RS62151B1 - Konstrukti koji sadrže sirp-alfa domen ili njegovu varijantu - Google Patents

Konstrukti koji sadrže sirp-alfa domen ili njegovu varijantu

Info

Publication number
RS62151B1
RS62151B1 RS20210912A RSP20210912A RS62151B1 RS 62151 B1 RS62151 B1 RS 62151B1 RS 20210912 A RS20210912 A RS 20210912A RS P20210912 A RSP20210912 A RS P20210912A RS 62151 B1 RS62151 B1 RS 62151B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
aspects
sirp
domain
polypeptide
residue
Prior art date
Application number
RS20210912A
Other languages
English (en)
Inventor
Jaume Pons
Laura Deming
Corey Goodman
Bang Janet Sim
Steven Elliot Kauder
Hong Wan
Tracy Chia-Chien Kuo
Original Assignee
Alx Oncology Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Alx Oncology Inc filed Critical Alx Oncology Inc
Publication of RS62151B1 publication Critical patent/RS62151B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/1774—Immunoglobulin superfamily (e.g. CD2, CD4, CD8, ICAM molecules, B7 molecules, Fc-receptors, MHC-molecules)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4703—Inhibitors; Suppressors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C07K14/765—Serum albumin, e.g. HSA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2833—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cardiology (AREA)

Description

Opis
OSNOV PRONALASKA
[0001] WO 2013/109752 opisuje visokoafinitetne SIRP-α reagense. WO 2010/070047 opisuje rastvorljive CD47-vezujuće polipeptide za upotrebu u lečenju autoimunskih i zapaljenskih oboljenja.
KRATAK OPIS PRONALSKA
[0002] Predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid, koji sadrži signal-regulatorni protein α (signal regulatory protein α, SIRP-α) D1 varijantu i Fc varijantu, pri čemu polipeptid sadrži sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od: SEQ ID NO: 98-104, 107-113, 116-122, i 135-136. Isto tako, obezbeđuju se (i) dimer koji se sastoji od dve kopije pomenutog polipeptida, (ii) nukleinska kiselina koja kodira pomenuti polipeptid, (iii) vektor koji sadrži pomenutu nukleinsku kiselinu, i (iv) ćelija-domaćin koja sadrži pomenutu nukleinsku kiselinu ili pomenuti vektor. Predmetni pronalazak obezbeđuje još i postupak proizvodnje polipeptida pronalaska, koji uključuje kultivisanje ćelije-domaćina pronalaska pod odgovarajućim uslovima da bi došlo do ekspresije polipeptida, i oporavak polipeptida. Isto tako, obezbeđuje se (i) farmaceutska kompozicija koja sadrži polipeptid pronalaska, ili dimer pronalaska, i farmaceutski prihvatljivi nosač; i (ii) pomenuta farmaceutska kompozicija za upotrebu u postupku lečenja kancera.
[0003] U ovom tekstu, objavljeni su polipeptidi koji uključuju: signal-regulatorni protein α (SIRP-α) D1 varijantu koja uključuje SIRP-α D1 domen, ili njegov fragment, sa aminokiselinskom mutacijom na rezidui 80 u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena; i najmanje jednu dodatnu aminokiselinsku mutaciju u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena, na rezidui odabranoj iz grupe koja se sastoji od: rezidue 6, rezidue 27, rezidue 31, rezidue 47, rezidue 53, rezidue 54, rezidue 56, rezidue 66, i rezidue 92. U nekim aspektima, divlji tip SIRP-α D1 domena ima sekvencu prema bilo kojoj od SEQ ID NO: 1-10. U nekim aspektima, SIRP-α D1 domen sadrži između jedne i devet dodatnih aminokiselinskih mutacija u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena na rezidui odabranoj iz grupe koja se sastoji od: rezidue 6, rezidue 27, rezidue 31, rezidue 47, rezidue 53, rezidue 54, rezidue 56, rezidue 66, i rezidue 92. U nekim aspektima, SIRP-α D1 varijanta ima najmanje tri aminokiselinske supstitucije u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu prema SEQ ID NO: 1. U nekim aspektima, SIRP-α D1 varijanta ima najmanje četiri aminokiselinske supstitucije u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu prema SEQ ID NO: 1. U nekim aspektima, SIRP-α D1 varijanta ima najmanje pet aminokiselinskih supstitucija u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu prema SEQ ID NO: 1. U nekim aspektima, SIRP-α D1 varijanta ima najmanje šest aminokiselinskih supstitucija u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu prema SEQ ID NO: 1. U nekim aspektima SIRP-α D1 varijanta ima najmanje sedam aminokiselinskih supstitucija u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu prema SEQ ID NO: 1. U nekim aspektima, SIRP-α D1 varijanta ima aminokiselinsku sekvencu prema bilo kojoj od SEQ ID NO: 81-85. U nekim aspektima, polipeptid se vezuje za humani CD47 sa KD manjom od oko 5 x 10<-9>M. U nekim aspektima, polipeptid uključuje još i Fc domenski monomer vezan za N-terminus ili C-terminus polipeptida, pri čemu je Fc domenski monomer Fc region humanog IgG1, IgG2, ili IgG4. U nekim aspektima, Fc domenski monomer sadrži najmanje jednu mutaciju u odnosu na humanog IgG1, IgG2, ili IgG4. U nekim aspektima, polipeptid pokazuje smanjenje fagocitoze u testu fagocitoze u poređenju sa polipeptidom sa divljim tipom Fc regiona humanog IgG. U nekim aspektima, Fc domenski monomer povezan je sa drugim polipeptidom koji sadrži drugi Fc domenski monomer da bi se formirao Fc domenski dimer. U nekim aspektima, drugi Fc domenski monomer povezan je sa dodatnim polipeptidom. U nekim aspektima, dodatni polipeptid sadrži varijabilni domen antitela. U nekim aspektima, varijabilni domen antitela cilja antigen koji se eksprimira na ćeliji. U nekim aspektima, ćelija je kancerska ćelija. U nekim aspektima, varijabilni domen antitela cilja ćelijski površinski protein uključen u regulaciju imunskih ćelija. U nekim aspektima, dodatni polipeptid sadrži terapijski protein. U nekim aspektima, terapijski protein je citokin, interleukin, antigen, steroid, antiinflamatorno sredstvo, ili imunomodulatorno sredstvo. U nekim aspektima, dodatni polipeptid sadrži SIRP-α D1 varijantu. U nekim aspektima, polipeptid uključuje još i humani serum-albumin (human serum albumin, HSA) (SEQ ID NO: 12). U nekim aspektima, HSA sadrži C34S ili K573P aminokiselinsku supstituciju u odnosu na SEQ ID NO: 12. U nekim aspektima, polipeptid uključuje još i albumin-vezujući peptid. U nekim aspektima, albumin-vezujući peptid uključuje aminokiselinsku sekvencu DICLPRWGCLW (SEQ ID NO: 160). U nekim aspektima, polipeptid uključuje još i polietilen glikolni (polyethylene glycol, PEG) polimer. U nekim aspektima, PEG polimer je pridružen cisteinskoj supstituciji u polipeptidu.
[0004] U nekim aspektima, jedan od Fc domenskih monomera u Fc domenskom dimeru sadrži humani IgG1 Fc region koji uključuje mutacije L234A, L235A, G237A, i N297A. U nekim aspektima, Fc varijanta pokazuje izostanak ili smanjeno vezivanje za Fcγ receptor u poređenju sa verzijom divljeg tipa humanog IgG Fc regiona. U nekim aspektima, IgG1 ili IgG2 Fc varijanta pokazuje izostanak ili smanjeno vezivanje za CD16a, CD32a, CD32b, CD32c, i CD64 Fcγ receptore u poređenju sa verzijom divljeg tipa humanog IgG1 ili IgG2 Fc regiona. U nekim aspektima, IgG4 Fc varijanta pokazuje izostanak ili smanjeno vezivanje za CD16a i CD32b Fcγ receptore u poređenju sa verzijom divljeg tipa humanog IgG4 Fc regiona. U nekim aspektima, IgG1 ili IgG2 Fc varijanta pokazuje izostanak ili smanjeno vezivanje za C1q u poređenju sa verzijom divljeg tipa humane IgG1 ili IgG2 Fc fuzije. U nekim aspektima, Fc varijanta se vezuje za Fcγ receptor sa KD većom od oko 5 x 10<-6>M.
[0005] U ovom tekstu, objavljeni su polipeptidi koji sadrže Fc varijantu, pri čemu Fc varijanta sadrži Fc domenski dimer koji ima dva Fc domenska monomera, pri čemu se svaki Fc domenski monomer nezavisno bira između (i) humanog IgG1 Fc regiona koji se sastoji od mutacija L234A, L235A, G237A, i N297A; (ii) humanog IgG2 Fc regiona koji se sastoji od mutacija A330S, P331S i N297A; ili (iii) humanog IgG4 Fc regiona koji sadrži mutacije S228P, E233P, F234V, L235A, delG236, i N297A. U nekim aspektima, najmanje jedan od Fc domenskih monomera je humani IgG1 Fc region koji se sastoji od mutacija L234A, L235A, G237A, i N297A. U nekim aspektima, najmanje jedan od Fc domenskih monomera je humani IgG2 Fc region koji se sastoji od mutacija A330S, P331S i N297A. U nekim aspektima, Fc varijanta pokazuje izostanak ili smanjeno vezivanje za Fcγ receptor u poređenju sa verzijom divljeg tipa humanog IgG Fc regiona. U nekim aspektima, Fc varijanta pokazuje izostanak ili smanjeno vezivanje za CD16a, CD32a, CD32b, CD32c, i CD64 Fcγ receptore u poređenju sa verzijom divljeg tipa humanog IgG Fc regiona. U nekim aspektima, Fc varijanta pokazuje izostanak ili smanjeno vezivanje za C1q u poređenju sa verzijom divljeg tipa humane IgG Fc fuzije. U nekim aspektima, najmanje jedan od Fc domenskih monomera je humani IgG4 Fc region koji sadrži mutacije S228P, E233P, F234V, L235A, delG236, i N297A. U nekim aspektima, Fc varijanta pokazuje izostanak ili smanjeno vezivanje za Fcγ receptor u poređenju sa divljim tipom humanog IgG4 Fc regiona. U nekim aspektima, Fc varijanta pokazuje izostanak ili smanjeno vezivanje za CD16a i CD32b Fcγ receptore u poređenju sa verzijom divljeg tipa svog humanog IgG4 Fc regiona. U nekim aspektima, Fc varijanta vezuje se za Fcγ receptor sa KD većom od oko 5 x 10<-6>M. U nekim aspektima, polipeptid sadrži još i CD47-vezujući polipeptid. U nekim aspektima, Fc varijanta pokazuje izostanak ili smanjeno vezivanje za Fcγ receptor u poređenju sa divljim tipom verzije humanog IgG Fc regiona. U nekim aspektima, CD47-vezujući polipeptid ne izaziva akutnu anemiju kod glodara i nehumanih primata. U nekim aspektima, CD47-vezujući polipeptid ne izaziva akutnu anemiju kod ljudi. U nekim aspektima, CD47-vezujući polipeptid je signal-regulatorni protein α (SIRP-α) polipeptid ili njegov fragment.
[0006] U ovom tekstu, u određenim aspektima, objavljeni su polipeptidi koji uključuju: signal-regulatorni protein α (SIRP-α) D1 varijantu, pri čemu je SIRP-α D1 varijanta visokoafinitetni SIRP-α D1 domen koji se ne sreće u prirodi, pri čemu se SIRP-α D1 varijanta vezuje za humani CD47 sa afinitetom koji je najmanje 10-struko veći od afiniteta D1 domena koji se sreće u prirodi; i Fc domenski monomer, pri čemu je Fc domenski monomer spojen sa drugim polipeptidom koji sadrži drugi Fc domenski monomer da se formira Fc domen, pri čemu Fc domen pokazuje izostanak ili smanjenu efektorsku funkciju. U nekim aspektima, visokoafinitetni SIRP-α D1 domen koji se ne sreće u prirodi sadrži aminokiselinsku mutaciju na rezidui 80.
[0007] U ovom tekstu, objavljeni su polipeptidi koji sadrže signal-regulatorni protein α (SIRP-α) D1 varijantu, pri čemu se SIRP-α D1 varijanta vezuje sa CD47 iz prve vrste sa KD manjom od 250 nM; i pri čemu se SIRP-α D1 varijanta vezuje za CD47 iz druge vrste sa KD manjom od 250 nM; i KD za CD47 iz prve vrste i KD za CD47 iz druge vrste su unutar raspona od 100 puta jedna u odnosu na drugu; pri čemu se prva vrsta i druga vrsta biraju iz grupe koja se sastoji od: čoveka, glodara, i nehumanog primata. U nekim aspektima, SIRP-α D1 varijanta vezuje se za CD47 iz najmanje 3 različite vrste. U nekim aspektima, nehumani primat je majmun cinomolgus.
[0008] U ovom tekstu objavljeni su polipeptidi koji sadrže: (a) signal-regulatorni protein α (SIRP-α) D1 domen koji se vezuje za humani CD47 sa KD manjom od 250 nM; i (b) Fc domenski monomer vezan za N-terminus ili C-terminus SIRP-α D1 domena, pri čemu polipeptid ne izaziva akutnu anemiju kod glodara i nehumanih primata. U nekim aspektima, polipeptid je varijanta humanog SIRP-α koja se ne sreće u prirodi. U nekim aspektima, primena polipeptida in vivo rezultuje smanjenjem hemoglobina za manje od 50% tokom prve nedelje posle primene. U nekim aspektima, primena polipeptida kod ljudi rezultuje smanjenjem hemoglobina za manje od 50% tokom prve nedelje posle primene. U nekim aspektima, polipeptid uključuje još i najmanje jednu Fc varijantu, pri čemu se Fc varijanta bira između (i) humanog IgG1 Fc regiona koji se sastoji od mutacija L234A, L235A, G237A, i N297A; (ii) humanog IgG2 Fc regiona koji se sastoji od mutacija A330S, P331S i N297A; ili (iii) humanog IgG4 Fc regiona koji sadrži mutacije S228P, E233P, F234V, L235A, delG236, i N297A. U nekim aspektima, Fc varijanta je humani IgG1 Fc region koji se sastoji od mutacija L234A, L235A, G237A, i N297A. U nekim aspektima, Fc varijanta je humani IgG2 Fc region koji se sastoji od mutacija A330S, P331S i N297A. U nekim aspektima, Fc varijanta je humani IgG4 Fc region koji sadrži mutacije S228P, E233P, F234V, L235A, delG236, i N297A.
[0009] U ovom tekstu objavljeni su postupci lečenja pojedinaca koji imaju oboljenje ili poremećaj, postupak uključuje davanje subjektu polipeptida objavljenog u ovom tekstu. U nekim aspektima, polipeptid uključuje signal-regulatorni protein α (SIRP-α) D1 varijantu koja uključuje SIRP-α D1 domen, ili njegov fragment, sa aminokiselinskom mutacijom na rezidui 80 u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena; i najmanje jednu dodatnu aminokiselinsku mutaciju u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena na rezidui odabranoj iz grupe koja se sastoji od: rezidue 6, rezidue 27, rezidue 31, rezidue 47, rezidue 53, rezidue 54, rezidue 56, rezidue 66, i rezidue 92. U nekim aspektima, polipeptid uključuje Fc varijantu, pri čemu Fc varijanta uključuje Fc domenski dimer koji ima dva Fc domenska monomera, pri čemu se svaki Fc domenski monomer nezavisno bira između (i) humanog IgG1 Fc regiona koji se sastoji od mutacija L234A, L235A, G237A, i N297A; (ii) humanog IgG2 Fc regiona koji se sastoji od mutacija A330S, P331S i N297A; ili (iii) humanog IgG4 Fc regiona koji sadrži mutacije S228P, E233P, F234V, L235A, delG236, i N297A. U nekim aspektima, polipeptid sadrži signal-regulatorni protein α (SIRP-α) D1 varijantu, pri čemu je SIRP-α D1 varijanta visokoafinitetni SIRP-α D1 domen koji se ne sreće u prirodi, pri čemu se SIRP-α D1 varijanta vezuje za humani CD47 sa afinitetom koji je najmanje 10-struko veći od afiniteta D1 domena koji se sreće u prirodi; i Fc domenski monomer, pri čemu se Fc domenski monomer vezuje za drugi polipeptid koji uključuje drugi Fc domenski monomer da se formira Fc domen, pri čemu Fc domen pokazuje izostanak ili smanjenu efektorsku funkciju. U nekim aspektima, visokoafinitetni SIRP-α D1 domen koji se ne sreće u prirodi uključuje aminokiselinsku mutaciju na rezidui 80. U nekim aspektima, polipeptid uključuje signal-regulatorni protein α (SIRP-α) D1 varijantu, pri čemu se SIRP-α D1 varijanta vezuje za CD47 iz prve vrste sa KD manjom od 250 nM; i pri čemu se SIRP-α D1 varijanta vezuje za CD47 iz druge vrste sa KD manjom od 250 nM; i KD za CD47 iz prve vrste i KD za CD47 iz druge vrste su unutar raspona od 100 puta jedna u odnosu na drugu; pri čemu se prva vrsta i druga vrsta biraju iz grupe koja se sastoji od: čoveka, glodara, i nehumanog primata. U nekim aspektima, polipeptid uključuje (a) signal-regulatorni protein α (SIRP-α) D1 domen koji se vezuje za humani CD47 sa KD manjom od 250 nM; i (b) Fc domenski monomer vezan za N-terminus ili C-terminus SIRP-α D1 domena, pri čemu polipeptidi ne izazivaju akutnu anemiju kod glodara i nehumanih primata. U nekim aspektima, oboljenje ili poremećaj je kancer, autoimunsko oboljenje ili zapaljensko oboljenje. U nekim aspektima, oboljenje ili poremećaj je kancer, i kancer se bira između solidnog malignog tumora, hematološkog kancera, akutne mijeloidne leukemije, hronične limfocitne leukemije, hronične mijeloidne leukemije, akutne limfoblastne leukemije, ne-Hodgkinovog limfoma, Hodgkinovog limfoma, multiplog mijeloma, kancera mokraćne bešike, kancera pankreasa, kancera cerviksa, kancera endometrijuma, kancera pluća, kancera bronhije, kancera jetre, kancera ovarijuma, kancera kolona i rektuma, kancera želuca, gastričnog kancera, kancera žučne kesice, malignog tumora gastrointestinalne strome, kancera tiroide, kancera glave i vrata, orofaringealnog kancera, kancera jednjaka, melanoma, nemelanomskog kancera kože, karcinoma Merkelovih ćelija, kancera indukovanog virusima, neuroblastoma, kancera dojke, kancera prostate, kancera bubrega, kancera bubrežnih ćelija, kancera bubrežne karlice, leukemije, limfoma, sarkoma, glioma, tumora mozga, i karcinoma. U nekim aspektima, bolest ili poremećaj je autoimunsko oboljenje ili zapaljensko oboljenje, i autoimunsko oboljenje ili zapaljensko oboljenje bira se između multiple skleroze, reumatoidnog artritisa, spondiloartropatije, sistemskog eritemskog lupusa, zapaljenskog ili autoimunskog oboljenja posredovanog antitelima, bolesti kalema protiv domaćina, sepse, dijabetesa, psorijaze, ateroskleroze, Sjogrenovog sindroma, progresivne sistemske skleroze, skleroderme, akutnog koronarnog sindroma, ishemijske reperfuzije, Crohnove bolesti, endometrioze, glomerulonefritisa, mijastenije gravis, idiopatske plućne fibroze, astme, sindroma akutnog respiratornog distresa (acute respiratory distress syndrome, ARDS), vaskulitisa, i zapaljenskog autoimunskog miozitisa. U nekim aspektima, postupak uključuje još i primenu najmanje jednog dodatnog sredstva. U nekim aspektima, najmanje jedno dodatno sredstvo je antitelo, tumorasocirani antigen, ili terapijsko sredstvo koje nije antitelo. U nekim aspektima, primenjuju se najmanje dva dodatna sredstva. U nekim aspektima, najmanje dva dodatna sredstva uključuju dva antitela. U nekim aspektima, najmanje dva dodatna sredstva uključuju antitelo i tumor-asocirani antigen. U nekim aspektima, najmanje jedno dodatno sredstvo je antitelo. U nekim aspektima, antitelo je humano IgG1 izotipsko antitelo. U nekim aspektima, antitelo je humano IgG2 izotipsko antitelo. U nekim aspektima, antitelo je humano IgG4 izotipsko antitelo. U nekim aspektima, antitelo se bira između anti-HER2 antitela, anti-CD20 antitela, anti-CD19 antitela, anti-CS1 antitela, anti-CD38 antitela, anti-EGFR antitela, anti-PD1 antitela, anti-OX40 antitela, anti-PD-1 antitela, anti-PD-L1 antitela, anti-CD274 antitela, anti-CTLA-4 antitela, anti-CD137 antitela, anti-4-1BB antitela, anti-B7-H3 antitela, anti-FZD7 antitela, anti-CD27 antitela, anti-CCR4 antitela, anti-CD38 antitela, anti-CSFIR antitela, anti-CSF antitela, anti-CD30 antitela, anti-BAFF antitela, anti-VEGF antitela, ili anti-VEGFR2 antitela. U nekim aspektima, antitelo se bira između anti-HER2 antitela, anti-CD20 antitela, anti-CD19 antitela, anti-CS1 antitela, anti-CD38 antitela, anti-PD-1 antitela, anti-RANKL antitela, ili anti-PD-L1 antitela. U nekim aspektima, najmanje jedno dodatno sredstvo je najmanje jedno antitelo i antitelo se bira između cetuksimaba, necitumumaba, pembrolizumaba, nivolumaba, pidilizumaba, MEDI0680, MED16469, atezolizumaba, avelumaba, durvalumaba, MEDI6383, RG7888, ipilimumaba, tremelimumaba, urelumaba, PF-05082566, enoblituzumaba, vantiktumaba, varlilumaba, mogamalizumaba, SAR650984, daratumumaba, trastuzumaba, trastuzumab emtanzina, pertuzumaba, elotuzumaba, rituksimaba, ofatumumaba, obinutuzumaba, RG7155, FPA008, panitumumaba, brentuksimab vedotina, MSB0010718C, belimumaba, bevacizumaba, denosumaba, panitumumaba, ramucirumaba, necitumumaba, nivolumaba, pembrolizumaba, avelumaba, atezolizumaba, durvalumaba, MEDI0680, pidilizumaba, ili BMS-93659. U nekim aspektima, antitelo je trastuzumab. U nekim aspektima, antitelo je rituksimab. U nekim aspektima, antitelo je cetuksimab. U nekim aspektima, antitelo je daratumumab. U nekim aspektima, antitelo je belimumab. U nekim aspektima, antitelo je bevacizumab. U nekim aspektima, antitelo je denosumab. U nekim aspektima, antitelo je pantimumab. U nekim aspektima, antitelo je ramucirumab. U nekim aspektima, antitelo je necitumumab. U nekim aspektima, antitelo je nivolumab. U nekim aspektima, antitelo je pembrolizumab. U nekim aspektima, antitelo je avelumab. U nekim aspektima, antitelo je atezolizumab. U nekim aspektima, antitelo je durvalumab. U nekim aspektima, antitelo je MEDI0680. U nekim aspektima, antitelo je pidilizumab. U nekim aspektima, antitelo je BMS-93659. U nekim aspektima, najmanje jedno dodatno sredstvo je tumor asocirani antigen i tumorasocirani antigen pobuđuje imunski odgovor. U nekim aspektima, najmanje jedno dodatno sredstvo je antitelo i antitelo cilja HLA/peptidni ili MHC/peptidni kompleks. U nekim aspektima, antitelo cilja HLA/peptid ili MHC/peptidni kompleks koji sadrži NY-ESO-1/LAGE1, SSX-2, MAGE familiju (MAGE-A3), gp100/pmel17, Melan-A/MART-1, gp75/TRP1, tirozinazu, TRP2, CEA, PSA, TAG-72, nezreli lamininski receptor, MOK/RAGE-1, WT-1, Her2/neu, EphA3, SAP-1, BING-4, Ep-CAM, MUC1, PRAME, survivin, mezotelin, BRCA1/2 (mutirani), CDK4, CML66, MART-2, p53 (mutirani), Ras (mutirani), β-katenin (mutirani), TGF-βRII (mutirani), HPV E6, ili E7. U nekim aspektima, antitelo je ESK1, RL1B, Pr20, ili 3.2G1.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0010] Nove osobine pronalaska posebno su izložene u priloženim patentnim zahtevima. Bolje razumevanje osobina i prednosti predmetnog pronalaska postići će se upućivanjem na detaljni opis koji sledi, u kojem se navode ilustrativni primera izvođenja u kojima se koriste principi pronalaska, i na pridružene crteže gde:
SL. 1 predstavlja ilustraciju SIRP-α konstrukta koji uključuje SIRP-α D1 domen ili njegovu varijantu spojenu sa prvim Fc domenskim monomerom, koji formira Fc domen sa drugim Fc domenskim monomerom;
SL. 2 predstavlja ilustraciju SIRP-α konstrukta koji uključuje SIRP-α D1 domen ili njegovu varijantu spojenu sa prvim Fc domenskim monomerom i varijabilni domen antitela spojen sa drugim Fc domenskim monomerom, pri čemu se prvi Fc domenski monomer i drugi Fc domenski monomer kombinuju da formiraju Fc domen;
SL. 3 predstavlja ilustraciju SIRP-α konstrukta koji uključuje SIRP-α D1 domen ili njegovu varijantu spojenu sa prvim Fc domenskim monomerom i terapijski protein spojen sa drugim Fc domenskim monomerom, pri čemu se prvi Fc domenski monomer i drugi Fc domenski monomer kombinuju da formiraju Fc domen;
SL. 4A predstavlja ilustraciju SIRP-α konstrukta koji uključuje SIRP-α D1 domen ili njegovu varijantu spojenu sa prvim Fc domenskim monomerom koji ima mutaciju tipa "čvorić", koja formira Fc domen sa drugim Fc domenskim monomerom koji ima mutaciju tipa "rupica"; SL. 4B predstavlja ilustraciju SIRP-α konstrukta koji uključuje SIRP-α D1 domen ili njegovu varijantu spojenu sa prvim Fc domenskim monomerom koji ima mutaciju tipa "rupica", koja formira Fc domen sa drugim Fc domenskim monomerom koji ima mutaciju tipa "čvorić";
SL. 5A predstavlja ilustraciju SIRP-α konstrukta koji uključuje SIRP-α D1 domen ili njegovu varijantu spojenu sa Fc domenskim monomerom; SL. 5B predstavlja ilustraciju SIRP-α konstrukta koji je homodimer konstrukta ilustrovanog na SL.5A;
SL. 6 predstavlja primer SPR podataka za vezivanje za monofunkcionalne i bifunkcionalne SIRP-α konstrukte koji uključuju SIRP-α D1 domen;
SL. 7 predstavlja primer fagocitoze DLD-1-GFP-luciferaza tumorskih ćelija makrofagima poreklom od humanih monocita u prisustvu različitih koncentracija SIRP-α polipeptidnih konstrukata;
SL. 8 predstavlja primer fagocitoze DLD-1-GFP-luciferaza tumorskih ćelija makrofagima poreklom od humanih monocita u prisustvu različitih koncentracija SIRP-α polipeptidnih konstrukata;
SL. 9 predstavlja primer fagocitoze DLD-1-GFP-luciferaza tumorskih ćelija makrofagima poreklom od humanih monocita u prisustvu različitih koncentracija SIRP-α polipeptidnih konstrukata;
SL. 10 predstavlja primer stabilnosti poluživota SIRP-α polipeptida tokom definisanog vremenskog perioda;
SL. 11 predstavlja primer podataka za test hemaglutinacije za SIRP-α polipeptidne konstrukte;
SL. 12 predstavlja primer krivih preživljavanja u singenim modelima tumora miševa tretiranih SIRP-α polipeptidnim konstruktima i anti-mPD-L1;
SL. 13 predstavlja primer analize zapremine tumora u singenim modelima tumora miševa tretiranim SIRP-α polipeptidnim konstruktima u kombinaciji sa anti-mPD-L1;
SL. 14 predstavlja primer vezivanja različitih koncentracija C1q komplementa za SIRP-α - Fc fuzije;
SL. 15 predstavlja primer fagocitoze MM1R ćelija makrofagima poreklom od humanih monocita u prisustvu različitih koncentracija SIRP-α polipeptidnih konstrukata;
SL. 16 predstavlja primer fagocitoze MM1R ćelija makrofagima poreklom od humanih monocita u prisustvu različitih koncentracija SIRP-α polipeptidnih konstrukata;
SL. 17 predstavlja primer fagocitoze N87 ćelija makrofagima poreklom od humanih monocita u prisustvu različitih koncentracija SIRP-α polipeptidnih konstrukata;
SL. 18 predstavlja primer analize molekulske težine SIRP-α D1 varijante koja ima P83V mutaciju;
SL. 19A predstavlja primer tumorskog rasta ćelija humanog GFP-Luc-Raji limfoma u modelu kancera na NOD scid gama (NOD scid gamma, NSG) miševima tretiranim različitim SIRP-α konstruktima sa ili bez rituksimaba; SL.
19B predstavlja primer dijagrama rasejanja za zapreminu tumora, za tumore opisane na SL. 19A; SL. 19C predstavlja primer vrednosti hemoglobina kod tretiranih miševa opisanih na SL.19A; i
1
SL. 20 predstavlja primer broja crvenih krvnih ćelija uzetih iz miševa tretiranih konstruktom SIRP-α divlji tip IgG1 Fc ili konstruktom SIRP-α IgG1 Fc varijanta.
DETALJAN OPIS PRONALSKA
Definicije
[0011] Izraz "oko" ili "približno" znači unutar prihvatljivog raspona greške za određenu vrednost koju je odredio prosečno obučeni stručnjak u oblasti, što će zavisiti delom od toga kako se vrednost meri ili određuje, tj., od ograničenja mernog sistema. Na primer, "oko" može značiti unutar 1 ili više od 1 standardne devijacije, u skladu sa praksom u struci. Alternativno, "oko" može označavati raspon do 20%, do 10%, do 5%, ili do 1% od date vrednosti. Alternativno, posebno u vezi sa biološkim sistemima ili procesima, izraz može značiti unutar reda veličine, poželjno unutar 5 puta ili poželjnije unutar 2 puta od vrednosti. Kada se određene vrednosti opisuju u prijavi i patentnim zahtevima, ukoliko nije drugačije naznačeno treba pretpostaviti da izraz "oko" znači unutar prihvatljivog raspona greške za određenu vrednost.
[0012] Terminologija upotrebljena u ovom tekstu namenjena je samo opisivanju određenih slučajeva i nije ograničavajuća. Kako se koristi u ovom tekstu, oblici u jednini treba da uključe i oblike u množini, osim ako kontekst jasno ne kazuje drugačije. Pored toga, u meri u kojoj se izrazi "uključujući", "uključuje", "imati", "ima", "sa", ili njihove varijante koriste u detaljnom opisu ili patentnim zahtevima, takvi izrazi treba da budu inkluzivni na način sličan izrazu "sadrži ".
[0013] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "antitelo" označava intaktna antitela; fragmente antitela, uz uslov da ispoljavaju željenu biološku aktivnost (npr. vezivanje sa epitopom); monoklonska antitela; poliklonska antitela; monospecifična antitela; multispecifična antitela (npr., bispecifična antitela); i proteine slične antitelima.
[0014] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "varijabilni domen antitela" odnosi se na delove lakih i teških lanaca antitela koji uključuju aminokiselinske sekvence regiona koji određuju komplementarnost (complementary determining regions, CDR, npr., CDR L1, CDR L2, CDR L3, CDR H1, CDR H2, i CDR H3) i regiona okvira (framework regions, FR).
[0015] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "linker" odnosi se na vezu između dva elementa, npr., proteinska domena. U nekim aspektima, linker može biti kovalentna veza ili spejser. Izraz "spejser" označava komponentu (npr., polietilen glikolni (PEG) polimer) ili aminokiselinsku sekvencu (npr., sekvencu od 1-200 amino-kiselina) koja se sreće između dva polipeptida ili polipeptidna domena da bi obezbedila razmak ili fleksibilnost (ili i razmak i fleksibilnost) između dva polipeptida ili polipeptidna domena. U nekim aspektima, aminokiselinski spejser je deo primarne sekvence polipeptida (npr., preko polipeptidne osovine spojen sa polipeptidima ili polipeptidnim domenima koje razmiče).
[0016] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "terapijski efikasna količina" odnosi se na količinu polipeptida ili farmaceutske kompozicije koja sadrži polipeptid opisan u ovom tekstu, npr., polipeptid koji ima SIRP-α D1 domen ili njegovu varijantu, koja je dovoljna i efikasna za postizanje željenog terapijskog efekta u lečenju pacijenta koji ima oboljenje kao što je kancer, npr., solidni maligni tumor ili hematološki kancer. U nekim aspektima, terapijski efikasna količina polipeptida neće davati neželjene sporedne efekte.
[0017] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "farmaceutska kompozicija" označava medicinsku ili farmaceutsku formulaciju koja uključuje aktivni sastojak kao i ekscipijente ili razblaživače (ili i ekscipijente i razblaživače) i omogućava da se aktivni sastojak primeni pogodnim postupcima primene. U nekim aspektima, farmaceutske kompozicije objavljene u ovom tekstu uključuju farmaceutski prihvatljive komponente koje su kompatibilne sa polipeptidom. U nekim aspektima, farmaceutska kompozicija je u obliku tablete ili kapsule za oralnu primenu ili u vodenastom obliku za intravensku ili supkutanu primenu, na primer injekcijom.
[0018] Kako se koristi u ovom tekstu, izrazi "subjekt," "individua" i "pacijent" koriste se naizmenično da označe vertebrata, na primer, sisara. Sisari uključuju, ali se ne ograničavaju na miševe, simijan majmune, ljude, životinje na farmama, životinje za sport, i kućne ljubimce. Obuhvaćeni su i tkiva, ćelije, i njihovo potomstvo biološkog entiteta dobijeni in vivo ili kultivisani in vitro. Nijedan od pojmova ne zahteva nadzor medicinskog radnika.
[0019] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "afinitet" ili "vezujući afinitet" odnosi se na snagu vezujuće interakcije između dva molekula. Generalno, vezujući afinitet odnosi se na jačinu zbira svih nekovalentnih interakcija između molekula i njegovog vezujućeg partnera, kao što su visokoafinitetna SIRP-α D1 varijanta i CD47. Ukoliko nije drugačije navedeno, vezujući afinitet označava unutrašnji vezujući afinitet, koji odražava interakciju 1:1 između članova vezujućeg para. Vezujući afinitet između dva molekula obično se opisuje konstantom disocijacije (KD) ili konstantom asocijacije (KA). Dva molekula koja jedan sa drugim imaju niski vezujući afinitet obično se vezuju sporo, imaju tendenciju lakog razdvajanja i ispoljavaju veliku KD. Dva molekula koja jedan prema drugom imaju visok afinitet obično se brzo vezuju, imaju tendenciju da ostanu povezani duže vreme, i ispoljavaju malu KD. U nekim aspektima, KD dva interagujuća molekula određuje se korišćenjem poznatih postupaka i tehnika, npr., rezonancije površinskog plazmona (surface plasmon resonance, SPR). KD se može izračinati kao odnos koff/kon (konstanta
disocijacije/konstanta asocijacije).
[0020] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "KD manja od" označava numerički manju vrednost KD i rastući vezujući afinitet u odnosu na navedenu KD vrednost. Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "KD veća od" označava numerički veću KD vrednost i opadajući vezujući afinitet u odnosu na navedenu KD vrednost.
[0021] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "akutna anemija" označava smanjenje mase crvenih krvnih ćelija ili hemoglobina od 30% tokom prvih pet dana posle primene jedinjenja ili tretmana.
I. Signal-regulatorni protein α (SIRP-α) D1 domen i njegove varijante
[0022] U ovom tekstu, u nekim aspektima, objavljeni su polipeptidi koji uključuju signalregulatorni protein α (SIRP-α) D1 varijantu koja uključuje SIRP-α D1 domen, ili njegov fragment, sa aminokiselinskom mutacijom na rezidui 80 u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena; i najmanje jednu dodatnu aminokiselinsku mutaciju u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena na rezidui odabranoj iz grupe koja se sastoji od: rezidue 6, rezidue 27, rezidue 31, rezidue 47, rezidue 53, rezidue 54, rezidue 56, rezidue 66, i rezidue 92.
[0023] U ovom tekstu, u nekim aspektima, objavljeni su polipeptidi koji uključuju Fc varijantu, pri čemu Fc varijanta uključuje Fc domenski dimer koji ima dva Fc domenska monomera, pri čemu se svaki Fc domenski monomer nezavisno bira između (i) humanog IgG1 Fc regiona koji se sastoji od mutacija L234A, L235A, G237A, i N297A; (ii) humanog IgG2 Fc regiona koji se sastoji od mutacija A330S, P331S i N297A; ili (iii) humanog IgG4 Fc regiona koji sadrži mutacije S228P, E233P, F234V, L235A, delG236, i N297A.
[0024] Signal-regulatorni protein α ("SIRP-α" ili "SIRP-alfa") je transmembranski glikoprotein koji pripada Ig superfamiliji, koji se široko eksprimira na membrani mijeloidnih ćelija. SIRP-α interaguje sa CD47, proteinom koji se široko eksprimira na mnogim tipovima ćelija u telu. Interakcija SIRP-α sa CD47 sprečava zahvatanje "sopstvenih" ćelija, koje bi imunski sistem inače prepoznao. Zapaženo je da visoka ekspresija CD47 na tumorskim ćelijama može delovati, u akutnoj mijeloidnoj leukemiji i nekim drugim solidnim tumorskim kancerima, kao negativan prognostički faktor za preživljavanje.
[0025] Nativni SIRP-α sadrži 3 visokohomologa imunoglobulinu (Ig)-slična vanćelijska domena - D1, D2, i D3. SIRP-α D1 domen ("D1 domen") označava vanćelijski domen SIRP-α distalno u odnosu na membranu, koji posreduje u vezivanju SIRP-α sa CD47. Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "SIRP-α polipeptid" odnosi se na bilo koji SIRP-α polipeptid ili njegov fragment koji može da se veže za CD47. Postoji najmanje deset
1
varijanti divljeg tipa humanog SIRP-α. Tabela 1 prikazuje aminokiselinske sekvence D1 domena deset prirodnih varijanti divljeg tipa humanog SIRP-α D1 domena (SEQ ID NO: 1-10). U nekim aspektima, SIRP-α polipeptid uključuje SIRP-α D1 domen. U nekim aspektima, SIRP-α polipeptid uključuje divlji tip D1 domena, kao što su oni dati u SEQ ID NO: 1-10. U nekim aspektima, SIRP-α polipeptid uključuje D2 ili D3 domen (ili i D2 i D3 domen) (Tabela 3) divljeg tipa humanog SIRP-α.
Tabela 1. Sekvence divljeg tipa SIRP-α D1 domena
[0026] Kako se koriste u ovom tekstu, izrazi "visokoafinitetna SIRP-α D1 varijanta", "visokoafinitetna SIRP-α varijanta" ili "SIRP-α D1 varijanta" označavaju polipeptid koji uključuje SIRP-α D1 domen ili CD47-vezujući deo SIRP-α polipeptida koji imaju viši afinitet za CD47 nego divlji tip SIRP-α. Visokoafinitetna SIRP-α D1 varijanta uključuje
1
najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju, deleciju, ili inserciju (ili njihovu kombinaciju) u odnosu na divlji tip SIRP-α.
[0027] U nekim aspektima, visokoafinitetne SIRP-α D1 varijante objavljene u ovom tekstu uključuju SIRP-α D1 domen ili njegovu varijantu. U nekim aspektima, visokoafinitetna SIRP-α D1 varijanta uključuje jednu ili više aminokiselinskih supstitucija, insercija ili delecija u odnosu na divlji tip D1 domena, prikazano u SEQ ID NO: 1-10. Tabela 2 navodi primere aminokiselinskih supstitucija u svakoj varijanti SIRP-α D1 domena (SEQ ID NO: 13-22). U nekim aspektima, SIRP-α D1 domenski polipeptid visokoafinitetne SIRP-α D1 varijante uključuje fragment D1 domena. U nekim aspektima, fragment SIRP-α polipeptida ili fragment visokoafinitetne SIRP-α varijante uključuje aminokiselinsku sekvencu dugu manje od 10 amino-kiselina, dugu oko 10 amino-kiselina, dugu oko 20 amino-kiselina, dugu oko 30 amino-kiselina, dugu oko 40 amino-kiselina, dugu oko 50 amino-kiselina, dugu oko 60 amino-kiselina, dugu oko 70 amino-kiselina, dugu oko 80 amino-kiselina, dugu oko 90 amino-kiselina, dugu oko 100 amino-kiselina, ili dugu više od oko 100 amino-kiselina. U nekim aspektima, fragmenti SIRP-α D1 domena zadržavaju sposobnost vezivanja sa CD47.
[0028] U nekim aspektima, polipeptid objave uključuje visokoafinitetnu SIRP-α D1 varijantu sa višim afinitetom vezivanja za CD47 nego što ga ima divlji tip humanog SIRP-α D1 domena. U nekim aspektima, visokoafinitetna SIRP-α D1 varijanta vezuje se za humani CD47 sa najmanje 1-strukim (npr., najmanje 1.5-strukim, 2-strukim, 2.5-strukim, 3-strukim, 3.5-strukim, 4-strukim, 5-strukim ili više nego 5-strukim) afinitetom u odnosu na afinitet prirodnog D1 domena. U nekim aspektima, visokoafinitetna SIRP-α D1 varijanta vezuje se za humani CD47 sa najmanje 1-strukim (npr., najmanje 10-strukim, 100-strukim, 1000-strukim ili više nego 1000-strukim) afinitetom nego što je afinitet prirodnog D1 domena.
[0029] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "optimizovani afinitet" ili "optimizovani vezujući afinitet" odnosi se na optimizovanu snagu vezujuće interakcije između polipeptida objavljenog u ovom tekstu, uključujući visokoafinitetnu SIRP-α D1 varijantu, i CD47. Na primer, u nekim aspektima, polipeptid se vezuje prvenstveno ili sa većim afinitetom za CD47 na kancerskim ćelijama i suštinski se ne vezuje ili se vezuje sa nižim afinitetom za CD47 na nekancerskim ćelijama. U nekim aspektima, vezujući afinitet između polipeptida i CD47 je optimizovan tako da interakcija ne izaziva klinički relevantnu toksičnost ili snižava toksičnost u poređenju sa varijantom koja se vezuje sa maksimalnim afinitetom. U nekim aspektima, u cilju postizanja optimizovanog vezujućeg afiniteta između polipeptida obezbeđenog u ovom tekstu i CD47, polipeptid koji uključuje visokoafinitetnu
1
SIRP-α D1 varijantu razvijen je tako da ima niži vezujući afinitet za CD47 od onog koji se maksimalno može postići. U nekim aspektima, visokoafinitetne SIRP-α varijante objavljene u ovom tekstu reaguju unakrsno sa CD47 glodara, nehumanih primata (NHP) i čoveka.
[0030] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "imunogenost" označava osobinu proteina (npr., terapijskog proteina) koji izaziva imunski odgovor kod domaćina kao da je strani antigen. Imunogenost proteina može se testirati in vitro na veći broj različitih načina, na primer in vitro testovima proliferacije T-ćelija.
[0031] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "minimalna imunogenost" označava imunogenost proteina (npr., terapijskog proteina), koja je modifikovana, npr., aminokiselinskim supstitucijama, da bi bila niža (npr., najmanje 10%, 25%, 50%, ili 100% niža) od imunogenosti pre uvođenja aminokiselinskih supstitucija (npr., nemodifikovani protein). U nekim aspektima, protein (npr., terapijski protein) modifikovan je tako da ima minimalnu imunogenost i da ne izaziva ili da izaziva veoma mali domaćinov imunski odgovor, uprkos tome što je strani antigen.
[0032] U nekim aspektima, visokoafinitetna SIRP-α D1 varijanta ima minimalnu imunogenost. U nekim aspektima, SIRP-α polipeptid objave primenjen kod subjekta ima istu aminokiselinsku sekvencu kao SIRP-α polipeptid u biološkom uzorku subjekta, osim aminokiselinskih promena koje povećavaju afinitet SIRP-α D1 varijante. U nekim aspektima, polipeptidne varijante objavljene u ovom tekstu snižavaju rizik za sporedne efekte u poređenju sa anti-CD47 antitelima ili divljim tipom SIRP-α. U nekim aspektima, polipeptidne varijante objavljene u ovom tekstu snižavaju rizik za anemiju u poređenju sa anti-CD47 antitelima ili divljim tipom SIRP-α. U nekim aspektima, polipeptidne varijante objavljene u ovom tekstu ne izazivaju akutnu anemiju u studijama na glodarima ili nehumanim primatima (NHP).
[0033] Tabela 2 navodi specifične aminokiselinske supstitucije u visokoafinitetnoj SIRP-α D1 varijanti u odnosu na svaku D1 domensku sekvencu. U nekim aspektima, visokoafinitetna SIRP-α D1 varijanta uključuje jednu ili više (npr., dve, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset, jedanaest, dvanaest, trinaest, četrnaest ili više) supstitucija navedenih u Tabeli 2. U nekim aspektima, visokoafinitetna SIRP-α D1 varijanta uključuje najviše četrnaest aminokiselinskih supstitucija u odnosu na divlji tip D1 domena. U nekim aspektima, visokoafinitetna SIRP-α D1 varijanta uključuje najviše deset aminokiselinskih supstitucija u odnosu na divlji tip D1 domena. U nekim aspektima, visokoafinitetna SIRP-α D1 varijanta uključuje najviše sedam aminokiselinskih supstitucija u odnosu na divlji tip D1 domena. U nekim aspektima, visokoafinitetna SIRP-α D1 varijanta objave ima
1
najmanje 90% (npr., najmanje 92%, 95%, 97% ili više od 97%) identičnosti aminokiselinske sekvence sa sekvencom divljeg tipa D1 domena.
[0034] U nekim aspektima, visokoafinitetna SIRP-α D1 varijanta je himerna visokoafinitetna SIRP-α D1 varijanta koja uključuje deo dva ili više D1 domena divljeg tipa ili njihovih varijanti (npr., deo jednog D1 domena divljeg tipa ili njegove varijante i deo drugog D1 domena divljeg tipa ili njegove varijante). U nekim aspektima, himerna visokoafinitetna SIRP-α D1 varijanta uključuje najmanje dva dela (npr., tri, četiri, pet ili više delova) divljeg tipa D1 domena ili njegovih varijanti, pri čemu je svaki od delova iz različitog D1 domena divljeg tipa. U nekim aspektima, himerna visokoafinitetna SIRP-α D1 varijanta uključuje još i jednu ili više aminokiselinskih supstitucija navedenih u Tabeli 2.
Tabela 2. Aminokiselinske supstitucije u visokoafinitetnoj SIRP-α D1 varijanti
1
1
2
[0035] U nekim aspektima, polipeptid uključuje SIRP-α D1 varijantu koja ima sekvencu: EEEX1QX2IQPDKSVLVAAGETX3TLRCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPGRX6LIYNQX7X8 GX9FPRVTTVSDX10TX11RNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCX12KX13RKGSPDDVEX14KS GAGTELSVRAKPS (SEQ ID NO: 13), pri čemu X1 je L, I, ili V; X2 je V, L, ili, I; X3 je A ili V; X4 je A, I, ili L; X5 je I, T, S, ili F; X6 je E, V, ili L; X7 je K ili R; X8 je E ili Q; X9 je H, P, ili R; X10 je L, T, ili G; X11 je K ili R; X12 je V ili I; X13 je F, L, ili V; i X14 je F ili V; i pri čemu varijanta ima najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu SEQ ID NO: 1.
[0036] U nekim aspektima, polipeptid uključuje SIRP-α D1 varijantu koja ima sekvencu: EEGX1QX2IQPDKSVSVAAGESX3ILHCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPGRX6LIYNQX7X8 GX9 FPRVTTVSDX10TX11RNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCX12KX13RKGSPDDVEX14KS GAGTELSVRAKPS (SEQ ID NO: 16), pri čemu X1 je L, I, ili V; X2 je V, L, ili, I; X3 je A ili V; X4 je A, I, ili L; X5 je I, T, S, ili F; X6 je E, V, ili L; X7 je K ili R; X8 je E ili Q; X9 je H, P, ili R; X10 je L, T, ili G; X11 je K ili R; X12 je V ili I; X13 je F, L, ili V; i X14 je F ili V; i pri čemu varijanta ima najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu SEQ ID NO: 4.
[0037] U nekim aspektima, polipeptid uključuje SIRP-α D1 varijantu koja ima sekvencu: EEEX1QX2IQPDKFVLVAAGETX3TLRCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPGRX6LIYNQX7X8 GX9FPRVTTVSDX10TX11RNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCX12KX13RKGSPDDVEX14KS GAGTELSVRAKPS (SEQ ID NO: 17), pri čemu X1 je L, I, ili V; X2 je V, L, ili, I; X3 je A ili V; X4 je A, I, ili L; X5 je I, T, S, ili F; X6 je E, V, ili L; X7 je K ili R; X8 je E ili Q; X9 je H, P, ili R; X10 je L, T, ili G; X11 je K ili R; X12 je V ili I; X13 je F, L, ili V; i X14 je F ili V; i pri čemu varijanta ima najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu SEQ ID NO: 5.
[0038] U nekim aspektima, polipeptid uključuje SIRP-α D1 varijantu koja ima sekvencu: EEEX1QX2IQPDKSVLVAAGETX3TLRCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPGRX6LIYNQX7X8 GX9FPRVTTVSDX10TX11RNNMDFPIRIGNITPADAGTYYCX12KX13RKGSPDDVEX14KS GAGTELSVRAKPS (SEQ ID NO: 18), pri čemu X1 je L, I, ili V; X2 je V, L, ili, I; X3 je A ili V; X4 je A, I, ili L; X5 je I, T, S, ili F; X6 je E, V, ili L; X7 je K ili R; X8 je E ili Q; X9 je H, P, ili R; X10 je L, T, ili G; X11 je K ili R; X12 je V ili I; X13 je F, L, ili V; i X14 je F ili V; i pri čemu varijanta ima najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu SEQ ID NO: 6.
[0039] U nekim aspektima, polipeptid uključuje SIRP-α D1 varijantu koja ima sekvencu: EEEX1QX2IQPDKSVLVAAGETX3TLRCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPGRX6LIYNQX7X8 GX9FPRVTTVSDX10TX11RNNMDFSIRISNITPADAGTYYCX12KX13RKGSPDDVEX14KS GAGTELSVRAKPS (SEQ ID NO: 21), pri čemu X1 je L, I, ili V; X2 je V, L, ili, I; X3 je A ili V; X4 je A, I, ili L; X5 je I, T, S, ili F; X6 je E, V, ili L; X7 je K ili R; X8 je E ili Q; X9 je H, P, ili R; X10 je L, T, ili G; X11 je K ili R; X12 je V ili I; X13 je F, L, ili V; i X14 je F ili V; i pri čemu varijanta ima najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu SEQ ID NO: 9.
[0040] U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, polipeptid uključuje visokoafinitetnu SIRP-α D1 varijantu koja ima sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 13, 16-18, i 21, pri čemu X1 je L, I, ili V. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X2 je V, L, ili, I. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X3 je A ili V. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X4 je A, I, ili L. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X5 je I, T, S, ili F. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X6 je E, V, ili L. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X7 je K ili R. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X8 je E ili Q. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X9 je H, P, ili R. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X10 je L, T, ili G. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X11 je K ili R. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X12 je V ili I. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X13 je F, L, V. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X14 je F ili V. U nekim aspektima, polipeptid ovog aspekta objave uključuje ne više od šest aminokiselinskih supstitucija u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 1, 4-6, i 9.
[0041] U nekim aspektima, polipeptid se vezuje za CD47 sa najmanje 10-struko većim vezujućim afinitetom nego divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 1, 4-6, i 9. U nekim aspektima, polipeptid se vezuje za CD47 sa najmanje 100-struko većim vezujućim afinitetom nego divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 1, 4-6, i 9. U nekim aspektima, polipeptid se vezuje za CD47 sa najmanje 1000- struko većim vezujućim afinitetom nego divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 1, 4-6, i 9. U nekim aspektima, SIRP-α D1 varijantni polipeptid ili njegov fragment vezuje se za CD47 sa KD manjom od 1 x 10-8 M, manjom od 5 x 10-9 M, manjom od 1 x 10-9 M, manjom od 5 x 10-10 M, manjom od 1 x 10-10 M ili manjom od 1 x 10-11 M. U nekim aspektima, SIRP-α D1 varijantni polipeptid ili njegov fragment vezuje se za CD47 sa KD između oko 500 nM i 100 nM, između oko 100 nM i 50 nM, između oko 50 nM i 10 nM, između oko 10 nM i 5 nM, između oko 5 nM i 1 nM, između oko 1 nM i 500 pM, između oko 500 pM i 100 pM, između oko 100 pM i 50 pM, ili između oko 50 pM i 10 pM.
[0042] U nekim aspektima, polipeptid uključuje SIRP-α D1 varijantu koja ima sekvencu: EEEX1QX2IQPDKSVSVAAGESX3ILHCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPARX6LIYNQX7X8 GX9FPRVTTVSEX10TX11RENMDFSISISNITPADAGTYYCX12KX13RKGSPDTEX14KSGA GTELSVRAKPS (SEQ ID NO: 14), pri čemu X1 je L, I, ili V; X2 je V, L, ili, I; X3 je A ili V; X4 je V, I, ili L; X5 je I, T, S, ili F; X6 je E, V, ili L; X7 je K ili R; X8 je E ili Q; X9 je H, P, ili R; X10 je S, T, ili G; X11 je K ili R; X12 je V ili I; X13 je F, L, ili V; i X14 je F ili V; i pri čemu varijanta ima najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu SEQ ID NO: 2.
[0043] U nekim aspektima, polipeptid uključuje SIRP-α D1 varijantu koja ima sekvencu: EEEX1QX2IQPDKSVSVAAGESX3ILLCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPARX6LIYNQX7X8 GX9FPRVTTVSEX10TX11RENMDFSISISNITPADAGTYYCX12KX13RKGSPDTEX14KSGA GTELSV RAKPS (SEQ ID NO: 15), pri čemu X1 je L, I, ili V; X2 je V, L, ili, I; X3 je A ili V; X4 je V, I, ili L; X5 je I, T, S, ili F; X6 je E, V, ili L; X7 je K ili R; X8 je E ili Q; X9 je H, P, ili R; X10 je S, T, ili G; X11 je K ili R; X12 je V ili I; X13 je F, L, ili V; i X14 je F ili V; i pri čemu varijanta ima najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu SEQ ID NO: 3.
[0044] U nekim aspektima, polipeptid uključuje SIRP-α D1 varijantu koja ima sekvencu: EEEX1QX2IQPDKSVSVAAGESX3ILHCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPARX6LIYNQX7X8 GX9FPRVTTVSEX10TX11RENMDFSISISNITPADAGTYYCX12KX13RKGSPDTEX14KSGA
2
GTELSVRGKPS (SEQ ID NO: 19), pri čemu X1 je L, I, ili V; X2 je V, L, ili, I; X3 je A ili V; X4 je V, I, ili L; X5 je I, T, S, ili F; X6 je E, V, ili L; X7 je K ili R; X8 je E ili Q; X9 je H, P, ili R; X10 je S, T, ili G; X11 je K ili R; X12 je V ili I; X13 je F, L, ili V; i X14 je F ili V; i pri čemu varijanta ima najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu SEQ ID NO: 7.
[0045] U nekim aspektima, polipeptid uključuje SIRP-α D1 varijantu koja ima sekvencu: EEEX1QX2IQPDKSVSVAAGESX3ILHCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPARX6LIYNQX7X8 GX9FPRVTTVSEX10TX11RENMDFSISISNITPADAGTYYCX12KX13RKGSPDTEX14KSGA GTELSVRAKPS (SEQ ID NO: 22), pri čemu X1 je L, I, ili V; X2 je V, L, ili, I; X3 je A ili V; X4 je V, I, ili L; X5 je I, T, S, ili F; X6 je E, V, ili L; X7 je K ili R; X8 je E ili Q; X9 je H, P, ili R; X10 je S, T, ili G; X11 je K ili R; X12 je V ili I; X13 je F, L, ili V; i X14 je F ili V; i pri čemu varijanta ima najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu SEQ ID NO: 10.
[0046] U bilo kojem od gore pomenutih aspekata u ovom aspektu objave, polipeptid ima sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 14, 15, 19, i 22, pri čemu X1 je L, I, ili V. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X2 je V, L, ili, I. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X3 je A ili V. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X4 je V, I, ili L. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X5 je I, T, S, ili F. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X6 je E, V, ili L. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X7 je K ili R. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X8 je E ili Q. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X9 je H, P, ili R. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X10 je S, T, ili G. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X11 je K ili R. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X12 je V ili I. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X13 je F, L, ili V. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X14 je F ili V. U nekim aspektima, polipeptid ovog aspekta objave uključuje ne više od šest aminokiselinskih supstitucija u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 2, 3, 7, i 10.
[0047] U nekim aspektima, polipeptid se vezuje za CD47 sa najmanje 10-struko većim vezujućim afinitetom nego divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 2, 3, 7, i 10. U nekim aspektima, polipeptid se vezuje za CD47 sa najmanje 100-struko većim vezujućim afinitetom nego divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 2, 3, 7, i 10. U nekim aspektima, polipeptid se vezuje za CD47 sa najmanje 1000-struko većim vezujućim afinitetom nego divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 2, 3, 7, i 10. U nekim aspektima, SIRP-α D1 varijantni polipeptid ili njegov fragment vezuje se za CD47 sa KD manjom od 1 x 10<-8>M, manjom od 5 x 10<-9>M, manjom od 1 x 10<-9>M, manjom od 5 x 10<-10>M, manjom od 1 x 10<-10>M ili manjom od 1 x 10<-11>M. U nekim aspektima, SIRP-α D1 varijantni polipeptid ili njegov fragment vezuje se za CD47 sa KD između oko 500 nM i 100 nM, između oko 100 nM i 50 nM, između oko 50 nM i 10 nM, između oko 10 nM i 5 nM, između oko 5 nM i 1 nM, između oko 1 nM i 500 pM, između oko 500 pM i 100 pM, između oko 100 pM i 50 pM, ili između oko 50 pM i 10 pM.
[0048] U nekim aspektima, polipeptid uključuje SIRP-α D1 varijantu koja ima sekvencu: EEEX1QX2IQPDKSVLVAAGETX3TLRCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPARX6LIYNQX7X8 GX9FPRVTTVSEX10TX11RENMDFSISISNITPADAGTYYCX12KX13RKGSPDTEX14KSGA GTELSVRAKPS (SEQ ID NO: 20), pri čemu X1 je L, I, ili V; X2 je V, L, ili, I; X3 je A ili V; X4 je A, I, ili L; X5 je I, T, S, ili F; X6 je E, V, ili L; X7 je K ili R; X8 je E ili Q; X9 je H, P, ili R; X10 je S, T, ili G; X11 je K ili R; X12 je V ili I; X13 je F, L, ili V; i X14 je F ili V; i pri čemu varijanta ima najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu SEQ ID NO: 8.
[0049] U nekim aspektima, polipeptid ima sekvencu SEQ ID NO: 20, pri čemu X1 je L, I, ili V. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata u ovom aspektu objave, X2 je V, L, ili, I. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X3 je A ili V. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X4 je A, I, ili L. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X5 je I, T, S, ili F. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X6 je E, V, ili L. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X7 je K ili R. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X8 je E ili Q. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X9 je H, P, ili R. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X10 je S, T, ili G. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X11 je K ili R. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X12 je V ili I. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X13 je F, L, ili V. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X14 je F ili V. U nekim aspektima, polipeptid ovog aspekta objave uključuje ne više od šest aminokiselinskih supstitucija u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu SEQ ID NO: 8.
[0050] U nekim aspektima, polipeptid se vezuje za CD47 sa najmanje 10-struko većim vezujućim afinitetom nego divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima SEQ ID NO: 8. U nekim aspektima, polipeptid se vezuje za CD47 sa najmanje 100-struko većim vezujućim afinitetom nego divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu SEQ ID NO: 8. U nekim aspektima, polipeptid se vezuje za CD47 sa najmanje 1000-struko većim vezujućim afinitetom nego divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu SEQ ID NO: 8. U nekim aspektima, SIRP-α D1 varijantni polipeptid ili njegov fragment vezuje se za CD47 sa KD manjom od 1 x 10<-8>M, manjom od 5 x 10<-9>M, manjom od 1 x 10<-9>M, manjom od 5 x 10<-10>M, manjom od 1 x 10<-10>M ili manjom od 1 x 10<-11>M. U nekim aspektima, SIRP-α D1
2
varijantni polipeptid ili njegov fragment vezuje se za CD47 sa KD između oko 500 nM i 100 nM, između oko 100 nM i 50 nM, između oko 50 nM i 10 nM, između oko 10 nM i 5 nM, između oko 5 nM i 1 nM, između oko 1 nM i 500 pM, između oko 500 pM i 100 pM, između oko 100 pM i 50 pM, ili između oko 50 pM i 10 pM.
[0051] U nekim aspektima, polipeptid uključuje SIRP-α D1 varijantu koja ima sekvencu: EEX1X2QX3IQPDKX4VX5VAAGEX6X7X8LX9CTX10TSLX11PVGPIQWFRGAGPX12RX13LI YNQX14X15GX16FPRVTTVSX17X18TX19RX20NMDFX21IX22IX23NITPADAGTYYCX24KX25 RKGSPDX26X27EX28KSGAGTELSVRX29KPS (SEQ ID NO: 23), pri čemu X1 je E ili G; X2 je L, I, ili V; X3 je V, L, ili, I; X4 je S ili F; X5 je L ili S; X6 je S ili T; X7 je A ili V; X8 je I ili T; X9 je H ili R; X10 je A, V, I, ili L; X11 je I, T, S, ili F; X12 je A ili G; X13 je E, V, ili L; X14 je K ili R; X15 je E ili Q; X16 je H, P, ili R; X17 je D ili E; X18 je S, L, T, ili G; X19 je K ili R; X20 je E ili D; X21 je S ili P; X22 je S ili R; X23 je S ili G; X24 je V ili I; X25 je F, L, V; X26 je D ili odsutan; X27 je T ili V; X28 je F ili V; i X29 je A ili G; i pri čemu varijanta ima najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 1-10.
[0052] U bilo kojem od gore pomenutih aspekata u ovom aspektu objave, X2 je L, I, ili V. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X3 je V, L, ili, I. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X4 je S ili F. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X5 je L ili S. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X6 je S ili T. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X7 je A ili V. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X8 je I ili T. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X9 je H ili R. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X10 je A, V, I, ili L. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X11 je I, T, S, ili F. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X12 je A ili G. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X13 je E, V, ili L. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X14 je K ili R. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X15 je E ili Q. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X16 je H, P, ili R. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X17 je D ili E. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X18 je S, L, T, ili G. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X19 je K ili R. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X20 je E ili D. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X21 je S ili P. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X22 je S ili R. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X23 je S ili G. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X24 je V ili I U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X25 je F, L, V. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X26 je D ili odsutan. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X27 je T ili V. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X28 je F ili V. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X29 je A ili G. U nekim aspektima, polipeptid
2
ovog aspekta objave uključuje ne više od šest aminokiselinskih supstitucija u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 1-10.
[0053] U nekim aspektima, polipeptid se vezuje za CD47 sa najmanje 10-struko većim vezujućim afinitetom nego divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 1-10. U nekim aspektima, polipeptid se vezuje za CD47 sa najmanje 100-struko većim vezujućim afinitetom nego divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 1-10. U nekim aspektima, polipeptid se vezuje za CD47 sa najmanje 1000-struko većim vezujućim afinitetom nego divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 1-10. U nekim aspektima, SIRP-α D1 varijantni polipeptid ili njegov fragment vezuje se za CD47 sa KD manjom od 1 x 10<-8>M, manjom od 5 x 10<-9>M, manjom od 1 x 10<-9>M, manjom od 5 x 10<-10>M, manjom od 1 x 10<-10>M ili manjom od 1 x 10<-11>M. U nekim aspektima, SIRP-α D1 varijantni polipeptid ili njegov fragment vezuje se za CD47 sa KD između oko 500 nM i 100 nM, između oko 100 nM i 50 nM, između oko 50 nM i 10 nM, između oko 10 nM i 5 nM, između oko 5 nM i 1 nM, između oko 1 nM i 500 pM, između oko 500 pM i 100 pM, između oko 100 pM i 50 pM, ili između oko 50 pM i 10 pM.
[0054] U nekim aspektima, polipeptid objave koji uključuje visokoafinitetnu SIRP-α D1 varijantu sadrži još i D2 domen koji ima sekvencu SEQ ID NO: 24, D3 domen koji ima sekvencu SEQ ID NO: 25, ili D2 domen koji ima sekvencu SEQ ID NO: 24 i D3 domen koji ima sekvencu SEQ ID NO: 25 divljeg tipa humanog SIRP-α kako je prikazano u Tabeli 3. U nekim aspektima, visokoafinitetna SIRP-α D1 varijanta uključuje još i fragment ili varijantu D2 domena ili fragment ili varijantu D3 domena. U nekim aspektima, visokoafinitetna SIRP-α D1 varijanta uključuje još i fragment ili varijantu D2 domena i fragment ili varijantu D3 domena. U nekim aspektima, visokoafinitetna SIRP-α D1 varijanta je spojena sa D2 ili D3 domenom posredstvom linkera. U nekim aspektima, visokoafinitetna SIRP-α D1 varijanta je spojena sa D2 i D3 domenom posredstvom linkera.
Tabela 3. Aminokiselinske sekvence SIRP-α D2 i D3 domena
2
[0055] U nekim aspektima, polipeptid objave koji uključuje visokoafinitetnu SIRP-α D1 varijantu prikačen je za Fc domenski monomer, humani serum albumin (HSA) ili varijantu istog, serum-vezujući protein ili peptid, ili organski molekul, npr., polimer (npr., PEG polimer), sa ciljem poboljšanja farmakokinetičkih osobina polipeptida, npr., povećanja poluživota u serumu. U nekim aspektima, visokoafinitetna SIRP-α D1 varijanta prikačena je za Fc domenski monomer koji ne može da se dimerizuje. U nekim aspektima, Fc domenski monomeri, HSA proteini, serum-vezujući proteini ili peptidi, i organski molekuli kao što je PEG služe za povećanje poluživota u serumu polipeptida opisanih u ovom tekstu. U nekim aspektima, polipeptid objave koji uključuje visokoafinitetnu SIRP-α D1 varijantu ne uključuje sekvencu neke od SEQ ID NO: 26-36 prikazanih u Tabeli 4.
Tabela 4.
2
[0056] U nekim aspektima, polipeptidi i polipeptidni konstrukti opisani u ovom tekstu koriste se in vitro u testovima vezivanja, kao što su imunski testovi. Na primer, u nekim aspektima, polipeptidi i polipeptidni konstrukti opisani u ovom tekstu koriste se u tečnoj fazi ili vezani za čvrstofazni nosač. U nekim aspektima, polipeptidi koji se koriste za imunotestove detektabilno su obeleženi na različite načine.
[0057] U nekim aspektima, polipeptidi i polipeptidni konstrukti opisani u ovom tekstu vezani su za različite nosače i koriste se za detektovanje prisustva ćelija koje eksprimiraju specifične antigene. Primeri nosača uključuju staklo, polistiren, polipropilen, polietilen, dekstran, najlon, amilaze, prirodne i modifikovane celuloze, poliakrilamide, agaroze, i magnetit. Nosači mogu biti po prirodi rastvorljivi ili nerastvorljivi.
[0058] Poznat je veliki broj različitih obeleživača ili postupaka obeležavanja. Primeri obeleživača uključuju enzime, radioizotope, fluorescentna jedinjenja, koloidne metale, hemiluminiscentna jedinjenja, i bioluminiscentna jedinjenja. Na raspolaganju postoje različite tehnike vezivanja obeleživača za polipeptide objavljene u ovom tekstu.
[0059] U nekim aspektima, polipeptidi se povezuju sa haptenima male molekulske težine. Ovi hapteni se zatim specifično detektuju sekundarnom reakcijom. Na primer, u nekim aspektima, hapten biotin koristi se sa avidinom ili hapteni dinitrofenol, piridoksal, ili fluorescein detektuju se specifičnim anti-haptenskim antitelima (npr., antidinitrofenolantitela, antipiridoksal- antitela, odnosno antifluorescein-antitela).
2
II. Visokoafinitetni SIRP-α D1 domeni sa izmenjenom glikozilacijom
[0060] U ovom tekstu su objavljeni, u nekim aspektima, polipeptidi koji uključuju signalregulatorni protein α (SIRP-α) D1 varijantu koja uključuje SIRP-α D1 domen, ili njegov fragment, koji ima aminokiselinsku mutaciju na rezidui 80 u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena; i najmanje jednu dodatnu aminokiselinsku mutaciju u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena na rezidui odabranoj iz grupe koja se sastoji od: rezidue 6, rezidue 27, rezidue 31, rezidue 47, rezidue 53, rezidue 54, rezidue 56, rezidue 66, i rezidue 92.
[0061] Isto tako, u ovom tekstu su objavljeni, u nekim aspektima, polipeptidi koji uključuju Fc varijantu, pri čemu Fc varijanta uključuje Fc domenski dimer koji ima dva Fc domenska monomera, pri čemu se svaki Fc domenski monomer nezavisno bira između (i) humanog IgG1 Fc regiona koji se sastoji od mutacija L234A, L235A, G237A, i N297A; (ii) humanog IgG2 Fc regiona koji se sastoji od mutacija A330S, P331S i N297A; ili (iii) humanog IgG4 Fc region koji sadrži mutacije S228P, E233P, F234V, L235A, delG236, i N297A.
[0062] U nekim aspektima, polipeptid u kompoziciji objavljenoj u ovom tekstu uključuje visokoafinitetnu SIRP-α D1 varijantu koja ima smanjenu ili minimalnu glikozilaciju. D1 domen svakog od deset divljih tipova humanih SIRP-α proteina (SEQ ID NO: 1-10 u Tabeli 1) sadrži jedno potencijalno N-glikozilaciono mesto na amino-kiselini N80 u sekvenci N80ITP. Ekspresija SIRP-α D1 domena u ćelijama ovarijuma kineskog hrčka (Chinese hamster ovary, CHO) rezultuje glavnom trakom od 16 kDa (neglikozilovano) i malom trakom veće molekulske težine koja se uklanja Endo Hf. Endo Hf je rekombinantna proteinska fuzija endoglikozidaze H i maltoza-vezujućeg proteina. Endo Hf vrši odsecanje unutar hitobiozne srži visokomanoznih i nekih hibridnih oligosaharida od N-vezanih glikoproteina. To podrazumeva da prolin na aminokiselinskoj poziciji 83 može da smanji efikasnost glikozilacije, dajući protein sa različitim stepenima glikozilacije koji su prema tome heterogeni. Za razvijanje lekova, heterogenost može dovesti do nastanka problema u procesu razvoja. Prema tome, da bi se ispitala mogućnost stvaranja homogenih, neglikozilovanih formi visokoafinitetnih SIPR-α D1 varijanti, u nekim aspektima, aminokiselina N80 SIPR-α D1 varijante mutirana je u Ala. U nekim aspektima, da bi se napravila neglikozilovana, visokoafinitetna SIRP-α D1 varijanta, amino-kiselina N80 u visokoafinitetnoj SIRP-α D1 varijanti zamenjena je nekom amino-kiselinom, uključujući bilo koju amino-kiselinu koja se sreće ili koja se ne sreće u prirodi, npr., N80A i N80Q. U nekim aspektima, visokoafinitetna SIRP-α D1 varijanta uključuje N80A mutaciju i najmanje jednu dodatnu mutaciju (npr., najmanje 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 dodatnih mutacija ili više). U nekim aspektima, dodatna mutacija je na CD47-vezujućem mestu. U nekim aspektima, dodatna mutacija je u hidrofobnoj srži D1 domena.
[0063] U nekim aspektima, polipeptid u kompoziciji objavljenoj u ovom tekstu uključuje visokoafinitetnu SIRP-α D1 varijantu koja ima povećanu glikozilaciju u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena. Druga opcija za povećanje homogenosti finalnog proizvoda je pojačati efikasnost glikozilacije na amino-kiselini N80 i stvoriti visokoafinitetne SIRP-α D1 varijante sa povećanom glikozilacijom u odnosu na divlji tip. U nekim aspektima, aminokiselina P83 u sekvenci NITP83 utiče na stepen glikozilacije na amino-kiselini N80. U nekim aspektima, promena P83 u neku drugu amino-kiselinu povećava efikasnost glikozilacije na N80. U nekim aspektima, amino-kiselina P83 u visokoafinitetnoj SIRP-α D1 varijanti zamenjena je nekom drugom amino-kiselinom, uključujući amino-kiseline koje se sreću ili koje se ne sreću u prirodi, npr., P83V, P83A, P83I, i P83L. U nekim aspektima, polipeptid objave eksprimira se u ćeliji koja je optimizovana da se proteini koji se eksprimiraju u takvoj ćeliji ne glikozikuju, na primer genetičkim inženjerisanjem ćelijske linije (npr., genetičkim inženjerisanjem kvasca ili sisara kao domaćina) ili modifikacijama uslova ćelijske kulture kao što je dodavanje kifunenzina ili korišćenjem prirodno neglikolizujućeg domaćina kao što je prokariot (E. coli, itd.).
[0064] Tabela 5 navodi specifične aminokiselinske supstitucije u visokoafinitetnoj SIRP-α D1 varijanti u odnosu na sekvencu svake varijante D1 domena. U nekim aspektima, visokoafinitetna SIRP-α D1 varijanta uključuje jednu ili više (npr., dve, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset, jedanaest, dvanaest, trinaest, četrnaest ili više) supstitucija navedenih u Tabeli 5. U nekim aspektima, SIRP-α D1 varijante nisu glikozilovane ili su minimalno glikozilovane. U nekim aspektima, SIRP-α D1 varijante su potpuno glikozilovane ili su skoro potpuno glikozilovane. U nekim aspektima, visokoafinitetna SIRP-α D1 varijanta uključuje najviše četrnaest aminokiselinskih supstitucija u odnosu na divlji tip D1 domena. U nekim aspektima, visokoafinitetna SIRP-α D1 varijanta uključuje najviše deset aminokiselinskih supstitucija u odnosu na divlji tip D1 domena. U nekim aspektima, visokoafinitetna SIRP-α D1 varijanta uključuje najviše sedam aminokiselinskih supstitucija u odnosu na divlji tip D1 domena. U nekim aspektima, visokoafinitetna SIRP-α D1 varijanta objave ima najmanje 90% (npr., najmanje 92%, 95%, 97% ili više od 97%) identičnosti aminokiselinske sekvence sa sekvencom divljeg tipa D1 domena.
[0065] U nekim aspektima, visokoafinitetna SIRP-α D1 varijanta je himerna visokoafinitetna SIRP-α D1 varijanta koja uključuje deo dva ili više divljih tipova D1 domena ili njihovih varijanti (npr., deo jednog divljeg tipa D1 domena ili njegove varijante i deo drugog divljeg tipa D1 domena ili njegove varijante). U nekim aspektima, himerna
1
visokoafinitetna SIRP-α D1 varijanta uključuje najmanje dva dela (npr., tri, četiri, pet ili više delova) divljeg tipa D1 domena ili njegovih varijanti, pri čemu je svaki od delova iz različitog divljeg tipa D1 domena. U nekim aspektima, himerna visokoafinitetna SIRP-α D1 varijanta uključuje još i jednu ili više aminokiselinskih supstitucija navedenih u Tabeli 5.
Tabela 5. Aminokiselinske supstitucije u visokoafinitetnoj SIRP-α D1 varijanti
2
SEQ
ID O is Aminokiselinska sekvenca
SEQ
ID Opis Aminokiselinska sekvenca
4
SEQ
ID O is Aminokiselinska sekvenca
SEQ
ID O is Aminokiselinska sekvenca
Aminokiselinske X1=V, L, I; X2=V, I, L; X3=I, T, S, F; X4=K, R; -supstitucije u X5=H, P, R; X6=S, T, G; i X7=A
SEQ
ID Opis Aminokiselinska sekvenca
[0066] U nekim aspektima, polipeptid uključuje SIRP-α D1 varijantu koja ima sekvencu: EEEX1QX2IQPDKSVLVAAGETX3TLRCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPGRX6LIYNQX7X8 GX9FPRVTTVSDX10TX11RNNMDFSIRIGX12ITX13ADAGTYYCX14KX15RKGSPDDVEX16 KSGAGTELSVRAKPS (SEQ ID NO: 37), pri čemu X1 je L, I, ili V; X2 je V, L, ili, I; X3 je A ili V; X4 je A, I, ili L; X5 je I, T, S, ili F; X6 je E, V, ili L; X7 je K ili R; X8 je E ili Q; X9 je H, P, ili R; X10 je L, T, ili G; X11 je K ili R; X12 je N, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, ili Y; X13 je P, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, ili Y; X14 je V ili I; X15 je F, L, ili V; i X16 je F ili V; i pri čemu varijanta ima najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu SEQ ID NO: 1.
[0067] U nekim aspektima, polipeptid uključuje SIRP-α D1 varijantu koja ima sekvencu: EEGX1QX2IQPDKSVSVAAGESX3ILHCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPGRX6LIYNQX7X8 GX9FPRVTTVSDX10TX11RNNMDFSIRIGX12ITX13ADAGTYYCX14KX15RKGSPDDVEX16 KSGAGTELSVRAKPS (SEQ ID NO: 40), pri čemu X1 je L, I, ili V; X2 je V, L, ili, I; X3 je A ili V; X4 je A, I, ili L; X5 je I, T, S, ili F; X6 je E, V, ili L; X7 je K ili R; X8 je E ili Q; X9 je H, P, ili R; X10 je L, T, ili G; X11 je K ili R; X12 je N, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, ili Y; X13 je P, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, ili Y; X14 je V ili I; X15 je F, L, ili V; i X16 je F ili V; i pri čemu varijanta ima najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu SEQ ID NO: 4.
[0068] U nekim aspektima, polipeptid uključuje SIRP-α D1 varijantu koja ima sekvencu: EEEX1QX2IQPDKFVLVAAGETX3TLRCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPGRX6LIYNQX7X8 GX9FPRVTTVSDX10TX11RNNMDFSIRIGX12ITX13ADAGTYYCX14KX15RKGSPDDVEX16 KSGAGTELSVRAKPS (SEQ ID NO: 41), pri čemu X1 je L, I, ili V; X2 je V, L, ili, I; X3 je A ili V; X4 je A, I, ili L; X5 je I, T, S, ili F; X6 je E, V, ili L; X7 je K ili R; X8 je E ili Q; X9 je H, P, ili R; X10 je L, T, ili G; X11 je K ili R; X12 je N, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, ili Y; X13 je P, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, ili Y; X14 je V ili I; X15 je F, L, ili V; i X16 je F ili V; i pri čemu varijanta ima najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu SEQ ID NO: 5.
[0069] U nekim aspektima, polipeptid uključuje SIRP-α D1 varijantu koja ima sekvencu: EEEX1QX2IQPDKSVLVAAGETX3TLRCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPGRX6LIYNQX7X8 GX9FPRVTTVSDX10TX11RNNMDFPIRIGX12ITX13ADAGTYYCX14KX15RKGSPDDVEX16 KSGAG TELSVRAKPS (SEQ ID NO: 42), i pri čemu X1 je L, I, ili V; X2 je V, L, ili, I; X3 je A ili V; X4 je A, I, ili L; X5 je I, T, S, ili F; X6 je E, V, ili L; X7 je K ili R; X8 je E ili Q; X9 je H, P, ili R; X10 je L, T, ili G; X11 je K ili R; X12 je N, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, ili Y; X13 je P, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, ili Y; X14 je V ili I; X15 je F, L, ili V; i X16 je F ili V; i pri čemu varijanta ima najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu SEQ ID NO: 6.
[0070] U nekim aspektima, polipeptid uključuje SIRP-α D1 varijantu koja ima sekvencu: EEEX1QX2IQPDKSVLVAAGETX3TLRCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPGRX6LIYNQX7X8 GX9FPRVTTVSDX10TX11RNNMDFSIRISX12ITX13ADAGTYYCX14KX15RKGSPDDVEX16 KSGAG TELSVRAKPS (SEQ ID NO: 45), i pri čemu X1 je L, I, ili V; X2 je V, L, ili, I; X3 je A ili V; X4 je A, I, ili L; X5 je I, T, S, ili F; X6 je E, V, ili L; X7 je K ili R; X8 je E ili Q; X9 je H, P, ili R; X10 je L, T, ili G; X11 je K ili R; X12 je N, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, ili Y; X13 je P, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, ili Y; X14 je V ili I; X15 je F, L, ili V; i X16 je F ili V; i pri čemu varijanta ima najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu SEQ ID NO: 9.
[0071] U bilo kojem od gore pomenutih aspekata u ovom aspektu objave, polipeptid uključuje SIRP-α D1 varijantu koja ima sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 37, 40-42, i 45, pri čemu X1 je L, I, ili V. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X2 je V, L, ili, I. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X3 je A ili V. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X4 je A, I, ili L. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X5 je I, T, S, ili F. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X6 je E, V, ili L. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X7 je K ili R. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X8 je E ili Q. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X9 je H, P, ili R. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X10 je L, T, ili G. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X11 je K ili R. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X12 je N, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, ili Y. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X13 je P, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, ili Y. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X14 je V ili I. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X15 je F, L, V. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X16 je F ili V.
[0072] U nekim aspektima, polipeptid obezbeđen u ovom tekstu uključuje ne više od deset aminokiselinskih supstitucija u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 1, 4-6, i 9. U nekim aspektima, polipeptid obezbeđen u ovom tekstu uključuje ne više od sedam aminokiselinskih supstitucija u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 1, 4-6, i 9.
[0073] U nekim aspektima, polipeptid se vezuje za CD47 sa najmanje 10-struko većim vezujućim afinitetom nego divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 1, 4-6, i 9. U nekim aspektima, polipeptid se vezuje za CD47 sa najmanje 100-struko većim vezujućim afinitetom nego divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 1, 4-6, i 9. U nekim aspektima, polipeptid se vezuje za CD47 sa najmanje 1000- struko većim vezujućim afinitetom nego divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 1, 4-6, i 9. U nekim aspektima, SIRP-α D1 varijantni polipeptid ili njegov fragment vezuje se za CD47 sa KD manjom od 1 x 10<-8>M, manjom od 5 x 10<-9>M, manjom od 1 x 10<-9>M, manjom od 5 x 10<-10>M, manjom od 1 x 10<-10>M ili manjom od 1 x 10<-11>M. U nekim aspektima, SIRP-α D1 varijantni polipeptid ili njegov fragment vezuje se za CD47 sa KD između oko 500 nM i 100 nM, između oko 100 nM i 50 nM, između oko 50 nM i 10 nM, između oko 10 nM i 5 nM, između oko 5 nM i 1 nM, između oko 1 nM i 500 pM, između oko 500 pM i 100 pM, između oko 100 pM i 50 pM, ili između oko 50 pM i 10 pM.
[0074] U nekim aspektima, polipeptid uključuje SIRP-α D1 varijantu koja ima sekvencu: EEEX1QX2IQPDKSVSVAAGESX3ILHCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPARX6LIYNQX7X8 GX9FPRVTTVSEX10TX11RENMDFSISISX12ITX13ADAGTYYCX14KX15RKGSPDTEX16KS GAGTELSVRAKPS (SEQ ID NO: 38), pri čemu X1 je L, I, ili V; X2 je V, L, ili, I; X3 je A ili V; X4 je V, I, ili L; X5 je I, T, S, ili F; X6 je E, V, ili L; X7 je K ili R; X8 je E ili Q; X9 je H, P, ili R; X10 je S, T, ili G; X11 je K ili R; X12 je N, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, ili Y; X13 je P, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, ili Y; X14 je V ili I; X15 je F, L, ili V; i X16 je F ili V; i pri čemu varijanta ima najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu SEQ ID NO: 2.
[0075] U nekim aspektima, polipeptid uključuje SIRP-α D1 varijantu koja ima sekvencu: EEEX1QX2IQPDKSVSVAAGESX3ILLCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPARX6LIYNQX7X8 GX9FPRVTTVSEX10TX11RENMDFSISISX12ITX13ADAGTYYCX14KX15RKGSPDTEX16KS GAGTELSVRAKPS (SEQ ID NO: 39), pri čemu X1 je L, I, ili V; X2 je V, L, ili, I; X3 je A ili V; X4 je V, I, ili L; X5 je I, T, S, ili F; X6 je E, V, ili L; X7 je K ili R; X8 je E ili Q; X9 je H, P, ili R; X10 je S, T, ili G; X11 je K ili R; X12 je N, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, ili Y; X13 je P, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, ili Y; X14 je V ili I; X15 je F, L, ili V; i X16 je F ili V; i pri čemu varijanta ima najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu SEQ ID NO: 3.
[0076] U nekim aspektima, polipeptid uključuje SIRP-α D1 varijantu koja ima sekvencu: EEEX1QX2IQPDKSVSVAAGESX3ILHCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPARX6LIYNQX7X8 GX9FPRVTTVSEX10TX11RENMDFSISISX12ITX13ADAGTYYCX14KX15RKGSPDTEX16KS GAGTELSVRGKPS (SEQ ID NO: 43), pri čemu X1 je L, I, ili V; X2 je V, L, ili, I; X3 je A ili V; X4 je V, I, ili L; X5 je I, T, S, ili F; X6 je E, V, ili L; X7 je K ili R; X8 je E ili Q; X9 je H, P, ili R; X10 je S, T, ili G; X11 je K ili R; X12 je N, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, ili Y; X13 je P, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, ili Y; X14 je V ili I; X15 je F, L, ili V; i X16 je F ili V; i pri čemu varijanta ima najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu SEQ ID NO: 7.
[0077] U nekim aspektima, polipeptid uključuje SIRP-α D1 varijantu koja ima sekvencu: EEEX1QX2IQPDKSVSVAAGESX3ILHCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPARX6LIYNQX7X8 GX9FPRVTTVSEX10TX11RENMDFSISISX12ITX13ADAGTYYCX14KX15RKGSPDTEX16KS
4
GAGTELSVRAKPS (SEQ ID NO: 46), pri čemu X1 je L, I, ili V; X2 je V, L, ili, I; X3 je A ili V; X4 je V, I, ili L; X5 je I, T, S, ili F; X6 je E, V, ili L; X7 je K ili R; X8 je E ili Q; X9 je H, P, ili R; X10 je S, T, ili G; X11 je K ili R; X12 je N, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, ili Y; X13 je P, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, ili Y; X14 je V ili I; X15 je F, L, ili V; i X16 je F ili V; i pri čemu varijanta ima najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu SEQ ID NO: 10.
[0078] U bilo kojem od gore pomenutih aspekata u ovom aspektu objave, polipeptid uključuje SIRP-α D1 varijantu koja ima sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 38, 39, 43, i 46, pri čemu X1 je L, I, ili V. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X2 je V, L, ili, I. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X3 je A ili V. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X4 je V, I, ili L. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X5 je I, T, S, ili F. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X6 je E, V, ili L. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X7 je K ili R. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X8 je E ili Q. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X9 je H, P, ili R. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X10 je S, T, ili G. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X11 je K ili R. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X12 je N, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, ili Y. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X13 je P, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, ili Y. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X14 je V ili I. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X15 je F, L, ili V. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X16 je F ili V.
[0079] U nekim aspektima, polipeptid uključuje SIRP-α D1 varijantu koja ima ne više od deset aminokiselinskih supstitucija u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 2, 3, 7, i 10. U nekim aspektima, polipeptid uključuje SIRP-α D1 varijantu koja ima ne više od sedam aminokiselinskih supstitucija u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 2, 3, 7, i 10.
[0080] U nekim aspektima, polipeptid se vezuje za CD47 sa najmanje 10-struko većim vezujućim afinitetom nego divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 2, 3, 7, i 10. U nekim aspektima, polipeptid se vezuje za CD47 sa najmanje 100-struko većim vezujućim afinitetom nego divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 2, 3, 7, i 10. U nekim aspektima, polipeptid se vezuje za CD47 sa najmanje 1000- struko većim vezujućim afinitetom nego divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 2, 3, 7, i 10. U nekim aspektima, SIRP-α D1 varijantni polipeptid ili njegov fragment vezuje se za CD47 sa KD manjom od 1 x 10<-8>M, manjom od 5 x 10<-9>M, manjom od 1 x 10<-9>M, manjom od 5 x 10<-10>M, manjom od 1 x 10<-10>M ili manjom od 1 x 10<-11>M. U nekim aspektima, SIRP-α D1 varijantni polipeptid ili njegov fragment vezuje se za CD47 sa KD između oko 500 nM i 100 nM, između oko 100 nM i 50 nM, između oko 50 nM i 10 nM, između oko 10 nM i 5 nM, između oko 5 nM i 1 nM, između oko 1 nM i 500 pM, između oko 500 pM i 100 pM, između oko 100 pM i 50 pM, ili između oko 50 pM i 10 pM.
[0081] U nekim aspektima, polipeptid uključuje SIRP-α D1 varijantu koja ima sekvencu: EEEX1QX2IQPDKSVLVAAGETX3TLRCTX4TSLX5PVGPIQWFRGAGPARX6LIYNQX7X8 GX9FPRVTTVSEX10TX11RENMDFSISISX12ITX13ADAGTYYCX14KX15RKGSPDTEX16KS GAGTELSVRAKPS (SEQ ID NO: 44), pri čemu X1 je L, I, ili V; X2 je V, L, ili, I; X3 je A ili V; X4 je A, I, ili L; X5 je I, T, S, ili F; X6 je E, V, ili L; X7 je K ili R; X8 je E ili Q; X9 je H, P, ili R; X10 je S, T, ili G; X11 je K ili R; X12 je N, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, ili Y; X13 je P, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, ili Y; X14 je V ili I; X15 je F, L, ili V; i X16 je F ili V; i pri čemu varijanta ima najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu SEQ ID NO: 8.
[0082] U nekim aspektima, polipeptid ima sekvencu SEQ ID NO: 44, pri čemu X1 je L, I, ili V. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata u ovom aspektu objave, X2 je V, L, ili, I. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X3 je A ili V. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X4 je A, I, ili L. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X5 je I, T, S, ili F. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X6 je E, V, ili L. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X7 je K ili R. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X8 je E ili Q. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X9 je H, P, ili R. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X10 je S, T, ili G. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X11 je K ili R. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X12 je N, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, ili Y. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X13 je P, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, ili Y. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X14 je V ili I. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X15 je F, L, ili V. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X16 je F ili V.
[0083] U nekim aspektima, polipeptid uključuje SIRP-α D1 varijantu koja ima ne više od deset aminokiselinskih supstitucija u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu SEQ ID NO: 8. U nekim aspektima, polipeptid uključuje SIRP-α D1 varijantu koja ima ne više od sedam aminokiselinskih supstitucija u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu SEQ ID NO: 8.
[0084] U nekim aspektima, polipeptid se vezuje za CD47 sa najmanje 10-struko većim vezujućim afinitetom nego divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu SEQ ID NO: 8. U nekim aspektima, polipeptid se vezuje za CD47 sa najmanje 100-struko većim vezujućim afinitetom nego divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu SEQ ID NO: 8.
U nekim aspektima, polipeptid se vezuje za CD47 sa najmanje 1000-struko većim vezujućim afinitetom nego divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu SEQ ID NO: 8. U nekim aspektima, SIRP-α D1 varijantni polipeptid ili njegov fragment vezuje se za CD47 sa KD manjom od 1 x 10<-8>M, manjom od 5 x 10<-9>M, manjom od 1 x 10<-9>M, manjom od 5 x 10<-10>M, manjom od 1 x 10<-10>M ili manjom od 1 x 10<-11>M. U nekim aspektima, SIRP-α D1 varijantni polipeptid ili njegov fragment vezuje se za CD47 sa KD između oko 500 nM i 100 nM, između oko 100 nM i 50 nM, između oko 50 nM i 10 nM, između oko 10 nM i 5 nM, između oko 5 nM i 1 nM, između oko 1 nM i 500 pM, između oko 500 pM i 100 pM, između oko 100 pM i 50 pM, ili između oko 50 pM i 10 pM.
[0085] U sledećem aspektu, objava sadrži polipeptid koji uključuje SIRP-α D1 varijantu koja ima sekvencu:
EEX1X2QX3IQPDKX4VX5VAAGEX6X7X8LX9CTX10TSLX11PVGPIQWFRGAGPX12RX13LI YNQX14X15GX16FPRVTTVSX17X18TX19RX20NMDFX21IX22IX23X24ITX25ADAGTYYCX26KX
27RK GSPDX28X29EX30KSGAGTELSVRX31KPS (SEQ ID NO: 47), pri čemu X1 je E ili G; X2 je L, I, ili V; X3 je V, L, ili, I; X4 je S ili F; X5 je L ili S; X6 je S ili T; X7 je A ili V; X8 je I ili T; X9 je H, R, ili L; X10 je A, V, I, ili L; X11 je I, T, S, ili F; X12 je A ili G; X13 je E, V, ili L; X14 je K ili R; X15 je E ili Q; X16 je H, P, ili R; X17 je D ili E; X18 je S, L, T, ili G; X19 je K ili R; X20 je E ili N; X21 je S ili P; X22 je S ili R; X23 je S ili G; X24 je bilo koja amino-kiselina; X25 je bilo koja amino-kiselina; X26 je V ili I; X27 je F, L, V; X28 je D ili odsutno; X29 je T ili V; X30 je F ili V; i X31 je A ili G; i pri čemu varijanta ima najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 1-10.
[0086] U nekim aspektima, polipeptid ima sekvencu SEQ ID NO: 47, pri čemu X1 je E ili G. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata u ovom aspektu objave, X2 je L, I, ili V. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X3 je V, L, ili, I. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X4 je S ili F. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X5 je L ili S. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X6 je S ili T. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X7 je A ili V. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X8 je I ili T. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X9 je H, R, ili L. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X10 je A, V, I, ili L. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X11 je I, T, S, ili F. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X12 je A ili G. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata X13 je E, V, ili L. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X14 je K ili R. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X15 je E ili Q. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X16 je H, P, ili R. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X17 je D ili E. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X18 je S, L, T, ili G. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X19
4
je K ili R. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X20 je E ili N. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X21 je S ili P. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X22 je S ili R. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X23 je S ili G. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X24 je N, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W, ili Y. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X25 je P, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, ili Y. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X26 je V ili I. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X27 je F, L, V. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X28 je D ili je odsutan. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X29 je T ili V. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X30 je F ili V. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X31 je A ili G.
[0087] U nekim aspektima, polipeptid ovog aspekta uključuje ne više od deset aminokiselinskih supstitucija u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 1-10. U nekim aspektima, polipeptid ovog aspekta objave uključuje ne više od sedam aminokiselinskih supstitucija u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 1-10.
[0088] U nekim aspektima, polipeptid se vezuje za CD47 sa najmanje 10-struko većim vezujućim afinitetom nego divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 1-10. U nekim aspektima, polipeptid se vezuje za CD47 sa najmanje 100-struko većim vezujućim afinitetom nego divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 1-10.. U nekim aspektima, polipeptid se vezuje za CD47 sa najmanje 1000-struko većim vezujućim afinitetom nego divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 1-10. U nekim aspektima, SIRP-α D1 varijantni polipeptid ili njegov fragment vezuje se za CD47 sa KD manjom od 1 x 10<-8>M, manjom od 5 x 10<-9>M, manjom od 1 x 10<-9>M, manjom od 5 x 10<-10>M, manjom od 1 x 10<-10>M ili manjom od 1 x 10<-11>M. U nekim aspektima, SIRP-α D1 varijantni polipeptid ili njegov fragment vezuje se za CD47 sa KD između oko 500 nM i 100 nM, između oko 100 nM i 50 nM, između oko 50 nM i 10 nM, između oko 10 nM i 5 nM, između oko 5 nM i 1 nM, između oko 1 nM i 500 pM, između oko 500 pM i 100 pM, između oko 100 pM i 50 pM, ili između oko 50 pM i 10 pM.
[0089] U nekim aspektima, polipeptid uključuje SIRP-α D1 varijantu koja ima sekvencu:
[0090] EEELQX1IQPDKSVX2VAAGEX3AX4LX5CTX6TSLX7PVGPIQWFRGAGPX8RX 9LI YNQX10X11GX12FPRVTTVSX13X14TKRX15NMDFSIX16IX17X18ITPADAGTYYCX19KFRKG X20X21X22DX23EFKSGAGTELSVRAKPS (SEQ ID NO: 48), pri čemu X1 je V ili I; X2 je L ili S; X3 je T ili S; X4 je T ili I; X5 je R ili H; X6 je A, V, ili I; X7 je I, R, Y, K ili F; X8 je G ili A; X9 je E ili V; X10 je K ili R; X11 je E, D ili Q; X12 je H ili P; X13 je D ili E; X14 je S, L ili T; X15 je N ili E; X16 je R ili S; X17 je G ili S; X18 je N ili A; X19 je V ili I; X20 je S, I ili M; X21 je P ili odsutan; X22 je D ili P; i X23 je V ili T, ili fragment istog.
[0091] U sledećem aspektu, objava sadrži polipeptid koji uključuje SIRP-α D1 varijantu koja ima sekvencu:
EEELQX1IQPDKSVLVAAGETATLRCTX2TSLX3PVGPIQWFRGAGPGRX4LIYNQX5X6G X7FPRVTTVSDX8TKRNNMDFSIRIGX9ITPADAGTYYCX10KFRKGSPDDVEFKSGAGTE LSVRA KPS (SEQ ID NO: 49), pri čemu X1 je V, L, ili I; X2 je A, I, V, ili L; X3 je I, F, S, ili T; X4 je E, V, ili L; X5 je K ili R; X6 je E ili Q; X7 je H, P, ili R; X8 je L, T, S, ili G; X9 je A; i X10 je V ili I; i pri čemu varijanta ima najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 1.
[0092] U nekim aspektima, polipeptid ima sekvencu SEQ ID NO: 49, pri čemu X1 je V, L ili I. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata u ovom aspektu objave, X2 je A, I, V, ili L. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X3 je I, F, S, ili T. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X4 je E, V, ili L. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X5 je K ili R. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X6 je E ili Q. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X7 je H, P, ili R. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X8 je L, T, S ili G. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X9 je A. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X10 je V ili I.
[0093] U nekim aspektima, polipeptid ima visokoafinitetni SIRP-α D1 domen koji ima najmanje 85% sekvencione identičnosti (npr., najmanje 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% sekvencione identičnosti) sa SEQ ID NO: 49, pri čemu nijedna od X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8, X9, i X10 nisu amino-kiseline divljeg tipa.
[0094] U nekim aspektima, polipeptid ovog aspekta objave uključuje ne više od deset aminokiselinskih supstitucija u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 1. U nekim aspektima, polipeptid ovog aspekta objave uključuje ne više od sedam aminokiselinskih supstitucija u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 1.
[0095] U nekim aspektima, polipeptid se vezuje za CD47 sa najmanje 10-struko većim vezujućim afinitetom nego divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 1. U nekim aspektima, polipeptid se vezuje za CD47 sa najmanje 100-struko većim vezujućim afinitetom nego divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 1. U nekim aspektima, polipeptid se vezuje za CD47 sa najmanje 1000-struko većim vezujućim afinitetom nego divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 1. U nekim aspektima, SIRP-α D1 varijantni polipeptid ili njegov
4
fragment vezuje se za CD47 sa KD manjom od 1 x 10<-8>M, manjom od 5 x 10<-9>M, manjom od 1 x 10<-9>M, manjom od 5 x 10<-10>M, manjom od 1 x 10<-10>M ili manjom od 1 x 10<-11>M. U nekim aspektima, SIRP-α D1 varijantni polipeptid ili njegov fragment vezuje se za CD47 sa KD između oko 500 nM i 100 nM, između oko 100 nM i 50 nM, između oko 50 nM i 10 nM, između oko 10 nM i 5 nM, između oko 5 nM i 1 nM, između oko 1 nM i 500 pM, između oko 500 pM i 100 pM, između oko 100 pM i 50 pM, ili između oko 50 pM i 10 pM.
[0096] U sledećem aspektu, objava sadrži polipeptid koji uključuje SIRP-α D1 varijantu koja ima sekvencu:
EEELQX1IQPDKSVSVAAGESAILHCTX2TSLX3PVGPIQWFRGAGPARX4LIYNQX5X6G X7FPRVTTVSEX8TKRENMDFSISISX9ITPADAGTYYCX10KFRKGSPDTEFKSGAGTEL SVRAKPS, (SEQ ID NO: 50), pri čemu X1 je V ili I; X2 je V ili I; X3 je I ili F; X4 je E ili V; X5 je K ili R; X6 je E ili Q; X7 je H ili P; X8 je S ili T; X9 je N ili A; i X10 je V ili I; i pri čemu varijanta ima najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 2.
[0097] U nekim aspektima, polipeptid ima sekvencu SEQ ID NO: 50, pri čemu X1 je V ili I. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata u ovom aspektu objave, X2 je V ili I. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X3 je I ili F. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X4 je E ili V. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X5 je K ili R. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X6 je E ili Q. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X7 je H ili P. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X8 je S ili R. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X9 je N ili A. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X10 je V ili I.
[0098] U nekim aspektima, polipeptid ima visokoafinitetni SIRP-α D1 domen koji ima najmanje 85% sekvencione identičnosti (npr., najmanje 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% sekvencione identičnosti) sa SEQ ID NO: 50, pri čemu nijedno od X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8, X9, i X10 nije amino-kiselina divljeg tipa.
[0099] U nekim aspektima, polipeptid ovog aspekta objave uključuje ne više od deset aminokiselinskih supstitucija u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 2. U nekim aspektima, polipeptid ovog aspekta objave uključuje ne više od sedam aminokiselinskih supstitucija u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 2.
[0100] U nekim aspektima, polipeptid se vezuje za CD47 sa najmanje 10-struko većim vezujućim afinitetom nego divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 2. U nekim aspektima, polipeptid se vezuje za CD47 sa najmanje 100-struko većim vezujućim afinitetom nego divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu bilo koje
4
od SEQ ID NO: 2. U nekim aspektima, polipeptid se vezuje za CD47 sa najmanje 1000-struko većim vezujućim afinitetom nego divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 2. U nekim aspektima, SIRP-α D1 varijantni polipeptid ili njegov fragment vezuje se za CD47 sa KD manjom od 1 x 10<-8>M, manjom od 5 x 10<-9>M, manjom od 1 x 10<-9>M, manjom od 5 x 10<-10>M, manjom od 1 x 10<-10>M ili manjom od 1 x 10<-11>M. U nekim aspektima, SIRP-α D1 varijantni polipeptid ili njegov fragment vezuje se za CD47 sa KD između oko 500 nM i 100 nM, između oko 100 nM i 50 nM, između oko 50 nM i 10 nM, između oko 10 nM i 5 nM, između oko 5 nM i 1 nM, između oko 1 nM i 500 pM, između oko 500 pM i 100 pM, između oko 100 pM i 50 pM, ili između oko 50 pM i 10 pM.
[0101] U sledećem aspektu, objava sadrži polipeptid koji uključuje SIRP-α D1 varijantu koja ima sekvencu:
EEELQX1IQPDKSVLVAAGETATLRCTX2TSLX3PVGPIQWFRGAGPGRX4LIYNQX5EGX
6FPRVTTVSDX7TKRNNMDFSIRIGX8ITPADAGTYYCX9KFRKGSPDDVEFKSGAGTEL SVRAK PS (SEQ ID NO: 51), pri čemu X1 je V ili I; X2 je A ili I; X3 je I ili F; X4 je E ili V; X5 je K ili R; X6 je H ili P; X7 je L ili T; X8 je bilo koja amino-kiselina različita od N; i X9 je V ili I; i pri čemu varijanta ima najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 1.
[0102] U nekim aspektima, polipeptid ima sekvencu SEQ ID NO: 51, pri čemu X1 je V ili I. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata u ovom aspektu objave, X2 je A ili I. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X3 je I ili F. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X4 je E ili V. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X5 je K ili R. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X6 je H ili P. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X7 je L ili T. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X8 je N ili A. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X9 je V ili I. U nekim aspektima, X4 nije V.
[0103] U nekim aspektima, polipeptid ima sekvencu SEQ ID NO: 51, pri čemu X8 je A. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata u ovom aspektu objave, X8 je A i X1 je V ili I. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata u ovom aspektu objave, X8 je A i X2 je A ili I. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X8 je A i X3 je I ili F. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X8 je A i X4 je E ili V. U nekim aspektima, X4 nije V. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X8 je A i X5 je K ili R. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X8 je A i X6 je H ili P. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X8 je A i X7 je A ili V. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X8 je A i X9 je V ili I.
[0104] U nekim aspektima, polipeptid ima sekvencu SEQ ID NO: 51, pri čemu X8 je A. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata u ovom aspektu objave, X8 je A i X1 je I. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata u ovom aspektu objave, X8 je A i X2 je I. U bilo kojem
4
od gore pomenutih aspekata, X8 je A i X3 je F. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X8 je A i X4 je V. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X8 je A i X5 je R. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X8 je A i X6 je P. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X8 je A i X7 je T. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X8 je A i X9 je I.
[0105] U nekim aspektima, polipeptid ima visokoafinitetni SIRP-α D1 domen koji ima najmanje 85% sekvencione identičnosti (npr., najmanje 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% sekvencione identičnosti) sa SEQ ID NO: 51, pri čemu nijedna od X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8, i X9 nije amino-kiselina divljeg tipa.
[0106] U nekim aspektima, polipeptid ovog aspekta objave uključuje ne više od deset aminokiselinskih supstitucija u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 1. U nekim aspektima, polipeptid ovog aspekta objave uključuje ne više od sedam aminokiselinskih supstitucija u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 1.
[0107] U nekim aspektima, polipeptid se vezuje za CD47 sa najmanje 10-struko većim vezujućim afinitetom nego divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 1. U nekim aspektima, polipeptid se vezuje za CD47 sa najmanje 100-struko većim vezujućim afinitetom nego divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 1. U nekim aspektima, polipeptid se vezuje za CD47 sa najmanje 1000-struko većim vezujućim afinitetom nego divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 1. U nekim aspektima, SIRP-α D1 varijantni polipeptid ili njegov fragment vezuje se za CD47 sa KD manjom od 1 x 10<-8>M, manjom od 5 x 10<-9>M, manjom od 1 x 10<-9>M, manjom od 5 x 10<-10>M, manjom od 1 x 10<-10>M ili manjom od 1 x 10<-11>M. U nekim aspektima, SIRP-α D1 varijantni polipeptid ili njegov fragment vezuje se za CD47 sa KD između oko 500 nM i 100 nM, između oko 100 nM i 50 nM, između oko 50 nM i 10 nM, između oko 10 nM i 5 nM, između oko 5 nM i 1 nM, između oko 1 nM i 500 pM, između oko 500 pM i 100 pM, između oko 100 pM i 50 pM, ili između oko 50 pM i 10 pM.
[0108] U sledećem aspektu, objava sadrži polipeptid koji uključuje SIRP-α D1 varijantu koja ima sekvencu:
EEELQX1IQPDKSVLVAAGETATLRCTX2TSLX3PVGPIQWFRGAGPGRELIYNQX4EGX5 FPRVTTVSDX6TKRNNMDFSIRIGX7ITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSV RAKPS (SEQ ID NO: 52), pri čemu X1 je V, L, ili I; X2 je A, I, ili L; X3 je I, T, S, ili F; X4 je K ili R; X5 je H, P, ili R; X6 je L, T, ili G; X7 je N ili A; i pri čemu varijanta ima najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu prema SEQ ID NO: 1.
4
[0109] U nekim aspektima, polipeptid ima sekvencu SEQ ID NO: 52, pri čemu X1 je V, L, ili I. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata u ovom aspektu objave, X2 je A, I, ili L. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X3 je I, T, S, ili F. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X4 je K ili R. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X5 je H ili P. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X6 je L, T, ili G. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X7 je N ili A.
[0110] U nekim aspektima, polipeptid ima sekvencu SEQ ID NO: 52, pri čemu X1 je V ili I. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata u ovom aspektu objave, X2 je A ili I. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X3 je I ili F. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X4 je K ili R. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X5 je H ili P. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X6 je L ili T. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X7 je N ili A.
[0111] U nekim aspektima, polipeptid ima sekvencu SEQ ID NO: 52, pri čemu X7 je A. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata u ovom aspektu objave, X7 je A i X1 je V ili I. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata u ovom aspektu objave, X7 je A i X2 je A ili I. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X7 je A i X3 je I ili F. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X7 je A i X4 je K ili R. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X7 je A i X5 je H ili P. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X7 je A i X6 je L ili T.
[0112] U nekim aspektima, polipeptid ima sekvencu SEQ ID NO: 52, pri čemu X7 je A. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata u ovom aspektu objave, X7 je A i X1 je I. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata u ovom aspektu objave, X7 je A i X2 je I. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X7 je A i X3 je F. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X7 je A i X4 je R. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X7 je A i X5 je P. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X7 je A i X6 je T.
[0113] U nekim aspektima, polipeptid ima visokoafinitetni SIRP-α D1 domen koji ima najmanje 85% sekvencione identičnosti (npr., najmanje 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% sekvencione identičnosti) sa SEQ ID NO: 52, pri čemu nijedna od X1, X2, X3, X4, X5, X6 i X7 nije amino-kiselina divljeg tipa.
[0114] U nekim aspektima, polipeptid ovog aspekta objave uključuje ne više od deset aminokiselinskih supstitucija u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 1. U nekim aspektima, polipeptid ovog aspekta objave uključuje ne više od sedam aminokiselinskih supstitucija u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 1.
[0115] U nekim aspektima, polipeptid se vezuje za CD47 sa najmanje 10-struko većim vezujućim afinitetom nego divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 1. U nekim aspektima, polipeptid se vezuje za CD47 sa najmanje 100-struko
4
većim vezujućim afinitetom nego divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 1. U nekim aspektima, polipeptid se vezuje za CD47 sa najmanje 1000-struko većim vezujućim afinitetom nego divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 1. U nekim aspektima, fragmenti uključuju polipeptide duge manje od 10 amino-kiselina, duge oko 10 amino-kiselina, duge oko 20 amino-kiselina, duge oko 30 amino-kiselina, duge oko 40 amino-kiselina, duge oko 50 amino-kiselina, duge oko 60 amino-kiselina, duge oko 70 amino-kiselina, duge oko 80 amino-kiselina, duge oko 90 amino-kiselina, duge oko 100 amino-kiselina, ili duge više od oko 100 aminokiselina. Fragmenti zadržavaju sposobnost da se vezuju za CD47. Poželjno, SIRP-α D1 varijantni polipeptidi i njihovi fragmenti vezuju se za CD47 sa većim afinitetom nego što se SIRP-α polipeptid vezuje za CD47. Na primer, u nekim aspektima, SIRP-α D1 varijantni polipeptid ili njegov fragment vezuje se za CD47 sa KD manjom od 1 x 10<-8>M, manjom od 5 x 10<-9>M, manjom od 1 x 10<-9>M, manjom od 5 x 10<-10>M, manjom od 1 x 10<-10>M ili manjom od 1 x 10<-11>M. U nekim aspektima, SIRP-α D1 varijantni polipeptid ili njegov fragment vezuje se za CD47 sa KD između oko 500 nM i 100 nM, između oko 100 nM i 50 nM, između oko 50 nM i 10 nM, između oko 10 nM i 5 nM, između oko 5 nM i 1 nM, između oko 1 nM i 500 pM, između oko 500 pM i 100 pM, između oko 100 pM i 50 pM, ili između oko 50 pM i 10 pM.
[0116] U sledećem aspektu, objava sadrži polipeptid koji uključuje SIRP-α D1 varijantu koja ima sekvencu:
EEELQX1IQPDKSVSVAAGESAILHCTX2TSLX3PVGPIQWFRGAGPARELIYNQX4EGX5 FPRVTTVSEX6TKRENMDFSISISX7ITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVR AKPS (SEQ ID NO: 212), pri čemu X1 je V, L, ili I; X2 je V, I, ili L; X3 je I, T, S, ili F; X4 je K ili R; X5 je H, P, ili R; X6 je S, T, ili G; X7 je A; i pri čemu varijanta ima najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 2.
[0117] U nekim aspektima, polipeptid ima sekvencu SEQ ID NO: 212, pri čemu X1 je V, L, ili I. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata u ovom aspektu objave, X2 je V, I, ili L. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X3 je I, T, S, ili F. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X4 je K ili R. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X5 je H ili P. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X6 je S, T, ili G. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X7 je A.
[0118] U nekim aspektima, polipeptid ima sekvencu SEQ ID NO: 212, pri čemu X1 je V ili I. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata u ovom aspektu objave, X2 je V ili I. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X3 je I ili F. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X4 je K ili R. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X5 je H ili P. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X6 je S ili T. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X7 je A.
[0119] U nekim aspektima, polipeptid ima sekvencu SEQ ID NO: 212, pri čemu X7 je A. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata u ovom aspektu objave, X7 je A i X1 je V ili I. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata u ovom aspektu objave, X7 je A i X2 je V ili I. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X7 je A i X3 je I ili F. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X7 je A i X4 je K ili R. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X7 je A i X5 je H ili P. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X7 je A i X6 je S ili T.
[0120] U nekim aspektima, polipeptid ima sekvencu SEQ ID NO: 212, pri čemu X7 je A. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata u ovom aspektu objave, X7 je A i X1 je I. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata u ovom aspektu objave, X7 je A i X2 je I. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X7 je A i X3 je F. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X7 je A i X4 je R. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X7 je A i X5 je P. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata, X7 je A i X6 je T.
[0121] U nekim aspektima, polipeptid ima visokoafinitetni SIRP-α D1 domen koji ima najmanje 85% sekvencione identičnosti (npr., najmanje 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% sekvencione identičnosti) sa SEQ ID NO: 212, pri čemu nijedna od X1, X2, X3, X4, X5, X6 i X7 nije amino-kiselina divljeg tipa.
[0122] U nekim aspektima, polipeptid ovog aspekta objave uključuje ne više od deset aminokiselinskih supstitucija u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 2. U nekim aspektima, polipeptid ovog aspekta objave uključuje ne više od sedam aminokiselinskih supstitucija u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 2.
[0123] U nekim aspektima, polipeptid se vezuje za CD47 sa najmanje 10-struko većim vezujućim afinitetom nego divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 2. U nekim aspektima, polipeptid se vezuje za CD47 sa najmanje 100-struko većim vezujućim afinitetom nego divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 2. U nekim aspektima, polipeptid se vezuje za CD47 sa najmanje 1000-struko većim vezujućim afinitetom nego divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 2. U nekim aspektima, fragmenti uključuju polipeptide duge manje od 10 amino-kiselina, duge oko 10 amino-kiselina, duge oko 20 amino-kiselina, duge oko 30 amino-kiselina, duge oko 40 amino-kiselina, duge oko 50 amino-kiselina, duge oko 60 amino-kiselina, duge oko 70 amino-kiselina, duge oko 80 amino-kiselina, duge oko 90 amino-kiselina, duge oko 100 amino-kiselina, ili duge više od oko 100 aminokiselina. Fragmenti zadržavaju sposobnost da se vezuju za CD47. Poželjno, SIRP-α D1
1
varijantni polipeptidi i njihovi fragmenti vezuju se za CD47 sa većim afinitetom nego što se SIRP-α polipeptid vezuje za CD47. Na primer, u nekim aspektima, SIRP-α D1 varijantni polipeptid ili njegov fragment vezuje se za CD47 sa KD manjom od 1 x 10<-8>M, manjom od 5 x 10<-9>M, manjom od 1 x 10<-9>M, manjom od 5 x 10<-10>M, manjom od 1 x 10<-10>M ili manjom od 1 x 10<-11>M. U nekim aspektima, SIRP-α D1 varijantni polipeptid ili njegov fragment vezuje se za CD47 sa KD između oko 500 nM i 100 nM, između oko 100 nM i 50 nM, između oko 50 nM i 10 nM, između oko 10 nM i 5 nM, između oko 5 nM i 1 nM, između oko 1 nM i 500 pM, između oko 500 pM i 100 pM, između oko 100 pM i 50 pM, ili između oko 50 pM i 10 pM.
[0124] U ovom tekstu opisan je, u nekim aspektima, polipeptid koji uključuje SIRP-α D1 varijantu koja ima sekvencu prema:
EEELQX1IQPDKSVLVAAGETATLRCTX2TSLX3PVGPIQWFRGAGPGRX4LIYNQX5X6G X7FPRVTTVSDX8TKRNNMDFSIRIGX9X10X11X12ADAGTYYCX13KFRKGSPDDVEFKSG AGTELSVRAKPS (SEQ ID NO: 218), pri čemu X1 je V, L, ili I; X2 je A, V, L, ili I; X3 je I, S, T, ili F; X4 je E, L, ili V; X5 je K ili R; X6 je E ili Q; X7 je H, R, ili P; X8 je S,G, L, ili T; X9 je bilo koja amino-kiselina; X10 je bilo koja amino-kiselina; X11 je bilo koja amino-kiselina; X12 je bilo koja amino-kiselina; i X13 je V ili I; i pri čemu SIRP-α D1 varijanta ima najmanje dve aminokiselinske supstitucije u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu prema SEQ ID NO: 1.
[0125] U nekim aspektima, polipeptid ima sekvencu SEQ ID NO: 212, X9 je A. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata u ovom aspektu objave, X9 je N. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata u ovom aspektu objave X10 je I. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata u ovom aspektu objave X9 je N i X10 je P. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata u ovom aspektu objave X9 je N i X11 je bilo koja amino-kiselina različita od S, T, ili C. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata u ovom aspektu objave X11 je T. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata u ovom aspektu objave X11 je amino-kiselina različita od T. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata u ovom aspektu objave X12 je P. U bilo kojem od gore pomenutih aspekata u ovom aspektu objave X9 je N i X12 je bilo koja amino-kiselina različita od P.
[0126] U ovom tekstu opisan je, u nekim aspektima, polipeptid koji uključuje SIRP-α D1 varijantu koja ima sekvencu prema:
EEELQX1IQPDKSVLVAAGETATLRCTX2TSLX3PVGPIQWFRGAGPGRX4LIYNQX5X6G X7FPRVTTVSDX8TKRNNMDFSIRIGX9ITX10ADAGTYYCX11KFRKGSPDDVEFKSGAGT ELSVRAKPS (SEQ ID NO: 219), pri čemu X1 je V, L, ili I; X2 je A, V, L, ili I; X3 je I, S, T, ili F; X4 je E, L, ili V; X5 je K ili R; X6 je E ili Q; X7 je H, R, ili P; X8 je S, G, L, ili T; X9 je N;
2
X10 je bilo koja amino-kiselina različita od P; i X11 je V ili I; i pri čemu SIRP-α D1 varijanta ima najmanje dve aminokiselinske supstitucije u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena koji ima sekvencu prema SEQ ID NO: 1.
[0127] U sledećem aspektu objave, u ovom tekstu su objavljene kompozicije koje uključuju SIRP-α D1 varijantni polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 48, ili njegov fragment. U nekim aspektima, SIRP-α D1 varijantni polipeptid ili njegov fragment vezuje se za CD47 sa većim afinitetom u poređenju sa afinitetom kojim se SIRP-α polipeptid vezuje za CD47. U nekim aspektima, SIRP-α D1 varijantni polipeptid vezuje se za CD47 sa KD manjom od 1 x 10<-8>M, ili manjom od 1 x 10<-9>M, manjom od 1 x 10<-10>M ili manjom od 1 x 10<-11>M. U nekim aspektima, gore pomenuti SIRP-α D1 varijantni polipeptidi prikačeni su ili fuzionisani sa drugim polipeptidom. U nekim aspektima, drugi polipeptid uključuje, bez ograničavanja, Fc polipeptid, Fc varijantu, HSA polipeptid, albuminski peptid, PEG polimer ili fragment napred navedenog.
[0128] Bez ograničavanja gore navedenog, u nekim aspektima, SIRP-α D1 varijantni polipeptid bira se između bilo koje od SEQ ID NO: 53-87 i 213 prikazanih u Tabeli 6.
Tabela 6. SIRP-α varijantni polipeptidi
SEQ
ID Aminokiselinska sekvenca
4 SEQ
ID Aminokiselinska sekvenca
[0129] U nekim aspektima, polipeptid uključuje visokoafinitetni SIRP-α D1 domen koji ima najmanje 85% sekvencione identičnosti (npr., najmanje 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% sekvencione identičnosti) sa bilo kojom varijantom datom u Tabeli 6.
[0130] U nekim aspektima, polipeptid uključuje visokoafinitetni SIRP-α D1 domen koji ima najmanje 85% sekvencione identičnosti (npr., najmanje 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% sekvencione identičnosti) sa SEQ ID NO: 80, 81, ili 85 iz Tabele 6.
III. Fc domenske varijante i fuzioni konstrukti
[0131] U ovom tekstu objavljeni su, u nekim aspektima, polipeptidi koji uključuju signalregulatorni protein α (SIRP-α) D1 varijantu koja sadrži SIRP-α D1 domen, ili njegov fragment, koji ima aminokiselinsku mutaciju na rezidui 80 u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena; i najmanje jednu dodatnu aminokiselinsku mutaciju u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena na rezidui odabranu iz grupe koja se sastoji od: rezidue 6, rezidue 27, rezidue 31, rezidue 47, rezidue 53, rezidue 54, rezidue 56, rezidue 66, i rezidue 92.
[0132] Isto tako, u ovom tekstu su objavljeni polipeptidi koji uključuju Fc varijantu, pri čemu Fc varijanta sadrži Fc domenski dimer koji ima dva Fc domenska monomera, pri čemu se svaki Fc domenski monomer nezavisno bira između (i) humanog IgG1 Fc regiona koji se sastoji od mutacija L234A, L235A, G237A, i N297A; (ii) humanog IgG2 Fc regiona koji se sastoji od mutacija A330S, P331S i N297A; ili (iii) humanog IgG4 Fc regiona koji uključuje mutacije S228P, E233P, F234V, L235A, delG236, i N297A.
[0133] Antitela koja ciljaju ćelijske površinske antigene mogu pokrenuti imunostimulatorne i efektorske funkcije koje su udružene sa angažovanjem Fc receptora (FcR) na imunskim ćelijama. Postoje brojni Fc receptori specifični za određene klase antitela, uključujući IgG (gama receptori), IgE (eta receptori), IgA (alfa receptori) i IgM (mi receptori). Vezivanje Fc regiona za Fc receptore na površini ćelije može pokrenuti mnoge biološke odgovore uključujući fagocitozu čestica obloženih antitelom (ćelijama posredovana fagocitoza zavisna od antitela, antibody-dependent cell-mediated phagocytosis, ili ADCP), odstranjivanje imunskih kompleksa, lizu ćelijama-ubicama ćelija obloženih antitelima (ćelijama posredovana citotoksičnost zavisna od antitela, antibodydependent cell-mediated cytotoxicity, ili ADCC) i, oslobađanje medijatora zapaljenja, transfer kroz placentu, i kontrolu proizvodnje imunoglobulina. Pored toga, vezivanje C1 komponente komplementa za antitela može aktivirati sistem komplementa. Aktivacija komplementa može biti važna za lizu ćelijskih patogena. Međutim, aktivacija komplementa može takođe stimulisati zapaljenski odgovor i biti uključena u autoimunsku preosetljivost ili druge imunske poremećaje. Varijantni Fc regioni sa smanjenom ili nedostajućom sposobnošću vezivanja za određene Fc receptore korisni su za razvijanje terapijskih antitela i Fc-fuzionih polipeptidnih konstrukata koji dejstvuju tako što ciljaju, aktiviraju ili neutrališu funkciju liganada ne oštećujući ili ne uništavajući lokalne ćelije ili tkiva.
[0134] U nekim aspektima, SIRP-α D1 polipeptidni konstrukt uključuje visokoafinitetnu SIRP-α D1 varijantu koja se ne sreće u prirodi, vezanu za Fc domenski monomer koji formira Fc domen sa odsutnom ili smanjenom efektorskom funkcijom.
[0135] U nekim aspektima, Fc domenski monomer odnosi se na polipeptidni lanac koji uključuje drugi i treći konstantni domen antitela (npr., CH2 i CH3). U nekim aspektima, Fc domenski monomer uključuje i domen šarke. U nekim aspektima, Fc domenski monomer je iz bilo kojeg izotipa imunoglobulinskog antitela, uključujući IgG, IgE, IgM, IgA, i IgD. Pored toga, u nekim aspektima, Fc domenski monomer je iz bilo kojeg podtipa IgG (npr., IgG1, IgG2, IgG2a, IgG2b, IgG2c, IgG3, i IgG4). U nekim aspektima, Fc domenski monomeri uključuju čak deset izmena u odnosu na sekvencu divljeg tipa Fc domenskog monomera (npr., 1-10, 1-8, 1-6, 1-4 aminokiselinske supstitucije, adicije ili insercije, delecije, ili njihove kombinacije) koje menjaju interakciju između Fc domena i Fc receptora.
[0136] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "Fc domen" označava dimer dva Fc domenska monomera. U divljem tipu Fc domena, dva Fc domenska monomera se dimerizuju interakcijom između dva CH3 konstantna domena antitela, kao i jednom ili više disulfidnih veza koje se formiraju između regiona šarke dva dimerizovana Fc domenska monomera. U nekim aspektima, Fc domen je mutiran tako da mu nedostaju efektorske funkcije, na primer "mrtvi Fc domen". U nekim aspektima, svaki od Fc domenskih monomera u Fc domenu sadrži aminokiselinske supstitucije u CH2 konstantnom domenu antitela da bi se smanjila interakcija ili vezivanje Fc domena sa Fc receptorom, kao što je Fcγ receptor (FcγR), Fcα receptor (FcαR), ili Fcε (FcεR).
[0137] U nekim aspektima, visokoafinitetna SIRP-α D1 varijanta (npr., bilo koja od varijanti opisanih u Tabelama 2, 5, i 6) fuzionisana je sa Fc domenskim monomerom imunoglobulina ili fragmentom Fc domenskog monomera. U nekim aspektima, Fc domenski monomer imunoglobulina ili fragment Fc domenskog monomera sposoban je da formira Fc domen sa drugim Fc domenskim monomerom. U nekim aspektima, Fc domenski monomer imunoglobulina ili fragment Fc domenskog monomera nije sposoban da formira Fc domen sa drugim Fc domenskim monomerom. U nekim aspektima, Fc domenski monomer ili fragment Fc domena fuzionisan je sa polipeptidom objave da bi se povećao poluživot polipeptida u serumu. U nekim aspektima, Fc domenski monomer ili fragment Fc domenskog monomera fuzionisan sa polipeptidom objave dimerizuje se sa drugim Fc domenskim monomerom da se formira Fc domen koji se vezuje sa Fc receptorom, ili alternativno, Fc domenski monomer se vezuje sa Fc receptorom. U nekim aspektima, Fc domen ili fragment Fc domena fuzionisan sa polipeptidom da bi se povećao poluživot polipeptida u serumu ne indukuje nikakav odgovor povezan sa imunskim sistemom.
[0138] U nekim aspektima, SIRP-α polipeptid ili konstrukt obezbeđen u ovom tekstu uključuje SIRP-α D1 domen ili njegovu varijantu spojenu sa prvim Fc domenskim monomerom i varijabilni domen antitela spojen sa drugim Fc domenskim monomerom, gde se prvi i drugi domenski monomer kombinuju da bi formirali Fc domen (npr., heterodimerni Fc domen). Fc domen je proteinska struktura koja se nalazi na C-terminusu imunoglobulina. Fc domen uključuje dva Fc domenska monomera dimerizovana interakcijom između CH3 konstantnih domena antitela. Divlji tip Fc domena formira minimalnu strukturu koja se vezuje za Fc receptor, npr., FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa, FcγRIIIb, i FcγRIV.
[0139] Fc domen nije direktno uključen u vezivanje antitela za cilj, ali može biti uključen u različite efektorske funkcije, kao što je učešće antitela u ćelijskoj toksičnosti zavisnoj od antitela. U nekim aspektima, Fc domen u SIRP-α polipeptidu ili konstruktu objave uključuje aminokiselinske supstitucije, adicije ili insercije, delecije, ili bilo koje kombinacije toga, koje dovode do smanjenja efektorske funkcije kao što je smanjenje ćelijama posredovane citotoksičnosti zavisne od antitela (ADCC), smanjenje citolize zavisne od komplementa (complement-dependent cytolysis, CDC), smanjenje ćelijama posredovane fagocitoze zavisne od antitela (ADCP), ili bilo koje njihove kombinacije. U nekim aspektima, SIRP-α polipeptidi ili konstrukti objave karakterišu se smanjenim vezivanjem (npr., minimalnim vezivanjem ili odsustvom vezivanja) za humani Fc receptor i smanjenim vezivanjem (npr., minimalnim vezivanjem ili odsustvom vezivanja) za C1q protein komplementa. U nekim aspektima, SIRP-α konstrukti objave karakterišu se smanjenim vezivanjem (npr., minimalnim vezivanjem ili odsustvom vezivanja) za humani FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB, FcγRIIIB, FcγRIIIB, ili bilo koju njihovu kombinaciju, i C1q. Da bi se smanjila ili izmenila efektorska funkcija zavisna od antitela, na primer ADCC, CDC, ADCP, ili bilo koja njihova kombinacija, u nekim aspektima, Fc domeni u SIRP-α konstruktima objave su iz IgG klase i uključuju jednu ili više aminokiselinskih supstitucija na E233, L234, L235, G236, G237, D265, D270, N297, E318, K320, K322, A327, A330, P331, ili P329 (numerisanje prema EU indeksu Kabata (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))).
[0140] U nekim aspektima, polipeptidni konstrukti koji uključuju nenativni Fc region, opisani u ovom tekstu, pokazuju smanjenje ili izostanak vezivanja za najmanje jedan od Fcγ receptora CD16a, CD32a, CD32b, CD32c, i CD64 u poređenju sa polipeptidnim konstruktom koji uključuje nativni Fc region. U nekim slučajevima, polipeptidni konstrukti opisani u ovom tekstu ispoljavaju smanjenje ili izostanak vezivanja za CD16a, CD32a, CD32b, CD32c, i CD64 Fcγ receptore.
[0141] CDC označava formu citotoksičnosti u kojoj se kaskada komplementa aktivira vezivanjem C1q komponente komplementa za Fc antitela. U nekim aspektima, polipeptidni konstrukti uključuju nenativni Fc region opisan u ovom tekstu, koji ispoljava najmanje 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili više smanjenja vezivanja C1q u poređenju sa polipeptidnim konstruktom koji uključuje divlji tip Fc regiona. U nekim slučajevima, polipeptidni konstrukti koji uključuju nenativni Fc region opisan u ovom tekstu ispoljavaju smanjenu CDC u poređenju sa polipeptidnim konstruktom koji uključuje divlji tip Fc regiona. U nekim aspektima, polipeptidni konstrukti koji uključuju nenativni Fc region opisan u ovom tekstu ispoljavaju najmanje 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili veće smanjenje CDC u poređenju sa polipeptidnim konstruktom koji uključuje divlji tip Fc regiona. U nekim slučajevima, polipeptidni konstrukti koji uključuju neprirodnu Fc varijantu opisanu u ovom tekstu ispoljavaju zanemarljivu CDC u poređenju sa polipeptidnim konstruktom koji uključuje divlji tip Fc regiona.
[0142] U nekim aspektima, Fc varijante u ovom tekstu su minimalno glikozilovane ili imaju smanjenu glikozilaciju u poređenju sa divljim tipom sekvence. U nekim aspektima, deglikozilacija se obavlja mutacijom N297A, ili mutacijom N297 u bilo koju amino-kiselinu koja nije N. U nekim aspektima, deglikozilacija se obavlja narušavanjem motiva N-Xaa1-Xaa2-Xaa3, pri čemu N = asparagin; Xaa1 = bilo koja amino-kiselina osim P (prolin); Xaa2 = T (treonin), S (serin) ili C (cistein); i Xaa3 = bilo koja amino-kiselina osim P (prolin). U jednom aspektu, N-Xaa1-Xaa2-Xaa3 motiv označava rezidue 297-300 kako je označeno prema Kabat et al., 1991. U nekim aspektima, mutacija bilo koje ili više od N, Xaa1, Xaa2, ili Xaa3 rezultuje deglikozilacijom Fc varijante.
[0143] U nekim aspektima, varijante konstantnih regiona IgG antitela (npr., Fc varijante) imaju smanjen kapacitet specifičnog vezivanja za Fcγ receptore ili imaju smanjeni kapacitet indukovanja fagocitoze. U nekim aspektima, varijante konstantnih regiona IgG antitela (npr., Fc varijante) imaju smanjen kapacitet specifičnog vezivanja za Fcγ receptore i imaju smanjeni kapacitet indukovanja fagocitoze. Na primer, u nekim aspektima, Fc domen je mutiran tako da mu nedostaju efektorske funkcije, što je tipično za "mrtvi" Fc domen. Na primer, u nekim aspektima, Fc domen uključuje specifične aminokiselinske supstitucije za koje je poznato da na najmanju meru svode interakciju između Fc domena i Fcγ receptora. U nekim aspektima, Fc domenski monomer je iz IgG1 antitela i uključuje jednu ili više aminokiselinskih supstitucija L234A, L235A, G237A, i N297A (označeno EU sistemom numerisanja po Kabat et al., 1991). U nekim aspektima, jedna ili više mutacija uključene su u takvu IgG1 Fc varijantu. Neograničavajući primeri takvih dodatnih mutacija za humane IgG1 Fc varijante uključuju E318A i K322A. U nekim slučajevima, humana IgG1 Fc varijanta ima do 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5 ili 4 ili manje mutacija ukupno, u poređenju sa divljim tipom sekvence humanog IgG1. U nekim aspektima, jedna ili više delecija uključeno je u takvu IgG1 Fc varijantu. Na primer, u nekim aspektima, C-terminalni lizin Fc konstantnog regiona teškog lanca IgG1 dat u SEQ ID NO: 88 u tabeli 7 je uklonjen, na primer da bi se povećala homogenost polipeptida, kada se polipeptid proizvodi u bakterijskim ili sisarskim ćelijama. U nekim slučajevima, Fc varijanta humanog IgG1 ima do 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5 ili 4 ili manje delecija ukupno, u poređenju sa sekvencom divljeg tipa humanog IgG1. U nekim aspektima, IgG1 Fc varijanta ima sekvencu prema bilo kojoj od SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, ili SEQ ID NO: 137.
[0144] U nekim aspektima, Fc domenski monomer je iz IgG2 ili IgG4 antitela i uključuje aminokiselinske supstitucije A330S, P331S, ili i A330S i P331S. Gore pomenute aminokiselinske pozicije definisane su prema Kabat, et al. (1991). Kabatovo numerisanje aminokiselinskih rezidua može se odrediti za dato antitelo poravnavanjem u regionima homologije sekvence antitela sa "standardnom" sekvencom numerisanom po Kabatu. U nekim aspektima, Fc varijanta uključuje humanu IgG2 Fc sekvencu koja sadrži jednu ili više od A330S, P331S i N297A aminokiselinskih supstitucija (označeno EU sistemom numerisanja po Kabat, et al. (1991). U nekim aspektima, jedna ili više dodatnih mutacija uključeno je u takve IgG2 Fc varijante. Neograničavajući primeri takvih dodatnih mutacija za humanu IgG2 Fc varijantu uključuju V234A, G237A, P238S, V309L i H268A (označeno EU sistemom numerisanja po Kabat et al. (1991)). U nekim slučajevima, humana IgG2 Fc varijanta ima do 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 ili manje mutacija ukupno, u poređenju sa divljim tipom humane IgG2 sekvence. U nekim aspektima, jedna ili više dodatnih delecija uključeno je u takvu IgG2 Fc varijantu. Na primer, u nekim aspektima, C-terminalni lizin Fc konstantnog regiona teškog lanca IgG2 dat u SEQ ID NO: 89 u Tabeli 7 je uklonjen, na primer da bi se povećala homogenost polipeptida kada se polipeptid proizvodi u bakterijskim ili sisarskim ćelijama. U nekim slučajevima, humana IgG2 Fc varijanta ima do 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5 ili 4 ili manje delecija ukupno u poređenju sa divljim tipom humane IgG2 sekvence.
[0145] Kada je Fc varijanta IgG4 Fc varijanta, u nekim aspektima, takva Fc varijanta uključuje S228P mutaciju (označeno po Kabat, et al. (1991)). U nekim slučajevima, humana IgG4 Fc varijanta ima do 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ili 1 mutacije(-a) ukupno u poređenju sa sekvencom divljeg tipa humanog IgG4.
[0146] U nekim aspektima, Fc varijanta uključuje najmanje jednu od mutacija L234A, L235A, G237A ili N297A IgG1 Fc regiona ili najmanje jednu od mutacija A330S, P331S ili N297A IgG2 Fc regiona. U nekim aspektima, Fc varijanta uključuje najmanje dve od mutacija L234A, L235A, G237A ili N297A IgG1 Fc regiona ili najmanje dve od mutacija A330S, P331S ili N297A IgG2 Fc regiona. U nekim aspektima, Fc varijanta uključuje najmanje tri od mutacija L234A, L235A, G237A ili N297A IgG1 Fc regiona ili se sastoji od mutacija A330S, P331S i N297A IgG2 Fc regiona. U nekim aspektima, Fc varijanta sastoji se od mutacija L234A, L235A, G237A i N297A.
[0147] U nekim aspektima, Fc varijanta ispoljava smanjeno vezivanje za Fc receptor subjekta u poređenju sa divljim tipom humanog IgG Fc regiona. U nekim aspektima, Fc
1
varijanta ispoljava izostanak vezivanja za Fc receptor subjekta u poređenju sa divljim tipom humanog IgG Fc regiona. U nekim aspektima, Fc varijanta ispoljava smanjenje fagocitoze u poređenju sa divljim tipom humanog IgG Fc regiona. U nekim aspektima, Fc varijanta ispoljava izostanak fagocitoze u poređenju sa divljim tipom humanog IgG Fc regiona.
[0148] SEQ ID NO: 88 i SEQ ID NO: 89 obezbeđuju aminokiselinske sekvence Fc IgG1 i IgG2 konstantnih regiona teškog lanca. U nekim aspektima, Fc varijanta je bilo koja varijanta SEQ ID NO: 90-95 prikazanih u Tabeli 7.
Tabela 7. Aminokiselinske sekvence Fc varijanti
2
[0149] Ćelijama posredovana citotoksičnost zavisna od antitela, koja se u ovom tekstu označava i kao ADCC, odnosi se na formu citotoksičnosti u kojoj se sekretovani Ig vezuje za Fc receptore (FcR) prisutne na određenim citotoksičnim ćelijama (npr., ćelije prirodne ubice, (natural killer (NK) ćelije) i neutrofili) omogućavajući da se ove citotoksične efektorske ćelije specifično vežu za ciljnu ćeliju koja nosi antigen i da zatim ubiju ciljnu ćeliju. Ćelijama posredovana fagocitoza zavisna od antitela koja se u ovom tekstu označava i kao ADCP, odnosi se na formu citotoksičnosti u kojoj se sekretovani Ig vezuje za Fc receptore (FcR) prisutan na određenim fagocitnim ćelijama (npr., makrofagi) omogućavajući da se ove fagocitne efektorske ćelije specifično vežu za ciljnu ćeliju koja nosi antigen i da zatim fagocituju i razlože ciljnu ćeliju. Ligand-specifična visokoafinitetna IgG antitela usmerena ka površini ciljnih ćelija mogu stimulisati citotoksične ili fagocitne ćelije i mogu se koristiti u takvom ubijanju. U nekim aspektima, polipeptidni konstrukti koji uključuju Fc varijantu opisanu u ovom tekstu ispoljavaju smanjenu ADCC ili ADCP u poređenju sa polipeptidnim konstruktom koji uključuje divlji tip Fc regiona. U nekim aspektima, polipeptidni konstrukti koji uključuju Fc varijantu opisanu u ovom tekstu ispoljavaju najmanje 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili veće smanjenje ADCC ili ADCP u poređenju sa polipeptidnim konstruktom koji uključuje divlji tip Fc regiona. U nekim aspektima, polipeptidni konstrukti koji uključuju Fc varijantu opisanu u ovom tekstu pokazuju izostanak ADCC ili ADCP u poređenju sa polipeptidnim konstruktom koji uključuje divlji tip Fc regiona.
[0150] Komplementom usmerena citotoksičnost, koja se u ovom tekstu označava i kao CDC, označava oblik citotoksičnosti u kojoj se kaskada komplementa aktivira kada se komponenta komplementa C1q veže za Fc antitela. U nekim aspektima, polipeptidni konstrukti koji uključuju Fc varijantu opisanu u ovom tekstu ispoljavaju najmanje 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili više smanjenja vezivanja C1q u poređenju sa polipeptidnim konstruktom koji uključuje divlji tip Fc regiona. U nekim slučajevima, polipeptidni konstrukti koji uključuju Fc varijantu opisanu u ovom tekstu ispoljavaju smanjenu CDC u poređenju sa polipeptidnim konstruktom koji uključuje divlji tip Fc regiona. U nekim aspektima, polipeptidni konstrukti koji uključuju Fc varijantu opisanu u ovom tekstu ispoljavaju najmanje 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili veće smanjenje CDC u poređenju sa polipeptidnim konstruktom koji uključuje divlji tip Fc regiona. U nekim slučajevima, polipeptidni konstrukti koji uključuju Fc varijantu opisanu u ovom tekstu ispoljavaju zanemarljivu CDC u poređenju sa polipeptidnim konstruktom koji uključuje divlji tip Fc regiona.
[0151] Fc varijante u ovom tekstu uključuju one koje ispoljavaju smanjeno vezivanje za Fcγ receptor u poređenju sa divljim tipom Fc regiona humanog IgG. Na primer, u nekim aspektima, Fc varijanta ispoljava vezivanje za Fcγ receptor koje je manje od vezivanja koje ispoljava divlji tip Fc regiona humanog IgG za Fcγ receptor, kako je opisano u Primerima. U nekim slučajevima, Fc varijanta ima smanjeno vezivanje za Fcγ receptor za faktor od 10%, 20% 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% (potpuno odsustvo efektorske funkcije). U nekim aspektima, smanjeno vezivanje je za jedan ili više Fcγ receptora, npr., CD16a, CD32a, CD32b, CD32c, ili CD64.
[0152] U nekim slučajevima, Fc varijante objavljene u ovom tekstu pokazuju smanjenje fagocitoze u poređenju sa divljim tipom Fc regiona humanog IgG. Takve Fc varijante pokazuju smanjenje fagocitoze u poređenju sa svojim divljim tipom Fc regiona humanog IgG, pri čemu je smanjenje fagocitne aktivnosti npr., za faktor 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100%. U nekim slučajevima, Fc varijanta pokazuje odsustvo fagocitoze u poređenju sa svojim divljim tipom Fc regiona humanog IgG.
[0153] U nekim aspektima, Fc varijante objavljene u ovom tekstu povezane su sa jednim ili više fuzionih partnera. U nekim slučajevima fuzioni partner je terapijska komponenta. U nekim slučajevima, fuzioni partner se bira tako da omogući ciljanje eksprimiranog proteina, prečišćavanje, skrining, prikazivanje, i slično. U nekim aspektima, fuzioni partner utiče i na stepen vezivanja za Fc receptore ili stepen smanjenja fagocitoze. Kako
4
je opisano u ovom tekstu, u nekim aspektima, kada je Fc varijanta povezana sa fuzionim partnerom, on formira polipeptidni konstrukt opisan u nastavku ovog teksta.
[0154] U nekim aspektima, fuzioni partneri povezani su sa sekvencom Fc varijante preko linkerske sekvence. U nekim aspektima, linkerska sekvenca obično uključuje mali broj amino-kiselina, na primer manje od deset amino-kiselina, mada se koriste i duži linkeri. U nekim slučajevima, linker je dug manje od 10, 9, 8, 7, 6, ili 5 amino-kiselina, ili manje. U nekim slučajevima, linker je dug najmanje 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, ili 35 aminokiselina, ili više. Opciono, u nekim aspektima, koristi se linker koji može da se odseče.
[0155] U nekim aspektima, fuzioni partner je ciljajuća ili signalna sekvenca koja usmerava Fc varijantni protein i bilo koji od pridruženih fuzionih partnera na željenu ćelijsku lokaciju ili ka vanćelijskom medijumu. U nekim aspektima, određene signalne sekvence usmeravaju protein da se sekretuje u medijum za rast, ili u periplazmatski prostor, lociran između spoljašnje i unutrašnje membrane ćelije. U nekim aspektima, fuzioni partner je sekvenca koja kodira peptid ili protein koji omogućava prečišćavanje ili skrining. Takvi fuzioni partneri uključuju, ali se ne ograničavaju na polihistidinske oznake (tag) (His-tag) (Na primer His6 i His10) ili druge oznake za upotrebu sa sistemima za afinitetnu hromatografiju sa imobilisanim metalom (immobilized metal affinity chromatography, IMAC) (npr., Ni+2 afinitetne kolone), GST fuzije, MBP fuzije, Strep-oznake, BSP biotinisanu ciljnu sekvencu bakterijskog enzima BirA, i epitopske oznake, koji se ciljaju antitelima (na primer c-myc oznake, flag-oznake, i slično).
[0156] U nekim aspektima, takve oznake su korisne za prečišćavanje, za skrining, ili za oba. Na primer, u nekim aspektima, Fc varijanta se prečišćava korišćenjem His-oznake njenim imobilisanjem na Ni+2 afinitetnoj koloni, i zatim posle prečišćavanja iste Hisoznake koristi se za imobilisanje antitela za ploču obloženu Ni+2 da bi se izveo ELISA ili drugi test vezivanja kako je opisano na drugom mestu u ovom tekstu. U nekim aspektima, fuzioni partner omogućava upotrebu postupka selekcije za skrining Fc varijanti opisanih u ovom tekstu.
[0157] Na raspolaganju su različiti fuzioni partneri koji omogućavaju različite postupke selekcije. Na primer, fuzionisanje članova biblioteke Fc varijanti sa proteinom gena III, omogućava korišćenje prikazivanja na fagima. U nekim aspektima, fuzioni partneri omogućavaju obeležavanje Fc varijanti. Alternativno, u nekim aspektima, fuzioni partner se vezuje za specifičnu sekvencu na ekspresionom vektoru, omogućavajući da se fuzioni partner i pridružena Fc varijanta povežu kovalentno ili nekovalentno sa nukleinskom kiselinom koja ih kodira.
[0158] U nekim aspektima, kada je fuzioni partner terapijska komponenta, terapijska komponenta je, npr., peptid, protein, antitelo, siRNA, ili mali molekul. Neograničavajući primeri terapijskih antitela koja su povezana sa Fc varijantama predmetnog pronalaska uključuju, ali se ne ograničavaju na antitela koja prepoznaju CD47. Neograničavajući primeri terapijskih polipeptida koji su povezani sa Fc varijantama predmetne objave uključuju, ali se ne ograničavaju na CD47-vezujuće polipeptide, uključujući SIRP-α polipeptide. U takvim slučajevima, CD47-vezujući polipeptid je prikačen ili fuzionisan sa Fc varijantom objave. Primeri CD47-vezujućih polipeptida uključuju, ali se ne ograničavaju na anti-CD47 antitela ili njihove fragmente, ligande CD47 kao što je SIRP-α ili njegov fragment. Dodatni primeri CD47-vezujućih polipeptida uključuju, ali se ne ograničavaju na prirodne forme SIRP-α kao i njihove mutante.
[0159] U nekim aspektima, u ovom tekstu objavljen je polipeptid koji uključuje Fc varijantu, pri čemu Fc varijanta uključuje Fc domenski dimer koji ima dva Fc domenska monomera, pri čemu se svaki Fc domenski monomer nezavisno bira između (i) humanog IgG1 Fc regiona koji se sastoji od mutacija L234A, L235A, G237A, i N297A; (ii) humanog IgG2 Fc regiona koji se sastoji od mutacija A330S, P331S i N297A; ili (iii) humanog IgG4 Fc regiona koji uključuje mutacije S228P, E233P, F234V, L235A, delG236, i N297A. U nekim aspektima, Fc domenski monomeri su identični (tj., homodimerni). U nekim aspektima, Fc domenski monomeri su različiti (tj., heterodimerni). U nekim aspektima, najmanje jedan od Fc domenskih monomera u Fc domenskom dimeru je humani IgG1 Fc region koji se sastoji od mutacija L234A, L235A, G237A, i N297A. U nekim aspektima, najmanje jedan od Fc domenskih monomera u Fc domenskom dimeru je humani IgG2 Fc region koji se sastoji od mutacija A330S, P331S i N297A. U nekim aspektima, Fc varijanta pokazuje izostanak ili smanjeno vezivanje za Fcγ receptor u poređenju sa verzijom divljeg tipa humanog IgG Fc regiona. U nekim aspektima, Fc varijanta pokazuje izostanak ili smanjeno vezivanje za CD16a, CD32a, CD32b, CD32c, i CD64 Fcγ receptore u poređenju sa verzijom divljeg tipa humanog IgG Fc regiona. U nekim aspektima, Fc varijanta pokazuje izostanak ili smanjeno vezivanje za C1q u poređenju sa verzijom divljeg tipa humane IgG Fc fuzije. U nekim aspektima, najmanje jedan od Fc domenskih monomera u Fc domenskom dimeru je humani IgG4 Fc region koji uključuje mutacije S228P, E233P, F234V, L235A, delG236, i N297A. U nekim aspektima, Fc varijanta pokazuje izostanak ili smanjeno vezivanje za Fcγ receptor u poređenju sa verzijom divljeg tipa humanog IgG4 Fc regiona. U nekim aspektima, Fc varijanta pokazuje izostanak ili smanjeno vezivanje za CD16a i CD32b Fcγ receptore u poređenju sa verzijom divljeg tipa njegovog humanog IgG4 Fc regiona. U nekim aspektima, Fc varijanta vezuje se za Fcγ receptor sa KD većom od oko 5 x 10-6 M.
[0160] U nekim aspektima, Fc varijanta uključuje još i CD47-vezujući polipeptid. U nekim aspektima, Fc varijanta pokazuje izostanak ili smanjeno vezivanje za Fcγ receptor u poređenju sa verzijom divljeg tipa humanog IgG Fc regiona. U nekim aspektima, CD47-vezujući polipeptid ne izaziva akutnu anemiju kod glodara i nehumanih primata. U nekim aspektima, CD47-vezujući polipeptid ne izaziva akutnu anemiju kod ljudi.
[0161] U nekim aspektima, CD47-vezujući polipeptid je signal-regulatorni protein α (SIRP-α) polipeptid ili njegov fragment. U nekim aspektima, SIRP-α polipeptid uključuje SIRP-α D1 varijantu koja uključuje aminokiselinsku sekvencu EEELQX1IQPDKSVLVAAGETATLRCTX2TSLX3PVGPIQWFRGAGPGRX4LIYNQX5EGX
6FPRVTTVSDX7TKRNNMDFSIRIGX8ITPADAGTYYCX9KFRKGSPDDVEFKSGAGTEL SVRAK PS (SEQ ID NO: 51), pri čemu X1 je V ili I; X2 je A ili I; X3 je I ili F; X4 je E ili V; X5 je K ili R; X6 je H ili P; X7 je L ili T; X8 je bilo koja amino-kiselina različita od N; i X9 je V ili I. U nekim aspektima, SIRP-α polipeptid uključuje SIRP-α D1 varijantu pri čemu X1 je V ili I; X2 je A ili I; X3 je I ili F; X4 je E; X5 je K ili R; X6 je H ili P; X7 je L ili T; X8 nije N; i X9 je V.
[0162] U nekim aspektima, u ovom tekstu objavljen je polipeptid koji uključuje: SIRP-α D1 varijantu, pri čemu je SIRP-α D1 varijanta visokoafinitetni SIRP-α D1 domen koji se ne sreće u prirodi, pri čemu se SIRP-α D1 varijanta vezuje za humani CD47 sa afinitetom koji je najmanje 10-struko veći od afiniteta prirodnog D1 domena; i Fc domenskog monomera, pri čemu je Fc domenski monomer povezan sa drugim polipeptidom koji sadrži drugi Fc domenski monomer da se formira Fc domen, pri čemu Fc domen ima izostanak ili smanjenu efektorsku funkciju. U nekim aspektima, visokoafinitetni SIRP-α D1 domen koji se ne sreće u prirodi uključuje aminokiselinsku mutaciju na rezidui 80.
[0163] U nekim aspektima, u ovom tekstu objavljena je SIRP-α D1 varijanta, pri čemu se SIRP-α D1 varijanta vezuje sa CD47 iz prve vrste sa KD manjom od 250 nM; i pri čemu se SIRP-α D1 varijanta vezuje za CD47 iz druge vrste sa KD manjom od 250 nM; i KD za CD47 iz prve vrste i KD za CD47 iz druge vrste su jedna u odnosu na drugu unutar 100 puta; pri čemu se prva vrsta i druga vrsta biraju iz grupe koja se sastoji od: čoveka, glodara, i nehumanog primata. U nekim aspektima, SIRP-α D1 varijanta vezuje se sa CD47 iz najmanje 3 različite vrste. U nekim aspektima, nehumani primat je majmun cinomolgus.
[0164] U nekim aspektima, u ovom tekstu objavljen je polipeptid koji uključuje (a) SIRP-α D1 domen koji se vezuje za humani CD47 sa KD manjom od 250 nM; i (b) Fc domenski monomer vezan za N-terminus ili C-terminus SIRP-α D1 domena, pri čemu polipeptid ne izaziva akutnu anemiju kod glodara i nehumanih primata. U nekim aspektima, polipeptid je varijanta humanog SIRP-α koja se ne sreće u prirodi. U nekim aspektima, primena polipeptida in vivo rezultuje smanjenjem hemoglobina za manje od 50% tokom prve nedelje posle primene. U nekim aspektima, primena polipeptida kod ljudi rezultuje smanjenjem hemoglobina za manje od 50% tokom prve nedelje posle primene. U nekim aspektima, polipeptid uključuje još i najmanje jednu Fc varijantu, pri čemu Fc varijanta uključuje Fc domenski monomer koji se bira između (i) humanog IgG1 Fc regiona koji se sastoji od mutacija L234A, L235A, G237A, i N297A; (ii) humanog IgG2 Fc regiona koji se sastoji od mutacija A330S, P331S i N297A; ili (iii) humanog IgG4 Fc regiona koji uključuje mutacije S228P, E233P, F234V, L235A, delG236, i N297A.. U nekim aspektima, Fc domenski monomer je humani IgG1 Fc region koji se sastoji od mutacija L234A, L235A, G237A, i N297A.. U nekim aspektima, Fc domenski monomer je humani IgG2 Fc region koji se sastoji od mutacija A330S, P331S i N297A.
[0165] SIRP-α konstrukti objave uključuju SIRP-α domen ili njegovu varijantu, koji ima svoj C-terminus spojen sa N-terminusom Fc domenskog monomera preko linkera uz korišćenje konvencionalnih genetičkih ili hemijskih načina, npr., hemijskom konjugacijom. U nekim aspektima, linker (npr., spejser) insertuje se između polipeptida i Fc domenskog monomera. U nekim aspektima, polipeptid objave koji uključuje visokoafinitetnu SIRP-α D1 varijantu fuzioniše se sa Fc domenskim monomerom koji ne može da formira dimer. U nekim aspektima, polipeptid objave fuzioniše se sa Fc domenskim monomerom koji može da formira dimer, npr., heterodimer, sa još jednim Fc domenskim monomerom. U nekim aspektima, polipeptid objave fuzioniše se sa Fc domenskim monomerom i ovaj fuzioni protein formira homodimer. U nekim aspektima, polipeptid objave fuzioniše se sa prvim Fc domenskim monomerom i različiti protein ili peptid (npr., varijabilni region antitela) fuzioniše se sa drugim Fc domenskim monomerom. U nekim aspektima, SIRP-α D1 domen ili njegova varijanta, spojen je sa prvim Fc domenskim monomerom i terapijski protein (npr., citokin, interleukin, antigen, steroid, antizapaljensko sredstvo, ili imunomodulatorno sredstvo) spojen je sa drugim Fc domenskim monomerom. U nekim aspektima, prvi i drugi Fc domenski monomer formiraju heterodimer.
[0166] Bez ograničavanja gore navedenog, u nekim aspektima, SIRP-α D1 varijantni polipeptid (npr., bilo koja od varijanti opisanih u Tabelama 2, 5, i 6) fuzioniše se sa Fc polipeptidom ili Fc varijantnim polipeptidom, kao što je Fc domenski monomer. Primeri polipeptida uključuju SIRP-α D1 varijantni polipeptid i fuzionisani Fc varijantni polipeptid uključujući, ali ne ograničavajući se na SEQ ID NO: 96-137, 214, i 216 prikazane u Tabeli 8.
Tabela 8. Polipeptidi koji uključuju SIRP-α D1 varijante fuzionisane sa Fc varijantama SEQ Aminokiselinska sekvenca
SEQ Aminokiselinska sekvenca
SEQ Aminokiselinska sekvenca
1
SEQ Aminokiselinska sekvenca
2
SEQ Aminokiselinska sekvenca
SEQ Aminokiselinska sekvenca
4
SEQ Aminokiselinska sekvenca
SEQ Aminokiselinska sekvenca
[0167] U nekim aspektima, polipeptid uključuje visokoafinitetni SIRP-α D1 domen koji ima najmanje 85% sekvencione identičnosti (npr., najmanje 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% sekvencione identičnosti) sa bilo kojom varijantom obezbeđenom u Tabeli 8.
[0168] U nekim aspektima, polipeptid uključuje visokoafinitetni SIRP-α D1 domen koji ima najmanje 85% sekvencione identičnosti (npr., najmanje 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% sekvencione identičnosti) sa SEQ ID NO: 98-104, 107-113, 116-122, ili 135-137 u Tabeli 8.
[0169] U nekim aspektima, polipeptid uključuje (a) signal-regulatorni protein α (SIRP-α) D1 varijantu, pri čemu SIRP-α D1 varijanta uključuje aminokiselinsku sekvencu EEX1X2QX3IQPDKX4VX5VAAGEX6X7X8LX9CTX10TSLX11PVGPIQWFRGAGPX12RX13LI YNQX14X15GX16FPRVTTVSX17X18TX19RX20NMDFX21IX22IX23X24ITX25ADAGTYYCX26KX
27RK GSPDX28X29EX30KSGAGTELSVRX31KPS (SEQ ID NO: 47), pri čemu X1 je E, ili G; X2 je L, I, ili V; X3 je V, L, ili I; X4 je S, ili F; X5 je L, ili S; X6 je S, ili T; X7 je A, ili V; X8 je I, ili T; X9 je H, R, ili L; X10 je A, V, I, ili L; X11 je I, T, S, ili F; X12 je A, ili G; X13 je E, V, ili L; X14 je K, ili R; X15 je E, ili Q; X16 je H, P, ili R; X17 je D, ili E; X18 je S, L, T, ili G; X19 je K, ili R; X20 je E, ili N; X21 je S, ili P; X22 je S, ili R; X23 je S, ili G; X24 je bilo koja amino-kiselina; X25 je bilo koja amino-kiselina; X26 je V, ili I; X27 je F, L, ili V; X28 je D ili odsutno; X29 je T, ili V; X30 je F, ili V; i X31 je A, ili G; i pri čemu SIRP-α D1 varijanta ima najmanje dve aminokiselinske supstitucije u odnosu na SIRP-α D1 domen divljeg tipa koji ima sekvencu prema bilo kojoj od SEQ ID NO: 1 do 10; i (b) Fc varijantu koja uključuje Fc domenski dimer koji ima dva Fc domenska monomera, pri čemu je svaki Fc domenski monomer nezavisno (i) humani IgG1 Fc region koji uključuje N297A mutaciju; (ii) humani IgG1 Fc region koji uključuje L234A, L235A, i G237A mutacije; (iii) humani IgG1 Fc region koji uključuje L234A, L235A, G237A, i N297A mutacije; (iv) humani IgG2 Fc region koji uključuje N297A mutacije; (v) humani IgG2 Fc region koji uključuje A330S i P331S mutacije; (vi) humani IgG2 Fc region koji uključuje A330S, P331S, i N297A mutacije; (vii) humani IgG4 Fc region koji uključuje S228P, E233P, F234V, L235A, i delG236 mutacije; ili (viii) humani IgG4 Fc region koji uključuje S228P, E233P, F234V, L235A, delG236, i N297A mutacije.
[0170] U nekim aspektima, polipeptid uključuje SIRP-α D1 varijantu pri čemu SIRP-α D1 varijanta uključuje aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 47; Fc varijanta uključuje Fc domenski dimer koji ima dva Fc domenska monomera, pri čemu je jedan od Fc domenskih monomera u Fc domenu dimer koji uključuje humani IgG1 Fc region koji sadrži L234A, L235A, G237A, i N297A mutacije.
Dimerizacija Fc domenskih monomera
[0171] U nekim aspektima, SIRP-α D1 varijantni polipeptid (npr., bilo koja od varijanti opisanih u Tabelama 2, 5, i 6) fuzioniše se sa prvim Fc domenskim monomerom na N-terminusu ili na C-terminusu. U nekim aspektima, prvi Fc domenski monomer ne može da formira Fc domen ili dimer. U nekim aspektima, prvi Fc domenski monomer kombinuje se sa drugim Fc domenskim monomerom da formira Fc domen ili dimer. U nekim aspektima, prvi i drugi Fc domenski monomer uključuju aminokiselinske supstitucije koje promovišu heterodimerizaciju između prvog i drugog domenskog monomera.
[0172] U nekim aspektima, svaki od dva Fc domenska monomera u Fc domenu uključuje aminokiselinske supstitucije koje promovišu heterodimerizaciju dva monomera. U nekim aspektima, SIRP-α konstrukt se formira, na primer, od prve subjedinice koja sadrži SIRP-α D1 varijantni polipeptid fuzionisana sa prvim Fc domenskim monomerom i drugu podjedinicu koja sadrži drugi Fc domenski monomer (npr., bez SIRP-α D1 varijantnog polipeptida ili bilo kojeg drugog polipeptida). U nekim aspektima, konstrukt ima jedan SIRP-α D1 varijantni polipeptid povezan sa Fc domenom (npr., jedna ručica). U nekim aspektima, konstrukt ima dva SIRP-α D1 varijantna polipeptida povezana sa Fc domenom (npr., dve ručice). U nekim aspektima, SIRP-α D1 varijanta koja ima KD od oko 500 nM posebno je korisna u konstruktu sa dve ručice. U nekim aspektima, SIRP-α D1 varijanta koja ima KD od oko 50 nM posebno je korisna u konstruktu sa dve ručice. U nekim aspektima, SIRP-α D1 varijanta koja ima KD od oko 5 nM korisna je u konstruktu sa dve ručice i u konstruktu sa jednom ručicom. U nekim aspektima, SIRP-α D1 varijanta koja ima KD od oko 500 pM korisna je u konstruktu sa dve ručice i konstruktu sa jednom ručicom. U nekim aspektima, SIRP-α D1 varijanta koja ima KD od oko 100 pM korisna je u konstruktu sa dve ručice i konstruktu sa jednom ručicom. U nekim aspektima, SIRP-α D1 varijanta koja ima KD od oko 50 pM korisna je u konstruktu sa dve ručice i konstruktu sa jednom ručicom. U nekim aspektima, SIRP-α D1 varijanta koja ima KD od oko 10 pM korisna je u konstruktu sa dve ručice i konstruktu sa jednom ručicom.
[0173] U nekim aspektima, heterodimerizacija Fc domenskih monomera promoviše se uvođenjem različitih ali kompatibilnih supstitucija u dva Fc domenska monomera, kao što su parovi rezidua "čvorić u rupici" i naelektrisani parovi rezidua. Interakcija po tipu "čvorića u rupici" favorizuje formiranje heterodimera, dok interakcije "čvorić-čvorić" i "rupicarupica" ometaju formiranje homodimera zbog steričnog sudaranja i uklanjanja povoljnih interakcija. "Rupica" označava prazninu koja se stvara kada se originalna amino-kiselina u proteinu zameni različitom amino-kiselinom koja ima manju zapreminu bočnog lanca. "Čvorić" označava ispupčenje koje se stvara kada se originalna amino-kiselina u proteinu zameni različitom amino-kiselinom koja ima veću zapreminu bočnog lanca. Na primer, u nekim aspektima, zamenjena amino-kiselina se nalazi u CH3 konstantnom domenu Fc domenskog monomera antitela i uključena je u dimerizaciju dva Fc domenska monomera. U nekim aspektima, "rupica" u jednom CH3 konstantnom domenu antitela napravljena je tako da se u nju smesti "čvorić" iz drugog CH3 konstantnog domena antitela, tako da amino-kiseline "čvorića" i "rupice" dejstvuju tako što promovišu ili favorizuju heterodimerizaciju dva Fc domenska monomera. U nekim aspektima, "rupica" u jednom CH3 konstantnom domenu antitela napravljena je tako da se u nju bolje smesti originalna amino-kiselina iz drugog CH3 konstantnog domena antitela. U nekim aspektima, "čvorić" u jednom CH3 konstantnom domenu antitela napravljen je tako da se formiraju dodatne interakcije sa originalnim amino-kiselinama i drugog CH3 konstantnog domena antitela.
[0174] U nekim aspektima, "rupica" se konstruiše zamenom amino-kiselina koje imaju veće bočne lance, kao što su tirozin ili triptofan, amino-kiselinama koje imaju manje bočne lance, kao što su alanin, valin, ili treonin, na primer Y407V mutacija u CH3 konstantnom domenu antitela. Slično tome, u nekim aspektima, "čvorić" se konstruiše zamenom amino-kiselina koje imaju manje bočne lance amino-kiselinama koje imaju veće bočne lance, Na primer T366W mutacija u CH3 konstantnom domenu antitela. U nekim aspektima, jedan Fc domenski monomer uključuje mutaciju tipa "čvorić" T366W i drugi Fc domenski monomer uključuje mutacije tipa "rupica" T366S, L358A, i Y407V. U nekim aspektima, polipeptid objave koji uključuje visokoafinitetnu SIRP-α D1 varijantu fuzioniše se sa Fc domenskim monomerom koji sadrži mutaciju tipa "čvorić" T366W da bi se ograničilo nepoželjno formiranje homodimera "čvorić-čvorić". Primeri aminokiselinskih parova "čvorić u rupici" navedeni su, bez ograničavanja, u Tabeli 9, a primeri "čvorić u rupici" Fc varijanti SIRP-α - Fc fuzija dati su u Tabeli 10.
Tabela 9. Aminokiselinski parovi po tipu čvorić u rupici
Tabela 10. Primeri Fc varijanti i SIRP-α - Fc fuzija
[0175] Pored strategije "čvorić u rupici", u nekim aspektima, elektrostatičko upravljanje se takođe koristi za kontrolisanje dimerizacije Fc domenskih monomera. Elektrostatičko upravljanje označava korišćenje povoljnih elektrostatičkih interakcija između suprotno naelektrisnaih amino-kiselina u peptidima, proteinskim domenima i proteinima, za kontrolu formiranja proteinskih molekula višeg reda uređenosti. Posebno, da bi se kontrolisala dimerizacija Fc domenskih monomera korišćenjem elektrostatičkog upravljanja, jedna ili više aminokiselinskih rezidua koje čine CH3-CH3 interfejs zamenjuju se pozitivno ili negativno naelektrisanim aminokiselinskim reziduama tako da interakcija postane elektrostatički povoljna ili nepovoljna u zavisnosti od specifično naelektrisanih uvedenih amino-kiselina. U nekim aspektima, pozitivno naelektrisana amino-kiselina na interfejsu, na primer lizin, arginin, ili histidin, zamenjuje se negativno naelektrisanom amino-kiselinom, na primer asparaginskom kiselinom ili glutaminskom kiselinom. U nekim aspektima, negativno naelektrisana amino-kiselina na interfejsu zamenjuje se pozitivno naelektrisanom amino-kiselinom. U nekim aspektima, naelektrisane amino-kiseline uvode se u jedan od interagujućih CH3 konstantnih domena antitela, ili u oba. U nekim aspektima, uvođenje naelektrisanih amino-kiselina u interagujuće CH3 konstantne domene dva Fc domenska monomera promoviše selektivno formiranje heterodimera Fc domenskih monomera, kontrolisano efektima elektrostatičkog upravljanja što je rezultat interakcije između naelektrisanih amino-kiselina. Primeri aminokiselinskih parova elektrostatičkog upravljanja prikazani su, bez ograničavanja, u Tabeli 11.
Tabela 11. Aminokiselinski parovi elektrostatičkog upravljanja
1
[0176] Dostupni su i drugi postupci koji kontrolišu heterodimerizaciju Fc domenskih monomera, posebno u kontekstu konstruisanja bispecifičnog antitela,.
[0177] U nekim aspektima, prvi Fc domenski monomer i drugi Fc domenski monomer, svaki, uključuje jednu ili više sledećih aminokiselinskih supstitucija: T366W, T366S, L368A, Y407V, T366Y, T394W, F405W, Y349T, Y349E, Y349V, L351T, L351H, L351N, L351K, P353S, S354D, D356K, D356R, D356S, E357K, E357R, E357Q, S364A, T366E, L368T, L368Y, L368E, K370E, K370D, K370Q, K392E, K392D, T394N, P395N, P396T, V397T, V397Q, L398T, D399K, D399R, D399N, F405T, F405H, F405R, Y407T, Y407H, Y407I, K409E, K409D, K409T, i K409I, u odnosu na sekvencu humanog IgG1.
[0178] U nekim aspektima Fc domenski monomer uključuje: (a) jednu od sledećih aminokiselinskih supstitucija u odnosu na divlji tip humanog IgG1: T366W, T366S, L368A, Y407V, T366Y, T394W, F405W, Y349T, Y349E, Y349V, L351T, L351H, L351N, L351K, P353S, S354D, D356K, D356R, D356S, E357K, E357R, E357Q, S364A, T366E, L368T, L368Y, L368E, K370E, K370D, K370Q, K392E, K392D, T394N, P395N, P396T, V397T, V397Q, L398T, D399K, D399R, D399N, F405T, F405H, F405R, Y407T, Y407H, Y407I, K409E, K409D, K409T, ili K409I; ili (b) (i) N297A mutaciju u odnosu na humani IgG1 Fc region; (ii) L234A, L235A, i G237A mutaciju u odnosu na humani IgG1 Fc region; (iii) L234A, L235A, G237A, i N297A mutaciju u odnosu na humani IgG1 Fc region; (iv) N297A mutaciju u odnosu na humani IgG2 Fc region; (v) A330S i P331S mutaciju u odnosu na humani IgG2 Fc region; (vi) A330S, P331S, i N297A mutaciju u odnosu na humani IgG2 Fc region; (vii) S228P, E233P, F234V, L235A, i delG236 mutaciju u odnosu na humani IgG4 Fc region; ili (viii) S228P, E233P, F234V, L235A, delG236, i N297A mutaciju u odnosu na humani IgG4 Fc region. U nekim aspektima Fc domenski monomer uključuje: (a) jednu od sledećih aminokiselinskih supstitucija u odnosu na divlji tip humanog IgG1: T366W, T366S, L368A, Y407V, T366Y, T394W, F405W, Y349T, Y349E, Y349V, L351T, L351H, L351N, L351K, P353S, S354D, D356K, D356R, D356S, E357K, E357R, E357Q, S364A, T366E, L368T, L368Y, L368E, K370E, K370D, K370Q, K392E, K392D, T394N, P395N, P396T, V397T, V397Q, L398T, D399K, D399R, D399N, F405T, F405H, F405R,
2
Y407T, Y407H, Y407I, K409E, K409D, K409T, ili K409I; i (b) uključuje još i (i) N297A mutaciju u odnosu na humani IgG1 Fc region; (ii) L234A, L235A, i G237A mutaciju u odnosu na humani IgG1 Fc region; (iii) L234A, L235A, G237A, i N297A mutaciju u odnosu na humani IgG1 Fc region; (iv) N297A mutaciju u odnosu na humani IgG2 Fc region; (v) A330S i P331S mutaciju u odnosu na humani IgG2 Fc region; (vi) A330S, P331S, i N297A mutaciju u odnosu na humani IgG2 Fc region; (vii) S228P, E233P, F234V, L235A, i delG236 mutaciju u odnosu na humani IgG4 Fc region; ili (viii) S228P, E233P, F234V, L235A, delG236, i N297A mutaciju u odnosu na humani IgG4 Fc region.
[0179] U nekim aspektima, prvi i drugi Fc domenski monomer uključuju različite aminokiselinske supstitucije. U nekim aspektima, prvi Fc domenski monomer uključuje T366W. U nekim aspektima, drugi Fc domenski monomer uključuje T366S, L368A, i Y407V. U nekim aspektima, prvi Fc domenski monomer uključuje D399K. U nekim aspektima, drugi Fc domenski monomer uključuje K409D.
IV. Serumski albumin
[0180] U ovom tekstu, u nekim aspektima, objavljeni su polipeptidi koji uključuju signalregulatorni protein α (SIRP-α) D1 varijantu koja sadrži SIRP-α D1 domen, ili njegov fragment, koji ima aminokiselinsku mutaciju na rezidui 80 u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena; i najmanje jednu dodatnu aminokiselinsku mutaciju u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena na rezidui odabranoj iz grupe koja se sastoji od: rezidue 6, rezidue 27, rezidue 31, rezidue 47, rezidue 53, rezidue 54, rezidue 56, rezidue 66, i rezidue 92.
[0181] U ovom tekstu, u nekim aspektima, objavljeni su polipeptidi koji uključuju Fc varijantu, pri čemu Fc varijanta uključuje Fc domenski dimer koji ima dva Fc domenska monomera, pri čemu se svaki Fc domenski monomer bira između (i) humanog IgG1 Fc regiona koji se sastoji od mutacija L234A, L235A, G237A, i N297A; (ii) humanog IgG2 Fc regiona koji se sastoji od mutacija A330S, P331S i N297A; ili (iii) humanog IgG4 Fc regiona koji se sastoji od mutacija S228P, E233P, F234V, L235A, delG236, i N297A.
[0182] Fuzije sa serumskim albuminima mogu poboljšati farmakokinetiku proteinskih farmaceutika, i u nekim aspektima, polipeptidi objave, uključujući visokoafinitetnu SIRP-α D1 varijantu opisanu u ovom tekstu, spojeni su sa serumskim albuminom.
[0183] Serumski albumin je globularni protein koji je visoko zastupljen u krvi sisara. Serumski albumin se proizvodi u jetri i može činiti oko polovine proteina krvnog seruma. Monomeran je i rastvorljiv u krvi. Neke od najvažnijih funkcija serumskog albumina uključuju transport hormona, masnih kiselina, i drugih proteina u telu, puferisanje pH, i održavanje osmotskog pritiska potrebnog za ispravnu distribuciju telesnih tečnosti između krvnih sudova i telesnih tkiva. U poželjnim aspektima, serumski albumin je humani serumski albumin (HSA). U nekim aspektima, HSA je spojen sa C-terminusom polipeptida objave da bi se povećao poluživot polipeptida u serumu. U nekim aspektima, N-terminus HSA spojen je sa C-terminusom polipeptida objave. U nekim aspektima, HSA spojen je, direktno ili preko linkera, sa C-terminusom polipeptida. U nekim aspektima, HSA spojen je, direktno ili preko linkera, sa N-terminusom polipeptida.
[0184] U nekim aspektima, humani serumski albumin uključuje sekvencu amino-kiselina (aa) 25-609 UniProt ID NO: P02768 (SEQ ID NO: 12) kako je prikazano u Tabeli 12. U nekim aspektima, HSA je spojen sa visokoafinitetnom SIRP-α D1 varijantom (npr., bilo koja SIRP-α D1 varijanta opisana u Tabelama 2, 5, i 6) koja uključuje amino-kiseline 25-609 (SEQ ID NO: 12) sekvence UniProt ID NO: P02768. U nekim aspektima, HSA uključuje C34S ili K573P supstitucije, u odnosu na SEQ ID NO: 12. U nekim aspektima, HSA uključuje C34S i K573P supstitucije, u odnosu na SEQ ID NO: 12.
Tabela 12. Sekvence HSA
[0185] U nekim aspektima, serumski albumin fuzionisan je genetički sa polipeptidom objave ili je spojen sa polipeptidom hemijski, npr., hemijskom konjugacijom. U nekim aspektima, spejser se insertuje između polipeptida i HSA. Neki primeri spejsera opisani su detaljno na drugom mestu u ovom tekstu. U nekim aspektima, spejser je A ili AAAL. U nekim aspektima, fuzija HSA u polipeptidu objave dovodi do produženog zadržavanja polipeptida kao i do porasta poluživota.
4
[0186] Polipeptidi koji uključuju SIRP-α D1 varijantni polipeptid i fuzionisani HSA uključuju, ali se ne ograničavaju na SEQ ID NO: 150-159 date u Tabeli 13.
Tabela 13. Polipeptidi koji uključuju SIRP-α varijantu fuzionisanu sa HSA SEQ ID Aminokiselinska sekvenca
SEQ
ID Aminokiselinska sekvenca
SEQ
ID Aminokiselinska sekvenca
S
I
N
1
[0187] U nekim aspektima, polipeptid uključuje visokoafinitetni SIRP-α D1 domen koji ima najmanje 85% sekvencione identičnosti (npr., najmanje 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% sekvencione identičnosti) sa bilo kojom varijantom datom u Tabeli 13.
[0188] U nekim aspektima, polipeptid uključuje visokoafinitetni SIRP-α D1 domen koji ima najmanje 85% sekvencione identičnosti (npr., najmanje 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% sekvencione identičnosti) sa SEQ ID NO: 154, 155, i 159 u Tabeli 13.
V. Albumin-vezujući peptid
[0189] U ovom tekstu, u nekim aspektima, objavljeni su polipeptidi koji uključuju signalregulatorni protein α (SIRP-α) D1 varijantu koja uključuje SIRP-α D1 domen, ili njegov fragment, koji ima aminokiselinsku mutaciju na rezidui 80 u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena; i najmanje jednu dodatnu aminokiselinsku mutaciju u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domen na rezidui odabranoj iz grupe koja se sastoji od: rezidue 6, rezidue 27, rezidue 31, rezidue 47, rezidue 53, rezidue 54, rezidue 56, rezidue 66, i rezidue 92.
[0190] Isto tako, u ovom tekstu su objavljeni, u nekim aspektima, polipeptidi koji uključuju Fc varijantu, pri čemu Fc varijanta uključuje Fc domenski dimer koji ima dva domenska monomera, pri čemu se svaki Fc domenski monomer nezavisno bira između (i) humanog IgG1 Fc regiona koji se sastoji od mutacija L234A, L235A, G237A, i N297A; (ii) humanog IgG2 Fc regiona koji se sastoji od mutacija A330S, P331S i N297A; ili (iii) humanog IgG4 Fc regiona koji uključuje mutacije S228P, E233P, F234V, L235A, delG236, i N297A.
[0191] Vezivanje sa serumskim proteinima može poboljšati farmakokinetiku proteinskih farmaceutika, i posebno, u nekim aspektima, polipeptidi opisani u ovom tekstu fuzionisani su sa peptidima ili proteinima koji se vezuju za serumske proteine.
[0192] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "albumin-vezujući peptid" odnosi se na aminokiselinsku sekvencu od oko 12 do 16 amino-kiselina, koja ima afinitet i funkcije da se veže za serumski albuminski protein. U nekim aspektima, albumin-vezujući peptid poreklom je iz čoveka, miša ili pacova.
[0193] U nekim aspektima, polipeptid objave koji uključuje visokoafinitetnu SIRP-α D1 varijantu (npr., bilo koju varijantu datu u Tabelama 2, 5, i 6) fuzioniše se sa albuminvezujućim peptidom koji pokazuje aktivnost vezivanja za serumski albumin da bi se povećao poluživot polipeptida. Dostupni su različiti albumin-vezujući peptidi koji mogu da se koriste u ovde opisanim postupcima i kompozicijama. U nekim aspektima, albuminvezujući peptid uključuje sekvencu DICLPRWGCLW (SEQ ID NO: 160). U nekim aspektima, albumin-vezujući peptid fuzionisan je genetički sa polipeptidom objave ili je prikačen za polipeptid hemijski, npr., hemijskom konjugacijom.
[0194] U nekim aspektima, linker (npr., spejser) insertuje se između polipeptida i albuminvezujućeg peptida da bi omogućio dodatnu strukturnu i prostornu fleksibilnost fuzionog proteina. Specifični linkeri (npr., spejser) i njihove aminokiselinske sekvence opisani su detaljno u nastavku ovog teksta. U nekim aspektima, albumin-vezujući peptid fuzionisan je sa N- ili C-terminusom polipeptida objave. U jednom primeru, N-terminus albuminvezujućeg peptida direktno je fuzionisan sa C-terminusom polipeptida objave preko peptidne veze. U drugom primeru, C-terminus albumin-vezujućeg peptida direktno je fuzionisan sa N-terminusom polipeptida objave preko peptidne veze. U nekim aspektima, fuzija albumin-vezujućeg peptida sa polipeptidom objave dovodi do produženog zadržavanja polipeptida preko njegovog vezivanja za serumski albumin.
VI. Polietilen glikolni (PEG) polimer
[0195] U ovom tekstu, u nekim aspektima, objavljeni su polipeptidi koji uključuju signalregulatorni protein α (SIRP-α) D1 varijantu koja uključuje SIRP-α D1 domen, ili njegov fragment, koji ima aminokiselinsku mutaciju na rezidui 80 u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena; i najmanje jednu dodatnu aminokiselinsku mutaciju u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domen na rezidui odabranoj iz grupe koja se sastoji od: rezidue 6, rezidue 27, rezidue 31, rezidue 47, rezidue 53, rezidue 54, rezidue 56, rezidue 66, i rezidue 92.
[0196] Isto tako, u ovom tekstu su objavljeni, u nekim aspektima, polipeptidi koji uključuju Fc varijantu, pri čemu Fc varijanta uključuje Fc domenski dimer koji ima dva Fc domenska monomera, pri čemu se svaki Fc domenski monomer nezavisno bira između (i) humanog IgG1 Fc regiona koji se sastoji od mutacija L234A, L235A, G237A, i N297A; (ii) humanog IgG2 Fc regiona koji se sastoji od mutacija A330S, P331S i N297A; ili (iii) humanog IgG4 Fc regiona koji uključuje mutacije S228P, E233P, F234V, L235A, delG236, i N297A.
[0197] U nekim aspektima, polipeptid koji uključuje visokoafinitetni SIRP-α D1 domen (npr., bilo koju varijantu datu u Tabelama 2, 5, i 6) fuzioniše se sa polimerom (npr., polietilen glikolom, PEG). U nekim aspektima, povezivanje polimera sa proteinskim farmaceutikom "sakriva" proteinski farmaceutik od domaćinovog imunskog sistema. Pored toga, u nekim aspektima, određeni polimeri, kao što su hidrofilni polimeri, hidrofilnim proteinima i lekovima obezbeđuju rastvorljivost u vodi. Na primer, u nekim aspektima, takvi polimeri uključuju molekule PEG, polisijalinskog kiselinskog lanca i PAS lanca. U nekim aspektima, polimer kao što je PEG, kovalentno se spaja sa cisteinskom supstitucijom ili adicijom u polipeptidu. U nekim aspektima, cisteinska supstitucija u polipeptidu je I7C, A16C, S20C, T20C, A45C, G45C, G79C, S79C, ili A84C, u odnosu na sekvencu bilo koje od sekvenci datih u Tabelama 2, 5, i 6. U nekim aspektima, dodavanje cisteinske rezidue polipeptidu vrši se korišćenjem peptidne sinteze, genetičke modifikacije, molekulskog kloniranja, ili bilo koje njihove kombinacije. U nekim aspektima, polimer, na primer PEG, prikačen je za cisteinsku reziduu korišćenjem cistein-maleimidne konjugacije. U nekim aspektima, polimer kao što je PEG, kovalentno je prikačen za polipeptid koji uključuje visokoafinitetnu SIRP-α D1 varijantu na N- ili C-terminusu ili na unutrašnjoj lokaciji, korišćenjem konvencionalnih hemijskih metoda kao što je hemijska konjugacija.
VII. Bispecifični konstrukt
[0198] U ovom tekstu, u nekim aspektima, objavljeni su polipeptidi koji uključuju signalregulatorni protein α (SIRP-α) D1 varijantu koja uključuje SIRP-α D1 domen, ili njegov fragment, koji ima aminokiselinsku mutaciju na rezidui 80 u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena; i najmanje jednu dodatnu aminokiselinsku mutaciju u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena na rezidui odabranoj iz grupe koja se sastoji od: rezidue 6, rezidue 27, rezidue 31, rezidue 47, rezidue 53, rezidue 54, rezidue 56, rezidue 66, i rezidue 92.
[0199] Isto tako, u ovom tekstu su objavljeni, u nekim aspektima, polipeptidi koji uključuju Fc varijantu, pri čemu Fc varijanta uključuje Fc domenski dimer koji ima dva Fc domenska monomera, pri čemu se svaki Fc domenski monomer nezavisno bira između (i) humanog IgG1 Fc regiona koji se sastoji od mutacija L234A, L235A, G237A, i N297A; (ii) humanog IgG2 Fc regiona koji se sastoji od mutacija A330S, P331S i N297A; ili (iii) humanog IgG4 Fc regiona koji uključuje mutacije S228P, E233P, F234V, L235A, delG236, i N297A.
[0200] U nekim aspektima, polipeptid koji ima visokoafinitetnu SIRP-α D1 varijantu (npr., bilo koju od varijanti datih u Tabelama 2, 5, i 6) uključuje bispecifični konstrukt. Bispecifični konstrukt označava konstrukt koji ima dva sa ciljem interagujuća domena. U nekim aspektima, bispecifični konstrukt uključuje Fc domen i dva sa ciljem interagujuća domena: (1) SIRP-α D1 domen ili njegovu varijantu (npr., bilo koja od varijanti obezbeđenih u Tabelama 2, 5, i 6) i (2) varijabilni domen antitela. U nekim aspektima, bispecifični konstrukt uključuje prvi polipeptid i drugi polipeptid. U nekim aspektima, prvi polipeptid ima formulu A-L-B, gde A uključuje SIRP-α D1 domen ili njegovu varijantu, L je linker, i B uključuje prvi Fc domenski monomer. U nekim aspektima, drugi polipeptid ima formulu A'-L'-B', gde A' uključuje varijabilni domen antitela, L' je linker; i B' uključuje drugi Fc domenski monomer. U nekim aspektima, orijentacija prvog i drugog polipeptida je B-L-A, odnosno B'-L'-A'. U nekim aspektima, prvi i drugi Fc domenski monomeri kombinuju se da formiraju Fc domen u bispecifičnom konstruktu. U nekim aspektima, bispecifični konstrukt je bilo kojeg izotipa imunoglobulinskog antitela (npr., IgG, IgE, IgM, IgA, i IgD). Varijanta SIRP-α D1 domena uključuje D1 domen divljeg tipa humanog SIRP-α i jednu ili više aminokiselinskih supstitucija u odnosu na divlji tip D1 domena (npr., bilo koja SIRP-α D1 varijanta opisana u Tabelama 2, 5, i 6). U nekim aspektima, SIRP-α D1 varijanta vezuje se sa većim afinitetom vezivanja za CD47 nego divlji tip humanog SIRP-α D1 domena. U nekim aspektima, varijabilni domen antitela u bispecifičnom konstruktu cilja ćelijski antigen (npr., ćelijski antigen na kancerskoj ćeliji).
[0201] Varijabilni domen antitela odnosi se na delove lakih i teških lanaca antitela koji uključuju aminokiselinske sekvence regiona koji određuju komplementarnost (complementary determining region, CDR, npr., CDR LI, CDR L2, CDR L3, CDR HI, CDR H2, i CDR H3) i regione okvira (framework regions, FR). Varijabilni domen antitela može antitelu davati sposobnost da se vezuje za specifične antigene. Mogu se konstruisati mnogi različiti molekuli varijabilnih domena antitela. U nekim aspektima, upotrebljeni molekuli varijabilnog domena antitela uključuju, ali se ne ograničavaju na jednolančani Fv.
[0202] U nekim aspektima, varijabilni domen antitela u bispecifičnom konstruktu cilja ćelijski antigen (npr., ćelijski antigen na kancerskoj ćeliji ili na imunskoj ćeliji). Neki proteini se eksprimiraju u višim nivoima u kancerskim ćelijama nego u nekancerskim ćelijama. Na primer, kancerski antigen je protein koji preferencijalno eksprimiraju kancerske ćelije (npr., on se u višem nivou eksprimira kancerskim ćelijama nego nekancerskim ćelijama)
1
i u nekim slučajevima eksprimiraju ga samo kancerske ćelije. U nekim aspektima, proteini, npr., proteini koje eksprimiraju kancerske ćelije, koji su mete varijabilnih domena antitela koji formiraju Fc domen sa visokoafinitetnim SIRP-α domenom ili njegovom varijantom uključuju, ali se ne ograničavaju na: 5T4, AGS-16, ALK1, ANG-2, B7-H3, B7-H4, c-fms, c-Met, CA6, CD123, CD19, CD20, CD22, EpCAM, CD30, CD32b, CD33, CD37, CD38, CD40, CD52, CD70, CD74, CD79b, CD98, CEA, CEACAM5, CLDN18.2, CLDN6, CS1, CXCR4, DLL-4, EGFR, EGP-1, ENPP3, EphA3, ETBR, FGFR2, fibronektin, FR-alfa, GCC, GD2, glipikan-3, GPNMB, HER-2, HER3, HLA-DR, ICAM-1, IGF-1R, IL-3R, LIV-1, mezotelin, MUC16, MUC1, NaPi2b, Nektin-4, Notch 2, Notch 1, PD-L1, PD-L2, PDGFR-a, PS, PSMA, SLTRK6, STEAP1, TEM1, VEGFR, CD25, CD27L, DKK-1, ili CSF-1R. U nekim aspektima, varijabilni domen antitela u bispecifičnom konstruktu nije inženjerisan da se vezuje za humani protein.
[0203] U nekim aspektima, svaki od prvog i drugog Fc domenskog monomera u Fc domenu bispecifičnog konstrukta uključuje jednu ili više aminokiselinskih supstitucija koje promovišu heterodimerizaciju prvog i drugog Fc domenskog monomera. Postupci promovisanja heterodimerizacije Fc domenskih monomera opisani su detaljno u nastavku ovog teksta, vidi, npr., strategiju "čvorića u rupici" i strategiju elektrostatičkog upravljanja.
[0204] U nekim aspektima, Fc domen bispecifičnog konstrukta mutiran je tako da mu nedostaju jedna ili više efektorskih funkcija, što je tipično za "mrtvi Fc domen." U nekim aspektima, Fc domen bispecifičnog konstrukta je iz IgG1 antitela i uključuje aminokiselinske supstitucije L14A, L15A, i G17A, u odnosu na sekvencu SEQ ID NO: 161 (Tabela 14) da bi se smanjila interakcija ili vezivanje između Fc domena i Fcγ receptora. U nekim aspektima, Fc domenski monomer je IgG1 antitela i uključuje jednu ili više aminokiselinskih supstitucija L234A, L235A, G237A, i N297A (označeno u skladu sa EU sistemom numerisanja po Kabat et al., 1991). U nekim aspektima, Fc varijante opisane u ovom tekstu su minimalno glikozilovane ili imaju smanjenu glikozilaciju. U nekim aspektima, deglikozilacija je postignuta mutacijom N297A, ili mutiranjem N297 u bilo koju amino-kiselinu koja nije N (označeno u skladu sa EU sistemom numerisanja po Kabat, et al. (1991)). U nekim aspektima, bispecifični konstrukt dizajniran je tako da se preferencijalno vezuje sa proteinima (npr., receptorima kao što su Fc receptori) koje eksprimiraju različiti tipovi ćelija. Studije su pokazale da aminokiselinske supstitucije u regionu šarke, konstantnim domenima (npr., CH2 i CH3 konstantnim domenima), ili šarki i konstantnim domenima antitela mogu efikasno izmeniti vezujuće afinitete antitela prema specifičnim receptorima (npr., Fc receptori) eksprimiranim na različitim tipovima ćelija (npr., regulatorne T-ćelije i efektorske T-ćelije). IgG2 sa aminokiselinskim supstitucijama
2
A111S i P112S (u odnosu na SEQ ID NO: 162, Tabela 14) pokazuju značajno smanjenje vezivanja za FcγRIIIa 131 H u poređenju sa divljim tipom IgG2. U nekim aspektima, Fc varijante u ovom tekstu su minimalno glikozilovane ili imaju smanjenu glikozilaciju. U nekim aspektima, deglikozilacija je postignuta mutacijom N297A, ili mutiranjem N297 u bilo koju amino-kiselinu koja nije N (označeno u skladu sa EU sistemom numerisanja po Kabat, et al. (1991)). U nekim aspektima, bispecifični konstrukt uključuje Fc domen IgG2 ili IgG4 podklase. U nekim aspektima, a bispecifični konstrukt koji uključuje Fc domen IgG2 podklase uključuje aminokiselinske supstitucije A111S i P112S, u odnosu na SEQ ID NO: 162 (Tabela 14). U nekim aspektima, Fc varijanta uključuje sekvencu humanog IgG2 Fc koja uključuje jednu ili više od A330S, P331S i N297A aminokiselinskih supstitucija (označeno u skladu sa EU sistemom numerisanja po Kabat, et al. (1991)).
Tabela 14. Aminokiselinske sekvence IgG
[0205] Primer SIRP-α konstrukta uključuje SIRP-α D1 domen ili njegovu varijantu spojenu sa prvim Fc domenskim monomerom preko linkera i drugi Fc domenski monomer, gde se prvi i drugi Fc domenski monomer kombinuju da formiraju Fc domen prikazan je na SL. 1. U nekim aspektima, protein ili varijabilni domen antitela nisu prikačeni za drugi Fc monomer. U nekim aspektima, SIRP-α konstrukt uključuje SIRP-α D1 domen ili njegovu varijantu spojenu sa prvim Fc domenskim monomerom preko linkera i varijabilni domen antitela spojen sa drugim Fc domenskim monomerom preko linkera, gde se prvi i drugi Fc domenski monomer kombinuju da formiraju Fc domen (kako je prikazano na SL.2). U nekim aspektima, SIRP-α konstrukt uključuje SIRP-α D1 domen ili njegovu varijantu spojenu sa prvim Fc domenskim monomerom preko linkera i terapijski protein (npr., citokin, interleukin, antigen, steroid, antiinflamatorno sredstvo, ili imunomodulatorno sredstvo) spojene sa drugim Fc domenskim monomerom preko linkera, gde se prvi i drugi Fc domenski monomer kombinuju da formiraju Fc domen (kako je prikazano na SL.3). U nekim aspektima, svaki od dva Fc domenska monomera u Fc domenu SIRP-α konstrukta opisanog ranije (npr., SIRP-α konstrukti prikazani na SL. 1-3), uključuju aminokiselinske supstitucije koje promovišu heterodimerizaciju dva monomera. Različite strategije (npr., strategija "čvorić u rupici", strategija elektrostatičkog upravljanja) i aminokiselinske supstitucije Fc domena koje promovišu heterodimerizaciju dva Fc domenska monomera opisani su detaljno u ovom tekstu. Na primer, SL.4A ilustruje SIRP-α konstrukt koji ima SIRP-α D1 domen ili njegovu varijantu spojenu sa Fc domenskim monomerom koji uključuje mutaciju tipa "čvorića", npr., T366W, da bi se ograničilo neželjeno formiranje homodimera "čvorić-čvorić". SL.4B ilustruje SIRP-α konstrukt koji ima SIRP-α D1 domen ili njegovu varijantu spojenu sa Fc domenskim monomerom koji uključuje mutacije tipa "rupice", npr., T366S, L358A, i Y407V. U nekim aspektima, slične strategije heterodimerizacije Fc domena primenjene su na Fc domenima u konstruktima opisanim na SL. 2 i 3. U nekim aspektima, SIRP-α konstrukt uključuje fuzioni protein SIRP-α D1 domena ili njegove varijante spojene sa Fc domenskim monomerom (kako je prikazano na SL.5A). U nekim aspektima, ovaj fuzioni protein formira homodimer (kako je prikazano na SL.5B).
[0206] Fc varijante objave spojene sa fuzionim partnerom poželjno ispoljavaju smanjenje ili izostanak vezivanja za najmanje jedan od Fcγ receptora CD16a, CD32a, CD32b, CD32c, i CD64 u poređenju sa sličnim polipeptidnim konstruktom koji sadrži nativni ili divlji tip (nemutirani) Fc region antitela. U nekim slučajevima, Fc varijanta ili fuzioni partner opisan u ovom tekstu pokazuje smanjenje ili izostanak vezivanja za CD16a, CD32a, CD32b, CD32c, i CD64 Fcγ receptore.
[0207] U nekim aspektima, Fc varijante objave povezane sa fuzionim partnerom ispoljavaju smanjeno vezivanje sa C1q komponentom komplementa i smanjenu CDC u poređenju sa sličnim polipeptidnim konstruktom koji uključuje nativni ili divlji tip (nemutirani) Fc regiona. U nekim slučajevima, Fc varijanta pokazuje najmanje 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili veće smanjenje C1q vezivanja u poređenju sa polipeptidnim konstruktom koji uključuje divlji tip Fc regiona. U nekim slučajevima, Fc varijanta ispoljava smanjenu CDC u poređenju sa polipetidnim konstruktom koji uključuje nativni ili divlji tip (nemutirani) Fc regiona. U nekim aspektima, Fc varijanta ispoljava najmanje 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili veće smanjenje CDC u poređenju sa polipeptidnim konstruktom koji uključuje divlji tip Fc regiona.
VIII. Linkeri
4
[0208] U ovom tekstu objavljeni su, u nekim aspektima, polipeptidi koji uključuju signalregulatorni protein α (SIRP-α) D1 varijantu koja uključuje SIRP-α D1 domen, ili njegov fragment, koji ima aminokiselinsku mutaciju na rezidui 80 u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena; i najmanje jednu dodatnu aminokiselinsku mutaciju u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena na rezidui odabranoj iz grupe koja se sastoji od: rezidue 6, rezidue 27, rezidue 31, rezidue 47, rezidue 53, rezidue 54, rezidue 56, rezidue 66, i rezidue 92.
[0209] Isto tako, u ovom tekstu su objavljeni, u nekim aspektima, polipeptidi koji uključuju Fc varijantu, pri čemu Fc varijanta uključuje Fc domenski dimer koji ima dva Fc domenska monomera, pri čemu se svaki Fc domenski monomer nezavisno bira između (i) humanog IgG1 Fc regiona koji se sastoji od mutacija L234A, L235A, G237A, i N297A; (ii) humanog IgG2 Fc regiona koji se sastoji od mutacija A330S, P331S i N297A; ili (iii) humanog IgG4 Fc regiona koji uključuje mutacije S228P, E233P, F234V, L235A, delG236, i N297A.
[0210] U predmetnoj objavi, linker se koristi da opiše vezu ili spoj između polipeptidnih ili proteinskih domena ili pridruženih neproteinskih komponenti. U nekim aspektima, linker je veza ili spoj između Fc domenskog monomera, albumin-vezujućeg peptida, ili HSA, i visokoafinitetne SIRP-α D1 varijante. U nekim aspektima, linker spaja C-terminus SIRP-α D1 varijante i N-terminus Fc domenskog monomera, albumin-vezujućeg peptida, ili HSA, tako da su dva polipeptida spojena jedan sa drugim u tandemskim nizovima.
[0211] U nekim aspektima, linker je jednostavna kovalentna veza, npr., peptidna veza, sintetski polimer kao polietilen glikolni (PEG) polimer, ili bilo koja vrsta veze nastale hemijskom reakcijom, npr. hemijskom konjugacijom. Kada je linker peptidna veza, u nekim aspektima, karboksilnokiselinska grupa na C-terminusu jednog proteinskog domena reaguje sa amino grupom na N-terminusu drugog proteinskog domena u reakciji kondenzacije da se formira peptidna veza. U nekim aspektima, peptidna veza se formira sintetskim putem konvencionalnom reakcijom organske hemije, ili prirodnom proizvodnjom u ćeliji-domaćinu, pri čemu molekul nukleinske kiseline koji kodira DNK sekvencu oba proteina (npr., Fc domenski monomer i visokoafinitetna SIRP-α D1 varijanta) u tandemskom nizu može biti direktno transkribovan i translatovan u kontinuirani polipeptid koji kodira oba proteina, neophodnim molekulskim mašinerijama (npr., DNK polimeraza i ribozom) u ćeliji-domaćinu.
[0212] Kada je linker predstavljen sintetskim polimerom (npr., PEG polimer), u nekim aspektima, polimer je funkcionalizovan reaktivnim hemijskim funkcionalnim grupama na svakom kraju da bi reagovao sa terminalnim amino-kiselinama na krajevima dva proteina, koji učestvuju u spoju.
[0213] Kada je linker (osim peptidne veze pomenute gore) napravljen hemijskom reakcijom, u nekim aspektima, hemijske funkcionalne grupe (npr., aminska, karboksilnokiselinska, estarska, azidna ili druge funkcionalne grupe), prikačene su sintetski za C-terminus jednog proteina, odnosno N-terminus drugog proteina. U nekim aspektima, dve funkcionalne grupe tada reaguju sintetskom hemijskom reakcijom da se formira hemijska veza, čime se dva proteina spajaju.
Spejseri
[0214] U predmetnoj objavi, u nekim aspektima, linker između Fc domenskog monomera, albumin-vezujućeg peptida, ili HSA, i polipeptida objave je aminokiselinski spejser koji uključuje oko 1-200 amino-kiselina. Pogodni peptidni spejseri uključuju peptidne linkere koji sadrže fleksibilne aminokiselinske rezidue kao što su glicin i serin. Primeri linkerskih sekvenci dati su u Tabeli 15. U nekim aspektima, spejser sadrži motive, npr., višestruke ili ponavljajuće motive GS, GG, GGS, GGG, GGGGS (SEQ ID NO: 163), GGSG (SEQ ID NO: 164), ili SGGG (SEQ ID NO: 165). U nekim aspektima, spejser sadrži 2 do 12 amino-kiselina uključujući motive GS, npr., GS, GSGS (SEQ ID NO: 166), GSGSGS (SEQ ID NO: 167), GSGSGSGS (SEQ ID NO: 168), GSGSGSGSGS (SEQ ID NO: 169), ili GSGSGSGSGSGS (SEQ ID NO: 170). U nekim aspektima, spejser sadrži 3 do 12 amino-kiselina koje uključuju motive GGS, npr., GGS, GGSGGS (SEQ ID NO: 171), GGSGGSGGS (SEQ ID NO: 172), i GGSGGSGGSGGS (SEQ ID NO: 173). U nekim aspektima, spejser sadrži 4 do 12 amino-kiselina koje uključuju motive GGSG (SEQ ID NO: 164), npr., GGSG (SEQ ID NO: 164), GGSGGGSG (SEQ ID NO: 174), ili GGSGGGSGGGSG (SEQ ID NO: 175). U nekim aspektima, spejser sadrži motive GGGGS (SEQ ID NO: 163), npr., GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 176). U nekim aspektima, spejser sadrži amino-kiseline različite od glicina i serina, npr., AAS (SEQ ID NO: 177), AAAL (SEQ ID NO: 178), AAAK (SEQ ID NO: 179), AAAR (SEQ ID NO: 180), EGKSSGSGSESKST (SEQ ID NO: 181), GSAGSAAGSGEF (SEQ ID NO: 182), AEAAAKEAAAKA (SEQ ID NO: 183), KESGSVSSEQLAQFRSLD (SEQ ID NO: 184), GGGGAGGGG (SEQ ID NO: 185), GENLYFQSGG (SEQ ID NO: 186), SACYCELS (SEQ ID NO: 187), RSIAT (SEQ ID NO: 188), RPACKIPNDLKQKVMNH (SEQ ID NO: 189), GGSAGGSGSGSSGGSSGASGTGTAGGTGSGSGTGSG (SEQ ID NO: 190), AAANSSIDLISVPVDSR (SEQ ID NO: 191), ili GGSGGGSEGGGSEGGGSEGGG SEGGGSEGGGSGGGS (SEQ ID NO: 192).
[0215] U nekim aspektima, spejser sadrži motive, npr., višestruke ili ponavljajuće motive EAAAK (SEQ ID NO: 193). U nekim aspektima, spejser sadrži motive, npr., višestruke ili ponavljajuće motive sekvenci bogatih prolinom kao što su (XP)n, gde je X bilo koja aminokiselina (npr., A, K, ili E) i n je iz 1-5, i PAPAP(SEQ ID NO: 194).
Tabela 15. Linkerske sekvence
[0216] U nekim aspektima, dužina peptidnog spejsera i upotrebljenih amino-kiselina podešava se u zavisnosti od dva uključena proteina i željenog stepena fleksibilnosti u finalnom proteinskom fuzionom polipeptidu. U nekim aspektima, dužina spejsera podešena je tako da se osigura ispravno savijanje proteina i izbegne formiranje agregata. U nekim aspektima, spejser kao što je spejser između HSA i polipeptida objavljenog u ovom tekstu, je A ili AAAL (SEQ ID NO: 178).
IX. Vektori, ćelije-domaćini i proizvodnja proteina
[0217] U ovom tekstu objavljeni su, u nekim aspektima, polipeptidi koji uključuju signalregulatorni protein α (SIRP-α) D1 varijantu koja uključuje SIRP-α D1 domen, ili njegov fragment, koji ima aminokiselinsku mutaciju na rezidui 80 u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena; i najmanje jednu dodatnu aminokiselinsku mutaciju u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena na rezidui odabranoj iz grupe koja se sastoji od: rezidue 6, rezidue 27, rezidue 31, rezidue 47, rezidue 53, rezidue 54, rezidue 56, rezidue 66, i rezidue 92.
[0218] Isto tako, u ovom tekstu su objavljeni, u nekim aspektima, polipeptidi koji uključuju Fc varijantu, pri čemu Fc varijanta uključuje Fc domenski dimer koji ima dva Fc domenska monomera, pri čemu se svaki Fc domenski monomer nezavisno bira između (i) humanog IgG1 Fc regiona koji se sastoji od mutacija L234A, L235A, G237A, i N297A; (ii) humanog IgG2 Fc regiona koji se sastoji od mutacija A330S, P331S i N297A; ili (iii) humanog IgG4 Fc regiona koji uključuje mutacije S228P, E233P, F234V, L235A, delG236, i N297A.
[0219] U nekim aspektima, polipeptide objave proizvode ćelije-domaćini. Ćelija-domaćin označava prenosnika koji uključuje neophodne ćelijske komponente, npr., organele, potrebne za ekspresiju polipeptida i fuzionih polipeptida opisanih u ovom tekstu, na osnovu odgovarajućih nukleinskih kiselina. U nekim aspektima, nukleinske kiseline su uključene u vektore nukleinskih kiselina uvedene u ćeliju-domaćina transformacijom, transfekcijom, elektroporacijom, kalcijum-fosfatnom precipitacijom, direktnim mikroinjektiranjem, infekcijom, itd. U nekim aspektima, izbor vektora nukleinske kiseline zavisi od upotrebljene ćelije-domaćina. U nekim aspektima, ćelije-domaćini su ili prokariotskog (npr., bakterije) ili eukariotskog (npr., sisari) porekla.
[0220] U nekim aspektima, polipeptid, na primer polipeptidni konstrukt koji sadrži SIRP-α D1 varijantu (npr., bilo koju varijantu datu u Tabelama 2, 5, i 6) i fuzionog partnera kao što je Fc varijanta, HSA, i albumin-vezujući peptid, proizvode se kultivisanjem ćelijedomaćina transformisane nukleinskom kiselinom, poželjno ekspresionim vektorom, koji sadrži nukleinsku kiselinu kodirajuću za polipeptidni konstrukt (npr., Fc varijanta, linker, i fuzioni partner) pod odgovarajućim uslovima da bi se indukovala ili izazvala ekspresija polipeptidnog konstrukta. U nekim aspektima, uslovi odgovarajući za ekspresiju variraju sa izabranim ekspresionim vektorom i ćelijom-domaćinom. U nekim aspektima, koristi se veliki broj različitih odgovarajućih ćelija-domaćina, uključujući, ali ne ograničavajući se na sisarske ćelije, bakterije, insekatske ćelije i kvasac. Na primer, različite ćelijske linije koje nalaze primenu u predmetnoj objavi opisane su u ATCC<®>katalogu ćelijskih linija, dostupan kod American Type Culture Collection. U nekim aspektima, Fc varijante ove objave eksprimiraju se u ćeliji koja je optimizovana da ne glikoziluje proteine koji se eksprimiraju u toj ćeliji, genetičkim inženjerisanjem ćelijske linije ili modifikacijama uslova ćelijske kulture kao što je dodavanje kifunenzina, ili korišćenjem prirodno neglikozilišućeg domaćina kao što je prokariot (E. coli, itd.), i u nekim slučajevima, modifikacija glikozilacione sekvence u Fc nije potrebna.
Konstruisanje vektora nukleinske kiseline i ćelije-domaćini
[0221] Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira aminokiselinsku sekvencu polipeptida objave može se pripremiti različitim postupcima. Ovi postupci uključuju, ali se ne ograničavaju na oligonukleotidom posredovanu (ili usmerenu) mutagenezu i PCR mutagenezu. U nekim aspektima, molekul nukleinske kiseline koja kodira polipeptid objave dobija se korišćenjem standardnih tehnika, npr., genske sinteze. Alternativno, molekul nukleinske kiseline koja kodira divlji tip SIRP-α D1 domena mutirana je tako da uključi specifične aminokiselinske supstitucije, korišćenjem standardnih tehnika, npr., QuikChange™ mutageneze. U nekim slučajevima, molekuli nukleinske kiseline sintetišu se korišćenjem sintetizera nukleotida ili tehnika PCR.
[0222] U nekim aspektima, nukleinske kiseline koje kodiraju polipeptidni konstrukt, na primer polipeptidni konstrukt koji uključuje SIRP-α D1 varijantu (npr., bilo koju varijantu datu u Tabelama 2, 5, i 6) i fuzionog partnera kao što je Fc varijanta, HSA, i albuminvezujući peptid, inkorporisani su u ekspresioni vektor u cilju ekspresije proteina. Za ekspresiju proteina mogu se koristiti različiti ekspresioni vektori. Ekspresioni vektori mogu uključivati samoreplicirajuće, vanhromozomske vektore ili vektore koji se integrišu u genom domaćina. Vektor može uključivati i različite komponente ili elemente. Na primer, u nekim aspektima, vektorske komponente uključuju, ali se ne ograničavaju na transkripcione i translacione regulatorne sekvence kao što su promotorska sekvenca, mesto vezivanja ribozoma, signalna sekvenca, sekvence početka i zaustavljanja transkripcije, sekvence početka i zaustavljanja translacije, 3' i 5' netranslatujuće regione (untranslated regions, UTR), i enhenserske ili aktivatorske sekvence; mesto početka replikacije; selekcioni markerski gen; i sekvencu nukleinske kiseline koja kodira polipeptid od interesa, i sekvencu završetka transkripcije. U nekim aspektima, ekspresioni vektori uključuju protein operabilno povezan sa kontrolnim ili regulatornim sekvencama, selektabilnim markerima, bilo kojim fuzionim partnerima, dodatnim elementima, ili bilo kojom njihovom kombinacijom. Izraz "operabilno povezan" znači da se nukleinska kiselina nalazi u funkcionalnom odnosu sa drugom sekvencom nukleinske kiseline. Generalno, ovi ekspresioni vektori uključuju transkripcionu i translacionu regulatornu nukleinsku kiselinu operabilno povezanu sa nukleinskom kiselinom koja kodira Fc varijantu, i tipično odgovaraju ćeliji-domaćinu koja se koristi za ekspresiju proteina. Selekcioni gen ili marker, kao što je, bez ograničavanja, gen za rezistenciju na antibiotike ili gen za fluorescentni protein, može se koristiti za selekciju ćelije-domaćina koja sadrži ekspresioni vektor, na primer ekspresijom antibiotika ili fluorescencije. Na raspolaganju su različiti selekcioni geni.
[0223] U nekim aspektima, komponente ili elementi vektora optimizovani su tako da su ekspresioni vektori kompatibilni sa tipom ćelije-domaćina. Ekspresioni vektori koji nalaze primenu u predmetnoj objavi uključuju, ali se ne ograničavaju na one koji omogućavaju ekspresiju proteina u sisarskim ćelijama, bakterijama, insekatskim ćelijama, kvascu, i u sistemima in vitro.
[0224] U nekim aspektima, ćelije sisara koriste se kao ćelije-domaćini za proizvodnju polipeptida objave. Primeri tipova ćelija sisara uključuju, ali se ne ograničavaju na ćelije
1
bubrega humanog embriona (human embryonic kidney, HEK) (npr., HEK293, HEK 293F), ćelije ovarijuma kineskog hrčka (Chinese hamster ovary, CHO), HeLa, COS, PC3, Vero, MC3T3, NS0, Sp2/0, VERY, BHK, MDCK, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT20, T47D, NS0 (ćelijska linija mišjeg mijeloma koja endogeno ne proizvodi imunoglobulinske lance), CRL7O3O, i HsS78Bst ćelije. U nekim aspektima, ćelije E. coli koriste se kao ćelijedomaćini za proizvodnju polipeptida objave. Primeri sojeva E. coli uključuju, ali se ne ograničavaju na E. coli 294 (ATCC<®>31,446), E. coli λ 1776 (ATCC<®>31,537, E. coli BL21 (DE3) (ATCC<®>BAA-1025), i E. coli RV308 (ATCC<®>31,608).
[0225] Različite ćelije-domaćini imaju karakteristike i specifične mehanizme za posttranslaciono obrađivanje i modifikovanje proteinskih proizvoda (npr., glikozilacija). U nekim aspektima, odgovarajuće ćelijske linije ili sistemi domaćina biraju se da osiguraju ispravnu modifikaciju i obradu eksprimiranog polipeptida. Kada se vektori uvedu u ćelijedomaćine za proizvodnju proteina, ćelije-domaćini se kultivišu u konvencionalnom hranljivom medijumu modifikovanom na odgovarajući način za indukovanje promotora, selektovanje transformanata, ili amplifikovanje gena koji kodiraju željene sekvence.
[0226] U nekim aspektima, polipeptidni konstrukt, na primer polipeptidni konstrukt koji uključuje SIRP-α D1 varijantu (npr., bilo koju varijantu datu u Tabelama 2, 5, i 6) i fuzionog partnera kao što je Fc varijanta, HSA, i albumin-vezujući peptid, eksprimiraju se u sisarskim ekspresionim sistemima, uključujući sisteme u koje su ekspresioni konstrukti uvedeni u sisarske ćelije korišćenjem virusa kao što su retrovirus ili adenovirus. U nekim aspektima, koriste se ćelije čoveka, miša, pacova, hrčka ili primata. Pogodne ćelije uključuju i poznate ćelije za istraživanja, uključujući, ali ne ograničavajući se na Jurkat T ćelije, NIH3T3, CHO, COS, i 293 ćelije. Alternativno, u nekim aspektima, proteini se eksprimiraju u bakterijskim ćelijama. Bakterijski ekspresioni sistemi dobro su poznati u struci i uključuju Escherichia coli (E. coli), Bacillus subtilis, Streptococcus cremoris, i Streptococcus lividans. U nekim slučajevima, polipeptidni konstrukti koji uključuju Fc varijante proizvode se u insekatskim ćelijama kao što su, bez ograničavanja, Sf9 i Sf21 ćelije ili ćelije kvasca kao što su, bez ograničavanja, ćelije organizama iz rodova Saccharomyces, Pichia, Kluyveromyces, Hansenula i Yarrowia. U nekim slučajevima, polipeptidni konstrukti koji uključuju Fc varijante eksprimiraju se in vitro korišćenjem translacionih sistema koji ne sadrže ćelije. Na raspolaganju su in vitro translacioni sistemi poreklom iz prokariotskih (npr., E. coli) i eukariotskih (npr., pšenične klice, retikulociti zeca) ćelija i, u nekim aspektima, biraju se na osnovu nivoa ekspresije i funkcionalnih osobina proteina od interesa. Na primer, kako razumeju stručnjaci u oblasti, in vitro translacija je potrebna za neke tehnologije prikazivanja, na primer prikazivanje na
1 1
ribozomima. Pored toga, u nekim aspektima, Fc varijante se proizvode postupcima hemijske sinteze kao što su, bez ograničavanja, sinteza peptida u tečnoj fazi i sinteza peptida u čvrstoj fazi. U slučaju in vitro transkripcije koja koristi neglikozilišući sistem kao što je bakterijski ekstrakt, Fc se neće glikozilovati čak ni u prisustvu prirodnog mesta glikozilacije i prema tome inaktivacija Fc biće ekvivalentno dobijena.
[0227] U nekim aspektima, polipeptidni konstrukt uključuje neprirodne amino-kiseline, aminokiselinske analoge, aminokiselinske mimetike, ili bilo koju njihovu kombinaciju koja funkcioniše na način sličan prirodnim amino-kiselinama. Prirodno kodirane amino-kiseline generalno se odnosi na 20 uobičajenih amino-kiselina (alanin, arginin, asparagin, asparaginska kiselina, cistein, glutamin, glutaminska kiselina, glicin, histidin, izoleucin, leucin, lizin, metionin, fenilalanin, prolin, serin, treonin, triptofan, tirozin, i valin) i pirolizin i selenocistein. Aminokiselinski analozi označavaju jedinjenja koja imaju istu osnovnu hemijsku strukturu kao prirodne amino-kiseline, npr., ugljenik koji je vezan za vodonik, karboksilnu grupu, amino grupu i R grupu, na primer homoserin, norleucin, metionin sulfoksid, metionin metil sulfonijum. U nekim aspektima, ti analozi imaju modifikovane R grupe (na primer, norleucin) ili modifikovanu peptidnu osovinu, ali generalno zadržavaju istu osnovnu hemijsku strukturu kao prirodne amino-kiseline.
Proizvodnja, oporavak i prečišćavanje proteina
[0228] U nekim aspektima, ćelije-domaćini upotrebljene za proizvodnju polipeptida objave rastu u medijumu pogodnom za kultivisanje odabranih ćelija-domaćina. Primeri medijuma pogodnih za sisarske ćelije-domaćine uključuju minimalni esencijalni medijum (minimal essential medium, MEM), Eagleov medijum modifikovan po Dulbecou (Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM), Expi293<™>ekspresioni medijum, DMEM suplementisan fetalnim goveđim serumom (fetal bovine serum, FBS), i RPMI-1640. Primeri pogodnih medijuma za bakterijske ćelije-domaćine uključuju Luria bujon (Luria broth, LB) sa neophodnim suplementima, kao što je selekciono sredstvo, npr., ampicilin. U nekim aspektima, ćelije-domaćini se kultivišu na pogodnim temperaturama, na primer od oko 20 °C do oko 39 °C, npr., od oko 25 °C do oko 37 °C, poželjno 37 °C, i nivoima CO2, na primer oko 5% do 10%. U nekim aspektima, pH medijuma je od oko pH 6.8 do pH 7.4, npr., pH 7.0, zavisno uglavnom od organizma-domaćina. Ako se inducibilni promotor koristi u ekspresionom vektoru, ekspresija proteina može da se indukuje pod uslovima pogodnim za aktivaciju promotora.
[0229] U nekim aspektima, oporavljanje proteina uključuje narušavanje integriteta ćelijedomaćina, na primer osmotskim šokom, sonifikacijom ili lizom. Kada se ćelije razore,
1 2
ćelijski detritus se ukloni centrifugiranjem ili filtriranjem. Proteini mogu zatim dodatno da se prečišćavaju. U nekim aspektima, polipeptid objave prečišćava se različitim postupcima prečišćavanja proteina, na primer, hromatografijom (npr., jonoizmenjivačkom hromatografijom, afinitetnom hromatografijom, i hromatografijom zasnovanom na veličini čestica), centrifugiranjem, diferencijalnim rastvaranjem, ili nekom drugom standardnom tehnikom za prečišćavanje proteina. Na primer, u nekim aspektima, protein se izoluje i prečišćava pogodnim selektovanjem i kombinovanjem afinitetnih kolona na primer Protein A kolone (npr., POROS Protein A hromatografija) sa hromatografskim kolonama (npr., POROS HS-50 katjonska razmenjivačka hromatografija), procedurama filtracije, ultrafiltracije, desalinizacije i dijalize. U nekim aspektima, polipeptid se konjuguje sa markerskim sekvencama, kao što je peptid, da bi se olakšalo prečišćavanje. Primer markerske aminokiselinske sekvence je heksahistidinski peptid (His6-oznaka), koji može da se veže za niklom funkcionalizovanu agaroznu afinitetnu kolonu sa mikromolarnim afinitetom. Kao alternativa, može se koristiti hemaglutininska "HA" oznaka, koja odgovara epitopu izvedenom iz hemaglutininskog proteina influence.
[0230] U nekim aspektima, polipeptidi objave, na primer polipeptidni konstrukt koji uključuje SIRP-α D1 varijantu (npr., bilo koju varijantu datu u Tabelama 2, 5, i 6) i fuzionog partnera kao što je Fc varijanta, HSA, i albumin-vezujući peptid, proizvode se u ćelijama subjekta (npr., čoveka), npr., u kontekstu genske terapije, primenom vektora kao što je virusni vektor (npr., retrovirusni vektor, adenovirusni vektor, poksvirusni vektor (npr., vakcinija-virusni vektor, kao Ankara-modifikovani vakcinija virus (modified vaccinia ankara, MVA)), adeno-udruženi virusni vektor, i alfavirusni vektor) koji sadrži molekul nukleinske kiseline koji kodira polipeptid objave. Vektor, kada uđe u ćeliju subjekta (npr., transformacijom, transfekcijom, elektroporacijom, kalcijum-fosfatnom precipitacijom, direktnim mikroinjektiranjem, infekcijom, itd.) može se upotrebiti za ekspresiju polipeptida objavljenog u ovom tekstu. U nekim slučajevima, polipeptid se sekretuje iz ćelije. U nekim aspektima, ako je željeni ishod izlečenje bolesti ili poremećaja, nije potrebno dodatno delovanje. U nekim aspektima, ako je poželjno sakupljanje proteina, krv se sakuplja od subjekta i protein prečišćava iz krvi različitim postupcima.
X. Farmaceutske kompozicije i preparati
[0231] U ovom tekstu, u nekim aspektima, objavljeni su polipeptidi koji uključuju signalregulatorni protein α (SIRP-α) D1 varijantu koja uključuje SIRP-α D1 domen, ili njegov fragment, koji ima aminokiselinsku mutaciju na rezidui 80 u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena; i najmanje jednu dodatnu aminokiselinsku mutaciju u odnosu na divlji tip
1
SIRP-α D1 domena na rezidui odabranoj iz grupe koja se sastoji od: rezidue 6, rezidue 27, rezidue 31, rezidue 47, rezidue 53, rezidue 54, rezidue 56, rezidue 66, i rezidue 92.
[0232] Isto tako, u ovom tekstu su objavljeni, u nekim aspektima, polipeptidi koji uključuju Fc varijantu, pri čemu Fc varijanta uključuje Fc domenski dimer koji ima dva Fc domenska monomera, pri čemu se svaki Fc domenski monomer nezavisno bira između (i) humanog IgG1 Fc regiona koji se sastoji od mutacija L234A, L235A, G237A, i N297A; (ii) humanog IgG2 Fc regiona koji se sastoji od mutacija A330S, P331S i N297A; ili (iii) humanog IgG4 Fc regiona koji uključuje mutacije S228P, E233P, F234V, L235A, delG236, i N297A.
[0233] Objava sadrži farmaceutske kompozicije koje uključuju polipeptide opisane u ovom tekstu, kao što su polipeptidi koji imaju visokoafinitetnu SIRP-α D1 varijantu. U nekim aspektima, farmaceutska kompozicija objave uključuje polipeptid objave kao terapijski protein. U nekim aspektima, farmaceutska kompozicija objave, koja uključuje polipeptid opisan u ovom tekstu koristi se u kombinaciji sa drugim sredstvima ili kompozicijama (npr., terapijskim sredstvima, biološkim sredstvima, malim molekulima ili bilo kojom njihovom kombinacijom) u lečenju. U nekim aspektima, jedno ili više dodatnih terapijski aktivnih sredstava, kao na primer mali molekul, hemijsko jedinjenje ili biološko jedinjenje kao što su polinukleotidi i polipeptidi uključujući, ali ne ograničavajući se na siRNA, kratke polipeptide i antitela sa terapijskom aktivnošću, opciono se formulišu u farmaceutske kompozicije polipeptida opisanih u ovom tekstu. U nekim aspektima, formulacije polipeptidnih konstrukata opisanih u ovom tekstu pripremaju se za skladištenje mešanjem polipeptidnog konstrukta opisanog u ovom tekstu koji ima željeni stepen čistoće sa opcionim, farmaceutski prihvatljivim nosačima, ekscipijentima ili stabilizerima u obliku liofilizovanih formulacija ili vodenih rastvora. U nekim aspektima, farmaceutska kompozicija objave uključuje molekul nukleinske kiseline (DNK ili RNK, npr., iRNK) koja kodira polipeptid objave, ili vektor koji sadrži takav molekul nukleinske kiseline.
[0234] Prihvatljivi nosači, ekscipijenti ili stabilizeri u farmaceutskoj kompoziciji su poželjno netoksični za primaoca u primenjenim dozama i koncentracijama. U nekim aspektima, prihvatljivi nosači, ekscipijenti i stabilizeri uključuju pufere kao što su fosfatni, citratni, HEPES, TAE, i drugih organskih kiselina; antioksidante kao što su askorbinska kiselina i metionin; prezervanse (npr., heksametonijum hlorid; oktadecildimetilbenzil amonijum hlorid; benzalkonijum hlorid, benzetonijum hlorid; fenol, butil orbenzil alkohol; alkil parabeni kao metil ili propil paraben; katehol; rezorcinol; cikloheksanol; 3-pentanol; i mkrezol); polipeptide male molekulske težine (npr., manje od oko 10 rezidua); proteine kao što su humani serumski albumin, želatin, dekstran, i imunoglobulini; hidrofilne polimere
1 4
kao što su polivinilpirolidon; amino-kiseline kao što su glicin, glutamin, histidin, i lizin; monosaharide, disaharide, i druge ugljene hidrate kao što su glukoza, manoza, saharoza, i sorbitol; helirajuća sredstva kao što je EDTA, šećere kao saharoza, manitol, trehaloza ili sorbitol; zaslađivače i druga sredstva za poboljšavanje ukusa; potporne supstance kao mikrokristalna celuloza, laktoza, kukuruzni i drugi skrobovi; vezujuća sredstva; aditive; sredstva za bojenje; kontrajone koji formiraju soli kao što je natrijum; metalne komplekse (npr., Zn-protein kompleksi); nejonske surfaktante kao što su TWEEN™, PLURONICS,™ i polietilen glikol (PEG); ili bilo koju njihovu kombinaciju.
[0235] U nekim aspektima, farmaceutske kompozicije koje uključuju polipeptide opisane u ovom tekstu su u obliku rastvorljivom u vodi, na primer prisutni u vidu farmaceutski prihvatljivih soli, što treba da uključi i kisele i bazne adicione soli. Izraz "farmaceutski prihvatljive kisele adicione soli" odnosi se na one soli koje zadržavaju biološku efikasnost slobodnih baza i koje nisu na drugi način nepoželjne, formirane sa neorganskim kiselinama kao što su hlorovodonična kiselina, bromovodonična kiselina, sumporna kiselina, azotna kiselina, fosforna kiselina i slično i organskim kiselinama kao što su sirćetna kiselina, propionska kiselina, glikolna kiselina, piruvinska kiselina, oksalna kiselina, maleinska kiselina, malonska kiselina, sukcinska kiselina, fumarna kiselina, tartarna kiselina, limunska kiselina, benzoeva kiselina, cinaminska kiselina, mandelična kiselina, metansulfonska kiselina, etansulfonska kiselina, p-toluensulfonska kiselina, salicilna kiselina i slično. Izraz "farmaceutski prihvatljive bazne adicione soli" uključuje one koje su izvedene iz neorganskih baza, kao što su soli natrijuma, kalijuma, litijuma, amonijuma, kalcijuma, magnezijuma, gvožđa, cinka, bakra, mangana, aluminijuma i slično. Posebno su poželjne amonijumove, kalijumove, natrijumove, kalcijumove i magnezijumove soli. Soli izvedene iz farmaceutski prihvatljivih organskih netoksičnih baza uključuju soli primarnih, sekundarnih i tercijarnih amina, supstituisanih amina uključujući prirodne supstituisane amine, ciklične amine i bazne jonoizmenjivačke smole, kao što su izopropilamin, trimetilamin, dietilamin, trietilamin, tripropilamin, i etanolamin. Formulacije koje će se koristiti za in vivo primenu su poželjno sterilne. Ovo može da se obavi filtracijom kroz sterilne filtracione membrane ili drugim postupcima.
[0236] U nekim aspektima, farmaceutske kompozicije objave primenjuju se parenteralno u vidu injektabilnih formulacija. U nekim aspektima farmaceutske kompozicije za injekciju formulišu se korišćenjem sterilnog rastvora ili bilo koje farmaceutski prihvatljive tečnosti kao prenosnika. Farmaceutski prihvatljivi prenosnici uključuju, ali se ne ograničavaju na sterilnu vodu, fiziološki slani rastvor i ćelijski kultivacioni medijum (npr., Eagleov medijum
1
modifikovan po Dulbeccou (DMEM), α-modifikovani Eagleov medijum (a-MEM), i F-12 medijum). Na raspolaganju su različiti postupci formulisanja.
[0237] U nekim aspektima, polipeptidi opisani u ovom tekstu formulisani su kao imunolipozomi. Lipozom je mala vezikula koja sadrži različite tipove lipida, fosfolipida ili surfaktanata, koje su korisne za dostavljanje terapijskog sredstva sisaru. Lipozomi koji sadrže antitelo ili Fc fuziju mogu se pripremiti različitim postupcima poznatim u struci. U nekim aspektima, komponente lipozoma aranžirane su u dvoslojnu formaciju, slično aranžmanu lipida u biološkim membranama. U nekim aspektima, lipozomi se stvaraju postupkom reverzno-fazne evaporacije sa lipidnom kompozicijom koja sadrži fosfatidiliholin, holesterol i PEG-derivatizovani fosfatidiletanolamin (PEG-PE). U nekim aspektima, lipozomi se ekstrudiraju kroz filtere definisane veličine pora da se dobiju lipozomi željenog dijametra. U nekim aspektima, hemioterapijsko sredstvo ili drugo terapijski efikasno sredstvo opciono je sadržano u lipozomu.
[0238] U nekim aspektima, polipeptidni konstrukti opisani u ovom tekstu i druga terapijski aktivna sredstva zatvorena su u mikrokapsulama pripremljenim postupcima koji uključuju, ali se ne ograničavaju na tehnike koacervacije, interfacijalne polimerizacije (na primer korišćenjem hidroksimetilceluloznih ili želatinskih mikrokapsula, ili poli-(metilmetacilat) mikrokapsula), koloidnih sistema za dostavu leka (na primer, lipozomi, albuminske mikrosfere, mikroemulzije, nanočestice i nanokapsule), i makroemulzija.
[0239] U nekim aspektima, pripremaju se preparati sa produženim oslobađanjem. Pogodni primeri preparata sa produženim oslobađanjem uključuju semipermeabilne matrikse čvrstog hidrofobnog polimera, matriksi su u formi uobličenih artikala, npr., filma, ili mikrokapsula. Primeri matriksa sa produženim oslobađanjem uključuju poliestre, hidrogelove (na primer poli(2-hidroksietilmetakrilat), ili poli(vinilalkohol)), polilaktide, kopolimere L-glutaminske kiseline i gama etil-L-glutamata, nedegradabilni etilen-vinil acetat, degradabilne kopolimere mlečne kiseline-glikolne kiseline kao što je LUPRON DEPOT™ (što su injektabilne mikrosfere sačinjene od kopolimera mlečne kiseline-glikolne kiseline i leuprolid acetata), poli-D-(-)-3-hidroksibuternu kiselinu i, ProLease® (komercijalno se nabavlja od Alkermes), što je dostavni sistem baziran na mikrosferama sačinjen od željenog bioaktivnog molekula inkorporisanog u matriks poli-DL-laktida-koglikolida (poly-DL-lactide-co-glycolide, PLG). Neke formulacije sa produženim oslobađanjem omogućavaju oslobađanje molekula tokom nekoliko meseci, npr., jedan do šest meseci, dok druge formulacije oslobađaju farmaceutske kompozicije objave tokom kraćih perioda vremena, npr., danima do nedeljama.
1
[0240] U nekim aspektima, koncentracija polipeptida opisanog u ovom tekstu u farmaceutskoj formulaciji varira od oko 0.1 do 100 težinskih %. U nekim slučajevima, koncentracija polipeptida opisanog u ovom tekstu u rasponu je od 0.003 do 1.0 mola. U nekim slučajevima, koncentracija polipeptida u farmaceutskoj formulaciji varira od oko 5 mg/mL do oko 50 mg/mL (npr., od oko 10 mg/mL do oko 40 mg/mL ili od oko 20 mg/mL do oko 30 mg/mL). U nekim aspektima, u cilju lečenja pacijenta, primenjuje se terapijski efikasna doza polipeptida opisanog u ovom tekstu. Izraz "terapijski efikasna doza" odnosi se na dozu koja proizvodi efekte zbog kojih se primenjuje. Tačna doza zavisiće od svrhe tretmana. U nekim aspektima, dozni opseg je od 0.01 do 100 mg/kg telesne težine ili više, na primer 0.1, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ili 50 mg/kg telesne težine. U nekim aspektima, neophodna su podešavanja za degradaciju polipeptidnog konstrukta, sistemsku u odnosu na lokalnu dostavu, i stopu sinteze nove proteaze, kao i u vezi sa starošću, telesnom težinom, opštim stanjem zdravlja, polom, načinom ishrane, vremenom primene, interakcije sa drugim lekom i jačinom stanja.
[0241] U nekim aspektima, kompozicije i formulacije opisane u ovom tekstu primenjuju se kod subjekta kojem je to potrebno. U nekim aspektima, takva primena izvodi se in vivo. U nekim aspektima, takva primena izvodi se ex vivo. U nekim aspektima, primena farmaceutske kompozicije koja uključuje polipeptid opisan u ovom tekstu, vrši se na različite načine, uključujući, ali ne ograničavajući se na oralni, supkutani, intravenski, intranazalni, intraotički, transdermalni, površinski (npr., gelovi, melemi, losioni, kremovi, itd.), intraperitonealni, intramuskularni, intrapulmonalni (npr., AERx<®>inhalabilna tehnologija koja se komercijalno može nabaviti od Aradigm, ili Inhance™ plućni dostavni sistem komercijalno se može nabaviti od Inhale Therapeutics), vaginalni, parenteralni, rektalni, ili intraokularni. U nekim aspektima, farmaceutska kompozicija se formuliše u zavisnosti od načina uvođenja.
[0242] U nekim aspektima, farmaceutska kompozicija za gensku terapiju je u prihvatljivom razblaživaču, ili uključuje matriks sa sporim oslobađanjem u kojem se nalazi prenosnik za dostavu gena. U nekim aspektima, vektori upotrebljeni kao in vivo prenosnici za dostavu gena uključuju, ali se ne ograničavaju na retrovirusne vektore, adenovirusne vektore, poksvirusne vektore (npr., vakcinija-virusni vektori, kao Ankara-modifikovani vakcinija virus, adeno-udruženi virusni vektori, i alfavirusni vektori.
XI. Putevi, doziranje i primena
[0243] U ovom tekstu, u nekim aspektima, objavljeni su polipeptidi koji uključuju signalregulatorni protein α (SIRP-α) D1 varijantu koja uključuje SIRP-α D1 domen, ili njegov
1
fragment, koji ima aminokiselinsku mutaciju na rezidui 80 u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena; i najmanje jednu dodatnu aminokiselinsku mutaciju u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena na rezidui odabranoj iz grupe koja se sastoji od: rezidue 6, rezidue 27, rezidue 31, rezidue 47, rezidue 53, rezidue 54, rezidue 56, rezidue 66, i rezidue 92.
[0244] Isto tako, u ovom tekstu su objavljeni, u nekim aspektima, polipeptidi koji uključuju Fc varijantu, pri čemu Fc varijanta uključuje Fc domenski dimer koji ima dva Fc domenska monomera, pri čemu se svaki Fc domenski monomer nezavisno bira između (i) humanog IgG1 Fc regiona koji se sastoji od mutacija L234A, L235A, G237A, i N297A; (ii) humanog IgG2 Fc regiona koji se sastoji od mutacija A330S, P331S i N297A; ili (iii) humanog IgG4 Fc regiona koji uključuje mutacije S228P, E233P, F234V, L235A, delG236, i N297A.
[0245] U nekim aspektima, farmaceutske kompozicije koje uključuju polipeptide objave kao terapijske proteine formulisane su za, npr., intravensku primenu, parenteralnu primenu, supkutanu primenu, intramuskularnu primenu, intraarterijsku primenu, intratekalnu primenu, ili intraperitonealnu primenu. U nekim aspektima, farmaceutska kompozicija je formulisana ili se primenjuje oralnim, nazalnim, putem spreja, aerosola, rektalnim, ili vaginalnim putem. Za injektabilne formulacije, na raspolaganju se različiti efikasni farmaceutski prenosnici.
[0246] U nekim aspektima, farmaceutska kompozicija koja uključuje molekul nukleinske kiseline koja kodira polipeptid objave ili vektor koji sadrži takav molekul nukleinske kiseline primenjuje se genskom dostavom. Na raspolaganju su različiti postupci dostave gena. U nekim aspektima, vektori upotrebljeni za in vivo dostavu i ekspresiju gena uključuju, ali se ne ograničavaju na retrovirusne vektore, adenovirusne vektore, poksvirusne vektore (npr., vakcinija-virusni vektori, kao Ankara-modifikovani vakcinija virus), adeno-udruženi virusni vektori, i alfavirusni vektori. U nekim aspektima, molekuli iRNK koji kodiraju polipeptide objave primenjuju se kod subjekta direktno.
[0247] Doza farmaceutske kompozicije objave zavisi od faktora koji uključuju put primene, oboljenje koje treba lečiti, i fizičke karakteristike, npr., starost, telesnu težinu, opšte stanje zdravlja subjekta. U nekim aspektima, količina polipeptida objave sadržana u jednoj dozi je količina koja efikasno sprečava, odlaže ili leči bolest ne indukujući značajnu toksičnost. U nekim aspektima, farmaceutska kompozicija objave uključuje dozu polipeptida objave u rasponu od 0.01 do 500 mg/kg (npr., 0.01, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, ili 500 mg/kg) i, u specifičnijem aspektu, oko 0.1 do oko 50 mg/kg, u specifičnijem aspektu, oko 1 do oko 30 mg/kg. U nekim aspektima, dozu prilagođava lekar u skladu sa obimom bolesti i različitim parametrima subjekta.
1
[0248] U nekim aspektima, toksičnost terapijskih sredstava i polipeptida opisanih u ovom tekstu određuje se standardnim farmaceutskim procedurama u ćelijskim kulturama ili eksperimentalnim životinjama, npr., određivanjem LD50 (doza letalna za 50% populacije) ili LD100 (doza letalna za 100% populacije). U nekim aspektima, podaci dobijeni ovim testovima na ćelijskim kulturama i studijama na životinjama koriste se za formulisanje doznog opsega koji nije toksičan za upotrebu kod ljudi. Doziranje proteina opisanih u ovom tekstu prevashodno je u rasponu cirkulišućih koncentracija koje uključuju efikasnu dozu sa malo toksičnosti ili bez toksičnosti. U nekim aspektima, doza varira unutar tog opsega u zavisnosti od korišćene dozne forme i puta primene. U nekim aspektima, tačnu formulaciju, put primene i dozu bira pojedinačni lekar prema pacijentovom stanju.
[0249] U nekim aspektima, farmaceutske kompozicije se primenjuju na način kompatibilan sa doziranjem formulacije i u količini koja je terapijski efikasna da rezultuje poboljšanjem ili remedijacijom simptoma bolesti ili poremećaja. U nekim aspektima, farmaceutske kompozicije se primenjuju u različitim doznim formama, npr., intravenske dozne forme, supkutane dozne forme, i oralne dozne forme (npr., ingestibilni rastvori, kapsule za oslobađanje leka). Generalno, terapijski proteini se doziraju u količini 0.1-100 mg/kg, npr., 1-50 mg/kg. U nekim aspektima, farmaceutske kompozicije koje uključuju polipeptid objave primenjuju se kod subjekta kojem je to potrebno, na primer, jednom ili više puta (npr., 1-10 puta ili više) dnevno, nedeljno, mesečno, dva puta godišnje, jednom godišnje, ili kako je medicinski potrebno. Doziranje se može obezbediti u vidu pojedinačnog ili višestrukog režima doziranja. U nekim aspektima, vreme između primena se smanjuje sa poboljšanjem medicinskog stanja ili povećava sa pogoršanjem zdravlja pacijenta.
XII. Postupci lečenja
[0250] U ovom tekstu, u nekim aspektima, objavljeni su polipeptidi koji uključuju signalregulatorni protein α (SIRP-α) D1 varijantu koja uključuje SIRP-α D1 domen, ili njegov fragment, koji ima aminokiselinsku mutaciju na rezidui 80 u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena; i najmanje jednu dodatnu aminokiselinsku mutaciju u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena na rezidui odabranoj iz grupe koja se sastoji od: rezidue 6, rezidue 27, rezidue 31, rezidue 47, rezidue 53, rezidue 54, rezidue 56, rezidue 66, i rezidue 92.
[0251] Isto tako, u ovom tekstu su objavljeni, u nekim aspektima, polipeptidi koji uključuju Fc varijantu, pri čemu Fc varijanta uključuje Fc domenski dimer koji ima dva Fc domenska monomera, pri čemu se svaki Fc domenski monomer nezavisno bira između (i) humanog IgG1 Fc regiona koji se sastoji od mutacija L234A, L235A, G237A, i N297A; (ii) humanog
1
IgG2 Fc regiona koji se sastoji od mutacija A330S, P331S i N297A; ili (iii) humanog IgG4 Fc regiona koji uključuje mutacije S228P, E233P, F234V, L235A, delG236, i N297A.
[0252] Pored toga, u ovom tekstu, u nekim aspektima, objavljeni su postupci lečenja koji uključuju primenu polipeptida koji uključuju signal-regulatorni protein α (SIRP-α) D1 varijantu koja uključuje SIRP-α D1 domen, ili njegov fragment, koji ima aminokiselinsku mutaciju na rezidui 80 u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena; i najmanje jednu dodatnu aminokiselinsku mutaciju u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena na rezidui odabranoj iz grupe koja se sastoji od: rezidue 6, rezidue 27, rezidue 31, rezidue 47, rezidue 53, rezidue 54, rezidue 56, rezidue 66, i rezidue 92.
[0253] U nekim aspektima, objava obezbeđuje farmaceutske kompozicije i postupke lečenja koji se koriste za lečenje pacijenata koji pate od oboljenja i poremećaja udruženih sa SIRP-α ili CD47 aktivnošću, kao što su kanceri i imunska oboljenja (npr., autoimunske bolesti i zapaljenske bolesti). U nekim aspektima, polipeptidi opisani u ovom tekstu primenjuju se kod subjekta u postupku povećanja fagocitoze ciljne ćelije (npr., kancerske ćelije) kod subjekta. U nekim aspektima, polipeptidi se primenjuju kod subjekta u postupku ubijanja kancerskih ćelija kod subjekta. U nekim aspektima, polipeptidi se primenjuju kod subjekta u postupku eliminisanja regulatornih T-ćelija kod subjekta. U nekim aspektima, polipeptidi opisani u ovom tekstu primenjuju se kod subjekta u postupku povećanja kalemljenja matičnih ćelija hematopoeze kod subjekta, pri čemu postupak uključuje modulisanje interakcije između SIRP-α i CD47 kod subjekta. U nekim aspektima, polipeptidi opisani u ovom tekstu primenjuju se kod subjekta u postupku menjanja imunskog odgovora (npr., supresije imunskog odgovora) kod subjekta. U nekim aspektima, gore navedeni postupci povezani su sa drugim postupcima lečenja bolesti. U nekim aspektima, u ovom tekstu objavljene su kombinacije polipeptida (npr., SIRP-α D1 varijanta) i drugog terapijskog sredstva. U nekim aspektima, kombinacija uključuje polipeptid (npr., SIRP-α D1 varijanta) i drugo terapijsko sredstvo, pri čemu je drugo terapijsko sredstvo antitelo. U nekim aspektima, kombinacija uključuje SIRP-α D1 varijantu koja uključuje SIRP-α D1 domen, ili njegov fragment, koji ima aminokiselinsku mutaciju na rezidui 80 u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena; i najmanje jednu dodatnu aminokiselinsku mutaciju u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena na rezidui odabranoj iz grupe koja se sastoji od: rezidue 6, rezidue 27, rezidue 31, rezidue 47, rezidue 53, rezidue 54, rezidue 56, rezidue 66, i rezidue 92; i antitelo. U nekim aspektima, kombinacija uključuje polipeptid koji ima sekvencu prema bilo kojoj od SEQ ID NO: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137, ili 152-159; i antitelo.
11
[0254] U nekim aspektima, gore pomenuti postupci koriste se sa strategijama lečenja bolesti gde je primena polipeptida terapijska opcija. Neograničavajući primeri gore pomenutog uključuju upotrebu antitela ili proteinskog fragmenta. Na primer, u nekim aspektima, antitelo ili proteinski fragment primenjuje se u kombinaciji sa Fc varijantnim polipeptidima objavljenim u ovom tekstu. U nekim aspektima, polipeptidni konstrukti objavljeni u ovom tekstu koriste se za poboljšanje fagocitoze drugih agenasa.
[0255] Postupci lečenja uključuju primenu kod subjekta koji ima bolest (npr., kancer) (i) polipeptida koji uključuje SIRP-α D1 varijantu i opciono (ii) antitela. U nekim aspektima, pre lečenja bolesti (npr., kancera) kod subjekta, određuje se aminokiselinska sekvenca(-e) SIRP-α kod subjekta, na primer, iz svaka dva alela koja kodiraju SIRP-α gen. U ovom postupku lečenja, prvo se određuje aminokiselinska sekvenca(-e) SIRP-α polipeptida u biološkom uzorku subjekta. Kod subjekta se zatim primenjuje terapijski efikasna količina polipeptida objave. U nekim aspektima, primenjena visokoafinitetna SIRP-α D1 varijanta ima istu aminokiselinsku sekvencu kao što je sekvenca SIRP-α polipeptida u biološkom uzorku subjekta, osim uvođenja aminokiselinskih izmena koje povećavaju afinitet SIRP-α polipeptida za CD47. Posle primene polipeptida, visokoafinitetna SIRP-α D1 varijanta u polipeptidu poželjno ima minimalnu imunogenost u subjektu.
[0256] U nekim aspektima, antitelo se primenjuje kao dodatak polipeptidima objavljenim u ovom tekstu. U nekim aspektima, antitelo se primenjuje uporedo sa polipeptidom. U nekim aspektima, antitelo se primenjuje istovremeno, na primer u farmaceutskoj kompoziciji koja sadrži i polipeptid i antitelo. Alternativno, antitelo se primenjuje pre ili posle primene polipeptida. U nekim aspektima, polipeptid i antitelo primenjuju se suštinski istovremeno (npr., unutar jedne nedelje, 6, 5, 4, 3, 2, 1 dana, 12, 6, 3, 2, 1 sata, jedno u odnosu na drugo, ili suštinski istovremeno), što je praćeno primenom samo antitela. U nekim aspektima, antitelo se primenjuje prvo, što je praćeno primenom polipeptida i antitela istovremeno (tj., unutar jedne nedelje, 6, 5, 4, 3, 2, 1 dana, 12, 6, 3, 2, 1 sata, jedno u odnosu na drugo, ili suštinski istovremeno).
[0257] Antitelo koje se primenjuje istovremeno ili je obezbeđeno u kompoziciji ili postupku objavljenom u ovom tekstu, označava antitelo koje cilja ćeliju kao što je kancerska ćelija ili ćelija imunskog sistema kao što je T-ćelija (npr., regulatorna T-ćelija). Antitelo može biti predstavljeno bilo kojim izotipom imunoglobulinskog antitela, npr., IgG, IgE, IgM, IgA, ili IgD. U nekim aspektima, antitelo je humano antitelo IgG1 izotipa. U nekim aspektima, antitelo je humano antitelo IgG2 izotipa. U nekim aspektima, antitelo je humano antitelo IgG4 izotipa.
[0258] Izraz "antitelo" u ovom tekstu koristi se u najširem smislu i obuhvata antitela različitih struktura, uključujući, ali ne ograničavajući se na monoklonska antitela, poliklonska antitela, multispecifična antitela (npr., bispecifična antitela), fragmente antitela, i proteine slične antitelima, ukoliko ispoljavaju željenu aktivnost. "Fragmenti antitela " uključuju deo intaktnog antitela, poželjno antigen-vezujući ili varijabilni region intaktnog antitela. Primeri fragmenata antitela uključuju Fab, Fab', F(ab')2, i Fv fragmente, dijatela, linearna antitela, jednolančane molekule antitela, i multispecifična antitela. Monoklonsko antitelo označava antitelo dobijeno iz populacije suštinski homogenih antitela, npr., pojedinačnih antitela u populaciji sa istom primarnom sekvencom osim mogućih prirodnih mutacija koje mogu biti prisutne u veoma malom broju. Monoklonska antitela mogu biti visokospecifična i usmerena protiv jednog antigenskog mesta (npr., epitopa na kancerskom antigenu). Nasuprot preparatima poliklonskog antitela koji tipično sadrže različita antitela usmerena prema različitim epitopima, svako monoklonsko antitelo je generalno usmereno protiv jednoga epitopa na antigenu. Modifikator "monoklonsko" ukazuje na karakter antitela kao dobijenog iz suštinski homogene populacije antitela, i ne treba ga shvatiti kao da zahteva da antitelo bude proizvedeno nekim posebnim postupkom. U nekim aspektima, antitelo u kompoziciji predmetne objave izaziva ćelijsku fagocitozu zavisnu od antitela (antibody-dependent cellular phagocytosis, ADCP) ili ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC). Neograničavajući primeri oboljenja koja se leče korišćenjem takvih strategija uključuju kancere kao što su hematološki kanceri, na primer leukemije (npr., akutna mijeloidna leukemija); imunski poremećaji (npr., za pojačanje subjektovog ometenog ili smanjenog imunskog odgovora ili alternativno za ograničavanje subjektovog preterano aktivnog imunskog odgovora); i infekcija patogenima.
[0259] U nekim aspektima, postupci objavljeni u ovom tekstu uključuju primenu polipeptida opisanog u ovom tekstu (npr., SIRP-α D1 varijante) i antitela koje cilja kancerski antigen. U nekim aspektima, kancerski antigen ciljan antitelom ili proteinom sličnim antitelu predstavljen je izloženim peptidima poreklom od unutarćelijskih antigena udruženih sa tumorom (tumor-associated antigens, TAA) u kompleksu sa molekulima humanog leukocitnog antigena (human leukocyte antigen, HLA) klase I na površini (poznati i kao MHC/peptidni kompleks). Neograničavajući primeri takvih kancerskih antigena, npr. peptida u kompleksu sa HLA molekulima izloženim na površini kancerskih ćelija, koje cilja antitelo ili protein sličan antitelu u kompoziciji objave uključuju: NY-ESO-1/LAGE1, SSX-2, MAGE familiju (MAGE-A3), gp100/pmel17, Melan-A/MART-1, gp75/TRP1, tirozinazu, TRP2, CEA, PSA, TAG-72, nezreli lamininski receptor, MOK/RAGE-1, WT-1, Her2/neu, EphA3, SAP-1, BING-4, Ep-CAM, MUC1, PRAME, survivin, mezotelin, BRCA1/2 (mutirani), CDK4, CML66, MART-2, p53 (mutirani), Ras (mutirani), β-katenin (mutirani), TGF-βRII (mutirani), HPV E6, E7. Primeri takvih antitela uključuju ESK1 (WT-1), RL1B (Her2-E75), Pr20 (PRAME), i 3.2G1 (hCGβ).
[0260] U nekim aspektima, postupci objavljeni u ovom tekstu uključuju primenu polipeptida koji uključuje SIRP-α D1 varijantu koja uključuje SIRP-α D1 domen, ili njegov fragment, koji ima aminokiselinsku mutaciju na rezidui 80 u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena; i najmanje jednu dodatnu aminokiselinsku mutaciju u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena na rezidui odabranoj iz grupe koja se sastoji od: rezidue 6, rezidue 27, rezidue 31, rezidue 47, rezidue 53, rezidue 54, rezidue 56, rezidue 66, i rezidue 92; i antitela koje cilja kancerski antigen. U nekim aspektima, postupci objavljeni u ovom tekstu uključuju primenu polipeptida koji uključuje SIRP-α D1 varijantu koja uključuje SIRP-α D1 domen, ili njegov fragment, koji ima aminokiselinsku mutaciju na rezidui 80 u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena; i najmanje jednu dodatnu aminokiselinsku mutaciju u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena na rezidui odabranoj iz grupe koja se sastoji od: rezidue 6, rezidue 27, rezidue 31, rezidue 47, rezidue 53, rezidue 54, rezidue 56, rezidue 66, i rezidue 92; i antitela koje cilja NY-ESO-1/LAGE1, SSX-2, MAGE familiju (MAGE-A3), gp100/pmel17, Melan-A/MART-1, gp75/TRP1, tirozinazu, TRP2, CEA, PSA, TAG-72, nezreli lamininski receptor, MOK/RAGE-1, WT-1, Her2/neu, EphA3, SAP-1, BING-4, Ep-CAM, MUC1, PRAME, survivin, mezotelin, BRCA1/2 (mutirani), CDK4, CML66, MART-2, p53 (mutirani), Ras (mutirani), β-katenin (mutirani), TGF-βRII (mutirani), HPV E6, E7. U nekim aspektima, postupci objavljeni u ovom tekstu uključuju primenu polipeptida koji uključuje SIRP-α D1 varijantu koja uključuje SIRP-α D1 domen, ili njegov fragment, koji ima aminokiselinsku mutaciju na rezidui 80 u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena; i najmanje jednu dodatnu aminokiselinsku mutaciju u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena na rezidui odabranoj iz grupe koja se sastoji od: rezidue 6, rezidue 27, rezidue 31, rezidue 47, rezidue 53, rezidue 54, rezidue 56, rezidue 66, i rezidue 92; i antitela pri čemu je antitelo ESK1 (WT-1), RL1B (Her2-E75), Pr20 (PRAME), i 3.2G1 (hCGβ).
[0261] U nekim aspektima, postupci objavljeni u ovom tekstu uključuju primenu polipeptida koji ima sekvencu prema SEQ ID NO: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137, ili 152-159. i antitela koje cilja kancerski antigen. U nekim aspektima, postupci objavljeni u ovom tekstu uključuju primenu polipeptida koji ima sekvencu prema bilo kojoj od sekvenci SEQ ID NO: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137, ili 152-159; i antitela koje cilja NY-ESO-1/LAGE1, SSX-2, MAGE familiju (MAGE-A3), gp100/pmel17, Melan-A/MART-1, gp75/TRP1, tirozinazu, TRP2, CEA, PSA, TAG-72, nezreli lamininski
11
receptor, MOK/RAGE-1, WT-1, Her2/neu, EphA3, SAP-1, BING-4, Ep-CAM, MUC1, PRAME, survivin, mezotelin, BRCA1/2 (mutirani), CDK4, CML66, MART-2, p53 (mutirani), Ras (mutirani), β-katenin (mutirani), TGF-βRII (mutirani), HPV E6, E7. U nekim aspektima, postupci objavljeni u ovom tekstu uključuju primenu polipeptida koji ima sekvencu prema bilo kojoj od sekvenci SEQ ID NO: SEQ ID NO: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137, ili 152-159; i antitela, pri čemu je antitelo ESK1 (WT-1), RL1B (Her2-E75), Pr20 (PRAME), i 3.2G1 (hCGβ).
[0262] U nekim aspektima, antitelo cilja kancerske ćelije, na primer, vezivanjem za proteine eksprimirane kancerskim ćelijama. Neki proteini se u kancerskim ćelijama eksprimiraju u višim nivoima nego u nekancerskim ćelijama. Na primer, kancerski antigen je protein koji se eksprimira preferencijalno u kancerskim ćelijama (npr., eksprimira se u višem nivou u kancerskim ćelijama nego u nekancerskim ćelijama) i u nekim slučajevima eksprimiraju ga samo kancerske ćelije. Neograničavajući primeri proteina, npr., proteina koje eksprimiraju kancerske ćelije, koji su ciljani antitelima u kompoziciji objave uključuju: 4-1BB, 5T4, AGS-16, ALK1, ANG-2, B7-H3, B7-H4, c-fms, c-Met, CA6, CCR4, CD123, CD19, CD20, CD22, CD27, EpCAM, CD30, CD32b, CD33, CD37, CD38, CD40, CD52, CD70, CD74, CD79b, CD98, CEA, CEACAM5, CLDN18.2, CLDN6, CS1, CTLA-4, CXCR4, DLL-4, EGFR, EGP-1, ENPP3, EphA3, ETBR, FGFR2, fibronektin, FR-alfa, Frizzled receptor, GCC, GD2, glipikan-3, GPNMB, HER-2, HER3, HLA-DR, ICAM-1, IGF-1 R, IL-3R, LAG-3, LIV-1, mezotelin, MUC16, MUC1, NaPi2b, Nektin-4, Notch 2, Notch 1, OX40, PD-1, PD-L1, PD-L2, PDGFR-α, PS, PSMA, SLTRK6, STEAP1, TEM1, VEGFR, CD25, CD27L, DKK-1, CSF-1 R, ili bilo koju njihovu kombinaciju. U nekim aspektima, polipeptidi opisani u ovom tekstu primenjuju se u kombinaciji sa inhibitorom kontrolne tačke, kao što je antitelo koje inhibira CTLA-4 (npr., ipilimumab, tremelimumab), PD-1 (npr., nivolumab, Pidilizumab, MK3475 poznat i kao pembrolizumab, BMS936559, i MPDL3280A), i LAG-3 (npr., BMS986016).
[0263] U nekim aspektima, postupci objavljeni u ovom tekstu uključuju primenu polipeptida koji uključuje SIRP-α D1 varijantu koja sadrži SIRP-α D1 domen, ili njegov fragment, koji ima aminokiselinsku mutaciju na rezidui 80 u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena; i najmanje jednu dodatnu aminokiselinsku mutaciju u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena na rezidui odabranoj iz grupe koja se sastoji od: rezidue 6, rezidue 27, rezidue 31, rezidue 47, rezidue 53, rezidue 54, rezidue 56, rezidue 66, i rezidue 92; i antitela koje cilja protein koji eksprimira kancerska ćelija. U nekim aspektima, postupci objavljeni u ovom tekstu uključuju primenu polipeptida koji uključuje SIRP-α D1 varijantu koja sadrži SIRP-α D1 domen, ili njegov fragment, koji ima aminokiselinsku mutaciju na rezidui 80 u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena; i najmanje jednu dodatnu aminokiselinsku mutaciju u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena na rezidui odabranoj iz grupe koja se sastoji od: rezidue 6, rezidue 27, rezidue 31, rezidue 47, rezidue 53, rezidue 54, rezidue 56, rezidue 66, i rezidue 92; i antitela koje cilja 4-1BB, 5T4, AGS-16, ALK1, ANG-2, B7-H3, B7-H4, c-fms, c-Met, CA6, CCR4, CD123, CD19, CD20, CD22, CD27, EpCAM, CD30, CD32b, CD33, CD37, CD38, CD40, CD52, CD70, CD74, CD79b, CD98, CEA, CEACAM5, CLDN18.2, CLDN6, CS1, CTLA-4, CXCR4, DLL-4, EGFR, EGP-1, ENPP3, EphA3, ETBR, FGFR2, fibronektin, FR-alfa, Frizzled receptor, GCC, GD2, glipikan-3, GPNMB, HER-2, HER3, HLA-DR, ICAM-1, IGF-1 R, IL-3R, LIV-1, mezotelin, MUC16, MUC1, NaPi2b, Nektin-4, Notch 2, Notch 1, OX40, PD-1, PD-L1, PD-L2, PDGFR-α, PS, PSMA, SLTRK6, STEAP1, TEM1, VEGFR, CD25, CD27L, DKK-1, CSF-1 R, ili bilo koju njihovu kombinaciju. U nekim aspektima, postupci objavljeni u ovom tekstu uključuju primenu polipeptida koji uključuje SIRP-α D1 varijantu koja sadrži SIRP-α D1 domen, ili njegov fragment, koji ima aminokiselinsku mutaciju na rezidui 80 u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena; i najmanje jednu dodatnu aminokiselinsku mutaciju u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena na rezidui odabranoj iz grupe koja se sastoji od: rezidue 6, rezidue 27, rezidue 31, rezidue 47, rezidue 53, rezidue 54, rezidue 56, rezidue 66, i rezidue 92; i antitela, pri čemu je antitelo inhibitor CTLA-4 (npr., ipilimumab, tremelimumab), PD-1 (npr., nivolumab, Pidilizumab, MK3475 poznat i kao pembrolizumab, BMS936559, i MPDL3280A), ili LAG-3 (npr., BMS986016).
[0264] U nekim aspektima, postupci objavljeni u ovom tekstu uključuju primenu polipeptida koji ima sekvencu prema bilo kojoj od SEQ ID NO: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137, ili 152-159; i antitela koje cilja protein koji eksprimira kancerska ćelija. U nekim aspektima, postupci objavljeni u ovom tekstu uključuju primenu polipeptida koji ima sekvencu prema bilo kojoj od SEQ ID NO: SEQ ID NO: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137, ili 152-159; i antitela koje cilja 4-1BB, 5T4, AGS-16, ALK1, ANG-2, B7-H3, B7-H4, c-fms, c-Met, CA6, CCR4, CD123, CD19, CD20, CD22, CD27, EpCAM, CD30, CD32b, CD33, CD37, CD38, CD40, CD52, CD70, CD74, CD79b, CD98, CEA, CEACAM5, CLDN18.2, CLDN6, CS1, CTLA-4, CXCR4, DLL-4, EGFR, EGP-1, ENPP3, EphA3, ETBR, FGFR2, fibronektin, FR-alfa, Frizzled receptor, GCC, GD2, glipikan-3, GPNMB, HER-2, HER3, HLA-DR, ICAM-1, IGF-1 R, IL-3R, LAG-3, LIV-1, mezotelin, MUC16, MUC1, NaPi2b, Nectin-4, Notch 2, Notch 1, OX40, PD-1, PD-L1, PD-L2, PDGFR-α, PS, PSMA, SLTRK6, STEAP1, TEM1, VEGFR, CD25, CD27L, DKK-1, CSF-1 R, ili bilo koju njihovu kombinaciju. U nekim aspektima, postupci objavljeni u ovom tekstu uključuju primenu polipeptida koji ima sekvencu prema bilo kojoj od SEQ ID NO:
11
SEQ ID NO: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137, ili 152-159; i antitela, pri čemu je antitelo inhibitor CTLA-4 (npr., ipilimumab, tremelimumab), PD-1 (npr., nivolumab, pidilizumab, MK3475 poznat i kao pembrolizumab, BMS936559, i MPDL3280A), ili LAG-3 (npr., BMS986016).
[0265] U nekim aspektima, postupci objavljeni u ovom tekstu uključuju primenu polipeptida opisanog u ovom tekstu (npr., SIRP-α D1 varijanta) i imunoonkološkog antitela. U nekim aspektima, antitela koja se koriste u kompozicijama objave uključuju, ali se ne ograničavaju na: cetuksimab, necitumumab, pembrolizumab, nivolumab, pidilizumab, MEDI0680, MED16469, atezolizumab, avelumab, durvalumab, MEDI6383, RG7888, ipilimumab, tremelimumab, urelumab, PF-05082566, enoblituzumab, vantiktumab, varlilumab, mogamalizumab, SAR650984, daratumumab, trastuzumab, trastuzumab emtanzin, pertuzumab, elotuzumab, rituksimab, ofatumumab, obinutuzumab, RG7155, FPA008, panitumumab, brentuksimab vedotin, MSB0010718C, belimumab, bevacizumab, denosumab, panitumumab, ramucirumab, necitumumab, nivolumab, pembrolizumab, avelumab, atezolizumab, durvalumab, MEDI0680, pidilizumab, ili BMS-93659, anti-HER2 antitelo, anti-CD20 antitelo, anti-CD19 antitelo, anti-CS1 antitelo, anti-CD38 antitelo, anti-EGFR antitelo, anti-PD1 antitelo, anti-RANKL antitelo, anti-OKS40 antitelo, anti-PD-1 antitelo, anti-PD-L1 antitelo, anti-CD274 antitelo, anti-CTLA-4 antitelo, anti-CD137 antitelo, anti-4-1BB antitelo, anti-B7-H3 antitelo, anti-FZD7 antitelo, anti-CD27 antitelo, anti-CCR4 antitelo, anti-CD38 antitelo, anti-CSFIR antitelo, anti-CSF antitelo, anti-CD30 antitelo, anti-BAFF antitelo, anti-VEGF antitelo, ili anti-VEGFR2 antitelo. U nekim aspektima, postupci objavljeni u ovom tekstu uključuju primenu polipeptida koji uključuje SIRP-α D1 varijantu koja sadrži SIRP-α D1 domen, ili njegov fragment, koji ima aminokiselinsku mutaciju na rezidui 80 u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena; i najmanje jednu dodatnu aminokiselinsku mutaciju u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena na rezidui odabranoj iz grupe koja se sastoji od: rezidue 6, rezidue 27, rezidue 31, rezidue 47, rezidue 53, rezidue 54, rezidue 56, rezidue 66, i rezidue 92; i antitela, gde je antitelo, anti-HER2 antitelo, anti-CD20 antitelo, anti-CD 19 antitelo, anti-CS1 antitelo, anti-CD38 antitelo, anti-EGFR antitelo, anti-PD1 antitelo, anti-RANKL antitelo, anti-OKS40 antitelo, anti-PD-1 antitelo, anti-PD-L1 antitelo, anti-CD274 antitelo, anti-CTLA-4 antitelo, anti-CD137 antitelo, anti-4-1BB antitelo, anti-B7-H3 antitelo, anti-FZD7 antitelo, anti-CD27 antitelo, anti-CCR4 antitelo, anti-CD38 antitelo, anti-CSF1R antitelo, anti-CSF antitelo, anti-CD30 antitelo, anti-BAFF antitelo, anti-VEGF antitelo, ili anti-VEGFR2 antitelo. U nekim aspektima, postupci objavljeni u ovom tekstu uključuju primenu polipeptida koji uključuje SIRP-α D1 varijantu koja sadrži SIRP-α D1 domen, ili
11
njegov fragment, koji ima aminokiselinsku mutaciju na rezidui 80 u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena; i najmanje jednu dodatnu aminokiselinsku mutaciju u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena na rezidui odabranoj iz grupe koja se sastoji od: rezidue 6, rezidue 27, rezidue 31, rezidue 47, rezidue 53, rezidue 54, rezidue 56, rezidue 66, i rezidue 92; i antitela, gde je antitelo cetuksimab, necitumumab, pembrolizumab, nivolumab, pidilizumab, MEDI0680, MED16469, atezolizumab, avelumab, durvalumab, MEDI6383, RG7888, ipilimumab, tremelimumab, urelumab, PF-05082566, enoblituzumab, vantiktumab, varlilumab, mogamalizumab, SAR650984, daratumumab, trastuzumab, trastuzumab emtanzin, pertuzumab, elotuzumab, rituksimab, ofatumumab, obinutuzumab, RG7155, FPA008, panitumumab, brentuksimab vedotin, MSB0010718C, belimumab, bevacizumab, denosumab, panitumumab, ramucirumab, necitumumab, nivolumab, pembrolizumab, avelumab, atezolizumab, durvalumab, MEDI0680, pidilizumab, ili BMS-93659.
[0266] U nekim aspektima, postupci objavljeni u ovom tekstu uključuju primenu polipeptida koji uključuje SIRP-α D1 varijantu koja sadrži SIRP-α D1 domen, ili njegov fragment, koji ima aminokiselinsku mutaciju na rezidui 80 u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena; i najmanje jednu dodatnu aminokiselinsku mutaciju u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena na rezidui odabranoj iz grupe koja se sastoji od: rezidue 6, rezidue 27, rezidue 31, rezidue 47, rezidue 53, rezidue 54, rezidue 56, rezidue 66, i rezidue 92; i antitela gde je antitelo trastuzumab.
[0267] U nekim aspektima, postupci objavljeni u ovom tekstu uključuju primenu polipeptida koji uključuje SIRP-α D1 varijantu koja sadrži SIRP-α D1 domen, ili njegov fragment, koji ima aminokiselinsku mutaciju na rezidui 80 u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena; i najmanje jednu dodatnu aminokiselinsku mutaciju u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena na rezidui odabranoj iz grupe koja se sastoji od: rezidue 6, rezidue 27, rezidue 31, rezidue 47, rezidue 53, rezidue 54, rezidue 56, rezidue 66, i rezidue 92; i antitela, gde je antitelo rituksimab.
[0268] U nekim aspektima, postupci objavljeni u ovom tekstu uključuju primenu polipeptida koji uključuje SIRP-α D1 varijantu koja sadrži SIRP-α D1 domen, ili njegov fragment, koji ima aminokiselinsku mutaciju na rezidui 80 u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena; i najmanje jednu dodatnu aminokiselinsku mutaciju u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena na rezidui odabranoj iz grupe koja se sastoji od: rezidue 6, rezidue 27, rezidue 31, rezidue 47, rezidue 53, rezidue 54, rezidue 56, rezidue 66, i rezidue 92; i antitela, gde je antitelo cetuksimab.
11
[0269] U nekim aspektima, postupci objavljeni u ovom tekstu uključuju primenu polipeptida koji uključuje SIRP-α D1 varijantu koja sadrži SIRP-α D1 domen, ili njegov fragment, koji ima aminokiselinsku mutaciju na rezidui 80 u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena; i najmanje jednu dodatnu aminokiselinsku mutaciju u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena na rezidui odabranoj iz grupe koja se sastoji od: rezidue 6, rezidue 27, rezidue 31, rezidue 47, rezidue 53, rezidue 54, rezidue 56, rezidue 66, i rezidue 92; i antitela, gde je antitelo daratumumab.
[0270] U nekim aspektima, postupci objavljeni u ovom tekstu uključuju primenu polipeptida koji uključuje SIRP-α D1 varijantu koja sadrži SIRP-α D1 domen, ili njegov fragment, koji ima aminokiselinsku mutaciju na rezidui 80 u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena; i najmanje jednu dodatnu aminokiselinsku mutaciju u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena na rezidui odabranoj iz grupe koja se sastoji od: rezidue 6, rezidue 27, rezidue 31, rezidue 47, rezidue 53, rezidue 54, rezidue 56, rezidue 66, i rezidue 92; i antitela, gde je antitelo belimumab.
[0271] U nekim aspektima, postupci objavljeni u ovom tekstu uključuju primenu polipeptida koji uključuje SIRP-α D1 varijantu koja sadrži SIRP-α D1 domen, ili njegov fragment, koji ima aminokiselinsku mutaciju na rezidui 80 u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena; i najmanje jednu dodatnu aminokiselinsku mutaciju u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena na rezidui odabranoj iz grupe koja se sastoji od: rezidue 6, rezidue 27, rezidue 31, rezidue 47, rezidue 53, rezidue 54, rezidue 56, rezidue 66, i rezidue 92; i antitela, gde je antitelo bevacizumab.
[0272] U nekim aspektima, postupci objavljeni u ovom tekstu uključuju primenu polipeptida koji uključuje SIRP-α D1 varijantu koja sadrži SIRP-α D1 domen, ili njegov fragment, koji ima aminokiselinsku mutaciju na rezidui 80 u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena; i najmanje jednu dodatnu aminokiselinsku mutaciju u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena na rezidui odabranoj iz grupe koja se sastoji od: rezidue 6, rezidue 27, rezidue 31, rezidue 47, rezidue 53, rezidue 54, rezidue 56, rezidue 66, i rezidue 92; i antitela, gde je antitelo denosumab.
[0273] U nekim aspektima, postupci objavljeni u ovom tekstu uključuju primenu polipeptida koji uključuje SIRP-α D1 varijantu koja sadrži SIRP-α D1 domen, ili njegov fragment, koji ima aminokiselinsku mutaciju na rezidui 80 u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena; i najmanje jednu dodatnu aminokiselinsku mutaciju u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena na rezidui odabranoj iz grupe koja se sastoji od: rezidue 6, rezidue 27, rezidue 31, rezidue 47, rezidue 53, rezidue 54, rezidue 56, rezidue 66, i rezidue 92; i antitela, gde je antitelo pantimumab.
11
[0274] U nekim aspektima, postupci objavljeni u ovom tekstu uključuju primenu polipeptida koji uključuje SIRP-α D1 varijantu koja sadrži SIRP-α D1 domen, ili njegov fragment, koji ima aminokiselinsku mutaciju na rezidui 80 u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena; i najmanje jednu dodatnu aminokiselinsku mutaciju u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena na rezidui odabranoj iz grupe koja se sastoji od: rezidue 6, rezidue 27, rezidue 31, rezidue 47, rezidue 53, rezidue 54, rezidue 56, rezidue 66, i rezidue 92; i antitela, gde je antitelo ramucirumab.
[0275] U nekim aspektima, postupci objavljeni u ovom tekstu uključuju primenu polipeptida koji uključuje SIRP-α D1 varijantu koja sadrži SIRP-α D1 domen, ili njegov fragment, koji ima aminokiselinsku mutaciju na rezidui 80 u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena; i najmanje jednu dodatnu aminokiselinsku mutaciju u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena na rezidui odabranoj iz grupe koja se sastoji od: rezidue 6, rezidue 27, rezidue 31, rezidue 47, rezidue 53, rezidue 54, rezidue 56, rezidue 66, i rezidue 92; i antitela, gde je antitelo necitumumab.
[0276] U nekim aspektima, postupci objavljeni u ovom tekstu uključuju primenu polipeptida koji uključuje SIRP-α D1 varijantu koja sadrži SIRP-α D1 domen, ili njegov fragment, koji ima aminokiselinsku mutaciju na rezidui 80 u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena; i najmanje jednu dodatnu aminokiselinsku mutaciju u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena na rezidui odabranoj iz grupe koja se sastoji od: rezidue 6, rezidue 27, rezidue 31, rezidue 47, rezidue 53, rezidue 54, rezidue 56, rezidue 66, i rezidue 92; i antitela, gde je antitelo nivolumab.
[0277] U nekim aspektima, postupci objavljeni u ovom tekstu uključuju primenu polipeptida koji uključuje SIRP-α D1 varijantu koja sadrži SIRP-α D1 domen, ili njegov fragment, koji ima aminokiselinsku mutaciju na rezidui 80 u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena; i najmanje jednu dodatnu aminokiselinsku mutaciju u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena na rezidui odabranoj iz grupe koja se sastoji od: rezidue 6, rezidue 27, rezidue 31, rezidue 47, rezidue 53, rezidue 54, rezidue 56, rezidue 66, i rezidue 92; i antitela, gde je antitelo pembrolizumab.
[0278] U nekim aspektima, postupci objavljeni u ovom tekstu uključuju primenu polipeptida koji uključuje SIRP-α D1 varijantu koja sadrži SIRP-α D1 domen, ili njegov fragment, koji ima aminokiselinsku mutaciju na rezidui 80 u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena; i najmanje jednu dodatnu aminokiselinsku mutaciju u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena na rezidui odabranoj iz grupe koja se sastoji od: rezidue 6, rezidue 27, rezidue 31, rezidue 47, rezidue 53, rezidue 54, rezidue 56, rezidue 66, i rezidue 92; i antitela, gde je antitelo avelumab.
11
[0279] U nekim aspektima, postupci objavljeni u ovom tekstu uključuju primenu polipeptida koji uključuje SIRP-α D1 varijantu koja sadrži SIRP-α D1 domen, ili njegov fragment, koji ima aminokiselinsku mutaciju na rezidui 80 u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena; i najmanje jednu dodatnu aminokiselinsku mutaciju u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena na rezidui odabranoj iz grupe koja se sastoji od: rezidue 6, rezidue 27, rezidue 31, rezidue 47, rezidue 53, rezidue 54, rezidue 56, rezidue 66, i rezidue 92; i antitela, gde je antitelo atezolizumab.
[0280] U nekim aspektima, postupci objavljeni u ovom tekstu uključuju primenu polipeptida koji uključuje SIRP-α D1 varijantu koja sadrži SIRP-α D1 domen, ili njegov fragment, koji ima aminokiselinsku mutaciju na rezidui 80 u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena; i najmanje jednu dodatnu aminokiselinsku mutaciju u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena na rezidui odabranoj iz grupe koja se sastoji od: rezidue 6, rezidue 27, rezidue 31, rezidue 47, rezidue 53, rezidue 54, rezidue 56, rezidue 66, i rezidue 92; i antitela, gde je antitelo durvalumab.
[0281] U nekim aspektima, postupci objavljeni u ovom tekstu uključuju primenu polipeptida koji uključuje SIRP-α D1 varijantu koja sadrži SIRP-α D1 domen, ili njegov fragment, koji ima aminokiselinsku mutaciju na rezidui 80 u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena; i najmanje jednu dodatnu aminokiselinsku mutaciju u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena na rezidui odabranoj iz grupe koja se sastoji od: rezidue 6, rezidue 27, rezidue 31, rezidue 47, rezidue 53, rezidue 54, rezidue 56, rezidue 66, i rezidue 92; i antitela, gde je antitelo MEDI0680.
[0282] U nekim aspektima, postupci objavljeni u ovom tekstu uključuju primenu polipeptida koji uključuje SIRP-α D1 varijantu koja sadrži SIRP-α D1 domen, ili njegov fragment, koji ima aminokiselinsku mutaciju na rezidui 80 u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena; i najmanje jednu dodatnu aminokiselinsku mutaciju u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena na rezidui odabranoj iz grupe koja se sastoji od: rezidue 6, rezidue 27, rezidue 31, rezidue 47, rezidue 53, rezidue 54, rezidue 56, rezidue 66, i rezidue 92; i antitela, gde je antitelo pidilizumab.
[0283] U nekim aspektima, postupci objavljeni u ovom tekstu uključuju primenu polipeptida koji uključuje SIRP-α D1 varijantu koja sadrži SIRP-α D1 domen, ili njegov fragment, koji ima aminokiselinsku mutaciju na rezidui 80 u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena; i najmanje jednu dodatnu aminokiselinsku mutaciju u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena na rezidui odabranoj iz grupe koja se sastoji od: rezidue 6, rezidue 27, rezidue 31, rezidue 47, rezidue 53, rezidue 54, rezidue 56, rezidue 66, i rezidue 92; i antitela, gde je antitelo BMS-93659.
12
[0284] U nekim aspektima, postupci objavljeni u ovom tekstu uključuju primenu polipeptida koji ima sekvencu prema bilo kojoj od SEQ ID NO: SEQ ID NO: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137, ili 152-159; i antitela, gde je antitelo anti-HER2 antitelo, anti-CD20 antitelo, anti-CD19 antitelo, anti-CS1 antitelo, anti-CD38 antitelo, anti-EGFR antitelo, anti-PD1 antitelo, anti-RANKL antitelo, anti-OX40 antitelo, anti-PD-1 antitelo, anti-PD-L1 antitelo, anti-CD274 antitelo, anti-CTLA-4 antitelo, anti-CD137 antitelo, anti-4-1BB antitelo, anti-B7-H3 antitelo, anti-FZD7 antitelo, anti-CD27 antitelo, anti-CCR4 antitelo, anti-CD38 antitelo, anti-CSFIR antitelo, anti-CSF antitelo, anti-CD30 antitelo, anti-BAFF antitelo, anti-VEGF antitelo, ili anti-VEGFR2 antitelo. U nekim aspektima, postupci objavljeni u ovom tekstu uključuju primenu polipeptida koji ima sekvencu prema SEQ ID NO: SEQ ID NO: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137, ili 152-159; i antitela, gde je antitelo cetuksimab, necitumumab, pembrolizumab, nivolumab, pidilizumab, MEDI0680, MED16469, atezolizumab, avelumab, durvalumab, MEDI6383, RG7888, ipilimumab, tremelimumab, urelumab, PF-05082566, enoblituzumab, vantiktumab, varlilumab, mogamalizumab, SAR650984, daratumumab, trastuzumab, trastuzumab emtanzin, pertuzumab, elotuzumab, rituksimab, ofatumumab, obinutuzumab, RG7155, FPA008, panitumumab, brentuksimab vedotin, MSB0010718C, belimumab, bevacizumab, denosumab, panitumumab, ramucirumab, necitumumab, nivolumab, pembrolizumab, avelumab, atezolizumab, durvalumab, MEDI0680, pidilizumab, ili BMS-93659.
[0285] U nekim aspektima, postupci objavljeni u ovom tekstu uključuju primenu polipeptida koji ima sekvencu prema bilo kojoj od SEQ ID NO: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137, ili 152-159; i antitela, gde je antitelo trastuzumab.
[0286] U nekim aspektima, postupci objavljeni u ovom tekstu uključuju primenu polipeptida koji ima sekvencu prema bilo kojoj od SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137, ili 152-159; i antitela, gde je antitelo rituksimab.
[0287] U nekim aspektima, postupci objavljeni u ovom tekstu uključuju primenu polipeptida koji ima sekvencu prema bilo kojoj od SEQ ID NO: SEQ ID NO: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137, ili 152-159; i antitela, gde je antitelo daratumumab.
[0289] U nekim aspektima, postupci objavljeni u ovom tekstu uključuju primenu polipeptida koji ima sekvencu prema bilo kojoj od SEQ ID NO: SEQ ID NO: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137, ili 152-159; i antitela, gde je antitelo belimumab.
[0290] U nekim aspektima, postupci objavljeni u ovom tekstu uključuju primenu polipeptida koji ima sekvencu prema bilo kojoj od SEQ ID NO: SEQ ID NO: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137, ili 152-159; i antitela, gde je antitelo bevacizumab.
[0291] U nekim aspektima, postupci objavljeni u ovom tekstu uključuju primenu polipeptida koji ima sekvencu prema bilo kojoj od SEQ ID NO: SEQ ID NO: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137, ili 152-159; i antitela, gde je antitelo denosumab.
[0292] U nekim aspektima, postupci objavljeni u ovom tekstu uključuju primenu polipeptida koji ima sekvencu prema bilo kojoj od SEQ ID NO: SEQ ID NO: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137, ili 152-159; i antitela, gde je antitelo pantimumab.
[0293] U nekim aspektima, postupci objavljeni u ovom tekstu uključuju primenu polipeptida koji ima sekvencu prema bilo kojoj od SEQ ID NO: SEQ ID NO: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137, ili 152-159; i antitela, gde je antitelo ramucirumab.
[0294] U nekim aspektima, postupci objavljeni u ovom tekstu uključuju primenu polipeptida koji ima sekvencu prema bilo kojoj od SEQ ID NO: SEQ ID NO: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137, ili 152-159; i antitela, gde je antitelo necitumumab.
[0295] U nekim aspektima, postupci objavljeni u ovom tekstu uključuju primenu polipeptida koji ima sekvencu prema bilo kojoj od SEQ ID NO: SEQ ID NO: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137, ili 152-159; i antitela, gde je antitelo nivolumab.
[0296] U nekim aspektima, postupci objavljeni u ovom tekstu uključuju primenu polipeptida koji ima sekvencu prema bilo kojoj od SEQ ID NO: SEQ ID NO: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137, ili 152-159; i antitela, gde je antitelo pembrolizumab.
[0297] U nekim aspektima, postupci objavljeni u ovom tekstu uključuju primenu polipeptida koji ima sekvencu prema bilo kojoj od SEQ ID NO: SEQ ID NO: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137, ili 152-159; i antitela, gde je antitelo avelumab.
[0298] U nekim aspektima, postupci objavljeni u ovom tekstu uključuju primenu polipeptida koji ima sekvencu prema bilo kojoj od SEQ ID NO: SEQ ID NO: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137, ili 152-159; i antitela, gde je antitelo atezolizumab.
[0299] U nekim aspektima, postupci objavljeni u ovom tekstu uključuju primenu polipeptida koji ima sekvencu prema bilo kojoj od SEQ ID NO: SEQ ID NO: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137, ili 152-159; i antitela, gde je antitelo durvalumab.
[0300] U nekim aspektima, postupci objavljeni u ovom tekstu uključuju primenu polipeptida koji ima sekvencu prema bilo kojoj od SEQ ID NO: SEQ ID NO: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137, ili 152-159; i antitela, gde je antitelo MEDI0680.
[0301] U nekim aspektima, postupci objavljeni u ovom tekstu uključuju primenu polipeptida koji ima sekvencu prema bilo kojoj od SEQ ID NO: SEQ ID NO: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137, ili 152-159; i antitela, gde je antitelo pidilizumab.
[0302] U nekim aspektima, postupci objavljeni u ovom tekstu uključuju primenu polipeptida koji ima sekvencu prema bilo kojoj od SEQ ID NO: SEQ ID NO: 78-85, 98-104, 107-113, 116-122, 135-137, ili 152-159; i antitela, gde je antitelo BMS-93659.
[0303] U nekim aspektima, polipeptidi objavljeni u ovom tekstu pojačavaju antitumorsku aktivnost rituksimaba. U nekim aspektima, polipeptidi objavljeni u ovom tekstu pojačavaju antitumorsku aktivnost u Raji-NSG modelu ksenokalema. U nekim aspektima, polipeptidi objavljeni u ovom tekstu pojačavaju rituksimabom posredovano iscrpljivanje B-ćelija kod nehumanih primata (NHP).
[0304] U nekim aspektima, polipeptidi i farmaceutske kompozicije objave koriste se za terapiju različitih kancera. Kanceri koji se mogu lečiti prama objavi uključuju, ali se ne ograničavaju na solidni tumorski kancer, hematološki kancer, akutnu mijeloidnu leukemiju, hroničnu linfocitnu leukemiju, hroničnu mijeloidnu leukemiju, akutnu limfoblastnu leukemiju, ne-Hodgkinov limfom, Hodgkinov limfom, multipli mijelom, kancer mokraćne bešike, kancer pankreasa, kancer cerviksa, kancer endometrijuma, kancer pluća, kancer bronhija, kancer jetre, kancer ovarijuma, kancer kolona i rektuma, kancer želuca, gastrični kancer, kancer žučne kese, maligni tumor gastrointestinalne strome, tiroidni kancer, kancer glave i vrata, orofaringealni kancer, kancer ezofagusa, melanom, nemelanomski kancer kože, karcinom Merkelovih ćelija, virusom indukovani kancer, neuroblastom, kancer dojke, kancer prostate, kancer bubrega, kancer bubrežnih ćelija, kancer bubrežne karlice, leukemiju, limfom, sarkom, gliom, tumor mozga, i karcinom. U nekim aspektima, kancerozna stanja koja se mogu lečiti prema objavi uključuju metastatske kancere. U nekim aspektima, kancer koji se može lečiti prema objavi je solidni maligni tumor ili hematološki kancer.
[0305] U nekim aspektima, antitelo cilja ćelije imunskog sistema, kao što su T-ćelije, npr., regulatorne T-ćelije, vezivanjem za proteine koje eksprimiraju ćelije imunskog sistema. U nekim aspektima, postupci objavljeni u ovom tekstu uključuju primenu polipeptida opisanog u ovom tekstu (npr., SIRP-a D1 varijanta) i antitela koje cilja ćelije imunskog sistema. Primeri proteina koje eksprimiraju ćelije imunskog sistema uključuju, ali se ne ograničavaju na 41BB, CD40, CD40L, CD163, CD206, CTLA4, PD1, TIM-3, BTLA, VISTA, LAG-3, CD28, OX40, GITR, CD137, CD27, HVEM, CCR4, CD25, CD103, KIrg1, Nrp1, CD278, Gpr83, TIGIT, CD154, CD160, i PD1H. U nekim aspektima, antitelo je dizajnirano tako da se preferencijalno vezuje za proteine (npr., receptore) koje eksprimiraju T-ćelije (npr., regulatorne T-ćelije), u poređenju sa drugim ćelijama imunskog sistema. U nekim aspektima, antitelo u kompoziciji objave uključuje Fc domen IgG1, IgG2 ili IgG4 potklase.
12
[0306] U nekim aspektima, postupci objave uključuju promenu imunskog odgovora subjekta. Postupci uključuju davanje subjektu polipeptida koji sadrži visokoafinitetnu SIRP-α D1 varijantu i antitela, čime se menja imunski odgovor subjekta. U nekim aspektima, promena imunskog odgovora uključuje suprimiranje imunskog odgovora.
[0307] U nekim aspektima, polipeptidi i farmaceutske kompozicije objave koriste se u različitim terapijama za lečenje imunoloških oboljenja. Autoimunske bolesti i zapaljenske bolesti koje se mogu lečiti prema objavi uključuju, ali se ne ograničavaju na multiplu sklerozu, reumatoidni artritis, spondiloartropatiju, sistemski eritemski lupus, antitelima posredovano zapaljensko ili autoimunsko oboljenje, bolest kalema protiv domaćina, sepsu, dijabetes, psorijazu, aterosklerozu, Sjogrenov sindrom, progresivnu sistemsku sklerozu, sklerodermu, akutni koronarni sindrom, ishemijsku reperfuziju, Crohnovu bolest, endometriozu, glomerulonefritis, mijasteniju gravis, idiopatsku plućnu fibrozu, astmu, sindrom akutnog respiratornog distresa (ARDS), vaskulitis, i zapaljenski autoimunski miozitis.
[0308] U nekim aspektima, dostavljanje polipeptida ćeliji uključuje dovođenje u kontakt ćelije sa jednom ili više kompozicija opisanih u ovom tekstu.
[0309] Efikasne doze za takve opcije lečenja variraju u zavisnosti od mnogih različitih faktora, uključujući način primene, ciljno mesto, fiziološko stanje pacijenta, da li je pacijent čovek ili životinja, drugih lekova koji se primenjuju, i da li je tretman profilaktički ili terapijski. U nekim aspektima, pacijent je čovek, ali se mogu lečiti i nehumani sisari, npr., životinje za društvo kao što su psi, mačke, konji, itd., laboratorijski sisari kao što su zečevi, miševi, pacovi, itd., i slično. U nekim aspektima, doze tretmana se titruju da bi se optimizovale bezbednost i efikasnost.
[0310] U nekim aspektima, terapijski dozni opseg je od oko 0.0001 do 100 mg/kg, i običnije 0.01 do 30 mg/kg, telesne težine domaćina. U nekim aspektima, na primer, doze su 1 mg/kg telesne težine ili 30 mg/kg telesne težine ili u opsegu od 1-30 mg/kg. U nekim aspektima, primer režima tretmana podrazumeva primenu jednom nedeljno ili jednom svake dve nedelje ili jednom mesečno ili jednom svakih 3 do 6 meseci. U nekim aspektima, terapijska sredstva i polipeptidni konstrukti opisani u ovom tekstu primenjuju se u više navrata. U nekim aspektima, intervali između pojedinačnih doza su nedeljni, mesečni ili godišnji. U nekim aspektima, intervali su i nepravilni kako je indikovano merenjem nivoa u krvi terapijskog entiteta kod pacijenta. Alternativno, terapijska sredstva ili polipeptidni konstrukti opisani u ovom tekstu primenjuju se kao formulacije sa produženim oslobađanjem, i u tim slučajevima moguća je manje česta primena. U nekim aspektima, doza i frekvencija variraju u zavisnosti od poluživota polipeptida u pacijentu.
[0311] U profilaktičkim primenama, u nekim aspektima, relativno niska doza primenjuje se u relativno retkim intervalima tokom dugog vremenskog perioda. U nekim aspektima, pacijenti nastavljaju da primaju tretman do kraja života. U drugim terapijskim primenama, potrebna je relativno visoka doza u relativno kratkim intervalima dok se progresija bolesti ne smanji ili ne zaustavi, i poželjno dok pacijent ne pokaže delimično ili potpuno ublažavanje simptoma bolesti. Posle toga, u nekim aspektima, kod pacijenta se primenjuje profilaktički režim.
[0312] Kako se koristi u ovom tekstu, izrazi "tretman/lečenje", "tretirati/lečiti", i slično, označavaju primenu sredstva, ili izvođenje procedure, sa svrhom dobijanja efekta. U nekim aspektima, efekat je profilaktički u smislu potpunog ili delimičnog sprečavanja pojave bolesti ili njenih simptoma. U nekim aspektima, efekat je terapijski u smislu postizanja delimičnog ili potpunog izlečenja oboljenja ili simptoma oboljenja.
XIII. Kitovi
[0313] U ovom tekstu, u nekim aspektima, objavljeni su polipeptidi koji uključuju signalregulatorni protein α (SIRP-α) D1 varijantu koja uključuje SIRP-α D1 domen, ili njegov fragment, koji ima aminokiselinsku mutaciju na rezidui 80 u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena; i najmanje jednu dodatnu aminokiselinsku mutaciju u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena na rezidui odabranoj iz grupe koja se sastoji od: rezidue 6, rezidue 27, rezidue 31, rezidue 47, rezidue 53, rezidue 54, rezidue 56, rezidue 66, i rezidue 92.
[0314] Isto tako, u ovom tekstu su objavljeni, u nekim aspektima, polipeptidi koji uključuju Fc varijantu, pri čemu Fc varijanta uključuje Fc domenski dimer koji ima dva Fc domenska monomera, pri čemu se svaki Fc domenski monomer nezavisno bira između (i) humanog IgG1 Fc regiona koji se sastoji od mutacija L234A, L235A, G237A, i N297A; (ii) humanog IgG2 Fc regiona koji se sastoji od mutacija A330S, P331S i N297A; ili (iii) humanog IgG4 Fc regiona koji uključuje mutacije S228P, E233P, F234V, L235A, delG236, i N297A.
[0315] Isto tako, obezbeđeni su kitovi koji uključuju polipeptide opisane u ovom tekstu i uputstva za njihovu upotrebu. Opciono, kitovi mogu uključivati još i najmanje jedan dodatni reagens. Kao neograničavajući primer, hemioterapijsko sredstvo ili antitumorsko antitelo može služiti kao najmanje jedno dodatno sredstvo. U nekim aspektima, kitovi uključuju oznaku koja ukazuje na namensku upotrebu sadržaja kitova. Izraz oznaka uključuje svaki pisani ili snimljeni materijal na ili u kitu, ili koji je na drugi način pridružen kitu.
[0316] U nekim aspektima, kit sadrži (i) polipeptid koji uključuje visokoafinitetnu SIRP-α D1 varijantu; opciono (ii) antitelo; i (iii) uputstva za primenu (i) i (ii) (ako je dato) kod
12
subjekta koji ima oboljenje. U nekim aspektima, kitovi sadrže (i) polipeptid koji sadrži visokoafinitetnu SIRP-α D1 varijantu; i (ii) uputstva za primenu (i) sa antitelom, na primer, antitelom koje nije dato u kitu, kod subjekta koji ima bolest. U nekim aspektima, kitovi sadrže (i) antitelo; i (ii) uputstva za primenu (i) sa polipeptidom koji uključuje visokoafinitetnu SIRP-α D1 varijantu kod subjekta koji ima bolest.
[0317] U nekim aspektima, kitovi se koriste za lečenje subjekta koji ima kancer, kao što je solidni maligni tumor, hematološki kancer, akutnu mijeloidnu leukemiju, hroničnu limfocitnu leukemiju, hroničnu mijeloidnu leukemiju, akutnu limfoblastnu leukemiju, ne-Hodgkinov limfom, Hodgkinov limfom, multipli mijelom, kancer mokraćne bešike, kancer pankreasa, kancer cerviksa, kancer endometrijuma, kancer pluća, kancer bronhija, kancer jetre, kancer ovarijuma, kancer kolona i rektuma, kancer želuca, gastrični kancer, kancer žučne kese, maligni tumor gastrointestinalne strome, tiroidni kancer, kancer glave i vrata, orofaringealni kancer, kancer ezofagusa, melanom, nemelanomski kancer kože, karcinom Merkelovih ćelija, virusom indukovani kancer, neuroblastom, kancer dojke, kancer prostate, kancer bubrega, kancer bubrežnih ćelija, kancer bubrežne karlice, leukemiju, limfom, sarkom, gliom, tumor mozga, karcinom, ili bilo koju njihovu kombinaciju. U nekim aspektima, kitovi se koriste za lečenje subjekta koji ima solidni maligni tumor ili hematološki kancer.
[0318] U nekim aspektima, kitovi se koriste za lečenje subjekata koji imaju imunološka oboljenja. U nekim aspektima, imunološko oboljenje je autoimunsko oboljenje ili zapaljensko oboljenje kao multipla skleroza, reumatoidni artritis, spondiloartropatija, sistemski eritemski lupus, antitelima posredovano zapaljensko ili autoimunsko oboljenje, bolest kalema protiv domaćina, sepsa, dijabetes, psorijaza, ateroskleroza, Sjogrenov sindrom, progresivna sistemska skleroza, sklerodermu, akutni koronarni sindrom, ishemijska reperfuzija, Crohnova bolest, endometrioza, glomerulonefritis, mijastenija gravis, idiopatska plućna fibroza, astma, sindrom akutnog respiratornog distresa (ARDS), vaskulitis, zapaljenski autoimunski miozitis ili bilo koja njihova kombinacija.
PRIMERI
Primer 1 - SIRP-α D1 varijantni polipeptidi
Generisanje polipeptida objave
[0319] Polipeptid objave, koji uključuje visokoafinitetnu SIRP-α D1 varijantu generiše se konvencionalnim tehnikama molekularnog kloniranja i ekspresije proteina. Moguće aminokiselinske supstitucije u SIRP-α D1 varijanti u odnosu na divlji tip SIRP-α D1 domena navedene su u Tabelama 2 i 5. Molekul nukleinske kiseline koji kodira polipeptid
12
objave klonira se u vektor optimizovan za ekspresiju u bakterijskim ili sisarskim ćelijama, korišćenjem dobro poznatih tehnika molekularne biologije. Posle indukcije proteinske ekspresije, ćelije se sakupljaju i eksprimirani polipeptidi se prečišćavaju iz supernatanta ćelijske kulture korišćenjem afinitetne hromatografije na koloni. Prečišćeni polipeptidi se zatim analiziraju pomoću SDS-PAGE, posle čega sledi bojenje Coomassie plavim da bi se potvrdilo prisustvo proteinskih traka očekivane veličine.
[0320] Prečišćeni polipeptidi se pretraže u pogledu vezivanja za CD47, korišćenjem tehnika raspoloživih u struci, kao što su prikazivanje na fagima, prikazivanje na kvascu, rezonancija površinskog plazmona (surface plasmon resonance, SPR), testovi blizine scintilacije, ELISA, ORIGEN imunotestovi (IGEN), gašenje fluorescencije, transfer fluorescencije, ili bilo koji pogodni biotest. Željeni polipeptidi vezuju se sa višim afinitetom za CD47, npr., humani CD47, nego divlji tip SIRP-α.
Vezujući afinitet SIRP-α D1 varijantnih polipeptida
[0321] U nizu eksperimenata, polipeptidi divljeg tipa SIRP-α D1 domena i visokoafinitetnih SIRP-α D1 varijanti generišu se korišćenjem konvencionalnih tehnika molekularnog kloniranja i ekspresije proteina. Vezivanje za humani CD47 određuje se korišćenjem SPR na sledeći način: ukratko, vezivanje humanog CD47 (R and D Systems, kataloški broj 4670-CD ili naš proizveden kao monomerni vanćelijski domen, extracellular domain, ECD) za divlji tip SIRP-α i SIRP-α D1 varijantne polipeptide analizira se na Biacore T100 instrumentu (GE Healthcare) ili Proteon XPR36 (Bio-rad, Hercules, CA) korišćenjem slanog rastvora puferisanog fosfatom (PBS, pH 7.4), suplementisanog sa 0.01% Tween-20 (PBST) kao radnim puferom.200 do 1000 RU liganda imobiliše se u 10 mM natrijum acetatnom puferu (pH 4.5) na Biacore CM4 čip-senzoru ili Proteon GLC čipu, standardnim aminskim kuplovanjem prema preporukama proizvođača. Nekoliko koncentracija analita (ili SIRP-α D1 varijantnih polipeptida), npr., u rasponu od najmanje 0.1x do 10x KD vrednosti, injektira se tokom dva minuta pri stopi protoka 100 µL/min, posle čega sledi vreme disocijacije u trajanju od deset minuta. Posle svake injekcije analita, površina se regeneriše korišćenjem mešavine 2:1 Pierce IgG pufera za eluiranje (Life Technologies, kataloški broj 21004) i 4 M NaCl injektiranih 30 sekundi. Potpuna regeneracija površine potvrđuje se analizom na bazalnom nivou i injektiranjem istog analita na početku i na kraju eksperimenta. Svi senzogrami se referenciraju dvostruko korišćenjem referentne površine i puferske injekcije i podešavanja 1:1 po Langmuiru. Analit je primarno monomeran, CD47 ECD ili SIRP-α bez Fc. Ligand na čipu može biti
12
monomeran ili Fc fuzija. Podaci za vezivanje dati su u Tabeli 16. Svi SPR testovi se izvode na 25 °C.
Tabela 16. SIRP-α varijantni polipeptid i pridružene KD vrednosti
12
[0322] Isto tako bilo je određeno da prisustvo glutamatne ili aspartatne rezidue na poziciji 54 poboljšava vezivanje SIRP-α D1 varijantnih polipeptida za mišji CD47. Kao neograničavajući primer, SIRP-α D1 varijantni polipeptidi identifikovani u Tabeli 17, dole, pokazuju visoki afinitet vezivanja za mišji CD47. Vezujući afinitet za humani CD47 nekoliko SIRP-α D1 varijantnih polipeptida upoređuje se sa vezujućim afinitetom za mišji CD47 korišćenjem SPR kako je ranije opisano, sa mišjim CD47 proteinom korišćenim umesto humanog CD47 kada je pogodno. Rezultati su prikazani u Tabeli 18.
Tabela 17. Sekvence SIRP-α varijantnih polipeptida sa poboljšanim vezivanjem za mišji
CD47
12
1
[0323] Isto tako, određeno je da N80A mutacija, koja može da minimizira ili obustavi delimičnu glikozilaciju prisutnu u određenim SIRP-α D1 varijantnim polipeptidima, daje funkcionalnu korist povišavanja homogenosti udružene sa SIRP-α D1 varijantnim polipeptidima koji sadrže takvu mutaciju. Kada se SIRP-α varijantni polipeptidi eksprimiraju u E.coli, neće doći do glikozilacije na N80 zbog odsustva glikozilacionog sistema u E.coli u poređenju sa sisarskim sistemom. Tabela 19 prikazuje da efikasno vezivanje SIRP-α D1 varijantnog polipeptida proizvedenog u E.coli i humanog CD47 i dalje može da se dešava, pokazujući time da deglikozilacija ne utiče na vezujući afinitet sa kojim SIRP-α D1 varijante i dalje mogu da se vežu za CD47. Pored N80A mutacije, deglikozilacija može da se obavi mutiranjem N80 u bilo koju amino-kiselinu koja nije N, ili narušavanjem motiva N-Xaa1-Xaa2 gde N = asparagin; Xaa1 = bilo koja amino-kiselina osim P (prolin); Xaa2 = T (treonin), S (serin) ili C (cistein), pri čemu motiv označava rezidue 80-82 SIRP-α D1 varijantnog polipeptida. Mutiranje P83 u valin ili drugu reziduu koja nije P, može dovesti do povećane glikozilacije na N80 i mogu se generisati homogeno glikozilovani SIRP-α D1 varijantni polipeptidi.
[0324] Amino-kiselina P83 takođe može da utiče na stepen glikozilacije. Promena P83 u bilo koju amino-kiselinu može povećati efikasnost glikozilacije na N80. SIRP-α D1 varijanta koja ima valin (V) na poziciji 83 (SEQ ID NO: 213) eksprimirana je u HEK293FS sisarskim ćelijama. Veličina eksprimiranog proteina upoređivana je sa SIRP-α D1 varijantom koja ima divlji tip aminokiselinske rezidue (npr., prolin, P) na poziciji 83 (SEQ ID NO: 71). Analiza molekularne težine eksprimiranog proteina na proteinskom gelu (SL.
18) pokazuje da varijanta koja ima P83V mutaciju (SEQ ID NO: 213, linija 2) ima višu molekulsku težinu (npr.,~22 kDa) nego varijanta koja nema mutaciju na poziciji 83 (linija 1). Kako je prikazano na SL. 18, kada je rezidua 83 mutirana u Val, SIRP-α varijantni
1 1
polipeptid eksprimiran u sisarskoj ćeliji-domaćinu je prvenstveno molekul na višoj molekulskoj težini (∼22kDa), što ukazuje na to da efikasnost glikozilacije na N80 može biti povećana.
Tabela 19. Reprezentativni podaci o vezivanju za sekvence SIRP-α varijantnog polipeptida koji imaju različite profile glikozilacije
Primer 2 - Stvaranje jednogranih i bispecifičnih SIRP-α polipeptida
1 2
[0325] Sposobnost konstrukata koji sadrže heterodimere (i) SIRP-α - Fc fuzionog proteina i (ii) Fc domenskog monomera fuzionisanog sa polipeptidom, kao što je antigenvezujući domen, da se vežu za CD47 i antigen, npr., EGFR, određuje se pomoću SPR kao što je prethodno opisano u ovom primeru. Fc fuzioni proteini za formiranje heterodimera dati su u Tabeli 20. Testirane su tri monofunkcionalne (npr., koji se vezuje za jedan cilj) SIRP-α - Fc fuzije. Ovi fuzioni proteini prikazani su kao A, B, C na SL.6A. Prva monofunkcionalna SIRP-α - Fc fuzija ("A") bila je homodimer SEQ ID NO: 136. Druga i treća monofunkcionalna SIRP-α - Fc fuzija bile su heterodimeri (i) SIRP-α - Fc fuzije i (ii) Fc domenskog monomera bez dodatnog polipeptida fuzionisanog sa njim. Generisani su korišćenjem strategije inženjerisanja mutacije "čvorić u rupici" prikazane na SL. 4A i 4B. Jedna monofunkcionalna SIRP-α - Fc fuzija ("B") formira se heterodimerizacijom SEQ ID NO: 139 (Fc varijanta) i SEQ ID NO: 142 (SIRP-α - Fc fuzija). Druga monofunkcionalna SIRP-α - Fc fuzija ("C") formira se heterodimerizacijom SEQ ID NO: 139 (Fc varijanta) i SEQ ID NO: 138 (SIRP-α Fc fuzija). Bifunkcionalna (npr., koja se vezuje za dva cilja) SIRP-α - Fc fuzija ("D") formira se heterodimerizacijom SEQ ID NO: 127 (SIRP-α Fc fuzija) i SEQ ID NO: 144 (antigen-vezujući region erbituksa povezanog sa Fc varijantom). SEQ ID NO: 220 predstavlja laki lanac erbituks antitela.
Tabela 20. Aminokiselinske sekvence Fc fuzionih proteina za formiranje heterodimera
1
[0326] Ukratko, CD47 se imobiliše na Proteon GLC čipu, hemijom amina, kako je opisano ranije u ovom tekstu. U prvoj injekciji, analiti (npr., A, B, C, D, i erbituks) injektiraju se stopom od 30 uL/min u PBST tokom 60 s u količini 100 nM i vezivanje za površinu CD47 određuje se pomoću SPR. U drugoj, injekcija 100 nM EGFR-ECD (vanćelijski domen receptora za epidermski faktor rasta proizveden u HEK293 ćelijama) injektira se i meri se vezivanje EGFR-ECD za CD47-vezane analite. Erbituks se nije vezao za CD47 na čipu i prema tome on ne može da se veže za EGFR u drugoj injekciji kako je pokazano krivom označenom kao "Erbituks" na SL.6B i ilustrovano na SL.6A. SIRP-α - Fc fuzije (npr., A, B, i C) vezale su se za CD47, ali se nisu vezale za EGFR u drugoj injekciji kako je prikazano krivama označenim kao "A", "B" i "C" prikazanim na SL.6B i ilustrovano na SL.
6A. Monomerni proteini, ili proteini sa jednim SIRP-α D1 domenom (npr., B i C) pokazuju više rezonancione jedinice nego dimerni protein (npr., A) zbog veće količine molekula vezanih za ista CD47 mesta raspoloživa na čipu kako je pokazano krivama označenim kao "B" i "C", što ukazuje na vezivanje za imobilisani CD47 i zanemarljivo vezivanje za EGFR-ECD (npr., monofunkcionalnost). Heterodimerni SIRP-α - erbituks-Fc vezuje se za CD47 na čipu i može da se veže za EGFR-ECD u drugoj injekciji kako je pokazano krivom
1 4
obeleženom kao "D" na SL.6B, što ukazuje na vezivanje za imobilisani CD47 i vezivanje za EGFR-ECD (npr., bifunkcionalnost).
Primer 3 - Testiranje polipeptida sa visokim vezujućim afinitetom za CD47 kod miševa
[0327] Genetički inženjerisani mišji modeli različitih kancera, npr., solidnih malignih tumora i hematoloških kancera, koriste se za testiranje vezivanja polipeptida objave za CD47. Polipeptid objave injektira se u miša, koji se kasnije disekuje da bi se detektovalo prisustvo kompleksa polipeptida i CD47. Antitela specifična za SIRP-α ili CD47 koriste se za detekciju.
Primer 4 - Testiranje polipeptida u pogledu imunogenosti
[0328] Polipeptidi koji sadrže visokoafinitetnu SIRP-α D1 varijantu ispituju se u testovima imunogenosti. Polipeptidi se testiraju in silico i in vitro u testovima proliferacije T-ćelija, od kojih su neki komercijalno dostupni. Za dalje razvijanje biraju se polipeptidi koji provociraju minimalnu imunogenu reakciju u testu proliferacije T-ćelija in vitro i pokazuju veći vezujući afinitet za CD47 nego divlji tip SIRP-α.
Primer 5 - Testiranje polipeptida na in vivo toksičnost
[0329] Različiti polipeptidi koji uključuju različite visokoafinitetne SIRP-α D1 varijante koje pokazuju različite stepene povišenog afiniteta vezivanja za CD47 nego divlji tip SIRP-α injektiraju se u životinjski model kancera (npr., mišji model kancera) da bi se ispitao efekat različitih vezujućih afiniteta na toksičnost u organizmu. Nehumani primat (NHP) takođe može da se koristi za testiranje visokoafinitetnih SIRP-α D1 varijanti, jer nivo unakrsne reaktivnosti za CD47 nehumanog primata (NHP) i CD47 miša može biti različit.
Primer 6 - Vezivanje Fc varijanti za Fcγ receptor
[0330] Pored sposobnosti da modulišu funkciju cilja, terapijska monoklonska antitela i Fcsadržavajući fuzioni proteini sposobni su i da pobude dva primarna imunska efektorska mehanizma: ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC) i citotoksičnost zavisnu od komplementa (CDC). ADCC je posredovana vezivanjem Fc regiona za aktivirajuće Fcγ receptore i polipeptidni konstrukti koji uključuju Fc varijante opisane u ovom tekstu testiraju se u pogleda vezivanja za Fcγ receptor. Kako je prikazano u Tabeli 21 u nastavku ovog teksta, polipeptidni konstrukti pokazuju smanjeno vezivanje za jedan ili više Fcγ receptora u poređenju sa odgovarajućim divljim tipom IgG Fc. U vezi sa IgG1, mutacije
1
L234A, L235A, G237A, i N297A IgG1 Fc rezultuju ozbiljnim gubitkom vezivanja za Fcγ receptore CD16a, CD32a, CD32b, CD32c, i CD64 u poređenju sa divljim tipom IgG1, ili konstruktom koji nema jednu ili više ovih mutacija. Prema tome, mutacije L234A, L235A, G237A (npr., IgG1 AAA), zajedno sa aglikozilacionom ili deglikozilacionom mutacijom N297A rezultuju potpunim gubitkom vezivanja za ispitivane Fcγ receptore. Pošto je poznato da je vezivanje za Fcγ receptor važno za fagocitozu, mutacije L234A, L235A, G237A, i N297A mogu rezultovati smanjenjem fagocitoze konstruktom koji sadrži Fc varijantu.
[0331] Sledeći materijali i postupci upotrebljeni su u ovom primeru. Vezivanje humanog Fcγ receptora RI (CD64), RIIA (CD32a), RIIB/C (CD32b/c) i RIIIA (CD16a) (R & D Systems, kataloški brojevi 1257-FC-050, 1330-CD-050, 1875-CD-050, odnosno 4325-FC-050) za Fc varijantne konstrukte analizirano je na ProteOn XPR36 instrumentu (Bio-Rad, Hercules, CA) korišćenjem slanog rastvora puferisanog fosfatom (PBS, pH 7.4) suplementisanog 0.01% Tween-20 kao radnim puferom. Približno 400 rezonantnih jedinica (RU) minimalno biotinisanih Fc konstrukata imobiliše se na ćelijama za protok NLC senzorskog čipa (Bio-rad, Hercules, CA) interakcijom avidin-neutravidin. Biotinisanje se izvodi prema uputstvima proizvođača, korišćenjem Pierce EZ-Link Sulfo-NHS- LC-LC-Biotina i ekvimolarnog odnosa linker:protein. Analiti (hFcγR) se injektiraju po kinetičkom modelu jedne injekcije u nominalnim koncentracijama od 0, 61, 185, 555, 1666, i 5000 nM. Vremena asocijacije i disocijacije prate se tokom 90 s, odnosno 600 s. Posle svake injekcije, površina se regeneriše korišćenjem 2:1 zapr./zapr. mešavine Pierce IgG elucionog pufera (Life Technologies, kataloški broj 21004) i 4 M NaCl. Kompletna regeneracija površine potvrđena je injektiranjem Fc varijanti na početku i na kraju eksperimenta. Podaci sa biosenzora su dvostruko referencirani oduzimanjem podataka za međutačku (ne sadrži imobilsani protein) od podataka za reakcionu tačku (imobilisani protein) i zatim oduzimanjem odgovora injekcije puferskog "praznog" analita od onog injekcije analita. Dvostruko referencirani podaci podešeni su za ravnotežnu analizu korišćenjem jednostavne izoterme vezivanja. KD,app. Za Fc molekule sa jakim vezivanjem za hFcγRI, podaci su takođe podešeni globalno prema jednostavnom Langmuirovom modelu i KD,app vrednost je izračunata iz odnosa prividnih kinetičkih konstanti brzine reakcije (KD app = kd,app/ka,app)
[0332] Kako je prikazano u Tabeli 21, mutacije A330S, P331S, i N297A IgG2 Fc regiona rezultuju ozbiljnim gubitkom vezivanja za Fcγ receptore CD16a, CD32a, CD32b, CD32c, i CD64 u poređenju sa divljim tipom IgG ili konstrukta koji nema te mutacije. Prema tome, mutacije A330S i P331S zajedno sa aglikozilacionom ili deglikozilacionom mutacijom
1
N297A rezultuje potpunim gubitkom vezivanja za ispitivane Fcγ receptore. Pošto je poznato da je vezivanje za Fcγ receptor važno za fagocitozu, pretpostavljeno je da mutacije A330S, P331S, i N297A rezultuju smanjenjem fagocitoze Fc varijante. Podaci o vezivanju za IgG4 i različite mutacije takođe su obezbeđeni.
Tabela 21. Podaci vezivanja (KD) za vezivanje Fc varijanti za Fcγ receptor.
Odsustvo vezivanja prikazano je kao "-"
Primer 7 - Određivanje vezivanja Fc varijanti za C1q
[0333] Citotoksičnost zavisna od komplementa (CDC) posredovana je C1q proteinom komplementa i aktivacijom kaskade komplementa. Vezivanje različitih koncentracija C1q komplementa za različite SIRP-α Fc konstrukte određuje se enzimskim imunotestom (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA). SIRP-α Fc fuzije pripremaju se u koncentraciji od 5 µg/mL u PBS pH 7.4 i koriste za oblaganje duplikata bunarčića Nunc Immulon 4HBX ELISA ploča sa 96 bunarčića (korišćenjem 50 µL/bunarčiću) preko noći na 4°C. Sledećeg dana, ploče se isperu u pet promena pufera za ispiranje (PBS i 0.05% Tween-20) i inkubiraju sa 200 µL/bunarčiću blokirajućeg pufera (PBS i 0.5% BSA) 1 sat
1
na sobnoj temperaturi. Ploče se isperu pet puta i inkubiraju 2 sata na sobnoj temperaturi sa 0, 0.13, 0.41, 1.23, 3.7, 11.1, 33.3, 100 µg/mL C1q u testnom puferu (PBS, 0.5% BSA, 0.05% Tween-20, 0.25% CHAPS, 5 mM EDTA, i 0.35% NaCl). Ploče se isperu i inkubiraju 1 sat sa 50 µl/bunarčiću HRP-konjugovanim ovčjim antihumanim C1q pri 2.0 µg/mL u testnom puferu. Ploče se isperu pet puta i inkubiraju ∼10 minuta sa TMB (1-Step Ultra TMB-ELISA, Thermo Sci. Cat. # 34028). Konačno, 50 µL/bunarčiću Pierce/Thermo Sci. Stop rastvora (0.16 M sumporna kiselina, kat. # N600) se doda i apsorbancija ploča se očitava na 450 nm sa 570 nm kao referencom. Bunarčići koji ne sadrže SIRP-α - Fc fuziju testiraju se da bi se kontrolisalo nespecifično vezivanje C1q ili HRP-konjugovanog detekcionog antitela za ploču. Bunarčići koji ne sadrže C1q testiraju se kao kontrola za nespecifično vezivanje HRP-konjugovanog detekcionog antitela za SIRP-α - Fc fuziju ili za ploču.
[0334] Kako je prikazano na SL. 14, i divlji tip IgG1 (SEQ ID NO: 123) i divlji tip IgG2 (SEQ ID NO: 126) vezuju se za C1q na dozno-zavisan način. Nasuprot tome, IgG1 varijante IgG1_AAA (SEQ ID NO: 124); IgG1_N297A (SEQ ID NO: 125); i IgG1_AAA_N297A (SEQ ID NO: 96) pokazuju značajno smanjenu i minimalno detektabilnu C1q vezujuću aktivnost. Slično tome, IgG2 varijante IgG2_ A330S, P331S (SEQ ID NO: 127); IgG2_N297A (SEQ ID NO: 128); i IgG2 _N297A, A330S, P331S (SEQ ID NO: 129) takođe pokazuju značajno smanjenu i minimalno detektabilnu C1q vezujuću aktivnost. Ova smanjena i minimalno detektabilna C1q vezujuća aktivnost IgG1 i IgG2 varijanti uporediva je sa divljim tipom IgG4 (SEQ ID NO: 130), koji se ne vezuje za C1q.
Primer 8 - Proizvodnja divljeg tipa Fc i Fc varijanti
[0335] Korišćenjem postupaka opisanih u ovom tekstu i u skladu sa aspektima objave, proizvedeni su divlji tip Fc polipeptida i Fc varijante iz Tabele 7.
Primer 9 - Proizvodnja SIRP-α varijantnih i Fc varijantnih polipeptida
[0336] Korišćenjem postupaka opisanih u ovom tekstu i u skladu sa aspektima objave, proizvedeni su sledeći SIRP-α D1 varijantni-Fc varijantni polipeptidi, kako je prikazano u Tabeli 22 dole. Vezivanje za humani CD47 određeno je postupcima opisanim u Primeru 1.
Tabela 22. Vezujući afinitet SIRP-α varijantnih- Fc varijantnih polipeptida za CD47.
1
Primer 10 - Fagocitoza SIRP-α - Fc varijanti
[0337] Da bi se dobila kvantitativna mera fagocitoze, koristi se test fagocitoze u kojem se primarni humani makrofagi i GFP+ ili CFSE-obeležene tumorske ćelije kokultivišu sa Fc varijantnim polipeptidnim konstruktima opisanim u ovom tekstu. Koriste se sledeći materijali i postupci:
1
Kultura tumorskih ćelijskih linija
[0338] DLD-1-GFP-Luciferaza ćelije, MM1R, i N87 održavaju se u medijumu za rast koji sadrži RPMI (Gibco), suplementisanom 10% toplotom inaktiviranim fetalnim goveđim serumom (Gibco), 1% penicilinom/streptomicinom (Gibco), i 1% Glutamax (Gibco). DLD-1-GFP-Luciferaza i N87 ćelije rastu kao adherentni monoslojevi i MM1R ćelije rastu u suspenziji.
Derivacija i kultura makrofaga poreklom od humanih monocita
[0339] Slojevi istaloženih leukocita i krvnih pločica (buffy coats) cele krvi razblaže se 1:2 fosfatom puferisanim slanim rastvorom (PBS, Gibco). Razblažena krv se podeli u dve epruvete i nanese na 20 ml Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare). Epruvete se centrifugiraju 30 minuta na 400 x g. Mononuklearne ćelije periferne krvi (peripheral blood mononuclear cells, PBMC) sakupe se sa granične površine. isperu dva puta dodavanjem 40 ml PBS, centrifugiraju 10 minuta na 100 x g, i resuspenduju u FACS puferu (PBS sa 0.5 % goveđim serum-albuminom (Gibco)). CD14+ monociti se prečiste negativnom selekcijom korišćenjem Monocyte Isolation Kit II (Miltenyi Biotec) i LS kolona (Miltenyi Biotec) prema protokolu proizvođača. CD14+ monociti se zaseju na ploče za kulturu tkiva od 15 cm (Corning) pri količini od 10 miliona ćelija po posudi u 25 ml diferencijacionog medijuma koji sadrži IMDM (Gibco) suplementisan 10% humanim AB serumom (Corning), 1% penicilinom/streptomicinom, i 1% glutamaksom. Ćelije se kultivišu sedam do deset dana.
In vitro testovi fagocitoze
[0340] DLD-1-GFP-Luciferaza i N87 ćelije odvoje se sa ploča za kulturu ispiranjem u dve promene od po 20 ml PBS i inkubiraju u 10 ml TrypLE Select (Gibco) 10 minuta na 37°C. Ćelije se uklone strugačem ćelija (Corning), centrifugiraju, isperu u PBS, i resuspenduju u IMDM. MM1R i N87 ćelije obeleže se sa Celltrace CFSE kitom za proliferaciju ćelija (Thermo Fisher) prema uputstvima proizvođača i resuspenduju u IMDM. Makrofagi se odvoje sa ploča za kulturu ispiranjem u dve promene od po 20 ml PBS i inkubiraju u 10 ml TrypLE Select 20 minuta na 37°C. Ćelije se uklone strugačem ćelija (Corning), isperu u PBS, i resuspenduju u IMDM.
[0341] Testovi fagocitoze izvode se u pločama sa ultraniskim pričvršćivanjem, sa 96 bunarčića sa U-dnom (Corning) koje sadrže 100,000 DLD-1 GFP Luciferaza, MM1R, ili N87 ćelija, petostruka serijska razblaženja SIRP-α - Fc varijanti od 1000 nM do 64 pM, i cetuksimab (Absolute Antibody), daratumumab, ili kontrolno antitelo istog izotipa (Southern Biotech) u koncentraciji 1 µg/ml. Ploče se preinkubiraju 30 minuta na 37°C u
14
humidifikovanom inkubatoru sa 5 procenata ugljen-dioksida, zatim se doda 50,000 makrofaga. Ploče se inkubiraju dva sata na 37°C u humidifikovanom inkubatoru sa 5 procenata ugljen-dioksida. Ćelije se peletiraju centrifugiranjem pet minuta na 400 x g i isperu u 250 µl FACS pufera. Makrofagi se boje na ledu 15 minuta u 50 µl FACS pufera koji sadrži 10 µl humanog FcR blokirajućeg reagensa (Miltenyi Biotec), 0.5 µl anti-CD33 BV421 (Biolegend), i 0.5 µl anti-CD206 APC-Cy7 (Biolegend).Ćelije se isperu u 200 µl FACS pufera, isperu u 250 µl PBS, i boje na ledu 30 minuta u 50 µl Fixable Viability Dye eFluor 506 (ebioscience) u razblaženju 1:1000 u PBS. Ćelije se isperu dva puta u 250 µl FACS pufera i fiksiraju 30 minuta na ledu u 75 µl Cytofix (BD Biosciences). Ćelije se isperu u 175 µl FACS pufera i resuspenduju u 75 µl FACS pufera. Ćelije se analiziraju na FACS Canto II (BD Biosciences), posle čega sledi analiza podataka pomoću Flowjo 10.7 (Treestar). Mrtve ćelije se isključuju ograđivanjem na e506-negativnu populaciju. Makrofagi koji su fagocitovali tumorske ćelije identifikuju se kao pozitivni za CD33, CD206, i GFP ili CFSE. Pet polipeptidnih konstrukata koji uključuju SIRP-α D1 domenske varijante fuzionisane za respektivne Fc varijante testiraju se u pogledu fagocitoze in vitro:
4) (SEQ ID NO: 124)
Rezultati
[0342] SL. 7 prikazuje fagocitozu DLD-1-GFP-Luciferaza tumorskih ćelija makrofagima poreklom od humanih monocita u prisustvu SEQ ID NO: 105 (Fc varijantni IgG2_A330S, P331S, N297A) i SEQ ID NO: 127 (Fc varijantni IgG2_A330S, P331S). Posebno, SL.7 prikazuje da SEQ ID NO: 105 (Fc varijantni IgG2_A330S, P331S, N297A) (u prisustvu ili odsustvu kontrolnog antitela IgG1,k) ukida fagocitozu u testu fagocitoze kao pojedinačno sredstvo dok može da poveća fagocitozu sa cetuksimabom (CTX) (SEQ ID NO: 105 CTX). Nasuprot tome, polipeptid sa Fc varijantnim IgG2_A330S, P331S (SEQ ID NO: 127 IgG1,k) ima merljivu fagocitnu aktivnost kao pojedinačno sredstvo. Procenat makrofaga koji fagocituju tumorske ćelije i koji su GFP+ naznačen je na y-osi (SL. 7). Koncentracija CD47-vezujućih mesta iz dodavanja SEQ ID NO: 105 i SEQ ID NO: 127 naznačena je na x-osi. DLD-1-GFP-Luciferaza ćelije i makrofagi inkubirani su sa naznačenim koncentracijama SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107 i CTX (1 ug/mL) i kontrolnim antitelom (IgG1, k). Ćelije se inkubiraju i sa PBS plus cetuksimab (linija obeležena kao PBS CTX) ili PBS plus kontrolno antitelo istog izotipa (linija obeležena kao PBS IgG1k).
[0343] SL. 8 prikazuje fagocitozu DLD-1-GFP-Luciferaza tumorskih ćelija makrofagima poreklom od humanih monocita u prisustvu SEQ ID NO: 96 (Fc varijantni IgG1 L234A, L235A, G237A, N297A i SEQ ID NO: 124 (Fc varijantni IgG1 L234A, L235A, G237A). Posebno, SL. 8 prikazuje da Fc varijantni IgG1 L234A, L235A, G237A, N297A(SEQ ID NO: 96) i Fc varijantni IgG1 L234A, L235A, G237A (SEQ ID NO: 124) ukidaju fagocitozu u testu fagocitoze kao pojedinačna sredstva. Ovo je prikazano linijama označenim kao SEQ ID NO 96 IgG1, k i SEQ ID NO: 124 IgG1,k respektivno. Interesantno, oba polipeptida SEQ ID NO: 96 i SEQ ID NO: 124 povećavaju fagocitozu tumor-specifičnog antitela, CTX. Kako je prikazano na SL.8, procenat makrofaga koji fagocituju tumorske ćelije i koji su GFP+ naznačen je na y-osi. Koncentracija CD47-vezujućih mesta iz dodavanja SEQ ID NO: 96 i SEQ ID NO: 124 naznačena je na x-osi. DLD-1-GFP-Luciferaza ćelije i makrofagi su inkubirani sa CTX u koncentraciji od 1 µg/mL i naznačenim koncentracijama SEQ ID NO: 96 (linija obeležena kao SEQ ID NO: 96 CTX) ili SEQ ID NO: 124 (linija obeležena kao SEQ ID NO: 124 CTX). Da bi se identifikovali nespecifični efekti cetuksimaba na fagocitozu, ćelije se inkubiraju sa kontrolnim antitelom istog izotipa kao cetuksimab i navedenim koncentracijama SEQ ID NO: 96 (linija obeležena kao SEQ ID NO: 96 IgG1,k) ili SEQ ID NO: 124 (linija obeležena kao SEQ ID NO: 124 IgG1,k). Ćelije se inkubiraju i sa PBS plus cetuksimab (linija obeležena kao PBS CTX) ili PBS plus kontrolno antitelo istog izotipa (linija obeležena kao PBS IgG1k).
[0344] SL. 9 prikazuje fagocitozu DLD-1-GFP-Luciferaza tumorskih ćelija makrofagima poreklom od humanih monocita u prisustvu SEQ ID NO: 134 (Fc varijantni IgG4_S228P). Posebno, SL. 9 prikazuje da SEQ ID NO: 134 konstrukt ima znatnu fagocitnu aktivnost kao pojedinačno sredstvo u fagocitozi in vitro. Kako je prikazano na SL. 9, procenat makrofaga koji fagocituju tumorske ćelije i koji su GFP+ naznačen je na y-osi. Koncentracija CD47-vezujućih mesta iz dodavanja SEQ ID NO: 134 naznačena je na xosi. DLD-1-GFP-Luciferaza ćelije i makrofagi su inkubirani sa naznačenim koncentracijama SEQ ID NO: 134 (linija obeležena kao SEQ ID NO: 134 medijum). Ćelije su inkubirane i sa kontrolnim antitelom (IgG1, k; crni pravougaonik).
Primer 11 - Proizvodnja SIRP-α varijante i HSA polipeptida
[0345] Pored toga, korišćenjem postupaka opisanih u ovom tekstu i u skladu sa aspektima objave, SIRP-α D1 varijantni polipeptid eksprimira se fuzijom sa HSA polipeptidima, kako je prikazano u Tabeli 23 u nastavku ovog teksta. Vezivanje za humani CD47 određeno je postupcima opisanim u Primeru 1.
Tabela 23. Afinitet vezivanja SIRP-α varijanti fuzionisanih sa HSA polipeptidima za
CD47
14
Primer 12 - Produženi poluživot udružen sa SIRP-α varijantnim polipeptidima [0346] Kako je prikazano u Tabeli 24 i na SL. 10, SIRP-α D1 varijantni polipeptidi koji sadrže Fc i HSA fuzije mogu imati produženi poluživot u poređenju sa SIRP-α D1 varijantom samom. Na primer, SIRP-α D1 varijantni polipeptid fuzionisan sa Fc kako je prikazano SEQ ID NO: 104 i SIRP-α D1 varijantni polipeptid fuzionisan sa HSA kako je prikazano SEQ ID NO: 159 imaju produžen poluživot u odnosu na SIRP-α D1 varijantni polipeptid koji nije fuzionisan sa Fc ili HSA kako je prikazano SEQ ID NO: 85. Produženje poluživota može se pripisati sposobnosti SIRP-α D1 varijantnih polipeptida koji su fuzionisani sa Fc i HSA da se vežu za FcRn, što može biti udruženo sa produženim cikliranjem.
Tabela 24. Merenja poluživota za tretmane jednom dozom SIRP-α varijantnim
polipeptidima
[0347] Postupci korišćeni u ovom Primeru su sledeći. Ukratko, CD-1 mužjaci miševa, teški približno 25 grama dobijeni su od Harlan Labs, i korišćeni su za jednodoznu PK studiju jedinjenja predstavljenih SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 159, i SEQ ID NO: 85. Svako jedinjenje je formulisano u radnoj dozi od 5 mg/mL. Zapremina doze je podešena na osnovu težine svakog miša, obezbeđujući da svaki miš dobije 1, 3 i 10 mg/kg. Jedinjenja se daju intravenski preko repne vene miša. Tri miša se doziraju u svakoj vremenskoj tački, pri svakom od nivoa doza za svako jedinjenje. Posle doziranja, miševima je uzimana krv u sledećih 8 vremenskih tačaka: 0.25, 1, 4, 8, 24, 48, 72 i 120 h. 500 µL cele krvi sakupi se, iz orbitalnog sinusa, u mikrotejnerske epruvete. Uzorci cele krvi ostave se da odstoje 30 minuta da se dopusti izdvajanje seruma. Uzorci se zatim centrifugiraju 10 min na 4 °C na RCF 1000. Serum se zatim prenese u 0.5 mL epruvete unutar 40 min od procesovanja i drži zamrznut do analize.
[0348] Podaci za SEQ ID NO: 104 dobijeni su korišćenjem ELISA protokola za humani Fc. Ukratko, ploče Immulon 4HBX ELISA sa 96 bunarčića obložene su (Thermo Scientific kat. #3855) sa 2 µg/ml, 100 µl/bunarčiću prečišćenog CD47 preko noći na sobnoj temperaturi u 1x antigen-oblažućem puferu (ImmunoChemistry Technologies, kat. # 6248). Bunarčići se isperu 5 puta sa 200-300 µL/bunarčiću 1x TBST (Tris-puferisani slani rastvor 0.05% Tween-20) (Thermo Scientific 20x, kat. # 28360). Bunarčići se blokiraju sa 200 µL/bunarčiću 7.5% BSA u PBS (GIBCO, kat. # 15260-037) 1-2 sata. Bunarčići se isperu 5 puta sa 200-300 µL/bunarčiću 1x TBST. Dodaju se bunarčići sa 50 µL/bunarčiću za standardnu krivu, kontrole kvaliteta (quality controls, QC) i sa nepoznatim uzorcima, razblaženi u normalnom CD1 mišjem serumu u razblaženju 1:4 u TBS. Standardna kriva, QC i nepoznati uzorci inkubiraju se na sobnoj temperaturi 1 sat. Koncentracije za standardnu krivu bile su sledeće: 0.2500 µg/mL; 0.1250 µg/mL; 0.0625 µg/mL; 0.0313 µg/mL; 0.0156 µg/mL; 0.0078 µg/mL; 0.0039 µg/mL; 0.0020 µg/mL; 0.0010 µg/mL; 0.0005 µg/mL; 0.00025 µg/mL; i 0.00000 µg/mL. Kontrole kvaliteta (QC) se zamrznu i alikvotiraju, i vrednosti proteina za standardnu krivu u koncentracijama "visoko", "srednje", i "nisko" na linearnom delu standardne krive, koje služe kao kontrole da bi se obezbedila tačnost testa bile su sledeće: QC Visoko = 0.125 µg/ml; QC Srednje = 0.016 µg/ml; i QC Nisko = 0.004 µg/ml.
[0349] Zatim se bunarčići isperu 5 puta sa 200-300 µL/bunarčiću 1x TBST. 50 µL/bunarčiću 0.25 ug/mL Abbexa kozjeg antihumanog IgG Fc poliklonskog antitela (11.6 mg/mL stok, Abbexa kat. # abx023511) razblaženog u 1x TBST 1% BSA doda se i inkubira 1 sat na sobnoj temperaturi. Ploče se isperu 5 puta sa 200-300 µL/bunarčiću 1x TBST. 50 µL/bunarčiću 0.125 µg/mL ZyMax / Invitrogen zečjeg antikozjeg IgG - HRP konjugovanog (Thermo Scientific, kat. # 81-1620), razblaženog u TBST 1% BSA doda se i inkubira 1 sat na sobnoj temperaturi. Bunarčići se isperu 6 puta sa 200-300 µL/bunarčiću 1x TBST. Sledeći koraci se izvode i reagensi koriste na sobnoj temperaturi: 0 µL/bunarčiću sobna temperatura 1-Step Ultra TMB - ELISA (Thermo Scientific kat. # 34028) doda se i inkubira 2-5 minuta na sobnoj temperaturi dok razvijanje boje ne bude dovoljno. 50 µL/bunarčiću Stop rastvora sobne temperature (0.16M sumporna kiselina,
14
Thermo Scientific kat. # N600) odmah se doda i dobro izmeša. Ploče se očitavaju odmah na spektrofotometru na O.D. 450 i na O.D. 570. O.D. Očitavanje na 570 je pozadinsko očitavanje koje se oduzima od O.D. 450 očitavanja. Korišćenjem softverskog programa kao što je Molecular Devices SoftMax Pro ili Graph Pad Prism, vrednosti standardne krive se unose korišćenjem 4-parametarske podešene krive i koncentracije nepoznatih uzoraka se interpoliraju sa standardne krive korišćenjem softvera.
[0350] Podaci za SEQ ID NO: 85 dobijeni su korišćenjem His Tag ELISA protokola. Immulon 4HBX ELISA ploče sa 96 bunarčića (Thermo Scientific kat. #3855) oblože se sa 2 µg/mL, 100 µL/bunarčiću prečišćenog CD47 preko noći na sobnoj temperaturi u 1x antigen-oblažućem puferu (ImmunoChemistry Technologies, kat. # 6248). Bunarčići se isperu 5 puta sa 200-300 µL/bunarčiću korišćenjem 1x TBST (Tris-puferisani slani rastvor 0.05% Tween-20) (Thermo Scientific 20x, kat. # 28360). Bunarčići se blokiraju sa 200 µL/bunarčiću 7.5% BSA u PBS (GIBCO, kat. # 15260-037) 1-2 sata. Bunarčići se isperu 5 puta sa 200-300 µL/bunarčiću 1x TBST. Dodaju se, 50 µL/bunarčiću, bunarčići za standardnu krivu, kontrolu kvaliteta (QC) i nepoznati uzorci razblaženi u normalnom CD1 mišjem serumu u razblaženju 1:4 u TBS. Standardna kriva, QC i nepoznati uzorci inkubiraju se na sobnoj temperaturi 1 sat. Koncentracije za standardnu krivu bile su sledeće: 0.12500 µg/mL; 0.06250 µg/mL; 0.03125 µg/mL; 0.01563 µg/mL; 0.00781 µg/mL; 0.00391 µg/mL; 0.00195 µg/mL; 0.00098 µg/mL; i 0.00000 µg/mL. Kontrole kvaliteta (QC) se zamrznu i alikvotiraju, i vrednosti proteina za standardnu krivu u koncentracijama "visoko", "srednje", i "nisko" na linearnom delu standardne krive, koje služe kao kontrole da se obezbedi da test radi dobro bile su sledeće: QC Visoko = 0.02 µg/ml; QC Srednje = 0.01 µg/ml; i QC Nisko = 0.005 µg/ml.
[0351] Posle toga se bunarčići isperu 5 puta sa 200-300 µL/bunarčiću 1x TBST. 50 µL/bunarčiću 0.2 ug/mL Abcam zečjeg anti-6x His Tag -HRP konjugovanog poliklonskog antitela (1 mg/mL stok, abcam kat. # ab1187) razblaženog u TBST 1% BSA se doda i inkubira 1 sat na sobnoj temperaturi. Ploče se isperu 6 puta sa 200-300 uL/bunarčiću 1x TBST. Posle toga, sledeći koraci i sredstva koriste se na sobnoj temperaturi. 50 µL/bunarčiću 1-Step Ultra TMB - ELISA (Thermo Scientific kat. # 34028) zagrejanog na sobnu temperaturu doda se i inkubira 3-5 minuta na sobnoj temperaturi dok se ne razvije dovoljna obojenost. 50 µL/bunarčiću Stop rastvora (0.16M sumporna kiselina, Thermo Scientific kat. # N600) zagrejanog na sobnu temperaturu odmah se doda i dobro izmeša. Ploče se odmah očitavaju na spektrofotometru na O.D. 450 i na O.D. 570. O.D. Očitavanje na 570 je pozadinsko očitavanje koje se oduzima od O.D. 450 očitavanja. Korišćenjem softverskog programa kao što je Molecular Devices SoftMax Pro ili Graph
14
Pad Prism, vrednosti standardne krive se unose korišćenjem 4-parametarske podešene krive i koncentracije nepoznatih uzoraka se interpoliraju sa standardne krive korišćenjem softvera.
[0352] Podaci za SEQ ID NO: 159 dobijeni su korišćenjem HSA ELISA protokola. Immulon 4HBX ELISA ploče sa 96 bunarčića (Thermo Scientific kat. #3855) oblože se sa 2 µg/mL, 100 µL/bunarčiću prečišćenog CD47 preko noći na sobnoj temperaturi u 1x antigen-oblažućem puferu (ImmunoChemistry Technologies, kat. # 6248). Bunarčići se isperu 5 puta sa 200-300 µL/bunarčiću korišćenjem 1x TBST (Tris-puferisani slani rastvor 0.05% Tween-20) (Thermo Scientific 20x, kat. # 28360). Bunarčići se blokiraju sa 200 µL/bunarčiću Li-Cor Odyssey blokirajućeg pufera (TBS) (Li-Cor, kat. # 927-50000) 2 sata, a blokirajući pufer koji sadrži albumin se ne koristi. Bunarčići se isperu 5 puta sa 200-300 µL/bunarčiću 1x TBST. Dodaju se bunarčići za standardnu krivu za 50 µL/bunarčiću, kontrole kvaliteta (QC) i nepoznati uzorci razblaženi u normalnom CD1 mišjem serumu u razblaženju 1:4 u TBS. Standardna kriva, QC i nepoznati uzorci inkubiraju se na sobnoj temperaturi 1 sat.
[0353] Koncentracije za standardnu krivu bile su sledeće: 3.20 µg/ml; 1.60 µg/ml; 0.80 µg/ml; 0.40 µg/ml; 0.20 µg/ml; 0.10 µg/ml; 0.05 µg/ml; 0.025 µg/ml; i 0.00 µg/ml. Kontrole kvaliteta (QC) se zamrznu i alikvotiraju, i vrednosti proteina za standardnu krivu u koncentracijama "visoko", "srednje", i "nisko" na linearnom delu standardne krive, koje služe kao kontrole da se obezbedi da test radi dobro bile su sledeće: QC Visoko = 0.6 µg/ml; QC Srednje = 0.3 µg/ml; QC Nisko = 0.15 µg/ml i QC Nisko = 0.01 µg/ml.
[0354] Posle toga se bunarčići isperu 5 puta sa 200-300 µL/bunarčiću 1x TBST. 50 µL/bunarčiću 0.1 µg/mL Thermo Scientific/Pierce zečjeg anti-HSA-HRP konjugovanog (Thermo Scientific kat. # PA1-26887) razblaženog u 1x TBST doda se i inkubira 1 sat na sobnoj temperaturi. Ploče se isperu 6 puta sa 200-300 uL/bunarčiću 1x TBST. Posle toga, sledeći koraci i sredstva koriste se na sobnoj temperaturi.50 µL/bunarčiću 1-Step Ultra TMB - ELISA supstrata (Thermo Scientific kat. # 34028) zagrejanog na sobnu temperaturu doda se i inkubira 3-5 minuta na sobnoj temperaturi dok se ne razvije dovoljna obojenost. 50 µL/bunarčiću TMB Stop rastvora (0.16M sumporna kiselina, Thermo Scientific kat. # N600) zagrejanog na sobnu temperaturu odmah se doda i dobro izmeša. Ploče se odmah očitavaju na spektrofotometru na O.D.450 i na O.D.570. O.D. Očitavanje na 570 je pozadinsko očitavanje koje se oduzima od O.D. 450 očitavanja. Korišćenjem softverskog programa kao što je Molecular Devices SoftMax Pro ili Graph Pad Prism, vrednosti standardne krive se unose korišćenjem 4-parametarske podešene
14
krive i koncentracije nepoznatih uzoraka se interpoliraju sa standardne krive korišćenjem softvera.
Primer 13 - Smanjena hemaglutinacija prikazana SIRP-α varijantnim polipeptidima [0355] Kako je prikazano na SL.11, SIRP-α D1 varijantni polipeptidi pokazuju smanjenu ili obustavljenu hemaglutinaciju. Specifično, kada se dešava hemaglutinacija, prisutna je difuzna crvena boja umesto crvene tačke, kako je pokazano za pozitivnu kontrolu B6H12. Za SIRP-α D1 varijantne polipeptide testirane na SL. 11, postoji smanjenje ili izostanak hemaglutinacije.
[0356] Metodologije upotrebljene za ovaj Primer bile su sledeće: slojevi istaloženih leukocita i krvnih pločica (buffy coat) cele krvi čoveka dobijene od Stanford University Blood Center razblažene su fosfatom puferisanim slanim rastvorom (PBS, Gibco) u odnosu 1:2. Razblažena krv se podeli u dve epruvete i nanese na 20 ml Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare). Epruvete se centrifugiraju 30 minuta na 400 x g. Supernatanti se uklone i eritrocitni peleti se isperu dva puta dodavanjem 30 mL PBS i centrifugiranjem na 3500 RPM. Posle toga, izvodi se test hemaglutinacije na sledeći način: humani eritrociti se razblaže u PBS i prenesu u polistirenske ploče sa 96 bunarčića (Corning) pri 4 miliona ćelija po bunarčiću u zapremini od 75 µL. Petostruka serijska razblaženja naznačenih proteina dodaju se u bunarčiće u zapremini od 75 µL PBS, sa finalnom koncentracijom od 1000 nM do 0.488 nM. Kao negativna kontrola, u jedan red bunarčića doda se samo PBS. Eritrociti istaloženi na dno bunarčića, formiraju mali dobro definisani pelet. Kao pozitivna kontrola, ćelije se tretiraju anti-CD47 antitelom B6H12 (ebioscience). Ovo antitelo izaziva hemaglutinaciju u koncentracijama između 8 i 63 nM, na šta ukazuje formiranje velikog i difuznog ćelijskog peleta. Među testiranim konstruktima, polipeptidi na bazi IgG2 (SEQ ID NO: 109 i SEQ ID NO: 113) izazvali su blagu hemaglutinaciju pri 4 i 8 nM. Nije zapažena hemaglutinacija za sve druge polipeptidne konstrukte (bazirane na IgG1 i bazirane na HSA).
Primer 14 - Antitumorska aktivnost SEQ ID NO: 211 u mišjem singenskom modelu tumora
[0357] Korišćeni su C57BL/6 miševi (ženke stare 7 do 10 nedelja) dobijene od Charles River Laboratory. Ćelijska linija mišjeg adenokarcinoma kolona MC38 oporavljena je iz zamrznutog stoka i ćelije su rasle u RPMI 1640 koji sadrži 10% fetalni goveđi serum, penicilin-streptomicin, i L-glutamin. Ćelije se obore i resuspenduju u koncentraciji od 2E+07 ćelija/mL u medijumu koji ne sadrži serum, bez aditiva. Na Dan -7 (tj., 7 dana pre
14
projektovanog dana određivanja stadijuma), miševima se supkutanom injekcijom implantira u levi bok 100 µL (2.0 x 10<6>ćelija) po mišu sveže pripremljenih MC38 u fosfatom puferisanom slanom rastvoru (PBS). Kada tumori dostignu prosečnu zapreminu od približno 50 mm<3>, pedeset životinja sa uspostavljenim tumorima i umerenim telesnim težinama randomizuju se u 5 grupa tretmana (Grupa 1-5, n=10 miševa svaka). Počevši na Dan 1, miševi iz Grupa 1 do 5 tretiraju se prenosnikom (PBS), anti-mPD-L1 (Klon 10F.9G2, 200 µg), SEQ ID NO: 211 (200 µg), anti-mPD-L1 (200 µg) SEQ ID NO: 211 (100 µg), ili anti-mPD-L1 (200 µg) SEQ ID NO: 211 (200 µg), respektivno. Doze se primenjuju intraperitonealnom (IP) injekcijom 0.05 mL/mišu na dane 1, 4 i 7.
[0358] SEQ ID NO: 211 se napravi genetičkim fuzionisanjem SED ID NO: 206 za Fc domenski monomer. SEQ ID NO: 206 sadrži mutacije za koje je pokazano da poboljšavaju vezivanje za mišji CD47. Podaci o vezivanju prikazani su u Tabeli 18.
[0359] Kliničke opservacije i telesna težina prate se tokom studije do Dana 42. Veličina tumora meri se dva puta nedeljno, i na kraju studije, perpendikularne manje dimenzije (širina, width, W, i visina, height, H) i veća dimenzija (dužina, length, L) mere se korišćenjem mikro-pomičnog kljunastog merača (Mitutoyo, Aurora, Illinois). Zapremina tumora (mm<3>) izračunava se korišćenjem formule za elipsoidnu sferu (L x W<x>H / 2). Životinje u studiji bile su na human način žrtvovane kada su zapremine tumora kod pojedinačnih životinja prešle (ili bile blizu) 2500 mm<3>. Životinje preostale u studiji do Dana 42 korišćene su za analizu preživljavanja.
[0360] Tumori su rasli do različitog stepena u svih pet grupa. Među miševima doziranim prenosnikom ili SEQ ID NO: 211 (200 (Grupa 1, odnosno 3), žrtvovanje je počelo u toku 4. nedelje (od Dana 25) i sve životinje u ovim grupama bile su mrtve do kraja 5. nedelje (Dan 35). Među miševima koji su bili dozirani anti-mPD-L1 (samim ili u kombinaciji sa SEQ ID NO: 211; Grupe 2, 4, i 5), žrtvovanje je počelo u toku 5. nedelje (od Dana 29 ili 32) ali podgrupa (40-70%) ovih životinja preživela je do predviđenog kraja studije (Dan 42). SL.12 prikazuje krive preživljavanja za svaku grupu tretmana tokom trajanja studije. Numerički, grupa tretmana anti-mPD-L1 plus 200 µg SEQ ID NO: 211 imala je veći broj preživelih životinja, posle toga sledila je grupa tretmana anti-mPD-L1 plus 100 µg SEQ
14
ID NO: 211 i grupa samo anti-mPD-L1, sa 7 od 10 (70%), 5 od 10 (50%), odnosno 4 od 10 (40%) miševa koji su preostali na Dan 42 (Tabela 25). Medijana preživljavanja bila je 29, odnosno 30.5 dana za tretman prenosnikom (Grupa 1) i SEQ ID NO: 211 samim (Grupa 3). Medijana preživljavanja porasla je na 42 dana za tretmane anti-mPD-L1 samim (Grupa 2) i anti-PD-L1 plus 100 µg SEQ ID NO: 211 (Grupa 4). Medijana preživljavanja za tretman anti-mPD-L1 plus 200 µg SEQ ID NO: 211 (Grupa 5) nije određivana jer je više od 50% životinja preostalo na kraju studije (Dan 42).
[0361] Tumori su pokazali brz rast u grupi tretmana prenosnikom, što ukazuje na to da tumor raste u odsustvu efikasnog tretmana. Doziranje sa 200 µg SEQ ID NO: 211 (Grupa 3) daje značajno slabljenje rasta tumora samo u nekim vremenskim tačkama (Dan 7 i 14, za sirovu i normalizovanu zapreminu tumora) u poređenju sa doziranjem prenosnikom. Doziranje sa 200 µg anti-mPD-L1, samim ili u kombinaciji sa SEQ ID NO: 211 (Grupe 2, 4, i 5), obezbeđuje značajno slabljenje rasta tumora od Dana 4 ili 7 (za sirovu, odnosno normalizovanu zapreminu tumora) u poređenju sa doziranjem prenosnikom (SL. 13 i Tabela 26). Dodavanje SEQ ID NO: 211 anti-mPD-L1 režimu (Grupa 2 u odnosu na 4 ili Grupa 2 u odnosu na.5) dovodi do dodatne inhibicije rasta tumora nad tretmanom samo anti-mPD-L1. Zapremine tumora na Dan 22, uključujući inhibiciju rasta tumora (tumor growth inhibition, %TGI), dati su u Tabeli 26. Dan 22 upotrebljen je za poređenje jer je taj dan poslednja vremenska tačka u kojoj su sve životinje bile još uvek žive. Inhibicija rasta tumora (% TGI) na Dan 22 u odnosu na Dan 1 bila je 83%, 81% i 77% za anti-mPD-L1
1
plus 200 µg SEQ ID NO: 211 grupu, anti-mPD-L1 plus 100 µg SEQ ID NO: 211 grupu i
anti-mPD-L1 samo grupu, respektivno (Tabela 26).
Tabela 26. Analiza zapremine tumora
1 1
Primer 15 - Optimizujuća kombinovana terapija za lečenje kancera
[0362] Polipeptidi koji uključuju visokoafinitetnu SIRP-α D1 varijantu primenjuju se zajedno sa inhibitorima kontrolnih tačaka za lečenje različitih kancera u modelima na miševima, npr., solidnog malignog tumora i hematološkog kancera. Imunski sistem može prepoznati kancere, i pod nekim uslovima, imunski sistem može biti uključen u eliminisanje tumora. Blokiranje koinhibitornih molekula, kao što su CTLA-4, PD-1, i LAG-3, može biti uključeno u pojačavanje odgovora T-ćelija protiv tumora. Polipeptidi opisani u ovom tekstu primenjuju se u kombinaciji sa inhibitorom kontrolne tačke, kao što je antitelo inhibitor CTLA-4 (npr., ipilimumab, tremelimumab), PD-1 (nivolumab, pidilizumab, MK3475 poznat i kao pembrolizumab, BMS936559, i MPDL3280A), i LAG-3 (npr., BMS986016).
[0363] Uspostavljeni A20 tumori u BALB/c miševima (npr., modeli limfoma) tretiraju se antitelom inhibitorom CTLA-4 i visokoafinitetnom SIRP-α D1 varijantom fuzionisanom sa IgG Fc varijantom obezbeđenom u ovom tekstu (npr., SIRP-α konstrukt). Počevši na Dan 1, miševi se tretiraju prenosnikom (PBS), tremelimumabom (200 µg) SIRP-α konstruktom (100 µg), ili tremelimumabom (200 µg) SIRP-α konstruktom (200 µg). Doze se daju intraperitonealnom (IP) injekcijom u količini 0.05 mL/mišu na dane 1, 4 i 7. Odgovor tumora na kombinovanu terapiju određuje se dnevno merenjem zapremine tumora. Ako na dan 4, zapremina tumora miševa tretiranih kombinovanom terapijom ne pokaže značajno poboljšenje, tremelimumab se zamenjuje ipilimumabom. Slično tome, ako na dan 7, zapremina tumora miševa tretiranih kombinovanom terapijom ne pokaže značajno poboljšenje, tremelimumab se zamenjuje ipilimumabom. Očekuje se da iako tremelimumab i ipilimumab ciljaju isti protein kontrolne tačke, oni imaju različitu terapijsku efikasnost i sinergističke efekte sa SIRP-α konstruktom zbog svojih različitih Fc regiona. Tremelimumab je IgG2 antitelo koje može biti efikasnije pri fiksiranju komplementa dok je ipilimumab IgG1 antitelo koje može biti korisno u sprečavanju eliminacije aktiviranih T-ćelija.
Primer 16 - Postupak lečenja kancera koji eksprimira epitelni marker
[0364] SIRP-α polipeptidni konstrukti, kao što je visokoafinitetna SIRP-α D1 varijanta (npr., bilo koja varijanta data u Tabelama 2, 5, i 6) fuzionisani sa IgG Fc varijantom, primenjuju se za lečenje kancera koji eksprimira marker epitelne ćelije. Povećana fagocitoza koja rezultuje iz blokade CD47 signalizacije, na primer SIRP-α D1 konstruktom, može zavisiti od prisustva makrofaga. Stoga, primena SIRP-α D1 polipeptidnog konstrukta u kombinaciji sa antitelom koje cilja epitelni marker koji se
1 2
eksprimira u ili na kancerskoj ćeliji koristi se za lečenje kancera smanjujući rizik od sporednih efekata, npr., fagocitoze epitelnih ćelija, zbog niske zastupljenosti makrofaga na periferiji kože.
[0365] Mišji modeli kancera koji eksprimiraju epitelni marker, na primer EGFR ili EpCAM, primenjuju SIRP-α konstrukt u kombinaciji sa antitelom koje cilja epitelni marker, npr., anti-EGFR antitelo ili anti-EpCAM antitelo. Antitela koja ciljaju epitelne markere mogu prepoznati i kancerske i nekancerske ćelije, na primer nekancerske ćelije na periferiji kože. Međutim, očekuje se da nekancerske ćelije na periferiji kože neće podleći fagocitozi zbog niske zastupljenosti makrofaga u blizini kože.
Primer 17 - Fagocitoza jednogranim SIRP-α - Fc fuzijama
[0366] Da bi se dobila kvantitativna mera fagocitoze indukovane SIRP-α - Fc fuzijama koje imaju jedan SIRP-α molekul (npr., jednograni molekul) (prikazan na SL.1, 4A, i 4B), test fagocitoze sa različitim tipovima ćelija MM1R i N87 ćelijama izvodi se korišćenjem postupaka opisanih u Primeru 8.
[0367] Šest jednogranih konstrukata testira se u pogledu fagocitoze in vitro. Ovi jednograni konstrukti generisani su korišćenjem strategija "čvorić u rupici". Homodimerna SIRP-α Fc fuzija SEQ ID NO: 136 koristi se za poređenje kao dvograna kontrola. Prva jednograna SIRP-α Fc fuzija (npr., A) formira se od heterodimera SEQ ID NO: 139 (Fc varijanta) i SEQ ID NO: 138 (SIRP-α Fc fuzija). Druga jednograna SIRP-α Fc fuzija (npr., B) formira se od heterodimera SEQ ID NO: 141 (Fc varijanta) i SEQ ID NO: 140 (SIRP-α Fc fuzija). Treća jednograna SIRP-α Fc fuzija (npr., C) formira se od heterodimera SEQ ID NO: 139 (Fc varijanta) i SEQ ID NO: 142 (SIRP-α Fc fuzija). Četvrta jednograna SIRP-α Fc fuzija (npr., D) formira se od heterodimera SEQ ID NO: 141 (Fc varijanta) i SEQ ID NO: 143 (SIRP-α Fc fuzija). Peta jednograna SIRP-α Fc fuzija (npr., E) formira se od heterodimera SEQ ID NO: 147 (Fc varijanta) i SEQ ID NO: 146 (SIRP-α Fc fuzija). Šesta jednograna SIRP-α Fc fuzija (npr., F) formira se od heterodimera SEQ ID NO: 149 (Fc varijanta) i SEQ ID NO: 148 (SIRP-α Fc fuzija). CD47 vezujući afiniteti (KD) SIRP-α jednogranog kada se testira kao monomer su sledeći:~10 pM (A,B), ~100 pM (C, D) i ~5 nM (E, F). Sekvence su date u Tabeli 27 u nastavku ovog teksta.
Tabela 27. Aminokiselinske sekvence SIRPα - Fc fuzija za konstruisanje heterodimera
1
14
[0368] SL. 15-17 prikazuju fagocitozu linije multiplog mijeloma 1R (MM1R) i linije gastričnog karcinoma N87 nepolarizovanim makrofagima poreklom od humanih monocita. "+" i "-" označava dodavanje ili odsustvo daratumumaba (Dara) respektivno na SL. 15-16. Na SL. 17, "+" i "-" označavaju dodavanje, odnosno odsustvo herceptina/trastuzumaba (Her).
[0369] SL.15 prikazuje konstrukt A u prisustvu kontrolnog antitela (IgG1,k), npr., "A-" ima odstranjenu fagocitozu kao pojedinačno sredstvo dok može da poveća fagocitozu u prisustvu daratumumaba (Dara), npr., "A+". Slično tome, konstrukt B u prisustvu kontrolnog antitela (IgG1,k), npr., "B-" pokazuje odsustvo fagocitoze kao pojedinačno sredstvo dok može da poveća fagocitozu u prisustvu daratumumaba (Dara), npr., "B+". Procenat makrofaga koji fagocituju MM1R i koji su CFSE<+>naveden je na y-osi. Koncentracija CD47-vezujućih mesta iz dodavanja konstrukta A, B, ili kontrolnog konstrukta naznačena je na x-osi. Nivoi fagocitoze uporedivi su sa kontrolnim konstruktom (koji je dvograni SIRP-α). Nivo fagocitoze koji je rezultat inkubacije sa anti-CD47 antitelom, npr. B6H12 (100 nM), uporediv je sa inkubacijom sa Dara, npr. PBS+. Kako je prikazano, jednograne SIRP-α - Fc fuzije mogu povećati Dara fagocitozu uporedivo sa dvogranim SIRP-α - Fc fuzijama.
[0370] SL. 16 prikazuje konstrukt C u prisustvu kontrolnog antitela (IgG1,k), npr., "C-" pokazuje odsustvo fagocitoze u testu fagocitoze kao pojedinačno sredstvo dok može da poveća fagocitozu u prisustvu daratumumaba (Dara), npr., "C+". Slično tome, konstrukt
1
D u prisustvu kontrolnog antitela (IgG1,k), npr., "D-" pokazuje odsustvo fagocitoze u testu fagocitoze kao pojedinačno sredstvo dok može da poveća fagocitozu u prisustvu daratumumaba (Dara), npr., "D+". Procenat makrofaga koji fagocituju MM1R i koji su CFSE<+>naznačen je na y-osi. Koncentracija CD47 vezujućih mesta iz dodavanja konstrukta C, D, ili kontrolnog konstrukta naznačena je na x-osi. Nivoi fagocitoze uporedivi su sa kontrolnim konstruktom (koji je dvograni SIRP-α). Nivo fagocitoze koji je rezultat inkubacije sa anti-CD47 antitelom, npr. B6H12 (100 nM), uporediv je sa inkubacijom sa Dara, npr. PBS+. Kako je prikazano, jednograne SIRP-α - Fc fuzije mogu povećati Dara fagocitozu uporedivo sa dvogranim SIRP-α - Fc fuzijama. Kako je prikazano, jednograne SIRP-α - Fc fuzije mogu povećati Dara fagocitozu uporedivo sa dvogranim SIRP-α - Fc fuzijama.
[0371] SL. 17 prikazuje fagocitozu u prisustvu niskoafinitetnih jednogranih SIRP-α konstrukata (E, F) što je izvedeno na sličan način kao u gornjim primerima. Kako je pokazano, ovi niskoafinitetni jednograni SIRP-α konstrukti (E, F) u kombinaciji sa herceptinom pokazuju uporedivu fagocitozu N87 ćelija sa herceptinom samim (PBS+). Prema tome, 5 nM afinitet za CD47 nije dovoljan za jednogranu SIRP-α-Fc fuziju da pojača in vitro fagocitozu u kombinaciji sa herceptinom.
Primer 17 - Unakrsna reaktivnost visokoafinitetnih SIRP-α D1 varijanti
[0372] Polipeptidi visokoafinitetnih SIRP-α D1 varijanti generisani su kako je ranije opisano. Vezivanje za humani, mišji i pacovski CD47 određuje se korišćenjem SPR, mereno pomoću Biacore T100 instrumenta (GE Healthcare) i Proteon XPR36 (Bio-rad, Hercules, CA) kako je opisano u Primeru 1. SEQ ID NO: 215 je inženjerisana SIRP-α D1 varijanta koja se ne vezuje za humani, mišji ili pacovski CD47 i koristi se kao negativna kontrola.
Tabela 28. Reprezentativni unakrsno-vrsni CD47 vezujući afinitet za visokoafinitetne SIRP-α varijante
1
[0373] S EQ ID NO: 215:
Primer 18 - Antitumorska aktivnost visokoafinitetnih SIRP-α konstrukata u mišjem ksenokalemskom modelu tumora
[0374] Imunodeficijentni NOD scid gama (NSG) miševi (NOD.Cg-Prkdc<scid>Il2rg<-tm1Wjl>/SzJ; 50 ženki, plus rezerve) nabavljeni su kao životinje stare 6 do 10 nedelja. Ćelije ćelijske linije humanog limfoma GFP-Luc-Raji rasle su u RPMI 1640 koji sadrži 10% fetalni goveđi serum, penicilin, streptomicin, i L-glutamin. Ćelije se zatim obore i resuspenduju u koncentraciji od 1.0 x 10<7>ćelija/mL u medijumu koji ne sadrži serum, bez aditiva, i kombinuju 1:1 sa Matrigel™ (Trevigen, Gaithersburg, MD). Na Dan -11 (tj., 11 dana pre projektovanog dana određivanja stadijuma), miševima se implantira supkutanom injekcijom u levi bok 200 µL (1.0 x 10<6>ćelija) po mišu sveže pripremljene mešavine GFP-Luc-Raji:Matrigel. Kada tumori dostignu prosečnu zapreminu od približno 55 mm<3>, pedeset životinja sa uspostavljenim tumorima i umerenim telesnim težinama randomizuju
1
se u 5 grupa tretmana (Grupe 1-5, n=10 miševa svaka). Počevši od Dana 1, Grupe 1 do 5 tretiraju se sa (1) SEQ ID NO: 215 [10 mg/kg (mpk), 3x/nedeljno]; (2) SEQ ID NO: 104 (10 mpk, 3x/nedeljno); (3) rituksimabom (5 mpk, 2x/nedeljno) SEQ ID NO: 100 (10 mpk, 3x/nedeljno); (4) rituksimabom (5 mpk, 2x/nedeljno) SEQ ID NO: 104 (10 mpk, 3x/nedeljno); ili (5) rituksimabom (5 mpk, 2x/nedeljno) SEQ ID NO: 215 (10 mpk, 3x/nedeljno), respektivno. Doze se daju intraperitonealnom (IP) injekcijom u količini od 0.05 mL/mišu. Za sve životinje, doze se daju počevši od dana određivanja stadijuma i nastavljaju se ukupno 31 dan (Dani 1-31).
[0375] Klinička zapažanja beleže se dva puta dnevno (ujutru i uveče). Dodatni nalazi se beleže ako se primete. Telesna težina se meri tri puta nedeljno korišćenjem elektronske vage (Ohaus SCOUT<®>PRO). Veličina tumora se meri tri puta nedeljno, korišćenjem mikro-pomičnog kljunastog merača (Mitutoyo, Aurora, Illinois) da bi se izmerile perpendikularne manje dimenzije (širina, W, i visina, H) i veća dimenzija (dužina, L). Zapremina tumora (mm<3>) izračunava se korišćenjem formule za zapreminu elipsoidne sfere (L x W<x>H / 2). Uzorci krvi uzeti su od 20 životinja na Dan 1 (bazalna vrednost; pre raspoređivanja u grupe) i od svih životinja na Dan 8 (Nedelja 1) i Dan 31 (na kraju). Uzorci krvi dati su na analizu kompletne krvne slike (complete blood counts, CBC) na dan uzimanja krvi.
[0376] SIRP-α konstrukt SEQ ID NO: 215 ne pokazuje merljivo vezivanje za CD47 (vidi Tabelu 28). Tumori u grupi doziranoj sa SEQ ID NO: 215 (Grupa 1) rasli su linearno do Dana 31 (SL.19A), slično tumorima zapaženim u grupi tretiranoj PBS kao prenosnikom istog modela (podaci nisu prikazani). Ovo zapažanje pokazuje da tumori nastavljaju da rastu u odsustvu efikasnog tretmana.
[0377] Upoređivanja Grupa 1 i 5 (SEQ ID NO: 215 sa ili bez rituksimaba) i Grupa 2 i 4 (SEQ ID NO: 104 sa ili bez rituksimaba) pokazuje da kombinovani tretman dovodi do značajnog smanjenja zapremine tumora, i kao sirovih vrednosti (od Dana 9) i kao normalizovanih vrednosti (od Dana 7). Do Dana 16, trećina miševa u Grupi 3 (SEQ ID NO: 100 rituksimab) i Grupi 4 (SEQ ID NO: 104 rituksimab) više ne nosi detektabilne tumore; ova dva kombinovana tretmana pokazuju sličnu efikasnost. Nasuprot tome, rast tumora izgleda da se ponovo javlja kod životinja iz Grupe 5 (SEQ ID NO: 215 rituksimab) od Dana 18 nadalje. Zapremine tumora u svih pet grupa tokom perioda studije (srednja vrednost /- SEM i pojedinačni dijagrami rasejanja) prikazani su na SL. 19A, odnosno SL.19B.
[0378] Vrednosti za kompletnu krvnu sliku (CBC) (crvene krvne ćelije, hemoglobin, hematokrit, pločice, itd.) merene su pre doziranja (Dan 1), 1 nedelju posle doziranja (Dan
1
9), i 4 nedelje posle doziranja (Dan 31). Parametri se nisu značajno razlikovali posle Nedelje 1 ili Nedelje 4 između pet grupa. Vrednosti hemoglobina (HGB) prikazane su na SL. 19C. Ovi rezultati pokazuju da visokoafinitetni SIRP-α konstrukti mogu efikasno da smanje rast tumora i sinergizuju se sa rituksimabom u mišjem modelu kancera in vivo. Pored toga, nasuprot tretmanima na bazi anti-CD47 antitela, nisu zapažene akutne epizode anemije ni u jednoj od testnih grupa tretiranih visokoafinitetnim SIRP-α konstruktima.
Primer 19: SIRP-α Fc varijantni konstrukti pokazuju smanjenu toksičnost prema crvenim krvnim ćelijama
[0379] Gubitak crvenih krvnih ćelija predstavlja problem kada se cilja CD47. Da bi se ispitali efekti SIRP-α Fc varijantnog konstrukta na toksičnost prema crvenim krvnim ćelijama, miševi se tretiraju visokoafinitetnim SIRP-α varijantnim konstruktom koji sadrži ili divlji tip IgG1 Fc konstrukta (SEQ ID NO: 216) ili IgG1 Fc varijanti konstrukt (SEQ ID NO:96) sa IgG1 mutacijama L234A, L235A, G237A, i N297A (IgG1_AAA_N297A). Miševi se rasporede u pet grupa od po šest životinja i tretiraju se na dan 1 i 7 (vidi pune strelice na SL.20) korišćenjem: (1) PBS; (2) 10 mg/kg SEQ ID NO: 216 (divlji tip IgG1 Fc); (3) 30 mg/kg SEQ ID NO: 216; (4) 10 mg/kg SEQ ID NO: 96 (IgG1_AAA_N297A); ili (5) 30 mg/kg SEQ ID NO: 96. Bazalne vrednosti kompletne krvne slike (CBC) određuju se kod svih životinja na dan -7 i kod tri od šest životinja na dan 1. Tri životinje od kojih se uzima krv (vidi SL.20) rotiraju se u svakoj grupi da se ne prevaziđe dozvoljena količina krvi koja se može uzeti u jednoj nedelji. Kako je pokazano na SL. 20, tretman divljim tipom IgG1 koji sadrži SIRP-α D1 varijantni konstrukt rezultuje dozno-zavisnim smanjenjem broja eritrocita. Suprotno tome, tretman IgG1_AAA_N297A koji sadrži SIRP-α D1 varijantni konstrukt rezultuje brojem crvenih krvnih ćelija sličnim onom u PBS kontrolnoj grupi.
1

Claims (12)

PATENTNI ZAHTEVI
1. Polipeptid, naznačen time, što sadrži signal-regulatorni protein α (SIRP-α) D1 varijantu i Fc varijantu, pri čemu polipeptid sadrži sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od: SEQ ID NO: 98-104, 107-113, 116-122, i 135-136.
2. Dimer, naznačen time, što se sastoji od dve kopije polipeptida iz patentnog zahteva 1.
3. Nukleinska kiselina, naznačena time, što kodira polipeptid iz patentnog zahteva 1.
4. Vektor, naznačen time, što uključuje nukleinsku kiselinu iz patentnog zahteva 3.
5. Ćelija-domaćin, naznačena time, što uključuje nukleinsku kiselinu iz patentnog zahteva 3 ili vektor iz patentnog zahteva 4.
6. Postupak proizvodnje polipeptida iz patentnog zahteva 1, naznačen time, što uključuje kultivisanje ćelije-domaćina iz patentnog zahteva 5 pod odgovarajućim uslovima da bi došlo do ekspresije polipeptida, i oporavak polipeptida.
7. Farmaceutska kompozicija, naznačena time, što uključuje polipeptid iz patentnog zahteva 1, ili dimer iz patentnog zahteva 2, i farmaceutski prihvatljivi nosač.
8. Farmaceutska kompozicija iz patentnog zahteva 7 za upotrebu u postupku lečenja kancera.
9. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 8, pri čemu je kancer solidni maligni tumor, hematološki kancer, akutna mijeloidna leukemija, hronična limfocitna leukemija, hronična mijeloidna leukemija, akutna limfoblastna leukemija, ne-Hodgkinov limfom, Hodgkinov limfom, multipli mijelom, kancer mokraćne bešike, kancer pankreasa, kancer cerviksa, kancer endometrijuma, kancer pluća, kancer bronhija, kancer jetre, kancer ovarijuma, kancer kolona i rektuma, kancer želuca, gastrični kancer, kancer žučne kese, maligni tumor gastrointestinalne strome, tiroidni kancer, kancer glave i vrata, orofaringealni kancer, kancer ezofagusa, melanom, nemelanomski kancer kože, karcinom Merkelovih ćelija, virusom indukovani kancer, neuroblastom, kancer dojke, kancer prostate, kancer bubrega, kancer bubrežnih ćelija, kancer bubrežne karlice, leukemija, limfom, sarkom, gliom, tumor mozga, ili karcinom.
10. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 8 ili 9, pri čemu postupak uključuje primenu farmaceutske kompozicije i terapijskog antitela.
11. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 10, pri čemu se terapijsko antitelo vezuje za 4-1BB, 5T4, ALK1, ANG-2, B7-H3, B7-H4, c-Met, CA6, CCR4, CD123, CD19, CD20, CD22, CD27, EpCAM, CD30, CD32b, CD33, CD37, CD38, CD40, CD52, CD70, CD74, CD79b, CD98, CEA, CEACAM5, CLDN18.2, CLDN6, CS1, CTLA-4, CXCR4, DLL-4, EGFR, EGP-1, ENPP3, EphA3, ETBR, FGFR2, fibronektin, FR-alfa, Frizzled receptor, GCC, GD2, glipikan-3, GPNMB, HER2, HER3, HLA-DR, ICAM-1, IGF-1R, IL-3R, LIV-1, mezotelin, MUC16, MUC1, NaPi2b, Nektin-4, Notch 2, Notch 1, OX-40, PD-1, PD-L1, PD-L2, PDGFR-α, PS, PSMA, SLTRK6, STEAP1, TEM1, VEGFR, CD25, DKK-1, ili CSF-1R.
12. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 10, pri čemu je terapijsko antitelo cetuksimab, necitumumab, pembrolizumab, nivolumab, pidilizumab, MEDI0680, atezolizumab, avelumab, durvalumab, MEDI6383, MEDI6469, RG7888, ipilimumab, tremelimumab, urelumab, PF-05082566, enoblituzumab, vantiktumab, varlilumab, mogamulizumab, SAR650984, daratumumab, trastuzumab, trastuzumab emtanzin, pertuzumab, elotuzumab, rituksimab, ofatumumab, obinutuzumab, RG7155, FPA008, panitumumab, ili brentuksimab vedotin.
1 1
RS20210912A 2015-08-07 2016-08-05 Konstrukti koji sadrže sirp-alfa domen ili njegovu varijantu RS62151B1 (sr)

Applications Claiming Priority (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562202772P 2015-08-07 2015-08-07
US201562202779P 2015-08-07 2015-08-07
US201562202775P 2015-08-07 2015-08-07
US201562265887P 2015-12-10 2015-12-10
US201662276796P 2016-01-08 2016-01-08
US201662276801P 2016-01-08 2016-01-08
US201662346414P 2016-06-06 2016-06-06
EP16835723.4A EP3331902B1 (en) 2015-08-07 2016-08-05 Constructs having a sirp-alpha domain or variant thereof
PCT/US2016/045914 WO2017027422A1 (en) 2015-08-07 2016-08-05 Constructs having a sirp-alpha domain or variant thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS62151B1 true RS62151B1 (sr) 2021-08-31

Family

ID=57983500

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20210912A RS62151B1 (sr) 2015-08-07 2016-08-05 Konstrukti koji sadrže sirp-alfa domen ili njegovu varijantu

Country Status (33)

Country Link
US (5) US10259859B2 (sr)
EP (2) EP3331902B1 (sr)
JP (4) JP6898303B2 (sr)
KR (2) KR102855748B1 (sr)
CN (3) CN117777267A (sr)
AU (2) AU2016304794B2 (sr)
CA (1) CA2993835A1 (sr)
CL (3) CL2018000340A1 (sr)
CO (1) CO2018002471A2 (sr)
CY (1) CY1124372T1 (sr)
DK (1) DK3331902T3 (sr)
ES (1) ES2881771T3 (sr)
GE (4) GEAP202215294A (sr)
HR (1) HRP20211167T1 (sr)
HU (1) HUE055139T2 (sr)
IL (3) IL294679B2 (sr)
LT (1) LT3331902T (sr)
MX (2) MX395275B (sr)
MY (1) MY185014A (sr)
NZ (1) NZ738950A (sr)
PE (1) PE20180778A1 (sr)
PH (1) PH12018500269B1 (sr)
PL (1) PL3331902T3 (sr)
PT (1) PT3331902T (sr)
RS (1) RS62151B1 (sr)
RU (2) RU2740672C2 (sr)
SA (1) SA518390881B1 (sr)
SG (2) SG10201912905VA (sr)
SI (1) SI3331902T1 (sr)
SM (1) SMT202100424T1 (sr)
UA (2) UA130083C2 (sr)
WO (1) WO2017027422A1 (sr)
ZA (3) ZA201800857B (sr)

Families Citing this family (133)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10053513B2 (en) * 2009-11-30 2018-08-21 Janssen Biotech, Inc. Antibody Fc mutants with ablated effector functions
US12466897B2 (en) 2011-10-10 2025-11-11 Xencor, Inc. Heterodimeric human IgG1 polypeptides with isoelectric point modifications
US10858417B2 (en) 2013-03-15 2020-12-08 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
KR102689285B1 (ko) 2014-11-26 2024-07-31 젠코어 인코포레이티드 Ｃｄ3 및 종양 항원과 결합하는 이종이량체 항체
US20170151281A1 (en) 2015-02-19 2017-06-01 Batu Biologics, Inc. Chimeric antigen receptor dendritic cell (car-dc) for treatment of cancer
HRP20211167T1 (hr) 2015-08-07 2021-10-15 ALX Oncology Inc. Konstrukcije koje imaju sirp-alfa domenu ili njihove varijante
SI3341015T2 (sl) 2015-08-26 2024-03-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford, Junior University Izboljšana deplecija ciljanih celic z blokado CD47 in imunostimulatornim agonistom
CN116063566A (zh) 2015-10-01 2023-05-05 热生物制品有限公司 作为异源嵌合蛋白邻接i型和ii型胞外结构域的组合物和方法
SG11201805894YA (en) 2016-01-11 2018-08-30 Forty Seven Inc Humanized, mouse or chimeric anti-cd47 monoclonal antibodies
US11560433B2 (en) 2016-05-27 2023-01-24 Albert Einstein College Of Medicine Methods of treatment by targeting VCAM1 and MAEA
CN110267977A (zh) 2016-08-10 2019-09-20 亚洲大学校产学协力团 细胞因子免疫球蛋白Fc融合异二聚体和包含其的药物组合物
US11299530B2 (en) 2017-01-05 2022-04-12 Kahr Medical Ltd. SIRP alpha-CD70 fusion protein and methods of use thereof
WO2018127919A1 (en) 2017-01-05 2018-07-12 Kahr Medical Ltd. A SIRP1 alpha-41BBL FUSION PROTEIN AND METHODS OF USE THEREOF
LT3565579T (lt) 2017-01-05 2023-09-11 Kahr Medical Ltd. Pd1-41bbl sulietas baltymas ir jo panaudojimo būdai
WO2018127916A1 (en) 2017-01-05 2018-07-12 Kahr Medical Ltd. A pd1-cd70 fusion protein and methods of use thereof
MX2019009255A (es) 2017-02-06 2019-11-05 Orionis Biosciences Nv Proteínas quiméricas dirigidas y sus usos.
EP3585409A4 (en) 2017-02-27 2020-12-02 Shattuck Labs, Inc. CHEMERICAL PROTEINS BASED ON CSF1R
JP7260477B2 (ja) * 2017-02-27 2023-04-18 シャタック ラボ，インコーポレイテッド Ｔｉｇｉｔ及びｌｉｇｈｔベースのキメラタンパク質
EP3600424A4 (en) * 2017-03-28 2020-12-23 Trillium Therapeutics Inc. CD47 BLOCKED THERAPY
EP3623388A4 (en) * 2017-05-08 2021-08-04 Shanghai JMT-Bio Technology Co., Ltd. BISPECIFIC RECOMBINANT PROTEIN AND ITS USE
AU2018281337B2 (en) * 2017-06-06 2022-08-25 Relinia, Inc. Single-chain TNF receptor 2 agonist fusion proteins
US11529425B2 (en) 2017-09-07 2022-12-20 Dingfu Biotarget Co., Ltd. Immunoconjugates comprising signal regulatory protein alpha
CA3084391C (en) 2017-11-20 2023-10-10 Taizhou Mabtech Pharmaceutical Co., Ltd A bifunctional fusion protein targeting cd47 and pd-l1
BR112020011295A2 (pt) 2017-12-04 2020-11-24 Beijing Hanmi Pharmaceutical Co., Ltd. anticorpo biespecífico anti-pd-l1/anti-cd47 com estrutura semelhante ao anticorpo natural e em forma de heterodímero e preparação do mesmo
CN109971716B (zh) * 2017-12-28 2023-08-01 上海细胞治疗研究院 自分泌cd47抗体的egfr特异性car-t细胞及其用途
AU2019218271B2 (en) 2018-02-12 2024-12-12 Forty Seven, LLC Anti-cancer regimen using anti-CD47 and anti-CD20 antibodies
CN111836647A (zh) * 2018-03-13 2020-10-27 延龄草治疗公司 Cd47阻断疗法和cd38抗体的组合
WO2019173903A1 (en) * 2018-03-13 2019-09-19 Trillium Therapeutics Inc. Improvements in cd47 blockade therapy by egfr antibody
CN110386984B (zh) * 2018-04-17 2022-04-22 杭州尚健生物技术有限公司 结合cd47蛋白的融合蛋白及其应用
US20210221914A1 (en) * 2018-05-17 2021-07-22 Immunome, Inc. Ch3 domain epitope tags
US20210221908A1 (en) 2018-06-03 2021-07-22 Lamkap Bio Beta Ltd. Bispecific antibodies against ceacam5 and cd47
CA3104780A1 (en) * 2018-07-11 2020-01-16 Kahr Medical Ltd. Sirpalpha-4-1bbl variant fusion protein and methods of use thereof
US12286466B2 (en) 2018-07-11 2025-04-29 Kahr Medical Ltd. PD1-4-1BBL variant fusion protein and methods of use thereof
EP3833391A4 (en) 2018-08-08 2022-08-10 Orionis Biosciences, Inc. CHIMERIC PROTEINS TARGETED AT SIRP1alpha AND THEIR USES
US10780121B2 (en) 2018-08-29 2020-09-22 Shattuck Labs, Inc. FLT3L-based chimeric proteins
JP2021534769A (ja) * 2018-08-31 2021-12-16 エーエルエックス オンコロジー インコーポレイテッド デコイポリペプチド
US11591390B2 (en) 2018-09-27 2023-02-28 Celgene Corporation SIRP-α binding proteins and methods of use thereof
TW202028237A (zh) 2018-09-27 2020-08-01 美商西建公司 SIRPα結合蛋白及其使用方法
US12331320B2 (en) 2018-10-10 2025-06-17 The Research Foundation For The State University Of New York Genome edited cancer cell vaccines
CN109306017B (zh) * 2018-10-12 2021-02-09 倍而达药业（苏州）有限公司 一种基于SIRP-αD1突变体制备的重组蛋白及应用
TWI891611B (zh) * 2018-10-23 2025-08-01 美商蜻蜓醫療公司 異二聚體fc融合蛋白
WO2020097193A1 (en) 2018-11-06 2020-05-14 The Regents Of The University Of California Chimeric antigen receptors for phagocytosis
CN111303293B (zh) * 2018-11-14 2022-08-30 杭州尚健生物技术有限公司 一种融合蛋白及其用途
CN109517054B (zh) * 2018-12-04 2022-04-08 江苏东抗生物医药科技有限公司 SIRPα变体或其融合蛋白及其应用
CA3132078A1 (en) 2019-03-06 2020-09-10 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. Bifunctional fusion protein and pharmaceutical use thereof
WO2020200941A1 (en) 2019-03-29 2020-10-08 F. Hoffmann-La Roche Ag Spr-based binding assay for the functional analysis of multivalent molecules
CN111763261B (zh) * 2019-04-02 2022-08-09 杭州尚健生物技术有限公司 一种融合蛋白及其用途
US11026973B2 (en) 2019-04-30 2021-06-08 Myeloid Therapeutics, Inc. Engineered phagocytic receptor compositions and methods of use thereof
US11613564B2 (en) * 2019-05-31 2023-03-28 ALX Oncology Inc. Methods of treating cancer
CN114786708A (zh) * 2019-06-05 2022-07-22 亚设生物治疗公司 用于调节免疫细胞功能的突变体白介素-2多肽与抗原结合分子的融合物
US20200400662A1 (en) 2019-06-07 2020-12-24 ALX Oncology Inc. Methods and reagents for reducing the interference of drugs that bind cd47 in serological assays
CN112125975B (zh) * 2019-06-25 2024-03-01 上海翰森生物医药科技有限公司 Pd-l1和cd47双特异性融合蛋白及其医药用途
KR102228271B1 (ko) * 2019-07-16 2021-03-17 한국과학기술연구원 항암활성을 갖는 면역조절 단백질-siRNA 복합체
KR102922000B1 (ko) 2019-07-16 2026-02-05 길리애드 사이언시즈, 인코포레이티드 Hiv 백신, 및 이의 제조 및 사용 방법
CA3149897A1 (en) 2019-09-03 2021-03-11 Daniel Getts Methods and compositions for genomic integration
AU2020365113B2 (en) 2019-10-18 2025-04-24 Forty Seven, LLC Combination therapies for treating myelodysplastic syndromes and acute myeloid leukemia
US20210147568A1 (en) 2019-10-31 2021-05-20 Forty Seven, Inc. Anti-cd47 based treatment of blood cancer
JP7713447B2 (ja) * 2019-11-27 2025-07-25 エーエルエックス オンコロジー インコーポレイテッド がんを治療するための組み合わせ療法
US10980836B1 (en) 2019-12-11 2021-04-20 Myeloid Therapeutics, Inc. Therapeutic cell compositions and methods of manufacturing and use thereof
SI4081305T1 (sl) 2019-12-24 2025-03-31 Carna Biosciences, Inc. Spojine, ki modulirajo diacilglicerol kinazo
JP2023511274A (ja) 2020-01-14 2023-03-17 シンセカイン インコーポレイテッド Ｉｌ２オルソログおよび使用法
EP4090674A4 (en) 2020-01-14 2024-01-24 Synthekine, Inc. Biased il2 muteins methods and compositions
WO2021163064A2 (en) 2020-02-14 2021-08-19 Jounce Therapeutics, Inc. Antibodies and fusion proteins that bind to ccr8 and uses thereof
CN111253482B (zh) * 2020-02-18 2021-11-30 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 SIRPa变体、融合蛋白、及其应用
CN115916963A (zh) 2020-03-27 2023-04-04 门德斯有限公司 白血病来源的经修饰细胞用于增强过继性细胞治疗的效力的离体用途
WO2021231976A1 (en) 2020-05-14 2021-11-18 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind prostate specific membrane antigen (psma) and cd3
JP2023528341A (ja) 2020-06-01 2023-07-04 エーエルエックス オンコロジー インコーポレイテッド 低メチル化剤を含むがんを治療するための併用療法
CA3183389A1 (en) * 2020-06-30 2022-01-06 Lei Shi Bispecific antibody and use thereof
AU2021302958A1 (en) 2020-06-30 2023-02-16 Mendus B.V. Use of leukemia-derived cells in ovarian cancer vaccines
WO2022010806A1 (en) 2020-07-06 2022-01-13 ALX Oncology Inc. Methods for reducing the interference of drugs that bind therapeutic targets expressed on blood cells in serological assays
CN113912736A (zh) * 2020-07-09 2022-01-11 上海交通大学 靶向cd47与pd-l1双效融合蛋白及其应用
CN111808183B (zh) * 2020-07-25 2022-07-08 北京吉尔麦迪生物医药科技有限公司 一种靶向CD47的高亲和力SIRPα突变体及其融合蛋白
CN114057888A (zh) * 2020-07-30 2022-02-18 三生国健药业（上海）股份有限公司 一种SIRPα-Fc融合蛋白
CN116390768B (zh) * 2020-08-14 2024-07-09 韩国科学技术研究院 具有抗癌活性的免疫调节蛋白-siRNA复合物
KR102557016B1 (ko) * 2020-09-22 2023-07-20 비피진 주식회사 암 치료를 위한 cd47 바인더 및 리포좀 복합체
KR102579284B1 (ko) * 2020-09-22 2023-09-18 비피진 주식회사 신규의 cd47 바인더와 폴리뉴클레오티드를 포함하는 암 치료를 위한 리포좀 복합체
WO2022087458A1 (en) 2020-10-23 2022-04-28 Asher Biotherapeutics, Inc. Fusions with cd8 antigen binding molecules for modulating immune cell function
IL302639A (en) 2020-11-04 2023-07-01 Myeloid Therapeutics Inc Engineered chimeric fusion protein compositions and methods of using them
EP4256336A1 (en) 2020-12-06 2023-10-11 ALX Oncology Inc. Multimers for reducing the interference of drugs that bind cd47 in serological assays
CN112979782B (zh) * 2021-03-08 2023-07-18 深圳市乐土生物医药有限公司 一种多肽及其用途
JP2024511319A (ja) * 2021-03-09 2024-03-13 ゼンコア インコーポレイテッド Ｃｄ３及びｃｌｄｎ６に結合するヘテロ二量体抗体
WO2022190058A1 (en) 2021-03-12 2022-09-15 Dcprime B.V. Methods of vaccination and use of cd47 blockade
TW202302145A (zh) 2021-04-14 2023-01-16 美商基利科學股份有限公司 ＣＤ４７／ＳＩＲＰα結合及ＮＥＤＤ８活化酶Ｅ１調節次單元之共抑制以用於治療癌症
CA3218780A1 (en) 2021-05-11 2022-11-17 Daniel Getts Methods and compositions for genomic integration
US12098214B2 (en) * 2021-05-13 2024-09-24 ALX Oncology Inc. Combination therapies for treating cancer
EP4340866A4 (en) 2021-05-19 2025-05-21 Asher Biotherapeutics, Inc. Il-21 polypeptides and targeted constructs
CA3222277A1 (en) 2021-06-23 2022-12-29 Gilead Sciences, Inc. Diacylglyercol kinase modulating compounds
WO2022271650A1 (en) 2021-06-23 2022-12-29 Gilead Sciences, Inc. Diacylglyercol kinase modulating compounds
CA3222439A1 (en) 2021-06-23 2022-12-29 Gilead Sciences, Inc. Diacylglyercol kinase modulating compounds
AU2022297373B2 (en) 2021-06-23 2025-04-17 Gilead Sciences, Inc. Diacylglyercol kinase modulating compounds
WO2023003331A1 (en) * 2021-07-19 2023-01-26 Yuhan Corporation Sirp-alpha variants and use thereof
CN113896802A (zh) * 2021-10-09 2022-01-07 宜明昂科生物医药技术（上海）有限公司 靶向cd47和cd38的重组融合蛋白及其制备和用途
CA3234909A1 (en) 2021-10-28 2023-05-04 Gilead Sciences, Inc. Pyridizin-3(2h)-one derivatives
JP7787991B2 (ja) 2021-10-29 2025-12-17 ギリアード サイエンシーズ， インコーポレイテッド Ｃｄ７３化合物
WO2023072279A1 (zh) * 2021-11-01 2023-05-04 江苏先声药业有限公司 SIRPa突变体及其应用
US12534732B2 (en) 2021-11-19 2026-01-27 Kist (Korea Institute Of Science And Technology) Therapeutic compounds for red blood cell-mediated delivery of an active pharmaceutical ingredient to a target cell
CN116178561B (zh) * 2021-11-26 2025-07-18 杭州尚健生物技术有限公司 包含SIRPα突变体的融合蛋白
WO2023088429A1 (zh) * 2021-11-19 2023-05-25 杭州尚健生物技术有限公司 SIRPα变体及其应用
KR20250172692A (ko) * 2021-12-21 2025-12-09 에프비디 바이올로직스 리미티드 조작된 SIRPα 변이체 및 이의 사용 방법
JP2024546851A (ja) 2021-12-22 2024-12-26 ギリアード サイエンシーズ， インコーポレイテッド Ｉｋａｒｏｓジンクフィンガーファミリー分解剤及びその使用
WO2023122615A1 (en) 2021-12-22 2023-06-29 Gilead Sciences, Inc. Ikaros zinc finger family degraders and uses thereof
KR102710779B1 (ko) * 2022-01-04 2024-09-26 주식회사 보령바이오파마 5'-뉴클레오티다아제 변형 단백질을 암호화하는 암 치료를 위한 폴리뉴클레오티드
TW202340168A (zh) 2022-01-28 2023-10-16 美商基利科學股份有限公司 Ｐａｒｐ７抑制劑
EP4479084A1 (en) 2022-02-14 2024-12-25 Sana Biotechnology, Inc. Methods of treating patients exhibiting a prior failed therapy with hypoimmunogenic cells
TW202346277A (zh) 2022-03-17 2023-12-01 美商基利科學股份有限公司 Ｉｋａｒｏｓ鋅指家族降解劑及其用途
WO2023183313A1 (en) 2022-03-22 2023-09-28 Sana Biotechnology, Inc. Engineering cells with a transgene in b2m or ciita locus and associated compositions and methods
US20250257113A1 (en) 2022-03-24 2025-08-14 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Multivalent sirp-alpha fusion polypeptides
AU2023240361A1 (en) 2022-03-24 2024-10-03 Bitterroot Bio, Inc. Sirp-alpha fusion polypeptides with modified fc domains
EP4499146A1 (en) 2022-03-24 2025-02-05 Gilead Sciences, Inc. Combination therapy for treating trop-2 expressing cancers
TWI876305B (zh) 2022-04-05 2025-03-11 美商基利科學股份有限公司 用於治療結腸直腸癌之組合療法
JP2025513258A (ja) 2022-04-21 2025-04-24 ギリアード サイエンシーズ， インコーポレイテッド Ｋｒａ ｇ１２ｄ調節化合物
EP4522658A1 (en) 2022-05-11 2025-03-19 Daiichi Sankyo Company, Limited Combination of an antibody specific for a tumor antigen and a cd47 inhibitor
CA3253030A1 (en) 2022-06-01 2023-12-07 ALX Oncology Inc. Polytherapy for the treatment of urothelial carcinoma
AU2023298558A1 (en) 2022-07-01 2024-12-19 Gilead Sciences, Inc. Cd73 compounds
AU2023307100A1 (en) 2022-07-12 2025-01-02 Gilead Sciences, Inc. Hiv immunogenic polypeptides and vaccines and uses thereof
CN116041470B (zh) * 2022-08-04 2024-10-22 四川大学华西医院 具有高亲和力结合肿瘤细胞cd47的细胞膜材料及其制备方法和应用
KR102896511B1 (ko) * 2022-09-07 2025-12-08 주식회사 시프트바이오 SIRPα 변이체에 특이적으로 결합하는 항체
WO2024064668A1 (en) 2022-09-21 2024-03-28 Gilead Sciences, Inc. FOCAL IONIZING RADIATION AND CD47/SIRPα DISRUPTION ANTICANCER COMBINATION THERAPY
AU2023409398A1 (en) 2022-12-22 2025-06-05 Gilead Sciences, Inc. Prmt5 inhibitors and uses thereof
EP4695260A1 (en) 2023-04-11 2026-02-18 Gilead Sciences, Inc. Kras modulating compounds
WO2024220917A1 (en) 2023-04-21 2024-10-24 Gilead Sciences, Inc. Prmt5 inhibitors and uses thereof
CN119451994A (zh) * 2023-05-31 2025-02-14 Fbd生物制品有限公司 靶向cd47/pd-l1的蛋白质复合物和其使用方法
US20250042922A1 (en) 2023-06-30 2025-02-06 Gilead Sciences, Inc. Kras modulating compounds
TW202519517A (zh) 2023-07-26 2025-05-16 美商基利科學股份有限公司 Ｐａｒｐ７抑制劑
CN121568935A (zh) 2023-07-26 2026-02-24 吉利德科学公司 Parp7抑制剂
WO2025054530A1 (en) 2023-09-08 2025-03-13 Gilead Sciences, Inc. Pyrimidine-containing polycyclic derivatives as kras g12d modulating compounds
WO2025054347A1 (en) 2023-09-08 2025-03-13 Gilead Sciences, Inc. Kras g12d modulating compounds
TW202519543A (zh) 2023-09-29 2025-05-16 美商崔克斯生物公司 TNF-α變體融合分子
WO2025096589A1 (en) 2023-11-03 2025-05-08 Gilead Sciences, Inc. Prmt5 inhibitors and uses thereof
US20250230168A1 (en) 2023-12-22 2025-07-17 Gilead Sciences, Inc. Azaspiro wrn inhibitors
US20250332216A1 (en) * 2024-04-26 2025-10-30 Immuneonco Biopharmaceuticals (Shanghai) Inc. Combination therapy for classic hodkin's lymphoma
WO2025245003A1 (en) 2024-05-21 2025-11-27 Gilead Sciences, Inc. Prmt5 inhibitors and uses thereof
WO2026039365A1 (en) 2024-08-12 2026-02-19 Gilead Sciences, Inc. Kras modulating compounds

Family Cites Families (107)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
US5697901A (en) 1989-12-14 1997-12-16 Elof Eriksson Gene delivery by microneedle injection
FI101678B1 (fi) 1990-12-31 1998-08-14 Akzo Nv Happolabiileja kytkentämolekyylejä
US6613332B1 (en) 1991-06-21 2003-09-02 The University Of Cincinnati Oral administration of therapeutic proteins
AU664561B2 (en) 1991-06-21 1995-11-23 University Of Cincinnati, The Orally administrable therapeutic proteins and method of making
IL99120A0 (en) 1991-08-07 1992-07-15 Yeda Res & Dev Multimers of the soluble forms of tnf receptors,their preparation and pharmaceutical compositions containing them
WO1993006217A1 (en) 1991-09-19 1993-04-01 Genentech, Inc. EXPRESSION IN E. COLI OF ANTIBODY FRAGMENTS HAVING AT LEAST A CYSTEINE PRESENT AS A FREE THIOL, USE FOR THE PRODUCTION OF BIFUNCTIONAL F(ab')2 ANTIBODIES
US5505931A (en) 1993-03-04 1996-04-09 The Dow Chemical Company Acid cleavable compounds, their preparation and use as bifunctional acid-labile crosslinking agents
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US6261554B1 (en) 1995-07-25 2001-07-17 Introgene B.V. Compositions for targeted gene delivery
DE69733815T2 (de) 1996-02-15 2006-06-08 Biosense Webster, Inc., Diamond Bar Sonde zur exkavation
EP0920339A2 (en) 1996-07-09 1999-06-09 The Johns Hopkins University Gene delivery system
US6541615B1 (en) 1996-11-15 2003-04-01 Max-Planck-Gellschaft Zur Foderung Der Wissenschaften E.V. SIRP proteins and uses thereof
CA2226962A1 (en) 1998-02-16 1999-08-16 Marie Sarfati Use of binding agents to cd47 and its ligands in the treatment or the prophylaxis of various inflammatory, autoimmune and allergic diseases and in the treatment of graft rejection
AU5591200A (en) 1999-06-11 2001-01-02 Human Genome Sciences, Inc. 49 human secreted proteins
US6613026B1 (en) 1999-12-08 2003-09-02 Scimed Life Systems, Inc. Lateral needle-less injection apparatus and method
GB9930706D0 (en) 1999-12-24 2000-02-16 Medical Res Council Composition for inhibiting macrophage activity
US7662367B2 (en) 2000-03-02 2010-02-16 Xencor, Inc. Pharmaceutical compositions for the treatment of TNF-α related disorders
TWI334439B (en) 2001-08-01 2010-12-11 Centocor Inc Anti-tnf antibodies, compositions, methods and uses
GB0124145D0 (en) 2001-10-08 2001-11-28 Bayer Ag Genes and proteins for prevention,prediction,prognosis and therapy of cardiovascular disease
US20040018522A1 (en) 2002-05-09 2004-01-29 Brigham And Women's Hospital, Inc. Identification of dysregulated genes in patients with multiple sclerosis
WO2004011618A2 (en) 2002-07-29 2004-02-05 Hmgene, Inc. Methods of identifying adipocyte specific genes, the genes identified, and their uses
JP2006515165A (ja) 2002-09-16 2006-05-25 ジェネンテック・インコーポレーテッド 免疫関連疾患の治療のための新規組成物と方法
JP2006520584A (ja) 2002-11-08 2006-09-14 アブリンクス エン．ヴェー． 安定化単一ドメイン抗体
US20040213792A1 (en) 2003-04-24 2004-10-28 Clemmons David R. Method for inhibiting cellular activation by insulin-like growth factor-1
US8613922B2 (en) 2003-04-24 2013-12-24 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods for inhibiting diabetic retinopathy with an antibody against integrin associated protein (IAP)
US20100215640A1 (en) 2003-04-24 2010-08-26 The University Of North Carolina At Chapel Hill Method for inhibiting cellular activation by insulin-like growth factor-1
WO2005019254A1 (en) 2003-08-25 2005-03-03 Pieris Proteolab Ag Muteins of a bilin-binding protein with affinity for a given target
MXPA06009805A (es) 2004-02-27 2007-04-02 Vaxconsulting Peptidos de interleucina 1 beta y factor de necrosis tumoral alfa y metodo de tratamiento utilizando los mismos.
WO2005092362A2 (de) 2004-03-29 2005-10-06 Hallstroem Seth Pharmazeutisches kombinationspräparat enthaltend ein therapeutisches protein
US20080299042A1 (en) 2004-04-30 2008-12-04 Biogen Idec Ma Inc. Membrane Associated Molecules
US7514229B2 (en) 2005-09-29 2009-04-07 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for diagnosing and evaluating treatment of blood disorders
AR060017A1 (es) * 2006-01-13 2008-05-21 Novartis Ag Composiciones y metodos de uso para anticuerpos de dickkopf -1
US8377448B2 (en) 2006-05-15 2013-02-19 The Board Of Trustees Of The Leland Standford Junior University CD47 related compositions and methods for treating immunological diseases and disorders
US20080260738A1 (en) 2007-04-18 2008-10-23 Moore Margaret D Single chain fc, methods of making and methods of treatment
CN101977935A (zh) * 2007-04-23 2011-02-16 惠氏公司 用于治疗和监测il-13相关病症的方法和组合物
US20090304719A1 (en) 2007-08-22 2009-12-10 Patrick Daugherty Activatable binding polypeptides and methods of identification and use thereof
US20100239578A1 (en) 2007-10-11 2010-09-23 University Health Network Modulation of sirp-alpha - cd47 interaction for increasing human hematopoietic stem cell engraftment and compounds therefor
JO3076B1 (ar) 2007-10-17 2017-03-15 Janssen Alzheimer Immunotherap نظم العلاج المناعي المعتمد على حالة apoe
US8592562B2 (en) 2008-01-07 2013-11-26 Amgen Inc. Method for making antibody Fc-heterodimeric molecules using electrostatic steering effects
ES2735144T5 (en) 2008-01-15 2026-01-02 Univ Leland Stanford Junior Methods for manipulating phagocytosis mediated by cd47
EP2111869A1 (en) 2008-04-23 2009-10-28 Stichting Sanquin Bloedvoorziening Compositions and methods to enhance the immune system
WO2010070047A1 (en) * 2008-12-19 2010-06-24 Novartis Ag Soluble polypeptides for use in treating autoimmune and inflammatory disorders
JP5851842B2 (ja) 2009-01-12 2016-02-03 サイトムエックス セラピューティクス, インク.CytomX Therapeutics, Inc. 改変した抗体組成物、それを作製および使用する方法
US8399219B2 (en) 2009-02-23 2013-03-19 Cytomx Therapeutics, Inc. Protease activatable interferon alpha proprotein
PT2995315T (pt) 2009-05-15 2024-03-14 Hospital For Sick Children Composições e métodos para o tratamento de cancros hematológicos que visam a interação sirpa-cd47
JP2012533631A (ja) 2009-07-20 2012-12-27 國立成功大學 ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の変異体と接合したαｖβ３インテグリンに対して選択的なポリペプチドおよびその医薬上の使用
KR101632312B1 (ko) 2009-11-03 2016-06-21 삼성전자주식회사 항체 불변 영역에 특이적으로 결합하는 융합 단백질, 그의 제조 방법 및 이를 이용한 항체 분리 방법
EA201890907A1 (ru) * 2009-11-30 2020-04-30 Янссен Байотек, Инк. МУТИРОВАННЫЕ Fc АНТИТЕЛА С УСТРАНЕННЫМИ ЭФФЕКТОРНЫМИ ФУНКЦИЯМИ
CA2785139A1 (en) 2009-12-22 2011-06-30 Novartis Ag Tetravalent cd47-antibody constant region fusion protein for use in therapy
EP3181149A1 (en) 2010-05-14 2017-06-21 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Humanized and chimeric monoclonal antibodies to cd47
SG189313A1 (en) 2010-10-08 2013-05-31 John C Williams A monoclonal antibody framework binding interface for meditopes, meditope delivery systems and methods for their use
US8609621B2 (en) 2010-11-15 2013-12-17 E I Du Pont De Nemours And Company Acid-cleavable linkers exhibiting altered rates of acid hydrolysis
US9566347B2 (en) 2011-02-07 2017-02-14 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Peptides and methods using same
HUE041335T2 (hu) 2011-03-29 2019-05-28 Roche Glycart Ag Antitest FC-variánsok
US9469676B2 (en) 2011-04-13 2016-10-18 Bristol-Myers Squibb Company Fc fusion proteins comprising novel linkers or arrangements
WO2012145746A1 (en) 2011-04-21 2012-10-26 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Compositions and methods for the treatment of neuromyelitis optica
MX355908B (es) * 2011-04-22 2018-05-04 Aptevo Res & Development Llc Proteinas que se unen al antigeno de membrana especifico de prostata y composiciones y metodos relacionados.
US20140193408A1 (en) 2011-06-16 2014-07-10 Novartis Ag Soluble proteins for use as therapeutics
WO2013056352A1 (en) 2011-10-19 2013-04-25 University Health Network Antibodies and antibody fragments targeting sirp-alpha and their use in treating hematologic cancers
WO2013063076A1 (en) 2011-10-25 2013-05-02 Indiana University Research & Technology Corporation Compositions for and methods of modulating complications, risks and issues with xenotransplantation
LT2804617T (lt) 2012-01-17 2020-09-10 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Didelio giminingumo sirp-alfa reagentai
US9428553B2 (en) 2012-02-10 2016-08-30 City Of Hope Meditopes and meditope-binding antibodies and uses thereof
PE20150643A1 (es) 2012-06-22 2015-05-29 Cytomx Therapeutics Inc Anticuerpos de reaccion cruzada anti-jagged 1/jagged 2 anticuerpos anti-jagged activables y metodos de uso de los mismos
WO2013192546A1 (en) 2012-06-22 2013-12-27 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable antibodies having non-binding steric moieties and mehtods of using the same
GB201216649D0 (en) 2012-09-18 2012-10-31 Univ Birmingham Agents and methods
EP3575326B8 (en) 2012-12-17 2022-05-25 Trillium Therapeutics ULC Treatment of cd47+ disease cells with sirp alpha-fc fusions
WO2014121093A1 (en) 2013-01-31 2014-08-07 Thomas Jefferson University Fusion proteins that facilitate cancer cell destruction
EP2953633B1 (en) 2013-02-05 2017-10-04 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Cd47 targeted therapies for the treatment of infectious disease
AU2013377886B2 (en) 2013-02-06 2018-11-29 Inhibrx Biosciences, Inc. Non-platelet depleting and non-red blood cell depleting CD47 antibodies and methods of use thereof
WO2014160183A1 (en) 2013-03-13 2014-10-02 The United States Of America,As Represented By The Secretary,Department Of Health And Human Services Methods for modulating chemotherapeutic cytotoxicity
ES2728066T3 (es) 2013-03-15 2019-10-22 Univ Leland Stanford Junior Métodos para la obtención de dosis terapéuticamente eficaces de agentes anti-CD47
ES2898627T3 (es) 2013-04-29 2022-03-08 Univ Leland Stanford Junior Uso de agentes anti-CD47 para mejorar la inmunización
WO2014186761A2 (en) 2013-05-17 2014-11-20 The Board Of Trustes Of The Leland Stanford Junior University Methods for determining responsiveness to an anti-cd47 agent
EA035319B1 (ru) * 2013-07-31 2020-05-27 Эмджен Инк. СТАБИЛИЗАЦИЯ Fc-СОДЕРЖАЩИХ ПОЛИПЕПТИДОВ
ES2765483T3 (es) 2013-09-18 2020-06-09 Univ Leland Stanford Junior Modulación de las vías de eferocitosis para el tratamiento de una enfermedad aterosclerótica
SMT201900067T1 (it) 2013-09-23 2019-02-28 Regeneron Pharma Animali non umani aventi un gene di proteina regolatoria del segnale umanizzato
NZ756892A (en) 2013-09-25 2022-05-27 Cytomx Therapeutics Inc Matrix metalloproteinase substrates and other cleavable moieties and methods of use thereof
AU2014337367B2 (en) * 2013-10-15 2020-04-30 The Scripps Research Institute Peptidic chimeric antigen receptor T cell switches and uses thereof
IL317045A (en) 2014-01-31 2025-01-01 Cytomx Therapeutics Inc Polypeptide substrates activating tryptase and U-plasminogen and other cleavable groups, compositions containing them and uses thereof
US10519237B2 (en) 2014-03-12 2019-12-31 Yeda Research And Development Co. Ltd Reducing systemic regulatory T cell levels or activity for treatment of disease and injury of the CNS
NZ725006A (en) 2014-03-12 2019-11-29 Yeda Res & Dev Reducing systemic regulatory t cell levels or activity for treatment of disease and injury of the cns
US9394365B1 (en) 2014-03-12 2016-07-19 Yeda Research And Development Co., Ltd Reducing systemic regulatory T cell levels or activity for treatment of alzheimer's disease
WO2016023001A1 (en) 2014-08-08 2016-02-11 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Multispecific high affinity pd-1 agents and methods of use
ES2962260T3 (es) 2014-08-08 2024-03-18 Univ Leland Stanford Junior Proteínas de fusión SIRPa alfa-anticuerpo
CN106535914B (zh) 2014-08-08 2021-08-27 Alx 肿瘤生物技术公司 SIRP-α变体构建体及其用途
PL3177640T3 (pl) 2014-08-08 2020-11-02 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Charakteryzujące się wysokim powinowactwem środki terapeutyczne naśladujące PD-11 i sposoby ich wykorzystania
AU2015303135B2 (en) 2014-08-15 2021-05-20 Merck Patent Gmbh SIRP-alpha immunoglobulin fusion proteins
PL3656869T5 (pl) 2014-08-26 2025-06-09 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Wszczepienie komórek macierzystych z kombinacją środka, który celuje w komórki macierzyste i modulowanie sygnałowania immunoregulatorowego
WO2016044021A1 (en) 2014-09-15 2016-03-24 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Targeting aneurysm disease by modulating phagocytosis pathways
WO2016057980A1 (en) 2014-10-10 2016-04-14 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods to eliminate cancer stem cells by targeting cd47
EP3012271A1 (en) 2014-10-24 2016-04-27 Effimune Method and compositions for inducing differentiation of myeloid derived suppressor cell to treat cancer and infectious diseases
US10316094B2 (en) 2014-10-24 2019-06-11 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Compositions and methods for inducing phagocytosis of MHC class I positive cells and countering anti-CD47/SIRPA resistance
EP3221358B1 (en) 2014-11-18 2021-07-21 Janssen Pharmaceutica, N.V. Cd47 antibodies, methods, and uses
EP4218812A1 (en) 2015-02-27 2023-08-02 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Combination therapy for treatment of atherosclerosis
CN106146670B (zh) 2015-04-24 2019-01-15 宜明昂科生物医药技术（上海）有限公司 一种新的重组双功能融合蛋白及其制备和应用
HRP20211167T1 (hr) 2015-08-07 2021-10-15 ALX Oncology Inc. Konstrukcije koje imaju sirp-alfa domenu ili njihove varijante
JOP20190009A1 (ar) 2016-09-21 2019-01-27 Alx Oncology Inc أجسام مضادة ضد بروتين ألفا منظم للإشارات وطرق استخدامها
EA201891882A1 (ru) 2017-02-17 2019-07-31 Осе Иммьюнотерапьютикс НОВЫЕ АНТИТЕЛА К SIRPa И ВАРИАНТЫ ИХ ТЕРАПЕВТИЧЕСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ
US11613564B2 (en) 2019-05-31 2023-03-28 ALX Oncology Inc. Methods of treating cancer
US20200400662A1 (en) 2019-06-07 2020-12-24 ALX Oncology Inc. Methods and reagents for reducing the interference of drugs that bind cd47 in serological assays
JP7713447B2 (ja) 2019-11-27 2025-07-25 エーエルエックス オンコロジー インコーポレイテッド がんを治療するための組み合わせ療法
JP2023528341A (ja) 2020-06-01 2023-07-04 エーエルエックス オンコロジー インコーポレイテッド 低メチル化剤を含むがんを治療するための併用療法
WO2022010806A1 (en) 2020-07-06 2022-01-13 ALX Oncology Inc. Methods for reducing the interference of drugs that bind therapeutic targets expressed on blood cells in serological assays
EP4256336A1 (en) 2020-12-06 2023-10-11 ALX Oncology Inc. Multimers for reducing the interference of drugs that bind cd47 in serological assays
US12098214B2 (en) 2021-05-13 2024-09-24 ALX Oncology Inc. Combination therapies for treating cancer

Also Published As

Publication number Publication date
JP2018525382A (ja) 2018-09-06
ES2881771T3 (es) 2021-11-30
RU2018108103A (ru) 2019-09-09
US10696730B2 (en) 2020-06-30
HRP20211167T1 (hr) 2021-10-15
UA130083C2 (uk) 2025-11-05
GEAP202114720A (en) 2021-06-10
US20240343778A1 (en) 2024-10-17
KR20250133806A (ko) 2025-09-08
MX395275B (es) 2025-03-25
UA125638C2 (uk) 2022-05-11
JP6898303B2 (ja) 2021-07-07
BR112018001353A2 (pt) 2018-09-11
PH12018500269A1 (en) 2018-08-29
RU2740672C2 (ru) 2021-01-19
JP2021063082A (ja) 2021-04-22
CA2993835A1 (en) 2017-02-16
AU2016304794A1 (en) 2018-02-01
EP3331902B1 (en) 2021-04-28
US20190169266A1 (en) 2019-06-06
SI3331902T1 (sl) 2021-09-30
CN117777267A (zh) 2024-03-29
GEP20227447B (en) 2022-12-12
CN108350048B (zh) 2024-02-09
EP3331902A4 (en) 2019-04-03
SMT202100424T1 (it) 2021-09-14
WO2017027422A1 (en) 2017-02-16
CN108350048A (zh) 2018-07-31
JP7591917B2 (ja) 2024-11-29
EP3331902A1 (en) 2018-06-13
ZA202001863B (en) 2023-12-20
PE20180778A1 (es) 2018-05-07
NZ738950A (en) 2023-03-31
US10259859B2 (en) 2019-04-16
GEP20217326B (en) 2021-11-25
RU2018108103A3 (sr) 2019-12-20
CY1124372T1 (el) 2022-07-22
SG10202101909RA (en) 2021-04-29
ZA201800857B (en) 2020-10-28
DK3331902T3 (da) 2021-07-26
CL2020000530A1 (es) 2020-07-10
IL294679B1 (en) 2023-06-01
IL294679A (en) 2022-09-01
US20210070838A1 (en) 2021-03-11
AU2021218004B2 (en) 2023-06-15
SA518390881B1 (ar) 2021-11-14
HUE055139T2 (hu) 2021-11-29
JP2025069164A (ja) 2025-04-30
CO2018002471A2 (es) 2018-05-31
MY185014A (en) 2021-04-30
KR20180028548A (ko) 2018-03-16
CL2018000340A1 (es) 2018-05-11
CN117964732A (zh) 2024-05-03
SG10201912905VA (en) 2020-02-27
HK1257372A1 (zh) 2019-10-18
ZA202000743B (en) 2022-07-27
AU2021218004A1 (en) 2021-09-09
US20200239543A1 (en) 2020-07-30
US20170107270A1 (en) 2017-04-20
IL256989B (en) 2022-08-01
IL302491A (en) 2023-06-01
NZ778013A (en) 2025-02-28
PH12018500269B1 (en) 2023-10-20
LT3331902T (lt) 2021-08-10
PT3331902T (pt) 2021-07-26
RU2020143675A3 (sr) 2021-10-29
MX2022010803A (es) 2022-09-27
AU2016304794B2 (en) 2021-07-15
JP2023061969A (ja) 2023-05-02
US11208459B2 (en) 2021-12-28
EP3913051A1 (en) 2021-11-24
MX2018001428A (es) 2018-09-05
GEAP202215294A (en) 2022-07-11
PL3331902T3 (pl) 2021-11-22
CL2020000531A1 (es) 2020-07-10
KR102855748B1 (ko) 2025-09-09
US11639376B2 (en) 2023-05-02
IL256989A (en) 2018-03-29
RU2020143675A (ru) 2021-05-26
IL294679B2 (en) 2023-10-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2021218004B2 (en) Constructs having a SIRP-alpha domain or variant thereof
CA2956126A1 (en) Sirp-alpha immunoglobulin fusion proteins
TW202221015A (zh) 單一及雙靶定配體誘導之t細胞銜接體組合物
EP4274605A1 (en) Indinavir based chemical dimerization t cell engager compositions
HK40064097A (en) Constructs having a sirp-alpha domain or variant thereof
HK40108172A (zh) 具有SIRP-α结构域或其变体的构建体
JP2025528101A (ja) 多重特異性ポリペプチド複合体
HK1257372B (zh) 具有SIRP-α结构域或其变体的构建体
BR112018001353B1 (pt) Polipeptídeo compreendendo uma variante d1 da proteína reguladora de sinal a (sirp-a) e uma variante fc, seu método de produção e seus usos, célula hospedeira, e composição farmacêutica