verzije antitela pod a) ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta,
d) antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, koji sadrže
i. varijabilni region lakog lanca imunoglobulina, koji sadrži sekvencu prema SEQ ID NO: 21, 22 i 23, i
ii. varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina, koji sadrži amino kiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 26, 27 i 28,
e) antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, koji sadrže
i. varijabilni region lakog lanca imunoglobulina, koji sadrži amino kiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 54, 55 i 56, i
ii. varijabilni region teškog lanca imunoglobulina, koji sadrži amino kiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 57, 58 i 59,
f) humanizovane verzije antitela pod d) ili e) ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta.
4. Konjugat antitelo-lek, prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačen time da je antitelo izabrano između mišjeg antitela, himernog antitela, humanog antitela, humanizovanog antitela, antigen-vezujućeg fragmenta humanizovanog antitela, Fab fragmenta, Fab' fragmenta, F(ab')2 fragmenta, Fv, jednolančanog antitela (SCA), kao što je scFv, varijabilnog dela teškog i/ili lakog lanca i Fab mini-antitela.
5. Konjugat antitelo-lek, prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačen time da je antitelo monoklonsko antitelo.
6. Konjugat antitelo-lek, prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačen time da je aktivni agens hemoterapeutski agens, kao što je hemoteraputski agens izabran iz grupe koja se sastoji od alkilirajućih agenasa, antraciklina, antimetabolita, anti-mikrotubularnih/anti-mitotičkih agenasa, inhibitora histonske deacetilaze, inhibitora kinaza, peptidnih antibiotika, antineoplastika na bazi platine, inhibitora topoizomeraze i citotoksičnih antibiotika.
7. Konjugat antitelo-lek, prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačen time da je aktivni agens neki anti-mitotički agens, na primer, agens izabran iz grupe koja se sastoji od monometil auristana E (MMAE), monometil auristatina F (MMAF), taksana (na pr. Paklitaksel ili Docetaksel), vinka alkaloida (na primer, Vinblastin, Vinkristin, Vindezin ili Vinorelbin), kolhicina ili podofilotoksiina.
8. Konjugat antitelo-lek, prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačen time da je aktivni agens, agens DNK umrežavanja, kao što je agens DNK umrežavanja izabran između pirolobenzodiazepina ili dimernog derivata pirolo-benzodiazepina.
9. Konjugat antitelo-lek, prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačen time da je aktivni agens alkilirajući agens, kao što je Duokarmicin SA.
10. Konjugat antitelo-lek, prema bilo kom od prethodnih zahteva, za primenu kao medikamenta.
11. Farmaceutska kompozicija koja sadrži konjugat antitelo-lek, prema zahtevima 1 do 9, i farmaceutski prihvatljiv pufer, diluens, nosač, adjuvans ili eksipijens.
12. Konjugat antitelo-lek, prema zahtevima 1 do 9 ili farmaceutska kompozicija prema zahtevu 11, za primenu u postupku lečenja bolesti koja je naznačena prisustvom ćelija koje eksprimiraju uPARAP, pri čemu se bolest odlikuje ćelijama koje eksprimiraju uPARAP izabrana između kancera, bolesti degradacije kostiju, kao što je osteoporoza, fibroze ili bolesti povezane sa makrofragima ili poremećaji kao što su ateroskleroza ili hronična upala.
13. Konjugat antitelolek ili farmaceutska kompozicija, za primenu prema zahtevu 12, naznačeno time da je bolest kancer.
14. Konjugat antitelo-lek ili farmaceutska kompozicija za primenu prema zahtevu 13, naznačena time da je kancer sarkom, na primer, osteosarkom, liposarkom, miksofibrosarkom, dermatofibrosarkom protuberans (DFSP) i/ili leiomiosarkom (LMS).
4
15. Konjugat antitelo-lek ili farmaceutska kompozicija za primenu prema zahtevu 13, naznačena time da je kancer glioblastom.
16. Konjugat antitelo-lek ili farmaceutska kompozicija za primenu prema zahtevu 13, naznačeno time da je kancer, kancer prostate ili koštana metastaza kancera prostate.
17. Konjugat antitelo-lek ili farmaceutska kompozicija za primenu prema zahtevu 13, naznačeno time da je kancer, kancer dojke.
18. Konjugat antitelo-lek ili farmaceutska kompozicija za primenu prema zahtevu 13, naznačeno time da je kancer, kancer glave i vrata.
19. Konjugat antitelo-lek ili farmaceutska kompozicija za primenu prema zahtevu 13, naznačeno time da je kancer, leukemija.
20. Komplet koji obuhvata konjugat antitelo-lek, prema bilo kom zahtevu 1do 9, ili farmaceutska kompozicija prema zahtevu 11, koja opciono sadrži sredstvo za administraciju konjugata antitelo-lek kod subjekta, kao i/ili upustvo za upotrebu.
RS20210886A 2016-02-05 2017-02-03 Konjugati antitelo-lek usmereni prema uparap RS62115B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DKPA201670063 2016-02-05
DKPA201670834 2016-10-24
PCT/DK2017/050024 WO2017133745A1 (en) 2016-02-05 2017-02-03 ANTIBODY-DRUG CONJUGATES TARGETING uPARAP
EP17706673.5A EP3411076B1 (en) 2016-02-05 2017-02-03 Antibody-drug conjugates targeting uparap

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS62115B1 true RS62115B1 (sr) 2021-08-31

Family

ID=58108381

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20210886A RS62115B1 (sr) 2016-02-05 2017-02-03 Konjugati antitelo-lek usmereni prema uparap
RS20230401A RS64219B1 (sr) 2016-02-05 2017-02-03 Konjugati antitelo-lek usmereni prema uparap

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20230401A RS64219B1 (sr) 2016-02-05 2017-02-03 Konjugati antitelo-lek usmereni prema uparap

Country Status (23)

Country Link
US (3) US10940213B2 (sr)
EP (2) EP3895736B1 (sr)
JP (2) JP7125059B2 (sr)
KR (2) KR20260021643A (sr)
CN (1) CN108883197B (sr)
AU (1) AU2017215869B2 (sr)
BR (1) BR112018015448A2 (sr)
CA (2) CA3252097A1 (sr)
CY (2) CY1124280T1 (sr)
DK (2) DK3411076T3 (sr)
ES (2) ES2946073T3 (sr)
FI (1) FI3895736T3 (sr)
HR (2) HRP20230505T1 (sr)
HU (2) HUE061880T2 (sr)
LT (2) LT3895736T (sr)
MX (2) MX2018009461A (sr)
PL (2) PL3895736T3 (sr)
PT (2) PT3895736T (sr)
RS (2) RS62115B1 (sr)
RU (1) RU2740311C2 (sr)
SI (2) SI3895736T1 (sr)
SM (1) SMT202100386T1 (sr)
WO (1) WO2017133745A1 (sr)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3252097A1 (en) 2016-02-05 2026-03-02 The University Of Copenhagen ANTIBODY-DRUG CONJUGATES TARGETING uPARAP
WO2023275112A1 (en) 2021-06-29 2023-01-05 Rigshospitalet Antibody-drug conjugates comprising humanized antibodies targeting urokinase type plasminogen activator receptor associated protein (uparap)
IL321193A (en) 2022-12-28 2025-07-01 Adcendo Aps Antibody-drug conjugates targeting UPARAP including extacan derivatives
WO2025099152A1 (en) * 2023-11-08 2025-05-15 Rigshospitalet Antibodies and molecular conjugates thereof targeting upar
WO2025141153A1 (en) 2023-12-29 2025-07-03 Oncomatryx Biopharma, S.L. Endo180 targeted antibody-drug conjugates
EP4578463A1 (en) * 2023-12-29 2025-07-02 Oncomatryx Biopharma, S.L. Endo-180 targeted antibody-drug conjugates
WO2025149667A1 (en) 2024-01-12 2025-07-17 Pheon Therapeutics Ltd Antibody drug conjugates and uses thereof

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
SI1545613T1 (sl) 2002-07-31 2011-11-30 Seattle Genetics Inc Avristatinski konjugati in njihova uporaba za zdravljenje raka avtoimunske bolezni ali infekcijskebolezni
JP2004137151A (ja) 2002-10-15 2004-05-13 Keio Gijuku 脳腫瘍の治療・診断薬
CN102378766A (zh) 2009-03-23 2012-03-14 夸克医药公司 治疗癌症和纤维化疾病的化合物组合物和方法
JP2015509085A (ja) * 2012-01-01 2015-03-26 キュービーアイ エンタープライゼズ リミテッドＱｂｉ Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅｓ Ｌｔｄ． 治療剤および診断剤の選択的送達のためのｅｎｄｏ１８０を標的とする粒子
RU2530553C2 (ru) * 2012-11-07 2014-10-10 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) Рекомбинантное однодоменное антитело, способное специфически связывать фактор некроза опухолей человека, и его производные
CA3252097A1 (en) 2016-02-05 2026-03-02 The University Of Copenhagen ANTIBODY-DRUG CONJUGATES TARGETING uPARAP

Also Published As

Publication number Publication date
SI3895736T1 (sl) 2023-07-31
US20190046658A1 (en) 2019-02-14
RS64219B1 (sr) 2023-06-30
AU2017215869B2 (en) 2024-02-01
KR20260021643A (ko) 2026-02-13
HK1258338A1 (en) 2019-11-08
CA3013677C (en) 2025-09-23
JP2022064906A (ja) 2022-04-26
US10940213B2 (en) 2021-03-09
RU2018125309A (ru) 2020-03-06
HUE054938T2 (hu) 2021-10-28
JP7304595B2 (ja) 2023-07-07
US20240131179A1 (en) 2024-04-25
HUE061880T2 (hu) 2023-08-28
KR20180105155A (ko) 2018-09-27
JP2019511205A (ja) 2019-04-25
EP3411076A1 (en) 2018-12-12
US11819552B2 (en) 2023-11-21
ES2874668T3 (es) 2021-11-05
CN108883197A (zh) 2018-11-23
PT3895736T (pt) 2023-06-02
PL3895736T3 (pl) 2023-07-24
EP3895736A1 (en) 2021-10-20
BR112018015448A2 (en) 2018-12-18
PL3411076T3 (pl) 2021-11-02
AU2017215869A1 (en) 2018-07-19
HRP20211152T1 (hr) 2021-10-15
EP3895736B1 (en) 2023-04-19
CA3252097A1 (en) 2026-03-02
RU2018125309A3 (sr) 2020-04-27
JP7125059B2 (ja) 2022-08-24
RU2740311C2 (ru) 2021-01-13
SI3411076T1 (sl) 2021-09-30
HRP20230505T1 (hr) 2023-08-04
LT3895736T (lt) 2023-06-12
ES2946073T3 (es) 2023-07-12
CY1126032T1 (el) 2023-11-15
DK3895736T3 (da) 2023-07-24
MX2022014231A (es) 2022-12-07
DK3895736T5 (da) 2024-06-10
US20210162062A1 (en) 2021-06-03
KR102904012B1 (ko) 2025-12-26
CN108883197B (zh) 2022-05-10
CY1124280T1 (el) 2022-07-22
FI3895736T3 (fi) 2023-06-26
CA3013677A1 (en) 2017-08-10
WO2017133745A1 (en) 2017-08-10
DK3411076T3 (da) 2021-07-26
SMT202100386T1 (it) 2021-09-14
US20240226317A9 (en) 2024-07-11
PT3411076T (pt) 2021-06-17
MX2018009461A (es) 2018-12-11
LT3411076T (lt) 2021-07-26
EP3411076B1 (en) 2021-04-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11819552B2 (en) Antibody-drug conjugates targeting uPARAP
CN111201038A (zh) Psgl-1拮抗剂及其用途
ES3005158T3 (en) Anti-cd46 antibodies and methods of use
JP7719799B2 (ja) 抗ガレクチン－９抗体およびその使用
JP2025527535A (ja) 抗ｃｃｒ８抗体およびその使用
US20220363776A1 (en) Methods and pharmaceutical composition for the treatment of ovarian cancer, breast cancer or pancreatic cancer
US20220213187A1 (en) Compositions and methods related to xct antibodies
HK40059962A (en) Antibody-drug conjugates targeting uparap
HK40059962B (en) Antibody-drug conjugates targeting uparap
TW202135861A (zh) 藉由靶向igsf8以治療自體免疫疾病及癌症之組合物及方法
HK1258338B (en) Antibody-drug conjugates targeting uparap
JP2025524650A (ja) 改変抗ガレクチン－９抗体およびその使用
WO2026050587A1 (en) Novel anti-nectin-4 antibodies, conjugated biological molecules, pharmaceutical compositions and uses thereof
HK40120080A (zh) 经修饰的抗半乳凝素-9抗体及其用途
CN120225559A (zh) 新型抗itgb8抗体及其用途