RS62143B1 - Proteini koji uključuju podjedinice proksimalnih aminoterminalnih efektorskih regiona šiga toksina i vezni regioni imunoglobulinskog tipa koji ciljaju ćelije sposobni da specifično vezuju cd38 - Google Patents

Proteini koji uključuju podjedinice proksimalnih aminoterminalnih efektorskih regiona šiga toksina i vezni regioni imunoglobulinskog tipa koji ciljaju ćelije sposobni da specifično vezuju cd38

Info

Publication number
RS62143B1
RS62143B1 RS20210846A RSP20210846A RS62143B1 RS 62143 B1 RS62143 B1 RS 62143B1 RS 20210846 A RS20210846 A RS 20210846A RS P20210846 A RSP20210846 A RS P20210846A RS 62143 B1 RS62143 B1 RS 62143B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
cell
protein
seq
shiga toxin
cancer
Prior art date
Application number
RS20210846A
Other languages
English (en)
Inventor
Eric Poma
Erin Willert
Original Assignee
Molecular Templates Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Molecular Templates Inc filed Critical Molecular Templates Inc
Publication of RS62143B1 publication Critical patent/RS62143B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A61K47/6829—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxins or Pseudomonas exotoxin A
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/245—Escherichia (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/25—Shigella (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/081—DNA viruses
    • C07K16/085—Orthoherpesviridae (F), e.g. pseudorabies virus or Epstein-Barr virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/081—DNA viruses
    • C07K16/085—Orthoherpesviridae (F), e.g. pseudorabies virus or Epstein-Barr virus
    • C07K16/088—Varicella-zoster virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/081—DNA viruses
    • C07K16/085—Orthoherpesviridae (F), e.g. pseudorabies virus or Epstein-Barr virus
    • C07K16/089—Cytomegalovirus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—RNA viruses
    • C07K16/112—Retroviridae (F), e.g. leukemia viruses
    • C07K16/114—Lentivirus (G), e.g. human immunodeficiency virus [HIV], feline immunodeficiency virus [FIV] or simian immunodeficiency virus [SIV]
    • C07K16/1145—Env proteins, e.g. gp41, gp110/120, gp160, V3, principal neutralising domain [PND] or CD4-binding site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/20—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans from protozoa
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2833—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/286—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against neuromediator receptors, e.g. serotonin receptor, dopamine receptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2881—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD71
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3015—Breast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3023—Lung
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/303—Liver or Pancreas
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3038—Kidney, bladder
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3046—Stomach, Intestines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3053—Skin, nerves, brain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)

Description

OBLAST PRONALASKA
[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na citotoksične proteine koji sadrže regione vezivanja imunoglobulinskog tipa za posredovano ciljanje ćelija i efektorske regione Šiga toksina koji su kombinovani tako da su efektorski regioni Šiga toksina proksimalni u odnosu na aminoterminale citotoksičnih proteina, kako je definisano u zahtevima. Proteini iz ovog pronalaska imaju upotrebu, na primer, za selektivno ubijanje specifičnih tipova ćelija, isporuku egzogenih materijala unutar ciljnih ćelija, obeležavanje podćelijskih odeljaka ciljnih ćelija i kao terapijski molekuli za lečenje različitih bolesti, poremećaja i stanja, uključujući karcinome, tumore, imunološke poremećaje i mikrobne infekcije.
STANJE TEHNIKE
[0002] Razvoj sintetičkih, fuzionih proteina iz toksina koji su efektivni kao terapeutici decenijama je izazivao naučnike (Pastan I et al., Annu Rev Med 58: 221-37 (2007)). Jedna prepreka je da enzimski toksinski ostaci sintetičkih citotoksičnih proteina izvedenih iz bakterijskih i biljnih toksina moraju da dođu do svojih ciljnih citozolnih supstrata kako bi ubili ćelije. Za mnoge rekombinantne citotoksične proteine, snaga citotoksičnosti zavisi od efikasnosti molekula u unutarćelijskom usmeravanju (Pirie C et al., J Biol Chem 286: 4165-72 (2011)); međutim, razumevanje kako toksini usmeravaju svoj sopstveni unutarćelijski transport iz endozoma do citozola ostaje izazov za naučno istraživanje (Antignani A, Fitzgerald D, Toxins 5: 1486-502 (2013)).
[0003] Mnogi proteini sadrže konzervisane polipeptidne sekvence nazvane domeni, koje formiraju samossadržajne sklopive jedinice proteinike strukture koje mogu funkcionisati nezavisno od celokupnog proteina ili kada su rekombinovane u ortologni protein (Kirshner M, Gerhart J, Proc Natl Acad Sci USA 95: 8420 -7 (1988)). Upotreba modularnih proteinikih domena u stvaranju novih proteina nudi gotovo neograničene mogućnosti (Nixon A et. al, Proc Natl Acad Sci USA.94: 1069-73 (1997)).
Jedna od mogućnosti je molekularno inženjerstvo himernih molekula sastavljenih od ciljajućih domena i domena proteinikih toksina. Toksini koji su prirodno nastali ili krnji fragmenti toksina povezani su ili spojeni sa domenima imunoglobulina ili ligandima receptora hemijskom konjugacijom ili tehnikama inženjerstva rekombinantnih proteina sa nadom da će stvoriti terapijske molekule koji ciljaju ćelije (Moolten F, Cooperband S, Science 169: 68-70 (1970); Thorpe P et al., Nature 271: 752-5 (1978); Krolick K et al., Proc Natl Acad Sci USA 77: 5419-23 (1980); Krolick K et al., Cancer Immunol Immunother 12: 39-41 (1981); Blythman H et al., Nature 290: 145-46 (1981); Chaudhary V et al., Nature 339: 394-7 (1989); Strom T et al., Semin Immunol 2: 467-79 (1990); Pastan I et al., Annu Rev Biochem 61: 331-54 (1992); Foss F et al., Curr Top Microbiol Immunol 234: 63-81 (1998)). Jedan od ciljeva takvog molekularnog inženjerstva je dizajniranje himernih molekula sa dvostrukom funkcionalnošću: 1) dostavljanja toksina do određenih tipova ćelija ili mesta unutar organizma nakon sistemske primene; i 2) ostvarenje ciljane citotoksičnosti na određene ćelije korišćenjem moćnih mehanizama citotoksičnosti koji su efefektivni u eukariotskim ćelijama.
[0004] Porodica Šiga toksina iz srodnih proteinikih toksina, posebno toksina izolovanih iz S. disenteriae i E. coli, sastoji se od različitih prirodno nastalih toksina koji su strukturno i funkcionalno povezani (Johannes L, Römer W, Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (2010)). Na primer, porodica Šiga toksina obuhvata pravi Šiga toksin (Stx) izolovan iz S. disenteriae serotipa 1, varijante Šiga-sličnog toksina 1 (SLT1 ili Stx1 ili SLT-1 ili Slt-1) koje su izolovane iz serotipova enterohemoragične E. coli, i varijante Šiga-sličnog toksina 2 (SLT2 ili Stx2 ili SLT-2) izolovane iz serotipova enterohemoragične E. coli. SLT1 se razlikuje samo po jednom ostatku od Stx, a oba su nazivana Verocitotoksini ili Verotoksini (VT-i) (O’Brien A et al., Curr Top Microbiol Immunol 180: 65-94 (1992)). Članovi porodice Šiga toksina dele istu ukupnu strukturu i mehanizam delovanja (Engedal N et al., Microbial Biotech 4: 32-46 (2011)). Na primer, Stx, SLT-1 i SLT-2 pokazuju enzimsku aktivnosti koja se ne moze razlikovati u sistemima bez ćelija (Head S et al., J Biol Chem 266: 3617-21 (1991); Tesh V et al., Infect Immun 61: 3392 -402 (1993); Brigotti M et al., Tokicon 35: 1431-37 (1997)). Članovi porodice Šiga toksina sadrže ciljajuće domene koji preferencijalno vezuju specifični glikosfingolipid koji je prisutan na površini ćelija domaćina i jedan enzimski domen sposoban da trajno inaktivira ribozome jednom kada se nađe u ćeliji (Johannes, Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (2010)).
[0005] Članovi porodice Šiga toksina su angažovani od strane bakterija kao faktori virulencije tokom infekcije domaćina (Johannes, Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (2010)). U zaraženom domaćinu, Šiga toksini su citotoksični zbog njihove potentne sposobnosti da inhibiraju sintezu proteina i da pokrenu apoptotsku smrt ćelija (Johannes, Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (2010)). Potentni citotoksični efekti Šiga toksina na ćelije domaćina mogu dovesti do hemoragičnog kolitisa i hemolitičko uremičkog sindroma (Johannes, Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (2010)).
[0006] Članovi porodice Šiga toksina dele zajedničku, multimernu, proteiniku strukturu koja je karakterisana sa jednim A(B)5rasporedom podjedinica Šiga proteina (Johannes, Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (2010)). Svaki Šiga toksin se sastoji od dve proteinike podjedinice, A i B, koje se udružuju u A(B)5aranžman da bi stvorile holotoksinski proteiniki kompleks. Podjedinica Šiga toksina A je 32 kilodaltonski monomer koji sadrži jedan enzimski domen, a Šiga toksin B podjedinica je 7,7 kilodaltonska podjedinica koja se udružuje sa četiri druge podjedinice Šiga toksina B da bi se formirao pentamer Šiga toksina B podjedinice.
Pentamer B podjedinica udružuje se sa jednom A podjedinicom da bi se formirao Šiga holotoksin, koji je oko 70 kilodaltona (O’Brien A, Holmes, R, Microbiol Rev 51: 206-20 (1987)).
[0007] Članovi porodice Šiga toksina dele zajednički proces intoksikacije ćelije domaćina koji se može podeliti u pet glavnih faza: vezivanje za ćelijsku površinu, endocitoza, retrogradno podćelijsko kretanje u endoplazmatski retikulum, translokacija iz endoplazmatskog retikuluma u citozol i enzimska inaktivacija ribozoma u citozolu. Prvo, Šiga holotoksini su usmereni na ćelijske površine specifičnih ćelija domaćina uz pomoć sposobnosti podjedinice B da specifično veže glikosfingolipid globotriaozilceramid Gb3, takođe poznat kao CD77, koji je prisutan na delu površine egzoplazmatske membrane (Ling, H et al, Biochemistry 37: 1777-88 (1998); Thorpe C et al., Infect Immun 67: 5985-93 (1999); Soltyk A et al., J Biol Chem 277: 5351-59 (2002)). Drugo, Šiga holotoksini koriste endocitotičku mašineriju ćelije domaćina da uđu u ćeliju domaćina, gde su holotoksini inicijalno sadržani u endosomima (Sandvig K et al., J Cell Biol 108: 1331-43 (1989); Sandvig K et al., Histochem Cell Biol 117: 131-141 (2002)). Treće, Šiga holotoksini iskorišćavaju mašinu za unutarćelijski transport ćelije domaćina da bi došli do endoplazmatskog retikuluma i stekli pristup citozolu (Nichols B et al., J Cell Biol 153: 529-41 (2001); Lauvrak S et al., J Cell Sci 117: 2321-31 (2004); Saint-Pol A et al., Dev. Cell 6: 525-38 (2004)). Četvrto, enzimski aktivni fragmenti Šiga holotoksina se retrotranslociraju iz lumena endoplazmatskog retikuluma u citozol (Yu M, Haslam D, Infect Immun 73: 2524-32 (2005); LaPointe P et al., J Biol Chem 280: 23310-18 (2005); Falguieres T, Johannes L, Biol Cell 98: 125-34 (2006); Tam P, Lingwood C, Microbiology 153: 2700-10 (2007)). Peto, citozolna frakcija enzimski aktivnih fragmenata Šiga toksina uzrokuje citotoksičnost, inaktivacijom ribozoma ćelije domaćina (Tam, Microbiology 153: 2700-10 (2007)).
[0008] Tokom procesa intoksikacije Šiga toksinom, podjedinica A Šiga toksina proteolitički se cepa između konzervisanog ostatka arginina i ostatka metionina (na pr. Arg251-Met252 u StxA i SLT-1A) pomoću furina, endoproteaze ćelije domaćina (Garred Ø et al., J Biol Chem 270: 10817-21 (1995)). Amino-terminalni fragment podjedinice A Šiga toksina, koja je razdvojena furinom, naziva se Šiga-toksin "A1 fragment" (ili Stxn-A1, SLTn-A1, SLT-nA1). Fragment Šiga toksina A1 je protein od 28 kilodaltona koji sadrži katalitički domen Šiga toksina (Fraser M et al., Nat Struct Biol 1: 59-64 (1994)). Mehanizam citotoksičnosti Šiga toksina za ćelije domaćina je pretežno kroz potentnu katalitičku inaktivaciju eukariotskih ribozoma fragmenta A1 i široku ćelijsku inhibiciju sinteze proteina (Johannes, Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (2010)).
[0009] Fragment Šiga toksina A1 inhibira translaciju proteina svojom snažnom aktivnošću odvraćanja prema univerzalno konzervisanoj adeninskoj nukleobazi na položaju 4,324 u alfa-sarcin-ricin petlji iz 28S ribozomske RNK eukariotskog ribozoma (Johannes, Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (2010)). Nakon što se inaktivira granični broj ribozoma, predviđa se da ćelija domaćin doživljava dovoljno smanjenje sinteze proteina kako bi se indukovala ćelijska smrt apoptozom (Iordanov M et al., Mol Cell Biol 17: 3373-81 (1997); Smith W et al., Infect Immun 71: 1497-504 (2003); Lee S et al., Cell Microbiol 10: 770-80 (2008); Tesh V, Future Microbiol 5: 431-53 (2010)).
[0010] A-B toksin koji inaktivira ribozom može trajno da ošteti jedan ribozom za drugim u istoj ćeliji brzinom od približno 1.500 ribozoma u minuti (Endo Y, Tsurugi K, Eur J Biochem 171: 45-50 (1988); Endo Y et al., J Biol Chem 263: 8735-9 (1988)). Izvešteno je da je potentnost A-B toksina izuzetno visoka, tako da samo jedan molekul toksina može da ubije ćeliju (Yamaizumi M et al., Cell 15: 245-50 (1978); Antignani, Toxins 5: 1486-502 (2013)). Veruje se da jedan molekul A-B toksina može nepovratno da inaktivira 300 ribozoma za 35 minuta i dovoljan je da ubije ćeliju kancera (Weldon J, Pastan I, FEBS Journal 278: 4683-700 (2011)). Ovaj nivo citotoksične potencije se dalje predviđa za Šiga toksina A podjedinicu, za koju se pretpostavlja da bi jedan molekul translociran u citozol bio dovoljan da ubije ćeliju (Tam, Microbiology 153: 2700-10 (2007)).
[0011] Predviđa se da su holotoksini porodice Šiga toksina previše toksični za neciljanu upotrebu kao terapeutici (Jain, R, Tumor physiology and antibody delivery, Front Radiat Ther Oncol 24: 32-46 (1990)). Međutim, članovi porodice Šiga toksina imaju potencijal da budu sintetski konstruisani za terapijske primene racionalnim promenama strukturetoksina, njegovih karakteristika i bioloških aktivnosti (Johannes, Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (2010); Engedal, Microbial Biotech 4: 32-46 (2011)). Šiga holotoksini imaju bipartitnu strukturu koja se sastoji od dva nekovalentno vezana, modulaRNK dela: A-ostatak koji sadrži enzimski aktivan A1 fragment i B-ostatak koji sadrži mesta vezivanja za ciljnu površinu Gb3 na ćelijskoj površini. Budući da su podjedinice Šiga toksina modularne, pretpostavlja se da se terapeutske smeše mogu stvarati na osnovu odvojenih struktura i funkcija A i B ostataka (U.S. prijava 20090156417 A1; Johannes, Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (2010); Engedal, Microbial Biotech 4: 32-46 (2011); EP prijava 2402367 A1; U.S. prijava 20130196928 A1).
[0012] A-ostatak članova porodice Šiga toksina je stabilan, enzimski aktivan i citotoksičan nezavisno od bilo kog B-ostatka (Engedal, Microbial Biotech 4: 32-46 (2011)). Podjedinica Šiga toksina 1 A je katalitički aktivna, sposobna je da enzimski inaktivira ribozome in vitro i citotoksična je čak i ako je skraćena ili spojena sa drugim domenima proteina Haddad J et al., J Bacteriol 175: 4970-8 (1993); Al-Jaufy A et al., Infect Immun 62: 956-60 (1994); Al-Jaufy A et al., Infect Immun 63: 3073-8 (1995); LaPointe P et al., J Biol Chem 280: 23310-18 (2005); Di R et al., Toxicon 57: 525-39 (2011)). Podrezane podjedinice Šigasličnog toksina 1 A su katalitički aktivne, sposobne da enzimski inaktiviraju ribozome in vitro i citotoksične su kada se eksprimiraju unutar ćelije (LaPointe, J Biol Chem 280:
23310-18 (2005)).
[0013] Ideja povezivanja toksina sa ciljanim domenom da bi se stvario himerni molekul koji selektivno ubija ćelije karcinoma nije nova (Strebhardt K, Ullrich A, Nat Rev Cancer 8: 473-80 (2008)). Na primer, od 1970-ih imunotoksini su razvijeni koristeći tri, primarno toksinskih kandidata: bakterijski toksin za difteriju, Pseudomonas bakterijski egzotoksin i biljni toksini kao na primer ricin (Antignani, Toxins 5: 1486-502 (2013)). Do 2013. godine, međutim, ova tri toksina su ostala „među najboljim izborima za razvoj imunotoksina“ (Antignani, Toxins 5: 1486-502 (2013)). Do danas niko nije opisao citotoksični protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izvedenu iz Šiga-toksina u kombinaciji sa vezujućim regionom imunoglobulinskog tipa koji cilja ćeliju, a koji je bio sposoban da specifično i selektivno ubije ciljani tip ćelije.
[0014] Citotoksična potentnost Šiga toksin konstrukta zavisi od njegove efikasnosti u dostizanju do citozola (Tam, Microbiology 153: 2700-10 (2007)); međutim, trenutno razumevanje molekularnih mehanizama usmeravanja toksina u citozol ostaje izazov za naučno istraživanje (Antignani, Toxins 5: 1486-502 (2013)). Al-Jaufy, et al., Infekcija and Immunity, 62(3): 956-960 (1994), opisuje citotoksičnost fuzijskog proteina Šiga Toksin A podjedinice-CD4 za ćelije zaražene virusom humane imunodeficijencije;
Roudkenar, et al., Cell Biology and Toxicology, 22(3): 213-219 (2006), opisuje selektivnu citotoksičnost rekombinantnog STXA1-GM-CSF proteina u hematopoetskim ćelijama karcinoma; Pastan, et al., Annual Review of Medicine, 58: 221-237 (2007), opisuje imunotoksinsko lečenje od raka; WO2014/164693 opisuje citotoksične proteine koji sadrže regione vezivanja imunoglobulinskog tipa za posredovanje ciljanja regiona specifičnih za ćelijski tip i efektorskih regiona Šiga toksina izvedenih iz A podjedinice iz članova porodice Šiga toksina za postizanje citotoksičnosti; WO 00/06194 opisuje iscrpljivanje ćelija odgovornih za odbacivanje transplantata posredovano antitelima; Goldmacher, et al., Blood, American Society of Hematology, 84(9); 3017-3025 (1994), opisuje anti-CD38 blokirani ricin: jedan imunotoksin za lečenje multiplog mijeloma; Peng, et al., Blood, American Society of Hematology, 101(7): 2557-2562 (2003), opisuje onkolitičke viruse morbila koji pokazuju jednolančana antitela protiv CD38, markera ćelija mijeloma; Stevenson G T, Molecular Medicine, 12: 11-12 (2006), opisuje CD38 kao terapijski cilj. Bilo bi poželjno da se imaju citotoksični proteini koji ciljaju ćelije koji se sastoje od regiona izvedenih iz Šiga-toksin-podjedinice-A, koji sami usmeravaju svoje unutarćelijsko kretanje i pokazuju potentnu citotoksičnost za upotrebu koja uključuje ciljano ubijanje određenih tipova ćelija i za upotrebu kao terapeutskog leka u lečenju različitih bolesti, kao što su na pr. rak, tumori, imunološki poremećaji i mikrobne infekcije. Prema tome, u stanju tehnike ostaje potreba za načinima inženjeringa citotoksičnih proteina koji sadrže regije izvedene iz Šiga-toksin-podjedinice-A koji zadržavaju efektorske funkcionalnosti toksina, kao što je samostalno usmereno unutarćelijsko kretanje i citotoksičnost, nakon što su povezani sa heterolognim regionima vezivanja polipeptida za ciljanje ćelija.
KRATAK OPIS PRONALASKA
[0015] Predmetni pronalazak obezbeđuje različite proteine koji sadrže 1) regione vezivanja imunoglobulinskog tipa, kao što su imunoglobulini, kako je definisano u patentnim zahtevima, i 2) efektorske regione šiga toksina, kao što je SLT1A, kako je definisano u patentnim zahtevima. Povezivanje regiona vezivanja imunoglobulinskog tipa sa polipeptidnim regionima dobijenim iz Šiga-toksin-podjedinice-A omogućilo je inženjering specifičnog ciljanja ćelija iz citotoksičnosti Šiga-toksina, a citotoksičnost je bila najveća kada su ove dve regije kombinovane tako da vezni regioni imunoglobulinskog tipa nisu bili proksimalni u odnosu na regione Šiga toksina iz amino-terminalinog dela proteina. Proteini iz pronalaska imaju upotrebu kao što je, na primer, za ciljano ubijanje ćelija, isporuku egzogenih materijala, kao dijagnostička sredstva i kao terapeutski molekuli za lečenje različitih bolesti, poremećaja i stanja, uključujući karcinome, tumore, abnormalnosti rasta, imunološki poremećaji i mikrobne infekcije.
[0016] Protein iz ovog pronalaska sadrži (a) jedan vezni region imunoglobulinskog tipa koji sadrži jedan ili više polipeptida i koji je sposoban da specifično veže najmanje jedan vanćelijski ciljani biomolekul, kako je definisano u patentnim zahtevima, i (b) jedan efektorski region Šiga toksina koji sadrži polipeptid izveden iz aminokiselinske sekvence podjedinice A iz najmanje jednog člana porodice Šiga toksina, kako je definisano u patentnim zahtevima; pri čemu su navedeni vezni region imunoglobulinskog tipa i navedeni efektorski region Šiga toksina fizički raspoređeni ili orijentisani unutar citotoksičnog proteina tako da se vezni region imunoglobulinskog tipa ne nalazi proksimalno u odnosu na aminapomena rminalni deo efektorskog područja Šiga toksina.
[0017] Protein iz ovog pronalaska obuhvata (a) jedan vezni region imunoglobulinskog tipa koji sadrži jedan ili više polipeptida i koji je sposoban da specifično veže najmanje jedan vanćelijski ciljani biomolekul, kako je definisano u patentnim zahtevima i (b) jedan efektorski region Šiga toksina koji sadrži polipeptid izveden iz aminokiselinske sekvence podjedinice A iz najmanje jednog člana porodice Šiga toksina, kako je definisano u patentnim zahtevima; pri čemu su navedeni vezni region imunoglobulinskog tipa i navedeni efektorski region Šiga toksina fizički raspoređeni ili orijentisani unutar citotoksičnog proteina tako da se vezni region imunoglobulinskog tipa ne nalazi proksimalno na aminapomena rminalni deo proteina u odnosu na efektorski region Šiga toksina.
[0018] U određenim daljim rešenjima, protein iz ovog pronalaska obuhvata (a) jedan vezni region imunoglobulinskog tipa koji sadrži jedan ili više polipeptida i koji je sposoban da specifično veže najmanje jedan vanćelijski ciljni biomolekul, kako je definisan u patentnim zahtevima i (b) jedan efektorski region Šiga toksina koji sadrži polipeptid izveden iz aminokiselinske sekvence podjedinice A iz najmanje jednog člana porodice Šiga toksina, kako je definisano u patentnim zahtevima; pri čemu su navedeni vezni region imunoglobulinskog tipa i navedeni efektorski region Šiga toksina fizički raspoređeni ili orijentisani unutar citotoksičnog proteina, tako da se efektorski region Šiga toksina nalazi proksimalno u odnosu na amino-terminalni deo proteina.
[0019] Za određene realizacije za proteine iz ovog pronalaska, vezni region imunoglobulinskog tipa obuhvata polipeptid izabran iz grupe koju čine: fragment antitela sa jednim domenom (sdAb), nanobody®, domen antitela teškog lanca izveden iz kamelida (VHH fragment), domen antitela teškog lanca izveden iz hrskavične ribe, imunoglobulinski novi antigeniki receptor (IgNAR), VNARfragment, jednolančani varijabilni fragment (scFv), varijabilni fragment antitela (Fv), fragment komplementarnog određenog regiona 3 (CDR3), ograničeni FR3-CDR3-FR4 (FR3-CDR3-FR4) polipeptid, Fd fragment, mali modularni imunofarmaceutski (SMIP™) domen, antigen vezujući fragment (Fab), 10. domen fibronektina tipa III (10Fn3) koji je izveden iz fibronektina (na pr. mono telo), domen tenascina tipa III (na pr. TNfn3), domen ankirin ponavljajućeg motiva (ARD), lipoproteinreceptor sa niskom gustinom izveden iz A-domena (A domen LDLR ili LDLR-A), lipokalin (antikalin), Kunic domen, Z domen izveden iz proteina A, domen izveden iz gama-B kristalina, domen izveden iz ubikvitina, polipeptid koji potiče od Sac7d (afitin ), SH2 domen izveden iz Fin-a, miniprotein, skafold domena sličan lektinu tipa C, inženjerski konstruisana imitacija antitela i bilo koji genetski manipulisani pandani bilo kog od prethodnih koji zadržavaju vezujuću funkcionalnost.
[0020] Za određene realizacije, nakon primene proteina iz ovog pronalaska na ćeliju koja je fizički povezana sa vanćelijskim ciljanim biomolekulom vezujućeg regiona proteina, protein je sposoban da izazove smrt ćelije. U određenim daljim rešenjima, nakon primene proteina iz pronalaska na dve različite populacije ćelijskih tipova koje se razlikuju s obzirom na prisustvo ili nivo vanćelijskog ciljanog biomolekula, protein je sposoban da izazove ćelijsku smrt ćelijskih tipova fizički povezanih sa vanćelijskim ciljanim biomolekulom veznog regiona citotoksičnog proteina na CD50 koji je najmanje tri puta manji od CD50 koji je uočen za tipove ćelija koji fizički nisu povezani sa vanćelijskim ciljanim biomolekulom veznog regiona proteina. Za određene realizacije, nakon primene proteina prema pronalasku na prvoj populaciji ćelija čiji su članovi fizički povezani sa vanćelijskim ciljanim biomolekulima veznog regiona proteina, i na drugoj populaciji ćelija čiji članovi nisu fizički povezani sa bilo kojim vanćelijskim ciljanim biomolekulom veznog regiona, citotoksični efekat ćelijski ciljanog molekula na članove pomenute prve populacije ćelija u odnosu na članove pomenute druge populacije ćelija je najmanje 3 puta veći. Za određene realizacije, nakon primene proteina prema pronalasku na prvu populaciju ćelija čiji su članovi fizički povezani sa značajnom količinom vanćelijskog ciljanog biomolekula veznog regiona proteina, i na drugu populaciju ćelija čiji članovi nisu fizički povezani sa značajnom količinom bilo kog vanćelijskog ciljanog biomolekula veznog regiona, citotoksični efekat na molekule ciljane ćelije iz članova pomenute prve populacije ćelija u odnosu na članove pomenute druge populacije ćelija je najmanje 3 puta veći. Za određene realizacije, nakon primene proteina prema pronalasku na prvu populaciju ćelija pozitivnih na ciljane biomolekule, i na drugu populaciju ćelija čiji članovi ne eksprimiraju značajnu količinu ciljane biomolekula na proteinikom veznom regionu na ćelijskoj površini, citotoksični efekat proteina na članove prve populacije ćelija u odnosu na članove druge populacije ćelija je najmanje 3 puta veći.
[0021] U određenim realizacijama, vezni region imunoglobulinskog tipa je dizajniran il izabran prema svojoj sposobnosti da vezuje ekstracelularni ciljani biomolekul koji je izabran iz grupe koju čine: CD20, CD22, CD40, CD74, CD79, CD25, CD30, HER2/neu/ErbB2, EGFR, EpCAM, EphB2, prostatski specifični membranski antigen, Cripto, CDCP1, endoglin, protein za aktivaciju fibroblasta, Lewis-Y, CD19, CD21, CS1/ SLAMF7, CD33, CD52, CD133, gpA33, mucin, TAG-72, transmembranski receptor tirozin-protein kinaze (ROR1 ili NTRKR1), karbon anhidraza IX, folat vezujući protein, gangliozid GD2, gangliozid GD3, gangliozid GM2, gangliozid Lewis-Y2, VEGFR, Alfa Vbeta3, Alfa5beta1, ErbB1/EGFR, Erb3, c-MET, IGF1R, EphA3, TRAIL-R1, TRAIL-R2, RANK, FAP, tenascin, CD64, mezotelin, BRCA1, tirozinaza, TRP-1, TRP-2, MAGE-1, MAGE-3, GAGE-1/2, BAGE, RAGE, NY-ESO-1, CDK-4, beta-katenin, MUM-1, kaspaza-8, KIAA0205, HPVE6, SART-1, PRAME, karcinoembrionalni antigen, prostatni specifični antigen, antigen matičnih ćelija prostate, humana aspartil (asparaginil) beta-hidroksilaza, EphA2, HER3/ErbB-3, MUC1, MART-1/MelanA, gp100, antigen povezan sa tirozinazom, HPV-E7, Epstejn-Bar-ov virusni antigen, Bcr-Abl, alfa-fetoprotein antigen, 17-A1, antigen tumora bešike, CD38, CD15, CD23, CD53, CD88, CD129, CD183, CD191, CD193, CD244, CD294, CD305; C3AR, FceRIa, galektin 9, mrp-14, ligand programirane smrti 1 (PD-L1), Siglec-8, Siglec-10, CD49d, CD13, CD44, CD54, CD63, CD69, CD123, CD193, TLR4, IgE, CD107a, CD203c, CD14, CD15, CD33, CD64, CD68, CD80, CD86, CD105, CD115, F4/80, ILT-3, galektin-3, CD11a-c, GITRL, MHC molekul klase I (opciono kompleksiran sa peptidom), MHC molekul klase II (opciono kompleksiran sa peptidom), CD284-TLR4, CD107-Mac3, CD195-CCR5, HLA-DR, CD16/32, CD282-TLR2, CD11c, CD123, i bilo koji imunogeni fragment bilo čega od prethodno navedenog.
[0022] U određenim realizacijama, proteini iz ovog pronalaska sadrže efektorski region Šiga toksina koji je izveden iz aminokiselina 75 do 251 iz SEKV ID BR:1, SEKV ID BR:2, ili SEKV ID BR:3. U određenim daljim rešenjima, protein iz ovog pronalaska obuhvata efektorski region Šiga toksina koji je izveden iz aminokiselina 1 do 241 iz SEKV ID BR:1, SEKV ID BR:2, ili SEKV ID BR:3. U određenim daljim rešenjima, efektorski region Šiga toksina je izveden iz aminokiselina 1 do 251 iz SEKV ID BR:1, SEKV ID BR:2, ili SEKV ID BR:3. U određenim daljim rešenjima, efektorski region Šiga toksina je izveden iz aminokiselina 1 do 261 iz SEKV ID BR:1, SEKV ID BR:2, ili SEKV ID BR:3.
[0023] U određenim realizacijama, proteini iz ovog pronalaska sadrže karboksiterminalni motiv retencije/povraćaja endoplazmatskog retikuluma. U određenim daljim rešenjima, proteini iz ovog pronalaska sadrže karboksi-terminalni motiv retencije/povraćaja endoplazmatskog retikuluma koji je izabran iz grupe koju čine: KDEL (SEKV ID BR:32), HDEF (SEKV ID BR:33), HDEL (SEKV ID BR:34), RDEF (SEKV ID BR:35), RDEL (SEKV ID BR:36), WDEL (SEKV ID BR:37), YDEL (SEKV ID BR:38), HEEF (SEKV ID BR:39), HEEL (SEKV ID BR:40), KEEL (SEKV ID BR:41), REEL (SEKV ID BR:42), KAEL (SEKV ID BR:43), KCEL (SEKV ID BR:44), KFEL (SEKV ID BR:45), KGEL (SEKV ID BR:46), KHEL (SEKV ID BR:47), KLEL (SEKV ID BR:48), KNEL (SEKV ID BR:49), KQEL (SEKV ID BR:50), KREL (SEKV ID BR:51), KSEL (SEKV ID BR:52), KVEL (SEKV ID BR:53), KWEL (SEKV ID BR:54), KYEL (SEKV ID BR:55), KEDL (SEKV ID BR:56), KIEL (SEKV ID BR:57), DKEL (SEKV ID BR:58), FDEL (SEKV ID BR:59), KDEF (SEKV ID BR:60), KKEL (SEKV ID BR:61), HADL (SEKV ID BR:62), HAEL (SEKV ID BR:63), HIEL (SEKV ID BR:64), HNEL (SEKV ID BR:65), HTEL (SEKV ID BR:66), KTEL (SEKV ID BR:67), HVEL (SEKV ID BR:68), NDEL (SEKV ID BR:69), QDEL (SEKV ID BR:70), REDL (SEKV ID BR:71), RNEL (SEKV ID BR:72), RTDL (SEKV ID BR:73), RTEL (SEKV ID BR:74), SDEL (SEKV ID BR:75), TDEL (SEKV ID BR:76), SKEL (SEKV ID BR:77), STEL (SEKV ID BR:78), i EDEL (SEKV ID BR:79).
[0024] U određenim daljim rešenjima, protein iz ovog otkrića obuhvata vezni region koji sadrži ili se sastoji u osnovi od aminokiselina 269-508 iz bilo koje od SEKV ID BR: 4-19.
[0025] U određenim realizacijama, protein iz ovog otkrića sadrži ili se sastoji u osnovi od polipeptida koji je prikazan u bilo kojoj SEKV ID BR: 4-31.
[0026] U određenim realizacijama, proteini iz ovog pronalaska obuhvataju jedan efektorski region Šiga toksina koji obuhvata mutaciju u odnosu na prirodno pojavnu A podjedinicu iz člana porodice Šiga toksina koja menja enzimsku aktivnosti efektorskog regiona Šiga toksina gde je mutacija odabrana od najmanje jednog od delecije, insercije ili supstitucije aminokiselinskog ostatka čime se smanjuje ili eliminiše citotoksičnost regiona Šiga toksina, kako je definisano u patentnim zahtevima. U određenim daljim rešenjima, protein obuhvata mutaciju koja smanjuje ili eliminiše katalitičku aktivnost ali ostaju druge Efektorske funkcije Šiga toksina, kao što su, na pr., promovisanje ćelijske internalizacije i/ili usmeravanje unutarćelijske rute. U određenim realizacijama, mutacija je odabrana od najmanje jedne od supstitucije aminokiselinskih ostataka, kao što su, na pr., A231E, R75A, Y77S, Y114S, E167D, R170A, R176K i/ili W203A u SEKV ID BR:1, SEKV ID BR:2, ili SEKV ID BR:3.
[0027] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje sadrže protein iz ovog pronalaska i najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv ekscipijens ili nosač, kako je definisano u patentnim zahtevima; i upotrebu takvog proteina ili kompozicije koja ga sadrži kako je ovde dalje opisano. Pojedina rešenja iz ovog pronalaska su farmaceutske kompozicije koje sdrže bilo koji protein iz ovog pronalaska i najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv ekscipijens ili nosač, kako je definisano u patentnim zahtevima.
[0028] Među pojedinim rešenjima iz predmetnog otkrića je dijagnostička kompozicija koja sadrži protein iz pronalaska dalje obuhvata sredstvo za promociju detekcije za prikupljanje informacija, kao što su dijagnostički korisne informacije o tipu ćelije, tkivu, organu, bolesti, poremećaju, stanju, i/ili pacijentu.
[0029] Pored proteina iz ovog pronalaska i njihovih kompozicija, polinukleotidi sposobni za kodiranje proteina iz pronalaska kako je definisano u patentnim zahtevima su u okviru obima ovog pronalaska, kao i ekspresioni vektori koji sadrže polinukleotide iz pronalaska i ćelije domaćina koje sadrže ekspresioni vektor iz pronalaska. ûelije domaćina koje sadrže ekspresioni vektor mogu se koristiti, na pr., metodama za proizvodnju proteina iz pronalaska kako je definisano u patentnim zahtevima ili njihovih polipeptidnih komponenti ili fragmenta uz pomoć rekombinantne ekspresije.
[0030] Otkriće takođe uključuje sistem za postizanje poboljšane citotoksičnosti proteina koji obuhvata(ju) jedan vezni region imunoglobulinskog tipa koji sadrži jedan ili više polipeptida i koji je sposoban da specifično veže najmanje jedan vanćelijski ciljani biomolekul i (b) jedan efektorski region Šiga toksina koji sadrži polipeptid izveden iz aminokiselinske sekvence podjedinice A iz najmanje jednog člana porodice Šiga toksina; sistem obuhvata korak uređenja navedenog vezujućeg regiona imunoglobulinskog tipa proksimalno u odnosu na karboksilni kraj iz navedenog efektorskog regiona Šiga toksina unutar proteina. Otkriće takođe uključuje sistem za postizanje poboljšane citotoksičnosti proteina koji obuhvata (a) jedan vezni region imunoglobulinskog tipa koji sadrži jedan ili više polipeptida i koji je sposoban da specifično veže najmanje jedan vanćelijski ciljani biomolekul i (b) jedan efektorski region Šiga toksina koji sadrži polipeptid izveden iz aminokiselinske sekvence podjedinice A iz najmanje jednog člana porodice Šiga toksina; sistem obuhvata korak uređenja navedenog vezujućeg regiona imunoglobulinskog tipa proksimalno u odnosu na karboksilni kraj iz proteina u odnosu na navedeni efektorski region Šiga toksina. Otkriće takođe uključuje sistem za postizanje poboljšane citotoksičnosti proteina koji obuhvata (a) jedan vezni region imunoglobulinskog tipa koji sadrži jedan ili više polipeptida i koji je sposoban da specifično veže najmanje jedan vanćelijski ciljani biomolekul i (b) jedan efektorski region Šiga toksina koji sadrži polipeptid izveden iz aminokiselinske sekvence iz A podjedinice kod najmanje jednog člana porodice Šiga toksina; sistem obuhvata korak uređenja navedenog efektorskog regiona Šiga toksina proksimalno u odnosu na amino-terminus iz proteina.
[0031] Pored toga, predmetni pronalazak obezbeđuje in vitro metode za ubijanje ćelije(a) kako je definisano u patentnim zahtevima, koji obuhvata korak omogućavanja kontakta ćelije(a) sa proteinom iz pronalaska ili sa farmaceutskom kompozicijom koja sadrži protein iz pronalaska. U daljim rešenjima za metode ubijanja ćelija, metod je sposoban da selektivno ubija ćeliju(e) i/ili ćelijskih tipova prvenstveno u odnosu na druge ćelije i/ili ćelijskih tipova prilikom kontakta sa mešavinom ćelija što se razlikuje u odnosu na nivo vanćelijske prisutnosti i/ili ekspresije nekog vanćelijskog ciljanog biomolekula iz veznog regiona iz proteina.
[0032] Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje sredstvo za lečenje bolesti, poremećaja, i/ili stanja kod pacijenata upotrebom terapeutski efektivne količine proteina ili farmaceutske kompozicije iz pronalaska, kako je definisano u patentnim zahtevima. U određenim realizacijama, bolest, poremećaj ili stanje koje treba lečiti korišćenjem pronalaska je odabrano od: raka, tumora, imunološkog poremećaja ili mikrobne infekcije, kako je definisano u patentnim zahtevima. U određenim realizacijama, rak koji se može tretirati je izabran iz grupe koju čine: rak kostiju, rak dojke, rak centralnog/perifernog nervnog sistema, rak gastrointestinalnog trakta, rak polnih ćelija, rak žlezda, rak glave i vrata, hematološki rak, rak bubrega i urinarnog trakta, rak jetre, rak pluća/pleure, rak prostate, sarkom, rak kože i rak materice. U određenim realizacijama, bolest, poremećaj ili stanje koje treba lečiti korišćenjem pronalaska je imunološki poremećaj, kako je definisano u patentnim zahtevima. U određenim realizacijama, imunološki poremećaj koji se može tretirati je imunološki poremećaj povezan sa bolešću koji je izabran iz grupe koju čine: amiloidoza, ankilozirajući spondilitis, astma, Kronova bolest, dijabetes, odbacivanje transplantata, bolest transplantat protiv domaćina, Hašimotov tiroiditis, hemolitički uremički sindrom, bolest povezana sa HIV-om, eritematozni lupus, multipla skleroza, poliartritis nodoza, poliartritis, psorijaza, psorijatični artritis, reumatoidni artritis, sklerodermija, septični šok, Sjogrenov sindrom, ulcerozni kolitis i vaskulitis.
[0033] Upotreba bilo koje kompozicije iz ovog pronalaska za lečenje ili prevenciju raka, tumora, abnormalnosti rasta, i/ili imunološkog poremećaja je u okviru obima predmetnog otkrića. Među pojedinim rešenjima iz ovog pronalaska je protein iz ovog pronalaska i/ili njihova farmaceutska kompozicija za korišćenje u lečenju ili prevenciji karcinoma, tumora, imunološkog poremećaja ili mikrobne infekcije, kako je definisano u patentnim zahtevima. Među pojedinim rešenjima iz predmetnog otkrića je korišćenje proteina iz pronalaska i/ili njegove farmaceutske kompozicije u proizvodnji leka za lečenje ili prevenciju raka, tumora, abnormalnosti rasta, imunološkog poremećaja ili mikrobne infekcije.
[0034] Pojedina rešenja za proteine iz pronalaska mogu biti upotrebljena za isporuku dodatnog egzogenog materijala u ćeliju koja je fizički uparena sa vanćelijskim ciljanim biomolekulom iz proteina iz pronalaska. Pored toga, predmetno otkriće obezbeđuje metod za isporuku egzogenog materijala u unutrašnjost ćelije(a) koji obuhvata omogućavanje kontakta ćelije(a), bilo in vitro ili in vivo, sa proteinom, farmaceutskom kompozicijom, i/ili dijagnostičkom kompozicijom iz ovog pronalaska. Predmetno otkriće dalje obezbeđuje metod za isporuku egzogenog materijala u unutrašnjost ćelije(a) kod pacijenta, metod koji obuhvata korak primenu kod pacijenta, proteina iz ovog pronalaska (sa ili bez citotoksične aktivnosti), pri čemu ciljna ćelija(e) je fizički uparena sa vanćelijskim ciljanim biomolekulom iz proteina.
[0035] Upotreba bilo koje kompozicije iz ovog pronalaska za dijagnozu, prognozu, i/ili karakterizaciju bolesti, poremećaja, i/ili stanja je u okviru obima predmetnog otkrića. Među pojedinim rešenjima iz predmetnog otkrića je metod za korišćenje proteina iz pronalaska koji obuhvata sredstvo za promociju detekcije i/ili kompoziciju otkrića (na pr. dijagnostička kompozicija) za prikupljanje informacija korisnih u u dijagnozi, prognozi ili karakterizaciji bolesti, poremećaja ili stanja. Među pojedinim rešenjima iz predmetnog otkrića je metod detekcije ćelije korišćenjem proteina i/ili dijagnostičke kompozicije iz otkrića koji obuhvata korake omogućavanja kontakta ćelije sa proteinom i/ili dijagnostičkom kompozicijom i detekciju prisustva navedenog molekula koji cilja ćeliju i/ili dijagnostičke kompozicije. U određenim realizacijama iz otkrića, korak omogućavanja kontakta ćelije(a) se događa in vitro. U određenim realizacijama iz otkrića, korak omogućavanja kontakta ćelije(a) se događa in vivo. U određenim realizacijama iz otkrića, korak detekcije ćelije(a) se događa in vitro. U određenim realizacijama iz otkrića, korak detekcije ćelije(a) se događa in vivo. U određenim daljim rešenjima iz otkrića, metod uključuje detekciju lokacije proteina u nekom organizmu korišćenjem jedne ili više procedura vizualizacije nakon administracije proteina u navedeni organizam. Na primer, proteini iz otkrića koji uključuju agense za podsticanje detekcije kako je ovde opisano mogu se koristiti za karakterizaciju bolesti kao potencijalno lečive uz pomoć odgovarajuće farmaceutske kompozicije iz pronalaska. Na primer, određena jedinjenja (na pr. proteini) iz pronalaska, kompozicije (na pr. farmaceutske kompozicije i dijagnostičke kompozicije) iz pronalaska, i metode iz otkrića mogu se koristiti da se determiniše da li pacijent pripada grupi koja daje odgovore na farmaceutske kompozicije iz pronalaska.
[0036] Među pojedinim rešenjima iz predmetnog otkrića su kitovi koji obuhvataju kompoziciju od značaja iz pronalaska, i opciono, uputstvo za upotrebu, dodatni reagens(e), i/ili uređaj(e) za isporuku leka.
[0037] Ove i druge karakteristike, aspekti i prednosti iz ovog pronalaska postaće bolje razumljivi s obzirom na sledeći opis, priložene zahteve i prateće slike. Gore pomenuti elementi iz pronalaska mogu se pojedinačno kombinovati ili ukloniti slobodno kako bi se ostvarila druga ostvarenja iz pronalaska, u okviru obima patentnih zahteva, bez ikakve izjave koja bi se usprotivila takvoj kombinaciji ili uklanjanju u daljem tekstu.
KRATAK OPIS SLIKA
[0038]
Slika 1 prikazuje opšte uređenje proteina iz pronalaska gde "N" i "C" označavaju aminoteminalni deo i karboksilni terminalni deo, respektivno, u proteinu ili u polipeptidnoj komponenti iz proteina koji obuhvata efektorski region Šiga toksina.
Slika 2 grafički prikazuje SLT-1A::DCD38scFv koji je pokazao poboljšanu citotoksičnost u poređenju sa obrnutom orijentacijom DCD38scFv::SLT-1A. Procenat vijabilnosti ćelija je nacrtan preko logaritma do baze 10 za koncentraciju citotoksičnog proteina.
Slika 3 grafički prikazuje poboljšanu citotoksičnost specifičnu za ciljane ćelije proteina SLT-1A::DHER2scFv u poređenju sa proteinom obrnute orijentacije DHER2scFv::SLT-1A. Procenat vijabilnosti ćelija je nacrtan preko logaritma do baze 10 za koncentraciju citotoksičnog proteina.
Slika 4 prikazuje mikroskopsku sliku subcelularne lokalizacije proteina DHER2scFv::SLT-1A i SLT-1A::DHER2scFv. Slike prikazuju kako su oba citotoksična proteina ušla u ciljane ćelije u roku od jednog sata od primene.
DETALJAN OPIS
[0039] Predmetni pronalazak je u nastavku detaljnije opisan koristeći ilustrativne, neograničavajuće realizacije i reference za prateće slike. Ovaj pronalazak, međutim, može biti realizovan u mnogo različitih oblika u okviru obima patentnih zahteva i ne bi trebalo da se tumači kao ograničen na dole navedene realizacije. Umesto toga, ove realizacije su obezbeđene tako da je ovo otkriće detaljno i prenosi opseg pronalaska stručnjacima u ovoj oblasti.
[0040] Da bi se predmetni pronalazak mogao lakše razumeti, određeni pojmovi su definisani u nastavku. Dodatne definicije mogu se naći u detaljnom opisu pronalaska.
[0041] Kao što se koristi u specifikaciji i priloženim patentnim zahtevima, izrazi "jedan," i "taj" uključuju i jedninu i množinu referenta, osim ako kontekst jasno ne nalaže drugačije.
[0042] Kao što se koristi u specifikaciji i priloženim patentnim zahtevima, izraz "i/ili" kada se odnosi na dve vrste, A i B, znači najmanje jednu od A i B. Kao što se koristi u specifikaciji i priloženim patentnim zahtevima, izraz "i/ili" kada se odnosi na više od dve vrste, kao što su A, B, i C, znači najmanje jedan od A, B ili C, ili bar jedan od bilo koje kombinacije A, B ili C (sa svakom vrstom u pojedinačnoj ili višestrukoj mogućnosti).
[0043] Kroz ovu specifikaciju, reč „sadrži“ ili varijacije poput „obuhvata“ ili „koji obuhvata“ će se razumeti da se odnosi na uključivanje navedene celine (ili komponenti) ili grupe celina (ili komponenti), ali ne i isključivanje bilo koje druge celine (ili komponente) ili grupa celina (ili komponente).
[0044] U celoj ovoj specifikaciji izraz „uključujući“ se koristi u značenju „uključujući, ali bez ograničenja na“. „Uključujući“ i „uključujući, ali ne ograničavajući se na“ koriste se naizmenično.
[0045] Izraz "aminokiselinski ostatak" ili "aminokiselina" uključuje referencu na aminokiselinu koja je ugrađena u protein, polipeptid ili peptid. Izraz "polipeptid" uključuje bilo koji polimer aminokiselina ili aminokiselinskih ostataka. Izraz „polipeptidna sekvenca“ odnosi se na niz aminokiselina ili aminokiselinskih ostataka od kojih je polipeptid fizički sačinjen. „Protein“ je makromolekul koji obuhvata jedan ili više polipeptida ili polipeptidnih „lanaca“. „Peptid“ je mali polipeptid veličine manje od ukupno 15-20 aminokiselinskih ostataka. Izraz "aminokiselinska sekvenca" odnosi se na niz aminokiselina ili aminokiselinskih ostataka koje fizički sadrže peptid ili polipeptid u zavisnosti od dužine. Ako nije drugačije naznačeno, polipeptidne i proteinske sekvence ovde otkrivene su napisane sleva nadesno predstavljajući njihov redosled od amino terminalnog do karboksi terminalnog dela.
[0046] Izrazi „aminokiselina“, „aminokiselinski ostatak“, „aminokiselinska sekvenca“ ili polipeptidna sekvenca uključuju aminokiseline koje se javljaju u prirodi (uključujući L i D izosteriomere) i, ukoliko nije drugačije ograničeno, takođe uključuju poznate analoge prirodnih aminokiselina koje mogu funkcionisati na sličan način kao aminokiseline koje se javljaju u prirodi, poput selenocisteina, pirolizina, N-formilmetionina, gamakarboksiglutamata, hidroksiprolinhipuzina, piroglutaminske kiseline i selenmetionina. Ovde pomenute aminokiseline opisane su skraćenicama kako sledi u Tabeli A:
TABELA A. Nomenklatura aminokiselina
[0047] Fraza „konzervativna supstitucija“ u odnosu na polipeptid, odnosi se na promenu aminokiselinskog sastava polipeptida koja u suštini ne menja funkciju i strukturu celokupnog polipeptida (videti Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W. H. Freeman and Compbilo koji, New York (2nd ed., 1992)).
[0048] Kako se ovde koriste, izrazi „ekspresovani“, „ekspresijski“ ili „ekspresujući“ i njihove gramatičke varijante odnose se na prevod polinukleotida ili nukleinske kiseline u polipeptid ili protein. Eksprimirani polipeptidi ili proteini mogu da ostanu unutarćelijski, da postanu komponenta ćelijske površinske membrane ili da se izluče u vanćelijskim prostorima.
[0049] Kako se ovde koristi, ćelije koje eksprimiraju značajnu količinu nekog vanćelijskog ciljanog biomolekula najmanje na jednoj ćelijskoj površini su "ciljane pozitivne ćelije" ili "ciljne ćelije" i one su ćelije koje su fizički povezane sa navedenim vanćelijskim ciljanim biomolekulom.
[0050] Kako se ovde koristi, simbol "D" je skraćenica za jedan vezni region imunoglobulinskog tipa koji je sposoban da se vezuje za biomolekul koji sledi simbol.
Simbol „D“ se koristi za označavanje funkcionalnih karakteristika veznih regiona imunoglobulinskog tipa na osnovu njegove sposobnosti vezivanja za biomolekul koji sledi simbol.
[0051] Simbol "::" označava polipeptidne regione pre i posle njih fizički povezane zajedno da bi se formirao kontinuirani polipeptid.
[0052] Izraz „selektivna citotoksičnost“ s obzirom na citotoksičnu aktivnost citotoksičnog proteina odnosi se na relativne nivoe citotoksičnosti između ciljane populacije ćelija i neciljane populacije ćelija koje se mogu posmatrati, što se može izraziti kao odnos polovina maksimalne citotoksične koncentracije (CD50) za ciljani tip ćelije u odnosu na CD50 za neciljani tip ćelije kako bi se pokazala preferencijalnost ubijanja ćelija ciljanog tipa ćelije.
[0053] U svrhe ovog pronalaska, izraz "efektor" znači obezbeđivanje biološke aktivnosti, kao što su citotoksičnost, biološka signalizacija, enzimska kataliza, subcelularno usmeravanje, i/ili intermolekularno vezivanje koje dovodi do jačanja faktora i/ili alosteričnih efekata.
[0054] U svrhe ovog pronalaska, fraza „izveden iz“ znači da polipeptidni region obuhvata aminokiselinske sekvence koje su prvobitno pronađene u proteinu i koje sada mogu sadržavati adicije, delecije, odsecanja ili druge promene originalne sekvence tako da su ukupna funkcija i struktura u velikoj meri očuvane.
[0055] U svrhe ovog pronalaska, efektorska funkcija Šiga toksina je biološka aktivnost koju daje polipeptidni region izveden iz podjedinice Šiga toksina A. Neograničavajući primeri efektorske funkcije Šiga toksina uključuju ćelijsku internalizaciju, subcelularno usmeravanje, katalitičku aktivnost i citotoksičnost. Katalitičke aktivnosti šiga toksina uključuju, na primer, inaktivaciju ribozoma, inhibiciju sinteze proteina, aktivnost N-glikozidaze, aktivnost polinukleotid:adenozin glikozidaze, aktivnost RNAaze i aktivnost DNAaze. RIP-ovi mogu depurinisati nukleinske kiseline, polinukleozide, polinukleotide, rRNK, ssDNK, dsDNK, mRNK (i poli A) i virusne nukleinske kiseline (Barbieri L et al., Biochem J 286: 1-4 (1992); Barbieri L et al., Nature 372: 624 (1994); Ling J et al., FEBS Lett 345: 143-6 (1994); Barbieri L et al., Biochem J 319: 507-13 (1996);
Roncuzzi L, Gasperi-Campani A, FEBS Lett 392: 16-20 (1996); Stirpe F et al., FEBS Lett 382: 309-12 (1996); Barbieri L et al., Nucleic Acids Res 25: 518-22 (1997); Wang P, Tumer N, Nucleic Acids Res27: 1900-5 (1999); Barbieri L et al., Biochim Biophys Acta 1480: 258-66 (2000); Barbieri L et al., J Biochem 128: 883-9 (2000); Bagga S et al., J Biol Chem 278: 4813-20 (2003); Picard D et al., J Biol Chem 280: 20069-75 (2005)). RIP-ovi pokazuju antivirusnu aktivnost i aktivnost superoksid dismutaze (Erice A et al., Antimicrob Agents Chemother 37: 835-8 (1993); Au T et al., FEBS Lett 471: 169-72 (2000); Parikh B, Turner N, Mini Rev Med Chem 4: 523-43 (2004); Sharma N et al., Plant Physiol 134: 171-81 (2004)). Katalitičke aktivnosti Šiga toksina primećene su i in vitro i in vivo. Eseji za efektorsku aktivnost Šiga toksina mogu meriti različite aktivnosti, kao što su, na pr., aktivnost inhibicije sinteze proteina, aktivnost depurinacije, inhibicija rasta ćelija, citotoksičnost, aktivnost superpovijene DNK relaksacije i/ili aktivnost nukleaze.
[0056] Kako se ovde koristi, zadržavanje efektorske funkcije Šiga toksina odnosi se na nivo funkcionalne aktivnosti Šiga toksina, što je mereno odgovarajućim kvantitativnim testom sa ponovljivošću uporedivom sa kontrolom koju čini efektorski region Šiga toksina divljeg tipa. Za inhibiciju ribozoma, efektorska funkcija Šiga toksina pokazuje IC50 od 10.000 pikomola (pM) ili manje. Za citotoksičnost u testu za ubijanje pozitivne ciljane ćelije, efektorska funkcija Šiga toksina pokazuje CD50 od 1.000 nanomola (nM) ili manje, u zavisnosti od tipa ćelije i njene ekspresije odgovarajućeg vanćelijskog ciljanog biomolekula.
[0057] Na efikasnost i potencije imunotoksin i ligand-toksin fuzije, kao citotoksičnih molekula, utiču gustine njihovih ciljnih antigena na površini ciljane ćelije (videti na pr. Decket T et al., Blood 103: 2718-26 (2004); Du X et al., Blood 111: 338-43 (2008); Baskar S et al., mAbs 4: 349-61 (2012)), lokacija epitopa (Press O et al., J Immunol 141: 4410-7 (1988); Godal A et al., In J Cancer 52: 631-5 (1992); Yazdi P et al., Cancer Res 55: 3763-71 (1995)), brzina internalizacije površinski vezanog citotoksičnog molekula (videti na pr. Du X et al., Cancer Res 68: 6300-5 (2008)) i unutarćelijska maršuta (Tortorella L et al., PLoS One 7: e47320 (2012)).
[0058] Zastupljenost ćelijske površine i/ili gustina datog vanćelijskog ciljanog biomolekula može uticati na primene za koje se određeni proteini iz pronalaska mogu najprikladnije koristiti. Razlike u zastupljenosti ćelijske površine i/ili gustine datog ciljanog biomolekula između ćelija mogu promeniti internalizaciju i/ili citotoksičnost datog proteina iz pronalaska i kvantitativno i kvalitativno. Zastupljenost ćelijske površine i/ili gustina datog ciljanog biomolekula može se uveliko razlikovati među ciljanim biomolekul pozitivnim ćelijama ili čak na istoj ćeliji u različitim tačkama ćelijskog ciklusa ili ćelijske diferencijacije. Ukupna zastupljenost ćelijske površine datog ciljanog biomolekula na određenoj ćeliji ili populaciji ćelija može se odrediti upotrebom metoda poznatih radniku I struke, kao što su metode koje koriste fluorescencijom aktivirano sortiranje ćelija (FACS) pomoću protočne citometrije.
Uvod
[0059] Predmetni pronalazak rešava probleme za inženjerstvo potentno citotoksičnih proteina, koji obuhvataju regione izvedene iz Šiga-toksin-podjedinice-A povezane sa heterolognim regionima vezivanja za ciljanje ćelija, kako je definisano u patentnim zahtevima, na pr. fuzioni proteini koji zadržavaju robusne efektorske efekte Šiga toksina poput samo-usmerenog unutarćelijskog kretanja do citozola i citotoksičnost. Predmetni pronalazak se zasniva na zapažanju da određeni strukturni odnos između regina toksina koji potiče iz Šiga-toksin-podjedinice A i heterolognog vezivnog regiona može uticati na efektivnost ubijanja ćelija za inženjerski oblikovane citotoksične proteine zasnovane na Šiga-toksinu. Unutarćelijsko usmeravanje ovih polipeptida mora biti dovoljno da omogući enzimski aktivnom polipeptidu(ima) izvedenim iz Šiga-toksinpodjedinice A, da efikasno dospeju do citozolnog odeljenja i inaktiviraju ribozome kako bi izazvali ćelijsku smrt. Kao što je detaljnije opisano u primerima, postojanje regiona toksina izvedenog iz Šiga-toksin-podjedinice-A koji je orijentisan proksimalno od amino-terminala u odnosu na vezni region heterolognih ćelija dovelo je do znatno robusnijih rezultata ubijanja ćelija od identičnih ostataka raspoređenih u suprotnoj orijentaciji.
Predmetni pronalazak obezbeđuje specifičan način inženjeringa takvih citotoksičnih proteina da bi se time postiglo uređivanje vezne regije za ciljanje ćelija proksimalno u odnosu na karboksilni kraj efektorskog regiona Šiga toksina unutar citotoksičnog proteina. Povezivanje heterolognih veznih regiona za ciljanje ćelija sa regionima Šiga-toksin-podjedinica-A u ovoj specifičnoj orijentaciji omogućilo je inženjerstvo snažnijeg ciljanja specifičnog za ćelijsku citotoksičnost Šiga toksina, kao i proteine sa poželjnim unutarćelijskim usmeravanjem na endoplazmatski retikulum i/ili citozol.
[0060] Ranije se pokazalo da su fuzioni konstrukti podjedinice A Šiga toksina citotoksični i verovatno sposobni za samostalno usmeravanje sopstvenog unutarćelijskog kretanja da bi isporučili enzimski aktivni fragment toksina u citozol (Al-Jaufy, Infect Immun 62: 956-60 (1994); A1-Jaufy, Infect Immun 63: 3073-8 (1995); Su, Protein Expr Purif 66: 149-57 (2009)). Kada su stvoreni višestruko citotoksični proteini i testirani sa regionima koji su izvedeni iz Šiga toksina koji su povezani sa ciljanim regionima izvedenim iz imunoglobulina na njihovim amino-terminalima, ovi konstruisani proteini nisu pokazali Rčekivani nivo citotoksičnosti (videti primere u nastavku). Međutim, ovi proteini niže citotoksičnosti pokazali su vezivanje na površinu ćelije i ulazak, kao i druge slične in vitro enzimske aktivnosti i slične afinitete vezivanja u poređenju sa više citotoksičnim varijantama sa istim polipeptidnim regionima povezanim u drugačijoj konfiguraciji (videti primere u nastavku).
[0061] Kao što je dalje opisano u primerima, citotoksičnost citotoksičnih proteina zasnovanih na Šiga-toksin-podjedinici A, poboljšana je promenom orijentacije tako da je vezni region imunoglobulinskog tipa povezan sa karboksi-proksimalnim regionima u Šiga-toksin regionu. Međutim, orijentacija inženjeringa nije promenila ni katalitičku aktivnost regiona dobijenog od Šiga toksina, ni kinetiku vezivanja veznog regiona imunoglobulinskog tipa. Osetljivost citotoksičnosti (i unutarćelijskog usmeravanja) proteina zasnovanih na Šiga toksinu u odnosu na orijentacioni inženjering njegovih polipeptidnih komponenti je neočekivana i ostaje neobjašnjena. Ovi rezultati se ne mogu objasniti razlikama u veznim karakteristikama ciljnih proteina, karakteristikama vezivanja ćelija ili katalitičkim aktivnostima.
I. Opšta struktura za proteine iz pronalaska
[0062] Predmetni pronalazak obezbeđuje različite citotoksične proteine, gde svaki protein obuhvata 1) jedan vezni region imunoglobulinskog tipa za ciljanje ćelija, kako je definisano u patentnim zahtevima i 2) jedan efektorski region Šiga toksina za ćelijsku internalizaciju, unutarćelijsko usmeravanje, i/ili ubijanje ćelije, kako je definisano u patentnim zahtevima. Povezivanje ćelijskog ciljanja veznog regiona imunoglobulinskog tipa sa regionima dobijenim iz Šiga-toksin-podjedinice A omogućava inženjerstvo ciljanja ćelija specifičnog tipa sa potencijom citotoksičnosti Šiga-toksina. Protein iz pronalaska obuhvata jedan efektorski region Šiga toksina koji je izveden iz jedne ili više A podjedinice iz članova porodice Šiga toksina, kako je definisano u patentnim zahtevima, povezan za jedan vezni region imunoglobulinskog tipa koji se može specifično vezati za najmanje jedan vanćelijski ciljani biomolekul u fizičkoj asocijaciji sa ćelijom, kao što je ciljani biomolekul eksprimiran na površini ćelije, pri čemu je pomenuti vanćelijski ciljani biomolekul CD38. Ova opšta struktura je modulaRNK tako što bilo koji broj različitih veznih regiona imunolobulinskog tipa može biti povezan sa efektorskim regionima izvedenim iz podjedinice A Šiga toksina da bi se proizvele varijacije iste opšte strukture.
A. Vezni regioni imunoglobulinskog tipa
[0063] Vezni region of protein iz ovog pronalaska obuhvata jedan vezni region imunoglobulinskog tipa koji sadrži jedan ili više polipeptida koji su sposobni da selektivno i specifično vezuju vanćelijski ciljani biomolekul, kako je definisano u patentnim zahtevima. Izraz "vezni region imunoglobulinskog tipa" kako se ovde koristi, odnosi se na polipeptidni region sposoban da veže jedan ili više ciljanih biomolekula, kao što su antigen ili epitop. Vezni regioni imunoglobulinskog tipas su funkcionalno definisani njihovom sposobnošću vezivanja za ciljne molekule. Vezni regioni imunoglobulinskog tipa su obično izvedeni iz antitela ili struktura sličnih antitelima; međutim, u okviru obima izraza razmatraju se alternativni skafoldi iz drugih izvora.
[0064] Imunoglobulinski (Ig) proteini imaju strukturni domen poznat kao Ig domen. Dužine Ig domena kreću se od oko 70-110 aminokiselinskih ostataka i poseduju karakterističan Ignabor, u kojem se tipično 7 do 9 antiparalelnih beta lanaca raspoređuju u dve beta ploče koje čine strukturu sličnu sendviču. Ig nabor je stabilizovan hidrofobnim interakcijama aminokiselina na unutrašnjim površinama sendviča i visoko očuvanim disulfidnim vezama između ostataka cisteina u lancima. Ig domeni mogu biti varijabilni (IgV ili V-set), konstantni (IgC ili C-set) ili intermedijarni (IgI ili I-set). Ig domeni mogu biti povezani sa regijom koja određuje komplementarnost (CDR), koja se naziva i "regija koja određuje komplementarnost", što je važno za specifičnost antitela koja se vezuju za njihove epitope. Ig-slični domeni se takođe nalaze u neimunoglobulinskim proteinima i na osnovu toga su klasifikovani kao članovi Ig-porodice super-proteina. HUGO Komitet za gensku nomenklaturu (HGNC) obezbeđuje spisak članova porodice koja sadrži Ig-sličan domen.
[0065] Jedan vezni region imunoglobulinskog tipa može biti polipeptidna sekvenca antitela ili njegov antigen-vezujući fragment, pri čemu je aminokiselinska sekvenca varirala od sekvence nativnog antitela ili Ig-sličnog domena neimunoglobulinskog proteina, na primer, uz pomoć molekularnog inženjeringa ili selekcijom uz pomoć skrininga biblioteke. Zbog relevantnosti tehnika rekombinantne DNK i in vitro skrininga biblioteke u stvaranju vezne regije imunolobulinskog tipa, antitela se mogu redizajnirati da bi se dobila željena svojstva, poput manje veličine, ulaska u ćelije ili drugih terapijskih poboljšanja. Mogućih varijacija je mnogo i mogu se kretati od promene samo jedne aminokiseline do potpunog redizajna, na rimer, varijabilnog regiona. Tipično, promene u varijabilnom regionu će biti napravljene kako bi se poboljšale karakteristike vezivanja antigena, poboljšala stabilnost varijabilnog regiona ili smanjio potencijal za imunogeni odgovor.
[0066] Postoje i brojni vezni regioni imunolobulinskog tipa koji se smatraju komponentama proteina iz ovog pronalaska, kako je definisano u patentnim zahtevima. U određenim realizacijama, vezni region imunoglobulinskog tipa je izveden iz veznog regiona nekog imunoglobulina, kao što je paratop antitela koji je sposoban da veže neke vanćelijske ciljane biomolekul. U drugim realizacijama, vezni region imunoglobulinskog tipa obuhvata dizajnirani polipeptid koji nije izveden iz bilo kog domena imunoglobulina, ali koji funkcioniše kao vezni region imunoglobulina tako što pruža vezivanje visokog afiniteta za neke vanćelijske ciljane biomolekulie. Ovaj dizajnirani polipeptid može opciono da sadrži polipeptidne skafolde koje obuhvataju ili se sastoje u osnovi od komplementarnih određujućih regiona iz imunoglobulina, kako je ovde opisano.
[0067] Postoje brojni vezni regioni izvedeni iz imunoglobulina i neimunoglobulinski dizajnirani polipeptidi, u stanju tehnike, koji su korisni za ciljanje polipeptida za specifične tipove ćelija putem njihovih sposobnosti vezivanja sa visokim afinitetom. U određenim realizacijama, vezni region imunoglobulinskog tipa iz predmetnog proteina je izabran iz grupe koja uključuje domene antitela sa pojedinačnim domenom (sdAb), nanotela®, domeni antitela teškog lanca izvedeni iz kamelida (VHH fragmenti), bivalentna nanotela®, domeni antitela teškog lanca izvedeni iz hrskavičnih riba, imunoglobulinski novi receptori antigena (IgNARs), VNARfragmenti, jednolančani varijabilni (scFv) fragmenti, multimerizovani scFv fragmenti (dijatela, tria-tela, tetratela), bispecifični tandem scFv fragmenti, varijabilni (Fv) fragmenti antitela stabilizovana disulfidom, disulfidom stabilizovani antigen vezujući (Fab) fragmenti koji se sastoje od VL, VH, CLi CH1 domena, divalentni F(ab’)2 fragmenti, Fd fragmenti koji se sastoje od teškog lanca i CH1 domena, jednolančana Fv-CH3 minitela, bispecifična minitela, dimerni CH2 domen fragmenti (CH2D), Fc antigen vezujući domeni (Fcabs), izolovani komplementarni određujući region 3 (CDR3) fragmenti, ograničeni okvirni region 3, CDR3, okvirni region 4 (FR3- CDR3-FR4) polipeptidi, mali modularni imunofarmaceutski (SMIP™) domeni, scFv-Fc fuzije, multimerizovani scFv fragmenti (dijatela, tria-tela, tetra-tela), varijabilni (Fv) fragmenti antitela stabilizovana disulfidom, disulfidom stabilizovani antigen vezujući (Fab) fragmenti koji se sastoje od VL, VH, CLi CH1 domena, bivalentna nanotela®, bivalentna minitela, bivalentni F(ab’)2fragmenti (Fab dimeri), bispecifični tandem VHH fragmenti, bispecifični tandem scFv fragmenti, bispecifična nanotela, bispecifična minitela®, i bilo koji odgovarajući pandan prethodno pomenutih koji su genetski manipulisani tako da zadržavaju svoj paratop i vezujuću funkciju (videti Saerens D et al., Curr Opin Pharmacol 8: 600-8 (2008); Dimitrov D, MAbs 1: 26-8 (2009); Weiner L, Cell 148: 1081-4 (2012); Ahmad Z et al., Clin Dev Immunol 2012: 980250 (2012)). Postoji niz veznih regiona koji obuhvataju polipeptide izvedene iz konstantnih regiona imunoglobulina, kao što su, na pr., dizajnirani dimerni Fc domeni, monomerni Fcs (mFcs), scFv-Fcs, VHH-Fcs, CH2 domeni, monomerni CH3s domeni (mCH3s), sintetički reprogramirani imunoglobulinski domeni, i/ili hibridne fuzije imunoglobulinskih domena sa ligandima (Hofer T et al., Proc Natl Acad Sci U. S. A.105: 12451-6 (2008); Xiao J et al., J Am Chem Soc 131: 13616-13618 (2009); Xiao X et al., Biochem Biophys Res Commun 387: 387-92 (2009); Wozniak-Knopp G et al., Protein Eng Des Sel 23289-97 (2010); Gong R et al., PLoS ONE 7: e42288 (2012); Wozniak-Knopp G et al., PLoS ONE 7: e30083 (2012); Ying T et al., J Biol Chem 287: 19399-408 (2012); Ying T et al., J Biol Chem 288: 25154-64 (2013); Chiang M et al., J Am Chem Soc 136: 3370-3 (2014); Rader C, Trends Biotechnol 32: 186-97 (2014); Ying T et al., Biochimica Biophys Acta 1844: 1977-82 (2014)).
[0068] U skladu sa određenim drugim realizacijama, vezni region imunoglobulinskog tipa obuhvata dizajnirani, alternativni skafold za imunoglobulinske domene. Dizajnirani alternativni skafoldi poznati su u struci i oni pokazuju slične funkcionalne karakteristike kao strukture izvedene iz imunoglobulina, poput visokog afiniteta i specifičnog vezivanja ciljanih biomolekula, i mogu pružiti poboljšane karakteristike imunoglobulinskih domena, kao što su, na pr., veća stabilnost ili smanjena imunogenost. Generalno, alternativni skafoldi za imunoglobuline su manji od 20 kilodaltona, sastoje se od jednog polipeptidnog lanca, nemaju ostatke cisteina i pokazuju relativno visoku termodinamičku stabilnost.
[0069] Za određene realizacije za proteine iz predmetnog otkrića, vezni region obuhvata alternativni skafold odabran iz grupe koja uključuje dizajnirani, izveden iz fibronektin, 10<th>fibronektin tip III (10Fn3) domen (monotela, AdNectins™, ili AdNexins™); dizajnirani, izveden iz tenascina, tenascin tip III domen (Centryns™); dizajnirani, ponavljajući motiv ankirina koji sadrži polipeptid (DARPins™); dizajnirani, izveden iz receptora lipoproteina male gustine, A domen (LDLR-A) (Avimers™); lipokalin (antikalini); dizajnirani, izveden iz inhibitora proteaze, Kunic domen; dizajnirani, Izveden iz proteina A, Z domen (Affibodies™); dizajnirani, izveden iz gama-B Kristalina skafold ili dizajnirani, izveden iz ubikvitina skafold (Affilins); polipeptidi izvedeni iz Sac7d (Nanoffitins® ili afitini); dizajnirani, izveden iz Fyn, SH2 domen (Fynomers®); miniproteini; C-tip skafold domen sličan lektinu, dizajnirani mimici antitela, i bilo koji odgovarajući pandan od prethodno pomenutih koji je genetski manipulisan a koji zadržava svoju veznu funkcionalnost (Wörn A, Plćckthun A, J Mol Biol 305: 989-1010 (2001); Xu L et al., Chem Biol 9: 933-42 (2002); Wikman M et al., Protein Eng Des Sel 17: 455-62 (2004); Binz H et al., Nat Biotechnol 23: 1257-68 (2005); Hey T et al., Trends Biotechnol 23 :514-522 (2005); Holliger P, Hudson P, Nat Biotechnol 23: 1126-36 (2005); Gill D, Damle N, Curr Opin Biotech 17: 653-8 (2006); Koide A, Koide S, Methods Mol Biol 352: 95-109 (2007); Byla P et al., J Biol Chem 285: 12096 (2010); Zoller F et al., Molekulas 16: 2467-85 (2011)).
[0070] Na primer, identifikovani su brojni alternativni skafoldi koji se vezuju za vanćelijski receptor HER2 (videti na pr. Wikman M et al., Protein Eng Des Sel 17: 455-62 (2004); Orlova A et al. Cancer Res 66: 4339-8 (2006); Ahlgren S et al., Bioconjug Chem 19: 235-43 (2008); Feldwisch J et al., J Mol Biol 398: 232-47 (2010); U.S. patenti 5,578,482; 5,856,110; 5,869,445; 5,985,553; 6,333,169; 6,987,088; 7,019,017;
7,282,365; 7,306,801; 7,435,797; 7,446,185; 7,449,480; 7,560,111; 7,674,460;
7,815,906; 7,879,325; 7,884,194; 7,993,650; 8,241,630; 8,349,585; 8,389,227;
8,501,909; 8,512,967; 8,652,474; i U.S. patentna prijava 2011/0059090).
[0071] Bilo koji od gore navedenih veznih regiona imunoglobulinskog tipa može se koristiti kao komponenta iz ovog pronalaska, kako je definisano u patentnim zahtevima, sve dok komponenta veznog regiona ima konstantu disocijacije od 10<-5>do 10<-12>mola/litar, poželjno manju od 200 nM, prema vanćelijskim ciljanim biomolekulima kako je ovde opisano.
Vanćelijski ciljani biomolekuli
[0072] Vezni region iz proteina iz pronalaska obuhvata polipeptidni region koji je sposobnu da se specifično veže za neke vanćelijske ciljne biomolekule, kako je definisano u patentnim zahtevima, poželjno koji je fizički povezan sa površinom ćelijskog tipa od interesa, kao što je ćelija karcinoma, tumorska ćelija, plazma ćelija, zaražena ćelija ili ćelija domaćina koja nakuplja unutarćelijske patogene.
[0073] Izraz "ciljani biomolekul" se odnosi na biološki molekul, obično protein ili protein modifikovan posttranslacionim modifikacijama, kao što je glikozilacija, koji je sposoban da se veže veznim regionom za ciljni protein na određeni tip ćelije ili na određeno mesto unutar nekog organizma. Vanćelijski ciljani biomolekuli mogu da uključuju različite epitope, uključujući nemodifikovane polipeptide, polipeptide modifikovane dodavanjem biohemijskih funkcionalnih grupa i glikolipide (videti na pr. U.S. Patent 5,091,178; EP 2431743). Poželjno je da se vanćelijski ciljani biomolekuli endogeno internalizuju ili se prisile na internalizaciju nakon interakcije sa proteinom iz pronalaska.
[0074] U svrhe ovog pronalaska, Izraz "vanćelijski" u odnosu na modifikovanje ciljanog biomolekula, odnosi se na biomolekul koji ima bar deo svoje strukture izložen vanćelijskoj sredini. Vanćelijski ciljani biomolekuli uključuju komponente ćelijske membrane, proteine koji se protežu preko membrana, biomolekule usidrene u ćelijsku membranu, biomolekule povezane sa ćelijskom površinom i izlučene biomolekule.
[0075] Što se tiče predmetnog pronalaska, izraz „fizički spregnut“ kada se koristi za opis ciljanog biomolekula označava i kovalentne i/ili nekovalentne intermolekularne interakcije koje spajaju ciljani biomolekul ili njegov deo sa spoljnom stranom ćelije, kao što je na pr. mnoštvo nekovalentnih interakcija između ciljanog biomolekula i ćelije gde je energija svake pojedinačne interakcije veličine oko 1-5 kilokalorija (na pr. elektrostatičke veze, vodonične veze, Van der Valls-ove interakcije, hidrofobne sile itd.). Svi integralni membranski proteini mogu se naći fizički povezani sa ćelijskom membranom, kao i proteini periferne membrane. Na primer, vanćelijski ciljani biomolekul može sadržati transmembranski region u rasponu, lipidno sidro, glikolipidno sidro, i/ili može biti nekovalentno povezao (na pr. putem nespecifičnih hidrofobnih interakcija i/ili lipidnih interakcija) sa faktorom koji obuhvata bilo šta od navedenog.
[0076] Vanćelijski ciljani biomolekuli iz veznog regiona za proteine iz otkrića mogu da uključuju biomarkere koji su prekomerno ili ekskluzivno prisutni na ćelijama karcinoma, imunskim ćelijama i ćelijama zaraženim unutarćelijskim patogenima, poput virusa, bakterija, gljivica, priona ili protozoa.
[0077] Vezni regioni za proteine iz otkrića mogu se dizajnirati ili odabrati na osnovu brojnih kriterijuma, kao što je ekspresija specifična za ćelijski tip njihovih ciljanih biomolekula i/ili fizička lokalizacija njihovih ciljanih biomolekula s obzirom na specifične ćelijske tipove. Na primer, određeni proteini iz predmetnog otkrića obuhvataju vezne domene koji su sposobni da vezuju ciljne molekule na površini ćelije koje eksprimira samo jedan tip ćelije na površini ćelije.
[0078] Opšta struktura za proteine iz predmetnog otkrića je modularna, tako da se različiti, raznovrsni vezni regioni imunoglobulinskog tipa mogu koristiti sa istim efektorskim regionom Šiga toksina kako bi se obezbedilo raznoliko ciljanje različitih vanćelijskih ciljanih biomolekula, a time i ciljanje citotoksičnosti, citostaze, dijagnostičkih agenasa i/ili dostava egzogenog materijala u raznolike ćeijske tipove.
B. Efektorski regioni Šiga toksina izvedeni iz A podjedinica iz članova porodice Šiga toksina
[0079] U svrhe ovog pronalaska, fraza „efektorski region Šiga toksina“ odnosi se na polipeptidni region izveden iz Šiga toksin A podjedinice iz člana porodice Šiga toksina koji je sposoban da pokaže najmanje jednu funkciju Šiga toksina, kako je definisano u patentnim zahtevima. Funkcije šiga toksina uključuju, na pr., ulazak u ćelije, deformaciju lipidne membrane, usmeravanje subćelijskog kretanja, izbegavanje degradacije, katalitičku inaktivaciju ribozoma, citotoksični efekat i citostataki efekat.
[0080] Član porodice Šiga toksina odnosi se na bilo kog člana porodice prirodnih proteinskih toksina koji su strukturno i funkcionalno povezani, naročito toksina izolovanih iz S. dysenteriae i E. coli (Johannes, Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (2010) )). Na primer, porodica Šiga toksina obuhvata pravi Šiga toksin (Stx) izolovan iz S. dysenteriae serotip 1, varijante Šiga-sličan toksin 1 (SLT1 ili Stx1 ili SLT-1 ili Slt-I) koje su izolovane iz serotipova enterohemoragične E. coli i varijante Šiga-sličan toksin 2 (SLT2 ili Stx2 ili SLT-2) koje su izolovane iz serotipova enterohemoragične E. coli. SLT1 se razlikuje samo po jednom ostatku od Stx, a oba su nazivana Verocitotoksini ili Verotoksini (VT-i) (O’Brien, Curr Top Microbiol Immunol 180: 65-94 (1992)). Iako su varijante SLT1 i SLT2 samo oko 53-60% slične jedna drugoj na nivou aminokiselinske sekvence, one dele mehanizme enzimske aktivnosti i citotoksičnosti zajedničke svim članovima porodice Šiga toksina (Johannes, Nat Rev Microbiol 8: 105-16 (2010)).
Opisano je preko 39 različitih Šiga toksina, kao što su definisani podtipovi Stxla, Stxlc, Stxld i Stx2a-g (Scheutz F et al., J Clin Microbiol 50: 2951-63 (2012)). Članovi porodice Šiga toksina nisu prirodno ograničeni ni na jednu bakterijsku vrstu, jer se geni koji kodiraju šiga-toksin mogu širiti među bakterijskim vrstama horizontalnim prenosom gena (Strauch E et al., Infect Immun 69: 7588-95 (2001); Zhaxybayeva O, Doolittle W, Curr Biol 21: R242-6 (2011). Kao primer prenosa između vrsta, Šiga toksin je otkriven u soju A. haemolyticus koji je izolovan kod pacijenta (Grotiuz G et al., J Clin Microbiol 44: 3838-41 (2006)). Jednom kada Šiga toksin koji kodira polinukleotid uđe u novu podvrstu ili vrstu, pretpostavlja se da je aminokiselinska sekvenca Šiga toksina sposobna da razvije male varijacije sekvence zbog genetskog pomeranja i/ili selektivnog pritiska, a da i dalje održava mehanizam citotoksičnosti koji je zajednički članovima porodica Šiga toksina (videti Scheutz, J Clin Microbiol 50: 2951-63 (2012)).
[0081] Efektorski region Šiga toksina iz pronalasaka obuhvataju ili se sastoje u osnovi od polipeptida izvedenog iz Šiga toksin A podjedinice koji je razdvojen od bilo kog oblika svoje nativne Šiga toksin B podjedinice, kako je definisano u patentnim zahtevima. Pored toga, proteini iz ovog pronalaska ne sadrže polipeptid koji obuhvata ili se sastoji u osnovi od funkcionalnog veznog domena nativne Šiga toksin B podjedinice. Umesto toga, regioni izvedeni iz Šiga toksin A podjedinice su funkcionalno povezani sa heterolognim veznim regionom imunoglobulinskog tipa da bi se postiglo ciljanje ćelija.
[0082] U određenim realizacijama, jedan efektorski region Šiga toksina iz pronalaska može obuhvatati ili se sastojati u osnovi od Šiga toksin A podjedinice pune dužine (na pr. SLT-1A (SEKV ID BR: 1), StxA (SEKV ID BR: 2), ili SLT-2A (SEKV ID BR: 3)), napominjući da Šiga toksin A podjedinice, koje se javljaju u prirodi, mogu da obuhvataju oblike prekursora koji sadrže signalne sekvence od oko 22 aminokiselina na njihovim amino terminalima koji se uklanjaju kako bi se proizveli zrele Šiga toksin A podjedinice i koji su prepoznatljivi iskusnom radniku. U drugim izvođenjima, efektorski region Šiga toksina iz pronalaska sadrži ili se sastoji u osnovi od odsečene Šiga toksin A podjedinice kojija je kraća od Šiga toksin A podjedinice pune dužine, kako je definisano u patentnim zahtevima.
[0083] Otsečci Šiga slični toksin 1 A podjedinice su katalitički aktivni, sposobni da enzimski inaktiviraju ribozome in vitro i citotoksični kada se eksprimiraju u ćeliji (LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)). Najmanji fragment Šiga toksin A podjedinice koji pokazuje punu enzimsku aktivnost je polipeptid sastavljen od rezidua 1-239 iz Slt1A (LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)). Iako su najmanji fragmenti Šiga toksin A podjedinice koji su zadržali značajnu katalitičku aktivnost su ostaci 75-247 StxA (Al-Jaufi, Infect Immun 62: 956-60 (1994)), za StxA skraćivanje eksprimirano de novo u eukariotskoj ćeliji je potrebno samo do rezidua 240 da bi mogao da dođe do citozola i izvrši katalitičku inaktivaciju ribozoma (LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)).
[0084] Efektorski region Šiga toksina obično mogu biti manje od A podjedinica pune dužine. Poželjno je da efektorski region Šiga toksina održava polipeptidni region iz položaja aminokiselina 77 do 239 (SLT-1A (SEKV ID BR:1) ili StxA (SEKV ID BR:2)) ili ekvivalentno u drugim A podjedinicima iz članova porodice Šiga toksina (na pr. 77 do 238 of (SEKV ID BR:3)). Na primer, u određenim realizacijama iz pronalaska, jedan efektorski region Šiga toksina izveden iz SLT- 1A može da obuhvata ili se sastoji uglavnom od aminokiselina 75 do 251 iz SEKV ID BR:1, 1 do 241 iz SEKV ID BR:1, 1 do 251 iz SEKV ID BR:1, ili od aminokiselina 1 do 261 iz SEKV ID BR:1. Između drugih realizacija, jedan efektorski region Šiga toksina izveden iz StxA može da obuhvata ili se sastoji uglavnom od aminokiselina 75 do 251 iz SEKV ID BR:2, 1 do 241 iz SEKV ID BR:2, 1 do 251 iz SEKV ID BR:2, ili od aminokiselina 1 do 261 iz SEKV ID BR:2. Između drugih realizacija, jedan efektorski region Šiga toksina izveden iz SLT-2 može da obuhvata ili se sastoji uglavnom od aminokiselina 75 do 251 iz SEKV ID BR:3, 1 do 241 iz SEKV ID BR:3, 1 do 251 iz SEKV ID BR:3, ili od aminokiselina 1 do 261 iz SEKV ID BR:3.
[0085] Pronalazak dalje obezbeđuje varijante za proteine iz pronalaska, pri čemu se efektorski region Šiga toksina razlikuje od prirodnog Šiga toksin A podjedinice po do 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 , 25, 30, 35, 40 ili više aminokiselinskih ostataka (ali ne više od onoga koji zadržava najmanje 90%, 95%, 99% ili više identiteta sekvence aminokiselina, kako je definisano u patentnim zahtevima). Dakle, polipeptidni region izveden iz A podjedinice iz člana porodice Šiga toksina može sadržati adicije, delecije, odsecanja ili druge promene originalne sekvence sve dok se identitet sekvence aminokiselina najmanje 90%, 95%, 99% ili više održava kao u prirodno nastaloj Šiga toksin A podjedinici, kako je definisano u patentnim zahtevima.
[0086] Shodno tome, u određenim realizacijama, efektorski region Šiga toksina sadrži ili se sastoji u osnovi od aminokiselinskih sekvenci koje imaju najmanje 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ili 99,7% ukupnog identiteta sekvence prirodno nastale Šiga toksin A podjedinice SLT-1A (SEKV ID BR:1), Stx (SEKV ID BR:2), i/ili SLT-2A (SEKV ID BR:3).
[0087] Opciono, ili cela verzija ili skraćena verzija Šiga toksin A podjedinice mogu da obuhvate jednu ili više mutacija (na pr. supstitucije, delecije, insercije ili inverzije). U određenim realizacijama, poželjno je da efektorski region Šiga toksina ima dovoljnu identičnost sekvence prirodno nastale Šiga toksin A podjedinice da zadrži citotoksičnost nakon ulaska u ćeliju, bilo pomoću poznatih metoda transformacije, transfekcije, infekcije ili indukcije ćelija domaćina ili pomoću internalizacije posredovane ciljanjem ćelija, u vezni region imunoglobulinskog tipa povezan sa efektorskim regionom Šiga toksina. Najkritičniji ostaci za enzimsku aktivnost i/ili citotoksičnost u Šiga toksin A podjedinicima mapirani su na sledeće položaje ostataka: aspargin-75, tirozin-77, glutamat-167, arginin-170 i arginin-176, između ostalih (Di, Toxicon 57: 525-39 (2011)). U bilo kojoj realizaciji iz pronalaska, efektorski region Šiga toksina može poželjno, ali ne nužno da održi jednu ili više konzervisanih aminokiselina na položajima, kao što su oni koji se nalaze na pozicijama 77, 167, 170 i 176 u StxA, SLT-1A, ili ekvivalentne očuvane položaje u drugim članovima porodice Šiga toksina koji su tipično potrebni za citotoksičnu aktivnost. Sposobnost citotoksičnog proteina iz pronalaska da izazove ćelijsku smrt, na pr. njegova citotoksičnost, može se meriti pomoću bilo kog jednog ili više testova koji su dobro poznati u tehnici.
[0088] U određenim realizacijama iz pronalaska, jedan ili više aminokiselinskih ostataka mogu se mutirati, insertovati ili izbrisati kako bi se povećala enzimska aktivnost efektorskog regiona Šiga toksina. Na primer, mutirajuća pozicija ostatka alanin-231 u StxlA u glutamat povećava njegovu enzimsku aktivnost in vitro (Suhan M, Hovde C, Infect Immun 66: 5252-9 (1998)).
[0089] U određenim realizacijama iz pronalaska, jedan ili više aminokiselinskih ostataka mogu biti mutirani ili izbrisani kako bi se smanjila ili eliminisala katalitička i/ili citotoksična aktivnost efektorskog regiona Šiga toksina. Katalitička i/ili citotoksična aktivnost A podjedinica iz članova porodice Šiga toksina može se smanjiti ili eliminisati mutacijom ili skraćivanjem. Pokazalo se da su položaji označeni sa tirozin-77, glutamat-167, arginin-170, tirozin-114 i triptofan-203 važni za katalitičku aktivnost Stx, Stx1 i Stx2 (Hovde C et al., Proc Natl Acad Sci USA 85: 2568-72 (1988); Deresiewicz R et al., Biochemistry 31: 3272-80 (1992); Deresiewicz R et al., Mol Gen Genet 241: 467-73 (1993); Ohmura M et al., Microb Pathog 15: 169-76 (1993); Cao C et al., Microbiol Immunol 38: 441-7 (1994); Suhan, Infect Immun 66: 5252-9 (1998)). Mutiranjem i glutamata-167 i arginina-170 eliminisana je enzimska aktivnost Slt-I A1 u testu inaktivacije ribozoma bez ćelija (LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)). U drugom pristupu korišćenjem de novo ekspresije Slt-I A1 u endoplazmatskom retikulumu, mutiranjem i glutamata-167 i arginina-170 eliminisana je citotoksičnost fragmenta Slt-I A1 na tom nivou ekspresije (LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)). Analiza skraćivanja pokazala je da fragment StxA od ostataka 75 do 268 i dalje zadržava značajnu enzimsku aktivnost in vitro (Haddad, J Bacteriol 175: 4970-8 (1993)). Skraćeni fragment Slt-I A1 koji sadrži ostatke 1-239 pokazao je značajnu enzimatsku aktivnost in vitro i citotoksičnost de novo ekspresijom u citozolu (LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)). Ekspresija fragmenta Slt-I A1 skraćenog na ostatke 1-239 u endoplazmatskom retikulumu nije bila citotoksična jer on nije mogao da se retrotranslocira u citozol (LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)).
[0090] Kako se ovde koristi, zadržavanje „značajne“ efektorske funkcije Šiga toksina odnosi se na nivo funkcionalne aktivnosti Šiga toksina, kako je mereno odgovarajućim kvantitativnim testom sa ponovljivošću uporedivom sa kontrolnim polipeptidom Šiga toksina divljeg tipa. Za in vitro inhibiciju ribozoma, značajna efektorska funkcija Šiga toksina pokazuje IC50od 300 pM ili manje, u zavisnosti od izvora ribozoma (na pr. bakterije, arheje ili eukarioti (alge, gljive, biljke ili životinje)). Ovo je značajno veća inhibicija u poređenju sa približno IC50od 100,000 pM za katalitički neaktivni dvostruki mutant SLT-1A 1-251 (Y77S/E167D). Za citotoksičnost u pozitivnog testu ubijanja ciljanih ćelija u laboratorijskoj kulturi ćelija, značajna efektorska funkcija Šiga toksina pokazuje CD50od 100, 50 ili 30 nM ili manje, u zavisnosti od ćelijske linije i njegove ekspresije odgovarajućeg vanćelijskog ciljanog biomolekula. To je značajno veća citotoksičnost za odgovarajuću ciljanu ćelijsku liniju u poređenju sa samo SLT-1A komponentom, bez ciljanog ćelijskog veznog regiona koji ima CD50od 100-10,000 nM, u zavisnosti od ćelijske linije.
[0091] Za neke uzorke, tačne vrednosti za IC50ili CD50se ne mogu dobiti zbog nemogućnosti sakupljanja potrebnih tačaka podataka za tačno uklapanje krive. Netačne vrednosti IC50i/ili CD50ne treba uzimati u obzir pri određivanju značajne aktivnosti efektorske funkcije Šiga toksina. Podaci nedovoljni da se tačno uklapaju u krivu, kao što je opisano u analizi podataka iz primera testova efektorske funkcije Šiga toksina, kao što su, na pr., testovi opisani u primerima, ne bi se trebali smatrati reprezentativnim za stvarnu efektorsku funkciju Šiga toksina. Na primer, teoretski se ne može utvrditi ni IC50ni CD50ako se ne dogodi inhibicija veća od 50% ribozoma, odnosno ćelijske smrti u koncentracionoj seriji datog uzorka.
[0092] Neuspeh u otkrivanju aktivnosti u efektorskoj funkciji Šiga toksina može biti posledica nepravilne ekspresije, presavijanja polipeptida i/ili zbog stabilnosti polipeptida, pre nego zbog nedostatka ulaska u ćelije, subcelularnog usmeravanja, i/ili enzimske aktivnosti. Esej za efektorske funkcije Šiga toksina možda neće zahtevati puno polipeptida iz pronalaska za merenje značajnih količina efektorske aktivnosti Šiga toksina. U meri u kojoj se osnovni uzrok niske ili nikakve efektorske funkcije empirijski utvrdi da se odnosi na ekspresiju ili stabilnost proteina, stručnjak u ovoj oblasti može biti u stanju da nadoknadi takve faktore korišćenjem proteinske hemije i tehnika molekularnog inženjerstva poznatih u struci, tako da se funkcionalna efektorska aktivnost Šiga toksina može obnoviti i izmeriti. Kao primeri, nepravilna ekspresija zasnovana na ćelijama može se nadoknaditi korišćenjem različitih kontrolnih sekvenci ekspresije; neodgovarajuće umotavanje polipeptida i/ili stabilnost može imati koristi od stabilizacije terminalnih sekvenci ili kompenzatornih mutacija u neefektorskim regionima koji stabilizuju trodimenzionalnu strukturu iz proteina, itd. Kada postanu dostupni novi testovi za pojedinačne funkcije Šiga toksina, efektorski region Šiga toksina ili polipeptidi mogu da se analiziraju na bilo kom nivou tih efektorskih funkcija Šiga toksina, kao što je na primer određena aktivnost uvijanja polipeptidnog efektora Šiga toksina divljeg tipa. Primeri značajnih razlika u aktivnostima su, na pr., efektorski regioni Šiga toksina koji imaju 1000 puta ili 100 puta ili manju aktivnost efektora polipeptida Šiga toksina divljeg tipa; ili koji imaju 3 do 30 puta ili veću aktivnost u poređenju sa funkcionalnim obaranjem ili nokautom polipeptidnog efektora Šiga toksina.
[0093] Određene efektorske funkcije Šiga toksina nisu lako merljive, na pr. subcelularne funkcije rutiranja. Trenutno ne postoji rutinski kvantitativni test koji bi razlikovao da li je neuspeh polipeptidnog efektora Šiga toksina da bude citotoksičan zbog nepravilnog subćelijskog usmeravanja, ali u vreme kada su dostupni testovi, tada se polipeptidni efektori Šiga toksina mogu analizirati za bilo koji značajan nivo subcelularnog usmeravanja u poređenju sa odgovarajućim efektorskim regionom Šiga toksina divljeg tipa.
[0094] Treba napomenuti da čak i ako je citotoksičnost polipeptidnog efektora Šiga toksina smanjena u odnosu na divlji tip, u praksi, aplikacije koje koriste oslabljeni poligeptidni efektor Šiga toksina mogu biti podjednako ili efikasnije od onih koje koriste polipeptidnog efektora Šiga toksina divljeg tipa jer varijante najviše potencije mogu pokazivati neželjena dejstva koja su umanjena u varijantama smanjene potencije.
Polipeptidni efektori Šiga toksina divljeg tipa su vrlo potentni, jer mogu da ubijaju samo jednim molekulom koji je dostigao do citozola ili možda sa 40 molekula koji se internalizuju. Polipeptidni efektori Šiga toksina sa čak i znatno smanjenim efektorskim funkcijama Šiga toksina, kao što su, na pr., subcelularno usmeravanje ili citotoksičnost, u poređenju sa polipeptidim efektorom Šiga toksina divljeg tipa i dalje mogu biti dovoljno potentni za praktične primene koje uključuju ciljano ubijanje ćelije i/ili specifičnu detekciju ćelija.
[0095] U svrhu ovog pronalaska utvrđen je specifičan redosled ili orijentacija efektora Šiga toksina i veznih regiona imunoglobulinskog tipa, kako je definisano u patentnim zahtevima, tako da se vezni region imunoglobulinskog tipa nalazi unutar proteina koji je više proksimalan karboksilnom kraju efektorskog regiona Šiga toksina nego u odnosu na aminoterminus efektorskog regiona Šiga toksina (videti na pr. Slika 1). U gornjim realizacijama proteini iz pronalaska, vezni regioni, efektorski region Šiga toksina (koji mogu biti citotoksični i/ili imaju jednu ili više mutacija koje smanjuju ili eliminišu katalitičku aktivnost i/ili citotoksičnosti) mogu biti direktno povezani jedni sa drugima i/ili na odgovarajući način povezani jedni sa drugima preko jedne ili više intervenišućih polipeptidnih sekvenci, kao na primer sa jednim ili više linkera dobro poznatih u tehnici i/ili ovde opisanih.
C. Veze koje povezuju polipeptidne komponente iz pronalaska i/ili njihove potkomponente
[0096] Pojedinačni polipeptidni i/ili proteinski sastojci iz pronalaska, na pr. vezni regioni i efektorski region Šiga toksina (koji mogu biti citotoksični i/ili imaju jednu ili više mutacija koje menjaju, smanjuju ili eliminišu katalitičku aktivnost i/ili citotoksičnost), mogu biti odgovarajuće povezani jedni sa drugima putem jednog ili više linkera koji su dobro poznati u stanju tehnike i/ili su ovde opisani. Pojedinačne podkomponente polipeptida iz veznog regiona, na pr. Vrednost CDR i/ili ABR regioni mogu biti međusobno pogodno povezani preko jednog ili više linkera koji su dobro poznati u stanju tehnike i/ili su ovde opisani (videti na pr. Weisser N, Hall J, Biotechnol Adv 27: 502-20 (2009); Chen X et al., Adv Drug Deliv Rev 65: 1357-69 (2013)). Polipeptidne komponente iz pronalaska, na pr., višelančani vezni regioni, mogu biti pogodno povezani jedni sa drugima ili sa drugim polipeptidnim komponentama iz pronalaska preko jednog ili više linkera koji su dobro poznati u stanju tehnike. Peptidne komponente iz pronalaska, na pr., motivi za retenciju/povraćaj signala endoplazmatskog retikuluma iz porodice KDEL, mogu biti odgovarajuće povezani sa drugom komponentom iz pronalasaka pomoću jednog ili više linkera, kao što je proteinski linker, koji su dobro poznati u stanju tehnike.
[0097] Pogodni linkeri su obično oni koji omogućavaju da se svaka polipeptidna komponenta iz pronalaska presavije sa trodimenzionalnom strukturom vrlo sličnom sa polipeptidnim komponentama proizvedenim pojedinačno bez ikakvog linkera ili druge komponente. Pogodni linkeri uključuju pojedinačne aminokiseline, peptide, polipeptide i linkere kojima nedostaje bilo koji od gore pomenutih, kao što su, na pr., različiti neproteinski lanci ugljenika, bilo da su razgranati ili ciklični (videti na pr. Chen X et al., Adv Drug Deliv Rev 65: 1357-69 (2013)).
[0098] Pogodni linkeri mogu biti proteinski i da obuhvataju jednu ili više aminokiselina, peptida, i/ili polipeptida. Proteinski linkeri su pogodni i za rekombinantne fuzione proteine i za hemijski povezane konjugate. Proteinski linker obično ima od oko 2 do oko 50 aminokiselinskih ostataka, kao što je na primer, od oko 5 do oko 30 ili od oko 6 do oko 25 aminokiselinskih ostataka. Dužina izabranog linkera zavisiće od različitih faktora, kao što su, na pr., željeno svojstvo ili svojstva za koja se linker odbira (videti na pr. Chen X et al., Adv Drug Deliv Rev 65: 1357-69 (2013)).
[0099] Pogodni linkeri mogu biti neproteinski, kao što su, na pr. hemijski linkeri (videti na pr. Dosio F et al., Toxins 3: 848-83 (2011); Feld J et al., Oncotarget 4: 397-412 (2013)). Razni neproteinski linkeri poznati u stanju tehnike mogu se koristiti za povezivanje veznih regija sa efektorskim regionom Šiga toksina, kao što su linkeri koji se obično koriste za konjugaciju polipeptida izvedenih iz imunoglobulina i heterolognih polipeptida. Na primer, polipeptidni regioni proteina iz ovog pronalaska mogu se povezati pomoću funkcionalnih bočnih lanaca njihovih aminokiselinskih ostataka i ostataka ugljenih hidrata kao što su, na pr., karboksi, amin, sulfhidril, karbonska kiselina, karbonil, hidroksil, i/ili ciklična prstenasta grupa. Na primer, disulfidne veze i tioetarske veze mogu se koristiti za povezivanje dva ili više polipeptida (videti na pr. Fitzgerald D et al., Bioconjugate Chem 1: 264-8 (1990); Pasqualucci L et al., Haematologica 80: 546-56 (1995)). Pored toga, neprirodni aminokiselinski ostaci mogu se koristiti sa drugim funkcionalnim bočnim lancima, kao što su ketonske grupe (videti na pr. Sun S et al., Chembiochem Jul 18 (2014); Tian F et al., Proc Natl Acad Sci USA 111: 1766-71 (2014)). Primeri neproteinskih hemijskih linkera uključuju, ali nisu ograničeni na N-sukcinimidil (4-jodoacetil)-aminobenzoat, S-(N-sukcinimidil) tioacetat (SATA), N-sukcinimidil-oksikarbonil-cu-metil-a-(2-piridilditio) toluen (SMPT), N-sukcinimidil 4-(2-piridilditio)-pentanoat (SPP), sukcinimidil 4-(N-maleimidometil) cikloheksan karboksilat (SMCC ili MCC), sulfosukcinimidil (4-jodoacetil)-aminobenzoat, 4-sukcinimidil-oksikarbonil-D-(2-piridilditio) toluen, sulfosukcinimidil-6-(D-metil-D-(piridilditiol)-toluamido) heksanoat, N-sukcinimidil-3-(-2-piridilditio)-proprionat (SPDP), sukcinimidil 6(3(-(-2-piridilditio)-proprionamido)heksanoat, sulfosukcinimidil 6(3(-(-2-piridilditio)-propionamido)heksanoat, maleimidokaproil (MC), maleimidokaproil-valin-citrulin-p-aminobenziloksikarbonil (MC-vc-PAB), 3-maleimidobenzoeva kiselina N-hidroksisukcinimid estar (MBS), alfa-alkil derivati, sulfoNHS-ATMBA (sulfosukcinimidil N-[3-(acetiltio)-3-metilbutiril-beta-alanin]), sulfodihlorfenol, 2-iminotiolan, 3-(2-piridilditio)-propionil hidrazid, Elmanov reagens, dihlortriazinska kiselina, i S-(2-tiopiridil)-L-cistein (videti na pr. Thorpe P et al., Eur J Biochem 147: 197-206 (1985); Thorpe P et al., Cancer Res 47: 5924-31 (1987); Thorpe P et al., Cancer Res 48: 6396-403 (1988); Grossbard M et al., Blood 79: 576-85 (1992); Lui C et al., Proc Natl Acad Sci USA 93: 8618-23 (1996); Doronina S et al., Nat Biotechnol 21: 778-84 (2003); Feld J et al., Oncotarget 4: 397-412 (2013)).
[0100] Pogodni linkeri, bilo da su proteinski ili neproteinski, mogu da uključuju, na pr., osetljive na proteaze, osetljive na okolinski redoks potencijal, osetljive na pH, kiselinom cepajuće, fotocepajuće, i/ili toplotno osetljive linkere (videti na pr. Dosio F et al., Toxins 3: 848-83 (2011); Chen X et al., Adv Drug Deliv Rev 65: 1357-69 (2013); Feld J et al., Oncotarget 4: 397-412 (2013)).
[0101] Proteinski linkeri mogu biti izabrani za ugradnju u rekombinantne fuzione proteine iz ovog pronalaska. Na primer, komponentni polipeptidi proteina iz ovog pronalaska ili njihove potkomponente mogu se spojiti sa jednim ili više linkera koji obuhvataju jednu ili više aminokiselina, peptida, i/ili polipeptida. Za rekombinantne fuzione proteine iz pronalaska, linkeri obično sadrže oko 2 do 50 aminokiselinskih ostataka, poželjno oko 5 do 30 aminokiselinskih ostataka (Argos P, J Mol Biol 211: 943-58 (1990); Williamson M, Biochem J 297: 240-60 (1994); George R, Heringa J, Protein Eng 15: 871-9 (2002); Kreitman R, AAPS J 8: E532-51 (2006)). Obično, proteinski linkeri sadrže većinu aminokiselinskih ostataka sa polarnim, nenaelektrisanim, i/ili naelektrisanim ostacima, kao što su, na pr., treonini, prolini, glutamini, glicini i alanini (videti na pr. Huston J et al. Proc Natl Acad Sci USA 85: 5879-83 (1988); Pastan I et al., Annu Rev Med 58: 221-37 (2007); Li J et al., Cell Immunol 118: 85-99 (1989); Cumber A et al. Bioconj Chem 3: 397-401 (1992); Friedman P et al., Cancer Res 53: 334-9 (1993); Whitlow M et al., Protein Engineering 6: 989-95 (1993); Siegall C et al., J Immunol 152: 2377-84 (1994); Newton et al. Biochemistry 35: 545-53 (1996); Ladurner et al. J Mol Biol 273: 330-7 (1997); Kreitman R et al., Leuk Lymphoma 52: 82-6 (2011); U.S.
4,894,443). Neograničavajući primeri proteinskih linkera uključuju alanin-serin-glicinglicin-prolin-glutamat (ASGGPE) (SEKV ID BR: 80), valin-metionin (VM), alaninmetionin (AM), AM (G2do4S)XAM (SEKV ID BR: 81) gde je G glicin, S je serin, a x je ceo broj od 1 do 10.
[0102] Proteinski linkeri se mogu odabrati na osnovu željenih svojstava. Proteinski linker može da bude odabran od strane stručne osobe imajući na umu specifične karakteristike, kao što su optimizacija namotavanja jednog ili više fuzionih molekula, stabilnost, ekspresija, rastvorljivost, farmakokinetička svojstva, farmakodinamička svojstva, i/ili aktivnosti fuzionisanih domena u kontekstu fuzionog konstrukta u poređenju sa aktivnošću istog domena samog po sebi. Na primer, mogu se odabrati proteinski linkeri na osnovu fleksibilnosti, krutosti, i/ili cepljivosti (videti na pr. Chen X et al., Adv Drug Deliv Rev 65: 1357-69 (2013)). Stručna osoba može koristiti baze podataka i softverske alate za dizajniranje linkera pri odabiru linkera. Određeni linkeri mogu biti izabrani da bi se optimizovala ekspresija (videti na pr. Turner D et al., J Immunl Methods 205: 43-54 (1997)). Određeni linkeri mogu biti izabrani da promovišu intermolekularne interakcije između identičnih polipeptida ili proteina da bi se formirali homomultimeri ili različitih polipeptida ili proteina da bi se formirali heteromultimeri. Na primer, mogu se odabrati proteinski linkeri koji omogućavaju željene nekovalentne interakcije između polipeptidnih komponenata proteina iz pronalaska, kao što su, na pr., interakcije povezane sa formacijom dimera i drugih multimera višeg reda (videti na pr. U.S. 4,946,778).
[0103] Fleksibilni proteinski linkeri su često duži od 12 aminokiselinskih ostataka i bogati su malim, nepolarnim aminokiselinskim ostacima, polarnim aminokiselinskim ostacima, i/ili hidrofilnim aminokiselinskim ostacima, kao što su, na pr., glicini, serini i treonini (videti na pr. Bird R et al., Science 242: 423-6 (1988); Friedman P et al., Cancer Res 53: 334-9 (1993); Siegall C et al., J Immunol 152: 2377-84 (1994)). Fleksibilni proteinski linkeri mogu biti izabrani da povećaju prostorno razdvajanje između komponenata i/ili kako bi se omogućile intramolekularne interakcije između komponenata. Na primer, stručnim osobama su poznati različiti "GS" linkeri i oni se sastoje od multiplih glicina i/ili jednog ili više serina, ponekad u ponavljajućim jedinicama, kao što su, na pr., (GxS)n (SEKV ID BR: 82), (SxG)n (SEKV ID BR: 83), (GGGGS)n (SEKV ID BR: 84) i (G)n (SEKV ID BR: 85) u kojima je x 1 do 6, a n 1 do 30 (videti na pr. WO 96/06641). Neograničavajući primeri fleksibilnih proteinskih linkera uključuju GKSSGSGSESKS (SEKV ID BR:86), GSTSGSGKSSEGKG (SEKV ID BR:87), GSTSGSGKSSEGSGSTKG (SEKV ID BR:88), GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEKV ID BR:90), EGKSSGSGSESKEF (SEKV ID BR:91), SRSSG (SEKV ID BR:92), i SGSSC (SEKV ID BR:93).
[0104] Rigidni proteinski linkeri često su krute alfa-helične strukture i bogati su ostacima prolina i/ili jednim ili više strateški postavljenih prolina (videti Chen X et al., Adv Drug Deliv Rev 65: 1357-69 (2013)). Rigidni linkeri se mogu odabrati kako bi se sprečile intramolekularne interakcije između komponenata.
[0105] Pogodni linkeri se mogu odabrati kako bi se omogućilo in vivo razdvajanje komponenata, kao što su, na pr., zbog cepanja i/ili nestabilnosti specifičnih za okolnu sredinu (videti Dosio F et al., Toxins 3: 848-83 (2011); Chen X et al., Adv Drug Deliv Rev 65: 1357-69 (2013)). In vivo cepajući proteinski linkeri su sposobni da se odvežu proteolitičkom obradom i/ili redukcijom okoline često na specifičnom mestu unutar nekog organizma ili unutar određenog tipa ćelije (videti na pr. Doronina S et al., Bioconjug Chem 17: 144-24 (2006); Erickson H et al., Cancer Res 66: 4426-33 (2006)). In vivo cepajući proteinski linkeri često obuhvataju motive osetljive na proteaze i/ili disulfidne veze koje su formirane od jednog ili više parova cisteina (videti na pr. Pietersz G et al., Cancer Res 48: 4469-76 (1998); The J et al., J Immunol Methods 110: 101-9 (1998); see Chen X et al., Adv Drug Deliv Rev 65: 1357-69 (2013)). In vivo cepajući proteinski linkeri mogu biti dizajnirani tako da budu osetljivi na proteaze koje postoje samo na određenim lokacijama u nekom organizmu, odeljcima unutar ćelije i/ili postaju aktivni samo pod određenim fiziološkim ili patološkim uslovima (kao što su, na pr., proteaze sa abnormalno visokim nivoima, proteaze prekomerno eksprimirane na određenim mestima bolesti i proteaze specifično eksprimirane pomoću patogenih mikroorganizama). Na primer, postoje proteinskilinkeri poznati u stanju tehnike koji se cepaju proteazama prisutnim samo unutarćelijski, proteazama prisutnim samo u određenim ćeijskim tipovima i proteazama prisutnim samo u patološkim uslovima poput raka ili upale, kao što su, na pr., R-x-x-R motiv i AMGRSGGGCAGNRVGSSLSCGGLNLQAM (SEKV ID BR:94).
[0106] U određenim realizacijama za proteine iz ovog pronalaska, može se koristiti linker koji obuhvata jedno ili više mesta osetljivih na proteaze kako bi se obezbedilo cepanje proteazom prisutnom u ciljanoj ćeliji. U određenim realizacijama za proteine iz pronalaska, može se koristiti linker koji se ne može cepati da bi se smanjio neželjeni toksični efekat nakon primene na organizam iz grupe kičmenjaka (videti na pr. Polson A et al., Cancer Res 69: 2358-64 (2009)).
[0107] Pogodni linkeri mogu da uključuju, na pr., osetljive na proteaze, osetljive na redoks potencijal okoline, osetljive na pH, koji se raskidaju kiselinama, fotocepajuće i/ili toplotno osetljive, bilo da su proteinski ili neproteinski (videti Chen X et al., Adv Drug Deliv Rev 65: 1357-69 (2013)).
[0108] pogodni cepajući linkeri mogu da uključuju linkere koji obuhvataju grupe koje se mogu cepati i koji su poznati u stanju tehnike, kao što su, na pr. linkeri iz napomena koje su dali Zarling D et al., J Immunol 124: 913-20 (1980); Jung S, Moroi M, Biochem Biophys Acta 761: 152-62 (1983); Bouizar Z et al., Eur J Biochem 155: 141-7 (1986); Park L et al., J Biol Chem 261: 205-10 (1986); Browning J, Ribolini A, J Immunol 143: 1859-67 (1989); Joshi S, Burrows R, J Biol Chem 265: 14518-25 (1990).
[0109] Pogodni linkeri mogu da sadrže pH osetljive linkere. Na primer, mogu se odabrati određeni pogodni linkeri zbog njihove nestabilnosti u okruženjima sa nižim pH kako bi se obezbedila disocijacija unutar subćelijskog dela ciljane ćelije. Na primer, linkeri koji obuhvataju jednu ili više tritil grupa, derivatizovane tritil grupe, bismaleimideotoksi propan grupe, dihidrazidne grupe adipinske kiseline i/ili kiselinski labilne transferin grupe, mogu obezbediti oslobađanje komponenata iz pronalaska, na pr. polipeptidna komponenta, u sredinama sa određenim opsegom pH (videti na pr. Welhöner H et al., J Biol Chem 266: 4309-14 (1991); Fattom A et al., Infect Immun 60: 584-9 (1992)). Mogu se odabrati određeni linkeri koji se cepaju u opsezima pH koji odgovaraju fiziološkim razlikama pH između tkiva, kao što je, na pr., pH tumorskog tkiva, koji je niži nego u zdravim tkivima (videti na pr. U.S. 5,612,474).
[0110] Fotocepajući linkeri su linkeri koji se cepaju nakon izlaganja elektromagnetnom zračenju određenih talasnih dužina, poput svetlosti u vidljivom opsegu (videti na pr. Goldmacher V et al., Bioconj Chem 3: 104-7 (1992)). Fotocepajući linkeri mogu se koristiti za oslobađanje komponente proteina iz pronalaska, na pr. polipeptidne komponente, nakon izlaganja svetlosti određenih talasnih dužina. Neograničavajući primeri fotocepajućih linkera uključuju nitrobenzil grupu kao zaštitnu grupu za cistein koja se može ukloniti, nitrobenziloksikarbonil hloridni umrežavači, hidroksipropilmetakrilamid kopolimer, glicin kopolimer, fluorescein kopolimer i metilrodamin kopolimer (Hazum E et al., Pept Proc Eur Pept Symp, 16th, Brunfeldt K, ed., 105-110 (1981); Senter et al., Photochem Photobiol 42: 231-7 (1985); Yen et al., Makromol Chem 190: 69-82 (1989); Goldmacher V et al., Bioconj Chem 3: 104-7 (1992)). Fotocepajući linkeri mogu imati posebnu upotrebu u povezivanju komponenata za formiranje proteina iz pronalaska dizajniranih za lečenje bolesti, poremećaja i stanja koja mogu biti izložena svetlosti pomoću optičkih vlakana.
[0111] U određenim realizacijama za proteine iz pronalaska, vezni region za ćelijsko ciljanje povezan je sa jednim efektorskim regionom Šiga toksina koristeći bilo koji broj načina poznatih stručnoj osobi, uključujući i kovalentne i nekovalentne veze (videti na pr. Chen X et al., Adv Drug Deliv Rev 65: 1357-69 (2013); Behrens C, Liu B, MAbs 6: 46-53 (2014).
[0112] U određenim realizacijama proteina iz ovog pronalaska, protein obuhvata vezni region koji je scFv sa linkerom koji povezuje varijabilni domen teškog lanca (VH) i varijabilni domen lakog lanca (VL). U stanju tehnik, poznati su brojni linkeri, pogodni za ovu namenu, kao što su, na pr., peptid sa 15 ostataka (Gly4Ser) 3 (SEKV ID BR: 95). Pogodni scFv linkeri koji mogu da se koriste u formiranju nekovalentnih multivalentnih struktura uključuju GGS, GGGS (Gly3Ser ili G3S) (SEKV ID BR:96), GGGGS (Gly4Ser ili G4S) (SEKV ID BR:97), GGGGSGGG (SEKV ID BR:98), GGS- GGGG (SEKV ID BR:99), GSTSGGGSGGGSGGGGSS (SEKV ID BR:100), I GSTSGSGKPGSSEGSTKG (SEKV ID BR:101) (Plćckthun A, Pack P, Immunapomena chnology 3: 83-105 (1997); Atwell J et al., Protein Eng 12: 597-604 (1999); Wu A et al., Protein Eng 14: 1025-33 (2001); Yazaki P et al., J Immunol Methods 253: 195-208 (2001); Carmichael J et al., J Mol Biol 326: 341-51 (2003); Arndt M et al., FEBS Lett 578: 257-61 (2004); Bie C et al., World J Hepatol 2: 185-91 (2010)).
[0113] Pogodne metode za povezivanje komponenata proteina iz ovog pronalaska mogu biti uz pomoć bilo kog postupka koji je trenutno poznat u stanju tehnike, za njihovo postizanje, sve dok povezivanje ne ometa bitno vezujuću sposobnost veznog regiona, ćelijsku internalizaciju iz proteina, i/ili željenu efektorsku funkciju(e) toksina kod efektorskog regiona Šiga toksina, kako je mereno odgovarajućim testom, uključujući testove kako je ovde opisano.
II. Primeri specifičnih strukturnih varijacija za proteine iz pronalaska
[0114] Među pojedinim rešenjima iz ovog pronalaska, proteini iz pronalaska sadrže vezni region izveden iz polipeptida imunoglobulinskog tipa koji je izabran za specifično i visoko afinitetno vezivanje za površinski antigen, kako je definisano u patentnim zahtevima, na ćelijskoj površini ćelije karcinoma, gde je antigen ograničen u ekspresiji na ćelije karcinoma (videti Glokler J et al., Molekulas 15: 2478-90 (2010); Liu Y et al., Lab Chip 9: 1033-6 (2009)). U skladu sa drugim rešenjima, vezni region je izabran za specifično i visoko afinitetno vezivanje za površinski antigen na ćelijskoj površini ćelije karcinoma, gde je antigen prekomerno eksprimiran ili preferentno eksprimiran uz pomoć ćelija raka u poređenju sa nekarcinomskim ćelijama. Reprezentativni ciljani biomolekuli uključuju, ali nisu ograničeni na, sledeće nabrojane targete povezane sa karcinomom i/ili sa specifičnim imunskim ćeijskim tipovima.
[0115] Mnogi vezni regioni imunoglobulinskog tipa koji prepoznaju epitope povezane sa ćelijama raka postoje u stanju tehnike, kao što su vezni regioni koji ciljaju (alternativna imena su navedena u zagradama) aneksin AI, B3 melanomski antigen, B4 melanomski antigen, CD2, CD3, CD4, CD20 (antigen protein B-limfocita CD20), CD22, CD25 (interleukin-2 receptor IL2R), CD30 (TNFRSF8), CD38 (ciklične ADP riboza hidrolazee), CD40, CD44 (hijaluronan receptor), ITGAV (CD51), CD66, CD71 (transferin receptor), CD73, CD74 (invarijantni lanac povezan sa HLA-DR antigenima), CD79, CD98, endoglin (END ili CD105), CD106 (VCAM-1), hemokin receptor tip 4 (CDCR-4, fuzin, CD184), CD200, insulinu sličan faktor rasta 1 receptor (CD221), mucin1 (MUC1, CD227), adhezioni molekul bazalnih ćelija (B-CAM ili CD239), CD248 (endozijalin ili TEM1), receptor faktora nekroze tumora 10b (TNFRSF10B, CD262), receptor faktora nekroze tumora 13B (TNFRSF13B, TACI, CD276), receptor vaskularnog endotelnog faktora rasta 2 (KDR, CD309), adhezioni molekul epitelnih ćelija (EpCAM, CD326), receptor humanog epidermalnog faktora rasta 2 (HER2/Neu/ErbB2/CD340), tumorski antigen 15-3 (CA15-3), tumorski antigen 19-9 (CA 19-9), tumorski antigen 125 (CA125, MUC16), CA242, karcinoembrionalni molekuli ćelijske adhezije povezani sa antigenom (na pr. CEACAM3 (CD66d) i CEACAM5), karcinoembrionalni antigen protein (CEA), hondroitin sulfat proteoglikan 4 (CSP4, MCSP, NG2), CTLA4, DLL4, receptor epidermalnog faktora rasta (EGFR/ErbB1), folat receptor (FOLR), G-28, gangliozid GD2, gangliozid GD3, HLA-Dr10, HLA-DRB, receptor humanog epidermalnog faktora rasta 1 (HER1), Efrin tip-B receptor 2 (EphB2), adhezioni molekul epitelnih ćelija (EpCAM), protein za aktivaciju fibroblasta (FAP/sepraze), insulinu sličan faktor rasta 1 receptor (IGF1R), interleukin 2 receptor (IL-2R), interleukin 6 receptor (IL-6R), integrini alfa-V beta-3 (DVE3), integrini alfa-V beta-5 (DvE5), integrini alfa-5 beta-1 (D5E1), L6, MPG, sa melanomom povezan antigen 1 protein (MAGE-1), sa melanomom povezan antigen 3 (MAGE-3), mezotelin (MSLN), MPG, MS4A, p21, p97, polio virus receptoru sličan 4 (PVRL4), proteazama aktivirani receptori (kao što je PARI), za prostatu specifičan membranski antigen protein (PSMA), trofoblastni glikoprotein (TPGB), i transduceri kalcijumskog signala povezani sa tumorom (TACSTDs) (videti na pr. Lui B et al., Cancer Res 64: 704-10 (2004); Novellino L et al., Cancer Immunol Immunother 54: 187-207 (2005); Bagley R et al., Int J Oncol 34: 619-27 (2009); Gerber H et al., mAbs 1: 247-53 (2009); Beck A et al., Nat Rev Immunol 10: 345-52 (2010); Andersen J et al., J Biol Chem 287: 22927-37 (2012); Nolan-Stevaux O et al., PLoS One 7: e50920 (2012); Rust S et al., Mol Cancer 12: 11 (2013)). Namera ove liste ciljanih biomolekula je da ne bude ograničavajuća. Biće procenjeno od strane stručne osobe da bilo koji željeni ciljni biomolekul, kako je definisano u patentnim zahtevima, povezan sa ćelijom raka ili drugim željenim tipom ćelije, može da se koristi za dizajniranje ili odabir veznog regiona koji će biti povezan sa efektorskim regionom Šiga toksina da bi se proizveo protein iz pronalaska.
[0116] Primeri drugih ciljanih biomolekula koji su snažno povezani sa ćelijama karcinoma i veznim regionima imunoglobulinskog tipa za koje je poznato da ih vezuju, uključuju BAGE proteine (B melanomski antigeni), adhezioni molekul bazalnih ćelija (BCAMs ili glikoproteini Luterijan krvne grupe), antigen tumora bešike (BTA), antigen tumora testisa NY-ESO-1, antigen tumora testisa LAGE proteini, CD19 (antigen protein B-limfocita CD19), CD21 (komplement receptor-2 ili komplement 3d receptor), CD26 (dipeptidil peptidaza-4, DPP4, ili adenozin deaminaza kompleksirajući protein 2), CD33 (lektin imunoglobulinskog tipa koji vezuje sijalnu kiselinu-3), CD52 (CAMPATH-1 antigen), CD56 (adhezioni molekul neuronskih ćelija ili NCAM), CD133 (prominin-1), CS1 (SLAM porodica broj 7 ili SLAMF7), ćelijski površinski A33 antigen protein (gpA33), Epstejn-Bar-ovi virusni antigen proteini, GAGE/PAGE proteini (tumor povezan sa melanomom/testis antigeni), receptor hepatocitnog faktors rasta (HGFR ili c-Met), MAGE proteini, melanomski antigen prepoznat od strane T-ćelija 1 protein (MART-1/MelanA, MARTI), mucini, proteini preferencijalno eksprimiranog antigena melanoma (PRAME), prostatni specifični antigen protein (PSA), protein antigen matičnih ćelija prostate (PSCA), receptor za napredne glikacione endrodukte (RAGE), glikoproteini povezani sa tumorima 72 (TAG-72), transmembranski receptor tirozin-protein kinaze (ROR1 ili NTRKR1), receptor vaskularnog endotelnog faktora rasta (VEGFRs), i Wilmsov tumor antigen.
[0117] Primeri drugih ciljanih biomolekula koji su snažno povezani sa ćelijama karcinoma su karbon anhidraza IX (CA9/CAIX), klaudin proteini (CLDN3, CLDN4), efrin tip-A receptor 3 (EphA3), folat vezujući proteini (FBP), gangliozid GM2, insulinu slični receptori faktora rasta, integrini (kao što je CD11a-c), receptor aktivator nuklearnog faktora kapa B (RANK), receptor tirozin-protein kinaze erB-3, receptor faktora nekroze tumora 10A (TRAIL-R1/DR4), receptor faktora nekroze tumora 10B (TRAIL-R2), tenascin C i CD64 (FcyRI) (videti Hough C et al., Cancer Res 60: 6281-7 (2000); Thepen T et al., Nat Biotechnol 18: 48-51 (2000); Pastan I et al., Nat Rev Cancer 6: 559-65 (2006); Pastan, Annu Rev Med 58: 221-37 (2007); Fitzgerald D et al., Cancer Res 71: 6300-9 (2011); Scott A et al., Cancer Immun 12: 14-22 (2012)). Namera ove liste ciljanih biomolekula je da ne bude ograničavajuća
[0118] Pored toga, postoje brojni drugi primeri od posmatranih, ciljanih biomolekula kao što su ADAM metalo-proteinaze (na pr. ADAM-9, ADAM-10, ADAM-12, ADAM-15, ADAM-17), ADP-riboziltransferaze (ART1, ART4), antigen F4/80, antigeni strome koštane srži (BST1, BST2), tačka preloma klaster region-c-abl onkogen (BCR-ABL) proteini, C3aR (komponenta komplementa 3a receptori), CD7, CD13, CD14, CD15 (Luis X ili embrionalni antigen specifičan za fazu 1), CD23 (FC epsilon RII), CD49d, CD53, CD54 (intercelularni adhezioni molekul 1), CD63 (tetraspanin), CD69, CD80, CD86, CD88 (komponenta komplement 5a receptor 1), CD115 (faktor stimulacije kolonije 1 receptor), CD123 (interleukin-3 receptor), CD129 (interleukin 9 receptor), CD183 (hemokin receptor CXCR3), CD191 (CCR1), CD193 (CCR3), CD195 (hemokin receptor CCR5), CD203c, CD225 (interferon-indukovani transmembranski protein 1), CD244 (Receptor ćelija prirodnih ubica 2B4), CD282 (tol-slični receptor 2), CD284 (Tol-slični receptor 4), CD294 (GPR44), CD305 (receptor sličan imunoglobulinu povezan sa leukocitima 1), efrin tip-A receptor 2 (EphA2), FceRIa, galektin-9, alfafetoprotein antigen 17-A1 protein, humani aspartil (asparaginil) beta-hidroksilaza (HAAH), transkript sličan imunoglobulinu ILT-3, lizofosfatidilglicerol aciltransferaza 1 (LPGAT1/IAA0205), membranski proteini povezani sa lizozomom (LAMPs, kao što je CD 107), melanocitni protein PMEL (gp100), mijeloidima srodan protein-14 (mrp-14), ligand programirane smrti 1 (PD-L1), receptor tirozin-protein kinaze erbB-3, SART proteini, skavendžer receptori (kao što je CD64 i CD68), Sigleks (lektin imunoglobulinskog tipa koji vezuje sijalne kiseline), sindekani (kao što je SDC1 ili CD138), tirozinaza, tirozinaza srodni protein 1 (TRP-1), tirozinaza srodni protein 2 (TRP-2), antigen povezan sa tirozinazom (TAA), APO-3, BCMA, CD2, CD3, CD4, CD8, CD18, CD27, CD28, CD29, CD41, CD49, CD90, CD95 (Fas), CD103, CD104, CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD152 (CTLA-4), hemokin receptori, komplement proteini, citokin receptori, histokompatibilni proteini, ICOS, interferon-alfa, interferon-beta, cmik, osteoprotegerin, PD-1, RANK, TACI, TNF receptor član superporodice (TNF-R1, TNFR-2), Apo2/TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRAIL-R3, i TRAIL-R4 (videti Cheever M et al., Clin Cancer Res 15: 5323-37 (2009); Scott A et al., Cancer Immun 12: 14 (2012)), za ciljane biomolekule i napomena za ciljane molekule koji su tamo opisani su neograničavajući primeri). Biće procenjeno od strane stručne osobe da bilo koji željeni ciljani biomolekul, kako je definisano u patentnim zahtevima, može da se koristi za dizajn ili za odabir veznog regiona koji će biti povezan sa efektorskim regionom Šiga toksina da bi se proizveo protein iz pronalaska.
[0119] U određenim realizacijama, vezni region sadrži ili se sastoji u osnovi od nekog polipeptida imunoglobulinskog tipa koji je izabran za specifično i visoko afinitetno vezivanje za ćelijsku površinu ćelijskog tipa iz imunog sistema. Na primer, za vezujući domen imunoglobulinskog tipa je poznato da se vezuje za CD1, CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD9, CD10, CD11, CD12, CD13, CD14, CD15, CD16, CD17, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD26, CD27, CD28, CD29, CD30, CD31, CD33, CD34, CD35, CD36, CD37, CD38, CD40, CD41, CD56, CD61, CD62, CD66, CD95, CD117, CD123, CD235, CD146, CD326, interleukin-2 receptor (IL-2R), receptor aktivator nuklearnog faktora kapa B (RANK), SLAM-povezan protein (SAP), i TNFSF18 (ligand tumorskog nekrotičnog faktora 18 ili GITRL).
[0120] U određenim realizacijama, vezni region se vezujue sa visokim afinitetom za ciljani biomolekul koji je hemokin receptor izabran od sledećih CXCR- 1, CXCR-2, CXCR-3 A, CXCR3B, CXCR-4, CXCR-5, CCR-I, CCR-2A, CCR- 2B, CCR-3, CCR-4, CCR-5, CCR-6, CCR-7, CCR-8, CCR-9, CCR-10, CX3CR-1, XCR1, CXCR-6, CXCR-7, hemokin vezujući protein-2 (CCBP2, D6 receptor), i Dafi antigen/hemokin receptor (DARC, Fy glikoprotein, FY, CD234). Za više neograničavajućih ciljanih biomolekula, pogledati Tabelu 11 u primerima koji slede.
[0121] Među pojedinim rešenjima, proteini iz ovog pronalaska sadrže efektorski region Šiga toksina koji sadrži ili se sastoji u osnovi od aminokiselina 75 do 251 iz SLT-1A (SEKV ID BR:1), StxA (SEKV ID BR:2), i/ili SLT-2A (SEKV ID BR:3). Dalja rešenja su proteini u kojima efektorski region Šiga toksina sadrži ili se sastoji u osnovi od aminokiselina 1 do 241 iz SLT-1A (SEKV ID BR:1), StxA (SEKV ID BR:2), i/ili SLT-2A (SEKV ID BR:3). Dalja rešenja su proteini u kojima efektorski region Šiga toksina sadrži ili se sastoji u osnovi od aminokiselina 1 do 251 iz SLT-1A (SEKV ID BR:1), StxA (SEKV ID BR:2), i/ili SLT-2A (SEKV ID BR:3). Dalja rešenja su proteini u kojima efektorski region Šiga toksina sadrži ili se sastoji u osnovi od aminokiselina 1 do 261 iz SLT- 1A (SEKV ID BR:1), StxA (SEKV ID BR:2), i/ili SLT-2A (SEKV ID BR:3).
[0122] U određenim realizacijama iz pronalaska, kako je definisano u patentnim zahtevima, proteini sadrže vezni region imunoglobulinskog tipa koji sadrži ili se sastoji u osnovi od aminokiselina 269-508 iz SEKV ID BR:4, koji pokazuje visoki afinitet vezivanja specifično za humani CD38. Dalja rešenja su proteini koji obuhvataju ili se u osnovi sastoje od bilo kog od polipeptida koji su prikazani u SEKV ID BR: 4-7.
[0123] U određenim realizacijama iz otkrića, proteini iz ovog pronalaska sadrže vezni region imunoglobulinskog tipa koji sadrži ili se sastoji u osnovi od aminokiselina 269-512 iz SEKV ID BR:8, koji pokazuje visoki afinitet vezivanja specifično za humani HER2. Dalje realizacije iz otkrića su proteini koji obuhvataju ili se u osnovi sastoje od bilo kog od polipeptida koji su prikazani u SEKV ID BR: 8-11.
[0124] U određenim realizacijama iz otkrića, proteini obuhvataju vezni region imunoglobulinskog tipa koji sadrži ili se u osnovi sastoje od aminokiselina 269-516 iz SEKV ID BR:12, koji pokazuje visoki afinitet vezivanja specifično za humani CD19. Dalje realizacije iz otkrića su proteini koji obuhvataju ili se u osnovi sastoje od bilo kog od polipeptida koji su prikazani u SEKV ID BR: 12-15.
[0125] U određenim realizacijama iz otkrića, proteini obuhvataju vezni region imunoglobulinskog tipa koji obuhvataju ili se u osnovi sastoje od aminokiselina 269-518 iz SEKV ID BR:16, koji pokazuje visoki afinitet vezivanja specifično za humani CD74. Dalje realizacije iz otkrića su proteini koji obuhvataju ili se u osnovi sastoje od bilo kog od polipeptida koji su prikazani u SEKV ID BR: 16-19.
[0126] Među pojedinim rešenjima za proteine iz predmetnog otkrića, vezni region je pojedinačni domen region izveden iz imunoglobulina VHH koji pokazuje visoki afinitet vezivanja specifično za HER2, kao što je izveden iz pojedinačnog domena varijabilnog regiona kamelidnog antitela (VHH) protein 5F7, kao što je opisano u publikaciji U.S. patentnoj prijavi 2011/0059090. U određenim daljim rešenjima iz otkrića, proteini obuhvataju vezni region imunoglobulinskog tipa koji sadrži ili se sastoji u osnovi od aminokiselina 268-385 iz SEKV ID BR:20, koji pokazuje visoki afinitet vezivanja specifično za humani HER2. Dalje realizacije iz otkrića su proteini koji obuhvataju ili se u osnovi sastoje od bilo kog od polipeptida koji su prikazani u SEKV ID BR: 20-27.
[0127] U određenim realizacijama iz otkrića, proteini obuhvataju vezni region imunoglobulinskog tipa koji sadrži ili se u osnovi sastoji od aminokiselina 269-365 iz SEKV ID BR:16, koji pokazuje visoki afinitet vezivanja specifično za humani CD20.
Dalje realizacije iz otkrića su proteini koji obuhvataju ili se u osnovi sastoje od bilo kog od polipeptida koji su prikazani u SEKV ID BR: 28-31.
[0128] Kao što je ovde korišćeno, izraz "varijabilni domen teškog lanca (VH)" ili "varijabilni domen lakog lanca (VL)" respektivno, se odnosi na bilo koji VHili VLdomen antitela (na pr. humani VH iliVLdomen) kao i na bilo koji njhov derivat koji zadržava barem kvalitativnu sposobnost vezivanja antigena u odnosu na odgovarajuće nativno antitelo (na pr. humanizovani VH iliVLdomen koji je izveden iz nativnog VH iliVLdomena miša). VH iliVLdomen se sastoji od „okvirnih“ regiona koji se prekidaju uz pomoć tri CDRova ili ABRova. Okvirni regioni služe za poravnanje CDRova za specifično vezivanje za epitop na nekom antigenu. Od amino-terminusa do karboksilterminusa, oba domena, VHi VLsadrže sledeće okvirne (FR) i CDR regione: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, i FR4. Za kamelidne VHH fragmente, IgNARovi iz hrskavičastih riba, VNARfragmente, i njihove derivate, postoji jedan varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata isti osnovni raspored: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, i FR4.
[0129] U okviru obima ovog pronalaska je da se koriste fragmenti, varijante, i/ili derivati iz polipeptida iz proteina ovog pronalaska koji sadrže funkcionalni vanćelijski ciljani biomolekul za vezno mesto, kako je definisano u patentnim zahtevima, i čak još poželjnije sposobno da vezuje ciljani biomolekul sa visokim afinitetom (na pr. kao što je prikazano sa KD). Na primer, dok pronalazak obezbeđuje polipeptidne sekvence koje mogu da se vezuju za CD38, bilo koji vezni region imunoglobulinskog tipa koji sadrži polipeptid kako je definisano u patentnim zahtevima koji se vezuje za vanćelijski CD38, eksprimiran na ćelijskoj površini, sa konstantom disocijacije od 10<-5>do 10<-12>mola po litri, poželjno manje od 200 nM, može biti supstituisan za primenu u proizvodnji proteina iz pronalaska i u metodama iz pronalaska.
[0130] Među pojedinim rešenjima iz ovog pronalaska, vezni region imunoglobulinskog tipa je izveden iz regiona pojedinačnog domena koji je izveden iz imunoglobulina VHH kako je definisano u patentnim zahtevima. Generalno, nanotela® su konstruisana iz fragmenata prirodno nastalihpojedinačnih, monomernih varijabilnih domena antitela (sdAbs) koje se nalaze u kamilidima i hrskavičavim ribama (Chondrichthyes). Nanotela su dizajnirana od ovih prirodno nastalih antitela, skraćivanjem pojedinačnog, monomernog varijabilnog domena da bi se kreirao manji i stabilniji molekul. Zbog svoje male veličine, nanotela® se mogu vezati za antigene koji nisu dostupni za cela antitela. Među pojedinim rešenjima iz predmetnog otkrića, vezni region imunoglobulinskog tipa je izveden iz nanotela ili iz regiona pojedinačnog domena koji je izveden iz imunoglobulina VHH koji pokazuje visoki afinitet vezivanja specifično za humane HER2 proteine.
III. Opšte funkcije za proteine iz pronalaska
[0131] Predmetni pronalazak obezbeđuje različite citotoksične proteine, od kojih svaki obuhvata 1) jedan vezni region imunoglobulinskog tipa za ciljanje ćelija, kako je definisano u patentnim zahtevima i 2) citotoksični efektorski region Šiga toksina, kako je definisano u patentnim zahtevima. Povezivanje veznog regiona imunoglobulinskog tipa koji cilja ćelije sa regionima dobijenim iz Šiga-toksin-podjedinice A omogućava dizajniranje ciljanje specifično za ćelijski tip, potentne Šiga-toksin citotoksičnosti.
Proteini iz pronalaska su sposobni da vezuju vanćelijske ciljane biomolekule koji su udruženi sa ćelijskom površinom odrešenih ćelijskih tipova i da prodiru u te ćelije, kako je definisano u patentnim zahtevima. Kada je jednom internalizovano unutar ciljanog ćelijskog tipa, pojedina rešenja za proteine iz pronalaska su sposobna da usmere citotoksični fragment polipeptida efektora Šiga toksina u citozol ciljne ćelije. Kada se nađu u citozolu ciljanog ćelijskog tipa, pojedina rešenja za citotoksične proteine iz pronalaska su sposobna da enzimski inaktiviraju ribozome, ometaju homeostazu ćelija i na kraju ubijaju ćeliju. Ovaj sistem je modularan, tako da bilo koji broj različitih imunolobulinskih vrsta veznog regiona može da se koristi za ciljanje ove potentne citotoksičnosti ili citostaze na različite, raznolike ćeijske tipove. Kao alternativa, netoksične varijante proteina iz otkrića mogu se koristiti za isporuku dodatnih egzogenih materijala u ciljane ćelije, kao što su agensi za promociju detekcije koji označavaju unutrašnjost cilajnih ćelija radi funkcija prikupljanja dijagnostičkih informacija.
A. Ubijanje ćelija ciljanom citotoksičnošću šiga toksina
[0132] Budući da su članovi porodice Šiga toksina prilagođeni ubijanju eukariotskih ćelija, proteini dizajnirani korišćenjem efektorskog regiona Šiga toksina mogu pokazivati snažnu aktivnost ubijanja ćelija. A podjedinice iz članova porodice Šiga toksina obuhvataju enzimatski domen sposoban da ubije eukariotsku ćeliju kada se nađe u ćelijskom citozolu. Pojedina rešenja za citotoksične proteine iz pronalaska koriste ovaj citotoksični mehanizam, ali moraju biti sposobna da efektorski region Šiga toksina dovedu do citozola ciljanog tipa ćelije. Orijentacija dizajna utiče na citotoksičnost verovatno poboljšanjem isporuke u citozol putem funkcionalnosti koje potiču iz efektorskog regiona Šiga toksina.
[0133] U određenim realizacijama citotoksičnih proteina iz ovog pronalaska, kontaktom ćelije fizički uparene sa vanćelijskim ciljnim biomolekulom iz veznog regiona imunoglobulinskog tipa citotoksičnog proteina iz pronalaska, citotoksični protein je sposoban da izazove smrt ćelije. Ubijanje ćelija može se postići korišćenjem citotoksičnog proteina iz pronalaska pod različitim uslovima ciljanih ćelija, kao što je ex vivo manipulisana ciljana ćelija, ciljana ćelija kultivisana in vitro, ciljana ćelija u uzorku tkiva kultivisana in vitro ili ciljana ćelija in vivo.
[0134] Ekspresija ciljanog biomolekula ne mora biti nativna za ciljano ubijanje ćelije citotoksičnim proteinom iz pronalaska. ûelijska površinska ekspresija ciljanog biomolekula mogao bi biti rezultat infekcije, prisustva patogena i/ili prisustva unutarćelijskog mikrobnog patogena. Ekspresija ciljanog biomolekula može biti veštačka kao što je na primer, prisilna ili indukovana ekspresija nakon infekcije virusnim ekspresionim vektorom, videti na pr. adenovirusni, adeno-povezani virusni i retrovirusni sistemi. Primer indukovanja ekspresije ciljanog biomolekula je pojačana regulacija CD38 ekspresije ćelija izloženih retinoidima, kao što je all-trans retinoična kiselina i različiti sintetički retinoidi, ili bilo koji agonist receptora retinoične kiseline (RAR) (Drach J et al., Cancer Res 54: 1746-52 (1994); Uruno A et al., J Leukoc Biol 90: 235-47 (2011)). U drugom primeru, ekspresija CD20, HER2 i EGFR može biti indukovana izlaganjem ćelije jonizujućem zračenju (Wattenberg M et al., Br J Cancer 110: 1472-80 (2014)).
B. Selektivna citotoksičnost među ćelijskim tipovima
[0135] Ciljanjem isporuke enzimski aktivnih regiona Šiga toksina koristeći visokoafinitetne vezne regione imunoglobulinskog tipas na specifične ćeijske tipove, ova snažna aktivnost ubijanja ćelija može biti ograničena na preferencijalno ubijanje izabranih ćeijskih tipova. Predmetni pronalazak obezbeđuje različite citotoksične proteine sa ovom funkcionalnom sposobnošću kako je definisano u patentnim zahtevima.
[0136] U određenim realizacijama, primena citotoksičnog proteina iz ovog pronalaska u mešavini ćeijskih tipova, citotoksični protein je sposoban da selektivno ubije one ćelije koje su fizički uparene sa određenim vanćelijskim ciljanim biomolekulom u poređenju sa ćeijskim tipovima, koje nisu fizički uparene bilo kojim ekstracelularnim ciljanim biomolekulom specifično vezan uz pomoć veznog regiona tog citotoksičnog proteina. Budući da su članovi porodice Šiga toksina prilagođeni za ubijanje eukariotskih ćelija, citotoksični proteini dizajnirani pomoću efektorskog regiona Šiga toksina mogu pokazivati snažnu citotoksičnu aktivnost. Ciljanjem isporuke enzimski aktivnih regiona Šiga toksina za određene ćeijske tipove koristeći vezne regione sa visokim afinitetom, ova potentna aktivnost ubijanja ćelija može biti ograničena na preferencijalno ubijanje samo onih ćeijskih tipova za koje se želi da budu ciljane prema njihovoj fizičkoj povezanošćstiu sa ciljanim biomolekulom koji je specifično vezan uz pomoć odabranih veznih regiona.
[0137] U određenim realizacijama, citotoksični protein iz ovog pronalaska sposoban je da selektivno ili preferencijalno uzrokuje smrt određenog tipa ćelije u mešavini dve ili više različitih ćelijskih tipova. Ovo omogućava ciljanje citotoksične aktivnosti na određene ćeijske tipove sa visokom preferencijalnošću, kao što je trostruki citotoksični efekat, nad "posmatračkim" ćelijskim tipovima koje ne eksprimiraju ciljani biomolekul. Alternativno, ekspresija ciljanog biomolekula iz veznog regiona može biti ne-ekskluzivna za jedan tip ćelije ako je ciljani biomolekul eksprimiran u dovoljno malim količinama i/ili fizički povezan u malim količinama sa ćelijskim tipovima koje ne treba ciljati. Ovo omogućava ciljano ubijanje određenih ćeijskih tipova sa visokom preferencijalnošću, kao što je trostruki citotoksični efekat, nad "posmatračkim" ćelijskim tipovima koje ne eksprimiraju značajne količine ciljanih biomolekula ili nisu fizički povezane sa značajnim količinama ciljanih biomolekula.
[0138] Nivoi vanćelijskih ciljanih biomolekula na površini ćelija mogu se odrediti upotrebom različitih metoda poznatih stručnoj osobi, kao što su, na pr., FACS metode. Kao što je ovde korišćeno, značajna količina nekog vanćelijskog ciljanog biomolekula eksprimirana na ćelijskoj površini veća je od 10.000, 20.000, 30.000, 40.000, 50.000, 60.000 ili 70.000 srednjih intenziteta fluorescencije (MFI) određeno pomoću FACS analize u zavisnosti od tipa ćelije.
[0139] U određenim daljim rešenjima, primena citotoksičnog proteina iz pronalaska na dve populacije ćeijskih tipova koje se razlikuju u odnosu na prisustvo i/ili sekvence polipeptida nekog vanćelijskog ciljanog biomolekula, citotoksični protein je sposoban da izazove ćelijsku smrt kako je definisano sa polovinom maksimalne citotoksične koncentracije (CD50) na populaciji ciljanih ćelija, čiji članovi eksprimiraju vanćelijski ciljni biomolekul iz veznog regiona citotoksičnog proteina, na pr., u dozi najmanje tri puta nižoj od doze CD50 istog citotoksičnog proteina u populaciji ćelija čiji članovi ne eksprimiraju vanćelijski ciljani biomolekul iz veznog regiona citotoksičnog proteina.
[0140] U određenim realizacijama, citotoksična aktivnost proteina iz ovog pronalaska prema populacijama ćeijskih tipova fizički uparenih sa vanćelijskim ciljanim biomolekulima je najmanje 3 puta veća od citotoksične aktivnosti prema populacijama ćeijskih tipova koje nisu fizički uparene sa bilo kojim vanćelijskim biomolekulom povezanim specifično sa onim proteinom iz pronalaska. Prema predmetnom pronalasku, selektivna citotoksičnost može biti kvantifikovana u pogledu odnosa (a/b) citotoksičnosti prema populaciji ćelija specifičnog ćelijskog tipa koja je fizički uparena sa ciljanim biomolekulom iz veznog regiona prema (b) citotoksičnosti prema populaciji ćelija ćelijskog tipa koji nije fizički uparena sa ciljanim biomolekulom iz veznog regiona. U određenim realizacijama, odnos citotoksičnosti je indikativan za selektivnu citotoksičnost koja je najmanje 3-struka, 5-struka, 10-struka, 15-struka, 20-struka, 25-struka, 30-struka, 40-struka, 50-struka, 75-struka, 100-struka, 250-struka, 500-struka, 750-struka, 1000-struka, ili više za populacije ćelija ili ćelijskih tipova koji su fizički uparene sa ciljanim biomolekulom iz veznog regiona u poređenju sa populacijom ćelija ili ćelijskih tipova koje nisu fizički uparene sa ciljanim biomolekulom iz veznog regiona.
[0141] Ova preferencijalna funkcija ubijanja ćelija omogućava da ciljana ćelija bude ubijena određenim citotoksičnim proteinima iz pronalaska pod različitim uslovima i u prisustvu neciljanih, posmatračkih ćelija, kao što je ex vivo manipulisana smeša ćeijskih tipova, in vitro kultivsrana tkiva sa smešama ćelijskih tipova, ili in vivo u prisustvu višestrukih ćeijskih tipova (na pr. in situ ili na nativnom mestu u višećelijskom organizmu).
[0142] U određenim realizacijama, proteini iz ovog pronalaska su sposobni za selektivno ili preferencijalno izazivanje smrti kod specifičnog ćelijskog tipa unutar smeše od dva ili više različitih ćelijskih tipova. To omogućava ciljanu citotoksičnu aktivnost na specifične ćeijske tipove sa visokom preferencijalnošću, kao što je 3-struki citotoksični efekat, u odnosu na "posmatračke" ćelijske tipove koji ne eksprimiraju vanćelijski target povezan specifično za vezni region tog citotoksičnog proteina iz pronalaska. Alternativno, ekspresija nekog vanćelijskog ciljanog biomolekula može biti ne-ekskluzivna za jedan tip ćelije ako se vanćelijski ciljani biomolekul eksprimira u dovoljno malim količinama kod ćeijskih tipova koje ne treba ciljati. Ovo omogućava preferencijalno ubijanje ćelija samo onih tipova ćelija koji eksprimiraju najveće količine vanćelijskih ciljanih biomolekula, kao što je 3-struki citotoksični efekat u odnosu na "posmatračke" ćelijske tipove koje ne eksprimiraju značajne količine ciljanog biomolekula koji je specifično povezan sa tim citotoksičnim proteinom i/ili nije fizički povezan sa značajnim količinama vanćelijski izloženih ciljanih biomolekula povezanih specifično za taj citotoksični protein.
[0143] Citotoksični proteini iz ovog pronalaska korisni su za uklanjanje populacija određenih ćelijskih tipova. Na primer, citotoksični proteini iz pronalaska su korisni za lečenje određenih tumora, karcinoma, i/ili drugih abnormalnosti u rastu uz pomoć uklanjanja „ciljanog biomolekula+“ ćelija koje eksprimiraju povišeni nivo ciljanog biomolekula na jednoj ili više ćelijskih površina.
[0144] U određenim realizacijama, citotoksična aktivnost proteina iz ovog pronalaska prema populacijama ćelijskih tipova koje su fizički uparene sa vanćelijskim ciljanim biomolekulom je najmanje 3-struko viša u odnosu na citotoksičnu aktivnost prema populacijama ćelijskih tipova koji nisu fizički upareni sa značajnim količinama nekog vanćelijskog ciljanog biomolekula koji je povezan specifično uz pomoć veznog regiona tog određenog proteina iz pronalaska. Prema predmetnom pronalasku, selektivna citotoksičnost može biti kvantifikovana u pogledu odnosa (a/b) od (a) citotoksičnosti prema populaciji ćelija fizički uparenih sa značajnom količinom nekog vanćelijskog ciljanog biomolekula koji je povezan uz pomoć veznog regiona sa citotoksičnog proteina iz pronalaska do (b) citotoksičnosti prema populaciji ćelija ćelijskog tipa koji nije fizički uparen sa značajnom količinom bilo kog vanćelijskog ciljanog biomolekula koji je povezan specifično uz pomoć veznog regiona sa tog određenog citotoksičnog protein iz pronalaska. U određenim realizacijama, odnos citotoksičnosti je indikativan za selektivnu citotoksičnost koja je najmanje 3-struka, 5-struka, 10-struka, 15-struka, 20-struka, 25-struka, 30-struka, 40-struka, 50-struka, 75-struka, 100-struka, 250-struka, 500-struka, 750-struka, 1000-struka ili više za populacije ćelija ili ćelijskih tipova koje eksprimiraju vanćelijski ciljani biomolekul ili su fizički uparene sa vanćelijskim ciljanim biomolekulom koji je povezan uz pomoć veznog regiona sa citotoksičnog proteina iz pronalaska u poređenju sa populacijom ćelija ili ćelijskih tipova koji ne eksprimiraju vanćelijski ciljani biomolekul ili one nisu fizički uparene sa značajnim količinama nekog vanćelijskog ciljanog biomolekula koji je povezan specifično uz pomoć veznog regiona sa tog određenog citotoksičnog protein iz pronalaska. Na primer, nakon administracije citotoksičnih proteina iz ovog pronalaska u dve različite populacije ćelija koje se razlikuju u odnosu na prisustvo i/ili polipeptidnu sekvencu nekog vanćelijskog ciljanog biomolekula, citotoksični protein iz pronalaska je sposoban da dovede do smrti ćelijskih tipova koji su fizički upareni sa vanćelijskim ciljanim biomolekulom koji je povezan uz pomoć veznog regiona citotoksičnog proteina, na pr., pri CD50koja je najmanje tri puta manja od CD50uočen za vezivanje za ćelijske tipove koji nisu fizički upareni sa vanćelijskim ciljanim biomolekulom koji je povezan uz pomoć veznog regiona citotoksičnog proteina ili za ćelijske tipove koji su fizički upareni samo sa oblicima tog vanćelijskog ciljanog biomolekula koji obuhvataju varijacije sekvenci ili mutacija koje remete specifičnost vezivanja uz pomoć veznog regiona tog citotoksičnog proteina.
[0145] U određenim realizacijama citotoksičnih proteina iz ovog pronalaska, administracija citotoksičnog proteina u dve različite populacije ćelijskih tipova, citotoksični protein je sposoban da dovede do smrti kako je definisano sa polovinom maksimalne citotoksične koncentracije (CD50) na prvu populaciju ćelija, čiji članovi eksprimiraju određeni ciljani biomolekul na ćelijskoj površini, pri dozi koja je najmanje tri puta manja od CD50doze istog citotoksičnog proteina u drugoj populaciji ćelija čiji članovi ne eksprimiraju taj ciljani biomolekul, ne eksprimiraju značajnu količinu tog ciljanog biomolekula, ili nisu izloženi značajnoj količini tog ciljanog biomolekula koji je povezan uz pomoć veznog regiona citotoksičnog proteina.
C. Dopremanje dodatnog egzogenog materijala u unutrašnjost ciljane ćelije [0146] Kao dodatak direktnom ubijanju ćelije, proteini iz ovog pronalaska opciono se mogu koristiti za dopremanje dodatnih egzogenih materijala u unutrašnjost ciljanih ćelija. Dopremanje dodatnih egzogenih materijala može se koristiti, na pr., za citotoksičnu, citostatsku, sakupljanje informacija, i/ili dijagnostičke funkcije. Netoksične varijante citotoksičnih proteina iz otkrića, ili opciono toksične varijante, mogu se koristiti za dopremanje dodatnih egzogenih materijala u i/ili za obeležavanje unutrašnjosti ćelija koje su fizički uparene sa vanćelijskim ciljanim biomolekulom iz veznog regiona iz proteina iz pronalaska. Različiti tipovi ćelija i/ili ćelijskih populacija koje eksprimiraju ciljane biomolekule na najmanje jednoj ćelijskoj površini mogu biti ciljani sa proteinima iz pronalaska za primanje egzogenih materijala. Funkcionalne komponente iz ovog pronalaska su modularne, tako da različiti efektorski regioni Šiga toksina i dodatnih egzogenih materijala mogu biti povezani za različite vezne regione kako bi obezbedili različite aplikacije, kao što je neinvezivna in vivo vizuelizacija tumorskih ćelija.
[0147] Zbog toga što proteini iz ovog pronalaska, i njihovi katalitički neaktivni oblici, su sposobni da uđu u ćeliju koja je fizički uparena sa vanćelijskim ciljanim biomolekulom koji je prepoznat od strane njegovog veznog regiona, pojedina rešenja za proteine iz otkrića mogu se koristiti za dopremanje dodatnih egzogenih materijala u unutrašnjost ciljanih ćelijskih tipova. U jednom smislu, celokupan protein je egzogeni materijal koji će Xći u ćeliju; prema tome, "dodatni" egzogeni materijali su heterologni materijali koji su povezani za protein ali osim za samo jezgro proteina.
[0148] "Dodatni egzogeni materijal" kao što je ovde korišćeno se odnosi na jedan ili više molekula, često ne generalno prisutnih unutar nativne ciljane ćelije, gde proteini iz ovog pronalaska mogu se koristiti da konkretno prevoze takav materijal u unutrašnjost ćelije. Neograničavajući primeri dodatnih egzogenih materijala su citotoksični agensi, peptidi, polipeptidi, proteini, polinukleotidi, agensi za promociju detekcije, i hemoterapeutski agensi malih molekula.
[0149] U određenim realizacijama za proteine iz predmetnog otkrića za dopremanje dodatnih egzogenih materijala, dodatni egzogeni materijal je citotoksični agens, kao što su, na pr., hemoterapeutski agens malih molekula, citotoksični antibiotik, alkilirajući agens, antimetabolit, inhibitor topoizomeraze, i/ili tubulin inhibitor. Neograničavajući primeri citotoksičnih agensa uključuju aziridine, cisplatine, tetrazine, prokarbazin, heksametilmelamin, vinka alkaloide, taksane, kamptotecine, etopozid, doksorubicin, mitoksantron, tenipozid, novobiocin, aklarubicin, antracikline, aktinomicin, bleomicin, plikamicin, mitomicin, daunorubicin, epirubicin, idarubicin, dolastatine, majtanzine, docetaksel, adrijamicin, kaliheamicin, auristatine, pirolobenzodiazepin, karboplatin, 5-fluorouracil (5-FU), kapecitabin, mitomicin C, paklitaksel, 1,3-bis (2-hloretil)-1nitrozourea (BCNU), rifampicin, cisplatin, metotreksat i gemcitabine,
[0150] U određenim realizacijama iz otkrića, dodatni egzogeni materijal obuhvata protein ili polipeptide koji obuhvataju enzim. U određenim drugim realizacijama, dodatni egzogeni materijal je nukleinska kiselina, kao što su, na pr. ribonukleinska kiselina koja funkcioniše kao mala inhibirajuća RNK (siRNK) ili microRNK (miRNK). U određenim realizacijama, dodatni egzogeni materijal je antigen, kao što je antigeni izveden je antigenz bakterijskih proteina, viralnih proteina, proteini mutirani u kancer, proteini aberantno eksprimirani u kanceru, ili komplementarni određujući regioni T-ćelija. Na primer, egzogeni materijali uključuju antigene, kao što su one karakteristične za ćelije koje prezentuju antigen inficirane bakterijama, i komplementarni određujući regioni T-ćelija koji su sposobni da funkcionišu kao egzogeni antigeni.
D. Sakupljanje informacija za dijagnostičke funkcije
[0151] Proteini iz pronalaska imaju upotrebu u in vitro i/ili in vivo detekciji specifičnih ćelija, ćelijskih tipova, i/ili ćelijskih populacija. U određenim realizacijama iz otkrića, citotoksični proteini opisani ovde su korišćeni i za dijagnozu i za tretman, ili samo za dijagnozu. Kada se isti citotoksični protein koristi i za dijagnozu i za tretman, varijanta citotoksičnog proteina koja inkorporira sredstvo za promociju detekcije za dijagnostiku može se učiniti netoksičnim uz pomoć katalitičke inaktivacije nekog efektorskog regiona Šiga toksina putem jedne ili više supstitucija aminokiselina, uključujući supstitucije koje su date kao primeri opisani ovde. Katalitički neaktivni oblici citotoksičnih proteina iz otkrića katalkoji su konjugovani za agense za promociju detekcije opciono se mogu koristiti za dijagnostičke funkcije, kao što je za prateću dijagnostiku koja se koristi zajedno sa terapijskim režimom koji obuhvata isti ili srodni vezni region.
[0152] Sposobnost agensa konjugacije za promociju detekcije, koja je poznata u stanju tehnike, različitim proteinima iz pronalaska obezbeđuje korisne kompozicije za detekciju ćelija karcinoma, tumora, imunih i inficiranih. Ova dijagnostička ostvarenja za proteine iz pronalaska mogu se koristiti za sakupljanje informacija putem različitih slikovnih tehnika i testova koje su poznate u tehnici. Na primer, dijagnostičke realizacije proteina iz pronalaska mogu se koristiti za sakupljanje informacija putem snimanja unutarćelijskih organela (na pr. endocitotski, Goldžijev, endoplazmatski retikulum i citozolni odeljci) pojedinačnih ćelija karcinoma, imunih ćelija ili inficiranih ćelija kod pacijenta ili u uzorku iz biopsije.
[0153] Razni tipovi informacija mogu se prikupiti pomoću dijagnostičkih realizacija za proteine iz pronalaska, bilo za dijagnostičku upotrebu ili za druge namene. Ove informacije mogu biti korisne, na primer, u dijagnostici neoplastičnih ćelijskih tipova, u određivanju terapijske osetljivosti bolesti kod pacijenta, u ispitivanju napredovanja antineoplastičnih terapija tokom vremena, u analiziranju napretka imunomodulatornih terapija tokom vremena, u analiziranju napretka antimikrobnih terapija tokom vremena, u proceni prisustva inficiranih ćelija u transplantacionim materijalima, proceni prisustva neželjenih ćelijskih tipova u transplantacionim materijalima, i/ili u proceni prisustva rezidualnih tumorskih ćelija nakon hirurške ekscizije tumorske mase.
[0154] Na primer, subpopulacije pacijenata mogu se utvrditi korišćenjem podataka prikupljenih korišćenjem dijagnostičke varijante za proteine iz pronalaska, a zatim bi se pojedinačni pacijenti mogli svrstati u subpopulacije na osnovu njihovih jedinstvenih karakteristika otkrivenih korišćenjem tih dijagnostičkih realizacija. Na primer, efektivnost određenih farmaceutskih proizvoda ili terapija može biti jedan od kriterijuma koji se koristi za definisanje subpopulacije pacijenta. Na primer, netoksična dijagnostička varijanta određenog citotoksičnog proteina iz otkrića može se koristiti za razlikovanje pacijenata koji pripadaju klasi ili subpopulaciji pacijenata za koje se predviđa pozitivan odgovor na citotoksičnu varijantu istog proteina iz pronalaska. Shodno tome, smatra se da su povezane metode za identifikaciju pacijenta, stratifikaciju pacijenta i dijagnozu pomoću proteina iz pronalaska i/ili njihovih netoksičnih varijanti obuhvaćene u okviru obaslti predmetnog otkrića.
IV. Varijacije u polipeptidnoj sekvenci za proteine iz pronalaska koje održavaju ukupnu strukturu i funkciju
[0155] Stručna osoba će prepoznati da se mogu izvršiti varijacije proteina iz ovog pronalaska (i polinukleotida koji ih kodiraju) u okviru obima patentnih zahteva, bez umanjivanja njihovih bioloških aktivnosti, na pr. održavanjem celokupne strukture i funkcije proteina iz pronalaska. Na primer, neke modifikacije mogu olakšati ekspresiju, prečišćavanje, farmakokinetička svojstva, i/ili imunogenost. Takve modifikacije su dobro poznate stručnoj osobi i uključuju, na primer, metionin dodat na amino terminusu kako bi se obezbedilo mesto inicijacije, dodatnu aminokiselinu postavljenu na bilo koji kraj da bi se kreirala pogodno locirana mesta restrikcije ili terminacioni kodoni, i biohemijske oznake afiniteta spojene na bilo koji kraj kako bi se obezbedili za pogodnu detekciju i/ili prečišćavanje.
[0156] Ovde se takođe razmatra uključivanje dodatnih aminokiselinskih ostataka na amino i/ili karboksi terminusu, kao što su sekvence za epitopske oznake ili druge ostatke. Dodatni aminokiselinski ostaci mogu se koristiti u različite svrhe, uključujući, na pr., za olakšavanje kloniranja, ekspresije, post-translacione modifikacije, sinteze, prečišćavanja, detekcije, i/ili administracije. Neograničavajući primeri epitopskih oznaka i ostataka su: hitin vezujući protein domen, mesta cepanja enter-opeptidazom, mesta cepanja faktorom Xa, FIAsH oznake, FLAG oznake, zeleni fluorescentni proteini (GFP), glutation-S-transferaza ostaci, HA oznake, maltoza vezujući protein domen, mik oznake, polihistidinske oznake, ReAsH oznake, strep oznake, strep oznake II, mesta TEV proteaze, tioredoksin domen, mesto cepanja trombina i V5 epitopske oznake.
[0157] U od gore navedenih realizacija, protein iz ovog pronalaska je varijanta u kojoj postoji jedna ili više konzervativnih supstitucija aminokiselina uvedenih u polipeptidne regione, kako je definisano u patentnim zahtevima. Kao što je ovde korišćeno, izraz „konzervativna supstitucija“ označava da su jedna ili više aminokiselina zamenjene drugim, biološki sličnim aminokiselinskim ostatkom. Primeri uključuju supstituciju aminokiselinskih ostataka sa sličnim karakteristikama, kao što su na pr. mala aminokiselina, kisela aminokiselina, polarna aminokiselina, bazna aminokiselina, hidrofobna aminokiselina i aromatična aminokiselina (videti, na primer, tabela B dole). Primer konzervativne supstitucije sa ostatkom koji se obično ne može naći u endogenim peptidima i proteinima sisara je konzervativna supstitucija ostatka arginina ili lizina sa primer, ornitinom, kanavaninom, aminoetilcisteinom ili drugom baznom aminokiselinom. Za dalje informacije razmotriti fenotipske tihe supstitucije u peptidima i proteinima (videti na pr. Bowie J et al., Science 247: 1306-10 (1990)).
[0158] U šemi konzervativne supstitucije u tabeli B dole, primeri konzervativne supstitucije aminokiselina su grupisani prema fizičko-hemijskim svojstvima - I: neutralna, hidrofilna; II: kiseline i amidi; III: bazni; IV: hidrofobni; V: aromatična, glomazna aminokiselina, VI hidrofilni nenaelektrisani, VII alifatski nenaelektrisani, VIII nepolarni nenaelektrisani, IX povezani sa cikloalkenilom, X hidrofobni, XI polarni, XII mali, XIII dozvoljen zaokret i XIV fleksibilni. Na primer, konzervativna supstitucija aminokiselina uključuje sledeće: 1) S može biti supstituisan za C; 2) M ili L može biti supstituisan za F; 3) Y može biti supstituisan za M; 4) Q ili E može biti supstituisan za K; 5) N ili Q može biti supstituisan za H; i 6) H može biti supstituisan za N.
TABELA B. Primeri konzervativne supstitucije aminokiselina
[0159] U određenim realizacijama kako je definisano u patentnim zahtevima, protein iz predmetnog pronalaska može da obuhvata funkcionalne fragmente ili varijante polipeptidnih regiona iz pronalaska koji imaju, najviše, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, ili 1 aminokiselinsku supstituciju(e) u poređenju sa ovde opisanom polipeptidnom sekvencom, sve dok supstituisani polipeptidni region zadržava merljivu biološku aktivnost sam ili kao komponenta proteina iz pronalaska. Varijante proteina iz pronalaska su u okviru obima pronalaska kako je definisano u patentnim zahtevima kao rezultat promene polipeptida iz proteina iz pronalaska promenom jedne ili više aminokiselina ili delecijom ili insercijom jedne ili više aminokiselina, kao što je unutar veznog regiona imunoglobulinskog tipa ili efektorskog regiona Šiga toksina, da bi se postigla željena svojstva, kao što je promenjena citotoksičnost, promenjeni citostatski efekti, promenjena imunogenost, i/ili promenjeno poluvreme života seruma. Polipeptid proteina iz pronalaska može dalje biti sa ili bez signalne sekvence.
[0160] U određenim realizacijama, protein iz ovog pronalaska deli najmanje 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identiteta aminokiselinske sekvence sa aminokiselinskim sekvencama bilo kog od ovde pomenutih proteina, kako je definisano u patentnim zahtevima, sve dok zadržava merljivu biološku aktivnost, kao što je citotoksičnost, vanćelijsko ciljano vezivanje biomolekula, enzimska kataliza ili subćelijsko usmeravanje. Vezni region imunoglobulinskog tipa može se razlikovati od aminokiselinskih sekvenci koje su ovde pomenute, sve dok zadržava funkcionalnost vezivanja za svoje vanćelijske ciljne biomolekule, kako je definisano u patentnim zahtevima. Funkcionalnost vezivanja će se najverovatnije zadržati ako su aminokiselinske sekvence CDRova ili ABRova identične. Na primer, protein spada u obim patentnog zahteva ako sadrži ili se sastoji u osnovi od 85% identiteta aminokiselina prema ovde pomenutom proteinu za potrebe određivanja stepena identiteta aminokiselina, aminokiselinski ostaci koji čine CDRove ili ABRove su zanemareni. Funkcionalnost vezivanja može odrediti stručna osoba koristeći standardne tehnike.
[0161] U određenim realizacijama, efektorski region Šiga toksina može se promeniti kako bi promenio svoju enzimsku aktivnost i/ili citotoksičnost sve dok efektorski region Šiga toksina zadržava jednu ili više drugih efektorskih funkcija Šiga toksina. Ova promena možda neće rezultirati promenom u citotoksičnosti proteina čiji je izmenjeni efektorski region Šiga toksina komponenta. Moguće promene uključuju mutacije efektorskog regiona Šiga toksina koje su izabrane iz grupe koju čine: skraćivanje, delecija, inverzija, insercija, preuređivanje i supstitucija.
[0162] Citotoksičnost A podjedinica iz članova porodice Šiga toksina može se izmeniti, redukovati ili eliminisati mutacijom ili skraćivanjem. Pokazalo se da su položaji označeni kao tirozin-77, glutamat-167, arginin-170, tirozin-114 i triptofan-203 važni za katalitičku aktivnost Stx, Stx1, i Stx2 (Hovde C et al., Proc Natl Acad Sci USA 85: 2568-72 (1988); Deresiewicz R et al., Biochemistry 31: 3272-80 (1992); Deresiewicz R et al., Mol Gen Genet 241: 467-73 (1993); Ohmura M et al., Microb Pathog 15: 169-76 (1993); Cao C et al., Microbiol Immunol 38: 441-7 (1994); Suhan M, Hovde C, Infect Immun 66: 5252-9 (1998)). Mutiranjem i glutamata-167 i arginina-170 eliminiše se enzimska aktivnost iz SLT-I A1 u testu inaktivacije ribozoma bez ćelija (LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)). U drugom pristupu, korišćenjem de novo ekspresije iz SLT-I A1 u endoplazmatskom retikulumu, mutiranjem i glutamata-167 i arginina-170 eliminiše se citotoksičnost fragmenta Slt-I A1 na tom nivou ekspresije (LaPointe, J Biol Chem 280:
23310-18 (2005)). Analiza skraćivanja pokazala je da fragment StxA iz ostataka 75 do 268 i dalje zadržava značajnu enzimsku aktivnost in vitro (Haddad, J Bacteriol 175: 4970-8 (1993)). Skraćeni fragment iz SLT-I A1 koji sadrži ostatke 1-239 pokazao je značajnu enzimatsku aktivnost in vitro i citotoksičnost de novo ekspresijom u citozolu (LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)). Ekspresija fragmenta Slt-I A1 koji je skraćen na ostatke 1-239 u endoplazmatskom retikulumu nije bila citotoksična jer nije mogao da se retrotranslocira u citozol (LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)).
[0163] Najkritičniji ostaci za enzimsku aktivnost i/ili citotoksičnost u podjedinicima A Šiga toksina mapirani su na sledeće položaje ostataka: aspargin-75, tirozin-77, glutamat-167, arginin-170 i arginin-176, između ostalih (Di, Toxicon 57: 525-39 (2011)).
Konkretno, dvostruko mutirani konstrukt Stx2A koji sadrži glutamat-E167-na-lizin i arginin-176-na-lizin mutacijama bio je potpuno inaktiviran; dok, mnoge pojedinačne mutacije u Stx1 i Stx2 pokazuju 10-struko smanjenje citotoksičnosti. Dalje, skraćivanje StxlA na 1-239 ili 1-240 smanjilo je njegovu citotoksičnost, i slično, skraćivanje Stx2A na konzervirani hidrofobni ostatak smanjilo je njegovu citotoksičnost.
[0164] Najkritičniji ostaci za vezivanje eukariotskih ribozoma i/ili inhibicije eukariotskog ribozoma u podjedinicama A Šiga toksina mapirani su na sledećim položajima ostataka arginin-172, arginin-176, arginin-179, arginin-188, tirozin-189, valin-191, i leucin-233, između ostalih (McCluskey A et al., PLoS One 7: e31191 (2012).
[0165] Odsečci podjedinica A Šiga-sličnog toksina 1 su katalitički aktivni, sposobni da enzimski inaktiviraju ribozome in vitro i citotoksični kada se eksprimiraju u ćeliji (LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)). Najmanji fragment podjedinice A Šiga toksina koji pokazuje punu enzimsku aktivnost je polipeptid sastavljen od ostataka 1-239 iz SLT1A (LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)). Iako je najmanji fragment podjedinice A Šiga toksina za koji se navodi da zadržava značajnu katalitičku aktivnost bio ostatak 75-247 iz StxA (Al-Jaufy, Infect Immun 62: 956-60 (1994)), skraćenje StxA eksprimirano de novo u eukariotskoj ćeliji zahteva samo do ostatka 240 da bi se došlo do citozola i izvršila katalitička inaktivacija ribozoma (LaPointe, J Biol Chem 280: 23310-18 (2005)).
[0166] U određenim realizacijama izvedene iz SLT-1A (SEKV ID BR: 1) ili StxA (SEKV ID BR: 2), ove promene uključuju zamenu asparagina u poziciji 75, tirozina u poziciji 77, tirozina u poziciji 114, glutamata u poziciji 167, arginina na poziciji 170, arginina na poziciji 176, i/ili supstitucija triptofana na poziciji 203. Primeri takvih supstitucija biće poznati stručnoj osobi na osnovu stanja tehnike, kao što je asparagin na poziciji 75 do alanin, tirozin na poziciji 77 do serina, supstitucija tirozina na poziciji 114 do serina, supstitucija glutamata na poziciji 167 do aspartata, supstitucija arginina na poziciji 170 do alanina, zamena arginina na poziciji 176 do lizina, i/ili supstitucija triptofana na poziciji 203 do alanina.
[0167] Proteini iz ovog pronalaska mogu opciono da budu konjugovani sa jednim ili više dodatnih agenasa, kao što je terapeutsko i/ili dijagnostičko sredstvo poznato u stanju tehnike, uključujući takve agense kako je ovde opisano.
V. Priprema, proizvodnja i prečišćavanje proteina iz pronalaska
[0168] Proteini iz ovog pronalaska mogu se proizvesti korišćenjem tehnika biohemijskog inženjerstva dobro poznatih stručnjacima u ovoj oblasti. Na primer, citotoksični proteini iz pronalaska mogu se proizvesti standardnim sintetičkim metodama, upotrebom rekombinantnih ekspresijskih sistema ili bilo kojim drugim prikladnim metodama, Proteini iz pronalaska mogu se proizvoditi kao fuzijski proteini, hemijski kuplovani konjugati, i/ili njihove kombinacije, kao što je, na pr., komponenta fuzionog proteina kovalentno povezana sa jednom ili više komponenata. Prema tome, proteini iz pronalaska mogu se sintetizovati na više načina, uključujući na pr. metode koje obuhvataju: (1) sintezu polipeptidne ili polipeptidne komponente proteina iz pronalaska primenom standardne metodologije čvrste faze ili tečne faze, bilo postepeno ili skupljanjem fragmenata, i izolovanje i prečišćavanje konačnog proizvoda peptidnog jedinjenja; (2) eksprimiranje polinukleotida koji kodira polipeptid ili polipeptidnu komponentu proteina iz pronalaska u ćeliji domaćina i izdvajanje produkta ekspresije iz ćelije domaćina ili kulture ćelija domaćina; ili (3) bezćelijska in vitro ekspresija polinukleotida koji kodira polipeptid ili polipeptidnu komponentu proteina iz pronalaska i izdvajanje proizvoda ekspresije; ili bilo kojim kombinacijom metoda od (1), (2) ili (3) za dobijanje fragmenata peptidne komponente, naknadno spajanje (na pr. povezivanje) fragmenata za dobijanje peptidne komponente i izdvajanje peptidne komponente.
[0169] Može biti poželjno sintetizovati polipeptidnu ili polipeptidnu komponentu proteina iz ovog pronalaska pomoću sinteze peptida u čvrstoj ili tečnoj fazi. Proteini iz pronalaska mogu se na odgovarajući način proizvesti standardnim sintetičkim metodama. Prema tome, peptidi mogu da se sintetišu uz pomoć na pr. metoda koje obuhvataju sintezu peptida standardnom metodologijom čvrste faze ili tečne faze, postepeno ili skupljanjem fragmenata i izolovanjem i prečišćavanjem konačnog peptidnog proizvoda. U ovom kontekstu, može se uputiti na WO 1998/11125 ili, između ostalog, na Fields G et al., Principles and Practice of Solid-Phase Peptide Synthesis (Synthetic Peptides, Grant G, ed., Oxford University Press, U.K., 2nd ed., 2002) i na primere sinteze u njima.
[0170] Proteini iz ovog pronalaska mogu se pripremiti (proizvesti i prečistiti) primenom rekombinantnih tehnika dobro poznatih u stanju tehnike. Generalno, postupci za pripremu polipeptida kultivisanjem ćelija domaćina transformisanih ili transfektovanih vektorom koji obuhvata kodirajući polinukleotid i izdvajanjem polipeptida iz ćelijske kulture su opisani u, na pr. Sambrook J et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, U.S., 1989); Dieffenbach C et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., U.S., 1995). Bilo koja odgovarajuća ćelija domaćin može se koristiti za proizvodnju proteina iz pronalaska. ûelije domaćina mogu biti ćelije stabilno ili prolazno transfektovane, transformisane, transdukovane ili inficirane sa jednim ili više ekspresijskih vektora koji pokreću ekspresiju polipeptida iz pronalaska. Pored toga, protein iz pronalaska može se proizvesti modifikovanjem polinukleotida koji kodira protein iz pronalaska što rezultira promenom jedne ili više aminokiselina ili delecijom ili insercijom jedne ili više aminokiselina kako bi se postigla željena svojstva, kao što je promenjena citotoksičnost, promenjeni citostatski efekat, promenjena imunogenost, i/ili promenjeno poluvreme života seruma.
[0171] Postoji širok spektar ekspresijskih sistema koji mogu biti izabrani za proizvodnju proteina iz ovog pronalaska. Na primer, organizmi domaćini za ekspresiju proteina iz pronalaske uključuju prokariote, kao što su E. coli i B. subtilis, eukariotske ćelije, kao što je kvasac i nitaste gljive (poput S. cerevisiae, P. pastoris, A. avamori i K. lactis), alge (poput C. reinhardtii), ćelijske linije insekata, ćelije sisara (poput CHO ćelija), biljne ćelijske linije i eukariotski organizmi kao što su transgene biljke (poput A. thaliana i N. benthamiana).
[0172] Shodno tome, predmetno otkriće takođe obezbeđuje metode za proizvodnju proteina iz ovog pronalaska prema gore navedenim metodama i korišćenjem (i) dela polinukleotida koji kodira za ili ceo protein iz pronalaska ili njegov polipeptidni deo, (ii) vektora ekspresije koji obuhvata najmanje jedan polinukleotid iz pronalaska koji je sposoban da kodira deo ili ceo protein iz pronalaska ili njegovu polipeptidnu komponentu kada se uvede u odgovarajuću ćeliju domaćina ili ekspresioni sistem bez ćelije, i/ili (iii) ćeliju domaćina koja obuhvata polinukleotid ili ekspresijski vektor iz pronalaska.
[0173] Kada se polipeptid ili protein eksprimira rekombinantnim tehnikama u ćeliji domaćina ili u sistemu bez ćelija, korisno je dalje odvojiti (ili pročistiti) željeni polipeptid ili protein od ostalih komponenata, kao što su faktori ćelije domaćina, da bi se dobili preparati koji su visoke čistoće ili su u osnovi homogeni. Prečišćavanje se može izvršiti metodama koje su dobro poznate u stanju tehnike, kao što su tehnike centrifugiranja, tehnike ekstrakcije, hromatografske i tehnike frakcionisanja (na pr. razdvajanje veličine gelskom filtracijom, odvajanje naelektrisanja kolonom za izmenjivanje jona, hromatografija hidrofobne interakcije, hromatografija reverzne faze , hromatografija na silicijumskim ili katjon-izmenjivačkim smolama kao što je DEAE i slično, hromatofokusiranje i protein A sefarozna hromatografija za uklanjanje kontaminanata), i tehnike precipitacije (precipitacija etanolom na pr. ili taloženje amonijum-sulfatom). Bilo koji broj tehnika biohemijskog prečišćavanja mogu se koristiti za povećanje čistoće proteina iz pronalaska. U određenim realizacijama, proteini iz pronalaska mogu se opciono prečistiti u homo-multimernim oblicima (tj. proteinski kompleks od dva ili više identičnih proteina) ili u hetero-multimernim oblicima (tj. proteinski kompleks od dva ili više ne-identičnih proteina).
[0174] U primerima koji slede su opisi neograničavajućih primera metoda za proizvodnju proteina iz ovog pronalaska, kao i specifični, ali neograničavajući aspekti proizvodnje proteina za otkrivene, primerne, citotoksične proteine.
VI. Farmaceutske i dijagnostičke kompozicije koje sadrže protein iz pronalaska [0175] Predmetni pronalazak obezbeđuje proteine za upotrebu, pojedinačno ili u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih terapijskih sredstava, u farmaceutskoj kompoziciji, za lečenje ili profilaksu stanja, bolesti, poremećaja ili simptoma kako je definisano u patentnim zahtevima i detaljnije opisano u nastavku (na pr. karcinomi, maligni tumori, imunološki poremećaji nemaligni tumori i mikrobne infekcije).
Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje sadrže protein iz pronalaska, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so ili solvat, prema pronalasku, zajedno sa najmanje jednim farmaceutski prihvatljivim nosačem, pomoćnom supstancom ili nosačem, kako je definisano u patentnim zahtevima. U određenim realizacijama, farmaceutskom kompozicijom iz pronalaska mogu se obuhvatiti homo-multimerni i/ili hetero-multimerni oblici proteina iz pronalaska. Farmaceutske kompozicije će biti korisne u metodama lečenja, poboljšanja ili sprečavanja bolesti, stanja, poremećaja ili simptoma koji su detaljnije opisani u nastavku. Svaka takva bolest, stanje, poremećaj ili simptom je predviđena kao zasebna realizacija u pogledu korisnosti farmaceutske kompozicije prema pronalasku. Pronalazak dalje obezbeđuje farmaceutske kompozicije za primenu u najmanje jednom načinu lečenja prema pronalasku, kao što je detaljnije opisano u nastavku.
[0176] Kao što je ovde korišćeno, izrazi „pacijent“ i „subjekat“ koriste se naizmenično da bi se odnosili na bilo koji organizam, obično kičmenjake kao što su ljudi i životinje, koji pokazuju simptome, znake, i/ili indikacije najmanje jedne bolesti, poremećaja, ili stanja. Ovi pojmovi uključuju sisare kao što su neograničavajući primeri primata, stočnih životinja (na pr. goveda, konja, svinja, ovaca, koza itd.), pratećih životinja (na pr. mačaka, pasa itd.) i laboratorijskih životinja (na pr. miševi, zečevi, pacovi itd.).
[0177] Kao što je ovde korišćeno, „lečenje“, „tretiranje“ ili „tretman“ i njihove gramatičke varijante odnose se na pristup za dobijanje korisnih ili željenih kliničkih rezultata. Izrazi se mogu odnositi na usporavanje početka ili brzine razvoja stanja, poremećaja ili bolesti, na smanjenje ili ublažavanje simptoma povezanih s tim, na generisanje potpune ili delimične regresije stanja, ili neku kombinaciju bilo kog od gore navedenog. Za potrebe ovog pronalaska, korisni ili željeni klinički rezultati uključuju, ali nisu ograničeni na, smanjenje ili ublažavanje simptoma, smanjenje obima bolesti, stabilizaciju (na pr. nema pogoršanja) stanja bolesti, odlaganje ili usporavanje napredovanja bolesti, poboljšanje ili palijacija stanja bolesti i remisija (bilo delimična ili totalna), bilo da je detektibilna ili nedetektibilna. "Lečenje", „tretiranje“ ili „tretman“ takođe može značiti produžavanje preživljavanja u odnosu na očekivano vreme preživljavanja ako se ne leči. Subjekt (na pr. humani) kome je potrebno lečenje može prema tome biti subjekt koji je već pogođen dotičnom bolešću ili poremećajem. Izrazi „lečenje“, „tretiranje“ ili „tretman“ uključuje inhibiciju ili smanjenje povećanja težine patološkog stanja ili simptoma u odnosu na odsustvo lečenja, i nije nužno da podrazumeva potpuni prestanak relevantne bolesti, poremećaja, ili stanja. Što se tiče tumora i/ili karcinoma, lečenje uključuje smanjenje ukupnog opterećenja tumora i/ili pojedinačne veličine tumora.
[0178] Kao što je ovde korišćeno, izrazi "prvencija", "sprečavati", "sprečavanje" i njihove gramatičke varijante se odnose na pristup za sprečavanje razvoja ili promene patologije, stanja, bolesti ili poremećaja. Shodno tome, „prevencija“ se može odnositi na profilaktičke ili preventivne mere. Za potrebe ovog pronalaska, korisni ili željeni klinički rezultati uključuju, ali nisu ograničeni na, prevenciju ili usporavanje simptoma, napredovanja ili razvoja bolesti, bilo da je detektibilno ili nedetektibilno. Subjekt (na pr. humani) kome je potrebna prevencija može prema tome biti subjekt koji još uvek nije pogođen dotičnom bolešću ili poremećajem. Izraz "prevencija" uključuje usporavanje početka bolesti u odnosu na odsustvo lečenja i nije nužno da podrazumeva trajno sprečavanje relevantne bolesti, poremećaja ili stanja. Stoga se „prevencija“ ili „sprečavanje“ stanja u određenim kontekstima može odnositi na smanjenje rizika od razvoja stanja, ili sprečavanje ili odlaganje razvoja simptoma povezanih sa tim stanjem.
[0179] Kao što je ovde korišćeno, "efektivna količina" ili "terapeutski efektivna količina" je količina ili doza kompozicije (na primer terapeutska kompozicija ili sredstvo) koja proizvodi najmanje jedan željeni terapeutski efekat kod subjekta, kao što je sprečavanje ili lečenje ciljanog stanja ili blagotvorno ublažavanje simptoma povezanog sa tim stanjem. Najpoželjnija terapeutski efektivna količina je količina koja će proizvesti željenu efikasnost određenog tretmana izabranog od strane stručnjaka za datog subjekta kome je to potrebno. Ova količina će varirati u zavisnosti od različitih faktora koje stručna osoba razume, uključujući, ali ne ograničavajući se na, karakteristike terapijskog jedinjenja (uključujući aktivnost, farmakokinetiku, farmakodinamiku i bioraspoloživost), fiziološko stanje subjekta (uključujući starost, pol, tip bolesti, stadijum bolesti, opšte fizičko stanje, reakcija na datu dozu i tip leka), prirodu farmaceutski prihvatljivog nosača ili nosača u formulaciji i način primene. Stručna osoba u kliničkom i farmakološkom stanju tehnike moći će da odredi terapeutski efektivne količine rutinskim eksperimentisanjem, naime praćenjem reakcije subjekta na primenu jedinjenja i prilagođavanjem doze u skladu s tim (videti na pr. Remington: The Science and Practice of Pharmacy (Gennaro A, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, U.S., 19th ed., 1995)).
[0180] Dijagnostičke kompozicije iz predmetnog otkrića sadrže protein iz pronalaska i jedan ili više agensa za promociju detekcije. Različiti agensi za promociju detekcije poznati su u stanju tehnike, kao što su izotopi, boje, kolorimetrijska sredstva, agensi za pojačavanje kontrasta, fluorescentna sredstva, bioluminiscentna sredstva i magnetna sredstva. Ovi agensi se mogu ugraditi u protein iz pronalaska na bilo kojem položaju. Uključivanje agensa može biti putem aminokiselinskih ostataka iz proteina iz pronalaska ili preko nekog tipa veze koji je poznat u stanju tehnike, uključujući putem linkera i/ili helatora. Uključivanje agensa je na takav način da se omogući detekcija prisustva dijagnostičke kompozicije na ekranu, u eseju, u dijagnostičkoj proceduri, i/ili tehnici snimanja.
[0181] Pri pripremi ili proizvodnji dijagnostičke kompozicije iz predmetnog otkrića, protein iz pronalaska može biti direktno ili indirektno povezan na jedan ili više agenasa za promociju detekcije. Stručnoj osobi su poznati brojni agensi za promociju detekcija koji se mogu operativno povezati sa proteinima iz pronalaska za metode sakupljanja informacija, kao što je za dijagnostičku i/ili prognostičku primenu za bolesti, poremećaje ili stanja organizma (videti na pr. Cai W et al., J Nucl Med 48: 304-10 (2007); Nayak T, Brechbiel M, Bioconjug Chem 20: 825-41 (2009); Paudyal P et al., Oncol Rep 22: 115-9 (2009); Qiao J et al., PLoS ONE 6: e18103 (2011); Sano K et al., Breast Cancer Res 14: R61 (2012)). Na primer, agensi za promociju detekcije uključuju kontrastne agense za poboljšanje slike, kao što su fluorescentne boje (na pr. Alexa680, indocijanin zelena i Cy5.5), izotopi i radionuklidi, kao što su<11>C,<13>N,<15>O,<18>F,<32>P,<51>Mn,<52>mMn,<52>Fe,<55>Co,<62>Cu,<64>Cu,<67>Cu,<67>Ga,<68>Ga,<72>As,<73>Se,<75>Br,<76>Br,<82>mRb,<83>Sr,<86>Y,<90>Y,<89>Zr,<94>mTc,<94>Tc,<99>mTc,<110>In,<111>In,<120>I,<123>I,<124>I,<125>I,<131>I,<154>Gd,<155>Gd,<156>Gd,<157>Gd,<158>Gd,<177>Lu,<186>Re,<188>Re, i<223>R, paramagnetni joni, kao što su hrom (III), mangan (II), gvožđe (III), gvožđe (II), kobalt (II), nikal (II), bakar (II), neodimijum (III), samarijum (III), iterbijum (III), gadolinijum (III), vanadijum (II), terbijum (III), disprozijum (III), holmijum (III) ili erbijum (III), metali, kao što je lantan (III), zlato (III), olovo (II) i bizmut (III), agensi za pojačavanje ultrazvučnog kontrasta, kao što su lipozomi, radiopropusni agensi, kao što su jedinjenja barijuma, galijuma i talijuma. Agensi za promociju detekcije mogu se direktno ili indirektno uključiti korišćenjem posredničke funkcionalne grupe, kao što su helatori poput 2-benzil DTPA, PAMAM, NOTA, DOTA, TETA, njihovi analozi i funkcionalni ekvivalenti bilo kog od prethodno navedenog (videti Leyton J et al., Clin Cancer Res 14: 7488-96 (2008)).
[0182] Postoje brojne standardne tehnike koje su poznate stručnoj osobi za inkorporiranje, lepljenje, i/ili konjugaciju različitih agensa za promociju detekcije na proteine, posebno na imunoglobuline i domene izvedene iz imunoglobulina (Wu A, Methods 65: 139-47 (2014)). Slično tome, postoje brojni pristupi snimanju koji su poznati stručnoj osobi, kao što su neinvezivne in vivo tehnike snimanja koje se obično koriste u medicinskoj areni, na primer: snimanje računarskom tomografijom (CT skeniranje), optičko snimanje (uključujući direktno, fluorescentno i bioluminiscentno snimanje) ), snimanje magnetnom rezonancom (MRI), pozitronsko-emisiona tomografija (PET), ultrazvuk računarske tomografije sa emisijom pojedinačnog fotona (SPECT) i snimanje računarskom tomografijom rendgenom (videti Kaur S et al., Cancer Lett 315: 97-111 (2012), za recenziju).
Priprema ili proizvodnja farmaceutske i/ili dijagnostičke kompozicije koja sadrži protein iz pronalaska
[0183] Farmaceutski prihvatljive soli ili solvati bilo kog proteina iz ovog pronalaska su takođe u okviru obima ovog pronalaska.
[0184] Izraz "solvat" u kontekstu ovog pronalaska odnosi se na kompleks definisane stehiometrije koji je formiran između rastvorene supstance (u slučaju, polipeptidnog jedinjenja ili njegove farmaceutski prihvatljive soli prema pronalasku) i rastvarača. Rastvarač u ovoj vezi može, na primer, biti voda, etanol ili neka druga farmaceutski prihvatljiva vrsta, tipično male molekularne organske vrste, kao što je, ali bez ograničenja, sirćetna kiselina ili mlečna kiselina. Kada je rastvarač u pitanju voda, takav solvat se obično naziva hidratom.
[0185] Proteini iz ovog pronalaska, ili njihove soli, mogu se formulisati kao farmaceutske kompozicije pripremljene za skladištenje ili davanje, koje obično sadrže terapeutski efektivnu količinu jedinjenja iz pronalaska, ili njegove soli, u farmaceutski prihvatljivom nosaču. Izraz "farmaceutski prihvatljivi nosač" uključuje bilo koji od standardnih farmaceutskih nosača. Farmaceutski prihvatljivi nosači za terapijsku upotrebu dobro su poznati u farmaceutskom stanju tehnike i opisani su, na primer, u Remington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co. (A. Gennaro, ed., 1985). Kao što je ovde korišćeno, „farmaceutski prihvatljivi nosač“ uključuje bilo koje i sve fiziološki prihvatljivei, tj. kompatibilne, rastvarače, disperzijske medije, obloge, antimikrobna sredstva, izotonična i sredstva za usporavanje apsorpcije, i slično.
Farmaceutski prihvatljivi nosači ili razblaživači uključuju one koji se koriste u formulacijama. Pogodni za oralnu, rektalnu, nazalnu ili parenteralnu primenu (uključujući subkutanu, intramuskularnu, intravensku, intradermalnu i transdermalnu) primenu. Primeri farmaceutski prihvatljivih nosača uključuju sterilne vodene rastvore ili disperzije i sterilne praškove za privremenu pripremu sterilnih injekcionih rastvora ili disperzija. Primeri odgovarajućih vodenih i nevodenih nosača koji se mogu koristiti u farmaceutskim kompozicijama iz pronalaska uključuju vodu, etanol, poliole (kao što je glicerol, propilen glikol, polietilen glikol i slično) i njihove odgovarajuće smeše, biljna ulja, kao što je maslinovo ulje i organski injekabilni estri, kao što je etiloleat.
Odgovarajuća fluidnost se može održavati na primer, upotrebom materijala za oblaganje, kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzije i upotrebom tenzida. U određenim realizacijama, nosač je pogodan za intravensku, intramuskularnu, potkožnu, parenteralnu, spinalnu ili epidermalnu primenu (na pr. injekcijom ili infuzijom). U zavisnosti od izabranog načina davanja, protein iz pronalaska ili druge farmaceutske komponente mogu biti obloženi materijalom namenjenim zaštiti jedinjenja od dejstva niskog pH i drugih prirodnih stanja inaktivacije na koje aktivni protein iz pronalaska može naići kada se primenjuje kod pacijent uz pomoć određenog načina administracije.
[0186] Formulacije farmaceutskih kompozicija iz ovog pronalaska mogu se povoljno predstaviti u obliku jedinične doze i mogu se pripremiti bilo kojim od metoda koje su dobro poznate u stanju farmaceutske tehnike. U takvom obliku, kompozicija je podeljena u jedinične doze koje sadrže odgovarajuće količine aktivne komponente. Jedinični oblik doziranja može biti pakovan preparat, pakovanje koje sadrži zasebne količine preparata, na primer, zapakovane tabele, kapsule i praškovi u bočicama ili ampulama. Oblik jedinične doze takođe može biti kapsula, kašeta ili sama tableta, ili može biti odgovarajući broj bilo kog od ovih upakovanih oblika. Može se isporučiti u obliku injekcije za jednu dozu, na primer u obliku olovke. Kompozicije se mogu formulisati za bilo koji odgovarajući put i način administracije. Subkutani ili transdermalni načini primene mogu biti tehnički posebno pogodni za terapijske proteine opisani ovde.
[0187] Farmaceutske kompozicije iz ovog pronalaska mogu takođe sadržati dodatke kao što su konzervansi, sredstva za vlaženje, emulgatori i agensi za dispergovanje.
Sprečavanje prisustva mikroorganizama može se obezbediti kako postupcima sterilizacije, tako i uključivanjem različitih antibakterijskih i antifungalnih sredstava, na primer, parabena, hlorbutanola, fenola, sorbinske kiseline i slično. Izotonični agensi, kao što su šećeri, natrijum hlorid i slično u kompoziciji, takođe mogu biti poželjni. Pored toga, produžena apsorpcija injektibilnog farmaceutskog oblika može se postići uključivanjem sredstava koja odlažu apsorpciju, kao što je, aluminijum monostearat i želatin.
[0188] Farmaceutskom kompozicijom iz ovog pronalaska takođe je obuhvaćen farmaceutski prihvatljivi antioksidans. Primeri farmaceutski prihvatljivih antioksidanata su u vodi rastvorni antioksidanti kao što su askorbinska kiselina, cistein hidrohlorid, natrijum bisulfat, natrijum metabisulfit, natrijum sulfit i slično; antioksidanti rastvorljivi u ulju, kao što su askorbil palmitat, butilirani hidroksianizol (BHA), butilirani hidroksitoluen (BHT), lecitin, propilgalat, alfa-tokoferol i slično; i agensi za heliranje metala, kao što je limunska kiselina, etilendiamin tetrasirćetna kiselina (EDTA), sorbitol, tartarna kiselina, fosforna kiselina i slično.
[0189] U drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje obuhvataju jedan ili kombinaciju različitih proteina iz pronalaska, ili enekog stra, soli ili amida bilo kog od prethodno navedenog, i najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv nosač.
[0190] Terapijske kompozicije su obično sterilne i stabilne u uslovima proizvodnje i skladištenja. Kompozicija se može formulisati kao rastvor, mikroemulzija, lipozom ili druga uređena struktura pogodna za visoku koncentraciju leka. Nosač može biti rastvarač ili disperzijski medijum koji sadrži na primer, vodu, alkohol kao što je etanol, poliol (na pr. glicerol, propilen glikol i tečni polietilen glikol) ili bilo koju odgovarajuću smešu. Odgovarajuća fluidnost može se održavati na primer, upotrebom premaza kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzije i upotrebom površinski aktivnih supstanci u skladu sa hemijom formulacije dobro poznatom u stanju tehnike . U određenim realizacijama, izotonični agensi, na pr. šećeri, polialkoholi kao manitol, sorbitol ili natrijum hlorid mogu biti poželjni u kompoziciji. Produžena apsorpcija injektibilne kompozicije može se postići uključivanjem u sastav agensa koji odlaže apsorpciju na primer, soli monostearata i želatin.
[0191] Rastvori ili suspenzije koji se koriste za intradermalnu ili subkutanu primenu obično uključuju jedan ili više od sledećih: sterilni razblaživač kao što je voda za injekcije, fiziološki rastvor, teška ulja, polietilen glikoli, glicerin, propilen glikol ili drugi sintetički rastvarači; antibakterijska sredstva kao što je benzil alkohol ili metil parabeni; antioksidanti kao što je askorbinska kiselina ili natrijum bisulfit; helatna sredstva kao što je etilendiamintetrasirćetna kiselina; puferi kao što su acetati, citrati ili fosfati; i sredstva za podešavanje toničnosti kao što su natrijum hlorid ili dekstroza. pH se može podesiti kiselinama ili bazama, kao što je hlorovodonična kiselina ili natrijum hidroksid, ili puferima sa citratom, fosfatom, acetatom i slično. Takvi preparati mogu biti zatvoreni u ampule, špriceve za jednokratnu upotrebu ili bočice sa više doza od stakla ili plastike.
[0192] Sterilni rastvori za injektiranje mogu se pripremiti inkorporacijom proteina iz pronalaska u potrebnoj količini u odgovarajućem rastvaraču sa jednim ili kombinacijom gore opisanih sastojaka, prema potrebi, nakon čega sledi sterilizaciona mikrofiltracija. Disperzije se mogu pripremiti inkorporacijom aktivnog jedinjenja u sterilni sud koji sadrži medijum za disperziju i druge sastojke, kao što su gore opisani. U slučaju sterilnih prahova za pripremu sterilnih rastvora za injektiranje, metode pripreme su sušenje pod vakuumom i zamrzavanje (liofilizacija) koje daju prah aktivnog sastojka pored bilo kog dodatnog željenog sastojka iz njihovog sterilno filtriranog rastvora.
[0193] Kada se terapeutski efektivna količina proteina iz pronalaska dizajnira za primenu, na pr. intravenskom, subkutanom ili potkožnom injekcijom, vezivno sredstvo će biti u obliku parenteralno prihvatljivog vodenog rastvora bez pirogena. Postupci za pripremu parenteralno prihvaćenih rastvora proteina, uzimajući u obzir odgovarajući pH, izotoničnost, stabilnost i slično, su u okviru veštine iz stanja tehnike. Poželjna farmaceutska kompozicija za intravensku, kutanu ili subkutanu injekciju sadrži, pored sredstava za vezivanje, izotonični nosač kao što je injekcija natrijum hlorida, injekcija Ringer rastvora, injekcija dekstroze, injekcija smeše dekstroze i natrijum hlorida, injekcija Ringer rastvora sa laktatom ili drugo sredstvo kako je poznato u stanju tehnike. Farmaceutska kompozicija iz ovog pronalaska može takođe sadržati stabilizatore, konzervanse, pufere, antioksidante ili druge additive koji su dobro poznati stručnjacima u stanju tehnike.
[0194] Kao što je ovde opisano, protein iz ovog pronalaska ili njegova kompozicija (na pr. farmaceutska ili dijagnostička kompoziciji) može se pripremiti sa nosačima koji će zaštititi kompoziciju od brzog oslobađanja, kao što je formulacija sa kontrolisanim otpuštanjem, uključujući implante, transdermalne flastere i mikroinkapsulirane sisteme za isporuku. Mogu se koristiti biorazgradivi, biokompatibilni polimeri, kao što je etilen vinil acetat, polianhidridi, poliglikolna kiselina, kolagen, poliortoestar i polilaktična kiselina. Mnoge metode za pripremu takvih formulacija su patentirane ili opšte poznate stručnjacima u stanju tehnike (videti na pr. Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems (Robinson J, ed., Marcel Dekker, Inc., NY, U.S., 1978)).
[0195] U određenim realizacijama, kompozicija iz ovog pronalaska (na pr. farmaceutska ili dijagnostička kompozicija) može biti formulisana kako bi se osigurala željena distribucija in vivo. Na primer, krvno-moždana barijera isključuje bilo koja velika i/ili hidrofilna jedinjenja. Da bi se terapeutski protein ili kompozicije iz pronalaska usmerio na određenu in vivo lokaciju, on se može formulisati, na primer, u lipozomima koji mogu da obuhvate jedan ili više delova koji se selektivno transportuju u određene ćelije ili organe, čime se poboljšava isporuka ciljanog leka. Primerni ciljani delovi uključuju folat ili biotin; manozide; antitela; receptor za surfaktant protein A; p120 katenin i slično.
[0196] Farmaceutske kompozicije uključuju parenteralne formulacije dizajnirane za upotrebu kao implanti ili sistem čestica. Primeri implanta su depo formulacije sastavljene od polimernih ili hidrofobnih komponenata kao što su emulzije, jonoizmenjivačke smole i rastvorljivi rastvori soli. Primeri sistem čestica su dendrimeri, lipozomi, mikrosfere, mikročestice, nanokapsule, nanočestice, nanoštapići, nanosfere, polimerne micele i nanocevi (videti na pr. Honda M et al., Int J Nanomedicine 8: 495-503 (2013); Sharma A et al., Biomed Res Int 2013: 960821 (2013); Ramishetti S, Huang L, Ther Deliv 3: 1429-45 (2012)). Formulacije sa kontrolisanim oslobađanjem mogu se pripremiti pomoću polimera osetljivih na jone, kao što su, na pr. lipozomi, polaksamer 407 i hidroksiapatit. Formulacije čestica i polimera mogu sadržati agense za promenu propustljivosti citoplazmatske membrane, kao što su, na pr., različiti peptidi i proteini poput citolizina, agensa izvedenih iz toksina, agensa izvedenih iz virusa, sintetički biomimetički peptidi i hemijski agensi (videti na pr. Varkouhi A et al., J Control Release 151: 220-8 (2011); J Pirie C et al., Mol Cancer Ther 12: 1774-82 (2013)).
VII. Polinukleotidi. Ekspresioni vektori i ćelije domaćina
[0197] Pored proteina iz ovog pronalaska, polinukleotidi koji kodiraju takve proteine su u okviru obima ovog pronalaska. Izraz „polinukleotid“ je ekvivalentan izrazu „nukleinske kiseline“, koji uključuju polimere deoksiribonukleinskih kiselina (DNK), polimere ribonukleinskih kiselina (RNK), analoge ovih DNK ili RNK generisane korišćenjem nukleotidnih analoga, i njihove derivate, fragmente i homologe.
Polinukleotid iz pronalaska može biti jedno-, dvo- ili trolančani. Otkriveni polinukleotidi posebno su otkriveni da uključuju sve poli-nukleotide koji su sposobni da kodiraju primer proteina iz pronalaska, na primer, uzimajući u obzir kolebanje za koje se zna da se toleriše na trećem mestu na kodonu RNK, ali da kodira istu aminokiselinu kao različit RNK kodon (videti Stothard P, Biotechniques 28: 1102-4 (2000)).
[0198] U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje polinukleotide koji kodiraju protein iz pronalaska. Polinukleotidi mogu da uključuju, na pr., nukleinsko kiselinsku sekvencu koja kodira polipeptid koja je identična najmanje 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99 % ili više, polipeptidu koji obuhvata jednu od aminokiselinskih sekvenci iz proteina iz pronalaska. Pronalazak takođe uključuje polinukleotide koji obuhvataju nukleotidne sekvence koje se pod strogim uslovima hibridizuju sa polinukleotidom koji kodira protein iz pronalaska ili antisens ili komplement bilo kog takvog niza.
[0199] Derivati ili analogi polinukleotida (ili proteina) iz pronalasakea uključuju, između ostalog, molekule polinukleotida (ili polipeptida) koji imaju regione koji su u osnovi homologni polinukleotidima ili proteinima iz pronalaska, na pr. identitični za najmanje oko 45%, 50%, 70%, 80%, 95%, 98%, ili čak 99% (sa poželjnom identičnošću od 80-99%) u odnosu na polinukleotidnu ili polipeptidnu sekvencu iste veličine ili kada se porede sa poravnatim nizom pri čemu poravnanje vrši program za računarsku homologiju poznat u stanju tehnike. Primerni program je GAP program (Wisconsin Sequence Analysis Package, Verzija 8 za UNIX, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison, WI, U.S.) koristeći podrazumevane postavke, koje koriste algoritam koji je dao Smith T, Waterman M, Adv. Appl. Math.2: 482-9 (1981). Takođe su uključeni polinukleotidi sposobni za hibridizaciju za komplement sekvence koja kodira proteine iz pronalaska pod strogim uslovima (videti na pr. Ausubel F et al., Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, New York, NY, U.S., 1993)), i ispod. Strogi uslovi su poznati stručnjacima u stanju tehnike i mogu se naći u Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, NY, U.S., Ch. Sec.6.3.1-6.3.6 (1989)).
[0200] Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje ekspresione vektore koji sadrže polinukleotide u okviru obima iz pronalaska. Polinukleotidi sposobni za kodiranje proteina iz pronalaska mogu se insertovati u poznate vektore, uključujući bakterijske plazmide, virusne vektore i vektore faga, koristeći materijal i metode dobro poznate u stanju tehnike za proizvodnju vektora ekspresije. Takvi vektori ekspresije će uključivati polinukleotide neophodne za podršku proizvodnji posmatranih proteina iz pronalaska unutar bilo koje ćelije domaćina po izboru ili ekspresijskih sistema bez ćelija (na pr. pTxb1 i pIVEX2.3 koji su opsiani u primerima koji slede). Specifični polinukleotidi koji obuhvataju ekspresione vektore za upotrebu sa određenim tipovima ćelija domaćina ili ekspresione sisteme bez ćelija koji su dobro poznati prosečnom stručnjaku u stanju tehnike, mogu se odrediti rutinskim eksperimentisanjem ili se mogu kupiti.
[0201] Izraz "ekspresioni vektor", kao što je ovde korišćen, odnosi se na polinukleotid, linearni ili kružni, koji obuhvata jednu ili više ekspresionih jedinica. Izraz "ekspresiona jedinica" se odnosi na polinukleotidni segment koji kodira polipeptid od interesa i koji je sposoban da obezbedi ekspresiju nukleinsko kiselinskog segmenta u ćeliji domaćinu. Ekspresiona jedinica obično uključuje promotor transkripcije, otvoreni okvir čitanja koji kodira polipeptid od interesa i terminator transkripcije, sve u operativnoj konfiguraciji. Ekspresioni vektor sadrži jednu ili više ekspresionih jedinica. Prema tome, u kontekstu ovog pronalaska, ekspresioni vektor koji kodira protein iz pronalaska koji obuhvata jedan polipeptidni lanac (na pr. scFv genetski rekombinovan sa jednim efektorskim regionom Šiga toksina) uključuje barem jednu ekspresionu jedinicu za jedan polipeptidni lanac, dok protein iz pronalaska koji obuhvata, na pr. dva ili više polipeptidns lanaca (na pr. jedan lanac koji obuhvata VLdomen i drugi lanac koji obuhvata VHdomen povezan sa efektorskim regionom toksina) uključuju najmanje dve ekspresione jedinice, po jednu za svaki od dva polipeptidna lanca iz proteina. Za ekspresiju višelančanih proteina iz pronalaska, ekspresiona jedinica za svaki polipeptidni lanac takođe može biti odvojeno sadržana na različitim ekspresionim vektorima (na pr. ekspresija se može postići sa jednom ćelijom domaćina u kojoj eksprimirajući vektori za svaki polipeptidni lanac mogu biti uvedeni).
[0202] Ekspresioni vektori sposobni da usmeravaju prelaznu ili stabilnu ekspresiju polipeptida i proteina dobro su poznati u stanju tehnike. Ekspresioni vektori generalno uključuju, ali nisu ograničeni na jedan ili više od sledećeg: heterologna signalna sekvenca ili peptid, poreklo replikacije, jedan ili više markerskih gena, pojačavajući element, promotor i sekvencu završetka transkripcije, od kojih je svaki dobro poznat u stanju tehnike. Opcionalne regulatorne sekvence kontrole, sekvence integracije i korisni markeri koji se mogu koristiti su poznati u stanju tehnike.
[0203] Izraz "ćelija domaćin" odnosi se na ćeliju koja može podržati replikaciju ili ekspresiju ekspresionog vektora. ûelije domaćini mogu biti prokariontske ćelije, kao što su ćelije E. coli ili eukariotske ćelije (na pr. ćelije kvasca, insekata, vodozemaca, ptica ili sisara). Stvaranje i izolovanje ćelijskih linija domaćina koje obuhvataju polinukleotid iz pronalaska ili su sposobne za proizvodnju proteina iz pronalaska može se postići korišćenjem standardnih tehnika poznatih u stanju tehnike.
[0204] Proteini u okviru obima iz ovog pronalaska mogu biti varijante ili derivati za proteine opisani ovde, u okviru obima patentnih zahteva, koji su proizvedeni modifikovanjem polinukleotida koji kodira otkriveni protein iz pronalaska promenom jedne ili više aminokiselina ili delecijom ili insercijom jedne ili više aminokiselina koja je može učiniti pogodnijom za postizanje željenih svojstava, kao što je optimalnija ekspresija od strane ćelije domaćina.
VIII. Uređaji za isporuku i kompleti
[0205] U određenim realizacijama, otkriće se odnosi na uređaj koji obuhvata jednu ili više kompozicija materije iz pronalaska, kao što je farmaceutska kompozicija, za dopremanje do subjekta. Prema tome, uređaj za isporuku koji obuhvata jedno ili više jedinjenja iz pronalaska može se koristiti za primenu kompozicije od značaja iz pronalaska kod pacijenta, različitim načinima isporuke, uključujući: intravensku, subkutanu, intramuskularnu ili intraperitonealnu injekciju; oralnu administraciju; transdermalna primena; plućna ili transmukozna primena; administracija pomoću implanta, osmotske pumpe, kertridž ili mikro pumpe; ili na drugi način prepoznat od strane osobe koja je vešta u stanju tehnike.
[0206] Takođe u okviru obima iz otkrića su kitovi koji obuhvataju najmanje jednu kompoziciju materije iz pronalaska, i opciono, ambalažu i uputstvo za upotrebu. Kitovi mogu biti korisni za primenu lekova i/ili dijagnostičko sakupljanje informacija. Kit iz otkrića može da sadrži najmanje jedan dodatni reagens (na pr., standardi, markeri i slično). Kitovi obično uključuju nalepnicu koja označava namenu upotrebe sadržaja kita. Kit može dalje da obuhvata reagense i druge alate za detekciju tipa ćelije (na pr.
tumorske ćelije) u uzorku ili u subjektu, ili za dijagnozu da li pacijent pripada grupi koja daje odgovore terapijskoj strategiji koja koristi jedinjenje, kompoziciju ili srodni metod iz pronalaska kako je ovde opisano.
IX. Metode za korišćenje proteina iz pronalaska ili njihova kompozicija
[0207] Generalno, ovo je jedan cilj iz pronalaska kako bi se obezbedili farmakološki aktivni agensi, kao i kompozicije koje obuhvataju iste, koje se mogu koristiti u prevenciji i/ili lečenju bolesti, poremećaja i stanja, kao što su određeni karcinomi, tumori, imunološki poremećaji, mikrobne infekcije, ili dalje, ovde navedena patološka stanja. Shodno tome, predmetni pronalazak obezbeđuje metode upotrebe proteina i farmaceutske kompozicije iz pronalaska za ciljano ubijanje ćelija, kako je definisano u patentnim zahtevima. Otkriće takođe obezbeđuje metode za isporuku dodatnih egzogenih materijala u ciljane ćelije, za obeležavanje unutrašnjosti ciljanih ćelija, za prikupljanje dijagnostičkih informacija i za lečenje bolesti, poremećaja i stanja kako je ovde opisano.
[0208] Naročito je cilj pronalaska da obezbedi takva farmakološki aktivne agense, smeše i/ili pmetode koji imaju određene prednosti u odnosu na agense, smeše i/ili metode koji su trenutno poznati u tehnici. Shodno tome, ovaj pronalazak obezbeđuje metode upotrebe proteina prema pronalasku koji se karakterišu određenom polipeptidnom sekvencom i njihovim farmaceutskim kompozicijama, kako je definisano u zahtevima. Na primer, bilo koja polipeptidna sekvenca u SEKV ID BR: 1-31 može se specifično koristiti kao proteinska komponenta koja se koristi u narednim metodama.
[0209] Predmetni pronalazak obezbeđuje in vitro metode za ubijanje ćelija koje obuhvataju korak omogućavanja kontakta ćelije in vitro sa proteinom ili farmaceutskom kompozicijom iz ovog pronalaska, kako je definisano u patentnim zahtevima. Proteini i farmaceutske kompozicije iz pronalaska mogu biti korišćene za ubijanje specifičnog ćelijskog tipa nakon kontakta ćelije ili ćelija sa jednom od kompozicija materije iz patentnih zahteva. U određenim realizacijama, a protein ili farmaceutska kompozicija iz ovog pronalaska mogu biti korišćene za ubijanje specifičnog ćelijskog tipa u smeši različitih ćelijskih tipova, kao što su smeše koje obuhvataju ćelije karcinoma, inficirane ćelije, i/ili hematološke ćelije. U određenim realizacijama, protein ili farmaceutska kompozicija iz ovog pronalaska mogu biti korišćeni da ubiju ćelije kancera u smeši različitih ćelijskih tipova. U određenim realizacijama, protein ili farmaceutska kompozicija iz ovog pronalaska mogu biti korišćeni za ubijanje specifičnih ćelijskih tipova u smeši različitih ćelijskih tipova, kao što su tkiva pre transplantacije. U određenim realizacijama, protein ili farmaceutska kompozicija iz ovog pronalaska mogu biti korišćeni za ubijanje specifičnih ćelijske tipova u smeši ćelijskih tipova, kao što je pre-administracioni tkivni materijal za primene u terapeutske svrhe. U određenim realizacijama, protein ili farmaceutska kompozicija iz ovog pronalaska mogu biti korišćeni za selektivno ubijanje ćelija koje su inficirane virusima ili mikroorganizmima, ili na drugi način selektivno ubijanje ćelija koje eksprimiraju za određeni vanćelijski ciljani biomolekul, kao što je ćelijski površinski biomolekul. Proteini i farmaceutske smeše iz pronalaska imaju različitu primenu, uključujući, na pr., korišćenje u iscrpljivanju neželjenih ćelijskih tipova iz tkiva bilo in vitro ili in vivo, korišćenje u moduliranju imunoloških odgovora za lečenje bolesti transplantata protiv domaćina, korišćenje kao antivirusnog agensa, korišćenje kao antiparazitskog agensa i korišćenje u čišćenju transplantacionih tkiva od neželjenih ćelijskih tipova.
[0210] U određenim realizacijama, protein ili farmaceutska kompozicija iz ovog pronalaska, sama ili u kombinaciji sa drugim jedinjenjima ili farmaceutskim kompozicijama, može pokazati jaku aktivnost ubijanja ćelija kada se primenjuje kod populacije ćelija, in vitro ili in vivo kod subjekta kao što je kod pacijenta kome je potrebno lečenje. Ciljanjem isporuke enzimski aktivnih regiona Šiga toksina koristeći vezne regione imunoglobulinskog tipa sa visokim afinitetom na tipove ćelija karcinoma, ova potentna aktivnost ubijanja ćelija može se ograničiti na specifično i selektivno ubijanje određenih tipova ćelija unutar organizma, kao što su određene ćelije karcinoma, neoplastične ćelije, maligne ćelije, nemaligne tumorske ćelije ili inficirane ćelije.
[0211] Predmetno otkriće obezbeđuje metod za ubijanje ćelija kod pacijenta, metod koji obuhvata korak primene kod pacijenta kome je potrebno, najmanje jednog proteina iz ovog pronalaska ili farmaceutske kompozicije koja ga sadrži.
[0212] Pojedina rešenja za proteine iz pronalaske ili njihove farmaceutske kompozicije mogu biti korišćene za ubijanje ćelija karcinoma i/ili tumorske ćelije kod pacijenta, ciljanjem vanćelijskih biomolekula pronađenih fizički uparenih sa ćelijom kancera i/ili ćelijom tumora. Izrazi „ćelija karcinoma“ ili „kancerozna ćelija“ odnosi se na različite neoplastične ćelije koje rastu i dele se na nenormalno ubrzan način što će biti jasno stručnoj osobi. Izraz "tumorske ćelije" uključuju i maligne i nemaligne ćelije (na pr. nekancerogene, benigne tumorske ćelije, nekancerogene matične ćelije "karcinoma", matične ćelije tumora, ćelije koje iniciraju maligni tumor ili tumorigenske ćelije koje sve mogu da proizvedu ćerke ćelije koje postaju ćelije malignog tumora i/ili ćelije karcinoma, ali nisu u stanju da same metastaziraju (videti na pr. Martinez-Climent J et al., Haematologica 95: 293-302 (2010)). Generalno, kanceri i/ili tumori mogu se definisati kao bolesti, poremećaji ili stanja koja podležu lečenju i/ili prevenciji.
Karcinomi i tumori (bilo maligni ili nemaligni) koji obuhvataju ćelije karcinoma i/ili ćelije tumora koji mogu imati koristi od metoda i kompozicija iz pronalaska biće jasni stručnoj osobi. Neoplastične ćelije su često povezane sa jednim ili više od sledećeg: neregulisani rast, nedostatak diferencijacije, lokalna invazija tkiva, angiogeneza i metastaze.
[0213] Pojedina rešenja za proteine iz pronalaska ili njihove farmaceutske kompozicije mogu biti korišćene za ubijanje imune ćelije (bilo da je zdrava ili maligna) kod pacijenta uz pomoć ciljanja vanćelijskog biomolekula koji je nađen da je fizički uparen sa imunskom ćelijom.
[0214] Pojedina rešenja za proteine iz pronalaska ili njihove farmaceutske kompozicije mogu biti korišćene za ubijanje neke inficirane ćelije kod pacijenta uz pomoć ciljanja vanćelijskog biomolekula koji je nađen da je fizički uparen sa nekom inficiranom ćelijom.
[0215] U okviru obima predmetnog otkrića je upotreba proteina prema pronalasku ili njegove farmaceutske kompozicije u svrhe čišćenja populacija ćelija pacijenta (na pr. koštane srži) inficiranih malignih, neoplastičnih ili na drugi način neželjenih B-ćelija i/ili T- ćelija, a zatim reinfuzijom iscrpljenog materijala B-ćelija i/ili T-ćelija kod pacijenta (videti na pr. van Heeckeren W et al., Br J Haematol 132: 42-55 (2006); Alpdogan O, van den Brink M, Semin Oncol 39: 629-42 (2012)).
[0216] U okviru ovog pronalaska je korišćenje proteina prema pronalasku ili njegove farmaceutske kompozicije u svrhe ex vivo iscrpljivanja B-ćelija i/ili T ćelija iz izolovanih ćelijskih populacija uklonjenih sa pacijenta. U jednom neograničavajućem primeru, protein iz otkrića može se koristiti u postupku za profilaksu odbacivanja transplantiranog organa i/ili tkiva, gde je donatorski organ ili tkivo perfusovano pre transplantacije sa citotoksičnim proteinom prema pronalasku ili farmaceutskom kompozicijom koja ga sadrži kako bi se Rčistio organ od neželjenih donatorskih B-ćelija i/ili T-ćelija (videti na pr. Alpdogan O, van den Brink M, Semin Oncol 39: 629-42 (2012)).
[0217] Takođe je u okviru obima iz predmetnog otkrića upotreba proteina prema pronalasku ili njegove farmaceutske kompozicije u svrhe iscrpljivanja B-ćelija i/ili T-ćelija iz populacije donatorskih ćelija kao profilaksa protiv bolesti graft-protiv-domaćina i indukovanje tolerancije, kod pacijenta na transplantaciji koštane srži i/ili matičnih ćelija.
[0218] Pojedina rešenja iz proteina iz pronalaska ili njihove farmaceutske kompozicije mogu biti korišćene za ubijanje neke inficirane ćelije kod pacijenta uz pomoć ciljanja vanćelijskog biomolekula koji je nađen da je fizički uparen sa nekom inficiranom ćelijom.
[0219] Pojedina rešenja iz proteina iz pronalaska ili njihove farmaceutske kompozicije mogu biti korišćene za ubijanje ćelije(a) višećelijskog parazita. U određenim daljim rešenjima, ubijanje ćelije se događa dok je višećelijski parazit prisutan u organizmu domaćina ili subjektu. U određenim daljim rešenjima, protein iz pronalaska može se koristiti za ubijanje helminata, kao što je na pr. platelmint, nematelmint, cestoda, mongenean, nematoda i/ili trematoda.
[0220] Pored toga, predmetni pronalazak se obezbeđuje za lečenje bolesti, poremećaja ili stanja kod pacijenta upotrebom terapeutskih efektivne količine najmanje jednog proteina iz ovog pronalaska ili farmaceutske kompozicije koja ga sadrži kao što je opisano u zahtevima. Zamišljene bolesti, poremećaji i stanja koja se mogu lečiti uključuju karcinome, maligne tumore, nemaligne tumore, imunološke poremećaje i mikrobne infekcije. Primena "terapeutski efektivne doze" jedinjenja iz pronalaska može rezultirati smanjenjem ozbiljnosti simptoma bolesti, povećanjem učestalosti i trajanja perioda bez simptoma bolesti, ili sprečavanjem oštećenja ili invaliditeta usled nezgode od bolesti.
[0221] Terapeutski efektivna količina jedinjenja iz ovog pronalaska zavisiće od puta administracije, tipa sisara koji se leči i fizičkih karakteristika konkretnog pacijenta o kome se govori. Ovi faktori i njihov odnos prema određivanju ove količine dobro su poznati stručnim osobama koje se bave praktičnim medicinskim tehnikama. Ova količina i način primene mogu se prilagoditi postizanju optimalne efikasnosti i mogu zavisiti od faktora kao što su težina, dijeta, istovremenog uzimanja lekova i drugih faktora koji su dobro poznati stručnim osobama koje se bave medicinskim tehnikama. Veličine doziranja i režim doziranja koji su najprikladniji za humanu upotrebu mogu se rukovoditi rezultatima dobijenim predmetnim pronalaskom i mogu se potvrditi u pravilno dizajniranim kliničkim ispitivanjima. Efektivni protokol doziranja i lečenja može se odrediti konvencionalnim sredstvima, uspostavljanjem tehnike sa niskom dozom kod laboratorijskih životinja, a zatim povećanjem doze uz praćenje efekata i sistematskim promenom režima doziranja. Brojni faktori mogu uzeti u obzir od strane kliničara pri određivanju optimalne doze za datog subjekta. Takva razmatranja su poznata stručnoj osobi.
[0222] Prihvatljivi način primene može se odnositi na bilo koji put administracije poznat u stanju tehnike, uključujući, ali ne ograničavajući se na aerosol, enteralnu, nazalnu, oftalmološku, oralnu, parenteralnu, rektalnu, vaginalnu ili transdermalnu primenu (na pr. topikalna administracija kreme, gela ili masti, ili pomoću transdermalnog flastera).
„Parenteralna primena“ se obično povezuje sa injekcijom na ili u komunikaciji sa predviđenim mestom delovanja, uključujući intratumoralnu injekciju, infraorbitalnu, infuziju, intraarterijalnu, intrakapsularnu, intrakardijalnu, intradermalnu, intramuskularnu, intraperitonealnu, intrapulmonalnu, intraspinalnu, intrasternalnu, intratekalnu, intrauterinu, intravensku, subarahnoidnu, subkapsularnu, subkutanu, transmukoznu ili transtrahealnu primenu.
[0223] Za administraciju farmaceutske kompozicije iz pronalaska, opseg doziranja će obično biti od oko 0,0001 do 100 miligrama po kilogramu (mg/kg) i češće 0,01 do 5 mg/kg, telesne težine domaćina. Primeri doza mogu biti 0,25 mg/kg telesne težine, 1 mg/kg telesne težine, 3 mg/kg telesne težine, 5 mg/kg telesne težine ili 10 mg/kg telesne težine ili u opsegu od 1-10 mg/kg. jedan primer režima lečenja je administracija jednom ili dva puta dnevno, ili administracija jednom ili dva puta nedjeljno, jednom u dve nedelje, jednom u tri nedelje, jednom u četiri nedelje, jednom mesečno, jednom u dva ili tri meseca ili jednom u svaka tri do 6 meseci. Stručan radnik u zdravstvu može odabrati i prilagoditi doze prema potrebi kako bi se maksimizovala terapijska korist za određenog pacijenta.
[0224] Farmaceutske kompozicije iz pronalaska obično se daju istom pacijentu u više navrata. Intervali između pojedinačnih doza mogu biti, početno, 2-5 dana, nedeljno, mesečno, svaka dva ili tri meseca, svakih šest meseci ili godišnje. Intervali između primena takođe mogu biti neredovni, na osnovu regulisanja nivoa krvi ili drugih markera kod subjekta ili pacijenta. Režimi doziranja za jedinjenje iz pronalaska uključuju intravensko davanje od 1 mg/kg telesne težine ili 3 mg/kg telesne težine sa jedinjenjem koje se daje svake dve do četiri nedelje u šest doza, zatim svaka tri meseca po 3 mg/kg telesne težine ili 1 mg/kg telesne težine.
[0225] Farmaceutska kompozicija iz ovog pronalaska može se primenjivati na jedan ili više načina davanja, koristeći jedan ili više različitih postupaka poznatih u stanju tehnike. Kao što će proceniti kvalifikovani radnik, ruta i/ili način primene variraće u zavisnosti od željenih rezultata. Načini davanja proteina iz ovog pronalaska ili njihovih kompozicija uključuju, na pr. intravenski, intramuskularni, intradermalni, intraperitonealni, subkutani, spinalni ili drugi parenteralni načini primene, na primer injekcijom ili infuzijom na ili u komunikaciji sa predviđenim mestom delovanja (na pr. intratumoralna injekcija). U drugim realizacijama, protein ili farmaceutska kompozicija iz pronalaska može se primenjivati neparenteralno, kao što je topikalni, epidermalni ili mukozni način primene, na primer, intranazalno, oralno, vaginalno, rektalno, sublingvalno ili topikalno.
[0226] Proteini ili farmaceutske kompozicije iz pronalaska mogu biti primenjeni sa jednim ili više različitih medicinskih uređaja poznatih u stanju tehnike. Na primer, u jednoj realizaciji, farmaceutska kompozicija iz pronalaska može se primenjivati pomoću uređaja za hipodermijsku injekciju bez igle. Primeri dobro poznatih implanta i modula korisnih u predmetnom pronalasku su u stanju tehnike, uključujući na pr., implantabilne mikro-infuzione pumpe za isporuku sa kontrolisanom brzinom; uređaji za primenu kroz kožu; infuzione pumpe za dopremanje sa preciznom brzinom infuzije; implatabilni uređaji za infuziju varijabilnog protoka za kontinuiranu isporuku lekova; i osmotski sistemi za isporuku lekova. Ovi i drugi takvi implanti, sistemi za isporuku i moduli poznati su stručnim osobama u stanju tehnike.
[0227]. Protein ili farmaceutska kompozicija iz ovog pronalaska mogu se davati sami ili u kombinaciji sa jednim ili više drugih terapeutskih ili dijagnostičkih agenasa.
Kombinovana terapija može da uključuje protein iz pronalaska ili njegovu farmaceutsku kompoziciju u kombinaciji sa najmanje jednim drugim terapeutskim agensom odabranim na osnovu određenog pacijenta, bolesti ili stanja koje se može lečiti. Primeri drugih takvih agenasa uključuju, između ostalog, citotoksično, antikancerogeno ili hemoterapeutsko sredstvo, antiinflamatorno ili anti-proliferativno sredstvo, antimikrobni ili antivirusni agens, faktor rasta, citokine, analgetik, terapeutski aktivan mali molekul ili polipeptid, jednolančano antitelo, klasično antitelo ili njegov fragment ili molekul nukleinske kiseline koji modulira jedan ili više signalnih puteva i slični modulirajući terapeutici koji mogu dopuniti ili na drugi način biti korisni u terapijskom ili profilaktičkom režimu lečenja.
[0228] Lečenje pacijenta proteinom ili farmaceutskom kompozicijom iz pronalaska poželjno dovodi do ćelijske smrti ciljanih ćelija i/ili inhibicije rasta ciljanih ćelija. Kao takvi, proteini iz pronalaska i farmaceutske kompozicije koje ih sadrže biće korisni u metodama za lečenje različitih patoloških poremećaja u kojima ubijanje ili iscrpljivanje ciljanih ćelija može biti korisno, kao što su, između ostalog, karcinomi, tumori, imuni poremećaji i mikrobne infekcije. Predmetno otkriće pruža metode za suzbijanje proliferacije ćelija i za lečenje poremećaja ćelija, uključujući neoplaziju, preaktivne B-ćelije i preaktivne T-ćelije.
[0229] U određenim realizacijama, proteini i farmaceutske kompozicije iz pronalaska mogu se koristiti za lečenje ili prevenciju karcinoma, tumora (malignih i nemalignih), imunoloških poremećaja i mikrobnih infekcija. U daljem aspektu, gornja ex vivo metoda može se kombinovati sa gore navedenom in vivo metodom, kako bi se obezbedile metode lečenja ili sprečavanja odbacivanja kod primalaca transplantata koštane srži, i za postizanje imunološke tolerancije.
[0230] U određenim realizacijama, predmetni pronalazak obezbeđuje lečenje malignih tumora ili neoplazmi i drugih karcinoma povezanih sa krvnim ćelijama kod sisara kao što su humane, upotrebom terapeutski efektivne količine proteina ili farmaceutskom kompozicijom iz pronalaska kako je definisano u patentnim zahtevima.
[0231] Proteini i farmaceutske kompozicije iz pronalaska imaju različite primene, uključujući, na pr., upotrebu u uklanjanju neželjenih B-ćelija i/ili T-ćelija, upotrebu u moduliranju imunoloških odgovora za lečenje bolesti transplantata protiv domaćina, upotrebu kao antivirusnih agenasa, upotrebu kao antimikrobnih agenasa i koristi se u prečišćavanju tkiva za presađivanje od neželjenih ćelijskih tipova. Proteini i farmaceutske kompozicije iz ovog pronalaska su najčešće antineoplastični agensi - što znači da su sposobni za lečenje i/ili sprečavanja razvoja, sazrevanja ili širenja neoplastičnih ili malignih ćelija inhibiranjem rasta i/ili uzrokujući smrt ćelija karcinoma ili tumora.
[0232] U određenim realizacijama, protein ili farmaceutska kompozicija iz ovog pronalaska koristi se za lečenje amiloidoze, ankilozirajućeg spondilitisa, astme, Kronove bolesti, dijabetesa, odbacivanja grafta, bolesti transplantata protiv domaćina, Hašimotoovog tiroiditisa, hemolitičkog uremijskog sindroma, HIV-srodnih bolesti, eritematoznog lupusa, multiple skleroze, poliartritis nodoze, poliartritisa, psorijaze, psorijatičnog artritisa, reumatoidnog artritisa, skleroderme, septičkog šoka, Sjogrenovog sindroma, ulceroznog kolitisa i vaskulitisa.
[0233] U drugom aspektu, određena rešenja za proteine i farmaceutske smeše iz ovog pronalaska su antimikrobni agensi - što znači da su sposobni za lečenje i/ili sprečavanje sticanja, razvoja ili posledica mikrobioloških patogenih infekcija, kao što su virusi, bakterije, gljivice, prioni ili protozoe.
[0234] U okviru obima predmetnog otkrića je da se obezbedi profilaksa ili lečenje bolesti ili stanja posredovanih B-ćelijama i/ili T-ćelijama, profilaksu ili lečenje koje uključuje primenu proteina ili pronalaska, ili farmaceutske kompozicije koja ih sadrži, kod pacijenta kome je potrebno u svrhu ubijanja B-ćelija i/ili T-ćelija kod pacijenta. Ova upotreba je kompatibilna sa pripremom ili kondicioniranjem pacijenta za transplantaciju koštane srži, transplantaciju matičnih ćelija, transplantaciju tkiva ili transplantaciju organa, bez obzira na izvor transplantiranog materijala, na pr. ljudski ili neljudski izvori.
[0235] U okviru obima predmetnog otkrića je da se obezbedi primaoc koštane srži za profilaksu ili za lečenje bolesti domaćina protiv bolesti grafta putem ciljanog ubijanja ćelija domaćina B-ćelija, NK ćelija i/ili T-ćelija korišćenjem proteina ili farmaceutske kompozicije iz ovog pronalaska (videti na pr. Sarantopoulos S et al., Biol Blood Marrow Transplant 21: 16-23 (2015)).
[0236] Proteini i farmaceutske kompozicije iz ovog pronalaska mogu biti upotrebljena za lečenje karcinoma, što uključuje davanje pacijentu kome je to potrebno terapeutski efektivne količine proteina ili farmaceutske kompozicije iz ovog pronalaska kako je definisano u zahtevima. U određenim realizacijama metode iz ovog pronalaska, karcinom koji se leči izabran je iz grupe koju čine: rak kostiju (kao što je multipli mijelom ili Evingov sarkom), rak dojke, rak centralnog/perifernog nervnog sistema (kao što su rak mozga, neurofibromatoza ili glioblastom), rak gastrointestinalnog trakta (kao što je rak želuca ili debelog creva), rak polnih ćelija (kao što je rak jajnika i rak testisa), rak žlezde (kao što je rak pankreasa, rak paratireoidne žlezde, feohromocitom, rak pljuvačne žlezde ili rak štitaste žlezde), rak glave i vrata (kao što je rak nazofarinksa, rak usne šupljine ili rak faringsa), hematološki karcinomi (poput leukemije, limfom ili mijelom), rak bubrega i urinarnog trakta (kao što su rak bubrega i bešike), rak jetre, rak pluća/pleure (kao što je mezoteliom, karcinom malih ćelija pluća ili karcinom nemalih ćelija pluća), rak prostate, sarkom (kao što su angiosarkom, fibrosarkom, Kaposijev sarkom ili sinovijalni sarkom), rak kože (poput karcinoma bazalnih ćelija, karcinoma skvamoznih ćelija ili melanoma) i rak materice.
[0237] Proteini i farmaceutske kompozicije iz ovog pronalaska mogu biti upotrebljeni za lečenje imunološkog poremećaja, uključujući primenu kod pacijenta kome je to potrebno, terapeutski efektivne količine proteina ili farmaceutske kompozicije iz ovog pronalaska kako je definisano u patentnim zahtevima. U određenim realizacijama iz ovog pronalaska, imunološki poremećaj se odnosi na inflamaciju koja je povezana sa bolešću odabranom iz grupe koju čine: amiloidoza, ankilozirajući spondilitis, astma, Kronova bolest, dijabetes, odbacivanje grafta, bolest transplantata protiv domaćina, Hašimotov tireoiditis, hemolitički uremički sindrom, HIV-srodna bolest, eritematozni lupus, multipla skleroza, poliartritis nodoza, poliartritis, psorijaza, psorijatični artritis, reumatoidni artritis, skleroderma, septički šok, Sjogrenov sindrom, ulcerozni kolitis i vaskulitis.
[0238] Među pojedinim rešenjima iz ovog pronalaska je upotreba proteina prema pronalasku kao komponente farmaceutske kompozicije ili leka za lečenje ili prevenciju raka, tumora, imunološkog poremećaja i/ili mikrobne infekcije, kako je definisano u patentnim zahtevima. Na primer, imuni poremećaji koji se pojavljuju na koži pacijenta mogu se lečiti takvim lekom u nastojanju da smanje upale. U drugom primeru, tumori kože mogu se lečiti takvim lekom u nastojanju da se smanji veličina tumora ili tumor u potpunosti eliminiše.
[0239] Proteini iz pronalaska mogu se koristiti u aplikacijama molekularne neurohirurgije kao što su lezija imunološkog sistema i trejsiranje neurona (videti, Wiley R, Lappi D, Adv Drug Deliv Rev 55: 1043-54 (2003), za pregled). Na primer, ciljni domen može biti izabran ili izveden iz različitih liganada, kao što su neurotransmiteri i neuropeptidi, koji ciljaju specifične tipove neuronskih ćelija uz pomoć vezivanja neuronskih površinskih receptora, kao što je receptor za neuronsko kolo specifično povezan sa G-proteinom. Slično tome, ciljni domen može biti izabran od ili izveden iz antitela koja vezuju površinske receptore neurona. Budući da Šiga toksini robusno usmeravaju sopstveni retrogradni aksonski transport, određeni citotoksični proteini iz pronalaska mogu se koristiti za ubijanje neurona koji eksprimiraju vanćelijski target na mestu ubrizgavanja citotoksičnih proteina koje je udaljeno od tela ćelija (videti Llewellyn-Smith I et al., J Neurosci Metode 103: 83-90 (2000)). Ovaj neuronski ćelijski tip koji specifično cilja citotoksične proteine se koriste u istraživanjima neuronauka, kao što je za razjašnjavanje mehanizama senzacija (videti na pr. Mishra S, Hoon M, Science 340: 968-71 (2013), i za stvaranje modelnih sistema neurodegenerativnih bolesti, kao što su Parkinsonova i Alchajmerova bolest (videti na pr. Hamlin A et al., PLoS One e53472 (2013)).
[0240] Među pojedinim rešenjima iz predmetnog otkrića je metod za korišćenje proteina, farmaceutske kompozicije i/ili dijagnostičke kompozicije iz pronalaska za detekciju prisustva ćelijskog tipa u svrhu prikupljanja informacija u vezi sa bolestima, stanjima i/ili poremećajima. Metod uključuje kontakt ćelije sa dijagnostički dovoljnom količinom proteina prema pronalasku da bi se protein detektovao testom ili dijagnostičkom tehnikom. Izraz "dijagnostički dovoljna količina" odnosi se na količinu koja obezbeđuje adekvatnu detekciju i tačno merenje za svrhu prikupljanja informacija određenim testom ili dijagnostičkom tehnikom koja se koristi. Generalno, dijagnostički dovoljna količina za celokupan organizam i za in vivo dijagnostičku upotrebu biće nekumulativna doza između 0,1 mg i 100 mg proteina koji promoviše detekciju, po kg subjekta i po subjektu. Tipično, količina proteina iz pronalaska koja se koristi u ovim metodama sakupljanja informacija biće što niža pod uslovom da je to još uvek dijagnostički dovoljna količina. U prvom slučaju, za in vivo detekciju u nekom organizmu, količina proteina iz pronalaska davana subjektu biće što je moguće niža.
[0241] Ciljanje specifično za ćelijski tip, proteinom iz pronalaska u kombinaciji sa agensima za promociju detekcije obezbeđuje način za detekciju i prikaz ćelija koje su fizički uparene sa vanćelijskim ciljanim biomolekulom veznog regiona za proteine iz pronalaska. Snimanje ćelija pomoću proteina iz pronalaska može se izvoditi in vitro ili in vivo bilo kojom pogodnom tehnikom poznatom u stanju tehnike. Na primer, otkriće obezbeđuje metod za korišćenje proteina, farmaceutske kompozicije ili dijagnostičke kompozicije iz pronalaska za otkrivanje prisustva ćelijskog tipa u svrhu prikupljanja informacija, koji se može izvršiti na ćelijama in vivo unutar pacijenta, uključujući na ćelijama in situ. Na pr. u lokusu bolesti, na ćelijama in vitro i/ili u ex vivo okruženju na ćelijama i tkivima koji su uklonjeni iz nekog organizma, na pr. materijala za biopsiju.
[0242] Dijagnostičke informacije mogu se prikupiti pomoću različitih metoda poznatih u stanju tehnike, uključujući snimanje celog tela ili korišćenje ex vivo uzoraka uzetih iz nekog organizma. Izraz uzorak, koji se ovde koristi odnosi se na bilo koji broj stvari, ali ne ograničavajući se na tečnosti kao što su krv, urin, serum, limfa, pljuvačka, analni sekreti, vaginalni sekreti i sperma, i tkiva dobijena postupcima biopsije. Na primer, različiti agensi za promociju detekcije mogu biti upotrebljeni za neinvezivno in vivo snimanje tumora tehnikama kao što je magnetna rezonanca (MRI), optičkim metodama (kao što je direktno, fluorescentno i bioluminiscentno slikanje), pozitronskom emisionom tomografijom (PET), računarska tomografija sa pojedinačnim fotonom (SPECT), ultrazvuk, rendgenska računarska tomografija i kombinacije prethodno pomenutih (videti, Kaur S et al., Karcinom Lett 315: 97-111 (2012), za pregled).
[0243] Otkriće obezbeđuje metod za korišćenje proteina, farmaceutske kompozicije ili dijagnostičke kompozicije iz pronalaska za detekciju prisustva ciljanog ćelijskog biomolekula pozitivnog tipa ćelije u svrhu prikupljanja informacija koje se može izvršiti na ćelijama in vivo unutar pacijenta, na ćelijama in situ, na pr u lokusu bolesti, na ćelijama in vitro i/ili u ex vivo okruženju na ćelijama i tkivima uklonjenim iz organizma, na pr. materijal za biopsiju. Detekcija specifičnih ćelija, tipova ćelija i populacija ćelija upotrebom kompozicije prema pronalasku može se koristiti za dijagnostiku i snimanje ćelija, kao što su, na primer, ćelije tumora, raka, imunih i inficiranih ćelija. Na primer, proteini prema pronalasku i dijagnostičke kompozicije iz otkrića mogu se koristiti za slikanje ili vizualizaciju mesta mogućeg nakupljanja ćelija koje eksprimiraju ciljani biomolekul u organizmu. Ove metode se mogu koristiti za identifikaciju mesta razvoja tumora ili rezidualnih ćelija tumora nakon terapijske intervencije.
[0244] Pojedina rešenja za metode koja se koristi za detekciju prisustva ćelijskog tipa mogu se koristiti za prikupljanje informacija u vezi sa bolestima, poremećajima i stanjima, kao što su, na primer, rak kostiju (kao što je multipli mijelom ili Evingov sarkom), rak dojke, rak centralnog/perifernog nervnog sistema (kao što je rak mozga, neurofibromatoza ili glioblastom), rak gastrointestinalnog trakta (kao što je rak želuca ili kolorektalni karcinom), rak polnih ćelija (kao što su rak jajnika i rak testisa), rak žlezda (kao što je rak pankreasa, paratiroidni rak, feohromocitom, rak pljuvačne žlezde ili rak štitaste žlezde), rak glave i vrata (kao što je nazofaringealni rak, rak usne šupljine ili faringealni karcinom), hematološki rak (kao što je leukemija, limfom ili mijelom), rak bubrega i urinarnog trakta (kao što je karcinom bubrega i rak bešike), rak jetre, karcinom pluća/pleure (kao što je mezoteliom, plućni karcinom malih ćelija ili plućni karcinom nemalih ćelija), rak prostate, sarkom (kao što je angiosarkom, fibrosarkom, Kaposijev sarkom ili sinovijalni sarkom), karcinom kože (kao što je karcinom bazalnih ćelija, karcinom skvamoznih ćelija ili melanom), rak materice, AIDS, amiloidoza, ankilozirajući spondilitis, astma, autizam, kardiogeneza, Kronova bolest, dijabetes, eritematozus, gastritis, odbacivanje grafta, bolest transplantata protiv domaćina, Graveova bolest, Hašimotov tiroiditis, hemolitički uremični sindrom, HIV-srodne bolest, lupus eritematozus, limfoproliferativni poremećaji, multipla skleroza, mijastenija gravis neuroinflamacija, poliartritis nodoza, poliartritis, psorijaza, psorijatični artritis, reumatoidni artritis, skleroderma, septički šok, Sjogrenov sindrom, sistemski eritematozni lupus, ulcerozni kolitis, vaskulitis, proliferacija ćelija, inflamacija, aktivacija leukocita, adhezija leukocita, hemotaksa leukocita, sazrevanje leukocita, migracija leukocita, neuronska diferencijacija, akutna limfoblastna leukemija (ALL), T akutna limfocitna leukemija/limfom (ALL), akutna mijelogena leukemija, akutna mijeloidna leukemija (AML), hronična limfocitna leukemija B-ćelija (B-CLL), prolimfocitni limfom B-ćelija, Burkitov limfom (BL), hronična limfocitna leukemija (CLL), hronična mijelogena leukemija (CML-BP), hronična mijeloidna leukemija (CML), difuzni limfom velikih B ćelija, folikularni limfom, leukemija dlakavih ćelija (HCL), Hodžkinov limfom (HL), intravaskularni limfom velikih B-ćelija, limfomatoidna granulomatoza, limfoplazmocitni limfom, MALT limfom, limfom plaštnih ćelija, multipli mijelom (MM), leukemija prirodnih ćelija ubica, nodalni marginalni limfom Bćelija, Ne-Hodžkinov limfom (NHL), leukemija plazminih ćelija, plazmocitom, primarni izlivni limfom, prolimfocitna leukemija, promijelocitna leukemija, mali limfocitni limfom, limfom marginalne zone slezine, limfom T-ćelija (TCL), bolest teškog lanca, monoklonska gamopatija, bolest depozicije monoklonskog imunoglobulina, mijelodusplastični sindromi (MDS), tinjajući multipli mijelom i Valdenstromova makroglobulinemija.
[0245] Među određenim realizacijama iz predmetnog otkrića je metod za korišćenje proteina, farmaceutske kompozicije i/ili dijagnostičke kompozicije za obeležavanje ili detekciju unutrašnjosti neoplastičnih ćelija i/ili imunih ćelijskih tipova (videti na pr., Koyama Y et al., Clin Karcinom Res 13: 2936-45 (2007); Ogawa M et al., Karcinom Res 69: 1268-72 (2009); Yang L et al., Small 5: 235-43 (2009)). Na osnovu sposobnosti za proteine i farmaceutske kompozicije iz pronalaska da uđu u određene ćelijske tipove i da se kreću kroz ćelije retrogradnim unutarćelijskim transportom, unutrašnji delovi specifičnih ćelijskih tipova označene su za detekciju. Ovo se može izvršiti na ćelijama in situ unutar pacijenta ili na ćelijama i tkivima uklonjenim iz organizma, na pr. materijal za biopsiju.
[0246] Dijagnostičke kompozicije iz otkrića mogu se koristiti za karakterizaciju bolesti, poremećaja ili stanja kao potencijalno izlečivog uz pomoć pogodne farmaceutske kompozicije iz pronalaska. Određene kompozicije koje se tiču pronalaska mogu se koristiti da bi se utvrdilo da li pacijent pripada grupi koja daje odgovor na terapijsku strategiju koja koristi jedinjenje, kompoziciju ili srodnu metodu iz pronalaska kako je ovde opisano ili je dobro prilagođena za upotrebu uređaja za isporuku iz otkrića.
[0247] Dijagnostičke kompozicije iz otkrića mogu se koristiti nakon bolesti, na pr. karcinoma, detektuje se u cilju da bi se bolje okarakterisalo, kao što je nadgledanje udaljene metastaze, heterogenost i stadijum napredovanja karcinoma. Fenotipska procena poremećaja bolesti ili infekcije može pomoći u prognostičkom i predviđanju tokom terapijskog donošenja odluka. U ponovnom pojavljivanju bolesti, određene metode iz otkrića mogu se koristiti da bi se utvrdilo da li je lokalni ili sistemski problem.
[0248] Dijagnostičke kompozicije iz otkrića mogu se koristiti za procenu odgovora na terapijske lekove, bez obzira na vrstu terapeutika, na pr. lek sa malim molekulima, biološki lek ili terapija zasnovana na ćelijama. Na primer, pojedina dijagnostička rešenja iz otkrića mogu se koristiti za merenje promena veličine tumora, promena u populaciji ćelija pozitivnih na antigen, uključujući broj i raspodelu i/ili nadgledanje drugačijeg markera od antigena koji je ciljan uz pomoć terapije koja se već daje pacijentu (videti na pr. Smith-Jones P et al., Nat Biotechnol 22: 701-6 (2004); Evans M et al., Proc Natl Acad Sci USA 108: 9578-82 (2011)).
[0249] Predmetni pronalazak, kako je definisano u patentnim zahtevima, je dalje ilustrovan narednim neograničavajućim primerima za selektivno citotoksične proteine koji sadrže efektorski region Šiga toksina koji je izveden iz A podjedinica članova porodice Šiga toksina i za vezni region imunoglobulinskog tipa koji je sposoban da vezuje vanćelijske ciljane biomolekula koji su fizički povezani za specifične tipove ćelija.
PRIMERI
[0251] Sledeći primeri demonstriraju pojedina rešenja iz ovog pronalaska. Međutim, treba razumeti da su ovi primeri samo za ilustraciju i da nemaju nameru, niti bi trebalo da se tumače da su konstruisani, da budu potpuno definitivni u pogledu uslova i obima ovog pronalaska, koji je definisan u patentnim zahtevima. Primeri su izvedeni primenom standardnih tehnika, koje su dobro poznate i rutinske onima koji su vešti u stanju tehnike, osim tamo gde je drugačije detaljno opisano.
[0252] Sledeći primeri demonstriraju poboljšanu sposobnost citotoksičnih proteina iz primera za selektivno ubijanje ćelija koje su fizički uparene sa vanćelijskim ciljanim biomolekulom iz veznog regiona imunoglobulinskog tipa u poređenju sa njihovim proteinskim varijantama obrnute orijentacije. Citotoksični proteini iz primera, se vezuju za ciljane biomolekule koji su eksprimirani uz pomoć ciljanih ćelijskih tipova i ulaze u ciljane ćelije. Internalizovani citotoksični proteini efektivno usmeravaju njihove efektorske regiona Šiga toksina do citozola kako bi deaktivirali ribozome i potom prouzrokovali apoptotsku smrt ciljanih ćelija.
[0253] Jedan primer citotoksičnog proteina obuhvata fragment podjedinice A Šiga toksina koji je rekombinovan sa jednolančanim varijabilnim fragmentom veznog regiona koji je sposoban da vezuje CD38 sa visokim afinitetom. Ovaj primer citotoksičnog proteina je sposoban za selektivno ubijanje ćelija koje na svojoj površini eksprimiraju CD38. Drugi primer citotoksičnog proteina obuhvata fragment podjedinice A Šiga toksina koji je rekombinovan sa jednolančanim varijabilnim fragmentom veznog regiona koji je sposoban da vezuje HER2 sa visokim afinitetom. Ovaj drugi primer citotoksičnog proteina je sposoban za selektivno ubijanje ćelija koje eksprimiraju HER2 na svojoj površini. Treći primer citotoksičnog proteina obuhvata fragment podjedinice A Šiga toksina koji je rekombinovan sa jednolančanim varijabilnim fragmentom veznog regiona koji je sposoban da vezuje CD19 sa visokim afinitetom. Ovaj treći primer citotoksičnog proteina je sposoban za selektivno ubijanje ćelija koje eksprimiraju CD19 na svojoj površini. Četvrti primer citotoksičnog proteina obuhvata fragment podjedinice A Šiga toksina koji je rekombinovan sa jednolančanim varijabilnim fragmentom veznog regiona koji je sposoban da vezuje CD74 sa visokim afinitetom. Ovaj četvrti primer citotoksičnog proteina je sposoban za selektivno ubijanje ćelija koje na svojoj površini eksprimiraju CD74. Drugi primerni citotoksičnih proteina uključuju one sa veznim regionima koji ciljaju Epstejn-Bar-ove antigene, Lešmanija antigene, neurotenzinski receptore, receptore epidermalnog faktora rasta i receptore imunih ćelija CCR5.
Primer 1. Citotoksični protein usmjeren na CD38 izveden iz A podjedinice iz Šiga sličnog toksina-1 (SLT-1A::DCD38scFv)
[0254] Citotoksični protein iz ovog primera SLT-1A::DCD38scFv obuhvata fragment podjedinice A Šiga toksina koji je rekombinovan sa jednolančanim, varijabilnim fragmentom veznog regiona koji je sposoban da vezuje CD38 sa visokim afinitetom tako da je efektorski region Šiga toksina više proksimalan u odnosu na amino-terminus sa citotoksičnog proteina nego što je CD38 vezni region.
Konstruisanje, proizvodnja i prečišćavanje citotoksičnog proteina SLT-1A::DCD38scFv [0255] Prvo, jedan efektorski region Šiga toksina i jedan vezni region imunoglobulinskog tipa su dizajnirani ili izabrani. U ovom primeru, efektorski region Šiga toksina je izveden iz A podjedinice Šiga sličnog toksina 1 (SLT-1A). Polinukleotid je dobijen tako da kodira aminokiseline 1-251 iz SLT-1A (Cheung M et al., Mol Karcinom 9: 28 (2010). Jedan vezni region imunoglobulinskog tipa DCD38scFv je izveden iz monoklonskog antitela anti-CD38 HB7 (Peng et al., Blood 101: 2557-62 (2003); videti takoÿe GenBank Accession BD376144, National Center for Biotechnology Information, U.S.) tako da je jednolančani varijabilni fragment (scFv) kreiran sa dva imunoglobulinska varijabilna regiona (VLi VH) koji su razdvojeni uz pomoć linkera koji je poznat u stanju tehnike.
[0256] Drugo, vezni region i efektorski region Šiga toksina su povezani zajedno tako da formiraju fuzioni protein. U ovom primeru, polinukleotid koji kodira za efektorski region Šiga toksina iz SLT-1A (aminokiselina 1-251 iz SEKV ID BR:1) je kloniran u okviru sa polinukleotidom koji kodira za linker, kao što je "mišja šarka" koji je izveden iz mišjeg IgG3 molekula (ili drugi linkeri koji su poznati stručnoj osobi) i u okviru sa polinukleotidom koji kodira za vezni region imunoglobulinskog tipa DCD38scFv koji obuhvata aminokiseline 269-508 iz SEKV ID BR:4. U eksperimentima, kodirajuća sekvenca pune dužine sa citotoksičnog proteina iz ovog primera započinje sa polinukleotidom koji kodira za Strep-tag® kako bi se olakšala detekcija i prečišćavanje. Polinukleotidna sekvenca koja kodira za citotoksični protein SLT-1A::DCD38scFv iz ovog primera je kodon optimizovana za efikasnu ekspresiju u E. coli korišćenjem usluge iz DNK 2.0, Inc. (Menlo Park, CA, U.S.).
[0257] Treće, fuzioni protein je proizveden uz pomoć eksprimiranja polinukleotida koji kodira za citotoksični protein SLT-1A::DCD38scFv (SEKV ID BR:4). Ekspresija SLT-1A::DCD38scFv citotoksičnog proteina je ostvarena korišćenjem i bakterijskih i bezćelijskih, proteinskih traslacionih sistema.
[0258] U ovom primeru iz SLT-1A::DCD38scFv proizvodnja uz pomoć nekog E. coli ekspresionog sistema, polinukleotidna „insert“ sekvenca koja kodira za SLT-1A::DCD38scFv je klonirana u pTxb1 vektor (New England Biolabs, Ipswich, MA, U.S.) korišćenjem standardnih procedura da bi se proizvela polinukleotidna sekvenca koja kodira za citotoksični protein SLT-1A::DCD38scFv podvezan u okviru na polinukleotidne sekvence koje kodiraju za amino-terminalni intein na vektoru.
Plazmidno insertovana polinukleotidna sekvenca je verifikovana sa Sanger sekvenciranjem (Functional Biosciences, Madison, WI, U.S.) i transformisan u T7 Shuffle® ćelije (New England Biolabs, Ipswich, MA, U.S.). SLT-1A::DCD38scFv protein je proizveden i prečišćen u skladu sa uputstvom za IMPACT™ (Prečišćavanje posredstvom Inteina pomoću afinitetne oznake koja veže hitin) sistem (New England Biolabs, Ipswich, MA, U.S.). Prečišćavanje je ostvareno korišćenjem standardnih tehnika koje su poznate u stanju tehnike, kao što je koristeći imobilisane targete iz Strep-tag® ili vezni region imunoglobulinskog tipa.
[0259] U ovom primeru iz SLT-1A::DCD38scFv proizvodnja sa bezćelijskim, proteinskim translacionim sistemom, polinukleotidna „insert“ sekvenca koja kodira za SLT-1A::DCD38scFv je klonirana u pIVEX2.3 vektor sa stop kodonom direktno iz kodirajućeg regiona koristeći In-Fusion® HD Cloning Kit (Clonetech, Mountain View, CA, U.S.) u skladu sa uputstvima proizvođDča. Plazmidno insertovana polinukleotidna sekvenca je verifikovana sa Sanger sekvenciranjem (Functional Biosciences, Madison, WI, U.S.). SLT-1A::DCD38scFv protein je proizveden koristeći rapidni translacioni sistem 5 Prime™ RTS 100 E. coli Disulfide Kit (5 Prime, Gaithersburg, MD, U.S.) u skladu sa uputstvima proizvođDča. Prečišćavanje je ostvareno korišćenjem standardnih tehnika koje su poznate u stanju tehnike, kao što je korišćenje imobilisanih targeta iz Strep-tag® ili veznog regiona imunoglobulinskog tipa.
Određivanje maksimalne specifične veze (Bmax) i ravnotežne konstante vezivanja (KD) za SLT-1A::DCD38scFv ćelijske tipove koji vezuju target
[0260] Vezujuće karakteristike za SLT-1A::DCD38scFv protein koji je proizveden kako je opisano gore su određene uz pomoć testa protočne citometrije zasnovane na fluorescenciji. Uzorci koji sadrže CD38 pozitivne (+) ćelije i CD38 negativne (-) ćelije su suspendovani u IX PBS+1%BSA i inkubirani u toku 1 sata na 4°C sa 100 mL različitih razblaženja sa SLT- 1A::DCD38scFv proteinom koji treba da se analizira. Najviše koncentracije sa SLT-1A::DCD38scFv proteinom su izabrane da dovedu do zasićenja reakcije vezivanja. Nakon jednog sata inkubacije, uzorci ćelija su isprani dva puta sa IX PBS+1%BSA. Uzorci ćelija su inkubirani u toku 1 sata na 4°C sa 100 mL IX PBS+1%BSA koji sadrži 0.3 mg anti-Strep-tag® mAb-FITC (# A01736-100, Genscript, Piscataway, NJ, U.S.).
[0261] Uzorci ćelija su zatim isprani dva puta sa IX PBS+1%BSA, resuspendovani u 200 mL IX PBS i podvrgnuti protočnoj citometriji zasnovanoj na fluorescenciji. Podaci za srednju vrednost intenziteta fluorescencije (MFI) za sve uzorke su dobijeni getiranjem podataka pomoću FITC-samo uzorka kao negativne kontrole. Konstruisani su grafikoni sa MFI prema "koncentracija ćelija" korišćenjem Prism softvera (GraphPad Softvera, San Diego, CA, U.S.). Koristeći Prism softver funkciju vezivanja na jednom mestu [Y = Bmax<>X / (KD+ X)] pod naslovom vezivanje-zasićenje, Bmax i KDsu izračunati korišćenjem korigovanih podataka na osnovu bazne linije. Abs vrednosti su korigovane za pozadinu pomoću oduzimanja Abs vrednosti izmerenih za bunarčLće koji sadrže samo PBS. Bmaxje maksimalna vrednost za specifično vezivanje koja je zabeležena u MFI. KDje ravnotežna konstanta vezivanja, koja je zabeležena u nM.
[0262] Bmaxza SLT-1A::DCD38scFv vezivanje za CD38+ ćelije izmereno je od oko 100,000 MFI sa KDod oko 13 nM (Tabela 1). Ovaj rezultat je sličan sa Bmaxkoji je dobijen za protein obrnute orijentacije DCD38scFv::SLT-1A koji je vezan za CD38+ ćelije za koji je izmereno od oko 110,000 MFI sa KDod oko 17 nM (Tabela 1). Nijedan protein ne vezuje za CD38- ćelije. To pokazuje da efekat „orijentacije konstrukta“ verovatno nije sličan perturbaciji svojstava vezivanja ciljanih ćelija kod domena izvedenih iz imunoglobulina.
Tabela 1. Orijentacija konstrukta nije imao značajniji efekat na vezne karakteristike: reprezentativne vrednosti za Bmaxi KDza SLT-1A::DCD38scFv u poređenju sa obrnutom orijentacijom DCD38scFv::SLT-1A
In vitro određivanje polumaksimalne inhibitorne koncentracije (IC50) za SLT-1A::DCD38scFv na eukariotske ribozome
[0263] Mogućnosti inaktivacije ribozoma za SLT-1A::DCD38scFv određene su u bezćelijskom, in vitro testu proteinske translacije pomoću TNT® Quick Coupled Transcription/Translation Kit (L1170 Promega, Madison, WI, U.S.). Komplet uključuje Luciferaza T7 kontrolna DNK i TNT® Quick Master Mix. Reakcija aktivnosti ribozoma pripremljena je u skladu sa uputstvima proizvođDča da bi se stvorile reakcione smeše „TNT“.
[0264] Serije 10-o strukih razblaženja sa SLT-1A::DCD38scFv koji treba testirati su pripremljene u odgovarajućem puferu i serija sa identičnom TNT reakcionom smešom komponenti je kreirana za svako razblaženje sa SLT-1A::DCD38scFv. Svaki uzorak u serijama razblaženja sa SLT-1A::DCD38scFv proteinom je kombinovan sa svakom od TNT reakcionih smeša zajedno sa Luciferaza T7 kontrolnom DNK. Testirani uzorci su inkubirani u toku 1.5 sata na 30°C. Nakon inkubacije, Reagens iz luciferaza testa (E1483 Promega, Madison, WI, U.S.) je dodat u sve testirane uzorke i količina luciferaza protein translacija je merena pomoću luminiscencije u skladu sa uputstvima proizvođDča. Nivo inhibicije translacije je određen uz pomoć nelinearne regresione analize logtransformisanih koncentracija ukupog proteina prema jedinici relativne luminiscencije. Korišćenjem statističkog softvera (GraphPad Prism, San Diego, CA, U.S.), vrednost polovine maksimalne inhibitorne koncentracije (IC50) je izračunata za svaki uzorak. Zatim, podaci su normalizovani pomoću obračunavanja "procenat SLT-1A-samo kontrolnog proteina" koristeći Prism softver funkcije za log(inhibitor) prema odgovor (tri parametra) [Y = Bottom ((Top-Bottom) / (1+10^(X-LogIC50)))] pod naslovom dozaodgovor-inhibicija. Vrednosti IC50za eksperimentalne proteine i SLT-1A-samo kontrolni protein su izračunate. Procenat SLT-1A-samo kontrolnog proteina je izračunata pomoću [(IC50 za SLT-1A kontrolni protein / IC50 za eksperimentalni protein) x 100].
[0265] Inhibitorni efekat za SLT-1A::DCD38scFv na sintezu bezćelijskog proteina je jak. Eksperimenti za zavisnosti od doze su odredili da IC50SLT-1A::DCD38scFv na sintezu proteina u ovom bezćelijskom testu je oko 14 pikomola (pM) ili 109% od SLT-1A-samo pozitivne control (Tabela 2). Ovaj rezultat nije se bitno razlikovao od vrednosti IC50koji je dobijena za protein obrnute orijentacije DCD38scFv::SLT-1A, za koji je izmereno od oko 15 pM ili ekvivalentno sa SLT-1A-samo pozitivnom kontrolom (Tabela 2). To pokazuje da efekat „orijentacije konstrukta“ verovatno nije sličan sa bilo kojom značajnom perturbacijom enzimske aktivnosti podjedinice A Šiga toksina.
Tabela 2. Orijentacija konstrukta Nije imao značajniji efekat na inaktivaciju ribozoma: Reprezentativna polovina maksimalne inhibitorne koncentracije (IC50) za SLT-
1A::DCD38scFv u poređenju sa DCD38scFv:: SLT-1A obrnute orijentacije
Određivanje selektivne citotoksičnosti i polu-maksimalne citotoksične koncentracije (CD50) za SLT-1A::DCD38scFv korišćenjem testova ubijanja ćelija
[0266] Karakteristike citotoksičnosti za SLT-1A::DCD38scFv su određene uz pomoć sledećeg testa ubijanja ćelija. Ovaj test određuje kapacitet citotoksičnog proteina da ubija ćelije tako što eksprimira ciljani biomolekul veznog regiona imunoglobulinskog tipa iz citotoksičnog proteina u poređenju sa ćelijama koje ne eksprimiraju ciljani biomolekul. ûelije su zasejane (2 x 10<3>ćelija po bunarčLću) u 20 mL medijuma za kultivisanje ćelija u mikrotitarskoj ploči sa 384 bunarčLća. SLT-1A::DCD38scFv protein je razblažen bilo 5-struko ili 10-struko u IX PBS i 5 mL razblaženja je dodato u ćelije. Kontrolni bunarčLći koji sadrže samo medijum za kultivisanje ćelija su korišćeni za korekciju bazne linije. Uzorci ćelija su inkubirani sa SLT-1A::DCD38scFv, ili samo sa puferom, u toku 3 dana na 37°C i pri atmosferi od 5% CO2. Ukupno preživljavanje ćelija ili procenat vijabilnosti je određen korišćenjem luminiscentnog očitavanja korišćenjem ćelijskog Titer-Glo® Luminiscentnog testiranja ćelijske vijabilnosti (G7573 Promega Madison, WI, U.S.) u skladu sa uputstvima proizvođDča. Procenat vijabilnosti u eksperimentalnim bunarčLćima je izračunat koristeći sledeću jednačinu: (RLU uzorka – srednji medijumski RLU) / (srednji ćelijski RLU - srednji medijumski RLU) * 100. Odnos log koncentracije polipeptida prema procentu vijabilnosti je konstruisan u grafikonu Prism (GraphPad Prism, San Diego, CA, U.S.) i analiza log (inhibitor) prema normalizovanom odgovoru (nagib varijable) je korišćena da se determiniše vrednost polovine maksimalne citotoksične koncentracije (CD50) za SLT-1A::DCD38scFv.
[0267] Eksperimenti za zavisnosti od doze su odredili da CD50za SLT-1A::DCD38scFv protein je oko 0.2-0.7 nM za CD38+ ćelije u zavisnosti od ćelijske linije u poređenju sa 470 nM za CD38- ćelijsku liniju, što je slično sa CD50za SLT-1A-samo negativnu kontrolu (Tabela 3; Slika 2). Vrednost CD50za SLT-1A::DCD38scFv je oko 700-3000 puta veća (manja citotoksičnost) za ćelije koje nisu fizički uparene sa ekstracelularnim ciljanim biomolekulom CD38 u poređenju sa ćelijama koje su fizički uparene sa ekstracelularnim ciljanim biomolekulom CD38, na pr. ćelijske linije koje eksprimiraju CD38 na njihovoj ćelijskoj površini (Tabela 3; Slika 2). Vrednost CD50za isti proteinski domen koji je rekombinovan u obrnutoj orijentaciji, DCD38scFv::SLT-1A, izmeren je od oko 0.8-3.2 nM (Tabela 3; Slika 2). Ovo je pokazalo da poboljšana orijentaciona konstrukcija, gde region imunoglobulinskog tipa nije lociran proksimalno u odnosu na amino-terminus sa citotoksičnog proteina u odnosu na navedeni efektorski region Šiga toksina, donosi poboljšanje citotoksičnosti za oko 4-6 puta prema CD38 ćelijama (Tabela 3). Ovi rezultati ilustruju uticaj efekata „orijentacije konstrukta“ na citotoksičnost i selektivnu citotoksičnost. Razlike u ubijanju ćelija za ove citotoksične proteine nisu predvidljive na osnovu in vitro rezultata bilo za inaktivaciju ribozoma ili za karakteristike vezivanja ciljane ćelije.
Tabela 3. Efekat orijentacije konstrukta na citotoksičnost: Reprezentativne polumaksimalne citotoksične koncentracije (CD50) za SLT-1A::DCD38scFv u poređenju sa DCD38scFv::SLT-1A obrnute orijentacije
Određivanje internalizacije ćelije sa SLT-1A::DCD38scFv i njegove obrnute orijentacije DCD38scFv::SLT-1A korišćenjem imunofluorescencije
[0268] Sposobnost citotoksičnog proteina da uđe u ciljane ćelije istražena je korišćenjem standardnih imunocitohemijskih tehnika koje su poznate u stanju tehnike. Ukratko, 0.8 x 10<6>ćelija od svakog ćelijskog tipa (Raji (CD38+), Ramos(CD38+), Daudi (CD38+), BC-1 (CD38+), i U266 (CD38-)) je sakupljeno i suspendovano u 50 mL medijuma za kultivisanje ćelija koji sadrži koktel sa proteaza inhibitorima (na pr. P1860 Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, U.S.) i humanim Fc receptor proteinom kako bi se smanjilo nespecifično imunofluorescentno bojenje. Nakon toga, 100 nM citotoksičnog proteina koji treba da se anlizira je dodato to ćelije, i ćelije su inkubirane na 37°C u toku 1 sata kako bi se omogućilo napredovanje intoksikacije. Zatim, ćelije su „fiksirane“ i „permeabilizovane“ koristeći Cytofix/Cytoperm™ Kit (BD Biosciences San Diego, CA, U.S.) u skladu sa uputstvima proizvođDča. Efektorski region Šiga toksina was „obojen“ korišćenjem mišjeg monoklonskog antitela (mišji IgG anti-Šiga toksin 1 podjedinica A, BEI NR-867 BEI Reizvors, Manassas, VA, U.S.). Lokalizacija mišjih monoklonskih antitela je zatim detektovana sa Alexa Fluor® 555 Kitom za obeležavanje monoklonskih antitela(Life Technologies, Carlsbad, CA, U.S.) prema uputstvima proizvođDča.
[0269] U ovom testu, ćelijsko površinsko vezivanje i internalizacija ćelija su primećeni kod CD38 ćelija kako za SLT- 1A::DCD38scFv tako i za protein obrnute orijentacije DCD38scFv::SLT-1A. Nije primećena internalizacija ćelija za bilo koji protein u CD38-ćelijama. Ovo je pokazalo razlike u citotoksičnosti (Tabela 3; Slika 2) između ove dve varijante, koje se razlikuju samo u relativnom redosledu njihovog veznog regiona imunoglobulinskog tipa i efektorskog regiona Šiga toksina, verovatno nije slično bilo kojoj značajnoj promeni u vezivanju ciljane ćelije i/ili ulazak u ćeliju.
Određivanje in vivo efekata citotoksičnog proteina DCD38scFv::SLT-1A korišćenjem životinjskih modela
[0270] Životinjski modeli su korišćeni da se odrede efekti in vivo za citotoksični protein DCD38scFv::SLT-1A na CD38+ neoplastične i/ili imunske ćelije. Razni sojevi miševa su korišćeni za testiranje efekata citotoksičnog proteina nakon intravenske primene na ksenograftnim tumorima kod miševa koji su rezultat injektiranja u te miševe humanih neoplastičnih i/ili humanih imunih ćelija koje eksprimiraju CD38 na njihovoj ćelijskoj površini.
Primer 2. HER2-ciljan, citotoksični protein izveden iz A podjedinice Šiga sličnog toksina-1 (SLT- 1A::DHER2scFv)
[0271] Citotoksični protein iz ovog primera SLT-1A::DHER2scFv obuhvata fragment podjedinice A Šiga toksina koji je rekombinovan sa jednolančanim, varijabilnim fragmentom veznog regiona koji je sposoban da vezuje da vezuje HER2 sa visokim afinitetom tako da je efektorski region Šiga toksina više proksimalan u odnosu na aminoterminus na citotoksičnom proteinu nego što je HER2 vezni region.
Konstrukcija. Proizvodnja i prečišćavanje citotoksičnog proteina SLT-1A::DHER-2scFv [0272] U ovom primeru, efektorski region Šiga toksina je izveden iz A podjedinice sa Šiga sličnog toksina 1 (SLT-1A). Polinukleotid je dobijen tako da kodira aminokiseline 1-251 iz SLT-1A (Cheung M et al., Mol Karcinom 9: 28 (2010)). Jedan vezni region imunoglobulinskog tipa DHER2scFv je izveden iz trastuzumab (marketed as Herceptin®, Genen- tech, South San Francisco, CA) monoklonih antitela kao što je opisano (Zhao Y et al., J Immunol 183: 5563-74 (2009)) tako da je jednolančani varijabilni fragment (scFv) kreiran sa dva imunoglobulinska varijabilna regiona (VLi VH) koji su razdvojeni uz pomoć linkera.
[0273] U ovom primeru, vezni region imunoglobulinskog tipa i efektorski region Šiga toksina su povezani zajedno tako da formiraju fuzioni protein. U ovom primeru, polinukleotid koji kodira za efektorski region Šiga toksina koji je izveden iz SLT- 1A (aminokiseline 1-251 iz SEKV ID BR:1) je kloniran u okviru sa polinukleotidom koji kodira za linker, kao što je "mišja šarka" izvedena iz mišjeg IgG3 molekula ili drugi linker od onih koji su poznati stručnoj osobi, i u okviru sa polinukleotidom koji kodira za vezni region imunoglobulinskog tipa DHER2scFv koji obuhvata aminokiseline 269-512 iz SEKV ID BR:8. U eksperimentima, kodirajuća sekvenca pune dužine sa citotoksičnog proteina iz ovog primera započinje sa polinukleotidom koji kodira za Strep-tag® kako bi se olakšala detekcija i prečišćavanje. Polinukleotidna sekvenca koja kodira za citotoksični protein SLT-1A::DHER2scFv iz ovog primera je kodon optimizovana za efikasnu ekspresiju u E. coli korišćenjem usluge iz DNA 2.0, Inc. (Menlo Park, CA, U.S.).
[0274] Fuzioni protein je proizveden uz pomoć eksprimiranja polinukleotida koji kodira za citotoksični protein SLT-1A::DHER2scFv (SEKV ID BR:8). Ekspresija SLT-1A::DHER2scFv citotoksičnog proteina je ostvarena korišćenjem i bakterijskih i bezćelijskih, proteinskih traslacionih sistema.
[0275] U ovom primeru iz SLT-1A::DHER2scFv proizvodnja uz pomoć nekog E. coli ekspresionog sistema, polinukleotidna „insert“ sekvenca koja kodira za SLT-1A::DHER2scFv je klonirana u pTxb1 vektor (New England Biolabs, Ipswich, MA, U.S.) korišćenjem standardnih procedura da bi se proizvela polinukleotidna sekvenca koja kodira za citotoksični protein SLT-1A::DHER2scFv podvezan u okviru na polinukleotidne sekvence koje kodiraju za amino-terminalni intein na vektoru. Plazmidna inserciona polinukleotidna sekvenca je verifikovana sa Sanger sekvenciranjem (Functional Biosciences, Madison, WI, U.S.) i transformisana u T7 Shuffle® ćelije (New England Biolabs, Ipswich, MA, U.S.). SLT-1A::DHER2scFv protein je proizveden i prečišćen u skladu sa IMPACT™ (Intein posredovano prečišćavanje sa afinitetnom hitin vezujućom oznakom) sistemskim uputstvom (New England Biolabs, Ipswich, MA, U.S.). Prečišćavanje je ostvareno korišćenjem standardnih tehnika koje su poznate u stanju tehnike, kao što je korišćenje imobilisanih targeta sa Strep-tag® ili veznog regiona imunoglobulinskog tipa.
[0276] U ovom primeru sa SLT-1A::DHER2scFv proizvodnjom sa bezćelijskim, proteinskim translacionim sistemom, polinukleotidna „insert“ sekvenca koja kodira za SLT-1A::DHER2scFv je klonirana u pIVEX2.3 vektor sa stop kodonom direktno iz kodirajućeg regiona koristeći In-Fusion® HD Cloning Kit (Clonetech, Mountain View, CA, U.S.) u skladu sa uputstvima proizvođDča. Plazmidno insertovana polinukleotidna sekvenca je verifikovana sa Sanger sekvenciranjem (Functional Biosciences, Madison, WI, U.S.). SLT-1A::DHER2scFv protein je proizveden koristeći rapidni translacioni sistem 5 Prime™ RTS 100 E. coli Disulfide Kit (5 Prime, Gaithersburg, MD, U.S.) u skladu sa uputstvima proizvođDča. Prečišćavanje je ostvareno korišćenjem standardnih tehnika koje su poznate u stanju tehnike, kao što je korišćenje imobilisanih targeta sa Strep-tag® ili veznog regiona imunoglobulinskog tipa.
Određivanje maksimalnog specifičnog vezivanja (Bmax) i ravnotežne konstante vezivanja (KD) za SLT-1A::DHER2scFv ćelijske tipove koji vezuju target
[0277] Vezujuće karakteristike za SLT-1A::DHER2scFv protein koji je proizveden kako je opisano gore su određene uz pomoć testa protočne citometrije zasnovane na fluorescenciji. Uzorci koji sadrže HER2 pozitivne (+) ćelije i HER2 negativne (-) ćelije su suspendovani u slanom fosfatnom puferu (IX PBS) (Hyclone Brand, Fisher Scientific, Waltham, MA, U.S.) koji sadrži 1 procenat goveđeg serumskog albumina (BSA) (Calbiochem, San Diego, CA, U.S.), u daljem tekstu označen kao "IX PBS+1%BSA" i inkubirani su u toku 1 sata na 4 stepena Celzijusa (°C) sa 100 mL različitih razblaženja sa SLT-1A::DHER2scFv proteinom koji treba da se analizira. Najviše koncentracije sa SLT-1A::DHER2scFv proteinom su izabrane da dovedu do zasićenja reakcije vezivanja. Nakon jednog sata inkubacije, uzorci ćelija su isprani dva puta sa IX PBS+1%BSA. Uzorci ćelija su inkubirani u toku 1 sata na 4°C sa 100 mL IX PBS+1%BSA koji sadrži 0.3 mg anti-Strep-tag® mAb-FITC (# A01736-100, Genscript, Piscataway, NJ, U.S.).
[0278] Uzorci ćelija su zatim isprani dva puta sa IX PBS+1%BSA, resuspendovani u 200 mL sa IX PBS i podvrgnuti protočnoj citometriji zasnovanoj na fluorescenciji. Podaci za srednju vrednost intenziteta fluorescencije (MFI) data za sve uzorke su dobijeni getiranjem podataka pomoću FITC-samo uzorka kao negativne kontrole. Konstruisani su grafikoni sa MFI prema "koncentraciji ćelija" korišćenjem Prism softvera (GraphPad Softvera, San Diego, CA, U.S.). Koristeći Prism softver funkciju vezivanja na jednom mestu [Y = Bmax<>X / (KD+ X)] pod nazivom vezivanje-zasićenje, Bmaxi KDsu izračunati korišćenjem korigovanih podataka na osnovu bazne linije. Abs vrednosti su korigovane za pozadinu pomoću oduzimanja Abs vrednosti izmerenih za bunarčLće koji sadrže samo PBS. Bmaxje maksimalna vrednost za specifično vezivanje koja je zabeležena u MFI. KDje ravnotežna konstanta vezivanja, koja je zabeležena u nanomolima (nM).
[0279] Bmaxza SLT-1A::DHER2scFv vezivanje za HER2+ ćelije izmereno je od oko 230,000 MFI sa KDod oko 110 nM (Tabela 4). Ovaj rezultat je bio relativno sličan vrednosti Bmaxkojia je dobijena za protein obrnute orijentacije DHER2scFv::SLT-1A vezivanje za HER2+ ćelije za koji je izmereno od oko 140,000 MFI sa KDod oko 180 nM (Tabela 4). U ovom ispitivanju nije primećeno da bilo koji protein ima merljivo vezivanje za HER2-negativne ćelije. To pokazuje da efekat „orijentacije konstrukta“ verovatno nije sličan perturbaciji svojstava vezivanja ciljanih ćelija kod domena izvedenih iz imunoglobulina.
Tabela 4. Orijentacija konstrukta Nema efekat na karakteristike vezivanja:
Reprezentativne vrednosti za Bmaxi KDza SLT-1A::DHER2scFv u poređenju sa njegovom obrnutom orijentacijom DHER2scFv::SLT-1A
In vitro određivanje polovine maksimalne inhibitorne koncentracije (IC50) za SLT-1A::DHER2scFv na eukariotske ribozome
[0280] Mogućnosti inaktivacije ribozoma sa SLT-1A::DHER2scFv određena je u bezćelijskom, in vitro testu translacije proteina pomoću TNT® Quick Coupled Transcription/Translation Kit (L1170 Promega, Madison, WI, U.S.). Komplet uključuje Luciferaza T7 kontrolna DNK i TNT® Quick Master Mix. Reakcija aktivnosti ribozoma pripremljena je u skladu sa uputstvima proizvođDča da bi se stvorile "TNT" reakcione smeše.
[0281] Serije 10-o strukih razblaženja sa SLT-1A::DHER2scFv koji treba testirati su pripremljene u odgovarajućem puferu i serije sa identičnim komponentama TNT reakcionih smeša su kreirane za svako razblaženje sa SLT-1A::DHER2scFv. Svaki uzorak u serijama razblaženja sa SLT-1A::DHER2scFv proteinom je kombinovan sa svakom od TNT reakcionih smeša zajedno sa Luciferaze T7 kontrolnom DNK. Testirani uzorci su inkubirani u toku 1.5 sata na 30°C. Nakon inkubacije, reagens iz luciferaza testa (E1483 Promega, Madison, WI, U.S.) je dodat u sve testirane uzorke i količina luciferaza proteinske translacije je merena pomoću luminiscencije u skladu sa uputstvima proizvođDča. Nivo inhibicije translacije je određen uz pomoć nelinearne regresione analize log-transformisanih koncentracija ukupog proteina prema jedinici relativne luminiscencije. Korišćenjem statističkog softvera (GraphPad Prism, San Diego, CA, U.S.), vrednost polovine maksimalne inhibitorne koncentracije (IC50) je izračunata za svaki uzorak. Zatim, podaci su normalizovani pomoću obračunavanja "procenat SLT-1A-samo kontrolnog proteina" koristeći Prism softver funkcije za log(inhibitor) prema odgovoru (tri parametra) [Y = Bottom ((Top-Bottom) / (1410^(X-LogIC50)))] pod naslovom doza-odgovor-inhibicija. Vrednosti IC50za eksperimentalne proteine i SLT1A-samo kontrolni protein su izračunate. Procenat SLT-1A-samo kontrolnog proteina je izračunat uz pomoć jednačine [(IC50 iz SLT-1A kontrolni protein / IC50 za eksperimentalni protein) x 100].
[0282] Inhibitorni efekat za SLT-1A::DHER2scFv na sintezu bezćelijskog proteina je jak. Eksperimenti sa zavisnošću od doze su odredili da IC50za SLT-1A::DHER2scFv na sintezu proteina u ovom bezćelijskom testu je oko 110 pM ili unutar 19% od SLT-1A-samo pozitivne kontrola (Tabela 5). Ovaj rezultat nije se bitno razlikovao od vrednosti IC50koji je dobijen za protein obrnute orijentacije DHER2scFv::SLT-1A koja je merena da je 108% od SLT-1A-samo pozitivne kontrole (Tabela 5). To pokazuje da efekat „orijentacije konstrukta“ verovatno nije sličan sa bilo kojom značajnom perturbacijom enzimske aktivnosti podjedinice A Šiga toksina.
Tabela 5. Orijentacija konstrukta nije imao efekat na inaktivaciju ribozoma:
Reprezentativna relativna polovina maksimalne inhibitorne koncentracije (IC50) za SLT-1A::DHER2scFv u poređenju sa obrnutom orijentacijom DHER2scFv::SLT-1A
Određivanje selektivne citotoksičnosti i polovine maksimalne citotoksične koncentracije (CD50) za SLT-1A::DHER2scFv korišćenjem testa ubijanja ćelija
[0283] Karakteristike citotoksičnosti za SLT-1A::DHER2scFv su određene sledećim testom ubijanja ćelije. Ovaj test određuje kapacitet citotoksičnog proteina da ubija ćelije koje eksprimiraju ciljani biomolekul sa njihovog veznog regiona imunoglobulinskog tipa iz citotoksičnog proteina u poređenju sa ćelijama koje ne eksprimiraju ciljani biomolekul. ûelije su zasejane (2 x 10<3>ćelija po bunarčLću) u 20 mL medijuma za kultivisanje ćelija u mikrotitarskoj ploči sa 384 bunarčLća. SLT-1A::DHER2scFv protein je razblažen bilo 5-struko ili 10-struko u IX PBS i 5 mL razblaženja je dodato u ćelije. Kontrolni bunarčLći koji sadrže samo medijum za kultivisanje ćelija su korišćeni za korekciju bazne linije. Uzorci ćelija su inkubirani sa SLT-1A::DHER2scFv, ili samo sa puferom, u toku 3 dana na 37°C i pri atmosferi od 5% ugljen dioksida (CO2). Ukupno preživljavanje ćelija ili procenat vijabilnosti je određen korišćenjem luminiscentnog Rčitavanja korišćenjem ćelijskog Titer-Glo® Luminiscentnog testiranja ćelijske vijabilnosti (G7573 Promega Madison, WI, U.S.) u skladu sa uputstvima proizvođDča. Procenat vijabilnosti u eksperimentalnim bunarčLćima je obračunat koristeći sledeću jednačinu: (RLU uzorka - Srednji medijumski RLU) / (Srednji ćelijski RLU - Srednji medijumski RLU) * 100. Vrednost log koncentracije polipeptida prema procentu vijabilnosti je konstruisana u grafikonu Prism (GraphPad Prism, San Diego, CA, U.S.) i analiza log (inhibitor) prema normalizovanom odgovoru (nagib varijable) je korišćena da se determiniše polovina vrednost maksimalne citotoksične koncentracije (CD50) za SLT-1A::DHER2scFv.
[0284] Eksperimenti za zavisnosti od doze su odredili da CD50za SLT-1A::DHER2scFv protein je oko 0.07 nM za HER2 ćelije (Tabela 6; Slika 3). Vrednost CD50za isti proteinski domen koji je rekombinovan u obrnutoj orijentaciji, DHER2scFv::SLT-1A, izmerena je od oko 0.64 nM (Tabela 6; Slika 3). Rezultati za HER2- ćelijsku liniju MDA-MB468 su bile dvosmislene jer se odgovarajuće krive nisu mogle prilagoditi podacima. Rezultati u Tabeli 6 i Slika 3 predstavljaju primer uticaja „orijentacije konstrukta“ na citotoksičnost. Razlike u ubijanju ćelija za ove citotoksične proteine nisu predviđajuće na osnovu rezultata in vitro za inaktivaciju bilo ribozoma ili za karakteristike ciljno vezivanje ćelija.
Tabela 6. Orijentacija konstrukta utiče na citotoksičnost: Reprezentativne vrednosti polovine maksimalne citotoksične koncentracije (CD50) za SLT-1A::DHER2scFv u poređenju sa obrnutom orijentacijom DHER2scFv::SLT-1A
Utvrđivanje internalizacije ćelija za SLT-1A::DCDHER2scFv i njegovu obrnutu orijentaciju DHER2scFv::SLT-1A korišćenjem imunofluorescencije
[0285] Sposobnost citotoksičnog proteina da uđe u ciljane ćelije istražena je korišćenjem standardnih imunocitohemijskih tehnika koje su poznate u stanju tehnike. Ukratko, 0,8 x 106 ćelija od svakog ćelijskog tipa (SKBR3 (HER2+) i MDA-MB-231 (HER2-)) je sakupljeno i suspendovano u 50 ml medijuma za kultivisanje ćelija koji sadrži koktel sa inhibitorima proteaze (na pr. P1860 Sigma Aldrich Co., St. Louis, MO, US) i humanim protein Fc receptorom kako bi se smanjilo nespecifično imunofluorescentno bojenje. Nakon toga, 100 nM citotoksičnog proteina koji treba da se anlizira je dodato u ćelije, i ćelije su inkubirane na 37°C u toku 1 sata kako bi se omogućilo napredovanje intoksikacije. Zatim, ćelije su „fiksirane“ i „permeabilizovane“ koristeći Cytofix/Cytoperm™ Kit (BD Biosciences San Diego, CA, U.S.) u skladu sa uputstvima proizvođDča. Efektorski region Šiga toksina je „obojen“ korišćenjem mišjeg monoklonskog antitela (mišji IgG anti-Šiga toksin 1 podjedinica A, BEI NR-867 BEI Reizvors, Manassas, VA, U.S.). Lokalizacija mišjih monoklonskih antitela je zatim detektovana sa Alexa Fluor® 555 Kitom za obeležavanje monoklonskih antitela (Life Technologies, Carlsbad, CA, U.S.) prema uputstvima proizvođDča.
[0286] U ovom testu, primećeno je vezivanje ćelijske površine i internalizacija ćelija u ćelijama HER2+ i za SLT-1A::DHER2scFv i za protein obrnute orijentacije DHER2scFv::SLT-1A (slika 4). Nije primećena internalizacija ćelija ni za jedan protein za HER2-ćelije. Ovo pokazuje razlike u citotoksičnosti (tabela 6; slika 3) između ove dve varijante citotoksičnog proteina koji se razlikuju samo u relativnom redosledu njihovog veznog regiona imunoglobulinskog tipa i efektorskog regiona Šiga toksina što verovatno nije povezano sa bilo kakvom značajnom promenom vezivanja ciljane ćelije i/ili ulazak u ćeliju.
Određivanje in vivo efekata za citotoksični protein DHER2scFv::SLT-1A korišćenjem životinjskih modela
[0287] Životinjski modeli su korišćeni da se odrede efekti in vivo za citotoksični protein DHER2scFv::SLT-1A na HER2+ neoplastičnim ćelijama. Razni sojevi miševa su korišćeni za testiranje efekata citotoksičnog proteina nakon intravenske primene na ksenograftnim tumorima kod miševa koji su rezultat injektiranja u te miševe humanih neoplastičnih ćelija koje eksprimiraju HER2 na njihovim ćelijskim površinama.
Primer 3. Vrednost CD19-ciljani, citotoksični protein izveden iz A podjedinice Šiga sličnog toksina-1 (SLT- 1A::DCD19scFv)
[0288] Citotoksični protein iz ovog primera SLT-1A::DCD19scFv obuhvata fragment podjedinice A Šiga toksina koji je rekombinovan sa jednolančanim, varijabilnim fragmentom veznog regiona koji je sposoban da vezuje da vezuje CD 19 sa visokim afinitetom tako da je efektorski region Šiga toksina više proksimalan u odnosu na aminoterminus za citotoksični protein nego što je CD 19 vezni region.
Konstrukcija. proizvodnja i prečišćavanje citotoksičnog proteina SLT-1A::DCD19scFv [0289] U ovom primeru, efektorski region Šiga toksina je izveden iz A podjedinice Šiga sličnog toksina 1 (SLT-1A). Polinukleotid je dobijen tako da kodira aminokiselinu 1-251 iz SLT-1A (Cheung M et al., Mol Karcinom 9: 28 (2010). Jedan vezni region imunoglobulinskog tipa DCD19scFv je izveden iz humanizovanih, monoklonih antitela anti-CD19 4G7 (Peipp M et al., J Immunol Metode 285: 265-80 (2004) i reference u njima) tako da je jednolančani varijabilni fragment (scFv) kreiran sa dva imunoglobulinska varijabilna regiona (VLi VH) koji su razdvojeni uz pomoć linkera koji je poznat u stanju tehnike.
[0290] Vezni region i efektorski region Šiga toksina su povezani zajedno tako da formiraju fuzioni protein. U ovom primeru, polinukleotid kodira za efektorski region Šiga toksina iz SLT-1A (aminokiselina 1-251 iz SEKV ID BR:1) koji je kloniran u okviru sa polinukleotidom koji kodira za linker, kao što je "mišja šarka" izveden iz mišjeg IgG3 molekula (i drugih linkera koji su poznati stručnoj osobi) i u okviru sa polinukleotidom koji kodira za vezni region imunoglobulinskog tipa DCD19scFv koji obuhvata aminokiseline 269-516 iz SEKV ID BR:12. Polinukleotidna sekvenca koja kodira za citotoksični protein SLT-1A::DCD19scFv iz ovog primera je kodon optimizovan za efikasnu ekspresiju u E. coli korišćenjem usluge iz DNA 2.0, Inc. (Menlo Park, CA, U.S.).
[0291] Fuzioni protein je proizveden uz pomoć eksprimiranja polinukleotida koji kodira za citotoksični protein SLT-1A::DCD19scFv (SEKV ID BR:12). Ekspresija SLT-1A::DCD19scFv citotoksičnog proteina je ostvarena korišćenjem bakterijskog sistema koji je poznat u stanju tehnike.
[0292] U ovom primeru iz SLT-1A::DCD19scFv proizvodnja uz pomoć nekog E. coli ekspresionog sistema, polinukleotidna „insert“ sekvenca kodira za SLT-1A::DCD19scFv koji je kloniran u pTxb1 vektor (New England Biolabs, Ipswich, MA, U.S.) korišćenjem standardnih procedura da bi se proizvela polinukleotidna sekvenca koja kodira za citotoksični protein SLT-1A::DCD19scFv podvezan u okviru na polinukleotidne sekvence koje kodiraju za amino-terminalni intein na vektoru. Plazmidna inserciona polinukleotidna sekvenca je verifikovana sa Sanger sekvenciranjem (Functional Biosciences, Madison, WI, U.S.) i transformisana u T7 Shuffle® ćelije (New England Biolabs, Ipswich, MA, U.S.). SLT-1A::DCD19scFv protein je proizveden i prečišćen u skladu sa IMPACT™ (Intein posredovano prečišćavanje sa afinitetnom hitin vezujućom oznakom) sistemskim uputstvom (New England Biolabs, Ipswich, MA, U.S.).
Prečišćavanje je ostvareno korišćenjem standardnih tehnika koje su poznate u stanju tehnike, kao što je afinitetna hromatografija.
Određivanje polovine maksimalne inhibitorne koncentracije (IC50) za SLT-1A::DCD19scFv na eukariotske ribozomes in vitro
[0293] Mogućnosti inaktivacije ribozoma sa SLT-1A::DCD19scFv su određene u bezćelijskom, in vitro testu translacije proteina pomoću TNT® Quick Coupled Transcription/Translation Kit (L1170 Promega, Madison, VI, U.S.). Komplet uključuje Luciferazu T7 kontrolnu DNK i TNT® Quick Master Mix. Reakcija aktivnosti ribozoma pripremljena je u skladu sa uputstvima proizvođDča da bi se stvorila "TNT" reakciona smeša.
[0294] Serije 10-o strukih razblaženja sa SLT-1A::DCD19scFv koji treba testirati su pripremljene u odgovarajućem puferu i serije sa identičnom TNT reakcionom smešom komponenti su kreirane za svako razblaženje sa SLT-1A::DCD19scFv. Svaki uzorak u serijama razblaženja sa SLT-1A::DCD19scFv proteinom je kombinovan sa svakom od TNT reakcionih smeša zajedno sa Luciferaza T7 kontrolnom DNK. Testirani uzorci su inkubirani u toku 1.5 sata na 30°C. Nakon inkubacije, reagens iz luciferaza testa (E1483 Promega, Madison, WI, U.S.) je dodat u sve testirane uzorke i količina luciferaza protein translacija je merena pomoću luminiscencije u skladu sa uputstvima proizvođDča. Nivo inhibicije translacije je određen uz pomoć nelinearne regresione analize logtransformisanih koncentracija ukupog proteina prema jedinici relativne luminiscencije. Korišćenjem statističkog softvera (GraphPad Prism, San Diego, CA, U.S.), vrednost polovine maksimalne inhibitorne koncentracije (IC50) je izračunata za svaki uzorak.
[0295] Inhibitorni efekat za SLT-1A::DCD19scFv na sintezu bezćelijskog proteina je jak. Eksperimenti za zavisnosti od doze su odredili da IC50SLT-1A::DCD19scFv na sintezu proteina u ovom bezćelijskom testu je oko 5.2 pM (Tabela 7). Ovaj rezultat nije se bitno razlikovao od IC50koji je dobijen za protein obrnute orijentacije DCD19scFv::SLT- 1A, za koji je izmereno od oko 3.2 pM ili ekvivalentno sa SLT-1A-samo pozitivne kontrole (Tabela 7). To pokazuje da efekat „orijentacije konstrukta“ verovatno nije sličan sa bilo kojom značajnom perturbacijom enzimske aktivnosti podjedinice A Šiga toksina.
Tabela 7. Orijentacija konstrukta nije imala efekat na inaktivaciju ribozoma:
Reprezentativna polovina maksimalnih inhibitornih koncentracija (IC50) za SLT-1A::DCD19scFv u poređenju sa obrnutom orijentacijom DCD19scFv::SLT-1A
Određivanje selektivne citotoksičnosti i polovine maksimalne citotoksične koncentracije (CD50) za SLT-1A::DCD19scFv korišćenjem testa ubijanja ćelija
[0296] Citotoksične karakteristike za SLT-1A::DCD19scFv su određene uz pomoć sledećeg testa ubijanja ćelija. Ovaj test određuje kapacitet citotoksičnog proteina da ubija ćelije koje eksprimiraju ciljani biomolekul sa njihovog veznog regiona imunoglobulinskog tipa iz citotoksičnog proteina u poređenju sa ćelijama koje ne eksprimiraju ciljani biomolekul. ûelije su zasejane (2 x 10<3>ćelija po bunarčLću) u 20 mL medijuma za kultivisanje ćelija u mikrotitarskoj ploči sa 384 bunarčLća. SLT-1A::DCD19scFv protein je razblažen 10-struko u puferu i 5 mL razblaženja je dodato u ćelije. Kontrolni bunarčLći koji sadrže samo medijum za kultivisanje ćelija su korišćeni za korekciju bazne linije. Uzorci ćelija su inkubirani sa SLT-1A::DCD19scFv, ili samo sa puferom, u toku 3 dana na 37°C i pri atmosferi od 5% CO2. Ukupno preživljavanje ćelija ili procenat vijabilnosti je određen korišćenjem luminiscentnog očitavanja korišćenjem ćelijskog Titer-Glo® Luminiscentnog testiranja ćelijske vijabilnosti (G7573 Promega Madison, WI, U.S.) u skladu sa uputstvima proizvođDča. Procenat vijabilnosti u eksperimentalnim bunarčLćima je izračunata koristeći sledeću jednačinu: (RLU uzorka -Srednji medijumski RLU) / (Srednji ćelijski RLU - Srednji medijumski RLU) * 100. Log koncentracije polipeptida prema procentu vijabilnosti je konstruisan u grafikonu Prism (GraphPad Prism, San Diego, CA, U.S.) i analiza vrednost log (inhibitor) prema odgovoru (tri parametra) je korišćena da se determiniše vrednost polovine maksimalne citotoksične koncentracije (CD50) za SLT-1A::DCD19scFv.
[0297] Eksperimenti za zavisnosti od doze su odredili da CD50za SLT-1A::DCD19scFv protein je oko 0.28 nM za CD19 Daudi ćelije (Tabela 8; Slika 5). Vrednost CD50za SLT-1A-samo negativne kontrole i da isti proteinski domen koji je rekombinovan u obrnutoj orijentaciji, DCD19scFv::SLT-1A, ne može precizno biti izmeren na osnovu oblika krive. Vrednost CD50za SLT-1A::DCD19scFv za CD19 negativne U266 ćelije ne može biti izračunata zbog oblika krive; ove ćelije nisu fizički uparene sa ekstracelularnim ciljanim biomolekulom CD19. Ovi rezultati su pokazali da je specifična orijentacija proteinskog dizajniranja, gde region imunoglobulinskog tipa nije lociran proksimalno u odnosu na amino-terminus sa citotoksičnim proteinom u odnosu na navedeni efektorski region Šiga toksina, dala poboljšanje u citotoksičnosti prema CD19 ćelijama (Tabela 8; Slika 5). Razlike u ubijanju ćelija za ove citotoksične proteine nisu predvidljive na osnovu in vitro rezultata za inaktivaciju ribozoma i ne očekuje se da će biti predvidljive na osnovu karakteristika vezivanja za ciljane ćelije.
Tabela 8. Orijentacija konstrukta utiče na citotoksičnost: Reprezentativne vrednosti polovine maksimalne citotoksične koncentracijes (CD50) za SLT-1A::DCD19scFv u poređenju sa obrnutom orijentacijom DCD19scFv::SLT-1A
In vivo određivanje efekata citotoksičnog proteina SLT-1A::DCD19scFv korišćenjem životinjskih modela
[0298] Životinjski modeli su korišćeni da se odrede efekti in vivo za citotoksični protein SLT-1A::DCD19scFv na neoplastične i/ili imunske ćelije. Razni sojevi miševa su korišćeni za testiranje efekata citotoksičnog proteina nakon intravenske primene na ksenograftnim tumorima kod miševa koji su rezultat injektiranja u te miševe humanih neoplastičnih i/ili humanih imunih ćelija koje eksprimiraju CD19 na njihovoj ćelijskoj površini.
Primer 4. Vrednost CD74-ciljani, citotoksični protein koji je izveden iz A podjedinice Šiga sličnog toksina-1 (SLT- 1A::DCD74scFv)
[0299] Citotoksični protein iz ovog primera SLT-1A::DCD74scFv obuhvata fragment podjedinice A Šiga toksina koji je rekombinovan sa jednolančanim, varijabilnim fragmentom, veznog regiona koji je sposoban da vezuje CD74 sa visokim afinitetom tako da je efektorski region Šiga toksina više proksimalan u odnosu na amino-terminus sa citotoksičnog proteina nego što je CD74 vezni region.
Konstrukcija. Proizvodnja i prečišćavanje citotoksičnog proteina SLT-1A::DCD74scFv [0300] U ovom primeru, efektorski region Šiga toksina je izveden iz A podjedinice Šiga sličnog toksina 1 (SLT-1A). Polinukleotid je dobijen tako da kodira aminokiseline 1-251 iz SLT-1A (Cheung M et al., Mol Karcinom 9: 28 (2010). Jedan vezni region imunoglobulinskog tipa DCD74scFv je izveden iz humanizovanih monoklonih antitela anti-CD74, Milatuzumab (Sapra P et al., Clin Karcinom Res 11: 5257-64 (2005) i reference u njima) tako da je jednolančani varijabilni fragment (scFv) kreiran sa dva imunoglobulinska varijabilna regiona (VLi VH) koji su razdvojeni uz pomoć linkera koji je poznat u stanju tehnike.
[0301] Vezni region i efektorski region Šiga toksina su povezani zajedno tako da formiraju fuzioni protein. U ovom primeru, polinukleotid koji kodira za efektorski region Šiga toksina iz SLT-1A (aminokiseline 1-251 iz SEKV ID BR:1) je kloniran u okviru sa polinukleotidom koji kodira za linker, kao što je "mišja šarka" koji je izveden iz mišjeg IgG3 molekula (i drugih linkera koji su poznati stručnoj osobi) i u okviru sa polinukleotidom koji kodira za vezni region imunoglobulinskog tipa DCD74scFv koji obuhvata aminokiseline 269-518 iz SEKV ID BR:16. Polinukleotidna sekvenca koja kodira za citotoksični protein SLT-1A::DCD74scFv iz ovog primera je kodon optimizovana za efikasnu ekspresiju u E. coli korišćenjem usluge iz DNA 2.0, Inc.
(Menlo Park, CA, U.S.).
[0302] Fuzioni protein je proizveden uz pomoć eksprimiranja polinukleotida koji kodira za citotoksični protein SLT- 1A::DCD74scFv (SEKV ID BR:16). Ekspresija SLT-1A::DCD74scFv citotoksičnog proteina je ostvarena korišćenjem bakterijskog sistema koji je poznat u stanju tehnike.
[0303] U ovom primeru za SLT-1A::DCD74scFv proizvodnja uz pomoć nekog E. coli ekspresionog sistema, polinukleotidna „insert“ sekvenca koja kodira za SLT-1A::DCD74scFv je klonirana u pTxb1 vektor (New England Biolabs, Ipswich, MA, U.S.) korišćenjem standardnih procedura da bi se proizvela polinukleotidna sekvenca koja kodira za citotoksični protein SLT-1A::DCD74scFv podvezan u okviru na polinukleotidne sekvence koje kodiraju za amino-terminalni intein na vektoru. Plazmidna inserciona polinukleotidna sekvenca je verifikovana sa Sanger sekvenciranjem (Functional Biosciences, Madison, WI, U.S.) i transformisana u T7 Shuffle® ćelije (New England Biolabs, Ipswich, MA, U.S.). SLT-1A::DCD74scFv protein je proizveden i prečišćen u skladu sa IMPACT™ (Intein posredovano prečišćavanje sa afinitetnom hitin vezujućom oznakom) sistemskim uputstvom (New England Biolabs, Ipswich, MA, U.S.). Prečišćavanje je ostvareno korišćenjem standardnih tehnika koje su poznate u stanju tehnike, kao što je afinitetna hromatografija.
Određivanje polovine maksimalne inhibitorne koncentracije (IC50) za SLT-1A::DCD74scFv na eukariotske ribozome in vitro
[0304] Mogućnosti inaktivacije ribozoma sa SLT-1A::DCD74scFv su određene u bezćelijskom, in vitro testu translacije proteina pomoću TNT® Quick Coupled Transcription/Translation Kit (L1170 Promega, Madison, WI, U.S.). Komplet uključuje Luciferazu T7 kontrolnu DNK i TNT® Quick Master Mix. Reakcija aktivnosti ribozoma pripremljena je u skladu sa uputstvima proizvođDča da bi se stvorila „TNT“ reakciona smeša.
[0305] Serije 10-o strukih razblaženja sa SLT-1A::DCD74scFv koji treba testirati su pripremljene u odgovarajućem puferu i serije sa identičnom TNT reakcionom smešom komponenti je kreirana za svako razblaženje sa SLT-1A::DCD74scFv. Svaki uzorak u serijama razblaženja sa SLT-1A::DCD74scFv proteinom je kombinovan sa svakom od TNT reakcionih smeša zajedno sa Luciferaza T7 kontrolnom DNK. Testirani uzorci su inkubirani u toku 1.5 sata na 30°C. Nakon inkubacije, reagens iz luciferaza testa (E1483 Promega, Madison, WI, U.S.) je dodat u sve testirane uzorke i količina luciferaza protein translacija je merena pomoću luminiscencije u skladu sa uputstvima proizvođDča. Nivo inhibicije translacije je određen uz pomoć nelinearne regresione analize logtransformisanih koncentracija ukupog proteina prema jedinici relativne luminiscencije. Korišćenjem statističkog softvera (GraphPad Prism, San Diego, CA, U.S.), vrednost polovine maksimalne inhibitorne koncentracije (IC50) je izračunata za svaki uzorak.
[0306] Inhibitorni efekat za SLT-1A::DCD74scFv na sintezu bezćelijskog proteina je jak. Eksperimenti za zavisnosti od doze su odredili da vrednost IC50SLT-1A::DCD74scFv na sintezu proteina u ovom bezćelijskom testu je oko 8.7 pM (Tabela 9). Ovaj rezultat nije se bitno razlikovao od vrednosti IC50koji je dobijen za protein obrnute orijentacije DCD74scFv::SLT-1A, za koji je izmerena vrednost od oko 3.6 pM ili ekvivalentno sa SLT-1A-samo pozitivne kontrole (Tabela 9). To pokazuje da efekti „orijentacije konstrukta“ verovatno nisu slični sa bilo kojom značajnom perturbacijom enzimske aktivnosti podjedinice A Šiga toksina.
Tabela 9. Orijentacija konstrukta nije imala efekat na inaktivaciju ribozoma:
Reprezentativna polovina maksimalne inhibitorne koncentracijes (IC50) za SLT-1A::DCD74scFv u poređenju sa obrnutom orijentacijom DCD74scFv::SLT-1A
Određivanje selektivne citotoksičnosti i polovine maksimalne citotoksične koncentracije (CD50) za SLT-1A::DCD74scFv korišćenjem testa ubijanja ćelija
[0307] Citotoksične karakteristike za SLT-1A::DCD74scFv su određene uz pomoć sledećeg testa ubijanja ćelija. Ovaj test određuje kapacitet citotoksičnog proteina da ubija ćelije koje eksprimiraju ciljani biomolekul sa njihovog veznog regiona imunoglobulinskog tipa iz citotoksičnog proteina u poređenju sa SLT-1A proteinom koji ne poseduje vezni region. ûelije su zasejane (2 x 10<3>ćelija po bunarčLću) u 20 mL medijuma za kultivisanje ćelija u mikrotitarskoj ploči sa 384 bunarčLća. SLT-1A::DCD74scFv protein je razblažen 10-ostruko u puferu i 5 mL razblaženja je dodato u ćelije. Kontrolni bunarčLći koji sadrže samo medijum za kultivisanje ćelija su korišćeni za korekciju bazne linije. Uzorci ćelija su inkubirani sa SLT-1A::DCD74scFv, ili samo sa puferom, u toku 3 dana na 37°C i pri atmosferi od 5% CO2. Ukupno preživljavanje ćelija ili procenat vijabilnosti je određen korišćenjem luminiscentnog očitavanja korišćenjem ćelijskog Titer-Glo® Luminiscentnog testiranja ćelijske vijabilnosti (G7573 Promega Madison, WI, U.S.) u skladu sa uputstvima proizvođDča. Procenat vijabilnosti u eksperimentalnim bunarčLćima je izračunata koristeći sledeću jednačinu: (RLU uzorka -Srednji medijumski RLU) / (Srednji ćelijski RLU - Srednji medijumski RLU) * 100. Log koncentracije polipeptida prema procentu vijabilnosti je konstruisan u grafikonu Prism (GraphPad Prism, San Diego, CA, U.S.) i analiza vrednosti log (inhibitor) prema odgovoru (tri parametra) je korišćena da se determiniše vrednost polovine maksimalne citotoksične koncentracije (CD50) za SLT- 1A::DCD74scFv.
[0308] Eksperimenti za zavisnosti od doze su odredili da vrednost CD50za SLT-1A::DCD74scFv protein je oko 18.7 nM za CD74 Daudi ćelije (Tabela 10; Slika 6). Vrednost CD50za SLT-1A-samo negativnu kontrolu je 2026 nM i da za isti proteinski domen koji je rekombinovan u obrnutoj orijentaciji, DCD74scFv::SLT-1A, je 95.3 nM (Tabela 10; Slika 6). Ovo je pokazalo da je određena orijentacija dizajniranja citotoksičnog proteina, gde region imunoglobulinskog tipa nije lociran proksimalno u odnosu na aminoterminus sa citotoksičnim proteinom u odnosu na navedeni efektorski region Šiga toksina, dovela do poboljšanja citotoksičnosti prema CD74+ ćelijama. Razlike u ubijanju ćelija za ove citotoksične proteine nisu predvidljive na osnovu in vitro rezultata za inhibiciju sinteze proteina i nije očekivano da će biti predvidljive na osnovu karakteristika vezivanja ciljane ćelije.
Tabela 10. Orijentacija konstrukta utiče na citotoksičnost: Reprezentativne vrednosti polovine maksimalne citotoksične koncentracijes (CD50) za SLT-1A::DCD74scFv u poređenju sa obrnutom orijentacijom DCD74scFv::SLT-1A
In vivo određivanje efekata citotoksičnog proteina SLT-1A::DCD74scFv korišćenjem životinjskih modela
[0309] Životinjski modeli su korišćeni da se odrede efekti in vivo za citotoksični protein SLT-1A::DCD74scFv na CD74+ neoplastične i/ili imunske ćelije. Razni sojevi miševa su korišćeni za testiranje efekata citotoksičnog proteina nakon intravenske primene na ksenograftnim tumorima kod miševa koji su rezultat injektiranja u te miševe humanih neoplastičnih i/ili humanih imunih ćelija koje eksprimiraju CD74 na njihovoj ćelijskoj površini.
Rezime
[0310] Kada su testirana četiri različita citotoksičnog proteina koji obuhvataju regione izvedene iz podjedinice A Šiga toksina i ciljane regione koji su izvedeni iz imunoglobulina na njihovim amino-terminusima, ovi proteini nisu pokazali očekivanu citotoksičnost predviđenu njihovim in vitro karakteristikama inaktivacije ribozoma i/ili ciljnog vezivanja. Iznenađujuće je uočeno da povezivanje heterolognih veznih regiona proksimalno u odnosu na aminoterminus proteinske fuzije koja obuhvata jedan efektorski region Šiga toksina nije rezultiralo snažnom citotoksičnošću u poređenju sa ista dva polipeptidna regiona povezana u obrnutoj orijentaciji.
Primer 5. Citotoksični protein izveden iz A podjedinice Šiga sličnog toksina-1 i antitela DEpstejn-Bar antigena
[0311] U ovom primeru, efektorski region Šiga toksina je izveden iz A podjedinice Šiga sličnog toksina 1 (SLT-1A). Jedan vezni region imunoglobulinskog tipa DEpstejn-Barantigen je izveden iz monoklonih antitela prema Epstejn Barr antigenu (Fang C et al., J Immunol Metode 287: 21-30 (2004)), koji obuhvata jedan vezni region imunoglobulinskog tipa koji je sposoban da vezuje humane ćelije inficirane sa EpstejnBar-ovim virusom ili transformisane ćelije koje eksprimiraju Epstejn-Bar antigen.
Epstejn-Bar-ov antigen je eksprimiran u višestrukim ćelijskim tipovima, kao što su ćelije inficirane sa Epstejn-Bar virusom i ćelije karcinom (na pr. ćelije limfoma i nazofaringealnog karcinoma). Pored toga, Epstejn-Bar-ova infekcija je udružena sa drugim bolestima, na pr., multiplom sklerozom.
Konstrukcija. Proizvodnja i prečišćavanje citotoksičnog proteina SLT-1A::DEpstejnBar [0312] Vezni region imunoglobulinskog tipa DEpstejn-Bar-antigena i efektorski region Šiga toksina su povezani zajedno tako da formiraju protein u kome vezni region imunoglobulinskog tipa nije lociran proksimalno u odnosu na proteinski amino-terminus u poređenju sa efektorskim regionom Šiga toksina. Na primer, fuzioni protein je proizveden uz pomoć eksprimiranja polinukleotida koji kodira za DEpstejn-Bar-antigen vezujući protein SLT-1A::D Epstejn Bar. Ekspresija SLT-1A::DEpstejnBar citotoksični protein je ostvarena korišćenjem bilo bakterijskih i/ili bezćelijskih, proteinskih traslacionih sistema kao što je opisano u prethodnim primerima.
In vitro određivanje karakteristika citotoksičnog proteina SLT-1A::DEpstejnBar [0313] Vezujuće karakteristike za citotoksični protein iz ovog primera za Epstejn-Bar antigen pozitivne ćelije i Epstejn-Bar antigen negativne ćelije su određene uz pomoć testa protočne citometrije zasnovane na fluorescenciji kao što je opisano ranije u prethodnim primerima. Bmaxza SLT-1A::DEpstejnBar na Epstejn-Bar antigen pozitivne ćelije je izmereno da je približno 50,000-200,000 MFI sa KDu okviru opsega od 0.01-100 nM, gde nije bilo značajnog vezivanja za Epstejn-Bar antigen negativne ćelije u ovom testiranju.
[0314] Sposobnosti inaktivacije ribozoma za SLT-1A::DEpstejnBar citotoksični protein su određene u bezćelijskoj, in vitro proteinskoj translaciji kao što je opisano ranije u prethodnim primerima. Inhibitorni efekat citotoksičnog proteina iz ovog primera na sintezu bezćelijskog proteina je značajan. Vrednost IC50za SLT-1A::DEpstejnBar na sintezu proteina u ovom bezćelijskom testu je približno 0.1-100 pM.
Određivanje citotoksičnosti za citotoksični protein SLT-1A::DEpstejnBar korišćenjem testa ubijanja ćelija
[0315] Citotoksične karakteristike za SLT-1A::DEpstejnBar su određene uz pomoć opšteg testa ubijanja ćelija kao što je opisano ranije u prethodnim primerima korišćenjem Epstejn-Bar antigen pozitivne ćelije. Pored toga, karakteristike selektivne citotoksičnosti za SLT-1A::DEpstejnBar su određene uz pomoć istog opšteg testa ubijanja ćelija korišćenjem Epstejn-Bar antigen negativne ćelije u poređenju sa Epstejn-Bar antigen pozitivnim ćelijama. Vrednost CD50za citotoksični protein iz ovog primera je približno 0.01-100 nM za Epstejn-Bar antigen pozitivne ćelije u zavisnosti od ćelijske linije.
Vrednost CD50za citotoksični protein je približno 10-10,000 puta veća (manja citotoksičnost) za ćelije koje ne eksprimiraju Epstejn-Bar antigen na ćelijskoj površini u poređenju sa ćelijama koje eksprimiraju Epstejn-Bar antigen na ćelijskoj površini.
In vivo određivanje efekata citotoksičnog proteina SLT-1A::DEpstejnBar korišćenjem životinjskih modela
[0316] Životinjski modeli su korišćeni da se odrede efekti in vivo za citotoksični protein SLT-1A::DEpstejnBar na neoplastičnim ćelijama. Razni sojevi miševa su korišćeni za testiranje efekata citotoksičnog proteina nakon intravenske primene na ksenograftnim tumorima kod miševa koji su rezultat injektiranja u te miševe humanih neoplastičnih ćelija koje eksprimiraju Epstejn-Bar antigeni na njihovoj ćelijskoj površinis.
Primer 6. Citotoksični protein koji je izveden iz A podjedinice Šiga sličnog toksina-1 i antitelo DLajšmanija-antigena
[0317] U ovom primeru, efektorski region Šiga toksina je izveden iz A podjedinice Šiga sličnog toksina 1 (SLT-1A). Jedan vezni region imunoglobulinskog tipa DLajšmanijaantigena je izveden iz nekog antitela koje je generisano, korišćenjem tehnika koje su poznate u stanju tehnike, na antigen Lajšmanija koji se nalazi na površini ćelije i koji je prisutan na humanim ćelijama koje nakupljaju unutarćelijske tripanozomatidne protozoe (videti Berman J, Dwyer D, Clin Exp Immunol 44: 342-348 (1981); Kenner J et al., J Cutan Pathol 26: 130-6 (1999); Silveira T et al., Int J Parasitol 31: 1451-8 (2001)).
Konstrukcija. Proizvodnja i prečišćavanje citotoksičnog proteina SLT-1A::DLajšmanija [0318] Vezni region imunoglobulinskog tipa D-Lajšmanija-antigen i efektorski region Šiga toksina su povezani zajedno tako da formiraju protein u kome vezni region imunoglobulinskog tipa nije lociran proksimalno u odnosu na proteinski amino-terminus u poređenju sa efektorskim regionom Šiga toksina. Na primer, fuzioni protein je proizveden uz pomoć eksprimiranja polinukleotida koji kodira za Lajšmanija-antigenvezujući protein SLT-1A::DLajšmanija. Ekspresija SLT-1A::DLajšmanija citotoksičnog proteina je ostvarena korišćenjem bilo bakterijskih i/ili bezćelijskih, proteinskih traslacionih sistema kao što je opisano u prethodnim primerima.
In vitro određivanje karakteristika citotoksičnog proteina SLT-1A::DLajšmanija [0319] Vezujuće karakteristike za citotoksični protein iz ovog primera za Lajšmanija antigen pozitivne ćelije i Lajšmanija antigen negativne ćelije, su određene uz pomoć testa protočne citometrije zasnovane na fluorescenciji kao što je opisano ranije u prethodnim primerima. Vrednost Bmaxza SLT-1A::DLajšmanija na Lajšmanija antigen pozitivne ćelije je izmereno da je približno 50,000-200,000 MFI sa KDu okviru opsega od 0.01-100 nM, gde nije bilo značajnog vezivanja za Lajšmanija antigen negativne ćelije u ovom testiranju.
[0320] Sposobnosti inaktivacije ribozoma za SLT-1A::DLajšmanija citotoksične proteine su određene u bezćelijskoj, in vitro proteinskoj translaciji kao što je opisano ranije u prethodnim primerima. Inhibitorni efekat citotoksičnog proteina iz ovog primera na sintezu bezćelijskog proteina je značajan. Vrednost IC50za SLT-1A::DLajšmanija na sintezu proteina u ovom bezćelijskom testu je približno 0.1-100 pM.
Određivanje citotoksičnosti za citotoksični protein SLT-1A::DLajšmanija korišćenjem testa ubijanja ćelija
[0321] Citotoksične karakteristike za SLT-1A::DLajšmanija su određene uz pomoć opšteg testa ubijanja ćelija kao što je opisano ranije u prethodnim primerima korišćenjem Lajšmanija antigen pozitivne ćelije. Pored toga, karakteristike selektivne citotoksičnosti za SLT-1A::DLajšmanija su određene uz pomoć istog opšteg testa ubijanja ćelija korišćenjem Lajšmanija antigen negativne ćelije u poređenju sa Lajšmanija antigen pozitivne ćelije. Vrednost CD50za citotoksični protein iz ovog primera je približno 0.01-100 nM za Lajšmanija antigen pozitivne ćelije u zavisnosti od ćelijske linije. Vrednost CD50za citotoksični protein je približno 10-10,000 puta veća (manja citotoksičnost) za ćelije koje ne eksprimiraju Lajšmanija antigen na ćelijskoj površini u poređenju sa ćelijama koje eksprimiraju Lajšmanija antigen na ćelijskoj površini.
Primer 7. Citotoksični protein koji je izveden iz A podjedinice Šiga sličnog toksina-1 i vezni region imunoglobulinskog tipa DNeurotenzin-Receptor
[0322] U ovom primeru, efektorski region Šiga toksina je izveden iz A podjedinice Šiga sličnog toksina 1 (SLT-1A). Jedan vezni region imunoglobulinskog tipa DNeurotenzin-Receptor je izveden iz DARPin™ (GenBank Accession: 2P2C_R) ili iz monoklonih antitela (Ovigne J et al., Neuropeptidi 32: 247-56 (1998)) koja vezuju humanineurotenzin receptor. Neurotenzin receptor je eksprimiran uz pomoć različitih ćelija karcinoma, kao što je rak dojke, rak debelog creva, rak pluća, melanom i karcinom ćelija pankreasa.
Konstrukcija. Proizvodnja i prečišćavanje citotoksičnog proteina SLT-1A::DNeurotenzinR
[0323] Vezni region imunoglobulinskog tipa DNeurotenzinR i efektorski region Šiga toksina su povezani zajedno tako da formiraju protein u kome vezni region imunoglobulinskog tipa nije lociran proksimalno u odnosu na proteinski amino-terminus u poređenju sa efektorskim regionom Šiga toksina. Na primer, fuzioni protein je proizveden uz pomoć eksprimiranja polinukleotida koji kodira za neurotenzin-receptorvezujući protein SLT-1A::DNeurotenzinR. Ekspresija SLT-1A::DNeurotenzinR citotoksičnog proteina je ostvarena korišćenjem bilo bakterijskih i/ili bezćelijskih, proteinskih traslacionih sistema kao što je opisano u prethodnim primerima.
In vitro određivanje karakteristika citotoksičnog proteina SLT-1A::DNeurotenzinR [0324] Vezujuće karakteristike za citotoksični protein iz ovog primera za neurotenzin receptor pozitivne ćelije i neurotenzin receptor negativne ćelije su određene uz pomoć testa protočne citometrije zasnovane na fluorescenciji kao što je opisano ranije u prethodnim primerima. Vrednost Bmaxza SLT-1A::DNeurotenzinR na neurotenzin receptor pozitivne ćelije je izmereno da je približno 50,000-200,000 MFI sa KDu okviru opsega od 0.01-100 nM, gde nije bilo značajnog vezivanja za neurotenzin receptor negativne ćelije u ovom testiranju.
[0325] Sposobnosti inaktivacije ribozoma za SLT-1A::DNeurotenzinR citotoksičnog proteina su određene u bezćelijskoj, in vitro proteinskoj translaciji kao što je opisano ranije u prethodnim primerima. Inhibitorni efekat citotoksičnog proteina iz ovog primera na sintezu bezćelijskog proteina je značajan. Vrednost IC50za SLT-1A::DNeurotenzinR na sintezu proteina u ovom bezćelijskom testu je približno 0.1-100 pM.
Određivanje citotoksičnosti za citotoksični protein SLT-1A::DNeurotenzinR korišćenjem testa ubijanja ćelija
[0326] Citotoksične karakteristike za SLT-1A::DNeurotenzinR su određene uz pomoć opšteg testa ubijanja ćelija kao što je opisano ranije u prethodnim primerima korišćenjem neurotenzin receptor pozitivne ćelije. Pored toga, karakteristike selektivne citotoksičnosti za SLT-1A::DNeurotenzinR su određene uz pomoć istog opšteg testa ubijanja ćelija korišćenjem neurotenzin receptor negativne ćelije u poređenju sa neurotenzin receptor pozitivnom ćelijom. Vrednost CD50za citotoksični protein iz ovog primera je približno 0.01-100 nM za neurotenzin receptor pozitivne ćelije u zavisnosti od ćelijske linije.
Vrednost CD50za citotoksični protein je približno 10-10,000 puta veća (manja citotoksičnost) za ćelije koje ne eksprimiraju neurotenzin receptor na ćelijskoj površini u poređenju sa ćelijama koje eksprimiraju neurotenzin receptor na ćelijskoj površini.
In vivo određivanje efekata citotoksičnog proteina SLT-1A::DNeurotenzinR korišćenjem životinjskih modela
[0327] Životinjski modeli su korišćeni da se odrede efekti in vivo za citotoksični protein SLT-1A::DNeurotenzinR na neoplastičnim ćelijama. Razni sojevi miševa su korišćeni za testiranje efekata citotoksičnog proteina nakon intravenske primene na ksenograftnim tumorima kod miševa koji su rezultat injektiranja u te miševe humanih neoplastičnih ćelija koje eksprimiraju neurotenzin receptore na njihovoj ćelijskoj površini.
Primer 8. Citotoksični protein koji je izveden iz A podjedinice Šiga sličnog toksina-1 i jedan vezni region imunoglobulinskog tipa DEGFR
[0328] U ovom primeru, efektorski region Šiga toksina je izveden iz A podjedinice Šiga sličnog toksina 1 (SLT-1A). Jedan vezni region imunoglobulinskog tipa DEGFR je izveden iz AdNectin™ (GenBank Accession: 3QWQ_B), Affibody™ (GenBank Accession: 2KZI_A; U.S. patent 8,598,113), ili nekog antitela, od kojih svaki vezuje jedan ili više receptora humanog epidermalnog faktora rasta. Eksprimiranja receptora epidermalnog faktora rasta su povezane sa humanim ćelijama karcinoma, kao što su, na pr., ćelije tumora pluća, ćelije tumora dojke, i ćelije tumora debelog creva.
Konstrukcija. Proizvodnja i prečišćavanje citotoksičnog proteina SLT-1A::DEGFR [0329] Vezni region imunoglobulinskog tipa DEGFR i efektorski region Šiga toksina su povezani zajedno tako da formiraju protein u kome vezni region imunoglobulinskog tipa nije lociran proksimalno u odnosu na proteinski amino-terminus u poređenju sa efektorskim regionom Šiga toksina. Na primer, fuzioni protein je proizveden uz pomoć eksprimiranja polinukleotida koji kodira za EGFR vezujući protein SLT-1A::DEGFR. Ekspresija SLT-1A::DEGFR citotoksičnog proteina je ostvarena korišćenjem bilo bakterijskih i/ili bezćelijskih, proteinskih traslacionih sistema kao što je opisano u prethodnim primerima.
In vitro određivanje karakteristika citotoksičnog proteina SLT-1A::DEGFR
[0330] Vezujuće karakteristike za citotoksični protein iz ovog primera za EGFR+ ćelije i EGFR- ćelije su određene uz pomoć testa protočne citometrije zasnovane na fluorescenciji kao što je opisano ranije u prethodnim primerima. Vrednost Bmaxza SLT-1A::DEGFR na EGFR+ ćelije je izmereno da je približno 50,000-200,000 MFI sa KDu okviru opsega od 0.01-100 nM, gde nije bilo značajnog vezivanja za EGFR- ćelije u ovom testiranju.
[0331] Sposobnosti inaktivacije ribozoma sa SLT-1A::DEGFR citotoksičnim proteinom su određene u bezćelijskoj, in vitro proteinskoj translaciji kao što je opisano ranije u prethodnim primerima. Inhibitorni efekat citotoksičnog proteina iz ovog primera na sintezu bezćelijskog proteina je značajan. Vrednost IC50za SLT-1A::DEGFR na sintezu proteina u ovom bezćelijskom testu je približno 0.1-100 pM.
Određivanje citotoksičnosti za citotoksični protein SLT-1A::DEGFR korišćenjem testa ubijanja ćelija
[0332] Citotoksične karakteristike za SLT-1A::DEGFR su određene uz pomoć opšteg testa ubijanja ćelija kao što je opisano ranije u prethodnim primerima korišćenjem EGFR+ ćelije. Pored toga, karakteristike selektivne citotoksičnosti za SLT-1A::DEG-FR su određene uz pomoć istog opšteg testa ubijanja ćelija korišćenjem EGFR- ćelije u poređenju sa Lajšmanija antigen pozitivnom ćelijom. Vrednost CD50za citotoksični protein iz ovog primera je približno 0.01-100 nM za EGFR+ ćelije u zavisnosti od ćelijske linije. Vrednost CD50za citotoksični protein je približno 10-10,000 puta veća (manja citotoksičnost) za ćelije koje ne eksprimiraju EGFR na ćelijskoj površini u poređenju sa ćelijama koje eksprimiraju EGFR na ćelijskoj površini.
In vivo određivanje efekata citotoksičnog proteina SLT-1A::DEGFR korišćenjem životinjskih modela
[0333] Životinjski modeli su korišćeni da se odrede efekti in vivo za citotoksični protein SLT-1A::DEGFR na neoplastičnim ćelijama. Razni sojevi miševa su korišćeni za testiranje efekata citotoksičnog proteina nakon intravenske primene na ksenograftnim tumorima kod miševa koji su rezultat injektiranja u te miševe humanih neoplastičnih ćelija koje eksprimiraju EGFR(s) na njihovoj ćelijskoj površinis.
Primer 9. Citotoksični protein koji je izveden iz A podjedinice Šiga sličnog toksina-1 i antitelo DCCR5
[0334] U ovom primeru, efektorski region Šiga toksina je izveden iz A podjedinice Šiga sličnog toksina 1 (SLT-1A). Jedan vezni region imunoglobulinskog tipa DCCR5 je izveden iz monoklonih antitela prema humanom CCR5 (CD195) (Bernstone L et al., Hybridoma 31: 7-19 (2012)). CCR5 je dominantno eksprimiran na T-ćelijama, makrofagima, dendritičnim ćelijama i mikroglijama. Pored toga, CCR5 ima ulogu u patogenezi i širenju virusa humane imunodeficijencije (HIV).
Konstrukcija. Proizvodnja i prečišćavanje citotoksičnog proteina SLT-1A::DCCR5
[0335] Vezni region imunoglobulinskog tipa DCCR5 i efektorski region Šiga toksina su povezani zajedno tako da formiraju protein u kome vezni region imunoglobulinskog tipa nije lociran proksimalno u odnosu na proteinski amino-terminus u poređenju sa efektorskim regionom Šiga toksina. Na primer, fuzioni protein je proizveden uz pomoć eksprimiranja polinukleotida koji kodira za DCCR5-vezujući protein SLT-1A::DCCR5. Ekspresija SLT-1A::DCCR5 citotoksičnog proteina je izvedena korišćenjem bilo bakterijskih i/ili bezćelijskih, proteinskih traslacionih sistema kao što je opisano u prethodnim primerima.
In vitro određivanje karakteristika citotoksičnog proteina SLT-1A::DCCR5
[0336] Vezujuće karakteristike za citotoksični protein iz ovog primera za CCR5+ ćelije i CCR5- ćelije su određene uz pomoć testa protočne citometrije zasnovane na fluorescenciji kao što je opisano ranije u prethodnim primerima. Vrednost Bmaxza SLT-1A::DCCR5 na CCR5+ pozitivne ćelije je izmereno da je približno 50,000-200,000 MFI sa KDu okviru opsega od 0.01-100 nM, gde nije bilo značajnog vezivanja za CCR5- ćelije u ovom testiranju.
[0337] Sposobnosti inaktivacije ribozoma sa SLT-1A::DCCR5 citotoksičnim proteinom su određene u bezćelijskoj, in vitro proteinskoj translaciji kao što je opisano ranije u prethodnim primerima. Inhibitorni efekat citotoksičnog proteina iz ovog primera na sintezu bezćelijskog proteina je značajan. Vrednost IC50za SLT-1A::DCCR5 na sintezu proteina u ovom bezćelijskom testu je približno 0.1-100 pM.
Određivanje citotoksičnosti za citotoksični protein SLT-1A::DCCR5 korišćenjem testa ubijanja ćelija
[0338] Citotoksične karakteristike za SLT-1A::DCCR5 su određene uz pomoć opšteg testa ubijanja ćelija kao što je opisano ranije u prethodnim primerima korišćenjem CCR5+ ćelije. Pored toga, karakteristike selektivne citotoksičnosti za SLT- 1A::DCCR5 su određene uz pomoć istog opšteg testa ubijanja ćelija korišćenjem CCR5- ćelija u poređenju sa CCR5+ ćelijama. Vrednost CD50za citotoksični protein iz ovog primera je približno 0.01-100 nM za CCR5+ ćelije u zavisnosti od ćelijske linije. Vrednost CD50za citotoksični protein je približno 10-10,000 puta veća (manja citotoksičnost) za ćelije koje ne eksprimiraju CCR5 na ćelijskoj površini u poređenju sa ćelijama koje eksprimiraju CCR5 na ćelijskoj površini.
In vivo određivanje efekata citotoksičnog proteina SLT-1A::DCCR5 korišćenjem životinjskih modela
[0339] Životinjski modeli su korišćeni da se odrede efekti in vivo za citotoksični protein SLT-1A::DCCR5 na iscrpljivanje T-ćelija iz donorskih materijala (videti Tsirigotis P et al., Immunotherapy 4: 407-24 (2012)). Ne-humani primati se koriste da bi se odredili efekti in vivo za SLT-1A::DCCR5. Bolest graft-prema-domaćinu analizira se u rezus makakuima nakon transplantacije bubrega kada se donirani organi prethodno tretiraju sa SLT-1A::DCCR5 (videti Weaver T et al., Nat Med 15: 746-9 (2009)). In vivo iscrpljivanje T limfocita periferne krvi kod primata cinomolga primećuje se nakon parenteralne primene različitih doza sa SLT-1A::DCCR5. Korišćenje SLT-1A::DCCR5 da blokira HIV infekciju je testirano davanjem akutne doze SLT-1A::DCCR5 nehumanim primatima kako bi se ozbiljno iscrpele T-ćelije u cirkulaciji nakon izlaganja virusu imunodeficijencije simija (SIV) (videti Sellier P et al., PLoS One 5: e10570 (2010)).
Primer 10. Citotoksični protein koji je izveden iz A podjedinice Šiga toksina i anti-Env imunoglobulinski domen
[0340] U ovom primeru, efektorski region Šiga toksina je izveden iz A podjedinice Šiga toksina (Stx-A). Jedan vezni region imunoglobulinskog tipa DEnv je izveden iz postojećih antitela koja vezuju glikoprotein HIV omotača (Env), kao što je GP41, GP120, GP140, ili GP160 (videti na pr. Chen W et al., J Mol Bio 382: 779-89 (2008); Chen W et al., Expert Opin Biol Ther 13: 657-71 (2013); van den Kerkhof T et al., Retrovirology 10: 102 (2013) ili iz antitela koja su generisana korišćenjem standardnih tehnika (videti Prabakaran P et al., Front Microbiol 3: 277 (2012)). Env-i su HIV površinski proteini koji se takođe prikazuje na ćelijskim površinskima HIV-inficirane ćelije tokom replikacije HIV-a. Iako se Env-i eksprimiraju u zaraženim ćelijama pretežno u endozomskim odeljcima, dovoljne količine Env-a mogu biti prisutne na površini ćelije da bi bile ciljane visoko potentnim citotoksičnim proteinom. Pored toga, Env-ciljani citotoksični proteini mogu da vežu HIV virione i da uđu u novoinficirane ćelije tokom fuzije viriona sa ćelijom domaćina.
[0341] Budući da HIV pokazuje visoku stopu mutacije, poželjno je koristiti domen imunoglobulina koji veže funkcionalno ograničeni deo Env, kao što je prikazano sa široko neutralizujućim antitelima koja vezuju Env-e iz multiplih sojeva HIV-a (van den Kerkhof T et al., Retrovirology 10: 102 (2013)). Budući da se veruje da Env-i prisutni na površini zaražene ćelije predstavljaju sterički ograničene epitope (Chen W et al., J Virol 88: 1125-39 (2014)), poželjno je koristiti vezne regione manje od 100 kD i idealno manje od 25 kD, kao što su fragmenti sdAbs poput VHH domena.
Konstrukcija. Proizvodnja i prečišćavanje citotoksičnog proteina DEnv::SLT-1A [0342] Vezni region imunoglobulinskog tipa DEnv i efektorski region Šiga toksina su povezani zajedno tako da formiraju citotoksični protein. Na primer, fuzioni protein je proizveden uz pomoć eksprimiranja polinukleotida koji kodira za DEnv vezujući protein SLT-1A::DEnv. Ekspresija SLT-1A::DEnv citotoksičnog proteina je ostvarena korišćenjem bilo bakterijskih i/ili bezćelijskih, proteinskih traslacionih sistema kao što je opisano u prethodnim primerima.
In vitro određivanje karakteristika citotoksičnog proteina SLT-1A::DEnv
[0343] Vezujuće karakteristike za citotoksični protein iz ovog primera za Env+ ćelije i Env- ćelije su određene uz pomoć testa protočne citometrije zasnovane na fluorescenciji kao što je opisano ranije u prethodnim primerima. Vrednost Bmaxza SLT-1A::DEnv na Env+ pozitivne ćelije je izmereno da je približno 50,000-200,000 MFI sa KDu okviru opsega od 0.01-100 nM, gde nije bilo značajnog vezivanja za Env- ćelije u ovom testiranju.
[0344] Sposobnosti inaktivacije ribozoma sa SLT-1A::DEnv citotoksičnim proteinom su određene u bezćelijskoj, in vitro proteinskoj translaciji kao što je opisano ranije u prethodnim primerima. Inhibitorni efekat citotoksičnog proteina iz ovog primera na sintezu bezćelijskog proteina je značajan. Vrednost IC50za SLT-1A::DEnv na sintezu proteina u ovom bezćelijskom testu je približno 0.1-100 pM.
Određivanje citotoksičnosti za citotoksični protein SLT-1A::DEnv korišćenjem testa ubijanja ćelija
[0345] Citotoksične karakteristike za SLT-1A::DEnv su određene uz pomoć opšteg testa ubijanja ćelija kao što je opisano ranije u prethodnim primerima korišćenjem Env+ ćelija. Pored toga, karakteristike selektivne citotoksičnosti za SLT-1A::DEnv su određene uz pomoć istog opšteg testa ubijanja ćelija korišćenjem Env- ćelija u poređenju sa Env+ ćelijama. Vrednost CD50za citotoksični protein iz ovog primera je približno 0.01-100 nM za Env+ ćelije u zavisnosti od ćelijske linije i/ili HIV soja koji je korišćen za inficiranje ćelija da bi postale Env+. Vrednost CD50za citotoksični protein je približno 10-10,000 puta veća (manja citotoksičnost) za ćelije koje ne eksprimiraju Env na ćelijskoj površini u poređenju sa ćelijama koje eksprimiraju Env na ćelijskoj površini.
In vivo određivanje efekata citotoksičnog proteina SLT-1A::DEnv korišćenjem životinjskih modela
[0346] Korišćenje SLT-1A::DEnv za inhibiciju HIV infekcija je testirano uz pomoć administriranja SLT-1A::DEnv kod ne-humanih primata koji su inficirani sa virusom imunodeficijencije simija (SIV) i (videti Sellier P et al., PLoS One 5: e10570 (2010)).
Primer 11. Citotoksični protein koji je izveden iz A podjedinice Šiga sličnog toksina-1 i antitelo DUL18
[0347] U ovom primeru, efektorski region Šiga toksina je izveden iz A podjedinice Šiga sličnog toksina 1 (SLT-1A). Jedan vezni region imunoglobulinskog tipa DUL18 je izveden iz nekog antitela koje je generisano korišćenjem tehnika koje su poznate u stanju tehnike, na ćelijski površinski protein citomegalovirusa UL18, koji je prisutan na humanim ćelijama koje su inficirane sa citomegalovirusom (Yang Z, Bjorkman P, Proc Natl Acad Sci USA 105: 10095-100 (2008)). Humana citomegalovirusna infekcija povezana je sa različitim karcinomima i upalnim poremećajima.
Konstrukcija. Proizvodnja i prečišćavanje citotoksičnog proteina SLT-1A::DUL18
[0348] Vezni region imunoglobulinskog tipa DUL 18 i efektorski region Šiga toksina su povezani zajedno tako da formiraju protein u kome vezni region imunoglobulinskog tipa nije lociran proksimalno u odnosu na proteinski amino-terminus u poređenju sa efektorskim regionom Šiga toksina. Na primer, fuzioni protein je proizveden uz pomoć eksprimiranja polinukleotida koji kodira za DUL18-vezujući protein SLT-1A::DUL18. Ekspresija SLT-1A::DUL18 citotoksičnog proteina je ostvarena korišćenjem bilo bakterijskih i/ili bezćelijskih, proteinskih traslacionih sistema kao što je opisano u prethodnim primerima.
In vitro određivanje karakteristika citotoksičnog proteina SLT-1A::DUL18
[0349] Vezujuće karakteristike za citotoksični protein iz ovog primera za citomegalovirusni protein UL18 pozitivne ćelije I citomegalovirusni protein UL18 negativne ćelije su određene uz pomoć testa protočne citometrije zasnovane na fluorescenciji kao što je opisano ranije u prethodnim primerima. Vrednost Bmaxza SLT1A::DUL18 na citomegalovirusni protein UL18 pozitivne ćelije je izmereno da je približno 50,000-200,000 MFI sa KDu okviru opsega od 0.01-100 nM, gde nije bilo značajnog vezivanja za citomegalovirusni protein UL18 negativne ćelije u ovom testiranju.
[0350] Sposobnosti inaktivacije ribozoma sa SLT-1A::DUL18 citotoksičnog proteina su određene u bezćelijskoj, in vitro proteinskoj translaciji kao što je opisano ranije u prethodnim primerima. Inhibitorni efekat citotoksičnog proteina iz ovog primera na sintezu bezćelijskog proteina je značajan. Vrednost IC50za SLT-1A::DUL18 na sintezu proteina u ovom bezćelijskom testu je približno 0.1-100 pM.
Određivanje citotoksičnosti za citotoksični protein SLT-1A::DUL18 korišćenjem testa ubijanja ćelija
[0351] Citotoksične karakteristike za SLT-1A::DUL18 su određene uz pomoć opšteg testa ubijanja ćelija kao što je opisano ranije u prethodnim primerima korišćenjem citomegalovirusni protein UL18 pozitivnih ćelija. Pored toga, karakteristike selektivne citotoksičnosti za SLT-1A::DUL18 su određene uz pomoć istog opšteg testa ubijanja ćelija korišćenjem citomegalovirusni protein UL18 negativnih ćelija u poređenju sa citomegalovirusni protein UL18 pozitivnim ćelijama. Vrednost CD50za citotoksični protein iz ovog primera je približno 0.01-100 nM za citomegalovirusni protein UL18 pozitivne ćelije u zavisnosti od ćelijske linije. Vrednost CD50za citotoksični protein je približno 10-10,000 puta veća (manja citotoksičnost) za ćelije koje ne eksprimiraju citomegalovirusni protein UL18 na ćelijskoj površini u poređenju sa ćelijama koje eksprimiraju citomegalovirusni protein UL18 na ćelijskoj površini.
Primer 12. Citotoksični protein koji je izveden iz A podjedinice Šiga sličnog toksina-1 i antitelo Dhelmint-intestinal-antigen
[0352] U ovom primeru, efektorski region Šiga toksina je izveden iz A podjedinice Šiga sličnog toksina 1 (SLT-1A). Jedan vezni region imunoglobulinskog tipa Dhelmintintestinal-antigena je izveden iz nekog antitela koje je generisano korišćenjem tehnika koje su poznate u stanju tehnike, na helmintski ortolog humanog receptora transferina (videti na pr. nematodni gen gcp-2.1 UniProt G8JYE4_CAEEL; Rosa B et al., Mol Cell Proteomics M114.046227 (2015)).
Konstrukcija. Proizvodnja i prečišćavanje citotoksičnog proteina SLT-1A::DHelmintintestinal-antigen
[0353] Vezni region imunoglobulinskog tipa Dhelmint-intestinal-antigena i efektorski region Šiga toksina su povezani zajedno tako da formiraju protein u kome vezni region imunoglobulinskog tipa nije lociran proksimalno u odnosu na proteinski amino-terminus u poređenju sa efektorskim regionom Šiga toksina. Na primer, fuzioni protein je proizveden uz pomoć eksprimiranja polinukleotida koji kodira za Dhelmint-intestinalantigen-vezujući protein SLT-1A::Dhelmint-intestinal-antigen. Ekspresija za SLT-1A::DLajšmanija citotoksični protein je ostvarena korišćenjem bilo bakterijskih i/ili bezćelijskih, proteinskih traslacionih sistema kao što je opisano u prethodnim primerima.
In vitro određivanje karakteristika citotoksičnog proteina SLT-1A::DHelmint-intestinalantigen
[0354] Vezujuće karakteristike za citotoksični protein iz ovog primera su određene uz pomoć testa molekularnog vezivanja koji je poznat u stanju tehnike korišćenjem prečišćenog rekombinantnog ciljanog proteina. Vrednost KDza SLT-1A::Dhelmintintestinal-antigen na ciljani protein je izmerena da je približno 100 nM, gde nije bilo značajnog vezivanja za negativni kontrolni protein (na pr. prečišćeni, rekombinantni, humani transferin receptor) u ovom testiranju.
[0355] Sposobnosti inaktivacije ribozoma za SLT-1A::Dhelmint-intestinal-antigen citotoksični protein su određene u bezćelijskoj, in vitro proteinskoj translaciji kao što je opisano ranije u prethodnim primerima. Inhibitorni efekat citotoksičnog proteina iz ovog primera na sintezu bezćelijskog proteina je značajan. Vrednost IC50za SLT-1A::ahelmint-intestinal-antigen na sintezu proteina u ovom bezćelijskom testu je približno 0.1-100 pM.
Određivanje toksičnosti citotoksičnog proteina SLT-1A::Dhelmint-intestinal-antigena korišćenjem helminata
[0356] Toksičnost za SLT-1A::Dhelmint-intestinal-antigen za helminate određuje se pomoću modela na helminatima (videti na pr. Iatsenko I et al., Toxins 2050-63 (2014)).
Helminatu se može davati prečišćeni SLT-1A::Dhelmint-intestinal-antigen namakanjem ili alternativno hranjenjem helminata bakterijama koje eksprimiraju SLT-1A::Dhelmintintestinal-antigen fuzioni protein.
[0357] Pored toga, laboratorijskim životinjama koje nakupljaju helminate i/ili pokazuju bolesti povezane s helminatima daje se SLT-1A::Dhelmint-intestinal-antigen i nadgleda se pojava smanjenja ili uklanjanja helminata i/ili simptoma povezanih sa parazitskim helminatima.
Primer 13. Citotoksični proteini koji ciljaju različite ćelijske tipove
[0358] U ovom primeru, efektorski region Šiga toksina je izveden iz A podjedinice Šiga sličnog toksina 1 (SLT-1A), Šiga toksina (StxA), i/ili Šiga sličnog toksina 2 (SLT-2A). Jedan vezni region imunoglobulinskog tipa je izveden iz immunoglobulinskog domena od molekula koji je izabran iz kolone 1 u Tabeli 11 koja vezuje vanćelijski ciljani biomolekul koji je naznačen u koloni 2 u Tabeli 11. Primeri citotoksičnih proteina u ovom primeru su kreirani sa amino-terminalnim proksimalnim efektorskim regionima Šiga toksina korišćenjem tehnika poznatih u stanju tehnike i opciono su povezani sa agensom (agensima) za promociju detekcije. Primeri citotoksičnih proteina u ovom primeru su kreirani i testirani kako je opisano u prethodnim primerima, koristeći ćelije koje eksprimiraju odgovarajuće vanćelijske ciljane biomolekule. Primeri proteina iz ovog primera mogu se koristiti, na primer, za dijagnozu i lečenje bolesti, stanja i/ili poremećaja naznačenih u koloni 3 u tabeli 11.
Tabela 11. Različiti vezni regioni imunoglobulinskog tipa za ciljanje ćelija sa citotoksičnim proteinima

Claims (26)

Patentni zahtevi
1. Citotoksični protein koji obuhvata:
a) vezni region imunoglobulinskog tipa koji sadrži jedan ili više polipeptida i koji je sposoban da specifično veže najmanje jedan vanćelijski ciljani biomolekul, pri čemu je navedeni vezni region imunoglobulinskog tipa izveden iz antitela, pri čemu je navedeni vanćelijski ciljani biomolekul CD38; i
b) efektorski region Šiga toksina koji sadrži polipeptid koji je sposoban da izazove citotoksičnost Šiga toksina A podjedinice, i obuhvata:
aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90% identična aminokiselinskoj sekvenci koja je prikazana u bilo kojem od SEKV ID BR: 1, SEKV ID BR: 2, ili SEKV ID BR: 3; ili aminokiselinsku sekvencu koja je izabrana od:
(i) aminokiselina 75 do 251 iz SEKV ID BR:1, SEKV ID BR:2, ili SEKV ID BR:3; (ii) aminokiselina 1 do 241 iz SEKV ID BR:1, SEKV ID BR:2, ili SEKV ID BR:3; (iii) aminokiselina 1 do 251 iz SEKV ID BR:1, SEKV ID BR:2, ili SEKV ID BR:3; i (iv) aminokiselina 1 do 261 iz SEKV ID BR:1, SEKV ID BR:2, ili SEKV ID BR:3;
pri čemu je protein sposoban da izazove smrt ćelije koja je fizički povezana sa CD38; i pri čemu su vezni region i efektorski region Šiga toksina su orijentisani unutar proteina tako da se vezni region nalazi na položaju koji je bliži karboksi-terminusu efektorskog regiona Šiga toksina nego što je amino-terminus efektorskog regiona Šiga toksina.
2. Citotoksični protein prema zahtevu 1, koji pokazuje citotoksičnost koja je najmanje 3-struka veća u odnosu na prvu populaciju ćelija čiji su članovi fizički povezana sa CD38, u poređenju sa drugom populacijom ćelija čiji članovi nisu fizički povezani sa CD38.
3. Citotoksični protein prema zahtevu 2, pri čemu je navedena prva populacija ćelija fizički povezana sa CD38 pomoću kovalentnih i/ili nekovalentnih intermolekularnih interakcija koje spajaju CD38, ili njegov deo, na spoljnoj strani ćelije; ili pri čemu CD38 je integralni membranski protein ili periferni membranski protein eksprimiran od strane prve populacije ćelija.
4. Citotoksični protein prema bilo kom od zahteva 1-3, pri čemu efektorski region Šiga toksina obuhvata:
(i) aminokiseline 75 do 251 iz SEKV ID BR:1, SEKV ID BR:2, ili SEKV ID BR:3; (ii) aminokiseline 1 do 241 iz SEKV ID BR:1, SEKV ID BR:2, ili SEKV ID BR:3; (iii) aminokiseline 1 do 251 iz SEKV ID BR:1, SEKV ID BR:2, ili SEKV ID BR:3; ili (iv) aminokiseline 1 do 261 iz SEKV ID BR:1, SEKV ID BR:2, ili SEKV ID BR:3.
5. Citotoksični protein prema bilo kom od zahteva 1-3, pri čemu efektorski region Šiga toksina obuhvata mutaciju u odnosu na prirodno pojavnu A podjedinicu iz člana porodice Šiga toksina koja menja enzimsku aktivnost efektorskog regiona Šiga toksina, mutacija koja je izabrana od najmanje jednog od delecije, insercije ili supstitucije ostataka aminokiselina; pri čemu prirodno pojavna A podjedinica iz člana porodice Šiga toksina obuhvata ili se sastoji od aminokiselinske sekvence iz bilo koje od SEKV ID BR: 1-3.
6. Citotoksični protein prema zahtevu 5, pri čemu mutacija smanjuje citotoksičnost efektorskog regiona Šiga toksina.
7. Citotoksični protein prema bilo kom od zahteva 1-6, pri čemu vezni region imunoglobulinskog tipa obuhvata jednolančani varijabilni fragment (scFv).
8. Citotoksični protein prema zahtevu 7, pri čemu vezni region imunoglobulinskog tipa obuhvata aminokiseline 269-508 iz SEKV ID BR: 4.
9. Citotoksični protein prema bilo kom od zahteva 1-6, pri čemu vezni region imunoglobulinskog tipa obuhvata fragment antitela sa jednim domenom (sdAb).
10. Citotoksični protein prema zahtevu 9, pri čemu fragment antitela sa jednim domenom je VHH fragment.
11. Citotoksični protein prema bilo kom od zahteva 1-10, u obliku homo-multimera ili hetero-multimera.
12. Citotoksični protein prema bilo kom od zahteva 1-11, u obliku farmaceutski prihvatljive soli ili solvata.
13. Farmaceutska kompozicija koja sadrži citotoksični protein prema bilo kom od zahteva 1-12 i najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv ekscipijens ili nosač.
14. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 13, pri čemu farmaceutski prihvatljiv nosač sadrži fiziološki prihvatljiv rastvarač ili disperzioni medijum; i/ili pri čemu farmaceutski prihvatljivi nosač sadrži vodu, alkohol, poliol, i njihove odgovarajuće smeše; biljno ulje; ili injektibilni organski estar.
15. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 13 ili 14, koja dalje sadrži pomoćno sredstvo; premaz; antimikrobno, antibakterijsko ili antimikotično sredstvo; izotonično sredstvo; polialkohol; sredstvo za usporavanje apsorpcije; stabilizator; pufer; surfaktant; i/ili farmaceutski prihvatljiv antioksidans.
16. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 15, pri čemu:
pomoćno sredstvo je konzervans, sredstvo za vlaženje, sredstvo za emulgovanje ili sredstvo za dispergovanje;
premaz je lecitin;
antibakterijsko ili antimikotično sredstvo je paraben, hlorbutanol, fenol ili sorbinska kiselina;
izotonično sredstvo je šećer ili natrijum hlorid; polialkohol je manitol ili sorbitol; i/ili
farmaceutski prihvatljivi antioksidant je antioksidant rastvorljiv u vodi, antioksidant rastvorljiv u ulju ili sredstvo za heliranje metala.
17. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 16, pri čemu:
u vodi rastvoran antioksidant je askorbinska kiselina, cistein hidrohlorid, natrijum bisulfit, natrijum metabisulfit ili natrijum sulfit;
u ulju rastvoran antioksidant je askorbil palmitat, butilirani hidroksianizol (BHA), butilirani hidroksitoluen (BHT), lecitin, propilgalat ili alfa-tokoferol; i/ili
sredstvo za heliranje metala je limunska kiselina, etilendiamin tetrasirćetna kiselina (EDTA), sorbitol, tartarna kiselina ili fosforna kiselina.
18. Polinukleotid koji kodira za citotoksični protein prema bilo kom od zahteva 1-12 ili njegov komplement.
19. Ekspresioni vektor koji obuhvata polinukleotid prema zahtevu 18.
20. ûelija domaćina koja obuhvata polinukleotid prema zahtevu 18 ili ekspresioni vektor prema zahtevu 19.
21. In vitro metod za ubijanje CD38-eksprimirajuće ćelije, metod koji obuhvata korak kontakta ćelije sa citotoksičnim proteinom prema bilo kom od zahteva 1-12 ili farmaceutskom kompozicijom prema bilo kom od zahteva 13-17.
22. Citotoksični protein prema bilo kom od zahteva 1-12 ili farmaceutska kompozicija prema bilo kom od zahteva 13-17, za primenu u lečenju ili prevenciji bolesti, poremećaja ili stanja kod pacijenta kome je potrebno, pri čemu bolest, poremećaj ili stanje su okarakterisani sa ćelijama koje eksprimiraju CD38.
23. Citotoksični protein prema bilo kom od zahteva 1-12 ili farmaceutska kompozicija prema bilo kom od zahteva 13-17, za primenu prema zahtevu 22, pri čemu bolest, poremećaj ili stanje je karcinom ili tumor koji su okarakterisani sa ćelijama koje eksprimiraju CD38.
24. Citotoksični protein prema bilo kom od zahteva 1-12 ili farmaceutska kompozicija prema bilo kom od zahteva 13-17, za primenu prema zahtevu 23, pri čemu je karcinom izabran iz grupe koju čine: rak kostiju, rak dojke, rak centralnog/perifernog nervnog sistema, rak gastrointestinalnog trakta, rak polnih ćelija, rak žlezde, rak glave i vrata, hematološki rak, rak bubrega i urinarnog trakta, rak jetre, rak pluća/pleure, rak prostate, sarkom, rak kože i rak materice.
25. Citotoksični protein prema bilo kom od zahteva 1-12 ili farmaceutska kompozicija prema bilo kom od zahteva 13-17, za primenu prema zahtevu 22, pri čemu je bolest, poremećaj ili stanje imunološki poremećaj ili mikrobna infekcija koji su okarakterisani sa ćelijama koje eksprimiraju CD38.
26. Citotoksični protein prema bilo kom od zahteva 1-12 ili farmaceutska kompozicija prema bilo kom od zahteva 13-17, za primenu prema zahtevu 25, pri čemu je imunološki poremećaj povezan sa bolešću koja je izabrana iz grupa koju čine: amiloidoza, ankilozirajući spondilitis, astma, Kronova bolest, dijabetes, odbacivanje grafta, bolest grafta-prema-domaćinu, Hašimotov tiroiditis, hemolitički uremički sindrom, HIV-srodna bolest, lupus eritematozus, multipla skleroza, poliartritis nodoza, poliartritis, psorijaza, psorijatični artritis, reumatoidni artritis, skleroderma, septički šok, Sjogrenov sindrom, ulcerozni kolitis i vaskulitis.
RS20210846A 2014-03-11 2015-03-10 Proteini koji uključuju podjedinice proksimalnih aminoterminalnih efektorskih regiona šiga toksina i vezni regioni imunoglobulinskog tipa koji ciljaju ćelije sposobni da specifično vezuju cd38 RS62143B1 (sr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201461951121P 2014-03-11 2014-03-11
EP19195720.8A EP3604333B1 (en) 2014-03-11 2015-03-10 Proteins comprising amino-terminal proximal shiga toxin a subunit effector regions and cell-targeting immunoglobulin-type binding regions capable of specifically binding cd38

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS62143B1 true RS62143B1 (sr) 2021-08-31

Family

ID=52737411

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20210846A RS62143B1 (sr) 2014-03-11 2015-03-10 Proteini koji uključuju podjedinice proksimalnih aminoterminalnih efektorskih regiona šiga toksina i vezni regioni imunoglobulinskog tipa koji ciljaju ćelije sposobni da specifično vezuju cd38

Country Status (21)

Country Link
US (1) US20160376328A1 (sr)
EP (3) EP3872090A1 (sr)
JP (2) JP6856378B2 (sr)
KR (1) KR20160127759A (sr)
CN (1) CN106414503A (sr)
AU (2) AU2015229583B2 (sr)
CA (1) CA2940218A1 (sr)
CY (1) CY1124541T1 (sr)
DK (1) DK3604333T3 (sr)
ES (2) ES2809729T3 (sr)
HR (1) HRP20211084T1 (sr)
HU (1) HUE054529T2 (sr)
IL (2) IL247298B (sr)
LT (1) LT3604333T (sr)
MX (1) MX2016011821A (sr)
PL (1) PL3604333T3 (sr)
PT (1) PT3604333T (sr)
RS (1) RS62143B1 (sr)
SI (1) SI3604333T1 (sr)
SM (1) SMT202100379T1 (sr)
WO (1) WO2015138452A1 (sr)

Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3666795A1 (en) 2013-03-12 2020-06-17 Molecular Templates, Inc. Cytotoxic proteins comprising cell-targeting binding regions and shiga toxin a subunit regions for selective killing of specific cell types
BR112015021866A2 (pt) 2013-03-15 2017-08-29 Bayer Healthcare Llc Domínios de gla como agentes direcionadores
CN112851769A (zh) 2014-01-27 2021-05-28 分子模板公司 用于哺乳动物中的去免疫化志贺毒素a亚基效应子多肽
US11142584B2 (en) 2014-03-11 2021-10-12 Molecular Templates, Inc. CD20-binding proteins comprising Shiga toxin A subunit effector regions for inducing cellular internalization and methods using same
EP3253799B1 (en) 2015-02-05 2020-12-02 Molecular Templates, Inc. Multivalent cd20-binding molecules comprising shiga toxin a subunit effector regions and enriched compositions thereof
EP3303373B1 (en) 2015-05-30 2020-04-08 Molecular Templates, Inc. De-immunized, shiga toxin a subunit scaffolds and cell-targeting molecules comprising the same
KR20180030085A (ko) 2015-07-26 2018-03-21 몰레큘러 템플레이츠, 인코퍼레이션. 시가 독소 a 서브유닛 작동체 및 cd8+ t-세포 에피토프를 포함하는 세포-표적화 분자
WO2018106895A1 (en) 2016-12-07 2018-06-14 Molecular Templates, Inc. Shiga toxin a subunit effector polypeptides, shiga toxin effector scaffolds, and cell-targeting molecules for site-specific conjugation
MX2019008840A (es) 2017-01-25 2019-09-09 Molecular Templates Inc Moleculas con direccion hacia las celulas que comprenden efectores de la sub-unidad a de la toxina shiga desinmunizados y epitopos de las celulas t cd8+.
CN111201030B (zh) 2017-07-25 2024-11-01 真和制药有限公司 通过阻断tim-3和其配体的相互作用治疗癌症
EP3679129A1 (en) * 2017-09-05 2020-07-15 GLAdiator Biosciences, Inc. A method of intracellular delivery
CN109971725B (zh) * 2017-12-28 2024-02-02 上海细胞治疗研究院 抗体修饰的嵌合抗原受体修饰t细胞及其用途
CN110612117B (zh) 2018-04-17 2024-04-12 分子模板公司 包含去免疫化的志贺毒素a亚基支架的her2靶向分子
KR20210069048A (ko) * 2018-08-30 2021-06-10 티씨알2 테라퓨틱스 인크. 융합 단백질을 이용하는 tcr 재프로그래밍을 위한 조성물 및 방법
WO2020081493A1 (en) 2018-10-16 2020-04-23 Molecular Templates, Inc. Pd-l1 binding proteins
CN109829489A (zh) * 2019-01-18 2019-05-31 刘凯欣 一种基于多层特征的文物碎片重组方法及装置
EP3914610A1 (en) * 2019-01-23 2021-12-01 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Cd38-binding proteins comprising de-immunized shiga toxin a subunit effectors
US11414496B2 (en) 2019-01-23 2022-08-16 Takeda Pharmaceutical Company Limited Anti-CD38 binding domains
WO2020154475A1 (en) 2019-01-23 2020-07-30 Molecular Templates, Inc. Proteins comprising modified immunoglobulin variable light chains
WO2020160156A2 (en) 2019-01-30 2020-08-06 Immutics, Inc. Anti-gal3 antibodies and uses thereof
CN110142068B (zh) * 2019-06-12 2024-02-02 杭州华得森生物技术有限公司 一种上皮间质混合型循环肿瘤细胞检测试剂盒及方法
WO2021055816A1 (en) 2019-09-18 2021-03-25 Molecular Templates, Inc. Pd-l1 binding molecules comprising shiga toxin a subunit scaffolds
MX2022003195A (es) 2019-09-18 2022-04-11 Molecular Templates Inc Moleculas de union a pd-l1 que comprenden andamios de la subunidad a de la toxina shiga.
WO2021102445A1 (en) 2019-11-24 2021-05-27 Molecular Templates, Inc. Uses of cd20-binding molecules and additional therapeutic agents
EP4157338A4 (en) 2020-05-26 2024-11-13 TrueBinding, Inc. METHOD FOR TREATING INFLAMMATORY DISEASES BY GALECTIN-3 BLOCKING
EP4262858A1 (en) 2020-12-16 2023-10-25 Molecular Templates, Inc. Clinical methods for use of a pd-l1-binding molecule comprising a shiga toxin effector
WO2022197945A1 (en) 2021-03-17 2022-09-22 Molecular Templates, Inc. Pd-l1 binding proteins comprising shiga toxin a subunit scaffolds and cd8+ t cell antigens
CN114410588B (zh) * 2022-01-29 2022-11-04 西安电子科技大学 一种α1β1整合素依赖增强型CAR巨噬细胞及其制备方法和应用
EP4476733A4 (en) * 2022-02-09 2026-04-08 Absci Corp DE NOVO ANTIBODY DESIGN UNLOCKING WITH GENERAL ARTIFICIAL INTELLIGENCE

Family Cites Families (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4894443A (en) 1984-02-08 1990-01-16 Cetus Corporation Toxin conjugates
US5091178A (en) 1986-02-21 1992-02-25 Oncogen Tumor therapy with biologically active anti-tumor antibodies
US7838216B1 (en) 1986-03-05 2010-11-23 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Human gene related to but distinct from EGF receptor gene
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
DE69031120T2 (de) 1989-05-19 1998-01-15 Genentech, Inc., South San Francisco, Calif. Her2 extrazellulare domäne
US5578482A (en) 1990-05-25 1996-11-26 Georgetown University Ligand growth factors that bind to the erbB-2 receptor protein and induce cellular responses
US5834229A (en) 1991-05-24 1998-11-10 Genentech, Inc. Nucleic acids vectors and host cells encoding and expressing heregulin 2-α
US5869445A (en) 1993-03-17 1999-02-09 University Of Washington Methods for eliciting or enhancing reactivity to HER-2/neu protein
US5612474A (en) 1994-06-30 1997-03-18 Eli Lilly And Company Acid labile immunoconjugate intermediates
AU3374795A (en) 1994-08-29 1996-03-22 Prizm Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of vascular endothelial growth factor with targeted agents
AU723268B2 (en) 1996-09-09 2000-08-24 Zealand Pharma A/S Improved solid-phase peptide synthesis and agent for use in such synthesis
JP2001500730A (ja) * 1996-09-10 2001-01-23 ヘンリー エム ジャクソン ファンデーション フォージ アドバンスメント オブ ミリタリー メディシン ヒスチジン―タグ付き志賀毒素およびトキソイド、該毒素およびトキソイドとの融合タンパク質ならびにそれらの精製及び調製方法
WO2000006194A2 (en) * 1997-02-05 2000-02-10 Biotransplant, Inc. Depletion of cells responsible for antibody-mediated graft rejection
US7312318B2 (en) * 2002-03-01 2007-12-25 Immunomedics, Inc. Internalizing anti-CD74 antibodies and methods of use
AU779612C (en) 1999-07-02 2005-12-15 Genentech Inc. Peptide compounds that bind HER2
US7306801B2 (en) 2000-05-15 2007-12-11 Health Research, Inc. Methods of therapy for cancers characterized by overexpression of the HER2 receptor protein
WO2003055439A2 (en) 2001-07-18 2003-07-10 The Regents Of The University Of California Her2/neu target antigen and use of same to stimulate an immune response
AU2003208097A1 (en) * 2002-02-04 2003-09-02 Hideo Yoshida Anticancer agents using vero toxin variants
US20040248151A1 (en) 2002-04-05 2004-12-09 Ventana Medical Systems, Inc. Method for predicting the response to HER2-directed therapy
EP2289942B1 (en) 2002-04-10 2013-07-31 Genentech, Inc. Anti-HER2 antibody variants
US7019017B2 (en) 2002-05-14 2006-03-28 Baylor College Of Medicine Small molecule inhibitors of HER2 expression
US7449480B2 (en) 2002-05-14 2008-11-11 Baylor College Of Medicine Small molecule inhibitors of HER2 expression
EP1583833A1 (en) 2003-01-03 2005-10-12 Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P. Angeletti S.P.A. Rhesus her2/neu, nucleotides encoding same, and uses thereof
CA2531238C (en) 2003-07-04 2015-02-24 Affibody Ab Polypeptides having binding affinity for her2
US7674460B2 (en) 2003-08-01 2010-03-09 A&G Pharmaceutical, Inc. Compositions and methods for restoring sensitivity to treatment with HER2 antagonists
DK1771482T3 (da) 2004-07-22 2014-10-20 Genentech Inc HER2-antistofsammensætning
JP5225069B2 (ja) * 2005-03-23 2013-07-03 ゲンマブ エー／エス 多発性骨髄腫の治療のためのｃｄ３８に対する抗体
FI20055417A0 (fi) 2005-07-20 2005-07-20 Glykos Finland Oy Syöpäpesifiset glykaanit ja niiden käyttö
EP1945660B1 (en) 2005-09-26 2014-05-07 Molecular Templates, Inc. Library from toxin mutants, and methods of using same
GB0524788D0 (en) 2005-12-05 2006-01-11 Affibody Ab Polypeptides
EP2097529A4 (en) * 2006-12-29 2010-03-24 Osprey Pharmaceuticals Usa Inc METHOD FOR SELECTION AND PRODUCTION OF MODIFIED TOXINS, MODIFIED TOXINE CONJUGATES AND USES THEREOF
CA2689602A1 (en) 2007-06-06 2008-12-18 Avi Biopharma, Inc. Soluble her2 and her3 splice variant proteins, splice-switching oligonucleotides, and their use in the treatment of disease
EP2650311A3 (en) 2007-11-27 2014-06-04 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against heterodimeric cytokines and/or their receptors and polypeptides comprising the same
EP2072525A1 (en) 2007-12-21 2009-06-24 Affibody AB New polypeptides having affinity for HER2
TWI472339B (zh) 2008-01-30 2015-02-11 Genentech Inc 包含結合至ｈｅｒ２結構域ii之抗體及其酸性變異體的組合物
ES2342646B1 (es) 2008-06-02 2011-04-26 Institut De Recerca Hospital Universitari Vall Hebron Metodo de diagnostico de canceres que expresan el receptor her-2 o sus variantes truncadas.
WO2011130580A1 (en) 2010-04-15 2011-10-20 Alper Biotech, Llc Monoclonal antibodies against her2 antigens, and uses therefor
EP2576621B1 (en) * 2010-05-27 2019-04-10 Genmab A/S Monoclonal antibodies against her2
US20140065172A1 (en) * 2011-01-26 2014-03-06 Cenix Bioscience Gmbh Delivery system and conjugates for compound delivery via naturally occurring intracellular transport routes
CA2865243A1 (en) * 2012-02-23 2013-08-29 President And Fellows Of Harvard College Modified microbial toxin receptor for delivering agents into cells
EP3666795A1 (en) 2013-03-12 2020-06-17 Molecular Templates, Inc. Cytotoxic proteins comprising cell-targeting binding regions and shiga toxin a subunit regions for selective killing of specific cell types

Also Published As

Publication number Publication date
AU2015229583B2 (en) 2020-07-09
CA2940218A1 (en) 2015-09-17
ES2882274T3 (es) 2021-12-01
CY1124541T1 (el) 2022-07-22
PT3604333T (pt) 2021-06-07
AU2015229583A1 (en) 2016-09-15
PL3604333T3 (pl) 2021-11-08
EP3116904A1 (en) 2017-01-18
IL247298B (en) 2021-05-31
EP3116904B1 (en) 2020-05-06
JP2017518027A (ja) 2017-07-06
EP3604333A1 (en) 2020-02-05
AU2020250234A1 (en) 2020-11-05
EP3872090A1 (en) 2021-09-01
KR20160127759A (ko) 2016-11-04
CN106414503A (zh) 2017-02-15
SMT202100379T1 (it) 2021-09-14
HUE054529T2 (hu) 2021-09-28
IL282834A (en) 2021-06-30
ES2809729T3 (es) 2021-03-05
HRP20211084T1 (hr) 2021-10-15
US20160376328A1 (en) 2016-12-29
SI3604333T1 (sl) 2021-08-31
JP6856378B2 (ja) 2021-04-07
WO2015138452A1 (en) 2015-09-17
JP2020089385A (ja) 2020-06-11
DK3604333T3 (da) 2021-06-21
EP3604333B1 (en) 2021-05-05
MX2016011821A (es) 2017-04-27
LT3604333T (lt) 2021-06-10
IL247298A0 (en) 2016-09-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7152035B2 (ja) 結合領域、志賀毒素ａサブユニットのエフェクター領域、及びカルボキシ末端小胞体局在化シグナルモチーフを含むタンパク質
JP7054948B2 (ja) プロテアーゼ切断耐性、志賀毒素ａサブユニットエフェクターポリペプチド及びそれを含む細胞標的化分子
JP7370625B2 (ja) 部位特異的コンジュゲーションのための志賀毒素ａサブユニットエフェクターポリペプチド、志賀毒素エフェクター足場、及び細胞標的化分子
JP7126729B2 (ja) 哺乳動物への応用のための脱免疫化された志賀毒素ａサブユニットエフェクターポリペプチド
EP3604333B1 (en) Proteins comprising amino-terminal proximal shiga toxin a subunit effector regions and cell-targeting immunoglobulin-type binding regions capable of specifically binding cd38
US20180291359A1 (en) Cell-targeting molecules comprising amino-terminus proximal or amino-terminal, shiga toxin a subunit effector regions
HK40018838A (en) Proteins comprising amino-terminal proximal shiga toxin a subunit effector regions and cell-targeting immunoglobulin-type binding regions capable of specifically binding cd38
HK1229345A1 (en) Proteins comprising amino-terminal proximal shiga toxin a subunit effector regions and cell-targeting immunoglobulin-type binding regions capable of specifically binding her2/neu/erbb2
HK1229345B (en) Proteins comprising amino-terminal proximal shiga toxin a subunit effector regions and cell-targeting immunoglobulin-type binding regions capable of specifically binding her2/neu/erbb2