RS62129B1 - Kompozicije i postupci za sintezu rnk molekula sa 5’-kapom - Google Patents

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Predmetni prikaz obezbeđuje postupke i kompozicije za sintezu RNK molekula sa 5’ kapom. Konkretno, prikaz obezbeđuje inicijacione oligonukleotidne prajmere koji sadrže Cap kapu i koji imaju prirodne ili modifikovane 5’-Cap 0, Cap 1, Cap 2 ili trimetilguanozin-Cap (TMG-Cap) strukture. Prikaz takođe obezbeđuje postupke za efikasno generisanje i korišćenje ovih prajmera za pripremu RNK molekula sa 5’-kapom.

OSNOV PRONALASKA

[0002] Opis koji sledi je obezbeđen kako bi doprineo razumevanju čitalaca. Ni jedna od obezbeđenih informacija ili citiranih referenci ne smatra se stanjem tehnike u predmetnom pronalasku.

[0003] Informaciona RNK (mRNK), koja kodira fiziološki važne proteine za terapeutske primene, pokazala je značajne prednosti u odnosu na plazmidne i virusne vektore na bazi DNK, kad je u pitanju isporučivanje genetskog materijala. Najvažnije od ovih prednosti su:

(i) visok nivo bezbednosti (smanjuje potencijalna oštećenja genoma usled integracije virusa ili plazmida),

(ii) isporučivanje mRNK dovodi odmah do ekspresije proteina (za razliku od odloženih odgovora do kojih u principu dolazi sa plazmidima),

(iii) isporučivanje mRNK omogućava robustnu dozno-zavisnu kontrolu ekspresije proteina i

(iv) jednostavnost sinteze molekula mRNK u velikim količinama u poređenju sa proizvodnjom plazmidnih i virusnih vektora.

[0004] Informacione RNK mogu da predstavljaju kod za praktično bilo koji poznati protein i mogu da se isporučuju u specifična tkiva i organe putem niza različitih postupaka koji su poznati stručnjacima u oblasti. Kada su isporučene, ove mRNK usmeravaju ekspresiju ribozomskih proteina u ciljnim tkivima, što dovodi do proizvodnje stotina i stotina proteina po molekulu mRNK.

[0005] Nekoliko strukturnih elemenata, koji su prisutni u svakom aktivnom molekulu mRNK, koriste se za efikasnu translaciju kodiranih proteina. Jedan od ovih elemenata je Cap struktura na 5’-kraju molekula mRNK, koja je prisutna u svim eukariotskim organizmima (i nekim virusima).

Cap strukture koje se javljaju u prirodi obuhvataju ribo-guanozinski ostatak koji je metilovan na poziciji N7 guaninske baze. Ovaj 7-metilguanozin (<7m>G) je povezan tifosfatnog lanca u 5’ ka 5’ smeru, na 5’-kraju mRNK molekula. U celoj ovoj patentnoj prijavi, 7m i m7 se koriste naizmenično i sa ekvivalentnim značenjem. Prisustvo<7m>Gppp fragmenta na 5’-kraju je od suštinskog značaja za sazrevanje mRNK, jer on:

štiti mRNK molekule od degradacije egzonukleazama,

olakšava transport mRNK molekula iz nuklusa u citoplazmu i

igra ključnu ulogu u sklapanju kompleksa za inicijaciju translacije (Cell 9:645-653, (1976); Nature 266:235, (1977); Federation of Experimental Biologists Society Letter 96:1-11, (1978); Cell 40:223-24, (1985); Prog. Nuc. Acid Res. 35:173-207, (1988); Ann. Rev. Biochem. 68:913-963, (1999); J. Biol. Chem.274:30337-3040, (1999)).

[0006] Samo oni mRNK molekuli koji nose Cap strukturu, aktivni su u Cap-zavisnoj translaciji; "dekapizacija" mRNK molekula dovodi do skoro potpunog gubitka njihove aktivnosti kao matrice za sintezu proteina (Nature, 255:33-37, (1975); J. Biol. Chem., vol. 253:5228-5231, (1978); i Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72:1189-1193, (1975)).

[0007] Još jedan element kod eukariotske mRNK je prisustvo 2’-O-metil nukleozidnih ostataka na poziciji 1 (Cap 1) u transkriptu, i, u nekim slučajevima, na pozicijama 1 i 2 (Cap 2) u transkriptu. 2’-O-metilacija mRNK je neophodna za veću efikasnost translacije mRNK in vivo (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:3952-3956 (1980)) i dodatno poboljšava nukleaznu stabilnost mRNK sa 5’-kapom. mRNK sa kapom Cap 1 (i Cap 2) je prepoznatljiva oznaka koja omogućava ćelijama da prepoznaju 5’ kraj verne mRNK, i, u nekim slučajevima, da naprave razliku u odnosu transkripte koji potiču od infektivnih genetskih elemenata (Nucleic Acid Research 43: 482-492 (2015)).

[0008] Primarni mRNK transkript nosi 5’-trifosfatnu grupu (5’-pppmRNK) koja je rezultat inicijacije sinteze RNK koja in vivo počinje sa NTP molekulom (tipično GTP). Konverzija 5’-trifosforilisanog kraja mRNK transkripta u Cap strukturu (Cap 0) odvija se kroz nekoliko enzimskih koraka (J. Biol. Chem. 250:9322, (1975); J. Biol. Chem. 271:11936, (1996); J. Biol. Chem. 267:16430, (1992)). Ovi koraci koji predstavljaju enzimske reakcije uključuju:

Korak 1: RNK trifosfataza prevodi 5’-trifosfat u mRNK u 5’-difosfat, pppN1(pN)x→ppN1(pN)x+ neorganski fosfat;

Korak 2: RNK guaniltransferaza koristi GTP kako bi prebacila GMP ostatak na 5’-difosfat u mRNK, ppN1(pN)x+GTP→G(5’)ppp(5’)N1(pN)x+ neorganski pirofosfat; i Korak 3: guanin-7-metiltransferaza koristi S-adenozil-metionin (AdoMet) kao kofaktor i prebacuje metil grupu sa AdoMet na 7-azot guaninske baze, G(5’)ppp(5’)N1(pN)x AdoMet → 7mG(5’)ppp(5’)N1(pN)x AdoUgljov.).

[0009] RNK koja nastaje usled ovih enzimskih aktivnosti označava se kao "RNK sa 5’-kapom" ili "RNK sa kapom", a kombinacija enzima koji su uključeni u ovaj proces koji dovodi do obrazovanja "RNK sa kapom", označavaju se kao "enzimi za obrazovanje kape". Enzimi za obrazovanje kape, uključujući klonirane oblike ovih enzima, identifikovani su i prečišćeni iz brojnih izvora i dobro su poznati u stanju tehnike (Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 66:1-40, (2001); Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 50:101-129, (1995); i Microbiol. Rev. 44:175, (1980)). RNK sa kapom koja nastaje dodavanjem nukleotida kape na 5’-kraju primarne RNK, od strane enzima za dodavanje kape, označava se kao RNK sa kapom koja ima "Cap 0 strukturu" (J. Biol. Chem. 269:14974-14981, (1994); J. Biol. Chem. 271:11936-11944, (1996)). Enzimi za dodavanje kape koriste se za in vitro sintezu RNK sa kapom koja ima Cap 0 strukturu (J. Biol. Chem. 255:11588, (1980); Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:9573, (1997); J. Biol. Chem.

267:16430, (1992); J. Biol. Chem.269:14974, (1994); i J. Biol. Chem.271:11936, (1996)).

[0010] RNK sa kapom koja ima 5’-Cap 0 strukturu dalje može da se transformiše in vivo u "Cap 1" strukturu delovanjem (nukleozid-2’-O-) metiltransferaze (J. Biol. Chem. 269:14974-14981, (1994); J. Biol. Chem. 271:11936-11944, (1996); i EMBO 21:2757-2768, (2002)). Na primer, mRNK (nukleozid-2’-O) metiltransferaza iz vakcinije može da katalizuje metilaciju 2’-hidroksilne grupe 5’-pretposlednjeg nukleotida 5’-RNK sa kapom, koja ima Cap 0 strukturu, sledećom reakcijom:

[0011] Navodi se da se dimetilovane RNK sa sa kapom koje imaju Cap 1 strukturu prevode efikasnije od RNK sa kapom koje imaju Cap 0 strukturu (Nucleic Acids Res.26: 3208, (1998)). Eukariotske ćelije koriste drugu (nukleozid-2'-O) metiltransferazu (na primer hMTR2 u ljudskim ćelijama (Nucleic Acids Res. 39: 4756 (2011)) da katalizuju metilaciju 2'-hidroksilne grupe drugog transkribovanog nukleotida od 5 ' -kapirana RNK da konvertuje Cap 1 strukturu u Cap 2 strukturu sledećom reakcijom:

[0012] Da bi se proizveli dugački funkcionalni RNK molekuli za različite biološke studije, sredinom 1980-ih je razvijen postupak za in vitro enzimsku sintezu primarne RNK (Methods Enzymol. 180:51-62, (1989); Nucl. Acids Res., 10:6353-6362, (1982); Meth. Enzymol., 180:4250 (1989); Nucl. Acids Res., 12:7035-7056, (1984) i Nucleic Acid Research 15: 8783-8798, (1987)).

[0013] Nakon in vitro transkripcije, na primarnom mRNK transkriptu koji nosi 5’-trifosfatnu grupu može dodatno da se obrazuje kapa pomoću enzima za obrazovanje kape. Međutim, in vitro enzimatsko obrazovanje 5’-kape je skupo, naporno, neefikasno i teško se kontroliše.

[0014] Imajući u vidu ove nedostatke, razvijen je drugi postupak za in vitro sintezu mRNK sa kapom, gde se hemijski sintetisan dinukleotid<7m>G(5’)ppp(5’)G (koji se označava i kao mCAP) koristi za inicijaciju transkripcije (RNA 1: 957-967, (1995)). mCAP dinukleotid sadrži 5’-Cap 0 strukturu zrele mRNK ali nema 2’-O-metil nukleozide karakteristične za Cap 1 i Cap 2 strukture.

[0015] Međutim, postoje dva glavna nedostatka koja se pripisuju inicijaciji in vitro transkripcije kada se koristi sintetski mCAP dinukleotid. Prvi je izražena kompeticija mCAP i pppG za inicijaciju sinteze mRNK. Kada se mRNK inicira pomoći pppG dobijena ppp-mRNK je neaktivna u translaciji i imunogena, usled prisustva 5’- trifosfata. U skladu sa tim, kada se mRNK inicira sa mCAP dobijena mRNK sa 5’-kapom je aktivna prilikom translacije i nije u tolikoj meri imunogena.

[0016] Kako bi se poboljšao udeo mRNK molekula sa 5’-kapom u odnosu na molekule bez 5’-kape (ili 5’-trifosforilisane; pppmRNK), neophodno je da se koristi višak<7m>GpppG u odnosu na pppG (od 4:1 do 10:1) kako bi se pospešila proizvodnja mRNK transkripata sa 5’-Cap strukturom (do 80-90%). Negativna strana ovog pristupa je značajno smanjenje ukupnog prinosa mRNK usled brzog smanjenja zaliha GTP molekula tokom transkripcije i potrebe za velikim količinama sintetskog mCAP dimera koji može da bude skup. Posle transkripcije je neophodna dodatna obrade sirove smeše, koja sadrži i mRNK sa 5’- kapom, kao i mRNK i 5’-pppmRNK sa kapom, alkalnom fosfatazom, da bi se iz pppmRNK uklonile 5’-trifosfatne grupe bez kape, kako bi se smanjila imunogenost sintetisane mRNK. 5’-OH oblik mRNK bez kape, koji se dobija nakon obrade fosfatazom, neaktivan je i ne učestvuje u procesu translacije.

[0017] Drugi nedostatak, dvosmerna inicijacija, može da nastane kada se koristi nesimetrični mCAP dinukleotid. Postoji tendencija 3’-hidroksilne grupe, bilo G, bilo 7mG komponente

<7m>GpppG, da služi, sa približno istom verovatnoćom, kao tačka inicijacije za elongaciju transkripcije. Ona uobičajeno dovodi do sinteze dva izomerna RNK molekula oblika

<7m>G(5’)pppG(pN)n i G(5’)ppp7mG(pN)n, u približno jednakom udelu, u zavisnosti od uslova reakcije transkripcije (RNA 1: 957-967, (1995)).

[0018] Kako bi se eliminisala dvosmerna inicijacija sinteze mRNK sa mCAP dinukleotidom, razvijen je novi modifikovani mCAP analog u kome je 3’-OH grupa 7mG ostatka zamenjena sa OCH3 ("OMe") :<7m>G(3’-O-Me)pppG (poznat i kao anti-reverzni analog kape (ARCA)). ARCA inicira sintezu mRNK samo u korektnoj nizvodnoj orijentaciji (RNK 7:1486-1495 (2001)). U stanju tehnike je poznato nekoliko ARCA analoga (videti, na primer, SAD patent br.7,074,596). Međutim, veliki molski višak ARCA u odnosu na pppG i dalje je neophodan kako bi se osiguralo da molekuli mRNK transkripta imaju 5’-Cap strukturu. Dodatni nedostatak je to što mRNK sa Cap 1 strukturom ne može da se sintetiše pomoću<7m>GpppG<2’-OMe>Cap dimera (RNA 1: 957, (1995)) ili njegovog ARCA analoga.

[0019] U ovom trenutku, poznati putevi za proizvodnju aktivnih dugačkih mRNK molekula koji sadrže Cap 1 strukturu, sastoje se od enzimskog obrazovanja kape i enzimske 2’ O-metilacije 5’-trifosforilisanog mRNK transkripta ili enzimske 2’-O-metilacije mRNK prekursora sa omCAP-kapom i ARCA-kapom (Nucleosides, Nucleotides, and Nucleic Acids, 25:337-340, (2006) i Nucleosides, Nucleotides, i Nucleic Acids 25(3):307-14, (2006)). Oba pristupa su prilično naporna, teška za kontrolu, čak i uz značajnu optimizaciju, nijedan od njih ne može da garantuje visok prinos metilovanog mRNK prekursora sa kapom (J. Gen. Virol, 91:112-121, (2010)). Osim toga, postupci za pripremu mRNK molekula sa Cap 2 strukturom su čak i teži, i rezultati su manje predvidivi. Enzimi za konverziju Cap 1 u Cap 2 u ovom trenutku nisu komercijalno dostupni.

[0020] Još jedna značajna komplikacija in vitro sinteze mRNK, posebno u velikoj proizvodnji, je neophodnost izolovanja i prečišćavanja aktivnih molekula mRNK koji nose Cap iz svih neograničenih mRNK oblika koji su neaktivni i u nekim slučajevima imunogeni. Na žalost, ove metode nisu trivijalne i često zahtevaju sintezu modifikovanih mCAP analoga sa konjugovanim delovima afiniteta koji omogućavaju lakšu izolaciju i prečišćavanje RNK transkripta sa kapom. Postupci sinteze analoga mCAP sa afinitetnim oznakama kao reporter/afinitetnim delom i novi protokoli za izolaciju RNK sa kapom iz reakcione smeše transkripcije poznati su u struci (videti, na primer, SAD patent 8,344,118). Iako su ovi pristupi efikasni, zahtevaju upotrebu skupljih mCAP analoga i omogućavaju pripremu i izolaciju mRNK koje sadrže samo Cap 0 strukturu.

[0021] In vitro sinteza prirodnih i modifikovanih RNK pronalazi upotrebu u različitim primenama, uključujući ribozim, antisense, biofizičke i biohemijske studije. Pored toga, mRNK transkripti sa kapom se koriste za aplikacije koje zahtevaju sintezu proteina, kao što su eksperimenti in vivo ekspresije (koristeći mikroinjekciju, transfekciju i infekciju), eksperimenti i testovi za prevođenje in vitro, kao i razne primene u terapiji, dijagnostici, razvoju vakcina, obeležavanju i detekciji.

[0022] WO 2008/016473 A2 prikazuje analoge sa kapom koji su metilovani na N7 poziciji jednog ili oba guanozina dinukleotidne kape, kao i na 3’ poziciji prstena riboze. Supstitucione grupe na prstenu riboze dovode do inkorporacije kape u nizvodnoj orijentaciji. WO 2008/016473 A2 takođe obezbeđuje postupke za pripremanje analoga sa kapom, a razmatraju se i postupci za upotrebu mRNK vrsta koje sadrže ovakve analoge.

[0023] WO 2009/058911 A2 se tiče sinteze RNK sa kapom/oznakom i postupcima za upotrebu.

[0024] Thillier et al. ("Synthesis of 5’ cap-0 and cap-1 RNAs using solid-phase chemistry coupled with enzymatic methylation by human (guanin-N7)-methyl transferase", RNA, vol. 18, no. 4, strane 856-868) opisuju kako su kombinovali postupak hemijske sinteze i test enzimske metilacije, da bi proizveli RNK oligonukleotide koji nose cap-0 ili cap-1. Kratki RNK molekuli su sintetisani na čvrstoj podlozi putem fosforilacije terminalne 5’-OH i aktivacije imidazolom. Nakon deprotekcije i oslobađanja sa podloge, GpppN-RNK molekuli ili GpppN2’-Om-RNK molekuli su prečišćeni pre nego što je N<7>-metil grupa dodata enzimskim sredstvima, koristeći ljudsku (guanin-N<7>)-metil transferazu kako bi dala 7mGpppN-RNK molekule (cap-0) ili 7mGpppN2’-Om-RNK molekule (cap-1). RNK molekuli koji nose različite cap strukture (cap, cap-0 ili cap-1) deluju kao verni supstrati koji podražavaju ćelijske RNK sa kapama i mogu da se koriste za biohemijske i strukturne studije.

[0025] Sawai et al. ("Sythesis and Reactions of Nucleoside 5’-Diphospahte Imidazolide. A Nonenzymatic Capping Agent for 5’-Monophosphorylated Oligoribonucleotides in Aqueous Solution", Journal of Organic Chemistry, vol. 64, no. 16, strane 5836-5840) opisuju sintezu adenozin i 7-metilguanozin 5’-difosfat imidazolida od imidazola i odgovarajućih nukleozid 5-difosfata. Sawai et al. objašnjavaju da je fosforimidazolidna veza u jedinjenjima podložna hidrolizi i da se postepeno hidrolizuje u neutralnom vodenom rastvoru, ali da je stabiljnija od veze odgovarajućeg imidazolida u nukleozid 5’-monofosfatu. Metilguanozin 5’-difosfat imidazolid reaguje sa guanozin 5’-monofosfatom ili 5’-monofosforilisanim oligoribonukleotidima u neutralnom vodenom rastvoru u prisustvu Mn<2+>jonskog katalizatora konvertujući deo mRNK sa kapom ili m7Gppp-oligoribonukleotide sa kapom. Reakcija kondenzacije adenozin 5’-difosfat imidazolida sa adenozin 5’-monofosfatom na sličan način, u neutralnom vodenom rastvoru pomoću jonskog divalentnog metalnog katalizatora kao što je Mg<2+>ili Mn<2+>, dajući diadenozin 5’,5’-trifosfat.

[0026] Koukhareva et al. ("Chemical Route to the Capped RNAs", Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids, vol. 23, no. 10, strane 1667-1680) beleže konvencionalni hemijski pristup pripremanju miligramskih količina kratkih RNK oligonukleotida sa kapom. Postupak se bazira na upotrebi reaktivnog prekursora, m7GppQ [P1-7-metilguanozin-5’-O-il, P2-O-8-(5-hlorohinolil) pirofosfat]. Prekursor reaguje sa 5’-fosforilisanom neprtektovanom kratkom RNK u prisustvu CuCl2 u organskom medijumu. Koukhareva et al. prikazuju ostvarljivost pristupa sa sintezom pentaribonukleotida m7GpppGpApCpU sa kapom.

[0027] Shodno tome, u industriji postoji potreba za kompozicijama i metodama koje omogućavaju sintezu mRNK velikih razmera koje su (a) manje radne od konvencionalnih metoda, (b) eliminišu ili smanjuju dvosmerno pokretanje tokom transkripcije, (c) rezultiraju veći prinosi mRNK, uz (d) smanjeni trošak u poređenju sa trenutnim metodama, (e) smanjuju proizvodnju heterogenih proizvoda sa različitim 5'-sekvencama i (f) ne zahtevaju dodatne enzimske reakcije da bi se ugradile Cap 1 i Cap 2 strukture u sintetisana mRNK. Takođe postoji potreba za sintezom različitih mRNK koje sadrže modifikovane i/ili ne-prirodne nukleozide, koji nose specifične modifikacije i/ili oznake afiniteta poput fluorescentnih boja, radioizotopa, masene oznake i/ili jednog partnera molekularnog vezujućeg para kao što je npr. biotin na ili blizu 5 'kraja molekula.

KRATAK PREGLED PRONALASKA

[0028] U ovom dokumentu su obezbeđeni RNK molekuli sa 5’- kapom. U jednom aspektu predmetnog pronalaska, obezbeđen je kompleks koji sadrži inicijacioni oligonukleotidni prajmer sa kapom i DNK matricu, pri čemu inicijacioni oligonukleotidni prajmer sa kapom obuhvata sledeću strukturu:

pri čemu

B1 i B2 su nezavisno prirodne, modifikovane ili ne-prirodne nukleozidne baze,

R1 i R2 su nezavisno OH ili O-metil; i

R3 je OH ili OMe,

pri čemu DNK matrica sadrži promotorski region koji obuhvata mesto otpočinjanja transkripcije koje ima prvi nukleotid na nukleotidnoj poziciji 1 i drugi nukleotid na nukleotidnoj poziciji 2; i

gde je B1 potpuno komplementaran nukleozidnoj bazi na nukleotidno kiselinskoj matrici na poziciji 1 transkripcione matrice i B2 hibridizuje sa nukleotidom na poziciji 2.

[0029] U drugom aspektu predmetnog pronalaska, obezbeđen je kompleks koji sadrži inicijacioni oligonukleotidni prajmer sa kapom i DNK matricu, pri čemu inicijacioni oligonukleotidni prajmer sa kapom obuhvata strukturu:

pri čemu

B1, B2 i B3 su nezavisno prirodne, modifikovane ili ne-prirodne nukleozidne baze, R1, R2, R3 i R4 su nezavisno OH ili O-metil; i

pri čemu DNK matrica sadrži promotorski region koji obuhvata mesto otpočinjanja transkripcije koje ima prvi nukleotid na nukleotidnoj poziciji 1, drugi nukleotid na nukleotidnoj poziciji 2 i treći nukleotid na nukleotidnoj poziciji 3;

i

gde je B1 potpuno komplementarna nukleozidnoj bazi na nukleotidno kiselinskoj matrici na poziciji 1 transkripcione matrice, B2 hibridizuje sa nukleotidom na poziciji 2, a B3 hibridizuje sa nukleotidom na poziciji 3.

[0030] Takođe su obezbeđeni postupci za sintezu RNK molekula koji sadrže kapu koja sadrži inicijacioni nukleotidni prajmer Formule I u smeši koja sadrži polinuklotidnu matricu i RNK polimerazu pod uslovima u kojima je moguće sprovođenje transkripcije polinuklotidne matrice pomoću RNK polimeraze, i nakon toga, inkubacije dobijene smeše tokom vremena dovoljnog da omogući transkripciu navedene matrice.

KRATAK OPIS SLIKA

[0031]

Slika 1 prikazuje primer postupka za pripremanje 7-metilguanozin 5-difosfata (pp<7m>G) od guanozin 5’-difosfata;

Slika 2 prikazuje primer postupka za pripremanje 7-metilguanozin 5’-difosfat imidazolida (Im-pp<7m>G) od pp<7m>G;

Slika 3 prikazuje primer postupka za pripremanje 3’-O-metilguanozin 5’-fosfata (pG3’Ome) od 3’-O-metilguanozina;

Slike 4 prikazuju primer postupka za pripremanje 3’-O-metilguanozin 5’-fosforimidazolida (Im-pG3’Ome) od pG3’Ome;

Slika 5 prikazuje primer postupka za pripremanje 3’-O-metilguanozin 5’-difosfata (ppG3’Ome od ImpG3’Ome,

Slika 6 prikazuju primer postupka za pripremanje 7-metil-3’-O-metilguanozin 5-difosfata (pp7mG3’Ome) od ppG3’Ome,

Slika 7 prikazuju primer postupka za pripremanje 7-metil-3’-O-metilguanozin 5-difosfat imidazolida (Impp<7m>G3’ Ome) od pp<7m>G3’Ome;

Slika 8 prikazuje uopštenu proceduru za pripremanje pN2’-OR1pN oligonukleotida (R1 = H ili Me);

Slika 9 prikazuje uopštenu proceduru za sintezu inicijacionih oligonukleotida sa Cap 0, Cap 1 ili Cap 2 strukturama;

Slika 10A prikazuje strukturu inicijacionih oligonukleotidnih prajmera sa kapom koji se koriste u primerima prema Formuli I, pri čemu: B1 je guanin; M je 0; L je 1; q1 do q9 su 0; R1 je H; R2 je H; R3 je O-metil; X1 je O; X2 je O; X13 je O; Y13 je OH; Z0 je O; Z1 je O; Z2 je O; Z22 je O;

Slika 10B prikazuje strukturu inicijacionih oligonukleotidnih prajmera sa kapom koji se koriste u primerima prema Formuli I, pri čemu: B1 je guanin; B10 je guanin; M je 0; L je 1; q1 je 1; q2 do q9 su 0; R1 je H; R2 je H; R3 je H; X1 je O; X2 je 0; X4 je O; X13 je O; Y1 je OH; Y2 je OH; Y4 je OH; Y13 je OH; Z0 je O; Z1 je 0; Z2 je 0; Z4 je O; Z5 je 0; Z22 je O; R4 je O-metil;

Slika 10C prikazuje strukturu inicijacionih oligonukleotidnih prajmera sa kapom koji se koriste u primerima prema Formuli I, pri čemu: B1 je guanin; B10 je guanin; M je 0; L je

1

1; q1 je 1; q2 do q9 su 0; R1 je H; R2 je H; R3 je O-metil; X1 je O; X2 je O; X4 je 0; X13 je 0; Y1 je OH; Y2 je OH; Y4 je OH; Y13 je OH; Z0 je O, Z1 je O; Z2 je 0; Z4 je O; Z5 je O; Z22 je 0; R4 je O metil;

Slika 10D prikazuje strukturu inicijacionih oligonukleotidnih prajmera sa kapom koji se koriste u primerima prema Formuli I, pri čemu: B1 je adenin; B10 je guanin; M je 0; L je 1; q1 je 1; q2 do q9 su 0; R1 je H; R2 je H; R3 je H; X1 je O; X2 je O; X4 je 0; X13 je O; Y1 je OH; Y2 je OH; Y4 je OH; Y13 je OH; Z0 je O; Z1 je 0; Z2 je 0; Z4 je O; Z5 je 0; Z22 je O; R4 je O-metil;

Slika 10E prikazuje strukturu inicijacionih oligonukleotidnih prajmera sa kapom koji se koriste u primerima prema Formuli I, pri čemu: B1 je adenin; B10 je guanin; M je 0; L je 1; q1 je 1; q2 do q9 su 0; R1 je H; R2 je H; R3 je O-metil; X1 je 0; X2 je O; X4 je 0; X13 je 0; Y1 je OH; Y2 je OH; Y4 je OH; Y13 je OH; Z0 je O; Z1 je O; Z2 je 0; Z4 je O; Z5 je O; Z22 je 0; R4 je O-metil;

Slika 10F prikazuje strukturu inicijacionih oligonukleotidnih prajmera sa kapom koji se koriste u primerima prema Formuli I, pri čemu: B1 je citozin; B10 je guanin; M je 0 L je 1; q1 je 1; q2 do q9 su 0; R1 je H; R2 je H; R3 je H; X1 je O; X2 je O; X4 je O; X13 je O; Y1 je OH; Y2 je OH; Y4 je OH; Y13 je OH; Z0 je O; Z1 je 0; Z2 je 0; Z4 je O; Z5 je 0; Z22 je O; R4 je O-metil;

Slika 10G prikazuje strukturu inicijacionih oligonukleotidnih prajmera sa kapom koji se koriste u primerima prema Formuli I, pri čemu: B1 je citozin; B10 je guanin; M je 0; L je 1; q1 je 1; q2 do q9 su 0; R1 je H; R2 je H; R3 je O-metil; X1 je 0; X2 je O; X4 je 0; X13 je 0; Y1 je OH; Y2 je OH; Y4 je OH; Y13 je OH; Z0 je 0; Z1 je O; Z2 je 0; Z4 je O; Z5 je O; Z22 je 0; R4 je O-metil;

Slika 10H prikazuje strukturu inicijacionih oligonukleotidnih prajmera sa kapom koji se koriste u primerima prema Formuli I, pri čemu: B1 je adenin; B2 je guanin; B10 je guanin; M je 0; L je 1; q1 je 1; q2 je 1; q3 do q9 su 0; R1 je H; R2 je H; R3 je O-metil; X1 je O; X2 je O; X4 je O; X5 je O; X13 je O; Y1 je OH; Y2 je OH; Y4 je OH; Y5 je OH; Y13 je OH; Z0 je 0; Z1 je 0; Z2 je O; Z4 je 0; Z5 je O; Z6 je O; Z22 je 0; R4 je O-metil; R5 je O-metil;

Slika 11 prikazuje luciferaznu aktivnost mRNK molekula kojima je kontranskripciono dodata kapa;

Slike 12A-12H zbirno prikazuju efikasnost dodavanja kape na mRNK molekule kojima se kapa dodaje kotranskripciono pomoću 12A) ARCA, 12B)<m7>GpppG2’OmepG, 12C) m7G3’OmepppG2’OmepG, 12D)<m7>GpppA2’OmepG, 12E)<m7>G3’OmepppA2’-OMepG, 12F)

<m7>GpppC2’OmepG, 12G)<m7>G3’OmepppC2’OmepG, 12H)<m7>G3’OmepppA2’OmepG2’OmepG. Efikasnost dodavanja kape na Slikama 11B-11G je jednaka ili značajno nadmašuje efikasnost koja se zapaža na Slici 11A; i

Slike 13A-13D zbirno prikazuju efikasnost dodavanja kape i vernost inicijacije mRNK molekula kojima se kapa dodaje kotranskripciono pomoću<m7>GpppA2’OmepG na transkripcionoj matrici, pri čemu Slika 13A ilustruje upotrebu 2’-deoksitimidinskih i 2’-deoksicitidinskih ostataka na 1 i 2 pozicijama matrice, koristeći prajmer/NTP formulaciju 2; Slika 13B ilustruje upotrebu 2’-deoksitimidinskih i 2’-deoksicitidinskih ostataka na 1 i 2 pozicijama matrice, koristeći prajmer/NTP formulaciju 3; Slika 13C ilustruje upotrebu 2’-deoksicitidinskih ostataka na 1 i 2 pozicijama matrice, koristeći prajmer/NTP formulaciju 2; i Slika 13D ilustruje upotrebu 2’-deoksicitidinskih ostataka na 1 i 2 pozicijama matrice, koristeći prajmer/NTP formulaciju 3.

Slike 14A i 14B zbirno prikazuju poređenje translacije u diferenciranim THP-1 ćelijama za mRNK koja je napravljena pomoću<m7>GpppA2’OmepG inicijacionog oligonukleotida sa kapom na transkripcionoj matrici sa 2’-deoksitimidinskim i 2’-deoksicitidinskim ostacima na 1 i 2 pozicijama matrice u poređenju sa transkripcionom matricom sa citidinskim ostacima na 1 i 2 pozicijama matrice.

DETALJAN OPIS

[0032] Osim ako nije drugačije definisano, svi izrazi koji se ovde koriste imaju isto značenje koje uobičajeno imaju za stručnjaka u oblasti kojoj pronalazak pripada. U slučaju da za neki izraz koji je prisutan u ovom dokumentu postoji više definicija, važiće definicije date u ovom odeljku.

[0033] Kako se ovde koristi u vezi sa brojčanim vrednostima, izraz "približno" ili "oko" označava plus ili minus 30% od naznačene vrednosti, uključujući sve vrednosti unutar definisanog opsega, kao i navedene vrednosti.

[0034] Kako se ovde koristi, izrazi „nukleinska kiselina“, „nukleotidna sekvenca“ ili „sekvenca nukleinske kiseline“ odnose se na oligonukleotid, polinukleotid ili bilo koji njihov fragment, bilo koji derivat ribo ili deoksiribo i na prirodne ili sintetičke molekule koji sadrže prirodne i/ili modifikovani nukleotidni ostaci i internukleotidne veze. Ovi izrazi se takođe odnose na DNK ili RNK prirodnog (npr. genomskog) ili sintetičkog porekla koje mogu biti jednolančane, dvolančane, trolančane ili četvorolančane i mogu predstavljati smisao ili antisenski lanac ili bilo koju DNK -nalik ili RNK-materijal. „RNK ekvivalent“, u odnosu na DNK sekvencu, sastoji se od iste linearne sekvence nukleotida kao i referentna DNK sekvenca, s tim što su sve ili većina pojava azotne baze timina zamenjene uracilom, a okosnica šećera je sastavljen od riboze umesto 2'-deoksiriboze. Dodatne alternativne okosnice nukleinske kiseline pogodne za ovde date metode i kompozicije uključuju, ali se ne ograničavaju na fosforotioat, fosforoselenoat, alkilfosfotriestar, aril-fosfotriestar, alkil-fosfonat, aril-fosfonat, fosfoboronat, morfolino-nukleinska kiselina (MNA), zaključana nukleinska kiselina (LNA), peptidne nukleinske kiseline (PNA).

[0035] Kako se ovde koristi, izraz "prajmer" ili "oligonukleotidni prajmer" odnosi se na ribo- ili deoksiribo- ili himerni ribo/deoksiribo- oligonukleotid, jednolančani, koji može da se javlja u prirodi ili je sintetički i obično uključuje sekvencu od između oko 2 do oko 10 nukleotida, oko 3 do oko 8 nukleotida ili oko 3 do oko 5 nukleotida. Oligonukleotidni prajmeri mogu da sadrže jednu ili više modifikacionih grupa. Oligonukleotidni prajmeri mogu da uključuju RNK, DNK, i/ili druge modifikovane nukleozide. Obučeni stručnjak u oblasti je u stanju da dizajnira i pripremi oligonukleotidne prajmere koji su pogodni za transkripciju matrične sekvence DNK.

[0036] Kako se ovde koriste, izrazi "analozi inicijacionih oligonukleotidnih prajmera sa kapom" ili "inicijacioni oligonukleotidni prajmeri sa kapom", odnose se na inicijacioni oligonukleotidni prajmer koji sadrži Cap 0, Cap 1, Cap 2 ili TMG-Cap strukturu na 5’-kraju prajmera. Prajmer sa kapom ima nemodifikovanu ili otvorenu 3’-OH grupu i podleže ekstenziji pomoću RNK polimeraze putem inkorporacije NTP molekula na 3’-kraju prajmera. On je u stanju da inicira in vitro transkripciju pod kontrolom promotora u transkripcionom sistemu koji sadrži neophodne komponente: DNK matricu (npr. DNK plazmid), RNK polimerazu, nukleozid 5’-trifosfate i pogodan pufer. "Inicijacioni prajmer" ili "inicijacioni oligonukleotidni prajmer", koji se ovde takođe koristi, odnosi se na oligonukleotid koji nosi terminalnu 3’-OH grupu koja predstavlja validni supstrat za RNK polimerazu. U nekim primerima, inicijacioni oligonukleotidni prajmer je supstrat za RNK polimerazu i njegova elongacija može da se odvija putem inkorporacije NTP molekula na 3’-kraju prajmera. Inicijacioni oligonukleotidni prajmer je komplementaran DNK matrici na mestu inicijacije.

[0037] Kako se ovde koristi, izraz "nesupstituisani" ili "nemodifikovani", u kontekstu inicijacionog oligonukleotidnog prajmera sa kapom i NTP molekula, odnosi se na inicijacione oligonukleotidne prajmere sa kapom i NTP molekule koji nisu modifikovani.

[0038] Kako se ovde koristi, izraz "modifikovani inicijacioni oligonukleotidni prajmer sa kapom" odnosi se na inicijacioni oligonukleotidni prajmer sa kapom koji sadrži jednu ili više dodatnih modifikacionih grupa.

1

[0039] Kako se ovde koristi, izraz "modifikaciona grupa" odnosi se na bilo koju hemijsku komponentu koja može da se veže za inicijacioni prajmer na lokacijama koje uključuju, ali nisu ograničene na, šećer, nukleozidnu bazu, trifosfatni most i/ili internukleotid fosfat (npr. američka patentna prijava br. 20070281308). Modifikaciona grupa inicijacionog oligonukleotidnog prajmera sa kapom može biti grupa bilo koje prirode kompatibilna sa procesom transkripcije.

[0040] Kako se ovde koristi, izraz "internukleotidna veza" odnosi se na vezu ili veze koje povezuju dva nukleozida oligonukleotidnog prajmera ili nukleinske kiseline i može da bude prirodna fosfodiestarska veza ili modifikovana veza.

[0041] Kako se ovde koristi, izraz „oznaka“ ili „oznaka za detekciju“ odnosi se na svako jedinjenje ili kombinaciju jedinjenja koja mogu biti vezana ili na neki drugi način povezana sa molekulom, tako da se molekul može detektovati etiketu direktno ili indirektno. Oznaka koja se može detektovati može biti radioizotop (npr. ugljenik, fosfor, jod, indijum, sumpor, tricijum itd.), maseni izotop (npr. H2, C13 ili N15), boja ili fluorofor (npr. cijanin, fluorescein ili kumarin), hapten (npr. biotin) ili bilo koji drugi agens koji se može direktno ili indirektno detektovati.

[0042] Kako se ovde koristi, izraz "hibridizuje" ili "specifično hibridizuje" odnosi se na postupak gde se inicijacioni oligonukleotidni prajmeri sparuju sa DNK matricom pod odgovarajućim restriktivnim uslovima tokom reakcije transkripcije. Hibridizacija sa DNK se izvodi pomoću inicijacionog oligonukleotidnog prajmera sa kapom koji je, u određenim primerima, dužine 3-10 nukleotida, uključujući 5’-5’reverznu strukturu kape. Tehnike hibridizacije nukleinske kiseline su dobro poznate u oblasti (npr., Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y.(1989); Ausubel, F.M., et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Secaucus, N.J. (1994)).

[0043] Kako se ovde koristi, izraz "komplement", "komplementaran" ili "komplementarnost" u kontekstu kompleksa inicijacionog oligonukleotidnog prajmera sa kapom i DNK matrice odnosi se na standardna Votson/Krikova pravila o uparivanju baze. Na primer, sekvenca "5’-A-G-T-C-3’" je komplementarna sekvenci "3’-T-C-A-G-5’". Određeni ne-prirodni ili sintetički nukleotidi mogu biti uključeni u ovde opisane nukleinske kiseline; tu spadaju nukleozidi, nukleotidi i nukleinske kiseline modifikovani bazom i šećerom, kao što su inozin, 7-deazaguanozin, 2'-O-metilguanozin, 2'-fluoro-2'-deoksicitidin, pseudouridin, zaključane nukleinske kiseline ( LNA) i peptidne nukleinske kiseline (PNA). Komplementarnost ne mora biti savršena; dupleksi mogu da sadrže neusklađene parove baza, degenerativne ili neuporedive nukleotide. Stručnjaci u ovoj oblasti mogu empirijski odrediti dupleks stabilnost uzimajući u obzir brojne promenljive, uključujući, na primer, dužinu oligonukleotida, bazni sastav i sekvencu oligonukleotida, učestalost neusklađenih parova baza, jonsku snagu, komponente pufera za hibridizaciju i reakcione uslove.

[0044] Komplementarnost može biti „potpuna“ ili „totalna“ tamo gde se sve nukleotidne baze dve verige nukleinske kiseline podudaraju u skladu sa priznatim pravilima uparivanja baza, može biti „delimična“ u kojoj samo neke od nukleotidnih baza inicijacionog oligonukleotidnog prajmera sa kapom i ciljna DNK podudaraju se u skladu sa priznatim pravilima uparivanja baze ili ona može biti „odsutna“ gde se nijedna od nukleotidnih baza dve niti nukleinske kiseline ne podudara u skladu sa priznatim pravilima uparivanja baza. Stepen komplementarnosti između inicijacionog oligonukleotidnog prajmera sa kapom i DNK matrice može imati značajan efekat na snagu hibridizacije između inicijacionog kapicastog oligonukleotida i DNK matrice i shodno tome na efikasnost reakcije. Izraz komplementarnost se takođe može koristiti u odnosu na pojedinačne nukleotide. Na primer, određeni nukleotid unutar oligonukleotida može se primetiti zbog njegove komplementarnosti, ili nedostatka istog, sa nukleotidom unutar drugog lanca, za razliku ili radi upoređivanja sa komplementarnošću između ostatka inicijacionog oligonukleotidnog prajmera sa kapom i lanca DNK.

[0045] Kako se ovde koristi, izraz "potpuno", "sasvim" ili "savršeno" komplementaran znači da se svaka od nukleotidnih baza inicijacionog oligonukleotidnog prajmera sa kapom i ciljna DNK tačno podudaraju u skladu sa priznatim pravilima uparivanja baze.

[0046] Kako se ovde koristi, izraz "suštinski komplementaran" odnosi se na dve sekvence koje hibridizuju pod strogim uslovima hibridizacije. Stručnjaci u tehnici će shvatiti da suštinski komplementarne sekvence ne moraju hibridizovati celom dužinom. Konkretno, suštinski komplementarne sekvence mogu sadržati susednu sekvencu baza koje se ne hibridizuju u ciljnu sekvencu i mogu biti postavljene 3 ’ili 5’ u susednu sekvencu baza koje se hibridizuju pod strogim uslovima hibridizacije sa ciljnom sekvencom.

[0047] Kako se ovde koristi, izraz "specifičan", kada se koristi u vezi sa sekvencom inicijacionog oligonukleotidnog prajmera sa kapom i njegovom sposobnošću da hibridizuje sa DNK matricom, predstavlja sekvencu koja ima najmanje 50% identičnosti sa delom DNK matrice, kada se inicijacioni oligonukleotidni prajmer sa kapom i DNK lanac poravnaju. Viši nivoi identičnosti sekvence koji mogu da budu poželjni uključuju najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 99%, i najpoželjnije, 100% identičnosti sekvence.

[0048] Kako se ovde koristi, izraz "nukleozid" obuhvata sve nukleozide koji se javljaju u prirodi, uključujući sve oblike nukleozidnih baza i furanozida koji se nalaze u prirodi. Osnovni prstenovi koji se najčešće nalaze u prirodnim nukleozidima su purinski i pirimidinski prstenovi. Purinski prstenovi koji se javljaju u prirodi uključuju, na primer, adenin, guanin i N6-metiladenin. Pirimidinski prstenovi koji se javljaju u prirodi uključuju, na primer, citozin, timin, 5-metilcitozin, pseudouracil. Nukleozidi koji se prirodno javljaju, na primer, uključuju, ali nisu

1

ograničeni na, ribo, 2’-O-metil ili 2’-deoksiribo derivate adenozina, guanozina, citidina, timidina, uridina, inozina, 7-metilguanozina ili pseudouridina.

[0049] Kako se ovde koristi, izrazi "analozi nukleozida", "modifikovani nukleozidi" ili "derivati nukleozida" uključuju sintetičke nukleozide kako su ovde opisani. Derivati nukleozida takođe uključuju nukleozide sa modifikovanim baznim ili/i šećernim delovima, sa ili bez zaštitnih grupa i uključuju, na primer, 2’-deoksi-2’-fluorouridin, 5-fluorouridin i slično. Ovde navedena jedinjenja i postupci uključuju bazne prstenove i njihove sintetičke analoge, kao i neprirodne bazne šećere supstituisane heterociklom i aciklično supstituisane bazne šećere. Ostali nukleozidni derivati koji se mogu koristiti su, na primer, LNA nukleozidi, halogeni supstituisani purini (npr. 6-fluoropurin), halogenom supstituisani pirimidini, N6-etiladenin, N4-(alkil)-citozini, 5-etilcitozin i slično (SAD patent br.6,762,298).

[0050] Kako se ovde koriste, izrazi "univerzalna baza", "degenerisana baza", "univerzalni bazni analog" i "degenerisani bazni analog" uključuju, na primer, nukleozidni analog sa veštačkom bazom koju, u nekim primerima, može da prepozna RNK polimeraza kao zamenu za jedan ili više od prirodnih NTP molekula (npr., ATP, UTP, CTP i GTP) ili drugi specifični NTP. Univerzalne baze ili degenerisane baze su prikazane u publikaciji Loakes, D., Nucleic Acids Res., 29:2437-2447 (2001); Crey-Desbiolles, C., et. al., Nucleic Acids Res., 33:1532-1543 (2005); Kincaid, K., et. al., Nucleic Acids Res., 33:2620-2628 (2005); Preparata, FP, Oliver, JS, J. Comput. Biol. 753-765 (2004); i Hill, F., et. al., Proc Natl Acad. Sci. USA, 95:4258-4263 (1998)).

[0051] Kako se ovde koristi, izraz "modifikovani NTP" odnosi se na nukleozid 5’-trifosfat koji ima grupu hemijske komponente vezanu na bilo kojoj poziciji, uključujući šećer, bazu, trifosfatni lanac, ili bilo koju kombinaciju ova tri položaja. Primeri ovakvih NTP molekula mogu da se nađu, na primer, u publikaciji "Nucleoside Triphosphates and Their Analogs: Chemistry, Biotechnology and Biological Applications," Vaghefi, M., ed., Taylor and Francis, Boca Raton (2005).

[0052] Kako se ovde koristi, izraz "modifikovani oligonukleotid" uključuje, na primer, oligonukleotid koji sadrži modifikovani nukleozid, modifikovanu internukleotidnu vezu, ili koji ima bilo koju kombinaciju modifikovanih nukleozida i internukleotidnih veza. Primeri modifikacija internukleotidne veze u oligonukleotidima uključuju detivate fosforotioata, fosfotriestra i metilfosfonata (Stec, W.J., et al., Chem. Int. Ed. Engl., 33:709-722 (1994); Lebedev, A.V., et al., E., Perspect. Drug Discov. Des., 4:17-40 (1996); i Zon, et al., SAD patentna prijava br.20070281308). Drugiprimeri modifikacija internukleotidne veze mogu da se nađu u publikaciji Waldner, et al., Bioorg. Med. Chem. Letters 6:2363-2366 (1996).

1

[0053] Izraz "promotor" kako se ovde koristi, odnosi se na region dsDNK matrice koja usmerava i kontroliše inicijaciju transkripcije konkretne DNK sekvence (npr. gena). Promotori su locirani na istom lancu i uzvodno na DNK (ka 5’ regionu sens lanca). Promotori su neporedno susedni sa (ili se delimično preklapaju sa) DNK sekvencom koja se transkribuje. Pozicije nukleotida u promotoru su označene u odnosu na mesto otpočinjanja transkripcije, na kome počinje transkripcija DNK (pozicija 1). Inicijacioni oligonukleotidni prajmer je komplementaran sa mestom inicijacije promotorske sekvence (koje je, u nekim primerima, na pozicijama 1 i 2, a u slučaju inicijacionih tetramera, na pozicijama 1, 2 i 3).

[0054] Kako se ovde koriste, izrazi "transkripcija" ili "reakcije transkripcije" odnose se na postupke koji su poznati u stanju tehnike, za enzimatsko pravljenje RNK koja je komplementarna DNK matrici, čime se proizvodi određeni broj RNK kopija DNK sekvence. RNK molekul sintetisan u reakciji transkripcije, koji se zove "RNK transkript", "primarni trankript" ili "transkript". U reakciji transkripcije koja uključuje ovde obezbeđene kompozicije i postupke, koriste se "inicijacioni oligonukleotidni prajmeri sa kapom". Transkripcija DNK matrice može da bude eksponencijalna, nelinearna ili linearna. DNK matrica može da bude dvolančana linearna DNK, delimično dvolančana linearna DNK, cirkularna dvolančana linearna DNK, DNK plazmid, PCR amplikon, modifikovana matrica nukleinske kiseline koja je kompatibilna sa RNK polimerazom.

[0055] Kako se ovde koristi, izraz "acil" označava grupu -C(O)Ra, gde je Ra vodonik, niži alkil, cikloalkil, heterociklil, aril, heteroaril, i slično.

[0056] Kako se ovde koristi, izraz "supstituisani acil" označava grupu -C(O)Ra’, gde je Ra’ supstituisani niži alkil, supstituisani cikloalkil, supstituisani heterociklil, supstituisan aril, supstituisani heteroaril, i slično.

[0057] Kako se ovde koristi, izraz "aciloksi" označava grupi -OC(O)Rb, gde je Rb vodonik, niži alkil, supstituisani niži alkil, cikloalkil, supstituisani cikloalkil, heterociklil, supstituisani heterociklil, aril, supstituisani aril, heteroaril, supstituisani heteroaril, i slično.

[0058] Kako se ovde koristi, izraz "alkil" odnosi se na lanac jednostruke veze ugljovodonika u rasponu, u nekim primerima, od 1-20 atoma ugljenika, a u nekim primerima, od 1-8 atoma ugljenika; primeri uključuju metil, etil, propil, izopropil, n-butil, sec-butil, izobutil, terc-butil, pentil, izoamil, heksil, oktil, dodekanil i slično.

[0059] Kako se ovde koristi, izraz "niži alkil" odnosi se na prav lanac ili razgranati lanac ugljovodonika koji se u nekim primerima kreće u opsegu od 1-6 atoma ugljenika, a u nekim primerima od 2-5 atoma ugljenika. Primeri uključuju etil, propil, izopropil, i slično.

[0060] Kako se ovde koristi, izraz "alkenil" odnosi se na hidrokarbil pravog ili razgranatog lanca, koji ima jednu ili više dvostrukih veza i, ukoliko nije drugačije naznačeno, sadrži od oko 2 do

1

oko 20 atoma ugljenika, i kreće se u nekim primerima od oko 2 do oko 10 atoma ugljenika, a u nekim primerima od oko 2 do oko 8 atoma ugljenika, a u nekim primerima od oko 2 do oko 6 atoma ugljenika. Primeri alkenil radikala uključuju vinil, alil, 1,4-butadienil, izopropenil i slično.

[0061] Kako se ovde koristi, izraz "alkenilaril" odnosi se na alkenil-supstituisane aril grupe, a "supstituisani alkenilaril" se odnosi na alkenilaril grupe koje dodatno nose jedan ili više supstituenata, kao što je ovde izloženo.

[0062] Kako se ovde koristi, izraz "alkenilen" odnosi se na dvovalentne ravne ili razgranate lance hidrokarbilnih grupa koje imaju najmanje jednu dvostruku vezu ugljenik-ugljenik i koje obično sadrže 2-20 atoma ugljenika, a u nekim primerima se kreću od 2-12 atoma ugljenika, a u nekim primerima se kreću od 2 -8 atoma ugljenika, a "supstituisani alkenilen" odnosi se na alkenilenske grupe koje dalje nose jedan ili više supstituenata, kako je ovde izloženo.

[0063] Kako se ovde koristi, izraz "alkilen" odnosi se na dvovalentnu hidrokarbilnu grupu koja sadrži 1-20 atoma ugljenika i kreće se u nekim primerima od 1-15 atoma ugljenika, ravnog ili razgranatog lanca, od kojih su dva atoma vodonika uzeta iz isti atom ugljenika ili iz različitih atoma ugljenika. Primeri alkilena uključuju, ali nisu ograničeni na, metilen (-CH2-), etilen (-CH2CH2-) i slično.

[0064] Kako se ovde koristi, izraz "alkinil" odnosi se na hidrokarbil ravnog ili razgranatog lanca, koji ima jednu ili više trostrukih veza i sadrži oko 2-20 atoma ugljenika, a u nekim primerima se kreće od oko 2-10 atoma ugljenika i kreću se u nekim primerima od oko 2-8 atoma ugljenika, a u nekim primerima od oko 2-6 atoma ugljenika. Primeri alkinil radikala uključuju etinil, propinil (propargil), butinil i slično.

[0065] Kako se ovde koristi, izraz "alkinilaril" odnosi se na alkinil-supstituisane aril grupe, a "supstituisani alkinilaril" se odnosi na alkinilaril grupe koje dodatno nose jedan ili više supstituenata, kao što je ovde izloženo.

[0066] Kako se ovde koristi, izraz "alkoksi" označava grupu -OR<c>, gde je R<c>niži alkil, supstituisani niži alkil, aril, supstituisani aril, aralkil, supstituisani aralkil, heteroalkil, heteroarilalkil, cikloalkil, supstituisani cikloalkil, cikloheteroalkil, ili supstituisani cikloheteroalkil, kao što je definisano.

[0067] Kako se ovde koristi, izraz "niži alkoksi" označava grupu -OR<d>, gde je R<d>niži alkil.

[0068] Kako se ovde koristi, izraz "alkilaril" odnosi se na alkil-supstituisane aril grupe, a "supstituisani alkilaril" se odnosi na alkilaril grupe koje dodatno nose jedan ili više supstituenata, kao što je ovde izloženo.

[0069] Kako se ovde koristi, izraz "alkiltio" odnosi se na grupu -S-R<h>, gde je R<h>alkil.

[0070] Kako se ovde koristi, izraz "supstituisani alkiltio" odnosi se na grupu -S-R<i>, gde je R<i>supstituisani alkil.

1

[0071] Kako se ovde koristi, izraz "alkinilen" odnosi se na dvovalentne hidrokarbilne grupe ravnih ili razgranatih lanaca koje imaju najmanje jednu trostruku vezu ugljenik-ugljenik i koje obično imaju u rasponu od oko 2-12 atoma ugljenika i kreću se u nekim primerima od oko 2-8 atoma ugljenika, a "supstituisani alkinilen" odnosi se na alkinilinske grupe koje dalje imaju jedan ili više supstituenata kako je ovde izloženo.

[0072] Kako se ovde koristi, izraz "amido" označava grupu -C(O)NR<j>R<j>, gde R<j>i R<j’>mogu da budu, nezavisno, vodonik, niži alkil, supstituisani niži alkil, alkil, supstituisani alkil, aril, supstituisani aril, heteroaril, ili supstituisani heteroaril.

[0073] Kako se ovde koristi, izraz "supstituisani amido" označava grupu -C(O)NR<k>R<k’>, gde su R<k>i R<k’>, nezavisno, vodonik, niži alkil, supstituisani niži alkil, aril, supstituisani aril, heteroaril, ili supstituisani heteroaril, pod uslovom, međutim, da najmanje jedan od R<k>i R<k’>nije vodonik. R<k>R<k’>u kombinaciji sa azotom mogu da formiraju izborno supstituisani heterociklični ili heteroaril prsten.

[0074] Kako se ovde koristi, izraz "amino" ili "amin" označava grupu -NR<n>R<n’>, gde R<n>i R<n’>mogu da budu, nezavisno, vodonik, niži alkil, supstituisani niži alkil, alkil, supstituisani alkil, aril, supstituisani aril, heteroaril, ili supstituisani heteroaril, kao što je ovde definisano. "Dvovalentni amin" označava grupu -NH-. "Supstituisani dvovalentni amin" označava grupu -NR- gde je R niži alkil, supstituisani niži alkil, alkil, supstituisani alkil, aril, supstituisani aril, heteroaril, ili supstituisani heteroaril.

[0075] Kako se ovde koristi, izraz "supstituisani amino" ili "supstituisani amin" označava grupu -NR<p>R<p’>, gde su R<p>i R<p’>, nezavisno, vodonik, niži alkil, supstituisani niži alkil, alkil, supstituisani alkil, aril, supstituisani aril, heteroaril, supstituisani heteroaril, pod uslovom, međutim, da najmanje jedno od R<p>i R<p’>nije vodonik. R<p>R<p’>u kombinaciji sa azotom mogu da formiraju izborno supstituisani heterociklični ili heteroaril prsten.

[0076] Kako se ovde koristi, izraz "aroil" odnosi se na aril-karbonil vrste kao što je benzoil, a "supstituisani aroil" se odnosi na aroil grupe koje dodatno nose jedan ili više supstituenta kao što je ovde izloženo.

[0077] Kako se ovde koristi, izraz "aril" sam ili u kombinaciji odnosi se na fenil, naftil ili fuzionisani aromatični heterociklik, izborno sa cikloalkilom od 5-10 članova u prstenu, i u nekim primerima, 5-6 članova u prstenu i/ili izborno supstituisan sa 1 do 3 grupe ili supstituenta tipa halo, hidroksi, alkoksi, alkiltio, alkilsulfinil, alkilsulfonil, aciloksi, ariloksi, heteroariloksi, amino izborno mono- ili di-supstituisan sa alkil, aril ili heteroaril grupama, amidino, urea izborno supstituisana sa alkil, aril, heteroaril ili heterociklil grupama, aminosulfonil izborno N-mono- ili N,N-di-supstituisan sa alkil, aril ili heteroaril grupama, alkilsulfonil amino, arilsulfonilamino,

1

heteroarilsulfonilamino, alkilkarbonilamino, arilkarbonilamino, heteroarilkarbonilamino, ili slično.

[0078] Kako se ovde koristi, izraz "ariloksi" označava grupu -OAr, gde je Ar aril, ili supstituisana aril grupa.

[0079] Kako se ovde koristi, izraz "carbocikl" odnosi se na zasićenu, nezasićenu, ili aromatičnu grupu koja ima jedan prsten ili više kondenzovanih prstenova sastavljenih od povezanih atoma ugljenika. Prsten(ovi) mogu izborno da budu nesupstituisani ili supstituisani sa, npr., halogenom, nižim alkilom, alkoksi, alkiltio, acetilen (-C=CH), amino, amido, azido, karboksil, hidroksil, aril, ariloksi, heterociklom, heteroarilom, supstituisanim heteroarilom, nitro (-NO2), cijano (-CN), tiol (-SH), sulfamido (-S(O)2NH2), i slično.

[0080] Kako se ovde koristi, izraz "guanidinil" označava grupu -N=C(NH2)2, a "supstituisani guanidinil" označava grupu -N=C(NR2)2, gde je svako R, nezavisno, H, alkil, supstituisani alkil, aril, ili supstituisani aril, kao što je ovde izloženo.

[0081] Kako se ovde koristi, izraz "halo" ili "halogen" odnosi se na sve halogene, tj., hloro (Cl), fluoro (F), bromo (Br) i jodo (I).

[0082] Kako se ovde koristi, izraz "heteroaril" odnosi se na monocikličnu aromatičnu strukturu prstena koja sadrži 5 ili 6 atoma u prstenu, ili na bicikličnu aromatičnu grupu koja ima 8-10 atoma, koja sadrži jedan ili više, a u nekim primerima 1-4, a u nekim primerima 1-3, a u nekim primerima 1-2 heteroatoma, koji su nezavisno odabrani iz grupe O, S i N, i izborno supstituisani sa 1-3 grupe ili supstituenta od halo, hidroksi, alkoksi, alkiltio, alkilsulfinil, alkilsulfonil, aciloksi, ariloksi, heteroariloksi, amino, izborno mono- ili di-supstituisan sa alkil, aril ili heteroaril grupama, amidino, uree izborno supstituisane sa alkil, aril, heteroaril, ili heterociklil grupama, aminosulfonil izborno supstituisan sa N-mono- ili N,N-di-supstituisan sa alkil, aril ili heteroaril grupama, alkilsulfonilamino, arilsulfonilamino, heteroarilsulfonilamino, alkilkarbonilamino, arilkarbonilamino, heteroarilkarbonilamino, ili slično. Takođe je predviđeno da heteroaril uključuje oksidovani S ili N, recimo, sulfinil, sulfonil, i N-oksid tercijarnog azota u prstenu. Atom ugljenika ili azota je tačka vezivanja strukture heteroaril prstena, tako da se zadržava stabilan aromatični prsten. Primeri heteroaril grupa su ftalimid, piridinil, piridazinil, pirazinil, hinazolinil, purinil, indolil, hinolinil, pirimidinil, pirolil, oksazolil, tiazolil, tienil, izoksazolil, oksatiadiazolil, izotiazolil, tetrazolil, imidazolil, triazinil, furanil, benzofuril, indolil, i slično. Supstituisani heteroaril sadrži supstituent vezan za dostupan ugljenik ili azot, kako bi se proizvelo stabilno jedinjenje.

[0083] Kako se ovde koristi, izraz "supstituisani heteroaril" odnosi se na heterocikl izborno mono ili polisupstituisan sa jednom ili više funkcionalnih grupa, npr., halogenom, nižim alkilom,

2

nižim alkoksi, alkiltio, acetilen, amino, amido, karboksil, hidroksil, aril, ariloksi, heterocikl, supstituisan heterocycle, hetaril, supstituisan hetaril, nitro, cijano, tiol, sulfamido, i slično.

[0084] Kako se ovde koristi, izraz "heterocikl" odnosi se na zasićenu, nezasićenu, ili aromatičnu grupu koja ima jedan prsten (npr., morfolino, piridil ili furil) ili više kondenzovanih prstenova (npr., naftpiridil, hinoksalil, hinolinil, indolizinil ili benzo[b]tienil) i ima atome ugljenika i najmanje jedan hetero atom, kao što je N, O ili S, u prstenu, koji može da bude izborno nesupstituisan ili supstituisan sa, npr., halogenom, nižim alkilom, nižim alkoksi, alkiltio, acetilenom, amino, amido, karboksilom, hidroksilom, arilom, ariloksi, heterociklom, hetarilom, supstituisanim hetarilom, nitro, cijano, tiolom, sulfamido, i slično.

[0085] Kako se ovde koristi, izraz "supstituisani heterocil" odnosi se na heterocikl supstituisan sa 1 ili više, npr., 1, 2, ili 3, supstituenta odabranih iz grupe koja se sastoji od izborno supstituisanog alkila, izborno supstituisanog alkenila, izborno supstituisanog alkinila, halo, hidroksi, alkoksi, alkiltio, alkilsulfinil, alkilsulfonil, aciloksi, aril, supstituisanog arila, ariloksi, heteroariloksi, amino, amido, amidino, uree izborno supstituisane sa alkil, aril, heteroaril ili heterociklil grupama, aminosulfonil izborno N-mono- ili N,N-di-supstituisan sa alkil, aril ili heteroaril grupama, alkilsulfonilamino, arilsulfonilamino, heteroarilsulfonilamino, alkilkarbonilamino, arilkarbonilamino, heteroarilkarbonilamino, acil, karboksil, heterocikl, supstituisani heterocikl, hetaril, supstituisani hetaril, nitro, cijano, tiol, sulfonamido, i okso, vezani u bilo kojoj dostupnoj tački tako da proizvode stabilno jedinjenje.

[0086] Kako se ovde koristi, izraz "hidrokarbil" odnosi se na bilo koji organski radikal čija kičma sadrži samo ugljenik i vodonik. Dakle, hidrokarbil podrazumeva alkil, cikloalkil, alkenil, cikloalkenil, alkinil, aril, alkilaril, arilalkil, arilalkenil, alkenilaril, arilalkinil, alkinilaril, i slično.

[0087] Kako se ovde koristi, izraz "supstituisani hidrokarbil" odnosi se na bilo koju od prethodno pomenutih grupa koje dodatno nose jedan ili više supstituenata koji su odabrani od hidroksi, hidrokarbiloksi, supstituisan hidrokarbiloksi, alkiltio, supstituisan alkiltio, ariltio, supstituisan ariltio, amino, alkilamino, supstituisan alkilamino, carboksi, -C(S)SR, -C(O)SR, -C(S)NR2, gde je svako R, nezavosno, vodonik, alkil ili supstituisani alkil, nitro, cijano, halo, -SO3M ili -OSO3M, pri čemu, M je H, Na, K, Zn, Ca, ili meglumin, guanidinil, supstituisani guanidinil, hidrokarbil, supstituisani hidrokarbil, hidrokarbilkarbonil, supstituisani hidrokarbilkarbonil, hidrokarbiloksikarbonil, supstituisani hidrokarbiloksikarbonil, hidrokarbilkarboniloksi, supstituisani hidrokarbilkarboniloksi, acil, aciloksi, heterociklik, supstituisani heterociklik, heteroaril, supstituisani heteroaril, heteroarilkarbonil, supstituisani heteroarilkarbonil, karbamoil, monoalkilkarbamoil, dialkilkarbamoil, arilkarbamoil, karbamat grupa, ditiokarbamat grupa, aroil, supstituisani aroil, organosulfonil, supstituisani organosulfonil, organosulfinil, supstituisani alkilsulfinil, alkilsulfonilamino, supstituisani alkilsulfonilamino, arilsulfonilamino, supstituisani arilsulfonilamino, sulfonamid grupa, sulfuril, i slično, uključujući dve ili više prethodno opisane grupe, vezane za hidrokarbil komponentu putem linker/spejser komponenti -O-, -S-, -NR-, gde je R vodonik, alkil ili supstituisani alkil, -C(O)-, -C(S)-, gde je R’ alkil ili supstituisani alkil, -O-C(O)-, -O-C(O)-O-, -O-C(O)-NR- (ili -NR-C(O)-O-), -NR-C(O)-, -NR-C(O)-NR-, -S-C(O)-, -S-C(O)-O-, -SC(O)-NR-, -0-S(O)2-, -O-S(O)2-O-, -O-S(O)2-NR-, -O-S(O)-, -O-S(O)-O-, -O-S(O)-NR-, -O-NR-C(O)-, -O-NR-C(O)-O-, -O-NR-C(O)-NR-, -NR-O-C(O)-, -NR-O-C(O)-O-, -NR-O-C(O)-NR-, -O-NR-C(S)-, -O-NR-C(S)-O-, -O-NR-C(S)-NR-, -NR-O-C(S)-, -NR-O-C(S)-O-, -NR-O-C(S)-NR-, -O-C(S)-, -O-C(S)-O-, -O-C(S)-NR- (ili -NR-C(S)-O-), - NR-C(S)-, -NRC(S)-NR-, -S-S(O)2-, -S-S(O)2-O-, -S-S(O)2NR-, -NR-O-S(O)-, -NR-O-S(O)-O-, -NR-O-S(O)-NR-, -NR-O-S(O)2-, -NRO-S(O)2-O-, -NR-O-S(O)2-NR-, -O-NR-S(O)-, -O-NR-S(O)-O-, -O-NR-S(O)-NR-, -O-NR-S(O)2O-, -O-NR-S(O)2NR-, -ONR-S(O)2-, -O-P(O)R2, -S-P(O)R2-, ili -NR-P(O)R2-, gde je svako R, nezavisno, vodonik, alkil ili supstituisani alkil, i slično.

[0088] Kako se ovde koristi, izraz "hidroksil" ili "hidroksi" odnosi se na grupu -OH.

[0089] Kako se ovde koristi, izraz "okso" odnosi se na kiseonični supstituent dvostrukom vezom vezan za vezani ugljenik.

[0090] Kako se ovde koristi, izraz "sulfinil" označava grupu -S(O)-.

[0091] Kako se ovde koristi, izraz "supstituisani sulfinil" označava grupu -S(O)R<t>, gde je R<t>niži alkil, supstituisani niži alkil, cikloalkil, supstituisani cikloalkil, cikloalkilalkil, supstituisani cikloalkilalkil, heterociklil, supstituisani heterociklil, heterociklilalkil, supstituisani hetereociklilalkil, aril, supstituisani aril, heteroaril, supstituisani heteroaril, heteroaralkil, supstituisani heteroaralkil, aralkil, ili supstituisani aralkil.

[0092] Kako se ovde koristi, izraz "sulfonil" označava grupu -S(O)2-.

[0093] Kako se ovde koristi, izraz "supstituisan sulfonil" označava grup -S(O)2R<t>, gde je R<t>niži alkil, supstituisani niži alkil, cikloalkil, supstituisan cikloalkil, cikloalkilalkil, supstituisani cikloalkilalkil, heterociklil, supstituisani heterociklil, heterociklilalkil, supstituisani hetereociklilalkil, aril, supstituisani aril, heteroaril, supstituisani heteroaril, heteroaralkil, supstituisani heteroaralkil, aralkil, ili supstituisani aralkil.

[0094] Kako se ovde koristi, izraz "sulfuril" označava grupu -S(O)2-.

[0095] Predmetni prikaz obezbeđuje postupke i kompozicije za sintezu 5’RNK sa kapama pri čemu inicijacioni oligonukleotidni prajmeri sa kapom imaju opšti oblik<m7>Gppp[N2 ome]n[N]m pri čemu je<m7>G N7-metilovani guanozin ili bilo koji guanozinski analog, N je bilo koji prirodni, modifikovani ili ne-prirodni nukleozid "n" može da bude bilo koji ceo broj od 1 do 4, a "m" može da bude ceo broj od 1 do 9. Prikaz opisuje inicijacione oligonukleotidne prajmere sa kapom koji imaju strukturu Formule I:

pri čemu:

svako od B1 do B10 je nezavisno prirodna, modifikovana ili ne-prirodna nukleozidna baza; M je 0 ili 1;

L je 0 ili 1;

q1 je 1;

svako od q2 do q9 je nezavisno 0 ili 1;

R1 je H ili metil;

R2 i R3 su nezavisno H, OH, alkil, O-alkil, amin, azid, halogen, linker ili detektabilni marker;

svako od X1 do X13 je, nezavisno, O ili S;

2

svako od Y1 do Y13 je, nezavisno, OH, SH, BH3, aril, alkil, O-alkil ili O-aril; svako od Z1 do Z22 je, nezavisno O, S, NH, CH2, C(halogen)2 ili CH(halogen) i svako od R4 do R12 je, nezavisno, H, OH, OMe ili detektabilni marker.

[0096] U nekim primerima inicijacioni oligonukleotidni prajmer sa kapom je trimer (q<2>-q<9>=0), tetramer (q<3>-q<9>=0), pentamer (q<4>-q<9>=0), heksamer (q<5>-q<9>=0), heptamer (q<6>-q<9>=0), oktamer (q<7>-q<9>=0), nanomer (q<8>-q<9>=0), dekamer (q<9>= 0) ili undekamer. Izvestan broj primera inicijacionih oligonukleotidnih trimernih prajmera sa kapom predstavljen je u Tabeli I koja sledi:

[0097] Drugi inicijacioni oligonukleotidni prajmeri sa kapom koji su opisani u ovom dokumentu uključuju prajmere koji imaju poznate ili nove bazne analoge. Postupci za sintezu inicijacionih oligonukleotidnih prajmera sa kapom, dati su u primerima koji slede.

2

Transkripcija

[0098] Transkripciju molekula informacione RNK (mRNK molekuli) kod eukariota obavlja RNK polimeraza II. Ona predstavlja komplikovan enzim sa više subjedinica i sa kompleksnom regulacijom. Kako bi izvodili in vitro transkripciju u velikom obimu, istraživači obično koriste fagne polimeraze sa samo jednom subjedinicom koje se dobijaju iz bakteriofaga T7, T3, SP6, K1-5, K1E, K1F ili K11. Ova familija polimeraza ima jednostavne, minimalne promotorske sekvence od ∼17 nukleotida, koje ne zahtevaju pomoćne proteine i koje imaju minimalna ograničenja kada je u pitanju inicijaciona nukleotidna sekvenca. Premda je ova patentna prijava fokusirana na T7 RNK polimerazu (T7 RNKP), stručnjak u oblasti bi razumeo da se ovo može praktikovati i sa drugim RNK polimerazama.

[0099] T7 RNKP postoji u najmanje dva proteinska stanja. Prvo se označava kao "abortivni kompleks" i povezano je sa inicijacijom transkripcije. Drugo je veoma procesivna konformacija označena kao "elongacioni kompleks". In vitro transkripcija može da se razloži na šest koraka: 1) vezivanje RNK polimeraze za promotorsku sekvencu, 2) inicijacija transkripcije, 3) elongacija bez napredovanja koja se označava abortivna transkripcija, tokom koje polimeraza često otpušta DNK matricu i kratke abortivne transkripte 4) prevođenje otvorenog kompleksa u zatvoreni kompleks, 5) progresivna elongacija i 6) terminacija transkripcije. Značajna količina RNK koja se proizvodi tokom transkripcije, sastoji se od prevremeno završenih fragmenata dužine ~2-8 nukleotida (Biochemistry 19:3245-3253 (1980); Nucleic Acids Res. 9:31-45 (1981);Nucleic Acids Res. 15:8783-8798 (1987); Biochemistry 27:39663974 (1988)). Posle sinteze oko 10-14 baza, RNK polimeraze izlaze iz nedovršenih ciklusa, gubeći u isto vreme kontakte specifične za sekvencu sa promotorskom DNK, i obrazujući funcionalan elongacioni kompleks, u kome se RNK lanac produžava na način koji zavisi od sekvence (J. Mol. Biol.183:165-177(1985); Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.83:3614-3618(1986); Mol. Cell Biol.7:3371-3379 (1987)).

[0100] Konsenzusna sekvenca za najaktivnije promotore klase III T7 obuhvata 17 bp sekvence uzvodno i 6 bp nizvodno od početnog mesta transkripcije (Cell 16: 815-25. (1979)). Položaj prvog transkribovanog nukleotida obično se naziva 1 nukleotid transkripta RNK, drugog transkribovanog nukleotida kao 2 nukleotid transkripta i tako dalje (Tabela 2). Tokom transkripcije, dve niti se tope da bi se formirao mehur za transkripciju, a donji lanac dupleksa (prikazan od 3 do 5 u tabeli 2) predstavlja matricu za transkripciju. Za nukleotide transkripata 3 i dalje, matrica definiše identitet transkribovanih nukleotida prvenstveno kroz interakcije Votson-Krikovog sparivanja baza. Ovde je nukleotid koji kodira prvi nukleotid transkripta RNK definisan kao 1 nukleotid matrice. U primeru prikazanom u tabeli 2, 1 nukleotid transkripta je

2

G, a nukleotid 1 matrice je C. Takođe je 4 nukleotid transkripta A, a nukleotid 4 matrice je T.

[0101] Za razliku DNK polimeraze, T7 RNKP inicira RNK sintezu u odsustvu prajmera. Prvi korak u inicijaciji se zove de novo sinteza RNK, u kome RNK polimeraza prepoznaje specifične sekvence na DNK matrici, selektuje prvi par nukleotid trifosfata koji su komplementarni ostacima matrice na pozicijama 1 i 2, i katalizuje obrazovanje fosfodiestarske veze da bi se formirao dinukleotid. Inicijacioni nukleotidi imaju niže afinitete za polimerazu od nukleotida koji se koriste za elongacije. Vrednost Kd je 2 mM za prvi inicijacioni NTP i 80 mM za drugi, dok je Kd približno 5 mM za NTP tokom elongacije (J. Mol. Biol. (2007) 370, 256-268). Utvrđeno je da je de novo sinteza korak koji ograničava brzinu tokom transkripcije. T7 RNAP pokazuje snažnu pristranost prema GTP kao inicijacionom nukleotidu (J. Biol. Chem. 248: 2235-2244 (1973)). Među 17 T7 promotora u genomu, 15 započinje sa GTP (a 13 sa pppGpG), dok ne postoji očigledna NTP preferencija tokom elongacije transkripcije (J. Mol. Biol. 370: 256-268 (2007)). T7 RNK polimeraza slabo inicira na promoterima koji kodiraju A na položaju 1; transkripcija umesto toga započinje pretežno kodiranim G na poziciji 2 (J. Biol. Chem.

278:2819-2823 (2003)).

[0102] Tokom de novo sinteze RNK, vezivanje inicijacionih nukleotida se postiže pre svega slobodnom energijom stvorenom od slaganja baza, specifičnim interakcijama između ostataka polimeraze, guaninskim delovima inicijacionih nukleotida i interakcijama komplementarnosti baza (J. Mol. Biol.370:256-268 (2007)).

[0103] Poznato je da T7 RNAP takođe može da započne kratkim oligonukleotidnim prajmerima. Na primer, poznato je da 13 promotora u genomu T7 iniciraju sa pppGpG (J. Mol. Biol. 370: 256-268 (2007)). Nekoliko grupa je pokazalo da T7 RNAP može započeti iz dinukleotidnih prajmera (Biochemistri 24: 5716-5723 (1985)). Axelrod et al. pokazali su da neograničeni GpA dinukleotid može inicirati iz nukleotida 1 i 2 matrice koji su 2'-deoksicitidin i 2'-deoksitimidin (matrica "CT"). Njihovi reakcioni uslovi su bili 200 mikromolarnih (μM) dimera i 100 μM ATP, CTP, GTP i UTP. Njihova reakciona smeša je takođe sadržala 100 μM 3 ’dATP, 3’ dCTP 3 ’dUTP ili 50 μM 3’ dGTP. Oni posmatraju samo GpA inicirane RNK, a ne smešu GpA iniciranih

2

RNK i 5 ’trifosfatne RNK od inicijacije GTP. Ovo je verovatno zbog primenjenih reakcionih uslova. 100 μM GTP je znatno ispod 2 mM Kd polimeraze T7 za prvi inicijacioni guanozin (J. Mol. Biol. (2007) 370, 256-268). S obzirom da se GTP takmiči za inicijaciju sa inicijacionim oligonukleotidom, upotreba niske koncentracije GTP favorizuje inicijaciju GpA, ali rezultira malim prinosom transkripcije (maksimalni izračunati prinos procenjen je na <150 ug / ml reakcije). Kada su inicirali transkripciju na „CT“ matrici sa ApG, CpG, UpG ili GpG, primetili su stvaranje RNK transkripata sa dodatnim netemplatiranim 5 ’nukleotidom (A, C, U ili G, redom).

[0104] Axelrod et al. takođe je koristio neograničeni GpG dinukleotid za pokretanje sinteze RNK na promoteru gde su nukleotidi matrice 1 i 2 bili 2’-deoksicitidini („CC“ matrica). Primetili su malu vernost inicijacije i primetili tri različita proizvoda transkripcije. Oni kažu, „Pregled autoradiografa pokazuje da je po jedan član svakog tripleta proistekao iz inicijacije sa GpG u normalnom položaju (+ 1), drugi član svakog tripleta proizašao je iz inicijacije sa GpG u nenormalnom (-1) položaju, a treći član svakog tripleta proizašao je iz inicijacije guanozin trifosfatom u normalnom položaju.Tako je GpG relativno slab inicijator sa promotorom ø 10 matrica), kao i sa promotorom ø 1.1A matrica) i nije u stanju da spreči normalno započinjanje sa guanozin trifosfatom u koncentraciji koja je korišćena.“ Nisu primetili inicijaciju sa GpA dinukleotidom sa ø 10 promotorom matrica). CpA, ApC i ApA nisu poslužili kao inicijatori ni na jednom od gornjih matrice verovatno zato što oni ne mogu hibridizovati sa nukleotidima matrice na pozicijama 1 i 2. Postupak opisan u Axelrod et al. je dizajniran za proizvodnju vrlo malih količina radioaktivnih transkripata za sekvenciranje i nije pogodan za proizvodnju velikih količina korisnih farmaceutskih količina RNK. Ako su za povećanje prinosa RNK korišćene veće koncentracije (~ 5 mM) inicijacionog dimera i NTP-a, uključujući GTP, očekivani rezultat je mali udeo RNK koji započinje iniciranjem dimera, jer se GTP efikasno takmiči sa dimerom za inicijaciju 1 nukleotidi u koncentracijama NTP bliže Kd (2 mM), proizvodeći veliki udeo RNK koja započinje sa pppG.

[0105] Pitulle et al. su pokazali da se transkripcija sa T7 RNAP može započeti sa neograničenim oligonukleotidima (2-mer do 6-mer) (Gene, 112: 101-105 (1992)). Ovi oligonukleotidi su imali 5’-OH ili 5 ’monofosfat. Takođe su inicirali transkripciju sa oligonukleotidom strukture Biotin-ApG. Svi oligonukleotidi korišćeni u ovoj studiji sadržali su 3 ’terminal G. Pitulle et al. takođe je pokazao da 2’-O-metilni ostaci i ostaci deoksi mogu biti uključeni u prajmer sekvencu da bi se dobili RNK transkripti sa 2’-O-metiliranim ili 2’-deoksi ostacima na ili blizu 5’-kraja RNK. U ovoj publikaciji je jasno da 3 ’terminalni ostatak guanozina bilo kojeg inicijacionog oligonukleotida sparen sa nukleotidom 1 matrice. To rezultira netemplatiranim nukleotidima koji su se dodali na 5 ’kraj transkribovane RNK. Konkretno, autori navode, „Takođe su i

2

varijacije sekvence u ovom segmentu lako moguće, jer nije potrebno uparivanje baze sa DNK matrice osim I-terminala G.“ Prema tome, nijedan od inicijacionih oligonukleotidnih prajmera nije u potpunosti komplementaran samo nukleotidu matrice "C" na položaju 1, a ne ni jednom nukleotidu na sledećim pozicijama (+2, 3 itd.). To je potvrđeno u narednim radovima o metodama ove grupe (Methods Mol Biol.74: 99-110 (1997), Methods Mol. Biol. 252: 9-17, (2004)). Njihove metode se razlikuju od ovde opisane metode, gde se svi nukleotidi inicijacionog oligonukleotidnog prajmera sa kapom potpuno dopunjuju sa nukleotidima matrice na pozicijama 1 i sledećim pozicijama. Kleineidam et al. stvorili 5 'modifikovane transkripte tRNK inicijacijom dimera ili trimera koji su modifikovani sa 2'-deoksi ili 2'-O-metil šećerima (Nucleic Acids Research 21: 1097-1101 (1993). Ponovo autori navode da 3'- terminalni guanozin prajmera započinje na 1 nukleotidu matrice "C".

[0106] Druga studija Ishicawa et al. pokazala je da inicijacioni oligonukleotidni trimeri sa kapom strukture<m7>GpppApG,<m7>Gpppm6ApG,<m7>GpppA2'OmepG ili<m7>Gppp m6A2'OmepG mogu inicirati transkripciju na matrici sa ostacima 2'-deoksicitidina na pozicijama matrice 1 i 2 ("CC" matrica; Nucleic Acids Symposium Series No.53: 129 (2009)). Autori navode: „Različiti rezultat u slučaju upotrebe<m7>G5’pppG može biti prouzrokovan uparivanjem baze između dodatnog adenozina (N1) u<m7>G5’pppN1pG i 2’-deoksitimidina u T7 promotoru na -1 položaju.“ Ovaj postupak se jasno razlikuje od ovde opisanog postupka gde se 1 i 2 nukleotidi inicijacionog oligonukleotidnog trimera sa kapom u paru sa 1 i 2 nukleotidima matrice. Ishicawa et al. koristio je 6 mM inicijacioni oligonukleotidni trimer, 0,9 mM GTP i 7,5 mM ATP, CTP i UTP. Autori su koristili više od 6 puta veću količinu inicijacionog oligonukleotidnog prajmera sa kapom, najskuplje nukleotidne komponente transkripcione reakcije, u odnosu na konkurentski GTP da pokreće reakciju transkripcije ka RNk sa kapom, preko pppRNK, što povećava ukupne troškove sintetisane RNK. S druge strane, niska koncentracija GTP (0,9 mM) ograničava ukupan prinos RNK u reakciji transkripcije (teoretski na manje od 1,4 mg/ml). Suprotno tome, ovde opisana metoda ne zahteva ograničavanje koncentracije bilo kog NTP da bi se postiglo efikasno dodavanje kape na RNK i veći prinos RNK (2 do 6 mg/ml) i na taj način omogućava proizvodnja visokokvalitetne mRNK po komercijalno korisnoj ceni.

[0107] Nijedna od prethodno razmatranih publikacija nije direktno merila efikasnost dodavanja kape na RNK, tako da je stepen u kome se kapa dodaje u ovom studijama nepoznat.

[0108] Ono što je važno, u svim studijama koje se prethodno opisane u tekstu, 1 nukleotid matrice je 2’-deoksicitidin (Biochemistry 24:5716-5723 (1985), Gene, 112:101-105 (1992), Methods Mol. Biol.74: 99-110 (1997), Methods Mol. Biol. 252:9-17, (2004), Nucleic Acids Research 21:1097-1101 (1993), Nucleic Acids Symposium Series No.53: 129 (2009)).

2

[0109] Tokom više od 20 godina nakon objavljivanja studija o inicijaciji transkripcije pomoću oligonukleotidnih prajmera, nije bilo objavljenih primera inicijacije transkripcije pomoću inicijacionih oligonukleotidnih prajmera koji sadrže containing strukture kape5’- ka 5’ smeru, sve do publikacije u Nucleic Acids Symposium Series No.53: 129 (2009).

[0110] Ovde obezbeđeni postupci i kompozicije za pripremu 5’-RNK sa kapom uključuju, ali nisu ograničeni na, mRNK, male jedarne RNK (snRNK), male nukleolusne RNK (snoRNK), male RNK specifične za Kahalova tela (scaRNK). Ovi postupci uključuju korišćenje oligonukleotidnih prajmera koji sadrže Cap, nukleozid 5’-trifosfata (NTP molekula) i RNK polimeraze za sintezu RNK na osnovu DNK matrice i pod kontrolom promotora. U postupcima može da se koristi inicijacioni oligonukleotidni prajmer sa kapom koji obezbeđuje upotrebnu vrednost za sintezu RNK, posebno za sintezu mRNK molekula sa kapom. Inicijacioni oligonukleotidni prajmer ima strukturu koja liči na Cap 0, Cap 1, Cap 2 ili TMG-Cap prirodnih molekula RNK koji uključuju 2’-O-metilovane nukleozidne jedinice na Cap 1 na pretposlednjoj 5'-poziciji u RNK i Cap 2 na 5’-poziciji pre nje. Prirodna Cap 0 struktura nema 2’-O-metilovane nukleozidne jedinice.

[0111] Postupci i kompozicije za pripremu RNK, uključujući, ali bez ograničenja, mRNK, snRNK, snoRNK, scaRNK, transfer RNK (tRNK), ribozomsku RNK (rRNK) i prenosnoprenosnu RNK (tmRNK) koje nose modifikacije na ili blizu 5 '-kraja molekula. Ovi postupci uključuju upotrebu inicijacionih oligonukleotidnih prajmera sa ili bez Cap, nukleozidnih 5’-trifosfata (NTP) i RNK polimeraze za sintezu RNK na osnovu matrice i pod kontrolom promotora. u postupcima mogu da se koriste modifikovani inicijacioni oligonukleotidni prajmer koji nosi strukturne modifikacije koje pružaju korisnost u sintezi RNK; naročito sinteza 5’-modifikovanih RNK.

[0112] Inicijacioni oligonukleotidni prajmer ima otvorenu 3’-OH grupu koja omogućava pokretanje sinteze RNK polimeraze posredovane na DNK matrici dodavanjem nukleotidnih jedinica na 3’-kraj prajmera. Inicijacioni oligonukleotidni prajmer u osnovi je komplementaran sa sekvencom DNK matrice na mestu inicijacije transkripcije (tj. Mesto inicijacije je locirano bliže 3’-kraju promotorske sekvence i može se preklapati sa promotorskom sekvencom). U određenim primerima, inicijacioni oligonukleotidni prajmer sa kapom usmerava sintezu RNK pretežno u jednom smeru („napred“) počev od 3’-kraja prajmera. Inicijacioni oligonukleotidni prajmer može nadmašiti bilo koji nukleozidni 5'-trifosfat za pokretanje sinteze RNK, čime se maksimizira proizvodnja RNK koja započinje iniciranjem omeđenog oligonukleotidnog prajmera i minimizira proizvodnja RNK koja započinje sa 5'-trifosfat-nukleozidom (obično GTP).

[0113] Proizvodnja mRNK in vitro transkripcijom koristi visoko aktivne fage RNK polimeraze (T3, T7, SP6 i druge). RNK polimeraza deluje pod kontrolom specifičnog promotora koji je ugrađen u DNK plazmidnu konstrukciju ispred matrice nukleotidne sekvence. Proces transkripcije obično započinje sa purin-nukleozidnim 5’-trifosfatom (obično GTP) i nastavlja se sve dok RNK polimeraza ne naiđe na završnu sekvencu ili dovrši DNK matricu.

[0114] Kao što je gore pomenuto, analogi mCAP dinukleotida, 7mG (5 ’) ppp (5’) N, koji sadrže Cap 0, korišćeni su za iniciranje in vitro transkripcije (npr. RNA 1: 957-967 (1995)). Zatvoreni RNK molekuli proizvedeni korišćenjem ovih analoga dinu-kleotida sadrže Cap 0. Međutim, samo oko 50% sintetisanih RNK molekula sa kapom ima tačnu nizvodnu orijentaciju Cap. Da bi RNK sa Cap 0 pretvorili u RNK sa Cap 1, dodatni enzimski reakcija se mora izvršiti upotrebom (nukleozid-2'-O) metiltransferaze. Međutim, ova konverzija možda nije kvantitativna; nije lako kontrolisati i teško je odvojiti preostale Cap 0 RNK od Cap 1 RNK. Pored toga, konkurencija NTP molekula (posebno GTP) za inicijacionu transkripciju dalje smanjuje količinu proizvedenih aktivnih RNK molekula sa kapom.

[0115] Pored toga, za iniciranje in vitro transkripcije se koriste i modifikovani dinukleotidni analozi, kao što je<7m>G3’Ome(5’)ppp(5’) N i drugi srodni ARCA analozi, koji nose modifikovani

<7m>G ostatak sa blokiranom 3’ i/ili 2’ pozicijom na ribozi (npr. RNA 7: 1486-1495 (2001)). Ovi ARCA analozi sa kapom usmeravaju sintezu RNK samo u „nizvodnoj“ orijentaciji i zbog toga proizvode molekul RNK sa (prirodnim) Cap 0 na 5’-terminusu (koji ima 2 ’i/ili 3’ modifikacije na 7mG ostatka). Takve RNK su aktivnije u sistemima za translaciju u poređenju sa RNK pripremljenim korišćenjem standardnih analoga dinukleotida,<7m>G (5 ')ppp(5') N. Da bi se RNK sa ARCA Cap 0 pretvorila u RNK sa ARCA Cap 1, mora da se izvrši dodatna enzimska reakcija izvedena sa (nukleozid-2'-O) metiltransferazom slično onoj potrebnoj za analoge dinukleotida koji su prethodno razmatrani. Ova metoda ima iste nedostatke kao ona izrađena za mCAP analoge dinukleotida; konverzija RNK sa Cap 0 u RNK sa ARCA Cap 1 možda nije kvantitativna; reakciju nije lako kontrolisati, teško je odvojiti preostale Cap 0 RNK od Cap 1 RNK, a konkurencija NTP molekula (posebno GTP) za iniciranje transkripcije dalje smanjuje količinu proizvedenih aktivnih RNK molekula sa kapom.

[0116] Kratki oligonukleotidni prajmeri (2 do 6 mer) sa 3’-terminalnim ostatkom guanozina korišćeni su za iniciranje in vitro transkripcije (Pitulle, C. et al., Gene, 112: 101-105 (1992)). Ovi oligonukleotidni prajmeri su sadržali modifikovane i nemodifikovane ribonukleozidne ostatke (npr. Modifikovani ribonukleozidni ostaci uključuju 2’-O-metilirane nukleozidne ostatke i 2’-deoksiribonukleozidne ostatke). Kraći oligonukleotidni prajmeri (dimeri do tetramera) u osnovi nadmašuju GTP za iniciranje transkripcije, dok su duži prajmeri (pentamer do heksamera) mnogo manje efikasni u pokretanju transkripcije u poređenju sa GTP. To može biti zato što ovi

1

duži prajmeri (onako kako su dizajnirani) imaju mali procenat komplementarnosti sa DNK matricom na mestu inicijacije. Suprotno tome, dimer AG (kako je dizajniran) bio je komplementaran sa DNK matricom na mestu inicijacije. Molekuli RNK proizvedeni pomoću oligonukleotidnih prajmera, o kojima se govori u ovom odeljku, imali su unutrašnji 2’-O-metilirani nukleozid, ali nisu sadržali 5’-Cap 0, Cap1, Cap 2 ili TMG-cap. Da bi se RNK bez strukture kapice pretvorila u RNK sa kapom 1, kapom 2 ili TMG kapom, morale bi se izvršiti dodatne enzimske reakcije pomoću enzima za pokrivanje. Međutim, takva konverzija ima iste nedostatke kao i gore navedeni.

[0117] Ostali kratki RNK oligonukleotidi sa stukturom kape i unutrašnjim 2’-O-metiliranim nukleozidnim ostacima, hemijski su pripremljeni (Ohkubo et al., Org. Letters 15: 4386-4389 (2013)). Ovi kratki oligonukleotidi sa kapom povezani su sa „dekapiranim“ (bez strukture 5’-kape) fragmentom duge RNK koristeći T4 DNK ligazu i komplementarni DNK iverni oligonukleotod. Konačna RNK sintetisana ovom hemijsko-enzimskom metodom imala je i unutrašnje 2’-O-metilirane nukleozidne ostatke i 5’-TMG-kapicu strukturu. Međutim, samo kratke RNK sa kapom (<200 mer) pripremljene su korišćenjem ovog pristupa ligacije. Štaviše, prinosi su bili niski (15-30%). Nije lako kontrolisati i optimizovati reakciju ligacije T4 DNK i potreban je naporan postupak razdvajanja pomoću elektroforeze u poliakrilamidnom gelu i izolacija RNK sa kapom od preostalih RNK bez kape. Razdvajanje dugih (500 -10000 baza) mRNK sa kapom od preostalih mRNK bez kape metodom PAGE nije izvodljivo.

[0118] Na kraju, 5'-modifikovani nukleozid ili 5'-modifikovani mononukleotid ili 5'-modifikovani dinukleotid, obično derivat guanozina, korišćeni su za in vitro transkripciju RNK (Gene, 112: 101-105 (1992) i Bioconjug. Chem., 10371-378 (1999). Ovi inicijacioni nukleozidi i nukleotidi mogu da nose oznake ili grupe afiniteta (npr. Biotin) i, kada se ugrade na 5’-kraj RNK, omogućiće lako otkrivanje, izolaciju i prečišćavanje sintetisane RNK. Ova 5-obeležena ili označena RNK možda će biti potrebna za neke aplikacije. Međutim, ova strategija nije korišćena za pripremu mRNK sa Cap 0, Cap 1, Cap 2 ili TMG-cap strukturama.

[0119] Obezbeđene su kompozicije sa inicijacionim oligonukleotidnim prajmerima sa kapom, Formule I. Takođe su obezbeđeni postupci u kojima se RNK sintetiše pomoću inicijacionih oligonukleotidnih prajmera sa kapom, Formule I.

Inicijacioni oligonukleotidni prajmer sa kapom

[0120] Inicijacioni oligonukleotidni prajmeri sa kapom, koji su opisani ovde, imaju hibridizacionu sekvencu koja može da bude komplementarna sekvenci na DNK matrici na mestu inicijacije. Dužina hibridizacione sekvence prajmera za upotrebu u ovde datim metodama i kompozicijama zavisi od nekoliko faktora, uključujući identitet matrice nukleotidne sekvence i

2

temperature na kojoj se ovaj prajmer hibridizuje sa DNK matricom ili koristi tokom in vitro transkripcije. Određivanje željene dužine određene nukleotidne sekvence inicijacionog oligonukleotidnog prajmera sa kapom za upotrebu u transkripciji može lako da odredi osoba sa prosečnim iskustvom u tehnici ili rutinskim eksperimentisanjem. Na primer, dužina nukleinske kiseline ili oligonukleotida može se odrediti na osnovu željene hibridizacione specifičnosti ili selektivnosti.

[0121] U nekim primerima, dužina nukleotida inicijacionog oligonukleotidnog prajmera sa kapom (uključujući reverzni nukleotid Cap 5'-5 'Cap) je između 3 i oko 9, u nekim primerima dužina nukleotida inicijacionog olimonukleotidnog prajmera s kapicom (uključujući Cap) je između 3 do oko 7, u nekim primerima je nukleotidna dužina inicijacionog oligonukleotidnog prajmera sa kapom (uključujući Cap) između 3 i oko 5, a u nekim primerima nukleotidna dužina inicijacionog oligonukleotidnog prajmera sa kapom (uključujući Cap) je oko 3. Dužina hibridizacionog niza unutar inicijacionog oligonukleotidnog prajmera sa kapom može biti jednaka ili kraća od ukupne dužine inicijacionog oligonukleotidnog prajmera sa kapom.

[0122] Prisustvo hibridizacione sekvence primorava inicijacioni oligonukleotidni prajmer sa kapom da se pretežno poravna sa komplementarnom sekvencom DNK matrice na mestu inicijacije samo u željenoj orijentaciji (tj. Orijentaciji „napred“). U nizvodnoj orijentaciji, RNK transkript započinje obrnutim ostatkom guanozina (tj. 7mG (5 ') ppp (5') N ...) Dominacija nizvodne orijentacije poravnanja prajmera na DNK matrici (slika 1) sa netačnom „reverznom“ orijentacijom održava termodinamika hibridizacionog kompleksa. Potonje se određuje dužinom hibridizacione sekvence inicijacionog oligonukleotidnog prajmera sa kapom i identitetom baza uključenih u hibridizaciju sa DNK matricom. Hibridizacija u željenoj nizvodnoj orijentaciji takođe može da zavisi od temperature i uslova reakcije pri kojima se DNK matrica i inicijacioni oligonukleotidni prajmer hibridizuju ili koriste tokom in vitro transkripcije.

[0123] Ovde opisani inicijacioni oligonukleotidni prajmer sa kapom poboljšava efikasnost inicijacije transkripcije u poređenju sa efikasnošću inicijacije standardnim GTP, ATP, CTP ili UTP molekulima. U nekim primerima, inicijacija transkripcije smatra se poboljšanom kada sinteza RNK započinje pretežno od inicijacionih oligonukleotidnih prajmera sa kapom, a ne od bilo kog NTP molekula u smeši za transkripciju. Povećana efikasnost inicijacije transkripcije rezultira većim prinosom RNK transkripta. Poboljšana efikasnost inicijacije transkripcije može da se poveća na oko 10%, oko 20%, oko 40%, oko 60%, oko 80%, oko 90%, oko 100%, oko 150%, oko 200% ili oko 500% prekomernom sintezom RNK konvencionalnim metodama bez inicijacionog oligonukleotidnog prajmera sa kapom. U određenim primerima „iniciranje ograničenih oligonukleotidnih prajmera“ nadmašuje bilo koji NTP (uključujući GTP) za pokretanje transkripcije. Prosečan stručnjak u ovoj oblasti je u stanju da lako odredi nivo aktivnosti supstrata i efikasnost iniciranja oligonukleotidnih prajmera sa kapom. Jedan primer metode određivanja efikasnosti podloge ilustrovan je u primeru 13). U određenim primerima, inicijacija se odvija od oligonukleotidnog prajmera sa kapom umesto od NTP, što rezultira višim nivoom dodavanja kape na transkribovanu mRNK.

[0124] Obezbeđeni su postupci u kojima se RNK sintetiše korišćenjem inicijacionog oligonukleotidnog prajmera sa kapom koji ima supstitucije ili modifikacije. Supstitucije i modifikacije inicijacionog oligonukleotidnog prajmera sa kapom možda neće u značajnoj meri oštetiti sintezu RNK. Rutinske test sinteze mogu se izvršiti da bi se utvrdilo da li se mogu dobiti poželjni rezultati sinteze sa modifikovanim inicijacionim oligonukleotidnim prajmerima sa kapom. Stručnjaci u ovoj oblasti mogu da izvrše rutinske eksperimente kako bi utvrdili da li se mogu dobiti poželjni rezultati. Supstitucija ili modifikacija inicijacionog oligonukleotidnog prajmera uključuje, na primer, jednu ili više modifikovanih nukleozidnih baza, jedan ili više modifikovanih šećera, jednu ili više modifikovanih internukleotidnih veza i/ili jedan ili više modifikovanih trifosfatnih mostova.

[0125] Modifikovani inicijacioni oligonukleotidni prajmer sa kapom, koji može da uključuje jednu ili više modifikacionih grupa prema ovde navedenim postupcima i kompozicijama, može da podleže elongaciji RNK polimerazom na DNK matrici putem ugrađivanja NTP molekula u otvorenu 3’-OH grupu. Inicijacioni oligonukleotidni prajmer sa kapom može da uključuje prirodne nukleozide RNK i DNK, modifikovane nukleozide ili nukleozidne analoge. Inicijacioni oligonukleotidni prajmer sa kapom može sadržati prirodne internukleotidne fosfodiesterske veze ili njihove modifikacije, ili njihovu kombinaciju.

[0126] U jednom primeru modifikaciona grupa može biti termički labilna grupa koja se disocira od modifikovanog inicijacionog oligonukleotidnog prajmera sa kapom, sa sve većom brzinom kako se temperatura enzimske reakcione sredine podiže. Primeri termički labilnih grupa za oligonukleotide i NTP su opisani u Nucleic Acids Res., 36:e131 (2008), Collect. Symp. Ser., 10:259-263 (2008) i Analytical Chemistry, 81:4955-4962 (2009).

[0127] Obezbeđeni su postupci u kojima se RNK sintetiše gde se bar jedan ili više NTP molekula dodaje u reakciju transkripcije i može imati modifikaciju kao što je ovde otkriveno. Modifikacija najmanje jednog NTP molekula možda neće u značajnoj meri narušiti sintezu RNK posredovanu RNK polimerazom. Modifikacija NTP molekula može da uključuje, na primer, jednu ili više modifikovanih nukleozidnih baza, jedan ili više modifikovanih šećera, jedan ili više modifikovanih 5’-trifosfata. Modifikovani NTP može da se ugradi na 3’-kraj inicijacionog oligonukleotidnog prajmera sa kapom i ne blokira transkripciju i podržava dalju elongaciju prajmera.

4

[0128] U drugom primeru, modifikaciona grupa inicijacionog oligonukleotidnog prajmera može biti detektabilna oznaka ili marker koji se može detektovati. Dakle, nakon transkripcije, ciljna RNK, koja sadrži detektivnu etiketu ili marker, može se identifikovati prema veličini, masi, boji i/ili hvatanju afiniteta. U nekim primerima, etiketa ili marker koji se može detektovati je fluorescentna boja; a oznaka za hvatanje afiniteta je biotin. U određenim primerima, jedna ili više komponenti transkripcione reakcije (inicijacioni oligonukleotidni prajmer sa kapom i/ili NTP) mogu biti obeležene detektivnom etiketom ili markerom. Dakle, nakon transkripcije, molekul RNK može se identifikovati, na primer, veličinom, masom, hvatanjem afiniteta ili bojom. U nekim primerima detektivna etiketa je fluorescentna boja; a oznaka za hvatanje afiniteta je biotin.

[0129] Standardne metode hemijske i enzimske sinteze mogu se koristiti za sintezu "inicijacionih oligonukleotidnih prajmera sa kapom" i ovde su otkriveni u odeljku sa primerima.

Kitovi

[0130] Takođe se razmatraju kitovi koji uključuju "inicijacioni oligonukleotidni prajmer sa kapom" za izvođenje transkripcije. Na primer, kitovi mogu da sadrže sve transkripcione reagense za sintezu uobičajenih RNK (npr. FLuc mRNK). Preciznije, kit može da sadrži: „inicijacioni oligonukleotidni prajmer sa kapom“; kontejner označen za transkripciju; uputstva za izvođenje sinteze RNK; i jedan ili više reagenasa izabranih iz grupe koju čine jedan ili više modifikovanih ili nemodifikovanih inicijacionih oligonukleotidnih prajmera, jedan ili više nemodifikovanih NTP molekula, jedan ili više modifikovanih NTP (npr. pseudouridin 5'-trifosfat), RNK polimeraza, drugi enzimi, reakcioni pufer, magnezijum i DNK matricu.

[0131] Inicijacioni oligonukleotidni prajmeri sa kapom opisani ovde imaju značajnu prednost u odnosu na aktuelne postupke i kompozicije koje uključuju upotrebu različitih inicijacionih nukleozida, nukleotida i oligonukleotida ili upotrebu derivata dinukleotida polifos-fata koji sadrže Cap 0 strukturu, kao što su mCAP i ARCA. Inicijacioni oligonukleotidni prajmeri sa kapom su kompatibilni sa postojećim sistemima transkripcije i reagensima i nisu potrebni dodatni enzimi ili reagensi. Pored toga, upotreba inicijacionih oligonukleotidnih prajmera sa kapom čini nekoliko neenzimatskih i enzimatskih koraka (kao što je dodavanje kape i 2’-O-metilacija) nepotrebnim, smanjujući tako složenost procesa i troškove sinteze RNK.

[0132] Dok se primeri ovde opisanih postupaka odnose na transkripcionu reakciju posredovanu T7 RNK polimerazom, brojni drugi RNK polimeraze poznati u struci za upotrebu u reakcijama transkripcije mogu se koristiti sa ovde opisanim kompozicijama i postupcima. Ostali enzimi, uključujući prirodne ili mutirane varijante koje se mogu koristiti, uključuju, na primer, SP6 i T3 RNK polimeraze i RNK polimeraze iz drugih izvora, uključujući termostabilne RNK polimeraze.

[0133] Neke metode replikacije i amplifikacije nukleinske kiseline mogu da uključuju transkripciju kao deo procesa. Među ovim metodama su: amplifikacija posredovana transkripcijom (TMA) i amplifikacija zasnovana na sekvenci nukleinske kiseline (NASBA), sekvenciranje DNK i RNK i druge reakcije produženja nukleinske kiseline poznate u struci. Stručnjak će razumeti da se druge metode mogu koristiti ili umesto, ili zajedno sa metodama transkripcije, uključujući varijante transkripcionih reakcija razvijene u budućnosti.

Terapeutske upotrebe

[0134] Predmetno otkriće takođe razmatra proizvodnju mRNK koje sadrže inicijacioni oligonukleotidni prajmer sa kapom za upotrebu kao terapeutska sredstva u farmaceutskoj kompoziciji, uvođenje RNK koje sadrže inicijacioni oligonukleotidni prajmer sa kapom u ćelijama za lečenje medicinskog stanja ćelija ili uvođenje RNK koji sadrži inicijacioni oligonukleotidni prajmer sa kapom u ćelije koje koriste te RNK za proizvodnju proteina koji mogu imati terapeutski efekat na ćelije domaćina.

[0135] Jedna metoda za lečenje stanja koja koristi RNK koja sadrži inicijacioni oligonukleotidni prajmer sa kapom obuhvata korak davanja RNK koji sadrži inicijalni oligonukleotidni prajmer sa kapom formule I ili kompozicije koja sadrži takvu RNK kod subjekta koji ima ili sumnja da ima stanje čiji simptomi / simptomatologije se mogu smanjiti u težini ili eliminisati.

[0136] RNK koja sadrži inicijacioni oligonukleotidni prajmer sa kapom, formule I "jedinjenje", kada je formulisana u farmaceutski prihvatljivom nosaču i/ili farmaceutski prihvatljivoj soli u koncentraciji od 4 mg/ml ili manje, efikasna je za smanjenje simptoma i/ili simptomi za najmanje 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili više nego kod nelečene osobe koja ima samo farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0137] Farmaceutske smeše mogu se formulisati za primenu injekcijom ili drugim odgovarajućim putevima poznatim stručnjacima u lečenju određenog stanja. Sastav za injekcije za parenteralnu primenu obično sadrži aktivno jedinjenje u pogodnom rastvoru i/ili farmaceutskom nosaču kao što je sterilni fiziološki rastvor. Sastav se takođe može formulisati kao suspenzija u lipidu ili fosfolipidu, u liposomskoj suspenziji ili u vodenoj emulziji.

[0138] Postupci za pripremu različitih kompozicija i/ili formulacija poznati su stručnjacima u ovoj oblasti, videti Remington’s Pharmaceutical Sciences (19. izd., Villiams & Vilkins, 1995). Sastav koji će se primenjivati sadrži količinu izabranog jedinjenja u farmaceutski bezbednoj i efikasnoj količini za povećanje ekspresije željenog proteina u ciljnim ćelijama ili tkivu.

[0139] U nekim primerima, farmaceutska kompozicija sadrži najmanje 0,1% (m / v) jedinjenja, kao što je gore opisano, u nekim primerima farmaceutska kompozicija sadrži više od 0,1%, u nekim primerima farmaceutska kompozicija sadrži do oko 10 %, u nekim primerima, farmaceutska kompozicija sadrži do oko 5%, a u nekim primerima farmaceutska kompozicija sadrži do oko 1% (m / v) jedinjenja. Izbor pogodne koncentracije zavisi od faktora kao što su željena doza, učestalost i način isporuke aktivnog sredstva.

[0140] Za lečenje subjekta, kao što je sisar ili čovek, doze se određuju na osnovu faktora kao što su težina i celokupno zdravlje subjekta, stanje koje se leči, težina simptoma itd. Doze i koncentracije se određuju da proizvedu željenu korist, istovremeno izbegavajući neželjene neželjene efekte. Tipične doze predmetnih jedinjenja su u opsegu od oko 0.0005 do 500 mg / dan za ljudskog pacijenta i kreću se u nekim primerima između oko 1-100 mg / dan. Na primer, režimi većih doza uključuju npr.50-100, 75-100 ili 50-75 mg / dan, a režimi nižih doza uključuju npr. 1-50, 25-50 ili 1-25 mg / dan.

[0141] Predmetni pronalazak je ilustrovan sledećim neograničavajućim primerima. Prosečan stručnjak u ovoj oblasti lako će znati kako da sintetiše ili komercijalno dobije ovde opisane reagense i komponente.

PRIMER 1

Priprema 7-metilguanozin 5-difosfata (pp7mG) od guanozin 5’-difosfata (Slika 1)

[0142] Rastvoru za mešanje guanozin 5’-difosfata (2,5 mmol) u 40,0 ml vode dodaje se sirćetna kiselina da se pH rastvora prilagodi na 4,0. Ovoj smeši se dodaje kap po kap dimetil sulfat (4.0 mL) tokom perioda od 30 minuta i reakciona smeša se meša na sobnoj temperaturi 4 sata, održavajući pH reakcione smeše na oko 4.0, koristeći 0.1M rastvor NaOH. Posle 4 sata, reakciona smeša se ekstrahuje sa CH2Cl2 (3 x 50 ml) da bi se uklonio nereagovani dimetil sulfat. Vodeni sloj se razblaži vodom do 500 ml, podesi na pH 6,5 sa 1M TEAB i stavi u kolonu DEAE Sephadex (3 x 50 cm). Proizvod se eluira linearnim gradijentom od 0-1 M TEAB, pH 7,5 (3 L). Frakcije koje sadrže čisti pp7mG (trietilamonijumova so) se spajaju, isparavaju i suše pod visokim vakuumom dajući fini beli prah (prinos: 80%). Sličan postupak je otkriven u Bioorgan. Med. Chem. Letters 17:5295-5299 (2007).

PRIMER 2

Priprema 7-metilguanozin 5’-difosfat imidazolida (Im-pp7mG) od pp7mG (Slika 2)

[0143] Trietilamonijumova so pp<7m>G (0,4 mmol) reaguje sa imidazolom (4 mmol), trifenilfosfinom (2 mmol) i 2,2-dipiridil disulfidom (2 mmol) u suvom DMF (20 mL) tokom 8 sati. Sirovi Im-pp<7m>G se istaloži sipanjem reakcione smeše u 250 ml 0,2 M rastvora natrijum perhlorata. Smeša se ohladi na -20 °C i nastali talog se sakupi centrifugiranjem, ispere acetonom (3 x 50 ml) i osuši pod visokim vakuumom. Izolovani prinos Im-pp<7m>G je približno 100%.

Sličan postupak je prikazan u Nucleosides, Nucleotides, and Nucleic Acids 24:1131-1134 (2005) i J. Org. Chem.64:5836-5840 (1999).

PRIMER 3

Priprema 3’-O-metilguanozin 5’-fosfata (pGf3’Ome)) od 3’-O-metilguanozina

(Slika 3)

[0144] 3’-O-metilguanozin (10 mmol) se rastvara u trietilfosfatu (40 ml) na 60-70 ° C. Smeša se ohladi na 0 ° C u kupatilu sa ledenom vodom, doda se fosfor oksihlorid (30 mmol) i smeša se meša pod argonom 3 sata na sobnoj temperaturi. Reakcija se zaustavlja laganim dodavanjem 1M TEAB (100 ml; pH 8,5) uz mešanje. Smeša se meša 8 sati i razblaži sa 1 L vode. Dobijeni rastvor se nanosi na kolonu DEAE Sephadex (3 x 40 cm) i proizvod se eluira linearnim gradijentom 0,05 do 1,0 M (3 L) TEAB (pH 7,5). Frakcije koje sadrže čisti proizvod se kombinuju, upare do čvrstog ostatka i zajedno ispare sa metanolom (4 x 50 ml) dajući pG (3’ome) (trietilamonijevu so) u obliku bele čvrste supstance (prinos 60%). Sličan postupak je otkriven u serijskoj prijavi patentne prijave SAD.2012/0156751.

PRIMER 4

Priprema 3’-O-metilguanozin 5’-fosforimidazolida (Im-pG(3’Ome)) od pG(3’Ome)

(Slika 4)

[0145] Trietilamonijumova so pG (3'Ome) (0,5 mmol) reaguje sa imidazolom (5 mmol), trifenilfosfinom (2,5 mmol) i 2,2'-dipiridil disulfidom (2,5 mmol) u suvom DMF (25 mL) tokom 5 sati . Sirovi Im-pG (3’Ome) se taloži sipanjem reakcione smeše u 400 ml 0,2 M natrijum perhlorata u rastvoru acetona. Smeša se ohladi na -20°C i rezultujući talog se sakupi centrifugiranjem, ispere acetonom (3 x 60 ml) i osuši pod visokim vakuumom (prinos: 100%). Sličan postupak je otkriven u SAD patentnoj prijavi serijskog br.2012/0156751.

PRIMER 5

Priprema 3’-O-metilguanozin 5’-difosfata (ppG(3’Ome)) od Im-pG(3’Ome)

(Slika 5)

[0146] Čvrsti cink hlorid (14,0 mmol) dodaje se malim porcijama u rastvor Im-pG (3’Ome) (7,0 mmol) u suvom DMF (40 ml). Smeša se meša 15 minuta pod argonom dok se sve čvrste materije ne rastvore. Doda se rastvor 1M tributilamonijum-fosfata u DMF (40 ml) i smeša se meša na sobnoj temperaturi. Posle 5 sati smeša se razblaži sa 200 ml vode i ekstrahuje sa dihlorometanom (2 x 200 ml). Vodeni sloj se razblaži vodom (1 L), stavi na kolonu DEAE Sephadex (5 x 40 cm) i eluira linearnim gradijentom od 0,05 do 1,0 M (6 L) TEAB (pH 7,5). Frakcije koje sadrže čisti proizvod se kombinuju, ispare i zajedno ispare sa metanolom (4 x 50 ml) dajući ppG (3’Ome) (trietilamonijumovu so) u obliku bele čvrste supstance (prinos: 60%). Sličan postupak je prikazan u SAD patentnoj prijavi serijskog br.2012/0156751.

PRIMER 6

Priprema 7-metil-3’-O-metilguanozin 5-difosfata (pp7mG(3’Ome)) od ppG(3’Ome)

(Slika 6)

[0147] Priprema se rastvor ppG (3’Ome) (trietilamonijum soli; 3,0 mmol) u 50 ml vode i dodaje se ledena sirćetna kiselina da se pH rastvora prilagodi na 4,0. U ovu smešu se kap po kap dodaje dimetil sulfat (10,0 ml) tokom perioda od 30 minuta i reakciona smeša se meša na sobnoj temperaturi 4 sata, održavajući pH od 4,0±0,5, koristeći 0,1M rastvor NaOH. Posle 4 sata, reakciona smeša se ekstrahuje sa CH2Cl2 (3 x 150 ml) da bi se uklonio nereagovani dimetil sulfat. Vodeni sloj se podesi na pH 5,5, razblaži vodom (500 ml) i stavi u kolonu DEAE Sephadex (3 x 50 cm). Proizvod se eluira linearnim gradijentom od 0-1,0M TEAB, pH 7,5 (3 L). Frakcije koje sadrže čisti pp<7m>G3’Ome (trietilamonijum so) se spajaju, isparavaju i suše pod visokim vakuumom dajući fini beli prah (prinos: 80%). Sličan postupak je otkriven u RNA 9:1108-1122(2003); Nucleosides, Nucleotides & Nucleic acids 25:337-340 (2006); i SAD patentnoj prijavi serijski br.2012/0156751.

PRIMER 7

Priprema 7-metil-3’-O-metilguanozin 5-difosfat imidazolida (Im-pp<7m>G(3’Ome)) od pp<7m>G(3’Ome)

(Slika 7)

[0148] Protokol opisan u Primeru 1 se koristi za pripremu Im-pp<7m>G(3’Ome). Slična procedura je prikazana u RNA 14:1119-1131 (2008).

PRIMER 8

Opšta procedura za pripremu pN OR1)pN dinukleotida (R1= H ili Me)

(Slika 8)

[0149] Monomer fosforamidita (i) (1,0 mmol) i 2 ’, 3’, N-zaštićeni nukleozid (ii) (1,0 mmol) reaguju u 10 ml acetonitrila koji sadrži 2,5 molarnih ekvivalenata aktivatora (tetrazol). Posle 60 minuta mešanja na sobnoj temperaturi, intermedijarni proizvod se oksiduje iz stanja P (III) u P (V) jodom i ekstrahuje dihlorometanom (200 ml) i slanim rastvorom (200 ml). Organski sloj se osuši natrijum sulfatom i upari do čvrste pene (intermedijer (iii)).

[0150] Da bi se uklonila DMT zaštitna grupa, intermedijer (iii) se rastvara u 10 ml 80% sirćetne kiseline i, nakon završetka reakcije (oko 1-2 sata), smeša se ispari i zajedno ispari sa metanolom (5 x 30). mL) za uklanjanje sirćetne kiseline. Sirovi 5’-OH dimer (iv) je izolovan i prečišćen hromatografijom na silika gelu koristeći 5% metanola u dihlorometanu kao eluentu

[0151] 5’-OH dimer (iv) (1,0 mmol) je fosfitilovan sa 2 ekvivalenta bis-cijanoetil-N, N-diizopropil-fos-foramidita i 2 ekvivalenta aktivatora (tetrazola) u 10 ml acetonitrila. Posle 30 minuta mešanja na sobnoj temperaturi, 5’-fosfitilirani dimer se oksiduje iz stanja P (III) u P (V) jodom i ekstrahuje dihlorometanom (150 ml) i slanim rastvorom (150 ml). Organski sloj je uparen do uljnog ostatka, zajedno isparen sa metanolom (2 x 30 ml), rastvoren u 12 ml metanola i dodat je koncentrovani amonijak (12 ml). Smeša se drži na sobnoj temperaturi preko 48 sati dok se ne završi uklanjanje zaštite sa dimera pN2’OR1pN (v). Smeša je uparena i uparena sa metanolom (2 x 30 ml).

[0152] Kada je R = metil, sirovi dimer (v) se direktno prečišćava anjonskom izmenom i reverzno-faznom hromatografijom (Korak 5). Frakcije se uparavaju kako bi dale finalni pN2’OR1pN dimer (v) (v; R1 = metil; trietilamonijum so) u vidu čvrste supstance bele boje (35% ukupni prinos).

[0153] Kada je R = TBDMS, sirovi dimer (v) se tretira (Korak 4B) sa HF-3TEA smešom kako bi se uklonila 2’-OTBDMS zaštitna grupa (Org. Biomol. Chem. 3:3851-3868 (2005) i Nucl. Acids Res. 22:2430-2431 (1994)). Kada je reakcija okončana, smeša se razblažuje sa 0.05M TEAB i prečišćava anjonskom izmenom i reverzno-faznom hromatografijom (Korak 5). Frakcije se uparavaju kako bi dale finalni pN2’OR1pN dimer (v) (R1 = H; trietilamonijum so) u vidu čvrste supstance bele boje (ukupni prinos 30%).

PRIMER 9

Opšta procedura za sintezu inicijacionih oligonukleotida sa Cap 0, Cap 1 ili Cap 2 strukturama (u primeru se koristi 5’- fosforilisani dinukleotid)

(Slika 9)

A. Pristup 1:

4

[0154] U suspenziju Im-pp<7m>G(3’Ome) ili Im-pp<7m>G (2 mmol; oblik natrijumove soli) i 5’-fosforilisanog dinukleotida (1 mmol; trietilamonijum so) u DMF (50 mL), polako se dodaje anhidrovani ZnCl2 (1 g) dok se smeša meša na 35°C. Posle 24 sata reakcija se zaustavlja 25 mM rastvor EDTA u vodi (500 mL) i neutrališe 1M rastvorom natrijum bikarbonata. Smeša se razblažuje do 1L sa vodom i nanosi na DEAE Sephadex kolonu (3 x 50 cm). Proizvod se eluira upotrebom linearnog gradijenta 0-1 M amonijum bikarbonata, pH 7.2 (2 L). Frakcije koje sadrže čist proizvod se spajaju, uparavaju i suše pod visokim vakuumom kako bi dale fini beli prah (prinos: 60%). Sličan pristup je prikazan u SAD patentnoj prijavi serijskog br. 2012/0156751; Bioorg. Med. Chem. Lett.17:5295-5299 (2007) i RNA 14:1119-1131 (2008).

B. Pristup 2:

[0155] Im-pp<7m>G(3’Ome) ili Im-pp<7m>G (2 mmol) se rastvara u N-metil morfolinskom puferu (0.2 M, pH 7.0, 10 mL) koji sadrži MnCl2 (2 mmol) i dodaje čvrstom 5’-fosforilisanom dinukleotidu (1 mmol; trietilamonijum so). Reakcija se meša na sobnoj temperaturi. Nakon 24-40 sati reakcija se zaustavlja sa 10 mL 0.25M rastvora EDTA. Smeša se nanosi na DEAE Sephadex kolonu (3 x 50 cm). proizvod se eluira pomoću linearnog gradijenta 0-1.0M amonijum bikarbonata, pH 7.2 (2 L). Frakcije koje sadrže čist proizvod se spajaju, uparavaju i suše pod visokim vakuumom kako bi dale fini beli prah (prinos 50%). Sličan pristup je prikazan u Bioorganic & Medicinal Chemistry 21:7921-7928 (2013), Nucleic Acids Research 37:1925-1935 (2009); J. Org. Chem.

64:5836-5840 (1999). (Napomena: 1. A 5’-fosforilisani trimerni, tetramerni, pentamerni, heksamerni, heptamerni, oktamerni, nanomerni ili dekamerni oligonukleotid može da se koristi umesto 5’-fosforilisanog dinukleotida, kao što je ilustrovano u Primeru 9. 2. Kako bi se pripremio inicijacioni oligonucleotid sa kapom Cap 0, 5’-fosforilisani oligonukleotid nema 2’-O-metil grupe na prvim 5’- nukleozidnim ostacima, e.g. pApG.3. Kako bi se pripremio inicijacioni oligonukleotid sa kapom Cap 1, 5’- fosforilisani oligonukleotid nosi jednu 2’-O-metil grupu na prvom 5’-nukleozidnom ostatku, npr. pA(2’Ome)pG. 4. Kako bi se pripremio inicijacioni oligonucleotid sa kapom Cap 2, 5’- fosforilisani oligonukleotid nosi dve 2’-O-metil groupe n prvom i drugom 5’-nukleozidnom ostatku, npr. pA(2’Ome)pG(2’Ome)pG).

PRIMER 10

Strukture inicijacionih oligonukleotidnih prajmera sa kapom prema Formuli I

[0156] Slika 10 prikazuje strukture inicijacionih oligonukleotidnih prajmera sa kapom koji se koriste u primerima prema Strukturi I. A)<m7>G3’OmepppG, B)<m7>GpppG2’OmepG, C)<m7>G3’OmepppG2’OmepG, D)<m7>GpppA2’OmepG, E)<m7>G3’OmepppA2’OmepG, F)<m7>GpppC2’OmepG,, G)

<m7>G3’OmepppC2OmepG,, H)<m7>GpppA2’OmepG2’OmepG

PRIMER 11

In vitro transkripcija pomoću ARCA prajmera

[0157] Dvolančana matrica za transkripciju DNK, koja kodira luciferazu svica, generisana je lančanom reakcijom polimeraze. Nukleotid matrice 1 bio je 2’-deoksicitidin. Transkripcione reakcije su sastavljene sa 25 ug/ml matrice za transkripciju, 40 mM Tris-HCl (pH 8,0), 27 mM MgCl2, 2 mM spermidina, 10 mM DTT, 0,002% Triton X-100, 1000 jedinica/ml inhibitora mišje RNaze (New England Biolabs kataloški broj M0314), 2 jedinice/mL neorganske pirofosfataze (New England Biolabs kataloški broj M2403), 4000 jedinica/ml T7 RNK polimeraze (New England Biolabs kataloški broj M0251), 6 mM ARCA (<m7>G3'OmepppGG), 1,5 mM GTP , 7,5 mM ATP, 7,5 mM CTP i 7,5 mM UTP. Transkripcije su inkubirane na 37 ° C tokom 2 sata. Reakcije su dopunjene sa 10 mM Tris-HCl (pH 7,6), 2,5 mM MgCl2, 0,5 mM CaCl2 i 100 jedinica/ml DNaze I (New England Biolabs kataloški broj M0303) i inkubirane 1 sat na 37 ° C. Dobijene mRNK su prečišćene upotrebom RNeasy maxi kita (Qiagen kataloški broj 75162) u skladu sa uputstvima proizvođača. mRNK su eluirane u vodi i defosforilisane podešavanjem rastvora na 50 mM Bis-Tris-propan HCl (pH 6,0), 1 mM MgCl2, 0,1 mM ZnCl2 i 250 jedinica/mg Antarktik fosfataze (New England Biolabs kataloški broj M0289). Reakcije su inkubirane na 37 °C tokom 1 sata. Dobijene mRNK su prečišćene upotrebom RNeasy Maxi kita (Qiagen kataloški broj 75162) u skladu sa uputstvima proizvođača. mRNK su eluirane u vodi.

PRIMER 12

In vitro transkripcija pomoću trimernih inicijacionih oligonukleotidnih prajmera sa kapom

[0158] Neki inicijacioni oligonukleotidni prajmeri koji se koriste u transkripcijama navedeni su u Tabeli 1. Dvolančana DNK matrica za transkripciju luciferaze specifična za svaki trimer generiše se lančanom reakcijom polimeraze. Ove matrice su se razlikovali po nukleotidima matrice 1 i 2. Za dati trimer, nukleotid matrice 1 bio je komplementaran B1 (nukleotid kome je suđeno da postane transkript nukleotid 1). Slično tome, nukleotid matrice 2 bio je komplementaran B10 (nukleotid kome je suđeno da postane transkriptirani nukleotid 2; videti Primer 10)). Transkripcione reakcije se sastavljaju sa matricom za transkripciju od 25 ug/ml, 40 mM Tris-HCl (pH 8,0), 27 mM MgCl2, 2 mM spermidina, 10 mM DTT, 0,002% Triton X-100, 1000 jedinica/ml inhibitora mišje RNaze New England Biolabs kataloški broj M0314), 2 jedinice/mL neorganske pirofosfataze (New England Biolabs kataloški broj M2403), 4000 jedinica/ml T7 RNK polimeraze (New England Biolabs kataloški broj M0251) i 6 mM inicijacionog oligonukleotidnog prajmera sa kapom, 1,5 mM GTP i 7,5 mM ATP, CTP i UTP. U sledećim primerima, ova formulacija prajmer/NTP će se nazivati formulacija prajmer/NTP 1. Stručnjaku je jasno da se druge polimeraze kao što su T7, T3 ili SP6 RNK polimeraze umesto T7 RNK polimeraze mogu koristiti da obavljaju istu funkciju koristeći njihove odgovarajuće promotore. Smeše transkripcionih reakcija se inkubiraju na 37°C tokom 2 sata. Reakcije su dopunjene sa 10 mM Tris-HCl (pH 7,6), 2,5 mM MgCl2, 0,5 mM CaCl2 i 100 jedinica/ml DNaze I (katalog New England Biolabs broj M0303) i inkubirane 1 sat na 37 °C. Dobijene mRNK se prečišćavaju pomoću RNeasy Maxi kita (Qiagen kataloški broj 75162) u skladu sa uputstvima proizvođača. mRNK se eluiraju u vodi i defosforiluju podešavanjem rastvora na 50 mM Bis-Tris-Propan HCl (pH 6,0), 1 mM MgCl2, 0,1 mM ZnCl2 i 250 jedinica/mg Antarktik fosfataze (New England Biolabs kataloški broj M0289). Reakcija se inkubira na 37 °C tokom 1 sata. Dobijene mRNK se prečišćavaju pomoću RNeasy Maxi kita (Qiagen kataloški broj 75162) u skladu sa uputstvima proizvođača. mRNK se eluiraju u vodi.

PRIMER 13

In vitro transkripcija pomoću tetramernog inicijacionog oligonukleotidnog prajmera

<7m>G3’OmepppA2’OmepG2’OmepG

[0159] Inicijacioni oligonukleotidni prajmer 7mG3’OmepppA2’OmepG2’OmepG je korišćen u transkripciji. Transkripcija je izvedena kao u Primeru 11 sa sledećim modifikacijama. Dvolančana DNK transkripcija matrice specifična za tetramer je generisana lančanom reakcijom polimeraze. Nukleotid matrice 1 deoksitimidin) bio je komplementaran sa Adenozinom (prvi nukleotid prajmera namenjen da postane transkript nukleotid 1). Slično tome, nukleotid matrice 2 (2’-deoksicitidin) bio je komplementaran sa guanozinom (drugi nukleotid prajmera namenjen da postane transkript nukleotid 2). Slično tome, nukleotid matrice 3

deoksicitidin) bio je komplementaran sa guanozinom (treći nukleotid prajmera namenjen da postane transkripcioni nukleotid 3). Transkripcione reakcije su sastavljene sa 25 ug / ml matricom za transkripciju, 40 mM Tris-HCl (pH 8,0), 27 mM MgCl2, 2 mM spermidina, 10 mM DTT, 0,002% Triton X-100, 1000 jedinica/ml inhibitora mišje RNaze (novo England Biolabs kataloški broj M0314), 2 jedinice / mL neorganske piro-fosfataze (New England Biolabs kataloški broj M2403), 4000 jedinica/ml T7 RNK polimeraze (New England Biolabs kataloški broj M0251), 6 mM inicijacionog oligonukleotidnog prajmera sa kapom<7m>G3'OMepppA2

'OMepG2OMepG, 1,5 mM GTP, 7,5 mM ATP, 7,5 mM UTP i 7,5 mM CTP. Stručnjaku je jasno

4

da bi druge polimeraze kao što su T7, T3 ili SP6 RNK polimeraze umesto T7 RNK polimeraze mogle da se koriste za obavljanje iste funkcije korišćenjem njihovih odgovarajućih promotora. Reakcione smeše transkripcije su inkubirane na 37 ° C tokom 2 sata, reakcije su dopunjene sa 10 mM Tris-HCl (pH 7,6), 2,5 mM MgCl2, 0,5 mM CaCl2 i 100 jedinica/ml DNaze I (New England Biolabs kataloški broj M0303) i inkubirano 1 sat na 37 °C. Dobijene mRNK su prečišćene upotrebom RNeasy maxi kita (Qiagen kataloški broj 75162) u skladu sa uputstvima proizvođača. mRNK su eluirane u vodi i defosforilisane podešavanjem rastvora na 50 mM Bis-Tris-Propane HCl (pH 6,0), 1 mM MgCl2, 0,1 mM ZnCl2 i 250 jedinica/mg Antarktik fosfataze (New England Biolabs kataloški broj M0289). Reakcija je inkubirana na 37 ° C tokom 1 sata. Dobijene mRNK su prečišćene upotrebom RNeasy maxi kita (Qiagen kataloški broj 75162) u skladu sa uputstvima proizvođača. mRNK su eluirane u vodi.

PRIMER 14

In vitro transkripcija pomoću<m7>GpppA2’OmepG inicijacionih oligonukleotidnih prajmera sa kapom na transkripcionoj matrici sa 2’-deoksitimidinskim i 2’-deoksicitidinskim ostacima na pozicijama matrice 1 i 2, redom.

[0160] Korišćena je dvolančana DNK matrica za luciferazu svica, sa 2’-deoksitimidinskim i 2’-deoksicitidinskim ostacima na pozicijama matrice 1 i 2, redom. Formirane su dve reakcije transkripcije sa 25 ug/mL transkripcione matrice, 40 mM Tris-HCl (pH 8.0), 27 mM MgCl2, 2 mM spermidina, 10 mM DTT, 0.002% Triton X-100, 1000 jedinica/mL inhibitora mišije RNaze (New England Biolabs kataloški br. M0314), 2 jedinice/mL neorganske pirofosfataze (New England Biolabs kataloški broj M2403), 4000 jedinica/mL T7 RNK polimeraza (New England Biolabs kataloški broj M0251). Dve transkripcije su se razlikovale po količini inicijacionog nukleotida sa kapom, količini NTP molekula i vrsti NTP molekula. Prva transkripcija je dizajnirana tako da podražava uslove transkripcije prema Ishicawa et al. (Nucleic Acids Symposium Series No. 53:129 (2009)). Ova reakcija transkripcije sadržala je 6 mM

<m7>GpppA2’OmepG inicijacionog nukleotidnog prajmera sa kapom, 0.9 mM GTP i 7.5 mM ATP, CTP i UTP. U primerima koji slede, ova Prajmer/NTP formulacija će biti označena kao Prajmer/NTP Formulacija 2. U ovoj formulaciji, inicijacioni oligonukleotidni prajmer bio je u višku većem od šestostrukog u odnosu na GTP. U drugoj transkripciji je korišćeno 5 mM

<m7>GpppA2’OmepG inicijacionog oligonukleotidnog prajmera sa kapom, 5 mM GTP, ATP, CTP i pseudouridin trifosfata (ΨTP). U primerima koji slede, ova Prajmer/NTP formulacija će biti označena kao Prajmer/NTP Formulacija 3. U Prajmer/NTP Formulaciji 3, koncentracija GTP je povećana kako bi bile proizvedene komercijalno korisne količine RNK. Stručnjaku u oblasti je jasno da bi druge polimeraze kao što su T7, T3 ili SP6 RNK polimeraze umesto T7 RNK polimeraze mogle da se koriste za obavljanje iste funkcije korišćenjem njihovih odgovarajućih promotora. Smeše transkripcionih reakcija se inkubiraju na 37 ° C tokom 2 sata. Reakcije su dopunjene sa 10 mM Tris-HCl (pH 7,6), 2,5 mM MgCl2, 0,5 mM CaCl2 i 100 jedinica/ml DNaze I (New England Biolabs kataloški broj M0303) i inkubirane 1 sat na 37 ° C. Dobijene mRNK su prečišćene upotrebom RNeasy maxi kita (Qiagen kataloški broj 75162) u skladu sa uputstvima proizvođača. mRNK su eluirane u vodi i defosforilisane podešavanjem rastvora na 50 mM Bis-Tris-Propan HCl (pH 6,0), 1 mM MgCl2, 0,1 mM ZnCl2 i 250 jedinica/mg antarktik fosfataze (New England Biolabs kataloški broj M0289). Reakcija je inkubirana na 37 ° C tokom 1 sata za Prajmer/NTP Formulaciju 2 i 3 sata za Prajmer/NTP Formulaciju 3. Dobijene mRNK su prečišćene upotrebom RNeasy maxi kita (Qiagen kataloški broj 75162) u skladu sa uputstvima proizvođača. mRNK su eluirane u vodi. Prečišćeni prinosi transkripcije sa Prajmer/NTP formulacijama 2 i 3 bili su 0,7 miligrama/mililitru transkripcione reakcije (mg/ml), odnosno 3,9 mg/ml transkripcione reakcije, redom. Prinos sa Prajmer/NTP Formulacijom 3 bio je znatno bolji od onog dobijenog sa Prajmer/NTP Formulacijom 2.

PRIMER 15

In vitro transkripcija pomoću<m7>GpppA2’OmepG inicijacionih oligonukleotidnih prajmera sa kapom na trankripcionoj matrici sa citidinskim ostacima na pozicijama matrice 1 i 2

[0161] Korišćen je dvolančani matrica transkripcije DNK luciferaze DNK u kome su nukleotidi 1 i 2 matrice bili citidini i stoga nisu u potpunosti komplementarni sa<m7>GpppA2’OmepG inicijacionim oligonukleotidnim prajmerom sa kapom. Dve transkripcione reakcije su sastavljene sa 25 ug/ml matrice za transkripciju, 40 mM Tris-HCl (pH 8,0), 27 mM MgCl2, 2 mM spermidina, 10 mM DTT, 0,002% Triton X-100, 1000 jedinica/ml inhibitora mišje RNaze ( New England Biolabs kataloški broj M0314), 2 jedinice/mL neorganske pirofosfataze (New England Biolabs kataloški broj M2403), 4000 jedinica/ml T7 RNK polimeraze (New England Biolabs kataloški broj M0251). Dve transkripcije su se razlikovale u količini inicijacionih oligonukleotida sa kapom i NTP molekula. Prva transkripcija je dizajnirana da imitira uslove transkripcije Ishicawa et al. (Nucleic Acids Symposium Series No.53: 129 (2009). Ova reakcija transkripcije sadržala je Prajmer/NTP Formulaciju 2. Druga transkripcija je koristila Prajmer/NTP Formulaciju 3. Stručnjaku je jasno da se druge polimeraze kao što su T7, T3 ili SP6 RNK polimeraze umesto T7 RNK polimeraze mogu koristiti za obavljaju istu funkciju koristeći njihove odgovarajuće promotore. Reakcione smeše transkripcije su inkubirane na 37 ° C tokom 2 sata. Reakcije su dopunjene sa 10 mM Tris-HCl (pH 7,6), 2,5 mM MgCl2, 0,5 mM

4

CaCl2 i 100 jedinica/ml DNaze I (New England Biolabs kataloški broj M0303) i inkubirane 1 sat na 37 °C. Dobijene mRNK su prečišćene upotrebom RNeasy maxi kita (Qiagen kataloški broj 75162) u skladu sa uputstvima proizvođača ili tečnom hromatografijom visokih performansi reverzne faze. mRNK su defosforilisane podešavanjem rastvora na 50 mM Bis-Tris-Propane HCl (pH 6,0), 1 mM MgCl2, 0,1 mM ZnCl2 i 250 jedinica/mg Antarktik fosfataze (New England Biolabs kataloški broj M0289). Reakcije su inkubirane na 37 ° C tokom 1 sata za Prajmer/NTP Formulaciju 2 i 3 sata za Prajmer/NTP Formulaciju 3. Dobijene mRNK su prečišćene upotrebom RNeasy maxi kita (Qiagen kataloški broj 75162) u skladu sa uputstvima proizvođača. mRNK su eluirane u vodi. Prinosi prečišćene transkripcije sa Prajmer/NTP formulacijama 2 i 3 bili su 0,6 miligrama / mililitra transkripcione reakcije (mg / ml), odnosno 3,9 mg / ml transkripcione reakcije. Prinos sa Prajmer/NTP Formulacijom 3 bio je znatno bolji od onog dobijenog Prajmer/NTP Formulacijom 2.

PRIMER 16

Translacija mRNK molekula u Huh-7 ćelijama

(Slika 11)

[0162] Translaciona aktivnost mRNK molekula za luciferazu koji su generisani pomoću inicijacionih oligonukleotidnih prajmera sa kapom, procenjena je u kulturi hepatocita, u triplikatu. Huh-7 ćelije su gajene u DMEM medijumu suplementiranom sa 10% FBS, L-glutaminom, neesencijalnim aminokiselinama i penicilinom/streptomicinom, na 37°C u atmosferi sa 5% CO2. Ćelije su transfektovane sa 400 ng mRNK. Za poređenje, ćelije su takođe transfektovane mNKK CapO luciferaze generisane inicijacijom sa ARCA. Posle 20 sati, ćelije su sakupljene i merena je aktivnost luciferaze pomoću kita za ispitivanje sistema luciferaze ONE-Glo (Promega kataloški broj E6120) prema preporukama proizvođača. Luminescencija je merena pomoću instrumenta GloMax-Multi Detection System prema preporukama proizvođača. Aktivnost luciferaze je detektovana za sve testirane mRNK (slika 11). Činjenica da se mRNK generisane inicijacionim oligonukleotidnim prajmerima sa kapom ili 3’-O-metil-inicijacionim oligonukleotidnim prajmerima sa kapom prevode sa sličnom efikasnošću u RNK sa ARCA kapom, ukazuje na to da su efikasno ograničene ko-transkripcijom.

PRIMER 17

Test za određivanje efikasnosti obrazovanja kape na mRNK koja se dobija kotranskripcionim obrazovanjem kape pomoću ARCA ili inicijacionog oligonukleotidnog prajmera sa kapom, koristeći Prajmer/NTP Formulaciju 1.

4

(Slike 12A-12H)

[0163] Za svaki testirani inicijacioni oligonukleotidni prajmer sa kapom, količine mRNK dovoljne za detekciju tečnom hromatografijom-masenom spektroskopijom (LC-MS) podvrgnute su testu dodavanja kape. U ovom testu, mali fragment je otcepljen sa 5’ kraja mRNK pune dužine i ona je analizirana pomoću LC-MS. Pre otcepljivanja, mRNK je tretirana Antarktik fosfatazom (New England Biolabs, kataloški broj M0289) kako bi se monofosfati, difosfati i trifosfati bez kape konvertovali u 5’ OH, a da bi se olakšala analiza. mRNK tretirana fosfatazom je zatim podvrgnuta otcepljivanju i prečišćena. Prečišćena RNK je podvrgnuta LC-MS analizi. Slika 12 prikazuje LC tragove. Za LC pikove koji odgovaraju odsustvu kape (5’ OH nakon tretmana fosfatazom) i prisustvu Cap 1 naznačene su zabeležene mase. Umetnuta šema prikazuje poravnanje inicijacionog nukleotidnog prajmera na transkripcionoj matrici. Uočiti na šemi da "|" označava sparenu bazu inicijacionog nukleotida sa kapom, sa nuklotidom matrice. Subskript "m" označava 2’-O-metil grupu, a superskript "m7" označava metilaciju baze. u cilju poređenja, mRNK kojoj je kotranskripciono dodata kapa pomoću ARCA podvrgnuta je testu dodavanja kape. Efikasnost dodavanja kape je procenjena pomoću sledeće formule (intenzitet pikova sa kapom)/[ (intenzitet pika sa kapom) (intenzitet 5’ OH pika)]. Zabeleženi % dodavanja kape na Slici 12 bio je A)<m7>G3’OmepppG = 79%, B)<m7>GpppG2’OmepG = 89%, C)<m7>G3’OmepppG2’OmePG= 87%, D)<m7>GpppA2’OmepG= 99%, E)<m7>G3’OmepppA2’OmepG = 99%, F)<m7>GpppC2’OmepG = 98%, G)<m7>G3’OmepppC2’OmepG = 97%, H)<m7>GpppA2’OmepG2’OmepG = 50%. U svakom ovom slučaju, efikasnost dodavanja kape na transkripte kojima su kotranslaciono dodati inicijacioni trimerni oligonukleotidni prajmeri sa kapom, bila je veća od efikasnosti koja je zabeležena sa

<m7>G3’OmepppG (ARCA).

Primer 18

Poređenje dodavanja kape pomoću<m7>GpppA2’OmepG inicijacionog oligonukleotida sa kapom, na transkripcionu matricu sa 2’-deoksitimidinskim i 2’-deoksicitidinskim ostacima na pozicijama matrice 1 i 2, sa dodavanjem na transkripcionu matricu sa citidinskim ostacima na pozicijama matrice 1 i 2

(Slike 13A-13D)

[0164] mRNK molekuli napravljeni u Primerima 14 i 15 podvrgnuti su testu postavljanja kape kako bi se odredila relativna efikasnost i specifičnost postavljanja kape na transkripte sa 2’-deoksitimidinskim i 2’-deoksicitidinskim ostacima na 1 i 2 pozicijama matrice u odnosu na transkripcionu matricu sa citidinskim ostacima na pozicijama 1 i 2 matrice. Količine mRNK

4

dovoljne za detekciju tečnom hromatografijom-masenom spektroskopijom (LC-MS) podvrgnute su testu dodavanja kape. U ovom testu, mali fragment je otcepljen sa 5’ kraja mRNK pune dužine i analiziran pomoću LC-MS. Pre otcepljivanja, mRNK je tretirana Antarktik fosfatazom (New England Biolabs kataloški broj M0289) kako bi se monofosfati, difosfati i trifosfati bez kape konvertovali u 5’ OH, a da bi se olakšala analiza. mRNK tretirana fosfatazom je zatim podvrgnuta otcepljivanju i prečišćena. Prečišćena RNK je podvrgnuta LC-MS analizi. Slika 13 prikazuje LC tragove. Za LC pikove koji odgovaraju odsustvu kape i prisustvu Cap 1 naznačene su zabeležene mase. Umetnuta šema prikazuje poravnanje inicijacionog nukleotidnog prajmera na transkripcionoj matrici. Subskript "m" označava 2’-O-metil grupu, a superskript "m7" označava metilaciju baze. Transkripti sa slike 13A i 13B transkribovani su sa matrica sa 2’-deoksitimidinskim i 2’-deoksicitidinskim nuklotidima na poziciji 1 i 2 matrice, redom, pomoću Prajmer/NTP Formulacija 2 i 3, redom. Slike 13C i 13D su transkripti transkribovani sa obrazaca sa 2’-deoksicitidinima na nukleotidima matrice 1 i 2, koristeći Prajmer/NTP formulacije 2, odnosno 3. Kada je<m7>GpppA2’OmepG inicijacioni oligonukleotid u potpunosti komplementaran sa 1 i 2 nukleotidima, glavni uočeni proizvod bio je željeni transkript matrice Cap 1 pokrenut<m7>GpppA2’OmepG ... (slike 13A i 13B). Za slike 13A i 13B napravljena je procena efikasnosti dodavanja kape korišćenjem sledeće formule (intenzitet pikova sa kapom)/[(intenzitet pika sa kapom) (intenzitet 5 'OH pika)] i efikasnosti dodavanja kape pomoću Prajmer/NTP Formulacije 2 i Prajmer/NTP Formulacije 3 su iznosile 99%, odnosno 96%. Detektovani su samo manji aberantni proizvodi inicijacije. Suprotno tome, kada su nukleotidi matrice 1 i 2 citidini, ne postoji savršena komplementarnost između<m7>GpppA2’OmepG inicijacionih oligonukleotida i ovih nukleotida matrice. Slike 13C i 13D pokazuju da je inicijacioni oligonukleotid sa kapom dovodi do inicijacije u dva registra. U prvom registru, 3’guanozinsi ostatak inicijacionog oligonukleotida sa kapom sparuje se sa 1 citidinom matrice da bi se stvorio transkript sa dodatnim 5’ adenozinom koji nije u matrici (Cap 1 A). Uočiti na šemi da "|" označava bazni par inicijacionog nukleotida sa sa kapom sa nukleotidom matrice. Označena je pozicija nukleotida matrice. U drugom registru, ostatak 3 ’guanozina inicijacionog oligonukleotida sa kapom sparen sa 2 citidinom matrice i 1 adenozin inicijacionog oligonukleotida sa kapom ne formira potpuni hibrid sa 1 nukleotidom matrice. Ovo daje transkript gde je 5 ’guanozin matrice zamenjen adenozinom koga nema u matrici (Cap 1 GuA). Procena efikasnosti ograničavanja napravljena je pomoću sledeće formule (intenzitet pikova sa kapom "Cap1 A" "Cap1 GuA")/[(intenzitet pikova sa kapom "Cap 1 A" "Cap 1 GuA") (intenzitet 5 'OH pika)]. Izračunata efikasnost dodavanja kape na Slici 13C i 13D bila je 97 i 77 %. Zabeležili smo iznenađujuće otkriće da su efikasnost dodavanja kape i vernost inicijacije transkripcije na osnovu matrice bile mnogo više kada je inicijacioni oligonukleotidni prajmer sa kapom bio potpuno

4

komplementaran 1 i 2 nukleotidima odgovarajuće matrice. Osim toga, efikasno dodavanje kape pomoću našeg postupka može da se postigne bez smanjenja koncentracije NTP molekula koji iniciraju dodavanje kape, što obezbeđuje mnogo veće prinose transkripcije. Postupak za dodavanje kape koji mi opisujemo, različit je, i bolji, u odnosu na postupak iz publikacije autora Ishikawa et al.

Primer 19

(Slika 14A-14B)

Poređenje translacije, u diferenciranim THP-1 ćelijama, mRNK koja je napravljena pomoću<m7>GpppA2’OmepG inicijacionog oligonukleotida sa kapom, na transkripcionoj matrici sa 2’-deoksitimidinskim i 2’-deoksicitidinskim ostacima na poziciji matrice 1 i 2, nasuprot transkripcionoj matrici sa citidinskim ostacima na poziciji matrice 1 i 2

[0165] Kako bi bila ocenjena ekspresija mRNK molekula za luciferazu koji su generisani u Primerima 14 i 15, THP-1 ćelije (ATCC, kataloški broj TIB-202) su transfektovane mRNK molekulima, u šest replikata. THP-1 ćelije su gajene u medijumu RPMI-1640 (ATCC, kataloški broj 30-2001), koji je formulisala ATCC, i koji je suplementiran sa 10% FBS, natrijum piruvatom i penicilinom/streptomicinom na 37°C u atmosferi sa 5% CO2. Ćelije su zasejavane sa gustinom od 2E+05 ćelija po bunaru u formatu ploče sa 24 bunara, u prisustvu forbol estra, 12-O-tetradekanoilforbol-13-acetata (TPA; Cell Signaling Technologies, kataloški broj 4174), kako bi se indukovala diferencijacija. Ćelije su transfektovane sa 100 ng mRNK po bunaru, 72 sata nakon zasejavanja. U cilju poređenja, ćelije su transfektovane i sa CapO mRNK molekulima za luciferazu koji su generisani putem inicijacije sa ARCA. 20 sati nakon transfekcije, ćelije su sakupljane i luciferazna aktivnost je merena uz pomoć kita ONE-Glo Luciferase Assay System kit (Promega, kataloški broj E6120) u skladu sa preporukama proizvođača. Luminescencija je merena pomoću instrumenta GloMax- Multi+ Detection System, u skladu sa preporukama proizvođača. Podaci su grafički predstavljeni kao srednja vrednost šest replikata /- standardna devijacija od srednje vrednosti. Podaci su analizirani neuparenim t-testom kako bi se generisale p vrednosti kao mera značajnosti. Naznačena je p-vrednost za parove. Translacija je poređena kod THP-1 ćelija za transkripte generisane pomoću<m7>GpppA2’OmepG inicijacionog oligonukleotida sa kapom i matrice koja sadrži 2’-deoksitimidinske i 2’-deoksicitidinske ostatke na 1 i 2 pozicijama matrice ("TC" matrica) u odnosu na transkripcionu matricu sa citidinskim ostacima na 1 i 2 pozicijama matrice ("CC" matrica). A) Transkripcija je sprovedena pomoću Prajmer/NTP Formulacije 2 ili B) Prajmer/NTP Formulacije 3. Sa obe formulacije, translacija u gajenim THP-1 ćelijama bila je značajno bolja kada je<m7>GpppA2’OmepG inicijacioni

4

oligonukleotidni prajmer sa kapom bio potpuno komplementaran sa nukleotidima matrice 1 i 2 ("TC" matrica), kao što je opisano u aktuelnom prikazu. Na Slici 14B, takođe smo ocenjivali aktivnost mRNK koja je napravljena pomoću "TC" matrice, a kapa joj je dodata pomoću ARCA (Cap 0). ovo je trenutno industrijski standard za kotranskripciono generisanje mRNK molekula sa kapom. ARCA RNK sa kapom imala je značajno nižu aktivnost od transkripata napravljenih kada je<m7>GpppA2’OmepG oligonukleotidni prajmer sa kapom bio potpuno komplementaran sa nukleotidima matrice 1 i 2 ("TC" matrica).

[0166] U zaključku, ovde prikazani Primeri pokazuju da, u odnosu na prethodno objavljene postupke, postupci koji su ovde opisani generišu molekule RNK sa kombinacijom 1) visokog prinosa, 2) visokog prisustva kapa, 3) velike vernosti transkripcije na osnovu matrice i 4) superiorne aktivnosti u ćelijama.

[0167] Pronalasci koji su u ovom dokumentu ilustrativno opisani mogu pogodno da se praktikuju u odsustvu bilo kog, jednog ili više elementa, jednog ili više ograničenja, koja ovde nisu specifično prikazana. Tako, na primer, izrazi „a“ i „an“ i „the“ i slični referenti u kontekstu opisivanja pronalaska (posebno u kontekstu sledećih zahteva) treba da se tumače tako da pokrivaju i jedninu i množinu , osim ako je ovde drugačije naznačeno ili je kontekstom jasno protivrečno. Izrazi „sadrži“, „ima“, „uključujući,„ sadrži “, itd., Čitaće se ekspanzivno i bez ograničenja (npr., Što znači„ uključujući, ali ne ograničavajući se na njih “). Recitovanje opsega vrednosti ovde je samo namenjeno da služi kao stenografska metoda pojedinačnog pozivanja na svaku zasebnu vrednost koja spada u opseg, osim ako je ovde drugačije naznačeno, a svaka posebna vrednost je ugrađena u specifikaciju kao da je ovde pojedinačno navedena. Sve ovde opisane metode mogu se izvoditi u bilo kojoj pogodnoj Ako ovde nije drugačije naznačeno ili kontekst na drugi način jasno nalaže drugačije. Upotreba bilo kog ili svih primera ili jezika za opisivanje primera (npr. „kao što je“) koji je ovde dat, namenjena je samo boljem osvetljavanju pronalaska i ne predstavlja ograničenje obima pronalaska, osim ako se drugačije ne zahteva. Nijedan jezik u specifikaciji ne treba tumačiti tako da ukazuje na bilo koji element koji nije zaštićen kao suštinski važan za praktikovanje pronalaska.

Claims (14)

1. Patentni zahtevi 1. Kompleks koji sadrži inicijacioni oligonukleotidni prajmer sa kapom i DNK matricu, pri čemu inicijacioni oligonukleotidni prajmer sa kapom sadrži sledeću strukturu:

   pri čemu: B1 i B2 su, nezavisno, prirodna, modifikovana ili ne-prirodna nukleozidna baza, R1 i R2 su, nezavisno, OH ili O-metil; i R3 je OH ili OMe, pri čemu DNK matrica sadrži promotorski region koji obuhvata mesto otpočinjanja transkripcije koje ima prvi nukleotid na nukleotidnoj poziciji 1 i drugi nukleotid na nukleotidnoj poziciji 2; i gde je B1 potpuno komplementarna nukleozidnoj bazi na matrici nukleinske kiseline na poziciji 1 matrice za transkripciju i B2 hibridizuje sa nukleotidom na poziciji 2.
2. 2. Kompleks prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što su B1 i B2 prirodne nukleozidne baze.
3. 3. Kompleks prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što je B1 adenin i B2 je guanin.
4. 4. Kompleks prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što je B1 guanin i B2 je guanin.
5. 5. Kompleks prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što je R3 O-metil.
6. 6. Kompleks prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što je najmanje jedno od R1 i R2 O-metil, B1 je adenin, i B2 je guanin.
7. 7. Kompleks prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što je najmanje jedno od R1 i R2 O-metil, i B1 i B2 je guanin.
8. 8. Kompleks prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što su R1 i R2 OH, R3 je O-metil, B1 je adenin, i B2 je guanin.
9. 9. Kompleks koji sadrži inicijacioni oligonukleotidni prajmer sa kapom i DNK matricu, pri čemu inicijacioni oligonukleotidni prajmer sa kapom sadrži strukturu:

   pri čemu B1, B2 i B3 su, nezavisno, prirodna, modifikovana ili ne-prirodna nukleozidna baza; i R1, R2, R3 i R4 su, nezavisno, OH ili O-metil; pri čemu DNK matrica sadrži promotorski region koji obuhvata mesto otpočinjanja transkripcije koje ima prvi nukleotid na nukleotidnoj poziciji 1, drugi nukleotid na nukleotidnoj poziciji 2 i treći nukleotid na nukleotidnoj poziciji 3; i gde je B1 potpuno komplementarna nukleozidnoj bazi na matrici nukleinske kiseline na poziciji 1 matrice za transkripciju, B2 hibridizuje sa nukleotidom na poziciji 2 i B3 hibridizuje sa nukleotidom na poziciji 3.
10. 10. Kompleks prema patentnom zahtevu 9, naznačen time što su R3 i R4 O-metil.
11. 11. Kompleks prema patentnom zahtevu 9, naznačen time što je R4 O-metil.
12. 12. Kompleks prema patentnom zahtevu 9, naznačen time što je najmanje jedno od R1 i R2 O-metil, R3 je O-metil i R4 je O-metil.
13. 13. Kompleks prema patentnom zahtevu 9, naznačen time što su B1, B2, i B3 prirodne nukleozidne baze.
14. 14. Kompleks prema patentnom zahtevu 9, naznačen time što je B1 adenin, citozin, timin ili uracil.