RS62203B1 - Kompozicija za kašalj - Google Patents

Description

Opis pronalaska

[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na novu kompoziciju za upotrebu u lečenju kašlja, koja sadrži jednu ili više polisaharidnih frakcija pisanga, jednu ili više polisaharidnih frakcija belog sleza, meda, smeđeg šećera, jednu ili više polifenolnih frakcija agrimonije koje sadrže tanine.

STANJE PRETHODNE TEHNIKE

[0002] Klasična farmakološka terapija u osnovi se zasniva na suzbijanju kašlja hemijskim i farmakološkim mehanizmima. Na osnovu njihovog mehanizma delovanja, lekovi protiv kašlja mogu se klasifikovati u 3 kategorije:

Mukolitici: povećavaju fluidnost sluzi mehanizmima depolimerizacije mukoproteinskih kompleksa i nukleinskih kiselina.

Ekspektoransi: povećavaju bronhijalnu sekreciju i indirektno smanjuju viskoznost

sluzi

Sedativi: inhibiraju centar za kašalj, eliminišući simptom.

[0003] Ograničenja lekova protiv kašlja leže u njihovoj specifičnosti delovanja i u njihovim neželjenim efektima: mukolitici deluju samo kod vlažnog kašlja; sedativi su naznačeni samo kod suvog kašlja, ometajući njegovo fiziološko delovanje; ekspektoransi imaju jedva racionalan mehanizam delovanja, toliko da zapravo nisu propisani. Štaviše, lekovi protiv kašlja su jedva adekvatni u pedijatrijskom dobu: u stvari, mukolitici i centralni sedativi su kontraindikovani za mlađe od 2 godine.

[0004] Prema tome, lečenje kašlja ne-iritirajućim kompozicijama, efikasnim, stabilnim i bez lekova kao što su, na primer, lekovi na bazi kortizona ili antibiotici, koji se stoga mogu koristiti bez kontraindikacija zbog predoziranja takvim tipologijama lekova i stoga su takođe pogodni za pedijatrijsku upotrebu, od evidentnog je interesa za stanje tehnike.

SAŽETAK PRONALASKA

[0005] Stoga se ovaj pronalazak odnosi na formulaciju za lečenje kašlja čije komponente mogu sinergijstički da interaguju tako da lokalno intervenišu sa mehaničko-fizičkim efektima njegovih fiziopatogenetskih mehanizama i koja ima, zajedno sa mukoadhezivnim efektom zaštite sluznice, i snažan antioksidativni efekat.

[0006] Formulacija prema pronalasku može delovati uglavnom sa mehaničkim efektom:

I. na upalu (koja je faktor koji izaziva kašalj), indirektnim dejstvom koje se sprovodi stvaranjem zaštitnog sloja koji, s jedne strane, sprečava dalji kontakt sa spoljnim iritantnim sredstvima i čuva hidrataciju sluzokože, a sa druge strane, zahvaljujući intervenciji antioksidativnih supstanci, ublažava štetan efekat slobodnih radikala nastalih infekcijom;

II. na sluz, čineći je tečnijom i stoga se lakše uklanja pomoću mehanizama fiziološkog čišćenja, njenom hidratacijom zbog hidrofilnih supstanci koje privlače vodu.

[0007] Tako se simptomi kašlja mogu ublažiti bez poništavanja njegove fiziološke uloge i promovisanja obnavljanja normalnog stanja sluzi i sluzokože. Autori ovog pronalaska su napravili kompoziciju koja ima dobra mukoadhezivna svojstva i svojstva efekta barijere na sluznici, zajedno sa antioksidativnim svojstvima uporedivim sa onima u dozama vitamina C koje se obično koriste u antitusivnim formulacijama, stabilnim tokom vremena, pa ne zahteva prisustvo stabilizatora koji se obično koriste za stabilizaciju askorbinske kiseline.

[0008] Autori su ustvari napravili kompoziciju u kojoj je jedan sastojak, predstavljen agrimonijom (Agrimonia), odgovoran i za jaka mukoadhezivna svojstva formulacije, i za njena antioksidativna svojstva, pri čemu su takva antioksidativna svojstva uporediva sa onima od vitamina C, ali je mnogo stabilniji od pomenutog vitamina.

[0009] U stvari, poznato je da je brza razgradnja askorbinske kiseline u vodenim proizvodima do danas veoma relevantan faktor u formulaciji proizvoda koji je sadrže. Takođe je poznato da do oksidacije askorbinske kiseline dolazi brzo u alkalnom okruženju. Razgradnja askorbinske kiseline se dešava i aerobno i anaerobno, i zavisi od mnogih faktora, kao što su kiseonik, temperatura, svetlost, pH i uslovi skladištenja. Kompozicija koja je predmet pronalaska pronalaska je umesto toga pokazala odlične sposobnosti mukoadhezije i efekta barijere, antioksidativno delovanje uporedivo sa onim koje imaju uobičajene doze vitamina C, zajedno sa odličnom stabilnošću tokom vremena. Zapravo, kompozicija pronalaska, čak i u tečnom obliku, pokazala se stabilnom ako se analizirani uzorci drže u ekstremnim uslovima, na 40 °C i 75% relativne vlažnosti. Dobijeni podaci su prikazani u analizi stabilnosti, u delu Primeri.

[0010] Kao što se očekivalo iz literature, a kako su takođe pronašli istraživači, vitamin C se pokazao izrazito nestabilnim u istoj tečnoj formi (sa istim ekscipijentima).

[0011] Ovaj pronalazak stoga obezbeđuje kompoziciju optimizovanu za lečenje kašlja, čije komponente kao odabrane pokazuju efekat barijere, mukoadhezivni i antioksidativni efekat zajedno sa odličnom stabilnošću tokom vremena.

[0012] Stoga se ovaj pronalazak odnosi na kompoziciju za upotrebu u lečenju kašlja koja sadrži jednu ili više polisaharidnih frakcija pisanga, jednu ili više polisaharidnih frakcija belog sleza, jednu ili više polifenolnih frakcija agrimonije koje sadrže tanine, smeđi šećer, med, pri čemu pomenuta jedna ili više polifenolnih frakcija agrimonije koje sadrže tanine sadrže polifenole pri težinskom procentu većem od ili jednakom 3%.

[0013] Ovaj pronalazak se takođe odnosi na postupak za pripremu pomenute kompozicije u kojoj su jedna ili više polisaharidnih frakcija pisanga, jedna ili više polisaharidnih frakcija belog sleza, jedna ili više polifenolnih frakcija agrimonije koje sadrže tanine, pomešane sa medom, smeđim šećerom i jednim ili više farmaceutski prihvatljivijih nosača i/ili ekscipijenata.

GLOSAR

[0014] Za potrebe ovog pronalaska, pod " pisang" se podrazumeva Plantago lanceolata, pod "agrimonija" Agrimonia eupatoria i pod "beli slez" Althaea officinalis.

[0015] Pod vrhovima ili vrhovima cvetanja podrazumeva se termin koji se obično koristi u biljnoj medicini i u botaničkim studijama, dakle vazdušni krajevi biljke koji obuhvataju lišće, stabljike (znači kao grane, a ne kao glavna stabljika biljke) i cvetove , ili najmanje jednu od ovih komponenti.

[0016] Pod polisaharidnim frakcijama belog sleza i pisanga podrazumevaju se frakcije ekstrakata, poželjno hidroalkoholnih ili vodenih, korena belog sleza, i frakcije ekstrakata, hidroalkoholnih ili vodenih, listova pisanga, koji sadrže polisaharide.

[0017] Pod polifenolnim frakcijama agrimonije koje sadrže tanine podrazumevaju se frakcije ekstrakata, poželjno hidroalkoholnih ili vodenih, vrhova ili vrhova cvetova agrimonije, koji sadrže polifenole, naročito koji sadrže polifenolnu podklasu tanina.

DETALJAN OPIS SLIKA

[0018] Na slici 1 prikazan je procenat mukoadhezivnosti proizvoda u statičkim uslovima, u različitim razblaženjima, prema humanim bukalnim ćelijama, meren procenom sposobnosti proizvoda da se prilepi za ćelije inhibiranjem vezivanja lektina sa membranskim glikoproteinima, kao što je ilustrovano u detaljnom opisu i u primerima u nastavku.

Slika 1 prikazuje takav procenat za formulaciju prema pronalasku u obliku sirupa sa sledećim razblaženjima: nerazblažen, razblažen 1: 2 i razblažen 1: 5. Na slici 2 prikazana je otpornost mukoadhezivnog sloja u dinamičkim uslovima, tj. procena sposobnosti proizvoda da ostane prilepljen na sluznicu tokom vremena, podvrgavanjem sistema do 2 ml/min protoka veštačke pljuvačke na Franz-ovoj ćeliji kao što je ilustrovano u detaljnom opisu i u primerima u nastavku.

Slika 2 prikazuje otpornost mukoadhezivnog sloja dobijenog sa proizvodom u obliku sirupa razblaženog 1: 2 u različito vreme, 0.5 h, 1 h i 2 h prema simuliranom rastvoru pljuvačke (0.9% fiziološki rastvor NaCl).

Slika 3 prikazuje procenu efekta barijere koji proizvod ima u sirupu, koji formira zaštitni film sposoban da zaštiti ćelije od povreda inflamatornih sredstava (LPS).

Slika 4 prikazuje podatke dobijene izvođenjem istih koraka analize barijere sprovedene za sliku 3, međutim obrnuvši redosled stresiranja ćelija, tj. prvo stimulišući ćelije sa LPS, a zatim ih izlažući uzorku (kompozicija pronalaska i pozitivna kontrola ), dobijeni podaci pokazuju da se antiinflamatorna aktivnost kompozicije prema pronalasku treba pripisati efektu barijere i da to nije direktna anti-inflamatorna aktivnost.

Slike 5 i 6 prikazuju rezultate, izražene respektivno kao grafikon koji predstavlja razvoj slobodnih radikala tokom vremena, i histogram koji predstavlja delovanje sakupljanja tokom vremena različitih koncentracija kompozicije.

Eksperimenti su izvedeni na 1 gramu kompozicije prema pronalasku, dovedeni do finalne zapremine od 10 ml u fiziološkom rastvoru i ispitani na maksimalnoj koncentraciji od 0.5 mg/ml i na minimalnoj koncentraciji od 0.03 mg/ml kompozicije.

DETALJAN OPIS PONALASKA

[0019] Kašalj je iznenadni izdisajni manevar koji se može pojaviti kao refleks ili kao dobrovoljna radnja i ima za cilj oslobađanje respiratornog trakta od bilo kakvog prisutnog materijala (ekspektorata), čime se obavlja uloga neophodna za fiziološko funkcionisanje respiratornog sistema.

[0020] Međutim, ovaj sistem za odbranu respiratornog trakta postaje patološko stanje kada se vremenski odugovlači, usled ponovljenih iritativnih nadražaja (infektivna sredstva, nadražujuće supstance) koji izazivaju prekomernu proizvodnju sekreta i sluzi, koji se nakupljaju u respiratornom traktu i postaju prateći uzrok stimulusa prouzrokovanog kašljanjem.

[0021] Sluznica koja oblaže respiratorni trakt ima zaštitnu ulogu funkcionalne barijere između spoljašnjeg okruženja i tkiva:

a) predstavlja stvarnu fizičku barijeru, štiteći tkiva ispod od kontakta sa spoljašnjom sredinom;

b) zbog prisustva trepljastih ćelija, sinhronizovanim i jednosmernim pokretima potiskuje stranu materiju zarobljenu sa sluzi ka jednjaku;

c) proizvodi sekrete i sluz;

d) obavlja imunološke funkcije i u prisustvu virusa odigrava niz efikasnih odbrambenih mehanizama koji su ključni u odgovoru protiv virusa.

[0022] Deo svoje zaštitne funkcije obavlja sluz koja ga prekriva, koja je lepljivi, viskoelastični gel koji proizvode peharske ćelije i čiji su glavni makromolekuli glikoproteini.

[0023] Treba uzeti u obzir da sluz, koja u normalnim uslovima ima zaštitnu ulogu, u slučaju infekcije ili druge vrste iritacije sama postaje uzrok kašlja: u stvari, osvedočeno je prekomernom proizvodnjom i njenim većim viskozitetom.

[0024] Glavni mehanizmi koji su nastaju usled infektivnog i/ili događaja iritacije koji izaziva flogozu uha i grla mogu se opisati na sledeći način:

1. direktno zahvaćanje grkljana i dušnika, zbog njihove blizine i bliskih komunikacionih odnosa sa ustima, ždrelom i nosom;

2. transport medijatora upale proizvedenih na mestu infekcije, kroz krvotok, do donjih disajnih puteva, gde pokreću upalni odgovor; studije na zamorcima i ljudima pokazale su da senzorni stimulusi hemijskog tipa koji deluju iz nosa ili jednjaka mogu povećati osetljivost na kašalj centralnih nervnih puteva, doprinoseći stanju koje je"hiper prouzrokovano kašljem" koje prate inflamatorne bolesti respiratornog trakta, nosa i jednjaka.

3. kod postnazalnog slivanja sekreta dolazi do kontinuiranog prisustva sluzi, često u obliku viskoznih vlakana koja se teško izbacuju iz nazofarinksa, koji ga spuštanjem duž ždrela iritira. Ova iritacija uzrokuje gubitak koordinacije između nerava i mišića dušnika i jednjaka, tako da se deo viška sekreta izlije u grkljan, uzrokujući njihovu mehaničku stimulaciju koja se pretvara u uporni, kontinuirani i nadražujući kašalj, vrlo čest kod dece.

[0025] Važnu ulogu u mehanizmima kašlja imaju različiti tipovi receptora lokalizovani na nivou jednjaka, čija stimulacija može izazvati kašalj različitim mehanizmima:

stimulacija mehanosenzora napetosti ponovljenim pokušajima degluticije obilne i viskozne sluzi u slučaju infektivnih događaja;

stimulacija receptora sluzokože osetljivih na stimuluse svetlosnog pritiska koje stvaraju mukozna vlakna koja stagniraju između hipofarinksa i jednjaka;

stimulacija nociceptora posrednicima upale proizvedenih lokalno i sluzom prenete na druga mesta (slično mehanizmima stimulacije koji su dokazani kod zamoraca, čak i sa kiselim hemijskim stimulusima)

[0026] Na osnovu činjenice da su i fiziološki mehanizmi za zaštitu sluzokože respiratornog trakta i patogenetski postupci kašlja zapravo zasnovani na mehanizmima mehaničkog tipa (sluz i netaknuta sluznica sa jedne strane, prekomerna proizvodnja sluzi i mehanička stimulacija na sa druge strane) istraživači su smatrali da bi intervencija sa zaštitom sluzokože mogla biti jedini pristup koji je zaista efikasan. Osim toga, istraživači su tražili i izdvojili formulaciju, stabilnu tokom vremena, zasnovanu na supstancama prirodnog porekla, koja bi imala visoku mukoadhezivnu sposobnost, delotvoran efekat barijere protiv nadražujućih sredstava, zajedno sa visokim antioksidativnim delovanjem.

[0027] To je zahtevalo razvoj formulacije koja bi bila aktivna u svojoj složenosti, tj. da bi njene komponente mogle da ostvare sinergističku interakciju tako da lokalno intervenišu sa mehaničko-fizičkim efektima na njene fiziopatogenetske mehanizme i istovremeno obezbede antioksidativni efekat koji omogućava efikasnu zaštitu od slobodnih radikala.

[0028] Imajući u vidu takav cilj, napravljena je kompozicija za upotrebu u lečenju kašlja, koja sadrži jednu ili više polisaharidnih frakcija pisanga, jednu ili više polisaharidnih frakcija belog sleza, jednu ili više polifenolnih frakcija agrimonije koje sadrže tanine, smeđi šećer i med, zajedno sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih nosača i/ili ekscipijenata, pri čemu pomenuta jedna ili više polifenolnih frakcija agrimonije koja sadrži tanine sadrži polifenole pri težinskom procentu većem od ili jednakom 3%.

[0029] Kao što je prethodno naznačeno, pod polisaharidnim frakcijama biljke x ili y, ili polifenolnim frakcijama biljke z koje sadrže tanine, podrazumevaju se frakcije ekstrakata pomenutih biljaka, koje sadrže klase jedinjenja koja su naznačena i oslobođene drugih klasa jedinjenja koja su obično prisutna u delovima od interesa biljke. Posebno, prethodno pomenute frakcije mogu se proizvesti hidroalkoholnom ekstrakcijom ili tehnikama ekstrakcije u vodi. Ove frakcije mogu biti u obliku hidroalkoholnih ili vodenih ekstrakata, suvih ekstrakata, ekstrakata sušenih tehnikom sušenja raspršivanjem (različito od liofilizacije), mekih ekstrakata ili njihovih smeša.

[0030] Liofilizirani ekstrakti ili ekstrakti sušeni tehnikom sušenja raspršivanjem prema pronalasku mogu biti liofilizirani ili osušeni hidroalkoholni ili vodeni ekstrakti. Prema pronalasku, prethodno pomenute frakcije su poželjno standardizovane za sadržaj karakterističnih markera.

[0031] U jednom primeru izvođenja, polisaharidna frakcija pisanga je frakcija (ili skup frakcija) koja sadrži polisaharide koji imaju molekulsku masu veću od 20000 Daltona pri težinskom procentu većem od ili jednakom 3%. Npr. 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36% , 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%. Prema sledećem primeru izvođenja, polisaharidna frakcija belog sleza je frakcija (ili skup frakcija) koja sadrži polisaharide koji imaju molekulsku masu veću od 20000 Daltona pri težinskom procentu većem od ili jednakom 5%. Na primer, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% , 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%.

[0032] Prema jednom primeru izvođenja, polisaharidna frakcija belog sleza je sluzava frakcija ekstrahovana iz pomenute biljke.

[0033] Prema pronalasku, polifenolna frakcija agrimonija je polifenolna frakcija (ili skup frakcija) (tj. koje sadrže polifenole), koja sadrži tanine, koja sadrži polifenole pri težinskom procentu većem od ili jednakom 3%. Npr.4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36% , 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%.

[0034] U jednom poželjnom primeru izvođenja, kompozicija sadrži polisaharidnu frakciju pisanga koja sadrži polisaharide sa molekulskom masom većom od 20000 Daltona pri težinskom procentu većem od ili jednakom 3%; polisaharidna frakcija belog sleza je frakcija koja se sastoji od polisaharida sa molekulskom masom većom od 20000 Daltona pri težinskom procentu većem od ili jednakom 5%, i polifenolna frakcija agrimonije koja sadrži tanine, koja sadrži polifenole pri težinskom procentu većem od ili jednakom do 3%.

[0035] U slučaju pisanga i belog sleza, poželjni su liofilizirani ekstrakti ili ekstrakti osušeni raspršivanjem, jer se za ekstrakciju polisaharida konvencionalno koriste rastvori sa niskim procentom alkohola ili vode, a takve tehnike sušenja su najbolje da bi se dobile frakcije pogodnih karakteristika za skladištenje. Priprema takvih vrsta frakcija može se izvršiti dobro poznatim postupcima, stoga nije potrebna dalja naznaka da bi tehničar na terenu izveo ovaj pronalazak. Međutim, u delu primeri navedeni su odgovarajući postupci, ne ograničavajući pronalazak, za pripremu frakcija pogodnih za kompoziciju prema pronalasku.

[0036] Kompozicija prema pronalasku je pogodna za upotrebu kod odraslih pacijenata, pacijenata u gerijatrijskoj dobi, u gestaciji, tinejdžera i dece. Priprema ekstrakata, kao što je već pomenuto, može se izvesti prema bilo kojoj tehnici poznatoj stručnjaku u tehnici, u specifičnom primeru izvođenja, pri čemu pomenuti ekstrakti mogu biti liofilizovani ekstrakti.

[0037] Med može biti pčelinji med, med od medne rosa ili njihova mešavina, a može se koristiti i u liofilizovanom obliku ili u bilo kom obliku.

[0038] Formulacija bi tada mogla da sadrži formulativna sredstva kao što su sredstva za zgušnjavanje, sredstva za aromu i konzervanse (sredstva za konzervisanje) prirodnog ili sintetičkog porekla ili druge tehnološke ađuvante koje bi stručnjak u ovoj oblasti mogao da odabere prema stanju tehnike. Čisto kao primer, mogu se odabrati sokovi (kao što su limunov sok ili druge voćne arome (npr. prirodna aroma pomorandže, prirodna aroma limuna, prirodna aroma breskve, prirodna aroma mirte, prirodna aroma kupine), sredstva za zgušnjavanje (kao što su ksantanska guma i arapska guma ).

[0039] Prema tome, prethodno opisana kompozicija može se sastojati od jedne ili više polisaharidnih frakcija pisanga, jedne ili više polisaharidnih frakcija belog sleza, jedne ili više polifenolnih frakcija agrimonije koje sadrže tanine, smeđi šećer, med i pogodne ekscipijente, arome, konzervanse pri čemu pomenuta jedna ili više polifenolnih frakcija agrimonije koje sadrže tanine sadrže polifenole pri težinskom procentu većem od ili jednakom 3%.

[0040] U jednom poželjnom primeru izvođenja prema pronalasku, jedina aktivna načela sadržana u kompoziciji biće predstavljeni jednom ili više polisaharidnih frakcija pisanga, jednom ili više polisaharidnih frakcija belog sleza, jednom ili više polifenolnih frakcija agrimonije koje sadrže tanine, smeđi šećer, med pri čemu pomenuta jedna ili više polifenolnih frakcija agrimonije koje sadrže tanine sadrže polifenole pri težinskom procentu većem od ili jednakom 3%.

[0041] Prema tome, kompozicija prema pronalasku se takođe može definisati kao kompozicija koja se sastoji od jedne ili više polisaharidnih frakcija pisanga, jedne ili više polisaharidnih frakcija belog sleza, jedne ili više polifenolnih frakcija agrimonije koje sadrže tanine, smeđi šećer, med i farmaceutski prihvatljive nosače i/ili ekscipijente, pri čemu pomenuta jedna ili više polifenolnih frakcija agrimonije koje sadrže tanine sadrže polifenole pri težinskom procentu većem od ili jednakom 3%.

[0042] Prema jednom primeru izvođenja, kompozicija prema pronalasku može sadržati 30-60% tež./tež. smeđeg šećera; 20-50% tež./tež. meda; 0.1-2% tež./tež. polisaharidne frakcije pisanga; 0.1-2% polisaharidne frakcije belog sleza; 0.1-2% polifenolne frakcije agrimonije koja sadrži tanine i najmanje jedan od farmaceutski prihvatljivih nosača i/ili ekscipijenata, q.s. do 100%.

[0043] Prema tome, težinskim procentima blizu gornjeg kraja opsega meda, odgovaraće težinski procenti blizu donjeg kraja opsega smeđeg šećera i obrnuto, jer je ukupan zbir težine delova sastojaka, uključujući najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv nosač i/ili ekscipijent 100.

[0044] U prethodno navedenim opsezima, sadržani su donji i gornji kraj, sve vrednosti sadržane između takvih krajeva, i sve moguće kombinacije težine delova sastojaka koji spadaju u takve intervale a čiji je zbir 100. U nastavku teksta obezbeđeni su neograničavajući primeri mogućih primera izvođenja prema pronalasku

[0045] Prema jednom primeru izvođenja, kompozicija prema pronalasku može sadržati 30-50% tež./tež. smeđeg šećera; 30-50% tež./tež.meda; 0.1-1% tež./tež. polisaharidne frakcije pisanga; 0.1-1% polisaharidne frakcije belog sleza; 0.4-2% polifenolne frakcije agrimonije koja sadrži tanine, i najmanje jedan među farmaceutski prihvatljivim nosačima i/ili ekscipijentima, tako da ukupna količina dostigne 100% (to jest, "q.s. do 100%").

[0046] Prema drugom primeru izvođenja, kompozicija prema pronalasku može sadržati 35-55% tež./tež. smeđeg šećera; 30-50% tež./tež.meda; 0.1-1% tež./tež. polisaharidne frakcije pisanga; 0.1-5% polisaharidne frakcije belog sleza; 0.2-2% polifenolne frakcije agrimonije koja sadrži tanine, i najmanje jedan među farmaceutski prihvatljivim nosačima i/ili ekscipijentima, q.s. do 100%".

[0047] Prema daljem primeru izvođenja, kompozicija prema pronalasku može sadržati 40-60% tež./tež. smeđeg šećera; 20-30% tež./tež.meda; 0.1-1% tež./tež. polisaharidne frakcije pisanga; 0.1-5% polisaharidne frakcije belog sleza; 0.2-2% polifenolne frakcije agrimonije koja sadrži tanine, i najmanje jedan među farmaceutski prihvatljivim nosačima i/ili ekscipijentima, q.s. do 100%".

1

[0048] Prema još daljem primeru izvođenja, kompozicija prema pronalasku može sadržati 40-60% tež./tež. smeđeg šećera; 20-30% tež./tež.meda; 0.1-1% tež./tež. polisaharidne frakcije pisanga; 0.1-1.7% polisaharidne frakcije belog sleza; 0.2-1% polifenolne frakcije agrimonije koja sadrži tanine, i najmanje jedan među farmaceutski prihvatljivim nosačima i/ili ekscipijentima, q.s. do 100%.

[0049] Prema još dodatnom primeru izvođenja, kompozicija prema pronalasku može sadržati 40-60% tež./tež. smeđeg šećera; 20-30% tež./tež.meda; 0.1-1% tež./tež. polisaharidne frakcije pisanga; 0.1-1.6% polisaharidne frakcije belog sleza; 0.3-1% polifenolne frakcije agrimonije koja sadrži tanine, i najmanje jedan među farmaceutski prihvatljivim nosačima i/ili ekscipijentima, q.s. do 100%.

[0050] Prema još dodatnom primeru izvođenja, kompozicija prema pronalasku može sadržati 40-60% tež./tež. smeđeg šećera; 20-30% tež./tež.meda; 0.2-1% tež./tež. polisaharidne frakcije pisanga; 0.1-1.6% polisaharidne frakcije belog sleza; 0.3-1% polifenolne frakcije agrimonije koja sadrži tanine, i najmanje jedan među farmaceutski prihvatljivim nosačima i/ili ekscipijentima, q.s. do 100%.

[0051] U svim primerima izvođenja prema pronalasku, termin "polisaharidna frakcija" takođe obuhvata skup frakcija, kao i termin "polifenolna frakcija" koja takođe sadrži skup frakcija, sve dok su prisutne klase prethodno navedenih jedinjenja, poželjno u koncentracijama navedenim u ovom opisu.

[0052] Tretirani sa kompoyicijom od interesa u odnosu na količinu vezanog lektina u kontroli, u kojoj se ćelije ne tretiraju sa kompozicijom od interesa.

[0053] Šema korišćenog postupka prikazana je u nastavku teksta:

[0054] Stepen mukoadhezije može se meriti, na primer, kolorimetrijskom reakcijom koja omogućava kvantifikovanje mesta na glikoproteinima koji nisu zahvaćeni lektinom, kao što je zahvaćen mukoadhezivnim produktom. Kolorimetrijska reakcija je moguća zahvaljujući posebnom sistemu označavanja lektina, ilustrovanom na sledećem dijagramu:

[0055] Smanjenje vrednosti apsorpcije proporcionalno je sposobnosti proizvoda da se prilepi ("mukoadhezuje") na ćelije. Mukoadhezivna sposobnost izražena je kao procenat inhibicije vezivanja glikoproteina/lektina i predstavlja procenat mesta sluznice zauzetih produktom prema jednačini:

Procenat mukoadhezivnog produkta = (1- abs uzorka/abs kontrole) × 100

[0056] Pri čemu je abs za apsorpciju meren sa spektrofotometrom na λ = 450 nm

[0057] Proizvod se nanosi nakon razblaživanja, uzimajući u obzir činjenicu da se u stvarnoj upotrebi, odmah nakon isporuke, dešava mešanje sa pljuvačkom prisutnom u orofaringealnoj šupljini.

[0058] Prema ovom pronalasku, kompozicija, nerazređena ili razblažena na 1:5 sa pogodnim razblaživačem, mogla bi imati procenat mukoadhezije, meren analizom vezivanja lektina, između 85% i 50%, poželjno između 82 i 52% (videti Sliku 1).

[0059] Sa izražavanjem između 85% i 50% misli se na bilo koji ceo broj, što bi moglo biti 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76%, 75%, 74%, 73%, 72%, 71%, 70%, 69%, 68%, 67%, 66%, 65%, 64%, 63%, 62%, 61%, 60%, 59%,

Procenat mukoadhezivnog produkta = (1- abs uzorka/abs kontrole) × 100

[0060] Pri čemu je abs za apsorpciju meren spektrofotometrom na λ = 450 nm

[0061] Proizvod se nanosi nakon razblaživanja, uzimajući u obzir činjenicu da se u stvarnoj upotrebi, odmah nakon isporuke, dešava mešanje sa pljuvačkom prisutnom u orofaringealnoj šupljini.

[0062] Prema ovom pronalasku, kompozicija, nerazređena ili razblažena na 1:5 sa pogodnim razblaživačem, mogla bi imati procenat mukoadhezije, meren analizom vezivanja lektina, između 85% i 50%, poželjno između 82 i 52% (videti Sliku 1).

[0063] Sa izražavanjem između 85% i 50% misli se na bilo koji ceo broj, što bi moglo biti 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76%, 75%, 74%, 73%, 72%, 71%, 70%, 69%, 68%, 67%, 66%, 65%, 64%, 63%, 62%, 61%, 60%, 59%, 58%, 57%, 56%, 55%, 54%, 53%, 52%, 51%, 50% i svaki decimalni broj prethodno navedenih celih brojeva manji od 85% i veći od 50% (dakle od 84.9% do 50.1%).

[0064] Bilo koji interval mukoadhezivne sposobnosti, prethodno izmeren, sadržan između ova dva ekstrema je cilj ovog pronalaska.

[0065] Štaviše, kompozicija prema pronalasku ima, kako je očigledno iz sprovedenih analiza, dobru otpornost mukoadhezije na ispiranje fiziološkim rastvorom, podvrgavanjem sistema protoku veštačke pljuvačke od 2 ml/min na Franz-ovu ćeliju. Ovaj tretman, oponašajući otpornost kompozicije prema protoku pljuvačke in situ, pokazuje da se kompozicija prema pronalasku karakteriše visokom mukoadhezijom koja traje tokom vremena, što je evidentno iz podataka prikazanih na slici 2.

[0066] Štaviše, kompozicija se može dalje ili alternativno okarakterisati po tome što ima zaštitni efekat barijere, procenjen izračunavanjem procenta smanjenja proizvodnje citokina u eksperimentima sprovedenim na ćelijama u prisustvu produkta prema pronalasku u odnosu na pozitivnu kontrolu bez produkta, nakon kontakta sa pogodnim inflamatornim sredstvom sposobnim da izazove proizvodnju pomenutog citokina.

[0067] Kao sistem za merenje, može se koristiti bilo koje poznato inflamatorno sredstvo i odgovarajući aktivirani citokin. Primer mogućeg sistema inflamatornog sredstva predstavlja lipopolisaharid (LPS) i IL-6.

[0068] Analiza efekta barijere je in vitro analiza biološkog tipa koji se koristi za procenu sposobnosti gotovih produkata i/ili sirovina da zaštite, stvaranjem tankog "izolacionog" sloja, sluzokožu i kožu od kontakta sa zagađivačima životne sredine (prašina, polena, mikroorganizmi itd.).

[0069] Analiza je razvijena da simulira in vitro dejstvo produkata koji se nanose na kožu i/ili sluzokožu sa ciljem stvaranja zaštitnog filma protiv spoljnih agresora.

[0070] Model koristi prednost principa prema kome ćelije izložene kontaktu sa inflamatornim sredstvom proizvode i luče proinflamatorne medijatore (citokine) u vanćelijskom okruženju u količini koja se odnosi na stepen izazvane inflamacije; unutar određenog opsega, postoji

1

direktna proporcionalnost između koncentracije i vremena izloženosti inflamatornim sredstvima i količinama oslobođenih citokina.

[0071] Usvojeni eksperimentalni model obezbeđuje dve komore fizički odvojene polupropusnom membranom (pore od 0.4 µm). Ćelije su zasejane u donjoj komori, dok se u gornjoj komori nalazi inflamatorno sredstvo; na polupropusnoj membrani koja razdvaja dve komore tanki film uzorka koji se analizira se stratifikuje da bi se istaknuo, ako postoji, efekat barijere za slobodan prolaz inflamatornog sredstva.

[0072] Polupropusna membrana omogućava prolaz inflamatornog sredstva u donju komoru i predstavlja oslonac na kojem je uzorak za ispitivanje stratifikovan. U zavisnosti od "izolacione" sposobnosti uzorka, doći će do smanjenja migracije LPS iz gornje komore u donju (stoga manja stimulacija ćelija na proizvodnju citokina).

[0073] Sprovedene analize pokazale su da efekat barijere koji ostvaruje kompozicija prema pronalasku smanjuje proizvodnju markera IL-6, u ćelijama podložnim dejstvu inflamatornog sredstva u prisustvu pomenute kompozicije, za oko 65-75%, u odnosu na kontrolne ćelije podvrgnute dejstvu istog inflamatornog sredstva u odsustvu pomenute kompozicije.

[0074] Ova analiza je razvijena da bi se in vitro simuliralo zaštitno dejstvo supstanci i formulacija koje, nanete na kožu i sluzokožu, formiraju "izolacioni" film prema spoljašnjim sredstvima. Model koristi prednost principa prema kojem ćelije izložene kontaktu sa inflamatornim sredstvom proizvode i luče proinflamatorne medijatore (citokine) u vanćelijskom okruženju u količini koja se odnosi na stepen izazvane inflamacije. Analizom je predočeno postavljanje dve komore fizički odvojene polupropustljivom membranom koja omogućava prelaz dovoljno malih rastvora.

[0075] U donjoj komori, koja se sastoji od udubljenja na pločicama za ćelijske kulture, uzgajaju se ćelije (primarna ćelijska linija humanih fibroblasta - HUDE), dok se gornja komora sastoji od umetaka (transwell) i tu se smešta inflamatorno sredstvo LPS.

[0076] Na unutrašnjoj površini transwell membrane koja razdvaja dve komore, tanki film uzorka koji se ispituje je stratifikovan da bi se procenio bilo kakav efekat barijere (BE) nakon slobodnog prolaska inflamatornog sredstva.

[0077] Obim inflamatorne reakcije procenjuje se polukvantitativnim doziranjem citokina oslobođenih u medijumu kulture donje komore, posebno interleukina 6 (IL-6) tipičnog za kasnu fazu inflamatorne reakcije.

[0078] U tabeli u nastavku prikazani su rezultati dobijeni prethodno opisanim eksperimentom sumiranim na slici 3.

[0079] Iz rezultata je vidljivo značajno smanjenje koncentracije IL-6 proizvedeno u eksperimentima u kojima je prisutan ispitivani produkt.

[0080] Vrednost IL-6 jednaka 63.28 pg/µL detektovana za negativnu kontrolu uporediva je sa normalnom bazalnom vrednošću, tj. ne-inflamatornim stanjem.

[0081] Sledeći grafikon jasno prikazuje pruženu zaštitu sa produktima na ćelijama. Podaci su izraženi u obliku umotavanja (F.O.) u poređenju sa kontrolom C- primenom sledeće formule:

UMOTAVANJE (C-) = [izmeren IL-6] / [C - IL-6]

[0082] Od srednjih vrednosti IL-6 izmerenih u analizi barijere i u pozitivnoj kontroli, procenat smanjenja oslobađanja IL-6 se izračunava:

1

100-[(IL-6UZORAK)/IL-6C+) X 100]

[0083] Stoga se primenom formule dobija vrednost smanjenja proizvodnje IL-6, u eksperimentima koji su sprovedeni u prisustvu ispitivanih uzoraka. Srednja vrednost dobijena izvođenjem analize sa kompozicijom prema pronalasku bila je 70.93% u poređenju sa pozitivnom kontrolom kako je prikazano na slici 3.

[0084] Da bi se proverilo da li rezultati zavise isključivo od efekta barijere ispitivanih uzoraka i isključile bilo kakve smetnje u sintezi citokina (antiinflamatorni efekat), paralelno sa analizom barijere (B.A.) na svakom uzorku takođe je izvršena analiza INTERNE KONTROLE (IC) u kojoj su izvedeni isti koraci prethodno opisane analize barijere, međutim, obrnut je redosled stresiranja ćelija: ćelije su prvo stimulisane LPS, a zatim izložene uzorku.

[0085] U ovom slučaju, prisustvo uzoraka ne utiče na proizvodnju interleukina, što je prikazano grafikonom prikazanom na slici 4, što ukazuje na to da produkti nemaju direktnu antiinflamatornu aktivnost. Na kraju, analiza vitalnosti ćelija pokazuje da se nijedna izvedena operacija i obavljeni tretmani nisu pokazali citotoksičnim za ćelije.

[0086] Dobijeni rezultati, koji nisu saopšteni, pokazuju dobru sposobnost tableta da formiraju zaštitnu barijeru koja ometa prelazak antiinflamatornog sredstva LPS.

[0087] Autori pronalaska su sproveli eksperimente za procenu antioksidativne aktivnosti kompozicije prema pronalasku u različitim razblaženjima eksperimentom koji je sproveden paralelno na kompoziciji prema pronalasku u odnosu na slepu probu i u odnosu na rastvorljiv vitamin C u pomenutoj slepoj probi.

[0088] Prema tome, podaci navedeni u nastavku pokazuju kako kompozicija prema pronalasku takođe ima odličnu antioksidativnu aktivnost, i kako pomenuta kompozicija ostaje stabilna takođe u tečnom obliku u odnosu na vitamin C suspendovan u istim ekscipijentima.

[0089] Dobijeni podaci su pokazali da kompozicija prema pronalasku ima delovanje sakupljanja slobodnih radikala uporedivu sa onom koju ima vitamin C kada se uvede kao zamena za polifenolnu frakciju agrimonije u kompoziciji prema pronalasku. Slike 5 i 6 pokazuju rezultate, izražene respektivno kao grafikon koji predstavlja razvoj slobodnih radikala tokom vremena i histogram koji predstavlja delovanja sakupljanja tokom vremena različitih koncentracija kompozicije. Eksperimenti su izvedeni na 1 gramu kompozicije prema pronalasku, dovedeni do krajnje zapremine od 10 ml u fiziološkom rastvoru i ispitani pri maksimalnoj koncentraciji od 0.5 mg/ml i pri minimalnoj koncentraciji od 0.03 mg/ml kompozicije.

1

[0090] Eksperiment je izveden procenom efikasnosti uzorka analiziranog da bi se neutralisali slobodni radikali nastali tretiranjem kultivisanih ćelija sa 500µM H2O2rastvorom. Zaštita od oksidativnog stresa izazvanog sa H2O2izražena je u procentima zaštite od razvoja slobodnih radikala izmerenih sa saopštenom analizom iz eksperimentalnog primera 2, u vremenu od 100 minuta.

[0091] U eksperimentalnom delu su detaljno prikazani eksperimenti izvedeni za procenu aktivnosti sakupljanja kompozicije prema pronalasku.

[0092] Eksperimenti koji su sprovedeni pokazali su da kompozicija prema pronalasku ima dobro delovanje sakupljanja, sposobno da neutrališe H2O2-indukovane slobodne radikale (FR): prva analizirana doza (0.5 mg/ml) smanjuje stvaranje FR 39-50-53-53 -55 i 56%, respektivno, posle svakog vremena izlaganja; druga analizirana doza (0.25 mg/ml) smanjuje stvaranje FR 40 - 50 - 51 - 49 - 48 i 47%, respektivno, posle svakog vremena izlaganja; treća doza (0.125 mg/ml) smanjuje stvaranje FR 41 - 43 - 42 - 35 - 32 i 30%, respektivno, posle svakog vremena izlaganja; četvrta doza (0.0625 mg/ml) smanjuje stvaranje FR 31 - 32 - 30 -27 - 25 i 23%, respektivno, posle svakog vremena izlaganja, i peta doza (0.0313 mg/ml) značajno inhibira stvaranje FR 30-26-24-23-22 i 19%, respektivno, posle svakog vremena izlaganja.

[0093] Askorbinska kiselina (0.05 mg/ml) ima delovanje sakupljanja koja može smanjiti FRs od 45 - 57 - 60 - 60 - 63 e 61% respektivno nakon šest puta izloženosti stresu, dakle sa vrednostima uporednim sa onima iz ispitivane prve doze kompozicije.

[0094] Prema ovom pronalasku, kompozicija se može napraviti za oralnu primenu i može se napraviti u obliku tableta, pilula, granula, praha, sirupa, tečnosti, eliksira, spreja, suspenzije, emulzije, rastvora.

[0095] Za oralnu primenu, kompozicija se može napraviti u obliku dnevnih jedinica doza ili frakcija dnevnih jedinica doza (npr. 2, 3, 4, 5, 6 ili više tableta, pilula, granula ili praha, pojedinačnih doza, sirup, eliksir, sprej ili tečnost mogu se uzimati tokom dana, u skladu sa procenom lekara koji leči), i mogu obuhvatiti konvencionalne ekscipijente uključujući, na primer, sredstva za vezivanje, sredstva za zgušnjavanje, kao što su gume (guma tragakant, arapska guma), životinjski želatin i polivinilpirolidon; razblaživači, kao što su šećer, polialkoholi (sorbitol, manitol, ksilitol), maltodekstrini, neorganske soli (dvobazni kalcijum fosfat, kalcijum karbonat); dezintegratori, kao što su pirinčani skrob, kukuruzni skrob i krompirov skrob; lubrikanti, kao što su magnezijum stearat, polietilen glikoli sa različitim molekulskim težinama; glidanti, kao što je koloidni silicijum dioksid; sredstva protiv adhezije,

1

kao što je, na primer, talk; sredstva za vlaženje kao što je natrijum lauril sulfat. Tablete se mogu obložiti prema postupcima dobro poznatim u standardnoj farmaceutskoj praksi.

[0096] Kompozicija se takođe može napraviti u tečnom ili polutečnom obliku, kao suspenzija, emulzija, rastvor za oralnu primenu i izborno može obuhvatati prirodne arome koje joj daju prijatan ukus.

[0097] Kompozicija u obliku praha ili granula bi se mogla unapred odmeriti u pogodnim posudama i spremiti za upotrebu, bilo gutanjem kao takvih, bilo da se ponovo suspenduju u odgovarajućoj tečnosti kao što je voda, čaj itd. I u ovom slučaju, kompozicija bi mogla da obuhvati prirodne arome koje joj daju prijatan ukus.

[0098] Očigledno je da se svi prethodno navedeni ekscipijenti mogu koristiti u farmaceutski prihvatljivom gradusu.

[0099] U jednom primeru izvođenja, kompozicija kako je opisana ovde, u bilo kojoj od prethodno navedenih primera izvođenja, može biti u obliku farmaceutske kompozicije, tj. sadrži sastojke sa farmaceutskim gradusom, ili bi mogla biti ili biti uvedena u medicinsku hranu ili u medicinski uređaj.

[0100] Kompozicija prema ovom opisu mogla bi biti napravljena u obliku farmaceutske kompozicije ili medicinskog uređaja prema bilo kojoj od klasa opisanih u Direktivi 93/42/EEC o medicinskim uređajima (koja takođe sadrži supstance, a ne samo "uređaje" u smislu objekata).

[0101] U slučaju sirupa mogu se koristiti, osim prethodno opisanih aktivnih komponenti i jedan ili više prethodno opisanih sredstava (konzervansi, sredstva za zgušnjavanje, ekscipijenti, arome itd.).

[0102] Stoga, u specifičnom primeru izvođenja prema ovom pronalasku, kompozicija se može sastojati od ili sadržati sledeće komponente

Tabela 3

1

mogu biti, na primer, u sledećim proporcijama:

Tabela 4

[0103] Ovaj pronalazak se takođe odnosi na postupak za pripremu pomenute kompozicije, pri čemu se ekstrakti pisanga, belog sleza i agrimonije, kako su prethodno opisani, pomešani sa medom, smeđim šećerom i jednom ili više prirodnih aroma, konzervansima, sredstvima za zgušnjavanje i izborno sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijentima.

1

[0104] Konačno, ovaj pronalazak se takođe odnosi na postupak za lečenje suvog kašlja, produktivnog kašlja, kašlja povezanog sa URTI (infekcijom gornjih disajnih puteva) i kašlja uzrokovanog postnazalnim slivanjem sekreta, koji sadrži primenu terapeutski aktivne doze kompozicije prema pronalasku na pacijentu kome je to potrebno, pri čemu pomenuti pacijent takođe može biti u pedijatrijske starosti, gerijatrijske starosti, u gestaciji.

PRIMERI FORMULACIJE

[0105] U nastavku teksta obezbeđeni su neki posebni primeri tečnih formulacija koji se ne smeju podrazumevati kao ograničenje primene.

Tabela 5

Tabela 6

2

Tabela 6

Tabela 7

Tabela 8

Tabela 9

[0106] U jednom poželjnom primeru izvođenja, u svim prethodno saopštenim primerima polisaharidne i polifenolne frakcije su liofilizovane ili osušene raspršivanjem.

EKSPERIMENTALNI PRIMERI

[0107] Sledeći eksperimentalni primeri imaju za cilj da ilustruju neke od anaiza izvedenih na kompoziciji prema ovom pronalasku.

1. MUKOADHEZIVNA ANALIZA

[0108] Mukoadhezivni efekat proizvoda, koji doprinosi stvaranju zaštitnog filma na sluznici, može se proceniti odgovarajućim in vitro modelima.

[0109] Korišćeni model pokazuje da se mukoadhezivnost produkata namenjenih za lečenje sluzokože može odrediti procenom procenta inhibicije vezivanja lektina i glikoproteina. Bukalne ćelije sluznice se u početku tretiraju biotinilovanim lektinom (Con-A), proteinom

2

sadržanom u nekim Leguminosae (Canavalia ensiformis) koji ima veliki afinitet za ostatke glukozida i manozida prisutnih u glikoproteinima membrane. Tako će mesta glikoproteina sluznice biti zauzeta sa biotinilovanim lektinom (tretiranim biotinom, tj. vitaminom H). Ćelije, tretirane biotinilovanim lektinom, napunjene su streptavidin peroksidazom, što omogućava formiranje kompleksa protein/glukoza/lektin/biotin/streptavidin peroksidaza zahvaljujući visokom afinitetu između biotina i streptavidina.

[0110] U ovom trenutku ćelije se isperu, a kompleks protein/glukoza/lektin/biotin/streptavidin peroksidaza se kvantifikuje, procenjujući aktivnost peroksidaze, putem reakcije oksidacije orto-fenilendiamina (kolorimetrijska procena).

[0111] U stvari, kompleks protein/glukoza/lektin/biotin/streptavidin peroksidaza će katalizovati oksidacionu reakciju:

H2O2

O-fenilendiamin 2,3 –diaminofenazin (žuto)

Strep. peroks.

[0112] Intenzitet žuto/narandžaste boje rastvora (meren pomoću spektrofotometra sa λ = 450 nm) srazmeran je količini glikoproteinlektinskih veza, a samim tim i količini dostupnih mesta (glikoproteina) za mukoadheziju

[0113] Tako određena vrednost apsorpcije čini "kontrolu".

[0114] Prilikom određivanja mukoadhezivnosti proizvoda, ćelije se prethodno tretiraju ovim produktom (inkubacija na 30 °C 15 minuta pre tretmana sa lektinom).

[0115] Ako produkt koji se ispituje obuhvata mukoadhezivne supstance, one će se vezati za mesta glukozida i manozida prisutna u glikoproteinima membrana.

[0116] U sledećoj fazi, dodavanjem sekvence biotinilovanog lektina, streptavidin peroksidaze i orto-fenilendiamina, dobiće se manje intenzivna obojenost, u poređenju sa kontrolom, i to pošto su deo glukozidnih mesta dostupnih za vezivanje sa Con-A već bila zauzeta mukoadhezivnim supstancama prisutnim u produktu za ispitivanje. U stvari, početno vezivanje između mukoadhezivnih supstanci sadržanih u produktu koji se analizira, i glukozidnih mesta delimično ugrožava kasniju konjugaciju Con-A sa kompleksom streptavidin peroksidaze i posledični razvoj boje nakon dodavanja oksigenisane vode.

[0117] Smanjenje vrednosti apsorpcije proporcionalno je sposobnosti ispitivanih supstanci da se "mukoadheziraju" na ćelije sluzokože.

[0118] Mukoadhezivna sposobnost izražena je kao procenat inhibicije vezivanja glikoproteina/lektina i predstavlja procenat mesta sluznice zauzetih produktom prema izrazu: Procenat mukoadhezivng produkta = (1-abs uzorka/abs kontrole) × 100

[0119] Štaviše, pored mukoadhezivnih sposobnosti, procenjuje se i otpornost mukoadhezivnog sloja na delovanje rastvora pljuvačke sa kojim dolazi u kontakt.

[0120] U tu svrhu, u drugoj fazi eksperimenta, otpor nost tokom vremena (0.5-2 h) mukoadhezivnosti produkta nakon izlaganja stalnom toku veštačkog rastvora pljuvačke.

[0121] Za izvođenje ove analize, sistem Franz-ovih ćelija, generalno se koristi za procenu perkutane apsorpcije supstance ili za proučavanje drugih postupaka prodiranja kroz prirodne ili veštačke membrane.

[0122] U eksperimentu, kulture bukalnih ćelija su uzete od davaoca i tretirane formulacijama produkta kako je opisano u analizi na 2, u različitim razblaženjima, kako je prikazano na slici 2, (razblaženje je najverovatnije bliže stvarnim uslovima koji bi se mogli dogoditi in vivo). Davaoc je zatim napajan peristaltičkom pumpom sa kontinuiranim protokom (2 ml/min.) rastvora veštačke pljuvačke.

[0123] Na bazi davaoca, u zoni razdvajanja sa receptorom, postavljena je membrana celuloznog acetata, sposobna da dozvoli odliv rastvora pljuvačke od davaoca do receptora, zadržavajući ćelije sluzokože u davaocu.

[0124] Protok pljuvačke kroz ćelije sluzokože tretirane produktom koji se ispituje redovno se prekida nakon 0.5, 1, 2 sata i ćelije davaoca se prenose u odgovarajuću epruvetu za procenu mukoadhezivnosti.

[0125] U svetlu dobijenih rezultata, moguće je konstatovati da produkt, koji pokazuje da poseduje dobru, otpornu mukoadhezivnost, može imati zanimljivu zaštitnu ulogu na ćelijama sluznice usnog trakta.

[0126] Da bi se imitiralo prirodno razblaživanje sirupa u usnoj duplji, analize mukoadhezivnosti su sprovedene na produktu razblaženom 1:2; zbog veće potpunosti, takođe je ispitivana mukoadhezivnost produkta razblaženog 1:5.

[0127] Procenat mukoadhezivnosti nerazređenog ili razblaženog (1:2 i 1:5) produkta prema humanim bukalnim ćelijama prikazan je na slici 1.

[0128] Otpornost mukoadhezivnog sloja dobijenog sa proizvodom razblaženim 1:2 u različito vreme, 0.5 h, 1 h i 2 h prema simuliranom rastvoru pljuvačke (0.9% fiziološki rastvor NaCl) prikazana je na slici 2.

2

2. ANALIZA ANTIOKSIDATIVNE AKTIVNOSTI TIPA SAKUPLJANJA

[0129] Procena antioksidativne aktivnosti uzorka na ljudskim ćelijama izloženim progresivnom oksidativnom stresu hemijskog tipa.

[0130] Procena antioksidativnog dejstva se dobija kvantifikacijom stvaranja slobodnih radikala u ćelijama izloženim uzorku i oksidativnom stresu.

[0131] Primenjena postupka se zasniva na upotrebi fluorimetrijske sonde 2,7 dihlorfluorescein acetata -DCA-: ova sonda prodire u ćelije, vezuje se za proteine ćelijske membrane i makromolekule. U ovom obliku sonda nije fluorescentna, već postaje fluorescentna samo kada se oksiduje slobodnim radikalima. Ćelije prethodno tretirane sa DCA izložene su različitim razblaženjima uzorka i vodonik peroksida. U redovnim razmacima od 20 minuta do 100 minuta (5 merenja), formiranje slobodnih radikala se procenjuje sa fluorimetrom (Victor X4 Perkin Elmer): dejstvo sakupljanja se postiže poređenjem slobodnih radikala proizvedenih ćelijma izloženim uzorku i vodonik peroksidu i onih izloženih samo vodonik peroksidu.

[0132] Pripremljene su kompozicije prema primerima 2, 4 i 6. 1 g kompozicije koja se sastoji od 0.2% tež./tež. polisaharidne frakcije belog sleza, 0.35% polisaharidne frakcije pisanga, 0.2% polifenolne frakcije Agrimonije koja sadrži tanine, 25% meda (za kompozicije 4 i 6 i 35% za kompozicija 2), izmereno je 46.6% smeđeg šećera i farmaceutski prihvatljivih nosača i ekscipijenata (prema respektivnim primerima) i dovedeno do finalne zapremine od 10 ml (10 mg/ml) u fiziološkom rastvoru. Ispitivani rastvor je imao pH veći od 7. Polazeći od ovog matičnog rastvora, prvo razblaživanje je pripremljeno na koncentraciji od 0.5 mg/ml u fiziološkom rastvoru; od toga, primenom faktora razblaživanja 1:2, dobijena su druga četiri razblaženja

[0133] Ispitivane su i druge kompozicije prema prethodno navedenim primerima kompozicije, dajući analogne rezultate. Takođe je potvrđeno odsustvo antioksidativne aktivnosti nosača i ekscipijenata korišćenih u kompozicijama. Istovremeno sa kompozicijom, takođe su analizirane pozitivna kontrola i unutrašnja kontrola.

Pozitivna kontrola: ćelije izložene 500µM rastvoru H2O2.

Unutrašnja kontrola: ćelije izložene rastvoru askorbinske kiseline (0.05 mg/ml).

Negativna kontrola: ćelije izložene medijumu za inokulaciju.

2

[0134] Analiza je izvedena na jednostavnom ćelijskom modelu koji se sastoji od jednoslojnih stabilizovanih humanih keratocita (ćelije su kupljene od IZSLER i garantovano su čiste od bilo koje virusne/bakterijske kontaminacije i/ili od mikoplazme).

Opis reagensa/rastvora i povezane skraćenice:

[0135]

Fetalni teleći serum FCS

Natrijum dodecil sulfat SDS

Medijum kulture: Dulbecco-va visoka glukoza (D-MEM) upotpunjena sa glutaminom (2mM), antibioticima kao što su penicilin (2000 UI/ml)-streptomicin (1000 Ul/ml)-Fungizon (2µg/ml) i fetalni teleći serum (10%), hidrokortizon 0.5ng/ml, Insulin 5µg/ml, faktor rasta epitela 0.01µg/ml DMEM

Medijum za inokulaciju: Dulbecco-va visoka glukoza (D-MEM) upotpunjena sa glutaminom (2mM), antibioticima kao što su penicilin (2000 Ul/ml)- streptomicin (1000 Ul/ml)-Fungizon (2µg/ml) i fetalni teleći serum (5%), hidrokortizon 0.5 ng/ml, Insulin

5µg/ml, faktor rasta epitela 0.01 µg/ml DMEMi

Fosfatni pufer PBS

Neutralno crveni radni rastvor: 0.4% uskladištenog rastvora je razblaženo u minimalnom osnovnom medijumu (MEM), filtrirano na papiru neposredno pre upotrebe. Korišćena koncentracija je

0.04% NRw

Neutralno crvena tečnost za ekstrakciju: pripremljena nekoliko minuta pre upotrebe, sastoji se od 49%

destilovana voda - 50% etanol - 1% glacijalna sirćetna kiselina ExB

2,7 DIHLOROFLUORESCEIN DIACETAT: 4 µm DCA

2

Doze, način primene i analitičke replike

[0136] Postavljene su dve serije (u prisustvu i odsustvu H2O2) od pet razblaženja uzorka baze 2: od 0.5 – 0.25 – 0.125 – 0.0625 i 0.0313 mg/ml. Isti postupak je sproveden da bi se dobilo istih pet razblaženja u 500µM rastvoru H2O2u fiziološkom rastvoru. 150 µl po svakom razblaženju (u fiziološkom rastvoru i u H2O2) raspodeljeno je u četiri udubljenja na dve različite pločice.

Dan 1

Zasejavanje ćelija

[0137] Kultivisane ćelije su enzimski odvojene od medijuma za rast i prebrojane pomoću elektronskog brojača ćelija (Scepter); pripremljena je suspenzija ćelija (u medijumu za inokulaciju) na gustinu od 300,000 ćelija/ml, koja je zatim raspoređena u pločice sa 96 udubljenja: 100 ml po udubljenju, čime je dobijena gustina sejanja od 30,000 ćelija po udubljenju. Na kraju, pločice su vraćene u kulturu u inkubator na 37 °C i vlažnu atmosferu obogaćenu sa 5% CO2tokom naredna 24 sata.

Dan 2

Izloženost DCA probi

[0138] Medijum za inokulaciju je uklonjen, ćelije su isprane jednom sa PBS, zatim je PBS odbačen i 150 µl DCA (4 µM) je distribuirano u obe pločice. Zatim su pločice vraćene u inkubator na 37 °C i atmosferu obogaćenu sa 5% CO2na 15 minuta.

[0139] Na kraju perioda inkubacije sa DCA, rastvor je uklonjen, i ćelije su isprane jednom sa PBS, zatim je 150 µl prethodno opisanih razblaženja uzorka i kontrola raspoređeno po pločicama. Zatim je stvaranje slobodnih radikala mereno od T0 (odmah nakon inokulacije u dve pločice) svakih 20 minuta, do 100 minuta (5 merenja) sa fluorimetrom. Na kraju merenja, nakon 100 minuta, inokulat sa obe pločice je uklonjen i izvršena je analiza vitalnosti unošenjem neutralno crvenog.

[0140] Ćelije su ostavljene u kontaktu sa 150µl NRw tokom 3 sata na 37 °C u inkubatoru sa obogaćenom atmosferom sa 5%CO2. Neutralno crveno (NR) prodire u ćelije i skladišti se u

2

lizosomima. Samo vitalne ćelije koje su očuvale netaknutu funkcionalnost membrane moći će da zadrže NR. Shodno tome, što je veći broj vitalnih ćelija, veća je količina NR uskladištena u ćelijama. Na kraju tri sata inkubacije, pločice su sakupljene, rastvor NR je uklonjen i ćelije su podvrgnute ispiranju sa 150 µl PBS da bi se eliminisalo NR u višku. Zatim je izvršena ekstrakcija neutralno crvenog nakupljenog u lizosomima primenom, u svakom udubljenju, 150 µl ExB. Faza ekstrakcije je produžena 15 minuta uz mešanje na sobnoj temperaturi. Tako se dobija crvena tečnost čiji se intenzitet, proporcionalan broju prisutnih vitalnih ćelija, meri spektrofotometrijskim očitavanjem na 570±30 nm.

[0141] Intenzitet emitovane fluorescencije i neutralno crvenog ekstrahovan u pločicama sa 96 udubljenja meren je fluorimetrijskim i spektrofotometrijskim očitavanjem na 540 nm sa čitačem ploča Victor X4 (Perkin Elmer).

PROCENA REZULTATA I PRORAČUN

Detekcija stope preživljavanja

[0142]

%Vitalnosti = [(O.D. Uzorak ± H2O2/ O.D. Pozitivna kontrola/Negativna) × 100]

%Inhibicije vitalnosti = (100 - % vitalnosti)

O.D.: optička gustina

O.D. Uzorak 6 H2O2: prosečna optička gustina, dobijena od ćelija izloženih uzorku sa i bez H2O2

O.D. pozitivna/negativna kontrola: optička gustina medijuma dobijena od ćelija izloženih rastvoru H2O2 ili samo fiziološkom rastvoru (100% vitalnost)

Procena antioksidativne aktivnosti sakupljanjem

[0143]

F.U.: fluorescentna jedinica

2

F.U. pozitivna kontrola: prosek F.U. emitovan sa ćelija izloženih rastvoru H2O2 (maksimalna proizvodnja slobodnih radikala)

F.U. negativna kontrola: prosek F.U. emitovan sa ćelija koje nisu izložene oksidativnom stresu

[0144] Na svakom vremenskom intervalu izlaganja (TO-T1-T2-T3-T4-T5) sprovedeno je:

1) Normalizacija proseka F.U. emitovanih iz ćelija izloženih uzorku, vitaminu C bez oksidativnog stresa, se oduzima od proseka F.U. emitovanih iz ćelija izloženih uzorku, vitaminu C i oksidativnom stresu. Drugim rečima, prosečne vrednosti fluorescencije emitovane sa pločica koje nisu izložene stresu oduzete su od prosečnih vrednosti fluorescencije emitovane sa pločica koje jesu izložene stresu.

2) Proračun procenta smanjenja slobodnih radikala:

% FR inhibicije =

[100 – (F.U. UzorakPoz- F.U. UzorakNeg) / (U.F. KontrolaPoz- U.F. KontrolaNeg) * 100]

F.U. UzorakPoz: ćelije izložene uzorku i oksidativnom stresu

F.U. UzorakNeg: ćelije izložene samo uzorku

F.U. KontrolaPoz: ćelije izložene samo oksidativnom stresu

F.U. KontrolaNeg: ćelije izložene fiziološkom rastvoru bez oksidativnog stresa

Kriterijumi prihvatanja studije

[0145] Uzorak- pozitivna i negativna kontrola: koeficijent varijacije mora biti <20%. Koeficijent varijacije

VC = ((sd/ODprosek) × 100)

[0146] p vrednost (tip 2 dvostrani t test) mora biti niža od 0.05%.

[0147] Tabela u nastavku prikazuje podatke koji se odnose na razvoj slobodnih radikala. Podaci su prikazani, obrađeni, na slici 5.

Tabela 10

[0148] Podaci navedeni u tabeli pokazuju da su, na razblaženjima od 0.5 mg/ml i 0.25 mg/ml, vrednosti dobijene sa kompozicijom prema pronalasku uporedive sa onima dobijenim sa vitaminom C.

[0149] Dobijeni podaci su zatim obrađeni u smislu % zaštite od slobodnih radikala koje vrše analizirane supstance.

[0150] Tabela u nastavku prikazuje podatke koji se odnose na dobijene rezultate. Ono što je prikazano u tabeli u nastavku je grafički obrađeno na slici 6.

Tabela 11

1

[0151] Podaci navedeni u tabeli pokazuju da su, u razblaženjima od 0.5 mg/ml i 0.25 mg/ml, vrednosti dobijene sa kompozicijom prema pronalasku uporedive sa onima dobijenim sa vitaminom C.

[0152] Tabela u nastavku pokazuje ststističku značajnost dobijenih rezultata.

Tabela 12

2

[0153] Kao što se vidi iz prezhodne tabele, statistička analiza dobijenih rezultata potvrdila je da izvršeno ispitivanje ispunjava sve tražene kriterijume prihvatljivosti, stoga su potvrđeni podaci dobijeni za ispitivane supstance.

[0154] Sumirajući prethodno navedeno, analize izvedene na uzorcima kompozicije prema pronalasku u različitim primerima izvođenja, kako je prethodno opisano, pokazali su da kompozicija ima dobro delovanje sakupljanja, sposobno da neutrališe slobodne radikale izazvane sa H2O2(FR): prva analizirana doza (0.5 mg/ml) smanjuje stvaranje FR 39-50-53-53-55 odnosno 56%, respektivno, posle svakog vremena izlaganja. Zahvaljujući ovom rezultatu, ova doza se može smatrati najefikasnijom dozom.

[0155] Druga analizirana doza (0.25 mg/ml) smanjuje stvaranje FR 40 - 50 -51 - 49 - 48 i 47%, respektivno, posle svakog vremena izlaganja.

[0156] Na trećoj dozi (0.125 mg/ml), smanjeno je stvaranje FR 41 - 43 - 42 - 35 - 32 i 30%, respektivno, posle svakog vremena izlaganja.

[0157] Na četvrtoj dozi (0.0625 mg/ml) smanjeno je stvaranje FR 31 - 32 - 30 -27 - 25 i 23%, respektivno, posle svakog vremena izlaganja.

[0158] Peta doza (0.0313 mg/ml) značajno inhibira stvaranje FR 30- 26 - 24 - 23 - 22 i 19%, respektivno, posle svakog vremena izlaganja.

[0159] Askorbinska kiselina (0.05 mg/ml) ima delovanje sakupljanja koje može smanjiti FRs od 45 - 57 - 60 - 60 – 63 i 61%, respektivno nakon šest puta izloženosti stresu. Analiza vitalnosti unošenjem neutralno crvenog, izvedena na pločici koja nije izložena oksidativnom stresu, istakla je da nema smanjenja vitalnosti ćelija, što bi ugrozilo značaj analize.

[0160] Shodno tome, kompozicija prema pronalasku, uzimajući u obzir veliku silu primenjenog stresa, pokazala se kao dobro sredstvo za sakupljanje.

3. PROCENA STABILNOSTI KOMPOZICIJE PREMA PRONALASKU

[0161] Stabilnost kompozicije prema pronalasku u tečnom obliku (sirup, prema prethodno navedenim primerima, na 2) u odnosu na tanine procenjena je merenjem sadržaja ukupnih tanina, izraženih kao pirogalol, pomoću spektrofotometrijskog postupka opisanog u Evropskoj farmakopeji ( EP 9.2, 2.8.14) za poljoprivredu.

[0162] Kao što se može videti iz podataka navedenih u tabeli u nastavku, ne primećuju se promene titra u razmaku od šest meseci, držeći uzorak u ekstremnim uslovima, na 40 °C i 75% relativne vlažnosti.

[0163] Vitamin C, u preparatima koji su se razlikovali u formulaciji samo zbog prisustva vitamina C umesto tanina, nije pokazao stabilnost izvan T0.

4. ANALIZA EFEKTA BARIJERE

[0164] Za analizu efekta barijere korišćene su dve komore fizički odvojene polupropustljivom membranom (pore od 0.4 µm). Ćelije humanih fibroblasta zasejane su u donju komoru, dok je inflamatorno sredstvo LPS (prečišćeni lipopolisaharid E. coli) unet u gornju komoru; na polupropustljivoj membrani koja razdvaja dve komore stratifikovan je tanki film kompozicije kako je opisana u ovom pronalasku.

[0165] Indukovani inflamatorni odgovor procenjen je pomoću polu-kvantitativne doze citokina interleukin 6 (IL6) oslobođenog u medijumu kulture donje komore: procena efekta barijere dobijena je poređenjem sa pozitivnom kontrolom u kojoj su dve komore razdvojene istim tipom polupropustljive membrane, bez ikakvih barijera.

[0166] Što se tiče granične vrednosti iznad koje se može reći da supstanca izaziva efekat barijere u ovde opisanoj analizi, istraživači su identifikovali vrednost jednaku 15% inhibicije u poređenju sa kontrolom, prilikom postavljanja analize , na osnovu analiza sprovedenih na supstancama za koje je poznato da imaju efekat barijere.

[0167] Zatim je procenjen efekat barijere kompozicije u formulacijama na 2 prethodno.

[0168] Podaci prikazani na slici 3 pokazuju kako kompozicija ima izvanredan efekat barijere.

[0169] Analiza procene je izvedena na sledeći način, putem postupka razvijenog da bi se simulisalo in vitro zaštitno dejstvo supstanci i formulacija koje, kada se nanesu na kožu i sluzokože in vivo, formiraju „izolacioni“ film protiv sredstava životne sredine.

4

[0170] Model koristi prednost principa prema kome ćelije izložene kontaktu sa inflamatornim sredstvom proizvode i luče proinflamatorne medijatore (citokine) u vanćelijskom okruženju u količini koja se odnosi na stepen izazvane inflamacije. Što je veća količina inflamatornog sredstva stigla do ćelija, veća je količina oslobođenog citokina.

[0171] Postavljene su dve komore, fizički odvojene polupropustljivom membranom koja omogućava prelazak rastvora dovoljno male veličine.

[0172] U donjoj komori, koja se sastoji od pločica sa udubljenjima za ćelijske kulture, uzgajaju se HuDe ćelije (br. BS PRC 41, kupljene od Istituto Zooprofilattico di Brescia, Italy), dok se u gornju komoru koja se sastoji od umetka za složene ćelijske kulture (transwells) smešta inflamatorno sredstvo.

[0173] Na površini polupropustljive membrane umetka koji razdvaja dve komore.

[0174] Na površini polupropustljive membrane umetka koji razdvaja dve komore, pre uvođenja inflamatornog sredstva u gornju komoru, tanki film uzorka koji se ispituje se stratifikuje da bi se procenila bilo koja BE nakon slobodnog prelaska inflamatornog sredstva.

[0175] U zavisnosti od izolacionih sposobnosti uzorka, doći će do smanjenja migracije inflamatornog sredstva iz gornje komore i, kao posledica, manje stimulacije ćelija za proizvodnju citokina. Obim inflamatorne reakcije procenjuje se pomoću polukvantitativne doze citokina oslobođenih u medijumu kulture donje komore, posebno interleukina 6 (IL-6).

[0176] Kao kontrola koristi se sličan eksperiment u kojem nijedan uzorak nije slojevit na membrani, pa je tako moguće meriti efekat inflamatornog sredstva bez ikakve barijere pored polupropustljive membrane.

[0177] Štaviše, koristi se unutrašnja kontrola u kojoj se kultivisane ćelije prethodno tretiraju supstancom prilagođenom da izazove oslobađanje markera, a uzorak se stavlja na polupropustljivu membranu u odsustvu pomenute supstance, pa se tako vrši jedno ili više merenja tokom vremena količine markera u medijumu kulture pomenute unutrašnje kontrole. U unutrašnjoj kontroli ćelije se stoga prvo stimulišu indukcionom supstancom, a zatim se mora proceniti da li uzorak koji može proći kroz membranu i otići u ćelije potisnute prethodnim medijumom ima ikakvog efekta na smanjenje oslobađanja markera koji nije povezan sa efektom barijere. Na primer, kada se inflamatorno sredstvo koristi kao indukciona supstanca, unutrašnja kontrola omogućava da se razume da li je smanjenje koncentracije citokina u medijumu kulture posledica efekta barijere ili da li uzorak koji može proći u ćelije potisnute prethodnom medijumom ima bilo kakav efekat na smanjenje inflamatornog odgovora nezavisno od efekta barijere.

[0178] Efekat barijere (BE) izražava se kao procenat smanjenja oslobađanja IL-6 i izračunava se upoređivanjem sa pozitivnom kontrolom u kojoj su dve komore razdvojene istim tipom polupropustljive membrane bez barijere koju stvara uzorak.

4.1 PRIPREMA ĆELIJSKE KULTURE:

[0179] Za svaki analizirani uzorak (prema 2 prethodno), ćelijske linije HuDe zasejane su u udubljenja pločice sa ćelijskom kulturom, jedna za analizu barijere (T.B.) (BA) i druga za unutrašnju kontrolu pri gustini od 40,000 ćelija/ml u MEM medijumu dopunjenom sa 10% goveđeg seruma (FBS); 1 ml ćelijske suspenzije po udubljenju.

[0180] Ćelije su tretirane sa UZORKOM (CAM), sa POZITIVNOM KONTROLOM (C+) (inflamatorno sredstvo bez uzorka), i sa NEGATIVNOM KONTROLOM (C-) (samo medijum) i svaka analiza je izvedena u triplikatu.

[0181] Pločice su inkubirane na 37°C, preko noći (22-24 sata).

4.2 PRIPREMA UMETAKA ZA KOMPLEKSNE ĆELIJSKE KULTURE

[0182] Umetci ćelijske kulture (Becton Dickinson) za složene ćelijske kulture postavljeni su na druge pločice i na svaku od njih je isporučena fiksna količina kolagena od 0.1 mg/ml. Pločice su inkubirane na 37 °C preko noći (22-24 sata).

[0183] Da bi se nastavio eksperiment, očekuje se spajanje ne manje od 95%.

[0184] Iz dve pločice (BA i IC) sa umetcima uklonjen je kolagen, a umetci su ostavljeni ispod prekrivenog protoka tokom vremena potrebnog da se potpuno osuše (10÷15 minuta).

4.3 ANALIZE BARIJERE (BA)

[0185] Koraci opisan u nastavku su sprovedeni u pločicama kulture za BA.

Postavljanje sloja uzorka u BA:

[0186] Na polupropustljivoj membrani uzorka, 100 µl kompozicije na bazi 0.5% alginata je inokulirano i ostavljeno da se stratifikuje 20 minuta, dok u C+ i C- umetcima ništa nije dodato. Nakon što je proteklo 20 minuta, višak uzorka je uklonjen, a membrane isprane sa PBS prema postupcima navedenim u protokolu.

Dodavanje LPS (inflamatornog sredstva) BA umetcima

[0187] Nakon što se sloj uzorka osušio, kao u primeru 2 prethodno, u prva tri CAM umetka i u tri C+, 300 µl rastvora LPS (lipopolisaharid membrana) je inokulirano na koncentraciji od 1 µg/ml, dok je u preostala tri C- dodato 300 µl MEM medijuma sa 5% FBS. Umetci su umetnuti u njihova odgovarajuća udubljenja sa ćelijama i pločice su inkubirane 1 h na 37 °C i u atmosferi obogaćenoj sa 5% CO2preko noći (22-24 sata). Kada je inkubacija završena nakon 1 sata, umetci su uklonjeni i odbačeni, a pločice su ponovo inkubirane preko noći (22-24 sata).

4.4 ANALIZA INTERNE KONROLE (IC):

[0188] Analiza interne kontrole je izvršena istovremeno sa BA.

Izlaganje IC ćelija LPS:

[0189] Nakon što se osuši, u prvih šest umetaka IC, tri za uzorak koji se analizira, CAM i tri za C+, inokulirano je 300 µl LPS rastvora, dok je u preostala tri C- dodato 300 µl medijuma.

[0190] Umetci sa LPS i MEM su onda umetnuti u udubljenja sa IC ćelijama i sve je inkubirano 1 h.

Uklanjanje LPS i sušenje IC membrane:

[0191] Nakon što je inkubacija završena posle 1 sata, umetci su uklonjeni iz udubljenja sa ćelijama i prebačeni na praznu pločicu, dok je pločica sa ćelijama stavljena u inkubator.

[0192] Još prisutni rastvor LPS uklonjen je iz umetaka, koji su podvrgnuti brzom ispiranju ultračistom sterilnom vodom i ostavljeni da se osuše.

Raspored sloja uzorka u IC:

[0193] Na polupropustljivoj membrani tri umetka za uzorak, 100 µl kompozicije na bazi 0.5% alginata je inokulirano i ostavljeno da se stratifikuje 20 minuta, dok u umetke C+ i C- ništa nije dodato. Nakon što je proteklo 20 minuta, višak uzorka je uklonjen, a membrane su isprane sa PBS prema postupcima navedenim u protokolu.

Dodavanje LPS umetcima IC

[0194] Kada su umetci sa uzorkom spremni, u sve umetke (CAM, C+, C-) dodato je 300 µl medijuma. Umetci su umetnuti u njihova odgovarajuća udubljenja sa ćelijama i pločice su inkubirane 1 h na 37 °C.

[0195] Nakon što je inkubacija završena posle 1 h, umetci su uklonjeni i odbačeni, a pločice su ponovo inkubirane preko noći (22-24 sata).

4.5 PRIKUPLJANJE SUPERNATANTA I IMUNOANALIZA ENZIMA

[0196] Nakon što je proteklo 22-24 sata, supernatanti su sakupljeni sa BA i IC pločica za izvođenje ELISA analize i polukvantitativne doze IL-6.

PROCENA EFEKTA BARIJERE (BE)

[0197] BE supstance ili jedinjenja izražava se kao % smanjenja oslobađanja citokina IL-6 ćelija izloženih LPS, pri čemu je uzorak analiziran u odnosu na pozitivnu kontrolu (C+) pri čemu su ćelije bile izložene samo LPS.

BE = % smanjenja oslobađanja citokina IL-6 = 100- [(pg/µL oslobođenog citokina iz uzorka / pg/µL oslobođenog citokina iz C+) × 100]

[0198] Kao što se može videti iz rezultata na slikama 1-4, kompozicija prema pronalasku ima odlična mukoadhezivna svojstva i visok efekat barijere.

[0199] Očigledno, dakle, pored aktivnosti sakupljanja slobodnih radikala i stabilnosti tokom vremena, kompozicija takođe ima efekat barijere i visoka mukoadhezivna svojstva.

5. PRIPREMA FRAKCIJA

1. Primer pripreme polisaharidne (sluzave) frakcije belog sleza

[0200] Osušeni i izmrvljeni koren belog sleza podvrgava se ekstrakciji vodom, u statičkom ekstraktoru digestijom perkolata, pri čemu se biljka potapa u rastvarač, a rastvarač reciklira od dna do vrha pomoću mehaničke pumpe.

[0201] Odnos lek-rastvarač (DSR) je jednak 1:10, temperatura ekstrakcije je 90 °C, dužina ekstrakcije je 12 sati. Od dobijene smeše, nerastvorljivi ostatak se odvaja od rastvorljive frakcije statičkim pretakanjem, a zatim filtriranjem na papirnom filteru. Dobijeni rastvor se koncentruje isparavanjem etanola, korišćenjem sistema za koncentraciju u vakuumu. Kada se dostigne stepen koncentracije 10:1, koncentracija se prekida, a sušenje se završava liofilizacijom ili sušenjem raspršivanjem. Liofilizirani materijal sačinjava frakciju od interesa (DER 4-10:1).

2. Primer pripreme polisaharidne frakcije pisanga

[0202] Osušeni i izmrvljeni listovi pisanga podvrgavaju se ekstrakciji pomoću 50% etanola (etanol: voda 50:50 tež./tež.), u statičkom ekstraktoru digestijom perkolata, pri čemu se biljka potapa u rastvarač, a rastvarač reciklira od dna do vrha pomoću mehaničke pumpe. Odnos lekrastvarač (DSR) je jednak 1:10, temperatura ekstrakcije je 50 °C, dužina ekstrakcije je 6-8 sati. Od dobijene smeše, nerastvorljivi ostatak se odvaja od rastvorljive frakcije statičkim pretakanjem, a zatim filtriranjem na papirnom filteru. Dobijeni rastvor se koncentruje isparavanjem etanola, korišćenjem sistema za koncentraciju u vakuumu. Kada se dostigne stepen koncentracije 10:1, koncentracija se prekida, a sušenje se završava liofilizacijom ili sušenjem raspršivanjem. Liofilizirani materijal sačinjava frakciju od interesa (DER 4-10:1).

3. Primer pripreme polifenolne frakcije agrimonije

[0203] Osušeni i izmrvljeni vrhovi agrimonije podvrgavaju se ekstrakciji vodom, u statičkom ekstraktoru digestijom perkolata, pri čemu se biljka potapa u rastvarač, a rastvarač reciklira od dna do vrha pomoću mehaničke pumpe.

[0204] Odnos lek-rastvarač (DSR) jednak je 1: 8, temperatura ekstrakcije je 90 °C, dužina ekstrakcije je 12 sati. Od dobijene smeše, nerastvorljivi ostatak se odvaja statičkim pretakanjem, a zatim filtriranjem na papirnom filteru. Od dobijene smeše, nerastvorljivi ostatak se odvaja od rastvorljive frakcije statičkim pretakanjem, a zatim filtriranjem na papirnom filteru. Dobijeni rastvor se koncentruje isparavanjem etanola, korišćenjem sistema za koncentraciju u vakuumu. Kada se dostigne stepen koncentracije 10:1, koncentracija se prekida, a sušenje se završava liofilizacijom ili sušenjem raspršivanjem. Liofilizirani materijal sačinjava frakciju od interesa (DER 4-10:1).

4

Claims (10)

Patentni zahtevi:

1. Kompozicija za upotrebu u lečenju kašlja, koja sadrži jednu ili više polisaharidnih frakcija pisanga, jednu ili više polisaharidnih frakcija belog sleza, jednu ili više polifenolnih frakcija agrimonije koje sadrže tanine, smeđi šećer, med i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača i/ili ekscipijenata, naznačena time da pomenuta jedna ili više polifenolnih frakcija agrimonije koje sadrže tanine sadrže polifenole pri težinskom procentu većem od ili jednakom 3%.

2. Kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, naznačena time da pomenuta jedna ili više polisaharidnih frakcija pisanga sadrži polisaharide koji imaju molekulsku masu veću od 20000 Daltona pri težinskom procentu većem od ili jednakom 3%.

3. Kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 1 ili prema patentnom zahtevu 2, naznačena time da pomenuta jedna ili više polisaharidnih frakcija belog sleza sadrži polisaharide koji imaju molekulsku masu veću od 20000 Daltona pri težinskom procentu većem od ili jednakom 5%.

4. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patenthih zahteva 1 do 3, naznačena time da su pomenuti ekscipijenti odabrani od prirodnih aroma, konzervanasa, sredstava za zgušnjavanje.

5. Kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 4, naznačena time da su pomenuti jedan ili više prirodnih aroma, konzervanasa, sredstava za zgušnjavanje odabrani od limunovog soka, soka od kupine, prirodne arome pomorandže, prirodne arome limuna, prirodne arome mirte, ksantanske gume.

6. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patenthih zahteva 1 do 5, naznačena time da su pomenuti ekstrakti u liofilizovanom obliku ili osušeni raspršivanjem.

7. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6, u obliku tableta, pilula, granula, praha, sirupa, eliksira, tvrdog želatina, mekog želatina, suspenzije, spreja, emulzije, rastvora.

8. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7, naznačena time da ima procenat mukoadhezije, meren sa inhibicijom vezivanja lektina između 85% i 50% kada nije razblažen ili kada je razblažen do maksimalno 1:5.

9. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8, naznačena time da pomenuti tretman je tretman suvog kašlja, produktivnog kašlja, kašlja povezanog sa URTI (infekcijama gornjih disajnih puteva), kašlja kod postnazalnog slivanja sekreta.

10. Postupak za pripremu kompozicije koja se sastoji od polisaharidne frakcije(a) pisanga, frakcije(a) polisaharida belog sleza, polifenolne frakcije(a) agrimonije koje sadrži tanine, smeđeg šećera, meda i jednog ili više farmaceutski prihvatljivih nosača i ekscipijenata, naznačen time da su polisaharidna frakcija(e) pisanga, polisaharidna frakcija(e) belog sleza, polifenolna frakcija(e) agrimonije koje sadrže tanine kako su definisani prema patentnom zahtevu 1 pomešane sa medom, smeđim šećerom i jednim ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenata i nosača.